SK712000A3 - Induction of male sterility in plants by expression of high levels of avidin - Google Patents

Description

Vynález opisuje spôsob riadenia plodnosti rastlín s použitím molekúl DNA, ktoré kódujú avidín. Vynález zvlášť opisuje spôsoby produkcie transgénnych rastlín, ktoré vykazujú samčiu sterilitu a exprimujú avidín. Vynález opisuje spôsoby obnovenia samčej plodnosti u potomstva rastlín vykazujúcich samčiu sterilitu. Vynález ďalej opisuje spôsoby produkcie hybridných semien, zvlášť hybridných semien s jedným alebo viacerými charakteristickými znakmi s použitím rastlín, ktoré exprimujú avidín.

Doterajší stav techniky

Riadenie peľovej plodnosti je pri produkcii hybridných plodín podstatné. Opisuje sa napríklad v publikácii J. M. Poehlman, Breeding fíeld crops, 3-rd ed. (Van Nostrand and Reinhold, New York, NY, 1987). Pri produkcii hybridnej kukurice riadenie peľovej fertility v typickom prípade sprevádza fyzické odstránenie samčieho kvetenstva alebo odstránenie tyčiniek skôr než dôjde k rozprášeniu peľu. Mechanické odstraňovanie tyčiniek je menej prácne v porovnaní s manuálnym odstraňovaním. Je menej spoľahlivé a vyžaduje následné testovanie plodiny. Bežne sa používa manuálne odstránenie. Oba spôsoby spôsobujú stratu výťažku samičieho rodiča.

Najzaujímavejšie poľnohospodárske plodiny majú však samičie aj samčie orgány na jednom kvete, preto emaskulácia nie je jednoduchá. Zatiaľ čo je možné pred rozptylom peľu odstrániť ručne orgány, kde sa tvorí peľ, táto forma hybridnej produkcie je veľmi-prácna a finančne náročná.

Peľovú plodnosť je možné tiež riadiť aplikáciou spreja, ktorý má gametocídne vlastnosti. Opisuje sa napríklad v publikácii Cross et al., Ser. Plánt Reprod. 7: 235 (1991). Napríklad aplikácia etrelu na prašníky vedie k ďalšej peľovej mitóze u pšenice, k degenerácii tapetálnych buniek u jačmeňa a k malformácii alebo aborcii peľu u Eragrostis. Opisuje sa napríklad v publikácii Bennet et al., Náture 240: 566 (1972), Colhoun et al., Plánt Celí Environ. 6: 21 (1983); Berthe et al., Crop. Sci. 18: 35: (1978). Chemický prístup je však tiež veľmi prácny a nesie potenciálne problémy s toxicitou použitých chemikálií, ktoré sa dostanú do okolitého prostredia. Tento prístup je veľmi citlivý na správne načasovanie aplikácie.

Naviac komerčná produkcia hybridného semena použitím gametocídov je veľmi obmedzená nákladmi a dostupnosťou chemikálií, rovnako ako vhodnosťou a dĺžkou pôsobenia aplikácie. Použitie gametocídov vážne obmedzujú ich fytotoxické účinky. Intenzita týchto účinkov závisí od genotypu rastliny. K ďalšiemu obmedzeniu vedú skutočnosti, že chemikálie nie sú účinné v prípade plodín s dlhým obdobím kvetenstva pretože novo vzniknuté kvety nemusia byť touto chemikáliou ovplyvnené. Preto je nutné aplikáciu opakovať.

Rad súčasných bežne dostupných produkčných systémov hybridných semien vhodných na produkciu plodín na poli sa spolieha na genetické spôsoby riadenia opelenia. Rastliny, ktoré sa používajú ako samičie rastliny, buď nie sú dostatočné v rozptyle peľu, produkujú peľ, ktorý nie je schopný biochemický umožniť samooplodnenie, alebo sú nedostatočné v produkcii peľu. Rastliny, ktoré nie sú schopné sa samé oplodniť sa nazývajú „samo-inkompatibilné,,. Problémy spojené s použitím samo-inkompatibilného systému zahrnujú dostupnosť a množenie samo-inkompatibilnej samičej línie. V niektorých prípadoch sa samoinkompatibilita obchádza chemickou cestou alebo nezrelé púčiky sa opelia ručne skôr než sa aktivuje biochemický mechanizmus, ktorý blokuje peľ. Samoinkompatibilné systémy, ktoré sa môžu deaktivovať, sú často veľmi citlivé k stresujúcim klimatickým podmienkam alebo znižujú účinnosť biochemického blokovania samoopelenia.

Širšiemu záujmu z hľadiska komerčne dostupnej produkcie semien sa tešia systémy založené na genetickej kontrole peľu, ktoré spôsobujú samčiu sterilitu. Tieto systémy sa delia do dvoch základných typov: (1) jadrová samčia sterilita, kde nedochádza k tvorbe peľu vzhľadom k mutácii v jednom alebo viac jadroJ výcli génoch alebo (2) cytoplazmatická genetická samčia sterilita, ktorá sa bežne nazýva „cytoplazmatická samčia sterilita,, (CMS), kde je blokovaná alebo prerušená tvorba peľu, pretože dôjde ku zmenám v cytoplazmatickej organele, ktorou sú obvykle mitochondrie.

Jadrová sterilita môže byť buď dominantná alebo recesívna. V typickom prípade sa dominantná sterilita môže použiť iba v prípade tvorby hybridných semien, ak je možné vegetatívne alebo klonálne pomnoženie samičej línie. Recesívna sterilita sa môže použiť, ak je možné ľahko rozlíšiť sterilné a plodné rastliny. Komerčná využiteľnosť systémov dominantnej a recesívnej sterility je však obmedzená finančnými nákladmi na klonálne množenie, resp. hrubnutím samičej línie samooplodňujúcich sa rastlín.

Aj keď existujú hybridizačné schémy zahrnujúce použitie CMS, ich komerčné využitie je obmedzené. Jedným príkladom systému CMS je špecifická mutácia v mitochondriách, ktoré sa nachádzajú v cytoplazme, čo môže viesť v správnom jadrovom pozadí k zlyhaniu tvorby zrelého peľu. V niektorých prípadoch jadrové pozadie môže kompenzovať cytoplazmatickú mutáciu a dochádza v

k normálnej tvorbe peľu. Špecifické jadrové „obnovovacie gény,, umožňujú tvorbu peľu v rastlinách s mitochondriami CMS. Vo všeobecnom prípade použitia CMS pri komerčnej produkcii semien zahrnuje použitie troch Šľachtiacich línií: línie vykazujúcej samčiu sterilitu (samičí rodič), udržovacej línie, ktorá je izogénna s líniou vykazujúcou samčiu sterilitu, ale obsahuje plne funkčné mitochondrie, a samčej rodičovskej línie. Samčia rodičovská línia môže alebo nemusí niesť v cytoplazme špecifické obnovovacie gény.

U plodín, ako je zelenina, kde získanie semena z hybridu nemá význam, je možné použiť systém CMS, bez nutnosti obnovenia tvorby peľu. V prípade plodín, kde plody alebo semena sú komerčným produktom, sa musí u samčieho rodiča obnoviť plodnosť hybridného semena špecifickými obnovovacími génmi alebo hybrid vykazujúci samčiu sterilitu sa musí opeliť. Opelenie neobnovených hybridov sa môže dosiahnuť tým, že zahrnujú malé percento samčích plodných rastlín, ktoré spôsobujú opelenie. Vo väčšine druhov je rys CMS dedičný po samičom rodičovi, pretože všetky cytoplazmatické organely sa obvykle dedia iba z bunky vajíčka.

Systém CMS má obmedzenia, ktoré môžu zabrániť jeho použitiu ako jedinej metódy na produkciu rastlín vykazujúcich samčiu sterilitu. Napríklad jeden určitý typ CMS v kukurici (T-cytoplazma) prepožičiava citlivosť na toxín produkovaný infekciou určitou pliesňou. Aj keď sa systémy CMS doposiaľ používajú v prípade radu plodín, môžu byť zničené za určitých podmienok prostredia.

Je preto zrejmé, že spôsoby riadenia produkcie peľu iným spôsobom, ako sú manuálne, mechanické, chemické a tradičné genetické metódy sú veľmi potrebné.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je spôsob produkcie rastlín vykazujúcich samčiu sterilitu, ktorá sa dosiahne heterogénnou expresiou avidínu.

Ďalej je predmetom vynálezu chimérický gén obsahujúci sekvenciu DNA, ktorá kóduje avidín, ktorá je operatívne spojená so sekvenciou rastlinného promótora.

Predmetom vynálezu je taktiež spôsob zrušenia samčej sterility vyvolanej expresiou avidínu.

Ďalej sú predmetom vynálezu spôsoby produkcie semien s jedným alebo viacerými charakteristickými znakmi.

Tieto a ďalšie predmety vynálezu možno dosiahnuť v súlade s jedným uskutočnením vynálezu tým, že sa izolovaná molekub DNA obsahujúca'nukleotiďovú sekvenciu kódujúcu avidin operatívne spojí so sekvenciou rastlinného promótora. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu je izolovaná sekvencia DNA obsiahnutá v expresívnom vektore. V inom preferovanom uskutočnení vynálezu je sekvencia rastlinného promótora konštitutívny promótor a v inom preferovanom uskutočnení vynálezu je konštitutívny promótor promótor ubikvitínu. V inom preferovanom uskutočnení vynálezu je gén avidínu operatívne spojený s exportnou signálnou sekvenciou.

V súlade s iným uskutočnením vynálezu sa pripravuje transgénna rastlina, ktorá obsahuje heterogénnu nukleotidovú sekvenciu obsahujúcu gén avidínu, pričom heterogénna nukleotidová sekvencia zvyšuje koncentráciu avidínu v tkanivách rastliny, čo spôsobuje samčiu sterilitu. V preferovaných uskutočneniach vynálezu je transgénnou rastlinou kukurica, sója, kanola alebo slnečnica. V inom uskutočnení vynálezu heterogénna molekula DNA ďalej obsahuje sekvenciu konštitutívneho promótora, ktorá je v preferovanom uskutočnení vynálezu sekvenciou promótora ubikvitínu. V inom preferovanom uskutočnení vynálezu molekula heterológnej DNA ďalej obsahuje tkanivovo špecifický promótor. Zvlášť preferovaným tkanivovo špecifickým promótorom je promótor špecifický pre prašník.

v

Ďalej je predmetom vynálezu spôsob produkcie transgénnej rastliny vykazujúcej samčiu sterilitu, pri ktorom sa do rastlinných buniek zavádza expresívny vektor obsahujúci promótor a gén avidínu, pričom promótor kontroluje expresiu génu avidínu a kde expresia génu avidínu spôsobuje samčiu sterilitu. V preferovanom uskutočnení vynálezu sa transgénna rastlina regeneruje z rastlinných buniek. V inom preferovanom uskutočnení vynálezu promótor obsahuje ubikvitínový promótor, tkanivovo špecifický promótor alebo indukovateľný promótor.

Vynález ďalej opisuje spôsob použitia génu avidínu za účelom produkcie hybridnej rastliny vykazujúcej samčiu sterilitu, ktorý zahrnuje produkciu prvej rodičovskej rastliny vykazujúcej samčiu sterilitu obsahujúcej vyššie v texte opísanú molekulu DNA, kde expresia avidínu spôsobuje samčiu sterilitu. Ďalej zahrnuje produkciu druhej transgénnej rodičovskej rastliny exprimujúcej druhý cudzorodý gén a kríženie prvého rodiča s druhým rodičom za vzniku hybridnej rastliny, ktorá exprimuje druhý cudzorodý gén a v ktorej produkt druhého cudzorodého génu redukuje expresiu avidínu v hybridnej rastline, pričom vzniká hybridná rastlina vykazujúca samčiu fertilitu.

V preferovanom uskutočnení vynálezu sa druhý cudzorodý gén vybral zo skupiny zahrnujúcej antimediátorový gén, ribozýmový gén a gén externej sprievodnej sekvencie. V inom preferovanom uskutočnení vynálezu antimediátorový gén obsahuje sekvencie mRNA avidinu, ktoré v ďalšom preferovanom uskutočnení sú riadené indukovateľným promótorom. V inom preferovanom uskutočnení vynálezu ribozýmový gén obsahuje sekvencie mRNA avidinu. V ďalšom preferovanom uskutočnení vynálezu gén externej sprievodnej sekvencie obsahuje sekvencie mRNA avidinu. V ďalšom preferovanom uskutočnení vynálezu molekula DNA prvej rodičovskej rastliny ďalej obsahuje operátor LexA, ktorý je operatívne spojený s uvedeným promótorom, kde druhým cudzorodým génom je represorový gén LexA. V inom preferovanom uskutočnení je promótorová sekvencia promótorovou sekvenciou špecifickou pre prašník obsahujúcou prašníkový box vybraný zo skupiny zahrnujúcej nukleotidovú sekvenciu SEQ ID NO: 4, nukleotidovú sekvenciu SEQ ID NO: 5, nukleotidovú sekvenciu SEQ ID NO: 6 a ich funkčné fragmenty.

V ďalšom preferovanom uskutočnení vynálezu prašníkový box vykazuje nukleotidovú sekvenciu SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 alebo SEQ ID NO: 6 a promótor špecifický pre prašník ďalej obsahuje jadrový promótor vybraný zo skupiny zahrnujúcej CaMV35S, nukleotidovú sekvenciu SEQ ID NO: 7, nukleotidovú sekvenciu SEQ ID NO: 8, nukleotidovú sekvenciu SEQ ID NO: 9 a ich funkčné fragmenty.

Vynález ďalej opisuje spôsob obnovenia plodnosti u rastlín vykazujúcich samčiu sterilitu expresiou avidinu, zahrnujúci aplikácie roztoku biotínu vo forme spreja na rastliny.

Vynález opisuje spôsob produkcie semien, ktoré vykazujú jednu alebo viac zaujímavých charakteristík. V preferovanom uskutočnení vynálezu prvá rodičovská rastlina, ktorá vykazuje samčiu sterilitu a nesie jednu alebo viac kópií génu avidinu, sa kríži ako samičia rastlina s druhou rodičovskou rastlinou, ktorá vykazuje samčiu plodnosť a nesie jednu alebo viac zaujímavých charakteristík semena. Produkované semená vykazujú charakteristiky samčieho rodiča. V preferovanom uskutočnení vynálezu rodičovskou rastlinou je kukurica, sója,

Ί kanola alebo slnečnica. V inom preferovanom uskutočnení vynálezu gén avidínu je gén streptavidínu.

I. Definície

V opise, ktorý nasleduje sa často používa rad termínov. Nasledujú definície, ktoré umožňujú porozumieť vynálezu.

Termín „štruktúrny gén,, je sekvencia DNA, ktorá sa prepisuje na informačnú RNA (mRNA), ktorá sa potom prekladá na aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je charakteristická pre špecifický polypeptid.

Termín „cudzorodý gén,, znamená sekvenciu DNA, ktorá je operatívne spojená s aspoň jedným heterogénnym regulačným elementom. Napríklad ľubovoľný iný gén nezje kukuričný štrukturálny gén 5126 sa považuje za cudzorodý gén, ak expresiu uvedeného génu riadi regulačný element špecifický pre prašník génu 5126.

Termín „promótor,, znamená sekvenciu DNA, ktorá riadi prepis génu, ako je štrukturálny gén, antimediátorový gén, ribozýmový gén alebo gén externej sprievodnej sekvencie. V typickom prípade sa promótor nachádza v 5'oblasti génu blízko miesta počiatku transkripcie. Ak promótorom je indukovateľný promótor potom rýchlosť transkripcie sa zvyšuje ako odozva na indukčné činidlo. Naopak rýchlosť transkripcie nie je regulovaná indukčným činidlom, ak promótor je konštitutívny. Rastlinný promótor je promótorová sekvencia, ktorá bude riadiť expresiu génu v rastlinnom tkanive.

„Jadrový promótor,, obsahuje nukleotidové sekvencie podstatné pre funkciu promótora, ktoré zahrnujú TATA box a počiatok transkripcie. Podľa tejto definície jadrový promótor môže alebo nemusí vykazovať detegovateľnú aktivitu za neprítomnosti špecifických sekvencii, ktoré môžu zosilniť aktivitu alebo prepožičať tkanivovo špecifickú aktivitu. Jadrový promótor SGB6 je napríklad tvorený asi 38 nukleotidmi v smere 5‘ od miesta počiatku transkripcie génu SGB6, s

zatiaľ čo jadrový promótor vírusu karfiolovej mozaiky (CaMV35S) je tvorený Βει 33 nukleotidmi v smere 5‘ od miesta počiatku transkripcie genómu 35S.

„Tkanivovo špecifický promótor,, je sekvencia DNA, ktorá v prípade, že je operatívne spojená s génom, riadi silnejšiu transkripciu uvedeného génu v špecifickom tkanive v porovnaní s niektorým alebo so všetkými ostatnými tkanivami v organizme. Napríklad promótor špecifický pre prašník je sekvencia DNA, ktorá riadi silnejšiu transkripciu asociovaného génu v rastlinnom tkanive prašníka. Promótor SGB6 špecifický pre prašník môže napríklad riadiť expresiu cudzorodého génu v tkanive prašníka, ale nie v tkanive koreňov alebo v koleoptilnom tkanive.

Termín „promótor špecifický pre prašník,, zahrnuje dva funkčné elementy: „prašníkový box,, a jadrový promótor. Konkrétny prašníkový box môže vykazovať funkčné charakteristiky klasického zosilňovača. Kombinácia prašníkového boxu a jadrového promótora môže stimulovať expresiu génu do vyššieho rozsahu než samotný jadrový promótor. To platí aj v prípade chimérického promótora špecifického pre prašník obsahujúceho prašníkový box a jadrový promótor odvodené z rôznych génov. Také chimérické regulačné promótory špecifické pre prašník sa opisujú ďalej v texte.

„Operátor,, je sekvencia DNA, ktorá sa nachádza v géne smerom k 5‘ a ktorá obsahuje nukleotidovú sekvenciu, ktorú rozoznáva a na ktorú sa viaže represorový proteín. Väzba represorového proteínu s rozpoznaným operátorom vedie k inhibicii transkripcie génu. Napríklad gén LexA kóduje represorový protein, ktorý sa viaže na operátor LexA.

„Izolovaná molekula DNA,, je fragment DNA, ktorý sa oddelil z DNA organizmu. Napríklad klonovaná molekula DNA kódujúca gén avidínu je izolovaná '-molekula DNA. Iným príkladom izolovanej molekuly DNA je chemicky syntetizovaná molekula DNA alebo enzymaticky produkovaná cDNA, ktorá nie je začlenená do genómovej DNA organizmu.

„Zosilňovač,, je regulačný element DNA, ktorý môže zvýšiť účinnosť transkripcie.

Termín „komplementárna DNA (cDNA),, znamená molekulu jednoreťazcovej DNA, ktorá sa vytvorila z templátovej mRNA enzýmovou reverznou transkripciou. V typickom prípade sa pri iniciácii reverznej transkripcie používa primér komplementárny s časťami mRNA. Odborníci tiež používajú termín „cDNA,,, čo znamená molekulu dvojreťazcovej DNA obsahujúcu uvedenú molekulu jednoreťazcovej DNA a jej komplementárny reťazec DNA.

Termín „expresia,, znamená biosyntézu génového produktu. Napríklad v prípade štrukturálneho génu expresia zahrnuje transkripciu štrukturálneho génu na mRNA a transláciu mRNA na jeden alebo viac polypeptidov.

„Klonovací vektor,, je molekula DNA, ako je plazmid, kozmid alebo bakteriofág, ktorý má schopnosť sa samostatne replikovať v hostiteľských bunkách. Klonovacie vektory v typickom prípade obsahujú jedno alebo malý počet rozpoznávacích miest reštrikčných endonukleáz, do ktorých možno začleniť cudzorodú sekvenciu DNA tak, aby sa dala stanoviť, bez toho, že dôjde ku strate podstatnej biologickej funkcie vektora. Do uvedených miest sa dá tiež začleniť markerový gén, ktorý je vhodný na použitie pri identifikácii a selekcii buniek transformovaných klonovacím vektorom. Markerové gény v typickom prípade zahrnujú gény, ktoré poskytujú rezistenciu na tetracyklín alebo ampicilín.

„Expresívny vektor,, je molekula DNa obsahujúca gén, ktorý sa exprimuje v hostiteľskej bunke. V typickom prípade expresiu génu riadia isté regulačné elementy, ktoré zahrnujú konštitutívny alebo indukovateľný promótor, tkanivovo špecifické elementy a zosilňovače. Usudzuje sa, že taký gén je „operatívne spojený,, s regulačnými elementárni.

„Rekombinantný hostiteľ,, môže byť ľubovoľná prokaryontná alebo eukaryontná bunka, ktorá obsahuje buď klonovací vektor alebo expresívny vektor. Tento termín tiež; zahrnuje tie prokaryontné a eukaryontné bunk-y, ktoré sú geneticky upravené, aby obsahovali v chromozóme alebo v genóme hostiteľskej bunky klonovaný gén(y).

„Transgénna rastlina,, je rastlina vykazujúca jednu alebo viac rastlinných buniek, ktoré obsahujú cudzorodý gén.

U eukaryontov RNA polymeráza II katalyzuje transkripciu štrukturálneho génu za vzniku mRNA. Molekula DNA sa môže navrhnúť tak, aby obsahovala templát RNA polymerázy II, v ktorej transkript RNA má sekvenciu, ktorá je komplementárna so sekvenciou špecifickej RNA. Transkript RNA sa nazýva antimediátorová RNA a sekvencia DNA, ktorá kóduje antimediátorovú RNA, sa označuje ako antimediátorový gén. Molekula antimediátorovej RNA je schopná sa viazať na molekulu mRNA, čo vedie k inhibícii translácie mRNA.

„Ribozým,, je molekula RNA, ktorá obsahuje katalytické centrum. Termín zahrnuje RNA enzýmy, RNA upravené samo-zostrihom a samo-štiepené RNA. Sekvencia DNA, ktorá kóduje ribozým sa nazýva ribozýmový gén.

„Externá sprievodná sekvencia,, je molekula RNA, ktorá smeruje endogénny ribozým, RNázu P., na určitý typ intracelulárnej mRNA, čo vedie ku štiepeniu mRNA RNázou P. Sekvencia DNA, ktorá kóduje externú sprievodnú sekvenciu, sa nazýva gén externej sprievodnej sekvencie.

„Charakteristika zrna alebo semena,, je nutričná alebo fyziologická charakteristika semena, prednostne riadená dominantným génom, ktorá podstatne ovplyvňuje priemyselný typ. Charakteristiky zrna alebo semena zahrnujú obsah oleja, proteinu alebo škrobu a kvalitu proteinu a typ škrobu.

Termín „jednoduché kríženie,, znamená kríženie medzi dvoma inbrednými líniami.

Termín „dvojité kríženie,, znamená kríženie medzi dvoma jednoduchými kríženiami.

Termín „trojcestné kríženie,, označuje potomstvo kríženia medzi jednoduchým krížením a inbrednou líniou.

„Hybrid„-je prvá generácia potomkov kríženia medzi dvoma jednotlivcami, ktoré sa líšia jedným alebo viacerými génmi.

„Inbredná,, línia je čistá línia, ktorá obvykle vzniká samoopelením a selek ciou.

„Syntetická línia,, je zmes kmeňov, klonov, inbredov alebo ich vzájomných hybridov, ktorá sa udržuje voľným opelením po špecifický počet generácii. Komponentové jednotky sa v pravidelných intervaloch pomnožia a synteticky rekonštruujú.

Termín „schopnosť špecifického kombinovania,, znamená charakteristiku špecifického kombinovania genetických kmeňov pri krížení vo vzťahu k priemernej účinnosti všetkých kombinácií.

Termín „opeľovač,, znamená rodičovskú rastlinu vykazujúcu samčiu plodnosť, ktorá je donorom peľu pre samičiu rodičovskú rastlinu, ktorá vykazuje samčiu sterilitu. Rastlina opeľovač môže mať akékoľvek z mnohých genetických pozadí, a preto môže byť inbrednou líniou, hybridom, syntetickou voľne opeľovanou líniou alebo genetickou materskou rastlinou. Touto rastlinou môže byť transgénna línia. Rastlina opeľovač môže vykazovať jednu alebo viac žiaducich charakteristík semena alebo zrna.

2. Prehľad

Vynález opisuje spôsoby vytvorenia rastlín vykazujúcich samčiu sterilitu tým, že sa pripravia transgénne rastliny, ktoré exprimujú avidín. Avidín sa môže exprimovať konštitutívne, spôsobom, ktorý nie je tkanivovo špecifický alebo sa môže exprimovať spôsobom, ktorý je špecifický pre prašník. Vynález ďalej opisuje spôsoby obnovenia plodnosti.

Vynález sa týka spôsobu produkcie hybridných semien, ktoré vykazujú jednu alebo viac charakteristík zrna alebo semena. V preferovanom uskutočnení vynálezu sa prvý hybrid, ktorý vykazuje samčiu sterilitu a nesie jednu alebo viac kópií génu avidínu, kríži ako samičí radič s druhým hybridom. Druhý hybridvykazuje samčiu plodnosť a jednu alebo viac charakteristík zrna alebo semena. Produkované hybridné semena vykazujú jednu alebo viac charakteristík zrna alebo semena samčej rodičovskej rastliny.

Izoloval sa gén avidínu a začlenil sa do expresívneho vektora vhodného na zavedenie do rastlinného tkaniva. Expresívny vektor ďalej obsahuje promótor, ktorým môže byť konštitutívny promótor, ktorý nie je tkanivovo špecifický, ako je promótor ubikvitínu, tkanivovo špecifický promótor, ako je promótor špecifický pre prašník alebo indukovateľný promótor. Expresívny vektor môže obsahovať exportnú signálovú sekvenciu. Silná expresia génového produktu, ktorý sa akumuluje v cytoplazme môže viesť k toxicite vzhľadom k rastlinnej bunke.

Odstránením génového produktu z cytoplazmy tak môže dôjsť k obmedzeniu bunkovej toxicity. Rastlinné gény a ich exportné signálne sekvencie sú v odbore dobre známe (opisuje sa v publikácii Jones and Robinson, Tansley Review 17: 567-597 (1989). Expresívny vektor sa zaviedol do rastlinného tkaniva s použitím štandardných metód a vybrali sa a pomnožili sa transgénne rastliny. Transgénne rastliny exprimujúce avidín vykazujú samčiu sterilitu. Samčiu plodnosť je možné obnoviť, keď sa v transgénnej rastline súčasne exprimuje druhý gén, ktorý inhibuje transkripciu génu avidínu alebo inhibuje transláciu mRNA avidínu. Podľa uvedeného uskutočnenia vynálezu sa dočasná supresia génu avidínu dosiahne, ak sa supresorový gén operatívne spoji s indukovateľným promótorom. V inom prípade sa samčia plodnosť obnoví, keď sa vyvíjajúce sa rastliny postriekajú roztokom biotínu.

3. Izolácia molekúl DNA, ktoré kódujú avidín

Nukleotidové sekvencie kódujúce avidín sa môžu izolovať s použitím metód dobre známych v odbore. Napríklad nukleotidová sekvencia génu streptavidínu je dobre známa. Opisuje sa v publikácii Argarana et al., Nucleic Acids Res., 14(4): 1871-1882 (1986). V inom prípade cDNA kódujúca avidín bielka kuracieho vajíčka sa môže izolovať z-cDNA'-knižnice kuracích vajcovodov spôsobmi, ktoré sa opisujú v publikácii Gope et al., Nucleic Acid. Res. 15: 3595 (1987).

Genómové klony génu avidínu je možné získať z genómovej DNA organizmu, o ktorom je známe, že produkuje avidín. Avidínový gén kurčaťa sa môže napríklad klonovať z kuracej genómovej DNA spôsobmi opísanými v publikácii Keinanen et al., Eur. J. Biochem. 220: 616 (1994).

Avidínové gény je tiež možné izolovať s použitím polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) s použitím štandardných metód, ktoré sa opisujú v publikácii Erlich, PCR Technology: Principles and applications for DNA amplification (Stockton Press, NY, 1989 a Innis et al., PCR Protocols: A guide to methods and applications (Academic Press, San Diego, 1990). Spôsoby amplifikácie PCR dlhých nukleotidových sekvencii, ako je systém ELONGASE^1M (Life Technologies, Inc. Gathersburg, MD), sa môžu tiež použiť pri získaní dlhších nukleotidových sekvencii, ako sú genómové klony kódujúce avidín. Priméry PCR, ktoré sú komplementárne s 5' a 3'koncami známych sekvencii génu avidínu, sa môžu syntetizovať s použitím komerčných oligonukleotidových syntetizérov, ako sú tie, ktoré produkuje firma Applied Biosystems (Foster City, CA). V preferovanom uskutočnení vynálezu priméry zahrnujú ďalšie nukleotidové sekvencie obsahujúce miesta, ktoré štiepia reštrikčné endonukleázy. Prítomnosť takých miest umožňuje riadené klonovanie produktov PCR do vhodných klonovacích vektorov po ošetrení vhodným reštrikčným enzýmom; opisuje sa v publikácii Finney, „Molecular Cloning of PCR Products,, v Current protocols in molecular biology, Ausubel et al., Eds. (John Wiley and Sons, New York, 1987) str.

25.7.1.

Templátovou DNA pre PCR môže byť buď cDNA alebo genómová DNA a môže sa pripravovať z vhodného organizmu s použitím metód dobre známych v odbore (opisuje sa v publikácii Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd. Ed. (1989), Cold Spring Harbor, New York.). Genómová DNA sa môže pripraviť priamo z vtáčieho tkaniva, tkaniva plazov alebo z tkaniva obojživelníkov s použitím bežne dostupných činidiel, ako je Triazol™ (Life Technológies, Inc. Gaithersburg, MD). V inom prípade cDNA kódujúca avidín sa môže pripraviť s použitím mRNA extrahovanej z tkaniva kuracích vajcovodov s použitím komerčne dostupného kitu (Pharmacia, Piscataway, NJ). Pripravená mRNA sa použije ako templát pre syntézu cDNA s použitím poly(dT) alebo náhodných hexamérových primérov pomocou štandardných metód, čo sa opisuje v publikácii Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd. Ed. (1989), Cold Spring Harbor, New York. Syntéza cDNA potom prebieha s použitím bežne dostupného kitu (Pharmacia) a je možné ju použiť priamo pre PCR s použitím spôsobu opísaného v publikácii Saiki et al., Science 239: 487 (1988).

Fragmenty genómovej DNA alebo cDNA izolovanej metódami opísanými vyššie v texte sa začlenili do vektora, ako je bakteriofág alebo kozmid, v súlade s bežnými metódami, ako je použitie štiepenia reštrikčnými enzýmami, pričom vznikajú vhodné konce, alebo sa môže použiť alkalická fosfatáza, aby sa predišlo nežiaducemu spojeniu molekúl DNA, a ligácia vhodnými ligázami. Metódy úpravy takých vektorov sa opisujú v publikácii Ausubel et al., (eds.), Current protocols in molecular biology, str. 3.0.5-3.17.5 (1990).

V inom prípade nukleotidové sekvencie kódujúce avidín sa môžu získať syntézou molekúl DNA kódujúcich avidín s použitím začleňujúcich sa dlhých oligonukleotidov (opisuje sa v publikácií Ausubel et al., (eds.), Current protocols in molecular biology, str. 8.2.3 až 8.2.13 a Wosnick et al., Gene 60: 115 (1987)). Súčasné metódy využívajúce polymerázovú reťazovú reakciu poskytujú schopnosť syntetizovať gény s veľkosťou až 1,8 kb (opisuje sa v publikácii Adang et al.. Plánt Molec. Biol. 21: 1131 (1993); Bambot et al., PCR Methods and Applications 2: 266 (1993)). Nukleotidová sekvencia syntetizovaného génu avidínu môže byť založená na ľubovoľnej molekule DNA kódujúcej avidín (opisuje sa napríklad v publikácii Gope et al., Nucleic Acid. Res. 15: 3595 (1987).

Tieto klony sa môžu analyzovať s použitím rôznych štandardných metód, ako je reštrikčná analýza, Southernova analýza, analýza extenzií priméru a analýza DNA sekvencie. Analýza extenzie priméru alebo analýza ochranou nukleázou SI sa môže napríklad použiť pri lokalizácii predpokladaného miesta počiatku transkripcie klonovaného génu (opisuje sa v publikácii Ausubel et al., (eds.), . Current protocols in molecular biology, str. 4.8.1-4.8.5 (1990), Walmsley et al., „Quantitative and Qualitative Analysis of Exogenous Gene Expression by SI Nuclease Protection Assay,, in Methods in Molecular Biology, vol. 7: Gene transfer and expression protocols, Murray (ed.) str. 271-281 (Humana Press Inc.

1991). Tieto a príbuzné metódy sú dobre známe v odbore a používajú sa pri izolácii iných žiaducich génov a pri ich klonovaní a expresii.

4. Klonovanie génu avidínu do expresívneho vektora a príprava transgénnej rastliny

Po tom, čo sa izoloval gén avidínu, začlenil sa do expresívneho vektora s použitím štandardných metód (opisuje sa v publikácii Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^d. Ed. (1989), Cold Spring Harbor, New York.). Výber vhodného expresívneho vektora bude závisieť od spôsobu zavedenia vektora do hostiteľských buniek. V typickom prípade expresívny vektor obsahuje: (1) prokaryontné elementy DNA kódujúce bakteriálny počiatok replikácie a gén rezistencie na antibiotiká, aby došlo k rastu a k selekcii expresívneho vektora v bakteriálnom hostiteľovi, (2) klonovacie miesto na začlenenie exogénnej sekvencie DNA, napríklad génu avidínu, (3) elementy eukaryontnej DNA, ktoré riadia iniciáciu transkripcie exogénneho génu, ako je promótor, (4) elementy DNA, ktoré riadia spracovanie transkriptov, ako je transkripčná terminačná/polyadenylačná sekvencia a (5) gén kódujúci markerový proteín (napr. reportný gén), kde gén je operatívne spojený s elementárni DNA, ktoré riadia iniciáciu transkripcie. Expresívny vektor môže ďalej obsahovať sekvenciu DNA kódujúcu exportnú signálnu sekvenciu operatívne spojenú s exogénnou sekvenciou DNA. Všeobecne sa rastlinné expresívne vektory a reportné gény opisujú v publikácii Gruber et al., „Vectors for Plánt Transformation,,, in Methods in Plánt Molecular Biology and Biotechnology, Glick et al. (eds.) p. 89-111 (CRC Press, 1993).

V preferovanom uskutočnení vynálezu sa používa systém rastlinného ubikvitinového promótora. Rastlinné ubikvitínové promótory sú v odbore známe. Opisujú sa napríklad v dokumente prihlášky európskeho patentu č. 0 342 92. Ubikvitínový promótor je konštitutívny promótor.

V inom preferovanom uskutočnení vynálezu sa používa indukovateľný promótor, čo umožňuje indukovateľnú reguláciu expresie avidínu. Príkladom ta kého indukovateľného promótora je systém gIutatión-5-transferázy u kukurice, opisuje sa v publikácii Wiegand et al.. Plánt. Mol. Biol. 7: 235 (1986). Táto metóda tiež umožňuje reverzibilnú indukciu samčej sterility. Tak expresia avidínu a sprievodná samčia sterilita sa môže riadiť aktiváciou promótora. V prípade, že promótor nie je aktivovaný, nie je exprimovaný avidín a rastliny vykazujú samčiu fertilitu.

Expresia môže zahrnovať selektovateľný alebo vyhľadávateľný marker. Mnohé z bežne používaných pozitívnych selektovateľných markerových génov vhodných pre rastlinnú transformáciu boli izolované z baktérii a kódujú enzýmy, ktoré metabolický odstraňujú toxicitu selektívneho chemického činidla, ktorým môže byť antibiotikum alebo herbicíd. Iné pozitívne selektívne markerové gény kódujú zmenený cieľ, ktorý nie je citlivý voči inhibítoru.

Bežne používaným selektovateľným markerovým génom pri transformácii rastlín je gén fosfotransferáza neomycínu II (nptll), izolovaný z Tn8, ktorý, ak je umiestnený pod kontrolu rastlinných regulačných signálov, prepožičiava rezistenciu na kanamycín; Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 4803 (1983). Iný bežne používaný selekčný marker je gén fosfotransferázy hygromycínu, ktorý dodáva rezistenciu na antibiotikum hygromycín; Vanden Elzen et al., Plánt Mol. Biol. 5: 299 (1985)). Ďalšími pozitívnymi selektovateľnými markerovými génmi bakteriálneho pôvodu, ktoré dodávajú rezistenciu na antibiotiká, sú acetyltransferáza gentamycínu, fosfotransferáza streptomycínu, aminoglykozid3*-adenyltransferáza a determinant rezistencie na bleomycín; Hayford et al., Plánt Physiol. 86: 1216 (1988), Jones et al., Mol. Gen. Genet. 210: 86 (1987), Svab et al., Plánt Mol. Biol. 14: 197 (1990), Hille et al., Plánt Mol. Biol. 7: 171 (1986).

Ďalšie pozitívne selekčné markerové gény pre transformáciu rastlín nie sú bakteriálneho pôvodu. TÍeto gény zahrnujú myšiu dihydrofolátovú reduktázu, rastlinnú syntázu 5‘-enolpyruvylšikimát-3-fosfátu a rastlinnú syntázu acetolaktátu; Eichhelz et al., Somatic Celí Mol. Genet. 13: 67 (1987), Shah et al., Science 233: 478 (1986), Charest et al., Plánt Celí Rep. 8: 643 (1990).

Iné bežné selektovateľné markerové gény pre rastliny nesú rezistenciu na herbicidne inhibitory syntázy glutaminu. V dokumentoch prihláška európskeho patentu č. 0 333 033 (Kumada et al.) a US patent č. 4,975,374 (Goodman et al.) sa opisujú nukleotidové sekvencie génov syntázy glutaminu, ktoré dodávajú rezistenciu na herbicídy, ako je L-fosfinotricín. Nukleotidová sekvencia génu fosfinotricínacetyltransferázy sa uvádza v dokumente prihláška európskeho patentu č. 0 242 246 (Leamans et al.). V publikácii De Greef et al., Bio/Technology 1: 61 (1985) sa opisuje produkcia transgénnych rastlín, ktoré exprimujú chimérické gény bar kódujúce aktivitu fosfinotricínacetyltransferázy.

Ďalšia skupina markerových génov pre transformáciu rastlín vyžaduje vyhľadávanie potenciálne transformovaných rastlinných buniek miesto priamej genetickej selekcie transformovaných buniek na rezistenciu k toxickej látke, ako je antibiotikum. Tieto gény sú zvlášť vhodné pri kvantifikácii alebo vizualizácii priestorového profilu expresie génu v špecifických tkanivách a často sa nazývajú repórtnými génmi, pretože môžu fúzovať s génom alebo s génovou regulačnou sekvenciou pri skúmaní génovej expresie.

Bežne používané gény na vyhľadávanie potenciálne transformovaných buniek zahrnujú β-glukuronidázu (GUS), β-galaktozidázu, luciferázu a acetyltransferázu chloramfenikolu (opisuje sa v publikácii Jefferson, Plánt. Mol. Biol. Rep. 5: 387 (1987), Teeri et al., EMBO J. 8: 343 (1989), Koncz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 131 (1987), De Block et al., EMBO J. 3: 1681 (1984). Iným génu, ktorý kóduje dominantný konštitutívny regulátor dráhy antomycínovej pigmentácie Zea Mays, čo sa opisuje v publikácii Ludwig et al., Science 247: 449 (1990).

Expresívne vektory môžu obsahovať gén avidinu operatívne spojený so - sekvenciou DNA, ktorá kóduje peptidovú exportnú signálnu sekvenciu; opisuje sa v publikácii Hones and Robinson Vektor je pripravený tak, že signálna sekvencia sa fúzuje s N-koncom proteínovej sekvencie avidinu, čo umožňuje pri normálnom bunkovom spracovaní presné štiepenie molekuly proteínu za vzniku zrelého aktívneho avidinu. Vo zvlášť preferovanom uskutočnení vynálezu sa ako signálna sekvencia používa signálna sekvencia alfa-amylázy jačmeňa (opisuje sa v publikácii Rogers et al., J. Biol. Chem. 260: 3731-3738 (1985)).

Expresívne vektory obsahujúce gén avidínu sa môžu zaviesť do protoplastov alebo do intaktných tkanív, ako sú nezrelé embryá a meristémy alebo do kultúr kalusu alebo do izolovaných buniek. Uprednostňuje sa, aby sa expresívne vektory zaviedli do intaktných tkanív. Všeobecné metódy kultivácie rastlinných tkanív sa opisujú napríklad v publikácii Miki et al., „Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants,,, in Methods in plánt molecular biology and biotechnology, Glick et al., (eds.), str. 67-88 (CRC Press, 1993) a Phillips et al., „Cell/Tissue Culture and In Vitro Manipulation,, in Corn and Corn improvement, 3^rd Edition, Sprague et al., (eds.) p. 345-387 (Američan Society of Agronomy, Inc et al., 1988).

Metódy zavádzania expresívnych vektorov do rastlinných tkanív zahrnujú priamu infekciu alebo spoločnú kultiváciu rastlinného tkaniva s mikroorganizmom Agrobacterium tumefaciens. (opisuje sa v publikácii Horsch et al., Science 227: 1299 (1985)). Prednostne sa ako vektor pre cudzorodé sekvencie DNA používa odstrojený Ti-plazmid. Transformácia sa môže uskutočniť s použitím postupov opísaných napríklad v prihláške európskeho patentu č. 116 718 (1984) a 270 822 (1988). Preferované vektory Ti-plazmidu obsahujú cudzorodú sekvenciu DNA uloženú medzi hraničnými sekvenciami alebo aspoň umiestnenú proti smeru expresie od pravej hraničnej sekvencie.

Ďalšie typy vektorov môžu byť používané pri transformácii rastlinných buniek postupmi, ako je priamy transfer génu (opisuje sa napríklad v prihláške PCT WO 85/01856 a v prihláške európskeho patentu č. 275 069), in vitro transformácia protoplastov (opisuje sa napríklad v US patente č. 4,684,611), transformácia sprostredkovaná rastlinnými vírusmi (opisuje sa napríklad - v prihláške európskeho patentu č. 067 553 a-US patentu č. 4,407,956) a transformácia sprostredkovaná lipozómami (opisuje sa napríklad v US patente č. 4,536,475). Vhodné metódy pri transformácii kukurice sa opisujú v publikácii Fromm et al., Bio/Technology 8: 833 (1990) a Gordon-Kamm et al., The Plánt Celí 2: 603 (1990). Štandardné metódy vhodné na transformáciu ryže sa opisujú v publikácii Christou et al., Trends in Bioteclinology 10: 239 (1992) a Lee et al., Proc. Naťl.Acad. Sci USA 88: 6389 (1991). Pšenicu je možné transformovať s použitím metód, ktoré sú podobné postupom transformácie kukurice a ryže. Ďalej v publikácii Casas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1 1212 (1993) sa opisuje spôsob transformácie ciroku, zatiaľ čo v publikácii Wan et al., Plánt Physiol. 104: 37 (1994) sa opisuje spôsob transformácie jačmeňa.

Vo všeobecnom prípade sa preferujú metódy priamej transformácie jednoklíčnych rastlín, zvlášť obilnín, ako je ryža, kukurica, cirok, jačmeň a pšenica. Vhodné metódy priameho prenosu zahrnujú zavedenie sprostredkované mikroprojektilmi, DNA je možné zaviesť injekciou, elektroporáciou a podobne (opisuje sa napríklad v publikácii Gruber et al., „Vectors for Plánt Transformation,„ in Methods in Plánt Molecular Bioiogy and Biotechnology, Glick et al. (eds.) p. 89-111 (CRC Press, 1993), Miki et al., Miki et al., „Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants,,, in Methods in plánt molecular bioiogy and biotechnology, Glick et al., (eds.), str. 67-88 (CRC Press), 1993), Klein et al., Bio/Technology 10: 268 (1992). Viac sa uprednostňuje, keď sa expresívne vektory zavedú do tkanív jednoklíčnej rastliny s použitím mikroprojektilov.

5. Regulácia samčej plodnosti

A. Produkcia rastlín vykazujúcich samčiu sterilitu

S cieľom vyvolať samčiu sterilitu v súlade s vynálezom sa skonštruuje expresívny vektor, v ktorom sekvencia DNA kódujúca avidín je operatívne spojená so sekvenciami DNA, ktoré regulujú transkripciu génu v rastlinnom tkanive. Všeobecné požiadavky, ktoré musia spĺňať expresívne vektory, sú formulované vyššie v texte. Na dosiahnutie samčej sterility expresiou avidínu sa preferuje, aby avidín nebol exprimovaný iba dočasným spôsobom, ale aby- bol expresívny vektor zavedený do rastlinného embryonálneho tkaniva takým spôsobom, že bude avidín exprimovaný v neskoršom štádiu vývoja v dospelej rastline. Mitotickú stabilitu možno napríklad dosiahnuť s použitím rastlinných vírusových vektorov, ktoré sa replikujú epichromozomálne

Preferovaným spôsobom získania mitotickej stability je integrácia sekvencii expresívneho vektora do hostiteľského chromozómu. Takú mitotickú stabilitu možno dosiahnuť zavedením expresívneho vektora do rastlinného tkaniva mikroprojektilmi alebo použitím iných štandardných metód, ktoré sa opisujú vyššie v texte (Fromm et al., Bio/Technology 8' 833 (1990), Gordon-Kamm et al., The Plánt Celí 2: 603 (1990) a Walters et al., Plánt Molec Biol. 18: 189 (1992).

Transkripcia génu avidínu po zavedení do rastlinného tkaniva sa prednostne riadi konštitutívnym promótorom, ktorý nešpecifický stimuluje génovú expresiu v rastlinnom tkanive. Príkladom konštitutívneho promótora vhodného na tieto účely je ubikvitínový promótor, ako sa opisuje vyššie v texte.

Transkripcia génu avidínu sa môže tiež riadiť promótorom, ktorý stimuluje expresiu génu tkanivovo špecifickým spôsobom. Zvlášť preferovaným promótorom, ktorý je špecifický pre prašník, je promótor 5126, ktorý sa izoloval z kukuričnej inbrednej línie B73. Promótor 5126 stimuluje expresiu cudzorodého génu z prašníkov v kvartérnom štádiu jednojadrových mikrospór.

v

Ďalším vhodným promótorom, ktorý je špecifický pre prašník, je promótor SGB6, ktorý sa tiež izoluje z línie B73. Promótor SGB6 môže indukovať expresiu cudzorodého génu v tapetálnych bunkách prašníka od kvartérneho štádia do stredného jednojadrového štádia vývoja mikrospór.

V inom prípade expresia génu špecifického pre prašník sa môže uskutočniť s použitím kombinácie prašníkového boxu a jadrového promótora. Zvlášť preferovaným prašnikovým boxom je box 5126, ktorý obsahuje nasledujúcu nukleotidovú sekvenciu:

5' GCGGCCGCGG ATCCGCTCAT CTQCTCGGTA CCAACCAGCC CGCCGGCGCC TAGGCGAGTA GACGAGCCAT GGTTGGTCGG TTTCCTAŤTA CCÄTGCACAG ATCT _3' ~ [SEQ ID N0:4]’. AÄÄGGATAAŤ GGTACGTGTC TAGA

Iný vhodný prašnikový box je vo fragmente, ktorý obsahuje 94 báz a je definovaný nukleotidmi 583 až 490 proti smeru expresie génu od počiatočného miesta transkripcie SGB6. Nukleotidová sekvencia tvoriaca prašnikový box SGB6 obsahujúca 94 párov báz je:

(-58 3) ACAGTTCACT AGATATGCAT GATCTTTAAC AATTGCTGCT

TGTCAAGTGA TCTATACGTA CTAGAAATTG TTAACGACGA

GGATTGTGCG CTTTCTTTTG GCACAAATGG CATGAACAGA

CCTAACACGC CAAAGAÄAAC CGTGTTTACC GTACTTGTCT

GTAATCCGGG ACGG (-4 90) [SEQ 10 HO í 5]. CATTAGGCCC TGCG

V inom prípade vhodný prašnikový box sa získal z kukuričného promótora G9, ktorý stimuluje expresiu génu počas meiotického až kvartérneho štádia vývoja. Prašnikový box G9 obsahuje nasledujúcu nukleotidovú sekvenciu:

5' GCGGCCGCGG ATCCTGGCTG GATGAAACCG ATGCGAGAGA CGCCGGCĎCC taggaccgac CTACTTTGGC tacgctctct agääaaaäaa attgttgcat gtagttggcg gctgtcäccc τοτπτττττ taacaacgta catcaaccgc ggacagtggg

AACCAAACCA GTAGTTGAGG CACGCCCTGT TTGCTCACGA ttggtttggt catcaactcc gtgcgggaca AACGAGTGCT

TCACGAÄCGT AGATCT 3* AGTGCTTGCA TCTAGA [SEQ ID NO:C).

Prašnikové boxy 5126, SGB6 a G9 sa môžu získať syntézou oligonukleotidov, ako sa opisuje vyššie v texte. Odborníci môžu uskutočniť delečnú analýzu opísaného prašníkového boxu, aby sa lokalizovala jedna alebo viac ďalších regulačných sekvencii, ktoré sú špecifické pre prašník. Také „funkčné fragmenty,, prasnikovýčh boxov sa môžu tiež použiť_pri regulácii.expresie génu avidínu spôsobom, ktorý je špecifický pre prašník

Preferované jadrové promótory sa získali zjadrového promótora 5126, z jadrového promótora SGB6, zjadrového promótora G9 a zjadrového promótora vírusu karfiolovej mozaiky 35S.

Zvlášť preferovaným jadrovým promótorom je jadrový promótor 5126, ktorý obsahuje nasledujúcu nukleotidovú sekvenciu:

5' AGATCTAAGT AAGGTATATA TGTGCATAGT CTCCTAACTC TCTAGATTCA TTCCATATAT ACACGTATCA GAGGATTAAG

TTCATCTTCA ACCTCTAGCT GATTGATCTC TGGTATTTAC AAGTAGAAGT TGGAGATCGA CTAACTAGAG ACCATAAATG

CACTCTTTCC TTCCTTCCTT CCTTCAATTC TAAATACCAC GTGAGAAAGG AAGGAAGGAA GGÄAGTTAÄG ATTTATGGTG

AAATCAAAGT TGCTTTGCCA TG 3' [SEQ ID NO:?]. TTTAGTTTCA ÄCGAAACGGT AC

Jadrový promótor SGB6 obsahuje približne 38 nukleotidov proti smeru prepisu génu od počiatočného miesta transkripcie génu SGB6. Vhodný jadrový promótor SGB6 obsahuje nasledujúcu nukleotidovú sekvenciu:

5'

ATCTCACCCT ATTAATACCA TGCTGÄCGAG TAGAGTGGGA TAATTATGGT ÄCGACTGCTC

CCAATAGC 3' [SEC -D NO: 8].

GGTTATCG

Vhodný jadrový promótor získaný z génu G9 obsahuje nukleotidovú sek venciu :

5' AGATCTCTAT AAAACACGCA GGGACTGGAA AGCGAGATFT TCTAGAGATA TTTTGTGCGT CCCTGACCTT TCGCTCTAAA

CACAGCTGAA AGCAGCCAAA ACGCAGAAGC TGCACTGCAT GTGTCGACTT TCGTCGGTTT TGCGTCTTCG ACGTGACGTA

ACATCGAGCT'AACTATCTďC AGCCATG 3' [SEQ IĎ NO:9]~ TGTAGCTCGA TTGATAGACG TCGGTAC

Vhodnými jadrovými promótormi sú tiež funkčné fragmenty jadrových promótorov 5 126, SGB6 a G9. Metódy získania takých funkčných fragmentov sú uvedené vyššie v texte.

Okno vývoja expresie génu avidínu sa môže rozšíriť s použitím chimérového regulačného elementu, ktorý obsahuje prašníkový box z jedného génu a promótor z druhého génu, ktorý je špecifický pre prašník. Regulačné sekvencie SGB6 stimulujú expresiu génu z kvartérneho do stredno-jednojadrového štádia vývoja, zatiaľ čo regulačné sekvencie G9 stimulujú expresiu génu počas meiózy a kvartérneho štádia vývoja. Transkripcia cudzorodého génu počas meiózy a stredného jednojadrového štádia vývoja sa stimuluje kombináciou prašníkového boxu a promótora G9. Také rôzne kombinácie prašníkových boxov a promótorov špecifických pre prašník sú zvlášť vhodné na využitie podľa vynálezu.

Môže sa tiež použiť vírusový jadrový promótor. Príklady vhodných jadrových vírusových promótorov zahrnujú jadrový promótor karfiolového mozaikového vírusu (CaMV), jadrový promótor mozaikového vírusu krtičníka a podobne (opisuje sa v publikácii Gruper et al.,). Výhodný vírusový jadrový promótor je CaMV35S alebo jeho varianty.

Za účelom vybrať transformované bunky, expresívny vektor obsahuje selekčný markerový gén, ako je gén nesúci rezistenciu na herbicíd. Také gény napríklad nesú rezistenciu na fosfinotricín, glyfozát, sulfonylmočoviny, atrazín alebo imidazolinón. Uprednostňuje sa, aby selekčným markerovým génom bol gén bar alebo pat, ktorý kóduje acetyltransferázu fosfinotricínu. Nukleotidové sekvencie génov bar sa opisujú v dokumente prihláške Európskeho patentu č. 0 242 246 (Laemans et al., 1987), v publikácii White et al., Nucleic Acids Res. 18: 1062 (1990). V publikácii Wohllenben et al., Gene 70: 25 (1988) sa opisuje nukleotidová sekvencia génu pat. Expresia génu bar a pat umožňuje rezistenciu na herbicídy^ ako je glufozinát (predávaný ako Bašta® a Igňite®)a bialafos (predávaný ako Herbi-ace® a Liberty®).

Expresívny vektor môže obsahovať sekvencie DNA kódujúce avidín, ktoré riadi konštitutívny promótor alebo promótor špecifický pre prašník, rovnako ako selekčný markerový gén riadený konštitutívnym promótorom. V inom prípade selekčný markerový gén sa môže zaviesť do hostiteľských buniek v oddelenom selekčnom expresívnom vektore „ko-transformáciou„ embryonálneho tkaniva.

B. Obnovenie samčej plodnosti u hybridu F1

Vyššie opísané metódy sa môžu použiť pri produkcii transgénnych rastlín vykazujúcich samčiu sterilitu na produkciu hybridov F1 pomocou kríženia inbredných línií vo veľkom meradle. Ak všetky vaječné bunky transgénnych rastlín vykazujúcich samčiu sterilitu neobsahujú rekombinantný gén avidínu, potom časť hybridov F1 bude vykazovať fenotyp samčej plodnosti. Na druhej strane hybridy F1 budú vykazovať samčiu sterilitu, ak rekombinantný gén avidínu je prítomný vo všetkých vajíčkových bunkách transgénnych rastlín vykazujúcich samčiu sterilitu. Aby došlo k produkcii hybridov FI vykazujúcich samčiu fertilitu, môže byť nutné použiť systém obnovenia samčej plodnosti. Taký systém obnovenia samčej plodnosti je zvlášť výhodný u autogamných species, ak produkt, ktorý sa zberá je semeno.

Bežne používaný prístup, ako obnoviť plodnosť u línie transgénnych rastlín vykazujúcich samčiu neplodnosť, vyžaduje produkciu druhej línie transgénnych rastlín „línie obnovujúcej fertilitu,,. Transgénna rastlina, ktorá vykazuje samčiu sterilitu spôsobenú expresiou barnázy sa bude krížiť s rastlinou vykazujúcou samčiu plodnosť, ktorá exprimuje inhibítor barnázy, ako sa diskutuje vyššie v texte (opisuje sa v publikácii Mariani et al., Náture 157: 384 (1992).

V tomto prípade analogický prístup vyžaduje produkciu línie obnovujúcej fertilitu transgénnych rastlín, ktorá exprimuje ribozýmy cielené k mRNA avidínu alebo ktorá exprimuje antimediátorový avidín. Ribozýmy sa napríklad môžu navrhnúť tak, aby sa exprimovala endonukleázová aktivita, ktorá je riadená do istej cieľovej sekvencie v molekule mRNA. Napríklad v publikácii Stainecke et al., EMBO J. 1 1: 1525 (1992) sa dosiahlo až 100 % inhibície expresie génu fosfotransferázy neomycínu ribozýmami v protoplastoch rastliny tabaku. V publikácii

Farrizan et al., Antisense Res. And Devel. 3: 253, sa opisuje inhibícia aktivity acetyltransferázy chloramfenikolu u protoplastov rastliny tabaku s použitím vektora, ktorý je exprimovaný upraveným ribozýmom. V súlade s vynálezom mRNA avidinu poskytuje vhodnú cieľovú molekulu RNA pre ribozým.

S použitím podobného prístupu sa môže plodnosť obnoviť použitím expresívneho vektora obsahujúceho nukleotidovú sekvenciu, ktorá kóduje antimediátorovú RNA. Naviazanie molekúl antiinediátorovej RNA na cieľové molekuly mRNA vedie k hybridizačnému blokovaniu translácie (opisuje sa v publikácii Paterson et al., Porc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 4370 (1987). V súlade s vynálezom vhodná molekula antimediátorovej RNA bude mať sekvenciu, ktorá je komplementárna s molekulou mRNA. V preferovanom uskutočnení vynálezu antimediátorová RNA je riadená indukovateľným promótorom, ktorý umožňuje obnovenie samčej fertility.

Ďalej sa môžu skonštruovať expresívne vektory, v ktorých expresívny vektor kóduje transkripty RNA schopné vyvolať štiepenie molekúl RNA avidinu sprostredkované RNázou P. V súlade s týmto prístupom je možné skonštruovať externú sprievodnú sekvenciu, ktorá smeruje endogénny ribozým, RNázu P na mRNA avidinu, ktorá je následne štiepená bunkovým ribozýmom (opisuje sa v publikácii Altman et al., U.S. Patent č. 5,268,053, Yuan et al., Science 263: 1269 (1994). Externá sprievodná sekvencia výhodne zahrnuje 10 až 15 nukleotidov, ktoré sú komplementárne s mRNA avidinu, a 3'-NCCA nukleotidovú sekvenciu, kde N je výhodne purín. Transkripty externej sprievodnej sekvencie sa viažu na špecies cieľovej mRNA tým, že vytvoria páry báz medzi RNA a komplementárnymi externými sprievodnými sekvenciami, čo vyvolá štiepenie mRNA RNázou P v nukleotide, ktorý sa nachádza na 5'-strane oblasti párovaných báz.

V prípade alternatívnej metódy obnovenia samčej plodnosti transgénnej rastliny vykazujúcej samčiu sterilitu obsahujú rastliny expresívny vektor, ktorý vedľa promótorovej sekvencie operatívne spojenej s génom avidinu, tiež obsahuje prokaryontný regulačný element. Transgénne rastliny vykazujúce samčiu plodnosť sa produkujú tak, že exprimujú prokaryontný polypeptid. Táto expresia je riadená promótorom. V prípade hybridov F1 prokaryontný polypeptid viaže prokaryontnú regulačnú sekvenciu a potlačuje expresiu avidinu.

Systém gén LexA/operátor LexA sa môže použiť pri regulácii expresie génu podľa vynálezu (opisuje sa v dokumente US patent č. 4,833,080 a Wang et al.. Mol. Celí. Biol. 13: 1805 (1993)). Expresívny vektor rastliny vykazujúcej samčiu sterilitu bude obsahovať sekvenciu operátora LexA, zatiaľ čo expresívny vektor rastliny vykazujúcej samčiu fertilitu bude obsahovať sekvenciu kódujúcu represor LexA. V prípade hybridu F1 sa represor LexA bude viazať na sekvenciu operátora LexA a bude inhibovať transkripciu génu avidinu.

Molekuly DNA operátora LexA je možné získať napríklad syntézou fragmentov DNA, ktoré obsahujú známe sekvencie operátora LexA; viď napríklad US patent č. 4,833,080 a Garriga et al., Mol. Gen. Genet. 235: 125 (1992). Gén LexA sa môže získať syntézou molekuly DNA kódujúcej represor LexA. Postup syntézy génu sa diskutuje vyššie v texte a sekvencie génu LexA sa opisujú napríklad v publikácii Garriga et al., Mol. Gen. Genet. 235: 125 (1992). V inom prípade sa môžu molekuly DNA kódujúce represor LexA získať z plazmidu pRB500 z inštitúcie Američan Type Culture Collection, č. uloženia 67758.

Odborníci môžu ľahko nájsť iné stratégie obnovenia samčej fertility s použitím prokaryontných regulačných systémov, ako je systém lac represor/lac operón alebo systém trp xvpxzsorltrp operón.

Iné metóda obnovenia plodnosti využíva vysokú afinitu avidinu k biotínu na postrekovanie vyvíjajúcich sa rastlín roztokom biotínu. Roztok biotínu môže obsahovať minimálne množstvo pomocného organického rozpúšťadla, ako je DMSO, aby sa zaručilo úplné rozpustenie biotínu. Roztok biotínu však nemusí obsahovať žiadne ďalšie organické rozpúšťadlo. Postrek môže byť zahájený už v meiotickej fáze vývoja peľu. Môže však byť zahájený' aj neskôr počas vývoja peľu. Postrek sa obvykle opakuje v pravidelných intervaloch až do doby, kedy dôjde k rozprášeniu peľu. Intervaly medzi jednotlivými postrekmi sa pohybujú medzi 1 až 7 dňami. V preferovanom uskutočnení vynálezu sa postrek opakuje každých 3 až 5 dní.

6. Produkcia hybridných semien s požadovanými charakteristikami zrna

Hybridné semená s jednou alebo viacerými požadovanými charakteristikami zrna alebo semena sa môžu výhodne produkovať s použitím rastlinných línií vykazujúcich samčiu sterilitu podľa vynálezu. Transgénna línia nesúca gén avidínu sa kríži ako samičí rodič vykazujúci samčiu sterilitu s rastlinou opeľovačom, ktorá vykazuje samčiu plodnosť a nesie jeden alebo viac génov kódujúcich požadovanú charakteristiku zrna alebo semena. Rastlinná línia opeľovač vykazujúca samčiu plodnosť je prednostne v prípade génu(ov) riadiacich požadovanú charakteristiku zrna alebo semena homozygótna. Produkujú sa a zberajú sa hybridné semená, ktoré majú požadovanú charakteristiku zrna alebo semena. Spôsob produkcie hybridných semien, kedy rodič vykazujúci samčiu sterilitu sa kríži s opeľovacou líniou vykazujúcou samčiu plodnosť nesúcou jeden alebo viac génov kódujúcich požadované charakteristiky zrna alebo semena, sa niekedy nazýva metóda „top,, kríženia (opisuje sa napríklad v dokumente US patentu č. 5,196,636).

Línie vykazujúce samčiu sterilitu a plodnosť, ktoré sa krížia za vzniku hybridných semien podľa vynálezu, môžu byť ľubovoľnou kompatibilnou kombináciou hybridnej, inbrednej alebo syntetickej línie. Transgénne línie nesúce gén avidínu operatívne spojený s konštitutívnym alebo indukovateľným promótorom sa produkujú s použitím metód opísaných vyššie v texte. Línie vykazujúce samčiu sterilitu môžu niesť jednu alebo viac kópií génu avidínu.

Transgénne línie vykazujúce samčiu sterilitu, ktoré nesú gén avidínu sa môžu stať inbrednou líniou tým, že sa potlačí samčia sterilita ľubovoľnou z opísaných metód. Ribozýmy sa napríklad navrhnú tak, aby sa exprimovala endonukleázová aktivita, ktorá je cielená na istú sekvenciu v molekule RNA avidínu. Gén kódujúci ribozým je operatívne spojený s indukovateľným promótorom. Rastlina vykazujúca samčiu sterilitu sa ošetrí indukčným činidlom, exprimuje sa ribozým a deaktivuje sa mRNA avidínu, čo vedie k obnoveniu samčej plodnosti. V inom prípade sa plodnosť obnoví použitím nukleotidovej sekvencie, ktorá kóduje antimediátorovú RNA. Naviazanie molekúl antimediátorovej RNA na molekuly cieľovej mRNA vedie k hybridizačnému zablokovaniu translácie. V súlade s vynálezom vhodná molekula antimediátorovej RNA bude mať sekvenciu, ktorá je komplementárna s mRNA avidínu. V preferovanom uskutočnení vynálezu antimediátorová RNA sa riadi indukovateľným promótorom. Aktivácia tohto promótora potom umožňuje obnovenie samčej fertility

Pri ďalšom alternatívnom prístupe sa v línii vykazujúcej samčiu sterilitu produkujú transkripty RNA, ktoré sú schopné vyvolať štiepenie molekuly mRNA avidínu sprostredkované RNázou P. V súlade s týmto prístupom sa môže skonštruovať externá sprievodná sekvencia riadiaca endogénnu ribozým RNázu P. na mRNA avidínu, ktorá sa následne štiepi bunkovým ribozýmom. Transkripty externej sprievodnej sekvencie sa viažu na špécie cieľovej mRNA tým, že vytvoria páry báz medzi RNA a komplementárnymi externými sprievodnými sekvenciami, čo vyvolá štiepenie mRNA RNázou P. v nukleotide, ktorý sa nachádza na 5'strane oblasti párovaných báz.

V prípade ďalšieho prístupu obnovenia samčej plodnosti podľa vynálezu sa produkujú transgénne rastlinné línie vykazujúce samčiu sterilitu, ktoré obsahujú expresívny vektor, ktorý vedľa promótorovej sekvencie operatívne spojenej s génom avidínu, obsahuje tiež prokaryontný regulačný element. Vznikajú transgénne línie, ktoré obsahujú uvedený gén avidínu spolu s génom kódujúcim prokaryontný gén operatívne spojený s indukovateľným promótorom. Transgénna rastlinná línia sa ošetrí indukčným činidlom za vzniku prokaryontného polypeptidu, ktorý sa viaže na prokaryontnú regulačnú sekvenciu, čím sa potlačí expresia avidínu a obnoví sa samčia plodnosť.

Pri ďalšej metóde obnovenia plodnosti sa využíva vysoká afinita avidínu voči biotínu. Transgénne línie vykazujúce samčiu sterilitu sa postrekujú roztokom biotínu. Biotín sa viaže na avidín a deaktivuje ho, čím dochádza k obnoveniu samčej fertility. Postrek sa vykonáva na začiatku meiózy pri vývoji peľu, môže prebiehať aj neskôr. V~preferovanom uskutočnení vynálezu potlačenie samčej sterility sa dosahuje postrekom rastlín biotínom.

Opeľujúce línie vykazujúce samčiu sterilitu a samčiu fertilitu, ktoré sa používajú pri produkcii hybridných semien s požadovanou charakteristikou zrna a semena podľa metód v súlade s vynálezom, sú inbredné línie, hybridné línie, syntetické voľne opelené línie alebo genetická materská rastlina. Inbredné línie, hybridné línie, syntetické voľne opelené línie alebo genetická materská rastlina sa produkujú ľubovoľnými spôsobmi, ktoré sú dobre známe v odbore (opisujú sa v publikácii J. M. Poehlman, Breeding field crops, 3^rd ed. (Van Nostrand and Reinhold, New York, NY, 1987). Medzi vybranými inbrednými a/alebo hybridnými líniami sa uskutočňuje testovacie kríženie, aby sa vyhodnotila schopnosť špecifického kombinovania. Stanovujú sa komerčne prijateľné kombinácie.

Vybrala sa opeľovacia rastlinná línia vykazujúca samčiu plodnosť, ktorá (I) nesie jeden alebo viac génov s požadovanými charakteristikami zrna alebo semena a (2) je kompatibilná s líniou vykazujúcou samčiu sterilitu, s ktorou sa bude krížiť. Gén(y) riadiaci(e) vybranú charakteristiku zrna alebo semena môže(u) byť dominantný tak, že sa ľahko exprimuje v hybridných semenách. Avšak gén(y) riadiaci vybrané charakteristiky semien a zrna môže byť recesívny. V prípade, že gén(y) riadiaci charakteristiku zrna alebo semena môže byť recesívny, potom línia vykazujúca samčiu sterilitu a opeľovacia línia vykazujúca samčiu plodnosť sa krížia a vzniká rastlina, ktorá nesie tento charakter recesivity. V prípade, že gén(y) riadiaci charakteristiku zrna alebo semena sú recesívne potom obe línie vykazujúce samčiu sterilitu a opeľovač sú prednostne homozygótne v prípade uvedeného génu(ov) tak, že požadovaný fenotyp sa exprimuje vo všetkých semenách produkovaných krížením. Obdobne línie vykazujúce samčiu sterilitu a opeľujúce línie vykazujúce samčiu plodnosť môžu každá niesť gény, ktoré riadia charakteristiky zrna alebo semien v semenách potomstva. Gén(y) kódujúce charakteristiky zrna alebo semena sa zavedú do línie vykazujúcej samčiu sterilitu alebo do opeľujúcej línie vykazujúcej samčiu plodnosť tradičnými metódami šľachtenia a/alebo metódami genetického inžinierstva.

Požadovaná charakteristika zŕn alebo semien je nutričná alebo fyziologická charakteristika semena, ktorá podstatne ovplyvňuje priemyselný typ, klíčenie alebo rezistenciu voči rôznym ochoreniam. Požadovaná charakteristika zrna alebo semena zahrnuje také charakteristiky, ako je obsah oleja, proteínu a škrobu, rovnako ako kvalita proteínu a typ škrobu. Metódy podľa vynálezu sa používajú pri produkcii špeciálnych typov semien alebo zrna vhodných na obchodovanie na rôznych trhoch. Kukurica s vysokým obsahom oleja sa napríklad používa pri nahradení živočíšnych tukov, ktoré sa pridávajú do potravy chovných zvierat. Kukurica s vysokým obsahom amylózy sa používa pri výrobe lepidiel, degradovateľných plastových filmov a baliaceho materiálu. Škrob pochádzajúci z kukurice s vysokým obsahom vosku sa používa pri príprave mnohých rôznych potravín, ako sú polievky a pudingy.

Opeľujúca línia vykazujúca samčiu fertilitu môže niesť jeden alebo viac génov, ktoré ovplyvňujú charakteristiky týkajúce sa škrobu a proteínu. Gény, ktoré ovplyvňujú charakteristiky týkajúce sa škrobu a proteínu zahrnujú, ale nie sú obmedzené na cukornatosť (su), amylózový extender (ae), krehkosť (bť), matnosť (du), múčnatosť (//), opalescenciu (o), zrohovatelosť (Λ), scvrklosť (sh) a voskovatosť (wr) (opisuje sa napríklad v publikácii Hannah et al., Sci. Hortic. 55: 177-197 (1993)). Charakterizovali sa vlastnosti škrobu získaného z rastlín kukurice, ktoré sú homozygótne, recesívne v prípade génu ae, du, wx, ae a aewx (opisuje sa v publikácii Brockett et al., Starch/Starke 40: 175-177 (1988) a US patent č. 5,516,939.

V inom prípade opeľujúca línia sa môže transformovať génom, ktorý môže ovplyvňovať obsah Škrobu. Opeľujúca línia vykazujúca samčiu fertilitu sa môže transformovať bakteriálnym génom, ktorý kóduje pyrofosforylázu ADP-glukózy, ktorá je aktívna v prítomnosti metabolitov, ktoré inhibujú rastlinný enzým. Výsledné semená majú vyšší obsah škrobu (opisuje sa v publikácii Sivak et al., J. of Environ. Polymér Degradation 3(3): 145-152 (1995).

Opeľujúca línia môže niesť jeden alebo viac génov, ktoré ovplyvňujú obsah mastných kyselín. Gén fanl napríklad kontroluje v sóji nízky obsah linolénovej mastnej kyseliny (opisuje sa v publikácii Hammond et al., Crop Sci. 231: 192 _(l 993)). Gén fas kontroluje v sóji vysoký Obsah mastnej stearovej kyseliny (opisuje sa v publikácii Graef et al., Crop Sci. 25: 1076 (1985)). Gény fapl a fap2 riadia v sóji nízky, resp. vysoký obsah palmitovej kyseliny (Erickson et al., Crop Sci. 18: 544 (1988)).

Opeľujúca línia môže byť transformovaná génom, ktorý ovplyvňuje obsah oleja v semenách. Opeľujúca línia môže napríklad niesť gén kódujúci desaturázu stearoylacylového nosičového proteínu (stearoyl-ACP), ktorá katalyzuje prvý desaturačný krok pri biosyntéze semenného oleja. Gén stearoyl-ACP desaturázy môže byť operatívne spojený s promótorom špecifickým pre semená. Rastliny, ako je slnečnica, kukurica, kanola alebo sója, ktoré sú transformované génom stearoyl-ACP desaturázy, produkujú zmenené množstvo kyseliny stearovej a môžu sa použiť pri produkcii semenného oleja, ktorý obsahuje upravené alebo pozmenené množstvo nasýtených a nenasýtených mastných kyselín (opisuje sa napríklad v dokumente US patent č. 5,443,974).

V inom prípade opeľujúca línia môže niesť antimediátorový gén, ktorý inhibuje expresiu cieľového génu pri biosyntetickej dráhe charakteristiky zrna alebo semena. Opeľujúca línia napríklad nesie antimediátorový gén, ktorý inhibuje expresiu stearoylacylovej desaturázy. Antimediátorový gén môže byť operatívne spojený s promótorom, ktorý je špecifický pre semeno. Rastliny transformované antimediátorovým génom stearoyl-ACP desaturázy produkujú v semenách zvýšené množstvo stearátu (opisuje sa napríklad v publikácii Knutzon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2624-2628 (1992)).

Pomer rodičovských semien línie vykazujúcej samčiu sterilitu a opeľujúcej línie vykazujúcej samčiu fertilitu, kultivovaných na poli za účelom produkcie semien v súlade s metódou „top,, kríženia, závisí od génového vybavenia každej rodičovskej línie a kolíše za účelom optimalizácie výťažku. Pomer línie vykazujúcej samčiu sterilitu k opeľujúcej línii vykazujúcej samčiu fertilitu je približne v rozmedzí 6:1 až 9:1. Uprednostňuje sa, aby tento pomer bol približne 8:1. Viac sa uprednostňuje pomer 8:1.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok č. 1 zobrazuje plazmid PHI5168 kódujúci avidín, v ktorom kukuričný promótor ubikvitínu (zahrnujúci prvý exón plus prvý intrón) riadi expresiu exportnej signálnej sekvencie alfa-amylázy jačmeňa a oblasť kódujúcu avidín.

Obrázok č. 2 zobrazuje plazmid PHI610 kódujúci gén bar.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1: Príprava transgénnej rastliny kukurice vykazujúcej samčiu sterilitu silnou konštitutívnou expresiou avidínu.

Spôsob tvorenia transgénnych rastlín kukurice sa opisuje v dokumente prihlášky Európskeho patentu č. 0 442 174. Ďalej pokračuje opis metodiky.

PHIS168 je vektor nesúci gén avidínu, ktorý je riadený promótorom ubikvitínu a tiež obsahuje terminačnú sekvenciu PÍNII. Tento vektor sa použil pri príprave transgénnych rastlín kukurice. Štruktúra vektora PHI5168 sa uvádza na obrázku č. 1. PHI610, čo je expresívny vektor nesúci gén bar, ktorý riadi dvojitý promótor 35S, a tiež nesie terminačnú sekvenciu PÍNII, sa transformoval spolu s avidínovou konštrukciou, čo umožňuje selekciu transgénnych rastlín tým, že sa ošetria transformačnou zmesou s bialofos. Štruktúra PHI610 sa uvádza na obrázku č. 2. Dva expresívne vektory sa transformovali do embryogénnych suspenzných kultúr, ktoré sa získali z embryogénnej kultúry typu II podľa metódy opísanej v publikácii Green et al., Molecular Genetics of Plants and Animals, eds. Downey et al., Academic Press, NY, 20, 147 (1983). Kultúry sa udržovali v kultivačnom médiu Murashige and Skoog (,,MS„), ako sa opisuje v publikácii Murashige et al., Physio. Plánt 15: 453 (1962), doplnenom kyselinou

2,4-dichlórfenoxyoctovou (2,4-D) v koncentrácii 2 mg/1 a sacharózou v koncentrácii 30 g/l. Suspenzné kultúry prešli 7 dní pred experimentom sitom s veľkosťou pórov 710 mikrónov a fíltráty sa udržovali v kultivačnom médiu MS.

Bunky sa zberali zo suspenznej kultúry vákuovou filtráciou “prebiehajúcou s použitím Buchnerovho lievika (Whatman č. 614) a 100 ml (čerstvej hmotnosti) buniek sa umiestnilo na Petriho misku veľkosti 3,3 cm. Bunky sa dispergovali v čerstvom kultivačnom médiu s objemom 0,5 ml za vzniku tenkej vrstvy buniek. Nezakrytá Petriho miska sa umiestnila do komory pristroja na vystreľovanie *> η •K* častíc vyrobeného firmou Biolistics Inc. (Geneva, NY). Na zníženie tlaku v komore na hodnotu 10,13 kPa, za účelom zníženia decelerácie mikročastíc vzdušným trením sa použila vákuová pumpa. Bunky bombardované volfrámovými časticami majú priemernú hodnotu priemeru približne 1,2 mikrónu (GTE Sylvania Precision Materials Group, Tovanda, Pennsylvania). Rovnaké množstvá zmesi vektorov PHI5168 a PHI610 sa naniesli na mikročastice tým, že sa do 25 μΐ suspenzie 50 mg volfrámových častíc na jeden mililiter destilovanej vody v Ependorfovej skúmavke s objemom 1,5 ml pridalo 5 μΙ roztoku DNA (1 μg DNA na 100 lambda) v pufre TE pri pH 7,7. Partikuly tvoria agregáty a v skúmavke sa usadzujú na dne.

Kultúry transformovaných rastlinných buniek obsahujúce cudzorodé gény sa kultivovali počas 4 až 8 týždňov v kultivačno.m médiu 560R (kultivačné médium založené na N6 obsahujúce 1 mg/ml bialafosu). Toto médium je selekčné médium pre bunky, ktoré exprimujú gén bar.

Tvorba embryí sa potom indukovala v embryogénnych kultúrach a bunky klíčia za vzniku rastlín. Na klíčenie somatických embryí pozorovaných na udržovacom médiu pre kalus sa použili dve kultivačné médiá. Kalus sa najskôr preniesol na kultivačné médium (maturačné médium) obsahujúce 5,0 mg/1 kyseliny indoloctovej (IAA) na dobu 10 až 14 dní, zatiaľ čo pokračovala proliferácia kalusu. Kalus sa naniesol v množstve 50 mg na jednu platňu, aby sa optimalizoval zisk na jednu jednotku hmotnosti materiálu.

Kalus sa potom preniesol z maturačného média na druhé kultivačné médium, ktoré obsahuje obmedzené množstvo IAA (1 mg/ml) v porovnaní s prvým kultivačným médiom. Kultúry sa umiestia v tomto okamihu na svetlo. Klíčiace somatické embryá sa charakterizovali predlžovaním zelených výhonkov, čo je spojené s vývojom koreňov. Somatické embryá sa potom preniesli na médium do kultivačnej skúmavky (150 x. 25 mm) na ďalších 10 až 14 dní. V tomto čase rastliny dosahujú výšku 7 až 10 cm a sú dostatočne veľké a otužilé, aby sa mohli preniesť do skleníka.

S cieľom otužiť regenerované rastliny sa rastliny preniesli, vybrali zo sterilných nádob a z koreňov sa opláchlo stuhnuté agarové médium. Rastlinky sa umiestnili do bežných kvetináčov v rastovej komore so zariadením na rozprašovanie hmly, aby sa udržala relatívna vlhkosť blízko 100 %, bez toho, aby došlo k nadmernému zmáčaniu koreňov rastlín. Po 3 až 4 týždňoch v zahmlievanej komore boli rastliny dostatočne silné, aby sa mohli preniesť na pole.

Rastliny na poli sa analyzovali pozorovaním samčej sterility. U vybraných rastlín sa potom ďalej skúmala prítomnosť génu avidínu pomocou PCR a Southernovho blotovania a expresia avidínu testom ELISA s použitím štandardných metód.

rastlín sa analyzovalo pomocou PCR. Zistilo sa, že 53 z nich je plodných a 41 je sterilných. Keď sa porovnala plodnosť každej rastliny s prítomnosťou génu pre avidín, ktorý sa zistil pomocou PCR, dosiahla sa 98 % korelácia medzi prítomnosťou génu a sterilitou rastliny. U 5 rastlín sa detailnejšie zisťovala prítomnosť génu avidínu Southernovým blotovaním. Southernova analýza ukázala, že tri rastliny obsahujú gén avidínu. Všetky tieto tri rastliny vykazujú sterilitu. Dve rastliny, ktoré nemajú gén avidínu boli úplne plodné. Existuje 100 % korelácia medzi prítomnosťou génu avidínu a samčou sterilitou.

Príklad 2: Použitie kmeňov Agrobacterium obsahujúcich binárny vektor zahrnujúci sekvenciu DNA kódujúcu avidín, pričom vznikajú transgénne rastliny sóje vykazujúce samčiu sterilitu

Spôsob tvorenia transgénnych rastlín sóje sa opisuje v dokumente v prihláške US patentu č. 07/920,409. Semeno sóje (Glycine max) odrody Pioneer 9341 sa povrchovo sterilizovalo tak, že-sa vystavilo pôsobeniu plynného chlóru, ktorý sa vyvíjal v sklenenej nádobe. Plyn vzniká pridaním 3,5 ml kyseliny chlorovodíkovej (34 až 37 % hmotn.) ku 100 ml chlórnanu sodného (5,25 % hmotn.) Expozícia trvá 16 až 20 hodín v nádobách s objemom približne I kubickej stopy. Povrchovo sterilizované semeno sa uchováva v Petriho miske pri teplote miestnosti. Semeno klíči tak, že sa umiestni na 1/10 riedené agarové pevné médium podľa Gambourga (B5 základné médium s minimálnym množstvom organických látok, Sigma katalóg. Č. G5893, O,32g/I sacharózy, 0,2 % (hmotn./objem) 2-(N-morfolino)-etánsulfónová kyselina (MES) (3,0 mM)), bez použitia regulátorov rastu a kultivácia prebieha pri teplote 28 °C, dĺžka dňa je 16 hodín, používa sa chladné biele fluorescenčné osvetlenie s intenzitou približne 20 pEm'²S'’. Po 3 alebo 4 dňoch sú semená pripravené na spoločnú kultiváciu. Odstránil sa poťah semien. Koreňové predĺženie sa odrezalo 3 až 4 mm pod klíčnymi lístkami.

Kultúry mikroorganizmu Agrobacterium tumefaciens, kmeň LBA4404, ktoré sa kultivujú cez noc a nesú upravený binárny plazmid obsahujúci gén avidínu, sa kultivovali do dosiahnutia logaritmickej fázy v minimálnom kultivačnom médiu A, ktoré obsahuje tetracyklín v koncentrácii 1 pg/ml. Tieto kultúry sa spojili a zisťovala sa hodnota optickej hustoty pri vlnovej dĺžke 550 nm. Dostatočný objem kultúry sa umiestnil do 15 kónických centrifugačných skúmaviek s objemom 15 ml tak, že sa po sedimentácii v každej skúmavke získalo približne 1 až 2 x 1O¹⁰ buniek s koncentráciou 10⁹ buniek v jednom mililitri. Pó centrifugácii sa zleje supernatant a skúmavky sa uložili pri teplote miestnosti až do ďalšieho použitia inokula, nie však dlhšie ako 1 hodinu.

Inokulácia sa uskutočňuje tak, že každá platňa semien je ošetrená novo resuspendovaným peletom mikroorganizmov Agrobaclerium. Bakteriálne pelety sa resuspendovali jednotlivo v objeme 20 ml inokulačného média, ktoré obsahuje soli B5 (G5893), 3,2 g/l sacharózy, 2,0 % (hmotn./objem); 6-benzylaminopurín (BAP), 45 pM; indolmaslovú kyselinu (IBA) koncentrácie 0,5 μΜ; acetosyringón (AS) koncentrácie 100 μΜ, s upraveným pH na hodnotu 5,5 pomocou MES koncentrácie 10 mM. Resuspendovanie sa dosiahlo zamiešaním na vortexe. Inokulum sa potom nalialo na Petriho misku obsahujúcu pripravené semená a klíčne nodusy sa zúžilÍskalpelom. To sprevádza pozdĺžne rozpolenie-semena cez hrot výhonku, pričom sa zachovali dva celé kotyledóny. Obe polovice výhonku sa potom oddelia, respektíve ich kotyledóny, tým, že sa od seba oddialujú skalpelom. Klíčny nodus sa potom stenči skalpelom podľa osi symetrie. Je treba dať pozor, aby sa neprerezal celý explantát do axiálnej strany. Explantáty sa pripravujú približne 5 minút a potom sa inkubujú počas 30 minút pri teplote miestnosti spolu s baktériami, bez toho, aby došlo k miešaniu. Po 30 minútach sa explantáty prenesú na platne na rovnaké pevné médium obsahujúce Geltrite (Merck and Cornpany Inc.) v koncentrácii 0,2 % (hmotn./objem). Explantáty sa uložia adaxiálnou stranou nahor a porovnajú sa s povrchom média a kultivujú sa pri teplote 22 °C počas 3 dní pri chladnom bielom fluorescenčnom osvetlení s intenzitou približne 20 gEnf’S¹·

Po troch dňoch sa explantáty preniesli do kvapalného selekčného média, ktoré obsahuje 3,2 g/l solí B5 (G5S93); 2% (hmotn./objem) sacharózy, 5 μΜ BAP, 0,5 μΜ IBA, 200 p.g/l vankomycínu, 500 μβ/ml cefotaxímu, hodnota pH sa upraví s MES koncentrácie 3 mM na hodnotu 5,7. Explantáty sa premývali v Petriho miske za konštantného krúživého miešania pri teplote miestnosti počas 4 dní. Selekčné médium sa vymení štyrikrát.

Explantáty sa potom prenesú do agarózového selekčného média, ktoré obsahuje soli B5 (G5893) koncentrácie 3,2 g/l, 2 % (hmotn./objem) sacharózy, 5,0 μΜ BAP, 0,5 μΜ IBA, 50 pg/ml sulfátu kanamycínu, 100 μβ/ιηΐ vankomycínu, 30 μg/ml cefotaxímu, 30 μg/ml timentinu. Hodnota pH sa upravila 3 mM MES na hodnotu 5,7. Selekčné médium sa nechá stuhnúť 0,3 % (hmotn./objem) agarózou Seakem. Explantáty sa položili do média adaxiálnou stranou nadol a kultivovali sa pri teplote 28 °C a pri dĺžke dňa 16 hodín. Svietilo sa chladným bielym fluorescenčným svetlom s intenzitou 60 až 80 μΕτη'^’·

Po dvoch týždňoch sa explantáty opäť premyli kvapalným médiom na miešačke s krúživým pohybom. Premytie sa uskutočnilo cez noc v selekčnom médiu, ktoré obsahuje sulfát kanamycínu v koncentrácii 50 μg/ml. Nasledujúci deň sa explantáty umiestnili do selekčného média obsahujúceho agarózu. Umiestnili sa adaxiálnou stranou nadol a kultivovali sa ďalšie dva týždne.

Po kultivácii počas jedného mesiaca na selekčnom médiu je transformované tkanivo viditeľné ako zelené oblasti regenerovaného tkaniva proti pozadiu, ktoré tvorí vyblednuté nezdravé tkanivo. Explantáty bez uvedených zelených oblastí sa vyhodia a explantáty so zelenými oblasťami sa prenesú na elongačné médium, ktoré obsahuje soli B5 (G5893) koncentrácie 3,2 g/l, 2 % (hmotn./objem) sacharózy, IBA koncentrácie 3,3 μΜ, 1,7 μΜ kyseliny giberelovej, 100 μβ/πιΐ vankomycínu, 30 ng/ml cefotaximu, 30 μβ/πιΙ timentinu. pH sa upravilo s 3 mM MES na hodnotu 5,7. Elongačné médium je v pevnej forme a obsahuje gelrit v koncentrácii %,2 % (hmotn./objem). Zelené oblasti sa umiestnia adaxiálnou stranou nahor a kultivujú sa, ako sa uvádza vyššie v texte. Kultivácia sa uskutočňuje na uvedenom médiu a každé dva týždne sa kultivované tkanivo prenesie na nové platne Keď výhonky dosiahnu dĺžku 0,5 cm, odstrihnú sa a umiestnia sa na zakoreňovacie médium do testovacích skúmaviek 13 x 100 ml. Zakoreňovacie médium obsahuje soli B5 (G5893) koncentrácie 3,2 g/l, 15 g/l sacharózy, 20 μΜ kyseliny nikotínovej, 900 mg/1 kyseliny pyroglutámovej (PGA) a 10 μΜ IBA. Zakoreňovacie médium sa upravilo 3 mM MES na hodnotu pH 5,7 a vyskytuje sa v pevnej forme obsahujúcej geltrit v koncentrácii 0,2 % (hmotn./objem). Po desiatich dňoch sa výhonky preniesli do rovnakého média, ktoré neobsahuje IBA alebo PGA. Výhonky sa zakorenili a uchovávali sa v skúmavkách za rovnakých podmienok okolia, ako pred tým.

Keď sa koreňový systém dobre vyvinul, tak sa rastlinky preniesli do sterilnej pôdy. Teplota, svetelná perióda, intenzita svetla zostávajú rovnaké ako predtým.

Expresia avidinu v transformovaných rastlinách sa potvrdila a kvantifikovala s použitím testu ELISA a prítomnosť génu sa potvrdila PCR a Southernovým blotovaním. Stabilita expresie v nasledujúcich generáciách rastlín sa môže hodnotiť tými istými spôsobmi. Zistilo sa, že v sóji problémy sterility korelujú s expresiou avidinu.

Príklad 3: Príprava Tastlín slnečníc vykazujúcich samčiu sterilitu expresidU avidínu.

Na prípravu transgénnych rastlín slnečníc a semien sa použila expresívna kazeta kódujúca avidín. Sekvencia DNA kódujúca avidín sa začlenila do expresívnej kazety a riadi ich promótor ubikvitínu. Táto expresívna kazeta sa potom sub-klonovala do binárneho vektora, ako je PHI 5765 s použitím reštrikčného miesta EcoRl. Binárny vektor sa potom preniesol do pomocného kmeňa Agrobacterim tumefaciens.

Rastliny slnečníc sa transformovali mikroorganizmom Agrobacterim tumefaciens kmeň LBA4404 po bombardovaní mikročasticami, ako sa opisuje v publikácii Bidney et al,, Plánt Mol. Biol. 18: 301 (1992). Semená slnečnicovej línie Pioneer SMF-3 sa olúpali a povrchovo sterilizovali. Semená sú uložené na vlhkom filtračnom papieri v tme pri teplote 26 °C počas 18 hodín. Kotyledóny a korene sa odstránili a meristémové explantáty sa kultivovali na kultivačnom médiu 374BGA (soli MS, vitamíny podľa Shepharda, 40 mg/1 adenínsulfátu, 3 % sacharóza, 2,8 % fytoagaru pH 5,6 plus 0,5 mg/1 BAP, 0,25 mg/1 IBA a 0,1 mg/1 GA). O 24 hodín neskôr sa odstránia primárne listy, aby sa odhalil apikálny meristém a explantáty sa umiestnia do 2 cm kruhu do stredu Petriho misky s vodným agarom s rozmermi 60 mm x 20 mm tak, aby apikálny oblúk smeroval nahor. Explantáty sa dvakrát bombardujú volfrámovými časticami, ktoré sú v suspenzii v TE pufre alebo časticami spojenými s expresívnym plazmidom, ktorý obsahuje gén avidinu. Explantáty meristému sa spoločne kultivujú na médiu 374BGA, na svetle pri teplote 26 °C, počas ďalších 72 hodín.

Meristémy ošetrené mikroorganizmom Agrobacterium sa potom prenesú na médium 374 (374 BGA s 1 % sacharózou, neobsahuje BAP, IAA alebo GA) doplnené 250 pg/ml cefotaxímu. Rastlinky sa nechajú vyvíjať ďalšie 2 týždne pri 16 hodinách svetelnej periódy a teplote 26 °C až vznikne zelená oblasť alebo vyblednutá oblasť. Rastlinky sa prenesú na médium, ktoré obsahuje kanamycín a nechajú sa rásť. Prítomnosť avidinu v rastlinách sa potvrdí a kvantifikuje, ako sa opisuje v príklade 2. Ukázalo sa, že výskyt samčej sterility koreluje s expresiou avidinu v rastlinách.

Hoci predchádzajúci opis-sa vzťahuje k zvlášť výhodným uskutočneniam, je treba rozumieť, že vynález nimi nie je limitovaný. Pre odborníkov v odbore je zrejmé, že možno uskutočniť mnohé modifikácie uvedených uskutočnení a že tieto modifikácie budú spadať do rozsahu vynálezu, ktorý je definovaný nasledujúcimi patentovými nárokmi

Claims (18)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1 Izolovaná molekula DNA obsahujúca promótor špecifický pre prašník operatívne spojený s nukleotidovou sekvenciou kódujúcou streptavidín.
2. 2. Expresívny vektor obsahujúci izolovanú molekulu DNA podľa nároku 1.
3. 3. Transgénna rastlina, kde táto rastlina obsahuje uvedený expresívny vektor podľa nároku 2.
4. 4. Transgénna rastlina podľa nároku 3, kde táto rastlina je vybratá zo skupiny zahrnujúcej kukuricu, sóju a slnečnicu.
5. 5. Expresívny vektor podľa nároku 2, kde nukleotidová sekvencia kódujúca signálnu sekvenciu je operatívne spojená s uvedenou nukleotidovou sekvenciou kódujúcou streptavidín.
6. 6. Expresívny vektor podľa nároku 5, kde uvedená signálna sekvencia je signálna sekvencia alfa-amylázy jačmeňa.
7. 7. Spôsob produkcie transgénnej rastliny vykazujúcej-samčiu sterilitu, vyznačujúci sa tým, že sa do rastlinných buniek zavedie expresívny vektor obsahujúci s rastlinou kompatibilný promótor operatívne spojený s nukleotidovou sekvenciou kódujúcou streptavidín a transgénna rastlina sa regeneruje z uvedených transformovaných buniek, pričom uvedený promótor riadi expresiu u40 vedeného génu a uvedená expresia génu spôsobuje samčiu sterilitu uvedenej transgénnej rastliny.
8. 8. Spôsob použitia génu streptavidínu pri produkcii hybridnej rastliny vykazujúcej samčiu fertilitu, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje:

   (a) produkciu prvej rodičovskej rastliny vykazujúcej samčiu sterilitu obsahujúcej molekulu DNA, ktorá zahrnuje s rastlinou kompatibilný promótor operatívne spojený s nukleotidovou sekvenciou kódujúcou streptavidin, pričom expresia uvedeného streptavidínu spôsobuje samčiu sterilitu, (b) produkciu druhej transgénnej rodičovskej rastliny exprimujúcej druhý cudzorodý gén a

   I (c) kríženie uvedeného prvého rodiča s uvedeným druhým rodičom, pričom vzniká hybridná rastlina, kde táto rastlina exprimuje uvedený druhý cudzorodý gén a kde produkt uvedeného druhého cudzorodého génu znižuje v uvedenej hybridnej rastline expresiu streptavidínu, pričom vzniká hybridná rastlina vykazujúca samčiu fertilitu.
9. 9. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že uvedený druhý cudzorodý gén je vybratý zo skupiny zahrnujúcej antimediátorový gén, ribozýmový gén a gén externej sprievodnej sekvencie.
10. 10. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že uvedená molekula DNA uvedenej prvej rodičovskej rastliny ďalej obsahuje operátor LexA, ktorý je operatívne spojený s uvedeným promótorom a kde uvedený druhý cudzorodý gén je gén represoru LexA.
11. 11. Spôsob produkcie semien, ktoré vykazujú požadovanú charakteristiku zrna, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje.

    (a) produkciu prvej rodičovskej rastliny, ktorá vykazuje samčiu sterilitu a obsahuje nukleotidovú sekvenciu kódujúcu streptavidin operatívne spojenú so sekvenciou promótora, ktorý je kompatibilný s rastlinou, (b) produkciu druhej rodičovskej rastliny, ktorá vykazuje samčiu fertilitu a nesie jeden alebo viac génov riadiacich požadovanú charakteristiku zrna, (c) kríženie uvedeného prvého rodiča s uvedeným druhým rodičom za vzniku hybridných semien s uvedenou charakteristikou zrna a (d) zber uvedených semien.
12. 12. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že uvedená prvá rodičovská rastlina je hybridná rastlina.
13. 13. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že uvedená charakteristika zrna je vybratá zo skupiny zahrnujúcej obsah oleja, proteínu a škrobu.
14. 14. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že uvedená prvá a druhá rastlina je vybratá zo skupiny obsahujúcej kukuricu, sóju, kanolu a slnečnicu.
15. 15. Spôsob podľa nárokov 8 alebo I I, vyznačujúci sa tým, že uvedená sekvencia promótora kompatibilného s rastlinou je sekvencia promótora špecifického pre prašník obsahujúca prašnikový box vybraný zo skupiny zahrnujúcej:

    (a) molekulu DNA vykazujúcu nukleotidovú sekvenciu uvedenú v SEQ ID NO: I, (b) molekulu DNA vykazujúcu nukleotidovú sekvenciu uvedenú v SEQ ID NO: 2, (c) molekulu DNA vykazujúcu nukleotidovú sekvenciu uvedenú v SEQ ID NO: 3, (d) funkčný fragment molekúl DNA opísaných v odstavci (a), (b) alebo (c).
16. 16. Spôsob podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že uvedený prašníkový box má nukleotidovú sekvenciu SEQ ID NO: 1 a uvedený promótor špecifický pre prašník ďalej obsahuje jadrový promótor vybraný zo skupiny zahrnujúcej:

    (a) jadrový promótor CaMV 35S (b) molekulu DNA vykazujúcu nukleotidovú sekvenciu uvedenú v SEQ ID NO: 4, (c) molekulu DNA vykazujúcu nukleotidovú sekvenciu uvedenú v SEQ ID NO: 5, (d) molekulu DNA vykazujúcu nukleotidovú sekvenciu uvedenú v SEQ ID NO: 6 a (e) funkčný fragment molekúl DNA opísaných v odstavci (b), (c) alebo (d)·.
17. 17. Spôsob podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že uvedený prašníkový box má nukleotidovú sekvenciu SEQ ID NO: 2 a uvedený promótor špecifický pre prašník ďalej obsahuje jadrový promótor vybraný zo skupiny zahrnujúcej:

    (a) jadrový promótor CaMV 35S, (b) molekulu DNA vykazujúcu nukleotidovú sekvenciu uvedenú v SEQ ID NO: 4, (c) molekulu DNA vykazujúcu nukleotidovú sekvenciu uvedenú v SEQ ID NO: 5, (d) molekulu DNA vykazujúcu nukleotidovú sekvenciu uvedenú v SEQ ID NO: 6 a (e) funkčný fragment molekúl DNA opísaných v odstavci (b), (c) alebo (d).
18. 18. Spôsob podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že uvedený prašníkový box má nukleotidovú sekvenciu SEQ ID NO: 3 a uvedený promótor špecifický pre prašník ďalej obsahuje jadrový promótor vybraný zo skupiny zahrnujúcej:

    (a) jadrový promótor CaMV 35S, (b) molekulu DNA vykazujúcu nukleotidovú sekvenciu uvedenú v SEQ ID NO: 4, (c) molekulu DNA vykazujúcu nukleotidovú sekvenciu uvedenú v SEQ ID NO: 5, (d.) molekulu DNA vykazujúcu nukleaiidovú-sekvenciu uvedenú v SEQ ID NO: 6 a (e) funkčný fragment molekúl DNA opísaných v odstavci (b), (c) alebo (d).