[go: up one dir, main page]

SK288200B6 - Použitie geneticky skonštruovaného oslabeného vírusu chrípky na liečbu alebo prevenciu infekčného ochorenia citlivého na interferón - Google Patents

Použitie geneticky skonštruovaného oslabeného vírusu chrípky na liečbu alebo prevenciu infekčného ochorenia citlivého na interferón Download PDF

Info

Publication number
SK288200B6
SK288200B6 SK1907-2000A SK19072000A SK288200B6 SK 288200 B6 SK288200 B6 SK 288200B6 SK 19072000 A SK19072000 A SK 19072000A SK 288200 B6 SK288200 B6 SK 288200B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
influenza virus
amino acids
protein
virus
ifn
Prior art date
Application number
SK1907-2000A
Other languages
English (en)
Other versions
SK19072000A3 (sk
Inventor
Peter Palese
Adolfo Garcia-Sastre
Thomas Muster
Original Assignee
Mount Sinai School Of Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27376229&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=SK288200(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Mount Sinai School Of Medicine filed Critical Mount Sinai School Of Medicine
Publication of SK19072000A3 publication Critical patent/SK19072000A3/sk
Publication of SK288200B6 publication Critical patent/SK288200B6/sk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A61K39/17—Newcastle disease virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/205—Rhabdoviridae, e.g. rabies virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/543—Mucosal route intranasal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16132—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/16143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16151—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16161—Methods of inactivation or attenuation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16161—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2760/16162—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16171—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16221—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16232—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16241—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/16243—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16251—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16261—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2760/16262—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16271—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
    • C12N2760/18122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
    • C12N2760/18134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18522—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
    • C12N2760/20222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
    • C12N2760/20234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Použitie geneticky skonštruovaného oslabeného vírusu influenza, ktorého genóm kóduje skrátený NS1, pričom tento vírus má zníženú schopnosť antagonizovať bunkovú interferónovú reakciu, na liečbu alebo prevenciu infekčného ochorenia citlivého na interferón. Vynález sa týka najmä použitia oslabených influenza vírusov majúcich modifikácie v NS1 géne, ktoré redukujú alebo eliminujú schopnosť NS1 génového produktu antagonizovať bunkovú IFN odpoveď. Mutantné vírusy sa replikujú in vivo, ale majú redukovanú patogenicitu, a preto sú veľmi vhodné pre živé vírusové vakcíny a farmaceutické prostriedky.

Description

Oblasť techniky
Predložený vynález sa vo všeobecnosti týka použitia oslabených vírusov chrípky, ktoré majú zníženú schopnosť antagonizovať bunkovú interferónovú (IFN) odpoveď.
Vynález sa týka použitia oslabených vírusov chrípky, ktoré majú modifikácie NS1 génu, ktoré zmenšujú alebo eliminujú schopnosť produktu NS1 génu antagonizovať bunkovú IFN odpoveď. Mutantné vírusy sa replikujú in vivo, ale majú zníženú patogenicitu, a preto sú veľmi vhodné na použitie v živých vírusových vakcínach a farmaceutických prostriedkoch.
Doterajší stav techniky
Vírus chrípky
Vírusové čeľade obsahujúce obalené jednovláknové RNA s negatívnymsense genómom sú rozdelené do skupiny, v ktorej sú vírusy s nesegmentovaným genómom (Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae a vírus ochorenia Borna) alebo vírusy so segmentovaným genómom (Orthomyxoviridae, Bunyaviridae a Arenaviridae). Ako príklad tu bola použitá čeľaď Orthomyxoviridae, ktorá je podrobne opísaná nižšie a zahŕňa vírusy chrípky typu A, B a C, ako aj Thogoto a Dhori vírusy a vírus infekčnej lososej anémie.
Virióny vírusu chrípky pozostávajú z vnútorného ribonukleoproteínového jadra (závitnicovitý nukleokapsid) obsahujúceho jednovláknový RNA genóm a vonkajšieho lipoproteínového obalu, ktorý je vnútri spojený matricovým proteínom (Ml). Segmentovaný genóm vírusu chrípky A pozostáva z ôsmich molekúl (sedem molekúl vírusu chrípky C) lineárnych, jednovláknových RNAs s negatívnou polaritou, ktoré kódujú desať polypeptidov zahŕňajúcich: RNA závislé RNA polymerázové proteíny (PB2, PB1 a PA) a nukleoproteín (NP), ktorý vytvára nukleokapsid; matricové membránové proteíny (M 1, M2); dva povrchové glykoproteíny, ktoré vyčnievajú z obalu obsahujúceho lipidy: hemaglutinín (HA) a neuramidázu (NA); neštruktúrny protein (NS1) a jadrový exportný protein (NEP). Transkripcia a replikácia genómu sa uskutočňuje v jadre a zostavenie nastáva pučaním na plazmatickej membráne. Počas zmiešanej infekcie si vírusy môžu preusporiadať gény.
Vírus chrípky sa adsorbuje prostredníctvom HA na sialyloligosacharidy v bunkových membránových glykoproteínoch a glykolipidoch. Po endocytóze viriónu nastáva konformačná zmena v HA molekule vnútri bunkového endozómu, ktorý uľahčuje membránovú fúziu, a tak sa spúšťa odhaľovanie. Nukleokapsid migruje do jadra, kde sa transkribuje vírusová mRNA. Vírusová mRNA sa transkribuje unikátnym mechanizmom, pri ktorom vírusová endonukleáza odštiepi 5’-koniec s čiapočkou od bunkových heterológnych mRNAs, ktoré potom slúžia ako priméry na transkripciu vírusových RNA templátov vírusovou transkriptázou. Transkripty končia v mieste 15. až 22. bázy od konca ich templátov, tam, kde oligo(U) sekvencie slúžia ako signály na pridanie poly(A) pásov. Z ôsmich takto vyrobených RNA molekúl je šesť monocistronickými poslami, ktoré sa translatujú priamo do proteínov predstavujúcich HA, NA, N P a vírusové polymerázové proteíny, PB2, PB1 a PA. Ďalšie dva transkripty sa zostrihávajú za vzniku dvoch mRNAs, ktoré sú translatované v odlišných čítacích rámcoch, čím vznikajú Ml, M2, NS1 a NEP. Inak povedané, osem vírusových RNA segmentov kóduje desať proteínov: deväť štrukturálnych a jeden neštrukturálny. Zhrnutie génov vírusu chrípky a ich proteínových produktov je uvedené v tabuľke 1.
Tabuľka 1
Genómové RNA segmenty vírusu chrípky a kódované proteíny3
Segment Dížkab (nukleotidy) Kódovaný polypeptide DÍžkad (aminok.) Molekuly/ virión Poznámky
1 2341 PB2 759 30-60 Zložka RNA transkriptázy; viazanie hostiteľskej bunkovej RNA čiapočky
2 2341 PB1 757 30-60 Zložka RNA transkriptázy; iniciácia transkripcie
3 2233 PA 716 30-60 Zložka RNA transkriptázy
4 1778 HA 566 500 Hemaglutinín; trimér; obalový glykoproteín; sprostredkúva pripojenie na bunky
5 1565 NP 498 1000 Nukleoproteín; spojený s RNA; štrukturálna zložka RNA transkriptázy
6 1413 NA 454 100 Neuraminidáza; tetramér; obalový glykoproteín
7 1027 Ml 252 3000 Matricový protein; leží vnútri obalu
M2 96 ? Štrukturálny protein v plazmatickej membráne; zostri- haná m RN A
8 890 NS1 230 Neštrukturálny protein; neznáma funkcia
NEP 121 ? Jadrový exportný protein; zostrihaná mRNA
SK 288200 Β6 a Adaptované podľa R. A. Lamb a P. W. Choppin (1983); Annual Review of Biochemistry, Zv. 52,467 - 506 b pre A/PR/8/34 kmeň c Stanovené biochemickými a genetickými postupmi d Stanovené analýzou nukleotidovej sekvencie a sekvenovaním proteinu
Genóm vírusu chrípky A obsahuje osem segmentov jednovláknovej RNA s negatívnou polaritou, ktoré kódujú jeden neštrukturálny protein a deväť štrukturálnych proteinov. Neštrukturálny protein NS1 sa vo veľkom množstve nachádza v bunkách infikovaných vírusom chrípky, ale nebol detegovaný vo viriónoch. NS1 je fosfoproteín, ktorý sa nachádza v jadre hneď na začiatku infekcie a aj v cytoplazme v neskoršej fáze vírusového cyklu (King a ďalší, 1975, Virology 64: 378). Štúdie s tepelne senzitívnymi (ts) mutantmi vírusu chrípky majúcimi lézie v NS géne naznačili, že NS1 protein je transkripčný a posttranskripčný regulátor mechanizmov, prostredníctvom ktorých je vírus schopný inhibovať hostiteľskú bunkovú génovú expresiu a stimulovať vírusovú proteínovú syntézu. Podobne ako mnohé iné proteiny, ktoré regulujú posttranskripčné procesy, interaguje NS1 protein so špecifickými RNA sekvenciami a štruktúrami. Bolo zverejnené, že NS1 proteín sa viaže na odlišné RNA druhy vrátane vRNA, poly-A, U6 snRNA, 5' netranslatovanú oblasť ako vírusové mRNAs a ds RNA (Qiu a ďalší, 1995, RNA 1: 304; Qiu a ďalší, 1994, J. Virol. 68: 2425; Hatada Fukuda 1992, J Gen Virol. 73: 3325 - 9). Expresia NS1 proteinu z cDNA v transfekovaných bunkách bola spojená s niekoľkými účinkami: inhibícia nukleocytoplazmatického transportu mRNA, inhibícia pre-mRNA zostrihu, inhibícia polyadenylácie hostiteľskej mRNA a stimulácia translácie vírusovej mRNA (Fortes, a ďalší, 1994, EMBO J. 13: 704; Enami a ďalší, 1994, J. Virol. 68: 1432; de la Luna, a ďalší, 1995, J. Virol. 69: 2427; Lu, a ďalší, 1994, Genes Dev. 8: 1817; Park, a ďalší, 1995, J. Biol Chem. 270, 28433; Nemeroff a ďalší, 1998, Mol. Celí. 1: 1991; Chen, a ďalší, 1994, EMBO J. 18: 2273 - 83).
Oslabené vírusy
Inaktivované vírusové vakcíny sa pripravujú usmrtením vírusového patogénu, napr. zahriatím alebo ošetrením s formalínom, aby nebol schopný replikácie. Inaktivované vakcíny majú obmedzené využitie, pretože neposkytujú dlhotrvajúcu imunitu, a preto zaručujú len obmedzenú ochranu. Alternatívny prístup na výrobu vírusových vakcín zahŕňa použitie oslabených živých vírusových vakcín. Oslabené vírusy sú schopné sa replikovať, ale nie sú patogénne, a teda poskytujú dlhšie trvajúcu imunitu a zaručujú väčšiu ochranu. Ale bežné spôsoby na výrobu oslabených vírusov zahŕňajú šancu izolovať mutanty so zmeneným rozsahom hostiteľov, z ktorých mnohé sú citlivé na zmenu teploty; napr. vírus sa pasážuje na neprirodzených hostiteľoch a selektuje sa potomstvo vírusov, ktoré je imunogénne, a nie je patogénne.
Bežným substrátom na izoláciu a pestovanie vírusov chrípky na vakcinačné účely sú kuracie vajcia s embryami. Vírusy chrípky typicky rastú 2 až 4 dni pri 37 °C v 10 až 11 dňových vajciach. Hoci väčšina ľudských primárnych izolátov vírusov chrípky A a B rastie lepšie v amniotickej dutine embryí, po 2 alebo 3 pasážach sa vírusy prispôsobia rastu v bunkách alantoickej dutiny, ktorá je prístupná z vonkajšej strany vajec (Murphy, B. R., a R. G. Webster, 1996. Orthomyxoviruses str. 1397 - 1445. V In Fields Virology. Lippincott-Raven P. A.).
Technológia rekombinantnej DNA a techniky genetického inžinierstva by teoreticky poskytli vynikajúci prístup na výrobu oslabených vírusov, pretože by mohli byť do vírusového genómu premyslene zavedené mutácie. Ale genetické zmeny potrebné na oslabenie vírusov nie sú známe alebo sa nedajú predpokladať. Vo všeobecnosti smerovali pokusy použiť techniku rekombinantnej DNA k navrhnutiu vírusových vakcín na produkciu podjednotkových vakcín, ktoré obsahujú len proteínové podjednotky patogénu, ktoré sa podieľajú na imunitnej odpovedi, pričom sú tieto podjednotky exprimované v rekombinantných vírusových vektoroch, ako napríklad vírusoch kiahní alebo bakulovírusoch. V súčasnosti sa použili techniky rekombinantnej DNA v pokuse vyprodukovať herpes vírusové delečné mutanty alebo poliovírusy, ktoré napodobujú oslabené vírusy nachádzajúce sa v prírode alebo známe mutanty meniace rozsah hostiteľov. Do roku 1990 nebolo vôbec možné pre negatívne vláknité RNA vírusy použiť miestne špecifickú manipuláciu, takže nemohli byť menené genetickým inžinierstvom.
Egorov A. a kol. (Transfectant Influenza A Viruses with Long Deletions in the NS1 Protein Grow Efficiently in Vero Cells, Journal of Virology, The American Society for Microbiology, vyd. 72, č. 8, August 1998, str. 6437 - 6441) opisuje reverzný genetický systém na zavedenie špecifických delečných mutantov NS1, t. j. NS1/124, NS1/80, NS1/38 do vírusov chrípky A. Egorov a kol. uvádza, že vírusy chrípky A obsahujú N-koncové 124, 80 a 38 aminokyseliny NS1.
V takejto miere oslabené živé vírusy chrípky nemohli byť schopné suprimovať interferónovú odpoveď v hostiteľovi, v ktorom sa replikujú. Preto, hoci sú tieto vírusy užitočné, pretože sú imunogénne, a nie sú patogénne, je ťažké ich množiť na substrátoch, ktoré sú bežné na výrobu vakcín.
Navyše, oslabené vírusy môžu mať také slabé virulenčné vlastnosti, že neumožnia hostiteľovi zostaviť imunitnú odpoveď dostatočnú na vysporiadanie sa s následnými vyzývacími infekciami.
Podstata vynálezu
Vynález sa týka použitia geneticky skonštruovaných oslabených vírusov chrípky, ktoré majú zníženú schopnosť antagonizovať bunkovú IFN odpoveď, a použitia takýchto vírusov vo vakcínach a farmaceutických prostriedkoch. Mutantné vírusy so zníženou IFN antagonistickou aktivitou sú oslabené, sú infekčné, môžu sa replikovať in vivo, aby poskytli subklinickú úroveň infekcie, a nie sú patogénne. Preto sú ideálnymi kandidátmi pre živé vírusové vakcíny. Navyše, oslabené vírusy môžu indukovať masívnu IFN odpoveď, ktorá má iné biologické následky in vivo, ktoré poskytujú ochranu proti následným infekčným ochoreniam. Preto je možné oslabené vírusy použiť farmaceutický na prevenciu alebo liečbu infekčných ochorení citlivých na interferón.
Vírusy chrípky používané podľa vynálezu zahŕňajú tak segmentované, ako aj nesegmentované vírusy. Vírusy použité vo vynáleze môžu byť vybrané z prirodzene sa vyskytujúcich kmeňov, variantov alebo mutantov; z mutovaných vírusov (napr. generovaných vystavením vírusov mutagénom, opakovaným pasážovaním vírusov v nepermisívnych hostiteľoch); vírusov s preusporiadanými génmi (v prípade segmentovaných vírusových genómov); a/alebo vírusov získaných genetickým inžinierstvom (napr. použitím techník „reverznej genetiky“), ktoré majú požadovaný fenotyp, tzn. zníženú schopnosť antagonizovať bunkovú IFN odpoveď. Mutantné vírusy chrípky alebo vírusy chrípky pripravené prostredníctvom genetického inžinierstva je možné vybrať na základe odlišného rastu v IFN defícientných systémoch versus IFN kompetentných systémoch. Selektované môžu byť napríklad vírusy, ktoré rastú v IFN deficientnom systéme, ale nerastú v IFN kompetentnom systéme (alebo rastú horšie v IFN kompetentnom systéme).
Takto vybraný oslabený vírus môže byť použitý ako taký, ako účinná zložka vakcín alebo farmaceutických prostriedkov. Alternatívne môže byť oslabený vírus použitý ako vektor alebo „kostra“ rekombinantne produkovaných vakcín. Na tento účel je možné použiť techniky reverznej genetiky, aby sa zaviedli mutácie alebo cudzie epitopy do oslabených vírusov, ktoré by slúžili ako rodičovský kmeň. Týmto spôsobom je možné navrhnúť vakcíny na imunizáciu proti kmeňovým variantom alebo alternatívnym spôsobom proti úplne odlišným infekčným činidlám alebo chorobným antigénom. Oslabené vírusy môžu byť napríklad navrhnuté tak, aby exprimovali neutralizujúce epitopy iných vopred vybraných druhov. Alternatívne môžu byť do oslabeného mutantného vírusu zabudované epitopy iných ako negatívnych jednovláknových RNA vírusov (napr. gpl60, gpl20 alebo gp41 HIV vírusu). Alternatívne môžu byť do vírusu zavedené epitopy nevírusových infekčných patogénov (napr. parazitov, baktérií, plesní). Ako iná alternatíva môžu byť pripravené rakovinové vakcíny, napr. zavedením nádorových antigénov do oslabenej vírusovej kostry.
V hlavnom uskutočnení zahŕňajúcom vírusy chrípky so segmentovanými genómami, je možné použiť techniky preskladania na prenos oslabeného fenotypu z rodičovského segmentovaného RNA vírusového kmeňa (prirodzený mutant, mutovaný vírus alebo vírus skonštruovaný technikami genetického inžinierstva) do odlišného vírusového kmeňa (vírus divého typu, prirodzený mutant, mutovaný vírus alebo vírus skonštruovaný technikami genetického inžinierstva).
Oslabené vírusy chrípky, ktoré indukujú masívne IFN odpovede v hostiteľoch, môžu byť použité aj vo farmaceutických prostriedkoch na prevenciu alebo liečbu infekcií citlivých na interferón. V tomto ohľade je možné zmeniť tropizmus oslabeného vírusu tak, aby vírus smeroval do požadovaného cieľového orgánu, tkaniva alebo buniek, in vivo alebo ex vivo. Použitím tohto pristupuje možné indukovať IFN odpoveď lokálne, v cieľovom mieste, a tak vylúčiť alebo minimalizovať vedľajšie účinky systémových IFN ošetrení. Na tento účel je možné navrhnúť oslabené vírusy na expresiu ligandu špecifického pre receptor cieľového orgánu, tkaniva alebo cieľových buniek.
Vynález je čiastočne založený na zistení prihlasovateľov, že NS1 vírusu chrípky divého typu pôsobí ako IFN antagonista tým, že NS1 inhibuje IFN sprostredkovanú odpoveď hostiteľských buniek infikovaných vírusom. Zistilo sa, že vírusové mutanty s deficitom NS1 aktivity sú silnými induktormi bunkovej IFN odpovede a demonštrovali oslabený fenotyp in vivo; t. j. mutantné vírusy sa replikujú in vivo, ale majú redukované patogenické účinky. Zatiaľ čo nemáme v úmysle byť viazaní akoukoľvek teóriou alebo vysvetlením týkajúcim sa fungovania vynálezu, oslabené znaky vírusov sú podľa všetkého v dôsledku ich schopnosti indukovať masívnu bunkovú IFN odpoveď a ich zníženej schopnosti antagonizovať IFN odpoveď hostiteľa. Ale priaznivé znaky oslabených vírusov nemôžu byť pripisované jedine účinkom na bunkovú interferónovú odpoveď. V skutočnosti aj zmeny v iných aktivitách spojených s NS1 môžu prispievať k žiaducemu oslabenému fenotypu.
Ukázalo sa, že mutantné vírusy chrípky so zníženou IFN antagonistickou aktivitou sa replikujú in vivo, pričom generujú titre, ktoré sú dostatočné na to, aby indukovali imunologické a cytokinínové odpovede. Napríklad, vakcinácia s oslabeným vírusom chrípky znížila vírusové titre u zvierat, ktoré boli následne vystavené vírusu chrípky divokého typu. Oslabené vírusy chrípky tiež vykazovali antivírusovú a antitumorovú aktivitu. Predchádzajúca infekcia s oslabeným vírusom chrípky inhibovala replikáciu iných kmeňov vírusu chrípky divokého typu a iných vírusov (ako je Sendai vírus), ktoré boli superinfikované do embryotických vajec. Naočkovanie oslabenej chrípky zvieratám, ktorým boli injikované nádorové bunky, znížilo počet vy4 tvorených ohnísk. Pretože je známe, že vírus chrípky indukuje CTL (cytotoxické T-lymfocyty) odpoveď, oslabený vírus je veľmi atraktívnym kandidátom pre vakcíny proti rakovine.
Mutácie, ktoré zmenšujú, ale nerušia IFN antagonistickú aktivitu vírusu, sú výhodné pre vakcínové prostriedky —. Takéto vírusy môžu byť selektované tak, že rastú tak na bežných, ako aj nebežných substrátoch, a tak, aby boli stredne virulentné. Konkrétne, prihlasovatelia demonštrovali, že mutant NS1 skrátený na C-konci sa replikuje s vysokými titrami v IFN deficientných substrátoch ako napríklad v 6 a 7 dňových kuracích vajciach s embryami, ako aj v alantoickej membráne 10 dňových kuracích vajec s embryami, čo je bežný substrát pre vírus chrípky, ktorý neumožňuje rast mutantov chrípkového vírusu, v ktorých je deletovaný celý NS1 gén (tu označované aj ako „knockout“ mutanty). Ale replikácia mutantu NS1 skráteného na C-konci je redukovaná v 12-dňových vajciach s embryami. Tento prístup po prvýkrát umožňuje generovanie a identifikáciu živých oslabených vírusov chrípky, ktoré majú zmenenú, ale nie zrušenú IFN antagonistickú aktivitu, a ktoré sú schopné rásť v substrátoch vhodných na prípravu vakcín. Tento prístup tiež po prvýkrát poskytuje účinný selekčný identifikačný systém pre vírusy chrípky a iné vírusy, ktoré obsahujú mutácie spôsobujúce zmenu, ale nie zrušenie interferónovej antagonistickej aktivity.
Oslabené vírusy, ktoré nemôžu rásť v bežných teraz používaných systémoch na produkciu vakcín sa môžu množiť v IFN deficientných systémoch. Výraz IFN deficientné systémy, ako je tu používaný, znamená systémy, napr. buniek, bunkových línií a zvierat, napríklad myší, kurčiat, moriek, králikov, potkanov, atď., ktoré neprodukujú IFN alebo produkujú nízke hladiny IFN, neodpovedajú alebo odpovedajú menej účinne na IFN a/alebo sú deficientné v aktivite antivírusových génov indukovaných prostredníctvom IFN. Na tento účel prihlasovatelia identifikovali alebo navrhli množstvo IFN deficientných systémov, ktoré môžu byť použité, vrátane, ale bez obmedzenia, mladých embryotických vajec, IFN deficientných bunkových línií (ako napríklad VERO bunky alebo geneticky skonštruované bunkové línie, napríklad STATI knockouty). Alternatívne je možné embryotické vajcia alebo bunkové línie vopred ošetriť so zlúčeninami, ktoré inhibujú IFN systém (zahŕňajúc liečivá, protilátky, antisense, ribozýmy, atď.). Jeden príklad zahŕňa použitie vajec deficientných v IFN systéme, napr. vajec produkovaných STATI negatívnymi vtákmi, hlavne hydinou vrátane, ale bez obmedzenia, transgénnych kurčiat, kačíc alebo moriek.
Vynález sa teda týka generovania, selekcie a identifikácie oslabených vírusov chrípky, ktoré majú zníženú schopnosť antagonizovať bunkovú IFN odpoveď, a použitia takýchto vírusov vo vakcínových a farmaceutických prostriedkoch.
Konkrétne sa vynález týka geneticky skonštruovaného oslabeného vírusu chrípky, pričom genóm geneticky skonštruovaného oslabeného vírusu chrípky kóduje skrátený NS1 proteín majúci 1 až 130 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky, 1 až 120 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky, 1 až 110 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky, 1 až 100 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky, 1 až 99 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky, 1 až 90 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky, 1 až 89 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky, 1 až 70 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky alebo 1 až 60 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky, pričom N-koncová aminokyselina má číslo 1, a geneticky skonštruovaný vírus chrípky má zníženú schopnosť antagonizovať bunkovú interferónovú reakciu, na použitie na liečbu alebo prevenciu infekčného ochorenia citlivého na interferón u subjektu, a pričom geneticky skonštruovaný oslabený vírus chrípky kódujúci skrátený NS1 proteín majúci 1 až 89 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky je vírus chrípky B.
Vynález sa tiež týka použitia geneticky skonštruovaného oslabeného vírusu chrípky na výrobu liečiva na použitie na prevenciu alebo liečbu infekčného ochorenia citlivého na interferón u subjektu, pričom genóm geneticky skonštruovaného oslabeného vírusu kóduje skrátený NS1 proteín majúci 1 až 130 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky, 1 až 120 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky, 1 až 110 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky, 1 až 100 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky, 1 až 99 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky, 1 až 90 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky, 1 až 89 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky, 1 až 70 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky alebo 1 až 60 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky, pričom N-koncová aminokyselina má číslo 1, a geneticky skonštruovaný vírus chrípky má zníženú schopnosť antagonizovať bunkovú interferónovú reakciu a pričom geneticky skonštruovaný oslabený vírus chrípky kódujúci skrátený NS1 proteín majúci 1 až 89 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky je vírus chrípky B.
Vírusy majú segmentované genómy a môžu byť vybrané z prirodzene sa vyskytujúcich kmeňov, variantov alebo mutantov; mutovaných vírusov (napr. vystavením UV žiareniu, mutagénom a/alebo pasážovaním); vírusov s preskupenými génmi; a/alebo geneticky skonštruovaných vírusov. Mutované vírusy môžu byť generované napríklad prirodzenými variáciami, vystavením UV žiareniu, vystavením chemickým mutagénom, pasážovaním v nepermisívnych hostiteľoch, preskupovaním (tzn. spoločnou infekciou oslabeného segmentovaného vírusu s iným kmeňom, ktorý má požadované antigény) a/alebo genetickým inžinierstvom (napr. použitím reverznej genetiky). Vírusy vybrané na použitie vo vynáleze majú defektnú IFN antagonistickú aktivitu a sú oslabené, tzn. sú infekčné a môžu sa replikovať in vivo, ale generujú len nízke titre, ktorých výsledkom sú subklinické úrovne infekcie, ktoré nie sú patogénne. Takto oslabené vírusy sú ideálnymi kandidátmi pre živé vakcíny.
Vo výhodnom uskutočnení by mali byť oslabené vírusy chrípky vybrané na použitie vo vynáleze schopné indukovať masívnu IFN odpoveď v hostiteľovi --, čo je znak, ktorý sa podieľa na generovaní silnej imunitnej odpovede, keď sa použije ako vakcína, a ktorý má ďalšie biologické následky, ktoré robia vírusy užitočné ako farmaceutické činidlá na prevenciu a/alebo liečbu iných vírusových infekcií alebo iných ochorení, ktoré sú liečiteľné s IFN.
Vynález je čiastočne založený na množstve objavov a pozorovaní, ktoré urobili prihlasovatelia, keď pracovali s mutantmi vírusu chrípky. Ale princípy je možné analogicky aplikovať a extrapolovať na iné segmentované a nesegmentované negatívne jednovlákové RNA vírusy vrátane, ale bez obmedzenia na, paramyxovírusy (Sendai vírus, vírus parachrípky, príušnice, vírus Newcastelskej choroby), morbilivírusy (vírus osýpok, vírus psinky, vírus dobytčieho moru), pneumovírusy (respiračný syncytiálny vírus a hovädzí respiračný vírus), a rabdovírusy (vírus vezikulárnej stomatitídy a lyssavírus).
Po prvé, je dôležité, aby IFN odpoveď zahŕňala in vivo vírusovú infekciu. Prihlasovatelia zistili, že rast divého typu vírusu chrípky A/WSN/33 v IFN deficientných myšiach (STATI-/- myši) vedie k panorgánovej infekcii, tzn. vírusová infekcia nebola obmedzená na pľúca, ako je tomu pri divom type myši, ktorá generuje IFN odpoveď (Garcia-Sastre, a ďalší, 1998, J. Virol. 72: 8550). Po druhé, prihlasovatelia stanovili, že NS1 vírus chrípky funguje ako IFN antagonista. Prihlasovatelia vyskúmali, že mutant vírusu chrípky, ktorý má deletovaný celý NS1 gén (tzn. NS1 „knockout“) nebol schopný rásť vo vysokých titroch v IFN kompetentných hostiteľských bunkách a bolo ho možné množiť len v IFN deficientných hostiteľoch. NS1 knockoutové vírusy demonštrovali oslabený fenotyp (tzn. boli letálne.v IFN deficientných STATI-/- myšiach, ale neboli letálne v divom type myší) a zistilo sa, že sú účinným induktorom IFN odpovedí v hostiteľských bunkách (Garcia-Sastre, a ďalší, 1998, J. Virol. 252: 324 - 330). Predchádzajúca infekcia s NS1 knockoutovým mutantným vírusom redukovala titre divého typu vírusu chrípky a iných vírusov (napr. Sendai), ktoré boli superinfikované do embryotických vajec. V inom experimente infekcia s NS1 knockout mutantným vírusom chrípky redukovala vytváranie ohnísk v zvieratách, ktorým boli inokulované nádorové bunky. Takže NS1 knockout vírus chrípky demonštroval zaujímavé biologické vlastnosti. Ale NS1 knockout mutantné vírusy nemohli byť množené v bežných systémoch na produkciu vakcín. Aby sa prekonal tento problém, prihlasovatelia použili a vyvinuli IFN deficientný systém, ktorý umožňuje produkciu značných výťažkov oslabených vírusov.
Okrem toho prihlasovatelia navrhli delečné mutanty NS1, ktoré nemali deletovaný celý gén. Prekvapujúco sa zistilo, že tieto NS1 mutanty vykazujú intermediálny fenotyp, teda, že vírus môže rásť v bežných hostiteľoch používaných na množenie vírusu chrípky (hoci rast je lepší v IFN deficientných systémoch, v ktorých sú dosiahnuté vyššie titre). Dôležitejšie je, že delečné mutanty sú oslabené in vivo a indukujú masívnu IFN odpoveď. Výsledkom vakcinácie s mutantmi vírusu chrípky so skráteným NS1 boli nízke titre vírusu v zvieratách, ktoré boli následne infikované divým typom vírusu, a poskytnutie ochrany proti chorobe.
Predložený vynález sa týka aj substrátov navrhnutých na izoláciu, identifikáciu a pestovanie vírusov na vakcinačné účely. Opísané sú najmä interferón deficientné substráty na účinný rast mutantov vírusu chrípky. V súlade s predloženým vynálezom je interferón-deficientný substrát neschopný produkovať alebo odpovedať na interferón. Substrát podľa predloženého vynálezu môže byť použitý na pestovanie akéhokoľvek množstva vírusov, ktoré môžu potrebovať interferón-deficientné rastové prostredie. Takéto vírusy zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na paramyxovírusy (Sendai vírus, vírus parachrípky, príušnice, vírus Newcastelskej choroby), morbilivírusy (vírus osýpok, vírus psinky, vírus dobytčieho moru), pneumovírusy (respiračný syncytiálny vírus a hovädzí respiračný vírus), a rabdovírusy (vírus vezikulárnej stomatitídy a lyssavírus).
Vynález sa týka aj použitia oslabeného vírusu podľa vynálezu vo vakcínach a farmaceutických prostriedkoch pre ľudí alebo zvieratá. Konkrétne, oslabené vírusy môžu byť použité najmä ako vakcíny proti širokému rozsahu vírusov a/alebo antigénov vrátane, ale bez obmedzenia na antigény kmeňových variantov, odlišné vírusy alebo iné infekčné patogény (napr. baktérie, parazity, plesne). V inom uskutočnení môžu byť oslabené vírusy, ktoré inhibujú vírusovú replikáciu a vytváranie nádorov, použité na profylaxiu alebo liečbu infekcie citlivej na interferón (vírusovými alebo nevírusovými patogénmi). Na zavedenie živých oslabených vírusových prípravkov do ľudského alebo živočíšneho subjektu na indukciu imunitnej alebo príslušnej cytokínovej odpovede je možné použiť množstvo metód. Tieto zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na vnútronosové, vnútropriedušnicové, ústne, vnútrokožné, vnútrosvalové, vnútrobrušné, vnútrožilové, miechové a podkožné spôsoby podania. Vo výhodnom uskutočnení sú oslabené vírusy podľa predloženého vynálezu formulované na vnútronosové podanie.
Generovanie mutantov so zmenenou IFN antagonistickou aktivitou
Akýkoľvek mutantný vírus alebo kmeň, ktorý má zníženú IFN antagonistickú aktivitu, môže byť vybraný a použitý podľa vynálezu. V jednom príklade môžu byť prirodzene sa vyskytujúce mutanty alebo varianty, alebo spontánne mutanty vybrané tak, že majú zníženú schopnosť antagonizovať bunkovú IFN odpoveď. V inom uskutočnení môžu byť generované mutantné vírusy vystavením vírusu mutagénom, napríklad ultrafialovému žiareniu alebo chemickým mutagénom, alebo viacnásobným pasážam a/alebo pasážam na nepermi6 sívnych hostiteľoch. Na selekciu tých mutantov, ktoré majú zníženú IFN antagonistickú funkciu, môže byť použitý skríning v odlišnom pestovacom systéme. Pri vírusoch so segmentovanými genómami môže byť oslabený fenotyp prenesený na iný kmeň, ktorý má požadovaný antigén, preusporiadaním (tzn. spoločnou infekciou oslabeného vírusu a požadovaného kmeňa a selekciou na preusporiadané vírusy majúce oba fenotypy)·
V ďalšom príklade môžu byť mutácie zavádzané do negatívneho jedno vláknového RNA vírusu, napríklad vírusu chrípky, RSV, NDV, VSV a PIV, použitím prístupov reverznej genetiky. Týmto spôsobom je možné do vakcínových kmeňov zaviesť prirodzené alebo iné mutácie, ktorých následkom je oslabený fenotyp. Napríklad je možné zaviesť delécie, inzercie alebo substitúcie kódujúcej oblasti génu zodpovedného za IFN antagonistickú aktivitu (napríklad do NS1 vo víruse chrípky). Do úvahy sa berú aj delécie, substitúcie alebo inzercie v nekódujúcej oblasti génu zodpovedného za IFN antagonistickú aktivitu. S týmto cieľom je možné zaviesť mutácie v signáloch zodpovedných za transkripciu, replikáciu, polyadenyláciu a/alebo skladanie génu zodpovedného za IFN antagonistickú aktivitu. Napríklad vo víruse chrípky môžu takéto modifikácie zahŕňať, ale nie sú obmedzené na substitúcie nekódujúcich oblastí génu vírusu chrípky A nekódujúcimi oblasťami génu vírusu chrípky B (Muster a ďalší, 1991, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 88: 5177), výmena bázových párov v nekódujúcich oblastiach génu vírusu chrípky (Fodor a ďalší, 1998, J Virol. 72: 6283), mutácie v promótorovej oblasti génu vírusu chrípky (Piccone a ďalší, 1993, Virus Res. 28: 99; Li a ďalší, 1992, J. Virol. 66: 4331), substitúcie a delécie v sekvencií uridínových zvyškov na 5’-konci génu vírusu chrípky ovplyvňujúce polyadenyláciu (Luo a ďalší, 1991, J. Virol. 65: 2861; Li a ďalší, J. Virol, 1994, 68(2): 1245 - 9). Takéto mutácie, napríklad v promótore, by mohli znížiť expresiu génu zodpovedného za IFN antagonistickú aktivitu. Vírusy s mutáciami vo vírusových génoch, ktoré môžu regulovať expresiu génu zodpovedného za IFN antagonistickú aktivitu, sú tiež zahrnuté do rozsahu vírusov, ktoré môžu byť použité podľa vynálezu.
Predložený opis sa týka aj mutácií NS1 génového segmentu, ktorých výsledkom nemusí byť zmenená IFN antagonistická aktivita alebo IFN indukujúci fenotyp, ale ktorých výsledkom sú zmenené vírusové funkcie a oslabený fenotyp, napr. zmenená inhibícia jadrového exportu poly(A)-obsahujúcej mRNA, zmenená inhibícia pre-mRNA zostrihu, zmenená inhibícia aktivácie PKR prostredníctvom sekvestrovania dsRNA, zmenený účinok na transláciu vírusovej RNA a zmenená inhibícia polyadenylácie hostiteľskej mRNA (pozri napr. Krug v Textbook of Influenza, Nicholson a ďalší, vyd. 1998, 82 - 92, a tam citované publikácie).
Technika reverznej genetiky zahŕňa prípravu syntetických, rekombinantných, vírusových RNAs, ktoré obsahujú nekódujúce oblasti negatívnej jedno vlákno vej vírusovej RNA, ktoré sú nevyhnutné na rozoznáme vírusovými polymerázami a pre baliace signály potrebné na generovanie zrelého viriónu. Rekombinantné RNAs sa syntetizujú z rekombinantného DNA templátu a in vitro sa rekonštituujú s purifikovaným vírusovým polymerázovým komplexom, aby sa vytvorili rekombinantné ribonukleoproteíny (RNPs), ktoré môžu byť použité na transfekciu buniek. Účinnejšia transfekcia sa dosiahne, keď sú polymerázové proteíny prítomné počas transkripcie syntetických RNAs buď in vitro, alebo in vivo. Syntetické rekombinantné RNPs môžu byť pohltené do infekčných vírusových častíc. Uvedené techniky sú opísané v US patente č. 5166057 vydanom 24. novembra 1992, v US patente č. 5854037 vydanom 29. decembra 1998, v zverejnenej európskej patentovej prihláške EP 0702085A1 zverejnenej 20. februára 1996, v US prihláške vynálezu č. 09/152845, v medzinárodnej prihláške vynálezu PCT W097/12032 zverejnenej 3. apríla 1997, vo W096/34625 zverejnenej 7. novembra 1996, v európskej prihláške vynálezu EP-A780475, vo WO 99/02657 zverejnenej 21. januára 1999, vo WO 98/53078 zverejnenej 26. novembra 1998, vo WO 98/02530 zverejnenej 22. januára 1998, vo WO 99/15672 zverejnenej L apríla 1999, vo WO 98/13501 zverejnenej 2. apríla 1998, vo WO 97/06270 zverejnenej 2O.februára 1997, a v EPO 78047SA1 zverejnenej 25. júna 1997.
Oslabené vírusy generované postupom reverznej genetiky môžu byť použité v opísaných vakcínach a farmaceutických prostriedkoch. Techniky reverznej genetiky môžu byť použité aj na zavedenie ďalších mutácií do iných vírusových génov dôležitých na produkciu vakcín tzn., že do oslabených vírusov je možné vniesť epitopy užitočných vakcínových kmeňových variantov. Alternatívne je do oslabeného kmeňa možné zaviesť úplne cudzie epitopy, vrátane antigénov odvodených od iných vírusových alebo nevírusových patogénov. Do oslabeného kmeňa je možné zaviesť napríklad antigény nepríbuzných vírusov ako HIV (gpl60, gpl20, gp41), antigény parazitov (napr. malárie), bakteriálne alebo plesňové antigény. Alternatívne môžu byť do chimémych oslabených vírusov podľa vynálezu zavedené epitopy, ktoré menia tropizmus vírusu in vivo.
V alternatívnom uskutočnení je možné použiť kombináciu techník reverznej genetiky a techniky preusporiadania na skonštruovanie oslabených vírusov, ktoré majú požadované epitopy v segmentovaných RNA vírusoch. Napríklad oslabeným vírusom (generovaným prirodzenou selekciou, mutagenézou alebo technikami reverznej genetiky) a kmeňom nesúcim požadovaný vakcínový epitop (generovaným prirodzenou selekciou, mutagenézou alebo technikami reverznej genetiky) sa môžu zároveň infikovať hostitelia, ktorí umožňujú preusporiadanie segmentovaných genómov. Vírusy s preusporiadaným genómom, ktoré majú tak oslabený fenotyp, ako aj požadovaný epitop, sa potom môžu selektovať.
V ďalšom uskutočnení je vírusom, ktorý sa má mutovať, DNA vírus (napr. vírus kiahní, adenovírus, ba7 kulovírus) alebo pozitívny j ednovláknový RNA vírus (napr. poliovírus). V takých prípadoch je možné použiť techniky rekombinantnej DNA, ktoré sú v oblasti dobre známe (napr. US patent č. 4769330 v mene Paoletti, US patent č. 4215051 v mene Smith).
Podľa predloženého vynálezu môže byť skonštruovaný akýkoľvek vírus vrátane, ale bez obmedzenia na čeľade uvedené v tabuľke 2 nižšie.
Tabuľka 2
Čeľade ľudských a živočíšnych vírusov
Vlastnosti vírusu dsDNA obalené
Vírusová čeľaď
Poxviridae
Irididoviridae
Herpesviridae neobalené
Adenoviridae
Papovaviridae
Hepadinaviridae ssDNA neobalené dsRNA neobalené ssRNA obalené pozitívny-sense genóm bez DNA kroku v replikácii
Parvoviridae
Reoviridae
Birnaviridae
Togaviridae Flaviviridae Coronaviridae Vírus hepatitídy C
DNA krok v replikácii negatívny-sense genóm nesegmentovaný genóm
Retroviridae
Paramyxoviridae
Rhabdoviridae
Filoviridae segmentovaný genóm neobalené
Orthomyxoviridae
Bunyaviridae
Arenavirldae
Picornaviridae
Caliciviridae
Použité skratky:
ds = dvojvláknová; ss = jednovláknová; obalené = majúce vonkajšiu lipidovú dvojvrstvu vzniknutú z hostiteľskej bunkovej membrány; pozitívny-sense genóm = pre RNA vírusy, genómy, ktoré sú zložené z nukleotidových sekvencií priamo translatovaných na ribozómoch, = pre DNA vírusy, genómy, ktoré sú zložené z nukleotidových sekvencií, ktoré sú rovnaké ako mRNA; negatívny-sense genóm = genómy, ktoré sú zložené z nukleotidových sekvencií komplementárnych s pozitívnym-sense vláknom.
Vo výhodnom uskutočnení sa predložený vynález týka geneticky skonštruovaných vírusov chrípky obsahujúcich delécie a/alebo skrátenia NS1 génového produktu. Výhodné sú najmä NS1 mutanty vírusu chrípky A a B. V jednom prístupe sa časti aminokoncovej oblasti NS 1 génového produktu zachovávajú, zatiaľ čo časti C-koncovej oblasti NS1 génového produktu sú deletované. Do príslušného kodónu je možné zaviesť špecifické požadované mutácie prostredníctvom inzercie, delécie alebo mutovania nukleovej kyseliny. Konkrétne, skrátené NS1 proteíny majú najmä aminokyseliny 1 až 60, aminokyseliny 1 až 70, aminokyseliny 1 až 90 (N-koncová aminokyselina je 1) a výhodne 90 aminokyselín, aminokyseliny 1 až 100 a výhodne 99 aminokyselín aminokyseliny 1 až 110, aminokyseliny 1 až 120 alebo aminokyseliny 1 až 130 divého typuNSl génového produktu.
SK 288200 Β6
Predložený vynález sa týka aj akéhokoľvek geneticky skonštruovaného vírusu chrípky, v ktorom bol NS1 génový produkt modifikovaný skrátením alebo modifikáciou NS1 proteínu, čoho následkom sú nasledujúce fenotypy mutovaných vírusov: schopnosť vírusov rásť s vysokými titrami na nie bežných substrátoch, napríklad na 6 až 7 dňových kuracích vajciach, alebo schopnosť vírusov indukovať hostiteľskú interferónovú odpoveď. Pre vírusy chrípky A tieto modifikácie zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na vírusy, ktoré majú skrátené NS1.
Predložený vynález zahŕňa použitie prirodzene sa vyskytujúcich mutantných vírusov chrípky A alebo B, ktoré majú oslabený fenotyp, ako aj kmeňov vírusu chrípky skonštruovaných tak, aby mali mutácie zodpovedné za oslabený fenotyp. Pre vírusy chrípky A zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na vírusy majúce NS1 s dĺžkou 124 aminokyselín (Norton a ďalší, 1987, Virology 156: 204-213). Pre vírusy chrípky B zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na vírusy obsahujúce NS1 skracujúcu mutáciu zahŕňajúc 110 aminokyselín odvodených od N-konca (B/201) (Norton a ďalší, 1987, Virology 156: 204 - 213) a vírusy obsahujúce NS1 skracujúcu mutáciu zahŕňajúc 89 aminokyselín odvodených od N-konca (B/AWBY-234) (Tobita a ďalší, 1990, Virology 174: 314 - 19). Predložený vynález zahŕňa použitie prirodzene sa vyskytujúcich analógov k NS1/38, NS1/80, NS1/124 (Egorov a ďalší, 1998, J. Virol. 72 (8): 6437 - 41), ako aj prirodzene sa vyskytujúcich mutantov A/Turkey/ORE/71, B/201 alebo B/AWBY-234.
Oslabený vírus chrípky môže byť ďalej skonštruovaný tak, že exprimuje antigény iných vakcinačných kmeňov (napr. použitím reverznej genetiky alebo preusporiadania). Alternatívne môžu byť oslabené vírusy chrípky skonštruované použitím reverznej genetiky alebo preusporiadavania s geneticky skonštruovanými vírusmi, aby exprimovali úplne cudzie epitopy, napr. antigény iných infekčných patogénov alebo smerovacích antigénov. Keďže NS RNA segment je najkratší spomedzi ôsmich vírusových RNAs, je možné, že NS RNA bude tolerovať dlhšie inzercie heterológnych sekvencií ako iné vírusové gény. Navyše NS RNA segment riadi syntézu vysokých hladín proteínu v infikovaných bunkách, z čoho vyplýva, že by bol ideálnym segmentom na inzercie cudzích antigénov. Ale podľa predloženého vynálezu môže byť na inzerciu heterológnych sekvencií použitý ktorýkoľvek z ôsmich segmentov vírusov chrípky. Napríklad tam, kde je želateľná prezentácia antigénu na povrchu, je možné použiť segmenty kódujúce štrukturálne proteíny, napr. HA alebo NA. Selekčný systém založený na reštrikcii hostiteľa
V kontexte tohto vynálezu sú použité spôsoby selekcie vírusov, ktoré majú požadovaný fenotyp, tzn. vírusov, ktoré majú nízku alebo žiadnu IFN antagonistickú aktivitu, či už sú získané z prirodzených variantov, spontánnych variantov (tzn. variantov, ktoré sa vyvinuli počas množenia vírusu), mutovaných prirodzených variantov, vírusov s preusporiadaným genómom a/alebo geneticky skonštruovaných vírusov. Takéto vírusy môžu byť najlepšie skrínované v rozlišovacích rastových testoch, ktoré porovnávajú rast v IFN deficientnom versus IFN kompetentnom hostiteľskom systéme. Vírusy, ktoré lepšie rastú v IFN deficientných systémoch ako v IFN kompetentných systémoch, sa selektujú. Výhodne sa vyberajú vírusy, ktoré rastú v titroch, ktoré sú najmenej o jeden log vyššie v IFN deficientných systémoch ako v IFN kompetentnom systéme.
Alternatívne sa vírusy môžu skrínovať použitím IFN testovacích systémov, napr. systémov založených na transkripcii, v ktorých sa kontroluje expresia reporterového génu prostredníctvom IFN responzívneho promótora. Je možné merať expresiu reporterového génu v infikovaných versus neinfikovaných bunkách, aby sa identifikovali vírusy, ktoré účinne indukujú IFN odpoveď, ale ktoré nie sú schopné antagonizovať IFN odpoveď. Vo výhodnom uskutočnení sú však na výber vírusov s požadovaným fenotypom používané rozlišovacie rastové testy, pretože použitý hostiteľský systém (IFN kompetentný versus IFN deficientný) poskytuje príslušný selekčný tlak.
Napríklad, rast vírusu (meraný prostredníctvom titra) je možné porovnávať v rôznych bunkách, bunkových líniách alebo živočíšnych modelových systémoch, ktoré exprimujú IFN a zložky IFN odpovede, versus v bunkách, bunkových líniách alebo živočíšnych modelových systémoch, ktoré nezahŕňajú IFN alebo zložky IFN odpovede. S týmto cieľom je možné porovnávať rast vírusu v bunkovej línii, napríklad vo VERO-bunkách (ktoré sú IFN deficientné) s rastom v MDCK bunkách (ktoré sú IFN kompetentné). Alternatívne je možné IFN deficientné bunkové línie odvodiť a založiť zo živočíšnych plemien alebo je ich možné geneticky skonštruovať tak, aby boli deficientné v INF systéme (napr. STATI -/- mutantné myši). Je možné merať rast vírusu v takýchto bunkových líniách v porovnaní s rastom v IFN kompetentných bunkách odvodených napríklad od divého typu zvieraťa (napr. od divého typu myší). V ešte inom uskutočnení je možné manipulovať s bunkovými líniami, ktoré sú IFN kompetentné a je o nich známe, že podporujú rast divého typu vírusu, tak, aby boli IFN deficientné (napr. knockoutovaním STATI, IRF3, PKR, atď.). Je možné použiť techniky, ktoré sú dobre známe v oblasti množenia vírusov v bunkových líniách (pozri napríklad uvedené príklady). Je možné porovnať rast vírusu v štandardnej IFN kompetentnej bunkovej línii a IFN deficientnej geneticky skonštruovanej bunkovej línii.
Použité môžu byť aj živočíšne systémy. Napríklad pre vírus chrípky je možné porovnávať rast v mladých IFN deficientných emryotických vajciach, napr. približne 6 až 8 dňových, s rastom v starších IFN kompetentných vajciach, napr. približne 10 až 12 dňových. Na tento účel je možné použiť techniky, ktoré sú dobre známe v oblasti infekcie a množenia vo vajciach (pozri napríklad uvedené príklady). Alternatívne je možné porovnávať rast v IFN defícientných STATI -/- myšiach s rastom v IFN kompetentných myšiach divého typu. Ešte inou alternatívou môže byť porovnávanie rastu v IFN defícientných embryotických vajciach produkovaných napríklad STAT1 -/- transgénnou hydinou s rastom v IFN kompetentných vajciach produkovaných divým typom hydiny.
Ale namiesto geneticky manipulovaných systémov môže byť na účely skríningu použitý prechodný IFN deficientný systém. Napríklad hostiteľský systém môže byť ošetrený zlúčeninami, ktoré inhibujú IFN produkciu a/alebo produkciu zložiek IFN odpovede (napr. chemickými látkami, protilátkami proti IFN, protilátkami proti IFN receptoru, inhibítormi PKR, antisense molekulami a ribozýmami, atd’.). Rast vírusu v IFN kompetentných neošetrených kontrolách môže byť porovnaný s rastom vírusu v IFN defícientných ošetrených systémoch. S takýmito chemikáliami je napríklad možné ošetriť pred infekciou vírusov, ktoré majú byť skrinované, staršie vajcia, ktoré sú IFN kompetentné. Rast je porovnávaný s rastom dosiahnutým v neošetrených kontrolných rovnako starých vajciach.
Spôsoby skríningu podľa vynálezu poskytujú jednoduchý a ľahký skríning na identifikáciu mutantných vírusov so zrušenou IFN antagonistickou aktivitou, prostredníctvom neschopnosti mutantného vírusu rásť v IFN responzívnych prostrediach, v porovnaní so schopnosťou mutantného vírusu rásť v IFN defícientných prostrediach. Spôsoby skríningu podľa vynálezu môžu byť použité aj na identifikáciu mutantných vírusov so zmenenou, ale nie zrušenou, IFN antagonistickou aktivitou prostredníctvom merania schopnosti mutantného vírusu rásť tak v IFN responzívnom prostredí, napr. desaťdňových embryotických vajciach alebo MDCK bunkách, ako aj v IFN defícientnom prostredí, napr. 6- až 7-dňových embryotických vajciach alebo Vero-bunkách. Napríklad vírusy chrípky, ktoré majú najmenej o jeden log nižšie titre v 10-dňových vajciach v porovnaní s titrami v 6- až 7-dňových vajciach, budú považované za vírusy so zníženou schopnosťou inhibovať IFN odpoveď. V inom príklade sú vírusy chrípky, ktoré majú najmenej o jeden log nižší titer v 12-dňových vajciach (ktoré vykazujú vysokú IFN odpoveď) v porovnaní s titrom v 10-dňových vajciach (ktoré vykazujú miernu IFN odpoveď) považované za vírusy s čiastočne zníženou schopnosťou antagonizovať IFN odpoveď a sú považované za atraktívnych vakcínových kandidátov.
Spôsoby selekcie podľa vynálezu zahŕňajú aj identifikáciu tých mutantných vírusov, ktoré indukujú IFN odpovede.
V súlade so selekčnými metódami podľa vynálezu je možné indukciu IFN odpovedí merať testovaním úrovne IFN expresie alebo úrovne expresie cieľových génov alebo reportérových génov indukovanej prostredníctvom IFN po infekcii s mutantnými vírusmi alebo aktiváciou transaktivátorov podieľajúcich sa na IFN expresii a/alebo IFN odpovedi.
V ešte inom uskutočnení selekčných systémov podľa vynálezu je možné stanoviť indukciu IFN odpovedí meraním stavu fosforylácie zložiek IFN dráhy po infekcii s testovaným mutantným vírusom, napr. IRF-3, ktorý je fosforylovaný ako odpoveď na dvoj vláknovú RNA. Ako odpoveď na IFN typu I sa rýchlo fosforylujú na tyrozínoch Jakl kináza a TyK2 kináza, podjednotky IFN receptora STATI a STAT2. Takže na stanovenie toho, či mutantný vírus indukuje IFN odpovede, sa bunky, napríklad 293 bunky, infikujú s testovaným mutantným vírusom a po infekcii sa lyžujú. Z infikovaných bunkových lyzátov sa imunoprecipitujú zložky IFN dráhy, napríklad Jakl kináza alebo TyK2 kináza, použitím špecifických polyklonálnych sér alebo protilátok, a stav tyrozínovej fosforylácie kinázy sa stanoví imunoblotovým testom s anti-fosfotyrozínovou protilátkou (pozri napr. Krishnan a ďalší, 1997, Eur. J. Biochem. 247: 298 - 305). Zosilnený fosforylovaný stav akejkoľvek zložky IFN dráhy po infekcii s mutantným vírusom by indikoval, že mutantný vírus indukoval IFN odpovede.
V ešte inom uskutočnení zahŕňajú selekčné systémy podľa vynálezu meranie schopnosti viazať špecifické DNA sekvencie alebo schopnosti premiestňovať transkripčné faktory indukovanej ako odpoveď na vírusovú infekciu, napr. 1RF3, STATI, STAT2, atď. Ako odpoveď na IFN typu I sú fosforylované a premiestňované z cytoplazmy do jadra najmä STATI a STAT2. Schopnosť viazať špecifické DNA sekvencie alebo premiestňovať transkripčné faktory je možné merať technikami, ktoré sú pre priemerného odborníka v oblasti známe, napr. testom posunu elektromobility v géli, bunkovým farbením atď.
V ešte inom uskutočnení selekčných systémov podľa vynálezu je možné stanoviť indukciu IFN odpovedí meraním IFN závislej transkripčnej aktivácie po infekcii s testovaným mutantným vírusom. V tomto uskutočnení je možné analyzovať expresiu génov, o ktorých je známe, že sú indukované prostredníctvom IFN, napr. Mx, PKR, 2-5-oligoadenylátsyntetázy, hlavného histokompatibilného komplexu (MHC) triedy I, atď., technikami známymi pre priemerného odborníka v oblasti (napr. northem blotmi, westem blotmi, PCR, atď.). Alternatívne sa skonštruujú testovacie bunky, napríklad ľudské embryotické obličkové bunky alebo bunky ľudského osteogenického sarkómu, tak, aby prechodne alebo konštitutívne exprimovali reporterové gény, napríklad luciferázový reporterový gén alebo chloramfenikol transferázový (CAT) reporterový gén, pod kontrolou interferónom stimulovaného responzívneho elementu, napríklad IFN stimulovaného promótora ISG-54K génu (Bluyssen a ďalší, 1994, Eur. J. Biochem. 220: 395 - 402). Bunky sa infikujú s testovacím mutantným vírusom a porovnáva sa úroveň expresie reporterového génu s úrovňou expresie génu v neinfikova10
SK 288200 Β6 ných bunkách alebo v bunkách infikovaných s divým typom vírusu. Zo zvýšenia úrovne expresie reporterového génu po infekcii s testovaným vírusom by vyplývalo, že testovaný mutantný vírus indukuje IFN odpoveď.
V ešte inom uskutočnení zahŕňajú selekčné systémy podľa vynálezu meranie IFN indukcie prostredníctvom stanovenia toho, či je extrakt z buniek alebo vajec infikovaných s testovaným mutantným vírusom schopný poskytnúť ochrannú aktivitu proti vírusovej infekcii. Konkrétnejšie sa skupiny 10-dňových embryotických kuracích vajec infikujú s testovaným mutantným vírusom alebo vírusom divého typu. Približne 15 až 20 hodín po infekcii sa odoberie alantoická tekutina a testuje sa na IFN aktivitu stanovením najvyššieho riedenia s ochrannou aktivitou proti VSV-infekcii v tkanivovej kultúre buniek, ako napríklad v CEF-bunkách.
Množenie vírusu v interferón deficientných pestovacích substrátoch
Vynález zahŕňa aj spôsoby a IFN deficientné substráty na pestovanie a izoláciu prirodzene sa vyskytujúcich alebo skonštruovaných mutantných vírusov, ktoré majú zmenenú IFN antagonistickú aktivitu. IFN deficientné substráty, ktoré môžu byť použité na podporu rastu oslabených mutantných vírusov, zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na prirodzene sa vyskytujúce bunky, bunkové línie, živočíchy alebo embryotické vajcia, ktoré sú IFN deficientné, napr. Vero-bunky, mladé embryotické vajcia rekombinantné bunky alebo bunkové línie, ktoré sú skonštruované tak, aby boli IFN deficientné, napr. IFN deficientné bunkové línie odvodené od STATI knockoutových myší alebo iných podobne skonštruovaných transgénnych živočíchov, embryotické vajcia získané od IFN deficientných vtákov, najmä hydiny (napr. kurčiat, kačíc, moriek), vrátane hydiny, ktorá je šľachtená tak, aby bola IFN deficientná alebo transgénnych vtákov (napr. STATI knockoutov). Alternatívne môže byť hostiteľský systém, bunky, bunkové línie, vajcia alebo zvieratá geneticky skonštruované tak, aby exprimovali transgény kódujúce inhibítory IFN systému, napr. dominantne negatívne mutanty ako STATI, ktorému chýba DNA viažuca doména, antisense RNA, ribozýmy, inhibítory produkcie IFN, inhibítory IFN signalizácie a/alebo inhibítory antivírusových génov indukovaných prostredníctvom IFN. Treba zdôrazniť, že živočíchy, ktoré sú šľachtené alebo geneticky konštruované tak, aby boli IFN deficientné, budú do istej miery imunologický oslabené a mali by byť udržiavané v kontrolovanom prostredí bez choroboplodných zárodkov. Takže príslušné merania (vrátane použitia antibiotík v strave) by mali byť uskutočňované tak, aby sa obmedzilo riziko vystavenia transgénnych IFN deficientných živočíchov infekčným agensom, napríklad hejná šľachtených sliepok, kačíc, moriek, atď. Alternatívne je možné ošetriť hostiteľský systém, napr. bunky, bunkové línie, vajcia alebo živočíchov, so zlúčeninou, ktorá inhibuje IFN produkciu a/alebo IFN dráhu, napr. liečivami, protilátkami, antisense molekulami, ribozýmovými molekulami, ktorých cieľom je STATI gén a/alebo antivírusovými génmi indukovanými prostredníctvom IFN.
V súlade s predloženým vynálezom zahŕňajú nezrelé embryotické kuracie vajcia, ktoré sú prirodzene mladšie ako desaťdňové, výhodne šesť až deväťdňové vajcia, a vajcia, ktoré umelo napodobujú nezrelé vajcia mladšie ako desať dní, následkom zmien v inkubačných teplotách, ošetrenia liečivami alebo následkom iných zmien, ktoré vedú k retardovanému vývinu vajec, takže IFN systém vajca nie je tak kompletne vyvinutý ako systém v 10- až 12-dňových vajciach.
Prirodzené IFN deficientné substráty
Predložený vynález týka pestovania prirodzene sa vyskytujúcich a skonštruovaných mutantných vírusov v nezvyčajných substrátoch, napríklad v nezrelých embryotických vajciach, ktoré ešte nemajú vyvinutý IFN systém. Nezrelé embryotické vajcia sa normálne nepoužívajú na pestovanie vírusu, pretože sú krehké a majú menší alantoický objem. Predložený vynález zahŕňa pestovanie mutantných vírusov v embryotických vajciach mladších ako 10 dní, výhodne pestovanie mutantného vírusu v 8-dňových embryotických vajciach a najvýhodnejšie v 6- až 8-dňových vajciach.
Predložený vynález tiež opisuje spôsoby pestovania a izolácie mutovaných vírusov, ktoré majú zmenenú IFN antagonistickú aktivitu v bunkách a bunkových líniách, ktoré prirodzene nemajú IFN dráhu alebo majú deficientnú IFN dráhu alebo majú deficientnú IFN dráhu alebo majú deficit v IFN systéme napr. nízke hladiny IFN expresie v porovnaní s bunkami divého typu. Predložený vynález opisuje spôsoby rastu mutovaných vírusov majúcich zmenenú IFN antagonistickú aktivitu vo Vero-bunkách.
Geneticky skonštruované IFN deficientné substráty
Predložený vynález opisuje spôsoby pestovania a izolácie mutovaných vírusov, ktoré majú zmenenú IFN antagonistickú aktivitu v geneticky skonštruovanom IFN deficientnom substráte. Predložený vynález zahŕňa transgénne vtáky, v ktorých je mutovaný gén potrebný pre IFN systém, napr. STATI, ktoré môžu znášať IFN deficientné vajcia. Predložený vynález ďalej zahŕňa transgénne vtáky, ktoré exprimuju dominantne negatívne transkripčné faktory, napr. STATI bez DNA viažucej domény, ribozýmy, antisense RNA, inhibítory IFN produkcie, inhibítory IFN signalizácie a inhibítory antivírusových génov indukovaných ako odpoveď na IFN. Výhodou použitia vajec od IFN deficientných transgénnych vtákov je to, že je možné na pestovanie vírusu použiť bežné 10 dňové vajcia, ktoré sú stabilnejšie a majú väčší objem, keďže sú väčšie. V ešte inom usku11 točnení je možné geneticky skonštruovať bunkové línie tak, aby boli IFN deficientné. Predložený vynález zahŕňa bunkové línie, v ktorých je mutovaný gén esenciálny pre IFN syntézu, IFN dráhu a/alebo antivírusový gén (gény) indukovaný prostredníctvom IFN, napr. STATI.
Vynález poskytuje rekombinantné bunkové línie alebo živočíchy, najmä vtáky, v ktorých je jeden alebo viacero génov esenciálnych pre IFN dráhu, napr. gén interferónového receptora, STATI, atď., prerušený, tzn. je knockoutovaný. Rekombinantným živočíchom môže byť akýkoľvek živočích, ale vo výhodnom uskutočnení je ním vták, napr. kurča, morka, sliepka, kačka atď. (pozri napr. Sang, 1994, Trends Biotechnol. 12: 415; Perry a ďalší, 1993, Transgenic Res. 2: 125; Stem, C. D., 1996, Curr Top Microbiol Immunol 212: 195 až 206; a Shuman, 1991, Experientia 47: 897), ako zhrnutie týkajúce sa produkcie transgénnych vtákov, pričom každá z uvedených publikácií je tu komplet zahrnutá jej citáciou. Takáto bunková línia alebo živočích môžu byť generované akoukoľvek v oblasti známou metódou na prerušenie génu na chromozóme bunky alebo živočícha. Takéto techniky zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na pronukleámu mikroinjekciu (Hope & Wagner, 1989, US patent č. 4873191), retrovírusom sprostredkovaný génový transfer do zárodočných línií (Van der Putten a ďalší, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82: 6148 - 6152), zacielenie génu v embryotických kmeňových bunkách (Thompson a ďalší, 1989, Celí 56: 313), elektroporáciu embryí (Lo, 1983, Mol Celí. Biol. 3: 1803), spermaticky sprostredkovaný génový transfer (Lavitrano a ďalší, 1989, Celí 57: 717), atď. Takéto techniky sú zhrnuté v Gordon, 1989, Transgenic Animals, Intl. Rev. Cytol. 115: 171.
Konkrétne, STATI knockoutového živočícha je možné vyprodukovať najmä homologickou rekombináciou medzi STATI génom v jeho chromozóme a exogénnym STATI génom, ktorý bol upravený na biologicky neaktívny (výhodne zavedením heterológnej sekvencie, napr. génu antibiotikovej rezistencie). Spôsoby homologickej rekombinácie na prerušenie génu v myšacom genóme sú opísané napríklad v Capechi (1989, Science 244: 1288) a Mansour a ďalší (1988, Náture 336: 348).
V stručnosti, celý genomický kloň STATI alebo časť STATI genomického klonu sa izoluje z genomickej DNA z rovnakých druhov ako knockoutovaná bunka alebo živočích. STATI genomický kloň je možné izolovať akýmkoľvek spôsobom na izolovanie genomických klonov známym v oblasti (napr. prehľadávanie genomickej knižnice sondou odvodenou od STATI sekvencie, napríklad od sekvencií poskytnutých v Meraz a ďalší, 1996, Celí 84: 431, Durbin a ďalší, 1996, Celí 84: 443 a tam citované publikácie). Keď sa izoluje genomický kloň, zavedie sa celý alebo jeho časť do rekombinantného vektora. Výhodne časť klonu zavádzaná do vektora obsahuje najmenej časť exónu STATI génu, tzn. obsahuje STATI proteín kódujúcu sekvenciu. Potom sa do STATI génového exónu zavedie sekvencia, ktorá nie je homologická so STATI sekvenciou, výhodne pozitívny selekčný marker, napríklad gén kódujúci antibiotikovú rezistenciu. Selekčný marker je výhodne operačne spojený s promótorom, výhodnejšie s konštitutívnym promótorom. Nehomologická sekvencia je zavádzaná hocikde do STATI kódujúcej sekvencie, kde bude narušovať STATI aktivitu, napr. do polohy, pre ktorú sa demonštrovalo, že v nej bodové alebo iné mutácie inaktivujú STATI proteínovú funkciu. Napríklad, ale bez obmedzenia, môže byť nehomologická sekvencia zavedená do sekvencie kódujúcej časť STATI proteínu, ktorá zahŕňa celú kinázovú doménu alebo časť kinázovej domény (napr. nukleotidová sekvencia kódujúca najmenej 50, 100, 150, 200 alebo 250 aminokyselín kinázovej domény).
Pozitívnym selektovateľným markerom je výhodne gén neomycínovej rezistencie (neo gén) alebo gén hygromycínovej rezistencie (hygro gén). Promótorom môže byť akýkoľvek promótor známy v oblasti, napríklad promótor fosfoglycerát kinázy (PGK) (Adra a ďalší, 1987, Gene 60: 65 - 74), Polil promótor (Soriano a ďalší, 1991, Celí 64: 693 - 701) alebo MCI promótor, ktorý je syntetickým promótorom skonštruovaným na expresiu v zárodočných bunkách odvodených od embrya (Thomas & Capecchi, 1987, Celí 51: 503 - 512). Použitie selektovateľného markera, ako napríklad génu antibiotikovej rezistencie, umožňuje selekciu buniek, do ktorých bol zavedený cieľový vektor (napríklad expresia neo génového produktu poskytuje rezistenciu voči G418 a expresia hygro génového produktu poskytuje rezistenciu voči hygromycínu).
Vo výhodnom uskutočnení je mimo STATI genomického klonového inzertu zavedený negatívny selektovateľný marker na paralelný selekčný krok na indikáciu homologickej, na rozdiel od nehomologickej, rekombinácie vektora. Takýmto negatívnym selektovateľným markerom môže byť napríklad gén HSV tymidín kinázy (HS V-tk), ktorého expresia robí bunky citlivými voči ganciklovírusu. Negatívny selektovateľný marker je výhodne pod kontrolou promótora, ako napríklad, ale bez obmedzenia na PGK promótora, Polil promótora alebo MCI promótora.
Keď nastane homologická rekombinácia, časti vektora, ktoré sú homologické so STAT1 génom, ako aj nehomologický inzert vnútri STATI génových sekvencií, sa začlenia do STATI génu v chromozóme a zvyšok vektora sa stratí. Takže, keďže je negatívny selektovateľný marker mimo oblasti homológie so STATI génom, bunky, v ktorých nastala homologická rekombinácia (alebo v ich predkovi), nebudú obsahovať negatívny selektovateľný marker. Napríklad, ak je negatívnym selektovateľným markerom HSV-tk gén, bunky, v ktorých nastala homologická rekombinácia, nebudú exprimovať tymidín kinázu a prežijú vystavenie ganciklovírusu. Tento postup umožňuje selekciu buniek, v ktorých prebehla homologická rekombinácia, od buniek, v ktorých neprebehla homologická rekombinácia, a v ktorých je pravdepodobné, že bol do genómu zabudovaný aj negatívny selektovateľný marker spolu so STATI sekvenciami a pozitívnym selektovateľným marke12
SK 288200 Β6 rom. Takže bunky, v ktorých prebehla nehomologická expresia, budú najpravdepodobnejšie exprimovať tymidín kinázu a budú citlivé na ganciklovírus.
Keď sa pripraví zameriavací vektor, linearizuje sa reštrikčným enzýmom, ktorý má len jedno štiepne miesto v zameriavacom vektore, a linearizovaný vektor sa zavedie do zárodočnej bunky odvodenej od embrya (ES) (Gossler a ďalší, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9065 - 9069) akoukoľvek metódou známou v oblasti, napríklad elektroporáciou. Ak zameriavací vektor obsahuje pozitívny selektovateľný marker a negatívny selektovateľný marker na paralelnú selekciu, ES bunky, v ktorých nastala homologická rekombinácia, sa môžu selektovať inkubovaním v selektívnom médiu. Napríklad, ak sú selektovateľnými markermi gén neo rezistencie a HSV-tk gén, bunky sa vystavia G418 (napr. približne 300 ng/ml) a ganciklovírusu (napr. približne 2 μΜ).
Na potvrdenie toho, že prerušené STATI sekvencie sa homologicky rekombinovali do STATI génu v genóme ES buniek, je možné použiť akúkoľvek techniku známu v oblasti genotypingu, napríklad, ale bez obmedzenia na Southern blot analýzu alebo polymerázovú reťazovú reakciu. Pretože reštrikčná mapa STATI genomického klonuje známa a sekvencia STATI kódujúcej sekvencie je známa (pozri Meraz a ďalší, 1996, Celí 84: 431; Durbin a ďalší, 1996, Celí 84: 443 - 450, a všetky tam uvedené citácie), je možné stanoviť veľkosť konkrétneho reštrikčného fragmentu alebo PCR amplifíkačného produktu generovaného z DNA tak prerušených, ako aj neprerušených alel. Takže testovaním reštrikčných fragmentov alebo PCR produktu, ktorých veľkosť sa líši medzi prerušeným a neprerušeným STATI génom, je možné stanoviť, či nastala homologická rekombinácia s prerušeným STATI génom.
ES bunky s prerušeným STATI lokusom sa môžu zaviesť do blastocytov mikroinjekciou, a potom je možné implantovať blastocyty do maternice pseudogravidných myší použitím rutinných techník. Živočíchy, ktoré sa vyvinú z implantovaných blastocytov sú chiméme v prerušenej alele. Chimérni samčekovia sa môžu krížiť so samičkami a tento kríženec môže byť navrhnutý tak, aby bol zárodočný prenos alely spojený s prenosom určitej farby srsti. Zárodočný prenos alely sa môže potvrdiť Southern blotingom alebo PCR analýzou, ako je opísané, genomickej DNA izolovanej z tkanivových vzoriek.
Prechodné IFN deficientné substráty
Bunky, bunkové línie, živočíchy alebo vajcia je možné vopred ošetriť so zlúčeninami, ktoré inhibujú IFN systém. Podľa predloženého vynálezu je možné na predošetrenie hostiteľov použiť zlúčeniny, ktoré inhibujú syntézu IFN alebo aktivitu, alebo expresiu zložiek IFN systému, napr. zlúčeniny, ktoré inhibujú syntézu IFN, aktivitu IFN, IFN receptor, iné ciele v IFN signálnej prenosnej dráhe, alebo inhibujú aktivitu antivírusových génov indukovaný prostredníctvom IFN. Príklady zlúčenín, ktoré môžu byť použité, zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na, molekuly nukleovej kyseliny, protilátky, peptidy, antagonisty IFN receptora, inhibítory STAT1 dráhy, inhibítory PKR, atď. V súlade s predloženým vynálezom zahŕňajú molekuly nukleovej kyseliny antisense molekuly, ribozýmy a trojzávitnicové molekuly, ktorých cieľom sú gény kódujúce esenciálne zložky IFN systému, napr. STATI. Molekuly nukleovej kyseliny zahŕňajú aj nukleotidy kódujúce dominantne negatívne mutanty zložiek IFN systému, napr. pred infekciou s vírusovým mutantom je možné transfekovať bunky s DNA kódujúcou skrátený, signalizačné nekompetentný mutant IFN receptora.
Dominantne-negatívne mutanty, ktoré môžu byť použité podľa predloženého vynálezu na inhibíciu IFN dráhy, zahŕňajú kináza deficientné verzie Jakl, TyK2 alebo transkripčné faktory, ktorým chýbajú DNA viažuce domény STATI a STAT2 (pozri napr. Krishnan a ďalší, 1997, Eur. J. Biochem. 247: 298 - 305). Vakcinačné prostriedky
Vynález zahŕňa použitie opísaných vírusov alebo použitie vakcinačných prostriedkov obsahujúcich oslabené vírusy chrípky, ktoré majú zníženú schopnosť antagonizovať bunkovú IFN odpoveď, a vhodný excipient. Vírus použitý vo vakcinačnom prostriedku môže byť vybraný z prirodzene sa vyskytujúcich mutantov alebo variantov, mutovaných vírusov alebo geneticky skonštruovaných vírusov. Oslabené kmene segmentovaných RNA vírusov je možné generovať aj technikami preusporiadavania alebo použitím kombinácie prístupu reverznej genetiky a techník preusporiadavania. Prirodzene sa vyskytujúce varianty zahŕňajú vírusy izolované z prírody, ako aj spontánne sa vyskytujúce varianty generované počas množenia vírusu, ktoré majú zníženú schopnosť antagonizovať bunkovú IFN odpoveď. Oslabený vírus môže byť samotný použitý ako účinná zložka vakcinačného prostriedku. Alternatívne je možné použiť oslabený vírus ako vektor alebo kostru rekombinantne produkovaných vakcín. Na tento účel je možné použiť rekombinantné techniky, napríklad reverznú genetiku (alebo pre segmentované vírusy kombinácie reverznej genetiky a techník preusporiadavania) na skonštruovanie mutácií alebo na zavedenie cudzích antigénov do oslabeného vírusu používaného vo vakcinačnom prostriedku. Týmto spôsobom je možné navrhnúť vakcíny na imunizáciu proti kmeňovým variantom alebo alternatívne proti úplne iným infekčným činidlám alebo antigénom ochorení.
V skutočnosti je možné zaviesť do vírusov podľa vynálezu na použitie vo vakcínach akúkoľvek heterológnu génovú sekvenciu. Výhodne je možné exprimovať vo vírusoch celé alebo časti epitopov, ktoré indukujú ochrannú imunitnú odpoveď proti ktorémukoľvek z rôznych patogénov alebo antigénov, ktoré sa viažu na
SK 288200 Β6 neutralizujúce protilátky. Napríklad, heterológne génové sekvencie, ktoré je možné zaviesť do vírusov podľa vynálezu na použitie vo vakcínach, zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na epitopy vírusu ľudskej imunodeficiencie (HlV), napríklad gpl20, povrchový antigén vírusu hepatitídy B (HBsAg), glykoproteíny herpes vírusu (napr. gD, gE), VPI poliovírusu, antigénové determinanty nevírusových patogénov, napríklad baktérií a parazitov, pričom bolo vymenovaných len zopár. V inom uskutočnení je možné exprimovať celé alebo časti imunoglobulínových génov. Napríklad, do vírusov podľa vynálezu je možné zaviesť variabilné oblasti antiidiotypických imunoglobulínov, ktoré napodobujú takéto epitopy. Je tu opísané, že je možné exprimovať antigény asociované s nádorom.
Je možné pripraviť buď živú rekombinantnú vírusovú vakcínu, alebo inaktivovanú rekombinantnú vírusovú vakcínu. Výhodná môže byť živá vakcína, pretože jej rozmnožovanie v hostiteľovi vedie k pretrvávajúcim stimulom podobného druhu a rozsahu ako pri prirodzených infekciách, a preto poskytuje podstatnú, dlhotrvajúcu imunitu. Produkcia takýchto živých rekombinantných vírusových vakcínových prostriedkov sa môže uskutočňovať použitím bežných metód zahŕňajúcich množenie vírusu v bunkovej kultúre alebo v alantoickej dutine kuracieho embrya a následne purifikáciu.
Vakcínové prostriedky môžu zahŕňať geneticky skonštruované vírusy chrípky, ktoré majú mutácie v NS1 alebo analogickom géne, vrátane, ale bez obmedzenia na mutanty vírusu chrípky opísané v príkladoch so skráteným NS1. Môžu byť pripravené aj použitím prirodzených variantov, napríklad A/turkey/Ore/71 prirodzeného variantu vírusu chrípky A, alebo B/201 a B/AWBY-234, ktoré sú prirodzenými variantmi vírusu chrípky B. Keď sa pripravuje vo forme živej vírusovej vakcíny, mal by byť použitý rozsah od približne 104 pfú do približne 5x106 pfú na dávku.
Na podanie opísaných vakcínových prostriedkov je možné použiť mnohé spôsoby, ktoré zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na vnútronosové, vnútropriedušnicové, ústne, vnútrokožné, vnútrosvalové, vnútrobrušné, vnútrožilové a podkožné podanie. Výhodné môže byť podávanie vírusového vakcinačného prostriedku prirodzenou cestou infekcie patogénu, pre ktorý je vakcína navrhnutá, alebo prirodzenou cestou infekcie rodičovského oslabeného vírusu. Keď sa použije živý vakcinačný prostriedok vírusu chrípky, môže byť výhodné podávanie prostriedku prirodzenou cestou pre infekciu vírusom chrípky. Výhodné môže byť využitie schopnosti vírusu chrípky indukovať masívnu sekrečnú a bunkovú imunitnú odpoveď. Napríklad infekcia respiračného traktu vírusmi chrípky môže indukovať silnú sekrečnú imunitnú odpoveď, napríklad v urogenitálnom systéme spolu so súčasnou ochranou proti konkrétnemu agensu, ktorý spôsobuje chorobu.
Vakcína na použitie podľa predloženého vynálezu obsahujúca 104 až 5xl06 pfú mutantných vírusov so zmenenou IFN antagonistickou aktivitou by mohla byť podávaná raz. Alternatívne, vakcína podľa predloženého vynálezu obsahujúca 104 až 5x106 pfu mutantných vírusov so zmenenou IFN antagonistickou aktivitou by mohla byť podávaná dvakrát alebo trikrát s 2- až 6-mesačnými intervalmi medzi dávkami. Alternatívne, vakcína podľa predloženého vynálezu obsahujúca 104 až 5xl06 pfú mutantných vírusov so zmenenou IFN antagonistickou aktivitou by mohla byť podávaná tak často, ako je potrebné, živočíchovi, výhodne cicavcovi a najvýhodnejšie človeku.
Farmaceutické prostriedky
Predložený vynález zahŕňa farmaceutické prostriedky obsahujúce mutantné vírusy so zmenenou IFN antagonistickou aktivitou na použitie ako antivírusové činidlá alebo ako činidlá proti IFN senzitívnym ochoreniam. Farmaceutické prostriedky majú využitie ako antivírusové profylaktické činidlá a môžu byť podávané jedincom, u ktorých je riziko, že budú infikovaní, alebo ktorí sú podozriví z toho, že boli vystavení vírusu. Napríklad, v prípade, že by dieťa prišlo domov zo školy, kde bolo vystavené niekoľkým spolužiakom s chrípkou, rodič by podal antivírusový farmaceutický prostriedok podľa vynálezu sebe, dieťaťu a ďalším členom rodiny, aby zabránil vírusovej infekcii a následnému ochoreniu. Ošetrení môžu byť aj ľudia, ktorí cestujú do častí sveta, kde prevažujú určité infekčné ochorenia (napr. hepatitída A vírus, malária, atď.).
Alternatívne môžu byť farmaceutické prostriedky používané na liečbu nádorov alebo na prevenciu vytvárania nádorov, napr. u pacientov, ktorí majú rakovinu, alebo u pacientov s vysokým rizikom vývinu neoplaziem alebo rakoviny. Napríklad pacienti s rakovinou môžu byť liečení, aby sa predišlo ďalšej tumorogenéze. Alternatívne je možné ošetriť jedincov, ktorí boli alebo ktorí sú podozriví, že boli vystavení karcinogénom. Možné je ošetrovať jedincov, ktorí sa zúčastnili na environmentálnom čistení, a mohli byť vystavení znečisťovacím látkam (napr. azbestu). Alternatívne je možné jedincov, o ktorých sa predpokladá, že budú vystavení žiareniu, ošetriť pred vystavením a po vystavení (napr. pacienti, ktorí sú vystavovaní vysokým dávkam žiarenia alebo ktorí musia brať karcinogénne lieky).
Prihlasovateľ tiež zistil, že oslabený mutant vírusu chrípky obsahujúci deléciu vo svojom IFN antagonistickom géne je schopný redukovať vytváranie nádoru v myšiach. Protinádorové vlastnosti vírusov podľa vynálezu môžu aspoň čiastočne súvisieť s ich schopnosťou indukovať IFN a IFN odpovede. Alternatívne môžu protinádorové vlastnosti oslabených vírusov podľa vynálezu súvisieť s ich schopnosťou špecificky rásť a usmrcovať nádorové bunky, z ktorých je o mnohých známe, že sú deficientné v IFN systéme.
Predložený vynález ďalej zahŕňa mutantné vírusy so zmeneným IFN antagonistickým fenotypom, ktoré sú nasmerované do špecifických orgánov, tkanív a/alebo buniek v tele, aby indukovali lokálne terapeutické alebo profylaktické účinky. Výhodou takéhoto prístupu je, že IFN indukujúce vírusy podľa vynálezu sú nasmerované do špecifických miest, aby sa IFN indukoval miestne špecifickým spôsobom, aby sa získal liečebný účinok, a nie aby sa indukoval IFN systémovo, čo by mohlo mať toxické účinky.
Mutantné IFN indukujúce vírusy podľa vynálezu môžu byť skonštruované použitím opísaných spôsobov na expresiu proteínov alebo peptidov, ktoré by smerovali vírusy na konkrétne miesto. Je opísané, že IFN indukujúce vírusy by boli nasmerované na miesta nádorov. V takom prípade môžu byť mutantné vírusy skonštruované tak, aby exprimovali antigénové kombinačné miesto protilátky, ktorá rozoznáva nádorový špecifický antigén, a tak by bol IFN indukujúci vírus smerovaný do nádoru. Je tu tiež opísané, že kde cieľový nádor exprimuje hormónový receptor, napríklad nádory prsníka alebo vaječníkov, ktoré exprimujú estrogénové receptory, môže byť IFN indukujúci vírus skonštruovaný tak, aby exprimoval príslušný hormón. Ďalej sa tu opisuje, že kde cieľový nádor exprimuje receptor rastového faktora, napr. VEGF, EGF alebo PDGF, môže byť IFN indukujúci vírus skonštruovaný tak, aby exprimoval príslušný rastový faktor alebo jeho časť (časti). Takže v súlade s vynálezom môžu byť IFN indukujúce vírusy skonštruované tak, aby exprimovali akýkoľvek cieľový génový produkt vrátane peptidov, proteínov, napríklad enzýmov, hormónov, rastových faktorov, antigénov alebo protilátok, ktorý bude slúžiť na nasmerovanie vírusu na miesto, kde je potrebný antivírusový, antibakteriálny alebo antimikrobiálny účinok.
Spôsoby podávania zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na vnútrokožný, vnútrosvalový, vnútrobrušný, vnútrožilový, podkožný, vnútronosový, miechový a ústny spôsob. Farmaceutické prostriedky podľa predloženého vynálezu môžu byť podávané akýmkoľvek bežným spôsobom, napríklad infúziou alebo bolusovou injekciou, absorpciou cez epiteliálne alebo mukokutánne náplasti (napr. sliznicou úst, rekta alebo tenkého čreva, atď.) a môžu byť podávané spolu s inými biologicky účinnými činidlami. Podávanie môže byť systémové alebo lokálne. Okrem toho vo výhodnom uskutočnení môže byť želateľné podávanie farmaceutických prostriedkov podľa vynálezu akýmkoľvek vhodným spôsobom do pľúc. Použité môže byť aj pulmonálne podávanie, napr. použitím inhalátora alebo nebulizéra a prostriedkom s činidlom vytvárajúcim aerosól.
V špecifickom uskutočnení môže byť želateľné podávanie farmaceutických prostriedkov podľa vynálezu lokálne, do oblasti, kde je potrebná liečba. To je možné dosiahnuť napríklad, ale bez obmedzenia, lokálnou infúziou počas chirurgického zákroku, miestnou aplikáciou, napr. spolu s obviazaním rany po chirurgickom zákroku, injekciou, cez katéter, čapíkom alebo prostredníctvom implantátu, ktorý je porézny, neporézny alebo zo želatínového materiálu vrátane membrán ako sialastikových membrán, alebo vlákien. Opisuje sa tu, že sa podanie môže udiať priamou injekciou do miesta (alebo pôvodného miesta) malígneho nádora alebo do miesta neoplastického alebo preneoplastického tkaniva.
V ešte inom uskutočnení sa farmaceutický prostriedok môže podávať systémom riadeného uvoľňovania. V jednom uskutočnení môže byť použitá pumpa (pozri Langer, vyššie; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201; Buchwald a ďalší, 1980, Surgery 88: 507; Saudek a ďalší, 1989, N. Engl. J. Med. 321: 574). V inom uskutočnení môžu byť použité polyméme materiály (pozri Medical Applications of Controlled Release, Langer a Wise (vyd.), CRC Preš., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Ďrug Biovailability, Drug Product Design and Performance, Smolen a Balí (vyd.), Wiley, New York (1984); Ranger & Peppas, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61; pozri aj Leby a ďalší, 1985, Science 228: 190; Durin a ďalší, 1989, Ann. Neurol. 25: 351 (1989); Howard a ďalší, 1989, J. Neurosurg. 71: 105). V ešte inom uskutočnení je možné umiestniť systém na riadené uvoľňovanie do blízkosti cieľa prostriedku, tzn. do pľúc, a tak je potrebný len čas systémovej dávky (pozri napr. Goodson, 1984, v Medical Applications of Controlled Release, vyššie, zv. 2, str. 115 - 138). Iné systémy na riadené uvoľňovanie sú diskutované v zhrnutí od Langer (1990, Science 249: 1527- 1533).
Farmaceutické prostriedky na použitie podľa predloženého vynálezu obsahujú terapeuticky účinné množstvo oslabeného vírusu a farmaceutický prijateľný nosič. V konkrétnom uskutočnení znamená výraz farmaceutický prijateľný to, že látka bola schválená regulárnou inštitúciou federálnej alebo národnej vlády alebo je uvedená v US Farmakopei alebo v inej všeobecne uznávanej farmakopei na použitie pre živočíchy a najmä pre ľudí. Výraz nosič znamená riedidlo, adjuvans, excipient alebo vehikulum, s ktorým sa môže farmaceutický prostriedok podávať. Ako kvapalné nosiče, najmä pre injekčné podávané roztoky, je možné využiť aj fyziologické roztoky a vodnú dextrózu a glycerolové roztoky. Vhodné farmaceutické excipienty zahŕňajú škrob, glukózu, laktózu, sacharózu, želatínu, slad, ryžu, fluór, kriedu, silikagél, stearát sodný, glycerol monostearát, mastenec, chlorid sodný, sušené odstredené mlieko, glycerol, propylén, glykol, voda, etanol a podobne. Tieto prostriedky môžu byť formulované ako čapiky. Orálne prostriedky môžu obsahovať štandardné nosiče ako farmaceutické stupne manitolu, laktózu, škrob, stearát horečnatý, sacharín sodný, celulózu, uhličitan horečnatý, atď. Príklady vhodných farmaceutických nosičov sú opísané v Remington’s Pharmaceutical Sciences od E. W. Martina. Takéto prostriedky budú obsahovať terapeuticky účinné množstvo liečiva, výhodne v purifikovanej forme, spolu s vhodným množstvom nosiča tak, aby sa poskytla forma na správne podanie pacientovi. Formulácia by mala byť vhodná na spôsob podania.
Množstvo farmaceutického prostriedku podľa vynálezu, ktoré bude účinné na liečbu konkrétnej choroby alebo stavu, bude závisieť na povahe choroby alebo stavu a môže byť stanovené štandardnými klinickými technikami. Okrem toho môžu byť voliteľne využité in vitro testy na pomoc identifikácie optimálneho rozsahu dávky. Presná dávka, ktorá sa má použiť vo formulácii, bude závisieť aj od spôsobu podania a od závažnosti ochorenia alebo poruchy a mala by byť určená v súlade s posúdením praktického lekára a na základe konkrétnych okolností pri každom pacientovi. Ale vhodná dávka na podanie je vo všeobecnosti v rozsahu približne 104 až 5xl06 pfú a môže byť podávaná raz alebo viackrát s intervalmi tak často, ako je to potrebné. Farmaceutické prostriedky podľa predloženého vynálezu obsahujú 104 až 5xl06 pfú mutantných vírusov so zmenenou 1FN antagonistickou aktivitou a môžu sa podávať vnútronosovo, vnútropriedušnicovo, vnútrosvalovo alebo podkožné. Účinné dávky môžu byť extrapolované z dávkovo závislých kriviek odvodených na základe in vitro testov alebo na základe živočíšnych modelových testovacích systémov.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obrázok 1. DeINSl vírus inhibuje replikáciu divého typu vírusu chrípky A vo vajciach. Desaťdňové embryotické kuracie vajcia sa inokulovali s uvedeným pfú deINSl vírusu. O osem hodín sa vajcia infikovali s 103 pfú WSN vírusu. Po dvoch dňoch inkubovania pri 37 °C sa odobrala alantoická tekutina a stanovili sa WSN vírusové titre plakovým testom v MDBK bunkách. Výsledky sú priemerom dvoch vajec.
Obrázok 2. Indukcia antivírusovej odpovede v embryotických vajciach deINSl vírusom. Desaťdňové embryotické kuracie vajcia sa inokulovali s PBS (neošetrené) alebo s 2x104 pfú deINSl vírusu (ošetrené s deINSl). O osem hodín sa vajcia infikovali s 103 pfú A/WSN/33 (HIN1) vírusom chrípky, A/PR8/34 (H+Nl) vírusom chrípky, A/X-31 (H3N2) vírusom chrípky, B/Lee/40 vírusom chrípky alebo Sendai vírusom. Po dvoch hodinách inkubovania sa odobrala alantoická tekutina a stanovili sa vírusové titre hemaglutinačným testom. Výsledky sú priemerom dvoch vajec.
Obrázok 3. CV1 bunky sa transfekovali plazmidom exprimujúcim IRF-3 fúzovaným so zeleným fluorescenčným proteínom (GFP). To umožnilo stanoviť lokalizáciu 1RF-3 vnútri buniek fluorescenčnou mikroskopiou. V niektorých prípadoch sa s IRF-3 kotransfekoval NS1 expresný plazmid v uvedených pomeroch. 24 hodín po transfekcii sa bunky infikovali s vysokým moi s PR8 (WT) alebo s deINSl vírusom, ako je uvedené. 10 hodín po infekcii sa bunky analyzovali vo fluorescenčnom mikroskope na zistenie lokalizácie IRF-3GRP. Uvedené je percento buniek vykazujúcich len cytoplazmatickú lokalizáciu (CYT), ako aj cytoplazmatickú a jadrovú lokalizáciu IRF-3 (Nuc+Cyt).
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Generovanie a charakterizácia mutantov vírusu chrípky A so skráteným NS1
Materiál a metódy
A/PR/8/34 (PR8) vírus chrípky sa množil v 10-dňových embryotických kuracích vajciach pri 37 °C. Vírus chrípky A 25A-1, preusporiadaný vírus obsahujúci NS segment z kmeňa adaptovaného na chlad A/Leningrad/134/47/57 a zvyšné gény z PR8 vírusu (Egorov a ďalší, 1994,Vopr. Virusol. 39: 201 - 205; Shaw a ďalší, 1996, v Options of the Control of Influenza III, vyd. Brown, Hampson Webster (Elsevier Science) str. 433 až 436), sa pestoval vo Vero-bunkách pri 34 °C. 25A-1 vírus je citlivý na teplotu v cicavčích bunkách a používal sa ako pomocný vírus na zhromažďovanie NS1/99 transfektantových vírusov. Vero-bunky a MDCK bunky udržiavané v minimálnom esenciálnom médiu (MEM) obsahujúcom 1 pg/ml trypsínu (Difco Laboratories, Detroid, Michigan) sa používali na pestovanie vírusov chrípky. Vero-bunky sa používali aj na selekciu, purifikáciu plakov a titráciu NS1/99 vírusu. MDCK bunky sa udržiavali v DMEM (Dulbeccovo minimálne esenciálne médium) obsahujúcom 10 % teplom inaktivované fetálne teľacie sérum. Vero-bunky sa pestovali v AIM-V médiu (Life Technologies, Grand Island, N Y).
Plazmid pT3NSl/99, ktorý obsahuje 99 aminokyselinovú na C-konci skrátenú formu NS1, sa pripravil nasledovne. Najprv sa pPUC19-T3/NS PR8, obsahujúci kompletný NS gén PR8 vírusu ohraničený T3 RNA polymerázovým promótorom a BpuAI reštrikčným miestom, amplifikoval reverznou PCR (Ochman a ďalší, 1988, Genetics 120: 621 - 623) použitím príslušných primérov. Získaná cDNA obsahujúca skrátený NS1 gén sa fosforylovala, ošetrila sa Klenowovým fragmentom, ligovala sa sama so sebou a množila sa v E. coli kmeni TG L Konštrukt získaný po purifikácii sa označil pT3NSl/99 a skontroloval sa sekvenovaním. Plazmidy na expresiu NP, PBI, PB2 a PA proteínov PR8 vírusu (pHMG-NP, pHMG-PBl, pHMG-PB2 a pHMG-PA) už boli opísané (Pleschka a ďalší, 1996, J. Virol. 70: 4188 - 4192). pPOLI-NS-RB sa vyrobil substituovaním CAT otvoreného čítacieho rámca pPOLI-CAT-RT (Pleschka a ďalší, 1996, J. Virol. 70: 4188 - 4192) vnútri RT-PCR produktu odvodeného od kódujúcej oblasti NS génu A/WSN/33 (WSN) vírusu chrípky. Tento
SK 288200 Β6 plazmid exprimuje NS špecifický vírusový RNA segment WSN vírusu pod kontrolou skráteného ľudského promótora pre polymerázu I.
Generovanie NS1/99 vírusu sa uskutočnilo transfekciou ribonukleoproteínu (RNP) (Luytjes a ďalší, 1989, Celí 59: 1107 - 1113). RNPs sa vytvorili T3 RNA polymerázovou transkripciou z pT3NSl/99, ktorý bol linearizovaný s BpuAI, v prítomnosti purifikovaného nukleoproteínu a polymerázy 25A-l vírusu chrípky (Enami a ďalší, 1991, J. Virol. 65: 2711 - 2713). RNP komplexy sa transfekovali do Vero-buniek, ktoré sa predtým infikovali s 25A-l vírusom. Transfekované bunky sa inkubovali 18 hodín pri 37 °C a supernatant sa dvakrát pasážoval vo Vero-bunkách pri 40 °C a plaky sa purifikovali trikrát vo Vero-bunkách pokrytých agarovým zalievacím médiom pri 37 °C. Izolovaný NS1/99 vírus sa analyzoval prostredníctvom RT-PCR použitím špecifických primérov. Transfektantové vírusy divého typu sa generovali nasledovne: Vero-bunky na 35 mm platniach sa transfekovali plazmidmi pHMG-NP, pHMG-PBl, pHMG-PB2, pHMG-PA a pPOLINSRB, ako už bolo opísané (Pleschka a ďalší, 1996, J. Virol. 70: 4188 - 4192). Dva dni po transfekcii sa bunky infikovali s 5 x 104 pfu dellNSl vírusu a inkubovali sa ďalšie dva dni pri 37 °C. Bunkový supernatant sa pasážoval raz v MDCK bunkách a dvakrát v kuracích embryotických vajciach. Transfektantové vírusy sa klonovali limitujúcim riedením vo vajciach. Genomická RNA z purifikovaného NS1/99 transfektatnového vírusu sa analyzovala polyakrylamidovou gélovou elektroforézou, ako už bolo opísané (Zheng a ďalší, 1996, Virology 217: 242 - 251). Expresia skráteného NS1 proteínu NS1/99 vírusom sa skontrolovala imunoprecipitáciou značených infikovaných bunkových extraktov použitím králičieho polyklonálneho antiséra proti NS 1.
Alantoické dutiny embryotických kuracích 6-, 10- a 14-dňových vajec sa inokulovali s približne 103 pfu PR8, NS1/99 alebo deINSl (v ktorom je deletovaný celý NS1 gén) vírusmi, inkubovali sa pri 37 °C dva dni a vírusy nachádzajúce sa v alantoickej tekutine sa túrovali hemaglutinačným (HA) testom.
Skupiny 5 BALB/c myší (Taconic Farms) sa vnútronosovo inokulovali s 5 x 106 pfu, 1,5 x 105 pfu alebo 5 x x 103 pfu divého typu A/PR/8/34 (PR8) alebo NS1/99 vírusu. Inokulácie sa uskutočňovali v anestéze použitím 50 nl MEM obsahujúceho príslušné množstvo pfu príslušného vírusu. Zvieratá sa denne monitorovali a usmrtili sa, keď sa pozorovali extrémy. V nasledujúcom experimente sa všetky myši, ktoré prežili, infikovali o štyri týždne neskôr dávkou 100LD5O divým typom PR8 vírusu. Všetky postupy boli v súlade s NIH regulami na starostlivosť a použitie laboratórnych živočíchov.
Oslabovanie vírusov chrípky A NS1 deléciami
Prihlasovatelia predtým ukázali, že vírus chrípky A, v ktorom sa deletoval NS1 gén (deINSl vírus), je schopný rásť s túrami približne 107 pfú/ml v bunkách deficientných v produkcii interferónu typu I (IFN), napríklad Vero-bunkách. Ale tento vírus mal zníženú schopnosť replikovať sa a spôsobiť ochorenie u myší (Garcia-Sastre a ďalší, 1998, Virology 252: 324). Na rozdiel od toho, deINSl vírus bol schopný rásť v a usmrcovať STATI -/- myši. Tieto výsledky demonštrovali, že NS1 proteín vírusu chrípky A je virulentným faktorom, ktorý sa podieľa na inhibícii hostiteľských antivírusových odpovedí, ktoré sú sprostredkované IFN typu I. Nasledujúce experimenty sa uskutočňovali tak, aby sa stanovilo, či by bolo možné generovať vírusy chrípky s virulentnými vlastnosťami v strede medzi vlastnosťami divého typu vírusu a vlastnosťami deINSl vírusu deletovaním častí NS1 génu a či by niektoré z týchto vírusov mohli mať optimálne vlastnosti na to, aby boli použité ako živé oslabené vakcíny proti vírusom chrípky, tzn. stabilitu a príslušnú rovnováhu medzi oslabením, imunogénnosťou a rastom v substrátoch vhodných na prípravu vakcín, akými sú napríklad embryotické kuracie vajcia.
Na otestovanie tejto hypotézy sa generoval A/PR/8/34 (PR8) vírus chrípky, v ktorom bol NS1 gén modifikovaný tak, aby riadil expresiu skráteného NS1 proteínu obsahujúceho len 99 aminokyselín na aminokonci, ktoré sa nachádzajú aj v rámci 230 aminokyselín divého typu NS1 proteínu. Tento vírus (NS1-99) sa získal RNP transfekciou umelo skonštruovaného NS génu použitím jedného 25A-l pomocného vírusu, ako už bolo opísané (Garcia-Sastre a ďalší, 1998, Virology 252: 324). Analýza NS1 expresie vo vírusom infikovaných bunkách odhalila skrátenú povahu NS1 proteínu NS1-99 vírusu.
Analyzovala sa schopnosť deINSl, NS1-99 a divého typu PR8 vírusov rásť v embryotických kuracích vajciach rôzneho veku. Základ tohto experimentu pochádza zo skutočnosti, že schopnosť embryotických vajec syntetizovať a odpovedať na IFN typu I po príslušnom stimule je závislá na veku. V skutočnosti tak IFN indukovateľnosť, ako aj responzívnosť začína približne v 10. dni, a potom sa exponenciálne zvyšuje s vekom (Sekellick a ďalší, 1990, In Vitro Celí. Dev. Biol. 26: 997; Sekellick & Marcus, 1985 J. Interferón Res. 5: 657). Takže použitie rôzne starých vajec predstavuje unikátny systém na testovanie schopnosti rôznych vírusov inhibovať IFN odpovede. 6-, 10- a 14-dňové vajcia sa inokulovali približne 103 pfu PR8, NS1-99 alebo deINSl vírusov, inkubovali sa pri 37 °C 2 dni a vírusy nachádzajúce sa v alantoickej tekutine sa túrovali hemaglutinačným (HA) testom. Ako je uvedené v tabuľke 3, zatiaľ čo divý typ vírusu rástol s podobnými HA túrami v 6-, 10- aj 14-dňových vajciach, deINSl sa replikoval s detegovateľným HA titrom len v 6-dňových vajciach. Na rozdiel od toho, NS1-99 vírus sa správal na rozhraní medzi správaním deINSl vírusu a správaním divého typu vírusu a bol schopný rásť s HA túrami, ktoré sú podobné titrom pre divý typ vírusu v 10-dňových vajciach, ale nie v 14-dňových vajciach.
Tabuľka 3
Replikácia vírusu v embryotických kuracích vajciach
Vírus Hemaglutinačný titer
6-dňové vajcia 10-dňové vajcia 14-dňové vajcia
WTPR82 2,048 4,096 1,071
NS1/99 n. d.3 2,048 <2
deINSl 64 <2 <2
1 titre predstavujú najvyššie riedenie s hemaglutinačnou aktivitou 2 divý typ A/PR/8/34 vírusu chrípky 3 nestanovené
Vlastnosti oslabenia NS1-99 vírusu sa potom stanovili v myšiach. S týmto cieľom sa skupiny 5 BALB/c myší vnútronosovo infikovali 5 x 106 pfú, 1,5 x 105 alebo 1,5 x 103 pfú divého typu PR8 alebo NS1-99 vírusu. Myši sa potom monitorovali z hľadiska prežívania tri týždne. Výsledky sú uvedené v tabuľke 4. NS1-99 vírus mal LD50 najmenej o tri log vyššie ako divý typ vírusu.
Tabuľka 4
Oslabenie NS1-99 vírusu v myšiach
Vírus Prežívajúce jedince
5 x 106 1,5 x 10 1,5 x 103
WTPR81 1/5 1/5 1/5
NS1-99 3/5 5/5 5/5
1 divý typ A/PR/8/34 vírusu chrípky
Príklad 2
Generovanie a charakterizácia mutantov vírusu chrípky B so skráteným NS1
Materiál a metódy
Experimentálne detaily sú podobné ako v príklade 1. Dva mutanty vírusov chrípky B, B/610B5B/201 (B/201) a B/BWBY-234, dlhé 127 aminokyselín a 90 aminokyselín (NS1 proteíny skrátené na C-konci) (Norton a ďalší, 1987 Virology 156:204; Tobita a ďalší, 1990 Virology 174: 314) sa odvodili od koinfekčných experimentov v tkanivovej kultúre obsahujúcej B/Yamagata/1/73 (B/Yam) a A/Aichi/2/68 vírusy v prítomnosti anti-A (H3N2) vírusovej protilátky. Rast mutantných vírusov chrípky v rôzne starých embryotických vajciach sa porovnával s rastom rodičovského vírusu B/Yam, ktorý obsahuje divý typ NS1 proteínu s dĺžkou 281 aminokyselín. 6-, 10- a 14-dňové vajcia sa inokulovali s približne 103 pfu B/Yam, B/201 alebo B/AWBY-234 vírusmi, inkubovali sa pri 35 °C 2 dni a vírusy nachádzajúce sa v alantoickej tekutine sa túrovali HA testom.
Ďalej sa stanovovali charakteristiky oslabenia B/201 a B/AWBY-234 vírusov v myšiach. Skupiny troch BALB/c myší sa vnútronosovo infikovali s 3xl05 pfu divých typov B/Yam alebo B/201 vírusov a B/AWBY/234 mutantného vírusu a stanovila sa schopnosť týchto vírusov replikovať sa prostredníctvom merania vírusových titrov v pľúcach 3 dni po infekcii, pretože divý typ B/Yam neindukoval zjavné známky ochorenia v myšiach.
Výsledky
Tabuľka 5
Replikácia vírusu chrípky B v embryotických kuracích vajciach
Vírus Hemaglutinačný titer
6-dňové vajcia 10-dňové vajcia 14-dňové vajcia
B/Yam 362 256 <2
B/201 32 <2 <2
B/AWBY-234 8 <2 <2
Výsledky rastu mutantného vírusu chrípky B a vírusov chrípky B divého typu v embryotických vajciach uvedené v tabuľke 5 demonštrujú, že tak ako v prípade vírusov chrípky A je skrátenie NS1 na C-konci vo víruse chrípky B zodpovedné za nižší replikačný výťažok v starších embryotických kuracích vajciach, ktoré vykazujú účinnú IFN odpoveď. Z tohto zistenia vyplýva, že NS1 vírusu chrípky B sa tiež podieľa na inhibovaní IFN odpovedí v hostiteľovi, a že výsledkom delécií v NS1 géne vírusu chrípky B je oslabený fenotyp.
Výsledky replikačných experimentov v myšiach sú uvedené v tabuľke 6. Titre B/201 vírusu a B/AWBY-234 vírusu boli približne o tri log nižšie ako titre B/Yam, z čoho vyplýva, že skrátenia NS1 karboxylovej termi18
SK 288200 Β6 nálnej domény vírusu chrípky B sú zodpovedné za oslabený fenotyp u myší.
Tabuľka 6
Replikácia vírusu chrípky B v pľúcach myší
Vírus Titre v pľúcach 3 dni po infekcii (pfu/pľúca)
B/Yam 2x104 lxlO4 3x104
B/201 30 < 10 60
B/AWBY-234 < 10 40 < 10
Príklad 3
Ochrana proti infekcii vírusom chrípky divého typu u myší imunizovaných vírusmi chrípky A a B obsahujúcimi delécie v ich NS1 proteíne
Aby sa stanovilo, či sa myši imunizované oslabenými vírusmi chrípky A a B obsahujúcimi skrátené NS1 proteíny chránia proti vyzývacej infekcii s príslušnými vírusmi divého typu, uskutočnil sa nasledujúci experiment. BALB/c myši sa vnútronosovo imunizovali A/NS1-99 vírusom a o tri týždne neskôr sa infikovali 100 LD50 vírusom chrípky divého typu A/PR/8/34. Imunizované zvieratá boli ochránené pred smrťou, zatiaľ čo kontrolné naivné myši po vyzývacej infekcii zomreli (tabuľka 7). V druhom experimente sa BALB/c myši vnútronosovo imunizovali s vírusmi chrípky B, B/201 alebo B/AWBY-234, ktoré exprimujú skrátené NS1 proteíny. O tri týždne neskôr sa myši infikovali 3 x 105 pfu B/Yam/1/73 vírusom chrípky divého typu. Keďže tento kmeň vírusu chrípky B neindukuje v myšiach symptómy ochorenia, stupeň ochrany sa stanovoval meraním vírusových titrov v pľúcach tri dni po infekcii. Zatiaľ čo naivné kontrolné zvieratá mali titre okolo 104 pfu/pľúca, vírusy sa nedetegovali v pľúcach imunizovaných zvierat (pozri tabuľku 8). Z týchto zistení vyplýva, že vírusy chrípky A, ako aj vírusy chrípky B obsahujúce modifikované NS1 gény sú schopné indukovať imunitnú odpoveď u myší, ktorá poskytuje úplnú ochranu proti následnej infekcii vírusom divého typu.
Tabuľka 7
Prežívanie myší imunizovaných A/NS1-99 vírusom chrípky po vyzývacej infekcii so 100 LD50 A/PR/8/34 vírusom chrípky divého typu
Imunizačná dávka A/NS1-99 vírusu Prežívajúce/celkový počet
5 x 10” pfu 3/3
1,5 x 105 pfu 4/4
PBS 0/5
Tabuľka 8
Titre v pľúcach myší imunizovaných B/201 a B/AWBY-234 vírusom chrípky po infekcii s 3 x 105 pfu B/Yamagata/73 vírusu chrípky divého typu
Imunizačná dávka Titre v pľúcach (pfu/pľúca)
3 x 105 B/201 <10‘, < 10', < 10', <10‘, <10*,
3 x 105 B/AWBY-234 < 10‘,< 10*,< 10‘,<10‘,< 10‘,
PBS 2,5xl04, lxlO4, l,7x!04, 3xl04, 5xl04,
Príklad 4
Indukcia interferónu typu I v embryotických vajciach infikovaných deINSl vírusom
Ďalej sa stanovovala schopnosť deINSl vírusu, vírusu chrípky A bez NS1 génu, indukovať vylučovanie
IFN typu I v embryotických kuracích vajciach. S týmto cieľom sa skupiny dvoch desaťdňových embryotických kuracích vajec infikovali s 5 x 103 pfu deINSl alebo PR8 vírusom divého typu. Osemnásť hodín po inkubovaní pri 37 °C sa odobrala alantoická tekutina a dialyzovala sa oproti kyslému pH cez noc, aby sa inaktivovali infekčné vírusy. Po ošetrení s kyslým pH sa vzorky dialyzovali oproti PBS a testovala sa ich IFN aktivita stanovením najvyššieho riedenia s ochrannou aktivitou proti VSV infekcii (približne 200 pfu) v CEF bunkách. Z výsledkov uvedených v tabuľke 9 vyplýva, že pri absencii NS1 sú vírusy chrípky A silnejšími induktormi IFN.
Tabuľka 9
Indukcia IFN vo vajciach
Vírus IFN (U/ml)
PR8 <16, <16 deINSl 400,400 kontrola <16, <16
SK 288200 Β6
Príklad 5
Antivírusová aktivita deINSl vírusu
Výsledkom eliminácie IFN antagonistického (NS1) génu z vírusu chrípky A môže byť vírus so schopnosťou indukovať vysoké hladiny IFN. Ak ide o taký prípad, bude deINSl interferovať s replikáciou IFN senzitívnych vírusov. Aby sa otestovala táto možnosť, skúmali prihlasovatelia schopnosť deINSl vírusu inhibovať replikáciu A/WSN/33 (WSN) vírusu, bežne používaného laboratórneho kmeňa vírusu chrípky, vo vajciach. Ako je možné vidieť na obrázku 1, ošetrenie len s 2 pfú deINSl vírusu bolo schopné znížiť konečné titre WSW vírusu v alantoickej tekutine a jeden log. Okrem toho, ošetrenie s 2 x 104 pfú deINSl vírusu viedlo prakticky k úplnej eliminácii WSN replikácie vo vajciach. DeINSl vírus bol schopný interferovať s replikáciou aj iných vírusových kmeňov chrípky A (H1N1 a H3N2), vírusov chrípky B a rôznych iných vírusov, ako Sendai vírusu vo vajciach (obrázok 2).
Povzbudený týmito výsledkami stanovovali prihlasovatelia ďalej schopnosť deINSl vírusu interferovať s replikáciou divého typu vírusu chrípky v myšiach. Hoci ošetrenie s IFN typu I zabraňuje v tkanivovej kultúre replikácii vírusu chrípky A in vitro, ošetrenie myší s IFN nebolo schopné inhibovať replikáciu vírusov chrípky (Halier, 1981, Current Top Microbiol Immunol 92: 25 - 52). To platí pre väčšinu inbredných myší, okrem A2G myší. A2G myši, ako aj značný podiel myší divého typu (približne 75 %) obsahuje najmenej jednu neporušenú Mxl alelu, zatiaľ čo väčšina laboratórnych kmeňov je Mxl -/- (Halier, 1986, Current Top Microbiol Immunol 127: 331 - 337). Mxl proteín, ktorý je homologický s ľudským MxA proteínom (Aebi, 1989, Mol. Celí. Biol. 11: 5062), je účinným inhibítorom replikácie vírusu chrípky (Halier, 1980, Náture 283: 660). Tento proteín sa neexprimuje konštitutívne, ale jeho expresia je transkripčne indukovaná IFN typu I. Takže A2G myši môžu byť použité na testovanie schopnosti IFN induktorov stimulovať antivírusovú odpoveď proti vírusom chrípky A /Halier, 1981, Current Top Microbiol Immunol 92: 25 - 52).
Prihlasovatelia vnútronosovo infikovali osem štvortýždňových A2G myší s 5x106 pfu vysokopatogénneho izolátu A/PR/8/34 vírusu chrípky (Halier, 1981, Current Top Microbiol Immunol 92: 25 - 52). Polovica myší sa vnútronosovo ošetrila s 5xl06 pfú deINSl 24 hodín pred PR8 infekciou. Ďalšie štyri myši sa ošetrili s PBS. Monitorovali sa zmeny telesnej hmotnosti a prežívanie. Tieto výsledky demonštrujú, že deINSl ošetrenie bolo schopné ochrániť A2G myši proti vírusom chrípky indukovanej smrti a strate telesnej hmotnosti. Rovnaké ošetrenie nebolo účinné v Mxl -/- myšiach, z čoho vyplýva, že mechanizmus vírusovej ochrany bol Mxl, tzn. sprostredkovaný IFN.
Príklad 6
Protinádorové vlastnosti deINSl vírusu v myšiach
Vychádzajúc z toho, že sa ukázalo, že IFN typu I a/alebo induktory IFN typu I majú protinádorové vlastnosti (Belardelli a Gresser, 1996 Immunology Today 17: 369 - 372; Qin a ďalší, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 14411 - 14416), je možné, že ošetrenie nádorov s deINSl vírusom by mohlo sprostredkovať regresiu nádora. Alternatívne by deINSl vírus mohol mať onkolytické vlastnosti, tzn. mohol by byť schopný špecificky rásť v a usmrcovať nádorové bunky, z ktorých o mnohých je známe, že majú deficiencie v IFN systéme. Aby sa otestoval protinádorový účinok deINSl vírusu, uskutočnil sa ďalší experiment použitím hlodavčej karcinómovej bunkovej línie CT26.WT v myšacom nádorovom modeli pľúcnych metastáz (Restifo a ďalší, 1998 Virology 249: 89 - 97). 5 x 105 CT26.WT buniek sa vnútrožilovo injektovalo dvanástim 6-týždňovým BALB/c myšiam. Polovica myší sa vnútronosovo ošetrovala každých 24 hodín na 1., 2. a 3. deň po inokulácii s 106 pfú deINSl vírusu. Dvanásť dní po injektovaní nádora sa myši usmrtili a spočítali sa metastázy v pľúcach. Ako je ukázané v tabuľke 10, ošetrenie s deINSl sprostredkúva značnú regresiu hlodavčích pľúcnych metastáz.
Tabuľka 10
Protinádorový účinok deINSl vírusu v BALB/c myšiach injektovaných s CT26.WT nádorovými bunkami Počet pľúcnych metastáz ošetrené s PBS ošetrené s deINSl
Myš 1 >250 120
Myš 2 >250 28
Myš 3 >250 9
Myš 4 >250 6
Myš 5 >250 2
Myš 6 >250 1
SK 288200 Β6
Príklad 7
NS1 proteín inhibuje premiestňovanie IRF-3 počas infekcie vírusom chrípky
Z opísaných výsledkov vyplýva, že NS1 proteín vírusu chrípky je zodpovedný za inhibíciu IFN typu I odpovede proti vírusu a že mutácie/delécie v tomto proteine vedú k oslabeniu vírusov kvôli zvýšeniu IFN odpovede počas infekcie. Je známe, že syntéza IFN typu I počas vírusovej infekcie môže byť spustená prostredníctvom dvojvláknovej RNA (dsRNA). 1RF-3 je transkripčný faktor, ktorý sa zvyčajne nachádza v inaktívnej forme v cytoplazme cicavčích buniek. Dvojvláknová RNA indukuje fosforyláciu (aktiváciu) transkripčného faktora 1RF-3, ktorá vedie k jeho premiestneniu do jadra, kde indukuje transkripciu špecifických génov vrátane génov kódujúcich IFN typu I (Weaver a ďalší, 1998, Mol. Celí. Biol. 18: 1359). Aby sa stanovilo, či NS1 vírusu chrípky vplýva na IRF-3, monitorovala sa IRF-3 lokalizácia v CV1 bunkách infikovaných s divým typom vírusu PR8 alebo s deINSl vírusom chrípky A. Obrázok 3 ukazuje, že premiestňovanie IRF-3 je minimálne v PR8-infikovaných bunkách (v menej ako 10 % buniek). Na rozdiel od toho sa v približne 90 % deINSl infikovaných buniek dokázala jadrová lokalizácia IRF-3. Prekvapujúco bolo možné čiastočne inhibovať IRF-3 premiestňovanie v deINSl infikovaných bunkách expresiou NS1 z plazmidu trans spôsobom. Výsledky demonštrujú, že NS1 vírusu chrípky A je schopný inhibovať IRF-3 premiestnenie vo vírusom infikovaných bunkách. NS1 vírusu chrípky pravdepodobne zabraňuje dsRNA sprostredkovanej aktivácii IRF-3 prostredníctvom sekvestrovania dsRNA generovanej počas vírusovej infekcie, a tak inhibuje IFN syntézu.

Claims (24)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Použitie geneticky skonštruovaného oslabeného vírusu chrípky na výrobu liečiva na prevenciu alebo liečbu infekčného ochorenia citlivého na interferón u subjektu, pričom genóm geneticky skonštruovaného oslabeného vírusu kóduje skrátený NS1 proteín majúci 1 až 130 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky, 1 až 120 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky, 1 až 110 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky, 1 až 100 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky, 1 až 99 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky, 1 až 90 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky, 1 až 89 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky, 1 až 70 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky alebo 1 až 60 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky, pričom N-koncová aminokyselina má číslo 1 a geneticky skonštruovaný vírus chrípky má zníženú schopnosť antagonizovať bunkovú interferónovú reakciu a pričom geneticky skonštruovaný oslabený vírus chrípky kódujúci skrátený NS1 proteín majúci 1 až 89 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky je vírus chrípky B.
  2. 2. Použitie podľa nároku 1, pričom genóm geneticky skonštruovaného oslabeného vírusu chrípky kóduje skrátený NS1 proteín majúci 1 až 130 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky, 1 až 120 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky, 1 až 110 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky, 1 až 100 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky alebo 1 až 90 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky.
  3. 3. Použitie podľa nároku 1, pričom genóm geneticky skonštruovaného oslabeného vírusu chrípky kóduje skrátený NS1 proteín majúci 1 až 99 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky.
  4. 5. Použitie podľa nároku 1, pričom genóm geneticky skonštruovaného oslabeného vírusu chrípky kóduje skrátený NS1 proteín majúci 1 až 70 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky alebo 1 až 60 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky.
  5. 6. Použitie podľa nároku 1 alebo 3, pričom oslabeným vírusom chrípky je NS1/99.
  6. 7. Použitie podľa nárokov 1, 2, 3 alebo 5, pričom oslabeným vírusom chrípky, ktorého genóm kóduje skrátený NS1 proteín majúci 1 až 130 aminokyselín, 1 až 120 aminokyselín, 1 až 110 aminokyselín, 1 až 100 aminokyselín, 1 až 99 aminokyselín, 1 až 90 aminokyselín, 1 až 70 aminokyselín alebo 1 až 60 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky, je vírus chrípky A.
  7. 8. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, pričom oslabeným vírusom chrípky je vírus chrípky B.
  8. 9. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, pričom infekčným ochorením je vírusová infekcia.
  9. 10. Použitie podľa nároku 9, pričom vírusovou infekciou je infekcia vírusom chrípky.
  10. 11. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, pričom koncentrácia oslabeného vírusu chrípky je 101 až 5 x 106 pfu.
  11. 12. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, pričom liečivo je formulované na vnútrokožné, vnútrosvalové, vnútrobrušné, vnútrožilové, podkožné, vnútronosové, miechové alebo ústne podanie.
  12. 13. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 11, pričom liečivo je formulované na pľúcne podávanie.
  13. 14. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, pričom subjektom je človek.
  14. 15. Geneticky skonštruovaný oslabený vírus chrípky, pričom genóm geneticky skonštruovaného oslabe21
    SK 288200 Β6 neho vírusu chrípky kóduje skrátený NS1 protein majúci 1 až 130 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky, 1 až 120 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky, 1 až 110 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky, 1 až 100 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky, 1 až 99 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky, 1 až 90 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky, 1 až 89 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky, 1 až 70 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky alebo 1 až 60 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky, pričom N-koncová aminokyselina má číslo 1, a geneticky skonštruovaný vírus chrípky má zníženú schopnosť antagonizovať bunkovú interferónovú reakciu, na použitie na liečbu alebo prevenciu infekčného ochorenia citlivého na interferón u subjektu a pričom geneticky skonštruovaný oslabený vírus chrípky kódujúci skrátený NS1 protein majúci 1 až 89 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky je vírus chrípky B.
  15. 16. Geneticky skonštruovaný oslabený vírus chrípky na použitie podľa nároku 15, pričom genóm geneticky skonštruovaného oslabeného vírusu chrípky kóduje skrátený NS1 protein majúci 1 až 130 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky, 1 až 120 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky, 1 až 110 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky, 1 až 100 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky, 1 až 99 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky alebo 1 až 90 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky.
  16. 17. Geneticky skonštruovaný oslabený vírus chrípky na použitie podľa nároku 15, pričom genóm geneticky skonštruovaného oslabeného vírusu chrípky kóduje skrátený NS1 protein majúci 1 až 89 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky B.
  17. 18. Geneticky skonštruovaný oslabený vírus chrípky na použitie podľa nároku 15, pričom genóm geneticky skonštruovaného oslabeného vírusu chrípky kóduje skrátený NS1 protein majúci 1 až 70 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky alebo 1 až 60 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky.
  18. 19. Geneticky skonštruovaný oslabený vírus chrípky na použitie podľa nárokov 15, 16 alebo 18, pričom oslabeným vírusom chrípky, ktorého genóm kóduje skrátený NS1 protein majúci 1 až 130 aminokyselín, 1 až 120 aminokyselín, 1 až 110 aminokyselín, 1 až 100 aminokyselín, 1 až 99 aminokyselín, 1 až 90 aminokyselín, 1 až 70 aminokyselín alebo 1 až 60 aminokyselín NS1 proteínu kmeňa vírusu chrípky, je vírus chrípky A.
  19. 20. Geneticky skonštruovaný oslabený vírus chrípky na použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 15 až 18, pričom oslabeným vírusom chrípky je vírus chrípky B.
  20. 21. Geneticky skonštruovaný oslabený vírus chrípky na použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 15 až 20, pričom je formulovaný na vnútrokožné, vnútrosvalové, vnútrobrušné, vnútrožilové, podkožné, vnútronosové, miechové alebo ústne podanie.
  21. 22. Geneticky skonštruovaný oslabený vírus chrípky na použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 15 až 20, pričom je formulovaný na pľúcne podávanie.
  22. 23. Geneticky skonštruovaný oslabený vírus chrípky na použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 15 až 22, pričom infekčným ochorením je vírusová infekcia.
  23. 24. Geneticky skonštruovaný oslabený vírus chrípky na použitie podľa nároku 23, pričom vírusovou infekciou je infekcia vírusom chrípky.
  24. 25. Geneticky skonštruovaný oslabený vírus chrípky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 15 až 24, pričom subjektom je človek.
SK1907-2000A 1998-06-12 1999-06-11 Použitie geneticky skonštruovaného oslabeného vírusu chrípky na liečbu alebo prevenciu infekčného ochorenia citlivého na interferón SK288200B6 (sk)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US8910398P 1998-06-12 1998-06-12
US10883298P 1998-11-18 1998-11-18
US11768399P 1999-01-29 1999-01-29
PCT/US1999/013144 WO1999064068A1 (en) 1998-06-12 1999-06-11 Attenuated negative strand viruses with altered interferon antagonist activity for use as vaccines and pharmaceuticals

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK19072000A3 SK19072000A3 (sk) 2001-09-11
SK288200B6 true SK288200B6 (sk) 2014-06-03

Family

ID=27376229

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK50021-2008A SK288567B6 (sk) 1998-06-12 1999-06-11 Geneticky skonštruovaný oslabený vírus chrípky, vakcinačný prostriedok a farmaceutický prostriedok s jeho obsahom a ich použitie
SK50041-2015A SK288544B6 (sk) 1998-06-12 1999-06-11 Geneticky skonštruovaný oslabený chimérny vírus chrípky, vakcinačný prostriedok a farmaceutický prostriedok s jeho obsahom a ich použitie
SK1907-2000A SK288200B6 (sk) 1998-06-12 1999-06-11 Použitie geneticky skonštruovaného oslabeného vírusu chrípky na liečbu alebo prevenciu infekčného ochorenia citlivého na interferón

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK50021-2008A SK288567B6 (sk) 1998-06-12 1999-06-11 Geneticky skonštruovaný oslabený vírus chrípky, vakcinačný prostriedok a farmaceutický prostriedok s jeho obsahom a ich použitie
SK50041-2015A SK288544B6 (sk) 1998-06-12 1999-06-11 Geneticky skonštruovaný oslabený chimérny vírus chrípky, vakcinačný prostriedok a farmaceutický prostriedok s jeho obsahom a ich použitie

Country Status (24)

Country Link
US (12) US6669943B1 (sk)
EP (4) EP1085904B1 (sk)
JP (7) JP4531255B2 (sk)
KR (2) KR20060080249A (sk)
CN (1) CN1312725A (sk)
AT (1) ATE351901T1 (sk)
AU (2) AU771110B2 (sk)
BR (1) BR9911163A (sk)
CA (2) CA2334895C (sk)
CY (1) CY1113689T1 (sk)
CZ (2) CZ306637B6 (sk)
DE (1) DE69934885T2 (sk)
DK (4) DK1086207T3 (sk)
ES (4) ES2653557T3 (sk)
HU (1) HUP0102441A3 (sk)
IL (6) IL140264A0 (sk)
MX (2) MXPA00012402A (sk)
NO (1) NO20006328L (sk)
NZ (2) NZ509054A (sk)
PL (3) PL219128B1 (sk)
PT (1) PT1085904E (sk)
RU (1) RU2236252C2 (sk)
SK (3) SK288567B6 (sk)
WO (2) WO1999064068A1 (sk)

Families Citing this family (83)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2905284B2 (ja) 1989-11-06 1999-06-14 株式会社日本触媒 アクリル酸の製造方法
US7470426B1 (en) 1997-10-09 2008-12-30 Wellstat Biologics Corporation Treatment of neoplasms with viruses
US20030044384A1 (en) 1997-10-09 2003-03-06 Pro-Virus, Inc. Treatment of neoplasms with viruses
US7780962B2 (en) 1997-10-09 2010-08-24 Wellstat Biologics Corporation Treatment of neoplasms with RNA viruses
MXPA00012402A (es) * 1998-06-12 2003-07-14 Sinai School Medicine Metodos y substratos deficientes de interferon, novedosos, para la propagacion de virus.
MXPA01010393A (es) 1999-04-15 2004-04-02 Pro Virus Inc Tratamiento de neoplasmas con virus.
DE60041210D1 (de) 1999-09-17 2009-02-05 Wellstat Biologics Corp Onkolytisches Virus
US8147822B1 (en) 1999-09-17 2012-04-03 Wellstat Biologics Corporation Oncolytic virus
ATE299943T1 (de) * 2000-03-02 2005-08-15 Polymun Scient Immunbio Forsch Rekombinantes influenza a virus
AU2001257001A1 (en) * 2000-04-10 2001-10-23 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Screening methods for identifying viral proteins with interferon antagonizing functions and potential antiviral agents
DE10020505A1 (de) * 2000-04-26 2001-10-31 Conzelmann Karl Klaus RSV NS Proteine antagonisieren die Interferon (IFN) Antwort
AU2002223560B2 (en) 2000-09-25 2006-06-29 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung Gmbh Live influenza vaccine and method of manufacture
EP3246396B1 (en) 2001-02-14 2020-01-29 Celularity, Inc. Renovation and repopulation of decellularized tissues and cadaveric organs by stem cells
CN1246074C (zh) 2001-05-22 2006-03-22 通达商业集团国际公司 用于分配定制的液态产品的手持式喷墨分配系统和方法
SI1406607T1 (sl) * 2001-07-16 2006-04-30 Greenhills Biotechnology Res D Uporaba razreda antivirusnih spojin (ditiokarbamatne spojine) za pripravo sredstva za zdravljenje oz. preprecevanje virusne infekcije v resporatornemtraktu
US7037707B2 (en) * 2003-09-04 2006-05-02 St. Jude Children's Research Hospital Method for generating influenza viruses and vaccines
EP2497492B1 (en) 2004-06-01 2018-08-08 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Genetically engineered swine influenza virus and uses thereof
US8137676B2 (en) * 2005-02-15 2012-03-20 Mount Sinai School Of Medicine Genetically engineered equine influenza virus and uses thereof
AT502275B8 (de) * 2005-08-08 2007-08-15 Greenhills Biotechnology Res D Immunantwort-induzierende zusammensetzungen
AP2911A (en) 2005-12-02 2014-05-31 Sinai School Medicine Chimeric Viruses presenting non-native surface proteins and uses thereof
EP1911836A1 (en) 2006-10-12 2008-04-16 AVIR Green Hills Biotechnology Trading GmbH Medium supplement for virus production
US7860646B2 (en) * 2007-04-16 2010-12-28 The Boeing Company Method and apparatus for routing ocean going vessels to avoid treacherous environments
WO2008144067A1 (en) * 2007-05-21 2008-11-27 Board Of Regents, University Of Texas System Methods and compositions for treatment of cancer using oncolytic rsv activity
EP2048237A1 (en) * 2007-10-05 2009-04-15 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag Replication deficient Influenza virus for the expression of heterologous sequences
EP2045323A1 (en) * 2007-10-05 2009-04-08 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag Linear expression constructs for production of influenza virus particles
EP2072058A1 (en) 2007-12-21 2009-06-24 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag Modified influenza virus
US8108138B2 (en) * 2008-10-02 2012-01-31 The Boeing Company Optimal vehicle router with energy management system
KR101741848B1 (ko) 2008-11-25 2017-05-30 나노테라퓨틱스, 인코포레이티드 ｐＨ에 안정한 외피보유 바이러스의 생산 방법
EP2233568A1 (en) 2009-03-19 2010-09-29 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade AG Novel method for generation of RNA virus
CN107365751B (zh) 2008-12-16 2021-07-09 纳米医疗公司 流感疫苗的生产
EP2233152A1 (en) 2009-03-24 2010-09-29 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag High growth reassortant influenza A virus
US8935174B2 (en) * 2009-01-16 2015-01-13 The Boeing Company Analyzing voyage efficiencies
ES2550179T3 (es) 2009-02-05 2015-11-05 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Virus quiméricos de la enfermedad de Newcastle y usos de los mismos
EP3009145A1 (en) 2009-03-30 2016-04-20 Mount Sinai School of Medicine of New York University Influenza virus vaccines and uses thereof
WO2010125461A1 (en) 2009-04-27 2010-11-04 Novartis Ag Adjuvanted vaccines for protecting against influenza
WO2010144797A2 (en) 2009-06-12 2010-12-16 Vaccine Technologies, Incorporated Influenza vaccines with enhanced immunogenicity and uses thereof
EP2451940A4 (en) * 2009-07-06 2013-08-28 Alnylam Pharmaceuticals Inc bioprocessing
CN102648000A (zh) 2009-07-22 2012-08-22 阿维尔绿山生物技术研究发展贸易股份公司 新的流感病毒
WO2011014504A1 (en) 2009-07-27 2011-02-03 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Recombinant influenza virus vectors and uses thereof
EP2459585B1 (en) 2009-07-30 2024-09-04 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Influenza viruses and uses thereof
EP2459722B1 (en) 2009-07-31 2017-09-06 Seqirus UK Limited Reverse genetics systems
EP2295543A1 (en) * 2009-09-11 2011-03-16 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Method for the preparation of an influenza virus
CN102939103A (zh) 2010-03-30 2013-02-20 西奈山医学院 流感病毒疫苗及其应用
US8597637B1 (en) * 2010-05-18 2013-12-03 Weidong Zhang Breast cancer therapy using an engineered respiratory syncytial virus
CN103237890A (zh) * 2010-06-02 2013-08-07 巴克斯特保健股份有限公司 用于产生rna 病毒的方法和辅助病毒
US9044499B1 (en) 2010-06-22 2015-06-02 Weidong Zhang NS1/2-deficient respiratory syncytial virus and melanoma treatment
US8377901B2 (en) * 2010-07-07 2013-02-19 The University Of Manitoba Target host factors for treating viral infection
CN102021148A (zh) * 2010-07-27 2011-04-20 张卫东 一种基因ns1缺陷型呼吸道合胞病毒及其应用
CN102021149B (zh) * 2010-07-27 2013-04-24 张卫东 基因ns1缺陷型呼吸道合胞病毒及其治疗肺癌的应用
EP4241785B1 (en) 2011-09-20 2026-01-28 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Influenza virus vaccines and uses thereof
US9157746B2 (en) 2011-11-16 2015-10-13 The Boeing Company Vessel routing system
CA2895508A1 (en) 2012-12-18 2014-06-26 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus vaccines and uses thereof
CN103330723A (zh) * 2013-01-14 2013-10-02 艾克星（武汉）生物医药科技有限公司 基因工程呼吸道合胞病毒（△ns1 rsv)在治疗癌症药物中的用途
US10947543B2 (en) 2013-03-13 2021-03-16 Yale University Interferon production using short RNA duplexes
CA2905272A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Newcastle disease viruses and uses thereof
WO2014159960A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Antibodies against influenza virus hemagglutinin and uses thereof
EP3110443A4 (en) 2014-02-27 2017-11-15 Viralytics Limited Combination method for treatment of cancer
US10736956B2 (en) 2015-01-23 2020-08-11 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus vaccination regimens
MX2017010908A (es) 2015-02-26 2017-12-07 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Vacuna bivalente contra el virus de gripe porcina.
WO2017030997A1 (en) * 2015-08-14 2017-02-23 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Respiratory syncytial virus having altered ns1 protein function and related materials and methods
RU2628690C2 (ru) 2015-11-06 2017-08-21 Общество С Ограниченной Ответственностью 'Фарминтерпрайсез' Аттенуированные гриппозные векторы для профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний, а также для лечения онкологических заболеваний
EA037571B1 (ru) * 2015-11-06 2021-04-15 Общество с ограниченной ответственностью "ФАРМИНТЕРПРАЙСЕЗ БИОТЕХ" Аттенуированный вирус гриппа а, аттенуированный грипозный вектор, фармацевтическая композиция и их применение для профилактики или лечения инфекционных заболеваний, а также для лечения онкологических заболеваний
RU2660562C2 (ru) * 2016-03-30 2018-07-06 Общество с ограниченной ответственностью "ФАРМИНТЕРПРАЙСЕЗ БИОТЕХ" Аттенуированный гриппозный вектор и мукозальная универсальная гриппозная вакцина на его основе
EP3380616A4 (en) * 2015-11-24 2019-11-06 Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation MANUFACTURE OF VIRUSES IN BIRDS
JP7189017B2 (ja) 2015-11-24 2022-12-13 コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガナイゼーション 細胞培養におけるウイルスの生産
EP3471767A4 (en) 2016-06-15 2020-01-15 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Influenza virus hemagglutinin proteins and uses thereof
CN110268052A (zh) 2016-12-22 2019-09-20 蓝天疫苗有限责任公司 纯化病毒的方法
EP3596202A4 (en) 2017-03-14 2021-01-27 The Regents of the University of California GENOME-SCALE IDENTIFICATION OF IMMUNE EVASURE FUNCTIONS IN A VIRUS
WO2018187706A2 (en) 2017-04-07 2018-10-11 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Anti-influenza b virus neuraminidase antibodies and uses thereof
JOP20190256A1 (ar) 2017-05-12 2019-10-28 Icahn School Med Mount Sinai فيروسات داء نيوكاسل واستخداماتها
CN111527202B (zh) 2017-11-08 2024-03-29 蓝天免疫疗法有限责任公司 So3色谱在病毒纯化方法中的应用
WO2019246363A1 (en) 2018-06-21 2019-12-26 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Mosaic influenza virus hemagglutinin polypeptides and uses thereof
US12391957B2 (en) 2018-08-17 2025-08-19 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Recombinant Newcastle disease viruses and uses thereof for the prevention of RSV disease or human metapneumovirus disease
CN113853215B (zh) 2019-01-24 2025-07-18 蓝天免疫疗法有限责任公司 高生长流感病毒
WO2020163768A1 (en) * 2019-02-07 2020-08-13 Duke University Stabilized 9 and 10 segmented influenza viruses as a vaccine platform and methods of making and using same
KR102370100B1 (ko) * 2019-02-15 2022-03-07 아이디바이오 주식회사 이종 인플루엔자 a 바이러스에 대한 면역/치료반응을 형성하는 신규한 재조합 인플루엔자 바이러스 및 이를 포함하는 유전자 전달체 및 치료백신
AU2020287915B2 (en) * 2019-06-07 2025-05-15 Intervet International B.V. MDBK IRF3/IRF7 knock out mutant cell and its use for vaccine production
JP7222552B2 (ja) * 2020-01-30 2023-02-15 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 豚デルタコロナウイルスの増殖方法
ES3005234T3 (en) * 2020-11-30 2025-03-14 Bluesky Immunotherapies Gmbh Novel replication deficient influenza a virus inducing high levels of type i interferon
US20240035035A1 (en) * 2020-12-09 2024-02-01 Yale University Compositions and methods for treating, ameliorating, and/or preventing viral infections
WO2022261206A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Gene combination as a broad spectrum antiviral
CN115896035B (zh) * 2022-12-22 2024-04-16 苏州沃美生物有限公司 一种应用于病毒扩增的Vero细胞株、其构建方法及应用
WO2025019631A1 (en) 2023-07-19 2025-01-23 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Immunogenic compositions containing inactivated influenza a virus and cpg oligonucleotide adjuvant and uses thereof

Family Cites Families (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4071618A (en) 1974-09-03 1978-01-31 Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University Process for preparing virus disease live vaccines
US4215051A (en) 1979-08-29 1980-07-29 Standard Oil Company (Indiana) Formation, purification and recovery of phthalic anhydride
JPS57136528A (en) * 1981-02-09 1982-08-23 Hayashibara Biochem Lab Inc Preparation of viral vaccine
US4873191A (en) 1981-06-12 1989-10-10 Ohio University Genetic transformation of zygotes
US4769330A (en) 1981-12-24 1988-09-06 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus and methods for making and using the same
JPS5939831A (ja) 1982-08-27 1984-03-05 Biseibutsu Kagaku Kenkyusho:Kk 豚用インフルエンザウイルス不活化ワクチン
US5106619A (en) 1983-12-20 1992-04-21 Diamond Scientific Co. Preparation of inactivated viral vaccines
US4693981A (en) 1983-12-20 1987-09-15 Advanced Genetics Research Institute Preparation of inactivated viral vaccines
JPS60202827A (ja) * 1984-03-28 1985-10-14 Chibaken 弱毒痘そうワクチン株
US5166057A (en) 1989-08-28 1992-11-24 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand rna virus expression-systems
US5786199A (en) 1989-08-28 1998-07-28 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand RNA virus expression systems and vaccines
US5854037A (en) * 1989-08-28 1998-12-29 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand RNA virus expression systems and vaccines
US5840520A (en) 1989-08-28 1998-11-24 Aviron Recombinant negative strand RNA virus expression systems
US5766601A (en) 1990-08-08 1998-06-16 University Of Massachusetts Medical Center Cross-reactive influenza a immunization
US6162432A (en) 1991-10-07 2000-12-19 Biogen, Inc. Method of prophylaxis or treatment of antigen presenting cell driven skin conditions using inhibitors of the CD2/LFA-3 interaction
WO1993006866A2 (en) 1991-10-07 1993-04-15 Biogen, Inc. Method of prophylaxis or treatment of antigen presenting cell driven skin conditions using inhibitors of the cd2/lfa-3 interaction
EP0570357B1 (en) 1992-05-14 1997-06-25 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung GmbH Peptides that induce antibodies which neutralize genetically divergent HIV-1 isolates
US7344722B1 (en) * 1993-06-29 2008-03-18 The Regents Of The University Of Michigan Cold-adapted influenza virus
DE69532369T3 (de) 1994-07-18 2010-11-04 Conzelmann, Karl-Klaus, Prof. Dr. Rekombinantes infektiöses nicht-in-Segmente-geteiltes, negativ-Strange-RNS-Virus
US6300090B1 (en) * 1994-07-29 2001-10-09 The Rockefeller University Methods of use of viral vectors to deliver antigen to dendritic cells
US6146873A (en) * 1994-11-10 2000-11-14 Baxter Aktiengesellschaft Production of orthomyxoviruses in monkey kidney cells using protein-free media
US7153510B1 (en) 1995-05-04 2006-12-26 Yale University Recombinant vesiculoviruses and their uses
DE69510207T3 (de) 1995-08-09 2007-02-15 Schweiz. Serum- & Impfinstitut Bern Verfahren zur Herstellung von infektiösen minussträngigen RNA-Viren
US5840565A (en) 1995-08-22 1998-11-24 The Regents Of The University Of California Methods for enhancing the production of viral vaccines in PKR-deficient cell culture
WO1997012032A1 (en) 1995-09-27 1997-04-03 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of infectious respiratory syncytial virus from cloned nucleotide sequences
GB9605808D0 (en) * 1996-03-20 1996-05-22 Isis Innovation CFTR gene regulator
AU3799797A (en) 1996-07-15 1998-02-09 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Production of attenuated respiratory syncytial virus vaccines from cloned nucleotide sequences
KR20000048628A (ko) 1996-09-27 2000-07-25 윌리암 에이취 캘넌, 에곤 이 버그 모노네가비랄레스 목의 바이러스에서 감쇠를 책임지는 3' 게놈프로모터 영역 및 폴리머라제 유전자 돌연변이
US6330090B1 (en) * 1997-02-14 2001-12-11 Photonetics Optical fiber wavelength, multiplexer and demultiplexer
AU726374B2 (en) 1997-03-05 2000-11-02 University Of Washington Novel screening methods to identify agents that selectively inhibit hepatitis C virus replication
US5891705A (en) 1997-04-08 1999-04-06 Pentose Pharmaceuticals, Inc. Method for inactivating a virus
US6884414B1 (en) * 1997-04-30 2005-04-26 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Recombinant influenza viruses expressing tumor-associated antigens as antitumor agents
CN1250725C (zh) 1997-05-23 2006-04-12 美国政府健康及人类服务部 从克隆的核苷酸序列制备减毒副流感病毒疫苗的方法
PT1012244E (pt) 1997-07-11 2007-08-21 Univ Yale ''rabdovírus com revestimentos remanipulados''
JP2001517448A (ja) 1997-09-19 2001-10-09 アメリカン・サイアナミド・カンパニー 弱毒化呼吸合胞体ウイルス
JP4441595B2 (ja) * 1998-06-12 2010-03-31 マウント シナイ スクール オブ メディシン オブ ニューヨーク ユニバーシティー インターフェロン誘導性の遺伝子工学的に作製された弱毒ウイルス
MXPA00012402A (es) 1998-06-12 2003-07-14 Sinai School Medicine Metodos y substratos deficientes de interferon, novedosos, para la propagacion de virus.
US6146642A (en) * 1998-09-14 2000-11-14 Mount Sinai School Of Medicine, Of The City University Of New York Recombinant new castle disease virus RNA expression systems and vaccines
US6544785B1 (en) * 1998-09-14 2003-04-08 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Helper-free rescue of recombinant negative strand RNA viruses
AT407958B (de) 1999-02-11 2001-07-25 Immuno Ag Inaktivierte influenza-virus-vakzine zur nasalen oder oralen applikation
EP1194580B2 (en) 1999-07-14 2010-08-25 Mount Sinai School of Medicine of New York University In vitro reconstitution of segmented negative-strand rna viruses
ATE299943T1 (de) 2000-03-02 2005-08-15 Polymun Scient Immunbio Forsch Rekombinantes influenza a virus
AU2001257001A1 (en) 2000-04-10 2001-10-23 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Screening methods for identifying viral proteins with interferon antagonizing functions and potential antiviral agents
DE10020505A1 (de) 2000-04-26 2001-10-31 Conzelmann Karl Klaus RSV NS Proteine antagonisieren die Interferon (IFN) Antwort
AU2002223560B2 (en) * 2000-09-25 2006-06-29 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung Gmbh Live influenza vaccine and method of manufacture
AUPR343601A0 (en) * 2001-02-28 2001-03-29 Dickins, Philip Trenching machine
US20080234175A1 (en) * 2002-11-13 2008-09-25 Montelione Gaetano T Process for Designing Inhibitors of Influenza Virus Structural Protein 1
EP2497492B1 (en) 2004-06-01 2018-08-08 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Genetically engineered swine influenza virus and uses thereof
US8137676B2 (en) 2005-02-15 2012-03-20 Mount Sinai School Of Medicine Genetically engineered equine influenza virus and uses thereof
US20070116717A1 (en) * 2005-08-01 2007-05-24 Shneider Alexander M Influenza vaccine compositions and methods
AT502275B8 (de) * 2005-08-08 2007-08-15 Greenhills Biotechnology Res D Immunantwort-induzierende zusammensetzungen
AP2911A (en) 2005-12-02 2014-05-31 Sinai School Medicine Chimeric Viruses presenting non-native surface proteins and uses thereof
US7507411B2 (en) * 2006-06-23 2009-03-24 University Of Saskatchewan Attenuated influenza NS1 variants

Also Published As

Publication number Publication date
DK1086207T3 (da) 2007-05-29
CA2334895C (en) 2016-01-19
EP1086207A4 (en) 2003-01-22
US8057803B2 (en) 2011-11-15
EP1085904A4 (en) 2004-12-29
US6669943B1 (en) 2003-12-30
EP2316924B1 (en) 2017-10-11
SK19072000A3 (sk) 2001-09-11
AU770619B2 (en) 2004-02-26
US20050054074A1 (en) 2005-03-10
ES2400445T3 (es) 2013-04-09
CA2334850C (en) 2013-11-26
DK1085904T3 (da) 2013-02-25
IL140264A (en) 2008-03-20
ES2281177T3 (es) 2007-09-16
EP2316924A3 (en) 2014-03-19
WO1999064570A1 (en) 1999-12-16
EP1086207B1 (en) 2007-01-17
US9352033B2 (en) 2016-05-31
KR20010052782A (ko) 2001-06-25
US20090053264A1 (en) 2009-02-26
CA2334850A1 (en) 1999-12-16
WO1999064570A9 (en) 2000-03-09
WO1999064068A9 (en) 2000-03-09
US7588768B2 (en) 2009-09-15
CY1113689T1 (el) 2016-06-22
JP2010142248A (ja) 2010-07-01
EP2316923A3 (en) 2014-04-09
DK2316924T3 (en) 2018-01-02
EP2316923B1 (en) 2017-10-18
DE69934885D1 (de) 2007-03-08
HUP0102441A2 (hu) 2001-10-28
CZ20004635A3 (en) 2001-06-13
US20090203114A1 (en) 2009-08-13
US9387240B2 (en) 2016-07-12
MXPA00012402A (es) 2003-07-14
PT1085904E (pt) 2013-03-05
SK288567B6 (sk) 2018-06-01
PL212316B1 (pl) 2012-09-28
NO20006328D0 (no) 2000-12-12
JP4531255B2 (ja) 2010-08-25
EP2316923A2 (en) 2011-05-04
JP2014036654A (ja) 2014-02-27
NZ509055A (en) 2004-02-27
WO1999064068A1 (en) 1999-12-16
IL188362A0 (en) 2008-03-20
JP5081220B2 (ja) 2012-11-28
AU4434599A (en) 1999-12-30
JP2013226154A (ja) 2013-11-07
US20140341948A1 (en) 2014-11-20
AU771110B2 (en) 2004-03-11
ES2653557T3 (es) 2018-02-07
RU2236252C2 (ru) 2004-09-20
AU4434399A (en) 1999-12-30
EP1085904B1 (en) 2012-11-28
BR9911163A (pt) 2002-01-15
EP1086207A1 (en) 2001-03-28
US20120258134A1 (en) 2012-10-11
KR20060080249A (ko) 2006-07-07
EP1085904A1 (en) 2001-03-28
JP2011050384A (ja) 2011-03-17
MXPA00012403A (es) 2003-05-15
CZ302601B6 (cs) 2011-08-03
JP5810134B2 (ja) 2015-11-11
CA2334895A1 (en) 1999-12-16
NO20006328L (no) 2001-02-02
US20040109877A1 (en) 2004-06-10
US6573079B1 (en) 2003-06-03
CZ306637B6 (cs) 2017-04-12
US20100233785A1 (en) 2010-09-16
ES2650500T3 (es) 2018-01-18
IL189766A0 (en) 2008-08-07
US8765139B2 (en) 2014-07-01
US20160279227A1 (en) 2016-09-29
HUP0102441A3 (en) 2004-10-28
EP2316924A2 (en) 2011-05-04
US6852522B1 (en) 2005-02-08
JP2002517470A (ja) 2002-06-18
IL140265A (en) 2008-06-05
PL200977B1 (pl) 2009-02-27
KR100637937B1 (ko) 2006-10-23
PL219128B1 (pl) 2015-03-31
JP5829655B2 (ja) 2015-12-09
US7494808B2 (en) 2009-02-24
JP2010099081A (ja) 2010-05-06
JP2002517229A (ja) 2002-06-18
DE69934885T2 (de) 2007-11-08
IL140264A0 (en) 2002-02-10
ATE351901T1 (de) 2007-02-15
CN1312725A (zh) 2001-09-12
IL140265A0 (en) 2002-02-10
DK2316923T3 (en) 2018-01-08
JP4837827B2 (ja) 2011-12-14
PL346212A1 (en) 2002-01-28
NZ509054A (en) 2004-01-30
US20100158942A1 (en) 2010-06-24
SK288544B6 (sk) 2018-03-05
PL398576A1 (pl) 2012-10-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2334850C (en) Novel methods and interferon deficient substrates for the propagation of viruses
HK1155486A (en) Attenuated negative strand viruses with altered interferon antagonist activity for use as vaccines and pharmaceuticals
HK1155488A (en) Attenuated negative strand viruses with altered interferon antagonist activity for use as vaccines and pharmaceuticals

Legal Events

Date Code Title Description
TC4A Change of owner's name

Owner name: MOUNT SINAI SCHOOL OF MEDICINE, NEW YORK, NY, US

Effective date: 20110926

MK4A Patent expired

Expiry date: 20190611