SK16692000A3

SK16692000A3 - Spôsob fermentačnej výroby l-lyzínu použitím koryneformných baktérií

Info

Publication number: SK16692000A3
Application number: SK1669-2000A
Authority: SK
Inventors: Bettina M�Ckel; Walter Pfefferle; Sven Brand; Alfred Phler; Jrn Kalinowski; Brigitte Bathe
Original assignee: Degussa-h�ls aktiengesellschaft
Priority date: 1999-11-09
Filing date: 2000-11-03
Publication date: 2001-12-03
Also published as: HU0004414D0; ID28193A; KR20010051533A; AU7143000A; DE19953809A1; ZA200006442B; PL343780A1; MXPA00010779A; HUP0004414A2; JP2001178481A; US20030087400A1; CN1295131A; BR0005307A; EP1104810A1; CA2323149A1

Description

Oblasť techniky

Predmetom vynálezu je spôsob fermentačnej výroby L-aminokyselín, najmä L-lyzínu, použitím koryneformných baktérií, v ktorých sa zoslabuje gén cspl.

Doterajší stav techniky

L-Aminokyseliny, najmä L-lyzín, sa používajú vo výžive zvierat, v humánnej medicíne a vo farmaceutickom priemysle.

Je známe, že tieto aminokyseliny sa vyrábajú fermentáciou kmeňov koryneformných baktérií, najmä Corynebacterium glutamicum. Kvôli veľkému významu sa stále pracuje na zlepšení spôsobov výroby. Zlepšenia spôsobov sa môžu týkať fermentačno-technologických opatrení, ako napríklad miešania a zásobovania kyslíkom alebo zloženia živných médií, ako napríklad koncentrácie cukru počas fermentácie, alebo spracovania na produktovú formu, napríklad ionexovou chromatografiou, alebo vlastných úžitkových vlastností samotného mikroorganizmu.

Na zlepšenie úžitkových vlastností týchto mikroorganizmov sa používajú metódy mutagenézy, selekcie a voľby mutantov. Týmto spôsobom sa získajú kmene, ktoré sú rezistentné voči antimetabolitom, ako je napríklad analóg lyzinu S—(2— -aminoetyl)cysteín, alebo sú auxotrofné vzhladom na regulačné významné metabolity a produkujú L-aminokyseliny.

·· ···· • · • ··· ·· ·· • · · · · • · t

Už niekoľko rokov sa taktiež používajú metódy technológie rekombinantných DNA na kmeňové zlepšenie kmeňov Corynebacterium glutamicum produkujúcich L-aminokyselinu tak, že jednotlivé gény pre biosyntézu aminokyseliny sa amplifikujú a skúma sa účinok na produkciu L-aminokyseliny. Prehľadný článok k tomu sa nachádza medzi iným v Kinoshita („Glutamic Acid Bacteria, in: Biology of Industrial Microorganisms, Demain and Solomon (eds.), Benjamín Cummings, Londýn, Veľká Británia, 1985, 115-142), Hilliger (BioTec 2, 40-44 (1991)), Eggeling (Amino Acids 6, 261-272 (1994)), Jetten a Sinskey (Critical Reviews in Biotechnology 15, 73-103 (1995)) a Sahm et al. (Annuals of the New York Academy of Science 782, 25-39 (1996)).

Vynálezcovia si stanovili za úlohu poskytnúť nové základy zlepšených spôsobov fermentačnej výroby L-aminokyselín, najmä L-lyzínu, pomocou koryneformných baktérií.

L-Aminokyseliny, najmä L-lyzín, sa používajú v humánnej medicíne, vo farmaceutickom priemysle, v potravinárskom priemysle a celkom obzvlášť vo výžive zvierat. Existuje preto všeobecný záujem o poskytnutie nových, zlepšených spôsobov výroby aminokyselín, najmä L-lyzínu.

Keď sa v nasledovnom texte uvedie L-lyzín alebo lyzín, mieni sa tým nielen zásada, ale aj soli, ako napríklad lyzín-monohydrochlorid alebo lyzín-sulfát.

Podstata vynálezu

Predmetom tohto vynálezu je spôsob fermentačnej výroby L-aminokyselín, najmä L-lyzínu, použitím koryneformných baktérií, v ktorých sa zoslabuje, najmä na nízkej úrovni ·· ··· • · • ··· ·· ·· • · · · · • · · • · · · • · · · ···· ···· ·· ··· ·· • · · exprimuje aspoň nukleotidová sekvencia (gén cspl) kódujúca génový produkt Cspl, žiadaný produkt sa koncentruje v médiu alebo v bunkách a izoluje sa L-aminokyselina.

Použité kmene prednostne produkujú L-aminokyseliny, najmä L-lyzín, už pred zoslabením génu cspl.

Prednostné formy uskutočnenia sa nachádzajú v nárokoch.

Pojem „zoslabenie opisuje v tejto súvislosti zníženie alebo elimináciu intracelulárnej aktivity jedného alebo viacerých enzýmov (proteínov) v mikroorganizme, ktoré sú kódované príslušnou DNA (tu génom cspl), tým, že sa napríklad použije slabý promótor alebo gén, poprípade alela, ktorá kóduje príslušný enzým s nízkou aktivitou, poprípade sa inaktivuje príslušný gén alebo enzým (proteín) a tieto opatrenia sa poprípade kombinujú.

Mikroorganizmy, ktoré sú predmetom predloženého vynálezu, môžu produkovať aminokyseliny, najmä lyzin, z glukózy, sacharózy, laktózy, fruktózy, maltózy, melasy, škrobu, celulózy alebo z glycerolu a etanolu. Môže sa jednať o zástupcov koryneformných baktérií, najmä rodu Corynebacterium. Pri rode Corynebacterium treba uviesť najmä druh Corynebacterium glutamicum, ktorý je v odbornom svete známy pre svoju schopnosť produkovať L-aminokyseliny.

Vhodnými kmeňmi rodu Corynebacterium, najmä druhu Corynebacterium glutamicum, sú najmä známe kmene divého typu

Corynebacterium glutamicum ATCC13032,

Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806,

Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, ·· ·· ·· ···· ·· ···· · · · · · · • · · · ··· · · • · · · · · · ··· ···· ·· ··· ·· ·

Corynebacterium melassecola ATCC17965, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, Brevibacterium flavum ATCC14067,

Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 a Brevibacterium divaricatum ATCC14020 a z nich vytvorené mutanty, poprípade kmene, produkujúce L-aminokyseliny, ako napríklad kmene produkujúce L-lyzín

Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709,

Brevibacterium flavum FERM-P 1708,

Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712,

Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463,

Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 a

Corynebacterium glutamicum DSM 5714.

Zistilo sa, že koryneformné baktérie po zoslabení génu cspl zlepšeným produkujú spôsobom L-aminokyseliny, najmä L-lyzín.

Gén cspl kóduje proteín PSI, pre ktorý sa doteraz nemohla dokázať žiadna enzymatická aktivita. Nukleotidovú sekvenciu génu cspl opísal Joliff et al. (Molecular Microbiology 1992 Aug; 6 (16): 2349-62). Je všeobecne dostupná v databanke nukleotidových sekvencii National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA) pod prírastkovým číslom g40486. Gén cspl opísaný v uvedenom texte sa môže použiť podlá vynálezu. Ďalej sa môžu použiť alely génu cspl, ktoré vyplývajú z degenerovatelnosti genetického kódu alebo vznikajú funkčne neutrálnymi mutáciami so zmyslom (sense mutations).

99 ·· ···· · • 9 · 9 ··· · · · • 9 9 · 999 9 · • 9 · 9 · 9 · 9 9 • 9 9 · 9 · · ·99· ···· ·· 9·· 99 9

Na dosiahnutie zoslabenia sa môže zoslabiť alebo vylúčiť buď expresia génu cspl, alebo katalytické vlastnosti génového produku. Poprípade sa obidve tieto opatrenia kombinujú.

Expresia génov sa môže zoslabiť vhodným uskutočnením kultivácie alebo genetickou zmenou (mutáciou) signálnych štruktúr expresie génov. Signálnymi štruktúrami expresie génov sú napríklad represorové gény, aktivátorové gény, operátory, promótory, atenuátory, väzbové miesta pre ribozómy, iniciačný kodón a terminátory. Údaje k tomu nájde odborník napríklad v patentovej prihláške WO 96/15246, v Boyd a Murphy (Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988)), vo Voskuil a Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998), v Jensen a Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191 (1998)), Pátek et al. (Microbiology 142: 1297 (1996)) a v známych učebniciach genetiky a molekulovej biológie, ako napríklad v učebnici od Knippers („Molekulare Genetik, 6. vydanie, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Nemecko, 1995) alebo Winnacker („Gene und Klone, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Nemecko, 1990).

Mutácie, ktoré vedú k zmene, poprípade zoslabeniu katalytických vlastností enzýmových proteínov, sú známe zo stavu techniky; ako príklady sa môžu uviesť práce Qiu a Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760-1762 (1997)) a Môckel („Die Threonindehydratase aus Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen Regulation und Struktur des Enzyms, správa Výskumného centra Jíilich, Jul-2906, ISSN09442952, Julich, Nemecko, 1994). Súborné opisy sa môžu prevziať zo známych učebníc genetiky a molekulovej biológie, ako napríklad

··

Hagemann („Allgemeine Genetik, Gustáv Fischer Verlag,

Stuttgart, 1986).

Ako mutácie prichádzajú do úvahy tranzície, transverzie, inzercie a delécie. V závislosti od účinku zámeny aminokyselín na enzýmovú aktivitu sa hovorí o mutáciách s pozmeneným zmyslom („missense mutations) alebo mutáciách bez zmyslu („nonsense mutations). Inzercie alebo delécie aspoň jedného páru báz v géne vedú k posunovým mutáciám („frame shift mutations), následkom ktorých sa vkladajú nesprávne aminokyseliny alebo sa predčasne prerušuje translácia. Delécie viacerých kodónov vedú typicky k úplnému zlyhaniu enzýmovej aktivity. Návody na vytvorenie takých mutácií patria do stavu techniky a môžu sa nájsť v známych učebniciach genetiky a molekulovej biológie, ako napríklad v učebnici Knippers („Molekulare Genetik, 6. vydanie, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Nemecko, 1995), Winnacker („Gene und Klone, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Nemecko,

1990) alebo Hagemann („Allgemeine Genetik, Gustáv Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).

Príkladom mutovaného génu cspl je alela Acspl nachádzajúca sa v plazmide pK18mobsacB Acspl (obrázok 1). Alela Acspl obsahuje len sekvenciu 5'- alebo 3'-konca génu cspl; 1690 bp dlhý úsek kódujúcej oblasti chýba (delécia). Táto alela Acspl sa môže pomocou integračnej mutagenézy vsunúť do koryneformných baktérií. Na to sa používa vyššie uvedený plazmid pK18mobsacBAcspl, ktorý nie je replikovatelný v C. glutamicum. Po transformácii a homológnej rekombinácii pomocou prvej „cross over udalosti spôsobujúcej integráciu a druhej „cross over udalosti spôsobujúcej excíziu v ·· ·· ·· ···· ·· ···· 9 · · · · · « · · · ··· · · ·* ·* · · · · · ···· ···· ·· 999 99 9 géne cspl sa dosiahne vloženie delécie Acspl a docieli úplná strata funkcie v danom kmeni.

Návody a vysvetlenia k integračnej mutagenéze sa nachádzajú napríklad vo Schwarzer a Piihler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)) alebo Peters-Wendisch.et al. (Microbiology 144, 915-927 (1998)).

Príkladom kmeňa koryneformných baktérií so zoslabeným génom cspl, produkujúceho aminokyselinu, je producent lyzínu Corynebacterium glutamicum R167 Acspl.

Prídavné môže byť pre produkciu aminokyselín, najmä L-lyzínu, výhodné prídavné k zoslabeniu génu cspl zosilniť jeden alebo viac enzýmov danej biosyntetickej dráhy, glykolýzy, anaplerotiky, cyklu kyseliny citrónovej alebo exportu aminokyseliny.

Takto sa na výrobu L-lyzínu napríklad môže zvýšene exprimovať:

• súčasne gén dapA kódujúci dihydrodipikolinátsyntázu (EP-B 0 197 335) a/alebo • súčasne gén gap kódujúci glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázu (Eikmanns (1992). Journal of Bacteriology 174: 6076-6086) alebo *

• súčasne gén pyc kódujúci pyruvátkarboxylázu (Eikmanns (1992). Journal of Bacteriology 174, 6076-6086) alebo • · • · · · • · • · · • · ·· ·· ···· • · • ··· ·· ··· • súčasne gén mqo kódujúci malát-chinónoxidoreduktázu (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395 - 403 (1998)) alebo • súčasne gén lysE kódujúci export lyzinu (DE-A-195 48 222) .

Ďalej môže byť pre produkciu aminokyselín, najmä L-lyzínu, výhodné okrem génu cspl súčasne zoslabiť • gén pck kódujúci fosfoenolpyruvátkarboxykinázu (DE

199 50 409.1, DSM 13047) a/alebo • gén pgi kódujúci glukóza-6-fosfátizomerázu (US

09/396,478, DSM 12969). '

Napokon môže byť pre produkciu aminokyselín, najmä L-lyzínu, výhodné okrem zoslabenia génu cspl vylúčiť nežiaduce vedľajšie reakcie (Nakayama: „Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms, in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, Londýn, Veľká Británia, 1982).

Použité kultivačné médium musí vhodným spôsobom vyhovovať nárokom daných kmeňov. Opisy kultivačných médií rozličných mikroorganizmov sa nachádzajú v príručke „Manual of Methods for General Bacteriology od American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981). Ako zdroje uhlíka sa môžu používať cukry a sacharidy, ako je napríklad glukóza, sacharóza, laktóza, fruktóza, maltóza, melasa, škrob a celulóza; oleje a tuky, ako napríklad sójový olej, slnečnicový olej, podzemnicový olej a kokosový olej; mastné kyseliny, ako je kyselina palmitová, kyselina stearová, kyselina ·· ·· ·· ···· ·· • · 9 · ··· ··· • · · · ··· · · • · · · · ···· • · · · · · · ···· ···· ·· ··· ·· * linolová; alkoholy, ako je napríklad glycerol a etanol; a organické kyseliny, ako je napríklad kyselina octová. Tieto látky sa môžu používať ako jednotlivé zložky alebo ako zmes. Ako zdroje dusíka sa môžu používať organické zlúčeniny obsahujúce dusík, napríklad peptóny, kvasnicový extrakt, mäsový extrakt, sladový extrakt, kukuričný extrakt, sójová múka a močovina, alebo anorganické zlúčeniny, ako je napríklad síran amónny, chlorid amónny, fosforečnan amónny, uhličitan amónny a dusičnan amónny. Zdroje dusíka sa môžu používať jednotlivo alebo ako zmes. Ako zdroje fosforu sa môžu používať kyselina fosforečná, dihydrogenfosforečnan draselný alebo hydrogenfosforečnan draselný alebo príslušné sodné soli. Kultivačné médium musí ďalej obsahovať soli kovov, ako napríklad síran horečnatý alebo síran železa, ktoré sú potrebné na rast. Napokon sa môžu prídavné k vyššie uvedeným látkam používať esenciálne rastové látky, ako sú aminokyseliny a vitamíny. Ku kultivačnému médiu sa môžu okrem toho pridávať vhodné prekurzory. Uvedené vsádzkové suroviny sa môžu ku kultúre pridávať vo forme jednorazovej vsádzky alebo sa môžu vhodným spôsobom pridávať počas kultivácie.

Na kontrolu pH kultúry sa vhodne používajú zásadité zlúčeniny, ako je hydroxid sodný, hydroxid draselný, amoniak, poprípade amoniaková voda, alebo kyslé zlúčeniny, ako je kyselina fosforečná alebo kyselina sírová. Na kontrolu tvorby peny sa môžu používať odReňovadlá, ako napríklad polyglykolestery mastných kyselín. Na udržiavanie stability plazmidov sa môžu k médiu pridávať vhodné selektívne pôsobiace látky, napríklad antibiotiká. Aby sa udržiavali aeróbne podmienky, zavádza sa ku kultúre kyslík alebo zmesi plynov obsahujúce kyslík, napríklad vzduch. Teplota pri kultivácii je zvyčajne približne 20 °C až 45 °C a najmä

«· ·· • · · · β · • · · • · ··· • · · · • · · ·· ··· ·· · približne 25 °C až 40 °C. Kultivácia prebieha tak dlho, kým sa nevytvorí maximum požadovaného produktu. Tento ciel sa zvyčajne dosiahne za 10 hodín až 160 hodín.

Metódy stanovenia L-aminokyselín sú známe zo stavu techniky. Analýza sa môže uskutočňovať anexovou chromatografiou s následnou ninhydrínovou derivatizáciou tak, ako sa opisuje v Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958),

1190), alebo sa môže uskutočňovať pomocou HPLC v obrátenej fáze (reversed phase HPLC), ako sa opisuje v Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174).

Nasledovný mikroorganizmus bol uložený v Nemeckej zbierke mikroorganizmov a bunkových kultúr (DSMZ, Braunschweig, Nemecko) podľa Budapeštianskej zmluvy:

kmeň Escherichia coli Sl7-l/pK18mobsacB Acspl ako DSM 13048.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Predložený vynález sa v nasledovnom texte bližšie vysvetľuje na základe príkladov uskutočnenia.

Príklad 1

Príprava delečného vektora na de-lečnú mutagenézu génu cspl

Z kmeňa ATCC 13032 sa metódou podlá Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)) izolovala chromózomová DNA. Nukleotidová sekvencia génu cspl pre C. glutamicum je dostupná v databanke nukleotidových sekvencii National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, ··

USA) pod prírastkovým číslom g40486. Na základe známej sekvencie sa selektovali nasledovné oligonukleotidy pre polymerázovú reťazovú reakciu:

·· • · · · β · • · • · ·· ···· • · · • · ··· • · · · · • · · • · ··· ·· • · · • · • · • · ·· · cspl-10:

5' GAT CTA G(GA TC)C CGA TGA GCG CGT CCA TGT GT 3 cspl-11:

5' GAT CTA G (GA TC)C TCG ACC TTG CGG TGC TGC TT 3' cspl-del:

5' GGA ATA CGT AGC CAC CTT CGG TCC CGA AAG TTC CCC GCT T 3

Znázornené priméry syntetizovala firma MWG Biotech (Ebersberg, Nemecko) a PCR reakcia sa uskutočnila podía metódy PCR od Karremana (BioTechniques 24:736-742, 1998) s polymerázou Pwo od firmy Boehringer. Priméry cspl-10 a cspl-11 obsahujú vložené štiepne miesto pre reštrikčný enzým BamHI, ktoré je v znázornení uvedené v zátvorke. Pomocou polymerázovej reťazovej reakcie sa amplifikoval a izoloval fragment DNA s veľkosťou približne 0,9 kb, ktorý nesie 1690 bp veľkú deléciu génu cspl.

Amplifikovaný fragment DNA sa štiepil reštrikčným enzýmom BamHI a izoloval z agarózového gélu (0,8%). Aj plazmid pK18mobsacB (Jáger et al., Journal of Bacteriology, 1:784-791 (1992)) sa štiepil reštrikčným enzýmom BamHI. Plazmid pK18mobsacB a fragment PCR sa ligovali. Potom sa kmeň E. coli S17-1 (Šimon et al., 1993, Bio/Technology 1:784-791) elektroporoval s ligačnou zmesou (Hanahan, In:

DNA Cloning. A Practical Approach. zv. I., IRL-Press,

Oxford, Washington DC, USA, 1985). Selekcia buniek nesúcich plazmid sa uskutočnila nanesením transformačnej zmesi na ·· ···· agar LB (Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold ·· ·· • · • ··· ·· ··· ·· • · · • · • · • · ·· ·

Spring Harbor, N.Y., 1989), ktorý bol doplnený 25 mg/1 kanamycínu. Plazmidová DNA sa izolovala z jedného transformantu použitím QIAprep Spin Miniprep Kit od firmy Qiagen a analyzovala reštrikciou reštrikčným enzýmom BamHI a následnou elektroforézou v agarózovom géle (0,8%). Plazmid sa nazval pK18mobsacB Acspl. Kmeň sa označil ako E. coli S17-l/pK18mobsacB Acspl a je uložený v Nemeckej zbierke mikroorganizmov a bunkových kultúr (DSMZ, Braunschweig, Nemecko) pod číslom DSM 13048.

Príklad 2

Delečná mutagenéza génu cspl v· C. glutamicum R167 divého typu

Vektor pK18mobsacBAcspl uvedený v príklade 2 sa elektroporoval do Corynebacterium glutamicum R167 (Liebl et al. (1989) FEMS Microbiological Letters 65:299-304) podľa elektroporačnej metódy od Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters, 123:343-347 (1994)). Pri kmeni R167 sa jedná o reštrikčné deficientný kmeň C. glutamicum divého typu. Vektor pK18mobsacB Acspl sa nemôže samostatne replikovať v C. glutamicum a zachováva sa v bunke len vtedy, ak sa integroval do chromozómu. Selekcia klonov pomocou integrovaného pK18mobsacB Acspl sa uskutočnila nanesením elektroporačnej zmesi na agar LB (Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), ktorý bol doplnený 15 mg/1 kanamycínu. Vyrastené klony sa naniesli na agarové platne LB s 25 mg/1 kanamycínu a inkubovali 16 hodín pri 33 °C. Aby sa dosiahla excízia plazmidu spoločne s úplnou ·· ···· ·· ·· • · · · • · • · · • · · • · ··· • · · · • · · ·· ··· ·· • · · φ · • · • · ·· · chromozómovou kópiou génu cspl, naniesli sa potom klony na agar LB s 10% sacharózy. Plazmid pK18mobsacB obsahuje jednu kópiu génu sacB, ktorý premieňa sacharózu na levansacharózu toxickú pre C. glutamicum. Na agare LB so sacharózou preto rastú len také klony, pri ktorých sa zasa excidoval integrovaný pK18mobsacB Acspl. Pri excí'zii sa môže excidovať spolu s plazmidom buď úplná chromozómová kópia génu cspl, alebo neúplná kópia s internou deléciou. Aby sa dokázalo, že neúplná kópia cspl zostala v chromozóme, označil sa fragment plazmidu pKl8mobsacB Acspl metódou „The DIG System Users Guide for Filter Hybridization od firmy Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Nemecko, 1993) pomocou hybridizačného kitu Dig od firmy Boehringer. Chromozómová DNA potenciálneho delečného mutantu sa izolovala metódou od Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817 - 1828 (1994)) a štiepila reštrikčným enzýmom EcoRI. Vznikajúce’fragmenty sa separovali pomocou elektroforézy v agarózovom géle a hybridizovali pomocou hybridizačného kitu Dig od firmy Boehringer pri 68 ’C. Pri kontrolnom kmeni sa získali dva hybridizačné fragmenty s veľkosťou približne 6500 bp a približne 4000 bp, zatiaľ čo pri mutante sa získali dva hybridizačné fragmenty s veľkosťou približne 6500 bp a približne 3200 bp. Tým sa mohlo ukázať, že kmeň R167 stratil svoju úplnú kópiu génu cspl a namiesto nej má už len neúplnú kópiu s deléciou približne 1690 bp. Kmeň sa označil ako C. glutamicum R167Acspl.

Príklad 3

Príprava lyzinu ·· ·· ···· ··

··

Kmeň C. glutamicum R167Acspl získaný v príklade 2 sa kultivoval v živnom médiu vhodnom na produkciu lyzínu a obsah lyzínu sa stanovoval v kultivačnom supernatante.

Na tento účel sa kmeň na začiatok inkuboval 24 hodín pri 33 °C na agarovej platni. Vychádzajúc z kultúry z tejto agarovej platne sa naočkovala predkultúra (10 ml média v 100 ml Erlenmeyerovej banke). Médiom použitým pre predkultúru bolo úplné médium CglII. Predkultúra sa inkubovala 48 hodín pri 33 °C pri 240 ot./min v pretrepávačke. Touto predkultúrou sa naočkovala hlavná kultúra tak, aby začiatočná optická hustota (660 nm) hlavnej kultúry bola 0,1. Pre hlavnú kultúru sa použilo médium MM.

Médium MM:

CSL (Corn Steep Liquor) 5 g/1

MOPS 20 g/1

Glukóza (oddelene autoklávovaná) 50 g/1

Soli:

(NH₄)₂SO₄ kh₂po₄

MgSO₄.7H₂O CaCl₂.2H₂O FeSO₄.7H₂O MnSO₄.H₂O

Biotín (sterilizovaný filtráciou) Tiamín.HCl (sterilizovaný filtráciou) CaCO₃ g/1 0,1 g/1 1,0 g/1 10 mg/1 10 mg/1 5,0 mg/1 0,3 mg/1 0,2 mg/1 25 g/1

CSL, MOPS a roztok solí sa roztokom amoniaku nastavili na pH 7 a autoklávovali. Potom sa pridali sterilné roztoky substrátu a vitamínov, ako aj za sucha autoklávovaný CaCO₃.

Kultivácia sa uskutočňovala v 10 ml objemoch v 100 ml » Erlenmeyerovej banke s priehradkami. Kultivácia sa uskutočňovala pri 33 °C a 80% vlhkosti vzduchu.

Po 48 hodinách sa určila optická hustota (OD) pri meracej vlnovej dĺžke 660 nm pomocou Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Mníchov). Vytvorené množstvo lyzínu sa stanovilo pomocou analyzátora aminokyselín od firmy EppendorfBioTronik (Hamburg, Nemecko) ionexovou chromatografiou a derivatizáciou na prídavnom stĺpci s ninhydrínovou detekciou.

Výsledok pokusu je uvedený v tabuľke 1.

Tabulka 1

Kmeň	Optická hustota (660 nm)	Lyzín-HCl mg/1
R167	13,8	0,00
R167Acspl	12,6	0,99

·· ·· ·· ···· ·· • · · · · · · • · · ··· · · ···· ···· • · · · · · ··· ·· ··· ·· ·

Prehľad obrázkov na výkresoch

Priložený je nasledovný obrázok:

Obrázok 1: Mapa plazmidu pK18mobsacBAcspl.

Použité skratky a značky majú nasledovný význam. Dĺžkové údaje treba chápať ako približné hodnoty.

sacB: gén sacB oriV: počiatok replikácie V

KmR: rezistencia na kanamycín

BamHI: štiepne miesto pre reštrikčný enzým BamHI cspľ : neúplný fragment génu cspl s internou 1690 bp deléciou

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Spôsob výroby L-aminokyselín, najmä L-lyzínu, vyznačujúci sa tým, že sa uskutočňujú nasledovné kroky:

a) fermentácia baktérií produkujúcich žiadanú

L-aminokyselinu, v ktorých sa zoslabuje aspoň gén cspl,

b) koncentrovanie žiadaného produktu v médiu alebo v bunkách baktérií a

c) izolácia L-aminokyseliny.
2. Spôsob podľa nároku 1,. vyznačujúci sa tým, že sa používajú baktérie, v ktorých sa prídavné zosilňujú ďalšie gény pre biosyntetickú dráhu žiadanej L-aminokyseliny.
3. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa používajú baktérie, v ktorých sú aspoň čiastočne eliminované metabolické dráhy, ktoré znižujú tvorbu žiadanej L-aminokyseliny.
4. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa znižuje expresia polynukleotidu, ktorý kóduje gén cspl. ^h
5. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že sa zoslabujú katalytické vlastnosti polypeptidu (enzýmového proteínu), ktorý kóduje polynukleotid cspl.

·· ·· ·· ···· • · · · · · · • · · · »·· • · · · · · · • · · · · ···· ···· ·· ··· ·· ·
6. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že na dosiahnutie zoslabenia sa používa spôsob integračnej mutagenézy pomocou vektora pK18mobsacBAcspl znázorneného na obrázku 1 a uloženého v E. coli ako DSM , 13048.

» 7. Spôsob podlá nároku 1,vyznačujúci sa tým, že na výrobu L-lyzínu sa fermentujú baktérie, v ktorých sa súčasne zvýšene exprimuje alebo amplifikuje jeden alebo viac génov vybraných zo skupiny zahŕňajúcej
7.1 gén dapA kódujúci dihydrodipikolinátsyntázu,

7.2 fragment DNA sprostredkovávajúci rezistenciu na S-(2-aminoetyl)cysteín,

7.3 gén pyc kódujúci pyruvátkarboxylázu,

7.4 gén dapD kódujúci tetradihydrodipikolinátsukcinylázu,

7.5 gén dapE kódujúci gén pre sukcinyldiaminopimelátdesukcinylázu,

7.6 gén gap kódujúci glyceraldehyd-3-fosfátdehydro► genazu,

7.7 gén mqo kódujúci malát-chinónoxidoreduktázu,

7.8 gén lysE kódujúci export lyzínu.
8. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že sa na výrobu L-lyzínu fermentujú baktérie, v ·· ·· ·· ···· ·· ···· ··· · · · • · · · ··· · · • ···· ···· • · · · · · · ktorých sa súčasne zoslabuje jeden alebo viac génov vybraných zo skupiny zahŕňajúcej

8.1 gén pck kódujúci fosfoenolpyruvátkarboxykinázu,

8.2 gén pgi kódujúci glukóza-6-foSfátizomerázu.
9. Spôsob podía jedného alebo viacerých z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že sa používajú mikroorganizmy rodu Corynebacterium glutamicum.