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CN1312725A - 用作疫苗和药剂的具有被改变的干扰素拮抗剂活性的减毒负链病毒 - Google Patents

用作疫苗和药剂的具有被改变的干扰素拮抗剂活性的减毒负链病毒 Download PDF

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CN1312725A
CN1312725A CN99809582A CN99809582A CN1312725A CN 1312725 A CN1312725 A CN 1312725A CN 99809582 A CN99809582 A CN 99809582A CN 99809582 A CN99809582 A CN 99809582A CN 1312725 A CN1312725 A CN 1312725A
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CN
China
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virus
interferon
host system
attenuated
ifn
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN99809582A
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English (en)
Inventor
P·帕勒瑟
A·加西亚－萨斯特雷
T·穆斯特
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Icahn School of Medicine at Mount Sinai
Original Assignee
Mount Sinai School of Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27376229&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN1312725(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Mount Sinai School of Medicine filed Critical Mount Sinai School of Medicine
Publication of CN1312725A publication Critical patent/CN1312725A/zh
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Abstract

本发明涉及,总的说来,具有拮抗细胞干扰素(IFN)应答的活性受损的减毒负链RNA病毒,以及这些减毒病毒在疫苗和药剂制剂中的作用。本发明也涉及开发和应用IFN－缺陷系统以挑选这些减毒的病毒。特别地,本发明涉及对NS1基因具有修饰的减毒流感病毒,该修饰减弱或消除NS1基因产物拮抗细胞IFN应答的能力。该突变病毒在体内复制,但表现出减弱的病原性,因此十分适用于活病毒疫苗,及药剂制剂。

Description

用作疫苗和药剂的具有被改变的干 扰素拮抗剂活性的减毒负链病毒
反映在本申请中的工作部分得到国立卫生研究院(the NationalInstitutes of Health)的支持，因此政府对本发明具有一定的权利。
本申请是申编号60/117,683,1999年1月29日提交；申编号60/108,832,1998年11月18日提交；及申请号60/089,103,1998年6月12日提交的部分延续，这些申请中每一部的全部内容均作为参考引入本申请中。
1．前言
本发明涉及，总的说来，具有拮抗细胞干扰素(IFN)应答的活性减弱的减毒负链RNA病毒，以及这种减毒的病毒在疫苗和药剂制剂中的作用。本发明也涉及开发和应用IFN-缺陷系统以挑选、鉴定和复制这种减毒病毒。
在一个特定的实施例中，本发明涉及对NS1基因具有修饰的减毒流感病毒，这些修饰减弱或消除NS1基因产物拮抗细胞IFN应答的能力。该突变病毒在体内复制，但表现出减弱的病原性，因此十分适用于活病毒疫苗，及药剂制剂。
2．发明背景
2.1 流感病毒
含有负向基因组的有包膜的单链RNA的病毒家族被分为两组，具有非分段的基因组(副粘病毒科(Paramyxoviridae)、棒状病毒科(Rhabdoviridae)、线状病毒科(Filoviridae)、博纳病病毒科(BornaDisease Virus))或具有分段的基因组(正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)和砂粒病毒科(Arenaviridae))。正粘病毒科，如以下所详细描述的，在本说明书中被用于实施例中，包括A、B和C型流感病毒，以及索戈托(Thogoto)和Dhori病毒以及传染性的鲑鱼贫血病毒(salmon anemia virus)。
流感病毒颗粒包括一个含有单链RNA基因组的内部核糖核蛋白核心(一种螺旋状的核壳体)，和一层内部衬有基质蛋白(M1)的外层脂蛋白被膜。A型流感病毒的分段的基因组包括八种线性、负极性、单链的RNA分子(七种是C型流感病毒的)，它们编码十种多肽，包括：RNA依赖性的RNA聚合酶蛋白(PB2、PB1和PA)和形成核壳体的核蛋白(NP)；基质膜蛋白(M1、M2)；两种从含有脂质的被膜伸出的表面糖蛋白：血凝素(HA)和唾液酸苷酶(NA)；非结构蛋白(NS1)和核外运蛋白(nuclear export protein)(NEP)。基因组的转录和复制在核内发生并通过从质膜上出芽发生组装。这些病毒在混合感染的时候可以将基因重排列。
流感病毒经由HA吸附到细胞膜糖蛋白和糖脂的唾液酰基低聚糖(siaiyloligosaccharides)。在病毒体的胞饮作用之后，HA分子在细胞的内涵体内发生构象变化，其有利于膜融合，因此诱导脱壳。核壳体迁移到核心处，病毒mRNA在此处被转录。病毒mRNA通过一种独特的机制转录，其中病毒核酸内切酶将带帽的5末端从细胞异源mRNA上切下来，该5末端然后作为病毒RNA模板通过病毒转录酶转录的引物。转录在离它们模板末端的15至22个碱基处终止，寡聚(U)序列在该处作为多聚(A)簇加入的信号。在这样产生的八种病毒RNA分子中，六种是单顺反子信息，其直接转录成蛋白，表示为HA、NA、NP和病毒聚合酶蛋白、PB2、PB1和PA。其他两种转录本被剪接，各得到两种mRNA，其以不同的阅读框翻译，产生M1、M2、NS1和NEP。换言之，八种病毒RNA片段编码十种蛋白：九种结构的和一种非结构的。流感病毒的基因和它们的蛋白产物的概况如以下表Ⅰ中所示。
                             表Ⅰ流感病毒基因组RNA片段及编码分配a
片段  长度b  编码    长度d  分子    注释(核苷)  多肽c (氨基酸) 每病毒体
1    2341      PB2      759      30-60  RNA转录酶组分；宿主细胞RNA帽结合2    2341      PB1      757      30-60  RNA转录酶组分；起始转录3    2233      PA       716      30-60  RNA转录酶组分4    1778      HA       566      500    血凝素；三聚体；被膜糖蛋白；调节对细胞的黏附5    1565      NP       498      1000   核蛋白；与RNA结合。RNA转录酶的结构组分6    1413      NA       454      100    神经氨酸酶；四聚体；被膜糖蛋白7    1027      M1      252      3000   基质蛋白；形成膜内侧内衬M2     96       ？     质膜上的结构蛋白；切割的mRNA8   890       NS1     230             非结构蛋白；功能未知NEP      121      ？     核外运蛋白；切割的mRNA
 a．改编自R.A.Lamb和P.w.Choppin(1983)，生化年鉴，第52卷，467-506。b．就A/PR/8/34菌株而言c．通过生化和遗传方法确定d．通过核酸序列分析和蛋白测序确定
流感A病毒基因组包括八种负极性单链RNA片段，编码一种非结构和九种结构蛋白。非结构蛋白NS1大量存在于在流感病毒感染的细胞内，但在病毒体内却没有检测到。NS1是一种在感染早期的细胞核内以及病毒周期晚期的细胞质内发现的一种磷蛋白质(King等，1975,病毒学64：378)。对在NS基因上带有损伤的温度敏感(temperature-sensitive,ts)型流感突变体的研究显示NS1蛋白是多种机制的转录和转录后调节子，通过这些机制病毒能够阻止宿主细胞基因表达并刺激病毒蛋白合成。同许多其它调节转录后过程的蛋白一样，NS1蛋白同特定的RNA序列和结构相互作用。NS1蛋白已经被报道结合不同种类的RNA，包括：vRNA、多聚-A、U6snRNA、病毒mRNA的5非翻译区域以及dsRNA(Qiu等，1995,RNA 1:304；Qiu等，1994，病毒学杂志.68:2425；Hatada Fukuda 1992，遗传病毒学杂志73:3325-9)。在被转染的细胞内NS1蛋白从eDNA的表达已经同几种影响相关：阻止mRNA的核-质运输、阻止前-mRNA剪接、阻止宿主mRNA多聚腺苷酸化和刺激病毒mRNA的翻译(Fortes，等，1994,EMBO J.13:704；Enami，等，1994,J.Virol.68:1432；de la Luna，等，1995，病毒学杂志69:2427；Lu，等，1994,Genes Dev.8:1817；Park，等，1995，生物化学杂志270,28433；Nemeroff等，1998，分子细胞1:1991；Chen，等，1994,EMBO J.18:2273-83)。
2.2 减毒的病毒
失活的病毒疫苗是通过“杀灭”病毒病原体制备的，如，通过加热或福尔马林处理，以至其不能复制。失活的疫苗的应用具有局限性，因为它们不能提供持续长久的免疫性以及，因此，提供的是有限的保护。一种生产病毒疫苗可选的方法包括使用减毒的活病毒疫苗。减毒的病毒能够复制但不具有病原性，以及，因此，提供了持续更长久的免疫性并提供更强的保护。然而，生产减毒病毒的传统方法包括宿主范围突变体的随机分离，其中许多是温度敏感型的；如，病毒通过非天然的宿主传代，挑选具免疫原性，但不具有病原性的子代病毒。
分离和培养流感病毒以用于疫苗目的的传统培养基为含胚家鸡卵。流感病毒典型地是在37℃下、在10-11天龄的卵内生长2-4天。虽然大多数人初级分离的流感A和B病毒在胚胎的羊膜囊内生长得更好，但在2至3代以后，病毒变得适于在尿囊腔的细胞内生长，其易受卵外部的影响(Murphy,B.R.，和R.G.Webster,1996.正粘病毒，第1397-1445页.在Fields Virology.Lippincott-RavenP.A.)。
重组DNA技术和基因工程技术，在理论上，将提供一种更强的生产减毒病毒的方法，因为特定的突变能够被特意地工程化到病毒基因组内。然而，对于病毒减毒，在遗传上的变化是未知的或无法预计的。通常，将重组DNA技术应用到工程化病毒疫苗上的尝试主要是针对亚单位疫苗的生产，其仅包括涉及免疫应答、在重组病毒载体(如痘苗病毒或杆状病毒)内表达的蛋白亚基。新近，重组DNA技术已经在尝试生产疱疹病毒缺失突变体或脊髓灰质炎病毒中被利用，它们是在天然状态中发现的、或已知的宿主范围突变体的模拟减毒病毒。直到1990年，没有负链RNA病毒未曾经受被位点特异性操作，因此其无法在基因工程化。
迄今为止，减毒的活流感病毒可能无法抑制它们在其中复制的宿主内部的干扰素应答。因此，虽然这些病毒是有利的，因为它们具免疫原性且不具有病原性，但对于生产疫苗的目的，它们在传统培养基内复制是困难的。此外，减毒的病毒可能带有毒性，这种毒性很轻，以至不会使宿主产生足以迎接后继的攻击的免疫应答。
3．发明概述
本发明涉及拮抗细胞IFN应答的能力受损伤的减毒负链RNA病毒，以及这类病毒在疫苗和药剂制剂中的应用。IFN干扰素活性损伤的突变病毒被减毒-它们具感染性、能够在体内复制以提供亚临床感染水平、且不具有病原性。因此，它们是活病毒疫苗的理想候选者。而且，这些减毒能够诱导强IFN应答，这在体内具有其它生物结果，提供了抗后来感染疾病的防护和/或诱导抗肿瘤应答。因此，减毒的病毒可以被在治疗上使用，用于防止或治疗高危个体的其它感染疾病、癌症、及/或IFN-可治疗的疾病。
依据本发明使用的负链RNA病毒包括分段的及非分段的病毒；优选的实施例包括但不局限于流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、新城疫病毒(NDV)、水泡性口炎病毒(VSV)和副流感病毒(PIV)。在本发明中使用的病毒的选取可以从天然产生的株系、变体或突变体；诱导突变的病毒(如，通过暴露在诱变剂中、反复传代和/或在非许可性宿主内传代产生)；重排列(对于分段的病毒基因组)；和/或具有理想表型的(如，一种损伤的拮抗细胞IFN应答的能力)的遗传工程化的病毒(如，使用“反向遗传学”技术)。可以基于在IFN缺陷系统和在IFN充足的系统内生长之间的不同，选择突变体或遗传工程化的病毒。例如，可以选择在一种IFN缺陷系统中生长、但不在一种IFN充足的系统中生长的病毒(或在一种IFN充足系统中生长较差的病毒)。
选择减毒病毒使其自身可以在疫苗或药剂制剂中用作活性成分。可选地，减毒病毒可以被用作重组产生的疫苗的载体或“主链”。为此目的，可以采用“反向遗传学”技术来工程化突变或将外来的抗原决定簇引入到减毒病毒中，其可以作为“亲本”株系。这样，可以工程化疫苗以免疫对抗株系变体，和可选地，对抗完全不同的感染因子或疾病抗原。例如，减毒病毒可以被工程化以表达其它预选株系的中和抗原决定簇。可选地，可以将负链RNA病毒之外的病毒的抗原决定簇构建到减毒的突变病毒内(如，HIV的gp160、gp120、或gp41)。可选地，可以将非病毒性感染的病原体(如，寄生虫、细菌、真菌)的抗原决定簇工程化到病毒内。在又另一个可选的情况下，可以制备癌症疫苗，如通过将肿瘤抗原工程化到减毒的病毒主链上。
在一个涉及具分段基因组的RNA病毒的特定实施例中，重排列技术可以被用于将减毒的表现型从一种母本分段的RNA病毒株系(一种天然突变体、一种诱变病毒、或一种工程化的病毒)转到一种不同的病毒株系(一种野生型病毒、天然突变体、一种诱变病毒、或一种遗传工程化的病毒)中。
减毒的病毒，其在宿主内诱导强IFN应答，可以被用于药剂制剂中以预防或治疗其它病毒感染、或可用IFN-治疗的疾病，如癌症中。在这点上，可以改变减毒病毒的趋性，以在体内或来自体内将病毒对准想要的靶器官、组织或细胞。使用该方法，IFN应答可以被就地诱导，在靶位点，因此避免或最小化系统IFN治疗的副作用。为此，可以工程化减毒病毒以表达一种特异性针对靶器官、组织或细胞的受体的配基。
本发明部分基于申请者们的发现，即野生型流感病毒的NS1作为一种IFN拮抗剂发挥功能，在其中NS1阻止病毒感染的宿主细胞内IFN调节的应答。缺乏NS1活性的病毒突变体被发现是细胞IFN应答的有效诱因，并在体内被证明具有一种减毒的表现型；即，该突变病毒在体内复制，但具有降低的病原性影响。不想将本发明如何起作用拘泥于任何理论或解释，推测本发明中的病毒的减毒特性是由于它们诱导强的细胞IFN应答的能力，以及它们拮抗宿主IFN应答的能力受损伤。然而，本发明中的减毒病毒的有利特性不能仅仅归于对细胞干扰素应答的影响。事实上，与NS1相关的其它活性上的改变可能促成想要的减毒表现型。
具有损伤的IFN拮抗活性的突变流感病毒被显示在体内复制，产生的滴度足以诱导免疫和细胞因子应答。例如，用减毒的流感病毒接种疫苗在动物体内降低病毒滴度，其继而被野生型流感病毒攻击。减毒病毒也表现出抗病毒和抗肿瘤活性。用减毒的流感病毒预感染阻止了再度感染的野生型流感病毒的其它株系、和其它病毒(如仙台病毒)在含胚卵内的复制。将减毒的流感病毒接种到肿瘤细胞注射过的动物体内降低了转化灶形成的数目。因为已知流感病毒诱导一种CTL(细胞毒性T细胞)应答，因此减毒的病毒是癌症疫苗的一种十分有吸引力的候选者。
降低但不消除病毒的IFN拮抗活性的突变对于疫苗制剂是优选的-可以就其在传统及非传统的培养基中的生长，及具有的中间毒性选择这些病毒。特别地，本申请者们已经证明一种NS1 C-末端-截短的突变体在IFN缺乏的培养基(如6和7天龄含胚家鸡卵)中、以及在10天龄含胚家鸡卵的尿囊膜内(流感病毒的传统培养基，其不允许流感病毒突变体(其中整个NS1基因被缺失，在本说明书中也称为“敲除”突变体)的生长)复制到高滴度。然而，NS1-C-末端截短突变体在12天龄含胚卵中减少。该方法第一次允许，活减毒的负链RNA病毒(其具有改变的、但不是消除的、IFN拮抗活性，并且其能够在适合疫苗药剂的培养基中生长)的产生和鉴定。该方法也首次提供，流感或其它病毒(其含有提供改变的、但不是消除的干扰素拮抗活性的突变)的一种有效的选择鉴定系统。
本发明也涉及使用IFN缺陷系统来增殖减毒的病毒，该病毒不能在普遍用于疫苗生产的传统系统中生长。在本说明书中用到的术语“IFN-缺陷系统”是指系统，如，细胞、细胞系和动物，如小鼠、家鸡、火鸡、兔子、大鼠等，其不产生IFN或产生低水平的IFN，对IFN不应答或较低效率地应答，及/或缺乏由IFN诱导的抗病毒基因活性。为此，申请者们已经鉴定或设计了许多可以被使用的IFN-缺陷系统，包括但不局限于初期的含胚卵、IFN缺陷型细胞系(如VERO细胞、或如STAT1敲除的遗传工程化的细胞系)。可选地，可以用抑制IFN系统的化合物(包括药物、抗体、反义核酸分子、核糖酶，等)预处理含胚卵或细胞系。又另一个实施例涉及IFN系统缺陷型的卵的应用，如，由STAT1阴性的鸟生的卵，尤其是家禽，包括但不局限于转基因家鸡、家鸭或火鸡。
4．附图说明
图1、DelNS1病毒抑制卵中野生型流感A病毒的复制。将标出的pfu的delNS1病毒接种十天龄含胚鸡卵。八小时以后，用103pfu WSN病毒感染这些卵。在37℃孵育两天之后，收集尿囊液并在MDBK细胞中通过噬斑分析确定WSN的滴度。结果是两个卵的平均。
图2、在含胚卵中由delNS1病毒诱导的抗病毒应答。将十天龄的含胚鸡卵与PBS(未处理)或与2×104fpu delNS1病毒(delNS1处理过)一起孵育。八小时以后，立刻用10 pfu的流感A/WSN/33(H1N1)病毒、流感A/PR8/34(H+N1)病毒、流感A/X-31(H3N2)病毒、流感B/Lee/40病毒、或仙台病毒感染鸡卵。孵育两天以后，收集尿囊液并通过血凝分析确定病毒滴度。结果是两个卵的平均。
图3、用表达与绿色荧光蛋白(GFP)融合的IRF-3的质粒转染CV1细胞。这使得可以通过荧光显微镜确定IRF-3在细胞内的定位。在一些情况下，将一种表达NS1的质粒以指定的比例同表达IRF-3的质粒一起共转染。转染的24小时以后，用PR8(WT)或delNS1病毒如指定的高感染复数(moi)转染感染这些细胞。感染的10小时以后，在荧光显微镜下分析细胞中IRF-3-GFP的定位。表现IRF-3仅在细胞质定位(CYT)和在细胞质及细胞核定位(Nuc+Cyt)的细胞的百分率被表示出来。
5．发明详述
本发明涉及拮抗细胞IFN应答的能力受损伤的减毒负链RNA病毒的产生、挑选和鉴定，以及这类病毒在疫苗和药剂制剂中的应用。
这些病毒可以具有被分段的和没有被分段的基因组，并且可以选自天然发生的株系、变体或突变体；诱变的病毒(如，通过暴露在紫外辐射、诱变剂、和/或传代)；重排列(对于具有被分段的基因组的病毒)；和/或遗传工程病毒。例如，突变体病毒的产生可以通过天然变异、暴露在紫外辐射、暴露在化学诱变剂、通过在非许可性宿主内传代、通过重排列(即，通过将一种减毒的被分段病毒与另一种具有想要的抗原的株系一起协同感染)、和/或通过遗传工程(如，使用“反向遗传学”)。选择用于本发明的病毒具有缺损的IFN拮抗活性并且是减毒的；即，它们是具有感染力的并且能够在体内复制，但仅产生导致非病原性的亚临床感染水平的低滴度。这些减毒的病毒是活疫苗的理想候选者。
在一个优选的实施例中，挑选用于本发明的减毒病毒应该能够在宿主内诱导强的IFN应答--一种特性，当作为一种疫苗使用时，导致强免疫应答的产生，并且其具有其它的生物学后果，使这些病毒能够作为一种制药试剂用于本发明及/或治疗其它病毒感染、或高危患者体内的肿瘤形成、或其它用IFN治疗的疾病。
本发明部分，基于本发明者们在研究流感病毒突变体时的许多发现和观察。然而，这些原理能够被类似地应用和外推到其它被分段的和没有被分段的负链RNA病毒中，包括，但不局限于副粘病毒(仙台病毒、副流感病毒、腮腺炎、新城疫病毒)；麻疹病毒(麻疹病毒、犬瘟病毒和牛瘟病毒)；肺炎病毒(呼吸道合胞病毒和牛呼吸道病毒)；以及弹状病毒(水泡性口炎病毒和狂犬病病毒)。
首先，IFN应答对于在体内遏制病毒感染是重要的。本发明者们发现野生型流感病毒A/WSN/33在IFN缺陷型小鼠(STAT1-/-小鼠)内的生长导致泛器官的感染；即，病毒感染与产生一种IFN应答的野生型小鼠中的情形不同，不局限于肺部(Garcia-Sastre，等，1998，病毒学杂志72:8550，其全部内容作为参照结合于本说明书中)。第二，本发明者们证实流感病毒的NS1作为一种IFN拮抗剂发挥功能。本发明者们发现一种缺失了整个NS1基因的流感病毒突变体(即，一种NS1“敲除”)无法在IFN产生型的宿主细胞内生长到高滴度，并且仅能够在IFN-缺陷型的宿主体内复制。NS1基因敲除小鼠证实了一种减毒表现型(即，其在IFN缺陷型STAT1-/-小鼠体内是致死的，但在野生型小鼠体内没有)，并且被发现是宿主细胞内IFN应答的一种强诱导子(Garcia-Sastre，等，1998，病毒学252:324-330，其全部内容作为参照结合于本说明书中)。用NS1敲除突变病毒的预感染降低了在含胚卵内再度感染的野生型流感和其它病毒(如，仙台病毒)的滴度。在另一个实施例中，用NS1敲除突变流感病毒感染降低了接种过肿瘤细胞的动物体内的转化性形成。因此，NS1敲除流感病毒证明颇具吸引力的生物特性。然而，S1敲除流感病毒不能够在用于疫苗产生的常规系统中复制。为了克服这一困难，本发明者们使用并开发了产生合理产量的减毒病毒IFN缺陷型系统。
另外，本发明者们设计了NS1的缺失突变体，其不缺失整个基因。令人惊讶的是，发现这些NS1突变体呈现一种“过渡”表现型-病毒能够在用于复制流感病毒的传统宿主内生长(虽然在IFN-缺陷型的系统内生长较好，其获得较高的滴度)。最重要的是，这些缺失突变体在体内是减毒的，并诱导一种强的IFN应答。流感病毒NS1截短的突变体疫苗接种在动物体内引起低滴度，并继而被野生型病毒攻击，提供抗病毒的防护。
本发明也涉及用于用作疫苗的病毒的分离、鉴定和生长的培养基。特别地，描述了用于有效生长流感病毒突变体的干扰素缺陷型培养基。依据本发明，一种干扰素缺陷型培养基是一种在其产生或应答干扰素的能力上存在缺陷的培养基。本发明中的培养基可以被用于任意数目的，可能需要干扰素缺陷型生长环境的病毒的生长。这些病毒可以包括，但不局限于仙台病毒、副流感病毒、腮腺炎、新城疫病毒)；麻疹病毒(麻疹病毒、犬瘟病毒和牛瘟病毒)；肺炎病毒(呼吸道合胞病毒和牛呼吸道病毒)；弹状病毒(水泡性口炎病毒和狂犬病病毒)。
本发明也涉及本发明中的减毒病毒在用于人类或动物的疫苗和药剂制剂中的使用。特别地，这些减毒病毒可以被用作疫苗以抵抗广范围的病毒和/或抗原，包括但不局限于株系变体、不同病毒或其它感染性病原体(如，细菌、寄生虫、真菌)的抗原，或肿瘤特异性抗原。在另一个实施例中，这些减毒的病毒，其抑制病毒复制和肿瘤形成，可以被用于预防或治疗感染(病毒性的或非病毒性的)或肿瘤形成或治疗IFN在治疗上有效的疾病。可以采用多种方法将活减毒病毒制剂引入到某人类或动物患者体内，以诱导一种免疫或适当的细胞因子应答。这些包括，但不局限于，鼻内、气管内(trachial)、口服、真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内及皮下途径。在一个优选的实施例中，本发明中的减毒病毒的配制是用于鼻内施用的。
5.1 具有改变的IFN拮抗活性的突变体的产生
任何具有降低的IFN拮抗活性的突变病毒或株系均可以被选择并依据本发明进行使用。在一个实施方案中，可以选择天然发生的突变体或变体、或自发的突变体，它们拮抗细胞IFN应答的能力受损。在另一个实施方案中，突变体病毒的产生可以通过将病毒暴露在诱变剂(如紫外辐射或化学诱变剂)中、或者通过多次传代及/或在非许可性宿主内传代。差示生长系统筛选可用于挑选具有损伤的IFN拮抗功能的突变体。对于基因组被分段的病毒，可以通过重排列将减毒的表现型转移到另一种具有一种理想抗原的株系内，(即，通过该减毒病毒与理想的株系的共转染，并挑选两种表现型均表现的重排列体)。
在另一个实施方案中，突变体可以被工程化到一种负链RNA病毒内，如流感、RSV、NDV、VSV和PIV，使用“反向遗传学”的方法。这样，具有减毒表现型的天然的或其它突变体能够被工程化到疫苗株系中。例如，可以工程化负责IFN拮抗活性的基因(如流感病毒的NS1)中编码区域的缺失、插入或替换。也可以考虑负责IFN拮抗活性的基因中非编码区域的缺失、替换或插入。为此，可以对担负负责IFN拮抗活性的基因的转录、复制、多聚腺苷酸化和/或包装的信号进行工程化。例如，在流感病毒中，这些修饰包括，但不局限于：用一种流感B病毒基因中的非编码区域替代一种流感A病毒基因中的非编码区域Muster，等，1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:5177),在一种流感病毒基因的非编码区域上的碱基对交换(Fodor，等，1998，病毒学杂志72:6283)，在一种流感病毒基因的启动子区域上的突变(Piccone，等，1993,Virus Res.28:99；Li，等，1992，病毒学杂志66:4331)，在一种流感病毒基因5’末端影响多聚腺苷酸化的尿嘧啶残基链段的替换和缺失(Luo，等，1991，病毒学杂志65:2861；Li，等，病毒学杂志1994,68(2):1245-9)。这些突变体，如对启动子，能够减量调节负责IFN拮抗活性的基因的表达。在病毒基因上的突变，其可能调节负责IFN拮抗活性的基因表达，也在可以依据本发明进行使用的病毒范围之内。
本发明也涉及对NS1基因片段的突变，其可能不会导致IFN拮抗活性的改变或一种IFN-诱导表现型，而导致改变的病毒功能和一种减毒的表现型如，改变了的对于含多聚(A)的mRNA的核外运的抑制，改变了的对于前mRNA剪接的抑制，改变了的对于由dsRNA的隐蔽引起的PKR活化的抑制，改变了的对于病毒RNA翻译的影响，以及改变了的对于宿主mRNA多聚腺苷酸化的抑制(如.，见Krug在流感教科书中，Nicholson等1998年编辑，82-92，及其中所引用的参考文献)。
反向遗传学技术包括制备合成的重组病毒RNA，其包括负链病毒RNA的非编码区域，这对于病毒多聚酶的识别及对于在产生成熟病毒体中所必需的包装信号是必要的。重组RNA从重组DNA模板中合成，并与纯化的病毒聚合酶复合物在体外进行重构，以形成能够被用于转染细胞的重组的核糖核蛋白(RNPS)。在合成的RNA在体外或在体内转录的过程中，如果存在病毒聚合酶蛋白，将达到更有效的转染。这些合成的重组RNP能够被获救到感染性病毒颗粒内。上述技术的描述在美国专利编号5,166,057,1992年11月24日提交；在美国专利编号5,854,037,1998年12月29日提交；在欧洲专利出版物EP0702085Al,1996年2月20日出版；在美国专利申请系列编号09/152,845；在国际专利出版物WO97/12032,1997年4月3日出版；WO96/34625,1996年11月7日出版；欧洲专利出版物P-A780475；WO99/02657,1999年1月21日出版；WO98/53078,1998年11月26日出版；WO98/02530,1998年1月22日出版；WO99/15672,1999年4月1日出版；WO98/13501,1998年4月2日出版；WO97/062701997年2月20日出版；以及EPO 780 47SAl,1997年6月25日出版，每篇的全文均作为参照结合于本说明书中。
通过反向遗传学方法产生的减毒病毒能够被用于本说明书中所描述的疫苗和药剂制剂中。反向遗传学技术也可以被用于工程化对于疫苗生产很重要的其它病毒基因另外的突变--即，有用的疫苗株系变体的抗原决定簇可以被工程化到减毒病毒中。可选地，完整的异源抗原决定簇，包括来自其它病毒或非病毒病原体的抗原可以被工程化到减毒株系中。例如，可以将非相关病毒的抗原如HIV(gp160、gp120、gp4l)、寄生虫抗原(如，疟疾)、细菌或真菌抗原或肿瘤抗原工程化到减毒的株系中。可选地，在体内改变病毒趋性的抗原决定簇可以被工程化到本发明的嵌合减毒病毒中。
在一个可选的实施方案中，反向遗传学技术和重排列技术的组合可以被应用于工程化具有理想抗原决定簇的分段的RNA病毒减毒病毒。例如，可以将一种减毒的病毒(通过自然选择、诱变或通过反向遗传学技术产生)和一种带有想要的疫苗抗原决定簇的株系(通过自然选择、诱变或通过反向遗传学技术产生)共转染到允许被分段的基因组重排列的宿主内。然后可以选择表现减毒表现型及想要的抗原决定簇的重排列体。
在另一个实施方案中，被突变的病毒是一种DNA病毒(如，牛痘、腺病毒、杆状病毒)或一种负链RNA病毒(如，脊髓灰质炎病毒)。在这些情况下，可以采用在工艺上熟知的重组DNA技术(如，见美国专利编号4,769,330,Paoletti；美国专利编号4,215,051,Smith，各篇的全文均作为参照结合于本说明书中)。
任何病毒可以依据本发明被工程化，包括但不局限于以下表2中所列出的家族。
表2
        人类和动物病毒的科病毒特性                     病毒科dsDNA有被膜的                     痘病毒科
                         Irididoviridae
                         疱疹病毒科无被膜的                     腺病毒科
                         乳头多瘤空泡病毒科
                         嗜肝DNA病毒科ssDNA无被膜的                     小DNA病毒科dsRNA无被膜的                 呼肠孤病毒科
                     BirnaviridaessRNA有被膜的有义基因组
  复制中无DNA步骤    披盖病毒科
                     黄病毒科
                     冠状病毒科复制中有DNA步骤          反转录病毒科反义基因组非分段的基因组           副粘病毒科
                     棒状病毒科
                     丝状病毒科分段的基因组             正粘病毒科
                     布尼亚病毒科
                     砂粒病毒科无被膜的                 细小核糖核酸病毒科
                     杯状病毒科
使用的缩写：ds=双链；ss=单链；有被膜的=具有来自宿主细胞膜的外部脂双层；有义基因组=对于RNA病毒，基因组由直接在核糖体上翻译的核苷酸序列组成，=对于DNA病毒，基因组由与mRNA相同的核苷酸序列组成；反义基因组=基因组由与有义链互补的核苷酸序列组成。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及被遗传工程化的流感病毒，其含有NS1基因产物的缺失和/或截短。流感A和B的NS1突变体是尤其优选的。在一种方法中，NS1基因产物的氨基末端区域的部分被保留，然而NS1基因产物的C-末端区域的部分被缺失。可以通过在合适的密码子上的核酸缺失、插入、或突变来工程化特定的理想突变体。特别地，截短的NS1蛋白具有野生型NS1基因产物的1-60个氨基酸、1-70个氨基酸、1-80个氨基酸、1-90个氨基酸(N-末端氨基酸是1)，优选的是90个氨基酸；1-100个氨基酸，优选的是99个氨基酸；或从1-130个氨基酸，优选的是124个氨基酸。
本发明也涉及任何被遗传操作的流感病毒，其中NS1基因产物已经通过NS1蛋白的截短或修饰而被修饰，修饰的NS1蛋白赋予突变体病毒以下的表现型：病毒在非常规的培养基(如6-7天龄的鸡卵)中甚至到高滴度的能力，或病毒诱导宿主干扰素应答的能力。对于流感A病毒，这些包括，但不局限于：具有一段NS1截短的病毒。
本发明包括天然发生、具有减毒表现型的突变流感病毒A或B的应用，以及被工程化以含有这些负责减毒表现型的突变的流感病毒株系的应用。对于流感A病毒，这些包括，但不局限于：具有一段124个氨基酸的NS1的病毒(Norton等，1987，病毒学156:204-213，其全部作为参照结合于本说明书中)。对于流感B病毒，这些包括，但不局限于：具有一种包括来自N-末端的127个氨基酸的NS1截短突变体病毒(B/201)(Norton等，1987，病毒学156:204-213，其全部作为参照结合于本说明书中)，以及有一种包括来自N-末端的90个氨基酸的NS1截短突变体病毒(B/AWBY-234)(Tobita等，1990，病毒学174:3201-213，其全部作为参照结合于本说明书中)。本发明包括与NS1/38、NS1/80、NS1/124类似的天然发生的突变体的应用(Egorov，等，1998，病毒学杂志72(8):6437-41)，以及天然发生的突变体A/Turkey/ORE/71、B/201或B/AWBY-234。
减毒的流感病毒可以进一步被工程化以表达其它疫苗株系的抗原(如，使用反向遗传学或重排列)。可选地，减毒的流感病毒可以被工程化，采用遗传操作过的病毒反向遗传学或重排列，以表达完整的外来抗原决定簇，如，其它感染病原体的抗原、肿瘤抗原、或靶抗原。由于NS RNA片段是八种病毒RNA中最短的，因此有可能NS RNA将比其它病毒基因能够容纳更长的异源序列的插入。此外，NS RNA片段在被感染的细胞内指导高水平蛋白的合成，暗示着它对于外来抗原的插入可能将是一种理想的片段。然而，依据本发明，感冒病毒的8个片段之任一个均可用于异源序列的插入，例如当需要表面抗原递呈时，可以采用编码结构蛋白的片段，如，HA或NA。
5.2  基于宿主-限制性的选择系统
本发明包括选择具有理想表现型的病毒的方法，即，具有低的或无IFN拮抗活性的病毒，无论是来自天然的变体、自发的变体(即，在病毒复制过程中发展起来的变体)、诱变的天然变体、重排列体和/或遗传操作的病毒。这些病毒最好以差示生长鉴定方式筛选，其是将在IFN-缺陷型同IFN-产生型宿主系统中的生长进行比较。挑选表现出在IFN-缺陷型系统内的生长比在IFN-产生型系统内地生长好的病毒；优选的，挑选在IFN-缺陷型系统内生长比在IFN-产生型系统内生长的滴度至少高一个对数的病毒。
可选地，可以采用IFN分析系统筛选病毒，如，基于转录的分析系统，其中报告基因的表达受一种IFN应答启动子的控制。可以测定报告基因在被感染/未感染的细胞内的表达，以鉴定有效诱导IFN应答、但不能够拮抗IFN应答的病毒。然而，在一个优选的实施例中，采用差示生长分析来挑选具有理想表现型的病毒，因为所使用的宿主系统(IFN-产生型比IFN-缺陷型)施加了适当的选择压力。
例如，可以在多种表达IFN及IFN应答元件的细胞、细胞系、或动物模型系统与IFN或IFN应答元件缺陷的细胞、细胞系、或动物模型系统之间比较病毒生长(通过滴度测定)。为此，可以比较病毒在细胞系内的生长，如VERO细胞(其为IFN-缺陷型)/MDCK细胞(其为IFN-产生型)。可选地，IFN-缺陷型细胞系可以来自或建立于动物繁殖的或遗传操作以成为INF系统缺陷型(如，STAT1-/-突变小鼠)。可以测定病毒在这些细胞系内的生长/在IFN-产生型细胞衍生、例如，来自野生型动物(如，野生型小鼠))的细胞系内的生长的比较。在又另一个实施例中，可以将IFN-产生型的及已知能够支持野生型病毒的生长的细胞系工程化为IFN-缺陷型，(如，通过敲除STAT1、IRF3、PKR，等。)可以采用工艺上熟知的、用于病毒在细胞系内复制的技术(见，例如，在下文中的工作实施例)。可以比较病毒在标准IFN产生型细胞系/IFN缺陷型遗传操作过的细胞系内的生长。
也可以采用动物系统。例如，对于流感病毒，在未成熟的、IFN-缺陷型含胚卵(如，大约6至8天龄)内的生长，可以同在较老的、IFN-产生型卵(如，大约10至12天龄)内的生长进行比较。为此可以采用工艺上熟知的、用于在卵内感染和复制的技术(如，见在下文中的工作实施例)。可选地，可以将在IFN-缺陷型STAT1-/-小鼠内的生长同在IFN-产生型野生型小鼠内的生长进行比较。在又另一个实施例中，可以将在由，如，STAT1-/-转基因家禽产生的IFN-缺陷型含胚卵内的生长同在由野生型家禽产生的IFN-产生型卵内的生长进行比较。
然而，为了筛选的目的，可以采用瞬时IFN-缺陷型系统以替代遗传操作的系统。例如，宿主系统的处理可以用抑制IFN产生的化合物和/或IFN应答的组分(如，药物、抗IFN的抗体、抗IFN-受体的抗体、PKR抑制物、反义分子和核糖酶，等)。可以比较病毒在IFN-产生型未经处理的对照内的生长和在IFN-缺陷型处理过的系统内的生长。例如，在用待筛选的病毒感染之前，IFN-产生型的较老的卵可以用这些药物预处理。将其生长与在未处理的相同天龄的对照卵内的生长进行比较。
本发明的筛选方法提供了一种鉴定具有消除的IFN拮抗活性的突变体病毒的简单且容易的方法，通过将这些突变体病毒无能力在IFN-应答环境中生长，同这些突变体病毒能够在IFN-缺陷型环境中生长相比。本发明的筛选方法也可以被用于鉴定具有改变的、但不是消除的IFN拮抗活性的突变体病毒，通过测定这些突变体病毒在IFN-应答(如，10-天龄含胚卵或MCDK细胞)及IFN-缺陷(如，6-至7-天龄含胚卵或Vero细胞)环境中都能够生长的能力。例如，在10-天龄卵内的生长低于6-7天龄卵内的生长至少一个对数的滴度的流感病毒将被认为它们抑制IFN应答的能力受损伤。在另一个实施例中，在12-天龄卵(其具有(mount)一种高IFN应答)内的生长低于10天龄卵(其具有(mount)一种中等IFN应答)内的生长至少一个对数的滴度的流感病毒将被认为它们拮抗IFN应答的能力受到部分损伤，并且被认为是具有吸引力的疫苗候选者。
本发明中的选择方法也包括鉴定诱导IFN应答的突变体病毒。依据本发明的选择方法，IFN应答的诱导的测定可以通过测定各种水平，包括IFN表达、或在突变体病毒感染之后或涉及IFN表达和/或IFN应答的转催化剂的活化而由IFN诱导的靶基因表达、或报告基因表达。
在本发明选择系统的又另一个实施例中，IFN应答的诱导的确定可以通过在待测试的突变体病毒(如，IRF-3，其响应双链RNA被磷酸化)感染之后测定IFN途径中的组分的磷酸化状态。响应I型IFN、Jak1激酶和TyK2激酶，IFN受体的亚基，STAT1，和STAT2迅速被酪氨酸磷酸化。因此，为了确定突变体病毒是否诱导IFN应答，将细胞，如293细胞，用待测试的突变体病毒感染并在感染之后，裂解细胞。IFN途径组分，如Jak1激酶或TyK2激酶，采用特定的多克隆血清或抗体，从被感染的细胞溶解产物中被免疫沉淀下来，激酶的酪氨酸磷酸化状态的确定是通过用抗-磷酪氨酸抗体进行免疫印迹分析(如，见Krishnan等1997，欧洲生物化学杂志247:298-305)。在突变体病毒感染之后，IFN途径中任何组分的磷酸化状态的增强均表明突变体病毒诱导了IFN应答。
在又一个实施方案中，本发明的选择系统包括测定响应病毒感染诱导的转录因子(如，IRF3、STAT1、STAT2，等)结合特定的DNA序列或转运的能力。特别地，STAT1和STAT2是磷酸化的，并且响应I型IFN从细胞质到细胞核被转运。转录因子结合特定的DNA序列或转运的能力可以通过本工艺熟练人员了解的技术进行测定，如，电迁移率变动分析、细胞染色，等。
在本发明选择系统的又另一个实施例中，IFN应答的诱导的测定可以通过在待测病毒感染之后，测定IFN-依赖的转录活化。在该实施例中，已知由IFN诱导的基因的表达，如，Mx、PKR、2-5-寡聚腺苷酸合成酶、主要组织相容性复合物(MHC)I型，等，可以通过本工艺熟练人员了解的技术进行分析(如，RNA印迹、蛋白质印迹、PCR，等)。可选地，在一种干扰素激活的应答元件(如IFN-激活的ISG-54K基因的启动子)的控制下，将待测细胞(如人胚肾细胞或人骨肉瘤细胞)工程化成瞬时或组成型表达报告基因(如荧光素酶报告基因或氯霉素转移酶(CAT)报告基因)(Bluyssen等，1994，欧洲生物化学杂志220:395-402)。用待测的突变体病毒感染细胞，并将报告基因的表达水与在未感染的细胞内或在野生型病毒感染的细胞内进行比较。在用待测的病毒感染之后，报告基因表达水平的提高将表明待测的突变体病毒诱导了IFN应答。
在由另一个实施例中，本发明的选择方法包括测定IFN的诱导，通过确定待测的突变体病毒感染的细胞或卵的抽提物是否能够提供抗病毒感染的保护性活性。更具体地，用待测的突变体病毒或野生型病毒感染10-天龄含胚鸡卵的组群。感染约15至20小时以后，收集尿囊液并测定IFN活性，通过确定在组织培养细胞(如CEF细胞)内抗VSV感染的保护性活性的最大稀释度。
5.3  病毒在干扰素缺陷型
生长培养基中的增殖
本发明也包括用于具有改变的IFN拮抗活性的、天然发生的或工程化过的突变体病毒的生长或分离的，方法和IFN-缺陷型培养基。可以被用于支持减毒的突变体病毒生长的IFN-缺陷型培养基包括，但不局限于IFN缺陷型的天然发生的细胞、细胞系、动物或含胚卵，如，Vero细胞、未成熟的含胚卵；工程化为IFN缺陷型的重组细胞或细胞系，如，来自STAT1敲除小鼠或其它类似工程化的转基因动物的IFN-缺陷型细胞系；来自IFN缺陷型鸟类的含胚卵，尤其是家禽(如，家鸡、家鸭、火鸡)，包括被培育成IFN-缺陷型的组群(flock)或转基因鸟类(如，STAT1敲除)。可选地，宿主系统，细胞、细胞系、卵或动物可以被遗传操作以表达编码IFN系统的抑制物的转基因，如，显性阴性突变体，如缺乏DNA结合功能区的STAT1、反义RNA、核糖酶、IFN产生的抑制物、IFN信号传递的抑制物、和/或由IFN诱导的抗病毒基因的抑制物。应该了解的是被培育或遗传操作以成为IFN缺陷型的动物将存在一定的无免疫应答的，应当保持在一种控制的、无疾病的环境下。因此，应当采取适当的措施(包括食用抗生素的使用)以减少转基因IFN缺陷型动物(如成群培育的母鸡、家鸭、火鸡，等)暴露在感染因子中的危险性。可选的，宿主系统，如，细胞、细胞系、卵或动物可以用一种抑制IFN产生和/或IFN途径的化合物进行处理，如，药物、抗体、反义分子、靶向STAT1基因的核糖酶分子、和/或由IFN诱导的抗病毒基因。
依据本发明，未成熟的含胚鸡卵包括的卵作为一种自然的过程最高可达、但不到10-天龄的卵，优选的是6-至10-天龄，但不到10-天龄，作为生长条件的选择的结果，如，在孵育温度上的改变；药物处理；或其它任何导致卵迟滞发育的改变，以至该卵的IFN系统相比于10-至12-天龄的卵是不完全发育的。
5.3.1 天然的IFN
缺陷培养基
在一个实施方案中，本发明涉及天然发生的和工程化突变的病毒在非传统的培养基中的生长，如还没有发育一个IFN系统的未成熟的含胚卵。由于脆弱的状态和较小的尿囊体积，未成熟的含胚卵通常不用于培养病毒。本发明包括在小于10天龄的含胚卵中生长突变体病毒；优选的是在8-天龄的含胚卵中生长突变体病毒，最优选是，在6至8-天龄的卵内。
本发明也包括在细胞或细胞系中生长和分离具有改变的IFN拮抗活性的突变体病毒的方法，这些细胞或细胞系天然不具有一种IFN途径或具有一种缺陷的IFN途径或在IFN系统上具有一种缺陷，如，IFN的表达水平低于野生型细胞。在一个尤其优选的实施例中，本发明涉及在Vero细胞中生长具有改变的IFN拮抗活性的突变体病毒的方法。
5.3.2 遗传操作的IFN
缺陷型培养基
本发明涉及在一种遗传操作的IFN缺陷型培养基中生长和分离具有改变的IFN拮抗活性的突变体病毒的方法。本发明包括转基因鸟类，其中IFN系统的一种必需基因，如，STAT1被突变，其将产下IFN缺陷型的卵。本发明进一步包括转基因以表达显性阴性转录因子的鸟类，如，缺少DNA结合功能域的STAT1、核糖酶、反义RNA、IFN产生的抑制物、IFN信号传递的抑制物、以及响应IFN诱导的抗病毒基因的抑制物。采用来自一种IFN-缺陷型转基因鸟类的卵的长处在于传统的10天龄卵可以被用于生长病毒，因为其较大的尺寸，所有具有更高的稳定性和更大的体积。在又另一个实施例中，可以将细胞系遗传操作成为IFN缺陷型。本发明包括的细胞系，其中IFN合成、IFN途径的必需基因和/或一种由IFN诱导的抗病毒基因被突变，如，STAT1。
本发明提供了重组细胞系或动物，尤其是鸟类，其中对于IFN途径为必需的一种或多种基因，如，干扰素受体、STAT1等，已经被破坏，即，为“敲除”；重组动物可以是任何动物，但在一个优选的实施例中是鸟类，如，家鸡、火鸡、母鸡、家鸭，等。(见，如，Sang,1994，生物技术趋势12:415；Perry，等，1993,Transgenic Res.2:125；Stern,C.D.,1996,Curr Top Microbiol Immunol212:195-206；和Shuman,1991,Experientia 47:897，为了关于鸟类转基因的产生的回顾，各篇的全部内容均作为参照结合于本说明书中)。这种细胞系或动物可以通过任何技术上已知的破坏细胞或动物染色体上的一个基因方法产生。这些技术包括，但不局限于前核微注射(Hoppe & Wagner,1989，美国专利编号4,873,191)；逆转录病毒介导的基因转移到种系中；(Van der Putten等，1985,Proc.Natl.Acad.Sci.，美国82:6148-6152)；基因靶向胚胎干细胞(Thompson等，1989，细胞56:313)；胚胎的电穿孔(Lo,1983，分子细胞生物学3:1803)；以及精子一介导的基因转移(Lavitrano等，1989，细胞57:717)；等。为了这些的回顾，见Gordon,1989，转基因动物，Intl.Rev.Cytol.115:171，其全文均作为参照结合于本说明书中。
特别地，一种STAT1敲除小鼠的产生可以通过启动其染色体上的一种STAT1基因同一种已经被生物失活(优选的是通过插入一段异源序列，如，一种抗生素抗性基因)的外来STAT1基因之间的同源重组。同源重组以在小鼠基因组中破坏基因的方法已经被描述，如，在Capecchi(1989，科学244:1288)和Mansour等(1988，自然336:348)。
简要地，一种STAT1基因克隆的全部或部分是从相同种类的基因敲除细胞或动物的基因组DNA中分离出来的。该STAT1基因组克隆可以通过任何工艺上已知的分离基因组克隆的方法进行分离(如，通过用一种来自一段STAT1序列的探针来探察基因组文库，如见Meraz等，1996，细胞84:431；Durbin等，1996，细胞84:443，和本说明书中所引用的参考文献中所描述的序列)。一旦分离出基因组克隆，即将该克隆的全部或部分引入到一个重组载体内。优选地，引入到载体内的该克隆的部分至少包括STAT基因一个外显子的一部分，即，包括一种STAT1蛋白的编码序列。然后将一段不与STAT1序列同源的序列，优选的是一种阳性选择性标记，如一种编码一种抗生素抗性基因的基因，引入到STAT1基因外显子内。选择性标记优选的是与启动子操作性连接，更优选的是与一种组成型启动子。该非同源序列被引入到STAT1编码序列的任何将破坏STAT1活性的位置，如，在其中点突变或其它突变已经被证明可以失活STAT1蛋白功能的位置。例如，但不是作为限制，非同源序列可以被插入到STAT1蛋白中含有所有或部分激酶功能域的片段的编码序列上(如，编码激酶功能域至少50、100、150、200或250个氨基酸的核苷酸序列)。
阳性选择标记优选的是一种新霉素抗性基因(neo基因)或一种潮霉素抗性基因(hygro基因)。启动子可以是任何工艺上已知的启动子；通过举例的方式，启动子的例子可以是磷酯酰甘油酸激酶(PGK)启动子(Adra等，1987，基因60:65-74),polⅡ启动子(Soriano等，1991，细胞64:693-701)，或MC1启动子，其是一种工程化用于在胚胎衍生的干细胞内表达的合成启动子(Thomas&Capecchi,1987，细胞51:503-512)。一种选择性标记(如抗生素抗性基因)的使用，使得可以挑选结合了靶载体的细胞(例如，neo基因产物的表达提供了对G418的抗性，hygro基因产物的表达提供了对潮霉素的抗性)。
在一个优选的实施例中，一种用于同源的与非同源相反，载体的重组的反选择步骤的阴性选择性标记，被插入到STAT1基因组克隆插入物的外部。例如，这种阴性选择标记是HSV胸腺嘧啶激酶基因(HSV-tk)，其表达使细胞对更昔洛韦敏感。阴性选择性标记优选的是在一种启动子例如，但不局限于PGK启动子、PolⅡ启动子或MC1启动子的控制之下。
当发生同源重组时，载体中与STAT1基因同源、以及同插入到STAT1基因序列内部的非同源的部分，被结合到染色体上的STAT1基因内，载体的剩余部分丢失。因此，由于该阴性选择标记是在与STAT1基因同源的区域的外部，发生同源重组的细胞(或它们的子代)，将不含有该阴性选择标记。例如，如果该阴性选择标记是HSV-tk基因，发生同源重组的细胞将不表达胸腺嘧啶激酶，并且将在暴露在更昔洛韦*中仍能生存。该过程允许了发生同源重组的细胞的选择，同非同源重组相比，非同源重组中有可能该阴性选择标记也同STAT1序列以及阳性选择标记一起被结合到基因组上。因此，非同源重组在其中已经发生的细胞将最有可能表达胸腺嘧啶激酶及对更昔洛韦*敏感。
一旦靶载体构建完成，即用一种限制性酶(靶载体中对于该酶有一单一性位点)使其线性化，并通过任何工艺上已知的方法(如通过电穿孔)将线性化的载体引入到胚胎衍生的干(ES)细胞内(Gossler等，1986,Proc.Natl.Acad.Sci.美国83:9065-9069)。如果靶载体包括一个阳性选择标记和一个阴性、反选择标记，可以通过在选择性培养基中的孵育来选择同源重组在其中发生的ES细胞。例如，如果该选择性标记是neo抗性基因和HSV-tk基因，则将细胞暴露于G41(如，大约300微克/毫升)和更昔洛韦(如，大约2μM)。
任何已知的基因分型的技术，例如但不局限于DNA印迹分析或聚合酶链式反应，均可以被采用以确定被破坏的STAT1序列已经同源重组到ES细胞基因组的STAT1基因上。由于STAT1基因克隆的限制性图谱是已知的，而且STAT1编码序列的序列是已知的(见Meraz等，1996，细胞84:431；Durbin等，1996，细胞84:443450，所有本说明书中所引用的参考文献)，因此可以确定来自被破坏的和没有被破坏的等位基因中的DNA的特定限制性片段或PCR扩增产物的大小。因此，通过分析限制性片段或PCR产物(其大小在被破坏的和没有被破坏的STAT1基因之间存在区别)，即可以确定同源重组是否发生以破坏STAT1基因。
然后可以将带有破坏的STAT1位点的ES细胞通过微量注射引入到胚泡内，然后可以采用常规的技术将胚泡移植到假孕小鼠的子宫内。由移植的胚泡发育而来的动物是被破坏的等位基因的嵌合体。该嵌合雄鼠可以同雌鼠杂交，并且可以工程化该杂交使等位基因的生殖系传递与某一外表颜色的传递相连。等位基因的生殖系传递的确定，如以上所描述的，可以通过DNA印迹或PCR分析从组织样品中分离出来的基因组DNA。
5.3.3 瞬时IFN缺陷型培养基
细胞、细胞系、动物或卵可以用抑制IFN系统的化合物预处理。依据本发明，抑制IFN合成、或IFN系统组分的活性或表达的化合物具可以被用于预处理宿主，如，抑制IFN合成、IFN的活性、IFN受体、IFN信号传导途径中的其它靶物的化合物，或抑制由IFN诱导的抗病毒基因的活性的化合物。可以依据本发明被使用的化合物的例子，包括，但不局限于，核酸分子、抗体、多肽、IFN受体的拮抗剂、STAT1途径的抑制物、PKR的抑制物，等。依据本发明，核酸分子包括靶向编码IFN系统必需组分(如，STAT1)的基因的反义分子、核糖酶和三股螺旋分子。核酸分子也包括编码IFN系统组分的显性阴性*突变体的核苷；如，在病毒突变体感染之前，可以用一种编码IFN受体的截短的、无传导信号能力的突变体的DNA转染细胞。
可以依据本发明进行使用，以抑制IFN途径的显性-阴性*突变体包括Jak1、TyK2的激酶缺陷型或缺少DNA结合功能域STAT1、和STAT2的转录因子(见，如，Krishnan等，1997，欧洲生物化学杂志247:298-305)。
5.4 疫苗制剂
本发明包括含有减毒的负链RNA病毒(其拮抗细胞IFN应答的能力受损)、和一种合适的赋形剂的疫苗制剂。用于疫苗制剂的病毒可以选自天然发生的突变体或变体、诱导突变的病毒或遗传操作的病毒。被分段的RNA病毒的减毒的链也可以通过重排列结束产生，或者通过采用反向遗传学方法和重排列的组合。天然发生的变体包括从天然分离的病毒、以及在病毒复制过程中自发产生的变体，具有受损的拮抗细胞IFN应答的能力。该减毒的病毒本身可以被用作疫苗制剂中的活性成分。可选地，该减毒病毒可以被用作重组产生的疫苗的载体或“主链”。为此，可以采用重组技术，如反向遗传学(或者，对于被分段的病毒，反向遗传学和重排列技术的组合)来工程化突变或将外来抗原引入到用于疫苗制剂的减毒病毒内。这样，疫苗可以被工程化以对株系变体免疫，或者可选的，对完全不同的感染因子或疾病抗原免疫。
事实上，可以将任何异源基因序列构建到本发明的病毒内以在疫苗中使用。优选地，诱导对多种病原体中的任何一种的防护型免疫应答的抗原决定簇，或结合中和抗体的抗原可以被病毒表达作为病毒的部分被表达。例如，可以构建到本发明的病毒内以在疫苗中使用的异源基因序列，包括但不局限于人免疫缺陷病毒(HIV)的抗原决定簇如gp120；乙型肝炎表面抗原(HBsAg)；疱疹病毒糖蛋白(如，gD、gE)；脊髓灰质炎病毒的VP1；非病毒病原体(如细菌和寄生虫)的抗原决定簇，等等。在另一个实施例中，可以表达全部或部分免疫球蛋白基因。例如，模拟这些抗原决定簇的抗-独特型免疫球蛋白的可变区域可以被构建到本发明的病毒内。在由另一个实施例中，可以表达肿瘤相关的抗原。
可以配制活的重组病毒疫苗或失活的重组病毒疫苗。活的疫苗可能是优选的，因为在宿主内的增殖导致与在自然感染中的发生类具有类似种类和量级的延长的刺激，因此，提供了重要的、长久的免疫。这种活重组病毒疫苗制剂的产生可以通过采用常规方法达到，包括病毒在细胞培养物内或在鸡胚的尿囊内复制，接着进行纯化。
疫苗制剂可以包括遗传操作的负链RNA病毒，其在NS1基因或类似基因上存在突变，包括但不局限于在下文工作实施例中所描述的截短的NS1流感突变体。它们也可以采用天然的变体进行配制，如流感A的A/火鸡/Ore/71天然变体、或流感B的B/201及B/AWBY-234天然变体。当作为一种活病毒疫苗配制时，应当采用每剂的范围是从约104pfu至约5×106pfu。
可以采用多种方法以输入以上所描述的疫苗制剂，这些包括但不局限于鼻内、气管内、口服、真皮内、肌肉、腹膜内、静脉内、以及皮下途径。可能优选的是通过为此工程化疫苗的病原体的天然感染途径、或通过母本减毒病毒的天然感染途径输入病毒疫苗制剂。当采用一种活流感病毒疫苗制剂时，可能优选的是通过流感病毒感染的天然途径输入该制剂。流感病毒诱导充分分泌和细胞免疫应答的能力可以被有利地利用。例如，流感病毒的呼吸道感染可能诱导一种强的分泌免疫应答，例如在泌尿生殖系统中，一种特定疾病致病原的同时防护。
本发明这的一种疫苗，包括104-5×106pfu具有改变的IFN拮抗活性的突变体病毒，可以一次性施用。可选地，本发明中的一种疫苗，包括104-5×108pfu具有改变的IFN拮抗活性的突变体病毒，可以根据动物(优选的是一种哺乳动物，更优选的是人类)的需要经常施用。
5.5 药物组合物
本发明包括含有具有改变的IFN拮抗活性的突变体病毒的药物组合物，这些病毒可以用作一种抗病毒因子或抗肿瘤因子或用作抗IFN-敏感疾病的因子。该药物组合物作为一种抗病毒预防药具有实用性，也可以施用到处于已经被感染或估计暴露于病毒的危险的患者体内。例如，如果一个孩子在学校接触了几名患有流感的同学，他回家后其母亲将施用本发明中的抗病毒药物组合物给她自己、该小孩和其他家庭成员以预防病毒感染和后继的疾病。旅行到世界部分地区，在该地区流行一种特定的传染疾病(如，甲型肝炎病毒、疟疾，等)，的人们也可以被治疗。
可选地，这些药物组合物可以被用于治疗肿瘤或阻止肿瘤形成，如，在患有癌症或存在发展肿瘤或癌症的危险的患者中。例如，患有癌症的患者可以被治疗以预防进一步的肿瘤发生。可选地，能够治疗已经或估计接触过致癌物质的患者；可以治疗环境清理从业者，他们有可能接触污染物(如，石棉)。可选地，将接触射线的患者可以在暴露之前或之后进行治疗(如，暴露于高剂量射线的或必需服用致癌药物的患者)。
本发明中的减毒病毒作为抗肿瘤剂的使用是以本申请人的发现为基础的，即在其IFN-拮抗基因上含有一个缺失的减毒的流感病毒突变体，在小鼠中能够降低肿瘤的形成。本发明的抗肿瘤特性可能至少部分与它们诱导IFN和IFN应答的能力相关。可选地，本发明中的减毒病毒的抗肿瘤特性，可能与它们在肿瘤细胞内的特异性生长并杀灭肿瘤细胞的能力相关，其中许多病毒已知在IFN系统中存在缺陷。不考虑担负抗肿瘤特性的分子机制，本发明中的减毒病毒可以被用于治疗肿瘤或用于预防肿瘤形成。
本发明进一步包括具有改变的IFN-拮抗剂表现型的突变体病毒，其在体内靶向特定气管、组织和/或细胞，目的是在局部诱导治疗或预防效果。这种方法的一个优点是本发明中的IFN-诱导病毒靶向特定的位点，如，在肿瘤的位置，以位点特异性的方式诱导IFN以得到治疗效果，而不是系统性诱导IFN，这可能具有毒性作用。
本发明中的突变体IFN-诱导病毒可以用本说明书中所描述的方法进行工程化，以表达将使病毒靶向特定位点的蛋白或肽段。在一个优选的实施例中，IFN-诱导病毒将被靶向肿瘤的位置。在该实施方案中，突变体病毒可以被工程化以表达一种识别肿瘤特定抗原的抗体的抗原结合位点，从而使该IFN-诱导病毒靶向肿瘤。在又另一个实施例中，其中被靶向的肿瘤表达一种激素受体，如乳腺或卵巢肿瘤表达的雌激素受体，IFN-诱导的病毒可以被工程化表达合适的激素。在又一个实施例中，其中被靶向的肿瘤表达一种生长因子(如，VEGF、EGF、或PDGF)的一种受体，IFN-诱导的病毒可以被工程化表达合适的生长因子或其部分。因此，依据本发明，IFN-诱导病毒可以被工程化表达任何靶基因产物，包括肽，蛋白，如酶、激素、生长因子、抗原或抗体，其将执行使病毒靶向需要抗-病毒、抗细菌、抗-杀菌剂或抗-癌活性的位点的功能。
输入的方法包括但不局限于真皮内、肌肉、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬脑膜外(epidural)、及口服途径。本发明中的药物组合物可以通过任何方便的途径施用，例如通过灌输或快速浓注、通过上皮或皮肤黏膜层(如，口腔黏膜、直肠和肠黏膜，等)的吸收，也可以同其它生物活性因子结合施用。施用可以为系统性或局部性。另外，在一个优选的实施例中，可能理想的是通过任何合适的途径将本发明中的药物组合物引入到肺内。也可以采用肺部施用，如，通过施用一种吸入器或喷雾器，并用气溶性因子配制。
在一个特定的实施例中，可能理想的是局部施用本发明中的药物组合物到需要治疗的部位；这可以通过，例如，但不是作为限制，外科手术的过程中局部融合，局部应用，如，手术之后结合伤口敷料，通过导液管的方式，通过栓剂的方式，或通过植入物的方式注射，上述植入物为多孔、无孔、或凝胶状材料，包括膜，如sialastic*膜，或纤维。在一个实施例中，可以通过直接注射施用到恶性肿瘤或瘤或前瘤组织的位点(或前位点)。
在又一个实施例中，该药物组合物可以控释系统递送。在一个实施例中，可以使用一种泵(见Langer,supra；Seften,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201；Buchwald等，1980,Surgery 88:507；Saudek等，1989,N.Engl.J.Med.321:574)。在另一个实施例中，可以采用聚合材料(见药物施用的控制释放，Smolen和Ball(编辑)，Wiley,New York(1984)；Ranger & Peppas,1983,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61；也见Levy等，198S，科学228:190；During等，1989,Ann.Neurol.25:351(1989)；Howard等，1989,J.Neurosurg.71:105)。在又一个实施例中，可以将一种控制释放的系统放置在复合物靶位点(即，肺部)的附近，因此仅需要系统剂量的一部分(见，如，Goodson,1984，在药物施用的控制释放，上述，第2卷，第115-138页)。其它控制释放系统的讨论在Langer的综述中(1990，科学249:1527-1533)。
本发明中的药物组合物包括一种治疗上有效剂量的减毒病毒，及一种药用载体，在一个特定实施例中，术语“药用”表示经联邦或州政府的某一管理机构核准、或列于美国药典或其它普遍公认用于动物(或更特别地是用于人类)的药典中。术语“载体”表示一种药物组合物与其一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。盐溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以被用作液体载体，尤其是对于注射溶液。合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸盐、滑石粉、氯化钠、干脱脂牛奶、甘油、丙烯、乙二醇、水乙醇等等。这些组合物可以采用的形式有溶液、悬液、乳剂、药片、药丸、胶囊、粉末、持续释放的制剂等等。这些组合物可以配制成栓剂。口服制剂可以包括标准的载体，如制药级的D-甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁，等。合适的药剂载体的例子在E.W.Martin的“Remington’s Pharmaceutical Sciences”中被描述。这些组合物将包含治疗上有效剂量的治疗剂，优选的是以纯化的形式，同一种合适量的载体一起以提供适当地施用到患者体内的形式。其制剂应当适合施用的模式。
本发明中的药物组合物的量，其将在治疗一种特定的紊乱或症状中有效，将依赖于该紊乱或症状的本质，并且可以通过标准的临床技术确定。另外，可以选择性地采取体外分析以帮助鉴定最优的剂量范围。在制剂中需要采用的精确剂量也将依赖于施用的途径、及疾病或紊乱的严重程度，及其决定应当依据医师的判断及各患者的状况。然而，施用的合适剂量范围通常是大约104-5×106pfu并且可以一次性施用，或者如所需要的以多次间隔施用多次。本发明中包括104-5×106pfu具有改变的IFN拮抗活性的突变体病毒的药物组合物，可以鼻内、气管内、肌肉或皮下施用。有效剂量可以从体外或动物模型测试系统得出的剂量应答曲线中推知。
6．实施例：流感A病毒的
NS1截短突变体的产生和特性
6.1 材料和方法
流感A/PR/8/34病毒在37℃下、在10-天龄含胚鸡卵中孵育。流感A病毒25A-1，一种含有来自耐低温株系A/Leningrad/134/47/57的NS片段及PR8病毒的保留基因的重排列体(Egorov等，1994,Vopr.Virusol.39:201-205；Shaw等，1996，在流感病毒Ⅲ控制的选择中,Brown,Hampson Webster编辑(Elsevier Science)第433-436页)于34℃在Vero细胞中生长。25A-1病毒在哺乳动物细胞内为温度敏感型，并且被用作NS1/99转染病毒获救的一种辅助病毒。保存在含有1微克/毫升胰酶的最低必需培养基(minimal essentialmedium,MEM)中的Vero细胞和MDCK细胞(Difco Laboratories,Detroid,Michigan)被用于流感病毒的生长。Vero细胞也被用于NS1/99病毒的选择、噬菌斑纯化和滴定。MDCK细胞被保存在含有10％热失活胎牛血清的DMEM(DuLbecco’s最低必需培养基)。Vero细胞在AIM-V培养基中生长(生命技术，Grand Island,NY)。
质粒pT3NS1/99，包括NS1的99个氨基酸的C-末端截短形式，其构建如以下。首先，pPUC19-T3/NS PR8，含有PR8病毒的完整NS基因，其侧翼为T3 RNA聚合酶启动子和BpuAI限制性位点，采用适当的引物通过反向PCR被扩增(Ochman等，1988，遗传学120:621-623)。将由此得到的含有被截短的NS1基因的cDNA磷酸化，Klenow处理，自身连接并在大肠杆菌株系TG1中复制。纯化之后得到的构建物命名为pT3NS1/99并通过测序鉴定。表达PR8病毒的NP、PB1、PB2、和PA蛋白的质粒(pHMG-NP、pHMG-PB1、pHMG-PB2、和pHMG-PA)以前已被描述(Pleschka等，1996，病毒学杂志70:4188-4192)。pPOLI-NS-RB的产生是通过替换流感A/WSN/33(WSN)病毒NS基因的编码区域的RT-PCR产物内部的pPOLI-CAT-RT(Plesehka等，1996，病毒学杂志70:4188-4192)的CAT开读框。该质粒在一段被截短的人聚合酶I启动子的控制下表达WSN病毒的NS-特异性病毒RNA片段。
NS1/99病毒的产生是通过核糖核蛋白酶(RNP)转染(Luytjes等，1989，细胞59:1107-1113)。这些RNP的形成是通过T3 RNA聚合酶转录在BpuAⅠ位点被线性化的pT3NS1/99，存在纯化的核蛋白和流感25A-1病毒的聚合酶的条件下(Enami，等，1991，病毒学杂志65:2711-2713)。RNP复合物被转染到之前已经被25A-1病毒转染过的Vero细胞内。将转染后的细胞在37℃孵育18小时，上清在40℃下在Vero细胞内传代两次，并在覆盖有琼脂铺层培养基的Vero细胞内将噬菌斑纯化三次。通过RT-PCR，采用特定的引物分析所分离的NS1/99病毒。野生型转染病毒的产生如下；如以上所描述的(Pleschka等，1996，病毒学杂志70:4188-4192)，在35-毫米培养皿中Vero细胞被质粒pHMG-NP、pHMGPBI、pHMG-PB2、pHMG-PA和pPOLI-NS-RB转染。转染两天以后，将细胞用5×104pfu的delNS1病毒转染并在37℃再孵育两天。细胞上清在MCDK细胞内传代一次并在鸡胚卵内传代两次。通过在卵内进行有限稀释以克隆转染病毒。如以上所描述的，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析纯化的NS1/99转染体病毒的基因组RNA(Zheng等，1996，病毒学217:242-251)。NS1/99病毒表达被截短的NS1蛋白的鉴定是通过对标记的被感染细胞抽提物的进行免疫沉淀，采用了一种兔的抗NS1多克隆抗血清。
用大约103pfu的PRB、NS1/99、或delNS1(其中整个NS1基因被缺失)病毒接种含胚鸡卵(6、10、和14天龄)的尿囊腔，在37℃孵育两天，通过血细胞凝集(HA)分析以滴定存在于尿囊液中的病毒。
用5×106pfu、1.5×105pfu、或5×103pfu的野生型A/PR/8/34(PR8)或NS1/99病毒以鼻内接种5只BALB/c小鼠(TaconicFarms)的组群。接种是在麻醉下进行的，采用50微升含有适当病毒的适当数目的噬菌斑形成单位的MEM。每天对动物进行监视，在发现濒死时将其处死。在一个后继的实验中，对所有存活的小鼠在四星期以后均施用100LD50剂量的野生型PR8病毒。在照料和使用实验室动物上的所有操作均遵从NIH指导原则。
6.2 结果：流感A病毒
通过NS1缺失的减毒
申请人先前已经证明其中NS1基因被缺失的流感A病毒(delNS1病毒)，能够在在I型干扰素(IFN)的产生上存在缺陷的细胞(如Vero细胞)内生长到大约107pfu/ml滴度。然而，该病毒在其复制能力上存在损伤并在小鼠体内引起疾病(Garcia-Sastre等，1998，病毒学252:324)。相反，delNS1病毒能够在其中生长并杀死STAT1-/-小鼠。这些结果证明流感A病毒的NS1蛋白是一种毒性因子，其涉及由I型IFN调节的宿主抗病毒应答的抑制。以下实验的构建是为了证明人们是否能够通过缺失部分NS1基因，来产生毒性在野生型和delNS1病毒之间的流感病毒，以及这些病毒是否可能具有用作抗流感病毒的活减毒疫苗的最优特性，即，稳定性，和在减毒性、免疫原性以及在适合疫苗制备的培养基中生长之间的适当平衡，如含胚鸡卵。
为了验证该假说，构建一种流感A/PR/8/34(PR8)病毒，其中NS1基因已经被修饰，目的是指导仅含有与野生型NS1蛋白的230个氨基酸共享的氨基末端99个氨基酸的、截短的NS1蛋白的表达。如以上所描述的(Garcia-Sastre等，1998，病毒学252:324)，该病毒(NS1-99)的获得是通过使用25A-1辅助病毒，RNP转染人工工程化的NS基因。对NS1在病毒感染的细胞内表达的分析显示了NS1-99病毒中NS1蛋白的被截短的本质。
分析delNS1、NS1-99和野生型PR8病毒在不同天龄的含胚鸡卵中的生长能力。本实验的原理来自事实，即含胚卵在适当的刺激下合成和应答I性IFN的能力是天龄依赖性的。事实上，IFN诱导力即应答均开始于大约10天龄，然后随着天龄指数性提高(Sekellick等，1990,In Vitro Cell.Dev.Biol.26:997；Sekellick & Marcus,1985 J.Interferon Res.5:657)。因此，不同天龄的卵的采用代表了一个单独的测定不同病毒抑制IFN应答的能力的系统。用大约103pfu的PR8、NS1-99或delNS1病毒接种6、10、和14天龄的卵，在37℃下孵育2天，通过红血球凝集(HA)分析滴定存在于尿囊液中的病毒。如表3中所显示的，其中野生型病毒在6、10、和14天龄的含胚卵内生长到类似的HA滴度，delNS1仅在6-天龄的卵内复制到可检测的HA滴度。相反，NS1-99病毒表现出介于delNS1和野生型病毒之间的行为，能够在10-天龄的卵内，但不能在14-天龄的卵内生长到类似于野生型病毒的HA滴度。
表3：病毒在含胚鸡卵内的复制红血球凝集滴度1病毒    卵的天龄：   6天       10天     14天WT PR82            2,048     4,096    1,071NS1/99               N.D.3   2,048    ＜2delNS1               64        ＜2      ＜21滴度代表具有血凝活性的最高稀释度2野生型流感A/PR/8/34病毒。3未确定
NS1-99病毒的减毒特性接下来在小鼠中被证明。为了这一目的，用5×106pfu、1.5×105pfu、或1.5×103pfu的野生型PR8或NS1/99病毒鼻内感染5只BALB/c小鼠的组群。然后在3周内监视小鼠的存活率。结果在表4中给出。NS1-99病毒的LD50至少高于野生型病毒的3个对数。表4．NS1-99病毒在小鼠内的减毒性
存活率病毒    感染剂量(pfu):5×106    1.5×105    1.5×103WT PR81               1/5        1/5         1/5NS1-99                  3/5        5/5         5/51野生型流感病毒A/PR/8/34
7．实施例：流感B病毒NS1截短突变体的产生和特性
7.1 材料和方法
实验细节同章节6.1.中的类似。两种突变体流感B病毒，B/610B5B/201(B/201)和B/AWBY-234，全长(C-末端被截短的NS1蛋白)分别为127个氨基酸和90个氨基酸(Norton等，1987，病毒学156:204；Tobita等，1990病毒学174:314)，来自组织培养物中的在抗-A(H3N2)病毒抗体的存在下的，涉及B/Yamagata/1/73(B/Yam)和A/Aichi/2/68病毒共转染实验。将突变的流感病毒在不同天龄的含胚卵内的生长同母本病毒B/Yam(其含有一种野生型281个氨基酸的NS1蛋白)的生长相比较。将6、10和14天龄的卵同大约103pfu的B/Yam、B/201或B/AWBY-234病毒一起孵育，在35℃孵育2天，并通过HA分析滴定存在于尿囊液中的病毒。
此外，确定了B/201和B/AWBY-234病毒在小鼠内的减毒特性。用3×105pfu的野生型B/Yam或B/201和B/AWBY-234突变体病毒鼻内感染三只BALB/小鼠的组群，并在感染后的第3天，通过测定病毒在肺部的滴度来确定这些病毒复制的能力，因为野生型B/Yam在小鼠中不能诱导疾病的明显信号。
7.2 结果
表5：流感B病毒在含胚鸡卵内的复制
                                  红血球凝集滴度
病毒    卵的天龄：    6天    10天    14天
B/Yam                 362    256     ＜2
B/201                 32     ＜2     ＜2
B/AWBY-234            8      ＜2     ＜2
从突变体和野生型流感B病毒在含胚鸡卵内的生长中获得的结果，如表5中显示，证明了，象在流感A病毒的情况下，流感B病毒NS1的羧基末端的截短在较老的含胚鸡卵(其引起有效的IFN应答)内导致了较低的复制产率。该发现暗示着流感B病毒的NS1涉及抑制宿主的IFN应答，并且在流感B病毒NS1基因上的缺失导致了一种减毒的表现型。
从在小鼠中的复制实验得到的结果列于表6。B/201和B/AWBY-234病毒的滴度大约低于B/Yam滴度量级的三个对数，暗示着流感B病毒羧基末端功能域的截短导致了小鼠内的一种减毒的表现型。
表6．流感B病毒在小鼠肺部内的复制
病毒    转染后第3天的肺部滴度(pfu/肺部)
B/Yam          2×104   1×104   3×104
B/201           30       ＜10      60
B/AWBY-234      ＜10     40        ＜10
8．小鼠内抗野生型流感病毒感染的防护，
该小鼠被其NS1蛋白上含有缺失的流感A和B病毒免疫
为了确定被含有截短的NS1蛋白的减毒流感A和B病毒免疫的小鼠是否被保护以抗它们各自野生型病毒的攻击，进行了以下的实验。用A/NS1-99病毒鼻内免疫BALB/c小鼠，三周以后将它们用100 LD50的野生型流感A/PR/8/34病毒攻击。保护被免疫的动物以防死亡，然而所有对照初次受试小鼠在感染之后均死亡(见表7)。在第二个实施例中，用流感B病毒B/201或B/AWBY-234(表达截短的NS1蛋白)鼻内免疫BALB/c小鼠。三周以后，用3×105pfu的野生型流感B/Yam/1/73病毒感染小鼠。由于流感B病毒的这种株系在小鼠内不诱导疾病症状，在攻击后第3天通过测定病毒滴度来确定防护程度。然而初次受试对照动物的滴度大约为104pfu/肺部，但在被免疫动物的肺部没有检测到病毒(见表8)。这些发现表明含有被修饰的NS1基因的流感A以及流感B病毒能够在小鼠中诱导一种免疫应答，其能够完全防护后继的野生型病毒的攻击。
表7．被流感A/NS1-99病毒免疫过的小鼠在100 LD50野生型流感A/PR/8/34病毒入侵之后的存活率。
A/NS1-99病毒的免疫剂量    存活的数目/总数
5×106pfu                     3/3
1.5×105pfu                   4/4
PBS                            0/5
表8．被流感B/201和B/AWBY-234病毒免疫过的小鼠在3×105pfu野生型流感B/Yamagata/73病毒入侵之后的肺部滴度。
免疫剂量                肺部滴度(pfu/肺)
3×105pfu B/201        ＜101,＜101,＜101,＜101,＜101
3×105pfu B/AWBY-234   ＜101,＜101,＜101,＜101,＜101
PBS                     2.5×104,1×104,1.7×104,
                        3×104,5×104
9．实施例：I型干扰素在被delNS1病毒
感染之后的含胚卵内的诱导
delNS1病毒，一种缺乏NS1基因的流感A病毒，其在含胚鸡卵内诱导I型IFN的分泌能力如下检测。为了这一目的，用5×103pfu的delNS1或野生型PR8病毒感染每组两只10天龄的含胚鸡卵的组群。在37℃孵育18小时以后，收集尿囊液并对酸性pH透析过夜，以失活感染病毒。在酸性pH处理之后，将样品对PBS透析，通过确定在CEF细胞内具有抗VSV感染(大约200 pfu)保护活性的最高稀释度而测定IFN活性。如表9中所显示的结果表明在NS1的缺乏下，流感A病毒是IFN的较高诱导者。
表9．IFN在卵内的诱导
病毒    IFN(U/毫升)
PR8     ＜16,＜16
delNS1  400,400
模拟    ＜16,＜16
10．实施例：delNS1病毒的
抗病毒活性
从流感A病毒中除去IFN拮抗(NS1)基因可以导致一种具有诱导高水平的IFN的能力的病毒的产生。如果情况是这样的话，delNS1病毒将“干涉”IFN-敏感病毒的复制。为了测定这一可能性，申请人研究了在卵内delNS1病毒抑制流感A/WSN/33(WSN)病毒(一种普遍使用的实验室流感病毒株系)的复制的能力。如图1中可以看出，仅用2pfu的delNS1病毒处理能够诱导WSN病毒在尿囊液中的最终滴度降低一个对数。另外，用2×104pfu的delNS1病毒处理导致WSN在卵内的复制几乎完全被废除。delNS1病毒也能够干涉卵内其它流感A病毒株系(H1N1和H3N2)、流感B病毒以及一种不同的病毒如仙台病毒的复制(图2)。
受到这些结果的鼓励，本发明者们接着确定了delNS1病毒在小鼠体内干涉野生型流感病毒复制的能力。虽然在组织培养物中用I型IFN处理在体外抑制了流感A病毒的复制，但在小鼠体内用IFN处理不能够抑制流感病毒的复制(Haller,1981,Current Top MicrobiolImmunol 92:25-52)。在对于大多数近交株系的小鼠是正确的，除了A2G小鼠。A2G小鼠，以及显著比例的野生型小鼠(大约75％)，含有至少一个完整的M×1-/-等位基因，然而大多数实验株系都是M×1-/-(Haller,1986,Current Top Microbiol Immunol 127:331-337)。M×1蛋白，人类M×A蛋白的一种同族蛋白(Aebi,1989,Mol.Cell.Biol.11:5062)，是流感病毒复制的一种有效抑制物(Haller,1980,自然283:660)。该蛋白不是组成型表达的，但其表达受I型IFN的转录诱导。因此，A2G小鼠可以被用于测定IFN-诱导物激活抗流感A病毒的抗病毒应答的能力(Haller,1981,Current Top MicrobiolImmunol 92:25-52)。
申请人用5×106pfu的高度病原性流感A/PR/8/34病毒隔离群鼻内感染八只4-周龄的A2G小鼠(Haller,1981,Current TopMicrobiol Immunol 92:25-52)。一半的小鼠在PR8感染之前24小时接受了5×106pfu的delNS1的鼻内处理。其它四只小鼠用PBS处理。检测体重变化和存活率。这些结果证明delNS1处理能够保护A2G小鼠抗流感病毒引发的死亡和体重减轻。同样的处理在M×1-/-小鼠中是无效的，表明病毒防护基因是受M×1，即，IFN，介导的。
11．实施例：delNS1病毒在
小鼠体内的抗肿瘤特性
假如I型IFN和/或I型IFN的诱导物已经显示出具有抗肿瘤活性(Belardelli和Gresser,1996今日免疫学17:369-372；Qin等，1998,Proc.Nati.Acad.Sci.95:14411-14416)，有可能用delNS1病毒处理肿瘤可以调节肿瘤的退化。可选地，delNS1病毒可能具有瘤溶解特性，即，它有可能能够特异性地在其中生长并杀灭肿瘤细胞，已知许多这些特性在IFN系统中是存在缺陷的。为了验证delNS1病毒的抗肿瘤活性，采用肺部肿瘤转移的小鼠肿瘤模型中的鼠科癌细胞系CT26.WT完成了以下实验(Restifo等，1998，病毒学249:89-97)。静脉内注射5×105 CT26.WT细胞到十二只6-周龄的BALB/c小鼠体内。一半的小鼠在接种后的1、2和3天每隔24小时鼻内处理106pfu的delNS1病毒。在肿瘤注射的十二天以后，杀死小鼠并计算肺部肿瘤转移。如表10中所显示的，delNS1处理介导了鼠科肺部肿瘤转移显著退化。
表10．delNS1病毒在注射过CT26.WT肿瘤细胞
的BALB/c小鼠内的抗肿瘤活性
             肺部肿瘤转移的数目
         PBS-处理的    delNS1-处理的
小鼠1      ＞250             120
小鼠2      ＞250             28
小鼠3      ＞250             9
小鼠4      ＞250             6
小鼠5      ＞250             2
小鼠6      ＞250             1
12．实施例：NS1蛋白在流感病毒
感染过程中抑制IRF-3的移位
此处所描述的结果说明流感病毒的NS1蛋白是负责抑制抗病毒的I型IFN应答的，并且在该蛋白上的突变/缺失导产生了一种减毒病毒，因为在感染过程中IFN应答被增强。已知在病毒感染过程中I型IFN的合成可以被双链RNA(dsRNA)攻击。IRF-3是一种转录因子，发现其在哺乳动物细胞的细胞质内常常以失活的形式存在。双链RNA诱导转录因子IRF-3磷酸化(活化)，导致其移位到细胞核内，它在该处诱导特定基因的转录，包括编码I型IFN的基因(Weaver等，1998，分子细胞生物学18:1359)。为了确定流感病毒的NS1是否对IRF-3起作用，监测IRF-3在被野生型PR8或delNS1感染的CV1细胞内的定位。图3显示IRF-3的移位在PR8感染的细胞内是最小的(小于细胞的10％)。相反，大约90％的delNS1-感染的细胞表现出IRF-3的核移位。引人注意的是，有可能通过从反式质粒表达NS1来部分抑制IRF-3在delNS1-缺陷型细胞内的移位。这些结果证明流感A病毒的NS1能够在病毒-感染的细胞内抑制IRF-3的移位。有可能流感病毒的NS1通过隐蔽病毒感染时产生的dsRNA来抑制dsRNA-介导的IRF-3活化，因此导致了IFN合成的抑制。
本发明不受所描述的特定实施例范围的局限，它们仅作为本发明个别方面的单个说明，任何功能上等价的构造物或病毒均在本发明的范围之内。事实上，除了在本说明书中所表示和描述的以外，从以上的描述和附图中，本发明中的各种变通对于本工艺的熟练人员将是很明显的。这些变通落入附加的权利要求范围之内。
本说明书中引用了多种参考文献，其中所公布的全部内容均作为参考结合于本说明书中。

Claims (51)

1．疫苗制剂，包括：具有干扰素拮抗表现型的减毒负链RNA病毒，其(a)负责减毒，及(b)在相同的条件下增殖，允许该减毒的病毒同在干扰素-产生型宿主系统内相比，在干扰素-缺陷型宿主系统内能够生长到更高的滴度；以及药用赋形剂。
2．如权利要求1中所述的疫苗制剂，其中减毒的病毒选自天然发生的病毒、诱导突变的病毒或重排列体。
3．如权利要求1中所述的疫苗制剂，其中减毒的病毒选择遗传操作的突变体。
4．如权利要求3中所述的疫苗制剂，其中减毒的病毒是表达外来病原体的抗原决定簇的嵌合体病毒。
5．如权利要求1、2、3或4中所述的疫苗制剂，其中减毒的病毒是流感病毒。
6．疫苗制剂，包括减毒的流感病毒，其在NS1基因上具有突变以负责减毒表现型，和药用赋形剂。
7．如权利要求1、2、3或4中所述的疫苗制剂，其中减毒的病毒是一种呼吸道合胞病毒。
8．如权利要求1、2、3或4中所述的疫苗制剂，其中减毒的病毒是一种副流感病毒。
9．如权利要求1、2、3或4中所述的疫苗制剂，其中减毒的病毒是一种水泡性口炎病毒。
10．如权利要求1、2、3或4中所述的疫苗制剂，其中减毒的病毒是新城疫病毒。
11．如权利要求1中所述的疫苗制剂，其中干扰素-缺陷型宿主系统为STAT1阴性，干扰素-产生型系统是STAT1阳性。
12．如权利要求5中所述的疫苗制剂，其中干扰素-缺陷型宿主系统是一种大约6至大约8天龄的含胚鸡卵，干扰素-产生型宿主系统是大约10至大约12天龄的含胚鸡卵。
13．如权利要求8中所述的疫苗制剂，其中干扰素-缺陷型宿主系统是一种大约6至大约8天龄的含胚鸡卵，干扰素-产生型宿主系统是大约10至大约12天龄的含胚鸡卵。
14．如权利要求9中所述的疫苗制剂，其中干扰素-缺陷型宿主系统是一种大约6至大约8天龄的含胚鸡卵，干扰素-产生型宿主系统是大约10至大约12天龄的含胚鸡卵。
15．如权利要求10中所述的疫苗制剂，其中干扰素-缺陷型宿主系统是一种大约6至大约8天龄的含胚鸡卵，干扰素-产生型宿主系统是大约10至大约12天龄的含胚鸡卵。
16．如权利要求1或11中所述的疫苗制剂，其中在干扰素-缺陷型宿主系统中复制的减毒病毒的滴度至少高于在干扰素-产生型宿主系统中复制的减毒病毒的滴度一个对数。
17．如权利要求12中所述的疫苗制剂，其中在干扰素-缺陷型宿主系统中复制的减毒病毒的滴度至少高于在干扰素-产生型宿主系统中复制的减毒病毒的滴度一个对数。
18．如权利要求13中所述的疫苗制剂，其中在干扰素-缺陷型宿主系统中复制的减毒病毒的滴度至少高于在干扰素-产生型宿主系统中复制的减毒病毒的滴度一个对数。
19．如权利要求14中所述的疫苗制剂，其中在干扰素-缺陷型宿主系统中复制的减毒病毒的滴度至少高于在干扰素-产生型宿主系统中复制的减毒病毒的滴度一个对数。
20．如权利要求15中所述的疫苗制剂，其中在干扰素-缺陷型宿主系统中复制的减毒病毒的滴度至少高于在干扰素-产生型宿主系统中复制的减毒病毒的滴度一个对数。
21．如权利要求5中所述的疫苗制剂，其中减毒的病毒的浓度为每剂大约104至大约5×106pfu。
22．如权利要求6中所述的疫苗制剂，其中减毒的病毒的浓度为每剂大约104至大约5×106pfu。
23．一种药剂制剂，包括：一种具有干扰素拮抗表现型的减毒负链RNA病毒，其(a)负责减毒，及(b)使得当在相同的条件下增殖时，同在干扰素-产生型宿主系统内相比，该减毒的病毒在干扰素-缺陷型宿主系统内能够生长到更高的滴度；以及一种药用赋形剂。
24．如权利要求23中所述的药剂制剂，其中减毒的病毒选自天然发生的病毒、诱导突变的病毒或重排列体。
25．如权利要求23中所述的药剂制剂，其中减毒的病毒选自遗传工程化的突变体。
26．如权利要求25中所述的药剂制剂，其中减毒的病毒是一种表达一种外来病原体的一种抗原决定簇的嵌合体病毒。
27．如权利要求23、24、25、或26中所述的药剂制剂，其中减毒的病毒是一种流感病毒。
28．一种药剂制剂，包括在NS1基因上具有一个突变以负责减毒表现型的减毒流感病毒，和药用赋形剂。
29．如权利要求23、24、25、或26中所述的药剂制剂，其中减毒的病毒是一种呼吸道合胞病毒。
30．如权利要求23、24、25、或26中所述的药剂制剂，其中减毒的病毒是一种副流感病毒。
31．如权利要求23、24、25、或26中所述的药剂制剂，其中减毒的病毒是一种水泡性口炎病毒。
32．如权利要求23、24、25、或26中所述的药剂制剂，其中减毒的病毒是一种新城疫病毒。
33．如权利要求23中所述的药物组合物，其中干扰素-缺陷型宿主系统为STAT1阴性，干扰素-产生型系统是STAT1阳性。
34．如权利要求27中所述的药物组合物，其中干扰素-缺陷型宿主系统是一种大约6至大约8天龄的含胚鸡卵，干扰素-产生型宿主系统是大约10至大约12天龄的含胚鸡卵。
35．如权利要求30中所述的药物组合物，其中干扰素-缺陷型宿主系统是一种大约6至大约8天龄的含胚鸡卵，干扰素-产生型宿主系统是大约10至大约12天龄的含胚鸡卵。
36．如权利要求31中所述的药物组合物，其中干扰素-缺陷型宿主系统是一种大约6至大约8天龄的含胚鸡卵，干扰素-产生型宿主系统是大约10至大约12天龄的含胚鸡卵。
37．如权利要求32中所述的药物组合物，其中干扰素-缺陷型宿主系统是一种大约6至大约8天龄的含胚鸡卵，干扰素-产生型宿主系统是大约10至大约12天龄的含胚鸡卵。
38．如权利要求23或33中所述的药物组合物，其中在干扰素-缺陷型宿主系统中复制的减毒病毒的滴度至少高于在干扰素-产生型宿主系统中复制的减毒病毒的滴度一个对数。
39．如权利要求34中所述的药物组合物，其中在干扰素-缺陷型宿主系统中复制的减毒病毒的滴度至少高于在干扰素-产生型宿主系统中复制的减毒病毒的滴度一个对数。
40．如权利要求35中所述的药物组合物，其中在干扰素-缺陷型宿主系统中复制的减毒病毒的滴度至少高于在干扰素-产生型宿主系统中复制的减毒病毒的滴度一个对数。
41．如权利要求36中所述的药物组合物，其中在干扰素-缺陷型宿主系统中复制的减毒病毒的滴度至少高于在干扰素-产生型宿主系统中复制的减毒病毒的滴度一个对数。
42．如权利要求37中所述的药物组合物，其中在干扰素-缺陷型宿主系统中复制的减毒病毒的滴度至少高于在干扰素-产生型宿主系统中复制的减毒病毒的滴度一个对数。
43．如权利要求27中所述的药物组合物，其中减毒的病毒的浓度为每剂大约104至大约5×106pfu。
44．如权利要求28中所述的药物组合物，其中减毒的病毒的浓度为每剂大约104至大约5×106pfu。
45．一种减毒的流感病毒，包括一种被修饰过的NS1基因和一种被改变的干扰素拮抗表现型。
46．如权利要求45中所述的减毒流感病毒，其中NS1基因在羧基末端被修饰或截短。
47．如权利要求45中所述的减毒流感病毒，其中NS1基因在氨基末端被修饰或截短。
48．如权利要求45中所述的减毒流感病毒，其是NS1/99。
49．一种接种某一患者的方法，包括将权利要求1或6中所述的疫苗制剂以引起免疫应答的有效剂量施用到该患者。
50．一种在某一患者体内预防传染性疾病的方法，包括将权利要求23或28中所述的药物组合物以引起一种细胞干扰素应答的有效剂量施用到该患者。
51．一种在某一患者体内治疗或预防肿瘤的方法，包括将权利要求23或28中所述的药物组合物以有效引起一种细胞干扰素应答或瘤溶解的剂量施用到该患者。
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