[go: up one dir, main page]

SK16702000A3 - Zlúčeniny na liečenie sexuálnej dysfunkcie u žien - Google Patents

Zlúčeniny na liečenie sexuálnej dysfunkcie u žien Download PDF

Info

Publication number
SK16702000A3
SK16702000A3 SK1670-2000A SK16702000A SK16702000A3 SK 16702000 A3 SK16702000 A3 SK 16702000A3 SK 16702000 A SK16702000 A SK 16702000A SK 16702000 A3 SK16702000 A3 SK 16702000A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
agent
pde
camp
hydrolyzing
fsd
Prior art date
Application number
SK1670-2000A
Other languages
English (en)
Inventor
Graham Nigel Maw
Christopher Peter Wayman
Original Assignee
Pfizer Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB9926437A external-priority patent/GB9926437D0/en
Priority claimed from GB0004021A external-priority patent/GB0004021D0/en
Priority claimed from GB0013001A external-priority patent/GB0013001D0/en
Priority claimed from GB0016563A external-priority patent/GB0016563D0/en
Priority claimed from GB0017141A external-priority patent/GB0017141D0/en
Application filed by Pfizer Inc. filed Critical Pfizer Inc.
Publication of SK16702000A3 publication Critical patent/SK16702000A3/sk

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4402—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof only substituted in position 2, e.g. pheniramine, bisacodyl
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/192—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having aromatic groups, e.g. sulindac, 2-aryl-propionic acids, ethacrynic acid 
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/4015—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. piracetam, ethosuximide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4412—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/4985—Pyrazines or piperazines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A61K31/52—Purines, e.g. adenine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/55—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/02—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for disorders of the vagina
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/12—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for climacteric disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/24—Drugs for disorders of the endocrine system of the sex hormones
    • A61P5/30—Oestrogens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/689—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to pregnancy or the gonads
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/107—Rabbit
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Biophysics (AREA)

Description

Zlúčeniny na liečenie sexuálnej dysfunkcie u žien
Oblasť techniky
Vynález sa týka farmaceutika, ktoré je užitočné pri liečení sexuálnych dysfunkcií u žien (FSD), predovšetkým poruchy sexuálnej vzrušivosti u žien (FSAD).
Ďalej sa vynález týka spôsobu liečenia FSD, predovšetkým FSAD.
Vynález sa tiež týka skúšok, ktorými je možné stanoviť zlúčeniny užitočné pri liečení FSD, predovšetkým FSAD.
Zoznam skratiek, ktoré sa používajú v nasledujúcom texte je zaradený pred patentovými nárokmi.
Doterajší stav techniky
Fáza vzrušenia pri sexuálnej odpovedi u žien nie je od fázy túžby dobre odlíšitelná, kým nedôjde k fyziologickým zmenám vo vagíne a klitorise a tiež v iných pohlavných orgánoch. Sexuálne vzrušenie a rozkoš sú sprevádzané kombináciou vaskulárnych a neuromuskulárnych procesov, ktoré vedú k prekrveniu klitorisu, ohanbovýjpyskov a stien vagíny, zvýšenej lubrikácii vagíny a dilatácii vaginálneho lúmenu (Levin, 1980; Ottesen, 1983; Levin, 1991; Levin 1992; Sjoberg, 1992; Wagner, 1992; Schiavi et al., 1995; Masters et al., 1996; Bergman et al., 1999).
Prekrvenie vagíny umožní, aby došlo k transsudácii, a tento proces je zodpovedný za zvýšenú lubrikäciu vagíny. Transsudácia umožní priestup plazmy cez epitel na povrch vagíny. Hnacou silou tohto procesu je zvýšené prekrvenie kapilárneho lôžka vagíny počas stavu vzrušenia. Prekrvenie tiež vedie k predĺženiu vagíny a zväčšeniu priemeru jej lúmenu, • · ···· • ·· · • · • ···
• · predovšetkým v distálnych 2/3 vaginálneho kanálu. Dilatácia vaginálneho lúmenu je vyvolaná kombináciou relaxácie hladkého svalstva steny a relaxáciou kostrového svalstva panvového dna. Predpokladá sa, že niektoré sexuálne bolestivé poruchy, ako je vaginizmus, sú aspoň sčasti vyvolané neadekvátnou relaxáciou, ktorá zabraňuje dilatácii vagíny; ešte je nutné overiť, či ide v prvom rade o problém hladkého alebo kostrového svalstva (Levin, 1980; Ottesen, 1983; Levin, 1991; Levin 1992; Sjoberg, 1992; Wagner, 1992; Schiavi et al., 1995; Master et al., 1996; Bergman et al., 1999).
Vaskulatúra a mikrovaskulatúra vagíny je inervovaná nervmi obsahujúcimi neuropeptidy a iné potenciálne neurotransmitery. Ako ich príklady je možné uviesť peptid so vzťahom ku kalcitonínovému génu (CGRP), neuropeptid Y (NPY), oxid dusnatý syntázu (NOS), látku P a vazoaktívny intestinálny peptid (VIP) (Hoyle et al., 1996). Peptidy, ktoré sú prítomné v klitorise sú diskutované dalej. Oxid dusnatý syntáza, ktorá je často lokalizovaná spolu s VIP vykazuje vyššiu expresiu, imunologický, v hlbokých tepnách a žilách, a nie v cievach propria (Hoyle et al., 1996).
Sexuálna dysfunkcia u žien
Je známe, že niektorí jedinci môžu trpieť ženskými sexuálnymi dysfunkciami (FSD).
FSD je možné najlepšie definovať ako obťažné dosahovanie sexuálneho uspokojenia alebo neschopnosť jeho dosiahnutia. FSD je súhrnný pojem pre rôzne ženské sexuálne poruchy (Leiblum, 1988, Berman et al., 1999). Žena môže trpieť nedostatkom libida, obťažným dosiahnutím vzrušenia alebo orgazmu, bolesťou pri styku alebo kombináciou týchto problémov. FSD môže vyvolávať niekolko typov chorôb, liečiv, poranení alebo psychologických problémov.
• ·
0· · · • · · · • ···· · · • · · ·· · ·
Štúdie zaoberajúce sa sexuálnymi dysfunkciami pri pároch ukázali, že až 76 % žien si sťažuje na sexuálne dysfunkcie a 30 až 50 % žien v USA zažíva FSD.
Ako podtypy FSD je možné uviesť znížené libido, poruchu ženskej sexuálnej vzrušivosti, poruchu orgazmu a porušené libido.
Vyvíjané liečenia sú zamerané na liečenie špecifických podtypov FSD, prevážne porúch libida a vzrušivosti.
Kategórie FSD je možné najlepšie definovať ich priradením k fázam normálnej ženskej sexuálnej odpovedi: túžbe, vzrušeniu a orgazmu (Leiblum 1998). Túha či libido sú pohonom pre sexuálne správanie a jeho prejavy sú často sexuálne predstavy v prítomnosti zainteresovaného partnera alebo pri vystavení iným erotickým stimulom. Oproti tomu, sexuálne vzrušenie predstavuje vaskulárnu reakciu na sexuálnu stimuláciu, ktorej dôležitou zložkou je lubrikácia a predĺženie vagíny. Sexuálne vzrušenie je teda oproti sexuálnej túžbe spojené s genitálnym prekrvením (napríklad vagíny a klitorisu), a nie nezbytne sa senzitivitou. Orgazmus predstavuje uvoínenie sexuálnej tenzie, ktorá kulminuje počas vzrušenia. FSD sa teda zvyčajne vyskytuje u žien, ktoré neadekvátne alebo neuspokojivo reagujú v ktorejkoívek z týchto fáz, zvyčajne vo fáze túžby, vzrušenia alebo orgazmu. Ako kategórie FSD je možné uviesť znížené libido, poruchu sexuálnej vzrušivosti, orgastickú poruchu a bolestivé sexuálne poruchy.
Nízke libido majú ženy, ktoré po sexu netúžia, alebo túžia iba málo, a nemajú alebo takmer nemajú žiadne sexuálne predstavy alebo fantázie. Tento typ FSD môže byt vyvolaný nízkymi hladinami testosterónu, bud kvôli prirodzenej alebo chirurgicky navodenej menopauze. Ako iné pri·· ···· • · ···· · · ·· · · • · · · • · · • · · • · · ·· ···· činy je možné uviesť choroby, medikáciu, únavu, depresiu a úzkosť.
Pre poruchu sexuálnej vzrušivosti u žien (FSAD) je charakteristická neadekvátna odpoveď genitálií na sexuálnu stimuláciu. Nedochádza k prekrveniu genitálií (napríklad vagíny a/alebo klitorisu), ktoré je príznačné pre normálne sexuálne vzrušenie. Steny vagíny sú málo lubrikované, takže styk je bolestivý. Dosiahnutie orgazmu je sťažené. Porucha vzrušivosti môže byť vyvolaná zníženou hladinou estrogénu pri menopauze alebo po pôrode a počas laktácie, a tiež ochorením, ktoré tiež postihuje vaskulatúru, ako je diabetes a ateroskleróza. Iné príčiny môžu byť spojené s liečením diuretikami, antihistaminikami, antidepresívami, napríklad SSRI, alebo antihypertenzívnymi činidlami. FSAD je podrobnejšie diskutovaná ďalej.
Bolestivé sexuálne poruchy (ktoré zahŕňajú dyspauréniu a vaginizmus) sú charakterizované bolesťou spôsobenou penetráciou a môžu byť vyvolané medikáciou, ktorá znižuje lubrikáciu, endometriózou, zápalovou chorobou panve, zápalovou chorobou čriev alebo problémami s močovým traktom.
Prevalenciu FSD je ťažké odhadnúť, pretože tento pojem pokrýva niekolko typov problémov, z ktorých niektoré sú nie lahko meratelné a pretože záujem liečiť FSD vznikol relatívne nedávno. Vela sexuálnych problémov u žien je spojených buď priamo s procesom ich starnutia alebo s chronickým ochorením, ako je diabetes alebo hypertenziou.
Uvádzané údaje o incidencii a prevalencii FSD silne kolíšu; sčasti to je možné vysvetliť použitím rôznych hodnotiacich kritérií, ale väčšina výskumníkov uvádza, že významný podiel inak zdravých žien má symptómy jedného alebo viacerých podtypov FSD. Napríklad štúdie porovnávajúce sexuálnu dysfunkciu pri pároch ukázala, že 63 % žien trpí • '· ·
poruchou vzrušivosti alebo orgastickou poruchou oproti 40 % mužov, ktorí sú postihnutý erektilnou alebo ejakulačnou dysfunkciou (Frank et al., 1978).
Prevalencia poruchy sexuálnej vzrušivosti u žien však pozoruhodne kolíše od prieskumu k prieskumu. Pri nedávnom prieskume National Health and Social Life Survey 19 % žien uvádzalo ťažkosti s lubrikáciou, zatiaľ čo podobné problémy s lubrikáciou uvádzalo 14 % ambulantných pacientiek gynekologickej kliniky (Rosen et al., 1993).
Niekoľko štúdií tiež uvádza dysfunkčnú sexuálnu vzrušivosť, do ktorej spadá aj znížená vaginálna lubrikácia, u diabetičiek (až 47 %) (Wincze et al., 1993). Neexistuje žiadne spojenie medzi neuropatiou a sexuálnou dysfunkciou.
Početné štúdie tiež ukázali, že celkom u 11 až 48 % žien môže byť znížená sexuálna túžba spojená s vekom. Podobne 11 až 50 % žien uvádza problémy so vzrušivosťou a lubrikáciou, čiže zážitok bolesti pri styku. Vaginizmus je ovela menej častý; postihuje približne 1 % žien.
Štúdie u sexuálne skúsených žien podrobne uvádzajú, že 5 až 10 % z nich trpí primárnou anorgazmiou. Ďalších 10 % má orgazmus zriedkakedy a ďalších 10 % ho prežíva nepravidelne (Spector et al., 1990).
Pretože FSD tvorí niekoľko podtypov, ktoré zodpovedajú symptómom v oddelených fázach cyklu sexuálnej odpovedi, neexistuje jediná terapia. Súčasné spôsoby liečenia FSD sú zamerané predovšetkým na psychologické alebo vzťahové problémy. Liečenie FSD sa postupne vyvíja ako klinickejšie a skúmaniu tohto problému sú venované základné vedecké štúdie. Sexuálne ťažkosti u žien nie sú z hľadiska patofyziológie vždy psychologické, predovšetkým u tých žien, na ktorých celkovom sexuálnom probléme sa môže podieľať zložka • · ···· ·· ··· · I · • · · · · ·· ·· • · · · • · · • · · • · · ·· ···· vaskulogenetickej dysfunkcie (napríklad FSAD). V súčasnosti neexistujú žiadne povolené lieky na liečenie FSD. Empirická lieková terapia zahŕňa podávanie estrogénu (topicky alebo ako hormonálnu substitúciu), androgénov alebo liečiv pozmeňujúcich náladu, ako je buspiron alebo trazodon. Tieto liečebné možnosti sú vzhladom na ich nízku účinnosť alebo nepri jatelné vedlajšie účinky často neuspokojivé.
Pretože záujem liečiť FSD farmakologicky je relatívne nedávny, sa terapia skladá z psychologického poradenstva, volne predajných sexuálnych lubrikantov a dosial nevyskúšaných potenciálnych liečiv, ktorými môžu byť liečivá schválené pre iné stavy. Takú medikáciu môžu predstavovať hormonálne činidlá, testosterón alebo kombinácie estrogénu a testosterónu, a nedávno vyvinuté vaskulárne liečivá s overenou účinnosťou na erektilnú dysfunkciu u mužov. Nepreukázalo sa, že by niektoré z týchto činidiel bolo príliš účinné pri liečení FSD.
Porucha sexuálnej vzrušivosti u žien
Sexuálne vzrušenie je tvorené vazokongesciou v panve, lubrikáciou vagíny a zväčšením vonkajších genitálií. Porucha vyvoláva značný distres a/alebo interperzonálne problémy. Štúdie zaoberajúce sa sexuálnymi dysfunkciami pri pároch ukázali, že existuje rad žien, ktoré trpia poruchou sexuálnej vzrušivosti, ktorá je inak známa ako FSAD (female sexual arousal disorder).
Diagnostický a štatistický manuál (DSM) IV Americkej psychiatrickej asociácie definuje poruchu sexuálnej vzrušivosti u žien (FSAD) takto:
Trvalá alebo prechodná neschopnosť dosiahnuť adekvátnu odozvu pohlavného vzrušenia, ktorá spočíva v lubrikácii a zväčšení, alebo neschopnosť ju udržať až do konca sexuálnej aktivity. Porucha musí vyvolávať značný distres alebo interperzonálne ťažkosti.
FSAD je sexuálna porucha s vysokou prevalenciou u pre-, peri a postmenopauzálnych (±HRT) žien. Je spojená s ďalšími sprievodnými poruchami, ako sú depresia, kardiovaskulárne choroby, diabetes a UG poruchy.
Primárnymi následkami FSAD sú nedostatočné prekrvenie/zväčšenie, nedostatočná lubrikácia a nedostatok príjemného genitálneho pocitu. Druhotnými následkami FSAD sú znížené libido, bolesť počas styku a ťažké dosiahnutie orgazmu.
Nedávno bola navrhnutá hypotéza, že aspoň pri časti pacientov so symptómami FSAD má tato porucha vaskulárnu bázu (Goldstein et al., 1998), a tento názor bol podporený údajmi získanými na zvieratách (Park et al., 1997).
Liečivami, ktorá prichádzajú do úvahu na liečenie FSAD, ktorých účinnosť sa v súčasnom čase skúma, sú primárne liečivá na liečenie mužskej erektilnej dysfunkcie, ktoré zvyšujú prekrvenie mužských genitálií. Takú terapiu tvoria dva typy formulácií, perorálne alebo sublinguálne medikácie (apomorfin, fentolamín, sildenafil), a prostaglandín (PGE^
- alprostadil), ktorý sa mužom podáva injekčné alebo transuretrálne, a ženám topicky na genitálie.
Úlohou vynálezu je vyvinúť účinné prostriedky na liečení FSD, predovšetkým FSAD.
V tomto texte sa pojem žena používa ako súhrnný pojem na označenie pohlavia u človeka alebo iného živočí99
9999 • ·
999 • 9 9 · • 9 · • 9 9 · ·
9 9 9
9999 cha, pokial to nie je uvedené inak. Do jeho rozsahu teda spadá aj pojem samica”. Podobný vztah je tiež napríklad medzi prívlastkami ženský - samičí apod.
Podstata vynálezu
Vynález sa opiera o zistenie, že ženy, ktoré trpia FSD, prednostne FSAD, je možné liečit pri použití I:PDE.
V súvislosti s týmto vynálezom je I:PDE podlá vynálezu označované ako činidlo podlá vynálezu.
Činidlo podlá vynálezu je tiež možné použit v kombinácii s jedným alebo viacerými prídavnými farmaceutický účinnými činidlami. Také prídavné farmaceutický účinné činidlo, pokial je prítomné alebo sa používa spolu s činidlom podlá vynálezu, môže byt označené ako prídavné činidlo. Jedným alebo viacerými prídavnými činidlami môže byt jeden alebo viac iných I:PDE, I:NEP a I:NPY. Kombinácie činidiel sú podrobnejšie diskutované dalej.
Činidlom podlá vynálezu je inhibítor PDE (I:PDE alebo PDEi), ktorý hydrolyzuje cAMP (a prípadne hydrolyzujúci cGMP). Do pojmu hydrolyžujúci cAMP tiež spadá metabolizujúci a/alebo rozkladajúci cAMP. Pod pojmom hydrolyzujúci cAMP (a prípadne cGMP) sa rozumie, že prídavné činidlo môže byt schopné okrem cAMP hydrolyzovat i cGMP. Pod pojmom hydrolýza cGMP sa tiež rozumie metabolizovanie a/alebo rozkladanie cGMP. Pri niektorých rozpracovaniach tohto vynálezu sa predpokladá, že prídavné činidlo nemusí nezbytne byt schopné hydrolyzovat cGMP.
Všeobecné odkazy na činidlá je možné vztiahnut na činidlá prídavné i na činidlá podlá vynálezu.
·· ···· • · • ··· ···♦ · · ·· ····
Činidlo podlá vynálezu pôsobí na ciel, prednostne špecificky na ciel. Tento ciel je niekedy označovaný ako ciel podlá vynálezu. Činidlo podlá vynálezu môže pôsobiť na jeden ciel alebo väčší počet cielov. Tieto ďalšie ciele môžu byt označované ako prídavné ciele. Podobne, pokial sa použije prídavné činidlo, potom toto prídavné činidlo môže byt zacielené na rovnaký ciel ako je ciel podlá vynálezu a/alebo prídavný ciel (ktorý nemusí byt rovnaký ako prídavný ciel, na ktorý pôsobí činidlo podlá vynálezu). Ciele sú opísané v tomto texte. Všeobecný odkaz na ciele je možné vztiahnuť na ciele prídavné i ciele podlá vynálezu.
Vynález sa ďalej opiera o zistenie, že je možné zvýšiť prekrvenie ženského genitálu (napríklad vagíny alebo klitorisu) pri použití činidla podlá vynálezu.
Pri našich experimentoch sa zistilo, že FSAD je spojená so zníženým prekrvením, predovšetkým zníženým prekrvením vagíny a/alebo klitorisu. Liečenie žien s FSAD je teda možné dosiahnuť zvýšením prekrvenia genitálií pri použití vazoaktívnych činidiel. Naše skúšky ukázali, že cAMP je mediátorom vaginálnej a klitoriálnej vazorelaxácie a že genitálne (napríklad vaginálne a klitoriálne) prekrvenie je možné zvýšiť/potencovať zvýšením hladiny cAMP. To predstavuje ďalší základný poznatok.
V tomto ohlade nikto predtým nenavrhol, že by FSAD bolo možné liečit takým spôsobom - tzn. priamym alebo nepriamym zvýšením hladiny cAMP. Okrem toho, v doterajšom stave techniky neexistujú žiadne informácie, na základe ktorých by bolo možné predpokladať, že FSAD je spojená so škodlivou moduláciou aktivity a/alebo hladiny cAMP alebo že cAMP je zodpovedný za sprostredkovanie vaginálnej alebo klitoriálnej vazorelaxácie. Toto predstavuje ďalšie prekvapujúce zistenie.
·· ···· • · · « · · ··· • · « · · * • · · · • ·· ··· • · · • · · ·· ····
- 10 Okrem toho sme zistili, že pri použití činidiel podlá vynálezu je možné zvýšit genitálne prekrvenie a liečiť FSAD - napríklad zvýšenou lubrikáciou vagíny a zvýšenou citlivosťou vagíny a klitorisu.
Vo všeobecnom vyjadrení sa teda vynález týka použitia potenciátoru cAMP na liečenie FSD, predovšetkým FSAD.
Tento vynález je výhodný v tom, že poskytuje prostriedky na obnovenie normálnej sexuálnej vzrušivosti, predovšetkým zvýšeného prekrvenia genitálií, ktoré vedú k prekrveniu vagíny, klitorisu a labií. Toto prekrvenie vyústi v zvýšenú lubrikáciu vagíny transsudáciou plazmy, zvýšenú poddajnosť vagíny a zvýšenú citlivosť genitálií (napríklad vagíny a klitorisu). Vynález teda poskytuje prostriedky ako obnoviť alebo potencovať normálnu sexuálnu vzrušivosť.
Podlá jedného aspektu je predmetom vynálezu farmaceutická kompozícia na použitie (alebo ked sa používa) pri liečení FSD, predovšetkým FSAD; pričom táto farmaceutická kompozícia obsahuje činidlo schopné potencovať cAMP v pohlavných orgánoch ženy, ktorá trpí FSD, predovšetkým FSAD; a toto činidlo je prípadne zmiešané s farmaceutický vhodným nosičom, riedidlom alebo excipientom; pričom týmto činidlom je činidlo podlá vynálezu definované v tomto opise. Kompozícia (rovnako ako ktorákolvek z ostatných kompozícií uvedených v tomto texte) môže byť balená za účelom následného použitia pri liečení FSD, predovšetkým FSAD.
Podlá ďalšieho aspektu je predmetom vynálezu použitie činidla na výrobu liečiva (ako farmaceutickej kompozície) na liečenie FSD, predovšetkým FSAD; pričom toto činidlo je schopné potencovať cAMP v pohlavných orgánoch ženy, ktorá trpí FSD, predovšetkým FSAD; a týmto činidlom je činidlo podlá vynálezu definované v tomto texte.
»«·· · · ·· ···· • · ·· • · · · • · · • · · • · · ·· *···
Podlá ďalšieho aspektu je predmetom vynálezu spôsob liečenia žen trpiacich FSD, predovšetkým FSAD; ktorého podstata spočíva v tom, že sa žene podáva činidlo, ktoré je schopné potencovat cAMP v pohlavných orgánoch, v množstve, ktoré vyvoláva potenciáciu cAMP v pohlavných orgánoch ženy; pričom toto činidlo je prípadne zmiešané s farmaceutický vhodným nosičom, riedidlom alebo excipientom; a činidlom je činidlo podlá vynálezu definované v tomto texte.
Podlá ďalšieho aspektu je predmetom vynálezu skúšobný postup na identifikáciu činidla, ktoré je možné použit na liečenie FSD, predovšetkým FSAD, ktorého podstata spočíva v tom, že zahŕňa stanovenie, či činidlo môže priamo alebo nepriamo potencovat cAMP; pričom potenciácia cAMP v prítomnosti činidla svedčí o tom, že činidlo môže byt užitočné pri liečení FSD, predovšetkým FSAD; a pričom takým činidlom je I:PDE, pričom PDE je PDE hydrolyzujúca cAMP (či prípadne hydrolyžujúca cGMP).
Predmetom vynálezu je teda napríklad skúšobný postup na identifikáciu činidla, ktoré môže priamo alebo nepriamo potencovat cAMP za účelom liečenia FSD, predovšetkým FSAD, ktorého podstata spočíva v tom, že sa pri ňom činidlo uvedie do styku s entitou schopnou pôsobit na aktivitu a/alebo hladinu cAMP; a zmerí sa aktivita a/alebo hladina cAMP; pričom potenciácia cAMP v prítomnosti činidla svedčí o tom, že činidlo môže byt užitočné pri liečení FSD, predovšetkým FSAD; I:PDE, pričom PDE je PDE hydrolyzujúca cAMP (a prípadne hydrolyzujúca cGMP).
Predmetom vynálezu je teda napríklad ďalej skúšobný postup na identifikáciu činidla, ktoré môže priamo alebo nepriamo potencovat cAMP za účelom liečenia FSD, predovšetkým FSAD, ktorého podstata spočíva v tom, že sa pri ňom činidlo uvedie do styku s cAMP; a.zmerí sa aktivita cAMP; pričom potenciácia cAMP v prítomnosti činidla svedčí o tom, ···· ·· ···· • · · • · ··· • · · · ·· ·· • · · · • · · • · · • · · ·· ···· že činidlo môže byt užitočné pri liečení FSD, predovšetkým FSAD; a pričom takým činidlom je I:PDE, pričom PDE je PDE hydrolyzujúca cAMP (a prípadne hydrolyzujúca cGMP).
Podlá ďalšieho aspektu je predmetom vynálezu spôsob, ktorého podstata spočíva v tom, že zahŕňa (a) stupeň, v ktorom sa vykoná skúška podlá vynálezu;
(b) stupeň, v ktorom sa identifikuje jedno alebo viac činidiel, ktoré môžu priamo alebo nepriamo potencoval aktivitu cAMP; a (c) pripraví sa množstvo jedného alebo väčšieho počtu identifikovaných činidiel;
pričom takým činidlom je I:PDE, pričom PDE je PDE hydrolyzujúca cAMP (a prípadne hydrolyzujúca cGMP).
V tomto ohlade je činidlo identifikované v stupni (b) možné modifikoval tak, aby napríklad maximalizovalo aktivitu, a stupeň je možné opakoval. Tieto stupne je možné opakoval, kým sa nedosiahne požadovaná aktivita alebo požadovaný farmakokinetický profil.
Podlá ďalšieho aspektu je predmetom vynálezu spôsob, ktorého podstata spočíva v tom, že zahŕňa (al) stupeň, v ktorom sa vykoná skúška podlá vynálezu;
(bl) stupeň, v ktorom sa identifikuje jedno alebo viac činidiel, ktoré môžu priamo alebo nepriamo potencoval aktivitu cAMP,
- 13 ·· ···· » · · • · ·· » · · > · · ·· ··· ·· ··
I · · (fc>2) stupeň, v ktorom sa jedno alebo viac identifikovaných činidiel modifikuje;
(a2) stupeň, v ktorom sa opakuje stupeň (al); a (c) stupeň, v ktorom sa pripraví množstvo jedného alebo viacerých identifikovaných činidiel, tzn. ktoré boli modif ikované;
pričom činidlom je I:PDE, pričom PDE je PDE hydrolyzujúca cAMP (a prípadne hydrolyzujúca cGMP).
Podlá ďalšieho aspektu je predmetom vynálezu spôsob liečenia FSD, predovšetkým FSAD, in vivo potenciáciou cAMP činidlom, ktoré je schopné priamo alebo nepriamo potencovať cAMP pri skúške in vitro, pričom skúškou in vitro je skúšobný postup pódia vynálezu; a činidlom je I:PDE, pričom PDE je PDE hydrolyzujúca cAMP (a prípadne hydrolyzujúca cGMP).
Pódia ďalšieho aspektu je predmetom vynálezu použitie činidla pri výrobe farmaceutickej kompozície na liečenie FSD, predovšetkým FSAD, pričom toto činidlo je schopné priamo alebo nepriamo potencovat cAMP pri in vitro skúšobnom postupe pódia vynálezu; a činidlom je I:PDE, pričom PDE je PDE hydrolyzujúca cAMP (a prípadne hydrolyzujúca cGMP)
Pódia ďalšieho aspektu je predmetom vynálezu zvierací model používaný na identifikáciu činidiel schopných liečiť FSD, predovšetkým FSAD, ktorý zahŕňa anestetizovanú samicu zvieraťa a prostriedky na meranie zmien prekrvenia vagíny a/alebo klitorisu takého zvieraťa po stimulácii jeho pelvického nervu; pričom takým činidlom je I:PDE, pričom PDE je PDE hydrolyzujúca cAMP (a prípadne hydrolyzujúca cGMP).
Pódia ďalšieho aspektu je predmetom vynálezu spôsob identifikácie činidla, ktoré môže priamo alebo nepriamo poten• · • ··
·· ···· ·· ·· • · · · · · · • · ··· · · · • · · · · · · • · · ♦ ♦ · ·· ··· ·· ····
- 14 covaŕ. cAMP za účelom liečenia FSAD, ktorého podstata spočíva v tom, že zahŕňa podanie činidla zvieraciemu modelu podlá vynálezu? a meranie akejkoľvek potenciácie cAMP a/alebo zvýšenia prekrvenia vo vagíne a/alebo klitorise tohto zvieratá; pričom činidlom je I:PDE, pričom PDE je PDE hydrolyžujúca cAMP (a prípadne hydrolyžujúca cGMP).
Podlá ďalšieho aspektu je predmetom vynálezu diagnostická metóda, ktorej podstata spočíva v tom, že zahŕňa izoláciu vzorky zo samice? stanovenie, či vzorka obsahuje danú entitu prítomnú v takom množstve, aby vyvolala FSD, prednostne FSAD? pričom táto entita má priamy alebo nepriamy vplyv na hladinu alebo aktivitu cAMP v pohlavných orgánoch samice; a túto entitu je možné modulovat za účelom dosiahnutia kladného účinku pri použití činidla, pričom takým činidlom je I:PDE, pričom PDE je PDE hydrolyzujúca cAMP (a prípadne hydrolyzujúca cGMP).
Podlá ďalšieho aspektu je predmetom vynálezu diagnostická kompozícia alebo kit obsahujúci prostriedky na detekciu entity v izolovanej vzorke ženského organizmu; pričom tieto prostriedky je možné použiŕ na stanovenie, či vzorka obsahuje túto entitu, a či ju obsahuje v takom množstve, aby vyvolala FSD, prednostne FSAD, pričom táto entita má priamy alebo nepriamy vplyv na hladinu alebo aktivitu cAMP v ženských pohlavných orgánoch; a túto entitu je možné modulovaŕ za účelom dosiahnutia kladného účinku pri použití činidla, pričom takým činidlom je I:PDE, pričom PDE je PDE hydrolyzujúca cAMP (a prípadne hydrolyzujúca cGMP).
V nasledujúcom texte sú opätovne rozobrané tieto a ďalšie aspekty vynálezu, ktoré sú pre lahšiu orientáciu rozdelené do oddielov označených zodpovedajúcimi nadpismi. Informácie uvedené v jednom konkrétnom oddiele sa neomedzujú iba na tento jediný oddiel.
• φ • ··· ···
φφ φφφφ • · • φφφ • · · φ φ · φφ ··· φφ ·· • · φ · φ · · φ ♦ · · φ · φ φφ φφφφ
Prednostné aspekty
V prednostnom rozpracovaní je činidlo podlá vynálezu určené na liečenie FSAD.
Činidlom podlá vynálezu je prednostne mediátor vazorelaxácie ženských genitálií (napríklad vagíny alebo klitorisu).
V jednom rozpracovaní je činidlo podlá vynálezu určené na perorálne podávanie.
Podlá ďalšieho rozpracovania činidlo podlá vynálezu môže byt určené na topické podávanie.
Činidlo má prednostne priamy potenciačný účinok na cAMP.
Pri niektorých aplikáciách je činidlom podlá vynálezu prednostne inhibítor, tzn. že činidlo je schopné vykazovať inhibičnú funkciu.
Činidlom podlá vynálezu je I:PDE (niekedy označovaný ako PDEi).
Pri niektorých aplikáciách je činidlom prednostne I:PDE1 alebo I:PDE2 (niekedy označovaný ako I:PDEII alebo I:PDEIIi alebo PDE2i) alebo I:PDE3 alebo I:PDE4 alebo I:PDE7 alebo I:PDE8, výhodnejšie I:PDE2.).
Činidlom je prednostne selektívny I:PDE.
Činidlom je prednostne I:PDEII (niekedy označovaný ako I:PDE2 alebo I:PDEIIi alebo I:PDE2i).
Prednostne je činidlom selektívny I:PDEII.
• · ·· · • · · • ···· · • · ··· · ·· ···· • · · • ♦ ··· • · · • · · ·· ··· ·· ·· • · · · • · · • · · · • · · *« ····
Pri niektorých aplikáciách je činidlo podlá vynálezu, možné podávať spolu s ďalším farmaceutický aktívnym činidlom. Toto spoločné podávanie nemusí nutne prebiehať v rovnaký čas, ani rovnakým spôsobom. Ako príklad kompozície pre spoločné podávanie je možné uviesť kompozíciu, ktorá obsahuje činidlo podlá vynálezu a prídavné činidlo, pričom prídavné činidlo môže mať priamy potenciačný účinok na cAMP. Príklady kombinácií sú uvedené ďalej.
Pri niektorých aplikáciách má prídavné činidlo prednostne nepriamy potenciačný účinok na cAMP. Ako príklady prídavných činidiel je možné uviesť I:NEP a/alebo I:NPY. Inými slovami, pri niektorých aplikáciách prídavné činidlo prednostne nemá priamy potenciačný účinok na cAMP. Prídavné činidlo môže mať nepriamy potenciačný účinok na cAMP prostredníctvom pôsobenia na priamo účinkujúce činidlá, ktoré sa vyskytujú prirodzene a sú prirodzene umiestnené, ako je prirodzene sa vyskytujúci a umiestnený VIP.
Pri niektorých aplikáciách má prídavné činidlo prednostne priamy potenciačný účinok na cAMP. Ako príklady takých prídavných činidiel je možné uviesť I:PDE.
Pri niektorých aplikáciách je prídavným činidlom inhibítor, tzn. že činidlo je schopné vykazovať inhibičnú funkciu.
Pri niektorých aplikáciách je prídavným činidlom antagonista.
Pri niektorých aplikáciách je prídavným činidlom prednostne I:PDE (niekedy tiež označované ako PDEi).
Pri niektorých aplikáciách je prednostne prídavným činidlom I:PDE1 alebo I:PDE2 (ktorý je niekedy uvádzaný ako « · e·*· · ·· ···· ·· ·· • · φ · · · · • · ··· · · · • · · · · · · • · · · · · ·· ··· ·· ····
I:PDEII alebo I:PDEIIi alebo PDE2Í) alebo I:PDE3 alebo I:PDE4 alebo I:PDE7 alebo I:PDE8, prednostne I:PDE2.).
Pri niektorých aplikáciách je prídavným činidlom prednostne selektívny I:PDE.
Pri niektorých aplikáciách je prídavným činidlom prednostne I:PDEII (niekedy tiež uvádzaný ako I:PDE2 alebo PDEIIi alebo PDE2i.
Pri niektorých aplikáciách je prídavným činidlom prednostne IxPDEII.
Pri niektorých aplikáciách je prednostným prídavným činidlom I:NEP (niekedy uvádzaný ako NEPi).
Pri niektorých aplikáciách je prednostným prídavným činidlom selektívny I:NEP.
Pri niektorých aplikáciách je prednostným prídavným činidlom I:NEP, kde NEP predstavuje EC 3.4.24.,11.
Pri niektorých aplikáciách je prednostným prídavným činidlom selektívne I:NEP, kde NEP predstavuje EC 3.4.24.11.
Pri niektorých aplikáciách je prídavným činidlom prednostne I:NPY (niekedy označovaný ako NPYi).
Pri niektorých aplikáciách je prídavným činidlom prednostne I:NPY Y1 alebo I:NPY Y2 alebo I:NPY Y5, výhodnejšie I:NPY Yl.
Pri niektorých aplikáciách je prídavným činidlom prednostne selektívny I:NPY.
·· ···· • · • ··· ·· · • · · • · ··· • · ··· · • · « ·· ··· ·· ·· ♦ · · · • · · • · · • · · ·· ····
Pri niektorých aplikáciách je prídavným činidlom prednostne I:NPY Yl.
Pri niektorých aplikáciách je prídavným činidlom prednostne selektívny I:NPY Yl.
Pri niektorých aplikáciách činidlo nevyvoláva - alebo je podávané takým spôsobom, aby nevyvolávalo - dlhotrvajúci pokles krvného tlaku (napríklad počas asi 5 minút alebo dlhšie). V tomto rozpracovaní, pokial sa má činidlo podávat topicky, činidlo môže mat schopnost vyvolávat pokles krvného tlaku (ktorý by vyvolalo pri intravenóznom podaní), pričom však pri topickom podaní do krvného obehu prechádza minimálna hladina činidla. Pri perorálnom podávaní prednostne činidlo nevyvoláva dlhotrvajúci pokles krvného tlaku.
V prednostnom rozpracovaní činidlo podlá vynálezu nevyvoláva, alebo je podávané takým spôsobom, aby nevyvolávalo, velké zmeny v srdcovej frekvencii.
Liečenie
Vo všetkých prípadoch, keď je v texte uvedený pojem liečenie, rozumie sa pod ním aspoň jeden typ zvolený zo súboru skladajúceho sa z kuratívneho, paliatívneho a profylaktického ošetrovania. V prednostnom rozpracovaní tento pojem zahŕňa aspoň kuratívne ošetrovanie a/alebo paliatívne ošetrovanie .
Ženské genitálie
Pojem ženské genitálie sa používa v súlade s ich definíciou v Grayovej anatómii, C. D. elemente, 13. americké vydanie:
Genitálne orgány sú tvorené orgánmi vnútornými a vonkajšími. Vnútorné orgány sú umiestnené v panve a tvoria
I··· · · ·· ···· ·· ···· • · • ··· ·· ich vaječníky, vajíčkovody, maternica a vagína. Vonkajšie orgány sú povrchové vzhladom k urogenitálnej diafragme a nachádzajú sa pod panvovým oblúkom. Tvoria ich panenská blana, velké pysky ohanbia a malé pysky ohanbia, klitoris, vestibulum, bulbus vestibuli a velké vestibulárne žlazy.
Endogénny cAMP
Vo velmi prednostnom rozpracovaní činidlo podlá vynálezu potencuje endogénny cAMP - ako napríklad potencuje hladinu endogénneho cAMP.
Pod pojmom endogénny cAMP sa rozumie cAMP, ktorý vzniká sexuálnou stimuláciou (pri sexuálnom vzrušení). Tento pojem sa teda nevzťahuje k hladinám cAMP, ktoré budú zvýšené nezávisle od sexuálneho vzrušenia.
Podlá vynálezu sa teda liečenie FSAD vykonáva priamym alebo nepriamym potencovaním endogénnej-cAMP signalizácie, ktorá ďalej zvýši vaginálne prekrvenie/lubrikáciu a/alebo prekrvenie klitorisu, čiže posilnením prirodzenej reakcie sexuálneho vzrušenia. Spôsobom liečenia podlá vynálezu sa teda obnoví alebo potencuje normálna reakcia sexuálneho vzrušenia.
Pri spôsobe liečenia podlá vynálezu je tento výsledok možné dosiahnuť pri použití inhibítoru PDE hydrolyzujúcej cAMP.
Predmetom vynálezu je tiež zvierací model. Tento zvierací skúšobný model je možné použiť na stanovenie zvýšenia prekrvenia genitálií, ako výsledku potenciácie cAMP. Pri tomto zvieracom modele je stimulovaný pelvický nerv, čo privodí efekt, ktorý napodobuje fyziológiu sexuálneho vzrušenia/reakcie. Pri týchto skúškach činidlá podlá vynálezu po stimulácii nervu vyvolávajú zvýšenie prekrvenia, ·· ···· • · • ··· • · ···· ·· ·· • · · · • · · • · 9 9 · · • · · · · ··· ·· ··♦· ktoré je vyššie ako zvýšenie kontrolné. Pri absencii stimulácie činidla nemajú žiadny (alebo majú iba zanedbateíný) účinok na zvýšenie prekrvenia. Nerv je zvyčajne pri týchto skúškach stimulovaný, aby sa získala základná línia prekrvenia. Potom sa zvieraťu systemický alebo miestne, ako intravenózne, topicky alebo perorálne, podá potenciálne (alebo skutočné) činidlo. Prírastok prekrvenia v porovnaní s kontrolnými prírastkami svedčí o tom, že ide o činidlo podlá vynálezu.
Sexuálna stimulácia
Predmetom vynálezu je tiež podávanie činidla podlá vynálezu pred sexuálnou stimuláciou a/alebo počas nej. Pojem sexuálna stimulácia môže byť synonymom sexuálneho vzrušovania alebo sexuálneho vzrušenia. Tento aspekt vynálezu je výhodný, pretože poskytuje systemickú selektivitu. Prirodzená kaskáda môže prebehnúť iba v genitáliách, a nie na iných miestach, napríklad v srdci apod. Je teda možné dosiahnuť selektívny účinok na genitálie.
Z hladiska niektorých aspektov tohto vynálezu je vysoko žiadúce, aby došlo k stupni sexuálnej stimulácie. Zistili sme, že tento stupeň môže poskytnúť systemickú selektivitu. Pod pojmom sexuálna stimulácia sa rozumie aspoň jedna zo stimulácií vizuálnych, fyzikálnych, sluchových alebo myšlienkových.
Činidlá podlá vynálezu sa teda podávajú prednostne pred sexuálnou stimuláciou alebo počas nej, predovšetkým pokial sú podávané perorálne.
Predmetom vynálezu je teda prednostne použitie činidla podlá vynálezu pri výrobe liečiva na liečenie FSAD; pričom toto činidlo je schopné potencovať cAMP v genitáliách ženy trpiacej FSAD; pričom táto žena je se·· ·«·· • · • ··· • · ···· ·· ·· • · · · • · · • · · · · · · • B · · · · ·· ·«· ·· ···· xuálne stimulovaná pred podaním liečiva alebo počas jeho podávania.
Predmetom vynálezu je prednostne použitie činidla podlá vynálezu pri výrobe liečiva na liečenie FSAD; pričom toto činidlo je schopné potencovať cAMP v genitáliách ženy trpiacej FSAD; pričom táto žena je sexuálne stimulovaná pred podaním alebo počas podávania liečiva, ktoré je jej podávané perorálne.
Ďalej je predmetom vynálezu prednostný spôsob liečenia žien trpiacich FSAD, ktorého podstata spočíva v tom, že sa takej žene podáva činidlo podlá vynálezu, ktoré je schopné potencovať cAMP v genitáliách, pričom toto činidlo je v takom množstve, aby vyvolalo potenciáciu cAMP v genitáliách ženy, a je prípadne zmiešané s farmaceutický vhodným nosičom, riedidlom alebo excipientom; a pričom žena je sexuálne stimulovaná pred podaním alebo počas podávania tohto činidla.
Ďalej je predmetom vynálezu prednostný spôsob liečenia žien trpiacich FSAD, ktorého podstata spočíva v tom, že sa takej žene podáva činidlo podlá vynálezu, ktoré je schopné potencovať cAMP v genitáliách, pričom toto činidlo je v takom množstve, aby vyvolalo potenciáciu cAMP v genitáliách ženy, a je prípadne zmiešané s farmaceutický vhodným nosičom, riedidlom alebo excipientom; a pričom žena je sexuálne stimulovaná pred podaním alebo počas podávaní tohto činidla; a činidlo sa žene podáva perorálne.
Potenciácia cAMP
V súvislosti s cAMP sa pod pojmom potenciácia rozumie jeden alebo väčší počet z nasledujúcich javov: zvýšenie účinnosti cAMP, zvýšenie hladiny cAMP, zvýšenie akti• · ···· ··· · ·· ···· • · · • · ··· • · · · • · · ·· ··· ·· ·* • · · · • · · • · · • · · ·· ···· vitý cAMP, zníženie hladiny degradácie cAMP a zníženie hladiny inhibície cAMP.
Potenciačný účinok môže byť priamy. Ako príklad priameho účinku je možné uviesť pozitívnu reguláciu hladiny cAMP činidlom, ktoré zvyšuje jeho expresiu.
Potenciačný účinok tiež môže byť nepriamy. Príkladom takého účinku môže byť pôsobenie na látku, ktorá by inak inhibovala a/alebo znižovala hladinu a/alebo aktivitu cAMP. Ako ďalší príklad takého účinku je možné uviesť zvýšenie účinku látky, ktorá zvyšuje účinnosť cAMP, zvyšuje aktivitu cAMP, znižuje hladinu degradácie cAMP alebo znižuje hladinu inhibície cAMP.
Ako príklad PcAMP je možné uviesť I:PDEII.
cAMP mimetiká
Pre niektoré aspekty tohto vynálezu môže prídavné činidlo pôsobiť ako cAMP mimetikum.
Pod pojmom cAMP mimetikum sa rozumie činidlo, ktoré môže pôsobiť podobným spôsobom (napríklad môže mať podobný biologický profil a účinok) ako cAMP v ženských genitáliách, pričom dochádza k jednému alebo väčšiemu počtu z nasledujúcich javov: zvýšenie účinnosti entít podobných cAMP, zvýšenie hladiny entít podobných cAMP, zvýšenie aktivity entít podobných cAMP, zníženie hladiny degradácie entít podobných cAMP a zníženie hladiny inhibície entít podobných cAMP.
Ako príklad cAMP mimetiká je možné uviesť forskolín. Bolo zistené, že forskolín zvyšuje prekrvenie vagíny a klitorisu, a môže teda pôsobiť tiež ako vaginálny relaxant.
• · · · · ·· ···· • · ·· · · • ··· · · · • · · · · · • · « · · ·· · ·· ·· ····
V prednostnom rozpracovaní sa cAMP mimetikum podáva perorálne.
Aktivátor cAMP
Pod pojmom aktivátor cAMP sa rozumie látka, ktorá kontroluje alebo uvolňuje cAMP v genitáliách ženy. Kontrola môže byt priama (napríklad nad cAMP samotnou) alebo nepriama (napríklad aktiváciou cAMP). Pre zjednodušenie tieto látky označujeme ako AcAMp.
Ciel
Pod pojmom ciel sa rozumie akákolvek látka, ktorá je cAMP, AcAMp, IcAMP alebo AMcAMp. Inak vyjadrené, ciel podlá vynálezu môže byt označovaný ako PcAMp ciel.
Cielom podlá vynálezu a/alebo prídavným cielom môže byt aminokyselinové sekvencia a/alebo nukleotidové sekvencia, ktorá ju kóduje a/alebo expresná jednotka zodpovedná za jej expresiu a/alebo jej modulátor.
Činidlo
Činidlom podlá vynálezu môže byt akékolvek činidlo, ktoré pôsobí ako PC7^p·
Činidlo (tzn. činidlo podlá vynálezu a/alebo prídavné činidlo) môže byt aminokyselinovou sekvenciou alebo jej chemickým derivátom. Látkou môže byt dokonca organická zlúčenina alebo iná chemická zlúčenina. Činidlom môže byt i nukleotidové sekvencia, ktorá môže byt pozitívna i negatívna. Činidlom môže byt tiež protilátka.
• · ···· • · · · · · • · · • · ··· • · · • · · ·· ··· ·· ·· • · · • · ··· ·
Ako neobmedzujúci príklad pojmu činidlo je možné uviesť zlúčeninu, ktorú je možné získať alebo vyrobiť z akéhokoivek vhodného zdroja, nech už prírodného alebo nie.
Činidlo je možné skonštruovať alebo získať z knižnice zlúčenín, ktoré môžu zahŕňať peptidy, ako tiež iné zlúčeniny, ako malé organické molekuly, ako sú zlúčeniny olova.
Činidlom môžu napríklad byt prírodná látka, biologická makromolekula alebo extrakt vyrobený z biologických materiálov, ako bakteriálnych, fungálnych alebo živočíšnych (predovšetkým cicavčích) buniek alebo tkanív, organická alebo anorganická molekula, syntetické činidlo, semisyntetické činidlo, štruktúrne alebo funkčné mimetikum, peptid, peptidomimenikum, derivatizované činidlo, peptid vyštiepený z úplného proteínu alebo peptid získaný synteticky (ako napríklad pri použití syntetizátoru peptidov alebo postupov génového inžinierstva alebo ich kombinácií), rekombinantné činidlo, protilátka, prírodné alebo neprírodné činidlo, fúzny proteín alebo jeho ekvivalent a ich mutanty, deriváty alebo ich kombinácie.
Činidlom môže byť jediná entita alebo kombinácia činidiel.
Pokiaí je činidlom organická zlúčenina, potom pri niektorých aplikáciách, ako keď je činidlom I:PDE, táto organická zlúčenina zvyčajne môže obsahovať dve alebo viac viazaných hydrokarbolových skupín. Pri niektorých aplikáciách činidlo prednostne obsahuje aspoň dve cyklické skupiny, pričom jedna z nich môže byť anelovaná cyklická kruhová štruktúra. Pri niektorých aplikáciách je prednostne aspoň jedna z cyklických skupín heterocyklická. Pri niektorých aplikáciách heterocyklická skupina prednostne obsahuje v kruhu aspoň jeden dusík. Príklady takých zlúčenín sú uvedené v príkladoch uskutočnenia.
• · · • · · · · • · I • · 4 ·· ··· • · · · • · · • · · • · · ·· ····
Pokiaľ je činidlom organická zlúčenina, potom pri niektorých aplikáciách, ako keď je činidlom I:NEP, táto organické! zlúčenina môže zvyčajne obsahovať amidovú skupinu (tzn. -N(H)-C(O)- či -C(O)-N(H)-) a jednu alebo viac hydrokarbolskupín. Pod pojmom hydrokarbolskupina sa rozumie skupina obsahujúca aspoň uhlík a vodík, ktorá prípadne môže obsahovať jeden alebo viac iných vhodných substituentov.
Ako príklady takých substituentov je možné uviesť halogén, alkoxyskupinu, nitroskupinu, alkylskupinu, cyklickú skupinu apod. Okrem možnosti, že substituentom bude cyklická skupina, môžu cyklickú skupinu tvoriť kombinácie substituentov. Pokial hydrokarbolskupina obsahuje viac ako jeden uhlík, potom tieto uhlíky nemusia byť nutne vzájomne spojené. Aspoň dva atómy uhlíka môžu byť napríklad spojené cez vhodný prvok alebo vhodnú skupinu. Hydrokarbolskupina teda môže obsahovať heteroatómy. Vhodnými heteroatómami, ktoré budú odborníkovi v tomto odbore zrejmé, sú napríklad síra, dusík a kyslík.
Pri niektorých aplikáciách činidlo prednostne obsahuje aspoň jednu cyklickú skupinu. Pri niektorých aplikáciách činidlo prednostne obsahuje aspoň jednu cyklickú skupinu viazanú k ďalšej hydrokarbolovej skupine amidovou väzbou. Príklady takých zlúčenín sú uvedené v príkladoch uskutočnenia.
Pokial je činidlom organická zlúčenina, potom pri niektorých aplikáciách, ako keď je činidlom I:NPY, táto organická zlúčenina zvyčajne môže obsahovať dve alebo viac viazaných hydrokarbolových skupín. Pri niektorých aplikáciách činidlo prednostne obsahuje aspoň dve cyklické skupiny, pričom prípadne jedna z nich môže byt anelovaná cyklická kruhová štruktúra. Pri niektorých aplikáciách je prednostne aspoň jedna z cyklických skupín heterocyklická.
Pri niektorých aplikáciách heterocyklická skupina prednostne obsahuje aspoň jeden dusík v kruhu. Príklady takých zlúčenín sú uvedené v príkladoch uskutočnenia.
• · · · · ··· · · · ······· · · · · · · • · · · · · · · ··· · ·· ··· ·· ····
- 26 Činidlo môže obsahovať halogénskupiny. Pod pojmom halogén sa rozumie fluór, chlór, bróm alebo jód.
Činidlo môže obsahovať jednu alebo viac z alkyl-, alkoxy-, alkenyl-, alkylén- a alkenylénskupín, ktoré môžu mat reťazec nerozvetvený alebo rozvetvený.
Činidlo môže mat formu farmaceutický vhodnej soli, ako adičnej soli s kyselinou alebo soli s bázou, alebo formu ich solvátu, vrátane hydrátu. Prehlad vhodných solí pozri v Berge et al., J. Pharm. Sci., 1977, 66, 1 až 19.
Vhodné adičné soli s kyselinami vznikajú s kyselinami, ktoré tvoria netoxické soli. Ako príklady takých solí je možné uviesť hydrochloridové, hydrobromidové, hydrojodidové, sulfátové, hydrogensulfátové, nitrátové, fosfátové, hydrogenfosfátové, acetátové, maleátové, fumarátové, laktátové, tartrátové, citrátové, glukonátové, sukcinátové, sacharátové, benzoátové, metánsulfonátové, etánsulfonátové, benzénsulfonátové, p-toluénsulfonátové a pamoátové soli.
Vhodné soli s bázami vznikajú s bázami, ktoré tvoria netoxické soli. Ako príklady takých solí je možné uviesť soli sodné, draselné, hlinité, vápenaté, horečnaté, zinočnaté a dietanolamínové.
Farmaceutický vhodné soli činidiel podlá vynálezu je možné lahko pripravovať tak, že sa zmieša roztok činidla a roztok príslušnej kyseliny alebo bázy. Sol je možné z roztoku vyzrážať a zhromaždiť filtráciou alebo ju je možné izolovať odparením rozpúšťadla.
Činidlo môže byt v polymorfnej forme.
Činidlo môže obsahovať jeden alebo väčší počet asymetrických atómov uhlíka, a môže sa teda vyskytovať v dvoch • ··· • · · · · · • · • ··· • · · · · • · · ·· ··· alebo viacerých stereoizomérnych formách. Činidlo, ktoré obsahuje alkenylskupinu alebo alkenylénskupinu, môže tiež tvoriť (E) a (Z) izoméry. Predmetom vynálezu sú jednotlivé stereoizoméry činidla, a v prípade, že je to možné i tautoméry, a ich zmesi.
Separáciu diastereomérov alebo cis a trans izomérov je možné vykonávať pri použití obvyklých postupov, napríklad frakčnou kryštalizáciou, chromatografiou alebo vysoko účinnou kvapalinovou chromatografiou stereoizomérnej zmesi činidla alebo jeho vhodnej soli alebo derivátu. Individuálny enantiomér činidla je tiež možné pripraviť zo zodpovedajúceho opticky čistého medziproduktu alebo štiepením, ako vysoko účinnou kvapalinovou chromatografiou zodpovedajúceho racemátu pri použití vhodného chirálneho nosiča alebo frakčnou kryštalizáciou diastereomérnych solí vytvorených reakciou zodpovedajúceho racemátu s vhodnou opticky aktívnou kyselinou alebo bázou.
Do rozsahu vynálezu tiež spadajú izotopové varianty činidiel alebo ich farmaceutický vhodných solí. Izotopový variant činidla podlá vynálezu alebo jeho farmaceutický vhodnej soli je definovaný ako činidlo alebo jeho farmaceutický vhodná sol, v ktorých je aspoň jeden atóm nahradený atómom s rovnakým atómovým číslom, ale s atómovou hmotnosťou odlišnou od atómovej hmotnosti s akou sa zvyčajne nachádza v prírode. Ako príklady izotopov, ktoré je možné začleniť do činidiel a ich farmaceutický vhodných solí, je možné uviesť izotopy vodíka, uhlíka, dusíka, kyslíka, fosforu, fluóru a chlóru, ako je 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 180, 170, 31P, 32P, 35S, 18F a 36C1. Určité izotopovo značené varianty činidiel a ich farmaceutický vhodných solí, napríklad značené rádioaktívnymi izotopmi, ako 3H alebo 14C, sú užitočné pri skúškach distribúcie liečiva alebo substrátu v tkanivách. Mimoriadnu prednosť majú trítiované izotopy tzn. 3H, a 14C izotopy, pretože sa dajú lahko pripravovať a detekovať. Nahra- 28 • ·
9 9
9 9 9
9999 9 9
9 9 ·· ···· • 9 • ···
99
9 9 9 • 9 9
9 9
9 9
9999 dením ťažšími izotopmi, ako deutériom, tzn. 2H, je možné dosiahnuť určité terapeutické výhody vyplývajúce z vyššej metabolickej stability, napríklad predĺženia polčasu in vivo alebo zníženia potrebných dávok, ktorým sa za určitých okolností venuje prednosť. Izotopové varianty činidiel a ich farmaceutický vhodných solí je možné pripravovať obvyklými spôsobmi pri použití vhodných izotopových variantov vhodných reagensov.
Odborníkom v tomto odbore bude zrejmé, že činidlo môže byť odvodené od proliečiva. Ako príklady proliečiv je možné uviesť entity, ktoré obsahujú niektorú chránenú skupinu alebo niektoré chránené skupiny a ktoré nemusia vykazovať farmakologickú aktivitu samotné, ale v niektorých prípadoch môžu byť podávané (ako perorálne alebo parenterálne), a potom v organizmu metabolizované za vzniku činidla, ktoré je farmakologicky aktívne.
Na vhodné funkčné skupiny činidiel je možné zaviesť určité zvyšky, známe ako pro-zvyšky, ktoré sú napríklad opísané v publikácii Desing of Prodrugs, H. Bundgaard, Elsevier, 1985 (ktorá je tu citovaná náhradou za prenesenie celého jej obsahu do tohto textu). Také proliečivá rovnako spadajú do rozsahu tohto vynálezu.
pcAMP môže vykazovať ktorúkoívek alebo ktorékoívek z nasledujúcich aktivít: priame alebo nepriame zvyšovanie účinnosti cAMP, priame alebo nepriame zvyšovanie hladiny cAMP, priame alebo nepriame zvyšovanie aktivity cAMP, priame alebo nepriame znižovanie hladiny degradácie cAMP, a priame alebo nepriame znižovanie hladiny inhibície cAMP.
V prednostnom rozpracovaní činidlo podía vynálezu priamo alebo nepriamo zvyšuje hladinu cAMP v genitáliách ženy trpiacej FSAD.
• · • · ···· ·· ···· ·· • · · · • ···· · · · ··· ···· · • · · · · · · • ·· c·· ·· ····
Činidlo podlá vynálezu výhodnejšie priamo alebo nepriamo selektívne zvyšuje hladinu cAMP v genitáliách ženy trpiacej FSAD.
Výhodnejšie činidlo podlá vynálezu priamo alebo nepriamo selektívne zvyšuje hladinu cAMP, pričom cAMP je cAMP indukovaný sexuálnym vzrušením.
Vo vysoko prednostnom rozpracovaní tohto vynálezu činidlo podlá vynálezu zvyšuje relatívne množstvo cAMP indukovaného sexuálnym vzrušením.
Pri niektorých aplikáciách činidlo podlá vynálezu selektívne lieči FSAD.
Podlá jedného aspektu činidlo môže inhibovať alebo antagonizovať vhodný ciel, pričom potencuje hladinu cAMP v genitáliách ženy. V tomto texte sa pod pojmom inhibítor rozumie inhibítor a/alebo angatonista.
Podlá ďalšieho aspektu činidlo môže aktivovať alebo agonizovať vhodný ciel, pričom potencuje hladinu cAMP v genitáliách ženy. V tomto texte sa pod pojmami 'aktivátor a pozitívny regulátor rozumie aktivátor a/alebo pozitívny regulátor a/alebo agonista.
Činidlo teda môže agonizovať, antagonizovať, pozitívne regulovať alebo inhibovať vhodný ciel.
Činidlo podlá vynálezu môže byť jedinou entitou, ktorá je schopná vykazovať dve alebo viac z týchto vlastností. Alternatívne, alebo navyše, môže činidlo podlá vynálezu predstavovať kombináciu činidiel, ktoré sú schopné vykazovať jednu alebo viaceré z týchto vlastností.
• · · ·· ···· • · • ··· ···· · · • · ··· • · · ·· ····
Činidlo prednostne môže selektívne agonizovat, selektívne antagonizovat, selektívne pozitívne regulovať alebo selektívne inhibovať vhodný ciel.
V prednostnom rozpracovaní činidlo môže selektívne agonizovat, selektívne antagonizovat, selektívne pozitívne regulovať alebo selektívne inhibovať selektívny vhodný ciel.
Činidlo tiež môže byt schopné vykazovať jednu alebo viac z ďalších kladných funkčných vlastností, činidlo podlá vynálezu napríklad môže potencovat cAMP a tiež potencovat cGMP.
Pri niektorých aplikáciách (ako pri topickom podávaní) môže činidlo tiež vykazovať inhibičný účinok na ACE (angiotenzín konvertujúci enzým). Skúška na ACE je uvedená v príkladoch uskutočnenia. Pri niektorých aplikáciách (predovšetkým pri niektorých typoch pacientov) také činidlá (tzn. činidlá, ktoré vykazujú inhibičný účinok na ACE) nemusia byt vhodné na perorálne podávanie.
Pri niektorých aplikáciách môže činidlo vykazovať inhibičný účinok na EDE (endotelin konvertujúci enzým). Skúšky na ECE sú v tomto odbore dobre známe.
Farmaceutické kombinácie
Činidlo podlá vynálezu je možné použiť v kombinácii s jedným činidlom alebo väčším počtom činidiel, ako je Pcqjjp (ako inhibítor fosfodiesterázy typu 5, napríklad sildenafil, alebo donor oxidu dusnatého alebo prekurzor oxidu dusnatého, napríklad L-arginín alebo inhibítory arginázy) a/alebo centrálne pôsobiace farmaceutika (napríklad agonista receptoru dopamínu, ako apomorfín alebo selektívny agonista receptoru dopamínu D2, ako PNU-95666 alebo agonista receptoru melanokortínu, ako melanotan II). Použitie apomorfínu ako farma- 31 «· · ···· • · • ··· • · · · · * • · · · · ··· ·· ···· ceutika je možné nájsť v US-A-5945117. Podlá tohto dokumentu je apomorfín podávaný sublinguálne. Navyše, alebo alternatívne, je činidla možné použiť v kombinácii s jednou alebo väčším počtom látok, ktorými sú: inhibítor PDE5 (napríklad sildenafil, vardenafil (Bayer BA 38-9456) a IC351 (Cialis, Icos Lilly), jeden alebo viac donorov oxidu dusnatého (napríklad NMI-921), jeden alebo viac agonistov receptoru dopamínu (napríklad apomorfín, Uprima, Ixsen), jeden alebo viac heterocyklických amínov, ako sú heterocyklické amíny genericky a špecificky opísané vo WO 00/40226, konkrétne v príkladoch č. 7, 8 a 9, jeden alebo viac agonistov receptoru melanokortínu (napríklad Melanotan II alebo PT14), jeden alebo viac otváračov draslíkového kanálu (napríklad otvárač kanálu KATp (napríklad minoxidil, nikorandil) a/alebo vápnikom aktivovaný otvárač draslíkového kanálu (napríklad BMS-204352), alebo jeden alebo viac antagonistov αΐ-adrenoceptoru (napríklad fentolamin, Vasofem, Vasomax), jeden alebo viac agonistov receptorov VIP alebo analógov VIP (napríklad Ro-125-1553) alebo fragmentov VIP, jeden alebo viac antagonistov α-adrenoceptoru v kombinácii s VIP (napríklad Invicorp, Aviptadil), jeden alebo viac antagonistov a2-adrenoceptoru (napríklad yohimbin), jedno alebo viac činidiel na terapeutickú substitúciu hormónu estrogénu, estrogénu a medroxyprogesterónu alebo medroxyprogesterónacetátu (MPA) alebo estrogénu a metyltestosterónu (napríklad HRT, predovšetkým Premarin, Cenestin, Oestrofeminal, Equin, Estrace, Estrofem, Elleste Solo, Estring, Eastraderm, Eastraderm TTS, Eastraderm Matrix, Dermestril, Premphase, Prempro, Prempak, Premique, Estratest, Estratest HS, Tibolone), jedno alebo viac činidiel na substitúciu testosterónu (ako DHEA (dehydroandrostendión), testosterón (Tostrelle) alebo testosterónový implantát (Organon)), jedno alebo viac testosterónových/estradiolových činidiel, jeden alebo viac agonistov estrogénu, napríklad Lasofoxiden, jeden alebo viac agonistov alebo antagonistov receptoru serotonínu (napríklad agonistov a antagonistov receptoru 5HT1A, 5HT2C, 5HT2A • ·· ···· ·· ·· • · · · ···· • · · · ··· · · · ····«· · ··· · · • · · · · · · • ·· ··· ·· ···· a 5HT3, ako sú opísané vo W02000/28993), jeden alebo viac agonistov receptoru prostanoidu (napríklad Muse, alprostadil, misoprostol), jeden alebo viac agonistov purinergického receptoru (predovšetkým P2Y2 a P2Y4), jedno alebo viac antidepresívnych činidiel (napríklad bupropion (Willbutrin), mirrtazapin, nefazodon).
Štruktúra IC351 zodpovedá nasledujúcemu vzorcu
IC351 (Icos Lilly)
Pokial je podávaná kombinácia aktívnych činidiel, je možné tieto činidlá podávať simultánne, oddelene alebo postupne.
Kombinácia s VIP
Činidlom podlá tohoto vynálezu nie je VIP (alebo prednostne jeho analóg alebo fragment). Podlá niektorých rozpracovaní však činidlo podlá vynálezu môže byť podávané spolu s VIP alebo jeho analógom alebo fragmentom.
Vo vysoko prednostnom aspekte VIP alebo jeho analóg alebo jeho fragment nie je podávaný. Dôvodom je informácia, že infúzie VIP vedú k značným kardiovaskulárnym škodlivým účinkom, ako je zvýšenie srdcovej frekvencie a zníženie diastolického arteriálneho tlaku (Ottesen 1983, 1987,
1995).
·· ····
- 33 • 999 • « <
» 9*9 ·· 9« • · · · • · 9 • · · · • · 9 ·· 9999
Okrem toho, i keď Ottesen a spolupracovníci demonštrovali, že VIP pri zdravých dobrovoľníkoch indukuje zvýšenie vaginálneho prekrvenia a lubrikáciu, mechanizmus akým VIP dosahuje tieto účinky nie je jasný. V literatúre je uvedený rad príkladov VIP signalizácie cez rôzne systémy druhých poslov, ako je napríklad cGMP/guanylát cykláza (AshurFabian, 1999); oxid uholnatý (CO)/hem oxygenáza (Fan et al., 1998) a cAMP/adenylát cykláza (Foda, 1995; Shoeffter, 1985; Gu, 1992). To je doložené príkladmi uvedenými v nedávnej správe, ktorá opisuje ako je možné vysvetlit vazorelaxačné účinky VIP v maternicovej artérií uvoľňovaním oxidu dusnatého (Jovanovic, 1998). Existuje teda dôkaz pre VIP moduláciu oxidu dusnatého (NO)/cGMP pri urogenitálnych funkciách samcov (Kim, 1994).
V literatúre sa ďalej uvádza, že VIP neovplyvňuje hladinu cAMP v kultúrach buniek hladkého svalu vagíny (pozri Traish, A., Moreland, R. B., Huang, Y., et al., 1999, Development of human and rabbit vaginal smooth muscle celí cultures: Effects of vasoactive agents on intracellular levels of cyclic nucleotides, Mol. Celí. Biol. Res. Comm., 2, 131 až 137).
Ottesen a spolupracovníci v následných štúdiách (pozri Palle, Bredkjaer, Ottesen a Fahrenkrug, 1990 Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, zv. 17, 61 - 68) uvádzajú, že účinok VIP na vaginálne prekrvenie je bez ohľadu na spôsob podávania súčast systemického vazodilatačného účinku, a nie miestna odpoveď. Okrem toho uvádzajú rad vaskulárnych vedľajších účinkov spojených s VIP - viď flush, hypotenzia a tachykardia.
Hodnoty
Pre niektoré aplikácie má činidlo podľa vynálezu (a prípadne prídavné činidlo) prednostne hodnotu menej ·· ···· ·· ·· • ··· · ·· · • · · · ··· « · · ···· ··· ···· · • · · · · · · • · ·· ··· ·· ···· ako asi ΙΟΟηΜ, výhodnejšie menej ako asi 75nM, výhodnejšie menej ako asi 50nM, výhodnejšie ako asi 25nM, výhodnejšie ako asi 20nM, výhodnejšie ako asi 15nM, výhodnejšie ako asi lOnM a ešte výhodnejšie menej ako asi 5nM.
Hodnoty
Pre niektoré aplikácie má činidlo podlá vynálezu (a prípadne prídavné činidlo) prednostne hodnotu menej ako asi ΙΟΟηΜ, výhodnejšie menej ako asi 75nM, výhodnejšie menej ako asi 50nM, výhodnejšie ako asi 25nM, výhodnejšie ako asi 20nM, výhodnejšie ako asi 15nM, výhodnejšie ako asi lOnM a ešte výhodnejšie menej ako asi 5nM.
Hodnoty Ka
Pre niektoré aplikácie má činidlo podlá vynálezu (a prípadne prídavné činidlo) prednostne hodnotu Ka menej ako asi ΙΟΟηΜ, výhodnejšie menej ako asi 75nM, výhodnejšie menej ako asi 50nM, výhodnejšie ako asi 25nM, výhodnejšie ako asi 20nM, výhodnejšie ako asi 15nM, výhodnejšie ako asi lOnM a ešte výhodnejšie menej ako asi 5nM.
Farmakokinetika
Pri niektorých rozpracovaniach činidlá podlá tohto vynálezu (a prípadne prípadné prídavné činidlá) majú prednostne log D -2 až +4, výhodnejšie -1 až +2. Hodnotu log D je možné stanoviť štandardnými postupmi, ktoré sú v tomto odbore známe, ktoré sú napríklad opísané v J. Pharm. Pharmacol. 1990, 42, 144.
Navyše, alebo alternatívne, pri niektorých rozpracovaniach činidlá podlá tohto vynálezu (a prípadne prípadné prídavné činidlá) prednostne vykazujú caco-2 flux vyšší ako 2 x 10-6 cm.s-1, výhodnejšie vyšší ako 5 x 10-6 ·· ·« • · · · • · ···· ·· ···· • · • ··· • · « · • · · · • · ·· ··· • · · ·· «·»· cm.s“1. Hodnotu caco-2 flux je možné stanoviť štandardnými postupmi známymi v tomto odbore, ako je postup uvedený v J. Pharm. Sci. 79, 7, str. 595 až 600 (1990) a Pharm. Res. zv. 14, č. 6 (1997).
Selektivita
Pri niektorých aplikáciách činidlo podlá vynálezu (a prípadne prípadné prídavné činidlo) vykazuje aspoň 100 násobnú selektivitu na požadovaný ciel, prednostne aspoň 150násobnú selektivitu na požadovaný ciel, prednostne aspoň 200násobnú selektivitu na požadovaný ciel, prednostne aspoň 250násobnú selektivitu na požadovaný ciel, prednostne aspoň 300násobnú selektivitu na požadovaný ciel, a prednostne aspoň 350 násobnú selektivitu na požadovaný ciel.
Pri niektorých aplikáciách činidlo podlá vynálezu (a prípadne prípadné prídavné činidlo) vykazuje aspoň 400 násobnú selektivitu na požadovaný ciel, prednostne aspoň 500násobnú selektivitu na požadovaný ciel, prednostne aspoň 600násobnú selektivitu na požadovaný ciel, prednostne aspoň 700násobnú selektivitu na požadovaný ciel, prednostne aspoň 800násobnú selektivitu na požadovaný ciel, prednostne aspoň 900násobnú selektivitu, a prednostne aspoň lOOOnásobnú selektivitu na požadovaný ciel.
Spôsoby chemickej syntézy
Činidlo sa zvyčajne bude pripravovať chemickou syntézou.
Činidlo alebo ciel alebo ich varianty, homológy, deriváty, fragmenty alebo mimetiká je možné pripravovať pri použití úplne alebo čiastočne chemických spôsobov. Napríklad peptidy je možné syntetizovať postupmi v pevnej fáze, vyštiepením z živice a prečistením preparatívnou vysoko účinnou ·· φφφφ • · • ··· • · φφφφ ·· ·· • · · φ • · e ··· φφφφ · • · ·· φφφφ ··· φ φφ φφφ φφ φφφφ kvapalinovou chromatografiou (napríklad Creighton, 1983, Proteins Structures And Molecular Principles, WH Freeman and Co., New York, NY, USA). Zloženie syntetických peptidov je možné potvrdiť analýzou aminokyselín alebo sekvenovaním (napríklad Edmanov degradačný postup; Creighton pozri hore).
Činidla alebo jeho varianty, homológy, deriváty, fragmenty alebo mimetiká je možné priamo syntetizovať pri použití rôznych postupov v pevnej fáze (Roberge JY et al., 1995, Science 269: 202 až 204) a automatizovanú syntézu je možné vykonávať napríklad pri použití syntetizátoru peptidov ABI 43 IA Peptide Synthesizer (Perkin Elmer) v súladu s inštrukciami poskytovanými výrobcom. Okrem toho je možné za účelom výroby variant činidla alebo cieľa, ako je napríklad variant NEP, aminokyselinovej sekvencie zahŕňajúcej činidlo alebo ktorúkoľvek jeho časť počas priamej syntézy chemicky modifikovať a/alebo kombinovať pri použití sekvencie z iných podjednotiek alebo ktorejkoľvek ich časti.
V alternatívnom rozpracovaní je možné kódujúcu sekvenciu činidla, ciele alebo ich varianty, homológy, deriváty, fragmenty alebo mimetiká celkom alebo sčasti syntetizovať pri použití chemických spôsobov známych v tomto odbore (pozri Caruthers M. H. et al., 1980, Nuc. Acids Res. Symp. Ser. 215 až 223, Horn T., et al., (1980) Nuc. Acids Res. Symp. Ser. 225 až 232).
Mimetikum
Pod pojmom mimetikum sa v tomto texte rozumie ktorákoľvek chemická látka, ktorými neobmedzujúcimi príkladmi sú peptidy, polypeptidy, protilátky alebo iné organické chemické látky, ktoré vzhľadom na cieľ vykazujú rovnakú kvalitatívnu aktivitu alebo účinok ako uvedené činidlo.
·· ···· • ·
I · ··· » · · • · ···· ··· ·· • ·· ·· ·· • · · · • · · • · · • · · ·· ····
Chemický derivát
Pojem derivát” alebo derivatizovaný sa vzťahuje k chemickej modifikácii činidla. Ako ilustratívne príklady takých chemických modifikácií je možné uviesť nahradenie atómu vodíka atómom halogénu, alkylskupinou, acylskupinou alebo aminoskupinou.
Chemické modifikácie
Podlá jedného rozpracovania tohto vynálezu činidlo môže byť chemicky modifikovaným činidlom.
Chemická modifikácia činidla môže bučí posilniť alebo oslabiť vodíkové väzbové interakcie, iónové interakcie, hydrofóbne interakcie, Van Der Waalsove interakcie alebo dipólové reakcie medzi činidlom a cielom.
Podlá jedného aspektu identifikované činidlo môže účinkovať ako model (napríklad templát) pre vývoj iných zlúčenín.
Rekombinantné postupy
Ciel pri použití pri skúškach podlá vynálezu je zvyčajne možné pripraviť postupmi génového inžinierstva.
Potenciácia cGMP
Pod pojmom potenciácia sa vo vzťahu k cGMP rozumie jeden alebo väčší počet z nasledujúcich javov: zvýšenie účinnosti cGMP, zvýšenie hladiny cGMP, zvýšenie aktivity cGMP, zníženie hladiny degradácie cGMP a zníženie hladiny inhibície cGMP.
• · ···· ·· ···· • · · • · ··· • · · · · • · · · • ·· ··· ·· ·· • · · · • · · • · · • · · ·· ····
Potenciačný účinok môže byt priamy. Alternatívne tento účinok môže byt účinkom sekundárnym a/alebo účinkom v smere toku (downstream effect).
V prednostnom rozpracovaní činidlo, ktoré potencuje cGMP pôsobí na IcGMp a/alebo AMcGMp, pričom modulátor cGMP má negatívny účinok na cGMP, takže činidlo znižuje a/alebo eliminuje a/alebo prekrýva (maskuje) a/alebo odvráti nežiadúci účinok IcGMp a/alebo AMcGMp na cGMP.
Predmetom vynálezu je teda kombinácia jedného alebo viacerých l!lc^Mp a jedného alebo viacerých I:lcGnp· V jednom rozpracovaní j® I:PDEcGMP’
-cAMP a/aleb° ^cAMP
Ukázali sme, že cAMP sprostredkováva prekrvenie genitálií (napríklad vagíny alebo klitorisu) a posilnením cAMP signalizácie môžeme zvýšit prekrvenie genitálií (napríklad vagíny alebo klitorisu) u zvieracieho modelu. Činidlo, ktoré pozitívne reguluje/posilňuje vazorelaxáciu sprostredkovanú cAMP teda bude účinné pri liečení FSAD.
Látky IcAMP a AMcAMp majú negatívny účinok na hladinu alebo aktivitu cAMP. Na zjednodušenie tieto látky označujeme ako ^cAMP a/alebo AMcAMp.
Vzhladom na hore uvedené, činidlom môže byt I:IcAMP a/alebo I:AMcAMp.
Činidlo môže byt jedinou entitou, ktorá je schopná vykazovat dve alebo viac z týchto vlastností. Alternatívne, alebo navyše, môže činidlo podlá vynálezu predstavovat kombináciu činidiel, ktoré sú schopné vykazovat jednu alebo viac z týchto vlastností.
• · '»· · • · · • ···· · • · »· · · ·· ···· • · · • · ··· • · · • · · ·· ··· ·· • · · · • · · • · · · • · · ·· ···· ··
Ako príklady Icamp a AMcAMp je možné uviesť jednu alebo viac PDE a prípadne prídavné ciele, ako NPY alebo NEP, alebo akúkoívek zložku, ktorá je s nimi združená.
Touto združenou zložkou môže napríklad byť receptor a/ alebo kofaktor.
Činidlo I:PDEcAMp je teda možné používať spolu s jednou alebo viacerými látkami zvolenými zo súboru skladajúceho sa z I:NPY (niekedy označovaný ako NPYi), I:NPY Yn (niekedy označovaný ako NPY YnI) a I:NEP.
V tomto prípade podobne platí, že činidlo môže byť jedinou entitou, ktorá je schopná vykazovať dve alebo viac z týchto vlastností. Alternatívne, alebo navyše, môže činidlo podlá vynálezu predstavovať kombináciu činidiel, ktoré sú schopné vykazovať jednu alebo viac z týchto vlastností.
I:IcAMP a/alebo I:AMcAMp
V súvislosti s týmto vynálezom sa zistilo, že FSAD je možné liečiť alebo jej predchádzať pri použití činidla, ktoré znižuje a/alebo eliminuje a/alebo prekrýva a/alebo odvráti nežiadúci účinok ICj^p a/alebo AMcAMp na cAMP. Činidlo môže dokonca obnoviť hladinu cAMP, ktorá bola znížená pôsobením Icamp a/alebo AMcAMp. Na zjednodušenie tieto látky označujeme ako I:IcAMP a/alebo I:AMcAMp. I:IcAmp a I:AMCÄMp zabraňujú negatívnemu účinku na hladinu alebo aktivitu cAMP alebo tento účinok znižujú.
Podlá jedného prednostného aspektu je činidlom I:IcAMP a/alebo I:AMCAMp, kde ΑΜοΑΜρ má negatívny účinok na AMcAMp.
AcAMP
V súvislosti s týmto vynálezom sme zistili, že • · ·· · • · · • ···· · ·· ···· • · · • · ··· • · · • · · ·· ·· • · t e • · · • · · · • · · ·· ···· jednou z dôležitých príčin FSAD je nízka hladina alebo nízka aktivita cAMP v genitáliách ženy.
Činidlom čiže môže byť U:ACAMP'
Činidlo podlá vynálezu teda prednostne môže byť schopné pôsobiť ako jedna alebo viac látok zvolených z A:AC, A:VIPr, A:VIPn, I:I:VIPr alebo I:I:VIPn a/alebo je činidlo podlá vynálezu možné použiť spolu s jednou alebo väčším počtom hore uvedených látok.
Činidlo môže byť jedinou entitou, ktorá je schopná vykazovať dve alebo viac z týchto vlastností. Alternatívne, alebo navyše, môže činidlo podlá vynálezu predstavovať kombináciu činidiel, ktoré sú schopné vykazovať jednu alebo viaceré z týchto vlastností.
U:AcAMP
V inom rozpracovaní prídavným cielom môže byť zložka, ktorá zvyšuje hladinu cAMP. Činidlo teda tiež môže pôsobiť ako U:AC.
Činidlo podlá vynálezu môže tiež byť schopné pôsobiť napríklad ako ktorékolvek jedno činidlo alebo viac činidiel, pričom týmto činidlom môže byt ktorákolvek jedna látka zvolená z U:AcAMp, A:AC, A:VIPr, A:VIPn, I:I:VIPr alebo I:I:VIPn a/alebo je činidlo podlá vynálezu možné použiť spolu s jedným takým činidlom alebo väčším počtom takých činidiel.
Cielom môže napríklad byť cAMP samotný alebo AC alebo VIP (alebo ich kombinácie).
Kombinácie I:IcAmp a/alebo I:McAMp a/alebo U:AcAMp ·· ···· • · • ··· ····
·· ·· • · · · • · · • · ♦ • · · ·· ····
Podlá ďalšieho aspektu je činidlo podlá vynálezu možné použiť s kombináciou potenciátorov cAMP. Činidlo podlá vynálezu je teda napríklad možné použiť v kombinácii s jednou látkou alebo viacerými látkami zvolenými z
I
I
I
I
I u
A
A
A
I
I PDECAMP PDEncAMP
NPY
NPY Yn NEP AcAMP
AC
VlPr V!pn I:VIPr I:VIPn a cAMP mimetik.
Inhibítor
Pod pojmom inhibítor, ako sa používa v tomto texte v súvislosti s činidlom podlá vynálezu, sa rozumie činidlo, ktoré znižuje a/alebo eliminuje a/alebo zakrýva a/alebo zabraňuje negatívnemu pôsobeniu Iq^jjp a/alebo negatívnemu pôsobeniu McAMP na cAMP. Inhibítor môže pôsobiť ako antagonista. Ako príklad antagonistu je možné uviesť I:NPY, pokial sa používa ako prídavné činidlo.
Aktivátor
Pod pojmom aktivátor, ako sa používa v tomto texte v súvislosti s činidlom podlá vynálezu, sa rozumie činidlo, ktoré zvyšuje a/alebo produkuje a/alebo odkrýva a/alebo zväčšuje a/alebo zaisťuje pôsobenie cAMP a/alebo AcAMP* Aktivátor môže pôsobiť ako agonista.
9999 ···· • 9 9
9 ···
9 9
999
9· • · · · • · ·
9 9 9
9 · «9 9999
Iné aktívne zložky
Podlá ďalšieho aspektu môže činidlo podlá vynálezu dokonca byť v kombinácii s jednou alebo viacerými inými aktívnymi zložkami, ako je jedno alebo viac činidiel schopných potencovať cGMP.
Aminokyselinová sekvencia
Pojem aminokyselinová sekvencia, ako sa používa v tomto texte, je synonymom s pojmom polypeptid a/alebo pojmom proteín. V niektorých prípadoch je pojem aminokyselinová sekvencia synonymom pojmu peptid. V niektorých prípadoch je pojem aminokyselinová sekvencia synonymom pojmu proteín.
Aminokyselinovú sekvenciu je možné pripraviť izoláciou s vhodného zdroja, alebo ju je možné vyrobiť synteticky alebo pri použití postupov génového inžinierstva.
Podlá jedného aspektu je predmetom vynálezu aminokyselinová sekvencia, ktorá je schopná pôsobiť ako ciel pri skúškach v rámci identifikácie jedného alebo väčšieho počtu činidiel a/alebo ich derivátov, ktoré sú schopné ovplyvniť aminokyselinovú sekvenciu za účelom potenciácie cAMP na liečenie FSAD.
Nukleotidová sekvencia
Pojem nukleotidová sekvencia, ako sa používa v tomto texte, je synonymom s pojmom polynukleotid.
Nukleotidovou sekvenciou môže byť DNA alebo RNA genómová alebo syntetická alebo rekombinantného pôvodu. Nukleotidová sekvencia môže byť dvojreťazcová alebo jedno• · 9 ···· « · ·· ···· • 9 9· 999 ·· ·· • · · · • · · reťazcová, ktorá môže predstavovať negatívny alebo pozitívny reťazec alebo ich kombinácie.
Pri niektorých aplikáciách je nukleotidovou sekvenciou prednostne DNA.
Pri niektorých aplikáciách sa nukleotidová sekvencia pripraví pri použití postupov rekombinácie DNA (napr. rekombinantnej DNA).
Pri niektorých aplikáciách je nukleotidovou sekvenciou prednostne cDNA.
Pri niektorých aplikáciách sa venuje prednosť nukleotidovej sekvencii, ktorá v tomto ohlade môže byť zhodná so sekvenciou, ktorá sa vyskytuje v prírode.
Podlá jedného aspektu je predmetom vynálezu nukleotidová sekvencia kódujúca látku schopnú pôsobiť ako ciel pri skúške (ako kvasinkovej dvojhybridovej skúške), ktorou sa identifikuje jedno činidlo alebo väčší počet činidiel a/alebo ich derivátov, ktoré sú schopné ovplyvniť látku, aby potencovala cAMP pri liečení FSAD.
Odborníkovi v tomto odbore bude zrejmé, že ciele môže kódovať rad rôznych nukleotidových sekvencii, čo je následok degenerácie genetického kódu. Je možné predpokladať, že odborník v tomto odbore je pri použití rutinných postupov schopný vykonať substitúcie nukleotidov, ktoré v podstate neovplyvnia aktivitu kódovanú nukleotidovou sekvenciou podlá vynálezu, aby sa prejavilo využitie kodónov akéhokoľvek konkrétneho hostiteľského organizmu, v ktorom má byť ciel exprimovaný. Pojem variant, homológ alebo derivát uvedený v súvislosti s nukleotidovou sekvenciou uvedenou v pripojenom sekvenčnom protokole zahŕňa akúkoľvek substitúciu, variáciu, modifikáciu, nahradenie, deléciu alebo • · • ··· • · ···· • · • ··· ·· ·· • · · · • · · • · · • · · ·· ···· adíciu jednej nukleovej kyseliny alebo viacerých nukleových kyselín z alebo do sekvencie za vzniku výslednej nukleotidovej sekvencie, ktorá kóduje funkčný ciel podlá vynálezu (alebo dokonca činidlo podlá vynálezu, pokial toto činidlo zahŕňa nukleotidovú sekvenciu alebo aminokyselinovú sekvenciu) .
Ako je naznačené hore, čo sa týka homológie sekvencií, venuje sa prednosť aspoň 75%, výhodnejšie aspoň 85%, ešte výhodnejšie aspoň 90% homológii vzhíadom na sekvencie uvedené v sekvenčnom protokole. Výhodnejšia je aspoň 95% a ešte výhodnejšia je aspoň 98% homológia. Porovnanie nukleotidovej homológie je možné vykonávať hore opísaným postupom. Prednostným programom na porovnávanie sekvencii je program GCG Wisconsin Bestfit opísaný hore. Implicitná bodovacia matica priraďuje hodnotu 10 každej zhode dvoch rovnakých nukleotidov a hodnotu -9 každej nezhode. Implicitná penalizácia vytvorenia medzery je -50 a implicitná penalizácia predĺženia medzery je -3 za každý nukleotid.
Predmetom vynálezu je tiež nukleotidová sekvencia, ktorá je schopná selektívnej hybridizácie s tu uvedenými sekvenciami, alebo akýmkolvek ich variantom, fragmentom alebo derivátom, alebo akýmkolvek ich komplementom. Nukleotidové sekvencie majú dĺžku prednostne aspoň 15 nukleotidov, výhodnejšie aspoň 20, 30, 40 alebo 50 nukleotidov.
Tieto sekvencie je tiež možné používať ako sondy, napríklad v diagnostických kitoch.
Varianty/homológy/deriváty
Okrem uvedených konkrétnych aminokyselinových sekvencii a nukleotidových sekvencii je predmetom vynálezu tiež použitie ich variantov, homológov a derivátov. Pojem homológia je možné tiež vyjadriť ako zhodu.
··· • · · ···· · · ·· ···· • · • ··· • · · • · ·· ··· ·· ·· • · · · • · · • · · • · · ·· ····
V tomto kontexte je za homologickú sekvenciu braná aminokyselinová sekveneia, ktorá vykazuje aspoň 75%, 85% alebo 90% zhodu, prednostne aspoň 95 alebo 98% zhodu. Homológia by sa mala zvyčajne brať do úvahy pri tých oblastiach sekvencie, o ktorých je známe, že sú podstatné pre aktivitu. Hoci homológia môže byť tiež chápaná ako podobnosť (napríklad pri aminokyselinových zvyškoch s podobnými chemickými vlastnosťami alebo funkciami), v kontexte tohto vynálezu sa prednostne rozumie homológia v zmysle zhody sekvencie.
Porovnávanie sekvencii s hladiska homológie je možné vykonávať odhadom, alebo lepšie pri použití lahko dostupných programov na porovnávanie sekvencii. Tieto počítačové programy dostupné na trhu sú schopné vyrátať percento homológie medzi dvoma alebo viacerými sekvenciami.
Percento homológie je možné vyrátať cez juxtaponované sekvencie, tzn. jedna sekveneia sa vyrovná s druhou sekvenciou a každá aminokyselina v jednej sekvencii sa porovná priamo so zodpovedajúcou aminokyselinou v druhej sekvencii, jeden zvyšok v rovnaký čas. Tento postup je označovaný ako zoradenie sekvencii bez medzier (ungappéd alignment). Zvyčajne sa také zoradenie bez medzier uskutočňuje iba pri malom počte zvyškov.
Tento velmi jednoduchý a logický postup však zlyháva, kedí má napríklad brať do úvahy, že v inak identickom páre sekvencii jedna inzercia alebo delécia vyvolá vyradenie nasledujúcich sekvencii z alignmentu. To v prípade vykonania celkového alignmentu potenciálne vedie k velkému zníženiu percenta homológie.
Väčšina spôsobov porovnávania sekvencii je teda navrhnutá tak, aby sa dosiahli optimálne alignmenty, ktoré berú do úvahy možné inzercie a delécie, bez toho aby bolo prílišne penalizované skóre homológie. To sa dosiahne zavá-
- 46 ·· · • · · • ···· · • · ··· · ·· ···· • · • ··· dzaním medzier do sekvenčného alignmentu, čím sa skúša maximalizovať miestna homológia.
Tieto zložitejšie postupy však pridelujú medzerové penále každej medzere, ktorá sa v alignmente vyskytuje tak, že pre rovnaký počet identických aminokyselín, sekvenčný alignment s čo možné najmenším počtom medzier - pri reflexii vyššej príbuznosti dvoch porovnávaných sekvencii - dosiahne vyššie skóre ako alignment s radom medzier. Zvyčajne sa používajú afinné hodnoty medzery, ktoré priraďujú relatívne vysokú hodnotu existencii medzery a nižšie penále každému následnému zvyšku v medzere. To je najčastejšie používaný systém vyhodnocovania medzier. Vysoká penalizácia medzier samozrejme povedie k optimalizovaným alignmentom s menším počtom medzier. Väčšina alignmentových programov umožňuje medzerové penále modifikovať. Avšak pokial sa využíva taký Software na porovnávanie sekvencii, majú prednosť implicitné hodnoty. Napríklad keď sa použije balíček GCG Wisconsin Bestfit (pozri dalej) implicitné medzerové penále pre aminokyselinovú sekvenciu je -12 za medzeru a -4 za každé predĺženie.
Vyratúvanie maxima percentuálnej homológie teda najskôr vyžaduje prípravu optimálneho alignmentu (zoradenia), pričom sa berú do úvahy medzerové penalizácie. Vhodným programom na toto vyratúvanie je balíček GCG Wisconsin Bestfit (University of Wisconsin, USA; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12; 387). Ako neomedzujúce príklady iných Software, ktoré sú schopné porovnávať sekvencie, je možné uviesť balíček BLAST (pozri Ausubel et al., 1999, tamtiež - kapitola 18), FASTA (Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403 až 410) a súpravu porovnávacích nástrojov GENENWORKS.
Ako BLAST, tak i FASTA sú rešeršovateíné offline i online (pozri Ausubel et al., 1999, tamtiež, str. 7-58 až 7-60). Prednosť sa však venuje programu GCG Bestfit. Na porovnávanie proteínu a nukleotidovej sekvencie je tiež dostupný nový nástroj, BLAST 2 Sequences (viz FEMS Microbiol. Lett., 1999,
- 47 ·· ··· · ·· ·· • · · · • · · • 9 9 9 9 9 · ·· 999 99 999·
174(2): 247 až 250; FEMS Microbiol. Lett., 1999, 177(1):
187 až 188 a tatiana@ncbi.nlm.nih.gov).
Hoci konečné percento homológie je možné merat ako zhodu, proces alignmentu (zorad'ovaní) samotný zvyčajne nie je založený ná párovom porovnaní všetko alebo nič. Namiesto toho sa zvyčajne používa vyvážená matica skre podobnosti, ktorá priraďuje skóre každému párovému porovnaniu na základe chemickej podobnosti alebo evolučnej vzdialenosti. Ako príklad takej zvyčajne používanej matice je možné uviest maticu BLOSUM62 - implicitnú matici pre programovú súpravu BLAST. Programy GCG Winconsin zvyčajne využívajú buď všeobecné implicitné hodnoty alebo tabulku zákazníckych symbolov, pokial je dodaná (ďalšie podrobnosti pozri v užívateľskom manuále). Pri balíčku GCG sa venuje prednosť použitiu všeobecných implicitných hodnôt, alebo v prípade iného Software implicitnej matici, ako je BLOSUM62.
Ako náhle Software poskytne optimálne zoradenie, je možné vyrátať percento homológie, prednostne percento zhody sekvencie, čo Software zvyčajne vykoná ako súčasť porovnaní sekvencii a generuje číselný výsledok.
Sekvencie tiež môžu obsahovať delécie, inzercie alebo substitúcie aminokyselinovýeh zvyškov, ktoré vedú k tichým zmenám, a funkčne ekvivalentnej látke. Úmyselné substitúcie aminokyselín je možné uskutočňovať na základe podobnosti polarity, náboja, rozpustnosti, hydrofóbnosti, hydrofility a/alebo amfipatického charakteru zvyšku, pokial zostane zachovaná sekundárna väzbová aktivita látky. Napríklad ako negatívne nabité aminokyseliny je možné uviest kyselinu asparágovú a kyselinu glutámovú; ako pozitívne nabité aminokyseliny je možné menovať lyzín a arginín; a aminokyselinami s nenabitými polárnymi hlavnými skupinami s podobnými hodnotami hydrofóbnosti sú napríklad leucín, izoleucín,
- 48 ·· ··· · » · · ·· ·· ι valín, glycín, alanín, asparagín, glutamín, serín, treonín, fenylalanín a tyrozín.
Konzervatívne substitúcie je možné realizovať napríklad podía tabuíky uvedenej dalej. Vzájomne sa môžu nahradzovať aminokyseliny uvedené v rovnakom okienku v druhom stĺpci a prednostne v rovnakom riadku v tretom stĺpci.
Alifatické Nepoláme GAP
I L V
Polárne - nenabité C S T M
N Q
Polárne - nabité D E
K R
Aromatické H F W Y
Do rozsahu vynálezu tiež spadajú homologické substitúcie (ako pojem substitúcia, tak pojem nahradenie sa používa na označenie výmeny existujúceho aminokyselinového zvyšku za zvyšok alternatívny), ku ktorým môže dôjsť, tzn. substitúcia podobného zvyšku za podobný, ako bázického za bázický, kyslého za kyslý, polárneho za polárny apod. Rovnako môže dôjsť k nehomologickej substitúcii, tzn. náhrade zvyšku z jednej triedy za zvyšok z triedy inej, alebo alternatívne táto substitúcia môže zahŕňať začlenenie neprirodzených aminokyselín, ako ornitínu (ktorý je tu označovaný ako Z), diaminomaslovej kyseliny ornitínu (označovaný ako B), norleucínu ornitínu (označovaný ako O), pyriylalanínu, tienylalanínu, naftylalanínu a fenylglycínu.
Na nahradenie je tiež možné použit neprirodzené aminokyseliny, ako alfa* a alfa-disubstituovanú* aminokyselinu*, N-alkylaminokyselinu*, kyseliny mliečnu*, halo·· e· ······ ·· • o e ··· ···· «·· · ···· · · · o ···· ··· ···· · o · · · · · · · •φο · ·· ··· ·· ····
- 49 genidové deriváty prirodzených aminokyselín, ako trifluórtyrozín*, p-Cl-fenylalanín*, p-Br-fenylalanín*, p-I-fenylalanm , L-alylglycín , L-epsilon-aminokaproovú kyselinu#, 7-aminoheptánovú kyselinu*, L-metionínsulfón*#, L-norleucín , L-norvalín , p-nitro-L-fenylalanín , L-hydroxyprolín#, L-tioprolín*, metylová deriváty fenylalanínu (Phe), ako je 4-metyl-Phe*, pentametyl-Phe*, L-Phe (4-amino)#, L-Tyr (metyl)*, L-Phe (4-izopropyl)*, L-Tic (1,2,3,4-tetrahydroizochinolín-3-karboxylovú kyselinu)*, L-diaminopropiónovú kyselinu a L-Phe (4-benzyl) . Označenie bolo použité na účely predchádzajúcej diskusie (týkajúcej sa homologických alebo nehomologických substitúcii), pričom označuje hydrofóbny charakter derivátu, zatial čo # označuje hydrofilný charakter derivátu, kombinácia týchto znamienok (*#) označuje amfipatické vlastnosti.
Variantné aminokyselinové sekvencie môžu obsahovat vhodné medzerníkové skupiny, ktoré je možné vložit medzi dva aminokyselinové zvyšky sekvencie. Takými medzerníkmi môžu okrem aminokyselinových medzerníkov, ako zvyškov glycínu alebo β-alanínu, byt alkylskupiny, ako metyl-, etyl- alebo propylskupina. V ďalšom variante je prítomný jeden aminokyselinový zvyšok alebo väčší počet aminokyselinových zvyškov v peptoidnej forme. Tento výraz bude síce odborníkom v tomto odbore dobre známy, ale z dôvodov prehladnosti uvádzame jeho definíciu: pojem peptoidná forma sa používa na označenie variantných aminokyselinových zvyškov, v ktorých je substituent α-uhlíka viazaný k dusíkovému atómu tohto zvyšku, a nie k α-uhlíku. Spôsob výroby peptidov v peptoidnej forme je známy a je možné ho nájst napríklad v Šimon,
R. J. et al., PNAS (1992) 89(20), 9362 až 9371 a Horwell,
D. C., Trends Biotechnol. (1995), 13(4), 132 až 134.
- 50 • · ·· ···· ·· ·· ·· · ··· · · · · • · · · · ··· · · · • ···· · · · · · · · · • · · · · · · · ··· · ·· ··· ·· ····
Hybridizácia
Predmetom vynálezu je ďalej použitie sekvencií, ktoré sa môžu hybridizovať s cielovými sekvenciami uvedenými v tomto texte, ako v prípade, že činidlo je pozitívna sekvencia .
Pod pojmom hybridizácia sa rozumie spôsob, ktorým sa reťazec nukleovej kyseliny spojuje s komplementárnym reťazcom prostredníctvom párovania báz, ako tiež spôsob amplifikácie, ktorá sa vykonáva PCR postupmi (polymerázou katalyzovanej reakcie).
Nukleotidové sekvencie podlá vynálezu, ktoré sú schopné selektívnej hybridizácie s nukleotidovými sekvenciami opísanými v tomto texte, alebo ich komplemento-m, budú zvyčajne vykazovať aspoň 75%, prednostne aspoň 85% alebo 90%, a výhodnejšie aspoň 95% alebo 98% homológiu so zodpovedajúcou komplementárnou nukleotidovou sekvenciou uvedenou v tomto texte v oblasti s dĺžkou aspoň 20, prednostne aspoň 25 alebo 30, napríklad aspoň 40, 60 alebo 100 alebo viac susediacich nukleotidov. Prednostná nukleotidová sekvencia podlá vynálezu zahŕňa oblasti homologické s nukleotidovými sekvenciami uvedenými v SEQ ID NO: 2 sekvenčného protokolu podlá vynálezu, prednostne homologickéj z 80 % alebo 90 %, výhodnejšie aspoň z 95 %, s nukleotidovou sekvenciou uvedenou v SEQ ID NO: 2 v sekvenčnom protokole tohto vynálezu.
Pojmom selektívne hybridizovatelná sa rozumie, že nukleotidová sekvencia, pokial sa používa ako sonda, sa používa za podmienok, o ktorých bolo zistené, že umožňujú hybridizáciu cielovej nukleotidovéj sekvencie so sondou v úrovni významne vyššej, ako je úroveň pozadia. K hybridizácii pozadia môže dôjsť vzhladom na prítomnosť iných nukleotidových sekvencií, napríklad v knižnici cDNA alebo ge- 51 nómovej DNA, ktorá je prehľadávaná. V tomto prípade pozadie znamená hladinu signálu generovaného interakciou medzi sondou a nešpecifickým DNA členom knižnice, ktorý je menej ako desaťnásobne, prednostne menej ako stonásobne intenzívnejší ako špecifická interakcia s cielovou DNA. Intenzitu interakcie je možné napríklad merať rádioaktívnym značením sondy, napríklad pomocou 32P.
Hybridizačné podmienky sú založené na teplote topenia (Tt) väzbového komplexu nukleovej kyseliny (pozri Berger a Kimmel, 1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, zv. 152, Academic Press, San Diego, CA, USA) a prepožičajú definovanú stringenciu, ako je vysvetlené ďalej.
Maximálna stringencia sa zvyčajne dosahuje pri teplote približne Tt-5°C (tzn. pri teplote o 5°C nižšej, ako je teplota topenia sondy); vysoké stringencie pri teplote o asi 5 až 10°C nižšej ako Tt; stredné stringencie pri teplote o asi 10 až 20°C nižšej ako Tt; a nízke stringencie pri teplote o asi 20 až 25°C nižšej ako Tt. Odborníkovi v tomto odbore bude zrejmé, že hybridizácia za maximálnej strigencie sa bude používať na identifikáciu alebo detekciu identických nukleotidových sekvencií, zatial čo hybridizáciu za strednej (alebo nízkej) stringencie je možné použiť na identifikáciu alebo detekciu podobných alebo príbuzných polynukleotidových sekvencií.
V prednostnom aspekte do rozsahu vynálezu spadajú nukleotidová sekveneie, ktoré sa môžu hybridizovať s nukleotidovými sekvenciami podlá vynálezu za stringentných podmienok (napríklad 65°C a O,1XSSC (1XSSC = 0,15M chlorid sodný, 0,015M citran sodný, pH 7,0). V prípade, že je nukleotidová sekvencia podlá vynálezu dvojreťazcová, do rozsahu vynálezu spadajú obidva reťazce duplexu, buď jednotlivo alebo v kombinácii. Pokial je nukleotidová sekvencia jedno• · ·· ···· ·· ·· ··· ··· ···· • · · · · ··· · · · • ···· ··· ···· · • · · · · · · · ··· · ·· ··· ·· ····
- 52 reťazcová, do rozsahu vynálezu spadá tiež jej komplementárna sekvencia.
Nukleotidové sekvencie, ktoré nie sú zo 100 % homologické so sekvenciami podlá vynálezu, ale do rozsahu vynálezu spadajú, je možné získať radom spôsobov. Iné varianty tu opísaných sekvencii je možné získať napríklad sondovaním DNA knižníc z rôznych zdrojov. Okrem toho je možné získať iné vírusové/bakteriálne, alebo bunkové homológy, predovšetkým bunkové homológy, ktoré sa nachádzajú v cicavčích bunkách (napríklad bunkách potkanov, myší, hovädzieho dobytka a primátov), a také homológy a ich fragmenty sú zvyčajne schopné selektívnej hybridizácie so sekvenciami uvedenými v pripojenom sekvenčnom protokole. Také sekvencie je možné získať sondovaním cDNA knižníc alebo knižníc genómovej DNA iných druhov živočíchov, a sondovaním takých knižníc sondami, ktoré obsahujú celú nukleotidovú sekvenciu opísanú v tomto texte alebo jej časť za podmienok strednej až vysokej stringencie. Hore uvedené je možné podobne vztiahnuť na získanie druhových homológov a alelických variantov aminokyselinových a/alebo nukleotidových sekvencii podlá vynálezu.
Varianty a kmeňové/druhové homológy je možné tiež získať pri použití degenerovanej PCR, pri ktorej sa používajú prajmery vytvorené pre výber sekvencii v rámci variantov a homológov kódujúcich konzervované aminokyselinové sekvencie v sekvenciách podlá tohto vynálezu. Konzervované sekvencie je napríklad možné predpovedať zoradením aminokyselinových sekvencií z niekolkých variantov/homológov. Sekvenčné alignmenty je možné vykonávať pri použití počítačového Software, ktorý je v tomto odbore známy. Takým programom je napríklad rozšírený program GCG Wisconsin PileUp. Prajmery, ktoré sa používajú pri degenerovanej PCR, obsahujú jednu alebo viac degenerovaných polôh a používajú sa za menej stringentných
- 53 ·· ···· ·· ·· » · · I podmienok, ako sú podmienky klonovania sekvencii pri použití jednosekvenčných prajmerov proti známym sekvenciám.
Alternatívne je nukleotidové sekvencie možné získať miestne cielenou mutagenézou charakterizovaných sekvencii, ako je nukleotidová sekvencia uvedená v SEQ ID NO: 2 v priloženom sekvenčnom protokole. To môže byť napríklad užitočné v prípade, že z dôvodov optimalizácie kodónových preferencií pre konkrétnu hostiteľskú bunku, v ktorej má byt nukleotidová sekvencia exprimovaná, sú potrebné tiché zmeny kodónov. Iné sekvenčné zmeny môžu byť žiadúce za účelom zavedenia rozpoznávacích miest reštrikčných enzýmov alebo za účelom zmeny aktivity proteínu kódovaného nukleotidovou sekvenciou.
Nukleotidové sekvencie podľa vynálezu je možné používať pri produkcii prajmeru, napríklad PCR prajmeru, prajmeru na alternatívnu amplifikačnú reakciu, sondy, napríklad sondy obvyklými postupmi značenej indikačnými rádioaktívnymi alebo nerádioaktívnymi značkami, alebo je nukleotidové sekvencie možné klonovať do vektorov. Také prajmery, sondy a iné fragmenty budú mať dĺžku aspoň 15, prednostne aspoň 20, napríklad aspoň 25, 30 alebo 40 nukleotidov, a rovnako spadajú do rozsahu pojmu nukleotidová sekvencia podlá tohto vynálezu, ako je definovaný v tomto texte.
Nukleotidové sekvencie, ako DNA polynukleotidy a sondy podlá vynálezu, je možné získať postupmi génového inžinierstva, synteticky alebo akýmikoľvek spôsobmi, ktoré sú odborníkom v tomto odbore dostupné. Tiež je ich možné klonovať pri použití štandardných postupov.
Prajmery sa zvyčajne získavajú syntetickými postupmi, čo zahŕňa stupeň odbornej výroby požadovanej nukleotidovej sekvencie po jednom nukleotidu. Túto výrobu je možné
- 54 • · ·· ···· ·· ·· ··· ··· ···· • · · · · ··· · · · « ···· ··· · · · · · • · · · ···· ··· · ·· ··· ·· ···· vykonávať pri použití automatizovaných postupov, ktoré sú v tomto odbore lahko dostupné.
Dlhšie nukleotidové sekvencie sa zvyčajne pripravujú pri použití postupov génového inžinierstva, napríklad pri použití PCR klonovacích techník. Pri takom postupe sa najskôr pripraví pár prajmerov (napríklad s asi 15 až 30 nukleotidmi) lemujúca oblasť sekvencie, ktorá sa má klonovať, prajmery sa uvedú do styku s mRNA alebo cDNA získanou z živočíšnych alebo ludských buniek, vykoná sa polymerázová reťazová reakcia (PCR) za podmienok, ktoré vyvolávajú amplifikáciu požadovanej oblasti, amplifikovaný fragment sa izoluje (napríklad tak, že sa reakčná zmes prečistí na agarózovom géli) a izoluje sa amplifikovaná DNA. Prajmery môžu byt zostavené tak, aby obsahovali vhodné rozpoznávacie miesta pre reštrikčné enzýmy, takže sa amplifikovaná DNA môže klonovať do vhodného klonovacieho vektoru.
Vzhladom na inherentnú degeneráciu genetického kódu je pre klonovanie a exprimovanie delových sekvencii možné použit aj iné DNA sekvencie, ktoré kódujú v podstate rovnaké alebo funkčne ekvivalentné aminokyselinové sekvencie. Odborníkovi v tomto odbore bude zrejmé, že pre niektoré expresné systémy môže byt výhodné získať cielové sekvencie s neprirodzenými kodónmi. Kodóny preferované konkrétnym prokaryontným alebo eukaryontným hostitelom (Murray E. et al., 1989, Nuc. Acids Res. 17: 477 až 508) môžu byt napríklad zvolené tak, aby zvyšovali cielovú expresiu alebo produkovali transkripty rekombinantnej RNA, ktoré oproti prirodzenej sekvencii vykazujú požadované vlastnosti, ako dlhší polčas.
Expresné vektory
Nukleotidové sekvencie na použitie ako ciel alebo na expresiu ciela je možné začleniť do rekombinantného replikovatelného vektoru. Vektor je možné použit na repliβ 9 99 ·99· ·· 99
I» ο · 9 9 · «999
Ο 9 · «99·· 0 9 9 « ···· 999 · · β 9 9
Ο 9 99 9999
999 9 ·9 999 99 9999 káciu a expresiu nukleotidovej sekvencie v kompatibilnej hostiteľskej bunke a/alebo z kompatibilnej hostiteľskej bunky. Expresiu je možné regulovať pri použití regulačných sekvencií, ktoré obsahujú promotory/zosilňovače a iné expresné regulačné signály. Je možné použit prokaryontné promotory a promotory, ktoré pôsobia v eukaryontných bunkách.
Je možné použit tkanivové špecifické alebo stimulačne špecifické promotory. Tiež je možné použit chimerické promotory, ktoré obsahujú časti sekvencií z dvoch alebo viacerých rôznych promotorov opísaných hore.
Proteín produkovaný hostiteľskou rekombinantnou bunkou prostredníctvom expresie nukleotidovej sekvencie môže byt vylúčený alebo môže zostat obsiahnutý vnútri bunky v závislosti od použitej sekvencie a/alebo použitého vektoru. Kódujúcu sekvenciu je možné zostaviť so signálnymi sekvenciami, ktoré vedú sekréciu látky kódujúcej sekvencie cez membránu konkrétnej prokaryontnéj alebo eukaryontnej bunky.
Fúzne proteíny
Cieľovú aminokyselinovú sekvenciu je možné získať ako fúzny proteín, napríklad na uľahčenie extrakcie a purifikácie. Ako príklady fúznych proteínových náprotivkov je možné uviesť glutatión-S-transferázu (GST), 6xHis, GAL4 (DNA väzbové a/alebo transkripčné aktivačné domény) a β-galaktozidázu. Tiež môže byt účelné medzi fúzny proteínový náprotivok a proteínovú sekvenciu, ktorá je predmetom záujmu, zaviesť miesta pre proteolytické štiepenie, čo umožní odstránenie sekvencií fúzneho proteínu. V prednostnom rozpracovaní fúzny proteín nebráni aktivite cieľa.
Fúzny proteín môže obsahovať antigén alebo antigénny determinant fúzovaný k látke podľa vynálezu. V tomto rozpracovaní fúzny proteín môže byť neprirodzený fúzny proteín, ktorý obsahuje látku, ktorá môže pôsobiť ako adjuvans • · ·· ···· ·· · · · · ··· · · · ·· • ···· ·· · · · · • · · · · ··· · ·· ··· ·· ·· • · · · • · · • · · • · · ·· ···· v tom zmysle, že môže poskytovať generalizovanú stimuláciu imunitného systému. Antigén alebo antigénny determinant môže byť pripojený k amínovému alebo karboxylovému koncu látky.
V inom rozpracovaní tohto vynálezu môže byť aminokyselinová sekvencia ligovaná k heterolognej sekvencii, aby kódovala fúzny proteín. Napríklad pri screeningu peptidových knižníc na činidlá schopné ovplyvniť aktivitu látky môže byť užitočné kódovať chimerickú látku exprimujúcu heterológny epitop, ktorý je rozpoznávaný protilátkou dostupnou na trhu.
Protilátky
Podlá jedného rozpracovania tohto vynálezu činidlo môže byť protilátkou. Navyše, alebo alternatívne, protilátka môže byť cielom. Navyše, alebo alternatívne, protilátka môže byť prostriedkom na detekciu ciela.
Protilátky je možné získať pri použití štandardných postupov, ako imunizáciou pri použití látky podlá vynálezu alebo postupom vystavenia na fáge.
Na účely tohto vynálezu je ako neobmedzujúce príklady pojmu protilátka možné uviesť polyklonálnu protilátku, monoklonálnu protilátku, chimerickú protilátku, jednoreťazcovú protilátku, Fab fragmenty, fragmenty produkované Fab expresnou knižnicou, ako tiež ich mimetiká. Takými fragmentmi môžu byť fragmenty úplných protilátok, pri ktorých je zachovaná väzbová aktivita pre cielovú látku, Fv, F(ab') a F(ab')2 fragmenty, a tiež jednoreťazcové protilátky (scFv), fúzne proteíny a iné syntetické proteíny, ktoré obsahujú väzbové miesto pre antigén protilátok. Neutralizujúcim protilátkam, tzn. protilátkam, ktoré inhibujú biologickú aktivitu polypeptidov, sa venuje osobitná prednosť pri diagnostických a terapeutických aplikáciách.
99··
9
1» 9 9
9 ·
Ο 9999 9
9 (»9 9 9 ··
99
99
9 9 9
9 9
9 9
Pokial sú požadované polyklonálne protilátky, zvolený cicavec (napríklad myš, králik, koza, kôň apod.) je imunizovaný imunogénnym polypeptidom nesúcim epitop(y) , ktorý je možné získať z identifikovaného činidla a/alebo látky podlá vynálezu.
V závislosti od druhu hostitela je za účelom zvýšenia imunologickej odpovedi možné použiť rôzne adjuvansy. Ako neobmedzujúce príklady takých adjuvansov je možné uviesť Freundovo adjuvans, minerálne gély, ako hydroxid hlinitý, a povrchovo aktívne látky, ako lyzolecitín, polyoly pluronic, polyanióny, peptidy, olejové emulzie, hemokyanín z prílipky Diodora aspera a dinitrofenol. BCG (Bacilli CalmetteGuerin) a Corynebacterium parvum sú potenciálne užitočné ludské adjuvansy, ktoré je možné použiť, keď je purifikovaný polypeptid podávaný imunologický oslabeným jedincom za účelom stimulácie systemickej obrany.
Sérum imunizovaného živočícha sa zhromaždí a spracuje známymi postupmi. Pokial sérum obsahujúce polyklonálne protilátky pre epitopy, ktoré je možné získať z identifikovaného činidla, a/alebo látka podlá vynálezu obsahuje protilátky proti iným antigénom, je polyklonálnu protilátku možné purifikovať imunoafinitnou chromatografiou. Spôsoby výroby a spracovania polyklonálnych antisér sú známe.. Podlá usporiadania v akom je možné protilátky pripraviť, sú predmetom vynálezu polypeptidy podlá vynálezu alebo ich fragmenty heptenizované k ďalšiemu polypeptidu na použitie ako imunogény u zvierat alebo ludí.
Monoklonálne protilátky zamerané proti epitopom, ktoré je možné získať z identifikovaného činidla a/alebo látky podlá vynálezu bude odborník v tomto odbore schopný lahko pripraviť. Obvyklá metodológia prípravy monoklonálnych protilátok pomocou hybridómov je dobre známa. Nesmr58 ·· ···· • · · • · ··· • · · • · · ·· ···
telné bunkové línie produkujúce protilátky je možné získať bunkovou fúziou a tiež inými postupmi, ako priamou transformáciou B lymfocytov onkogénnej DNA alebo transfékciou vírusom Epstein-Barrové. Panely monoklonálnych protilátok produkovaných proti orbitovým epitotom je možné prehladávať na rôzne vlastnosti, tzn. na izotyp a afinitu epitopu.
Monoklonálne protilátky proti látke a/alebo identifikovanému činidlu je možné pripravovať pri použití postupov, ktorými sa dosahuje produkcia molekúl protilátky v kultúre nesmrtelných buniek. Ako ich neomedzujúce príklady je možné uviesť hybridómový postup, ktorý bol pôvodne opísaný v Koehler a Milstein (1975, Náture 256: 495 až 497), postup s hybridómom ludských B-buniek (Kosbor et al., 1983, Immunol. Today 4: 72, Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 2026 až 2030) a postup s EBV-hybridómom (Cóle et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss Inc., str. 77 až 96). Okrem toho je možné použiť postupy, ktoré boli vyvinuté na výrobu chimérických protilátok, zostrihu myších génov pre protilátky na ludské gény pre protilátky, čím sa získa molekula s vhodnou antigénnou špecifičnosťou a biologickou aktivitou (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 6851 až 6855; Neuberger et al., 1984, Náture 312: 604 až 608; Takeda et al., 1985, Náture 314: 452 až 454). Alternatívne je za účelom produkcie látky, látkovo špecifických jednoreťazcových protilátok, možné adaptovať postupy opísané na produkciu jednoreťazcových protilátok (US patent č. 4 946 779).
Protilátky, ako monoklonálne, tak polyklonálne, ktoré sú zamerané proti epitopom, ktoré je možné získať z identifikovaného činidla a/alebo látky, sú osobitne užitočné v diagnostike, a protilátky, ktoré sú neutralizované sú užitočné pri pasívnej imunizácii. Predovšetkým je možné monoklonálne protilátky použiť na zvýšenie anti-idiotypových protilátok. Anti-idiotypové protilátky sú imunoglobu• · ·· ···· ·· ·· ··« · · · «··· • · · · · ··· t · · • ···· · · · ··· · · • · ·· · · · · ··· · ·· ··· ·· ····
- 59 líny, ktoré nesú vnútorný obraz látky a/alebo činidla, proti ktorým je žiadúca ochrana. Postupy na zvyšovanie anti-idiotypových protilátok sú známe. Tieto anti-idiotypové protilátky môžu byť rovnako užitočné pri liečení.
Protilátky je tiež možné vyrábať in vivo indukciou produkcie v populácii lymfocytov alebo screeningom knižníc rekombinantných imunoglobulínov alebo panelov vysoko špecifických väzbových reagensov (pozri Orlandi et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 3833 až 3837 a Winter, G. a Milstein C, 1991, Náture 349: 293 až 299).
Je tiež možné pripraviť fragmenty protilátok, ktoré obsahujú špecifické väzbové miesta pre látku. Ako neobmedzujúce príklady takých fragmentov je možné uviesť fragmenty F(ab')2, ktoré je možné získať štiepením molekuly protilátky pepsínom, a Fab fragmenty, ktoré je možné získať redukciou disulfidových mostíkov F(ab')2 fragmentov. Alternatívne je možné identifikáciu monoklonálnych Fab fragmentov s požadovanou špecifickosťou urýchliť a uľahčiť zostavením Fab expresných knižníc (Huse W. D. et al., 1989, Science 256: 1275 až 1281).
Reportéry
Pri skúšobných postupoch (ako tiež screeningu) podľa tohto vynálezu je možné používať rôznych reportérov, pričom prednosť sa venuje reportérom, ktoré účelne poskytujú detekovateľné signály (napríklad spektroskopicky). Reportérový gén môže napríklad kódovať enzým, ktorý katalyzuje reakciu, ktorá mení charakteristiky absorpcie svetla.
Ako neobmedzujúce príklady reportérových molekúl je možné uviesť β-galaktozidázu, invertázu, zelene fluoreskujúci proteín, luciferázu, chlóramfenikol, acetyltransferázu, β-glukuronidázu, exo-glukanázu a glukoamylázu.
• · ·· ···· ·· ·· ·· · ··· · · · · • · · · · ··· · · · • ···· ··· ···· · • · · · ···· ··· · ·· ··· ·· ····
- 60 Alternatívne je do nascentných transkriptov možné zaviesť rádioaktívne značené nukleotidy alebo nukleotidy značené fluorescenčnými značkami, a tieto značené látky sa potom identifikujú po väzbe k oligonukleotidovým sondám.
V jednom prednostnom rozpracovaní sa produkcia molekuly reportéra merí enzymatickou aktivitou produktu reportérového génu, ako je β-galaktozidáza.
V tomto odbore sú známe rôzne protokoly na detekciu a meranie expresie ciela, ako je použitie polyklonálnych alebo monoklonálnych protilátok špecifických pre proteín.
Ako príklady je možné uviesť enzýmovo spriahnuté imunochemické stanovenia na pevnom povrchu (ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay), rádioimunostanovenia (RIA) a triedenie fluorescenčné aktivovaných buniek (FACS). Prednosť však má dvojmiestne imunostanoveníe na monoklonálnej báze, ktoré využíva monoklonálne protilátky, ktoré sú reaktívne k dvom neinterferujúcim epitopom na polypeptidoch. Je však tiež možné použiť kompetitívne väzbové stanovenie. Tieto a iné stanovenia sú opísané okrem iných v Hampton, R. et al., 1990, Serological Methods, A Laboratory Manual, APS Press, St. Paul, Minesota, USA a Maddox, D. E. et al.,
1983, J. Exp. Med. 15, 8: 121.
Odborníkovi v tomto odbore bude známy rad rôznych značiek a konjugačných techník, ktoré je možné použiť pri rôznych stanoveniach nukleových kyselín a aminokyselín. Ako prostriedky na produkciu značenej hybridizácie alebo PCR prób na detekciu cielovej polynukleotidovej sekvencie je možné uviesť oligoznačenie, posun jednoreťazcového zlomu, koncové značenie alebo PCR amplifikáciu pri použití značeného nukleotidu. Alternatívne je kódujúcu sekvenciu alebo akúkolvek jej časť možné klonovať do vektoru za účelom produkcie mRNA sondy. Také vektory sú v tomto odbore známe a sú dostupné na trhu. Je možné ich použit pri syntéze RNA sond • · ···· · ·· ···· ·· ·· • · · · · · · • · ··· · · · • · · · · · · • · · · ···· ··· · ·· ··· ·· ····
- 61 in vitro pridaním vhodnej RNA polymerázy, ako T7, Z3 alebo SP6 a značených nukleotidov.
Pre tieto postupy rad spoločností, ako Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ, USA), Promega (Madison, WI, USA) a US Biochemical Corp. (Cleveland, OH, USA), dodáva komerčné kity a protokoly. Ako vhodné reportérové molekuly alebo značky je možné uviesť rádionuklidy, enzýmy, fluorescenčné, chemiluminiscenčné alebo chromogénne činidlá, ako tiež substráty, kofaktory, inhibítory, magnetické častice apod. Použitie takých značiek je napríklad opísané v patentoch US-A-3 817 738, US-A-3 850 752, US-A-3 939 350, US-A-3 996 345, US-A-4 277 437, US-A-4 275 149 a US-A-4 366 241. Rekombinantné imunoglobulíny je možné pripravovať spôsobom opísaným v US-A-4 816 567.
Ďalšie postupy kvantifikácie expresie konkrétnej molekuly zahŕňajú rádioznačenie (Melby, P. C. et al., 1993, J. Immunol. Methods 159: 235 až 244) alebo biotinyláciu (Duplaa, C. et al., 1993 Anál. Biochem. 229 až 236) nukleotidov, koamplifikáciu kontrolnej nukleovej kyseliny, a štandardnej krivky, na ktorých sa interpolujú experimentálne výsledky. Kvantifikáciu väčšieho počtu vzoriek je možné urýchliť tak, že sa stanovenie vykonáva vo formáte ELISA, pričom oligomér, ktorý je predmetom záujmu, je prítomný v rôznych zriedeniach a spektrofotometrická alebo kalorimetrická odpoveď poskytuje rýchlu kvantifikáciu.
Hoci prítomnosť/neprítomnosť expresie markérového génu napovedá, že gén, ktorý je predmetom záujmu, je tiež prítomný, mala by prítomnosť a expresia byť potvrdená. Napríklad, pokial je nukleotidová sekveneia inzertovaná do sekvencie markérového génu, rekombinantnej bunky, ktoré ju obsahujú, je možné identifikovať na základe absencie funkcie markérového génu. Alternatívne je markérový gén možné umiestniť v tandemu s cieľovou kódujúcou sekvenciou pod kontrolu • · ·· ···· ·« ·« ··· ··· ···· • · · · · ··· · · · • ···· ·· · ··· · · • · ·· · · · · ··· · ·· ··· ·· ····
- 62 jediného promotoru. Expresia markérového génu pri odpovedi na indukciu alebo selekciu zvyčajne tiež indikuje expresiu cieľa.
Alternatívne je možné rôznymi známymi postupmi identifikovať hostiteľské bunky, ktoré obsahujú kódujúcu sekvenciu pre cieľ a exprimujú cieľové kódujúce oblasti.
Ako neobmedzujúce príklady takých postupov je možné uviesť hybridizácii DNA-DNA alebo DNA-RNA a proteínové biostanovenia alebo imunostanovenia, ktorými môžu byt postupy vykonávané pri použití membrán, roztokov alebo čipov, na detekciu a/alebo kvantifikáciu nukleovej kyseliny alebo proteínu.
Všeobecné stanovenia aktivity/hladiny cAMP
Schopnosť skúšaného činidla potencovať cAMP je možné stanoviť meraním relevantného zvýšenia alebo zníženia hladiny cieľa. Navyše, alebo alternatívne, je schopnosť skúšaného činidla potencovať cAMP možné stanoviť meraním relevantného zvýšenia hladiny cAMP. Napríklad je možné prispôsobiť postupy opísané v Smith et al., 1993 (Appl. Biochem. Biotechnol. 41: 189 až 218). Na trhu sú tiež dostupné kity na imunostanovenie určené na meranie cAMP (napríklad Amersham International, Arlington Heights, IL, USA a DuPont, Boston, MA, USA). Vhodné cAMP stanovenie je podrobnejšie opísané v príkladoch uskutočnenia.
Screening
Na identifikáciu Pc^jjp je možné použiť akýkoľvek jeden alebo väčší počet z vhodných cieľov, ako aminokyselinových sekvencii a/alebo nukleotidových sekvencii, pri akejkoívek technike z radu techník na screening liečiv. Cieľ používaný pri takej skúške môže byť voľne v roztoku, pripojený k pevnému nosiču, nesený na bunkovom povrchu alebo • · ·· ···· ·· ·· ··· · · · ···· • · · · · ··· · · · • ···· ··· ···· · • · ·· · · · · ··· · ·· ··· ·· ····
- 63 umiestnený intracelulárne. Ciel môže dokonca byť v zvieracom modele, kde týmto cielom môže byt exogénny ciel alebo zavedený ciel. Zvieracím modelom je nehumánny živočíšny model. Odstránenie aktivity ciela alebo tvorbu väzbových komplexov medzi cielom a skúšaným činidlom je možné merať.
Postupy na sereening liečiv sú založené na spôsobe opísanom v Geysen, Európskej patentovej prihláške 84/03564, zverejnenej 13. septembra 1984. Tieto postupy je možné stručne opísať takto: Velké množstvo rôznych malopeptidových skúšaných zlúčenín sa syntetizuje na pevnom substráte, ako plastových výstupkoch (pinoch) alebo inom povrchu. Peptidové skúšané zlúčeniny sa nechajú reagovať s vhodným cielom alebo jeho fragmentom a premyjú sa. Naviazané látky sa potom detekujú, napríklad pri použití vhodne prispôsobených známych postupov. Purifikovaný ciel je tiež možné naniesť priamo na dosky na použitie pri screeningu liečiv. Alternatívne je na zachytenie peptidu a jeho imobilizáciu.na pevnom nosiči možné použiť nie-neutralizujúce protilátky.
Do rozsahu vynálezu spadá tiež použitie kompetitívnych screeningových skúšok liečiv, pri ktorých neutralizačné protilátky schopné viazat ciel špecificky súťažia so skúšanou zlúčeninou o väzbu k cieli.
Ďalší sereeningový postup predstavuje vysoko výkonný sereening (HTS) činidiel s vhodnou väzbovou afinitou k látkam, ktorý je založený na spôsobe podrobne opísanom v W084/03564.
Predpokladá sa, že skúšobné postupy podlá vynálezu budú vhodné ako na sereening skúšaných zlúčenín v malom aj velkom meradle, ako tiež pri kvantitatívnych stanoveniach.
• · ···· ·· ···· • · • ··· ·· • · ··· · • · · · • · · • · · · · · · · • · · · · · ·· ··· ·· ····
Predmetom vynálezu je teda spôsob identifikácie činidiel, ktoré potencujú cAMP, pričom tento postup spočíva v tom, že sa vhodný ciel uvedie do styku s činidlom a potom sa merí hladina aktivity a/alebo hladina cAMP.
Ďalej je predmetom vynálezu spôsob identifikácie činidiel, ktoré selektívne potencujú cAMP v ženských genitáliách, pričom tento postup spočíva v tom, že sa pri ňom uvedie do styku vhodný ciel z ženských genitálií a potom sa merí aktivita a/alebo hladina cAMP.
Ďalej je predmetom vynálezu spôsob identifikácie činidiel, ktorá potencujú cAMP, ktorého podstata spočíva v tom, že sa vhodný ciel uvedie do styku s činidlom a potom sa merí aktivita a/alebo hladina ciela.
Predmetom vynálezu je tiež spôsob identifikácie činidiel, ktoré selektívne potencujú cAMP v ženských genitáliách, ktorého podstata spočíva v tom, že sa uvedie do styku vhodný ciel z ženských genitálií a potom sa merí aktivita a/alebo hladina ciela.
Podlá prednostného aspektu screening podlá vynálezu zahŕňa aspoň jeden z nasledujúcich stupňov (ktoré nemusia byť v rovnakom poradí, v akom sú uvedené): (a) vykonanie in vitro screeningu za účelom stanovenia, či potenciálne činidlo vykazuje relevantnú aktivitu (ako moduláciu PDEII);
(b) vykonanie aspoň jedného selektívneho screeningu za účelom stanovenia selektivity potenciálneho činidla (napríklad, aby sa zistilo, či toto činidlo je tiež inhibítor ACE - ako pri použití tu opísaného skúšobného protokolu); a (c) vykonanie in vivo screeningu s potenciálnym činidlom (napríklad pri použití funkčného zvieracieho modelu). Pokial sa toto potenciálne činidlo podrobí screeningu (a) a (b), zvyčajne sa potom uskutoční screening (c).
·· ···· • · ·· ·· • · · · • · ··· · · · ··· · · · · · • · · · ···· ··· · ·· ··· ·· ····
- 65 • · ····
Diagnostika
Predmetom vynálezu je tiež diagnostická kompozícia alebo kit na detekciu predispozície pre FSAD. Taká kompozíceia alebo kit obsahuje entitu, ktorá je schopná indikovať prítomnosť jedného alebo viacerých - alebo dokonca absenciu jedného alebo viacerých - z cielov v skúšobnej vzorke. V prednostnom rozpracovaní sa skúšobná Vzorka získa z ženských genitálií alebo ich výlučku.
Diagnostická kompozícia môže napríklad obsahovať ktorúkoľvek z tu uvedených nukleotidových sekvencii alebo jej variant, homológ, fragment alebo derivát, alebo sekvenciu, ktorá je schopná sa hybridizovat ku ktorejkolvek z uvedených nukleotidových sekvencii, a to úplnej alebo čiastočnej .
Aby sa získala základňa na diagnózu choroby, mali by sa stanoviť normálne alebo štandardné hodnoty. To je možné vykonať tak, že sa telesné kvapaliny alebo bunkové extrakty odobrané normálnym subjektom, zvieratám alebo lučfom, uvedú do styku s protilátkou proti cielu za podmienok vhodných na tvorbu komplexu, ktoré sú v tomto odbore dobre známe. Množstvo tvorby štandardného komplexu je možné kvantifikovat porovnaním so zried’ovacími sériami pozitívnej kontroly, v ktorých je prítomné známe množstvo protilátky spolu so známymi koncentráciami purifikovaného ciela.
Potom je štandardné hodnoty získané z normálnych vzoriek možné porovnať s hodnotami získanými z vzoriek odobraných subjektom, ktoré sú potenciálne postihnuté FSAD. Odchýlka medzi štandardom a hodnotami subjektu preukazuje prítomnosť chorobného stavu.
• · ·· ···· ·· ·· ·· · ··· ···· • · · · ···· · « · ······« · · · · · · • · · · · · · · ··· · ·· ··· ·· «··«
- 66 Ciel samotný, alebo jeho časť, môže predstavovať základ pre diagnostické a/alebo terapeutické zlúčeniny. Na účely diagnostiky je možné použiť cielové polynukleotidové sekvencie pri detekcii a kvantifikácii expresie génu pri stavoch, poruchách alebo chorobách, na ktorých sa môže podielať FSAD.
Polynukleotidovú sekvenciu kódujúcu ciel je možné použiť na diagnózu FSAD, ktorá je vyvolaná expresiou ciela. Napríklad je polynukleotidovú sekvenciu kódujúcu ciel možné použiť pri hybridizácii alebo PCR stanovení tkanív z biopsie alebo autopsie alebo biologických tekutín, za účelom detekcie abnormalít v expresii ciela. Také kvalitatívne alebo kvantitatívne postupy môžu napríklad zahŕňať Southern analýzu alebo northern analýzu, bodkový prenos alebo iné postupy založené na membránach; PCR postupy; postupy využívajúce máčacie tyčinky, dipy alebo čipy; a ELISA alebo iné postupy pre väčší počet vzoriek.
Také skúšky je možné prispôsobiť na hodnotenie účinnosti konkrétneho terapeutického režimu a je možné ich používať pri skúškach na zvieratách, pri klinických skúškach alebo pri monitorovaní liečenia jednotlivého pacienta. Aby sa získala základňa na diagnózu choroby, mal by sa stanoviť normálny alebo štandardný profil na expresiu ciela. To je možné vykonať tak, že sa telesné kvapaliny alebo bunkové extrakty odobrané normálnym subjektom, zvieratám alebo luďom, uvedú do styku s cielom alebo jeho častou za podmienok vhodných na hybridizáciu alebo amplifikáciu. štandardnú hybridizáciu je možné kvantifikovať porovnaním so zrieďovacími sériami pozitívnej kontroly získanej pri rovnakej skúške pri použití známeho množstva purifikovaného ciela. Potom je štandardné hodnoty získané z normálnych vzoriek možné porovnať s hodnotami získanými z vzoriek odobraných subjektom, ktoré sú potenciálne postihnuté poruchou alebo chorobou spojenou s expresiou cielovej kódujúcej sekvencie. Odchýlka • · ·«·· ·· ···· • · • ··· • · · ·· ··· • · ·· • · · · • · · • · · • · · « · ··· · medzi štandardom a hodnotami subjektu preukazuje prítomnosť chorobného stavu. Pokial je choroba preukázaná, podáva sa existujúce terapeutické činidlo, a tak je možné získať profil alebo hodnoty liečenia. Stanovenie je možné pravidelne opakovať, aby sa zistilo, či sa hodnoty vyvíjajú alebo sa navracajú k normálnemu alebo štandardnému profilu. Postupne vzniknuté liečebné profily je možné použit na ilustráciu účinnosti liečenia v čase niekolkých dní alebo niekolkých mesiacov.
Podlá jedného aspektu je teda predmetom vynálezu použitie cielového polypeptidu alebo jeho variantu, homológu, fragmentu alebo derivátu na výrobu anti-cielových protilátok, ktoré je napríklad možné použiť diagnosticky za účelom detekcie a kvantifikácie hladiny ciela v stavoch FSAD.
Ďalej sú predmetom vynálezu diagnostické stanovenia a kity na detekciu ciela v bunkách a tkanivách, ktoré obsahujú purifikovaný ciel, ktorý je možné použiť ako pozitívnu kontrolu, a anti-cielovú protilátku. Také protilátky je možné používať pri postupoch založených na roztokoch, membránach alebo tkanivách na detekciu akéhokoľvek chorobného stavu spojeného s expresiou cielového proteínu alebo expresiou deléciou alebo jeho variantu, homológu, fragmentu alebo derivátu.
Postupy stanovenia
Diagnostické kompozície a/alebo spôsoby a/alebo kity je možné používať v postupoch, ako ktorých neobmedzujúce príklady je možné uviesť kompetitívne a nekompetitivne stanovenia, rádioimunostanovenia, bioluminiscenčné a chemiluminiscenčné stanovenia, fluorometrické stanovenia, sendvičové stanovenia, imunoradiometrické stanovenia, bodkový prenos, enzýmovo spriahnuté stanovenia, ako je ELISA, mikrotitračné • · ·· ···· « ·· · · · · · • · · · ···· · • ···· · · · · · · • · · · · · ··· · ·· ··· · ·· • · · • · • · • · ···· doštičky, prúžky alebo namáčacie tyčinky potiahnuté protilátkou na rýchle monitorovanie moča alebo krvi, imunohistochemické a imunocytochemické analýzy.
Napríklad imunohistochemický kit je tiež možné použiť pri lokalizácii aktivity PDE v tkanive genitálií. Tento imunohistochemický kit umožňuje lokalizovať PDE v tkanivových rezoch a bunkových kultúrach pri použití ako svetelnej, tak elektrónovej mikroskopie a je možné ho využívať ako na výskumné, tak aj na klinické účely. Taká informácia môže byt užitočná na diagnostické a potenciálne terapeutické účely pri detekcii a/alebo prevencii a/alebo liečení FSD, ako FSAD. Pre každý kit sú stanovené rozmedzie, citlivosť, presnosť, spolahlivost, špecifickosť a reprodukovatelnosť stanovení. Variancie v stanovení (intraassay) a v čase (interassay) sa stanovia pri bodoch 20%, 50% a 80% na štandardných krivkách posunu alebo aktivity.
Sondy
Ďalším predmetom tohto vynálezu sú sondy na hybridizáciu nukleových kyselín alebo PCR, ktoré sú schopné detekovat (predovšetkým ktoré sú schopné selektívneho výberu) polynukleotidových sekvencií, ako genómových sekvencií, kódujúcu cielovú kódujúcu oblast alebo blízko príbuzné molekuly, ako alely. Špecifickosť sondy, tzn. či je odvodená od vysoko konzervovanej, konzervovanej alebo nekonzervovanej oblasti alebo domény, a stringencie hybridizácie alebo amplifikácie (vysoká, strední alebo nízka) bude určovať, či sonda bude identifikovať iba prirodzene sa vyskytujúcu cielovú kódujúcu sekvenciu alebo príbuzné sekveneie. Sondy na detekciu príbuzných sekvencií nukleových kyselín sa volia z konzervovaných alebo vysoko konzervovaných nukleotidových oblastí príslušníkov cielovej triedy a také sondy je možné použiť v poole degenerovaných sond. Pri detekcii identických sekvencií nukleových kyselín, alebo v prípade po69 • 999999 «· 9 · • 999 9999 • « 99999 99 9 ««««99 9 999 9 9 • · · 9 9 9 9 • 99 999 99 99 99 treby maximálnej špecifickosti, sa sondy, nukleové kyseliny, volia z nekonzervovaných nukleotidových oblastí alebo jedinečných oblastí cieľových polynukleotidov. Pod pojmom nekonzervovaná nukleotidová oblasť sa tu rozumie oblasť nukleotidu, ktorá je vzhíadom na tu opísanú cielovú kódujúcu sekvenciu jedinečná a nevyskytuje sa pri príbuzných príslušníkoch rovnakej triedy.
Ďalšie použitie oligonukleotidov založených na delových sekvenciách predstavuje PCR, ako je napríklad opísaná V US-A-4 683 195, US-A-4 800 195 a US-A-4 965 188. Tiež oligoméry sú zvyčajne chemicky syntetizované, ale je možné ich získať tiež enzymaticky alebo z rekombinantného zdroja. Oligoméry zvyčajne obsahujú dve nukleotidové sekvencie, z ktorých jedna má orientáciu po smere (5'->3') a druhá orientáciu proti smeru (3 ’ <—5') používané za podmienok optimalizovaných na identifikáciu špecifického génu alebo stavu.
Na detekciu a/alebo kvantifikáciu blízko príbuzných DNA alebo RNA sekvencií je možné použiť dva rovnaké oligoméry, sady oligomérov alebo dokonca degenerovaný pool oligomérov.
Sekvenciu nukleovej kyseliny pre ciel je tiež možné použit na tvorbu hybridizačných sónd, ako je opísané hore, na mapovanie endogénnej genómovej sekvencie. Sekvencia môže byť zamapovaná na konkrétny chromozóm alebo na špecifickú oblasť chromozómu pri použití dobre známych postupov. Ako príklad takých postupov je možné uviesť hybridizáciu in situ na rozvinuté chromozomálne preparáty (Verma et al., 1988, Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York City, USA), na separované (flow sorted) chromozomálne preparáty alebo umelé chromozomálne konštrukcie, ako sú YAC (umelé kvasinkové chromozómy), umelé bakteriálne chromozómy (BAC), bakteriálne PI konštrukcie alebo cDNA knižnice jediného chromozómu.
·· ···· • · · • · ··· • · · · • · · · • ·· ···
In situ hybridizácie chromozomálnych preparátov a fyzikálne metódy mapovania, ako je analýza väzieb pri použití daných chromozomálnych markérov sú pri zväčšujúcom sa rozsahu genetických máp neocenitelné. Príklady genetických máp je možné nájsť v Science (1995, 27Ó; 410f a 1994, 265; 1981f). Umiestnenie génu na chromozóm iného cicavčieho druhu často môže odhaliť súvisiace markéry, a to dokonca i keď nie je známe číslo alebo ramienko konkrétneho ludského chromozómu. Nové sekvencie je chromozornáInému ramienku alebo jeho časti možné prideliť fyzikálnym mapovaním. To poskytuje výskumníkom, ktorí hladajú gény chorôb pri použití pozičného klonovania alebo iných metód zisťovania génov, cenné informácie. Ako náhle je choroba alebo syndróm zhruba lokalizovaný genetickou väzbou na konkrétnu oblasť genómu, všetky sekvencie zamapované pre túto oblasť môžu predstavovať asociované alebo regulačné gény pre ďalší výskum. Nukleotidové sekvencie podlá tohto vynálezu je tiež možné používať pri detekcii rozdielov v chromozomálnej lokalizácii vyvolanej translokáciou, inverziou apod. medzi normálnymi, prinášajúcimi alebo postihnutými indivíduami.
Hostitelské bunky
Pod pojmom hostitelská bunka sa v súvislosti s týmto vynálezom rozumie akákolvek bunka, ktorá by mohla obsahovať ciel pre činidlo.
Ďalším predmetom vynálezu sú teda hostitelské bunky transformované alebo transfekované polynukleotidom, ktorý je cielom alebo ciel exprimuje. Prednostne je taký polynukleotid nesený vo vektore na replikáciu a expresiu nukleotidov, ktoré môžu byť cielom alebo môžu ciel exprimovať. Bunky sa volia tak, aby boli kompatibilné s vektorom, a môžu to byt napríklad bunky prokaryontné (napríklad bakteriálne), fungálne, kvasinkové alebo rastlinné.
·· φφ • φφφ φ φ
Φ· φφφ
Na expresiu heterológnych génov sa ako hostitelské bunky používajú bunky gram-negatívnej baktérie E. coli. Avšak heterológny proteín má sklon sa vo velkom množstve akumulovať vnútri bunky. Následná izolácia požadovaného proteínu zo všetkých intracelulárnych proteínov môže byť niekedy ťažká.
Oproti E. coli sú baktérie rodu Bacillus ako hostitelské bunky velmi vhodné, vzhladom na ich schopnost vylučovať proteíny do kultivačného média. Ako iných vhodných bakteriálnych hostitelov je možné uviesť rody Streptomyces a Pseudomonas.
V závislosti od povahy polynukleotidu kódujúceho polypeptid podlá vynálezu a/alebo miery nutnosti ďalšieho spracovania exprimovaného proteínu, sa venuje prednosť eukaryontným hostitelom, ako kvasinkám alebo iným fungálnym hostitelom. Zvyčajne sa bunkám kvasiniek venuje väčšia prednosť ako fungálnym bunkám, pretože sa s nimi lahšie manipuluje. Niektoré proteíny sú však z kvasinkových buniek špatné vylučované alebo v niektorých prípadoch nie sú dobre spracované (napríklad hyperglykozylácia v kvasinke). V týchto prípadoch by bolo potrebné zvoliť iného fungálneho hostitela.
Ako príklady vhodných expresných hostitelov na účely tohto vynálezu je možné uviesť huby, ako druhy Aspergillus (aké sú napríklad opísané v EP-A-0 184 438 a EP-A-0 284 603) a druhy Trichoderma; baktérie, ako druhy Bacillus (aké sú napríklad .opísané v EP-A-0 314 048 a EP-A-0 253 455), druhy Streptomyces a Pseudomonas; kvasinky, ako druhy Kluyveromyces (aké sú napríklad opísané v EP-A-0 096 430 a EP-A-0 301 670) a druhy Saccharomyces. Typické expresné hostitelia môžu byť napríklad zvolené z Aspergillus niger, Aspergillus niger var. butigenis, Aspergillus niger var. awamori, Aspergillus aculeatis, Aspergillus nidulans, Asper·· ···· ·· · ··· ···· • · · · ···· · · · • ···· ··· ···· · • · · · ···· ··· · ·· ··· ·· ····
- 72 gillus oryzae, Trichoderma reesei, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Kluyveromaces lactis a Saccharomyces cerevisiae.
Pri použití vhodných hostitelských buniek - ako kvasinkových, fungálnych a rastlinných hostitelských buniek, je možné dosiahnuť posttranslačné modifikácie (napríklad myristoyláciu, glykozyláciu, krátenie, lapidáciu a fosforyláciu tyrozínu, serínu alebo treonínu), ako môže byť potrebné na potvrdenie biologickej aktivity na rekombinantných expresných produktoch podlá vynálezu.
Organizmus
Pod pojmom organizmus sa v súvislosti s vynálezom rozumie akýkolvek organizmus, ktorý by mohol obsahovať ciel a/alebo produkt z nej získaný. Ako príklady organizmov je možné uviesť huby, kvasinky a rastliny.
Do rozsahu pojmu transgénny organizmus v súvislosti s vynálezom spadá akýkolvek organizmus, ktorý obsahuje ciel a/alebo získané produkty.
Transformácia hostitelských buniek/hostitelského organizmu
Ako už bolo uvedené hore, hostitelským organizmom môže byť prokaryontný alebo eukaryontný organizmus. Ako vhodných prokaryontných hostitelov je možné napríklad uviesť E. coli a Bacillus subtilis. Poznatky o transformáciách prokaryontných hostitelov sú dobre dokumentované - pozri napríklad Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydanie, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) a Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, Inc.
·· ···· ·· ·· • · · · · · •··· · · · • · · · · · • · · · · · · • 99 ··· ·« ····
Pokial sa používa prokaŕyontný hostite!, potom môže byť potrebné nukleotidovú sekvenciu pred transformáciou vhodne modifikovať, ako odstránením intrónov.
V ďalšom rozpracovaní môže transgénnym organizmom byť kvasinka. Používanie kvasinky ako vehikula na expresiu heterológnych génov je rozšírené. Dlhú históriu priemyselného využitia, ako je použitie pri expresii heterológnych génov, majú druhy Saccharomyces cerevisiae. Prehladné články o expresii heterológnych génov v Saccharomyces cerevisiae je možné nájsť v Goodey et al. (1987, Yeast Biotechnology,
D. R. Berry et al., ed. str. 401 až 429, Alien and Unwin, Londýn) a King et al. (1989, Molecular and Celí Biology of Yeasts, E. F. Walton a G. T. Yarronton, ed., str. 107 až 133, Blackie, Glasgow).
Saccharomyces cerevisiae je na expresiu heterológnych génov vhodná z niekolkých dôvodov. Po prvé je nepatogénna pre človeka a je schopná produkovať určité endotoxíny, a po druhé po storočiach jej komerčného využívania k rôznym účelom má dlhú históriu bezpečného používania. To viedlo k širokej akceptovatelnosti pre verejnosť. Po tretí, rozsiahle komerčné využitie a výskumy vykonané pri tomto organizmu viedli k nazhromaždeniu velkého množstva znalostí o genetike a fyziológii Saccharomyces cerevisiae a charakteristikách jej fermentácie vo velkom meradle.
Prehlad o princípoch expresie heterológnych génov v Saccharomyces cerevisiae a sekrécii génových produktov je podaný v E. Hinchcliffe, E. Kenny (1993, Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes, Yeasts, zv. 5, Anthony H. Rose a J. Stuart Harrison, ed., 2. vydanie, Academic Press Ltd.).
• · ···· ·· ··· · • · • ··· • · · • · · ·· ··· • · · · • · · • · · · • · · • · ··· ·
Je dostupných niekolko typov kvasinkových vektorov, ako sú integratívne vektory, ktoré na udržanie potrebujú rekombináciu s genómom hostitela, a autonómne sa replikujúce plazmidové vektory.
Za účelom prípravy transgénnej Saccharomyces sa inzerciou nukleotidovej sekvencie podlá vynálezu do konštruktu zostaveného na expresiu v kvasinke pripravia expresné konštrukty. Na heterológnu expresiu bolo vyvinutých niekolko typov konštruktov. Tieto konštrukty obsahujú promótor aktívny v kvasinke fúzovaný s nukleotidovou sekvenciou podlá vynálezu, zvyčajne sa používa promotor kvasinkového pôvodu, ako promotoru GALI. Zvyčajne sa používa signálna sekvencia kvasinkového pôvodu, ako sekvencia kódujúca signálny peptid SUC2. Expresný systém uzatvára terminátor aktívny v kvasinke.
Na transformáciu kvasiniek bolo vyvinutých niekolko transformačných protokolov. Napríklad transgénnu Saccharomyces podlá vynálezu je možné pripraviť podlá Hinnen et al. (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929); Beggs, J. D. (1978, Náture, Londýn, 275, 104) a Ito, H. et al., (1983, Bacteriology 153, 163 až 168).
Transformované kvasinkové bunky sa selektujú pri použití rôznych selekčných markérov. Z markérov používaných na transformáciu je možné uviesť rad auxotrofných markérov, ako LEU2, HIS4 a TRPÍ a dominantné markéry rezistencie voči antibiotikám, ako aminoglykozidové antibiotické markéry, napríklad G418.
Ďalším hostiteľským organizmom je rastlina. Základným princípom pri konštrukcii geneticky modifikovaných rastlín je taká inzercia genetickej informácie do genómu rastliny, aby sa dosiahlo stabilné zachovanie inzertovaného genetického ··· ··· ···· • · ·. · ···· · · · • ··»· ··· ···· · • · · · ···· ··· · ·· ··· ·· ····
- 75 materiálu. Na inzerciu genetickej informácie existuje niekolko techník, pričom dva hlavné princípy predstavujú priame zavedenie genetickej informácie a zavedenie genetickej informácie pri použití vektorových systémov. Prehlad takých všeobecných postupov je možné nájsť v článkoch Potrykus (Annu. Rev. Plánt. Physiol. Plánt Mol. Biol, 1991, 42: 205 až 225) a Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994, 17 až 27). Ďalšie informácie o transformácii rastlín je možné Získať Z EP-A-0 449 375.
Predmetom vynálezu je teda ďalej spôsob transformácie hostitelskej bunky nukleotidovou sekvenciou, ktorá má byt cielom alebo má ciel exprimovat. Hostitelské bunky transformované nukleotidovou sekvenciou je možné kultivovať za podmienok vhodných na expresiu a izoláciu kódovaného proteínu z bunkovej kultúry. Proteín produkovaný rekombinantnou bunkou môže byt vylučovaný alebo môže byt obsiahnutý vnútri bunky v závislosti od použitej sekvencie a/alebo vektoru. Odborníkovi v tomto odbore bude zrejmé, že expresné vektory obsahujúce kódujúce sekvencie je možné zostrojiť pri použití signálnych sekvencii, ktoré riadia vylučovanie kódujúcich sekvencii cez membránu konkrétnej prokaryontnej alebo eukaryontnej bunky. Iné rekombinantné konštrukcie môžu spojovať kódujúcú sekvenciu s nukleotidovou sekvenciou kódujúcou polypeptidovú doménu, ktorá umožní purifikáciu rozpustných proteínov (Kroll, D. J. et al., 1993, DNA Celí Biol.
12: 441 až 453).
Farmaceutické kompozície
Predmetom vynálezu je tiež farmaceutická kompozícia, ktorej podstata spočíva v tom, že obsahuje terapeuticky účinné množstvo činidla podlá vynálezu a farmaceutický vhodný nosič, riedidlo alebo excipienty (vrátane ich kombinácií).
·· ···· ·· ·· • · · · · · · • · ··· · · · • · · ···· · • · · · · · ··· · ·· ··· ·· ····
- 76 * · ····
Farmaceutické kompozície môžu slúžiť na podávanie lučfom alebo zvieratám, v humánnej a veterinárnej medicíne, a zvyčajne obsahujú jedno alebo viac z farmaceutický vhodných riedidiel, nosičov alebo excipientov. Nosiče alebo riedidlá vhodné na terapeutické použitie sú vo farmácii dobre známe a sú opísané napríklad v Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing C. (A. R. Gennaro edit., 1985). Pri volbe farmaceutického nosiča, excipientu alebo riedidla sa môže brať do úvahy zvolený spôsob podávania a štandardná farmaceutická prax. Farmaceutické kompozície môžu ako nosič, excipient alebo riedidlo, alebo namiesto nich, obsahovať vhodné spojivo (alebo spojivá), lubrikant (alebo lubrikanty), suspenzné činidlo (alebo činidlá), poťahovacie činidlo (alebo činidlá) alebo solutilizačné činidlo (alebo činidlá).
Farmaceutické kompozície tiež môžu obsahovať konzervačné prísady, stabilizátory, farbiace prísady a aromatizačné činidlá. Ako príklady konzervačných činidiel je možné uviesť benzoan sodný, kyselinu sorbovú a estery p-hydroxybenzoovej kyseliny. Tiež je možné používať antioxidanty a suspenzné činidlá.
V závislosti od rôznych systémov dodávky sa požiadavky na kompozíciu/formuláciu môžu líšiť. Farmaceutická kompozícia môže byt napríklad formulovaná pre dodávku pri použití minipumpy, alebo mukozálnu dodávku, napríklad vo forme nazálneho spreja alebo aerosólu na inhaláciu alebo vstrebáteIného roztoku. Na parenteráinu dodávku kompozície môže byt formou vhodnou na injekčné podávanie, napríklad intravenózne, intramuskulárne alebo subkutánne podávanie. Alternatívne môže formulácia byť prispôsobená na podávanie obidvoma spôsobmi.
Pokial sa činidlo má podávať mukozálne, cez gastrointestinálnu sliznicu, mala by byť schopná zostať stabilná • ••ο ·® ···· ·· ·· • · · · · · · • · ··· · · · • · · ···· · • · · · · · ·· ··· ·· ···· počas priechodu gastrointestinálnym traktom. Napríklad by mala byť rezistentná voči proteolytickej degradácii, stabilná pri kyslom pH a rezistentná voči detergentným účinkom žlči.
Pokiaľ je to vhodné, je farmaceutické kompozície možné podávať inhalačné, vo forme čapíkov alebo pesarov, topicky vo forme lotiónov, roztokov, krémov, mastí alebo zásypov, pri použití náplastí na kožu. Tiež je možné ich podávať perorálne vo forme tabliet obsahujúcich také excipienty, ako škrob alebo laktózu, alebo vo forme toboliek alebo ovúl, bud samotné alebo v zmesi s excipientmi, alebo vo forme elixírov, roztokov alebo suspenzií, ktoré obsahujú aromatizačné alebo farbiace činidlá. Ďalej je možné ich podávať parenterálne, napríklad intravenózne, intramuskulárne alebo subkutánne. Na parenterálne podávanie sa najlepšie hodia sterilné vodné roztoky, ktoré môžu obsahovať aj iné látky, napríklad soli alebo monosacharidy v množstve dostatočnom na izotonizáciu roztoku vzhľadom ku krvi. Pri bukálnom a sublinguálnom podávaní je kompozície možné podávať vo forme tabliet alebo pastiliek, ktoré je možné pripravovať obvyklým spôsobom.
Pri niektorých rozpracovaniach je činidlá tiež možné používať v kombinácii s cyklodextrínmi. O cyklodextrínoch je známe, že tvoria inklúzne a neinklúzne komplexy s molekulami liečiva. Tvorba komplexu liečivo-cyklodextrín môže modifikovať rozpustnosť, rýchlosť rozpúšťania, biodostupnosť a/alebo stabilitu molekuly liečiva. Komplexy liečivo-cyklodextrín sú užitočné pri väčšine dávkovacích foriem a spôsobov podávania. Alternatívu k priamej tvorbe komplexu liečiva s cyklodextrníom môže predstavovať použitie cyklodextrínu ako pomocnej prísady, napríklad nosiča, riedidla alebo solubilizačnej prísady. Najčastejšie sa používajú alfa-, beta- a gama-cyklodextríny, ktorých vhodné príklady sú opísané vo WO-A-91/11172, WO-A-94/02518 a WO-A-98/55148.
·· ···· • · • 9·9 ·· 99
9 9 • 9
9 999 9 ·
9 9 9 9 9 ··· · 99 999 99 9999
- 78 • · 9999
V prednostnom rozpracovaní sa činidlá podlá vynálezu podávajú systemicky (ako perorálne, bukálne alebo sublinguálne), výhodnejšie perorálne.
Činidlo má teda prednostne formu, ktorá je vhodná na perorálne podávanie.
Pri niektorých rozpracovaniach činidlo - keď sa použije - prednostne nepôsobí na centrálny nervový systém.
Pri niektorých rozpracovaniach činidlo - keď sa použije - má prednostne periférny účinok.
Podávanie
Pod pojmom podávanie sa rozumie dodávka pomocou vírusových alebo nevírusových postupov. Ako neobmedzujúce príklady mechanizmu vírusovej dodávky je možné uviesť adenovírusové vektory, adeno-asociované vírusové (AW) vektory, herpesvírusové vektory, retrovírusové vektory, lentivírusové vektory a bakulovírusové vektory. Nevírusové mechanizmy dodávky zahŕňajú transfekciu sprostredkovanú lipidmi, lipozómami, imunolipozómami, lipofektínom, katiónovými faciálnymi amfifilmi (CFA) a ich kombinácie.
Činidlá podlá vynálezu je možné podávať samotné, ale zvyčajne sa budú podávať vo forme farmaceutických kompozícií, v ktorých je činidlo napríklad zmiešané s vhodným farmaceutickým excipientom, riedidlom alebo nosičom zvoleným s ohladom na zamýšlaný spôsob podávania a štandardnú farmaceutickú prax.
Činidlo podlá vynálezu je napríklad možné podávať (napríklad orálne alebo topicky) vo forme tabliet, toboliek, ovúl, elixírov, roztokov alebo suspenzií, ktoré môžu obsa- 80 • · ···· ·· ···· • · · • · ··· • · · • · · ·· ··· ·· ·* • · · · • · · • · · · • · · ·· ···· transdermálne, rektálne, bukálne, vaginálne, epidurálne a sublinguálne podávanie.
Je zrejmé, že všetky činidlá nemôžu byť podávané rovnakým spôsobom. Podobne, pokial kompozícia obsahuje viac ako jednu účinnú prísadu, potom tieto prísady môžu byť podávané rôznymi spôsobmi.
Pokial sa činidlo podlá vynálezu podáva parenterálne, je ako príklady takého podávania možné uviesť intravenózne, intraarteriálne, intraperitoneálne, intracekálne, intraventrikulárne, intrauretrálne, intrasternálne, intrakraniálne, intramuskulárne alebo subkutánne podávanie činidla a/alebo podávanie pri použití infúznych postupov.
Na parenterálne podávanie sa najlepšie hodia sterilné vodné roztoky, ktoré môžu obsahovať aj iné látky, napríklad soli alebo glukózu v množstve dostatočnom na izotonizáciu roztoku vzhladom ku krvi. Vodné roztoky by v prípade potreby mali byť vhodne tlmené (prednostne na pH 3 až 9). Odborník v tomto odbore je formulácie vhodné na parenterálne podávanie schopný lahko pripraviť pri použití štandardných farmaceutických postupov.
Ako už bolo uvedené, činidlo podlá vynálezu je možné podávať intranazálne alebo inhalačné a je účelne podávané pri použití suchého prášku v inhalátore alebo aerosolového spreja v tlakovej nádobe, pumpe, spreji alebo rozprašovači pri použití vhodného hnacieho plynu, napríklad dichlórdifluórmetánu, trichlórfluórmetánu, dichlórtetrafluóretánu, hydrofluóralkánu, ako 1,1,1,2-tetrafluóretánu (HFA 134a(r)) alebo 1,1,1,2,3,3,3-heptaf luórpx-opánu (HFA 227Eä(r)), oxidu uhličitého alebo iných vhodných plynov.
V prípade tlakovaného aerosólu môže byt dávkovacia jednotka daná použitím ventilu uvolňujúceho odmerané množstvo. Tlakové nádoby, pumpy, spreje alebo rozprašovače môžu obsahovať • · ·· ···· ·· · · · · • · · · · ··· • ···· · · · · • · · · · ··· · ·· ··· ·· ·· • · · · • · · • · · • · · ·· ··»· hovať aromatizačné alebo farbiace činidlá, určené na okamžitú, odloženú alebo modifikovanú dodávku, dodávku s trvalým uvoľňovaním, pulznú dodávku alebo dodávku s riadeným uvoľňovaním.
Tablety môžu obsahovať excipienty, ako mikrokryštalickú celulózu, laktózu, citran sodný, uhličitan vápenatý, dibázický fosforečnan vápenatý a glycín, rozvolňovadlá, ako škrob (prednostne kukuričný, zemiakový alebo tapiokový škrob), sodnú sol škrobového glykolátu, sodnú sol kroskarmelózy a niektoré komplexné silikáty, a granulačné spojivá, ako polyvinylpyrolidón, hydroxypropylmetylcelulózu (HPMC), hydroxypropylcelulózu (HPC), sacharózu, želatínu a živicu. Okrem toho môžu obsahovať tiež lubrikačné činidlá, ako stearan horečnatý, kyselinu stearovú, glycerylbehenát a mastenec.
Pevné kompozície podobného typu je tiež možné použiť ako náplne želatínových toboliek. Také kompozície ako excipienty prednostne obsahujú laktózu, škrob, celulózu, laktózu alebo vysokomolekulárne polyetylénglykoly. Vo vodných suspenziách môžu byť činidlá v kombinácii s rôznymi sladidlami alebo aromatizačnými činidlami, farbiacimi látkami alebo farbivami, emulgačnými a/alebo suspenznými činidlami, a riedidlami, ako vodou, etanolom, propylénglykolom a glycerínom alebo ich kombináciami.
Ako neobmedzujúce príklady spôsobov podávania (dodávky) je možné uviesť perorálne podávanie (napríklad vo forme tabliet, toboliek alebo požívateľných roztokov), nazálne, parenterálne (napríklad vo forme injekčných foriem), gastrointestinálne, intraspinálne, intraperitoneálne, intramuskulárne, intravenózne, intrauterinne, intraokulárne, intradermálne, intrakraniálne, intratracheálne, intravaginálne, intracerebrovaskulárne, intracerebrálne, subkutánne, oftalmické (vrátane podávanie do sklovca alebo očnej komory),
- 81 • · ···· ·· ···· • · • ··· ·· ·· • · · · • · · ·· ···· naprirozpúroztok alebo suspenziu účinnej zlúčeniny pripravený klad pri použití zmesi etanolu a hnacieho plynu ako štadla, a ďalej lubrikačné činidlo, napríklad sorbitantrioleát. Tobolky a patróny (vyrobené napríklad z želatíny) na použitie v inhalátoroch alebo insuflátoroch môžu byt napríklad formulované tak, že obsahujú práškovú zmes činidla a vhodného práškového základu, ako laktózy alebo škrobu.
Alternatívne je činidlo možné podávat vo forme čapíku alebo pesaru alebo sa dá podávat topicky vo forme gélu, hydrogélu, lotiónu, roztoku, krému, masti alebo zásypu, činidlá je možné tiež podávat dermálne alebo transdermálne, napríklad pri použití transdermálnych náplastí na kožu. Do úvahy tiež prichádza pulmonárne alebo rektálne podávanie a ďalej rovnako okulárne podávanie. Pri očnom podávaní zlúčeniny môžu byt formulované do podoby mikronizovaných suspenzií v izotonickom sterilnom soínom roztoku s nastaveným pH alebo, prednostne, do podoby roztoku v izotonickom sterilnom solnom roztoku s nastaveným pH, prípadne v kombinácii s konzervačným činidlom, ako benzalkóniumchloridom. Alternatívne činidlá tiež môžu byt začlenené do mastí, napríklad väzelínových.
Na účely topického podávania na kožu činidlo môže byt formulované ako vhodná mast obsahujúca suspenziu alebo roztok účinnej zlúčeniny v jednej alebo viacerých látkach zvolených zo súboru skladajúceho sa z minerálnych olejov, väzelinového oleja, bielej vazelíny, propylénglykolu, polyoxyetylénpolyoxypropylénových zlúčenín, emulgačných voskov a vody. Alternatívne môže byt formulované do podoby vhodného lotiónu alebo krému, suspendované alebo rozpustené napríklad v zmesi jednej alebo viacerých z nasledujúcich látok: v minerálnom oleji, sorbitanmonostearáte, polyetylénglykole, kvapalnom parafíne, Polysorbate 60, cetylesterovom vosku, cetearylalkohole, 2-oktyldodekanole, benzylalkohole a vode.
• φ φφφφ • Φ φφφφ • · · • · φφφ • φ φ φ φ • φφφ • ·· φφφ φφ φφ • φ φ φ φ φ φ φφφ φφφ φφ φφφφ
Kompozície podlá tohto vynálezu je možné podávať priamou injekciou.
Pri niektorých aplikáciách sa činidlo prednostne podáva perorálne.
Pri niektorých aplikáciách sa činidlo prednostne podáva topicky.
Dávkovanie
Presnú dávku, ktorá bude najvhodnejšia pre jednotlivý subjekt zvyčajne určuje ošetrujúci lekár. Konkrétna výška dávok a frekvencia podávania ktorémukoľvek konkrétnemu pacientovi môže kolísať a bude závisieť od radu faktorov, ako je účinnosť použitej zlúčeniny, jej metabolická stabilita a dĺžka pôsobenia, vek, telesná hmotnosť, celkový zdravotný stav, pohlavie a strava pacienta, spôsob a čas podávania, rýchlosť vylučovania, liekové kombinácie, závažnosť konkrétneho stavu a individuálny priebeh liečenia. Činidlo a/alebo farmaceutickú kompozíciu podlá vynálezu je možné podávať v súlade s režimom raz až desaťkrát za deň, ako raz alebo dvakrát za deň.
Na perorálne a parenterálne podávanie humánnym pacientom sa denná dávka môže podávať vo forme jedinej dávky alebo niekolkých čiastkových dávok.
V závislosti od potreby sa činidlo môže podávať v dávke od 0,01 do 30 mg/kg telesnej hmotnosti, ako od 0,1 do 10 mg/kg, prednostne od 0,1 do 1 mg/kg telesnej hmotnosti. Uvedené dávkovanie samozrejme slúži ako príklad vhodný pre priemerný prípad. V jednotlivých prípadoch sa dávkovanie môže pohybovať nad alebo pod hranicami hore uvedených rozmedzí.
• · ···· *· ···· • · · • · ··· • · · • · · ·· ···
99 • 9 9 · • · · • é · • · · ·· ····
Formulácie
Činidlo je možné spracovávať do formy farmaceutickej kompozície napríklad tak, že sa zmieša s jedným alebo viacerými vhodnými nosičmi, riedidlami alebo excipientmi pri použití spôsobov, ktoré sú v tomto odbore známe.
Ďalej sú uvedené neomedzujúce príklady niektorých formulácií.
Formulácia 1
Tableta sa pripraví pri použití nasledujúcich prísad:
hmotnosť (mg)
Činidlo 250 Mikrokryštalická celulóza 400 Sublimovaný oxid kremičitý 10 Kyselina stearová 5 Celkom 665
Tieto zložky sa zmiešajú a lisujú na tablety, z ktorých každá má hmotnosť 665 mg.
Formulácia 2
Intravenóznu formuláciu je možné pripraviť z nasledujúcich prísad:
Činidlo
Izotonický solný roztok
100 mg 1000 ml ·· ···· • · • ··· • · ···· ·· ·· • · · · • · · ··· · · · · · • · · · · · ·· ··· ·· ····
- 84 Farmaceutický účinné soli
Činidlo môže byť podávané ako farmaceutický vhodná sol. Farmaceutický vhodné soli je zvyčajne možné lahko pripraviť pri použití požadovanej kyseliny alebo bázy, podlá toho čo je vhodné. Soli je z roztoku možné vyzrážať a zhromaždiť filtráciou alebo ich izolovať odparením rozpúšťadla.
Zvieracie skúšobné modely
In vivo modely je možné používať pri skúmaní a/alebo navrhovaní terapií alebo terapeutických činidiel na liečenie FSAD. Tieto modely je možné použiť na skúmanie účinkov rôznych nástrojov/reprezentatívnych zlúčenín z hladiska rôznych parametrov, ktoré indikujú odpoveď v podobe sexuálneho vzrušenia. Takým modelom je nehumánny zvierací skúšobný model.
Pre vaskulogénnu ženskú sexuálnu dysfunkciu (FSAD) je dostupný rad použitelných modelov.
Napríklad je možné odkázať na invazívne zvieracie modely (pozri napríklad Park et al., 1997). V tomto prípade je vaginálne alebo klitoriálne hemodynamické reakcie možné zaznamenávať priamo po stimulácii pelvického nervu pri normálnych a aterosklerotických samiciach králikov.
Ďalej je možné napríklad odkázať na neinvazívne zvieracie modely (pozri napríklad Goldstein et al., 1998;
Laan et al., 1988). V tomto prípade sú prostriedkom na detekciu zmien krvného prietoku vo vaginálnych a klitoriálnych artériách pulzné vlny Dopplerovskej ultrasonografié. Tento model je možné použiť na skúmanie vaskulogénnych účinkov počas farmakologického podávania vazodilatancií.
·· · • · · • ···· · • · ··· · ·· ···· • · · • · ··· • · φ • · · ·· ··· ·· ·· • · · · • · · • · · 9 • · · ·· ·*··
Ako ďalšiu použitelnú neinvazívnu metódu je možné uviesť vaginálnu fotopletysmografiu, ktorá umožňuje kvantitatívne meranie prekrvenia vaginálnej sliznice, a metódy vaginálnej termálnej clearance, ktoré sú založené na princípe, že vaginálne prekrvenie je možné zaznamenať meraním transferu tepla z intravaginálnej sondy udržovanej pri konštantnej teplote.
Zvierací model sexuálneho vzrušenia
Pri našich štúdiách bol vyvinutý robustný reprodukovateiný model fyziológie sexuálneho vzrušenia. Tento model sa používa na anestetizovaných králikoch a využíva laserové Dopplerovské technológie na monitorovanie genitálneho prekrvenia pri rutinnom zaznamenávaní kardiovaskulárnych parametrov. Sme schopní zmerať malé zmeny vaginálneho (a dokonca klitoriálneho) prekrvenia indukované stimuláciou pelvického nervu alebo infúziou VIP v prítomnosti alebo v neprítomnosti skúšaných činidiel.
Veríme, že náš zvierací model priamo reflektuje klinické údaje. Tento model je teda možné používať pri štúdiách činidiel, ktoré sú potenciálne účinné pri liečení FSAD, ako je meranie zvýšenia vaginálneho alebo klitoriálneho prekrvenia.
Fyziologické meranie ženského sexuálneho vzrušenia
Podlá tohto vynálezu je na meranie klitoriálneho a vaginálneho prekrvenia možné použiť rad rôznych postupov. Je napríklad možné použiť vaginálnu fotopletysmografiu, NMR zobrazovanie klitorisu alebo vagíny pri použití kontrastného činidla, laser-Dopplerovské pulzné zobrazovanie klitorisu/vulvy a ultrasonografiu klitorisu.
• · ··· · ·· ···· 9 9 • ··· • 9 • · ··
99
9 9 9
9 9 • · · · 9 9 9 • · 9 9 9 9 ·· ··· ·· ····
Zvlhčenie vagíny je tiež možné merať postupmi známymi v tomto odbore, ako je (a) váženie vaginálnych tampónov pred a po stimulácii, a (b) meranie pH vaginálnej tekutiny.
K posledne uvedenému je účelné uviesť, že médium, ktoré sa normálne nachádza vo vagíne, sa stáva zásaditejšie, keď sa pri transsudácii kvapaliny počas sexuálnej stimulácie približuje krvnému pH.
PDE (fosfodiesteráza)
Podlá jedného aspektu tohto vynálezu je cielom pcAMP cieí' íe PDE (fosfodiesteráza), ktorou je PDE hydrolyzujúca cAMP (a prípadne hydrolyzujúca cGMP).
Je známe, že cyklické nukleotidy, ako cAMP a cGMP, sú dôležité intracelulárne druhé poslovia. Cyklický nukleotid fosfodiesterázy - inak známy ako PDE - tvorí triedu enzýmov, ktoré katalyzujú degradáciu cyklických nukleotidov, a tým že takto pôsobí, predstavujú jednu z bunkových zložiek, ktoré regulujú koncentráciu cyklických nukleotidov.
V posledných rokoch bolo na základe substrátovej afinity a potreby kofaktorov definovaných aspoň sedem PDE enzýmov (ako PDEI až PDEVII) a ďalej vela podtypov týchto enzýmov (Beavo J. A. a Reifsnyder D. H., Trends Pharmacol. Sci. 11: 150, 1990; Beavo J., Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases: Structure, Regulation and Drug Action, Beavo,
J. a Housley, M. D. (ed.), Wiley: Chichester, str. 3 až 15, 1990) .
Ako príklady PDE je možné uviesť PDEI, čo je Ca2+/kalmodulin-dependentná PDE; PDEII, čo je cAMP a cGMP stimulovaná PDE; PDEIII, čo je cGMP inhibovaná PDE; PDEIV, čo je vysoko afinitná cAMP-špecifická PDE; a PDEV, čo je cGMP špecifická PDE. PDEI apod. sú niekedy tiež označované ako PDE typu I apod. alebo PDE typu 1 apod.
• · ·· ···· ·· e, ·· · ··· · · · · • · · · · ··· · · · • ···· ··· · Ο · · · • · · · ···· ··· · ·· ··· ·· ····
- 87 Každá trieda PDE môže obsahovať dve alebo viac izoforiem (tzn. že môžu existovať dva alebo viac PDE izoenzýmov). Napríklad o cicavčej PDE IV, homológu génu hlúpych (Dunce) drozofil (Chen, C. N. et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 8SA,
83. 9313, 1986), je známe, že pri potkanoch tvorí štyri izoformy (Swinnen J. V. et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA,
86; 5325, 1989). 0 ludských PDE je tiež známe, že sa vyskytujú ako izoformy a majú zostrihové varianty. Napríklad v roku 1990 bolo opísané klonovanie ludskej izoformy PDEIV z monocytov (Livi, G. P. et al., Mol. Celí. Biol., 10;
2678, 1990). Ďalej napríklad iní pracovníci nezávisle klonovali zostrihové varianty PDEIV, ktoré sú teraz označované ako hPDEIV-Bl, hPDEIV-B2 a hPDEIV-B3.
Informácie o cyklický nukleotid fosfodiesterázach je možné tiež nájsť v US-A-5 932 423 a US-A-5 932 465.
Informácie o cyklický nukleotid fosfodiesteráze, predovšetkým CN PCDE8, je možné nájsť v WO-A-97/35989. Podlá WO-A-97/35989 má CN PCDE8 dva izozymy, ktoré sa označujú ako CN PCDE8A a CN PCDE8B. Pojmom izozym býva v tomto odbore niekdy označovaná izoforma.
Podlá WO-A-97/35989 bol identifikovaný rad inhibítorov PDE, a niektoré z nich prešli klinickými skúškami. Napríklad boli vyvinuté inhibítory PDEIII ako protitrombotické činidlá, antihypertenzívne činidlá a ako kardiotonické činidlá, užitočné pri liečení hromadivého srdcového zlyhania. Rolipram, inhibítor PDEIII, sa používa pri liečení depresie a iné inhibítory PDEIII sú teraz skúšané ako protizápalové činidlá. Tiež sa ukázalo, že Rolipram inhibuje lipopolysacharid (LPS) indukovaný TNF-alfa, o ktorom sa ukázalo, že podporuje replikáciu HIV-1 in vitro. Rolipram teda môže inhibovať replikáciu HIV-1 (Angel et al., 1995, AIDS 9: 1137 až 1144). Okrem toho na základe svojej schopnosti • · ···· ·· ···· • · · • · ··· • · · • · · ·· ··· ·· ·· • · 9 9
9 9
9 9
9 9
9999 potlačovať produkciu TNF-alfa a beta a interferónu-gama, sa rolipram ukázal byť užitočný pri liečení encefalomyelitdy, na experimentálnom zvieracom modele roztrúsenej sklerózy (Sommer et al. , 1995, Nat. Med. 1: 244 až 248) a môže byt účinný pri liečení tardívnej dyskinézy (Sasaki et al.,
1995, Eur. J. Pharmacol. 282: 71 až 76).
Podlá WO-A-97/35989 tiež existujú nešpecifické inhibítory PDE, ako teofylín, ktorý sa používa pri liečení astmy bronchiale a iných respiračných chorôb, a pentoxifylín, ktorý sa používa pri liečení intermitentnej klaudikácie a periférnych vaskulárnych chorôb indukovaných diabetes. Teofylín je považovaný za látku, ktorá ovplyvňuje funkciu hladkého svalu dýchacích ciest a prostredníctvom svojich protizápalových alebo imunomodulačných vlastností je užitočný pri liečení respiračných chorôb (Banner et al., 1995, Respir. J. 8: 996 až 1000), pričom sa predpokladá, že pôsobí prostredníctvom inhibície hydrolýzy ako CN PDE cAMP tak cGMP (Banner et al., 1995, Monaldi Árch. chest. Dis.
50: 256 až 292). Pentoxyfilín, o ktorom je tiež známe, že blokuje produkciu TNF-alfa, môže inhibovať replikáciu HIV-1 (Angel et al., pozri hore). Zoznam CN PDE inhibítorov je uvedený v publikácii Beavo 1995 pozri hore.
Predpokladá sa, že selektívne inhibítory PDE, okrem svojich izozymov a ich podtypov, povedú k účinnejšej terapii s menšími vedlajšími účinkami. Pozri Vieshaar, R. E. et al.,
J. Med. Chem., 28: 537, 1985; Giembycz, M. A., Biochem. Pharm., 43: 2041, 1992; a Lowe, J. A. a Cheng, J. B., Drugs of the Future, 17: 799 až 807, 1992.
Pri niektorých aplikáciách je teda žiadúce dosiahnuť selektívnu inhibiciu konkrétneho typu PDE.
- 89 • 9 ···· ·· ···· ·· ·· • · · · • · · • · · · • · · ·· ····
Základné informácie o PDE sú uvedené na adrese http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/0mim/searchomem.htm (Vietor A. McKusick et al.). Nasledujúce údaje týkajúce sa PDE2 alebo cGMP-stimulovanej PDE pochádzajú z tohto zdroja.
Cyklické nukleotidy slúžia ako druhí poslovia, ktoré sprostredkovávajú rôzne bunkové reakcie na extracelulárne signály, ako hormóny, svetlo a neurotrasmitery. Cyklický nukleotid fosfodiesteŕázy (PDE) sa podiela na transdukcii signálu reguláciou koncentrácie cyklických nukleotidov v bunkách. Cicavčie bunky obsahujú rôzne PDE, ktoré sa na základe svojej afinity k substrátom a selektívnej citlivosti ku kofaktorom a inhibičným látkam delie do 7 tried. Týmito triedami sú: (I) Ca(2a)/kalmodulin-dependentné PDE;
(II) cGMP-stimulované PDE; (III) cGMP-inhibované PDE; (IV) cAMP-špecifické PDE; (V) cGMP-špecifické PDE; (VI) fotoreceptorové PDE; a (VII) vysoko afinitné, cAMP-špecifické.
Z aminokyselinových sekvencii je zrejmé, že všetky triedy PDE obsahujú príbuznú doménu, o ktorej sa predpokladá, že je doménou katalytickou, s približne 30% sekvenčnou identitou medzi triedami. Príslušníci rovnakej triedy si sú podobnejšie; majú 60 až 80% sekvenčnú identitu v rámci celej kódujúcej oblasti.
Michaeli et al. (1993) vyvinuli vysoko citlivý funkčný sereening na izoláciu cDNA kódujúcich cAMP fosfodiesterázy komplementáciou defektov v kmeni Saccharomyces cerevisiae postrádajúcim obidva endogénne cAMP PDE gény,
PDE1 a PDE2. Pri použití tohto funkčného screeningu boli z cDNA knižnice ludského glioblastómu izolované tri skupiny cDNA zodpovedajúcej trom rôznym ludským génom kódujúcim cAMP-špecifické PDE. Dva z týchto génov sú blízko príbuzné génu hlúpych (dunce) cAMP-špecifickej PDE drozofily. Tretí gén, ktorý Michaeli et al., (1993) označujú ako HCP1, kódoval novú cAMP-špecifickú PDE. Aminokyselinová sekvencia HCPl bola podobná sekvenciám katalytických domén všetkých • · ·· ···· ·· ·· ··· ··· ···· • · · · · ··· · · · • ···· ··· ···· · • · ·· ···· ··· · ·· ··· ·· ···· cyklický nukleotid fosfodiesteráz. Je to však vysoko afinitná cAMP-špecifická PDE, ktorá nemá iné vlastnosti triedy cAMP-špecifických PDE. PDE aktivita HCPl nebola citlivá na cGMP alebo iné inhibítory cGMP-inhibovatelné PDE. Biochemické a farmakologické vlastnosti HCPl kolektívu Michaeli et al. napovedali, že ide o príslušníka skôr neobjavenej triedy cyklický nukleotid PDE, ktorú tento kolektív označil ako triedu VII. Analýza northern prenosom ukázala prítomnosť vysokých hladín HCPl RNA v kostrovom svalstve človeka.
Analýzou Southern prenosom hybridných línií somatických buniek Milatowich et al. (1994) zaznamenali HCPl lokus na chromozóm 8; štúdiou hybridných línií somatických buniek, ktoré obsahovali rôzne oblasti chromozómu 8, regionalizovali priradenie na 8ql3-q22. Han et al. (1998) fluorescenčnou hybridizáciou in situ zaznamenali gén PDE7A na 8ql3 a medzidruhovou krížovou analýzou zaznamenali myší gén Pde7A na proximálnu oblasť chromozómu 3.
Základné informácie o PDE2 zverejnili Jennifer P. Mačke et al. na adresa http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/0mim/ /searchomim.htm. Nasledujúce informácie týkajúce sa PDE2 stimulovanej cGPM sú výťahom z tohto zdroja.
Rosman et al. (1997) klonovali cDNA zodpovedajúce ludskej PDE2A. Gén PDE2A kóduje polypeptid s 941 aminokyselinami s predpokladanou molekulovou hmotnosťou 106 kD. Sekvencia proteínu je z 90 % identická s bovinnou sekvenciou a sekvenciou potkana PDE2A. Analýza northern blot ukázala, že PDE2A je exprimovaná ako 4,2kb mRNA v rôznych úrovniach vo všetkých skúšaných tkanivách, s najvyššou expresiou v mozgu. Expresné štúdie ukázali, že PDE2A hydrolyzuje cAMP a cGMP a je inhibovaná PDE2A-špecifickým inhibítorom EHNA.
• 9
999« í · · ) 9 9 9 9
Nukleotidové sekvencie a aminokyselinové sekvencie pre fosfodiesterázy sú dostupné z literatúry. Niektoré sekvencie sú uvedené v pripojenom sekvenčnom protokole.
Podlá jedného aspektu je PDE ciel zvolený z jedného alebo viacerých nasledujúcich PDE enzýmov: PDEcamp 1/ PDEcAMP 2> PDEcAMP 3' PDEcAMP 4' PDEcAMP 7 a PDEcAMP 8·
Vo výhodnejšom rozpracovaní je PDE ciel zvolený z jedného alebo viacerých nasledujúcich PDE enzýmov: PDEcAMp 11 PDEcAMP 2' PDEcAMP 3· PDEcAMP 4·'
Pre tento vynález je PDE ciel aspoň PDE2.
I:PDE
Ako už bolo uvedené hore, činidlom môže byt akékolvek vhodné činidlo, ktoré môže pôsobiť ako I:PDE.
Príklady I:PDE sú opísané v EP-A-091133 a EP-A-0771799.
I:PDE je prednostne I:PDE2. Prednostnými príkladmi takých zlúčenín sú teda zlúčeniny uvedené v dokumente EP-A-0771799.
Pre účelnosť je tu uvedený nárok 1 EP-A-0771799:
Deriváty purin-6-onu všeobecného vzorca I
R1
E—L
V (I)
A
I
D • · ···· ·· ···· • · • ··· kde
R1 predstavuje vodík alebo lineárnu alebo rozvetvenú alkylskupinu obsahujúcu až 8 atómov uhlíka;
R2 predstavuje lineárnu alebo rozvetvenú acylskupinu obsahujúcu až 4 atómy uhlíka, alebo lineárnu alebo rozvetvenú alkylskupinu obsahujúcu až 8 atómov uhlíka prípadne substituovanú hydroxyskupinou, azidoskupinou alebo skupinou všeobecného vzorca -NR3R4 alebo -OSO2R5; kde
R3 a R4 sú rovnaké alebo rôzne a predstavujú cykloalkylskupinu obsahujúcu 3 až 6 atómov uhlíka, vodík, formylskupinu, alebo lineárnu alebo rozvetvenú alkylskupinu obsahujúcu až 6 atómov uhlíka, prípadne substituovanú lineárnou alebo rozvetvenou alkoxyskupinou alebo alkoxykarbonylskupinou obsahujúcou až 6 atómov uhlíka alebo skupinou všeobecného vzorca -(CO)a-NR6R7, kde a predstavuje číslo 0 alebo 1;
R6 a R7 sú rovnaké alebo rôzne a predstavujú vodík, formylskupinu, hydroxyskupinu, fenylskupinu alebo lineárnu alebo rozvetvenú alkylskupinu obsahujúcu až 6 atómov uhlíka prípadne substituovanú hydroxyskupinou alebo lineárnou alebo rozvetvenou alkoxyskupinou obsahujúcou až 5 atómov uhlíka; alebo
R3 a/alebo R4 predstavuje lineárnu alebo rozvetvenú alkoxykarbonylskupinu obsahujúcu až 6 atómov uhlíka, karboxyskupinu alebo lineárnu alebo rozvetvenú acylskupinu obsahujúcu až 6 atómov uhlíka prípadne substituovanú hydroxyskupinou alebo line·· · • · · · · • ··»· · · · • · · · ··· · ·· ·· ···· • · · ·
- 93 árnou alebo rozvetvenou alkoxyskupinou obsahujúcou až 4 atómy uhlíka; alebo
R3 a/alebo R4 predstavuje zvyšok vzorca -(CO)b-T-NR8R9,
-COR10, -SO2Ri:l alebo -SO2NR12R13, kde b má význam uvedený hore pre a, pričom môže mať konkrétnu hodnotu rovnakú ako a alebo odlišnú od a;
T môže predstavovať lineárnu alebo rozvetvenú alkylskupinu obsahujúcu až 5 atómov uhlíka, alebo ked b nie je rovné 0, môže tiež predstavovať väzbu;
R8 a R9 majú význam uvedený pre R8 a R7, pričom môžu byť rovnaké ako R6 a R7 alebo odlišné od R6 a R7;
R10 predstavuje nasýtený, čiastočne nasýtený alebo nenasýtený päť- až sedemčlenný heterocyklus obsahujúci až 3 heteroatómy zvolené z atómov síry, dusíka a/alebo kyslíka, ktorý je tiež prípadne substituovaný na dusíkatej funkčnej skupine lineárnou alebo rozvetvenou alkylskupinou, alkoxyskupinou alebo alkoxykarbonylskupinou obsahujúcou až 4 atómy uhlíka, karboxyskupinou, benzyloxykarbonylskupinou alebo hydroxyskupinou;
R11 predstavuje lineárnu alebo rozvetvenú alkylskupinu obsahujúcu až 5 atómov uhlíka, benzylskupinu alebo fenylskupinu;
R12 a R13 sú rovnaké alebo rôzne a predstavujú vodík, fenylskupinu alebo lineárnu alebo rozvetvenú alkylskupinu obsahujúcu až 6 atómov uhlíka; alebo
R3 a R4 dohromady s atómom dusíka tvoria päť- alebo šesťčlenný nasýtený, čiastočne nasýtený alebo nenasý• · · · · · ·· ·· ···· « · « ··· • · · · • · · • · t • · · ·« ····
- 94 tený heterocyklus, ktorý môže obsahovať až 3 heteroatómy zvolené z atómov dusíka, síry a/alebo kyslíka alebo zvyšok -NR14 a ktorý je prípadne substituovaný karbonylskupinou, lineárnou alebo rozvetvenou alkoxykarbonylskupinou obsahujúcou až 5 atómov uhlíka alebo lineárnou alebo rozvetvenou alkylskupinou obsahujúcou až 5 atómov uhlíka, ktorá ďalej môže byť substituovaná hydroxyskupinou, karboxyskupinou alebo lineárnou alebo rozvetvenou acylskupinou, alkoxyskupinou alebo alkoxykarbonylskupinou, z ktorých každá obsahuje až 6 atómov uhlíka; kde
R14 predstavuje vodík, karbonylskupinu alebo lineárnu alebo rozvetvenú alkylskupinu alebo alkoxykarbonylskupinu, z ktorých každá obsahuje až 5 atómov uhlíka; a
R5 predstavuje fenylskupinu alebo lineárnu alebo rozvetvenú alkylskupinu obsahujúcu až 5 atómov uhlíka;
A predstavuje lineárny alebo rozvetvený alkylénový alebo alkenylénový reťazec, z ktorých každý obsahuje až 6 atómov uhlíka;
D a L sú rovnaké alebo rôzne a predstavujú arylskupinu obsahujúcu 6 až 10 atómov uhlíka alebo päť- až sedemčlennú aromatickú, prípadne benzoanelovanú heterocyklickú skupinu obsahujúcu až 3 heťeroatómy zvolené z atómov síry, dusíka a/alebo kyslíka, ktorá je prípadne substituovaná až tromi substituentmi, ktoré môžu byť rovnaké alebo rôzne, zvolenými zo súboru skladajúceho sa z halogénu, hydroxyskupiny nitroskupiny, trifluórmetylskupiny, karboxyskupiny, lineárnej alebo rozvetvenej alkylskupinu, alkoxyskupiny alebo alkoxykarbonylskupinu, z ktorých ···· ·· ···· • · • ··· • · · · • · · ·· ··· ·· ·· • · · · • · · • · · • · · ·· ····
- 95 každá obsahuje až 6 atómov uhlíka, alebo skupinou vzorca -(V)C-NR15R16 a/alebo -OR17, kde c predstavuje číslo 0 alebo 1;
v predstavuje zvyšok vzorca -CO alebo -SO2;
R15 a R16 sú rovnaké alebo rôzne a majú význam uvedený hore pre R3 a R4;
R17 predstavuje vodík, lineárnu alebo rozvetvenú alkenylskupinu obsahujúcu až 8 atómov uhlíka alebo lineárnu alebo rozvetvenú alkylskupinu obsahujúcu až 8 atómov uhlíka, ktorá je prípadne substituovaná až 3 substituentmi, ktoré môžu byt rovnaké alebo rôzne, zvolenými z hydroxyskupiny, karbonylskúpiny a lineárnej alebo rozvetvenej alkoxykarbonylskupiny obsahujúcej až 5 atómov uhlíka; a/alebo kruhy sú prípadne substituované arylskupinou obsahujúcou 6 až 10 atómov uhlíka alebo pät- až sedemčlenným aromatickým, prípadne benzoanelovaným heterocyklom obsahujúcim až 3 heteroatómy zvolené z atómov síry, dusíka a/alebo kyslíku, ktorý je dalej prípadne substituovaný až dvoma substituentmi, ktoré môžu byt rovnaké alebo rôzne, zvolenými z halogénu, hydroxyskupiny, nitroskupiny, karboxyskupiny, trifluórmetylskupiny alebo lineárnej alebo rozvetvenej alkylskupiny, alkoxyskupiny alebo alkoxyskupiny, z ktorých každá obsahuje až 5 atómov uhlíka alebo skupinou vzorca (V’)d-NR18R19; kde d má význam uvedený hore pre a, pričom môže mat konkrétnu hodnotu rovnakú ako a alebo odlišnú od a;
R18 a R19 majú význam uvedený pre R3 a R4, pričom môžu byt rovnaké ako R3 a R4 alebo odlišné od R3 a R4;
·· ····
- 96 • · ·· ···· ·· · · · · • · · · · ··· • ···· · · · · • · · · · ··· · ·· ··· ··
V má význam uvedený hore pre V, pričom môže byť rovnaký ako V alebo odlišný od V; a/alebo predstavuje kruhový systém uvedený dalej pre D, prípadne substituovaný lineárnou alebo rozvetvenou acylskupinou obsahujúcou až 5 atómov uhlíka, prípadne substituovanú hydroxyskúpinou, lineárnou alebo rozvetvenou alkoxyskupinou obsahujúcou až 5 atómov uhlíka alebo skupinou vzorca -NR20R21; kde
R20 a R21 sú rovnaké alebo rôzne a majú význam uvedený hore pre R3 a R4; alebo
E predstavuje zvyšok vzorca -CH2-Y-Z-; kde
Y predstavuje väzbu alebo atóm kyslíka alebo síry alebo skupinu vzorca -NH-;
Z predstavuje lineárny alebo rozvetvený alkylový reťazec obsahujúci až 5 atómov uhlíka; a
D predstavuje zvyšok vzorca
Prednostné I:PDE sú zvolené zo zlúčenín nasledujúcich štruktúrnych vzorcov;
• · ·· ···· ·· ·· ·· · ··· · · · · • · « · · ··· · · · • ···· · · · »··· · • · ·· ···· ··· · ·· ··· ·· ····
Zlúčenina Štruktúrny vzorec Typ pôsobenia - Odkaz
Fla I:PDE1 EP-A-0911333 (príklad 50)
Flb NH, čn N Nv/ 0H I:PDE2 EHNA (tiež inhibítor adeinozín deaminázy)
FH OMe O MeO^Js. , O 0 I:PDE2 EP-A-0771799 Milrinón (dostupný na trhu)
Fm Von OH ĽPDE3 Rolipram (dostupný na trhu)
FIV oO “Xu M® o I:PDE4 Rolipram (dostupný na trhu)
···· · ··· · ·· ···· • · · • · ··· • · · • · · ·· ··· ·· ·· • · · · « · · • · · · • · · ·· ····
NEP (neutrálna endopeptidáza)
Podlá jedného aspektu tohto vynálezu prídavným cielom môže byť iný Pc^p ciel ako NEP.
Nukleotidové sekvencie a aminokyselinové sekvencie NEP sú dostupné v literatúre a niektoré z nich sú uvedené v pripojenom sekvenčnom protokole.
Podlá jedného aspektu je NEP NEP (EC 3.4.24.11), tiež známa ako enkefalináza alebo endopeptidáza-2. Našli sme NEP EC 3.4.24.11 mRNA a exprimovaný proteín v ludskej a králičej vagíne.
Predpokladá sa to, že u žien, vrátane žien, ktoré trpia FSAD, je VIP degradovaný NEP EC 3.4.24.11. Inhibítory NEP teda budú počas vzrušenia potencovať endogénny vazorelaxačný účinok VIP. To povedie k liečeniu FSAD, napríklad prostredníctvom posilnenia vaginálneho prekrvenia. Ukázali sme, že selektívne inhibítory NEP EC 3.4.24.11 zvyšujú genitálne (napríklad vaginálne alebo klitoriálne) prekrvenie vyvolané stimuláciou pelvického nervu a indukovanej VIP. Okrem toho selektívne inhibítory NEP zvyšujú relaxáciu izolovanej steny vagíny mediovanej VIP a nervovo.
Základné poznatky o NEP zverejnili Vietor A. McKusick et al. na http://www3.nebi.hlm.nih.gov/Omim/searchomim. htm. . Nasledujúce informácie týkajúce sa NEP sú výňatkom z tohto zdroja.
Všeobecný antigén akútnej lymfocytovej leukémie (common ALLA, CALLA) je dôležitý bunkový povrchový markér pri diagnóze ludskej akútnej lýmfoblastovej leukémie (ALL). Je prítomný na leukémických bunkách pre-B fenotypu, čo predstavuje 85 % prípadov ALL. CALLA sa však neobmedzuje na leu···· ·· ···· • · • ··· ·· ···· kemické bunky, a je možné ho nájsť pri rade normálnych tkanív. CALLA je glykoproteín, ktorý je osobitne hojný v obličkách, kde je prítomný na kefovom leme proximálnych tubulov a na glomeruálnom epiteli. Letarte et al. (1988) klonovali cDNA kódujúcu CALLA a ukázali, že aminokyselinová sekvencia dedukovaná z cDNA sekvencie je identická so sekvenciou ludskej neutrálnej endopeptidázy asociovanej s membránami (NEP; EC 3.4.24.11), známej tiež ako enkefalináza. NEP štiepi peptidy v amínovom mieste hydrofóbnych zvyškov a inaktivuje niekolko peptidových hormónov, ako glukagón, enkefalíny, látku P, neurotenzín, oxytocín a bradykinín. Transfekčnou analýzou cDNA Shipp et al. (1989) potvrdili, že CALLA je funkčnou neutrálnou endopeptidázou typu, ktorý bol skôr uvádzaný ako enkefalináza. Barker et al. (1989) doložili, že CALLA gén, ktorý kóduje lOOkD transmembránový glykoproteín typu II existuje v jedinej kópii s viac ako 45 kb, ktoré pri malignancií exprimujúcich CALLA na povrchu buniek nie je preskupený. Gén bol lokalizovaný na ludskom chromozóme 3 štúdií hybridných somatických buniek a in situ hybridizáciou lokalizovaný na 3q21-q27. Tran-Paterson et al. (1989) pri použití Southern analýzy DNA z hybridných ludských-hlodavčích buniek lokalizovali tento gén na chromozóme 3. D'Adamio et al. (1989) doložili, že gén CALLA má rozsah viac ako 80 kb a je tvorený 24 exónmi.
I:NEP
Ako už bolo uvedené hore, činidlom môže byť akékolvek vhodné činidlo, ktoré pôsobí ako I:NEP.
Podrobnosti o vhodnom systému na identifikáciu a/alebo štúdium I:NEP sú uvedené v nasledujúcom oddiele.
I:NEP sa zaoberajú nasledujúce prehľadné články:
- 100 ·· · • φ · • ···· • · ···· • · · t · ··· • · · • · · ·· ··· ·· ·· • · · · • · · • · · • · · • · ··· ·
Pathol. Biol., 46(3), 1998, 191.
Current Pharm. Design, 2(5), 1996, 443. Biochem. Soc. Trans., 21(3), 1993, 678. Handbook Exp. Pharmacol., 104/1,1993, 547 TiPS, 11, 1990, 245.
Pharmacol. Rev., 45(1), 1993, 87.
Curr. Opin. Inves. Drugs, 2(11), 1993,1175. Antihypertens. Drugs, (1997), 113.
Chemtracts, (1997), 10(11), 804.
Zinc MetalJoproteases Health Dis. (1996), 105. Cardiovasc. Drug Rev., (1996), 14(2), 166.
Gen. Pharmacol., (1996), 27(4), 581.
Cardiovasc. Drug Rev., (1994), 12(4), 271.
Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., (1995), 22(1), 63. Cardiovasc. Drug Rev., (1991), 9(3), 285.
Exp. Opin. Ther. Patents (1996), 6(11), 1147.
I:NEP.sú opísané v nasledujúcich dokumentoch
EP-509442A
US-192435
US-4929641
EP-599444B
US-884664
EP-544620A
US-798684
J. Med. Chem. 1993,3821.
Circulation 1993, 88(4), 1.
EP-136883 JP-85136554 US-4722810
Curr. Pharm. Design, 1996, 2, 443. EP-640594
J. Med. Chem. 1993, 36(1), 87.
··· ·
- 101 « · · • · · ·· ··· e
* · · • · · · • · · ·♦ ··♦·
EP-738711-A WO-9309101
JP-270957 WO-9109840
CAS# 115406-23-0 EP-519738
DE-19510566 EP-690070
DE-19638020 J. Med. Chem. (1993), 36, 2420.
EP-830863 JP-95157459
JP-98101565 EP-733642 WO9614293 JP-08245609 JP-96245609 WO9415908 JP05092948 Bioorg. Med. Chem. Letts., 1996, 6(1), 65.
Prednostné I:NEP sú opísané v nasledujúcich dokumentoch: EP-A-0274234 . JP-88165353
Biochem.Biophys.Res. Comm.,1989, .164, 58
EP-629627-A
US-77978
Perspect. Med. Chem. (1993), 45.
EP-358398-B
Prednostné príklady I:NEP sú zvolené zo zlúčenín nasledujúcich štruktúrnych vzorcov:
Zlúčenina Štruktúrny vzorec Typ pôsobenia Odkaz
FXH Me Cryf Ve SAc* '-'V l:NEP EP-509442A US-192435 US-4929641
FXní HOjC—\ N-VX -SH <Z I:NEP (tiež inhibítor ACE) EP-599444B US-8 84664
FXIV co,» 0 0 ΟΛνΛ OH I.-NEP EP-544620A US-798684 J. Med. Chem. 1993,3821.
'· ···· • · · • · ··· • · * • * ·· ···
- 102 ·« ·· « · · · • · ···· ····
FXV SL-A1* Me 'i H HOjC Me I:NEP (tiež inhibítor ACE) Mixanpril Circulation 1993,88(4), 1.
FXVI 0 I:NEP EP-136883 JP-85136554 US-4722810
FXVn Ox oo H I:NEP Retrothiorphan Curr. Pharm. Design, 1996,2,443.
FXVin v θ Λ>νΑ 0 COjH Γ.ΝΕΡ (tiež inhibítor ACE) EP-640594
FXIX 1 Λ ? 1 CO,H J H I:NEP J. Med, Chem. 1993, 36(1), 87.
FXX ^^hÍACOiH V-n/T ? bH<< •I:NEP (tiež inhibítor ACE) EP-738711-A JP-270957
FXXI ct 9 OH - “•AVsV 0 0 M 0 I:NEP CAS# 115406-23-0
FXXD 0 H ><\-CO,Et I:NEP (tiež inhibítor ECE) DE-19510566 DE-19638020 EP-830863 JP-98101565
FXXín θχοH 0 °° »<} HOjC-^ I:NEP (tiež inhibítor ECE) ’ EP-733642
·« ···· • · • ··· ····
- 103 ····
FXXIV OH Ah ° Ε'Ογ'^ΗγΗγ'^ΟΕ1 I:NEP WO96/14293
FXXV A'i N ΗΟγζ^χΝγΝ'ι °H ° ° I:NEP JP-08245609 JP-96245609
FXXVI o H ΗΟ^Λ^ΧγΝ^σΟ,Η ' H 0 I:NEP WO9415908
FXXVII 0 0 'Y'''· HO'N'^ý'fAcO!H ĽNEP JP05092948
FXXVIĽ “Ay\ O n-n '-COjH I:NEP WO-9309101
FXXIX 0 COjH I:NEP WO-9109840
FXXXI οΑ*ίΑ$ HOjC I:NEP EP-519738 EP-690070
FXXXH HOjC ./λ oyT · AcS^n-'<-O H I:NEP |(tiež inhibítor ACE) J, Med. Chem. (1993), 36,2420. ..
Fxxxm 0 0 I:NEP JP-95157459 Bioorg. Med. Chem. Letts., 1996,6(1), 65.
- 104 ·· ···· • · · • · ··· ···· · · · · • · · · • · ·· ··· • · * • · · ·· ····
I:NEP, ktorým sa venuje najväčšia prednosť sú zvolené zo zlúčenín nasledujúcich štruktúrnych vzorcov:
Zlúčenina Štruktúrny vzorec Typ pôsobenia Odkaz
FV 0 I:NEP EP-A-0274234 (príklad 300)
FVI I:NEP EP-A-0274234 (príklad 379)
FVH <j)Me OH I:NEP Kandoxatrilat EP-274234 JP-88165353 Biochem.Biophys.Res. Comm.,1989,164, 58
Fvm P ?°2H ° ^sh I:NEP Oraapatrilat , (tiež inhĺbítor ACE) ' EP-0629627-A US-77978
FIX NHSO2Me H2Nx'xXx'lxf0 HN^ Ηθ/JcB 0 ^OH I:NEP Sampatrilat (tiež inhibítor ACE) » Perspect. Med. Chem. (1993), 45. EP-0358398-B
FX HQ °L ^P.~NÁYN<VrÍH k/O OH $ CO,H ho^h I:NEP Fosforamidon (dostupný na trhu)
FXI hs^t^nV0H ďHo I:NEP Thiorfan (dostupný na trhu)
• ·· ···· • · · · • · · · ··· ···· · · · · • · ·· ···
105
Väčšia prednosť sa venuje I;NEP zvoleným z nasledujúcich zlúčenín:
- 106 ·· ···· ·· ·· • · · · · · · • · ··· · · · • · · · · · · • · · · · · ·· ··· ·· ··· ·
107 • 9 9999 ·· ··
9 9 · · · ·
99999 · · *
9 9 9 ·· · • · · 9 9 9 • 9 999 ·· 9999
Tieto zlúčeniny boli pripravené pri použití spôsobov opísaných v príkladoch uskutočnenia. Tiež boli skúšané ako činidlá, a tie, o ktorých bolo zistené, že sú užitočné pri potenciácii cAMP, sú teda užitočné pri liečení FSAD. Niektoré údaje zo skúšok týchto zlúčenín sú uvedené v príkladoch uskutočnenia.
Stanovenie NEP
Príprava a stanovenie rozpustnej neutrálnej endopeptidázy (NEP) z kôry obličiek psa, potkana a králika
Rozpustná NEP bola získaná z kôry obličiek a jej aktivita bola stanovená meraním rýchlosti štiepenia NEP substrátu, Abz-D-Arg-Arg-Leu-EDDnp, za vzniku jeho fluorescenčného produktu, Abz-D-Arg-Arg.
Skúšobný postup
1. Látky
Všetka voda bola dvojité deionizovaná.
1.1. Tkanivá iudské obličky HAM (Pensylvánia, USA)
Potkanie obličky
Králičie obličky
Psie obličky
1.2. Homogenizačné médium lOOmM manitol a 20mM Tris s pH 7,1
2,42 g Tris (Fisher T/P630/60) sa zriedi v 1 litre vody a pH zriedenej zmesi sa pri použití 6M kyseliny chlorovodíkovej
- 108 ·· ···· • · • é·· )
» · « » · ι ·· ··· t· ·· • · · · e · · • · · • · · ·· ···· pri teplote miestnosti nastaví na 7,1. K tejto zmesi sa pridá manitol (Sigma M-9546).
1.3. Tris tlmivý roztok (NEP tlmivý roztok)
50ml 50mM Tris pH 7,4 (Sigma T2663) sa zriedi 950 ml vody.
1.4. Substrát (Abz-D-Arg-Arg-Leu-EDDnp)
Pripraví sa podlá pokynov firmy SNPE a skladuje sa ako prášok pri -20°C. 20mM rezervná suspenzia sa pripraví šetrným resuspendovaním substrátu v Tris tlmivom roztoku, pričom by sa nemal používať ani vírivý pohyb ani sonikácia. 600μ1 alikvóty 2mM rezervnej suspenzie sa skladujú až 1 mesiac pri -20°C. (Medeiros, M.A.S., Franca, M. S. F. et al., 1997, Brazilian Journal of Medicinal and Biological Research, 30, 1157 až 1162).
1.5. Úplný produkt
Na dosku sa zaradia vzorky zodpovedajúce 100% konverzii substrátu na produkt, aby bolo možné stanoviť % obratu substrátu. Úplný produkt sa vytvorí inkubáciou 1 ml 2mM substrátu s 20 μΐ rezervnej suspenzie enzýmu počas 24 hodín pri 37°C.
1.6. Ukončovací roztok
Pri použití NEP tlmivého roztoku sa pripraví 300μΜ rezervný roztok Fosforamidonu (Sigma R7385), ktorý sa v 50μ1 alikvótoch skladuje pri -20°C.
1.7. Dimetylsulfoxid (DMSO)
1.8. Chlorid horečnatý (MgC^.ô^O, Fisher M0600/53)
- 109 • · · ·· · • · • ··· ·· · · · · • · · · • ·· ··· ·· ·· • · · · • · · • · · • · · ·· ····
1.9. Čierne doštičky s 96 jamkami s gulatým dnom (Costar 3915)
1.10. TopSeal A (Packard 6005185)
1.11. Centrifugačné skúmavky
2. Špeciálne zariadenia
2.1. Centrifúga Sorvall RC-5B (rotor SS34 GSA, predchladená na 4°C).
2.2. Miniprajmer mixér Braun
2.3. Centrifúga Beckman CS-6R
2.4. Fluorstar Galaxy
2.5. Trepaný inkubátor Wesbart 1589
3. Postupy
3.1. Tkanivové preparáty
3.2. Psia, potkania, králičia a ludská NEP sa získa z kôry obličiek pri použití modifikovaného spôsobu opísaného v Booth, A. G. a Kenny, A. J. (1974) Biochem. J. 142, 575 až 581.
3.3. Zmrazené obličky sa nechajú roztopiť pri teplote miestnosti a od medully sa oddelí kôra.
3.4. Kôra sa jemne naseká a homogenizuje približne v 10 objemoch homogenizačného tlmivého roztoku (1.2) pri použití mixéru Miniprimer Braun (2.2) • · ···
- 110 ·· ···· ·· ·· • · · · · · · • · ··· · · * • · · · · · · • · · · · · ·· ··· ·· ····
3.5. K homogenitu sa pridá chlorid horečnatý (1.8) (20,3 mg/ /g tkaniva) a vzniknutá zmes sa 15 minút mieša v kúpeli z ladovej vody.
3.6. Homogenát sa v centrifúge Beckman (2.3) centrifúguje pri 1500xg (3820 min1) počas 12 minút. Supernatant sa premiestni do čerstvej centrifugačnej skúmavky a peleta sa odloží.
3.7. Supernatant sa v centrifúge Sovall (2.1) centrifuguje pri 15 OOOxg (12 100 min1) počas 12 minút a supernatant sa odloží.
3.8. Svetloružová vrstva na vrchu výslednej pelety sa oddelí a resuspenduje v homogenizačnom tlmivom roztoku obsahujúcom chlorid sodný (9 mg chloridu sodného v 5 ml tlmivého roztoku na 1 g tkaniva).
3.9. Suspenzia sa v centrifúge Beckman (2.3) centrifuguje pri 2200xg (4630 min1) počas 12 minút a peleta sa odloží.
3.10. Supernatant sa v centrifúge Sovall (2.1) centrifuguje pri 15 OOOxg (12 100 min1) počas 12 minút a supernatant sa odloží.
3.11. Výsledná peleta sa resuspenduje v homogenizačnom tlmivom roztoku obsahujúcom chlorid horečnatý (0,9 mg chloridu horečnatého v 0,5 ml tlmivého roztoku na 1 g tkaniva). Homogénna suspenzia sa získa pri použití mixéru Braun Miniprimer (2.2), v ΙΟΟμΙ alikvótoch zmrazí a je možné ju skúšat na aktivitu NEP.
- 111 ·· ···· • · · • · ···
4.0. Stanovenie aktivity NEP
Aktivita sa pri použití alikvótov NEP pripravených hore opísaným spôsobom merí ako schopnosť štiepiť NEP špecifický peptidový substrát.
4.1. Pripraví sa 4% roztok DMSO v NEP tlmivom roztoku (4 ml DMSO v 96 ml NEP tlmivého roztoku).
4.2. Rezervný substrát, úplný produkt, enzým a roztok fosforamidónu sa nechajú roztopiť na lade.
4.3. Do každej jamky sa pridá 50 μΐ 4% roztoku DMSO v NEP tlmivom roztoku.
4.4. 2mM rezervný substrát sa zriedi 1:4, čím sa získa 50μΜ roztok. Do každej jamky sa pridá ΙΟΟμΙ 50μΜ substrátu (konečná koncentrácia 25μΜ).
4.5. Reakcia sa zaháji prídavkom 50μ1 od každej koncentrácie pri sériovom riedení enzýmu (zvyčajne sa používa riedenie 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600 a 1:3200). Do prázdnych jamiek sa pridá 50 μΐ NEP tlmivého roztoku.
4.6. 2mM úplný produkt sa zriedi v pomere 1:80, čím sa získa 25μΜ roztok. 200 μΐ 25μΜ produkt sa pridá do prvých štyroch jamiek novej doštičky.
4.7. Doštičky sa inkubujú v trepacom inkubátore počas 60 minút pri 37’C.
4.8. 300μΜ rezervný roztok fosforamidónu sa zriedi 1:100, čím sa získa 300nM roztok. Reakcia sa zastaví prídavkom 100 μΐ 300nM fosforamidónu. Výsledná zmes sa inkubuje v trepacom inkubátori 20 minút pri 37°C a odčíta na zariadení Fluostar (ex320/em420).
• · ···· • · ···· • · • ··· ·· ·· • · · · • · ·
Stanovenie NEP inhibície
5.1. Substrát, úplný produkt, enzým a rezervný roztok fosforamidónu sa nechajú roztopiť na lade.
5.2. Rezervný roztoky zlúčenín sa pripraví pri použití 100% dimetylsulfoxidu a zriedi v pomere 1 : 25 NEP tlmivým roztokom, čím sa získajú 4% dimetylsulfoxidové roztoky. Všetky ďalšie riedenia sa vykonávajú pri použití 4% dimetylsulfoxidového roztoku (4 ml DMSO v 96 ml NEP tlmivého roztoku).
5.3. 50μ1 zlúčeniny sa dvojmo navzorkuje do 96jamkových doštičiek; do kontrolných jamiek a jamiek na slepý pokus sa navzorkuje 50 μΐ 4% roztoku DMSO v NEP tlmivom roztoku.
5.4. 2mM rezervný substrát sa zriedi v pomere 1 : 40 pri použití NEP tlmivého roztoku, čím sa získa 50μΜ roztok (275 μΐ 2mM substrátu na 10,73 ml tlmivého roztoku postačuje pre 1 doštičku).
5.5. Rezervný enzým sa zriedi NEP tlmivým roztokom (stanovené z kontrol aktivity).
5.6. 2mM rezervný úplný produkt sa zriedi v pomere 1 : 80 NEP tlmivým roztokom, čím sa získa 25μΜ roztok. Do prvých štyroch jamiek separátnej doštičky sa navzorkuje 200 μΐ.
5.7. 300μΜ rezervný roztok fosforamidónu sa zriedi v pomere 1 : 1000, čím sa získa 300nM rezervný roztok (11 μΐ fosforamidónu na 10,99 ml NEP tlmivého roztoku).
5.8. Do každej jamky 96jamkovej doštičky sa pridajú nasledujúce látky:
- 113
0Φ· * • · φφφφ φφ ···· φ φ φ ··· φ φ · · φ φ · · φφ φφφ φφ φφ φ φ φ φ φ φ · φφφ φφφ φφ φφφφ
Tabuíka látok, ktoré sa majú navzorkovať do 96jamkovéj doštičky
Zlúčenina/ Tris Substrát Enzým Úplný
DMSO tlmivý NEP produkt roztok
vzorky 2 μΐ zlúčeniny 50 μΐ 100 μί 50 μί žiadny
kontrolné 2 μΐ DMSO 50 μΐ 100 μί 50 μΐ žiadný
slepé pokusy 2 μΐ DMSO 100 μΐ 100 μΐ žiadny žiadny
s úplným 2 μΐ DMSO žiadny žiadny žiadny 200 μΐ
produktom
5.9. Reakcia sa zaháji prídavkom NEP enzýmu a pokračuje jednohodinovou inkubáciou pri 37’C v trepacom inkubátore.
5.10. Reakcia sa ukončí 100 μΐ 300nM fosforamidónu. Zmes sa inkubuje 20 minút pri 37’C v trepacom inkubátore. Odčítanie sa vykoná na zariadení Fluostar (ex320/em420).
6. Výpočty
Aktivita enzýmu NEP sa stanoví v prítomnosti a v neprítomnosti zlúčeniny a vyjadrí sa pomocou percent.
FU = jednotky fluorescencie
Kontrolná aktivita
Stredná hodnota FU kontroly
Stredná hodnota FU s úplným produktom (%) (obrat enzýmu)
Stredná hodnota FU slepých pokusov
---x 100
Stredná hodnota FU slepých pokusov • · ·· ··«· ·· ·· ·· · ··· ···· • · · 9 9 999 · · · • ···· · · 9 9 ·· · · • · ·· 9 9 9 9 ··· · ·· ··· ·· ····
- 114 Aktivita s inhibítorom (%)
Stredná hodnota Stredná hodnota
FU zlúčeniny - FU slepých pokusov
- x 100
Stredná hodnota
FU úplného - Stredná hodnota produktu FU slepých pokusov
Aktivita vyjadrená ako % kontroly
Aktivita s inhibítorom (%) - x íoo
Kontrolná aktivita (%)
Preloží sa S-krivka závislosti odpovedi od dávky (% aktivity (% kontroly) verzus koncentrácia zlúčeniny) a pri použití balíčku LabStats na extrapoláciu kriviek v Excele sa vyrátajú hodnoty IC5Q.
NPY (neuropeptid Y)
Podlá jedného aspektu tohto vynálezu je prídavným cielom Pcamp ciel, pričom týmto PcAMp je NPY alebo jeho združené receptory.
Nukleotidové sekvencie a aminokyselinové sekvencie pre NPY a jeho receptory sú dostupné z literatúry. Niektoré sekvencie sú uvedené v pripojenom sekvenčnom protokole.
Zistili sme, že neuropeptid Y (NPY) uplatňuje inhibičný regulačný vplyv na vazorelaxáciu sprostredkovanú vazoaktívnym intestinálnym peptidom (VIP). Inhibícia receptorov NPY teda povedie k zväčšeniu zvýšenia prekrvenia genitálií (napríklad vagíny alebo klitorisu) sprostredkovanému pelvi• · ·· ···· ·· ·· • · · · Φ é · · · · • · · ····· ·· · • ···· · · · ···· · • · · · · · · · ··· · ·· ··· 99 ····
- 115 ckým nervom alebo VIP. To klinicky povedie k zvýšenému vaginálnemu a/alebo klitoriálnemu prekrveniu, čo sa nakoniec prejaví v zvýšenej lubrikácii prostredníctvom transsudácie plazmy a zvýšenia poddajnosti vagíny. Vhodným cielom na liečenie FSAD je teda NPY alebo niektorý z jeho združených receptorov.
Podlá jedného prednostného aspektu je teda prídavným činidlom antagonista NPY Yj Y2 alebo Y5, prednostne perorálny antagonista NPY YY2 alebo Y5. Toto činidlo bude FSAD liečiť zväčšením zvýšenia prekrvenia a lubrikácie genitálií (napríklad vagíny alebo klitorisu).
NPY-mediovaný antagonizmus VlP-indukovaného zvýšenia prekrvenia teda predstavuje potenciálny terapeutický ciel, ktorým je možné ovplyvniť prekrvenie ženských genitálií. Mechanizmom, ktorého prostredníctvom k tomuto antagonizmu dochádza, je najpravdepodobnejšie aktivácia G^/θ indukovaná NPY Y^-receptorom. V iných fyziologických systémoch sa receptory NPY Yj podielajú na mediácii vazokonstrikcie a inhibícii sympatického uvolnenia transmiterov (Lundberg et all., 1996; pričom nie je možné vylúčiť vplyv NPY Y2)· Predpokladáme, že tento NPY v ženskom genitálnom trakte inhibuje vazorelaxáciu prostredníctvom priamej inhibície adenylát cyklázy priamo inhibujúcej uvolňovanie VIP alebo sympatickej neurotransmisie.
Ako už bolo uvedené, prídavným Pc^j{p cielom je jeden z receptorov NPY.
Neuronálne uvolňovanie NPY reguluje vazorelaxáciu vaskulárneho lôžka vagíny indukovanú VIP. K tomu najskôr dochádza prostredníctvom presynaptického mechanizmu zahŕňajúceho receptory NPY Υχ, hoci nie je možné vylúčiť ani postsynaptickú formu. Antagonista NPY bude potencovať vazodilatáciu vaskulárneho lôžka vagíny indukovanú VIP, čo klinicky ·· ···· • · · · · ··· · · · • ···· · · · ···· · • · · · ···· ··· · ·· β·· ·· ····
- 116 povedie k zvýšeniu vaginálnej lubrikácie a poddajnosti sprostredkovanému prekrvením steny vagíny.
Pri expresných pokusoch s NPY receptorom, ktoré sme uskutočnili, boli v ludskej vagíne identifikované podtypy receptoru NPY Y^, Y2 a Y5.
Základné poznatky o NPY a jeho združených receptoroch uvádzajú Vietor A. McKusick et al. na adresa http:/ /www3.nebi.nim.nih.gov/Omim/searchomim.htm. Nasledujúci text pochádza z tohto zdroja.
Neuropeptid Y (NPY) je hojný a rozšírený peptid v nervovom systému cicavcov. Vykazuje sekvenčnú homológiu s peptidom YY a viac ako 50% homológiu v aminokyselinovej a nukleotidovej sekvencii s pankreatickým polypeptidom (PNP; 167780). NPY je peptidom zahŕňajúcim 24 aminokyselín. Minth et al. (1984) klonovali gén NPY, pri použití východiskovej mRNA feochromocytomu. Takeuchi et al. (1985, 1986) izolovali cDNA klony génov NPY z feochromocytómu, a PNP z endokrinného nádoru pankreasu. Pri použití týchto cDNA sónd na analýzu genómovej DNA z panelov chrozomálnych priradení hybridných ludských-myších somatických buniek potom skúmali otázku, či sú tieto gény synténne. Štúdie ukázali nesyntenitu s NPY na 7pter-7q22 a PNP na 17pll.l-17qter. Na základe skúšok so spätným krížením Mus spretus, Bahary et al. (1991) zaznamenali homológny NPY gén na myší chromozóm 6. Pretože je myší chromozóm 6 homológny s ludským 7q, je pravdepodobné, že NPY gén je u človeka umiestený v regióne 7cen-g22. Meisler et al. (1987) vylúčili blízku väzbu medzi miestami pre cystickú fibrózu a neuropeptidom Y. Terenghi et al. (1987) pri použití postupov hybridizácie in situ určili distribúciu mRNA kódujúcej NPY v neurónoch mozgovej kôry vo vzorkách z chirurgickej biopsie a mozgu post mortem. Ukázali zhodnú lokalizáciu transkripcie a expresie génu NPY v normálnych maturovaných kortikálnych neurónoch. Baker et al. (1995) pomocou
OO 9 9
- 117 fluorescenčnej hybridizácie in situ zistili, že NPY gén je umiestnený na 7pl5.1 a vyskytuje sa v jedinej kópii. Poznamenali, že NPY je jedným z najviac konzervovaných peptidov, aké sú známe, kde rozdiel medzi človekom a žralokom predstavujú iba 3 aminokyseliny. Neuropeptid Y je neuromodulátorom, ktorý sa podiela na regulácii energetickej rovnováhy a je nadprodukovaný v hypotalame myší ob/ob. Pri stanovovaní úlohy NPY pri odpovedi na nedostatok leptínu (164160) Erickson et al. (1996) vytvorili ob/ob myši s nedostatkom NPY. V neprítomnosti NPY boli ob/ob myši menej obézne, pretože mali znížený príjem potravy a zvýšené vydávanie energie, a boli menej závažne postihnuté diabetes, sterilitou a somatotropnými defektmi. Tieto výsledky boli interpretované ako dôkazy, že NPY je centrálnym efektorom nedostatku leptínu. Analýzou genetickej väzby u potkanov, ktorí boli selektívne vyšľachtení na preferenciu alkoholu bol identifikovaný chromozomálny región, ktorý obsahuje NPY gén (Carx· et al.,
1998). Potkany preferujúce alkohol mali v niekoľkých oblastiach mozgu nižšiu hladinu NPY ako potkany nepreferujúce alkohol. Thiele et al. (1998) preto študovali spotrebu alkoholu u myší, ktoré úplne postrádajú NPY ako výsledok cieleného vyradenia génu (Erickson et al., 1996). Zistili, že NPY-deficientné myši vykazujú zvýšenú spotrebu roztokov obsahujúci 6 %, 10 % a 20 % obj. etanolu v porovnaní s myšami divokého typu. NPY-deficientné myši boli tiež menej citlivé na sedatívne/hypnotické účinky etanolu, čo sa ukázalo pri rýchlejšom zotavení zo spánku vyvolaného etanolom, napriek tomu, že sa pri nich koncentrácia etanolu v plazme výrazne neodlišovala od kontrolných myší. Oproti tomu, myši, ktoré v neurónoch nadexprimovali značený NPY gén, ako zvyčajne exprimujú, vykazovali nižšiu preferenciu etanolu a boli vnímavejšie k jeho sedatívnym/hypnotickým účinkom ako myši kontrolné. Tieto údaje poskytli priamy dôkaz, že spotreba alkoholu a rezistencie k nemu sú nepriamo úmerne spojené s hladinou NPY v mozgu. V rámci prebiehajúcej štúdie genetického základu obezity Karvonen et al. (1998) identifikovali 1128T-C ·· ···· • · · · · ··· · · · • · · · ·· ····
- 118 polymorfizmus, ktorý vedie k substitúcii leucínu prolínom na zvyšku 7 v signálnej peptidovej časti pre-pro-NPY. Tento polymorfizmus nie je spojený s obezitou alebo energetickým metabolizmom, ale je významne a konzistentne spojený s vysokými hladinami celkového a LDL cholesterolu pri Fínoch s normálnou hmotnostou a obéznych Fínoch a pri obéznych Holanďanoch. Uusitupa et al. (1998) našli pro7 polymorfizmus pri 14 % Fínov, ale iba pri 6 % Holanďanov. Subjekty s pro 7 v NPY mali priemerne o 0,6 až 1,4 mmol/liter vyššiu hladinu celkového cholesterolu ako subjekty bez tohto variantu génu. Vzhladom na to, že pri Holanďanoch s normálnou hmotnostou nebolo možné nájst vplyv pro7 NPY na hladinu cholesterolu v sére, je možné urobit záver, že obézne osoby môžu byt susceptibilnejšie k účinkom tohto génového variantu. Bolo vyrátané, že pravdepodobnost výskytu pro7 v NPY by pri obéznych subjektoch s celkovým cholesterolom v sére >8 mmol/liter mohla byt až 50 - 60 %. Aspoň pri Fínoch je pro7 forma NPY jedným z najsilnejších genetických faktorov ovplyvňujúcich hladinu cholesterolu v sére. Pozri tiež Alien a Bloom (1986); Dockray (1986); Maccarrone a Jarrott (1986); Minth et al. (1986).
Ako už bolo uvedené hore, základné poznatky o NPY a jeho združených receptoroch, pripravili Vietor A. McKusick et al. (tamtiež). Nasledujúci text týkajúci sa NPYR1 pochádza z tohto zdroja.
Neuropeptid Y (NPY, 162640) je jedným z najčastejších neuropeptidov v nervovom systému cicavcov a vykazuje rôznorodé dôležité fyziologické aktivity, ako sú účinky na psychomotorickú aktivitu, príjem potravy, reguláciu centrálnej endokrinnej sekrécie a značné vazoaktívne účinky na kardiovaskulárny systém. Na základe farmakologických kritérií boli definované dva hlavné podtypy NPY (Y1 a Y2). Receptory NPY Y1 boli identifikované v rôznych tkanivách, ako mozgu, slezine, tenkom čreve, obličkách, vajciach, placente a hlad·· ···· • · · • · ···
119 kom svale aorty. Receptor Y2 sa vyskytuje predovšetkým v centrálnom nervovom systému. Herzog et al. (1992) opísali klonovanie cDNA kódujúcej ludský receptor NPY, o ktorom sa potvrdilo, že je členom nadtriedy receptorov spriahnutých s G proteínom. Pokiaľ je receptor exprimovaný v bunkách vaječníkov čínskeho chrčka (CHO) alebo bunkách obličiek ľudského embrya, vykazuje charakteristickú ligandovú špecifickosť. V obličkovej bunkovej línii je receptor spriahnutý s toxínom čierneho kašľa - senzitívnym G proteínom, ktorý sprostredkováva inhibíciu akumulácie cyklického AMP. V bunkovej línii CHO bol receptor oproti tomu spriahnutý nie s inhibíciou adenylát cyklázy, ale so zvýšením intracelulárneho kalcia. Tento druhý posol zapojujúci receptor NPY je teda špecifický vzhľadom na bunkový typ v závislosti od špecifického repertoáru G proteínov a efektorovém systému, ktoré sú prítomné v danom bunkovom type. Larhammar et al. (1992) nezávisle klonovali a charakterizovali neuropeptid Y. Herzog et al. (1993) určili molekulárnu organizáciu a reguláciu génu pre ľudský receptor NPY Yl. Oproti súvislej štruktúre väčšiny génov receptorov spriahnutých s G-proteínom zistili, že gén pre receptor NPY Yl má 3 exóny. Fluorescenčnou hybridizáciou in situ s vysokým rozlíšením lokalizovali gén na 4q31.3-q32. Herzog et al. (1997) zistili, že gény pre NPY1R a NPY5R (602001) sú spoločne umiestnené na chromozóme 4q31-q32. Tieto dva gény sú transkribované v opačnom smere od spoločnej promotorovej oblasti. Jeden z alternatívne zostrihnutých 5' exónov génu pre receptor Yl tvorí časť kódujúcu sekvencie receptoru Y5„ Na základe tohto nezvyčajného usporiadania Herzog et al. (1997) usúdili, že tieto dva gény vznikli génovou duplikáciou a že môžu byt exprimované koordinovane. Analýzou medzidruhového spätného kríženia Lutz et al. (1997) zaznamenali gény Npylr a Npy2r na konzervovanej väzbové skupiny na myšie chromozómy 8 (Npylr) a 3 (Npy2r), čo zodpovedá distálnej oblasti ľudského chromozómu 4q.
• · ·· ···· ·· ·· ·· · · · e ···· • · · · ··· · · · ······· · ··· · · • · ·· ···· ··· · ·· ··· ·· ····
- 120 Ako už bolo uvedené hore, základné poznatky o NPY a jeho združených receptoroch, pripravili Vietor A. McKusick et al. (tamtiež). Nasledujúci text týkajúci sa NPYR2 pochádza z tohto zdroja.
Neuropeptid Y (NPY) prenáša signál cez triedu receptorov spriahnutých s G protexnom prítomných v mozgu a neurónoch sympatiku. Na základe farmakologických kritérií, distribúcie v tkanivách a štruktúry kódujúceho génu boli definované aspoň tri typy receptoru neuropeptidu Y; pozri 162641 a 162643. Rose et al. (1995) uvádzajú expresné klonovanie cDNA pre ľudský receptor typu 2, NPY2R, v bunkách COS. Transfekované bunky vykázali vysokú afinitu pre NPY (162640), peptid YY (PYY, 600781) a fragment NPY obsahujúci aminokyseliny 13 až 36. Predpokladaný 381-aminokyselinový proteín má 7 transmembránových domén charakteristických pre receptory združené s G-proteínom a vykazuje iba 31% zhodu s ľudským receptorom Yl (NPY1R; 162641). Northern prenosom tkanivových vzoriek z rôznych oblastí nervového systému bola detekovaná 4kb mRNA. Gerald et al. (1995) klonovali cDNA zodpovedajúcej ľudskému receptoru Y2 z cDNA expresnej knižnice ľudského hippocampu pri použití väzbového stanovenia rádioznačeného PYY. Exprimovali gén pre Y2 v bunkách COS-7 a vykonali hormonálnu väzbovú skúšku, ktorá ukázala, že receptor Y2 viaže hormóny (v poradí od najvyššej po najnižšiu afinitu) PYY,
NPY a pankreatický polypeptid (PP; 167780). Ammar et al. (1996) klonovali a charakterizovali ľudský gén kódujúci receptor NPY typu 2. Transkript zahŕňa 9 kb genómovej sekvencie a je kódovaný v 2 exónoch. Ako pri géne pre receptor NPY typu 1 je 5' netranslatovaná oblasť NPY2R prerušená 4,5kb medziľahlou sekvenciou. Ammar et al. (1996) Southern analýzou hybridných hlodavčích-ľudských buniek a následnou fluorescenčnou hybridizáciou in situ (FISH) zaznamenali gén NPY2R na 4q31, rovnakú oblasť, aká obsahuje gén NPY2R, čo napovedá, že tieto podtypy cez svoje štrukturálne rozdiely vznikli génovou duplikáciou. Analýzou medzidruhového ···· 9 9
121 ·· • 9 · · •9 9 · · « 9 · ···· spätného kríženia Lutz et al. (1997) zaznamenali gény Npylr a Npy2r na konzervovanej väzbovej skupiny na myšie chromozómy 8 (Npylr) a 3 (Npy2r), čo zodpovedá distálnej oblasti ludského chromozómu 4q.
Postup na stanovenie, či sa domnelé alebo skutočné činidlo môže viazať k NPY je uvedený vo WO-A-98/52890 (pozri ďalej).
I: NPY
Ako už bolo uvedené hore, prídavným činidlom môže byť akékolvek vhodné činidlo, ktoré môže pôsobiť ako I:NPY (niekedy označovaný ako antagonista NPY). Navyše, alebo alternatívne, činidlo podlá vynálezu môže tiež pôsobiť ako I:NPY.
I:NPY (predovšetkým antagonisty NPY) sú diskutované v nasledujúcich prehladných článkoch:
• · ·· ···· ·· ·· ··· ··· · · · · • · · · · ··· · · · • ···· · · · · · · · · • · ·· · · · · ··· · ·· ··· ·· ····
- 122 Dunlop J, Rosenzweig-Lipson S : Therapeutic approaches to obestity Exp Opin Ther Pat 1999 8 12 1683 -1694
Wang S, Ferguson KC, Burris TP, Dhurandhar NV: 8th annual International conference on obesity and non-insulin dependent diabetes mellitus: novel drug developments. Exp Opin Invest Drugs 1999 8 7 1117-1125
Ling AL: Neuropeptide Y receptor antagonists Exp Opin Ther Pat 1999 9 4 375-384 Adham N, Ťamm J, Du P, Hou C, et al : Identification of residues involved in the binding of the antagonist SNAP 6608 to the Y5 receptor Soc Neurosci Abstr 1998 24 part 2 626.9
Shu YZ, Cutrone JQ, Klohr SE, Huang S : BMS-192548, a tetracyclic binding inhibítor of neuropeptide Y receptors, from Aspergillus niger WB2346. II. Physico-chémical properties and structural characterization J Antibiot 1995 48 101060-1065
Rigollier P, Rueger H, Whitebread S, Yamaguchi Y, Chiesi M, Schilling W, Criscione L : Synthesis and SAR of CGP 71683A, a potent and selective antagonist of the neuropeptide Y Y5 receptor. Int Symp Med Chem 1998 15th Edinburgh 239
Criscione L, Rigollier P, Batzl-Hartmann C, Rueger H, Strícker-Krongrad A, et al : Food intake in free-feeding and energy-deprived lean rats is mediated by the neuropeptide Y5 receptor. J Clin Invest 1998 102 12 2136 -2145
Neurogen Corp : NGD 95-1 Clin Trials Monitor 1996 5 10 Ab 19244
Buttle LA : Antí-obesity drugs: on target for huge market sales. Exp Opin Invest Drugs 1996 5 12 1583-1587
- 122a • · 99 ···· ·· ·· • · · · · · ···· • · · · · ··· · · · • ···· · · · ···· · • · ·· ····
999 9 ·· ··« «· ····
Gehlert DR, Hipskind PA : Neuropéptide Y receptor antagonists in obesity. Exp Opin Invest Drugs 1996 7 9 1827 -1838
Goidstein DJ, Trautmann ME : Treatments for obesity. Emerging Drugs 1997 2-127
Hipskind P A, Lobb K L, Nixon J A, Britton T C, Bruns R F, Catlow J, Dieckman McGinty D K, Gackenheimer Š L, Gitter B D, lyengar S, Schober D A, et al. : Potent and selective 1,2,3-trisubstituted indole NPY Y-1 antagonists. J Med Chem 1997 40 3712-3714
Zimmerman DM, Cantrall BE, Smith ECR, Nixon JA, Bruns RF, Gitter B, Hipskind PA, Ornstein PL, Zarrinmayeh H, Britton TC, Schober DA, Gehlert DR: Structureačtivity relationships of a šerieš of 1-substituted-4-methylbenzimidazole neuropeptide Y-1 receptor antagonists Bioorganic Med Chem Lett 1998 8 5 473 -476
Zarrinmayeh H, Nunes A, Ornstein P, Zimmerman D, Arnold MB, et al : Synthesis and evaluation of a šerieš of novel 2-[(4-chlorophenoxy)rnethy]benzimidazoles as selectiveneuropeptide Y Y1 receptor antagonists J Med Chem 1998 41 15 2709 2719
Britton TC, Spinazze PG, Hipskind PA, Zimmerman DM, Zarrinmayeh H, Schober DA, Gehlert DR, Bruns RF : Structure-activity relationships of a šerieš of benzothiophene-dervied NPY-Y1 antagonists: optimization of the C2 side chain Bioorganic Med Chem Lett 1999 9 3 475 -480
Zarrinmayeh H, Zimmerman DM, Cantrell BE, Schober DA, Bruns RF, Gackenheimer SL, Ornstein PL, Hipskind PA, Britton TC, Gehlert DR : Structure-activity relationship of a šerieš of diaminoalkyl substituted benzimidazole as neuropeptide Y Y1 receptor antagonists Bioorganic Med Chem Lett 1999 9 5 647 -652
Murakami Y, Hara H, Okada T, Hashizume H, Kii M, lshihara Y, Ishikawa M, Mihara S-l, Kato G, Hanasaki K, Hagishita S, Fujimoto M : 1,3-disubstituted benzazepines as novel, potent, selective neurpeptide Y Y1 receptor antagonists J Med Chem 1999 42 14 2621-2632
123 • · ·« ···· ·· ·· ··· · · · ···· • · · · · ··· · · · ······· · · · · · · • · ·· ···· ··· · ·· ··· ·· ····
Rudolf K, Eberlein W, Engel W, Wieland HA, Willim KD, Entzeroth M, Wienen W, Beck Sickinger AG, Doods HN : The first highly potení and selective non-peptide neuropeptide YY1 receptor antagonist: BIBP3226 Eur J Pharmacol 1994 271 2-3 R11-R13
Wieland HA, Willim KD, Entzeroth M, Wienen W, Rudolf K, Eberlein W, Engel W, Doods HN : Subtype selectivity and antagonbist profile of the nonpeptide neuropeptide Y1 receptor antagonist BIBP 3226 J Pharmacol Exp Ther 1995 275 1 143-149.
Wright J, Bolton G, Creswell M, Downing D, Georgic L, Heffner T, Hodges J, MacKenzie R, Wise L : 8-amino-6-(arylsulphonyl)-5-nitroquinolones: novel nonpeptide neuropeptide Y1 receptor antagonists Bioorganic Med Chem Lett 1996 6 15 1809-1814
Capurro D, Huidobro-Toro JP : The involvement of neyropeptide Y Y1 receptore in the blood pressure baroreflex:studies with BIBP 3226 and BIB 3304. Eur J Pharmacol 1999 376 3 251 -255
Dumont Y, Cadieux A, Doods H, Quirion R : New tools to investigate neuropeptide Y receptors in the centrál and peripheral nervous systems: BIBO-3304 (Y1), BIIE-246 (Y2) and [125IJ-GR-231118 (Y1/Y4). Soc Neurosci Abstr 1999 25 Part 1 Abs 74.11
Hegde SS, Bonhaus DW, Stanley W, Eglen RM, Moy TM, Loeb M, et al : Pharmacological evaluation of 1229U91, a high affinity and selective neuropeptide Y(NPY) - Y1 receptor antagonist Pharmacol Res 1995 31 190
Matthews JE, Chance WT, Grizzle MK, Heyer D, Daniels AJ : Food intake inhibition and body weight loss in rats treated with Gl 264879A, an NPY-Y1 receptor. Soc Neurosci Abstr 1997 23 Pt 2 1346
Doods HN, Willim K-D, Smith SJ : BIBP 3226: a selective and highly potent NPY-Y1 antagonist Proc Br Pharmacol Soc 1994 13-16 Dec. C47
Rudolf K, Eberlein W, Engel W, Wieland HA, Willim KD, Entzeroth M, Wienen W, Beck Sickinger AG, Doods HN : The first highly potent and selective non-peptide
- 124 ·· ···· ·· • · · · · · · • · ♦·· · · e • · · · · · · * • · · · · · · • ·· ··· ·· ··· · ·· • · • ··· neuropeptide-YY-1-receptor-antagonist: BIBP3226 Eur J Pharmacol 1994 271 2-3 R11 -R13
Serradelil-Le-Gal C, Valette G, Rouby PE, Peliet A, Villanova G, Foulon L, Lespy L, Neliat G, Chambon JP, Maffrand JP, Le-Fur G : SR 120107A and SR 120819A: Two potent and selective, orally-effective antagonists for NPY Y1 receptors Soc Neurosci Abstr 1994 20 Pt 1 907 -Abs 376.14
Hong Y, Gregor V, Ling AL, Tompkins EV, Porter J, Chou TS, Paderes G, Peng Z, Hagaman C, Anderes K, Luthin D, May J : Synthesis and biological evaluation of novel guanylurea compounds as poterit NPY Y1 receptor antagonist Acs 1999 217 Anaheim MED1108
I:NPY (predovšetkým antagonisty NPY) sú opísané v nasledujúcich dokumentoch:
WO-98/07420
WO-94/00486
WO-96/22305
WO'97/20821
WO-97/20822
WO-96/14307
JP-07267988
WO-96/12489
US-5552422
WO-98/35957
WO-96/14307
WO-94/17035
EP-0614911
WO-98/40356
EP-0448765
EP-0747356
WO-98/35941
WO-97/46250
EP-0747357
Prednostné príklady I:NPY sú zvolené zo zlúčenín nasledujúcich štruktúrnych vzorcov. Tieto zlúčeniny boli skúšané a bolo zistené, že sú užitočné pri potenciácii cAMP, a teda aj užitočné pri liečení FSAD. Niektoré experimentálne
- 125 • · ···· φφ ΦΦ·· • φ φ φφφ • · · φ · φ • ·· ··· ·· ·· φ φ · φ φ φ · • · · • φ φ ·· φφφφ údaje vzťahujúce sa na tieto zlúčeniny sú uvedené v príkla doch uskutočnenia.
Zlúčenina Štruktúrny vzorec Typ pôsobenia Odkaz
F34 '’O. ó“ XV l:NPY Y1 WO-98/07420 odkaz 3
F35 OH O OH 1 1 J ..XIX 1 0 0 Ή i jJA H I:NPY odkaz 5
F36 ccn~o,AÄO 0 Ό I:NPY Y5 odkazy 1, 4
F37 íle - Cys- Pro- Cys- Tyr- Arg- Leu- Arg- TyrNH2 cyklický (2,2j, (4,4')disulfid, dimérny I:NPY Y1 WO-94/00486 WO-96/22305 odkazy 1, 2, 23
F38 V jA h AA'YT NH, I:NPY Y5 WO-97/20821 WO-97/20822 odkazy 1, 3, 6, 7
F39 U I:NPY Y1 WO-96/14307 odkazy 1, 8, 9, 10, 11
F40
F41
F42
F43
F44
F45
- 126 • · 99 9999 99 99
Ο·· 999 9999 • · 9 9 · 999 9 9 9 • 9999 999 9·99 9 • 9 99 9999
9·· * 99 999 99 9999
/Λ o λο
NH,
O. H
F · F
Chiral ,ο. Λ
Ι;ΝΡΥ Υ1 JP-07267988 odkaz 1
LNPYY1
WO-96/12489 odkazy 3, 12, 13, 14, 15, 16, 17
Ι:ΝΡΥ Yl US-5552422 odkazy 17, 13, 19, 20
I:NPY Y5 WO-98/35957 odkaz 3
I:NPY Yl odkazy 21, 22
I:NPY Yl WO-96/14307 odkaz 3
- 127 ·
···· ···· • · 9
9 999
9 ·
9 · ·· ··· ·· ·· • · · ·
9 9
9 9
9 9
9999
-------------------------- -----------—--- .............—.......-
F46 vzorec viď odkaz I:NPY YI odkaz 24
F47a XX chirálny I:NPY YI WO-94/17035
ho^C^ S c X H U JC ^Xh, odkazy 3, 17, 25, 26
F47b vzorec viď odkaz I:NPY YI odkazy 3, 12,13,14,15,16,17
F48 ox«S ň' \ T j N 4 I:NPY YI EP-0614911 odkaz 27
0 0 A CT NH oo 0 XT rxx i
F49 COa? „ XtoVoa 0 I:NPY YI EP-0614911 odkaz 27
F50 NH 0 Ι^χΑΛιΛΛ ΧΓ h h h L/ I:NPY YI odkaz 28
^NH r< 'X,
1 II
F51 x F xx .n. / ζϊ I:NPYY5 WO-98/40356
ô
F52 Cx NH X H H X '—& I:NPY EP-0448765
• · ····
- 128 ·· ·· ···· • · · • · ··· • « · • · · ·· ··· ·· ·· • · · · • · · • · · • · · ·· ····
F53 Η πτίΓ°^ 0 0 « / ll Ί ° 0 Η-Cl J Ι:ΝΡΥ Υ1 ΕΡ-0747356
F54 Λ Λ XX οσΧ —Ν Ι:ΝΡΥ Υ1 WO-98/35941
F55 CCVOj-C σ - Ι:ΝΡΥ Υ5 WO-97/46250
F56 /°γΧ)γ0^ ° ÓCx H-C1 LNPYY1 ΕΡ-Ο747357
• · ····
129 ·· ··· • · · • · ··· • · · • · · ·· ··· ·· ·· • · · · • · · • · · · • · · ·· ····
VIP (vazoaktívny intestinálny peptid)
Podľa jedného aspektu tohto vynálezu je prídavným cielom PcAMP cieľ, pričom Pc^jip cielom je VIP alebo jeden z jeho združených receptorov. Súčasná klasifikácia/nomenklatúra ich uvádza ako VPAC1, VPAC2 a PACAP.
Nukleotidové sekvencie a aminokyselinové sekvencie VIP a jeho receptorov sú dostupné z literatúry. Niektoré sekvencie sú uvedené v priloženom sekvenčnom protokole.
Zistili sme, že VPAC1 a VPAC2 sú prítomné vo vagíne človeka a králika. PACAP vo vagíne králika i človeka chýba.
VIP je hlavný endogénny neurotransmiter uvoľňovaný počas sexuálneho vzrušenia, ktorý je zodpovedný za nervovo indukovanú vaginálnu vazodilatáciu vaskulárneho lôžka umiestneného vo vaginálnej stene. Tieto vazodilatačné účinky sú sprostredkované aktiváciou adenylát cyklázy a produkciou cAMP. Bez toho aby sme sa chceli viazať dajakou teóriou, tento účinok môže byt sprostredkovaný cez receptory VIP podtypov VPAC^, VPAC2 alebo PACAP (hypofyzárny peptid aktivujúci adenylát cyklázu). VPAC2 a PACAP receptory sú najrozsiahlejšie exprimované v CNS, a napriek tomu, že sú exprimované v hypofýze, nezdá sa, že by mali širšiu biologickú funkciu.
Činidlo môže potencovať VIP a/alebo pôsobiť ako VIP mimetikum alebo jeho analóg. Činidlo teda bude potencovať a/alebo napodobovať vazorelaxačné účinky endogénneho VIP uvoľňovaného počas sexuálneho vzrušenia. Činidlo tiež môže mat prídavný účinok na relaxáciu hladkého svalstva vagíny indukovanú VIP. To klinicky povedie k liečeniu FSAD prostredníctvom zvýšenia vaginálnej lubrikácie, ku ktorej dôjde prekrvením vaginálnej steny, a zvýšeniu poddajnosti vagíny.
• 9
- 130
9 • • 9 ··· 9 • 9 • 999 ·· 9999 • 9 9 ··· ·« 9 ·· 9 ·· ··· • ·· 9 • 9 9 ··· 9 • · 9 •9 ····
Nežiadúce vlastnosti VIP sú opísané hore, hoci mimetiká alebo analógy by ich nemali vykazovať.
Základné poznatky o VIP a s ním spojených receptoroch uviedli Vietor A. McKusick et al. na adresa http:// www3.ncbi.nlm.nih.gov/0mim/searchomim.htm. Nasledujúci text týkajúci sa VIP pochádza z tohto zdroja:
Vazoaktívny intestinálny peptid (VIP), peptid tvorený 28 aminokyselinami, ktorý bol pôvodne izolovaný z dvanástniku ošípaných, nie je prítomný iba v gastrointestinálnych tkanivách, ale tiež v nervovom tkanive, pravdepodobne ako neurotransmiter, a vykazuje rôzne biologické účinky. Pretože je VIP podobný glukagónu, sekretínu a žalúdočnému inhibičnému peptidu (GIP), bol považovaný za člen glukagónsekretínovej triedy. Primárny translačný produkt mRNA kódujúcej VIP (prepro-VIP) mal molekulovú hmotnosť 20 daltonov. Klonovaním DNA sekvencie komplementárnej k mRNA kódujúcej ľudský VIP Itoh et al. (1983) zistili, že prekurzor VIP obsahuje nielen VIP, ale tiež nový peptid s 27 aminokyselinami označený ako PHM27, ktorý obsahoval aminoterminálny histidín a karboxyterminálny metionín. Od PHI17 izolovaného z vnútorných orgánov ošípaných sa líšil dvoma aminokyselinami; PHI27, ako napovedá jeho označenie, obsahuje karboxyterminálny izoleucín. Linder et al. (1987) izolovali ludský gén pre VIP a PHM27 a skúmali jeho expresiu v rôznych tkanivách potkana. Heinz-Erian et al. (1985) navrhli, že nedostatočná obnova potných žliaz pri pacientoch trpiacich cystickou fibrózou prostredníctvom neuropeptidu VIP môže byť základným mechanizmom zníženého obsahu vody a relatívnej nepriepustnosti epitelu pre chloridové a iné ióny, ktorá je charakteristická pre cystickú fibrózu. Na overenie tejto hypotézy Gozes et al. (1987) zvolili prístup s génovými kandidátmi. Bodner et al. (1985) ukázali, že VIP a PHM-27 sú kódované susednými exónmi. Gozes et al. (1987) použili genómový fragment kódujúci PHM-27 na detekciu prítomnosti VIP génu na 6q21-qter.
• · ····
131 ·· ···· • · · • · ··· • · « • · · · • ·· ··· ·· ·· • · · · • · · • · · • · · ·· ····
Týmto teda vylúčili defektný VIP gén ako potenciálnu primárnu príčinu cystickej fibrózy (ktorá je kódovaná chromozómom 7). Metódami hybridizácie in situ Gozet et al. (1987) určili VIP gén na 6q24. Umiestnili VIP na oblasť MYB (189990), ktorá bola zaznamenaná na 6q22. Gozes et al. (1987) skúmali funkčný vzťah medzi týmito dvoma génmi v neuronálnom tkanive. Pozorovali ostrý pik MYB mRNA v hippokampe trojdenných potkanov, predchádzajúci pik VIP mRNA, ktorý sa v tejto oblasti objavil vo veku 8 dní. Omary a Kagnoff (1987) našli jadrové receptory pre VIP v bunkovej línii ludského adenokarcinómu hrubého čreva. Gotoh et al. (1988) spot blot hybridizáciou molekulárne klonovaného fragmentu génu s chromozomálnymi preparátmi VIP priradili chromozómu 6. Lokalizácia bola upresnená hybridizáciou in situ na 6q26-q27.
Ako už bolo uvedené hore, základné poznatky o VIP a jeho združených receptoroch, pripravili Vietor A. McKusick et al. (tamtiež). Nasledujúci text týkajúcu sa VIPR1 alebo VPAC1 pochádza z tohto zdroja.
Vazoaktívny intestinálny peptid (VIP; 192320) je okťakosamerným neuroendokrinným mediátorom, ktorý sa prevážne nachádza v cholinergických presynaptických neurónoch centrálneho nervového systému a v periférnych peptidergických neurónoch inervujúcich rôzne tkanivá. Od radu neuroendokrinných peptidov s imunologickými funkciami sa VIP odlišuje svojou schopnosťou pôsobiť priamo na B i T bunky. Osobitné podskupiny nervových, respiračných, gastrointestinálnych a imunitných buniek nesú špecifické receptory s vysokou afinitou pre VIP, ktoré sú spojené s proteínom viažúcim nukleotid guanín (G), ktorý je schopný aktivovať adenylát cyklázu. Libert et al. (1991) selektívnou amplifikáciou a klonovaním z tyroidnej cDNA získali štyri nové receptory z triedy receptorov združených s G proteínom. Jeden z nich, označený ako RDC1, Sreedharan et al. (1991) identifikovali ako VIP receptor. Libert et al. (1991) in situ hybridizá- 132 ···· ·· ···· • · · • · ··· • · · • · · ·· ··· ·· ·· • · 9 9 »9 · • · « · • · · ·· ···· ciou zaznamenali gén pre VIPR na 2q37. Neskoršie informácie zpochybnili, že tento gén zaznamenaný na 2q37 je skutočne génom pre VIP receptor (Vassart, 1992). O sekvencii, ktorá bola Sreedharanom et al. (1991) označená ako GPRN1 a zaznamenaná na 2q37, Wegner et al. (1993) zistili, že neviaže VIP. Sreedharan et al. (1995) izolovali autentický gén pre receptor VIP typu I a fluorescenčnou hybridizáciou in situ ho zaznamenali na 3p22 pás v oblasti spojenej s malobunkovou rakovinou pľúc. Analýzou pomocou medzidruhového spätného kríženia Hashimoto et al. (1999) zaznamenali gén Viprl na distálnu oblast chromozómu 9, oblast, ktorá vykazuje synténnu homológiu s ludským chromozómom 3p. Sreedharan et al. (1993) klonovali gen ľudského intestinálneho receptoru VIP; dedukovaná aminokyselinová sekvencia vykazovala 84% identitu s VIP receptorom pľúc potkana. Couvineau et al. (1994) z cDNA knižnice ľudských buniek epitelu jejuna izolovali dva VIPR cDNA klony. Jeden kóduje receptor VIP tvorený 460 aminokyselinami a siedmimi predpokladanými transmembránovými doménami, ako je to i pri iných receptoroch združených s G proteínom. Druhý kóduje proteín príbuzný VIP receptoru s 495 aminokyselinami, ktorého 428 aminokyselín na C-terminálnej oblasti vykazuje 100% homológiu s funkčným receptorom VIP, ale jeho N-terminálna 67-aminokyselinová doména je celkom odlišná. Pri expresii v bunkách COS druhý proteín neviaže VIP značený rádioaktívnym jódom, hoci je pri imunofluorescenčnom stanovení normálne rozpoznávaný na plazmatickej membráne. 0 receptore VIP typu I, ktorý býva tiež označovaný ako receptor PACAP typu II (ďalší typ receptoru PACAP pozri 102981), Sreedharan et al. (1995) zistili, že merí asi 22 kb a obsahuje 13 exónov (v rozmedzí od 42 do 1400 bp) a 12 intrónov (v rozmedzí od 0,3 do 6,1 kb). Sreedharan et al. (1995) tiež charakterizovali promotor a 5' lemujúcu oblast génu.
·· ···· • · ····
- 133 ·· · • ··· • · ··· ·· ·· • · · · • · · • · e « · · ·· ····
Ako už bolo uvedené hore, základné poznatky o VIP a jeho združených receptoroch, pripravili Vietor A. McKusick et al. (tamtiež). Nasledujúci text týkajúci sa VIPR2 alebo VPAC2 pochádza z tohto zdroja.
Vazoaktívny intestinálny peptid (VIP, 192320) a hypofyzárny peptid aktivujúci adenylát cyklázu (PACAP, 102980) sú homológne peptidy, ktoré pôsobia ako neurotransmitery a neuroendokrinné hormóny. Zatial čo receptory VIP a PACAP sú vzájomne homológne, v svojej substrátovej špecifickosti a profile expresie sa líšia. Pozri VIPR1 (192321) a ADCYAP1R1 (102981). Svoboda et al. (1994) vykonali PCR pri nízkej stringencii pri použití prajmerov na báze sekvencie konzervovanej pri VIP receptoroch. Klonovali gén pre ludský receptor VIP2 z cDNA knižnice lymfoblastu. Tieto gény kódovali polypeptid s 438 aminokyselinami, ktorý bol z 86 % identický s receptorom VIP2. Exprimovali ludský receptor VIP2 v bunkách vaječníkov čínskeho chrčka a zistili, že sa viaže k PACAP-38, PACAP-27, VIP a helodermínu, a táto väzba receptoru ku ktorémukolvek z týchto peptidov aktivuje adenylát cyklázu. O väzbe peptidov sa zistilo, že je inhibovaná GTP. Adamou et al. (1995) klonovali gén receptoru VIP2 z cDNA knižnice ludskej placenty. Northern prenosom sa zistilo, že VIPR2 je exprimovaný vo forme dvoch transkriptov s 4,6 kb a 2,3 kb, pričom úroveň expresie je vysoká v kostrovom svalstve a nižšia v srdci, mozgu, placente a pankrease. Mackay et al. (1996) pri použití fluorescenčnej hybridizácie in situ zaznamenali gén VIPR2 na ludský chromozóm 7q36.3. Ďalším mapovaním bunkových línií od pacientov postihnutých holoprosencefáliou typu 3 (HPE3; 142945) sa zistilo, že gén pre VIPR2 leží v minimálnom kritickom regióne HPE3. Mackay et al. (1996) uviedli, že hoci sa VIPR2 môže na fenotype HPE3 podielať, nie je jediným zodpovedným faktorom.
·· ···· • · · • · ··· • · · · • · · ·· ··· • · ····
- 134 β
·· · ·· ·· • · · · • · · • · · • · · ·· ····
AC (adenylát cykláza)
Podľa jedného aspektu tohto vynálezu, prídavným cieľom je PcAMp cieľ, pričom týmto Pc^ip cieľom je AC.
Nukleotidové sekvencie a aminokyselinové sekvencie pre AC sú dostupné z literatúry.
Aby sme potvrdili, že VIP indukuje vazorelaxáciu prostredníctvom zvýšenia intracelulárnej hladiny cAMP a následnej aktivácie adenylát cyklázy, merali sme koncentrácie cAMP vo vagíne počas stimulácie VIP a použili sme forskolín, aktivátor adenylát cyklázy, za účelom napodobenia účinkov aktivácie cAMP/AČ dráhy.
Pri týchto skúškach sme zistili, že ošetrenie vazointestinálnym peptidom a ošetrenie forskolínom zvyšuje intracelulárne koncentrácie cAMP v izolovanom tkanive vagíny.
Tiež sme zistili, že forskolín pri zvieracom modele sexuálneho vzrušenia zvyšuje prekrvenie vagíny.
Okrem toho sme zistili, že forskolín indukuje relaxáciu v izolovanej vagíne.
Základné poznatky o AC uvádzajú Vietor A. McKusick et al. na http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/0mim/searchomim.htm. Nasledujúci text týkajúci sa AC pochádza z tohto zdroja:
Adenylyl cykláza (EC 4.6.1.1) katalyzuje transformáciu ATP na cyklický AMP. Táto enzymatická aktivita je pod kontrolou niekoľkých hormónov a na transdukcii signálu z receptoru na katalytický zvyšok sa podieľajú rôzne polypeptidy. Stimulačné alebo inhibičné receptory (Rs a Ri) interagujú s G proteínmi (Gs a Gi), ktoré vykazujú GTPázovú ·· ···· • · • ··· • · · ···· · ·
135 • · • · · ·· ··· ·· ·· • · · · • · · • · · • · · ·· ···· aktivitu a modulujú aktivitu katalytickej podjednotky adenylyl cyklázy. Panna et al. (1991) klonovali cDNA zo odpovedajúcej adenylylcyklázy ludského mozgu, ktorú označili symbolom HBAC1. Hybridizáciou in situ s preparátmi chromozómov v metafáze pri použití cDNA sondy z ludského mozgu Stengel ét al. (1992) ukázali, že gén je umiestnený na 8q24.2. Vysoko homologický gén, ADCY2 (103071) bol rovnakým postupom určený na 5ql5.3.
Všeobecné postupy génového inžinierstva
Hoci všeobecné postupy, uvádzané v tomto texte sú známe, je možné urobiť odkaz najmä na Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989) a Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1990), 4. vydanie, John Wiley & Sons, Inc. Polymerázová reťazová reakcia je opísaná v US-A-4 683 159, US-A-4 800 195 a US-A-4 965 188.
Súhrn
Súhrne je možné uviesť, že sa vynález týka použitia I:NEP na liečenie FSD, predovšetkým FSAD.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Vynález je v nasledujúcom texte opísaný iba pomocou príkladov, v ktorých sú uvedené odkazy na nasledujúce obrázky:
obr. 1, ktorým j e graf; obr. 2, ktorým j e graf; obr. 3, ktorým je graf; obr. 4, ktorým je graf; obr. 5, ktorým je graf; obr. 6, ktorým j e graf; obr. 7, ktorým j e graf;
• · ···· • · • ···
9· • 9 9 9
9 9 • ·<Ο· 9 9 9 ···· 9 • Ο 99 9999 ··· ο 99 9·9 99 9999
- 136 obr. 8, ktorým je graf;
obr. 8, ktorým je graf;
obr. 9, ktorým je graf;
obr. 10, ktorým je graf;
obr. 11, ktorým je graf;
obr. 12, ktorým je graf.
Rozumie sa, že činidlom podlá vynálezu je I:NEP.
Sú tu tiež uvedené informácie týkajúce sa I:PDE a I;NPY, pretože, ako to bude odborníkom v tomto odbore zrejmé, obidva typy týchto činidiel je možné použiť v kombinácii s činidlom podlá vynálezu za účelom dosiahnutia opísaného pozitívneho účinku. Tieto ďalšie poznatky sú tu uvedené na podporu našich pôvodných poznatkov.
Prehlad obr. na výkresoch
Obr. 1:
Elektrická stimulácia pelvického nervu pri modelovej skúške sexuálneho vzrušenia na anestetizovaných králičkoch indukuje zvýšenie prekrvenia vagíny v závislosti od frekvencie. Zvýšenie stimulačnej frekvencie indukuje väčšie zvýšenie prekrvenia. Zmeny boli monitorované pri použití laserovej Dopplerovskej technológie.
Na obr. 1 je graficky znázornený vzťah medzi stimuláciou pelvického nervu a prekrvením genitálií ako závislosť prekrvenia od frekvencie. Parametre stimulácie: 2 až 16 Hz, 15 až 20 V, 0,5 ms, 10 s. Čierne štvorčeky označujú prekrvenie klitorisu a biele kolieska označujú prekrvenie vagíny.
• ·· · ·
- 137 ·· ···· » · ·
I · · · ·
I · · » · · ·· ··· ·· ·· • · · I
Obr. 2:
Vazoaktívny intestinálny peptid (VIP) indukuje zvýšenie vaginálneho prekrvenia pri modelovej skúške sexuálneho vzrušenia na anestetizovaných králikoch.
Na obr. 2a je graficky znázornený účinok VIP na zmenu vaginálneho prekrvenia. VIP bol podaný infúziou vo forme intravenóznych bolusov (trojuholníčky - VIP v dávke 6 μg/kg, štvorčeky - VIP v dávke 20 μg/kg, obrátené trojuholníčky - VIP v dávke 60 μg/kg; sonda 2, vonkajšia stena vagíny) .
Na obr. 2b je graficky znázornený účinok dvoch opakovaných infúzií VIP (biele štvorčeky - VIP v dávke 60 pgkg1, čierne štvorčeky - VIP v dávke 60 ^gkg1) na zmenu vaginálneho prekrvenia. Tento obr. demonštruje, že dochádza k podobnému zvýšeniu prekrvenia. Tiež čas trvania odpovedi je podobný.
Všetky zmeny boli monitorované pri použití laserovej Dopplerovskej technológie.
Vazoaktívny intestinálny peptid (VIP) znižuje stredný arteriálny tlak krvi pri modelovej skúške sexuálneho vzrušenia na anestetizovaných králikoch. Tento graf ilustruje typické účinky vazoaktívnych činidiel (biele kolieska - Hepsaline, čierne trojuholníčky - VIP v dávke 6,0 μg/kg, čierne štvorčeky - NEPi v dávke 7,5 mg/kg, čierne kosoštvorčeky - PDEcAMpI v dávke 25 μg/kg) a parametrov stimulácie pelvického nervu (čierne kolieska), ktoré boli použité na skúmanie vaginálneho prekrvenia prostredníctvom stredného arteriálneho tlaku pri anestetizovanom králiku. Pozorované účinky sú typické pre trendy pozorované
- 138 ··· · · · ···· ··· · · · · · · · · • ···· · · · · · · · · • 9 9 9 · · · · ··· · ·· ··· ·· ···· pri všetkých skúšaných zvieratách. VIP indukuje významné zníženie stredného arteriálneho tlaku, zatiaí čo stimulácia pelvického nervu, kontrolná infúzia Hepsaline alebo inhibítorov PDEcAMP alebo NEP nemajú žiadny vplyv na krvný tlak. Zníženie krvného tlaku spojené s infúziami VIP je tiež sprevádzané veíkým zrýchlením srdcovej frekvencie,,
Obr. 4:
Aktivácia cAMP/adenylát cyklázovej dráhy napodobuje VIP mediovanú vazorelaxáciu a relaxáciu hladkého svalu v tkanive vagíny.
Na obr. 4a je graficky znázornená indukcia významného zvýšenia vaginálneho prekrvenia infúziou forskolínu (40 nmol/kg, i.v. bolus, cAMP mimetikum). Je možné si povšimnúť, že amplitúda a trvanie odpovedi sú podobné ako indukcia prostredníctvom VIP (20,0 μg/kg, i.v. bolus). Zaujímavé je, že účinky na prekrvenie sa dalej prejavujú na vonkajšej stene vagíny (vnútorná stena vagíny - obdĺžniky, vonkajšia stena vagíny - kolieska). Všetky zmeny boli monitorované pri použití laserovej Dopplerovskej technológie.
Na obr. 4b je znázornený stĺpcový graf, ktorý demonštruje, že ako VIP (Ο,ΙμΜ), tak forskolín (ΙΟμΜ) v izolovanej králičej vagíne významne zvyšujú intracelulárne koncentrácie cAMP (μΜ) nad bazálnu hladinu.
Na obr. 4c je uvedený graf, ktorý znázorňuje, ako forskolín (cAMP mimetikum) indukuje účinnú relaxáciu prekontrahovaných (ΙμΜ fenylefrin) prúžkov králičej vagíny pri IC50 približne 300nM (kontrola+vehikulum - biele štvorčeky, forskolín IC5Q 302 ± 20nM - čierne štvorčeky). Všetky zmeny boli kvantifikované in vivo laserovou Dopplerovskou technológiou, biochemickým cAMP enzymatickým imunostanovením alebo relaxáciou tkaniva in vitro.
- 139 Obr. 5:
• ······ ·· ·· • · · · ···· • · · · ··· · · · ···· ··· · · · · · • · · · · · · • ·· ··· ·· ····
Infúzia VIP zvyšuje prekrvenie klitorisu a aktivácia dráhy cAMP/adenylát cykláza simuluje vazorelaxáciu klitorisu sprostredkovanú VIP pri modelovej skúške sexuálneho vzrušenia na anestetizovaných králikoch. Infúzia VIP (60 až 200 μ9/^9) indukuje zvýšenie prekrvenia klitorisu závislé od koncentrácie. Po i.v. infúzii 200 μ9/^ VIP bolo pozorované 115% zvýšenie prekrvenia klitorisu. Účinok VIP na prekrvenie klitorisu je možné simulovať infúziou cAMP mimetika, forskolínu (FSK, 40 nmol/kg, i.v. bolus). Po i.v. infúzii forskolínu v dávke 40 nmol/kg bolo pozorované 156% zvýšenie prekrvenia klitorisu. Všetky zvýšenia predstavovali významné zvýšenie oproti kontrolným infúziám (Hepsaline). Amplitúda odpovedi bola podobná amplitúde odpovedi pri indukcii VIP (200 μg/kg, i.v bolus) a porovnateíná s hodnotami zistenými pri vaginálnom prekrvení (pozri obr. 2 a 4). Všetky zmeny boli kvantifikované in vivo pri použití laserovej Dopplerovskej technológie a v porovnaní s infúziami, vehikula (Hepsaline) išlo o významné zvýšenia.
Selektívny inhibítor NEP EC 3.4.24.11 podporuje zvýšenie vaginálneho prekrvenia indukované stimuláciou pelvického nervu pri modelovej skúške sexuálneho vzrušenia na anestetizovaných králikoch. Opakovaná stimulácia pelvického nervu v 15minútových intervaloch indukuje reprodukovateíné zvýšenie vaginálneho prekrvenia (biely stĺpec). Podanie inhibítoru NEP (šedý stĺpec) zdvíha pik zvýšenia vaginálneho prekrvenia indukovaného submaximáInými stimulačnými frekvenciami (napríklad 4Hz) v porovnaní so zvýšeniami pozorovanými počas porovnávacích kontrolných stimulácií alebo pri použití kontrolného vehikula (čiarkovaný stĺpec). V závislosti od dávky boli pozorované nasledujúce zvýšenia - dávka 0,3 mg/kg
9 9999
9 9 9 9 9 · · 9
9 9 9 9 999 9 · 9
9999999 9 999 9 9
9 99 9999
999 9 99 9*9 99 9999
140 iv. indukovala 40% zvýšenie a dávka 0,1 mg/kg iv. indukovala 91% zvýšenie (stredná hodnota, n = 3). Inhibítor nemal žiadny účinok na bazálne (nestimulované) prekrvenie vagíny (údaje nie sú znázornené). Všetky zmeny boli monitorované pri použití laserovej Dopplerovskej technológie.
Obr. 7:
Selektívne inhibítory NEP EC 3.4.24.11 podporujú zvýšenie vaginálneho prekrvenia indukované VIP pri modelovej skúške sexuálneho vzrušenia na anestetizovaných králikoch. Opakované infúzie VIP v 30minútových intervaloch indukovali reprodukovatelné zvýšenia vaginálneho prekrvenia (pozri obr. 2b). Inhibítor NEP potencuje amplitúdu a tiež predlžuje čas pretrvania zvýšeného prekrvenia, pokial sú tieto zvýšenia indukované submaximáInými dávkami VIP, napríklad 6,0 μg/kg. Pri dávkach VIP, ktoré indukujú maximálne zvýšenie vaginálneho prekrvenia, napríklad 60 μg/kg, inhibítory NEP iba potencujú čas pretrvania zvýšeného vaginálneho prekrvenia. Zvýšenie indukované VIP v prítomnosti inhibítoru NEP sú označené čiernymi trojuholníčkami a kontrolné VIP odpovedi sú znázornené ako biele trojuholníčky. Kontrolná infúzia Hepsaline nemala na amplitúdu odpovedí žiadny účinok. Všetky zmeny boli minotorované pri použití laserovej Dopplerovskej technológie.
Na obr. 7a je teda graficky znázornený účinok VIP v dávke 6 μ/kg na vaginálne prekrvenie v prítomnosti a v neprítomnosti inhibítoru NEP.
Na obr. 7b je teda graficky znázornený účinok VIP v dávke 60 μ/kg na vaginálne prekrvenie v prítomnosti a v neprítomnosti inhibítoru NEP. (sonda 2, vonkajšia stena vagíny).
• · • ·
- 141 Obr. 8:
• · ····
Selektívny inhibítor PDEcAMp typu 2 podporuje zvýšenie vaginálneho prekrvenia indukovaného stimuláciou pelvického nervu (PNS) pri modelovej skúške sexuálneho vzrušenia na anestetizovaných králikoch. Opakovaná PNS v 15minútových intervaloch indukuje reprodukovatelné zvýšenia vaginálneho prekrvenia (biele štvorčeky). Podanie inhibítoru pdecAMP tYPu 2 zdviha Pik zvýšenia vaginálneho prekrvenia indukovaného submaximálnou stimulačnou frekvenciou (čierne štvorčeky; pri 4 Hz) v porovnaní s hodnotami pozorovanými počas kontrolnej časovo zladenej stimulácie (biele štvorčeky). Vehikulum je označené čiernym kolieskom. Infúzia inhibítoru PDE2 (500 pg/kg) indukovala 86,8±21,9% zvýšenie vaginálneho prekrvenia (stredná hodnota±SEM, n = 2). Všetky zmeny boli monitorované pri použití laserovej Dopplerovskej technológie.
Selektívne inhibítory PDEcAMP podporujú zvýšenie vaginálneho prekrvenia indukované VIP pri modelovej skúške sexuálneho vzrušenia na anestetizovaných králikoch. Opakované infúzie VIP v 30minútových intervaloch indukujú reprodukovatelné zvýšenia vaginálneho prekrvenia (pozri obr. 2b). Selektívny inhibítor PDEcAMp typu 2 (25 μg/kg iv. bolus) potencuje čas pretrvania zvýšeného prekrvenia vagíny indukovaného VIP (60 μg/kg iv. bolus). Zvýšenie indukované VIP v prítomnosti inhibítoru PDEcAMp sú znázornené ako čierne trojuholníčky a kontrolné VIP odpovedi sú znázornené ako biele trojuholníčky. Kontrolná infúzia Hepsaline na odpovedi nemala žiadny účinok. Všetky zmeny boli monitorované pri použití laserovej Dopplerovskej technológie.
• · ··« · • 9
- 142 • 9 9 · ··· 9 · · · · · · · ······· · ··· · · • · 9 · ···· ··· · ·· ··· ·· ····
Obr. 10:
Selektívny antagonista receptorov NPY Yl podporuje zvýšenie vaginálneho prekrvenia indukované stimuláciou pelvického nervu (PNS) pri modelovej skúške sexuálneho vzrušenia na anestetizovaných králikoch. Opakovaná PNS v 15minútových intervaloch indukuje reprodukovateíné zvýšenia vaginálneho prekrvenia (nie je znázornené). Podanie antagonistu NPY Yl (šedé stĺpce) zdvíha pik zvýšenia vaginálneho prekrvenia indukovaného submaximálnou stimulačnou frekvenciou (napr. 4 Hz) v porovnaní so zvýšeniami pozorovanými počas kontrolnej časovo zladenej stimulácie alebo kontrolným vehikulom (čiarkovaný stĺpec). V závislosti od dávky boli pozorované nasledujúce zvýšenia - dávka 0,01 mg/kg iv. indukovala 15,8±19,6% zvýšenie, dávka 0,03 mg/kg iv. indukovala 35,1±27,4% zvýšenie; dávka 0,10 mg/kg iv. indukovala 60,l±16,9% zvýšenie a dávka 0,3 mg/kg iv. indxikovala 91,9±27,4% zvýšenie (stredná hodnotaiSEM, n = 3). Antagonista NPY Yl nemal žiadny účinok na bazálne (nestimulované) prekrvenie vagíny (údaje nie sú znázornené). Všetky zmeny boli monitorované pri použití laserovej Dopplerovskej technológie.
Obr. 11:
Na obr. 11 je znázornený súhrnný graf niektorých údajov, ktoré tu boli uvedené, ktorý ukazuje, že uvedené činidlá sú veími užitočné pri zvyšovaní vaginálneho prekrvenia prostredníctvom potenciácie hladiny endogénneho cAMP. Zvýšenie cAMP signalizácie potencuje nervovo stimulované zvýšenie vaginálneho prekrvenia u králika.
Obr. 12:
Na obr. 12 je graficky znázornený účinok NEPi na prekrvenie klitorisu indukované stimuláciou pelvického • · • ···
- 143 ·· ···· • · • ··· ·· ·· • · · • · ·
9 ·
9999 nervu. Selektívny inhibítor NEP (NEPi) EC 3.4.24.11 podporuje zvýšenie prekrvenia klitorisu indukované stimuláciou pelvického nervu pri modelovej skúške sexuálneho vzrušenia na anestetizovaných králikoch. Podanie inhibítoru NEP (šedý stĺpec) zdvíha pik zvýšenia prekrvenia klitorisu indukovaného submaximálnou stimulačnou frekvenciou (napríklad 4 Hz) v porovnaní so zvýšeniami pozorovanými počas časovo zladených kontrolných stimulácií alebo pri použití kontrolného vehikula (čiarkovaný stĺpec). V závislosti od dávky boli pozorované nasledujúce zvýšenia - dávka 1,0 mg/kg iv. indukovala 131% zvýšenie (stredná hodnota n = 3). NEP inhibítor nemal žiadny účinok na bazálne (nestimulované) prekrvenie vagíny (údaje nie sú znázornené). Všetky zmeny boli monitorované pri použití laserovej Dopplerovskej technológie.
Skúšobné postupy merania aktivity/hladiny cAMP
Meranie cAMP z vzoriek vaginálneho tkaniva pri použití kitu na enzymatické imunostanovenie (EIA) Biotrak cAMP (Amersham Life Sciences RPN 225).
cAMP hladina sa merí pomocou EIA v vzorkách vaginálneho tkaniva. EIA je založená na kompetícii medzi neznačným cAMP a fixným množstvom cAMP značeným peroxidázou s obmedzeným množstvom cAMP špecifickej protilátky.
1. Látky
Všetky látky boli dodané v rámci kitu pre EIA Amersham Life Science (RPN 225), pokiaí to nie je uvedené inak.
1.1. Mikrotitračné doštičky - 96jamkové doštičky potiahnuté oslím antikráličím IgG.
• 9 • ·
····
- 144
999
9 ·
9. · •9 9994
1.2. Skúškový tlmivý roztok - 0,05M tlmivý roztok na báze octanu sodného s pH 5,8 obsahujúci po rekonštitúcii 0,02% hovädzí sérový albumín a 0,5% konzervačnú látku. Obsah nádoby sa trojitým prepláchnutím 15 ml destilovanej vody vykoná do odmerného valca a potom sa doplní na konečný objem 500 ml.
1.3. cAMP štandard (na acetylačný postup). cAMP s koncentráciou 10,24pmol/ml v 0,05M acetátovom tlmivom roztoku s pH 5,8 obsahujúcom po rekonštitúcii 0,02% hovädzí sérový albumín a 0,5% konzervačnú látku.
1.4. Antisérum. Anti-cAMP protilátka v 0,05M acetátovom tlmivom roztoku s pH 5,8 obsahujúcom po rekonštitúcii 0,02% hovädzí sérový albumín a 0,5% konzervačnú látku. Pred použitím sa protilátka zriedi 11 ml skúškového tlmivého roztoku a premieša miernym obracaním, aby sa obsah rozpustil.
1.5. cAMP konjugát. cAMP-chrenová peroxidáza v 0,05M acetátovom tlmivom roztoku s pH 5,8 obsahujúcom po rekonštitúcii 0,02% hovädzí sérový albumín a 0,5% konzervačnú látku. Pred použitím sa roztok zriedi 11 ml skúškového tlmivého roztoku a premieša miernym obracaním, aby sa obsah rozpustil.
1.6. Premývací tlmivý roztok. 0,01M fosfátový tlmivý roztok s pH 7,5 obsahujúci po rekonštitúcii 0,05% (obj.) Tween^R) 20. Obsah nádoby sa trojitým prepláchnutím 15 ml destilovanej vody premiestni do odmerného valca a potom doplní na konečný objem 500 ml.
1.7. TMB substrát. 3,3',5,5'-tetrametylbenzidin (TMB)/ peroxid vodíka v 20% (obj.) dimetylformamidu.
1.8. Acetylačné činidlo. 2ml acetanhydridu, 4 ml trietylamínu, pripraví sa podlá požiadaviek.
- 145 • · ·· ···· ·· ·· ··· · · · ···· • · · · · ··· · · · ······· · ··· · · • · · · ···· ··· · ·· ··· ·· ····
1.9. Kyselina sírová (IM). IM kyselina sírová sa pripraví z 18M rezervného roztoku (BDH). 1,11 ml kyseliny sa pridá k 18,8 ml destilovanej vody.
2. Špeciálne zariadenia
2.1. 5ml sklenené skúmavky na jedno použitie
2.2. Spektrofotometrické čítacie zariadenie pre doštičky (Spectra max 190)
2.3. Trepačka mikrotitračných doštičiek (Luckham R100)
3. Postupy
- Príprava tkanivových vzoriek: Tkanivá sa podrobia príslušnému predbežnému ošetreniu v 5ml vzorkách vo fyziologickom soľnom roztoku napríklad agonistov, cAMP mimetik apod. Po ošetrení sa vzorky rýchlo zmrazia v kvapalnom dusíka a potom rozbijú kladivom. Prášok sa zoškrabe do centrifugačnej skúmavky, do ktorej sa potom pridá 1 ml 0,5M ľadovo chladnej kyseliny chloristej (PCA). Vzorka sa premieša vírivým pohybom a 1 hodinu nechá stáť na ľade.
- Extrakcia cAMP z tkanivových vzoriek: Vzorky sa 5 minút centrifugujú pri 4°C a 10 OOOxg. Supernatant sa oddelí a umiestni do iných centrifugačných skúmaviek. Peleta sa na analýzu proteinov uchováva pri -80C. Vzorky supernatantu sa pri použití fosforečnanu draselného (K3PO4) zneutralizujú na pH asi 6 a centrifugujú 5 minút pri 4°C a 10 OOOxg. Supernatant sa izoluje a premyje 4x5 objemami (5 ml) vody nasýtenej dietyléterom. Horná éterová vrstva by sa po každom premytí mala odložiť. Vodné fázy sa premiestnia do krátkej tenkej skúmavky a sušia pod prúdom dusíka pri 60°C. Vysušený extrakt sa rozpustí v 1 ml skúškového tlmivého roztoku a až do použití skladuje v chladničke (alebo môže byť zmrazený).
- 146 • 9 ···· · • · • ···
- Rezervné reagensy sa nechajú vyrovnať s teplotou miestnosti a potom sa pripravia pracovní roztoky.
- V sklenených skúmavkách značených 2, 4, 8, 16, 32, 64,
128, 256 a 512fmol sa pripravia cAMP štandardy. To sa dosiahne tak, že sa 1 ml skúškového tlmivého roztoku pridá do všetkých skúmaviek s výnimkou 512fmol štandardu. Potom sa k dvom horným štandardom (256 a 512 fmol) pridá 1 ml acetylačného štandardu (10,24 pmol/ml). 256fmol štandard sa vírením premieša a 1 ml sa premiestni do 128fmol štandardu. Tak sa pokračuje, kým sa nezíska 2fmol štandard, keď sa pripraví 1 ml roztoku. Pripraví sa skúmavka s nulovým štandardom obsahujúca 1 ml skúškového tlmivého roztoku.
- Vzorky tkanivové extraktu sa nechajú roztopiť na ľade (pokiaľ je to nutné) a stonásobne zriedi (10 μΐ vzorky na 990 μΐ skúškového tlmivého roztoku) v značených sklenených skúmavkách.
- cAMP vo všetkých štandardoch a vzorkách sa v digestore acetyluje prídavkom 100 μΐ acetylačného činidla, ktoré sa pridá po strane skúmavky bezprostredne pred premiešaním vírivým pohybom.
- 50 μΐ všetkých štandardov a vzoriek sa navzorkuje do zodpovedajúcich jamiek 96jamkovej doštičky a do jamiek na nešpecifickú väzbu (NSB) sa pridá 150 μΐ skúškového tlmivého roztoku.
- 100 μΐ antiséra sa navzorkuje do všetkých jamiek, s výnimkou jamiek na slepé pokusy (B) a NSB a potom nasleduje dvojhodinová inkubácia pri 3 až 5C.
- Po inkubácii sa do všetkých jamiek, okrem B, navzorkuje 100 μΐ cAMP peroxidázového konjugátu a nasleduje jednohodinová inkubácia pri 3 až 5°C.
• · ····
- 147 ·· ·· • · · · • · · ··· · · · · · • · · · · · ·· ··· ·· ···· ·· ···· • · • ···
- Doštičky sa vyprázdnia tak, že sa obrátia dnom hore, odsajú absorpčným papierom a potom sa každá jamka premyje štyrikrát 400 μΐ premývacieho tlmivého roztoku. Po každom premytí sa doštičky opäť. odsajú, aby sa zaistilo úplné odstránenie premývacieho tlmivého roztoku. Ihnedf potom sa do všetkých jamiek rozdelí 200 μΐ TMB.
- Doštičky sa pri teplote miestnosti na 30 minút umiestnia do trepačky a potom sa do všetkých jamiek pridá 100 μΐ kyseliny sírovej. Na zariadení Spectra max 190 sa pri 450 nm počas 30 minút odčíta optická denzita.
4. Štandardy
Pre každú skúšku sa pripravia nasledujúce štandardné skúmavky:
4.1. Pridanie štandardu do skúškovém tlmivého roztoku
Za účelom zistenia účinnosti stanovení sa do skúškového tlmivého roztoku pridá známe množstvo cAMP. Do skúškového tlmivého roztoku sa pridá 70 pmol/ml cAMP, ekvivalent 35 fmol/jamku pri skúške, čo je stred krivky závislosti odpovedi od dávky.
Na prípravu 1 ml štandardu: 68,4 μΐ 521fmol štandardu/jamka 931,6 μΐ skúškového tlmivého roztoku
4. Účinky zlúčenín na doštičku
Za účelom stanovenia, či zlúčeniny použité pri funkčných skúškach majú účinok na 96jamkové doštičky alebo ovplyvňujú väzbu cAMP, sa pripravia štandardy tak, že sa
- 148 • · ·· ···· ·· ·· ··· ··· ···· • · · 9 · ··· · « · • ···· ··· ···· · • · · · ···· ··· · ·· ··· ·· ····
- do samotného skúškového tlmivého roztoku pridá zlúčenina, čím sa stanovia účinky zlúčeniny priamo na doštičku;
- zlúčenina sa pridá do plazmy obsahujúcej bazálnu hladinu cAMP, čím sa stanovia účinky zlúčeniny na väzbu cAMP na doštičku.
Do každého štandardu sa pridá zlúčenina v 5nM koncentrácii. Koncentrácia 5nM je zvolená preto, že celkové koncentrácie liečiva na konci infúzie v minulosti boli približne 150 až 300mM. Vzorky sa pred skúškou zriedia 1 : 100, 5nM koncentrácia teda ráta s akoukolvek vyššou koncentráciou, ako je predpokladaná celková koncentrácia liečiva na konci infúzie.
5. Výpočty
Spectra max odčíta optickú hustotu (OD) pri 450 nm.
Štandardná krivka sa zostrojí tak, že sa vynesie %B/Bo (na osu y) proti cAMP fmol/jamka (na osu x) na Spectra max, kde Bo predstavuje nulový štandard (pozri postup 3.2) %B/Bo (% väzby) pre každú vzorku a štandard sa vyráta podlá nasledujúceho vzorca
OD štandardu alebo vzorky - OD NSB) %B/Bo ---x 100 (OD Bo - OD NSB)
Hodnoty fmol/objem v jamke je možné odčítať priamo zo štandardnej krivky pre každú vzorku. Hodnoty sa potom prevedú na pmol/ml a potom sa stanoví stredná hodnota každého páru vzoriek.
Prevedenie hodnôt z fmol/jamka na pmol/ml:
• · · · • · · • · · · · · · · • · · · · · · · ··· · ·· ··· ·· ····
- 149 ···· ·· ···· • · • ··· ·· fmol na pmol = delené 1000 objem v jamke = 50 μΐ ... So (xlOOO)
Vzorky sa riedia 1 : 100, takže celkom = 1 x 1000/1000x100/50 = 2
Z toho vyplýva, že hodnoty v fmol/jamka je potrebné násobiť dvoma, aby sa získali hodnoty v pmol/ml.
Zvierací skúšobný model
Potenciácia účinkov cyklického adenozín-3',5’-monofosfátu (cAMP) vedie k zvýšeniu vaginálneho prekrvenia pri modelovej skúške sexuálneho vzrušenia na anestetizovaných králikoch.
1.0. Ciele
1. Vyvinúť a overiť zvierací model ženského sexuálneho vzrušenia.
2. Identifikovať mechanizmus (mechanizmy) zodpovedný za reguláciu prekrvenia genitálií anestetizovaného králika.
3. Identifikovať potenciálne prístupy k zvýšeniu vaginálneho a klitoriálneho prekrvenia.
4. Skúmať mechanizmus (mechanizmy), ktorý je základom relaxácie hladkého svalu vagíny a identifikovať potenciálne prístupy k zvýšeniu vaginálnej relaxácie.
2.0. Úvod
Normálne sexuálne vzrušenie je tvorené radom fyziologických odpovedí, ktoré sú pozorované počas sexuálnej excitácie. Tieto zmeny, ako prekrvenie vagíny, labií a klitorisu, sú výsledkom zvýšeného prekrvenia genitálií. Pre• · ·· ···· ·· ·· ·· · ··· · · · · • · · · · ··· · · · ···«·· · ··· · · • · · · · · · · ··· · ·· ··· ·· ····
- 150 krvenie vedie k zvýšeniu vaginálnej lubrikácie prostredníctvom transsudácie plasmy, zvýšeniu poddajnosti vagíny (relaxácii hladkého svalu vagíny) a zvýšeniu citlivosti vagíny a klitorisu.
Porucha sexuálnej vzrušivosti u žien (FSAD) je poruchou s vysokou prevalenciou, ktorá postihuje až 40 % pre-, peri- a postmenopauzálnych (±HRT) žien. Primárnym dôsledkom FSAD je znížené prekrvenie alebo zväčšenie genitálií, ktoré sa manifestuje ako nedostatočná lubrikácia vagíny a nedostatok príjemných vnemov. Druhotným dôsledkom je znížená sexuálna túha, bolesť počas styku a ťažké dosahovanie orgazmu. Najobvyklejšou príčinou FSAD je znížené prekrvenie genitálií, ktoré vedie k zníženému prekrveniu vagíny, labií a klitorisu. (Park, 1997; Goldstein, 1998; Berman, 1999a, Werbin, 1999).
Ako už tu bolo vysvetlené, tento vynález poskytuje prostriedky na obnovenie alebo potenciáciu normálneho sexuálneho vzrušenia u žien, ktoré trpia FSAD, prostredníctvom zvyšovania prekrvenia genitálií.
Pri našich skúškach sme identifikovali cAMP (cyklický adenozín-3',5'-monofosfát) ako mediátor vazorelaxácie, pričom sme na meranie malých zmien prekrvenia genitálií použili laserové Dopplerovské technológie. Pri použití inhibítoru VIP metabolizmu (inhibítoru NEP EC 3.4.24.11) sme tiež doložili, že zvýšenie prekrvenia genitálií pozorované počas stimulácie pelvického nervu (tzn. sexuálneho vzrušovania) je sprostredkované VIP. Táto činnosť zahŕňala vyvinutie zvieracieho modelu sexuálneho vzrušenia a doloženia, že údaje reflektujú fyziologické zmeny pozorované počas sexuálneho vzrušenia ženy. Tento model bol použitý na identifikáciu a potvrdenie mechanizmov, ktoré podporujú prekrvenie genitálií, napríklad priamej alebo nepriamej potenciácie vazorelaxácie sprostredkovanej cAMP.
• 9 ···· ·· ···· 99 ··
9 9 9 9 9 9
9 999 9 9 9 • 99 9999 ·
9 99 9 9 9 ·
99« 9 99 9·9 ·· ····
- 151 3.0. Postupy
3.1. Anestetický protokol
Samice novozélandského králika (asi 2,5 kg) sa premedikujú kombináciou medetomidínu (Domitor^R^, 0,5 ml/kg i.m.), a ketamínu (Vetalar^R\ 0,25 ml/kg i.m), pričom sa udržuje prívod kyslíka pri použití obličajovej masky. Králičí sa tracheotomizujú pri použití endotracheálnej rúry bez manžety Protex^R^ 3 ID., napoja na ventilátor a udržujú pri ventilačnej frekvencii 30 až 40 dychov za minútu s priemerným respiračným objemom 18 až 20 ml a maximálnom tlaku 981 Pa. Anestéza sa potom vykoná na Isoflurane a ventiluje sa pomocou kyslíka (2 1/min). Pravá marginálna ušné véna sa kanyluje pri použití katétru 23G alebo 24G a perfunduje sa laktátovaným Ringerovým roztokom (0,5 ml/min). Králik sa počas invazívnej chirurgie udržuje na 3% Isofluranu, ktorý sa pri udržovacej anestéze zníži na 2%.
3.2. Kanylácia ciev
Oblasť íavej slabiny králika sa oholí a pozdĺž stehna sa urobí vertikálny rez s dĺžkou asi 5 cm. Exponuje sa femorálna véna a artérie, ktoré sa izolujú a kanylujú PVC katétrom (17G) na infúziu liečiv a zlúčenín. Pri femorálnej artérie sa kanylácia opakuje, pričom sa katéter zavedie do hĺbky asi 10 cm, aby sa zaistilo, že katéter dosiahne abdominálnu aortu. Arteriálny katéter sa spojí so systémom Gould, aby bolo možné zaznamenávať krvný tlak. Arteriálnym katétrom sa tiež odoberajú vzorky na analýzu krvných plynov. Merí sa systolický a diastolický tlak a pri použití vzorca (diastolický x 2 + systolický) + 3 sa vyráta stredný arteriálny tlak. Srdcová frekvencia sa merí pomocou pulzného oxymetru a softwarového systému na zber údajov Po-ne-mah (Ponemah Physiology Platform, Gould Inštrument Systems Inc.).
- 152 • · ·· · • · · • ···· · • · ··· · ·· ···· • · · • · ··· • · · • · · ·· ··· ·· ·· • · · · • · · • · · • · · ·· ····
3.3. Stimulácia pelvického nervu
Do abdominálnej dutiny sa vedie rez strednou čiarou brucha. Rez je asi 5 cm tesne nad ohanbovou kosťou. Tuk a svaly sa tupo oddelia, čím sa odhalí hypogastrický nerv, ktorý zbieha do telnej dutiny. Je nezbytné udržať bočnú stenu pubis uzatvorenú, aby nedošlo k porušeniu femorálnej vény a artérie, ktoré ležia pod ohanbovou kosťou. Ischiatický a pelvický nerv sú uložené hlbšie a objavia sa po ďalšej disekcii na dorzálnej strane králika. Po identifikácii ischiatického nervu je možné lahko lokalizovať pelvický nerv. Pojem pelvický nerv je používaný volne; anatomické knihy pri identifikácii týchto nervov v dostatočných detailoch zlyhávajú. Stimulácia tohto nervu však vyvoláva zvýšenie vaginálneho a klitoriálneho prekrvenia, a inerváciu panvovej oblasti. Pelvický nerv sa zbaví obklopujúcich tkanív a dookola neho sa umiestni bipolárna stimulačná elektróda Harvard. Nerv sa mierne nadvihne, aby sa vyvolalo určité napätie a potom sa bezpečne upevní v polohe. Dookola nervu a elektródy sa nanesie asi 1 ml lahkého parafínového oleja. Ten funguje ako ochranný lubrikant nervu a zabraňuje kontaminácii elektródy krvou. Elektróda sa spojí so stimulátorom Grass S88. Pelvický nerv sa stimuluje pri nasledujúcich parametroch: 5 V, šírka impulzu 0,5 ms, trvanie stimulu 10 sekúnd a frekvencia v rozmedzí 2 až 16 Hz. Pri stimulácii nervu každých 15 až 20 minút sa dosiahnu reprodukovatelné odpovedi.
Na začiatku každej skúšky sa stanoví krivka závislosti odpovedi od frekvencie za účelom stanovenia optimálnej frekvencie, ktorá sa používa ako sub-maximálna odpoveď, zvyčajne 4 Hz. Zlúčenina (zlúčeniny), ktorá sa má skúšať, sa podá infúziou do femorálnej vény pri použití infúznej pumpy Harvard 22 umožňujúcej pokračovanie 15minútového stimulačného cyklu.
·· · · • ·· · • · • ··· ···· · ·
- 153 3.4. Umiestnenie laserovej Dopplerovskej sondy
Vykoná sa rez ventrálnou strednou čiarou na kaudálnom konci pubis, aby sa exponovala pubická oblasť. Spojivové tkanivá sa odstránia, čím sa exponuje obal klitorisu. Tým sa zaistí, že stena bude zbavená malých ciev. Vonkajšia stena vagíny sa tiež exponuje a zbaví všetkého spojivového tkaniva. Jedna laserová Dopplerovská prietoková sonda sa vloží 3 cm do vagíny tak, že držadlo sondy zostáva stále viditeľné. Druhá sonda sa umiestni tak, aby ležala práve nad vonkajšou stenou klitorisu. Polohy týchto sónd sa upravujú, kým sa nezíska signál. Druhá sonda sa umiestni tesne nad povrch cievy vonkajšej vaginálnej steny. Obidve sondy sa v polohách upevnia svorkami.
Vaginálne a klitoriálne prekrvenie sa zaznamenáva buď vo forme čísel priamo z prietokomeru pri použití softwarového systému na zber údajov Po-ne-mah (Ponemah Physiology Platform, Gould Inštrument Systems Inc.) alebo nepriamo zo stopy pásového záznamu Gould. Na začiatku skúšky sa vykoná kalibrácia (0 až 125 ml/min/100 g tkaniva). .
3.5. Infúzia vazoaktívneho intestinálneho peptidu (VIP)
Infúzia iv. sa podá VIP v dávkach 2,0, 6,0, 20,0, 60,0 μg/kg v objeme 0,5 ml soľného roztoku. Infúzia VIP sa uskutoční pri použití pumpy Harvard 22 rýchlosťou 500 μΙ/min pomocou trojcestného napojenia do femorálnej vény. Po infúzii VIP sa katéter prepláchne heparinizovaným soľným roztokom (Hepsaline) tak, aby v katétre nezostal žiadny VIP. Na skúšky pri použití infúzií VIP je potrebné zostaviť krivku závislosti odpovedi od počiatočnej senzitizačnej dávky (2 až 60 μg/kg), aby bolo možné získať. reprodukovateľné odpovedi. Počiatočná infúzia Hepsaline (50 Ul/ml) slúži ako negatívna kontrola.
154
• · ·
• · · ·· ····
3.6. Infúzia inhibítorov
Inhibítory NEP (neutrálne nedopeptidázy EC 3.4.24.11), inhibítory fosfodiesterázy typu 5 (PDE5) a antagonisty NPY Yl sa pripravia ako roztoky v solnom roztoku alebo 5% roztoku glukózy (200 μΐ 50% glukózy v 1,8 ml vody na injekcie). Inhibítory PDEcAMp sa rozpustia v 40% etanolickom roztoku (200 μΐ 50% glukózy v 1,8 ml zmesi vody a etanolu pre injekcie). Inhibítory a kontrolné vehikulum sa podajú infúziou rovnakou rýchlosťou ako VIP. NEP inhibítory sa nechajú stáť 30 minút pred zostavením krivky závislosti odpovedi od dávky VIP, zatiaľ čo inhbítory VIP, antagonisty receptoru NPY Yl a inhibítory PDEcAMp sa nechajú stáť 15 minút pred stimuláciou pelvického nervu.
3.7. Meranie relaxácie hladkého svalu na izolovanej králičej vagíne
3.7. (a) Králičia vagína in vitro: Samice novozélandských bielych králikov (2,0 až 3,0 kg) sa usmrtia cervikálnou dislokáciou. Ich brušná dutina sa otvorí a vyreže sa vagína. Tkanivové prúžky sa hodvábnou chirurgickou niťou (6/0) pozdĺžne upevnia do 5ml silanizovaných komôr pre orgány Wesley Co. pri počiatočnom pokojovom napätí 1,5 g v Krebsovom bikarbonátovom tlmivom roztoku udržovanom pri 37°C a aerovanom zmesou 5 % oxidu uhličitého a 95 % kyslíka. Horná ligatúra každého tkanivové prúžku sa napojí na zariadenie na meranie zmien v izometrickej sile s kapacitou 10 g a namerané hodnoty sa zaznamenávajú pri použití systému DART na zber údajov in vitro. Tkanivá sa počas 1 hodiny nechajú ekvilibrovat a pravidelne premývajú Krebsovým roztokom.
3.7. (b) Relaxácia králičej vagíny indukovaná vazoaktívnym intestinálnym peptidom: Každé tkanivo sa kontrahuje pri použití kúpela fenylefrínu s ΙμΜ koncentráciou. Ked kontra·· ···· • · ····
155 ktilná odpoveď dosiahne stabilné plató (asi 15 minút) VIP sa kumulatívne pridáva do komory na orgány v logaritmických jednotkách, aby sa dosiahli koncentrácie 0,1 až lOOnM. Relaxačné odpovedi sa merajú 5 minút po prídavku každej koncentrácie VIP, kým sa nedosiahne maximum relaxácie. Tkanivá sa potom ošetrujú buď skúšanou zlúčeninou (napríklad inhibítorom NEP alebo PDE) alebo DMSO vehikulom (časovo zladená kontrola).
3.7 (c) Analýza údajov zo skúšok VIP relaxácie: Vždy sa zostaví krivka relaxačnej odpovedi na koncentráciu VIP, relaxačná odpoveď indukovaná VIP sa vyjadrí ako percento maxima kontrakcie indukovanej fenylefrinom. Tieto hodnoty sa vynesú do grafu proti logaritmu koncentrácie VIP a preložia sa S-krivkou. Krivka sa preloží medzi bodom zodpovedajúcim 0 % (minimum relaxačnej odpovedi), pričom bod zodpovedajúci maximu relaxačnej odpovedi sa neupravuje. Stanoví sa koncentrácia VIP potrebná na dosiahnutie 50% relaxácie fenylefrinovej kontrakcie (EC50 pE).
3.7 (d) Relaxácia králičej vagíny stimulovaná elektrickým polom: Prúžky z králičej vagíny sa pripravia spôsobom opísaným v časti 3.7 (a). Tkanivové prúžky sa umiestnia medzi dve platinové elektródy umiestnené na vrchu a na dne komory na orgány asi 4 cm od seba. Každé tkanivo sa kontrahuje pri použití kúpela s ΙμΜ koncentráciou fenylefrinu. Keď kontraktilná odpoveď dosiahne stabilné plató (15 minút), tkanivá absolvujú krivku relaxácie indukovanej stimuláciou elektrickým polom (EFS) v rámci predbežného ošetrenia. To sa vykoná pri 40 až 60 V pri použití radu frekvencií 2, 4, 8 a 16 Hz ako desatsekundový rad pulzov s šírkou 0,5 milisekúnd. Tkanivá sa medzi každou frekvenciou nechajú vrátiť na základnú líniu prekontraktilného napätia (5 minút) a zaznamená sa velkosť relaxačnej odpovedi.
·· ···· • · • ··· • · ·
- 156 ·· ·· • · ····
Po predbežnej charakteristike EFS odpovedi sa všetky tkanivá 15 minút premývajú, pričom sa nechajú vrátiť na základnú líniu napätia. Tkanivá sa potom ošetria budf skúšaným činidlom (napríklad inhibítorom NEP alebo PDE, inhibítorom oxid dusnatý syntázy (NOS)) alebo DMSO vehikulom (časovo zladená kontrola). Tkanivá sa 15 minút po prídavku zlúčeniny alebo vehikulá opäť kontrahujú fenylefrinom (ΙμΜ) a spôsobom opísaným hore sa stanoví krivka EFS-indukovanej relaxačnej odpovedi.
Pri EFS skúškach sa Krebsov roztok doplní atropínom (ΙΟμΜ) a guanetidínom (150μΜ), aby sa odstránila eholínergická alebo adrenergická neuronálna inervácia vagíny.
3.8. Meranie hladiny cAMP v izolovanej vagíne králika
Koncentrácia cAMP sa merí v extraktoch z vaginálneho tkaniva pri použití kitu na enzymatické imunostanovenie Biotrak cAMP (EIA) (Amersham Life Sciences RPN 225).
Izolované vzorky tkaniva vagíny sa ošetria skúšanými činidlami (napríklad forskolínom alebo VIP). Po 5 minútach sa vzorky rýchlo zmrazia pri použití kvapalného dusíka, homogenizujú a extrahuje sa cAMP. Hladiny cAMP sa meria pomocou EIA. EIA je založené na kompetícii medzi neznačeným cAMP a fixovaným množstvom cAMP značeného peroxidázou s obmedzeným množstvom cAMP špecifickej protilátky.
3.9. Meranie aktivity fosfodiesterázy (PDE) v izolovanej vagíne králika
Cytosolické extrakty zo steny ľudskej vagíny boli dodané firmou ABS Inc., Delaware, USA (vek darcov bol 41 a 61 rokov). PDE izoenzýmy sa oddelia chromatografiou na anexe Mono-Q a charakterizujú na základe substrátovej se·· ···· • · • ···
- 157 ·· ·· • · · · • · 9 • · · · • · · ·· ···· lektivity, citlivosti k alosterickým modulátorom a selektívnych inhibítorov. Za účelom detekcie expresie PDE v ludskej vagíne sa tiež vykoná Western analýza pri použití PDE izoenzýmových protilátok.
Všetky údaje sa uvedú ako stredná hodnota ± SEM. Významné zmeny sa identifikujú pri použití Študentovho t-testu.
4.0. Výsledky a diskusia
4.1. Zvierací model sexuálneho vzrušenia
Pri našich štúdiách bol vyvinutý robustný reprodukovatelný model fyziológie sexuálneho vzrušenia. Pri použití tohto modelového organizmu, anestetizovaného králika, sme schopní merat malé zmeny prekrvenia genitálií pri použití laserovej Dopplerovskej technológie. Na stimuláciu neuronálnych efektov sexuálneho vzrušenia sa používa stimulácia pelvického nervu.
Zistili sme, že stimulácia pelvického nervu indukuje zvýšenie vaginálneho a klitoriálneho prekrvenia závislého od frekvencie (pozri obr. 1). Tieto zvýšenia vaginálneho prekrvenia sú významné pri snímaní na vnútornej alebo vonkajšej stene vagíny. Stimulácia pelvického nervu pri 2 Hz indukuje stredné maximum zvýšenia vaginálneho prekrvenia o 10,3±l,8, pri 4 Hz 20,0±4,6, 8 Hz 36,3±4,8 a 16 Hz 46,6±4,7 ml/min/100 g tkaniva (n = 4, 0,5 ms, lOs) a zvýšenie klitoriálneho prekrvenia o 14,7±3,6 pri 2 Hz, 29,4±
1,4 Hz a 69,7±2,1 pri 8 Hz. Tieto hodnoty majú podobnú amplitúdu ako hodnoty skôr pozorované pri skúškach na človeku a zvieracích modeloch vzrušenia (Berman, 1999a, Park, 1997).
Zistili sme, že submaximálna stimulácia pélvického nervu vedie k reprodukovatelným zvýšením genitálneho prekrve• 9
- 158
Μ ···· • · · • · · · · * · · ·· ·· ···· nia (napríklad stimulácia 4 Hz každých 15 minút vedie k strednému zvýšeniu vaginálneho prekrvenia o 8,5±0,10 ml/min/100 g tkaniva, n = 8, a strednému zvýšeniu klitoriálneho prekrvenia o 13,65±0,86 ml/min/100 g tkaniva, n = 11). Táto reprodukovatelnosť sa udržala až 5 hodín. Táto reprodukovatelnost odpovedí sa môže použit na a) identifikáciu endogénneho vazoaktívneho činidla/mechanizmu, ktorým je sprostredkované prekrvenie genitálií a b) skúmanie vplyvu liečiv, ktoré môžu byt účinné pri zvyšovaní vaginálneho a/alebo klitoriálneho prekrvenia.
Zistili sme, že so stimuláciou pelvického nervu u anestetizovaného králika nie sú spojené žiadne nežiadúce účinky (pozri obr. 3).
Prekrvenie genitálií sa počas sexuálneho vzrušenia zvyšuje (Berman, 1999) prostredníctvom zvýšenej dodávky arteriálnej krvi: vaginálna artéria, vaginálna vetva maternicovej artérie, ohanbová artéria a stredná vetva strednej rektálnej artérie sa všetky podielajú na zásobovaní vagíny a klitorisu krvou. Pelvický nerv, ktorý vychádza z miechovej oblasti S2/S4, inervuje ženské genitálie a má vetve, ktoré sú zakončené v dolnej vagíne, klitorise a s nimi súvisiacich cievach. Stimuláciou pelvického nervu môžeme stimulovať efekty prekrvenia pozorované počas sexuálneho vzrušenia, tzn. zvýšenie arteriálneho prekrvenia genitálií. Je zaujímavé, že zvýšené arteriálne prekrvenie sa neodráža v žilnej drenáži, čo umožňuje prekrvenie sita kapilár. Prekrvenie vagíny vedie k jej lubrikácii prostredníctvom zvýšenej transsudácie plazmy, a to je jedna z prvých pelvických odpovedí pozorovaných počas sexuálnej stimulácie. Neurotransmitery, ktoré sú uvoíňované po stimulácii pelvického nervu alebo počas sexuálneho vzrušenia v súčasnosti nie sú identifikované. Nervy obsahujúce neuropeptidy a iné potenciálne neurotransmitery, ktoré inervujú vaskulatúru a mikrovaskulatúru vagíny a klitorisu, boli identifikované imunohistologicky. Tieto ·· ···· • · • ···
- 159 • · ···· • · · ·· ··· ·· ·· • · · · • · · • · · • · · ·· ···· štúdie napovedajú, že peptid so vzťahom ku kaleitonínovému génu (CGRP), neuropeptid Y (NPY), oxid dusnatý syntáza (NOS), látka P a vazoaktivny intestinálny peptid (VIP) sú všetky prítomné v nervoch, ktoré inervujú ludskú vagínu a klitoris (Hoyle, 1996; Burnett, 1997; Hauser-Kronberger, 1999).
4.2. Overovanie modelu sexuálneho vzrušenia na anestetizovaných králikoch
Za účelom korelácie údajov týkajúcich sa prekrvenia získaných pri použití tohto modelu s údajmi pozorovanými na ludskom modele sexuálneho vzrušenia sme priamo porovnávali naše údaje o vaginálnom prekrvení a kardiovaskulárne údaje získané v predklinických skúškach.
Zistili sme, že infúzia VIP mala pri králičom modele sexuálneho vzrušenia nasledujúce účinky:
- Exogénny VIP (iv. bolus) indukuje významné zvýšenia vaginálneho prekrvenia v závislosti od koncentráciu (pozri obr. 2a). Tieto zvýšenia sú významne nad bazálnymi hodnotami prekrvenia pri snímaní na intra- alebo extravaginálnej stene. Intravenóznym podávaním VIP (60 μg/kg) sa vaginálne prekrvenie významne zvyšuje o 24,7 ± 3,6 ml/min/100 g tkaniva. Prekrvenie zostáva zvýšené nad bazálnu hodnotu asi 11 minút po infúzii. Nižšie dávky indukujú menšie zvýšenie, napríklad dávka 6,0 μg/kg vyvolá zvýšenie prekrvenia o 7,5 ± 1,3 ml/ min/100 g tkaniva a zvýšenie pretrváva asi 7 minút po infúzii.
- Opakované infúzie podobných dávok VIP (iv. v 30minútových intervaloch) indukuje významné reprodukovatelné zvýšenia vaginálneho prekrvenia (pozri obr. 2b).
- 160 • · ·· · • · · • ···· · • · ·· · · ·· ···· • · · • · · · · • · β · • · Ο ·· ··· ·· ·· • · · · • · · • · · • · · ·· ····
- VIP (iv.) významne zvyšuje srdcovú frekvenciu a znižuje stredný arteriálny tlak krvi (pozri obr. 3). VIP v dávke 6,0 μg/kg (iv.) vyvoláva významné zníženie stredného arteriálneho tlaku krvi o 1760±93 Pa a významné zvýšenie srdcovej frekvencie o 16±4 tepy za minútu.
Zvierací model priamo odráža klinické údaje pozorované po infúzii VIP zdravým dobrovolníkom, tzn. zvýšenie vaginálneho prekrvenia, zníženie krvného tlaku a zvýšenie srdcovej frekvencie. Tento model je teda možné použiť na skúmanie mechanizmu (alebo mechanizmov), ktoré sú základom fyziologických zmien, ku ktorým dochádza počas sexuálneho vzrušenia, a ďalej na overenie nových prístupov k zvyšovaniu vaginálneho prekrvenia, čiže liečenia FSAD.
4.3. Zmeny prekrvenia vagíny indukované VIP prostredníctvom stimulácie dráhy cAMP/adenylát cyklázovej dráhy
Ottesen a spolupracovníci demonštrovali, že VIP indukuje zvýšenie vaginálneho prekrvenia a lubrikáciu pri zdravých dobrovoíníkoch. Mechanizmus, akým k tomu dochádza, je však nejasný. V literatúre je rad príkladov VIP signalizácie cez rôzne systémy druhých poslov, ako cGMP/guanylát cyklázu (Ashur-Fabian, 1999), oxid uhličitý/hem oxygenázu (Fan, 1988) a cAMP/adenylát cyklázu (Schoeffter, 1985; Gu, 1992; Foda, 1995). To je doložené príkladmi v nedávnej správe, ktorá opisuje, ako je relaxačné účinky VIP v maternicovej artérii možné vysvetliť uvolňovaním oxidu dusného (Jovanovic, 1998). Pozoruhodné je, že existuje tiež dôkaz o VIP modulácii NO/cGMP pri urogenitálnej funkcii samcov (Kim, 1994) a existuje priamy dôkaz, že ošetrenie kultúr buniek hladkého svalu ženskej vagíny vazoaktívnym intestinálnym peptidom (0,5μΜ) nezvyšuje hladinu cAMP (Traish, 1999, tamtiež).
- 161 ·· · · · • ···· · ··· ·· ···· • · · • · ··· • · · • · · ·· ··· ·· ·· • · · ·
9 · • · · · • · · ·· ····
Pri tejto skúške sme demonštrovali, že VIP indukuje vazoreláxaciu prostredníctvom zvýšenia hladiny intracelulárneho cAMP. Pri rade funkčných experimentov sme okrem biochemického merania intracelulárnych koncentrácií cAMP merali prekrvenie a relaxáciu hladkého svalu. Na napodobenie aktivačných účinkov na cAMP/adenylát cyklázovú dráhu sme použili forskolín, aktivátor adenylát cyklázy alebo cAMP mimetika. VIP a forskolín majú rovnaké účinky na fyziologické prejavy vzrušenia z hladiska vaginálneho prekrvenia a relaxácie.
VIP (20 μg/kg) a forskolín (40 nmol/kg) indukujú významné zvýšenie vaginálneho prekrvenia (VIP 13,2 ml/min/ 100 mg tkaniva, VIP 12,7 ml/min/100 mg tkaniva) (pozri obr. 2a a 4a). Tieto zmeny v amplitúde indukovanej VIP a forskolínom sa významne nelíšili. Tieto zvýšenia sú významne nad hodnotami bazálneho prekrvenia pri meraní na intra- alebo extravaginálnej stene.
VIP (Ο,ΙμΜ) a forskolín (ΙΟμΜ) významne zvyšovali intracelulárne koncentrácie cAMP nad bazálnu hladinu v izolovanom tkanive vagíny (pozri obr. 4b)
VIP (Ο,ΙμΜ) a forskolín (ΙΟμΜ) zvyšujú bazálne koncentrácie od 276nM o 156 % (VIP) a 238 % (forskolín). Rozdiel v týchto percentuálnych hodnotách odráža rozdiel v použitých koncentráciách VIP a forskolínu; napríklad VIP v koncentrácii Ο,ΙμΜ relaxuje prekontrahovanú izolovanú vagínu približne z 80 %, zatial čo ΙΟμΜ forskolín dostačuje na úplnú relaxáciu izolovaného tkaniva.
Okrem toho sme ukázali, že VIP a forskolín indukujú relaxáciu v izolovanom tkanive vagíny pri EC50 18,8±0,6nM (VIP) a 320±20nM (forskolín) (pozri obr. 4 c).
- 162 ·· ···· • · ·· ···· ·« · · · · • · · ♦ · ··· • ···· · · · Ο • · · · ο ··· · ·· ··· ··
Tieto údaje potvrdzujú, že VIP indukuje vaginálnu vazorelaxáciu prostredníctvom cAMP/adenylát cyklázovej dráhy, takže je tento model možné použiť na skúmanie, či stimulácia pelvického nervu, tzn. sexuálne vzrušovanie, vedie k uvoľneniu VlP/aktivácie cAMP/adenylát cyklázovej dráhy. Tiež je možné skúmať prístupy k zvyšovaniu vaginálneho> prekrvenia počas sexuálneho vzrušenia, napríklad priamym alebo nepriamym posilnením cAMP signalizácie.
4.4. cAMP je mediátorom vaginálnej vazorelaxácie
Potenciálne neurotransmitery a druhí poslovia zodpovedné za zvýšenie vaginálneho prekrvenia počas sexuálneho vzrušenia dosial neboli identifikované. Výskumníci sa dosial zameriavali na dráhu oxid dusnatý (NO)/cGMP. V súvislosti s týmto vynálezom sme doložili, že 1) cAMP/adenylát cyklázové dráhy sprostredkováva zvýšenie vaginálneho prekrvenia indukované VIP; 2) VIP je endogénny neurotransmiter uvoľňovaný počas sexuálneho vzrušenia; a 3) endogénne uvolnený VIP nadväzuje svoje vazorelaxačné účinky prostredníctvom zvýšenia cAMP.
Neurotransmiter zodpovedný za relaxáciu vaginálnej steny dosial nebol identifikovaný. Doložili sme, že VIP je neurotransmiter uvoľňovaný po stimulácii pelvického nervu a že cAMP je mediátor vazorelaxácie sprostredkovanej VIP. Činidlá, ktoré zabraňujú metabolizmu VIP alebo priamo posilňujú cAMP signalizáciu podporujú zvýšenie vaginálneho prekrvenia pri stimulácii pelvického nervu, napríklad inhibítory NEP alebo inhibítory PDEcAMp (pozri nasledujúce odseky).
Pri našich skúškach sme zistili, že môžeme vylúčiť úlohu NO pri relaxácii vagíny indukovanej VIP. Účinné a selektívne inhibítory PDE typu 5 majú minimálny účinok na re- 163 ·· ···· » · · » · ··· ·· ·· • · · · • · · • · · • · · ·· ···· laxáciu izolovaného svalu vagíny indukovanú VIP (30% zvýšenie relaxácie indukované VIP, pozri tabulku 1).
Tabulka 1
Zvýšenie relaxácie izolovanej králičej vagíny sprostredkovanej VIP
Táto tabulka ilustruje percentuálne zvýšenie EC50 pre relaxácie prekontrahovaného (ΙμΜ fenylefrinom) hladkého svalu vagíny indukovanej VIP. Selektívne inhibítory PDEcAMp typu 1, 2, 3 a 4 všetky významne potencujú relaxácie sprostredkované VIP, zatial čo selektívny inhibítor PDEcGMp typu 5 alebo kontrolné vehikulum nemajú na relaxáciu sprostredkovanú VIP žiadny vplyv.
PDE inhibítor Zvýšenie relaxácie v selektívnej dávke indukovanej VIP
PDECAMP typu 1 210 %
PDEcAMP typu 2 130 %
PDEcAMP typu 3 220 %
PDEcAMP typu 4 160 %
PDEcGMP typu 5 žiadny účinok (30
Kontrola - vehikulum žiadny účinok
Rovnako sme ukázali, že VIP je tiež endogénny NANC (neadrenergický, necholinergický) neurotransmiter sčasti zodpovedným za EFS indukovanú relaxáciu izolovaného hladkého svalu vagíny. Vysoká dávka inhibítoru oxid dusnatý syntázy (L-NOARG, 300μΜ) inhibuje iba 50 % EFS-indukovaných relaxácií. Inhibítor NEP (ΙμΜ), ktorý zabraňuje metabolizmu VIP indukovanému NEP, a teda zosilňuje VIP signalizáciu, zvyšuje non-oxid dusnatý NANC relaxáciu indukovanú EFS. Preukázali sme, že ako NO, tak VIP regulujú tonus hladkého svalu vaginálnej steny. Terapeuticky bude možné zvýšiť relaxáciu
- 164
9 99 9999
9 9 9 9 • · · · · ··· • 9999 9 9 9 9 · 9 9 9
999 9 99 999
99
9 9 9
9 ·
9 9
9 9
9999 hladkého svalu vagíny pri použití činidiel, ktoré posilňujú NO/cGMP a/alebo VIP/cAMP sprostredkovanú signalizáciu.
4.5. VIP indukuje klitoriálnu vazorelaxáciu cez cAMP dráhu
Potenciálne neurotransmitery a druhí poslovia zodpovedné za zvýšenie prekrvenia klitorisu pri sexuálnom vzrušení dosial neboli identifikované. Paralelne s výskumami prekrvenia vagíny bola vytvorená teórie, a výskum sa zameral na dráhu oxid dusnatý (NO)/cGMP. Neexistujú žiadne správy o podiele VIP na sprostredkovaní prekrvenia/prekrvenia klitorisu, hoci neuróny obsahujúce VIP boli v tkanive klitorisu vizualizované (Hauser-Kronberger et al., 1999).
Pri našich skúškach sme preukázali, že
1. Infúzia VIP zvyšuje prekrvenie klitorisu.
2. cAMP/adenylát cyklázová dráha sprostredkováva zvýšenie prekrvenia klitorisu indukované VIP.
3. VIP je endogénny klitoriálny neurotransmiter, ktorý je uvoľňovaný počas sexuálneho vzrušenia:
1. Infúzia VIP (60 až 200 μg/kg, iv. bolus) indukuje zvýšenie prekrvenia klitorisu závislé od koncentrácie (obr. 5). 115% zvýšenie prekrvenia klitorisu je pozorované po iv. infúzii VIP v dávke 200 μg/kg, čo predstavuje významné zvýšenie oproti kontrolným infúziám (Hepsaline).
2. Účinky VIP na prekrvenie klitorisu je možné näpodobiť infúziou cAMP mimetiká, forskolínu (40nmol/kg, iv. bolus, obr. 5). Po iv. infúzii forskolínu v dávke 40 nmol/kg bolo pozorované 156% zvýšenie prekrvenia klitorisu, čo predstavuje významné zvýšenie oproti kontrolným infúziám (Hepsaline). Amplitúda odpovedi je podobná ako pri VIP • · ·· · • · · • ··· • é • · · ·
- 165 ·· ···· • · · • · t ·· • * · · • · · «· ··· ·· ·· ♦ · · · • · · • · · · • · · ·· ···· pozorele(200 μg/kg, iv. bolus) a porovnatelná s hodnotami rovanými pri prekrvení vagíny (pozri obr. 2 a 4).
3. Selektívne inhibítory NEP EC 3.4.24.11 v klinicky vantných dávkach významne posilňujú zvýšenie prekrvenia klitorisu indukované stimuláciou pelvického nervu (pozri obr. 12). NEP inhibítor zdvíha pik zvýšenia prekrvenia klitorisu až o 131 % v porovnaní s hodnotami zvýšenia pri použití vehikulá ako kontroly.
Tieto údaje preukazujú, že VIP je schopný zvýšiť prekrvenie/vazorelaxáciu klitorisu a že tento účinok môže byť napodobený aktiváciou cAMP/adenylát cyklázovej dráhy. Zistenie, že inhibítor NEP EC 3.4.24.11 (zodpovedný za metabolizmus VIP) posilňuje zvýšenie prekrvenia klitorisu pri stimulácii pelvického nervu, dokazuje, že VIP je neurotransmiter, ktorý je uvolňovaný počas stimulácie pelvického nérvu/sexuálneho vzrušenia.
4.6. Prekrvenie genitálií je posilnené farmaceutickými činidlami, ktoré priamo alebo nepriamo zvyšujú hladinu cAMP
FSAD je spojené so zníženým prekrvením genitálií, ktoré túto poruchu môže vyvolávať. Potenciálne prístupy k liečení tejto poruchy boli zamerané na posilnenie prekrvenia genitálií. Keď je preukázané, že cAMP je mediátor genitálnej vazorelaxácie a že zvýšené hladiny cAMP sú výsledkom neuronálne uvolneného VIP, predpokladá sa, že pokial je posilnená cAMP signalizácia, dôjde následkom toho k zvýšeniu prekrvenia genitálií, a teda k obnoveniu normálnych hladín prekrvenia a liečeniu FSAD.
Vo vysoko prednostnom aspekte sme za účelom priameho alebo nepriameho posilnenia vazorelaxácie sprostredkovanej cAMP zvolili tri ciele: inhibítory pdec;ymp, napríklad ·· ·· • · ·
- 166 • · ···· ·· ···· • · · -φ · Φ·Ο · · · • · · ···· · • · · · » ·
4· ··· ·· ···· inhibítory PDEcAMp typu 2, inhibítory NEP (EC 3.4.24.11) a antagonisty receptoru neuropeptidu Y Yl (NPY Yl).
4.6.1. Inhibítory neutrálnej endopeptidázy (NEP EC 3.4.24.11)
NEP EC 3.4.24.11 metabolizuje VIP, a teda zakončuje biologickú aktivitu sprostredkovanú VIP. Inhibítory NEP budú potencovať endogénny vazorelaxačný účinok VIP uvolneného počas vzrušenia. To sa klinicky prejaví v posilnení prekrvenia genitálií.
V predchádzajúcej literatúre nie sú žiadne správy o lokalizácii alebo funkčnej úlohe NEP EC 3.4.24.11 v tkanive vagíny alebo jej úlohe pri sexuálnom vzrušení.
Selektívne inhibítory NEP EC 3.4.24.11 v klinicky relevantných dávkach významne posilňujú zvýšenie vaginálneho prekrvenia pri stimulácii pelvického nervu (pozri obr. 6).
NEP inhibítor zdvíha pik zvýšenia vaginálneho prekrvenia až o 53 % v porovnaní s časovo zladenými kontrolnými zvýšeniami. Toto zvýšenie submaximáIných stimulačných frekvencií (napr. 4 Hz), bolo závislé od dávky, napríklad dávka 0,1 mg/kg iv. indukovala 35,0±7,6% zvýšenie; dávka 0,3 mg/kg iv. indukuvala 42,6±27,7% zvýšenie a dávka 1,0 mg/kg iv. indukovala 52,8±32,5% zvýšenie. Inhibítory NEP nemali žiadny účinok na bazálne (nestimulované) prekrvenie vagíny. Činidlá podía vynálezu teda zvyšujú vzrušenie potenciáciou cAMP signalizácie, a neindukujú vzrušenie bez prítomnosti sexuálnej túhy, tzn. priamym zvýšením cAMP signalizácie.
Selektívne inhibítory NEP EC 3.4.24.11 v klinicky relevantných dávkach významne posilňujú zvýšenie prekrvenia klitorisu pri stimulácii pelvického nervu (pozri obr. 12). NEP inhibítor zdvíha pik zvýšenia klitoriálneho prekrvenia až o 131 % v porovnaní s kontrolnými zvýšeniami pri použití • ······ ·· ·· • ··· ···· • · · ···· · · · ···· ··· ···· · • · · · · · · • · ····· ······
- 167 vehikula. Inhibítory NEP nemali žiadny účinok na bazálne (nestimulované) prekrvenie vagíny. To predstavuje ďalšiu podporu pre náš predpoklad, že činidlá podlá vynálezu zvyšujú vzrušenie potenciáciou cAMP signalizácie, a neindukujú vzrušenie bez prítomnosti sexuálnej túhy, tzn. priamym zvýšením cAMP signalizácie.
Selektívne inhibítory NEP EC 3.4.24.11 v klinicky relevantných dávkach posilňovali zvýšenie vaginálneho prekrvenia indukovaného VIP v porovnaní s časovo zladenou kontrolou. Pri submaximálnych dávkach VIP (napríklad 6,0 μg/kg) došlo k významnej potenciácii piku zvýšenia (95±6%) a tiež predĺženiu času zvýšenia (asi 140 % - zo 7 minút na viac ako 17 minút, pozri obr. 7). Inhibítory NEP významne predlžujú čas pretrvania zvýšenia vaginálneho prekrvenia indukovaného VIP, pokial sú podávané v kombinácii s dávkou VIP, ktorá vyvoláva maximálne zvýšenie prekrvenia (asi 80% predĺženie času - 11 až 20 minút).
Inhibítory NEP v klinicky relevantných dávkach významne zvyšovali relaxáciu indukovanú VIP a nervovo sprostredkovanú relaxáciu v izolovanom tkanive. Hodnota EC^q VIP je v prítomnosti selektívneho inhibítoru NEP (ΙμΜ) významne znížená - z 18,8+0,6nM na 2,9±0,3nM. Účinok inhibítoru NEP je závislý od koncentrácie.
NEP EC 3.4.24.11 mRNA informácia a proteín je exprimovaný a bol identifikovaný v ludskej a králičej vagíne Northern a Western analýzou.
4.6.2. Inhibítory fosfodiesterázy (PDE) cAMP je degradovaný fosfodiesterázami hydrolyzujúcimi cAMP, tj. PDEcAMp. Inhibítory PDEcAMp teda budú potencovat endogénny vazorelaxačný účinok cAMP uvolnenej počas ·· ···· • · • ··· • · · · • · · • · · • · · · · · · vzrušenia. To by sa klinicky malo prejaviť ako zvýšenie vaginálneho prekrvenia.
V literatúre nie sú žiadne informácie o lokalizácii PDEcAMP alel>o ° funkčnej úlohe týchto izozymov vo vaginálnom tkanive alebo pri sexuálnom vzrušení. Analýzou PDE ľudskej a králičej vagíny, sme preukázali, že v nich sú prítomné izozymy PDEcAMp 1, 2, 3, 4, 7a8. Inhibítory týchto P°EcAMp predstavujú potenciálne činidlá zvyšujúce vaginálne prekrvení a/alebo relaxujúci hladký sval vagíny.
Selektívny inhibítor PDEcAMp typu 2 v klinicky relevantných dávkach významne posilňoval zvýšenie vaginálneho prekrvenia pri stimulácii pelvického nervu (pozri obr.
9). Inhibítor PDEcAMp (500 μg/kg) zdvíhal pik zvýšenia vaginálneho prekrvenia o 86,8+21,9 % v porovnaní so zvýšeniami pozorovanými počas časovo zladenej kontroly (pri 4 Hz).
Selektívny inhibítor PDEcAMp typu 2 významne predlžoval pretrvanie zvýšení indukovaných VIP (60 μg/kg) na piku vaginálneho prekrvenia o viac ako 100 % (merané pri 50% amplitúde, pozri obr. 9). Selektívny inhibítor Ρ°ΕσΑΜρ typu 2 významne zdvíhal pik zvýšenia prekrvenia indukovaného stimuláciou VIP (asi 15±3 %, 200 μg/kg).
Významne predlžoval pretrvanie zvýšenia indukovaného VIP na piku vaginálneho prekrvenia o viac ako 100 % (merané pri 50% amplitúde, pozri obr. 8). Selektívny inhibítor ΡΟΕθ^ρ typu 2 významne zdvíhal pik zvýšenia prekrvenia indukovaného stimuláciou pelvického nervu (asi 15±3 %, 200 μg/kg, pri 4 Hz).
Inhibítory PDEcAMp zvyšujú relaxáciu prekontrahovaného izolovaného hladkého svalu vagíny indukovanú VIP (ΙμΜ fenylefrin, pozri tabulku 1). Všetky selektívne inhibítory PDEcAMP typu -1-' 2/ 3 a 4 význame potencujú relaxáciu sproI ·· ······ ·· ·· ··· · · ···· ··· · ···· · · · • ···· ··· · * t · · • · ·· ···· ··· · ·· ··· ·· ····
- 169 stredkovanú VIP. (210 % pri 76nM, 130 % pri 8nM, 220 % pri 3,4μΜ a 160 % pri 686nM potenciácii VIP EC50). Tieto inhibítory sa podávajú v dávkach, o ktorých je známe, že sú selektívne voči konkrétnej pdecampz ktorá je predmetom záujmu. Selektívny inhibítor PDEcAMP typu 5 alebo kontrolné vehikulum nemali žiadny zretelný účinok na relaxáciu sprostredkovanú VIP.
4.6.3. Antagonisty receptoru NPY Yl
NPY vykazuje inhibičný vplyv na vazorelaxáciu sprostredkovanú VIP, a antagonisty receptoru NPY Yl budú podporovať vazorelaxačný účinok endogénneho VIP uvolňovaného počas vzrušenia. To sa klinicky prejaví ako zvýšenie vaginálneho prekrvenia.
Literatúra neobsahuje žiadne informácie o lokalizácii receptorov NPY alebo ich funkčnej úlohe v tkanive vagíny alebo pri sexuálnom vzrušení.
Northern a Western analýzou pri expresných štúdiách receptoru NPY bolo zistené, že v ludskej a králičej vagíne sú prítomné receptory NPY podtypov Yj Y2 a Y5.
Selektívne inhibítory NPY Yl v klinicky relevantných dávkach posilňujú zvýšenie vaginálneho prekrvenia pri stimulácii pelvického nervu (pozri obr. 10). Antagonisty NPY Yl zdvíhajú pik zvýšenia vaginálneho prekrvenia až o 92 % v porovnaní s časovo zladenou kontrolou. Toto zvýšenie submaximálnej stimulačnej frekvencie (napríklad 4 Hz) bolo závislé od dávky; napríklad dávka 0,01 mg/kg iv. indukovala 15,8+19,6% zvýšenie, 0,03 mg/kg iv. indukovala 35,1±17,17% zvýšenie, 0,10 mg/kg iv. indukovala 60,l±16,9% zvýšenie a 0,3 mg/kg iv. indukovala 91,9±27,4% zvýšenie (stredná hodnota ± SEM, n = 3). Antagonisty NPY Yl nevykázali žiadny
9999
- 170 ··
9·· ····
9 9 9 999 9 9 9
999999 9 ··· · ·
9 · · · · «
9 99 ··· ······ účinok na bazálne (nestimulované) vaginálne prekrvenie. To posilňuje náš názor, že budú zvyšovať vzrušenie potenciáciou cAMP signalizácie, a nie indukovať vzrušenie pri absencii sexuálnej túhy, tzn. priamym zvýšením cAMP signalizácie.
4.7 Účinky činidiel, ktoré zvyšujú cAMP alebo zvyšujú vaginálne prekrvenie, na stredný arteriálny tlak krvi pri anestetizovanom králiku
Pri híadaní perorálnej terapie FSAD je potrebné mat na mysli, aby taká terapia nebola spojená s nežiadúcimi kardiovaskulárnymi účinkami, napríklad účinkami na krvný tlak alebo srdcovú frekvenciu. Pri našich skúškach sme zistili, že infúzia VIP významne znižuje stredný arteriálny tlak krvi (pozri obr. 3) a významne zvyšuje srdcovú frekvenciu. Vo vysoko prednostnom rozpracovaní teda činidlom nie je VIP. Stimulácia pelvického nervu a inhibítory pDEcAMp a NEP však nevykázali žiadne účinky na krvný tlak. Vazoaktívny intestinálny peptid v dávke 6,0 μg/kg (iv.) vyvoláva významné zníženie stredného arteriálneho tlaku o 1760193 Pa (13,2±0,7 mm ortuťového stĺpca) a významné zníženie srdcovej frekvencie o 1614 tepy za minútu. VIP (iv.) pri vysokých dávkach, ako 60,0 μg/kg vyvoláva významné zníženie stredného arteriálneho tlaku o 19601183 Pa, čo je spojené s významným zvýšením srdcovej frekvencie o 111130 tepov za minútu, ktoré následne vedie k zvýšeniu stredného arteriálneho tlaku o 11331187 Pa.
Skúšané zlúčeniny
Rad zlúčenín uvedených hore bol skúšaný podía vynálezu, a ukázalo sa, že sú účinné podía tohto vynálezu, tzn. že môžu pôsobiť ako pcAMp za účelom liečenia FSD, predovšetkým FSAD.
·· ······ ·· ·· ··· ··· ···· ··· ····· ·· · ······· · ··· · · • · ·· ···· ··· · ·· ··· ·· ····
- 171 Ako tieto zlúčeniny je možné uviesť:
Zlúčeninu vzorca la (Fla) - viď 5-[4-(dietylamino)benzyl]-l-metyl-3-propyl-6,7-dihydro-lH-pyrazolo[ 4,3-d]pyrimidin-7-on. Zlúčeninu Fla je možné pripraviť podlá EP-A-0 911 333 (podlá príkladu 50).
Zlúčeninu vzorca II (FII) - viď 9-(l-acetyl-4-fenylbutyl)-2-[(3,4-dimetoxyfenyl)metyl]-1,9-dihydro-6H-purin-6-on. Zlúčeninu FII je možné pripraviť podlá EP-A-0 771 799 (podlá príkladu 100).
Zlúčeninu vzorca III (FIII) - viď milrinon. Zlúčenina FIII je produkt dostupný na trhu.
Zlúčeninu vzorca IV (FIV) - viď rolipram. Zlúčenina FIV je produkt dostupný na trhu.
Zlúčeninu vzorca V (FV) - viď 1-etylester 3-[[[l-(2-karboxy-4-pentenyl) cyklopentyl ] karbonyl ] amino ] cyklohexankarboxylovej kyseliny. Zlúčeninu FV je možné pripraviť podlá EP-A-0 274 234 (príkladu 300).
Zlúčeninu vzorca VI (FVI) - viď 3-[[[l-(2-karboxy-4-pentenyl)cyklopentenyl]karbonyl]amino]cyklohexánkarboxylová kyselina. Zlúčeninu vzorca FVI je možné pripraviť podlá EP-A-0 274 234 (príkladu 379).
Konkrétne sú zlúčeniny Fla, FII, FIII a FIV inhibítormi PDEcAMp. Zlúčenina Fla je I:PDEI, FII je I:PDEII, FIII je I:PDEIII a FIV je I:PDEIV.
Údaje o týchto zlúčeninách sú uvedené hore napríklad v tabulke I.
·· ·· • ··· ···· • · · · ··· · · · ······ · ··· · · • · · · · · · • · ····· ······ ·· ····
- 172
Je zrejmé, že tieto inhibítory PDEcAMp zvyšujú relaxáciu izolovaného tkaniva indukovanou VIP.
Zlúčenina FII, ktorá je selektívny I:PDEII, v klinicky relevantných dávkach posilňuje zvýšenie vaginálneho prekrvenia indukované VIP.
Zlúčenina FII v klinicky relevantných dávkach tiež posilňuje zvýšenie vaginálneho prekrvenia indukované stimuláciou pelvického nervu.
Zlúčeniny FV a FVI sú selektívne inhibítory NEP EC 3.4.24.11.
Informácie uvedené hore sa týkajú zlúčeniny FVI. Podobné výsledky sa však dosiahli aj pre zlúčeninu FV.
Ako je zrejmé, zlúčeniny FV a FVI v klinicky relevantných dávkach posilňujú zvýšenie vaginálneho prekrvenia indukované VIP.
Zlúčeniny FV a FVI v klinicky relevantných dávkach posilňujú zvýšenie vaginálneho prekrvenia indukované stimuláciou pelvického nervu.
Zlúčeniny FV a VI v klinicky relevantných dávkach tiež posilňujú relaxáciu izolovaného tkaniva, ktorá je indukovaná VIP a nervovo sprostredkovaná.
Ako ďalšie skúšané zlúčeniny, ktoré sa ukázali ako účinné, je možné uviesť:
2-[(1-{[(l-benzyl-6-oxo-l,6-dihydro-3-pyridyl)amino]karbonyl jcyklopen tyl) metyl ]-4-metoxybutánovú kyselinu (F57);
• ·· ·
173 ·· ···· • · • ··· • · • · ·· ·· • · · · • · · • · · · • · · ·· ··· ·
2-{[1-({[3-(2-oxo-l-pyrolidinyl)propyl]amino}karbonylcyklopentyl]metyl}-4-fenylbutánovú kyselinu (F58);
(+)-2-{[1-({[2-(hydroxymetyl)-2,3-dihydro-lH-inden-2-yl]amino}karbony1)cyklopenty1]mety1}-4-fenylbutánovú kyselinu (F59);
2-[(1-{[(5-metyl-l,3,4-tiadiazol-2-yl)amino]karbonyl}cyklopentyl)metyl]-4-fenylbutánovú kyselinu (F60);
cis-3-(2-metoxyetoxy)-2-[(l-{[(4-{[(fenylsulfonyl)amino]karbonyl}cyklohexyl)amino]karbony1}cyklopentyl)metyl]propánovú kyselinu (F61);
(+)-2-{[l-({[2-(hydroxymetyl)-2,3-dihydro-lH-inden-2-yl]amino}karbonyl)cyklopentyl]metyl}pentánovú kyselinu (F62);
(+)-2-[(1-{[5-etyl-l,3,4-tiadiazol-2-yl)amino]karbonyl}cyklopentyl)metyl]pentánovú kyselinu (F63);
2-({1-[(3-benzylanilino)karbonyl]cyklopentyl}metyl)pentánovú kyselinu (F64);
2-[(l-{[(l-benzyl-6-oxo-l,6-dihydro-3-pyridy1)amino]karbonyl} cyklopentyl ) metyl ]pentánovú kyselinu (F65); a
2-{[l-({[(ÍR,3S,4R)-4-(aminokarbonyl)-3-butylcyklohexyl]amino}karbonyl)cyklopentyl]metyl}pentánovú kyselinu (F66).
Všetky zlúčeniny F57 až F66 sú I:NEP.
Syntéza zlúčenín F57 až F66 • · ·· ···· ·· ·· ·· · ··· ···· • · · · · 999 9 9 9
9999 9 9 9 9999 9 • · ·· ···· ··· · ·· ··· ·· ····
- 174 V preparatívnych postupoch je opísaná syntéza medziproduktov, zatial čo v príkladoch je opísaná syntéza jednotlivých zlúčenín podlá vynálezu.
Príklad 1
2-[(l-{[(l-Benzyl-6-oxo-l,6-dihydro-3-pyridyl)amino]karbonyl}cyklopentyl)metyl]-4-metylbutánová kyselina (F57)
Zmes benzylesteru z preparatívneho postupu 1 (1/62) (850 mg, 1,64 mmol) a 5% paládia na uhlíku (250 mg) v 40% vodnom etanole (21 ml) sa 30 minút hydrogenuje pri teplote miestnosti a tlaku 206,1 kPa. Reakčná zmes sa prefiltruje cez Hyflo(R) a filtrát sa odparí pri zníženom tlaku. Penovitý zvyšok sa prečistí stĺpcovou chromatografiou na silikagéli pri použití zmesi dichlórmetánu a metanolu v pomere 97 : 3 ako elučného činidla. Získa sa zlúčenina uvedená v nadpise vo forme bielej peny (550 mg, 79 %). LH NMR (DMSO-dg, 300 MHz): S 1,24 - 2,17 (m, 12H), 2,18 - 2,31 (m, IH), 3,07 (s, 3H), 3,21 (t, 2H), 5,08 (s, 2H), 6,63 (d, IH), 7,23 7,41 (m, 5H), 7,72 (d, IH), 8,24 (s, IH). Analýza pre c24H30N2°5: nájdené: C 67,46, H 7,18, N 6,24, vyrátané:
C 67,58, H 7,09, N 6,57 %.
Príklad 2
2-{[1-({[3-(2-Oxo-l-pyrrolidinyl)propyl]amino jkarbonylcyklopentyl]metyl}-4-fenylbutánová kyselina (F58) • · ·· ···· ·· ··· ··· ···· φφφ φ φ φφφ · · · • φφφφ · φ · φφφφ · φ φ φφ φφφφ • ΦΦ φ ·· φφφ φφ φφφφ
Zmes benzylesteru z preparatívneho postupu 3 (3/67) (780 mg, 1,55 mmol) a 10% paládia na uhlíku (100 mg) v zmesi etanolu a vody v objemovom pomere 90 : 10 sa 1,5 hodiny hydrogenuje pri teplote miestnosti za tlaku vodíka 412,2 kPa. Katalyzátor sa odfiltruje a filtrát sa odparí pri zníženom tlaku. Získa sa zlúčenina uvedená v nadpisu vo forme bielej peny (473 mg, 74 %). 1H NMR (CDC13, 300 MHz): S 1,26 - 1,77 (m, lOh), 1,78 - 2,46 (m, 11H), 2,49 - 2,70 (m, 2H), 2,95 - 3,36 (m, 4H), 6,92 - 7,38 (m, 5H). Analýza pre C24H34N2°4· 0,75H2O: nájdené: C 64,05, H 7,73, N 6,22, vyrátané: C 65,88, H 7,83, N 6,40 %.
Príklad 3 (+)-2-{[1-({[2-(Hydroxymetyl)-2,3-dihydro-lH-inden-2-yl]amino}karbonylJcyklopentyl]metyl}-4-fenylbutánová kyselina (F59);
2-{C1— ({[2-(Hydroxymetyl)-2,3-dihydro-lH-inden-2-yl]aminojkarbonyl)cyklopentyl]metyl}-4-fenylbutánovú kyselinu (WO91/10644) je možné prečistiť štandardnou vysokotlakovou ·· ····
- 176 ·· ·· ·· · · · · ···· • · · · · 999 · · · ······· · · · 9 · · • · · · · · · 9
999 9 99 999 99 9999 kvapalinovou chromatografiou na stĺpci AD pri použití zmesi hexánu, izopropylalkoholu a trifluóroctovej kyseliny v pomere 70 : 30 : 0,2 ako elučného činidla. Získa sa zlúčenina uvedená v nadpise (99,5% enantiomérny nadbytok). [a]D = +9,1° (c = 1,76 v etanole).
Príklad 4
2- [ (1-{((5-Metyl-l,3,4-tiadiazol-2-yl)amino jkarbonyl}cyklopentyl)metyl]-4-fenylbutánová kyselina (F60)
Zmes benzylesteru z preparatívneho postupu 4 (4/70) (187 mg, 0,39 mmol) a 10% paládia na uhlíku (80 mg) v etanole (20 ml) sa 18 hodín hydrogenuje za tlaku 412,2 kPa. Chromatografia na tenkej vrstve ukáže, že v reakčnej zmesi sa ešte nachádza východisková látka, takže sa k nej pridá ďalšia dávka 10% paládia na uhlíku (100 mg) a v reakcii sa pokračuje ďalších 5 hodín. Chromatografia na tenkej vrstve ukáže, že reakčná zmes stále obsahuje východiskovú látku, takže sa k nej pridá ďalší katalyzátor (100 mg) a v hydrogenácii sa pokračuje 18 hodín. Reakčná zmes sa prefiltruje cez Arbocel^) a filtrát sa skoncentruje pri zníženom tlaku. Zvyšok sa azeotropicky odparí s dichlórmetánom. Surový produkt sa prečistí chromatografiou na stĺpci silikagélu Biotage^p^ pri použití zmesi dichlórmetánu a metanolu v pomere 95 : 5 ako elučného činidla. Získa sa zlúčenina uvedená v nadpise vo forme číreho oleja (80 mg, 53 %). 1H NMR (CDC13, 300 MHz): S 1,51 • · ···· ·· ···· ·· ·· • · · · · · · • · ··· · · · ··· ···· · • · · · · · ·· ··· ·· ····
- 177 - 1,89 (m, 9H), 2,03 (m, 1H), 2,20 (m, 1H), 2,40 (m, 2H) , 2,60 (m, 5H), 7,15 - 7,30 (m, 5H). LRMS: m/z 387,8 (MH+)
Príklad 5 cis-3-(2-Metoxyetoxy)-2-[(1— {[(4—{[(fenylsulfonyl)amino]karbony1}cyklohexyl)amino]karbonyl}cyklopenty1)metyl]propánová kyselina (F61)
Roztok terc-butylesteru z preparatívneho postupu 8 (8/66) (446 mg, 0,75 mmol) v dichlórmetáne (5 ml) a trifluóroctovej kyseline (5 ml) sa 18 hodín mieša pri teplote miestnosti a potom skoncentruje pri zníženom tlaku. Zvyšok sa azeotropicky odparí s dichlórmetánom, potom s toluénom a nakoniec s éterom. Získa sa zlúčenina uvedená v nadpise vo forme peny (385 mg, 95 %). ^H NMR (CDClg, 400 MHz): δ 1,48 - 2,17 (m, 18H), 2,40 (s, 1H), 2,66 (s, 1H), 3,37 (s, 3H), 3,50 - 3,70 (m, 6H), 3,94 (s, 1H), 6,10 (d, 1H), 6,59 (S, 1H), 7,55 (t, 2Hj, 7,61 (m, 1H), 8,02 (d, 2H), 9,11 (s, 1H). Analýza pre C26H38N2°8S,1,7H2O: nájdené: C 54,88, H 6,90, N 5,04, nájdené: C 57,97, H 7,11, N 5,20 %.
Príklad 6 (+)-2-{[l-({[2-(Hydroxymetyl)-2,3-dihydro-lH-inden-2-yl]amino}karbonyl)cyklopenty1]metyl}pentánová kyselina (F62) ·· ···· • · • · · ·
- 178
2-([1-({[2-(Hydroxymetyl)-2,3-dihydro-lH-inden-2-yl]aminojkarbonyl)cyklopentyl]metyljpentánová kyselina (WO 91/ 10644) sa ďalej prečistí vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou na stĺpci AD pri použití zmesi hexánu, izopropylalkoholu a trifluóroctovej kyseliny v pomere 90 : 10 : 0,1 ako elučného činidla. Získa sa zlúčenina uvedená v nadpise (99% enantiomérny nadbytok). [a]D = +10,4° (c = 0,067, etanol).
P r í k 1 a d 7 (+)-2-[(1—{[5-Etyl-l,3,4-tiadiazol-2-yl)amino]karbonyl}cyklopentyl)metyl Jpentánová kyselina (F63)
Kyselina z preparatívneho postupu 18 (l8/ex4) (824 mg) sa ďalej prečistí vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou na stĺpci AD pri použití zmesi hexánu, izopropylalkoholu a trifluóroctovej kyseliny v pomere 85 : 15 : 0,2 ako elučného činidla. Získa sa zlúčenina uvedená v nadpise vo forme bielej peny (386 mg, 99% enantiomérny nadbytok).
1H NMR (CDC13, 400 MHz): δ 0,90 (t, 3H), 1,38 (m, 6H), 1,50 ·· 9 ·
····
9999
9 9 999
99 • · · · • 9 9
9 · · · · · · · · · · ·· ··· ·· ···
- 179
- 1,79 (m, 9H), 2,19 (m, 1H), 2,30 (m, 1H), 2,44 (m, 1H), 2,60 (m, 1H) , 2,98 (q, 2H) , 12,10 - 12,27 (bs, 1H). LRMS: m/z 338 (MH~). [a]D =+3,8° (c =0,1, etanol).
Príklad 8
2-({1— C(3-Benzylanilino)karbonyl]cyklopentyl}metyl)pentánová kyselina (F64)
Zmes benzylesteru z preparatívneho postupu 10 (10/53) (1,3 mg, 2,47 mmol) a 5% paládia na uhlíku (130 mg) vo vode (10 ml) a etanole (40 ml) sa 2 hodiny hydrogenuje pri teplote miestnosti za tlaku 206,1 kPa. Reakčná zmes sa prefiltruje cez Arbocel^R\ filtrát sa skoncentruje pri zníženom tlaku a zvyšok sa trituruje s dichlórmetánom. Živicový zvyšok sa trituruje s éterom a potom hexánom a vysuší pri 50°C. Získa sa zlúčenina uvedená v nadpise vo forme pevnej látky (0,79 g, 81 %). 1H NMR (CDC13, 300 MHz): δ 0,95 (t, 3H), 1,24 - 1,51 (m, 3H), 1,58 - 1,80 (m, 7H), 1,88 (ded, 1H), 2,15 (m, 2H), 2,24 (m, 1H), 2,48 (m, 1H), 4,00 (s, 2H), 6,98 (d, 1H), 7,24 (m, 6H), 7,40 (m, 3H). Analýza pre C25H31NO3.0,25^0: nájdené: C 75,48, H 7,76,
N 3,59, vyrátané: C 75,44, H 7,98, N 3,51 %.
Príklad 9
2-[(l-{[(l-Benzyl-6-oxo-l,6-dihydro-3-pyridyl)amino]karbonyl}cyklopentyl)metyl]pentánová kyselina (F65) ·· ···· ·· ·· « e · · · · · • · ··· · · · ··· · · · · · • · · · · · · • · ····
Z benzylesteru z preparatívneho postupu 13 (13/56) sa podobným spôsobom, aký je opísaný v preparatívnom postupe 19 (19/ex21), pri ktorom sa však prečistenie vykoná chromatografiou na stĺpci silikagélu pri použití etylacetátu ako elučného činidla, získa zlúčenina uvedená v nadpise vo forme bielej peny (výťažok 51 %). NMR (CDC13, 300 MHz): δ 0,96 (t, 3H), 1,28 - 1,80 (m, 12H), 2,01 (m, 1H), 2,30 - 2,52 (m, 2H), 5,02 (dd, 2H), 6,60 (d, 1H), 7,27 (m, 5H), 7,70 (s,
1H), 8,34 (s, 1H). Analýza pre C24H30N2°4* 0'25H2O: nájdené:
C 69,52, H 7,41, N 6,51, vyrátané: C 69,45, H 7,41, N 6,75.
Príklad 10
2-{[1—({[(lR,3S,4R)-4-(aminokarbonyl)-3-butylcyklohexyl]amino}karbonyl)cyklopentyl]metyl}pentánová kyselina (F66)
Zlúčeniny všeobecného vzorca lc, tzn. zlúčeniny *1 všeobecného vzorca I, kde R predstavuje propylskupinu
(CH2)nY (lc) • 9 999· ·· ·· · ··· ···· • · · · · 999 · · β • ···· · · · ···· · * · 9999 ··· · ·· ··· 99 9999
- 181 9» sa pripravia zo zodpovedajúceho terc-butylesteru pri použití podobného spôsobu, aký je opísaný v preparatívnoin postupe 14 (14/exl).
Preparatívny postup 1 (1/62)
Benzyl-2-[(1-{[(l-Benzyl-6-oxo-l,6-dihydro-3-pyridyl)amino ] karbony1}cyklopentyl)metyl]-4-metoxybutanoát
Oxalylchlorid (0,26 ml, 3,0 mmol) sa pridá k íadom chladenému roztoku 1-{2-[(benzyloxy)karbonyl]-4-metoxybutyl}cyklopentánkarboxylovej kyseliny (EP 274 234) (1,0 g, 3,0 mmol) a N,N-dimetylformamidu (2 kapky) v dichlórmetáne (20 ml). Reakčná zmes sa 2 hodiny mieša pri teplote miestnosti. Vzniknutý roztok sa skoncentruje pri zníženom tlaku a zvyšok sa azeotropicky odparí s dichlórmetánom (3 x 10 ml). Zvyšok sa rozpustí v dichlórmetáne (20 ml), dichlórmetánový roztok sa ochladí v íadovom kúpeli a pridá sa k nemu amín z preparatívneho postupu 2 (2/28) (600 mg, 3 mmol) a N-metylmorfolín (0,6 ml, 5,45 mmol). Reakčná zmes sa 18 hodín mieša pri teplote miestnosti a potom skoncentruje pri zníženom tlaku. Zvyšok sa rozdelí medzi vodu a éter. Organická vrstva sa premyje kyselinou chlorovodíkovou (2M), roztokom hydrogenuhličitanu sodného a potom vodou, vysuší síranom horečnatým a odparí pri zníženom tlaku. Zelený pevný zvyšok sa prečistí stredotlakovou chromatografiou na stĺpci silikagélu pri použití zmesi etylacetátu a hexánu v pomere 90 : 10 ako elučného činidla. Získa sa zlúčenina uvedená v nadpise (880 mg,
%). 1H NMR (CDC13, 300 MHz): δ 1,37 - 2,28 (m, 12H) ,
- 182 ···· · · • · ·· • · · · · · • · · · · ·· ··· ·· ····
2,46 - 2,64 (m, 1H), 3,20 (s, 3H), 3,31 (m, 2H) , 4,97 (dd, 2H), 5,08 (dd, 2H), 6,57 (d, 1H), 7,12 (m, 1H), 7,18 - 7,48 (m, 10H), 8,08 (d, 1H).
Preparatívny postup 2 (2/28)
5-Amino-l-benzyl-2(1H)-pyridinón
H2N
Zmes l-benzyl-5-nitro-lH-pyridin-2-onu (Justus Liebigs Ann. Chem. 484, 1930, 52) (1,0 g, 4,35 mmol) a granulovaný cín (3,5 g, 29,5 mmol) v koncentrovanej kyseline chlorovodíkovej (14 ml) sa 1,5 hodiny zahrieva na 90°C. Výsledný roztok sa zriedi vodou a vodná zmes sa neutralizuje pri použití roztoku uhličitanu sodného a extrahuje etylacetátom (250 ml celkom). Spojené organické extrakty sa prefiltrujú, vysušia síranom horečnatým a odparia pri zníženom tlaku. Získa sa zlúčenina uvedená v nadpise vo forme svetlej zelenej pevnej látky (ktorá s časom zmodrá) (440 mg, 51 %). ΤΗ NMR (CDC13, 250 MHz): δ 4,12 - 4,47 (bs, 2H), 5,00 (s, 2H), 6,31 (d, 1H), 6,86 (s, 1H), 7,07 (m, 1H), 7,14 - 7,42 (m, 5H)
Preparatívny postup 3 (3/67)
Benzyl-2-{[l-({[3-(2-oxo-l-pyrrolidinyl)propyl]amino)karbonylcyklopentyl]metyl}-4-fenylbutanoát
• « ···· ···· • · • ···
183
Hydrochlorid 1-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimidu (1,06 g, 5,53 mmol), hydrát 1-hydroxybenzotriazolu (0,60 g, 4,44 mmol) a 4-metylmorfolín (0,56 g, 5,53 mmol) sa pri teplote miestnosti postupne pridajú k chladenému roztoku l-{2-[ (benzyloxy)karbonyl]-4-fenylbutyl}cyklopentankarboxylovej kyseliny (EP 274 234) (1,5 g, 3,94 mmol) v suchom dichlórmetáne (15 ml). K vzniknutej zmesi sa pridá N-(3-aminopropyl)-2-pyrolidinón (0,56 g, 3,94 mmol). Reakčná zmes sa 18 hodín mieša pri teplote miestnosti, potom premyje vodou, 2M kyselinou chlorovodíkovou a nasýteným vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného, vysuší síranom horečnatým a odparí pri zníženom tlaku. Žltý olejovitý zvyšok sa prečistí chromatografiou na stĺpci silikagélu pri použití zmesi etylacetátu a pentánu v pomere 50 : 50 ako elučného činidla. Získa sa zlúčenina uvedená v nadpise vo forme čírej živice (800 mg, 40 %). ^H NMR (CDClg, 300 MHz): δ 1,37 -2,20 (m, 16H), 2,34 - 2,58 (m, 5H), 2,92 - 3,46 (m, 6H), 5,07 (d,
1H), 5,18 (d, 1H), 6,98 - 7,47 (m, 10H).
Preparatívny postup 4 (4/70)
Benzyl-2-[(1—{C(5-metyl-l,3,4-tiadiazol-2-yl)amino]karbonyl}cyklopentyl)metyl]-4-fenylbutanoát
Z l-{2-[(benzyloxy)karbonyl]-4-fenylbutyl}cyklopentánkarboxylovej kyseliny (EP 274 234) a 2-amino-5-metyl-1,3,4-tiadiazolu sa podobným spôsobom, aký je opísaný v pŕeparatívnom postupe 5 (5/68), získa zlúčenina uvedená • · · ·· ···· • · · · · · • · • ··· ··
184 v nadpise vo forme číreho oleja (výtažok 74 %). NMR t - 1,98 (m 2,44 (m,
(CDC1 3, 40 0 MHz): δ 1,58 - 1,76 (m, 7H) , 1
3H), 2,03 (m, 1H) , 2,20 (m, 1H), 2,35 ( m, :
3H), 2,65 (s, 3H) , 5,02 (dd, 2H), 7,00 (d,
1H), 7,19 (m, 2H) , 7,35 (m, 5H). LRMS: m/z
Pre par a t í v n y post u p
(5/68)
Benzyl-2-{[1-({[3-(metylamino)-3-oxopropyl]amino}karbonyl)cyklopentyl]metyl}-4-fenylbutanoát
Hydrochlorid 1-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimidu (122 mg, 0,64 mmol), hydrát 1-hydroxybenzotriazolu (86 mg, 0,64 mmol) a 4-metylmorfolín (173 μΐ,
1,59 mmol) sa pri teplote miestnosti postupne pridajú k chladenému roztoku l-{2-[(benzyloxy)karbonyl]-4-fenylbutyl}cyklopentánkarboxylovej kyseliny (EP 274 234) (202 mg, 0,53 mmol) v N,N-dimetylformamide (5 ml). K vzniknutej zmesi sa pridá aminhydrochlorid z preparatívneho postupu 6 (6/23) (146 mg, 1,06 mmol). Reakčná zmes sa 18 hodín mieša pri 90“C. Vzniknutý roztok sa ochladí a skoncentruje pri zníženom tlaku. Zvyšok sa rozdelí medzi vodu (20 ml) a etylacetát (100 ml). Vrstvy sa oddelia a organická fáza sa premyje vodou (3 x 30 ml) a vodným roztokom chloridu sodného (25 ml), vysuší síranom horečnatým a odparí pri zníženom tlaku. Získa sa číry olej. Tento surový produkt sa prečistí chromatografiou na stĺpci silikagélu pri použití zmesi dichlórmetánu a metanolu v pomere 98 : 2 ako elučného činidla. Získa sa zlúčenina uvedená v nadpise vo forme bezfarbého • · • ···
- 185 ·· ····
oleja (16 2 mg, 67 %). XH NMR (CDC13, 400 MHz): δ 1,38
- 1,53 (m, 2H) , 1,53 - 1,96 (m, 8H), 2,02 (m, 2H), 2, 27
(t, 2H), 2,46 (m, ŠH), 2,76 (d, 3H), 3,44 (m, 2H), 5, 13
(s, 2H), 5,79 (bs, 1H), 6,38 (m, 1H) , 7,06 (d, 2H), 7 ,18
(m, 1H), 7,22 (m, 2H), 7,38 (m, 5H). LRMS: m/z 465,5 (MH+)
P r e p a ratívny pos tup 6 (6/23)
Hydrochlorid 3-amino-N-metylpropánamidu
O
Zmes benzylkarbamátu z preparátívneho postupu 7 (7/13) (7,92 g, 33,5 mmol) a 5% paládia na uhlíku (800 mg) v etanole (300 ml) sa 4 hodiny hydrogenuje pri teplote miestnosti za tlaku 343,5 kPa. Reakčná zmes sa prefiltruje cez Arbocel^1*) za premývania etanolom. K spojeným filtrátom sa pridá IM kyselina chlorovodíková (36,9 ml, 36,9 mmol). Výsledný roztok sa odparí pri zníženom tlaku a zvyšok sa azeotropicky odparí s dichlórmetánom. Získa sa zlúčenina uvedená v nadpise vo forme bezfarbej peny (4,66 g). 1H NMR (DMSO-dg, 300 MHz): δ 2,46 (t, 2H), 2,60 (s, 3H), 2,95 (m,
2H), 7,98 - 8,16 (m, 2H).
Preparatívny postup (7/13)
Benzyl-3-(metylamino)-3-oxopropylkarbamát
Zmes N-[(benzyloxy)karbonyl]-p-alanínu (10 g,
44,8 mmol), hydrochloridu metylamínu (3,33 g, 49,28 mmol),
- 186 ···· • ··«
hydrátu 1-hydroxybenzotriazolu (6,05 g, 44,8 mmol), hydrochloridu l-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimidu (10,3 g, 53,76 mmol) a N-metylmorfolínu (11,33 ml, 103 mmol) v dichlórmetáne (200 ml) sa 18 hodín mieša pri teplote miestnosti. Vylúčená zrazenina sa odfiltruje, čím sa získa požadovaný produkt vo forme bezfarbej peny. Filtrát sa odparí pri zníženom tlaku. Zvyšok sa prečistí chromatografiou na stĺpci silikagélu pri použití elučného gradientu etylacetát : hexán 90 : 10 až 100 : 0. Získa sa ďalší produkt (7,96 g, celkový výťažok 75 %). ΧΗ NMR (CDC13, 300 MHz): δ 2,42 (t, 2H), 2,80 (s, 3H), 3,50 (m, 2H), 5,21 (s, 2H), 5,49 (bs, 1H), 5,63 (bs, 1H),7,36 (m, 5H). Analýza pre ci2H16N2°3: nájdené: C 60,68, H 7,00, N 11,95, vyrátané: 61,00, H 6,83, N 11,86 %.
Preparatívny postup 8 (8/66) cis-terc-Butyl-3-(2-metoxyetoxy)-2-[(l-{[(fenylsulfonyl)amino]karbony1}cyklohexyl)amino]karbonylJcyklopentyl)-
N,N'-Dicyklohexylkarbodiimid (199 mg, 0,97 mmol), 4-dimetylaminopyridín (118 mg, 0,97 mmol) a benzénsulfónamid (152 mg, 0,97 mmol) sa pridajú k íadom chladenému roztoku kyseliny z preparatívného postupu 9 (9/63) (400 mg, 0,878 mmol) v dichlórmetáne (12 ml) a N,N-dimetylformamidu (0,5 ml). Reakčná zmes sa 20 hodín mieša pri teplote miestnosti a potom skoncentruje pri zníženom tlaku. Zvyšok sa • · ····
- 187 ··· ·· ···· • · · * · ··· • ♦ · ·· • ·Β ·· ·· • · t « • · β suspenduje v chladnom etylacetáte. Výsledná nerozpustná látka sa odfiltruje a filtrát sa premyje kyselinou chlorovodíkovou (IM) a vodou, vysuší síranom horečnatým a odparí pri zníženom tlaku. Surový produkt sa prečistí chromatografiou na stĺpci silikagélu pri použití elučného gradientu dichlórmetán : metanol 95 : 5 až 90 : 10. Získa sa zlúčenina uvedená v nadpise vo forme bielej peny (480 mg, 92 %). XH NMR (CDC13, 400 MHz): δ 1,44 (s, 9H), 1,63 (m, 13H), 1,80
(m, 2H) , 1,88 (m, 1H), 1,98 (m, 2H) , 2,36 (m, 1H), 2,57 (m,
1H) , 3, 38 (s, 3H) , 3,40 (m, 1H), 3, 51 (t, 2H), 3,58 (m.
3H) , 3, 95 (m, 1H) , 5,92 (d, 1H), 7, 56 (m, 2H), 7,62 (m,
1H) , 8, 05 (d, 2H) , 8,75 (bs , 1H). LRMS: m/z 618 (MNa+).
P r e p a r a t í v n Y PO stup 9 (9/63)
4-{[(l-{3-terc-Butoxy-2-[(2-metoxyetoxy)metyl]-3-oxopropy1}cyklopenty1)karbonyl]amino}cyklohexánkarboxylová
Zmes benzyl-4-{[ (1-{3-terc-butoxy-2-[(2-metoxyetoxy ) metyl ] - 3 -oxopropyl} cyklopentyl) karbonyl ] amino } cyklohexankarboxylátu (EP 274 234) a 10% paládia na uhlíku (250 mg) vo vode (10 ml) a etanole (50 ml) sa 18 hodín hydrogenuje pri teplote miestnosti za tlaku 343,5 kPa. Reakčná zmes sa prefiltruje cez Solkafloc^R^ a filtrát sa skoncentruje pri zníženom tlaku. Zvyšok sa azeotropicky odparí s toluénom (3x) a potom s dichlórmetánom (3x), čím sa získa titulná zlúčenina (2,0 g, 96 %). NMR (CDC13, 300 MHz): δ 1,48 (s, 9H), 1,53 - 1,84 (m, 14H), 1,94 - 2,10 (m, 5H), ···· ·· ···· • · • ···
188 ·· ·· • · · · • · · • · · • · · ·· ····
2,60 (m, 2H), 3,40 (s, 3H), 3,41 - 3,63 (m, 5H) , 3,96 (m, 1H), 5,90 (bd, 1H).
Preparatívny postup 10 (10/53)
Zlúčenina vzorca
CH3 kde
Prep. postup R Výťažok (%) Údaje
10 (10/53)* . 90 Ή NMR (CDC13, 300MHz) δ: 0,84 (t. 3H), 1,24 (m, 2H), 1,40-1,76 (m, 7H), 1,84 (dd, 1H), 1,98 (m, 1H), 2,19 (dd, 1H), 2,28 (m, 1H), 2,56 (m, 1H), 3,98 (s, 2H), 4,99 (dd, 2H), 6,,98 (d, 1H), 7,19-7,42 (m, 15H).
1Ako elučné činidlo sa použije dichlórmetán.
sa pripraví z chloridu kyseliny z preparátívneho postupu 11 (11/3) a zodpovedajúceho amínu podobným postupom, aký je opísaný v preparatívnom príklade 12 (12/52).
Preparatívny postup ll (11/3)
Benzyl-2-{[1-(chlórkarbonyl)cyklopentyl]metylJpentanoát
Q
Cl CH, • · ····
- 189 ·· ···· • · · • · ··· • · · • · · ·· ··· ·· ·· i · · · • · · • · · • · · ·· ····
Oxalylchlorid (1,15 ml, 13,2 mmol) sa pridá k íadom chladenému roztoku l-{2-[(benzyloxy)karbonyl]pentyl}cyklopropánkarboxylovej kyseliny (EP 274 234) (2,0 g, 6,3 mmol) v suchom dichlórmetáne (20 ml). Výsledný roztok sa 2 hodiny mieša pri teplote miestnosti. Reakčná zmes sa skoncentruje pri zníženom tlaku a zvyšok sa azeotropicky odparí s dichlórmetánom (3 x). Získa sa zlúčenina uvedená v nadpise vo forme zlatého oleja (2,1 g). 1H NMR (CDC13, 300 MHz): δ 0,88 (t, 3H), 1,28 (m, 2H), 1,43 (m, 2H), 1,63 (m, 6H), 2,00 (m, 1H), 2,08 - 2,35 (m, 3H), 2,44 (m, 1H), 5,15 (s, 2H), 7,28 (m, 5H)
Preparatívny postup 12 (12/52)
Benzyl-2-({l-[(3-pyridylamino)karbonyl]cyklopentyl}metyl)-
Trietylamín (0,11 ml, 0,78 mmol) sa pridá k zmesi chloridu kyseliny z preparátívneho postupu 11 (11/3) (200 mg, 0,60 mmol) a 2-aminopyridínu (61 mg, 0,65 mmol) v dichlórmetáne (3 ml). Reakčná zmes sa 16 hodín mieša pri teplote miestnosti a potom odparí pri zníženom tlaku. Zvyšok sa rozdelí medzi roztok hydrogenuhličitanu sodného (5 ml) a etylacetát (20 ml) a vrstvy sa oddelia. Organická fáza sa vysuší síranom horečnatým a odparí pri zníženom tlaku. Živicový surový produkt sa prečistí chromatografiou na stĺpci silikagélu pri použití etylacetátu ako elučného činidla. Získa sa zlúčenina uvedená v nadpise (130 mg).
^H NMR (CDC13, 400 MHz): δ 0,82 (t, 3H) , 1,21 (m, 3H) ,
1,40 (m, 1H), 1,43 - 1,72 (m, 6H), 1,81 (d, 1H), 1,98 (m, 1H), 2,18 (m, 1H), 2,24 (m, 1H), 2,46 (m, 1H), 4,98 (m, • ······ ·· ·· • · · · ···· • · · · ··· · · · ···· ··· ···· · • · · · · · ·
99 999 99 9999
190
2Η), 7,20 - 7,38 (m, 6H) , 7,42 (s, 1H), 8,06 (d, 1H),
8,35 (d, 1H), 8,56 (s, 1H)
Preparatívny postup 13 (13/56)
Zlúčenina vzorca
Prep. postup R Výťažok (%) Údaje
13 0 II 53 *H NMR (CDClj, 300MHz) δ: 0,84 (t, 3H), 1,25 (m,
(13/56)2 ΐψΓΟ _^-NH 2H), 1,27-1,99 (m, 10H), 2,07-2,30 (m, 2H), 2,47 (m, 1H), 4,99 (s, 2H), 5,10 (dd, 2H), 6,59 (d, 1H), 7,15 (d, 1H). 7,34 (m, 11H), 8,10 (s, 1H).
2Ako báza sa použije N-metylmorfolín.
sa pripraví z chloridu kyseliny z preparatívneho postupu 11 (11/3) a zodpovedajúceho amínu podobným postupom, aký je opísaný v preparatívnom príklade 12 (12/52).
Preparatívny postup 14 (14/ex 1)
2-({1—C(l,3-Benzodioxol-5-ylamino)karbonyl]cyklopentyl>metyl)pentánová kyselina
O ·· ······ ·· ·· ··· · · · ···· • · · · · ··· · · · ······· · · · · · · • · ·· ···· ··· · *· ·· ····
- 191 Trifluoroctová kyselina (5 ml) sa pridá k roztoku terc-butylesteru z preparatívneho postupu 15 (15/34) (130 mg, 0,31 mmol) v dichlórmetáne (5 ml). Výsledný roztok sa 4 hodiny mieša pri teplote miestnosti. Reakčná zmes sa skoncentruje pri zníženom tlaku a zvyšok sa azeotropicky odparí s toluénom a dichlórmetánom. Získa sa zlúčenina uvedená v nadpise vo forme číreho oleja (112 mg). XH NMR (CDC13, 400 MHz): S 0,83 (t, 3H), 1,22 - 1,40 (m, 3H), 1,50 - 1,72 (m, 8H), 1,95 (m, 1H), 2,10 (m, 2H), 2,19 (m, 1H), 4,30 (m, 2H), 5,93 (s, 2H), 5,99 (bs, 1H), 6,74 (m, 3H). LRMS: m/z 380 (MH~).
Preparatívny postup 15 (15/34)
Zlúčenina vzorca
Prep. postup R Východiskový amín Výťažok (%) 1 Údaje
15 (15/3 4) Piperonylamín 88 *H NMR (CDCb, 400MHz) δ: 0,85 (t, 3H), 1,26 (m, 4H). 1,42 (s, 9H), 1,46 (m, 2H), 1,59-1,75 (m, 5H), 1,95 (m, 2H), 2,06 (m, 1H), 2,22 (m, 1H), 4,26 (dd, 1H), 4,39 (dd, 1H), 5,95 (m, 3H), 6,78 (m, 3H). LRMS : m/z 418,3 (ΜΗ4)
sa pripraví z kyseliny z preparatívneho postupu 16 (16/1) (11/3) a zodpovedajúcej aminovej zlúčeniny podobným postupom, aký je opísaný v preparatívnom príklade 17 (17/33).
- 192 ·· ···· • · · • · ··· • φ · φ • · · · · ··· · ·· ··· • · ···· φφ φφ • φ φ φ • φ φ φφφ φφφ •Φ ΦΦ··
Preparatívny postup 16 (16/1)
1-(2-(terc-Butoxykarbonyl)-4-pentyl]cyklopentánkarboxylová kyselina
Zmes 1-(2-(terc-butoxykarbonyl)-4-pentenyl]cyklopentánkarboxylovej kyseliny (EP 274 234) (23 g, 81,5 mmol) a 10% paládia na uhlíku (2 g) v suchom etanole (200 ml) sa 18 hodín hydrogenuje pri teplote miestnosti za tlaku 206,1 kPa. Reakčná zmes sa prefiltruje cez Arbocel^R^ a filtrát sa odparí pri zníženom tlaku. Žltý olejovitý zvyšok sa prečistí chromatografiou na stĺpci silikagélu pri použití zmesi etylacetátu a pentánu v pomere 40 : 60 ako elučného činidla. Získa sa požadovaný produkt vo forme číreho oleja (21 g, 91 %). XH NMR (CDCl3): 6 0,86 (t, 3H), 1,22 - 1,58 (m, 15 H), 1,64 (m, 4H), 1,78 (dd, 1H), 2,00 - 2,18 (m, 3H) , 2,24 (m, 1H). LRMS: m/z 283 (M-H)~.
P r e p a r a t ívny postup 17 (17/33) terc-Butyl-2-{[l-({[1—(hydroxymetyl)cyklopentyl]amino}karbonyl)cyklopentyl]metyl}pentanoát
OH
- 193 ·· ···· • 9 · • · ··· • · 9 t
9 · ·· ··· ·· 99 • · · 9
9 9
9 9
9«
9· 9·99
Hydrochlorid 1- (3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimidu (41 mg, 0,21 mmol), hydrát 1-hydroxybenzotriazolu (27 mg, 0,2 mmol), N-metylmorfolín (35 μΐ, 0,31 mmol) a na záver 1-amino-l-cyklopentánmetanol (25 mg, 0,22 mmol) sa pridá k roztoku kyselinu z preparatívneho postupu 16 (16/1) (150 mg, 0,53 mmol) v Ν,Ν-dimetylformamide (3 ml). Reakčná zmes sa 18 hodín mieša pri 90“C. Výsledný roztok sa ochladí a zriedi etylacetátom (90 ml). Etylacetátová zmes sa premyje vodou (3 x 25 ml) a vodným roztokom chloridu sodného (25 ml), vysuší síranom horečnatým a odparí pri zníženom tlaku. Surový produkt sa prečistí chromatografiou na silikagélu pri použití zmesi etylacetátu a pentánu v pomere (30 : 70) ako elučného činidla. Získa sa zlúčenina uvedená v nadpise (38 mg, 57 %). ^H NMR (CDCI3, 400 MHz): δ 0,88 (t, 3H), 1,29 (m, 3H), 1,41 - 1,78 (m, 26H), 1,78 - 1,98 (m, 4H), 2,04 (m, 1H), 2,26 (m, 1H), 3,59 (dd, 1H), 3,70 (dd, 1H), 4,80 (t, 1H), 5,81 (s, 1H). LRMS: m/z 380 (MH).
Preparatívny postup 18 (18/ex4)
Zlúčenina vzorca Ic
H3C (IC)
HO (CH2)nY
- 194 • ·· ··♦· ·· ·· • · · ♦ · · · · • · · · ··· · · · ···· · · · «··· · • · · · · · · • ·· ··· ·· ··· · kde
Pŕ. N R Výťaž. Údaje
18 (18/e x.4)3 0 CH3 N—N 86 'H NMR (CDClj, 400MHz) δ: 0,92 (t, 3H), 1,35 (t, 3H), 1,25-1,80 (m, 11H), 2,20-2,50 (m, 4H), 2,95 (q, 2H), 12,10 (bs, 1H). LRMS : m/z339,8 (MH*); Anál. zistené : C, 56,46; H, 7,46; N, 12,36. Ci6H25N3O3Svyrát. :C, 56,62; H, 7,44; N, 12,37%.
3prekryštalizovanie z éteru sa pripraví zo zodpovedajúceho terc-butylesteru podobným spôsobom, aký je opísaný v preparatívnom postupe 14 (14/exl).
Preparatívny postup 19 (19/ex21)
2—({1—[(3-Benzylanilino)karbonyl]cyklopentyl}metyl)pentánová kyselina
Zmes benzylesteru z preparatívneho postupu 1Ó (10/53) (1,3 mg, 2,47 mmol) a 5% paládia na uhlíku (130 mg) vo vode (10 ml) a etanole (40 ml) sa 2 hodiny hydrogenuje pri teplote miestnosti za tlaku 206,1 kPa. Reakčná zmes sa prefiltruje cez Arbocel^R^ a filtrát sa skoncentruje pri
195 ···· ·
zníženom tlaku. Zvyšok sa trituruje s dichlórmetánom. Výsledná živica sa trituruje s éterom a potom s hexánom a vysuší pri 50°C. Získa sa zlúčenina uvedená v nadpise vo forme pevnej látky (0,79 g, 81 %). 1H NMR (CDC13, 300 MHz): δ 0,95 (t, 3H), 1,24 - 1,51 (m, 3H), 1,58 - 1,80 (m, 7H), 1,88 (dd, 1H), 2,15 (m, 2H), 2,24 (m, 1H), 2,48 (m, 1H), 4,00 (S, 2H), 6,98 (d, 1H), 7,24 (m, 6H), 7,40 (m, 3H). Analýza pre C25H31NO3.0,25H2O: nájdené: C 75,48, H 7,76,
N 3,59, vyrátané: C 75,44, H 7,98, N 3,51 %.
Stanovenie ACE
Príprava a stanovenie rozpustného enzýmu konvertujúceho angiotenzín (ACE) z kôry obličiek ošípaných a človeka
Rozpustný NEP bol získaný z kôry obličiek a jeho aktivita bola stanovená meraním rýchlosti štiepenia ACE substrátu, Abz-Gyl-p-nitro-Phe-Pro-OH, za vzniku jeho fluorescenčného produktu, Abz-Gly.
1. Látky
Všetka voda bola dvojité deionizovaná.
1.1
Ľudské obličky
IAM (Pensylvánia, USA) alebo
UK Human Tissue Bank (UK HTB)
1.2. ACE z obličiek Sigma (A2580) ošípaných
1.3. Homogenizačný tlmivý roztok 1
100mM manitol a 20mM Tris s pH 7,1
2,42 g Tris (Fisher T/P630/60) sa zriedi 1 litrom vody a pH zriedenej zmesi sa pri použití 6M kyseliny chlorovodíkovej pri teplote miestnosti nastaví na 7,1. K tejto zmesi sa pridá 18,22 g manitolu (Sigma M-9546).
9 · ··· ··· · · · · · · · • · · · · ··· · · · • 9999 999 9 9·· · • · ·· ····
999 9 99 999 99 9999
- 196 1.4. Homogenizačný tlmivý roztok 2 lOOmM manitol a 20mM Tris s pH 7,1 a lOmM hexahydrát chloridu horečnatého (Fisher M0600/53)
K 500 ml homogenizačného tlmivého roztoku 1 (1.4) sa pridá chlorid horečnatý (1,017 g).
1.4. Tris tlmivý roztok (ACE tlmivý roztok)
50mM Tris pH 7,4 a 300mM chlorid sodný s pH 7,4 ml 50mM Tris pH 7,4 (Sigma 2663) a 17,52 g chloridu sodného (Fisher S/3160/60) sa doplní vodou do objemu 1000 ml.
1.6. Substrát (Abz-D-Gly-p-nitro-Phe-Pro-OH) (Bachem M-1100)
ACE substrát sa skladuje vo forme prášku pri -20‘C. 2mM rezervná suspenzia sa pripraví opatrným resuspendovaním substrátu v ACE tlmivom roztoku, pričom by sa nemalo používať ani vírivý pohyb ani sonikácia. 400μ1 alikvóty 2mM rezervnej suspenzie sa skladujú až 1 mesiac pri -20“C.
1.7. Úplný produkt
Na doštičku sa zaradia vzorky zodpovedajúce 100% konverzii substrátu na produkt, aby bolo možné stanoviť % obratu substrátu (pozri výpočty). Úplný produkt sa vytvorí inkubáciou 1 ml 2mM substrátu s 20 μΐ rezervnej suspenzie enzýmu počas 24 hodín pri 37°C.
1.8. Ukončovací roztok
0,5M EDTA (Promega CAS (6081/92/6)) sa zriedi v pomere 1 : 250 ACe tlmivým roztokom, čím sa získa 2mM roztok.
··· ··· · · · · • · · · · ··· · · · • ···· ··· ···· · • · · ·· · ··· ··· · ·· ··· ·· ····
- 197 ·· ··· ·
1.9. Dimetylsulfoxid (DMSO)
1.10. Chlorid horečnatý (MgCl2.6H2O, Fisher M0600/53)
1.11. Čierne doštičky s 96 jamkami s gulatým dnom (Costar 3915 alebo Packard)
1.12. TopSeal A (Packard 6005185)
1.13. Centrifugačné skúmavky
2. Špeciálne zariadenia
2.1. Centrifúga Sorvall RC-5B (rotor SS34 GSA, predchladená na 4·C).
2.2. Miniprimer mixér Braun
2.3. Centrifúga Beckman CS-6R
2.4. Fluorstar Galaxy
2.5. Trepací inkubátor Wesbart 1589
3. Postupy
3.1. Tkanivové preparáty
3.2. Ľudský ACE sa získa z kôry obličiek pri použití modifikovaného spôsobu opísaného v Boot, A. G. a Kenny, A. J. (1974) Biochem. J. 142, 575 až 581.
3.3. Zmrazené obličky sa nechajú roztopiť pri teplote miestnosti a od medully sa oddelí kôra.
3.4. Kôra sa jemne naseká a homogenizuje približné v 10 objemoch homogenizačného tlmivého roztoku 1 (1.4) pri použití mixéru Miniprimer Braun (2.2)
198 • ······ · · ·· • · · · · · · · • · ····· · · · ···· · 9 · 9 · · · · • · · 9 9 9 · • · ····· ······
3.5. K homogenátu sa pridá chlorid horečnatý (1.11) (20,3 mg/g tkaniva) a vzniknutá zmes sa 15 minút mieša v kúpeli z ladovej vody.
3.6. Homogenát sa v centrifúge Beckman (2.3) centrifúguje pri 1500xg (3820 min“1) počas 12 minút. Supernatant sa premiestni do čerstvej centrifugačnej skúmavky a peleta sa odloží.
3.7. Supernatant sa v centrifúge Sovall (2.1) centrifuguje pri 15 OOOxg (12 100 min“1) počas 12 minút a supernatant s odloží.
3.8. Svetlo ružová vrstva na vrchu výslednej pelety sa oddelí a resuspenduje v homogenizačnom tlmivom roztoku 2 (1.5) (5 ml tlmivého roztoku na 1 g tkaniva).
3.9. Suspenzia sa v centrifúge Beckman (2.3) centrifuguje pri 2200xg (4630 min“1) počas 12 minút a peleta sa odloží.
3.10. Supernatant sa v centrifúge Sovall (2.1) centrifuguje pri 15 OOOxg (12 100 min“1) počas 12 minút a supernatant sa odloží.
3.11. Výsledná peleta sa resuspenduje v homogenizačnom tlmivom roztoku 2 (0,5 ml tlmivého roztoku na 1 g tkaniva). Homogénna suspenzia sa získa pri použití mixéru Braun Miniprimer (2.2), v ΙΟΟμΙ alikvótoch zmrazí a je možné ju skúšať: na aktivitu ACE.
4.0. Stanovenie aktivity ACE
Aktivita sa pri použití alikvótov ACE pripravených hore opísaným spôsobom merí ako schopnost štiepit ACE špecifický peptidový substrát.
• ·· ···· ·· ·· • · · · · · · · • · t · ··· · · · ···· · · · ···· · • · · · · · · • ·· ··· ·· ····
ACE ošípaných (1.2) sa rozmrazí a resuspenduje v tlmivom roztoku ACE (1.6) pri 0,004υ/μ1, a vzniknutá suspenzia sa zmrazí vo forme 50μ1 alikvótov.
4.1. Pripraví sa 4% roztok DMSO v ACE tlmivého roztoku (4 ml DMSO v 96 ml ACE tlmivého roztoku).
4.2. Substrát (1.7), úplný produkt (1.8), enzým (1.1, 1.2, 1.3) sa nechajú roztopiť na lade.
4.3. Do každej jamky sa pridá 50 μΐ 4% roztoku DMSO v tlmivom roztoku ACE.
4.4. 2mM rezervný substrát sa zriedi 1 : 100, čím sa získa 20μΜ roztok. Do každej jamky sa pridá ΙΟΟμΙ 20μΜ substrátu (konečná koncentrácia ΙΟμΜ).
4.5. Reakcia sa zaháji prídavkom 50 μΐ od každej koncentrácie zo sériového riedenia enzýmu (zvyčajne sa používa riedenie 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600 a 1:3200). Do prázdnych jamiek sa pridá 50 μΐ ACE tlmivého roztoku.
4.6. 2mM úplný produkt sa zriedi v pomere 1:200, čím sa získa 10μΜ roztok. 200 μΐ 10μΜ produktu sa pridá do prvých štyroch jamiek novej doštičky.
4.7. Doštičky sa inkubujú v trepacom inkubátore počas 60 minút pri 37“C.
4.8. Reakcia sa zastaví prídavkom 100 μΐ 2mM EDTA v tlmivom roztoku ACE. Výsledná zmes sa inkubuje v trepacom inkubátore 20 minút pri 37°C a sníma na zariadení Fluostar (ex320/em420).
200
• · · • · ·· ···· • · · • · · · · • · · ·· · · · ·· ··
Stanovenie inhibície ACE
5.1. Rezervný substrát, úplný produkt a enzým sa nechajú roztopiť na lade.
5.2. Rezervný roztoky zlúčenín sa pripraví pri použití 100% dimetylsulfoxidu a zriedi v pomere 1 : 25 tlmivým roztokom ACE, čím sa získajú 4% dimetylsulfoxidové roztoky. Všetky dalšie riedenia sa vykonávajú pri použití 4% dimetylsulfoxidového roztoku v tlmivom roztoku ACE (4 ml DMSO v 96 ml tlmivého roztoku ACE).
5.3. 50μ1 zlúčeniny sa dvojité navzorkuje do 96jamkových doštičiek, do kontrolných jamiek a jamiek pre slepý pokus sa navzorkuje 50 μΐ 4% roztoku DMSO v tlmivom roztoku ACE.
5.4. Stupne 5.2 a 5.3 je možné vykonať ručne alebo pri použití viacsondových robotov Packard.
5.5. 2mM rezervný substrát sa zriedi v pomere 1 : 100 pri použití tlmivého roztoku ACE, čím sa získa 20μΜ roztok (10μΜ konečná skúšková koncentrácia) (110 μΐ 2mM substrátu pridaného k 10,89 ml tlmivého roztoku postačuje pre 1 doštičku) .
5.6. Rezervný enzým sa zriedi tlmivým roztokom ACE (stanovené z kontrol aktivity) (4.0).
5.7. 2mM rezervný úplný produkt sa zriedi v pomere 1 : 200 tlmivým roztokom ACE, čím sa získa 10μΜ roztok. Do prvých štyroch jamiek separátnej doštičky sa navzorkuje 200 μΐ.
5.8. 0,5mM rezervný roztok EDTA sa zriedi 1 : 250, čím sa získa 2mM rezervný roztok (44 μΐ EDTA v 10,96 ml tlmivého roztoku ACE).
·· ·· • ··· · · · · é · · · ··· · · * ······ · · · · · · • · · · · · · • ·· ··· ·· ····
- 201 ·· ····
5.9. Do každej jamky 96jamkové doštičky sa pridajú nasledujúce látky:
Tabulka látok, ktoré sa navzorkujú do 96jamkové doštičky
Zlúčenina/ DMSO Tris tlmivý roztok Substrát Enzým ACE Úplný produkt
vzorky 2 μΐ zlúčeniny 50 μΐ 100 μΐ 50 μΐ žiadny
kontrolné 2 μΐ DMSO 50 μΐ 100 μΐ 50 μΐ žiadny
slepé pokusy 2 μΐ DMSO 100 μΐ 100 μΐ žiadny žiadny
s úplným 2 μΐ DMSO žiadny žiadny žiadny 200 μΐ
produktom
5.10. 50 μΐ každého roztoku zlúčenín s najvyššou koncentráciou použitej pri skúške sa dvojité navzorkuje do rovnakých 96jamkových doštičiek ako úplný produkt (5.7). Za účelom stanovenia fluorescencie sa pridá 150 μΐ tlmivého roztoku ACE.
5.11. Reakcia sa zaháji prídavkom enzýmu ACE a pokračuje jednohodinovou inkubáciou pri 37°C v trepacom inkubátore.
5.12. Reakcia sa ukončí 100 μΐ 2mM EDTA. Zmes sa inkubuje minút pri 37°C v trepacom inkubátore. Odčítanie sa vykoná pri použití zariadenia BMG Fluostar Galaxy (ex320/em420).
6. Výpočty
Aktivita enzýmu ACE sa stanoví v prítomnosti a v neprítomnosti zlúčeniny a vyjadrí sa pomocou percent.
FU = jednotky fluorescencie • · · • ··
- 202 ·· · ·· · • · » · · · · ··· ·· ·· • · · · • · · • e · · • · · ·· ···· (i) Kontrolná aktivita (%) (obrat enzýmu)
Stredná hodnota FU kontroly
Stredná hodnota FU úplného produktu
Stredná hodnota
FU slepých pokusov --x 100
Stredná hodnota FU slepých pokusov (ii) Aktivita s inhibítorom (%)
Stredná hodnota Stredná hodnota
FU zlúčeniny - FU slepých pokusov
--x 100
Stredná hodnota
FU úplného - Stredná hodnota produktu FU slepých pokusov (iii) Aktivita vyjadrená ako % kontroly
Aktivita s inhibítorom (%)
- x 100
Kontrolná aktivita (%) alebo
Stredná hodnota FU zlúčeniny
Stredná hodnota FU kontroly
Stredná hodnota
FU slepých pokusov
- x 100
Stredná hodnota FU slepých pokusov (iv) % Inhibície = 100 kontroly
- 203 • ·· ···· • · · · • · · · ···
·.··· · · · · ·· ··· ·· ···· (v) Pre fluorescenčné zlúčeniny sa stredná hodnota FU slepých pokusov obsahujúcich zlúčeninu (5.10) odčíta zo strednej hodnoty FU zlúčenín, ktorá bola použitá na výpočet % aktivity.
S-krivka závislosti odpovedi od dávky sa preloží % aktivity (% kontroly) versus koncentrácia zlúčeniny a pri použití balíčku LabStats sa v Excele vyrátajú hodnoty IC5Q.
Závery
Vyvinuli sme zvierací model, ktorý reflektuje fyziologickú odpoveď pozorovanú počas sexuálneho vzrušenia ženy a priamo odráža klinické údaje získané na íudských dobrovolníkoch. V tomto modele sa na zaznamenávanie malých zmien prekrvenia vagíny alebo klitorisu indukovaných stimuláciou pelvického nervu alebo vazoaktívnymi neurotransmitermi používa laserová Dopplerovská technológia. Počas sexuálneho vzrušenia dochádza k zvýšeniu prekrvenia genitálií vyvolanému zvýšenou inerváciou z pelvického nervu. Zvýšenie prekrvenia vagíny a klitorisu indukované stimuláciou pelvického nervu pozorované na zvieracom modele predstavuje endogénne vaskulárne účinky pozorované počas sexuálneho vzrušenia ženy, tzn. prekrvenia. Tento model je teda možné použiť 1) na identifikáciu mechanizmu, ktorý sa podieía na regulácii prekrvenia vagíny a klitorisu a 2) na overenie nových prístupov k zvýšeniu prekrvenia genitálií.
Táto štúdia úspešne využila kombináciu postupov vykonávaných in vivo a in vitro a biochemických postupov pri preukazovaní, že VIP sprostredkováva prekrvenie genitálií a pri identifikácii cAMP ako mediátoru/druhého posla regulujúceho vazorelaxáciu genitálií (a relaxáciu vaginálnej steny). Na tomto zvieracom model sme doložili, že infúzia VIP indukuje zvýšenie vaginálneho a klitoriálneho prekrvenia.
Pri použití inhibítoru metabolizmu VIP (napríklad inhibítoru
- 204 ·· »·ο· • · • · · · ··· ···· · · · · • · · · • ·· ··· ·· • · · · • · · • · · • · · ·· ····
NEP EC 3.4.24.11) sme tiež preukázali, že zvýšenie prekrvenia genitálií pozorované počas stimulácie pelvického nervu (tzn. sexuálneho vzrušenia) je sprostredkované VIP. Ukázali sme, že zvýšenie prekrvenia genitálií sprostredkované VIP je výsledkom zvýšenia tkanivového cAMP, pričom vplyv VIP na zvýšenie prekrvenia vagíny u zdravých dobrovolníkov už bol známy, avšak nebol známy bunkový mechanizmus. Ďalej sme preukázali, že prekrvenie genitálií je možné zvýšiť priamo, pri použití cAMP mimetiká, alebo nepriamo, prostredníctvom zvýšenia koncentrácie cAMP pri použití inhibítoru pdecamp typu 2 alebo antagonisty receptoru NPY Yl.
Hlavnou príčinou FSAD je znížené prekrvenie genitálií, ktoré sa manifestuje ako znížené prekrvenie vagíny, labií a klitorisu. Ženy postihnuté FSAD je možné liečiť obnovením normálnej sexuálnej vzrušivosti. To je možné dosiahnuť zvýšením prekrvenia genitálií. Náš prístup k liečeniu FSAD spočíva v zvýšení prekrvenia genitálií, a teda potenciácii prekrvenia/lubrikácie vagíny a prekrvenia/citlivosti klitorisu buď priamou alebo nepriamou potenciáciou cAMP signalizácie, napríklad pri použití inhibítoru NEP (EC 3.4.24.11), inhibítoru PDE hydrolyžujúcej cAMP alebo antagonistami receptoru NPY. Celkovým účinkom potom bude obnovenie alebo potenciácia normálneho vzrušenia bez vedlajších kardiovaskulárnych účinkov. Tak dôjde k zvýšeniu sexuálneho vzrušenia/prekrvenia, a nie k jeho prostej indukcii bez prítomnosti sexuálnej túžby, ako to môže byt v prípade niektorých exogénne podávaných vazoaktívnych činidiel, napríklad VIP.
Predmetom vynálezu je tedy okrem iných:
- Farmaceutická kompozícia na použitie (alebo keď sa používa) pri liečení FSD, prednostne FSAD; pričom táto farmaceutická kompozícia obsahuje činidlo schopné potencovať cAMP v pohlavných orgánoch ženy, ktorá trpí FSD, prednostne
- 205 ·· é··· • · · • · ··· • · · • · · ·· ··· ·· ·· • · · · • · · • · · · • · · ·· ····
FSAD; a toto činidlo je prípadne zmiešané s farmaceutický vhodným nosičom, riedidlom alebo excipientom.
- Použitie činidla pri výrobe', liečiva na liečenie FSD, prednostne FSAD; pričom toto činidlo je schopné potencovat cAMP v pohlavných orgánoch ženy, ktorá trpí FSD, prednostne FSAD.
- Spôsob liečenia žien (ako žien trpiacich FSD, prednostne FSAD), ktorého podstata spočíva v tom, že sa žene podáva činidlo, ktoré je schopné potencovat cAMP v pohlavných orgánoch, v množstve, ktoré vyvoláva potenciáciu cAMP v pohlavných orgánoch ženy; pričom toto činidlo je prípadne zmiešané s farmaceutický vhodným nosičom, riedidlom alebo excipientom.
Vo vysoko prednostnom rozpracovaní je predmetom vynálezu okrem iných:
- Farmaceutická kompozícia na použitie (alebo keď sa používa) pri liečení FSD, prednostne FSAD; pričom táto farmaceutická kompozícia obsahuje činidlo schopné potencovat cAMP v pohlavných orgánoch ženy, ktorá trpí FSD, prednostne FSAD; a toto činidlo je prípadne zmiešané s farmaceutický vhodným nosičom, riedidlom alebo excipientom a je podávané perorálne.
- Použitie činidla pri výrobe liečiva na liečenie FSD, prednostne FSAD; pričom toto činidlo je schopné potencovat cAMP v pohlavných orgánoch ženy, ktorá trpí FSD, prednostne FSAD a je podávané perorálne.
- Spôsob liečenia žien (ako žien trpiacich FSD, prednostne FSAD), ktorého podstata spočíva v tom, že sa žene podáva činidlo, ktoré je schopné potencovat cAMP v pohlavných orgánoch, v množstve, ktoré vyvoláva potenciáciu cAMP • · • β ··
- 206 ·· ···· • · * ·· ··· ··
9 9 9 • 9 9 • · · · • · · ·· ···· v pohlavných orgánoch ženy; pričom toto činidlo je prípadne zmiešané s farmaceutický vhodným nosičom, riedidlom alebo excipientom a je podávané perorálne.
V ešte výhodnejšom rozpracovaní je predmetom vynálezu okrem iných:
- Farmaceutická kompozícia na použitie (alebo ked sa používa) pri liečení FSD, prednostne FSAD; pričom táto farmaceutická kompozícia obsahuje činidlo schopné potencovat cAMP v pohlavných orgánoch ženy, ktorá trpí FSD, prednostne FSAD; a činidlo je prípadne zmiešané s farmaceutický vhodným nosičom, riedidlom alebo excipientom, pričom činidlo potencuje endogénny cAMP.
- Použitie činidla pri výrobe liečiva na liečenie FSD, prednostne FSAD; pričom toto činidlo je schopné potencovat cAMP v pohlavných orgánoch ženy, ktorá trpí FSD, prednostne FSAD a potencuje endogénny cAMP.
- Spôsob liečenia žien (ako žien trpiacich FSD, prednostne FSAD), ktorého podstata spočíva v tom, že sa žene podáva činidlo, ktoré je schopné potencovat cAMP v pohlavných orgánoch, v množstve, ktoré vyvoláva potenciáciu cAMP v pohlavných orgánoch ženy; pričom toto činidlo je prípadne zmiešané s farmaceutický vhodným nosičom, riedidlom alebo excipientom a potencuje endogénny cAMP.
V ešte výhodnejšom rozpracovaní je predmetom vynálezu okrem iných:
- Farmaceutická kompozícia na použitie (alebo ked’ sa používa) pri liečení FSD, prednostne FSAD; pričom táto farmaceutická kompozícia obsahuje činidlo schopné potencovat cAMP v pohlavných orgánoch ženy, ktorá trpí FSD, prednostne • 99 ·
207
9999 9 9
9 ·
999 9 • 9 · • · · 9 · • · · • · 9
99
9 9 9
FSAD; a činidlo je prípadne zmiešané s farmaceutický vhodným nosičom, riedidlom alebo excipientom, pričom činidlo sa podáva perorálne a potencuje endogénny cAMP.
- Použitie činidla pri výrobe liečiva na liečenie
FSD, prednostne FSAD; pričom toto činidlo je schopné potencovať cAMP v pohlavných orgánoch ženy, ktorá trpí FSD, prednostne FSAD, podáva sa perorálne a potencuje endogénny cAMP.
- Spôsob liečenia žien (ako žien trpiacich FSD, prednostne FSAD), ktorého podstata spočíva v tom, že sa žene podáva činidlo, ktoré je schopné potencovat cAMP v pohlavných orgánoch, v množstve, ktoré vyvoláva potenciáciu cAMP v pohlavných orgánoch ženy; pričom toto činidlo je prípadne zmiešané s farmaceutický vhodným nosičom, riedidlom alebo excipientom, podáva sa perorálne a potencuje endogénny cAMP.
Všetky citované publikácie sú tu uvedené náhradou za prenesenie celého ich obsahu do tohto textu. Odborníci v tomto odbore budú schopní spôsoby a systémy podía tohto vynálezu rôzne modifikovať alebo obmeňovať, a také modifikácie alebo varianty nebudú predstavovať únik z rozsahu tohto vynálezu. Hoci je vynález opísaný v spojení s konkrétnymi uskutočneniami, na také uskutočnenia sa neobmedzuje. Rôzne modifikácie opísaných foriem tohto vynálezu, ktoré sú odborníkom v odbore biochémie a biotechnológie zrejmé, spadajú do rozsahu pripojených patentových nárokov.
- 208 • · φφφφ
ΦΦΦ φφ φφφφ φ · φ • φφφφ φ φ · · φ φ · φφ φφφ φφ φ φ φ φ φ · φ φ · φφφ φφ φφφφ
Všeobecné odkazy
Ashur-Fabian, Ο., Perl ,0., Lilling, G., etal. (1999). SNV, a lipophilic superactive VIP analog, acts through cGMP to promote neuronal survival. Peptides, 20, 629-633.
Berman, J.R., Berman, L. & Goldstein, I. (1999). Female sexual dysfunction: Incidence, pathophysiology, evaluation, and treatment options. Urology, 54,385-391.
Berman, J., Goldstein, I., Werbin, T. et al. (1999a). Double blind placebo controlled study with crossover to assess effect of sildenafil on physiologícal parameters of the female sexual response. J. Urol., 161, 805.
Burnett, A, Calvin, D., Silver, R. et al. (1997). Immunohistochemical description of nitric oxide synthase isoforms in human clitoris. J. Urol., 158, 75-78.
Diagnostíc and statlstlcal manual of mental disorders-IV, American Psychiatrie Association: Washington, DC., 1987, pp 493-518.
Fan, Y.P., Chakder, S. & Ratton, S. (1998). Inhibitory effect of zinc protoporphyrin IX on lower esophageal sphincter smooth muscle relaxation by vasoactive intestinal polypeptide and other receptor agonists. J. Pharmacol. Exp. Ther., 285,468-474.
Foda, H.D., Sharaf, H.H., Absood, A. et al. (1995). Pituitary adenylate cyclaseactivating peptide (PACAP), a VlP-like peptide, has prolonged airway smooth muscle relaxant activity. Peptides, 16,1057-1061.
Frank, E., Anderson, C. & Rubinstein, D. (1978). Frequency of sexual dysfunction in “normál” couples. N. Engl. J. Med., 229, 111-115.
Goldstein, I. & Berman, J.R. (1998). Vasculogeníc female sexual dysfunction: vaginal engorgement and clitoral erectile insufficiency syndromes. Int. J. Impot. Res., 10, S84-S90.
Gu, Z.F., Jensen, R.T. & Maton, P.N. (1992). A primary role for protein kinase A in smooth muscle relaxation induced by adrenergic agonists and neuropeptides. Am. J. Physiol., 263, G360-G364.
- 209 • · ···· ·· ·· • · · · · · • ··· · · · • · · · · · • · · · ···· ··· · ·· ··· ·· ····
Hauser-Kronberger, C., Cheung, A., Hacker, G. et al. (1999). Peptidergic innervation of the human clitoris. Peptides, 20, 539-543.
Hoyle, C.H.V., Stones, R.W., Robson, T. et al. (1996). Innervation of vasculature and microvasculature of the human vagina by NOS and neuropeptide containíng nerves. J. Anat., 188, 633-644.
Ingenhoven, N. & Beck-Sickinger, A.G. (1997). Flourescent labelled analogues of neuropeptide Y for the characterisation of celíš expressing NPY receptor subtypes. J. Recept. Signál Transduct. Res., 17,407-418.
Jovanovic, A., Jovanovic, S., Tulic,. I. et al. (1998). Predominant role for nitric oxide in the relaxation induced by vasoactive intestinal polypeptide in human uterine artery. Mol. Human Reprod., 4, 71-76.
Kaplan, H.S. (1974). The New Sex Therapy. London, Bailliere Tindall.
Kaplan, S.A., Reis, R.B., Kohm, I.J. et al. (1999). Safety and efficacy of sildenafil in postmenopausal women with sexual dysfunction. Urology, 53, 481 -486.
Kim, Y.C., Choi, H.K., Ahn, Y.S., et al. (1994). The effect of vasoactive intestinal polypeptide (VI P) on rabbit cavernosal smooth muscle contractility. J. Androl., 15, 392-739.
Laan, E. & Everaerd, W. (1998). Physiological measures of vaginal vasocongestion. Int. J. Impot. Res., 10, S107-S110.
Leiblum, S.R. (1998). Definition and classification of female sexual disorders. Int. J. Impotence Res., 10, S104-S106.
Levin, R.J. (1980). The physiology of sexual function in women. Clin. Obstet. GynecoL, 7, 213-252.
Levin, R.J. (1991). VIP, vagina, clitoral and preurethral glans: An update on female genital arousal. Exp. Clin. Endocrínol., 98, 61-69.
···· ·· · ·· · ·· ·· • · · · · · · • ···· · · · * · · ···· · • · · · · · ♦ · ·· ··· ·· ····
- 209a Levin, R.J. (1992). The mechanisms of human female sexual arousal. Ann. Rev. Sex Res., 3, 1-48.
Levin, R.J. & Wagner, G. (1986). TRH and vaginal blood flow-effects in concious women and anaesthetised sheep. J. Physiol., 373, 83P.
Lundberg, J.M., Modin, A. & Malmstrom, R.E. (1996). Recent developments with neuropeptide Y receptor antagonists. Trends. Pharmacol. Sci., 17, 301-304.
Masters, W.H., Johnson, V.E. Human Sexual Response. Little, Brown: Boston, 1996.
Ottesen, B., Gerstenberg, T., Ulrichsen, H. et al. (1983). Vasoactive intestinal polypeptide (VIP) increases vaginal blood flow and inhibits smooth muscle activity in women. Eur. J. Clin. Invest., 13, 321-324.
Ottesen, B., Wagner, G. & Fahrenkrug, J. Peptide innervation ofthe sexual organs. In: Handbook of Sexology, Vol. 6, The Pharmacological and Endocrinology of Sexual Function, Sitsen, J.M.A. (eds), Amsterdam: Elsevier Science Publishers (1988), chapter 4, pp 66-97.
Ottensen, B., Pedersen, B., Nielsen, J. et al. (1987). Vasoactive intestinal polypeptide (VIP) provokes vaginal lubrication in normál women. Peptides, 8, 797800.
Park, K., Goldstein, I., Andry, C., et al. (1997). Vasculogenic female sexual dysfunction: The hemodynamic basis for vaginal engorgement insufficiency and clitoral erectile insufficiency. Int. J. Impotence Res., 9, 27-37.
Rosen, R., Taylor, J., Leiblum, S. et al. (1993). Prevalence of. sexual dysfunction in women: results of a survey of 329 women in an outpatient gynecological ciinic. J. Sex Marital Ther. ,19,171-188.
Schiavi, R.C. & Seagraves, R.T. (1995). The biology of sexual function. Psychiat. Clin. North. Am., 18, 7-23.
- 210 ·· ······ ·· · · · · ··· · · · ·· • ···· · · · · • · · · · ··· · ·· ··· • · · • · t e • · · ·· ····
Schoeffter, P. & Stoclet, J.C. (1985). Effect of vasoactive intestinal polypeptide (VIP) on cyclic AMP level and reiaxation in rat isolated aorta. Eur. J. Pharmacol., 109, 275279.
Serradeil-Le Gal, C., Valette, G., Rouby, P.E. et al. (1995). SR 120819A, an orallyactive and seleetive neuropeptide Y Y1 receptor antagonist. FEBS Letters, 3, 192196.
Sjoberg, I. (1992). The vagína: Morphological, functional and ecological aspects. Acta Obst. Gynecol. Scand., 71,84-85.
Spector, I.P. & Carey, M.P. (1990). Incidence and prevalence of sexual dysfunctions: a critical review of the empirical literatúre. Árch. Sex. Behav., 19, 389-408.
Wagner, G. (1992). Aspects of genital physiology and pathology. Sem. Neurol., 12, 87-97.
Werbin, T., Salimpour, P., Berman.L., et al. (1999). Effect of sexual stimulation and age on genital blood flow in women with sexual stimulation. J. Urol., 161, 688
Wíncze, J.P., Albert, A. & Bansal, S. (1993). Sexual arousal in diabetic females: Physiological and self-report measures. Árch. Sex Behav., 22, 587-601.
Wieland, H.A., Willim, K.D., Entzeroth, M. et al. (1995). Subtype selectivity and antagonist profile of the nonpeptide Y1 receptor antagonist BIBP 3226. J Pharmacol Exp Ther., 275,143-9.
Odkazy pre časť týkajúcu sa PDE
Han, P.; Fletcher, C. F.; Copeland, N. G.; Jenkins, N. A.; Yaremko, L. M.; Michaeli, T.
: Assignment of the mouse Pde7A gene to the proximal región of chromosome 3 and of the human PDE7A gene to chromosome 8q13. Genomics 48: 275-276, 1998.
2. Michaeli, T.; Bloom, T. J.; Martins, T.; Loughney, K.; Ferguson, K.; Riggs, M.; Rodgers; L.; Beavo, J. A.; Wigler, M. : Isolation and characterization of a previously undetected human cAMP phosphodiesterase by complementation of cAMP ·· ···· * · · ··.· ··· ··· · ···· · · • ···· ··· ···· · • · · · ····
999 9 ·· 999 99 999
- 211 phosphodiesterase-deficient Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 268: 1292512932, 1993.
3. Mílatovich, A.; Bolger, G.; Michaeli, T.; Francke, U. : Chromosome localizations of genes for five cAMP-specific phosphodiesterases in man and mouse. Somat. Celí Molec. Genet. 20:75-86,1994.
4. Rosman, G. J.; Martins, T. J.; Sonnenburg, W. K.; Beavo, J. A.; Ferguson, K.; Loughney, K. : Isolation and characterization of human cDNAs encoding a cGMPstimulated 3-prime,5-prime-cyclic nucleotide phosphodiesterase. Gene 191: 89-95,
1997.
Odkazy pre časť týkajúcu sa NEP
1. Barker, P. E.; Shipp, M. A.; D'Adamio, L.; Masteller, E. L.; Reinherz, E. L. The common acute lymphoblastic leukémia antigén gene maps to chromosomal región 3(q21-q27). J. Immun. 142: 283-287, 1989.
2. D'Adamio, L; Shipp, M. A.; Masteller, E. L.; Reinherz, E. L. : Organization of the gene encoding common acute lymphoblastic leukémia antigén (neutrál endopeptidase 24.11): multiple miniexons and separáte 5-prime untranslated regions. Proc. Nat. Acad. Sci. 86:7103-7107,1989.
3. Letarte, M.; Vera, S.; Tran, R.; Addis, J. B. L.; Onizuka, R. J.; Quackenbush, E. J.; Jongeneel, C. V.; Mclnnes, R. R. : Common acute lymphocytic leukémia antigén is identical to neutrál endopeptidase. J. Exp. Med. 168:1247-1253,1988.
4. Shipp, M. A.; Vijayaraghavan, J.; Schmidt, E. V.; Masteller, E. L.; D'Adamio, L.;
Hersh, L. B.; Reinherz, E. L. : Common acute lymphoblastic leukémia antigén (CALLA) is active neutrál endopeptidase 24.11 (’enkephalinasej: direct evidence by cDNA transfection analysis. Proc. Nat, Acad. Sci. 86:297-301, 1989.
5. Tran-Paterson, R.; Willard, H. F.; Letarte, M. : The common acute lymphoblastic leukémia antigén (neutrál endopeptidase--3.4.24.11) gene is located on human chromosome 3. Cancer Genet. Cytogenet. 42:129-134, 1989.
- 212 ·· ···· • · • ··· • ·
I · · ·· ··· ·· ·· • · · · • · · • · · • · · • · ··· ·
Odkazy pre časť týkajúcu sa NPY
1. Alien, J. M.; Bloom, S. R. : Neuropeptide Y: a putative neurotransmitter. Neurochem. Int. 8: 1-8, 1986.
2. Bahary, N.; Zorich, G.; Pachter, J. E.; Leibel, R. L.; Friedman, J. M. : Molecular genetic linkage maps of mouse chromosomes 4 and 6. Genomics 11: 33-47, 1991.
3. Baker, E.; Hort, Y. J.; Balí, H.; Sutherland, G. R.; Shine, J.; Herzog, H. : Assignment of the human neuropeptide Y gene to chromosome 7p15.1 by nonisotopic in situ hybridization. Genomics 26:163-164,1995.
5. Carr, L. G.; Foroud, T.; Biče, P.; Gobbett, T.; Ivashina, J.; Edenberg, H.; Lumeng, L.; Li, T. K. : A quantitative trait locus for alcohol consumption in seiectively bred rat lines. Alcohol Clin. Exp. Res. 22: 884-887,1998.
5. Dockray, G. J. : Neuropeptide Y: in search of a function. Neurochem. Int. 8: 9-11, 1986.
6. Erickson, J. C.; Clegg, K. E.; Palmiter, R. D.: Sensitivity to leptin and susceptibility to seizures of mice lacking neuropeptide Y. Náture 381:415-421,1996. PubMed ID : 8632796
7. Erickson, J. C.; Hollopeter, G.; Palmiter, R. D. : Attenuation of the obesity syndróme of ob/ob mice by the loss of neuropeptide Y. Science 274: 1704-1706, 1996.
8. Karvonen, M. K.; Pesonen, U.; Koulu, M.; Niskanen, L.; Laakso, M.; Rissanen, A.; Dekker, J. M.; 't Hart, L. M.; Valve, R.; Uusitupa, M. I.: Association of a leucine(7)-toproline(7) poiymorphism in the signál peptide of neuropeptide Y with high sérum cholesterol and LDL cholesterol levels. Náture Med. 4:1434-1437,1998.
9. Maccarrone, C.; Jarrott, B. : Neuropeptide Y: a putative neurotransmitter. Neurochem. Int. 8:13-22, 1986.
• ·
- 213 ·· · ···· ·· ···· • · • ··· • · 9 9
9 9
999
9 9 9
9 9
9 9
9 9
9999
10. Meisler, M. H.; Spence, J. E.; Dixon, J. E.; Caldwell, R. M.; Minth, C. D.; Beaudet, A. L. : Exclusion of close línkage between the loci for cystic fibrosis and neuropeptide Y on human chromosome 7. Oytogenet. Celí Genet. 44:175-176,1987.
11. Minth, C. D.; Andrews, P. C.; Dixon, J. E. : Characterization, sequence, and expression of the cloned human neuropeptide Y gene. J. Biol. Chem. 261: 1197411979.1986.
12. Minth, C. D.; Bloom, S. R.; Polak, J. M.; Dixon, J. E. : Cloning, characterization, and DNA sequence of a human cDNA encoding neuropeptide tyrosine. Proc. Nat. Acad. Sci. 81: 4577-4581,1984.
13. Takeuchi, T.; Gumucio, D.; Eddy, R.; Meisler, M.; Minth, C.; Dixon, J.; Yamada, T.; Shows, T. : Assignment of the related pancreatic polypeptide (PPY) and neuropeptide Y (NPY) genes to regions on human chromosomes 17 and 7. (Abstract) Cytogenet. Celí Genet. 40: 759 only, 1985.
14. Takeuchi, T.; Gumucio, D. L.; Yamada, T.; Meisler, M. H.; Minth, C. D.; Dixon, J. E.; Eddy, R. E.; Shows, T. B. : Genes encoding pancreatic polypeptide and neuropeptide Y are on human chromosomes 17 and 7. J. Clin. Invest. 77: 10381041.1986.
15. Terenghi, G.; Polak, J. M.; Hamid, Q.; O’Brien, E.; Denný, P.; Legon, S.; Dixon,
J.;· Minth, C. D.; Palay, S. L.; Yasargil, G.; Chan-Palay, V. : Localization of neuropeptide Y mRNA in neurons of human cerebral cortex by means of in situ hybridization with a complementary RNA próbe. Proc. Nat. Acad. Sci. 84: 73157318, 1987.
16. Thiele, T. E.; Marsh, D. J.; Ste. Márie, L.; Bernstein, I. L; Palmiter, R. D. : Ethanol consumption and resístance are inversely related to neuropeptide Y levels. Náture 396: 366-369, 1998.
17. Uusitupa, M. I. J.; Karvonen, M. K.; Pesonen, U.; Koulu, M. : Neuropeptide Y: a novel link between the neuroendocrine systém and cholesterol metabolísm. Ann. Med. 30:508-510, 1998.
·· ···· • · • ··· • ·
- 214 • · ·· ···
Odkazy pre časť týkajúcu sa NPYR1
1. Herzog, H.; Baumgartner, M.; Vivero, C.; Selbie, L. A.; Auer, B.; Shine, J. : Genomic organization, localization, and allelic differences in the gene for the human neuropeptide Y Y1 receptor. J. Biol. Chem. 268: 6703-6707, 1993.
2. Herzog, H.; Darby, K.; Balí, H.; Hort, Y.; Beck-Sickinger, A.; Shine, J.: Overlapping gene structure of the human neuropeptide Y receptor subtypes Y1 and Y5 suggests coordinate transcriptional regulation. Genomics 41: 315-319, 1997.
3. Herzog, H,; Hort, Y. J.; Balí, H. J.; Hayes, G.; Shine, J.; Selbie, L. A. : Cloned human neuropeptide Y receptor couples to two different second messenger Systems. Proc. Nat. Acad. Sci. 89: 5794-5798, 1992.
4. Larhammar, D.; Blomqvist, A. G.; Yee, F.; Jazin, E.; Yoo, H.; Wahlestedt, C. : Cloning and functional expression of a human neuropeptide Y/peptide YY receptor of the Y1 type. J. Biol. Chem. 267:10935-10938, 1992.
5. Lutz, C. M.; Frankel, W. N.; Richards, J. E.; Thompson, D. A. : Neuropeptide Y receptor genes on human chromosome 4q31-q32 map to conserved linkage groups on mouse chromosomes 3 and 8. Genomics 41:498-500,1997.
Odkazy pre časť týkajúcu sa NPYR2
1. Ammar, D. A.; Eadie, D. M.; Wong, D. J.; Ma, Y.-Y.; Kolakowski, L. F., Jr.; YangFeng, T. L.; Thompson, D. A.: Characterization of the human type 2 neuropeptide Y receptor gene (NPY2R) and localization to the chromosome 4q región containing the type 1 neuropeptide Y receptor gene. Genomics 38: 392-398, 1996.
2. Gerald, C.; Walker, M. W.; Vaysse, P. J.-J.; He, C.; Branchek, T. A.; Weinshank, R. L. : Expression cloning and pharmacological characterization of a human hippocampal neuropeptide Y/peptide YY Y2 receptor subtype. J. Biol. Chem. 270: 26758-26761, 1995.
• ·
- 215 • · ·· ···· ·· · · · · • · · · · ··· • ···· · · t · • · · · · ··· · ·· ··· • · · · • · · • · · • · « ·· ····
3. Lutz, C. M.; Frankel, W. N.; Richards, J. E.; Thompson, D. A. : Neuropeptide Y receptor genes on human chromosome 4q31-q32 map to conserved linkage groups on mouse chromosomes 3 and 8. Genomics 41: 498-500, 1997.
4. Rose, P. M.; Fernandes, P.; Lynch, J. S.; Frazier, S. T.; Fisher, S. M.; Kodukula,
K.; Kienzle, B.; Seethala, R.: Cloning and functional expression of a cDNA encoding a human type 2 neuropeptide Y receptor. J. Biol. Chem. 270: 22661-22664,1995.
Odkazy pre časť týkajúcu sa VIP
1. Bodner, M.; Fridkin, M.; Gozes, I. : Coding sequences for vasoactive intestinal peptide and PHM-27 peptide are located on two adjacent exons in the human genome. Proc. Nat. Acad. Sci. 82: 3548-3551, 1985.
2. Gotoh, E.; Yamagami, T.; Yamamoto, H.; Okamoto, H.: Chromosomal assignment of human VIP/PHM-27 gene to 6q26-q27 región by spot blot hybridization and in situ hybridization. Biochem. Int. 17: 555-562,1988.
3. Gozes, I.; Avidor, R.; Yahav, Y.; Katznelson, D.; Croce, C. M.; Huebner, K. : The gene encoding vasoactive intestinal peptide is located on human chromosome 6p216qter. Hum. Genet. 75: 41-44,1987.
4. Gozes, I.; Nakai, H.; Byers, M.; Avidor, R.; Weinstein, Y.; Shani, Y.; Shows, T. B.: Sequential expression in the nervous systém of C-MYB and VIP genes, located in human chromosomal región 6q24. Somat. Celí Moiec. Genet. 13:305-313,1987.
5. Heinz-Erian, P.; Dey, R. D.; Flux, M.; Said, S. I. : Deficient vasoactive intestinal peptide innervation in sweat glands of cystic fibrosis patients. Science 229: 14071408, 1985.
6. Itoh, N.; Obata, K.; Yanaihara, N.; Okamoto, H. : Human preprovasoactive intestinal polypeptíde contains a novel ΡΗΙ-27-like peptide, PHM-27. Náture 304: 547-549, 1983.
7. Linder, S.; Barkhem, T.; Norberg, A.; Persson, H.; Schalling, M.; Hokfelt, T.; Magnusson, G. : Structure and expression of the gene encoding the vasoactive intestinal peptide precursor. Proc. Nat. Acad. Sci. 84: 605-609, 1987.
9999
9
999 • · «9··
99
9 9 9
9 9 « 9 9 9 9
9 9 9 9
I ··· 99 9999
- 216 ~
8. Omary, M. B.; Kagnoff, M. F. : Identification of nuclear receptors for VIP on a human colonic adenocarcinoma celí line. Science 238:1578-1581,1987.
Odkazy pre časť týkajúcu sa ACE
1. Parma, J.; Stengel, D.; Gannage, M.-H.; Poyard, M.; Barouki, R.; Hanoune, J. : Sequence of a human brain adenylyl cyclase partial cDNA: evidence for a consensus cyclase domain. Biochem. Biophys. Res. Commun. 179:455-462,1991.
2. Stengel, D.; Parma, J.; Gannage, M.-H.; Roeckel, N.; Mattel, M.-G.; barouki, R.; Hanoune, J. : Different chromosomal localization of two adenylyl cyclase genes expressed in human brain. Hum. Genet. 90:126-130,1992.
odkazy pre časť týkajúcu sa VPAC1
1. Couvineau, A.; Rouyer-Fessard, C.; Darmoul, D.; Maoret, J.-J.; Carrero, I.; OgierDenis, E.; Laburthe, M. : Human intestinal VIP receptor: cloning and functional expression of two cDNA encoding proteins with different N-terminal domains. Biochem. Biophys. Res. Commun. 200:769-776,1994.
2. Hashimoto, H.; Nishino, A.; Shintani, N.; Hagihara, N.; Copeland, N. G.; Jenkins, N. A.; Yamamoto, K.; Matsuda, T.; Ishihara, T.; Nagata, S.; Baba, A. : Genomic organization and chromosomal location of the mouse vasoactive intestinal polypeptide 1 (VPAC-1) receptor. Genomics 58: 90-93,1999.
3. Libert, F.; Passage, E.; Parmentier, M.; Simons, M.-J.; Vassart, G.; Mattel, M.-G. : Chromosomal mapping of A1 and A2 adenosine receptors, VIP receptor, and a new subtype of serotonin receptor. Genomics 11: 225-227,1991.
4. Sreedharan, S. P.; Huang, J.-X.; Cheung, M.-C.; Goetzl, E. J. : Structure, expression, and chromosomal localization of the type I human vasoactive intestinal peptide receptor gene. Proc. Nat. Acad. Sci. 92: 2939-2943, 1995.
5. Sreedharan, S. P.; Patel, D. R.; Huang, J.-X.; Goetzl, E. J.: Cloning and functional expression of a human neuroendocrine vasoactive intestinal peptide receptor. Biochem. Biophys. Res. Commun. 193: 546-553, 1993.
• 9
9999
9999
9 9 999
99
9 9 9
9 9
217
6. Sreedharan, S. P.; Robichon, A.; Peterson, K. E.; Goetzl, E. J. : Cloning and expression of the human vasoactive intestinal peptide receptor. Proc. Nat. Acad. Sci. 88: 4986-4990,1991.
7. Vassart, G. : Persona! Communication. Brussels, Belgium, 1/15/1992. 8. Wenger, G. D.: Personál Communication. Cotumbus, Ohio, 8/3/1993.
Odkazy pre časť týkajúcu sa VPAC2
1. Adamou, J. E.; Aiyar, N.; Van Horn, S.; Elshourbagy, N. A.: Cloning and functionai characterization of the human vasoactive intestinal peptide (VIP)-2 receptor. Biochem. Biophys. Res. Commmun. 209:385-392,1995.
2. Mackay, M.; Fantes, J.; Scherer, S.; Boyle, S.; West, K.; Tsui, L.-C.; Bellorii, E.; Lutz, E.; Van Heyningen, V.; Harmar, A. J.: Chromosomal localization in mouse and human of the vasoactive intestinal peptide receptor type 2 gene: a possible contributor to the holoprosencephaly 3 phenotype. Genomics 37: 345-353, 1996.
3. Svoboda, M.; Tastenoy, M.; Van Rampeibergh, J.; Goossens, J.-F.; De Neef, P.; Waelbroeck, M.; Robberecht, P.: Molecular cloning and functionai characterization of a human VIP receptor from SUP-T1 lymphoblasts. Biochem. Biophy. Res. Commun. 205:1617-1624,1994.
- 218 • · ·· · • · · • ···· · • · ··· · ·· ···· • · · • · ··· • · · • · · ·· ··· ·· ·· • · · · • · · • · · · • · · ·· ····
Zoznam skratiek
FSD
FSAD
CAMP cGMP PCÄMP PCGMP ACAMP AcGMP ^CAMP ^cGMP TCAMP TcGMP 1:τσΑΜΡ 1:TcGMP I;AMCAMP I:AMcGMP U:AcAMP U:AcGMP
AC
A:AC
NEP
I: NEP
VIP
VlPr sexuálna dysfunkcia u žien porucha sexuálnej vzrušivosti u žien cyklický adenozín-3',5’-monofosfát cyklický guanozín-3',5 *-monofosfát potenciátor cAMP potenciátor cGMP aktivátor cAMP aktivátor cGMP negatívny negatívny modulátor modulátor cAMP cGMP inhibítor inhibítor inhibítor inhibítor inhibítor inhibítor pozitívny pozitívny cAMP cGMP inhibítoru cAMP inhibítoru cGMP negatívneho modulátoru cAMP negatívneho modulátoru cGMP regulátor aktivátoru cAMP regulátor aktivátoru cGMP adenylát cykláza aktivátor AC neutrálna inhibítor endopeptidáza
NEP vazoaktívny intestinálny peptid receptor VIP (môže byt tiež označený ako VIPR)
219 ···· · · ·· ···· • · • ··· ·· *· • · · · • · · • · · • * · ·· ····
VIPn = podtyp receptoru VIP (ako VIPR1, VIPR2)
A:VlPr = aktivátor VlPr
A:VIPn = aktivátor VIPn
I:VIPr = inhibítor VlPr
I:VIPn = inhibítor VIPn
I:I:VIPr = inhibítor inhibítoru VlPr
I:I:VIPn = inhibítor inhibítoru VIPn
PDE = fosfodiesteráza
PDEn = trieda PDE (napríklad PDE1, PDE2 apod.)
PDEcAMP = PDE hydrolyžujúca cAMP
pdecGMP = PDE hydrolyžujúca cGMP
I:PDE = inhibítor PDE
I;PDEcAMP = inhibítor PDE hydrolyzujúcej cAMP
1:PDECÄMP = inhibítor PDE triedy hydrolyzujúcej cAMP
NPY = neuropeptid Y
NPYr = receptor NPY (môže byť označený tiež ako NPYR)
NPYn = receptor NPY podtypu Yn (napríklad NPY Y (napríklad NPYR1)
I:NPY = inhibítor NPY
I:NPY Yn = inhibítor NPY Yn
kDa = kilodalton
bp = bázový pár (pár báz)
kb = 1000 bázových párov
·· ····

Claims (38)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Farmaceutická kompozícia na použitie pri liečení FSD, prednostne FSAD; vyznačujúca sa tým, že obsahuje činidlo schopné potencovať cAMP v pohlavných orgánoch ženy, ktorá trpí FSD, prednostne FSAD, ktoré je prípadne zmiešané s farmaceutický vhodným nosičom, riedidlom alebo excipientom, pričom činidlom je inhibítor PDE, I:PDE, kde PDE je PDE hydrolyžujúca cAMP a prípadne hydrolyžujúca cGMP.
  2. 2. Farmaceutická kompozícia podlá nároku 1, vyznačujúca sa tým, že činidlom je mediátor vazorelaxácie pohlavných orgánov, napríklad vagíny alebo klitorisu.
  3. 3. Farmaceutická kompozícia podlá nároku 1 alebo 2, vyznačujúca sa tým, že je kompozíciou na perorálne podávanie.
  4. 4. Farmaceutická kompozícia podlá niektorého z nárokov l až 3, vyznačujúca sa tým, že cAMP je endogénny cAMP.
  5. 5. Farmaceutická kompozícia podlá niektorého z nárokov laž4, vyznačujúca sa tým, že kompozícia sa podáva pred sexuálnou stimuláciou alebo počas nej.
  6. 6. Použitie činidla pri výrobe liečiva na liečenie FSD, prednostne FSAD; pričom toto činidlo je schopné potencovať cAMP v pohlavných orgánoch ženy, ktorá trpí FSD, prednostne FSAD, a týmto činidlom je I:PDE, kde PDE je PDE hy> drolyzujúca cAMP a prípadne hydrolyzujúca cGMP.
    221 « · «'· · • φ φ φ φφφφ • φ • ΦΦ φ ·· ···· • · • φφφ ··
  7. 7. Použitie podía nároku 6, pri ktorom je činidlom mediátor vazorelaxácie pohlavných orgánov, napríklad vagíny alebo klitorisu.
  8. 8. Použitie podlá nároku 6 alebo 7, pri ktorom je liečivom liečivo na perorálne podávanie.
  9. 9. Použitie podlá niektorého z nárokov 6 až 8, pri ktorom je cAMP endogénny cAMP.
  10. 10. Použitie podlá ktoréhokolvek z nárokov 6 až 9, pri ktorom sa kompozícia podáva pred sexuálnou stimuláciou alebo počas nej.
  11. 11. Spôsob liečenia žien, ako žien trpiacich FSD, prednostne FSAD, vyznačujúci sa tým, že sa žene podáva činidlo, ktoré je schopné potencovať cAMP v pohlavných orgánoch, v množstve, ktoré vyvoláva potenciáciu cAMP v pohlavných orgánoch ženy; pričom toto činidlo je prípadne zmiešané s farmaceutický vhodným nosičom, riedidlom alebo excipientom, a je ním I:PDE, kde PDE je PDE hydrolyzujúca cAMP a prípadne hydrolyzujúca cGMP.
  12. 12. Spôsob podlá nároku 11, vyznačujúci sa t ý m , že činidlom je mediátor vazorelaxácei pohlavných orgánov, napríklad vagíny alebo klitorisu.
  13. 13. Spôsob podlá nároku 11 alebo 12, vyznačujúci sa tým, že činidlo sa podáva perorálne.
  14. 14. Spôsob podlá niektorého z nárokov 11 až 13, vyznačujúci sa tým, že cAMP je endogénny cAMP.
    - 222 • ·
    99 · • · · • 9999 · ·· ···· • · 9 • · ··· • · · • · · ·· ··· ·· ··
    9 9 9 9
    9 9 9 ••9 ·
    9 9·
    99 ·999
  15. 15. Spôsob podía niektorého z nárokov 11 až 14, vyznačujúci sa tým, že kompozícia sa podáva pred sexuálnou stimuláciou alebo počas nej.
  16. 16. Spôsob identifikácie činidla, ktoré je možné použiť na liečenie FSD, predovšetkým FSAD, vyznačujúci sa tým, že sa stanoví či činidlo priamo alebo nepriamo potencuje cAMP, pričom potenciácia cAMP v prítomnosti činidla svedčí o tom, že činidlo môže byť užitočné pri liečení FSD, predovšetkým FSAD; a pričom takým činidlom je I:PDE, kde PDE je PDE hydrolyžujúca cAMP a prípadne hydrolyžujúca cGMP.
  17. 17. Spôsob, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa (a) stupeň, pri ktorom sa vykoná spôsob podía nároku 16;
    (b) stupeň, pri ktorom sa identifikuje jedno činidlo alebo väčší počet činidiel, ktoré priamo alebo nepriamo potencujú cAMP; a (c) stupeň, pri ktorom sa pripraví množstvo tohto činidla alebo väčšieho počtu činidiel;
    pričom týmto činidlom je I:PDE, kde PDE je PDE hydrolyzujúca cAMP a prípadne hydrolyzujúca cGMP.
  18. 18. Spôsob liečenia FSD, predovšetkým FSAD, potenciáciou cAMP in vivo pri použití činidla, vyznačujúci sa tým, že činidlo je schopné priamo alebo nepriamo potencovať cAMP pri skúške in vitro, pričom skúška in vitro sa vykonáva spôsobom podía nároku 16 a činidlom je I:PDE, kde PDE je PDE hydrolyzujúca cAMP a prípadne hydrolyzujúca cGMP.
    - 223
    ΦΦ φ • φ · • φφφφ • · ·· φ φ ·· ·ΜΦ • Φ Φ • · Φ φφ ο Φ • · · Φ • φ φ • · · Φ • · · • · φφ φ φ
  19. 19. Použitie činidla pri výrobe farmaceutickej kompozície na liečenie FSD, prednostne FSAD; pričom toto činidlo je pri skúške in vitro vykonávanej spôsobom podía nároku 16 schopné priamo alebo nepriamo potencovat cAMP, a pričom týmto činidlom je I:PDE, kde PDE je PDE hydrolyzujúca cAMP a prípadne hydrolyzujúca cGMP.
  20. 20. Činidlo identifikované spôsobom podlá nároku 16, pričom týmto činidlom je I;PDE, kde PDE je PDE hydrolyzujúca cAMP a prípadne hydrolyzujúca cGMP.
  21. 21. Činidlo podlá nároku 20 na použitie v lekárstve, pričom týmto činidlom je I:PDE, kde PDE je PDE hydrolyzujúca cAMP a prípadne hydrolyzujúca cGMP.
  22. 22. činidlo podlá nároku 21 na použitie pri liečení FSD, prednostne FSAD, pričom týmto činidlom je I:PDE, kde PDE je PDE hydrolyzujúca cAMP a prípadne hydrolyzujúca cGMP.
  23. 23. Liečivo na perorálne podávanie za účelom liečenia FSD, prednostne FSAD, vyznačujúce sa tým, že obsahuje činidlo podlá nároku 20, pričom týmto činidlom je I;PDE, kde PDE je PDE hydrolyzujúca cAMP a prípadne hydrolyzujúca cGMP.
  24. 24. Spôsob stanovenia diagnózy, vyznačujúci sa tým, že sa izoluje vzorka z ženského organizmu, stanoví sa, či vzorka obsahuje entitu prítomnú v takom množstve, aby vyvolávala FSD, prednostne FSAD; pričom táto entita má priamy alebo nepriamy účinok na hladinu alebo aktivitu cAMP v pohlavných orgánoch ženy a túto entitu je možné modulovat za účelom dosiahnutia pozitívneho účinku pomocou činidla, ktorým je I:PDE, kde PDE je PDE hydrolyzujúca cAMP a prípadne hydrolyzujúca cGMP.
    224 ···· · · • · • · • · · • · · ·· ··· • · ·· ····
  25. 25. Diagnostická kompozícia alebo kit, vyznačujúca sa tým, že obsahuje prostriedok na detekciu entity v izolovanej vzorke ženského organizmu, ktorú je možné použiť na stanovenie, či vzorka obsahuje entitu a či ju obsahuje v takom množstve, aby vyvolávala FSD, prednostne FSAD; pričom táto entita má priamy alebo nepriamy účinok na hladinu alebo aktivitu cAMP v pohlavných orgánoch ženy a túto entitu je možné modulovať za účelom dosiahnutia pozitívneho účinku pomocou činidla, ktorým je I:PDE, kde PDE je PDE hydrolyzujúca cAMP a prípadne hydrolyzujúca cGMP.
  26. 26. Zvierací model používaný na identifikáciu činidiel schopných liečiť FSD, prednostne FSAD, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa anestetizovanú samicu zvieraťa vrátane prostriedku na meranie zmien prekrvenia pohlavných orgánov, napríklad vagíny alebo klitorisu, tohto zvieraťa po stimulácii pelvického nervu; pričom činidlom je I:PDE, kde PDE je PDE hydrolyzujúca cAMP a prípadne hydrolyzujúca cGMP.
  27. 27. Spôsob identifikácie činidla, ktoré je schopné priamo alebo nepriamo potencovať cAMP za účelom liečenia FSD, prednostne FSAD, vyznačujúci sa tým, že sa zvieraciemu modelu podlá nároku 26 podáva činidlo, a merí sa akákolvek potenciácia cAMP a/alebo zvýšenie prekrvenia pohlavných orgánov, napríklad vagíny alebo klitorisu tohto zvieraťa; pričom činidlom je I:PDE, kde PDE je PDE hydrolyzujúca cAMP a prípadne hydrolyzujúca cGMP.
  28. 28. Činidlo identifikované spôsobom podlá nároku
    27, pričom týmto činidlom je I:PDE, kde PDE je PDE hydrolyzujúca cAMP a prípadne hydrolyzujúca cGMP.
  29. 29. Farmaceutická kompozícia na použitie pri liečení FSD, prednostne FSAD, vyznačujúca sa tým, • · ···· · ·» ···· • · • ··· ·· ·· • · · · • · ·
    225 že obsahuje činidlo, ktoré je prípadne zmiešané s farmaceutický vhodným nosičom, riedidlom alebo excipientom, pričom činidlom je I:PDE, kde PDE je PDE hydrolyžujúca cAMP a prípadne hydrolyzujúca cGMP.
  30. 30. Použitie činidla na výrobu liečiva, ako farmaceutickej kompozície na liečenie FSD, prednostne FSAD; pričom činidlom je I:PDE, kde PDE je PDE hydrolyzujúca cAMP a prípadne hydrolyzujúca cGMP.
  31. 31. Spôsob liečenia ženy trpiacej FSD, prednostne FSAD, vyznačujúci sa tým, že sa žene podáva činidlo, ktoré je prípadne zmiešané s farmaceutický vhodným nosičom, riedidlom alebo excipientom, pričom činidlom je I:PDE, kde PDE je PDE hydrolyzujúca cAMP a prípadne hydrolyzujúca cGMP.
  32. 32. Farmaceutická kompozícia na použitie pri zvyšovaní prekrvenia ženských pohlavných orgánov, napríklad vagíny alebo klitorisu, vyznačujúca sa tým, že obsahuje činidlo, ktoré je prípadne zmiešané s farmaceutický vhodným nosičom, riedidlom alebo excipientom, pričom činidlom je I:PDE, kde PDE je PDE hydrolyzujúca cAMP a prípadne hydrolyzujúca cGMP.
  33. 33. Použitie činidla pri výrobe liečiva, ako farmaceutickej kompozície, na zvyšovanie prekrvenia ženských pohlavných orgánov, napríklad vagíny alebo klitorisu, pričom týmto činidlom je I:PDE, kde PDE je PDE hydrolyzujúca cAMP a prípadne hydrolyzujúca cGMP.
  34. 34. Spôsob liečenia ženy trpiacej FSD, prednostne FSAD, alebo prevencie FSD, prednostne FSAD, vyznačujúci sa tým, že sa žene podáva činidlo, pričom týmto činidlom je I:PDE, kde PDE je PDE hydrolyzujúca cAMP a prípadne hydrolyzujúca cGMP.
    • · ·· ···· ·· ··· ··· ··· • · · · · ··· · · ······· · ··· · · • · ·· ···· ··· · ·· ··· ·· ···- 226
  35. 35. Vynález podlá ktoréhokolvek z nárokov 29 až 34, kde činidlo potencuje cAMP.
  36. 36. Vynález podlá ktoréhokolvek z predchádzajúcich nárokoch, kde cAMP je endogénny cAMP.
  37. 37. Vynález podlá ktoréhokolvek z predchádzajúcich nárokov, kde činidlom je I:PDE1 alebo I:PDE2 alebo I:PDE3 alebo I:PDE4 alebo I:PDE7 alebo I:PDE8.
  38. 38. Vynález podlá nárok 37, kde činidlom je I:PDE2.
SK1670-2000A 1999-11-08 2000-11-03 Zlúčeniny na liečenie sexuálnej dysfunkcie u žien SK16702000A3 (sk)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB9926437A GB9926437D0 (en) 1999-11-08 1999-11-08 Pharmaceutical
GB0004021A GB0004021D0 (en) 2000-02-18 2000-02-18 Pharmaceutical
GB0013001A GB0013001D0 (en) 2000-05-26 2000-05-26 Pharmaceutical
GB0016563A GB0016563D0 (en) 2000-07-05 2000-07-05 Pharmaceutical
GB0017141A GB0017141D0 (en) 2000-07-12 2000-07-12 Pharmaceutical

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK16702000A3 true SK16702000A3 (sk) 2002-07-02

Family

ID=27515922

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1671-2000A SK16712000A3 (sk) 1999-11-08 2000-11-03 Zlúčeniny na liečenie sexuálnej dysfunkcie u žien
SK1670-2000A SK16702000A3 (sk) 1999-11-08 2000-11-03 Zlúčeniny na liečenie sexuálnej dysfunkcie u žien
SK1672-2000A SK16722000A3 (sk) 1999-11-08 2000-11-03 Zlúčeniny na liečenie sexuálnej dysfunkcie u žien

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1671-2000A SK16712000A3 (sk) 1999-11-08 2000-11-03 Zlúčeniny na liečenie sexuálnej dysfunkcie u žien

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1672-2000A SK16722000A3 (sk) 1999-11-08 2000-11-03 Zlúčeniny na liečenie sexuálnej dysfunkcie u žien

Country Status (25)

Country Link
US (1) US6734186B1 (sk)
EP (5) EP1481667A1 (sk)
JP (9) JP2001247479A (sk)
KR (7) KR20010082544A (sk)
CN (5) CN1320426A (sk)
AT (1) ATE285249T1 (sk)
AU (6) AU781400B2 (sk)
BR (3) BR0005266A (sk)
CA (4) CA2323464A1 (sk)
CO (2) CO5680109A1 (sk)
CZ (3) CZ20004106A3 (sk)
DE (1) DE60016877T2 (sk)
DK (1) DK1097719T3 (sk)
EA (3) EA006254B1 (sk)
ES (1) ES2233297T3 (sk)
HK (3) HK1040626A1 (sk)
HU (4) HUP0004347A2 (sk)
IL (4) IL139457A0 (sk)
MY (2) MY141651A (sk)
NO (3) NO20005662L (sk)
NZ (4) NZ508011A (sk)
PE (4) PE20010925A1 (sk)
PL (3) PL343753A1 (sk)
PT (1) PT1097719E (sk)
SK (3) SK16712000A3 (sk)

Families Citing this family (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040014761A1 (en) * 1997-10-28 2004-01-22 Place Virgil A. Treatment of female sexual dysfunction with phosphodiesterase inhibitors
DK172900B1 (da) 1998-12-18 1999-09-27 Per Julius Nielsen Præparat samt kit til brug ved intraoculære operationer
US20050070499A1 (en) * 1999-11-08 2005-03-31 Pfizer Inc. Compounds for the treatment of female sexual dysfunction
US20020052370A1 (en) * 2000-07-06 2002-05-02 Barber Christopher Gordon Cyclopentyl-substituted glutaramide derivatives as inhibitors of neutral endopeptidase
CA2431747A1 (en) * 2000-12-15 2002-06-20 Alasdair Mark Naylor Treatment of male sexual dysfunction
HUP0303624A3 (en) 2001-03-28 2005-06-28 Pfizer N-phenpropylcyclopentyl-substituted glutaramide derivatives as nep inhibitors for fsad and process for preparation of the compounds
US6660756B2 (en) 2001-03-28 2003-12-09 Pfizer Inc. N-phenpropylcyclopentyl-substituted glutaramide derivatives as inhibitors of neutral endopeptidase
GB0111709D0 (en) * 2001-05-14 2001-07-04 Pfizer Ltd Novel pharmaceuticals
AR037097A1 (es) 2001-10-05 2004-10-20 Novartis Ag Compuestos acilsulfonamidas, composiciones farmaceuticas y el uso de dichos compuestos para la preparacion de un medicamento
HN2002000317A (es) * 2001-11-02 2003-05-21 Pfizer Inhibidores de pde9 para tratamiento de trastornos cardiovasculares
GB0219961D0 (en) 2002-08-28 2002-10-02 Pfizer Ltd Oxytocin inhibitors
GB0225908D0 (en) * 2002-11-06 2002-12-11 Pfizer Ltd Treatment of female sexual dysfunction
WO2004089953A1 (en) * 2003-03-04 2004-10-21 Altana Pharma Ag Purin-6-one-derivatives
JP4565193B2 (ja) 2003-04-23 2010-10-20 バレリタス， インコーポレイテッド 長い持続時間の医薬投与のための液圧作動式ポンプ
US7291640B2 (en) 2003-09-22 2007-11-06 Pfizer Inc. Substituted triazole derivatives as oxytocin antagonists
US7427611B2 (en) 2003-09-26 2008-09-23 Solvay Pharmaceuticals Gmbh Amidomethyl-substituted 1-(carboxyalkyl)-cyclopentyl-carbonylamino-benzazepine-N-acetic acid compounds, process and intermediate products for their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US7262184B2 (en) 2003-09-26 2007-08-28 Solvay Pharmaceuticals Gmbh Amidomethyl-substituted 1-(carboxyalkyl) cyclopentyl-carbonylamino-benzazepine-N-acetic acid compounds, process and intermediate products for their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US7452875B2 (en) 2003-09-26 2008-11-18 Solvay Pharmaceuticals Gmbh Amidomethyl-substituted 1-(carboxyalkyl) cyclopentyl-carbonylamino-benzazepine-N-acetic acid compounds, process and intermediate products for their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US20050267124A1 (en) * 2004-05-14 2005-12-01 Solvay Pharmaceuticals Gmbh Pharmaceutical compositions comprising NEP-inhibitors, inhibitors of the endogenous producing system and PDEV inhibiitors
US20050267072A1 (en) * 2004-05-14 2005-12-01 Solvay Pharmaceuticals Gmbh Pharmaceutical compositions containing dually acting inhibitors of neutral endopeptidase for the treatment of sexual dysfunction
WO2005123119A2 (en) * 2004-06-10 2005-12-29 Catalyst Biosciences, Inc. Administration of neutral endopeptidase to treat inflammatory bowel disease
US9089636B2 (en) 2004-07-02 2015-07-28 Valeritas, Inc. Methods and devices for delivering GLP-1 and uses thereof
WO2006100557A1 (en) 2005-03-21 2006-09-28 Pfizer Limited Substituted triazole derivatives as oxytocin antagonists
SG173319A1 (en) 2006-03-30 2011-08-29 Valeritas Inc Multi-cartridge fluid delivery device
WO2007143705A2 (en) 2006-06-06 2007-12-13 Intra-Cellular Therapies, Inc. Organic compounds
CA2707218A1 (en) 2007-12-06 2009-06-11 Intra-Cellular Therapies, Inc. Organic compounds
US8986253B2 (en) 2008-01-25 2015-03-24 Tandem Diabetes Care, Inc. Two chamber pumps and related methods
US8408421B2 (en) 2008-09-16 2013-04-02 Tandem Diabetes Care, Inc. Flow regulating stopcocks and related methods
CA2737461A1 (en) 2008-09-19 2010-03-25 Tandem Diabetes Care, Inc. Solute concentration measurement device and related methods
BRPI0922700A2 (pt) 2008-12-06 2015-08-11 Intracellular Therapies Inc Compostos orgânicos
JP5813511B2 (ja) 2008-12-06 2015-11-17 イントラ−セルラー・セラピーズ・インコーポレイテッドＩｎｔｒａ−Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ， Ｉｎｃ． 有機化合物
WO2010065147A1 (en) 2008-12-06 2010-06-10 Intra-Cellular Therapies, Inc. Organic compounds
US20130213393A1 (en) 2009-12-22 2013-08-22 Evoke Pharma, Inc. Nasal formulations of metoclopramide
US9468637B2 (en) 2009-05-13 2016-10-18 Intra-Cellular Therapies, Inc. Organic compounds
EP2456440B1 (en) 2009-07-22 2015-08-19 Merck Sharp & Dohme Corp. Quinolinone pde2 inhibitors
EP3284494A1 (en) 2009-07-30 2018-02-21 Tandem Diabetes Care, Inc. Portable infusion pump system
EP2590657A4 (en) 2010-05-31 2014-02-12 Intra Cellular Therapies Inc ORGANIC CONNECTIONS
EP2575817A4 (en) 2010-05-31 2014-01-08 Intra Cellular Therapies Inc ORGANIC CONNECTIONS
US9186321B2 (en) * 2011-12-05 2015-11-17 Suda Ltd. Oral spray formulations and methods for administration of sildenafil
US9180242B2 (en) 2012-05-17 2015-11-10 Tandem Diabetes Care, Inc. Methods and devices for multiple fluid transfer
US9381297B2 (en) 2012-06-07 2016-07-05 Tandem Diabetes Care, Inc. Sealed infusion device with electrical connector port
EP2956141A4 (en) 2013-02-17 2016-10-26 Intra Cellular Therapies Inc NEW USES
US9173998B2 (en) 2013-03-14 2015-11-03 Tandem Diabetes Care, Inc. System and method for detecting occlusions in an infusion pump
WO2015096651A1 (en) 2013-12-23 2015-07-02 Merck Sharp & Dohme Corp. Pyrimidone carboxamide compounds as pde2 inhibitors
US9546175B2 (en) 2014-08-07 2017-01-17 Intra-Cellular Therapies, Inc. Organic compounds
US10131671B2 (en) 2014-08-07 2018-11-20 Intra-Cellular Therapies, Inc. Organic compounds
US10285992B2 (en) 2014-08-07 2019-05-14 Intra-Cellular Therapies, Inc. Combinations of PDE1 inhibitors and NEP inhibitors and associated methods
WO2016145614A1 (en) 2015-03-17 2016-09-22 Merck Sharp & Dohme Corp. Triazolyl pyrimidinone compounds as pde2 inhibitors
US10287269B2 (en) 2015-03-26 2019-05-14 Merck Sharp & Dohme Corp. Pyrazolyl pyrimidinone compounds as PDE2 inhibitors
EP3291817B1 (en) 2015-05-05 2019-10-02 Merck Sharp & Dohme Corp. Heteroaryl-pyrimidinone compounds as pde2 inhibitors
WO2016183741A1 (en) 2015-05-15 2016-11-24 Merck Sharp & Dohme Corp. Pyrimidinone amide compounds as pde2 inhibitors
WO2016191935A1 (en) 2015-05-29 2016-12-08 Merck Sharp & Dohme Corp. 6-alkyl dihydropyrazolopyrimidinone compounds as pde2 inhibitors
WO2016192083A1 (en) 2015-06-04 2016-12-08 Merck Sharp & Dohme Corp. Dihydropyrazolopyrimidinone compounds as pde2 inhibitors
WO2016209749A1 (en) 2015-06-25 2016-12-29 Merck Sharp & Dohme Corp. Substituted pyrazolo/imidazolo bicyclic compounds as pde2 inhibitors
WO2017000276A1 (en) 2015-07-01 2017-01-05 Merck Sharp & Dohme Corp. Bicyclic heterocyclic compounds as pde2 inhibitors
WO2017000277A1 (en) 2015-07-01 2017-01-05 Merck Sharp & Dohme Corp. Substituted triazolo bicycliccompounds as pde2 inhibitors
ES2971969T3 (es) 2015-07-07 2024-06-10 H Lundbeck As Inhibidores de PDE9 con cadena principal de imidazopirazinona para el tratamiento de enfermedades periféricas
US10492141B2 (en) 2015-11-17 2019-11-26 Tandem Diabetes Care, Inc. Methods for reduction of battery usage in ambulatory infusion pumps
WO2017172795A1 (en) 2016-03-28 2017-10-05 Intra-Cellular Therapies, Inc. Novel compositions and methods
WO2017168174A1 (en) 2016-04-02 2017-10-05 N4 Pharma Uk Limited New pharmaceutical forms of sildenafil
EP3554489A4 (en) 2016-12-15 2020-06-17 Evoke Pharma, Inc. TREATMENT OF MODERATE AND SERIOUS GASTROPARESIS
US11839614B2 (en) 2018-01-31 2023-12-12 Intra-Cellular Therapies, Inc. Methods for treating or mitigating cardiotoxicity characterized by inhibition of adenosine A2 signaling and/or adenosine A2 receptor expression
MA52792A (fr) 2018-05-25 2021-04-14 Imara Inc Formes cristallines et monohydrate de 6- [(3s,4s)-4-méthyl-1-(pyrimidin-2-ylméthyl) pyrrolidin-3-yl]-3-tétrahydropyran-4-yl-7h-imidazo [1,5-a] pyrazin-8-one
CN112639999B (zh) * 2018-07-05 2025-03-14 波士顿科学国际有限公司 确定炎症和/或纤维化的设备、系统和方法
KR20250108770A (ko) 2018-08-31 2025-07-15 카듀리온 파마슈티칼스, 인크. 겸상 세포 질환의 치료를 위한 pde9 억제제
CN114533740B (zh) * 2022-02-10 2024-04-12 广州威生医药科技有限公司 一种公猪气味剂组合物及其应用
CN115944584A (zh) * 2023-01-18 2023-04-11 南京诺令生物科技有限公司 一种妇科用凝胶产品及制备方法和应用

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4666908A (en) * 1985-04-05 1987-05-19 Warner-Lambert Company 5-Substituted pyrazolo[4,3-d]pyrimidine-7-ones and methods of use
KR880007441A (ko) * 1986-12-11 1988-08-27 알렌 제이.스피겔 스피로-치환된 글루타르아미드 이뇨제
US4749717A (en) * 1987-01-08 1988-06-07 Smithkline Beckman Corporation Dopamine-beta-hydroxylase inhibitors
WO1991004042A1 (en) * 1989-09-18 1991-04-04 Senetek, Plc Method for inducing vaginal lubrication
US5380758A (en) 1991-03-29 1995-01-10 Brigham And Women's Hospital S-nitrosothiols as smooth muscle relaxants and therapeutic uses thereof
GB9514465D0 (en) 1995-07-14 1995-09-13 Glaxo Lab Sa Chemical compounds
US6143746A (en) 1994-01-21 2000-11-07 Icos Corporation Tetracyclic cyclic GMP-specific phosphodiesterase inhibitors, process of preparation and use
US5612314A (en) 1995-04-21 1997-03-18 Brigham & Women's Hospital Nitrosylated neuropeptides
DE19541264A1 (de) * 1995-11-06 1997-05-07 Bayer Ag Purin-6-on-derivate
AU7692696A (en) * 1995-12-01 1997-06-27 Novartis Ag Heteroaryl derivatives
US5798246A (en) 1996-03-25 1998-08-25 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Cyclic nucleotide phosphodiesterase
GB9608408D0 (en) * 1996-04-23 1996-06-26 Adams Michael A Treatment of erectile dysfunction
ATE230403T1 (de) * 1996-07-23 2003-01-15 Neurogen Corp Einige amido- und ammo- substituierte benzylaminderivate: eine neue klasse von neuropeptid y1 spezifische ligande
US5958926A (en) 1996-11-01 1999-09-28 Nitromed, Inc. Nitrosated and nitrosylated phosphodiesterase inhibitor compounds, compositions and their uses
US6331543B1 (en) * 1996-11-01 2001-12-18 Nitromed, Inc. Nitrosated and nitrosylated phosphodiesterase inhibitors, compositions and methods of use
US6043252A (en) 1997-05-05 2000-03-28 Icos Corporation Carboline derivatives
US20020004529A1 (en) * 1997-10-20 2002-01-10 Gary W. Neal Methods, compositions, and kits for enhancing female sexual desire and responsiveness
US5965718A (en) * 1997-10-24 1999-10-12 The Scripps Research Institute Analogs of sarcodictyin and eleutherobin
GB9722520D0 (en) * 1997-10-24 1997-12-24 Pfizer Ltd Compounds
JP2001520999A (ja) * 1997-10-28 2001-11-06 アシビ， エルエルシー 女性の性的機能不全の処置
AUPP010397A0 (en) * 1997-10-30 1997-11-20 Vaisman, Jakov Method and composition for treatment of sexual dysfunction
CA2309332C (en) * 1997-11-12 2002-12-03 Bayer Aktiengesellschaft 2-phenyl substituted imidazotriazinones as phosphodiesterase inhibitors
CA2314369A1 (en) * 1997-12-18 1999-06-24 Nathan Earl Scott Prostaglandin e2/f2.alpha. combination for treating impotence and enhancing sexual arousal
CA2339630C (en) 1998-09-16 2006-05-23 Icos Corporation Carboline derivatives as cgmp phosphodiesterase inhibitors
US6486207B2 (en) * 1998-12-10 2002-11-26 Nexmed (Holdings), Inc. Compositions and methods for amelioration of human female sexual dysfunction
US20020169101A1 (en) * 1999-05-10 2002-11-14 Gonzalez Maria Isabel Treatment of sexual dysfunction
US20020052370A1 (en) * 2000-07-06 2002-05-02 Barber Christopher Gordon Cyclopentyl-substituted glutaramide derivatives as inhibitors of neutral endopeptidase

Also Published As

Publication number Publication date
MY140534A (en) 2009-12-31
CZ20004106A3 (cs) 2002-04-17
NO20005662L (no) 2001-05-09
KR20040074021A (ko) 2004-08-21
NO20005661L (no) 2001-05-09
CO5680109A1 (es) 2006-09-29
HUP0004350A2 (hu) 2001-06-28
EA200001042A3 (ru) 2002-04-25
AU781403B2 (en) 2005-05-19
AU7141100A (en) 2001-05-10
CN1322526A (zh) 2001-11-21
PL343754A1 (en) 2001-05-21
JP2005021167A (ja) 2005-01-27
SK16712000A3 (sk) 2002-07-02
IL139457A0 (en) 2001-11-25
PE20010926A1 (es) 2001-09-15
EA200001042A2 (ru) 2001-12-24
CO5680108A1 (es) 2006-09-29
EA200001044A2 (ru) 2001-12-24
HU0004350D0 (sk) 2001-01-29
SK16722000A3 (sk) 2002-09-10
CA2324484A1 (en) 2001-05-08
NZ508007A (en) 2002-06-28
NZ508011A (en) 2002-06-28
AU7140700A (en) 2001-05-17
EP1097719A1 (en) 2001-05-09
PE20010924A1 (es) 2001-09-13
EA200001044A3 (ru) 2002-04-25
KR20010082544A (ko) 2001-08-30
EA200001043A3 (ru) 2002-04-25
AU781400B2 (en) 2005-05-19
NO20005662D0 (no) 2000-11-07
NZ508006A (en) 2002-06-28
NZ508012A (en) 2002-06-28
JP2005013237A (ja) 2005-01-20
ES2233297T3 (es) 2005-06-16
CN1575816A (zh) 2005-02-09
KR20010086267A (ko) 2001-09-10
KR20040074022A (ko) 2004-08-21
BR0005266A (pt) 2003-04-08
AU7140800A (en) 2001-05-17
HK1040626A1 (zh) 2002-06-21
CZ20004110A3 (cs) 2002-04-17
AU7140900A (en) 2001-05-10
CA2323191A1 (en) 2001-05-08
CN1320426A (zh) 2001-11-07
PE20010817A1 (es) 2001-08-14
CN1328824A (zh) 2002-01-02
EA200001043A2 (ru) 2001-12-24
HU0004349D0 (sk) 2001-01-29
HK1041646A1 (zh) 2002-07-19
DE60016877D1 (de) 2005-01-27
DE60016877T2 (de) 2005-12-15
JP2005043377A (ja) 2005-02-17
JP2001247478A (ja) 2001-09-11
JP2001206855A (ja) 2001-07-31
AU781186B2 (en) 2005-05-12
HU0004347D0 (sk) 2001-01-29
JP2005070055A (ja) 2005-03-17
CZ20004107A3 (cs) 2002-04-17
AU2005202166A1 (en) 2005-06-16
HUP0004347A2 (hu) 2001-06-28
DK1097719T3 (da) 2005-03-29
KR20010082545A (ko) 2001-08-30
PL343755A1 (en) 2001-05-21
EP1097719B1 (en) 2004-12-22
HUP0004349A2 (hu) 2001-06-28
EP1097707A1 (en) 2001-05-09
IL139455A0 (en) 2001-11-25
HUP0004348A2 (hu) 2001-06-28
IL139456A0 (en) 2001-11-25
JP2001213802A (ja) 2001-08-07
US6734186B1 (en) 2004-05-11
EP1097706A1 (en) 2001-05-09
HU0004348D0 (sk) 2001-01-29
EA006242B1 (ru) 2005-10-27
JP2001247479A (ja) 2001-09-11
KR20040074023A (ko) 2004-08-21
BR0005299A (pt) 2003-04-15
IL139454A0 (en) 2001-11-25
NO20005661D0 (no) 2000-11-07
AU2005202750A1 (en) 2005-07-21
EA006254B1 (ru) 2005-10-27
ATE285249T1 (de) 2005-01-15
PL343753A1 (en) 2001-05-21
EP1481667A1 (en) 2004-12-01
CA2323183A1 (en) 2001-05-08
CA2323464A1 (en) 2001-05-08
NO20005618L (no) 2001-05-09
JP2005350482A (ja) 2005-12-22
PT1097719E (pt) 2005-04-29
MY141651A (en) 2010-05-31
EP1097718A1 (en) 2001-05-09
CN1636597A (zh) 2005-07-13
HK1040627A1 (zh) 2002-06-21
PE20010925A1 (es) 2001-09-17
BR0005276A (pt) 2003-04-08
KR20010051481A (ko) 2001-06-25
NO20005618D0 (no) 2000-11-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK16702000A3 (sk) Zlúčeniny na liečenie sexuálnej dysfunkcie u žien
HUP0400528A2 (hu) Neuropeptidáz Y inhibitor alkalmazása férfiak szexuális funkciózavarának kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására
US20050020547A1 (en) Compounds for the treatment of female sexual dysfunction
AU2005201482A1 (en) Compounds for the treatment of female sexual dysfunction