[go: up one dir, main page]

SK12402000A3 - Spôsob fermentačnej prípravy cytostatík a ich kryštalických foriem - Google Patents

Spôsob fermentačnej prípravy cytostatík a ich kryštalických foriem Download PDF

Info

Publication number
SK12402000A3
SK12402000A3 SK1240-2000A SK12402000A SK12402000A3 SK 12402000 A3 SK12402000 A3 SK 12402000A3 SK 12402000 A SK12402000 A SK 12402000A SK 12402000 A3 SK12402000 A3 SK 12402000A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
cyclodextrin
epothilones
epothilone
weak
culture medium
Prior art date
Application number
SK1240-2000A
Other languages
English (en)
Other versions
SK286517B6 (sk
Inventor
Hans Hofmann
Marion Mahnke
Klaus Memmert
Frank Petersen
Thomas Schupp
Ernst Ksters
Michael Mutz
Original Assignee
Novartis Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novartis Ag filed Critical Novartis Ag
Publication of SK12402000A3 publication Critical patent/SK12402000A3/sk
Publication of SK286517B6 publication Critical patent/SK286517B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
    • C07D493/02—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D493/04—Ortho-condensed systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D417/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00
    • C07D417/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/16—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing two or more hetero rings
    • C12P17/167—Heterorings having sulfur atoms as ring heteroatoms, e.g. vitamin B1, thiamine nucleus and open chain analogs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/181—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system, e.g. Salinomycin, Septamycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2299/00—Coordinates from 3D structures of peptides, e.g. proteins or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

Spôsob fermentačnej prípravy cytostatík a ich kryštalických foriem
Oblasť techniky
Predkladaný vynález sa týka nového biotechnologického spôsobu prípravy, ktorý sa môže využiť v priemyselnom meradle na výrobu epothilonov, najmä na koncentrovanie týchto zlúčenín v kultivačnom médiu. Vynález sa tiež týka nových kmeňov na fermentačnú prípravu týchto zlúčenín. Vynález sa ďalej týka nových kryštalických foriem epothilonov, najmä epothilonu B, ktoré sa môžu pripraviť týmto spôsobom, ich použitia na výrobu farmaceutických prípravkov, a ďalej sa týka nových farmaceutických prípravkov, ktoré obsahujú nové kryštalické formy a/alebo použitia týchto zlúčenín na liečenie proliferatívnych ochorení ako sú nádory a/alebo na výrobu farmaceutických prípravkov vhodných na takéto liečenie.
Doterajší stav techniky
Medzi súčasnými cytotoxicky aktívnymi látkami na liečenie nádorov má významnú úlohu Taxol® {Paklitaxel, Bristol-Myers Squibb), činidlo stabilizujúce mikrotubuly, ktoré dosiahlo pozoruhodný komerčný úspech. Avšak Taxol® má tiež mnohé nevýhody. Problémom je najmä jeho zlá rozpustnosť vo vode. Je preto nevyhnutné podávať Taxol® formulovaný spoločne s prípravkom Cremophor EL® (polyoxyetylovaný ricínový olej, BASF, Ludwigshafen, NSR). Ale Cremophor EL® má výrazné vedľajšie účinky, napr. spôsobuje alergiu, ktorá najmenej v jednom známom prípade viedla k smrti pacienta.
Hoci sa protinádorové prípravky stabilizujúce mikrotubuly patriace do triedy taxánových zlúčenín označili za „asi najdôležitejší príspevok k protinádorovej farmakoterapii poslednej dekády (pozri napr. Rowinsky, E. K., Annu. Rev. Med.
48, 353-374, 1997), a i napriek komerčnému úspechu prípravku
Taxol®, tieto zlúčeniny nepredstavujú v podstate žiadny skutočný „prielom” v chemoterapii nádorov. Liečenie prípravkom Taxol® je spojené s mnohými nežiaducimi vedľajšími účinkami, a mnohé primárne nádory, najmä hrubého čreva a prostaty, reagujú na tieto látky iba v malej miere (pozri napr. Rowinsky, hore) . Okrem toho účinnosť Taxolu sa znižuje a môže byť i celkom neutralizovaná rezistenčnými mechanizmami, najmä takými, ktoré sú založené na nadmernej expresii („overexpression) fosfoproteínov, ktoré pôsobia ako pumpy na vstup účinnej látky, teda ide napr. o tzv. „multidrug rezistance” spôsobenú nadmernou expresiou multiliekového transportného glykoproteínu „P-glykoproteínu”.
Epothilony A a B predstavujú novú triedu cytotoxických účinných látok stabilizujúcich mikrotubuly (Gerth, K. a kol., J. Antibiot. 49, 560-563, 1966), ktoré majú štruktúru podľa nasledujúceho vzorca:
kde R je atóm vodíka (epothilon A) alebo metylová skupina (epothilon B).
Tieto zlúčeniny majú v porovnaní s prípravkom Taxol® nasledujúce výhody:
a) Majú oveľa lepšiu rozpustnosť vo vode a sú preto ovela prístupnejšie na formuláciu do prípravkov.
b) Publikovalo sa, že v experimentoch s bunkovými kultúrami sú tiež účinné proti proliferácii buniek, ktoré sú z dôvodu aktivity p-glykoproteínovej pumpy „multiliekovo” rezistentné k iným chemoterapeutikám vrátane Taxolu (pozri Bolag, D. M., a kol., „Epothilones, a new class of microtubulestabilizing agents with a Taxol-like mechanism of action. Cancer Research 55, 2325-2333, 1995) .
c) Je možné ukázať, že sú veľmi účinné in vitro proti bunkám bunkových línií nádorov ovárií rezistentných voči Taxolu s modifikovaným β-tubulínom (pozri Kowalski, R. J., a kol., J. Biol. Chem. 272(4), 2534-2541, 1997).
Farmaceutické aplikácie epothilonov, napr. na liečenie nádorov, sú možné analogicky ako použitie Taxolu, pozri napr. patenty USA č. 5 641 803, 5 496 804, 5 565 478.
Aby bolo možné používať epothilony vo veľkom meradle na farmaceutické účely, je nevyhnutné získať zodpovedajúce množstvo týchto látok.
Doteraz sa v odbornej literatúre opísala iba extrakcia prírodných látok z myxobaktérií, išlo najmä o epothilony z buniek Sorangium cellulosum kmeň Soce90 (ktorý je uložený pod č. 6773 v nemeckej zbierke mikroorganizmov, pozri patentová prihláška WO 93/10121). Na získanie dostatočnej koncentrácie prírodnej látky, a najmä epothilonov, sa na následnú extrakciu pridávala do kultivačného média adsorpčná živica na báze polystyrénu, napr. Amberlite XAD-1180 (Rohm & Haas, Frankfurt, NSR) .
Avšak nevýhodou takéhoto spôsobu je, že vo veľkom meradle vedie k mnohým problémom. Časticami živice sa poškodzujú ventily, upchávajú sa trubice a celkovo sa prístroj silne opotrebováva vďaka vysokému treniu. Častice živice sú porézne, a majú preto veľký vnútorný povrch (približne 825 m2/g živice). Problémom je tiež sterilizácia, pretože vzduch uzavretý v živici sa neautoklávuje. Takže pomocou živice nemožno spôsob vykonávať v priemyselnom meradle.
Na druhej strane bez pridania živice nemožno dosiahnuť dostatočnú koncentráciu epothilonu v kultivačnom médiu.
Prekvapivo sa riešenie tejto dilemy našlo a je popísané v predkladanom vynáleze, ktorý umožňuje dosiahnuť dostatočnú koncentráciu prírodnej látky z mikroorganizmov, najmä myxobaktérií, ktoré produkujú epothilony ako napr. epothilon A a B, konkrétne koncentrácie epothilonu A a B, v kultivačnom médiu bez toho, aby sa pridávala živica, čím sa umožňuje výroba týchto zlúčenín, najmä epothilonov, v technickom a priemyselnom meradle bez hore uvedených nevýhod.
Podstata vynálezu
Prvý aspekt predkladaného vynálezu sa týka spôsobu koncentrovania epothilonov, najmä epothilonu A a/alebo B, obzvlášť epothilonu B, v kultivačnom médiu, aby bolo možné produkovať túto zlúčeninu v biotechnologickom meradle, pričom tento spôsob obsahuje mikroorganizmy, ktoré produkujú tieto zlúčeniny, najmä myxobaktérie (producenti prírodnej látky), ku ktorým sa do média pridá komplexotvorná zložka, ktorá je rozpustná v kultivačnom médiu.
Ďalší aspekt vynálezu sa týka kultivačného média, ktoré obsahuje komplexotvornú zložku a mikroorganizmy, najmä myxobaktérie, konkrétne rodu Sorangium, ktoré sú vhodné na produkciu epothilonu, najmä epothilonu A a/alebo B.
Ďalší aspekt predkladaného vynálezu sa týka spôsobu výroby epothilonov, najmä epothilonu A a/alebo epothilonu B, a obzvlášť týchto čistých látok, najmä epothilonu B, pričom tento spôsob spočíva v tom, že epothilon sa získava spracovaním kultivačného média na biotechnologickú prípravu epothilonu, pričom toto médium obsahuje ako producentov prírodnej látky mikroorganizmy, najmä myxobaktérie, ktoré produkujú tieto zlúčeniny, ku ktorým sa do kultivačného média pridá komplexotvorná zložka, ktorá je v kultivačnom médiu rozpustná, a potom nasleduje krok purifikácie a pokiaľ je to potrebné i separácie epothilonov, napr. epothilonu A a epothilonu B.
Štvrtý aspekt vynálezu sa týka spôsobu separácie epothilonov, najmä epothilonu A a epothilonu B od seba navzájom, ktorý spočíva v chromatografickej separácii na kolóne s reverznou fázou s elučným činidlom obsahujúcim nižší alkylkyanid.
Ďalší aspekt predkladaného vynálezu sa týka kmeňa Sorangium cellulosum, ktorý sa získava mutagenézou, a ktorý za rovnakých podmienok produkuje viac epothilonov než kmeň Sorangium cellulosum Soce90.
Ďalší aspekt predkladaného vynálezu sa týka novej kryštalickej formy epothilonu B.
Pokiaľ sa odkazuje na dokumenty, potom sa citujú a sú súčasťou prihlášky vo forme odkazu, pokiaľ je to nutné. Všeobecné termíny použité v popise predkladaného vynálezu majú nasledujúci význam:
Termín „nižší, napr. v spojení (nižší)alkyl-, vždy znamená, že zodpovedajúca skupina obsahuje výhodne najviac Ί atómov uhlíka, obzvlášť najviac 4 atómy uhlíka, a je buď rozvetvená alebo nerozvetvená. Tak napr. nižšie alkylové skupiny sú buď nerozvetvené alebo rozvetvené jedenkrát alebo viackrát, a patrí k nim napr. metylová a etylová skupina, propylová skupina ako je izopropylová alebo n-propylová skupina, butylová skupina ako je izobutylová, sek-butylová, terc-butylová alebo n-butylová skupina a tiež pentylová skupina ako je amylová alebo n-pentylová skupina.
Kultivačné médium na biotechnologickú prípravu epothilonov, ktoré obsahuje mikroorganizmy produkujúce tieto zlúčeniny, najmä myxobaktérie, ako producentov prírodnej látky, je primárne médium, ktoré obsahuje zodpovedajúci mikroorganizmus (vyskytujúci sa prirodzene alebo získaný kultiváciou alebo obzvlášť genetickou modifikáciou) , najmä kmeň myxobaktérie, ktorý je schopný produkovať tieto zlúčeniny, obzvlášť kmeň myxobaktérie rodu' Sorangium, výhodne (konkrétne na produkciu epothilonu) mikroorganizmus typu Sorangium cellulosum kmeňa Soce90 (pozri dokument WO 93/10121), alebo z neho odvodený biologický materiál (napr. mutagenézou alebo metódami rekombinantnej génovej technológie) alebo z časti tejto myxobaktérie, najmä odvodeného kmeňa označeného BCE33/10 alebo jeho mutantov. Okrem toho kultivačné médium obsahuje vodu a výhodne obsahuje ďalšie obvyklé zložky kultivačných médií, ako sú biopolyméry, cukor, aminokyseliny, soli, nukleové kyseliny, vitamíny, antibiotiká, semiochemické látky, rastové látky, extrakty z biologických materiálov ako sú kvasinky alebo extrakty iných buniek, sójovú múčku, škrob, napr. zemiakový, stopové prvky ako napr. ióny železa vo forme viazanej v komplexoch, alebo vhodné kombinácie niektorých z hore uvedených zložiek a/alebo ich analógov. Zodpovedajúce kultivačné médiá sú odborníkovi známe a je možné ich pripraviť známym spôsobom (pozri napr. kultivačné médiá uvedené v príkladoch tohto predkladaného vynálezu alebo v patentovej prihláške WO 93/10121). Výhodným mikroorganizmom je kmeň myxobaktérie selektovaný UV mutagenézou a potom selekciou na zvýšenú tvorbu epothilonu A a/alebo B z kmeňa Sorangium cellulosum kmeňa Soce90, ktorý je uložený v DSM pod č. 6773, najmä potom mutant BCE33/10, ktorý bol uložený v nemeckej zbierke mikroorganizmov (DSM, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, NSR) .
Kmeňová kultúra a morfologický popis kmeňa BCE33/10: Kmeň je schopný rásť na celulóze ako výhradnom zdroji uhlíka a energie v prítomnosti dusičnanu draselného ako zdroja dusíka, teda napr. na filtračnom papieri na agare s minerálnymi soľami ST21 (0,1 % KNO3, 0,1 % MgSO4 x 7 H2O, 0,1 % CaCl2 x 2 H2O, 0,1 % K2HPO4, 0,01 % Mn5O4 x 7 H2O, 0,02 % FeCl3, 0,002% kvasinkový
Ί extrakt, štandardný roztok stopových prvkov, 1 % agar). V tomto médiu dochádza k tvorbe tmavo červenohnedých až čiernohnedých rozmnožovacích teliesok. Tie sú tvorené malými sporangiolami (s priemerom 15 až 30 pm) v hustých zhlukoch alebo skupinách. Vegetatívne bunky majú tvar typický pre Sorangium (ide o relatívne kompaktný, v mikroskope s fázovým kontrastom tmavý, valcovitý baciloformný mikroorganizmus, so širokými zaoblenými koncami, dlhý približne 3 až 6 pm a 1 pm hrubý.
Epothilonmi sú primárne epothilon A a/alebo epothilon B, ale aj iné epothilony, napr. epothilon C a D uvedené v medzinárodných patentových prihláškach WO 97/19086 a WO 98/22461, epothilony E a F popísané v medzinárodnej patentovej prihláške WO 98/22461 a ďalšie epothilony získané zo zodpovedajúcich mikroorganizmov.
Vo vode rozpustnou komplexotvornou zložkou je primárne vo vode rozpustný oligopeptidový alebo polypeptidový derivát alebo oligosacharidový alebo polysacharidový derivát s cyklickou alebo závitnicovitou štruktúrou, ktorý vytvára intramolekulové dutiny, ktoré vďaka svojej dostatočnej hydrofóbnosti viažu epothilony, najmä epothilon A a/alebo epothilon B. Obzvlášť výhodnou vo vode rozpustnou komplexotvornou zložkou je zložka vybratá zo skupiny obsahujúcej cyklodextrín alebo deriváty cyklodextrínu alebo ich zmesi.
Cyklodextríny sú cyklické oligosacharidy s a-D-glukopyranózovými jednotkami naviazanými a-1,4 väzbou s relatívne hydrofóbnou centrálnou dutinou a hydrofilnou povrchovou oblasťou. Rozlišujú sa najmä nasledujúce (v zátvorke je uvedený počet glukózových jednotiek v jednej molekule):
a-cyklodextrín (6), β-cyklodextrín (7), y-cyklodextrín (8), δ-cyklodextrín (9), ε-cyklodextrín (10), ξ-cyklodextrín (11), η-cyklodextrín δ-cyklodextrín (12) , a θ-cyklodextrín (13). Obzvlášť výhodné sú a najmä a-cyklodextrín, β-cyklodextrín, γ-cyklodextrín alebo ich zmesi. Cyklodextrínovými derivátmi sú najmä deriváty hore uvedených cyklodextrínov, najmä a-cyklodextrínu, β-cyklodextrínu, γ-cyklodextrínu, hlavne také, kde jeden alebo niekoľko až všetky hydroxylové skupiny (3 v jednej glukózovej jednotke) sú éterifikované alebo esterifikované. Étermi sú hlavne alkylétery, najmä nižších alkylov ako je napr. metyléter alebo etyléter, a tiež propylalebo butyléter, ďalej arylhydroxyalkylétery, ako je fenylhydroxy(nižší)alkyl, hydroxyalkylétery, najmä hydroxy(nižšie) alkylétery ako sú hlavne hydroxypropyl- alebo hydroxybutylétery ako je 2-hydroxybutyléter, karboxyalkylétery, najmä karboxy(nižšie)alkylétery ako karboxymetyl- alebo karboxyetyléter, derivatizované karboxyalkylétery, najmä derivatizované karboxy(nižšie)alkylétery, kde derivatizovaná karboxylová skupina je éterifikovaná alebo amidovaná karboxylová skupina (najmä napr. aminokarbonylová, mono- alebo di(nižšia)alkylaminokarbonylová skupina, morfolín-, piperidín-, pyrolidin- alebo piperazínkarbonylová alebo alkyloxykarbonylová skupina), najmä nižší alkoxy-karbonyl(nižší)alkyléter, napr. metyloxykarbonylpropyléter alebo etyloxykarbonylpropyléter, sulfoalkylétery, najmä sulfo(nižšie)alkylétery, najmä sulfobutyléter, cyklodextríny, kde jedna alebo niekolko skupín OH je éterifikovaných radikálom podľa vzorca:
-0-[alk-O-]n-H kde alk je alkylová skupina, najmä nižšia alkylová skupina, a n je celé číslo od 2 do 12, obzvlášť 2 až 5, ešte výhodnejšie 2 alebo 3, cyklodextríny, kde jedna alebo niekolko skupín OH je éterifikovaných radikálom podľa vzorca:
kde R' je vodík, hydroxylové skupina, -0-(alk-O)Z-H, -0-(alk(-R)-0-)p-H alebo -0-(alk(-R)-0-)q-alk-C0-Y, pričom alk znamená alkylovú skupinu, najmä nižšiu alkylovú skupinu a m, n, p, q a z sú celé čísla 1 až 12, výhodne 1 až 5, obzvlášť výhodne 1 až 3 a Y je OR1 alebo NR2R3, kde R1, R2 a R3 sú navzájom nezávisle atómy vodíka alebo nižšie alkylové skupiny, alebo R2 a R3 kombinované spoločne s väzobným atómom dusíka sú morfolínová, piperidínová, pyrolidínová alebo piperazínová skupina, alebo rozvetvené cyklodextríny, kde je prítomná éterifikácia alebo sa vyskytujú acetálové väzby s inými molekulami cukru, najmä glukozyl-, diglukozyl-(G2-p-cyklodextrín), maltozyl- alebo dimaltozylcyklodextrín, alebo W-acetyglukozaminyl-, glukozaminyl-, N-acetylgalaktozaminylalebo galaktozaminylcyklodextrín.
Estermi sú najmä alkanoylestery, obzvlášť nižšie alkanoylestery ako napr. acetylestery cyklodextrínov.
Je tiež možné použiť cyklodextríny, kde sú súčasne prítomné dve alebo viaceré odlišné éterové alebo esterové skupiny. Tiež zmesi dvoch alebo viacerých cyklodextrínov a/alebo derivátov cyklodextrínov.
Výhodné sú a-cyklodextrín, β-cyklodextrín, y-cyklodextríny alebo ich nižšie alkylétery, ako je napr. metyl-p-cyklodextrín alebo najmä 2,6-di-0-metyl-p-cyklodextrín, alebo najmä ich hydroxy(nižšie)alkylétery ako je 2-hydroxypropyl-a-cyklodextrín, 2-hydroxypropyl-3-cyklodextrín alebo 2-hydroxypropyl-y-cyklodextrín.
Cyklodextríny alebo deriváty cyklodextrínov sa pridávajú do kultivačného média výhodne v koncentráciách 0,02 až 10, výhodne 0,05 až 5, obzvlášť výhodne 0,1 až 4, napr. 0,1 až 2 % (hmotnosť/objem).
Cyklodextríny alebo deriváty cyklodextrínov sú v danej oblasti známe a môžu sa pripraviť známymi spôsobmi (pozri napr. dokumenty US 3 459 731, US 4 383 992, US 4 535 152, US 4 659 696, EP 0 094 157, EP 0 149 197, EP 0 197 571, EP
300 526, EP Ο 320 032, EP Ο 499 322, EP Ο 503 710, EP Ο 818 469, WO 90/12035, WO 91/11200, WO 93/19061, WO 95/08993, WO 96/14090, GB 2 189 245, DE 3 118 218, DE 3 317 064 a tu citované dokumenty, ktoré sa týkajú syntézy cyklodextrínov, a tiež: T. Loftsson a M. E. Brewster (1996): Pharmaceutical Applications of Cyclodextrins: Drug Solubilization and Stabilisation. Journal of Pharmaceutical Science 85 (10):1017-1025,- R. A. Rajewski a V. J. Stella (1996): Pharmaceutical Applications of Cyclodextrins: In vivo Drug Delivery. Journal of Pharmaceutical Science 85 (11): 1142-1169).
V nasledujúcom opise spracovania a purifikácie sa pod epothilonom rozumie epothilon, ktorý je možné získať zo zodpovedajúcich mikroorganizmov, výhodne ide o epothilon C, D, E a F, alebo najmä epothilon A a obzvlášť výhodne o epothilon B. Pokiaľ nie je uvedené inak, termín „epothilon je všeobecný termín, ktorý zahrnuje tak jednotlivé epothilony, ako aj ich zmesi.
Spracovanie epothilonov sa vykonáva obvyklými spôsobmi, najprv teda separáciou kultúry na kvapalnú (supernatant alebo filtrát) a pevnú fázu (bunky) centrifugáciou alebo filtráciou (tubulárna centrifúga alebo separátor). Hlavná časť epothilonov v supernatante alebo filtráte sa potom priamo zmieša so syntetickou živicou, napr. živicou na báze polystyrénu (ďalej skrátene označovaná ako polystyrénová živica) ako je napr. Amberlite XAD-1180 (Rohm & Haas, Frankfurt, NSR) alebo Diaion HP-20 (Resindion S.R.L., Mitsubishi Chemical Co., Miláno), výhodne v pomere objemov supernatant:živica približne 10:1 až 100:1, výhodne 50:1). Po období kontaktu výhodne 0,25 až 50 hodín, obzvlášť 0,8 až 22 hodín, sa živica separuje, napr. filtráciou alebo centrifugáciou. Pokiaľ je to potrebné, po adsorpcii sa živica premyje v silnom polárnom rozpúšťadle, výhodne vo vode. Desorpcia epothilonov sa potom vykoná vhodným rozpúšťadlom, najmä alkoholom, najvýhodnejšie izopropanolom. Fáza rozpúšťadla, najmä izopropanolová fáza, sa potom z rozpúšťadla odstráni, výhodne predchádzajúcim, súčasným alebo následným pridaním vody, výhodne v rotačnom odparovači, čím dôjde ku skoncentrovaniu, pokiaľ je to potrebné, a výsledná vodná fáza sa potom extrahuje rozpúšťadlom vhodným na vytvorenie druhej fázy, ako je napr. ester, teda napr. nižší alkanol(nižší)alkanoát, typicky etylacetát alebo izopropylacetát. Epothilony sa takto prenesú do organickej fázy. Potom sa organická fáza koncentruje v nutnom rozsahu, výhodne do sucha, napr. použitím rotačného odparovača.
Ďalšie spracovanie prebieha uskutočnením nasledujúcich krokov, a síce kroku podľa vynálezu, ktorý je nutný, keď sa epothilon purifikuje pomocou chromatografie s reverznou fázou elúciou nitrilom, prípadne ďalšími voliteľnými krokmi, ktorými sú:
- molekulová filtrácia a gélová chromatografia, napr. na kolóne so Sephadexom LH-20 (Pharmacie, Uppsala, Švédsko) s elúciou alkoholom, napr. metanolom,
- separácia epothilonov pomocou chromatografie s reverznou fázou po tom, čo sa rozpustili vo vhodnom rozpúšťadle a potom elúcia zmesi nitril/voda (nutná), pričom výhodné je uskutočnenie chromatografie na kolóne s materiálom RP-18, ktorý je naplnený uhľovodíkmi, napr. uhľovodíkovými reťazcami s 18 atómami uhlíka, a elučným činidlom obsahujúcim nitril, najmä nižší alkylnitril, obzvlášť acetonitril, a zmes nitril/voda, najmä acetonitril/voda, výhodne s pomerom nitrilu a vody 1:99 až 99:1, obzvlášť 1:9 až 9:1, napr. 2:8 až 7:3 alebo výhodnejšie 3:7 alebo 4:6.
- jednoduchá alebo niekoľkonásobná extrakcia rezídua (najmä po odparení) v dvojfázovom systéme obsahujúcom vodu a rozpúšťadlo nemiešateľné s vodou, výhodne ester, najmä nižší alkyl(nižší)alkanoát, ako je napr. etylacetát alebo izopropylacetát,
- adsorpčná chromatografia, najmä pomocou kolóny naplnenej silikagélom a následnej elúcie vhodným rozpúšťadlom alebo zmesou rozpúšťadiel, akou je najmä zmes ester/uhlovodík, napr. nižší alkylalkanoát/alkán so 4 až 10 atómami uhlíka, najmä etylacetát alebo izopropylacetát/n-hexán, kde pomer medzi esterom a uhľovodíkom je 99:1 až 1:99, výhodne 10:1 až 1:10, napr. 4:1,
- rozpúšťanie rezídua, ktoré sa získa po koncentrácii, vo vhodnom rozpúšťadle, ako je alkohol, napr. metanol,
- zmiešanie s aktívnym uhlím a jeho následné odstránenie,
- rekryštalizácia, napr. z vhodného rozpúšťadla alebo zmesi rozpúšťadiel, napr. obsahujúcej estery, zmesi ester/uhlovodík alebo alkoholy, najmä etyl- alebo izopropylacetát:toluén v pomere 1:10 až 10:1, výhodne 2:3 (pre epothilon A) alebo metanol či etylacetát (pre epothilon B), pričom medzi každými dvoma krokmi sa roztoky alebo suspenzie skoncentrujú, ak je to potrebné a/alebo sa kvapalné a pevné zložky navzájom separujú, najmä filtráciou alebo centrifugáciou roztoku/suspenzie. Podrobnejšie definície uvedené ďalej sa môžu výhodne použiť v jednotlivých krokoch.
Spracovanie a purifikácia sa výhodne vykonávajú nasledujúcim spôsobom: Po zozbieraní sa kultúra separuje na kvapalnú fázu (centrifugát alebo supernatant) a pevnú fázu (bunky) centrifugáciou (tubulárna centrifúga alebo separátor). Hlavná časť epothilonov v supernatante alebo vo filtráte sa potom priamo zmieša s polystyrénovou živicou, ako je napr. Amberlite XAD-1180 (Rohm & Haas, Frankfurt, NSR) alebo Diaion HP-20 (Resindion S.R.L., Mitsubishi Chemical Co., Miláno) (a to výhodne v pomere objemov supernatant:živica približne 10:1 až 100:1, výhodnejšie 50:1). Po čase kontaktu približne 1 hodina, sa živica separuje, napr. filtráciou alebo centrifugáciou.
živicu sa môže
Adsorpcia epothilonov na v chromatografickej kolóne, vykonať tiež a to tak, že sa živicou naplní kolóna a supematant z predchádzajúcich krokov sa nanesie na kolenu a nechá sa pretekať cez živicu. Po adsorpcii sa živica premyje výhodne vo vode. Desorpcia epothilonov zo živice sa potom vykoná izopropanolom. Izopropanolová fáza sa potom z rozpúšťadla odparovači, etylacetátom. etylacetátu.
odstráni a výsledná v rotačnom extrahuje fázy do dosiahne pridaním vody, výhodne vodná fáza sa potom Epothilony sa takto prenesú z vodnej Prvé skoncentrovanie epothilonov sa použitím molekulovej filtrácie (napr. Sephadex LH-20, Uppsala, Švédsko) s metanolom ako elučným činidlom. Frakcie z molekulovej filtrácie s maximálnou koncentráciou obsahujú epothilony A a B a celkový obsah epothilonov je vyšší než 10 %. Separácia týchto frakcií s maximálnou koncentráciou, ktoré obsahujú zmes epothilonov A a B, na jednotlivé zložky potom prebieha pomocou chromatografie s reverznou fázou, napr. s fázou RP-18 (fáza modifikovaná alkylovými skupinami obsahujúcimi reťazce 18 atómov uhlíka) s vhodným elučným činidlom, výhodne obsahujúcim nitril ako napr. acetonitril (čím sa dosahuje lepšia separácia než s alkoholmi ako napr. s metanolom). Epothilon A sa eluuje pred epothilonom B. Frakcie s maximálnou koncentráciou epothilonu B môžu obsahovať malý podiel epothilonu A, ktorý sa môže odstrániť ďalšou separáciou na RP-18. Nakoniec sa frakcia epothilonu A kryštalizuje priamo zo zmesi etylacetát:toluén v pomere 2:3 a frakcia epothilonu B z metanolu alebo etylacetátu.
Výhodné uskutočnenia vynálezu
Predkladaný vynález sa výhodne týka spôsobu koncentrácie epothilonov, najmä epothilonu A a/alebo epothilonu B, a obzvlášť epothilonu B, v kultivačnom médiu na biotechnologickú prípravu týchto zlúčenín, pričom toto médium obsahuje mikroorganizmy vhodné na túto prípravu, najmä kmeň rodu Sorangium, a najmä Sorangium cellulosum kmeň Soce90, alebo z neho pochádzajúce mutanty, najmä kmeň označený BCE33/10, a ďalej vodu a ďalšie obvyklé zložky kultivačného média, pričom do kultivačného média sa pridá cyklodextrín alebo derivát cyklodextrínu alebo zmes dvoch alebo viacerých týchto zlúčenín, najmä jeden alebo niekoľko, výhodne jeden, dva alebo viacero cyklodextrínov vybraných zo skupiny obsahujúcej: a-cyklodextrín (6), β-cyklodextrín (7), y-cyklodextrín (8), δ-cyklodextrín (9), ε-cyklodextrín (10), ξ-cyklodextrín (11), η-cyklodextrín (12), a θ-cyklodextrín (13) obzvlášť a-cyklodextrín, β-cyklodextrín, γ-cyklodextrín alebo cyklodextrínové deriváty alebo zmesi cyklodextrínových derivátov vybraných z derivátov, kde jedna alebo niekoľko až všetky hydroxylové skupiny sú éterifikované na alkyléter, najmä nižších alkylov ako je napr. metyléter alebo etyléter, a tiež propyl- alebo butyléter, arylhydroxyalkyléter, ako je fenylhydroxy(nižší)alkyl, najmä fenylhydroxyetyléter, hydroxyalkyléter, najmä hydroxy(nižší)alkyléter, hlavne 2-hydroxypropyl- alebo hydroxybutyléter ako 2-hydroxybutyléter, karboxyalkyléter, najmä karboxy(nižší)alkyléter, ako karboxymetyl- alebo karboxyetyléter, derivatizovaný karboxyalkyléter, najmä derivatizovaný karboxy(nižší)alkyléter, kde derivatizovaná karboxylová skupina je aminokarbonylová, mono- alebo di(nižšia)alkylaminokarbonylová skupina, morfolín-, piperidín-, pyrolidín- alebo piperazínkarbonylová alebo alkyloxykarbonylová skupina, najmä výhodne nižší alkoxykarbonyl(nižší)alkyléter, ako je napr. metyloxykarbonylpropyléter alebo etyloxykarbonylpropyléter, sulfoalkyléter, najmä sulfo(nižší)alkyléter, najmä sulfobutyléter, cyklodextríny, kde jedna alebo niekoľko skupín OH je éterifikovaných radikálom podľa vzorca:
-O-[alk-O-j n-H kde alk je alkylová skupina, najmä nižšia alkylová skupina, a n je celé číslo od 2 do 12, obzvlášť 2 až 5, ešte výhodnejšie 2 alebo 3, cyklodextríny, kde jedna alebo niekoľko skupín OH sa éterifikuje radikálom podľa vzorca
R'
I (Alk-O)--Alk
Z
kde R' je vodík, hydroxylové skupina, -0-(alk-0) Z-H, -0-(alk(-R)-0-)P-H alebo -0-(alk(-R)-0-)q-alk-CO-Y, pričom alk znamená alkylovú skupinu, najmä nižšiu alkylovú skupinu a m, n, p, q a z sú celé čísla 1 až 12, výhodne 1 až 5, obzvlášť výhodne 1 až 3 a Y je OR1 alebo NR2R3, kde R1, R2 a R3 sú navzájom nezávisle atómy vodíka alebo nižšie alkylové skupiny, alebo R2 a R3 kombinované spoločne morfolínová, piperidínová, skupina, alebo rozvetvený atómom dusíka sú alebo piperazínová kde sa vyskytujú s väzobným pyrolidínová cyklodextrín, éterifikácie alebo acetálové väzby s inými molekulami cukru, ktorý sa vyberá zo skupiny obsahujúcej glukozyl-, diglukozyl-(G2^-cyklodextrín), maltozyl- alebo dimaltozylcyklodextrín, alebo Ν-acetyglukozaminyl-, glukozaminyl-, N-acetylgalaktozaminyl- alebo galaktozaminylcyklodextrín, alebo nižší alkanoyl ako je acetylester cyklodextrínu.
Obzvlášť výhodný je spôsob, keď cyklodextríny alebo deriváty cyklodextrínov sa pridávajú do kultivačného média v koncentráciách 0,02 až 10, výhodne 0,05 až 5, obzvlášť výhodne 0,1 až 4, napr. 0,1 až 2 % (hmotnosť/objem).
Obzvlášť výhodný je spôsob podlá jedného z predchádzajúcich odstavcov, keď sa cyklodextrínový derivát vyberá zo skupiny obsahujúcej cyklodextrín, alebo hydroxy(nižší)alkylcyklodextrín, najmä 2-hydroxypropyl-a-cyklodextrín, 2-hydroxypropyl-p-cyklodextrín alebo 2-hydroxypropyl-y- cyklodextrín, alebo ich zmesi, pričom najvýhodnejším je samotný 2-hydroxypropyl^-cyklodextrín.
Predkladaný vynález sa ďalej konkrétne týka kultivačného média, ktoré obsahuje cyklodextrín, derivát cyklodextrínu alebo zmes dvoch alebo viacerých komplexotvorných zložiek vybraných z cyklodextrínov a derivátov cyklodextrínu, najmä cyklodextrínov a derivátov cyklodextrínu popísaných v predchádzajúcich odstavcoch, obzvlášť v bezprostredne predchádzajúcom odstavci, alebo zmes týchto zlúčenín, a mikroorganizmy, ktoré sú vhodné na produkciu epothilonu, najmä epothilonu A a/alebo B, najmä myxobaktérie rodu Sorangium, najmä kmeň Sorangium cellulosum, napr. Soce90 alebo z neho odvodený mutant, napr. kmeň BCE33/10.
Ďalší aspekt predkladaného vynálezu sa týka spôsobu výroby epothilonov, najmä epothilonu A a/alebo epothilonu B, a obzvlášť týchto čistých látok, najmä epothilonu B, pričom tento spôsob spočíva v tom, že epothilon sa získava spracovaním kultivačného média na biotechnologickú prípravu epothilonu, ktoré sa popísalo hore, pričom sa do kultivačného méd'ia pridá komplexotvorná zložka, ktorá je v kultivačnom médiu rozpustná, najmä cyklodextrín alebo derivát cyklodextrínu alebo zmes dvoch alebo viacerých cyklodextrínov a/alebo derivátov cyklodextrínu, potom sa supernatant zmieša so živicou, najmä polystyrénovou živicou alebo sa nanesie na kolónu naplnenú takouto živicou, a pokiaľ je to potrebné, živica sa premyje vodou, desorpcia epothilonov sa potom vykoná pomocou polárneho rozpúšťadla, najmä alkoholu, najvýhodnejšie nižším alkanolom ako je izopropanol, potom sa vykoná skoncentrovanie, výhodne predchádzajúcim, súčasným alebo následným pridaním vody, pridá sa organické rozpúšťadlo nemiešatelné s vodou, ako je napr. ester (napr. etylacetát), čím sa epothilony prenesú do organickej fázy, napr. vytrepaním alebo miešaním, a potom sa organická fáza skoncentruje, pokiaľ je to potrebné, epothilony získané z organického roztoku sa potom koncentrujú pomocou molekulového sita pre nízkomolekulové zlúčeniny, frakcia obsahujúca epothilony, najmä epothilony A a/alebo B, sa separujú chromatografiou s reverznou fázou, a výhodne sa eluujú činidlom obsahujúcim nitril, ako je acetonitril (alebo miesto toho elučné činidlo obsahuje alkohol, ako je metanol), čím sa epothilony extrahujú oddelene a pokial je to žiaduce, môžu sa ďalej skoncentrovať rekryštalizáciou.
Ďalší výhodný aspekt predkladaného vynálezu sa týka spôsobu separácie epothilonov, najmä epothilonu A a epothilonu B od seba navzájom, ktorý spočíva v chromatografickej separácii na kolóne s reverznou fázou s elučným činidlom obsahujúcim nižší alkylkyanid, keď sa chromatografia vykonáva na kolóne, najmä na kolóne s materiálom RP-18, ktorý je naplnený uhľovodíkmi, napr. uhľovodíkovými reťazcami s 18 atómami uhlíka, a elučným činidlom obsahujúcim nitril, obzvlášť nižší alkylnitril, obzvlášť acetonitril, a zmes nitril/voda, najmä acetonitril/voda, výhodne s pomerom nitrilu a vody 1:99 až 99:1, najmä 1:9 až 9:1,. napr. 2:8 až 7:3 alebo výhodnejšie 3:7 alebo 4:6. Táto separácia môže nasledovať po filtrácii cez molekulové sito alebo sa výhodne vykonáva priamo použitím rezídua po adsorpcii epothilonov z kultivačného média obsahujúceho komplexotvornú zložku na živici. Výhodou separácie s elučným činidlom obsahujúcim nižší alkylkyanid v porovnaní s použitím alkoholu ako je metanol, je lepšia separácia epothilonov A a B.
Predkladaný vynález sa výhodne týka spôsobu prípravy epothilonov, ktorý
a) obsahuje krok skoncentrovania epothilonov, najmä epothilonu A a/alebo epothilonu B, a najmä epothilonu B, v kultivačnom médiu na biotechnologickú prípravu týchto zlúčenín, pričom toto médium obsahuje mikroorganizmy vhodné k tejto príprave, najmä kmeň rodu Sorangium, a najmä Sorangium cellulosum kmeň Soce90, alebo z neho pochádzajúce mutanty, najmä kmeň označený BCE33/10, a ďalej vodu a ďalšie obvyklé zložky kultivačného média, pričom do kultivačného média sa pridá cyklodextrín alebo derivát cyklodextrínu alebo zmes dvoch alebo viacerých týchto zlúčenín, najmä jeden alebo niekoľko, výhodne jeden, dva alebo viacero cyklodextrínov vybraných zo skupiny obsahujúcej:
a-cyklodextrín (6), β-cyklodextrín (7), γ-cyklodextrín (8), δ-cyklodextrín (9), ε-cyklodextrín (10), ξ-cyklodextrín (11), η-cyklodextrín (12), a θ-cyklodextrín (13) obzvlášť a-cyklodextrín, β-cyklodextrín, γ-cyklodextrín alebo cyklodextrínové deriváty alebo zmesi cyklodextrínových derivátov vybraných z derivátov, kde jedna alebo niekolko až všetky hydroxylové skupiny sú éterifikované na alkyléter, najmä nižších alkylov ako je napr. metyléter alebo etyléter, a tiež propyl- alebo butyléter, arylhydroxyalkyléter, ako je fenylhydroxy(nižší)al18 kyl, najmä fenylhydroxyetyléter, hydroxyalkyléter, najmä hydroxy (nižší ) alkyléter, hlavne 2-hydroxypropyl- alebo hydroxybutyléter ako 2-hydroxybutyléter, karboxyalkyléter, najmä karboxy(nižší)alkyléter, ako karboxymetyl- alebo karboxyetyléter, derivatizovaný karboxyalkyléter, najmä derivatizovaný karboxy(nižší ) alkyléter, kde derivatizovaná karboxylová skupina je aminokarbonylová, mono- alebo di(nižšia)alkylaminokarbonylová skupina, morfolín-, piperidín-, pyrolidín- alebo piperazínkarbonylová alebo alkyloxykarbonylová skupina, najmä výhodne nižší alkoxykarbonyl(nižší)alkyléter, ako je napr. metyloxykarbonylpropyléter alebo etyloxykarbonylpropyléter, sulfoalkyléter, najmä sulfo(nižší)alkyléter, najmä sulfobutyléter, cyklodextríny, kde jedna alebo niekoľko skupín OH je éterifikovaných radikálom podľa vzorca:
-O-[alk-O-]n-H kde alk je alkylová skupina, najmä nižšia alkylová skupina, a n je celé číslo od 2 do 12, obzvlášť 2 až 5, ešte výhodnejšie 2 alebo 3, cyklodextríny, kde jedna alebo niekoľko skupín OH sa éterifikuje radikálom podlá vzorca
R'
I 0 (Alk-O)--Alk-# / \ skupina, alebo rozvetvený kde R' je vodík, hydroxylová skupina, -0-(alk-O)Z-H, -0-(alk(-R)-0-)p-H alebo -0-(alk(-R)-0-)q-alk-CO-Y, pričom alk znamená alkylovú skupinu, najmä nižšiu alkylovú skupinu a m, n, p, q a z sú celé čísla 1 až 12, výhodne 1 až 5, obzvlášť výhodne 1 až 3 a Y je OR1 alebo NR2R3, kde R1, R2 a R3 sú navzájom nezávisle atómy vodíka alebo nižšie alkylové skupiny, alebo R2 a R3 kombinované spoločne s väzobným morfolínová, piperidínová, pyrolidínová cyklodextrín, atómom dusíka sú alebo piperazínová kde sa vyskytujú éterifikácie alebo acetálové väzby s inými molekulami cukru, ktorý sa vyberá zo skupiny obsahujúcej glukozyl-, diglukozyl-(G2-p-cyklodextrín), maltozyl- alebo dimaltozylcyklode xtrín, alebo W-acetyglukozaminyl-, glukozaminyl-, W-acetylgalaktozaminyl- alebo galaktozaminylcyklodextrín, alebo nižší alkanoyl ako je acetylester cyklodextrínu, a
b) obsahuje krok separácie A a epothilonu B navzájom v chromatografickej separácii s elučným činidlom epothilonov, od 'seba, na kolóne najmä epothilonu ktorý spočíva s reverznou fázou obsahujúcim nižší alkylkyanid, keď sa chromatografia vykonáva na kolóne, najmä na kolóne s materiálom RP-18, ktorý je naplnený uhľovodíkom, napr. uhľovodíkovými reťazcami s 18 atómami uhlíka, a elučným činidlom obsahujúcim nitril, najmä nižší alkylnitril, obzvlášť acetonitril, a zmes nitril/voda, najmä acetonitril/voda, výhodne s pomerom nitrilu a vody 1:99 až 99:1, najmä 1:9 až 9:1, napr. 2:8 až 7:3 alebo výhodnejšie 3:7 alebo 4:6, pričom je možné použiť ešte ďalšie kroky na ďalšie spracovanie a purifikáciu.
Predkladaný vynález sa najmä týka tiež mutanta získaného z kmeňa Sorangium cellulosum Soce90, obzvlášť Sorangium cellulosum získaného mutagenézou, výhodne mutagenézou uskutočnenou jedným alebo niekoľkými krokmi mutagenézy indukovanej ultrafialovým (UV) žiarením (najmä UV žiarením s vlnovou dĺžkou 200 až 400 nm, obzvlášť 250 až 300 nm) , po ktorých nasleduje selekcia na zvýšenú tvorbu epothilonu (najmä zvýšenú koncentráciu epothilonov v kultivačnom médiu), pričom tento kmeň za rovnakých podmienok tvorí viac epothilonu najmä epothilonu A a/alebo epothilonu B, a obzvlášť epothilonu B, než Sorangium cellulosum Soce90, a najmä kmeň Sorangium cellulosum BCE33/10.
Predkladaný vynález sa konkrétne týka jednotlivých krokov procesu opísaných v príkladoch alebo ich akejkoľvek kombinácie, kultivačného média tu opísaného, kryštalických foriem epothilonov a kmeňov mikroorganizmov, ktoré sa tu opísali.
Predkladaný vynález sa tiež týka nových kryštalických foriem epothilonu B, najmä kryštalickej formy epothilonu B opísanej ako modifikácia B a obzvlášť modifikácie popísanej ako A.
Kryštalické formy sa môžu rozlíšiť najmä na základe ich róntgenových diagramov. Rôntgenové diagramy získané pomocou difraktometra a žiarenia Cu-Κα1 sa výhodne používajú na charakterizáciu pevných organických zlúčenín. Difrakčné diagramy rôntgenového žiarenia sa používajú obzvlášť úspešne na stanovenie kryštalických modifikácií látok. Na charakterizáciu kryštalických modifikácií A a B epothilonu B sa uskutočnili merania uhlových rozmedzí (2Θ) 2° až 35° so vzorkami látok udržovaných pri teplote miestnosti.
Takto stanovené rôntgenové difrakčné diagramy (odrazové čiary a intenzity najdôležitejších čiar) kryštalickej modifikácie A (modifikácia A) epothilonu B sú uvedené v nasledujúcej tabuíke.
2Θ Intenzita
7,7 velmi silná
10, 6 slabá
13, 6 priemerná
14,4 priemerná
15,5 priemerná
16, 4 slabá
16,8 slabá
17,1 slabá
17,3 slabá
17,7 slabá
18,5 slabá
20,7 silná
21,2 silná
21,9 slabá
22,4 slabá
23,3 silná
25, 9 priemerná
31,2 slabá
32,0 priemerná
Predkladaný vynález sa tiež týka najmä novej kryštalickej formy epothilonu B, ktorá je charakterizovaná teplotou topenia vyššou než 120 °C, najmä 120 až 128 °C, konkrétne 124 až 125 °C. Prekvapivo je táto hodnota významne vyššia než hodnoty udávané predtým v odbornej literatúre. Vynález sa týka najmä kryštalickej formy epothilonu B, ktorá je charakterizovaná rôntgenovým difrakčným diagramom kryštalickej formy A a teplotou topenia vyššou než 120 °C, najmä 120 až 128 ’C, konkrétne napr. 124 až 125 ’C.
Takto stanovené rôntgenové difrakčné diagramy (odrazové čiary a intenzity najdôležitejších čiar) pre kryštalickú modifikáciu B (modifikácia B) epothilonu B sú uvedené v nasledujúcej tabulke.
2Θ Intenzita
6,9 velmi silná
8,0 slabá
8,3 priemerná
10,8 silná
11,5 priemerná
12,4 slabá
13,1 silná
15,5 slabá
16,2 slabá
16,7 priemerná
18,1 priemerná
18,6 priemerná
20,4 slabá
20, 9 silná
21,3 slabá
21,5 velmi slabá
22,5 priemerná
24,2 slabá
25,1 priemerná
Nové kryštalické formy sú obzvlášť stabilné, najmä formu A je nutné považovať za termodynamicky stabilnejšiu, a sú preto vhodné ako účinné látky na formuláciu do pevných liekových foriem, na skladovanie v pevnej forme alebo ako medziprodukty (najmä s dobrou skladovateľnosťou) na prípravu pevných alebo kvapalných prípravkov.
Predkladaný vynález sa tiež týka použitia nových kryštalických foriem, najmä kryštalickej formy B, ale primárne kryštalickej formy A (ďalej označované ako účinné látky) na výrobu farmaceutického prípravku, nových farmaceutických prípravkov obsahujúcich tieto nové kryštalické formy a ich použitia na liečenie proliferatívnych ochorení ako sú nádory. V nasledujúcom popise, keď sa spomínajú farmaceutické prípravky obsahujúce účinné látky podlá predkladaného vynálezu, v prípade kvapalných foriem alebo prípravkov, ktoré už neobsahujú kryštalickú formu ako takú, vždy sa myslí farmaceutický prípravok, ktorý možno získať použitím kryštalických foriem predkladaného vynálezu (napr. infúzny roztok z kryštalickej formy A alebo B epothilonu B), dokonca i keď už neobsahujú uvedenú kryštalickú formu (napr. preto, že existuje vo forme roztoku).
Predkladaný vynález sa tiež týka použitia nových kryštalických foriem epothilonu B, najmä kryštalickej formy B, a obzvlášť kryštalickej formy A na výrobu farmaceutického prípravku, keď sa nová kryštalická forma epothilonu B zmieša s jedným alebo niekoľkými nosičmi.
Predkladaný vynález sa ďalej týka liečenia teplokrvných živočíchov trpiacich proliferatívnou chorobou, keď sa podáva dávka epothilonu B, ktorá je účinná na liečenie danej choroby, v novej kryštalickej forme, teplokrvnému živočíchovi, ktorý takéto liečenie potrebuje, a tiež sa týka liečenia prípravkami, ktoré sa vyrobili použitím nových kryštalických foriem a/alebo použitím novej kryštalickej formy epothilonu B na takéto liečenie.
Účinná látka sa použije na výrobu farmaceutických prípravkov napr. takým spôsobom, že farmaceutický prípravok obsahuje účinné množstvo účinnej látky spoločne alebo v zmesi s významným množstvom jednej alebo niekolkých organických alebo anorganických, kvapalných alebo tuhých, farmaceutický prijateľných látok vo funkcii nosiča.
Predkladaný vynález sa ďalej týka farmaceutických prípravkov vhodných na podávanie teplokrvným živočíchom, najmä človeku, na liečenie proliferatívnych ochorení ako sú nádory, pričom prípravok obsahuje množstvo účinnej látky, ktoré je dostatočné na liečenie choroby, spoločne s farmaceutický prijateľným nosičom.
Farmaceutické prípravky podľa predkladaného vynálezu sú určené na enterálne, najmä nazálne, rektálne alebo perorálne podávanie, výhodne na parenterálne, najmä intramuskulárne alebo intravenózne podávanie, teplokrvným živočíchom, najmä ľuďom, a obsahujú účinné množstvo účinnej látky samotnej alebo spoločne s farmaceutický prijateľným nosičom. Dávka účinnej látky závisí od druhu liečeného živočícha, telesnej hmotnosti, veku a individuálneho stavu, individuálnej farmakokinetickej situácie, choroby, ktorá sa lieči a spôsobu podávania.
Farmaceutický prípravok obsahuje napr. približne 0,0001 % až 95 %, výhodne 0,001 % až 10 % alebo 20 % až 90 % účinnej látky. Farmaceutické prípravky podľa predkladaného vynálezu môžu byť v jednotkovej liekovej forme ako sú napr. ampule, skúmavky s uzáverom, čapíky, dražé, tablety alebo tobolky.
Farmaceutické prípravky podľa vynálezu sa vyrábajú postupmi, ktoré sú odborníkom známe, napr. konvenčným rozpúšťaním, lyofilizáciou, miešaním, granuláciou a ďalšími výrobnými postupmi.
Roztoky účinnej látky, a tiež suspenzie, najmä vodné roztoky alebo suspenzie, sú výhodné formy, pričom je možné, v prípade lyofilizovanych prípravkov obsahujúcich samotnú účinnú látku alebo účinnú látku s farmaceutický prijateľným nosičom ako je napr. manitol, pripraviť roztok alebo suspenziu pred podaním. Farmaceutické prípravky podľa vynálezu sa môžu sterilizovať a/alebo môžu obsahovať excipienty, napr. konzervačné činidlá, stabilizátory, zvlhčovadlá a/alebo emulgátory, činidlá napomáhajúce rozpúšťaniu, soli na reguláciu osmotického tlaku a/alebo pufry, a pripravujú sa konvenčnými postupmi, napr. rozpúšťaním alebo lyofilizáciou. Roztoky alebo suspenzie môžu tiež obsahovať činidlá zvyšujúce viskozitu, ako je sodná soľ karboxymetylcelulózy, karboxymetylcelulóza, dextrán, polyvinylpyrolidín alebo želatína.
Suspenzia v oleji obsahuje ako olejovú zložku rastlinné oleje, syntetické oleje alebo semisyntetické oleje, ktoré sú vhodné na injekčné podanie. K príkladom takýchto olejov patria kvapalné estery mastných kyselín, ktoré obsahujú ako kyselinovú zložku mastné kyseliny s dlhým reťazcom s 8 až 22, najmä s 12 až 22 atómami uhlíka, ako je napr. kyselina laurová, tridecylová, myristová, pentadecylová, palmitová, margarová, stearová, arachidová a behenová alebo zodpovedajúce nenasýtené kyseliny ako je napr. kyselina olejová, elaidová, eruková, brassidová, linolová, pokial je to potrebné aj s prídavkom antioxidantov, napr. vitamínom E, β-karoténom alebo 3,5-di-terc-butyl-4-hydroxytoluénom. Alkoholová zložka týchto esterov mastných kyselín výhodne obsahuje najviac 6 atómov uhlíka a jedná sa o monoalebo polyhydroxyalkohol, napr. mono-, di- alebo tri-hydroxyalkohol, ako je napr. metanol, etanol, propanol, butanol alebo pentanol, alebo jeho izomér, avšak najmä glykol a glycerol. Ako príklady sa môžu uviesť najmä nasledujúce: propylmyristát, izopropylpalmitát, „Labrafil M 2375 (t.j. polyoxyetylénglyceroltrioleát, Gattefossé, Paríž), „Miglyol 812 (t.j. triglycerid nasýtených mastných kyselín majúcich reťazec s 8 až 12 atómami uhlíka, Húls AG, NSR), a obzvlášť rastlinné oleje ako olej z bavlníkových semien, mandľový olej, olivový olej, ricínový olej, sezamový olej a obzvlášť podzemnicový olej.
Prípravky vo forme injekcie alebo infúzie sa vyrábajú konvenčnými postupmi v sterilných podmienkach, a to isté platí pre plnenie prípravkov do ampuliek alebo skúmaviek s uzáverom a zatavených kontajnerov.
Výhodné sú infúzne roztoky, ktoré obsahujú účinnú látku podľa predkladaného vynálezu a farmaceutický prijateľné organické rozpúšťadlo.
Farmaceutický prijateľné organické rozpúšťadlo, ktoré sa môže použiť na prípravky podľa vynálezu sa môže vybrať z vhodných rozpúšťadiel, ktoré sú odborníkom známe. Výhodne sa môže rozpúšťadlo vybrať zo skupiny obsahujúcej alkohol, napr. absolútny etanol, zmes etanol/voda, výhodne 70% etanol, polyetylénglykol 300, polyetylénglykol 400, polypropylénglykol a N-metylpyrolidón, obzvlášť výhodné sú polypropylénglykol a 70% etanol.
Účinná látka je v prípravku prítomná v koncentrácii 0,001 až 100 mg/ml, výhodne 0,05 až 5 mg/ml alebo 5 až 50 mg/ml.
Prípravky podľa vynálezu sa ľahko skladujú v skúmavkách s uzáverom alebo ampulkách. Skúmavky s uzáverom a ampulky sa typicky vyrábajú zo skla, napr. borokremičitého skla. Skúmavky s uzáverom a ampulky sú vhodné pre akýkoľvek obvykle používaný objem, známy zo stavu techniky. Obvykle sú skúmavky s uzáverom a ampulky vhodné pre objem 0,5 až 5 ml prípravku.
Pred podaním musí byt prípravok nariedený vo vodnom médiu vhodnom na intravenózne podávanie predtým, než sa účinná látka podá pacientovi.
V prípade infúznych roztokov je výhodné, keď majú tieto roztoky rovnaký alebo v podstate rovnaký osmotický tlak ako telesné tekutiny. Preto vodné médium obsahuje izotonizujúce činidlo, ktoré pôsobí tak, že osmotický tlak infúznych roztokov je rovnaký alebo v podstate rovnaký ako osmotický tlak telesných tekutín.
Izotonizujúce činidlo sa vyberá z látok odborníkovi známych, napr. je to manitol, dextróza, glukóza a chlorid sodný. Izotonizujúcim činidlom je výhodne glukóza alebo chlorid sodný. Izotonizujúce činidlo sa používa v takom množstve, ktoré zaisťuje, že osmotický tlak infúznych roztokov je rovnaký alebo v podstate rovnaký ako osmotický tlak telesných tekutín. Presné množstvo, ktoré je potrebné, sa môže stanoviť rutinnými postupmi a závisí od zloženia infúzneho roztoku a od typu izotonizujúceho činidla.
Použitá koncentrácia izotonizujúceho činidla závisí od typu izotonizujúceho činidla. Pokiaľ sa použije glukóza, obvykle je jej koncentrácia 1 až 5 % (hmotnosť/objem), výhodne 5 % (hmotnosť/objem). Pokiaľ sa použije ako izotonizujúce činidlo chlorid sodný, obvykle je jeho koncentrácia najviac 1 % (hmotnosť/objem), výhodne 0,9 % (hmotnosť/objem).
Infúzny roztok sa môže nariediť vodným médiom. Množstvo vodného média sa zvolí na základe požadovanej koncentrácie účinnej látky v infúznom roztoku. Infúzny roztok sa výhodne pripraví zmiešaním skúmavky s uzáverom alebo ampulky, obsahujúcej infúzny koncentrát (pozri hore), s vodným médiom, takže sa získa objem 200 až 1000 ml. Infúzny roztok môže obsahovať ďalšie aditíva, ktoré sa obvykle používajú v prípravkoch na intravenózne podávanie. K týmto aditívam patria tiež antioxidanty.
Antioxidanty sa môžu použiť k ochrane účinnej látky pred degradáciou spôsobenou oxidáciou. Antioxidanty sa vyberajú z látok odborníkovi známych, ktoré sú- vhodné do prípravku na intravenózne podávanie. Presné množstvo, ktoré je potrebné, sa môže stanoviť rutinnými postupmi. Ako alternatíva k prídavku antioxidantov alebo naviac k prídavku antioxidantov sa môže antioxidačný účinok dosiahnuť tiež obmedzením kontaktu infúzneho roztoku s kyslíkom (vzduchom). Toto sa môže dosiahnuť jednoduchým spôsobom, napr. naplnením nádob obsahujúcich infúzny roztok inertným plynom, napr. dusíkom alebo argónom.
Infúzne roztoky sa pripravia zmiešaním ampulky alebo skúmavky s uzáverom s vodným médiom, napr. 5% roztokom glukózy vo WFI vo vhodnej nádobe, napr. infúznom vaku alebo infúznej fľaši.
Nádoby na infúzne roztoky sa vyberajú z nádob obvykle používaných pre infúzne roztoky, ktoré nereagujú s infúznymi roztokmi. K vhodným nádobám patria sklenené nádoby, najmä z borokremičitého skla, výhodné sú plastové nádoby ako sú napr. plastové infúzne vaky.
Plastové nádoby môžu byť z termoplastických polymérov. Materiál plastu môže obsahovať také aditíva ako sú napr. zmäkčovadlá, plnidlá, antioxidanty, antistatické činidlá alebo iné obvyklé aditíva.
Vhodné plasty na použitie podľa predkladaného vynálezu musia byť odolné proti zvýšenej teplote používanej na sterilizáciu. Výhodné plastové infúzne vaky sú z PVC materiálov, ktoré sú odborníkom známe.
Použiť sa môže široká škála veľkosti nádob. Pri výbere vhodnej veľkosti je treba brať do úvahy faktory ako je rozpustnosť epothilonov vo vodnom médiu, ľahké zaobchádzanie a pokiaľ je to potrebné taktiež skladovateľnosť nádob. Výhodne sa použijú nádoby obsahujúce približne 200 až 1000 ml infúzneho roztoku.
Vzhľadom na ich dobré formulačné vlastnosti nové kryštalické formy epothilonov B podľa predkladaného vynálezu sú obzvlášť vhodné na jednoduchú a reprodukovateľnú výrobu uvedených infúznych roztokov. Avšak nové kryštalické formy sú tiež mimoriadne vhodné i na výrobu farmaceutických prípravkov, ktoré obsahujú účinnú látku v pevnej forme, napr. perorálnych prípravkov.
Farmaceutické prípravky na perorálne podávanie sa môžu získať zmiešaním účinnej zložky s pevnými nosičmi, prípadne granuláciou takto vzniknutej zmesi, a ďalším spracovaním tejto zmesi, pokial je to žiaduce alebo nutné, po pridaní vhodných adjuvans, do tabliet, jadier pre dražé (obaľované tablety) alebo toboliek. Je tiež možné zaliatie do plastového substrátu, čo umožňuje difúziu alebo uvoľňovanie účinnej látky v definovaných množstvách.
Vhodné farmaceutický použitelné nosiče sú najmä plnidlá, ako je laktóza, sacharóza, manitol alebo sorbitol, celulózové prípravky a/alebo fosforečnany vápnika, napr. fosforečnan vápenatý alebo hydrogenfosforečnan vápenatý, a spojivá ako sú škroby, napr. kukuričný, pšeničný, ryžový alebo zemiakový škrob, želatína, tragakant, metylcelulóza, hydroxymetylcelulóza a sodná sol karboxymetylcelulózy a/alebo polyvinylpyrolidón, a/alebo tiež, pokial sa to vyžaduje, rozvoľňovadlá, ako sú napr. už hore uvedené škroby, zosieťované vinylpyrolidóny, agar, kyselina alginová alebo jej soli ako je alginát sodný. Medzi adjuvans patria najmä činidlá zlepšujúce tokové vlastnosti a lubrikanty, t.j. klzné látky ako napr. silikáty, mastenec, kyselina stearová a jej soli, napr. stearan vápenatý alebo horečnatý a/alebo polyetylénglykol. Jadrá dražé (obaľovaných tabliet) sa, pokiaľ je to potrebné, obaľujú vhodným obalom odolným proti žalúdočným šťavám použitím, okrem iného, koncentrovaných roztokov cukrov, arabskej gumy, mastenca, polyvinylpyrolidónu, polyetylénglykolu a/alebo oxidu titaničitého, alebo obaľovacích roztokov vo vhodnom organickom rozpúšťadle, aby sa vytvoril obal odolný proti žalúdočným šťavám, vhodných preparátov celulózy ako je ftalát etylcelulózy alebo ftalát hydroxypropylmetylcelulózy. Tobolky sú spravidla suché tobolky obsahujúce želatínu alebo pektín, a podľa potreby zmäkčovadlo ako je glycerol alebo sorbitol. Suché tobolky môžu obsahovať účinnú látku vo forme granulátu, napr. spoločne s plnidlami ako je laktóza, spojivami ako sú napr. škroby a/alebo klznými látkami ako je napr. mastenec alebo stearan horečnatý, a pokiaľ je to potrebné ešte stabilizujúcimi činidlami. V mäkkých tobolkách môže byť účinná látka prítomná v rozpustenej alebo suspendovanej podobe, pričom sa pridávajú olejové adjuvans ako sú mastné oleje, parafínový olej alebo kvapalné propylénglykoly, a tiež sa môžu pridať stabilizátory a/alebo antibakteriálne činidlá. Do obalov tabliet alebo dražé sa môžu pridať farbivá, napr. na zlepšenie identifikácie alebo na rozlíšenie rôznych dávok účinnej látky.
Na liečenie proliferatívnych ochorení pomocou jednej z kryštalických foriem B a/alebo najmä A, ktoré sa vykonáva tak, že sa kryštalická forma (výhodne vo forme prípravku alebo infúzneho roztoku, ako sa hore popísalo) teplokrvnému živočíchovi, najmä človeku, v dávke, ktorá predstavuje 20 až 133 %, výhodne 25 až 100 % maximálnej tolerované dávky (MTD) stanovenej štandardnou metódou, napr. použitím Fibronacciho radu, kde po sebe idúce množstvá zvýšenia dávok sú 100 %, 67%, 50 % a 40 % a potom nasleduje 33 % pre všetky nasledujúce dávky, a pokiaľ je to potrebné, jedna alebo niekoľko ďalších dávok podaných v hore popísanom dávkovacom režime pre prvú dávku, pričom každá dávka nasleduje po období, ktoré umožňuje dostatočné zotavenie liečeného jedinca, konkrétne napr. jeden týždeň alebo dlhšie po prvej dávke, výhodne 2 až 10 týždňov, najmä 3 až 6 týždňov po každej predchádzajúcej dávke. Všeobecne takýto liečebný režim, keď sa velká dávka podáva jedenkrát, dvakrát alebo niekolkokrát s dostatočne dlhým intervalom medzi jednotlivými dávkami na zotavenie, je výhodnejší než častejšie podávanie menších dávok, pretože hospitalizácia je menej častá a trvá kratšiu dobu a naviac sa môže očakávať zvýšený protinádorový účinok. Dávka epothilonu B pre človeka je výhodne 0,1 až 50 mg/m2, výhodnejšie 0,2 až 10 mg/m2.
Nasledujúce príklady sú uvedené na podrobnejšie vysvetlenie vynálezu a ilustráciu a nijako vynález neobmedzujú.
Upozornenie: Pri zaobchádzaní s epothilonmi je potrebné vykonať príslušné bezpečnostné opatrenia a používať ochranné pomôcky tam, kde je to potrebné, vzhľadom na vysokú toxicitu týchto látok.
Fermentorom s objemom 750 1 použitým v príkladoch bol zlepšený oceľový fermentor firmy Aplha AG, Nidau, Švajčiarsko.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Príprava kmeňa BCE33/10 mutáciou a selekciou
Použitým kmeňom je mutant BCE33/10 (ktorý bol 9. februára 1998 uložený v nemeckej zbierke mikroorganizmov (DSM) pod číslom DSM 11999), ktorý sa získal z kmeňa Sorangium cellulosum Soce90 mutáciou a selekciou tak, ako sa ďalej podrobnejšie popisuje. V tekutom médiu vytvára mutant BCE33/10 baciloformné bunky s guľatými koncami typické pre rod Sorangium, dlhé 3 až 6 pm a hrubé 1 pm. Kmeň Sorangium cellulosum Soce90 sa získal z nemeckej zbierky mikroorganizmov (DSM) ako č. DSM 6773.
Príprava mutanta BCE33/10 spočívala v troch krokoch mutácie pomocou UV žiarenia s následnou selekciou jednotlivých kolónii. Celý postup sa uskutočnil tak, ako sa ďalej popisuje.
Kultivácie z ampulky
Bunky z ampulky DSM6773 sa preniesli do 10 ml média G52 v 50 ml Erlenmeyerovej banke a inkubovali sa 6 dní na trepačke pri 180 rpm a 30 °C. 5 ml tejto kultúry sa potom prenieslo do 50 ml média G52 (v 200 ml Erlenmeyerove j banke) a inkubovalo sa trepaním pri 180 rpm a 30 °C.
Prvý krok mutácie UV žiarením a selekcia
0,1 ml časti hore popísanej kultúry sa vysiali na Petriho misky obsahujúce agarové médium S42. Misky sa potom vystavili na 90 alebo 120 sekúnd UV žiareniu (maximálna ožiarenosť pri vlnovej dĺžke 250 až 300 nm) pri ožiarenosti 500 pW/cm2. Misky sa potom inkubovali 7 až 9 dní pri 30 °C, pokiaľ sa nezískali jednotlivé kolónie s veľkosťou 1 až 2 mm. Bunky zo 100 až 150 kolónií sa z jednotlivých kolónií preniesli plastovou očkovacou ihlou do sektorov Petriho misky (4 sektory v miske) s agarovým médiom S42 a inkubovali sa 7 dní pri 30 °C. Bunky, ktoré narástli na ploche asi cm2 agaru sa plastovou očkovacou ihlou preniesli do 10 ml média G52 v 50 ml Erlenmeyerovej banke a inkubovali sa 7 dní trepaním pri 180 rpm a 30 °C. 5 ml tejto kultúry sa potom prenieslo do 50 ml média G52 (v 200 ml Erlenmeyerovej banke) a inkubovalo sa 3 dni trepaním pri 180 rpm a 30 °C. 10 ml tejto kultúry sa potom prenieslo do 50 ml média 23B3 a inkubovalo sa 7 dní trepaním pri 180 rpm a 30 °C.
Na stanovenie množstva epothilonu A a epothilonu B vytvoreného touto kultúrou sa použil nasledujúci postup. 50 ml kultúry sa filtrovalo cez nylonové sito (veľkosť pórov 150 pm) a polystyrénová živica Amberlite XAD-16 zachytená na site sa opláchla malým množstvom vody a potom sa i s filtrom vložila do 50 ml centrifugačnej skúmavky (Falcon Labware, Becton Dickinson AG, Immengasse 7, 4056 Bazilej). 10 ml izopropanolu (>99 %) sa pridalo do skúmavky obsahujúcej filter. Potom sa dobre uzavretá skúmavka' trepala 1 hodinu pri 180 rpm, aby sa v izopropanole rozpustili epothilony A a B naviazané na živici. Potom sa 1,5 ml kvapaliny centrifugovalo a približne 0,8 ml odobratých zo supernatantu sa nanieslo na HPLC kolónu. Analýza pomocou HPLC sa vykonávala tak, ako sa popísalo ďalej v časti analýzy produktu. Pomocou HPLC analýzy sa stanovilo, ktorá kultúra má najvyšší obsah epothilonu B. Z hore popísanej sektorovej Petriho misky zodpovedajúcej vybranej kolónii (misky sa medzitým uchovávali pri 4 °C) sa pomocou plastovej očkovacej ihly preniesli bunky z plochy približne 1 cm2 do 10 ml média G52 v 50 ml Erlenmeyerovej banke a inkubovali sa 7 dní trepaním pri 180 rpm a 30 °C. 5 ml tejto kultúry sa potom prenieslo do 50 ml média G52 (v 200 ml Erlenmeyerovej banke) a inkubovalo sa 3 dni trepaním pri 180 rpm a 30 °C.
Druhý a tretí krok mutácie UV žiarením a selekcia.
Postupy v týchto krokoch boli presne rovnaké ako v prvom, hore popísanom kroku, pričom vybraná kultúra z najlepšej kolónie z prvej UV mutagenézy sa použila v druhom kroku. Na tretiu mutagenézu sa taktiež použila kultúra z najlepšej kolónie z druhej UV mutagenézy. Najlepšou kolóniou po treťom cykle mutačného UV ožarovania nasledovaného selekciou na zlepšenú tvorbu epothilonu B je mutant BCE33/10.
Uchovanie kmeňa ml trojdennej kultúry v médiu G52 (50 ml média v 200 ml Erlenmeyerovej banke, 30 °C, 180 rpm) sa prenieslo do 50 ml média 23B3 (v 200 ml Erlenmeyerovej banke) a inkubovalo sa 3 dni pri 180 rpm a 30 °C. Odobrali sa časti kultúry s objemom 1 ml, a to pokiaľ možno čo naj homogénnejšie (pred každým odberom sa banka ručne zatrepala), spoločne s polystyrénovou živicou Amberlite XAD-16 (polystyrénová adsorpčná živica, Rohm & Haas, Roslide, Dánsko) a uložili sa buď pri teplote -70 °C alebo v kvapalnom dusíku.
Kultivácie kmeňov z týchto ampuliek sa vykonali zahriatím vo vzduchu na teplotu miestnosti a potom sa celý obsah kryoskúmavky preniesol do 10 ml média G52 v 50 ml Erlenmeyerovej banke a inkuboval sa 5 až 7 dní trepaním pri 180 rpm a teplote 30 °C.
Prehlad použitých médií
Médium G52:
extrakt z kvasiniek, nízky obsah soli 2 g/1 (Springer, Maison Alfort, Francúzsko) MgSO4 (7 H2O) g/1
CaCl2 (2 H20) 1 g/1 odtučnená sója (Mucedola S.r.l., Settimo 2 g/1
Miláno, Taliansko) zemiakový škrob Noredux (Blattmann, Wadenswil, 8 g/1 Švajčiarsko) bezvodá glukóza 2 g/1
Fe-EDTA 8 g/1 (Produkt č. 03625, Fluka Chemie 1 g/1 AG, Švajčiarsko) pH 7,4, upravené KOH Sterilizácia: 20 minút, 120 °C
Médium S42 s agarom
Tak ako sa publikovalo v S. Jaoua a kol. Plasmid 28, 157-165 (1992)
Médium 23B3:
bezvodá glukóza zemiakový škrob Noredux (Blattmann, Wadenswil, Švaj čiarsko) odtučnená sója (Mucedola S.r.l., Settimo Miláno, Taliansko)
Fe-EDTA 8 g/1 (Produkt č. 03625, Fluka Chemie
AG, Švajčiarsko) pH 7,4, korigované KOH
HEPES (Fluka, Buchs, Švajčiarsko) polystyrénová živica XAD-16 (Rohm & Haas) deionizovaná voda, upravené pomocou NaOH na pH 7,8
Sterilizácia: 20 minút, 120 °C g/1 20 g/1 g/1 g/1 g/1 2 % (objem.) (HEPES = kyselina 4-(2-hydroxyetyl)-piperazín-l-etánsulfonová)
Príklad 2
Kultivácia s cielom produkovať epothilony
Kmeň: Sorangium cellulosum Soce-90 BCE33/10 (z príkladu 1)
Uchovanie kmeňa: v kvapalnom dusíku, pozri príklad 1
Médiá: Predkultúra a medzikultúra: médium G52
Hlavná kultúra: médium 1B12
Médium G52:
extrakt z kvasiniek, nízky obsah soli 2 g/1
(Springer, Maison Alfort, Francúzsko)
MgSO4 (7 H2O) 1 g/1
CaCl2 (2 H2O) 1 g/i
odtučnená sója Soyamine 50 T (Lucas Meyer, 2 g/i
Hamburg, NSR)
zemiakový škrob Noredux (Blattmann, Wadenswil, 8 g/i
Švajčiarsko)
bezvodá glukóza 2 g/i
Na soľ EDTA-Fe (III) (8 g/1) 1 g/i
pH 7,4, upravené KOH Sterilizácia: 20 minút, 120 °C
Médium 1B12:
zemiakový škrob Noredux (Blattmann, Wadenswil, 20 g/1 Švajčiarsko) odtučnená sója Soyamine 50 T (Lucas Meyer, 11 g/1
Hamburg, NSR)
Na sol EDTA-Fe (III) pH 7,4, upravené KOH Sterilizácia: 20 minút, 120 °C g/1
Pridanie cyklodextrínov a derivátov cyklodextrínov:
Cyklodextríny (Fluka, Buchs, Švajčiarsko, alebo Wacker Chemie, Mníchov, NSR) sa v rôznych koncentráciách sterilizovali samostatne a pridali sa k médiu 1B12 pred zaočkovaním.
Kultivácia ml suspenzie Sorangium cellulosum Soce90 BCE33/10 z ampulky uchovávanej v kvapalnom dusíku sa prenieslo do 10 ml média G52 (v 50 ml Erlenmeyerovej banke) a inkubovalo sa 3 dni na trepačke pri 180 rpm a 30 °C, posun 25 mm. 5 ml tejto kultúry sa potom pridalo k 45 ml média G52 (v 200 ml Erlenmeyerovej banke) a inkubovalo sa 3 dni trepaním pri 180 rpm a 30 °C, posun 25 mm. 50 ml tejto kultúry sa potom pridalo k 450 ml média G52 (v 2 1 Erlenmeyerovej banke) a inkubovalo sa 3 dni trepaním pri 180 rpm a 30 °C, posun 50 mm.
Udržiavacie kultúry
Kultúra sa preočkovala každé 3 až 4 dni, a to tak, že 50 ml kultúry sa pridalo k 450 ml média G52 (v 2 1 Erlenmeyerovej banke). Všetky experimenty a fermentácie sa vykonávali vždy tak, že sa začalo touto udržiavacou kultúrou.
Testy v kultivačných fľašiach
I) Predkultúra v trepacej fľaši
Kultivácia sa začala z 500 ml udržiavacej kultúry, 1 x 450 ml média G52 sa inokulovalo 50 ml udržiavacej kultúry a inkubovalo sa 4 dni na trepačke pri 180 rpm a 30 °C s 50 mm posunom.
II) Hlavná kultúra v pretrepávanej kultivačnej fľaši ml média 1B12 s 5 g/1 4-morfolínpropánsulfónovej kyseliny (MOPS) v prášku '(v 200 ml Erlenmeyerovej banke) sa zmiešalo s 5 ml 10 x koncentrovaného roztoku cyklodextrínu, inokulovalo sa 10 ml predkultúry a inkubovalo sa 5 dní na trepačke pri 180 rpm a 30 °C s posunom 50 mm.
Fermentácia
Fermentácie sa vykonávali v množstvách 10 litrov, 100 litrov a 500 litrov. Fermentácie s objemami 20 1 a 100 1 slúžili ako medzikroky pri kultivácii. Zatiaľ čo predkultúry a medzikultúry sa ako udržiavacie kultúry inokulovali 10 % (objem.), hlavné kultúry sa inokulovali 20 % (objem.) medzikultúry. Dôležité je, že na rozdiel od kultúr, ktoré sa trepali, zložky kultivačného média na fermentácie sa vypočítali vzhladom ku konečnému objemu kultúry vrátane inokula. Takže napr. ak sa zmiešalo 18 1 média a 2 1 inokula, odvážili sa zložky média pre 20 1, i keď sa namiešali do 18 litrov.
Predkultúra v pretrepávanej kultivačnej fľaši
Kultivácia sa začala z 500 ml udržovacej kultúry, 4 x 450 ml média G52 (v 2 litrových Erlenmeyerových bankách) sa inokulovalo 50 ml udržovacej kultúry a inkubovalo sa 4 dni na trepačke pri 180 rpm a 30 °C s 50 mm posunom.
Medzikultúry s objemom 20 alebo 100 litrov litrová kultúra: 18 1 média G52 vo fermentore s celkovým objemom 30 1 sa inokulovalo 2 1 predkultúry. Kultivácia prebiehala 3 až 4 dni v nasledujúcich podmienkach: 30 °C, 250 rpm, 0,5 1 vzduchu na 1 1 média za minútu, pretlak 500 kPa (0,5 bar), bez kontroly pH.
100 litrová kultúra: 90 1 média G52 vo fermentore s celkovým objemom 150 1 sa inokulovalo 10 1 z 20 1 medzikultúry. Kultivácia prebiehala 3 až 4 dni v nasledujúcich podmienkach: 30 °C, 150 rpm, 0,5 1 vzduchu na 1 1 média za minútu, pretlak 500 kPa (0,5 bar), bez kontroly pH.
Hlavné kultúry s objemom 10, 100 a 500 litrov litrová kultúra: Zložky pre 10 1 média 1B12 sa sterilizovali v 7 1 vody, potom sa pridal 1 1 sterilného roztoku 10% 2-hydroxypropyl-p-cyklodextrínu a médium sa inokulovalo 2 1 z 20 litrovej medzikultúry. Kultivácia hlavnej kultúry trvala 6 až 7 dní v nasledujúcich podmienkach: 30 °C, 250 rpm, 0,5 1 vzduchu na 1 1 média za minútu, pretlak 500 kPa (0,5 bar), pH sa regulovalo pomocou H2SO4/KOH na hodnotu pH 7,6 ± 0,5 (t.j. žiadna regulácia pre pH 7,1 až 8,1).
1OO litrová kultúra: Zložky pre 100 1 média 1B12 sa sterilizovali v 70 1 vody, potom sa pridalo 10 1 sterilného roztoku · 10% 2-hydroxypropyl-p-cyklodextrínu a médium sa inokulovalo 20 1 z 20 litrovej medzikultúry. Kultivácia hlavnej kultúry trvala 6 až 7 dní v nasledujúcich podmienkach: 30 °C, 250 rpm, 0,5 1 vzduchu na 1 1 média za minútu, pretlak 500 kPa (0,5 bar), pH sa regulovalo pomocou H2SO4/KOH na hodnotu pH 7,6 ± 0,5. Celý postup inokulácií pre výslednú 100 litrovú fermentáciu je znázornený nasledujúcou schémou:
udržiavacia kultúra (500 ml) médium G52
udržiavacia kultúra (500 ml) médium G52 medzikultúra
10%
-► (napr. 20 1) médium G52 %
hlavná kultúra (napr. 100 1) médium + ΗΡ-β-CD
500 litrová kultúra: zložky pre 500 1 média 1B12 sa sterilizovali v 350 1 vody, potom sa pridalo 50 1 sterilného roztoku 10% 2-hydroxypropyl^-cyklodextrínu a médium sa inokulovalo 100 1 zo 1OO litrovej medzikultúry. Kultivácia hlavnej kultúry trvala 6 až 7 dní v nasledujúcich podmienkach: 30 °C, 250 rpm, 0,5 1 vzduchu na 1 1 média za minútu, pretlak
500 kPa (0,5 bar), pH sa regulovalo pomocou H2SO4/KOH na hodnotu pH 7,6 ± 0,5.
Analýza produktov e
Príprava vzoriek:
• ml vzorky sa zmiešali s 2 ml polystyrénovej živice Amberlite XAD-1180 (Rohm & Haas, Frankfurt, NSR) a trepali sa pri 180 rpm 1 hodinu pri 30 °C. Živica sa potom odfiltrovala pomocou 150 pm nylonového sita, opláchla sa malým množstvom vody a potom sa vložila aj s filtrom do 15 ml skúmavky Nunc.
Elúcia produktu zo živice ml izopropanolu (>99%) sa pridalo do skúmavky s filtrom a živicou. Potom sa zatvorená skúmavka trepala 30 minút pri teplote miestnosti na zariadení Rota-Mixer (Labinco BV, Holandsko). 2 ml tejto tekutiny sa centrifugovali a supernatant sa pipetou naniesol do HPLC skúmaviek.
HPLC analýza:
Kolóna: Waters-Symetry C18, 100 x 4 mm, 3,5 pm WAT066220 + predkolóna 3,9 x 20 mm WAT054225 Rozpúšťadlá: A: 0,02 % kyselina fosforečná
B: Acetonitril (kvalita pre HPLC)
Gradient: 41 % B od 0 do 7 minút
100% B od 7, 2 , do 7,8 minúty
41 % B od 8 do 12 minút
Teplota: 30 °C
Detekcia: 250 nm, UV-DAD detekcia
Injikovaný objem: 10 pl
Retenčný čas: Epo A: 4,30 minúty, Epo B: 5,38 minúty
Príklad 2A
Vplyv pridania cyklodextrínu a derivátov cyklodextrínu na koncentrácie epothilonov
Všetky tu testované deriváty cyklodextrínu pochádzali od firmy Fluka, Buchs, Švajčiarsko. Testy sa vykonávali v 200 ml pretrepávaných fľašiach s kultúrou s objemom 50 ml. Ako kontroly slúžili fľaše s adsorpčnou živicou Amberlite XAD-16 (Rohm & Haas, Frankfurt, NSR) a bez prídavku živice. Po päťdennej kultivácii sa pomocou HPLC stanovili titre epothilonov uvedené v nasledujúcej tabuľke 1:
Tabuľka 1
Prídavok porád. č. kon- centrá -cia (%)1 epo A (mg/1) epo B (mg/1)
Amberlite XAD-16 2,0 9,2 3, 8
2-hydroxypropyl-3-cyklodextrín 56332 0,1 2,7 1,7
2-hydroxypropyl-3-cyklodextrín tt 0,5 4,7 3, 3
2-hydroxypropyl-p-cyklodextrín n 1,0 4,7 3,4
2-hydroxypropyl-^-cyklodextrín n 2,0 4,7 4,1
2-hydroxypropyl-p-cyklodextrín n 5,0 1,7 0,5
2-hydroxypropyl-a-cyklodextrín 56330 0,5 1,2 1,2
2-hydroxypropyl-a-cyklodextrín tr 1,0 1,2 1,2
2-hydroxypropyl-a-cyklodextrín tr 5, 0 2,5 2,3
β-cyklodextrín 28707 0,1 1,6 1,3
β-cyklodextrín tt 0, 5 3, 6 2,5
β-cyklodextrín tt 1,0 4,8 3,7
β-cyklodextrín tt 2,0 4,8 2,9
β-cyklodextrín tt 5, 0 1,1 0,4
metyl^-cyklodextrín 66292 0,5 0,8 <0,3
metyl-p-cyklodextrín tt 1,0 <0,3 <0,3
metyl-p-cyklodextrín tt 2,0 <0,3 <0,3
2,6-di-o-metyl-p-cyklodextrín 39915 1,0 <0,3 <0,3
2-hydroxypropyl-y-cyklodextrín 56334 0,1 0,3 <0,3
2-hydroxypropyl-y-cyklodextrín tt 0,5 0,9 0,8
2-hydroxypropyl-y-cyklodextrín tt 1,0 1,1 0,7
2-hydroxypropyl-y-cyklodextrín tt 2,0 2,6 0,7
2-hydroxypropyl-y-cyklodextrín tt 5,0 5,0 1,1
bez prídavku 0,5 0,5
-1) okrem Amberlitu, kde sú údaje v objemových % (objem/objem) sú ostatné údaje v hmotnostných % (hmotnosť/objem).
Niekolko testovaných cyklodextrínov neprejavilo žiadny účinok (2,6-di-0-metyl-p-cyklodextrín, metyl-p-cyklodextrín) alebo negatívny účinok na produkciu epothilonov pri použitých koncentráciách. 1 % až 2 % 2-hydroxypropyl-p-cyklodextrín a β-cyklodextrín zvýšili v príkladoch produkciu epothilonov 6 až 8 x v porovnaní s kontrolou bez prídavku cyklodextrínov.
Príklad 2B litrová fermentácia s 1 % 2-hydroxypropyl-p-cyklodextrínom
Fermentácia sa vykonávala v 15 litrovom sklenenom fermentore. Médium obsahovalo 10 g/l 2-hydroxypropyl-p-cyklodextrínu od firmy Wacker Chemie, Mníchov, NSR. Postup fermentácie je znázornený v tabulke 2. Fermentácia sa ukončila po 6 dňoch a vykonalo sa spracovanie produktu.
Tabulka 2: Postup fermentácie v objeme 10 1
trvanie kultúry (dni) epothilon A (mg/1) epothilon B (mg/1)
0 0 0
1 0 0
2 0, 5 0,3
3 1,8 2,5
4 3,0 5,1
5 3,7 5,9
6 3,6 5,7
Príklad 2C
100 litrová fermentácia s 1 % 2-hydroxypropyl-p-cyklodextrínom
Fermentácia sa vykonávala v 150 litrovom fermentore. Médium obsahovalo 10 g/l 2-hydroxypropyl-p-cyklodextrínu. Postup fermentácie je zobrazený v tabuľke 3. Fermentácia sa ukončila po 7 dňoch a vykonalo sa spracovanie produktu.
Tabuľka 3: Postup fermentácie v objeme 100 1
trvanie kultúry (dni) epothilon A (mg/l) epothilon B (mg/l)
0 0 0
1 0 0
2 0,3 0
3 0,9 1,1
4 1,5 2,3
5 1,6 3,3
6 1,8 3,7
7 1,8 3,5
Príklad 2D
500 litrová fermentácia s 1 % 2-hydroxypropyl-p-cyklodextrínom
Fermentácia sa vykonávala v 750 litrovom fermentore. Médium obsahovalo 10 g/l 2-hydroxypropyl-p-cyklodextrínu. Postup fermentácie je zobrazený v tabulke 4. Fermentácia sa ukončila po 7 dňoch a vykonalo sa spracovanie produktu.
Tabuľka 4: Postup fermentácie v objeme 100 1
trvanie kultúry (dni) epothilon A (mg/l) epothilon B (mg/l)
0 0 0
1 0 0
2 0 0
3 0, 6 0, 6
4 1,7 2,2
5 3,1 4,5
6 3,1 5,1
Príklad 2E
Porovnanie 10 litrovej fermentácie bez prídavku adsorpčného činidla
Eermentácia sa vykonávala v 15 litrovom sklenenom fermentore. Médium neobsahovalo žiadny cyklodextrín ani iné adsorpčné činidlo. Postup fermentácie je zobrazený v tabulke 5. Fermentácia sa nepozbierala a nespracovala sa na produkt.
Tabulka 5: Postup fermentácie v objeme 10 1 bez prídavku adsorpčného činidla
trvanie kultúry (dni) epothilon A (mg/1) epothilon B (mg/1)
0 0 0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
4 0,7 0,7
5 0,7 1,0
6 0,8 1,3
Príklad 3
Spracovanie epothilonov: Izolácia z 500 litrovej hlavnej kultúry
Objem pozbieranej kultúry z 500 litrovej fermentácie popísanej v príklade 2D bol 450 1 a separoval sa pomocou čistiaceho separátora Westfalia SA-20-06 (rpm = 6500) na tekutú fázu (supernatant + preplachovacia voda) = 650 1) a pevnú fázu (bunky = približne 15 kg). Hlavná časť epothilonov sa nachádzala v supernatante. Bunková kaša po centrifugácii obsahovala menej než 15 % stanovených epothilonov a nebola ďalej spracovávaná. 650 1 centrifugátu sa prenieslo do 4000 litrovej miešacej
1. Etylacetátové až 51 vo vákuovom nádoby, zmiešalo sa s 10 1 živice Amberlite XAD-16 (objem centrifugát:živica =65:1) a premiešalo sa. Po kontaktnej dobe približne 2 hodiny sa živica odstránila pomocou Heineho prietokovej centrifúgy (objem kaše 40 1, rpm = 2800) . Živica sa potom vybrala z centrifúgy a opláchla sa 10 až 15 1 deionizovanej vody. Desorpcia sa uskutočnila dvakrát, zakaždým po častiach s 30 1 izopropanolu v 80 litrovej sklenenej miešacej nádobe po dobu 30 minút. Oddelenie izopropanolovej fázy od živice sa vykonalo odsávacím filtrom. Izopropanol sa potom odstránil zo zmiešaných izopropanolových fáz pridaním 15 až 20 1 vody vo vákuovom cirkulačnom odparovači (Schmid-Verdampfer) a výsledná vodná fáza s objemom približne 10 1 sa extrahovala 3 x za každým s 10 1 etylacetátu. Extrakcia prebiehala v sklenenej miešacej nádobe s objemom extrakty sa skoncentrovali na objem 3 cirkulačnom odparovači (Schmid-Verdampfer) a potom sa skoncentrovali do sucha v rotačnom odparovači (typ Buchi) pod vákuom. Tak sa získal etylacetátový extrakt s hmotnosťou 50,2 g. Tento etylacetátový extrakt sa rozpustil v 500 ml metanolu, nerozpustný podiel sa odfiltroval pomocou skladaného filtra a roztok sa naniesol na kolónu s 10 kg Sephadexu LH 20 (Pharmacia, Švédsko) (kolóna s priemerom 20 cm, hladina plnenia približne 1,2 m). Na elúciu sa použil metanol ako elučné činidlo. Epothilony A a B boli prítomné hlavne vo frakciách 21 až 23 (veľkosť frakcie je 1 liter). Tieto frakcie sa skoncentrovali do sucha v rotačnom odparovači vo vákuu (celková hmotnosť 9,0 g). Potom sa tieto sephadexové frakcie s maximálnou koncentráciou (9,0 g) rozpúšťali v 92 ml zmesi acetonitril:voda : metylénchlorid = 50:40:2, roztok sa filtroval cez skladaný filter a potom sa naniesol na kolónu RP (zariadenie Prepbar 200, Merck, 2,0 kg LiChrospher RP-18 Merck, zrnitosť 12 pm, priemer kolóny 10 cm, hladina plnenia 42 cm, Merck, Darmstadt, NSR) . Elúcia sa uskutočnila zmesou acetonitril:voda =3:7 (prietok = 500 ml/min, retenčný čas epothilonu A = približne 51 až 59 minút, retenčný čas epothilonu B = približne 60 až 69 minút). Frakcionácia sa monitorovala UV detektorom pri 250 nm. Frakcie sa skoncentrovali do sucha v rotačnom odparovači typu Buchi. Hmotnosť frakcie s maximálnou koncentráciou epothilonu A bola 700 mg a podľa analýzy HPLC (vonkajší štandard) ho obsahovala 75,1 %. Hmotnosť frakcie s maximálnou koncentráciou epothilonu B bola 1980 mg a podlá analýzy HPLC (vonkajší štandard) ho obsahovala 86,6 %. Nakoniec sa frakcia epothilonu A (700 mg) kryštalizovala zo zmesi etylacetát:toluén = 2:3 a výťažok bol 170 mg čistej kryštalickej formy typu A (obsah podľa HPLC (% plochy) = 94,3 %) . Kryštalizácia frakcie epothilonu B (1980 mg) sa uskutočnila z 18 ml metanolu a výťažok bol 1440 mg čistej kryštalickej formy epothilonu B (obsah podľa HPLC (% plochy) = 99,2 %) .
Epothilon B: 124 °C-125 °C, 1H-NMR údaje pre epothilon B:
500 Mhz-NMR, rozpúšťadlo: DMSO-d6, chemický posun δ v ppm vzhľadom na TMS, s = singlet, d = dublet, m = multiplet.
δ (multiplicita) Integrál (počet H)
7,34 (s) 1
6,50 (s) 1
5,28 (d) 1
5,08 (d) 1
4,46 (d) 1
4,08 (m) 1
3,47 (m) 1
3,11 (m) 1
2,83 (dd) 1
2,64 (s) 3
2,36 (m) 2
2,09 (s) 3
2,04 (m) 1
1,83 (m) 1
1,61 (m) 1
1,47-1,24 (m) 4
1,18 (s) 6
1,13 (m) 2
1,06 (d) 3
0,89 (d+s, prekrytie) 6
Σ = 41
V tomto príklade (príklad 3) sa epothilon B získal v kryštalickej modifikácii A (pozri všeobecnú časť popisu predkladaného vynálezu).
Príklad 4
Kryštalická modifikácia B epothilonu B mg epothilonu B (získaného v predchádzajúcom príklade) sa suspendovalo v 1 ml izopropanolu a trepalo sa 24 hodín pri 25 °C. Produkt sa potom filtroval a vysušil. Po vysušení vo vákuu sa získal epothilon B vo forme bielych kryštálov. Kryštalická modifikácia produktu je charakterizovaná róntgenovým difrakčným diagramom modifikácie B (pozri všeobecnú časť popisu predkladaného vynálezu).

Claims (23)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY » 1. Spôsob skoncentrovania epothilonov v kultivačnom médiu na biotechnologickú výrobu týchto zlúčenín, vyznačujúci sa t ý m, že obsahuje mikroorganizmy, ktoré vytvárajú tieto zlúčeniny, pričom sa do média pridá komplexotvorná zložka, ktorá je v kultivačnom médiu rozpustná.
  2. 2. Spôsob skoncentrovania epothilonov podlá nároku 1 v kultivačnom médiu na biotechnologickú výrobu týchto zlúčenín, vyznačujúci sa tým, že obsahuje myxobaktérie ako producentov prírodných látok, pričom sa do média pridá komplexotvorná zložka, ktorá je v kultivačnom médiu rozpustná.
  3. 3. Spôsob skoncentrovania epothilonov podlá nároku 1, vyznačujúci sa tým, že na biotechnologickú výrobu epothilonov sa použije kultivačné médium obsahujúce kmeň Sorangium vhodný na prípravu týchto zlúčenín, vodu a ďalšie obvyklé zložky kultivačného média, pričom sa do média pridá jeden alebo niekoľko cyklodextrínov, ktoré sa vyberajú zo skupiny obsahujúcej: a-cyklodextrín, β-cyklodextrín, γ-cyklodextrín, δ-cyklodextrín, ε-cyklodextrín, ξ-cyklodextrín, η-cyklodextrín, a θ-cyklodextrín, alebo cyklodextrínové deriváty , alebo zmesi cyklodextrínových derivátov vybraných z derivátov, kde jedna alebo niekoľko až všetky hydroxylové skupiny sú éterifikované na alkyléter, arylhydroxyalkyléter, hydroxyalkyléter, karboxylakyléter, derivatizovaný karboxy(nižší)alkyléter, kde derivatizovaná karboxylová skupina je aminokarbonylová, mono- alebo di(nižšia)alkylaminokarbonylová skupina, morfolín-, piperidín-, pyrolidín- alebo piperazínkarbonylová alebo alkyl49 oxykarbonylová skupina, sulfoalkyléter, cyklodextrín, kde jedna alebo niekoľko skupín OH je éterifikovaných skupinou vzorca:
    -0-[alk-O-]n-H, kde alk je alkylová skupina a n je celé číslo od 2 do 12 vrátane, cyklodextrín, kde jedna alebo niekoľko skupín OH je éterifikovaných skupinou vzorca:
    (Alk-O)--Alk
    Y kde R' je vodík, hydroxylová skupina, -0-(alk-O) Z-H, -0-(alk(-R)-0-)P-H alebo -0-(alk(-R)-0-)q-alk-CO-Y, pričom alk znamená alkylovú skupinu am, n, p, q a z sú celé čísla 1 až 12, a Y je OR1 alebo NR2R3, kde R1, R2 a R3 navzájom nezávisle sú atómy vodíka alebo nižšie alkylové skupiny, alebo R2 a R3 kombinované spoločne s väzobným atómom dusíka sú morfolínová, piperidínová, pyrolidínová alebo piperazínová skupina, alebo rozvetvený cyklodextrín, kde sa vyskytujú éterifikácie alebo acetálové väzby s inými molekulami cukru, ktorý sa vyberá zo skupiny obsahujúcej glukozyl-, diglukozyl (G2^-cyklodextrín), maltozyl- alebo dimaltozylcyklodextrín, alebo N-acetyglukozaminyl-, glukozaminyl-, N-acetylgalaktozaminyl- a galaktozaminylcyklodextrín, a nižšie alkanoylové deriváty ako je acetylester cyklodextrínu, alebo zmesi dvoch alebo viacerých cyklodextrínov a/alebo derivátov cyklodextrínov.
  4. 4. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že cyklodextrín a/alebo derivát cyklodextrínu sa do kultivačného média pridáva v koncentrácii 0,05 až 10 % hmotnostných (hmotn./objem) .
  5. 5. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že cyklodextrín a/alebo derivát cyklodextrínu sa pridáva v koncentrácii 0,1 až 2 % hmotnostné (hmotn./objem).
  6. 6. Spôsob podlá nároku 3, vyznačujúci sa tým, že derivát cyklodextrínu sa vyberá zo skupiny obsahujúcej cyklodextrín a hydroxy(nižší)alkylcyklodextrín alebo zmesi jedného alebo niekoľkých z nich.
  7. 7. Spôsob podlá nároku 1, vyznačujúci sa tým, že komplexotvornou zložkou je 2-hydroxypropyl-p-cyklodextrín.
  8. 8. Kultivačné médium, ktoré obsahuje komplexotvornú zložku a mikroorganizmus vhodný na výrobu epothilonov.
  9. 9. Kultivačné médium podľa nároku 8, kde komplexotvornou zložkou je cyklodextrín, derivát cyklodextrínu alebo zmes dvoch alebo viacerých komplexotvorných zložiek vybraných z cyklodextrínov a derivátov cyklodextrínu.
  10. 10. Kultivačné médium podľa nároku 9, kde mikroorganizmom je myxobaktéria.
    vyznačuj ucí
  11. 11. Spôsob výroby epothilonov, tým, že epothilony sa získali spracovaním kultivačného média na biotechnologickú prípravu týchto zlúčenín, pričom toto médium obsahuje ako producentov prírodných látok mikroorganizmy schopné vytvárať epothilony, najmä myxobaktérie, pričom sa do média pridá komplexotvorná zložka rozpustná v médiu, potom sa epothilony purifikujú a podlá potreby separujú.
  12. 12. Spôsob výroby epothilonov podľa nároku 11, čujúci sa tým, že epothilony sa získali spracovaním kultivačného média na biotechnologickú prípravu týchto zlúčenín, vyzná51 ktoré obsahuje myxobaktérie rodu Sorangium, pričom sa do média pridá komplexotvorná zložka rozpustná v médiu, kultúra sa separuje centrifugáciou na pevnú a kvapalnú fázu (centrifugát), centrifugát sa potom zmieša so živicou alebo sa aplikuje na kolónu naplnenú takouto živicou, pokial je to potrebné živica sa prepláchne vodou, epothilony sa desorbujú zo živice polárnym >
    rozpúšťadlom, a ak je to potrebné skoncentrujú sa predchádzajúcim, súčasným alebo následným pridaním vody, potom sa pridá organické rozpúšťadlo nemiešateľné s vodou a epothilony sa extrahujú do organickej fázy, získaná organická fáza sa podľa potreby skoncentruje, epothilony z organického roztoku sa získajú skoncentrovaním cez molekulové sito pre nízkomolekulové zlúčeniny, a potom sa frakcia obsahujúca epothilony podrobí separácii na kolóne s reverznou fázou, pričom epothilon A a B sa získajú oddelene a podľa potreby sa ďalej skoncentrujú rekryštalizáciou.
  13. 13. Spôsob výroby epothilonov, vyznačujúci sa tým, že
    a) ide o spôsob skoncentrovania epothilonov z kultivačného média na biotechnologickú prípravu týchto zlúčenín, ktoré obsahuje mikroorganizmy vhodné na ich produkciu, vodu a ďalšie obvyklé súčasti kultivačného média, pričom sa do média pridá cyklodextrín alebo derivát cyklodextrínu alebo zmes dvoch alebo viacerých týchto látok, a
    b) obsahuje krok, v ktorom sa epothilony separujú od seba *
    navzájom, a síce chromatografiou na kolóne s reverznou fázou » s elučným činidlom obsahujúcim (nižší)alkylkyanid, pričom chromatografická kolóna je naplnená materiálom s naviazanými uhľovodíkovými reťazcami a použije sa elučné činidlo obsahujúce (nižší)alkylnitril, pričom sú podľa potreby možné ďalšie kroky spracovania a purifikácie.
  14. 14. Spôsob vzájomnej separácie epothilonov, najmä epothilonu
    A a epothilonu B, vyznačujúci sa tým, že sa uskutočňuje chromatografiou na kolóne s reverznou fázou s elučným činidlom obsahujúcim (nižší)alkylkyanid.
  15. 15. Spôsob podlá nároku 14, vyznačujúci sa tým, že ako náplň kolóny sa použije materiál s naviazanými uhľovodíkovými reťazcami obsahujúcimi 18 atómov uhlíka a ako elučné činidlo sa použije zmes vody a acetonitrilu.
  16. 16. Kmeň Sorangium cellulosum, ktorý sa získal mutagenézou a ktorý za rovnakých podmienok produkuje viac epothilonov než kmeň Sorangium cellulosum Soce90.
  17. 17. Kmeň podlá nároku 16 označený BCE33/10.
  18. 18. Kryštalická forma epothilonu B označená ako modifikácia A, ktorá je charakteristická rôntgenovým difrakčným diagramom získaným pomocou difraktometra a žiarenia Cu-Κα1, pričom tento diagram sa popisuje v nasledujúcej tabulke:
    20 Intenzita 7,7 veľmi silná 10,6 slabá 13,6 priemerná 14,4 priemerná 15,5 priemerná 16, 4 slabá 16, 8 slabá 17,1 slabá 17,3 slabá 17,7 slabá 18,5 slabá 20,7 silná 21,2 silná
    21, 9 slabá 22,4 slabá 23,3 silná 25,9 priemerná 31,2 slabá 32,0 priemerná
  19. 19. Kryštalická forma epothilonu B označená ako modifikácia B, ktorá je charakteristická róntgenovým difrakčným diagramom získaným pomocou difraktometra a žiarenia Cu-Κα1, pričom tento diagram sa popisuje v nasledujúcej tabulke:
    2Θ Intenzita 6,9 velmi silná 8,0 slabá 8,3 priemerná 10,8 silná 11,5 priemerná 12,4 slabá 13,1 silná 15,5 slabá 16,2 slabá 16,7 priemerná 18,1 priemerná 18,6 priemerná 20,4 slabá 20,9 silná 21,3 slabá 21,5 velmi slabá 22,5 priemerná 24,2 slabá 25,1 priemerná
  20. 20. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje účinnú látku podľa jedného z nárokov 18 a 19 spoločne s farmaceutický prijateľným nosičom.
  21. 21. Spôsob liečenia teplokrvného živočícha trpiaceho proliferatívnym ochorením, vyznačujúci sa tým, že sa teplokrvnému živočíchovi, ktorý takéto liečenie potrebuje, podáva dávka epothilonu B podľa jedného z nárokov 18 a 19, ktorá je účinná pri liečení tejto choroby.
  22. 22. Použitie kryštalických foriem podľa jedného z nárokov 18 a 19 na liečenie proliferatívnych chorôb.
  23. 23. Použitie novej kryštalickej formy epothilonu B podľa jedného z nárokov 18 a 19 na výrobu farmaceutického prípravku, v ktorom sa kryštalická forma tohto typu zmieša s jedným alebo viacerými nosičmi.
SK1240-2000A 1998-02-19 1999-02-17 Spôsob koncentrovania epotilónov v kultivačnom médiu na biotechnologickú prípravu týchto zlúčenín, kultivačné médium a spôsob výroby epotilónov SK286517B6 (sk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CH39698 1998-02-19
CH100798 1998-05-05
PCT/EP1999/001025 WO1999042602A2 (en) 1998-02-19 1999-02-17 Fermentative preparation process for cytostatics and crystal forms thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK12402000A3 true SK12402000A3 (sk) 2001-05-10
SK286517B6 SK286517B6 (sk) 2008-12-05

Family

ID=25684443

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK5014-2008A SK287677B6 (sk) 1998-02-19 1999-02-17 Kryštalická forma epotilónu B, farmaceutická kompozícia s jej obsahom a použitie kryštalickej formy epotilónu B
SK5029-2009A SK288058B6 (sk) 1998-02-19 1999-02-17 Process for separating epothilones
SK1240-2000A SK286517B6 (sk) 1998-02-19 1999-02-17 Spôsob koncentrovania epotilónov v kultivačnom médiu na biotechnologickú prípravu týchto zlúčenín, kultivačné médium a spôsob výroby epotilónov

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK5014-2008A SK287677B6 (sk) 1998-02-19 1999-02-17 Kryštalická forma epotilónu B, farmaceutická kompozícia s jej obsahom a použitie kryštalickej formy epotilónu B
SK5029-2009A SK288058B6 (sk) 1998-02-19 1999-02-17 Process for separating epothilones

Country Status (24)

Country Link
US (8) US6194181B1 (sk)
EP (2) EP1054994B1 (sk)
JP (3) JP3681109B2 (sk)
KR (4) KR100595774B1 (sk)
CN (2) CN1286839C (sk)
AT (1) ATE282710T1 (sk)
AU (1) AU746294B2 (sk)
BR (1) BR9908119A (sk)
CA (1) CA2318818A1 (sk)
CZ (1) CZ301517B6 (sk)
DE (1) DE69921966T2 (sk)
DK (1) DK1054994T3 (sk)
ES (1) ES2233028T3 (sk)
HU (1) HU225851B1 (sk)
IL (4) IL137691A0 (sk)
NO (4) NO322588B1 (sk)
NZ (2) NZ506138A (sk)
PL (2) PL404926A1 (sk)
PT (1) PT1054994E (sk)
RU (1) RU2268306C2 (sk)
SI (1) SI1054994T1 (sk)
SK (3) SK287677B6 (sk)
TR (2) TR200101634T2 (sk)
WO (1) WO1999042602A2 (sk)

Families Citing this family (125)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT1186606E (pt) 1995-11-17 2004-08-31 Biotechnolog Forschung Mbh Gbf Derivados do epotilone sua preparacao e utilizacao
DK0941227T5 (da) 1996-11-18 2009-10-05 Biotechnolog Forschung Gmbh Epothilon D, dens fremstilling samt dens anvendelse som cytostatisk middel og som plantebeskyttelsesmiddel
CA2273083C (en) 1996-12-03 2012-09-18 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Synthesis of epothilones, intermediates thereto, analogues and uses thereof
US20050043376A1 (en) * 1996-12-03 2005-02-24 Danishefsky Samuel J. Synthesis of epothilones, intermediates thereto, analogues and uses thereof
US6204388B1 (en) * 1996-12-03 2001-03-20 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Synthesis of epothilones, intermediates thereto and analogues thereof
US6605599B1 (en) 1997-07-08 2003-08-12 Bristol-Myers Squibb Company Epothilone derivatives
US6365749B1 (en) 1997-12-04 2002-04-02 Bristol-Myers Squibb Company Process for the preparation of ring-opened epothilone intermediates which are useful for the preparation of epothilone analogs
US6194181B1 (en) * 1998-02-19 2001-02-27 Novartis Ag Fermentative preparation process for and crystal forms of cytostatics
FR2775187B1 (fr) * 1998-02-25 2003-02-21 Novartis Ag Utilisation de l'epothilone b pour la fabrication d'une preparation pharmaceutique antiproliferative et d'une composition comprenant l'epothilone b comme agent antiproliferatif in vivo
US6380395B1 (en) 1998-04-21 2002-04-30 Bristol-Myers Squibb Company 12, 13-cyclopropane epothilone derivatives
US6498257B1 (en) 1998-04-21 2002-12-24 Bristol-Myers Squibb Company 2,3-olefinic epothilone derivatives
US6410301B1 (en) 1998-11-20 2002-06-25 Kosan Biosciences, Inc. Myxococcus host cells for the production of epothilones
NZ511722A (en) 1998-11-20 2004-05-28 Kosan Biosciences Inc Recombinant methods and materials for producing epothilone and epothilone derivatives
US6518421B1 (en) * 2000-03-20 2003-02-11 Bristol-Myers Squibb Company Process for the preparation of epothilone analogs
US6593115B2 (en) 2000-03-24 2003-07-15 Bristol-Myers Squibb Co. Preparation of epothilone intermediates
NZ546497A (en) * 2000-04-28 2008-04-30 Kosan Biosciences Inc Production of polyketides
US6589968B2 (en) 2001-02-13 2003-07-08 Kosan Biosciences, Inc. Epothilone compounds and methods for making and using the same
US6998256B2 (en) * 2000-04-28 2006-02-14 Kosan Biosciences, Inc. Methods of obtaining epothilone D using crystallization and /or by the culture of cells in the presence of methyl oleate
UA75365C2 (en) * 2000-08-16 2006-04-17 Bristol Myers Squibb Co Epothilone analog polymorph modifications, a method for obtaining thereof (variants), a pharmaceutical composition based thereon
IL155306A0 (en) 2000-10-13 2003-11-23 Univ Mississippi Methods for producing epothilone derivatives and analogs and epothilone derivatives and analogs produced thereby
GB0029895D0 (en) * 2000-12-07 2001-01-24 Novartis Ag Organic compounds
MXPA03006485A (es) * 2001-01-25 2003-09-22 Bristol Myers Squibb Co Formulacion parenteral que contiene analogos de epotilona.
NZ526871A (en) * 2001-01-25 2006-01-27 Bristol Myers Squibb Co Pharmaceutical dosage forms of epothilones for oral administration
BRPI0206509B8 (pt) 2001-01-25 2021-05-25 R Pharm Us Operating Llc processo para formular, para administração parenteral, um análogo de epotilona, preparação farmacêutica, processo para formar uma composição farmacêutica para administração parental, composição farmacêutica e uso de um análogo de epotilona na preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de câncer
US6893859B2 (en) 2001-02-13 2005-05-17 Kosan Biosciences, Inc. Epothilone derivatives and methods for making and using the same
EP1385529A4 (en) 2001-02-20 2007-05-09 Bristol Myers Squibb Co TREATMENT OF REFRACTORY TUMORS USING EPOTHILONE DERIVATIVES
MXPA03007423A (es) 2001-02-20 2003-11-18 Bristol Myers Squibb Co Derivados de epotilona para tratamiento de tumores refractarios.
IL157443A0 (en) * 2001-03-14 2004-03-28 Bristol Myers Squibb Co Pharmaceutical compositions for the treatment of cancer including an epothilone analog and a chemotherapeutic agent
EP1392664A4 (en) * 2001-06-01 2005-01-26 Bristol Myers Squibb Co EPOTHILONE DERIVATIVES
TWI315982B (en) 2001-07-19 2009-10-21 Novartis Ag Combinations comprising epothilones and pharmaceutical uses thereof
TWI287986B (en) * 2001-12-13 2007-10-11 Novartis Ag Use of Epothilones for the treatment of the carcinoid syndrome
IL162595A0 (en) 2002-01-14 2005-11-20 Novartis Ag Combinations comprising epothilones and antimetabolites
TW200303202A (en) * 2002-02-15 2003-09-01 Bristol Myers Squibb Co Method of preparation of 21-amino epothilone derivatives
US6900331B2 (en) * 2002-03-01 2005-05-31 University Of Notre Dame Derivatives of epothilone B and D and synthesis thereof
AU2003218107A1 (en) * 2002-03-12 2003-09-29 Bristol-Myers Squibb Company C12-cyano epothilone derivatives
TW200403994A (en) * 2002-04-04 2004-03-16 Bristol Myers Squibb Co Oral administration of EPOTHILONES
WO2003092683A1 (en) * 2002-05-01 2003-11-13 Novartis Ag Epothilone derivative for the treatment of hepatoma and other cancer diseases
TW200400191A (en) * 2002-05-15 2004-01-01 Bristol Myers Squibb Co Pharmaceutical compositions and methods of using C-21 modified epothilone derivatives
CN101389334A (zh) * 2002-05-20 2009-03-18 高山生物科学股份有限公司 埃坡霉素d的给药方法
WO2003105828A1 (en) * 2002-06-14 2003-12-24 Bristol-Myers Squibb Company Combination of epothilone analogs and chemotherapeutic agents for the treatment of proliferative diseases
US6921769B2 (en) 2002-08-23 2005-07-26 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Synthesis of epothilones, intermediates thereto and analogues thereof
PT1506203E (pt) 2002-08-23 2007-04-30 Sloan Kettering Inst Cancer Síntese de epotilonas, seus intermediários, seus análogos e suas utilizações
US7649006B2 (en) 2002-08-23 2010-01-19 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Synthesis of epothilones, intermediates thereto and analogues thereof
KR100606016B1 (ko) * 2002-09-13 2006-07-26 삼성전자주식회사 이동 통신시스템에서 양방향 데이터 서비스 제공 방법
CN1705662B (zh) * 2002-09-23 2011-07-06 布里斯托尔-迈尔斯斯奎布公司 埃坡霉素b的制备、分离和纯化的方法,及埃坡霉素b的x-射线晶体结构
AU2003279911A1 (en) * 2002-10-09 2004-05-04 Kosan Biosciences, Inc. Therapeutic formulations
RU2358729C2 (ru) * 2003-10-09 2009-06-20 Козан Байосайенсиз, Инк. Терапевтические композиции
WO2005034964A1 (en) * 2003-10-09 2005-04-21 Kosan Biosciences, Inc. Therapeutic formulations
PL2253614T3 (pl) 2004-04-07 2013-03-29 Novartis Ag Inhibitory IAP
US20060121511A1 (en) 2004-11-30 2006-06-08 Hyerim Lee Biomarkers and methods for determining sensitivity to microtubule-stabilizing agents
GB0510390D0 (en) 2005-05-20 2005-06-29 Novartis Ag Organic compounds
EP1996550A2 (en) 2005-09-27 2008-12-03 Novartis AG Carboxyamine compounds and their use in the treatment of hdac dependent diseases
CN1312286C (zh) * 2005-10-19 2007-04-25 华南理工大学 一种利用纤维堆囊菌高效生产埃博霉素的方法
NO346575B1 (no) 2005-11-21 2022-10-17 Novartis Ag Anvendelse av 40-O-(2-hydroksyetyl)-rapamycin i behandling av carcinoid eller småøyet celle cancer
GB0605120D0 (en) 2006-03-14 2006-04-26 Novartis Ag Organic Compounds
CA2644143C (en) 2006-04-05 2013-10-01 Novartis Ag Combinations comprising bcr-abl/c-kit/pdgf-r tk inhibitors for treating cancer
RU2447891C2 (ru) 2006-04-05 2012-04-20 Новартис Аг Комбинации терапевтических средств, предназначенные для лечения рака
EP2026800A1 (en) 2006-05-09 2009-02-25 Novartis AG Combination comprising an iron chelator and an anti-neoplastic agent and use thereof
AR062375A1 (es) * 2006-08-16 2008-11-05 Novartis Ag Cristal de epotilona b y composiciones farmaceuticas
MX2009003185A (es) 2006-09-29 2009-04-03 Novartis Ag Pirazolopirimidinas como inhibidores de lipido cinasa pi3k.
US8463852B2 (en) * 2006-10-06 2013-06-11 Oracle International Corporation Groupware portlets for integrating a portal with groupware systems
CN101626758A (zh) 2007-02-15 2010-01-13 诺瓦提斯公司 用于治疗癌症的lbh589和其他治疗剂的组合
EP2241566B1 (en) * 2008-02-01 2013-08-21 Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co. Ltd. A method for the separation and purification of epothilones
WO2009118292A1 (en) 2008-03-24 2009-10-01 Novartis Ag Arylsulfonamide-based matrix metalloprotease inhibitors
EP2628726A1 (en) 2008-03-26 2013-08-21 Novartis AG Hydroxamate-based inhibitors of deacetylases b
PT2370076T (pt) * 2008-11-28 2017-03-31 Novartis Ag Combinações de inibidor hsp90
WO2010083617A1 (en) 2009-01-21 2010-07-29 Oncalis Ag Pyrazolopyrimidines as protein kinase inhibitors
PT2391366E (pt) 2009-01-29 2013-02-05 Novartis Ag Benzimidazoles substituídos para o tratamento de astrocitomas
JP5456891B2 (ja) 2009-06-26 2014-04-02 ノバルティス アーゲー Ｃｙｐ１７阻害剤としての１，３−二置換イミダゾリジン−２−オン誘導体
US8389526B2 (en) 2009-08-07 2013-03-05 Novartis Ag 3-heteroarylmethyl-imidazo[1,2-b]pyridazin-6-yl derivatives
BR112012003262A8 (pt) 2009-08-12 2016-05-17 Novartis Ag compostos de hidrazona heterocíclica e seus usos para tratar câncer e inflamação
BR112012008061A2 (pt) 2009-08-20 2016-03-01 Novartis Ag compostos de oxima heterocíclica
IN2012DN01693A (sk) 2009-08-26 2015-06-05 Novartis Ag
BR112012010519A2 (pt) 2009-11-04 2017-12-05 Novartis Ag derivados de sulfonamida heterocíclicos
ES2484171T3 (es) 2009-12-08 2014-08-11 Novartis Ag Derivados de sulfonamidas heterocíclicas
CU24130B1 (es) 2009-12-22 2015-09-29 Novartis Ag Isoquinolinonas y quinazolinonas sustituidas
US8440693B2 (en) 2009-12-22 2013-05-14 Novartis Ag Substituted isoquinolinones and quinazolinones
EP2571525A4 (en) 2010-05-18 2016-04-27 Cerulean Pharma Inc Compositions and methods for treating autoimmune and other diseases
UA112517C2 (uk) 2010-07-06 2016-09-26 Новартіс Аг Тетрагідропіридопіримідинові похідні
EP2627648A1 (en) 2010-09-16 2013-08-21 Novartis AG 17aHYDROXYLASE/C17,20-LYASE INHIBITORS
EP2673277A1 (en) 2011-02-10 2013-12-18 Novartis AG [1, 2, 4]triazolo [4, 3 -b]pyridazine compounds as inhibitors of the c-met tyrosine kinase
ES2656218T3 (es) 2011-04-28 2018-02-26 Novartis Ag Inhibidores de 17 alfa-hidroxilasa/C17,20-liasa
IN2014DN00123A (sk) 2011-06-09 2015-05-22 Novartis Ag
US8859535B2 (en) 2011-06-20 2014-10-14 Novartis Ag Hydroxy substituted isoquinolinone derivatives
EP2721007B1 (en) 2011-06-20 2015-04-29 Novartis AG Cyclohexyl isoquinolinone compounds
KR20140025530A (ko) 2011-06-27 2014-03-04 노파르티스 아게 테트라히드로-피리도-피리미딘 유도체의 고체 형태 및 염
EP2755976B1 (en) 2011-09-15 2018-07-18 Novartis AG 6-substituted 3-(quinolin-6-ylthio)-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pyridines as c-met tyrosine kinase inhibitors
US8969341B2 (en) 2011-11-29 2015-03-03 Novartis Ag Pyrazolopyrrolidine compounds
US20150148377A1 (en) 2011-12-22 2015-05-28 Novartis Ag Quinoline Derivatives
PT2794600T (pt) 2011-12-22 2018-03-13 Novartis Ag Derivados de 2,3-di-hidro-benzo[1,4]oxazina e compostos relacionados como inibidores de fosfoinositídeo-3-cinase (pi3k) para o tratamento de, por exemplo, artrite reumatoide
EA201491268A1 (ru) 2011-12-23 2014-11-28 Новартис Аг Соединения и композиции для ингибирования взаимодействия bcl2 с партнерами по связыванию
CN104136428A (zh) 2011-12-23 2014-11-05 诺华股份有限公司 用于抑制bcl2与结合配偶体相互作用的化合物
JP2015503518A (ja) 2011-12-23 2015-02-02 ノバルティス アーゲー Ｂｃｌ２と結合相手の相互作用を阻害するための化合物
CA2859867A1 (en) 2011-12-23 2013-06-27 Novartis Ag Compounds for inhibiting the interaction of bcl2 with binding partners
JP2015503519A (ja) 2011-12-23 2015-02-02 ノバルティス アーゲー Ｂｃｌ２と結合相手の相互作用を阻害するための化合物
UY34591A (es) 2012-01-26 2013-09-02 Novartis Ag Compuestos de imidazopirrolidinona
EA201492007A1 (ru) 2012-05-15 2015-03-31 Новартис Аг Производные бензамида для ингибирования активности abl1, abl2 и bcr-abl1
SG11201407152XA (en) 2012-05-15 2014-11-27 Novartis Ag Benzamide derivatives for inhibiting the activity of abl1, abl2 and bcr-abl1
CN104379574B (zh) 2012-05-15 2017-03-01 诺华股份有限公司 用于抑制abl1、abl2和bcr‑abl1的活性的苯甲酰胺衍生物
BR112014027584B1 (pt) 2012-05-15 2023-01-24 Novartis Ag Uso de inibidores da atividade de abl1, abl2 e bcr-abl1, e composição farmacêutica
US9365576B2 (en) 2012-05-24 2016-06-14 Novartis Ag Pyrrolopyrrolidinone compounds
JP6427097B2 (ja) 2012-06-15 2018-11-21 ザ ブリガム アンド ウィメンズ ホスピタル インコーポレイテッドＴｈｅ Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｉｎｃ． 癌を処置するための組成物および該組成物を製造するための方法
PT2903968T (pt) 2012-10-02 2017-03-13 Gilead Sciences Inc Inibidores de desmetilases de histonas
TW201422625A (zh) 2012-11-26 2014-06-16 Novartis Ag 二氫－吡啶并－□衍生物之固體形式
CN103910742B (zh) * 2013-01-07 2016-07-13 浙江海正药业股份有限公司 一种制备埃博霉素b无定形粉末的方法
US9556180B2 (en) 2013-01-22 2017-01-31 Novartis Ag Pyrazolo[3,4-d]pyrimidinone compounds as inhibitors of the P53/MDM2 interaction
US9403827B2 (en) 2013-01-22 2016-08-02 Novartis Ag Substituted purinone compounds
WO2014128612A1 (en) 2013-02-20 2014-08-28 Novartis Ag Quinazolin-4-one derivatives
EP2961736B1 (en) 2013-02-27 2018-04-11 Gilead Sciences, Inc. Inhibitors of histone demethylases
US20150018376A1 (en) 2013-05-17 2015-01-15 Novartis Ag Pyrimidin-4-yl)oxy)-1h-indole-1-carboxamide derivatives and use thereof
CN103275098B (zh) * 2013-06-07 2015-07-08 江苏迪沃特仪器设备科技有限公司 用动态轴向压缩柱分离纯化埃博霉素的方法
UY35675A (es) 2013-07-24 2015-02-27 Novartis Ag Derivados sustituidos de quinazolin-4-ona
US9227969B2 (en) 2013-08-14 2016-01-05 Novartis Ag Compounds and compositions as inhibitors of MEK
WO2015022663A1 (en) 2013-08-14 2015-02-19 Novartis Ag Compounds and compositions as inhibitors of mek
WO2015022664A1 (en) 2013-08-14 2015-02-19 Novartis Ag Compounds and compositions as inhibitors of mek
JP6494634B2 (ja) 2013-09-22 2019-04-03 キャリター・サイエンシーズ・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーＣａｌｉｔｏｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｌｌｃ 置換されているアミノピリミジン化合物および使用方法
EP3312164B1 (en) 2014-03-28 2020-12-09 Calitor Sciences, LLC Substituted heteroaryl compounds and methods of use
EP3126345A1 (en) 2014-03-31 2017-02-08 Gilead Sciences, Inc. Inhibitors of histone demethylases
US10426753B2 (en) 2014-04-03 2019-10-01 Invictus Oncology Pvt. Ltd. Supramolecular combinatorial therapeutics
EA201790154A1 (ru) 2014-08-27 2017-08-31 Джилид Сайэнс, Инк. Соединения и способы для ингибирования гистоновых деметилаз
JP2018527362A (ja) 2015-09-11 2018-09-20 サンシャイン・レイク・ファーマ・カンパニー・リミテッドＳｕｎｓｈｉｎｅ Ｌａｋｅ Ｐｈａｒｍａ Ｃｏ．，Ｌｔｄ． 置換されたヘテロアリール化合物および使用方法
US10683297B2 (en) 2017-11-19 2020-06-16 Calitor Sciences, Llc Substituted heteroaryl compounds and methods of use
US10751339B2 (en) 2018-01-20 2020-08-25 Sunshine Lake Pharma Co., Ltd. Substituted aminopyrimidine compounds and methods of use
FR3087650B1 (fr) 2018-10-31 2021-01-29 Bio Even Flavine adenine dinucleotide (fad) pour son utilisation pour la prevention et/ou le traitement de cancer
EP4512395A1 (en) 2023-08-21 2025-02-26 Bio Even Composition comprising flavin adenine dinucleotide (fad), l-gsh, atp and myristic acid, alone or with a drug

Family Cites Families (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3459731A (en) 1966-12-16 1969-08-05 Corn Products Co Cyclodextrin polyethers and their production
HU181703B (en) 1980-05-09 1983-11-28 Chinoin Gyogyszer Es Vegyeszet Process for producing aqueus solutuins of water insoluble or hardly soluble vitamines, steroides, localanesthetics, prostanoides and non-steroid and antiphlogistic agents
US4383992A (en) 1982-02-08 1983-05-17 Lipari John M Water-soluble steroid compounds
JPS58179496A (ja) 1982-04-12 1983-10-20 Takeda Chem Ind Ltd ランカシジンの改良製造法
US4659696A (en) 1982-04-30 1987-04-21 Takeda Chemical Industries, Ltd. Pharmaceutical composition and its nasal or vaginal use
DE3372705D1 (en) 1982-04-30 1987-09-03 Takeda Chemical Industries Ltd Pharmaceutical composition and its use
HU191101B (en) 1983-02-14 1987-01-28 Chinoin Gyogyszer Es Vegyeszeti Termekek Gyara Rt,Hu Process for preparing water-soluble cyclodextrin polymers substituted with ionic groups
DE3317064A1 (de) 1983-05-10 1984-11-15 Consortium für elektrochemische Industrie GmbH, 8000 München Verfahren zur herstellung von cyclooctaamylose
DE3346123A1 (de) 1983-12-21 1985-06-27 Janssen Pharmaceutica, N.V., Beerse Pharmazeutische praeparate von in wasser schwerloeslichen oder instabilen arzneistoffen und verfahren zu ihrer herstellung
GB8506792D0 (en) 1985-03-15 1985-04-17 Janssen Pharmaceutica Nv Derivatives of y-cyclodextrin
ATE51003T1 (de) * 1985-09-13 1990-03-15 Biotechnolog Forschung Gmbh Makrozyklische antibiotika.
US4920214A (en) 1986-04-16 1990-04-24 American Maize-Products Company Process for producing modified cyclodextrins
NZ224497A (en) 1987-05-18 1990-04-26 Janssen Pharmaceutica Nv Pharmaceutical composition comprising flunarizine
NZ225045A (en) 1987-07-01 1990-06-26 Janssen Pharmaceutica Nv Antiviral pharmaceutical compositions containing cyclodextrin and an antiviral agent
MY104343A (en) 1987-11-23 1994-03-31 Janssen Pharmaceutica Nv Novel pyridizinamine deravatives
AU631628B2 (en) 1989-04-03 1992-12-03 Janssen Pharmaceutica N.V. Regioselectively hydroxyalkylated cyclodextrins and process therefor
GB8910069D0 (en) 1989-05-03 1989-06-21 Janssen Pharmaceutica Nv Method of topically treating acne vulgaris
ES2053208T3 (es) 1989-11-22 1994-07-16 Janssen Pharmaceutica Nv Metodo para prevenir o limitar el daño por reperfusion.
GB9001987D0 (en) 1990-01-29 1990-03-28 Janssen Pharmaceutica Nv Improved cyclodextrin based erythropietin formulation
IL100856A (en) 1991-02-15 1998-03-10 Janssen Pharmaceutica Nv (carboxyl) alkyloxyalkyl derivatives of cyclodextrins, their preparation and pharmaceutical compositions containing them
CA2061891A1 (en) 1991-03-08 1992-09-09 Robert F. Van Ginckel Flunarizine containing anti-neoplastic compositions
DE4138042C2 (de) 1991-11-19 1993-10-14 Biotechnolog Forschung Gmbh Epothilone, deren Herstellungsverfahren sowie diese Verbindungen enthaltende Mittel
DE4207092A1 (de) * 1992-03-06 1993-09-16 Schott Glaswerke Endoskop
DE4207922A1 (de) 1992-03-13 1993-09-23 Pharmatech Gmbh Wasserloesliche einschlussverbindungen und verfahren zu deren herstellung
PT631578E (pt) 1992-03-18 2001-11-30 Janssen Pharmaceutica Nv Estereoisomeros de itraconazol e saperconazol
IL105553A (en) 1992-05-06 1998-01-04 Janssen Pharmaceutica Inc Solid dosage form comprising a porous network of matrix forming material which disperses rapidly in water
CA2086874E (en) 1992-08-03 2000-01-04 Renzo Mauro Canetta Methods for administration of taxol
US5395951A (en) * 1992-11-17 1995-03-07 Council Of Scientific & Industrial Research Triterpene derivatives of azadirachtin having insect antifeedant and growth inhibitory activity and a process for extracting such compounds from the neem plant
CA2092271C (en) 1993-03-09 2009-10-13 Eddie Reed Use of g-csf for treating taxol side-effects
HU213200B (en) 1993-05-12 1997-03-28 Chinoin Gyogyszer Es Vegyeszet The cyclodextrin or cyclodextrin derivative cluster complexes of taxol, taxotere, or taxus, pharmaceutical preparations containing them and process for their production
PH31594A (en) 1993-09-30 1998-11-03 Janssen Pharmaceutica Nv Oral formulations on an antifungal.
US5565478A (en) 1994-03-14 1996-10-15 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Combination therapy using signal transduction inhibitors with paclitaxel and other taxane analogs
TW438601B (en) 1994-05-18 2001-06-07 Janssen Pharmaceutica Nv New mucoadhesive emulsion compositions and a process for the preparation thereof
WO1996014090A1 (en) 1994-11-07 1996-05-17 Janssen Pharmaceutica N.V. Compositions comprising carbazoles and cyclodextrins
PT1186606E (pt) 1995-11-17 2004-08-31 Biotechnolog Forschung Mbh Gbf Derivados do epotilone sua preparacao e utilizacao
PL189122B1 (pl) 1995-11-23 2005-06-30 Janssen Pharmaceutica Nv Sposób wytwarzania mieszaniny stałej zawierającejjedną lub wiele cyklodekstryn, mieszanina stała ikompozycja farmaceutyczna
JP3865436B2 (ja) 1996-07-11 2007-01-10 塩水港精糖株式会社 分岐シクロデキストリンの製造方法
NZ334821A (en) 1996-08-30 2000-12-22 Novartis Ag Method for producing epothilones
DK0941227T5 (da) 1996-11-18 2009-10-05 Biotechnolog Forschung Gmbh Epothilon D, dens fremstilling samt dens anvendelse som cytostatisk middel og som plantebeskyttelsesmiddel
CA2273083C (en) * 1996-12-03 2012-09-18 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Synthesis of epothilones, intermediates thereto, analogues and uses thereof
US6441186B1 (en) 1996-12-13 2002-08-27 The Scripps Research Institute Epothilone analogs
US6605599B1 (en) 1997-07-08 2003-08-12 Bristol-Myers Squibb Company Epothilone derivatives
US7407975B2 (en) 1997-08-09 2008-08-05 Bayer Schering Pharma Ag Epothilone derivatives, method for producing same and their pharmaceutical use
US6242489B1 (en) * 1997-09-25 2001-06-05 Ecological Technologies Corporation Malodorant compositions
US6194181B1 (en) * 1998-02-19 2001-02-27 Novartis Ag Fermentative preparation process for and crystal forms of cytostatics
DE19826988A1 (de) 1998-06-18 1999-12-23 Biotechnolog Forschung Gmbh Epothilon-Nebenkomponenten
KR100685336B1 (ko) * 1999-02-22 2007-02-23 게젤샤프트 퓌어 비오테크놀로기쉐 포르슝 엠베하(게베에프) Ｃ-21 변형 에포틸론
US6291684B1 (en) * 1999-03-29 2001-09-18 Bristol-Myers Squibb Company Process for the preparation of aziridinyl epothilones from oxiranyl epothilones
UA75365C2 (en) * 2000-08-16 2006-04-17 Bristol Myers Squibb Co Epothilone analog polymorph modifications, a method for obtaining thereof (variants), a pharmaceutical composition based thereon
GB0029895D0 (en) * 2000-12-07 2001-01-24 Novartis Ag Organic compounds
GB0230024D0 (en) * 2002-12-23 2003-01-29 Novartis Ag Organic compounds

Also Published As

Publication number Publication date
NO20004114L (no) 2000-10-17
KR100595774B1 (ko) 2006-07-03
CZ301517B6 (cs) 2010-03-31
US20030194787A1 (en) 2003-10-16
AU3028799A (en) 1999-09-06
NO20061736L (no) 1999-08-20
NO321596B1 (no) 2006-06-06
DE69921966T2 (de) 2005-11-03
CA2318818A1 (en) 1999-08-26
JP2002504346A (ja) 2002-02-12
HU225851B1 (en) 2007-11-28
IL159631A (en) 2007-07-04
PL342423A1 (en) 2001-06-04
RU2268306C2 (ru) 2006-01-20
KR20070058021A (ko) 2007-06-07
CN1286839C (zh) 2006-11-29
EP1428826A3 (en) 2004-10-27
JP3681109B2 (ja) 2005-08-10
SI1054994T1 (en) 2005-06-30
NO20061735L (no) 1999-08-20
JP2010099089A (ja) 2010-05-06
US7101702B2 (en) 2006-09-05
IL137691A0 (en) 2001-10-31
NO322588B1 (no) 2006-10-30
WO1999042602A2 (en) 1999-08-26
CN1535971A (zh) 2004-10-13
NO20004114D0 (no) 2000-08-17
WO1999042602A3 (en) 1999-11-25
SK286517B6 (sk) 2008-12-05
EP1428826A2 (en) 2004-06-16
US20070197611A1 (en) 2007-08-23
CZ20002994A3 (cs) 2000-11-15
KR20080070781A (ko) 2008-07-30
PT1054994E (pt) 2005-04-29
AU746294B2 (en) 2002-04-18
EP1054994B1 (en) 2004-11-17
HUP0100855A3 (en) 2005-05-30
HUP0100855A2 (hu) 2001-06-28
NZ506138A (en) 2003-07-25
US20040142990A1 (en) 2004-07-22
US6380227B1 (en) 2002-04-30
NO329063B1 (no) 2010-08-09
SK288058B6 (sk) 2013-03-01
CN1291239A (zh) 2001-04-11
DE69921966D1 (de) 2004-12-23
JP2005068156A (ja) 2005-03-17
PL404926A1 (pl) 2013-12-09
TR200002431T2 (tr) 2001-01-22
EP1054994A4 (en) 2001-06-19
CN1229502C (zh) 2005-11-30
US20020165256A1 (en) 2002-11-07
US6194181B1 (en) 2001-02-27
TR200101634T2 (tr) 2002-06-21
KR20010041068A (ko) 2001-05-15
EP1054994A2 (en) 2000-11-29
SK287677B6 (sk) 2011-05-06
KR20060032222A (ko) 2006-04-14
BR9908119A (pt) 2000-10-24
IL137691A (en) 2007-12-03
HK1034100A1 (en) 2001-10-12
PL196787B1 (pl) 2008-01-31
DK1054994T3 (da) 2005-03-14
US6656711B2 (en) 2003-12-02
ATE282710T1 (de) 2004-12-15
US20030220379A1 (en) 2003-11-27
KR100873526B1 (ko) 2008-12-11
US20090326239A1 (en) 2009-12-31
NZ525622A (en) 2004-10-29
NO20052034L (no) 2000-10-17
IL159631A0 (en) 2004-06-01
ES2233028T3 (es) 2005-06-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK12402000A3 (sk) Spôsob fermentačnej prípravy cytostatík a ich kryštalických foriem
AU2002300841B2 (en) Fermentative preparation process for cytostatics and crystal forms thereof
MXPA00008115A (en) Fermentative preparation process for cytostatics and crystal forms thereof
HK1034100B (en) Fermentative preparation process for cytostatics and crystal forms thereof

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees

Effective date: 20140217