[go: up one dir, main page]

HUP0400528A2 - Neuropeptidáz Y inhibitor alkalmazása férfiak szexuális funkciózavarának kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására - Google Patents

Neuropeptidáz Y inhibitor alkalmazása férfiak szexuális funkciózavarának kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására Download PDF

Info

Publication number
HUP0400528A2
HUP0400528A2 HU0400528A HUP0400528A HUP0400528A2 HU P0400528 A2 HUP0400528 A2 HU P0400528A2 HU 0400528 A HU0400528 A HU 0400528A HU P0400528 A HUP0400528 A HU P0400528A HU P0400528 A2 HUP0400528 A2 HU P0400528A2
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
npy
med
inhibitor
treatment
npyi
Prior art date
Application number
HU0400528A
Other languages
English (en)
Inventor
Pieter Hadewijn Graaf
Alasdair Mark Naylor
Christopher Peter Wayman
Original Assignee
Pfizer Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB0030647A external-priority patent/GB0030647D0/en
Priority claimed from GB0108730A external-priority patent/GB0108730D0/en
Priority claimed from GB0109910A external-priority patent/GB0109910D0/en
Priority claimed from GB0111037A external-priority patent/GB0111037D0/en
Priority claimed from US09/895,367 external-priority patent/US20020028799A1/en
Priority claimed from US09/905,846 external-priority patent/US6878529B2/en
Priority claimed from GB0120679A external-priority patent/GB0120679D0/en
Application filed by Pfizer Inc. filed Critical Pfizer Inc.
Publication of HUP0400528A2 publication Critical patent/HUP0400528A2/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/165—Amides, e.g. hydroxamic acids having aromatic rings, e.g. colchicine, atenolol, progabide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/17—Amides, e.g. hydroxamic acids having the group >N—C(O)—N< or >N—C(S)—N<, e.g. urea, thiourea, carmustine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/18—Sulfonamides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/196—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino group being directly attached to a ring, e.g. anthranilic acid, mefenamic acid, diclofenac, chlorambucil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/4015—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. piracetam, ethosuximide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/433—Thidiazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4412—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/4523—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/454—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pimozide, domperidone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/10—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for impotence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/689—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to pregnancy or the gonads
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/34—Genitourinary disorders
    • G01N2800/344—Disorders of the penis and the scrotum and erectile dysfuncrion

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)

Abstract

A találmány tárgya neuropeptid Y (NPY) inhibitor, előnyösen NPY Y'-receptor-inhibitor - amely szelektív hím genitáliákkal asszociált NPY-vagy NPY Y'-receptorokra -, alkalmazása férfi erekciós funkciózavar(<male erectile dysfunction<; MED) kezelésére vagy megelőzésérealkalmas gyógyszer előállítására/készítésére. Ó

Description

P 04 00 5 2 8 /7,9 2 'V /LeJmc2< ' 'X—
L Cetére pepúcÍa_2_ / inhibuJcAférfiak szexuális funkciózavarának kezelésére a lua, s .c)Niji·^«ele. <MI( k'k/'n.'v KÖZZÉTÉTELI PÉLDÁNY
A találmány tárgyát hatóanyagok és gyógyászati készítmények képezik, amelyek alkalmasak férfiak szexuális funkciózavarának {“male sexual disfunction ', MSD), közelebb- ről merevedési (erekciós) zavarának {“male erectile disfunction’', MED) kezelésére és/vagy megelőzésére.
A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás MSD, közelebbről MED megelőzésére és/vagy kezelésére.
A találmány tárgyát képezi továbbá vizsgálati eljárás MSD, közelebbről MED kezelő lésére alkalmas vegyül etek szűrésére.
A könnyebb értelmezhetőség kedvéért, a leírásban alkalmazott rövidítéseket egybegyűjtve, a szabadalmi igénypontok előtt ismertetjük.
A szexuális funkciózavar (”sexual disfunction’’’·, SD) jelentős klinikai probléma, amely férfiakat és nőket egyaránt érinthet. Az SD oka lehet organikus vagy pszichológiai.
Az organikus SD-t jellemzően a háttérben meghúzódó érbetegségek okozzák, mint amelyek a magas vérnyomáshoz és cukorbetegséghez társulnak, vagy előírásszerűén szedett gyógyszerek, és/vagy pszichiátriai betegségek, mint például depresszió. Pszichológiai tényezők közé tartozik a félelem, az elvárt teljesítmény miatti szorongás, valamint interperszonális konfliktus. Az SD gátolja a szexuális teljesítményt, csökkenti az önbizalmat, ront- ja a személyes kapcsolatokat, ezáltal személyiségzavarhoz vezet. A klinikai gyakorlatban az SD rendellenességeket nők szexuális funkciózavarára {“female sexual disorder, FSD) és férfiak szexuális funkciózavarára {“male sexual disfunction, MSD) osztjuk [Melman és mtsai.: (1999)]. Az FSD leginkább úgy határozható meg, mint a nő számára annak nehézsége vagy lehetetlensége, hogy szexuális expresszióban kielégülést találjon. Az MSD álta-
Iában merevedési zavarral kapcsolatos, amelyet mint férfiak merevedési funkciózavarát (finale erectile disfunction’’’, MED) ismerünk [Benet és mtsai.: (1994)].
Férfiak merevedési funkciózavarát, más néven férfiak merevedési (erekciós) rendellenességét az alábbiak szerint határozhatjuk meg:
“kielégítő szexuális teljesítményhez szükséges hímvessző-merevedés elérésére és/vagy fenntartására való képtelenség” [”NIH Concensus Development Panel on Impotence” (1993)].
Becslések szerint, a különböző fokú (enyhe, mérsékelt és teljes impotencia) merevedési zavarok előfordulása a 40-70 éves férfiak körében 52%, a 70 év felettiek esetében magasabb [Melman és mtsai.: (1999)]. Ez az állapot jelentős negatív hatással bír az egyén és partnere életminőségére, gyakran okozva fokozott idegességet és feszültséget, amely depresszióhoz és csökkent önbizalomhoz vezet. Míg két évtizeddel ezelőtt a MED-et elsősorban pszichológiai rendellenességnek tartották [Benet és munkatársai, (1994)], ma már tudjuk, hogy az egyének többségénél a háttérben valamely szervi ok mutatható ki. Ennek a felismerésnek eredményeképp, nagymérvű előrehaladás történt a normális hímvesszőmerevedés mechanizmusa és a MED patofiziológiai hátterének felderítése vonatkozásában.
A hímvessző merevedése hemodinamikai történés, amely a hímvessző barlangos testének simaizomzata és erezete összehúzódásának és elernyedésének az egyensúlyától függ [Lemer és mtsai.: (1993)]. A leírásban a ’’barlangos test simaizomzata” kifejezés mellett alkalmazzuk a korporális simaizom, vagy többes számban a corpus cavernosa kifejezést. A barlangos testek simaizomzatának elernyedése fokozott vérbeáramlást eredményez a barlangos testek gerendás üregeibe, azok nekifeszülnek a környező buroknak, és elszorítják az elvezető vénákat. Ez helyi vérnyomás-emelkedést okoz, amely erekciót (merevedést) eredményez [Naylor: (1998)].
Az erekció során történő változások összetettek, és azokhoz a perifériás és központi idegrendszer, valamint a belső-elválasztású mirigyrendszer magas szintű koordinált szabályozása szükséges [Naylor: (1998)]. A korporális simaizom összehúzódását szimpatikus noradrenerg beidegzés közvetíti posztszinaptikus oci-adrenoceptorok aktiválásán keresztül. A MED összefügghet a barlangos testek simaizomzata endogén tónusának az emelkedésével. A barlangos testek simaizomzata elernyedésének a folyamatát azonban részben nemadrenerg, nem-kolinerg (non-adrenergic non-cholinergic”, NANC) neurotranszmisszió közvetíti. A hímvesszőben a nitrogénoxid (NO) neurotranszmittereken kívül számos más NANC-neurotranszmitter van jelen, például a kalcitonin-génnel összefüggő peptid (^calcitonin gene related pepiidé1, CGRP), vagy a vazoaktív intesztinális peptid (VIP). Az elernyedést közvetítő fő relaxáló faktor a nitrogénoxid (NO), ami L-argininből nitrogénoxid-szintetáz (NOS) révén szintetizálódik [Taub és mtsai: (1993); Chuang és mtsai: (1998)]. Feltevések szerint, a korporális simaizomtónus csökkentése segítheti a NO-t a barlangos test elernyedésének kiváltásában. Férfiak szexuális izgalma során NO szabadul fel a neuronokból és az endothéliumból, majd köti és aktiválja a simaizomsejtekben és endothéliumban található szolúbilis guanilciklázt (sGC), ami az intracelluláris ciklikus guanozin 3',5'-monofoszfát (cGMP) szint emelkedéséhez vezet. A cGMP-emelkedés az intracelluláris kalciumkoncentráció ([Ca ]j) csökkenésén keresztül a barlangos test elernyedéséhez vezet eddig felderítetlen mechanizmusok révén, amelyekről feltételezzük, hogy proteinkináz-G aktiválással járnak [valószínűleg Ca2+-pumpák aktiválása és Ca2+ által aktivált K+-csatomák révén; Chuang és mtsai.: (1998)].
A Pfizer nemrégen fejlesztette ki a szildenafil-citrátot (más néven Viagra™), az első MED kezelésére alkalmas, szájon át adható készítményt. A szildenafil úgy hat, hogy gátolja a cGMP lebomlását a barlangos testben azáltal, hogy szelektív módon gátolja a foszfodieszteráz-5 (PDE5) enzimet, ezzel korlátozva a cGMP hidrolízisét 5'GMP-vé [Boolel és mtsai.: (1996); Jeremy és mtsai.: (1997)], növelve a cGMP intracelluláris koncentrációját, és segítve a barlangos test simaizomzatának elernyedését.
Napjainkban, minden más kereskedelemben hozzáférhető MED-terápia, például prosztaglandin-alapú vegyületekkel, mint például alprostadillal történő kezelés - amely intrauretrálisan beadható (hozzáférhető a Vivus Inc. cégtől Muse™ néven) vagy kis tűvel injektálható (Pharmacia & Upjohn; Caverject™) - vagy kényelmetlen és/vagy invazív. További kezelési lehetőségek a vákuumos összehúzó készülék alkalmazása, vazoaktív drogok injektálása, vagy hímvesszőprotézisek beültetése [Montague és mtsai.: (1996)]. Bár az injektálható vazoaktív drogok igen hatásosak, gyakoriak az olyan mellékhatások, mint például hímvesszőfájdalom, fibrózis és priapizmus; ezen felül, az injekciós terápia nem olyan kényelmes, mint az orális terápia, ezért napjainkban a szildenafil alkalmazása jelenti a legelőnyösebb hozzáférhető terápiás megoldást.
A fentiek alapján szükség mutatkozik új eljárások kidolgozására férfiakban kialakuló szexuális funkciózavarok, közelebbről MED kezelésére.
A találmány szerinti megoldás azon az eredeti megfigyelésen alapul, hogy szexuális funkciózavarban szenvedő férfiak szelektív kezelésére alkalmazhatunk neuropeptid-Yinhibitort (NPYi), előnyösen NPY Y1-receptorinhibitort anélkül, hogy a kezelés következményeképp perifériás mellékhatások jelentkeznének. Meglepő módon azt találtuk, hogy NPY, előnyösen NPY Yí gátlása neuropeptid-Y-inhibitorral - továbbiakban NPYi - jelentősen fokozza az idegi úton stimulált erektilis folyamatokat. A leírásban az I:NPY és NPYi, I:NPY Y1 és NPY Yli kifejezéseket felcserélhető módon használjuk.
A „perifériás mellékhatások kiváltása nélkül” kifejezésen azt értjük, hogy az NPYi, előnyösen a NPY Yli nem hat, vagy lényegében hat a szív-érrendszerre (kardiovaszkuláris rendszerre). Az NPYi, előnyösen NPY Yli tehát inaktív a szív-érrendszerben, csökkentve vagy kiküszöbölve az NPYi, előnyösen NPY Yli szisztémás úton (például szájon át) történő adagolását követően a szív-érrendszeri események, például vérnyomásesés bekövetkeztének kockázatát. Perifériás mellékhatásokon az NPY-, előnyösen NPY Y1-receptor genitáliákon (nemi szerveken) és/vagy központi idegrendszeren kívül eső helyeken történő gát4
lásából eredő mellékhatásokat értünk. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, az NPYi, előnyösen a NPY Yli a genitáliákban található NPY-, előnyösen, NPY Ylreceptorokon felül centrális hatást is kifejt a központi idegrendszerben, miáltal alkalmas lehet rendellenes italozási vagy táplálékfelvételi zavarok, például elhízás, anorexia, bulimia (beteges éhség) vagy anyagcserezavarok hatékony kezelésére. A találmány szerinti megoldással összhangban azonban, az NPYi, előnyösen a NPY Yli alkalmazása a genitáliákkal kapcsolatos aktivitáson kívül nem vált ki, vagy lényegében nem vált ki perifériás aktivitást, azaz szív-érrendszeri és/vagy gyomor-bélrendszeri (gasztrointesztinális) hatást. A hatást tehát szisztémás szelektivitás jellemzi a genitáliákra, bár bizonyos aktivitás jelentkezhet a központi idegrendszerben is.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát neuropeptid-Y- (NPY-) inhibitor, előnyösen NPY Y1-inhibitor alkalmazása képezi amelynek hatása szelektív, vagy nagymértékben szelektív a hím genitáliákkal asszociált NPY- vagy NPY Y1-receptorokra -, férfiakban jelentkező szexuális funkciózavar, közelebbről MED kezelésére.
A találmány tárgyát képezi neuropeptid-Y- (NPY-), előnyösen NPYY1receptorihibitor alkalmazása - amelynek hatása szelektív, vagy nagymértékben szelektív a hím genitáliákkal asszociált NPY- vagy NPY Y1-receptorokra -, idegi úton stimulált erekciós folyamatok erősítésére.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a férfi szexuális funkciózavar, közelebbről MED kezelésére alkalmazott NPY/NPY Y1-inhibitorok IC50-értéke kisebb mint 100 nanomol/1 (nmol/1), előnyösen kisebb mint 75 nmol/1, előnyösebben kisebb mint 50 nmol/1.
„Szelektív” kifejezésen azt értjük, hogy a találmány szerinti NPY-inhibitor több mint körülbelül 100-szor, előnyösebben, több mint körülbelül 300-szor szelektívebb módon hat NPY-, közelebbről NPY Y1-receptorokra a hím genitáliákon, előnyösen a barlangos testben, mint az NPY Y2- vagy NPY Y5-receptorokra. Előnyösen, az NPYi vagy NPY Yli nem hat, vagy lényegében nem hat NEP-endopeptidázra (EC 3.4.24.11) és/vagy angiotenzin-konvertáló enzimre (ACE). Előnyösen, a találmány szerinti NPY- vagy NPY Yl-inhibitor nem hat endothelin-konvertáló enzimre (ECE). Ennek megfelelően, az NPY- vagy NPY Y1-inhibitorok több mint 300-szor, előnyösebben több mint 500-szor, még előnyösebben több mint 1000-szer szelektívebb módon hatnak NPY/NPY Y1-, mint NÉP- és/vagy ACE-enzimekre. Szintén előnyösen, az NPYi több mint 1000-szer szelektívebb NPY/NPY Y1-re, mint ECE-re. Ez, az NPYi, előnyösen NPY Yli szisztémás úton <1 (például szájon át) történő adagolását követően csökkenti a szív-érrendszeri események, például vérnyomásesés bekövetkeztének kockázatát. A „szelektív módon” kifejezés a fentieknek megfelelően értelmezendő.
A leírás szerinti értelemben „nagymértékben szelektív” kifejezésen azt értjük, hogy a 5 találmány szerinti NPY/NPY Y1-inhibitorok több mint körülbelül 400-szor, előnyösen legalább körülbelül 500-szor, előnyösebben legalább körülbelül 600-szor, még előnyösebben legalább körülbelül 700-szor, még előnyösebben legalább körülbelül 800-szor, még előnyösebben legalább körülbelül 900-szor, még előnyösebben legalább körülbelül 1000szer szelektívebb módon hatnak NPY-, közelebbről NPY Y1-receptorokra hím genitáliá10 kon (előnyösen a barlangos testben), mint NPY Y2- vagy NPY Y5-receptorokra. Előnyösen, az NPYi vagy NPY li nem hat, vagy lényegében nem hat NNEP és/vagy ACE és/vagy ECE-enzimekre. A „nagymértékben szelektív” kifejezés a fentieknek megfelelően értelmezendő.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, férfi szexuális funkciózavar, 15 közelebbről MED kezelésére alkalmazott NPY-inhibitorok, előnyösen NPY Y1-inhibitorok hatása nagymértékben szelektív a reproduktív rendszerre. Az NPY-inhibitor, előnyösen NPY Yli-inhibitor alkalmazása tehát lokalizált hatást vált ki a genitáliákon, és/vagy nem hat, vagy lényegében nem hat a szív-érrendszerre. Ez, az NPYi, előnyösen NPY Yli szisztémás úton (például szájon át) történő adagolását követően csökkenti a szív-érrendszeri 20 események (például vérnyomásesés) bekövetkeztének kockázatát.
A találmány tárgyát képezi továbbá NPYi, előnyösen NPY Yli alkalmazása MED szelektív kezelésére és/vagy szelektív megelőzésére alkalmas gyógyszer készítésére.
A találmány tárgyát képezi továbbá NPYi, előnyösen NPY Yli alkalmazása MED szelektív kezelésére és/vagy szelektív megelőzésére alkalmas gyógyszer előállítására. Eb25 ben az összefüggésben, az NPYi vagy NPY Yli alkalmazható például egy találmány szerinti hatóanyag előállítására; és/vagy - előkészítő lépésként - annak azonosítására; és/vagy módosítására.
Az NPY-nek tulajdonított funkció a hímvesszőben a vénák elzáródásának előidézése, amely a hímvessző szintjén következik be, és a merevedés fenntartását szolgálja. Azaz, az 30 NPY-ről alkotott elképzelések szerint, az vazokonstriktorként (érösszehúzóként) működik, és a hímvessző vénáinak összehúzódását idézi elő, elsősorban azokét, amelyek a vér kiáramlását szabályozzák a hímvesszőből. Feltételezik, hogy az erekció során az NPY a hímvessző ereinek összehúzásával segít fenntartani a merevedést, megakadályozva vagy csökkentve a vér kiáramlását a barlangos testből a hímvesszőben. A technika állása szerinti
ismereteink fényében, az NPY gátlása várhatóan a hímvessző vénáinak elernyedését idézi elő, amelyek a vér áramlását szabályozzák a barlangos testből, ennek megfelelően, NPYi vagy NPY Yli adagolása a hímvessző elernyedését kell, hogy előidézze. Más szóval, azt várjuk, hogy az NPY gátlása a hímvesszőt elernyedt állapotban tartja.
Meglepő módon azonban, azt találtuk, hogy NPY-inhibitorok, közelebbről NPY Ylreceptorantagonisták alkalmazása az intrakavemozus nyomás (barlangos testben uralkodó nyomás) emelkedéséhez vezet, ezáltal elősegíti és/vagy kiváltja a hímvessző erekcióját. A barlangos testben uralkodó nyomás NPYi, előnyösen NPY Yli hatására bekövetkező növekedése előnyösen szexuális stimuláció során következik be.
Szintén a találmány tárgyát képezi inhibitor, amelynek hatása, előnyösen a genitáliákban, nagymértékben szelektív szexuális válasszal kapcsolatos NPY-, előnyösen NPY Y1-receptorokra.
Ugyancsak a találmány tárgyát képezi NPYi, előnyösen NPY Yli, amely nagymértékben szelektív NPY-receptorokra, előnyösen NPY Y1-receptorokra, és amelynek alkalmazása az intrakaverzozus nyomás emelkedésével jár a barlangos testben.
A találmány tárgyát képezi továbbáNPYi, előnyösen NPY Yli alkalmazása szexuális izgalmi állapotban az intrakavemozus (i.c.) nyomás szelektív növelésére alkalmas gyógyszer előállítására. Az NPYi, előnyösen NPY Yli előnyösen fokozza a szexuális izgalmi által közvetített i.c. nyomást; ennek megfelelően, a találmány szerinti NPY/NPYY1inhibitorok, például a genitális véráramlás befolyásolásával, szelektív módon növelik a szexuális izgalmi által közvetített i.c. nyomást.
Közelebbről, a találmány tárgyát képezik NPYi-, előnyösen NPY Yli-vegyületek MED szelektív kezelésére és/vagy megelőzésére.
NPY Y1-inhibitor alkalmazásán felül, vagy ahelyett, NPY Y2-receptorinhibitort is alkalmazhatunk. A leírás szerinti értelemben, az NPY-inhibitor kifejezés NPYY2inhibitorokra is vonatkozik.
A találmány szerinti megoldás lehetőséget ad normális szexuális izgalmi válasz - nevezetesen, megemelkedett véráramlás a hímvesszőben, amely a hímvessző merevedéséhez vezet - helyreállítására. A találmány szerinti megoldás tehát lehetőséget teremt a normális szexuális izgalmi válasz helyreállítására vagy fokozására.
Néhány NPYi, közelebbről NPY Yli-vegyületet arra nézve teszteltünk, hogy alkalmasak-e az endogén erekciós folyamat fokozására, ezáltal MED kezelésére. AZ NPYi, közelebbről NPY Yli alkalmazására vonatkozó kísérleti eredményeinket a csatolt példákban ismertetjük (lásd az alábbiakban).
Anélkül, hogy igényünket bármely elméletre korlátoznánk, feltételezzük, hogy az NPYi, előnyösen NPY Yli gátlásával a barlangos testben és annak környezetében, közvetlenül vagy közvetett úton fokozható az adenilát cikláz szintje. Ez végső soron a cAMPszint fokozódásához vezethet a barlangos testben és annak környezetében. Az adenilát cikláz és/vagy cAMP-szintek emelkedése érfalelemyedést (vazorelaxációt) okoz a barlangos testben, és a genitális véráramlás a barlangos testben fokozódhat.
Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmány szerinti megoldást.
A találmány egy szempontja szerint, a találmány tárgyát NPYi- (előnyösen NPY Yli) vegyületek és NPYi-, előnyösen NPY Yli-tartalmú gyógyászati készítmények, NPYi, előnyösen NPY Yli-tartalmú gyógyászati kombinációk; valamint PDEi, előnyösen PDE5i alkalmazása képezi férfi szexuális funkciózavar, közelebbről MED szelektív kezelésére és/vagy szelektív megelőzésére. A gyógyászati készítményekben, az NPYi, előnyösen NPY Yli (és amennyiben jelen van, és PDEi vagy PDE5i) adott esetben gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal, hígítóanyaggal vagy kötőanyaggal van elegyítve. A készítményt (hasonlóan bármely említett készítményhez) csomagolhatjuk, és később, férfi szexuális funkciózavar, közelebbről MED kezelésére alkalmazhatjuk.
A találmány egy további szempontja szerint, a találmány tárgyát NPYi, előnyösen NPY Yli alkalmazása képezi férfi szexuális funkciózavar, közelebbről MED szelektív, vagy nagymértékben szelektív módon történő kezelésére alkalmas gyógyszer (például gyógyászati készítmény) készítésére.
A találmány egy további szempontja szerint, a találmány tárgyát NPYi, előnyösen NPY Yli alkalmazása képezi férfi szexuális funkciózavar, közelebbről MED szelektív, vagy nagymértékben szelektív módon történő kezelésére alkalmas gyógyszer (például gyógyászati készítmény) előállítására.
A találmány egy még további szempontja szerint, a találmány tárgyát NPYi-, előnyösen NPY Yli-tartalmú gyógyszer képezi, amelynek hatása szelektív genitáliákban található NPY-receptorra, előnyösen NPY Y1-receptorra.
A találmány egy további szempontja szerint, a találmány tárgyát eljárás képezi MED szelektív vagy nagymértékben szelektív kezelésére vagy megelőzésére emberben vagy állatban, amely szerint NPYi-t, előnyösen NPY Yli-t adunk be hatásos mennyiségben az egyednek, ahol az NPYi, előnyösen NPY Yli adott esetben gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal, hígítóanyaggal vagy kötőanyaggal van elegyítve.
A találmány egy további szempontja szerint, a találmány tárgyát eljárás képezi férfiak szexuális funkciózavarában, közelebbről MED-ben szenvedő férfiak kezelésére, amely ben NPYi-t, előnyösen NPY Yli-t adunk be a férfinak olyan mennyiségben, amely szexuális izgalmi állapotban perifériás mellékhatások kiváltása nélkül képes az intrakavemozus nyomás szelektív emelésére.
Szintén a találmány tárgyát képezi gyógyászati készlet, amely egy vagy több tartályt foglal magában, ahol a tartályok legalább egyike egy vagy több NPYi-t, előnyösen NPY Yli-t tartalmaz.
Ugyancsak a találmány tárgyát képezi eljárás a találmány szerinti gyógyászati készítmény előállítására, amelyben egy vagy több NPYi-t, előnyösen NPY Yli-t elegyítünk gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal, hígítóanyaggal vagy kötőanyaggal.
A találmány tárgyát képezi továbbá a találmány szerinti NPYi, előnyösen NPY Yli alkalmazása férfi szexuális funkciózavar, közelebbről MED szelektív módon történő kezelésére és/vagy szelektív módon történő megelőzésére, és/vagy kóros italozási vagy táplálékfelvételi zavarok, például elhízás, anorexia, bulimia (beteges éhség) vagy anyagcserezavarok kezelésére és/vagy megelőzésére alkalmas gyógyszer készítésére és/vagy előállítására..
A találmány egy további szempontja szerint, a találmány tárgyát vizsgálati eljárás képezi férfi szexuális funkciózavar, közelebbről MED szelektív módon történő kezelésére vagy megelőzésére alkalmas hatóanyag (a továbbiakban NPYi vagy NPY Yli) azonosítására, amelyben: megállapítjuk, hogy a teszthatóanyag közvetlenül képes-e endogén merevedési folyamat (erekció) fokozására, ahol az erekció fokozódását a teszthatóanyag jelenlétében az intrakavemozus nyomás emelkedése (és/vagy a kavemozus véráramlás fokozódása) jelzi; a teszthatóanyag ilyen hatása arra utal, hogy az alkalmas lehet férfi szexuális funkciózavar, közelebbről MED szelektív módon történő kezelésére vagy megelőzésére; ahol a teszthatóanyag NPYi, előnyösen NPY Yli.
Előnyösen, a teszthatóanyag gátolja a genitáliákkal, közelebbről barlangos testtel aszszociált NPY-, előnyösen NPY Y1-receptorokat. Előnyösen, a hatóanyagnak nincs hatása vagy nincs jelentős hatása az artériás vérnyomásra.
Például, a találmány tárgyát képezi vizsgálati eljárás endogén merevedési folyamat közvetlen fokozására, ezáltal férfi szexuális funkciózavar, közelebbről MED kezelésére vagy megelőzésére alkalmas hatóanyag azonosítására, amelyben teszthatóanyagot - amely pepiid (előnyösen fluoreszcensen jelölt pepiid) metabolikus lebomlását gátolni képes egységet tartalmaz -, érintkeztetünk normális esetben NPY, előnyösen NPYY1 által metabolizált pepiiddel; és meghatározott idő elteltével (például fluorometriás analízissel) mérjük a megmaradt peptid aktivitását és/vagy szintjét; ahol a peptid szintjének fluoresz cencia alapján mért változása a teszthatóanyag hatásosságára (IC50), és arra utal, hogy a hatóanyag alkalmazható-e férfi szexuális funkciózavar, közelebbről MED kezelésére vagy megelőzésére, ahol a hatóanyag NPYi vagy NPY Yli.
A találmány egy további szempontja szerint, a találmány tárgyát eljárás képezi, amelyben:
(a) elvégezzük a találmány szerinti vizsgálati eljárást;
(b) egy vagy több, NPY, előnyösen NPY Y1 gátlására képes hatóanyagot azonosítunk; és (c) az egy vagy több azonosított hatóanyagot megfelelő mennyiségben előállítjuk;
ahol a hatóanyag NPYi, előnyösen NPY Yli.
A találmány fenti szempontjával összefüggésben, a (b) lépésben azonosított hatóanyagot úgy módosíthatjuk, hogy például annak aktivitását maximalizáljuk, majd az (a) lépést megismételjük. Ezeket a lépéseket addig ismételhetjük, amíg a kívánt aktivitást vagy farmakokinetikai profilt el nem érjük.
A találmány egy további szempontja szerint, a találmány tárgyát eljárás képezi, amelyben: (al) elvégezzük a találmány szerinti vizsgálati eljárást; (bl) egy vagy több, az endogén erekciós folyamatot közvetlen módon fokozni képes hatóanyagot azonosítunk; és (b2) az egy vagy több azonosított hatóanyagot módosítjuk; és (a2) az (al) lépést adott esetben megismételjük; és (c) az egy vagy több azonosított hatóanyagot (azaz módosított hatóanyagot) megfelelő mennyiségben előállítjuk;
ahol a hatóanyag NPYi, előnyösen NPY Yli.
A találmány egy további szempontja szerint, a találmány tárgyát eljárás képezi, amelyben:
(i) elvégezzük a találmány szerinti vizsgálati eljárást;
(ii) egy vagy több, NPY, előnyösen NPY Y1 gátlására képes hatóanyagot azonosítunk;
(iii) az azonosított hatóanyagot tesztállatban, például anesztetizált nyulakban artériás vérnyomásra kifejtett hatásra teszteljük;
(iv) olyan hatóanyagokat választunk, amelyek az nem hatnak vagy lényegében nem hatnak az artériás vérnyomásra; és (v) az egy vagy több kiválasztott hatóanyagot megfelelő mennyiségben előállítjuk;
ahol a hatóanyag NPYi, előnyösen NPY Yli.
A találmány fenti szempontjával összhangban, a (b) lépésben azonosított hatóanyagot úgy módosíthatjuk, hogy például annak aktivitását maximalizáljuk, majd az (a) lépést meg ismételhetjük. Ezeket a lépéseket addig ismételhetjük, amíg a kívánt aktivitást vagy farmakokinetikai profilt el nem érjük.
A találmány egy további szempontja szerint, a találmány tárgyát eljárás képezi férfiak szexuális funkciózavara, közelebbről MED kezelésére vagy megelőzésére, amelyben az idegi úton stimulált endogén erekciós folyamatot erősítjük in vivo (például nyulakban) az intarkavemozus nyomás vagy kavemozus véráramlás fokozására képes hatóanyag adagolásával, ahol a hatóanyag közvetlenül képes fluoreszcens peptid metabolikus úton történő lebomlását gátolni (az alábbiakban részletesen ismertetettek szerint) egy in vitro vizsgálati eljárásban; ahol az in vitro vizsgálati eljárás a találmány szerinti vizsgálati eljárás, és a hatóanyag NPYi vagy NPY Yli.
A találmány egy további szempontja szerint, a találmány tárgyát hatóanyag alkalmazása képezi férfi szexuális funkciózavar, közelebbről MED szelektív kezelésére vagy szelektív megelőzésére alkalmas gyógyászati készítmény előállítására, ahol a hatóanyag - in vitro, a találmány szerinti eljárással tesztelve - közvetlenül képes fluoreszcens peptid metabolikus úton történő lebomlását gátolni; ahol a hatóanyag NPYi, előnyösen NPY Yli.
A találmány egy további szempontja szerint, a találmány tárgyát hatóanyag alkalmazása képezi férfi szexuális funkciózavar, közelebbről MED szelektív kezelésére vagy szelektív megelőzésére alkalmas gyógyászati készítmény készítésére, ahol a hatóanyag - in vitro, a találmány szerinti eljárással tesztelve - közvetlenül képes fluoreszcens peptid metabolikus úton történő lebomlását gátolni; ahol a hatóanyag NPYi, előnyösen NPY Yli.
A találmány egy még további szempontja szerint, a találmány tárgyát állatmodell képezi férfi szexuális funkciózavar (közelebbről MED) kezelésére vagy megelőzésére alkalmas hatóanyag - amely NPYi, előnyösen NPY Yli - azonosítására, amely a pelvikus ideg stimulációját követően az intrakavemozus nyomás és/vagy kavemozus véráramlás változásainak mérésére alkalmas eszközzel ellátott, anesztetizált hím állatot tartalmaz. Az állatmodell az állatban artériás vérnyomás mérésére alkalmas eszközöket is tartalmazhat.
A találmány egy további szempontja szerint, a találmány tárgyát vizsgálati eljárás képezi az endogén erekciós folyamat közvetlen fokozására, ezáltal MED szelektív módon történő kezelésére, vagy MED szelektív módon történő megelőzésére hatóanyag azonosítására, amelyben: hatóanyagot adunk be a találmány szerinti állatmodellbe; és mérjük az endogén erekciós folyamat változását; ahol a változás az intrakavemozus nyomás (és/vagy a kavemozus véráramlás) teszthatóanyag jelenlétében megfigyelhető fokozódása az állatmodellben; ahol a teszthatóanyag NPYi, előnyösen NPY Yli.
A találmány egy további szempontja szerint, a találmány tárgyát vizsgálati eljárás képezi az endogén erekciós folyamat közvetlen fokozására, ezáltal MED szelektív módon történő kezelésére, vagy MED szelektív módon történő megelőzésére képes hatóanyag azonosítására, amelyben: hatóanyagot adunk be a találmány szerinti állatmodellbe; és mérjük az endogén erekciós folyamat változását; ahol a változás az intrakavemozus nyomás (és/vagy a kavemozus véráramlás) teszthatóanyag jelenlétében megfigyelhető fokozódása az állatmodellben; ahol a teszthatóanyag NPYi, előnyösen NPY Yli.
A találmány egy további szempontja szerint, a találmány tárgyát vizsgálati eljárás képezi az endogén erekciós folyamat közvetlen fokozására képes, ezáltal MED szelektív módon történő kezelésére, vagy MED szelektív módon történő megelőzésére - az artériás vérnyomás befolyásolása nélkül - alkalmas hatóanyag azonosítására, amelyben: hatóanyagot adunk be a találmány szerinti állatmodellbe; és méljük az endogén erekciós folyamat változását, ahol a változás az intrakavemozus nyomás (és/vagy a kavemozus véráramlás) teszthatóanyag jelenlétében megfigyelhető fokozódása az állatmodellben; és az artériás vérnyomás mérésével az állatmodellben megbizonyosodunk arról, hogy a vérnyomás nem változik, vagy nem változik jelentősen; ahol a hatóanyag NPYi, előnyösen NPY Yli.
A találmány egy további szempontja szerint, a találmány tárgyát diagnosztikai eljárás képezi, amelyben mintát veszünk hímnemű egyedtől; meghatározzuk, hogy a minta tartalmaz-e valamely entitást - amely közvetlen hatást fejt ki az endogén erekcióra a hímnemű egyed barlangos testében - férfiak szexuális funkciózavarát, közelebbről MED-et okozni képes mennyiségben; ahol az entitás hatóanyag - amely NPYi vagy NPY Yli - alkalmazásával előnyösen modulálható.
A találmány egy további szempontja szerint, a találmány tárgyát diagnosztikai készítmény vagy reagenskészlet képezi, amely hímnemű egyedtől származó izolált mintában jelenlévő entitás - amely közvetlen hatást fejt ki az endogén erekciós folyamatokra, és hatóanyag — amely NPYi vagy NPY Yli - alkalmazásával előnyösen befolyásolható - kimutatására alkalmas eszközöket tartalmaz; ahol az eszközök alkalmasak annak meghatározására, hogy a minta tartalmazza-e, és MED-et okozni képes mennyiségben tartalmazza-e az entitást; vagy a minta mennyisége olyan, hogy MED-et okozni képes.
Meglepő módon azt találtuk, az NPY, közelebbről NPY Y1 gátlása NPYi-, közelebbről NPY Yli-inhibitorral jelentősen növeli a PDE-inhibitor, közelebbről PDE5-inhibitor által közvetített, erekciós folyamatot fokozó hatást.
Mivel NPY- és NPY Y1-receptorok az egész testbe jelen vannak, teljesen váratlan volt, hogy az NPYi, előnyösen NPY Yli szisztémásán adagolható, és azzal terápiás hatás érhető el hím genitáliákban anélkül, hogy a kezeléssel tolerálhatatlan (káros) mellékhatásokat, közelebbről tolerálhatatlan (káros) perifériás mellékhatásokat váltanák ki. Az in vivo (például nyulakban végzett) kísérletekben azt találtuk, hogy az NPY Yli (amely a fenti szelektivitást mutatja) egymagában vagy az NPYÍ/PDE5 kombináció szisztémásán adagolva szexuális izgalmi állapot (pelvikus idegi stimulációval utánzóit) kiváltására növeli a genitális véráramlást, anélkül, hogy károsan befolyásolná a szív-érrendszeri paramétereket, például jelentősebb mértékű vérnyomásesést vagy vérnyomás-emelkedést okozna.
A találmány egy további szempontja szerint tehát, a találmány tárgyát NPYi, előnyösen NPY Yli alkalmazása képezi férfi szexuális funkciózavar, közelebbről MED szelektív kezelésére vagy szelektív megelőzésére alkalmas, szisztémás úton [előnyösen szájon át, például lenyelhető tablettában vagy kapszulában, vagy nyelv alá tehető (szublingvális) vagy nyálkahártyán keresztül felszívódó (bukkális) formulában] adagolható gyógyszer előállítására.
A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát egy vagy több NPYi-t, előnyösen NPY Yli-t és egy vagy több PDE-inhibitort, előnyösen PDE5-inhibitort tartalmazó kombináció alkalmazása képezi férfi szexuális funkciózavar, közelebbről MED szelektív kezelésére vagy szelektív megelőzésére alkalmas gyógyszer készítésére/előállítására.
A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát egy vagy több NPYi-t, előnyösen NPY Yli-t és egy vagy több PDE-inhibitort, előnyösen PDE5-inhibitort tartalmazó kombináció alkalmazása képezi férfi szexuális funkciózavar, közelebbről MED kezelésére vagy megelőzésére alkalmas gyógyszer készítésére/előállítására. Előnyösen, csak NPYi-ket, közelebbről NPYYli-ket és PDEinhibitorokat, közelebbről PDE5-inhibitorokat alkalmazunk a kombinációban.
Előnyösen, a fenti kombinált kezelésben egy vagy több NPYi-t, közelebbről NPY Yli-t kombinálunk egy vagy több PDE-inhibitorral, közelebbről PDE5-inhibitorral. Előnyösebben, egy vagy több NPYi-t, közelebbről NPY Yli-t adunk be egy vagy több PDE-inhibitorral, közelebbről PDE5-inhibitorral kombinálva MED kezelésére.
A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát egy vagy több NPYi-t, közelebbről NPY Yli-t és egy vagy több PDE-inhibitort, közelebbről PDE5-inhibitort [további aktív komponensek/összetevők, például egyéb inhibitorok, például neutrális endopeptidáz (NÉP) inhibitorok nélkül] tartalmazó gyógyászati készítmény alkalmazása képezi MED kezelésére vagy megelőzésére. Előnyösen, a MED kezelésére alkalmas gyógyászati készítmény aktív komponensként/összetevöként csak egy vagy több NPYi-t, közelebbről NPY Yli-t tartalmaz egy vagy több PDE-inhibitorral, közelebbről PDE5-inhibitorral kombinálva.
A találmány egy még további előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát egy vagy több NPYi-t, közelebbről NPY Yli-t és egy vagy több PDE-inhibitort, közelebbről PDE5-inhibitort, valamint egy további, alábbiakban ismertetett járulékos aktív hatóanyagot tartalmazó gyógyászati készítmény alkalmazása képezi.
A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát egy vagy több NPYi-t, közelebbről NPY Yli-t és egy vagy több PDE-inhibitort, közelebbről PDE5-inhibitort - adott esetben, gyógyászatiig elfogadható hordozóanyaggal, hígítóanyaggal vagy kötőanyaggal elegyítve - tartalmazó gyógyászati készítmény képezi.
Meglepő módon azt találtuk, hogy ez a kombináció szisztémás úton [előnyösen, szájon át, például lenyelhető tablettában vagy kapszulában, vagy nyelv alá tehető (szublingvális) vagy bukkális formulában] adagolható minimális mértékű vérnyomásesés mellett, lehetővé téve a kombináció alkalmazásával férfi szexuális funkciózavar szisztémás kezelését.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a MED szelektív kezelésre vagy megelőzésére alkalmas gyógyászati készítményekben különösen előnyösen hatásos és szelektív NPYi-t, előnyösen NPY Yli-t kombinálunk hatásos és szelektív PDEinhibitorral, közelebbről PDE5-inhibitorral.
A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát egy vagy több NPYi-t, közelebbről NPY Yli-t és egy vagy több PDE-inhibitort, közelebbről PDE5-inhibitort tartalmazó gyógyászati készítmény alkalmazása képezi MED szelektív kezelésére.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, az NPYi-t, közelebbről NPY Yli-t és egy vagy több PDE-inhibitort, közelebbről PDE5-inhibitort együtt adjuk be. A leírás szerinti értelemben „együttes beadáson” PDE (közelebbről PDE5i) és NPYi (közelebbről NPY Yli) egy időben (külön-külön); egy időben, egymással kombinálva; különkülön; kombinációban; egymást követően; és egy formulában történő beadását értjük.
Az alábbiakban részletesen ismertetettek szerint, PDE (közelebbről PDE5i) és NPYi (közelebbről NPY Yli) együttes beadása növelheti a hatásosságot PDE-, közelebbről PDE5-asszociált MED kezelésében a PDE-inhibitorok önmagában történő alkalmazásával elérhető hatásossághoz képest.
A találmány egy további szempontja szerint, NPYi (közelebbről NPY Yli) és PDEi (közelebbről PDE5i) együttes alkalmazásával gyorsabb hatás érhető el, mint amilyen PDEi vagy PDE5i önmagában történő alkalmazásával elérhető. Más szóval, szintén a találmány tárgyát képezi gyors hatású készítmény alkalmazása MED kezelésére. A leírás szerinti értelemben, „MED kezelésére alkalmas gyors hatású készítményen” a következőket értjük: a készítmény (NPYi-t, közelebbről NPYYli-t és PDEi-t, közelebbről PDE5i-t tartalmazó készítmény) intravénás (i.v.) beadását követően az intrakavemozus nyomásra kifejtett maximális hatás jelentkezésének ideje csökken az ugyanolyan dózisú PDEi vagy PDE5i önmagában történő beadásával elérhető megfelelő időhöz képest.
A találmány egy további szempontja szerint tehát, a találmány tárgyát NPYi-t, közelebbről NPYYli-t és PDEi-t, közelebbről PDE5i-t tartalmazó gyors hatású készítmény képezi MED szelektív kezelésére.
A találmány egy további szempontja szerint tehát, a találmány tárgyát csak NPYi-t, közelebbről NPYYli-t és PDEi-t, közelebbről PDE5i-t tartalmazó gyors hatású készítmény képezi MED szelektív kezelésére.
Feltételeztük, hogy a NPY Yli/PDE5i-kombináció fokozhatja a PDE5i hatásosságát, lehetővé téve a PDE5-inhibitor specifikus hatás eléréséhez szükséges dózisának csökkentését. A leírás szerinti értelemben, NPY Yli-t és csökkentett dózisú PDE5i-t tartalmazó készítmény alkalmazása azt jelenti, hogy a találmány szerinti NPY Yli hatásos mennyiségével kombinálva kisebb mennyiségű PDE5i alkalmazására van szükség adott válasz kiváltásához, mint PDE5i önmagában történő alkalmazása esetén. Az ilyen, MED kezelésére szánt, csökkentett dózist tartalmazó készítmények mérséklik a PDE5 potenciális nitrátkölcsönhatását. Ezen felül, annak alkalmazása előnyös lehet egyes egyének, például enyhe MED-ben szenvedő férfiak esetében. Ilyen készítmény alkalmazása különösen előnyös lehet olyan egyének számára, akik nem reagálnak megfelelőképp PDE5-inhibitor (például szildenafil) önmagában történő alkalmazására.
Ugyancsak a találmány tárgyát képezi szájon át adagolható gyógyászati kombináció alkalmazása férfi szexuális funkciózavar szelektív kezelésére alkalmas gyógyszer előállítására, amely kombináció NPY- vagy NPY Y1-inhibitort - amelynek ICso-értéke NPY- vagy NPY Y1-enzimmel szemben kisebb mint 100 nmol/1, és genitáliákban található NPY- vagy NPY Y1-receptorok iránt mutatott szelektivitása angiotenzinkonvertáló enzimhez képest nagyobb mint 1000 -, valamint foszfodiészteráz-5-enzimet (PDE5) - amelynek ICso-értéke PDE5-enzimmel szemben kisebb mint 100nmol/I, és PDE5 iránt mutatott szelektivitása PDE3-enzimhez képest nagyobb mint 100 - tartalmaz.
Előnyösen, a találmány szerinti megoldásban alkalmazott PDE5 szildenafil, előnyösen szildenafil-citrát.
A találmány egy további szempontja szerint, a találmány tárgyát képezi egyedüli aktív összetevőként lényegében NPYi-t, közelebbről NPY Yli-t tartalmazó készítmény alkalmazása férfi szexuális funkciózavar, közelebbről MED kezelésére alkalmas gyógyszer (például gyógyászati készítmény) előállítására.
A találmány egy további szempontja szerint, a találmány tárgyát képezi egyedüli aktív összetevőként NPYi-t, közelebbről NPY Yli-t tartalmazó készítmény alkalmazása férfi szexuális funkciózavar, közelebbről MED kezelésére alkalmas gyógyszer (például gyógyászati készítmény) előállítására.
A leírás szerinti értelemben „aktív összetevőn” férfi szexuális funkciózavar, közelebbről MED kezelésére hatásos összetevőt értünk.
A könnyebb értelmezhetőség kedvéért, a találmány fenti és egyéb szempontjait a továbbiakban a megfelelő címek alatt kifejtjük. A fejezetcímek alatt található kitanítás azonban nem szükségszerűen korlátozódik az adott fejezetben tárgyalt témára.
Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmány szempontjait.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, MED szelektív kezelésére vagy megelőzésére NPY-inhibitort és/vagy NPY Y1-inhibitort alkalmazunk.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a MED szelektív kezelésére vagy szelektív megelőzésére alkalmazott hatóanyagok nagymértékű szelektivitást mutatnak a genitáliákban található NPY- és/vagy NPY Y1-receptorok iránt a szervezetben található egyéb, perifériás elhelyezkedésű, például a szív-érrendszerben és/vagy gyomorbélrendszerben található NPY- és/vagy NPY Y1-receptorokhoz képest.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a MED szelektív kezelésére vagy szelektív megelőzésére alkalmazott hatóanyagok azon felül, hogy nagymértékű szelektivitást mutatnak a genitáliákban található NPY- és/vagy NPY Y1-receptorok iránt, aktivitást fejtenek ki a központi idegrendszerben található NPY- és/vagy NPYY1receptorokon, ezáltal mind MED, mind italozási és táplálékfelvételi zavarok kezelésére vagy megelőzésére alkalmazhatók.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a hatóanyagot szájon át adjuk be.
A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, a hatóanyagot lokálisan vagy intrakavemozusan alkalmazzuk.
Szintén a találmány tárgyát képezi a találmány szerinti hatóanyag alkalmazása szexuális izgalmi állapot előidézését megelőzően és/vagy annak során. Ez azért előnyös, mert szisztémás szelektív hatást idézhet elő úgy, hogy az NPYi és/vagy NPY Yli a genitáliákon
- 16 - *' aktív, de nem aktív például a szív-étrendszerben. Ez a szelektivitás inkább fiziológiás hatásnak tudható be, mint farmakológiai hatásnak.
A találmány egyes szempontjai szerint, igen előnyös, ha a kezelést szexuális izgalmi állapot elöidézése/stimulációja kíséri. Azt találtuk, hogy ez a lépés szisztémás szelektivitást eredményezhet.
A leírás szerinti értelemben, „szexuális izgatáson/stimuláción” egy vagy több, vizuális úton előidézett izgatást/stimulációt, fizikai úton előidézett izgatást/stimuláciot hanghatás útján előidézett izgatást/stimulációt vagy gondolati úton előidézett izgatást/stimulációt értünk.
Előnyösen tehát, a találmány szerinti hatóanyagokat szexuális izgatást/stimuláciot megelőzően vagy annak során alkalmazzuk, különösen, ha azok szájon át adagolhattak.
A találmány fenti előnyös szempontja szerint, a találmány tárgyát képezi hatóanyag alkalmazása férfi szexuális funkciózavar, közelebbről MED szelektív kezelésre vagy szelektív megelőzésére alkalmas gyógyszer előállítására; ahol a hatóanyag perifériás mellek15 hatások kiváltása nélkül képes NPY előnyösen NPY Y1 gátlására valamely egyen genitáliáiban; és ahol az egyén a gyógyszer beadását megelőzően vagy annak során szexuálisan izgatva/stimulálva van.
Előnyösen, a gyógyszert szájon át adagoljuk az egyénnek.
A találmány fenti előnyös szempontján felül, a találmány tárgyát képezi eljárás egyen 20 kezelésére, amelyben az egyénnek olyan hatóanyagot adunk be, amely a genitáliákban perifériás mellékhatások kiváltása nélkül - képes NPY, előnyösen NPY Y1 gátlására; és a hatóanyagot MED szelektív kezelésére vagy szelektív megelőzésere elegendő mennyiségben adjuk be; ahol a hatóanyagot adott esetben gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal, hígítóanyaggal vagy kötőanyaggal elegyítjük; és ahol az egyént a hatóanyag alkalma25 zását megelőzően vagy annak során szexuálisan izgatjuk/stimuláljuk.
Előnyösen, a hatóanyagot szájon át adjuk be az egyénnek.
Az alábbi meglepő és váratlan eredményeket kaptuk.
Meglepő és váratlan módon azt találtuk, hogy:
(i) NPY-receptorok, közelebbről NPY Y1 -receptorok gátlása fokozott intra30 kavemozus nyomást eredményez, ezáltal elősegíti/előidézi a hímvessző erekcióját;
(b) NPY-t vagy NPY Yl-t gátló hatóanyag alkalmazható az erekciós válasz fokozására, és mellékhatások kiváltása nélkül segítheti erekciós zavar, például MED leküzdését;
(c) NPYi, előnyösen NPY Yli adagolása szisztémás úton (például szájon át) - perifériás mellékhatások előidézése nélkül, közelebbről, a szív-érrendszerre kifejtett káros mel *1 lékhatások, például vérnyomásesés előidézése nélkül - lehetővé teszi MED szelektív kezelését.
(d) NPYi, előnyösen NPY Yli adagolása szisztémás úton előnyös lehet mind MED, mind italozási és táplálékfelvételi zavarok szelektív kezelésére vagy szelektív megelőzésére, mivel perifériásán, a genitáliákra kifejtett hatáson felül a központi idegrendszerre is hathat (egyéb perifériás hatás kifejtése nélkül);
(e) NPY, közelebbről NPY Y1 gátlása NPYi, közelebbről NPY Yli alkalmazásával jelentősen megnöveli PDE-inhibitorok, közelebbről PDE5-inhibitor erekciós folyamatra kifejtett előnyös hatását.
A találmány szerinti megoldás a következő előnyöket kínálja.
A találmány szerinti megoldás előnyös, mert:
(i) a genitáliákban NPY-, előnyösen NPY Y1-receptorokat gátolni képes hatóanyagok alkalmazásával szelektív módon megelőzhető és/vagy kezelhető, vagy szelektív módon helyreállítható a normális szexuális válasz, például hím erekciós válasz azáltal, hogy az intrakavemozus nyomás és/vagy kavemozus véráramlás fokozódását idézzük elő káros mellékhatások, például a szív-érrendszerre kifejtett káros mellékhatások jelentkezésének kockázata nélkül. Ezáltal, a találmány megoldást kínál a normális erekciós válasz helyreállítására vagy utánzására.
(ii) Az NPY, előnyösen NPY Y1 gátlása és szexuális izgatás kombinációjával kiváltott fokozott intrakavemozus nyomás és/vagy fokozott véráramlás a barlangos testben specifikusnak tűnik a genitáliákra, ezen belül a barlangos testre, és nincs hatással egyéb perifériás rendszerekre, közelebbről a szív-érrendszerre. Ez a szelektív, célzott hatás csökkenti és/vagy kiküszöböli egyes, MED kezelésére alkalmazott vazoaktív hatóanyagok adagolásával járó mellékhatások (például vérnyomásesés) jelentkezésének kockázatát.
A találmány egyéb előnyei nyilvánvalóak a fentiek és az alábbiakban ismertetettek alapján.
Betegcsoportok:
Az NPYi- vagy NPY Yli-kezelés enyhe vagy közepes MED-ben szenvedő betegek számára előnyös, de súlyos MED-ben szenvedő betegek is reagálhatnak a kezelésre.
Az első vizsgálatok azonban azt mutatják, hogy az enyhe, közepes és súlyos MEDben szenvedő betegek között a jól reagálók aránya az NPY- vagy NPY Yl-inhibitor/PED5inhibitor kombináció alkalmazását követően magasabb.
Az „enyhe, közepes és súlyos MED” kifejezések szakember számára ismertek; megfelelő útmutatást találunk a következő szakirodalmi helyen: The Journal of Urology 151, 54 (1994, január).
Az első vizsgálatok szerint, az NPYi/NPY Yli- és PDE5-kezelés (vagy a leírásban szereplő egyéb kombináció alkalmazása) az említett MED-betegcsoportok számára lehet előnyös. Ezek a betegcsoportok - melyek részletes ismertetését megtaláljuk a következő szakirodalmi helyeken: Clinical Andrology, 23(4), 773; valamint Eardley I. és Sethia K.: „Erectile Dysfunction - Current Investigation and Management”, Mosby-Wolfe - a következők: pszichogén organikus, vaszkuláris, endokrin, idegrendszeri, artériás, gyógyszer által indukált szexuális funkciózavarok (laktogén), és kavemozus faktorokkal kapcsolatos, elsősorban vénás eredetű szexuális funkciózavarok.
NPY
A fent ismertetettek szerint, a hatóanyag bármely, NPY-inhibitor hatású hatóanyag (más néven NPY-antagonista) lehet.
A NPY-re és azzal kapcsolatos receptorokra vonatkozó ismereteinket foglalták össze Victor A McKusick és mtsai.: http://www3. ncbi.nlm.nih.gov/Omim/searchomim.htm. A következő, NPY-ra vonatkozó szöveget ebből a forrásból vettük át.
„A neuropeptid Y (NPY) nagy mennyiségben és sok helyen előforduló pepiid az emlősök idegrendszerében. Az szekvencia-homológiát mutat az YY-peptiddel, és aminosavszekvencia és nukleinsav-szekvencia szintjén több mint 50%-ban homológ a hasnyálmirigy polipeptiddel (PNP; 167780). Az NPY 36 aminosavból álló peptid. Minth és mtsai. az NPY-gént pheokromocitoma mRNS-ről klónozták (1984). Takeuchi és mtsai. NPY- és PNP-géneket tartalmazó cDNS-klónokat izoláltak pheokromocitomából, illetve hasnyálmirigy endokrin tumorból (1985, 1986). A fenti cDNS-próbák alkalmazásával genomi DNS-t analizáltak humán-egér szomatikus sejthibridek kromoszóma-asszignációs paneljeiből, („chromosome assignment panels”), majd megvizsgálták, hogy a gének mesterséges úton jöttek-e létre. A vizsgálatok szerint, azok nem mesterséges úton keletkeztek, és az NPYgént a 7pter-7q22, a PNP-gént a 17pl l.l-17qter-kromoszómarégión azonosították. Bahary és munkatársai, Mus spretusszal visszakeresztezve a homológ NPY-gént az egér 6. kromoszómán lokalizálták (1991). Mivel az egér 6. kromoszóma homológiát mutat a humán 7qrégióval, valószínű, hogy az NPY-gén emberben a 7cen-q22-régióban található. Meisler és mtsai. kizárták annak lehetőségét, hogy szoros kapcsolat áll fenn a cisztikus fibrozis (219700) és neuropeptid Y lokuszok közt (1987). Terenghi és mtsai. in situ hibridizációs technikával meghatározták az NPY-t kódoló mRNS megoszlását sebészeti biopsziás min iákból származó agykérgi neuronokbán és post mortem (a halál beálltát követően eltávolított) agyszövetben. Ők, NPY-géntranszkripció és expresszió állandó jelenlétét figyelték meg normális, érett kérgi neuronokbán (1987). Baker és mtsai. fluoreszcens in situ hibridizációval kimutatták, hogy az NPY-gén a 7p 15.1-kromoszómarégióban található, egyetlen kópiában (1995). Megjegyezték, hogy az NPY az egyik legnagyobb mértékben konzervált ismert peptid, és például csupán 3 aminosav eltérés mutatható ki a humán és cápaeredetű pepiid között. A neuropeptid Y az energiaegyensúly szabályozásában résztvevő neuromodulátor, amely túltermelődik ob/ob-egerek hipotalamuszában. Az NPY leptin (164160) deficienciás válaszreakcióban betöltött szerepének meghatározására, Erickson és mtsai. NPY-defíciens ob/ob-egereket hoztak létre (1996). NPY hiányában, az ob/ob-egerek kevésbé híztak el, mivel táplálékfelvételük csökkent, energia-felhasználásuk nőtt; ezen felül, kevésbé voltak érintettek diabétesz, sterilitás, és szomatotrop rendellenességek által. A fenti eredmények alapján azt a következtetést vonták le, hogy az NPY a leptindeficiencia centrális effektora. Alkoholpreferenciára szelektív módon tenyésztett patkányok genetikai kapcsoltsági analízise során az NPY-gént magában foglaló kromoszómális régiót azonosítottak [Carr és mtsai.: (1998)]. Az alkoholt kedvelő patkányokban az NPY szintje alacsonyabb volt több agyi régióban, mint az alkoholt nem preferáló patkányokéban. Ezért, Thiele és mtsai. (1988) célzott génmegszakítás következtében NPY-t egyáltalán nem tartalmazó egerek alkoholfogyasztását tanulmányozták [Erickson és mtsai.: (1996)]. Azt találták, hogy NPY-defíciens egerek több 6%, 10% vagy 20% etanolt (térfogatra számítva) tartalmazó oldatot fogyasztottak, mint a vad-típusú egerek. Ezen túl, az NPY-defíciens egerek kevésbé voltak érzékenyek etanol szedatív/hipnotikus hatására, mivel sokkal gyorsabban magukhoz tértek etanollal kiváltott alvásból, bár a plazma etanolkoncentrációk nem tértek el szignifikáns mértékben a kontrollokétól. Ezzel szemben, transzgénikus egerek, amelyek NPY-t egyébként expresszáló neuronjaiban jelölt NPY-gént gént hiperexpresszáltattunk, alacsonyabb szintű preferenciát mutattak etanollal szemben, és érzékenyebbek voltak etanol szedatív/hipnotikus hatására, mint a kontrollok. Ezek az adatok közvetlen bizonyítékát szolgáltatták annak, hogy az alkoholfogyasztás és -rezisztencia fordítottan arányos az agyban mérhető NPY-szintekkel. Egy, az elhízás genetikai hátterének felderítését célzó, folyamatban lévő vizsgálatban Karvonen és mtsai. egy 1128T-Cpolimorfizmust azonosítottak (1998), amely a pre-pro-NPY szignálpeptidjében, a 7. pozícióban leucin profínnal történő helyettesítését eredményezte. Ez a polimorfizmus nem volt kapcsolatba hozható elhízással vagy megváltozott energia-metabolizmussal, de jelentősen és következetesen magas szérum teljes és LDL-koleszterinszinttel járt mind normális test tömegű, finn, mind elhízott holland egyénekben. Uusitupa és mtsai. a pro7-polimorfízmust a Finnek 14%-ában, de a Hollandok csak 6%-ában mutatták ki (1998). A NPY-génben pro7-polimorfízmust hordozó egyének teljes szérum-koleszterinszintje átlagosan 0,6-1,4 mmol/1 -rel magasabb volt, mint a fenti génvariánst nem hordozó egyéneké. Mivel a pro7 NPY szérum-koleszterinszintre kifejtett hatását normális testtömegű Hollandokban nem sikerült igazolni, feltételezték, hogy az elhízott egyének érzékenyebbek a génvariáns jelenlétére. Számítások szerint, a pro7 jelenléte az NPY-génben 50-60%-ra tehető elhízott egyénekben, amit 8 mmol/1 vagy azt meghaladó teljes szérum-koleszterinszint kísér. Legalábbis a finnek közt, az NPY pro7-formája a szérum-koleszterinszintet befolyásoló egyik legerősebb genetikai faktor. Lásd még: Allen és Bloom: (1986); Dockray: (1986); Maccarrone és Minth és mtsai.: (1986).”
A már említettek szerint, az NPY-re és azzal kapcsolatos receptorokra vonatkozó ismereteinket Victor A McKusick és mtsai. foglalták össze (lásd fent). A következő, NPYYl-re vonatkozó szöveget ebből a forrásból vettük át.
„A neuropeptid Y (NPY; 162640) az egyik legelterjedtebb neuropeptid az emlősök idegrendszerében, és fontos fiziológiás hatások széles skáláját fejti ki, ezen belül, részt vesz pszichomotoros aktivitások, a táplálékfelvétel és centrális endokrin szekréciós folyamatok szabályozásában, ezen felül, hatásos vazoaktív szer a szív-érrendszerben. Az NPY fő altípusait (Y1 és Y2) farmakológia szempontok alapján azonosították. Az NPYY1receptorokat különböző szövetekben azonosították, például agyban, lépben, vékonybélben, vesében, herében, méhlepényben és aorta simaizomban. Az Y2-receptort főképp a központi idegrendszerben mutatták ki. Herzog és mtsai. (1992) humán NPY-receptor klónozásáról adtak hírt, amelyről igazolták, hogy az a G-protein-asszociált receptor-főcsaládhoz tartozik. Kínai hörcsög petefészekben (CHO) vagy humán embrionális vesesejtekben expresszáltatva, a receptor jellemző ligandumspecifitást mutatott. A vesesejtvonalban, a receptor pertussistoxinra érzékeny G-proteinnel volt kapcsolt, amely ciklikus AMP felhalmozódásának gátlását közvetítette. Ezzel szemben, a receptor a receptor a CHOsejtvonalban nem az adenilcikláz gátlásával volt, hanem az intracelluláris kalciumszint fokozódásával volt kapcsolt. Az NPY-receptorhoz kapcsolódó második hírvivő tehát az adott sejttípusban jelenlévő specifikus G-proteinrepertoártól és effektorrendszertől függően sejttípusspecifikus. Larhammar és mtsai. (1992) ettől függetlenül klónozták és jellemezték a neuropeptid-Y-receptort. Herzog és mtsai. meghatározták a humán NPY Y1-receptorgén molekuláris szerveződését és szabályozását (1993). Azt találták, hogy a legtöbb G-proteinasszociált receptorgén folyamatos struktúrájával szemben az NPY Y1-gén 3 exonból áll.
Herzog és mtsai. egy gyakori Pstl-polimorfizmust is azonosítottak a gén első exonjában. Nagy feloldású fluoreszcens in situ hibridizációval a gént a 4q31.3-q32-régióban lokalizálták. Herzog és mtsai. azt találták, hogy az NPYÍR- és NPY5R- (602001) gének a 4q31q32-kromoszómarégióban vannak jelen (1997). A két gén ellentétes orientációban íródik át egy közös promóterrégióról. Az Y1-receptorgén egy alternatív módon összeállítódott 5’végi exonja az Y5-receptor kódoló szekvenciájának része. Ez a szokatlan elrendeződés Herzog és mtsai. szerint annak következménye, hogy a 2 gén génduplikációval jött létre, és feltételezték, hogy azok koordináltan expresszálódhatnak. Lutz és mtsai. fajok közti visszakeresztezési analízissel az Npylr- és Npy2r-géneket konzervatív kapcsoltsági csoportokban lokalizálta az egér 8. és 3. kromoszómán, ami a humán kromoszóma 4q disztális régiójának felel meg.”
A már említettek szerint, az NPY-re és azzal kapcsolatos receptorokra vonatkozó ismereteinket Victor A McKusick és mtsai. foglalták össze (lásd fent). A következő, NPYY2-re vonatkozó szöveget ebből a forrásból vettük át.
„A neuropeptid Y (NPY) az agyban és szimpatikus neuronokbán jelenlévő Gproteinasszociált receptorok családján keresztül adja át a szignált. Farmakológiai szempontok, szöveti megoszlás és a kódoló gén struktúrája alapján a neuropeptid Y receptorok legalább 3 típusát különböztették meg; lásd 162641 és 162643. Rose és mtsai. humán 2-es típusú receptort - NPY 2R - kódoló cDNS expresszióját és klónozását írták le COSsejtekben (1995). A transzfektált sejtek magas affinitást mutattak NPY (162640), YYpeptid (PYY; 600781) és egy, a 13-36. aminosavakat magában foglaló NPY-fragmentum iránt (1995). A következtetett, 381 aminosavból álló protein G-proteinasszociált receptorokra jellemző 7 transzmembrándomént tartalmaz, és csak 31%-ban azonos a humán Ylreceptorral (NPYÍR; 162641). Az idegrendszer több régiójából származó minták Northemblot analízisével egy 4 kb mRNS-t mutattak ki. Gerald és mtsai. humán hippokapmusz cDNS expressziós génkönyvtárból, radioaktívan jelölt PYY-kötő vizsgálati eljárással klónozták a humán Y2-receptomak megfelelő cDNS-t (1995). Az Y2-gént COS-7sejtekben expresszáltatták, és hormonkötődési vizsgálati eljárással kimutatták, hogy az Y2receptor képes megkötni (a legmagasabbtól a legalacsonyabb affinitás sorrendjében) PYY, NPY és hasnyálmirigy (PP; 167780) hormonokat. Ammar és munkatársai klónozták, és jellemezték a 2-es típusú NPY-receptort kódoló humán gént (1996). A transzkriptum 9 kb genomi szekvenciát fed át, és 2 exon által kódolt. Az NPY-1 receptor génhez hasonlóan, az NPY2R 5’-végi nem-transzlálódó régióját egy 4,5 kb közbeiktatott szekvencia szakítja meg. Anmar és mtsai. rágcsáló-humán sejthibridek Southem-blot analízisével és fluoresz cens in situ hibridizációval (FISH) kimutatták, hogy az NPY2R-gén a 4q31-kromoszómarégióban - az NPYlR-gént is tartalmazó régióban - található, ami arra utal, hogy ezek az altípusok, az azokban megfigyelhető strukturális eltérések ellenére, génduplikációval jöhettek létre (1996). Lutz és mtsai. az Npylr- és Npy2r-géneket fajok közti visszakeresztezéses analízissel konzervatív kapcsoltsági csoportokba lokalizálta az egér 8. és 3. kromoszómán, ami a humán kromoszóma 4q disztális régiójának felel meg.”
NPY-szekvenciák
Az NPY és receptorainak (azaz NPYY1) nukleotid-szekvenciája és aminosavszekvenciája szakirodalmi helyeken hozzáférhető. Néhány szekvenciát a 4-6. ábrákon mutatunk be.
NPY-inhibitorok és/vagy NPY Y1-inhibitorok
NYi (vagy NPYYi) azonosítására és/vagy tanulmányozására alkalmas megfelelő vizsgálati rendszerek részleteit mutatjuk be alább az “NPY vizsgálatok” fejezetben, amelyeket a WO-A-98/52890 nemzetközi közzétételi irat ismertet (lásd a 96. oldal, 2-28 sorokat).
NPY-inhibitorokat vagy NPY Y1-inhibitorokat ismertetnek az alábbi összefoglalókban:
• Dunlop J, Rosenzweig-Lipson S: Therapeutic approaches to obesity Exp Opin Ther Pat 1999 8 12 1683-1694 • Wang S, Ferguson KC, Burris TP, Dhurandhar NV: 8th annual international conference on obesity and non-insulin dependent diabetes mellitus : novel drug developments. Exp Opin Invest Drugs 1999 8 7 1117-1125 • Ling AL: Neuropeptide Y receptor antagonists Exp Opin Ther Pat 1999 9 4 375-384 • Adham N, Tamm J, Du P, Hou C, et al : Identification of residues involved in the binding of the antagonist SNAP 6608 to the Y5 receptor Soc Neurosci Abstr 1998 24 part 2 626.9 • Shu YZ, Cutrone JQ, Klohr SE, Huang S: BMS-192548, a tetracyclic binding inhibitor of neuropeptide Y receptors, from Aspergillus niger WB2346.il. Physico-chemical properties and structural characterization J Antibiot 1995 48 10 1060-1065 • Rigollier P, Rueger H, Whitebread S, Yamaguchi Y, Chiesi M, Schilling W, Criscione L: Synthesis and SAR of CGP 71683A, a potent and selective antagonist of the
- 23 - ....... * neuropeptide Y Y5 receptor. Int Symp Med Chem 1998 15th Edinburgh 239 • Criscione L, Rigollier P, Batzl-Elartmann C, Rueger H, Stricker-Krongrad A, et al : Food intake in free-feeding and energy-deprived lean rats is mediated by the neuropeptide Y5 receptor. J Clin Invest 1998 102 12 2136 - 2145 • Neurogen Corp: NGD 95-1 Clin Trials Monitor 1996 5 10 Ab 19244 • Buttle LA: Anti-obesity drugs: on target for huge market sales. Exp Opin Invest Drugs 1996 5 12 1583-1587 • Gehlert DR, Hipskind PA: Neuropeptide Y receptor antagonists in obesity. Exp Opin Invest Drugs 1996 7 9 1827-1838 • Goldstein DJ, Trautmann ME: Treatments for obesity. Emerging Drugs 19972-1-27 • Hipskind P A, Lobb K L, Nixon J A, Britton T C, Bruns R F, Catlow J, Dieckman McGinty D K, Gackenheimer S L, Gitter B D, Iyengar S, Schober D A, et al. : Potent and selective 1,2,3-trisubstituted indole NPY Y-l antagonists. J Med Chem 1997 40 3712-3714 • Zimmerman DM, Cantrail BE, Smith ECR, Nixon JA, Bruns RF, Gitter B, Hipskind PA, Ornstein PL, Zarrinmayeh H, Britton TC, Schober DA, Gehlert DR: Structure-activity relationships of a series of l-substituted-4 methylbenzimidazole neuropeptide Y-l receptor antagonists Bioorganic
Med Chem Lett 1998 8 5 473-476 • Zarrinmayeh H, Nunes A, Ornstein P, Zimmerman D, Arnold MB, et al : Synthesis and evaluation of a series of novel 2- [ (4- chlorophenoxy) methy] benzimidazoles as selectiveneuropeptide Y Y1 receptor antagonists J Med Chem 1998 41 15 2709-2719 • Britton TC, Spinazze PG, Hipskind PA, Zimmerman DM, Zarrinmayeh H, Schober DA, Gehlert DR, Bruns RF: Structure-activity relationships of a series of benzothiophene-dervied NPY-Y1 antagonists: optimization of the
C2 side chain Bioorganic Med Chem Lett 1999 9 3 475-480 • Zarrinmayeh H, Zimmerman DM, Cantrell BE, Schober DA, Bruns RF, Gackenheimer SL, Ornstein PL, Hipskind PA, Britton TC, Gehlert DR: Structure-activity relationship of a series of diaminoalkyl substituted benzimidazole as neuropeptide Y Y1 receptor antagonists Bioorganic Med Chem Lett 1999 9 5 647-652 • Murakami Y, Hara H, Okada T, Hashizume H, Kii M, Ishihara Y, Ishikawa M, Mihara S-I, Kato G, Hanasaki K, Hagishita S, Fujimoto M: 1,3 disubstituted benzazepines as novel, potent, selective neuropeptide Y Y1 receptor antagonists J Med Chern 1999 42 14 2621-2632 • Rudolf K, Eberlein W, Engel W, Wieland HA, Willim KD, Entzeroth M, Wienen W, Beck Sickinger AG, Doods HN: The first highly potent and selective nonpeptide neuropeptide YY1 receptor antagonist: BIBP3226
Eur J Pharmacol 1994 271 2-3 RI 1-RI 3 • Wieland HA, Willim KD, Entzeroth M, Wienen W, Rudolf K, Eberlein W, Engel W, Doods HN: Subtype selectivity and antagonbist profile of the nonpeptide neuropeptide Y1 receptor antagonist BIBP 3226 J Pharmacol Exp Ther 1995 275 1 143-149.
• Wright J, Bolton G, Creswell M, Downing D, Georgie L, Heffner T, Hodges J, MacKenzie R, Wise L: 8-amino-6- (arylsulphonyl)-5-nitroquinolones : novel nonpeptide neuropeptide Y1 receptor antagonists Bioorganic Med Chern Lett 1996 6 15 1809-1814 • Capurro D, Huidobro-Toro JP: The involvement of neuropeptide Y Y1 receptors in the blood pressure baroreflex : studies with BIBP 3226 and BIB 3304. Eur J Pharmacol 1999 376 3 251-255 • Dumont Y, Cadieux A, Doods H, Quirion R: New tools to investigate neuropeptide Y receptors in the central and peripheral nervous systems: BIBO-3304 (Yl), BIIE-246 (Y2) and [1251J-GR-231118 (Y1/Y4). Soc
Neurosci Abstr 1999 25 Part 1 Abs 74.11 • Hegde SS, Bonhaus DW, Stanley W, Eglen RM, Moy TM, Loeb M, et al : Pharmacological evaluation of 1229U91, a high affinity and selective neuropeptide Y (NPY)-Yl receptor antagonist Pharmacol Res 1995 31 190 • Matthews JE, Chance WT, Grizzle MK, Heyer D, Daniels AJ: Food intake inhibition and body weight loss in rats treated with GI 264879A, an NPY-Y1 receptor. Soc Neurosci Abstr 1997 23 Pt 2 1346 • Doods HN, Willim K-D, Smith SJ: BIBP 3226: a selective and highly potent NPY-Y1 antagonist Proc Br Pharmacol Soc 1994 13-16 Dec. C47 • Rudolf K, Eberlein W, Engel W, Wieland HA, Willim KD, Entzeroth M, Wienen W, Beck Sickinger AG, Doods HN: The first highly potent and selective non- peptide neuropeptide YY1 receptor antagonist: BIBP3226
Eur J Pharmacol 1994 271 2-3 RI 1-R13 • Serradelil-Le-Gal C, Valette G, Rouby PE, Pellet A, Villanova G, Foulon L, Lespy L, Neliat G, Chambon JP, Maffrand JP, Le-Fur G: SR 120107A and SR 120819A : Two potent and selective, orally-effective antagonists for NPY Y1 receptors Soc Neurosci Abstr 1994 20 Pt 1 907-Abs 376.14 • Hong Y, Gregor V, Ling AL, Tompkins EV, Porter J, Chou TS, Paderes G, Peng Z, Hagaman C, Anderes K, Luthin D, May J: Synthesis and biological evaluation of novel guanylurea compounds as potent NPY Y1 receptor antagonist Acs 1999 217 Anaheim MEDI 108
További NPY-inhibitorokat és/vagy NPY Y1-inhibitorokat írnak le az alábbi közzétételi iratokban és szabadalmi leírásokban:
WO-98/07420;
WO-94/00486;
WO-96/22305;
WO-97/20821;
WO-97/20822; és
WO-96/14307 számú nemzetközi közzétételi iratok;
JP-07267988 számú japán szabadalmi bejelentés;
WO-96/12489 számú nemzetközi közzétételi irat;
US-5552422 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás;
WO-98/35957;
WO-96/14307; és
WO-94/17035 számú nemzetközi közzétételi iratok;
EP-0614911 számú európai szabadimi leírás;
WO-98/40356 számú nemzetközi közzétételi irat;
EP-0448765; és
EP-0747356 számú európai szabadalmi leírás;
WO-98/35941; és
WO-97/46250 számú nemzetközi közzétételi irat;
EP-0747357;
EP-0896822;és
EP-1033366 számú európai szabadalmi leírás; valamint
WO-OO/66578 számú nemzetközi közzétételi irat.
NPY-inhibitorok és/vagy NPY Y1-inhibitorok például az alábbi struktúrák:
Vegyül et Struktúra 1 A hatás módja 1 Hivatkozások
F34 \ o P p °\ l:NPY Y1 WO-98/07420
F35 OH O OH Ο O IrNPY
Jk ^OH
OH
F37 He - Cys- Pro- Cys- Tyr- Arg- Leu- Arg- TyrNH2 cyclic (2,2'), (4,4')- disulfide dimer l:NPYY1 WO-94/00486 WO-96/22305
F39 l:NPY Y1 WO-96/14307
F40 । >—l ο=ς X 21 21 —áJ | 0=^x w-u 2=° y—' íz xz V—\ ! )=° 0=\ /““ ! < O O ZX ' 2^ xT1 “ i o l:NPYY1 JP-07267988
F41 o^CX -o l-.NPY Y1 WO-96/12489
F42 iSci A ° ° /► // . LNPYY1 US-5552422
F44 Y4 zx zx O=/ y--' =x -J i/v Λ Chiral Χ^,Ι^ΝΗ, o l:NPY Y1
F45 / ^i| 1 I: NPY Y1 WO-96/14307
F47a o II H JL Ay n > £ J H -< Í HO — ] % h Chiral £ A NH ^£nh, 2 l:NPY Y1 WO-94/17035 (BIBP 3226)
F48 3 QA “y<£) A ‘ 8 < Z—- / l:NPY Y1 EP-0614911
F49 9 Γι l Η Τ Νγ» ΝΗ ο Ι:ΝΡΥ Υ1 ΕΡ-0614911
_ _________ , Ι:ΝΡΥ Υΐ
F50 ο /—\ / y—ζ / I \ ο ο \=/ V U ΙΖ >=ο χζ
F52 Ι:ΝΡΥ ΕΡ-0448765
F53 \ ο ο=/ / Τ Oyj21 ζζ ο=/ ' y=o ο 3 Ζ 0 Ι:ΝΡΥ Υ1 ΕΡ-0747356
F54 1 Η ίΓ^Ι 1 11 JU oh //-Ν —Ν Ι:ΝΡΥ Υ1 WO-98/35941
F56 ΛΛ / yj~~° ζ—' / ° °ν_ ο=( ϊ \ Λ=Ο ΗΙ 1 / y=o Ο\ Ι:ΝΡΥΥ1 ΕΡ-0747357
NPY-vizsgálatok
A WO-98/52890 számú nemzetközi közzétételi iratban részletesen ismertetettek szerint (96. oldal, 2-28 sorok), hatóanyagok azon tulajdonsága, hogy kötődnek-e NPY-hez, vizsgálható például M.W. Walker és munkatársai eljárásával: Journal of Neurosciences 8, 2438 (1988).
Ebben a vizsgálatban SK-N-MC-sejtvonalat alkalmazunk. A sejtvonalat a new yorki Sloan-Kettering Memorial Hospital intézményből szereztük be.
A sejteket T-150 típusú fiaskókban tenyésztettük, 5% fötális boíjúszérummal kiegészített Dulbecco-féle Minimal Essential Medium (DMEM) tápközegben. A sejteket manuálisan távolítottuk el a flaskákból lekaparással, majd ülepítettük és -70°C-on tároltuk.
Az üledékeket üveghomogenizátor alkalmazásával reszuszpendáltuk 2,5 mmol/1 kalcium-kloridot, 1 mMól/1 magnézium-kloridot és 2 g/1 bacitracint tartalmazó, 25 mMól/1 HEPES-pufferben(pH=7,4). Az inkubációkat körülbelül két órán át, szobahőmérsékleten végeztük 200 μΐ össztérfogatban, olyan reakcióelegyben, amely 0,1 nmol/1 125I-izotóppal jelzett YY-peptidet (2200 Ci/mMól) és 0,2-0,4 mg proteint tartalmazott.
Nem specifikus kötődésként azt a mennyiségű radioaktivitást definiáltuk, amely 1 pmól/l Y-neuropeptid jelenlétében történt inkubálás után a szövetekhez kötődve maradt. Néhány vizsgálat során, a hatóanyagokat különböző koncentrációban alkalmaztuk a reakcióelegyben.
Az inkubációkat olyan üvegszálas filtereken történő gyors átszuréssel állítottuk le, amelyeket 96 csatornás sejtgyújtő berendezést alkalmazva 0,3%-os polietiléniminnel előre átitattunk. A filtereket 5 ml 50 mmól/l Tris-pufferrel (pH=7,4) 4°C-on mostuk, majd 60°Con gyorsan megszárítottuk. Ezután a filtereket ráolvadós szcintillációs lapokkal kezeltük, majd meghatároztuk a filtereken visszamaradt radioaktivitást. Az eredményeket különböző szoftver-csomagokkal értékeltük. A proteinkoncentrációkat szokásos, Coumassie-festődésen alapuló protein-meghatározó reagensekkel határoztuk meg, szarvasmarha-eredetü szérumalbumin standarddal szemben.
Kombinációk
Részletesebben, a találmány tárgyát képezi a találmány szerinti hatóanyagok kombinációja egy vagy több kiegészítő aktív ágenssel (lásd alább, a megfelelő példák ismertetésénél) férfiak szexuális funkciózavarának (közelebbről férfiak merevedési zavarának) a kezelésére. A kombináció kezelést biztosít organikus, vaszkuláris, neurogén, drog által indukált és/vagy pszichogén eredetű merevedési zavarra.
A találmány tárgyát képezi továbbá olyan kombináció alkalmazása, amely lényegében a találmány szerinti NPYi vagy NPY Yi-t, valamint két kiegészítő aktív ágenst tartalmaz, férfiak a leírásban ismertetett szexuális funkciózavarának (közelebbről férfiak merevedési zavarának) a kezelésére és/vagy megelőzésére alkalmas gyógyszer előállítására. A kombináció kezelést biztosít organikus, vaszkuláris, neurogén, drog által indukált és/vagy pszichogén eredetű merevedési zavarra.
A találmány tárgyát képezi továbbá olyan kombináció alkalmazása, amely a találmány szerinti NPYi-t vagy NPY Yli-t valamint két kiegészítő aktív ágenst tartalmaz, férfiak a leírásban ismertetett szexuális funkciózavarának (közelebbről férfiak merevedési zavarának) a kezelésére és/vagy megelőzésére alkalmas gyógyszer előállítására. A kombináció kezelést biztosít organikus, vaszkuláris, neurogén, drog által indukált és/vagy pszichogén eredetű merevedési zavarra.
A találmány tárgyát képezi továbbá olyan kombináció alkalmazása, amely lényegében a találmány szerinti NPYi vagy NPY Yi-hatóanyagot, valamint egy kiegészítő aktív ágenst tartalmaz férfiak szexuális funkciózavarának (közelebbről férfiak merevedési zavarának) a kezelésére és/vagy megelőzésére alkalmas gyógyszer előállítására vagy készítésére. A kombináció kezelést biztosít organikus, vaszkuláris, neurogén, drog által indukált és/vagy pszichogén eredetű merevedési zavarra.
A találmány tárgyát képezi továbbá olyan kombináció alkalmazása, amely a találmány szerinti NPYi-t vagy NPY Yli-t, valamint egy kiegészítő aktív ágenst tartalmaz, férfiak szexuális funkciózavarának (közelebbről férfiak merevedési zavarának) a kezelésére és/vagy megelőzésére alkalmas gyógyszer előállítására vagy készítésére. A kombináció kezelést biztosít organikus, vaszkuláris, neurogén, drog által indukált és/vagy pszichogén eredetű merevedési zavarra.
Ennek megfelelően, a találmány tárgyát képezi továbbá gyógyászati készítmény kombináció (szimultán, külön-külön vagy egymást követő alkalmazás céljára), amely a találmány szerinti hatóanyagot és egy vagy több kiegészítő aktív ágenst tartalmaz (lásd alább a megfelelő példák ismertetésénél).
A találmány tárgyát képezi továbbá gyógyászati készítmény (szimultán, külön-külön 10 vagy egymást követő alkalmazás céljára), amely lényegében NPYi-t vagy NPY Yli-t, valamint két kiegészítő aktív ágenst tartalmaz (lásd alábbiakban, a csatolt példákban).
A találmány tárgyát képezi továbbá gyógyászati készítmény (szimultán, külön-külön vagy egymást követő alkalmazás céljára), amely NPYi-t vagy NPY Yli-t, valamint két kiegészítő aktív ágenst tartalmaz (lásd alábbiakban a csatolt példákban).
A találmány tárgyát képezi továbbá gyógyászati készítmény (szimultán, külön-külön vagy egymást követő alkalmazásra), amely lényegében NPYi-t vagy NPY Yli-t, valamint egy kiegészítő aktív ágenst tartalmaz (lásd a csatolt példákban).
A találmány tárgyát képezi továbbá gyógyászati készítmény (szimultán, külön-külön vagy egymást követő alkalmazás céljára), amely NPYi-t vagy NPY Yli-t, valamint egy 20 kiegészítő aktív ágenst tartalmaz (lásd alább a megfelelő példák ismertetését).
Kiegészítő aktív ágensek
A találmány szerinti kombinációkban előnyösen alkalmazható megfelelő kiegészítő ágensek közé tartoznak:
1) Természetben előforduló, vagy szintetikus prosztaglandinok és észtereik. A talál25 mány szerint alkalmazható prosztaglandinok közé tartoznak olyan vegyületek, mint az alprosztadil, prosztaglandin Ei, prosztaglandin Eo, 13, 14-dihidroprosztaglandin Ei, prosztaglandin E2, eprosztinol, természetes, szintetikus és félszintetikus prosztaglandinok és származékaik, beleértve azokat, amelyeket a WO-00033825 számú nemzetközi közzétételi irat és/vagy a 2000 március 14.-én benyújtott US 6.037.346 számú amerikai egyesült 30 államokbeli szabadalmi leírás ismertet, és amelyek teljes terjedelmükben a kitanítás részét képezik, továbbá PGEo, PGEi, PGAi, PGBi, PGFia, 19-hidroxi-PGAi, 19-hidroxi-PGBi, PGE2, PGB2, 19-hidroxi-PGA2, 19-hidroxi-PGB2, PGEaa, karboproszt, trometamin, dinoproszt, trometamin, dinoproszton, lipoproszt, gemeproszt, metenoproszt, szulprosztun, tiaproszt moxiszilát;
2) α-adrenerg-receptor antagonista vegyületei, amelyek α-adrenoceptorokként, αreceptorokként vagy α-blokkolókként is ismertek. A találmány szerint előnyösen alkalmazható vegyületek közé tartoznak azon α-adrenerg-receptor blokkolók, amelyeket az 1998 június 14.-én benyújtott WO-99/30697 számú PCT nemzetközi közzétételi irat ismertet, és amelynek α-adrenerg-receptorokra vonatkozó ismertetése teljes terjedelmében a kitanítás részét képezi, ide tartoznak szelektív oti-adrenoceptor- vagy a2-adrenoceptorblokkolók és nem szelektív adrenoceptor-blokkolók; előnyös ai-adrenoceptor-blokkolók például a fentolamin, fentolamin mezilát, trazodon, alfuzozin, indoramin, naftopidil, tamszulozin,dapiprazol, fenoxibenzamin, idazoxán, efaraxán, yohimbin, rauwolfiaalkaloidák, Recordati 15/2739, SNAP 1069, SNAP 5089, RS17053, SL 89.0591, doxazozin, terazozin, abanokvil és prazozin; az US-6 037 346 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban (bejelentés napja: 2000 március 14) ismertetett a2adrenoceptor-blokkolók, például dibenamin, tolazolin, trimazozin és dibenamin; aadrenerg receptorok, amelyeket az US 4 188 390, 4 026 894, 3 511 836, 4 315 007, 3 527 761, 3 997 666, 2 503 059, 4 703 063, 3 381 009, 4 252 721 és 2 599 000 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások ismertetnek, és amelyek teljes terjedelmükben a kitanítás részét képezik; a2-adrenoceptor-blokkolók, mint a klonidin, papaverin, papaverin-hidroklorid, adott esetben szíverősítő ágens, mint például pirxamin jelenlétében;
3) NO-donor (NO-agonista) vegyületek. A találmány szerint előnyösen alkalmazható NO-donor vegyületek közé tartoznak olyan szerves nitrátok, mint például mono-, di- vagy trinitrátok, vagy szerves nitrát észterek, például glicerol-trinitrát (ismertebb néven nitroglicerin), izoszorbid-5-mononitrát, izoszorbid-dinitrát, pentaeritritol-tetranitrát, eritriltetranitrát, nitroprusszid-nátrium (SNP), 3-morfolino-szidnonimin, molszidomin, Snitrozo-N-acetil-penicillinamin (SNAP), S-nitrozo-N-glutation (SNO-GLU), N-hidroxi-Larginin, amilnitrát, linszidomin, linszidomin-klorohidrát, S-nitrozo-N-cisztein (SIN-1), diazénium diolátok, NONOátok, 1,5-pentanedinitrát, L-arginén, ginzeng, zizphi gyümölcs, molszidomine, RE-2047, nitrozilált maxiszilit-származékok, például a WO-OO12075 számú nemzetközi közzétételi iratban ismertetett NMI-678-11 és NMI-937;
4) Káliumcsatomát nyitó és moduláló vegyületek. A találmány szerint előnyösen alkalmazható káliumcsatoma megnyitó vagy moduláló vegyületek közé tartozik a nikorandil, kromokalim, levkromokalim, lemakalim, pinacidil, kliazoxid, minoxidil, charibdotoxin, gliburid, 4-aminipiridin és BaCl2;
5) Dopaminerg ágensek, előnyösen apomorfin vagy egy szelektív D2, D3 vagy D2/D3 agonista, mint például pramipexol és ropirinol (amint azt a WO-0023056 számú nemzetközi közzétételi irat ismerteti) és PNU95666 (amint azt a WO-0040226 számú nemzetközi közzétételi irat ismerteti);
6) Értágító ágensek. A találmány szerint előnyösen alkalmazható értágító ágensek közé tartozik a nimodepin, pinacidil, ciklandelát, izoxszurpin, klórprumazin, haloperidol, Rec 15/2739 és trazodon;
7) Tromboxán A2 agonisták;
8) CNS aktív ágensek;
9) Ergot alkaloidák; előnyös ergot alkaloidákat ismertet a 2000 március 14.-én benyújtott US-6 037 346 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, ezek közé tartozik az acetergamin, brazergolin, bromergurid, cianergolin, delorgotril, diszulergin, ergovinmaleát, ergotamin-tartarát, etiszulergin, lergotril, lizergid, mezulergin, metergolin, metergotamin, nicergolin, pergolid, propizergid, protergurid és tergurid;
10) A natriuretikus faktorok, közelebbről az atriális natriuretikus faktor (más néven atriális natriuretikus peptid) működését, valamint a B-típusú és C-típusú natriuretikus faktorok hatását moduláló vegyületek, mint például a neutrális endopeptidázok gátlói;
11) Angiotenzinreceptor-antagonisták, például lozartán;
12) A NO-szintetáz szubsztrátjai, például L-arginin;
13) Kalciumcsatoma-blokkolók, például amlodipine;
14) Endothelin-receptorok antagonistái és az endothelinkonvertáló enzim gátlói;
15) Koleszterint csökkentő ágensek, például sztatinok [például atorvasztatin (Lipitor™)] és Ábrátok;
16) Vérlemezke-aggregációt gátló és antitrombotikus ágensek, például tPA, uPA, warfarin, hirudin és más trombin-inhibitorok, heparin és a tromboplasztin-aktiváló faktor gátlói;
17) Inzulint szenzitizáló ágensek, például rezulin, valamint hipoglikémiát kiváltó ágensek, például glipizid;
18) L-DOPA vagy karbidopa;
19) Acetilkolineszterázt gátló vegyületek, például donezipil;
20) Szteroid vagy nem szteroid gyulladásgátlók;
21) Ösztrogénreceptor-modulátorok és/vagy az ösztrogénagonisták és/vagy antagonisták, előnyösen raloxifen vagy lazofoxifen, (-)-cisz-6-fenil-5-[4-(2-pirrolidin-l-il etoxi)-fenil]-5,6,7,8-tetrahidronaftalén-2-ol és gyógyászatilag elfogadható sóik, amelyek előállítását a WO-96/21656 számú nemzetközi közzétételi irat részletesen ismerteti;
22) PDE-inhibitor, közelebbről PDE2-, 3-, 4-, 5-, 7- vagy 8-inhibitor, előnyösen PDE2- vagy PDE5-inhibitor, előnyösebben PDE5-inhibitor (lásd alább), amely inhibitorok ICso-értékei a megfelelő enzimekkel szemben előnyösen 100 nmól/1 alatt vannak (azzal a megkötéssel, hogy a PD3 és 4 vegyületeket csak helyileg alkalmazzuk, vagy a hímvesszőbe injektáljuk);
23) NEP-gátló, amelynek ICso-értéke NEP-pel szemben kisebb, mint 300 nmól/1, előnyösen kisebb, mint 100 nmól/1;
24) Vazoaktív intesztinalis protein (VIP), VIP-mimetikum, VIP-analóg, közelebbről, amelyet egy vagy több VPAC1, VPAC vagy PACAP (“pituitory adenylate cyclase activating peptid” hipofízis-eredetű adenilát cikláz aktiváló peptid) VIP-receptor szubtípus közvetít, egy vagy több VIP-receptoragonista vagy VIP-analóg (például Ro-125-1553) vagy VIP-fragmentum, egy vagy több α-adrenoceptor antagonista VIP-kombinációval (például Invicorp, Aviptadil);
25) Melanokortin-receptor agonistái vagy modulátorai, vagy melanokortin hatását fokozó vegyületek, például a melanotan II, PT-14 vagy PT-141 vagy a WO-09964002, WO-00074679, WO-09955679, WO-00105401, WO-00058361, WO-00114879, WO00113112 és WO-09954348 számú nemzetközi közzétételi iratokban ismertetett vegyületek;
26) Szerotonin-receptorok agonistái, antagonistái vagy modulátorai, közelebbről az 5HT1A- (beleértve a VML670 vegyületet), 5HT2A-, 5HT2C-, 5HT3- és/vagy 5HT6receptorok agonistái, antagonistái vagy modulátorai, beleértve a WO-09902159, WO00002550 és/vagy WO-00028993 számú nemzetközi közzétételi iratokban ismertetetteket;
27) Tesztoszteronpótló hatóanyagok (például dehidroandrosztendion), tesztosztemon (Tostrelle), dihidrotesztoszteron vagy tesztoszteron-implantátum;
28) Ösztrogén, ösztrogén és medroxiprogeszteron vagy medroxiprogeszteron-acetát (MPA) (például kombinációban), vagy ösztrogén és metiltesztoszteron hormonpótló terápiás ágens (például HRT, közelebbről Premarin, Cenestin, Oestrofeminal, Equin, Estrace, Estrofem, Elleste, Solo, Estring, Eastraderm TTS, Eastraderm Matrix, Dermestril, Premphase, Preempro, Prempak, Premique, Estratest, Estratest HS és Tibolone);
29) Noradrenalin, dopamin és/vagy szerotonin transzportereinek a modulátorai, például bupropion, vagy GW-320659;
30) Purinerg-receptorok agonistái és/vagy modulátorai;
31) Neurokinin- (NK-) receptorok antagonistái, például a WO-09964008 számú nemzetközi közzétételi iratban ismertetettek;
32) Opioidreceptorok agonistái, antagonistái vagy modulátorai, előnyösen az 0RL-1receptor agonistái;
33) Oxitocin- vagy vazopresszin-receptorok agonistái vagy modulátorai, előnyösen szelektív oxitocin agonisták vagy modulátorok;
34) kannabinoid-receptorok modulátorai;
35) Bombezin-receptor antagonistái, közelebbről BBi-, BB2- vagy BB3 bombezinreceptorok antagonistái, előnyösen BBi-bombezin gátlói (lásd alább), amely inhibitorok10 nak a megfelelő enzimmel szemben mutatott IC50 értéke kisebb, mint 100 nmól/1;
36) SEP gátlói (SEPi), például bármely SEPi, amelynek IC50 értéke kisebb, mint 100 nmól/1, előnyösen kisebb, mint 50 nmól/1. Előnyösen, a találmány szerint alkalmazható SEP-inhibitorok előnyösen 30-szoros, előnyösebben 50-szeres szelektivitást mutatnak SEP-pel szemben, mint a NEP EC 3.4.24.11 neutrális endopeptidázzal és angiotenzint 15 konvertáló enzimmel (“angiotensin converting enzyme”, ACE) szemben. Előnyösen, a SEPi 100-szorosnál nagyobb szelektivitást mutat SEP-pel szemben, mint az endothelint konvertáló enzimmel (“endothelin converting enzyme”, ECE) szemben;
37) Olyan ágens, amely modulálni képes valamely közbülső, feszültségfuggő, kalciumaktivált káliumcsatomát adott egyén genitáliáiban.
A közzétételi iratokból és szabadalmi leírásokból idézett hatóanyagokon olyan, a találmány szerinti megoldással összhangban alkalmazható, terápiásán hatásos hatóanyagokat értünk, amelyeket a szabadalmi igénypontok, közelebbről az 1. szabadalmi igénypont és a példák definiálnak, és amelyek teljes terjedelmükben a kitanítás részét képezik.
Amennyiben aktív ágensek kombinációját alkalmazzuk, azok alkalmazhatók szimul25 tán, külön-külön vagy egymást követően.
Kiegészítő ágensek - PDE5-inhibitorok
Bármely adott cGMP PDE5-gátló alkalmasságát könnyen meghatározhatjuk oly módon, hogy szakirodalomból ismert eljárásokkal értékeljük hatásosságát és szelektivitását, majd ezt követően vizsgáljuk toxicitását, felszívódását, metabolizmusát, farmako30 kinetikáját és más tulajdonságait, a szokásos gyógyszerkutatási gyakorlatnak megfelelően.
A cGMP PDE5-inhibitorok IC5o-értékeit PDE-vizsgálattal határozhatjuk meg (lásd a leírásban alább).
Előnyösen, a találmány szerinti gyógyászati kombinációkban alkalmazott cGMP PDE5-inhibitorok a PDE5 enzimre szelektívek. Előnyösen (szájon át alkalmazva), szelektív módon kevésbé gátolják a PDE3-enzimet, előnyösebben a PDE3- és PDE4enzimet. Előnyösen (szájon át adagolva), a találmány szerinti cGMP PDE5-inhibitorok 100-nál nagyobb, előnyösen 300-nál nagyobb szelektivitási hányadost mutatnak PDE3-ra nézve, előnyösebben PDE3-ra és PDE4-re nézve.
Szakember könnyen meghatározhatja a szelektivitási hányadost. A PDE3 és PDE4 enzimekre vonatkozó IC5o értékeket szakirodalomban ismertetett szokásos eljárásokkal határozhatjuk meg [lásd S. A. Ballard és munkatársai: Journal of Urology 159, 2164-2171 (1998), valamint a leírásban alább részletezve].
A találmány szerint alkalmazható megfelelő cGMP PDE5-inhibitorok közé tartoznak az alábbiak:
az EP-A-0463756 számú európai szabadalmi leírásban ismertetett pirazolo[4,3-d]-pirimidin-7-on -ok; az EP-A-0526004 számú európai szabadalmi leírásban ismertetett pirazolo-[4,3-d]-pirimidin-7-onok; a WO-93/06104 számú nemzetközi közzétételi iratban ismertetett pirazolo-[3,4-d]-pirimidin-7-onok; a WO93/07149 számú nemzetközi közzétételi iratban ismertetett izomer pirazolo-[3,4d]-pirimidin-4-onok; a WO-93/12095 számú nemzetközi közzétételi iratban ismertetett kvinazolin-4-onok; a WO-94/05661 számú nemzetközi közzétételi iratban ismertetett pirido-[3,2-d]-pirimidin-4-onok; a WO-94/00453 számú nemzetközi közzétételi iratban ismertetett purin-6-onok; a WO-98/49166 számú nemzetközi közzétételi iratban ismertetett pirazolo-[4,3-d]-pirimidin-7-onok; a WO99/54333 számú nemzetközi közzétételi iratban ismertetett pirazolo-[4,3-d]pirimidin-7-onok; az EP-A-0995751 számú európai szabadalmi leírásban ismertetett pirazolo-[4,3]-pirimidin-4-onok; a WO-OO/24745 számú nemzetközi közzétételi iratban ismertetett pirazolo-[4,3-d] pirimidin-7-onok; az EP-A-0995750 számú európai szabadalmi leírásban ismertetett pirazolo-[4,3-d]-pirimidin-4-onok; a WO-95/19978 számú nemzetközi közzétételi iratban ismertetett vegyületek; a WO-99/24433 számú nemzetközi közzétételi iratban ismertetett vegyületek és a WO-93/07124 számú nemzetközi közzétételi iratban ismertetett vegyületek. A WO-01/27112 számú nemzetközi közzétételi iratban ismertetett pirazolo-[4,3-d]pirimidin-7-onok; a WO-Ol/27113 számú nemzetközi közzétételi iratban ismertetett pirazolo-[4,3-d]-pirimidin-7-onok; az EP-A-1092718 és az EP-A-1092719 számú európai szabadalmi leírásokban ismertetett vegyületek.
A találmány szerinti megoldában előnyösen alkalmazható további vegyületek az alábbiak:
5[2-etoxi-5-(4-metil-l-piperazinszulfonil)fenil]-l-metil-3-n-propil-l,6dihidro-7H-pirazolo[4,3-d]pirimidin-7-on (szildenafíl), másképp l-[[3-(6,75 dihidro-1 -metil-7-oxo-3 -propil-1 H-pirazolo [4,3 -d]pirimidin-5-il)4etoxifenil]szulfonil]-4-metilpiperazin (lásd EP-A-0463756 számú európai szabadalmi bejelentés); 5-(2-etoxi-5-morfolinoacetilfenil)-l-metil-3-n-propil-l,6dihidro-7H-pirazolo[4,3-d]pirimidin-7-on (lásd EP-A-0526004 számú európai szabadalmi bejelentés); 3-etil-5-[5-(4-etilpiperazin-1 -ilszulfonil)-2-n10 prpoxifenil]-2-(piridin-2-il)metil-2,6-dihidro-7H-pirazolo[4,3-d]pirimidin-7-on (lásd a WO 98/49166 számú nemzetközi közzétételi iratot); 3-etil-5-[5-(4etilpiperazin-l-ilszulfonil)-2-(2-metoxietoxi)piridin-3]-2-(piridin-2-il)metil-2,6dihidro-7H-pirazolo[4,3-d]pirimidin-7-on (lásd a WO 99/54333 számú nemzetközi közzétételi iratot); (+)-3-etil-5-[5-(4-etilpiperazin-l-ilszulfonil)-2-(2-metoxi15 lR-metiletoxi)piridin-3-il]-2-metil-2,6-dihidro-7H-pirazolo[4,3-d]pirimidin-7-on, másképp 3-etil-5 - {5-[4-etilpiperazin-1 -ilszulfonil)-2([( 1 R)-2-metoxi-1 metiletil]oxi)piridin-3-il}-2-metil-2,6-dihidro-7H-pirazolo[4,3-d]pirimidin-7-on (lásd a WO 99/54333 számú nemzetközi közzétételi iratot); 5-[2-etoxi-5-(4etilpiperazin-l-ilszulfonil)piridin-3-il]-3-etil-2-[2-metoxietil]-2,6-dihidro-7H20 pirazolo[4,3-d]pirimidin-7-on, másképp l-{6-etoxi-5-[3-etil-6,7-dihidro-2-(2metoxietil)-7-oxo-2H-pirazolo[4,3-d]pirimidin-5-il]-3-piridilszulfonil}-4etilpiperazin (lásd WO 01/27113 számú nemzetközi közzétételi irat, 8. példa); 5[2-izo-butoxi-5-(4-etilpierazin-l-ilszulfonil)piridin-3-il]-3-etil-2-(lmetilpiperidin-4-il)-2,6-dihidro-7H-pirazolo[4,3-d]pirimidin-7-on (lásd
WO 01/27113 számú nemzetközi közzétételi irat, 15. példa); 5-[2-etoxi-5-(4etilpiperazin-l-ilszulfonil)piridin-3-il]-3-etil-2-fenil-2,6-dihidro-7H-pirazolo[4,3d]pirimidin-7-on (lásd a WO 99/54333 számú nemzetközi közzétételi iratot); 2,6dihidro-7H-pirazolo[4,3-d]pirimidin-7-on (lásd WO 01/27113 számú nemzetközi közzétételi irat, 66. példa); 5-(5-acetil-2-propoxi-3-piridinil)-3-etil-2-(l-izopropil30 3-azetidinil)-2,6-dihidro-7H-pirazolo[4,3-d]pirimidin-7-on (lásd WO 01/27113 számú nemzetközi közzétételi irat, 124. példa); 5-(5-acetil-2-butoxi-3-piridinil)3-etil-2-(l-etil-3-azetidinil)-2,6-dihidro-7H-pirazolo[4,3-d]pirimidin-7-on (lásd WO 01/27112 számú nemzetközi közzétételi irat, 132. példa); (6R,12aR)2,3,6,7,12a-hexahidro-2-metil-6-(3,4-metiléndioxifenil)- 38 -
pirazino[2’,r:6,l]pirido[3,4-b]indol-l,4-dion (IC-351), azaz a WO 95/19978 számú nemzetközi közzétételi irat 78. és 95. példájában ismertetett vegyület, valamint a fenti közzétételi irat 1., 3., 7. és 8. példájában ismertetett vegyületek; 2[2-etoxi-5-(4-etil-piperazin-l-il-l-szulfonol)fenil]-5-metil-7-propil-3Himidazo[5,l,f][l,2,4]triazin-4-on (vardenafil), másképp l-[[3-(3,4-dihidro-5metil-4-oxo-7-propilimidazo[5,l,f]-áz-triazin-2-il)-4-etoxifenil]szulfonil]-4etilpiperazin, azaz a WO 99/24433 számú nemzetközi közzétételi irat 20., 19., 337. és 336. példájában ismertetett vegyületek; valamint a WO 93/07124 számú nemzetközi közzétételi irat 11. példájában leírt vegyidet (EISAI); és a következő közleményben leírt vegyületek: Rotella D.P.: J. Med. Chem. 43, 1257 (2000).
PDE5-inhibitorként alkalmazhatjuk továbbá az alább felsorolt vegyületeket:
4-bróm-5-(piridilmetilamino)-6-[3-(4-klórfenil)-propoxi]-3(2H)piridazinon;
_ [4- [(1,3 -benzodioxol-5 -ilmetil)amino] -6-klór-2-quinozinil] -4-piperidinkarbonsav, nátriumsó (I); (+)-cisz-5,6a,7,9,9,9a-hexahidro-2-[4-(trifluorometil)fenilmetil-5-metil-ciklopent-4,5]imidazo[2,l-b]purin-4(3H)on; furazlocillin; cisz2-hexil-5-metil-3,4,5,6a,8,9,9a-oktahidrociklopent[4,5]-imidazo[2,l-b]purin-4on; 3-acetil-l-(2-klórbenzil)-2-proplindiol-6-karboxilát; 3-acetil-l-(2-klórbenzil)2-proplindiol-6-karboxilát; 4-bróm-5-(3-piridilmetilamino)-6-(3-(4klórfenil)propoxi)-3-(2H)piridazinon; I-metil-5-(5-morfolinoacetil-2-npropoxifenil)-3-n-propil-l,6-dihidro-7H-pirazolo(4,3-d)pirimidin-7-on; 1,[4[(l,3-benzodioxol-5-ilmetil)amino]-6-klór-2-quinazolinil]-4-piperidin-karbonsav, nátrium(I) só; Pharmaproject No. 4516 (Glaxo Wellcome); Pharmaproject No. 5051 (Bayer); Pharmaproject No. 5064 (Kyowa Hakko; lásd a WO 96/26940 számú nemzetközi közzétételi iratot); Pharmaproject No. 5069 (Schering Plough); GF-196960 (Glaxo Wellcome); E-8010 és E-4010 (EISAI); Bay-38-3045 és 389456 (Bayer) és Sch-51866.
Ciklikus guanozin 3',5'-monofoszfát (cGMP) és ciklikus adenozin 3',5'-monofoszfát (cAMP) foszfodieszterázok elleni in vitro PDE-gátlási aktivitásokat ICso-értékeik (adott vegyület azon koncentrációja, amely adott enzimaktivitás 50%-os csökkenését eredményezi) mérésével határoztuk meg.
A kívánt PDE-enzimeket különböző forrásokból állítottuk elő, így humáneredetű barlangos testből, humán- és nyúleredetü vérlemezkékből, humáneredetű szívkamrából, humáneredetű vázizomzatból, valamint humán és kutya retinából, lényegében W. J. Thompson és Μ. M. Appleman eljárása szerint [Biochem. 10, 311 (1971)]. Közelebbről, a ·**·*··* .·*:··♦*··* - 39 - * cGMP-specifíkus PDE (PDE5) és a cGMP által gátolt cAMP PDE- (PDE3-) enzimeket humán barlangos testekből vagy humán vérlemezkékből kaptuk; a cGMP által stimulált PDE- (PDE2-) enzimet humáneredetű barlangos testekből és humán vérlemezkékből kaptuk; a kalcium/kalmodulin (Ca/CAM) -függő PDE- (PDE1-) enzimet humáneredetű szívkamrából; a cAMP-specifíkus PDE- (PDE4-) enzimet humán vázizomzatból és SF9sejtekben expresszált, humán rekombináns klónokból kaptuk, míg a fotoreceptor PDE(PDE6-) enzimet humán, valamint kutya retinából állítottuk elő. A foszfodieszteráz 7-11. enzimeket SF9-sejtekbe transzfektált, teljes hosszúságú humán rekombináns klónokból állítottuk elő.
A vizsgálatokat végezhetjük vagy W.J. Thompson és munkatársai szakaszos (“batch”) eljárásával [Biochem. J_8, 5228 (1979)], vagy az AMP/GMP közvetlen kimutatására alkalmas szcintillációs proximitás eljárással, az Amersham cég TRKQ7090/7100 katalógusszáma alatt ismertetett eljárás módosított változatának alkalmazásával. Összefoglalva, a PDE-inhibitorok hatását úgy vizsgáltuk, hogy adott állandó mennyiségű enzimet vizsgáltunk változó inhibitorkoncentrációk és alacsony szubsztrátkoncentráció jelenlétében (nem jelölt: [3H]-jelölt cGMP vagy cAMP 3 : 1 arányú elegye ~l/3ÁTm koncentrációban) úgy, hogy az IC50 értéke körülbelül megegyezzen K, értékkel. A reakcióelegy végtérfogatát 100 μΐ-re egészítettük ki vizsgálati pufferrel (1 mg/ml szarvasmarha-eredetű szérumalbumint tartalmazó, 20 mmól/1 Tris-HCl puffer, pH=7,4). A reakciót enzimmel indítottuk el, 30-60 percen át inkubáltuk 30°C-on, hogy <30% szubsztrát-átalakulást érjünk el, majd a reakciót 50 μΐ ittriumszilikát-gyöngyökkel állítottuk le (amely elegy a PDE9 és PDE11 számára megfelelő ciklikus nukleotid 3 mmól/1 koncentrációját tartalmazta). A lemezeket ismét lezártuk 20 percre, ezt követően a gyöngyöket 30 percig sötétben ülepedni hagytuk, majd a beütésszámot TopCount lemezolvasó készülékkel (Packard, Meriden, CT) mértük. A radioaktivitási egységeket a nem gátolt kontroll (100%) százalékos aktivitására számoltuk át, majd ábrázoltuk az inhibitorkoncentráció függvényében, és az inhibitor ICso-értékeit Microsoft Excel kiterjesztett “Fit Curve” szoftverjének (vagy házi fejlesztésű megfelelője) alkalmazásával kaptuk meg. Ezen vizsgálatok eredményei azt mutatták, hogy a találmány szerinti vegyületek a cGMP-specifíkus PDE5 gátlói.
A hatóanyagok in vitro funkcionális vizsgálata oly módon végezhető el, hogy lényegében S. A. Ballard és munkatársai által leírt eljárással meghatározzuk adott hatóanyag azon tulajdonságát, hogy milyen mértékben fokozza prekontrahált, nyúleredetű barlangos testből származó szövetcsíkok nitroprusszid-nátrium vagy elektromos tér által stimulált ’ .· r;.
- 40 - ·*·' ' relaxációját [Brit. J. Pharmacol. 118(suppl.), 153P kivonat (1996); J. Urology 159, 2164 (1998)].
A hatóanyagok vizsgálhatók in vitro kísérleti állatokon, például altatott nyulakon, hogy meghatározzuk azon tulajdonságukat, hogy intravénás beadásukat követően milyen mértékben fokozzák a nitroprusszid-nátrium intrakavemozus injektálása által indukált vérnyomás-emelkedést a hímvessző barlangos testében, alapjaiban azon eljárás szerint, amelyet Trigo-Rocha és munkatársai [Neurourol. and Urodyn. 13, 71 (1994)] ismertettek.
A találmány szerinti gyógyászati készítményekben NPYi hatóanyaggal kombinálva nagyon előnyösen alkalmazhatók hatásos és szelektív PDE5-inhibitorok.
A találmány szerint különösen előnyös egy, vagy több hatásos és szelektív cGMP PDE5-gátló kombinálása az NPY Y-receptor egy, vagy több, erősen szelektív gátlójával.
Kiegészítő ágensek - NEP-inhibitorok (LNEP vagy NEPi)
A NEP EC3.4.24.11 [FEBS Lett. 229(1), 206-210 (1988)], más néven enkefalináz vagy neprilizin, egy cink-dependens endopeptidáz. Ez az enzim számos bioaktív oligopeptid lebontásában játszik szerepet, hidrofób aminosav-csoportok amino-terminális oldalán található peptidkötések hasításával [összefoglalót lásd Turner és munkatársai (1997)]. A NÉP által metabolizált, neuronálisan felszabadított kulcsfontosságú bioaktív ágensek közé tartoznak olyan natriuretikus peptidek, mint például az atriális natriuretikus peptidek (ANP), valamint agyi natriuretikus peptid és C-típusú natriuretikus pepiid, endothelinek, enkefalinok, neurotenzin, P-anyag és vazoaktív intesztinális peptid. A felsoroltak közül több peptid hatásos értágító és neurohormonális funkciót, valamint diuretikus és natriuretikus aktivitást mutat, vagy viselkedési hatásokat közvetít. A NEP-re vonatkozó leírást találunk a http://www.3.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/searchomim.htlm interneteimen (Victor A. McKusick és munkatársai).
Adott I:NEP alkalmazhatósága egyszerűen eldönthető úgy, hogy szakirodalomban fellelhető szokásos eljárásokkal vizsgáljuk hatékonyságát és szelektivitását, amelyet követően megállapítjuk toxieitását, felszívódását, metabolizmusát, farmakokinetikáját és más hasonló tulajdonságait, a szokásos gyógyszerkutatási gyakorlatnak megfelelően.
Előnyösen, az LNEP ACE-vel szemben mutatott szelektivitási hányadosa nagyobb, mint 300. Az ACE-vel szemben mutatott ICso-értékek és szelektivitási hányadosok az EP1097719-A1 számú európai szabadalmi leírásban ismertetett eljárásokkal határozhatók meg.
NEP-inhibitorokat ismertetnek és írnak le az alábbi összefoglalókban:
Pathol. Bioi. 46(3), 191 (1998); Current Pharm. Design 2(5), 443 (1996); Biochem. Soc. Trans. 21(3), 678 (1993); Handbook Exp. Pharmacol. 104(1). 547 (1993); TiPS U, 245 (1990); Pharmacol Rev. 45(1) 87 (1993); Curr. Opin. Inves. Drugs 2(11) 1175 (1993); Antihypertens. Drugs 113, (1997); Chemtracts 10(11) 804 (1997); Zinc Metalloproteases Health Dis. 105, (1996); Cardiovasc. Drug Rev. 14(2), 166 (1996); Gen. Pharmacol. 27(4), 581 (1996); Cardiovasc. Drug Rev. 12(4), 271 (1994); Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 22(1) 63 (1995); Cardiovasc. Drug Rev. 9(3), 285 (1991); Exp. Opin. Ther. Patents 6(11) 1147(1996).
További NEP-inhibitorok ismertetését találjuk az alábbi szakirodalmi helyeken: EP509442A számú európai szabadalmi bejelntés; US-192435 és US-4929641 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások; EP-599444B számú számú európai szabadalmi leírás; US-884664 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; EP-544620A számú európai szabadalmi bejelentés; US-798684 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; J. Med. Chem. 3821 (1993); Circulation 88(4), 1 (1993); EP-136883 számú európai szabadalmi leírás; JP-85136554 számú japán szabalmi bejelentés; US4722810 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; Curr. Pharm. Design 2, 443 (1996); EP-640594 számú európai szabadalmi leírás; J. Med. Chem. 36(1) 87 (1993); EP-738711-A számú európai szabadalmi bejelentés; JP-270957 számú japán szabadimi bejelentés, CAS# 115406-23-0; DE-19510566; DE-19638020; EP-830863 számú európai szabadalmi leírás; JP-98101565 számú japán szabadalmi bejelentés; EP-733642 számú európai szabadalmi leírás; WO96/14293 számú nemzetközi közzétételi irat; JP-082445609 számú japán szabadimi bejelentés, WO94/15908 számú nemzetközi közzétételi irat; JP05092948 számú japán szabadalmi bejelentés; WO-93/09101 számú nemzetközi közzétételi irat; WO-91/09840 számú nemzetközi közzétételi irat; EP-519738 és EP-690070 számú európai szabadalmi leírás; J. Med. Chem 36, 2420 (1993); JP-95157459 számú japán szabadalmi bejelentés; Biorg. med. Chem. Letts. 6(1) 65 (1996); EP-A-0274234 számú európai szabadalmi leírás; JP-88165353 számú japán szabadalmi bejelentés; Biochem. Biophys. Res. Comm. 164, 58 (1989); EP-629627-A számú európai szabadimi bejelentés; US-77978 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; valamint Perspect. Med. Chem. 45, (1993); EP-3 58398 számú európai szabadalmi leírás.
További NEP-inhibitorokat ismertetnek az EP-1097719-A1 számú európai szabadalmi leírásban; közelebbről, ilyen vegyületek a fenti leírásban a FXII-FXIII jelű vegyületek.
Előnyös NEP-inhibitorok az EP-1097719-A1 számú európai szabadalmi leírásban ismertetett FV-FXI és F57-F65 jelű vegyületek.
Kiegészítő ágensek - bombezinreceptor-antagonisták
Tapasztalatok szerint, a bombezinreceptor-antagonisták előnyösen alkalmazhatók hím egyedek szexuális funkciózavarának kezelésére, közelebbről drogok által kiváltott, valamint generalizált szexuális válaszképtelenséggel és a szexuális ingerlékenység időskori csökkenésével párosuló, pszichogén eredetű hím szexuális funkciózavarok és kezelésére.
Bombezinreceptor-antagonista vegyületeket vizsgáltak megbízható és előrejelző értékű állatmodelleken, különös tekintettel, hogy nőstényekre vonatkozó előrejelzéseket kapjanak. Rágcsálókban a proceptív magatartás hormonális szabályozás alatt áll, mivel a proceptív magatartás indukciójához nélkülözhetetlen az ösztrogénnel kombinált progeszteron [Johnson M. és Everitt B.: Essential Reproduction (3. kiadás) Blackwell, Oxford (1988)]. Főemlősök esetében a proceptív magatartás hormonális szabályozásának a bizonyítéka ellentmondásos, összességében úgy tűnik, hogy ösztrogének és/vagy androgének fokozzák a proceptív magatartást [Baum M. J.: Biosci. 33, 578-582 (1983)]. Patkányokban a proceptív magatartás viselkedési megnyilvánulásai közé tartozik az “ugráló és szökellő“ mozgás, a fülek gyors vibrálása mellett. Szexuális kontaktus keresésére való erős késztetés megállapítására alkalmas vizsgálatokról számoltak be, mint a proceptivitás mérésére legalkalmasabb megfelelő eljárásról [Meyerson B. J. és Lindstrom L. H.: Acta Physiol. Scand. 389, (Suppl.) 1-80 (1973)]. A receptivitás patkányban úgy nyilvánul meg, hogy a nőstény lordózisos helyzetet vesz fel. Ez akkor történik, amikor hágáskor a hím nyomást fejt ki mellső lábaival a receptív nőstény oldalaira. Ezen viselkedés neuronális szabályozásának fő helye a ventromediális mag (“ventromedial nucleus”, VMN) és a köztiagy központi szürkeállománya (“midbrain central grey area”, MCG) [Öszszefoglaló ismertetést lásd Wilson C. A.: Sexual Pharmacology szerk.: Riley A. J. és munkatársai, Clarendon Press, Oxford, 1-58 (1993)].
A bombezin egy 14 aminosavból álló pepiid, amelyet eredetileg a Bombina bombina európai békafajból izoláltak [Anastasi A. és munkatársai: Experientia 27, 166 (1971)]. Olyan peptidek osztályába tartozik, amelyek C-terminális dekapeptid-régiójukban strukturális homológiát mutatnak [Dutta A. S.: Small peptides; Chemistry, Biology, and Clinical Studies, II. fejezet 66-82]. Napjainkig két emlőseredetű bombezinszerű peptidet azonosítottak, a neuromedin B (NMB) peptidet és egy 23 aminosav-csoportot tartalmazó, gasztrint felszabadító peptidet (“gastrin-releasing peptide”, GRP).
A bombezin számos centrális hatást vált ki, receptorok heterogén populációjára történő hatáson keresztül. A BBi-receptor nagyobb affinitással köti a neuromedin B (NMB) pepiidet, mint a gasztrint felszabadító peptidet (GRP) és neuromedin C pepiidet, míg a BB2 receptor nagyobb affinitással köt GRP és NMC peptideket, mint NMB peptidet. Újabban bizonyítékot találtak két további, BB3 és BB4 receptornak elnevezett receptor-szubtípus létezésére, azonban korlátozott gyógyszertani ismeretek miatt funkcióikról keveset tudunk.
A BB|- és BB2-receptorok heterogén eloszlást mutatnak a központi idegrendszerben, ami arra utal, hogy ezen receptorok endogén ligandumai differenciáltan modulálják a neurotranszmissziót. Más területek mellett, a BBi-receptorok a ventromediális 10 hipothalamuszban találhatók [Ladenheim E.E. és és mtsai.: Brain Res. 537, 233 (1990)].
Bombezinszerü immunreakciót és mRNS-t mutattak ki emlőseredetü agyból [Braun M. és munkatársai: Life Sci. 23, 2721 (1978); Battey J. és munkatársai: TINS 14, 524 (1991)]. Úgy tudjuk, hogy az NMB és GRP számos biológiai funkciót közvetít [összefoglalót lásd a WO-98/07718 számú nemzetközi közzétételi iratban],
Az alábbi közzétételi iratokban és szabadalmi leírásokban NMB és/vagy GRP hatásait bombezin-receptorok szintjén antagonizálni képes hatóanyagokat ismertetnek:
CA 2030212 számú kanadai szabadalmi leírás; EP-0309297, EP-0315367, EP0339193, EP-0345990, EP-0402852, EP-0428700, EP-0438519, EP0468497, EP-0559756, EP-0737691 és EP-0835662 számú európai szabadalmi leírások; JP07258081 számú japán szabadalmi bejelentés, UK 2231051 számú nagy-britanniai szabadalmi bejelentés; US 4943561, US 5019647, US 5028692, US-5047502, US 5068222, US5084555, US 5162497, US 5244883, US 5439884, US 5620955, US 5620959, US 5650395,
US 5723578, US 5750646, US 5767236, US 5877277, US 5985834 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások; WO 88/07551, WO 89/02897, WO 89/09232, 25 WO 90/01037, WO 90/03980, WO 91/02746, WO 91/04040, WO 91/06563,
WO 92/02545, WO 92/07830, WO 92/09626, WO 92/20363, WO 92/20707,
WO 93/16105, WO 94/02018, WO 94/02163, WO 94/21674, WO 95/00542,
WO 96/17517, WO 96/28214, WO 97/09347, WO 98/07718, WO 00/09115 és
WO 00/09116 számú nemzetközi közzétételi iratok. Úgy gondoljuk, hogy a fenti közzété teli iratokban és szabadalmi leírásokban ismertetett hatóanyagok alkalmazhatók szexuális funkciózavar megelőzésére és/vagy kezelésére, amely indikáció a fenti iratokban nem említett vagy nem javasolt indikáció, és annak felvetése valójában egyetlen, bombezinreceptorokkal foglalkozó korábbi szakirodalmi helyen sem szerepel.
A WO-98/07718 számú nemzetközi közzétételi iratban ismertetett előnyös bombezinreceptor-antagonista családba az alábbi, (I) általános képletű vegyületek és gyógyászatilag elfogadható sóik tartoznak:
R3 (I) általános képlet ahol:
j értéke 0 vagy 1;
k értéke 0 vagy 1;
értéke 0, 1, 2 vagy 3;
m értéke 0 vagy 1;
n értéke 0, 1 vagy 2;
Árjelentése fenil, piridil vagy pirimidil, amelyek bármelyike lehet szubsztituálatlan, vagy 1-3 szubsztituenssel szubsztituált, ahol a szubsztituens jelentése alkil-, halogén-, alkoxi-, acetil-, nitro-, amino, -CH2NR10Rh-, ciano-, -CF3-, -NHCONH2- vagy -CO2R12csoport;
R1 jelentése hidrogén, vagy 1-7 szénatomos, lineáris, elágazó vagy ciklikus alkilcsoport;
R8 jelentése hidrogén, vagy gyűrűt képezhet 3-7 szénatomos R1-csoporttal;
R2 jelentése hidrogén, vagy 1-8 szénatomos, lineáris, elágazó vagy ciklikus alkilcsoport, amely tartalmazhat 1-2 oxigén- vagy nitrogénatomot;
R9 jelentése hidrogén, vagy 3-7 szénatomos gyűrűt képezhet R2-csoporttal, amelyben jelentése egy oxigén vagy nitrogén atom; vagy R2 és R9 együtt alkothat karbonilcsoportot;
Ar1 jelentése függetlenül Ar, és tartalmazhat piridil-N-oxid-, indolil-, imidazolil vagy piridilcsoportot;
R4, R5, R6 és R7 jelentése egymástól függetlenül hidrogén és alacsony szénatomszámú alkilcsoport; és R4 2-3 atomos - amely oxigén- vagy nitrogénatomot tartalmazhat - kovalens összeköttetést képezhet R5-tel;
R3 jelentése egymástól függetlenül Ar, vagy hidrogén, hidroxi-, -NMe2-, Nmetilpirrolil-, imidazolil-, N-metilimidazolil-, tetrazolil-, Ν-metil-tetrazolil-, tiazolil-, CONR13R14- vagy alkoxicsoport;
ahol p értéke 0, 1 vagy 2, és Ar2 jelentése fenil- vagy piridil-; és
R10, R11, R12, R13 és R14 jelentése egymástól függetlenül hidrogén vagy 1-7 szénatomos, lineáris, elágazó vagy ciklikus alkilcsoport.
A fenti vegyületcsaládon belül különösen előnyös vegyület a (S) 3-(lH-indol-3-il)-N15 [i-(5-metoxi-piridin-2-il)-ciklohexilmetil]-2-[3-(4-nitrofenil)-ureido]-propionamid és gyógyászatilag elfogadható sói.
BBj- és BEh-kötődésvizsgálatok
Az alábbi vizsgálatokban BBi és BB2 kötődésének mérését végeztük az alábbiak szerint. Humáneredetű klónozott MNB (BBi-vizsgálat céljára) és GRP (BB2 vizsgálat céljára) 20 receptorokat stabilan expresszáló CHO-Kl-sejteket tenyésztettünk szokásos eljárással, 10% magzati borjúszérummal és 2 mmól/1 glutaminnal kiegészített Ham-féle FI 2tápközegben. Kötődésvizsgálatokhoz a sejteket tripszines kezeléssel összegyűjtöttük, majd felhasználásig 5% DMSO krioprotektív reagenst tartalmazó Ham-féle F12-tápközegben 70°C-on fagyasztva tároltuk. A felhasználás napján a sejteket gyorsan felolvasztottuk, táp25 közeggel hígítottuk, majd 5 percen át, 2000 g-n centrifugáltuk. A sejteket vizsgálati pufferben (0,02% szarvasmarha szérumalbuminnal, 40 pg/ml bacitracinnal, 2 pg/ml kimosztatinnal, 4 pg/ml leupeptinnel és 2 pmól/l foszforamidonnal kiegészített 50 mmól/1 Tris-HCl, pH=7,4 21°C-on) reszuszpendáltuk, számoltuk, majd politron kezelésnek vetettük alá (5-ös fokozat, 10 mp), mielőtt 10 percen át, 28000 g-n centrifugáltuk. A végső üle30 déket vizsgálati pufferben szuszpendáltuk 1,5 x 105/ml végső sejtkoncentrációban. A kötési vizsgálatokhoz a membránok 200 pl térfogatnyi mennyiségét [125I][Tir4]bombezinnel inkubáltuk (<0,l nmól/1), vizsgálandó vegyületek jelenlétében és anélkül (végső vizsgálati térfogat 250 μΐ volt), NMB-receptor esetében 60 percen át, GRP-receptor esetében percen át. A nem specifikus kötődést 1 pmól/l bombezinnel határoztuk meg. A vizsgálatokat >2 órán át 0,2% PEI-reagensbe áztatott Whatman GF/C filtereken történt, vákuum alatt végzett filtrálással állítottuk le, majd a filtereket 50 mmól/1 Tris pufferei (pH=6,9 21°C-on; 6x1 ml) mostuk. A kötődött radioaktivitást gammaszámlálóval határoztuk meg.
A kompetíciós eredményeket nonlineáris regresszióval analizáltuk, Prism® (GraphPad Software Inc., San Diego, USA) iteratív görbeszerkesztési eljárásokat alkalmazva. Az ICso-értékeket a Cheng-Prusoff egyenlet alkalmazásával korrigáltuk Kj értékekre [Cheng Y., Prusoff W. H.: Biochem. Pharmacol 22, 3099-3108 (1973)].
Kiegészítő ágensek - SEP-gátlók (SEPi)
Egy SEPi olyan vegyület, amely gátol, vagy szelektív módon gátol SEP-aktivitást mutató polipeptidet.
A SEP egy oldható, szekretált endopeptidáz. Az endopeptidázok, például szerinproteázok, ciszteinproteázok és metalloproteázok, pepiiden belül egy adott szekvenciánál hasítanak.
Az endopeptidázok egy fontos csoportja cink-metalloproteázként ismert, és azzal jellemezhető, hogy katalitikus helyükön egy cinkion kötődését igénylik. A cinkmetalloproteázok osztályokra bonthatók [összefoglaló ismertetést lásd FEBS Letters 354. 1-6 (1994)], egyik osztályuk a neprilizin (NEP)-szerü cink-metalloproteázok [FASEB Journal U, 355-384 (1997)]. A NÉP osztályba legalább 7 enzim tartozik, amelyek struktúrálisan hasonlóak egymáshoz (lásd alább). Jellemzően membránhoz kötöttek, hoszszú karboxiterminális extracelluláris doménnal, egy rövid, membránon áthúzódó régióval, és egy rövid intracelluláris doménnal az amino-terminális végén. A család ismert tagjai a neprilizin (más néven NÉP, CD 10, CALLA, enkefalináz vagy EC 3.4.24.11), endothelinkonvertáló enzimek (ECE-1 és ECE-2), PEX, KELL, X-konvertáló enzim (“X-converting enzyme”, XCE) vagy sérülés által indukált neurális endopeptidáz (“demage induced neural endopeptidase”, DINE), és egy rágcsálókban azonosított enzim, amelyet szolúbilis szekretált endopeptidáznak vagy neprilizinll-nek neveznek [SEP/NEPII; Ghaddar, G. és munkatársai: Biochem. Journal 347. 419-429 (2000); Ikeda, K. és munkatársai: Journal Biological Chemistry 274, 32469-32477 (1999); Tanja, O. és munkatársai: Biochem Biophys. Research Communication 271. 565-570 (2000); WO-99/53077 számú nemzetközi közzétételi irat]. Ezen osztály tagjainak funkciójáról azt gondoljuk, hogy peptiderg szignálozással függ össze. Ez a folyamat minden organizmusban jelen van, embereket is beleértve, és amelynek során a szervezet peptidmolekulákat “hírvivőként” alkalmaz fiziológiai válaszok kiváltására. Ez jellemzően magába foglalja a peptid hírvivő molekula specifikus sejt általi előállítását és felszabadulását, esetenként inaktív prekurzorként, amelyet egy proteáz hasít, hogy aktívvá váljon. A peptid aktív formája aztán egy másik sejt felszínén található specifikus receptorhoz kötődik, ahol választ vált ki. Ezt követően a peptid egy másik proteáz által történő degradáció révén inaktiválódik.
A NEPII valószínűleg az egéreredetű SEP-enzim patkányban előforduló megfelelője, mivel 91% aminosav-azonosságot mutatnak. Ezek az osztály azon képviselői, amelyek a legközelebb állnak a NÉP aminosav-szekvenciájához, amivel mindkettő 54% azonosságot mutat. Mindkét enzim mRNS-e nagy mennyiségben fordul elő a herékben, és kis mennyiségben kimutatható többféle más szövetben. A patkányeredetű NEPII esetében a mRNS-t viszonylag nagy mennyiségben mutatták ki az agyban és agyalapi mirigyben is. Emlőssejtekben rekombináns eljárással előállítva, mind az egéreredetű SEP, mind a patkányeredetű NEPII megtalálható a tápközegben. Ez arra utal, hogy képesek szekretált proteázokként keringeni, és így hasítani proteineket a test más helyein. Az egéreredetű SEP és patkányeredetü NEPII, az osztály néhány tagjához, így például az ECE-1-hez hasonlóan hasítási variációt mutatnak. Az egéreredetű SEP és patkányeredetű NEPII esetében ez a hasítási variáció izoformokat eredményez, a membrán-lokalizálódásban és szekretálódásban résztvevő szekvenciák módosulásával. Ennek fiziológiai jelentősége nem világos, valószínű azonban, hogy léteznek ezen enzimek membránhoz kötött, keringő és intracelluláris formái. Az egéreredetú SEP-ről kimutatták, hogy fontos biológiai peptidek egész sorát képes hasítani, ezek közé tartozik az enkefalin, endothelin, big-endothelin, bradikinin és P-anyag („substance P”). Ennek megfelelően, a NEP-hez hasonlóan, széles szubsztrát-specificitást mutat, és különböző szövetekben számos fiziológiai funkciója lehet.
Az ebbe a NEP-osztályba tartozó enzimekről, mint más metalloproteáz enzimekről kimutatták, hogy gátolhatok kisméretű, drogszerű molekulákkal (például tiorfánnal és foszforamidonnal). Ez a tény, továbbá a NEP-szerű enzimek néhány tagjának a peptiderg szignálozás modulálásában betöltött élettani szerepe természetének a megismerése ezen enzimeket gyógyszertani beavatkozások vonzó célpontjává teszik.
SEP-szekvenciákat ismertetnek a WO-99/53077 és WO-00/47750 számú nemzetközi közzétételi iratok, valamint az EP-1069188 számú európai szabadalmi leírás, továbbá a leírás 7-9. ábrái (4-6. azonosítószámú szekvenciák).
A leírásban -például vizsgálatok céljára - ismertetett SEP-szekvenciák utalás formájában kiterjednek bármely, vagy több olyan szekvenciára, amelyeket a WO99/53077 és
WO-00/47750 számú nemzetközi közzétételi iratok, valamint az EP-1069188 számú európai szabadalmi leírás ismertetnek, vagy a leírás szerinti 4., 5. és 6. azonosítószámú szekvenciák mutatnak, továbbá azok variánsaira, fragmentumaira, homológjaira, analógjaira vagy származékaira.
A 4. és 5. azonosítószámú szekvenciák mindegyike humáneredetű SEP-enzimet kódoló nukleotid-szekvenciát (cDNS-t) mutat. Az 5. azonosítószámú szekvencia részleges vektorszekvenciákat is tartalmaz. A 6. azonosítószámú szekvencia humáneredetű SEPproteint mutat.
Bármely adott SEPi alkalmassága meghatározható hatásosságának és szelektivitásának az értékelésével, például az alábbi vizsgálatokkal, amelyet követően meghatározzuk toxicitását, felszívódását, metabolizmusát, farmakokinetikáját és más hasonló tulajdonságát, a szokásos gyógyszerkutatási gyakorlatnak megfelelően.
Előnyös SEP-vizsgálat, amely alkalmazható SEP reménybeli gátlóinak kimutatására, egy fluoreszcencia rezonancia energia transzfer (FRET) vizsgálat. A vizsgálatban alkalmazott legelőnyösebb jelzett szubsztrát pepiid a Rhodamin-zölddel jelölt Gly-Gly-dPhe-LeuArg-Arg-Val-Cys(QSY™-7)-pAla-NH2.
SEP FRET vizsgálat
A SEP FRET vizsgálat Carvalho és munkatársai által, NEP-re kifejlesztett eljáráson alapul [Carvalho és mtsai.: Annál. Biochem. 237, 167 (1996)]. A SEP FREP vizsgálatban hasonló, intramolekulárisan elnyelt szignálú fluorogén peptidszubsztrátot alkalmazunk, de fluorogén donor / akceptor fluoroforok, közelebbről Rhodaminzöld (Molecular Probes, Inc., Eugen, OR, USA) és QSY™-7 (a továbbiakban “QSY-7” vagy “QSY7”; Molecular Probes, Inc.) új kombinációjával.
A SEP endopeptidáz aktivitását annak a Rhodaminzöld-Gly-Gly-dPhe-Leu-Arg-ArgVal-Cys(QSY7)-pAla-NH2 szintetikus peptidszubsztrátot proteolitikus úton hasító képessége alapján mérjük.
A fenti vizsgálatban alkalmazott két fluorofor (fluorogén reagensek) átfedő emissziós és abszorbciós spektrummal rendelkezik, ezáltal azok alkalmasak energiatranszferre. A Rhodaminzöld donorként funkcionál, és 485 nm-en gerjesztve 535 nm-es emissziót (fluoreszcenciát) bocsát ki, amely viszont a QSY7-t gerjeszti (FRET megy végbe). A QSY7 fluoreszcensen néma, és nem emittál 535 nm felett, ezért szignál nem mutatható ki (a Rhodaminzöld emissziója elnyelődik).
A SEP által, a peptidszubsztrát Arg-Val-peptidkötésénél történő hasítást (szelektív hidrolízist) követően, a Rhodaminzöld- és QSY7-egységek eltávolodnak egymástól, és
485 nm-en történő gerjesztéskor nem mehet végbe többé energiatranszfer. Következésképp, a Rhodaminzöld emissziójának megfelelően, a fluoreszcencia növekedése figyelhető meg 535 nm-en.
A Rhodaminzöld-Glv-Gly-dPhe-Leu-Arg-Arg-Val-Cys(QSY7)-0Ala-NH2 szintetikus peptidszubsztrát előállítása
A peptidek összeállítását 0,25 mmól/1 FMOC-PAL-PEG-PS gyantán végeztük, szilárdfázisú peptidszintézis eljárással úgy, hogy a gyártó által (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) szállított 9-fluorenilmetoxikarbonil (FMOC) alapú szintézis ciklusokhoz módosításokat eszközöltünk. Módosított ciklusaink 20% piperidin / N-metilpirrolidinon (NMP) reagenssel történt 2x5 perces kezeléssel megszüntették a védelmet az amino végződésen, aminek a hatékonyságát 301 nm hullámhosszon történő UV-elnyelés mérésével követtük úgy, hogy a védelmet megszüntető oldat kis mintáját átengedtük egy UV-elnyelést detektáló készüléken. Egy másik töltetben, a bejövő aminosavat aktiváltuk egyenként 0,9 ekvivalens mennyiségű 2-(lH-benzotriazol-l-il)-l,l,3,3-tetrametiluroniumhexafluorofoszfát és 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) Ν,Ν-dimetilformamidban (DMF) oldott elegyével. A rendszerhez 2 ekvivalens mennyiségű diizopropiletilamin reagenst adtunk. Egyidejűleg, a gyantát NMP-vei mostuk, hogy eltávolítsuk a védelem-megszüntetés melléktermékeit. A mosófolyadékot eltávolítottuk a gyantáról, majd az aktivált aminosavésztert a gyantára vittük és 20 percen át kevertettük, hogy az aminovégződéshez történő kötődést lehetővé tegyük. A maradék kötőoldatot eltávolítottuk, majd a gyantát újramostuk NMP-vei. Hogy biztosítsuk a peptid homogenitását, NMP-ben oldott 0,4 mól/1 ecetsavanhidrid, 0,04 mól/1 HOBt és 12 mmól/1 DOEA elegyét adtuk a gyantához, hogy acetiláljuk az esetleg nem reagált helyeket. Végül a gyantát NMP-vei mostuk, a mosófolyadékot eltávolítottuk, majd diklorometán és 2,2,2-trifluoroetanol 1:1 arányú elegyével mostuk, és szárítottuk. A fenti folyamat a peptidszintézis egyetlen ciklusát jellemzi. A befejezett, szintetizált terméket a hordozó gyantáról lehasítottuk, és a védelmet Reagent K [King, D. S. és munkatársai: Int. J. Pep. Prot. Res. 36, 255-66 (1990)] reagenssel megszüntetve, 251 mg (100%) nyers CP1-pepiidet nyertünk [elektrospray tömegspektrográfiás (ESMS) vizsgálattal, (m/z kalkuláció {calc. )=977,21 {MH+ átlag), obs.=977,47)].
QSY-7 kapcsolása ciszteinhez
Ötven mg (51 μΜόΙ) nyers CP1-pepiidet oldottunk fel 45 mg (52,4 μΜόΙ) QSY-7maleimidet, és 10% DIEA-reagenst tartalmazó DMF oldatban. Tíz perc múlva a reakciót HPLC-MS vizsgálattal befejezetlennek ítéltük, és további 30 mg (30,7 μΜόΙ) nyers pepiidet adtunk a reakcióelegyhez. További 30 perc múlva a reakciót HPLC-MS vizsgálattal befejezettnek ítéltük, a kiindulási reagensek felhasználódtak. A végterméket Cl8 preparatív HPLC kromatográfiás eljárással izoláltuk, MALDI-tömegspektrográfiás (“Matrix Assisted Laser Desorption Ionization mass spectrometry”) mérés szerint a kívánt molekulatömeget mutató frakciókat összeöntöttük és 73,7 mg (50%) lila porrá liofileztük, így nyerve a CP2 pepiidet; ESMS [m/z calc.=1797,86 (MH+ monoizotópos), obs.=1797,86].
Bisz(trifluoracetil) Rhodaminzöld fluorofor kapcsolása aminovégződéshez
A reakcióhoz 73,7 mg (41 μΜόΙ) CP2 pepiidet oldottunk fel, 35 mg (52,8 μΜόΙ) Rhodaminzöld-karbonsavat, trifluoracetamidot, szukcinimidil-észter [5(6)-CR 110 TFA, SE] “kevert izomereket” és 2% DIEA reagenst tartalmazó DMF-oldatban. Két óra múlva a reakciót HPLC-MS-vizsgálat szerint befejezettnek ítéltük. A végterméket C4 preparatív HPLC-kromatográfiával izoláltuk és a kívánt molekulatömeget mutató (MALDI-MS-sel) frakciókat összegyűjtöttük, majd 71,4 mg lila porrá liofileztük; ESMS [m/z calc.=2345,92 (MH+ monoizotópos), obs.=2345,47]
Trifluoracetíl védőcsoportok eltávolítása Rhodaminzöld fluoroforról
A reakcióhoz 71,4 mg (30,4 μΜόΙ) CP3-peptidet oldottunk 10 ml CH3CN és H2O 1:4 arányú elegyében. Tizenhat órán át tartó erős kevertetést követően a felülúszót dekantáltuk az oldhatatlan fázisról. A reakcióedényt 1 ml DMSO-val kiöblítettük; ezt a felülúszó és a termék C4 preparatív HPLC-kromatográfiás izolálásával kombináltuk. A termékre jellemző molekulatömeget mutató frakciókat (MALDI-MS) összegyűjtöttük és 64 mg (98%) lila porrá liofileztük, így nyertük a CP4-peptidet; ESMS [m/z calc.=2155,54 (MH+ átlag), obs.=2155,27]. A CP4 termék a kívánt Rhodaminzöld-Gly-Gly-dPhe-Leu-Arg-Arg-ValCys(QSY7)-pAla-NH2.
A reakcióhoz alkalmazott anyagok
Minden reagens a kereskedelemben kapható legnagyobb tisztaságú volt, és további finomítás nélkül alkalmaztuk. A peptidszintézishez minden reagenst az Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) cégtől szereztünk be, az alábbi kivételekkel: QSY™-7 maleimidet (katalógusszáma Q-10257), Rhodaminzöld-karbonsavat, trifluoracetamidot és szukcinimidilészter [5(6)-CR 110 TFA, SE] “kevert izomereket” (katalógusszáma R-6112) a Molecular Probes Inc. (OR, USA) cégtől, FMOC-PAL-PEG-PS reagenst a Perseptive Biosystems (MA, USA) cégtől (katalógusszáma GEN913384), FMOC-B-alanin és FMOCd-fenilalanin reagenseket a Novobiochem (CA, USA) cégtől, FMOC-Arg(Pbf)-OH reá genst az AnaSpec Inc. (CA, USA) cégtől és 2,2,2-Trifluoretanolt az Aldrich (WI, USA) cégtől szereztünk be. Nátrium-karbonátot a Fisher cégtől (PA, USA) vásároltunk.
A preparatív HPLC-vizsgálatokat Vydac (CA, USA) Cl8 (katalógusszáma 218TP1022) vagy C4 (katalógusszáma 214TP1022) oszlopokon végeztük, 10 ml/perc átfo5 lyási sebesség mellett, az eluálást 0-80% lineáris gradiens alkalmazásával végeztük (az Aeluens 5% CH3CN, 0.1% TFA és 94,5% H2O elegye, a B-eluens 100% CH3CN volt) 30 percen át, 30 másodperces frakciókat gyűjtve. Az analitikus HPLC-MS vizsgálatokat Micromass (Manchester, Egyesült Királyság) LCT tömeg-spektrométeren végeztük (a tömegeket külső kalibrált standardokhoz viszonyítottuk), amelyhez egy Waters (MA, USA) 10 2690 típusú HPLC becsatlakozót és egy Waters 996 típusú fotodióda detektort csatlakoztattunk, a kromatográfíát Vydac C4 (katalógusszáma 214TP5415) oszlopon végeztük 080%-os lineáris gradienssel, ahol az A -eluens 5% CH3CN, 0,1% TFA és 94,9% H2O, a Beluens 100% CH3CN volt, 30 percen át, 1 ml/perc átfolyási sebesség mellett. A molekulatömegeket a megfigyelt többszörös töltést mutató ionokból számoltuk ki, Micromass 15 transzform szoftver alkalmazásával. A MALDI-MS értékeket Perseptive Biosystems
Voyager-DE lineáris tömeg-spektrométerrel határoztuk meg, alfa ciano-4-hidroxicinnaminsav mátrix alkalmazásával (Hewlett Packard, CA, USA), és a közölt tömegeket külső kalibrációra alapoztuk.
A szintézis menete (beleértve a kémiai struktúrákat)
A CP4 Rhodaminzöld-Gly-Gly-dPhe-Leu-Arg-Arg-Val-Cys(QSY™-7)-PAla-NH2 szintetikus pepiid szubsztrátot úgy szintetizáltuk, hogy a közbülső CP3 terméket szilárdfázisú peptidszintézis sémájába illesztettük.
1. séma:
(il)
FMOC-PAL-PEG gyanta ciklus szilárdfázisú peptidszintézis
Összefoglalva, FMOC-PAL-PEG-gyantát állítottunk elő szilárdfázisú peptidszintézis eljárással, amelyet hatásfok és idő paraméterekre optimalizáltunk. Ezek a ciklusok (részleteket lásd fentebb) magukba foglaltak 2 FMOC védelem-megszüntetést, mosásokat, egyetlen, HBTU-aktivált aminosav kötését, mosásokat, fedést és végül mosást NMP-vel, majd trifluoretanol és diklórmetán 1:1 arányú elegyével. Ezek a mosások segítenek visszanyerni a gyanta másodlagos struktúráját, ami lehetővé teszi a védelem maradéktalan megszüntetését és a következő bejövő aminosav hatásos kötését a következő ciklus során.
A CP2 peptidet a 2. séma szerint szintetizáltuk (a részleteket lásd fent):
I DIEA/DMF
A QSY-7 csoport beépülését követően, hozzáadjuk a második, Rhodaminzöld fluoro fort, mint bisz-trifluoracetillel védett festéket, a 3. séma szerint:
- 54 ···· ·· · *· ··
Végül a trifluoracetil-csoportokat NazCCh-kezeléssel eltávolítjuk, így nyerve a kívánt CP4 szubsztrátot:
(CP4)
A vizsgálat ismertetése
A vizsgálat céljára a reagenseket az alábbiak szerint állítottuk elő:
Szubsztrátoldatot állítottunk elő úgy, hogy Rhodaminzöld-Gly-Gly-dPhe-Leu-ArgArg-Val-Cys(QSY7)-PAla-NH2 szubsztrátot 2 μΜόΙ koncentrációban 50 mmól/l HEPES (Sigma, Egyesült Királyság) puffer pH=7,4 oldatban szuszpendáltuk, majd az elegyhez 25 ml-enként egy EDTA-mentes proteázinhibitor-tablettát (Roche Diagnistics, Egyesült Királyság) adtunk.
A fent ismertetett SEP enzim egy adagját felolvasztottuk, majd 50 mmól/l HEPESpuffer pH=7,4 oldatban hígítottuk az egyes enzimadagokra specifikusan meghatározott faktor szerint úgy, hogy a vizsgálat során a reakcióelegy 50 μΐ-e elegendő enzimet tartalmazzon a szubsztrát körülbelül 30%-ának termékké alakításához.
ml DMSO-t és 96 ml, 50 mmól/l HEPES-puffert pH=7,4 tartalmazó 4%-os DMSOoldatot állítottunk elő.
Oldatot készítettünk úgy, hogy 500 μΐ szubsztrátoldatot elegyítettünk 250 μΐ enzimoldattal és 250 μΐ 4%-os DMSO-oldattal, majd az elegyet 16 órán át 37°C-on inkubáltuk.
A vizsgálatot az alábbiak szerint végeztük: Sötétfalú, 96 lyukú mikrotitráló lemezeken 100 μΐ szubsztrátoldatot adtunk 50 μΐ 4%-os DMSO-oldathoz. Egy hasonló, nem specifikus háttér-vakpróbát is készítettünk, amelyben az 50 μΐ 4%-os DMSO kiegészítésül 40 μΜόΙ foszforamidont tartalmazott. Ötven μΐ enzimet adtunk a vizsgálati mintákhoz és a vakpróbához, és a lemezt Biolise szoftvercsomaggal üzemelő BMG Galaxy típusú fluoreszcencia-leolvasó készülékbe helyeztük (BMG Láb Technologies, Offenberg, Németország).
A lemezt a fluoreszcencia-leolvasó készülékben 1 órán át, 37°C-on inkubáltuk, ezalatt a készülék 3 percenként fluoreszcencia-mérést végzett [excitáció (Ex) 485 nm-en, emisszió (Em) 535 nm-en]. A SEP proteolitikus aktivitása összefügg a minta fluoreszcenciájának az emelkedésével, kivonva a nem specifikus háttér-vakpróba fluoreszcenciaegységeinek emelkedési ütemét. A szoftver által számított, 4 egymást követő leolvasás során kapott maximális sebesség mérést (MaxV) alkalmaztuk kalkulációnkhoz.
Fluoreszcencia-mérést végeztünk a termék 200 μΐ térfogatán, identikus mikrotitráló lemezek lyukában. Kívánt esetben ezt az értéket alkalmaztuk, a SEP-vizsgálat 60 perces ideje alatt mért fluoreszcencia-egységekkel együtt, hogy kiszámítsuk a proteolizált termék százalékos arányát az egy órás inkubálás alatt, vagy konvertáltuk a fluoreszcencia növekedésének mért rátáját más alkalmazható egységekre, mint például az enzim által percenként és milliliterenként proteolizált szubsztrát ng-ban megadott mennyiségére.
A vizsgálatot olyan enzimkinetikai paraméterek kiszámítására alkalmaztuk, mint a Vmax és Km, a Fundamentals of Enzyme Kinetics [Athel Cornish Bowden, Butterworths kiadó, (1979)] szakirodalmi helyen ismertetett rögzített elveket követve.
SEP-vizsgálat alkalmazása SEP-gátlók gátlási paramétereinek meghatározásához
SEP-gátlók (például foszforamidon) IC5o-értékeinek meghatározása céljából több párhuzamos, fentiek szerinti SEP-vizsgálatot végeztünk, amelyben az inhibitor vizsgálati koncentrációinak sorát belefoglaltuk az 50 μΐ DMSO-oldatba (ezt úgy oldottuk meg, hogy az inhibitor 100% DMSO-ban felvett 10 mMól mennyiségét megfelelően hígítottuk 4%-os DMSO-t tartalmazó, 50 mmól/1 HEPES pH=7,4 pufferrel). Megfelelő standard görbeillesztő számítógépes programot alkalmazva, egy szigmoid dózis-hatásgörbét illesztettünk az inhibitor koncentráció log értéke versus MaxV (vagy gátlás %, vagy % aktivitás) értéke. Az ICso-értéket az 50% maximális gátlást okozó inhibitorkoncentrációként adtuk meg. Általában egy adott IC5o meghatározáshoz legalább 10 inhibitor-koncentráció sorozatát alkalmaztuk, amelyek egymástól fél log egység léptékben tértek el.
A SEP-vizsgálatot alkalmaztuk Kj-értékek, valamint a gátlás módjának a meghatározására (például hogy a gátlás kompetitív, kevert vagy nem kompetitív és így tovább), a Fundamentals of Enzyme Kinetics [Athel Cornish Bowden, Butterworths kiadó, (1979)] szakirodalmi helyen ismertetett rögzített elveket követve.
Kiegészítő ágensek - közbülső feszültségfiiggő kalciumaktivált káliumcsatoma (IKcJ modulálok
A “kalciumaktivált káliumcsatoma” kifejezés alatt nagy feszültségfiiggő kalciumaktivált (BKca) csatornákat (más néven Maxi K+ csatornákat), kis feszültségfiiggő kalciumaktivált (SKca) csatornákat és közbülső feszültségfiiggő kalciumaktivált (IKCa) csatornákat értünk, amelyeket néha I1SK4 csatornáknak, IK csatornáknak vagy hlKi csatornáknak neveznek.
Jelenleg a kalciumfiiggö káliumcsatomák három szubtípusát ismerjük. Ezek a nagy feszültségfüggő kalciumaktivált (BKca) káliumcsatomák (más néven Maxi K+ csatornákat), kis feszültségfiiggő kalciumaktivált (SKca) káliumcsatomák és közbülső feszültségfiiggő kalciumaktivált (IKca) káliumcsatomák. Ezeket a csatornákat a rajtuk áthaladó ionvezetés azon mértéke jellemzi, amely egyetlen nyitáskor rajtuk áthalad [Fan és munkatársai, (1995)]. A megkülönböztetés kedvéért: a nagy feszültségfiiggő (BK) kalciumaktivált káliumcsatomákat belső kalciumionok és a membránpotenciál együttes hatása tartja zárva, és 100-220 pikoSiemens (pS) egység vezetőképességet mutat; míg a közbülső (IK) és kis (SK) csatornákat csak belső kalciumionok zárják le. További megkülönböztetés kedvéért, az IKca csatornák 20-85 pS, a SKca csatornák 2-20 pS egység vezetőképességet mutatnak, és érzékenyebbek kalciumra, mint a BK csatornák. Mindegyik csatomatípus eltérő gyógyszertani tulajdonságokat mutat [Ishii és munkatársai, (1997)].
A leírásban a “közbülső feszültségfiiggő kalciumaktivált (IKca) csatorna” alatt a kalciumaktivált káliumcsatomák azon szubtípusát értjük, amelyet a rajtuk áthaladó ionvezetés azon mértéke jellemez, amely egyetlen nyitáskor rajta áthalad [Fan és munkatársai, (1995)]. Szemben a nagy feszültségfiiggő (BK) kalciumaktivált káliumcsatomákkal, amelyet belső kalciumionok és a membránpotenciál együttes hatása tart zárva, és 100-220 pikoSiemens (pS) egység vezetőképességet mutat; a közbülső (IK) csatornákat csak belső kalciumionok zárják le, és 20-85 pS egység vezetőképességet mutatnak, és érzékenyebbek kalciumionokra, mint a BK csatornák.
A leírás szerinti “IKca csatorna aktivitás modulálása” kifejezés alatt az alábbiak közül egy, vagy több hatást értünk: az IKca aktivitás javítása, fokozása, segítése, agonizálása, depolarizálása vagy regulációval emelése, vagy hogy emelkedik az IKca csatorna Ca2+ érzékenysége - azaz csökken az a kalciumkoncentráció, amely az IKca csatorna aktivitásához és/vagy kinyitásához szükséges. Az IKCa csatorna Ca2+-érzékenységének a fokozódása növelhető/segíthető az IKCa csatornák direkt vagy indirekt kinyitásával. Az IKCa csatorna Ca2+-érzékenységének ez a fokozódása eredményezheti a csatorna tulajdonságainak a mó dosulását úgy, hogy az IKCa csatorna olyan módon lesz érintett, hogy korábban megnyílik, és/vagy alacsonyabb intracelluláris kalciumkoncentrációk mellett, és/vagy hosszabb időtartamra, és/vagy a nyitva tartás idejének fokozott valószínűségével nyílik ki.
Az “IKca csatorna aktivitásának a modulálása” kifejezés alatt értjük továbbá a barlangos test simaizomzat szövetében az IKCa csatorna expressziójának reguláció útján való fokozását, például olyan ágens által, amely fokozza az IKCa csatorna expresszióját, és/vagy az ágens olyan anyagra történő hatásával, amely más esetben akadályozná vagy antagonizálná az IKCa csatorna modulálását, és/vagy expresszióját.
A moduláló ágens például az alábbi, (II) általános képlet szerinti struktúrájú lehet:
R1 ahol:
RÍ jelentése H vagy megfelelő szubsztituens, például alkilcsoport, amely adott esetben lehet szubsztituált;
R2 jelentése H vagy megfelelő szubsztituens, amely előnyösen H;
R3 jelentése egy, vagy több megfelelő szubsztituens.
További lehetőség szerint, a moduláló ágens az (1) általános képlet szerinti struktúrá-
ahol:
X jelentése NR-, O- vagy S-csoport, ahol R jelentése H vagy alkilcsoport (előnyösen alacsony szénatomszámú alkilcsoport, előnyösebben 1-6 szénatomszámú alkilcsoport)
RÍ jelentése alkilcsoport (előnyösen alacsony szénatomszámú, előnyösebben 1-6 szénatomszámú alkilcsoport)
R2 jelentése H, halogén, alkilcsoport (előnyösen alacsony szénatomszámú, előnyösebben 1-6 szénatomszámú alkilcsoport), alkoxi (előnyösen alacsony szénatomszámú, előnyösebben 1 -6 szénatomszámú alkoxicsoport);
R3 jelentése H, halogén, alkilcsoport (előnyösen alacsony szénatomszámú, előnyösebben 1-6 szénatomszámú alkilcsoport), alkoxi (előnyösen alacsony szénatomszámú, előnyösebben 1-6 szénatomszámú alkoxicsoport);
R4 jelentése H, halogén, alkilcsoport (előnyösen alacsony szénatomszámú, előnyösebben 1-6 szénatomszámú alkilcsoport), alkoxi (előnyösen alacsony szénatomszámú, előnyösebben 1 -6 szénatomszámú alkoxicsoport);
R5 jelentése H, halogén, alkilcsoport (előnyösen alacsony szénatomszámú, előnyösebben 1-6 szénatomszámú alkilcsoport), alkoxi (előnyösen alacsony szénatomszámú, előnyösebben 1 -6 szénatomszámú alkoxicsoport).
Az (1) képlet szerinti vegyületek - ahol X jelentése O [(la) képlet], vagy X jelentése S [(1b) képlet] előállíthatok a kiindulási (2a) és (2b) heterociklusos vegyület számára alkalmas alap-körülmények mellett történő N-alkilezéssel, ezek viszont előállíthatok a megfelelő aminofenol (3a) vagy aminotiofenol (3b) foszgénnel vagy más megfelelő karbonilezö ágenssel történő kezeléssel. Aminofenolok és aminotiofenolok szokásosan előállíthatok a megfelelő nitrofenolokból (4a) vagy nitrotiofenolokból (4b) redukció útján. Számos szubsztituált nitrofenol (4a) és nitrotiofenol (4b) a kereskedelemben hozzáférhető.
DO
ZU 1 R3 híj Ύ T * R5 (3a) X = 0 25 (3b) X = S '' R2 1 H 30 DL z^o R4^Y^x R5 (2a) X = O (2b) X = S R3 R4'^V^XH R5 (4a) X = O (4b) X = S R1 —jJ I R4^J^S?ííJ 'X R5 (1a)X = O (1b) X = S
Az (1) általános képletű vegyületek, amelyekben X jelentése NH [(le) képlet] előállíthatok a fenti séma módosításával. Ebben a tekintetben, a megfelelő nitroanilin (5c) alkilezése elvégezhető a nitrocsoport redukciója előtt, fenildiamint eredményezve [(3c), X=NH], amelyet karbonilezéssel a fentiek szerint (lc)-vé ciklizálhatunk.
(7)X=NH (1c)X=NH
Előnyösen, a modulátor EBIO (l-etil-2-benzimidazolinon), vagy annak mimetikuma, vagy gyógyászatilag elfogadható sója. Az EBIO struktúrája a következő:
(8)
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a hatóanyag IC50-értéke kisebb mint 300nmol/l, 250nmol/l, 200 nmol/1, 150nmol/l, előnyösen kisebb mint körülbelül 100nmol/l, előnyösebben kisebb mint körülbelül 75 nmol/1, még előnyösebben kisebb mint 50 nmol/1, még előnyösebben kisebb mint körülbelül 25 nmol/1, még előnyösebben kisebb mint körülbelül 20 nmol/1, még előnyösebben kisebb mint körülbelül 15 nmol/1, még előnyösebben kisebb mint körülbelül 10 nmol/1, még előnyösebben kisebb mint körülbelül 5 nmol/1.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a hatóanyag legalább körülbelül 25-ször, 50-szer, 75-ször, 100-szor szelektívebb a kívánt célmolekulára, előnyösen legalább körülbelül 150-szer szelektívebb a kívánt célmolekulára, előnyösen legalább körülbelül 200-szor szelektívebb a kívánt célmolekulára, még előnyösebben legalább körülbelül 250-szer szelektívebb a kívánt célmolekulára, még előnyösebben legalább körülbelül 300szor szelektívebb a kívánt célmolekulára, és még előnyösebben legalább körülbelül 3 50szer szelektívebb a kívánt célmolekulára.
Barlangos test (corpus cavernosum)
A leírás szerinti értelemben „barlangos testen” többek között a hímvesszőben található szövetet értünk. Ebben a vonatkozásban, a hímvessző három, cilindrikusan elhelyezkedő szövettömegből áll, amelyek mindegyikét „tunica albugineának” nevezett fibrózus kötőszövet veszi körül. A dorzolaterálisan, párosán elhelyezkedő szövettömeget a hímvessző barlangos testének nevezzük („corpora cavernosa penis”; corpora = testek; cavernosa = üreges, barlangos); a kisebb, ventrális szövettömeg, a „corpus spongiosum penis” (a hímvessző szivacsos teste), tartalmazza a húgycső „pars spongiosa” részét, és a hímvessző szivacsos testét nyitva tartja az ejakuláció során. Mindhárom szövettömeget rostos kötőszövet (fascia) és bőr veszi körül, és mindhárom vérrel telt üregekkel áthálózott erektilis szövetből áll. A barlangos test simaizomsejteket tartalmaz.
Kezelés
Nyilvánvaló, hogy a kezelés kifejezés vonatkozik terápiás, palliatív és/vagy megelőzőz (profilaktikus) kezelésre.
Szexuális stimuláció
Szintén a találmány tárgyát képezi NPYi, előnyösen NPY Yli (és adott esetben PDEi, előnyösen PDE5i) alkalmazása szexuális stimulus előtt és/vagy annak során. A „szexuális stimuláció” kifejezést a „szexuális izgalmi állapot előidézése” kifejezéssel szinonim értelemben használjuk. A találmány fenti vonatkozása azért előnyös, mert szisztémás (fiziológiás) szelektív hatást idéz elő. A természetes kaszkád csak a genitáliákon érvényesül, és más helyeken, például a szíven, stb. nem. A találmány szerinti, MED kezelésére alkalmas eljárással tehát szelektív hatást érhetünk el a genitáliákon.
A találmány szerinti megoldással összhangban igen előnyös, hogy bizonyos stádiumban szexuális stimulust alkalmazzunk. Azt találtuk, hogy ez a lépés szisztémás szelektivitást idézhet elő. A leírás szerinti értelemben, „szexuális stimuláción” egy vagy több, vizuális úton előidézett stimulációt, fizikai úton előidézett stimulációt, vagy hanghatás útján előidézett stimulációt, vagy gondolati úton előidézett stimulációt értünk.
Hatóanyagok
A találmány szerinti megoldással összhangban, férfi szexuális funkciózavar, közelebbről MED kezelésére bármely alkalmas, NPYi, előnyösen NPY Yli-aktivitású hatóanyagot alkalmazhatunk; vagy adott esetben, NPYi, előnyösen NPY Yli és PDEi, előnyösen PDE5i megfelelő kombinációját alkalmazhatjuk. A leírás szerinti értelemben, „hatóanyagon” értünk bármely entitást, amely képes NPY-, előnyösen NPY Y1-receptorokok gátlására.
Ilyen hatóanyagok (például a fenti meghatározás szerinti hatóanyagok) lehetnek aminosav-szekvenciák vagy azok kémiai úton módosított származékai. A hatóanyag lehet továbbá szerves vegyület vagy más kémiai vegyület. A hatóanyag lehet nukleotid-szekvencia - amely viszont lehet „szensz” szekvencia vagy „antiszensz” szekvencia. A hatóanyag lehet ellenanyag is.
Ennek megfelelően, a leírás szerinti értelemben „hatóanyagon” értünk például, de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, bármely alkalmas forrásból - természetes vagy nem természetes forrásból - kinyerhető, vagy az által előállítható vegyületet.
A hatóanyagot megtervezhetjük vagy kinyerhetjük peptideket és más vegyületeket például kisméretű szerves molekulákat, például „vezető” vegyületeket („lead compounds”) tartalmazó vegyületkönyvtárból.
A hatóanyag lehet például természetben előforduló vegyület; biológiai forrásból származó makromolekula; biológiai forrásból, például baktériumokból, gombákból vagy állatokból (előnyösen emlősből), sejtekből vagy szövetekből származó extraktum; szerves vagy szervetlen vegyület; szintetikus vegyület, félszintetikus vegyület; strukturális vagy funkcionális mimetikum, peptid, peptidomimetikum; derivatizált hatóanyag, például teljes proteinből lehasított peptid, szintetikus úton előállított peptid (például peptidszintetizáló berendezéssel vagy rekombináns technológiával vagy azok kombinációjával előállított peptid); rekombináns hatóanyag, ellenanyag; természetben előforduló vagy természetben elő nem forduló hatóanyag, azok fúziós proteinje, ekvivalense, mutánsa, származéka; vagy a felsoroltak valamilyen kombinációja.
A találmány tárgyát képezi továbbá ACE vizsgálati eljárás. Egyes esetekben (például egyes egyéneknél) ilyen hatóanyagok (azaz ACE-inhibitor aktivitást is mutató hatóanyagok) esetleg nem alkalmasak szájon át történő adagolásra. Előnyösen, a találmány szerinti NPY- vagy NPY Y1-inhibitorok egyáltalán vagy lénygében nem mutatnak aktivitást ACEval szemben.
ECE vizsgálati eljárások a technika állása szerint jól ismertek.
Ebben a vonatkozásban, a hatóanyag lehet egyetlen entitás, vagy hatóanyagok kombinációja.
Amennyiben a hatóanyag szerves vegyület - egyes esetekben, például ha a hatóanyag NPYi vagy NPY Yli - az tipikusan két vagy több összekapcsolt szénhidrogén-csoportot tartalmaz. A találmány egyes előnyös megvalósítási módjai szerint, a hatóanyag legalább két ciklikus csoportot tartalmaz, amelyek közül az egyik ciklikus gyűrűstruktúrával lehet fuzionáltatva. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a ciklikus csoportok legalább egyike heterociklikus csoport. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a heterociklikus csoport legalább egy nitrogént (N) tartalmaz a gyűrűben. Ilyen vegyületek ismertetését megtaláljuk a leírásban.
Amennyiben a hatóanyag szerves vegyület - egyes esetekben, például ha a hatóanyag PDE5i - az tipikusan két vagy több összekapcsolt szénhidrogén-csoportot tartalmaz. A találmány egyes előnyös megvalósítási módjai szerint, a hatóanyag legalább két ciklikus csoportot tartalmaz, amelyek közül az egyik ciklikus gyűrűstruktúrával lehet fuzionáltatva. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a ciklikus csoportok legalább egyike heterociklikus csoport. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a heterociklikus csoport legalább egy nitrogént (N) tartalmaz a gyűrűben. Ilyen vegyületek ismertetését megtaláljuk a leírásban, a PDE5 ismertetésénél.
A hatóanyag halogéncsoportokat is tartalmazhat. A leírásban „halogéncsoporton” flór-, klór-, bróm- vagy jódtartalmú csoportokat értünk.
Az említetteken felül a hatóanyag tartalmazhat egy vagy több alkil-alkoxi-, alkenil-, alkilén- és/vagy alkenilén-csoportot, amely lehet nem elágazó vagy elágazó láncú.
Gyógyászatilag elfogadható sók
A hatóanyagot lehet - és azt beadhatjuk - gyógyászatilag elfogadható só formájában, például savaddíciós só vagy bázikus só formájában, vagy azok szolvátjaként, például hidrátjaként. Megfelelő sók ismertetését találjuk például a következő összefoglalóban: Berge és mtsai.: J. Pharm. Sci. 66, 1 (1977).
Tipikusan, gyógyászatilag elfogadható sókat egyszerűen előállíthatunk kívánt sav vagy bázis alkalmazásával. A sót precipitálhatjuk oldatból, és kinyerhetjük szűréssel, vagy az oldószer bepárlással történő eltávolításával.
Megfelelő savaddíciós sók, amelyek nem-toxikus sókat képeznek, például hidroklorid-, hidrobromid-, hidrojodid-, szulfát-, biszulfát,- nitrát-, foszfát-, hidrogénfoszfát-, acetát-, maleát-, fumarát-, laktát-, tartarát-, citrát-, glukonát-, szukcinát-, szacharát-, benzoát-, metánszulfonát-, etánszulfonát-, benzénszulfonát-, p-toluénszulfonát- vagy pamoát- sók.
Alkalmas bázikus sók, amelyek nem-toxikus sókat képeznek, például nátrium-, kálium- alumínium-, kalcium-, magnézium-, cink- és dietanolamin- sók.
Polimorf forma (formák) / aszimmetrikus szénatom (szénatomok)
A hatóanyag lehet polimorf formában.
A hatóanyag tartalmazhat egy vagy több aszimmetrikus szénatomot, ezért előfordulhat két vagy több sztereoizomer formában. Amennyiben a hatóanyag alkenil- vagy alkenilén-csoportot tartalmaz, cisz (E) vagy transz (Z) izomerek is előfordulhatnak, a találmány tárgyát képezik a hatóanyag sztereoizomerjei, és adott esetben, azok tautomer formái, valamit azok elegyei is.
Diasztereoizomerek vagy cisz- vagy transz-izomerek szokásos eljárásokkal választhatók szét, például a hatóanyag sztereoizomerjeit tartalmazó elegy vagy annak sója vagy származéka frakcionált kristályosításával, kromatografálásával, vagy HPLC-elj árassal történő szétválasztásával. A hatóanyag egyes enantomerjei előállíthatok továbbá megfelelő, optikailag tiszta köztitermékből, vagy a megfelelő racemát szétválasztásával, például HPLC-technológiával, megfelelő királis hordozó alkalmazásával; vagy a megfelelő racemát és megfelelő, optikailag aktív sav vagy bázis reagáltatásával kapott diasztereoizomer-sók frakcionált kristályosításával.
Izotóppal jelölt változatok
Szintén a találmány tárgyát képezik a hatóanyag megfelelő, izotóppal jelölt változatai, valamint azok gyógyászatilag elfogadható sói. A találmány szerinti hatóanyag izotóppal jelölt változatán vagy annak gyógyászatilag elfogadható sóján olyan hatóanyagokat értünk amelyekben legalább egy atom azonos atomszámú, de a természetben előforduló atomtól eltérő tömegű atommal van helyettesítve. A hatóanyagokba vagy azok gyógyászatilag elfogadható sóiba építhető izotópok például hidrogén-, szén-, nitrogén-, oxigén-, foszfor-, kén-, fluor, vagy klór-izotópok, mint például a következők: 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 17O, Ο, P, S, F és Cl. A találmány szerinti hatóanyagok és azok gyógyászatilag elfogadható sói egyes izotópos változatai, például 3H vagy 14C radioaktív izotópot tartalmazó változatai, alkalmasak lehetnek drog és/vagy szubsztrát szöveti megoszlásának tanulmányozására. Triciált H, azaz 3H-, és 14-es szén, azaz 14C-izotópok különösen előnyösen alkalmazhatók, mivel könnyen előállíthatok, és kimutathatók. Ezen felül, izotóppal, például deutériummal, azaz 2H-val történő szubsztitúció jelenléte bizonyos terápiás előnyökkel járhat, amelyek nagyobb metabolikus stabilitásból, például hosszabb in vivo féléletidőből ·· ·· ···· · · · * . ... ·» · · .· .*·. ! · ί
- 64 - ........
vagy alacsonyabb dózisok alkalmazásának szükségességéből fakadnak; ilyen szubsztitúciók alkalmazása tehát bizonyos esetekben kívánatos lehet. A hatóanyagok és azok gyógyászatilag elfogadható sói izotóppal jelölt változatai szokásos eljárásokkal állíthatók elő, megfelelő reagensek megfelelő izotópos változatainak alkalmazásával.
Prodrogok
Szakember számára nyilvánvaló, hogy a hatóanyag származhat prodorgból. Prodrogoknak például olyan entitásokat nevezünk, amelyek védett csoportot (csoportokat) tartalmaznak, és ilyen formában nem rendelkeznek gyógyászati aktivitással, de bizonyos esetekben beadhatók (például szájon át vagy parenterálisan), és a szervezetben metabolizálódva a gyógyászatilag aktív hatóanyaggá alakulhat.
Hatásos egységekké átalakuló egységek ('„pro-znoígtíg^”)
Nyilvánvaló továbbá, hogy bizonyos, például hatásos egységgé átalakuló egységeknek („pro-wozgú’gí”) is nevezett egységeket helyezhetünk el a hatóanyag megfelelő funkcionális részein; ilyen egységek leírását lásd: Bundgaard H.: „Design of Prodrogs”, Elsevier (1985; amely teljes terjedelmében a kitanítás részét képezi]. Ilyen prodrogok szintén a találmány tárgyát képezik.
Inhibitorok/antagonisták
A leírás szerinti értelemben az „inhibitor” kifejezést NPYi vagy NPY Yli (és adott esetben, PDEi vagy PDE5i-vegyületek és egyéb járulékos aktív ágensek) vonatkozásában, az antagonista kifejezéssel felcserélhető módon használjuk.
„Antagonistának” nevezünk bármely ágenst, amely gátolja egy másik ágens vagy célmolekula hatását. Az antagonizmus származhat a gátlandó vegyülettel történő kombinálódásból (kémiai antagonizmus), vagy másik célmolekulára kifejtett ellentétes hatásból (funkcionális antagonizmus vagy fiziológiás antagonizmus), vagy a célmolekula aktiválódását a megfigyelt hatással összekapcsoló köztitermék kötőhelyéért történő versengésből (közvetett antagonizmus).
Az „endogén erekciós folyamat erősítése” kifejezést ugyancsak felcserélhető módon használjuk az „endogén erekciós folyamat fokozása” kifejezéssel.
Gyógyászati készítmények
Szintén a találmány tárgyát képezik a találmány szerinti hatóanyagot - hatásos menynyiségben -, valamint gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot, hígítóanyagot vagy kötőanyagot (vagy azok valamilyen kombinációját) tartalmazó gyógyászati készítmények.
A gyógyászati készítmények alkalmasak lehetnek emberben vagy állatban történő alkalmazásra a humán vagy állatgyógyászatban, és tipikusan egy vagy több gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot, hígítóanyagot vagy kötőanyagot tartalmaznak. Terápiás alkalmazásra szánt gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagok vagy higítóanyagok a gyógyszergyártásban jól ismertek; ilyenek leírását találjuk például a kővetkező kézikönyvben: „Remington’s Pharmaceutical Sciences, szerk.: A.R. Gennaro, Mack Publishing
Co.(1985). A gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot vagy hígítóanyagot a szándékolt beadási útnak és a szokásos gyógyszerkészítési gyakorlatnak megfelelően választjuk meg.
A gyógyászati készítmény hordozóanyagként, kötőanyagként vagy hígítóanyagként - vagy azon felül - tartalmazhat megfelelő kötóanyago(ka)t, síkosító anyago(ka)t, szuszpendáló anyago(ka)t, bevonóanyago(ka)t, vagy szolubilizáló szert (szereket).
A gyógyászati készítményhez adhatunk tartósítószereket, stabilizátorokat, festékeket vagy ízesítőszereket is. Tartósítószerként alkalmazhatunk például nátrium-benzoátot, szorbinsavat, p-hidroxibenzoesav észtereit. Antioxidánsokat és szuszpendálószereket is hozzáadhatunk a készítményhez.
A különböző szállítórendszereknek megfelelően különböző készítményé15 ket/formulákat kell előállítanunk. A találmány szerinti gyógyászati készítményt formulazhatjuk például mini-pumpával, vagy nyálkahártyán át történő bejuttatásra, például orrsprayként vagy aeroszolként, inhalációs úton, vagy szájon át beadható oldatként történő alkalmazásra, vagy parenterális alkalmazásra, ahol a készítményt injektálható fonnában szereljük ki, például intravénás, intramuszkuláris vagy szubkután beadásra. A készítményt 20 megtervezhetjük úgy, is, hogy mindkét úton beadható legyen.
Amennyiben a hatóanyagot nyálkahártyán át, közelebbről, a gyomor-béltraktus nyalkahártyáján át kívánjuk beadni, annak stabilnak kell maradnia a gyomor-bélrendszeren történő áthaladás során; például ellent kell állnia proteolitikus degradációnak, stabilnak kell maradnia savas pH mellett, és ellenállónak kell lennie epe detergens hatásával szem25 ben.
Adott esetben, a gyógyászati készítményt beadhatjuk inhalációval, kúp vagy pesszarium formájában; lokálisan, lotion, oldat krém, kenőcs vagy hintőpor formájában; bőrre helyezhető tapasz formájában; szájon át, kötőanyagot, például keményítőt vagy laktózt tartalmazó tabletták formájában; vagy kapszulákban vagy felszívódó labdacsokban 30 („ovules”) - egymagukban vagy kötőanyagokkal elegyítve; vagy ízesítőanyagokat vagy színezékeket tartalmazó elixírekként, oldatokként vagy szuszpenziókként; vagy injektálhatok parenterális úton, például intravénásán, intramuszkulárisan vagy szubkután. Parenterális beadásra, a készítményeket legelőnyösebben steril, vizes oldatokként alkalmazzuk, amelyek tartalmazhatnak egyéb összetevőket is, például elegendő sót vagy
- 66 - *· * * monoszacharidot ahhoz, hogy az oldatot a vérrel izotóniássá tegyék. Bukkális vagy szublingvális beadásra, a készítményeket beadhatjuk szokásos módon formulázható tablettákként vagy cukorkákként.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti hatóanyagot ciklodextrinnel kombinálva alkalmazzuk. A ciklodextrinről ismert, hogy zárványos és nem-zárványos komplexeket képez drogmolekulákkal. A drog-ciklodextrin komplexek képződése módosíthatja a drogmolekula szolubilitását, oldódási sebességét, biológiai hozzáférhetőségét és/vagy stabilitását. Drog-ciklodextrin komplexek jelenléte általában valamennyi adagolási forma és beadási út esetében előnyös. A droggal alkotott közvetlen komplexképzésen felül, a ciklodextrint adalékanyagként is alkalmazhatjuk, például hordozóanyagként, hígítóanyagként vagy szolubilizálószerként. Leggyakrabban alfa-, béta- és gamma-ciklodextrint alkalmaznak, és azok alkalmazására vonatkozó leírásokat találunk például a WO-A-91/U172, WO-A-94/02518 és WO-A-98/55148 számú nemzetközi közzétételi iratokban.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti hatóanyagot szisztémás úton adjuk be (például szájon át, bukkálisan, szublinválisan), előnyösebben szájon át (per os).
Ennek megfelelően, a hatóanyag előnyösen szájon át történő beadásra alkalmas formában van.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a hatóanyag a genitáliakra kifejtett perifériás hatáson felül - amennyiben így alkalmazzuk - a központi idegrendszerre is hat.
A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, hatóanyag a genitáliákon található receptorokra, előnyösen, a barlangos testekkel asszociált receptorokra kifejtett perifériás hatáson felül - amennyiben így alkalmazzuk - más perifériás hatást nem fejt ki.
Adagolás
A leírás szerinti értelemben „adagoláson virális es nem-virális technológiákkal történő bejuttatást értünk. Virális szállítórendszerekként például, de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, alkalmazhatunk adenovirus vektorokat, adeno-asszociált vírusvektorokat (AAV), herpesz vírusvektorokat, retrovirus vektorokat, lentivírus vektorokat vagy baculovírus vektorokat. Nem virális mechanizmusok például, de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, lipid által közvetített transzfekció, liposzómák,
immunoliposzómák, lipofektin, kationos faciális amfifllek (CFA-k) által közvetített transzfekció; és azok kombinációi.
A találmány szerinti hatóanyagot beadhatjuk egymagában, de azt általában gyógyászati készítményként adjuk be, például úgy, hogy azt a beadási útnak és szokásos gyogy5 szerkészítési gyakorlatnak megfelelően megválasztott, gyógyászatilag elfogadható kötőanyaggal, hígítóanyaggal vagy hordozóanyaggal elegyítjük.
A hatóanyagot beadhatjuk (például szájon át vagy lokálisan) tablettaként, kapszulaként felszívódó labdacsként, elixírként, oldatként vagy szuszpenzióként - amelyek tartalmazhatnak ízesítőszereket vagy színezékeket -, azonnah, késleltetett, módosított, tartós, 10 lökésszerű vagy szabályozott felszabadulasu formaban.
A tabletták tartalmazhatnak kötőanyagokat, például mikrokristályos cellulózt, laktózt, nátrium-citrátot, kalcium-karbonátot, kétbázisos kalcium-foszfátot vagy glicint; a készítmény szétesését megkönnyítő (dezintegráló) anyagokat, például keményítőt (előnyösen kukorica-, burgonya- vagy tápiókakeményitőt), nátrium-keményítő glikollátot, 15 kroszkarmellóz-nátriumot, és egyes komplex szilikátokat; szemcsekötőanyagokat, például poliviml-pirrolidont, hidroxipropil-metil-cellulózt (HPMC), hidroxipropil-cellulózt (HPC), szacharózt, zselatint vagy akáciát. A készítményhez adhatunk még sikositóanyagokat, például magnézium-sztearátot, sztearinsavat, glicerin-behenátot vagy talkumot.
Hasonló típusú szilárd készítményeket töltőanyagokként is alkalmazhatunk zselatm20 kapszulákban. Ebben a vonatkozásban, előnyös kötőanyagok a laktóz, keményítő, cellulóz, tejcukor, vagy nagy molekulatömegü polietilén-glikolok. Vizes oldatokban és/vagy ehxirekben, a hatóanyagot különböző édesítőszerekkel vagy ízesítőszerekkel, színezékekkel vagy ' festékekkel, emulgeátorokkal és/vagy szuszpendálószerekkel, valamint hígítóanyagokkal, például vízzel, etanollal, propilén-glikollal vagy glicinnel; vagy azok 25 valamilyen kombinációjával elegyíthetjük.
A készítményt beadhatjuk például, de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, szájon át (például tablettaként, kapszulaként vagy szájon át bevehető oldatként), lokálisan, nyálkahártyán át (például orrsprayként vagy aeroszolként inhalációs úton), orron át (nazálisán), parenterálisan (például injektálható formában), gasztrointesztinálisan, 30 intraszpinálisan, intramuszkulárisan, intravénásán, intraokulárisan, intradermáhsan, tntrakraniálisan, intrathekálisan, intravaginálisan, intra-eerebroventrikulárisan, intracerebrálisan, szubkután, ophtalmikusan (például az üvegtestbe vagy csarnokba), transzdermálisan, rektálisan (végbélbe), bukkálisan, a hímvesszőbe, vagináhsan, epidurálisan vagy szublingválisan.
Nyilvánvaló, hogy nem mindegyik hatóanyag adandó be ugyanazon az úton. Hasonlóképp, amennyiben a készítmény egynél több aktív összetevőt tartalmaz, azokat különböző úton adhatjuk be.
Amennyiben a találmány szerinti hatóanyagot parenterális úton adjuk be, azt beadhatjuk például intravénásán, intraartériásan, intraperitoneálisan, intrathekalisan, intraventrikulárisan, intrauretrálisan (húgycsőbe), intrasztemálisan, intrakraniálisan, intramuszkulárisan, vagy szubkután; és/vagy infúzióban.
Parenterális beadásra, a készítményeket legelőnyösebben steril, vizes oldatokként alkalmazzuk, amelyek egyéb összetevőket is tartalmazhatnak, például elegendő sót vagy glükózt ahhoz, hogy az oldatot a vérrel izotóniássá tegyék. A vizes oldatokat szükség szerint, megfelelően pufferelnünk kell (előnyösen 3-9-es pH-ra). A parenterális úton adagolható készítményeket steril körülmények mellett állítjuk elő, a gyógyszergyártásban szokásos, szakember számára jól ismert technológiákkal.
Az említettek szerint, a találmány szerinti hatóanyagot intranazálisan vagy inhalációval adhatjuk be, előnyösen száraz porinhalátor vagy aeroszolspray alkalmazásával túlnyomásos tartályból, pumpából, spray vagy porlasztó berendezésből, megfelelő hajtóanyag, például diklór-difluor-metán, triklór-fluor-metán, diklór-tertrafluor-metán, hidrofluoralkán, például 1,1,1,2-tetrafluoretán (HFA 134™) vagy 1,1,1,2,3,3,3-heptafluorpropán (HFA 227EA™), széndioxid, vagy más alkalmas gáz alkalmazásával. Túlnyomásos aeroszol alkalmazása esetén, az egységnyi dózist úgy határozhatjuk meg, hogy a berendezést meghatározott mennyiséget adagoló szeleppel látjuk el. A túlnyomásos tartály, pumpa, spray vagy porlasztó-berendezés az aktív hatóanyagot tartalmazó oldatot vagy szuszpenziót foglalhat magában, például úgy, hogy abban etanol és hajtógáz elegyét alkalmazzuk oldószerként, amelyhez adhatunk még síkosítót, például szorbitán-trioleátot. Az inhalátorokban vagy inszufflátorokban alkalmazható kapszulákat és cserélhető egységeket (például zselatinkapszulák) úgy formulázhatjuk, hogy azok a hatóanyag és megfelelő poralap, például laktóz vagy keményítő keverékét magában foglaló porkeveréket tartalmazzanak.
A találmány szerinti hatóanyagot beadhatjuk továbbá kúp vagy pesszárium formájában, vagy alkalmazhatjuk lokálisan, gél, hidrogél, lotion, oldat, krém, kenőcs vagy hintőpor formájában. A találmány szerinti hatóanyagot beadhatjuk továbbá dermálisan vagy transzdermálisan, például bőrre felhelyezhető tapasz alkalmazásával. Azok beadhatók továbbá pulmonáris vagy rektális úton (tüdőbe vagy végbélbe). A készítmények beadhatók még okulárisan (szembe). Ophtalmikus beadásra, a készítményt formulázhatjuk mikronizált szuszpenzióként, izotóniás, megfelelő pH-ra beállított, steril fiziológiás sóol datban; vagy előnyösen oldatként, izotóniás, megfelelő pH-ra beállított, steril fiziológiás sóoldatban; adott esetben, tartósító szerrel, például benzilalkonium-kloriddal kombinálva. A készítményt kiszerelhetjük továbbá kenőcsként, például petrolátumban.
Lokális, bőrön történő alkalmazásra, a találmány szerinti hatóanyagot megfelelő kenőcsben formulázhatjuk, amely az aktív összetevőt például egy vagy több, az alábbiakban felsorolt komponensben szuszpendálva vagy feloldva tartalmazza: ásványi olaj, vazelinolaj, fehér vazelin, propilénglikol, polioxietilén polioxipropilén, emulgeáló viasz és/vagy víz. A készítményt formulázhatjuk lotionként vagy krémként, egy vagy több, az alábbiakban felsorolt komponensben szuszpendálva vagy feloldva: ásványi olaj, szorbitánmonosztearát, polietilén-glikol, paraffmolaj, poliszorbát 60, cetilészter viasz, cetearilalkohol, 2-oktildodekanol, benzilalkohol és/vagy víz.
A találmány szerinti készítmények beadhatók közvetlen injektálással.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a hatóanyagot szájon át adjuk be.
A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, a hatóanyagot lokálisan alkalmazzuk.
Dózisszintek
Az adott egyén számára megfelelő dózist általában a kezelőorvos határozza meg. Az adott egyén esetében alkalmazott dózis és az adagolás gyakorisága különböző lehet, és több faktortól függ, például a hatóanyag aktivitásától, a hatóanyag metabolikus stabilitásától és hatástartamától, a kezelendő egyén korától, testtömegétől, általános egészségi állapotától, nemétől, táplálkozásától; a beadás módjától és idejétől, a kiürülés sebességétől, drogkombinációk alkalmazásától, a kezelendő állapot súlyosságától, valamint a folyamatban lévő kezeléstől. A találmány szerinti hatóanyagot és/vagy gyógyászati készítményt naponta 1-10-szer, például naponta egy-kétszer adjuk be.
Embernek történő, szájon át vagy parenterális adagolásra a napi dózist beadhatjuk egyszerre, vagy több dózisra felosztva.
Az adott esettől függően, a hatóanyagot beadhatjuk 0,01-30 mg/testtömeg-kg dózisban, például 0,1-10 mg/testtömeg-kg dózisban, előnyösebben 0,1-1 mg/testtömeg-kg dózisban. Természetesen, az említett dózisok csak az átlagos esetekben alkalmazható dózisok szemléltetését szolgálják. Lehetnek egyedi esetek, amikor magasabb vagy alacsonyabb dózistartományok alkalmazása előnyös.
A szájon át beadható napi dózis tipikusan 20-1000 mg, előnyösen 50-300 mg.
Formulázás
A találmány szerinti hatóanyagokat gyógyászati készítményekként formulázhatjuk, például úgy, hogy azokat a technika állása szerint ismert módon, egy vagy több gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal, hígítóanyaggal vagy kötőanyaggal elegyítjük.
Az alábbi készítmények ismertetésén keresztül a találmány szerinti megoldást kívánjuk szemléltetni, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk.
1. készítmény:
Tablettát állítunk elő a következő összetevőkből
Tömeg (mg)
Hatóanyag 250
Cellulóz, mikrokristályos 400
Szilikon-dioxid, gőzölt 10
Sztearinsav 5
Teljes tömeg 665
Az összetevőket elegyítettük, és 665 mg tömegű tablettákká sajtoltuk.
2, készítmény
intravénás készítményt állíthatunk eio a K.oveiKezu usmclüvukuui
Hatóanyag 100 mg
Izotóniás sóoldat 1 000 ml
Egyedek
A leírás szerinti értelemben „egyedeken” értünk gerinceseket, közelebbről, emlős fajokhoz tartozó gerinceseket. A kifejezés például, de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, vonatkozik háziállatokra, sportállatokra, főemlősökre és emberre.
Biológiai hozzáférhetőség
Előnyösen, a találmány szerinti hatóanyagok (vagy azok kombinációi) szájon át adagolva biológiailag hozzáférhetőek. A biológiai hozzáférhetőség szájon át történő adagolást követően arra vonatkozik, hogy a szájon beadott hatóanyag milyen arányban éri el a szisztémás keringést. Egy drog orális biológiai hozzáférhetőségét befolyásoló tényezők a készítmény oldhatósága, membrán-permeabilitása, és metabolikus stabilitása. Tipikusan, az orális biológiai hozzáférhetőség meghatározására először in vitro, majd in vivo szűrővizsgálatokat végzünk.
Az oldhatóság, a drog szolubilizálódása a gyomor-béltraktus (GIT) vizes tartalmában kikövetkeztethető a GIT-ben uralkodó körülményeket utánzó megfelelő pH mellett végzett in vitro szolubilizálási kísérletekkel, előnyösen, a találmány szerinti hatóanyag minimális szolubilitása legalább 50 mcg/ml. A szolubilitást a technika állása szerint ismert eljárásokkal határozható meg, például az alábbi közleményben ismertetettek szerint: Adv. Drug Deliv. Rév. 23, 3 (1997).
A membránpermabilitás kifejezés a hatóanyagnak a GIT sejtjein történő átjutására vonatkozik. Ennek kikövetkeztetéséhez a legfontosabb a lipofil tulajdonság ismerete, és azt in vitro, LogD7,4-mérésekkel határozzák meg szerves oldószer és puffer alkalmazásával. Előnyösen, a találmány szerinti hatóanyagok LogD7>4-értéke -2 és +4 közé, előnyösebben -1 és +2 közé esik. A logD a technika állása szerint ismert eljárásokkal határozható meg, például az alábbi közleményben ismertetettek szerint: J. Pharm. Pharmacol. 42, 144 (1990).
Egyrétegű sejteken végzett, például CaCCh-vizsgálatok meggyőzően alátámasztják az effluxtranszporterek, például p-glikoprotein jelenlétében megfigyelhető előnyös membránpermeabilitásra vonatkozó következtetéseket, az úgy nevezett caco-2-flux értéket. Előnyösen, a találmány szerinti hatóanyagok caco-2-flux értéke nagyobb mint 2x10 6 cms \ előnyösebben nagyobb mint 5xl0’6 cms’1. A caco-2-flux érték a technika állása szerint ismert eljárásokkal határozható meg, lásd például: J. Pharm. Sci. 79, 595 (1970).
A metabolikus stabilitás a GIT vagy máj hatóanyagot metabolizáló képességére, az úgy nevezett első passzázs hatásra utal a felszívódás során. A metabolikus stabilitásra vonatkozó következtetéseket tesznek lehetővé például mikroszómák, hepatociták, stb. alkalmazásán alapuló vizsgálati rendszerek. Előnyösen, a példákban szereplő hatóanyagok metabolikus stabilitása az általunk alkalmazott, májextrakción alapuló vizsgálati rendszerben kisebb mint 0,5. Ilyen vizsgálati rendszerek és adatfeldolgozási eljárások ismertetését találjuk például a következő közleményekben. Curr. Opin. Drug Disc. Devel. 201(4), 36, és Drug Met. Disp. 28,1518 (2000).
A fenti vizsgálatok összehangzó eredményeinek figyelembevételével, állatokon végzett in vivo kísérletekben további bizonyítékát kaphatjuk a drog biológiai hozzáférhetőségének emberben. Az abszolút biológiai hozzáférhetőséget úgy határozzuk meg ezekben a kísérletkben, hogy a hatóanyagot önmagában vagy elegyítve, orális úton adjuk be. Az abszolút biológiai hozzáférhetőség meghatározására (% felszívódás) a hatóanyagot intravéna san is adagolhatjuk. Orális biológiai hozzáférhetőség állatokban történő megállapítására vonatkozó leírásokat találunk például a következő szakirodalmi helyeken: Drug Met. Disp. 29, 82 (2001); J. Med. Chem. 40, 827 (1997); Drug Met. Disp. 27, 221 (1999).
Kémiai szintézis eljárások
Tipikusan, a találmány szerinti megoldásban alkalmazott NPYi/NPYYl- (és/vagy PDEi/PDE5i-) inhibitorokat kémiai szintézis-technológiával állítjuk elő.
A hatóanyagok, azok celmolekulai, variánsai, homológjai, származékai, fragmentumai vagy mimetikumai előállíthatok kémiai eljárásokkal, amelyekben a hatóanyagot egészében vagy részben szintetizáljuk. Peptideket szintetizálhatunk például szilárd fázisú technológiával, azokat a töltetről lehasíthatjuk, majd preparatív, nagy teljesítményű folyadék-kromatográfiával tisztíthatjuk [lásd például: Creighton: „Proteins Structures and Molecular Principles”, WH Freeman and Co., New York, NY (1983). A szintetikus peptidek összetételét aminosavanalízissel vagy szekvenálással [például Edmandegradációval; Creighton: (lásd fent)] ellenőrizhetjük.
A hatóanyagok, variánsai, homológjai, származékai, fragmentumai vagy mimetikumai közvetlenül szintetizálhatok szilárd fázisú technológiákkal [Roberge J.Y. és mtsai.: Science 269, 202 81995)], és automatizált szintézist végezhetünk például az “ABI 431A Peptide Sythesizer” (Perkin Elmer) készülék alkalmazásával, a gyártó utasításai szerint eljárva. Ezen felül, a hatóanyagot vagy annak részét tartalmazó aminosav-szekvenciát a közvetlen szintézis során módosíthatjuk, és/vagy kémiai eljárásokkal egyéb alegységekből származó szekvenciákkal vagy azok részeivel kombinálhatjuk, hogy variáns hatóanyagokat vagy célmolekulákat, például variáns NPY- vagy NPY Y1-molekulákat kapjunk.
A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, a hatóanyagok, azok célmolekulái, variánsai, homológjai, származékai, fragmentumai vagy mimetikumai - egészében vagy részben - a technika állása szerint ismert kémiai eljárásokkal szintetizálhatok [lásd például Caruthers M.H. és mtsai.: Nuc. Acids Res. Symp. Ser. 215-23; valamint Hom T. és mtsai.: Nuc. Acids Res. Symp. Ser. 225-232],
Mimetikumok
A leírás szerinti értelemben “mimetikumon” értünk bármely molekulát, például, de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, peptidet, polipeptidet, ellenanyagot vagy más szerves vegyületet -, amely a célmolekulaval reagáló referecia-hatoanyaggal azonos kvalitatív aktivitással vagy hatással rendelkezik.
Kémiai származékok “Származék” vagy “származtatott” kifejezéseken valamely hatóanyag kémiai módosítását értjük. Ilyen kémiai módosítások például egy hidrogén helyettesítése halogéncsoporttal, alkilcsoporttal, acilcsoporttal vagy aminocsoporttal.
Kémiai módosítás
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a hatóanyag kémiai úton módosítva van.
Valamely molekula kémiai úton előidézett módosítása fokozhatja vagy csökkentheti a hatóanyag és célmolekula közt kialakuló, hidrogénkötéseken, töltéskülönbségen, hidrofóbicitáson, Van Dér Waals erőkön vagy dipólusokon alapuló kölcsönhatásokat.
A találmány egy szempontja szerint, az azonosított hatóanyagot modellként (például templátként) alkalmazhatjuk más vegyületek kifejlesztésére.
Célmolekulák
A találmány egy további szempontja szerint, az NPY- vagy NPY Y1-receptort célmolekulaként alkalmazzuk szűrésre, NPY-t vagy NPYYl-t gátolni képes hatóanyagok azonosítására. Ebben a vonatkozásban, a celmolekula az 1., 2. vagy 3. azonositoszamu nukleotid-szekvencia által kódolt aminosav-szekvenciát tartalmaz, vagy azok variánsát, homológját, származékát vagy fragmentumát tartalmazza, amelyet rekombináns és/vagy szintetikus úton állítottunk elő; vagy a fentieket kódoló expressziós konstrukciót tartalmaz.
További lehetőség szerint, az NPY- vagy NPY Y1-receptort célmolekulaként alkalmazzuk intrakavemozus nyomás NPY- vagy NPY Yl-receptor gátlása által közvetített fokozására alkalmas hatóanyagok azonosítására. Ebben a vonatkozásban, célmolekulát megfelelő szövetextraktum tartalmazhatja.
A célmolekula lehet továbbá ilyen szöveti és/vagy rekombináns célmolekulák kombinációja.
Rekombináns eljárások
Tipikusan, a találmány szerinti hatóanyag előállítható rekombináns DNStechnológiával.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a hatóanyag NPYi vagy NPY Yli. Az NPYi vagy NPY Yli előállítható rekombináns DNS-technológával.
Aminosav-szekvencia
A leírás szerinti értelemben az „aminosav-szekvencia” kifejezést a „polipeptid” és/vagy „protein” kifejezéssel szinonim értelemben használjuk. Egyes esetekben, az „aminosav-szekvencia” kifejezést a „peptid” kifejezéssel szinonim értelemben használjuk. Bi zonyos esetekben, az „aminosav-szekvencia” kifejezést a „protein” kifejezéssel azonos értelemben használjuk.
Az aminosav-szekvenciát előállíthatjuk izolált formában megfelelő forrásból, vagy előállíthatjuk szintetikus úton, vagy rekombináns DNS-technológiával.
A találmány egy szempontja szerint, a találmány tárgyát képezi aminosavszekvencia, amely célmolekulaként alkalmazható egy vagy több találmány szerinti hatóanyag és/vagy annak származéka azonosítására irányuló vizsgálati eljárásban.
Előnyösen, a célmolekula NPY- vagy NPY Y1-receptor.
Előnyösen, az NPY- vagy NPY Y1-receptor izolált NPY- vagy NPY Y1-receptor és/vagy tisztított és/vagy nem-natív NPY- vagy NPY Y1-receptor.
A találmány szerinti NPY- vagy NPY Y1-receptor lehet lényegében izolált formában. Nyilvánvaló, hogy az NPY- vagy NPY Y1-receptor a receptor szándékolt alkalmazását nem gátló hordozóanyaggal, hígítóanyaggal lehet elegyítve úgy, hogy azt még lényegében izoláltnak tekinthetjük. Ezen felül, a találmány szerinti NPY- vagy NPY Y1-receptor lehet lényegében tiszta formában, amely esetben az NPY- vagy NPY Y1-receptor több mint 90%, például 95%, 98% vagy 99% arányban az 1., 2. vagy 3. azonosítószámú szekvenciáról expresszálható peptidként, annak variánsaként, homológjaként, származékaként vagy fragmentumaként van jelen a készítményben.
Nukleotid-szekvencia
A leírás szerinti értelemben „nukleotid-szekvencia” kifejezést a „polinukleotid” kifejezéssel azonos értelemben használjuk.
A nukleotid-szekvencia lehet genomi vagy szintetikus vagy rekombináns eredetű DNS vagy RNS. A nukleotid-szekvencia lehet kettősszálú vagy egyszálú, és képviselheti a „szensz” vagy „antiszensz” szálat vagy azok kombinációját.
A találmány egyes előnyös megvalósítási módjai szerint, a nukleotid-szekvencia DNS.
A találmány egyes előnyös megvalósítási módjai szerint, a nukleotid-szekvenciát rekombináns DNS-technológiával (például rekombináns DNS-ként) állítjuk elő.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a nukleotid-szekvencia cDNS.
A találmány fenti szempontja szerint, a nukleotid-szekvencia azonos lehet a természetben előforduló formával.
A találmány egy további szempontja szerint, a találmány tárgyát képezi nukleotidszekvencia amely egy vagy több találmány szerinti hatóanyag és/vagy annak származéka azonosítására irányuló vizsgálati eljárásban célmolekuaként alkalmazható aminosavszekvenciát kódol.
A találmány egy további szempontja szerint, a nukleotid-szekvencia NPY- vagy NPY Y1 -receptort kódol
Szakember számára nyilvánvaló, hogy a genetikai kódon degeneráltságából következően számos különböző nukleotid-szekvencia kódolhatja ugyanazt a célszekvenciát. Az is nyilvánvaló, hogy szakember ismert technológiákkal képes nukleotid-szubsztitúciók végrehajtására úgy, hogy azok tükrözzék a célszekvencia expresszáltatására alkalmazott gazdaorganizmus kódonhasználatát, és lényegében ne befolyásolják a találmány szerinti nukleotid-szekvencia által kódolt protein aktivitását. A leírás szerinti értelemben tehát, a csatolt szekvencialistában szereplő nukleotid-szekvenciák vonatkozásában „variánson” „homológon” vagy „származékon” értjük a szekvenciában egy vagy több nukleinsav szubsztiúci ójával, megváltoztatásával, módosításával vagy helyettesítésével vagy deletálásával kapott szekvenciákat, feltéve, hogy a kapott nukleotid-szekvenciák a találmány szerinti funkcionális célszekvenciát (vagy ilyen nukleotid-szekvenciát vagy aminosav-szekvenciát tartalmazó, találmány szerinti hatóanyagot) kódolnak.
A fent ismertetettek szerint, a szekvenciahomológia vonatkozásában, legalább 75%, előnyösebben 85%, még előnyösebben 90% homológia mutatható ki az NPYszekvenciával. Még előnyösebben legalább 95% homológia, még előnyösebben 98% homológia áll fenn a szekvenciák közt. Nukleotid-szekvenciák közti homológiát a fent ismertetettek szerint mutathatunk ki. Erre a célra előnyösen alkalmazhatjuk a fent említett „GCG Wisconsin Bestfít” programot.
Az alapértelmezés szerinti pontozásos mátrix 10 pontot ad az egyező nukleotidokra, és 9 pontot von le mindegyik eltérésre. Alapértelmezés szerint, a hézag beszúrásakor alkalmazott büntetőpont -50, és a meglévő hézag növelésekor alkalmazott büntetőpont mindegyik nukleotidra -3.
Szintén a találmány tárgyát képezik a találmány szerinti szekvenciákkal szelektív módon hibridizálódni képes nukleotid-szekvenciák, azok variánsai, fragmentumai, származékai, vagy a felsoroltak komplementer szekvenciái. A nukleotid-szekvenciák előnyösen 15 nukleotid hosszúságúak, előnyösebben legalább 20, 30, 40 vagy 50 nukleotid hosszúságúak. Ezek a szekvenciák alkalmazható próbákként, például diagnosztikai készletben.
Variánsok/homológok/származékok
A fent említett nukleotid-szekvenciák és azokról származtatott aminosav-szekvenciák alkalmazásán felül, ugyancsak a találmány tárgyát képezi variánsok, homológok és szár mazékok alkalmazása. A leírás szerinti értelemben a „homológia” kifejezés „azonosságra” is vonatkozhat.
A találmány szerinti megoldással összhangban, homológ szekvenciákon legalább 75%-ban, 85%-ban vagy 90%-ban azonos, előnyösebben legalább 95%-ban vagy 98%-ban azonos szekvenciákat értünk. Közelebbről, a homológiát tipikusan az aktivitáshoz nélkülözhetetlen szekvenciarégiók figyelembevételével kell értelmezni. Bár a homológia hasonlóságot is jelenthet (azaz hasonló kémiai tulajdonságú/funkciójú aminosavak jelenléte esetén), a leírás szerinti értelemben homológián előnyösen szekvencia-azonosságot értünk.
Homológia fokát megállapíthatjuk szemmel történő összehasonlítással, vagy előnyösebben, valamely rendelkezésre álló szekvencia-összehasonlító programmal. Ezek, a kereskedelemben hozzáférhető számítógépes programok két vagy több szekvencia közti homológia fokát %-ban képesek megadni.
A %-os homológiát meghatározhatjuk folyamatos szekvenciák mentén, azaz egy szekvenciát összerendezhetünk egy másik szekvenciával, és a szekvenciában mindegyik aminosavat egyenként, közvetlenül összehasonlíthatunk a másik szekvenciában található megfelelő aminosavval. Ezt „hézag nélküli összerendezésnek” nevezzük. Tipikusan, ilyen hézag nélküli összerendezést csak viszonylag kis számú aminosav esetében végzünk.
Bár ez igen egyszerű és következetes eljárás, figyelmen kívül hagyja például azt, hogy egy inszerció vagy deléció - másképp azonos szekvenciapárok jelenléte esetén - kizökkenti a következő aminosavat az összerendezésből, globális összerendezés esetén a teljes összerendezésre számított %-os homológia nagymértékű csökkenését okozva. Következésképp, a szekvencia-összehasonlító eljárások többségét úgy tervezik meg, hogy azok optimális összerendezést hozzanak létre figyelembe véve az esetleges inszerciók és deléciók lehetőségét, anélkül, hogy feleslegesen büntetőpontokkal csökkentenék az összességében vett homológiát.
Ezt úgy érik el, hogy a lokális homológia maximalizálása érdekében „hézagokat” iktatnak a szekvencia-összerendezésbe.
Ezek az összetettebb eljárások azonban hézag beszúrásakor büntetőpontokat („gap penalties} adnak az összerendezésben előforduló minden egyes hézagra, úgy, hogy ugyanolyan számú egyező aminosav esetén a kevesebb hézagot tartalmazó szekvenciaösszerendezés - ami közelebbi rokonságra utal a két összehasonlított szekvencia között magasabb hasonlósági pontszámot kap, mint a sok hézagot tartalmazó. „Kapcsolt hézagbüntetésen” tipikusan azt értjük, hogy viszonylag magas pontszámot vonunk le hézag előfordulására, és kisebb pontszámot a hézagban előforduló egyes nukleotidokra. Ez a legel terjedtebb hézagpontozásos rendszer. Hézag előfordulására magas pontszámok levonása természetesen kevesebb hézagot tartalmazó optimalizált összerendezésekhez vezet. A legtöbb összerendező program lehetőséget ad a hézag beszúrásakor alkalmazott büntetőpontok módosítására. Ilyen programokkal végzett szekvencia-összehasonlítás esetén ajánlott azonban az alapértelmezett értékek alkalmazása. Például, a „GCG Wisconsin Bestift” programcsomag alkalmazásakor (lásd az alábbiakban) az alapértelmezés szerinti büntetőpontok aminosav-szekvenciákra hézag beszúrásakor -12, és minden egyes további nukleotidra -4.
Ahhoz, hogy a maximális százalékos homológiát kiszámítsuk, először optimális öszszerendezést kell keresnünk figyelembe véve a hézagokra adott büntetőpontokat. Ilyen összerendezések létrehozására alkalmas számítógépes program például a „GCG Wisconsin Bestift” programcsomag [University of Wisconsin, U.S.A.; Deveroux és mtsai: Nucleic Acids Research 12. 387 (1984)]. Szekvencia-összehasonlítások végzésére alkalmas további programcsomag például, de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, a BLAST [lásd Ausubel és mtsai.: 18. fejezet (1999) lásd fent], a FASTA [Atschul és mtsai.: J. Mól. Bioi. 403 (1990)] és az összehasonlító programcsomagok GENEWORKS tagja. Mind a BLAST, mind a FASTA alkalmazható „offline” és „online” keresésre [lásd Ausubel és mtsai.: (1999) lásd fent, 7-58. - 7-60. oldal]. Előnyösen azonban a „GCG Bestift” programcsomagot alkalmazzuk. Új eszközként rendelkezésre áll a „BLAST 2 Sequences” elnevezésű program, amely protein és nukleotid-szekvenciák összehasonlítására alkalmas [lásd FEMS Mocrobiol Lett. 174(2). 247 (1999); FEMS Microbiol. Lett. 177(1), 187 (1999); valamint tatiana@ncbi.nlm.nih.gov].
Bár a végső százalékos szekvencia-homológia meghatározható az azonosság alapján, maga az összerendezés tipikusan nem minden vagy semmi típusú pár-összehasonlításon alapul. Ehelyett, súlyozott hasonlósági pontmátrixokat állítanak össze, amelyben minden egyes páronkénti összehasonlítást a kémiai hasonlóság vagy evolúciós távolság figyelembe vételével pontoznak. Egy ilyen, gyakran alkalmazott mátrix a BLOSUM2 elnevezésű mátrix - a BLAST programcsoport alapértelmezett aminosav-helyettesítési mátrixa. A „GCG Wisconsin” programokban általában publikus, alapértelmezett értékeket vagy - amennyiben ilyen rendelkezésre áll - a szokásos szimbólumokat tartalmazó aminosav-helyettesítési mátrixokat alkalmaznak (további részletek vonatkozásában lásd a kézikönyvet). A GCGcsomag esetében előnyös a nyilvános, alapértelmezett értékek alkalmazása, más programcsomagok esetében az alapértelmezett aminosav-helyettesítési mátrix, például a BLOSUM62 alkalmazása.
Miután a program optimális összerendezést hozott létre, százalékos homológiát, előnyösen, százalékos szekvencia-azonosságot számíthatunk. A program a szekvenciaösszehasonlítás részeként általában kiszámítja ezt, és számszerű eredményt ad.
A szekvenciák olyan aminosav-deléciókat, -inszerciókat vagy -szubsztitúciókat is tar5 talmazhatnak, amelyek némák maradnak, és funkcionálisan egyenértékű proteineket eredményeznek. Mesterséges úton hozhatunk létre aminosav-szubsztitúciókat az aminosavak hasonlósága, polaritása, töltése, szolubilitása, hidrofóbicitása, és/vagy azok amfipátiás természete alapján, amennyiben a protein másodlagos kötőaktivitása megmarad. Negatív töltésű aminosavak például az aszparaginsav és glutaminsav; pozitív töltésű aminosavak a 10 lizin és arginin; hasonló hidrofil tulajdonságú, töltéssel nem-rendelkező poláris főcsoportokat tartalmazó aminosavak a leucin, izoleucin, valin, glicin, alanin, aszparagin, glutamin, szerin, treonin, fenilalanin és tirozin.
Konzervatív szubsztitúciókat hozhatunk létre például az alábbi táblázatban ismertetettek szerint. Az második oszlop azonos cellájában, előnyösen, a harmadik oszlop azonos 15 sorában szereplő aminosavak helyettesíthetők egymással.
Alifás Nem-poláris GAP
ILV
Poláris — töltés nélküli CSTM
NQ
Poláris - töltéssel rendelkező DE
KR
Aromás H.F.W.Y
Szintén a találmány tárgyát képezik homológ szubsztitúciók (szubsztitúción és helyettesítésen egyaránt létező aminosavak helyettesítését értjük más aminosawal), amelyek 20 lehetnek „hasonló a hasonlóval” típusú helyettesítések, például bázikus aminosav helyettesítése bázikus aminosawal, savas aminosav helyettesítése savas aminosawal, poláris aminosav helyettesítése poláris aminosawal, stb. Előfordulhatnak nem-homológ szubsztitúciók is, azaz aminosavak egyik csoportjából származó aminosav helyettesítése más csoportba tartozó aminosawal, vagy a szekvenciába iktathatunk természetben előforduló amino25 savakat, például orinitint (a továbbiakban Z), diaminovajsav-orinitint (a továbbiakban B), norleucin-omitint (a továbbiakban O), pirilalanint, tiénalanint, naftilalanint vagy fenilglicint.
Helyettesítést végezhetünk természetben elő nem forduló aminosavakkal is, például alfa*- és alfa-diszubsztituált- aminosavakkal, Ν-alkil-aminosavakkal-, természetben előforduló aminosavak tejsavas- vagy halogén-származékaival, például trifluortirozinnal*, pCl-fenilalaninnal*, p-Br-fenilalaninnal*, p-I-fenilalaninnal*, L-allil-glicinnel*, βalaninnal*, L-cc-amino-vajsavval*, L-y-amino-vaj savval*, L-a-amino-izovajsavval*, L-εaminokapronsavval#, 7-aminoheptánsawal*, L-metioninszulfonnal#*, L-norleucinnal*, Lnorvalinnal*, p-nitro-L-fenilalaninnal*, L-hidroxiprolinnal#, L-tioprolinnal*, fenilalnin (Phe) metilszármazékaival, például 4-metil-Phe*, pentametil-Phe*, L-Phe (4-amino)#, LTyr (metil)*, L-Phe (4-izopropil)*, L-Tic (l,2,3,4-tetrahidroizoquinolin-3-karboxnsav)*, L-diaminopropionsav és L-Phe (4-benzil)*. A * használata a könnyebb értelmezhetőséget szolgálja (homológ vagy nem-homológ szubsztitúciókra vonatkoztatva), és a származék hidrofób jellegére utal, míg a # a származék hidrofób tulajdonságára utal; az #* amfípátiás származékot jelent.
Variáns aminosav-szekvenciák a szekvencia bármely két aminosava között tartalmazhatnak megfelelő távtartó csoportokat, amelyek lehetnek alkilcsoportok, például metil, etil- vagy propilcsoportok, vagy aminosav távtartók, például glicin vagy β-alanin aminosavak. Szakember számára ismertek további lehetséges változtatások, például egy vagy több aminosav jelenléte peptoid formájában. A félreértések elkerülésére, „peptoid formán” variáns aminosavat értünk, amelyben az α-szén szubsztituens csoport az aminosav nitrogénatomján foglal helyet az α-szén helyett, peptidek peptoid formában történő előállítására alkalmas eljárások a technika állása szerint ismertek, lásd például: Simon R.J. és mtsai.: PNAS 89(20), 9367 (1992); valamint Horwell D.C.: Trends Biotechnoi. 13(4), 132 (1995).
Hibridizáció
A leírás szerinti értelemben „hibridizáción” azt a folyamatot értjük, melynek során egy nukleinsavszál bázispárképződéssel komplementer szállal kapcsolódik, a kifejezés vonatkozik továbbá például (PCR) polimeráz-láncreakciós technológiával végzett amplifikációra.
A leírásban szereplő nukleotid-szekvenciákkal vagy azokkal komplementer szekvenciával szelektív módon hibridizálódni képes találmány szerinti nukleotid-szekvencia legalább 20, előnyösen legalább 25 vagy 30, például legalább 40, 60 vagy 100 egymást követő nukleotid mentén legalább 75%-ban, előnyösen legalább 85%-ban vagy 90%-ban, elő nyösebben legalább 95%-ban vagy 98%-ban homológ a megfelelő, komplementer nukleotid-szekvenciával.
„Szelektív hibridizáción” azt értjük, hogy a nukleotid-szekvenciát próbaként alkalmazva olyan körülmények mellett hibridizáltatjuk, ahol a cél nukleotid-szekvencia a hátteret jelentősen meghaladó mértékben hibridizálódik a próbával. A háttérhibridizációt okozhatja más nukleotid-szekvencák jelenléte, például szűrendő cDNS- vagy genomigénkönyvtárban. Ebben az esetben, a hátteret a próba és a génkönyvtár nem-specifikus DNS-komponense közti kölcsönhatás által generált szignál okozza, amely 10-szer, előnyösen 100-szor kevésbé intenzív, mint a cél DNS esetében megfigyelt specifikus kölcsönhatás. A kölcsönhatás erősségét mérhetjük például a promoter radioaktív jelölésével, például 32P-vel történő jelölésével.
A hibridizációs körülmények a kötődő nukleinsav komplex olvadási hőmérsékletén („melting temperature”; Tm) értékén alapulnak [lásd Berger és Kimmel: “Guide to Molecular Cloning Techniques”, Methods in Enzymology 152, Academic Press, San Diego, CA, (1987)]. és az alább ismertetettek szerint, a „sztringencia fokát” határozzák meg.
Maximálisan sztringens körülmények körülbelül Tm-5°C-on (a próba Tm-értéke alatt 5°C-kal) állnak fenn; nagymértékben sztringens körülmények a Tm-érték alatt körülbelül 5-10°C-kal; közepesen sztringens körülmények a Tm-érték alatt körülbelül 10-20°C-kal; alacsony fokban sztringens körülmények a Tm-érték alatt körülbelül 20-25°C-kal állnak fenn. Szakember számára nyilvánvaló, hogy maximálisan sztringens körülmények mellett végzett hibridizációval teljesen megegyező nukleotid-szekvenciák azonosíthatók vagy mutathatók ki, míg közepesen (vagy alacsony fokban) sztringens körülmények mellett végzett hibridizációval hasonló vagy rokonságban álló polinukleotid-szekvenciák azonosíthatók vagy mutathatók ki.
A találmány egy előnyös szempontja szerint, a találmány tárgyát a találmány szerinti nukleotid-szekvenciákkal sztringens körülmények mellett (például 65°C-on, 0,lxSSCpufferben (lxSSC= 0,15 mol/1 NaCl; 0,015 mol/l Na3-citrát)] hibridizálódni képes nukleotid-szekvenciák képezik. Amennyiben a találmány szerinti nukleotid-szekvencia kettösszálú, a találmány vonatkozik mindkét szálra, külön-külön vagy kombinációban. Amennyiben a nukleotid-szekvencia egyszálú, nyilvánvaló, hogy szintén a találmány tárgyát képezi a nukleotid-szekvenciával komplementer szekvencia.
A találmány szerinti szekvenciákkal nem 100%-ban homológ, de a találmány tárgykörébe tartozó nukleotid-szekvenciákat számos különböző módon kaphatunk. A szekvenciák egyéb variánsait kaphatjuk például úgy, hogy különböző eredetű DNSgénkönyvtárakat hibridizáltatunk próbával. Ezen felül, egyéb vírus eredetű, bakteriális vagy celluláris homológokat, elsősorban emlős sejtekben (például patkány, egér, szarvasmarha és főemlős sejtekben) előforduló celluláris homológokat kaphatunk, amely homológok és azok fragmentumai szelektív módon képesek hibridizálódni a szekvencialistában szereplő szekvenciákkal. Ilyen szekvenciákat kaphatunk más állatfajokból származó cDNS-génkönyvtárak vagy genomi DNS-génkönyvtárak szűrésével úgy, hogy a DNSgénkönyvtárakat nagymértékben vagy közepesen sztringens körülmények mellett a találmány szerinti nukleotid-szekvenciák egészét vagy részét tartalmazó próbával hibridizáltatjuk. Hasonló módon kaphatjuk meg a találmány szerinti aminosav-szekvencia és/vagy nukleotid-szekvencia azonos fajból származó homológjait és allélikus variánsait.
Variánsokat és törzs-/fajspecifikus homológokat kaphatunk degenerált PCReljárással, amelyben a variánsokban és homológokban előforduló, a találmány szerinti szekvenciákban konzervatív aminosav-szekvenciákat kódoló szekvenciákat megcélzó láncindítókat alkalmazunk. Konzervatív szekvenciákat kikövetkeztethetünk például úgy, hogy több variáns/homológ aminosav-szekvenciáját összerendezzük. Szekvencia-összerendezéseket végezhetünk a technika állása szerint ismert számítógépes programokkal. Széles körben alkalmazzák például a „GCG Wisconsin PileUp” programját. A degenerált PCR-ban alkalmazott láncindítók egy vagy több degenerált pozíciót tartalmaznak, és azokat alacsonyabb fokban sztringens körülmények mellett alkalmazzuk, mint amelyeket szekvenciák klónozására alkalmazunk, ahol egyetlen, adott szekvenciájú láncindítót hibridizáltatunk ismert szekvenciákkal.
További lehetőség szerint, ilyen nukleotid-szekvenciákat kaphatunk alaposan jellemzett szekvenciák helyspecifikus mutagenezisével, például a szekvencialistában szereplő 1. vagy 2. azonosítószámú szekvenciák mutagenezisével. Ez akkor lehet előnyös, ha néma kódoncserék szükségesek a kódonpreferencia optimalizálására adott gazdasejtben, amelyben a nukleotid-szekvenciát expresszáltatni kívánjuk. Egyéb szekvencia-változtatásokra lehet szükség restrikciós enzim felismerőhelyek beiktatására, vagy nukleotid-szekvenciák által kódolt proteinek akivitásának módosítására.
A találmány szerinti nukleotid-szekvenciák alapján előállíthatunk láncindítókat, például PCR-láncindítókat, alternatív amplifikációs reakcióban alkalmazandó láncindítókat; próbákat, például szokásos módon, kimutatható jelölőanyaggal, például radioaktív vagy nem-radioaktív jelölőanyaggal jelölt próbákat; vagy a nukleotid-szekvenciákat vektorba klónozhatjuk. Az ilyen láncindítók, próbák és egyéb fragmentumok legalább 15, előnyösen legalább 20, például 25, 30, 40 nukleotid hosszúságúak, és azokat szintén a találmány szerinti nukleotid-szekvenciák közé soroljuk.
A találmány szerinti nukleotid-szekvenciákat, például DNS-polinukleotidokat és próbákat rekombináns úton, szintetikus úton, vagy bármely, szakember számára ismert módon is előállíthatjuk. Azok ismert eljárásokkal klónozhatok is.
Általánosságban, láncindítókat szintetikus úton állítunk elő, a kívánt nukleinsavszekvencia lépcsőzetes, nukleotidok egyenként történő beépítésével járó szintetizálásával. Erre alkalmas, automatizált berendezések alkalmazásán alapuló technológiák a technika állása szerint ismertek.
Hosszabb nukleotid-szekvenciákat általában rekombináns úton állítunk elő, például PCR (polimeráz-láncreakciós) technológián alapuló klónozó technológiával. Ehhez, a klónozni kívánt célzott régiót közrefogó láncindítópárt állítunk elő (például 15-31 nukleotid hosszúságú láncindítókat), a láncindítókat állati vagy emberi sejtből származó mRNS-sel vagy cDNS-sel érintkeztetjük, polimeráz-láncreakciót (PCR) végzünk olyan körülmények mellett, amelyek a kívánt régió amplifíkációját eredményezik, az amplifíkált régiót izoláljuk (például a reakcióelegyet agarózgélen tisztítva), és az amplifíkált DNS-t kinyerjük. A láncindítókat úgy tervezhetjük meg, hogy azok megfelelő restrikciós enzim felismerő helyeket tartalmazzanak, amelyek lehetővé teszik az amplifíkált DNS klónozását megfelelő klónozó vektorba.
A genetikai kódon degeneráltságának következtében a célszekvenciák klónozására és expresszáltatására egyéb, lényegében azonos, vagy funkcionálisan egyenértékű aminosavszekvenciákat kódoló DNS-szekvenciákat is alkalmazhatunk. Amint az szakember számára ismert, egyes expressziós rendszerek esetén előnyös lehet a célszekvencia természetben elő nem forduló kódonokat tartalmazó formában történő előállítása. Bizonyos prokariota vagy eukariota gazdák által preferált kódonokat választhatunk például a célszekvencia expressziós sebességének fokozására, vagy kívánt tulajdonságú, például a természetben előforduló szekvenciáról átíródott transzkriptuménál hosszabb féléletidejű RNStranszkriptumok előállítására.
Vektorok
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a hatóanyagot (azaz NPYi-t vagy NPY Yli-t) közvetlenül adjuk be az egyénnek.
A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti hatóanyagot kódoló nukleotid-szekvenciát tartalmazó vektort adunk be az egyénnek.
Előnyösen, a rekombináns hatóanyagot gén vektor alkalmazásával állítjuk elő és állítjuk elő és/vagy juttatjuk a célhelyre.
Amint az a technika állása szerint jól ismert, vektoron valamely entitás egyik környezetből másikba történő átvitelét lehetővé tevő vagy megkönnyítő eszközt nevezünk. A találmány szerinti megoldással összhangban, és a találmány szerinti megoldás szemléltetésére, rekombináns DNS-technológákban alkalmazott vektorok egy része lehetővé teszi entitások, például DNS-szegmens (például heterológ DNS-szegmens, mint például heterológ 10 cDNS-szegmens) gazdaszervezetbe és/vagy gazdasejtbe történő juttatását, ezáltal a találmány szerinti nukleotid-szekvenciát tartalmazó vektorok replikáltatását, és/vagy a találmány szerinti nukleotid-szekvencia által kódolt találmány szerinti proteinek expresszáltatását. Rekombináns DNS-technológiában alkalmazható vektorok például, de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, plazmidok, kromoszómák, mester15 séges kromoszómák vagy vírusok.
A leírás szerinti értelemben „vektoron” expressziós vektorok és/vagy transzformációs vektorok.
„Expressziós vektoron” in vivo vagy in vitro vagy ex vivo expresszáltatható konstrukciót értünk.
„Transzformációs vektoron” egyik fajból a másikba átvihető konstrukciót nevezünk.
Csupasz DNS
A találmány szerinti, MSD, például MED kezelésére alkalmas hatóanyagot kódoló nukleotid-szekvenciát magában foglaló vektort beadhatjuk közvetlenül, „csupasz nukleinsav-konstrukcióként”, amely előnyösen a gazdasejt genomjával homológ határoló szek25 venciákat is tartalmaz.
A leírás szerinti értelemben „csupasz DNS-en” a találmány szerinti hatóanyagot kódoló nukleotid-szekvenciát a kódolt hatóanyag termelődését szabályozó rövid promóterrégióval együtt tartalmazó plazmidot értünk. Azt ezért nevezzük „csupasz DNS”nek, mert a plazmidokat nem hordozza semmilyen szállítóeszköz. Amikor ilyen plazmidok 30 bekerülnek a gazdasejtbe, például eukariota sejtbe, az általa kódolt proteinek (például a találmány szerinti hatóanyag) átíródnak, és transzlálódnak a sejtben.
Nem-virális szállítóvektorok
A találmány szerinti nukleotid-szekvenciákat tartalmazó vektorok vagy a találmány szerinti hatóanyagok (NPYi vagy NPY Yli) vagy a találmány szerinti célszekvenciák (az az NPY vagy NPY Yl) megfelelő gazdasejtekbe juttathatók különböző, a technika állása szerint ismert nem-virális eljárásokkal, például transzfekcióval, transzformációval, elektroporációval vagy biolisztikus (DNS-sel bevont lövedék alkalmazásán alapuló) transzformációval.
„Transzfekción” olyan eljárást értünk, amellyel nem-virális vektorok alkalmazásával géneket jutathatunk célzott emlőssejtekbe.
Tipikus transzfekciós eljárások például a következők: elektroporáció, DNS bejuttatását célzó biolisztikus eljárások, lipid által közvetített transzfekció, tömörített DNS által közvetített transzfekció, liposzómák, immunoliposzómák, lipofektin alkalmazása; kationos ágens által közvetített transzfekció, kationos felszíni amfífilek (CFA-k) [Nature Biotechnology 14, 556 (1996)] alkalmazása; multivalens kationok, például spermin, kationos lipidek vagy polilizin, l,2,-bi(oleoiloxi)-3-(trimetilammonio)propán-koleszterin (DOTAP-koleszterin) komplexek [Wolff és Trubetskoy: Nature Biotechnology 16, 421 (1998)], valamint a felsoroltak kombinációinak alkalmazása.
Csupasz nukleinsav-konstrukciók emlős gazdasejtekbe történő felvételét több ismert transzfekciós eljárással, például transzfekciós ágensek alkalmazásával elősegíthetjük. Ilyen ágensek lehetnek például kationos ágensek (például kalcium-foszfát vagy DEAE-dextrán), lipofektánsok (például lipofektam™ és transzfektam™). Tipikusan, a nukleinsavkonstrukciókat készítményként a transzfekciós ágenssel elegyítjük.
Virális vektorok
További lehetőség szerint, a találmány szerinti hatóanyagot vagy célszekvenciát vagy találmány szerinti nukleotid-szekvenciát tartalmazó vektorokat megfelelő gazdasejtekbe juttathatjuk a technika állása szerint ismert, különböző, virális vektorok alkalmazásán alapuló eljárásokkal, például rekombináns vírusvektorokkal, mint például retrovírusvektorokkal, herpes simplex vírusokkal vagy adenovírusokkal végzett fertőzéssel.
Előnyösen, a vírus rekombináns rekombináns vírusvektor. Rekombináns vírusvektorkként például, de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, alkalmazhatunk adenovírus-vektorokat, adeno-asszociált vírus (AAV) vektorokat, herpesvirus vektorokat, retrovirus vektorokat, lentivírus vektorokat, baculovírus vektorokat, poxvirus vektorokat vagy parvovirus vektorokat [lásd Kestler és mtsai.: Human Gene Ther. 10(10), 1619 (1999)]. Vírusvektorok esetében, a találmány szerinti hatóanyagot kódoló nukleotidszekvenciát a célsejtek vírusfertőzésével juttatjuk a sejtekbe.
Célzott vektorok „Célzott vektoron” olyan vektort értünk, amely bizonyos sejttípusokra korlátozódva képes a gazdaorganizmusban sejteket - rendszerint azonos vagy hasonló fenotípusú sejteket - fertőzni/transzfektálni/transzdukálni, vagy a gazdában expresszálódni, és/vagy sejteket megcélozni.
Replikációs vektorok
A találmány szerinti hatóanyagokat (azaz NPYi vagy NPY Yli, vagy PDEi vagy PDE5i) vagy célszekvenciákat (NPY vagy NPYY1) kódoló nukleotid-szekvenciákat rekombináns replikációs vektorokba építhetjük. A vektor alkalmazásával a nukleotidszekvencia kompatibilis gazdasejtben replikáltatható. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi eljárás a találmány szerinti célszekvenciák előállítására, amelyben a találmány szerinti nukleotid-szekvenciát replikálódni képes vektorba építjük, a vektort kompatibilis gazdasejtbe juttatjuk, és a gazdasejtet a vektor replikálódását lehetővé tevő körülmények mellett tenyésztjük. A vektort a gazdasejtekből kinyerhetjük.
Expressziós vektorok
Előnyösen, a találmány szerinti ágens, nukleotid-szekvencia vagy célszekvencia amely vektorba van inszertálva -, a gazdasejtben a kódoló szekvencia, például NPY vagy NPYY1 expresszálódását eredményező szabályozó szekvenciákkal funkcionálisan kapcsolt, azaz a vektor expressziós vektor. A találmány szerinti hatóanyag vagy gazda rekombináns sejt által előállított célprotein szekretálódhat, vagy intracellulárisan maradhat az alkalmazott szekvenciától és/vagy vektortól függően. Amint az szakember számára nyilvánvaló, a találmány szerinti hatóanyagot vagy célmolekulát kódoló szekvenciát tartalmazó expressziós vektorokat megtervezhetjük úgy, hogy a találmány szerinti kódoló szekvenciákról expresszálódó hatóanyag vagy célmolekula szekrécióját prokariota vagy eukariota sejtmembránokon keresztül irányító szignálszekvenciákat tartalmazzanak.
Expresszáltatás in vitro
A találmány szerinti vektorokat transzfekcióval vagy transzformációval megfelelő gazdasejtekbe és/vagy célsejtekbe juttathatjuk, hogy a találmány szerinti hatóanyagot vagy célszekvenciát expresszáltassuk. Ezt végezhetjük úgy, hogy az expressziós vektorral transzformált gazdasejtet és/vagy célsejtet olyan körülmények mellett tenyésztjük, amelyek lehetővé teszik a vektor által a találmány szerinti hatóanyagot vagy célmolekulát kódoló szekvenciák expresszióját, és adott esetben, az expresszálódott találmány szerinti hatóanyagot vagy célmolekulát kinyerjük. A vektorok lehetnek például replikációs origót, és adott esetben a polinukleotid expresszióját irányító promótert, és szintén adott esetben, a promótert szabályozó szekvenciát tartalmazó plazmidok vagy vírusvektorok. A vektorok tartalmazhatnak egy vagy több szelektálható markergént, például bakteriális plazmid esetében ampicillin-rezisztenciagént, vagy emlős vektor esetében neomycin-rezisztenciagént. A találmány szerinti hatóanyag vagy találmány szerinti célmolekula expressziója lehet konstitutív, azaz azok folyamatosan termelődhetnek; vagy lehet indukálható, amikor valamilyen stimulusra van szükség az expresszió megindításához. Indukálható expressziós esetén, a találmány szerinti hatóanyag vagy találmány szerinti célmolekula expresszióját kívánság szerint indíthatjuk meg, például úgy, hogy indukálószert, például dexametazont vagy IPTG-t adunk a tenyésztő tápközeghez.
Fúziós proteinek
A találmány szerinti NPYi vagy NPY Y1 vagy hatóanyag (NPYi vagy NPY Yli) fúziós proteinként is expresszáltatható, hogy megkönnyítsük a találmány szerinti hatóanyag vagy NPY/NPY1-receptor célpont tisztítását és/vagy bejuttatását az egyénbe, és/vagy megkönnyítsük a hatóanyagok szűrésére alkalmas eljárás kifejlesztését. Fúziós protein partnerként előnyösen alkalmazhatjuk a következőket: glutation-S-transzferáz (GST), 6xHis, GAL4 (DNS-kötő és/vagy transzkripciót aktiváló doménokat) vagy β-galaktozidázt. Előnyös lehet továbbá proteolitikus hasítási helyek közbeiktatása a fúziós partner és a proteinszekvencia közé, ami lehetővé teszi a fúziós protein szekvencia eltávolítását. Előnyösen, a fúziós protein nem gátolja a célprotein aktivitását.
A fúziós protein antigént vagy antigéndeterminánst is tartalmazhat a találmány szerinti proteinnel fúzionáltatva. A találmány fenti előnyös megvalósítási módja szerint, a fúziós protein természetben elő nem forduló fúziós protein, amely adjuvánsként ható komponenst tartalmaz abban az értelemben, hogy az említett komponens immunrendszer általános stimulációját eredményezi. Az antigént vagy antigéndeterminánst a protein aminovagy karboxi-terminális végéhez kapcsolhatjuk.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, az aminosav-szekvenciát heterológ szekvenciákkal ligálhatjuk, hogy fúziós proteint kapjunk. Például ahhoz, hogy peptidkönyvtárakat szűrjünk a protein aktivitását befolyásoló hatóanyagok jelenlétére, előnyös lehet kereskedelemben hozzáférhető ellenanyagok által felismert heterológ epitópot expresszáló kiméra proteineket kódoló szekvenciák előállítása.
Gazdasejtek
Hatóanyagok - például a találmány szerinti hatóanyagok - vagy a találmány szerinti NPY/NPY1-receptorcélpont expresszáltatására gazdasejtek széles skáláját alkalmazhatjuk.
- ·· ,· ;·*♦ . 87 - 4.·’··* ’· - ··
Ezek a gazdasejtek lehetnek prokariota vagy eukariota eredetűek. Gazdasejtekként alkalmazhatunk például baktériumokat, például E. colit, élesztőket, fonalas gombákat, rovarsejteket, emlőssejteket, tipikusan folyamatos szaporodású sejteket, például egér-, CHO-, humán vagy majomsejtvonalakat és azok származékait.
A találmány tárgykörébe tartozó expressziós gazdák például gombák, például Aspergillus fajok (például az EP-A-0184438 és EP-A-0284603 számú európai szabadalmi leírásokban ismertetettek) és Trichoderma fajok; baktériumok, például Bacillus fajok (például az EP-A-0134048 és EP-A-0253455 számú európai szabadalmi leírásokban ismertetettek); Streptomyces és Pseudomonas fajok; és élesztőgombák, például Kluyveromyces fajok (például az EP-A-0096430 és EP-A-0301670 számú európai szabadalmi leírásokban ismertetettek); valamint Saccharomyces fajok. Expressziós gazdákként tipikusan alkalmazhatjuk például az alább felsoroltakat: Aspergillus niger, Aspergillus niger var. tubigenis, Aspergillus niger var. awamori, Aspergillus aculeatis, Aspergillus nidulans, Aspergillus orvzae, Trichoderma reesei, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloloquefaciens, Kluyveromyces lactis és Saccharomyces cerevisiae.
Megfelelő gazdasejtek, például élesztő-, gomba- vagy növényi sejtek alkalmazása a találmány szerinti rekombináns expressziós termék optimális biológiai aktivitásához szükséges poszt-transzlációs módosításokat (például mirisztilezést, glikozilezést, csonkítást, lipidezést, vagy tirozin-, szerin- vagy szerin-foszforilálást) eredményezhet.
Előnyösen, a gazdasejtek képesek az expressziós termék feldolgozására, és megfelelő, érett polipeptid előállítására. Ilyen feldolgozó lépés lehet például a termék glikozilezése, ubiquitinezése, diszulfídkötések létrehozása és általános poszt-transzlációs módosítások létrehozása.
Ellenanyagok
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a hatóanyag ellenanyag. Ezen felül, vagy más lehetőség szerint, a célprotein ellenanyag.
Ellenanyagokat ismert eljárásokkal állíthatunk elő, például a proteinnel végzett immunizációval, vagy fágprezentációs könyvtár alkalmazásával.
A leírás szerinti értelemben „ellenanyagon” - hacsak kifejezetten másképp nem kötjük ki - értünk például, de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, poliklonális, monoklonális ellenanyagokat, kiméra ellenanyagokat, egy szálú, Fabfragmentumokat, Fab expressziós könyvtárról előállított fragmentumokat, valamint azok mimetikumait. Ilyen fragmentumok például teljes ellenanyagok fragmentumai, amelyek kötőaktivitásukat a célantigénnel szemben megtartották; Fv-, F(ab’)- és F(ab’)2-
fragmentumok, egyszálú ellenanyagok (scFv), fúziós proteinek, és más, szintetikus úton előállított, az ellenanyag antigénkötő helyét tartalmazó proteinek. Az említetteken felül, az ellenanyagok és fragmentumok lehetnek humanizált ellenanyagok. Diagnosztikai és terápiás célra különösen előnyösen neutralizáló ellenanyagokat, azaz a polipeptid biológiai aktivitását gátló ellenanyagokat alkalmazunk.
Amennyiben poliklonális ellenanyagokat kívánunk előállítani, a kiválasztott emlőst (például egeret, nyulat, kecskét, lovat, stb.) immunizálunk a találmány szerinti azonosított hatóanyagból származó epitópo(ka)t hordozó immunogén polipeptiddel. A gazdafajtól függően, különböző adjuvánsokat alkalmazhatunk az immunogén válasz fokozására. Ilyen adjuvánsok például, de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, a Freundféle adjuváns, ásványi gélek, például alumínium-hidroxid, és felületaktív anyagok, például lizolektin, „pluronic” poliolok, polianionok, peptidek, olaj emulziók, kürtőscsiga hemocianin és dintitrofenol. A BCG és a Corynebacterium parvum potenciális humán adjuvánsok, amelyeket akkor alkalmazhatunk, ha a tisztított proteint immunkompromittált egyéneknek adjuk be szisztémás védekezés stimulálására.
Az immunizált állatoktól szérumot nyerünk, és azt ismert eljárásokkal kezeljük. Ha a találmány szerinti azonosított hatóanyagból és/vagy proteinből származtatható epitóp ellen poliklonáklis ellenanyagokat tartalmazó szérum más antigének ellen is tartalmaz ellenanyagokat, a poliklonáklis ellenanyagokat immunaffinitásos kromatográfiával tisztíthatjuk. Poliklonáklis ellenanyagok előállítására alkalmas eljárások a technika állása szerint ismertek. Ilyen ellenanyagok előállítására, szintén a találmány tárgyát képezik a találmány szerinti polipeptidek vagy azok fragmentumai más polipeptidekkel haptenizálva, immunogénként, állatokban vagy emberben történő alkalmazásra.
Szakember a találmány szerinti azonosított hatóanyagból és/vagy proteinből származtatható epitópok elleni monoklonális ellenanyagok előállítására is képes. A monoklonális ellenanyagok előállítására általánosan alkalmazott hibridómatechnológia jól ismert. Folyamatos szaporodású ellenanyagtermelő sejtvonalakat hozhatunk létre sejtfúzióval, és egyéb eljárásokkal, például úgy, hogy közvetlenül B-limfocitákat transzformálunk onkogén DNS-sel, vagy transzformálunk Epstein-Barr-vírussal. Az „orbit” epitópok ellen előállított monoklonális ellenanyagkészletet különböző tulajdonságokra, például izotípusra és epitópaffinitásra szűrhetjük.
A találmány szerinti protein és/vagy azonosított hatóanyag elleni monoklonális ellenanyagok bármely eljárással előállíthatok, amely alkalmas tenyészetben, folyamatos szaporodású sejtvonalakban ellenanyagtermelő molekulák előállítására. Ilyen eljárások például,
de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, az eredetileg Koehler és Milstein által leírt hibridómatechnológia [Nature: 256, 495 (1975)]; a humán B-sejtes hibridómatechnológia [Kosbor és mtsai.: Immunoi. Today 4, 72 (1983); Cote és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 2026 (1983)], valamint az EBV-hibridómatechnológia [Cole és mtsai.: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss Inc., 77-96. oldal (1985)]. Alkalmazhatjuk továbbá a „kiméra ellenanyagok” előállítására kidolgozott eljárásokat, egér ellenanyaggéneket humán ellenanyaggénekkel kombinálunk, hogy megfelelő antigénspecifitású és biológiai aktivitású molekulákat kapjunk [Morrison és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 6851 (1984); Neuberger és mtsai.: Nature 312, 604 (1984); Takeda és mtsai.: Nature 314, 452 (1985)]. További lehetőség szerint, egyláncú ellenanyagok kifejlesztett eljárások (lásd a 4 946 779 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást) alkalmazhatók a proteinre specifikus egyláncú ellenanyagok előállítására.
A találmány szerinti azonosított hatóanyagból és/vagy proteinből származtatható epitópok elleni monoklonális és poliklonális ellenanyagok különösen előnyösen alkalmazhatók a diagnosztikában, a neutralizáló ellenanyagok pedig előnyösen alkalmazhatók paszszív immunoterápiában. Monoklonális ellenanyagok alkalmazhatók anti-idiotípus ellenanyagok előállítására. „Anti-idiotípus ellenanyagoknak” immunglobulinokat nevezünk, amelyek a protein és/vagy hatóanyag „belső tükörképét” hordozzák, amely ellen védettséget kívánunk létrehozni. Anti-idiotípus ellenanyagok előállítására alkalmas eljárások a technika állása szerint ismertek. Ezek az anti-idiotípus ellenanyagok terápiás célra is alkalmazhatók.
Ellenanyagokat előállíthatunk továbbá limfocita-populáció in vivo indukciójával, vagy rekombináns immunglobulin-könyvtárak vagy nagy specifitású kötőreagensek sorozatának szűrésével [lásd Orland és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 3833 (1989); valamint Winter G. és Milstein C.: Nature 349, 293 (1991)].
Előállíthatunk továbbá a polipeptidekre specifikus kötőhelyeket tartalmazó ellenanyag-kötőhelyeket tartalmazó ellenanyag-fragmentumokat. Ilyen fragmentumok például, de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, az F(ab’)2-fragmentum, amelyet az ellenanyag-molekula pepszines emésztésével kaphatunk meg, vagy az Fabfragmentumok, amelyeket az F(ab’^-fragmentumokban található diszulfidhidak redukálásával kaphatunk. Más eljárás szerint, Fab expressziós génkönyvtárakat létesíthetünk, amelyek lehetővé teszik a kívánt specifitású monoklonális Fab-fragmentumok gyors és egyszerű azonosítását [Huse W.D. és mtsai.: Science 256, 1257 (1989)].
Riportergének és -molekulák
A találmány szerinti vizsgáló (és szűrő) eljárásokban riporterek széles skálája alkalmazható, ahol az előnyös riporterek egyszerűen (például spektroszkópiás eljárással) kimutatható szignált eredményeznek. Riportergének kódolhatnak például a fényabszorpciós tulajdonságokat megváltoztató reakciót katalizáló enzimet.
Riporter-molekulák például, de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, a β-galaktozidáz, invertáz, zöld fluoreszcens protein, luciferáz, kloramfenikol acetiltranszferáz, β-glukuronidáz, exo-glukanáz és glükoamiláz. További lehetőség szerint, radioaktív vagy fluoreszcens címkével ellátott nukleotidokat építhetünk naszcens transzkriptumokba, amelyek aztán oligonukleotid-próbákhoz kötődve azonosíthatunk.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a riporter-molekula termelődését a riportergén termékének, a β-galaktozidáz enzimatikus aktivitása alapján mérjük.
A technika állása szerint számos, a célmolekula expressziójának kimutatására és mérésére alkalmas, például a proteinre specifikus poliklonális vagy monoklonális ellenanyagok alkalmazásán alapuló eljárás ismert. Ilyen eljárások például az enzimes immunológiai vizsgálati eljárás (ELISA), radioimmun vizsgálati eljárás (RIA), és fluoreszcens aktivált sejtosztályozás (FACS). Előnyös lehet két kötőhelyű, monoklonális ellenanyag alapú immunológiai vizsgálati eljárás alkalmazása, amelyben adott polipeptid két, egymással neminterferáló epitópjával reagáló monoklonális ellenanyagokat alkalmazunk, de alkalmazhatunk kompetitív kötődési vizsgálatot is. A fenti, és egyéb vizsgálati eljárások leírását megtaláljuk többek között az alábbi szakirodalmi helyeken: Hampton R. és mtsai.: „Serological Methods, A Laboratory Manual”, APS Press, St. Paul MN.; valamint Maddox D.E. és mtsai.: J. Exp. Med. 158, 1211 (1983)].
Szakember számára jelölő és konjugációs technológiák széles skálája ismert, és alkalmazható különböző nukleinsav és aminosav vizsgálatokban. Célzott polinukleotidszekvenciák kimutatására szolgáló jelölt hibridizációs és PCR-próbák előállítására alkalmas eljárások például az oligonukleotid-jelölés, „mcAtranszláció”, végjelölés vagy PCRamplifikáció jelölt nukleotidok alkalmazásával. Más eljárás szerint, a kódoló szekvenciákat vagy azok bármely részét vektorba klónozhatjuk, hogy mRNS-próbát állítsunk elő. Ilyen vektorok a technika állása szerint ismertek, a kereskedelemben hozzáférhetőek, és megfelelő RNS-polimeráz - például T7, T3 vagy S6 - és jelölt nukleotidok hozzáadásával RNSpróbák in vitro szintetizálására alkalmazhatók.
Riporterek alkalmazására számos cég (például Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ; Promega; Madison, WI; US Biochemical Corp., Cleveland, OH) fejlesztett ki kereskedelemben hozzáférhető reagenskészleteket és eljárásokat.
Alkalmas riportermolekulák vagy jelölőanyagok például radionuklidok, enzimek, fluoreszcens jelölőanyagok, kemilumineszcens jelölőanyagok vagy kromogén vegyületek, valamint szubsztrátok, kofaktorok, inhibitorok, mágneses részecskék és hasonlók. Ilyen jelölőanyagok leírását találjuk például a US-A-3817837, US-A-3850752; US-A-3939350, US-A-3996345, US-A-4277437, US-A-4275149 és US-A-4366241 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban. Rekombináns immunglobulinokat előállíthatunk a US-A-4816567 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetettek szerint is.
Adott molekula expressziójának mennyiségi meghatározására alkalmazhatunk továbbá radioaktívan jelölt nukleotidokat [Melby P.C. és mtsai.: J. Immunol. Methods 159, 235 (1993)] vagy biotinezett nukleotidokat [Duplaa C. és mtsai.: Anal. Biochem. 229 (1993)], végezhetjük kontroll nukleinsav koamplifikációját, vagy standard görbéket vehetünk fel, amelyeken a kísérleti eredményeket interpoláljuk. Több minta mennyiségi meghatározását meggyorsíthatjuk úgy, hogy a vizsgálatot ELISA-formátumban végezzük, ahol a kérdéses oligomert különböző hígításban alkalmazzuk, és gyors mennyiségi meghatározást végzünk spektrofotometriás vagy kalorimetriás úton.
Bár a markergén expressziója vagy annak hiánya alapján gén jelenlétére is következtethetünk, szükség lehet arra, hogy annak jelenlétét és expresszióját bizonyítsuk. Amenynyiben például a polipeptidet kódoló szekvenciát markergén-szekvenciába inszertáltuk, a szekvenciákat tartalmazó rekombináns sejtek a markergén funkciójának kiesése alapján azonosíthatók. További lehetőség szerint, markergént helyezhetünk el a polipeptidet kódoló szekvenciával tandem elrendezésben úgy, hogy azok egyetlen promoter szabályozása alá kerüljenek. A markergén expressziója indukciós vagy szelekciós hatásra rendszerint célszekvencia expresszióját is jelenti.
A kívánt kódoló szekvenciát tartalmazó és a célprotein kódoló régióját expresszáló gazdasejteket szakember számára ismert egyéb eljárásokkal is azonosíthatunk. Ilyen eljárások például, de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, a következők: DNSDNS- vagy DNS-RNS-hibridizáció, proteinkimutatási vizsgálatok vagy immunológiai kimutatási eljárások, például nukleinsav vagy protein kimutatására és mennyiségi meghatározására alkalmas membrán, oldat vagy „chip” alapú technológiák.
Vizsgálati eljárások szűrésre
A hatóanyagok, például NPYi vagy NPY Yli azonosítására megfelelő célszekvenciák, például aminosav-szekvenciák és/vagy nukleotid-szekvenciák bármelyikét alkalmazhatjuk - egyedül vagy kombinációban -, bármely, hatóanyagok szűrésére alkalmas eljárásban. Az ilyen tesztekben alkalmazott célmolekula lehet szabadon, oldatban; lehet szilárd hordozóhoz kötve; sejtfelszínen megjelenítve; vagy intracellulárisan. A célmolekula akár állati modellben is jelen lehet, ahol az lehet exogén vagy kívülről bejuttatott célpont. Az állati modell nem-humán állatmodell. Mérhetjük a célmolekula aktivitásának megszűnését, vagy kötőkomplexek képződését a célmolekula és tesztelendő hatóanyag között.
Hatóanyagok szűrésére alkalmas eljárások alapulhatnak például Geysen eljárásán [84/03564 számú európai szabadalmi leírás (bejelentés napja: 1984, szeptember 13.)]. Öszszefoglalva, nagyszámú különböző, kisméretű peptid tesztvegyületet szintetizálunk szilárd hordozón, például műanyagtűkön vagy egyéb felszíneken. A peptid tesztvegyületeket megfelelő célmolekulával vagy annak fragmentumával reagáltatjuk, majd mossuk. A kötődött entitásokat kimutatjuk - például a technika állása szerint ismert eljárások alkalmazásával. Hatóanyagszűrő eljárásokban eljárhatunk úgy is, hogy közvetlenül, tisztított célmolekulákkal vonunk be lemezeket.
Más eljárás szerint, nem-neutralizáló ellenanyagokat alkalmazhatunk a peptid befogására és immobilizálására szilárd hordozón.
Szintén a találmány tárgyát képezik kompetitív hatóanyagszűrő eljárások, amelyekben a célmolekulákhoz specifikus módon kötődni képes neutralizáló ellenanyagok versengenek a tesztvegyülettel a célmolekulához történő kötődésért.
További szűrőeljárásokban, megfelelő kötőaffinitású ágensek nagy teljesítményű szűrését {„high throughput screening”; HTS) végezzük a WO 84/03564 számú nemzetközi közzétételi iratban ismertetett technológián alapuló eljárásokkal.
A találmány szerinti vizsgáló eljárások előnyösen mind kis számú, mind nagyszámú tesztvegyület szűrésére, valamint kvantitatív meghatározásra is alkalmasak.
A találmány egy előnyös szempontja szerint, a találmány szerinti szűrő vizsgálat legalább az alábbi lépéseket tartalmazza (amelyek nem feltétlenül az alábbi sorrendben): (a) in vitro szűrést annak meghatározására, hogy a jelölt vegyület rendelkezik-e a kívánt aktivitással (például NPY, előnyösen NPY Yl, például kutya veséből származó NPY, előnyösen NPY Y1 aktivitását módosító hatással); (b) egy vagy több szelektivitási vizsgálatot végzünk a jelölt vegyületek szelektivitásának meghatározására (például annak kimutatására, hogy a vegyület rendelkezik-e ACE-inhibitor aktivitással - amelyet meghatározhatunk például a leírásban ismertetett vizsgáló eljárással -; vagy annak kimutatására, hogy a vegyület aktív-e NPY Y2- és/vagy NPY Y5-receptoron); és (c) in vivo szűrővizsgálatot végzünk a jelölt vegyületek alkalmazásával (például megfelelő állatmodellben, amelyben egyúttal a vegyület szelektivitását is meghatározzuk az artériás vérnyomásra kifejtett hatás 5 alapján). Tipikusan, amennyiben a jelölt vegyület megfelelőnek bizonyul az (a) és (b) vizsgálatokban, végezzük el a (c) lépésben ismertetett vizsgálatokat.
Diagnosztikai készítmények
Szintén a találmány tárgyát képezik diagnosztikai készítmények vagy reagenskészletek MED kialakulására való hajlam kimutatására. Ebben a vonatkozásban, a készít10 mény vagy reagenskészlet a mintában egy vagy több célmolekula jelenlétét vagy hiányát igazolni képes entitást tartalmaz. Előnyösen, a tesztmintát a hímvesszőből nyerik.
A diagnosztikai készítmény tartalmazhatja például az említett nukleotid-szekvenciák bármelyikét, annak variánsát, homológját, fragmentumát vagy származékát, vagy az említett nukleotid-szekvenciák bármelyikének egészével vagy részével hibridizálódni képes 15 szekvenciát.
A betegség diagnózisának alapjául a célszekvenciára vonatkozó normál- vagy standard értékeket kell megállapítanunk. Ezt végezhetjük például úgy, hogy normális egyedektől - állatoktól vagy emberektől - származó testfolyadékot vagy sejtextraktumot érintkeztetünk a technika állása szerint ismert módon a célmolekula elleni ellenanyaggal, olyan kö20 rülmények mellett, amelyek lehetővé teszik komplexek kialakulását. A standard komplexképződés mennyiségileg meghatározható úgy, hogy az értékeket pozitív kontrollokból készített hígítási sorok értékeihez viszonyítjuk, ahol ismert mennyiségű ellenanyagot érintkeztettünk ismert koncentrációjú tisztított célmolekulával. Ezután, a normál minták alapján megállapított standard értékeket potenciálisan MED által érintett egyénekből származó 25 minták értékeivel hasonlítjuk össze. A standard értékek és a vizsgált egyének eredményei közti eltérést a betegségállapotra utaló jelnek tekintjük.
A célszekvencia vagy annak bármely része diagnosztikai és/vagy terápiás vegyület alapját képezheti. Diagnosztikai célra, a cél polinukleotid-szekvenciákat génexpresszió kimutatására és mennyiségi meghatározására alkalmazhatjuk olyan állapotokban, rendelle30 nességekben és betegségekben, ahol MED fennállását tételezzük fel.
A célproteint kódoló polinukleotid-szekvenciát alkalmazhatjuk MED diagnosztizálására, a célprotein expressziójának kimutatása alapján. Például, a célproteint kódoló polinukleotid-szekvenciák alkalmazhatók hibridizációs vizsgálatokban vagy PCRvizsgálatokban - biopsziás vagy autopsziás szövetek vagy biológiai folyadékok alkalmazó sával - a célprotein expressziójában jelentkező rendellenességek kimutatására. Ilyen kvantitatív vagy kvalitatív eljárások lehetnek például Southem-blot vagy northem-blot analízisek, „dot-blot” analízis, vagy más membrán alapú eljárások; PCR-technológián alapuló eljárások, bemártható pálcák (“Jzp sticks”), tűk vagy ”c/?zpek” alkalmazásán alapuló eljárások; ELISA, vagy más, több minta egyidejű vizsgálatára alkalmas eljárások. A fenti eljársok mindegyike a technika állása jól szerint ismert, és valójában számos, a kereskedelemben hozzáférhető diagnoszikus reagenskészlet alapját képezi.
Ezeket a vizsgáló eljárásokat úgy módosíthatjuk, hogy alkalmasak legyenek adott terápiás kezelési rend hatásosságának megállapítására, és állatokban végzett vizsgálatok kivitelezésére, klinikai kipróbálási vizsgálatokban történő alkalmazásra, vagy a kezelés hatásosságának követésére adott egyénben. Ahhoz, hogy a betegséget diagnosztizáljuk, a célszekvencia expressziójára vonatkozó normál- vagy standard értékeket kell megállapítanunk. Ezt úgy végezzük, hogy normális egyedektől - állatoktól vagy emberektől - származó testfolyadékot vagy sejtextraktumot érintkeztetünk a célszekvenciával vagy annak részével, a hibridizációt vagy amplifikációt lehetővé tevő körülmények mellett. A standard hibridizáció mennyiségileg meghatározható úgy, hogy a normális egyedek esetében kapott értékeket ugyanabban a kísérletben futtatott pozitív kontrollok hígítási sorainak értékeihez viszonyítjuk, ahol ismert mennyiségű tisztított célszekvenciát alkalmaztunk. Ezután, a normál minták alapján megállapított standard értékeket a cél kódoló szekvencia expressziójával összefüggő rendellenesség vagy betegség által potenciálisan érintett egyénekből származó minták értékeivel hasonlítjuk össze. A standard értékek és a vizsgált egyének eredményei közti eltérést a betegségállapotra utaló jelnek tekintjük. Amennyiben a betegség fennállását megállapítottuk, ismert terápiás hatóanyagot adunk be, és kezelési profilt vagy értékeket állapítunk meg. Végül, a vizsgálatot szabályos időközönként megismételhetjük annak ellenőrzésére, hogy az értékek rosszabbodnak-e vagy visszatérnek a normál vagy standard értékekhez. Egymást követő kezelési profilokat alkalmazhatunk a kezelés hatásosságának kimutatására több napot vagy több hónapot átfedő időszak során.
A találmány egy szempontja szerint tehát, a találmány tárgyát képezi a célpolipeptid, vagy a polipeptid variánsának, homológjának, fragmentumának vagy származékának alkalmazása célpolipeptid elleni ellenanyag előállítására, amelyek alkalmazhatók például a diagnosztikában, a célpolipeptid szintjének kimutatására és mennyiségi meghatározására MED-ben.
Szintén a találmány tárgyát képezik diagnosztikai vizsgálati eljárások és reagenskészletek célmolekula kimutatására sejtekben és szövetekben, amelyek pozitív kontrollként tisztított célmolekulát, és célmolekula elleni ellenanyagokat tartalmaznak. Ilyen ellenanyagok alkalmazhatók oldat-, membrán- vagy szövetalapú eljárásokban a célprotein, vagy a célprotein deléciós variánsának, homológjának, fragmentumának vagy származékának expressziójával kapcsolatba hozható betegségek vagy állapotok kimutatására.
Diagnosztikai reagenskészletek
Ugyancsak a találmány tárgyát képezik diagnosztikai készítmények és diagnosztikai eljárások vagy reagenskészletek: (i) NPY és NPY Y1 aktivitásának kimutatására és mérésére biológiai folyadékokban és szövetekben; és/vagy (ii) NPY- és NPY Y1-aktivitás lokalizálására erektilis szövetekben; és/vagy (iii) férfi szexuális funkciózavar, például MED kialakulására mutatott hajlam kimutatására. Ebben a vonatkozásban, a készítmény vagy reagenskészlet a mintában egy vagy több célmolekula, például NPYi- vagy NPYY1aktivitás jelenlétét - vagy akár hiányát - igazolni képes entitást tartalmaz. Előnyösen, a tesztmintát hím nemiszervekből, vagy abból vagy arról származó szekrétumból nyerik.
A diagnosztikai készítmény tartalmazhatja például az említett nukleotid-szekvenciák bármelyikét, annak variánsát, homológját, fragmentumát vagy származékát, vagy az említett nukleotid-szekvenciák bármelyikének egészével vagy részével hibridizálódni képes szekvenciát.
Diagnosztikai vizsgálati eljárások
Ahhoz, hogy egy betegséget diagnosztizálhassunk, a célmolekulára vonatkozó normál- vagy standard értékeket kell megállapítanunk. Ezt úgy végezzük, hogy normális egyedektől - állatoktól vagy emberektől - származó testfolyadékot vagy sejtextraktumot érintkeztetünk a technika állása szerint ismert módon, például a célmolekula elleni ellenanyaggal, a komplexek kialakulását lehetővé tevő körülmények mellett.
A standard komplexképződés mennyiségileg meghatározható úgy, hogy az értékeket pozitív kontroliokból készített hígítási sorok értékeihez viszonyítjuk, ahol ismert mennyiségű ellenanyagot érintkeztettünk ismert koncentrációjú tisztított célmolekulával. Ezután, a normál minták alapján megállapított standard értékeket férfi szexuális funkciózavar (például MED) által potenciálisan érintett egyénekből származó minták értékeivel hasonlítjuk össze. A standard értékek és a vizsgált egyének eredményei közti eltérést a betegségállapotra utaló jelnek tekintjük.
A célszekvencia vagy annak bármely része diagnosztikai és/vagy terápiás és/vagy profilaktikus hatású vegyület alapját képezheti. Diagnosztikai célra, a cél polinukleotidszekvenciákat génexpresszió kimutatására és mennyiségi meghatározására alkalmazhatjuk olyan állapotokban, rendellenességekben és betegségekben, ahol férfi szexuális funkciózavar, közelebbről MED fennállását tételezhetjük fel.
A célproteint kódoló polinukleotid-szekvenciát alkalmazhatjuk a célszekvencia expressziójával összefüggően kialakult SD diagnosztizálására. Például, a célproteint kódoló polinukleotid-szekvenciák alkalmazhatók hibridizációs vizsgálatokban vagy PCRvizsgálatokban - biopsziás vagy autopszás szövetek vagy biológiai folyadékok alkalmazásával - a célprotein expressziójában jelentkező rendellenességek kimutatására. Ilyen kvantitatív vagy kvalitatív eljárások lehetnek például Southem-blot vagy northem-blot analízisek, „dot-blot” analízis, vagy más membrán alapú eljárások; PCR-technológián alapuló eljárások, bemártható pálcák (“dzp sticks”), tűk vagy ’’cAzpek” alkalmazásán alapuló eljárások; ELISA, vagy más, több minta egyidejű vizsgálatára alkalmas eljárások. A fenti eljársok mindegyike a technika állása jól szerint ismert, és valójában számos, a kereskedelemben hozzáférhető diagnoszikus reagenskészlet alapját képezi.
Ezeket a vizsgáló eljárásokat úgy módosíthatjuk, hogy alkalmasak legyenek adott terápiás kezelési rend hatásosságának megállapítására, állatokban végzett vizsgálatok kivitelezésére, klinikai kipróbálási vizsgálatokban történő alkalmazásra, vagy a kezelés hatásosságának követésére adott egyénben. Ahhoz, hogy a betegséget diagnosztizáljuk, a célszekvencia expressziójára vonatkozó normál- vagy standard értékeket kell megállapítanunk. Ezt úgy végezzük, hogy normális egyedektől - állatoktól vagy emberektől - származó testfolyadékot vagy sejtextraktumot érintkeztetünk a célszekvenciával vagy annak részével, a hibridizációt vagy amplifíkációt lehetővé tevő körülmények mellett. A standard hibridizáció mennyiségileg meghatározható úgy, hogy a normális egyedek esetében kapott értékeket ugyanabban a kísérletben futtatott pozitív kontrollok hígítási sorainak értékeihez viszonyítjuk, ahol ismert mennyiségű tisztított célszekvenciát alkalmaztunk. Ezután, a normál minták alapján megállapított standard értékeket a cél kódoló szekvencia expressziójával összefüggő rendellenesség vagy betegség által potenciálisan érintett egyénekből származó minták értékeivel hasonlíthatjuk össze. A standard értékek és a vizsgált egyének eredményei közti eltérést a betegségállapotra utaló jelnek tekintjük. Amennyiben a betegség fennállását megállapítottuk, ismert terápiás hatóanyagot adunk be, és kezelési profilt vagy értékeket állapítunk meg. Végül, a vizsgálatot szabályos időközönként megismételhetjük annak ellenőrzésére, hogy az értékek rosszabbodnak-e vagy visszatérnek a normál vagy standard értékekhez. Egymást követő kezelési profilokat alkalmazhatunk a kezelés hatásosságának kimutatására több napot vagy több hónapot átfedő időszak során.
A találmány egy szempontja szerint tehát, a találmány tárgyát képezi a célpolipeptid, vagy a polipeptid variánsának, homológjának, fragmentumának vagy származékának alkalmazása a célpolipeptid elleni ellenanyagok előállítására, amelyek alkalmazhatók például a diagnosztikában, a célpolipeptid szintjének kimutatására és mennyiségi meghatározására férfiak szexuális funkciózavaraiban.
Szintén a találmány tárgyát képezik diagnosztikai vizsgálati eljárások és reagenskészletek a célmolekula kimutatására sejtekben és szövetekben, amelyek pozitív kontrollként tisztított célmolekulát, és a célmolekula elleni ellenanyagokat tartalmaznak. Ilyen ellenanyagok alkalmazhatók oldat-, membrán- vagy szövetalapú eljárásokban a célprotein, vagy a célprotein deléciós variánsának, homológjának, fragmentumának vagy származékának expressziójával kapcsolatba hozható betegségek vagy állapotok kimutatására.
A fenti entitásokat tartalmazó diagnosztikai készítmények és reagenskészletek alkalmasak NPY vagy NPY Y1 gyors, érzékeny és specifikus meghatározására és lokalizálására erektilis szöveti extraktumokban. Bizonyos esetekben, a reagenskészlet férfiak szexuális funkciózavara, például MED fennállására utalhat.
Vizsgálati eljárások
A diagnosztikai készítmények és/vagy eljárások és/vagy reagenskészletek például, de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, alapulhatnak a következő módszereken: kompetitív vagy nem-kompetitív vizsgálati eljárásokon; radioimmun vizsgálati eljárásokon; biolumineszcens és kemilumineszcens vizsgálati eljárásokon; fluorometriás vizsgálati eljárásokon; szendvics típusú vizsgálati eljárásokon; immunoradiometriás vizsgálati eljárásokon; “dot-biot vizsgálati eljárásokon; enzimmel jelölt reagens kötődésén alapuló vizsgálati eljárásokon, például ELISA-eljáráson; mikrotitráló lemezek alkalmazásán; és vizelet vagy vér gyors vizsgálatára alkalmas, ellenanyaggal fedett csíkok vagy bemártható pálcák (“dipsticks) alkalmazásán; valamint immunhisztokémiai és immunocitokémiai eljárásokon.
Immunhisztokémiai készletet alkalmazhatunk például NPY- vagy NPY Y1-aktivitás lokalizálására genitális szövetekben. Egy ilyen immunhisztokémiai készlet lehetővé teszi például NPY- vagy NPY Y1-aktivitás lokalizálását fény- vagy elektronmikroszkópos eljárással szöveti metszetekben és tenyésztett sejtekben, és egyaránt alkalmas kutatási vagy klinikai célokra. Ilyen információk hasznosak lehetnek diagnosztikai és esetleg terápiás célokra MED kimutatásában és/vagy megelőzésében és/vagy kezelésében. Mindegyik reagenskészlet esetében meghatározzuk a vizsgálat alkalmazhatóságának tartományát, annak szenzitivitását, pontosságát, megbízhatóságát, specifitását és az eredmények reprodu kálhatóságát. A vizsgálaton belüli variációt és vizsgálatok közti variációt a helyettesítési vagy aktivitási standard görbe 20%-os, 50%-os és 80%-os értékeinek megfelelően határozzuk meg.
Próbák
A találmány egy további szempontja szerint, a találmány tárgyát nukleinsavhibridizációs próbák vagy PCR-próbák képezik, amelyek képesek (előnyösen, szelektív módon képesek) a célzott kódoló régiót, például NPY- vagy NPY Y’-receptort vagy azzal közeli rokonságban álló molekulákat, például allélek által kódolt molekulákat kódoló polinukleotid-szekvenciák, ezen belül genomi szekvenciák kimutatására. A próba specifitása, azaz hogy nagymértékben konzervált, konzervált vagy nem-konzervált régióból vagy doménból származik, és a hibridizáció vagy amplifikáció sztringenciája (magas, közepes vagy alacsony) határozza meg, hogy a próba csak természetben előforduló célzott kódoló szekvenciákat, vagy rokon szekvenciákat is azonosít. Rokon nukleinsavszekvenciák kimutatására a próbák a célcsalád tagjainak konzervált vagy nagymértékben konzervált nukleotidrégióiból származó szekvenciákat tartalmaznak, és azok alkalmazhatók például degenerált próbák keverékeként, megegyező nukleinsav-szekvenciakimutatására, vagy amikor maximális specifitás előnyös, nukleinsav-próbákat a célzott polinukleotid nem-konzervált vagy egyedi régióiból választunk. A leírás szerinti értelemben „nem-konzervált nukleotidrégión” a célzott kódoló szekvenciára egyedileg jellemző, és a géncsalád rokon tagjaiban elő nem forduló nukleotidrégiót értünk.
A PCR-technológia (lásd az US-A-4683195, US-A-4800195 és US-A-4965188 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat) további lehetőséget nyújt a célszekvencián alapuló oligonukleotidok alkalmazására. Ilyen oligomereket általában kémiai úton szintetizálunk, de azok előállíthatok enzimatikus úton vagy rekombináns forrás alapján is. Tipikusan két - egy „szensz” (5’—>3’) orientációjú és egy „antiszensz” (3’-45’) orientációjú - nukleotid-szekvenciából álló oligomereket alkalmazunk optimális körülmények között specifikus gén vagy körülmények azonosítására. Ugyanez a két oligomer, beágyazott („nested”) oligomerkészlet vagy akár oligomerek degenerált készlete kevésbé sztringens körülmények mellett alkalmazható szoros rokonságban álló DNS- vagy RNSszekvenciák kimutatására és/vagy mennyiségi meghatározására.
Hatóanyagot vagy célproteint kódoló nukleinsav-szekvenciák a fent ismertetettek szerint alkalmazhatók továbbá az endogén genomi szekvenciák térképezésére alkalmas hibridizációs próbák előállítására. A szekvenciát jól ismert technológiákkal lokalizálhatjuk adott kromoszómán vagy a kromoszóma meghatározott régióján. Ilyen technológiák az in situ hibridizáció kromoszómakeneteken [Verma és mtsai.: Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques”, Pergamon Press, New York City (1988)], áramlásos eljárással osztályozott kromoszómakészítményeken vagy mesterséges kromoszómakonstrukciókon, például YAC-okon („Yeast Arteficial Chromosomes , mesterséges élesztő kromoszómákon), bakteriális mesterséges kromoszómákon („Bacterial Arteficial Chromosomes·, BAC), bakteriális plazmidkonstrukciókon vagy egy kromoszómát fedő cDN S- génkönyvtárakon.
Kromoszóma-készítmények in situ hibridizációja és a fizikai térképezési eljárások, például kapcsoltsági analízisek végzése ismert kromoszómamarkerek alkalmazásával felbecsülhetetlen értékű a genetikai térképek bővítésében. Géntérképeket találunk például a Science magazinban [1995; 271:410f és 1994; 265:1981f). Valamely gén elhelyezkedése egy másik fajhoz tartozó emlős kromoszómáján gyakran asszociált markerekre deríthet fényt, még akkor is, ha a gént tartalmazó humán kromoszóma száma vagy karja nem ismert. Fizikai térképezéssel új szekvenciák rendelhetők kromoszómakarokhoz vagy azok részeihez. Ez, pozícionális klónozás vagy egyéb génazonosító technológiák alkalmazásával értékes információt szolgáltat kutatók számára, betegségekkel kapcsolatos gének azonosítására. Miután egy betegséget vagy tünetegyüttest genetikai kapcsoltsági analízissel nagyjából meghatározott génrégióval kapcsolatba hoztak, az illető régióban azonosított egyéb szekvenciák további tanulmányozást érdemlő asszociált vagy szabályozó géneknek minősülhetnek. A találmány szerinti nukleotid-szekvenciák szintén alkalmazhatók a normális, hordozó vagy a betegség által érintett egyedeknél kromoszóma-lokalizációban jelentkező, transzlokáció, inverzió, stb. következtében létrejött eltérések kimutatására.
Organizmusok
A leírás szerinti értelemben „organizmuson” olyan szervezetet értünk, amely tartalmazhatja a célszekvenciát és/vagy annak termékeit. Ilyen organizmus lehet például emlős, gomba, élesztő vagy növény.
A leírás szerinti értelemben „transzgénikus organizmusnak” nevezünk bármely organizmust, amely a célszekvenciát és/vagy annak termékeit tartalmazza.
Gazdasejtek/gazda-organizmusok transzformációja
A már ismertetettek szerint, a gazdaorganizmus lehet prokariota vagy eukariota organizmus. Alkalmas prokariota gazdak például az E. coli es Bacillus subtilis. Prokanota ^zlzdák transzformációjára vonatkozó leírásokat a technika állása szerint bőségesen találunk: lásd például Sambrook és mtsai.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. kiadás,
- 100 Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Ausubel és mtsai.: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1995).
Amennyiben prokariota gazdát alkalmazunk, a nukleotid-szekvenciát a transzformációt megelőzően megfelelően módosítanunk kell - például az intronokat el kell tavolitanunk.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a transzgenikus organizmus lehet élesztő. Ebben a vonatkozásban, élesztőket széles körben alkalmaznak hordozóként heterológ gének expresszáltatására. A Saccharomyces cerevisiae fajt régen alkalmazzák az iparban, például heterológ gének expresszáltatására. Heterológ gének Saccharomyces cerevisiaeben történő expresszáltatására vonatkozó ismereteinket foglalják össze Goodey és mtsai. [Yeast Biotechnology, szerk.: D.R. Berry, 401-429. oldal, Allen and Unwin, London (1987)], valamint King és mtsai. [Molecular and Cell Biology of Yeasts, szerk.: Walton E.F. és Yarronton G.T., 107-133. oldal, Blackie, Glasgow (1989)].
A Saccharomyces cerevisiae több okból kifolyólag igen alkalmas heterológ génexpresszióra. Először, nem patogén emberre, és nem képes bizonyos endotoxinok termelésére. Másodszor, miután évszázadokon át alkalmazták különböző kereskedelmi célokra, biztonságosságáról sok éven bizonyosságot szereztünk. Ez alkalmazását széles körben elfogadottá tette. Harmadszor, az organizmus kereskedelmi és kutatási célokra történő széles körű alkalmazása során nagy mennyiségű ismeret gyűlt össze a Saccharomyces cerevisiae genetikájára, fiziológiájára, valamint nagy léptében történő fermentációs tulajdonságaira vonatkozólag.
Heterológ gének Saccharomyces cerevisiaeben történő expresszáltatásának elveire és a géntermékek szekréciójára vonatkozó összefoglalót lásd az alábbi szakirodalmi helyen: Hinchcliffe E. és Kenny E.: „Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes”, Yeast, 5, szerk.: Anthony H. Rose és J. Stuart Harrison: 2. kiadás, Academic Press Ltd. (1993)].
Élesztővektorok több típusa ismert, amelyek lehetnek integratív vektorok, amelyeknek fennmaradásukhoz rekombinálódniuk kell a gazda genommal, és lehetnek autonóm replikálódó plazmidvektorok.
A transzgenikus Saccharomyces előállításához expressziós konstrukciókat állítunk elő úgy, hogy a találmány szerinti nukleotid-szekvenciát élesztőben történő expresszáltatásra tervezett konstrukcióba inszertáljuk. Heterológ gén expresszáltatására több különböző konstrukciót fejlesztettek ki. A konstrukciók élesztőben aktív promótert, rendszerint élesztőeredetű promótert, például GÁLI-promótert tartalmaznak a találmány szerinti
- 101 nukleotid-szekvenciával fuzionáltatva. Általában élesztőeredetű szignálszekvenciát, például a SUC2-szignálpeptidet kódoló szekvenciát is alkalmazunk a konstrukcióban. Az expressziós rendszert élesztőben aktív terminátor zárja.
Élesztő transzformálására több eljárást kidolgoztak. Például, a találmány szerinti transzgénikus Saccharomyces előállítható például az alábbi közleményekben ismertetett eljárásokkal: Hinnen és mtsai.: Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929 (1978); Beggs_J.D.: Nature 275, 104 (1978); valamint Ito H. és mtsai.: J. Bacteriology 153, 163 (1983).
A transzformált élesztősejteket különböző szelektív markerek segítségével szelektálhatjuk. A transzformánsokban markerként alkalmazhatunk számos auxotrof markert, például LEU2-, HIS4- és TRP1-markert; vagy domináns antibiotikum-rezisztenciamarkereket, például amidoglikozid antibiotikum rezisztenciamarkert, például G418-rezisztenciamarkert.
Gazdaorganizmusként növényt is alkalmazhatunk. Géntechnológiai úton módosított növények előállításának alapelve az, hogy úgy inszertálunk genetikai információt a növényi genomba, hogy az inszertált genetikai anyag stabil maradjon. Genetikai információt különböző eljárásokkal inszertálhatunk; a két fő eljárás a genetikai információ közvetlen bejuttatása, és genetikai információ inszertálása vektorrendszer alkalmazásával. Az általános technológiákra vonatkozó összefoglalót találunk a következő szakirodalmi helyeken: Potrykus: Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42, 205 (1991); Christou: AgroFood-Industry Hi-Tech 17-27. oldal (1994 március/április). Növényi transzformációra alkalmazható eljárás ismertetését találjuk továbbá az EP-A-0449375 számú európai szabadalmi leírásban.
Ennek megfelelően, szintén a találmány tárgyát képezi eljárás gazdasejt transzformálására a célzott nukleotid-szekvenciával vagy a célproteint expresszáló nukleotidszekvenciával. A nukleotid-szekvenciával transzformált gazdasejtek olyan körülmények mellett tenyészthetők, amelyek lehetővé teszik a protein expresszáltatását és annak kinyerését a sejttenyészetből. A rekombináns sejtben előállított protein az alkalmazott szekvenciától és/vagy vektortól függően szekretálódhat, vagy intracellulárisan maradhat. Szakember számára nyilvánvaló, hogy a kódoló szekvenciákat tartalmazó expressziós vektorokat megtervezhetjük úgy, hogy szignálszekvenciákat tartalmazzanak, amelyek a kódolt polipeptid szekrécióját irányítják prokariota vagy eukariota sejtmembránon át. Más rekombináns konstrukciókban, a kódoló szekvenciát szolúbilis proteinek tisztítását meg
102 könnyítő polipeptiddomént kódoló nukleotid-szekvenciához kapcsolhatjuk [Kroll D.J. és mtsai.: DNA Cell Bioi. 12, 441 (1993)].
ACE kimutatási eljárás
ACE-ra vonatkoztatott aktivitási értékeket vagy NPY- vagy NPY Y1-inhibitorok szelektivitását ACE-val szemben a következő eljárással határoztuk meg.
Eljárás szolúbilis angiotenzin-konvertáló enzim (ACE) előállítása és aktivitásának meghatározására sertés és humán vesekéregben
Szolúbilis ACE-t vesekéregből nyertünk, és annak aktivitását az Abz-Gly-p-nitroPhe-Pro-OH ACE-szubsztrát lebomlásának sebessége alapján határoztuk meg, amely reakció fluoreszcens termék, Abz-Gly keletkezéséhez vezet.
1. Anyagok
Kísérleteinkben kétszer ionmentesített vizet alkalmaztunk.
1.1 Humán vese a HAM (Pennsylvania, U.S.A.) vagy „UK Human Tissue Bank” (UK HTB) szövetbankjából származott;
1.2 Sertésvese ACE a Sigma cégtől származott (A2580);
1.3 Homogenizáló puffer 1:
100 mmol/1 mannit és 20 mmol/1 Tris (pH=7,l);
2,42 g Tris-t (Fisher T/P630/60) hígítottunk 1 liter vízben, és a pH-t 6 mol/1 HCL-val, szobahőmérsékleten, 7,1-re állítottuk be. Ehhez, 18,22 g mannitot adtunk (Sigma M-9546).
1.4 2. Homogenizáló puffer 2
100 mmol/1 mannit és 20 mmol/1 Tris (pH=7,l) és 10 mmol/1 MgC12x6H2O (Fisher M0600/53).
Ötszáz (500) ml homogenizáló puffer 1-hez (1.4) 1,017 g MgCl2-t adtunk.
1.5 Tris-puffer (ACE-puffer) mmol/1 Tris és 300 mmol/1 NaCl (pH=7,4).
Ötven (50) ml 50 mmol/1 Tris (pH=7,4) (Sigma T2663) és 17,52 g NaCl (Fisher S/3160/60) elegyét 1000 ml-re egészíttettük ki vízzel.
1.6 Szubsztrát (Abz-Gly-p-nitro-Phe-Pro-OH) (Bachem M-1100)
Az ACE-szubsztrátot por formában, -20°C-on tároltuk. Két (2) mmol/1 törzsoldatot készítettünk oly módon, hogy a szubsztrátot óvatosan ACE-pufferben szuszpendáltuk; ezt nem szabad vortexelni vagy ultrahangozni. A 2 mmol/1 törzsoldatot 400 pl térfogató mintákra osztva tároltuk -20°C-on, egy hónapig.
103 -
1.7 Teljes termék
Száz (100) % szubsztrát -> termék konverziónak megfelelő mintákat is a lemezre vittünk, hogy a szubsztrát %-os átalakulását meghatározhassuk (lásd a számításoknál). A teljes terméket úgy állítottuk elő, hogy 1 ml térfogatú, 2 mmol/1 szubsztrátot inkubáltunk 20 μΐ enzim törzsoldattal 37°C-on, 24 órán át.
1.8 Stopoldat
0,5 mmol/1 EDTA-t (Promega CAS[6081/92/6]) hígítottunk 1:250 arányban ACEpufferben, hogy 2 mmol/1 oldatot kapjunk.
1.9 Dimetil-szulfoxid (DMSO);
1.10 Magnézium-klorid - MgCbxóIUO (Fisher M0600/53);
1.11 sötét falú, 96-lyukú, lapos fenekű mikrotitráló lemezek (Costar 3915 vagy Packard);
1.12 Topseal A (Packard 6005185);
1.13 centrifugacsövek.
2. Különleges berendezések
2.1 Sorvall RC-5B-centrifuga (SS34 GSA-rotor, 4 °C-on előhűtve);
2.2 „Braun miniprimer” keverő;
2.3 „Beckman CS-6R”-centrifuga;
2.4 „BMG Fluostar Galaxy” fluorométer;
2.5 „Wesbart 1589” rázóinkubátor.
3. Eljárások
3.1 Szövetek előkészítése
3.1 Humán ACE-t vesekéregből nyertünk Booth A.G. és Kenny A.J. eljárásával [Biochem J. 142, 575 (1974)].
3.3 Fagyasztott veséket szobahőmérsékleten hagytunk felolvadni, és a kérget elválasztottuk a velőállománytól.
3.4 A kérget összevagdaltuk, és mintegy 10 térfogatnyi 1. homogenizáló pufferben (1.4), Braun-miniprimer (2,2) alkalmazásával homogenizáltuk.
3.5 A homogenizátumhoz magnézium-kloridot adtunk (1.11) (20,3 mg/gramm szövet), és az elegyet 15 percig jégfurdőben kevertük.
3.6 A homogenizátumot 12 percig, 1500 g-n (3800 ford./perc), Beckmancentrifugában (2.3) centrifugáltuk, majd a felülúszót másik centrifugacsőbe vittük át, és az üledéket kidobtuk.
- 104 -
3.7 A felülúszót 12 percig, 15000 g-n (12 100 ford./perc) Sorvall-centrifugában (2.1) centrifugáltuk, és a felülúszót leöntöttük.
3.8 A maradék üledék tetején látható halványrózsaszín réteget eltávolítottuk, és 2. homogenizáló pufferben (1,5) szuszpendáltuk (5 ml puffer 1 gramm szövetre számítva).
3.9 A szuszpenziót 12 percig 2 200 g-n (4630 ford./perc) Beckman-centrifugában centrifugáltuk, majd az üledéket kidobtuk.
3.10 A felülúszót 12 percig, 15 000 g-n (12 100 ford./perc) a Sorvall-centrifugában (2.1) centrifugáltuk, és a felülúszót leöntöttük.
3.11 A végső üledéket 2. homogenizáló pufferben szuszpendáltuk (0,5 ml puffer 1 gramm szövetre számítva). Braun-miniprimer alkalmazásával homogén szuszpenziót kaptunk. Ezt 100 μΐ térfogatú adagokban lefagyasztottuk, majd NPY- vagy NPYY1aktivitásra teszteltük.
4.0 ACE-aktivitás meghatározása
Az előzőleg adagokra szétosztott ACE aktivitását annak ACE-specifikus peptidszubsztrátot hasító képessége alapján határoztuk meg.
Sertés ACE-t (1,2) felolvasztottunk, 0,004 egység/μΐ aktivitásig ACE-pufferben (1.6) szuszpendáltunk, majd 50 μΐ adagokban lefagyasztottunk.
4.1 Négy (4) % DMSO/ACE-pufferoldatot készítettünk (4 ml DMSO 96 ml ACEpufferben).
4.2 Szubsztrátot (1.7), teljes terméket (1.8) és enzimet (1.1, 1.2, 1.3) jégen felolvasztottunk.
4.3 Mindegyik lyukhoz 50 μΐ DMSO/ACE-pufferoldatot adtunk.
4.4 A 2 mmol/1 szubsztrát törzsoldatot 1:100 arányban hígítottuk, hogy 20 pmol/1 oldatot kapjunk. Mindegyik lyukhoz 100 μΐ 20 pmol/1 szubsztrátot adtunk (a vizsgálatban a végkoncentráció 10 pmol/l).
4.5 A reakció megindítására 50 μΐ megfelelő enzimhígítást (rendszerint 1:100, 1.200, 1:400, 1:800, 1:1600 és 1:3200) adtuk a lyukakhoz. A „blank” lyukakhoz 50 μΐ ACEpuffert adtunk. A 2 mmol/1 teljes terméket 1.200 arányban hígítottuk, hogy 10 pmol/l oldatot kapjunk. A 10 pmol/l oldat 200 pl adagját az első négy lyukhoz adtuk egy új lemezen.
4.6 A lemezeket 60 percig, rázóinkubátorban, 37°C-on inkubáltuk.
4.7 Az enzimreakciót úgy állítottuk le, hogy a reakcióelegyekhez 100 pl 2 mol/1 EDTA-t adtunk ACE-pufferben, és a lemezeket 20 percig, rázóinkubátorban, 37°C-on
- 105 inkubáltuk, majd “BMG Fluostar Galaxy” készülékben (excitáció: 320/ emisszió: 420) leolvastuk.
5. Eljárások ACE-inhibitor aktivitás meghatározására
5.1 Szubsztrátot, teljes terméket és enzim törzsoldatokat jégen hagytunk felolvadni.
5.2 Törzsoldatokat készítettünk 100% DMSO-ban, és azt 1:25 arányban ACEpufferben hígítottuk, hogy 4% DMSO-oldatot kapjunk. Valamennyi további hígítást 4% DMSO/ACE-puffer elegyében (4 ml DMSO 96 ml ACE-pufferben) készítettünk.
5.3 Ötven (50) μΐ hatóanyagot mértünk duplikátumokban 96-lyukú lemezekre; a kontroll és “blank” lyukakhoz 50 μΐ 4% DMSO/ACE-puffer elegyét adtuk.
5.4 Az 5.2 és 5.3 lépéseket manuálisan vagy “Packard multiprobe” robot alkalmazásával végezhetjük.
5.5 A 2 mmol/1 szubsztrát törzsoldatot 1:100 arányban ACE-pufferben hígítottuk, hogy 20 pmol/l oldatot kapjunk (a vizsgálatban a végkoncentráció 10 pmol/l). (1 lemezre elegendő mennyiséghez 110 μΐ 2 mmol/1 szubsztrátot adtunk 10,89 ml pufferhez).
5.6 Az enzim törzsoldatot ACE-pufferben hígítottuk, az aktivitásmérések alapján (4.0).
5.7 A 2 mmol/1 teljes termék törzsoldatot 1:200 arányban ACE-pufferben hígítottuk, hogy 10pmol/l oldatot kapjunk. Ebből, 200 μΐ-t adtunk egy másik lemez első négy lyukához.
5.8 A 0,5 mmol/1 EDTA-törzsoldatot 1:250 arányban hígítottuk, hogy 2 mmol/1 törzsoldatot kapjunk (44 μΐ EDTA-t adtunk 10,96 ml ACE-pufferhez).
5.9 A 96-lyukú mikrotitráló lemez minden lyukához a következő reagenseket adtuk:
1. táblázat
96-lyukú lemez lyukaiba a következő reagenseket mértük
Hatóanyag/DMSO Tris-puffer Szubsztrát ACE-enzim Teljes termék
Minták 2 μΐ hatóanyag 50 μΐ 100 μΐ 50 μΐ -
Kontrollok 2 μΐ DMSO 50 μΐ 100 μΐ 50 μΐ -
Blank 2 μΐ DMSO 100 μΐ 100 μΐ - -
teljes 2 μΐ DMSO - - - 200 μΐ
- 106 -
5.10 Ugyanezen 96-lyukú lemezre, teljes termékként, az egyes hatóanyagoknak a vizsgálatban alkalmazott legmagasabb hígítását mértük, duplikátumokban (5.7). A fluoreszcencia meghatározásához 150 μΐ ACE-puffert adtunk a lyukakhoz.
5.11 A reakciót ACE-enzim hozzáadásával indítottuk meg, majd 1 órán át, 37°C-on, rázóinkubátorban inkubáltuk.
5.12 A reakciót 100 μΐ 2 mmol/1 EDTA hozzáadásával állítottuk le, majd 20 percig, 37°C-, rázóinkubátorban inkubáltuk, végül a “BMG Fluostar Galaxy” készülékben (excitáció: 320 / emisszió: 420) leolvastuk.
6. Számítások
Az ACE-enzim aktivitását hatóanyag jelenlétében és anélkül határoztuk meg, és százalékban adtuk meg.
FU= fluoreszcens egység;
(i) % kontroll aktivitás (enzimátalakítás).
Kontrollok átlagos FU-értéke - „Blank” átlagos FU-értéke/teljes termék átlagos FUértéke - „Blank” átlagos FU-értéke xlOO;
(ii) Aktivitás inhibitor jelenlétében:
Átlagos FU-érték hatóanyag jelenlétében - „Blank” átlagos FU-értéke / teljes termék átlagos FU-értéke - „Blank” átlagos FU-értéke xlOO;
(iii) Aktivitás a kontroll %-ában kifejezve:
% aktivitás inhibitor jelenlétében / % kontroll aktivitás xlOO;
vagy
Átlagos FU-érték hatóanyag jelenlétében - „Blank” átlagos FU-értéke / kontrollok átlagos FU-értéke - „Blank” átlagos FU-értéke xlOO;
(iv) % gátlás = 100 - % kontroll;
(v) Fluoreszcens vegyületek esetében, a vegyületet tartalmazó „blank” (5.10) átlagos FU-értékét a %-os aktivitás meghatározására alkalmazott értékek átlagos FU-értékekből következtettük ki.
A %-os aktivitást (a kontroll %-ában megadva) a hatóanyag koncentrációval szemben ábrázoló pontsorra szigmoid dózis-válasz görbét illesztettünk, és IC50-értékeket számítottunk az Excel „LabStats fit-curve” programjával.
A leírásban szereplő PDE aktivitási értékeket a következőkben ismertetett eljárásokkal határoztuk meg:
107 PDE5-inhibitor - vizsgálati eljárás
Foszfodiészteráz- (PDE- ) inhibitor aktivitás
A találmány szerinti megoldással összhangban alkalmazható PDE-vegyületek hatásos és szelektív cGMP PDE5-inhibitorok. In vitro PDE-inhibitor aktivitásokat ciklikus guanozin-3’,5’-monofoszfát (cGMP) és ciklikus adenozin-3’,5’-monofoszfát (cAMP) foszfodiészterázokkal szemben azok IC50-értékeinek meghatározásával mérhetünk (azaz, a hatóanyagnak az enzimaktivitás 50%-os gátlásához szükséges koncentrációját határozzuk meg).
A kívánt PDE-enzimet különböző forrásokból izolálhatjuk, például humán barlangos testből, humán és nyúl vérlemezkékből, humán szív kamraizomból, humán vázizomból vagy szarvasmarha retinából, lényegében W.J. Thompson és M.M Appleman eljárásával [Biochem. 10, 311 (1971)]. Közelebbről, a cGMP-specifikus PDE (PDE5) és a cGMPgátolt cAMP PDE (PDE3) humán barlangos test szövetből, humán vérlemezkékből vagy nyúl vérlemezkékből; a cGMP-stimulált PDE (PDE2) humán barlangos testből származott; a kalcium/kalmodulin (Ca/CAM)-függő PDE-t (PDE1) humán szívkamrából nyertük; a cAMP-specifíkus PDE-t (PDE4) humán vázizomból izoláltuk; és a fotoreceptor PDE-t (PDE6) szarvasmarha retinából állítottuk elő. Foszfodiészteráz 7-11 SF9-sejtekbe transzfektált, teljes hosszúságú, humán rekombináns klónokról állítható elő.
Vizsgáló eljárásokat végezhetünk a „batch” eljárás módosításával [lásd Thompson W.E. és mtsai.: Biochem 18, 5228 (1979], vagy AMP/GMP közvetlen kimutatására, Amersham által leírt, TRKQ7090/7100 kód alatt forgalmazott, szomszédos pozícióba kerülő csoportok szcintillációt gerjesztő hatásán alapuló teszt módosításával. Összefoglalva, a PDE-inhibitorok hatását oly módon vizsgáltuk, hogy állandó mennyiségű enzimet inkubáltunk különböző inhibitorkoncentrációk és alacsony koncentrációjú szubsztrát jelenlétében, (cGMP vagy cAMP, 3:1 arányban jelöletlen illetve [3H]-jelölt formában, körülbelül 1/3 Km koncentrációban), úgy hogy az IC50 nagyjából megegyezzen a Ki-értékkel. A végső reakcióelegyet reakciópufferrel [20 mmol/1 Tris-HCl (pH=7,4); 5 mmol/1 MgCE, 1 mg/ml szarvasmarha szérumalbumin] 100 μΐ-re egészítettük ki. A reakciót enzim hozzáadásával indítottuk meg, 30-60 percig 30°C-on inkubáltuk, hogy a szubsztrát <30%-a alakuljon át, és a reakciót 50 μΐ (3 mmol/1, PDE9- vagy PDE 11-specifikus jelöletlen ciklikus nukleotidot tartalmazó) yttrium-szilikát SPA-gyöngygök hozzáadásával állítottuk le. A lemezeket újra lezártuk, és 20 percig rázattuk, majd a gyöngyöket 30 percig, sötétben hagytuk ülepedni, és TopCount (Packard, Meriden, CT) lemezolvasón lemértük. A radio
- 108 aktív egységeket a nem-gátolt kontroll aktivitása (100%) alapján %-os aktivitássá számoltuk át, és a Microsoft Excel „Fit Curve” funkciójának alkalmazásával inhibitorkoncentrációkkal és ICso-értékekkel szemben grafikusan ábrázoltuk.
Funkcionális aktivitás
A funkcionális aktivitás meghatározható in vitro úgy, hogy Ballard S.A és munkatársai eljárásával, nyúlból származó, kontrahált corpus cavernosus szövetcsíkokon meghatározzuk a hatóanyag nitroproszid-nátrium által indukált relaxációra kifejtett hatását [Ballard S.A. és mtsai.: Brit. J. Pharmacol. 118(suppl.), 153P kivonat (1996)].
A leírásban idézett valamennyi publikáció teljes teijedelmében a kitanítás részét képezi. Nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti eljárások és rendszerek vonatkozásában szakember képes különböző módosítások és változtatások végrehajtására, anélkül, hogy a találmányi gondolattól vagy a találmány oltalmi körétől eltérnénk. Bár a találmány szerinti megoldást A találmány szerinti megoldást a továbbiakban konkrét megvalósítási példákon keresztül kívánjuk szemléltetni, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk. Biokémiában, biotechnológiában és rokon szakterületeken jártas szakember képes különböző módosítások végrehajtására, és az ilyen módosítások szintén a találmány oltalmi körébe tartoznak.
A találmány szerinti megoldással összhangban alkalmazhatók olyan, szabadalmakban szereplő, kereszthivatkozás útján a kitanítás részét képező, terápiásán aktív vegyületek is, amelyeket az igénypontjainkban (közelebbről az 1. igénypontban) és a csatolt példákban definiálunk (a megfelelő szabadalmi bejelentések teljes terjedelmükben a kitanítás részét képezik).
A találmány szerinti megoldást a továbbiakban konkrét megvalósítási példákon és a csatolt ábrákon keresztül kívánjuk szemléltetni, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a leíráshoz csatolt ábrákat.
Az ábrán grafikon látható;
a 2. ábrán grafikon látható;
a 3. ábrán grafikon látható;
a 4. ábrán nukleotid-szekvenciát mutatunk be;
az 5. ábrán nukleotid-szekvenciát mutatunk be;
a 6. ábrán nukleotid-szekvenciát mutatunk be;
a 7. ábrán nukleotid-szekvenciát mutatunk be;
a 8. ábrán nukleotid-szekvenciát mutatunk be;
- 109 ♦ - · · · «·· ·» ♦* a 9. ábrán nukleotid-szekvenciát mutatunk be; és a 10 ábrán grafikon látható.
Közelebbről, az egyes ábrákon a következőket szemléltetjük.
Az 1. ábrán a BIBP3226 NPY Yl-antagonista (1-100 pg/kg, iv.) hatását szemléltetjük az intrakavemozus nyomásra („intracavernosal pressure”·, ICP) altatott nyulakban. (*P<0,05, Student-teszt szerint).
A 2. ábrán PDE5-inhibitor hatását ábrázoltuk az intrakavemozus nyomásra (ICP-re) stimuláció során, altatott nyulakban. Az adatokat az ICP százalékban kifejezett növekedésével adtuk meg a kontroliokban tapasztalt növekedéshez viszonyítva (*P<0,01, egytényezős Student-teszt szerint, a kontroliokban megfigyelhető növekedéshez képest)
A 3. ábrán a BIBP3226 NPY Yl-antagonista (0,03-0,3 mg/kg) hatását szemléltetjük az artériás vérnyomásra altatott nyulakban. Az átlagos artériás vérnyomást [átlag +/- az átlagtól való standard eltérés (S.E.M.)] értékekben adtuk meg (n=3). A világosszürke oszlopok az alap átlagos artériás vérnyomást jelentik a hatóanyag beadását megelőzően, a sötétszürke oszlopok pedig az átlagos artériás vérnyomást képviselik BIBP3226 intravénás beadását követően. A világos oszlopok a kontroll értékeknek felelnek meg.
A 4. ábrán humán neuropeptid Y (NPY nukleotid-szekvenciáját adtuk meg (1. azonosítószámú szekvencia).
Az 5. ábrán humán NPY Yl-receptor nukleotid-szekvenciáját adtuk meg (2. azonosítószámú szekvencia).
A 6. ábrán humán NPY Yl-receptor nukleotid-szekvenciáját adtuk meg (3. azonosítószámú szekvencia).
A 7. és 8. ábrákon humán SEP nukleotid-szekvenciáját (cDNS-szekvenciáját) adtuk meg (4. és 5. azonosítószámú szekvencia). Az 5. azonosítószámú szekvencia 5’- és 3’-végi vektorszekvenciákat tartalmaz.
A 9. azonosítószámú szekvencián humán SEP-protein aminosav-szekvenciáját mutatjuk be (6. azonosítószámú szekvencia).
A 10. ábrán NPY Yl-receptorantagonista, PDE5-inhibitor és NPY Yl-receptorantagonista, PDE5-inhibitor kombinációjának hatását szemléltetjük az intrakavemozus nyomásra (ICP-re) stimuláció során, altatott nyulakban. Az adatokat az ICP százalékban kifejezett növekedésével adtuk meg a kontroliokban tapasztalt növekedéshez viszonyítva.
A találmány szerinti megoldást a továbbiakban a pontosabb értelmezhetőség céljából konkrét megvalósítási példákon keresztül kívánjuk szemléltetni, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk.
1.0 Eljárások
1.1 Állatokban végzett vizsgálatok
1,1.1 Vizsgálatok altatott nyulakban
Új Zeelandi hím nyulakat (körülbelül 2,5 kg) 0,5 ml/kg Medetomidine (Dormitor®) (i.m.) és 0,25 ml/kg Ketamine (Vatalar®) (i.v.) kombinációjával előkezeltünk, közben az oxigénbevitelt az állatok pofájára illesztett maszkkal biztosítottuk. A nyulakat lélegeztetőkészülékhez csatlakoztatott, mandzsetta nélküli Portex™ endotracheális tubussal (3 ID.) tracheotomizáltuk, és a készüléket percenként 30-40 légvételre, körülbelül 18-20 ml belégzési térfogatra, és 10 H2Ocm maximális légúti nyomásra állított be. Az altatást Isoflurannal folytattuk, és az állatokat 2 1/perc O2-nel lélegeztettük. A jobb oldali marginális fül vénát 23 G vagy 24G méretű katéterrel kanüláltuk, és azon keresztül Laktát-Ringer-oldatot perfundáltunk 0,5 ml/perc sebességgel. A sebészeti beavatkozás során a nyulaknak 3% Isofluránt adagoltunk, majd a koncentrációt 2%-ra csökkentettük. A bal oldali nyaki vénát drogok és hatóanyagok infündálására kipreparáltuk, és izoláltuk, és PVC-katéterrel (17G) kanüláltuk.
A nyulak bal oldali ágyéki területét megborotváltuk, és körülbelül 5 cm hosszú hoszszanti metszést ejtettünk rajta a comb mentén. A femorális vénát és artériát drogok és hatóanyagok infündálására kipreparáltuk, izoláltuk, és PVC-katéterrel (17G) kanüláltuk. A kanülálást a femorális artéria esetében megismételtük, és abba 10 cm mélyen katétert vezettünk úgy, hogy annak vége elérje a hasi aortát. Ezt az arteriális katétert a vérnyomás monitorozására Gould-rendszerrel csatlakoztattuk. Vérgázanalízisre vérmintákat szintén az artériás katéterből vettünk. Mértük a szisztolés és diasztolés vérnyomást, és átlagos artériás vérnyomást számítottunk a következő képlet alapján: (diasztolés vérnyomás x2+szisztolés vémyomás):3. A szívfrekvenciát „Pulse oxymeter” és Po-ne-mah adatkezelő programcsomag alkalmazásával követtük (Ponemah Physiology Platform, Gould Instrument Systems Inc.).
A hasüregbe hatoló ventrális metszést ejtettünk a középvonalban. A bevágás körülbelül 5 cm hosszú volt, a szeméremcsont felett. A zsírt és izmokat tompán szétválasztottuk, hogy szabaddá tegyük testüregben lefelé futó hypogasztrikus ideget. Lényeges volt, hogy közel maradjunk a szeméremcsont görbületéhez, hogy elkerüljük a szeméremcsont alatt futó femorális véna és artéria megsértését. Az ülőideg és medenceideg (n pelvicus) mélyebben fekszenek, és további feltárást követően válnak láthatóvá a nyulak háti oldalán. Miután az ülőideget azonosítottuk, a medenceideg könnyen lokalizálható. A medenceideg kifejezést tágabb értelemben használjuk; az anatómiakönyvek nem adnak elég részletes
111 útmutatást annak meghatározására. Az ideg stimulálása azonban növeli intrakavemozus nyomást és kavemozus véráramlást és a medencerégió stimulálását. A medenceideget izoláltuk a környező szövetektől, és Harvard bipoláris stimulátor elektródával vettük körül. Az ideget kissé kiemeltük, hogy bizonyos mértékben megfeszítsük, majd az elektródát rögzítettük. Körülbelül 1 ml paraffinolajat tettünk az idegre és az elektródára. Ez az ideget védő síkosítóként hat, és magakadályozza az elektród kontaminálódását vérrel. Az elektródot „Grass S88” Stimulator” készülékhez csatlakoztattuk. A medenceideget a következő paraméterek alkalmazása mellett stimuláltuk: -5V, pulzusszélesség: 0,5 ms; stimulus időtartama: 20 másodperc, frekvenciája: 16 Hz. Amikor az ideget 15-20 percenként stimuláltuk, a válasz reprodukálható volt. Több stimulációt végeztünk a fenti paraméterek mellett, az átlagos kontrollválasz meghatározására. A tesztelendő hatóanyagot (hatóanyagokat) a nyaki vénán keresztül infundáltuk egy „Harvard 22” típusú infúziós pumpa alkalmazásával, amely lehetővé tette, hogy folyamatos, 15 perces stimulációs ciklusokat idézzünk elő. A hímvessző körüli bőrt és kötőszövetet eltávolítottuk, hogy a hímvesszőt szabaddá tegyük. A „tunica albugineán” keresztül katétereket vezettünk a bal oldali barlangos test üregrendszerébe, majd a tüt eltávolítottuk, és a rugalmas katétert bent hagytuk. A katétert nyomásátalakítón (Ohmeda 52990-04) keresztül Gould-rendszerhez kapcsoltuk, hogy az intrakavemozus nyomást regisztrálhassuk. Miután az intrakavemozus nyomás mérését lehetővé tettük, a katétert Vetbond (3M ragtapasz) alkalmazásával rögzítettük. A szívfrekvenciát a „Pulse oxyeter” és Po-ne-mah adatkezelő programcsomag alkalmazásával követtük (Ponemah Physiology Platform, Gould Instrument Systems Inc.).
Az intrakavemozus véráramlást vagy közvetlenül, a Flowmeter adatai alapján, Po-nemah adatkezelő programcsomag (Ponemah Physiology Platform, Gould Instrument Systems Inc.) alkalmazásával, számokként, vagy közvetett módon, a Gould-rendszer által rögzített görbeként vettünk fel. A kísérlet elején kalibrációt végeztünk (0125 ml/perc/100g szövet). Az NPY-inhibitort fiziológiás sóoldat és 10% 1 mol/1 NaOH elegyében vettük fel; a foszfodiészteráz-5-inhibitort (PDE5) fiziológiás sóoldat és 5% 1 mol/1 HC1 elegyében vettük fel. Az inhibitorokat és vívőanyag-kontrollokat 0,1 ml/másodperc sebességgel infundáltuk. Az NPY-inhibitorokat és a PDEcamp~ inhibitorokat a medenceideg stimulációját megelőzően 15 percig hatni hagytuk.
Valamennyi adatot (átlag +/- az átlagtól való standard eltérés) értékként adtunk meg. Szignifikáns eltéréseket Student-féle t-teszttel igazoltunk.
- 112 -
2.0 Eredmények és összefoglalás
2.1 NPY-receptorantagonisa
Erekció tanulmányozására számos altatott állatmodell ismert, amelyek a fiziológiás hímvessző-merevedést, azaz a fokozott véráramlást és intrakavemozus nyomást utánozzák a hímvesszőben. A szexuális izgatás hatását a hímvesszőt beidegző pelvikus neuronok stimulációjával utánozhatjuk. Ezzel tanulmányozhatók az erekciós mechanizmusok, és potenciális terápiás hatóanyagok hatása MED kezelésében.
Ismert, hogy szelektív PED5-inhibitorok, például a szildenafil, állatmodellekben fokozzák az intrakavemozus nyomás (ICP) idegi úton stimulált emelkedését, és az idegi stimuláció utánozza az emberben végbemenő erekciós folyamatokat [Carter és mtsai.: (1998), Traish és mtsai.: (1999); Omote: (1999); Wallis: (1999)]. Az ICP PDE5-inhibitor által indukált fokozódása a PDE5-inhibitorok hatásmechanizmusára vezethető vissza, és magyarázatul szolgál arra, hogy a szildenafílhoz hasonló hatóanyagok alkalmazásával miként gyözhetők le a MED-del vagy impotenciával kapcsolatos relaxáció-deficienciák. Az említett vizsgálatok eredményeivel összhangban, a csatolt példákban ismertetett kísérletben kimutattuk, hogy szelektív PDE5-inhibitorok, anesztetizált nyulaknak intravénásán adagolva, fokozzák az ICP idegi úton stimulált emelkedését (2. példa).
Az alábbi kísérletekben igazoltuk, hogy NPY-receptorok gátlása anesztetizált nyulakban szelektív NPY Yl-receptorantagonista (BIBP3226) alkalmazásával dózisfüggő módon fokozza az intrakavemozus nyomás idegi úton stimulált emelkedését (1. példa). Az alábbi kísérletben alkalmazott dózisok mellett, az erekciós folyamatok hasonló mértékű stimulációját figyeltük meg NPY-antagonisták alkalmazását követően, mint PDE5inhibitor alkalmazását követően (2. példa). Ezek a vizsgálatok NPY-receptorantagonisták potenciális terápiás klinikai alkalmazhatóságára utalnak erekciós folyamatok fokozására, ezáltal MED-kezelésére.
Az NPY- vagy NPY Y1-receptorok és PDE5-receptorok egyidejű gátlása jelentősen nagyobb mértékben fokozta az ICP-emelkedést, vagy az erekciót, mint ugyanazon PDE5inhibitor ugyanolyan dózisának egymagában történő alkalmazása. Nyúl erekciós modellben kimutathatjuk, hogy az ICP PDE5-gátlás által indukált fokozódása tovább növelhető NPY Yl-receptorantagonista egyidejű adagolásával. PDE5-inhibitor 1 mg/kg (i.v.) dózisban történő beadásával maximális ICP-emelkedést értünk el; igen valószerűtlen, hogy az ICP ezen, a PDE5-inhibitor által közvetített maximális hatáson felül tovább növelhető. Ez azt mutatja, hogy az egymagában alkalmazott PDE5-inhibitorterápiához képest számos előnye lehet a klinikumban PDE5-inhibitor és NPY Yl-receptorantagonista egyidejű be
- 113 adásának. Ilyen előnyök a fokozott hatásosság, és PDE5-inhibitorterápiára nem-reagáló MED-altípusok kezelésének lehetősége.
NPY Yl-receptorantagonisták és PDE5-inhibitor vagy azok kombinációjának alkalmazása nem fejt ki jelentős hatást nem-stimulált ICP-re, azaz, azok szexuális késztetés/izgatás hiányában nem fokozzák közvetlenül az ICP-t. Ez igen előnyös, mivel az egyetlen kereskedelemben hozzáférhető, hatásához szexuális stimulációt igénylő terápia MED kezelésére a szildenafil, a találmány használható alternatívát kínál az orális szildenafilterápiához és egyéb PDE5-alapú drogok önmagában történő alkalmazásához képest.
NPYi - kísérletek állatmodellben
Az 1-6. példákban ismerteit kísérletekben a következő általános képletű hatóanyagot alkalmaztuk:
NPY-receptorantagonista: BIBP 3226
NPY Yl-antagonista
Htr ,N
Hozzáférhető: Thomae GmbH (korábban Boehringer Ingelheim Pharma KG);
BIBP-3226;
leírását lásd a WO-09417035 számú nemzetközi közzétételi iratban.
A BIBP-3226 ICso-értéke humán natív NPY Yl-el szemben 7 nmol/1, szelektivitása NPY Y1-receptorra (humán) NPY Y5-receptorhoz képest nagyobb, mint 1000; és NPY Y1-szelektivitása NPY Y2-vel szemben (humán) nagyobb, mint 1000 [lásd Rudolf és mtsai.: (1994); Jacques és mtsai.: (1995)].
PDE5i: 3-etil-5-{5-[4-etilpiperzino)szulfonil-2-propoxifenil}-2-(2-piridilmetil)-6,7dihidro-2H-pirazolo[4,3-d]pirimidin-7-on, más néven 3-etil-5-[5-(4-etilpiperazin-l-ilszulfonil)-2-n-propoxifenil]-2-(piridin-2-il)metil-2,6-dihidro-7H-pirazolo[4,3,-d)pirimidin7-on (lásd a WO 98/491066 számú nemzetközi közzétételi iratot). ICso-értéke humán natív PDE5-receptorral szemben =1,1 nmol/1; szelektivitása PDE5-receptorra PDE3-receptorhoz viszonyítva (mindkettő natív, humán) nagyobb, mint 90 000; szelektivitása PDE4receptorhoz képest nagyobb, mint 18 545.
- 114 Valamennyi hatásossági és szelektivitási értéket a humán, natív enzimre vonatkoztatva adtunk meg (lásd az alábbi vizsgálatokat).
1. példa
NPY Y1-receptorok gátlása dózisfiiggő módon fokozza az intrakavemozus nyomás idegi úton stimulált emelkedését anesztetizált nyúl erekciós modellben
Idegi stimulációval indukált szubmaximális intrakavemozus nyomásemelkedés (ICPemelkedés) szignifikáns módon fokozódott szelektív NPY Yl-receptorantagonista (BIBP 3226) növekvő dózisának (intravénás bousinjekció) jelenlétében. A hatás szignifikánssá vált 30 pg/kg dózisnál és afelett. A maximális hatást (körülbelül 127%) 30 pg/kg dózissal értük el. Az adatokat a növekedés százalékában adtuk meg (%) a kontroliban megfigyelt emelkedéshez képest. Valamennyi adatot (átlag +/- az átlagtól való standard eltérés) értékként adtunk meg. *P<0,05, egytényezős Student-teszt szerint, a kontroliokban megfigyelhető növekedéshez képest (lásd 1. ábra).
Az NPY Yl-receptor-antagonizmusnak nem volt jelentős hatása a bazális / nemstimulált intrakavemozus nyomásra.
2. példa
A PDE5-gátlás szignifikáns mértékben növeli a PDE5-inhibitor hímvesszőerekciót fokozó hatásosságát anesztetizált nyúl erekciós modellben
Szelektív PDE5-inhibitor intravénás beadása (1 mg/kg) szignifikáns mértékben, 133+/-22%-kal növeli az ICP idegi úton stimulált emelkedését a kontroliokban megfigyelhető ICP-emelkedéshez képest. Valamennyi adatot (átlag +/- az átlagtól való standard eltérés) értékként adtunk meg. *P<0,01, egytényezős Student-féle t-teszt szerint, a kontrollokban megfigyelhető növekedéshez képest (lásd 2. ábra).
Az PDE5-antagonizmusnak nem volt hatása a bazális / nem-stimulált intrakavemozus nyomásra.
3. példa
Az intrakavemozus nyomást fokozó hatóanyagok hatása az átlagos artériás vérnyomásra anesztetizált nyulakban
Férfiak szexuális funkciózavarának, közelebbről MED kezelésére alkalmas új terápiás eljárások kutatásában fontos szempont, hogy ne lépjenek fel káros szív-érrendszeri mellékhatások, például a vérnyomást vagy szívfrekvenciát befolyásoló hatások. Vizsgálatainkban kimutattuk, hogy a BIBP 3226 elnevezésű NPY Yl-receptorantagonista (0,030,3 mg/kg dózisban) nem befolyásolja jelentős mértékben a vérnyomást vagy szívfrekven
- 115 ciát, ahol az alkalmazott dózis hasonló volt a pelvikus ideg közvetítésével stimulált intrakavemozus nyomásemelkedést fokozó dózisokhoz.
A BIBP 3226 (egy szelektív NPY Yl-antagonista) intravénás adagolása nem befolyásolja jelentős mértékben az artériás vérnyomást a hímvessző-merevedés modellezésére alkalmazott anesztetizált nyulakban. A 3. ábrán bemutatott grafikon szerint, a BIBP 3226 altatott nyulakban nincs jelentős hatással az átlagos artériás vérnyomásra olyan dózisok alkalmazása mellett, amelyek elegendőek a pelvikus ideg közvetítésével stimulált intrakavemozus nyomásemelkedés fokozásához. Az átlagos artériás vérnyomás értékeket („mean arterial pressure”·, MAP) (átlag +/- az átlagtól való standard eltérés) értékként adtuk meg. A világosszürke oszlopok a bazális vérnyomást képviselik a hatóanyag beadását megelőzően, a sötét oszlopok pedig a MAP-ot jelentik BIBP 3226 intravénás beadását követően. A világos oszlopok vivőanyagkontrollokat képviselnek. *P<0,05, egytényezős Student-féle t-teszt szerint, a kontroliokban megfigyelhető növekedéshez képest.
4. példa
Az NPY-receptorantagonizmus szignifikáns mértékben növeli a PDE5-inhibitor hímvessző-merevedést fokozó hatásosságát anesztetizált nyúl erekciós modellben
Szelektív PDE5-inhibitor intravénás beadása (1 mg/kg) szignifikáns mértékben, 133%-kal növelte az ICP idegi úton stimulált emelkedését a kontroliokban megfigyelhető ICP-emelkedéshez képest (lásd 2. példa). A BIBP 3226 (egy szelektív NPY Ylantagonista) intravénás adagolása (100pg/kg) szignifikáns mértékben, 110%-kal növelte az ICP idegi úton stimulált emelkedését a kontroliokban megfigyelhető ICP-emelkedéshez képest. Miután az ICP-emelkedést NPY Yl-antagonista alkalmazásával elértük, szelektív PDE5-inhibitor (1 mg/kg) együttes beadásával tovább, 350%-os maximális szintre fokoztuk az idegi úton stimulált ICP-t (10. ábra). A hatás nagyobb annál, amit az NPY Ylantagonista és PDE5-inhibitor együttes adagolásától várnánk (azaz 133% + 110%=243% szemben a valóságban elért 350%-os szinttel). Eredményeinket az ICP százalékban kifejezett növekedésével adtuk meg a kontrollokban tapasztalt növekedéshez viszonyítva.
A PDE5-inhibitor vagy PDE5-inhibitor/NPY Y1-antagonista együttes adagolása nem befolyásolta lényegesen a bazális / nem-stimulált intrakavemozus nyomást.
- 116 -
5. példa
NPY Yl-receptorantagonista alkalmazása fokozza a PDE5-inhibitorok erekciós folyamatokra kifejtett hatását, és gyorsítja a PDE5-gátlás hatásának jelentkezését erekció modellezésére alkalmazott anesztetizált nyulakban
Az első kísérletek arra utalnak, hogy NPY Yl-receptorantagonisták előnyösen fokozzák PDE5-inhibitorok hatását, és gyorsítják a PDE5-gátlás hatásának jelentkezését az anesztetizált erekciós nyúlmodellben.
- 117 HIVATKOZÁSOK • Allen, J. M.; Bloom, S. R.: Neuropeptide Y: a putative neurotransmitter. Neurochem. Int. 8: 1-8,1986.
• Ammar et al (1996), Genomics Dec 15; 38 (3): 392-8.
• Argiolas, A. et a/ (1995), Neuromodulation of penile erection. Prog Neurobiol. 47: 235-255.
• Bahary, N.; Zorich, G.; Pachter, J. E.; Leibei, R. L.; Friedman, J. M.: Molecular genetic linkage maps of mouse chromosomes 4 and 6. Genomics 11: 33 47,1991.
• Baker, E.; Hort, Y. J.; Ball, H.; Sutherland, G. R.; Shine, J.; Herzog, H. : Assignment of the human neuropeptide Y gene to chromosome 7pl5. 1 by nonisotopic in situ hybridization. Genomics 26: 163-164,1995.
• Benet, A. E. et a/ (1994), Male erectile dysfunction assessment and treatment options. Comp. Ther. 20: 669-673.
• Boolel, M. et al (1996). Sildenafil, a novel effective oral therapy for male erectile dysfunction. Br. J. of Urology 78: 257-261.
• Carr, L. G.; Foroud, T.; Bice, P.; Gobbett, T.; Ivashina, J.; Edenberg, H.; Lumeng, L.; Li, T. K.: A quantitative trait locus for alcohol consumption in selectively bred rat lines. Alcohol Clin. Exp. Res. 22: 884-887,1998.
• Carter AJ. et a/ (1998). Effect of the selective phosphodiesterase type 5 inhibitor sildenafil on erectile dysfunction in the anesthetized dog. J. Urol. 160: 242-6.
• Chiou, W. F. et al (1998). Relaxation of corpus cavemosum and raised intracavemous pressure by berberine in rabbit. Br. J. Pharmacol. 125: 1677-1684.
• Dockray, G. J.: Neuropeptide Y: in search of a function. Neurochem. Int. 8: 9 11,1986.
• Erickson, J. C.; Clegg, K. E.; Palmiter, R. D.: Sensitivity to leptin and susceptibility to seizures of mice lacking neuropeptide Y. Nature 381: 415-421,1996. PubMed ID: 8632796 • Erickson, J. C.; Hollopeter, G.; Palmiter, R. D.: Attenuation of the obesity syndrome of ob/ob mice by the loss of neuropeptide Y. Science 274: 1704-1706,1996.
• Gerald et al 1995, J. Biol Chern, Nov 10; 270 (45); 26758-61.
• Herzog, H.; Baumgartner, M.; Vivero, C.; Selbie, L. A.; Auer, B.; Shine, J.: Genomic organization, localization, and allelic differences in the gene for the human neuropeptide Y Y1 receptor. J. Biol. Chern. 268 : 6703-6707, 1993.
- 118 - • Herzog, H.; Darby, K.; Ball, Η. ; Hort, Y.; Beck-Sickinger, A.; Shine, J.: Overlapping gene structure of the human neuropeptide Y receptor subtypes Y1 and Y5 suggests coordinate transcriptional regulation. Genomics 41 : 315-319,1997.
• Herzog, H.; Hort, Y. J. ; Ball, H. J.; Hayes, G.; Shine, J.; Selbie, L. A.: Cloned human neuropeptide Y receptor couples to two different second messenger systems. Proc. Nat. Acad. Sci. 89: 5794-5798,1992.
• Jacques et al (1995) European Journal of Pharmacology 278,1; R3-R5.
• Jeremy, J. Y. et al (1997). Effects of sildenafil, a type-5 cGMP phosphodiesterase inhibitor, and papaverine on cyclic GMP and cyclic AMP levels in the rabbit corpus cavemosum in vitro. Br. J. Urology 79: 958-963.
• Karvonen, Μ. K.; Pesonen, U.; Koulu, M.; Niskanen, L.; Laakso, M.; Rissanen, A.; Dekker, J. M. ;'t Hart, L. M.; Valve, R.; Uusitupa, Μ. I. : Association of a leucine (7)to-proline (7) polymorphism in the signal peptide of neuropeptide Y with high serum cholesterol and LDL cholesterol levels. Nature Med. 4: 1434-1437,1998.
• Larhammar, D.; Blomqvist, A. G.; Yee, F.; Jazin, E.; Yoo, H.; Wahlestedt, C.: Cloning and functional expression of a human neuropeptide Y/peptide ΥΎ receptor of the Y1 type. J. Biol. Chem. 267: 10935-10938,1992.
• Lutz, C. M.; Frankel, W. N.; Richards, J. E.; Thompson, D. A.: Neuropeptide Y receptor genes on human chromosome 4q31-q32 map to conserved linkage groups on mouse chromosomes 3 and 8. Genomics 41: 498-500, 1997.
• Lerner, S. E. et a/ (1993). A review of erectile dysfunction: new insights and more questions. J. Urology 149 : 1246-1255.
• Maccarrone, C. ; Jarrott, B.: Neuropeptide Y: a putative neurotransmitter. Neurochem. Int. 8: 13-22, 1986.
• Meisler, Μ. H.; Spence, J. E.; Dixon, J. E.; Caldwell, R. M.; Minth, C. D.; Beaudet, A. L.: Exclusion of close linkage between the loci for cystic fibrosis and neuropeptide Y on human chromosome 7. Cytogenet. Cell Genet. 44: 175-176,1987.
• Melman, A. & Gingelf, J. C. (1999). The epidemiology and pathophysiology of erectile dysfunction. J. Urology 161 : 5-11.
• Minth, C. D.; Andrews, P. C.; Dixon, J. E.: Characterization, sequence, and expression of the cloned human neuropeptide Y gene. J. Biol. Chem. 261: 11974-11979, 1986.
- 119 - • Minth, C. D.; Bloom, S. R.; Polak, J. M.; Dixon, J. E.: Cloning, characterization, and DNA sequence of a human cDNA encoding neuropeptide tyrosine. Proc. Nat. Acad. Sci. 81: 4577-4581,1984.
• Montague, D. et al (1996). Clinical guidelines panel on erectile dysfunction: Summary report on the treatment of organic erectile dysfunction. J. Urology 156 : 2007-2011.
• Naylor, A. M. (1998). Endogenous neurotransmitters mediating penile erection. Br. J. Urology 81: 424-431. NIH Consensus Development Panel on Impotence (1993).
• NIH Consensus Conference Impotence. J. A. M. A. 270: 83.
• Omote M. (1999). Pharmacological profiles of sildenafil (VIAGRA) in the treatment of erectile dysfunction: efficacy and drug interaction with nitrate.
• Nippon Yakurigaku Zasshi. 114: 213-8.
• Rose et al (1995) J. Biol Chern, Sep 29; 270 (39); 22661-4.
• Rudolf et a/ (1994) European Journal of Pharmacology 271,2-3; RI 1-R13.
• Takeuchi, T.; Gumucio, D.; Eddy, R.; Meisler, M.; Minth, C.; Dixon, J.; Yamada, T.; Shows, T.: Assignment of the related pancreatic polypeptide (PPY) and neuropeptide Y (NPY) genes to regions on human chromosomes 17 and 7. (Abstract) Cytogenet. Cell Genet. 40: 759 only, 1985.
• Takeuchi, T.; Gumucio, D. L. ; Yamada, T.; Meisler, Μ. H.; Minth, C. D.; Dixon, J. E.; Eddy, R. E.; Shows, T. B.: Genes encoding pancreatic polypeptide and neuropeptide Y are on human chromosomes 17 and 7. J. Clin. Invest. 77: 1038-1041,1986.
• Taub, H. C. et a/ (1993). Relationship between contraction and relaxation in human and rabbit corpus cavemosum. Urology42 : 698-704.
• Terenghi, G.; Polak, J. M.; Hamid, Q.; O'Brien, E.; Denny, P.; Legon, S.; Dixon, J.; Minth, C. D.; Palay, S. L.; Yasargil, G.; Chan-Palay, V.: Localization of neuropeptide Y mRNA in neurons of human cerebral cortex by means of in situ hybridization with a complementary RNA probe. Proc. Nat. Acad. Sci. 84 : 7315-7318,1987.
• Thiele, T. E.; Marsh, D. J.; Ste. Marie, L.; Bernstein, I. L.; Palmiter, R. D.: Ethanol consumption and resistance are inversely related to neuropeptide Y levels. Nature 396: 366-369,1998.
• Traish AM, et al (1999). Effects of castration and androgen replacement on erectile function in a rabbit model. Endocrinology. 140: 1861-8.
120 - • Uusitupa, Μ. I. J.; Karvonen, Μ. K.; Pesonen, U.; Koulu, M.: Neuropeptide Y: a novel link between the neuroendocrine system and cholesterol metabolism. Ann. Med. 30: 508-510,1998.
Leírásunkban a következő rövidítéseket alkalmaztuk:
cAMP = ciklikus adenozin-3’5’-monofoszfát;
cGMP = ciklikus guanozin-3’5’-monofoszfát;
PDE = foszfodiészteráz;
PDEcgmp = cGMP-hidrolizáló PDE;
PDEi = PDE-inhibitor (más néven LPDE)
PDE5 = foszfodiészteráz-5;
PDE5i = PDE5-inhibitor;
NPY = neuropeptid Y;
NPYi = NPY-inhibitor;
NPY Y1 = neuropeptid Y Y1 receptor;
NPY Yli = neuropeptid Y Y1-inhibitor;
kDa = kilodalton;
bp = bázispár;
kb = kilobázispár.

Claims (41)

  1. - 121
    SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Neuropeptidáz Y (NPY) inhibitor alkalmazása, amely inhibitor hím genitáliákkal asszociált NPY-receptorokra szelektív hatású, hím erekciós funkciózavarok (MED) kezelésére vagy megelőzésére alkalmas gyógyszer előállítására.
  2. 2. Neuropeptidáz Y Y1 (NPY Yl) inhibitor alkalmazása, amely inhibitor hím genitáliákkal asszociált NPY-receptorokra szelektív hatású, férfiak erekciós funkciózavarának (férfiak merevedési zavarának; MED) kezelésére vagy megelőzésére alkalmas gyógyszer előállítására.
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az inhibitor nagymértékben szelektív hím genitáliákban található NPY/NPY Yl-receptorokra.
  4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az inhibitor egyáltalán vagy lényegében nem fejti ki aktivitást NÉP endopeptidáz és/vagy angiotenzin-konvertáló enzimekre.
  5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a kezelés vagy megelőzés MED szelektív.
  6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az intrakavemozus nyomás emelkedése figyelhető meg.
  7. 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az inhibitort szájon át beadható gyógyszer előállítására alkalmazzák
  8. 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az inhibitor nagymértékben szelektív a barlangos testtel asszociált NPY- és/vagy NPY Yl-receptorokra.
  9. 9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az NPY- és/vagy NPY Yl-inhibitort szexuális izgatás előtt és/vagy annak során alkalmazzák.
  10. 10. NPY-inhibitor alkalmazása szexuális izgalmi állapotban az intrakavemozus nyomás szelektív emelésére alkalmas gyógyszer előállítására.
  11. 11. A 10. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az NPY inhibitor NPY Yl inhibitor.
  12. 12. Gyógyászati készítmény férfiak erekciós funkciózavarának (MED) kezelésére, amely hím genitáliákkal asszociált NPY-receptorokra szelektív neuropeptid Y (NPY) inhibitort tartalmaz, adott esetben gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal, hígítóanyaggal vagy kötőanyaggal elegyítve.
  13. 13. A 10. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amely NPY Yl-inhibitort tar- talmaz.
    - 122 -
  14. 14. Vizsgálati eljárás MED kezelésére alkalmas hatóanyag azonosítására, azzal jellemezve, hogy meghatározzuk, hogy a teszthatóanyag - amely NPYi -, képes-e az endogén erekciós folyamat közvetlen úton történő fokozására - ahol a fokozódást az intrakavemozus nyomás (és/vagy kavemozus véráramlás) fokozódása jelzi a teszthatóanyag jelenlétében; és a teszthatóanyag jelenlétében megfigyelt fokozódást úgy tekintjük, hogy a teszthatóanyag alkalmas MED kezelésére.
  15. 15. A 14. igénypont szerinti vizsgálati eljárás, azzal jellemezve, hogy teszthatóanyagként NPY Yli-t alkalmazunk.
  16. 16. A 14. vagy 15. igénypont szerinti vizsgálati eljárás, azzal jellemezve, hogy teszthatóanyagként a genitáliákkal asszociált NPY- vagy NPY Y1-receptorokat szelektív módon gátló hatóanyagot alkalmazunk.
  17. 17. Eljárás, azzal jellemezve, hogy:
    (a) a 14-16. igénypontok bármelyike szerinti vizsgálatot végzünk;
    (b) egy vagy több, NPY-t vagy NPY Yl-et gátolni képes hatóanyagot azonosítunk; és (c) az egy vagy több azonosított hatóanyagot megfelelő mennyiségben előállítjuk; ahol a hatóanyag NPYi vagy NPY Yli.
  18. 18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (b) lépésben azonosított egy vagy több hatóanyagot artériás vérnyomásra kifejtett hatásra nézve is teszteljük, és a vérnyomást egyáltalán vagy lényegében nem befolyásoló hatóanyagokat választunk.
  19. 19. Vizsgálati eljárás MED kezelésére vagy megelőzésére alkalmas hatóanyag azonosítására, azzal jellemezve, hogy teszthatóanyagot, amely pepiid (előnyösen fluoreszcensen jelölt peptid) metabolikus úton történő lebomlását gátolni képes egységet tartalmaz, érintkeztetünk normális esetben NPY vagy NPY Y1 által metabolizált peptiddel; és meghatározott idő elteltével (például fluorometriás analízissel) mérjük a megmaradt peptid aktivitását és/vagy szintjét; ahol a peptid szintjének fluoreszcencia alapján mért változása a teszthatóanyag hatásosságára (IC5o), és arra utal, hogy a hatóanyag alkalmazható-e férfiak szexuális funkciózavarának, közelebbről MED kezelésére vagy megelőzésére;
    ahol a teszthatóanyag NPYi vagy NPY Yli.
  20. 20. A 19. igénypont szerint vizsgálati eljárás, azzal jellemezve, hogy teszthatóanyagként NPY Yli-t alkalmazunk.
  21. 21. A 22-23. igénypontok bármelyike szerinti in vitro vizsgálati eljárásban NPY vagy NPY Y1 gátlására képes hatóanyag alkalmazása MED kezelésére alkalmas gyógyszer előállítására.
    - 123 -
  22. 22. A 14-16. vagy 19-20. igénypontok bármelyike szerinti eljárással azonosított hatóanyag.
  23. 23. A 22. igénypont szerinti hatóanyag MED kezelésére vagy megelőzésére.
  24. 24. MED kezelésére alkalmas gyógyszer szájon át történő adagolásra, amely a 22. igénypont szerinti hatóanyagot tartalmaz.
  25. 25. Diagnosztikai eljárás, azzal jellemezve, hogy:
    mintát veszünk hímnemű egyedtől; meghatározzuk, hogy a minta tartalmaz-e valamely entitást - amely közvetlen hatást fejt ki az endogén erekciós folyamatra a hímnemű egyed barlangos testében - férfiak szexuális funkciózavarát, közelebbről MED-et okozni képes mennyiségben; ahol az entitás hatóanyag - amely NPYi vagy NPY Yli - alkalmazásával előnyös hatás elérésére befolyásolható.
  26. 26. Diagnosztikai készítmény vagy reagenskészlet, amely:
    hímnemű egyedtől származó izolált mintában jelenlévő entitás - amely közvetlen hatást fejt ki az endogén erekciós folyamatokra, és hatóanyag - amely NPYi vagy NPY Yli alkalmazásával előnyösen befolyásolható - kimutatására alkalmas eszközöket tartalmaz; ahol az eszközök alkalmasak annak meghatározására, hogy a minta tartalmazza-e, és MED-et okozni képes mennyiségben tartalmazza-e az entitást; vagy a minta MED-et okozni képes mennyiségű-e.
  27. 27. Állatmodell MED kezelésére alkalmas hatóanyag - amely NPYi vagy NPY Yli azonosítására, amely a pelvikus ideg stimulációját követően az intrakavemozus nyomás és/vagy kavemozus véráramlás változásainak mérésére alkalmas eszközzel ellátott, anesztetizált hím állatot tartalmaz.
  28. 28. A 27. igénypont szerinti állatmodell, amely az állatban az artériás vérnyomás meghatározására alkalmas eszközöket is tartalmaz.
  29. 29. Vizsgálati eljárás az endogén erekciós folyamatokat közvetlen módon fokozni képes, MED kezeléséne alkalmas hatóanyag - amely NPYi vagy NPY Yli - azonosítására, azzal jellemezve, hogy: az állatnak a 30. vagy 31. igénypont szerinti hatóanyagot adunk be; és mérjük az endogén erekciós folyamatokban bekövetkező változást; ahol a változást az intrakavemozus nyomás (és/vagy kavemozus véráramlás) teszthatóanyag jelenlétében kimutatható fokozódása jelzi az állatmodellben.
  30. 30. Az 1-10. igénypont bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az MED kezelésén felül kóros italozási és táplálék-felvételi rendellenességek, közelebbről elhízás, anorexia, bulimia és metabolikus rendellenességek kezelésére is alkalmas
    - 124 -
  31. 31. Egy vagy NPYi-t és egy vagy több alább felsorolt további aktív összetevőt tartalmazó kombináció alkalmazása MED kezelésére vagy megelőzésére alkalmas gyógyszer készítésére/előállítására:
    (i) természetben előforduló vagy szintetikus prosztaglandinok vagy azok észterei;
    (ii) α-adrenerg receptor antagonista vegyületek;
    (iii) NO-donor (NO-agonista) vegyületek;
    (iv) káliumcsatoma-megnyitók vagy szabályozók;
    (v) dopaminerg hatóanyagok, előnyösen apomorfm vagy szelektív D2-, D3- vagy D2/D3-agonista;
    (vi) vazodilatátor (értágító) hatóanyagok;
    (vii) tromboxán-A2-agonisták;
    (viii) CNS (központi idegrendszeri hatású) aktív hatóanyagok;
    (ix) ergot alkaloidák;
    (x) natriuretikus faktorok, közelebbről atriális natriuretikus faktorok (más néven atriális natriuretikus peptid), B- és C-típusú natriuretikus faktorok, például neutrális endopeptidáz inhibitorok, (xi) angiotenzinreceptor-gátlók, például losatran;
    (xii) NO-szintetáz szubsztrátok, például L-arginin;
    (xiii) kalciumcsatoma-blokkolók, például amlodipine;
    (xiv) endotelinreceptor-antagonisták vagy endotelinkonvertáló enzim gátlók;
    (xv) koleszterinszint-csökkentő hatóanyagok, például sztatinok (például atrovastatin/Lipitor ™) és fibrátok, (xvi) vérlemezketapadást gátló és antitrombotikus hatóanyagok, például tPA, uPA, warfarin, hirudin, és egyéb trombingátlók, heparin, tromboplasztin—aktiváló faktor gátlók;
    (xvii) inzulinszenzitizáló hatóanyagok, például rezulin és hipoglikémiás ágens, például glipizide;
    (xviii) L-DOPA vagy karbidopa;
    (xix) acetilkolineszteráz inhibitorok, például donezipil;
    (xx) szteroid vagy nem-szteroid gyulladásgátlók;
    (xxi) ösztrogénreceptor-szabályozók és/vagy ösztrogénagonisták és/vagy ösztrogénantagonisták;
    (xxii) PDE-inhibitorok, közelebbről PDE2-, 3-, 4-,5-, 7-, vagy 8-inhibitorok, előnyösen PDE2- vagy PDE5-inhibitor, legelőnyösebben PDE5-inhibitor;
    (xxiii) NEP-inhibitor;
    - 125 - (xxiv) vazoaktív intesztinális protein (VIP), VIP-mimetikumok, VIP-analógok, közelebbről egy vagy több alábbi VIP-receptoraltípus közvetítetésével ható VIP analóg: VPAC1, VPAC vagy PACAP (hipofízis adenilát cikláz aktiváló peptid); egy vagy több VIP-receptor-agonista vagy VIP-analóg vagy VIP-fragmentum; egy vagy több aadenoreceptor-antagonista VIP-pel kombinálva;
    (xxv) melanokortinreceptor-agonista vagy modulátor vagy melanokortin hatását fokozó hatóanyag;
    (xxvi) szerotoninreceptor-agonista, -antagonista vagy modulátor, közelebbről 5HT1A- (például VLM 670) 5HT2A-, 5HT2C-, 5HT3- és/vagy 5HT6-receptor-agonista, antagonista vagy -modulátor, (xxvii) tesztoszteronpótló hatóanyag (például dehidroanroszténdion), tesztoszteron (Tostrelle), dihidrotesztoszteron vagy tesztoszteron-implantátum;
    (xxviii) ösztrogén, ösztrogén és medroxiprogeszteron vagy medroxiprogeszteronacetát (MPA) (például kombinációként); vagy ösztrogén és metil-tesztoszteron hormonpótló terápiás hatóanyag;
    (xxix) noradrenalin-, dopamin- és/vagy szerotonin-transzpoter szabályozó;
    (xxx) purinerg receptoragonista és/vagy modulátor;
    (xxxi) neurokinin (NK) receptorantagonista;
    (xxxii) opioid-receptoragonista, -antagonista vagy -modulátor, előnyösen ORL-1receptoragonista;
    (xxxiii) oxitocin-Zvazopresszinreceptor-agonista vagy -modulátor, előnyösen szelektív oxitocinagonista vagy -modulátor;
    (xxxiv) kannabinoidreceptor-modulátorok;
    bombezinreceptor-antagonisták, közelebbről bombezin-BBl, BB2- vagy BB3receptorantagonisták, előnyösen bombezin-BBl-inhibitor;
    (xxxvi) SEP-inhibitorok; és/vagy (xxxvii) valamely egyed genitáliáiban található, közbülső, feszültségfuggő kalciumaktivált káliumcsatoma aktivitásának szabályozására képes hatóanyagok.
  32. 32. Egy vagy több NPYi-t és egy vagy több PDEi-t tartalmazó kombináció alkalmazása MED kezelésére vagy megelőzésére alkalmas gyógyszer készítésére/előállítására.
  33. 33. A 32. igénypont szerinti alkalmazás, ahol NPYi-ként NPY Yli-t alkalmazunk.
  34. 34. A 32. vagy 33. igénypont szerinti alkalmazás, ahol PDEi-ként PDE5i-t alkalma- zunk.
    - 126 -
  35. 35. A 32-34. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer szájon át beadható.
  36. 36. Gyógyászati készítmény, amely egy vagy több NPYi-t és egy vagy több PDEi-t tartalmaz, adott esetben gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal, hígítóanyaggal vagy kötőanyaggal elegyítve.
  37. 37. A 36. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amely NPYi-ként NPY Yli-t tartalmaz.
  38. 38. A 36. vagy 37. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amely NPY Yli-ként genitáliákkal asszociált NPY Y1-receptorra szelektív NPY Yli-t tartalmaz.
  39. 39. A 36. vagy 38. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amely PDEi-ként PDE5i-t tartalmaz.
  40. 40. A 36-39. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati készítmény, amely szájon át adagolható.
  41. 41. A 36-40. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati készítmény alkalmazása MED kezelésére vagy megelőzésére alkalmas gyógyszer előállítására.
    A meghatalmazott: DANUBIA
    Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft.
    Dr./Svingor Adám szabadalmi ügyvivő •íO uw
HU0400528A 2000-12-15 2001-12-10 Neuropeptidáz Y inhibitor alkalmazása férfiak szexuális funkciózavarának kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására HUP0400528A2 (hu)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0030647A GB0030647D0 (en) 2000-12-15 2000-12-15 Treatment of male sexual dysfunction
GB0108730A GB0108730D0 (en) 2001-04-06 2001-04-06 Treatment of male sexual dysfunction
GB0109910A GB0109910D0 (en) 2001-04-23 2001-04-23 Treatment of sexual dysfunction
GB0111037A GB0111037D0 (en) 2001-05-04 2001-05-04 Treatment of sexual dysfunction
US09/895,367 US20020028799A1 (en) 2000-07-06 2001-06-29 Treatment of male sexual dysfunction
US09/905,846 US6878529B2 (en) 2000-07-14 2001-07-13 Compounds for the treatment of sexual dysfunction
GB0120679A GB0120679D0 (en) 2001-08-24 2001-08-24 Treatment of male sexual dysfunction
PCT/IB2001/002399 WO2002047670A1 (en) 2000-12-15 2001-12-10 Treatment of male sexual dysfunction

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HUP0400528A2 true HUP0400528A2 (hu) 2004-06-28

Family

ID=27562581

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0400528A HUP0400528A2 (hu) 2000-12-15 2001-12-10 Neuropeptidáz Y inhibitor alkalmazása férfiak szexuális funkciózavarának kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására

Country Status (9)

Country Link
EP (1) EP1347750A1 (hu)
JP (1) JP2004522720A (hu)
CN (1) CN1496254A (hu)
AU (1) AU2002220977A1 (hu)
CA (1) CA2431747A1 (hu)
HU (1) HUP0400528A2 (hu)
IL (1) IL155775A0 (hu)
NZ (1) NZ526925A (hu)
WO (1) WO2002047670A1 (hu)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1250717C (zh) 1999-11-19 2006-04-12 索尔瓦药物有限公司 金属蛋白酶家族中的人酶
CA2462200A1 (en) 2001-08-10 2003-02-20 Palatin Technologies, Inc. Peptidomimetics of biologically active metallopeptides
US7456184B2 (en) 2003-05-01 2008-11-25 Palatin Technologies Inc. Melanocortin receptor-specific compounds
US7354923B2 (en) 2001-08-10 2008-04-08 Palatin Technologies, Inc. Piperazine melanocortin-specific compounds
WO2005000217A2 (en) * 2003-06-06 2005-01-06 Merck & Co., Inc. Combination therapy for the treatment of dyslipidemia
EP1925307A1 (en) * 2006-11-03 2008-05-28 Emotional Brain B.V. Use of 3-alpha-androstanediol in the treatment of sexual dysfunction
WO2009052376A1 (en) 2007-10-18 2009-04-23 Musc Foundation For Research Development Methods for the diagnosis of genitourinary cancer
DE102009018668A1 (de) 2009-04-23 2010-11-25 Igor Lier Faltbare Duschkabine
DK3326615T3 (da) * 2010-11-15 2020-03-09 Neuroderm Ltd Kontinuerlig indgivelse af l-dopa-, dopa- decarboxylase-inhibitorer, catechol-o-methyltransferaseinhibitorer og sammensætninger til samme
CN111840508A (zh) * 2020-07-17 2020-10-30 北京清大赛尔生物科技有限公司 一种预防及治疗男性性功能障碍的外用制剂及其应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998052890A1 (en) * 1997-05-21 1998-11-26 Eli Lilly And Company 3-arylpropylamino neuropeptide y receptor antagonists
IL139456A0 (en) * 1999-11-08 2001-11-25 Pfizer Compounds for the treatment of female sexual dysfunction
EP1268449A4 (en) * 2000-03-23 2004-09-15 Merck & Co Inc SUBSTITUTED PIPERIDINE AS MELANOCORTIN RECEPTOR AGONISTS
US6444675B2 (en) * 2000-05-10 2002-09-03 Bristol-Myers Squibb Company 4-alkyl and 4-cycloalkyl derivatives of dihydropyridine NPY antagonists
US6479482B2 (en) * 2000-05-10 2002-11-12 Bristol-Myers Squibb Company Alkylamine derivatives of dihydropyridine NPY antagonists
US6432960B2 (en) * 2000-05-10 2002-08-13 Bristol-Myers Squibb Company Squarate derivatives of dihydropyridine NPY antagonists

Also Published As

Publication number Publication date
IL155775A0 (en) 2003-12-23
EP1347750A1 (en) 2003-10-01
CA2431747A1 (en) 2002-06-20
WO2002047670A1 (en) 2002-06-20
JP2004522720A (ja) 2004-07-29
CN1496254A (zh) 2004-05-12
NZ526925A (en) 2005-03-24
AU2002220977A1 (en) 2002-06-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20030119714A1 (en) Treatment of male sexual dysfunction
SK16722000A3 (sk) Zlúčeniny na liečenie sexuálnej dysfunkcie u žien
KR20030016376A (ko) 남성 성기능 장애의 치료
JP2008266338A (ja) 性機能障害を治療するための選択的ドーパミンｄ３受容体アゴニスト
HUP0400528A2 (hu) Neuropeptidáz Y inhibitor alkalmazása férfiak szexuális funkciózavarának kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására
US20150072995A1 (en) Treatment of male sexual dysfunction
KR100829262B1 (ko) 수컷의 성 기능 부전을 치료하는 방법
JP2004517046A (ja) 医薬
US20050020547A1 (en) Compounds for the treatment of female sexual dysfunction
ZA200304460B (en) Treatment of male sexual dysfunction.
KR20030061441A (ko) 남성 성기능 장애의 치료
US20040185094A1 (en) Pharmaceutical
AU2003201471A1 (en) Treatment of male sexual dysfunction
HK1073109B (en) Pharmaceutical composition for treatment of male sexual dysfunction

Legal Events

Date Code Title Description
FD9A Lapse of provisional protection due to non-payment of fees