SK285916B6

SK285916B6 - Protilátky proti ED-B doméne fibronektínu, ich konštrukcia a použitie

Info

Publication number: SK285916B6
Application number: SK1612-98A
Authority: SK
Inventors: Dario Neri; Barbara Carnemolla; Annalisa Siri; Enrica Balza; Patrizia Castellani; Alessandro Pini; Luciano Zardi; Gregory Paul Winter; Giovanni Neri; Laura Borsi
Original assignee: Philogen S.R.L.
Priority date: 1996-05-24
Filing date: 1997-05-23
Publication date: 2007-11-02
Also published as: BR9709350B1; KR100741452B1; KR20060035812A; PL188557B1; US9096670B2; DE69737683T2; BG65138B1; AU729081B2; EA199801043A1; NO324904B1; UA74129C2; JP2009050261A; GB9610967D0; DK0906426T3; KR20050010081A; IL127216A0; CZ295531B6; SI0906426T1; NO985459L; SK161298A3

Abstract

Opisuje sa špecificky sa viažuci člen, ktorý je špecifický k ED-B onkofetálnej doméne fibronektínu (FN) a priamo sa na ňu viaže. Vynález tiež opisujemateriály a spôsoby produkcie takýchto väzbových členov.

Description

Oblasť techniky

Tento vynález sa vzťahuje na členy viažuce sa špecificky na zárodočnú izoformu fibronektínu označovanú ED-B, ktorú tiež exprimujú vyvíjajúce sa neovaskuláme nádory, ako sa dá preukázať cestou imunocytochémie a cieleným zavádzaním do nádorov in vivo. Vynález ďalej opisuje materiály a metódy, ktoré sa vzťahujú k týmto špecificky sa viažucim členom.

Doterajší stav techniky

Primárnym cieľom väčšiny existujúcich foriem terapie nádorov je usmrtiť čo najviac konštitutívnych buniek nádoru, ako len je možné. Obmedzený úspech sa dosiahol metódami chemoterapie a rádioterapie, ktorý závisí od relatívneho šťastia, čo sa týka špecifickosti liečby. Tieto metódy sú sprevádzané vedľajšími toxickými účinkami, ktoré postihujú normálne zdravé tkanivá. Jednou z ciest, ako možno dosiahnuť zlepšenie selektivity liečby nádorov, je zavedenie činidla priamo do nádoru pomocou väzbových proteínov, ktoré obvykle obsahujú väzbové domény protilátok a sú špecifické pre markerový antigén, ktorý sa exprimuje na povrchu nádoru, ale nenachádza sa na normálnych bunkách. Táto forma cieľovej terapie, ktorá sa nazýva „mágie bullets“ sa hlavne demonštruje pomocou monoklonálnych protilátok (mAbs), ktoré pochádzajú z hlodavcov a ktoré sú špecifické pre takzvané antigény spojené s nádormi. Tieto antigény sa exprimujú na povrchu buniek. Také monoklonálne protilátky sa spojujú s cytotoxickou látkou chemickou cestou (napr. toxín alebo liek) alebo sa môžu produkovať ako rekombinantný fúzny protein, kde gény kódujúce mAb a toxín sú spojené a exprimujú sa v tandeme.

Prístup označovaný „mágie bullct“ má obmedzený, hoci podstatný, účinok pri liečbe ľudskej rakoviny, obzvlášť pri zavádzaní do nádorov lymfatického pôvodu, kde maligné bunky sú najprístupnejšie terapeutickej dávke počas cirkulácie. Liečba pevných nádorov však zostáva vážnym klinickým problémom. Tento problém spočíva v tom, že iba malá časť celkovej bunkovej masy, prevládajú najperiférnejšie bunky nádoru, je vystavená cirkulujúcim terapeutickým imunokonjugátom; tieto periférne ciele tvoria takzvanú „bariéru väzbových miest“ vnútornej časti nádoru (Juweid et al, 1992, Cancer Res. 52, 5144 - 5153). V nádore je tkanivo všeobecne veľmi husté, tvorí ho vláknité podporné tkanivo a nádorové bunky, ktoré sú umiestnené veľmi blízko seba, čo umožňuje penetráciu molekúl v rozmedzí veľkostí zodpovedajúcej protilátkam. Nádory sú však známe tým, že majú zvýšený intersticiálny tlak, za ktorý zodpovedá nedostatok lymfatickej drenáže, čo ohrozuje prístup exogénnych molekúl. V publikácii Jain, R (1994), Sci. Am. 271 58 - 65 sa opisujú faktory, ktoré ovplyvňujú vstup terapeutických činidiel do nádorov.

Hoci existuje zrejmé obmedzenie pri liečbe nádorov pomocou cieleného zavádzania antigénu do nádorov, tieto nádory majú bežný rys, ktorý poskytuje alternatívny antigénny cieľ pre protilátkovú terapiu. Ak nádory dorastú do určitej veľkosti, sú univerzálne závislé, aby si udržali prí vod kyslíka a nutrientov pre svoj rast, od nezávislého prísunu krvi. V prípade, že táto dodávka krvi je zablokovaná alebo uzavretá, existuje reálny potenciál vyhladovať tisíce nádorových buniek. Ako sa nádor vyvíja, prechádza na angiogénny fenotyp, pričom produkuje odlišný súbor angiogénnych faktorov, ktoré pôsobia na okolité endoteliálne bunky kapilár, pričom sa indukuje ich množenie a migrácia. Štruktúra týchto novo vytvorených krvných ciev, na rozdiel od usporiadanej štruktúry kapilár v normálnom tkanive, je vysoko neorganizovaná so slepými koncami a s perforáciami, ktoré vedú k únikom. Indukcia angiogenézy je sprevádzaná neregulovanou expresiou istých bunkových povrchových antigénov, kedy mnohé z nich sú bežné pri vaskularizácii normálneho tkaniva. Identifikované antigény, ktoré sa vyskytujú iba pri neovaskularizácii nádorov, sú hlavným limitujúcim faktorom pri vývoji generickej liečby pevných nádorov prostredníctvom vaskulárneho cieleného zavádzania. Antigén, ktorý je predmetom tohto vynálezu, priamo súvisí s týmto problémom.

Počas vývoja nádoru sa extraceluláma matrica okolitého tkaniva remodeluje dvoma hlavnými postupmi: (1) proteolytická degradácia komponentov extracelulámej matrice normálneho tkaniva a (2) de novo syntéza komponentov extracelulámej matrice nádorovými bunkami a bunkami podporného tkaniva, ktorá sa aktivuje nádorom indukovanými cytokínmi. Tieto dva postupy generujú „nádorovú extracelulámu matricu“, ktorá poskytuje vhodnejšie prostredie na vývoj nádoru a kvantitatívne a kvalitatívne sa líši od prostredia normálnych tkanív. Medzi komponentmi uvedenej matrice sú veľké izoformy tenaskínu a fibronektínu (FN); opis týchto proteínov ako izoforiem uvádza ich rozsiahlu štrukturálnu heterogenitu, ktorá sa získa na stupni transkripcie, post-transkripčného a post-translačného spracovania (uvedené ďalej v texte). Predmetom vynálezu je jedna z izoforiem fibronektínu, ktorá sa nazýva izoforma B+ (B-FN).

Fibronektíny (FN) sú multifunkčné zložky glykoproteinov s vysokou molekulovou hmotnosťou tvoriacich extraceluláme matrice a telové kvapaliny. Podieľajú sa na rade rôznych biologických postupov, ako je zaistenie a udržanie normálnej bunkovej morfológie, migrácie buniek, hemostázy a trombózy, hojenia rán a onkogénnej transformácie (opisuje sa v publikáciách Alitalo et al., Adv. Cancer Res. 37, 111 - 158 (1982); Yamada, 1983; Hynes Ann., Rev. Celí Biol. 1, 67 - 90 (1985); Owens et al., Oxf. Surv. Eucaryot. Genes 3, 141 - 160 (1986); ). Štrukturálna diverzita FN sa ziska alternatívnym zostrihom troch oblastí (ED-A ED-B a IIICS) primárneho transkriptu FN (Hynes Ann., Rev. Celí Biol. 1, 67 - 90 (1985); Zardi et al., EMBO J. 6, 2337 - 2342 (1987), aby vzniklo najmenej 20 rôznych izoforiem, pričom niektoré z nich sa odlišne exprimujú v nádore alebo v normálnom tkanive. Rovnako ako regulácia tkanivovo a vývojovo špecifickým spôsobom je známe, že patern zostrihu FN-pre-mRNA je v transformovaných a maligných bunkách deregulovaný (Castellani et al., J. Celí. Biol. 103, 1671 - 1677 (1986); Borsi et al., J. Celí. Biol. 104, 595 - 600 (1987); Vartio et al., J. Celí Science 88, 419 - 430 (1987), Zardi et al., EMBO J. 6, 2337 - 2342 (1987); Barone et al., EMBO J. 8, 1079 - 1085 (1989); Camemolla et al., J. Celí Biol. 108, 1139 - 1148 (1989); Oyama et al., J. Biol. Chem. 10331 - 10334 (1989); Oyamaet al., Cancer Res. 50, 1075 - 1078 (1990); Borsi et al., Exp. Celí Res. 199, 98 - 105 (1992b)). Izoformy FN obsahujúce sekvencie ED-A ED-B a IIICS sa exprimujú vo väčšom rozsahu v transformovaných bunkách a v bunkách maligných nádorov. Obzvlášť izoforma FN obsahujúca sekvenciu ED-B (B+ izoforma) sa silne exprimuje v zárodočnom a nádorovom tkanive, rovnako ako počas hojenia rán,

SK 285916 Β6 ale expresia je obmedzená v normálnych dospelých tkanivách (Norton and Hynes, Mol. Celí. Biol. 7, 4297 - 4307 (1987); Gutman and Komblihtt, Proc. Natl. Acad. Sci USA 90 7179 - 7182, 1987; ); Camemolla et al., J. Celí Biol. 108, 1139 - 1148 (1989); Ffŕench-Constant et al., J. Celí Biol. 109, 903 - 914 (1989); Ffrench-Constant et al., Development 106, 375 - 388 (1989); Laitinen et al., Lab. Invest. 64, 375 - 388 (1991)). Molekuly B+ FN nie sú v dospelých cievach detegovateľné, ale pri normálnom (napr. vývoj endometria), patologickom (napr. pri diabetickej retinopatii) a nádorovom vývoji (Castellani et al., Int. J. Cancer 59, 612 - 618 (1994) angiogénnych krvných ciev je ich množstvo vysoké.

Sekvencia ED-B je celá homológna repetícia typu III, ktorá je kódovaná jediným exonom a obsahuje 91 aminokyselín. Na rozdiel od alternatívne zostrihanej izoformy IIICS, ktorá obsahuje väzbové miesto špecifické k bunkovému typu, biologická funkcia izoforiem A+ a B+ je stále predmetom špekulácie (Humphries et al., J. Celí Biol. 103, 2637-2647(1986).

Samotná prítomnosť izoformy B+ tvorí nádorom indukovaný neoantigén, ale navyše expresia ED-B vyjadruje normálne kryptický antigén v repetícii 7 typu III (predchádzajúci ED-B); pretože tento epitop nie je v molekulách FN, ktorým chýba ED-B, vyjadrený, čo umožňuje, že expresia ED-B indukuje priamu a nepriamu expresiu neoantigénov. Toto kryptické antigénne miesto tvorí cieľ monoklonálnych protilátok (mAb), ktoré sa nazývajú BC-1 (Carnemolla et al., J. Biol. Chem. 24689 - 24692 (1992). Špecifickosť a biologické vlastnosti týchto mAb sa opisujú v EP 0 344 134 BI aje ich možné získať z hybridómu uloženého v inštitúcii „European Collection of Animal Celí Cultures, Porton Down, Salisbury, UK s prístupovým číslom 88042101. Monoklonálne protilátky sa úspešne používajú pri lokalizácii angiogénnych krvných ciev nádorov, bez skríženého reagovania s dospelým vaskulámym endoteliom, čo ukazuje potenciál izoforiem FN pri vaskulámom cieľovom zavádzaní s použitím protilátok.

Stále však existujú isté námietky a to ku špecificite monoklonálnych protilátok BC-1. Na základe skutočnosti, že BC-1 priamo nerozoznávajú izoformu B+, vyvstala otázka, či v niektorých tkanivách je možné odmaskovať epitop, ktorý je rozpoznávaný protilátkami BC-1, bez prítomnosti ED-B, čo vedie nepriamo k nechcenej skríženej reaktivite BC-1. Ďalej BC-1 je prísne špecifický pre ľudskú izoformu B+, čo znamená, že štúdia biodistribúcie BC-1 pri zvieratách a ich lokalizácia v nádore nie je možná. Hoci sa produkujú polyklonálne protilátky proti rekombinantným fúznym proteínom, ktoré obsahujú izoformu B+ (Peters et al., Celí. Adhes. Commun. 3, 67 - 89 (1995), reagujú iba s FN, na ktoré sa aplikovala N-glykanáza s cieľom odkrytia epitopu.

Ďalší všeobecný problém s použitím myších monoklonálnych protilátok je odozva na anti-myšie protilátky u ľudí (HAMA) (Schroff et al., 1985, Cancer Res. 45: 879 - 885; Dejager et al., (1988), Proc. Am. Assoc. Cancer Res 29: 377). HAMA odozva má rozmedzie účinkov od neutralizácie aplikovaných protilátok, ktoré vedú ku zníženiu terapeutickej dávky, cez alergické reakcie, sérové ochorenia a renálne poškodenie.

Hoci sa určili polyklonálne antiséra reagujúce s rekombinantnou ED-B (uvedené v texte), izolácia mAbs s rovnakou špecifickosťou ako BC-1 nasledujúca po imunizácii myší bola všeobecne zlepšená, pretože ľudské a myšie proteíny ED-B majú 100 % sekvenčnú homológiu. Ľudský protein môže preto vystupovať ako myší samoantigén, ktorý potom nezosilňuje imunitnú odozvu. V skutočnosti po niekoľkých rokoch usilovného bádania sa identifikovali iba jediné mAb s nepriamou reaktivitou k FN izoforme B+ (BC-1), ktoré priamo nerozoznávajú ED-B. Väčšinou je podstatné, že špecificita BC-1 sa pre kryptický epitop vyjadruje ako konzekvencia ED-B, skôr než časť samotného ED-B, ktorý nie je pravdepodobne prítomný v myších FN a preto sa nezdá byť samotným myším imunitným systémom.

Realizácia vynálezu sa dosiahla použitím stratégie, ktorá je alternatívna k tej používanej predtým a kde predchádzajúca imunizácia s fibronektínom alebo ED-B nie je nutná: získali sa protilátky so špecifickosťou pre izoformu ED-B, ako jeden reťazec Fvs (scFvs) z knižníc ľudských protilátok variabilných oblasti vyjadrených na povrchu vláknitého bakteriofága (Nissim et al., EMBO J. 13, 692 - 698 (1994), ďalej tiež WO 92/01407, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172).

Zistili sme, s použitím protilátkovej fágovej knižnice, že sa môžu izolovať špecifické csFvs priamou selekciou rekombinantných fragmentov, ktoré obsahujú doménu ED-B a samotnej ED-B, kedy tieto antigény poťahujú pevný povrch („panning“). Uvedené zdroje antigénu sa s úspechom použili pri produkcii „druhej generácie“ scFvs s vylepšenými vlastnosťami príbuznými s rodičovskými klonmi v procese „afinitnej maturácie“. Zistilo sa, že izolované scFvs silne a špecificky reagujú s izoformou B+ ľudského FN bez toho, že sa vopred aplikuje N-glykanáza.

Pri anti-nádorových aplikáciách ľudskej väzbovej domény protilátkového antigénu podľa vynálezu majú tú výhodu, že nie sú subjektom odozvy HAMA. Ďalej, ako sa tu uvádza, používajú sa pri imunohistochemickej analýze nádorového tkaniva spôsobom in vivo a in vitro. Tieto a ďalšie použitia sú v odbore známe.

Terminológia

Špecificky sa viažuci člen

Termín opisuje člena páru molekúl, ktoré majú vzájomnú väzbovú špecifickosť. Členovia špecifického väzbového páru sa môžu získať prirodzenou cestou alebo sa môžu celkom alebo sčasti syntetizovať. Jeden člen páru molekúl má na svojom povrchu oblasť alebo dutinu, prostredníctvom ktorej sa viaže na určitú priestorovú a polámu organizáciu ďalšieho člena páru molekúl. Potom členovia páru molekúl sa vzájomne špecificky viažu jeden k druhému. Príklady typov špecificky sa viažucich párov sú dvojice antigén-protilátka, biotín-avidín, receptor hormón-hormón, receptor-ligand, enzým-substrát.

Protilátky

Termín „protilátky“ opisuje imunoglobin produkovaný prirodzeným spôsobom alebo čiastočne, alebo celkom syntetický, Termín tiež zahrnuje polypeptid alebo protein, ktorý má väzbovú doménu, ktorá je protilátkovou väzbovou doménou alebo je s ňou homológna. Protilátky sa dajú získať z prirodzených zdrojov alebo sa môžu čiastočne alebo celkom syntetizovať. Príklady protilátok sú imunoglobínové izotypy a ich izotypické podtriedy; fragmenty, ktoré obsahujú doménu viažucu antigén, ako je Fab, scFv, Fv, dAb, Fd; a diabodies.

Je možné vziať monoklonálne a iné protilátky a s použitím metód génového inžinierstva vytvoriť iné protilátky alebo chimérické molekuly, ktoré si ponechávajú špecifickosť pôvodných protilátok. Také metódy napríklad môžu zahrnovať zavedenie DNA kódujúcej variabilnú oblasť imunoglobulínu alebo oblasti určujúcej komplementaritu (CDR) protilátok proti konštantným oblastiam alebo konštantným oblastiam plus rámcovým oblastiam odlišného imunoglobulínu, čo sa opisuje napríklad v EP-A-184187,

GB 2188638A alebo EP-A-239400. Hybridom alebo iné bunky, ktoré produkujú protilátky, sa môžu stať predmetom génových mutácii alebo iných zmien, ktoré môžu alebo nemusia pozmeniť väzbovú špecifickosť produkovaných protilátok

Protilátky sa môžu modifikovať radom spôsobov. Termín „protilátky“ zahrnuje špecificky sa viažuce členy alebo látky, ktoré majú väzbovú doménu s požadovanou špecifickosťou. Ďalej zahrnujú fragmenty protilátok, deriváty, funkčné ekvivalenty a homológy protilátok, ľubovoľný polypeptid obsahujúci väzbovú doménu imunoglobulínu, či už sú pripravené prirodzenou cestou alebo sčasti alebo celkom syntetizované. Ďalej zahrnujú chimérické molekuly obsahujúce väzbovú doménu imunoglobulínu alebo ekvivalentu fúzovaného s iným polypeptidom. Klonovanie a expresia chimérických protilátok sa opisujú v EP-A-0120694 a EP-A-0125023.

Zistilo sa, že fiagmenty celých protilátok vykonávajú funkciu naviazania antigénov. Príklady väzbových fragmentov sú (i) Fab fragment obsahujúci VL, VH, CL a CH1 domény; (ii) Fd fragment obsahujúci domény VH a CH1; (iii) fragment Fv obsahujúci domény VL a VH jednej protilátky; (iv) fragment dAb (Ward, E. S. et al., Náture 341, 544 - 546 (1989), ktorý obsahuje doménu VH; (v) izolované oblasti CDR; (vi) fragmenty F(ab')2, čo sú bivalentné fragmenty obsahujúce dva spojené fragmenty Fab, (vii) jednoreťazcové molekuly Fv (scFv), kde doména VH a VL sú spojené peptidovým linkerom, ktorý umožňuje spojenie dvoch oblastí za vytvorenia väzbového miesta pre antigén (Bird et al., Science, 242, 423 - 426. (1988), (viii) bišpecifické jednoreťazcové diméry Fv (PCT/US 92/09965) a (xi) „diabodies“, čo sú multivalentné a multišpecifické fragmenty konštruované fúziou génov (WO 94/13804; Holliger et al., Proc. Natl, Acad. Sci. USA 90 6444 - 6448, 1993).

„Diabodies“ sú multiméry polypeptidov, kde každý polypeptid obsahuje prvú doménu, ktorá zahrnuje väzbovú oblasť ľahkého reťazca imunoglobulínu, a druhú doménu, ktorá zahrnuje väzbovú oblasť ťažkého reťazca imunoglobulínu. Tieto dve domény sú spojené (napr. peptidovým linkerom), ale nie sú schopné sa spojiť vzájomne za vzniku väzbového miesta pre antigén: väzbové miesta pre antigén sa tvoria spojením prvej domény jedného polypeptidu v multimére s druhou doménou iného polypeptidu v multimére (WO 94/13804).

V prípade, že sa používajú bišpecifické protilátky, môžu to byť bežné bišpecifiké protilátky, ktoré sa môžu vyrábať rôznymi spôsobmi (Holliger, P. and Winter G, Current Opinion Bitechnol. 4, 446 - 449 (1993)), napríklad chemickou cestou alebo z hybridných hybridómov, alebo to môžu byť ľubovoľné zo zmienených bišpecifických protilátkových fragmentov. Môže sa preferovať skôr použitie dimérov scFv alebo „diabodies“ než celých protilátok. „Diabodies“ a scFv sa môžu konštruovať bez oblasti Fc, s použitím iba variabilných oblastí, ktoré silne redukujú účinky anti-idiotypickcj reakcie. Iné formy bišpecifických protilátok zahrnujú jeden reťazec „Janusins“ opísaný v publikácii Traunecker et al., Embo Joumal, 10, 3655 - 3659, (1991).

Bišpecifické „diabodies“ na rozdiel od bišpecifických celých protilátok sa môžu tiež výhodne používať, pretože ich konštrukcia a expresia v baktériách E. coli je ľahká. Ľahko sa môžu vybrať „diabodies“ (a rad iných polypeptidov, ako sú fragmenty protilátok) vhodnej väzbovej špecifickosti s použitím fágovej knižnice (WO 94/13804). V prípade, že jedno rameno „diabody“ sa udržuje konštantné, napríklad so špecifickosťou riadenou proti antigénu X, môže sa potom vytvoriť knižnica, kde ďalšie rameno je variabilné a vyberú sa protilátky s vhodnou špecifickosťou.

Väzbová doména pre antigén

Tento termín opisuje časť protilátok, ktorá obsahuje oblasť, ktorá sa špecificky viaže na časť alebo na celý antigén a je s ním komplementárna. V prípade, že antigén je veľký, protilátka sa môže viazať iba na jeho časť, ktorá sa nazýva epitop. Väzbovú doménu pre antigén môže tvoriť jedna alebo viac variabilných domén protilátok. Uprednostňuje sa, aby väzbová doména pre antigén bola variabilná oblasť (VL) ľahkého reťazca protilátok a variabilná oblasť (VH) ťažkého reťazca protilátok.

Špecifický

Termín „špecifický“ označuje situáciu, kedy jeden člen špecifického väzbového páru nemá žiadnu podstatnú väzbu s ďalšími molekulami, než je jeho špecifický väzbový partner. Termín sa dá tiež využiť v prípade, že napríklad väzbová doména pre antigén je špecifická pre určitý epitop, ktorý je nesený radom antigénov, v takom prípade špecifický väzbový člen nesúci väzbovú doménu pre antigén bude schopný viazať rôzne antigény, ktoré nesú epitop.

Funkčne ekvivalentná forma variantu

Tento termín zahrnuje molekulu (variant), ktorá má hoci štrukturálne odlišnosti v porovnaní s inou molekulou (rodičovskou), stále si uchováva podstatnú homológiu a tiež najmenej niektorú z biologických funkcií rodičovskej molekuly, napr. schopnosť viazať sa na určitý antigén alebo epitop. Varianty sa môžu vyskytovať vo forme fragmentov, derivátov alebo mutantov. Variant, derivát alebo mutant sa môže získať modifikáciou rodičovskej molekuly adíciou, deléciou, substitúciou alebo inzerciou jednej alebo viac aminokyselín, alebo spojením s inou molekulou. K týmto zmenám môže dôjsť na úrovni nukleotidu alebo proteínu. Kódovaným polypeptidom môže byť napríklad fragment Fab, ktorý sa potom naviaže na chvost FC z iného zdroja. V inom prípade sa môže naviazať marker, ako je napríklad enzým, fluoresceín atď.

Podstata vynálezu

Vynález opisuje špecificky sa viažuci člen, ktorý je špecifický pre onkofetálnu doménu fibronektínu (FN) ED-B.

Špecificky sa viažuce členy podľa vynálezu sa viažu na doménu ED-B priamo. V jednom uskutočnení vynálezu špecificky sa viažuce členy sa viažu po aplikácii proteázového termolyzínu na FN, na ľubovoľný alebo na všetky FN, ktoré obsahujú ED-B. V ďalšom uskutočnení vynálezu sa špecificky sa viažuce členy viažu na ľubovoľný alebo všetky FN, ktoré obsahujú homológne repetície typu III, ktoré zahrnujú doménu ED-B. Známe FN sa opisujú vo dvoch publikáciách Camemolla et al., J. Biol. Chem 24689 -

- 24692 (1992) a Camemolla et al., J. Celí Biol. 108, 1139 -

- 1148 (1989). Odkaz na „všetky FN, ktoré obsahujú ED-B“, sa môže brať ako odkaz na všetky FN opísané v tejto publikácii, ktoré obsahujú ED-B.

Špecificky sa viažuci člen prednostne viaže ľudský ED-B a prednostne B+FN najmenej jedného ďalšieho druhu, ako je myš, krysa a/alebo kura. Uprednostňuje sa, aby špecificky sa viažuci člen páru bol schopný viazať tak ľudskú, ako aj neľudskú ED-B fibronektínu, ako je myšia ED-B, čo umožňuje testovanie a analýzu sbp člena vo zvieracom modeli.^

Špecificky sa viažuce párové členy podľa vynálezu viažu ED-B fibronektínu, bez súťaženia s bežne dostupnými uloženými protilátkami BC-1, ktoré sa opisujú ďalej v tex te. BC-1 je striktne špecifická pre ľudskú B+ izoformu. Špecificky sa viažuce párové členy podľa vynálezu sa neviažu na rovnaký epitop ako BC-1.

Naviazanie Špecificky sa viažuceho člena podľa vynálezu na B+FN sa môže inhibovať doménou ED-B.

S ohľadom na vynález má väzbová doména, keď sa meria ako čistený monomér, hodnotu disociačnej konštanty (Kd) 6 x 10’⁸ M alebo v prípade ED-B FN menšiu.

V súlade s vynálezom väzbová doména reaguje, čo znamená je schopná sa viazať, s ED-B fibronektínu bez toho, že sa ED-B fíbronektín vopred upraví N-glykanázou.

Špecificky sa viažuce párové členy podľa vynálezu sa môžu pripravovať ako izoláty alebo v čistenej forme. Pripravujú sa do formulácií alebo prípravkov, ktoré neobsahujú iné špecificky sa viažuce párové členy, napríklad protilátky alebo ich fragmenty alebo neobsahujú iné špecificky sa viažuce párové členy, ktoré sú schopné viazať ED-B fibronektínu. Uprednostňuje sa, aby špecificky sa viažuce párové členy podľa vynálezu sa pripravovali v podstate v čistej forme. Môžu byť monoklonálne v zmysle, že pochádzajú z jedného klonu, skôr než sa obmedziť na protilátky, ktoré sa získali použitím tradičnej technológie hybridómov. Ako sa uviedlo, špecificky sa viažuce párové členy podľa vynálezu sa môžu získať s použitím technológie vyjadrenia bakteriofága a/alebo expresie v rekombinantných, napríklad v bakteriálnych, hostiteľských bunkách. Neexistuje prioritná požiadavka na monoklonálne špecificky sa viažuce párové členy podľa vynálezu, ktoré priamo viažu ED-B fibronektínu.

Uprednostňuje sa, aby špecificky sa viažuci člen obsahoval protilátky. Špecificky sa viažuci člen môže obsahovať polypeptidovú sekvenciu vo forme fragmentu protilátok, ako je jediný reťazec Fv (scFV). Môžu sa tiež využívať iné typy fragmentov protilátok, ako sú Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Facb alebo diabody (Winter, G and C. Milstein, Náture 349, 293 - 299, 1991; WO 94/13804). Špecificky sa viažuci člen môže byť vo forme celých protilátok. Celé protilátky môžu byť v ľubovoľnej z foriem protilátkových izotypov napr. IgG, IgA, IgD, IgE a IgM a v ľubovoľných formách izotypových podtried, napríklad IgGl alebo IgG4.

Protilátky môžu byť ľubovoľného pôvodu, napríklad ľudské, myšie, ovčie. Iné odvodenia sú v odbore dobre známe. Uprednostňuje sa, aby protilátky boli ľudského pôvodu. Termín „ľudský“ znamená protilátky, ktoré sa čiastočne alebo celkom získali z ľudskej cDNA, proteínovej alebo peptidovej knižnice. Tento termín zahrnuje ľudské peptidy a proteíny, ktoré nemajú ľudský pôvod, ktoré sa modifikovali s cieľom ponechať si ľudské charakteristiky k molekule protilátok a tak umožňujú molekule obísť obranu ľudského imunitného systému.

Špecificky sa viažuci člen sa môže tiež vyskytovať vo forme manipulovaných protilátok, napríklad vo forme bišpecifickej molekuly protilátok (alebo fragment, ako je F(ab')2), ktorá má jedno rameno viažuce antigén (t. j. špecifickú doménu) proti ED-B fibronektínu a ďalšie rameno proti odlišnej špecifickosti, alebo bivalentnú, alebo multivalentnú molekulu.

Vedľa sekvencií protilátok špecificky sa viažuci člen môže obsahovať iné aminokyseliny, napr. môžu tvoriť peptid alebo polypeptid, alebo môžu udeľovať molekule vedľa schopnosti viazať antigén ďalšiu funkčnú charakteristiku. Špecificky sa viažuci člen môže napríklad obsahovať značku, enzým alebo jeho fragment a tak ďalej.

Väzbová doména môže obsahovať časť alebo celú doménu VH kódovanú segmentom zárodočnej línie alebo znovu usporiadaného génového segmentu. Väzbová domé na môže obsahovať časť alebo celú doménu VL kappa alebo VL lambda.

Väzbová doména môže obsahovať VH1, VH3 alebo VH4 génové sekvencie zárodočnej línie alebo ich znovu usporiadanú formu.

Špecificky sa viažuci člen podľa vynálezu môže obsahovať ťažký reťazec variabilnej oblasti („VH“ oblasti) získaný z ľudskej zárodočnej línie DP47, sekvenciu, ktorá je zobrazená na obr. č. l(a), zvyšky 1 až 98. Nomenklatúra „DP“ sa opisuje v publikácii Tomlinson I. M. et al., (1992) J. Mol. Biol. 227: 776 - 798. Aminokyselinová sekvencia CDR3 môže byť Ser Leu Pro Lys. Aminokyselinová sekvencia CDR3 môže byť Gly Val Gly Ala Phe Arg Pro Tyr Arg Lys His Glu. Takto väzbová doména špecificky sa viažuceho člena podľa vynálezu môže zahrnovať VH doménu, ktorá obsahuje aminokyselínové sekvencie na obr. č. 1 (a) pre CGS1 aCGS2.

Väzbová doména môže obsahovať variabilnú oblasť ľahkého reťazca („VL“ doménu) získanú z ľudskej zárodočnej línie DPL16, sekvenciu, ktorá je zobrazená na obr. č. 1 (b) ako kodóny 1 až 90.

Doména VL môže obsahovať sekvenciu CDR3 Asn Ser Ser Pro Val Val Leu Asn Gly Val Val. Doména VL môže obsahovať sekvenciu CDR3 Asn Ser Ser Pro Phe Glu His Asn Leu Val Val.

Špecificky sa viažuce členy podľa vynálezu môžu obsahovať funkčne ekvivalentné varianty sekvencií, ktoré sú zobrazené na obr. č. 1, napr. kde sa začlenili, deletovali, substituovali alebo pridali jedna alebo viac aminokyselín, čo poskytlo uvedené vlastnosti. Môže sa zmeniť sekvencia CDR3 alebo sa môže uskutočniť jedna alebo viac zmien v rámcových oblastiach alebo rámec môže byť nahradený inou rámcovou oblasťou alebo modifikovanou formou za vzniku špecifického väzbového člena, ktorý viaže ED-B.

Jedna alebo viac CDR z domén VL alebo VH tu opísaných protilátok, ktoré viažu antigén, sa môže použiť pri tzv. „implantácii CDR“, pri ktorej je jedna alebo viac sekvencií CDR prvých protilátok umiestnená do sekvencií rámca, ktorý nesúvisí s protilátkami, napr. iných protilátok, ako sa opisuje v EP-B-0239400. CDR sekvencie pre CGS1 a CGS2 sú uvedené na obr. č. 1 (a) a 1 (b).

Špecificky sa viažuci člen podľa vynálezu môže byť ten, ktorý pri väzbe s ED-B fibronektínu konkuruje protilátkam alebo tu opísanému scFv. Konkurencia medzi špecificky sa viažucimi členmi sa môže jednoducho testovať in vivo, napríklad pripojením špecifickej reportnej molekuly k jednému špecificky sa viažucemu členovi, ktorý sa môže delegovať v prítomnosti iných nepripojených väzbových členov, čo umožňuje identifikáciu špecificky sa viažuceho člena, ktorý sa viaže na rovnaký epitop alebo presahujúci epitop.

Špecificky sa viažuci člen podľa vynálezu sa môže využiť pri metóde, ktorá spôsobuje alebo umožňuje väzbu špecificky sa viažuceho člena na jeho epitop. Naviazanie môže nasledovať po aplikácii špecificky sa viažuceho člena cicavcovi, napríklad človeku alebo hlodavcovi, ako je myš.

Vynález opisuje použitie špecificky sa viažuceho člena ako diagnostického činidla v prípade nádorov. Experimentálny dôkaz na zvieracom modeli, ako sa opisuje ďalej v texte, ukazuje, že špecificky sa viažuce členy podľa vynálezu sú užitočné pri in vivo lokalizácii nádoru.

Preferovanými špecificky sa viažucimi členmi podľa vynálezu sú tie, ktoré sa viažu na ľudské nádory, napríklad v sekcii kryostatu, ktoré majú invazívny a angiogénny fenotyp a ktoré sa viažu na embryonálne tkanivá, napr. v sekcii kryostatu. Naviazanie sa môže demonštrovať imunocytochemickým farbením.

V preferovanom uskutočnení vynálezu sa špecificky sa viažuci člen neviaže alebo sa v podstate neviaže na tenaskín, čo je extracelulámy matricový protein.

V inom preferovanom uskutočnení vynálezu sa špecificky sa viažuci člen neviaže, alebo sa v podstate neviaže, na normálnu ľudskú kožu, napríklad v sekcii kryostatu a/alebo ako sa demonštrovalo použitím imunocytochemického farbenia.

Ďalšie uskutočnenia špecificky sa viažucich členov podľa vynálezu sa neviažu alebo sa v podstate neviažu na jedno alebo viac normálnych tkanív (napr. v sekcii kryostatu a/aiebo ako sa demonštruje použitím imunocytochemického farbenia) vybraných zo skupiny, ktorá zahrnuje pečeň, slezinu, obličky, žalúdok, tenké črevo, hrubé črevo, vaječníky, maternicu, močový mechúr, pankreas, suprarenálne žľazy, skeletový svat, srdce, pľúca, štítnu žľazu a mozog.

Špecificky sa viažuci člen pre ED-B sa môže použiť ako činidlo pre cieľové zavádzanie in vivo, ktoré sa môže použiť pri demonštrácii prítomnosti a lokalizácie nádorov, ktoré exprimujú alebo sú inak spojené s ED-B fibronektínu. Môžu sa používať ako zobrazovacie činidlo. Vynález opisuje metódu stanovenia prítomnosti bunky alebo nádoru, ktorý exprimuje alebo je inak spojený s expresiou ED-B fibronektínu, pričom spôsob zahrnuje kontakt buniek so špecificky sa viažucim členom a stanovenie naviazania špecificky sa viažuceho člena na bunky. Spôsob sa môže uskutočniť in vivo alebo in vitro na testovacej vzorke buniek, ktoré sa izolovali z tela.

Reaktivita protilátok v bunkovej vzorke sa môže stanoviť vhodným spôsobom. Jedna z možnosti je označenie s jednotlivými reportnými molekulami. Reportné molekuly môžu priamo a nepriamo generovať detegovateľné a prednostne merateľné signály. Spojenie reportných molekúl môže byť priame alebo nepriame, kovalentné, napríklad prostredníctvom peptidovej väzby alebo nekovalentné. Spojenie prostredníctvom peptidovej väzby môže byť ako výsledok rekombinantnej expresie génovej fúzie, ktorá kóduje protilátky a reportnú molekulu.

Jedným z favoritných módov je kovalentné spojenie každej protilátky s individuálnym fluorochrómom, fosforom alebo laserovým farbivom so spektrálne izolovanými absorpčnými alebo emisnými charakteristikami. Medzi vhodne fluorochrómy patri fluorosceín, rodamín, fykoerytrín a texasová červeň. Vhodné chromogénne farbivá zahrnujú diaminobenzidín.

Iné reportné molekuly zahrnujú makromolekulové koloidné partikuly alebo časticový materiál, taký ako sú latexové guľôčky, ktoré sú sfarbené, magnetické alebo paramagnetické a biologicky alebo chemicky aktívne činidlá, ktoré môžu priamo alebo nepriamo spôsobovať detegovateľné signály, aby mohli byť pozorované vizuálne, elektronicky detegovateľné alebo inak zaznamenávané. Týmito molekulami môžu byť napríklad enzýmy, ktoré katalyzujú reakcie, ktoré vyvíjajú alebo menia farby a spôsobujú zmeny elektrických vlastností. Molekuly môžu byť molekulárne excitabilné tak, že elektronické prechody medzi energetickými stavmi vedú k charakteristickej spektrálnej absorpcii alebo emisii. Môžu zahrnovať chemické entity používané v spojení s biosenzormi. Sú to spojenie biotin/avidín alebo biotín/streptavidin a detekčné systémy založené na alkalickej fosfatáze.

Spôsob stanovujúci väzbu nie je rysom vynálezu a odborník je schopný vybrať vhodný spôsob na základe svojich preferencií a všeobecných znalostí.

Signály generované jednotlivými konjugátmi protilátka-reportná molekula sa môžu použiť na získanie kvantifikovateľných absolútnych alebo relatívnych dát relevantné ho naviazania protilátok v bunkových vzorkách (normálnych a testovaných). Navyše pri použití všeobecného farbenia jadra je možné stanoviť vo vzorke celkovú bunkovú populáciu, čo umožňuje stanoviť kvantitatívne pomery jednotlivých bunkových populácií vzťahujúcich sa k celkovému počtu buniek. V prípade, že sa rádioaktívne značené nukleotidy ¹¹⁵I, ’ln alebo ‘^><,rTc pripoja k protilátkam, potom sa tieto protilátky prednostne lokalizujú v nádore skôr než v normálnych tkanivách. Prítomnosť rádioaktívnych značiek v nádorovom tkanive sa môže detegovať a kvantifikovať s použitím gamma snímača. Kvalita získaného zobrazenia nádoru priamo koreluje s pomerom signál: zvukový signál.

Protilátky sa môžu používať ako diagnostické činidlá na sledovanie novo vaskularizovaných nádorov a môžu sa tiež používať, napr. v modifikovanej forme, na zavedenie cytotoxických činidiel alebo pri koagulácii v nových krvných cievach, pričom vyvíjajúce sa nádory trpia nedostatkom kyslíka a nutrientov a tvoria tak nepriamu formu terapie nádoru.

Vynález ďalej opisuje použitie vyššie špecifikovaného špecificky sa viažuceho člena, ktorý sa používa ako terapeutické činidlo pri spojovaní, viazaní alebo manipulácii ako fúzny protein, aby získal funkciu efektora. Špecificky sa viažuci člen podľa vynálezu sa môže použiť na cielené zavedenie toxínu, rádioaktívnych látok, T-buniek, smrtiacich buniek alebo iných molekúl do nádoru, ktorý exprimuje alebo je spojený s antigénom v strede záujmu.

Vynález ďalej opisuje spôsoby liečby, ktoré zahrnujú aplikáciu špecificky sa viažuceho člena, farmaceutických kompozícií obsahujúcich taký špecificky sa viažuci člen a použitie uvedeného špecificky sa viažuceho člena pri výrobe medikamentu vhodného na aplikáciu, napríklad pri metóde prípravy medikamentu alebo farmaceutickej kompozície, ktorá obsahuje špecificky sa viažuci člen s farmaceutický prijateľným excipientom.

V súlade s vynálezom sa môžu uvedené kompozície aplikovať jednotlivcom. Prednostne sa aplikuje „terapeuticky účinné množstvo“, ktoré je pre pacienta prínosom. Taký prínos môže byť prinajmenšom zlepšenie najmenej jedného symptómu. Aktuálne aplikované množstvo, rýchlosť a časový priebeh aplikácie závisí od povahy a stavu ochorenia, ktoré sa lieči. Zodpovednosť za predpis liečby, napríklad rozhodnutie o dávke atď., nesú praktickí lekári a iní terapeuti. Vhodná dávka protilátok je v odbore dobre známa, uvádza sa v publikácii Ledermann J. A. et al., (1991) lnt. J. Cancer 47: 659 - 664; Bagshawe K. D. et al., (1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915 -922.

Kompozícia sa môže aplikovať samotná alebo v kombinácii s inou liečbou, buď súčasne, alebo sekvenčne, čo závisí od liečeného stavu.

Farmaceutické kompozície podľa vynálezu a na ich použitie v súlade s vynálezom môžu obsahovať navyše aktívnu ingredienciu, farmaceutický prijateľný excipient, nosič, pufer, stabilizátor alebo iné materiály, ktoré sú dobre známe v odbore. Také materiály by nemali byť toxické a nemali by interferovať s účinnosťou aktívnej ingrediencie. Presná povaha nosiča alebo iného materiálu závisí od spôsobu aplikácie, ktorá môže byť orálna alebo injekciou, napr. intravenózna.

Farmaceutické kompozície na orálnu aplikáciu môžu byť v tablctovej, kapsulovej, práškovej a kvapalnej forme. Tableta môže obsahovať pevný nosič, ako je želatína alebo adjuvans. Kvapalné farmaceutické kompozície všeobecne obsahujú kvapalný nosič, ako je voda, nafta, živočíšne alebo rastlinné oleje, minerálny olej alebo syntetický olej.

Môže sa používať fyziologický roztok, dextróza alebo iný sacharidový roztok, alebo glykoly, ako je etylénglykol, propylénglykol alebo polyetylénglykol.

Pri intravenóznej injekcii alebo injekcii do miesta postihnutia bude aktívna ingrediencia vo forme parenterálne prijateľného vodného roztoku, ktorý neobsahuje žiadne pyrogény a má vhodné pH, je vhodne izotonický a stabilný. Odborníci sú schopní ľahko pripraviť vhodné roztoky s použitím napríklad izotonických vehikulov, ako je napríklad injekcia chloridu sodného, Ringerova injekcia, laktátová Ringerova injekcia. Roztoky môžu zahrnovať konzervačné činidlá, stabilizátory, pufre, antioxidanty a/alebo iné aditíva, ak je to nutné.

Špecificky sa viažuci člen podľa vynálezu sa môže pripraviť expresiou z nukleovej kyseliny, ktorá ho kóduje. Nukleová kyselina kódujúca špecificky sa viažuci člen umožňuje spôsob produkcie uvedeného špecificky sa viažuceho člena, ktorý zahrnuje expresiu tejto kódujúcej nukleovej kyseliny. Expresiu možno bežne dosiahnuť kultiváciou rekombinantných hostiteľských buniek, ktoré obsahujú uvedenú nukleovú kyselinu, za vhodných podmienok.

Nukleová kyselina môže kódovať ľubovoľné tu uvedené aminokyselinové sekvencie domén protilátok viažuce antigén alebo ľubovoľnú funkčne ekvivalentnú formu. Zmeny sa môžu uskutočniť na úrovni nukleotidov adíciou, substitúciou, deléciou alebo inzerciou jedného alebo viac nukleotidov. Tieto zmeny sa môžu alebo nemusia odraziť na úrovni aminokyseliny v závislosti od degenerácie genetického kódu.

Systémy klonovania a expresie polypeptidu pri rôznych hostiteľských bunkách sú dobre známe. Vhodné hostiteľské bunky zahrnujú baktérie, cicavčie bunky, kvasinky a bakulovírusy. Cicavčie bunkové línie, ktoré sú dostupné pre expresiu heterogénneho polypeptidu zahrnujú bunky vaječníkov čínskych morčiat, bunky HeLa, obličkové bunky novorodených morčiat a mnoho ďalších. Bežným preferovaným bakteriálnym hostiteľom je E. coli.

Expresia protilátok a fragmentov protilátok v prokaryontných bunkách, ako sú baktérie E. coli, je v odbore dobre zavedená. Prehľad informácií je uvedený v publikácii Pluckthun, A Bio/Technology 9: 545 - 551 (1991). Pri produkcii špecificky sa viažuceho člena je možné tiež využiť jeho expresiu v kultivovaných eukaryontných bunkách (Reff) M. E. (1993) Curr. Opinion Biotech. 4: 573 - 576; Trill J. J. et al., (1995) Curr. Opinion Biotech. 6: 553 - 560.

Vhodné vektory sa môžu vybrať alebo konštruovať. Mali by obsahovať vhodné regulačné sekvencie, medzi ktoré patria promótorové sekvencie, polyadenylačné sekvencie, zosilňovacie sekvencie, markerové gény a iné sekvencie, ak je treba. Ďalšie detaily sú uvedené napr. v publikácii Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Rad známych metód a protokolov vhodných pri manipulácii nukleovej kyseliny, napríklad pri príprave konštrukcií nukleových kyselín, mutagenéze, sekvenovaní, zavedení DNA do buniek a expresii génu a analýze proteínov, sa detailne opisuje v publikácii Short Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al., eds., John Wiley and Sons, 1992.

Ďalej vynález opisuje hostiteľskú bunku, ktorá obsahuje tu opísanú nukleovú kyselinu. Ďalej vynález opisuje spôsob zahrnujúci zavedenie uvedenej nukleovej kyseliny do hostiteľskej bunky. Pri zavedení nukleovej kyseliny do hostiteľskej bunky sa môže použiť ľubovoľný dostupný spôsob. V prípade eukaryontných buniek vhodný spôsob môže zahrnovať transfekciu s fosforečnanom vápenatým, DEAE-dextran, elektroporáciu, transfekciu sprostredkovanú lipo zómami a transdukciu s použitím retrovírusov alebo iných vírusov, napr. vakcínie alebo v prípade hmyzích buniek, bakulovírusov. V prípade bakteriálnych buniek vhodné metódy môžu zahrnovať transformáciu chloridom sodným, elektroporáciu a transfekciu s použitím bakteriofaga.

Po zavedení nukleovej kyseliny môže nasledovať expresia nukleovej kyseliny, napríklad v kultivovaných hostiteľských bunkách v podmienkach vhodných pre expresiu génu.

V jednom uskutočnení vynálezu je nukleová kyselina začlenená do genómu (napr. chromozóm) hostiteľskej bunky. Integrácia sa môže podporiť v súlade so štandardnými metódami inklúziou sekvencií, ktoré podporujú rekombináciu s genómom.

Nasledujúca produkcia špecificky sa viažuceho člena sa môže napríklad používať ľubovoľným tu opísaným spôsobom, ako je napríklad pri formulácii farmaceutického alebo diagnostického produktu, ako je kit, ktorý obsahuje okrem špecificky sa viažuceho člena jedno alebo viac činidiel, ktoré slúžia pri stanovení naviazania špecificky sa viažuceho člena na bunky, ako sa diskutuje v texte.

Ďalšie predmety vynálezu a ich uskutočnenia sú pre odborníka zrejmé. Nasledujúce príklady sú uvedené na ilustráciu a v žiadnom prípade neobmedzujú rozsah vynálezu.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Na obrázku č. 1 sú uvedené aminokyselinové sekvencie VH a VL scFvs CGS-1 a CGS-2. Obrázok č. 1 (a) ukazuje sekvencie VH; obrázok č. 1 (b) ukazuje sekvencie VL. CDR (1, 2 a 3) sú označené. Ľudská zárodočná línia VH, ktorý má najväčšiu homológiu k obom scFvs, je segment DP47 rodiny VH3; segment VL oboch klonov je DPL16, ľahký reťazec sa používa na vybudovanie pôvodnej knižnice scFv (Nissim ct al., EMBO J. 13, 692 - 698 (1994)). Zvyšky, ktoré odlišujú jeden kloň od druhého, sú podčiarknuté.

Obrázok č. 2. Na obrázku č. 2A je zobrazený model doménovej štruktúry ľudskej FN podjednotky. Označené sú variabilné oblasti IIICS, EDA a ED-B, ktoré sú spôsobené alternatívnym zostrihom pre-mRNA FN. Obrázok tiež ukazuje vnútornú homológiu, rovnako ako hlavné produkty štiepenia termolyzínom obsahujúce ED-B (Zardi et al., EMBO J. 6, 2337 - 2342 (1987)). Obrázok 2B ukazuje 4 až 18 % SDS-PAGE plazmy a WI38VA FN a produkty ich štiepenia termolyzínom zafarbené Coomassieovou modrou a imunobloty, ktoré sa testovali sondou BC-1, 1ST-6, CGS-1 a CGS-2. V dráhe (1) sú neštiepené a v dráhe (3) sú štiepené FN plazmy s použitím termolyzínu, pričom koncentrácia FN je 1 pg/ml a 10 pg/ml (dráha (4)). V dráhe (2) sú neštiepené a v dráhe (5) sú štiepené WI38VA FN plazmy s použitím termolyzínu, pričom koncentrácia FN je 1 pg/ml a 5 pg/ml (dráha (6)) a 10 ug/ml (dráha 7). Čísla na pravej strane indikujú hlavné produkty štiepenia termolyzínom, ktoré sú zobrazené na obr. č. 2A. Hodnoty na ľavej strane indikujú štandardy molekulovej hmotnosti v kilodaltonoch (kD).

Obrázok č. 3. Na obrázku č. 3A sú zobrazené repetičné sekvencie FN typu III, ktoré sú obsiahnuté vo fúzii a rekombinantné proteíny exprimované v baktériách E. coli a reaktivita týchto proteínov s CGS-1 a CGS-2 a s mAbs BC-1 a IST-6. Obrázok č. 3B zobrazuje gél zafarbený Coomassiovou modrou a imunobloty, ktoré sa testovali sondou CGS-1, CGS-2, BC-1, IST-6. Číslovanie dráh zodpovedá číslovaniu peptidových konštrukcií vo vrchnej časti obráz

SK 285916 Β6 ka. Hodnoty naľavo označujú molekulovú váhu štandardov vkD.

Na obrázku č. 4 je uvedený infračervený zobrazovač myší; zobrazovač myší sa používa pri experimentoch cieleného zavádzania a tvorí ho čierna, nefluorescenčná skrinka, ktorá je vybavená volfrámovou halogénovou lampou, excitačnými a emisnými filtrami, ktoré sú špecifické pre CY7 fluorofor a počítačom riadenou osem bitovou monochromatickou CCD-kamerou.

Obrázok č. 5 zobrazuje cielené zavádzanie fluorescenčné značených protilátkových fragmentov proti F9 myšiemu teratokarcinómu s použitím monomémych scFv(CGS-l) a dimémych scFv(CGS-l)2 riadených k B-FN. Ako negatívna kontrola slúžili diméme scFv(D 1.3)2 s väzbovou špecifickosťou k lysozýmu.

Obrázok č. 6 zobrazuje cielené zavádzanie fluorescenčné značených protilátkových fragmentov proti F9 myšiemu teratokarcinómu s použitím afinitných maturovaných scFV(CGS-2) a menej afinitných scFv(28SI) riadených do rovnakého epitopu B-FN. Cielené zavádzanie sa deleguje tak pri veľkých (približne 0,6 g) ako aj pri malých nádoroch (približne 0,2 g), ktoré sa po 48 hodinách pokryjú čiernou krustou, ktorá čiastočne zastrie obraz.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1: Izolácia ľudských scFvs špecifických pre oblasť ED-B ľudského FN.

Fágová knižnica ľudských scFv ((Nissim et al., EMBO J. 13, 692 - 698 (1994) sa používa pri selekcii rekombinantných protilátok. Ako zdroj antigénu pri selekcii sa použili dve rôzne formy izoformy ED-B. V oboch prípadoch izoformou bol rekombinantný ľudský proteín.

Rekombinantné peptidy FN, ktoré obsahujú repetície typu IJI 2-11 (B-) a 2-11 (B+), sa exprimovali v baktériách Escherichia coli.

Konštrukcia sa pripravila s použitím cDNA FN z klonov pFH154 (Komblihtt et al., EM-BO J. 4, 1755 (1985)), ZFIO a /.F2 (Carnemolla et al., J. Celí Biol. 108, 1139 - 1148 (1989)). Konštrukcia cDNA v rozsahu 2229 - 4787 báz (Komblihtt, Proc. Natl. Acad. Sci USA 90 7179 - 7182, 1987) sa začlenila do vektoru pQE-3/5 s použitím kitu QIAexpress od Qiagen (Chatsworth, CA). Rekombinanty FN-III 2-11 (B-) a (B+) sa čistili imunoafinitnou chromatografiou s použitím mAb 3E3 (Pierschbacher et al., Celí 26, 259 - 267 (1981)), ktoré sú spojené so sefarózou 4B (Pharmacia). Fragmenty DNA na prípravu rekombinantných fragmentov FN, ktoré obsahujú typ III homológnej repeticie 7B89, 789, ED-B a FN-6, sa pripravili polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) s použitím UltMa DNA polymerázy (Perkin Elmer), cDNA z klonov FN 2-11 (B+) a FN 2-11 (B-) ako templátu. Priméry sa navrhli tak, aby umožnili klonovanie PCR produktov do pQE-12 s použitím kitu QIAexpress od Qiagen (Chatsworth, CA). Potom nasleduje transformácia buniek baktérie E. coli a expresia. Všetky klony cDNA sa sekvenovali s použitím Sequenase 2.0 DNA sekvenačného kitu (USB).

Rekombinantné proteíny sa čistili Ni-NTA chromatografiou (IMAC), podľa inštrukcií výrobcu (Qiagen), s použitím hcxahistidínového tag na C-konci fragmentov FN. Fúzny proteín ED-B-pGal sa pripravil klonovanim ED-B cDNA do bakteriofágového vektora Xgtll za vzniku klonu /.ED-B. Kloň ž.chFNóO (obsahujúci časť sekvencie ED-B) sa získal ako fúzny proteín z klonovaného kuracieho FN pchFNóO (Norton and Hynes, Mol. Celí. Biol. 7, 4297 -4307(1987)).

Pri selekcii fágovej knižnice ľudského scFv sa testoval každý z dvoch rôznych rekombinantných antigénov (7B89 a ED-B) v troch kolách. Imunoskúmavky (Nunc; Maxisorp, Roskilde, Denmark) sa pokryli antigénmi cez noc v koncentrácii 50 pg/ml v PBS (20 mM fosforečnanový pufer, 0,15 M NaCI, pH 7,2). Prvým antigénomje rekombinantný fragment 7B89, v ktorom oblasť ED-B je lemovaná priľahlou homológnou repetíciou typu III FN; tento antigén sa nanášal pri teplote 4 °C cez noc. Druhý používaný antigén je rekombinatný ED-B (Zardi et al., EMBO J. 6, 2337 -

- 2342 (1987)), ktorý má na C-konci hexahistidín tag; tento proteín neobsahuje zvyšky lyzínu, čo znamená, že terminálna aminoskupina prvej aminokyseliny je dostupná pre miestne špecifickú kovalentnú imobilizáciu ED-B na reaktívne doštičky pre test ELISA (Nunc; Covalink). Poťahovanie sa uskutočnilo cez noc pri teplote miestnosti.

Po troch kolách testovania sa bunky baktérie E. coli infikovali eluovaným fágom HB2151 a naniesli sa na platne, ako sa opisuje v publikácii (Nissim et al., EMBO J. 13, 692 - 698 (1994)). Po každom kole selekcie sa testovalo 95 na ampicilín rezistentných jednotlivých kolónií, aby sa testom ELISA identifikovali antigén špecifické scFvs. Na ďalšiu analýzu a afinitnú maturáciu sa vybrali klony, ktoré majú najsilnejší signál testu ELISA na imobilizované antigény. Tieto klony tiež demonštrujú pri imunocytochemickom farbení špecifické sfarbenie sekcii multiforiem glioblastómu a nádorov prsníka, ako sa opisuje detailnejšie v príklade 4.

Príklad 2: Afmitná maturácia ľudských scFvs špecifických pre oblasť ED-B ľudského FN.

Klony 35GE (vybratý s použitím 7B89) a 28SI (vybratý pomocou samotnej domény ED-B) sa vybrali ako kandidáti protilátok na afinitnú maturáciu. S cieľom obmeniť ľahké reťazce s cieľom vylepšenia afinity sa potom skúmali jednotlivé maturačné stratégie založené na náhodilosti šiestich centrálnych zvyškov (DSSGNH) ľahkého reťazca CDR3 s použitím degenerovaných oligonukleotidov a PCR (obr. č. 1), čo umožňuje potenciálnu sekvenčnú diverzitu 20⁶ = = 6,4 x 10⁷. Táto oblasť (podiel ťažkého reťazca CDR3) je lokalizovaná v centre väzbového miesta antigénu (Padlan, 1994). Ďalej sa mutoval zvyšok arginínu, ktorý priamo predchádza radu šiestich zvyškov k serínu s cieľom zabrániť možnosti elektrostatických účinkov dominujúcej selekcie.

Plazmid získaný z jednej bakteriálnej kolónie, ktorý exprimuje „rodičovský“ scFv fragment, sa amplifikoval PCR s primérmi LMB3 (5'CAG GAA ACA GCT ATG AC 3') a CDR3-6-VLFOR (5 CTT GGT CCC TCC GCC GAA TAC CAC MNN MNN MNN MNN MNN MNN AGA GGA GTT ACA GTA ATA GTC AGC CTC 3') (94C (ľ) -

- 55C (1 ’) - 72C (1 '30), 25 cyklov; v publikácii Marks et al., (1991), J. Mol. Biol., 222, 581 - 597 sa opisujú použité pufre a podmienky PCR). Výsledný produkt sa čistil na géli (s cieľom odstrániť stopy plazmidu, ktorý obsahuje pôvodný gén scFv) a použil sa ako templát pri druhej amplifikácii s primérmi LMB3 a Jl-Not-FOR (5ΆΤΤ GCT TTT CCT TTT TGC GGC CGC GCC TAG GAC GGT CAG CTT GGT CCC TCC GCC 3) (94C (ľ) - S5C (U) -72C (1 '30 ), 25 cyklov. Surový produkt PCR, ktorý sa na agarózovom géli javí ako jediný pruh so správnou molekulovou váhou, sa priamo čistil zo zmesi PCR s použitím Spin-Bind (FMC, Rockland, ME, USA), sa dvakrát štiepil s reštrikčnými enzýmami Ncol/Notl a ligoval sa do na géli čisteného fagemidu pHENl (Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res. 19, 4133 - 4137 (1991) štiepeného reštrikčnými enzýmami Ncol/Notl, ktorý obsahuje inzert Ncol/Notl, čo umožňuje separáciu vektora, ktorý je štiepený dvakrát, od vektora, ktorý je štiepený iba raz. Vektor sa pripravil s plazmid maxi-prep kit Qiagen (Chatsworth, CA, U. S. A.). Pri ligácii sa zmiešalo približne 5 pg štiepeného plazmidu a inzertu. Ligačná zmes sa extrahovala jeden raz s fenolom, jeden raz so zmesou fenol/chloroform/izoamylalkohol (25 : 25 : 1), potom sa precipitovala etanolom s použitím glykogénu (Boehringer, Mannheim, Germany) ako nosiča a sušila sa na speed-vaku.

Peleta sa resuspendovala v 20 pl vody a elektroporáciou sa vniesla do elektrokompetentných buniek E. coli TG1 (Gibson T. J. (1984), PhD thesis. (University of Cambridge, Cambridge, UK). V typickom prípade sa používajú elektrokompetentné bunky s titrom 109 transformantov na pg v prípade, že sa používa glycerol, alebo 1010 transformantov na pg čerstvo pripravených elektrokompetentných buniek. Elektroporácia vedie v typickom prípade k vytvoreniu viac ako 107 klonov.

Maturačná knižnica sa potom spracovala rovnakým spôsobom ako knižnica podľa Nissima (Nissim et al., EMBO J. 13, 692 - 698 (1994)) za vzniku fágových partikúl, ktoré sa používajú pri selekcii vjednom cykle pomocou imunoblotov, kde sa používa ako antigén 7B89 (v koncentrácii 10 pg/ml), potom nasleduje kinetická selekcia (Hawkins et al., J. Mol. Biol 226, 889 - 896 (1992). Táto selekcia prebehla inkubáciou biotinylovaných 7B89 (v koncentrácii 10 nM) s fagovou suspenziou (približne 10¹²1, u. ) z prvého kola výberu v 2 % roztoku mlieka a PBS (2 % MPBS) počas 5 minút, potom sa pridali 7B89 (v koncentrácii 1 pM), ktoré nie sú značené biotínom, a počas 30 minút prebiehala kompetícia. Do reakčnej zmesi sa pridalo 100 pl častíc dyňa (Dynal·. M480) potiahnutých streptavidínom, ktoré boli vopred zablokované v 2 % MPBS, všetko sa 2 minúty miešalo a potom sa častice zachytili na magnete a desaťkrát sa premyli roztokom PBS + + 0,1 % Tween-20 alebo PBS. Fág sa z častíc eluoval 0,5 ml trietylamínu v koncentrácii 100 mM. Tento roztok sa potom neutralizoval 1 M Tris, pH 7,4 s objemom 0,25 ml a použil sa na infekciu exponenciálne rastúcich buniek HB2151 (Nissim et al., EMBO J. 13, 692 - 698 (1994)). 95 jednotlivých kolónií rezistentných na ampicilín sa použilo pri produkcii supematantov, ktoré obsahujú scFv (Nissim et al., EMBO J. 13, 692 - 698 (1994) a ktoré sa testovali testom ELISA BIAcore a imunochemicky s cieľom identifikácie kolónii s najsilnejšou schopnosťou sa viazať. Tie sa potom subklonovali medzi reštrikčné miesta Sfil/Notl expresívneho vektora pDN268 (Neri et al., (1996a), Bio/Techniques, 20, 708 - 713; Neri et al., (1996b), Náture Biotechnology, 14, 385 - 390), ktorý pripojil k C-koncu scFv fosforylovateľný tag, epitop FLAG a hexahistidínový tag.

Jednotlivé kolónie relevantných protilátok subklonovaných do pDN268 sa kultivovali pri teplote 37 °C v 2x TY obsahujúcom 100 mg/1 ampicilínu a 0,1 % glukózy. Keď bunková kultúra dosiahla hodnotu OD⁶⁰⁰ = 0,8, pridalo sa IPTG tak, aby konečná koncentrácia bola I mM a kultivácia pokračovala 16 až 20 hodín pri teplote 30 °C. Po centrifugácii (GS-3 Sorvall rotor, pri 7000 ot/min. a počas 30 min.) sa supematant filtroval, zakoncentroval a s použitím prístroja Minisette (Filteron) s tangencionálnym tokom prešiel do pufra (50 mM fosforečnan, pH7, 4, 500 mM NaCl, 20 mM imidazol). Čistené protilátky sa analyzovali SDS-PAGE (Laemmli, 1970) a dialyzovali sa proti PBS pri teplote 4 °C. Čistené scFv sa ďalej spracovávali gélovou filtráciou s použitím prístroja FPLC vybaveného kolónou S-75 (Pharmacia), keďže je známe, že multivalentné fragmenty scFv môžu mať dobré naviazanie na BIAcore (Jonsson et al., BioTechniques 11, 620 - 627 (1991) účinkom avidity (Nissim etal., EMBO J. 13, 692 - 698 (1994); Crothers and Metzger et al., Immunochemistry 9, 341 - 357 (1972). Koncentrácia protilátok monomerických frakcií čistených na FPLC sa stanovila spektrofotometricky za predpokladu, že absorbancia pri vlnovej dĺžke 280 nm je pre roztok scFv v koncentrácii 1 pg/ml 1,4 jednotiek.

Na prístroji BIAcore (Pharmacia Biosensor) sa meralo naviazanie monovalentnej scFV pri koncentračnom rozmedzí 0,1 až 1 pM v PBS. Pri uvedenom meraní sa použili tieto činidlá: (i) 1 000 jednotiek rezonancie (RU) biotinovaného rekombinantného FN fragmentu 7B89, ktorý je imobilizovaný na čipe potiahnutom streptavidínom, ktorý sa špecificky viazal 250 RU scFv; (ii) 200 RU rekombinantného ED-B, chemicky imobilizovanom na N-terminálnej aminoskupine, ktorá sa špecificky viaže 600 RU scFv; (iii) 3500 RU fibronektínu WI38VA bohatého na ED-B (uvedené v príklade 3), ktorý sa špecificky viazal 150 RU scFv. Kinetická analýza dát sa uskutočnila podľa inštrukcií výrobcu. Na základe kvalitatívnej BlAcore analýzy supernatantov obsahujúcich protilátky sa vybrala jedna afinitne maturovaná verzia každého scFv klonu: kloň CGS-1 z výberu pomocou fragmentu 78B9 aa CGS-2 z výberu s ED-B rekombinantným FN fragmentom. V tabuľke č. 1 sú uvedené asociačné rýchlostné konštanty (k_on) a disociačné rýchlostné konštanty (kon) spolu s vypočítanými rovnovážnymi disociačnými konštantami (Kd) scFv a pôvodného klonu 28SI. Hoci oba klony CGS-1 a CGS-2 majú K_d v nanomolámom rozmedzí, kloň CGS-2 má najväčšie zlepšenie v porovnaní s rodičovským klonom. Jeho K_d vzhľadom na všetky tri testované proteíny na senzorovom čipe (tabuľka č. 1) je 1 nM (pôvodná hodnota bola 110 nM). Vylepšenie sa uskutočnilo hlavne pomalšou kinetickou disociačnou konštantou ( približne 10⁴ s'¹), čo sa meralo monomerickými protilátkovými prípravkami (dáta nie sú uvedené).

Stratégia maturácie sa javí byť všeobecnou a poskytuje protilátky so zlepšenou afinitou proti proteínu, ktorý sa viaže na maltózu, cytochrómu C, extracelulámcj doméne myšieho endoglíinu (D. N., L. Wyder, R. Klemenz), cytomegalovírusu (A. P, G. Neri, R. Botti, P. N), jadrovému nádorovému markerovému HMGI-C proteínu (A. P., P. Saldani, V. Giancotta, P. N.) a placentovej alkalickej fosfatáze, čo je marker nádoru vaječníkov (M. Deonarain and A. A. Epenetos). Stratégia sa preto zdá byť najmenej rovnako účinná ako iné maturačné stratégie (Marks et al., (1992), Bio/Technology, 10, 779 - 783; Low et al., 1996) a výsledkom sú protilátky s rovnakými afinitami ako tie získané z veľmi veľkých fágových protilátkových knižníc (Griffiths et al., (1994), EMBO J. 13, 3245 - 3260; Vaughan et al., (1996), Náture Biotechnol., 14, 309 - 314).

Afinitné maturované klony CGS-1 a CGS-2 sa sekvenovali a zaniesli sa do databázy génov ľudských zárodočných protilátok V (V-BASE), potom sa prekladali s použitím softvéru MacVector. Gén VH oboch klonov bol najviac homológny s ľudskou zárodočnou líniou DP47 (VH3) a navyše každý kloň mal rôzne sekvencie VH CDR3 (obr. č. 1). Gén VL oboch klonov zárodočnej línie DPL16 sa použil pri konštrukcii repertoáru ľudského syntetického scFv, ako opisuje (Nissim et al., EMBO J. 13, 692 - 698 (1994)). Sekvencie VL CDR3 sa líšia jedna od druhej štyrmi zo šiestich náhodných zvyškov (obr. č. lb).

Tabuľka č. 1

Kinetické a disociačné konštanty monomémych scFv fragmentov CGS-1 a CGS-2 k proteínom obsahujúcim doménu ED-B

Antigén	ED-B	7B89	FN WÍ38VA
ScFv	CGS-1	SI28	CGS-2	CGS-1	SI28	CGS-2	CGS-1	SI28	CGS-2
	7,0.10'³	2,7.10⁴	1,5.10⁴	3,9.10'^J~j	3,0.10'¹	2,3.10⁴	5,0.10⁴	7,1.10⁴	6,5.10⁴
UM-'s·¹)*	1,3.10⁵	2,5.10⁵	1,3.10⁵	1,1.10^5-	2,9.10⁵	1,1.10⁵	4,1.10^7-	1,2.10⁶	2,9.10⁵
K_d(M)*	5,4.10^	1,1.10'⁷	1,1.10 ⁴	3,5.10⁸	1,0.10'⁷	2,1.10⁴	1,2.10⁴	5,9.10⁴	2,4.10'’

Legenda k tabuľke č. 1

Experimenty sa uskutočnili spôsobom, ktorý sa opisuje v sekcii materiály a metódy.

*hodnoty k₀,_T a k_on dosahujú presnosť +/- 30 %, čo závisí od presnosti stanovenia koncentrácie a vo vzťahu k mierne odlišným výsledkom, ktoré sa získali, keď sa použili odlišné oblasti senzogramov. K_d = k₍.fA,.„.

Príklad 3: Špecifickosť afinitných maturovaných scFvs pri fibronektínoch, ktoré obsahujú ED-B.

Imunoreaktivita dvoch afinitných maturovaných scFvs, CGS-1 a CGS-2 sa spočiatku odhadla pomocou testu ELISA a porovnala sa priamo mAb BC-1 (ktoré rozpoznávajú izoformu B-FN) a mAb IST-6, ktoré rozpoznávajú iba izoformy FN, ktorým chýba doména ED-B (Camemolla et al., J. Celí Biol. 108, 1139 - 1148 (1989); Camemolla et al., J. Biol Chem. 24689 - 24692 (1992)). Potom prebehla analýza špecifickosti s použitím extenzívneho panelu fragmentov FN, ktoré sa získali aplikáciou termolyzínu, a rekombinantných fúznych proteínov.

Antigény, ktoré sa použili v teste ELISA a pri imunoblotovani, sa pripravili nasledovne. FN sa čistil z ľudskej plazmy a z upraveného média pre bunkovú líniu WI38VA13, ako sa opisuje v publikácii Zardi et al., EMBO J. 6, 2337 - 2342 (1987). Čistené FN sa_ štiepili termolyzinom (proteáza typ X; Sigma Chemical Čo), ako sa opisuje v publikácii Camemolla et al., J. Celí Biol. 108, 1139 -

- 1148 (1989). Natívne fragmenty FN s molekulovou hmotnosťou 110 000 (B-) a (B+) s molekulovou hmotnosťou 120 000 (obr. č. 2) sa čistili po štiepení FN, ako sa opisuje v publikácii (Borsi et al., Anál. Biochem. 192, 372 - 379 (1991)). Veľká izoforma tenaskínu-C sa čistila, ako sa opisuje v publikácii Saginati et al., Eur J. Biochem. 205, 545 -

- 549 (1992)). Rekombinantné proteíny sa exprimovali a čistili, ako sa opisuje v príklade 1. SDS-PAGE a westemové blotovanie sa uskutočňuje, ako sa opisuje v publikácii Camemolla et al., J. Celí Biol. 108, 1139- 1148 (1989).

Všetky antigény, ktoré sa užívali pri teste ELISA, sa nariedili roztokom PBS na koncentráciu v rozmedzí 50 až 100 pg/ml a potiahli sa pri teplote 4 °C na bunky Imuno-doštičiek (Nunc, Roskilde, Denmark). Nenaviazané antigény sa odstránili premytím PBS a doštičky sa potom blokovali roztokom PBS s 3 % (m/v) bovinným sérovým albumínom (BSA) počas 2 hod. pri teplote 37 °C. Potom nasledovali štyri premytia roztokom PBS a 0,5 % Tween 20 (PBST). Protilátky sa potom nechali naviazať pri teplote 37 °C počas 1,5 hod.; scFv sa preinkubovali s antisérom, ktoré je určené proti sekvencii tag: mAb M2 (Kodak, New Haven CT) pre FLAG tag alebo 9E10 (ATCC, Rockville, MD) pre myc tag. Ako kontrolné protilátky sa použili mAb BC-1 a IST-6. Po štyroch premytiach roztokom PBST sa platne inkubovali počas 1 hod. pri teplote 37 °C s biotínom značenými kozími protilátkami IgG (Bto-SPA Division, Milan, Taliansko) riedenými 1 : 2000 (v roztoku PBST + + 3 % BSA). Premytie sa opakovalo a pridal sa komplex streptavidín - biotinovaná alkalická fosfatáza (Bio-SPA Di vision, Milan, Taliansko) (riedený 1 : 800 v roztoku PBST, ktorý obsahuje 2 mM MgCl₂) počas 1 hod. pri teplote 37 °C. Reakcia sa vyvinula s použitím tabliet ťosfatázového substrátu (Sigma) v 10 % dietanolamínu, pH 9,8 a optická hustota sa odčítala pri vlnovej dĺžke 405 nm. Výsledky sú uvedené v tabuľke č. 2.

Tabuľka č. 2

	CGS-1	CGS-2	BC-1	IST-6
FN plazmy	0,07	0,04	0,09	1,73
FN WI38VA	1,16	0,72	1,20	1,12
nllOkD(B-)	0,03	0,01	0,05	1,20
nl20kD(B+)	0,82	0,81	1,20	0,02
rec FN7B89	1,11	1,02	1,02	0,01
rec FN789	0,01	0,01	0,05	1,25
rec ED-B	1,21	1,32	0,15	0,04
rec FN-6	0,01	0,01	0,08	0,03
tenaskín	0,01	0,02	0,06	0,02

Imunoreaktivita scFv a monoklonálnych protilátok s antigénmi odvodenými od fibronektínu sa merala testom ELISA. Hodnoty reprezentujú OD merané pri vlnovej dĺžke 405 nm po subtrakcii signálu pozadia. Dáta sú priemer zo štyroch experimentov, ktoré majú maximum 10 % štandardnej odchýlky.

Identita rôznych foriem fibronektínu používaného v experimente je nasledujúca: Plazmový FN- ľudský plazmový fibronektín; WI38-VA FN = fibronektín zo supematantov fíbroblastov transformovaných SV-40 (Zardi et al., EMBO J. 6, 2337 - 2342 (1987)); nl 10kD = domény 4 fibronektínu ošetreného termolyzínom bez ED-B; nl20kD = domény 4 fibronektínu ošetreného termolyzínom s ED-B; rec FN7B89 = doména ED-B, ktorá je lemovaná priľahlými FN homológnymi repetíciami typu III s doménou ED-B; rec ED-B = samotný rekombinantný ED-B; rec FN6 = doména 6 rekombinantného FN.

CGS-1 a CGS-2 rozoznávali rekombinantný peptid ED-B, rovnako ako natívne alebo rekombinantné fragmenty FN, ktoré obsahujú sekvenciu ED-B, zatiaľ čo sa nenaviažu na žiadny fragment FN, ktorému chýba ED-B. Navyše CGS-1 a CGS-2 nereaguje s tenaskínom (ktorý obsahuje 15 homológnych repetícií typu III, ako sa opisuje v publikácii Síri et al., Nucl. Acids Rcs 19, 525 - 531 (1991)) a s plazmovým FN, ktorý v produktoch štiepenia termolyzínom neobsahuje detegovateľné množstvo sekvencie ED-B (Zardi ct al., EMBO J. 6, 2337 - 2342 (1987)). Naopak CGS-1 a CGS-2 silne reaguje s FN, ktorý sa čistil z bunkovej línie WI38VA transformovanej SV-40. Približne 70 až 90 % molekúl FN z tejto bunkovej línie obsahuje ED-B, ako sa ukazuje pri štiepení termolyzínom a v experimentoch s SI nukleázou s použitím čisteného FN a celkovej RNA, ktorá sa získala z bunkovej línie (Zardi et al., EMBO J. 6, 2337 - 2342 (1987); Borsi et al., Exp. Celí Res. 199, 98 - 105 (1992b)). Špecifickosť scFvs pre ED-B komponent FN sa demonštrovala použitím rozpustného rekombinantného ED-B s cieľom inhibicie viazania CGS-1 a/alebo CGS-2 na FN buniek WI38VA (dáta nie sú uvedené).

Dáta potvrdili, že CGS-1 a CGS-2 reagujú špecificky iba s derivátmi FN, ktoré obsahujú doménu ED-B. Obe majú rovnakú reaktivitu ako mAb BC-1, okrem v prípade rekombinantnej ED-B, ktorú nerozoznávajú BC-1. Intenzita získaných signálov testu ELISA, vo vzťahu k mAb kontrolám, odráža vysokú špecifickosť dvoch scFvs pre antigény obsahujúce ED-B.

Špecifickosť CGS-1 a CGS-2 sa skúmala ďalej na imunoblotoch s použitím FN z plazmy a buniek WI38V a produktov po štiepení FN termolyzínom. Po štiepení termolyzinom FN z buniek WI38VA (väčšina z nich obsahuje ED-B) vzniká fragment s molekulovou hmotnosťou 120 000 (obsahujúci ED-B) a minoritný fragment s molekulovou hmotnosťou 110 000, ktorému chýba oblasť ED-B (uvedené na obr. č. 2; Zardi et al., EMBO J. 6, 2337 - 2342 (1987)). Ďalšie štiepenie domény s molekulovou hmotnosťou 120 000 generuje dva fragmenty; fragment s molekulovou hmotnosťou 85 000, ktorý obsahuje na svojom C-konci skoro celú sekvenciu ED-B a sekvenciu s molekulovou hmotnosťou 35 000 (obr. č. 2a; Zardi et al., EMBO J. 6, 2337 - 2342 (1987)).

Na ľavej strane obr. č. 2B jc Comassieovou modrou zafarbený gél proteínových frakcií, ktoré sa analyzovali imunoblotom. CGS-1 a CGS-2 nerozoznali plazmový FN (dráha 1) a produkt proteínu štiepencho termolyzínom (dráha 3 obsahuje proteín s molekulovou hmotnosťou 110 000 a dráha 4 obsahuje produkt štiepenia proteínu s molekulovou hmotnosťou 110 000). Naopak FN z buniek WI38VA bohatý na ED-B, oba intaktné (dráha 2) a po zvýšenom štiepení termolyzínom (dráhy 5, 6 a 7) boli rozoznávané oboma fragmentmi scFvs. Najmenší fragment získaný z FN, ktorý by mohol byť špecificky rozoznaný CGS-1, bol proteín s molekulovou hmotnosťou 120 000 (zahrnuje repetície 2 až 11 typu III), zatiaľ čo CGS-2 je schopná rozoznať fragment s molekulovou hmotnosťou 85 000, ktorý zahrnuje repetície 2 až 7 vedľa N-konca ED-B (obr. č. 2B; Zardi et al., EMBO J. 6, 2337 - 2342 (1987)). Tieto výsledky indikujú, že scFvs reagujú s odlišnými epitopmi v sekvencii ED-B. Naviazanie CGS-2 na doménu s molekulovou hmotnosťou 85 000 indikuje, že epitop tohto klonu leží na N-konci ED-B. Naopak, CGS-1 sa nenaviaže, keď je doména s molekulovou hmotnosťou 120 000 štiepená na fragment s molekulovou hmotnosťou 85 000, čo znamená, že rozoznáva epitop, ktorý sa nachádza skôr na C-konci ED-B molekuly.

Špecifickosť CGS-1 a CGS-2 sa ďalej skúmala imunoblotovaním s použitím rekombinantných fragmentov FN a fúznych proteínov, ktoré obsahujú alebo neobsahujú sekvenciu ED-B. Fúzne proteíny FN sa pripravili spôsobom, ako sa opisuje v publikácii Camemolla et al., J. Celí Biol. 108, 1139 - 1148 (1989). Výsledky týchto experimentov sú uvedené na obr. č. 3; v publikácii Camemolla et al., J. Biol. Chem. 24689 - 24692 (1992) sa uvádza spojenie schematického diagramu so štruktúrou domén ľudského FN. Získané väzbové profily v podstate potvrdzujú, čo sa zistilo testami ELISA a imunoblotmi s čisteným FN a produktmi proteolytického štiepenia: CGS-1 a CGS-2 silne reagovali s fragmentmi FN, ktoré obsahovali ED-B (dráha 2 a 4), ale nemajú žiadnu reaktivitu so sekvenciami FN, ktoré neobsahujú ED-B (dráhy 1 a 3). CGS-1 nereagujú ani s ľudským (dráha 5) ani s kuracím (dráha 6) fúznym proteínom ED-B, zatiaľ čo CGS-2 reagujú silne s oboma fragmentmi (obr. č. 3). Tento výsledok môže odrážať isté konformačné obmedzenie epitopu vo FN, ktorý obsahuje ED-B a ktorý je rozoznávaný CGS-1; je napríklad možné, že epitop je citlivý k denaturácii alebo je porušený pri frakcionácii SDS-PAGE a prenosu na pevný podklad, ktorým môže byť napríklad nitrocelulóza.

Spolu tieto výsledky demonštrujú, že CGS-1 a CGS-2 sa silne a špecificky viažu na FN obsahujúci ED-B v oblastiach, ktoré sa od seba líšia a líšia sa tiež od ED-B štruktúry, ktorú rozoznávajú mAb BC-1.

Príklad 4: Použitie afinitných maturovaných anti-ED-B scFvs pri imunocytochemickom farbení ľudských a myších nádorov.

CGS-1 a CGS-2 sa používajú pri imunolokalizácii molekúl FN, ktoré obsahujú ED-B v rôznych normálnych a neoplastických ľudských tkanivách. V prípade normálneho tkaniva sa vybrala koža, pretože o B-FN izoforme sa vie, že sa exprimuje v makrofágoch a fibroblastoch počas hojenia kožných poranení (Camemolla et al., J. Celí Biol. 108, 1139 - 1148 (1989); Brown et al., Amer. J. Pathol. 142, 793 - 801 (1993). Pri dvoch vybraných ľudských nádoroch sa analyzovala špecifickosť farbenia pomocou antifibronektínových mAbs: detailnejšie sa študovala multiforma glioblastómu, pretože endoteliálne bunky v cievach tohto nádoru sú v štádiu vysokej proliferácie so zvýšenou angiogenézou, čo zahrnuje aj expresiu izoforiem B-FN (Castellani et al., Int. J. Cancer 59, 612 - 618 (1994). Navyše pri štúdiu s použitím odlišného panelu normálnych, hyperplastických a neoplastických tkanív ľudského prsníka sa získal ďalší dôkaz korelácie medzi angiogenézou a expresiou B-FN (Kaczmarek et al., Int. J. Cancer 58,11 - 16 (1994)).

V tu opísaných experimentoch sa imunohistochemické farbenie CGS-1 a CGS-2 porovnalo s farbením mAb BC-1 (ktorá rozoznáva izoformu B-FN) a s ďalšími mAb, o ktorých sa vie, že reagujú buď so všetkými známymi izoformnými variantmi FN (IST-4) alebo iba s izoformami FN, ktoré nenesú ED-B (IST-6). Charakterizácia všetkých týchto kontrolných protilátok je uvedená v publikáciách Carnemolla et al., J. Celí Biol. 108, 1139 - 1148 (1989) a Carnemolla et al., J. Biol. Chem. 24689 - 24692 (1992).

Zo vzoriek odobratých počas operácie sa získali normálne a neoplastické tkanivá. Už skôr sa zistilo, že na presnú a citlivú detekciu molekúl, ktoré obsahujú FN, je kritická príprava a fixácia tkanív (Castellani et al., Int. J. Cancer 59, 612 - 618 (1994)). Pri imunohistochemickej analýze sa 5 pm hrubé kryostatické sekcie sušili na vzduchu a fixovali sa chladným acetónom počas 10 minút. Imunofarbenie sa uskutočnilo s použitím farbiaceho kitu s komplexom streptavidín-biotínalkalická fosfatáza (Bio-SPA Division, Milan, Taliansko) a naftol-AS-MX-fosforečnanu a Fast Red TR (Sigma). Ako kontrastné farbivo sa použil Gillov hematoxylín a potom nasledovala fixácia v glycergéli (Dáko, Carpenteria, CA), ako sa opisuje v publikácii Castellani et al., Int. J. Cancer 59, 612 - 618 (1994). S cieľom analyzovať špecifickosť ďalej v experimentoch, kde sa získalo pozitívne farbenie tkanív, sa špecifickosť pre ED-B demonštrovala preinkubáciou protilátok s rekombinantnou ED-B doménou, po čom nasleduje detekcia, ako sa opisuje v texte.

Výsledky týchto experimentov ukazujú, že tak CGS-1, ako CGS-2 reagujú s rovnakými histologickými štruktúrami, ako mAb BC-1. Patern farbenia, ktorý sa získal s kožou s použitím CGS-1, CGS-2 a BC-1, odráža neprítomnosť ED-B vo FN, ktorý sa exprimoval v koži. Pri farbení sekcií invazívneho duktálneho karcinómu protilátky CGS-1,

CGS-2 a BC-1 majú distribúciu farbenia obmedzenú na hranicu medzi neopiastickými bunkami a strómou. To je v súlade so skutočnosťou, že hoci celkové FN je homogénne distribuované celou strómou nádoru, expresia B-FN je obmedzená do určitých oblastí. Sú to tie oblasti invazívneho duktálneho karcinómu, kde sa B-FN úspešne lokalizovali (v 95 % prípadov) s použitím mAb BC-1 (Kaczmarek et al., Int. J. Cancer 58,11 - 16(1994)).

Potvrdil sa predchádzajúci nález sfarbenia protilátok BC-1 glioblastómového multiformného nádoru. V publikácii Castellani et al., Int. J. Cancer 59, 612 - 618 (1994) sa pozoruje typický patem farbenia vaskulámych štruktúr, ktoré sú podobné glomerulámym, a v uvedených experimentoch sa zistilo, že protilátky CGS-1 a CGS-2 majú kvalitatívne identické výsledky.

Existuje však dôležitý rozdiel medzi CGS-1 a CGS-2 a mAb BC-1: ukázalo sa, že dva ľudské scFv sa viažu na kurací a myší B-FN, zatiaľ čo BC-1 je striktne špecifický len pre človeka. CGS-2 reagovala s kuracími embryami (dáta nie sú uvedené) a CGS-1 a CGS-2 reagovali s myšími nádormi.

Tiež sa preukázalo CGS-1 farbenie vaskulámych štruktúr v sekciách myšieho teratokarcinómu F9. Na rozdiel od toho, všetky testované normálne myšie tkanivá (pečeň, slezina, obličky, žalúdok, tenké črevo, hrubé črevo, vaječníky, maternica, močový mechúr, pankreas, suprarenálne žľazy, skeletálny sval, srdce, pľúca, štítna žľaza a mozog) majú negatívnu farbiacu reakciu s protilátkami CGS-1 a CGS-2 (dáta nie sú uvedené). S použitím rekombinantnej ED-B domény, ktorá celkom inhibuje získané farbenie (dáta nie sú uvedené), sa ukázalo, že štruktúry zafarbené v sekciách teratokarcinómov F9 sú ED-B špecifické.

Príklad 5: Použitie afinitných maturovaných anti-ED-B scFvs pri in vivo cielenom zavádzaní do ľudských nádorov

Pre vývoj xenoimplantovaných nádorov pri 6 až 10 týždňov starých holých myšiach (Balb-c alebo MF-1; Harlan UK), keď sa zaviedlo 1 x 10⁷ buniek do boku jednej myši podkožnou injekciou, sa použila bunková línia SKMEL-28 ľudského melanómu. Myšiam, ktoré niesli nádory, sa aplikovala do chvostovej cievy injekcia so 100 pl roztoku scFvl-Cy71 v PBS s koncentráciou 1 mg/ml, keď nádory dosiahli približný priemer 1 cm.

Značenie rekombinantných protilátok s CY7 sa dosiahlo pridaním 100 μΐ IM hydrogenuhličitanu sodného, pH 9,3 a 200 μΙ CY7-bis-Osu (Amcrsham; Cat. Nr. PA 17000; 2 mg/ml v DMSO) do 1 ml roztoku protilátok v PBS (1 mg/ml). Po 30 minútach pri teplote miestnosti sa do zmesi pridalo 100 μ] 1 M Tris pH=7, 4 a značené protilátky sa separovali od nezreagovaného farbiva s použitím kolón PD10 na jedno použitie Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA). Tieto kolóny sa uviedli do rovnováhy roztokom PBS. Eluované zelené frakcie protilátok sa koncentrovali na koncentráciu približne 1 mg/ml s použitím skúmaviek Centricon-10 (Amicon, Beverly, MA, USA). Dosiahnutý pomer značenia bol všeobecne blízko hodnote 1 molekula CY7: jedna molekula protilátok. To sa odhadlo spektroskopicky v 1 cm kyvetách za predpokladu, že roztok protilátok s koncentráciou 1 mg/ml má pri vlnovej dĺžke 280 nm hodnotu absorbancie 1, 4 jednotiek. Molámy extinkčný koeficient CY7 pri vlnovej dĺžke 747 nm je 200 000 (M^cm’¹), pričom sa zanedbáva hodnota absorbcie CY7 pri vlnovej dĺžke 280 nm. Imunoreaktivita vzoriek protilátok po značení sa potvrdila posunom pásov (Neri et al., Bio/Techniques, 20, 708 - 713 (1996b)), afinitnou chromatografiou na kolóne s antigénom alebo analýzou BIAcore. Myš bola snímaná postaveným snímačom myší v pravidel ných časových intervaloch pri anastéze, ktorá sa dosiahla inhaláciou zmesi kyslíka/fluorotanu. S cieľom zistenia reprodukovateľnosti výsledkov sa v prípade každej vzorky študovalo 2 až 8 zvierat. Prebehli procedúry podľa projektu D. Neri UK Project Licence „Tumour Targeting“ (UK PPL 80/1056).

Infračervený snímač myší sa postavil ako modifikácia fotodetekčného systému podľa publikácie Fólii, et al., (1994), Cancer Res., 54, 2643 - 2649, ktorý umožňuje použitie infračerveného fluoroforu CY7. Infračervená iluminácia sa vybrala s cieľom dosiahnutia lepšej penetrácic tkaniva. Fluorescencia CY7 (vlnová dĺžka je väčšia ako 760 nm) je ľudským okom neviditeľná a je nutné použiť počítačom riadenú CCD kameru. Snímač myší sa skladá zo skrinky nafarbenej čiernou farbou a utesnenej pred vstupom svetla, vybavenej 100 W volfrámovou halogénovou lampou s excitačným filtrom s priemerom 50 mm, ktorý sa špecificky navrhol pre CY7 (Chromá Corporation, Brattleboro, VT, USA; 673 - 748 nm). Výsledný iluminačný lúč je pri dobrom priblížení homogénny v oblasti s veľkosťou 5x10 cm, do ktorej sa umiestnila myš na snímanie. Fluorescencia sa detegovala osembitovou monochromatickou Pulnix CCD kamerou, vybavenou C-orámovanou šošovkou a 50 mm emisným filtrom (Chromá Corporation, Brattleboro, VT, U-SA; 765 - 855 nm) a systémom ImageDok (Kinetic Imaging Ltd., Liverpool, UK). Tento systém obsahuje počítač vybavený pohlcovačom žiarenia a softvérom na integráciu sekvenčných obrázkov. Pri postupe spriemerňovania sa v typickom prípade snímajú tri sekvenčné obrázky v 50 ms; tento počet sa udržuje konštantný pri sériách obrázkov jedného zvieraťa, aby sa umožnilo priame porovnanie cieleného zavádzania do nádorov v rôznych časových okamihoch. Obrázky vo formáte T1FF sa potom previedli do fajlov PICT s použitím programu Graphics Converter a spracovali sa s použitím programu MacDraw Pro na počítači Power Macintosh 7100/66.

Schéma prístroja je uvedená na obr. č. 4.

Tieto experimenty ukázali, že obidva scFv, ktoré sa nachádzajú v nádore, sa vizualizovali v makroskopickom meradle.

Mikroskopická demonštrácia cielenia neovaskulatúry vyvíjajúceho sa nádoru s dvoma anti-ED-B scFvs je detailnejšie opísaná ďalej v texte.

Holým myšiam a/alebo myšiam SCID, ktoré nesú vo svojom boku xenoimplantované bunky SKMEL-28 ľudského melanómu alebo myšieho F9 teratokarcinómu, sa aplikovali injekciou buď neznačené fragmenty scFv s FLAG tag, alebo biotinované fragmenty scFv.

Myši sa usmrtili v rôznych časových intervaloch po injekcii, odobrali sa nádorové a nenádorové sekcie, ktoré sa potom zafarbili podľa bežného imunohistochemického protokolu s použitím buď anti-FLAG M2 protilátok (Kodak, 181), alebo detekčných činidiel založených na streptavidíne. Optimálne cielené zavádzanie sa všeobecne dosiahlo 12 hodín po injekcii. Ukázalo sa, že protilátky CGS1 a CGS2 sa viažu na neovaskulatúru xenoimplantovaného nádoru a myšieho teratokarcinómu.

Príklad 6: Cielené zavádzanie xenoimplantovaného myšieho F9 teratokarcinómu do holých myší.

Po zavedení podkožnej injekcie 4 x 106 buniek myšieho F9 teratokarcinómu sa na boku holých myší vyvinuli pevné nádory. Tento nádor rastie pri myšiach veľmi rýchlo, približne po jednom týždni po injekcii dosahuje priemer 1 cm a je vysoko vaskularizovaný. Na zobrazenie cieleného zavádzania protilátok sa použila modifikácia fotodetekčnej metódy podľa publikácie Fólii, et al., (1994), Cancer Res.,

54, 2643 - 2649, ktorá umožňuje kinetické zhodnotenie cieleného zavádzania do nádoru a zmien na nádore po aplikácii protilátok pri rovnakých zvieratách v rôznych časových okamihoch, ako sa opisuje detailnejšie v texte (obr. č. 4).

S cieľom cieleného zavádzania do nádoru a uskutočnenia detekcie protilátok, scFv(CGS-l), scFv(CGS-2) a antilysozým scFv(Dl. 3) (McCafferty j., Griffiths, AD, Winter, G, Chiswell, D. J. (1990) Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. Náture (London), 348, 552 - 554) boli pripojené s homodimerizačným tágom (Pack et al., (1993), Bio/Technology, II, 1271 -

- 1277) subklonovaním protilátok do reštrikčných miest Sfil/Notl expresívneho vektora pGIN50. Tento vektor je odvodený z pDN268 (Neri et al., (1996b), Náture Biotechnology, 14, 385-390), v ktorom je Hisó sekvencia tag nahradená sekvenciou: GGC LTD TLQ AFT DQL EDE KSA LQT EIA HLL KEK EKL EFI LAA H, ktorá obsahuje cysteínový zvyšok a amfípatický helix proteínu Fox pre kovalentnú homodimerizáciu fragmentov protilátok (Abate et al., 1990). Nedosiahla sa celková kovalentná dimerizácia: približne 30 až 50 % fragmentov protilátok tvorilo kovalentne spojené diméry.

Fragmenty protilátok sa čistili afinitnou chromatografiou na kolónach získaných spojením lysozýmu zo slepačích vajec (Dl. 3) alebo 7B89 (anti-ED-B protilátky; Carnemolla et al., J. Biol. Chem. 24689 - 24692 (1992)) so sefarózou aktivovanou CNBr (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA). Supematanty sa naniesli na afinitný podklad, ktorý sa potom premyl PBS, s PBS + 0,5 M NaCl a eluoval sa 100 mM Et₃N. Protilátky sa potom dialyzovali proti PBS. Protilátky sa značili spôsobom, ktorý sa opisuje v texte, a potom sa zaviedli injekciou do chvostovej cievy myší, ktoré nesú nádor. Injekcia obsahovala 100 μΐ roztoku csFv₁-Cy7_] v PBS a aplikovala sa v okamihu, keď nádory dosiahli priemer približne 1 cm.

Ako sa ukázalo na obr. č. 5, scFv(CGS-l) sa lokalizovali na nádore do troch dní. V tomto čase tiež zmizol nádor. Objavilo sa však tiež sfarbenie femuru. Cielené zavádzanie protilátok CGS-1 do nádoru sa významne vylepšilo zavedením amfipatického helixu, ktorý obsahuje cysteínový zvyšok na C-konci, aby došlo k podporeniu dimerizácie protilátok (Pack et al., (1993), Bio/Tcchnology, 11, 1271 -

- 1277). V skutočnosti lokalizácia dimérov scFv(CGS-2)₂sa neprejavila podstatným zvýšením z 24 na 72 hodín. Naopak negatívna kontrola (dimerické protilátky scFv (D 1,3)2, anti-lysozýmové protilátky) má rýchle zmiznutie a nedetegovateľnú lokalizáciu na nádore alebo femure.

ScFv(28SI) má slabé cielenie do nádoru po 6 hodinách (dáta nie sú uvedené), ale nebolo delegované po 24 hodinách alebo neskôr (obr. č. 6). Afinitná maturácia vedie k vylepšeniu cieleného zavádzania; potom scFv(CGS-2) sa cielene zavádza do malých a veľkých F9 nádorov s vysokou účinnosťou, keď sa vyskytuje ako monomér (obr. č. 6) alebo dimér (dáta nie sú uvedené). Po dvoch dňoch sa zistilo, že v nádore pretrvávajú 2 % injektovanej dávky protilátok na gram nádoru v prípade scFv(CGS-2) monoméru a v prípade scFv(CGS-2) diméru to sú 3 až 4 %. Dávka zavedená do nádoru pomocou scFv(CGS-2) bola tiež vyššia než v prípade scFv(CGS-l) (obrázky č. 5 a 6) a koreluje s ich afinitou (tabuľka č. 1). ScFv(28SI) a scFv(CGS-l) sa javia byť náchylné k proteolytickému štiepeniu a majú vysoké pohltenie pečeňou (obr. č. 6), zatiaľ čo protilátky scFv(CGS-l) sú podstatne viac stabilné a sú menej pohlcované pečeňou (obr. č. 5).

ZOZNAM SEKVENCIÍ (1) VŠEOBECNÉ INFORMÁCIE:

(i) PRIHLASOVATEĽ:

(A) MENO: PHILOGENS. r. 1.

(B) ULICA: ViaRoma22 (C) MESTO: SIENA (E) ŠTÁT: TALIANSKO (F) PSČ: 53100 (ii) NÁZOV VYNÁLEZU: PROTILÁTKY PROTI ED-B DOMÉNE FIBRONEKTÍNU, ICH KONŠTRUKCIA A POUŽITIE (iii) POČET SEKVENCIÍ: 12 (iv) STROJOVO ČITATEĽNÁ FORMA:

(A) TYP MÉDIA: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC kompatibilný (C) OPERAČNÝ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTVÉRE: Patentin Release #1.0, Verzia # L 90 (EPO) (v) ÚDAJE O PRIHLÁŠKE:

ČÍSLO PRIHLÁŠKY: PCT/GB97/01412 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 4 aminokyseliny (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH REŤAZCA: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 1:

Ser Leu Pro Lys (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 12 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH REŤAZCA: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 2:

Gly Val Gly Ala Ptie Arg Pro Tyr Arg Lys His Glu

5 10 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 17 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 3:

CAGGAAACAG ctatgac

2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 51 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 4:

CTTGGTCCCT CCSCCGAATA CCACMNNMNN TACAGTAATA gtcagcctc

MNNMNNMNNM NHAGAGGAGT 6&

2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 54 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO5:

ATTGCTTTTC CTTTTľGCGG CCGCGCCTAG GACGGTCAGC TTGGTCCCTC CGCC 54

2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 43 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH REŤAZCA: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 6:

Gíy Gly Cys Thr Asp Thf Leu Gin Ala Phe Tnr Asp Gin Lôu Glu

5 1015

Asp Gíu Lys Ser Ala Leu Gin Tnr Glu lle Ala His Leu Leu Lys Glu 20 2530

Lys Glu Lys Leu Glu Phe lle Leu Ala Ala His

3540

2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 8 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH REŤAZCA: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 7:

Pro Val Val Leu Asn Gly Va| Val

5

2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 8 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH REŤAZCA: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 8:

Pro Phe Glu His Asn Leu Val Vsi

5

2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 113 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH REŤAZCA: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA. lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: protein (vi) ZDROJ PÔVODU (B)KMEŇ: CGS1 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 9:

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 1016

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 2530

Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly lys Gly Leu Glu Trp Val 35 eo45

Ser Ala lle Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 5560

Lys Gly Arg pne Thr lle Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 7580

Leu Gin Mal Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 65 S065

Ala Arg Ser Leu Pro Lys Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105no

2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 121 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH REŤAZCA: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (i i) DRUH MOLEKULY: protein (vi) ZDROJ PÔVODU (B) KMEŇ: CGS2 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 10:

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Aia Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 2530

Ala Met Sar Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp val 35 4045

Ser Ala ne Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser val 50 5560

Lys Gly Arg Phe Thr lle Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 55 70 75gc

Leu Gin Mei Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 9095

Ala Arg Giy Val Gly Ala Pne Arg Pro Tyr Arg Lys His Glu Trp Gly 100 105110

Gm Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg

115120

2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 109 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH REŤAZCA: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: protein (vi) ZDROJ PÔVODU (B)KMEŇ: CGS1 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 11:

SK 285916 Β6

Ser Ser Glu Leu Thr Gin Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gin 15 10|5

Thr Val Arg Ile Thr Cys Gin Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala 20 2530

Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

4045

Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 5560

Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gin Ala Glu 65 70 7560

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser Pro Val Val Leu Asn Gly 85 9095

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105

2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 109 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH REŤAZCA: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: proteín (vi) ZDROJ PÔVODU (B) KMEŇ CGS2 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 12:

Ser Ser Glu Leu Thr Gin Asp Pro Aia val Ser Vai Ala Leu Gly Gin 1 5 10-,5

Thr val Arg Ile Thr Cys Gin Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala 20 2530

Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 4045

Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Pne Ser Gly Ser 50 5580

Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gin Ala Glu 65 70 7580

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser Pro PhB Glu His Asn Leu 85 9095

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Izolovaná protilátka alebo jej fragment, ktorá je špecifická k onkofetálnej doméne ED-B fibronektínu (FN) a priamo sa na ňu viaže, kde táto protilátka alebo fragment má disociačnú konštantu Kd pre ED-B nižšiu než 6 x x 10^f M, merané ako vyčistený monomér.
2. Izolovaná protilátka alebo jej fragment podľa nároku 1, ktorá obsahuje väzbovú doménu antigénu protilátky ľudského pôvodu.
3. Izolovaná protilátka alebo jej fragment podľa nároku 1, ktorá sa viaže na všetky FN obsahujúce ED-B po spracovaní FN proteázou termolyzinom.
4. Izolovaná protilátka alebo jej fragment podľa nároku 1, ktorá sa viaže na B-FN bez spracovania B-FN N-glykanázou,
5. Izolovaná protilátka alebo jej fragment podľa nároku 1, ktorá má variabilnú oblasť ťažkého reťazca (VH) so sekvenciou odvodenou od ľudskej zárodočnej línie DP47, kodón 1 Glu až kodón 98 Arg vrátane na obr. 1, a sekvenciu CDR3 Ser Leu Pro Lys.
6. Izolovaná protilátka alebo jej fragment podľa nároku 1, ktorá má variabilnú oblasť ťažkého reťazca (VH) so sekvenciou odvodenou od ľudskej zárodočnej línie DP47, kodón 1 Glu až kodón 98 Arg vrátane na obr. 1, a sekvenciu CDR3 Gly Val Gly Ala Phe Arg Pro Tyr Arg Lys His Glu.
7. Izolovaná protilátka alebo jej fragment podľa nároku 1, ktorá má variabilnú oblasť ľahkého reťazca (VL) so sekvenciou odvodenou od ľudskej zárodočnej línie DPL16, kodón 1 Ser až kodón 90 Ser vrátane na obr. 1, a zvyšok sekvencie CDR3 ako Pro Val Val Leu Asn Gly Val Val.
8. Izolovaná protilátka alebo jej fragment podľa nároku

I, ktorá má variabilnú oblasť ľahkého reťazca (VL) so sekvenciou odvodenou od ľudskej zárodočnej línie DPL16, kodón 1 Ser až kodón 90 Ser vrátane na obr. 1, a zvyšok sekvencie CDR3 ako Pro Phe Glu His Asn Leu Val Val.
9. Izolovaná protilátka alebo jej fragment podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8, kde táto protilátka alebo fragment zahŕňa molekulu scFv.
10. Izolovaná protilátka alebo jej fragment podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8, kde táto protilátka alebo fragment zahŕňa dimému molekulu scFv.
11. Izolovaný fragment protilátky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 6 až 8.
12. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa t ý m , že zahŕňa izolovanú protilátku alebo jej fragment podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 11 v účinnom množstve v spojení s farmaceutický prijateľným nosičom.
13. Nukleová kyselina, ktorá kóduje izolovanú protilátku alebo jej fragment podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až

II.
14. Fág, ktorý kóduje izolovanú protilátku alebo jej fragment podľa ktoréhokoľvek z nárokov l až 11.
15. Hostiteľská bunka in vitro transformovaná alebo transfektovaná nukleovou kyselinou podľa nároku 13.
16. Izolovaná protilátka alebo jej fragment podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 11 na použitie v terapii.
17. Použitie izolovanej protilátky alebo jej fragmentu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 11 na výrobu liečiva na cielené zavádzanie do nádorov.
18. Použitie izolovanej protilátky alebo jej fragmentu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 11 na výrobu prostriedku na zobrazovanie nádorov.
19. Spôsob výroby izolovanej protilátky alebo jej fragmentu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 11, vyznačujúci sa tým, že sa exprimuje nukleová kyselina podľa nároku 13 v hostiteľskej bunke in vitro za vzniku uvedenej protilátky alebo jej fragmentu.
20. Spôsob výroby izolovanej protilátky alebo jej fragmentu podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že a) knižnica protilátok alebo ich fragmentov, exprimovaných vo fágu, sa testuje rekombinantným fibronektinovým fragmentom obsahujúcim doménu ED-B odvodeným od fibronektínového proteínu, b) pozitívnymi klonmi sa infikujú hostiteľské bakteriálne bunky, c) pozitívne fágové klony sa podrobia procesu afinitnej maturácie, d) kroky (a) a (b) sa opakujú, pričom dochádza k selekcii pozitívnych klonov so zlepšenou afinitou k antigénu, e) hostiteľské bunky sa infikujú pozitívnymi klonmi a z týchto hostiteľských buniek sa čistia molekuly protilátky.
21. Spôsob podľa nároku 20. vyznačujúci sa t ý m , že stupeň (a) zahŕňa testovanie knižnice fragmentov protilátok, kde fragmenty protilátok sú molekuly scFv.
22. Spôsob podľa nároku 20, vyznačujúci sa t ý m , že molekuly scFv zahŕňajú väzbovú doménu antigénu protilátky ľudského pôvodu.
23. Spôsob podľa nároku 20, vyznačujúci sa t ý m , že stupeň (a) zahŕňa testovanie rekombinantnými antigénmi 7B89 alebo ED-B,
24. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 20 až 23, vyznačujúci sa tým, že nukleová kyselina pozitívneho klonu sa použije na produkciu požadovanej protilátky alebo jej fragmentu, kódovaných touto nukleovou kyselinou, expresiou v hostiteľskej bunke in vitro, pričom požadovaná protilátka alebo jej fragment zahŕňa väzbovú doménu antigénu, ktorá je špecifická k onkofetálnej doméne ED-B fibronektínu (FN) a priamo sa na ňu viaže.
25. Spôsob podľa nároku 24, vyznačujúci sa t ý m , že požadovaná protilátka je vo forme úplnej protilátky.
26. Spôsob podľa nároku 24, vyznačujúci sa t ý m , že požadovaný fragment protilátky je vo forme molekuly scFv.
27. Diagnostický kit, vyznačujúci sa t ý m , že zahŕňa izolovanú protilátku alebo jej fragment podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 11 a jedno alebo viac činidiel, ktoré umožňujú stanovenie väzby tejto protilátky alebo fragmentu na bunky.