SK16552002A3

SK16552002A3 - Stála, biologicky zlúčiteľná, dobre znášateľná mikroemulzia voda v oleji a jej použitie

Info

Publication number: SK16552002A3
Application number: SK1655-2002A
Authority: SK
Inventors: Francesco Autuori; Carlo Bianchini; Giuseppe Bottoni; Flavio Leoni; Paolo Mascagni; Valmen Monzani; Oreste Piccolo
Original assignee: Italfarmaco S. P. A.
Priority date: 2000-05-26
Filing date: 2001-05-23
Publication date: 2003-05-02
Also published as: KR100802625B1; NO334880B1; DE60118395D1; HU228926B1; HUP0301921A3; WO2001089479A3; HUP0301921A2; CY1105262T1; IT1318539B1; KR20030011856A; BR0111016A; RU2272615C2; ITMI20001173A0; DK1283700T3; WO2001089479A2; NO20025621D0; YU88202A; AU2001281786B8; EP1283700A2; HRP20020929A2

Description

Stála, biologicky zlučiteľná, dobre znášateľná mikroemulzia voda v oleji a jej použitie

Oblasť techniky

Vynález sa týka farmaceutických prostriedkov s riadeným uvoľňovaním na parenterálne podávanie účinných látok, ktoré sú hydrofilné, alebo sú upravené na hydrofilné vhodnou derivatizáciou, vo forme stálych, biologicky kompatibilných a ľahko pripraviteľných mikroemulzií typu voda v oleji (w/o). Je potrebné, aby sa peptidové farmaceutický účinné látky alebo biologicky aktívne oligo- alebo polysacharidy chránili proti okamžitému napadaniu hydrolytickými enzýmami prítomnými v živých organizmoch ako aj pri riadenom uvoľňovaní uvedených účinných látok; vhodnou ochranou sú výhodne formulované uvedené mikroemulzie. Uvedené mikroemulzie na terapeutické použitie možno podávať injekčné bez problémov alebo bez významných vedľajších účinkov, možno ich ľahko pripraviť aj v priemyselnom meradle a znamenajú významné technické zlepšenie.

Doterajší stav techniky

Mikroemulzie možno všeobecne definovať ako opticky izotropné systémy, nie dvojlomné pri pozorovaní v polarizovaom svetle, transparentné, termodynamicky stále, s extrémne malou veľkosťou, s priemerom kvapôčok v rozmedzí od 5 do 200 nm, pripravené dispergáciou dvoch nemiesiteľných kvapalín, ktoré sú stabilizované prítomnosťou emulgátorov; emulgátory modifikujú chemicko-fyzikálne vlastnosti i .

povrchu oddeľujúceho uvedené dve kvapaliny, podstatne znižujú až k nule medzifázové napätie. Mikroemulziu zvyčajne vytvárajú olej, voda, povrchovo aktívna látka (alebo tenzid) a voliteľne ko-tenzid; sklon k tvorbe mikroemulzií typu voda v oleji (w/o) alebo olej vo vode (o/w) závisí od vzájomných pomerov vodných a olejových fáz ako aj od druhu tenzidu. Sústavy, v ktorých jednotlivé zložky sú voda, hydrofóbna zlúčenina a zmes tenzidu a ko-tenzidu podľa experimentálnych výsledkov môžu v ternárnych fázových diagramoch zahŕňať jednofázovú plochu, v ktorej jestvujú mikroemulzie typu w/o a o/w a sú stále. Napríklad, Aboofazeli s

-2dälšími (Int. J. Pharm. 111, 63 až 72 (1994)) študovali schopnosť rôznych zlúčenín s ko-tenzidových účinkom vytvárať mikroemulzie. Uvedenými autormi študovaný systém pozostával zo zmesí esteru mastných kyselín, zmesi lecitínu - ko-tenzidu (1:1) a vody v rôznych pomeroch. Poradie zlúčenín použitých ako ko-tenzidy podľa ich účinku sa určilo nasledovne: primárne aminy > alkoholy > mastné kyseliny. Ďalej sa overilo, že účinnosť je vo vzťahu k dĺžke alkylového reťazca alkoholu a príslušnej mastnej kyseliny; teda v poradí butanol > pentanol > hexanol > kyselina pentánová > kyselina hexánová. Na základe uvedených experimentálnych údajov sa alkoholy, ako je butanol a pentanol a v menšej miere aj zodpovedajúce mastné kyseliny javia ako najlepší kandidáti ko-tenzidov. Použitie opisovaných zlúčenín umožňuje pripraviť stabilné w/o mikroemulzie, ale ich použitie nezabezpečuje tolerantnosť organizmu na uvedené formulácie, najmä v systémoch s dlhodobým dodávaním liečiva do organizmu (depot), kedy sú subskutánne alebo intramuskulárne tkanivá v styku s formuláciou dni alebo týždne.

Literatúra naviac uvádza, že pomer ko-tenzidu k tenzidu je kritický; údaje uvádzané Aboofazelim a ďalšími sa týkajú pomeru 1:1 uvedených látok. Atwood a ďalší (Int. J. Pharmacy 84, R5 (1992)) študoval vlastnosti zmesí lecitín/voda/ester mastnej kyseliny/butanol pričom pomer tenzid/ko-tenzid bol zvýšený od približne

1,7 do 3. Uvedení autori dokázali, že zníženie množstva ko-tenzidu v prospech lecitínu dramaticky obmedzuje plochu, v ktorej sú prítomné w/o mikroemulzie, ešte aj pri použití výrazne účinného ko-tenzidu ako je butanol.

Tenzidy sa všeobecne hodnotia podľa empirickej stupnice, známej hydrofilnej-lipofilnej rovnováhy (hydrophile-lipophile balance, HLB), ktorá označuje tenzidy hodnotami v rozmedzí od 1 do 40. Vhodné tenzidy pre mikroemulzie typu w/o majú spravidla nízku hodnotu HLB zatiaľ čo tenzidy vhodné pre o/w mikroemulzie majú HLB hodnotu vysokú. Ak je medzifázové napätie <2.10'² dyn.cm'¹, je vznik mikroemulzií možný. Voliteľná prítomnosť ko-tenzidu umožňuje zvýšenie medzifázovej tekutosti keď ko-tenzidové molekuly prenikajú medzi molekuly tenzidu čím vytvárajú dishomogénny povrchový film. Ko-tenzidy môžu tiež znižovať hydrofilnosť vodnej fázy a tým aj medzifázové napätie medzi uvedenými dvoma fázami. Použitie kotenzidov je v zásade výhodné tým, že umožňuje zníženie množstva potrebného tenzidu, pričom zvyšuje stálosť mikroemulzie; ako už bolo uvedené; je ale výhodné

-3čo najviac znížiť jeho množstvo, nakoľko ko-tenzid je potenciálne toxický, najmä v prípade dlhšie trvajúceho styku nosiča s subkutánnym alebo intramuskulárnym tkanivom.

Sú známe viaceré výhody použitia mikroemulzií ako nosičov pre účinné látky.

Pri určitých pomeroch medzi zložkami sa mikroemulzie môžu vytvárať spontánne bez potreby vysokej energie na ich prípravu; preto je ich príprava aj v priemyselnej mierke ľahká. Uvedené spontánne mikroemulzie sú termodynamicky stále, homogénne a transparentné tak, že ich možno monitorovať spektrometrickými technikami. Možno pripraviť mikroemulzie so stredným priemerom kvapôčok < 100 nm, ktoré možno sterilizovať za studená filtráciou cez 0,22 mikrometrové membrány komerčných filtrov. Mikroemulzie spravidla umožňujú podávanie zle rozpustných alebo málo stálych liečiv.

Keď je nadbytok dispergovanej fázy alebo pri zmenách teploty môžu uvedené systémy prejavovať fázovú inverziu; táto vlastnosť môže ovplyvňovať biologickú využiteľnosť účinnej látky mechanizmom, ktorý doteraz nebol vyjasnený.

Uvedené w/o mikroemulzie môžu riadiť uvoľňovanie účinnej zložky alebo predlžovať jej stálosť v fyziologických tekutinách tak, že ich ochraňujú pred hydrolytickými enzýmami. Jestvuje značný počet publikovaných prehľadov zaoberajúcich sa mikroemulziami, napríklad Industrial Application of Microemulsions, Marcel Dekker Ed., 1997, kde v kapitole Mikroemulzie v oblasti farmácie, perspektívy a aplikácie sa autori zaoberajú ich využiteľnosťou vo farmácii, a Handbook of Microemulsions Technology Ed. Kumar Mittal (1999); táto publikácia sa týka chemicko-fyzikáinych hľadísk mikroemulzií.

Použitie w/o mikroemulzií ako nosičov na dosiahnutie riadeného uvoľňovania

I účinných zložiek, ktoré sú hydrofilné alebo ich možno upraviť na hydrofilné vhodnou derivatizáciou, je v patentovej literatúre známe.

Podrobnejšie, parenterálne podávanie w/o mikroemulzií obsahujúcich biologicky odbúrateľné molekuly ako sú peptidy sa opisuje v štúdii (M. R. Gasco a ďalší, Int. J. Pharm. 62, 119 (1990)); v tejto štúdii LHRH hormónový analóg, formulovaný v mikroemulzií obsahujúcej zložky považované za biokompatibilné a obsahujúcej 500 pg.mľ¹ účinnej zložky, podávaný intramuskulárnou injekciou v dávkach 3 mg.kg'¹ dospelým samcom potkana o hmotnosti približne 200 g, znížil

-4hladiny testosterónu v plazme na dobu až do 30 dní po injekčnom podaní; uvedené hladiny boli nižšie ako hladiny pozorované v druhej skupine myší ošetrovaných opakovanými injekciami (jedna injekcia denne počas 28 dní) v dávkach 100 pg.kg'¹účinnej zložky v tlmivom roztoku.

Treba ale poznamenať, že uvedené zníženie koncentrácie testosterónu nebolo počas pozorovania homogénne a bolo terapeuticky účinné až po 8 dňoch po podaní.

Toto oneskorenie nástupu terapeutického účinku nie je veľmi výhodné, najmä pri liečbe nádoru prostaty o ktorom je známe že pre svoj rast vyžaduje testosterón; preto čím skôr sa zastaví normálna produkcia testosterónu, tým je liečba viac účinná.

Uvedená publikácia poukazuje na účinnosť w/o mikroemulzie na riadené uvoľňovanie peptidu, pozostávajúcej z etyloleátu (60,5 %), vody (10,1 %), fosfatidylcholínu (18,9 %) a kyseliny kaprónovej, (10,5 %). Pomer tenzidu (fosfatidylcholínu) ku ko-tenzidu (kyselina kaprónová) je 1,8. Zložky uvedenej mikroemulzie, posudzované jednotlivo sú autormi publikácie považované za biokompatibilné. Neuvádza sa nijaká zmienka o biokompatibilite mikroemulzie ako celku ani o stave subkutánneho tkaniva v styku s formuláciou.

Podľa zásad uvedených v spomenutej publikácii sa pripravila w/o emulzia obsahujúca áko účinnú zložku s LHRH aktivitou leuprolidacetát; mikroemulzia pozostávala z etyloleátu (66,9 %), vody (9,7 %), fosfatidylcholínu (19,4 %) a zo zmesi kyseliny kaprónovej/kyseliny maslovej (pomer 3:1) (3,9 %). Podľa tejto publikácie sa použila zmes s kyselinou maslovou miesto samotnej kyseliny kaprónovej aby sa minimalizoval podiel ko-tenzidu; v tomto prípade je pomer tenzidu ku ko-tenzidu 4,9 miesto1,8. Pokusy in vivo vykonané subkutánnym injekčným podaním produktu potkanom potvrdili účinnosť mikroemulznej formulácie, ale neočakávane tiež poukázali na znepokojujúcu miestnu ulcerogénnosť a pretrvávajúcu tvorbu subkutánnych granulómov. Tento farmaceutický neakceptovateľný výsledok, hoci s použitím nižšieho množstva ko-tenzidu, ukázal, že biokompatibilita jednotlivých zložiek mikroemulzie nie je dostatočným ukazovateľom na zabezpečenie biokompatibility zmesi tvoriacej mikroemulziu ako celok, ak sa formulácia použije na parenterálne podávanie.

-5Podobne, zmesi opísané a nárokované v rôznych patentoch, napríklad v WO 94/08 610, poskytujú stabilné mikroemulzie na možné riadenie uvoľňovania účinnej zložky v čase, ale v súvislosti s nimi sa neuvádza, ako môže skúsený odborník v danej oblasti dosiahnuť riadené uvoľňovanie hydrofilnej účinnej látky za súčasného zabránenia podobným vedľajším účinkom. Uvedené mikroemulzie zvyčajne obsahujú vodu, olejovú zložku, tenzid, ko-tenzid a voliteľne elektrolyty v rôznych pomeroch. V citovanom opise sa nehodnotí ani biokompatibilita mikroemulzie in toto (ako celku), ani sa neuvádzajú potrebné pomery zložiek zmesi k účinnej zložke aby sa dosiahla stálosť účinnej zložky, tak aj mikroemulzie, ako aj biokompatibilita celej formulácie.

Uvedené patenty na druhej strane špecificky neuvažujú problémy týkajúce sa tolerability v spojení s intramuskulárnym (i.m.) alebo subkutánnym (s.c.) podávaním, čo sú najvhodnejšie a najľahšie spôsoby parenterálneho podávania.

Vo viacerých patentoch, medzi inými aj v patente USA 3 976 071, sa opisujú a nárokujú alternatívne technológie použité v priemyselnej mierke na prípravu prostriedkov s riadeným uvoľňovaním peptidov, pričom uvoľňovanie sa dosahuje použitím biologicky odbúrateľných polymérov do ktorých je zabudovaná účinná zložka. Typické príklady biologicky odbúrateľných polymérov sú polyméry na báze kyseliny glykolovej a kyseliny mliečnej. Uvedené technológie majú nevýhodu v tom, že sú pomerne drahé a poruchové v porovnaní s hore opísanými mikroemulziami a pri príprave ďalej vyžadujú použitie organických, najmä chlórovaných rozpúšťadiel, čo vyvoláva problémy najmä s narušením životného prostredia a s bezpečnosťou farmaceutickej formulácie.

Na druhej strane sú uvedené formulácie výhodné, nakoľko nespôsobujú pretrvávajúce granulómy a nevyvolávajú miestnu ulcerogénnosť.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu sú farmaceutické prostriedky s riadeným uvoľňovaním vo forme stálych w/o mikroemulzií, ktoré možno ľahko pripraviť, možno ich sterilizovať a nespôsobujú významné systémové alebo miestne vedľajšie účinky, sú vhodné na parenterálne podávanie; výhodne na i.m. alebo s.c. podávanie účinných zložiek,

-6ktoré sú hydrofilné alebo ich možno upraviť na hydrofilné vhodnou derivatizáciou, čím sa dosiahne významné technické zlepšenie v porovnaní s doteraz známou technikou.

Pôvodcovia vynašli spôsob, založený na klinických, posmrtných a histologických vyšetreniach živočíchov liečených hore uvedenými mikroemulziami, vhodný na úplné zhodnotenie biokompatibilty ktorejkoľvek z formulácií vhodných na podávanie s riadeným uvoľňovaním.

Podľa uvedeného spôsobu a podľa údajov z literatúry (Protein Formulation and Delivery, F. J. McKelly 2000, strany 245 až 247) sa mikroemulzia považuje za farmaceutický prípustnú, keď menej alebo viac zreteľné miestne opuchnutie, v závislosti od podanej dávky, je v každom prípade vratné; na druhej strane sa pozoruje podobná tkanivová odozva aj u materiálov považovaných za biologicky odbúrateľné, pričom ich odozva je zrejme dôležitá pre ovplyvnenie riadeného uvoľňovania liečiva v čase. Za neakceprovateľný prejav sa naopak považuje miestna intolerancia vo forme pretrvávajúcej ulcerizácie.

Uvedené mikroemulzie podľa tohto vynálezu pozostávajú z až 20 % vnútornej - dispergovanej hydrofilnej vodnej fázy obsahujúcej účinnú zložku, z 30 až 98 % hydrofóbnej externej - spojitej fázy a až do 50 % samotného tenzidu alebo jeho zmesi s ko-tenzidom. Mikroemulzia výhodne obsahuje < 35 % tenzidu a ko-tenzidu, s pomerom tenzid/ko-tenzid > 2, najvýhodnejšie > 3,5.

V mikroemulzii môžu byť prítomné aj ďalšie biologicky kompatibilné prísady a pomocné látky, ktoré neovplyvňujú stálosť mikroemulzie.

Vhodné tenzidy do mikroemulzii podľa tohto vynálezu sa vyberú z prírodných alebo syntetických glycerofosfolipidov obsahujúcich zvyšky C4-C20- nasýtených alebo nenasýtených mastných kyselín, ktoré majú fosfoesteróvú štruktúrnu skupinu a zvyšok cholínu, etanolamínu, serínu, glycerolu; cholesterolu; C12-C20- esterov mastných kyselín cukrov ako je sorbitol, galaktóza, glukóza, sacharóza; polyoxyetylénsorbitanových esterov Ci2-C2o-mastných kyselín.

Voliteľne prítomné ko-tenzidy sa vyberú z C8-C₂o-mastných kyselín, C2-C14polyhydroxyalkánov, najmä propylénglykolu, hexándiolu a glycerolu, C₂-C₁₂alkoholov, esterov kyseliny mliečnej s C2-C8-alkoholmi.

-7Hydrofóbna spojitá fáza sa vyberie z nasledujúcich zlúčenín, samotných alebo v zmesi: estery C8-C20- nasýtených alebo nenasýtených karboxylových kyselín s C2-C8- alkoholmi, alebo mono-, di- a triglyceridy C8-C20- mastných kyselín, alebo rastlinné oleje vhodné na parenterálne podávanie ako je sójový olej, podzemnicový olej, sezamový olej, olej zo semien bavlníka, slnečnicový olej.

Mikroemulzie podľa tohto vynálezu sa ďalej vyznačujú hodnotou pH v rozmedzí od 4,5 do 7,5, výhodne od 5 do 7; pokiaľ uvedené pH nie je inherentnou vlastnosťou mikroemulzného farmaceutického prostriedku, výhodne sa upraví pridaním vhodného množstva prírodnej aminokyseliny do mikroemulzie bez ovplyvnenia jej stálosti a strednej veľkosti kvapôčok.

Uvedené w/o mikroemulzie podľa tohto vynálezu sú vhodné najmä ako nosiče peptidov, najmä LHRH analógov ako je leuprolidacetát, goserilín, triprorelín, nafarelínacetát, histrelín, cetrorelix alebo príslušné acetáty, alebo peptidov ako je somatostatín alebo jeho analógy ako octreotid a lanreotidacetát.

Mikroemulzie podľa tohto vynálezu sú ďalej vhodné najmä ako nosiče pre polysacharidy, najmä pre nefrakcionovaný heparín alebo heparíny s nízkou molekulovou hmotnosťou.

Mikroemulzie podľa tohto vynálezu umožňujú prípravu formulácií s riadeným uvoľňovaním hydrofilnej účinnej zložky. Formulácie s riadeným uvoľňovaním podľa ďalšieho hľadiská tohto vynálezu, nevyvolávajú miestnu ulcerigénnosť a spôsobujú iba nepretrvávajúce granulómy, ktoré sa vstrebávajú počas doby účinku liečiva. V prípade LHRH-typu peptidov, najmä v prípade leuprolidu, goserelínu, triptorelínu, nafarelínacetátu, histrelínu, cetrorelixu a ich acetátov možno dosiahnuť riadené uvoľňovanie počas najmenej 30 dní. V prípade somatostatínu, octreotidu a lanreotidu možno riadené uvoľňovanie dosiahnuť po dobu najmenej 8 dní.

Vynález sa ďalej týka použitia mikroemulzie podľa vynálezu, obsahujúcej leuprolid, goserelín, triptorelín, nafarelínacetát, histrelín, cetrorelix alebo ich octany na prípravu liekov na potláčanie produkcie testosterónu po jednom podaní liečiva na najmenej 30 dní, pričom hladina testosterónu poklesne už po 48 hodinách po podaní liečiva.

-8Vynález sa týka tiež použitia mikroemulzií obsahujúcich octreotid alebo jeho analógy na prípravu lieku na potláčanie produkcie rastového hormónu po jednom podaní počas najmenej 8 dní.

Vynález sa ďalej týka použitia mikroemulzií obsahujúcich nefrakcionovaný heparín alebo heparíny s nízkou molekulovou hmotnosťou na prípravu liekov s riadeným uvoľňovaním, podaných iba raz.

Vynález sa ďalej ozrejmuje nasledujúcimi príkladmi.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Na obr. 1 je znázornený vplyv mikroemulzií z Príkladu 1 a Príkladu 2 na hladiny testosterónu v plazme potkanov.

Na obr. 2 je znázornené hodnotenie pomeru dávka/účinnosť mikroemulzie obsahujúcej leuprolidacetát.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Príprava w/o mikroemulzie obsahujúcej leuprolidacetát

a) Príprava vodnej fázy

V 10 ml vody na injekcie s prídavkom 200 mg lyzínu sa rozpustí 350 mg leuprolidacetátu.

b) Príprava olejovej fázy

Vo osobitnej vhodnej nádobe, termostatovanej na 60 až 70 °C sa zmiešajú: 60 g etyloleátu, 25 g sójového lecitínu (čistoty >95 %) a 5 g kyseliny kaprylovej. Výsledný číry homogénny roztok sa ochladí na teplotu miestnosti.

c) Príprava mikroemulzie

Vodná fáza (roztok a) sa za miešania pridá do olejovej fázy (roztok b) a získa sa opticky transparentná, homogénna mikroemulzia. Na základe použitého

-9množstva lyzínu a rozpustenej časti kyseliny kaprylovej vo vodnej fáze sa vyhodnotila hodnota pH približne 6.

Uvedená mikroemulzia sa sterilizovala filtráciou vhodnou 0,22 pm membránou.

Obsah leuprolidacetátu v uvedenej mikroemulzii sa stanovil HPLC analýzou v podmienkach:

Stacionárna fáza: Vydac C18 5μ kolóna (250 x 4 mm)

Mobilná fáza A: H₂O + 0,1 % TFA

B: CH₃OH + O,1 %TFA Gradient: 20 minút, 100 % A do 100 % B

Prietok: 0,8 ml.min'¹

Detektor: UV 214 nm

Stanovený obsah leuprolidacetátu je 3 mg.ml'¹.

Príklad 2

Príprava w/o mikroemulzie obsahujúcej leuprolidacetát

Postupovalo sa ako v Príklade 1 s výnimkou, že sa v 10 ml vody rozpustilo 600 mg leuprolidacetátu.

Príklad 3

Príprava w/o mikroemulzie obsahujúcej leuprolidacetát

Postupovalo sa ako v Príklade 1 s výnimkou, že sa nepridal lyzín. Počítané pH bolo približne 3.

Príklad 4

Príprava w/o mikroemulzie obsahujúcej leuprolidacetát

Postupovalo sa ako v Príklade 1 s výnimkou, že sa v 10 ml vody rozpustilo

900 mg leuprolidacetátu.

- 10Príklad 5

Príprava w/o mikroemulzie obsahujúcej leuprolidacetát

Postupovalo sa ako v Príklade 1 s výnimkou, že sa zmenilo množstvo tenzidu a ko-tenzidu na 15 g sójového lecitínu a 3 g kyseliny kaprylovej. Hoci pomer medzi uvedenými dvoma zložkami ostal nezmenený (5:1) celkové množstvo zmesi tenzidu s ko-tenzidom sa v tomto príklade zmenilo z 30 % na 18 %.

Príklad 6

Príprava w/o mikroemulzie obsahujúcej octreotid

Postupovalo sa ako v Príklade 1 s výnimkou, že sa v 10 ml vody rozpustili 3 g octreotidu miesto 350 mg leuprolidacetátu.

Príklad 7

Príprava w/o mikroemulzie obsahujúcej heparín

Postupovalo sa ako v Príklade 1 s výnimkou, že sa v 10 ml vody rozpustilo 50 mg nefrakcionovaného heparínu vo forme vápenatej alebo sodnej soli miesto 350 mg leuprolidacetátu.

Príklad 8

Príprava w/o mikroemulzie obsahujúcej leuprolidacetát

Postupovalo sa ako v Príklade 1 s výnimkou, že sa zmenilo kvalitatívne zloženie olejovej fázy: etyloleát (66,9 %), fosfatidylcholín (19,4 %) a zmes kyseliny kaprónovej a kyseliny maslovej (3:1) (spolu 3,9 %).

Príklad 9

Príprava w/o mikroemulzie obsahujúcej leuprolidacetát

a) Príprava vodnej fázy

- 11 V 0,6 ml vody na injekcie s prídavkom 8 mg lyzínu sa rozpustilo 60 mg leuprolidacetátu

b) Príprava olejovej fázy

Vo vhodnej nádobe pri zahrievaní na 50 °C sa za miešania zmiešalo 2,1 g etyloleátu, 215 mg polyoxyetylénsorbitanu monooleátu a 1 g sójového lecitínu. Výsledná číra homogénna zmes sa ochladila na teplotu miestnosti.

Vodný roztok sa pomaly za miešania pridal po častiach do olejovej zmesi a získala sa opticky číra mikroemulzia obsahujúca 1,5 % leuprolidacetátu.

Príklad 10

Príprava w/o mikroemulzie obsahujúcej leuprolidacetát

a) Príprava vodnej fázy

V 0,2 ml vody na injekcie s prídavkom 4,1 mg lyzínu sa rozpustilo 60 mg leuprolidacetátu

b) Príprava olejovej fázy

Vo vhodnej nádobe pri zahrievaní na 50 °C sa za miešania zmiešalo 1,2 g etyloleátu, 0,5 g polyoxyetylénsorbitanu monooleátu a 0,1 g kyseliny kaprylovej. Výsledná číra homogénna zmes sa ochladila na teplotu miestnosti.

Vodný roztok sa pomaly za miešania pridal po častiach do olejovej zmesi a získala sa opticky číra mikroemulzia obsahujúca 3 mg.ml'¹ leuprolidacetátu.

Príklad 11

Príprava w/o mikroemulzie obsahujúcej octreotidacetát

a) Príprava vodnej fázy

V 0,2 ml vody na injekcie s prídavkom 0,2 g propylénglykolu a 4 mg lyzínu sa rozpustilo 20 mg octreotidacetátu;

b) Príprava olejovej fázy

- 12Vo vhodnej nádobe pri zahrievaní na 50 °C sa za miešania zmiešalo 0,98 g etyloleátu, 0,5 g sójového lecitínu a 0,1 g kyseliny kaprylovej. Výsledná číra homogénna zmes sa ochladila na teplotu miestnosti.

Vodný roztok sa pomaly za miešania pridal po častiach do olejovej zmesi a získala sa opticky číra mikroemulzia obsahujúca 10 mg.ml'¹ octreotidacetátu.

Príklad 12

Príprava w/o mikroemulzie obsahujúcej octreotidacetát

a) Príprava vodnej fázy

V 0,1 ml vody na injekcie s prídavkom 2 mg lyzínu sa rozpustilo 10 mg octreotidacetátu;

b) Príprava olejovej fázy

Vo vhodnej nádobe pri zahrievaní na 50 °C sa za miešania zmiešalo 0,59 g etyloleátu, 0,25 g sójového lecitínu a 0,05 g kyseliny kaprylovej. Výsledná číra homogénna zmes sa ochladila na teplotu miestnosti.

Vodný roztok sa pomaly za miešania pridal po častiach do olejovej zmesi a získala sa opticky číra mikroemulzia obsahujúca 1 % octreotidacetátu.

Príklad 13

Príprava w/o mikroemulzie obsahujúcej octreotidacetát

Vo vhodnej nádobe pri zahrievaní na 50 °C sa za miešania zmiešalo 0,59 g etyloleátu, 0,25 g sójového lecitínu a 0,05 g kyseliny kaprylovej. Výsledná číra homogénna zmes sa ochladila na teplotu miestnosti. Do olejovej fázy sa postupne za miešania pridalo 0,1 ml vody na injekcie, obsahujúcej 2 mg lyzínu. Do výslednej opticky čírej mikroemulzie sa za miešania pridalo 10 mg octreotidacetátu. Účinná zložka sa zabudovala do uvedenej mikroemulzie v priebehu niekoľkých sekúnd. Mikroemulzia sa filtrovala 0,22 pm polysulfónovým filtrom. Výsledná opticky číra

-13mikroemulzia sa analyzovala HPLC a mala koncentráciu octreotidacetátu 6,35 mg.ml'¹.

Príklad 14

Príprava w/o mikroemulzie obsahujúcej myoglobín

a) Príprava vodnej fázy

V 1,5 ml vody na injekcie s prídavkom 10 mg lyzinu sa rozpustilo 5,5 mg myoglobínu.

b) Príprava olejovej fázy

Vo vhodnej nádobe pri zahrievaní na 50 °C sa za miešania zmiešalo 2 g etyloleátu, 1,2 g sójového lecitínu a 0,25 g kyseliny kaprylovej. Výsledná číra homogénna zmes sa ochladila na teplotu miestnosti.

Vodný roztok sa pomaly za miešania pridal po častiach do olejovej zmesi a získala sa opticky číra mikroemulzia obsahujúca 1,3 mg.ml'¹ myoglobínu.

Príklad 15

Hodnotenie účinnosti mikroemulzií obsahujúcich leuprolidacetát, pripravených v Príkladoch 1 a 2

Tri skupiny samčekov potkana Sprague Dawley (10 v každej skupine) sa pred liečbou chovali 5 dní na vode a krmive ad libitum.

Pripravili sa dve mikroemulzie spôsobom, opísaným v Príkladoch 1 a 2 s rozdielnou koncentráciou leuprolidacetátu, menovite 3 mg.ml'¹ (Príklad 1) a 6 mg.ml'¹ (Príklad 2) a podávali sa v jednej dávke každému v skupine v dávke účinnej látky, zodpovedajúcej 0,750 mg.kg'¹.

Kontrolné zvieratá (3 v každej skupine) dostali roztok soli.

V odobratých vzorkách krvi sa určovala hladina testosterónu v dňoch 1, 2, 3, 4, 7, 14, 21,28, 42 a 56 po podaní. Vzorky krvi sa odstredili a testosterón v séru sa stanovil súpravou EIA.

Výsledky sa uvádzajú na Obr. 1.

- 14V nasledujúcej Tab.1 sú zhrnuté údaje o hmotnosti orgánov ošetrených zvierat.

Tabuľka 1

Vplyv mikroemulzií pripravených spôsobmi uvedenými v Príkladoch 1a 2 na hmotnosť reprodukčných orgánov a telesnú hmotnosť potkanov

Mikroemulzia	Hmotnosť v g po 28 dňoch
telesná hmotnosť	testes	prostata	semenné váčky
soľný roztok	570±13,2	3,73±0,09	0,72±0,07	1,95±0,010
z Príkladu 1	546,6±8,8	1,84±0,11*	0,33±0,03*	0,49±0,08*
z Príkladu 2	532,8±4,6	1,68±0,14*	0,22±0,03*	0,25±0,03*
	Hmotnosť v g po 56 dňoch
telesná hmotnosť	testes	prostata	semenné váčky
soľný roztok	631,2±10,0	3,54±0,05	0,80±0,05	1,96±0,26
z Príkladu 1	600,0±16,4	2,39±0,17*	0,50±0,03**	1,39±0,14
z Príkladu 2	626,6±25,5	2,5±0,21***	0,51±0,08**	1,43+0,22

Údaje sú vyjadrené ako stredná hodnota ± štandardná odchýlka v skupine (5 zvierat);

* < 0,001; ** p < 0,05; *** p < 0,01 vzhľadom na roztok soli (ANOVA test a Bonferroniho t-test pre násobné porovnávania).

Formulácie podľa tohto vynálezu, nezávisle od koncentrácie účinnej látky v mikroemulzií nespôsobujú nijaké podstatné systémové alebo miestne vedľajšie účinky a umožňujú riadené uvoľňovanie účinnej zložky počas najmenej 30 dní a terapeutickú účinnosť už od 48 hodín po injekčnom podaní.

Účinnosť je porovnateľná s komerčnou depotovou formuláciou Enantone, založenou na biologicky odbúrateľných polyméroch.

- 15Príklad 16

Hodnotenie subkutánnej tolerantnosti mikroemulzií

Skúška na hodnotenie subkutánnej tolerantnosti sa uskutočnila injektovaním skupín najmenej 9 potkanov jednou dávkou mikroemulzií uvedených v nasledujúcej Tab. 2.

Po 48 hodinách, 7 dňoch a 14 dňoch po podaní sa uskutočnili klinické, posmrtné a histologické vyšetrenia.

Tabuľka 2

Zlúčenina	Množstvo (mg)	Prítomnosť opuchnutia (priemerný stupeň*)	Prítomnosť ulcerácie
		48 hodín	7 dní	14 dní	48 hodín	7 dní	14 dní
Mikroemulzia A⁽¹⁾	125 μΙ	2	2	1	nie	nie	nie
Mikroemulzia A⁽¹⁾	500 μΙ	3	3	2,5	nie	nie	nie
Mikroemulzia B⁽²⁾	125 μΙ	3	3	3	áno	áno	áno

Poznámka:

(1) - mikroemulzia pripravená spôsobom uvedeným v Príklade 1;

(2) - mikroemulzia pripravená spôsobom uvedeným v Príklade 8;

* - stupeň opuchnutia: 1 = slabý prejav, 2 = mierny prejav, 3 = silné opuchnutie.

Pri tejto skúške sa považujú za biologicky znášateľné formulácie tie, ktoré nespôsobujú pretrvávajúcu ulceráciu, pričom opuchnutie je funkciou množstva injektovaného produktu a rýchlosti eliminácie etyloleátu z subkutánneho tkaniva ako to opisuje Howard a ďalší v Int. J. Pharm. 16, 31 až 39 (1983).

Príklad 17

Hodnotenie účinnosti in vivo mikroemulzie obsahujúcej octreotidacetát

- 16Šiestim samčekom potkana s hmotnosťou 175 až 200 g sa podala dávka zodpovedajúca 6 mg/potkana mikroemulzie obsahujúcej octreotid, pripravenej spôsobom uvedeným v Príklade 11. Pred podaním zlúčeniny a po 0,5 hodine, 24 hodinách, 4, 6 a 8 dňoch po ošetrení sa odobrali vzorky plazmy.

Z plazmy sa extrahoval octreotid a analyzoval prístrojovou zostavou LC-MSMS vrátane zhotovenia kalibračnej krivky. Hladiny octreotidu v plazme sa uvádzajú v nasledujúcej Tab.3.

Tabuľka 3

Vzorkovanie v čase:	0,5 hodiny	24 hodín	4 dni	6 dní	8 dní
octreotid (ng.mľ¹)	539	40,2	62,5	4,5	7,6

Významné hladiny octreotidu sa zistili ešte aj 8 dní po podaní.

Príklad 18

Hodnotenie pomeru dávky/účinnosť mikroemulzie obsahujúcej leuprolidacetát

Formulácia obsahujúca leuprolidacetát, pripravená spôsobom uvedeným v Príklade 2 sa podala potkanom v jednej dávke 2,25 mg.kg'¹ (pokus). Kontrolné zvieratá obdržali zodpovedajúcu dávku roztoku soli (kontrola).

Vo vzorkách plazmy sa vyhodnocovali hladiny testosterónu v krvi v dňoch 0, 1,2, 3, 5, 7, 14, 21,28, 42 a 56. Vzorky krvi sa odstredili a pomocou súpravy ELISA sa stanovil sérový testosterón. ₍

Výsledky sa uvádzajú na Obr. 2. Zistené hodnoty týkajúce sa hmotnosti orgánov pokusných zvierat sú zhrnuté v nasledujúcej Tab. 4

Tabuľka 4

Vplyv leuprolidacetátu v mikroemulzii v porovnaní s roztokom soli na telesnú hmotnosť a na hmotnosť reprodukčných orgánov potkanov

	Hmotnosť v g v 56 deň po podaní
telesná hmotnosť	testes	prostata	semenné váčky
kontrolná skupina	645±34	3,73±0,16	0,82±0,04	1,96±0,09
pokusná skupina	608±35	1,94±0,42 (p<0,01)	0,35±0,14 (p<0,5)	0,55±0,16 (<0,05)

Z Obr. 2 a Tab. 4 je celkom zrejmé zníženie hladín testosterónu v plazme a zníženie hmotnosti reprodukčných orgánov v 56 deň po podaní mikroemulzie.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Stála, biologicky zlučiteľná, dobre znášateľná mikroemulzia voda v oleji, vhodná na parenterálne podávanie biologicky účinných zlúčenín, ktoré sú hydrofilné, alebo ktoré možno upraviť na hydrofilné vhodnou derivatizáciou, umožňujúca riadené uvoľňovanie účinných zlúčenín v nej obsiahnutých, vyznačujúca sa tým, že obsahuje:

a) až do 20 % dispergovanej hydrofilnej vodnej fázy obsahujúcej terapeuticky účinnú hydrofilnú zlúčeninu;

b) 30 až 98 % spojitej hydrofóbnej fázy;

c) až do 50 % tenzidu v zmesi s ko-tenzidom, vybraným zo skupiny zahrnujúcej C₈-C₂o-mastné kyseliny; C₂-C₁₄-polyhydroxyalkány; C₂-Ci₂ alkoholy; estery C₂-C₈alkoholov s kyselinou mliečnou.
2. Mikroemulzia voda v oleji podľa nároku 1,vyznačujúca sa tým, že po podaní experimentálnym zvieratám nevyvoláva pretrvávajúcu ulceráciu a opuchnutie v mieste injekcie, ktoré by neboli vratné.
3. Mikroemulzia podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúca sa tým, že hydrofilnými, biologicky účinnými zlúčeniny sú peptidy, proteíny, oligo- alebo polysacharidy.
4. Mikroemulzia podľa nároku 3, vyznačujúca sa tým, že biologicky účinnou zlúčeninou je peptid.
5. Mikroemulzia podľa nároku 4, vyznačujúca sa tým, že biologicky účinnou zlúčeninou je LHRH hormónový peptidový analóg.
6. Mikroemulzia podľa nároku 5, vyznačujúca sa tým, že biologicky účinnou zlúčeninou je leuprolidacetát, goserelín, triptorelín, nafarelín, histrelín, cetrorelix alebo ich zodpovedajúce acetáty.

-197. Mikroemulzia podľa ktoréhokoľvek z nárokov 5 alebo 6, vyznačujúca sa t ý m, že poskytuje riadené uvoľňovanie účinnej zlúčeniny najmenej 30 dní.
8. Mikroemulzia podľa nároku 4, v y z n a č u j ú c a sa t ý m, že biologicky účinnou zlúčeninou je somatostatín, octreotid alebo lanreotid.
9. Mikroemulzia podľa nároku 8, vyznačujúca poskytuje riadené uvoľňovanie peptidov najmenej 8 dní.

sa t ý m, že
10. Mikroemulzia podľa nároku 3, vyznačujúca sa tým, že biologicky účinnou zlúčeninou je oligo- alebo polysacharid.
11. Mikroemulzia podľa nároku 10, vyznačujúca sa tým, že biologicky účinnou zlúčeninou je nefrakcionovaný heparín alebo heparíny s nízkou molekulovou hmotnosťou.
12. Mikroemulzia podľa nároku 1,vyznačujúca sa tým, že tenzid je vybraný zo skupiny, ktorá zahŕňa:

a) prírodné alebo syntetické glycerofosfolipidy obsahujúce zvyšky C4-C20nasýtených alebo nenasýtených karboxylových kyselín, ktoré majú fosfoesterovú skupinu, zvyšok cholínu, etanolamínu, serínu, glycerolu;

b) cholesterol;

c) estery cukrov s C12-C20- mastnými kyselinami;

d) estery polyoxyetylénsorbitanov s C12-C20- mastnými kyselinami;
13. Mikroemulzia podľa nároku l.vyznačujúca sa tým, že spojitá hydrofóbna fáza sa vyberie z nasledujúcich zlúčenín, samotných alebo v zmesi: estery C8-C20- nasýtených alebo nenasýtených karboxylových kyselín s C2-C8alkoholmi, alebo mono-, di- alebo triglyceridy C₈-C2o- mastných kyselín, alebo rastlinné oleje vhodné na parenterálne podávanie.

-2014. Mikroemulzia podľa nároku 12, vyznačujúca sa tým, že vodná fáza obsahujúca biologicky účinnú zlúčeninu má pH medzi 4,5 a 7,5, výhodne medzi 5 a 7.
15. Mikroemulzia podľa nároku 14, vyznačujúca sa tým, že pH sa nastaví pridaním prírodných aminokyselín.
16. Použitie mikroemulzie podľa predchádzajúcich nárokov obsahujúcej leuprolid, goserelín, triptorelín, nafarelinacetát, histrelín, cetrorelix alebo zodpovedajúce acetáty alebo iné LHRH analógy na výrobu lieku na potláčanie produkcie testosterónu po jednom podaní najmenej 30 dní, pričom hladina testosterónu sa zníži už po 48 hodinách po podaní.
17. Použitie mikroemulzie podľa predchádzajúcich nárokov obsahujúcej octreotid alebo jeho analógy na výrobu lieku na potláčanie produkcie rastového hormónu, pretrvávajúce najmenej 8 dní.
18. Použitie mikroemulzie podľa predchádzajúcich nárokov obsahujúcej nefrakcionovaný heparín alebo heparíny s nízkou molekulovou hmotnosťou na výrobu lieku s riadeným uvoľňovaním po jednom podaní.