RU2378370C2 - Штамм молочнокислой бактерии для лечения воспаления при воспалительном заболевании кишечника, компонент, эффективный для лечения язвы, способ лечения воспаления при воспалительном заболевании кишечника, продукт (варианты) и композиция (варианты) - Google Patents
Штамм молочнокислой бактерии для лечения воспаления при воспалительном заболевании кишечника, компонент, эффективный для лечения язвы, способ лечения воспаления при воспалительном заболевании кишечника, продукт (варианты) и композиция (варианты) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2378370C2 RU2378370C2 RU2007142174/13A RU2007142174A RU2378370C2 RU 2378370 C2 RU2378370 C2 RU 2378370C2 RU 2007142174/13 A RU2007142174/13 A RU 2007142174/13A RU 2007142174 A RU2007142174 A RU 2007142174A RU 2378370 C2 RU2378370 C2 RU 2378370C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- cells
- inflammation
- treating
- inflammatory
- Prior art date
Links
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 title claims abstract description 36
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 title claims abstract description 35
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 12
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 title claims description 7
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 title claims description 7
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 title abstract description 6
- 208000028774 intestinal disease Diseases 0.000 title abstract 4
- 241000186604 Lactobacillus reuteri Species 0.000 claims abstract description 47
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 5
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 38
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 claims description 28
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 claims description 20
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 claims description 19
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 claims description 19
- 229940001882 lactobacillus reuteri Drugs 0.000 claims description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 3
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 54
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 29
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 29
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 28
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 25
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 19
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 18
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 15
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 15
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 13
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 12
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 12
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 12
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 11
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 11
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 10
- 230000004044 response Effects 0.000 description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 8
- 230000006433 tumor necrosis factor production Effects 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 239000007376 cm-medium Substances 0.000 description 7
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 7
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 7
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 6
- 206010009887 colitis Diseases 0.000 description 6
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 6
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 6
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 241001070041 Lactobacillus reuteri CF48-3A Species 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 5
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 241001453258 Helicobacter hepaticus Species 0.000 description 4
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 4
- 102000057041 human TNF Human genes 0.000 description 4
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 4
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 4
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 235000015140 cultured milk Nutrition 0.000 description 3
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 2
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 2
- 208000018522 Gastrointestinal disease Diseases 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 241000589989 Helicobacter Species 0.000 description 2
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 2
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 2
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 2
- 241000917009 Lactobacillus rhamnosus GG Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 description 2
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 2
- 230000001745 anti-biotin effect Effects 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011953 bioanalysis Methods 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 239000006872 mrs medium Substances 0.000 description 2
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 2
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 2
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 210000002151 serous membrane Anatomy 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 2
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 2
- 235000013618 yogurt Nutrition 0.000 description 2
- AKXKFZDCRYJKTF-UHFFFAOYSA-N 3-Hydroxypropionaldehyde Chemical compound OCCC=O AKXKFZDCRYJKTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000004998 Abdominal Pain Diseases 0.000 description 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 description 1
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 1
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 description 1
- 206010012741 Diarrhoea haemorrhagic Diseases 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 208000007882 Gastritis Diseases 0.000 description 1
- 102100035716 Glycophorin-A Human genes 0.000 description 1
- 108091005250 Glycophorins Proteins 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101000998120 Homo sapiens Interleukin-3 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 1
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 1
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 1
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000914496 Homo sapiens T-cell antigen CD7 Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100033493 Interleukin-3 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 1
- 108010002335 Interleukin-9 Proteins 0.000 description 1
- 241000186842 Lactobacillus coryniformis Species 0.000 description 1
- 241000186840 Lactobacillus fermentum Species 0.000 description 1
- 241000186606 Lactobacillus gasseri Species 0.000 description 1
- 241000186605 Lactobacillus paracasei Species 0.000 description 1
- 241000186869 Lactobacillus salivarius Species 0.000 description 1
- 241000186610 Lactobacillus sp. Species 0.000 description 1
- 206010024305 Leukaemia monocytic Diseases 0.000 description 1
- 102000052508 Lipopolysaccharide-binding protein Human genes 0.000 description 1
- 108010053632 Lipopolysaccharide-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 1
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 1
- 206010028116 Mucosal inflammation Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 102100027208 T-cell antigen CD7 Human genes 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 1
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000009175 antibody therapy Methods 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010042854 bacteria histone-like protein HU Proteins 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000037893 chronic inflammatory disorder Diseases 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 206010061428 decreased appetite Diseases 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- 208000010643 digestive system disease Diseases 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 1
- 230000008622 extracellular signaling Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 206010016256 fatigue Diseases 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 244000000036 gastrointestinal pathogen Species 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 244000005709 gut microbiome Species 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N interleukin-8 Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@@H](NC(C)=O)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(N)=O)C1=CC=CC=C1 XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N 0.000 description 1
- 229940096397 interleukin-8 Drugs 0.000 description 1
- 210000005027 intestinal barrier Anatomy 0.000 description 1
- 230000007358 intestinal barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 229940059406 lactobacillus rhamnosus gg Drugs 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 201000006894 monocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000000581 natural killer T-cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000003334 potential effect Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000007126 proinflammatory cytokine response Effects 0.000 description 1
- 210000004206 promonocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 108091006024 signal transducing proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034285 signal transducing proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 description 1
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 triglyceride fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 208000016261 weight loss Diseases 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/164—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/74—Bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K2035/11—Medicinal preparations comprising living procariotic cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/225—Lactobacillus
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/853—Lactobacillus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению штаммов молочнокислых бактерий, и может быть использовано в медицине. Получают штамм молочнокислой бактерии Lactobacillus reuteri АТСС РТА-6475. Полученный штамм или кондиционированную среду после его культивирования используют для лечения воспаления при воспалительном заболевании кишечника. Изобретение позволяет получить эффективное средство для лечения воспалительных заболеваний кишечника. 7 н.п. ф-лы, 4 ил.
Description
Предшествующий уровень техники
Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к применению способа скрининга непатогенных противовоспалительных бактериальных штаммов и их продуктов; а также к способам применения таких штаммов для лечения и профилактики нежелательных воспалительных процессов, вызываемых некоторыми бактериями или другими индуцирующими воспаление агентами.
Описание уровня техники
Моноциты покидают костный мозг и через периферические кровеносные сосуды транспортируются в слизистую/серозную оболочку желудочно-кишечного тракта. Эти предполагаемые макрофаги играют ключевую роль во взаимодействии и передаче сигналов, необходимых для регуляции иммунной системы желудочно-кишечного тракта (ЖКТ).
В желудочно-кишечном тракте наблюдается постоянный уровень иммунного ответа, заключающегося в продуцировании макрофагов в эпителии слизистой в ответ на проникновение бактерий в полость тонкой кишки и их адгезии к слизистой тонкой кишки. В нормальном состоянии вырабатывание такого ответа приводит к ограничению продуцирования цитокиновых сигналов и к подавлению нежелательного воспалительного ответа. Однако, при попадании патогена или токсина на указанные клетки, они формируют первую линию защиты и реагируют посредством продуцирования возрастающего количества провоспалительных цитокинов, которые обеспечивают передачу воспалительного ответа до тех пор, пока воспаление не начнет спадать. Генерирование цитокинов, релевантных с точки зрения взаимодействия с бактериями-комменсалами (безопасными бактериями), а также с бактериями, участвующими в продуцировании полного воспалительного ответа на патогены, предотвращается либо самими молочнокислыми бактериями (включая поверхностные антигены), либо веществами, продуцируемыми этими молочнокислыми бактериями, и совершенно очевидно, что комменсальная флора интенсивно взаимодействует с макрофагами слизистой и поддерживает равновесную реакцию в кишечной флоре и тем самым обеспечивает оптимальные условия для сохранения здоровья (Rook GA, Adams V, Hunt J, Palmer R, Martinelli R, Brunet LR. Mycobacteria and other environmental organisms as immunomodulators for immunoregulatory disorders. Springer Semin Immunopathol 2004; 25:237-255).
Известно, что различные патогены могут вызывать воспаление, например, в желудочно-кишечном тракте. Такое воспаление, например, в желудке и в желудочно-кишечном тракте, опосредуется внеклеточными сигнальными белками, известными как цитокины, которые продуцируются макрофагами и дендритными клетками в эпителии в ответ на антигенные возбудители, такие как возбудители, продуцируемые патогеном. После контакта эпителия с антигеном патогена или продуцируемого им эндотоксина, такого как ЛПС, антиген-представляющие клетки (включая дендритные клетки), присутствующие в эпителии, передают сигнал “необученным” макрофагам, которые затем вырабатывают так называемый Th1-ответ, при котором указанными макрофагами продуцируются про-воспалительные цитокины, включая TNF-α, IL-1, IL-6 и IL-12. Эти цитокины, в свою очередь, стимулируют природные клетки-киллеры, Т-клетки и другие клетки, продуцирующие интерферон-γ (IFNγ), который является главным медиатором воспаления. IFNγ способствует усилению воспалительного ответа и стимулирует вышеописанные реакции, которые приводят к цитотоксичности. “Необученные” макрофаги могут также вырабатывать антигенный ответ Th2-типа. Этот ответ ингибируется IFNγ. Клетки Th2-типа продуцируют противовоспалительные цитокины, такие как IL-4, IL-5, IL-9 и IL-10.
Известно, что IL-10 ингибирует продуцирование IFNγ и, таким образом, подавляет иммунный ответ. Равновесие между клетками Th1- и Th2-типа и продуцируемыми ими соответствующими цитокинами определяет уровень воспалительного ответа на данный антиген. Клетки Th2-типа могут также стимулировать продуцирование иммуноглобулинов посредством иммунной системы. Противовоспалительная активность, продуцируемая в желудочно-кишечном тракте, в котором наблюдается снижение уровня TNFα, коррелирует с увеличением уровня эпителиальных клеток (целостности выстилки стенок кишки), а следовательно, и с ослаблением негативных эффектов, вызываемых желудочно-кишечными патогенами и токсинами.
Результаты ряда научных исследований показали, что ДНК может оказывать противовоспалительное действие на эпителиальные клетки тонкой кишки, либо она может стимулировать иммунную систему (Madsen et al. and Rachmilewitz et al, respectively, presentations at Digestive Disease Week, May 19-22, 2002, The Moscone Center, San Francisco).
Воспаление возникает при различных заболеваниях у млекопитающих и поражает как внешние органы, например, кожу, глаза и т.п., так и внутренние органы, такие как, например, различные слизистые оболочки в полости рта, желудочно-кишечном тракте, во влагалище и т.п., а также мышцы, суставы костей и ткани головного мозга. В желудочно-кишечном тракте возникает несколько заболеваний, ассоциированных с воспалением, например, гастрит, язва и воспалительное заболевание кишечника (ВЗК). ВЗК представляет собой хроническое расстройство, которое вызывает воспаление и набухание стенок пищеварительного тракта или тонкой кишки. При воспалении и набухании пищеварительного тракта при ВЗК возникают поражения ткани (язвы) и кровотечения. Это поражение, в свою очередь, может вызывать абдоминальные боли, водянистый стул, кровавый понос, усталость, пониженный аппетит, потерю веса или повышение температуры. Таким образом, воспаление при ВЗК приводит к повреждению ткани, такому как язвы, и к обострению заболевания у пациента.
Двумя наиболее распространенными формами ВЗК являются язвенный колит (ЯК) и болезнь Крона (БК). Болезнь Крона представляет собой хроническое состояние, характеризующееся рецидивирующими воспалительными поражениями стенок всего кишечника от слизистой до серозной оболочки, и может поражать многие участки тонкой кишки. Такое заболевание ассоциируется с дисбалансом микрофлоры кишечника и усилением воспалительной реакции с компонентами нормальной флоры кишечника; причем такая воспалительная реакция плохо поддается лечению современными лекарственными средствами, и одним из способов лечения является терапия с использованием анти-TNFα антитела, разработанная в целях снижения уровней TNFα в слизистой желудочно-кишечного тракта. Таким образом, пациенты с данным заболеванием представляют собой идеальную группу для исследования и, фактически, являются наиболее подходящей группой для применения иммуномодулирующих молочнокислых бактерий, способствующих ослаблению воспаления.
У мышей спонтанно развивается хронический колит, который не наблюдается у стерильных животных. Мышиный колит имеет сходство с человеческой болезнью Крона, то есть с тяжелым хроническим воспалительным заболеванием желудочно-кишечного тракта. Болезнь Крона обычно возникает в тонком кишечнике, но может наблюдаться и в любом другом участке желудочно-кишечного тракта. Для развития этих состояний необходимо присутствие кишечных бактерий, и такими состояниями являются Th1-опосредуемые IL-12-зависимые формы колита.
Из-за сходства причин и симптомов мышиные модели колита и мышиные модели других заболеваний часто используются для прямого исследования компонентов воспалительного ответа, а поскольку у человека наблюдаются те же самые механизмы продуцирования ответа, то такие модели часто применяются для разработки способов лечения желудочно-кишечных заболеваний у человека. Однако, в этой связи, все же возникают некоторые сомнения насчет уместности применения моделей животных для разработки способов лечения человека, а поэтому необходимо разработать альтернативные способы исследования человеческих механизмов и подтверждения результатов исследования, полученных с использованием других моделей, а именно моделей, более близких к человеческим системам. Целью настоящего изобретения является разработка способа, основанного на использовании человеческих клеток, для отбора молочнокислых бактерий, обладающих противовоспалительными свойствами, и последующего применения выбранных молочнокислых бактерий для профилактики и лечения различных воспалительных заболеваний.
Бактерия Lactobacillus reuteri представляет собой одну из природных обитателей желудочно-кишечного тракта животных и обычно присутствуют в тонком кишечнике здоровых животных, а иногда также и в желудке человека, несмотря на его низкий рН. Известно, что эта бактерия обладает антибактериальной активностью. См., например, патенты США № 5439678, 5458875, 5534253, 5837238 и 5849289. Если клетки L. reuteri растут в анаэробных условиях в присутствии глицерина, то они продуцируют противомикробное вещество, известное как рейтерин (β-гидроксипропиональдегид). Также известно, что некоторые штаммы молочнокислых бактерий, включая L. reuteri, обладают противовоспалительными свойствами, как описано в заявках на патент США 20040208863 и 20040067573. Другие иммуномодулирующие свойства также ассоциируются с различными другими молочнокислыми бактериями.
Клинические испытания, проводимые с участием человека, и исследования на животных показали, что Lactobacillus может предотвращать или снижать степень воспаления при хроническом колите. Была высказана гипотеза, что молочнокислые бактерии обладают способностью ингибировать провоспалительные цитокиновые ответы, индуцированные кишечными бактериями. J. Pefla с сотрудниками (2003) были проведены исследования для того, чтобы определить, снижают ли молочнокислые бактерии уровень продуцирования фактора некроза опухоли альфа (TNF-α) мышиными макрофагами. Было показано, что продуцирование TNF-α мышиными макрофагами, инкубированными с Lactobacillus rhamnosus GG и их липосахаридами, значительно снижалось по сравнению с контролем.
Той же самой группой исследователей были проведены исследования для того, чтобы определить, являются ли Lactobacillus spp. эффективными для ослабления Helicobacter-индуцированного воспаления in vivo. Для этого были проведены эксперименты по совместной инокуляции бактериями L. reuteri и L. paracasei мышей с моделью колита, вызываемого H. hepaticus. У самок мышей, которым вводили H. hepaticus и Lactobacillus spp., по сравнению с животными, которым вводили только H. hepaticus, наблюдалось значительное снижение уровней поражения. Было показано, что пробиотическое действие Lactobacillus spp. в этой модели не зависит от бактерии H. hepaticus, а зависит от посттранскрипционной регуляции экспрессии TNF-α. Эти данные позволяют предположить, что существует новый механизм, посредством которого Lactobacillus spp. может ингибировать Helicobacter-индуцируемое продуцирование провоспалительных цитокинов в макрофагах.
В патентной заявке WO 2004/031368 A1 описаны штаммы Lactobacillus, которые были отобраны по их способности снижать уровень воспаления желудочно-кишечного тракта, ассоциированного с инфекцией H. pylori у млекопитающих, с помощью анализа на TNF-α-активность мышиных макрофагов.
В патентной заявке US 20040057943 A1 описан способ отбора новых пробиотических штаммов L. coryniformis, L. salivarius, L. acidofilus, L. gasseri и L. fermentum, обладающих способностью выживать в грудном молоке и в амниотической жидкости.
S. Menard с сотрудниками (2003) провели исследования, чтобы определить, секретируют ли молочнокислые бактерии метаболиты, которые сохраняют противовоспалительные свойства после их транспорта в тонкий кишечник. Для того, чтобы определить, связывается ли ЛПС с ЛПС-связывающимся белком (ЛСБ) перед тем, как ЛПС-ЛСБ сможет распознать рецептор CD14, был проведен анализ на связывание ЛПС с про-моноцитами ТНР-1 в присутствии кондиционированной бактериями среды (КС). Уровень связывания измеряли с помощью проточной цитометрии. Было показано, что среда, кондиционированная бактериями Bifidobacterium и Streptococcus thermofilus, полностью ингибирует LDB-зависимое связывание ЛПС с клетками THP-1 путем высвобождения метаболитов, обладающих анти-TNF-α эффектом и способных пересекать барьер тонкого кишечника.
Хотя известно, что способности некоторых молочнокислых бактерий снижать воспаление, включая воспаление желудочно-кишечного тракта, являются различными, однако до сих пор не было известно, что эти различия могут быть более успешно предсказаны с использованием модели, созданной на основе человеческих клеток, и что такая модель является предпочтительной для отбора указанных штаммов по их потенциальному действию у человека.
Поэтому целью настоящего изобретения является получение штаммов молочнокислых бактерий, которые были отобраны с использованием человеческих клеточных линий по их способности снижать уровень воспаления, такого как воспаление, ассоциированное с ВЗК. Другой целью настоящего изобретения является получение продуктов, содержащих указанные штаммы, включая агенты, предназначенные для лечения или профилактики воспаления, ассоциированного, например, с ВЗК, а также кондиционированные среды, в которых могут быть культивированы указанные штаммы и их белоксодержащие экстракты, в целях их введения человеку и другим млекопитающим. Таким образом, настоящее изобретение предназначено для лечения воспаления при ВЗК, которое приводит к поражению ткани, такому как язва, и к обострению указанного заболевания у пациента.
Другие цели и преимущества настоящего изобретения будут более очевидны из описания изобретения и прилагаемой формулы изобретения.
Описание сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к новым штаммам молочнокислых бактерий, отобранных по их способности снижать степень воспаления, такого как воспаление, ассоциированное с заболеванием тонкого кишечника; к способу отбора таких штаммов; и к продуктам, содержащим указанные штаммы.
Краткое описание графического материала
На фиг.1 представлена гистограмма, иллюстрирующая влияние Lactobacillus-кондиционированной среды на продуцирование TNF-α ЛПС-активированными моноцитами. Три штамма и контроль инкубировали в течение 24 часов.
На фиг.2 представлена гистограмма, иллюстрирующая влияние Lactobacillus-кондиционированной среды на продуцирование TNF-α ЛПС-активированными моноцитами. Три штамма и контроль инкубировали в течение 9 часов.
На фиг.3 представлена гистограмма, иллюстрирующая влияние Lactobacillus-кондиционированной среды на ингибирование продуцирования TNF-α ЛПС-активированными первичными моноцитами. Были использованы первичные моноциты, взятые у пациентов с БК в фазе ремиссии (БК-рем) и с активной формой БК (БК-акт). Эти штаммы и контроль инкубировали в течение 24 часов.
На фиг.4 представлена гистограмма, иллюстрирующая влияние Lactobacillus-кондиционированной среды на продуцирование TNF-α ЛПС-активированными первичными моноцитами. Были использованы первичные моноциты, взятые у пациентов с активной формой БК. Указанные штаммы и контроль инкубировали в течение 24 часов.
Подробное описание настоящего изобретения и предпочтительных вариантов его осуществления
В настоящем изобретении описаны штаммы молочнокислых бактерий, которые были отобраны по их способности снижать уровень воспаления, такого как воспаление, ассоциированное с ВЗК. Такими штаммами являются штаммы ММ4-1А, АТСС РТА-6475 Lactobacillus reuteri. Продукты, такие как пищевые продукты, питательные добавки и препараты, а также фармацевтические средства или медицинские устройства, содержащие целые клетки или компоненты, происходящие от указанных штаммов, могут быть изготовлены методом, известным специалистам, и, как известно, они обычно включают носитель, подходящий для приема вовнутрь, и штамм Lactobacillus или происходящий от него компонент. При получении вышеуказанных препаратов могут быть также использованы уже известные штаммы, которые, как было установлено, обладают хорошей способностью снижать уровень TNFα, а именно такие штаммы, как GG L. rhamnosus АТСС 53103, ММ2-3 L. Reuteri, АТСС РТА-4659 и т.п.
Для определения факторов, снижающих или повышающих уровень воспаления, применяются системы-модели, в которых используются соответствующие цитокины. В настоящем изобретении применяется анализ, проводимый с использованием человеческих клеток.
Клетки ТНР-1 представляют собой человеческую моноцитарную клеточную линию, выделенную у пациента с лейкозом и хранящуюся в Американской коллекции типовых культур. Эти клетки были выделены у человека, что делает их особенно ценными для проведения исследований по взаимодействию человеческой иммунной системы желудочно-кишечного тракта с человеческими бактериями-комменсалами.
В настоящем изобретении приводятся данные, указывающие на эффективное ингибирование продуцирования TNFα конкретными штаммами L. reuteri ATCC PTA 4659 и L. reuteri ATCC PTA 6475 и на то, что такое ингибирование опосредуется веществом, высвобождаемым в культуральную среду этими двумя конкретными штаммами на поздней логарифмической/стационарной фазе роста. В противоположность этому, два других штамма L. reuteri не только неспособны ингибировать воспалительный ответ клеток на токсин E.coli, но также сами индуцируют такой воспалительный ответ. Неожиданно было обнаружено, что эти штаммы L. reuteri ATCC PTA 4659 и L. reuteri ATCC PTA 6475 обладают потенциальными противовоспалительными свойствами, которые ранее не были предсказаны.
Для подтверждения потенциальной клинической ценности этих данных были проведены дополнительные исследования на клетках, выделенных из крови пациентов с воспалительным заболеванием кишечника, а в частности с болезнью Крона (БК).
Для исследования взаимодействий молочнокислых бактерий и иммунных клеток слизистой авторами настоящего изобретения в качестве модели были выбраны дифференцированные макрофаги, поскольку считается, что они являются лучшей моделью, чем недифференцированные моноциты. Такие дифференцированные макрофаги, вероятно, имеют большее сходство с клеточной популяцией макрофагов in vivo в желудочно-кишечном тракте, отвечающих на присутствие молочнокислых бактерий и вызывающих регуляторные или воспалительные изменения в природной иммунной системе хозяина. Так, например, продуцирование про-воспалительного интерлейкина-8 клетками ТНР-1 в ответ на присутствие эндотоксинов заметно повышается после индуцирования дифференцировки этих клеток (Baqui et al., 1999), а после осуществления такой дифференцировки также значительно повышается уровень продуцирования TNF-α этими клетками (Klegeris et al., 1997).
Отличительные признаки настоящего изобретения будут более очевидны из описания нижеследующих примеров, которые не должны рассматриваться как ограничение объема изобретения.
Пример 1. Отбор противовоспалительных штаммов
Клетки ТНР-1 инкубировали вместе с контрольной средой или с кондиционированной средой (L-CM), полученной после культивирования отобранных штаммов L. reuteri, L. reuteri ATCC PTA 4659, L. reuteri ATCC PTA 6475, L. reuteri ATCC 55730 и L. reuteri CF48-3A. Кондиционированные среды (L-CM) представляют собой бесклеточные супернатанты, полученные после 9-часового или 24-часового культивирования каждой из культур L. reuteri. Клетки THP-1 стимулировали либо контрольной средой, либо липосахаридами (ЛПС), происходящими от E.coli (которые вызывают продуцирование TNF-α в виде обычного воспалительного ответа), путем инкубирования в течение 3,5 часов, после чего эти клетки удаляли и супернатанты анализировали на уровни TNF-α с помощью ELISA.
Материалы
Моноцитарная клеточная линия лейкоза ТНР-1 (ATCC, cat.№ TIB202);
Среда RPMI 1640 (Gibco-Invitrogen);
Фетальная бычья сыворотка (Gibco-Invitrogen);
Раствор пенициллина-стрептомицина (Sigma);
Липополисахарид E.coli серотипа О127: В8 (Sigma, cat.№ L3137);
Набор для проведения ELISA человеческих TNF-альфа/TNF-SFII DuoSet (R&D Systems, cat.№ DY210).
Метод
Использовали моноцитарную клеточную линию ТНР-1. Затем в соответствующие лунки добавляли 5% (об/об) среды MRS и 5% (об/об) Lactobacillus-кондиционированной среды. Lactobacillus-кондиционированная среда представляет собой супернатант, полученный в результате 24-часового культивирования бактерий Lactobacillus spp. в среде MRS. Затем рН кондиционированной среды корректировали путем скоростной вакуумной сушки и осадок ресуспендировали в равном объеме культуральной среды. Хотя для минимизации испарения жидкости была встроена увлажняющая камера, однако после инкубирования в течение 48 часов объем клеточной суспензии в 24-луночных планшетах снижался примерно до 475 мкл.
В соответствующие лунки добавляли 100 нг/мл липополисахарида E.coli серотипа О127:В8. Затем смесь инкубировали при 37°С в камере с повышенной влажностью при 5% СО2. После инкубирования в течение 3,5 часа культуры собирали в 1,5-миллилитровые центрифужные пробирки. Затем проводили центрифугирование при 1500 об/мин в течение 5 минут при 4°С. После этого собирали супернатанты.
Затем проводили анализ на экспрессию цитокинов с помощью ELISA (набора для количественной оценки человеческих TNF-альфа/ TNF-SFII DuoSet).
В качестве культуральной среды использовали 10% FBS, 2% раствор пенициллина-стрептомицина в среде RPMI.
Результаты примера 1
Инкубирование клеток THP-I с 24-часовой средой L-CM, полученной от штаммов L. reuteri ATCC PTA 4659 и L. reuteri ATCC PTA 6475, в отсутствии ЛПС, не приводило к продуцированию TNFα в среде для инкубирования (фиг.1). Неожиданно было обнаружено, что cреда L-CМ, полученная от штаммов L. reuteri ATCC 55730 и L. reuteri CF48-3A, стимулировала продуцирование TNFα клетками ТНР-1 на уровнях, аналогичных уровням, наблюдаемым при использовании только одного ЛПС. Таким образом, штаммы L. reuteri отличаются друг от друга по своей способности стимулировать продуцирование провоспалительных TNFα покоящимися моноцитами ТНР-1.
Добавление ЛПС в клетки ТНР-1 в отсутствие L-CM приводило к продуцированию 138 пг/мл TNFα в процессе инкубирования в течение 3,5 часов. Этот результат является ожидаемым воспалительным ответом клеток ТНР-1 на токсин. Добавление культуральной среды (MRS), которую использовали в качестве контроля в случае добавления L-CM, приводило к продуцированию 132 пг/мл TNFα, и, таким образом, было обнаружено, что MRS не влияет на ЛПС-стимулируемый ответ. Добавление 24-часовой среды L-CM от штамма L. reuteri ATCC PTA 4659 или штамма L. reuteri ATCC PTA 6475 приводило к резкому снижению уровней ЛПС-стимулируемых TNF-α вплоть до 14 и 10 пг/мл соответственно. Это означает, что такое ингибирование продуцирования ЛПС-стимулированного TNF-α составляет 89% и 92% соответственно. В противоположность этому, в присутствии 24-часовой среды L-CM от штамма L. reuteri ATCC 55730 и штамма L. reuteri CF48-3A, ЛПС все еще обладал способностью значительно повышать уровень продуцирования TNF-α, в отличие от уровней, наблюдаемых в отсутствии ЛПС. Несмотря на присутствие среды L-CM, полученной от штамма L. reuteri ATCC 55730 и от штамма L. reuteri CF48-3A, уровень продуцирования ЛПС-стимулированного TNFα повышался на 50% и 38% соответственно.
Аналогичные эксперименты, проведенные с использованием 9-часовой среды L-CM от штамма L. reuteri ATCC PTA 4659 или штамма L. reuteri ATCC PTA 6475, показали, что их действие, направленное на ингибирование продуцирования ЛПС-стимулированного TNF-α, значительно снижалось (на 52% и 16% соответственно; фиг.2), но все еще оставалось в пределах нормы. Таким образом, более длительное инкубирование штаммов L. reuteri с последующим сбором L-CM в поздней логарифмической/стационарной фазе роста давало лучший эффект в отношении ингибирования продуцирования TNF-α.
Пример 2: Препараты для негативного отбора на моноциты
Набор для выделения моноцитов II (Miltenyi Biotec, Inc. 12740 Earhart Avenue, Auburn, CA 95602 (800) 367-6227; http://www.miltenyibiotec.com/index.php?, порядковый номер 130-091-153) представляет собой систему непрямого магнитного мечения для выделения интактных моноцитов из мононуклеарных клеток человеческой периферической крови (МКПК). Немоноцитарные клетки, т.е. Т-клетки, В-клетки, NK-клетки, дендритные клетки и базофилы, подвергали непрямому магнитному мечению с использованием смеси конъюгированных с биотином антибиотиков против CD3, CD7, CD16, CD19, CD56, CD123 и гликофорина A, а также микросфер, покрытых антителом против биотина. Между двумя стадиями мечения не требовалось проведения стадий промывки. Уровень подвергнутых магнитному мечению клеток, не являющихся моноцитами, снижали путем их удерживания на колонке MACS® в магнитном поле сепаратора MACS, а немеченные моноциты проходили через эту колонку. Выделение относительно более высокого уровня немеченных моноцитов достигалось путем снижения уровня клеток, подвергнутых магнитному мечению. Уровень такого обогащения может быть проанализирован или подтвержден с помощью проточной цитометрии.
Данные о наборах: набор для выделения моноцитов II (порядковый номер 130-091-153). Состав набора: FcR-блокирующий реагент (1 ml); смесь конъюгированных с биотином антител (1 мл); микросферы, покрытые антителом против биотина (2 мл); материалы и оборудование, не поставляемые с набором: 15-миллилитровые центрифужные пробирки Corning; центрифуга, снабженная холодильником; пипетки и наконечники для пипеток; набор пипеток для взятия сыворотки и наконечники для этих пипеток; таймер; колонка Miltenyi Biotec MACS® MS; магнит Miltenyi Biotec MACS®; подставка для колонки Miltenyi Biotec MACS®; гемоцитометр Hausser Scientific Bright-Line; рабочий буфер (РБ): стерильный 1Х забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS, pH 7,4, Gibco, номер по каталогу 10010023) + 0,5% альбумин бычьей сыворотки (BSA, Panvera, номер по каталогу P2489) + 2 мМ этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA, Gibco, номер по каталогу 15553-035).
Метод (набор для выделения моноцитов II)
Клеточную плотность определяли путем подсчета клеток на гемоцитометре. Затем клеточную суспензию переносили в 15-миллилитровую коническую пробирку Corning. Клетки осаждали при скорости 300 об/мин в течение 10 минут при 4°С. Супернатант удаляли с использованием 10-миллилитровой пипетки для взятия сыворотки. Клеточный осадок ресуспендировали в 30 мкл РБ на 107 всех клеток. Затем добавляли 10 мкл FcR-блокирующего реагента на 107 всех клеток. После этого добавляли 10 мкл смеси конъюгированных с биотином антител на 107 всех клеток. Содержимое лунок перемешивали и инкубировали в течение 10 минут при 4-8°С. Затем добавляли 30 мкл РБ на 107 всех клеток. После этого добавляли 20 мкл микросфер, покрытых антителом против биотина, на 107 всех клеток. Содержимое лунок перемешивали и инкубировали еще 15 минут при 4-8°С. Клетки промывали путем добавления 10-20 Х объема РБ для мечения. Затем клетки центрифугировали при 300 об/мин в течение 10 минут при 4°С. Супернатант удаляли с использованием 2-миллилитровой пипетки для взятия сыворотки. Клеточный осадок ресуспендировали в 500 мкл РБ на 108 клеток. Колонку MACS MS помещали на магнит.
Колонку промывали 500 мкл РБ. Клеточную суспензию загружали на колонку. Затем ее сливали в пробирку для сбора образцов (~4 мин/мл). Колонку промывали 3·500 мкл РБ и жидкость сливали в ту же самую пробирку-сборник.
Захваченные клетки элюировали в другую пробирку-сборник путем подсоединения колонки к другой пробирке, а затем в колонку пипеткой вводили 1 мл РБ, и клетки интенсивно промывали путем подачи положительного давления поршнем, которым была снабжена колонка. Скорость потока составляла 2 секунды/дюйм.
Процедуры, описанные в данном протоколе, следует проводить быстро и, при этом, следует использовать только холодные растворы. При обработке на льду время инкубирования для микросфер MACS должно быть увеличено. Инкубирование проводят в холодильнике при 4-8°С. Буферы или среды не должны содержать Ca2+ или Mg+. BSA может быть заменен другими белками, такими как желатин, альбумин человеческой сыворотки или фетальная телячья сыворотка. Тип используемого антикоагулянта не имеет важного значения для данного протокола. Более высокие температуры и более длительные периоды инкубирования могут приводить к неспецифическому мечению клеток.
Пример 3. Биоанализ на первичные моноциты
Первичные человеческие моноциты выделяли из крови пациентов с болезнью Крона (БК) в фазе активного воспаления (БК-акт) или в фазе ремиссии (БК-рем), при которой интенсивность симптомов воспаления снижается. У пациентов с БК брали кровь и выделяли мононуклеарные клетки периферической крови. Обогащение периферической крови моноцитами проводили методом, описанным в примере 2. Суспензии этих клеток оставляли на 48 часов при 37°С в камере с повышенной влажностью и с 5% CO2 для дифференцировки клеток. После этой процедуры клетки превращались в макрофаги. Затем к моноцитам периферической крови или к дифференцированным макрофагам добавляли культуральную среду (контроль) или L-СМ, и клетки стимулировали либо контрольной средой, либо ЛПС E.coli, а затем инкубировали в течение 3,5 часов. После этого проводили анализ на уровень продуцирования TNFα в супернатантах, полученных после такого инкубирования. Были использованы следующие материалы: первичные моноциты периферической крови; среда RPMI 1640 (Gibco-Invitrogen); фетальная бычья сыворотка (Gibco-Invitrogen); раствор пенициллина-стрептомицина (Sigma); липополисахарид E.coli серотипа O127:B8 (Sigma, номер по каталогу L3137); транс-ретиноевая кислота (CalBioChem, номер по каталогу 554720); набор для проведения ELISA человеческих TNF-альфа/TNF-SFII DuoSet (R&D Systems, номер по каталогу DY210).
Моноциты периферической крови выделяли, как описано в протоколах, а именно в протоколе выделения мононуклеарных клеток периферической крови (как описано в примере 2) и в протоколе негативного отбора на моноциты (как описано в примере 2). Среду для суспендирования клеток (PBS) заменяли средой для культивирования клеток (10% FBS, 2% раствор пенициллина-стрептомицина в RPMI 1640).
Клетки разводили до 1,0·105 клеток/мл. В каждую лунку 24-луночного микротитрационного планшета добавляли 500 мкл клеточной суспензии. Затем клетки помещали на 48 часов при 37°С в камеру с повышенной влажностью с 5% CO2 для дифференцировки клеток. После этого начинали биоанализ. В соответствующие лунки добавляли 5% (об/об) среды MRS и 5% (об/об) Lactobacillus-кондиционированной среды. Lactobacillus-кондиционированная среда представляет собой супернатант, полученный от 24-часовой культуры Lactobacillus sp. в среде MRS. Затем рН кондиционированной среды корректировали путем скоростной вакуумной сушки, и осадок ресуспендировали в равном объеме культуральной среды. Хотя для минимизации испарения жидкости была встроена увлажняющая камера, однако, после инкубирования в течение 48 часов, объем клеточной суспензии в 24-луночных планшетах снижался примерно до 475-485 мкл. В соответствующие лунки добавляли 100 нг/мл липополисахарида E.coli серотипа О127:В8. Затем смесь инкубировали при 37°С в камере с повышенной влажностью и с 5% СО2. После инкубирования в течение 3,5 часов, культуры собирали в 1,5-миллилитровые центрифужные пробирки. Затем проводили центрифугирование при 1500 об/мин в течение 5 минут при 4°С. После этого собирали супернатанты. Затем проводили анализ на экспрессию цитокинов с помощью ELISA (набора для количественной оценки человеческих TNF-альфа/TNF-SFII DuoSet).
Результаты примера 3
В первичных моноцитах, выделенных у пациентов с БК в стадии ремиссии, ЛПС вызывали ожидаемое увеличение уровня TNFα, и такое увеличение может быть ингибировано на 43% в присутствии среды L-CM от L. reuteri ATCC PTA 6475. В первичных моноцитах, выделенных у пациентов с активной формой БК, уровень продуцирования ЛПС-стимулированного TNFα был несколько выше и ингибировался на том же уровне в присутствии L-CM от L. reuteri ATCC PTA 6475 (фиг.3).
По сравнению с контролем (среда) уровень продуцирования TNFα в ответ на действие ЛПС в дифференцированных макрофагах, происходящих от первичных моноцитов, выделенных у пациентов с активной формой БК, значительно ингибировался, а именно на 50% в присутствии L-CM от L. reuteri ATCC PTA 4659 и на 60% в присутствии L-CM от L. reuteri ATCC PTA 6475 (фиг.4). Данные, полученные для клеток THP-1, подтвердили, что среды L-CM, полученные от штаммов L. reuteri ATCC 55730 и L. reuteri CF48-3A, были неспособны ингибировать продуцирование TNFα, и наоборот, способствовали увеличению уровня продуцирования TNFα на 22% и на 30% соответственно по сравнению с соответствующим контролем (фиг.4).
Эти данные неожиданно показали, что различные штаммы от L. reuteri оказывают различное действие на продуцирование TNFα моноцитами и дифференцированными макрофагами, и что штаммы L. reuteri ATCC PTA 4659 и L. reuteri ATCC PTA 6475 являются особенно подходящими для их использования в целях лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта у человека, страдающего воспалительным заболеванием кишечника.
Пример 4. Использование кондиционированной среды
В соответствии с методом, описанным в примере 1, кондиционированной средой, выбранной для осуществления этого эксперимента, была среда, полученная от одного штамма, эффективно снижающего уровень TNFα, а именно от L. reuteri ATCC PTA-4659. Эта среда была получена в большом количестве путем культивирования штамма в среде de Man, Rogosa, Sharpe (MRS) (Difco, Sparks, MD). Ночные культуры молочнокислых бактерий разводили до OD600 = 1,0 (оптической плотности, соответствующей примерно 109 клеток/мл), а затем разводили 1:10 и культивировали еще 24 часа. Кондиционированную среду, не содержащую бактериальных клеток, собирали путем центрифугирования при 8500 об/мин в течение 10 минут при 4°С. Кондиционированную среду отделяли от клеточного осадка, а затем фильтровали через фильтрующее устройство с размером пор 0,22 мкм (Millipore, Bedford, Mass.). После этого кондиционированную среду лиофилизовали и составляли композицию, из которой затем, стандартными методами, изготавливали таблетки. Эти таблетки использовали в качестве лекарственных средств для эффективного лечения язвы у человека, вызываемой ВЗК.
Пример 5. Использование выбранных противовоспалительных штаммов Lactobacillus reuter
В соответствии с методом, описанным в примере 1, кондиционированной средой, выбранной для осуществления этого эксперимента, была среда, полученная от одного штамма, эффективно снижающего уровень TNFα, а именно L. reuteri ATCC PTA-4659. После этого штамм L. reuteri лиофилизовали и составляли композицию, из которой затем, стандартными методами, изготавливали капсулы. Эти капсулы использовали в качестве лекарственных средств для эффективного снижения уровня воспаления слизистой у пациентов с ВЗК.
Пример 6. Характеристика белка, продуцируемого эффективными штаммами Lactobacillus
Различные эффективные Lactobacillus-кондиционированные среды, включая среды, кондиционированные штаммами L. reuteri ATCC PTA 4659 и L. reuteri ATCC PTA-6475, обрабатывали различными денатурирующими соединениями для определения природы предполагаемых иммуномодулинов, происходящих от указанных бактерий. Так, например, кондиционированные среды подвергали нескольким циклам замораживания-оттаивания, термообработки, гидролиза ДНК-расщепляющими ферментами, протеазами и инактивированными протеазами. Таким образом, предполагаемый иммуномодулин был идентифицирован как один или несколько природных белков или пептидов. Для определения размера предполагаемого белка иммуномодулина кондиционированную среду фракционировали путем фильтрации, и полученные фильтраты тестировали на их эффективность. Таким образом, было обнаружено, что размер активного компонента кондиционированной среды, полученной от эффективных штаммов Lactobacillus, составлял приблизительно 5 кДа или менее.
Хотя настоящее изобретение описано на конкретных вариантах его осуществления, однако очевидно, что в него могут быть внесены различные изменения, модификации и варианты, и все такие изменения, модификации и варианты не выходят за рамки существа и объема настоящего изобретения.
Пример 7. Получение ферментированного молока.
Ферментированное молоко может быть получено с использованием следующих стадий.
Вариант а):
- стандартизация жира и твердого составляющего молока;
- гомогенизация молока, обезжиренного молока и лиофилизированного штамма (108 кое/г) - приблизительно 0,1 г на 1 кг молока, для достижения оптимальных физических свойств продукта;
- нагревание с последующей стадией гомогенизации;
- охлаждение,
- упаковка и хранение.
Вариант б):
- штамм выращивают и лиофилизируют, используя стандартные для пищевой промышленности способы, подходящие для выращивания Lactobacillus;
- культуру вносят в предварительно ферментированное молоко, используя стандартные йогуртные культуры, например йогуртные культуры с концентрацией 107 кое/г;
- гомогенизирование, упаковка и хранение.
Вариант в):
- смешивание масла триглицеридовых жирных кислот средней цепи и подсолнечного масла с диоксидом кремния в смесителе Больцмана;
- гомогенизирование;
- вакуумная сушка смеси при давлении 10 мбар;
- добавление порошка L. Reuteri, (предпочтительно лиофилизированного), количество зависит от конечного продукта, однако для примера количество составляет 0,2 кг культуры с 1011 кое/г;
- смешивание;
- перенос суспензии в стеклянный сосуд и обработка азотом;
- наполнение бутылок.
Пример 8. Получение фармацевтических продуктов.
Вариант а):
Пробиотические культуры подходят для введения в дозе 108 кое/г в каплях на основе коммерчески доступного масла из триглицеридов со средней длиной цепи или масла подсолнечника (согласно способу в примере 7).
Вариант б):
Лиофилизированный бактериальный порошок можно помещать в стандартные капсулы из желатина или целлюлозы. Стадии производства зависят от требуемого продукта и особенностей технологии используемой в каждом случае.
Claims (7)
1. Штамм молочнокислой бактерии для лечения воспаления при воспалительном заболевании кишечника, где указанный штамм молочнокислой бактерии представляет собой штамм Lactobacillus reuteri АТСС РТА-6475.
2. Компонент, эффективный для лечения язвы и включающий белковоподобное вещество размером 5 кДа, которое присутствует в Lactobacillus-кондиционированной среде после выращивания культуры выбранного бактериального штамма по п.1.
3. Способ лечения воспаления при воспалительном заболевании кишечника, включающий введение человеку кондиционированной среды после выращивания культуры выбранного бактериального штамма по п.1.
4. Продукт, предназначенный для введения пациенту с воспалительным заболеванием кишечника, содержащий штамм Lactobacillus reuteri ATCC РТА-6475.
5. Продукт, предназначенный для введения пациенту с воспалительным заболеванием кишечника, включающий кондиционированную среду из культуры штамма Lactobacillus reuteri ATCC РТА-6475.
6. Композиция, включающая известный носитель, подходящий для приема внутрь, и штамм Lactobacillus reuteri ATCC РТА-6475, подходящий для лечения воспаления при воспалительном заболевании кишечника.
7. Композиция, включающая известный носитель, подходящий для приема внутрь, и кондиционированную среду из культуры штамма Lactobacillus reuteri ATCC РТА-6475, подходящую для лечения воспаления при воспалительном заболевании кишечника.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US11/107,438 | 2005-04-15 | ||
| US11/107,438 US7344867B2 (en) | 2005-04-15 | 2005-04-15 | Selection and use of lactic acid bacteria for reducing inflammation in mammals |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2007142174A RU2007142174A (ru) | 2009-05-20 |
| RU2378370C2 true RU2378370C2 (ru) | 2010-01-10 |
Family
ID=37087291
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2007142174/13A RU2378370C2 (ru) | 2005-04-15 | 2006-04-12 | Штамм молочнокислой бактерии для лечения воспаления при воспалительном заболевании кишечника, компонент, эффективный для лечения язвы, способ лечения воспаления при воспалительном заболевании кишечника, продукт (варианты) и композиция (варианты) |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7344867B2 (ru) |
| EP (1) | EP1868622B1 (ru) |
| JP (1) | JP4740999B2 (ru) |
| KR (1) | KR101042123B1 (ru) |
| CN (1) | CN101160134B (ru) |
| AU (1) | AU2006234793B2 (ru) |
| DK (1) | DK1868622T3 (ru) |
| ES (1) | ES2606765T3 (ru) |
| HU (1) | HUE032297T2 (ru) |
| LT (1) | LT1868622T (ru) |
| MX (1) | MX2007012656A (ru) |
| PL (1) | PL1868622T3 (ru) |
| PT (1) | PT1868622T (ru) |
| RU (1) | RU2378370C2 (ru) |
| SI (1) | SI1868622T1 (ru) |
| WO (1) | WO2006110088A1 (ru) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2578577C2 (ru) * | 2010-09-21 | 2016-03-27 | Биогайа Аб | Продукт, содержащий молочнокислые бактерии, и влагопоглотитель |
| US11324786B2 (en) | 2017-11-20 | 2022-05-10 | University-Industry Cooperation Group Of Kyung Hee University | Lactic acid bacteria and use thereof |
| RU2778773C2 (ru) * | 2017-11-20 | 2022-08-24 | Юниверсити-Индастри Кооперэйшн Груп Оф Кён Хи Юниверсити | Новые молочнокислые бактерии и их применение |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080254011A1 (en) * | 2007-04-11 | 2008-10-16 | Peter Rothschild | Use of selected lactic acid bacteria for reducing atherosclerosis |
| US20110293710A1 (en) * | 2010-02-02 | 2011-12-01 | Delphine Saulnier | Immunomodulatory properties of lactobacillus strains |
| US20130022586A1 (en) * | 2011-07-21 | 2013-01-24 | James Versalovic | Production and use of bacterial histamine |
| ES2402014B1 (es) * | 2011-09-07 | 2014-02-27 | Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) | Peptido secretado por lactobacillus plantarum con función inmunomoduladora |
| AU2013240289B2 (en) | 2012-03-29 | 2018-01-25 | Therabiome, Llc | Gastrointestinal site-specific oral vaccination formulations active on the ileum and appendix |
| PL3456334T3 (pl) * | 2012-06-04 | 2021-05-04 | Biogaia Ab | Bakterie kwasu mlekowego do stosowania dla zapobiegania ubytkowi masy kostnej u ssaków |
| US9907755B2 (en) | 2013-03-14 | 2018-03-06 | Therabiome, Llc | Targeted gastrointestinal tract delivery of probiotic organisms and/or therapeutic agents |
| ES2874479T3 (es) * | 2014-01-23 | 2021-11-05 | Biogaia Ab | Agentes que modulan el dolor gastrointestinal |
| BR112017019660A2 (en) * | 2015-03-26 | 2018-05-15 | Biogaia Ab | Histamine-producing lactic acid bacterial strain and method of selecting a lactic acid bacterial strain for use |
| US10376563B1 (en) | 2016-02-12 | 2019-08-13 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Methods for systemically delivering polypeptides and microorganisms therefor |
| RS64503B1 (sr) | 2016-04-15 | 2023-09-29 | Baylor College Medicine | Lactobacillus reuteri mm4-1a za upotrebu u lečenju ili prevenciji poremećaja autističnog spektra |
| CN110893195B (zh) * | 2019-09-30 | 2023-03-14 | 内蒙古伊利实业集团股份有限公司 | 一种具有缓解肠道炎症功能的副干酪乳杆菌et-22 |
| PL3897836T3 (pl) | 2019-11-08 | 2023-10-30 | Biogaia Ab | Bakterie wytwarzające serotoninę |
| CN114196581B (zh) * | 2020-12-16 | 2023-06-13 | 江南大学 | 缓解高尿酸血症的罗伊氏乳杆菌ccfm1132及应用 |
| AU2022318574B2 (en) | 2021-07-30 | 2024-03-21 | Helaina, Inc. | Methods and compositions for protein synthesis and secretion |
| CA3228922A1 (en) | 2021-10-11 | 2023-04-20 | Ajinomoto Co., Inc. | Bacterium modified to express heterologous tat protein |
| KR102752058B1 (ko) * | 2023-08-25 | 2025-01-13 | 전남대학교 산학협력단 | 락토바실러스 루터리 nchbl-005 균주, 사균체 또는 이의 혼합물을 유효 성분으로 포함하는 염증성 질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2161494C2 (ru) * | 1995-06-07 | 2001-01-10 | Биогайа Биолоджикс АБ | Способ улучшения здоровья животных |
| WO2004031368A1 (en) * | 2002-10-07 | 2004-04-15 | Biogaia Ab | Selection and use of lactic acid bacteria for reducing inflammation caused by helicobacter |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5413960A (en) * | 1987-05-01 | 1995-05-09 | Biogaia Ab | Antibiotic reuterin |
| US5458875A (en) * | 1990-06-15 | 1995-10-17 | Biogaia Ab | In ovo method for delivering Lactobacillus reuteri to the gastrointestinal tract of poultry |
| US5837238A (en) * | 1996-06-05 | 1998-11-17 | Biogaia Biologics Ab | Treatment of diarrhea |
| US20010049115A1 (en) * | 2000-01-17 | 2001-12-06 | Collins John Kevin | Vitro model for gastrointestinal inflammation |
| AU5773600A (en) * | 1999-06-30 | 2001-01-31 | Board Of Regents Of The University Of Nebraska, The | Method of isolation of regulated virulence determinants from bacterial pathogens |
| US6953574B2 (en) * | 2002-06-21 | 2005-10-11 | Technology Commercialization, Inc. | Method for producing a fermented hydrolyzed medium containing microorganisms |
| US20040208863A1 (en) * | 2003-01-30 | 2004-10-21 | James Versalovic | Anti-inflammatory activity from lactic acid bacteria |
-
2005
- 2005-04-15 US US11/107,438 patent/US7344867B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2006
- 2006-04-12 RU RU2007142174/13A patent/RU2378370C2/ru active
- 2006-04-12 EP EP06733290.8A patent/EP1868622B1/en active Active
- 2006-04-12 KR KR1020077021996A patent/KR101042123B1/ko active Active
- 2006-04-12 CN CN2006800120990A patent/CN101160134B/zh active Active
- 2006-04-12 ES ES06733290.8T patent/ES2606765T3/es active Active
- 2006-04-12 DK DK06733290.8T patent/DK1868622T3/en active
- 2006-04-12 WO PCT/SE2006/000434 patent/WO2006110088A1/en not_active Ceased
- 2006-04-12 AU AU2006234793A patent/AU2006234793B2/en active Active
- 2006-04-12 HU HUE06733290A patent/HUE032297T2/en unknown
- 2006-04-12 JP JP2008506408A patent/JP4740999B2/ja active Active
- 2006-04-12 PL PL06733290T patent/PL1868622T3/pl unknown
- 2006-04-12 MX MX2007012656A patent/MX2007012656A/es active IP Right Grant
- 2006-04-12 SI SI200632125A patent/SI1868622T1/sl unknown
- 2006-04-12 PT PT67332908T patent/PT1868622T/pt unknown
- 2006-04-12 LT LTEP06733290.8T patent/LT1868622T/lt unknown
-
2007
- 2007-12-24 US US12/005,250 patent/US20080107635A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2161494C2 (ru) * | 1995-06-07 | 2001-01-10 | Биогайа Биолоджикс АБ | Способ улучшения здоровья животных |
| WO2004031368A1 (en) * | 2002-10-07 | 2004-04-15 | Biogaia Ab | Selection and use of lactic acid bacteria for reducing inflammation caused by helicobacter |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| MENARD S. et al. Lactic acid bacteria secrete metabolites retaining anti-inflammatory properties after intestinal transport, Gut., 2004, v.53, n.6, p.821-828. MARCEAU M. et al. Yersinia pseudotuberculosis anti-inflammatory components reduce trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis in the mouse, Infect Immun., 2004, v.72, n.4, p.2438-2441. * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2578577C2 (ru) * | 2010-09-21 | 2016-03-27 | Биогайа Аб | Продукт, содержащий молочнокислые бактерии, и влагопоглотитель |
| US11324786B2 (en) | 2017-11-20 | 2022-05-10 | University-Industry Cooperation Group Of Kyung Hee University | Lactic acid bacteria and use thereof |
| RU2778773C2 (ru) * | 2017-11-20 | 2022-08-24 | Юниверсити-Индастри Кооперэйшн Груп Оф Кён Хи Юниверсити | Новые молочнокислые бактерии и их применение |
| US11963988B2 (en) | 2017-11-20 | 2024-04-23 | University-Industry Cooperation Group Of Kyung Hee University | Lactic acid bacteria and use thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUE032297T2 (en) | 2017-09-28 |
| US20080107635A1 (en) | 2008-05-08 |
| CN101160134A (zh) | 2008-04-09 |
| KR20070121700A (ko) | 2007-12-27 |
| JP4740999B2 (ja) | 2011-08-03 |
| MX2007012656A (es) | 2007-12-13 |
| JP2008538288A (ja) | 2008-10-23 |
| AU2006234793B2 (en) | 2010-10-28 |
| PT1868622T (pt) | 2016-12-29 |
| DK1868622T3 (en) | 2017-01-16 |
| EP1868622A4 (en) | 2011-11-02 |
| CN101160134B (zh) | 2012-08-22 |
| PL1868622T3 (pl) | 2017-04-28 |
| WO2006110088A1 (en) | 2006-10-19 |
| US20060233775A1 (en) | 2006-10-19 |
| SI1868622T1 (sl) | 2017-01-31 |
| AU2006234793A1 (en) | 2006-10-19 |
| KR101042123B1 (ko) | 2011-06-16 |
| RU2007142174A (ru) | 2009-05-20 |
| LT1868622T (lt) | 2017-01-10 |
| EP1868622A1 (en) | 2007-12-26 |
| HK1115730A1 (en) | 2008-12-05 |
| EP1868622B1 (en) | 2016-09-28 |
| US7344867B2 (en) | 2008-03-18 |
| ES2606765T3 (es) | 2017-03-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2378370C2 (ru) | Штамм молочнокислой бактерии для лечения воспаления при воспалительном заболевании кишечника, компонент, эффективный для лечения язвы, способ лечения воспаления при воспалительном заболевании кишечника, продукт (варианты) и композиция (варианты) | |
| CN101171019B (zh) | 免疫功能调节剂 | |
| Tejada-Simon et al. | Ex vivo effects of lactobacilli, streptococci, and bifidobacteria ingestion on cytokine and nitric oxide production in a murine model | |
| SK280682B6 (sk) | Bifidobaktérie a ich použitie | |
| RU2262943C2 (ru) | Сомногенная активность непатогенных молочно-кислых бактерий | |
| CN116024131A (zh) | 一种植物乳杆菌菌株goldgut-lp101及用途 | |
| WO2009068474A1 (en) | Strains of lactobacillus plantarum as probiotics with immunomodulatory specific effect | |
| JP2617758B2 (ja) | 抗体産生増強型免疫賦活剤 | |
| KR101277050B1 (ko) | 조제유-수유 영아에서 전신 염증을 치료, 예방 또는감소하기 위한, 장쇄 다중불포화 지방산과 병용되는락토바실러스 람노수스 ｇｇ의 용도 | |
| CN101146544A (zh) | 鼠李糖乳杆菌用于治疗、预防或减少配方喂养婴儿的全身性炎症的用途 | |
| CN105154362A (zh) | 一种可预防胃溃疡的发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum suo及其保健用途 | |
| RU2505304C2 (ru) | Способ получения аутопробиотика, содержащего живые бифидобактерии и лактобациллы | |
| RU2176668C1 (ru) | ШТАММ БАКТЕРИЙ LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS N.V.EP 317/402 "НАРИНЭ" ТНСи, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ПРИ ПРИГОТОВЛЕНИИ ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ НОРМАЛИЗАЦИИ КИШЕЧНОЙ МИКРОФЛОРЫ | |
| HK1115730B (en) | Selection and use of lactic acid bacteria for reducing inflammation in mammals | |
| CN118161534B (zh) | 弗格森埃希菌及其产品在炎症疾病中的用途 | |
| McCoy | Effects of feeding Lactobacillus reuteri X-18 on blood chemistry and immune parameters in beagle (Canis familiaris) puppies | |
| US20010043933A1 (en) | Methods and compositions for modulating the immune systems of animals | |
| Adewoyin | Immunomodulating Potential of Exopolysaccharide Producing Lactic Acid Bacteria Isolated from Fer-mented Milk Products | |
| HK1115067B (en) | Immune function modulating agent | |
| HK1100508B (en) | A use of a lactic acid bacterial in preparation for pharmaceuticals for improving breast milk of feeding a baby |