CZ395998A3 - Polypeptidy schopné tvorby vazebných struktur pro antigen se specificitou pro Rhesus D antigeny, DNA kodující takové polypeptidy a způsob pro jejich přípravu a použití - Google Patents
Polypeptidy schopné tvorby vazebných struktur pro antigen se specificitou pro Rhesus D antigeny, DNA kodující takové polypeptidy a způsob pro jejich přípravu a použití Download PDFInfo
- Publication number
- CZ395998A3 CZ395998A3 CZ983959A CZ395998A CZ395998A3 CZ 395998 A3 CZ395998 A3 CZ 395998A3 CZ 983959 A CZ983959 A CZ 983959A CZ 395998 A CZ395998 A CZ 395998A CZ 395998 A3 CZ395998 A3 CZ 395998A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- ser
- gly
- thr
- val
- leu
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/80—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood groups or blood types or red blood cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/34—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood group antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
- Y10S424/80—Antibody or fragment thereof whose amino acid sequence is disclosed in whole or in part
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
- Y10S424/81—Drug, bio-affecting and body treating compositions involving autoimmunity, allergy, immediate hypersensitivity, delayed hypersensitivity, immunosuppression, immunotolerance, or anergy
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/868—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving autoimmunity, allergy, immediate hypersensitivity, delayed hypersensitivity, immunosuppression, or immunotolerance
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Diabetes (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
Description
Polypeptidy schopné tvorby vazebných struktur pro antigen se specificitou pro Rhesus D antigeny, DNA kódující takové polypeptidy a způsob pro jejich přípravu a použití
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká polypeptidů tvořících vazebné struktury pro antigen se specificitou pro Rhesus D antigeny a zejména Fab molekul se specificitou pro Rhesus D antigen. Vynález se také týká jejich použití pro farmakologické a diagnostické přípravky. Výše uvedené Fab fragmenty, pokud jsou geneticky zpracovány tak, aby byly částí kompletních protilátek, jsou použitelné pro profylaxi hemolytické nemoci novorozenců {HDN). Předkládaný vynález poskytuje nové DNA a aminokyselinové sekvence výše uvedených polypeptidů.
Tak mohou být protilátky použity pro ochranu Rh negativní ženy před nebo ihned po porodu Rh pozitivního dítěte pro zabránění HDN v následujících těhotenstvích.
Vynález také obsahuje použití uvedených Fab molekul bud' samostatně, nebo v kombinaci s Fc konstantními regiony, jako kompletních protilátek pro léčbu jiných onemocnění, u kterých může být přínosem použití anti-Rhesus D imunoglobulinu, například pro léčbu idiopatické trombocytopenické purpury.
Kromě toho může být Rhesus D imunoglobulin použit po chybné transfuzi Rh pozitivní krve Rh negativnímu příjemci, pro zabránění senzibilizace Rh D antigenem. Dále se vynález týká použití těchto Fab fragmentů a protilátek jako diagnostických činidel.
Dosavadní stav techniky
HDN je obecný název pro hemolytickou anemii plodů a novorozenců způsobenou protilátkami matky. Tyto protilátky jsou zaměřeny proti antigenům na povrchu fetálních erytrocytů. Tyto antigeny mohou náležet k Rhesus, ABO nebo jinému systému krevních skupin.
Rhesus systém krevních skupin obsahuje 5 hlavních antigenů: D, C, c, E a e (Issit, P.D. Med. Lab. Sci. 45: 395, 1988). D antigen je nejdůležitější z těchto antigenů, protože je vysoce imunogenní a vyvolává tvorbu Rhesus D protilátek v průběhu Rhesus inkopatibilního těhotenství a po transfusi Rhesus inkopatibilní krve. D antigen je nacházen přibližně u 85%
Kavkazské populace v Evropě a o těchto jedincích se říká, že jsou Rh pozitivní. Jedinci, kteří nemají D antigen, se nazývají Rh negativní. Exprese D antigenu může být různá z důvodů nízké hustoty antigenu, dále známé jako slabé D nebo Du, nebo z důvodu částečné antigenicity, známé jako částečné D antigeny.
Rhesus D antigen, membránový protein erytrocytů, byl nedávno klonován a byla popsána jeho primární struktura (Le Van Kim, C. et al., PNAS 89: 10925, 1992) . Modelové studie ukázaly, že Rhesus D antigen má 12 transmembránových domén s pouze velmi krátkým spojovacím regionem přesahujícím vně buněčné membrány nebo přesahujícím do cytoplasmy.
Parciální D fenotypy byly prvně identifikovány u lidí majících D antigen na erytrocytech, ale nemající aloanti-D v séru (Rose, R. R. a Sanger, R., Blood groups in man, Blackwell Scientific, Oxford, UK, 1975; Tippett, P. et al., Vox Sanguinis, 70: 123, 1996). Toto může být vysvětleno tak, že D antigen je mozaiková struktura s nejméně 9 odlišnými epitopy • ·
(epDl až epD9). Proto u některých lidí s D variantou nemají erytrocyty část této mozaiky a protilátky jsou namířeny proti chybějícím D epitopům. Rh pozitivní jedinci, kteří vytvářejí protilátky proti částečným D antigenům byly klasifikováni do šesti hlavních odlišných kategorií (D11 až DVI1j, kde každá má jinou abnormalitu D antigenů. Nověji bylo ukázáno, že tyto D kategorie dávají různý charakter reakce při testování proti panelu lidských monoklonálních anti-D protilátek (Tippett, P. et al., Vox Sanguinis, 70: 123, 1996). Podle různých charakterů reakce bylo identifikováno 9 epitopů a tak byly definovány různé parciální D kategorie. Počet epitopů přítomných na D antigenů se liší mezi jednotlivými parciálními D kategoriemi, kdy DV VI kategorie exprivuje nejméně, epD3, 4 a 9. DVI kategorie je klinicky významná, protože DVI ženy mohou být imunizovány dostatečně silně pro způsobení hemolytické nemoci novorozenců.
Profylaktická účinnost anti-RhD IgG pro prevenci hemolytické nemoci novorozenců je dobře prokázána a je rutinním postupem po mnoho let. V důsledku toho se závažné onemocnění stalo raritou. Nicméně, základní příčina onemocnění, t.j. RhD inkompatibilita mezi RhD negativní matkou a RhD pozitivním dítětem, stále zůstává a tak vyžaduje kontinuální dodávání terapeutického anti-RhD IgG.
V posledních letech se zajištění kontinuálního dodávání anti-RhD IgG stává narůstajícím problémem. Zásoba dostupného hyperimunního séra od aloimunizovaných Rh negativních vícerodiček se drasticky snížila díku úspěchu profylaktického podávání anti-RhD. Proto současné metody produkce vyžadují opakovanou imunizaci stále více neochotnějších dárců pro produkci vysokého titru antiséra (Selinger, M., Br. J. Obstet. Gynaecol. 98: 509, 1991). Jsou zde také asociované rizikové faktory a technické problémy, jako je použití Rh pozitivních • ·
erytrocytů pro opakovanou imunizaci, což má riziko přenosu virových onemocnění jako je hepatitida B, AIDS a jiné doposud neznámé viry (Hughes-Jones, N.C., Br. J. Haematol. 70: 263,
1988). Pro je žádoucí alternativní způsob pro produkci anti-RhD protilátek.
V posledních několika letech byly zkoušeny různé alternativní zdroje hyperimunního séra, ale všechny jsou spojeny s nevýhodami. Transformace lymfocytů virem Epstein-Barrové (EBV) za vzniku B lymfoblastoidních buněčných linií, které secernují specifickou protilátku včetně protilátky proti Rhesus D antigenu (Crawford et al., Lancet, 386: Feb.
19th, 1983) jsou nestabilní a vyžadují extensivní klonování. Také z důvodů nízké účinnosti transformace (1 - 3% B buněk) může být z potenciálního repertoáru získán pouze omezený rozsah protilátkových specificit. Dále se zdá, že myši neodpovídají na Rhesus D antigen a proto nejsou dostupné žádné myší monoklonální protilátky, které by mohly být použity pro výrobu chimérických nebo humanizovaných protilátek. Doposud byla jedinou alternativou produkce lidských protilátek hybridomní technikou, která je také omezena chyběním vhodného partnera pro fúzi s lidskými myelomovými buňkami (Kozbor, D. a Roder, J.C. Immunol Today, 4: 72, 1983).
Podstata vynálezu
Předmětem předkládaného vynálezu proto jsou Fab fragmenty mající reaktivitu proti Rhesus D antigenu, stejně jako kompletní protilátky obsahující Fab fragmenty, které nemají výše uvedené nedostatky.
V posledních několika letech technika repertoárového klonování a konstrukce fágových zobrazovacích knihoven otevřela • · • · • ·
nové možnosti pro produkci lidských protilátek definované specificity (Williamson, R.A. et al., PNAS 90: 4141, 1993).
Tyto metody byly proto použity pro přípravu polypeptidů schopných tvorby vazebných struktur pro antigen se specificitou pro Rhesus D antigeny, zejména pro přípravu Fab fragmentů majících aktivitu proti Rhesus D a částečným D antigenům.
Tvorba lidských protilátek repertoárovým klonováním jak byla popsána v posledních letech (Barbas III, C.F. a Lerner, R.A. Companion Methods Enzymol. 2: 119, 1991) je založena na izolaci mRNA z periferních B buněk. Tato metoda nabízí nástroje pro izolaci přirozených protilátek, autoprotilátek nebo protilátek tvořených v průběhu imunitní odpovědi (Zebedee, S.L. et al., PNAS 89: 3175, 1992; Vogel, M. et al., Eur. J. Immunol. 24: 1200, 1994) . Tato metoda spočívá v konstrukci knihovny rekombinantních protilátek od jednotlivých dárců z mRNA kódující imunoglobulinové (Ig) molekuly. Protože pouze lymfocyty periferní krve (PBL) mohou být izolovány od dárce, jsou šance na nalezení B buněk produkujících specifickou protilátku v periferii zvýšeny, pokud je jedinci podána dávka požadovaného antigenů těsně před odběrem PBL (Persson, M.A.A. et al., PNAS 88: 2432, 1991) . Celková RNA je potom izolována a mRNA Ig repertoáru může být klonována za použití Ig specifických primerů v polymerasové řetězové reakci (PCR), po které následuje současná exprese těžkých a lehkých řetězců Ig molekuly na povrchu filamentosního fágu, což vytvoří organismus, který analogicky s B buňkami může vázat antigen.
V literatuře je tato metoda také známá jako kombinatoriální přístup, jelikož umožňuje nezávislé kombinování těžkých a lehkých řetězců za vzniku funkčního Fab fragmentu protilátky připojeného na jeden z koncových proteinů, nazývaných plil, filamentosního fágu. Fágy nesoucí Fab molekuly (zde dále Phab částice) jsou podrobeny selekci na požadovanou antigenní • ·
specificitu procesem známým jako biopanorámování. Antigen může být navázán na pevný nosič, kdy specifická Phab se váže na antigen, zatímco nespecifické Phab jsou vypláchnuty a nakonec jsou specifické Phab eluovány z pevného nosiče. Specifické Phab jsou potom amplifikovány v bakteriích, je provedena opakovaná vazba na antigen na pevném nosiči a celý postup biopanorámování j e opakován.
Postupné opakování panorámování a amplifikace vybrané Phab v bakterii vede k obohacení specifických Phab, což je pozorováno z vzestupu titru kolonie tvořících jednotek (cfu) očkovaných na plotny po každém kole panorámování. Naše dřívější zkušenosti a publikovaná data naznačují, že specifický fág může být detekován obvykle po 4 až 6 kolech panorámování (Vogel, M. et al., Eur. J. Immunol. 24: 1200, 1994). Ve výše uvedené citaci nicméně není žádná zmínka, že naznačené kroky mohou být použity pro přípravu Fab fragmentů anti-RhD protilátek.
Popis obrázků na připojených výkresech
Obrázky la až 16b ukazují DNA sekvence kódující variabilní regiony (V regiony) anti-RhD Fab fragmentů a odpovídající polypeptidové sekvence.
Obrázek 17 ukazuje pComb3 expresní vektor použitý podle předkládaného vynálezu.
Obrázky 18 a 19 ukazují oddělenou přípravu genů pro těžký a lehký řetězec kompletní protilátky podle popisu v příkladu 6.
Předmětem předkládaného vynálezu jsou polypeptidy schopné tvorby vazebných struktur pro antigen se specificitou pro
Rhesus D antigeny podle definice v nároku 1. Tabulka v nároku 1 se vztahuje k připojeným obrázkům. Je uvedeno identifikační číslo pro každou sekvenci. Lokalizace Rhesus D specifických CDR1 (komplementaritu určující region 1), CDR2 a CDR3 regionů jsou uvedeny na obrázkách a podle číslování párů baží v tabulce nároku 1. Výhodnými polypeptidy podle předkládaného vynálezu jsou anti-Rhesus D protilátky, které obsahují variabilní regiony těžkých a lehkých řetězců sekvencí uvedených na obrázkách la - 16b. Obrázky la, 2a....16a se týkají variabilních regionů těžkých řetězců a obrázky lb, 2b....16b se týkají variabilních regionů lehkých řetězců.
Dalšími předměty předkládaného vynálezu jsou DNA sekvence kódující antigen vazebné polypeptidy podle nároku 6. Výhodné DNA sekvence jsou ty, které kódují variabilní regiony Fab fragmentů anti-RhD protilátek podle obrázků la - 16b. Obrázky la, 2a....16a se týkají těžkých řetězců a obrázky lb,
2b....16b se týkají lehkých řetězců.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je způsob pro přípravu rekombinantních Fab polypeptidů podle nároku 11.
Dalším předmětem předkládaného -vynálezu je způsob pro selekci rekombinantních polypeptidů podle nároku 12.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu jsou anti-RhD protilátky podle nároku 14, výhodně anti-RhD imunoglobulinové molekuly obsahující variabilní regiony těžkého a lehkého řetězce podle obrázků la až 16b v kombinaci se známými konstantními regiony těžkého a lehkého řetězce.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu jsou farmaceutické a diagnostické prostředky obsahující polypeptidy, anti-RhD • · · protilátky nebo Fab fragmenty podle předkládaného vynálezu.
Celková reamplifikovaná Phab populace získaná po každém panorámování může být testována na specificitu za použití různých metod jako je ELISA a imunologické bodové testy. Toto je také určeno charakterem antigenu, například anti-Rhesus D Phab jsou detekovány nepřímou hemaglutinaci za použití králičí anti-fágové protilátky nebo ekvivalentního Coombsova činidla jako zkřížené vazebné protilátky. Po identifikaci celkové Phab populace jako pozitivní pro požadovaný antigen jsou jednotlivé Phab klony izolovány a je sekvencována DNA kódující požadované Fab molekuly. Jednotlivé Fab mohou být potom vyrobeny za použití pComb3 expresního systému, který je zobrazen na obr. 16. V tomto systému je glll gen, kódující koncový protein plil, vystřižen z fagemidového vektoru pComb3. Toto umožňuje produkci solubilního Fab v periplasmě bakterie. Takové jednotlivé Fab fragmenty mohou být potom testovány na antigenní specificitu.
Fágový zobrazovací přístup byl také použit jako prostředek pro získání monoklonálních protilátek z nestabilních hybridomních buněčných linií. Toto bylo popsáno pro anti-Rhesus D protilátky (Siegel, D.L. a Silberstein, L.E. Blood, 83: 2334, 1994; Dziegiel, M. et al., J. Immunol. Methods, 182: 7, 1995). Fágová zobrazovací knihovna konstruovaná od neimunizovaných dárců byla také použita pro selekci Fv fragmentů (t.j. variabilních regionů těžkého a lehkého řetězce, V a V ) specifických pro antigeny lidských krevních skupin, které obsahují jeden Fv fragment reaktivní s Rhesus D antigenem (Marks , J.D. et al., Biotechnology, 11: 1145, 1993).
Důležitými podmínkami při konstrukci kombinatoriálních knihoven jsou zdroje buněk použitých pro extrakci RNA a • · charakter antigenu použitého pro panorámování. Proto předkládaný vynález používá hyperimunního dárce, kterému byla podána i.v. dávka Rhesus D* erytrocytů. PBL dárce jsou odebrány +5 a +18 dní po i.v. dávce a jsou použity pro konstrukci 2 kombinatoriálnich knihoven zde dále označovaných jako knihovna Dl (LD1) a knihovna D2 (LD2), v příslušném pořadí. Dvojitá imunofluorescenční analýza získaných PBL, za použití markérů CD20 a CD38 pro spektrum B buněk a lymfoblastoidních buněk, v příslušném pořadí, ukázala vyšší než normální procento lymfoblastoidních B buněk, morfologie plasmatických buněk.
Vyšší počet plasmatických buněk nalezených v periferní krvi je neobvyklý, protože v periferie je normálně méně než 1% a pravděpodobně ukazuje na to, že dárce měl vyšší procento cirkulujících B buněk se specificitou pro Rhesus D antigen.
Po konstrukci knihovny byla selekce Phab specifických pro Rhesus D antigen provedena biopanorámováním čerstvých celých erytrocytů fenotypu R1R1 (CDe/CDe), t.j. referenčních buněk pro Rhesus D typizaci. Toto bylo nezbytné, protože Rhesus D antigen, integrální membránový protein o 417 aminokyselinách (Le Van Kim, C. et al., PNAS 89: 10925, 1992), ztrácí svou imunogenicitu v průběhu přečištění (Paradis, G. et al., J. Immunol. 137: 240, 1986) a proto nemůže být chemicky přečištěný D antigen navázán na pevnou fázi pro selekci imunoreaktivních Phab jak je to provedeno pro jiné antigenní specificity dříve selektované v tomto systému (Vogel, M. et al., Eur. J. Immunol. 24: 1200, 1994). Modelové studie ukázaly, že pouze velmi krátký spojovací region Rhesus D antigenu přesahuje vně buněčné membrány nebo přesahuje do cytoplasmy (Chérif-Zahar, B. et al., PNAS 87: 6243, 1990). Proto jsou části RhD antigenu rozpoznatelné protilátkami relativně omezené a mohou být konformačně omezené. Tento aspekt Rhesus D antigenu se stává ještě důležitějším při selekci Phab s reaktivitou proti
částečným D fenotypům, které postrádají některé definované epitopy D membránového proteinu (Mouro, I. et al., Blood. 83: 1129, 1994) .
Kromě toho, protože celé erytrocyty neexprivuji pouze D antigen, musí být provedena serie negativních absorpcí na Rhesus D negativních erytrocytech z toho důvodu, aby se odabsorbovaly ty Phab, které reagují s jinými antigenními proteiny na erytrocytech.
Tento panorámovací postup provedený na Phab z obou LD1 a LD2 knihoven vedl k izolaci 6 různých klonů produkujících Fab z knihovny LD1, 8 různých klonů produkujících Fab z knihovny 2 a 2 klonů produkujících Fab ze souboru knihoven LD1 a LD2.
Nomenklatura a obrázky, kde jsou sekvence popsány, jsou uvedeny v tabulce 1.
Tabulka 1
| Knihovna | V - | V - | Knihovna | V - | V - |
| H | L | L | |||
| LD1 | sekvence | sekvence | LD2 | sekvence | sekvence |
| klon č. | obrázek | obrázek | klon č. | obrázek | obrázek |
| LD1-40 | la | lb | LD2-1 | 6a | 6b |
| LD1-52 | 2a | 2b | LD2-4 | 7a | 7b |
| LD1-84 | 3a | 3b | LD2-5 | 8a | 8b |
| LD1-110 | 4a | 4b | LD2-10 | 9a | 9b |
| LD1-117 | 5a | 5b | LD2-11 | 10a | 10b |
| LD2-14 | 11a | 11b | |||
| LD2-17 | 12a | 12b | |||
| LD2-20 | 13a | 13b |
• ·
Výše uvedené Fab klony vykazují výlučnou reaktivitu s Rhesus D antigenem, 3 a 5 Du testovaných erytrocytů a aglutinační reaktivitu proti částečným D fenotypům: Rh33, DUI, DIVa, DIVb, DVa, DVII.
Nicméně, za použití výše uvedených R1R1 erytrocytů pro panorámování Phab nebyly izolovány žádné klony reaktivní s částečným DVI fenotypem. Protože bylo známo, že sérum původního hyperimunního dárce testované v době tvorby rekombinantní knihovny je reaktivní s DVI fenotypem, měla by rekombinantní knihovna také obsahovat anti-DVI specificitu.
Pro selekci DVI reaktivity byly podmínky pro panorámování změněny v tom, že byly použity jiné buňky. Speciální dárce, jehož erytrocyty byly typizovány a bylo známo, že exprivují částečný DVI fenotyp, byl použit jako zdroj buněk pro opakované panorámování LD1 a LD2 knihoven. Tato druhá serie panorámování byla provedena v podstatě stejným způsobem jako první serie s výjimkou substituce DVI erytrocytů za R1R1 erytrocyty a přidání ošetření DVI erytrocytů bromelasou. DVI fenotyp exprivuje nejméně Rhesus D epitopů a je proto obtížné vyrobit proti němu protilátky. Bylo popsáno, že pouze 15% neselektovaných polyklonálních anti-D a 35% selektovaných anti-D tvořených Rhesus D negativními subjektu reaguje s DVI+ buňkami (Mouro, I. et al., Blood, 83: 1129, 1994). Ošetření bromelasou, která odstraňuje N-acetylneuraminovou kyseliny (sialovou kyselinu) z membrány erytrocytů bylo provedeo proto, aby byly epitopy Rhesus DVI lépe dosažitelné v průběhu panorámování s pre-absorbovanými Phab.
Tato druhá serie panorámování na LD1 knihovně vedla k zisku klonu produkujícího Fab, LD1-6-17. Nomenklatura je uvedena v tabulce 2.
• · · · · · · • fc fcfcfcfc • · · ··· ·· · • · · · »· fcfcfcfc ·· ··
Tabulka 2
| Knihovna LDI | V -sekvence H obrázek | V -sekvence obrázek |
| Klon č. LD1-6-17 | 14a | 14b |
| Nicméně, tento | klon reagoval s | Rhesus alelami C a |
| vykazoval falešně | pozitivní reakci | s DVI pozitivními |
erytrocyty. Toto bylo způsobeno také fenotypem DVI dárce (Cc DVI ee), který exprivoval C alelu, která nebyla odabsorbována Rhesus negativními erytrocyty (ccddee).
Proto byla provedena třetí serie panorámování na souboru LDI a LD2 knihoven za použití jiných erytrocytů pro absorpční fázi. Po 6 kolech panorámování za použití jak bromelasou ošetřených, tak bromelasou neošetřených erytrocytů pro oba absorpční kroky a eluci z DVI pozitivních erytrocytů byla získána celková populace Phab, které reagovaly výlučně s erytrocyty fenotypu R1R1 (CCDDee) a 2 různí dárci exprivující exprivující DVI variantu.
Tato třetí serie panorámování na LDI knihovně vedla k zisku 2 klonů produkujících Fab reagujících s DVI+ erytrocyty. Nomenklatura je uvedena v tabulce 3.
Tabulka 3
Knihovna LD1/LD2
V -sekvence - obr.
V -sekvence - obr.
L
Klon č. LDl/2-6-3 Klon č. LD1/2-6-33
15a
16a
15b
16b
Tak bylo izolováno 16 různých anti-Rhesus D Fab klonů. DNA z těchto klonů byla izolována a sekvencována za použití fluorescenčního cyklického sekvencování na ABI 373A Sequencing System. Nukleotidové a odpovídající aminokyselinové sekvence uvedených Fab klonů tvoří základ předkládaného vynálezu.
Analýza sekvence ukázala, že bylo izolováno několik klonů majících stejný Vh genový segment, ale jiné genové segmenty. Tak je tomu v případě dvou klonů LD2-1 a LD2-10, dvou klonů LD2-4 a LD2-11 a tří klonů LD2-14, LDl/2-6-3 a LDl/2-6-33, v příslušném pořadí.
Získané DNA sekvence a Fab fragmenty jsou použitelné pro přípravu kompletních protilátek majících aktivitu proti Rhesus D antigenu. Vhodnými expresními systémy pro takové protilátky jsou myší myelomové buňky nebo ovariální buňky čínského křečka.
Následující příklady podrobně popisují vynález, bez jakéhokoliv omezení rozsahu vynálezu.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1 popisuje konstrukci 2 kombinatoriálních knihoven; zejména výše uvedených LD1 a LD knihoven.
Příklad 2 popisuje podrobně sérii panorámování na LD1 a LD2 knihovnách za použití R1R1 erytrocytů.
Příklad 3 popisuje sérii panorámování za použití jak bromelasou ošetřených, tak bromelasou neošetřených erytrocytů pro absorpci a bromelasou ošetřených DVI pozitivních erytrocytů za použití souboru uvedených LDi a LD2 knihoven.
flfl flfl ·* flfl · · · * fl · · · flfl·· · • · · · • flflfl flfl ···· • fl ·· • flfl fl • · · · fl flflfl flflfl • · fl· «fl
Příklad 4 popisuje nepřímý hemaglutinační test využívající králičí anti-fágovou protilátku, jako ekvivalentní Coombsovo činidlo, pro sledování obohacení a specificity Rhesus D specifických Phabs po panorámování.
Příklad 5 popisuje přípravu a přečištění Fab fragmentů protilátky pro použití jako diagnostické činidlo.
Příklad 6 popisuje přípravu kompletních anti-Rhesus D imunoglobulinů za použití sekvencí podle předkládaného vynálezu.
Příklad 1 - Konstrukce rekombinantních LD1 a LD knihoven
a) Zdroj lymfocytů
Dospělému muži, který byl členem dobrovolné základny hyperimunních Rhesus D dárců, byla podána i.v. dávka 2 ml připravených erytrocytů od známého mužského dárce krevní skupiny 0 RhD. PBL byly odebírány v den +5 a +18 po dávce a mononukleární buňky byly izolovány centrifugací s Ficollovým gradientem (Lymphoprep, Pharmacia, Milwaukee, WI). Výsledky analýzy dárcovských lymfocytů v den +5 jsou uvedeny v tabulce 4. MNC z dne +5 byly použity přímo pro přípravu RNA za použití postupu fenol-chloroform-guanidiniumisothiokyanat (Chomczynski, P. a Sacchi, N. Anal. Biochem. 162: 156, 1987). MNC ze dne +18 byly nejprve kultivovány po dobu 3 dnů v RPMI-1640 mediu (Seromed, Basel) obsahujícím 103 U/ml IL-2 (Sandoz Research Center, Vienna, Austria) a 10 /zg/ml mitogenu z líčidla amerického (PWM; Sigma L9379, Buchs, Switzerland) před extrakcí RNA.
Tabulka 4 - Imunofluorescenční analýza dárcovských lymfocytů v den +5 po i.v. dávce erytrocytů
| Buněčný povrchový antigen | % pozitivních buněk | Buněčný povrchový antigen | % pozitivních buněk |
| CD20 | 15 | CD 8 | 12 |
| CD38 | 20 | CD25 | 7,6 |
| CD20/CD38 | 15 | CD57 | 12,5 |
| CD3 | 47 | CD14 | 6 |
| CD4 | 34 | HLA-DR | 18 |
b) Konstrukce knihovny
Byly konstruovány jednotlivé knihovny nazvané LD1 a LD2 (jak je podrobněji uvedeno výše) odpovídající buňkám odebraným v den +5 a +18 (dohromady +21 dní včetně +3 dní PWM stimulace) po i.v. dávce, v příslušném pořadí. Celková RNA byla potom připravena z těchto buněk za použití postupu fenol-chloroform-guanidiniumisothiokyanat. Z této RNA bylo 10 pg použito pro výrobu cDNA za použití oligo(dT) primeru (400 ng) a bylo reversně transkribováno za použití M-MuLV reversní transkriptasy podle návodu dodavatele (Boehringer Mannheim Germany). PCR amplifikace byla provedena podle postupu popsaného v Vogel, M. et al., E.J. of Immunol. 24: 1200, 1994. Stručně, 100 pl PCR reakce obsahovala Perkin-Elmer pufr s 10 mM MgCl^, 5 pl cDNA, 150 ng každého vhodného 5' a 3' primeru, všechny čtyři dNTP - 200 μΜ každý a 2 U/ml Taq polymerasy (Perkin Elmer, NJ). PCR amplifikace těžkého a lehkého řetězce Fab molekuly byla provedena jednotlivě se sadou primerů od Stratacyte (podrobnosti jsou uvedeny dále). Pro těžký řetězec bylo použito šest upstream primerů, které hybridizovaly s
každou ze šesti rodin Vh genů, zatímco primer pro jeden kappa a jeden lambda řetězec byl použit pro lehký řetězec. Downstream primery byly navrženy tak, aby odpovídaly pantovému regionu konstantních domén rl a t3 pro těžký řetězec. Pro lehký řetězec odpovídaly downstream primery 3' konci kappa a lambda konstantních domén. PCR produkty těžkého a lehkého řetězce byly shromážděny odděleně, byly přečištěny na gelu a tráveny Xhol/Spel a Sacl/Xbal restrikčními enzymy (Boehringer Mannheim), v příslušném pořadí. Po trávení byly produkty PCR extrahovány jednou fenol:chloroform:
:isoamylalkoholem a přečištěny gelovou excisí. Inserce Xhol/Spel tráveného Fd fragmentu a následná ligace Sacl/Xbal tráveného řetězce do pComb3 vektoru, transformace do XLl-Blue buněk a produkce fágů byly provedeny podle postupu popsaného v Barbas III, C.F. a Lerner, R.A. Companion Methods Enzymol. 2: 119, 1991) .
Po transformaci XLl-Blue E. coli buněk byly odebrány vzorky a byly titrovány na plotnách pro určení velikosti knihovny. Tyto výsledky ukazují expresní knihovny o 5 χ 106 a 7,7 χ 106 cfu (kolonie tvořící jednotky) pro LD1 a LD2, v příslušném pořadí.
c) PCR primery
VHI 5’-CAC TCC CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GG-3’
VHII 5’-GTG CTG TCC CAG GTC AAC TTA CTC GAG TCT GG-3'
VHIII 5'-GTC CAG GTG GAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GG-3'
VH1V 5’-GTC CTG TCC CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCG GG-3'
VHV 5’-GTC TGT GCC GAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GG-3'
VHVI 5'-GTC CTG TCA CAG GTA CAG CTG CTC GAG TCA GG-3' CHI(gl) 5'-AGC ATC ACT AGT ACA AGA TTT GGG CTC-3’ • · • · · · · ·· · · ·· · • ·· · · · ······ ·· ···· · · ··
VL(k) 5’-GT GCG AGA TGT GAG CTC GTG ATG ACC CAG TCT CCA-3' CL(k) 5’-T CCT TCT AGA TTA CTA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT
CTT TGT GAC GGG CGA ACT C-3’
VL(I) 5'C TGC ACA GGG TCC TGG GCC GAG CTC GTG GTG ACT CA-3’ CL(I) 5’G CAT TCT AGA CTA TTA TGA ACA TTC TGT AGG GGC-3’
d) Vektory a bakteriální kmeny pComb3 vektor použitý pro klonování Fd a lehkého řetězce byl získán od Scripps Research Institute La Jolla, CA;Barbas III, C.F. a Lerner, R.A. Companion Methods Enzymol. 2: 119, 1991). Escherichia coli kmen XLl-Blue použitý pro transformaci pComb3 vektoru a VCSM13 pomocný fág byly zakoupeny od Stratacyte (La Jolla, CA).
Příklad 2 - Selekce Rhesus D Phab z LD1 a LD2 knihoven na R1R1 erytrocytech
a) Absorpce a biopanorámování
Serie tří negativních absorpci na erytrocytech skupiny 0 Rh negativní byly provedeny před každým kolem panorámování před pozitivní selekcí na erytrocytech skupiny 0 Rh pozitivní (R1R1). Čerstvé erytrocyty byly odebrány v ACD (kyselá citratová dextrosa) antikoagulačním činidlu a byly promyty 3 krát v 0,9% NaCl. Erytrocyty byly počítány v Hayemsově roztoku a jejich počet byl upraven na 40 x 106/ml. Absorpce: 1 ml fágového přípravku v PBS/3%BSA byl přidán k peletě erytrocytů skupiny 0 Rh negativní (16 χ 106 erytrocytů) ve 12 ml tubách (Greiner 187261, Reinach, Switzerland) a byla provedena inkubace při pokojové teplotě po dobu 30 minut s jemným třepáním. Všechny tuby byly předem blokovány v PBS/3% BSA po dobu minimálně 1 hodiny při pokojové teplotě. Erytrocyty byly peletovány centrifugací po dobu 5 minut při 300 x g při 4 °C. Vzniklý fágový supernatant byl opatrně odebrán a proces byl
• · opakován ještě dvakrát. Po konečné absorpci byl fágový supernatant přidán k peletě erytrocytů skupiny 0 Rh pozitivní (16 x 106 erytrocytů) a znovu byla provedena inkubace při pokojové teplotě po dobu 30 minut s mírným třepáním. Potom byly erytrocyty promyty alespoň 5-krát v 10 ml ledově chladného PBS, byla provedena centrifugace při 300 x g po dobu 5 minut při 4 °C a potom následovala eluce s 200 μΐ 76 mM kyseliny citrónové pH 2,8 po dobu 6 minut při pokojové teplotě a neutralizace 200 μΐ 1 M Tris. Erytrocyty byly centrifugovány při 300 x g po dobu 5 minut při 4 °C a vzniklý supernatant obsahující eluované fágy byl pečlivě odebrán a skladován s proteinovým nosičem (0,3% BSA) při 4 °C připravený pro re-amplifikaci. Počet Rhesus D specifických Phab každého kola panorámování je uveden v tabulce 5.
• ·
I · · » · · • · · 4
Tabulka 5 - Selekce Rhesus D Phab z LDl a LD2 knihoven na R1R1 erytrocytech
| Počet eluovaných Rhesus D specifických fágů | ||||
| Panorámování | Knihovna Dl | Knihovna D2 | ||
| kolo č.a | cfu | cfu | ||
| 1 | 8 x 10® | 4,6 | X | 107 |
| 2 | 6 x 107 | 1,4 | X | 107 |
| 3 | 1 x 10® | 7,9 | X | 107 |
| 4 | 3 x 10® | 1,3 | X | 10® |
| 5 | 3 x 10® | 1 | X | 10® |
| 6 | nd | 2,8 | X | 10® |
Pro každé kolo bylo 1012 Phab inkubováno v tubách s erytrocyty skupiny 0 Rh negativní (absorpční fáze) a potom následovala eluce z erytrocytů skupiny 0 Rh pozitivní (R1R1). nd = meprovedeno cfu = kolonie tvořící jednotky
Příklad 3 - Selekce Rhesus D Phab ze souboru knihoven LDl a LD2 na DVI+ erytrocytech
a) Absorpce na erytrocytech skupiny 0 Rh negativní, fenotypu 1 (r'r,Ccddee) a 2 (ryry, CCddEE)
Serie čtyř negativních absorpcí na erytrocytech skupiny 0 Rh negativní byly provedeny pro každé kolo panorámování před pozitivní selekcí na erytrocytech skupiny 0 Rh DVI pozitivní. Negativní absorpce byly provedeny v následujícím pořadí: krok 1) fenotyp 1 ošetřený bromelasou; krok 2) fenotyp 1 neošetřený
bromelasou; krok 3) fenotyp 2 ošetřený bromelasou; krok 4) fenotyp 2 neošetřený bromelasou. Zmražené erytrocyty se nechaly roztát ve směsi sorbitu a fosfátem pufrovaného salinického roztoku, nechaly se stát v tomto roztoku po dobu minimálně 10 minut a potom se promyly 5 až 6-krát ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku a nakonec se uskladnily ve stabilizačním roztoku (DiaMed EC-roztok) připravené pro použití. Před panorámováním byly erytrocyty promyty 3-krát v 0,9% NaCl a potom následovalo počítání v Hayemově roztoku. Absorpce: 1 ml fágového přípravku v PBS/3%BSA byl přidán k peletě erytrocytů (2 x 10e) stejně jako v kroku 1 ve 12 ml tubách (Greiner 187261, Reinach, Switzerland) a byla provedena inkubace při pokojové teplotě po dobu 30 minut s jemným třepáním. Všechny tuby byly předem blokovány v PBS/3% BSA po dobu minimálně 1 hodiny při pokojové teplotě. Erytrocyty byly peletovány centrifugací po dobu 5 minut při 300 x g při 4 °C. Vzniklý fágovy supernatant byl pečlivě odebrán a proces byl opakován za použití erytrocytů jak je podrobněji popsáno výše v krocích 2, a 4.
b) Ošetření erytrocytů Rhesus D negativní r'r a ryry a Rhesus DVI+ bromalasou
Bromelasa 30 (Baxter, Dudingen, Switzerland) byla použita pro ošetření erytrocytů Rhesus DVI ve stejných poměrech, jako je používána v rutinním hemaglutinačním testu, t.j. 10 μΐ bromelasy na 2 x 10e erytrocytů. Bromelasa byla přidána do požadovaného množství erytrocytů a byla inkubována při 37 °C po dobu 30 minut a potom následovalo promytí 3-krát v 0,9% NaCl, opětovné počítání v Hayemově roztoku a upravení na požadovanou koncentraci v PBS/3% BSA a byly připraveny pro Phab panorámování.
• · • ·
c) Biopanorámování na bromelasou ošetřených Rhesus DVI+ erytrocytech
Po konečné absorpci na erytrocytech ryry neošetřených bromelasou byl fágový supernatant rozdělen na dvě stejné části a byl přidán buď k enzymem ošetřené nebo enzymem neošetřené peletě erytrocytů skupiny 0 Rh DVI+ (40 x 106), v příslušném pořadí, a byla znovu provedena inkubace při pokojové teplotě po dobu 30 minut s jemným třepáním. Potom byly dvě populace erytrocytů promyty alespoň 5-krát v 10 ml ledově chladného PBS, byla provedena centrifugace při 300 x g po dobu 5 minut při 4 °C a potom následovala eluce s 200 μΐ 76 mM kyseliny citrónové pH 2,8 po dobu 6 minut při pokojové teplotě a neutralizace 200 μΐ 1 M Tris. Erytrocyty byly centrifugovány při 300 x g po dobu 5 minut při 4 °C a vzniklý supernatant obsahující eluované fágy z bromelasou ošetřených a bromelasou neošetřených DVI+ erytrocytů byl pečlivě odebrán a skladován s proteinovým nosičem (0,3% BSA) při 4 °C připravený pro re-amplifikaci. V dalších kolech panorámování byly eluované fágy z bromelasou ošetřených a neošetřených DVI+ erytrocytů uchovávány odděleně a po každé následovaly kroky 1 až 4 absorpčního protokolu. Krok eluce byl mírně odlišný ve srovnání s kolem 1 panorámování, protože fágové populace nebyly znova rozděleny na dvě části. Pouze ty fágy, které byly eluovány z bromelasou ošetřených DVI+ erytrocytů byly také znova eluovány z bromelasou ošetřených DVI+ erytrocytů a pouze ty fágy, které byly eluovány z bromelasou neošetřených DVI+ erytrocytů byly také znova eluovány z bromelasou neošetřených DVI+ erytrocytů. Počet Rhesus D specifických Phab každého kola panorámování je uveden v tabulce 6.
• · • · • 4 « ·
Tabulka 6 - Selekce Rhesus D Phab ze souboru LD1 a LD2 knihoven na Rhesus DVI+ erytrocytech
| Počet eluovaných DVI+ specifických fágů | |||||
| Panorámování | - bromelasa | + bromelasa | |||
| kolo č.a | cfu | cfu | |||
| 1 | 1,9 x | 106 | 4,4 | X | 106 |
| 2 | 1,6 x | 10® | 4 | X | 105 |
| 3 | 2,4 X | 107 | 4,1 | X | 107 |
| 4 | 3 x | 10® | 5 | X | 107 |
| 5 | 1 x | 10® | 1 | X | 10® |
| 6 | nd | 3 | X | 10® |
Pro každé kolo bylo 1012 Phab inkubováno v tubách se 2 různými fenotypy erytrocytů skupiny 0 Rh negativní (absorpční fáze) a potom následovala eluce z erytrocytů skupiny 0 Rh DVI+.
Příklad 4 - Monitorování kol panorámování a určení specificity obohacených Phab za použití králičí anti-fágové protilátky
Nepřímý hemaglutinační test
Čerstvě odebrané erytrocyty různých ABO a Rhesus krevních skupin byly promyty 3-krát v 0,9% NaCl a byly upraveny na 3 5% roztok (45 - 50 x 107/ml) buď v 0,9% NaCl nebo v PBS/3%BSA. Pro každé testovací podmínky bylo 50 μΐ erytrocytů a 100 μΐ testovaného vzorku (vysrážený a amplifikovaný fág nebo kontrolní protilátky) inkubováno společně ve skleněných trubičkách pro určování krevních skupin (Baxter, Dudingen, Switzerland) po dobu 30 minut při 37 °C. Erytrocyty byly promyty 3-krát v 0,9% NaCI a potom byly inkubovány se dvěma kapkami Coombsova činidla (Baxter, Dudingen, Switzerland) pro pozitivní kontrolu nebo se 100 μΐ králičích anti-fágových protilátek (vyrobených imunizací králíků přípravkem fágu VCSM13 a potom přečištěním na Affi-Gel Blue koloně a absorpcí na E. coli pro odstranění E. coli specifických protilátek) ředěných 1/1000. Tuby byly inkubovány po dobu 20 minut při 37 °C, centrifugovány po dobu 1 minuty při 125 x g a erytrocyty byly vyšetřovány na aglutinaci pečlivým protřepáním a za použití lupy.
Při testování přečištěných Fab na aglutinaci byla afinitně přečištěná anti-Fab protilátka (The Binding Site, Birmingham, U.K.) použita místo králičí anti-fágové protilátky.
Tabulka 7 ukazuje výsledky hemaglutinačních testů Phab vzorků po různých kolech panorámování na R1R1 erytrocytech.
Tabulka 8 ukazuje výsledky hemaglutinačních testů Phab vzorků po různých kolech panorámování na Rhesus DVI+ erytrocytech.
Tabulka 9 ukazuje charakter reaktivity jednotlivých Fab klonů z knihoven LDI a LD s částečnými D variantami • · · · · · · • · · · · · · · · · * · · ·
Tabulka 7 - Monitorování Phab z LD1 a LD knihoven nepřímou hemaglutinací po panorámování na R1R1 erytrocytech
| Phab vzorek | Knihovna LD1 | Knihovna LD2 |
| kolo panorámování | testováno na | erytrocytech 0 Rh D+ <a> |
| č. 4 | ||
| neředěný | + | + |
| 1/4 | + | + |
| 1/20 | - | - |
| Č. 5 | ||
| neředěný | ++ | + |
| 1/4 | + + | + |
| 1/20 | - | - |
| č. 6 | ||
| neředěný | nd | + + + |
| 1/4 | nd | + + |
| 1/20 | nd | nd |
| Pomocný fág 5=5 | ||
| neředěný, 1/4, 1/20 | - | - |
nepřímá hemaglutinace byla provedena ve skleněných trubičkách za použití 50 μΐ erytrocytů {40 x 10v/ml) a 100 μΐ Phab s počátkem při 4 x 10i:L/ml. Po 30 minutách při 37 °C byly erytrocyty promyty 3-krát a byly dále inkubovány po dobu 20 minut při 37 °C s králičí anti-fágovou protilátkou při ředění 1/1000.
Aglutinace byla hodnocena vizuálně od +++ (silná aglutinace) do - (žádná aglutinace). nd = neprovedeno
Tabulka 8 - Monitorování Phab ze souboru LD1 a LD knihoven nepřímou hemaglutinací po panorámování na Rhesus DVI+ erytrocytech
| Phab vzorek Kolo panorámování | fenotypy erytrocytů | ||||
| CCDDee ccddee | Ccddee | CCddEE | DVI(E.J.) | DVI(K.S.) | |
| Bromelasou | neošetřené | ||||
| erytrocyty | DVI + | ||||
| Kolo č. 3 | a)+ + + | + | ( + ) | + | + |
| Kolo č. 5 | + + | - | - | - | - |
| Bromelasou | ošetřené | ||||
| erytrocyty | DVI + | ||||
| Kolo č. 4 | + + + | + | - | (+) | + |
| Kolo č. 5 | + + + | + | + | (+++) | + + |
| Kolo č. 6 | + + + + | - | - | + + + | + + + |
| LD1-6-17 | |||||
| LD1/2-6-3 | + + + + | - | - | + | nd |
| LD1/2-6-33 | + + + + | - | - | + | nd |
Aglutinace byla hodnocena vizuálně od +++ (silná aglutinace) do - (žádná aglutinace). nd = neprovedeno.
Povšimněte si: Pouze ty Phab, které byly eluované z bromelasou ošetřených DVI+ erytrocytů vykazovaly známky aglutinace proti 2 různým DVI+ dárcům.
Tabulka 9 - Klonální analýza reaktivity Fab anti-Rhesus D klonů z knihoven Dl a LD2 pro částečným D variantám
| <a> Fat | > klon | Č . | Rh33 | Částečné D varianty | DVI | DVII | |||
| DUI | DIVa | DIVb | DVa | ||||||
| LD1 - | 40 | - | +++ | + | + | + | - | ++ | |
| - | 52 | - | +++ | - | - | + + + | - | + + + | |
| - | 84 | - | ++ | - | - | - | - | + | |
| - | 110 | ( + ) | + + + | + + | + | + | - | + + | |
| - | 117 | - | +++ | - | - | - | - | + + | |
| LD2 - | 1 | + + + | nd | +++ | + + + | + | - | ++ + | |
| - | 4 | - | ++ + | - | + | - | - | + | |
| - | 5 | - | nd | + + + | ++ + | - | - | +++ | |
| - | 10 | (-) | +++ | +++ | + + + | + | - | + + | |
| - | 11 | - | ++ + | - | - | - | - | + + | |
| - | 14 | + + + | +++ | + + + | + + + | + + + | - | + + + | |
| - | 17 | - | +++ | + + + | + | + | - | + + + | |
| - | 20 | - | +++ | + + + | - | + | - | ++ + | |
| LD1/2 | - 6 - | 3 | + + | + + + | + + + | + + | + + + | + | + + |
| LD1/2 | - 6 - | 33 | + | +++ | + + + | + + | + + + | + | + + |
solubilní Fab přípravky byly vyrobeny z každého klonu a následovala nepřímá hemaglutinace
Aglutinace byla hodnocena vizuálním hodnocením od +++ (všechny buňky aglutinovány ve shluku) do - (žádné buňky nejsou aglutinovány)
Příklad 5 - Příprava a přečištění Fab fragmentů protilátky pro použití jako diagnostická činidla
Po postupech biopanorámování podrobně popsaných v příkladech a 3 byla fágová populace, která vykazovala specifickou aglutinaci na Rhesus D+ erytrocytech selektována a byla použita pro přípravu fagemidové DNA. Přesněji, Phab selektované na R1R1 erytrocytech byly použity po 5. a 6. kole biopanorámování pro LD1 a LD knihovny, v příslušném pořadí, a po 5. kole biopanorámování na DVI+ erytrocytech pro izolaci klonu
LDi-6-17. Pro produkci solubilního Fab musí být sekvence glll kódující plil koncový protein na fágové částici deletována.
Fagemidová DNA byla připravena za použití Nucleotrap kitu (Machery-Nagel) a glll sekvence byla odstraněna trávením takto izolované fagemidové DNA Nhel/Spel jak je popsáno (Burton, D.R. et al., PNAS, 1989) . Po transformaci do XL-1 Blue byly jednotlivé klony selektovány (nomenklatura je uvedena v tabulce 1) a kultivovány v LB (Luria Broth) obsahujícím 50 /zg/ml karbencilinu při 37 °C do OD 0,6 při 600 nm. Kultury byly indukovány 2 mM isopropyl β-D-thiogalaktopyranosidu (IPTG) (Biofinex, Praroman, Switzerland) a byly kultivovány přes noc při 37 °C. Celá kultura byla centrifugována při 10000 x g po dobu 30 minut při 4 °C pro peletování bakterií. Bakteriální peleta byla ošetřena roztokem lysozym/DNAsa pro uvolnění Fab fragmentů uvnitř buněk. Protože některé Fab fragmenty byly uvolněny do supernatantu kultury, byl supernatant odebrán zvlášč. Tyto Fab přípravky byly potom shromážděny a vysráženy 60% síranem amoonným (Merck, Darmstadt, Germany) pro koncentrování Fab a potom následovala extensivní dialýza ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku (PBS) a ultracentrifugace při 200000 x g pro peletování jakýchkoliv nerozpustných komplexů. Fab přípravky byly potom přečištěny na keramické hydroxyapatitové koloně (HTP Econo cartridge, BioRad, Glattbrugg, Switzerland) za použití gradientově eluce PBS (pufr A) a PBS + 0,5 M NaCl (pufr B). Lineární gradient byl programován na růst od 0 do 100% pufru B ve 40 min. Fab byl eluován jako jediný pík mezi 40 - 60% pufru B. Pozitivní frakce, jak byly identifikovány imunodot testem za použití konjugatu anti-Fab peroxidasa (The Binding Site, Birmingham, U.K.) byly shromážděny, koncentrovány za použití polyethylenglykolu a extensivně dialyzovány proti PBS.
Pozitivní frakce z hydroxyapatitové kolony pro každý klon byly použity v klasickém nepřímém hemaglutinačním testu ve skleněných trubičkách za použití buď stadartního Coombsova činidla (Baxter Diagnostics AG Dade, anti-lidské sérum), nebo anti-Fab (The Binding Sítě, Birmingham, U.K.) jako činidla pro zkříženou vazbu. Tyto Fab definované specificity k částečným D variantám jak je ukázána na str. 25 mohou být použity pro typizaci erytrocytů neznámého částečného D fenotypu.
Příklad 6 - Konstrukce kompletních imunoglobulinových genů
V gen LD2-14 pro těžký řetězec (V gen) byl amplifikován z anti-Rhesus D-Fab-kodujícího plasmidu LD2-14 za použití polymerasové řetězové reakce (PCR) se specifickými primery.
5'-primer měl sekvenci:
5'-GGGTCGACGCACAGGTGAAACTGCTCGAGTCTGG-3', zatímco 3'-primer měl sekvenci:
5'-GCCGATGTGTAAGGTGACCGTGGTCCCCTTG-3'.
PCR reakce byla provedena s Deep Vent DNA polymerasou a pufrovacím roztokem (2 mM Mg*“1·) od New England Biolabs za podmínek doporučených výrobcem včetně 100 pmol každého primeru a čtyřech deoxynukleotidů v koncentraci 250 μΜ každý. Reakce byla provedena při 30 cyklech s následujícími teplotními kroky: 60 s při 94 °C (prodlouženo o 2 minuty v průběhu prvního cyklu), 60 s při 57 °C a 60 s při 72 °C (prodlouženo o 10 minut • 0 00 00 ·· ··
0 0 0 · 000 0 • 00 0 0000
00 0 0 0 000000
0 0 0 · · 000 00 0000 00 ·· v průběhu posledního cyklu). Postamplifikační adice 3'
A-přesahujících konců byla provedena následnou inkubací po dobu 10 minut při 72 °C za přítomnosti 1 jednotky Taq DNA polymerasy (Boehringer Mannheim, Germany). PCR produkt byl přečištěn za použití QIAquick PCR purifikačního kitu (Qiagen, Switzerland) a byl klonován do vektoru pCRII za použití klonovacího kitu od Invitrogen (San Diego, USA). Po trávení vzniklého plasmidu TAVH14 Sáli a BstEII byl izolován Vh gen za použití preparativní agarosové gelové elektroforesy za použití QIAquick gel extraction kitu od Qiagen.
Vektor č. 50 (Sandoz Pharma, Basel), který obsahoval irelevantní, ale intaktní lidský genomový imunoglobulinový gen, byl tráven Sáli a BstEII a vektorový fragment byl izolován preparativní agarosovou gelovou elektroforesou za použití QIAquick gel extraction kitu od Qiagen. Ligace vektoru a PCR produktu byla provedena při 25 °C po dobu 2 hodin v celkovém objemu 20 μΐ za použití rychlého DNA Ligation kitu (Boehringer Mannheim, Germany). Po ligaci byla reakční směs ředěna 20 μΐ H^O a extrahována 10 objemy n-butanolu pro odstranění solí. DNA byla potom peletována centrifugací, sušena ve vakuu a resuspendována v 10 μΐ H20. 5 μΐ tohoto DNA roztoku bylo elektroporováno (0,1 cm kyvety, 1,9 kV, 200 Ω, 25 //FD) za použití GenePulser (BioRad, Gaithersburg) do 40 μί pro elektroporaci kompetentních E. coli XL-lblue MRF' (Stratagene, La Jolla), bylo provedeno ředění v SOC mediu, inkubace při 37 °C po dobu 1 hodiny a buňky byly umístěny na LB plotny obsahující ampicilin (50 /zg/ml) . Plasmidové minipřípravky (Qiagen, Basel) vzniklých kolonií byly ověřeny restrikčními tráveními na přítomnost požadovaného insertu.
Při tomto postupu byl irelevantní původní Vh gen ve vektoru
č. 150 nahrazen amplifikovanou anti-Rhesus D Vh sekvencí LD2-14
a byl získán plasmid cassVH14. Struktura vzniklého imunoglobulinového genového konstruktu byla potvrzena sekvencováním, byl rozstřižen trávením EcoRI a BamHI a přečištěn na gelu jak je popsáno výše. Expresní vektor č. 10 (Sandoz Pharma, Basel) obsahující lidský genomový imunoglobulinový Crl genový segment, byl také tráven EcoRI a BamHI, izolován preparativní agarosovou gelovou elektroforesou, ligován s EcoRI / BamHI-VH genovým segmentem předem získaným z plasmidu cassVH14 a elektroporován do E. coli XLl-blue MRF' jak bylo popsáno výše. Toto vedlo ke vzniku genu pro kompletní těžký řetězec anti-Rhesus D imunoglobulinu v expresním vektoru 14IgGl (obrázek a).
V gen LD2-14 pro lehký řetězec (V gen) byl amplifikován ze stejného anti-Rhesus D-Fab plasmidu LD2-14 PCR se specifickými primery. 5'-primer měl sekvenci:
5'-TACGCGTTGTGACATCGTGATGACCCAGTCTCCAT-3', zatímco 3'-primer měl sekvenci:
5'-AGTCGCTCAGTTCGTTTGATTTCAAGCTTGGTCC-3'.
PCR reakce, přečištění produktu a následující kroky klonování byly analogické s kroky popsanými pro Vh gen s tou výjimkou, že byly použity vhodné vektory pro lehký řetězec. Stručně, Vl PCR produkt byl klonován do pCRII vektoru za vzniku plasmidu TAVL14, byl z něj excidován za použití Mlul a HindlII a byl izolován gelovou extrakcí. Vl gen byl potom klonován do Mlul a HindlII míst vektoru č. 151 (Sandoz Pharma, Basel) a tak nahradil irelevantní původní V gen amplifikovanou anti-Rhesus D Vl sekvencí LD2-14. Po potvrzení sekvence vzniklého plasmidu cassVL-14 byl EcoRI/Xbal fragment obsahující gen potom subklonován do restrikčních míst EcoRI a Xbal vektoru č. 98 (Sandoz Pharma, Basel), který obsahuje lidský genomový genový
444 444 ·· 44 • · · · 4
4 4 ·
4 4 4 4
4 4 4
444 44 4444 segment pro imunoglobulin Ck. Tento postup nahrazuje irelevantní původní Vl gen v plasmidu č. 98 a je získán expresní vektor 14 kappa, který obsahuje gen pro kompletní lehký řetězec anti-Rhesus D imunoglobulinu.
Myší myelomová buněčná linie SP2/0-Ag 17 (ATCC CRL 1581) byla současně transfektována expresními vektory 14IgGl a 14 kappa předem linearizovaných v jedinečných EcoRI a Notl restrikčních místech, v příslušném pořadí. Elektroporace byla provedena následujícím způsobem: exponenciálně rostoucí buňky byly dvakrát promyty a suspendovány ve fosfátem pufrované sacharose (272 mM sacharosy, 1 mM MgCl^, 7 mM NaH^PO^, pH 7,4) v hustotě 2 χ 107 buněk na ml. 0,8 ml buněk bylo přidáno do 0,4 cm kyvety, smíseno s 15 μg linearizovaných plasmidů 14IgGl a 14 kappa, ponecháno na ledu po dobu 15 minut, elektroporováno za s 290 V, 200 Ω, 25 gFD, umístěno zpět na led na dobu 15 minut, přeneseno do buněčné kultivační nádoby T75 s 20 ml chladného RPMI 1640 media (10% teplem inaktivované fetální hovězí sérum, 50 μΜ beta-merkaptoethanolu), ponecháno po dobu 2 hodin při pokojové teplotě a potom inkubováno po dobu 60 hodin při 37 °C. Po této době byly buňky přeneseny do 50 ml media obsahujícího 1 mg/ml G418 pro selekci. Stabilní transfektanty byly potom selektovány za přítomnosti zvyšujících se koncentrací metotrexatu pro amplifikaci integrované DNA a tak zvýšení exprese odpovídající protilátky rD2-14.
Exprese rD2-14 v supernatantu kultury (SrD2-14) byla sledována enzymově vázaným imunosorbentním testem (ELISA) specifickým pro lidské rl a kappa řetězce. Kvantifikace Rhesus D specifických imunoglobulinů v anti-D testu podle Ph. Eur. ukázala mezi 1,1 až 11,4 μg/ml aglutinační protilátky v takových supernatantech. Byly testovány jako aglutinace negativní pro Rhesus negativní erytrocyty a vykazovaly stejný aglutinační potenciál proti ·· ·· fcfc >· ·· • · fc··· · · · · • ·· · ···· • · · · · · ····«· • fcfc· fcfc • •«fc ·· fcfcfcfc fcfc fcfc částečným D variantám jako Fab LD2-14 exprivované v E. coli. Data jsou ukázána v tabulce 10.
Tabulka 10 - Srovnávací analýza reaktivity Fab anti-Rhesus D klonu LD2-14 a protilátky rD2-14 proti částečným D variantám
| Částečné D varianty | ||||||||
| R1R1 | rr | Rh33 | DUI | DIVa | DIVb | DVa DVI | DVII | |
| LD2-14 | + + + | - | + + + | + + + | + + + | + + + | + + + | + + + |
| SrD2-14 | + + + | - | ++ + | + + + | + + + | + + + | ++ + | + + + |
| TCB | - | - |
Aglutinace byla hodnocena vizuálním hodnocením od +++ (všechny buňky aglutinovány ve shluku) do - (žádné buňky nejsou aglutinovány).
LD2-14: Fab fragment připravený jak je popsáno v příkladu 5;
SrD2-l4: supernatant buněčné kultury obsahující protilátku rD2-14;
TCB: supernatant buněčné kultury netransfektováných buněk.
·· ·· • · · 9 · · · • «·· ··· • · ·· ·· ·· • ·
I? sl t θ n to -v θ ra sl αγ o ·· ·· • · « · • · · • · · • · · ·· ····
1. Polypeptidy schopné tvorby vazebných struktur pro antigen se specificitou pro Rhesus D antigeny, které obsahují Rhesus D-specifické CDR1, CDR2 a CDR3 regiony párů aminokyselinových sekvencí Vr a Vl se stejnými nebo odlišnými identifikačními čísly podle obrázků uvedených v tabulce uvedené dále:
| V H | V | |||||||
| Identi- | Obr. | 2DR1 | CDR2 | CDR3 | Obr. | CDRl | CDR2 | CDR3 |
| fikační | páry | páry | páry | páry | páry | páry | ||
| číslo | baží č. | baží č. | baží č. | baží č | baží č | baží č | ||
| LD1-40 | Obr.la | 91-105 | 148-198 | 295-342 | Obr.lb | 64-96 | 142-162 | 259-288 |
| LD1-52 | Obr.2a | 91-105 | 148-198 | 295-342 | Obr.2b | 64-96 | 142-162 | 259-288 |
| LD1-84 | Obr.3a | 91-105 | 148-198 | 295-342 | Obr.3b | 64-96 | 142-162 | 259-285 |
| LD1-110 | Obr.4a | 91-105 | 148-198 | 295-342 | Obr.4b | 64-96 | 142-162 | 259-285 |
| LD1-117 | Obr.5a | 91-105 | 148-198 | 295-345 | Obr.5b | 64-96 | 142-162 | 259-288 |
| LD2-1 | Obr.6a | 91-105 | 148-198 | 295-342 | Obr.6b | 64-99 | 142-165 | 262-294 |
| LD2-4 | Obr.7a | 91-105 | 148-198 | 295-342 | Obr.7b | 64-96 | 142-162 | 259-282 |
| LD2-5 | Obr.8a | 91-105 | 148-198 | 295-342 | Obr.8b | 64-96 | 142-162 | 259-288 |
| LD2-10 | Obr.9a | 91-105 | 148-198 | 298-345 | Obr.9b | 61-102 | 148-168 | 265-294 |
| LD2-11 | Obr.10a | 91-105 | 148-198 | 295-342 | Obr.10b | 64 - 96 | 142-162 | 259-285 |
| LD2-14 | Obr.11a | 91-105 | 148-198 | 295-342 | Obr.11b | 64-96 | 142-162 | 259-285 |
| LD2-17 | Obr.12a | 91-105 | 148-198 | 295-342 | Obr.12b | 64 - 96 | 142-162 | 259-285 |
| LD2-20 | Obr.13a | 91-105 | 148-198 | 295-342 | Obr.13b | 64-96 | 142-162 | 259-285 |
| LD1-6-17 | Obr.14a | 91-105 | 148-198 | 295-351 | Obr.14b | 64-96 | 142-162 | 259-285 |
| LD1/2£ 7 | Obr.15a | 91-105 | 148-198 | 295-342 | Obr.15b | 64-96 | 142-162 | 259-285 |
| LDl/2- | Obr.16a | 91-105 | 148-198 | 295-342 | Obr.16b | 64 - 96 | 142-162 | 259-285 |
| -6-33 |
2. Polypeptidy podle nároku 1, které obsahují Rhesus D-specifické CDR1, CDR2 a CDR3 regiony párů aminokyselinových sekvencí a se stejnými identifikačními čísly podle obrázků uvedených v tabulce podle nároku 1.
3. Polypeptidy podle nároku 1, které obsahují regiony s aminokyselinovými sekvencemi vh a Vl a mají identifikační čísla podle obrázků uvedených v tabulce podle nároku 1.
• · • · • · • · > · · «
4. Polypeptidy podle nároku 1, 2 nebo 3, které jsou Fab fragmenty vážící antigen.
5. Polypeptidy podle nároku 1, 2 nebo 3 obsahující těžké a lehké imunoglobulinové řetězce schopné tvorby kompletních anti-Rhesus D protilátek.
6. DNA sekvence kódující polypeptidy schopné tvorby vazebných struktur pro antigen se specificitou pro Rhesus D antigeny, které obsahují regiony s Rhesus D-specifickými CDR1, CDR2 a CDR3 segmenty párů DNA sekvencí Vh a se stejnými nebo odlišnými identifikačními čísly podle obrázků uvedených v tabulce uvedené dále a jejich funkční ekvivalenty:
| V Hl· | V L | |||||||
| Identi- | Obr. | CDR1 | CDR2 | CDR3 | Obr. | CDR1 | CDR2 | CDR3 |
| fikační | páry | páry | páry | Páry | páry | páry | ||
| číslo | baží č. | baží č. | baží č. | baží č | baží č | baží č | ||
| LD1-40 | Obr.la | 91-105 | 148-198 | 295-342 | Obr.lb | 64-96 | 142-162 | 259-288 |
| LD1-52 | Obr.2a | 91-105 | 148-198 | 295-342 | Obr.2b | 64-96 | 142-162 | 259-288 |
| LD1-84 | Obr.3a | 91-105 | 148-198 | 295-342 | Obr.3b | 64-96 | 142-162 | 259-285 |
| LD1-110 | Obr.4a | 91-105 | 148-198 | 295-342 | Obr.4b | 64-96 | 142-162 | 259-285 |
| LD1-117 | Obr.5a | 91-105 | 148-198 | 295-345 | Obr.5b | 64-96 | 142-162 | 259-288 |
| LD2-1 | Obr.6a | 91-105 | 148-198 | 295-342 | Obr.6b | 64-99 | 142-165 | 262-294 |
| LD2-4 | Obr.7a | 91-105 | 148-198 | 295-342 | Obr.7b | 64-96 | 142-162 | 259-282 |
| LD2-5 | Obr.8a | 91-105 | 148-198 | 295-342 | Obr.8b | 64-96 | 142-162 | 259-288 |
| LD2-10 | Obr.9a | 91-105 | 148-198 | 298-345 | Obr.9b | 61-102 | 148-168 | 265-294 |
| LD2-11 | Obr.10a | 91-105 | 148-198 | 295-342 | Obr.10b | 64-96 | 142-162 | 259-285 |
| LD2-14 | Obr.lla | 91-105 | 148-198 | 295-342 | Obr.11b | 64-96 | 142-162 | 259-285 |
| LD2-17 | Obr.12a | 91-105 | 148-198 | 295-342 | Obr.12b | 64-96 | 142-162 | 259-285 |
| LD2-20 | Obr ,13a | 91-105 | 148-198 | 295-342 | Obr.13b | 64-96 | 142-162 | 259-285 |
| LD1-6-17 | Obr.14a | 91-105 | 148-198 | 295-351 | Obr.14b | 64-96 | 142-162 | 259-285 |
| LDl/2- r 7 | Obr.15a | 91-105 | 148-198 | 295-342 | Obr.15b | 64-96 | 142-162 | 259-285 |
| LDl/2- | Obr.16a | 91-105 | 148-198 | 295-342 | Obr.16b | 64-96 | 142-162 | 259-285 |
| -6-33 |
7. DNA sekvence podle nároku 6 kódující polypeptidy schopné tvorby vazebných struktur pro antigen se specificitou pro Rhesus
·· · · · · · · ··
D antigeny, které obsahují regiony s Rhesus D-specifickými CDR1, CDR2 a CDR3 segmenty párů DNA sekvencí Vh a se stejnými identifikačními čísly podle obrázků uvedených v nároku 6 a jejich funkční ekvivalenty.
8. DNA sekvence podle nároku 6 nebo 7, které obsahují regiony s DNA sekvencemi Vh a s identifikačními čísly podle obrázků uvedených v nároku 6.
9. DNA sekvence podle nároku 6, 7 nebo 8 kódující polypeptidy schopné tvorby Fab fragmentů vážících antigen.
10. DNA sekvence podle nároku 6, 7 nebo 8 kódující polypeptidy schopné tvorby kompletních anti-Rhesus D protilátek.
11. Způsob přípravy rekombinantních polypeptidů schopných tvorby vazebných struktur pro antigen, například Fab fragmentů, se specificitou pro Rhesus D antigeny vyznačující se tím, že obsahuje následující kroky v postupném pořadí:
a) podání dávky Rhesus D pozitivních erytrocytů jedinci schopnému tvorby anti-Rhesus D protilátek,
b) izolaci mononukleárních buněk od jedince,
c) izolaci celkové RNA z mononukleárních buněk,
d) přípravu cDNA za použití oligo(dT)primeru a reversní transkripci mRNA s M-MuLV reversní transkriptasou a amplifikaci cDNA repertoáru polymerasovou řetězovou reakcí za použití specifických primerů pro imunoglobulinovou genovou rodinu,
e) vytvoření fágové zobrazovací knihovny insercí DNA kódující
těžký a lehký řetězec Fab polypeptidu do fágemidového vektoru; kdy DNA pro těžký řetězec je insertována v rámečku s genem kódujícím fágový protein plil, který umožňuje expresi Fab plil fúsního proteinu na povrchu fágu,
f) transformaci bakteriálních buněk získanými rekombinantními plasmidy, kultivaci transformovaných bakteriálních buněk a současnou expresi těžkého a lehkého řetězce Fab na částicích filamentosního fágu,
g) amplifikaci fágu nesoucího Fab v bakterii,
h) selekci jednotlivých fágových klonů v několika kolech panorámování na Rhesus pozitivních erytrocytech,
i) izolaci plasmidové DNA ze selektovaných klonů a vystřižení glll genu,
j) transformaci bakteriálních buněk získaným plasmidem, kultivaci transformovaných bakteriálních buněk exprivujících Fab a izolaci Fab fragmentů.
12. Způsob pro selekci rekombinantních polypeptidů schopných tvorby vazebných struktur pro antigen se specificitou pro Rhesus D antigeny a zejména vykazujících reaktivitu s částečnými Rhesus DVI variantami a bez známek reaktivity s erytrocyty Rhesus negativního fenotypu, zejména bez reaktivity proti Rhesus alelám C, c, Eae, vyznačující se tím, že obsahuje následuj ící kroky v postupném pořadí:
a) provedení několika negativních absorpcí na následujících erytrocytech: fenotyp 1 (r'r, Ccddee) ošetřený bromelasou, fenotyp 1 neošetřený bromelasou, fenotyp 2 (ryry, CCddEE) * · · · ·· · · ·« 4» · · · · · ··· • · ♦ · · · · • · · · · · · · · · « • · · · · ···· · » < · · · ·· ošetřený bromelasou a fenotyp 2 neošetřený bromelasou,
b) provedení pozitivní absorpce na DVI+ erytrocytech s nebo bez ošetření bromelasou,
c) určení titru fágu vážícího se na DVI+ erytrocyty,
d) opakování kroků a), b) a c), dokud titr fágu vážícího se na DVI+ erytrocyty nedosáhne uspokojivé hladiny.
13. Způsob podle nároku 12 vyznačuj ící se tím, že rekombinantní polypeptidy schopné tvorby vazebných struktur pro antigen jsou Fab fragmenty.
14. Anti-Rhesus D protilátky mající variabilní regiony těžkého a lehkého řetězce obsahující Rhesus D-specifické CDRl, CDR2 a CDR3 sekvence párů aminokyselinových sekvencí Vh a Vl mající stejná nebo odlišná identifikační čísla podle tabulky uvedené dále:
• · · · ··
| V H | V L | |||||||
| Identi- | Obr. CDR1 | CDR2 | CDR3 | Obr. | CDRl | CDR2 | CDR3 | |
| fikační | páry | páry | páry | páry | páry | páry | ||
| číslo | baží č. | baží č. | baží č. | baží č | baží č | baží č | ||
| LD1-40 | Obr.la | 91-105 | 148-198 | 295-342 | Obr.lb | 64-96 | 142-162 | 259-288 |
| LD1-52 | Obr.2a | 91-105 | 148-198 | 295-342 | Obr.2b | 64-96 | 142-162 | 259-288 |
| LD1-84 | Obr.3a | 91-105 | 148-198 | 295-342 | Obr.3b | 64-96 | 142-162 | 259-285 |
| LD1-110 | Obr.4a | 91-105 | 148-198 | 295-342 | Obr.4b | 64-96 | 142-162 | 259-285 |
| LD1-117 | Obr.5a | 91-105 | 148-198 | 295-345 | Obr.5b | 64-96 | 142-162 | 259-288 |
| LD2-1 | Obr.6a | 91-105 | 148-198 | 295-342 | Obr.6b | 64-99 | 142-165 | 262-294 |
| LD2-4 | Obr ,7a | 91-105 | 148-198 | 295-342 | Obr.7b | 64-96 | 142-162 | 259-282 |
| LD2-5 | Obr.8a | 91-105 | 148-198 | 295-342 | Obr.8b | 64-96 | 142-162 | 259-288 |
| LD2-10 | Obr.9a | 91-105 | 148-198 | 298-345 | Obr.9b | 61-102 | 148-168 | 265-294 |
| LD2-11 | Obr.10a | 91-105 | 148-198 | 295-342 | Obr.10b | 64 - 9 6 | 142-162 | 259-285 |
| LD2-14 | Obr.lla | 91-105 | 148-198 | 295-342 | Obr.11b | 64-96 | 142-162 | 259-285 |
| LD2-17 | Obr.12a | 91-105 | 148-198 | 295-342 | Obr.12b | 64-96 | 142-162 | 259-285 |
| LD2-20 | Obr.13a | 91-105 | 148-198 | 295-342 | Obr.13b | 64-96 | 142-162 | 259-285 |
| LD1-6-17 | Obr.14a | 91-105 | 148-198 | 295-351 | Obr.14b | 64-96 | 142-162 | 259-285 |
| LDl/2£ 7 | Obr.15a | 91-105 | 148-198 | 295-342 | Obr.15b | 64-96 | 142-162 | 259-285 |
| LDl/2- | Obr.16a | 91-105 | 148-198 | 295-342 | Obr.16b | 64-96 | 142-162 | 259-285 |
| -6-33 |
15. Anti-Rhesus D protilátky mající variabilní regiony těžkého a lehkého řetězce obsahující Rhesus D-specifické CDR1, CDR2 a CDR3 sekvence párů aminokyselinových sekvencí Vh a mající stejná identifikační čísla podle tabulky uvedené v nároku 14.
16. Anti-Rhesus D protilátky podle nároku 14 nebo 15, které obsahují páry aminokyselinových sekvencí Vh a mající identifikační čísla podle obrázků, jak jsou uvedeny v tabulce v nároku 14.
17. Anti-Rhesus D protilátky podle nároku 14, 15 nebo 16, kde jsou imunoglobulinové konstantní regiony alespoň jeden z definovaných izotypů IgGl, IgG2, IgG3 nebo IgG4.
18. Způsob pro přípravu kompletních anti-Rhesus D protilátek
podle jakéhokoliv z nároků 14 až 17 vyznačuj ící se tím, že obsahuje postupně kroky:
a) oddělenou amplifikaci členů páru V genového segmentu těžkého řetězce a V genového segmentu lehkého řetězce obsahující Rhesus D-specifické CDRl, CDR2 a CDR3 regiony jak jsou znázorněny na obr. la - 16a a lb - 16b, v příslušném pořadí, z anti-Rhesus D-Fab-kodujícího plasmidu pomocí polymerasové řetězové reakce se specifickými primery,
b) oddělenou přípravu genů pro kompletní těžký řetězec anti-Rhesus D imunoglobulinu a pro kompletní lehký řetězec anti-Rhesus D imunoglobulinu ve vhodných plasmidech obsahujících genové segmenty pro konstantní region imunoglobulinu kódující jeden z lidských τΐ, t2, t3 a t4 těžkých řetězců a pro lidský kappa nebo lambda lehký řetězec a transformaci získaných plasmidů jednotlivě ve vhodných bakteriích E. coli, a
c) současnou transfekci získaných plasmidů do vhodných eukaryotických hostitelských buněk, kultivaci buněk, separaci netransformovaných buněk, klonování kultur, selekci nejlépe produkujícího klonu, jeho použití jako produkční kultury a izolaci kompletních protilátek ze supernatantu buněčné kultury.
19. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden polypeptid podle nároku 1, 2 nebo 3 nebo alespoň jednu anti-Rhesus D protilátku podle jakéhokoliv z nároků 14 až 17, pro profylaxi hemolytické choroby novorozenců, pro léčbu idiopatické trombocytopenické purpury a chybné transfuze Rhesus inkopatibilní krve.
20. Diagnostický prostředek pro Rhesus D typizaci vyznačující se tím, že obsahuje Fab fragmenty
podle nároku 4 nebo anti-Rhesus D protilátky podle jakéhokoliv z nároků 14 až 17.
Claims (2)
- ·· ·· ·· ·· ·· ·· · · · · «··· • · · · ···· • · · · » · ······ • · · · · · ···· 1« ···· ·· ·· 90 GCT TTT ATA TGG TTT GAT GGA AGT AAT AAA GGA TAT GTA GAC TCC GTG 192 Ala Phe Ile Trp Phe Asp Gly Ser Asn Lys Gly Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 AAG GGC CGA TTC ACC ATC TCC CGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTC TAT 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 CTG CAA ATG AAG AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCT GTA TAT TAT TGT 288 Leu Gin Met Lys Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 GCG AGA GAG AAG GCG CTT CGG GGA ATC AGT AGA TAC AAC TAT TAC CTG 336 Ala Arg Glu Lys Ala Leu Arg Gly Ile Ser Arg Tyr Asn Tyr Tyr Leu 100 105 110 GAC GTC TGG GGC AAG GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA 375 Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125
- (2) Informace pro SEQ ID NO: 46: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 125 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: : SEQ ID NO: 45: Gin 1 Val Lys Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Val Val Gin Pro Gly Gly 15 Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Val Ala Ser 25 Gly Phe Thr Phe Arg 30 Ser Tyr Gly Met His 35 Trp Val Arg Gin Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val Ala Phe 50 Ile Trp Phe Asp Gly 55 Ser Asn Lys Gly Tyr Val 60 Asp Ser Val Lys 65 Gly Arg Phe Thr Ile 70 Ser Arg Asp Asn Ser 75 Lys Asn Thr Leu Tyr 80• Μ Μ ·» ·· ·· Μ · · · ·· · · · · * • · · · · # · · · • · I I * · · ·····* • · « · · · · #·# »«Μ »· ···· ·· ·· 91 Leu Gin Met Lys Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys Ala Arg Glu Lys 100 Ala Leu Arg Gly Ile 105 Ser Arg Tyr Asn Tyr 110 Tyr Leu Asp Val Trp 115 Gly Lys Gly Thr Thr 120 Val Thr Val Ser Ser 125 (2) Informace pro SEQ ID NO: 47: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 315 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetická: Ne (iv) Antisense: Ne (v) Typ fragmentu: N-koncový (vi) Původní zdroj: (A) Organismus: Homo sapiens (C) Jednotlivý izolát: Hyperimunní Rhesus D dárce (D) Vývojový stav: Dospělý (E) Haplotyp: Diploidní (G) Typ buňky: Periferní B lymfocyt (vii) Bezprostřední zdroj: (A) Knihovna: cDNA knihovna, LD2 (B) Klon: LD2-17 (viii) Umístění v genomu: (A) Chromosom/segment: Chromosom 2 (B) Pozice v mapě: pil (C) Jednotky: číslo chromosomového proužku (ix) Vlastnosti: (A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 1...315 (D) Jiné informace: /produkt = "Imunoglobulin, Fab" (ix) Vlastnosti: (A) Jméno/klíč: CDR1, CDR2, CDR3 (B) Umístění: Hranice (64...96, 142...162, 259...285) 92 • ·· ·· ·· ·· ·· Μ * · · · · · ···· • · · · ·#··· • I « » · · · ·····» • · # · · · » ·»»·»*« Μ ···· ·· Μ (χι) Popis sekvencerSEQ ID NO: 47: GTG ATG ACC CAG TCT CCA TTC TCC CTG Val 1 Met Thr Gin Ser 5 Pro Phe Ser Leu GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG Val Thr Ile Thr 20 Cys Arg Ala Ser Gin 25 TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGG ACA GCC Trp Tyr Gin 35 Gin Lys Pro Gly Thr 40 Ala GCA TCC AGG TTG CAA AGT GGG GTC CCA Ala Ser 50 Arg Leu Gin Ser Gly 55 Val Pro TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC Ser 65 Gly Thr Asp Phe Thr 70 Leu Thr Ile TTT GCG ACT TAC TAC TGT CAA CAG AGT Phe Ala Thr Tyr Tyr 85 Cys Gin Gin Ser GGC CAA GGG ACC AAG CTG GAA ATC AAA Gly Gin Gly Thr 100 Lys Leu Glu Ile Lys 105 TCT GCA TCT GTA GGA GAC AGA 48 Ser 10 Ala Ser Val Gly Asp 15 Arg AAC ATT AGG AGT TTT TTA AGT 96 Asn Ile Arg Ser Phe 30 Leu Ser CCT AAG CTC CTG ATC TAT GCT 144 Pro Lys Leu Leu 45 Ile Tyr Ala TCA AGG TTC AGT GGC AGT GGG 192 Ser Arg Phe 60 Ser Gly Ser Gly AGC ACT CTG CAA CCT GAA GAT 240 Ser Thr 75 Leu Gin Pro Glu Asp 80 TAC AGT GCC CCT TGG ACG TTC 288 Tyr 90 Ser Ala Pro Trp Thr 95 Phe 315 (2) Informace pro SEQ ID NO: 48: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 105 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární 48 : Ser 10 Ala Ser Val Gly Asp Arg 15 Asn Ile Arg Ser Phe 30 Leu Ser Pro Lys Leu Leu 45 Ile Tyr Ala (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis ! sekvence : SEQ ID NO: Val 1 Met Thr Gin Ser 5 Pro Phe Ser Leu Val Thr Ile Thr 20 Cys Arg Ala Ser Gin 25 Trp Tyr Gin 35 Gin Lys Pro Gly Thr 40 Ala·· ·· ·« • · « ♦ • t · • · · · • · · ·· ···· ·· ·· V · · * • · · · ··· IM • · ·· «· 93 Ala Ser 50 Arg Leu Gin Ser Gly Val 55 Pro Ser Arg Phe 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly 65 Thr Asp Phe Thr 70 Leu Thr Ile Ser Thr 75 Leu Gin Pro Glu Asp 80 Phe Ala Thr Tyr Tyr 85 Cys Gin Gin Ser Tyr 90 Ser Ala Pro Trp Thr 95 Phe Gly Gin Gly Thr 100 Lys Leu Glu Ile Lys 105 (2) Informace pro SEQ ID NO: 49: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 375 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetická: Ne (iv) Antisense: Ne (v) Typ fragmentu: N-koncový (vi) Původní zdroj: (A) Organismus: Homo sapiens (C) Jednotlivý izolát: Hyperimunní Rhesus D dárce (D) Vývojový stav: Dospělý (E) Haplotyp: Diploidní (G) Typ buňky: Periferní B lymfocyt (vii) Bezprostřední zdroj: (A) Knihovna: cDNA knihovna, LD2 (B) Klon: LD2-20 (viii) Umístění v genomu: (A) Chromosom/segment: Chromosom 14 (B) Pozice v mapě: q32.3 (C) Jednotky: číslo chromosomového proužku (ix) Vlastnosti: (A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 1...375 (D) Jiné informace: /produkt = "Imunoglobulin, Fab" 94 ··· ··* (ix) Vlastnosti: (A) Jméno/klíč: CDR1, CDR2, CDR3 (B) Umístění: Hranice (91...105, 148...198, 295...342) (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 49: CAG GTG AAA CTG CTC GAG TCT GGG GGA GGC GTG GTC CAG CCG GGG GGG 48 Gin Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 TCC CTG AGA CTC TCC TGT GTA GCG TCT GGA TTC ACC TCC AGG AGT TAT 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Ser Arg Ser Tyr 20 25 30 GGC ATG CAC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGC AAG GGC CTG GAG TGG GTG 144 Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 50 55 60 GCT TTT ATA TGG TTT GAT GGA AGT AAT AAA GGA TAT GTA GAC TCC GTG 192 Ala Phe Ile Trp Phe Asp Gly Ser Asn Lys Gly Tyr Val Asp Ser Val 65 70 75 80 AAG GGC CGA TTC ACC ATC TCC CGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTC TAT 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 85 90 95 CTG CAA ATG AAG AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCT GTA TAT TAT TGT 288 Leu Gin Met Lys Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 100 105 110 GCG AGA GAG AAG GCG CTT CGG GGA ATC AGT AGA TAC AAC TAT TAC CTG 336 Ala Arg Glu Lys Ala Leu Arg Gly Ile Ser Arg Tyr Asn Tyr Tyr Leu 205 210 215 GAC GTC TGG GGC AAG GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA 375 Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 (2) Informace pro SEQ ID NO: 50: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 125 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein • · 95 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 50: Gin 1 Val Lys Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly Val 10 Val Gin Pro Gly Gly 15 Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Val Ala Ser 25 Gly Phe Thr Ser Arg 30 Ser Tyr Gly Met His 35 Trp Val Arg Gin Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val Ala Phe 50 Ile Trp Phe Asp Gly 55 Ser Asn Lys Gly Tyr Val 60 Asp Ser Val Lys 65 Gly Arg Phe Thr Ile 70 Ser Arg Asp Asn Ser 75 Lys Asn Thr Leu Tyr 80 Leu Gin Met Lys Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys Ala Arg Glu Lys 100 Ala Leu Arg Gly Ile 105 Ser Arg Tyr Asn Tyr 110 Tyr Leu Asp Val Trp 115 Gly Lys Gly Thr Thr 120 Val Thr Val Ser Ser 125 (2) Informace pro SEQ ID NO: 51: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 315 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetická: Ne (iv) Antisense: Ne (v) Typ fragmentu: N-koncový (vi) Původní zdroj: (A) Organismus: Homo sapiens (C) Jednotlivý izolát: Hyperimunní Rhesus D dárce (D) Vývojový stav: Dospělý (E) Haplotyp: Diploidní (G) Typ buňky: Periferní B lymfocyt 96 • ·(vii) Bezprostřední zdroj: (A) Knihovna: cDNA knihovna, LD2 (B) Klon: LD2-20 (viii) Umístění v genomu: (A) Chromosom/segment: Chromosom 2 (B) Pozice v mapě: pil (C) Jednotky: číslo chromosomového proužku (ix) Vlastnosti: (A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 1...315 (D) Jiné informace: /produkt = "Imunoglobulin, Fab" (ix) Vlastnosti: (A) Jméno/klíč: CDR1, CDR2, CDR3 (B) Umístění: Hranice (64...96, 142...162, 259...285) (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 51: GTG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTA GGA GAC AGA 48 Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg 1 5 10 15 GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG AGC ATT AGC AGC TAT TTA AAT 96 Val Thr ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn 20 25 30 TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGG AAA GCC CCT AAG CTC CTG ATC TAT GCT 144 Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala 35 40 45 GCA TCC AGT TTG CAA AGT GGG GTC CCA TCA AGG TTC AGT GGC AGT GGA 192 Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly 50 55 60 TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTG CAA CCT GAA GAT 240 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp 65 70 75 80 TTT GCA ACT TAC TAC TGT CAA CAG AGT TAC AGT ACC CGA TTC ACT TTC 288 Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Ser Thr Arg Phe Thr Phe 85 90 95 GGC CCT GGG ACC AAA GTG GAT ATC AAA 315 Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 « · • · 97 • · • · (2) Informace pro SEQ ID NO: 52: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 105 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 52: Val 1 Met Thr Gin Ser 5 Pro Ser Ser Leu Ser 10 Ala Ser Val Gly Asp 15 Arg Val Thr Ile Thr 20 Cys Arg Ala Ser Gin 25 Ser Ile Ser Ser Tyr 30 Leu Asn Trp Tyr Gin 35 Gin Lys Pro Gly Lys 40 Ala Pro Lys Leu Leu 45 Ile Tyr Ala Ala Ser 50 Ser Leu Gin Ser Gly 55 Val Pro Ser Arg Phe 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly 65 Thr Asp Phe Thr 70 Leu Thr Ile Ser Ser 75 Leu Gin Pro Glu Asp 80 Phe Ala Thr Tyr Tyr 85 Cys Gin Gin Ser Tyr 90 Ser Thr Arg Phe Thr 95 Phe Gly Pro Gly Thr 100 Lys Val Asp Ile Lys 105 (2) Informace pro SEQ ID NO: 53: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 384 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetická: Ne (iv) Antisense: Ne (v) Typ fragmentu: N-koncový (vi) Původní zdroj: (A) Organismus: Homo sapiens (C) Jednotlivý izolát: Hyperimunní Rhesus D dárce (D) Vývojový stav: Dospělý (E) Haplotyp: Diploidní (G) Typ buňky: Periferní B lymfocyt (vii) Bezprostřední zdroj: (A) Knihovna: cDNA knihovna, LD1 (B) Klon: LD1-6-17 (viii) Umístění v genomu: (A) Chromosom/segment: Chromosom 14 (B) Pozice v mapě: q32.3 (C) Jednotky: číslo chromosomového proužku (ix) Vlastnosti: (A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 1...384 (D) Jiné informace: /produkt = "Imunoglobulin, Fab" (ix) Vlastnosti: (A) Jméno/klíč: CDR1, CDR2, CDR3 (B) Umístění: Hranice (91...105, 148...198, 295...351) (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 53: CAG GTG AAA CTG CTC GAG TCT GGG GGA GGC GTG GTC CAG CCT GGG AGG 48 Gin 1 Val Lys Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Val Val Gin Pro Gly 15 Arg TCC CTG AGA CTT TCC TGT GCA GCG TCT GGA TTT ACC TTC AGT AGC TAT 96 Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Thr Phe Ser 30 Ser Tyr GGC ATG CAC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGC AAG GGG CTG GAG TGG GTG 144 Gly Met His 35 Trp Val Arg Gin Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val GCA GAT ATA TGG TTT GAT GGA GGT AAT AAA CAT TAT GCA GAC TTC GTG 192 Ala Asp 50 Ile Trp Phe Asp Gly 55 Gly Asn Lys His Tyr 60 Ala Asp Phe Val AAG GGC CGA TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG GTG TAT 240 Lys 65 Gly Arg Phe Thr Ile 70 Ser Arg Asp Asn Ser 75 Lys Asn Thr Val Tyr 80 CTA CAA ATG AAC AGC CTG AGA GTC GAG GAC ACG GCT GTG TAT TAC TGT 288 Leu Gin Met Asn Ser 85 Leu Arg Val Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys • · • · 99 t · • · · · GCG AGG GAT TAC TAT AGC GTT ACT AAG AAA CTC AGA CTC CAC TAC TAC 336 Ala Arg Asp Tyr 100 Tyr Ser Val Thr Lys 105 Lys Leu Arg Leu His 110 Tyr Tyr TAC TAC ATG GAC GTC TGG GGC AAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA 384 Tyr Tyr Met 220 Asp Val Trp Gly Lys 225 Gly Thr Thr Val Thr 230 Val Ser Ser (2) Informace pro SEQ ID NO: 54: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 128 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 54: Gin 1 Val Lys Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly Val 10 Val Gin Pro Gly Arg 15 Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser Gly 25 Phe Thr Phe Ser 30 Ser Tyr Gly Met His 35 Trp Val Arg Gin Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val Ala Asp 50 Ile Trp Phe Asp Gly 55 Gly Asn Lys His Tyr Ala 60 Asp Phe Val Lys 65 Gly Arg Phe Thr Ile 70 Ser Arg Asp Asn Ser 75 Lys Asn Thr Val Tyr 80 Leu Gin Met Asn Ser 85 Leu Arg Val Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys Ala Arg Asp Tyr 100 Tyr Ser Val Thr Lys Lys 105 Leu Arg Leu His 110 Tyr Tyr Tyr Tyr Met 115 Asp Val Trp Gly Lys 120 Gly Thr Thr Val Thr 125 Val Ser Ser (2) Informace pro SEQ ID NO: 55: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 315 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý ·· ·· 100(D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetická: Ne (iv) Antisense: Ne (v) Typ fragmentu: N-koncový (vi) Původní zdroj: (A) Organismus: Homo sapiens (C) Jednotlivý izolát: Hyperimunní Rhesus D dárce (D) Vývojový stav: Dospělý (E) Haplotyp: Diploidní (G) Typ buňky: Periferní B lymfocyt (vii) Bezprostřední zdroj: (A) Knihovna: cDNA knihovna, LD1 (B) Klon: LD1-6-17 (viii) Umístění v genomu: (A) Chromosom/segment: Chromosom 2 (B) Pozice v mapě: pil (C) Jednotky: číslo chromosomového proužku (ix) Vlastnosti: (A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 1...315 (D) Jiné informace: /produkt = "Imunoglobulin, Fab" (ix) Vlastnosti: (A) Jméno/klíč: CDR1, CDR2, CDR3 (B) Umístění: Hranice (64...96, 142...162, 259...285) (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 55: GTG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTA GGA GAC AGA Val 1 Met Thr Gin Ser 5 Pro Ser Ser Leu Ser 10 Ala Ser Val Gly Asp 15 Arg GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG GGC ATT AGA AAT GAT TTA ACC Val Thr Ile Thr 20 Cys Arg Ala Ser Gin 25 Gly Ile Arg Asn Asp 30 Leu Thr TGG TAT CAG CAA AAA CCA GGG AAA GCC CCT AAG CTC CTG ATC TAT GCT Trp Tyr Gin 35 Gin Lys Pro Gly Lys 40 Ala Pro Lys Leu Leu 45 Ile Tyr Ala 48 96 144 101 • ·• · GCA TCC AAT TTA CAA AGT GGG GTC CCA TCA AGG TTC AGC GGC AGT GGA 192 Ala Ser Asn Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly 50 55 60 TCT GGC ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGC CTG CAG CCT GAA GAT 240 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp 65 70 75 80 TTT GCA ACT TAT TAC TGT CTA CAA GAT AAC AAT TTC CCG TAC ACT TTT 288 Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Asp Asn Asn Phe Pro Tyr Thr Phe 85 90 95 GGC CAG GGG ACC AAG CTG GAG ATC AAA 315 Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 (2) Informace pro SEQ ID NO: 56: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 105 aminokyselin (B) Typ: : aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence : SEQ ID NO: 56 : Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg 1 5 10 15 Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly Ile Arg Asn Asp Leu Thr 20 25 30 Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala 35 40 45 Ala Ser Asn Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp 65 70 75 80 Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Asp Asn Asn Phe Pro Tyr Thr Phe 85 90 95 Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 102 • · (2) Informace pro SEQ ID NO: 57: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 375 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetická: Ne (iv) Antisense: Ne (v) Typ fragmentu: N-koncový (vi) Původní zdroj: (A) Organismus: Homo sapiens (C) Jednotlivý izolát: Hyperimunní Rhesus D dárce (D) Vývojový stav: Dospělý (E) Haplotyp: Diploidní (G) Typ buňky: Periferní B lymfocyt (vii) Bezprostřední zdroj: (A) Knihovna: cDNA knihovna, LD1 a LD2 (B) Klon: LD1/2-6-3 (viii) Umístění v genomu: (A) Chromosom/segment: Chromosom 14 (B) Pozice v mapě: q32.3 (C) Jednotky: číslo chromosomového proužku (ix) Vlastnosti: (A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 1...375 (D) Jiné informace: /produkt = "Imunoglobulin, Fab" (ix) Vlastnosti: (A) Jméno/klíč: CDR1, CDR2, CDR3 (B) Umístění: Hranice (91...105, 148...198, 295...342) (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 57: CAG GTG AAA CTG CTC GAG TCT GGG GGA GGC GTG GTC CAG CCG GGG GGG 48 Gin Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15 TCC CTG AGA GTC GCC TGT GTA GCG TCT GGA TTC ACC TTC AGG AAT TTT Ser Leu Arg Val Ala Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Phe 20 25 30 96 103 GGC ATG CAC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGC AAG GGG CTG GAG TGG GTG 144 Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 GCT TTT ATT TGG TTT GAT GCA AGT AAT AAA GGA TAT GGA GAC TCC GTT 192 Ala Phe Ile Trp Phe Asp Ala Ser Asn Lys Gly Tyr Gly Asp Ser Val 50 55 60 AAG GGC CGA TTC ACC GTC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTC TAT 240 Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 CTG CAA ATG AAC GGC CTG AGA GCC GAA GAC ACG GCT GTA TAT TAT TGT 288 Leu Gin Met Asn Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 GCG AGA GAG AAG GCG GTT CGG GGA ATT AGT AGA TAC AAC TAC TAC ATG 336 Ala Arg Glu Lys Ala Val Arg Gly Ile Ser Arg Tyr Asn Tyr Tyr Met 100 105 110 GAC GTC TGG GGC AAG GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA 375 Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 (2) Informace pro SEQ ID NO: 58: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 125 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 58: Gin 1 Val Lys Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly Val 10 Val Gin Pro Gly Gly 15 Ser Leu Arg Val 20 Ala Cys Val Ala Ser Gly 25 Phe Thr Phe Arg 30 Asn Phe Gly Met His 35 Trp Val Arg Gin Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val Ala Phe 50 Ile Trp Phe Asp Ala 55 Ser Asn Lys Gly Tyr Gly Asp 60 Ser Val Lys 65 Gly Arg Phe Thr Val 70 Ser Arg Asp Asn Ser 75 Lys Asn Thr Leu Tyr 80 Tyr Cys 95 Tyr Met Leu Gin Met Asn Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 Ala Arg Glu Lys Ala Val Arg Gly Ile Ser Arg Tyr Asn Tyr 100 105 110 Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 (2) Informace pro SEQ ID NO: 59: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 315 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetická: Ne (iv) Antisense: Ne (v) Typ fragmentu: N-koncový (vi) Původní zdroj: (A) Organismus: Homo sapiens (C) Jednotlivý izolát: Hyperimunní Rhesus D dárce (D) Vývojový stav: Dospělý (E) Haplotyp: Diploidní (G) Typ buňky: Periferní B lymfocyt (vii) Bezprostřední zdroj: (A) Knihovna: cDNA knihovna, LDl a LD2 (B) Klon: LDl/2-6-3 {viii) Umístění v genomu: (A) Chromosom/segment: Chromosom 2 (B) Pozice v mapě: pil (C) Jednotky: číslo chromosomového proužku (ix) Vlastnosti: (A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 1...315 (D) Jiné informace: /produkt = "Imunoglobulin, Fab" (ix) Vlastnosti: (A) Jméno/klíč: CDR1, CDR2, CDR3 (B) Umístění: Hranice (64...96, 142...162, 259...285) 105 • · • · 105 • · • · • · • · · · · · ♦ · · ··· ··· • · · · • · ···· Μ ·· (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 59: GTG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTA GGA GAC AGA 48 Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg 1 5 10 15 GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG AGC ATT ATC AGA TAT TTA AAT 96 Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile Ile Arg Tyr Leu Asn 20 25 30 TGG TAT CAG CAC AAA CCA GGG AAA GCC CCT AAG CTC CTG ATC CAT ACT 144 Trp Tyr Gin His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile His Thr 35 40 45 GCA TCC AGT TTG CAA AGT GGG GTC CCG TCA AGG TTC AGT GGC AGT GTA 192 Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Val 50 55 60 TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTG CAA CCT GAA GAT 240 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp 65 70 75 80 TTT GCA ACT TAC TAC TGT CAA CAG AGT TAC ACT ACC CCG TAC ACT TTT 288 Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Thr Thr Pro Tyr Thr Phe 85 90 95 GGC CAG GGG ACC AAG CTG CAG ATC AAA 315 Gly Gin Gly Thr Lys Leu Gin Ile Lys 100 105 (2) Informace pro SEQ ID NO: 60: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 105 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 60: Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg 15 10 15 Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile Ile Arg Tyr Leu Asn 20 25 30 Trp Tyr Gin His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile His Thr 35 40 45 Ala Ser 50 Ser Leu Gin Ser Gly Val 55 Pro Ser Arg Phe 60 Ser Gly Ser Val Ser Gly 65 Thr Asp Phe Thr 70 Leu Thr Ile Ser Ser 75 Leu Gin Pro Glu Asp 80 Phe Ala Thr Tyr Tyr 85 Cys Gin Gin Ser Tyr 90 Thr Thr Pro Tyr Thr 95 Phe Gly Gin Gly Thr 100 Lys Leu Gin Ile Lys 105 (2) Informace pro SEQ ID NO: 61: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 375 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetická: Ne (iv) Antisense: Ne (v) Typ fragmentu: N-koncový (vi) Původní zdroj: (A) Organismus: Homo sapiens (C) Jednotlivý izolát: Hyperimunní Rhesus D dárce (D) Vývojový stav: Dospělý (E) Haplotyp: Diploidní (G) Typ buňky: Periferní B lymfocyt (vii) Bezprostřední zdroj: (A) Knihovna: cDNA knihovna, LD1 a LD2 (B) Klon: LDl/2-2-33 (viii) Umístění v genomu: (A) Chromosom/segment: Chromosom 14 (B) Pozice v mapě: q32.3 (C) Jednotky: číslo chromosomového proužku (ix) Vlastnosti: (A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 1...375 (D) Jiné informace: /produkt = "Imunoglobulin, Fab" (ix) Vlastnosti: (A) Jméno/klíč: CDR1, CDR2, CDR3 (B) Umístění: Hranice (91...105, 148...198, 295...342) (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 61: CAG GTG AAA CTG CTC GAG TCT GGG GGA GGC GTG GTC CAG CCG GGG GGG 48 Gin Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 TCC CTG AGA GTC GCC TGT GTA GCG TCT GGA TTC ACC TTC AGG AAT TTT 96 Ser Leu Arg Val Ala Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Phe 20 25 30 GGC ATG CAC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGC AAG GGG CTG GAG TGG GTG 144 Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 GCT TTT ATT TGG TTT GAT GCA AGT AAT AAA GGA TAT GGA GAC TCC GTT 192 Ala Phe Ile Trp Phe Asp Ala Ser Asn Lys Gly Tyr Gly Asp Ser Val 50 55 60 AAG GGC CGA TTC ACC GTC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTC TAT 240 Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 CTG CAA ATG AAC GGC CTG AGA GCC GAA GAC ACG GCT GTA TAT TAT TGT 288 Leu Gin Met Asn Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 GCG AGA GAG AAG GCG GTT CGG GGA ATT AGT AGA TAC AAC TAC TAC ATG 336 Ala Arg Glu Lys Ala Val Arg Gly Ile Ser Arg Tyr Asn Tyr Tyr Met 100 105 110 GAC GTC TGG GGC AAG GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA 375 Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 (2) Informace pro SEQ ID NO: 62: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 125 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 62: Gin Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15 Ser Leu Arg Val Ala Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Phe 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Phe Ile Trp Phe Asp Ala Ser Asn Lys Gly Tyr Gly Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Asn Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Lys Ala Val Arg Gly Ile Ser Arg Tyr Asn Tyr Tyr Met 100 105 110 Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 (2) Informace pro SEQ ID NO: 63: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 315 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetická: Ne (iv) Antisense: Ne (v) Typ fragmentu: N-koncový (vi) Původní zdroj: (A) Organismus: Homo sapiens (C) Jednotlivý izolát: Hyperimunní Rhesus D dárce (D) Vývojový stav: Dospělý (E) Haplotyp: Diploidní (G) Typ buňky: Periferní B lymfocyt (vii) Bezprostřední zdroj: (vii) Bezprostřední zdroj: (A) Knihovna: cDNA knihovna, LD1 a LD2 (B) Klon: LD1/2-6-33 (viii) Umístění v genomu: (A) Chromosom/segment: Chromosom 2 (B) Pozice v mapě: pil (C) Jednotky: číslo chromosomového proužku (ix) Vlastnosti: (A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 1...375 (D) Jiné informace: /produkt = "Imunoglobulin, Fab" (ix) Vlastnosti: (A) Jméno/klíč: CDR1, CDR2, CDR3 (B) Umístění: Hranice (64..96, 142..162, 259..285) (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 63: (jTG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TTC CTG TCT GCA TCT GTA GGA GAC AGA 48 Kal Met Thr Gin Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg 1 5 10 15 oTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG AGC ATT ATC AGA TAT TTA AAT 96 Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile Ile Arg Tyr Leu Asn 20 25 30 TGG TAT CAG CAC AAA CCA GGG AAA GCC CCT AAG CTC CTG ATC CAT GCT 144 Trp Tyr Gin His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile His Ala 35 40 45 SCA TCC AGT TTG CAA AGT GGG GTC CCG TCA AGG TTC AGT GGC AGT GTA 192 Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Val 50 55 60 TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTG CAA CCT GAA GAT 240 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp 65 70 75 80 TTT GCA ACT TAC TAC TGT CAA CAG AGT TAC ACT ACC CCG TAC ACT TTT 288 Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Thr Thr Pro Tyr Thr Phe 85 90 95 3GC CAG GGG ACC AAG CTG CAG ATC AAA 315 Gly Gin Gly Thr Lys Leu Gin Ile Lys 100 105 110·« ·« Μ • · · · · · • · · · • · · · · 9 9 9 9 9 99 9 99 99·» m 99 99 9 9 9 · 9 9 9 9 999 999 9 9 99 99 (2) Informace pro SEQ ID NO: 64: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 105 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 64: Val 1 Met Thr Gin Ser 5 Pro Ser Phe Leu Ser 10 Ala Ser Val Gly Asp Arg 15 Val Thr Ile Thr 20 Cys Arg Ala Ser Gin 25 Ser Ile Ile Arg Tyr 30 Leu Asn Trp Tyr Gin 35 His Lys Pro Gly Lys 40 Ala Pro Lys Leu Leu 45 Ile His Ala Ala Ser 50 Ser Leu Gin Ser Gly 55 Val Pro Ser Arg Phe 60 Ser Gly Ser Val Ser Gly 65 Thr Asp Phe Thr 70 Leu Thr Ile Ser Ser 75 Leu Gin Pro Glu Asp 80 Phe Ala Thr Tyr Tyr 85 Cys Gin Gin Ser Tyr Thr 90 Thr Pro Tyr Thr 95 Phe Gly Gin Gly Thr 100 Lys Leu Gin Ile Lys 105
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP96810421 | 1996-06-24 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ395998A3 true CZ395998A3 (cs) | 1999-05-12 |
| CZ296807B6 CZ296807B6 (cs) | 2006-06-14 |
Family
ID=8225636
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ0395998A CZ296807B6 (cs) | 1996-06-24 | 1997-06-20 | Polypeptidy schopné tvorby vazebných struktur proantigen se specificitou pro Rhesus D antigeny, DNA kódující takové polypeptidy a zpusob jejich prípravy a pouzití |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US7038020B1 (cs) |
| EP (1) | EP0920509B1 (cs) |
| JP (1) | JP3841360B2 (cs) |
| KR (1) | KR100361449B1 (cs) |
| AT (1) | ATE272116T1 (cs) |
| AU (1) | AU722127B2 (cs) |
| BG (1) | BG64534B1 (cs) |
| BR (1) | BR9709958A (cs) |
| CA (1) | CA2258494C (cs) |
| CZ (1) | CZ296807B6 (cs) |
| DE (1) | DE69730031T2 (cs) |
| DK (1) | DK0920509T3 (cs) |
| ES (1) | ES2224255T3 (cs) |
| HU (1) | HUP9902605A3 (cs) |
| IL (1) | IL127595A (cs) |
| IS (1) | IS2220B (cs) |
| NO (1) | NO327947B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ333329A (cs) |
| PL (1) | PL186019B1 (cs) |
| RU (1) | RU2204602C2 (cs) |
| SK (1) | SK284879B6 (cs) |
| TR (1) | TR199802692T2 (cs) |
| WO (1) | WO1997049809A1 (cs) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU1631000A (en) * | 1998-11-19 | 2000-06-05 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Immunoglobulin superfamily proteins |
| EP1106625A1 (en) * | 1999-11-17 | 2001-06-13 | ZLB Bioplasma AG | Rhesus D specific peptide sequences |
| FR2807767B1 (fr) | 2000-04-12 | 2005-01-14 | Lab Francais Du Fractionnement | Anticorps monoclonaux anti-d |
| US20040029113A1 (en) | 2000-04-17 | 2004-02-12 | Ladner Robert C. | Novel methods of constructing libraries of genetic packages that collectively display the members of a diverse family of peptides, polypeptides or proteins |
| US8288322B2 (en) | 2000-04-17 | 2012-10-16 | Dyax Corp. | Methods of constructing libraries comprising displayed and/or expressed members of a diverse family of peptides, polypeptides or proteins and the novel libraries |
| AU2002226049A1 (en) * | 2000-12-05 | 2002-06-18 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Engineered plasmids and their use for in situ production of genes |
| PT2316940E (pt) | 2000-12-18 | 2013-10-16 | Dyax Corp | Bibliotecas orientadas de pacotes genéticos |
| AU2016225923B2 (en) * | 2001-04-17 | 2018-07-05 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Novel Methods of Constructing Libraries Comprising Displayed and/or Expressed Members of a Diverse Family of Peptides, Polypeptides or Proteins and the Novel Libraries |
| RU2209434C1 (ru) * | 2001-11-15 | 2003-07-27 | Российский центр судебно-медицинской экспертизы Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ получения резус-пептидов анти-d, специфически выявляющих антиген rhd в следах крови и выделений |
| US20040067532A1 (en) | 2002-08-12 | 2004-04-08 | Genetastix Corporation | High throughput generation and affinity maturation of humanized antibody |
| DK2053408T3 (da) | 2004-07-20 | 2012-06-04 | Symphogen As | Fremgangsmåde til strukturel karakterisering af et rekombinant polyklonalt protein eller en polyklonal cellelinje |
| EP1967529A1 (en) * | 2004-07-20 | 2008-09-10 | Symphogen A/S | Anti-rhesus D recombinant polyclonal antibody and methods of manufacture |
| GB0706558D0 (en) * | 2007-04-03 | 2007-05-09 | Common Services Agency For The | Diagnostic assay |
| CN101855242B (zh) | 2007-09-14 | 2014-07-30 | 阿迪马布有限责任公司 | 合理设计的合成抗体文库及其用途 |
| US8877688B2 (en) | 2007-09-14 | 2014-11-04 | Adimab, Llc | Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor |
| US12529164B2 (en) | 2007-09-14 | 2026-01-20 | Adimab, Llc | Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor |
| US20090093004A1 (en) | 2007-10-04 | 2009-04-09 | Symphogen A/S | Potency assay |
| WO2009114815A1 (en) | 2008-03-13 | 2009-09-17 | Dyax Corp | Libraries of genetic packages comprising novel hc cdr3 designs |
| AU2009240481B2 (en) | 2008-04-24 | 2015-07-30 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Libraries of genetic packages comprising novel HC CDR1, CDR2, and CDR3 and novel LC CDR1, CDR2, and CDR3 designs |
| DK2593594T3 (en) | 2010-07-16 | 2017-12-11 | Adimab Llc | ANTIBODY LIBRARIES |
| JP2015535005A (ja) * | 2012-11-06 | 2015-12-07 | メディミューン，エルエルシー | 抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ＰｓｌおよびＰｃｒＶ結合分子を用いた併用治療 |
| AU2018350372C9 (en) * | 2017-10-20 | 2025-06-05 | Csl Limited | Method |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2127434A (en) | 1982-09-17 | 1984-04-11 | Univ London | A human monoclonal antibody against Rhesus D antigen |
| GB8722018D0 (en) * | 1987-09-18 | 1987-10-28 | Central Blood Lab Authority | Human anti-rh(d)monoclonal antibodies |
| GB8925590D0 (en) * | 1989-11-13 | 1990-01-04 | Central Blood Lab Authority | Monoclonal antibodies |
-
1997
- 1997-06-20 JP JP50232398A patent/JP3841360B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-20 BR BR9709958A patent/BR9709958A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-06-20 NZ NZ333329A patent/NZ333329A/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-06-20 EP EP97929244A patent/EP0920509B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-20 TR TR1998/02692T patent/TR199802692T2/xx unknown
- 1997-06-20 DE DE69730031T patent/DE69730031T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-20 SK SK1761-98A patent/SK284879B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1997-06-20 KR KR10-1998-0710975A patent/KR100361449B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1997-06-20 HU HU9902605A patent/HUP9902605A3/hu unknown
- 1997-06-20 DK DK97929244T patent/DK0920509T3/da active
- 1997-06-20 ES ES97929244T patent/ES2224255T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-20 CA CA002258494A patent/CA2258494C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-06-20 AU AU33423/97A patent/AU722127B2/en not_active Expired
- 1997-06-20 PL PL97330794A patent/PL186019B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1997-06-20 US US09/147,443 patent/US7038020B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-06-20 AT AT97929244T patent/ATE272116T1/de active
- 1997-06-20 IL IL12759597A patent/IL127595A/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-06-20 WO PCT/EP1997/003253 patent/WO1997049809A1/en not_active Ceased
- 1997-06-20 CZ CZ0395998A patent/CZ296807B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-06-20 RU RU99101121/13A patent/RU2204602C2/ru not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-12-11 IS IS4922A patent/IS2220B/is unknown
- 1998-12-15 BG BG103016A patent/BG64534B1/bg unknown
- 1998-12-23 NO NO19986088A patent/NO327947B1/no not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-06-20 US US11/155,775 patent/US7399471B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2006
- 2006-01-18 US US11/333,197 patent/US7429647B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ395998A3 (cs) | Polypeptidy schopné tvorby vazebných struktur pro antigen se specificitou pro Rhesus D antigeny, DNA kodující takové polypeptidy a způsob pro jejich přípravu a použití | |
| JP6827021B2 (ja) | 単一抗原抗ｐｄ−ｌ１およびｐｄ−ｌ２二重結合抗体およびその使用方法 | |
| Ghiotto et al. | Remarkably similar antigen receptors among a subset of patients with chronic lymphocytic leukemia | |
| CN109414455B (zh) | Bcma结合分子及其使用方法 | |
| Bos et al. | Monoclonal immunoglobulin A derived from peritoneal B cells is encoded by both germ line and somatically mutated VH genes and is reactive with commensal bacteria | |
| CN103717619B (zh) | 治疗发炎及自体免疫疾病之抗-kir抗体 | |
| TWI373343B (en) | Antibodies that bind human interleukin-18 and methods of making and using | |
| AU634186B2 (en) | Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors | |
| US20030040605A1 (en) | Rh(D)-binding proteins and magnetically activated cell sorting method for production thereof | |
| HU228845B1 (en) | Improved anti-ige antibodies and method of improving polypeptides | |
| US20130267688A1 (en) | Novel antibody structures derived from human germline sequences | |
| JP2002522063A (ja) | 増加した血清半減期を有する改変された分子の生成 | |
| CZ361499A3 (cs) | Nový způsob přípravy antigenních receptorů a jejich použití | |
| JP2001513652A (ja) | 抗−ｇｐｉｉｂ／ｉｉｉａ組み換え抗体 | |
| RU99101121A (ru) | Полипептиды, способные к образованию антигенсвязывающих структур со специфичностью к резус-d-антигенам, днк, кодирующая их, способы их получения и применение | |
| CN102272160A (zh) | 抗rhd单克隆抗体 | |
| Andersen et al. | Extensive restrictions in the VH sequence usage of the human antibody response against the Rhesus D antigen | |
| Rijkers et al. | Antibody diversity and B cell-mediated immunity | |
| OYu et al. | Restricted V gene repertoire in the secondary response to insulin in young BALB/c mice | |
| Sutton et al. | IgE Antibodies: From Structure to Function and | |
| TW201012477A (en) | Treatment of thrombocytopenia | |
| Corley | Antibodies | |
| Rosenberg | Murine hybrid hybridomas provide excellent models for the study of immunoglobulin assembly, structure, and function | |
| Bankers-Fulbright et al. | Immunoglobulin Structure | |
| MXPA99008621A (es) | Peptidos de union a ctla-4, inmunoterapeuticos |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20120620 |