SK16542001A3 - Spôsob fermentačnej prípravy L-aminokyselín pomocou zosilnenia génu gnd - Google Patents
Spôsob fermentačnej prípravy L-aminokyselín pomocou zosilnenia génu gnd Download PDFInfo
- Publication number
- SK16542001A3 SK16542001A3 SK1654-2001A SK16542001A SK16542001A3 SK 16542001 A3 SK16542001 A3 SK 16542001A3 SK 16542001 A SK16542001 A SK 16542001A SK 16542001 A3 SK16542001 A3 SK 16542001A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- gene
- gene encoding
- bacteria
- lysine
- amino acid
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 30
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims abstract description 8
- 101150014950 gnd gene Proteins 0.000 title claims description 35
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title claims description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title claims description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 49
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims abstract description 33
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims abstract description 19
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 claims abstract description 19
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 9
- 241000186031 Corynebacteriaceae Species 0.000 claims abstract description 8
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 claims abstract description 6
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims abstract description 6
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims abstract description 6
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 108010042687 Pyruvate Oxidase Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 claims abstract description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 29
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 26
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 19
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 18
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 claims description 12
- 101150060030 poxB gene Proteins 0.000 claims description 10
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 claims description 7
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 6
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 6
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 claims description 5
- 102100031126 6-phosphogluconolactonase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 claims description 4
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 4
- 108010064711 Homoserine dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 4
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 claims description 4
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010053763 Pyruvate Carboxylase Proteins 0.000 claims description 4
- 102100039895 Pyruvate carboxylase, mitochondrial Human genes 0.000 claims description 4
- 101150024271 TKT gene Proteins 0.000 claims description 4
- 102000014701 Transketolase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010043652 Transketolase Proteins 0.000 claims description 4
- 101150073818 gap gene Proteins 0.000 claims description 4
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 4
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 4
- 101150096049 pyc gene Proteins 0.000 claims description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 4
- 101150078419 zwf gene Proteins 0.000 claims description 4
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 claims description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 3
- 101150107963 eno gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101150094267 mqo gene Proteins 0.000 claims description 3
- 108091000044 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase Proteins 0.000 claims description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 2
- 108010055400 Aspartate kinase Proteins 0.000 claims description 2
- 102000005731 Glucose-6-phosphate isomerase Human genes 0.000 claims description 2
- 108010070600 Glucose-6-phosphate isomerase Proteins 0.000 claims description 2
- 101710155796 Malate:quinone oxidoreductase Proteins 0.000 claims description 2
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 claims description 2
- 101150011371 dapA gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101150035025 lysC gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101150053253 pgi gene Proteins 0.000 claims description 2
- 229930029653 phosphoenolpyruvate Natural products 0.000 claims description 2
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 claims 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims 1
- 101150044424 lysE gene Proteins 0.000 claims 1
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N phosphoenolpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=C)OP(O)(O)=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 102000004567 6-phosphogluconate dehydrogenase Human genes 0.000 abstract description 8
- 108020001657 6-phosphogluconate dehydrogenase Proteins 0.000 abstract description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract description 8
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 abstract 1
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 31
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 25
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 24
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 15
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 14
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 14
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 14
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 13
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 13
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 13
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 13
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 13
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 13
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 12
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 12
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 12
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 10
- DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 7
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 7
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 7
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 7
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 5
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 5
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 5
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000644323 Escherichia coli C Species 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 4
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 4
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 4
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 4
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 4
- -1 linoleic acid, alcohols Chemical class 0.000 description 4
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 4
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 4
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 4
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 4
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001485655 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Species 0.000 description 3
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 3
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000319304 [Brevibacterium] flavum Species 0.000 description 3
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 3
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 3
- 238000002803 maceration Methods 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 3
- IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N sodium 2-[[2-[[hydroxy-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyphosphoryl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoic acid Chemical compound [Na+].C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NP(O)(=O)OC1OC(C)C(O)C(O)C1O IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 3
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 2
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 2
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 2
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 2
- 235000019728 animal nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150063051 hom gene Proteins 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LGVJIYCMHMKTPB-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxynorvaline Chemical compound CCC(O)C(N)C(O)=O LGVJIYCMHMKTPB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BIRSGZKFKXLSJQ-SQOUGZDYSA-N 6-Phospho-D-gluconate Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O BIRSGZKFKXLSJQ-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001479434 Agfa Species 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 102100039536 Calcium-activated chloride channel regulator 1 Human genes 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010062745 Chloride Channels Proteins 0.000 description 1
- 244000060011 Cocos nucifera Species 0.000 description 1
- 235000013162 Cocos nucifera Nutrition 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241001517047 Corynebacterium acetoacidophilum Species 0.000 description 1
- 241000186145 Corynebacterium ammoniagenes Species 0.000 description 1
- 241000807905 Corynebacterium glutamicum ATCC 14067 Species 0.000 description 1
- 241000337023 Corynebacterium thermoaminogenes Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 108010081616 FAD-dependent malate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 101100462488 Phlebiopsis gigantea p2ox gene Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010019653 Pwo polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 1
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 1
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 150000007514 bases Chemical class 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-M dihydrogenphosphate Chemical compound OP(O)([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000010359 gene isolation Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 239000003630 growth substance Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 239000013586 microbial product Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014593 oils and fats Nutrition 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 238000005895 oxidative decarboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 230000004108 pentose phosphate pathway Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-K phosphonatoenolpyruvate Chemical compound [O-]C(=O)C(=C)OP([O-])([O-])=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001522 polyglycol ester Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 150000003588 threonines Chemical class 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Spôsob fermentačnej prípravy L-aminokyselín pomocou zosilnenia génu,gnd
Oblasť techniky
Vynález sa týka spôsobu fermentačnej prípravy L-aminokyselín, najmä L-lyzínu, L-treonínu, L-izoleucínu a L-tryptofánu, použitím koryneformných baktérií, v ktorých sa zosilňuje aspoň gén gnd.
Doterajší stav techniky
L-Aminokyseliny sa používajú vo výžive zvierat, v humánnej medicíne a vo farmaceutickom priemysle.
Je známe, že aminokyseliny sa pripravujú fermentáciou kmeňov koryneformných baktérií, najmä Corynebacterium glutamicum. Kvôli ich veľkému významu sa stále pracuje na zlepšení týchto preparačných spôsobov. Zlepšenia spôsobov sa môžu týkať fermentačno-technologických opatrení, ako napríklad miešania a zásobovania kyslíkom, alebo zloženia živných médií, ako napríklad koncentrácie cukru počas fermentácie, alebo spracovania na produktovú formu, napríklad ionexovou chromatografiou, alebo vlastných produkčných vlastností samotného mikroorganizmu.
Na zlepšenie produkčných vlastností týchto mikroorganizmov sa používajú metódy mutagenézy, selekcie a volby mutantov. Týmto spôsobom sa získavajú kmene, ktoré sú rezistentné voči antimetabolitom, ako je napríklad analóg treonínu kyselina aamino-p-hydroxyvalérová (AHV), alebo sú auxotrofné vzhľadom na regulačné významné metabolity a produkujú L-aminokyseliny, ako napríklad L-treonín.
Už niekolko rokov sa taktiež používajú metódy technológie rekombinantných DNA na zlepšenie kmeňa Corynebacterium glutamicum produkujúceho L-aminokyseliny.
Vynálezcovia si stanovili za úlohu poskytnúť nové zlepšené postupy fermentačnej prípravy L-aminokyselín pomocou koryneformných baktérií.
L-Aminokyseliny sa používajú v humánnej medicíne, vo farmaceutickom priemysle, v potravinárskom priemysle a najmä vo výžive zvierat. Existuje preto všeobecný záujem o poskytnutie nových, zlepšených spôsobov prípravy týchto aminokyselín.
Podstata vynálezu
Vynález poskytuje spôsob fermentačnej prípravy L-aminokyselín najmä L-lyzínu, L-treonínu, L-izoleucínu a L-tryptofánu, použitím koryneformných baktérií, v ktorých sa zosilňuje, najmä zvýšene exprimuje nukleotidová sekvencia kódujúca enzým 6-fosfoglukonátdehydrogenázu (EC 1.1.1.44) (gén gnd) .
Použité kmene prednostne už produkujú L-aminokyseliny pred zosilnením génu gnd.
Prednostné uskutočnenia sa nachádzajú v patentových nárokoch.
Pojem „zosilnenie opisuje v tejto súvislosti- zvýšenie intracelulárnej aktivity jedného alebo viacerých enzýmov v mikroorganizme, ktoré sú kódované príslušnou DNA, napríklad zvýšením počtu 'kópií génu alebo génov, použitím silného promótora alebo použitím génu, ktorý kóduje príslušný enzým s vysokou aktivitou a tieto opatrenia sa poprípade kombinujú.
Mikroorganizmy, ktoré sú predmetom predloženého vynálezu, môžu produkovať L-aminokyseliny z glukózy, sacharózy, laktózy, fruktózy, maltózy, melasy, škrobu, celulózy alebo z glycerolu a etanolu. Jedná sa o zástupcov koryneformných baktérií, najmä rodu Corynebacterium. Pri rode Corynebacterium treba uviesť najmä druh Corynebacterium glutamicum, ktorý je v odbornom svete známy pre svoju schopnosť produkovať L-aminokyseliny.
Vhodnými kmeňmi rodu Corynebacterium, najmä druhu Corynebacterium glutamicum, sú napríklad známe kmene divého typu
Corynebacterium glutamicum ATCC13032,
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806,
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870,
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539,
Brevibacterium flavum ATCC14067,
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 a
Brevibacterium divaricatum ATCC14020 a z nich vytvorené mutanty produkujúce L-aminokyseliny, ako napríklad kmene produkujúce L-treonín
Corynebacterium glutamicum ATCC21649,
Brevibacterium flavum BB69,
Brevibacterium flavum DŠM5399,
Brevibacterium lactofermentum FERM-BP 269,
Brevibacterium lactofermentum TBB-10 a napríklad kmene produkujúce L-izoleucín
Corynebacterium glutamicum ATCC 14309,
Corynebacterium glutamicum ATCC 14310,
Corynebacterium glutamicum ATCC 14311,
Corynebacterium glutamicum ATCC 15168,
Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6871 a napríklad kmene produkujúce L-tryptofán
Corynebacterium glutamicum ATCC21850 a
Corynebacterium glutamicum KY9218 (pKW9901), a napríklad kmene produkujúce L-lyzín
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709,
Brevibacterium flavum FERM-P 1708,
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712,
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463,
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464,
Corynebacterium glutamicum DSM5715,
Corynebacterium glutamicum DM58-1,
Corynebacterium glutamicum DSM12866.
Zistilo sa, že koryneformné baktérie produkujú L-aminokyseliny, najmä L-lyzín, L-treonín, L-izoleucín a L-tryptofán, zlepšeným spôsobom po zvýšenej expresii génu gnd, ktorý kóduje 6-fosfoglukonátdehydrogenázu (EC 1.1.1.44).
Gén gnd kóduje enzým 6-fosfoglukonátdehydrogenázu, ktorá katalyzuje oxidačnú dekarboxyláciu kyseliny 6-fosfoglukónovej na ribulóza-6-fosfát. Nukleotidová sekvencia génu gnd je zverejnená v JP-A-9-224662. Gén gnd opísaný v uvedenom texte sa používa podlá predloženého vynálezu prvý raz. Ďalej sa môžu použiť alely génu gnd, ktoré sú výsledkom degenerácie genetického kódu alebo sú spôsobené mutáciou neutrálnej funkcie so zmyslom.
Na dosiahnutie zosilnenia (t.j. zvýšenej expresie) sa napríklad zvýši počet kópií príslušných génov alebo sa mutuje promótorová a regulačná oblasť alebo miesto pre naviazanie ribozómov, ktoré sa nachádza v protismere štruktúrneho génu. Rovnakým spôsobom pôsobia expresívne kazety, ktoré.sa vkladajú proti smeru štruktúrneho génu. Pomocou indukovatelných promótorov možno dodatočne zvýšiť expresiu v priebehu fermentačnej produkcie L-aminokyseliny. Opatreniami na predĺženie životnosti m-RNA sa expresia taktiež zlepšuje.
Ďalej sa enzýmová aktivita taktiež zvyšuje zabránením odbúravania enzýmového proteínu. Gény alebo génové konštrukty môžu buď existovať v plazmidoch s rozdielnym počtom kópií, alebo môžu byť v chromozóme integrované a amplifikované. Ďalej sa môže alternatívne dosiahnuť zvýšená expresia príslušných génov zmenou zloženia médií a zmenou postupu kultivácie.
Návody na to nájde odborník medzi iným v Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), v Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya a Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), v Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), v európskom patentovom spise EPS 0 472 869, v U,S patente 4,601,893, v práci Schwárzer and Púhler (Bio/Technology 9, 8487 (1991)), Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), v LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), v patentovej prihláške WO 96/15246, v Malumbres et al. (Gene 134, 15 - 24 (1993)), v japonskom zverejnenom spise JP-A-10-229891, v práci Jensen a Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)) a v známych učebniciach genetiky a molekulovej biológie.
6-Fosfoglukonátdehydrogenáza sa napríklad zvýšene exprimovala pomocou plazmidu. Na to sa použil kyvadlový vektor pEC-T18mob2 z E. coli - C. glutamicum znázornený na obrázku 1. Po vložení génu gnd do štiepneho miesta EcoRI vektora pECT18mob2 sa vytvoril plazmid pECgnd znázornený na obrázku 2.
Taktiež sa môžu použiť iné plazmidové vektory, ktoré sú schopné replikácie v C. glutamicum, ako je napríklad pEKExl (Eikmanns et al., Gene 102:93-98 (1991)) alebo pZ8-l (EP-B- 0 375 889).
Prídavné môže byť pre produkciu L-aminokyselín výhodné okrem génu gnd zosilniť jeden alebo viac enzýmov príslušnej biosyntetickej dráhy, glykolýzy, anaplerotiky, pentózafosfátovej dráhy alebo prenosu aminokyselín okrem zosilnenia génu gnd, ktorý kóduje 6-fosfoglukonátdehydrogenázu.
Teda napríklad sa môže na produkciu L-treonínu súčasne zosilniť, najmä zvýšene exprimovať jeden alebo viac génov zvolených zo skupiny zahŕňajúcej • gén hom kódujúci homoseríndehydrogenázu (Peoples et al., Molecular Microbiology 2, 63-72 (1988)) alebo alelu homdr kódujúcu homoseríndehydrogenázu rezistentnú na spätnú väzbu (Archer et al., Gene 107, 53-59 (1991), • gén gap kódujúci glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázu (Eikmanns et al., Journal of Bacteriology 174:
6076-6086 (1992)), • gén pyc kódujúci pyruvátkarboxylázu (Peters-Wendish et al., Microbiology 144: 915-927 (1998)), • gén mqo kódujúci malát:chinónoxidoreduktázu (Molenaar et al., European Journal of, Biochemistry 254, 395-403 (1998)), •gén tkt kódujúci transketolázu (prírastkové číslo AB023377, European Molecular Biologies Laboratories databank (EMBL, Heidelberg, Nemecko), • gén zwf kódujúci glukóza-6-fosfátdehydrogenázu (JP-A09224661), • gén thrE kódujúci prenos treonínu (DE 199 41 478.5; DSM 12840), • gén zwal (DE 199 59 328.0; DSM 13115), • gén eno kódujúci enolázu (DE: 199 41 478.5).
Teda napríklad najmä na prípravu L-lyzínu sa môže súčasne zosilniť, prednostne zvýšene exprimovať jeden alebo viac génov zvolených zo skupiny zahŕňajúcej • gén dapA kódujúci dihydrodipikolinátsyntázu (EP-B 0 197 335), • gén lysC kódujúci aspartátkinázu rezistentnú na spätnú väzbu (Kalinowski et al., (1990), Molecular and General Genetics 224: 317-324), • gén gap kódujúci glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázu (Eikmanns et al., (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), • gén pyc kódujúci pyruvátkarboxylázu (Eikmanns et al., (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), ‘ ' 1 • gén mqo kódujúci malát-chinónoxidoreduktázu (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)), • gén tkt kódujúci transketolázu (prírastkové číslo AB023377, European Molecular Biologies Laboratories databank (EMBL, Heidelberg, Nemecko)) , • gén zwf kódujúci glukóza-6-fosfátdehydrogenázu (JP-A09224661), • gén lysE kódujúci prenos lyzínu (DE-A-195 48 222), • gén zwal (DE 199 59 328.0; DSM 13115), • gén eno kódujúci enolázu (DE: 199 47 791.4).
Ďalej môže byť výhodné pre produkciu L-aminokyselín navyše k zosilneniu génu gnd súčasne zoslabiť jeden alebo viac génov zvolených zo súboru zahŕňajúceho:
• gén pck kódujúci fosfoenolpyruvátkarboxykinázu (DE
199 50 409.1, DSM 13047), • gén pgi kódujúci glukóza-6-fosfátizomerázu (US 09/396,478, DSM 12969), • gén poxB kódujúci pyruvátoxidázu (DE 199 51 975.7, DSM 13114),
I • gén zwa2 (DE 199 59 327.2; DSM 13113).
Ďalej môže byť pre produkciu aminokyselín okrem zvýšenej expresie 6-fosfoglukonátdehydrogenázy výhodné vylúčiť nežiaduce vedľajšie reakcie (Nakayama: „Breeding of Amino Acid Produci'ng Micro-organisms, in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, Londýn, Veľká Británia, 1982).
Mikroorganizmy vytvorené podlá vynálezu sa môžu na účely produkcie L-aminokyselín kultivovať kontinuálnym spôsobom alebo spôsobmi diskontinuálnymi, či už vsádzkovou (batch) kultiváciou alebo vsádzkovou kultiváciou s prítokom živín (fed batch) . alebo vsádzkovou kultiváciou s opakovaným prídavkom živín (repeated fed batch). Zhrnutie známych kultivačných metód je opísané v učebnici Chmiel: Bioprozesstechnik 1. Einfiihrung in die Bioverfahrenstechnik (Biotechnológia 1. Úvod do biotechnológie, nakladateľstvo Gustáv Fischer, Stuttgart, 1991) alebo v učebnici Storhas: Bioreaktoren und Periphere Einrichtungen (Bioreaktory a periférne zariadenia, nakladatelstvo Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).
Použité kultivačné médium musí patričným spôsobom .vyhovovať nárokom príslušného mikroorganizmu. Opisy rôznych známych kultivačných médií pre mikroorganizmy sú uvedené príručke Manual of Methods for General Bacteriology (Metodický manuál pre všeobecnú baktériológiu) vydaný Americkou bakteriologickou spoločnosťou (American Society' for Bacteriology), Washington D.C., USA, 1981. Ako zdroje uhlíka sa môžu použiť sacharidy, ako napríklad glukóza, sacharóza, laktóza, fruktóza, maltóza, melasa, škrob a celulóza; oleje a tuky, ako napríklad sójový olej, slnečnicový olej, podzemnicový olej a kokosový tuk;
mastné kyseliny, ako napríklad kyselina palmitová, kyselina stearová a kyselina linolová, alkoholy, ako napríklad glycerol a etanol, a organické kyseliny, ako napríklad kyselina octová. Tieto látky sa môžu použiť buď jednotlivo, alebo v zmesi. Ako zdroje dusíka sa môžu použiť organické zlúčeniny obsahujúce dusík, ako napríklad peptóny, kvasnicový extrakt, mäsový extrakt, sladový extrakt, kukuričný extrakt, sójová múčka a močovina, alebo anorganické zlúčeniny, ako napríklad síran amónny, chlorid amónny, fosforečnan amónny, uhličitan amónny a dusičnan amónny. Tieto zdroje dusíka sa môžu použiť buď jednotlivo, alebo v zmesi. Ako zdroje fosforu možno použiť hydrogenfosforečnan alebo dihydrogenfosforečnan draselný alebo príslušné sodné soli. Kultivačné médium musí ďalej obsahovať soli kovov, ktoré sú nutné na rast, ako napríklad síran horečnatý alebo síran železnatý. A napokon môže byť kultivačné médium okrem vyššie uvedených látok obohatené o esenciálne rastové látky, ako napríklad aminokyseliny a vitamíny. Ku kultivačnému médiu sa môžu ešte pridať vhodné prekurzory. Uvedené východiskové látka sa môžu pridať do média jednorazovo na začiatku alebo vhodným spôsobom v priebehu kultivácie.
Na kontrolu pH v priebehu kultivácie sú vhodné zásadité zlúčeniny, ako napríklad hydroxid sodný, hydroxid draselný, amoniak, alebo kyslé zlúčeniny, ako napríklad kyselina fosforečná alebo kyselina sírová. Penenie kultivačnej zmesi možno kontrolovať prídavkom činidiel potláčajúcich tvorbu peny, ako sú napríklad polyglykolestery mastných kyselín. Stabilitu plazmidov možno udržiavať prostredníctvom vhodného selekčného činidla, napríklad antibiotika. Vhodné aeróbne podmienky možno udržiavať privádzaním kyslíka alebo zmesi plynov obsahujúcej kyslík, napríklad vzduchu, do kultivačného média. Vhodná teplota na pestovanie baktérií je zvyčajne od 20 °C do 45 °C a výhodne od 25 °C do 40 ’C. Čas kultivácie by'mal byť taký, aby sa dosiahlo maximum tvorby aminokyselín. Toto maximum sa obvykle dosiahne v priebehu 10 až 160 hodín.
Analýza L-aminokyselín sa môže uskutočňovať anexovou chromatografiou s následnou ninhydrínovou derivatizáciou tak·, ako sa opisuje v práci Spackman et al. (Analytical Chemistry,
30, (1958), 1190) alebo sa môže uskutočňovať HPLC s reverznou fázou, ako sa opisuje v práci Lindroth et al. (Analytical Chemistry, (1979) 51: 1167-1174).
Nasledujúce mikroorganizmy boli uložené v Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ = Nemecká zbierka mikroorganizmov a bunkových kultúr, Braunschweig, Nemecko) podía Budapeštianskej zmluvy:
Escherichia coli K-12 DH5oc/pEC-T18mob2 ako DSM 13244.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Priložené sú nasledovné obrázky:
Obrázok 1: Mapa plazmidu pEC-T18mob2
Obrázok 2: Mapa plazmidu pECgnd
Obrázok 3: Mapa plazmidu pBGNA
Obrázok 4: Mapa plazmidu pCR2.lpoxBint
Stanovené počty párov báz sú približné hodnoty získané v súvislosti s reprodukovatelnosťou.
Použité skratky majú nasledovný význam:
Obrázok 1:
Tet: gén pre rezistenciu na tetracyklín
OriV: plazmidom kódovaný počiatok replikácie E.coli
RP4mob: oblasť mob na mobilizáciu plazmidu rep:
per:
lacZ-alpha
Obrázok 2:
Tet:
rep:
per:
lacZ:
gnd:
Obrázok 3:
LacP:
CMV:
ColEl: TkpolyA: Kan r:
SV40 ori: gnd:
Obrázok 4: ColEl:
lacZ: fl ori: . KmR:
ApR:
poxBint:
plazmidom kódovaný počiatok replikácie z plazmidu pGAl z C. glutamicum gén na kontrolu počtu kópií z pGAl génový fragment lacZa (N-koniec) génu pre β-galaktozidázu gén pre rezistenciu na tetracyklín plazmidom kódovaný počiatok replikácie z plazmidu pGAl z C. glutamicum gén na kontrolu počtu kópií z pGAl klonovací relikt génového fragmentu LacZa z pEC-T18mob2 gén pre 6-fosfoglukonátdehydrogenázu promótor laktózového operónu E. coli promótor cytomegalovírusu počiatok replikácie plazmidu ColEl polyadenylačné miesto gén pre rezistenciu na kanamycín počiatok replikácie opičieho vírusu 40 gén pre 6-fosfoglukonátdehydrogenázu počiatok replikácie plazmidu ColEl klonovací relikt génového fragmentu lacZa počiatok replikácie fága fl rezistencia na kanamycín rezistencia na ampicilín vnútorný fragment génu poxB
Ďalej sa použili nasledovné skratky:
| Accl: | cieľové | miesto | reštrikčného | enzýmu | Accl |
| BamHI: | cielové | miesto | reštrikčného | enzýmu | BamHI |
| EcoRI: | cieľové | miesto | reštrikčného | enzýmu | EcoRI |
| HindlII: | cieľové | miesto | reštrikčného | enzýmu | HindlII |
| KpnI: | cielové | miesto | reštrikčného | enzýmu | KpnI |
| PstI: | cielové | miesto | reštrikčného | enzýmu | PstI |
| Pvul: | cielové | miesto | reštrikčného | enzýmu | Pvul |
| Sali: | cielové | miesto | reštrikčného | enzýmu | Sali |
| Sací: | cielové | miesto | reštrikčného | enzýmu | Sací |
| Smal: | cielové | miesto | reštrikčného | enzýmu | Smal |
| Sphl: | cielové | miesto | reštrikčného | enzýmu | Sphl |
| Xbal: | cielové | miesto | reštrikčného | enzýmu | Xbal |
| Xhol: | cielové | miesto | reštrikčného | enzýmu | Xhol |
Príklady uskutočnenia vynálezu
Nasledovné príklady bližšie vysvetlujú tento vynález. Použili sa metódy molekulovej biológie, napríklad izolácia plazmidovej DNA, spracovanie reštrikčnými enzýmami, ligácie, štandardné transformácie Escherichia coli atď. (pokial nie je stanovené inak), opísané v práci Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories, USA).
Príklad 1
Konštrukcia génovej banky kmeňa Corynebacterium glutamicum AS019
Génová banka kmeňa Corynebacterium glutamicum ASO19 (Yoshihama et al., Journal of Bacteriology 162, 591-597 (1985) ) sa skonštruovala použitím systému e Zap Express™ (Short et al., (1988) Nucleic Acids Research, 16: 7583-7600), ako opisuje O'Donohue (O'Donohue, M. (1997), The Cloning and Molecular Analysis of Four Common Aromatic Amino Acid Biosynthetic Genes from Corynebacterium glutamicum, Ph.D. Thesis, National University of Ireland, Galway). Kit é Zap Express™ sa zakúpil od firmy Stratagene (Stratagene,.11011 North Torrey Pines Rd., La Jolla, California 920037) a použil podlá návodu výrobcu. AS019-DNA sa rozštiepila reštrikčným enzýmom Sau3A a ligovala s vetvami é Zap Express™ spracovanými pomocou BamHI a defosforylovanými.
Príklad 2
Klonovanie a sekvenovanie génu gnd
1. Konštrukcia sondy gnd
Rádionukleotidom označený oligonukleotid, interný vzhľadom na gén gnd, sa použil na skúmanie knižnice (génovej banky) AS019 é Zap Express™ opísanej vyššie. Oligonukleotid sa pripravil použitím degenerovaných primérov PCR interných vzhľadom na gén gnd. Degenerované nukleotidové priméry určené na PCR amplifikáciu DNA-fragmentov gnd:
•gndl: 5’ ATG GTK CAC ACY GGY ATY GAR TA 3’ gnď2: 5’ RGT CCA YTT RCC RGT RCC YTT 3’ kde -R=A+G; Y=C+T; K=T+G.
Odhadnutá velkosť výsledného produktu PCR bola približne
252 bp.
Stanovené optimálne podmienky PCR:
cyklov °C počas 1 minúty °C počas 1 minúty °C počas 30 sekúnd
2,5 až 3,5 mM MgCl2
100 až 150 ng genómovej DNA AS019. '
Sekvenačná analýza výsledného produktu PCR povrdila, že produkt je vnútornou časťou génu gnd. Sekvenačná analýza sa uskutočnila použitím univerzálneho dopredného.a reverzného priméru a sekvenačného kitu T7 od firmy Pharmacia Biotech (St. Albans, Herts, UK) . Sekvencia produktu PCR je znázorená v SEQ ID No. 1.
2. Klonovanie
Skríning knižnice AS019 é Zap Express™ sa uskutočnil podľa systémového protokolu é Zap Express™ (Stratagene, 11011 North Torrey Pines Rd., La Jolla, California 920037). Potom sa uskutočnila na izolovaných klonoch analýza použitím
Southernovho prenosu. Southernov prenos DNA bol opísaný v manuále od Schleichera a Schuella využívajúcom Nytran™ ako membránu („Nytran, Modified Nylon-ββ Membráne Filters (March 1987), Schleicher and Schuell, Dassel, Nemecko). Dvojvláknové fragmenty DNA vytvorené použitím tých istých primérov a optimálnych podmienok ako vyššie sa rádioaktívne označili pomocou a-32P-dCTP použitím značkovacieho kitu DNA Multiprime™ od firmy Amersham Life Science (Amersham Pharmacia Biotech UK Limited, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK) podlá návodu výrobcu. Podmienky prehybridizácie, hybridizácie a premývania boli také, ako sa opisujú manuále od Schleichera a Schuella. Autorádiografia sa uskutočnila podlá postupu navrhnutého v príručke od Sambrooka a ďalších použitím filmu AgFa Curix RPIL. Takto sa identifikovalo niekoľko klonov gnd. Plazmidová DNA sa izolovala z jedného klonu, označila ako pBGNA (obrázok 3) a vybrala na ďalšiu analýzu.
3. Sekvenovanie
Na sekvenovanie klonovaného inzertu pBGNA sa použila didéox'y-metóda ukončenia reťazca opísaná v práci Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74, 54635467 (1977)). Táto mettóda sa aplikovala použitím sekvenačného kitu a-35S-dCTP od firmy Pharmacia Biotech (St. Albans, Herts, UK). Vzorky sa podrobili elektroforéze počas 3 až 8 hodín na 6% polyakrylamidovom a močovinovom géle v tlmivom roztoku TBE pri konštantnom prúde 50 mA, podľa inštrukcií manuálu na klonovanie a sekvenovanie („T7 Sequencing™ Kit, č. XY-010-0019, Pharmacia Biotech, 1994). Analýza sekvencii sa uskutočnila použitím interných primérov navrhnutých zo sekvencie známej z interného PCR-produktu gnd (SEQ ID NO 1) poskytujúcej celú sekvenciu génu gnd, ktorý sa má odvodiť.
Sekvencie interných primérov:
| Interný | primér | 1: | 5 ’ | GGT | GGA | TGC | TGA | AAC | CG | 3’ |
| Interný | primér | 2: | t ! 5’· | GCT | GCA | TGC | CTG | CTG | CG | 3’ |
| Interný | primér | 3: | 1. 5’ | TTG | TTG | CTT | ÁCG | CAC | AG | 3’ |
| Interný | primér | 4: | 5’ | TCG | TAG. | GAC | TTT | GCT | GG. | 3’ |
Získaná sekvencia sa potom analyzovala použitím programu DNA Strider (Marek (1988), Nucleic Acids Research 16: 18291836), verzia 1.0 na počítači Apple Macintosh. Tento program umožnil analýzy, ako je napríklad stanovenie použitím reštrikčného miesta, analýza otvoreného čítacieho rámca a stanovenie použitím kodónu. Vyhladávanie medzi získanou sekvenciou DNA a sekvenciami v databázach EMBL a Genbank sa dosiahlo použitím programu BLAST (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25:3389-3402). Sekvencie DNA a proteínu sa vyrovnali použitím programov Clustal V a Clustal W (Higgins and Sharp, 1988 Gene 73: 237-244).
Takto získaná sekvencia je znázornená v SEQ ID NO 2. Analýza získanej nukleotidovej sekvencie odhalila otvorený čítací rámec s 1377 pármi báz, ktorý sa označil ako gén gnd. Kóduje proteín so 459 aminokyselinami znázornený v SEQ ID NO 3.
Príklad 3
Príprava kyvadlového vektora pEC-Tl8mob2
Kyvadlový vektor pEC-T18mob2 z E. coli - C. glutamicum sa skonštruoval podlá doterajšieho stavu techniky.
Tento vektor obsahuje replikačnú oblasť rep plazmidu pGAl vrátane replikačného efektora per (US-A- 5,175, 108; Nesve.ra et al., Journal of Bacteriology 179, 1525-1532 (1997)), gén tetA(Z) plazmidu pAGl sprostredkovávajúci rezistenciu na tetracyklín (US-A- 5,158,891; zápis do génovej banky v National Center for Biotechnology Information (NCBI,
Bethesda, MD, USA) s prírastkovým číslom AF121000), replikačnú oblasť oriV plazmidu pMBl (Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposium on Quntitative Biology 43, 77-90 (1979)), génový fragment lacZ zahŕňajúci promótor lac a viacnásobné klonovacie miesto (multiple cloning site, mcs) (Norrander, J. M. et al., Gene 26, 101-106 (1983) a oblasť mob plazmidu RP4 (Šimon et al., (1983), Bio/Technology 1: 784-791).
Skonštruovaný vektor sa transformoval do kmeňa E. coli DH5a (Hanahan, In: DNA Cloning. A Practical Approach. Vol. I., IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA, 1985). Bunky nesúce plazmid sa selektovali nanesením transformačnej zmesi na platne s agarom LB (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), ktorý bol doplnený 5 mg/1 tetracyklínu. Plazmidová DNA sa izolovala z jedného transformantu použitím kitu QIAprep Spin Miniprep Kit od firmy Qiagen a analyzovala reštrikciou reštrikčným enzýmom EcoRI a HindlII a potom elektroforézou v agarózovom géle (0/8%).
Plazmid sa nazval pEC-T18mob2 a je znázornený na obrázku 1. Je uložený vo forme kmeňa Escherichia coli K-12, kmeň DH5a/pEC-T18mob2 v Nemeckej zbierke mikroorganizmov a bunkových kultúr (DSMZ, Braunschweig, Nemecko) ako DSM 13244.
Príklad 4
Klonovanie génu gnd do kyvadlového vektora pEC-T18mob2 z E. coli - C. glutamicum
Na amplifikáciu fragmentov DNA obsahujúcich celý gén gnd z C. glutamicum a oblasti priliehajúce v jeho smere a v protismere sa použila PCR s použitím pBGNA ako templátu. PCR reakcie sa uskutočnili použitím olígonukleotidových primérov odvodených z SEQ ID NO 2. Použité priméry:
dopredný primér gnd: .5’ ACT CTA GTC GGC CTA AAA TGG'3' reverzný primér gnd:^ 5,’ CAC ACA GGA AAC AGA TAT GAC 3’
Parametre PCR:
cyklov °C počas '6 minút °C počas 1 minúty °C počas 1 minúty72 °C počas 45 sekúnd mM MgCl2 približne 150 až 200 ng pBGNA-DNA ako templátu.
Získaný produkt PCR sa klonoval do komerčne dostupného vektora pGEM-T zakúpeného od firmy Promega Corp. (pGEM-T Easy Vector System 1, katalógové číslo A1360, Promega UK,
Southampton) použitím kmeňa E. coli JM109 (Yanisch-Perron etal., Gene 33: 103-119 (1985)) ako hostiteľského mikroorganizmu. Celý gén gnd sa potom izoloval z vektora pGEM T vo fragmente EcoRI a klonoval do miesta lacZ EcoRI kyvadlového vektora pEC-T18mob2 z E. coli - C. glutamicum (obrázok 1) a ozhačil ako pECgnd (obrázok 2). Reštrikčná analýza použitím Accl (Boehringer Mannheim GmbH, Nemecko) odhalila správnu orientáciu (t.j. v smere promótora lac) génu gnd v géne lacZa vektora pEC-T18mob2.
Príklad 5
Príprava producenta aminokyseliny pomocou zosilnenej 6-fosfoglukonátdehydrogenázy
Vektor pECgnd z príkladu 3 sa elektroporoval do kmeňov Corynebacerium glutamicum DSM 5399 a DSM 5714 podlá elektroporačnej metódy od Taucha et al. (FEMS Microbiological Letters, 123:343-347 (1994)). Kmeň DSM 5399 je producent treonínu opísaný v EP-B-0358940. Kmeň DSM 5714 je producent lyzínu opísaný v EP-B-0435132. Selekcia transformantov sa uskutočnila nanesením elektroporačnej zmesi na agar. LB (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.,'Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), ktorý bol doplnený 25 mg/l kanamycínu. Týmto spôsobom sa vytvorili kmene DSM5399/pECgnd a DSM5714/pECgnd.
Príklad 6
Príprava L-treonínu
Kmeň C. glutamicum DSM5399/pECgnd získaný v príklade 5 sa kultivoval v živnom médiu vhodnom na produkciu treonínu a obsah treonínu sa stanovoval v kultivačnom supernatante.
Na tento účel sa kmeň najskôr inkuboval 24 hodín pri 33 °C na agarovej platni s vhodným antibiotikom (mozgovo-srdcový agar s tetracyklínom (5 mg/l)). Vychádzajúc z kultúry z tejto agarovej platne sa naočkovala predpestovaná kultúra (10 ml média v 100 ml Erlenmeyerovej banke). Ako médium pre predpestovanú kultúru sa použil mozgovo-srdcový bujón (Merck, Darmstadt, Nemecko). K tomu sa pridal tetracyklín (5 mg/l). Predpestovaná kultúra sa inkubovala 24 hodín pri 33 °C pri 240 ot./min v pretrepávačke. Hlavná kultúra sa naočkovala touto predkultúrou tak, aby začiatočná optická hustota (660 nm) hlavnej kultúry bola 0,1. Pre hlavnú kultúru sa použilo médium MM pre treonín.
Médium MM:
CSL
MOPS
Glukóza (oddelene autoklávovaná) Soli:
(NH4)2SO4
KH2PO4
MgSO4.7H2O
CaCl2.2H2O
FeSO4.7H2O
MnSO4.H2O
Biotín (sterilné filtrovaný) Tramín.HCI (sterilné filtrovaný) L-Leucín (sterilné filtrovaný) CaCO3 g/1 20 g/1 50 g/1 g/1 0,1 g/1 1,0 g/1 10 mg/l 10 mg/l 5,0 mg/l 0,3 mg/l 0,2 mg/l 0,1 g/1 25 g/1
CSL (kukuričná maceračná tekutina), MOPS (kyselina morfolinopropánsulfónová) a roztok solí sa vodným roztokom amoniaku nastavili na pH 7 a autoklávovali. Potom sa pridali roztoky sterilného substrátu a roztoky vitamínov, ako aj za sucha autoklávovaný CaCC>3.
Kultivácia sa uskutočňovala v 10 ml objeme v 100 ml Erlenmeyerovej banke s priehradkami. Pridal sa tetracyklín (5 mg/1). Kultivácia sa uskutočňovala pri 33 °C a 80% vlhkosti vzduchu.
Po 48 hodinách sa určila optická hustota (OD) pri meracej vlnovej dĺžke 660 nm pomocou Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Mníchov). Koncentrácia treonínu sa stanovila pomocou analyzátora aminokyselín od firmy Eppendórf-BioTronik (Hamburg, Nemecko) ionexovou chromatografiou a derivatizáciou na prídavnom stĺpci s ninhydrínovou detekciou.
Výsledok pokusu je uvedený v tabulke 1
Tabulka 1
| Kmeň | Optická hustota | L-Treonín.HCI |
| (660) | g/1 | |
| DSM5399/pECgnd | 11, 9 | 1,29 |
| DSM5399 | 11,8 | 0,33 |
Príklad 7
Príprava L-lyzínu
Kmeň Corynebacterium glutamicum DSM5714/pECgnd získaný v príklade 5 sa kultivoval v živnom médiu vhodnom na produkciu lyzínu a obsah lyzínu sa stanovoval v kultivačnom supernatante.
Na tento účel sa kmeň najskôr inkuboval 24 hodín pri 33 °C na agarovej platni s vhodným antibiotikom (mozgovo-srdcový agar s tetracyklínom (5 mg/1)). Vychádzajúc z kultúry z tejto agarovej platne sa naočkovala predpestovaná kultúra (10 ml média v 100 ml Erlenmeyerovej banke). Médiom použitým pre predpestovanú kultúru bolo úplné médium CglII.
Médium Cg III
NaCl
Bacto-peptón
Bacto-kvasnicový extrakt Glukóza (oddelene autoklávovaná) Hodnota pH sa nastavila na 7,4.
2,5 g/l g/l g/l % (hmotnosť/objem)
K tomu sa pridal tetracyklín (5 mg/1). Predpestovaná kultúra sa inkubovala 24 hodín pri 33 °C pri 240 ot./min v pretrepávačke. Hlavná kultúra sa naočkovala touto predpestovanou kultúrou tak, aby začiatočná optická hustota (660 nm) hlavnej kultúry bola 0,05. Pre hlavnú kultúru sa použilo médium MM.
Médium MM:
| CSL (kukuričná maceračná tekutina) MOPS (kyselina morfolinopropán- sulfónová) Glukóza (oddelene autoklávovaná) | 5 g/l 20 g/l 50 g/l |
| (NH4)2SO4 | |
| kh2po4 | 25 g/l |
| MgSO4.7H2O | 0,1 g/l |
| CaCl2.2H2O | 1,0 mg/1 |
| FeSO4.7H2O | 10 mg/1 |
MnSO4 .H2O 10 mg/1
Biotín (sterilné filtrovaný) 0,3 mg/1
Tramín.HCI (sterilné filtrovaný) 0,2 mg/1
L-Leucín (sterilné filtrovaný) 0,1 g/1
CaCO3 25’g/1
CSL, MOPS a roztok solí sa vodným roztokom amoniaku nastavili na pH 7 a autoklávovali. Potom sa pridali roztoky sterilného substrátu a roztoky vitamínov, ako aj za sucha autoklávovaný CaCO3.
Kultivácia sa uskutočňovala v 10 ml objeme v 100 ml Erlenmeyerovej banke s priehradkami. Pridal sa tetracyklín (5 mg/1). Kultivácia sa uskutočňovala pri 33 ’C a 80% vlhkosti vzduchu.
Po 48 hodinách sa určila optická hustota (OD) pri meracej vlnovej dĺžke 660 nm pomocou Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Mníchov). Vytvorené množstvo lyzínu sa stanovilo pomocou analyzátora aminokyselín od firmy Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Nemecko) ionexovou chromatografiou a derivatizáciou na prídavnom stĺpci s ninhydrínovou detekciou.
Výsledok pokusu je uvedený v tabuľke 2.
Tabulka 2
| Kmeň | Optická hustota | L-Lyzín.HCI |
| (660) | g/i | |
| DSM5715/pECgnd | 7,7 | 14,7 |
| DSM5715 | 7,1 | 13,7 |
Príklad 8
Vytvorenie kozmidovej genómovej knižnice baktérie Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 ( , I
Chromozómová DNA baktérie Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 sa izolovala a čiastočne naštiepila (viď Tauch et al., (1995), Plasmid 33: 168 - 179) reštrikčným enzýmom Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, katalógové č. 27-091302). Izolované fragmenty DNA sa defosforylovali pomocou alkalickej fosfatázy z morských garnátov (shrimp alkaline phosphatase, Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Nemecko, katalógové číslo 1758250). DNA kozmidového vektora SuperCosl (Wahl et al., (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84: 2160 - 2164), získaného od firmy Stratagene (La Jolla, USA, SuperCosl Cosmid Vektor Kit, katalógové č. 251301), sa naštiepila reštrikčným enzýmom Xbal (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, katalógové č. 27-0948-02) a taktiež defosforylovala alkalickou fosfatázou.
Následne sa kozmidová DNA naštiepila reštrikčným enzýmom BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, katalógové č. 27-0868-04). Týmto spôsobom získané fragmenty kozmidovej DNA sa zmiešali s DNA ATCC13032 a potom spojili pomocou T4-DNAligázy (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, katalógové č. 27-0870-04).
Ligačná zmes sa potom pomocou, baliaceho extraktu Gigapack II XL Packing (Stratagene, La Jolla, USA, Gigapack II XL Packing Extract, katalógové č. 200217) zabalila do fágových častíc. Tieto fágové častice sa použili na infekciu kmeňa E. coli NM554 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acid Research 16:
1563 - 1575) . Bunky sa resuspendovali v lOmM MgSO4 a zmiešali s alikvótom suspenzie fágov. Infekcia a titrácia kozmidovej knižnice sa uskutočnila tak, ako sa opisuje v knihe Sambrook et al., (1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor), pričom sa bunky naniesli na agar LB (Lennox,
1955, Virology, 1:190) so 100 μς/ml ampicilínu. Po inkubácii cez noc pri 37 °C sa selektovali jednotlivé rekombinantné klony.
Príklad 9
Izolácia a sekvenovanie génu poxB
Kozmidová DNA jednej kolónie (príklad 8) sa izolovala pomocou kitu Qiaprep Spin Miniprep Kit (katalógové č.. 27106, Qiagen, Hilden, Nemecko) podlá návodov výrobcu a čiastočne rozštiepila reštrikčným enzýmom Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, katalógové č. 27-0913-02). Získané fragmenty DNA sa defosforylovali pomocou alkalickej fosfatázy z morských garnátov (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Nemecko, katalógové č. 1758250). Po separácii gélovou elektroforézou sa uskutočnila izolácia fragmentov kozmidu s rozsahom velkostí 1 500 až 2 000 bp pomocou kitu QiaExII gel Extraction Kit (katalógové č. 20021, Qiagen, Hilden, Nemecko). DNA sekvenačného vektora pZero-1, získaného od firmy Invitrogen (Groningen, Holandsko, katalógové č. K2500-01), sa štiepila reštrikčným enzýmom BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, katalógové č. 27-0868-04). Ligácia kozmidových fragmentov do sekvenačného vektora pZero-1 sa uskutočnila tak, ako sa opisuje v príručke Sambrook et al., (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor), pričom zmes DNA s T4-ligázou (Pharmacia Biotech, Freiburg, Nemecko) sa inkubovala cez noc. Táto ligačná zmes sč následne elektroporovala (Tauch et al., 1994, FEMS Microbiol Letters, 123:343 - 347) do kmeňa E. coli DH5aMCR (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87: 4645 - 4649) a naniesli na agar LB (Lennox, 1955, Virology, 1:190) s prídavkom 50 pg/ml zeocínu.
Izolácia plazmidov z rekombinantných klonov sa uskutočňo vala pomocou zariadenia Biorobot 9600 (katalógové č. 900200,
Qiagen, Hilden, Nemecko). Sekvenovanie sa uskutočňovalo dideoxymetódou ukončenia reťazca (Sanger et al., 1997, Proceedings of the National Academies of Sciences U.S.A., 74: 5463 - 5467) s modifikáciami podlá Zimmermänna et al., (1990, Nucleic Acids Research, 18:1067). Pritom sa použil sekvenačný kit „RR dRhodamin Terminátor Cycle Sequencing Kit od firmy PE Applied Biosystems (katalógové č. 403044, Weiterstadt,
Nemecko). Separácia gélovou elektroforézou a analýza sekvenačnej reakcie sa uskutočňovala v géle „Rotiphoresis NF Acrylamid/Bisacrylamid (29:1) (katalógové č. A124.1, Roth, Karslruhe, Nemecko) pomocou prístroja „ABI Prism 377 od firmy PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Nemecko).
Získané nespracované údaje o sekvenciách sa následne spracovali použitím programového balíka Staden (1986, Nucleic Acids Research, 14: 217 - 231), verzia 97-0. Jednotlivé sekvencie derivátov plazmidu pZerol sa zostavili do jedného súvislého celku. Počítačová analýza kódujúcich oblastí sa uskutočnila pomocou programu XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14:217 - 231). Ďalšie analýzy sa uskutočnili pomocou programu „BLAST (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25: 3389 - 3402) proti neredundantnej databáze NCBI „National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA).
Výsledná nukleotidová sekvencia je znázornená v SEQ ID No. 4. Analýza tejto nukleotidovej sekvencie odhalila otvorený čítací rámec s velkosťou 1737 párov báz, ktorý sa označil ako gén poxB. Gén poxB kóduje polypeptid s velkosťou 579 aminokyselín (SEQ ID NO. 5).
Príklad 10
Príprava integračného vektora na integračnú mutagenézu génu poxB
Z kmeňa ATCC 13032 sa metódou podľa Eikmannsa et al.
(Microbiology 140: 1817-1828 (1994)) izolovala chromózomová
DNA. Na základe sekvencie génu poxB známej z príkladu 9 pre Ci glutamicum sa selektovali nasledovné oligonukleotidy pre polymerázovú reťazovú reakciu:
poxBintl:
5' TGC GAG ATG. GTG AAT GGT GG 3' poxBint2: __ ___ _______
5' GCA TGA GGC AAC GCA TTA GC 3'
Znázornené priméry syntetizovala firma MWG Biotech (Ebersberg, Nemecko) a PCR reakcia sa uskutočnila podlá štandardnej metódy PCR od Innisa et al. (PCR protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press) s polymerázou Pwo od firmy Boehringer. Pomocou tejto polymerázovej reťazovej reakcie sa izoloval fragment DNA s veľkosťou približne 0,9 kb, ktorý nesie interný fragment génu poxB a je znázornený v SEQ ID No. 6.
Amplifikovaný fragment DNA sa ligoval pomocou klonovacieho kitu TOPO TA od firmy Invitrogen Corporation. (Carlsbad, CA, USA; katalógové číslo K4500-01) do vektora pCR2.1-TOPO (Mead et al., (1991), Bio/Technology 9:657-663). Kmeň E. coli DH5a sa potom elektroporoval s ligačnou zmesou (Hanahan, In: DŇA Cloning. A Practical Approach. Vol. I., IRLPress, Oxford, Washington DC, USA, 1985). Selekcia buniek nesúcich plazmid sa uskutočnila nanesením transformačnej zmesi na agar LB (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), ktorý bol doplnený 25 mg/1 kanamycínu. Plazmidová DNA sa izolovala z jedného transformantu použitím kitu QIAprep Spin Miniprep Kit od firmy
Qiagen a analyzovala reštrikciou reštrikčným enzýmom EcoRI a následnou elektroforézou v agarózovom géle (0,8%). Plazmid sa nazval pCR2.IpoxBint (obrázok 4).
Plazmid pCR2.IpoxBint sa uložil vo forme kmeňa Escherichia coli DH5a/pCR2.IpoxBint ako DSM 13114 v Nemeckej zbierke mikroorganizmov a bunkových kultúr (DSMZ,
Braunschweig, Nemecko) podlá Budapeštianskej zmluvy.
Príklad 11
Integračná mutagenéza génu poxB v kmeni DSM 5715 produkujúcom lyzín
Vektor pCR2.IpoxBint uvedený v príklade 10 sa elektroporoval do Corynebacterium glutamicum DSM 5715 podlá elektroporačnej metódy Taucha et al. (FEMS Microbiological Letters, 123:343347 (1994)). Pri kmeni DSM 5715 sa jedná o producenta lyzínu rezistentného na AEC. Vektor pCR2.IpoxBint sa nemôže samostatne replikovať v DSM5715 a zachováva sa v bunke len vtedy, ak sa integroval do chromozómu DSM 5715. Selekcia klonov pomocou pCR2.IpoxBint integrovaného v chromozóme sa uskutočnila nanesením elektroporačnej zmesi na agar LB (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), ktorý bol doplnený 15 mg/1 kanamycínu. Na dôkaz integrácie sa fragment poxBint označil pomocou hybridizačného kitu Dig od firmy Boehringer metódou „The DIG Systems Users Guide for Filter Hybridization od firmy Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Nemecko, 1993). Chromozómová DNA potenciálneho integrantu sa izolovala metódou od Eikmanns et ál.
(Microbiology 140: 1817 - 1828 (1994)) a štiepila reštrikčným enzýmom Sali, Sací a HindlII. Vzniknuté fragmenty sa separovali pomocou elektroforézy v agarózovom géle a hybridizovali pomocou hybridizačného kitu Dig od firmy
Boehringer pri 68 °C. Plazmid pCR2.lpoxBint uvedený v príklade 9 sa vnútri chromozómového génu poxB vložil do chromozómu DSM5715. Kmeň sa označil DSM5715::pCR2.lpoxBint.
Príklad 12 - .
Účinok zvýšenej expresie génu gnd so súčasnou elimináciou génu poxB na produkciu lyzínu
12.1 Príprava kmeňa DSM5715::pCR2.lpoxBint/pECgnd
Kmeň DSM5715::pCR2.lpoxBint sa transformoval plazmidom pECgnd použitím elektroporačnej metódy opísanej v práci Liebl et al. (FEMS Microbiology Letters 53: 299-303 (1989)).
Selekcia transformantov sa uskutočňovala na agare LBHIS zloženom z 18,5 g/1 mozgovo-srdcového infúzneho bujónu, 0,5 M sorbitolu, 5 g/1 Bacto-tryptónu, 2,5 g/1 Bacto-kvasnicového extraktu, 5 g/1 NaCl a 18 g/1 Bacto-agaru, ktorý bol doplnený 5 mg/1 tetracyklínu a 25 mg/1 kanamycínu. Inkubácia sa uskutočňovala 2 dni pri 33 °C.
Plazmidová DNA sa izolovala vo všetkých prípadoch z transformantu obvyklou metódou (Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology, 144, 915-927), štiepila reštrikčnou endonukleáou Accl a plazmid sa analyzoval následnou elektroforézou v agarózovom géle. Získaný kmeň sa nazval
DSM5715::pCR2.lpoxBint/pECgnd.
12.2 Príprava L-lyzínu
Kmeň C. glutamicum DSM5715::pCR2.IpoxBint/pECgnd získaný v príklade 12.1 sa kultivoval v živnom médiu vhodnom na produkciu lyzínu a obsah lyzínu sa stanovoval v kultivačnom supernatante.
Na tento účel sa kmeň najskôr inkuboval 24 hodín pri 33 °C na agarovej platni s vhodným antibiotikom (mozgovo-srdcový agar s tetracyklínom (5 mg/1) a kanamycínom (25 mg/1)).
I
Kultúry porovnávacích kmeňov boli doplnené podľa ich rezistencie na antibiotiká. Vychádzajúc z kultúry z tejto agarovej platne sa naočkovala predpestovaná kultúra (10 ml média v 100 ml Erlenmeyerovej banke). Médiom použitým pre predpestovanú kultúru bolo úplné médium CglII.
Médium Cg III
NaCI
Bacto-peptón
Bacto-kvasnicový extrakt Glukóza (oddelene autoklávovaná) Hodnota pH sa nastavila na 7,4.
2,5 g/1 g/1 g/1 % (hmotnosť/objem)
K tomu sa pridal tetracyklín (5 mg/1) a kanamycín (25 mg/1)). Predpestovaná kultúra sa inkubovala 16 hodín pri 33 °C pri 240 ot./min v pretrepávačke. Hlavná kultúra sä naočkovala touto predpestovanou kultúrou tak, aby začiatočná optická hustota (660 nm) hlavnej kultúry bola 0,1. Pre hlavnú kultúru sa použilo médium MM.
Médium MM:
CSL (kukuričná maceračná tekutina) MOPS (kyselina morfolinopropánsulfónová)
Glukóza (oddelene autoklávovaná) (NH4)2SO4 KH2PO4 MgSO4.7H2O
| 5 g | /1 |
| 20 | g/i |
| 58 | g/i |
| 25 | g/i |
| 0,1 | g/i |
| 1,0 | g/i |
CaCl2.2H2O
FeSO4.7H2O
MnSO4.H2O
Biotín (sterilné filtrovaný) Tiamín.HCl (sterilné filtrovaný) L-Leucín (sterilné filtrovaný) CaCO3 mg/1 10 mg/1 5,0 mg/1 0,3 mg/1 0,2 mg/1 0,1 g/1 25 g/1
CSL, MOPS a roztok solí sa vodným roztokom amoniaku nastavili na pH 7 a autoklávovali. Potom sa pridali roztoky sterilného substrátu a roztoky vitamínov, ako aj za sucha autoklávovaný CaCO3.
Kultivácia sa uskutočňovala v 10 ml objemoch v 100 ml Erlenmeyerovej banke s priehradkami. Pridal sa tetracyklín (5 mg/1) a kanamycín (25 mg/1). Kultivácia sa uskutočňovala pri 33 °C a 80% vlhkosti vzduchu.
Po 72 hodinách sa určila optická hustota (OD) pri meracej vlnovej dĺžke 660 nm pomocou Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Mníchov). Vytvorené množstvo lyzínu sa stanovilo pomocou analyzátora aminokyselín od firmy Eppendorf-Bioľronik (Hamburg, Nemecko) ionexovou chromatografiou a derivatizáciou na prídavnom stĺpci s ninhydrínovou detekciou.
Výsledok pokusu je uvedený v tabuľke 3.
Tabulka 3
| Kmeň | Optická hustota | L-Lyzín.HCI g/i |
| DSM5715 | 10,8 | 16,0 |
| DSM5715/pECgnd | 7,6 | 16,5 |
| DSM5715::pCR2.lpoxBint | 7,1 | 16, 7 |
| DSM5715::pCR2.lpoxBint/ | 7,2 | 17,1 |
| pECgnd |
Claims (10)
1. Spôsob prípravy L-aminokyselín fermentáciou koryneformných baktérií, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa uskutočnenie nasledovných stupňov:
a) fermentácia baktérií produkujúcich žiadanú
L-aminokyselinu, v ktorých sa zosilňuje aspoň gén gnd,
b) koncentrovanie L-aminokyseliny v médiu alebo v bunkách baktérií a
c) izolácia produkovanej L-aminokyseliny.
2. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že sa používajú baktérie, v ktorých sa prídavné zosilňujú, najmä zvýšene exprimujú, ďalšie gény pre biosyntetickú dráhu žiadanej L-aminokyseliny.
3. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa používajú baktérie, ktoré produkujú L-treonín, L-lyzín, L-izoleucín alebo L-tryptofán.
4. Spôsob podľa nároku 3,vyznačujúci sa tým, že sa používajú baktérie, ktoré produkujú L-lyzín.
5. Spôsob fermentačnej prípravy L-lyzínu podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že v koryneformných mikroorganizmoch, ktoré najmä už produkujú L-lyzín, sa súčasne zosilňuje alebo zvýšene exprimuje jeden alebo viac génov zvolených zo skupiny zahŕňajúcej
5.1 gén dapA kódujúci dihydrodipikolinátsyntázu,
5.2 gén lysC kódujúci aspartátkinázu rezistentnú na spätnú väzbu,
5.3 gén gap kódujúci glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázu,
5.4 gén pyc kódujúci pyruvátkarboxylázu, 1 · I
5.5 gén tkt kódujúci transketolázu,
5.6 gén zwf kódujúci glukóza-6-fosfátdehydrogená.zu,
5.7 gén lysE kódujúci prenos lyzínu,
5.8 gén zwal,
5.9 gén eno kódujúci enolázu.
6. Spôsob fermentačnej prípravy L-treonínu podía nároku 2,vyznačujúci sa tým, že v koryneformných mikroorganizmoch, ktoré najmä už produkujú L-treonín, sa súčasne zosilňuje, najmä zvýšene exprimuje jeden alebo viac génov zvolených zo skupiny zahŕňajúcej
6.1 gén hom kódujúci homoseríndehydrogenázu alebo alelu homdr kódujúcu homoseríndehydrogenázu rezistentnú na spätnú väzbu,
6.2 gén gap kódujúci glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázu,
6.3 gén pyc kódujúci pyruvátkarboxylázu,
6.4 gén mqo kódujúci malát:chinónoxidoreduktázu,
6.5 gén tkt kódujúci transketolázu,
6.6 gén zwf kódujúci glukóza-6-fosfátdehydrogenázu,
6.7 gén thrE kódujúci prenos treonínu,
6.8 gén zwal,
6.9 gén eno kódujúci enolázu.
7. Spôsob podlá nároku 2, vyznačujúci sa tým, že na prípravu L-aminokyselín, najmä L-lyzínu alebo L-treonínu sa fermentujú baktérie, v ktorých sa súčasne zoslabuje jeden alebo viac génov zvolených zo skupiny zahŕňajúcej
7.1 gén pck kódujúci fosfoenolpyruvátkarboxykinázu,
7.2 gén pgi kódujúci glukóza-6-fosfátizomerázu,
7.3 gén poxB kódujúci pyruvátoxidázu,
7.4 gén zwa2.
8. Spôsob podlá nárokov 2 až 6, vyznačuj úci sa t ý m , že na dosiahnutie zosilnenia sa pomocou transformácie mikroorganizmov plazmidovými vektormi nesúcimi tieto gény alebo nukleotidové sekvencie zvýši počet kópií génov alebo nukleotidových sekvencií.
9. Plazmidový vektor pEC-T18mob2 uložený pod označením DSM 13244 v E. coli K-12 DH5a, znázornený na obrázku 2.
10. Koryneformný mikroorganizmus, najmä rodu Corynebacterium transformovaný pomocou vloženia plazmidového vektora podlá nároku 9, ktorý prídavné obsahuje gén gnd.
Obrázokι i; Mapa plazmidu pEC-T18mob2
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US53126500A | 2000-03-20 | 2000-03-20 | |
| PCT/EP2000/006299 WO2001071012A1 (en) | 2000-03-20 | 2000-07-05 | Process for the fermentative preparation of l-amino acids with amplification of the gnd gene |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK16542001A3 true SK16542001A3 (sk) | 2002-07-02 |
Family
ID=24116938
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK1654-2001A SK16542001A3 (sk) | 2000-03-20 | 2000-07-05 | Spôsob fermentačnej prípravy L-aminokyselín pomocou zosilnenia génu gnd |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20030119154A1 (sk) |
| EP (1) | EP1179076B9 (sk) |
| KR (1) | KR100826815B1 (sk) |
| CN (1) | CN1350586A (sk) |
| AT (1) | ATE292687T1 (sk) |
| AU (1) | AU6431600A (sk) |
| BR (1) | BR0010817A (sk) |
| CA (1) | CA2374265A1 (sk) |
| DE (1) | DE60019280T2 (sk) |
| ES (1) | ES2240135T3 (sk) |
| MX (1) | MXPA01011643A (sk) |
| PL (1) | PL358912A1 (sk) |
| SK (1) | SK16542001A3 (sk) |
| WO (1) | WO2001071012A1 (sk) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1330526B1 (en) * | 2000-11-04 | 2010-04-21 | Evonik Degussa GmbH | Process for the fermentative preparation of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family |
| US20030017554A1 (en) * | 2000-11-15 | 2003-01-23 | Mechthild Rieping | Process for the fermentative preparation of L-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family |
| DE10210527A1 (de) | 2002-03-09 | 2003-09-18 | Degussa | Allele des aceA-Gens aus coryneformen Bakterien |
| JP5572279B2 (ja) * | 2004-05-20 | 2014-08-13 | 味の素株式会社 | コハク酸生産菌及びコハク酸の製造方法 |
| DE102005032426A1 (de) | 2004-12-18 | 2006-06-22 | Degussa Ag | Allele des gnd-Gens aus coryneformen Bakterien |
| US8647642B2 (en) | 2008-09-18 | 2014-02-11 | Aviex Technologies, Llc | Live bacterial vaccines resistant to carbon dioxide (CO2), acidic PH and/or osmolarity for viral infection prophylaxis or treatment |
| KR101335853B1 (ko) | 2011-12-01 | 2013-12-02 | 씨제이제일제당 (주) | Ｌ-아미노산 및 리보플라빈을 동시에 생산하는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-아미노산 및 리보플라빈을 생산하는 방법 |
| US10676723B2 (en) | 2015-05-11 | 2020-06-09 | David Gordon Bermudes | Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria |
| CN105602966B (zh) * | 2016-01-08 | 2019-03-15 | 广西大学 | 一种编码6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的基因及其应用 |
| US11129906B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-09-28 | David Gordon Bermudes | Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria |
| US11180535B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-11-23 | David Gordon Bermudes | Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria |
| CN114729339B (zh) * | 2021-01-29 | 2023-01-03 | Cj第一制糖株式会社 | 新真菌硫酮还原酶变体及使用其生产l-赖氨酸的方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2165546B (en) * | 1984-08-21 | 1989-05-17 | Asahi Chemical Ind | A plasmid containing a gene for tetracycline resistance and dna fragments derived therefrom |
| GB2223754B (en) * | 1988-09-12 | 1992-07-22 | Degussa | Dna encoding phosphoenolpyruvate carboxylase |
| DE3943117A1 (de) * | 1989-12-27 | 1991-07-04 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Verfahren zur fermentativen herstellung von aminosaeure, insbesondere l-lysin, dafuer geeignete mikroorganismen und rekombinante dna |
| DE4027453A1 (de) * | 1990-08-30 | 1992-03-05 | Degussa | Neue plasmide aus corynebacterium glutamicum und davon abgeleitete plasmidvektoren |
| JP2817400B2 (ja) * | 1993-10-28 | 1998-10-30 | 味の素株式会社 | 物質の製造法 |
| JPH09224662A (ja) * | 1996-02-23 | 1997-09-02 | Mitsubishi Chem Corp | ６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼおよびそれをコードするｄｎａ |
| ID29569A (id) * | 1999-07-09 | 2001-09-06 | Degussa Ag Cs | Urutan nucleotida yang menyandi gen opca |
| PT1208205E (pt) * | 1999-07-23 | 2006-12-29 | Archer Daniels Midland Co | Métodos para produzir l-aminoácidos por aumento do nadph celular |
-
2000
- 2000-07-05 ES ES00951336T patent/ES2240135T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-07-05 EP EP00951336A patent/EP1179076B9/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-07-05 CN CN00807548A patent/CN1350586A/zh active Pending
- 2000-07-05 AT AT00951336T patent/ATE292687T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-07-05 MX MXPA01011643A patent/MXPA01011643A/es unknown
- 2000-07-05 SK SK1654-2001A patent/SK16542001A3/sk unknown
- 2000-07-05 DE DE60019280T patent/DE60019280T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-07-05 BR BR0010817-0A patent/BR0010817A/pt not_active Application Discontinuation
- 2000-07-05 WO PCT/EP2000/006299 patent/WO2001071012A1/en not_active Ceased
- 2000-07-05 AU AU64316/00A patent/AU6431600A/en not_active Abandoned
- 2000-07-05 KR KR1020017014821A patent/KR100826815B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2000-07-05 PL PL00358912A patent/PL358912A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2000-07-05 CA CA002374265A patent/CA2374265A1/en not_active Abandoned
-
2002
- 2002-02-20 US US10/078,167 patent/US20030119154A1/en not_active Abandoned
-
2003
- 2003-10-17 US US10/686,736 patent/US20040063181A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1179076B1 (en) | 2005-04-06 |
| MXPA01011643A (es) | 2003-02-27 |
| CA2374265A1 (en) | 2001-09-27 |
| DE60019280D1 (de) | 2005-05-12 |
| PL358912A1 (en) | 2004-08-23 |
| WO2001071012A1 (en) | 2001-09-27 |
| EP1179076A1 (en) | 2002-02-13 |
| KR100826815B1 (ko) | 2008-05-02 |
| US20030119154A1 (en) | 2003-06-26 |
| EP1179076B9 (en) | 2005-11-30 |
| US20040063181A1 (en) | 2004-04-01 |
| AU6431600A (en) | 2001-10-03 |
| ATE292687T1 (de) | 2005-04-15 |
| ES2240135T3 (es) | 2005-10-16 |
| BR0010817A (pt) | 2002-03-05 |
| KR20010113832A (ko) | 2001-12-28 |
| CN1350586A (zh) | 2002-05-22 |
| DE60019280T2 (de) | 2006-05-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7504242B2 (en) | Process for the fermentative production of amino acids using coryneform bacteria in which OpcA gene expression is amplified | |
| US20040214219A1 (en) | Nucleotide sequences which code for the tal gene | |
| US20060014259A9 (en) | Process for the preparation of L-amino acids with amplification of the zwf gene | |
| US6872553B2 (en) | Nucleotide sequences which code for the pck gene | |
| EP1179073B1 (en) | Process for the fermentative preparation of l-amino acids with amplification of the zwf gene | |
| US20030175911A1 (en) | Process for the preparation of L-amino acids with amplification of the zwf gene | |
| EP1179076B9 (en) | Process for the fermentative preparation of l-amino acids with amplification of the gnd gene | |
| US7759056B2 (en) | Nucleotide sequence encoding the dapC gene and process for the production of L-lysine | |
| EP1179084B1 (en) | Process for the fermentative preparation of l-amino acids with amplification of the tkt gene | |
| US20050112733A1 (en) | Process for the preparation of L-amino acids with amplification of the zwf gene | |
| US20030109014A1 (en) | Process for the fermentative preparation of L-amino acids with amplification of the tkt gene | |
| US20020168732A1 (en) | Process for the fermentative preparation of L-amino acids using coryneform bacteria | |
| EP1709166A1 (en) | Process for the preparation of l-amino acids with amplification of the zwf gene | |
| US20020034794A1 (en) | Nucleotide sequences which encode the gpsA gene | |
| SK17952000A3 (sk) | Nukleotidové sekvencie kódujúce gén gpm a spôsob fermentatívnej výroby L-aminokyselín | |
| US20020042106A1 (en) | Nucleotide sequences which code for the cma gene |