SK79595A3 - Method of production of modified cutinases, dna vector and host - Google Patents

Description

Tento vynález sa vo všeobecnosti vzťahuje na oblasť lipolytických enzýmov. Podrobnejšie sa vynález týka lipolytických enzýmov, ktoré boli modifikované pomocou rekombinantnej DNA techniky, ďalej spôsobov ich výroby a ich použitia, najmä v enzymatických detergenčných prípravkoch.

Doterajší stav techniky

Lipolytické enzýmy sú enzýmy, ktoré majú schopnosť hydrolyzovať triglyceridy na voľné mastné kyseliny a diglyceridy, monoglyceridy a prípadne glycerol. Môžu tiež štiepiť komplexnejšie estery, ako napríklad vrstvy kutínu v rastlinách alebo v kožnom maze. Lipolytické enzýmy sa používajú v priemysle pre rôzne enzymatické úpravy, ako napríklad inter- a trans- esterifikácia triglyceridov a syntéza esterov.

Tiež sa používajú v detergenčných prípravkoch s cieľom šovať vlastnosti detergenčného prípravku pri odstraňovaní mastnoty.

Najviac používanými lipolytickými enzýmami sú lipázy (EC 3.1.1.3). Napríklad, EP-A-258 068 a EP-A-305 216 (obidve Novo Nordisk) obidve opisujú tvorbu plesňových lipáz prostredníctvom heterológnych hostiteľských mikroorganizmov pomocou rDNA techník, najmä lipázy z Thermomyces lanuginosus/Humicola lanuginosa. EP-A-331 376 (Amano) opisuje lipázy a ich produkciu pomocou rDNA techník, ich použitie, vrátane sekvencie aminokyselín lipázy z Pseudomonas cepacia. Ďalšie príklady lipáz produkovaných rDAN technikou sú uvedené v VO-A-89/09263 a EP-218 272 (obidva Gist-Brocades). Napriek veľkému počtu publikácií o lipázach a ich modifikáciách, jedine lipáza z Humicola lanuginosa má v súčasnosti široké komerčné použitie vo fukcii aditíva v detergentoch pod obchodným názvom Lipoláza (TM).

I Charakteristickým rysom lipáz je, že vykazujú interfaI ciálnu aktiváciu. To znamená, že enzýmová aktivita je oveľa

J, ' vyššia na substráte, ktorý tvorí fázové rozhranie alebo micely, ako na celkom rozpustnom substráte. Medzifázová aktivácia sa prejavuje v náhlom zvýšení lipolytickej aktivity, keď sa koncentrácia substrátu zvýši nad kritickú koncentráciu pre vznik mycel (CMC - critical micell concentration) a tvoria sa rozhrania. Tento jav možno pozorovať experimentálne ako diskontinuitu v graficky znázornenej závislosti účinnosti enzýmu od koncentrácie substrátu.

Mechanizmus aktivácie rozhrania lipáz je vysvetľovaný zmenou konformácie v proteínovej štruktúre molekuly lipázy. Vo voľnom, neviazanom stave čiapočka špirály pokrýva katalytické väzobné miesto. Pri väzbe na lipidový substrát sa čiapočka posunie a katalytické miesto je exponované. Predpokladá sa, že špirálová čiapočka interaguje s lipidovým rozhraním, čo umožňuje, že enzým ostáva viazaný na rozhranie.

VO-A-92/05249 (Novo Nordisk) opisuje geneticky modifikované lipázy, hlavne lipázu z Humicola lanuginosa. ktoré sú 5 modifikované v lipidickej kontaktnej zóne. Lipidická kontaktná zóna je definovaná v prihláške ako povrch, ktorý je ' v aktívnej forme pokrytý špirálovou čiapočkou. Modifikácie zahrňujú deléciu alebo substitúciu jedného alebo viacerých aminokyselinových zvyškov v lipidickej kontaktnej zóne tak, aby sa zvýšil elektrostatický náboj a/alebo aby sa znížila hydrofobicita lipidickej kontaktnej zóny, alebo aby sa zmenila povrchová konformácia lipidickej kontaktnej zóny. Toto sa dosiahne deléciou jedného alebo viacerých negatívne nabitých aminokyselinových zvyškov v lipidickej kontaktnej zóne, alebo substituovaním týchto zvyškov neutrálnymi alebo pozitívnejšie nabitými aminokyselinami a/alebo substituovaním jedného alebo viacerých aminokyselinových zvyškov v lipidickej kontaktnej zóne pozitívne nabitými aminokyselinami a/alebo deléciou jedného alebo viacerých hydrofilných aminokyselinových zvyškov v lipidickej kontaktnej zóne, alebo substituovaním týchto zvyškov hydrofóbnymi aminokyselinami.

Kutinázy sú podtriedou enzýmov (EC 3. 1. 1. 50), hydroláz voskových esterov. Tieto enzýmy sú schopné degradovať kutín, sieť esterifikovaných mastných kyselín a mastných alkoholov s dlhým reťazcom, ktorý sa vyskytuje v rastlinách ako ochranný obal na listoch a stopkách. Okrem toho vykazujú určitú lipolytickú aktivitu, t. j. sú schopné hydrolyzovať triglyceridy. Preto ich možno považovať za špeciálny druh lipáz. Na rozdiel od lipáz však kutinázy navykazujú žiadnu podstatnú aktiváciu rozhrania.

Kutinázy možno získať z množstva zdrojov, ako sú rastliny (napríklad peľ), baktérie a plesne. Kvôli ich degradačným účinkom na tuky, sa kutinázy navrhujú ako súčasti enzymatických detergenčných prípravkov. Napríklad, VO-A-88/ 09367 (Genencor) navrhuje kombinácie surfaktantu a substanciálne čistého enzýmu bakteriálnej kutinázy na formuláciu účinných čistiacich prostriedkov. Objavujú sa detergenčné prípravky obsahujúce kutinázu získanú z Gram negatívnej baktérie Pseudomonas putida ATCC 53552. Avšak v novšej európskej patentovej prihláške EP-A-476 915 (Clorox) je zverejnené, že ten istý enzým, ktorý je potom uvedený ako lipáza - nie je o nič účinnejší ako iné lipázy pri odstraňovaní olejových škvŕn z textílií, pri použití bežnými spôsobmi.

Nedávno sa určila trojrozmerná štruktúra kutinázy z Fusarium solani pisi (Martinez et al., Náture, 356, 1992,

I

615-618). Zistilo sa, že táto kutináza nevykazuje špirálové pokrývanie katalytického väzbového miesta. Namiesto toho sa zdá, že aktívne miesto serínového zvyšku je dosiahnuteľné rozpúšťadlom. Zdá sa, že tieto zistenia potvrdzujú súčasnú teóriu o mechanizme aktivácie rozhrania u lipáz.

Gén kutinázy z Fusarium solani pisi bol klonovaný a sekvenovaný (Ettinger et al., Biochemístry, 26, 1987, 7883 - 7892). VO-A-90/09446,(Plánt Genetics Systems) opisuje klonovanie a výrobu tohto génu na E. colí. Kutináza môže účinne katalyzovať hydrolýzu a syntézu esterov vo vodných a nevodných médiách, v neprítomnosti i v prítomnosti rozhrania medzí kutinázou a substrátom. Na základe jej všeobecnej stability sa predpokladá, že by táto kutináza mohla byť pou žitá na výrobu čistiacich prostriedkov, ako sú detergenty v pracích prostriedkoch a iných špecializovaných prípravkoch rozpúšťajúcich mastnotu, ako sú napríklad kozmetické prípravky a šampóny. Spôsob výroby enzýmu ekonomicky výhodným spôsobom nie je známy, neexistujú ani špecifické enzymatické detergentné prípravky obsahujúce kutinázu.

V dôsledku uvedeného charakteristického znaku, t.j. v dôsledku chýbajúcej aktivácie rozhrania, definujeme pre účel tejto patentovej prihlášky kutinázy ako lipolytické enzýmy, ktoré v podstate nevykazujú žiadnu aktiváciu rozhrania. Kutinázy sa preto odlišujú od klasických lipáz v tom, že nevykazujú špirálovité .zakrytie miesto katalytickej väzby.

Ako je spomenuté vyššie, iba lipáza odvodená od Humicola lanuginosa má dosiaľ široké komerčné použitie ako aditívum detergenčných výrobkov pod obchodným názvom Lipoláza (TM) . Henrich Malmos vo svojom článku v Chemistry and Industry, 1990, s. 183 - 186 uvádza, že je známe, že vo všeobecnosti je účinnosť lipáz v pracom procese nízka a Lipoláza (TM) nie je výnimkou. Počas procesu sušenia, keď sa obsah vody v tkanine znižuje, enzým znovu získava svoju aktivitu a mastné škvrny sú hydrolyzované. Počas nasledujúceho pracieho cyklu sa hydrolyzovaný materiál odstráni. Toto tiež vysvetľuje, prečo účinok lipáz je po prvom pracom cykle nízky, ale je významný v nasledujúcich cykloch. Preto stále existuje potreba lipolytických enzýmov, ktoré vykazujú akúkoľvek významnú aktivitu počas pracieho procesu.

Teraz sa zistilo, že kutinázy, najmä kutináza z Fusarium solani pisi, majú zjavný účinok počas vlastného prania. Aj tak je ešte je dopyt po kutinázach so zvýšenou lipolytickou aktivitou počas prania a po spôsoboch výroby takýchto enzýmov.

Predmetom predkladaného vynálezu je poskytnúť kutinázy, ktoré sú modifikované tak, aby sa zvýšila ich účinnosť, hlavne ich lipolytická aktivita počas prania.

Teraz sa prekvapujúco zistilo, že lipolytická aktivita eukaryotických kutinázových enzýmov , zvlášť kutináz z Fusa5 rium solani pisi , Colletotrichum capsici, Collechotrichum gleosporiodes a Magnaporthe grisea, môže byť zvýšená modifikáciou sekvencie aminokyselín tak, že sa zvýši hydrofobicita na povrchu enzýmu .

Podstata vynálezu kuje vrchu vrchu dická

Kutináza je variant materskej sekvencia aminokyselín tak, . enzýmu . enzýmu . kontaktná kutinázy, kde sa modifiaby hydrofobicita na pobola zvýšená. Výhodne sa hydrofobicita na pozvyšuje tak, aby sa vytvorila rozšírená lipizóna.

vynálezu vyššie, rastliny má byť použitá ako sú varianty kutinázových kutinázy (napríklad

Podstatou Ako je uvedené zdrojov, ako sú Kutináza, ktorá východisková látka v tomto vynáleze kami rekombinantnej DNA, je vybratá kých kutináz. Eukaryotické kutinázy zdrojov, ako sú rastliny (napríklad peľ) alebo huby.

Zdá sa, že skupina (eukaryotických) hubových kutináz zahrňuje dve čeľade s rôznymi špecifickosťami, listovou špecifickosťou a stopkovou špecifickosťou. Kutinázy s listovou špecifickosťou majú tendenciu ku kyslému alebo neutrálnemu pH - optimu, kým kutinázy so stopkovou špecifickosťou majú tendeciu k alkalickému pH-optimu.

vhodnejšie na použitie prípravkoch, ako sú a tekutiny. Kutinázy s kyslým až neutrálnym vhodnejšie pre výrobky s miernym účinkom alebo kondicionéry, ale tiež pre čistiace produkty enzýmov. možno získať z množstva peľ), baktérie a plesne.

materská kutináza alebo ; pre modifikáciu technizo skupiny eukaryoticmožno získať z rôznych

Kutinázy s alkalickým v alkalický stavaných vysoko účinné textilné s kyslým až pH-optimom sú detergenčných pracie prášky pH-optimom sú oplachovacie v priemysle.

V nasledovnej Tabuľke I sú uvedené 4 rozdielne kutinázy so stopkovou špecifickosťou, spolu s ich pH-optimami.

Tabuľka I

Príklady kutináz so stopkovou špecificitou pH-optimum

Fusarium solani pisi9

Fusariura roseum culmorum10

Rhizoctonia solani8,5

Alternaria brassicicola (PNBáza I)9

Podľa tohto vynálezu sú zvlášť výhodné kutinázy, ktoré sú odvodené od štandardného typu Fusarium solani pisi (Ettinger et al., 1987). Keď je použitá v určitých detergentných prípravkoch, vykazuje táto kutináza jasné účinky pri vlastnom praní.

V tomto vynáleze sú tiež vhodné, ako materská kutináza alebo východiskový materiál pre modifikáciu pomocou techniky rekombinantnej DNA, kutinázy s vysokým stupňom homológie ich sekvencie aminokyselín ku kutináze z Fusarium solani pisi. Príkladmi sú kutinázy z Colletotrichum capsici, Collechotricum gloeosporoides a Magnaporthe grisea. Na obr. 12 sú znázornené parciálne sekvencie aminokyselín týchto kutináz a možno vidieť, že tu existuje vysoký stupeň homológie.

Alternatívne možno na zdokonalenie Fusarium solani pisi kutinázy pomocou modifikácie jej génu izolovať genetickú informáciu kódujúcu kutinázy z iných eukaryotických organizmov, môže byť izolovaná použitím 5’- a 3’- DNA sond odvodených od Fusarium solani pisi. Colletotrichum capsici, Collechotricum gloeosporoides a Magnaporthe grisea cDNA kódujúcej (pro)kutinázu a sondy rozpoznávajúce zachované sekvencie v iných lipolytických enzýmoch a ak je to potrebné, použitím týchto sond na multiplikáciu cDNA derivovaných z messenger RNA (mRNA) eukaryotických buniek produkujúcich kutinázu za použitia reakcie polymerázového reťazca alebo PCR technológie (viď napríklad VO-A-92/05249). Po klonovani a expresii takto získaných kutináz kódujúcich gény v E. coli podľa štandardného postupu, sa kutinázy testujú na ich účinnosť pri odstraňovaní mastných znečistením za vhodných pod mienok. Týmto spôsobom možno získať množstvo prirodzene sa vyskytujúcich variantov vyššie spomenutých kutináz so zlepšenou účinnosťou počas prania. Navyše, sekvencie týchto prirodzene sa vyskytujúcich kutináz poskytujú vynikajúci základ pre ďalšie génové inžinierstvo kutinázy Fusarium solani pisi .

Na základe nových prístupov v oblasti faktorov determinujúcich aktivitu lipolytických enzýmov pri vlastnom praní a starostlivým preskúmaním 3D štruktúry kutinázy Fusarium solani nisi sa zistilo množstvo možností, ako zlepšiť účinnosť tejto kutinázy a kutináz vo všeobecnosti pomocou techniky rekombinantnej DNA.

Keďže kutinázy sa zásadne odlišujú od lipáz, ako Lipoláza (TM), interakcia medzi kutinázou a substrátom (lipidické rozhranie) bude založená na princípich rozdielnych od otvárania viečka a expozície hydrofóbnej oblasti, ktorá môže viazať substrát (Brzozowski a ďalší (1991), Náture, 351, 491-494).

Predkladaný vynález ukazuje, že kutinázy môžu byť modifikované tak, že interakcia so substrátom môže byť zvýšená bez tvorby takej velkej hydrofóbnej plochy na povrchu modifikovanej kutinázy, že molekuly kutinázy sa začínajú zhlukovať. Rozšírenie hydrofóbneho povrchu možno dosiahnuť zavedením hydrofóbnych aminokyselín, ako sú alanín, valín, leucín, izoleucín, prolín, fenylalanín, tryptofán a tyrozín a metionín a v menšej miere kyselina glutámová, glutamín a histidín tak, že hydrofóbne bočné reťazce týchto aminokyselín nie sú skryté v hydrofóbnom jadre kutinázy. Metionín sa normálne nepovažuje za hydrofóbnu aminokyselinu, avšak, keď je integrovaný v určitých pozíciách, môže sa účinne podieľať na zvýšení hydrofobicity na povrchu molekuly kutinázy.

V niektorých prípadoch sa zistilo, že je výhodné zaviesť okrem hydrofóbnych aminokyselín tiež nabité aminokyseliny, aby sa zabránilo zhlukovaniu emzýmu. Prekvapujúco sa zistilo, že za integrácie v určitých pozíciách v molekule kutinázy, pozitívne nabité aminokyseliny ako lyzín a arginin tiež poskytujú rozšírenie hydrofóbnej plochy.

Toto je ohraničené na tie pozície v molekule kutinázy, kde metylénové skupiny prítomné v lyzíne a arginíne nemôžu byť skryté v molekule. Výhodou použitia lyzínu alebo arginínu je to, že amino- alebo imido- skupiny zvyšujú pravdepodobnosť, že metylénové skupiny budú exponované a preto budú schopné interagovať s lipidickou fázou.

Lyzín a arginín sa normálne nepovažujú za hydrofóbne aminokyseliny. Avšak, atómy tvoriace bočné reťazce týchto reziduí obsahujú veľké množstvo hydrofóbnych atómov ( v metylénových časticiach), ktoré môžu interagovať s lipidickou fázou. V skutočnosti veľkosť hydrofóbnej časti lyzínového zvyšku je porovnateľná s hydrofóbnou časťou valínového zvyšku.

Ak iné vnútorné vlastnosti kutinázy sú negatívne ovplyvnené zavedením pozitívneho náboja, toto môže byť kompenzované zavedením kompenzujúceho negatívneho náboja alebo zrušením pozitívneho náboja na povrchu alebo v blízkosti tej časti molekuly kutinázy, ktorá interaguje s lipidickou fázou .

Kontrola hydrofobicity povrchu kutinázy Fusarium solani pisi okolo aktívneho miesta ukazuje, že hydrofobicita nie je optimálna. Aby sa zlepšili tieto určité aminokyseliny v tejto oblasti, rezíduá by mali byť nahradené objemnejšími hydrofóbnymi zvyškami.

Kvôli lepšiemu pochopeniu vzťahu medzi štruktúrou a funkciou v lipolytických enzýmoch sa pozorne sledovali trojdimenzionálne (3D) štruktúry množstva takýchto enzýmov. Keďže tieto štruktúry neboli publikované, odvodili sa pomocou techník molekulárneho modelovania.

3D štruktúra lipázy Rhizomucor mieheí bola určená pomocou rontgenových kryštalografických metód (Brady a ďalší, 1990, Náture, 343, 767 - 770, Brzozowski a ďalší, 1991, Náture, 351, 491-494, Derewenda a ďalší, 1992, Biochemistry, 31, 1532-1541). Aktívne miesto Ser 144, patriace k Ser-His-Asp proteáze podobnej katalytickej triáde, je schované pod krátkym špirálovým viečkom (rezíduá 85 - 91). Štruktúra, v ktorej je aktívne miesto Ser schované, je uve9

dená nižšie ako zavretá konformácia enzýmu. Uznáva sa, že adsorpcia na rozhranie olej - voda súvisí s pohybom špirálovitého viečka. Ako dôsledok tohto pohybu sa stáva aktívne miesto serínu exponovaným a zväčšuje sa hodrofóbna plocha okolo aktívneho miesta. Uznáva sa, že otvorená konformácia zodpovedá aktivovanému enzýmu adsorbovanému na rozhraní olej - voda.

Ca-koordináty uzavretej formy lipázy huby Rhizomucor miehei sú uložené v proteínovej data banke v Brookhavene. Vypracované počítačové metódy sa použili na generovanie plnoproteínových koordinátov (hlavný reťazec a bočné reťazce proteínu) lipázy Rhizomucor miehei. Hrubý východzí model lipázy Rhizomucor miehei bol generovaný použitím počítačových metód opísaných v S. Vodák et al., 1989, Protein Engineering, 2, 335 -345. Táto metóda je implementovaná v SYBYL softwarovom balíku molekulárneho modelovania (TRIPOS associates, Inc. St. Luis, Missouri). Následne bol model vylepšený použitím techník minimalizácie energie (EM) a molekulárnej dynamiky (MD)za implementácie v BIOSYM softwarovom balíku molekulárneho modelovania (BIOSYM, San Diego, Kalifornia) . Počas EM a MD vylepšovania modelu sa použil prístup založený na poznatkoch. Model bol simultánne optimalizovaný pre detailné energetické hľadiská potenciálnej energetickej funkcie a známych štrukturálnych kritérií. Kvalita modelu bola určená kritériami, ako počet a kvalita vodíkových väzieb, známky vodíkovej väzby v elementoch sekundárnej štruktúry, orientácia peptidových jednotiek, hodnoty uhlov vzopätia hlavných reťazcov, uhol interakcie aromatických skupín a veľkostí dutín. Navyše bol model skúšaný na nevhodné skryté náboje, extrémne exponované hydrofóbne zvyšky a energeticky nevýhodné pozície disulfidových mostíkov. Relevantné rotaméry bočného reťazca boli vybrané z Ponder & Richardsovej rotamerovej knižnice (Ponder et al., ( 1987), J. Mol.

Biol., 193, 775 - 791). Konečný výber partikulárneho rotamera bočného reťazca z tejto knižnice bol založený na štrukturálnych kritériových hodnoteniach, ako je uvedené vyššie. MD bol použitý na spojenie atómov bočného reťazca do po- ίο zície. Vypracovanie hodnotenia modelovej štruktúry pre konzistenciu so známymi štrukturálnymi vlastnosťami a EM a MD prepočtami na optimalizáciu štrukturálnych charakteristík dovoľuje generovať úplne spoľahlivý atómový model lipázy Rhizomucor miehei. Otvorená konformácia lipázy Rhizomucor miehei bola získaná použitím MD počítačovej simulácie, v ktorej C^q - triglycerid bol oddelený do aktívneho miesta lipázy. Vypracovanie porovnania s publikovanými konformačnými charakteristikami otvorenej štruktúry (Derewenda et al., Biochemistry (1992), 31, 1532 - 1541) ukázalo, že počítačový model otvorenej konformácie, ktorý bol takto získaný, je v podstate rovnaký.

Výchádzajúc zo známej 3D štruktúry lipázy huby Rhizomucor miehei otvorené a uzavreté 3D - štruktúry boli získané použitím predpísanej komparatívnej modelovej techniky, keďže boli implementované do Composer modulu SYBYL molekulárneho softwarového balíka (Tripos associates, Inc. St. Luis, Missouri). Získaný model lipázy Humicola langinosa bol vylepšený tými istými počítačovými postupmi, ako bolo spomenuté vyššie.

Časť molekuly lipázy, ktorá sa podieľa na adsorpcii substrátu na enzýme bola identifikovaná porovnaním trojdimenzionálnych (3D) štruktúr lipázy huby Rhizomucor miehei a lipázy Humicola langinosa.

Vychádzajúc zo známej 3D štruktúry kutinázy Fusarium solani pisi sa získala 3D štruktúra kutinázy z Colletotrichum gloeosporiodes, použitím predpísaných komparatívnych modelových techník, keďže bola implementovaná do COMPOSER modulu SYBYL molekulárneho softwarového balíka (Tripos associates, Inc. St. Luis, Missouri). Získaný model lipázy Colletotrichum gloeosporiodes bol vylepšený tými istými počítačovými postupmi, ako bolo spomenuté vyššie.

Z trojdimenzioná'lnych štruktúr lipolvtických enzýmov uvedených dole v Tabuľke II, sa neočakávanej zistilo, že je možné definovať zvláštny vektor, ktorý je vyrovnávaný metódou najmenších štvorcov cez Ca-atómy zvyškov 116 až 120 kutinázy Fusarium solani pisi. Tento vektor je v podstate koľ11 r mý na povrch, kde sa vyskytuje interakcia so substrátom.

É Z nasledujúcej Tabuľky II vyplýva, že ak sa porovnávajú

I primárne sekvencie množstva lipolytických enzýmov z rozličl ných zdrojov, aminokyselinové zvyšky 116 až 120 kutinázy z Fusarium solani pisi sú asi lokalizované na ploche, ktorá má veľký rozsah funkčnej homológie. Orientácia môže byť riadená pomocou súčinnosti sekvencie Gly-(His/Tyr)-Ser-X-Gly pre lipolytické enzýmy.

Tabuľka II lipáza Humicola Lanuginosa lipáza Mucor miehei ľudská pankreatická lipáza kutináza Fusarium sp. kutináza C.gleosporiodes

Preto bol použitý vektor cez aminokyselinové zvyšky 116 až 120 v molekule kutinázy Fusarium solani pisi na definovanie časti molekuly kutinázy, v ktorej by mali byť urobené modifikácie aminokyselín, aby sa získala kutináza so zosilneným účinkom pri vlastnom praní. Nasledujúca Tabuľka III uvádza štruktúru susediacich aminokyselín pre lipolytické

enzýmy uvedené	v Tabuľke	II .
Tabuľka	III
	reťazec	reťazec		helix	akt.miesto
Líp. H.
Lanuginosa	138-141	142 Ser* 146	147-159	his258
líp. Mucor
miehei	136-139	(fit:140-Ser	*144)	145-157	his257
ľudská pankr.
lip.	144-147	(fit:148-Ser	*152)	153-165	his263
kutináza
F . s . p i s i	112-115	(fit:116-Ser	*120)	121-133	h.isl88
kutináza C.gloe.112-115	(f itl: 116-Ser	*120)	121-133	hisl88

Set* = aktívne miesto Serínu

Vynález v jednom zo svojich aspektov poskytuje modifikovaný enzým kutinázy so zosilneným lipolytickým účinkom pri vlastnom praní, kde je sekvencia aminokyselín modifikovaná tak, že je zvýšená hydrofobicita na povrchu enzýmu. Prednostne je hydrofobicita na povrchu enzýmu susedného lipidickou kontaktnou zónou zvýšená tak, aby sa vytvorila zväčšená lipidická kontaktná zóna.

Zvýšenie povrchovej hydrofobicity kutinázy možno dosiahnuť nahradením jedného alebo viacerých aminokyselinových zvyškov zvyškami aminokyselín vybraných zo skupiny pozostávajúcej z alanínu, valínu, leucínu, izoleucínu, prolínu, fenylalanínu, tryptofánu a tyrozínu, metionínu, kyseliny glutámovej, glutamínu a histidínu. Výhodné sú valín, leucín, izoleucín, fenylalanín, tryptofán a metionín.

Ukázalo sa, že je výhodné modifikovať sekvenciu aminokyselín tak, že okrem zvýšenia hydrofobicity na povrchu sa prostredníctvom jedného alebo viacerých zvyškov lyzinu alebo arginínu zavedie jeden alebo viac pozitívnych nábojov.

Prednostne, modifikované zvyšky sú lokalizované v tej časti molekuly, ktorá je definovaná vektorom , ktorý je vyrovnávaný metódou najmenších štvorcov cez Ca-atómy zvyškov 116 až 120 kutinázy Fusarium solani pisi. alebo zodpovedajúce Ca-atómy rozdielnej kutinázy a rovinu kolmú na uvedený vektor a s obsahom Ca-atómu zvyšku 117, alebo Ca-atómu odlišnej kutinázy.

Ako už bolo uvedené, trojdimenzionálna štruktúra kutinázy z Fusarium solani pisi bola publikovaná. V tom prípade bude jasné, ktorá modifikácia povedie k modifikáciám v zmysle tohto vynálezu. V prípade, že trojdimenzionálna štruktúra partikulárnej kutinázy nie je ešte známa, bude to možné usporiadaním sekvencie aminokyselín so známou sekvenciou ( viď obr. 12), riadenej pomocou súčinnosti sekvencie Gly-(His/ Tyr)-Ser-X-Gly pre lipolytické enzýmy, aby sa vhodnými modifikáciami dosiahol cieľ vynálezu. Prednostne sa v tomto postupe používajú tiež techniky molekulárneho modelovania.

Varianty kutináz produkované podľa vynálezu môžu vniesť výhodu do enzýmovej aktivity, keď sa použijú ako súčasť de tergentných alebo čistiacich prostriedkov. Zvlášť sa zistilo, že majú zvýšený účinok pri vlastnom praní počas hlavného cyklu pri praní. Pod účinkom pri vlastnom praní počas hlavného cyklu pri praní sa rozumie, že detergentný prípravok s obsahom enzýmu je schopný odstrániť významné množstvo mastnej nečistoty zo zašpinenej textílie v jednoduchom pracom procese v automatických práčkach európskeho typu, za normálnych pracích podmienok zahrňujúcich koncentráciu, tvrdosť vody, teplotu. Je treba mať na zreteli, že za tých istých podmienok, bežne komerčne dostupný lipolytický enzým Lipoláza (TM) od Novo Nordisk namá žiadny významný účinok pri vlastnom praní na mastnú znečisteninu.

Účinok enzýmu pri vlastnom praní na mastnú nečistotu môže byť stanovený nasledovnou metódou. Nový testovací polyester s obsahom bavlny menej ako 10% je predpraný za použitia bezenzýmového detergentu, ako je uvedené nižšie a potom sa následne dôkladne opláchne. Takéto nezašpinené tkaniny sa potom zašpinia olivovým olejom alebo iným vhodným hydrolyzovateľným olejovým povlakom. Všetky testovacie tkaniny ( s hmotnosťou približne 1 g) sa inkubujú v 30 ml pracej tekutiny v 100 m polystyrénovej fľaši. Pracia tekutina obsahuje detergent uvedený nižšie v dávke 1 g/1. Fľaše sú 30 min. miešané v práčke Miele TMT naplnenej vodou a pri programe hlavného prania pri 30°C. Variant kutinázy sa predtým pridá do pracej tekutiny v množstve 3 Lu/ml. Kontrola neobsahuje žiadny enzým. Prací prášok má nasledovné zloženie (v hmotnostných %):

Etoxylovaná alkoholická neiónová povrchovo aktívna látka 9.5 Síran sodný 38.6 Uhličitan sodný 40.4 Kremičitan sodný (Na£0 : S12O =2.4) 7.3 Voda 4.2

Ako neiónová povrchovo aktívna látka bol použitý £^2^_(315 ^etoxyľ°^vaný alkohol 10.5-13 EO, ale povaha neiónové ho etoxylovaného alkoholu môže byť v rozmedzí širokých limitov .

Po praní sú tkaniny dôkladne prepláchané studenou vodou a vysušené v bubnovom sušiči so studeným vzduchom a stanoví sa množstvo zvyškovej mastnoty. Toto možno previesť niekoľkými spôsobmi. Bežnou metódou je extrakcia testovacej tkaniny petroléterom v Soxhletovom extrakčnom prístroji, oddestilovanie rozpúšťadla a stanovenie percenta reziduálneho mastného materiálu ako frakcie počiatočného množstva mastnoty na tkanine vážením.

Podľa druhej, citlivejšej metódy sa používa brómovaný olivový olej na znečistenie testovacích tkanín (Richards, S., Morris, M. A. a Arklay, T. H. (1968), Textile Research Journal, 38, 105 - 107). Každá testovacia tkanina je potom inkubovaná v 30 ml pracej tekutiny v 100 ml polystyrénovej fľaši. Séria fliaš je potom vložená do práčky naplnenej vodou a použije sa normálny program hlavného prania pri 30°C. Po hlavnom praní sa testovacie tkaniny opatrne prepláchnu v studenej vode po dobu 5 sekúnd. Okamžite po prepláchaní sa testovacie tkaniny vysušili v sušičke so studeným vzduchom. Po vysušení sa môže stanoviť množstvo zvyškovej mastnoty meraním obsahu brómu v tkanine pomocou rôntgenovej fluorescenčnej spektrometrie. Odstránenie mastnoty môže byť stanovené ako percento množstva prítomného na testovacej tkanine na začiatku nasledovne:

% odstránenia zašpinenia = Bróm^_v - Bróm_av * 100% ^Brómbw kde: bróm^_w označuje percento brómu na tkanine pred praním a bróm percento brómu po praní.

Ďalšou metódou stanovenia enzymatickej aktivity je meranie reflektancie pri 460 nm podľa štandardných postupov.

V kontexte tohto vynálezu modifikovaný, mutovaný alebo mutantový enzým alebo variant enzýmu predstavuje enzým, ktorý je produkovaný mutantovým organizmom, ktorý exprimuje mutantový gén. Mutantový gén (iný ako ten s obsahom iba

I tichých mutácií) predstavuje gén kódujúci enzým, ktorý má í sekvenciu aminokyselín, ktorá je odvodená priamo alebo neI

I priamo, rozdielna v jednej alebo vo viacerých lokáciach.od f sekvencie zodpovedajúceho materského enzýmu. Materský enzým í- predstavuje génový produkt zodpovedajúceho nezmeneného génu.

Tichá mutácia v géne znamená zmenu alebo rozdiel v polynukleotidovej sekvencii génu, ktorý (pre redundanciu vo vzťahoch kodón - aminokyselina) nevedie k žiadnej zmene v sekvencii aminokyselín enzýmu kódovaného tým génom.

Mutant alebo mutantový mikroorganizmus je mikroorganizmus, ktorý je materský alebo od neho odvodený a je podrobený mutácii s ohľadom na jeho gén pre enzým. Taká mutácia organizmu môže byť prevedená alebo (a) mutáciou zodpovedajúceho génu (materský gén) už prítomného v materskom mikroorganizme alebo (b) transferom (zavedením) zodpovedajúceho génu získaného priamo alebo nepriamo z iného zdroja a potom zavedeného (zahrňujúc mutáciu génu) do mikroorganizmu, ktorý sa má stať mutantovým mikroorganizmom. Hostiteľský mikroorganizmus je mikroorganizmus, ktorého mutantový gén, alebo prenesený gén “ iného pôvodu je jeho časťou. Vo všeobecnosti to môže byť ten istý alebo odlišný kmeň alebo druh ako materský mikroorganizmus .

Zvlášť vynález poskytuje mutantové formy kutinázy Fusarium solani pisi objavenej vo Vo-A-90/09446 (Plánt Genetics Systems) a kutináz z Colletotrichum capsici, Collechotricum gloeospo.roides a Magnaporthe grisea. Tieto varianty kutinázy môžu byť produkované rDNA modifikovaným mikroorganizmom obsahujúcim gén získaný alebo vyrobený pomocou rDNA techník.

Akonáhle sa identifikovali zvyšky aminokyselín, ktoré sú umiestnené v tej časti molekuly, ktorá je definovaná vektorom , ktorý je vyrovnávaný metódou najmenších štvorcov cez Ca-atómy zvyškov 116 až 120 kutinázy Fusarium solani pisi. alebo cez zodpovedajúce Ca-atómy odlišnej kutinázy a rovinu kolmú na uvedený vektor a s obsahom Ca-atómu zvyšku 117, alebo zodpovedajúce Ca-atómy odlišnej kutinázy možno sa pokúsiť modifikovať sekvenciu aminokyselín zavedením vhodných aminokyselín v jednej alebo vo viacerých identifikovaných pozíciách, napríklad mutácia N712K príbuzná sekvencii kutinázy Fusarium solani pisi alebo jej homológu.

Odborníkom v oblasti bude jasné, že takéto modifikácie ovplyvnia štruktúru kutinázy. Všeobecne, sú preferované také modifikácie, ktoré príliš neovplyvňujú elektrostatický náboj okolo aktívneho miesta. Bol vyvinutý potrebný stupeň pochopenia rovnováhy medzi nevyhnutnou deformáciou konformácie enzýmu a výhodou zvýšenej aktivity enzýmu, čo umožnilo predikciu a úspešnú výrobu variantov kutinázy s vysokou mierou úspešnosti.

V nasledovnej Tabuľke IV a ďalej sú aminokyseliny a zvyšky aminokyselín v sekvencii peptidov označené jednoa troj-písmenovými skratkami nasledovne:

Tabuľka IV

A	=	Ala	= Alanín	V	=	Val	=	Valín
L	-	Leu	= Leucín	I	=	íle	=	Izolucín
P	=	Pro	= Prolín	F	=	Phe	=	Fenylalanínu
V	=	Trp	= Tryptofán	M	=	Met		Metionín
G	=	Gly	% Glycín	S	=	Ser	=	Serín
T	=	THR	= Treonin	C	-	Cys	=	Cystín
Y	=	Tyr	= Tyrozín	N	=	Asn	=	Asparagín
Q	=	Gin	= Glutamín	D	=	Asp		Kyselina asparágová
E	=	Glu	= Kyselina glutámová	K	=	Lys	=	Lyzín
R	—	Arg	= Arginín	H		His	=	Histidín

Podľa tohto vynálezu môže byť mutácia prítomná v sekvencii aminokyselín proteínu a teda mutantový proteín sám o sebe môže byť opísaný pozíciou a povahou mutácie nasledovnou skrátenou formou: pomocou identity zvyšku originálnej aminokyseliny ovplyvneného mutáciou; miestom (pomocou sekvenčného čísla) mutácie; identitou zvyšku aminokyseliny substituovaného v mieste originálu. Ak je tu inzercia extra aminokyseliny do sekvencie, jej pozícia je označená jedným alebo viacerými opisnými písmenami pripojenými k číslu posledného predchádzajúceho člena pravidelnej sekvencie alebo referenčnej sekvencie.

Napríklad mutant charakterizovaný substitúciou asparagínu lyzínom v pozícii je označený ako. Asnl72Lys alebo N172K. (Hypotetická) inzercia zvyšku pridanej aminokyseliny ako napríklad prolínu po asparagíne by bola označená ako Asnl72AsnPro alebo N172Np, alternatívne ako *172aP, s insertovaným zvyškom označeným číslom pozície 172a. (Hypotetická) delécia asparagínu v tej istej pozícii by mohla byť označená ako Asnl72* alebo N172*. Hviezdička vyjadruje deléciu alebo chýbanie aminokyselinového zvyšku v označenej pozícii, či je vypočítaný ako chýbajúci skutočnou deléciou alebo iba porovnávaním alebo homológiou s inou alebo referenčnou sekvenciou, ktorá má zvyšok v tej pozícii.

Mnohopočetné mutácie sú oddelené znamienkami plus, napríklad N172K+S54I+A128F označuje mutantový proteín nesúci 3 mutácie substitúciou, ako je označené pre každú z troch spomenutých pozícií v sekvencii aminokyselín. Mutácie uvedené v nasledovnej tabuľke môžu byť v prípade potreby kombinované .

Tabuľka 5 dole uvádza kutinázy podľa vynálezu, z Fusarium solani pisi.

určité vhodné príklady variantov založené na sekvencii kutinázy

Tabuľka 5

Varianty kutinázy Fusarium solani pisi

T19V, G41A, T45K, T45P, *I49a, S54I, N58R, G75R, A76P, G82A, D83S, A85F, A85V, S92R, A93V, L99K, G100R, A127L, A128F, N172K, T173I, T179F, I183F, V184I, A185L, L189F, A190L,

D194R, G197V, E201K

Výhodnými variantmi podľa vynálezu sú A85F, N172K a E201K kutinázy Fusarium solani pisi a zodpovedajúce varianty iných kutináz. Príkladom takého zodpovedajúceho variantu kutinázy je variant Aspl72Lys alebo D172K odvodený od kutinázy z Collechotricum gloeosporoides.

Podľa ďalšieho aspektu vynálezu sa tu poskytuje spôsob

výroby variantov kutinázy. Mikroorganizmy produkujúce prirodzene sa vyskytujúcu kutinázu sú obvykle rastlinné patogény a tieto mikroorganizmy nie sú veľmi vhodné pre účinkovanie ako hostiteľská bunka pre modifikované kutinázové gény. Následne gény kódujúce modifikované (pro)kutinázy boli integrované do rDNA vektorov, ktoré môžu byť transferované do výhodného hostiteľského mikroorganizmu pre rDNA technológiu. Z tohto dôvodu možno použiť rDNA vektory v zásade podobné rDNA vektoru opísanému vo VO-A-90/09446.

Mikroorganizmy produkujúce prirodzene sa vyskytujúcu kutinázu nie sú veľmi vhodné pre fermentačné procesy. Kvôli zvýšeniu výťažku fermentačného procesu by mal byť gén kódujúci zdokonalené kutinázy prenesený do mikroorganizmov, ktoré sú schopné rýchleho rastu na lacnom médiu a sú schopné syntetizovať a vylučovať veľké množstvá kutinázy. Takou vhodnou rDNA modifikovanou (hostiteľské mikroorganizmy) podľa predkladaného vynálezu sú baktérie, medzi iným Bacilli, Corynebacteria, Staphylococci a Streptomyces alebo nižšie eukaryoty ako napríkald Saccharomyces cerevisiae a príbuzné druhy, Kluyveromyces marxianus a príbuzné druhy, Hansenula polymorpha a príbuzné druhy a druhy rodu Aspergilus. Výhodnými hostiteľskými mikroorganizmami sú nižšie eukaryoty, pretože tieto mikroorganizmy produkujú a vylučujú enzýmy vo fermentačných procesoch veľmi dobre a sú schopné glykolyzovať molekulu kutinázy. Glykolyzácia sa môže podieľať na stabilite kutinázy v detergentných systémoch.

Vynález tiež poskytuje genetický materiál odvodený od zavedenia génov modifikovanej eukaryotickej kutinázy, napríklad génu z Fusarium solani pisi do klonujúcich rDNA vektorov a ich použitie pre transformáciu nových hostiteľských buniek a pre expresiu génov variantov kutinázy do nových hostiteľských buniek.

Vynález tiež poskytuje polynukleotidy vyrobené alebo modifikované rDNA technikou, ktoré kódujú také varianty kutinázy, rDNA vektory obsahujúce takéto polynukleotidy a rDNA modifikované mikroorganizmy s obsahom takýchto polynukleotídov a/alebo takýchto rDNA vektorov. Vynález tiež poskytuje zodpovedajúce polynukleotidy kódujúce modifikované eukaryotické kutinázy, t. j. polynukleotid so základnou sekvenciou, ktorá kóduje zrelý variant kutinázy, v ktorom konečný prenesený kodón je nasledovaný stop kodónom a mái voliteľnú sekvenciu nukleotidov, ktorá kóduje prepro- alebo pro-sekvenciu tohto variantu kutinázy priamo proti sekvenciám nukleotidov kódujúcim variant zrelej kutinázy. V takomto polynukleotide môže byť sekvencia nukleotidu kódujúceho kutinázu odvodená od pôvodného organizmu modifikovaná tak, že najmenej jeden kodón a výhodne čo najviac kodónov sa podrobí tichým mutáciám, aby sa vytvorili kodóny kódujúce ekvivalentné zvyšky aminokyselín a boli kodónmi preferovanými novým hostiteľom, čím poskytnú pri použití v bunkách takého hostiteľa messenger-RNA pre zavedené gény zvýšenej stability. Proti sekvenciám nukleotidu kódujúcim zrelé kutinázy je lokalizovaná nukleotidová sekvencia, ktorá kóduje signál alebo sekvenciu sekrécie vhodnú pre zvoleného hostiteľa. Teda, výnález sa týka vektora rDNA, do ktorého sa inzertuje nukleotidová sekvencia pre variant kutinázy alebo jej prekurzor.

Nukleotidová sekvencia môže byť odvodená napríklad z:

(a) prirodzene sa vyskytujúcej nukleotidovej sekvencie (t.j. kódujúcej originálnu sekvenciu aminokyselín proprealebo pro- kutinázy produkovanej Fusarium solani pisi);

(b) chemicky syntetizovaných nukleotidových sekvencií pozostávajúcich z kodónov, ktoré sú uprednostnené novým hostiteľom a z nukleotidovej sekvencie rezultujúcej v stabilnej messenger RNA u nového hostiteľa, stále kódujúcej originálnu sekvenciu aminokyselín;

(c) sekvencií nukleotidov vyrobených génovým inžinierstvom, ktoré sú odvodené od sekvencií nukleotidov spomenutých v predchádzajúcich odstavcoch (a) alebo (b) pre kutinázu Fusarium solani pisi s rôznou sekvenciou aminokyselín, ale s lepšou stabilitou a/alebo aktivitou v detergentných systémoch .

Zosumarizovane, rDNA vektory, ktoré sú schopné priamej expresie nukleotidovej sekvencie kódujúcej gén kutinázy, ako je uvedené vyššie, v jednom z výhodných hostiteľov výhodne obsahujú nasledovné komponenty:

(a) Dvojreťazcovú (ds) DNA kódujúcu zrelú kutinázu alebo prekutinázu alebo zodpovedajúcu prekutinázu, v ktorej bola najmenej jedna časť presekvencie priamo odstránená po smere sekrečného signálu (výhodného pre vybranú hostiteľskú bunku) . V prípadoch, kde časť génu, ktorá má byť prenesená neštartuje z kodónu ATG, ATG kodón by mal byť umiestnený vpredu. Prenesená časť génu by mala vždy končiť vhodným stop kodónom;

(b) Regulon expresie (vhodný pre vybraný hostiteľský organizmus) situovaný proti plus vláknu ds DNA kódujúcej kutinázu (komponent (a));

(c) Sekvencia terminátora (vhodná pre vybraný hostiteľský organizmus) situovaná proti plus reťazcu ds DNA kódujcej kutinázu (komponent (a));

(dl) Sekvencie nukleotidov, ktoré uľahčujú integráciu ds DNA do genómu vybraného hostiteľa alebo, (d2) Vznik replikácie vhodný pre vybraného hostiteľa;

(el) Voliteľne (auxotrofný) selekčný marker. Auxotrofný marker môže pozostávať z kódovacej oblasti auxotrofného markera a defektívneho promotera;

(e2) Voliteľne ds DNA sekvencia kódujúca proteíny zainteresované v zrení a/alebo vylučovaní jednej z prekurzorových foriem kutinázy u vybraného hostiteľa.

Takýto rDNA vektor môže tiež niesť proti alebo v smere nukleotidu, ako už bolo definované, ďalšie sekvencie uľahčujúce funkčnú expresiu kutinázy. Auxotrofný marker môže pozostávať z kódovacej oblasti auxotrofného markera a z defektívnej oblasti promótora. Ďalšou podstatou vynálezu je fermantačná produkcia jedného z rôznych variantov kutinázy opísaných vyššie. Takouto fermentáciou môže byť alebo obyčajná jednorazová fermentácia, fed batch fermentácia alebo kontinuálna fermentácia. Výber spôsobu závisí od hostiteľského kmeňa a od uprednostnenej protismernej metódy (známa per se). Teda, vynález tiež poskytuje spôsob výroby variantu kutinázy, ako je tu špecifikované, ktorý zahrňuje kroky fer21

kultivácie mikroorganizmu modifikovaného rDNA s obsahom génu vyrobeného rDNA technikou, ktorý je nosičom aspoň jednej mutácie ovplyvňujúcej sekvenciu aminokyselín kutinázy, pritom s väčšou aktivitou v porovnaní so zodpovedajúcim materským enzýmom, spôsob výroby variantu kutinázy separáciou kutinázy produkovanej mikroorganizmom alebo z fermentačného bujónu alebo separáciou buniek mikroorganizmu z fermentačného bujónu, dezintegráciou separovaných buniek a koncentrovaním alebo čiastočnou purifikáciou variantu kutinázy alebo z uvedeného bujónu alebo uvedených buniek fyzikálnym alebo chemickým koncentrovaním alebo purifikačnými metódami. Uprednostnené sú také podmienky, keď variant kutinázy je vylučovaný mikroorganizmom do fermentačného bujónu, enzým sa odstráni z bujónu po odstránení buniek filtráciou alebo centrifugáciou. Voliteľne variant kutinázy môže byť potom koncentrovaný a purifikovaný do požadovanej miery. Fermentačné procesy odhliadnúc od špeciálnej povahy mikroorganizmov môžu byť založené na známych fermentačných technikách a na obvyklom fermentačnom a smerovom zariadení.

Vynález tiež poskytuje spôsob výroby modifikovaného mikroorganizmu schopného produkovať variant kutinázy pomocou rDNA techník, ktorého podstatou je, že gén kódujúci variant kutinázy, ktorý je zavedený do mikroorganizmu je fúzovaný v jeho 5 -zakončení do génového fragmentu kódujúceho (modifikovanú) pre-sekvenciu fungujúcu ako signálna alebo sekréčna sekvencia hostiteľského organizmu. V ďalšom aspekte vynález poskytuje rDNA modifikované mikroorganizmy obsahujúce gén variantu kutinázy a schopné produkovať variant kutinázy kódovaný uvedeným génom. V rDNA modifikovanom mikroorganizme je gén (ak je pôvodne prítomný) kódujúci natívnu kutinázu výhodne odstránený, napríklad nahradený iným štrukturálnym génom.

Vynález ďalej poskytuje enzymatické detergenčné prípravky obsahujúce varianty kutinázy. Takéto prípravky sú kombináciami variantov kutinázy a ďalších súčastí, ktoré sú bežne používané v detergenčných systémoch, vrátane aditív pre detergenčné prípravky a plno-formulované detergenty a čistiace prípravky, napríklad druhov známych per se a opísaných v EP-A-258 068.

Podrobnejšie, môžu obsahovať 5 až 60, výhodne 20 až 50 % hmotnostných detergentotvornej látky a od 0,1 do 50 % hmotnostných aktívneho systému, ktorý naopak obsahuje 0 až 95 % hmotnostných jednej alebo viacerých aniónových povrchovoaktívnych látok a 5 až 100 % hmotnostných jednej alebo viacerých neiónových povrchovoaktívnych látok. Ďalšie zložky takýchto detergentných prípravkov môžu byť z rôznych známych druhov, napríklad ako uvádza GB-A-1 372 034 (Unilever) , US-A-3 950 277, US-A-4 011 169, EP-A-179 533 (Procter & Gambie) , EP-A-205 208 a EP-A-206 390 (Unilever), JP-A-63078000 (1988) a Research Disclosure 29056 z júna 1988, spolu so všetkými spomenutými špecifikáciami, ktoré sú uvedené v literatúre. Varianty kutinázy v predkladanom vynáleze môžu byť vhodne pridané do detergentného prípravku v akejkoľvek vhodnej forme, t.j. vo forme granulovaného prípravku, roztoku alebo suspenzie enzýmu, alebo s nosičovou látkou ( napríklad ako v EP-A-258 068 a Savináza (TM) a Lipoláza (TM) - výrobky Novo Nordisk).

Pridané množstvo variantu kutinázy môže byť zvolené v širokom rozmedzí, napríklad od 10 až 20,000 LU/gram, prednostne 50 až 20,000 LU/gram detergentného prípravku. Pri tejto špecifikácii LU alebo jednotky lipázy sú definované ako v EP-A-258 068 (Novo Nordisk) .

Podobne sa uvažuje použiť mutatis mutandis v prípade iných enzýmov, ktoré tiež môžu byť prítomné. Viď Európska patentová prihláška EP-A-407 225.

Prednosť majú tie detergentné prípravky, kde proteáza je prítomná spolu s kutinázou, s výberom takej proteázy z proteáz, ktoré majú pi nižšie ako 10. EP-A-271 154 (Unilever) opisuje množstvo takýchto proteáz. Proteázy na použitie spolu s variantmi kutinázy môžu za určitých podmienok zahrňovať subtilisin, napríklad BPN typu alebo množstva typov subtilisinu objavených v literatúre, z ktorých niektoré už boli navrhnuté na detergentné použitie, napríklad mutantové proteázy, ako je opísané napríklad v EP-A-130 756 alebo

ΕΡ-Α-251 446 (oba Genentech); US-A-4 760 025 (Genencor); EP-A-214 435 (Henkel); VO-A-87/04661 (Amgen); VO-A-87/05050 (Genex) ; Thomas et al. (1986/5), Náture, 316, 375-376 a (1987) J. Mol. Biol., 193, 803- 813; Russel et al. (1987), Náture, 328, 496-500.

Vynález bude ďalej ilustrovaný nasledovnými príkladmi. Všetky techniky, ktoré boli použité pri práci s materiálmi nukleových kyselín a pri ich analýze boli uskutočňované v podstate podlá Sambrook et al. (1989), s výnimkou, ak je uvedené inak.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Na priložených obrázkoch je znázornené:

Obr. 1A. Sekvencia nukleotidov kazety 1 syntetického génu kutinázy Fusarium solani pisi a konštitučných oligo-nukleotidov. Tranzície oligonukleotidov sú označené v kazetovej sekvencii. Malé písmená patria pozíciám nukleotidov mimo otvoreného čítacieho rámca.

Obr. 1B. Sekvencia nukleotidov kazety 2 syntetického génu kutinázy Fusarium solani pisi a konštitučných oligo - nukleotidov. Prechody oligonukleotidov sú označené v kazetovej sekvencii.

Obr. 1C. Sekvencia nukleotidov kazety 3 syntetického génu kutinázy Fusarium solani pisi a konštitučných oligo - nukleotidov. Tranzície oligonukleotidov sú označené v kazetovej sekvencii. Malé písmená patria pozíciám nukleotidov mimo otvoreného čítacieho

Obr. 1D. Sekvencia nukleotidov syntetického génu kutinázy kódujúceho pre-pro-kutinázu Fusarium solani pisi. Pre - sekvencia kutinázy, pro-sekvencia a zrelá sekvencia sú označené. Tiež sú označené miesta použité na klonovanie a tranzície nukleotidov. Malé písmená patria pozíciám nukleotidov mimo otvoreného čítacieho rámca.

Obr. 2. Sekvencia nukleotidov fragmentu syntetickej DNA pre väzbu pro-kutinázy Fusarium solani pisi kódujúcej sekvencie k sekvenciám kódujúcim phoA pre-sekvencie E. coli. Väzobné miesto ribozómov (RBS) a miesta reštrikcie enzýmov použitých pre klonovanie sú označené. . Tiež sekvencie aminokyselín kódovanej phoA signálnej sekvencie a časť génu kutinázy sú označené jednopísmenovým kódom.

Obr. 3. Sekvencia nukleotidov kazety 8, Sací-Beli fragment, ktorý kóduje bod fúzie kódovacích sekvencií pre presekvenciu invertázy a zrelú kutinázu Fusarium solani pisi.

Obr. 4. Plazmid pUR2741 získaný deléciou 0.2 kb Sali-Nrul z pUR2740 je kolísavý vektor E. coli- S, cerevisiae zahrňujúci časť pBR322, pôvod replikácie v kvasinkových bunkách odvodených od 2pm plazmidu, kvasinkový gén leu2D a fúziu kódujúcej oblasti signálnej sekvencie kvasinkovej invertázy s génom rastlinnej α-galaktozidázy za regulácie kvasinkového gal7 promótera.

Obr.5. Plazmid pUR7219 je kolísavý vektor E, coli- S. cerevisiae zahrňujúci časť pBR322, pôvod replikácie v kvasinkových bunkách odvodených od 2pm plazmidu, kvasinkový gén leu2D a fúziu kódujúcej oblasti signálnej sekvencie kvasinkovej invertázy s oblasťou kódujúcou zrelú kutinázu Fusarium solani pisi za regulácie kvasinkového gal7 promotera.

Obr. 6. Plazmid pUR7219 je kolísavý vektor E. coli- S, cerevisiae zahrňujúci časť pBR322, pôvod replikácie v kvasinkových bunkách odvodených od 2gm plazmidu, kvasinkový gén leu2D a fúziu kódujúcej oblasti signálnej sekvencie kvasinkovej invertázy s génom rastlinnej α-galaktozidázy za regulácie kvasinkového gal7 promotera.

Obr. 7. Sekvencia nukleotidov kaziet 5,6 a 7, zahrňujúca rôzne typy spojenia kódovacích sekvencií exlA pre-sekvencie a zrelú kutinázu Fusarium solani pisi.

Obr. 8. Plazmid pAV14B získaný inzerciou 5.3 kb Sali fragmentu genomovej DNA Aspergillus niger var. awamori v Sali mieste pUC19.

Obr. 9. Plazmid pUR7280 získaný premiestnením BspHI-Af1II fragmentu zahrňujúci exlA otvorený čítací rámec v pAV14B s BspHI-Af1III fragmentom zahrňujúcim kódujúcu sekvenciu pre-pro-kutinázy Fusarium solani pisi. Preto, plazmid pUR7280 zahrňuje gén pre-pro-kutinázy Fusarium solani pisi za regulácie proraotera a terminátora A. niger var. awamori.

Obr. 10. Plazmid pUR7280 získaný zavedením pyrG selekčných markerov A. nidulans a A. niger var. awamori.

Obr. 11. Schematické znázornenie molekuly kutinázy Fusarium solani pisi.

Obr. 12. Parciálne sekvencie aminokyselín kutináz z Fusarium solani pisi. Collechotricum gloeosporoides a Magnaporthe grisea, znázorňujúc lokáciu zvyškov v 3-D štruktúre.

Obr.	13.	In-the wash účinok pre	kutinázu	Fusarium	solani	BÍ-
si a	pre	variant kutinázy N172K.
Obr.	14.	In-the wash účinok pre	kutinázu	Fusarium	solani	pi-
si a	pre	variant kutinázy E201K.
Obr.	15.	In-the wash účinok pre	kutinázu	Fusarium	solani	RÍ-
si a	pre	variant kutinázy A85F.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Zostrojenie syntetického génu kódujúceho pre-pro-kutinázu Fusarium solani pisi.

Syntetický gén kódujúci pre-pro-kutinázu Fusarium solani pisi bol zostrojený v podstate podlá metódy opísanej v EP-A-407 225 (Unilever). Na základe publikovaných nukleotidových sekvencií génov Fusarium solani pisi ( Soliday et al. (1984) a VO-A-90/09446, Plánt Genetic Systems), bol navrhnutý kompletne syntetický fragment DNA, ktorý zahrňuje oblasť kódujúcu pre-pro-kutinázový polypeptid Fusarium solani pisi. V porovnaní s nukleotidovou sekvenciou pôvodného génu Fusarium solani pisi, syntetický gén kutinázy zahrňuje niekoľko zmien v nukleotidoch, prostredníctvom ktorých boli zavedené rozpoznávacie miesta reštrikčného enzýmu vo vhodných pozíciách v géne bez ovplyvnenia kódovanej aminokyselinovej sekvencie. Nukleotidovú sekvenciu vonkajšieho génu kutinázy prezentuje obr. 1D.

Zostrojenie syntetického génu kutinázy bolo uskutočňované zhromaždením troch rozličných kaziet vychádzajúcich zo syntetických DNA oligonukleotidov. Každá syntetická DNA kazeta je vybavená EcoRI miestom na začiatku a HindIII miestom na konci. Oligonukleotidy boli zosyntetizované použitím Applied Biosystems 380A DNA syntetizátora a boli purifikované elektroforézou na polyakrylamidových géloch. Na zostrojenie každej kazety sa použil postup vyznačený nižšie. Ekvimolárne množstvá (50 pmol) oligonukleotidov tvoriacich danú kazetu boli zmiešané, fosforylované na 5 zakončení , temperované a spojené podľa štandardných techník. Výsledná zmes molekúl dvojreťazcovej DNA bola prestrihnutá EcoRI a HindIII. bola frakcionizovaná elektroforézou na agarózových géloch a odstránená z gélu elektroelúciou. Výsledná syntetická kazeta DNA bola prestrihnutá EcoRi -HindIII fragmentom pUC9 a transformovala sa do Escherichia coli. EcoRi -H i nd111 inzert množstva klonov bol úplne sekventovaný v oboch smeroch za použitia vhodných nukleotidových primerov na verifikáciu sekvencie syntetických kaziet. Použitím tohto postupu boli zostrojené pUR7207 (zahrňujúc kazetu 1, obr. la), pUR7208 (zahrňujúc kazetu 2, obr. 1B) a pUR7209 (zahrňujúc kazetu 3, obr. 1C). Nakoniec bol syntetický gén kutinázy zhromaždený kombináciou 2.9 kb EcorRI -Apal fragmentu pUR7207 s 0.2 kb Apa-Nhel fragmentu pUR7207 s 0.2 kb Apa-Nhel fragmentu puR7208 a 0.3 kb NheI-HindIII fragmentu pUR7209, získajúc pUR7210.

Tento plazmid zahrňuje otvorený čítací rámec kódujúci úplnú pre-pro-kutinázu Fusarium solani pisi (Obr. 1D).

Príklad 2

Expresia (pro)kutinázy Fusarium solani pisi v Escherichia coli ,

Vektor expresie pre E. coli.

Vektor expresie pre E. coli. ktorý je funkčne podobný vektoru opísanému vo VO-A-90/09446 (Plánt Genetic Systems) bol skonštruovaný so syntetickým génom kutinázy. Bol navrhnutý taký spôsob konštrukcie, kde časť syntetického génu kódujúceho pro-kutinázu Fusarium solani pisi je predchádzaná vhodnými signálmi expresie E, coli. t. j. (i) indukovateľný promoter, (.ii) väzobné miesto ribozómov a (iii) signálna sekvencia, ktorá poskytuje kodón translačnej iniciácie a poskytuje informáciu požadovanú pre export pro-kutinázy cez cytoplazmatickú membránu.

Bola navrhnutá syntetická spojka (viď obr. 2) pre fúziu derivátu E. coli phoA signálnej sekvencie (Michaelis et al., 1983) k prosekvencii syntetického génu kutinázy. Kvôli optimalizácii štiepenia signálneho peptidu a sekrécie pro-kutinázy bola nukleotidová sekvencia spojky taká, že tri C-koncové aminikyselinové zvyšky phoA signálnej sekvencie (Thr-Lys-Ala) boli zamenené za Ala-Asn-Ala a N-koncový aminokyselinový zvyšok kutinázovej pro-sekvencie (Leu 1, viď obr. 1D) bol vymenený za Ala. Takáto konštrukcia zabezpečuje sekréciu kutinázy do periplazmatického priestoru (viď VO-A-90/09446, Plánt Genetic Systems).

Aby sa získala taká konštrukcia, 69 bp EcoRI- Spel fragment zahrňujúci kutinázovú pre-sekvenciu a časť pro-sekvencie boli odstránené z pUR7210 a boli nahradené syntetickou DNA spojkovou sekvenciou (EcoRI-Spel fragment) poskytujúcou derivát E. coli phoA pro-sekvencie a zmenili N-koncový aminokyselinový zvyšok kutinázovej pro-sekvencie (Obr. 2). Výsledný plazmid bol nazvaný pUR7250 a bol použitý na izoláciu 0.7 kb BamHI-HindIII fragmentu obsahujúceho väzobné ribozómové miesto a pro-kutinázou kódovaná oblasť bola fúzovaná k phoA signálnej sekvencii kódovanej oblasti. Tento fragment bol pripojený 8.9 kb BamHI-HindIII fragmentom pMMB67EH (Fúrste et al., 1986), aby sa získal pUR7220. Na tomto plazmide je syntetický gén kódujúci pro-kutinázu fúzovaný do zmenenej verzie phoA signálnej sekvencie a je umiestnený za regulácie indukovatelného tac-promotera.

Kmeň E, coli VK6 nesúci puR7220 vyrástol v 2-litrových miešacích fľašiach obsahujúcich 0.5 1 IXTB média (Tartof a Hobbs, 1988) pozostávajúceho z:

0,017 M KH₂P0₄

0,017 M K₂HP0₄ g/1 Bacto-tryptonu g/1 Bacto-kvasinkového extraktu

0,4 % glycerolu (v/v)

Kultúry vyrástli cez noc pri 25 °C až 30 °C v prítomnosti 100 pg/ml ampicilínu za silného miešania (150 rpm) k OD pri 610 nm 10 až 12. Potom bol IPTG (izopropyl-p-D-tiogalaktopyranozid) pridaný ku konečnej koncentrácii ΙΟμΜ a inkubácia pokračovala ďalších 12 - 16 hod. Keď sa nedal zistiť žiadny významný nárast v množstve produkovanej lipolytickej aktivity, dokázané analýzou vzoriek z kultúr, boli bunky zozbierané centrifugáciou a resuspendovali v pôvodnej kultúre s objemom pufra s obsahom 20% sacharózy pri 0 °C. Bunky sa zozbierali centrifugáciou a resuspendovali v pôvodnom objeme kultúry v ľadovej vode spôsobujúcej lýzu buniek prostredníctvom osmotického šoku. Zvyšok buniek bol odstránený centrifugáciou a a bezbunkový extrakt bol okyslený na pH 4,8 kyselinou octovou, nechal sa stáť cez noc pri 4°C a výsledný precipitát bol odstránený. Pomocou ultrafiltrácie a vysušenia bezbunkového extraktu ľadom sa získal prípravok s obsahom čistej kutinázy viac ako 75% bez endogénnych lipáz. Podobne mohla byť kutináza purifikovaná až do homogenity (t· j- čistota viac ako 95%) vložením acidifikovaného bezbunkového extraktu na SP-sephadex, eluovaním enzýmu pufrora pri pH 8,0, pasážovaním koncentrovaného alkalického roztoku cez vhodný objem DEAE-celulozy (Vhatman DE-52) a priamou aplikáciou DEAE-toku na Q)sepharozovú HP kolónu. Eluáciou so soľným gradientom sa získal homogénny prípravok kutinázy s typickým prevažujúcim výťažkom lepším ako 75%.

Príklad 3

Zostrojenie génov kódujúcich varianty kutinázy Fusarium solani pisi .

Použitím syntetického génu pre pre-pro-kutinázu Fusarium solani pisi opísaného v príklade 1, boli zostrojené variantové gény zahrňujúce zmeny v kódovanej aminokyselinovej sekvencii. Pri zostrojení sa použil v podstate ten istý prístup, ako je uvedený v príklade 1 pre zostrojenie troch kaziet tvoriacich kompletný syntetický gén kutinázy. Naprík lad gén kódujúci variant N172K kutinázy Fusarium solani pisi bol skonštruovaný zhromaždením novej verzie kazety 3 za použitia tých istých oligonukleotidov ako je opísané v príklade 1, okrem dvoch oligov, ktoré zahrňujú kódovací triplet pre pozíciu, ktorá má byť mutovaná, i.c. Asn 172. Namiesto nich sa použili dva nové oligy, ktoré zahrňujú mutantovú sekvenciu, ale ináč sú identické s pôvodnými oligami, ktoré nahrádzujú. Špecifickejšie, nová kazeta 3, zahrňujúca mutáciu N172K bola zhromaždená inkorporáciou variantu CUTI3D MH (obsahujúceho AAG namiesto AAT) a variantu CUTI3K (obsahujúceho CTT namiesto ATT) namiesto CUTI3D a CUTI3K ( viď obr. 1C) . Nová kazeta 3 bola klonovaná a sekventovaná v podstate, ako je uvedené v príklade 1 a 0.3 kb NheI-HindIII DNA fragment obsahujúci mutáciu bol vymenený za zodpovedajúci fragment v pUR7210, získajúc pUR7257 (N172K). 0.6 kb Spel- Hindlll z týchto plazmidov bol použitý na nahradenie zodpovedajúceho fragmentu v pUR7220, získajúc plazmid expresie E. coli pUR7224 (N172K). Tento plazmid expresie E, coli bol transformovaný do kmeňa E. coli VK6. Tranformanty narástli, ako je uvedené v príklade 2 a variant enzýmu pro-kutinázy bol znovuzískaný a bol purifikovaný v zásade, ako uvádza príklad 2.

Gén kódujúci variant E201K kutinázy Fusarium solani pisi bol skonštruovaný analogicky zozbieraním novej verzie kazety 3 zahŕňajúcej variant CUTI3F MH ( obsahujúci AAg namiesto GAG) a variant CUTI3M MH ( obsahujúci CTT namiesto CTC) namiesto CUTI3F MH a CUTI3M MH ( viď. obr. 1C) .

Gén kódujúci variant A58F kutinázy Fusarium solani pisi bol skonštruovaný analogicky zozbieraním novej verzie kazety 2 zahŕňajúcej variant CUTI2C MH ( obsahujúci TTC namiesto GCT) a variant CUTI2I MH ( obsahujúci GAA namiesto AGC) namiesto CUTI2C MH a CUTI2I Mh ( viď. obr. 1B) .

Príklad 4

Expresia kutinázy Fusarium solani pisi v Saccharomyces cerevisiae.

Pre expresiu syntetického génu kutinázy Fusarium solani pisi v Saccharomyces cerevisiae bol skonštruovaný vektor expresie, v ktorom syntetickému génu kódujúcemu zrelú kutinázu predchádza pre-sekvencia invertázy S. cerevisiae (Taussig a Carlson, 1983) a silný indukovateľný promoter (Nogi a Fukasawa, 1983) . Na prípravu syntetického génu kutinázy pre takúto fúziu bol zosyntetizovaný adaptor fragment, v ktorom kódujúca sekvencia pre pre-sekvenciu invertázy je fúzovaná k sekvencii kódujúcej N-zakončenie zrelej kutinázy. Tento fragment bol zozbieraný ako EcoRI-HindIII kazeta v pUC9 v podstate, ako je uvedené v príklade 1 (kazeta 8, viď. obr. 3), získajúc pUR217. Plazmidy pUR210 a pUR7217 boli transformované do E, coli JM110 (kmeň bez ohraničenej aktivity metylázy) a 2.8 kb Beli- HindlII fragment pUR7217 bol spojený s 0.6 kb Beli- HindIII fragmentom pUR210, získajúc pUR7218, v ktorom nukleotidová sekvencia kódujúca polypeptid zrelej kutinázy je fúzovaná s časťou kódovacej oblasti pre-sekvencie invertázy S. cerevisiae.

Vektor expresie pUR2741 (viď obr. 4) bol odvodený od pUR2740 (Verbakel, 1991, viď obr. 6) pomocou izolácie 8,9 kb Nrul- Sali fragmentu pUR2740, zaplniac Sali vyčnievajúci koniec Klenowovou polymerázou a recirkularizáciou fragmentu. 7,3 kb Sací-HindIII fragment pUR2741 bol spojený s 0,7 kb Sací-HindIII fragmentom pUR7218, získajúc pUR7219 (viď obr. 5). Prípadne, terminátor polil S. cerevisiae môže byť umiestnený za génom kutinázy, v mieste HindlII. ktoré v otočenej polohe nie je postačujúce pre expresiu génu kutinázy. Kolísavý sa plazmid E. coli-S. cerevisiae obsahuje základ pre replikáciu v kmeňoch S. cerevisiae nesúcich 2μ plazmid (cir ⁺ kmene) , promoter-deficientnú verziu Leu2 génu S', cerevisiae umožňujúcu selekciu vysokého počtu kópií transformantov v kmeňoch S. cerevisiae leu2^_ a syntetický gén kódujúci zrelú časť kutinázy Fusarium solani pisi funkčne pripojenú k pre-sekvencii invertázy S. cerevisiae za regulácie silného indukovatelného promótora S. cerevisiae ga!7.

Kmeň S. cerevisiae SU50 (a, οί,Γθ , leu2, his4, canl), ktorý je identický s kmeňom YT6-2-1L (Erhart a Hollenberg,

1981), bol ko-transformovaný s ekvimolárnou zmesou μ plazmidu S. cerevisiae a pUR7219 použitím štandardného protokolu pre elektroporáciu kvasinkových buniek. Transformanty boli selektované na prototrofiu leucínu a celková DNA bola izolovaná z množstva transformantov. Všetky tranformanty obsahovali 2μ plazmid pUR7219, dokazujúc, že promoter-dependentná verzia lue2 génu zostávajúca na pUR7219 môže funkčne komplementovať leu2 deficientné kmene, za prítomnosti vysokého počtu kópií spôsobených súčasnou prítomnosťou 2 μ kvasinkového plazmídu. Jeden z transformantov bol opravovaný na pUR7219 plazmid kultiváciou na kompletnom médiu pre viac ako 40 generácií s následnou replikáciou na platniach na selektívnych a kompletných tuhých médiách, získajúc kmeň S. cerevisiae SU51 (a,cir⁺, Ieu2,his4, canl).

Kmeň S. cerevisiae.Su51 nesúci pUR7219 narástol v 11 miešacích nádobách s obsahom 0,2 1 MM média pozostávajúceho z:

- kvasinkovej dusíkovej bázy (YNB) bez aminokyselín 6,7 g/1

- histitdínu 20 mg/1

- glukózy 20 g/1

Kultúry rástli cez noc pri 40°C za silného miešania (150 rpm) na OD pri 610 nm 2 až 4. Bunky sa zozbierali centrifugáciou a resuspendovali v 11 YPGAL média pozostávajúceho z:

- kvasinkového extraktu	10	g/1
- bacto peptónu	20	g/1
- galaktózy	50	g/1

v 2 litrových miešacích nádobách a inkubácia pokračovala ďalších 12 až 16 hodín. V pravidelných intervaloch sa z kultúry odoberali vzorky a boli centrifugované, aby sa odstránila biomasa. Supernantant bol analyzovaný na kutinázovú aktivitu titračnou metódodu za použitia olivového oleja ako substrátu. Pre každú vzorku sa pridalo 100 a 200 μΐ filtrátu do miešanej zmesi 5,0 ml substrátu lipázy (Sigma, obsahujúceho olivový olej ako substrát pre lipázu) a 25,0 ml pufra (5mM Tris-HCl pH 9,0, 40 mM NaCl, 20 mM CaCl₂). Test sa uskutočňoval pri 30 “C a uvoľňovanie mastných kyselín sa mera lo automatickou titráciou s 0,05 M NaOH do pH 9,0 za použitia Mettlerovho DL25 titrátora. Získala sa krivka množstva titračného činidla oproti času. Hodnota aktivity lipázy vo vzorke sa vypočítala z maximálneho sklonu krivky. Jednotka enzymatickej aktivity je ktoré uvoľní lgmol mastnej definovaná ako množstvo enzýmu, kyseliny z olivového oleja za 1 minútu za podmienok špecifikovaných vyššie. Tieto stanovenia sú odborníkom v oblasti dobre známe.

Ak sa produkcia kutinázovej aktivity viac nezvyšovala, bunky boli odstránené centrifugáciou a bezbunkový extrakt bol okyslený na pH 4,8 kyselinou octovou a kutináza sa opäť obnovila, ako bolo uvedené v príklade 1.

Príklad 5

Expresia variantov kutinázy Fusarium solani pisi v S. cerevísiae.

Variant N176K kutinázy Fusarium solani pisi bol exprimovaný v S. cerevisiae nasledovne: 0,5 kb Apal-HindIII fragmentu (nl72K) bol použitý na nahradenie analogického fragmentu pUR7218, za získania pUR7228 (N172K), v ktorom gén obsahujúci mutáciu je fúzovaný do sekvencie kódujúcej signálnu sekvenciu S.cerevisiae. 7,0 kb Sací-HindIII fragment pUR2741 bol spojený s 0,7 kb Sací -HindIII fragmentompUR7228 (N172K), získajúc pUR7234 (N172K). Tento plazmid bol transformovaný do kmeňa S.cerevisiae SU51. Výsledné transformanty boli inkubované, ako bolo opísané v príklade 4 a produkovaný variant enzýmu bol obnovený z kultivačného bujónu, ako je opísané v príkladoch 4 a 1.

Variant kutinázy Fusarium solani pisi E201K bol produkovaný v S,cerevisiae tým istým spôsobom 5 za použitia variantu génu kutinázy Fusarium solani pisi kódujúceho variant kutinázy E201K, ako bolo opísané v príklade 3.

Variant A85F kutinázy Fusarium solani pisi bol produkovaný v S,cerevisiae tým istým spôsobom za použitia variantu génu kutinázy Fusarium solani pisi kódujúceho variant kutinázy A85F, ako bolo opísané v príklade 3.

Príklad 6

Expresia kutinázy Fusarium solani pisi v Aspergilli.

Pre expresiu syntetického génu kutinázy Fusarium solani pisi v Aspergillus niger var.awamori bol skonštruovaný vektor expresie, v ktorom syntetický gén kódujúci pre-pro-kutinázu Fusarium solani pisi bol umiestnený pod kontrolou A. niger var. awamori. silného, indukovateľného promótora exlA (Maat et al., 1992, de Graaff et al., 1992).

Plazmid expresie pre-pro-kutinázy (pUR7280) bol zostrojený vychádzajúc z plazmidu pAV14B, ktorý bol uložený v kmeni E. coli JM109 z Centalbureau voor Schimrnelcultures, Ba arn, The Netherlands, pod N° CBS 237.90 31. mája 1990 a obsahuje a ca. 5,3 kb Sali fragment, na ktorom je lokalizovaný 0,7 kb gén endoxylanázy II, sekvencií a 2,0

V _PAV14B exlA pre-pro-kutinázu

TCATGA-3’) miesto (5’ -CTTAAG-3’) obsahujúce stop kodón (TAA) génu exlA kb 3’ kóduj úca kóduj úcou obsahujúce prvý spolu s 2,5 priľahlých oblasť oblasťou.

kodón (ATG) kb 5’- priľahlých sekvencií (obr. 8).

bola nahradená BspHI miesto (5’ exlA génu a AfIII uľahčili zostrojenie pUR7280.

Zostrojenie sa uskutočnilo nasledovne:pAV14B (7,9 kb) bol čiastočne prestrihnutý BspHI a linearizovaný plazmid (7,9 kb) bol izolovaný z agarózového gélu. Následne bol izolovaný 7,9 kb fragment prestrihnutý BsmI, ktorý pretína niekoľko nukleotidov po smere BspHI miesta záujmu, aby sa odstránili plazmidy linearizované na iných BspHI miestach.

Fragmenty boli separované na agarózovom géli a izoloval sa 7,9 kb BspHI-BsmI fragment. Tento bol čiastočne preťatý AfIII a bol izolovaný výsledný 7,2 kb BspHI-AfIII.

0,7 kb BspHI-AfIII fragment pUR7210 obsahujúci vonkajší otvorený čítací rámec kódujúci pre-pro-kutinázu Fusarium solani pisi bol spojený so 7,2 kb BspHI-AfIII fragmentom pAV14B, získajúc pUR7280. Skonštruovaný vektor (pUR7280) môže byť následne prenesený na matrice (napríklad Aspergilus niger, Aspergilus niger var, awamori, atď.) pomocou bežných ko-transformačných techník a gén pre-pro-kutinázy môže byť potom exprimovaný indukciou promótora endoxylanázy II. Skonštruovaný rDNA vektor môže byť tiež získaný s bežnými selekčnými markermi ( napríklad amdS alebo pyrG, hygromycín atď.) a matrice môžu byť transformované s rezultujúcim rDNA vektorom, aby sa vyrobil požadovaný proteín. Ako príklad boli do vektoru expresie zavedené selekčné markery amdS a pyrG, získajúc pUR7281 (obr. 10). Z tohto dôvodu bolo vytvorené Nôti miesto konverziou EcoRI miesta (prítomný 1,2 kb proti smeru ATG kodónu génu pre-pro-kutinázy) do NotI miesta za použitia syntetického oligonukleotidu (5’ -AATTGCGGCCGC

- 3’), získajúc puR7282. Vhodný DNA fragment obsahujúci vonkajší gén A. nidulans amdS a pyrG gén Aspergilus niger var. awamori spolu s ich vlastnými promotermi a terminátormi boli vybavené priľahlými NotI miestami a boli zavedené do NotI miesta pUR7282, získajúc pUR7281 (obr. 10). Ako alternatívny prístup pre expresiu syntetického génu kutinázy Fusarium solani pisi v Aspergilus niger var, awamori boli skonštruované vektory expresie, v ktorých syntetický gén kódujúci zrelú kutinázu nie je predchádzaný svojou vlastnou pre - pro

- sekvenciou, ale pre-sekvenciou A. niger var. awamori exlA.

Na prípravu génu syntetickej kutinázy pre takéto fúzie bolo rôznym spôsobom zosyntetizovaných niekoľko adaptorových fragmentov, v ktorých kódovacia sekvencia pre exlA pre-sekvenciu je pripojená ku sekvencii kódujúcej N-zakončenie zrelej kutinázy. V kazete 5 je toto spojenie vytvorené fúziou exlA pre-sekvencie k pro-sekvencii kutinázy. V kazete 6 je exlA pre/sekvencia fúzovaná s N-terminálnym zvyškom zrelej kutinázy. Kazeta 7 je identická s kazetou 6, ale N-terminálny zvyšok polypeptidu kódovanej zrelej kutinázy bol zmenený z pôvodného glycínového na serínový zvyšok, aby sa lepšie splnili požiadavky na štiepenie signálneho peptidu. Kazety 5, 6 a 7 boli zhromaždené zo syntetických oligonukleotidov v podstate, ako je opísané v príklade 1 (viď obr. 7). Kazeta 5 bola použitá na posunutie 0,1 kb EcoRI- SpeI fragmentu pUR7210, získajúc puR7287. Kazety 6a 7 sa použili na posunutie 0,1 kb EcoRI- Beli fragmentu pUR7210, získajúc pUR7288 a pUR7289. Pre každý | z plazmidov pUR7287, pUR7288 a pUR7289 bol 0,7 kb

I BspHI-AflII fragment bol spojený so 7,2 kb BsfiHI-AflII fragI mentu pAV14B, získajúc pUR7290, pUR7291 a pUR7292.

I Skonštruované rDNA vektory boli následne prenesené na j; matrice Aspergilus niger var, awamori) pomocou bežných kotransformačných techník a gén pre-pro-kutinázy bol potom exprimovaný indukciou promótora endoxylanázy II. Skonštruované rDNA vektory môžu byť tiež získané s bežnými selekčnými markermi (napríkladamdS alebo pyrG, hygromycín atď.) a matrica * môže byť transformovaná s rezultujúcim rDNA vektorom, aby sa vyrobil požadovaný proteín, ako je uvedené v tomto príklade ’ pre pUR7280 (viď vyššie).

Kmene Aspergilus transformované s vektormi expresie pUR7280, pUR7281, pUR7290, pUR7291, pUR7292 ( obsahujúce kódujúcu oblasť pre zrelú kutinázu Fusarium solani pisi s alebo bez zodpovedajúcej pro-sekvencie a alebo signálnu sekvenciu kutinázy alebo exlA signálnu sekvenciu za regulácie A, niger var.awamori exlA promótora a terminátora) vyrástli za

nasledovných podmienok:	Mnohopočetné 11	miešacie nádoby so
400 ml syntetického média (pH 6,5) boli	inokulované spórami
(konečná koncentrácia:	10E6/ml). Médium	malo nasledovné zlo-
ženie (AV médium): sacharóza 10 g/1
NaN03	6,0	g/1
KC1	0,52	g/1
kh2po4	1,52	g/1
MgSO4.7H2O	0,49	g/1
kvasinkový extrakt	1,0	g/1
ZnS04.7H2O	22	mg/1
h3bo3	11	mg/1
MnCl2.4H20	5	mg/1
FeS04 7H20	5	mg/1
CaCl2 6H2O	1,7	mg/1
CuSO4.5H2O	1,6	mg/1
NaH2Mo04.2H20	1,5	mg/1
Na2EDTA	50	mg/1

í;

| Inkubácia sa uskutočňovala pri 30 ’C, pri 200rpm 24 ho| dín v Mk X inkubátororvom miešači. Po narasteni sa bunky í zozbierali filtráciou (0,45 μτη filter), 2x sa premyli AV mép s diom bez sacharózy a kvasinkového extraktu, resuspendovali v 50 ml roztoku soli a preniesli sa do 300 ml miešacích náŕ dob obsahujúcich 50 ml roztoku soli, ku ktorej sa pridala xylóza do konečnej koncentrácie 10 g/1 (indukčné médium).

Inkubácia za tých istých podmienok ,ako je opísané vyššie , pokračovala cez noc. Vzniknuté kultúry boli sfiltrované cez tkaninu, aby sa odstránila biomasa a kutináza sa obnovila v podstate, ako je opísané v príklade 2.

Príklad 7

Expresia variantov kutinázy Fusarium solani pisi v Aspergilli .

V podstate nasledovaním postupu uvedeného v príklade 6, ale teraz s použitím plazmidu pUR257 (N172K) namiesto pUR7210 na konštrukciu fungálnych vektorov expresie, bol v Aspergilus niger var. awamori pripravený variant kutinázy Fusarium solani pisi zahrňujúci mutáciu N172K.

i i

Príklad 8 j

Identifikácia a izolácia génov príbuzných génu kutinázy Fusarium solani pisi. i

Z rôznych húb ; boli izolované gény kódujúce kutinázy s rozdielnym stupňom) homológie s kutinázou Fusarium solani p i s i. Fungálne kultúry narástli v 500 ml miešacích nádobách obsahujúcich 200 ml média opísaného Hankinom a Kolattukudym

I (1968) suplementovaného 0,15% glukózy a inkubovali sa 4 dni i

pri 28 ’C v Mk inkubátorovom miešači.(lOOrpm). Počas toho sa skonzumovala glukózja a produkcia kutinázy bola indukovaná pridaním hydrolyzátu tinger et vybrali z al (1987)1.

i kultúry á ^J I kutínu v podstate, ako to opísali EtV pravidelných intervaloch sa vzorky boli analyzované πει prítomnosť Lipolytickej aktivity podľa štandardných techník (viď príklad 4).

Obvykle asi po dvoch dňoch po indukcii mohla byť demonštrovaná lipolytická aktivita a v tom čase boli bunky zozbierané filtráciou za použitia štandardných techník. Mycélie boli premyté, zmrazené v tekutom dusíku a lyofilizované podľa štandardných techník. Všetky celulárne RNA prípravky boli izolované za použitia guanidinium tiokyanátovej metódy a boli purifikované céziumchloridom centrifugáciou v denzitnom gradiente. v podstate, ako opísali Sambrook et al (1989). PolyA(+)mRNA frakcie boli izolované pomocou izolačnej súpravy polyAT tract mRNA (Promga).PolyA(+)mRNA frakcie boli použité pri Nothern hybridizačnej analýze za použitia cDNA fragmentu z génu kutinázy Fusarium solani pisi ako sondy podľa štandardných techník, aby sa verifikovala expresia kutináze-podobných génov. Prípravky mRNA obsahujúce látku schopnú hybridizovať so sondou boli použité na syntézu cDNA za použitia ZAP cDNA syntéznej súpravy (Stratagene La Jolla) podľa návodu dodávateľa, získajúc cDNA fragmenty s Xhol kohezívnou a priľahlou poly-A oblasťou a EcoRI adaptorom na druhom konci. Získané cDNA fragmenty boli použité na konštrukciu bánk expresie smerovaným klonovaním v zmysle orientácie v lambda ZAPII vektoroch (Stratagene, La Jolla), umožňujúc expresiu proteínov fúzie β-galaktozidázy (Huse et al., 1988). Tieto banky boli roztriedené za použitia antiséra zvýšeného proti kutináze Fusarium solani pisi.

Alternatívne boli syntetizované frakcie cDNA podrobené PCR-skríningu za použitia špecifických primerov kutinázy (viď tab. 2). Tieto primery boli odvodené z porovnávania sekvencie aminokyselín niekoľkých génov fungálnych kutináz (Ettinger et al., 1987). Optimalizovali sa podmienky pre PCR reakciu pre každý set primerov, za použitia cDNA z Fusarium solani pisi ako kontroly. Pre prípravky cDNA, ktorými by fragment PCR mohol byť generovaný s rovnakou dĺžkou , ktorá je podobná (alebo väčšia) ako) dĺžka PCR fragmentu generovaného cDNA z kutinázy Fusarium solani pisi za tých istých podmienok, bol PCR fragment pu.ri.fikovaný gólovou elektroforézou a bol izolovaný z gélu.

Ako alternatívny prístup, bola tiež použitá PCR škri ningová technika za použitia špecifických primérov kutinázy priamo do genomovej DNA niektorých kmeňov húb, použijúc genomovú DNA Fusarium solani pisi ako pozitívnu kontrolu. Pre prípravky fungálnej genomovej DNA, ktorou by špecifický PCR fragment mohol byť generovaný s dĺžkou, ktorá je podobná (alebo väčšia) ako) dĺžka PCR fragmentu generovaného cDNA z kutinázy Fusarium solani pisi za tých istých podmienok, bol PCR fragment purifikovaný gélovou elektroforézou a bol izolovaný z gélu.

Pre kmene, ktoré boli pozitívne v prípade banky expresie alebo pri PCR skríningu (s cDNA alebo s genomovou DNA) ako aj pre množstvo iných kmeňov bola izolovaná genomová DNA. Kmene narástli v podstate, ako to opísal Ettinger et al. (1987), a genomová DNA bola izolovaná , ako to opísal de Graaff et al. (1988). Genomová DNA bola vyluhovaná s rôznymi reštrikčnými enzýmami a analyzovala sa pomocou Southern hybridizácie za použitia alebo analogického cDNA inzertu (prístup banky expresie) alebo PCR fragmentu (PCR skríningový prístup) alebo génu kutinázy Fusarium solani pisi (iné kmene) ako sondy a bola skonštruovaná fyzikálna mapa génov kutinázy. Primeraný výluh genomovej DNA bol frakcionovaný gélovou elektroforézou a fragmenty primeranej veľkosti boli z gélu izolované a subklonované v pUC19. Tieto genomové banky boli triedené so zodpovedajúcim cDNA inzertom (prístup banky expresie) alebo PCR fragmentom (PCR skríningový prístup) , získajúc klony zahrňujúce genomovú kópiu génov kutinázy. Tieto gény boli sekventované v oboch smeroch. Introny boli identifikované sekventovaním zodpovedajúcej cDNA alebo porovnaním s inými sekvenciami kutinázy (Ettinger et al., 1987) . N-terminálne zakončenie polypeptidu zrelej kutinázy bolo tiež odvodené z takéhoto porovnania. Za použitia štandardných PCR techník sa odstránili introny, HindIII miesto bolo okamžite umiestnené po smere otvorených čítacích rámcov a kódujúca sekvencia pre pre-sekvenciu génu invertázy Saccharomyces cerevisiae ( s predchádzajúcim Sací miestom, porovnávacia kazeta 8, obr. 3) bola fúzovaná do sekvencií kódujúcich N-zakončenie zrelých kutináz. Získané Sací -Hind 1.11 fragmenty zahrňujúce gény kutinázy viazané k sekvencii kódujúcej pre-sekvenciu invertázy S. cerevisiae boli spojené s 7,3 kb SacI-HindlII fragmentom pUR7241 (viď obr. 4) a boli transformované do kmeňa S. cerevisiae SU51. Fungálne kutinázy boli exprimované a obnovené z kultivačného bujónu v podstate, ako je uvedené v príklade 4.

Príklad 9

In-the wash aktivita variantu kutinázy Fusarium solani pisi N172K.

Účinok na odstránenie mastnoty variantom kutinázy N172K bol porovnávaný s účinkom štandardného typu kutinázy Fusarium solani pisi. V teste sa na monitorovanie použili polyesterové tkaniny znečistené bromovaným olivovým olejom. Množstvo mastnoty na testovacích tkaninách bolo určované meraním množstva brómu na nich pomocou roentgenovej fluorescenčnej spektrometrie (ako je opísané vyššie).

Množstvo enzymaticky odstráneného znečistenia štandardným typom kutinázy Fusarium solani pisi (VT) a N172K variantom bolo určené pri dávke 3 LU/ml za niekoľkých experimentálnych podmienok:

Odstránenie znečiatenia [%] VT	Odstránenie znečistenia [%] N172K	Teplota [°C]	Detergentný výrobok	Tvrdosť vody [FH]
4,9	10,1	40	A (lg/1)	6
1.6	6,7	40	B (2g/.l)	6
20,2	24,6	40	C (2g/l)	27
13,2	13,4	40	B (lg/1)	27
30,8	40,6	30	C (2g/l)	27
17,4	22,4	30	B (2g/l)	27

Zloženia (v % hmotnostných) detergentných produktov

A - C boli nasledovné:

Produkt A

Látka	Hmotnosť [%]
neionový surfaktantný alkohol 10.5-13 EO	9,5
síran sodný	38,6
uhličitan sodný, .	40,4
kremičitan sodný (Na20:SÍ20 = 2.4)	7,3
voda	4,2

Produkt B

Látka	Hmotnosť [%]
DOBS	6,4
mydlo	1,7
Synperonic A7	3,0
zeolit	43
Soko'lan CP7	9,9
vodné sklo	1,2
CMC sodný	0,77
uhličitan sodný	10,16
NaOH	2,6
voda	do 100 %

Produkt C ί5

Látka	Hmotnosť [%]
coco-primárny alkylsulfát	5,2
neionový surfaktantný	5,2
alkohol 7 EO
neionový surfaktantný C-£2_C15	6,6
alkohol 3 EO
kremičitan sodný	0,45
Zeolit Ä4	32,00
uhličitan sodný	11,52
tvrdené lojové mydlo	2,00

Zvýšenie in-the-wash účinnosti (odstránenie znečisteniny) vo vzťahu k štandardnému typu kutinázy Fusarium solani pisi za rôznych pracích podmienok je evidentné. Obr. 13 uvádza in-the-wash účinnosť pri rôznych koncentráciách enzýmu za použitia 2g/l detergenčného produktu C pri 30 min. praní pri 30°C pri 27°FH.

Na porovnanie sa tie isté experimenty prevádzali s lipolázou (TM). Za všetkých podmienok bol variant kutinázy N172K lepší.

Príklad 12

In-the wash aktivita variantu kutinázy Fusarium solani piS-i E201K.

Účinok na odstránenie mastnoty variantom kutinázy E201K pri rôznych koncentráciách enzýmu bol porovnávaný s účinkom štandardného typu kutinázy Fusarium solani pisi za použitia 2g/.L detergenčného produktu C (viď príklad 11) pri 30 minútovom praní pri 30 °C pri 27 °FH. V teste sa na moni

J. torovanie použili polyesterové tkaniny znečistené bromovaným í olivovým olejom. Množstvo mastnoty na testovacích tkaninách I bolo určované meraním množstva brómu na nich pomocou roent[I génovej fluorescenčnej spektrometrie (ako je opísané vyšt sie).

Výsledky sú uvedené na obr. 14. Zvýšenie in-the-wash účinnosti (odstránenie znečisteniny) vo vzťahu k štandardnému typu kutinázy Fusarium solani pisi za rôznych pracích podmienok je evidentné. Pre porovnanie sa tent istý experiment prevádzal s Lipolázou (TM). Za všetkých podmienok bol variant kutinázy N172K lepší.

Príklad 13

In-the wash aktivita variantu kutinázy Fusarium solani pisi A85F.

Účinok na odstránenie mastnoty variantom kutinázy A85F pri rôznych koncentráciách enzýmu bol porovnávaný s účinkom štandardného typu kutinázy Fusarium solani pisi za použitia 2g/l detergenčného produktu C (viď príklad 11) pri 30 min. praní pri 30 °C pri 27 ⁰FH. V teste sa na monitorovanie použili polyesterové tkaniny znečistené bromovaným olivovým olejom. Množstvo mastnoty na testovacích tkaninách bolo určované meraním množstva brómu na nich pomocou roentgenovej fluorescenčnej spektrometrie (ako je opísané vyššie).

Výsledky sú uvedené na obr. 15. Zvýšenie in-the-wash účinnosti (odstránenie znečisteniny) vo vzťahu k štandardnému typu kutinázy Fusarium solani pisi za rôznych pracích podmienok je evidentné. Pre porovnanie sa tent istý experiment prevádzal s Lipolázou (TM). Za všetkých podmienok bol variant kutinázy A85F výrazne lepší.

Claims (13)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Variant kutinázy z materskej kutinázy, kde je sekvencia aminokyselín modifikovaná tak, že je zvýšená hydrofobicita na povrchu enzýmu.
2. 2. Variant kutinázy podlá nároku 1, v ktorom je hydrofobicita na povrchu enzýmu susediaceho s lipidickou kontaktnou zónou zvýšená tak, aby sa vytvorila rozšírená lipidická kontaktná zóna.
3. 3. Variant kutinázy podľa ktoréhokoľvek predchádzajúceho nároku, ktorého hydrofobicita je zvýšená nahradením jedného alebo viacerých aminokyselinových zvyškov aminokyselinovými zvyškami vybranými zo skupiny pozostávajúcej z valínu, leucínu, izoleucínu, fenylalanínu, tryptofánu a metionínu.
4. 4. Variant kutinázy podľa ktoréhokoľvek predchádzajúceho nároku, kde je sekvencia aminokyselín modifikovaná tak, že okrem hydrofobicity na povrchu je zavedený jeden alebo viac pozitívnych nábojov.
5. 5. Variant kutinázy podľa nároku 4, v ktorom sa pozitívne náboje zavedú introdukciou jedného alebo viacerých lyzínových alebo arginínových zvyškov.
6. 6. Variant kutinázy podľa ktoréhokoľvek predchádzajúceho nároku, kde sekvencia aminokyselinového zvyšku, ktorá je nahradená, má malý bočný reťazec a je výhodne vybraná zo skupiny pozostávajúcej z alanínu, serínu alebo glycínu.
7. 7. Variant kutinázy podľa ktoréhokoľvek predchádzajúceho nároku, kde materskou kut.inázou je eukaryotická kutináza.
8. 8. Variant kutinázy podľa ktoréhokoľvek predchádzajúceho nároku, kde materským enzýmom je kutináza, ktorá iinunolo44

   Igicky skrížené reaguje s protilátkami zvýšenými proti kutináze z Fusa rium solani pisi.
9. 9. Variant kutinázy podľa ktoréhokoľvek predchádzajúce- ? ...

   J ho nároku, kde materským enzýmom je kutmaza z Fusarium sor lani pisi.
10. 10. Variant kutinázy podľa ktoréhokoľvek predchádzajúceho nároku, pričom modifikované zvyšky sú uložené v tej časti molekuly, ktorá je definovaná vektorom, ktorý je metódou najmenších štvorcov vyrovananý cez Ca-atómy zvyškov 116 až 120 kutinázy Fusarium solani pisi alebo zodpovedajúce Ca-atómy rozdielnej kutinázy a rovinu kolmú na daný vektor a obsahujúcu Ca-atom rozdielnej kutinázy.
11. 11.Variant kutinázy podľa ktoréhokoľvek predchádzajúceho nároku, v ktorom modifikované zvyšky sú uložené v tej časti molekuly, ktorá je umiestnená medzi prvou rovinou kolmou na vektor, ktorý je vyrovnaný metódou najmenšícj štvorcov cez Ca- atómy zvyškov 116 až 120 kutinázy Fusarium solani pisi vo vzdialenosti 15 A od Ca-atómu zvyšku 117 a druhou rovinou paralelnou s prvou rovinou a obsahujúcou Ca-atóm zvyšku 117.
12. 12.Variant kutinázy podľa ktoréhokoľvek predchádzajúceho nároku, v ktorom modifikované zvyšky sú uložené v jednej alebo vo viacerých z nasledovných polôh v sekvencii aminokyselín kuti názy Fusarium solani pisi alebo v zodpovedajúcich pozíciách rozdielnej kutinázy:

    17, 18, 19, 40, 42-46, 50, 53 , 54, 58, 74, 75, 76, 78. » 80-88 ,91, , 92, 93, 95, 96, 97, 99, 100, 119, 150-156, 158 , 160 , 168 , , 169, 170, 172, 173, 174, 176, 179, 180-190, 192, 193, 194, , 196, 197, 198, 201.
13. 13. Variant kutinázy podľa ktoréhokoľvek predchádzajúceho nároku, v ktorom modifikované zvyšky sú uložené v jednej alebo vo viacerých z nasledovných polôh v sekvencii ami45

    ij • « f nokvselín kutí názv Fusarium solani pisi alebo v zodpovedájúcich pozíciách rozdielnej kutinázy: 19, 41, 45, 49, 54, 58, 75, 76, 82, 85, 92, 93, 99, 100, 127, 128, 172, 173, 179, 183, 184, 185, 189, 190, 194, 197, 201. 14. Variant kutinázy podľa ktoréhokoľvek predchádzajúceho nároku, v ktorom je jedna alebo viac nasledovných modifikácií ovplyvnených v aminokyselinovej sekvencii kutinázy Fusarium solani pisi alebo zodpovedajúcimi pozíciami v rozdielnej kutináze: T19V, G41A, T45K, T45P, *I49a, S54I, N58R, G75R, A76P, G82A, D83S, A85F, A85V, S92R, A93V, L99K, G100R, A127L, A128F, N172K, T173I, T179F, V184I, A185L, L189F, A190L, D194R,G197V, E201K. ľ. ii l. G P 15. Variant kutinázy podľa ktoréhokoľvek predchádzajú- ceho nároku, v ktorom je jedna alebo viac nasledovných modi- ii ·' fikácií ovplyvnených v aminokyselinovej sekvencii kutinázy Fusarium solani pisi alebo zodpovedajúcimi pozíciami v roz- dielnej kutináze: A85F.N172K, E201K. 16. Spôsob výroby variantu kutinázy podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyzačujúci sa tým, že zahrňuje kroky fermentačne kultivovaného a rDNA modifikovaného mikroorganizmu obsahujúceho gén vyrobený rDNA technikou, ktorý kóduje variant kutinázy, výroba prípravku variantu kutinázy separáciou variantu kutinázy produkovaného mikroorganizmom alebo z fermentačného bujónu alebo separáciou buniek mikroorganizmu z fermentačného bujónu, dezintegráciou separovaných buniek a koncentrovaním alebo čiastočnou purifikáciou kutinázy alebo z uvedeného bujónu alebo zo spomenutých buniek fyzikálnymi alebo chemickými koncentračnými alebo purifikačnými metódami. 17. rDNA modifikovaný mikroorganizmus, ktorý je transformovaný rDNA vektorom nesúcim gén kódujúci variant kutiná-

    s zy podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 15 a ktorý je preto l schopný exprimovať uvedenú kutinázu.

    | 18. rDNA modifikovaný mikroorganizmus podľa nároku 17, !j nesúci gén kódujúci variant kutinázy, ktorý je zavedený do ; mikroorganizmu fúziou na svojom 5 ’ zakončení na génový fragment kódujúci (modifikovanú) pre-sekvenciu fungujúcu ako signálna alebo sekrečná sekvencia organizmu.

    ’ 19. rDNA modifikovaný mikroorganizmus podľa ktoréhokoľvek nároku 17 alebo 18, kde hostiteľský organizmus je euka- * ryot, napríklad kvasinky rodu Saccharomyces alebo Kluyveromyces alebo rod Hansenula alebo huba rodu Aspergilus.

    20. rDNA modifikovaný mikroorganizmus podľa ktoréhokoľvek nároku 17 až 19, nesúci vektor rekombinantnej DNA kódujúci variant kutinázy podľa ktoréhokoľvek nároku 1 až 15, uvedený mikroorganizmus s auxotrofným mutantom s nahradením génu kódujúceho auxotrofný marker v jednej z jeho primárnych * buniek ' 21. Polynukleotid so základnou sekvenciou, ktorá kóduje variant zrelej kutinázy podľa ktoréhokoľvek nároku 1 až 15 alebo funkčný ekvivalent alebo jeho mutant, v ktorom polynukleotid finálne translatovaného kodónu je nasledovaný stop kodónom a má nukleotidové sekvencie kódujúce pre-sekvenciu tejto kutinázy priamo proti smeru nukleotidovej sekvencie kódujúcej zrelý enzým.

    '22. Polynukleotid so základnou sekvenciou kódujúcou variant kutinázy podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 15, v ktorom polynukleotid finálne preneseného kodónu je nasledovaný stop kodónom a má nukleotidové sekvencie kódujúce najmenej časť zodpovedajúcej presekvencie a/alebo signálnu alebo sekrečnú sekvenciu vhodnú pre vybraný hostiteľský organizmus, priamo proti smeru nukleotidovej sekvencie kódujúcej zrelý enzým.

    ?. í

    23. Polynukleotid so základnou sekvenciou, variant zrelej kutinázy podlá ktoréhokoľvek z 15 alebo jej funkčný ekvivalent alebo mutant, ktorá kóduje nárokov 1 až v ktorom je variant kutinázy kódujúci nukleotidovú sekvenciu odvodený od pôvodného organizmu modifikovaný tak, že najmenej jeden kodón a výhodne tolko kodónov, ako je možné, je podrobených tichým mutáciám, aby sa vytvorili kodóny kódujúce ekvivalentné aminokyselinové zvyšky a boli preferovanými kodónmi nového hostitela, ako je uvedené v jednom z nárokov 17 až 20, a tým poskytnúť použitím buniek takéhoto hostiteľa messenger-RNA na zavedenie génu zvýšenej stability.

    24. Polynukleotid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 21 až 23, v ktorom proti smeru nukleotidovej sekvencie kódujúcej variant pro- alebo zrelej kutinázy je lokalizovaná nukleotidová sekvencia, ktorá kóduje signálnu alebo sekrečnú sekvenciu vhodnú pre hostiteľa, ako je špecifikované v ktoromkolvek z nárokov 17 až 20.

    25. Vektor rekombinantnej DNA schopný priamej expresie nukleotidovej sekvencie kódujúcej gén variantu kutinázy, zahrňujúci nasledovné komponenty:

    (a) Dvoj reťazcov (ds) DNA kódujúcu zrelú kutinázu alebo prekutinázu alebo zodpovedajúcu prekutinázu, v ktorej bola najmenej jedna časť presekvencie priamo odstránená po smere zo sekrečného signálu (výhodného pre vybranú hostiteľskú bunku). V prípadoch, kde časť génu, ktorá má byť prenesená neštartuje z kodónu ATG, ATG kodón by mal byť umiestnený vpredu. Prenesená časť génu by mala vždy končiť vhodným stop kodónom alebo má takýto kodón pridaný;

    (b) Regulon expresie (vhodný pre vybraný hostiteľský organizmus) situovaný proti plus vláknu ds DNA kódujúcej kutinázu (komponent (a);

    (c) Sekvencia terminátora (vhodná pre vybraný hostiteľský organizmus) situovaná proti plus vláknu ds DNA kódujúcej kutinázu (komponent (a);

    (dl) Sekvencie nukleotidov, ktoré uľahčujú integráciu ds DNA do genómu vybraného hostiteľa alebo, (d2) vznik replikácie vhodný pre vybraného hostiteľa;

    (el) voliteľne (auxotrofný) selekčný marker;

    (e2) voliteľne ds DNA sekvencia kódujúca proteiny zainteresované v zrení a/alebo vylučovaní jednej z prekurzorových foriem kutinázy u vybraného hostiteľa.

    26. Vektor rekombinantnej DNA podľa nároku 25, tiež nesúci po smere a proti smeru polynukleotid, ako už bolo definované, ďalšie sekvencie uľahčujúce funkčnú expresiu kutinázy.

    27. Vektor rekombinantnej DNA podľa ktoréhokoľvek z nárokov 25 - 26, nesúci auxotrofný marker pozostávajúci z kódovacej oblasti auxotrofného markera a a defektívnej promočnej oblasti.

    28. Enzymatický detergenčný prípravok obsahujúci variant kutinázy podľa ktoréhokoľvek nároku 1 až 15.