SK284879B6

SK284879B6 - Polypeptidy so schopnosťou tvorby väzbových štruktúr na antigén so špecificitou pre Rhesus D antigény, DNA kódujúce také polypeptidy, spôsob ich prípravy a použitie

Info

Publication number: SK284879B6
Application number: SK1761-98A
Authority: SK
Inventors: Sylvia Miescher; Monique Vogel; Beda Stadler; Andreas Morell; Martin Imboden; Hanspeter Amstutz
Original assignee: Zlb Behring Ag
Priority date: 1996-06-24
Filing date: 1997-06-20
Publication date: 2006-01-05
Also published as: NO986088L; PL186019B1; DE69730031T2; IL127595A0; BG103016A; KR100361449B1; SK176198A3; DE69730031D1; ATE272116T1; CA2258494A1; KR20000022530A; ES2224255T3; US7429647B2; PL330794A1; HUP9902605A3; US7399471B2; BG64534B1; RU2204602C2; BR9709958A; EP0920509B1

Abstract

Sú opísané polypeptidy schopné tvorby väzbových štruktúr na antigén, ktoré sú špecifické pre Rhesus D antigény. Získané polypeptidy, ktoré sú Fab fragmenty, sa môžu použiť priamo ako aktívna zložka vo farmaceutických a diagnostických prostriedkoch. Fab a ich DNA sekvencie sa môžu tiež použiť na prípravu kompletných rekombinantných anti-Rhesus D protilátok použiteľných vo farmaceutických a diagnostických prostriedkoch.

Description

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka polypeptidov, ktoré tvoria väzbové štruktúry na antigén so špecifícitou pre Rhesus D antigény a najmä Fab molekúl so špecifícitou pre Rhesus D antigén. Vynález sa tiež týka ich použitia pre farmakologické a diagnostické prípravky. Uvedené Fab fragmenty, ak sú geneticky spracované tak, aby boli časťou kompletných protilátok, sú použiteľné na profylaxiu hemolytickej choroby novorodencov (HDN). Predkladaný vynález poskytuje nové DNA a aminokyselinové sekvencie uvedených polypeptidov.

Tak sa môžu protilátky použiť na ochranu Rh negatívnej ženy pred alebo ihneď po pôrode Rh pozitívneho dieťaťa na zabránenie HDN v nasledujúcich tehotenstvách.

Vynález tiež obsahuje použitie uvedených Fab molekúl buď samostatne, alebo v kombinácii s Fc konštantnými regiónmi ako kompletných protilátok na liečbu iných ochorení, pri ktorých môže byť prínosom použitie anti-Rhesus D imunoglobulínu napríklad na liečbu idiopatickej trombocytopenickej purpury.

Okrem toho sa môže Rhesus D imunoglobulín použiť po chybnej transfúzii Rh pozitívnej krvi Rh negatívnemu príjemcovi, na zabránenie senzibilizácie Rh D antigénom. Ďalej sa vynález týka použitia týchto Fab fragmentov a protilátok ako diagnostických činidiel.

Doterajší stav techniky

HDN je všeobecný názov pre hemolytickú anémiu plodov a novorodencov spôsobenú protilátkami matky. Tieto protilátky sú zamerané proti antigénom na povrchu fetálnych erytrocytov. Tieto antigény môžu patriť k Rhesus, ABO alebo inému systému krvných skupín.

Rhesus systém krvných skupín obsahuje 5 hlavných antigénov: D, C, c, E a e (Issit, P. D. Med. Lab. Sci. 45: 395, 1988). D antigén je najdôležitejší z týchto antigénov, pretože je veľmi imunogénny a vyvoláva tvorbu Rhesus D protilátok počas Rhesus inkompatibilného tehotenstva a po transfúzii Rhesus inkompatibilnej krvi. D antigén sa nachádza približne u 85 % kaukazskej populácie v Európe a o týchto jedincoch sa hovorí, že sú Rh pozitívni. Jedinci, ktorí nemajú D antigén, sa nazývajú Rh negatívni. Expresia D antigénu môže byť rôzna z dôvodov nízkej hustoty antigénu, ďalej známej ako slabé D alebo D, alebo z dôvodov čiastočnej antigenicity, známej ako čiastočné D antigény.

Rhesus D antigén, membránový proteín erytrocytu, bol nedávno klonovaný a bola opísaná jeho primárna štruktúra (Le Van Kim, C. a kol., PNAS 89: 10925, 1992). Modelové štúdie ukázali, že Rhesus D antigén má 12 transmembránových domén s len veľmi krátkym spojovacím regiónom presahujúcim mimo bunkovú membránu alebo presahujúcim do cytoplazmy.

Parciálne D fenotypy sa najskôr identifikovali u ľudí, ktorí mali D antigén na erytrocytoch, ale nemali aloanti-D v sére (Rose, R. R. a Sanger, R., Blood groups in man, Blackwell Scientiftc, Oxford, UK, 1975; Tippett, P. a kol., Vox Sanguinis, 70: 123, 1996). Toto sa môže vysvetliť tak, že D antigén je mozaiková štruktúra s najmenej 9 odlišnými epitopmi (epDl až epD9). Preto u niektorých ľudí s D variantom nemajú erytrocyty časť tejto mozaiky a protilátky sú namierené proti chýbajúcim D epitopom. Rh pozitívni jedinci, ktorí vytvárajú protilátky proti čiastočným D antigénom boli klasifikovaní do šiestich hlavných odlišných kategórií (D¹¹ až D^vn), kde každá má inú abnormalitu D antigénu. Neskôr sa ukázalo, že tieto D kategórie dávajú rôz ny charakter reakcie pri testovaní proti panelu ľudských monoklonálnych anti-D protilátok (Tippett, P. a kol., Vox Sanguinis, 70: 123, 1996). Podľa rôznych charakterov reakcie sa identifikovalo 9 epitopov a tak boli definované parciálne D kategórie. Počet epitopov prítomných na D antigéne sa líši medzi jednotlivými parciálnymi D kategóriami, keď D^VI kategória exprivuje najmenej, epD3, 4 a 9. D^VIkategória je klinicky významná, pretože D^vl ženy môže byť imunizované dostatočne silno na spôsobenie hemolytickej choroby novorodencov.

Profylaktická účinnosť anti-RhD IgG na prevenciu hemolytickej choroby novorodencov je dobre dokázaná a je rutinným postupom počas mnohých rokov. V dôsledku toho sa závažné ochorenie stalo raritou. Ale, základná príčina ochorenia, t.j. RhD inkompatibilita medzi RhD negatívnou matkou a RhD pozitívnym dieťaťom, stále zostáva a tak vyžaduje kontinuálne dodávanie terapeutického anti-RhD IgG.

V posledných rokoch sa zabezpečenie kontinuálneho dodávania anti-RhD IgG stáva narastajúcim problémom. Zásoba dostupného hyperimúnneho séra od aloimunozovaných Rh negatívnych viacrodičiek sa výrazne znížila vďaka úspechu profylaktického podávania anti-RhD. Preto súčasné metódy produkcie vyžadujú opakovanú imunizáciu stále viac neochotnejších darcov na produkciu vysokého titra antiséra (Selinger, M., Br. J. Obstet. Gynaecol. 98: 509, 1991). Sú tu tiež asociované rizikové faktory a technické problémy, ako je použitie Rh pozitívnych erytrocytov na opakovanú imunizáciu, čo má riziko prenosu vírusových ochorení ako je hepatitída B, AIDS a iné dosiaľ neznáme vírusy (Hughes-Jones, N. C.m BR. J. Haematol. 70: 263, 1988). Preto je žiaduci alternatívny spôsob na produkciu anti-RhD protilátok.

V posledných niekoľkých rokoch sa skúšali rôzne alternatívne zdroje hyperimúnneho séra, ale všetky sú spojené s nevýhodami. Transformácie lymfocytov vírusom Epstein-Barrovej (EBV) za vzniku B lymfoblastoidných bunkových línii, ktoré secemujú špecifickú protilátku vrátane protilátky proti Rhesus D antigénu (Crawford a kol., Lancet, 386: 19. februára 1983) sú nestabilné a vyžadujú extenzívne klonovanie. Tiež z dôvodov nízkej účinnosti transformácie (1 až 3 % B buniek) sa môže z potenciálneho repertoáru získať len obmedzený rozsah protilátkových špecificít. Ďalej sa zdá, že myši neodpovedajú na Rhesus D antigén a preto nie sú dostupné žiadne myšie monoklonálne protilátky, ktoré by sa mohli použiť na výrobu chimerických alebo humanizovaných protilátok. Dosiaľ bola jedinou alternatívou produkcia ľudských protilátok hybridomnou technikou, ktorá je tiež obmedzená chýbaním vhodného partnera na fúziu s ľudskými myelomovými bunkami (Kozbor, D. a Roder, J. C. Immunol Today, 4: 72, 1983).

Podstata vynálezu

Predmetom predkladaného vynálezu preto sú Fab fragmenty, ktoré majú reaktivitu proti Rhesus D antigénu, rovnako ako kompletné protilátky s obsahom Fab fragmentov, ktoré nemajú uvedené nedostatky.

V posledných niekoľkých rokoch technika repertoárového klonovania a konštrukcie fágových zobrazovacích knižníc otvorila nové možnosti na produkciu ľudských protilátok definovanej špecificity (Williamson, R. A. a kol., PNAS 90: 4141, 1993). Tieto metódy sa preto použili na prípravu polypeptidov schopných tvorby väzbových štruktúr na antigén so špecifícitou pre Rhesus D antigény, najmä na prípravu Fab fragmentov, ktoré majú aktivitu proti Rhesus D a čiastočným D antigénom.

Tvorba ľudských protilátok repertoárovým klonovaním ako bola opísaná v posledných rokoch (Barbas III, C. F. a Lemer, R. A. Companion Methods Enzymol. 2: 119, 1991) je založená na izolácii mRNA z periférnych B buniek. Táto metóda ponúka nástroje na izoláciu prirodzených protilátok, autoprotilátok alebo protilátok tvorených počas imunitnej odpovede (Zebedee, S. L. a kol., PNAS 89: 3175, 1992; Vogel, M. a kol., Eur. J. Immunol. 24: 1200, 1994). Táto metóda spočíva v konštrukcii knižnice rekombinantných protilátok od jednotlivých darcov z mRNA kódujúcej imunoglobulínovej (lg) molekuly. Pretože len lymfocyty periférnej krvi (PBL) sa môžu izolovať od darcu, sú šance na nájdenie B buniek produkujúcich špecifickú protilátku zvýšené, ak sa jedincovi podá dávka požadovaného antigénu tesne pred odberom PBL (Persson, M. A. A. a kol., PNAS 88: 2432,1991). Celková RNA je potom izolovaná a mRNA lg repertoára sa môže klonovať s použitím lg špecifických primérov v polymerázovej reťazovej reakcii (PCR), po ktorej nasleduje súčasná expresia ťažkých a ľahkých reťazcov lg molekuly na povrchu filamentózneho fágu, čo vytvorí „organizmus“, ktorý analogicky s B bunkami môže viazať antigén. V literatúre je táto metóda tiež známa ako kombinatoriálny prístup, pretože umožňuje nezávislé kombinovanie ťažkých a ľahkých reťazcov za vzniku funkčného Fab fragmentu protilátky pripojeného na jeden z koncových proteínov, nazývaného pili, filamentózneho fágu. Fágy, ktoré nesú Fab molekuly (tu ďalej Phab častice) sa podrobia selekcii na požadovanú antigénnu špecificitu procesom známym ako biopanorámovanie. Antigén môže byť naviazaný na pevný nosič, keď sa špecifická Phab viaže na antigén, zatiaľ čo nešpecifické Phab sa vypláchnu a nakoniec sa špecifické Phab eluujú z pevného nosiča. Špecifické Phab sa potom amplifikujú v baktériách, uskutoční sa opakovaná väzba na antigén na pevnom nosiči a celý postup biopanorámovania sa opakuje.

Postupné opakovanie panorámovania a amplifikácie vybranej Phab v baktérii vedie k obohateniu špecifických Phab, čo sa pozoruje zo vzostupu titra kolónie tvoriacich jednotiek (cfu) očkovaných na platne po každom cykle panorámovania. Naše skoršie skúsenosti a publikované údaje naznačujú, že špecifický fág môže byť detegovaný obvykle po 4 až 6 cykloch panorámovania (Vogel, M. a kol., Eur. J. Immunol. 24: 1200, 1994). V uvedenej citácii však nie je žiadna zmienka, že naznačené kroky sa môžu použiť na prípravu Fab fragmentov anti-RhD protilátok.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. la až 16b ukazujú DNA sekvencie kódujúce variabilné regióny (V regióny) anti-RhD Fab fragmentov a zodpovedajúce polypeptidové sekvencie.

Obr. 17 ukazuje pComb3 expresný vektor použitý podľa predkladaného vynálezu.

Obr. 18 a 19 ukazujú oddelenú prípravu génov pre ťažký a ľahký reťazec kompletnej protilátky podľa opisu v príklade 6.

Predmetom predkladaného vynálezu sú polypeptidy schopné tvorby väzbových štruktúr na antigén so špecificitou na Rhesus D antigény podľa definície v nároku 1. Tabuľka v nároku 1 sa vzťahuje k pripojeným obrázkom. Je uvedené identifikačné číslo pre každú sekvenciu. Lokalizácie Rhesus D špecifických CDR1 (komplementárnu určujúci región 1), CDR2 a CDR3 regiónov sú uvedené na obrázkoch a podľa číslovania párov báz v tabuľke nároku 1.

Výhodnými polypeptidmi podľa predkladaného vynálezu sú anti-Rhesus D protilátky, ktoré obsahujú variabilné regióny ťažkých a ľahkých reťazcov sekvencií uvedených na obr. la až 16b. Obrázky la, 2a....16a sa týkajú variabilných regiónov ťažkých reťazcov a obrázky lb, 2b.... 16b sa týkajú variabilných regiónov ľahkých reťazcov.

Ďalšími predmetmi predkladaného vynálezu sú DNA sekvencie kódujúce antigén väzbové polypeptidy podľa nároku 6. Výhodné DNA sekvencie sú tie, ktoré kódujú variabilné regióny Fab fragmentov anti-RhD protilátok podľa obrázkov la až 16b. Obrázky la, 2a.... 16a sa týkajú ťažkých reťazcov a obrázky lb, 2b.... 16b sa týkajú ľahkých reťazcov.

Ďalším predmetom predkladaného vynálezu je spôsob na prípravu rekombinantných Fab polypeptidov podľa nároku 11.

Ďalším predmetom predkladaného vynálezu je spôsob na selekciu rekombinantných polypeptidov podľa nároku 12.

Ďalším predmetom predkladaného vynálezu sú anti-RhD protilátky podľa nároku 14, výhodne anti-RhD imunoglobulínové molekuly, ktoré obsahujú variabilné regióny ťažkého a ľahkého reťazca podľa obrázkov la až 16b v kombinácii so známymi konštantnými regiónmi ťažkého a ľahkého reťazca.

Ďalším predmetom predkladaného vynálezu sú farmaceutické a diagnostické prostriedky, ktoré obsahujú polypeptidy, anti-RhD protilátky alebo Fab fragmenty podľa predkladaného vynálezu.

Celková reamplifíkovaná Phab populácia získaná po každom panorámovaní sa môže testovať na špecificitu s použitím rôznych metód ako je ELISA a imunologické bodové testy. Toto je tiež určené charakterom antigénu, napríklad anti-Rhesus D Phab sú detegované nepriamou hemaglutináciou s použitím králičej anti-fágovej protilátky alebo ekvivaletného Coombsovho činidla ako skríženej väzbovej protilátky. Po identifikácii celkovej Phab populácie ako pozitívnej pre požadovaný antigén sa jednotlivé Phab klony izolujú a sekvencuje sa DNA kódujúca požadované Fab molekuly. Jednotlivé Fab sa môžu potom vyrobiť s použitím pComb3 expresného systému, ktorý je zobrazený na obr. 16. V tomto systéme je glll gén, ktorý kóduje koncový proteín pili, vystrihnutý z fagemidového vektora pComb3. Toto umožňuje produkciu solubilného Fab v periplazme baktérie. Také jednotlivé Fab fragmenty sa môžu potom testovať na antigénnu špecificitu.

Fágový zobrazovací prístup sa tiež použil ako prostriedok na získanie monoklonálnych protilátok z nestabilných hybridomných bunkových línií. Toto bolo opísané pre anti-Rhesus D protilátky (Siegel, D. L. a Silberstein, L. E. Blood, 83: 2334, 1994; Dziegiel, M. a kol., J. Immunol Methods, 182: 7, 1995). Fágová zobrazovacia knižnica konštruovaná od neimunizovaných darcov sa tiež použila na selekciu Fv fragmentov (t.j. variabilných regiónov ťažkého a ľahkého reťazca, V_H a V_L) špecifických pre antigény ľudských krvných skupín, ktoré obsahujú jeden Fv fragment reaktívny s Rhesus D antigénom (Marks, J. D. a kol., Biotechnology, 11: 1145,1993).

Dôležitými podmienkami pri konštrukcii kombinatoriálnych knižníc sú zdroje buniek použitých na extrakciu RNA a charakter antigénu použitého na panorámovanie. Preto predkladaný vynález používa hyperimúnneho darcu, ktorému bola podaná i. v. dávka Rhesus D⁺ erytrocytov. PBL darcu sa odoberú 5 a 18 dní po i. v. dávke a použijú sa na konštrukciu 2 kombinatoriálnych knižníc tu ďalej označovaných ako knižnica Dl (LD1) a knižnica D2 (LD2), v príslušnom poradí. Dvojitá imunofluorescenčná analýza získaných PBL, s použitím markerov CD20 a CD38 na spektrum B buniek a lymfoblastoidných buniek, v príslušnom poradí, ukázala vyššie ako normálne percento lymfoblastoidných B buniek, morfológie plazmatických buniek. Vyšší počet plazmatických buniek nájdených v periférnej krvi je neobvyklý, pretože v periférii je normálne menej ako 1 % a pravdepodobne ukazuje na to, že darca mal vyššie percento cirkulujúcich B buniek so špecificitou pre Rhesus D antigén.

Na konštrukciu knižnice sa selekcia Phab špecifických pre Rhesus D antigén uskutočnila biopanorámovaním čerstvých celých erytrocytov fenotypu R1R1 (CDe/CDe), t.j. referenčných buniek pre Rhesus D typizáciu. Toto bolo nevyhnutné, pretože Rhesus D antigén, integrálny membránový proteín so 417 aminokyselinami (Le Van Kim, C. a kol., PNAS 89: 10925, 1992), stráca svoju imunogenicitu počas prečistenia (Paradis, G a kol., J. Immunol. 137“ 240, 1986), a preto nemôže byť chemicky prečistený D antigén naviazaný na pevnú fázu na selekciu imunoreaktívnych Phab ako je to uskutočnené pre iné antigénne špecificity skôr selektované v tomto systéme (Vogel, M. a kol., Eur. J. Immunol. 24: 1200, 1994). Modelové štúdie ukázali, že len veľmi krátky spojovací región Rhesus D antigénu presahuje mimo bunkovú membránu alebo presahuje do cytoplazmy (Chérif-Zahar, B. a kol., PNAS 87: 6243, 1990). Preto sú časti RhD antigénu rozpoznateľné protilátkami relatívne obmedzené a môžu byť konformačne obmedzené. Tento aspekt Rhesus D antigénu sa stáva ešte dôležitejším pri selekcii Phab s reaktivitou proti čiastočným D fenotypom, ktorým chýbajú niektoré definované epitopy D membránového proteínu (Mouro, I. a kol., Blood. 83: 1129,1994).

Okrem toho, pretože celé erytrocyty neexprivujú len D antigén, musí sa uskutočniť séria negatívnych absorpcií na Rhesus D negatívnych erytrocytoch z toho dôvodu, aby sa odabsorbovali tie Phab, ktoré reagujú s inými antigénnymi proteínmi na erytrocytoch.

Tento panorámovací postup uskutočnený na Phab z obidvoch LD1 a LD2 knižníc viedol k izolácii 6 rôznych klonov, ktoré produkujú Fab z knižnice LD1, 8 rôznych klonov, ktoré produkujú Fab z knižnice 2 a 2 klonov, ktoré produkujú Fab zo súboru knižníc LD1 a LD2.

Nomenklatúra a obrázky, kde sú sekvencie opísané, sú uvedené v tabuľke 1.

Tabuľka 1

Knižnica LD1 kloň č.	v_Hsekven. obrázok	v_Lsekven. obrázok	Knižnica LD1 kloň č.	V_Hsekven. obrázok	v,sekven. obrázok
LD1-40	la	lb	LD2-1	6a	6b
LD1-52	2a	2b	LD2-4	7a	7b
LD1-84	3a	3b	LD2-5	8a	8b
LDl-110	4a	4b	LD2-10	9a	9b
LD1-117	5a	5b	LD2-11	10a	10b
			LD2-14	11a	11b
			LD2-17	12a	12b
			LD2-20	13a	13b

Uvedené Fab klony majú výlučnú reaktivitu s Rhesus D antigénom, 3 a 5 D^u testovaných erytrocytov a aglutinačnú reaktivitu proti čiastočným D fenotypom: Rh33, DIII, DIVa, DIVb, DVa, DVII.

Ale s použitím uvedených R1R1 erytrocytov na panorámovanie Phab neboli izolované žiadne klony reaktívne s čiastočným DVI fenotypom. Pretože bolo známe, že sérum pôvodného hyperimúnneho darcu testované v čase tvorby rekombinantnej knižnice je reaktívne s DVI fenotypom, mala by rekombinantná knižnica tiež obsahovať anti-DVI špecificitu.

Na selekciu DVI reaktivity sa podmienky na panorámovanie zmenili v tom, že sa použili iné bunky. Špeciálny darca, ktorého erytrocyty boli typizované a bolo známe, že exprivujú čiastočný DVI fenotyp, sa použil ako zdroj buniek na opakované panorámovanie LD1 a LD2 knižníc. Táto druhá séria panorámovania sa uskutočnila v podstate rovnakým spôsobom ako prvá séria s výnimkou substitúcie DVI erytrocytov za R1R1 erytrocyty a pridania ošetrenia DVI erytrocytov bromelázou. DVI fenotyp exprivuje najmenej Rhesus D epitopov a je preto ťažké vyrobiť proti nemu protilátky. Bolo opísané, že len 15 % neselektovaných polyklonálnych anti-D a 35 % selektovaných anti-D tvorených Rhesus D negatívnymi subjektmi reaguje s DVI+ bunkami (Mouro, I. a kol., Blood, 83“ 1129, 1994). Ošetrenie bromelázou, ktorá odstraňuje kyselinu N-acetylneuramínovú (kyselinu sialovú) z membrány erytrocytov sa uskutočnilo preto, aby boli epitopy Rhesus DVI ľahšie dosiahnuteľné počas panorámovania s preabsorbovanými Phab.

Táto druhá séria panorámovania na LD1 knižnici viedla k zisku 1 klonu produkujúceho Fab, LD1-6-17. Nomenklatúraje uvedená v tabuľke 2.

Tabuľka 2

Knižnica LD1	V_H-sekvencia obrázok	V_L-sekvencia obrázok
Kloň č. LD1-6-17	14a	14b

Ale tento kloň reagoval s Rhesus alelami C a E a mal falošne pozitívnu reakciu s DVI pozitívnymi erytrocytmi. Toto bolo spôsobené tiež fenotypom DVI darcu (Cc DVI ee), ktorý exprivoval C alelu, ktorá nebola odabsorbovaná Rhesus negatívnymi erytrocytmi (ccddee).

Preto sa uskutočnila tretia séria panorámovania na súbore LD1 a LD2 knižníc s použitím iných erytrocytov pre absorpčnú fázu. Po 6 cykloch panorámovania s použitím tak bromelázou ošetrených, ako bromelázou neošetrených erytrocytov pre obidva absorpčné kroky a elúciu z DVI pozitívnych erytrocytov sa získala celková populácia Phab, ktorá reagovala výlučne s erytrocytmi fenotypu R1R1 (CCDDee), a 2 rôzni darcovia exprívujúci DVI variant.

Táto tretia séria panorámovania na LD1 knižnici viedla k zisku 2 klonov produkujúcich Fab, ktoré reagovali s DVI+ erytrocytmi. Nomenklatúra je uvedená v tabuľke 3.

Tabuľka 3
Knižnica LD1/LD2	V_H-sekvencia obrázok	V_L-sekvencia obrázok
Kloň č. LD 1/2-6-3	15a	15b
Kloň č. LD1/2-6-33	16a	16b

Tak sa izolovalo 16 rôznych anti-Rhesus D Fab klonov. DNA z týchto klonov sa izolovala a sekvencovala s použitím fluorescenčného cyklického sekvencovania na ABI 373A Sequencing Systém. Nukleotidová a zodpovedajúce aminokyselinové sekvencie uvedených Fab klonov tvoria základ predkladaného vynálezu.

Analýza sekvencie ukázala, že sa izolovalo niekoľko klonov s rovnakým V_H génovým segmentom, ale s inými V_L génovými segmentmi. Tak je to v prípade dvoch klonov LD2-1 a LD2-10, dvoch klonov LD2-4 a LD2-11 a troch klonov LD2-14, LD1/2-6-3 a LD1 /2-6-33, v príslušnom poradí.

Získané DNA sekvencie a Fab fragmenty sú použiteľné na prípravu kompletných protilátok, ktoré majú aktivitu proti Rhesus D antigénu. Vhodnými expresnými systémami na také protilátky sú myšie myelomové bunky alebo ovariálne bunky čínskeho škrečka.

Nasledujúce príklady podrobne opisujú vynález bez akéhokoľvek obmedzenia rozsahu vynálezu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1 opisuje konštrukciu 2 kombinatoriálnych knižníc; najmä uvedených LD1 a LD knižníc.

Príklad 2 opisuje podrobne sériu panorámovania na LD1 a LD2 knižniciach s použitím R1R1 erytrocytov.

Príklad 3 opisuje sériu panorámovania s použitím tak bromelázou ošetrených, ako bromelázou neošetrených erytrocytov na absorpciu a bromelázou ošetrených DVI pozitívnych erytrocytov s použitím súboru uvedených LD1 a LD2 knižníc.

Príklad 4 opisuje nepriamy hemaglutinačný test, ktorý využíva králičiu antifágovú protilátku ako ekvivalentné Coombsove činidlo, na sledovanie obohatenia a špecificity Rhesus D špecifických Phabs po panorámovaní.

Príklad 5 opisuje prípravu a prečistenie Fab fragmentov protilátky na použitie ako diagnostické činidlo.

Príklad 6 opisuje prípravu kompletných anti-Rhesus D imunoglobulínov s použitím sekvencií podľa predkladaného vynálezu.

Príklad 1

Konštrukcia rekombinantných LD1 a LD knižníc

a) Zdroj lymfocytov

Dospelému mužovi, ktorý bol členom dobrovoľnej základne hyperimúnnych Rhesus D darcov, sa podala i. v. dávka 2 ml pripravených erytrocytov od známeho mužského darcu krvnej skupiny 0 RhDL PBL sa odoberali v deň +5 a +18 po dávke a mononukleáme bunky sa izolovali centrifugáciou s Ficollovým gradientom (Lymphoprep, Pharmacia, Milwaukee, WI). Výsledky analýzy darcovských lymfocytov v deň +5 sú uvedené v tabuľke 4. MNC z dňa +5 sa použili priamo na prípravu RNA s použitím postupu fenol-chloroform-guanidíniumizotiokyanát (Chomczynski, P. a Sacchi, N. Anál. Biochem. 162: 156, 1987). MNC zo dňa +18 sa najskôr kultivovali počas 3 dní v RPMI-1640 médiu (Seromed, Basel) s obsahom 10³ U/ml IL-2 (Sandoz Research Center, Vienna, Austria) a 10 pg/ml mitogénu z líčidla amerického (PWM; Sigma L9379, Buchs, Switzerland) pred extrakciou RNA.

Tabuľka 4

Imunofluorescenčná analýza darcovských lymfocytov v deň +5 po i. v. dávke erytrocytov

Bunkový povrchový antigén	% pozitívnych buniek	Bunkový povrchový antigén	% pozitívnych buniek
CD20	15	CD8	12
CD38	20	CD25	7,6
CD20/CD38	15	CD57	12,5
CD3	47	CD14	6
CD4	34	HLA-DR	18

b) Konštrukcia knižnice

Skonštruovali sa jednotlivé knižnice nazvané LD1 a LD2 (ako je podrobnejšie uvedené) zodpovedajúce bunkám odobraným v deň +5 a +18 (spolu +21 dní vrátane +3 dní PWM stimulácie) po i. v. dávke, v príslušnom poradí. Celková RNA sa potom pripravila z týchto buniek s použitím postupu fenol-chloroform-guanidíniumizotiokyanát. Z tejto RNA sa 10 pg použilo na výrobu cDNA s použitím oligo(dT)priméru (400 ng) a reverzne sa transkribovalo s použitím M-MuLV reverznej transkriptázy podľa návodu dodávateľa (Boehringer Mannheim Germany). PCR amplifikácia sa uskutočnila podľa postupu opísaného vo Vogel, M. a kol., E. J. of Immunol. 24: 1200, 1994. Stručne, 100 pl PCR reakcie obsahovalo Perkin-Elmer pufor s 10 mM MgCl₂, 5 pl cDNA, 150 ng každého vhodného 5' a 3' priméru, všetky štyri dNTP - 200 μΜ každý a 2 U/ml Taq polymerázy (Pcrkin Elmer, NJ). PCR amplifikácia ťažkého a ľahkého reťazca Fab molekuly sa uskutočnila jednotlivo so súborom primérou od Stratacyte (podrobnosti sú uvedené ďalej). Pre ťažký reťazec sa použilo šesť „upstream“ primérov, ktoré hybridizovali s každou zo šiestich rodín V_Hgénov, zatiaľ čo primér pre jeden x a jeden λ reťazec sa použil pre ľahký reťazec. „Downstream“ priméry boli navrhnuté tak, aby zodpovedali pantovému regiónu konštantných domén 1 a 3 pre ťažký reťazec. Pre ľahký reťazec zodpovedali „downstream“ priméry 3' koncu x a λ konštantných domén. PCR produkty ťažkého a ľahkého reťazca sa zhromaždili oddelene, pričom sa prečistili na géli a trávili Xhol/Spel a Sacl/Xbal reštrikčnými enzýmami (Boehringer Mannheim), v príslušnom poradí. Po trávení sa produkty PCR extrahovali jedenkrát fenol : chloroform : izoamylalkoholom a prečistili sa gólovou excisiou. Inzercia Xhol/Spel tráveného Fd fragmentu a následná ligácia Sacl/Xbal tráveného reťazca do pComb3 vektora, transformácia do XLl-Blue buniek a produkcia fágov sa uskutočnili podľa postupu opísaného v Barbas III, C. F. a Lerner, R.A. Companion Methods Enzymol. 2: 119, 1991.

Po transformácii XLl-Blue E. coli buniek sa odoberali vzorky a titrovali sa na platniach na určenie veľkosti knižnice. Tieto výsledky ukazujú expresné knižnice s 5 x 10” a 7,7 x 10⁶ cfu (kolónie tvoriace jednotky) pre LDI a LD2, v príslušnom poradí.

c) PCR priméry

VHI 5-CAC TCC CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GG-3' VHII 5'-GTG CTG TCC CAG GTC AAC TTA CTC GAG TCT GG-3' VHÍII 5'-GTC CAG GTG GAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GG-3' VHIV 5'-GTC CTG TCC CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCG GG-3' VHV 5’-GTC TGT GCC GAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GG-3' VHV1 5-GTCCTG TCA CAG GTA CAG CTG CTCGAG TCAGG-3' CHI(gl) 5'-AGC ATC ACT AGT ACA AGA TTT GGG CTC-3' VL(k) 5'-GT GCG AGA TGT GAG CTC GTG ATG ACC CAG TCT CCA-3’ CL(k) 5'-T CCT TCT AGA TTA CTA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT CTT TGT GAC GGG CGA ACT C-3'

W5C TGC ACA GGG TCC TGG GCC GAG CTC GTG GTG ACTCA-3' CL(I) 5'G CAT TCT AGA CTA TTA TGA ACA TTC TGT AGG GGC-3'

d) Vektory a bakteriálne kmene pComb vektor použitý na klonovanie Fd a ľahkého reťazca sa získal od Scripps Research Inštitúte La Jolla, CA; Barbas III, C. F. a Lemer, R. A. Companion Methods Enzymol. 2: 119, 1991. Escherichia coli kmeň XLl-Blue použitý na transformáciu pComb3 vektora a VCSM13 pomocný fág sa zakúpili od Stratacyte (La Jolla, CA).

Príklad 2

Selekcia Rhesus D Phab z LDI a LD2 knižníc na R1R1 erytrocytoch

a) Absorpcia a biopanorámovanie

Série troch negatívnych absorpcií na erytrocytoch skupiny 0 Rh negatívne sa uskutočnili pred každým cyklom panorámovania pred pozitívnou selekciou na erytrocytoch skupiny 0 Rh pozitívne (R1R1). Čerstvé erytrocyty sa odobrali v ACD (kyslá citrátová dextróza) antikoagulačnom činidle a premyli sa 3-krát v 0,9 % NaCl. Erytrocyty sa počítali v Ha5 yemsovom roztoku a ich počet sa upravil na 40 x 10⁶/ml. Absorpcia: 1 ml fágového prípravku v PBS/3 % BSA sa pridal k pelete erytrocytov skupiny 0 Rh negatívne (16 x 10⁶ erytrocytov) v 12 ml tubách (Greiner 187261, Reinach, Switzerland) a uskutočnila sa inkubácia pri izbovej teplote počas 30 minút s jemným trepaním. Všetky tuby sa vopred blokovali v PBS/3 % BSA počas minimálne 1 hodiny pri izbovej teplote. Erytrocyty sa peletovali centrifugáciou počas 5 minút pri 300 x g pri 4 °C. Vzniknutý fágový supematant sa opatrne odobral a proces sa opakoval ešte dvakrát. Po konečnej absorpcii sa fágový supematant pridal k pelete erytrocytov skupiny 0 Rh pozitívne (16 x 10⁶ erytrocytov) a znovu sa uskutočnila inkubácia pri izbovej teplote počas 30 minút s miernym trepaním. Potom sa erytrocyty premyli aspoň 5-krát v 10 ml ľadovo chladného PBS, uskutočnila sa centrifugácia pri 300 x g počas 5 minút pri 4 °C a potom nasledovala elúcia s 200 pl 76 mM kyseliny citrónovej pH 2,8 počas 6 minút pri izbovej teplote a neutralizácia 200 pl 1 M Tris. Erytrocyty sa centrifugovali pri 300 x g počas 5 minút pri 4 °C a vzniknutý supematant s obsahom eluovaných fágov sa starostlivo odobral a skladoval sa s proteínovým nosičom (0,3 % BSA) pri 4 °C pripravený na reamplifikáciu. Počet Rhesus D špecifických Phab každého cyklu panorámovania je uvedený v tabuľke 5.

Tabuľka 5

Selekcia Rhesus D Phab z LD1 a LD2 knižníc na R1R1 erytrocytoch

Počet eluovaných Rhesus D špecifických fágov
Panorámovanie	Knižnica Dl	Knižnica D2
cyklus č.^a	cfu	cfu
1	8 x 10^ó	4,6x10⁷
2	6 x 10⁷	1,4 x 10⁷
3	1 x 10⁸	7,9 x 10⁷
4	3 x 10⁸	1,3 x 10⁸
5	3 x 10⁸	1 x 10⁸
6	nd	2,8 x 10^s

^al Pre každý cyklus sa 10¹² Phab inkubovalo v tubách s erytrocytmi skupiny 0 Rh negatívne (absorpčná fáza) a potom nasledovala elúcia z erytrocytov skupiny 0 Rh pozitívne (R1R1).

nd = neuskutočnené cfu = kolónie tvoriace jednotky

Príklad 3

Selekcia Rhesus D Phab zo súboru knižníc LD1 a LD2 na DVI+ erytrocytoch

a) Absorpcia na erytrocytoch skupiny 0 Rh negatívne, fenotypu 1 (r'r, Ccddee) a 2 (ryry, CCddEE)

Séria štyroch negatívnych absorpcií na erytrocytoch skupiny 0 Rh negatívne sa uskutočnila pre každý cyklus panorámovania pred pozitívnou selekciou na erytrocytoch skupiny 0 Rh DVI pozitívne. Negatívne absorpcie sa uskutočnili v nasledujúcom poradí: krok 1. fenotyp 1 ošetrený bromelázou; krok 2. fenotyp 1 neošetrený bromelázou; krok 3. fenotyp 2 ošetrený bromelázou; krok 4. fenotyp 2 neošetrený bromelázou. Zmrazené erytrocyty sa nechali roztopiť v zmesi sorbitu a fosfátom pufrovaného salinického roztoku, nechali sa stáť v tomto roztoku počas minimálne 10 minút a potom sa premyli 5 až 6-krát vo fosfátom pufrovanom salinickom roztoku a nakoniec sa uskladnili v stabilizačnom roztoku (DiaMed EC-roztok) pripravené na použitie. Pred panorámovaním sa erytrocyty premyli 3-krát v 0,9 % NaCl a potom nasledovalo počítanie v Hayemovom roztoku. Absorpcia: 1 ml fágového roztoku v PBS/3 %

BSA sa pridal k pelete erytrocytov (2 x 10⁸) rovnako ako v kroku 1 v 12 ml tubách (Greiner 187261, Reinach, Switzerland) a uskutočnila sa inkubácia pri izbovej teplote počas 30 minút s jemným trepaním. Všetky tuby sa vopred blokovali v PBS/3 % BSA počas minimálne 1 hodiny pri izbovej teplote. Erytrocyty sa peletovali centrifugáciou počas 5 minút pri 300 x g pri 4 °C. Vzniknutý fágový supematant sa starostlivo odobral a proces sa opakoval s použitím erytrocytov ako je podrobnejšie opísané v krokoch 2, 3 a 4.

b) Ošetrenie erytrocytov Rhesus D negatívne r'r a ryry a Rhesus DVI+ bromelázou

Bromeláza 30 (Baxter, Dudingen, Switzerland) sa použila na ošetrenie erytrocytov Rhesus DVI v rovnakých pomeroch, ako sa používa v rutinnom hemaglutinačnom teste, t.j. 10 pl bromelázy na 2 x 10^č erytrocytov. Bromeláza sa pridala do požadovaného množstva erytrocytov a inkubovala sa pri 37 °C počas 30 minút a potom nasledovalo premytie 3-krát v 0,9 % NaCl, opätovné počítanie v Hayemovom roztoku a upravenie na požadovanú koncentráciu v PBS/3 % BSA a pripravili sa pre Phab panorámovanie.

c) Biopanorámovanie na bromelázou ošetrených Rhesus DVI+ erytrocytoch

Po konečnej absorpcii na erytrocytoch ryry neošetrených bromelázou sa fágový supematant rozdelil na dve rovnaké časti a pridal sa buď k enzýmom ošetrenej alebo enzýmom neošetrenej pelete erytrocytov skupiny 0 Rh DVI+ (40 x 10⁶), v príslušnom poradí, a znova sa uskutočnila inkubácia pri izbovej teplote počas 30 minút s jemným trepaním. Potom sa dve populácie erytrocytov premyli aspoň 5-krát v 10 ml ľadovo chladného PBS, uskutočnila sa centrifugácia pri 300 x g počas 5 minút pri 4 °C a potom nasledovala elúcia s 200 pl 76 mM kyseliny citrónovej pH 2,8 počas 6 minút pri izbovej teplote a neutralizácia 200 pl 1 M Tris. Erytrocyty sa centrifugovali pri 300 x g počas 5 minút pri 4 °C a vzniknutý supematant s obsahom eluovaných fágov z bromelázou ošetrených a bromelázou neošetrených DVI+ erytrocytov sa starostlivo odobral a skladoval sa s proteínovým nosičom (0,3 % BSA) pri 4 °C pripravený na reamplifikáciu. V ďalších cykloch panorámovania sa eluované fágy z bromelázou ošetrených a neošetrených DVI+ erytrocytov uchovávali oddelene a vždy nasledovali kroky 1 až 4 absorpčného protokolu. Krok elúcie bol mierne odlišný v porovnaní s cyklom 1 panorámovania, pretože fágové populácie neboli znovu rozdelené na dve časti. Len tie fágy, ktoré sa eluovali z bromelázou ošetrených DVI+ erytrocytov sa tiež znovu eluovali z bromelázou ošetrených DVI+ erytrocytov a len tie fágy, ktoré sa eluovali z bromelázou neošetrených DVI+ erytrocytov sa tiež znovu eluovali z bromelázou neošetrených DVI+ erytrocytov. Počet Rhesus D špecifických Phab každého cyklu panorámovaniaje uvedený v tabuľke 6.

Tabuľka 6

Selekcia Rhesus D Phab zo súboru LD1 a LD2 knižníc na Rhesus DVI+ erytrocytoch

Počet eluovaných Rhesus DVI+ špecifických fágov

Panorámovanie cyklus č.^a	- bromeláza cfu	+ bromeláza cfu
1	1,9 x 10⁶	4,4 x 10^é
2	1,6 x 10⁶	4 x 10⁵
3	2,4 x 10⁷	4,1 x 10'
4	3 s 10⁶	5 x 10⁷
5	1 x 10⁸	1 x 10⁸
6	nd	3 x 10⁸

^a) Pre každý cyklus sa 10¹² Phab inkubovalo v tubách s 2 rôznymi fenotypmi erytrocytov skupiny 0 Rh negatívne (absorpčná fáza) a potom nasledovala elúcia z erytrocytov skupiny 0 Rh DVI+

Príklad 4

Monitorovanie kôl panorámovania a určenie špecificity obohatených Phab s použitím králičej antifágovej protilátky

Nepriamy hemaglutinačný test

Čerstvo odobraté erytrocyty rôznych ABO a Rhesus krvných skupín sa premyli 3-krát v 0,9 % NaCl a upravili sa na 3 až 5 % roztok (45 až 50 x 10⁷/ml) buď v 0,9 % NaCl, alebo v PBS/3 % BSA. Pre každé testovacie podmienky sa 50 μΐ erytrocytov a 100 μΐ testovanej vzorky (vyzrážaný a amplifikovaný fág alebo kontrolné protilátky) inkubovalo spoločne v sklenených trubičkách na určovanie krvných skupín (Baxter, Dudingen, Switzerland) počas 30 minút pri 37 °C. Erytrocyty sa premyli 3-krát v 0,9 % NaCl a potom sa inkubovali s dvoma kvapkami Coombsovho činidla (Baxter, Dudingen, Switzerland) na pozitívnu kontrolu alebo so 100 μΐ králičích antifágových protilátok (vyrobených imunizáciou králikov prípravkom fágu VCSM13 a potom prečistením na Affi-Gel Blue kolóne a absorpciou na E. coli na odstránenie E. coli špecifických protilátok) riedených 1/1000. Tuby sa inkubovali počas 20 minút pri 37 °C, centrifugovali sa počas 1 minúty pri 125 x g a erytrocyty sa vyšetrovali na aglutináciu starostlivým pretrepaním a s použitím lupy.

Pri testovaní prečistených Fab na aglutináciu sa afinitne prečistila anti-Fab protilátka (The Binding Site, Birmingham, U.K.) použitá namiesto králičej antifágovej protilátky.

Tabuľka 7 ukazuje výsledky hemaglutinačných testov Phab vzoriek po rôznych cykloch panorámovania na R1R1 erytrocytoch.

Tabuľka 8 ukazuje výsledky hemaglutinačných testov Phab vzoriek po rôznych cykloch panorámovania na Rhesus DVI+ erytrocytoch.

Tabuľka 9 ukazuje charakter reaktivity jednotlivých Fab klonov z knižníc LD1 a LD s čiastočnými D variantmi.

Tabuľka 7

Monitorovanie Phab z LD1 a LD2 knižníc nepriamou hemaglutináciou po panorámovaní na R1R1 erytrocytoch

Phab vzorka cyklus panorámovania	Knižnica LD1 testované na erytrocytoch	Knižnica LD2 0RhD+^(a)
č.4
neriedený	+	+
1/4	+	±
1/20	-	-
č.5
neriedený	++	+
%	++	+
1/20	-	-
Č.6
neriedený	nd	+++
1/4	nd	++
1/20	nd	nd
Pomocný fág ^{a) b)}
neriedený, 1/4,1/20	-	-

^a' nepriama hemaglutinácia sa uskutočnila v sklenených trubičkách s použitím 50 μΐ erytrocytov (40 x 10⁷/ml) a 100 μΐ Phab so začiatkom pri 4 x 10’ ‘/ml. Po 30 minútach pri 37 °C sa erytrocyty premyli 3-krát a ďalej sa inkubovali počas 20 minút pri 37 °C s králičou antifágovou protilátkou pri riedení 1/1000.

^bl Aglutinácia sa hodnotila vizuálne od +++ (silná aglutinácia) do - (žiadna aglutinácia). nd = neuskutočnené

Tabuľka 8

Monitorovanie Phab zo súboru LD1 a LD knižníc nepriamou hemaglutináciou po panorámovaní na Rhesus DVI+ erytrocytoch

Phab vzorka Cyklus panorámovania CCDDee ccddee Bromelázou neošetrené erytrocyty DVI+	Ccddee	fenotypy erytrocytov
CCddEE	DVI(EJ.)	DVKJLS.)
Cyk. č. 3	^a)+++	±	(+)	±	±
Cyk. č. 5	++	-		-	-
Bromelázou ošetrené
erytrocyty DVI+
Cyk. č. 4	+++		-	(+)
Cyk. č. 5	+++	±	±	(+++)	-H-
Cyk. č. 6	++++	-	-	+++	+^+
LD1-6-17
LD1Z2-6-3	++++		-	±	nd
LD1/2-6-33	++++	-	-		nd

^a) Aglutinácia sa hodnotila vizuálne od +++ (silná aglutinácia) do - (žiadna aglutinácia). nd = neuskutočnené.

Všimnite si: Len tie Phab, ktoré sa eluovali z bromelázou ošetrených DVI+ erytrocytov mali známky aglutinácie proti 2 rôznym DVI+ darcom.

Tabuľka 9

Klonálna analýza reaktivity Fab anti-Rhesus D klonov z knižníc Dl a LD2 pre čiastočné D varianty____________

Čiastočné D varianty

^{a,Fab kloň č.	Rh33	DIII	DIVa	DIVb	DVa	DVI	DVII
LD1 - 40		<^b>₊₊₊	+	+	±		++
- 52	-	+++			+++		+++
- 84		++					+
- 110	(+)	+++	++	+	+		++
- 117	*++					++
LD2- 1	-++	nd	+++	+++	+		+++
4	-	+++		+			+
5	-	nd	+++	+++			+++
10	(-)	+++	+++	+++	+		++
11	-	+++					++
14	+++	+++	+++	+++	+++		+++
17	-	+++	+	+++-	±		+++
20	-	+++	+++		±		+++
LD1/2-6-3	-H-	+++	+++	++	-++	+	++
LD1/2-6-33	±	+++	+++	++	-++	+	-+

^a) solubilné Fab prípravky sa vyrobili z každého klonu a nasledovala nepriama hemaglutinácia ^b) Aglutinácia sa hodnotila vizuálnym hodnotením od +++ (všetky bunky aglutinovali v zhluku) do - (žiadne bunky nie sú aglutinované)

Príklad 5

Príprava a prečistenie Fab fragmentov protilátok na použitie ako diagnostických činidiel

Po postupoch biopanorámovania podrobne opísaných v príkladoch 2 a 3 sa fágová populácia, ktorá mala špecifickú aglutináciu na Rhesus D+ erytrocytoch selektovala a použila sa na prípravu fagemidovej DNA. Presnejšie, Phab selektované na R1R1 erytrocytoch sa použili po 5. a 6. cykle biopanorámovania pre LD1 a LD knižnice, v príslušnom poradí, a po 5. cykle biopanorámovania na DVI+ erytrocytoch na izoláciu klonu LD1-6-17. Na produkciu solubilného

SK 284879 Β6

Fab musia byť sekvencie glll kódujúce pili koncový proteín na fágovej častici deletované.

Fagemidová DNA sa pripravila s použitím Nucleotrap kitu (Machery-Nagel) a glll sekvencia sa odstránila trávením takto izolovanej fagemidovej DNA Nhcl/Spel ako je opísané (Burton, D. R. a kol., PNAS, 1989). Po transformácii do XL-1 Blue sa jednotlivé klony selektovali (nomenklatúra je uvedená v tabuľke 1) a kultivovali sa v LB (Luria Broth) s obsahom 50 pg/ml karbencilínu pri 37 °C do OD 0,6 pri 600 nm. Kultúry sa indukovali 2 mM izopropyl β-Dtiogalaktopyranozidu (IPTG) (Biofinex, Praroman, Switzerland) a kultivovali sa cez noc pri 37 °C. Celá kultúra sa centrifugovala pri 10000 x g počas 30 minút pri 4 °C na peletovanie baktérií. Bakteriálna peleta sa ošetrila roztokom lyzozým/DNAsa na uvoľnenie Fab fragmentov vnútri buniek. Pretože niektoré Fab fragmenty sa uvoľnili do supcmatantu kultúry, supematant sa odobral zvlášť. Tieto Fab prípravky sa potom zhromaždili a vyzrážali sa 60 % síranom amónnym (Merck, Darmstadt, Germany) na koncentrovanie Fab a potom nasledovala extenzívna dialýza vo fosfátom pufrovanom salinickom roztoku (PBS) a ultracentrifugácia pri 200000 x g na peletovanie akýchkoľvek nerozpustných komplexov. Fab prípravky sa potom prečistili na keramickej hydroxyapatitovej kolóne (HTP Econo cartrige, BioRad, Glattbrugg, Switzerland) s použitím gradientovej elúcie PBS (pufor A) a PBS + 0,5 M NaCl (pufor B). Lineárny gradient sa programoval na rast od 0 do 100 % pufra B počas 40 min. Fab sa eluoval ako jediný pík medzi 40 až 60 % pufra B. Pozitívne frakcie, ako boli identifikované „imunodot“ testom s použitím konjugátu anti-Fab peroxidáza (The Binding Site, Birmingham, U. K.) sa zhromaždili, koncentrovali sa s použitím polyetylénglykolu a extenzívne sa dialyzovali proti PBS. Pozitívne frakcie z hydroxyapatitovej kolóny pre každý kloň sa použili v klasickom nepriamom hemaglutinačnom teste v sklenených trubičkách s použitím buď štandardného Coombsovho činidla (Baxter Diagnostics AG Dade, antiľudské sérum), aIebo anti-Fab (The Binding Site, Birmingham, U. K.) ako činidla pre skríženú väzbu. Tieto Fab definované špecificity k čiastočným D variantom ako je ukázané na str. 25 sa môžu použiť na typizáciu erytrocytov neznámeho čiastočného D fenotypu.

Príklad 6

Konštrukcia kompletných imunoglobulínových génov

V gén LD2-14 pre ťažký reťazec (V_H gén) sa amplifikoval z anti-Rhesus D-Fab-kódujúceho plazmidu LD2-14 s použitím polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) so špecifickými primérmi. 5'-primér mal sekvenciu: S'-GGGTCGACGCACAGGTGAAACTGCTCGAGTCnGGG', zatiaľ čo 3'- primár mal sekvenciu: 5'-GCCGATGTGTAAGGTGACCGTGGTCCCCTTG-3'.

PCR reakcia sa uskutočnila s Deep Vent DNA polymerázou a pufrovacim roztokom (2 mM Mg⁺⁺) od New England Biolabs za podmienok odporúčaných výrobcom vrátane 100 pmol každého priméru a štyroch dezoxynukleotidov v koncentrácii 250 μΜ každý. Reakcia sa uskutočnila pri 30 cykloch s nasledujúcimi teplotnými krokmi: 60 s pri 94 °C (predĺžené o 2 minúty počas prvého cyklu), 60 s pri 57 °C a 60 s pri 72 °C (predĺžené o 10 minút počas posledného cyklu). Postamplifikačná adícia 3' A-presahujúcich koncov sa uskutočnila následnou inkubáciou počas 10 minút pri 72 °C v prítomnosti 1 jednotky Taq DNA polymerázy (Boehringer Mannheim, Germany). PCR produkt sa prečistil s použitím QIAquick PCR purifikačného kitu (Qiagen, Switzerland) a klonoval sa do vektora pCRII s použitím klonovacieho kitu od Invitrogen (San Diego, USA). Po trávení vzniknutého plazmidu TAVH14 Sali a BstEII sa izoloval V_H gén s použitím preparatívnej agarózovej gólovej elektroforézy s použitím QIAquick gel extraction kitu od Qiagen.

Vektor č. 50 (Sandoz Pharma, Basel), ktorý obsahoval irelevantný, ale intaktný ľudský genómový imunoglulínový V_H gén, sa trávil Sali a BstEII a vektorový fragment sa izoloval preparatívnou gélovou elektroforézou s použitím QIA quick gel extraction kitu od Qiagen. Ligácia vektora a PCR produktu sa uskutočnila pri 25 °C počas 2 hodín v celkovom objeme 20 pl s použitím rýchleho DNA Ligation kitu (Boehringer Mannheim, Germany). Po ligácii sa reakčná zmes riedila 20 pl H₂O a extrahovala sa 10 objemami n-butanolu na odstránenie solí. DNA sa potom peletovala centrifugáciou, sušila sa vo vákuu a resuspendovala sa v 10 pl H₂O. 5 pl tohto DNA roztoku sa elektropórovalo (0,1 cm kyvety, 1,9 kV, 200 Ω, 25 pFD) s použitím GenePulser (BioRad, Gaithersburg) do 40 pl na elektroporáciu kompetentných E. coli XL-lblue MRF' (Stratagene, La Jolla), uskutočnilo sa riedenie v SOC médiu, inkubácia pri 37 °C počas 1 hodiny a bunky sa umiestnili na LB platne s obsahom ampicilínu (50 pg/ml). Plazmidové miniprípravky (Qiagen, Basel) vzniknutých kolónií sa overili reštrikčnými tráveniami na prítomnosť požadovaného inzertu.

Pri tomto postupe sa ireleventný pôvodný V_H gén vo vektore č. 150 nahradil amplifikovanou anti-Rhesus D V_Hsekvenciou LD2-14 a získal saplazmid cassVH14. Štruktúra vzniknutého imunoglobulínového V_H génového konštruktora bola potvrdená sekvencovaním, bol rozstrihnutý trávením EcoRI a BamHI a prečistil sa na géli ako je opísaný. Expresný vektor č. 10 (Sandoz Pharma, Basel) s obsahom ľudského genómového imunoglobulínového C 1 génového segmentu sa tiež trávil EcoRI a BamHI, izoloval sa preparatívnou agarózovou gélovou elektroforézou, ligoval sa s EcoRI / BamHI-V_H génovým segmentom vopred získaným z plazmidu cassVH14 a elektropóroval sa do E. coli XLl-blue MRF' ako bolo opísané. Toto viedlo k vzniku génu pre kompletný ťažký reťazec anti-Rhesus D imunoglobulínu v expresnom vektore 14IgG 1 (obr. a).

V gén LD2-14 pre ľahký reťazec (V_L gén) sa amplifikoval z rovnakého anti-Rhesus D-Fab plazmidu LD2-14 PCR so špecifickými primérmi. 5'-primérmal sekvenciu: 5'-TACGCGTTGTGACATCGTGATGACCCAGTCTCCAT-3', zatiaľ čo 3’-primér mal sekvenciu: 5'-AGTCGCTCAGTTCGTTTGATTTCAAGCTTGGTCC-3'.

PCR reakcia, prečistenie produktu a nasledujúce kroky klonovania boli analogické s krokmi opísanými pre V_H gén s tou výnimkou, že sa použili vhodné vektory pre ľahký reťazec. Stručne, V_L PCR produkt sa klonoval do pCRII vektora za vzniku plazmidu TAVL14, bol z neho excidovaný s použitím Mlul a Hindlll a izoloval sa gélovou extrakciou. V_L gél sa potom klonoval do Mlul a Hindlll miest vektora č. 151 (Sandoz Pharma, Basel) a tak nahradil irelevantný pôvodný V_L gén amplifikovanou anti-Rhesus D V_Lsekvenciou LD2-14. Po potvrdení sekvencie vzniknutého plazmidu cassVL-14 sa EcoRI/Xbal fragment s obsahom V_L génu potom subklonoval do reštrikčných miest EcoRI a Xbal vektora č. 98 (Sandoz Pharma, Basel), ktorý obsahuje ľudský genómový génový segment pre imunoglobulín C_K. Tento postup nahrádza irelevantný pôvodný V_L gén v plazmide č. 98 a získa sa expresný vektor 14 k, ktorý obsahuje gén pre kompletný ľahký reťazec anti-Rhesus D imunoglobulínu.

Myšia myelomová bunková línia SP2/0-Ag 17 (ATCC CRL 1581) sa súčasne transfektovala expresnými vektormi 14IgGl a 14 x vopred linearizovanými v jedinečných EcoRI a Nôti reštrikčných miestach, v príslušnom poradí.

Elektroporácia sa uskutočnila nasledujúcim spôsobom: exponenciálne rastúce bunky sa dvakrát premyli a suspendovali vo fosfátom pufrovanej sacharóze (272 mM sacharózy, 1 mM MgCl₂, 7 mM NaH₂PO₄, pH 7,4) s hustotou 2 x 10⁷buniek na ml. 0,8 ml buniek sa pridalo do 0,4 cm kyvety, zmiešalo sa s 15 pg linearizovaných plazmidov 141gGl a 14 x, nechalo sa na ľade počas 15 minút, elektropórovalo sa s 290 V, 200 Ω, 5 pFD, umiestnilo sa späť na ľad na 15 minút, prenieslo sa do bunkovej kultivačnej nádoby T75 s 20 ml chladného RPMI 1640 média (10 % teplom inaktivované fetálne hovädzie sérum, 50 μΜ beta-merkaptoetanolu), nechalo sa počas 2 hodín pri izbovej teplote a potom sa inkubovalo počas 60 hodín pri 37 °C. Potom sa bunky preniesli do 50 ml média s obsahom 1 mg/ml G418 na selekciu. Stabilné transfektanty sa potom selektovali v prítomnosti zvyšujúcich sa koncentrácií metotrcxátu na amplifikáciu integrovanej DNA a tak zvýšenie expresie zodpovedajúcej protilátky rD2-14.

Expresia rD2-14 v supematante kultúry (SrD2-14) sa sledovala enzýmovo viazaným imunosorpčným testom (ELISA) špecifickým pre ľudské 1 a κ reťazce. Kvantifikácia Rhesus D špecifických imunoglobulínov v anti-D teste podľa Ph. Eur. ukázala medzi 1,1 až 11,4 pg/ml aglutinačnej protilátky v takých supematantoch. Testovali sa ako aglutinácia negatívna pre Rhesus negatívne erytrocyty a mali rovnaký aglutinačný potenciál proti čiastočným D variantom ako Fab LD2-14 exprivované v E. coli. Údaje sú ukázané v tabuľke 10.

Tabuľka 10

Porovnávacia analýza reaktivity Fab anti-Rhesus D klonu LD2-14 a protilátky rD2-14 pri čiastočným D variantom

Čiastočné D varianty
	R1R1	IT	Rh33	Dm	DIVa	DIVb	DVa	DVI	DV1I
LD2-14	++ +	-	++ +	++ 4-	++ +	4-4+	++ 4-	-	4-44-
SrD2-14	4-4+	-	4-+ +	4-4+	++ +	+4+	4-44-	-	4-44-
TCB	-

Aglutinácia sa hodnotila vizuálnym hodnotením od +++ (všetky bunky aglutinovali v zhluku) do - (žiadne bunky nie sú aglutinované).

LD2-14: Fab fragment pripravený ako je opísané v príklade 5; SrD2-14: supematant bunkovej kultúry s obsahom protilátky rD2-147;

TCB: supematant bunkovej kultúry netransfektovaných buniek.

Zoznam sekvencií (1) Všeobecné informácie (i) Prihlasovateľ:

(A) Rotkreuzstiftung Zentrallaboratorium Blutspendedienst (B) Ulica: Wankdorfstrasse 10 (C) Mesto: Bern 22 (E) Štát: Švajčiarsko (F) Poštový kód (ZIP): CH-3000 (ii) Názov vynálezu: Polypeptidy so schopnosťou tvorby väzbových štruktúr na antigén so špecificitou pre Rhesus D antigény, DNA kódujúce také polypeptidy a spôsob ich prípravy a použitie (iii) Počet sekvencií: 64 (iv) Počítačová čítacia forma:

(A) Typ média: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilný (C) Operačný systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1.0, verzia #1.30 (EPO) (v) Údaje o súčasnej prihláške:

(A) Číslo prihlášky: PCT/EP97/03253 (vi) Predchádzajúce údaje prihlášky:

(A) Číslo prihlášky: EP 96810421.6 (B) Dátum podania: 24.6.1996 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 1:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 375 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetická: Nie (iv) Antisenzia: Nie (v) Typ fragmentu: N-koncový (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Homo sapiens (C) Jednotlivý izolát: Hyperimúnny Rhesus D darca (D) Vývojový stav: Dospelý (E) Haplotyp: Diploidný (G) Typ bunky: Periférny B lymfocyt (vii) Bezprostredný zdroj:

(A) Knižnica: cDNA knižnica, LD1 (B) Kloň: LD1-40 (viii) Umiestnenie v genóme (A) Chromozóm/segment: Chromozóm 14 (B) Pozícia na mape: q32.3 (C) Jednotky: číslo chromozómového pásika (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/kľúč: CDR1, CDR2, CDR3 (B) Umiestnenie: Hranice (91...105, 148...198,

195...342) (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/kľúč: CDS (B) Umiestnenie: 1...375 (D) Iné informácie: /produkt= Jmunoglobulín, Fab“ (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 1:

CAG Gin 1

CTG AAA

CTG CTC GAG TCT GGG GGA GGC GTG GTC CAG CCT GGG AGG

48

Val

Lye

Leu

Leu Glu 5

Ser

Gly

Gly Gly 10

Val

Gin

Fro Gly Arg 15

TCC

CTG

AGA

CTC

TCC

TCT

ATA

GCG

TCT

GGA

ttc

ACC

CTC

AGG

AAT

TAT

96

Ser

l.eu

Arg

Leu

Ser

Cye

Ile

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Arg

Asn

Tyr

20

25

30

GCC

ATG

CAC

TGG

GTC

CGC

CAG

GCT

CCA

GGC

AAG

GGG

CTG

GAG

TGG

GTG

144

Ala

Met

HÍ8

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

GCA

GGT

ATA

TGG

TTT

GAT

GGA

AGT

AAC

AAA

AAC

TAT

GCA

GAC

TCC

GTG

192

Ala

Gly

Ile

Trp

Phe

Asp

Gly

Ser

Asn

Lys

Asn

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

SO

55

60

AAG

GGC

CGA

TTC

ACC

ATC

TCC

AGA

GAC

AAT

TCC

AAG

AAC

ACG

CTG

ΤΑΓ

240

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Aen

Thr

Leu

Tyr

£5

70

75

80

CTG

CAA

CTG

AAC

AGC

CTG

AGA

GAC

GAG

GAC

ACG

GCT

GTG

TAT

TGT

288

Leu

Gin

Leu

Asn

Ser

Leu

Arg

ÄBp

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

es

90

95

GCG

AGA

GAG

CGA

GCA

CGT

GGT

ATT

TCT

AGG

TTC

TAT

TAC

ATG

336

Ala

Arg

Glu

Arg

Ala

Arg Gly

Ile

Ser

Arg

Phe

Tyr

Met

LOO

105

110

GAC

GTC

TGG

GGC

AAA

GGG

ACC

ACG

GTC

ACC

GTC

TCC

CCA

375

Aep

Val

Trp

Gly

Lys

Gly

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Pro

115

120

125

(2) Informácie pre SEQ ID NO: 2:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) DÍžka: 125 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 2:

Gin Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ile Ala Ser Gly Phe Thr Leu Arg Asn Tyr 20 25 30

Ala

Met

HÍS

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ala

Gly

íle

Trp

Phe

ASp

Gly

Ser

Asn

Lys

Asn

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

íle

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

BO

Leu

Gin

Leu

Asn

Ser

Leu

Arg

Asp

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Glu

Arg

Ala

Arg

Gly

íle

Ser

Arg

Phe

Tyr

Met

100

105

110

Asp

val

Trp

Gly

Lys

Gly

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Pro

115

120

125

(2) Informácie pre SEQ ID NO: 3:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 318 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetická: Nie (iv) Antisenzia: Nie (v) Typ fragmentu: N-koncový (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Knižnica: cDNA knižnica, LD1 (B) Kloň: LD 1-40 (viii) Umiestnenie v genóme (A) Chromozóm/segment: Chromozóm 2 (B) Pozícia na mape: pl 1 (C) Jednotky: číslo chromozómového pásika (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/kľúč: CDS (B) Umiestnenie: 1...318 (D) Iné informácie: /produkt= „Imunoglobulín, Fab“ (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/kľúč: CDR1, CDR2, CDR3 (B) Umiestnenie: Hranice (64...96,142...162,259...288) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 3:

GTG ATG ACC CAG

TCT CCA TCC TCC

CTG TCT GCA TCT GTA GGC GAC AGA Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Ara

4S

val Met 1

Thr Gin

Ser 5

Pro

Ser

10

15

GTC

ACC

ATC

ACT

TCC

CGG

GCA

AGT

CAG

AGC.ATT

AGG

AGC

CAT

TTG

AAT

96

val

Thr

íle

Thr

Cy_B

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

íle

Arg

Ser

His

Leu

Asn

20

25

30

TGG

TAT

CAG

AAA

CCA

GGG

AAA

GCC

CCT

AAG

TTG

CTG

ATC

TAT

GGT

144

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

íle

Tyr

Gly

35

40

45

GCG

TCC

ACT

TTG

CAA

AGT

GGC

GTC

CCA

TCA

AGG

TTC

AGT

GGC

AGT

GGC

192

Ala

Ser

Thr

Leu

Gin

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

50

55

60

TCT

GGG

GCA

GTT

TTC

ACT

ctc

ACC

ATC

GCC

AGT

CTA

CAA

CCT

GAA

GAT

240

Ser

Gly

Ala

Val

Phe

Thr

Leu

Thr'

íle

Ala

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

65

70

75

80

TTT

GCA

ACT

TAC

TGT

CAA

GAG

AGT

TAC

AGT

AAT

CCT

CTA

ATC

ACC

288

Phe

Ala

Thr

Tyr

Cys

Gin

Glu

Ser

Tyr

Ser

Asn

Pro

Leu

íle

Thr

85

90

95

TTC

GGC

CAA

GGG

ACA

CGA

CTG

GAG

ACT

AAA

318

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Arg

Leu

Glu

Thr

Lys

100

105

(2) Informácie pre SEQ ID NO. 4:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 106 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 4:

Val

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

1

5

10

15

Val

Thr

íle

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

íle

Arg

Ser

His

Leu

Asn

20

25

30

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lyc

Leu

Zle

Tyr

Gly

35

40

45

Ala

Ser

Thr

Leu

Gin

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ala

val

Phe

Thr

Leu

Thr

íle

Ala

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

65

70

75

80

Phe

Ala

Thr

Tyr

Cys

Gin

Glu

Ser

Tyr

Ser

Afírt

Pro

Leu

íle

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Arg

Leu

Glu

Thr

Lys

100

105

(2) Informácie pre SEQ ID NO: 5:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) DÍžka: 375 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetická: Nie (iv) Antisenzia: Nie (v) Typ fragmentu: N-koncový (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Knižnica: cDNA knižnica, LD1 (B) Kloň: LD1-52 (viii) Umiestnenie v genóme (A) Chromozóm/segment: Chromozóm 14 (B) Pozícia na mape: q32.3 (C) Jednotky: číslo chromozómového pásika (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/kľúč: CDS (B) Umiestnenie: 1...375 (D) Iné informácie: /produkt= „Imunoglobulín, Fab“ (ix) Vlastnosti:

295...342)

(xi) Opis sekvencie: CAG GTG AAA CTG CTC GAG TCT

SEQ IDNO: 5:

GGG Gly

GGA GGC CTG

GTC CAG CCG GGG GGG

48

Gin Val Lys 1

Leu Leu S

Glu Ser

Gly Gly 10

Val

Gin

Pro Gly Gly 1S

TCC

CTG

AGA

CTC

TCC

TGT

GAA

GCG,

, tct

GGA

TTC

GCC

ctc

AGA

AGT

TCT

96

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Glu

Ala

Ser

Gly

Phe

Ala

Leu

Arg

Ser

20

25

30

GRC ATG CAC TGG GTC CGC CAC

i GCT

’ CCT

GGC

AAG

GGG

CTG

GAG

TGG

GTG

144

Gly Met His 3‘

i Trp Val

Arg Gin

t Ala 40

: Pre

Gly

Lys

Gly

Leu 45

Glu

Trp

val

GCA

CTT

ATA

TGG

TTT

GAT

GGA

AGT

ATC

AGA

TCG

TAT

GCA

GAA

tcc

GTG

192

Ala

Leu

íle

Trp

Phe

Aep

Gly

Ser

íle

Arg

Ser

Tyr

Ala

Glu

Ser

Val

50

55

60

AAG

GGC

CGA

TTC

ACC

ATC

TCC

AGA

GAC

ACT

TCC

AAG

AAC

ACC

CTA

TAT

240

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

íle

Ser

Arg

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

BO

CTC

CAA

ATC

CGC

AGT

CTC

AGT

GCC

GAC

ACG

GCT

GTG

TAT

TAC

TGT

288

Leu

Gin

Met

Arg

Ser

Leu

Ser

Ala

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

GCG

AGA

GAC

AAG

GCG

GTT

CGG

GGA

ATT

AGC

AGG

TAC

AAC

TAT

TAC

ATG

336

Ala

Arg

Asp

Lys

Ala

val

Arg

Gly

íle

Ser

Arg

Tyr

Asn

Tyr

Met

100

105

110

GAC

GTC

TGG

GGC

AAA

GGG

ACC

ACG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

375

Asp

Val

Trp 115

Gly

Lys

Gly

Thr

Thr 120

Val

Thr

Val

Ser

Ser 125

(2) Informácie pre SEQ ID NO: 6:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 125 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 6:

Gin

Val

Lys

Leu

Glu

Ser

Gly

Val

Gin

Pro

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Glu

Ala

Ser

Gly

Phe

Ala

Leu

Arg

Ser

20

25

30

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

val

35

40

45

Ala

Leu

íle

Trp

Phe

Asp

Gly

Ser

íle

Arg

Ser

Tyr

Ala

Glu

Ser

val

50

55

60

Lys 65

Gly

Arg

Phe

Thr

Íle 70

Ser

Arg

Asp

Thr

Ser 75

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr 80

Leu

Gin

Met

Arg

Ser

Leu

Ser

Ala

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

ASp

Lys

Ala

val

Arg

Gly

íle

Ser

Arg

Tyr

Asn

Tyr

Met

100

105

110

Asp

Val

Trp

Gly

Lys

Gly

Thr

Val

Thr

Val

Ser

115 120 125 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 7:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Knižnica: cDNA knižnica, LD1 (B) Kloň: LD1-52 (viii) Umiestnenie v genóme (A) Chromozóm/segment: Chromozóm 2 (B) Pozícia na mape: pl 1 (C) Jednotky: číslo chromozómového pásika (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/kľúč: CDS (B) Umiestnenie: 1...318 (D) Iné informácie: /produkt=, Jmunoglobulín, Fab“ (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/kľúč: CDR1, CDR2, CDR3 (B) Umiestnenie: Hranice (64...96, 142...162,

259...288) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 7:

GTG Val 1

ATG ACC

CAG TCT CCA TCC TCC CTG

TCT GCA TCT GTA GGA GAC AGA

48

Met

Thr

Gin

Ser Pro 5

Ser

Leu

Ser 10

Ala

Ser

Val Gly

Asp Arg 15

GTC

ACC

ATC

ACT

TGC

CGG

GCA

AGT

CAG

AAC

ATT

ATC

CGC

TAT

TTA

ÄAT

96

Val

Thr

íle

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Asn

íle

Íle

Arg

Tyr

Leu

Asn

20

26

30

TGG

TAT

CAG

AAG

CCA

GGG

AAA

GCC

cct

AGG

CTC

CTG

ATC

TAT

GGT

144

Trp Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Arg

Leu

íle

Tyr

Gly

35

40

45

GCG

TCC

ACT

TTC

CAA

AGT

GGG

GTC

CCA

TCA

AGG

TTC

AGT

GGC

AGT

GGA

192

Ala

Ser

Thr

Leu

Gin

Ser

Gly

Val

Pre

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

50

55

60

TCT

GGG

ACA

GAT

TTC

ACT

CTC

ACC

ATC

AGT

CTG

CAA

CCT

GAA

GAT

240

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

íle

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

65

70

75

BO

ΤΤΓ

GCA

ACT

TAC

TGT

CAA

CAG

AGT

TAC

CGT

ACC

CCT

CCA

TTC

ACT

288

Phe

Ala

Thr

Tyr

Cys

Gin

Ser

Tyr

Arg

Thr

Pro

Phe

Thr

85

90

95

TTC

GGC

CCT

GGG

ACC

AAA

GTG

GAG

ATC

AAA

318

Phe

Gly

Pro

Gly

Thr

Lys

val

Glu

íle

Lys

100

105

(2) Informácie pre SEQ ID NO: 8:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 106 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 8:

Va

1 Met Thr Gin Ser

Pro Ser Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

1

5

10

15

va

1 Thr íle Thr Cys

Arg Ala Ser

Gin

Asn

íle

Arg

Tyr

Leu

Asn

20

25

30

Trp Tyr Gin Gin Lys

Pro Gly Lys

Ala

Pro

Arg

Leu

íle

Tyr

Gly

35

40

45

Ala

Ser

Thr

Leu

Gin

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

50

55

60

Ser 65

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr 70

Leu

Thr

íle

Ser

Ser 75

Leu

Gin

Pro i

Glu

Asp 80

Phe

Ala

Thr

Tyr

Cys

Gin

Ser

Tyr

Arg

Thr

Pro

Pro :

Phe

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Pro

Gly

Thr

Ly6

Val

Glu

íle

Lys

100

105

(2) Informácie pre SEQ ID NO: 9:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Knižnica: cDNA knižnica, LD1 (B) Kloň: LD1-84 (viii) Umiestnenie v genóme (A) Chromozóm/segment: Chromozóm 14 (B) Pozícia na mape: q32.3 (C) Jednotky: číslo chromozómového pásika (ix) Vlastnosti:

295...342) (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/kľúč: CDS (B) Umiestnenie: 1...375 (D) Iné informácie: /produkt= „Imunoglobulín, Fab“ (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 9:

CAG Gin 1

GTG AAA

CTG CTC Leu Leu 5

GAG Glu

TCT GGG GGA GGC GTG GTC CAG CCG GGG GGG

Val

Lys

Ser

Gly

Gly Val 10

Val Gin

Pro Gly Gly 15

TCC

CTG

AGA

CTC

TCC

TGT

GAA

GCG

TCT

GGA

TTC

ACC

CTC

AGA

AGT

TCT

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Glu

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Arg

Ser

20

25

30

GGC

ATG

CAC

TGG

GTC

CGC

CAG

GCT

CCT

GGC

AAG

GGG

CTG

GAG

TGG

GTG

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lye

Gly

Leu

Glu

Trp

val

35

40

45

GCA

CTT

ATA

TGG

TTT

GAT

GGA

AGT

ATC

AGA

TCG

TAT

GCA

GAA

TCC

GTG

Ala

Leu

íle

Trp

Phe

Asp

Gly

Ser

íle

Arg

Ser

Tyr

Ala

Glu

Ser

Val

50

55

60

AAG

GGC

CGA

ttc

ACC

ATC

TCC

AGA

GAC

ACT

TCC

AAG

AAC

ACC

CTA

TAT

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

íle

Ser

Arg

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

CTC

CAA

ATG

CGC

AGT

CTG

AGT

GCC

GAC

ACG

GCT

GTG

TAT

TAC

TGT

Leu

Gin

Met

Arg

Ser

Leu

Ser

Ala

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

GCG

AGA

GAC

AAG

GCG

GTT

CGG

GGA

ATT

AGC

AGG

TAC

AAC

TAT

TAC

ATG

Ala

Arg

Asp

Lys

Ala

Val

Arg

Gly

íle

Ser

Arg

Tyr

Asn

Tyr

Met

100

105

110

GAC

GTC

TGG

GGC

AAA

GGG

ACC

ACG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

Asp

Val

Trp

Gly

Lys

Gly

Thr

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

4B

144

192

240

288

336

375 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 10:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 125 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 10:

Gin Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Glu

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Arg

Ser

20

25

30

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ala

Leu

íle

Trp

Phe

Asp

Gly

Ser

íle

Arg

Ser

Tyr

Ala

Glu

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

íle

Ser

Arg

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gin

Met

Arg

Ser

Leu

Ser

Ala

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Asp

Lys

Äla

Val

Arg

Gly

íle

Ser

Arg

Tyr

Asn

Tyr

Met

100

105

110

Asp

Val

Trp

Cly

Lys

Gly

Thr

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

(2) Informácie pre SEQ ID NO: 11:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) DÍžka: 315 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetická: Nie (iv) Antisenzia: Nie (v) Typ fragmentu: N-koncový (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Knižnica: cDNA knižnica, LD1 (B) Kloň: LD1-84 (viii) Umiestnenie v genóme (A) Chromozóm/segment: Chromozóm 2 (B) Pozícia na mape: pl 1 (C) Jednotky: číslo chromozómového pásika (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/kľúč: CDS (B) Umiestnenie: 1...315 (D) Iné informácie: /produkt= „Imunoglobulín, Fab“ (ix) Vlastnosti:

259...285) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 11:

GTG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT ATA GGA GAC AGA48

Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Xle Gly AcpArg

1015

GTC ACC ATC ACC TGC CGG GCA AGT CAG AGT ATC ATC AGG TAT TTG AAT96

Val Thr íle Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser íle íle Arg Tyr LeuAsn

2530

TGG TAT CAG CAC AAA CCA GGA AAA GCC CCT AAA CTC CTC ATC TTT GCT144

Trp Tyr Gin His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu íle Phe Ala

4045

GCA TGG AAT TTG CAA ACT GGG GTC CCA TCC AGG TTC AGT GGC AGT GGA192

Ala Ser Asn Leu Gin Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly

5560

TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGT GAC CTG CAG CCT GAG GAT240

Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr íle Ser Asp Leu Gin Pro Glu Asp

70 7580

TTC GCA ACT TAC TAC TCT CAA CAG AGT TAC AGT AGG CCG TTC ACT TTT289

Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Ser Arg Pro Phe Thr Phe

9095

GGC CGG GGG ACC AGC CTG GAC ATC AAA315

Gly Arg Gly Thr Ser Leu Asp íle Lys

100 105· (2) Informácie pre SEQ ID NO: 12:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) DÍžka: 105 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín

(xi)

Op

is sekve

;ncii

e: S

EQ

ID 1

MO:

12:

Val

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

íle

Gly

Asp

Arg

1

5

10

15

Val

Thr

íle

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

íle

Arg

Tyr

Leu

Asn

20

25

30

Trp

Tyr

Gin

His

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

íle

Phe

Ala

35

40

45

Ala

Ser

Asn

Leu

Gin

Thr

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

íle

Ser

Asp

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

65

70

75

80

Phe

Ala

Thr

Tyr

Cys

Gin

Ser

Tyr

Ser

Arg

Pro

Phe

Thr

Phe

85

90

95

Gly

Arg

Glý

Thr

Ser

Leu

Asp

íle

Lys

100 105 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 13:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Knižnica: cDNA knižnica, LD1 (B) Klon: LD1-110 (viii) Umiestnenie v genóme (A) Chromozóm/segment: Chromozóm 14 (B) Pozícia na mape: q32.3 (C) Jednotky: číslo chromozómového pásika (ix) Vlastnosti:

295...348)

(xi)

1 Opis :

;ekven

cie:

SE

:qi

D NO

: 13

CAG

GTG

AAA

CTG

CTC

GAG

TCT

GGG

GGA

GGC

GTG

GTC

CAG

CCT

GGG

AGG

48

Gin

Val

Lys

Leu

Glu

Ser

Gly

Val

Gin

Pro

Gly

Arg

1

5

10

15

TCC

CTG

AGA

CTC

TCC

TGT

ATA

GCG

TCT

GGA

TTC

ACC

CTC

AGG

AAT

TAT

96

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

íle

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Arg

Asn

Tyr

20

25

30

GCC

ATG

CAC

TGG

GTC

CGC

CAG

GCT

CCA

GGC

AAG

GGG

CTG

GAG

TGG

GTG

144

Ala

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

GCA

GGT

ATA

TGG

TTT

GAT

GGA

AGC

AAC

AAA

AAC

TAT

GCA

GAC

TCC

GTG

192

Ala

Gly

íle

Trp

Phe

Asp

Gly

Ser

Asn

Lys

Asn

Tyr

Ala

Asp

Ser

val

50

55

60

AAG

GGC

CGA

TTC

ACC

ATC

TCC

AGA

GAC

AAC

TCC

AAG

AAC

ACT

CTG

TTT

240

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

íle

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Phe

65

70

75

80

CTG

CAC

ATG

AAC

AGC

CTG

AGA

GCC

GAG

GAC

ACG

GCT

ACA

TAT

TAC

TCT

28S

Leu

His

Met

Asn

Ser 85

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp 90

Thr

Ala

Thr

Tyr

Tyr 9S

Cys

GCG

AGA

GAG

AGG

GCG

ATT

CGG

GGA

ATC

AGT

AGA

TAC

AAT

TAC

TAC ATG

336

Ala

Arg

Glu

Arg

Ala

íle

Arg

Gly

íle

Ser

Arg

Tyr

Asn

Tyr

Tyr Met

100

105

110

GAC

GTC

TGG

GGC

AAG

GGG

ACC

ACG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

375

ABp

val

Trp

Gly

Lye

Gly

Thr

val

Thr

val

ser

Ser

115

120

125

TCT GGG Ser Gly

ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT Thr Asp Phe Thr Leu Thr íle Ser Ser 70 75

CTG CAG CCT GAA GAT Leu Gin Pro Glu Asp

240

TTT GCG ACT TAT TAT TGT CAA CAG AGT TCC AGT TCC TCG TGG ACG TTC Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Ser Ser Ser Ser Trp Thr Phe 85 90 95

288 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 14:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 125 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 14:

Glr.

val

Lys

Leu

Glu

Ser

Gly

Val

Gin

Pro

Gly

Arg

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

íle

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Arg

Asn

Tyr

20

25

30

Ala

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ala

Gly

íle

Trp

Phe

Asp

Gly

Ser

Asn

Lys

Asn

Tyr

Ala

Asp

Ser

val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

íle

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Phe

65

70

75

80

Leu

His

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Glu

Arg

Ala

íle

Arg

Gly

íle

Ser

Arg

Tyr

Asn

Tyr

Met

100

105

110

ASp

val

Trp

Gly

Lys

Gly

Thr

val

Thr

Val

Ser

115

120

125

GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA

Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu íle Lys

100 105

315 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 16:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 105 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 16:

val

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

1

5

10

15

Val

Thr

íle

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

íle

Arg

Ser

Leu

Asn

20

25

30

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Val

Leu

íle

Tyr

Ala

35

40

45

Ala

Ser

Leu

Gin

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Arg

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

íle

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

65

70

75

80

Phe

Ala

Thr

Tyr

Cys

Gin

Ser

Trp

Thr

Phe

85

90

95

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

íle

Lys

100

105

(2) Informácie pre SEQ ID NO: 15:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 315 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetická: Nie (iv) Antisenzia: Nie (v) Typ fragmentu: N-koncový (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Knižnica: cDNA knižnica, LD1 (B) Kloň: LD1-110 (viii) Umiestnenie v genóme (A) Chromozóm/segment: Chromozóm 2 (B) Pozícia na mape: pil (C) Jednotky: číslo chromozómového pásika (ix) Vlastnosti:

259...285) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 15:

GTG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTA GGA GAC AGA48

Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg

1015

GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG AGC ATT CGA AGC TCT TTA AAT96

Val Thr íle Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser íle Arg Ser Ser Leu Asn

2530

TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGG AAA GCC CCT AAA GTC CTG ATC TAT GCT144

Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Íle Tyr Ala

4045

GCA TCC AGT TTG CAA AGT GGG GTC CCA TCC AGG TTC AGT GGC AGA GGA192

Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Arg Gly

5560 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 17:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) DÍžka: 378 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetická: Nie (iv) Antisenzia: Nie (v) Typ fragmentu: N-koncový (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Knižnica: cDNA knižnica, LD1 (B) Kloň: LD1-117 (viii) Umiestnenie v genóme (A) Chromozóm/segment: Chromozóm 14 (B) Pozícia na mape: q32.3 (C) Jednotky: číslo chromozómového pásika (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/kľúč: CDS (B) Umiestnenie: 1...378 (D) Iné informácie: /produkt= „Imunoglobulín, Fab“ (ix) Vlastnosti:

295...345) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 17:

CAG GTG AAA CTG CTC GAG TCA GGA GGA GGC GTG GTC CAG CCT GGG AAG48

Gin Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Lys 15 1015

TCC CTG AGA CTT TCC TGT GCA GCG TCT GGA TTC AGT TTC AAT AGC CAT96

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Ser His

2530

GGC ATG CAC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGC AAG GGG CTG GAG TGG GTG144

Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

40<5

GCA TTT ATA TGG TTT GAT GGC AGT AAT AAA TAC TAT GCA GAC TCC GTG192

Ala Phe íle Trp Phe Asp Gly Ser Asn Ly6 Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 5C 5560

AAG GGC CGA TTC ACC ATC ACC AGA GAC AAC TCC AAG AAC ACG CTG TAT 24í)

Lys Gly Arg Phe Thr íle Thr Arg Asp Asn Ser Lye Asn Thr Leu Tyr

70 75 BO

CTG

CAA

ATC

AAC

AGC

CTG

AGA

GCC

GAG

GAC

ACG

GCT

GTC

TAT

TAC

TGT

288

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

ASp

Thr

Ala

Val

Tyr

cys

85

90

95

GCG

AGA

GAG

ACC

TCA

GTA

AGG

CTA

GGG

TAT

AGC

CGC

TAC

AAT

TAC

336

Ala

Arg

Glu

Thr

Ser

Val

Arg

Leu

Gly

Tyr

ser

Arg

Tyr

Asn

Tyr

100

105

110

ATG

GAC

GTC

TGG

GGC

AAA

GGG

ACC

ACG

GTC

ACC

ATC

TCG

TCA

37S

Mec

Asp

Val

Trp

Gly

Lys

Gly

Thr

Val

Thr

íle

Ser

115

120

125

(2) Informácie pre SEQ ID NO: 18:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) DÍžka: 126 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: protein (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 18:

Gin

Val

Lys

Leu

Glu

Ser

Gly

Val

Gin

Pro

Gly

Lys

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ser

Gly

Phe

Ser

Phe

Asn

Ser

His

20

25

30

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ala

Phe

íle

Trp

Phe

Asp

Gly

Ser

Asn

Lys

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys 65

Gly

Arg

Phe

Thr

íle 70

Thr

Arg

Asp

Asn

Ser 75

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr 80

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

val

Tyr

Cys

as

90

95

Ala

Arg

Glu

Thr

Ser

Val

Arg

Leu

Gly

Tyr

Ser

Arg

Tyr

Asn

Tyr

100

105

110

Met

Asp

Val

Trp

Gly

Lys

Gly

Thr

Val

Thr

íle

Ser

115

120'

125

TGG TAT CAG Trp Tyr Gin

CAG AAA

CCA GGG AAA GCC CCT AAG CTC CTG ATC TAT GCT

144

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys Ala Pro 40

Lys

Leu

Leu 45

íle Tyr Ala

35

GCA

TCC

AGT

TTG

CAA

GGT

GGG

GTC

CCA

TCA

AGG

TTC

AGT

GGC

AGT

GGA

192

Ala

Ser

Leu

Gin

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

ser

Gly

50

55

60

TCT

GGG

ACA

GAT

TTC

ACT

CTC

ACC

ATC

AGC

AGT

CTG

CAA

CCT

GAA

GAT

240

Ser

Gly

Thr

ASp

Phe

Thr

Leu

Thr

íle

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

65

70

75

30

ΊΤΤ

GCA

ACT

TAT

TAC

TGT

CAA

CAG

AGT

TAC

AGG

GCC

CCT

CAG

TGG

ACG

288

Phe

Ala

Thr

Tyr

Cys

Gin

Ser

Tyr

Arg

Ala

Pro

Gin

Trp

Thr

85

90

95

TTC

GGC

CAA

GGG

ACC

AAG

GTG

GAA

ATC

AAA

318

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lyg

val

Glu

íle

Lys

100

105

(2) Informácie pre SEQ ID NO: 20:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 106 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: protein (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 20:

Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser

Ala

Ser Val

Gly

Asp 15

Arg

1

5

10

Val

Thr

íle

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

íle

Arg

Ser

His

Leu

Asn

20

25

30

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

íle

Tyr

Ala

35

40

45

Ala

Ser

Leu

Gin

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

íle

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

65

70

75

80

Phe

Ala

Thr

Tyr

Cys

Gin

Ser

Tyr

Arg

Ala

Pro

Gin

Trp

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

íle

Lys

100

105

(2) Informácie pre SEQ ID NO: 19:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) DÍžka: 318 párov báz.

(B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetická: Nie (iv) Antisenzia: Nie (v) Typ fragmentu: N-koncový (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Knižnica: cDNA knižnica, LD1 (B) Kloň: LD1-117 (viii) Umiestnenie v genóme (A) Chromozóm/segment: Chromozóm 2 (B) Pozícia na mape: pl 1 (C) Jednotky: číslo chromozómového pásika (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/kľúč: CDR], CDR2, CDR3 (B) Umiestnenie: Hranice (64...96, 142...162,

259...288) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 19:

GTG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTA GGA GAC AGA4 6

Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly AspArg

1015

GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG AGC ATT AGG AGC CAT TTC AAT96 val Thr íle Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser íle Arg Ser His LeuAan

2530 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 21:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Knižnica: cDNA knižnica, LD2 (B) Kloň: LD2-1 (viii) Umiestnenie v genóme (A) Chromozóm/segment: Chromozóm 14 (B) Pozícia na mape: q32.3 (C) Jednotky: číslo chromozómového pásika (ix) Vlastnosti:

295...342) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 21:

CAG GTG AAA ĽTG CTC GAG TCT GGG GGA GGC GTG GTC CAG CCG GGG GGG4f

Gin Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Glv ^{1 5} 1015

TCC CTG AGA CTC TCC TCT GTA GCG TCT GGA TTC ACC CTC AGG AGT TAT96

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala ser Gly Phe Thr Leu Arg Ser Tyr

2530

GGC ATG CAC TGG GTC CGC CAG GCT CCA Gly Met Mís Trp Val Arg Gin Ala Pro 3S<0

GCT TTT A TA TGG TTT GAT GGA AGT AAT Ala Phe íle Trp Phe Asp Gly Ser Asn 5055

AAG GGC CGA TTC ACC ATC TCC CGA GAC Lys Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg’Asp 6570

CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAT Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp 85

GGC AAG GGC CTG GAG TGG GTG 144 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

AAA GGA TAT GTA GAC TCC GTG 192 Lys Gly Tyr val Asp Ser val

AAT TCC AAG AAC ATG GTC TAT 240 Asn Ser Lys Asn Met Val Tyr

75bo

GAC ACG GCT GTA TAT TAT TGT 288 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

9095

AGC AGA TAC AAC TAT TAC CTG3 36

Ser Arg Tyr Asn Tyr Tyr Leu

110

GCG AGA GAG AAG GCG CTT CGG GGA ATC AGC AGA TAC AAC TAT TAC CTG336

Ala Arg Glu Lys Ala Leu Arg Gly íle Ser Arg Tyr Asn Tyr Tyr Leu

100 105110

GAC GTC TGG GGC AAG GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA375

Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120125

375 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 22:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) DÍžka: 125 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 22:

GTG GTG ACT CAG

CCA CCC TCA GCG

TCT GGG ACC CCC GGA CAG AGG GTC Ser Gly Thr Pro Gly Gin Arg val

48

Val val 1

Thr Gin

Pro 5

Pro

Ser

Ala

10

15

ACC

ATC

TCT

TGT

tct

GGA

AGC

AAC

TCC

ATC

ctt

GGA

AGT

AAG

TAT

GTA

96

Thr

íle

Ser

Cys

Ser

Gly

Ser

Asn

Ser

íle

Leu

Gly

Ser

Lys

Tyr

Val

20

25

30

TAC

TGG

TAC

CAG

AAA

CTC

CCA

GGA

ACG

GCC

CCC

AAA

CTC

ATC

TAT

144

Tyr

Trp

Tyr

Gin

Lys

Leu

Pro

Gly

Thr

Ala

Pro

Lys

Leu

íle

Tyr

35

40

45

AAG

AAT

GAT

CAG

CGG

CCC

TCA

GGG

GTC

TCT

GAC

CGA

TTC

TCT

GGC

TCC

192

Lys

Asn

Asp

Gin

Arg

Pro

Ser

Gly

Val

Ser

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

AAG

TCT

GGC

ACC

TCG

GCC

TCC

CTG

GCC

ATC

AGT

GGG

CTC

CGG

TCC

GAG

240

Lys

Ser

Gly

Thr

Ser

Ala

Ser

Leu

Ala

íle

Sar

Gly

Leu

Arg

Ser

Glu

65

70

75

80

GAT

GAG

GCT

GAC

TAT

TAC

TGT

GCA

CCA

TCG

GAT

GCC

AAC

CTG

GGT

GGC

288

Asp

Glu

Ala

Asp

Tyr

Cys

Ala

Pro

Trp

Aop

Ala

Asn

Leu

Gly

85

90

95

CCG

GTG

TTC

GGC

GGA

GGG

ACC

AAG

CTG

ACC

GTC

CTA

AGT

CAG

CCC

333

Pro

Val

Phe

Gly

Gly Gly

Thr

Lys

Leu

Thr

val

Leu

Ser

Gin

Pro

100

105

110

Gin Val Lys Leu 1

Leu Glu Ser 5

Gly

Gly 10

Val

Val Gin

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Val

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Arg

Ser

Tyr

20

25

30

Gly

Met

His

Trp

val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ala

Phe

Íle

Trp

Phe

Asp

Gly

Ser

Asn

Lys

Gly

Tyr

Val

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

íle

Ser

Arg

Asp

Αεη

Ser

Lys

Asn

Met

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Glu

Lys

Ala

Leu

Arg

Gly

íle

Ser

Arg

Tyr

Asn

Tyr

Leu

100

105

110

Asp

Val

Trp

Gly

Lys

Gly

Thr

Val

Thr

Val

Ser

115 120 125 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 24:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) DÍžka: 111 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 24:

Val Val Thr Gin Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gin Arg Val ¹ 5 10 15

Thr íle Ser Cys Ser Gly Ser Asn Ser íle Leu Gly Ser Lys Tyr Val 20 25 30

Tyr Trp

Lys Asn

Lys Ser

ASp Glu

Pro Val

Tyr Gin

Asp

Gly

Ala

Phe

Lys Leu

Arg Pro

Ser Ala

Tyr Tyr

Gin

Thr

Asp

Gly Gly Gly .100

Pro Gly

Ser Gly

Ser Leu

Cys Ala

Thr Lys

Thr Ala val Ser

Ala íle

Pro Trp

Leu Thr

105

Pro Lys

Asp Arg

Ser Gly

Asp Ala

Val Leu

Leu Leu

Phe Ser Leu Arg

Asn Leu

Ser Gin

110 íle Tyr

Gly Ser

Ser Glu

Gly Gly

Pro (2) Informácie pre SEQ ID NO: 23:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) DÍžka: 333 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetická: Nie (iv) Antisenzia: Nie (v) Typ fragmentu: N-koncový (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Knižnica: cDNA knižnica, LD2 (B) Kloň: LD2-1 (viii) Umiestnenie v genóme (A) Chromozóm/segment: Chromozóm 22 (B) Pozícia na mape: ql 1 (C) Jednotky: číslo chromozómového pásika (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/kľúč: CDS (B) Umiestnenie: 1...333 (D) Iné informácie: /produkt= „Imunoglobulín, Fab“ (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/kľúč: CDR], CDR2, CDR3 (B) Umiestnenie: Hranice (61...99, 145...165,

262...294) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 23:

(2) Informácie pre SEQ ID NO: 25:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) DÍžka: 375 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetická: Nie (iv) Antisenzia: Nie (v) Typ fragmentu: N-koncový (vi) Pôvodný zdroj :

(A) Knižnica: cDNA knižnica, LD2 (B) Kloň: LD2-4 (viii) Umiestnenie v genóme (A) Chromozóm/segment: Chromozóm 14 (B) Pozícia na mape: q32.3 (C) Jednotky: číslo chromozómového pásika (ix) Vlastnosti:

295...342) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 25:

CAG

GTG

AAA

CTG

CTC

GAG

TCG

GGG

GGA

GGC

GTG

GTC

CAG

CCG

GGG

4B

Gin

Val

Lys

Leu

Glu

Ser

Gly

Val

Gin

Pro

Gly

1

5

10

15

TCC

CTG

AGA

CTC

tcc

TGT

GAA

GCC

TCT

GGA

TTC

ACC

CTC

AGA

AGT

TCT

96

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Glu

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Arg

Ser

20

25

30

GGC ATG CAC TGG GTC CGC CAG GCT CCT GGC AAG GGG CTG GAG TGG GTG

Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 (B) Umiestnenie: Hranice (64...96, 142...162,

259...282) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 27:

GCA Ala

CTT Leu 50

ΑΤΑ -TGG TTT GAT GGA

AGT ATC AGA TCG TAT GCA GAA TCC GTG

192

íle

Trp

Phe Asp

Gly 55

Ser

íle

Arg Ser

Tyr Ala Glu Ser Val 60

AAG

GGC

CCA

TTC

ACC

ATC

TCC

AGA

GAC

ACT

TCC

AAG

AAC

ACC

CTA

TAT

240

LyB

Gly

Arg

Phe

Thr

íle

Ser

Arg

ÄBp

Thr

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

CIC

CAA

ATG

CGC

AGT

CTG

AGT

GCC

GAC

ACG

GCT

GTG

TAT

TAC

TGT

288

Leu

Gin

Met

Arg

Ser

Leu

Ser

Ala

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

GCG

AGA

GAC

AAG

GCG

GTT

CGG

GGA

ATT

AGC

AGG

TAC

AAC

TAT

TAC

ATG

336

Ala

Arg

Asp

Lys

Ala

val

Arg

Gly

íle

Ser

Arg

Tyr

Asn

Tyr

Met

100

105

110

GAC GTC TGG GGC AAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

375

GTG

ATG

ACC

CAG

TCT

CCA

TCC

CTG

TCT

GCA

TCT

GTA

GGA

GAC

AGA

48

val

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

1

5

10

15

GTC

ACC

ATC

ACT

TGC

CGG

ACA

AGT

CAG

ACC

ATT

AGC

AGA

AAT

TTA

AAT

96

val

Thr

íle

Thr

Cya

Arg

Thr

Ser

Gin

Thr

íle

Ser

Arg

Asn

Leu

Asn

20

25

30

TGG

TAT

CAG

AAA

CCA

GGG

AAA

GCC

CCT

AAG

CTC

CTG

ATC

TAT

GCT

144

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Lya

Ala

Pro

Lys

Leu

Íle

Tyr

Ala

35

40

45

ACA

TCC

AGT

TTG

CAA

AGT

GGG

GTC

CCA

TCA

AGG

TTC

AGT

GGC

AGT

GGA

192

Thr

Ser

Leu

Gin

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

50

55

60

TCT

GGG

ACA

GAT

ttc

ACT

CTC

ACC

ATC

AAT

AGT

CTA

CAA

CCT

GAA

GAT

24 0

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

íle

Asn

Set

Leu

Gin

Pro

Glu

ASp

65

70

75

80

TTT

GCA

ACT

TAC

TGT

CAA

CAG

AGT

TAC

ACT

ACC

CCT

TCG

TTC

GGC

288

Phe

Ala

Thr

Tyr

Cys

Gin

Ser

Tyr

Thr

Pro

Ser

Phe

Gly

85

90

9S

CAA

GGG

ACC

AAG

GTG

GAA

ATC

AAA

317

Gin

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

íle

Lys

100 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 26:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 125 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín

(xi) Opis

í sekvencie

: SEQ ID NO:

26:

Gin

Val

Lys

Leu

Glu

Ser

Gly

Val

val

Gin

Pro

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Glu

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Arg

Ser

20

25

30

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ala

Leu

íle

Trp

Phe

Asp

Gly

Ser

íle

Arg

Ser

Tyr

Ala

Glu

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

íle

Ser

Arg

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

7S

80

Leu

Gin

Met

Arg

Ser

Leu

Ser

Ala

Asp

Thr

Ala

val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Asp

Lys

Ala

Val

Arg

Gly

íle

Ser

Arg

Tyr

Asn

Tyr

Met

100

105

110

Asp

Val

Trp 115

Gly

Lys

Gly

Thr

Thr 120

Val

Thr

Val

Seť

Ser 125

(2) Informácie pre SEQ ID NO: 28:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 104 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 28:

Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ma Ser Val Gly ΛΒρ Arg 15 1“

Val Thr íle Thr Cys Arg Thr Ser Gin Thr íle Ser Arg Asn Leu Asn 20 ²⁵

Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu íle Tyr Ala 35 4045

Thr Ser Ser Leu Gin Ser Gly val Píq s_er Arg Phe Ser Gly Ser Gly 50 5S60

Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Íle Asn Ser Leu Gin Pro Glu Asp gj 70 7580

Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Thr Thr Pro Ser Phe Gly B5 9095

Gin Gly Thr Lys Val Glu íle Lys

100 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 27:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 312 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetická: Nie (iv) Antisenzia: Nie (v) Typ fragmentu: N-koncový (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Knižnica: cDNA knižnica, LD2 (B) Kloň: LD2-4 (viii) Umiestnenie v genóme (A) Chromozóm/segment: Chromozóm 2 (B) Pozícia na mape: pl 1 (C) Jednotky: číslo chromozómového pásika (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/kľúč: CDS (B) Umiestnenie: 1...312 (D) Iné informácie: /produkt= „fmunoglobulín, Fab“ (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/kľúč: CDR1, CDR2, CDR3 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 29:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Meno/kľúč: CDR1, CDR2, CDR3

SK 284879 Β6 (B) Umiestnenie: Hranice (91...105, 148...198,

295...342) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 29:

CAG GTG Gin val 1

AAA CTG CTC GAG TCT

GGG GGA GGC TTG GTC CAG CCG GGG GGG

48

Lya Leu Leu 5

Glu Ser

Gly Gly

Gly 10

Leu Val

Gin Pro Gly Gly 15

TCC

CTG

AGA

CTC

TCC

TGT

GTA

GCG

TCT

GGA

TTC

ACC

TTC

AGG

AGT

TAT

96

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cya

Val

Ala

Ser Gly

Phe

Thr

Phe

Arg

Ser

Tyr

20

25

30

GGC

ATG

CAC

TGG

GTC

CGC

CAG

GCT

CCA

GGC

AAG

GGC

CTG

GAG

TGG

GTG

144

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

4S

GCT

TTT

ATA

TGG

TTT

GAT

GGA

AGT

AAT

AAA

GGA

TAT

GTA

GAC

TCC

GTG

192

Ala

Phe

íle

Trp

Phe

Asp

Gly

ser

Asn

Lys

Gly

Tyr

Val

Asp

Ser

Val

50

55

60

AAG

GGC

CGA

TTC

ACC

ATC

TCC

CGA

GAC

AAT

TCC

AAG

AAC

ATG

CTC

TAT

240

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

íle

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lya

Asn

Met

Leu

Tyr

65

70

75

80

CTG

CAA

ATG

AAT

AGC

CTG

AGA

GCC

GAG

GAC

ACG

GCT

GTA

TAT

TGT

288

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

GCG

AGA

GAG

AAG

GCG

CTT

CGG

GGA

ATC

AGT

AGA

TAC

AAC

TAT

TAC

CTG

336

Ala

Arg

Glu

Lys

Ala

Leu

Arg

Gly

íle

Ser

Arg

Tyr

Asn

Tyr

Leu

100 105 110

GAC GTC TGG GGC AAG GGG GCC ACG GTC ACC GTC TCC TCA 375

Asp Val Trp Gly Lys Gly Ala Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120· 125 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 30:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 125 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: protein (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 30:

Gin

Val

Lys

Leu

Glu

Ser

Gly

Leu

Val

Gin

Pro

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Val

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Arg

Ser

Tyr

20

25

30

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ala

Phe

íle

Trp

Phe

Asp

Gly

Ser

Asn

Lys

Gly

Tyr

val

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

íle

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Met

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Glu

Lys

Ala

Leu

Arg

Gly

íle

Ser

Arg

Tyr

Asn

Tyr

Leu

100

105

110

Asp

val

Trp

Gly

Lys

Gly

Ala

Thr

val

Thr

Val

Ser

115 120 125 (ix) Vlastnosti:

259...288) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 31:

GTG ATG val Met 1

ACC CAG TCT

CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT

ATA GGC GAC AGA

48

Thr

Gin

Ser 5

Pro Ser

Ser

'Leu

Ser 10

Ala

Ser

íle

Gly Asp 15

Arg

GTC

ACC

ATC

ACT

TGC

CGG

GCA

AGT

CAG

AGC

GTT

ACC

AGG

tct

TTA

AAT

96

Val

Thr

íle

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

Thr

Arg

Ser

Leu

Asn

20

25

30

TGG

TAT

CAG

AAA

CCA

GGG

AAA

GCC

CCT

AGG

CTC

CTA

ATC

TTT

GCT

144

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Arg

Leu

íle

Phe

Ala

35

40

45

GCG

TCC

ACT

TTG

CAA

AGT

GGG

GTC

CCA

TCA

AGG

TTC

AGT

GGC

AGT

GGA

192

Ala

Ser 50

Thr

L.u

Gin

Ser

Gly 55

Val

Pro

Ser

Arg

Phe 60

Ser

Gly

Ser

Gly

TCT

GGG

ACA

GAT

TTC

ACC

CTC

ACC

ATC

AGC

AGT

CTG

CAA

CCT

GAG

GAT

240

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

íle

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

65

70

75

80

TTT GGA ACT TAC TAC TGT CAA CAG AAT TAC AGG ACC CCT CAG TGG ACG Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Asn Tyr Arg Thr Pro Gin Trp Thr

288

85

90

95

TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTA GAA ATC AAA

318

Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu íle Lys

100 105 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 32:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 106 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: protein (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 32:

val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser

Ala

Ser íle

Gly

Asp 15

Arg

1

5

10

Val

Thr

íle

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

Thr

Arg

Ser

Leu

Asn

20

25

30

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Arg

Leu

íle

Phe

Ala

35

40

45

Ala

Ser

Thr

Leu

Gin

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

íle

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

65

70

75

80

Phe

Gly

Thr

Tyr

Cys

Gin

Asn

Tyr

Arg

Thr

Pro

Gin

Trp

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

íle

Lys

100

105

(2) Informácie pre SEQ ID NO: 31:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Knižnica: cDNA knižnica, LD2 (B) Kloň: LD2-5 (viii) Umiestnenie v genóme (A) Chromozóm/segment: Chromozóm 2 (B) Pozícia na mape: pl 1 (C) Jednotky: číslo chromozómového pásika (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/kľúč: CDS (B) Umiestnenie: 1...318 (D) Iné informácie: /produkt= „Imunoglobulín, Fab“ (2) Informácie pre SEQ ID NO: 33:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 378 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetická: Nie (iv) Antisenzia: Nie (v) Typ fragmentu: N-koncový (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Knižnica: cDNA knižnica, LD2 (B) Kloň: LD2-10 (viii) Umiestnenie v genóme (A) Chromozóm/segment: Chromozóm 14 (B) Pozícia na mape: q32.3 (C) Jednotky: číslo chromozómového pásika (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/kľúč: CDR1, CDR2, CDR3 (91...105, 148...198, (B) Umiestnenie: Hranice

295...345) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:

33;

CAG GTG AAA CTG CTC GAG TCT GGG GGA GGC GTG Gin '

Val bye Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val

10

GTC Val

CAG CCG Gin Pro

GGG GGG Gly Gly 15 (B) Umiestnenie: 1...333 (D) Iné informácie: /produkt= „Imunoglobulín, Fab“ (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/kľúč: CDR1, CDR2, CDR3 (B) Umiestnenie: Hranice (61...102, 148...168,

265...294) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 35:

TCC CTG AGA CTC TCC TCT GTA GCG TCT GGA TTC Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val AL

Ser Gly Phe 25

ACC Thr

CTC AGG

Leu Arg

ACt Ser

TAT

Tyr

His

GGC Gly

CTG GAG

Leu Glu

TGG Trp

GTG val

144

TAT Tyr 60

GTA GAC

Val Asp

TCC Ser

GTG Val

192

240

CTG CAA ATG AAC AGC CTC AGA GCC GAT GAC ACG GCT GTA TAT TAT TAT Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Aep Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Tyr Θ5 90 95

336

CTG GAC GTC TGG GGC AAG GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA Leu Afip val Trp Gly Lys Gly Thr

115 120

Thr Val Thr Val Ser Se;

125

378

GTG GTC ACT CAG GAG CCC TCA CTG ACT GTG TCC CCA GGA GGG ACA GTC Val Val Thr Gin Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val

4S 96

1 ACT CTC Thr Leu

5 ACC TCT GCT TCC AGC ACT

GGG Gly 25

10 GCA GTC ACC ACG

16 GGT TAC TAT Gly Tyr Tyr 30

Thr Cys 20

Ala

Ser Ser Thr

Ala

Val

Thr

Arg

CCA

AAC

TGG

TTC

CAG

AAG

CCT

GGA

CAA

GCA

CCC

AGG

GCA

CTG

ATT

144

Pro

Asn

Trp

Phe

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Ala

Leu

íle

35

40

45

TAT

AGT

ACA

AAC

AAA

CAC

TCC

TGG

ACC

CCT

GCC

CGG

TTC

TCA

GGC

192

Tyr

Ser

Thr

Asn

Lys

His

Ser

Trp

Thr

pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

TCC

CTC

CTT

GGG

GGC

AAA

GCT

GCC·

CTG

ACA

CTG

TCA

GGT

GTG

CAG

cct

240

Ser

Leu

Gly Gly

Lys

Ala

Leu

Thr

Leu

Ser

Gly

val

Gin

Pro

65

70

75

90

GAA

GAC

GAG

GCT

GAA

TAT

TAC

TGC

CTG

CTC

TAC

TAT

GGT

GCT

CAA

288

Glu

Asp

Clu

Ala

Glu

Tyr

Cys

Leu

Tyr

Gly

Ala

Gin

65

90

95

CTC

GTA

TTC

GGC

GGA

GGG

ACC

AAG

CTG

ACC

GTC

CTA

CGT

CAG

CCC

333

Leu

Val

Phe

Gly

Thr

Lys

Leu

Thr

Val

Leu

Arg

Gin

Pro

100

105

110

(2) Informácie pre SEQ ID NO: 34:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 126 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín

(xi) Opis sekvencie

: SEQI

D NO:

34:

Gin

val

Lys

Leu

Glu

Ser

Gly

Val

val

Gin

Pro

Gly

1

S

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Val

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Arg

Ser

Tyr

20

25

30

Gly

Met

His

Trp

val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ala

Phe

íle

Trp

Phe

Asp

Gly

Ser

Asn

Lys

Gly

Tyr

val

Asp

Ser

val

50

55

60

by 8

Gly

Arg

Phe

Thr

íle

Ser

Arg¹

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Met

Val

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

ASp

Thr

Ala

Val

Tyr

85

90

95

Cys

Ala

Arg

Glu

Lys

Ala

Leu

Arg

Gly

íle

Ser

Arg

Tyr

Asn

Tyr

100

105

110

Leu

Asp

Val 115

Trp

Gly

Lys

Gly

Thr 120

Thr

val

Thr

val

Ser 125

Ser

(2) Informácie pre SEQ ID NO: 36:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 111 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 36:

Val

Thr

Gin

Glu

Pro

Ser

Leu

Thr

Val

Ser

Pro

Gly

Thr

Val

1

5

10

15

Thr

Leu

Thr

Cys

Ala

Ser

Thr

Gly

Ala

Val

Thr

Arg

Gly

Tyr

20

25

30

Pro

Asn

Trp

Phe

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Ala

Leu

íle

35

'40

45

Tyr

Ser

Thr

Asn

Lys

His

Ser

Trp

Thr

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Leu

Gly

Lys

Ala

Leu

Thr

Leu

Ser

Gly

Val

Gin

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Glu

Ala

Glu

Tyr

Cys

Leu

Tyr

Gly

Ala

Gin

85

90

95

Leu

val

Phe

Gly

Thr

Lys

Leu

Thr

Val

Leu

Arg

Gin

Pro

100 105 110 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 35:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 333 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetická: Nie (iv) Antisenzia: Nie (v) Typ fragmentu: N-koncový (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Knižnica: cDNA knižnica, LD2 (B) Klon:LD2-10 (viii) Umiestnenie v genóme (A) Chromozóm/segment: Chromozóm 22 (B) Pozícia na mape: ql 1 (C) Jednotky: číslo chromozómového pásika (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/kľúč: CDS (2) Informácie pre SEQ ID NO: 37:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Knižnica: cDNA knižnica, LD2 (B) Kloň: LD2-11 (viii) Umiestnenie v genóme (A) Chromozóm/segment: Chromozóm 14 (B) Pozícia na mape: q32.3 (C) Jednotky: číslo chromozómového pásika (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/kľúč: CDS (B) Umiestnenie: 1...375 (D) Iné informácie: /produkt= „Imunoglobulin, Fab“ (ix) Vlastnosti:

295...342) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 37:

CAG

GTG

AAA

CTG

CTC

¹ GAG

TCG

GGG

GGA

GGC

GTG

GTC

CAG

CCG

GGG

48

Gin

val

Lys

Leu

G1U

Ser

Gly

Val

Gin

Pro

Gly

1

5

10

15

TCC

CTG

AGA

CTC

TCC

TGT

GAA

GCG

TCT

GGA

TTC

ACC

CTC

AGA

AGT

TCT

9C

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Glu

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Arg

Ser

20

25

30

GGC

ATG

; CAC

: TGG

GTC

¹ CGC

CAG

GCT

CCT

GGC

AAG

GGG

CTG

GAG

TGG

GTG

144

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

val

35

40

45

GCA

CTT

ATA

TGG

ΤΓΤ

GAT

GGA

AGT

ATC

AGA

TCG

TAT

GCA

GAA

TCC

GTG

192

Ala

Leu

íle

Trp

Phe

Asp

Gly

Ser

íle

Arg

Ser

Tyr

Ala

Glu

Ser

Val

50

55

60

AAG

GGC

CGA

TTC

ACC

ATC

tcc

AGA

GAC

ACT

TCC

AAG

AAC

ACC

CTA

TAT

240

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

íle

Ser

Arg

ASp

Thr

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

BO

CTC

CAA

ATG

CGC

AGT

CTG

AGT

GCC

GAC

ACG

GCT

GTG

TAT

TAC

TGT

288

Leu

Gin

Met

Arg

ser

Leu

Ser

Ala

Αβρ

Asp

Thr

Ala

val

Tyr

Cys

85

90

95

GCG

AGA

GAC

AAG

GCC

GTT

CGG

GGA

ATT

AGC

AGG

TAC

AAC

TAT

TAC

ATG

336

Ala

Arg

Asp

Lys

Ala

Val

Arg

Gly

íle

Ser

Arg

Tyr

Asn

Tyr

Met

100

105

110

GAC

GTC

TGG

GGC

AAA

GGG

ACC

ACG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

375

Asp

val

Trp

Gly

Lys

Gly

Thr

Val

Thr

Val

Ser

115 120 125 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 38:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 125 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 38:

Gin

Val

Lys

Leu

Glu

Ser

Gly

Val

Gin

Pro

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Glu

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Arg

Ser

20

25

30

Gly

Met

His

Trp

val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

4Q

45

Ala

Leu

lle

Trp

Phe

Asp

Gly

Ser

íle

Arg

Ser

Tyr

Ala

Glu

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

íle

Ser

Arg

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

60

Leu

Gin

Met

Arg

Ser

Leu

Ser

Ala

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Asp

Lys

Ala

Val

Arg

ľ Gly

íle

Ser

Arg

Tyr

Asn

i Tyr

' Tyr

• Met

100

105

110

Asp

Val

Trp

Gly

Lys

Gly

Thr

• Thr

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

(2) Informácie pre SEQ ID NO: 39:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 315 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetická: Nie (iv) Antiscnzia: Nie (v) Typ fragmentu: N-koncový (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Knižnica: cDNA knižnica, LD2 (B) Kloň: LD2-11 (viii) Umiestnenie v genóme (A) Chromozóm/segment: Chromozóm 2 (B) Pozícia na mape: pil (C) Jednotky: číslo chromozómového pásika (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/kľúč: CDS (B) Umiestnenie: 1...315 (D) Iné informácie: /produkt= „Imunoglobulin, Fab“ (ix) Vlastnosti:

259...285) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 39:

GTG TTG Val Leu 1

ACC CAG TCT CCA TCC

TCC CTG TCT GCA TCT ATA CGA GAC AGA

48

Thr Gin Ser 5

Pro Ser

Ser Leu

Sex· 10

Ala Ser

íle Arg Asp Arg 15

GTC

ACC

ATC

ACT

TGC

CGG

GCA

AGT

CAG

AAC

ATT

GGC

AGT

TAT

TTA

AAT

96

val

Thr

lle

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Asn

lle

Gly

Ser

Tyr

Leu

Asn

20

25

30

TGG

TAT

CAG

CAC

AAA

CCA

GGG

ACA

GCC

CCT

AAA

CTC

CTG

ATC

TAT

GCT

144

Trp

Tyr

Gin

His

Lye

Pro

Gly

Thr

Ala

Pro

Lys

Leu

íle

Tyr

Ala

35

40

45

GTA

TCC

GCT

TTG

CAA

AGT

GGG

GTC

CCA

TCG

AGG

TTC

AGT

GGC

AGT

AGA

192

Val

Ser

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Val

Pre

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Arg

50

55

60

tct

GGG

ACA

GAT

TTC

ACT

CTC

ACC

ATC

AGC

AGT

CTG

CAA

CCT

GAA

GAT

240

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

íle

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

65

70

75

80

TTT

GCA

ACT

TAC

TGT

CAA

CAG

AGT

TAC

AGT

CCC

CCG

TAC

ACT

TTC

288

Phe

Ala

Thr

Tyr

Cys

Gin

Ser

Tyr

Ser

Pro

Tyr

Thr

Phe

85

90

95

GGC

CAG

GGG

ACC

AAC

CTG

CAG

ATC

AAA

315

Gly

Gin

Gly

Thr

Asn

Leu

Gin

íle·

Lys

100 105 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 40:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 105 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín

(

xi)

Opi

s se

kve

ncie: SEQ

ID NO:

40:

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

íle

Arg

Asp

Arg

1

5

10

15

Val

Thr

íle

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Asn

íle

Gly

Ser

Tyr

Leu

Asn

20

25

30

Trp

Tyr

Gin

His

Lys

Pro

Gly

Thr

Ala

Pro

Lys

Leu

íle

Tyr

Ala

35

40

45

Val

Ser

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Arg

50

55

60

Ser

Gly

Thr

Αβρ

Phe

Thr

Leu

Thr

íle

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

65

70

75

80

Phe

Ala

Thr

Tyr

Cys

Gin

Ser

Tyr

Ser

Pro

Tyr

Thr

Phe

85

90

95

Gly

Gin

Gly

Thr

Asn

Leu

Gin

íle

Lys

1O0

105

(2) Informácie pre SEQ ID NO: 41:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Knižnica: cDNA knižnica, LD2 (B) Kloň: LD2-14 (viii) Umiestnenie v genóme (A) Chromozóm/segment: Chromozóm 14 (B) Pozícia na mape: q32.3 (C) Jednotky: číslo chromozómového pásika (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/kľúč: CDS (B) Umiestnenie: 1...375 (D) Iné informácie: /produkt= „Imunogiobulín, Fab“ (ix) Vlastnosti:

295...342) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 41:

CAG

GTG

AAA

CTG

CTC

GAG

TCT

GGG

GGA

GGC

GTG

GTC

CAG

CCG

GGG

48

Gin

val

Lys

Leu

Glu

Ser

Gly

Val

Gin

Pro

Gly

1

S

10

15

TCC

CTG

AGA

GTC

GCC

TGT

GTA

GCG

TCT

GGA

TTC

ACC

TTC

AGG

AAT

TTT

96

Ser

Leu

Arg

Val

Ala

Cys

val

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Arg

Asn

Phe

2C

25

30

GGC

ATC

CÄC

TGG

GTC

CGC

CAG

GCT

CCA

GGC

AAG

GGG

CTG

GAG

TGG

GTG

144

Gly

Met

HÍB

Trp

val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

4Q

45

GCT

TTT

ATT

TGG

TTT

GAT

GCA

AGT

AAT

AAA

GGA

TAT

GGA

GAC

TCC

GTT

192

Ala

Phe

íle

Trp

Phe

Asp

Ala

Ser

Asn

Lys

Gly

Tyr

Gly

Asp

Ser

Val

50

55

60

AAG

GGC

CGA

TTC

ACC

GTC

tcc

AGA

GAC

AAT

TCC

AAG

AAC

ACG

CTC

TAT

240

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

vai

ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

BO

CTC

CAA

ATC

AAC

GGC

CTG

AGA

GCC'

GAA

GAC

ACG

GCT

GTA

TAT

TGT

288

Leu

Gin

Het

Asn

Gly

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

GCG

AGA

GAG

AAG

GCG

GTT

CGG

GGA

ATT

AGT

AGA

TÄC

AAC

TAC

ATC

336

Ala

Arg

Glu

Lys

Ala

val

Arg

Gly

íle

Ser

Arg

Tyr

Asn

Tyr

Met

íoo

105

110

GAC

GTC

TGG

GGC

AAG

GGG

ACC

ACG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

375

Asp

Val

Trp

Gly

Lys

Gly

Thr

val

Thr

Val

Ser

115 120 125 (C) Jednotky: číslo chromozómového pásika (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/kľúč: CDS (B) Umiestnenie: 1...315 (D) Iné informácie: /produkt= „Imunogiobulín, Fab“ (ix) Vlastnosti:

259...285) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 43:

GTG

ATC

ACC

CAG

TCT

CCA

TCC

CTG

TCT

GCA

TCT

GTG

GGA

GAC

AGA

48

Val

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

val

Gly

Asp

Arg

1

5

10

15

GTC

ACC

ATC

ACT

TGC

CGG

GCA

AGT

CAG

AGC

ATT

ATC

AAC

AAT

TTA

AAT

96

Val

Thr

íle

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

íle

Asn

Leu

Asn

20

25

30

TGG

TAT

CAG

AAA

CCA

GGC

AAA

GCC

CCT

GAA

CTC

CTG

ATC

TAT

GCT

144

Trp

Tyr

Gin

Lys

?ro

Gly

Lys

Ala

Pro

Glu

Leu

íle

Tyr

Ala

35

40

45

GCA

TCC

AGT

TTC

CAA

AGT

GGG

GTC

CCT

TCA

AGG

TTC

CGT

GGC

AGT

GGA

192

Ala

Ser

Leu

Gin

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Arg

Gly

Ser

Gly

50

55

60

TCT Ser 65

GGG Gly

AGA Arg

GAT Asp

TTC Phe

ACT Thr 70

CTC Leu

ACC Thr

GTC val

ACC Thr

AGT Ser 75

CTG Leu

CAA Gin

CCT Pro

GAA Glu

GAT Asp 80

240

TTT Phe

GCA Ala

ACT Thr

TAC Tyr

TAC Tyr 85

TGT Cys

CAA Gin

CAG Gin

AGT Ser

TAC Tyr 90

AGT Ser

ACC Thr

CTG Leu

TGG Trp

ACG Thr 95

TTC Phe

268

GGC

CAA

GGG

ACC

AAG

GTG

GAA

ATC

AAA

315

Gly

Gin

Gly

Thr 100

Lys

Val

Glu

íle

I.ys 105

(2) Informácie pre SEQ ID NO: 42:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 125 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 42:

Gin

val

Lys

Leu

Glu

Ser

Gly

Val

Gin

Pro

Gly

1

5

ID

1S

Ser

Leu

Arg

Val

Ala

Cys

Val

Ala

ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Arg

Asn

Phe

20

25

30

Gly

Met

His

Trp

val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

val

35

40

45

Ala

Phe

íle

Trp

Phe

Asp

Ala

Ser

Asn

Lys

Gly

Tyr

Gly

ASp

Ser

val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Val

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gin

Met

Asn

Gly

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Glu

Lys

Ala

Val

Arg

Gly

íle

Ser

Arg

Tyr

Asn

Tyr

Met

100

105

110

Asp

Val

Trp

Gly

Lys

Gly

Thr

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

(2) Informácie pre SEQ ID NO: 44:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 105 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 44:

Val

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

1

5

10

15

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

íle

Asn

Leu

Asn

20

25

30

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pre

Gly

Lys

Ala

pro

Glu

Leu

íle

Tyr

Ala

35

40

45

Ala

Ser

Leu

Gin

Ser

Gly

Val

pro

Ser

Arg

Phe

Arg

Gly

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Arg

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Val

Thr

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

ASp

65

70

75

60

Phe

Ala

Thr

Tyr

Cys

Gin

Ser

Tyr

Ser

Thr

Leu

Trp

Thr

Phe

85

90

95

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

val

Glu

íle

Lys

100

105

(2) Informácie pre SEQ ID NO: 43:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Knižnica: cDNA knižnica, LD2 (B) Kloň: LD2-14 (viii) Umiestnenie v genóme (A) Chromozóm/segment: Chromozóm 2 (B) Pozícia na mape: pl 1 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 45:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Knižnica: cDNA knižnica (B) Kloň: LD2-17 (viii) Umiestnenie v genóme (A) Chromozóm/segment: Chromozóm 14 (B) Pozícia na mape: q32.43 (C) Jednotky: číslo chromozómového pásika (ix) Vlastnosti:

295...342) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 45:

CAG GTG AAA CTG CTC Gin Val Lys Leu Leu

GAG TCT

GGG GGA GGC GTG GTC CAG

CCG GGG GGG Pro Gly Gly 15

48

Glu

Ser

Gly·Gly

Gly 10

Val

Val Gin

1

5

TCC

CTG

AGA

CTC

TCC

TGT

GTA

GCG

TCT

GGA

TTC

ACC

TTC

AGG

AGT

TAT

96

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Val

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Arg

Ser

Tyr

20

25

30

GGC

ATG

CAC

TGG

GTC

CGC

CAG

GCT

CCA

GGC

AAG

GGC

CTG

GAG

TGG

GTG

144

Gly

Met

HĹB

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pre

Gly

Lys

Gly

Leu

Clu

Trp

Val

35

40

45

GCT

TTT

ATA

TGG

TTT

GAT

GGA

AGT

ΑΑΓ

AAA

GGA

TAT

GTA

GAC

TCC

GTG

192

Ala

Phe

íle

Trp

Phe

Asp

Gly

Ser

Asn

Lys

Gly

Tyr

Val

Asp

Ser

Val

50

55

60

AAG

GGC

CGA

TTC

ACC

ATC

TCC

cga'

GAC

AAT

TCC

AAG

AAC

ACG

CTC

TAT

240

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

íle

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

TO

75

80

CTG

CAA

ATG

AAG

AGC

CTG

AGA

GCC

GAG

GAC

ACG

GCT

GTA

TAT

TGT

288

Leu

Gin

Met

Lys

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

val

Tyr

Cys

85

90

95

GCG

AGA

GAG

AAG

GCG

CTT

CGG

GGA

ATC

AGT

AGA

TAC

AAC

TAT

TAC

CTG

336

Ala

Arg

Glu

Lys

Ala

Leu

Arg

Gly

íle

Ser

Arg

Tyr

Asn

Tyr

Leu

íoo

105

110

GAC

GTC

TGG

GGC

AAG

GGG

ACC

ACG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

375

Asp

Val

Trp

Gly

Lys

Gly

Thr

Val

Thr

val

Ser

115 120 125 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 46:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 125 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 46:

Gin

Val

Lys

Leu

Glu

Ser

Gly

Val

Gin

Pro

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Val

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Arg

Ser

Tyr

20

25

30

Gly

Met

Bis

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

4Ú

45

Ala

Phe

íle

Trp

Phe

Asp

Gly

Ser

Asn

Lys

Gly

Tyr

Val

Asp

Ser

Val

50

5$

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

íle

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gin

Met

Lys

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Glu

Lys

Ala

Leu

Arg

Gly

íle

Ser

Arg

Tyr

Asn

Tyr

Leu

100

105

110

Asp

Val

Trp

Gly

Lys

Gly

Thr

Val

Thr

val

Ser

115 120 125 (viii) Umiestnenie v genóme (A) Chromozóm/segment: Chromozóm 2 (B) Pozícia na mape: pl 1 (C) Jednotky: číslo chromozómového pásika (ix) Vlastnosti:

259...285) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 47:

GTG ATG Val Met 1

ACC CAG TCT CCA TTC

TCC CTG TCT GCA TCT GTA GGA GAC AGA

48

Thr Gin Ser 5

Pro Phe

Ser Leu

Ser 10

Ala Ser

Val Gly Asp 15

Arg

GTC

ACC

ATC

ACT

TGC

CGG

GCA

AGT

CAG

AAC

ATT

AGG

AGT

TTT

ΊΤΑ

AGT

96

Val

Thr

íle

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Asn

íle

Arg

Ser

Phe

Leu

Ser

20

25

30

TGG

TAT

CAG

AAA

CCA

GGG

ACA

GĽC

CCT

AAG

CTC

CTG

ATC

TAT

GCT

144

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Thr

Ala

Pro

Lys

Leu

íle

Tyr

Ala

35

40

45

GCA

TCC

AGG

TTG

CAA

AGT

GGG

GTC

CCA

TCA

AGG

TTC

AGT

GGC

AGT

GGG

192

Ala

Ser

Arg

Leu

Gin

Ser

Gly

val

Pro

ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

50

55

60

TCT

GGG

ACA

GAT

TTC

ACT

CTC

ACC

ATC

AGC

ACT

CTG

CAA

CCT

GAA

GAT

240

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

íle

Ser

Thr

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

65

70

75

80

TTT

GCG

ACT

TAC

TGT

CAA

CAG

AGT

TAC

AGT

GCC

CCT

TGG

ACG

TTC

288

Phe

Ala

Thr

Tyr

Cys

Gin

Ser

Tyr

Ser

Ala

Pro

Trp

Thr

Phe

85

90

95

GGC

CAA

GGG

ACC

AAG

CTG

GAA

ATC

AAA

315

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

íle

Lys

100 105 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 48:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 105 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 48:

Val

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Phe

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

val

Gly

Asp

Arg

1

5

10

15

Val

Thr

íle

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Asn

íle

Arg

Ser

Phe

Leu

Ser

20

25

30

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Thr

Ala

Pro

Lys

Leu

íle

Tyr

Ala

35

40

45

Ala

Ser

Arg

Leu

Gin

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

íle

Ser

Thr

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

65

70

75

60

Phe

Ala

Thr

Tyr

Cys

Gin

Ser

Tyr

Ser

Ala

Pro

Trp

Thr

Phe

85

90

95

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

íle

Lya

100

105

(2) Informácie pre SEQ ID NO: 47:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Knižnica: cDNA knižnica, LD2 (B) Kloň: LD2-17 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 49:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Knižnica: cDNA knižnica, LD2 (B) Kloň: LD2-20 (viii) Umiestnenie v genóme (A) Chromozóm/segment: Chromozóm 14 (B) Pozícia na mape: q32.3 (C) Jednotky: číslo chromozómového pásika (ix) Vlastnosti:

295...342) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 49:

CAG Gin 1

GTG AAA

CTG CTC Leu Leu s

GAG Glu

TCT GGG CGA GGC GTC GTC CAG CCG GGG GGG

48

Val

Lys

Ser

Gly

Gly Val LC

Val Gin

Pro Gly Gly 15

TCC

CTG

AGA

CTC

TCC

TGT

GTA

GCG

TCT

GGA

TTC

ACC

TCC

AGG

AGT

TAT

96

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Val

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Ser

Arg

Ser

Tyr

20

25

30

GGC

ÄTG

CÄC

TGG

GTC

CGC

CAG

GCT

CCA

GGC

AAG

GGC

CTG

GAG

TGG

GTG

144

Gly

Met

Hie

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

50

55

SO

GCT

ΤΓΓ

ATA

TGG

ΓΤΤ

GAT

GGA

AGT

AAT

AAA

GGA

TAT

GTA

GAC

TCC

GTG

192

Ala

Phe

íle

Trp

phe

Asp

Gly

Ser

Asn

Lys

Gly

Tyr

Val

Asp

Ser

Val

65

70

75

80

AAG

GGC

CGA

TTC

ACC

ATC

TCC

CGA

GAC

AAT

TCC

AAG

AAC

ACG

CTC

TAT

240

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

íle

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

05

90

95

CTG

CAA

ÄTG

AAG

AGC

CTG

AGA

GCC

CAG

GAC

ACG

GCT

GTA

TAT

TGT

288

Leu

Gin

Met

Lys

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

100

105

110

GCG

AGA

GAG

AAG

GCG

CTT

CGG

GGA

ATC

AGT

AGA

TAC

AAC

TAT

TAC

CTG

336

Ala

Arg

Glu

Lys

Ala

Leu

Arg

Gly

íle

Ser

Arg

Tyr

Asn

Tyr

Leu

205

210

215

GAC

' GTC

TGG

GGC

' AAG

GGG

ACC

ACG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

375

Asp

' Val

Trp Gly

Lys

Gly

Thr

Val

Thr

val

Ser

115

120

125

(B) Kloň: LD2-20 (viii) Umiestnenie v genóme (A) Chromozóm/segment: Chromozóm 2 (B) Pozícia na mape: pl 1 (C) Jednotky: číslo chromozómového pásika (ix) Vlastnosti:

259...285) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 5 J :

GTG Val 1

ÄTG ACC

CAG TCT CCA TCC TCC CTG

TCT GCA TCT GTA GGA GAC AGA

48

Het

Thr

Gin

5

Ser

Leu

Ser 10

Ala

Ser

Val

Gly Asp Arg 15

GTC

ACC

ATC

ACT

TGC

CGG

GCA

AGT

CAG

AGC

ATT

AGC

TAT

TTÄ

AAT

96

val

Thr

íle

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

íle

Ser

Tyr

Leu

Asn

20

25

30

TGG

TAT

CAG

AAA

CCA

GGG

ΑΑΛ

GCC

CCT

AAG

CTC

CTG

ATC

TAT

GCT

144

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

íle

Tyr

Ala

35

40

45

GCA

TCC

AGT

TTG

CAA

AGT

GGG

GTC

CCA

TCA

AGG

TTC

AGT

GGC

AGT

GGA

192

Aia

Ser

Leu

Gin

Ser

Gly

val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

50

55

60

TCT

GGG

ACA

GAT

TTC

ACT

CTC

ACC

ATC

AGC

AGT

CTG

CAA

CCT

GAA

GAT

240

Ser

Gly

Thr

ASp

Phe

Thr

Leu

Thr

íle

Ser

ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

65

70

75

80

TTT

GCA

ACT

TAC

TGT

CAA

CAG

AGT

TAC

AGT

ACC

CGA

TTC

ACT

TTC

288

Phe

Ala

Thr

Tyr

Cys

Gin

Ser

Tyr

Ser

Thr

Arg

Phe

Thr

Phe

85

90

95

GGC

CCT

GGG

ACC

AAA

GTG

GAT

ATC

AAA

315

Gly

Pro

Gly

Thr

Lys

val

Asp

Íle

Lys

100

105

(2) Informácie pre SEQ ID NO: 50:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 125 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 50:

(2) Informácie pre SEQ ID NO: 52:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 105 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 52:

Gin val i

Ser Leu

Gly Met

Ala phe

Lys Gly

Leu Gin

Ala Arg

Lys Leu

Arg Leu

His Trp 35 íle Trp

Arg Phe

Met Lys

Glu Lys

100

Leu Glu

Ser Cys val Arg Phe Asp Thr íle

Ser Leu

Ala Leu

Ser Gly

Val Ala

Gin Ala

Gly Ser

Ser Arg

Arg Ala

Arg Gly

Gly Gly

Gly

Lys

Asn

Asp

Ser

Pro Asn Asp Glu íle

105

Val Val

Phe Thr

Lys Gly

Gly Tyr

Ser Lye

Thr Ala

Arg Tyr

Gin Pro

Ser Arg

Leu Glu

Val Asp Asn Ήιγ Val Tyr Asn Tyr

110

Gly Gly

Ser Tyr

Trp Val

Ser Val

Leu Tyr

Tyr Cys 95

Tyr Leu

Val

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

val

Gly

Asp

Arg

1

5

10

15

Val

Thr

íle

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

íle

Ser

Tyr

Leu

Asn

20

25

30

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

íle

Tyr

Ala

35

40

45

Ala

Ser

Leu

Gin

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

50

55

60

Ser 65

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr 70

Leu

Thr

íle

Ser

Ser 75

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp 80

Phe

Ala

Thr

Tyr

Cys

Gin

Ser

Tyr

Ser

Thr

Arg

Phe

Thr

Phe

85

90

95

Gly

Pro

Gly

Thr

Lys

Val

Asp

íle

Lys

100

105

Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val 115 120

Ser Ser

125 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 51:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Knižnica: cDNA knižnica, LD2 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 53:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 384 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetická: Nie (iv) Antisenzia: Nie (v) Typ fragmentu: N-koncový (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Knižnica: cDNA knižnica, LD1 (B) Kloň: LD1-6-17 (viii) Umiestnenie v genóme (A) Chromozóm/segment: Chromozóm 14 (B) Pozícia na mape: q32.3 (C) Jednotky: číslo chromozómového pásika (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/kľúč: CDS (B) Umiestnenie: 1...384 (D) Iné informácie: /produkt= „Imunoglobulín, Fab“ (ix) Vlastnosti:

295...351) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 53:

CAG GTC AAA CTG CTC GAG TCT GGG GGA GGC GTG GTC CAG CCT GGG AGG

48

Gin 1

Val

Lye Leu

5

Glu Ser

Gly Gly

Gly Val Val 10

Gin Pro

Gly Arg 15

TCC

CTC

AGA

CTT

TCC

TGT

GCA

GCG

TCT

GGA

TTT

ACC

TTC

AGT

AGC

TAT

96

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Tyr

20

25

30

GGC

ATG

CAC

TGG

GTC

CGC

CAG

GCT

CCA

GGC

AAG

GGG

CTG

GAG

TGG

GTG

144

Gly

Met

H1S

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

G1U

Trp

val

35

40

45

GCA

GAT

ATA

TGG

TTT

GAT

GGA

GGT

AAT

AAA

CAT

TAT

GCA

GAC

TTC

GTG

192

Ala

Asp

íle

Trp

Phe

Asp Gly

Gly

Asn

Lys

His

Tyr

Ala

Asp

Phe

val

50

55

60

ÄAG

GGC

CGA

TTC

ACC

ATC

TCC

AGA

GAC

AAT

TCC

AAG

AAC

ACG

GTG

TAT

240

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

íle

Ser

Arg

Asp

Αβη

Ser

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

CTA

CAA

ATG

AAC

AGC

CTG

AGA

GTC

GAG

GAC

ACG

GCT

GTG

TAT

TAC

TGT

288

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Val

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

9$

GCG

AGG

GAT

TAC

TAT

AGC

GTT

ACT

AAG

AAA

CTC

AGA

CTC

CAC

TAC

336

Ala

Arg

Asp

Tyr

Ser

val

Thr

Lye

Lys

Leu

Arg

Leu

H1S

Tyr

100

105

110

TAC

ATC

GAC

GTC

TGG

GGC

AAA

GGG

ACC

ACG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

364

Tyr

Met

Asp

Val

Trp

Gly

Lys

’Gly

Thr

val

Thr

Val

Ser

220

225

230

(A) Knižnica: cDNA knižnica, LD1 (B) Kloň: LD1-6-17 (viii) Umiestnenie v genóme (A) Chromozóm/segment: Chromozóm 2 (B) Pozícia na mape: pl 1 (C) Jednotky: číslo chromozómového pásika (ix) Vlastnosti:

259...285) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 55:

GTG ATG ACC CAG

TCT CCA TCC TCC

CTG TCT GCA TCT GTA GGA GAC AGA Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg

48

val Met 1

Thr Gin

Ser 5

Pro

Ser

10

15

GTC

' ACC

' ATC

’ ACT

TGC

CGG

GCA

AGT

CAG

GGC

ATT

AGA

AAT

GAT

TTA

ACC

96

val

Thr

íle

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Gly

íle

Arg

Asn

Asp

Leu

Thr

20

25

30

TGG

TAT

CAG

CAA

AAA

CCA

GGG

AAA

GCC

CCT

AAG

CTC

CTG

ATC

TAT

GCT

144

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Lye

Ala

Pro

Lys

Leu

íle

Tyr

Ala

35

40

45

GCA

tcc

AAT

TTA

CAA

AGT

GGG

GTC

CCA

TCA

AGG

TTC

AGC

GGC

AGT

GGA

192

Ala

Ser

Asn

Leu

Gin

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

50

55

60

TCT

GGC

ACA

GAT

TTC

ACT

CTC

ACC

ATC

AGC

CTG

CAG

CCT

GAA

GAT

240

Ser

Gly

Thr

ASp

Phe

Thr

Leu

Thr

íle

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

65

70

75

80

TTT

GCA

ACT

TAT

TAC

TGT

CTA

CAA

GAT

AAC

AAT

TTC

CCG

TAC

ACT

TTT

288

Phe

Ala

Thr

Tyr

Cys

Leu

Gin

Asp

Asn

Phe

Pro

Tyr

Thr

Phe

85

90

95

GGC

CAG

GGG

ACC

AAG

CTG

GAG

ATC

AAA

315

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

íle

Lys

100

105

(2) Informácie pre SEQ ID NO: 54:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 128 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 54:

(2) Informácie pre SEQ ID NO: 56:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 105 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 56:

Gin Val

Ser Leu

Gly Met

Ala Asp

Lys Gly

Leu Gin

Ala Arg

Tyr Tyr

Lys Leu

Arg Leu

His Trp íle Trp

Arg Phe

Met Asn

Asp Tyr

100

Met Asp

115

Leu Glu 5

Ser Cys

Val Arg

Phe Asp

Thr íle

Ser Leu 85

Tyr Ser

Val Trp

Ser Gly

Ala Ala

Gin Ala

Gly Gly 55

Ser Arg

Arg Val

Val Thr

Gly Lys

120

Gly

Ser

Pro Asn

Asp

Glu

Lys

105

Gly

Lys

Asn

Asp

Lys

Thr

Val

Phe

Lys

His

Ser

Thr

Leu

Thr

Val

Thr

Gly

Tyr

Lys

Ala

Arg

Val

Gin

Phe

Leu

Ala

Asn

Val

Leu

Thr

125

Pro

Ser

Glu

Asp

Thr

Tyr

His

110

Val

Gly Arg

Tyr

Val

Ser

Trp

Phe

Val

Tyr

Val

Tyr

Cys

Tyr Tyr

Ser ser

Val

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

val

Gly

Asp

Arg

1

5

10

15

Val

Thr

íle

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Gly

íle

Arg

Asn

Asp

Leu

Thr

20

25

30

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

íle

Tyr

Ala

35

40

45

Ala

Ser

Asn

Leu

Gin

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Thr

Agp

Phe

Thr

Leu

Thr

íle

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

65

70

75

80

Phe

Ala

Thr

Tyr

Cys

Leu

Gin

Asp

Asn

Phe

: Pro Tyr Th;

r Phe

85

90

9!

5

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

íle

Lys

100

105

(2) Informácie pre SEQ ID NO: 55:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(2) Informácie pre SEQ ID NO: 57:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Knižnica: cDNA knižnica, LDI a LD2 (B) Kloň: LD 1/2-6-3 (viii) Umiestnenie v genóme (A) Chromozóm/segment: Chromozóm 14 (B) Pozícia na mape: q32.3 (C) Jednotky: číslo chromozómového pásika (ix) Vlastnosti:

295...342) (xi) Opis sekvencie; SEQ ID NO: 57:

CAG GTG ÄÄA CTC CTC GAG TCT GGG GGA GGC GTG GTC CAG CCG GGG GGG 48

Gin Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

TCC CTG AGA GTC GCC TCT GTA GCG TCT GGA TTC ACC TTC AGG AAT TTT 96

Se

r Lei

j Arg Va.

L Al.

a Cyi

3 Va:

1 Al;

i Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Phe

2<

0

25

30

GGC

ATG

CAC

TGG

GTC

CGC

CAC

GCT

CCA

GGC

AAG

GGG

CTG

GAG

TGG

GTG

144

Gly

Met

Kis

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

GCT

TTT

ATT

TGG

ΤΓΓ

GAT

GCA

AGT

AAT

ÄAA

GGA

TAT

GGA

GAC

TCC

GTT

192

Ala

Phe

íle

Trp

Phe

Asp

Ala

Ser

Asn

l.ys

Gly

Tyr

Gly

Asp

Ser

Val

50

55

60

AAG

GGC

OGA

TTC

ACC

GTC

TCC

AGA

GAC

AAT

TCC

AAG

AAC

ACG

CTC

TAT

240

Lys

Gly

Arg

phe

Thr

Val

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

CTG

CAA

ATG

AAC

GGC

CTG

AGA

GCC

GAA

GAC

ACG

GCT

GTA

TAT

TGT

2B8

Leu

Gin

Met

Asn

Gly

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

GCG

AGA

GAG

AAG

GCG

GTT

CGG

GGA

ATT

AGT

AGA

TAC

AAC

TAC

ATG

336

Ala

Ary

Glu

Lys

Ala

Val

Arg

Gly

íle

Ser

Arg

Tyr

Asn

Tyr

Met

100

105

110

GAC

GTC

TGG

GGC

AAG

GGG

ACC

ACG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

375

Asp

Val

Trp

Gly

Lys

Gly

Thr

Val

Thr

Val

ser

Ser

115

120

125

(2) Informácie pre SEQ ID NO: 58:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 125 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (G) Typ bunky: Periférny B lymfocyt (vii) Bezprostredný zdroj:

(A) Knižnica: cDNA knižnica, LD1 a LD2 (B) Kloň: LD 1/2-6-3 (viii) Umiestnenie v genóme (A) Chromozóm/segment: Chromozóm 2 (B) Pozícia na mape: pl 1 (C) Jednotky: číslo chromozómového pásika (ix) Vlastnosti:

259...285) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 59:

GTG val 1

ATG ACC

CAG TCT CCA TCC TCC CTG

TCT GCA TCT GTA GGA GAC AGA

48

Met

Thr

Gin

Ser Pro 5

Ser

Leu

Ser 10

Ala

Ser

Val

Gly Asp Arg 15

GTC

ACC

ATC

ACT

TGC

CGG

GCA

AGT

CAG

AGC

ATT

ATC

AGA

TAT

TTA

AAT

96

Val

Thr

íle

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser·

Gin

Ser

íle

Arg

Tyr

Leu

Asn

20

25

30

TGG

TAT

CAG

CAC

AAA

CCA

GGG

AAA

GCC

CCT

AAG

CTC

CTG

ATC

CAT

ACT

144

Trp

Tyr

Gin

His

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

íle

His

Thr

35

40

45

GCA

TCC

AGT

TTG

CTIA

AGT

GGG

GTC

CCG

TCA

AGG

TTC

ACT

GGC

AGT

GTA

192

Ala

Ser

Leu

Gin

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

val

50

55

60

TCT

GGG

ACA

GAT

TTC

ACT

CTC

ACC

ATC

AGC

AGT

CTG

CAA

CCT

GAA

GAT

240

ser

Gly

Thr

Asp

pne

Thr

Leu

Thr

íle

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

65

70

75

80

TTT

GCA

ACT

TAC

TGT

CAA

CAG

AGT

TAC

ACT

ACC

CCG

TAC

ACT

TTT

288

Phe

Ala

Thr

Tyr

Cys

Gin

Ser

Tyr

Thr

Pro

Tyr

Thr

Phe

85

90

95

GGC

CAG

GGG

ACC

AAG

CTG

CAG

ATC

AAA

315

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Leu

Gin

íle

Lys

100

105

(2) Informácie pre SEQ ID NO: 60:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(

xi)

Opi

s se

:kve

ncie: S

EQ

ID NO:

: 58

Gin

val

Lys

Leu

Glu

Ser

Gly

Val

Gin

Pro

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Val

Ala

cys

val

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Arg

Asn

Phe

20

25

30

Gly

Met

His

Trp

val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ala

Phe

íle

Trp

Phe

Asp

Ala

Ser

Asn

Lys

Gly

Tyr

Gly

Asp

Ser

Val

50

55

60

LYS

Gly

Arg

Phe

Thr

Val

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

7S

80

Leu

Gin

Met

Asn

Gly

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Glu

Lys

Ala

val

Arg

Gly

íle

Ser

Arg

Tyr

Asn

Tyr

Met

100

105

110

Asp

Val

Trp

Gly

Lys

Gly

Thr

val

Thr

Val

Ser

115 120 125 (ii) Typ molekuly: proteín

(xi) Opi!

5 sel

kvencie: SEQ ID NO:

60:

val Met

Thr

Gin

Ser

Pro Ser

Ser

Leu

Ser

Ala Ser

Val

Gly

Asp

Arg

1

5

10

15

Val Thr

íle

Thr

Cys

Arg Ala

Ser

Gin

Ser

íle íle

Arg

Tyr

Leu

Asn

20

25

30

Trp Tyr

Gin 35

His

Lys

Pro Gly

Lys 40

Ala

Pro

Lys Leu

Leu 45

íle

His

Thr

Ala

Ser

Leu

Gin

Ser

Gly

val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Val

50

55

60

Ser 65

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr 70

Leu

Thr

íle

Ser

Ser 75

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp 80

Phe

Ala

Thr

Tyr

Cys

Gin

Ser

Tyr

Thr

Pro

Tyr

Thr

Phe

85

90

95

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Leu

Gin

íle

Lys

100

105

(2) Informácie pre SEQ ID NO: 59:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Organizmus: Homo sapiens (C) Jednotlivý izolát: Hyperimúnny Rhesus D darca (D) Vývojový stav: Dospelý (E) Haplotyp: Diploidný (2) Informácie pre SEQ ID NO: 61:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Knižnica: cDNA knižnica, LD1 a LD2 (B) Kloň: LD1/2-2-33 (viii) Umiestnenie v genóme (A) Chromozóm/segment: Chromozóm 14 (B) Pozícia na mape: q32.3 (C) Jednotky: číslo chromozómového pásika (ix) Vlastnosti:

295...342) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 61:

CÄG Gin 1

GTG AAA

CTG CTC GAG TCT GGG GGA GGC GTG GTC CAG CCG GGG GGG

48

Val

Lys

Leu

Leu Glu 5

Ser

Gly

Gly Gly 10

Val

val

Gin

Pro Gly Gly 15

TCC

CTG

AGA

GTC

GCC

TGT

GTA

GCG

TCT

GGA

TTC

ACC

TTC

AGG

AAT

TTT

96

Ser

Leu

Arg

Val

Ala

Cys

Val

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Arg

Asn

Phe

20

25

30

GGC

ATG

CACTGG

GTC

CGC

CAG

GCT

CCA

GGC

AAG

GGG

CTG

GAG

TGG

GTG

144

Gly

Mec

HiS

Trp

val

Arg

Gin

Ala

Pre

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

GCT

TTT

ΑΤΓ

TGG

TTT GAT

CCA AGT

AAT

AAA

GGA

TAT

GGA

GAC

TCC

GTT

192

Ala

Phe

íle

Trp

Phe

Asp

Ala

Ser

Asn

Lys

Gly

Tyr

Gly

Asp

Ser

Val

50

55

60

AAG

GGC

CGA

TTC

ACC

GTC

TCC

AGA

GAC

AAT

TCC

AAG

AAC

ACG

CTC

TAT

240

Lys

Gly Arg

phe

Thr

Val

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

CTG

CAA

ATG

AAC

GGC

CTG

AGA

GCC

GAA

GAC

ACG

GCT

GTA

TAT

TGT

288

Leu

Gin

Met

Asn

Gly

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

val

Tyr Tyr Cys

85

90

95

GCG

AGA

GAG

AAG

GCG

GTT

CGG

GGA

ATT

AGT

AGA

TAC

AAC

TAC TAC ATG

336

Ala

Arg

Glu

Lys

Ala

val

Arg

Gly

Íle

Ser

Arg

Tyr

Asn

Tyr Tyr Mec

100

105

110

GAC

GTC

TGG

GGC

AAG

GGG

ACC

ACG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

375

Asp

Val

Trp

Gly

Lys

Gly

Thr

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

(2) Informácie pre SEQ ID NO: 62:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 125 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 62:

Gin 1

Val

Lys

Leu

Leu 5

Glu

Ser

Gly

Gly ío

Val

Gin

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Val 20

Ala

Cys

Val

Ala

Ser 25

Gly

Phe

Thr

Phe

Arg 30

Asn

Phe

Gly

Met

His 35

Trp

val

Arg

Gin

Ala 40

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu 45

Glu

Trp

val

Ala

Phe

íle

Trp

Phe

Asp

Ala

Ser

Asn

Lys

Gly

Tyr

Gly

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys 65

Gly

Arg

Phe

Thr

val 70

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser 75

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr 80

Leu

Gin

Met

Asn

Gly

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Glu

Lys 100

Ala

Val

Arg

Gly

íle 105

Ser

Arg

Tyr

Asn

Tyr 110

Tyr

Met

Asp

Val

Trp 115

Gly

Lys

Gly

Thr

Thr 120

Val

Thr

Val

Ser

Ser 125

(2) Informácie pre SEQ ID NO: 63:

(i) Charakteristiky sekvencie:

259...285) (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 63:

(2) Informácie pre SEQ ID NO: 64:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) DÍžka: 105 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 64:

Val

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Phe

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

1

5

10

15

Val

Thr

íle

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

íle

Arg

Tyr

Leu

Asn

20

25

30

Trp

Tyr

Gin

His

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

íle

His

Ala

35

40

45

Ala

Ser

Leu

Gin

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Val

50

55

60

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

íle

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

65

70

75

80

Phe

Ala

Thr

Tyr

Cys

Gin

Ser

Tyr

Thr

Pro

Tyr

Thr

Phe

85

90

95

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Leu

Gin

íle

Lys

100 105

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Polypeptidy schopné tvorby väzbových štruktúr na antigén so špecificitou pre Rhesus D antigény, ktoré obsa hujú Rhesus D-špecifické CDR1, CDR2 a CDR3 regióny párov aminokyselinových sekvencii V_H a V_L s rovnakými alebo odlišnými identifikačnými číslami podľa obrázkov uvedených v nasledujúcej tabuľke:

V_H v_L

Identifikačné číslo