CZ157895A3 - VARIANTS OF CUTINASES, PREPARATION PROCEDURE FOR CUTINASE VARIANTS, MICRO-ORGANISMS OF A TREATED rDNA, POLYNUCLEOTIDES CONTAINING SEQUENCES OF NUCLEOTIDES ENCODING THE VARIANTS OF CUTINASES, VECTORS OF A RECOMBINANT DNA BEING CAPABLE OF CONTROLLING EXPRESSION OG GENES FOR THE CUTINASE VARIANTS, AND ENZYMATIC WASHING AGENTS CONTAINING THE VARIANTS OF CUTINASES - Google Patents

Description

Varianty kutináz. vvrobní postup pro varianty kutináz, mikroorganismy upravené rDNA. polvnukleotidv obsahující sekvence nukleotidů kódující varianty kutináz. vektory rekombinantni DNA schopné řídit expresi genů pro varianty kutináz. enzymatické prací prostředky obsahující varianty % kutináz.

Oblast techniky

Tento vynález obecně náleží do oblasti lipolytických enzymů. Přesněji řečeno, vynález se zabývá lipolytickými enzymy, které byly upraveny technikami rekombinantni DNA, a metodami pro jejich výrobu a využití zvláště v enzymatických pracích prostředcích.

Dosavadní stav techniky

Lipolvtické enzymy jsou enzymy, které mají schopnost hydrolyzovat triglyceridv na volné mastné kyseliny a nakonec na glycerol. Mohou rovněž štěpit složitější estery, jako je kutinová vrstva u rostlin nebo kožní tuk. Lipolvtické enzymy se využívají v průmyslu pro různé enzymatické procesy jako je inter- a trans-esterifikace triglvceridů a syntéza esterů. Jsou rovněž používány do pracích prostředků za účelem zvýšení účinnosti těchto pracích výrobků při odstraňování mastných i nečistot.

j Nejvíce využívanými enzymy jsou lipázy (EC

3.í. 1.3). Například EP-A-258 068 a’EP-A-305 216 (obojí z Novo Nordisk) popisují výrobu houbových lipáz s využitím heterologních hostitelských mikroorganismů pomocí technik rDNA, zvláště lipázy z Thermomyces lanuginosus/Humicola lanuginosa. EP-A-331 376 (Amano) popisuje lipázy a jejich _________________________________ _ výrobu technikami rDNA,. využiti těchto lipáz a aminosekvenci lipázy z Pseudomonas cepacia. Další příklady lipáz vyráběných technikami rDNA jsou uvedeny v WO-A-89/09236 o 5/ Π *7 ΓΖ i e rr\ o o c λ Dtpc xzaIW; nriApf tx v i_»x i O \j io vvuuv □x ivj rvuvj μνννι

publikací popisujících lipázy a jejich modifikace našla zatím široké komerční využití pouze lipáza z Humicola lanuginosa pod obchodním názvem Lipolase (TM) jako aditivum do pracích prostředků.

Charakteristickou vlastností lipáz je, že vykazují mezifázovou aktivaci. To znamená, že aktivita enzymu je mnohem vyšší na substrátu, který vytvořil mezifázi nebo micely, než na rozpuštěném substrátu. Mezifázová aktivace se projeví náhlým vzrůstem lipolytické aktivity, jakmile koncentrace substrátu přesáhne kritickou koncentraci micel substrátu (CMC) a vytvoří se mezifáze. Experimentálně lze tento jev sledovat jako diskontinuitu křivky aktivity enzymu v závislosti na koncentraci substrátu.

Mechanismus mezifázové aktivace lipáz se vvsvěluje konformačními změnami ve struktuře molekuly proteinu lipázy. Ve volném nevázaném stavu zakrývá katalytické vazebné místo helikální víčko. Při vazbě na lipidový substrát je toto víčko odstraněno a katalytické místo se odkryje. Ma se za to, ze toto helikální vičko interaguje s -lipidovou— mezifázi, čímž enzymu umožňuje₃—aby—zůstal k mezifázi vázán.

WO-A-92/05249 (Novo Nordisk) popisuje geneticky modifikovamé^lipázyr^žvláštěMipázu^z^Ař/zfwzboZď^ZazízÝgz/ioía pozměněnou v lipidové kontaktní zóně. Lipidová kontaktní zóna je v patentové přihlášce definována jako povrch, který je v. aktivní formě enzymu zakryt helikálním víčkem. Modifikace zahrnuje deleci nebo substituci jednoho nebo více aminokyselinových zbytků v lipidové kontaktní zóně tak, aby se zvýšil elektrostatický náboj a/nebo snížila hydrofobicita —~-lipidové kontaktní zóny nebo změnila její konformace.—Těchtozměn se dosáhne deleci jednoho nebo více záporně nabitých aminokyselinových zbytků v lipidové kontaktní zóně nebo nahrazením těchto zbytků jednou nebo více neutrálními nebo kladně nabitými aminokyselinami a/nebo nahrazením jednoho nebo více hydrofilních aminokyselinových zbytků v lipidové kontaktní zóně nebo nahrazením těchto zbytků hydrofobními ^£ ·- aminokyselinami.

¹ '' Kutinázy tvoří podtřídu enzymů (EC 3.1.1.50) označovaných jako voskové esterové hydrolázy. Tyto enzymy mají schopnost rozkládat kutin, což je síť esterifikovaných dlouhých řetězců mastných kyselin a mastných alkoholů, které se vyskytují v rostlinách jako ochranná vrstva na listech a ^{1 :} stoncích. Navíc mají tyto enzymy určitou lipolytickou aktivitu

- tj. mají schopnost hydrolvzovat triglyceridy. Proto mohou být považovány za zvláštní typ lipáz. Na rozdíl od lipáz však kutinázy nevykazují žádnou významnou mezifázovou aktivaci.

Kutinázy lze získat z mnoha zdrojů, jako jsou rostliny (např. pyl), bakterie, houby. Pro schopnost rozkládat , tuky byly kutinázy navrženy jako složky enzymatických - pracích prostředků. Například WO-A-88/09367 (Genencor) í navrhuje pro sestavení účinného enzymatického pracího prostředku použití kombinace, smáčedla. a dokonale čistého enzymu bakteriální kutinázy. Jsou popsány prací prostředky obsahující kutinázu získanou z gramnegativních bakterií

Pseudomonas putida ATCC 53552. Avšak v pozdější evropské patentové přihlášce EP-A-476 915 (Clorox) se uvádí, že enzym, o, kterém, s..e„p.o,zděi Lhovoří jako o li p á z e ^.n e n Lv_; ,o d straň ován L mastných nečistot z tkanin o nic účinnější než ostatní lipázy, jestliže je použit konvenčními metodami.

v u.a v ixv

1a x r 1 o u v ία » /A VAA Λ m Π

Li í_?j i νζ,ίίί v i iia óLiuis.tUiú kutinázv z Fusaríum solani pisi (Martinez a kol. (1992), Nátuře 356, 615-618). Zjistilo se, že tato kutináza nemá helikální víčko, které by zakrývalo katalytické vazebné místo. Místo toho má v aktivním místě zbytek šeřinu, který je zřejmě přístupný pro rozpouštědlo. Tato zjištění potvrzuje současnou teorii o mechanismu mezifázové aktivace lipáz.

Kutinázový gen z Fusaríum solani pisi byl klonován a sekvencován (Ettinger a kol., (1987) Biochemistry 26, 7883-7892). WO-A-90/09446 (Plant Genetics Systems) popisuje klonování a produkci tohoto genu v E. coli. Tato kutináza může účinně katalyzovat hydrolýzu a syntézu esterů ve vodných i bezvodých mediích, a to jak v přítomnosti, tak v nepřítomnosti mezifáze mezi kutinázou a substrátem. Na základě celkové stability tohoto enzymu je v této patentové přihlášce navrhováno, že by tato kutináza mohla být používána pro výrobu čisticích prostředků jako jsou prací prostředky a další speciální mastnoty rozpouštějící prostředky, např. kosmetických přípravků a šamponů. Přihláška neuvádí ekonomicky proveditelný způsob výroby tohoto enzymu ani -speeifi&ké-enz-ymatieké-pr-a&í-prostředkyobsahujícíkutinázu.--Pro tuto jejich charakteristickou vlastnost, tj.

____nepřítomnost mezifázové, aktivace, definujeme ,pro účely této ^příkTíšR^KuTiTá^y^jlKT^rip^iyfiďke^^nzymyT^kfěré^v^pŤŤdTtKrě nevykazují žádnou mezifázovou aktivaci. Kutinázy se tudíž od klasických lipáz liší tím, že nemají helikální víčko zakrývající . . katalytické vazebné místo.

Jak již bylo uvedeno, zatím pouze lipáza odvozená od Humicola lanuginosa našla široké komerční uplatnění jako přísada do pracích prostředků pod svým obchodním názvem '_iip-oláza-(-TM-)___Henrik Jvlalmos-ve-svém-článku-V—Chemistr-y_ and Industry (1990), na str. 183-186 uvádí, že je všeobecně známo, že aktivita lipáz je během pracího cyklu nízká a že lipoláza (TM) netvoří žádnou výjimku. Během procesu schnutí, kdy se sníží obsah vody, získává enzym opět svojí aktivitu a hvdrolyzuje mastné skvrny. Během následujícího pracího cyklu jsou hydrolyzované látky odstraněny. Tím se rovněž vysvětluje, proč je účinek lipáz po prvním pracím cyklu nízký, ale značný v dalších cyklech. Takže jsou stále potřebné lipolvtické enzymy, které vykazují jakoukoli významnou aktivitu během pracího cyklu.

Zjistili jsme, že kutinázy, a zvláště kutináza z Fusarium solani pisi, vykazují jasný prací účinek. Přesto je : ještě potřeba zvýšit prací lipolytickou aktivitu kutináz a

- vypracovat metody pro výrobu takových enzymů.

Účelem tohoto vynálezu je poskytnout kutinázy, které byly upraveny tak, aby se zvýšilo jejich působení, především jejich prací lipolytická aktivita.

Došli jsme k překvapivému zjištění, že lipolytická __aktivita eukaryotických kutinázových enzymů, přesněji kutináz z Fusarium solani pisi, Colleiotrichum capsici, Colletotrichum j g/oeospo/Vočfes a Mzzgna/joríAe. gr/se#, $e může zvýšit úpravou.

sekvence aminokyselin tak, aby se zvýšila hydrofobicita povrchu enzymu.

Podstata vynálezu τ- --Tento vynález -se·.· vztahuje-na^vaFÍanty-kutinázOvych^^—« enzymů. Jak již bylo popsáno výše, kutinázv lze získat z četných zdrojů, jako jsou rostliny (např. pyl), bakterie a houby.

Kutináza, která se má v tomto vynálezu používat jako rodičovská kutináza nebo počáteční materiál pro úpravy pomocí technik rekombinantní DNA, je vybrána ze skupiny eukaryotických kutináz. Eukaryotické kutinázy mohou být získány z různých zdrojů, jako jsou rostliny (např. pyl) nebo houby.

Skupina (eukaryotických) houbových kutináz obsahuje dvě různé specifické rodiny - se stonkovou specificitou a s listovou specificitou. Kutinázy s listovou specificitou mají většinou optimální pH kyselé nebo neutrální, zatímco kutinázy se stonkovou specificitou mají optimální pH alkalické. Kutinázy s alkalickým optimálním pH jsou vhodnější pro použití v alkalicky sestavených pracích prostředcích, jako jsou prací prášky a tekutiny na silně namáhané tkaniny.

Kutinázy mající kyselé nebo neutrální optimální pH jsou vhodnější pro výrobky s nižším zatížením nebo pro namáčecí kondicionéry, ale rovněž pro průmyslové čisticí prostředky.

V následující Tabulce 1 je seznam čtyř různých kutináz se stonkovou specificitou a jejich optimální pH.

-- ------:—_--T AB ULK A I----------------------Příklady kutináz se stonkovou specificitou optimální pH l ______Fusarium._s.olan i.pis.i.______________________________________________9______________________________________

Fusarium roseum culmorum 10

Rhizoctonia solemi 8,5

- 7 Alternaria brassicicola (PNBáza I) 9

V tomto vynálezu upřednostňujeme kutinázy, které lze odvodit z divokého typu Fusarium solani pisi (Ettinger a kol. 1987). Při použití v určitých pracích prostředcích ____vykazujetato_kutinázaj.asnýL·prací_ύčinek___

Jako rodičovská kutináza nebo počáteční materiál pro úpravy metodami rekombinantní DNA jsou rovněž vhodné kutinázy s vysokým stupněm homologie v sekvenci aminokyselin s kutinázou z Fusarium solani pisi. Příkladem jsou kutinázy z Colletotrichum capsici, Colletotrichum gloeosporiodes a Magnaporthe grisea. Na obrázku 12, který ukazuje částečnou sekvenci aminokyselin těchto kutináz, je patrný vysoký stupeň homologie.

Alternativou k vylepšení kutinázy z Fusarium solani pisi úpravou jejího genu je izolace genetické informace kódující kutinázu z jiného eukarvotického organismu použitím 5' a 3' nukleotidovvch sond odvozených od cDNA z Fusarium solani pisi, Colletotrichum capsici, Colletotrichum gloeosporiodes a Magnaporthe grisea kódující (pro)kutinázu a, je-li potřeba, i s použitím nukleotidových sond rozeznávájících konzervované sekvence v ostatních lipolytických enzymech. Tyto sondy se použijí ke znásobení molekul cDNA odvozených od mediátorových RNA (mRNA) pro kutinázy produkované eukarvtickými buňkami použitím PCR technologie (viz například WO-Á-92/05249). Pak jsou takto získané geny „ _ kódující kutinázy klonovány a exprimovány v E. co/z podle _ standardních_postupů, kutinázy jsou.testovány ve své účinnosti při odstraňování (mastných) nečistot z tkanin při vhodných podmínkách. Tímto způsobem může být získáno velké

- 8 množství přirozeně se vyskytujících variant výše uvedených kutináz se zvýšeným pracím účinkem. Navíc sekvence ₌přirozeně^se=3?yskytujících_i;kutináz.,poskytují_tiA-ýborný,^,základ^₌, pro další proteinové inženýrství kutinázy z Fusarium solani pisi.

Na základě nových představ o faktorech určujících aktivitu pracích lipolytických enzymů a po důkladném prošetření trojrozměrné struktury kutinázy z Fusarium solani pisi jsme našli mnoho způsobů, jak zvýšit účinek těchto kutináz a kutináz obecně pomocí technik rekombinantní DNA.

Protože kutinázy se výrazně liší od lipáz jako je Lipoláza (TM), bude interakce mezi kutinázou a jejím substrátem (povrchem lipidu) založena na jiném principu než na otevírání víčka a odhalení hydrofobní oblasti, která je schopná vázat substrát (Brzozowski a kol. (1991) Nátuře 351, 491 492).

.e··

Tento vynález ukazuje, že kutinázy mohou být upraveny tak, že může být zvýšena jejich reakce se substrátem bez vytváření tak rozsáhlých hvdrofobních oblastí na povrchu upravené kutinázy, že se molekuly kutinázy začnou shlukovat. Rozšíření hydrofobního povrchu lze dosáhnout zavedením hvdrofobních aminokyselin jako alaninu, valinu, leucinu, isoleucinu, prolinu, fenylalaninu, tryptofanu, tyrosinu a methioninu, v menší míře pak glutamové kyseliny, glutaminu a histidinu, za předpokladu, že postranní hydrofobní řetězce těchto—aminokyselin—nejsGu—pohřbeny- -v -hydr&fobním—jádru kutinázy. Methionin není za normálních okolností považován za hydrofobní.aminokyselinu^. avšakje-li.integrován do určitých Imí^^mŮžTnjcihWě^řisp^ěT^ke^zWšeKi^fíydrofobmfty povrcKu kutinázové molekuly.

- 9 Bylo zjištěno, že v některých případech je výhodné zavést vedle hvdrofobních aminokyselin rovněž nabité aminokyseliny, čímž se zabrání shlukování tohoto enzymu. Došli jsme k překvapivému zjištění. Jsou-li kladně nabité aminokyseliny jako lysin a arginin zavedeny do určitých míst v

-molekule-kutinázy—mohou”rovněž~způsObfrTozsírénLhyliTofobiTí' povrchové oblasti. Je to omezeno na ta místa v molekule kutinázy, kde methylové skupiny lysinu a argininu nemohou být pohřbeny v této molekule. Výhoda použití lysinu nebo argininu je v tom, že amino- nebo imido- skupiny zvyšují pravděpodobnost, že budou methylové skupiny exponovány a tudíž budou schopné reagovat s lipidovou fází.

Lysin a arginin nejsou za normálních okolností pokládány za hydrofobní aminokyseliny, avšak mezi atomy tvořícími postranní řetězce těchto zbytků se vyskytuje velký počet hvdrofobních atomů (v methylenovém podílu), které mohou reagovat s lipidovou fází. Ve skutečnosti je velikost hydrofobní části lysinového zbytku srovnatelná s hydrofobní částí zbytku valinu.

Jsou-li další vnitřní vlastnosti kutinázy negativně vlivněny zavedením kladného náboje, je možné zavést kompenzující záporný náboj nebo odstranit povrchový kladný náboj přímo v místě nebo v blízkosti té části molekuly kutinázy, která reaguje s lipidovou fází.

Bližším prozkoumáním hydrofobicity povrchu kutinázy z Fusarium solemi pisi v okolí aktivního místa bylo -” zj i š těno, ž e hy dr ofo bicí ta n e n r opt im á 1 n í. Ř e š en í m by m ě 1 o b ýt nahrazení určitých aminoky selin ...v .této oblasti rozměrnějšími hvdrofobními zbytky.

- 10 Důkladně jsme prostudovali trojrozměrnou strukturu mnoha takových enzymů, abychom lépe pochopili vztah mezi —strukturou-a^funkcí-lipolytických-enzymů.«Tam,-.kde^nebydy'-^^ trojrozměrné struktury ještě publikovány, jsme je odvodili technikami modelování molekul. _s,

Trojrozměrná struktura lipázv z Rhizomucor miehei byla určena rentgenovými krystalografickými metodami (Brady a kol. (1990) Nátuře 343, 767-770, Brzozowski a kol. (1991)

Nátuře 351, 491-494, Derewenda a kol. (1992) Biochemistry 31, 1532-1541). Ser 144 aktivního místa, patřící ke katalytické triádě Ser-His-Asp typu proteázy, je pohřben pod krátkým helikálním víčkem (zbytky 85-91). Struktura, ve které je Ser aktivního místa pohřben, je dále označována jako uzavřená konformace enzymu. Věří se, že adsorpce v mezifázi olej-voda je spojena s pohybem helikálního víčka. V důsledku tohoto pohybu dojde k odhalení šeřinu aktivního místa a ke zvětšení hydrofobní oblasti v okolí aktivního místa. Má se za to, že tato otevřená konformace odpovídá aktivnímu enzymu adsorbovanému na mezifázi olej-voda.

Cce-koordináty uzavřené formy lipázy z plísně Rhizomucor miehei bvlv uloženv v databance Protein Data ν' ·/

Bank v Brookhavenu. Pro vytvoření celých proteinových koordinát (páteře a postranních řetězců) lipázy z Rhizomucor miehei byly použity složité počítačové metody. Hrubý počáteční model lipázy Rhizomucor miehei byl vytvořen y použitím počítačových postupů popsaných S. Wodakem a kol.-------»— (1989) Protein Engineering 2, 335-345. Tato metoda je t součástí souboru..programů. SYBYL ..pro..modelováni molekul (TRÍPÓS associates, lne. st. CouišMMissouríy Model^-hýl potom upraven použitím technik minimalizace energie (EM) a

-11molekulární dynamiky (MD), které jsou součástí souboru programů pro modelování molekul (BIOSYM, San Diego, California). Během úprav technikami EM a MD byly použity dosavadní znalosti. Model byl současně optimalizován pro určité energetické podmínky pokud jde o funkci potenciální energie a podle známých strukturálních kriterií. Kvalita modelu_ byla vyhodnocena podle takových kriterií, jako je počet a kvalita vodíkových vazeb, rozložení vodíkových vazeb v sekundární struktuře, orientace peptidových jednotek, hodnoty a klínové úhly hlavního řetězce, úhel interakce aromatických skupin a velikosti dutin. Model byl navíc testován ohledně nevhodně uložených nábojů, extrémně vysunutých hydrofobních zbytků a energeticky nevýhodných poloh disulfidických můstků. Z knihovny rotamerů Ponder &

Richards byly vybrány důležité rotamery postranních řetězců (Ponder a kol (1987) J. Mol. Biol. 193, 775-791). Konečný výběr určitých rotamerů postranních řetězců byl založen na hodnotících strukturálních kriteriích, které byly uvedeny výše.

K upevnění atomů postranních řetězců do jejich poloh byly použity techniky molekulární dynamiky. Propracované testování struktur modelů jak odpovídají známým strukturálním vlastnostem a výpočty EM a MD pro optimalizaci strukturních charakteristik umožňují vytvoření spolehlivého celkového atomového modelu lipázv z Rhizomucor miehei. Otevřená konformace lipázy Rhizomucor miehei byla získána použitím počítačové simulace molekulární dynamiky, ve které byl do aktivního, ._mj_s.ta lipázy vpraven C,₀-triglvcerid. Podrobné ________ srovnání s publikovanými,, konformačními charakteristikami otevřené struktury (Derewenda a kol. Biochemistry (1992) 31, 1532-1541) ukázalo, že počítačový model otevřené

- 12 konformace získané tímto způsobem je s nimi v podstatě shodný.

Se znal ostí troj rozměrné struktury, . 1 i p á zy., h o u b v Řhizomucor miehei byla s použitím technik srovnávacího modelování, které jsou součástí souboru programů pro molekulární modelování SYBYL v modulu COMPOSER (TRIPOS associates, lne. St. Louis, Missouri), získána otevřená a uzavřená trojrozměrná struktura lipázy z Humicola langinosa. Získaný model lipázy z Humicola langinosa byl upraven již zmíněnými počítačovými postupy.

Ta část molekuly lipázy, která se podílí na adsorpci substrátu na enzym, byla určena porovnáním trojrozměrné struktury lipázy houby Řhizomucor miehei a lipázy z Humicola langinosa.

Se znalostí trojrozměrné struktury kutinázy z Fusarium solani pisi a s použitím technik založených na srovnávacím modelování (modul COMPOSER v souboru programů molekulárního modelování TRIPOS associates, lne. St. Louis, Missouri) byla získána trojrozměrná struktura kutinázy z Colletotrichum gloeosporiodes. Takto získaný model kutinázy Colletotrichum gloeosporiodes byl dále upraven již zmíněnými počítačovými postupy.

Z trojrozměrné struktury lipolytických enzymů uvedených v tabulce II lze překvapivě zjistit, že můžeme definovat určitý vektor, kterým je fitace nejmenších čtverců, _m^LC_a_-atomy_zbytků 116 až lv kuiÁr&zQ, Fusarium solani pisi. Tento vektor je v podstatě kolmý na povrch, na kterém dochází k interakci se substrátem.

-Z=n ásle duj í cí= ta bulky “Hyje^z rej méyže“z”pO rovná ní primárních sekvencí mnoha lipolytických enzymů z různých

- 13 zdrojů vyplývá, že zbytky aminokyselin 116 až 120 kutinázy z Fusarium solani pisi jsou zjevně umístěny v oblasti, která má rozsáhlou funkční homologii. Toto seřazení může být řízeno použitím společné sekvence pro lipolvtické enzymy Gly-(His/Tvr)-Ser-X-Gly.

TABULKA II lipáza Humicola lanuginosa lipáza z Mucor miehei lipáza lidského pankreatu kutináza z Fusarium s.p. kutináza z C. gloeosporiedes

YRVVFTGHSL G G AL AT V AG ADLRGN G Y YKVAVTGHSLGGATALLCALGLYOREE S N VHVIGHSLG AH AAGE AGRRTNGTIG ATLIAGGYSOGAALAAASIEDLDSAIR AAIVSGGASQGTAVMAGSISGLSTTIK

Použili jsme tudíž tento vektor mezi zbytky aminokyselin 116 až 120 v molekule kutinázy z Fusarium solani pisi, abychom určili tu část molekuly kutinázy, ve které by měly být provedeny úpravy za účelem získaní kutinázy se zvýšenou prací aktivitou. Následující tabulka III udává strukturu sousedních aminokyselin u lipolytických enzymu uvedených v tabulce II.

TABULKA III vlákno vlákno šroubovice akt. místo lip. H. lanuginosa 138-141 142 Ser* 146 147-159 his258 lip. M. miehei 136-139 (fit: 140-Ser*144) 145-157 his257 =ÍÍPi lids. pankr. 144-147 (fit: 148-Ser*152) 153-165 his? 6 3_ kut. F.s.pisi 112-115 (fit: 116-Ser*120) 121-133 hislSS kut. C. gloe. 112-115 (fit: 116-Ser*120) 121-133 hisl88 Ser* = šeřin aktivního místa

- 14 V jednom ze svých aspektů popisuje tento vynález modifikované kutinázové enzymy, které mají zvýšenou prací lipolytickou aktivitu tím, že j im byly p o zm ě n ěn v sek ve n c e aminokyselin takovým způsobem, že se zvýšila hvdrofobicita povrchu enzymu. Většinou byla hydrofobicita povrchu enzymu přeléhajícího k lipidové kontaktní zóně zvýšena tak, aby se rozšířila tato lipidová kontaktní zóna.

Zvýšení povrchové hydrofobicity kutinázy bylo dosaženo nahrazením jednoho nebo více aminokyselinových zbytků zbytky aminokyselin, které byly vybrány ze skupiny obsahující alanin, valin, leucin, isoleucin, prolin, fenylalanin, tryptofan a tyrosin, methionin, glutamovou kyselinu, glutamin a histidin. Používanější jsou valin, leucin, isoleucin, fenylalanin, tryptofan a methionin.

Bylo zjištěno, že je výhodné upravit sekvenci aminokyselin tak, aby ještě navíc ke zvýšení hydrofobicity povrchu byl zaveden jeden nebo více kladných nábojů vložením jednoho nebo více lvsinových nebo argininových zbytků.

Upravené zbytky jsou většinou umístěny v té části molekuly, která je určena vektorem fitace nejmenších čtverců procházejících Ca-atomy zbytků 116 až 120 kutinázy z Fusarium solárii pisi nebo odpovídajících Coc-atomů jiné kutinázy, a rovinou kolmou k uvedenému vektoru a obsahující Ca-atom zbytku 117 nebo odpovídající Ca-atom jiné kutinázy.

Jak již bylo řečeno, byla publikována trojrozměrná -Struktura-kutinážy-Z-^Mjarřu/Mtom-př-ípadě-budejasné, která úprava povede k úpravám v rozsahu tohoto vynálezu. V případě, že trojrozměrná struktura určité kutinázy -ne ní—j e š t ě-známa;-b ud e- nicmé ně~s t ále^_možné~ v rámci^tohot o~ vynálezu odvodit vhodné úpravy připojením sekvence

- 15 aminokyselin obsahující známou sekvenci (viz obr. 12) řízenou společnou sekvencí - pro lipolytické enzymy Gly-(His/Tvr)-Ser-X-Gly. V tomto postupu se většinou používají techniky molekulárního modelování.

Varianty kutináz vyrobené podle tohoto vynálezu TOohOU“přinéS't“výhody“pro~aktivitu~enzymů—buďouMi-používány' jako součást pracích a čisticích prostředků. Zjistilo se, že mají zejména vzýšenou účinnost během hlavního pracího procesu, to znamená, že prací prostředek obsahující tento enzym má schopnost odstraňovat značné množství mastných nečistot ze znečištěných tkanin v jednoduchém pracím procesu v evropském typu automatických praček při normálních pracích podmínkách pokud jde o koncentraci, tvrdost vody, teplotu. Je potřeba mít na paměti, že za stejným podmínek nemá komerčně dodávaný lipolytický enzym Lipoláza (TM) z Novo Nordisk zjevně žádný významný prací účinek při odstraňování mastných nečistot.

Prací účinek enzymu na mastné nečistoty může být vyhodnocen následujícícm způsobem. Nový testovací polyester s obsahem bavlny nižším než 10% je předeprán pracím prostředkem neobsahujícím takový enzym, jaký byl uveden výše, a pak důkladně vvmáchán. Takto vyčištěná látka je pak znečištěna olivovým olejem nebo jinou vhodnou hvdrolyzovatelnou látkou. Každý kousek testované látky (vážící přibližně lg) je inkubován v 30 ml prací tekutiny v lOOml polystyrénové láhvi. Prací tekutina obsahuje prací prostředek uvedený níže v dávce lg na litr. Lahve jsou třepány po dobu 30 minut v pračce. Miele TMT naplněné vodou a spuštěné na obyčejný 30°C hlavní prací program. Varianta kutinázv je předem přidána do prací tekutiny v dávce 3 LU/ml.

- 16 Kontrola neobsahuje žádný enzym. Prací prášek má následující složení (ve váhových procentech):

ethoxylované alkoholové neiontové. smáčedlo · ~ - 9,5 · — .

síran sodný 38,6 uhličitan sodný 40,4 p silikát sodný (Na,0:Si,0 = 2,4) 7,3 voda 4,2

Jako neiontové smáčedlo byl použit C₁₂-C₁₅ ethoxylovaný alkohol 10,5-13 EO, ale povaha použitelných ethoxylovaných alkoholů se může ve velké míře lišit.

Po vyprání je testovaná látka důkladně vymáchána ve studené vodě a vysušena v bubnové sušičce studeným vzduchem. Pak se vyhodnotí zbytková mastnota. Měření zbytkové mastnoty se může provádět několika způsoby. Nejběžnější metodou je extrakce testovaných látek petrol etherem v Soxhletově extrakčním přístroji, oddestilování rozpouštědla a stanovení procenta zbytkového mastného materiálu jako frakci původního množství tuku zvážením testovaných látek.

V druhé citlivější metodě se ke znečištěni testovaných látek používá brómovaný olivový olej (Richards,

S., Morris, M.A. a Arklay, T.H. (1968), Textile Research Journal 38, 105-107). Každý kousek testované látky je pak inkubován v 30 ml prací tekutiny ve 100 ml polystyrénové ?

láhví. Sada lahvi je třepána v pračce naplněné vodou a spuštěné na normální 30°C hlavní prací program. Po hlavním ^ri praní jsou látky pečlivě.máchány .po.dobu—5.sekund.ve.studené vohě. Látky jsou ihned po vymáchání vysušeny suchým vzduchem v sušičce. Po vysušení je určeno množství zbytkové

- 17 mastnoty změřením obsahu bromu v testovaných látkách pomocí rentgenové fluroscenční spektrometrie. Míra odstranění mastnoty může být stanovena jako procento původního množství mastnoty přítomné v testovaných látkách pomocí následujícího výpočtu:

% odstranění mastnoty = brom_b„. - brom.,.. * 100 % brom_bw kde: brom_bw označuje procento bromu v látce před praním brom_aw označuje procento bromu v látce po praní

Další metodou hodnocení aktivity enzymu je pomocí měření činitele odrazu při 460 nm pomocí standardních technik.

V kontextu tohoto vynálezu se modifikovaným, mutovaným nebo mutantním enzymem nebo variantou enzymu rozumí enzym, který byl produkován mutovaným organismem, který exprimuje mutovaný gen. Mutovaný gen (jiný než pouze gen obsahujícím pouze tichou mutaci) znamená gen kódující enzym mající sekvenci aminokyselin, která byla odvozena přímo nebo nepřímo a která je v jednom nebo více místech odlišná od sekvence odpovídajícího rodičovského enzymu. Rodičovským enzymem se rozumí genový produkt odpovídajícího nepozměněného genu. Tichá mutace v genu znamená změnu nebo odlišnost vytvořenou v sekvenci polvnukleotidů daného genu, která (z důvodu redundance ve — vztazích , kodon-aminoky sel ina) ne vede k žádné změně v sekvenci aminokyselin enzymu kódovaného tímto genem.

Mutantem nebo mutovaným organismem se rozumí mikroorganismus, který je rodičovským nebo dceřiným

- 18 organismem, který byl podroben mutaci v. genu pro daný enzym. Taková mutace organismu může být provedena buď (a) mutaci odpovídaj ic i ho genu (rodič ovs kéh o genu),již. přítomného_^ v rodičovském organismu, nebo (b) přenosem (zavedením) odpovídajícího genu získaného přímo nebo nepřímo z jiného zdroje a

V*

X/1 D7P * A- v ného (včetně mutace daného genu) du mikroorganismu, který se tak stává mutovaným mikroorganismem. Hostitelský mikroorganismus je mikroorganismus, který obsahuje mutovaný gen nebo přenesený gen jiného původu. Ve skutečnosti to může být mikroorganismus ze stejného nebo odlišného rodičovského nebo dceřiného kmene nebo druhu jako byl rodičovský mikroorganismus.

Tento vynález popisuje zejména mutované formy kutinázv z Fusarium solani pisi uváděné v WO-A-90/09446 (Plant Genetics Systems) a kutinázv z Colletotrichum capsici, Colletotrichum gloeosporiodes a Magnaporthe grisea. Tyto varianty kutináz lze získat pomocí mikroorganismů modifikovaných rekombinantní DNA obsahujících gen získaný nebo vytvořený technikami rDNA.

Jakmile jsou jednou určeny aminokyselinové zbytky přítomné v té části molekuly, která je určena vektorem získaného pomocí fitace nejmenších čtverců pro Ca-atomy zbytků 116 až 120 kutinázv Fusarium solani pisi nebo pro Ca-atomy odlišné kutinázv a rovinou kolmou k řečenému vektoru-obsahující-Ca-atom- zbytku- -1-17-nebo—odpovídajícíCa-atom odlišné kutinázv, je možno přistoupit k úpravám sekvence aminokyselin zavedením vhodných aminokyselin do je dné^ne ber v í ce~de fi novanýclrpoloh7”Nápři kladlmutac i' N 7 T2 K⁼

- 19 vztahující se na sekvenci kutinázy Fusarium solani pisi nebo na sekvenci s ní homologickou. “ '

Je jasné, že taková úprava ovlivní strukturu kutinázy. Dává se samozřejmě přednost takovým modifikacím, které příliš neovlivňují elektrostatický náboj v okolí aktivního místa7^_yAútořktohbfo“vynarěžTdb^_sáhli^_hežbýthě^_úrovňě^_žna]ósrí^_ o rovnováze mezi nevyhnutelnou distorzí konformace enzymu a ziskem v podobě zvýšené aktivity enzymu. Tyto znalosti jsou nezbytným a velice úspěšným pomocníkem při předpovědi vhodných variant kutináz a jejich výrobě.

V následující tabulce IV a dále v této patentové přihlášce jsou aminokyseliny a aminokyselinové zbytky v sekvencích peptidů označovány jednopísmennými nebo třípísmennými zkratkami:

TABULKA IV

A =	Ala	= Alanine	V =	Val	= Valin
L =	Leu	- Leucin	I =	Ile	= Isoleucin
P =	Pro	= Prolin	F =	Phe	= Fenvlalanin
W =	Trp	= Tryptofan	M =	Met	= Metionin
G =	Glv	= Glycin	S -	Ser	= Serin
T =	Thr	= Threonin	C =	Cys	= Cystein
Y =	Tyr	= Tyrosin	N =	Asn	= Asparagin
Q =	Gin	= Glutamin	D =	Asp	= K. asparágová
E = -	Glu	= K. slutamová	K =	Lvs	= Lysin
R -	Arg	- Arginin	H	His	- Histidin ~

V této přihlášce může být mutace v sekvenci aminokyselin proteinu, a tedy i sám mutovaný protein, popsána

- 20 umístěním a povahou mutace následující způsobem: určením původního aminokyselinového zbytku, který byl mutací •o v 1 i vně n; určení m - -*⁼ m í sta' m ut ac e ď' děfi n óVáňi rh~ aminokyselinových zbytků, které nahradily původní. Pokud se jedná o inzerci nové aminokyseliny do sekvence, je její poloha označena jedním nebo více písmeny v dolním indexu čísla posledního předcházejícího člena běžné sekvence nebo referenční sekvence.

Například mutant charakterizovaný výměnou asparaginu za lysin v poloze 172 se označuje: Asnl72Lys nebo N172K. Inzerce (hypotetická) dalšího aminokyselinového zbytku jako třeba prolinu za asparagin by se označovala Asnl72AsnPro nebo N172NP, popřípadě jako *172aP s tím, že vložený zbytek je vyznačen v poloze číslo 172a. Delece (hypotetická) asparaginu v té samé poloze by se označovala Asnl72* nebo N172*. Hvězdička znamená buď deleci nebo chybění zbytku aminokyseliny v určené poloze, ať už se má za to, že chybí v důsledku skutečné delece, nebo pouze podle porovnání nebo podle homologie s jinou nebo referenční sekvencí mající v této poloze přítomen aminokyselinový zbytek.

Násobné mutace jsou odděleny znaménkem +, např. NI 72K+S54I+A128F označuje mutovaný protein nesoucí tři mutace substitucí, které jsou určeny třemi uvedenými polohami v sekvenci aminokyselin. V následující tabulce jsou uvedeny mutace, které je v případě potřeby možno kombinovat.

Níže uvedená tabulka V uvádí určité užitečné příklady kutinázovvch variant___podle____tohoto vynálezu založených na sekvenci kutinázy z Fusarium solani pisi.

TABULKA V

Varianty kutinázy Ewjarzz/zzz so/nzzz pz'5z. T19V. G41A, T45K, T45P, *I49a, S54I, N58R, G75R, A76P, G82A, D83S, A85F, A85V, S92R, A93V, L99K, G100R, A127L. A128F. N172K, T173I, T179F, I183F, V184I, A185L, L189F, A190L, D194R, G197V, E201K.

Nejlepší varianty kutinázy z Fusarium solárii pisi jsou podle tohoto vynálezu A85F, N172K a E201K a odpovídající varianty dalších kutináz. Příkladem takové odpovídající varianty kutinázy jsou varianty Aspl72Lys nebo D172K odvozené od kutinázy z CoUetotrichum gloeosporiodes.

V dalším provedení tohoto vynálezu je popsán postup výroby variant kutináz tohoto vynálezu. Mikroorganismy produkující přirozeně se vyskytující kutinázy jsou většinou rostlinné patogeňy, a proto se příliš nehodí jako hostitelské organismy pro modifikované kutinázové geny. Geny kódující upravené prokutinázy byly následně integrovány do vektorů rDNA, které mohou být přeneseny do mikroorganismů vhodných pro techniky rekombinantní DNA. Pro tyto účely je možno použít rDNA vektory podobné těm, které byly popsány v WO-A-90/09446.

Mikroorganismy produkující přirozeně se vyskytující kutinázy nejsou příliš vhodné pro kultivaci. Za účelem zvýšení výtěžku kultivačního procesuje vhodné .přenést gen kódující vylepšenou kutinázu do mikroorganismů, které

- - — rych 1 e rostou na 1 evném mediu a které mají schopnost produkce a sekrece velkého množství kutinázy. Takovými vhodnými hostitelskými mikroorganismy upravenými metodami rDNA jsou pro účely tohoto vynálezu bakterie, mimo jiné Bacilli,

Corynebacteria, Staphylococci a Streptomyces, nebo nižší eukaryota jako Saccharomyces cerevisiae a příbuzné druhy, Kluyveromyces' marxianus ~ a 'příbuzné'druhy?Htinsenúla’ polymorpha a příbuzné druhy, a druhy rodu Aspergilhis. Nejpoužívanější mikroorganismy jsou nižší eukaryota, protože tyto mikroorganismy velice dobře produkují a sekretují enzymy v průběhu kultivačního procesu a jsou schopny glykosylovat molekulu kutinázy. Glykosylace může přispět ke stabilitě kutinázy ve smáčedlovém systému.

Tento vynález rovněž popisuje genetický materiál odvozený ze zavedení modifikovaných eukaryotických genů pro kutinázu, např. genu z Fusarium solani pisi, do klonovacích vektorů rDNA, jejich použití při transformaci nových hostitelských buněk a expresi těchto genů pro varianty kutináz v buňkách nových hostitelů.

Tento vynález zároveň popisuje polynukleotidy vytvořené nebo upravené technikami rekombinantní DNA kódující tyto varianty kutináz, rDNA vektory obsahující takové polynukleotidy, a mikroorganismy upravené technikami rekombinantní DNA obsahující tyto polynukleotidy a/nebo tyto vektory. Dále zde uvádíme odpovídající polynukleotidy kódující upravené eukaryotické kutinázy, např. polynukleotid mající sekvenci baží kódující variantu zralé kutinázy, kde je za posledním překládaným kodonem umístěn terminační kodon a který podle potřeby obsahuje proti směru exprese genu pro variantu zralé kutinázy sekvence nukleotidů kódující prepronebo prosekvence takové varianty.

. V takovém ^polynukleotidu může _.být ..sekvencenukleotidů odvozená od původního organismu upravena tak, že nejméně jeden kodon, avšak nejlépe co nejvíce kodonů, podléhá tiché mutaci, při které vznikají kodony upřednostňované novým hostitelem a kódující ekvivalentní zbytky aminokyselin, čímž se v hostitelské buňce pro vložený gen využívá stabilnější hostitelská mRNA.

Proti směru exprese genu může být v sekvenci nukleotidů kódující prokutinázu nebo zralou kutinázu umístěna sekvence nukleotidů, která kóduje signální nebo sekreční sekvenci vhodnou pro vybraný hostitelský organismus. Tak se začlenění tohoto vynálezu vztahuje k rDNA vektoru, do kterého byl vložena sekvence nukleotidů kódující variantu kutinázy či jejího prekurzora.

Sekvence nukleotidů může být odvozena například od:

(a) přirozeně se vyskytujících sekvencí nukleotidů (např. kódujících původní sekvence aminokyselin proprekutinázy nebo prokutinázy produkované Fusarium solárii pisi.} (b) chemicky syntetizovaných sekvencí nukleotidů kódujícících původní sekvenci aminokyselin a skládajících se z kodonů, které jsou přednostně používány novým hostitelským organismem, a sekvence nukleotidů vedoucí k stabilní mediátorové RNA v novém hostiteli.

(c) sekvencí nukleotidů vytvořených technikami genového inženýrství a odvozených od některé ze sekvence nukleotidů uvedené v předchozích odstavcích a) nebo b) pro kutinázu z Fusarium solani pisi s odlišnou sekvencí aminokyselin ale mající vyšší stabilitu a/nebo aktivitu ve smáčedlovém systému.

______Celkově shrnuto obsahují yDNA vektory schopné řídit expresi sekvence nukleotidů kódující kutinázový gen tak, jak bylo popsáno výše, v některém vhodném hostiteli především následující složky:

- 24 (a) Dvouvláknovou (ds) DNA kódující zralou kutinázu nebo prekutinázu nebo odpovídající prekutinázu, ve které byla ales poň část p resekvence přemístěna přímo..po_; směru. exprese , od sekrečního signálu (upřednostňovaného hostitelským organismem). Tam, kde ta část genu, která má bvt translatována, nezačíná kodonem ATG, by se měl umístit tento ATG kodon na začátek. Překládaná část genu by vždy měla končit vhodným terminačním kodonem.

(b) Expresívní regulon (vhodný pro vybraný hostitelský organismus) umístěný po směru exprese pozitivního řetězce dsDNA kódující kutinázu (složka (a)).

(c) Terminační sekvenci (vhodnou pro zvolený hostitelský organismus) umístěný po směru exprese na pozitivním řetězci dsDNA kódující kutinázu (složka (a)).

(dl) Sekvenci nukleotidů, která zabezpečuje integraci dsDNA do genomu zvoleného hostitelského organismu.

(d2) Počátek replikace vhodný pro zvolený hostitelský organismus.

(el) V případě potřeby selekční (auxotrofní) znak. Auxotrofní selekční znak se může skládat z kódující oblasti auxotrofního znaku a z defektního promotoru.

(e2) V případě potřeby sekvenci dsDNA kódující proteiny účastnící se maturace a/nebo sekrece jedné prekurzorní formy kutinázy ve zvoleném hostitelském organismu.

Takovýto rDNA vektor může rovněž nést po nebo proti směru exprese polynukleotiduAak -jak-bykdefinOván-výšer další sekvence zprostředkovávající funkční expresi kutinázy. Auxotrofní znak se může skládat z kódující oblasti tohoto ⁼au χό trofn í h o“ zn aku^a^z^obTa š f ΐ’ΤΤί’ε fektn í frpromot ořem.

- 25 Tento vynález dále popisuje výrobu jedné z variant kutinázy popsané výše pomocí kultivace. Tato kultivace může být buď vsádková, jednorázová nebo kontinuální. Výběr postupu záleží na kmeni hostitelského organismu a na samotných metodách dalšího zpracování. Tím tento vynález rovněž popisuje postup výroby variant kutináz zde specifikovaných zahrnující kroky kultivace mikroorganismů upravených rDNA tak, že obsahují gen vytvořený technikami rekombinantní DNA nesoucí alespoň jednu mutaci, která ovlivňuje sekvenci aminokyselin kutinázy tak, že ve srovnání s rodičovskou kutinázou má tato vyšší aktivitu. Příprava varianty kutinázy spočívá v separaci kutinázy produkované mikroorganismy buď z kultivačního bujónu nebo separací buněk mikroorganismu z kultivačního bujónu, rozrušením separovaných buněk a zahuštěním nebo částečnou purifikací varianty kutinázy, a to buď z již řečeného bujónu nebo rozrušených buněk fyzikálními nebo chemickými zahušťovacími či purifikačními metodami. Nejvhodnější kultivační podmínky jsou vybírány tak, aby varianta kutinázy byla vylučována mikroorganismy do kultivačního bujónu, odkud se enzym potom získá odstraněním buněk buď filtrací nebo centrifugací. Podle potřeby pak může být varianta kutinázy v žádané míře zahuštěna a purifikována. Tyto kultivační postupy samy o sobě mohou být založeny na známých kultivačních technikách a běžně používané kultivaci v závislosti na dostupném vybavení nm Holci ΎητοΛηνοπί ριυ uuioi /jpi uw v um.

~.. ™ γ _{e n t} θ vy n ál e z d á 1 e p o p i s uj e výr ob n í' me t od y pro modifikované mikroorganismy schopné produkce varianty kutinázy vytvořené technikami rDNA. Pro tyto mikroorganismy je charakteristické, že gen, který kóduje

- 26 variantu kutinázy a který je zaveden do daného mikroorganismu, je na svém 5'- konci připojen k fragmentu genu; který' kóduj e'(modifikovanou)' pře sekvenci'' funguj í cí^: pró daný, hostitelský organismus jako signální nebo sekreční sekvence.

V dalším použití popisuje tento vynález mikroorganismy upravené rDNA obsahující gen pro určitou variantu kutinázy a schopné produkce této varianty kódované zmíněným genem. V mikroorganismech, které byly upraveny technikami rDNA, je gen, je-li původně přítomen, kódující nativní kutinázu většinou odstraněn a nahrazen jiným strukturním senem.

V dalším použití popisuje tento vynález enzymatický prací prostředky obsahující variantu kutinázy, která je předmětem tohoto vynálezu. Takové prostředky jsou kombinací variant kutinázy a dalších složek, které jsou běžně používány v čisticích nebo pracích prostředcích včetně přísad do těchto prostředků, plně sestaveného prostředku a čisticích složek, např. takových, které jsou známy již samy o sobě a jsou popsány třeba v EP-A-258 068. Přesněji řečeno, mohou tyto prostředky obsahovat detergentní základ z 5-60%, většinou 20-50 % hmotnosti čisticího prostředku, a od 0,1 - 50% hmotnosti aktivní systém, který dále obsahuje z 0 - 95% hmotnosti jedno nebo více aniontových smáčedel a z 5 - 100% hmotnosti jedno nebo více neiontových smáčedel._

Ostatní složky takových prostředků mohou být kteréhokoli známého druhu, např. ty, které jsou popsány v GB_-A-1..372_03_<CUnile.ver),_US.-A,3_9.50_27_7.,_.U.S_-A=.4_0.1.1..1.69, EP-A-179 533 (Procter & Gamble), EP-A-205 208 a EP-A-206 390 (Unilever), JP-A-63-078000 (1988), a v Research and

- 27 Disclosure 29056 z června 1988, společně s každou z několika specifikací popsaných v těchto zdrojích, přičemž všechny jsou zde uvedeny v soupise literatury.

Varianty kutináz z tohoto vynálezu se mohou s výhodou přidávat do pracích prostředků v jakékoli vhodné formě, tj. buď jako granulovitá složka, roztok nebo kaše tohoto enzymu, popřípadě s nosičovým materiálem (např. jako v EP-A-258 068 a výrobky Savinase (TM) a Lipolase (TM) z

Novo Nordisk).

Přidávané množství varianty kutinázy je do značné míry volitelné, např. od 10 - 20 000 LU/g, většinou 50 2000LU/g čisticího prostředku. V této přihlášce jsou LU, neboli lipázové jednotky, definovány stejně jako v EP-A-258 068 (Novo Nordisk).

Stejné zřetele se použijí mutatis mutandis v případě jiného enzymu, který může být rovněž přítomen. Viz také evropská patentová přihláška EP-A-407 225.

S výhodou mohou být používány takové prací prostředky, ve kterých je přítomná společně s kutinázou i proteáza, přičemž proteázv se vybírají z těch, které mají pí nižší než 10. EP-A-271 154 (Unilever) popisuje několik takových proteáz. Proteázv, které se za určitých podmínek mohou používat společně s variantami kutináz, zahrnují subtlisin například typu BPN nebo mnoho dalších druhů subtilisinu popsaných v literatuře, z nichž některé již byly navrženy pro použití v čisticích prostředcích, jako například mutantní proteázv popsané mimo jiné v EP-A-130 756 nebo EP-A-251 446 (obojí Genentech), US-A-4 760 025 (Genencor), EP-A-214 435 (Henkel), WO-A-87/04661 (Amgen),

WO-A-87/05050 (Genex), Thomas a kol. (1986/5) Nátuře 316,

- 28 375-376 a (1987) J. Mol. Biol. 193, 803-813, Russel a kol. (1987) Nátuře 328, 496-500.^ „ — fénto vynález Sude dále popsán v následujících příkladech. Veškeré techniky použité pro zpracování a analýzu materiálů nukleových kyselin byly v podstatě prováděny podle Sambrooka a kol. (1989), kromě případů, kde je uvedeno jinak. Doprovodné obrázky obsahují:

Obr. 1A Sekvence nukleotidů kazety 1 syntetického genu kutinázy z Fusarium solárii pisi a počáteční oligonukleotidy. V sekvenci kazety jsou vyznačeny tranzice oligonukloetidů. Malá písmena označují postavení nukleotidů mimo otevřený čtecí rámec.

Obr. 1B Sekvence nukleotidů kazety 2 syntetického genu kutinázy z Fusarium solani pisi a počáteční oligonukleotidy. V sekvenci kazety jsou vyznačeny tranzice oligonukleotidů.

Obr. 1C Sekvence nukleotidků kazety 3 syntetického genu kutinázy Fusarium solani pisi a počáteční oligonukleotidy. V sekvenci kazety jsou vyznačeny tranzice oligonukleotidů. Malá písmena označují polohu nukleotidů mimo otevřený čtecí rámec.

Obr. ID Sekvence nukleotidů syntetického kutinázového ___________genu z Fusarium solani pisi kódujícího____ pre-pro-kutinázu. Jsou vyznačeny presekvence, prosekvence kutinázy a sekvence pro zralou

—.....- kutinázu—-Malá-pismena-označuji-polohy-nukleotidů mimo otevřený čtecí rámec.

- 29 Obr. 2

Obr. 3

Obr. 4

Obr. 5

Obr. 6

Sekvence nukleotidů syntetického fragmentu DNA spojující sekvenci kódující prokutinázu Fusarium solani pisi se sekvencí kódující derivát presekvence phoA z E. coli. Jsou vyznačena vazebná místa pro ribozom a místa pro restrikční enzymy. Pomocí jednopísmenného kódu jsou rovněž vyznačeny sekvence aminokyselin kódované signální sekvence phoA a část genu kutinázy.

Sekvence nukleotidů kazety 8, fragment SacI-BcII kódující místo sloučení kódující sekvence pro presekvenci invertázy a zralé kutinázy Fusarium solani pisi.

Plazmid pUR2741 získaný delecí fragmentu Sall-Nrul z pUR2740 o velikosti 0,2 kb je pendlujícím vektorem pro E. coli - S. cerevisiae, který obsahuje část pBR322, počátek replikace v kvasinkových buňkách odvozený od 2pm plazmidu, kvasinkový gen leu2D a spojení kódující oblasti pro kvasinkovou signální sekvenci invertázy s rostlinným genem pro α-galaktosidázu pod kontrolou kvasinkového promotoru gal7.

Plazmid pUR7219 je pendlujícím vektorem pro E. coli - S. cerevisiae obsahující část pBR322, počátek replikace v buňkách kvasinek odvozený od 2pm plazmidu, kvasinkový gen leu2D a spojení kódující =^oblastNpro=Sl·gnál-ní=sekvencLkvas-inkovéunv-ertázy,s kódující oblastí pro zralou kutinázu Fusarium solani pisi pod kontrolou kvasinkového promotoru gal7. Plazmid pUR2740 je pendlujícím vektorem pro E.coli - S. ceresiae obsahující část pBR322, počátek

- 30 replikace v buňkách kvasinek odvozený od 2pm ---------------- ,^^plazmidu,,kvasinkový^gen4eu2D,a=_;spojenkkódujíeí oblasti pro signální sekvenci kvasinkové invertázy s rostlinným genem pro a-galaktosidázu pod kontrolou kvasinkového promotoru gal7.

Obr. 7 Sekvence nukleotidů kazet 5, 6 a 7, obsahující různé typy spojení kódujících sekvencí presekvence exlA a zralé kutinázy Fusarium solani pisi.

Obr. 8 Plazmid pAW14B získaný inzercí 5,3 kb fragmentu Sáli z genomové DNA Apergillus niger var. awamori do pUC19 v místě Sáli.

Obr. 9 Plazmid pUR7280 získaný nahrazením fragmentu BspHI-AflII obsahujícího exlA otevřený čtecí rámec v pAW14B fragmentem BspHI-AflII obsahujícím kódující sekvenci preprokutinázy Fusarium solani pisi. Takže plazmid pUR7280 obsahuje pre-pro-kutinázový gen Fusarium solani pisi pod kontrolou promotoru a terminátoru z A. niger var. awamori.

Obr. 10 Plazmid pUR7281 získaný zavedením selekčních rozpoznávacích znaků amdS z A. nidulans a pyrG z A. niger var. awamori do pUR7280.

Obr. 11 Schematické znázornění molekuly kutinázy z Fusarium solani pisi.

----Obr. 12——částečné sekvence aminokyselin kutináz z

Fusarium solani pisi, Colletotrichum capsici, Colletotrichum gloeosporiodes a Magnaporťhe ~~ -grisěa zobrazující umístění zbytků v trojrozměrné struktuře molekul.

Obr.	13	Prací účinek kutinázy z Fusarium solam pisi kutinázové varianty NT72K.
Obr.	14	Prací účinek kutinázy z Fusarium solani pisi kutinázové varianty E201K.
Obr.	15	Prací účinek kutinázy z Fusarium solani pisi kutinázové varianty A85F.

LITERATURA

Sambrook, J., Fritsch, E.F. a Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning: a laboratory manual (2. vyd.). Cold Spring Harbor Laboratorv Press. Cold Spring Harbor, New York. ISNB 0-87969-309-6.

Furste, J.P., Pansegrau, W., Frank, R., Blócker, H., Scholz, P. Bagdasarian, M. a Lanka, E. (1986). Molecular cloning of the plasmid RP4 primase region in a amulti-host-range tacP expression vector. Gene 48. 119-131.

Michaelis a kol. (1983). J. Bacteriol 154. 366Tartof a Hobbs (1988). Gene 67, 169-182.

Soliday, C.L., Flurkey, W.H., Okita, T.W. a Kolattukudy, P.E. (1984). Cloning and structure determination of cDNA for cutinase, an enzyme involved in fungal penetration of plants. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81, 3939-3*943.

Nogi, Y a Fukasawa, T. (1983). Nucleotide sequence of the transcriptional initiation region of the yeast GAL7 gene. Nucleic Acids Re$. 1 1. 8555-8568.

Taussig, R. a Carlsson, M. (1983). Nucleotide sequence of the yeasť SUC2 ‘ gene for in vertas e. Nucle ic Acids Res. °T1 ? 1943-1954.

Erhart, E. a Hollenberg, C.P. (1981) Curing of Saccharomyces cerevisiae 2pm DNA by transformation. Curr. Genet._3, 83-89.

Verbakel, J.A.M.V. (1991) Heterologous gene expression in the veast Saccharomyces cerevisiae. Ph.D. thesis. Rijks U niv e r s i t e i t. U t r e c h t, Th e -N e the r 1 an d s·- - —Maat, J., Róza, M., Verbakel, J., Stam, J., Santos da Silva, M.J., Bosse, M., Egmond, M.R., Hagemans, M.L.D., v. Gercom, R.F.M., Hessig, J.G.M., v.d. Hondel, C.A.M.J.J. a v. Rotterdam, C. (1992). Xylanases and their application in bakerv. In: Visser, J., Beldman, G., Kusters-van Someren, M.A. a Voragen, A.G.J. (Eds), Xylans and Xylanases. Progress in Biotechnology Volume 7, Esevier Science Publishers, Amstrdam. ISBN 0-444-89477-2.

de Graaff, L.H., van den Broek, H.C., van Ooijen, A.J.J. a Visser, J. (1992). Structure and regulation of an Aspergillus xylanase gene. V: Visser, J., Beldman, G., Kusters-va Someren, M.A. a Voragen, A.G.J. (Eds), Xylans and Xylanases. Progress in Biotechnology Volume 7, Elsevier Science Publishers, Amsterdam. ISBN 0-444-89477-2.

Hankin, L. a Kolattukudy, P.E. (1968). J. Gen. Microbiol. 51, 457-463.

Ettinger, W.F., Thukral, S.K. a Kolattukudy, P.E. (1987). Structure of cutinase gene, cDNA, and the derived amino acid sequence from phytopathogenic fungi. Biochemistry 26, 7883-7892.

Huse, W.D. a Hansen, C. (1988). Strategies I, 1-3.

De Graaf, L.H., H.W.J. van den Broek a J. Visser (1988). Isolation and expression of Ahě^Aspergilluš nidulans pyruvate kinase gene. Curr. Genet. 13, 315-321.

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1

Konstrukce syntetického genu kódujícího pre-pro-kutinázu z Fusarium solani pisi.

Syntetický gen kódující pre-pro-kutinázu z Fusarium solani pisi byl zkonstruován v podstatě podle metodiky popsané v EP-A-407 225 (Unilever). Na základě publikovaných sekvencí nukleotidu genů Fusarium solani pisi (Soliday a kol. (1984) a WO-A-90/09446, Plant Genetic Systems) byl navržen kompletně syntetický fragment DNA í obsahující oblasti kódující polypeptid pre-pro-kutinázy z Fusarium solani pisi. Ve srovnání s nukleotidovou sekvencí původního genu Fusarium solani pisi obsahuje tento syntetický gen pro kutinázu několi změn v nukleotidech, pomocí kterých byla do vhodných míst v genu zavedena rozpoznávací místa restrikčních enzymů, aniž by se ovlivnila sekvence aminokyselin kódovaná tímto genem. Sekvence nukleotidů celého syntetického genu pro kutinázu je uvedena na obr. ID.

Konstrukce syntetického genu pro kutinázu byla provedena sloučením tří samostatných kazet začínajících syntetickými DNA oligonukleotidy. Každá syntetická DNA kazeta je na začátku vybavena místem EcoRI a na konci obsahuje místo HindlII. Oligonukleotidy byly syntetizovány s použitím svntetizeru Applied Biosvstems 380A DNA syntetizer “ a purifiko vány elektroforézou v póly akry lami do vém gelu. Dál e uvedený postup byl použit při konstrukci každé z kazet. Byla smíchána ekvimolární množství (50 pmol) počátečních oligonukleotidů pro danou kazetu, oligonukleotidy byla fosforylovány na 5'- koncích, teplotně hybridizovány a

- 34 ligovány standardními technikami. Vzniklá směs

- ··- _. d vouvláknových^mo 1eku 1· DNA- by 1 a štěpena enzvmv Έc oRI ~ a

HindlII, frakcionována podle velikosti fragmentů elektroforézou v agarosovém gelu a z gelu byly fragmenty získány pomocí elektroeluce. Výsledná syntetická kazeta DNA byla ligována s 2,7 kb fragmentem EcoRI-HindlII z pUC19 a přenesena do Escherichia coli. Inzert EcoRI-HindlII z mnoha klonů byl pak pro ověření sekvence syntetické kazety kompletně sekvenován s použitím vhodných oligonukleotidů jako primerů. Stejným způsobem byly konstruovány plazmidy pUR7207 (obsahující kazetu 1, obr. 1A), pUR7208 (obsahující kazetu 2, obr. 1B) a pUR7209 (obsahující kazetu 3, obr. 1C). Nakonec byl sestaven syntetický gen pro kutinázu kombinací 2,9 kb fragmentu EcoRI-Apal z pUR7207 s 0,2 kb fragmentem Apal-Nhel z pUR7208 a fragmentem o velikosti 0,3kb Nhel-HindlII z pUR7209 za vzniku pUR7210. Tento plazmid obsahuje otevřený čtecí rámec kódující kompletní pre-pro-kutinázu z Fusarium solani pisi (obr. ID).

Příklad 2

Exprese (pro)kutinázy z Fusarium solani pisi v Escherichia coli.

Byl sestrojen expresívní vektor pro E. coli obsahující syntetický gen pro kutinázu. Tento vektor je funkčně podobný v^_e:ktoru popsanemu vWO4S790709446 (PlantGenetic Systems). Konstrukt byl navržen do té části syntetického genu pro kutinázu Fusarium solani pisi. kde jsou před sekvencí pro prokutinázu umístěny signály pro expresi v E. coli, tj. (i) inducibilní promotor, (ii) vazebné místo pro ribozom a (iii) signální sekvence, která obsahuje iniciační kodon pro translaci

- 35 a informace potřebné pro export prokutinázy přes cytoplazmatickou membránu.

Byl navržen syntetický spojovník (viz obr. 2) pro spojení derivátu signální sekvence phoA E. coli (Michaelis a kol, 1983) s prosekvencí syntetického kutinázového genu. Aby se dosáhlo ideálního štěpení signálního peptidu a sekrece prokutinázy, byla pro tento spojovník zvolena taková sekvence nukleotidů, ve které byly tři C-koncové aminokyselinové zbytky signální sekvence phoA (Thr-Lys-Ala) nahrazeny Ala-Asn-Ala a N-konec aminokyselinového zbytku prosekvence kutinázy (Leu 1, viz obr. ID) byl nahrazen Ala. Tato stavba zabezpečuje sekreci kutinázy do periplazmatického prostoru (viz WO-A-90/09446, Planí Genetic Systems).

Při sestavování tohoto konstruktu byl z pUR7210 odstraněn fragment EcoRI-Spel o velikosti 69 kb obsahující presekvenci a část prosekvence kutinázy a byl nahrazen syntetickým DNA spojovníkem (fragment EcoRI-Spel) obsahující derivát presekvence phoA z E. coli a pozměněný N-koncový zbytek aminokyseliny prosekvence kutinázy (obr. 2). Výsledný plazmid byl pojmenován pUR7250 a byl použit pro izolaci fragmentu BamHI-HindlII o velikosti 0,7 kb a obsahujícím vazebné místo pro ribozom a kódující oblast pro prokutinázu spojenou s kódovací oblastí signální sekvence phoA. Tento fragment byl ligován s 8,9 kb fragmentem BamHI-HindlII z,pMMB67EH (Fůrste a kol., 1986) za vzniku pUR7220. V tomto plazmidu je fúzován syntetický gen kódující prokutinázu se změněnou verzí phoA signální sekvence a umístěn pod kontrolu inducibilního promotoru tac.

- 36 Kmen E. coli WK6 nesoucí pUR7220 byl pěstován v třepacích lahvích obsahujících 0,5 1 media IXTB (Tartof a H ob b s, 1-9 8 8), které ob s ah o val o

0,017 M KH₂PO₄

0,017MK_;HPO₄ a/í Bacto-tryptone

24g/l Bacto-yeast extract

0,4% glycerol (v/v)

Kultura byla pěstována přes noc při teplotě 25°C-30°C za přítomnost ampicilinu v koncentraci 100 pg/ml za vydatného třepání (150 ot/min) až do indexu lomu 10-12 při 610 nm. Pak byl přidán IPTG (izopropyl-B-D-thiogalaktopyranosid) do konečné koncentrace 10μΜ a inkubace pokračovala dalších 12-16 hodin. Jakmile nebyl pozorován žádný další nárůst lipolytické aktivity na základě analýzy odebíraných vzorků, byly buňky sklizeny centrifugací a resuspendovány ve ledové vodě v množství odpovídajícím původnímu objemu kultury, čímž došlo k lyži buněk v důsledku osmotického šoku. Centrifugací se odstranily zbytky buněk, bezbuněčný extrakt byl kyselinou octovou okyselen na pH 4,8 a ponechán přes noc v teplotě 4°C. Poté byl odstraněn vzniklý precipitát. Tímto postupem, který neobsahuje žádné endogenní lipázy, byla získána kutináza o čistotě vyšší než 75% pomocí ultrafiltrace a vymražování bezbuněčného extraktu. Kutináza může být popřípadě dále čištěna do homogenity (např. vyšší než 95%) navrstvením Okyseleného bezbuněčného extraktů na SP-sephadex, elucí enzymu pufrem s pH 8,0, puštěním koncentrovaného alkalického roztoku přes, vhodný objem DEAE-celulosy (Whatman DE-52) a přímou aplikaci výtoku z DEAE na sloupec Q-sepharosy HP (Pharmacia). Elucí solným

- 37 gradientem byl získán přípravek kutinázy s-typickým celkovým výtěžkem vyšším než 75%.

Příklad 3

Konstrukce genů kódujících varianty kutinázy z Fusarium solani pisi.

S použitím syntetického genu pro pre-pro-kutinázu Fusarium solani pisi popsanou v příkladu 1 byly použity různé geny obsahující změny v kódovaných sekvencích aminokyselin. Při těchto konstrukcích byl zvolen v podstatě stejný přístup jako ten, který je popsán v příkladu 1 pro konstrukci uvedených v tří kazet uvádějících kompletní syntetický gen pro kutinázu. Například gen kódující N172K variantu kutinázy z Fusarium solani pisi byl sestaven spojením nové verze kazety 3 s použitím oligonukleotidů popsaných v příkladu 1 s výjimkou dvou oligonukleotidů, které zakrývají kódující triplet pro polohu, která má být mutována, tj. Asn 172. Místo nich byly použity dva nové syntetické oligonukleotidv obsahující mutantní sekvenci, ale jinak zcela identické s původními nukleotidy, které nahrazovaly. Přesněji řečeno, nová kazeta 3 obsahující mutaci N172K byla sestavena vestavěním variant CUTI3D MH (obsahující AAG místo AAT) a CUTI3K MH (obsahující CTT místo ATT) na místa CUTI3D MH a CUTI3K MH (viz obr. 1C). Nová kazeta 3 byla klonována a sekvenována v podstatě tak, jak bylo popsánao v příkladu 1.

—=Fragmenů NheI-HindIITO’Velikosti-0,3=kb=obsahující,tuto=mutac.i_ byl nahrazen odpovídajícím fragmentem z pUR7210 za vzniku pUR7257 (N172K). Fragmenf 0,6 kb Spel-HindlII z tohoto plazmidu byl použit jako náhrada odpovídajícího fragmentu v pUR7220, čímž vznikl expresívní plazmid pro E. coli

- 38 označovaný pUR7224 (N172K). Tímto expresivním plazmidem byl -transformován kmen'ET čb/C WK67 ~ 'Ťransformánti^by 1 i pěstováni způsobem popsaným v příkladu 2 a varianty prokutinázového enzymu byly získány a purifikovány v podstatě podle postupů uvedených v příkladu 2.

Gen kódující E20K variantu kutinázy z Fusarium solani pisi byl sestaven stejným způsobem spojením nové verze kazety 3 se začleněnou variantou CUTI3F MH (obsahující AAG místo GAG) a variantou CUTI3M MH (obsahující CTT místo CTC) místo původních CUTI3F MH a CUTI3M MH (viz. obr. 1C)

Gen kódující A85F variantu kutinázy Fusarium solani pisi byl sestrojen stejným postupem spojením nové verze kazety 2 se začleněnými variantami CUTI2C MH (obsahující TTC místo GCT) a CUTI2C MH (obsahující CTT místo CTC) místo původních CUTI2C MH a CUTI2I MH (viz obr. 1B).

Příklad 4

Exprese kutinázy Fusarium solani pisi v Saccharomyces cerevisiae.

Pro expresi syntetického genu pro kutinázu Fusarium solani pisi v Saccharomyces cerevisiae byl zkonstruován expresívní vektor, ve kterém předchází syntetickému_genu kódujícímu zra]lou kutin á zu _presekvence , invertázy S. cerevisiae (Taussig a Carlsson, 1983) a silný inducibilní promotor gal7 (Nogi a Fukasawa. 1983). Pro .sestroj ení_.syntetického-_genu—pro—kutinázu—-vhodného—pro— takovouto fúzi bvl syntetizován adaptorový fragment obsahující kódující sekvenci pro presekvenci invertázy sloučenou se sekvencí kódující N-konec zralé kutinázy. Tento fragment byl

- 39 shromážděn jako kazeta EcoRI-HindlII v pUC9 v podstatě tak, jak bylo popsáno v příkladu 1 (kazeta 8, viz obr. 3) za vzniku pUR7217. Plazmidy pUR7210 a pUR7217 byly přeneseny do £. coli JMI 10 (kmen postrádající aktivitu dam methylázy), fragment z pUR7217 o velikosti 2,8 kb ohraničený restrikčními místy BclI-HindlII byl ligován s fragmentem 0,6 kb BclI-HindlII z pUR7210 za vzniku pUR7218, ve kterém je nukleotidová sekvence kódující polypeptid zralé kutinázy sloučena s Částí kódující oblasti pro presekvenci invertázy S. cerevisiae.

Expresívní vektor pUR2741 (viz obr. 4) byl odvozen od pUR2740 (Verbakel, 1991, viz obr. 6) izolací 8,9 kb fragmentu Nrul-Sall z pUR2740, vyplněním přesahujících konců Sáli pomocí polymerázy Klenow, a opětovným uzavřením fragmentu do kruhu. Fragment SacI-HindlII 7,3 kb z pUR2741 byl ligován s 0,7 kb SacI-HindlII fragmentem z pUR7218 (viz. obr. 5). V případě potřeby lze umístit terminátor poli z S. cerevisiae za kutinázový gen do místa HindlII, které se ukázalo být klíčovým pro účinnou expresi kutinázového genu. Pendlující plazmid pUR7219 pro E. coli-S. cerevisiae obsahuje počátek replikace v kmenech 5. cerevisiae, které nesou 2μ plazmid (kmeny cir), bezpromotorovou verzi genu 5. cerevisiae Leu 2 umožňující selekci velkého počtu transformantů v leu2‘ kmenech S. cerevisiae a syntetický gen kódující zralou část kutinázy Fusarium solani pisi operativně ~spójénou š presekvenci“invertázy“ST^cerevisiae^pod“ kontrolou silného inducibilního gal7 promotoru S. cerevisiae.

Kmen SU50 5. cerevisiae (a, cir°, leu2, his4, canl), který je shodný s kmenem YT6-2-1L (Erhart a Hollenberg, 1981) byl kotransformován ekvimolární směsí 2μ plazmidu S.

- 40 cerevisiae a pUR7219 s použitím standardního protokolu pro - -elektroporaci - -kvasinkových— buněkr· '— - Transformanti ' byli selektováni na leucinové prototrofii a z velkého počtu transformántů byla izolována celková DNA. Ukázalo se, že všechny transformanty obsahovaly jak 2μ plazmid, tak plazmid pUR7219, čímž se dokázalo, že bezpromotorová verze genu leu2 v pUR7219 může funkčně komplementovat kmeny deficientní v leu2, pouze je-li přítomna ve velkém množství kopií vzhledem k současné přítomnosti kvasinkového plazmidu

2μ. Jeden z transformantů byl léčen z plazmidu pUR7219 kultivací na kompletním mediu po více než 40 generací pomocí otisků na selektivní a kompletní pevná media za vzniku kmene S. cerevisiae označovaného SU51 (a, cir⁺, leu2, his4, canl).

Kmen S. cerevisiae SU51 nesoucí pUR7219 byl pěstován v litrových třepacích lahvích obsahujících 0,2 1 MM media o složení:

- yeast nitrogen base (YNB) bez aminokyselin 6,7 g/1

- histidin 20 mg/1

- glukosa 20 g/1

Kultury byly pěstovány přes noc při teplotě 30°C za vydatného třepání (150 ot/min) až do indexu lomu 2-4 při 610 nm. Buňky byly sebrány centrifugací a v dvoulitrových třepacích lahvích byly resuspendovány v 1 litru media YPGAL skládajícího se z:

- yeast extract 10 g/1 —p_ept_one r 20 g/í

- galaktosa 50 g/1

Inkubace pokračovala dalších 12-16 hodin. Z kultury byly v pravidelných intervalech odebírány vzorky, biomasa byla odstraňována centrifugací. Supernatant byl analyzován na aktivitu kutinázy titrací používající olivový olej jako substrát.

- 41 Ke každému vzorku o objemu filtrátu 100 - 200 μΐ byla přidána promíchaná směs skládající se z 5,0 ml lipázového substrátu (Sigma, obsahující olivový olej jako substrát pro lipázu) a 25,0ml pufru (5 mM Tris-HCl pH 9,0, 40 mM NaCl, 20 mM CaCl,). Test byl prováděn při teplotě 30°C a uvolňování mastných kyselin bylo měřeno automatickou titraci 0,05 M NaOH do pH 9,0 s použitím titrátoru Mettler DL25. Byla sestavena křivka množství titračního činidla v závislosti na čase. Hodnota aktivity lipázv byla počítána z maximálního stoupání křivky. Jedna jednotka aktivity enzymu je definována jako množství enzymu, kteréve výše uvedených podmínkách uvolní z olivového oleje lpmol mastných kyselin za jednu minutu. Tato definice je odborníkům v oboru dostatečně známa.

Jakmile se produkce kutinázové aktivity již nezvyšovala, byly buňky odstraněny centrifugací a bezbuněčný extrakt byl okyselen na pH 4,8 kyselinou octovou a kutináza byla získána postupem popsaným v příkladu 1.

Příklad 5

Exprese variant kutinázy Fusarium solani pisi v 5. cerevisieae.

Varianta N176K kutinázy Fusarium solani pisi byla exprimována v 5. cerevisiae následujícím způsobem. Apal-HindlII fragment o velikosti 0,5 kb z pUR7257-(-Nl 72K) byl použit místo analogického fragmentu pUR7218 za vzniku pUR7228 (N172K), ve kterém je gen obsahující danou mutacifunkčně spojen se sekvencí kódující signální sekvenci S. cerevisae. Fragment 7,0 kb SacI-HindlII z pUR2741 byl ligován s 0,7 kb SacI-HindlII fragmentem z pUR7228 (N172K) za vzniku pUR7234 (N172K). Tímto plazmidem byl

- 42 transformován kmen SU51 5. cerevisiae. Vzniklé ---------- ^-transformanty byly inktibovány--podle^τ popis_U “ _V 'příkladu ~4 á produkované varianty kutinázy byly získány z bujónu kultury podle popisů v příkladech 1 a 4.

Varianta E201K kutinázy Fusarium solani pisi byla vyrobena v S. cerevisiae stejným způsobem 5 používajícím variantu genu pro kutinázu Fusarium solani pisi kódující variantu E201K jak bylo popsáno v přikladu 3.

Varianta A85F kutinázy Fusarium solani pisi byla v S. cerevisiae produkována stejným způsobem používajícím variantu kutinázového genu Fusarium solani pisi kódujícího A85F variantu kutinázy podle popisu v příkladu 3.

Přiklad 6

Exprese kutinázy Fusarium solani pisi v Aspergilli.

Pro expresi syntetického genu kutinázy Fusarium solani pisi v Aspergillus niger var. awamori byl zkonstruován expresívní vektor, ve kterém byl syntetický gen kódující pre-pro-kutinázu Fusarium solani pisi umístěn pod kontrolu silného inducibilního promotoru exlA z A. niger var. awamori (Maat a kol., 1992, de Graaff a kol., 1992).

Expresívní plazmid pro pre-pro-kutinázu (pUR7280) byl sestrojen z počátečního plazmidu pAW14B, který byl umístěn do kmene E. coli JMI09 (Centraalbureau_jvoor Shimmelcultures, Baarn, The Netherlands, pod číslem N° CBS 237.90 z 31. května 1990) obsahujícím asi 5,3 kb Sáli fragment, . ve kterém je umístěn 0.7 kb. gen pro endoxvlánázu II-fexl AT společně s 2,5 kb 5'-lemovací sekvencí a 2,0 kb 3'-lemovací sekvencí (obr. 8). V pAW14B byla kódující oblast exlA nahrazena oblastí kódující pre-pro-kutinázu. Místo BspHI

- 43 (5'-TCATGA-3') obsahující terminační kodon (ŤAA) genu exlA umožnilo konstrukci pUR7280.

Konstrukce byla provedena následujícím způsobem: pAW14B (7,9 kb) byl částečně naštěpen BspHI. Linearizovaný plazmid (7,9 kb) byl izolován z agarosového gelu. Následně byl vyizolovaný 7,9 kb fragment štěpen Bsml, který štěpí několik nukleotidů po směru exprese od místa BspHI, které nás zajímalo, aby se odstranily plazmidy linearizované v jiných BspHI místech. Fragmenty byly separovány v agarosového gelu, odkud byl vyizolován fragment BspHI-BsmI o délce 7,9 kb. Ten byl částečně štěpen AflII a výsledný fragment BspHI-AflII o velikosti 7,2 kb byl vyizolován.

Fragment 0,7 kb BspHI-AflII z pUR7210 obsahující celý otevřený čtecí rámec kódující pre-pro-kutinázu Fusarium solani pisi byl ligován s 7,2 kb fragmentem BspHI-AflII z pAW14B za vzniku pUR7280. Zkonstruovaný vektor (pUR7280) může být pak převeden do plísní (např. Aspergillus niger, Aspergillus niger var. awamori, apod.) pomocí konvenčních kotransformačních technik a gen pro pre-pro-kutinázu může být exprimován přes indukci promotoru endoxylanázy II. Takto konstruovaný vektor může být rovněž vybaven konvenčními selekčními znaky (např. amdS nebo pvrG, hygromycin apod.) a výsledným rDNA vektorem mohou bvt transforuiovánv plísně, pomocí kterých lze vyrábět požadovány proteim Jako příklad uvádíme selekční rozpoznávací znaky amdS a pyrG, které byly zavedeny do tohoto expresívního vektoru, čímž vznikl pUR7281 (obr. 10). Pro tyto účely bylo vytvořeno místo Notl přeměnou místa EcoRI (přítomného 1,2 kb od kodonu ATG proti směru exprese

- 44 genu pro pre-pro-kutinázu) na místo Notl použitím syntetického oligonukleotidu ” (5'-AATTGCGGCCGC-3')'' ”“'ža^ 'vzniku’ pUR7282. Vhodný DNA fragment obsahující celý gen amdS z A. nidulans a gen pvrG z A. niger var. awamori společně s jejich vlastními promotory a terminátory byl opatřen lemujícími místy Notl a vložen do Notl místa v pUR7282, čímž vznikl pUR7281 (obr. 10).

Jako další přístup k expresi syntetického kutinázového genu Fusarium solani pisi v Aspergillus niger var. awamori byl sestrojeny takové expresívní vektory, ve kterých syntetickému genu kódujícímu zralou kutinázu nepředchází jeho vlastní pre-pro-sekvence, ale pre-sekvence pro exlA A. niger var. awamori.

Pro sestavení syntetického kutinázového genu pro takovouto fúzi bylo syntetizováno několik adaptorových fragmentů, ve kterých je různými způsoby připojena kódující sekvence pro presekvenci exlA k sekvenci kódující N-konec zralé kutinázy. V kazetě 5 je toto spojení provedeno sloučení presekvence exlA s prosekvencí kutinázy. V kazetě 6 je exlA presekvence sloučena s N-koncovým zbytkem zralé kutinázy. Kazeta 7 je identická s kazetou 6, ale zde byl N-koncový zbytek kódovaného polypeptidu zralé kutinázy změněn z původního glycinu na zbytek šeřinu, aby se dosáhlo lepších podmínek pro štěpení signálního peptidu. Kazety 5, 6 a 7 byly sestrojeny ze syntetických oligonukleotidů v podstatě podle postupu popsaném v příkladu 1 (viz obr. 7). Kazeta 5 byla použita při odstranění Q..LkKfragmentmEco.RL-BclNz>pURZ2M za vzniku pUR7287. Kazety 6 a 7 byly použity při odstraňování fragmentu 0,1 kb EcoRI-BclI z pUR7210 za vzniku pUR7288 nebo pUR7289. Pro každý z plazmidů pUR7287, pUR7288 a

- 45 pUR7289 byl fragment 0,7 kb BspHI-AflII ligován s fragmentem 7,2 kb BspHI-AflII z pAW14B za vzniku pUR7290, pUR7291 a pUR7292.

Takto konstruované vektory byly přeneseny do plísní (Aspergillus niger, Aspegillus niger var. awamori) konvenčními kotransformačními technikami a tento pre-(pro)-kutinázový gen byl exprimován přes indukci endoxylanázového II promotoru. Tyto rDNA vektory mohou být dále vybaveny konvenčními selekčními znaky (např. amdS nebo pvrG, hygromycin) a výsledným vektorem mohou být transformovány plísně, aby se dosáhlo produkce požadovaného proteinu tak, jak bylo popsáno v tomto příkladu pro pUR7280 (viz výše).

Kmeny Aspergillus transformované některým z expresivních vektorů pUR7280, pUR7281, pUR7291, pUR7292 (obsahujících kódující oblast pro zralou kutinázu Fusarium solani pisi s nebo bez odpovídající prosekvencí a buď se signální sekvencí kutinázy, nebo exlA signální sekvencí, pod kontrolou exlA promotoru a terminátoru z A. niger var. awamorf) byly pěstovány v následujících podmínkách: několik jednolitrových třepacích láhví obsahujících 400 ml syntetického media (pH 6,5) bylo zaočkováno sporami (konečná koncentrace: 10E6/ml). Medium mělo takovéto složení (AW medium):

sacharosa	10	2/1 w*
NaNO,	6,0	2/1 w.
KC1	n s:-).	rr/1 X/ 1
KH,PO4	1,52	g/1
MgŠ0..7H,0	0,49	g/1
kvasničný extrakt	1,0	g/1
ZnSO4.7H,O	22	mg/l

H3BO3	11	mg/1
MnCl,.4H,0	5	mg/1
FeSO4.7H,0	'5', .	mg/1
CaCl,.6H,0	1,7	mg/1
CuSÓ4.5H,O	1,6	mg/1
NaH,MoO4.2H,O	1,5	mg/1
Na,EDTA	50	mg/1

Inkubace probíhala při teplotě 30°C, třepání 200 ot/min po 24 hodiny v inkubační třepačce Mk X. Po namnožení byly buňky sebrány filtrací (filter 0,45 pm), dvakrát promyty AW mediem bez sacharosy a kvasničného extraktu (solný roztok), resuspendovány v 50 ml solného roztoku a přeneseny do 300 ml třepacích lahví obsahujících 50 ml solného roztoku, do kterého byla přidána xylosa do konečné koncentrace 10 g/1 (indukční medium). Další inkubace probíhala za stejných podmínek přes noc. Výsledná kultura byla filtrována přes miracloth, aby se odstranila biomasa, a kutináza byla získána v podstatě postupem popsaným v příkladu 2.

Příklad 7

Exprese variant kutinázy Fusarium solani pisi v Aspergilli.

Exprese byla provedena v podstatě cestou popsanou v příkladu 6, přičemž zde byl ke konstrukci houbového expresívního vektoru použit plazmid pUR7257 (N172K) místo pUR7210 a byla z Aspergillum niger var. awamori získána varianta kutinázy Fusarium solani pisi obsahující mutaci N172K.

- 47 Příklad 8

Identifikace a izolace genů příbuzných genu kutinázv Fusarium solani pisi.

Z různých hub byly izolovány geny pro kutinázv lišící se v různé míře v homologii s kutinázou Fusarium solani pisi. Houbové kultury byly pěstovány v 500 ml třepacích lahvích obsahujících 200 ml media popsaného Hankinem a Kolattukudym (1968) obohaceného 0,25% glukosou. Inkubace probíhala 4 dny při teplotě 28°C v inkubační třepačce Mk X při 100 ot/min. Po této době byla již glukosa spotřebována a produkce kutinázy byla indukována přidáním hvdrolyzátu kutinu v podstatě stejným způsobem jako uvádí Ettinger a kol. (1987). V pravidelných intervalech byly z kultury odebírány vzorky a standardními technikami analyzovány na přítomnost lipolytické aktivity (viz příklad 4). Asi dva dny po indukci íipolvtické aktivity byly buňky sklizeny pomocí standardních technik. Mycelia byla propláchnuta, zmražena tekutým dusíkem a lvofilizována standardním postupem. Přípravek celkové RNA byl izolován pomocí metody používající guanidin-thiokvanát a purifikován centrifugací v hustotním gradientu cesium chloridu v podstatě postupem popsaným Sambrookem a kol. (1989). Frakce mRNA poIyA(+) byla izolována pomocí izolační soupravy polyAT tract mRNA isolation kit (Progma): Frakce mRNA polyA(+) byly standardním postupem použitv nro analvzu Norhern hvbridizací ™ vy už í vaj í c f ’ fr agment ’ ’C DNA z kut i n áz o v é ho ~g e nu Fusa rium solani pisi jako sondu k ověření exprese genů příbuzných kutinázovému. Přípravky mRNA obsahující materiál schopný hybridizace s danou sondou byly použity pro syntézu cDNA s použitím syntetizaění soupravy ZAP cDNA synthesis kit

- 48 (Stratagene, La Jolla) podle návodu dodavatele. Syntézou •vznikly- fragmenty-cDNA- s- koh'ezními koň'cT\XíTór lemujícími oblast poly-A a s adaptorem EcoRI na druhém konci. Takto získané fragmenty cDNA byly použity pro sestrojení expresívní knihovny přímým klonováním ve smyslu orientace v lambda ZAPII vektorech (Stratagene, La Jolla) umožňujícícch expresi β-galaktozidázových fúzních proteinů (Huse a kol., 1988). Tyto knihovny byly prošetřeny pomocí antisera vytvořeného proti kutináze Fusarium solani pisi.

Syntetizované cDNA frakce byly rovněž podrobeny vyšetření pomocí technik PCR s použitím specifických kutinázových primerů (viz tabulka 2). Tyto primery byly odvozeny ze srovnání sekvencí aminokyselin několika houbových genů pro kutinázy (Ettinger a kol., 1987). Podmínky PCR reakce byly pro každou sadu primerů optimalizovány a jako kontrola byla použita cDNA kutinázy z Fusarium solani pisi. Pro tyto přípravy cDNA, kterými bylo možno vytvořit specifické PCR fragmenty o podobné délce (nebo větší) než byla délka PCR fragmentu vytvořená pomocí cDNA z kutinázy Fusarium solani pisi za stejných podmínek, byly PCR fragmenty purifikovány elektroforézou a z gelu vyizolovány.

V další verzi byly techniky vyšetření PCR využívající specifické kutinázové primery použity přímo na genóinovoú DNA některých kmenů hub, přičemž jako pozitivní kontrola byla použita genomová DNA Fusarium solani pisi. Pro tyto p r i p r a vy g e n o m o v é DN A h ub. kt e r v m i. b v 1 o - mo žno -v v t v o ři t specifické PCR fragmenty o podobné délce (nebo větší) než byla délka PCR fragmentu vytvořená pomocí cDNA z kutinázy

- 49 Fusarium solani pisi za stejných podmínek, byly PCR fragmenty purifikovány elektroforézou a z gelu vyizolovány.

Z kmenů, které byly pozitivní buď ve vyšetření technikami expresívní knihovny nebo PCR (buď cDNA nebo genomovou DNA) a z mnoho dalších kmenů byla vyizolována vysokomolekulární genomová DNA. Kmeny byly pěstovány v podstatě podle Ettingera a kol. (1987) a genomová DNA byla získána způsobem popsaným de Graaffem a kol. (1988). Genomová DNA byla štěpena různými restrikčními enzymy a analyzována technikami Southern hybridizace s použitím buď analogického inzertu cDNA (metoda expresívní knihovny), nebo PCR fragmentu (metodika PCR), nebo kutinázového genu Fusarium solárii pisi (jiných kmenů) jako sondy. Poté byla zkonstruována fyzikální mapa kutinázových genů. Vhodný štěp genomové DNA byl rozdělen podle velikosti fragmentů pomocí gelové elektroforézv a fragmenty vhodné velikosti byly z gelu vyizolovány a subklonovány v pUC19. Tyto genomové knihovny byly prošetřeny odpovídajícím inzertem cDNA (metoda expresívní knihovny) nebo PCR fragmentem (metoda PCR vyšetření), čímž se získaly klony obsahující genomovou kopii kutinázových genů. Tyto geny byly sekvenovánv v obou směrech. Introny byly určeny sekvenováním odpovídající cDNA nebo srovnáním se sekvencemi dalších kutináz (Ettinger a kol., 1987). N-konec polypeptidu zralé kutinázy byl-rovněž vydedukován pomocí takového srovnání. S použitím stanďardn ích technik “ PCR by 1 x ‘ odstraněny introny, ~^sbylo - vytvořeno místo HindlII přímo po směru otevřených čtecích rámců a kódující sekvence pro presekvenci genu invertázv Saccaromyces cerevisiae (které předchází místo Sací, srovnejte s kazetou 8, obr. 3) byla sloučena se sekvencí kódující N-konec

- 50 zralých kutináz. Takto získané fragmenty SacI-HindlII obsah ují c í ku ti n ázové g e n v funk č n ě _ připoj ₌e_n é k s e k v e ne i ~ .

kódující presekvenci invertázy 5. cerevisiae byly ligo vány s 7,3kb fragmentem SacI-HindlII z pUR7241 (viz obr. 4) a přeneseny do kmene 5. cerevisiae označovaného SU51. Exprimované houbové kutinázy byly z kultury získány v podstatě způsobem popsaným v příkladu 5. '*

Příklad 9

Prací účinek kutinázy Fusarium solani pisi varianty N172K.

Účinek kutinázy varianty N172K při odstraňování mastnot byl porovnán s účinkem divokého typu kutinázy Fusarium solani pisi. V tomto testu byla použita látka-polvester znečištěná brómovaným olivovým olejem.

Množství mastnoty na testováných látkách bylo určeno pomocí rentgenové fluorescenční spektrometrie (viz výše).

Bylo zjištěno množství mastné nečistoty odstraněné enzymy, kterými byl divoký typ kutinázy Fusarium solani pisi (WT) a varianta N172K v dávkách 3 LU/ml v různých experimentálních podmínkách:

Odstranění nečistot v % - WT	Odstranění nečistot v % -N172K	Teplota v °C	Čisticí prostředek	Tvrdost vody (FH)
4,9	“ΓΟ,ΐ	40	A (1 g/1)	6
1,6 τη n	6,7	40	B (2 g/1)	6	-.1
20,2	24,0	-40	C (2 g/1)	27
13,2	13,4	40	B (1 g/1)	27

30,8	40,6	30	C (2 g/1)	27
17,4 “	22,4	’ 30	B (2 g/1)

Složení pracích prostředků A - C bylo následující Hodnoty jsou uváděny've váhových procentech.

Prostředek A

NaOH	2,6
voda	do 100%
Vvrobek C
složka	váhová procenta
coco-primární alkyl-sulfát	5,2
neiontové smáčedlo alkohol Cr-C 7 EO	,s 5,2
neiontové smáčedlo alkohol Cr-C 3 EO	15 6,6
silikát sodný	0,45
zeolit 4A	32,00
uhličitan sodný	11,52
tvrzené lojové mýdlo	2,00
Zvýšený prací účinek	tohoto enzymu vzhledem

divokému typu kutinázy Fusarium solani pisi (v odstraňování mastných nečistot) v různých podmínkách je prokazatelný. Obrázek 13 ukazuje prací účinek při různých koncentracích enzymu při použití prostředku C v množství 2 g/1 v 30timinutovém pracím cyklu při 30°C a tvrdosti vody 27°FH.

p_ro srovnaní by 1₀ provedeno několik s t ej ný ch pokusů s lipolázou (TM). Ve všech podmínkách byla kutinázová varianta NI 72K lepší. ____\ .

- 53 Příklad 12

Prací účinek kutinázy Fusarium solani pisi varianty E201K.

Účinek kutinázové varianty E201K při odstraňování mastných nečistot při různých koncentracích enzymů byl porovnáván s účinkem kutinázy divokého typu z Fusarium solani pisi s použitím pracího prostředku C v množství 2 g/1 (viz příklad 11) v třicetiminutovém pracím cyklu při teplotě 30°C a tvrdosti vody 27°FH. Účinek byl sledován na testované polyesterová látce znečištěné brómovaným olivovým olejem. Množství mastnoty na testovaných látkách bylo určeno změřením množství bromu na látce pomocí rentgenové fluorescenční spektrometrie (viz výše).

Výsledky těchto testů jsou uvedeny na obrázku 14. Zvýšení pracího účinku (projevující se odstraňováním mastných nečistot) vzhledem k divokému typu kutinázy Fusarium solani pisi je průkazné. Pro srovnáni byly provedeny stejné experimenty s lipolázou (TM). Výsledky ukázaly, že účinek kutinázové varianty E201K byl jasně vyšší.

Příklad 13

Prací účinek kutinázy Fusarium solani pisi varianty A85F.

Účinnost kutinázové varianty A85F při odstraňování mastných nečistot byla srovnána s účinností divokého typu kutinázy Fusarium solani pisi při použití pracího prostředku C f»· (viz příklad 11) ve 30ti minutovém pracím cyklu při teplotě

3O°C a tvrdosti vody 27°FH. Účinek byl sledován na ™polyesterové látce znečištěné hromovaným .olejem.,„Množství _J: mastné nečistoty na testovaných látkách bylo určeno podle množství bromu na testovaných látkách změřeného pomocí rentgenové fluorescenční spektrometrie (viz výše).

- 54 Výsledky jsou uvedeny na obr. 15. Je zde patrné zvýšení pracího účinku (odstraňování mastných nečistot) vzhledem k ^Ivokému^typu kutinázy- EusaKium^solam^pisi^ Pro - srovnání byly provedeny stejné pokusy s lipolázou (TM). Bylo zjištěno, že účinek kutinázové varianty A85F je výrazně vyšší.

Claims (26)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Varianta kutinázy od rodičovské kutinázy, vyznačující se t í m, ž e v ní byla změněna sekvence aminokyselin tak, aby se zvýšila hydrofobicita na povrchu tohoto enzymu.
2. 2. Varianta kutinázy podle nároku 1 vyznačující se t í m, ž e hydrofobicita na povrchu enzymu přiléhajícího ke kontaktní zóně lipidu byla zvýšena tak, aby se vytvořila větší lipidová kontaktní zóna.
3. 3. Varianta kutinázy podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že v ní byla zvýšena hydrofobicita nahrazením jednoho nebo více aminokyselinových zbytků zbytky aminokyselin vybraných ze skupiny obsahující valin, leucin, isoleucin, fenylalanin, tryptofan a methionin.
4. 4. Varianta kutinázy podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že v ní byla pozměněna sekvence aminokyselin tak, že kromě zvýšení hydrofobicity na jejím povrchu do ní byl zaveden jeden nebo více kladných nábojů.
5. 5. Varianta kutinázy podle nároku 4, vyznačující se tím, že do ní byly zavedeny kladné náboje začleněním____jednoho nebo _více__ lysinových _nebo arsininovvch zbvtků.

   ·»»· w r¹
6. 6. Varianta kutinázy podle kteréhokoli z předchozích nároků,

   - 56 vyznačující se tím, že aminokyselinový zbytek, který je v ní vyměněn, má m a I ý_ p o stranní řetěz e c a j e vět šinou výbránlFsícupiny obsahující alanin, serin nebo glycin.
7. 7. Varianta kutinázy podle kteréhok vyznačující se tím, že její eukaryotická kutináza.

   předchozích nároků, rodičovskou kutinázou je nlí

   W X A
8. 8. Varianta kutinázy podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že jejím rodičovským enzymem je kutináza, která je pozitivní v imunologické křížové reakci s protilátkami vypěstovanými proti kutináze z Fusarium solani pisi.
9. 9. Varianta kutinázy podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že jejím rodičovským enzymem je kutináza z Fusarium solani pisi.
10. 10. Varianta kutinázy podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že pozměněné aminokyselinové zbytky jsou umístěny v té části molekuly, která je definována vekterom, který je fítací nejmenších Čtverců procházejících Ccc-atomy zbytků 116 až 120 kutinázy Fusarium solani pisi nebo odpovídajících Ccc-atomů jiné kutinázy, a rovinou kolmou k_uyedenému vektoru-a- obsahující Ga-atom zbytku 117 nebo odpovídajících zbytků jiné kutinázy.

    TU^arian4a^_u,t4_ná_Zy^p_Od^ vyznačující se tím, že pozměněné aminokyselinové zbytky jsou umístěny v té části molekuly, která je umístěna

    - 57 mezi první rovinou kolmou k vektoru, který je fitací nejmenších čtverců procházejících Ca-atomy aminokyselinových zbytků 116 až 120 kutinázy z Fusarium solani pisi ve vzdálenosti 15 A od Ca-atomu zbyku 117, a druhou rovinou, která je paralelní k první uvedené rovině a obsahuje Ca-atom zbytku 117.
11. 12. Varianta kutinázy podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že pozměněné aminokyselinové zbytky jsou v ní umístěny v jedné nebo více následujících polohách sekvence aminokyselin kutinázy Fusarium solani pisi nebo v odpovídající poloze v jiné kutináze:

    17, 18, 19, 40, 42-46, 50, 53, 54, 58, 74, 75, 76, 78, 80-88, 91, 92, 93, 95, 96, 97, 99, 100, 119, 150-56, 158, 160, 168, 169, 170, 172, 173, 174, 176, 179, 180-190, 192, 193, 194, 196, 197, 198, 201.
12. 13. Varianta kutinázy podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že pozměněné aminokyselinové zbytky jsou v ní umístěny v jedné nebo více následujících polohách sekvence aminokyselin kutinázy Fusarium solani pisi nebo v odpovídajících polohách jiné kutinázy:

    19, 41, 45, 49, 54, 58, 75, 76, 82, 85, 92, 93, 99, 100, 127, 128, 172, 173, 179, 183, 184, 185, 189, 190, 194, 197, 201.
13. 14. Varianta kutinázy podle kteréhokoli z předchozích nároků, v >’ ^{z n a} č u j i c í set í m, ž e se v ní jedna nebo více následujících úprav projevila na sekvenci aminokyselin kutinázy z Fusarium solani pisi nebo na odpovídající poloze v jiné kutináze: T19V, G41A, T45K, T45P, *I49a, S54I, N5SR, G75R, A76P, G82A, D83S, A85F, A85V, S92R, A93V, L99K,

    - 58 G100R, A127L, A128F, N172K, T173I, T179F, I183F, V184I, _ ..^Α185Ε-^Ε1 89F, A190L, D194R, G197V, E201K.
14. 15. Varianta kutinázy podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se t í m, ž e se v ní následující úpravv projevily na sekvenci aminokyselin kutinázy Fusarium solani pisi nebo na odpovídajících pozicích v jiné kutináze. Jedná se o následující modifikace: A85F, N172K, E201K.
15. 16. Výrobní postup pro variantu kutinázy podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky fermentativní kultivace mikroorganismu upraveného rDNA a obsahujícího gen vytvořený technikami rDNA kódující variantu kutinázy, dále přípravu varianty kutinázy separací kutinázové varianty vyprodukované tímto mikroorganismem buď z kultivačního bujónu, nebo separací buněk mikroorganismu z kultivačního bujónu, rozrušením těchto separovaných buněk a zahuštěním nebo částečnou purifikací kutinázy buď z řečeného bujónu nebo z daných buněk fyzikálními nebo chemickými zahušťovacími nebo purifikačními metodami.
16. 17. Mikroorganismus upravený rDNA, vyznačující se t í m, ž e byl transformován vektorem rDNA nesoucím gen ____________kAďujícL variantu.. kutinázy.-_p_odle_ kteréhokoli z předchozích nároků od 1 do 15 a který je tudíž schopen exprimovat danou variantu kutinázy.
17. 18. Mikroorganismus upravený rDNA podle nároku 17 vyznačující se tím, že nese gen kódující variantu kutinázy,

    - 59 který byl do mikroorganismu vpraven fúzí na jeho 5'- konci s fragmentem genu kódujícího (modifikovanou) funkční presekvenci jako signální nebo sekreční sekvenci pro hostitelský organismus.
18. 19. Mikroorganismus upravený rDNA podle nároku 17 nebo 18, vyznačující se tím, že hostitelským organismem je eukaryot, jako například kvasinky rodu Saccharomyces nebo Kluyveromyces nebo rod Hansenula nebo houby rodu Aspergillus.

    fem* _r
19. 20. Mikroorganismus upravený rDNA podle kteréhokoli nároku .« od 17 do 19, v y z n a č u j í c i se tím, že nese vektor « rekombinantní DNA kódující variantu kutinázv podle kteréhokoli nároku od 1 do 15, přičemž uvedený organismus je vytvořený jako auxotrofní mutant náhradou genu kódujícího ~ auxotrofní rozpoznávací znak v některé buňce jeho rodičovské linie.

    ·%
20. 21. Polynukleotid, vyznačující se tím, že má sekvenci baží kódujících variantu kutinázy podle kteréhokoli nároku od 1 do 15 nebo její funkční ekvivalent či mutaci a v tomto polynukleotidu je za posledním překládaným kodonem terminační kodon a může zde být přítomna sekvence nukleotidů kódující presekvenci této kutinázy přímo proti směru exprese od sekvence nukleotidu kódujících zralý enzym.
21. 22. Polynukleotid, vyznačující se t í m, ž e má sekvencí baží kódujících variantu kutinázy podle kteréhokoli z nároků od 1 do 15 a v tomto polynukleotidu je za posledním

    - 60 překládaným kodonem terminační kodon a může zde být přítomna sekvence nukleotidů kódující alespoň část od po ví d aj í c í p r es e k ve n c é 'a /ne b o ' s i g ňá I n í^; ne b o ’ ’s e kr éč n í sekvenci vhodnou pro zvolený hostitelský organismus přímo proti směru exprese od nukleotidové sekvence kódující zralý enzym.
22. 23. Polynukleotid, vyznačující se tím, že má sekvenci baží kódující variantu zralé kutinázy podle kteréhokoli nároku od 1 do 15 nebo její funkční ekvivalent či mutaci, tento polynukleotid obsahuje sekvenci nukleotidů odvozenou od původního organismu kódující variantu kutinázy, která byla upravena takovým způsobem, že alespoň jeden kodon, většinou však co nejvíce možných kodonů, podléhá tiché mutaci, kterou vznikají kodony kódující ekvivalent aminokyselinových zbytků a které jsou preferovány novým hostitelem, jak bylo uvedeno v nárocích 17 a 20, čímž umožňuje v buňkách takových hostitelů využití mediátorové RNA pro zavedený gen o zvýšené stabilitě.
23. 24. Polynukleotid podle kteréhokoli z nároků 21 až 23, vyznačující se tím, že proti směru exprese od nukleotidové sekvence kódující variantu prokutinázy nebo zralé kutinázy je umístěna nukleotidová sekvence, která kóduje signální nebo sekreční sekvenci vhodnou pro hostitelský organismus podlé specifikace v kterémkoli nároku od 17 do 20.

    „
24. 25,._JZektor^re kombi n antní^DN A—v^z-n-a. č-u^-LcX- s-.e^kLnij. ž e je schopný řídit expresi sekvence nukleotidů genu

    - 61 kódujícího variantu kutinázy a obsahuje následující komponenty:

    (a) Dvouvláknovou (ds) DNA kódující variantu zralé kutinázy nebo prekutinázy nebo odpovídající prekutinázv, ve které byla alespoň část této presekvence po směru exprese od sekrečního signálu (upřednostňovaného hostitelským organismem) odstraněna, za toho předpokladu, že jestliže ta část genu, která by se měla překládat, nezačíná kodonem ATG, se ATG kodon umístí na začátek, a rovněž za předpokladu, že část genu, která se má překládat, končí vhodným terminačním kodonem nebo tam byl takový kodon přidán.

    (b) Expresívní regulon (vhodný pro zvolený hostitelský organismus) umístěný proti směru exprese na pozitivním řetězci dvouvláknové DNA kódující variantu kutinázy (složka (a)).

    (c) Terminační sekvenci (vhodnou pro zvolený hostitelský organismus) umístěnou po směru exprese na kladném řetězci dvouvláknové DNA kódující variantu kutinázy (složka (a)).

    (dl) Nukleotidovou sekvenci, která zprostředkovává integraci této ds DNA do genomu vybraného hostitele nebo (d2) počátek replikace vhodný pro zvoleného hostitele, (el) volitelně (auxotrofní) selekční signální znak, (e2) volitelně sekvenci ds DNA kódující protein účastnící se zrání a/nebo sekrece jedné z prekurzových forem varianty kutinázy ve zvoleném hostiteli.
25. 26. Vektor rekombinantní DNA podle nároku 25, j í c í s e t í m, ž e rovněž nese proti nebo po směru exprese od výše specifikovaného polynukleotidu další sekvence zprostředkovávající funkční expresi kutinázy.

    - 62 7. Vektor rekombinantni DNA podle kteréhokoli nároku yL y ^z n a č u_j i c_í s e, ,t, i m, ž^e . _? nese,.auxotrofni signální znak skládající se z kódující oblasti auxotrofního znaku a z oblasti defektního promotoru.
26. 28. Enzymatický prací prostředek, vyznačující se tím, ž e obsahuje variantu kutinázy podle kteréhokoli nároku od 1 do 15.