SK56996A3 - Recombinant obese (ob) proteins - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Obezita sa uvádza ako najbežnejšia nutričná porucha v západných spoločnostiach /Zhang , Y. a kol., hature 372, 425-432 /1944/ /· Viac ako 3 z 10 dospelých Američanov má hmotnosť aspoň o 20% vyššiu , ako je ich ideálna hmotnosť f Zhang, Y. a kol., vid vyššie/ . Zvýšená telesná hmotnosť je všeobecným zdravotným problémom , pretože je spojená s dôležitou lekárskou nemocou ako je diabetes mellitus typ II / to je neinzulínovó závislá diabetes mellitus / , hýpertenzia a hyperlipidémia / Grundy , S.M. a Barnett, Disease - a - Mouth 36» 645-696 /1990// . Existuje dôkaz , že telesná hmotnosť je fyziologicky regulovaná a obezita / a súvi siace stavy alebo choroby / sú sčasti ovplyvnené poruchami v tejto regulácii / Zhang , Y.a kol., vid vyššie/.

U hlodavcov je opísané 7 jednotlivých génových mutácií , ktoré vedú k obéznemu fenotypu , z ktorých je prítomné pri myšiach · Z týchto 7 rodentných modelov ako jeden najintenzívnejšie Študovaných je obéz na /ob/ génová mutácia pri myšiach indentifikovaná v roku 1950 / Inglas, A.M.a kol.,J.Hered.41,317-318 /1950//. Homozygotné myši pre túto ob génovú mutáciu sú hlboko obézne , vyvíjajú diabetes mellius typ II a sú hyperfagické a hypometabolické ako súčasť syndrómu podobného morbídnej obezite u človeka /Eriedman J.M. a kol.Genomics 11, 1054-rl062, 1991 //. Tento ob gén je mapovaný na myšom proximálnom chromozóme 6 a kóduje proteín /to je ob proteín expresovaný v adipóznom tkanive / Zhang,T.

a kol. vi3 vyššie /. Homozygotné myši pre túto oh génovú mutáciu takmer nemajú žiadnu produkciu tohoto ob proteinu , a preto majú defektívnu reguláciu telesnej hmotnosti , vedúcej k obezite .

Myšacie alebo ľudské ob proteiny môžu byť podávané pacientom trpiacim defektami alebo mutáciami v Ich zodpovedajúcom fob) géne , a tieto defekty alebo mutácie bránia alebo interferujú s produkciou alebo funkciou ób proteinov pri modulácii telesnej hmotnosti . Tieto proteiny môžu byť tiež použité ako hormonálne substancie na potláčanie , prevenciu alebo lie čenie obezity a s nou spojených chorôb a stavov u človeka a zvierat .

Na použitie myšie alebo ľudské ob proteiny môžu byť podávané pomocou injekcii rôznymi epôsobmi, ako sú intraperitoneálne , intravenózne , intramuskulárne alebo sub kutánne , v opakovaných dávkach . Pretože sa podávanie robí často injekciami , je dôležité , aby myšacia alebo ľudské proteiny boli vyčistené výhodne do homogenity , boli bez kontaminačných proteínových látok a boli rekombinantne expresované v rozpustnej a biologicky aktívnej forme . Všeobecne je praktikom známe , že nečistoty prítomné v injektovateľnom liečení môžu často viesť k toxickým postranným účinkom alebo nepriaznivým imunologickým odozvám ·

Pokiaľ myšacia ob génová sekvencia je zverejnená v Zhang,Y. a kol., viä vyššie , žiadne spôsoby expresie murinového ob proteinu alebu jeho ľudského proťajšku nie sú uvádzané , pročom sa omnoho menej vyrábajú tieto proteiny v biologicky aktívnom a rozpustnom stave, z ktorého môžu byť tieto proteíny.vyčistené k homogenite . 5alej je dôležité , a to je objektom vynálezu, expresovať a produkovať vyššie alebo ľudské proteíny v homogénnom rozpustnom a biologicky aktívnom stave.

Zistilo sa , že rekombinantné ľudské a myšacie ©b pr®t£Íny môžu byť expresované v biologicky aktívnom a rozpustnom stave a potom vyčistené na homogenitu vhodnú na injekcie pacientom na liečenie , prevenciu alebo potláčanie obezity a s ňou spojených stavov a chorôb , ako je diabetes mellitus typ II , hypertenzia, hyperlipidémia a podobne .

Podstata vynálezu

Podľa tohoto vynálezu ľudské a myšacie proteíny ob môžu byť produkované rekombinantne v biologicky aktívnej forme a vyčistené na homogenitu najskôr vytvorením nových expresívnych vektorov pre Eächerichia coli /E.coli /. Tieto expresívne vektory obsahujú promótor DNA sekvenciu , ktorá DNA sekvencia kóduje fúzovaný. proteín , obsahujúci dve časti : signálny peptid vonkajšieho membránového proteínu A E.coli /to je sOmpA/ a ľudský alebo myšací ob proteín ·

Podľa tohoto vynálezu Úalší stupeň prš·©Aukciu biologicky aktívnej rekombinantnej formy myšacích a ľu dských proteínov. je zavedenie tohoto expresívneho vektora v E.coli hostiteľovi , čím sa získa výkonná expresia a translokácia fúzovaného proteínp do periplazmického priestoru / to je medzi vnútornou a vonkajšou bu nečnou membránou E.coli mikroorganizmu /, v ktorom bode sa signálny peptid excizuje z ob proteínu , zanecháva 4 júc ob proteín v rozpustnej a biologicky aktívnej f orme.

Ďalej sú ob proteíny účinne sekŕetované v rozpustnej a biologicky aktívnej forme do bezbunkového média , potom nasleduje úprava hostiteľských E.coli buniek do chladného osomotického šoku , v ktorom bo de sa ob proteíny vyčistia do homogenity postupným použitím aniontomennej chromatografie , hydrofobnej interakčnej stĺpcovej chromatografie a gelovej filtrá cie _t robeným v tomto potadí .

Predložený vynález je taktiež zameraný na

1. expresívny vektor obsahujúci DNA kódujúci fúzovaný proteín obsahujúci sOmpA signálny peptid a ľud ský glebo myšací proteín ,

2. na hostiteľský organizmus transfektovaný alebo transforomovaný takýmto expresívnym vektorom ,

3. na DNA sekvenciu jkóduj'úcu·''ľudský 'ob proteín r polyetylén alebo polypropylenglykol konjugáty ob proteínu .

Predložený vynález j® _:< ji&l® j~ zameraný na spôsoby expresie rekombinantných ľudských a myšacích ob proteínov v biologicky aktívnom a rozpustnom stave a na produkciu týchto proteínov v čistej horaogénnnej forme vhodnej na podanie zvieratám alebo ľuďom .

Spôsob pre expresiu a produkciu myšacieho ob proteínu podľa tohoto vynálezu sa dosiahne využitím myšacieho ob génu ako uvádza Zhang ä kol., viď vyššie sekvencie, pre tento gei je 702 párov báz /bp/ nukleotidovej sekvencie identifikovanej tu ako SEKV ID

Či l.Táto myšacia ob génová sekvencia obsahuje 501 bp kódujúcu sekvenciu alebo otvoreného čítacieho rámca /QRF/ vychádzajúceho zo štartovacím kodónom v nukleotide 36 a končiaceho s terminačným kodónom v nukleotide 537 a majúceho ňetranslátované sekvencie ako v 3-1 ťak 5 koncoch . ORF obsahuje 63 bp signálne sekvencie z nukleoidu 36 až 98.

Táto myšacia ob génová sekvencia /SEKV ID Č: 1 / kóduje myšací ob proteín /plus jeho signálna sekvencia / , ktorého anínokyselinová sekvencia je 167 aninokyselín po dĺžke a je identifikovaný../ ako SEKV ID Č : 2.

V tomto proteíne SEKV ID Č :2 prvých 21 aminokyselín predstavuje signálnu sekvenciu myšacieho ob proteínu . Úplný myšací ob proteín / s jeho signálnou sekvenciou / zasahuje od animokyseliny 22 /Val/ k aniraokyseline 167 /Cys/ a je predstavený SEKV ID Č : 3.

Spôsob pre expresiu a produkciu ľudského ob proteínu podľa tohoto vynálezu sa získa využitím ľudského ob génu , pričom sekvencia pre tento gén je 690 bp huklebtldhej sekvencie , identifikovanej tu ako SEKV ID Č : 4.

Zhang, Y. a kol. viň vyššie , uvádza ľudský ob gén ako vysoko homologný ob gén a zverejňuje, konvenčný spôsob využitia oligonukleotidových skúšok ,zameraných na myšací ob gén , ktoré môžu byť využité.

1. na roztriedenie cDNA banky klonov odvodených z ľu dské&o tukového tkaniva ,

2. na identifikáciu týchto klonov majúcich ľudský ©b gén , a

3. na izoláciu a sekvencovanie ľudskej ob génovej sekvencie .

Keä sa sekvencuje konvenčnými prostriedkami , je táto ľudská ob génová sekvencia určená , aby mala nukleotidovú sekvenciu SEKV ID Č : 4.

Ako myšací plt gén , ľudský ob gén obsahuje 501 bp kódujúci sekvenciu alebo otvoreného Čítacieho rámca /ORF/ vychádzajúc so štertovacieho kodónu a nukleotidu 37 a končiac terminačným kodónom pri nukleotide 538 a majúc ne trans lat ovanú sekvenciu ako pri

3*, tak 5* koncov. CRF	obsahuje 63 bp až 99 ·	signálnej sekve·
ncie z nukleoidu	37
Táto ľudská	ob	génová sekvencia	/SEKV ID C : 4/

kóduje ľudský ob protein jeho signálnu sekvenciu , ktorej amimokyšelinová sekvencia 167 aminokyselín v dĺžke je identifikovaná -ako SEKV ID Č : 5.

Prvých 21 aninokyselín tohoto proteínu zo 167 aminokyselín v dĺžke predstavuje signálnu sekvenciu. Úplný ľudský ob protein /bez jeho signálnej sekvencie / za sahuje od aminokyseliny 22 /Val/ k aminokyseline 167 /Cis/ a je predstavený SEKV ID Č : 6.

Zhang, Y.a kol., viä vyššie , uvádza 84% nú identitu medzi myšacími a ľudskými ob proteínmi . Zhang,Y. a kol., viä vyššie uvádzajú tiež , že varianty ľudských a myšacích proteínov existujú , pričom jeden taký variant je vyznačený pri oboch druhoch deleciou glutamínu 49. približne 30 cDNA klonov v bankách odvodených z myšacieho,.·.». adíposneho tkaniva a ľudského adipózneho tkaniva má chýbajúci kodón 49 /Zhang,Y.a kol. viä vyššie /.

Nasledujúce ·, významy majú äalej uvedený význam:

myšací ob protein /mob/ - sa týka proteínu SEKV ID Č:3» ktorého biologické vlastnosti vo vzťahu k liečeniu , potláčaniu alebo prevencii obezity alebo s ňou spo7 jených stavov a chorôb. Špecificky je myšací ob protein definovaný tak, že zahrnuje 'akýkoľvek proteín alebo polypeptid majúci aminokyselinovú sekven ciu, ktorá je v podstate homologná š äminokyselihovou sekvenciou .'SEKY IĽ Č : 3 a áalej majúca nasledovné biologické aktivity:

1/ kečl sa protein alebo polypeptid podáva intracerebroventrikulárnou /ICV/ injekciou 16 až 18 hodín hladujúcim dospelým obéznym ob/ób myšiam majúcim telesnú hmotnosť aäpoň 30 g v dávke 20 mikrogramov alebo menej za použitia postupov podľa Haleyho a McCormicka, Brit. J. Pharmacol. 12,

- 15 /1957/» potom protein alebo polypeptid:

/a/ znižuje príjem potravy počas 5 hodinového kŕmiaceho testu o 50 % v porovnaní s vehikulom injektovaným kontrolným myšiam /ED50 na zníženie príjmu potravy/, a /b/ znižuje prírastok telesnej hmotnosti počas 24 hodín po ICV injekcii aspoň o 50 % v porovnaní s vehikulom injektovaným kontrolným myšiam /ED50 na zníženie prírastku telesnej hmotnosti/, ♦

2/ ke3 sa protein alebo polypeptid podá intraperitoneálne /IP/, nevyhladnutým dospelým Ob/ob myšiam^ o telesnej hmotnosti aspoň 30 g 2 x denne na začiatku dňa a znovu v 3-hodinovom bode tmavej fázy počas doby 1 dňa v celkovej dennej dávke 20 mikrogramov alebo menej, protein alebo polypeptid:

/a/ znižuje 5 a 24 hodinový príjem potravy o aspoň 20 % v porovnaní s vehikulom injektovaným kontrolným myšiam /ED20 na zníženie príjmu potravy/ , a /b/ znižuje prírastok telesnej hmotnosti počas 24 hodín po prvej IP injekcii aspoň o 20 % v porovnaní s vehikulom injektovanýra kontrolným myšiam /ED20 na zníženie prírastku telesnej hmotnosti/.

Ako je tu použitý výraz myšací proteín, zahrňuje také proteíny, ktoré sú zámerne modifikované napríklad miestne riadenou mutagenéziou alebo poprípade mut ác i ami.

Ľudský ob proteín /hob/ - sa týka proteínu·' SEKY ID Č : 6, ktorého biologické vlastnosti su vô vzťahu k liečeniu , potlačovaniu alebo prevencii obezity alebo s ňou spojenými stavmi a chorobami.

Špecificky je ľudský ob jproteín definovaný tak, že zahrňuj é akýkoľvek proteín alebo polypeptidy, majúce aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je v podstate homologná a aminokyselinovou sekvenciou SEKY ID Č : 6 , a Halej majúca nasledovné biologické jaktivity: ;

1/ keň sa proteín alebo polypeptid podáva ICV 16 až 18 hodín vyhladnutej dospelej obéznej ob/ob myši majúcej telesnú hmotnosť aspoň 50 g v dávke 20 mikrogramov alebo menej pri použití spôsobu Haleyho a McCormicka, vi3 vyššie, proteín alebo polypeptid:

/a/ znižuje príjem potravy počas 5-hodinového kŕmneho testu o 50 % v porovnaní s vehikulom injektovaným kontrolným myšiam /ED 50 na zníženie príjmu potravy/ , a /b/ znižuje prírastok telesnej hmotnosti počas 24 hodín po ICV injekcii aspoň o 50 % v porovnaní s vehikulom injektovaným kontrolným myšiam /ED 50 na zníženie prírastku telesnej hmotnosti/ ,

2/ keä sa proteín alebo polypeptid podáva IP nevyhladnutým dospelým ob/ob myšiam majúcim telesnú hmotnosť aspoň 30 g 2 x denne na začiatku dňa a znovu v 3-hodinovom bode fázy tmy v dobe 1 týždňa v celkovej dennej dávke 20 mikrogramov alebo menej, proteín alebo polypeptid:

/a/ znižuje 5 a 24 hodinový príjem potravy aspoň o 20 % v porovnaní s vehikulom injektovaným kontrolným myšiam /ED20 na zníženie príjmu potravy/ , a /b/ znižuje prírastok telesnej hmotností behom hodín po prvej IP injekcii aspoň o· 20% v porovnaní b vehikulom injektoy.aným kontrolným myšiam /ED 20 na zníženie prírastku telesnej hmotnosti/.

Ako je tu použitý výraz ľudský ob proteín, zahrňuje také proteíny, ktoré sú zámerne modifiko10 vane ako napríklad miestne usmernenou rautagenéziou alebo poprípade mutáciami.

Výraz v podstate homologný - ktorý sa môže týkať ako sekvencií nukleových kyselín, tak aj aminokyselinových sekvencií, znamená, že príslušná sekvencia subjektu, napríklad mutantná sekvencia sa mení z referenčnej sekvencie jednou alebo viacerými substitúciami, deleciami alebo adíciami, ktorých výsledný efekt nemá za následok nepriaznivé funkčné odlišnosti medzi referenčnými a subjektovými sekvenciami

Na účely tohto vynálezu sekvencie majúce väčšiu než 95 % homologir., ekvivalentnú biologickej; vlastnosti a ekvivalentný expresívne:j vlastnosti sa považujú v podstate za homologné. Na účely určenia homológie by sa skomolenie zrelej sekvencie nemalo brať na vedomie. Sekvencie majúce menšie stupne homológie, porovnateľnú bioaktivitu a ekvivalentné, expresívne vlastnosti sa považujú v podstate za ekvivalentné. Obecne môžu byť homologné DNA sekvencie identifikované cross-hybridizáciou za štandartných hybridizačných podmienok priemernej prísnosti.

Fragment - myšieho alebo ľudského ob proteínu znamená akýkoľvek proteín alebo polypeptidy, majúce aminokyselinovú sekvenciu časti alebo fragmentu myšacieho alebo ľudského ob proteínu, a ktorý má biologickú aktivitu príslušného myšacieho alebo ľudského proteínu. Fragmenty zahrňujú proteíny alebo polypeptidy produkované proteolytickou degradáciou myšacích alebo ľudských ob proteínov alebo produko vaných chemickou syntérpu spôsobmi bežne známymi.

Ob proteín alebo jeho fragment je - biologický aktívny - ked podanie tohoto proteínu alebo jeho fragmentu cicavcom vrátane človeka znižuje príjem potraty a znižuje mieru hmotnostného prírastku pri tomto cicavcovi. Určenie takejto biologickej aktivity ľudského alebo myšacieho proteínu sa môže vykonávať konvenčnými dobre známymi testami užívanými na takéto účely na jednom alebo viacerých druhoch cicavcov zvyčajne obéznej’: ob/ob myši. Niektoré z týchto testov, ktoré môžu byť použité na demonštráciu tejto biologickej aktivity, sú tu opísané. Pri určovaní biologickej aktivity podľa ICV testu pri ob/ob myši je tu opísané, pričom ľudský alebo myšací ób proteín má výhodné ED50 na zníženie príjmu potravy 20 mikrogramov alebo menej a ED50 na zníženie prírastku telesnej hmotnosti 20 mikrogramov alebo menej. Alternatívne pri určovaní biologickej aktivity ľudského alebo myšacieho proteínu podľa OP testu u ob myší ako je tu opísané, má ľudský alebo myšací proteín výhodné ED20 na zníženie príjmu potravy 20 mikrogra mov alebo menej a ED20 nä zníženie prírastku telesnej hmotnosti 20 mikrogramov alebo menej.

Obecne sú výhodné fragmenty, ktoré vykažujú vyššie uvedenú biologickú aktivitu.

Replikon - je akýkoľvek genetický element /napríklad plazmid, chromozóm, vírus/ , ktorý pôsobí ako autonómny jednotka DNA replikácia in vivo, to je schopný replikácie za svojho vlastného riadenia.

Expresívny vektor - je replikon ako je plazmid, fág alebo kozmid, ku ktorému môže byť pripojený ňalší DNA segment, takže sa vyvolá replikácia pripojeného segmentu. Zahrňuje to transkripčnú jednotku obsahujúcu súbor /1/ genetického elementu alebo elementov majúcich regulačnú úlohu pri expresii génov, napríklad pro. ..motory alebo zosilovače, /2/ štrukturálnu alebo kódovaciu sekvenciu, ktorá sa transkribuje do mRNA a prechádza do proteínu a /3/ príslušných transkripčných, iniciačných a terminaČných sekvencií.

Kloň - je skupina DNA molekúl odvodených z jednej pôvodnej dĺžky DNA sekvencií a produkovaná baktériou alebo vírom za použitia technológií genetického inžinierstva, často zahrňujúce plazraidy.

Signálna sekvencia - je sekvencia nukleovej kyseliny uložená na začiatku /5 - koniec/ kódovacej sekvencie proteínu, ktorý má byť expresovaný. .Táto signálna sekvencia kóduje signálny peptid, N-terminál k novtf) syntetizovanému proteínu, ktorý smeruje hostiteľskú· bunku k translokácii proteínu k alebo cez hostiteľskú bunkovú membránu a ktorého signálny peptid je obvykle excizovaný behom tejto translokácii

Štartovací kodón je kodón obyčajne ATG uložený v kódovacej sekvencii proteínu a obyčajne na 5'konci a signalizuje prvú aminokyselinu v proteínovej sekvencii .

Terminačný kodón - je nezmyselný kodón uložený obyčajne, na 3*- konci , v kódovacej sekvencii proteínu a signalizuje koniec rastúceho polypeptidového reťazca ·

Otvorený čítací rámec / GRF/ - je lineárne usporiadanie kodónových tripletov v dvojreťazcovej DNA kódujúcej aminpkyselinovú sekvenciu v bunke in vitro alebo in vivo , keú sú uložené pod riadením príslušných regulačných sekvencii . Hranice ORF sú určené štartovacím kodónom v 5*- konci a terrainačným kodónom v 3*- konci <»Môže byť taktiež označený ako kódujúca sekvencia . ·

Fremotorová sekvencia v je DNA regulačné miesto schopné viazať RNA polymerasu v bunke a iniciujúce transkripciu po> smere expresie génu /3Ďsmer/ otvoreného čítacieho rámca jedného alebo viacerých štruk turálnych génov . Fromotorová sekvencia je obyčajne uložená na 5- konci signálnej sekvencie alebo otvo reného čítacieho rámca a prebieha proti smeru expresie v 5I smere , aby zahŕňala minimálny počet báz alebo článkov , potrebných na iniciovanie transkripcie polypeptidu v úrovni zaznamenateľnej oproti po zadiu .

Kódujúca sekvencia GRF je pod riadením promótorovej sekvencie , keú RNA polymerasa transkribuje kódujúcu sekvenciu do mRNA.

Zloženie obsahujúce A, /kde A je jeden polypeptid/ je homogénne pre Α» ke3 tam nie je žiadne zaistiteľné množstvo kontaminujúcich proteínov alebo iných endogénnych látok , pri zisťovaní konvenčnými prostriedkami, napríklad zafarbením polyakryllamidových gélov . Pre účely tohoto vynálezu výraz ''homogénny·· sa má vzťahovať na zloženie obsahujúce jeden proteín alebo polypeptid , keú aspoň 95^7 hmotnosti tohoto zloženia má tento jeden proteín alebo polypeptid .

Nasledovné kroky načrtávajú spôsoby pre rekombi nantné expresie ľudských a myšacích ob proteínov v biologicky aktívnom a rozpustnom bezbunkovom stave , jednoduchých iných proteínov ze cicavcov , z ktorých ob proteíny potom môžu byť vyčistené do homogenity. Tieto kroky sú príkladovo detailne uvedené v príkladoch zhotovenia.

1. Získanie myšacích a ľudských ob génov cDNA / SEKV ID Ô :1 / kódujúci myšací ob proteín plus jeho prirodzenú signálnu sekvenciu , je publikovaný vo vyššie uvedenej publikácii Zhang ,Y. a kol. Táto myšacia cDNA bola izolovaná a zosilnená PCR technológiou za použitia oligodeoxynuklotidových DNA primerov konvenčnými technológiami .Tieto DNA primery a spô sob ich získania sú opísané v Zhang , Y. a kol., vió vyššie.

čDNA /SEKV ID Č: 4/ kódujúca ľudský ob proteín plus jeho prirodzenú signálnu sekvenciu sa získa za pou — žitia tých istých oligodeoxynukleotidových DNA primérov, aké sú použité v Zhang* Y. a kol., vi3 vyššie , pa zí skanie myšacieho ob génu .Za použitia konvenčných technológií bola táto cDNA izolovaná z lambdy fágovej cDNA banky , vyrobenej z RNA odvodenej z ľudského adipocytového tkaniva .

Ľudská alebo myšacia cDNA môže byť získaná nielen z cDNA bániek , ale taktiež inými konvenčnými prostrie dkarai, napríklad chemickou genomickej DNA alebh jej požadovaných buniek . Tieto syntézou alebo klonovaním' fragmentárni vyčistenými od postupy opísal :Sambrook a kol. v DNA Cloning :A PracticäľApproach ”,zv. I a II, vydal D.N.Glovér, ed.1985,MRL Press,Ltd. /Oxford, U.K.,Benton a Davis,Sciens 196, 180-182 /1977/» a Grunstein a fiogness, Proc.Nat.Acad.Scii 72,3961-3965 /1975/.

Na získanie ľudskej alebo myšacej ób cDNA.z cDNA λ banky sa cDNA banky triWi konrôhfiaýäi' DNA hybridizačnými ť«ch nológiami spôsobmi'Beat®aa a Davisa , viä vyššie, alebo Grunsteina a Hognessa , viä vyššie, s použitím primerov pripravených reverznou transkripciou polyadenyloválne j RNA izolovanej z myšacích adipóznych buniek , obsahujúcich myšací; ob. gen. Klony, ktoré hybridizujú na priméry sa analyzujú reštrikčným endonukleasovým štiepením , agarosovou gelovou elektroforézou a äalšími hybridizačnými experimentami /Sauthernove prenosy)’/ zahrňujúcimi elektrofózované priméry. Po izolácii rôznych klonov , ktoré hybridizovalí na myšacích cDNA sondách , sa hybridizujúci segment jedného klonu subklonuje a sekvencuje konvenčnými technológiami .

Klony odvodené z genomickej DNA môžu obsahovať regulačné a intronové DNA miesta naviac k kódujúcim miestam : klony odvodené od cDNA nebudú obsahovať intronové sekvencie . Pri molekulárnom klonovaní génu z genomickej DNA sa vytvoria DNA fragmenty , z ktorých niektoré budú kódovať požadovaný gén .. DNA môže byť Štiepená na určitých miestach pomocou rôznych reštrikčných· enzýmov .

Alternatívne sa môžu použiť DNA v prítomnosti mangánu na delenie DNA alebo DNA môže byť fyzikál ne prerušená , napríklad sonikáciou . Lineárne. DNA fragmenty potom môžu byť oddelené podľa veľkosti vrátane štandardných technológií , ale bez obmedzenia, agarosovej a polyakrylamidovej gelovej elektroforézy a stĺpcovej chromatografíe.

Akýkoľvek zdroj , ľudský alebo myšací ob gén môže byť molokulárne klonovaný do vhodného vektoru na propagáciu génu známymi spôsobmi .Môže sa použiť akýkoľvek dostupný vektor. Napríklad myšacia cDNA môže byť insertovaná do pCDNA3 vektora a ľudská cDNA môže byť insertovaná do pBluescriptSk vektora .

príslušné vektory na použitie u bakteriálnych hostiteľov sú opísané Powelsom a kol. v Cloning Vecťors: A Labortory Manual”, 1985» Elsevier,N.Y. Ako predstaviteľ neobmedzujúceho príkladu môžu užitočné klonovacie vektory na bakteriálne použitie obsahovať selektovaný marker a bakteriálny originál replikácie odvodenej z komerčne dostupných plazmidov , ktoré sú naopak odvodené z dobre známeho klonovacieho vektora pBR223-3 /ATCC 37017 /· Takéto komerčné vektory zahŕňajú napríklad pKK223-3 /Pharmcia Fiune Chemicals, Uppsala, Švédsko/ a pGEMl / Promega Biotec, Madison, Wisc., USA/.

Nukleotidové sekvencie ľudského alebo myšacieho ob génu inzertované v týchto komerčne dostupných vektoroch , môžu byť overené známymi spôsobmi, technológiami štandardného nukleotidového sekvencovania.

Iné nukleové kyseliny, ktoré kódujú ob proteíny iných druhov , ako sú ľudia alebo myši , tu môžu byť použité . Podľa toho , pokiaľ špecifická DNA bola klo novaná a sekvencovaná vo vzťahu k ľudskému a myšacie mu ob génu , akýkoľvek živočíšny adipocyt sa môže po tenciálne použiť ako zdroj nukleovej kyseliny ob proteínu .

2. Konštrukcia expresívneho faktora pre ľudský a myšací ob proteín.

Ľudský alebo myšací ob gén klonovaný vyššie opi17 sanými spôsobmi sa použije na konštrukciu expresívnych vektorov pre ľudské a myšacie ob proteíny.

Na expresiu biologicky aktívneho ľudského a myšacieho ob proteínu transfektovanou alebo transfor movanou E.coli hostiteľskou bunkou a na sekréciu ob proteínu do períplazmy sa môže využiť nový expresívny vektor . Tento ' expresívny vektor obsahuje pr©motor a DNA sekvenciu kódujúcu a fúzny proteín·. Fúzny proteín sa skladá z dvoch častí : prvá časť je: signálny peptid - pre vonkajší membránový proteín A z E.coli //sOmpA/ a druhá časť fúzneho proteínu je ľudský alebo myšací proteín / mínus jeho vlastné prirodzené signálne sekvencie /.

DNA sekvencie kódujúce tento fúzny proteín tiež sa skladá z dvoch častí: prvá časť , ktorá kóduje sOmpA peptid a druhá časť , ktorá kóduje myšací alebo ľudský ob .proteín /mínus ich prirodzené signálne sekvencie /. Prvá časť DNÁ sekvencie , ktorá kóduje sOmpA peptid , je signálna sekvencia opísaná Le Sutterom K. a kol., Gene 14i , 163-170 /1994/ a má nukleotidovú sekvenciu SEKV ID Ô:7· Druhá časť dvojdielnej DNA sekvencie kóduje myšacie alebo ľudské ob proteíny a má nukleotidovú sekvenciu SEKV ID Č:1 alebo SEKV ID 0:2 , bez tej časti nukleotidovej sekven cie , ktorá kóduje príslušné prirodzené signálne sekvencie .

Signálny peptid kódovaný sCmpA signálnou sekvenciou SEKV 1D Ô:7,’ má aminokyselinovú sekvenciu SEKV ID C:8 , ako uvádza De Sutter , K. a kol.,. viä vyššie.

Nový expresívny vektor tohoto vynálezu sa zaistí inzerciou promotora a DNA sekvencie kódujúce fúzny proteín do konvenčného expresívneho vektora vhodného na expresiu rekombinantných proteínov v E.coli ho18 stitel’ských bunkách .

Pri konštrukcii tohoto nového expresívneho vek tora podľa tohoto vynálezu sa môže použiť akýkoľvek pr motor , ak je schopný riadiť transkripciu fúzneho proteínu obsahujúceho sOmpA peptid a ob proteín vE.coli hostiteľskej bunke . Ke5 sa použije sOmpA ako signálny peptid , je výhodné použiť ako lac- operátorový promotor /ΡΟ^θ^/ tak lipoproteínový promotor /^Plpp/·

Iné užitočné promotory na takúto ’ expresiu v E.coli zahŕňajú T7 RNA polymerasový promotor opísaný Studierom a kol., J.Mo.Biol. 189, 113-130 /1986/, lacz- promotor opísaný lauerom, J.Mol.Apll.Genet.1. 139? 147 /1981/ a dostupný z American Type Culture Collection /ATCC/ 3 37121, tac- promotor opísaný ^aniatisom v Molekular Clonin : A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor 1982 a dostupný ako ATCC 37158 , promotor alkalické jfosfáty /phoA/ a trp- promotor opísaný Goeddelom a kol., Nucleic Acids Research 8 , 4057-4075 /1980/ .

Iné promotory boli zistené a využité v E.coli a detaily týkajúce sa ich nukleotidových sekvencií umožňujúce odborníkom funkčne ich viazať a expresívnym vektorom tohoto vynálezu sú opísané / Siebenlist a kol., Celí 20 , 269-281 / 1980/ .

Špecificky expresívny vektor obsahuje :

a/ premotorovú sekvenciu a b/ DNA sekvenciu kódujúcu fúzn& proteín , ktorý obsahuje myšací ob proteín SEKY ID C:3 alebo ľudský ób proteín SEKV ID C:6 a signálny peptid pre vonk kajäí membránový proteín A E,coli .

l)alej je opísaný spôsob na konštrukciu tohoto nového expresívneho vektora . Tento spôsob je 3alej de 19 tailovaný v príkladoch zhotovenia a zobrazený na obr. 2 a 3.

Najskôr je kódujúca sekvencia ľudského alebo my sacieho ob génu / bez jeho prirodzenej signálnej sekvencie / začlenený do plazmidu , obsahujúceho sOmpA signálnu sekvenciu , ako je plazmid pTlQsOmpArPDI .Tento pTlQsOrapArPDR plazmid a jeho konštrukcia a príprava sú opísané De Sutterom,K.a kol., viď vyššie . Keď je raz začlenený do tohoto plazmidu , ľudský alebo myšací ob gén ša fúzuje do tohoto sOmpA génu , čím sa vytvorí hybridná génová sekvencia v tomto plazmide.

Tento sOmpA gén musí byť proti smeru 5- oblasti ob gén kódujúci sekvencie . Potom proraotory ako sú vyčíslené vyššie a výhodne lipoproteínový promotor /^Ipp/ ^a lac-promotor-operátor /ľO-L_ac/ ^sa začlení do to hoto plazmidu obsahujúceho hybridnú génovú sekvenciu , čím sa vytvorí expresívny vektor tohoto vynálezu. Dve zhotovenia tohoto expresívneho vektoru sú identifikované ako pLPPsOmpA mob a pLPPsOmpA hobl a sú zobrazené na obr. 2 a 3 .

Akýkoľvek spôsob alebo postup doteraz známy pre konštrukciu takéhoto plazmidu môže sa použiť . Naviac poriadok , akým sa fúzujú sOmpA a ob génové sekvencie , začleňujú génové sekvencie do vhodného plazmidu a začleňuje sa promotor , aby sa dospelo k expresnému vektoru tohoto vynálezu , nie je kritický . Napríklad sOmpA génová sekvencia môže byť spočiatku fúzova ná do myšacej alebo ľudskej ob génovej sekvencie pria mo na vytvorenie hybridnej génovej sekvencie a potom sa táto hybridná sekvencia inzertuje do plazmidu majúceho už začlenené príslušné promotory . Je však nutné, aby sOmpA génová sekvencia bola proti smeru expresie v 5- konci myšacej alebo ob génovej sekvencie.

Bolo objavené , že pri použití tohoto nového expresívneho vektora a hlavne pri použití signálnej sek· vencie kódujúcej sOmpA , môžu byť myšacie alebo ľud ské proteíny translokované do periplazmického priesto ru , kde sa signálny peptid príslušne štepí , zanechávajúc neporušený ľudský alebo myšací proteín v ro zpustnej a biologicky aktívnej forme .

Akonáhle sú v tomto periplazmickom priestore , sú ob proteíny účinne sekŕetované do bunkového roľného prostredia bez iných proteínov cicavcov po podrobení hostiteľských buniek chladiacemu osmotickému šoku , v ktorej dobe ob proteíny môžu byť čistené do homogeniny v biologicky aktívnej forme .

3/ Expresia ľudských alebo myšacích ob proteínov v transformovaných E.coli bunkách

Ďalej expresívne vektory konštruované podľa vyššie opísaných postupov sa inzertújú do hostiteľskej E.coli bunky ha transformáciu E.coli bunky . Môže sa použiť akýkoľvek kmeň E.coli , ako je E.coli Z-12 kmeň 294, ako je opísané v britskom patentovom spise číslo 2055582 A /ATCC č.31446 /. Iné kmene užitočné podľa tohoto vynálezu zahŕňajú E.coli MC1061 /Casadaban a Cohen , J.Mol.Biol.138, 179-207 /1980//, E.,coli B, E. coli X 1776 /ATTC č. 31557/, a Etebli W 5110 /ATCGL č. 27325 / alebo iné kmene , z. ktorých mnoho je uložené a sú dostupné z uznaných ukladacích zariadení mikroorganizmov.

Transformované E.coli bunky sú vypestované na príslušnú bunečnú hustotu a sú opatrované štandardný mi postupami . Pri takomto raste a pestovaní trans . formovaných E.coli hostiteľov expresie vektorov tohoto vynálezu účinne a výkonné umožňuje expresiu myša cích a ľudských ob proteínov a translokáciu týchto proteínov do periplazmy hostiteľských E.coli buniek v rozpustnej biologicky aktívnej forme .

Signálny peptid sOmpA , / to je časť 1 fúzneho proteínu / sa štiepi počas translokácie fúzneho proteínu do periplazmy , čím sa získa biologicky aktívny oh proteín bez iných preduktov cicavcov alebo polypeptidov . Špeciálne spôsob produkcie biologicky aktívneho rekombinantného ľudského alebo myšacieho ohézneho proteínu zahŕňe tieto kroky :

/a/ konštrukciu expresívneho vektora majúceho pr.omotorovú sekvenciu a DNA sekvenciu , kódujúcu protéín , ktorý zahŕňa SEKV ID Č:3 alebo SEKV ID Č:6 a signálny peptid na vonkajší membránový proteín A E.coli , /b/ inzerciu expresívneho vektora do E.coli. hostiteľskej bunky na transformáciu E.coli hostiteľskej bunky , /c/ expresiu fúzneho proteínu v E.coli hostiteľskej bunke , /d/ spracovanie E.coli hostiteľskej bunky chla diacim osmotickým šokovým pufrom na uvoľnenie layŠa cieho alebo ľudského proteínu bez iných cicavcových proteínov a bez signálneho peptidu .

Rekombinantne produkované ľudské alebo myšacie ob proteíny v rozpustnom biologicky aktívnom stave v periplazme transformovaných E.coli buniek sa potom vyčistí do homogenity.

Rekombinantné ľudské alebo myšacie ob proteíny trans1okované do bunkovej periplazmy podľa postupov tu opísaných , môžu byť účinne sekretované von z bunky podrobením hostiteľských buniek chladiacemu osmotickému šoku spôsobmi , ktoré sú známe a sú opísané D. Koehlandom a D. Botsteinom , Celí 20, 749- 760 /1980/ Použitie chladiaceho osmotického šoku uvoľňuje z E. coli ob proteíny v ich biologicky aktívnom stave bez ·· -v

- 22 iných cicavcových proteínov alebo polypeptidov .

ludäké alebo myšacie ob proteíny uložené v osmotickej kvapaline po chladiacom osmotickom šoku tras> nsformovaných E.coli buniek podľa vyššie opísaného pos tupu , sú biologicky aktívne a môžu byť vyčistené do homogenity pomocou kombinácie aniontomennéj stĺpcovej chromatografie , hydrofóbnej interakčnej stĺpcovej chromatografie a gelovej filtrácie . Aniontomenná a hydrofóbna intrakčná chr ornát ografia sa môže robiť v akomkoľvek poradí , avšak použitiu oboch musí predchádzať gelová filtrácia .

Aniontomenné štádium sa môže realizovať konvenčnými prostriedkami . Výhodný stĺpec pre aniontomennúú chromatograf i u je Q, Sepharose Fast Flow stĺpec . Vhodné aniontomenné chromatografické médiá zahŕňajú rôzne nerozpustné matrice , obsahujúce dietylaminometyl /DEAE/ alebo dietyl - /2-hydroxýpropy1 / aminoetyl /OAE/ skupiny. Matrice môžu byť akrylamid , agaroza , dextran , celulóza alebo iné typy. všeobecne používané pri čistení pro teínov . Obzvlášť užitočným materiálom pre aniontomenné chromatograf i u je DEAE -r Sephacel /Pharmacia , Uppsala,

Švédsko /.

Keň sá použijú médiá obsahujúce DEAE skupiny , potom extrakty , obsahujúce myšacie alebo ľudské proteíny sa aplikujú pri slabo zásaditom pH , napríklad pH 8,1 . Vybudované myšacie alebo ľudské proteíny môžu byť eluované vo vyššie vyčistenej forme aplikácie sof ného gradientu vo vhodnom pufri ako je tris- HCl.Všeobecne vlastnosti gradientu môžu byť určené predbežne elučnými experimentami , zahrňujúcimi malé množstvo rekombinantného proteínu .

Materiál , obsahujúci ľudský alebo myšací ob proteín získaný použitím aniontomennéj chromatografie, keä sa aniontomenná chromatografia použije ako prvé štádi23 um čistenia , sa Šalej podrobí hydrofóbnej interakčnej chromatografii . HydrofóSna interakčná chromatografia je separačná technológia , v ktorej sa látky separujú na báze rozličných síl hydrofóbnej interakcie s nenabudnutým vrstveným materiálom obsahujúcim hydrofdíne skupiny . Typicky sa hydrofóbny interakčný stĺpec najskôr vyváži za podmienok výhodných pre hydrof óbnu väzbu _t napríklad iontovou silou . Sa elúciu vzorky sa môže použiť klasajúci soľný gradient.

Môže sa použiť akýkoľvek hydrofóbny interakčný stĺpec . Výhodný hydrofóbny stĺpec je fenylová Separóza , avšak sa môže použiť tiež butylová Separóza.

Podľa vynálezu materiál , obsahujúci rekombinantný mašací alebo ľudský ob proteín , ktorý je eluovaný z aniontového stĺpca , sa naplní na stĺpec obsahujúci relatívne silný hydrofóbny gel , ako je fenylsefaróza . Na povzbudenie hydrofóbnej intarakcie s hydrofóbnym gélom sa použije rozpúšťadlo , ktoré napríklad obsahuje viac alebo rovnajúce sa 0,4M síranu amónneho , pričom 0,4M sa uprednostňuje .Tak sa stĺpec a vzorka nastavia na 0,4M síran amónny v 50 mM trispufri a vzorka sa nanesie do stĺpca . Stĺpec sa pre myje 0,4M pufrom síranu amónneho . Ob proteín sa potom eluuje rozpúšťadlami , ktoré zoslabujú hydrofóbnu interakciu , ako sú napríklad klesajúce soľné gradienty t etylén alebo propylénglykol alebo močovina.. Výhodné zhotovenie zahŕňa premytie stĺpca postupne tris- pu from obsahujúcim 20% etylénglykolu .

Ob proteín sa postupne eluuje zo stĺpca s gradientom klesajúcej koncentrácie síranu amónneho a zvyšujúcej sa koncentrácie etylénglykolu v tris-pufre. Spo ločne a postupné použitie aniontomennej chromatografie a hydrofóbnej interakčnej stĺpcovej chromatografie v a24 komkoívek poradí poskytuje ludský alebo myšací ob proteín rutinne v približnej čistote 90^.

Gelový filtračný chromatograficky krok pokračuje krokmi aniontomennej chromatografie a hydrofóbnej interakčnej stĺpcovej chromatografie uvedenej vyššie a môže sa realizovať akýmkoívek konvenčným postupom gelovej filtrácie . Ob proteín eluovaný z hydrofóbneho interakčného stĺpca alebo z aniontomenného stĺpca , pri čom ktorýkoívek z týchto stĺpcov môže byt použitý ako posledný , môže byt koncentrovaný a dialýzovaný na malý objem použitím membrány s vyhranenou molekulovou hmotnosťou 10000 /AMICON YM 10 membrána/. Koncentrovaný materiál potom môže byt naplnený do stĺpca , obsahujúceho gelové filtračné médiá , ako je G100 Sephadex / Pharmacia , Uppsala , Švédsko / . Ob proteín potom môže byt separovaný od iných nečistôt na báze svojej molekulovej hmotnosti štandardnými postupmi , užívajúcimi SDS-PAGE.

Spoločné a postupné použitie aniontomennej chromatografie , hydrofóbnej interakčnej stĺpcovej chromatografie a gelovej filtrácie rutinne poskytuje íudský alebo myšací ob proteín v 95^ nej čistote.

N-terminálové aminokyselinové sekvencovanie vyčisteného myšacieho alebo íudského proteínu sa môže realizovať známymi postupmi , napríklad elektrotransferom podlá spôsobu Laemliho , U.K.,Náture 227, 680-685 /1980/ alebo postupmi opísanými Matsudairaom, F.,J. Eiol.Chem. 262, 1OO35^- 10038 /1987/ . Interné sekvencovanie sa môže taktiež robiť známymi spôsobmi . Napríklad peptidové fragmenty môžu byt vytvorené digeráciou M pásu / na nitrocelulóze / s endoproteinázou Lysine C a potom separované HPLC systémom .

Biologická účinnosť vyčistených íudských a myšacích ob proteínov tohoto vynálezu je taká , že čas25 té podávanie ob proteínu injekcií ludským pacientom alebo myšiam vedie k zníženému príjmu potravy a k zníženej miere hmotnostného prírastku v porovnaní s injektovanými kontrolnými skupinami subjektov. E

Biologická aktivita ľudských a myšacích ob proteínov alebo ich fragmentov získaných a vyčistených podía tohoto vynálezu sa m<?že testovať rutinnými spôsobmi , napríklad opakovanou alebo jedinou intňacerebroventrikulárnou /ICV/ injekciou pri ob/ob myší. ; po-

día	postupov	Haley,T.J. a kol, viä vyššie ,	ako	je opi
sané	podrobne	v príkladoch zhotovenia 13	a 16.	Na zá-
klade	í tohoto	ICV testu ED50 na zníženie	pri jmu	pot -
ravy t ku	a ED50 môžu byť	na zníženie telesného hmotnostného určené .	príras

Naviac biologická aktivita vyčisteného íudského a myšacieho ob proteínu alebo ich fragmentov môže byt určená opakovanou IP injekciou pri ob/ob jmyší ~, ako je podrobne uvedené v príkl. 15. Na základe IP tes tu môže sa určiť EĽ20 na zníženie príjmu potravy a ED2O na zníženie telesného hmotnostného prírastku .

Biologická aktivita íudských a myšacích ob proteínov alebo ich fragmentov získaných a vyčistených podía tohoto vynálezu môže byt určená tiež pri íuäoch známymi postupmi , napríklad redukciou príjmu testová neho jedla po IV podaní ob proteínu obéznym ludským testovaným subjektom v porovnaní s IV podaním soínej kontroly podía postupov MUurahainena , N.E. a kol., Am. J.Physiol . 260, 672-680 /1991/ a ako je opísané po drobné v príkladoch 14 a 17.

Alternatívne schopnosť vyčisteného myšacieho a íudského ob proteínu tohto vynálezu znižovať mieru hmo26 tnostného prírastku / napríklad vyvolat stratu hmotnosti / môže byt určená opakovaným IV podaním obéznym iuds kým testovaným subjektom podlá spôsobu , ktoré opísal

Drent , M.L. a kol., Int.J.Obesity 1$, 221-226 /1995/, ako sa opisuje podrobne v príklade 18.

Myšacie a ludské ob proteíny tohto vynálezu , keá sú vyčistené pódia tohto vynálezu majú aktivitu v tom, že :

1/ keá sa podajú intracerebroventrikulárne /ICV/ injekcie 16 až 18 hodín hladujúcim dospelým obéznym ob/ob myšiam majúcim telesnú hmotnosť aspoň 30g, v dávke 20 mikrogramov alebo menej za použitia metód Haleyho a Mc Cormicka , viá vyššie , proteín alebo polypeptid :

/a/ redukuje príjem potravy počas 5 hodinového kŕmneho testu o 50# v porovnaní s vehikulom injektovaným kontrolným myšiam /ED50 na zníženie príjmu potravy/ , /b/redukuje prírastok telesnej hmotnosti počas 24 hodín po ICV,' injekcii aspoň o 50# v porovnaní k vehi— kule injektovanému kontrolným myšiam /ED50 na zníženie prírastku telesnej hmotnosti , a

2/ keá sa podajú intraperitoneálne nevyhladnutým dospelým ob/ob myšiam majúcim telesnú hmotnost aspoň 30g ,

2x denne na začiatku denného svetla a znovu v trojhodinovom bode fázy tmy počas 1 týždňa v celkovej dennej dávke 20 mikrogramov alebo menej , proteín alebo polypeptid :

/a/ redukuje 5 a 24 hodinový príjem potravy aspoň o 20 % v porovnaní s vehikulom injektovaným kontrolným myšiam /ED20/ na zníženie príjmu potravy a /b/ redukuje prírastok telesnej hmotnosti počas 24 hodín po prvej injekcii IP aspoň o 20#v porovnaní s vehikulom injektovaným kontrolným myšiam /ED 20/ na zní27 ženie prírastku telesnej hmotnosti .

Naviac sa táto redukcia telesnej hmotnosti a príjmu potravy dokonca uskutočňuje pri dávkach pod 20 mikrogramov alebo menej , hlavne ak sa tieto proteíny vyčistia do homogenity .

Vyššie opísané biologické skúšky a podrobne uvedené zhotovenie v príkladoch na určovanie biologickej aktivity ľudských alebo myšacích proteínov môžu byť použité na určovanie biologickej aktivity fragmentov týchto proteínov , či sú tieto fragmenty produkované proteolytickou degradáciou ob proteínu , chemickou syntézou rekombinantného proteínu , expresiou časti DNA sekvencie na ob proteíny, alebo akýmikoľvek inými prostriedkami známymi odborníkom v odbore.

Podľa ňalšieho zhotovenia tohto vynálezu môže byť myšací a ľudský proteín tohto vynálezu konjugov-aný. s polyetyle alebo polypropylénglykolovými homopolymérmi, ktoré môžu byť nesubstituované alebo substituované éterifikáciou jednej z hydroxyskupín na jednom -ž© sťojich koncov nižšou alkylovou skupinou · Tieto konjungáty zaisťujú ob proteín v stabilnej forme a zlepšujú polčas týchto proteínov . Naviac použitie týchto konjkugátov vytvorených z polyetylénglykolových alebo polypr opylénglykolových homopolymérov tvoria prostriedok na zvýšenie polčasu aktivity ob proteínu v tele.

Ďalej , ako sa zistilo , tieto konjugáty zaisťujú 3alšie výhody , ako je zvýšenie stability a cir kulačné doby terapeutického proteínu v tele , pričom sa tiež zníži imúnnogennosť ob proteínu . Tieto pegylóvané proteíny môžu byť tiež ľahko absorbované v ľudskom tele a zaisťujú zvýšené hladiny v krvnom systéme.

Výhodné polyetylén alebo polypropylénglykolové homopolyméry ktoré sú konjkugované na ob proteín , ipajú molekulové hmotnosti približne 15 až 60 kDa , čím vznikne pŕpteín, ktorý môže byť mono - alebo polypegylovaný s polyetylén alebo polypropylénglykolovými molekulami . Vo výhodnom prípade je ob proteín bud mono- alebo dipegylovaný , čím vznikne konjugát s polyetylén alebo polypropylénglykolovými jednotkami , ktoré v konjugáte majú celkovú molekulovú hmotnosť 15 až 60 kDa , najvýhodnejšie 35 až 45 kDa.

Všeobecne sa konjugáty produkujú ako zmes /kompozícia / polyetylén a polypropylénglykolových kunjugátóv, pretože polyetylén a polypropylénglykolové yých®^ískové materiály sa predávajú ako zmesi rôznych homopolymérov majúcich rôzne molekulové hmotnosti . Molekulová hmotnosť uvedená vyššie je priemerná molekulová hmotnosť zmesi ob konjugátov takto zhotovených . Tieto zmesi môžu byť rozdelené na jednotlivé konjugáty, ked je tre ba , konvenčnými prostriedkami , ako je stĺpcová chro matografia , ktorá zahŕňa HPCL . Avšak na liečenie sa všeobecne tento konjugát využíva ako zmes.

Polyetylénglykolové alebo polypropylénglykolové polyméry /PEG/ môžu byť pripojené k ob proteínu pomocou voľnej N-terminálnej aminokyseliny proteínu , čím sa vytvorí konjugát akýmikoľvek konvenčnými prostriedkami . Spôsob pripojenia polyetylénu alebo polypropylénglykolu na vytvorení konjugátov s ob proteínom môže byť akýmkoľvek z mnohých známych spôsobov teraz dostupných . Polyetylén alebo polypropylénglykol môže byť kovalentne viazaný cez N- terminálnu animokyselinu proteínu rovná« ko ako cez rôzne lysinové zvyšky na ob proteíne.

Naviac polyetylén alebo polypropylénglykolové homopolyméry môžu byť konjugované k ob proteínu bi - alebo polyfunkčnými väzbovými skupinami . Pri produkcii monopropylén alebo polypropylénglykolových homopolymérových konjugátov sa používajú difunkčné spájače a homopoly 29 mér sa konjuguje na jednu funkčnú skupinu tohto spájača , pokiaľ N-terminálna aminokyselina rovnako ako lysinová skupina oh proteínu môžu sa konjugovať na druhú funkčnú skupinu tohto spájača .

Tri - alebo poly-/polyetylén alebo polypropylénglykol/polymerové konjugáty s ob proteínom sa vytvoria použitím trifunkčného alebo polyfunkčného spájača . Homo polymér môže byť konjugovaný k dvom alebo viacerým týchto funkčných skupín s jednou zostávajúcou funkčnou skupinou spájača , pripojenou k ob proteínu .

Medzi týmito spájačmi sú polyfunkčné spájače majúce aminové a karboxy funkčné skupiny . Aminové skupiny môžu konjugovať s funkcionalizovanou hydroxyskupinou polyetylén alebo polypropylénglykolu , čím sa vytvorí amidové spojenie . Karboxyskupiny môžu konjugovať s amidovou skupinou na ob proteíne , čím sa vytvorí amidová väzba a s funkcionalizovanou hydroxyskupinou na glykole , Čím vznikne ester . Medzi mnohými typmi väzbových skupín , ktoré môžu byť použité na vytvorenie konjugátu medzi ob proteínom a PEG sú skupiny zverejnené v US patentoch číslo 4 902, 5 034 514, 4 609 546,

122 614 a 4 847 325 .

Podľa obzvlášť výhodného zhotovenia tohto vynálezu majú tieto konjugáty vzorce

MH

R'OCH₂CH₂(OCH₂CH₂)_n, — O - C-M ^(CH2>4 (I-A)

ROCH₂CH₂(OCH₂CH₂)_n

C,-NH

CH z\

-NH·

II

II

RO(CH CH-O) CH-CH- -ξ -NH-? (I-E) z z n z z >

kde P je myšací alebo ľudský ob proteín tu opísaný , ä n a n* sú celé čísla , ktorých súčet je ód 300 do 1200, takže priemerná molekulová hmotnosť všetkých PEG jednotiek je od 15 do 60 kDa a celko vá molekulová hmotnosť konjugátu je od 30 kDa , a R a R* sú nižšie alkyly .

Zlúčeniny vzorca I-A a I-B môžu byť pripravené zo známych polymérových materiálov r'och₂ch₂(och₂ch₂)_n, o — C -NH (ch₂)₄ (II-A)

ROCH^CH₂(OCH₂CH₂)_nRO(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂

CK / \

ich kondenzáciou s myšacím alebo ľudským ob proteínom tohto vynálezu .

Akýkoľvek konvenčný spôsob reakcie aktivizovaného esteru s aminom na vytvorenie amidu môže byt použitý ; Pri vyššie znázornenej reakcii príkladný sukcinimidylester je odstupujúcou skupinou vyvolávajúcou tvorenie amidu . Ak sa použije zlúčenina vzos-r rca II-B na . produkciu zlúčeniny vzorca Ι·»Β , reakcie s myšacím alebo ľudským ob proteínom tohto vynálezu sa robí rovnakým spôsobom , aký je opísaný v spojení s konverziou zlúčeniny vzorca II-A na zlúčeninu vzorca I-rA. Tieto sukcinimidylestery ako je zlúčenina vzorca II-A produkcie konjugátov s proteínmi sú zverejnené v Monfardini a kol. Bioconjugate Chem.,6, 62-69 /1995/ .

V prípade zlúčeniny vzorca I-Ä súčet n a n* je od 300 do 1500 , takže vznikne konjugát , majúci celkovú priemernú molekulovú hmotnosť PEG jednotiek od 15 do 60 kLa a výhodne od 35 do 45 kĎa. Pri výhodnom zhotovení vzorca I-A je súčet n a n* asi od 800 do 1200, pričom; priemerný súčet n a n' je od 850 do 1000 . Všeobecne je výhodný pomer n a n* v zlúčeninách vzorca I-A a II-A od 0,5 do 1,5 * pričom 0,8 až 1,2 je uprednostnený .

V prípade zlúčeniny vzorca I-B je n výhodne medzi 300 až 1500 , čím vznikne zlúčenina , majúca 300 až 1500 PEG jednotiek a celkovú molekulovú hmotnosť od 15 do 60 kDa a výhodne od 35 do 45 kDa. Vo výhodnom zhotovení je n asi od 850 do 1500 .

Ľudské alebo myšacie proteíny pripravené podľa tohoto vynálezu môžu byť pripravené vo farmaceutic kých zmesiach, vhodných na injektovanie so zlučiteľným farmaceutický prijateľným nosičom alebo vehikulom známymi postupmi . Môže sa použiť akýkoľvek konven - 32 čný nosný materiál .

Nosný materiál môže byť anorganický alebo orga nický, vhodný na enterálne , perkutánne alebo par.enterálne podanie . Vhodné nosiče zahŕňajú vodu , želatínu , arabskú živicu , laktózu , škrob , stearan horčičnatý , talok , rastlinné oleje , polyalkylenglykoly , ropné vazelíny a podobne.

Ďalej farmaceutické prípravky môžu obsahovať iné farmaceutický aktívne prostriedky . Ďalšie aditíva , ako sú aromatizačné prísady _f ochranné prísady , sta bilizátory , emulgátory , pufry a podobne môžu sa pri dať podľa akceptovateľných praktík farmaceutického miešania . Medzi výhodnými nosičmii pre formuláciu homogénnych ob proteínov tohto vynálezu sú ľudský sérový albumín » ľudské plazmové proteíny atä .

Podanie rekombinantného homogénneho ob proteínu ľudského alebo myšacieho alebo ich kombinácií , má za následok znížený príjem potravy a štrátu hmotnosti u obéznych ľudí a zvierat ·. Teda podanie ob proteínu dopĺňa tento proteín , ktorý je dôležitý pri regulácii telesnej hmotnosti ,

Farmaceutické zmesi , obsahujúce ľudské ⁰ alebo myšacie oh proteíny , môžu byť formulované v sile účinnej na podanie rôznymi prostriedkami ľudskému alebo živošíčnemu pacientovi , pričom sa berú do úvahy abnormálne fluktuácie telesnej hmotnosti , alebo samosta* tne alebo ako časť nepriaznivého liečebného stavu . alebo choroby , ako je diabetes· mellitus typ II. Môžu sa využiť rôzne techniky podávania ,· ako je injekcia , medzi nimi subkutánna , intravenózne a intraperitoneálne injekcie . Priemerné množstvá · ob proteínu sa môžu meniť a hlavne by mali- byť založené na doporuČeníach a predpisoch kvalifikovaných lekárov a veterinárov.

Ľudské alebo myšacie ob proteíny· pripravené podľa tohto vynálezu môžu sa tiež použiť pri s screeningových metódach na identifikáciu ob · proteínového receptora alebo proteínových receptorov .

Ďalej uvedené príklady zhotovenia nie sú určené na akékoľvek obmedzenie vynálezu ,

Stručný opis výkresov

Obr. 1 je schéma dvoch klonov pre ľudský proteín, to je hob cll a hob cl2, ktoré schematicky znázorňujú uloženie a typy reštrik čie miest, uložených v 5- a 3- koncoch ľudskej ob cDNA sekvencie.

Obr. 2 je schéma konštrukcie pLPPsOmpA mob expresívneho vektora .

Obr. 3 je schéma konštrukcie pLPPsOmpA hobl expre sívneho vektora ♦

Príklady zhotovenia vynálezu

Príklad 1

Získanie ľudského ob cDNA

Ľudský ob cDNA sa získal triedením komerčne dostupného lambda fágu cDNA banky /‘'Clontech” / pripraveného z RNA odvodenej ž ľudskej adipocytnéljo tkaniva . Z tejto banky sa získali dve lambda fágy, z ktorých každý obsahoval približne 2,5 kilobáz fragmentu zodpovedajúceho ľudskej ob cDNA sekvencií pomocou hybridizácie lambda fágových bank . Pri tejto technológii boli identifikované dva klony , to je hobl CDNA a hob2 cDNA . Ľudský ob gén sa subklonoval do plazmidového vektora DNA pBluescriptSk” komerčne dostupného zo Stratagénu . Výsledné vektory obsahujúce tieto ľudské ob génové sekvencie boli nazvané pBluescriptSk” komerčne dostupného zo Stratagénu . Výsledné vektory obsahujúce tieto ľudské ob génové sekvencié boli nazvané . pBluescriptSk” hobl a pBluescript” hob2»

Ľudská ob génová sekvencia v tomto úBluescript” Sk hobl a pBluescriptSk” hób2 sa overili nukleotič ným sekvencovaním . Aminokyselinové sekvéncie proteínu dedukovaného z nukleotidového sekvenee.ovania zodpovedajú ľudskému ob proteínu kódovanému SEKV ID Č:4 a ako jé zverejnená Zhangom , Y.a kól., vi3 vyššie. Tento pBlu escriptSk “hobl mal T-C mutáciu za terminačňým kodónom hobl £DNA. Táto mutácia mala za následok stratu Stul reštrikčného miesta inak predpokladaného , že je prítomné v nukleotidovéj sekvencií hobl nasledujúco:

hob 1

.... GGG.TGČ.TGA GGCCT TGA... Gly Cý? stop pBluescriptSk“hobl

...,GGG.TGC.TGA GGCCC TGA... Gly Cys stop pBluescriptSk’hob. .2 ...GGG.TGČ.TGA GGCCT TGA

Gly Cys stop

Pretože táto mutácia v pBluescriptSk“ hobl je uložená za terminačným kódónom ľudskej ob cDNA sekvencie , neprivádza to ku zmene aminokyselinovej sekvencie ľudského ob proteínu , ako je publikované Zhangom , Y, a kol., viá vyššie .

Ak sa jedná o nukleoidovú sekvenciu cDNA , prítomnú v pBluescriptSk”hob2 , demonštrovalo sa reštrikčnou enzýmovou analýzou , že tento plazmid má Stul reštrikčné miesto , nachádzajúce sa za terminačným kfccLÓňoa ľudskej ob cDNA sekvencie.

Baviac k faktu , že pBlúescriptSk“hobl má mu táciu v Stul reštrikčnom mieste nasledujúcom terminačný kodón , má taktiež pBluescripť’hobl EcoRl reštrikčné miesto za ORF v hobl cDNA , ktoré absentuje v hobä cDNA /viá obr. 1/ .

Príklad 2

Plazmidová konštrukcia pre ob myšací protein /mob/ . Myšacia ob cDNÄ SEKV ID Č:1 sa získala postupom Zhanga,Y. a kol., viä vyššie , a potom inzertovaná do pCDNA3 vektora komerčne dostupného od firmy Intro gén / San Diego, Californie, USA/. Myšací ob gén takto získaný sa použil na konštrukciu expresívneho ve ktorá pLPPsjDmpA- mob na expresiu myšacieho proteínu ob /mob/. Tento expresívny vektor a jeho konštrukcia je podrobne zobrazená na obr. 2.

Prvé štádium konštrukcie sa dosiahlo fúziou signálnej - kódovacej sekvencie z sOmpA génu do zrelej kódovacej oblasti myšacieho génu , to je bez jeho prirodzenej signálnej sekvencie DNA fragment 5Olbp kódujúci zrelý myšací ob protein , inzertovaný v pCDNA.3 vektori sa amplifikoval z tohto vektora poly merašovou reťazcovou reakciou /PCR/ pri použití Vent DNA polymerasy /New England Biolabs / pôvodného primeru /primer 1/ , vychádzajúc s prvým nukleoidom ko dónu kódujúceho valín / ktorý je prvou aminokyselinou v .zrelom mob/ /Zhang,Y. a kol., viä vyššie / a reverzného primeru /primer 2/ zodpovedajúceho miestu mob obsahujúci terminäčný kodón mob. Primer 2 tiež obsa hoval sekvenciu zodpovedajúcu Hind III reštrikčnému miestu .

Primer 1:5' GTG CCT ATC CAG AAA GTC 3'

Val Pro íle Glu Lys Val J

I

- -Primer 2: 5' TCCCÄAGCTT TCAGCATTCAGGGCTAAC 3'

HindlII stop

Amplifikovaný 501 bp DNA fragment bol vyčistený agarosovou gelovou elektrof orézou a f osf orylovaný za použitia T4 polynukleótidovej kinasy /VBoéhringer / a potom digerovaný s reštrikčným enzýmom HindlII, čím vznikol 5* vyčnievajúci koniec primeru 2.

Získaný fragment mal zarovnaný koniec zodpovedajúci prvému nukleoidu cDNA kódujúci zrelý mob a 5* vyčnievajúci koniec , zodpovedajúci štspenéa^i Hind III miestu .

Ďalej sOmpA plazmid pTlOsOmpArPDI získaný postupmi De Suttera ,K. a kol, vió vyššie, sa fúzoval dó mob génu na vytvorenie pTlOsCsnpAmob plazmidu . Na toto zhotovenie sa mob fragment klonoval ligáciou za použitia T4 ligasy /New England-Biolabs / do pTlOsOmpArPDI vektoru DNA , ktorý bol predtým degero vaný s reštrikčnými enzýmami Nael a HindlII , spô sobmi známymi v doterajšom stave techniky / Šambrook, J. a kol. v Molecular Cloning :A Iaboratory Manual” druhé vydanie , Cold Spring Laboratory Press , Cold Spring Harbor, New York, 1989.

Tento pTlOsOmpArPDI bol odvodený z plazmidu p714 /Parker a Wilex, Gene 83,117-134 /1989//. Tento plazmid obsahoval cDNA kódujúcu zrelú krysiu prote · ínovú disulfidovú izomeráziu /rPDI/ cDNA fúzovanú do sOmpA sekvencie .

v s OmpA /alanín/ rPDI /glycín / vyktoré po štiepení v sOmpA sekvencii rPDI sekvencii ako

Táto fúzia posledného kodónu do prvého kodónu v cDNA zrelého tvorila Nael reštrikčné miesto , Nael uvoľnilo reštrikčný kodón a prvý kodón v cDNA kódujúcej zarovnané konce ·

Nael

5'......CCGL./ GGC..........3'

Ala Grly sOmpA cDNA / zrelá rPDI cDNA

Hind. III miesto existuje na konči cDNA kódujúcej rPDI- . Teda äalšia digerácia tohto . plazmidu s HINDIII uvoľnila hlavnú čsusť rPDI a vytvorila 5' vyčnievajúci koniec kompatibilný s jedným z koncov PCR fragmentu . Výsledný plazmid , kde cDNA kódujúca rPDI bola nahradená cDNA kódujúcou zrelý myšací ob , bola označená pTlOsOmpAmob a je znázornená na obr. 2.

Ligatovaná DNA sa zaviedla do E.coli kmeňa MC1061 za použitia štandardnej elektroporácie a získané kolónie sa preskúmali na prítomnosť myšacieho ob DNA fragmentu reštrikčnou enzýmovou analýzou . Kloň pTlOsCmpAmob mal sekvenciu kódujúcu zrelý myšací ob pro teín fúzovaný do sekvencie , kódujúcej sOmpA .

íjalej exprešia mob v E.coli v tomto pTlOmpAmob bola uložená pod kontrolou ako lipoproteínového pro motora /^ipp/» tak ^lac promotora operátora /P0_lac/ · Aby sa to zhotovilo , hybridná génová sOmpA sekven cia sa Urobila z plazmidu pTlOsOmpAmob do plazraido vého vektora pLPPsOmpArPDI štandardnými postupmi , opísanými v De Suttérovi a kol., viä vyššie . Tento pLPPs OmpArPDI plazmid bol odvodený , ako už bolo skôr napísané , z plazmidu p7l4 /Parker a Wiley, Gene 83, 117134 /1989/ .

Pre tento krok bol plazmid pTlOsOMPaMOB DNA rozštiepený reštrikčnými enzýmami Xbal a Hind III. Fragment obsahujúci sOmpAmob kódujúci DNA bol potom liga39 tizovaný dó plazmidu pLPPšOmpArPDI . , z ktorého s®mpA-rPDI kódujúca DNA bola predbežne odstránená štiepením reštriktívnymi enzýmami Xbalľ a HindlII. Výsledný plazmid bol nazvaný pLPPsGmpAmob.

Príklad 3

Expresia myšacieho ob proteínu v E.coli /MCI06I/

Expresiä myšacieho 'ob proteínu v E.coli sa dosiahla nasledovne : Tento pLPPsOmpAmob plazmid konš truovaný podľa príkladu 2 bol inzertovaný elektro proporáciou do E.coli kmeňa MC1O61 . E.coli bunky /MC1O61/ chovajúce plazmid pLPPsOmpAmob sa rozpesto vali cez noc pri 28° C v Luria-BATtania /Difco Laboratories/ médií doplnenom antibiotickým karbenicillínom /100 mikrogramóv na ml , Beecham/ . Táto kultúra potom bola použitá ako inokulum v tom istom médiu . Táto kultúra potom bola zriedená stonásobne v troch litroch /napríklad 6x 0,5 1 v jednolitrových Erlenmayerových bankách /vo vyššie uvedenom médiu a mixovaná pri teplote 28°C v New Brunswick air shakeri. /300 ot/rain / v dobe asi 4 hodín , pokiaľ sa nedosiahla hustota Ag₀₀0,3 až 0,5· V tejto dobe bol lac promotor zavedený prídavkom 2mM finálnej koncentrácie izopropyl - beta - D- tiogalaktopyronozidu /IPTG, Boehringer/ ako je opísané v De Sutter a kol., vi3 vyššie .

Bunky sa 3alej inkubovali pri 28°C počas doby asi 5 hodín , pokiaľ hustota buniek nedosiahla Α^θθ

1,3 až 1,5 .

Potom boli bunky, zhromaždené odstredením v JAlO rotore /Beckmanove odstredivkové modely J2-21 alebo

J2-21M / počas 6 minút pri 6750 otáčkach za minútu /8000 x g / pri 4°C . Supernatant sa odstránil á bunečné pelety sa resuspendovali rýchlo v 250 ml ľadovo chladnom osmótickom šokovom pufri /1000mK tris-HCl , pH 7,4 , obsahujúci 20% sacharózy lOmM EDTA / a inkubované na ľade počas doby 10 až 20 minút , ako je opísané Koshlandom a Botsteinom , viď vyššie .

Potom sa suspenzia previedla do plastických odstredivkových trubíc a bunky zhromaždené odstredením pri 8 200 otáčkach za minútu /8 OOOx g/ počas 5 mi nút pri teplote 4° C v JA20 rotore . Supernatant sa odstránil a bunečné pelety rýchlo resuspendované v 120 ml ľadovo chladnej vody za živého mixovania.a in kubované na ľade ďalších 10 minút .

Suspenzia potom bola odstredená v JA20 rotore počas 6 minút pri 4° C pri 11 500 otáčkach za minútu /16 000 x g / a supernant odpovedajúci periplazmatickej frakcii / osmotická šoková tekutina / sa nahromadil /približne 120 ml /. Azid sodný tris-HCl /pH

7,5 / boli pridané do konečnej koncentrácie 0,5 % a 50 mM , príslušne . Osmotická šoková tekutina obsahujúca myšací ob proteín bola uskladnená pri -20 °C až do Ďalšieho použitia .

Príklad 4 '

Expresia myšacieho ob proteínu v E.coli /MC1061/

Expresia myšacieho ob proteínu bola získaná podľa postupu opísaného v príklade 3 okrem toho , že triacillín /100 mikrogramov /ml j bol antibiotikom po41 užitým ako prídavok Luria - Bertaria média / oproti karbenicilínu / .

Príklad 5

Čistenie myšacieho ob proteínu z E.coli osmo tickej tekutiny .

Myšací ob proteín uložený v 120 ml zmrazenej osmotickej šokovej tekutiny podľa príkladu 4 bol vyčistený nasledovne : 120 ml osmotickej šokovej te kutiny obsahujúcej myšací ob proteín b©l® rozmrazené a odstredené pri 4°C počas 20 minút pri 16 000 otáčkach za minútu v JA20 rotoru na odstránenie nerozpustného odpadu . Supernatant sa potom naplnil pria mo na stĺpec obsahujúci 30 ml objemovej vrstvy QSepharose Pást Flow /'’Pharmacia ”/ pred vyrovnané 50mM tris-HCl /pH 7,5/ pufru . Po premytí 50 mM tris- HCl /pH 7,5 pufrom /vbol . siob'-proteín kelfcevaný 50 mM tris-HCl /pH 7,5 / pufra , obsahujúcim 0,1 M NaCl.

Ďalej sa pridal tuhý /NH^/₂S0^ do materiálu eluovaného z Sepharose Fast Flow obsahujúceho stĺpca do konečnej koncentrácie 1,0 M a zmes sa naplnila na stĺpec obsahujúci 7,5 ml objemovej vrstvy Butyl-Sepharose Fast Flow /Pharmacia·’/ predvyváženej 50mM tris-HCl /pH 7,5/ pufra obsahujúceho 1,0 M síranu amónneho . Po premytí tris-HCl /pH 7,5 / pufrom obsahujúcim 1,0 M síranu amónneho bol mob proteín eluovaný pomocou gradientu od 1,0 M síranu -amónneho v 50 mM tris-HCl /pH 7,5/ pufra do 20 % -ného etylénglykolu vo vode . Mob proteín eluoval z Butyl-Sepharose Fast Flow stĺpca na samom konci gradientu , pokiaľ väčšina nečistôt eluovala omnoho skôr . Čistota mob proteínu v tomto stupni bola 90% , ako sa zistilo striebrom označenou polyakrylamidovou gelovou elektroforézou /PAGE/ .

Mob proteín v materiáli eluovanom z Butyl-Sepha rose East Elov obsahujúceho stĺpca sa potom ďalej vyčistil gelovou filtračnou chromatografiou . Aby sa to urobilo , bol myšací ob protéín koncentrovaný pri 4°G^: do objemu 1 ml na YM1O /Amocin/ membráne za použitia 8MC koncentračnej jednotky /^HAmicon’'/ a bol aplikovaný do stĺpca /1,0 cm x 50 cm / obsahujúceho 39 ml GlOO-Sephadexu /Pharmacia/ predvyváženého vo fosfátom pufrovanom soľnom roztoku . Frakcie obsahujúce mob proteín sa potom združili a proteín koncentrovaný na YM10 membráne. V tomto štádiu bol mob proteín čistejší viac ako 95 % , ako bolo stanovené PAGE a značením striebrom . SDS-PAGE vykázal jediný proteínový pás pri Mr 15 000.

Príklad 6

Sekvenčná analýza myšacieho ob proteínu

N- terminálna aminokyselinová sekvencia myšacieho ob proteínu získaná a vyčistená postupmi z príkladov 2,3,4 a 5 » vyššie opísanými , bola vytvorená postupmi podľa Laemli , U.K., viď vyššie , Po elektrotransferu elektro£orezovaných proteínov do poly / 4-vinylN-metylpyridiniumjodidom / potiahnutej sklenej vláknitej vrstvy , ako je opísané Bauw, G.a kol.J.Biol.Chem. 7, 194-196 /1988/ . Pás proteínu s Mr 15 000 bol excizovaný z membrány a N-terminálna aminokyselinová sekvencia bola určená Edmanovou degradáciou na 47OA plyno vom fázovom sekvenátore , vybavenom 120A on line fenylthiohydantoinovým aminokyselinovým analyzátorom /Applied Biosystems»/ . N-terminálna aminokyselinový sekvencia myšacieho ob proteínu získaná vyššie opísanými postupmi , bola Val-Pro-Ile-Gln , čo zodpovedá zrelému myšaciemu ob proteínu SEKV ID Č:3 ·

Príklad 7

Konštrukcia expresívneho vektora pre ľudský ob proteín /hob/

Ľudský ob gén získaný v súhlase s postupmi z príkladu 1 sa využil ku konštrukcii expresívneho vektora pLPsOrapAhobl na expresiu ľudského ob proteí nu. Táto konštrukcia bola podobná konštrukcii pIPPsOmpAmob , opísanej v príklade 2 a je podrobne znázornená na obr. 3. Trojfragmentálna ligácia bola požadovaná pre kompletáciu DNA fragmentu obsahujúceho celú zrelú ľudskú ob kódujúcu sekvenciu .

V prvom štádiu konštrukcie bola hob nukleoti dová sekvencia vychádzajúca s prvým nukleotidom kodónu kódujúceho prvú aminokyselinu zrelého ľudského ob proteínu /valín/ , fúzovaná do signálne kódovacej sekvencie OmpA /sOrapa/ , tak , že sOmpa sekvencia je proti smeru od 5* konca hob nukleotidovej kódujúcej sekvencie . Tento DNA fragment sa získal amplifikáciou v PCR zmesi obsahujúcej plazmid pBluescriptSK” hohl , vent DNA polymerasu a dva primery.

Predný primér /primer 1/ vychádzal s prvým nukleotidom kodónu kódujúceho prvú aminokyselinu zrelého ľudského proteínu a reverzný primer /primer 2 /. obsahoval sekvenciu ľudského cDNA obsahujúcu terminačný kodón .

Amplifikačná reakcia poskytla DNA fragment o 501 hp obsahujúci sekvenciu kódujúci zrelý ľudský ob proteín . 5* koniec tohoto DNA fragmentu sa potom fosforyloval/ T4 polynukleotidovou kydásou a digeroval/ s reštrikčným enzýmom HindlII , čím sa získalo 353 bp DNA fragmentu majúceho zarovnaný koniec odpovedajúci prvému nukleotidu cDNA kódujúci zrelý hob /pozícia zodpovedajúca primeru 1 a 5* vyčnievajú44 ci koniec zodpovedajúci štepenému HindlII miestu . Tento 353 bp DNA fragment bol vyčistený agarosovou geiovou elektroforézou a klonovaný v pTlOsOmpArPDI plazmidu , ktorý bol predtým digerovaný s reštrikč nými enzýmami Náe I a HindlII . Výsledný plazmid pTlOsOmpAhobl /paraciálny / má DNA fragment kódujúci časť zrelého ľudského ob proteínu /aminoterminálna časť / fúz ovanú do sekvencie kódujúcej sOmpA.

Primer 1: 5 'gTGCCQATCCAAAAAGTC; 3*

Primer 2: 5/ťcCCAAGCTTTCAGGACCCAGGGCTGAG 3' stop

V druhom kroku DNA sekvencie kódujúce karboxy terminálovú časť ľudského ob proteínu , to je fragment 2 , bola viazaná do DNA fragmentu kódujúceho aminoterminálnú časť zrelého hob a výsledný fragment kódujúci celú zrelú hob sekvenciu fúzovaný dó sOmpA sa transferoval do plazmidu pLPPsOmpArPDI , Čo viedlo k expresii zrelého ľudského ob proteínu v E.coli za riadenia lipoprotéínového promotora a lacpromotora - operátora . Aby sa to urobilo , bol plazmid pTlOsOmp Ahobl /parciálny / digerovaný s Sbal a HindlII a 400 bp DNA fragment 1 hob bol izolovaný agarosovou geiovou elektroforézou /fragment 1/ . Ďalej bol plazmid pBluescriptSK“hobl štiepený s HindlII a EcoRl a 450 bp bo lo izolované agarosovou geiovou elektroforézou /frag ment 2/ ·

Nakoniéc bol plazmid pLPPsOmpArPDI štiepený s Xbal a EcoRl a vektorový fragment izolovaný agarosovou geiovou elektroforézou / fragment 3/ ·

DNA fragmenty 1 , 2 a 3 potom boli viazané k sebe a ligačná zmes zavedená do E.coli kmeňa MC1061.

Kolónia obsahujúca konečnú plazmidovú konštrukciu pLPsOmpAhobl sa použila na expresiu a sekréciu zrelého ľudského ob proteinu .

Príklad 8

Expresia ľudského ob proteinu E.coli /MC1O61/ pLPPsOmpAhobl konštruovaný v súhlase s príkla dom 7» bol použitý na transformáciu E.coli kmeňa MC1061 na expresiu ľudského ob proteinu v rozpust nej biologicky aktívnej forme v periplazme hostiteľ ských E.coli bunkách . Inzercia plazmidu do týchto hostiteľských E.coli buniek bola urobená elektroporáciou .

E.coli bunky. /MC1061 / nesúce plazmid pLPPsOmpAhobl boli pestované pri 28 °C v Luria -Bertania /”Difco Laboratories/ médiu , doplnenom antibiotickým carbencillinom /100 raikrogramov/ml , ”Beecham/ na príslušnú hustotou , a potom sa lac promotor indukoval pridaním 2mM finálnej koncentrácie izopropyl - beta-L-tiogalaktopyranosidu / IPTG, Boehringer”/ , ako je opísané v De Sutterovi a kol, viä vyššie . Bunky boli äalej pestované až do bunečnej hustoty ^{1,5 A}600* Potom boli bunky zhromaždené odstredením /8000 x g pri 4 °C / a bun ková peleta bola rýchlo resuspendovaná v ľadovo chladnom osmotickom šokovom pufri /100 mM tŕis-HCl , pH 7,4 obsahujúcim 20% sacharózy a 10 EDTA / a boli ’inkubované na ľade počas 10 minút , ako je opísané Kos hlandom a Botsteinom , viä vyššie .

Potom boli bunky znovu kolektované odstredením ako. vyššie a bunková peleta sa resuspendovala v ľa dovo studenej vode a inkubovala na ľade počas 10 minút .

Suspenzia sa potom centrifugovala počas 5 minút pri 16 000 x g a supernatant /osmotická šoková tekutina/ sa odpbrala . Azid sodný a tris-HCl / pH 7,5 / boli pridané do finálnej koncentrácie 0,05 % , resp 55mM. Osmotická šoková tekutina obsahujúca ľudský ob proteín bola uskladnená pri -20 °C až do äalšieho pou žitia .

príklad 9

Expresia ľudského ob proteínu v E.coli /MC1061/

Expresia ľudského ob proteínu sa dosiahla použitím postupu z príkladu 8 okrem toho , že triacillín /100 mikrogramov /ml sa použil ako antibiotikum k pri dávku luria-Bertaria média oproti carbencillínu .

Príklad 10

Čistenie ľudského oh proteínu z E.coli osmotickej tekutiny

Na čistenie ľudského ob proteínu v osmotickej Šokovej tekutine z príkladu 9 hol do tekutiny pridaný NaCl na finálnu koncentráciu 0,1 M a tekutina bola na ložená priamo na stĺpec obsahujúci 30 ml objemovej vr stvy Q-Sepharose Fast Flow /Pharmacia / , predvyváženej 55 mM tris-HCl /pH 7,5/ pufrom .

Ďalej sa pridal pevný síran amónny do prietoko vého materiálu eluovaného z _jQrSepharose Fast Flow obsahujúceho stĺpce do finálnej koncentrácie 1,0 M a zmes bola naložená na stĺpec obsahujúci 7,5 ml vrstvy butyl-Sepharose Pást Flow /Pharmacia/ predvyvážené 55mM tris-HCl /ph 7,5 / pufrom obsahujúcim 1,0 M /NH^/₂SO^. Po premytí tris-HCl /pH 7»5 / pufrom obsahujúcimi 1,0 M si ranu amónneho bol hob proteín eluovaný aplikáciou gra dientu od 1,0 M síranu amónneho v 50 mM tris -HCI /pH 7,5 / pufra do 20 % -ného etylénglykolu vo vode.

Hob proteín eluoval z butyl- Sepharosé Pást Plow stĺpca na samom konci gradientu , pokiaľ väčšina nečis tôt eluovala omnoho skôr . Čistota hob proteínu v to mto štádiu bola 90 % ná ako bolo stanovené striebrom farbenou polyakrylamidovou gelovou elektroforézou /PAGE/

Hob proteín v materiáli eluovanom z butyl -Sepharose Pást Plow obsahujúceho stĺpca bol potom äalej vyčistený gelovou filtračnou chromatografiou . Aby sa to urobilo , bol ľudský ob proteín koncentrovaný pri 4°C na objem 1 ml na YMlO /Amicon / membráne . · zä pou žitia 8MC koncentračnej jednotky /Amicon/ a bol aplikovaný na stĺpec /1,0 cm x 50 cm / obsahujúci 39 ml GlOO-Sephadexu /Pharmacia / predvyváženého vo fosfá tom pufrovanora soľnom roztoku .

Frakcia obsahujúce hob proteín potom boli odsaté a proteín sa koncentroval na YMlO membráne. V tomto stave bol hob proteín viac ako 95 %ne čistý , · ako bolo stanovené PAGE a strieborným farbením . SDS PAGE analýza eluátu vykázala jeden proteínový pás pri Mr 15 000 .

x

Príklad 11

Čistenie ľudského ob proteínu z E.coli osmotickej tekutiny

Aby sa vyčistil ľudský proteín v osmotickej šokovej tekutine z príkladu 9 , bol použitý pos tup príkladu 10 s nasledovnou výnimkou : pred pri daním pevného síranu amónneho do pretekajúceho materiálu boli urobené nasledovné kroky s ohľadom na osmotickú šokovú tekutinu z príkladu 9 .

Ľudský ob proteín v osmotickej Šokovej tekutine z príkladu 9 bol nanesený priamo na stĺpec ob4 sahujúci 30 ml vrstvy Qr Sepharose Pást Plow /Pharmäcia ”/ predvyváženej 50mM tris- HCl /ph 7,5 / pufrora. Po premytí 50 mM tris-HCl /pH 7»5 / pufrom bol hob proteín eluovaný 50 mM tris- HCl /pH 7,5 / pufrom obsahujúcim 0, IM NaCl .

Príklad 12

Sekvenčná analýza ľudského ob proteínu

N- terminálna aminokyselinová sekvencia ľudského ob proteínu vyčistená a získaná postupmi z príkla dov 7 až 11 vyššie opísaných, bola zhotovená .podľa postupov laemliho , U.K., viä vyššie . Po elektrotransfere elektroforézovaných proteínov do vrstvy poly /4vinyl-N-metylpyridiniumjodidim / potiahnutého skleného vlákna ako je opísané Bauwom a kol., viä vyššie ,bol pás proteínu s Mr 15 000 excizoväný z membrány a N -terminálna aminokyselinová sekvencia potom bola ur čená Edmanovou degradáciou na 47QA plynofázovom sek49 venizátori vybavenom 120A on line £enyltiobydantoinovým aminokyšelinovým analyzátorom /·' Applied Biosystems’¹/ N- terminálna amlnokyselinová sekvencia hob proteínu získaného, vyššie opísanými .postupmi bola Val-Pro-IleGln odpovedajúca zrelému ľudskému ob proteínu SEKV ID (3:6 .

Príklad 13

Biologická aktivita myšacieho ob proteínu

Intracerebroventrikulárne /ICV/ injekcie pri ob/ob myšiach

Biologická aktivita zrelého myšacieho ob proteínu vyčisteného podľa príkladu 5 bola určená pomocou ICV metódy nasledovne : Infúzne kanyly boli implantované do postrannej komory mozgov anestetizovaných samíc obéznych ob/ob myší / vek 6 až 13 týždňov / za použitia nasledujúcich koordinantov / 2 mm stranou od strednej čiary , 0,6 mm s ohladom na bregmu , 2 mm dolu / založené na spôsoboch Haleyho a Mc Cormicka , viď vyššie . Koniec kanyly bol upevnený na lebke za použitia ušľachtilej skrutky a dentálneho cementu . Myši boli individuálne umiestnené v plastických klietkach s voľným prístupom k potrave / s výnimkou noci pred ICV injekciou / a vode. Po zotavení z chirur gického zákroku , posúdené denným príjmom potravy a prírastkom telesnej hmotnosti , boli myši študované pri rôznych príležitostiach po intracerebroventrikulárnej /ICV/ injekcii 1 mikrolitri jedného z nasledujúcich skúšaných roztokov :

1. umelý mozgomiechový mok /CSP/

2. bakteriálny kontrolný roztok

- 50 3. ob proteín /0,6 až 1 mikrogram/myš , alebo

4« žiadna infúzia .

Injekcia jedného z vyššie uvedených skúšobných roztokov ICV do každej myši nasledovala za jedným mikrolitrom umelého CSP na vyčistenie kanyly . Pre účely tohto experimentu bol bakteriálny kontrolný roztok vzorkou identicky spracovanou a pripraveným v súlade s postupmi uvedenými v príkladoch 2 až 4 okrem toho , že plazmid inzertovaný v E.coli baktérii nemal myšací ob gén .

Myši boli vyhladované počas doby 18 hodín /cez noc/ pred ICV injekciou . Myši boli mierne obmedzené a 10 míkrolitrová Hamilton injekčná striekačka vybavená kúskom predkalibrovej polyetylénovej /PE/ trubice /PE20/ bola použitá na injekciu 1 mikrolitra testovaného roztoku do kanyly umiestnenej v bočnej komore. Myši potom boli ihneä umiestnené v skúšobnej klietke s miskou potravy obsahujúcej dopredu zvážené množstvo paletizovanej myšacej potravy a s fľašou vody .

Myši sa vizuálne skúmali a »príjera potravy sa meral* počas äaläích 7 hodín . Meranie príjmu potravy sa získalo /po 0, 5 , 1» 2 , 3, 4» 6 a ý hodinách, po ICV injekcii a v 24 hodín neskoršie . Úspešné' umiestnenie ka nyly bolo dokumentované vzrastom príjmu potravín ; po 2 hodinách po ICV injekcii 10 mikrogramov neuropeptidrcY « hodiny hladujúce myši podľa Morley , J.E. a kol., American J. Physiol. 253 » 516- 522 /1987/ *

Výsledky ICV skúšky , ktorá je opísaná vyššie , sú nasledovné :

A. Redukcia príjmu potravy

Počas prvých 30 minút po ICV injekcii takmer vše tky myši požívali s krátkou latenciou a konzumovali približne 0,5 g· Myši , ktoré nedostali žiadnu injekciu alebo umelý CSF , pokračovali v kŕmení počas člalších 6,5 hodín a dosiahli kumulujúci 7 hodinový príjem 3,2 g. /tabuľka 1/ . V kontraste s tým , myši ošetrené ob proteínom ICV sa prestali kŕmiť po prvých 30 minútach ä potom nič nepožívali . Tak ich kumulujúci príjem potravy zostal potlačený počas celých 5 hodín , na približne 0,5 g /tabuľka 1 /.Myši, prijímajúce vehikulovaný kontrolný roztok ICV tiež prestali žrať po 30 minútach a príjem potravy začal opäť medzi 6 a 7 hodinami .

B. Redukcia telesnej hmotnosti hodinová zmena telesnej hmotnosti myší , injektovaných vehikulovou kontrolou , bola mierne zní žená od tých , ktoré boli injektované umelým CSP , alebo od neinjektovaných myší ,· /tabuľka 1/ . Avšak percentuálna zmena telesnej hmotnosti myši injektovanej ob proteínom bola takmer nulová a bola významne zní žená v porovnaní s vehikulovou kontrolou injektova nou myšou /tabuľka 1 /.

C. Záver

Zistený účinok priameho podania rekombinantného myšacieho ob proteínu /1,1 mikrogramov na myš / v je dnom mikrolitri do mozgu , bola trvalá a významná redukcia príjmu potravy a prírastku telesnej hmotnosti samíc ob/ob myší · To demonštruje , že ób 'proteín môže pôsobiť priamo na mozog a je konzistentný s účinkom ob proteínu , äk je injektovaný intraperitoneálne . Tento príklad tiež potvrdzuje biologickú účinnosť bakteriálne expresovaného rekombinantného myšacieho ob proteínu pri samiciach obéznych ob/ob myší podľa vynálezu .

Tabuľka 1

Ošetrenie	Príjem potravy /o - 7 hodín/	Prírastok telesnej hmotnosti /0-24 h/
umelý OSP	.......g	%xx.........	g......	. ·.........% .....
umelý CSP	3,2 - 0,2	100	3,8 i	0,3 100
vehikulová kontrola	.....0,9+0,3 «W	........28,1	2,9 +	0,2 . 76.....
ob proteín /1 mikr ogram/myš	0,5 + 0,1	15,6	0,3 +	0,5 8

x/ indikuje významné rozdiely medzi ob proteínom a umelým mozgov omiechovým mokom /CSP/ skupinami a p menším ako 0,05 xx/ indikuje percento kontroly .

Z'

Príklad 14

Biologická aktivita myšacieho proteínu podaného intravenózne /IV / pri ob/ob myšiach

Biologická aktivita mašacieho ob proteínu zís kaného a vyčisteného v súlade s príkladmi 2,3,4 a 5 bola testovaná intravenóznou /IV/ injekciou pri obéznych ob/ob myšiach ako sa Halej uvádza.

Samci a samice obéznych ob/ob myší /6 až 13 týždňov starých/ sa implantovali stálymi hrdelnými kanylami za pentoharbitalovej anestézie /80 mg/kg telesnej hmotnosti/ podľa spôsobu Mokhtariána A'., a kol., Physiol. Behav. 54, 895-898 /1993/. Myši boli individuálne umiestnené v plastických klietkach za konštantných podmienok prostredia s 12 hodinovým tmavým a 12 hodinovým svetlým cyklom. Telesné hmôt nosti sa merali pri fúzii denne a priechodnosť kanyl sa preverovala a udržovala každý další deň infúziou ^0,1 ml heparinu v soľnom roztoku /50 U/ml v 0,9 %nom soľnom roztoku/.

Po úplnom zotavení z chirurgického zákroku, prejavovanom prírastkom telesnej hmotnosti holi myši vyhladované na dobu 16 až 18 hodín /cez noc/. Nasledujúce ráno boli myši odvážané a umiestnené do testovacích pecí na dobu 45 minút na aklimatizáciu pred experimentom. Voda bola stále dostupná. Myšací ob proteín /3 mikrogramy v 0,1 ml/ alebo rovnaký objem vehikulovej kontroly alebo soľného 0,9 %ného roztoku holi injektované intravenózne. Vzbudené myši boli mierne obmedzené a 0,5 ml inzulínovej striekačky sa použil· na injekciu 0,1 ml testovaného roztoku, a potom následovalo 0,05 ml heparinu v soľnom roztoku. Skúšky boli oddelené aspoň troma dňami. Myši potom boli ihned uložené v testovacích klietkach s predom zváženou Petriho miskou obsahujúcou peletu myšej stravy. Myši sa vizuálne skúmali, príjem potravy sa meral áalších 7 hodín pri 0,5 í 1; 2; 3; 4; 6; a 7 hodinách po IV injekcii. Telesná hmotnosť sa merala pred IV injekciou a znovu b 24 hodín.

Dve oddelené skupiny kanylovaných myší /11 Ob/ob a 12 neobéznych/ sa použili v 5 jednotlivých skúškach. Väčšina myší dostala myšací ob protein a jednu alebo obe kontrolné injekcie vo vyváženom poradí. Dva oddelené prípravky myšacieho ob proteínu sa použili pri tomto experimente. Tu uvedené dátumy sú kombináciou výsledkov týchto jednotlivých replikácií.

A. Výsledky

Výsledky vyššie uvedeného experimentu sú nasledovné.

Počas prvých 30 minút po IV injekcii väčšina obéznych a neobéznych myší prijímala potravu s krát kou latenciou a skonzumovala približne 0,3 až 0,5 g. Príjem potravy so soľným roztokom a vehikulovou kontrolou injektovaných obéznych myší vzrastal počas experimentu. Kumulatívny príjem potravy obéznych ob/ob myší injektovaných vehikulovou kontrolou nebol rozdielny od príjmu potravy podobne vyhladovaných obéznych myší, ktoré boli injektované soľným roztokom. V kontraste s tým príjem potravy obéznych ob/ob myší injektovaných rekombinantným ob proteínom bol významne znížený a z.ostälj potlačený na 57 % od kontroly /tabuľka 2/.

Žiadne äalšie účinky sa nepozorovali pri vehikulovej kontrole a ob proteínových skupinách počas 7 hodín pozorovacéj periódy. Ako sa očakávalo, 24 hodinový postinjekčný telesný prírastok hmotnosti nebol rozdielny pri ošetrených skupinách /tabuľka 2/ vplivom obmedzeného trvania akcie jednej IV dávky myšacieho ob proteínu.

B. Závery

Tieto výsledky domonštrujú, že rekombinantný myšací ob proteín významne znižuje kumulatívny 7 hodinový príjem potravy po IV. podaní /3 mikrogramy na myš/ pri obéznych ob/ob myšiach. Schopnosť rekombinantného myšacieho ob proteínu znižovať príjem potravy pri ob/ob myšiach je konzistentný s výsledkami príjmu potravy získanými nasledujúcou opakovanou IP injekciou ob proteínu pri obéznych ob/ob myšiach. Tento príklad tiež potvrdzuje biologickú aktivitu bakteriálne expresovaného rekombinantného myšacieho ob proteínu pri samiciach obéznych ôb/ob myšiach.

Tabuľka 2

IV podanie myšacieho ob proteínu pri ob/ob myšiach

•	Ošetrenie	Príjem potravy /0 - 7 h/	Prírastok hmotnosti	telesnej /0-24 h/
		g	% xx/	g	%
z	soľný roztok /n = 4/ véhikulová kontrola /n=7/	1,8*0,2 1,4-0,3	100	2,9-0,3 2,2*0,6	100
	ob proteín /1 mikrogram /myš//n»8/	0,8*0,2X/	57	1,4*0,6	64

Údaje sú priemernou hodnotou f sem. n= označuje počet jednotlivých myší, sem znamená štandart njí priemerný chybu”, x/ označuje významné rozdiely medzi ob proteínovými a umelými CSP skupinami s p menším ako 0,05.

xx/ označujú percento kontroly.

Príklad 15

Biologický účinok myšacieho ob proteínu, opakovanej IP injekcie pri ob/ob myšiach.

Biologická aktivita myšacieho ob proteínu získaného a vyčisteného podľa príkladov 2 až 5 sa testovalo opakovanou intraperitoneálnou /IP/ injekciou obéznych ob/ob myšiach nasledujúc©:

skupiny 6. samíc ôb/ob myší sa študovali.

Myši boli umiestnené v plastických klietkach /3 na jednu klietku/ za konštantných podmienok prostredia s 12 hodinovým tmavým a 12 hodinovým svetelným cyklom. Dvadsáťštyri /24/ hodinový príjem potravy a telesná hmotnosť sa merali každý deň. Po adaptačnej perióde na podmienky prostredia a dennej manipulácii a injekcie boli myši roztriedené do 3 liečebných skupín. Každá myš dostala 2 intraperitoneálne /IP/ injekcie každý liečebný deň /krátko pred začiatkom tmavej fázy temno-svetelného cyklu a 3 hodiny do tmavej fázy/ 0,1 ml nasledujúcich skúšobných roztokov.

1/ soľný roztok /0,9 %/

2/ bakteriálny kontrolný roztok, alebo

3/ myšací ob proteín /3 mikrograray/0,1 ml/.

Bakteriálny kontrolný roztok bol vzorkou identicky spracovanou a pripravenou postupmi opísanými pre príklady 2 až 4 na získanie a čistenie myšacieho ob proteínu, s výnimkou, že plazmid inzertovaný v E.coli baktérii nemal myšací ob gén. Myši boli ošetrené 2 x denne počas 5 dňí a potom nedostali žiadne ošetrenie počas 2 dní. Príjem potravy v kaž dej klietke sa meral 2, 3, 5 a 24 hodín po prvej IP injekcii v každom liečebnom dni.

A. Výsledky

Zníženie príjmu potravy

Príjem potravy nebol rozdielny pri soľnom roztoku a bakteriálnej kontrole injektovanými myšiam v liečebných a neliečebných dňoch počas jednotýždňového experimentu /tabuľka 3/*

Avšak príjem potravy bol znížený pri 6 myšiach iňjektovaných 6 mikrogramami ob proteínu v liečebných dňoch počas experimentu. Zníženie príjmu potravy sa zisťovalo po 2, 3, 5 a 24 hodinách po prvej injek_ * cii v liečebných dňoch pri myšiach prijímajúcich oh proteín v porovnaní so skupinami bakteriálnej kon troly a soľnej kontroly .

Zníženie telesného prírastku hmotnosti

Kumulatívny prírastok telesnej hmotnosti počas 5 liečebných dní bol pri ob proteínovej skupine mínus

3,3 +/- 0,7 g v porovnaní s - 0,9+/-0,2 gramy pri soľ nom roztoku a -0,7+/- 0,4 gramy pri bakteriálnej skupine /tabuľka 3/ .

Záver

Tento príklad demonštruje , že 2 IP injekcie denne bakteriálne expresovaného rekombinantného myšacieho ob proteínu /6 mikrogramov na myš a deň/ mali za následok významnú podpornú redukciu príjmu potravy a významný pokles miery prírastku hmotnosti ošetrených samíc ob/ob myší v porovnaní soľným a bakteriálnym kontrolným roztokom ošetrenými ob/ob myšami . Tieto výsledky demonštrujú , že bakteriálne expresovaný myšací ob protein je biologicky aktívny a má očakávané intiobézne účinky na geneticky obézne ob/ob myši podľa tohto vynálezu .

V tabuľke 3 sú dvojhodinové a päťhodinové výsledky priemernými príjmami potravy , pokiaľ 24 hodinové výsledky sú päťdennými kumulatívnymi príjmami potravy.

Tabuľka 3

Opakované IP podania myšacieho ob proteínu pri ob/ob myšiach

Ošetrenie.	............ príjem potravy . ...... /g/3 myši/	prírastok nelesnej ....... imotnosti
	x 2 hodiny.........	r t f 5 hodín ...	24 hodín . *	.....g.....................
	g........	% k on	.....g	% kon	.....g.....	% kon.	•
žiadna injekcia ..	5,5+ 0,5.......		14,5 + 0,5		44,3+ 3,5		-0,9+ -0,2.
kontrola	7,0+ 0,5	100	16,5 + 1,5	100	49,5 + 6,1 ·	100	-0,7+ ...........0,4.....-.....
ob prote- í n l	3,5 + 0,5Xó	50	5,5 + 1,0	33	25,5+ 4,6*	5í r-	-3,3+ 0,7*/

Údaje sú priemerom + sem pre 6 ob/ob myši v každej skupine . Príjem potravy je priemrným kumulujúcim príjmom pre klietky 3 myší počas 5 diŕtí ošetrenia 2,5 a 24 hodín po prvej IP injekcii . Prírastok telesnej hmotnosti je kumulatívny zmenou telesnej hmotnosti počas 5 dní ošetrenia . x/ označuje zmeny medzi ob proteínovými a vehikulovými skupinami s p menším ako 0,05 ·

Príklad 16

Biologická aktivita ľudského ob proteínu : intrace rebroventrikulárna /ICV/ injekcia u ob/ob myšiach

Spôsoby použité na určenie biologickej aktivity ľudského ob proteínu intracerebroventrikulárnou ICV injekciou u ob/ob myšiach boli rovnaké ako v prík lade 13 s tou výnimkou , že testované roztoky boli:

. rekorabinantný ľudský ob proteín produkovaný v príklade 11 /0,05 mikŕograraov/ vo fosfä tovom pufrovanom soľnom roztoku /PBS/ obsahujúcom 0,1 % myšacieho sérového albumínu, a . PBS obsahujúci 0,1 % /hm/obj/ myšacieho sérového albumínu /albumínová kontrola / ako vehikulový kontrolný roztok .

> <

A. Redukcia príjmu potravy

Počas' prvých 30 minút po ICV injekcii takmer všetky myši požívali s krátkou latenciou a skonzumovali približne 0,5 g · ^A‘*yäi , ktoré nedostali in jekciu , pokračovali v jedle počas nasledujúcich 6,5 hodín a dosiahli kumulatívneho 7 hodinového príjmu 1,8 g Ť/ tabuľka 4/ . Myši , prijímajúce albu minový kontrolný roztok ICV tiež prestali prij í mať potravu po 30 minútach a začali žrať medzi až 7 hodinami . V kontraste s tým myši ošetrené ľudským proteínom IČV prijímali potravu významne menej v prvých 30 minútach / 0,2 g/ a žrali veľmi malé množstvá počas čalších 6,5 hodín . Tak ich kumulatívny príjem potravy zostal potlačený člalších 6,5 hodín na približné 0,4 g. /tabuľka

/.

B. Redukcia prírastku telesnej hmotnosti hodinová zmena telesnej hmotnosti myší in jektovaných vehikulovou kontrolou bola mierne znížená od prírastku myší injektovaných umelým CSP alebo neinjektovaných / tabuľka 4/ Avšak percentuálna zmena telesnej hmotnosti myší injektovaných ľudským ob proteínom bola takmer nulová / tabuľka 4/ .

C. Záver

Zistený účinok priameho podania rekombinantného ľudského ob proteínu / 0,05 mikrogramov /myš v 1 mikrolitri / do mozgu viedla k základnej a významnej redukcii príjmu potravy a prírastku telesnej hmôt nosti samíc ob/ob myší , čo demonštruje , že ' ob proteín môže pôsobiť priamo na mozog a je konzistentný s účinkom ob proteínu , keä je injektovaný IP . Tento príklad tiež potvrdzuje biologickú akti vitú bakteriálne expresovaného rekombinantného ľud ského ob proteínu u samíc obéznych ob/ob myší.

Tabuľka 4

ICV podanie ľudského ob proteínu u ob/ob myší

1 Ošetrenie	príjem potravy /0-7 hodín/	prírastok teles. hmotn./0 - 24 hod/
	1 .....&	Jíχχ/	g
žiadna injekcia 7n = 3 /	1,8 +0,2		3,1+0,4
albuminová kontrola / n=3 7	l,0± °*4	100	1,7- 0,6	100
ľudský ob proteín /1 mikrogram/ myš/ /n = 5/	0,4 - 0,2:	40	0 + 0,8	0

Údaje sú priemerné i sem. n » označuje počet jed notlivých myší .

x/ označuje rozdiely medzi ľudským proteínom a u melým CSF s p xh. 0,05 » xx/ označujú percento kontroly .

Príklad 17

Biologická aktivita ob proteínu ských subjektov:

redukcia príjmu skúšobného jedla po u obéznych

IV podaní ľudBiologická teínu získaného 11 je určená podaní ľudom, aktivita myšacieho a ľudského a vyčisteného podľa príkladov meraním príjmu skúšobného jedla ako je Úalej uvedené.

ob pro7 až po IY

Ne obézni a obézni ľudskí dobrovoľníci majú k dispozícii skúšobné jedlá s fixovaným kalorickým obsahom v laboratórnej jedálni' po 2 príležitosti za použitia spôsobu Muurahainena, N.E. a kol, , vid vyššie Aspoň hodinu pred podaním . jedla je umiestnený na dlhšiu dobu katedr v predlakťove j.’ žile a je udržiavaný otvorený heparinovou aretáciou. Vizuálna analogová miera hladu sa získa 15 minút pred, 15 minút po podaní a na záver skúšobného jedla. Myšací alebo ľudský ob proteín alebo soľný roztok sa potom infúzuje IV 20 minút pred podaním jedla. Každý subjek je inštruovaný tak, aby jedol toľko jedla koľko si praje, pokiaľ nie je uspokojený. Množstvo prijatého jedla každým subjektom sa meria. Každý sub jekt potom obdrží infúziu bud ľudského proteínu /0,5 mg/kg telesnej hmotnosti/ , myšacieho ob proteínu /0,5 mg/kg telesnej hmotnosti/ alebo soľného roz toku a rozdiel v množstve skúšobného jedla prijatého za týchto podmienok sa spočíta. U ľudskej alebo myšacej ob proteínovej skupiny je znížené množstvo spotrebovaného jedla aspoň o 20 % .

Príklad 18

Biologická aktivita ob proteínu u obéznych ľudských subjektov:

indukcia straty hmotnosti opakovaným IV podaním fc

Biologická aktivita myšacích a ľudských ob proteínov získaných a vyčistených podľa príkladu 7, alebo 11 , sa určí meraním straty-'hmotnosti po opakovanom IV podaní ob proteínu nasledujúcim spôsobom.

Placebom kontrolovaná dvojito slepá štúdia straty hmotnosti za použitia spôsobov Drenta,M.L. a kol., viň vyššie , sa realizuje . Obézne subjekty s telesným hmotnostným indexom /BMI/ väčším ako 27 sa zvážia a potom sa u nich uplatní diéta s 1500 kcal počas 2 äž 4 týždennej priebežnej, doby.- . Na konci tohoto času všetky obézne subjekty , ktoré stratili aspoň 1 kg telesnej hmotnosti sa náhodne rozdelia do 2 liečebných skupín vhodných na stratu hmotnosti počas fázy Úalšieho času . Subjekty obdržia denne intravenózne podaný buň ľudský alebo myšací ob proteín /0,5 mg/ďeň / alebo placebo /soľný roztok / počas aspoň 6 týždňov . Telesná hmotnosť sa zaznamenáva týždenne . Subjekty dostávajúce ľudská alebo myšací ob proteín majú významné zníženie telesnej hmotnosti oproti placebovej skupine po 6 týždňoch ošetrenia .

Príklad 19

A. Príprava polyetylénglykolom konjugovaného ob proteínu z E.coli buniek g E.coli bunkovej pelety pripravenej ako je opísané v príklade 8 pred resuspenziou bolo suspendované s 1 litrom 50 mM tris- HC1 /pH 8,5 / obsahujúci 5 mM EDTA . Suspenzia bola inkubovaná počas 15 minút pri 37 °C , zriedená áalším 1. 1 5Ô mM tris-HCl / pH 8,5/ obsahujúci 5 mM EDTA. Potom bola suspenzia homogenizovaná pomocou homogenizátorä počas 15 minút pri 50 % nom silovom nastavení . Suspenzia bola vyčis64 xená odstredením pri 8 000 otáčkach za minútu , °C , počas 1 hodiny. Paleta bola odstránená .

Supernatant sa zriedil vodou na vodivosť 1,8 mS a naniesol sa priamo na stĺpec naplnenia 200 ml ^-Sepharose Fast Flow /silná aniontomenhá živica / predvyváženej 50 mM tris- HCl /pH 8,5/ . Po premytí vyvažovacím pufrom bol absorbovaný ob proteín eluovaný zo stĺpca rovnakým vyvažovacím pufrom , ktorý naviac obsahoval 100 mM NaCl . Eluát získaný po spracovaní stĺpca vyvažovacím pufrom obsahujúcim chlorid sodný bol nazvaný Q-Sephar osový eluát .

Pevný NaCl bol pridaný k Q-Sephar osovému eluátu až sa dosiahlo konečnej vodivosti 82 mS. Potom bol eluát nanesený na hydrofóbny interakčný stĺpec /HIC/ naplnený 200 ml butyl - Sepharose Fast Flow , predvyváženej 50 mM tris-HCl /pH 8,5 /, obsahujúcej 1 M NaCl . Neadsorbované materiály boli vymyté vyvažovacím pufrom a absorbovaný ob proteín bol eluovaný 50 mM octanu amónneho /pH 6,9 / , Čím sa vy tvoril HIC eluát .

Ob proteín v HIC eluáte bol určený ako 95 % ne čistý reverznou fázovou HPCL . Vyčistený ob proteín bol koncentrovaný na 3,7 mg/ml pomocou triediacej membrány /YM-1Ó/ . Triediaca membrána boläⁱ mem brána , ktorá zadržiavala molekuly 10 000 daltonov alebo väčšie . po tomto koncentračnom stupni pri použití triediacej membrány bol ob proteín diafiltrovaný do 100mM borátového pufru /pH 8,0/ , ktorý sa použil ako zásobný roztok .

B. Pegylácia ľudského ob proteínu

Pri realizovaní tejto pegylačnej reakcie bol použitý' PEG₂-NHS reagent vzorca II-Aú , kde R je GH^ , súčet n a n* v rozmedzí 820 až 1040 s priemerným súčtom asi 930 a s priemernou molekulovou hmotnosťou 40 kDa, ,ktorý bol zakúpený od firmy Shearwater Polymers, Huntsville, Alabaraa.

Bola to zmes PEG₂~NHS reagentov vzorca II-A, kde pomer n k n* je približne 1,0 a súčet n a n* v tejto zmesi v rozmedzí 820 až 1040 jednotiek, s priemernou molekulovou hmotnosťou PEG reťazca v tejto zmesi približne 20 kDa, takže priemerná molekulová hmotnosť tohto reagentu je približne 40 kDa s priemerným súčtom n a n v tejto zmesi je asi 930.

K mg alebo 0,54 ml 3,7 mg/ml vyčisteného ľudského ob zásobného roztoku pripraveného vyššie v časti A /125 nmol ob proteínu/ bolo pridané 250 nmol vyššie uvedeného PEG₂~NHS reagenčného roztoku. Tento roztok obsahoval 10 mg alebo 0,1 ml 100 mg/ml PEG^-NHS reagenčného roztoku v 1 mM HCI.

lárny pomer proteínu zmes sa miešala pri . Celková reakčná zmés bola vytvorená až do 0,67 ml prídavkom 100 mM borátu o pH 5,0 . Finálny mok reagentu bol 1:2. Táto 4 °C počas 4 hodín a reakcia bola zastavená prídavkom 1 mikrolitra ľadovej kyseliny octovej, čím sa vytvorilo finálne pH 4,5.' Výsledná reakčná zmes 0,67 ml bola zriedená vodou, čím sa vytvorilo 27 ml roztoku, ktorý bol uložený na stĺpec obsahujúci 1,7 ml karboxymetylovanej kationtomennej živice /Perseptivec, Framinghara, Massachusetts/. Stĺpec bol uvedený do rovnováhy 3,3 mikroraólmi HEPES/MES acetát sodný pufrom, ‘ pH 5,0 . Zrie66 dená reakčná zmes bola nanesená na stĺpec a neadsorbovaný PEG₂~NHS reagent bol vymytý zo stĺpca. Adsorbované pegylované a nemodifikované ob proteíny sa eluovali stupňovitými soľnými gradientami / 15 objemov stĺpca každý / 80, 150 a 500 mM NaCI. 2 ml týchto eluátov boli separátne vysaté postupne a tieto vzorky každej frakcie boli podrobené SDS-PAGE analýz e .

Z tejto analýzy boli eluáty klasifikované ako vysoko pegylované konjugáty požadované rozvetvené mono- PEG- ob /OEGg-ob / a nemodifikovaný ob proteín. Λ-aždá z týchto frakcií bola zobratá do triediacich zariadení uvedených vyššie a druhá skupina obsaho valä požadovaný irosrisitvený mono - PEG₂~ ob proteín . Tento požadovaný proteín mal štruktúru zlúčeniny vzorca I-A ,· kde súčet n a n' bol približne 820 až 1040 , s priemerným súčtom asi 930 , R a R* sú CHj a priemerná molekulová hmotnosť každého PEG reťazca bola asi 20 kDa . Pegylovaný produkt mal priemernú molekulovú hmotnosť 56 kDa . Časť' obsahujúca PEG₂- ob bola koncentrovaná na 3,7 mg/ml pomocou YM 10 membrány .

ÝM 10 je triediaca membrána , ktorá zadržiava molekuly o molekulovej hmotnosti 10 000 daltonov alebo väčšie . Po roztrieňovacom kroku bol koncentrovaný materiál diäíiltyeýaný do PBS pufra /pH 7,3/ a uskladnený zmrazený pri - 20 °C. Tento uskladnený produkt bol pegylovaný ob proteín vzorca I-A , kde súčet n a n' bol približne 820 až 1040 a prie merná molekulová hmotnosť každého ob reťazca bola približne 20 kilodaltnov . Priemerná molekulová hmotnosť PEG proteínu v tejto proteínovej konjwgátovej zmesi bola 56 kilodaltnov .

Príklad 20

Biologická' skúška pegylovaného ľudského proteinu 1 IP injekcie ób/ob myšiam

Spôsoby

Boli študované dve skupiny 6 myších samíc obéznych ob/ob myší . Myši boli umiestnené v plastických klietkach / tri/ klietka / za konštantných podmienok prostredia s 12 hodinami tmavého / 12 hodinami svetelného cyklu . 24 hodín príjmu potravy a telesná hmotnosť sa merali každý deň . Po adaptačnom čase na podmienky prostredia , dennú manipuláciuc a injekcie , boli myši rozde lené do dvoch ošetrovaných skupín . Každá myš dostala 1 intraperitoneálnu /IP/ injekciu v deň tohto experimentu, /práve pred začiatkom temnotnej fázy temnotného /svetelného cyklu/ 0,1 ml nasledujúcich roztokov : soľný roztok /0,9% ný /, ľudský ob proteín vo forme zásobného roztoku pripraveného v časti A príkladu 19a /30 mikrogramov/0,1 ml / , pegylovaný kontrolný roztok /rovnako spracovanú a vyčistenú vzorku bez ľudského proteinu / alebo pegylovaný ob proteín /30 mikrogramov /0,1 ml / pripravený ako je opísané v príklade 19 ·

Myši boli injektované len raz za deň 1. Denný príjem potravy na klietku a telesná hmotnosť každej myši sa merali počas nasledujúcich 3 dní a opäť šiesty deň .

*

Výsledky

A. Redukcia príjmu potravy

Denný príjem potravy nabol rozdielny u soľného roztoku a pegylačnej kontroly , ktoré boli myšiam injektované v jednom ošetrení a v dvoch nasledujúcich za sebou dňoch /tabuľka 5/ . Avšak denný príjem hol redukovaný u 6 myší injekt ovaných 30 mikrogramami ľudského oh proteínu a pegylovaného ľudského oh proteínu v d eň ošetrenia / 5,27, 8,2- oproti 11,97, 11,4 g / v porovnaní so soľným rozto-i kom á pegylovanou kontrolnou injekciou u myši . Pri jem potravy myší injektovaných ľudským proteínom sa t

vrátil na kontrolnú úroveň _t pokiaľ príjem potravy myší injektovaných pegylovaným ľudským oh proteínom zostal znížený v nasledujúcich dňoch experimentu .

Redukcia príjmu potravy bola zisťovaná 48 hodín po 1 . injekcii pegylovanej ľudskej ob · proteínovej skupiny . Kumulatívny 24 hodinový príjem potravy v dobe 3 dní experimentu bol významne znížený na 49% kontroly u pegylovaných ľudských ob proteínov v porovnaní so soľnou a pegylovanou kontrolnou skupinou

B. Redukcia telesného prírastku hmotnosti

Zmena telesnej hmotnosti nebola rozdielna u soľných a pegylovaných kontrolne injektovaných myší pri jednom ošetrení a dvoch nasledovných dňoch /tabuľka 6/. . Avšak telesná hmotnosť bola znížená u 6. myší injektovaných 30 mikrogramami ľudského ob proteínu a pegylovaného ľudského proteínu v deň ošetrenia /- 0,9, - 0,7 oproti 0,1, 0,3 g / v porovnaní k soľným a pegylovaným kontrolne injektovanými myšami .

Telesná hmotnosť myší injektovaných ľudským ob proteínom zostala na kontrolných hladinách , pokiaľ telesná hmotnosť myši , injektovanej ľudským pegylovaným ob proteínom pokračovala v poklese v nasledujúcich dňoch experimentu . Pokračujúca redukcia teles 69 nej hmotnosti bola ^zistená 48 hodín po jednotli vej injekcii pri pegylovanej ľudskej ob proteínovej skupiny . Kumulatívna počas 6. dní experimentu s 0,4 pri ob proteínovej nom roztoku a 1,1 í 0,2 g nej skupine /tabuľka 6/ .

zmena telesnej hmotnosti bola - 1,6 g v porovnaní skupine , 0,7 g pri soľpri pegylovanej kontrol Záver

Tento príklad demonštruje , že jednotlivá IP injekcia pegylovaného ľudského ob proteínu /30 mikrogramov /myš / , mala za následok významné vytrvá*.;, lé zníženie príjmu potravy a významný pokles telesnej hmotnosti ošetrenej samice ob/ob myši počas

3. dní v porovnaní so soľným roztokom a pegylačným kontrolným roztokom pri ošetrených ob/ob myšiach . Tieto výsledky demonštrujú , že pegylované ľudské ob proteíny majú trvalý , potentný , biologicky aktívny účinok a majú očakávané antiobézne účinky na geneticky obéznych ob/ob myšiach .

Tabuľka 5

Denný príjem potravy jednotlivého IP podania pegylovaného ľudského proteínu u ob/ob myší

Ošetrenie	Príjem potravy t	/3 myši	/deň /
	deň 1	deň	2		deň 3
g	%	g	%	g	%
	kontroly		kontroly		'kontroly
soľný ? roztok 11,	9 100	.15,7	100	15,6	100
ob pro^é-o j t	45,7	11,7	85,4	12,5	92
teín
pegylovaná ko-11	,4 95,8	4,5	106	15,4	99

ntrola pegylovaný ob ⁸’^{2 68}’^{9 6}»° ⁴³’^{8 4}’^{9 36} proteín

Údaje sú priemerné·; pre 6 ob/ob myší v každej skupine . Príjem potravy je priemerný denný príjem potravy na klietku troch myší každý deň experimentu po jédnotlivej IP injekcii v den 1. Všimnite si stálu redukciu v dennom príjme potravy len pri pegylovanej ob proteínovej skupine .

Tabuľka 6

Zmena telesnej hmotností po jednotlivom IP podaní pegylovaného ľudského ob proteínu pri ob/ob myšiach.

Ošetrenie Zmena telesnej hmotnosti /gramy/

	deň 1	deň 2	deň 3	deň 6
soľný roztok	0,1	0,6	0,01	-0,01
OB proteín	-0,9	1,1	0,2	............ND.
pegylovaná
kontrola	0,3	0,4	0,6	-0,2
proteín .....	-0,7	-0,6..........·	-0,9	. 0,6........
Údaje sú	priemernou	hodnotou pne	6 ob/ob	myší
v každej skupine. Myši^	dostali jednotlivú IP	injekciu
v prvý deň.	Zmena telesnej hmotnosti	jé zmenou teles-
nej hmotnosti	každý deň	experimentu.	Zaznamenajte stálu

hmotnostnú stratu len pri pegylovanej ob proteínovej sku pine. ND v tabuľke znamená neurčené.

Sekvenčný zápis /1/ Obecná informácia:

/i/ Prihlasovateľ:

/A/ Meno: P. Hoffmann-La Roche AG /B/ Ulica: Grenzacherstrasse 124 /0/ Mesto: Basilej /D/ Štát: BS /E/ Zem: Švajčiarsko /F/ Poštový kód /ZIP/: CH-4O7O /G/ Telefón: 061 - 688 42 56 /H/ Telefax: 061 - 688 13 95 /1/ Telex: 962292/965542 hlr ch /ii/ Názov vynálezu: Rekombinantné obézne /ob/ proteíny /iii/ Počet sekvencií: 8 /iv/ Počítačovo čiteteľná forma:

/A/ Typ média: Floppy disk /B/ Počítač: Apple Macintosh //0/ Operačný systém: Systém 7.1 /Macintosh/ #D/ Software: Word 5·0 /2/ Informácie pre SEKV ID Č :1 :

/i/ Sekvenčné charakteristiky:

/A/ DÍžka: 702 pároí bázi //B/ Typ: nukleová kyselina /0/ Reťazec: jednoduchý /D/ Topológia: lineárna /ii/ Typ molekuly: cDNA /iii/ Hypotetický: žiadny /iv/ Antizmyselný: žiadny /xi/ Sekvenčný popis: SEKV ID Č :1 ;

CAAGGTGČAA TCCTGTGGCT	GAAGAAGAAG ATCCCAGGGA GGAAAATČTG CTGGAGACCC CTGTGTCGGT TTGGTCCTAT CTGTCTTATG TTCAAGCAGT GCCTATCCAG AAAGTCCAGG	60 120
ATGACACCAA	AACCCTCATC AAGACCATTG TCACCAGGAT CAATGACATT TCACACACGC	180
AGTCGGTATC	CGCCAAGCAG AGGGTCACTG GCTTGGACTT CATTCCTGGG CTTCACCCCA	240
TTCTGAGTTT	GTCCAAGATG GACCAGACTC TGGCAGTCTA TCAACAGGTC CTCACCAGCC	300
TGCCTTCCCA	AAATGTGCŤG CAGATAGCCA ATGACCTGGA GAATCTCCGA GACCTCCTCC	360
ATCTGCTGGC	CTTCTCCAAG AGCTGCTCCC TGCCTCAGAC CAGTGGCCTG CAGAAGCCAG	420
AGAGCCTGGA	TGGCGTCCTG GAAGCCTCAC TCTACTCCAC AGAGGTGGTG GCTTTGAGCA	480
GGCTGCAGGG	CTCTCTGCAG GACATTCTTC AACAGTTGGA TGTTAGCCCT GAATGCTGAA	540
GTTTCAAAGG	CCACCAGGCT CCCAAGAATC ATGTAGAGGG AAGAAACCTT GGCTTCCAGG	600
GGTCTTCAGG	AGAAGAGAGC CATGTGCACA CATCCATCAT TCATTTCTCT CCCTCCTGTA	660
GACCACCCAT	CCAAAGGCAT GACTCCACAA TGCTTGACTC AA	702

/2/ Informácie pre SEKV ID Č:2 :

/i/ Sekvenčné charakteristiky: /A/ DÍžka: 167 aminokyselín /B/ Typ: aminokyselina /0/ Reťazec: nerelevantný /D/ Topológia: neznáma /ii/ Typ molekuly: peptid /iii/ Hypotetický: žiadny /iv/ Antizmyselný: žiadny /xi/ Sekvenčný popis: SEKV ID Č:2

Met

Cys

Trp

Arg

Pro

Leu

Cys

Arg

Phe

‘Leu

Trp

Leu

Trp

Ser

Tyr

Leu

1

5

10

15

Ser

Tyr

Val

Gin

Ala

Val

Pro

íle

Gin

Lys

Val

Gin

Asp

Asp

Thr

Lys

20

25

30

Thr

Leu

íle

Lys

Thr

íle

Val

Thr

Arg

íle

Asn

Asp

íle

Ser

His

Thr

35

40

45

Gin

Ser

Val

Ser

Ala

Lys

Gin

Arg

Val

Thr

Gly

Leu

Asp

Phe

íle

Pro

50

55

60

Gly

Leu

His

Pro

íle

Leu

Ser

Leu

Ser

Lys

Met

Asp

Gin

Thr

Leu

Ala

65

70

75

80

Val

Tyr

Gin

Gin

Val

Leu

Thr

Ser

Leu

Pro

Ser

Gin

Asn

Val

Leu

Gin

85

90

95

íle

Ala

Asn

Asp

Leu

Glu

Asn

Leu

Arg

Asp

Leu

Leu

His

Leu

Leu

Ala

100

105

110

Phe

Ser

Lys

Ser

Cys

Ser

Leu

Pro

Gin

Thr

Ser

Gly

Leu

Gin

Lys

Pro

115

120

125

Glu

Ser

Leu

Asp

Gly

Val

Leu

Glu

Ala

Ser

Leu

Tyr

Ser

Thr

Glu

Val

130

135

140

Val

Ala

Leu

Ser

Arg

Leu

Gin Gly

Ser

Leu

Gin

Asp

íle

Leu

Gin

Gin

145

150

155

160

Leu

Asp

Val

Ser

Pro

Glu

Cys

165 /2/ Informácie pre SEKV ID Ô:3 :

/i/ Sekvenčné charakteristiky: /A/ Dĺžka: 146 aminokyselín /B/ Typ: aminokyselina /C/ Reťazec: nerelevantný /D/ Topológia: neznáma /ii/ Typ molekuly: peptid /iii/ Hypotetický: žiadny /iv/> Antizmyselný: žiadny / Xi / Popis sekvencie : SEKV ID Č: 3

Val 1	Pro	íle Gin	Lys Val Gin Asp 5	Asp^Thr 10	Lys	Thr		Lys 15	Thr
Leu	íle
íle	Val	Thr Arg	íle Asn Asp íle	Ser His	Thr	Gin	Ser	Val	Ser	Ala
		20		25				30
Lys	Gin	Arg Val	Thr Gly Leu Asp	Phe íle	Pro	Gly	Leu	His	Pro	íle
		35	40				45
Leu	Ser	Leu Ser	Lys Met Asp Gin	Thr Leu	Ala	Val	Tyr	Gin	Gin	Val
	50		55 ·			60
Leu	Thr	Ser Leu	Pro Ser Gin Asn	Val Leu	Gin	íle	Ala	Asn	Asp	Leu
65			70		75					80
Glu	Asn	Leu Arg	Asp Leu Leu His	Leu Leu	Ala	Phe	Ser	Lys	Ser	Cys
			85	90					95
Ser	Leu	Pro Gin	Thr Ser Gly Leu	Gin Lys	Pro	Glu	Ser	Leu	Asp	Gly
		100		105				110
Val	Leu	Glu Ala	Ser Leu Tyr Ser	Thr Glu	Val	Val	Ala	Leu	Ser	Arg
		115	120				125
Leu	Gin	Gly Ser	Leu Gin Asp íle	Leu Gin	Gin	Leu	Asp	Val	Ser	Pro
	130		135 ·			140
Glu	Cys
145

/2/ Informácie pre SEKV ID Č:4:

/i/ Sekvenčné charakteristiky :

/A/ DÍžka : 69® párov báz /.B/ Typ: nukleová kyselina /C/ Reťazec: jednoduchý /D/ Topológia: lineárna /ii/ Typ molekuly:cDNÁ /iii/ Hypotetický : žiadny /iv/ Antizmyselný: žiadny /xi/ Sekvenčný/ popis: SEKV ID Č:4 :

GTTGCAAGGC	CCAAGAAGCC	CATCCTGGGA	AGGAAAATGC	ATTGGGGAAC	CCTGTGCGGA	60
TTCTTGTGGC	TTTGGCCCTA	TCTTTTCTAT	‘l GTCCAAGCTG	TGCCCATCCA	AAAAGTCCAA	120
GATGACACCA	AAACCCTCAT	CAAGACAATT	GTCACCAGGA	TCAATGACAT	TTCACACACG	180
CAGTCAGTCT	CCTCCAAACA	GAAAGTCACC	GGTTTGGACT	TCATTCCTGG	GCTCCACCCC	240
ATCCTGACCT	TATCCAAGAT	GGACCAGACA	CTGGCAGTCT	ACCAACAGAT	CCTCACCAGT	300
atgccttcca	GAAACGTGAT	CCAAATATCC	ÄACGACCTGG	AGAACCTCCG	GGATCTTCTT	360
CACGTGCTGG	CCTTCTCTAA	GAGCTGCCAC	TTGCCCTGGG	CCAGTGGCCT	GGAGACCTTG	420
GACAGCCTGG	GGGGTGTCCT	GGAAGCTTCA	GGCTACTCCA	CAGAGGTGGT	GGCCCTGAGC	• 480
AGGCTGCAGG	GGTCTCTGCA	GGACATGCTG	TGGCAGCTGG	ACCTCAGCCC	TGGGTGCTGA	540
GGCCTTGAAG	GTCACTCTTC	CTGCAA.GGAC	TACGTTAAGG	GAAGGAACTC	TGGCTTCCAG	600
GTATCTCCAG	GATTGAÄGÄG	CATTGCATGG	ACACCCCTTA	TCCAGGACTC	TGTCAATTTC	660
CCTGACTCCT	CTAAGCCACT	CTTCCAAAGG				690

/2/ Informácie pre SEKV ID Č: 5:

/i/ Sekvenčné charakteristiky:

/A/ DÍžka : 167 aminokyselín /B/ Typ: aminokyselina /0/ Reťazec: nerelevantný /D/ Topológia: neznáma /ii/ Typ molekuly: peptid /iii/ Hypotetický: žiadny /iv/ Antizmyselný: žiadny / xi / Sekvenčný popis : SEKV ID Č: 5:

Met 1

His

Trp

Gly

Thr 5

Leu

Cys

Gly

Phe

Leu 10

Trp

Leu

Trp

Pro

Tyr 15

Leu

Phe

Tyr

Val

Gin 20

Ala

Val

Pro

íle

Gin 25

Lys

Val

Gin

Asp

Asp 30

Thr

Lys

Thr

Leu

íle 35

Lys

Thr

íle

Val

Thr 40

Arg

íle

Asn

Asp

íle 45

Ser

His

Thr

Gin

Ser 50

Val

Ser

Ser

Lys

Gin 55

Lys

Val

Thr

Gly

Leu 60

Asp

Phe

íle

Pro

Gly 65

Leu

His

Pro

íle

Leu 70

Thr

Leu

Ser

Lys

Met 75

Asp

Gin

Thr

Leu

Ala 80

Val

Tyr

Gin

Gin

íle 85

Leu

Thr

Ser

Met

Pro 90

Ser

Arg

Asn

Val

íle 95

Gin

íle

Ser

Asn

Asp 100

Leu

Glu

Asn

Leu

Arg 105

Asp

Leu

Leu

His

Val 110

Leu

Ala

Phe

Ser

Lys 115

Ser

Cys

His

Leu

Pro 120

Trp

Ala

Ser

Gly

Leu 125

Glu

Thr

Leu

Asp

Ser 130

Leu

Gly

Gly

Val

Leu 135

Glu

Ala

Ser

Gly

Tyr 140

Ser

Thr

Glu

Val

Val 145

Ala

Leu

Ser

Arg

Leu 150

Gin

Gly

Ser

Leu

Gin 155

Asp

Met

Leu

Trp

Gin 160

Leu

Asp

Leu

Ser

Pro 165

Gly

Cys

- 78 /2/ Informácie pre SEKV ID Ô:6 :

/i/ Sekvenčné charakteristiky:

/A/ Dĺžka: 146 aminokyselín /B/ Typ: aminokyselina /£/ Reťazec: nerelevantný /D/ Topológia: neznáma /ii/ Typ molekuly: peptid /iii/ Hypotetický: žiadny /iv/ AntizmyseIný: žiadny /xi/ Sekvenčný popis: 'SEKV ID Č: 6:

Val 1

Pro

Ile Gin

Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys

Thr

Leu

Ile

Lys 15

Thr

5

10

Ile

Val

Thr

Arg

Ile

Asn

Asp

íle

Ser

His

Thr

Gin

Ser.

Val

Ser

Ser

20

25

30

Lys

Gin

Lys

Val

Thr

Gly

Leu

Asp

Phe

íle

Pro

Gly

Leu

His

Pro

Ile

35

40

45

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Met

Asp

Gin

Thr

Leu

Ala

Val

Tyr

Gin

Gin

íle

50

55

60

Leu

Thr

Ser

Met

Pro

Ser

Arg

Asn

Val

íle

Gin

íle

Ser

Asn

Asp

Leu

65

70

75

80

Glu

Asn

Leu

Arg

Asp

Leu

Leu

His

Val

Leu

Ala

Phe

Ser

Lys

Ser

Cys

85

90

95

His

Leu

Pro

Trp

Ala

Ser

Gly

Leu

Glu

Thr

Leu

Asp

Ser

Leu

Gly Gly

100

105

110

•

Val

Leu

Glu

Ala

Ser

Gly Tyr

Ser

Thr

Glu

Val

Val

Ala

Leu

Ser Arg

115 120 , 125

Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin Leu Asp Leu Ser 130 135 > 140 t

Pro Gly Cys 145 /2/ Informácia pre SEKV ID Č : 7 :

/i/ sekvenčné- charakteristiky :

/A/ dĺžka : 63 párov báz /B/ typ : nukleová kyselina /C/ reťazec : dvojitý /D/ t©pológia : lineárna /ii/ typ molekuly : DNÁ / genomická / /iii/ hypotetický : žiadny //iv/ antisenza : žiadny /xi / sekvenčný popis : SEKV ID Č : 7

ATGAAAAAGA CAGCTATCGC GATTGCAGTG GCACTGGCTG GTTTCGCTAC CGTAGCGCAG GCC /2/ Informácia pre SEKV ID Č :8:

/i/ sekvenčné charakteristiky :

/A/ dĺžka i 21 aminokyselín /B/ typ : aminokyselina /Q/ reťazec : nerelevantný //D/ topológia : neznáma /ii/ typ molekuly : peptid /iii/ hypotetický : žiadny / iv/ antisenza : žiadny / xi / sekvenčný popis : SEKV ID Č : 8 :

Met Lys Lys Thr Ala íle Ala íle Ala Val Ala Leu Ala 1 5 10

Gly Phe Ala Thr Val Ala Gin Ala 15 20

Claims (31)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Homogénny biologicky aktívny ľudský alebo myšací obézny proteín alebo jeho fragment, ktorý má biologickú aktivitu uvedeného proteinu.
2. 2. Proteín alebo fragment podľa nároku 1, kde tento proteín alebo fragment je vyznačený rekombinantným biologicky aktívnym ľudským obéznym proteínom zbaveným iných proteínov z cicavcov alebo ich fragmentu, ktorýžto fragment má biologickú aktivitu uvedeného proteínu.
3. 3. Proteín podlá nároku 1 alebo 2 obsahujúci sekv. id. č. 6.
4. 4. Proteín alebo fragment podľa nároku 1, kde tento proteín aľebo fragment je vyznačený rekombinantným biologicky aktívnym myšacím obéznym proteínom zbaveným iných proteínov z cicavcov alebo ich fragmentu, ktorýžto fragment má biologickú aktivitu uvedeného proteínu.
5. 5. Proteín podlá nároku 1 alebo 4 obsahujúci sekv. id. č. 3.
6. 6. Proteín alebo fragment podľa nároku 1, kde biologická aktivita tohto proteínu alebo fragmentu je vyznačená redukciou príjmu potravy u cicavcov a redukčnou mierou prírastku hmotnosti u cicavcov.
7. 7. DNA sekvencia zahrnujúca prvú a druhú časí, kde (a) prvá čast je sOmpA génová sekvencia sekv. id. č. 7 kódujúca sOmpA peptid, a

   -Χ2 (b) druhá časť je nukleotidová sekvencia kódujúca myšací ob proteín alebo nukleotidová sekvencia kódujúca ľudský ob proteín.
8. 8. DNA sekvencia podľa nároku 7, kde myšací ob proteín zahŕňa sekv. id. č. 3.
9. 9. DNA sekvencia podlá nároku 7, kde ľudský ob proteín zahŕňa sekv. id. č. 6.
10. 10. Expresívny vektor zahrňujúci (a) promotorovú sekvenciu, a (b) DNA sekvenciu kódujúcu fúzny proteín, ktorý zahrňuje myšací ob proteín sekv. id. č. 3 alebo ľudský ob proteín sekv.

    id. č. 6, a signálny peptid pre vonkajší membránový proteín A E.coli, ktorýžto expresívny vektor je schopný expresovat fúzny proteín v Escherichia coli hostiteľských bunkách.
11. 11. Expresívny vektor podľa nároku 10, kde premotorová sekvencia sa skláda z ako lac-premotorového operátora, tak aj lipoproteinového premotora.
12. 12. Escherichia coli hostiteľský organizmus transformovaný expresívnym vektorom z nároku 10.
13. 13. Spôsob produkcie biologicky aktívneho rekombinantného ľudského alebo myšacieho obézneho proteinu zbaveného iných cicavcových proteinov vyznačený tým, že zahŕňa (a) konštrukciu expresívneho vek'tora majúceho premotorovú sekvenciu, DNA sekvenciu kódujúcu fúzny proteín, ktorý zahŕňa sekv. id. č. 3 alebo sekv. id. č. 6, a signálny peptid pre vnútorný membránový protenín A E.coli,

    -#3 (b) inzerciu expresívneho vektora do E.coli hostiteľskej bunky na transformáciu E.coli hostiteľskej bunky, (c) expresiu fúzneho proteínu v E.coli hostiteľskej bunke, a (d) ošetrenie E.coli hostiteľskej bunky chladným osmotickým šokovým pufrem na uvoľnenie myšacieho alebo ľudského proteínu zbaveného iných proteínov cicavcov a zbaveného sige nálneho peptidu.

    ’
14. 14. Sposob produkcie homogénneho biologicky aktívneho rekombinantneho ľudského alebo myšacieho obézneho proteínu vyznačený tým, že sa osmotická tekutina obsahujúca ľudský alebo myšací proteín podrobí kombinácii aniontomennej stĺpcovej chromatografii a gelovej filtrácii.
15. 15. Fúzny proteín zahrnujúci myšací obézny proteín alebo ľudský obézny proteín a signálny peptid pre vnútorný membránový proteín A Escherichia coli.
16. 16. Fúzny proteín podľa nároku 15, kde myšací obézny proteín zahrňuje sekv. id. č. 3 a kde ľudský obézny proteín zahrňuje sekv. id. č. 6.

    *>

    .
17. 17. Kompozícia zahrňujúca alespoň jeden konjugát polyethylénglykolu a/alebo polypropylén^glykolu viazaný na ľudský alebo myšací ob proteín ako je nárokované v nárokoch 1 až 6, pričom priemerná molekulová hmotnosť polyethylén- alebo polypropylénglykolových jednotek v týchto konjugátoch v uvedenej kompozícii je medzi 15 kDa až 60 kDa.
18. 18. Kompozícia zahrňujúca aspoň jeden konjugát vzorca

    I-A “$4 r·och₂ch₂(och₂ch₂)_n,

    -NH (_Ch₂)₄ (I-A) kde P je ľudský alebo myšací ob proteín ako je nárokované v nárokoch 1 až 6, n a n' sú celé čísla majúce súčet od 300 do 1500, pričom priemerná molekulová hmotnosť polyethylénglykolových jednotiek v týchto konjugátoch v tejto kompozícii je od 15 kDa do 60 kDa a R a R' sú nižší alkyly.
19. 19. Kompozícia podlá nároku 18, kde súčet n a n' je medzi 800 až 1200 a priemerná molekulová hmotnosť polyethy^B lénglykoloyých jednotiek v tomoto konjugáte v uvedenej kompozícii je 35 až 45 kDa.
20. 20. Kompozícia podl'a nároku 17 zahrňujúca aspoň jeden konjugát vzorca I-B θ

    RO(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂-C-NH-P (I-B) kde P je ťudský alebo myšací ob proteín ako je nárokovaný v nárokoch 1 až 6, n je celé číslo majúce súčet od 300 do 1500,

    -ff5 pričom priemerná molekulová hmotnosť polyethylénglykolových jednotiek v uvedených konjugátoch v uvedenej kompozícii je 15 kDa až 60 kDa, a R je nižší alkyl.

    jo
21. 21. Kompozícia podlá nároku 20, kde n asi od 850 do 1000 a priemerná molekulová hmotnosť polyethylénglykolových jednotiek v uvedených konjugátoch v tejto kompozícii je od 35 do 45 kDa.

    •
22. 22. Ľudský alebo myšací ob protein ako je nárokovaný v nárokoch 1 až 6 alebo kompozícia ako je nárokovaná v nárokoch 17 až 21, ako terapeuticky aktívne prostriedky.
23. 23. Ľudský alebo myšací ob protein ako je nárokovaný v nárokoch 1 až 6 alebo kompozícia ako je nárokovaná v nárokoch 17 až 21, ako terapeuticky aktívne prostriedky na liečenie, prevenciu a potláčanie obezity a pridružených chorôb.
24. 24. Farmaceutická zmes vyznačená tým, že obsahuje ľudský alebo, myšací ob protein podľa nárokov 1 až 6 alebo kompozíciu podľa nárokov 17 až 21 a kompatibilný farmaceutický akceptova* teľný nosný materiál.
25. 25. Použitie ľudského alebo myšaceho ob proteínu nárokovaného v nárokoch 1 až 6 alebo kompozície nárokované v nárokoch 17 až 21 na prípravu farmaceutických zmesí.
26. 26. Použitie ľudského alebo myšaceho ob proteínu nárokovaného v nárokoch 1 až 6 alebo kompozície nárokované v nárokoch 17 až 21 na prípravu farmaceutických zmesí na liečenie, prevenciu a potláčanie obezity a pridružených chorôb.
27. 27. Použitie ľudského alebo myšaceho ob proteínu nárokovaného v nárokoch 1 až 6 na identifikáciu ob proteínového receptora alebo receptorov.

    -g6
28. 28. Použitie expresívneho vektora nárokovaného v nárokoch 10 a 11 na produkciu ľudského alebo myšaceho ob proteínu ako je nárokovaný v nárokoch 1 až 6.
29. 29. Použitie DNA sekvencie nárokovanej v nárokoch 7 až 9 na produkciu ľudského alebo myšaceho ob proteínu nárokovaného v nárokoch 1 až 6.

    * _v
30. 30. Použitie Escherichia coli hostiteľského organizmu na produkciu ľudského alebo myšaceho proteínu nárokovanéhós v nárokoch 1 až 6.
31. 31. Homogénny biologicky aktívny rekombinantný ľudský alebo myšací ob proteín kdykoľvek pripravený sposobom nárokovaným v nárokoch 13 alebo 14.