RU2138163C1

RU2138163C1 - Medium for conservation of donor cornea

Info

Publication number: RU2138163C1
Application number: RU97110540A
Authority: RU
Inventors: А.А. Каспаров; В.Н. Розинова; В.П. Ямскова; Ю.Н. Наим
Original assignee: Розинова Вера Николаевна
Priority date: 1997-06-20
Filing date: 1997-06-20
Publication date: 1999-09-27

Abstract

FIELD: medicine, ophthalmology. SUBSTANCE: invention relates to the used liquid nutrient medium where optimal ratios of components for the survival of cornea-scleral panniculus are selected. This promotes to the safety of an adequate density of cornea posterior epithelium in the process of its conservation and provides the maintenance of normal thickness and transparency of cornea in patients with transplants from the adhelon-containing medium. Method is used for through keratoplastics due to stimulation of regeneration of damaged donor cornea endothelium with adhelon and for cornea bank making. EFFECT: improved quality and properties of medium. 2 dwg, 2 ex

Description

Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии, и может найти применение при создании банка роговиц. The invention relates to medicine, namely to ophthalmology, and may find application in creating a corneal bank.

Известен способ консервации донорских роговиц в жидких питательных средах, позволяющий создать запас высококачественной, жизнеспособной донорской ткани для осуществления успешной сквозной кератопластики (СКП) (Cornealsurgery. Theory, Technique and Tissue. Ed. F.S. Brightbill, M.D. The C.N. Mosby, Company. S.T. Louis-Washington, D.C.-Toronto, 1986, 775 p.). There is a method of preserving donor corneas in liquid culture media, allowing you to create a stock of high-quality, viable donor tissue for successful transverse keratoplasty (UPC) (Cornealsurgery. Theory, Technique and Tissue. Ed. FS Brightbill, MD The CN Mosby, Company. ST Louis- Washington, DC-Toronto, 1986, 775 p.).

Консервация донорских роговиц в жидких питательных средах была начата Mc Carey B.E. и Kaufman H.E. в 1974 году (Invest. Ophthalmol., - 1974, - 13, - 165 - 173). Созданная этими исследователями среда М-К представляла собой смесь среды Е-199, декстрана, бикарбонатного буфера, пенициллина и стрептомицина. Позднее ряд исследователей представили данные об использовании питательной среды для консервации роговиц в комплексе с хондроитин сульфатом (среда K-Sol) /Stein R.M., Bourne W.M., Campbell R.J./Arch. Ophthalmol., - 1986, - vol. 104, - p.p. 1358 - 1361/. Консервация роговиц в среде K-Sol дала наиболее хорошие результаты по сравнению со средой М-К (в ней значительно менее выражен отек роговицы). Недостатком этого способа являются неизбежные механические повреждения эндотелия роговицы в процессе оценки, стерилизации, выкраивания корнеосклерального лоскута из донорских глаз при создании глазного банка, а также ограничение сроков хранения в этих средах пригодных для СКП трансплантатов до 4 - 5 суток. Preservation of donor corneas in liquid culture media was initiated by Mc Carey B.E. and Kaufman H.E. in 1974 (Invest. Ophthalmol., - 1974, - 13, - 165 - 173). The MK medium created by these researchers was a mixture of E-199 medium, dextran, bicarbonate buffer, penicillin and streptomycin. Later, a number of researchers presented data on the use of nutrient medium for corneal preservation in combination with chondroitin sulfate (K-Sol medium) / Stein R.M., Bourne W.M., Campbell R.J./Arch. Ophthalmol., - 1986, - vol. 104, - p.p. 1358 - 1361 /. Conservation of corneas in K-Sol medium gave the best results compared to M-K medium (corneal edema is much less pronounced in it). The disadvantage of this method is the inevitable mechanical damage to the corneal endothelium during the evaluation, sterilization, cutting out of the corneoscleral flap from the donor eyes during the creation of the eye bank, as well as the limited shelf life of these transplants suitable for UPC up to 4-5 days.

Сравнительный анализ переживания донорских роговиц в средах М-К, K-Sol и среде с адгелоном показал, что роговицы, хранившиеся в среде с адгелоном характеризовались более высоким уровнем поддержания структурной и функциональной целостности: при сроках хранения до 7 суток включительно целостность эндотелиального монослоя была сохранена. Послеоперационный подсчет эндотелиальных клеток (ЭК) и пахиметрия в зеркальном микроскопе у больных с пересаженными трансплантатами из среды с адгелоном также показали лучшую сохранность роговичной ткани и ее функции, по сравнению с трансплантатами, хранившимися в среде М-К и K-Sol. A comparative analysis of the experience of donor corneas in M-K, K-Sol and Adgelon media showed that corneas stored in the Adgelon medium had a higher level of maintaining structural and functional integrity: with shelf life of up to 7 days, the integrity of the endothelial monolayer was preserved . Postoperative counting of endothelial cells (EC) and pachymetry under a mirror microscope in patients with transplanted grafts from medium with adheson also showed better preservation of corneal tissue and its function, compared with grafts stored in M-K and K-Sol medium.

Технический результат, достигаемый изобретением, - возможность стимулировать репаративную регенерацию поврежденных элементов роговицы, неизбежных при ручных и инструментальных манипуляциях с донорскими глазами при заготовке корнеосклеральных трансплантатов, благодаря чему восстанавливается структурная организация клеточных элементов, в частности заднего эпителия роговицы (ЗЭР). Сохранение адекватной плотности ЗЭР в процессе консервирования донорского материала обеспечивает поддержание нормальной толщины и прозрачности роговицы, т.е. значительно улучшает качество трансплантата для СКП. The technical result achieved by the invention is the ability to stimulate the reparative regeneration of damaged elements of the cornea, which are unavoidable during manual and instrumental manipulations with donor eyes during harvesting of corneoscleral grafts, due to which the structural organization of cellular elements, in particular, the posterior corneal epithelium (ZER), is restored. Maintaining an adequate density of ZER in the process of preserving donor material ensures the maintenance of normal corneal thickness and transparency, i.e. significantly improves graft quality for UPC.

Сущность изобретения заключается в достижении упомянутого технического результата благодаря использованию среды для среднепродолжительной консервации роговицы донора, содержащей питательную среду культуры тканей Т-199, HEPES-буфер для стабилизации pH среды до 7,3, декстран-40, смесь антибиотиков, витамины, электролиты, глюкозу и адгелон с возможным разбросом ингредиентов на 1 л среды 199 в пределах:
HEPES-буфер (IM) - 15 мМ - 20 мМ - 25 мМ
декстран (мол.вес 40000) - 25 г - 30 г - 50 г (2,5% - 3,5% - 5%)
ампициллин - 100 мг - 150 мг

глицин (2,0 мг/л) - 1 мл

биотин - 0,05 мг - 0,1 мг - 0,5 мг
фолиевая к-та - 0,5 мг - 1,0 мг
хлорид кальция - 166,0 мг - 332 мг
сульфат магния - 120,0 мг - 180 мг
фосфат калия - 80 мг - 160 мг - 170 мг
глюкоза - 100 г - 450 г
адгелон - 10^-13 М/мл р-ра - 5 мл
Оптимальное соотношение составляющих веществ в используемой среде указано в методике приготовления среды.The essence of the invention is to achieve the technical result due to the use of medium for medium-long preservation of the cornea of the donor containing culture medium of tissue culture T-199, HEPES buffer to stabilize the pH of the medium to 7.3, dextran-40, a mixture of antibiotics, vitamins, electrolytes, glucose and adheson with a possible dispersion of ingredients per 1 liter of medium 199 within:
HEPES buffer (IM) - 15 mm - 20 mm - 25 mm
dextran (mol.weight 40,000) - 25 g - 30 g - 50 g (2.5% - 3.5% - 5%)
ampicillin - 100 mg - 150 mg

glycine (2.0 mg / l) - 1 ml

Biotin - 0.05 mg - 0.1 mg - 0.5 mg
folic acid - 0.5 mg - 1.0 mg
calcium chloride - 166.0 mg - 332 mg
magnesium sulfate - 120.0 mg - 180 mg
potassium phosphate - 80 mg - 160 mg - 170 mg
glucose - 100 g - 450 g
Adgelon - 10 ^-13 M / ml solution - 5 ml
The optimal ratio of constituent substances in the medium used is indicated in the methodology for preparing the medium.

Методика приготовления среды и консервация в ней роговицы донора осуществляется следующим образом. The technique for preparing the medium and preserving the cornea of the donor in it is as follows.

В стерильном боксе (ламинарном шкафу) берется флакон с готовой средой 199 (1,0 л) фирмы Sigma (США), куда с соблюдением всех правил асептики стерильной мерной пипеткой добавляется 20 мМ HEPES-буфера (1 М) фирмы Sigma (США), отдельной стерильной пипеткой из готового флакона со 100 мл смеси антибиотиков (пенициллин-стрептомицин-неомицин) той же фирмы вливается 10 мл вышеуказанных антибиотиков в концентрации 5000 ЕД/мл, 5 мг/мл, 10 мг/мл соответственно и высыпается 100 мг ампициллина для инъекций из отдельного флакона фирмы Pharmachim (Болгария). Из готового пузырька с 25 мл смеси витаминов фирмы Bio Whittaker (США) другой пипеткой добавляется 1 мл витаминного раствора, содержащего 2,0 мг/л глицина, 0,5 мг/л никотиновой к-ты, 0,5 мг/л витамина B₆, 0,5 мг/л витамина B₁. Раздельные навески биотина (0,05 мг) фирмы Sigma (США) и фолиевой к-ты (0,5 мг) этой же фирмы делались в боксе на торсионных весах со стерильными чашечками, после чего высыпались во флакон со средой. Таким же образом туда добавлялись стерильные навески электролитов (332 мг хлорида кальция, 180 мг сульфата магния и 170 мг фосфата калия) фирмы Sigma. Стерильный порошок глюкозы той же фирмы отвешивался на стерильных чашках аптекарских весов (450 г), после чего высыпался в флакон со средой. Далее в полученный состав добавляли 5 мл адгелона (мол. масса 6 килодальтон) в концентрации 10^-13 М/мл раствора, полученного в Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН из супернатанта сыворотки крови животных и человека.In a sterile box (laminar cabinet), a vial of ready-made medium 199 (1.0 L) from Sigma (USA) is taken, where, following all aseptic rules, a sterile measuring pipette is added with 20 mM HEPES-buffer (1 M) from Sigma (USA), a separate sterile pipette from a finished bottle with 100 ml of a mixture of antibiotics (penicillin-streptomycin-neomycin) of the same company is poured into 10 ml of the above antibiotics at a concentration of 5000 IU / ml, 5 mg / ml, 10 mg / ml, respectively, and 100 mg of ampicillin is injected for injection from a separate bottle of Pharmachim (Bulgaria). From a finished vial with 25 ml of a mixture of vitamins from Bio Whittaker (USA), another pipette adds 1 ml of a vitamin solution containing 2.0 mg / l of glycine, 0.5 mg / l of nicotinic acid, 0.5 mg / l of vitamin B ₆ , 0.5 mg / l of vitamin B ₁ . Separate weighed samples of biotin (0.05 mg) from Sigma (USA) and folic acid (0.5 mg) of the same company were made in a torsion box with sterile cups and then poured into a bottle with medium. In the same way, sterile samples of electrolytes (332 mg of calcium chloride, 180 mg of magnesium sulfate and 170 mg of potassium phosphate) from Sigma were added there. Sterile glucose powder of the same company was weighed on sterile dishes of a pharmacy balance (450 g), after which it was poured into a vial of medium. Next, 5 ml of adheson (mol. Mass of 6 kilodaltons) was added to the resulting composition at a concentration of 10 ^-13 M / ml of the solution obtained at the Institute of Development Biology N.K. Koltsova RAS from the supernatant of blood serum of animals and humans.

Трупные глаза забираются не позднее 12 часов с момента констатации смерти донора. Перед консервированием роговицы донорских глаз тщательно исследовались в щелевой лампе фирмы "Opton" для выявления эпителиальной и стромальной патологии. Контроль состояния ЗЭР осуществлялся с помощью зеркального энотелиального микроскопа фирмы "Keeler-Canon", который позволял провести пахиметрию и морфометрический анализ ЗЭР. Для консервации донорских роговиц отбирались лишь те, потери в плотности ЭК которых не превышали 15% и которые содержали не менее 2500 ЭК в 1 мм². После биомикроскопического осмотра роговицы, формы и размеров зрачка, делалась адреналиновая проба (0,1% р-р солянокислого адреналина). Глаза с положительной адреналиновой пробой перед иссечением из них корнеосклерального лоскута стерилизовались в течение 5-7 минут по разработанному в нашем отделе способу в смеси раствора хлоргексидина и гентамицина соответственно 0,02% и 0,125% концентрации (А.А. Каспаров с соавт., 1990). Затем кадаверные глаза дважды ополаскивались в стерильном физиологическом р-ре, после чего из них выкраивался корнеосклеральный лоскут, который помещался в стерильный контейнер с герметически закрывающейся крышкой, содержащим 20 мл питательной среды с адгелоном.Cadaveric eyes are withdrawn no later than 12 hours after the death of the donor. Before preserving the corneas, donor eyes were thoroughly examined in an Opton slit lamp to identify epithelial and stromal pathologies. ZER condition was monitored using a Keeler-Canon mirror enothelial microscope, which allowed pachymetry and morphometric analysis of ZER. For preservation of donor corneas, only those were selected whose loss in EC density did not exceed 15% and which contained no less than 2500 EC in 1 mm ² . After biomicroscopic examination of the cornea, the shape and size of the pupil, an adrenaline test was done (0.1% solution of adrenaline hydrochloride). Eyes with a positive adrenaline test before being excised from the corneoscleral flap were sterilized for 5-7 minutes according to the method developed in our department in a mixture of a solution of chlorhexidine and gentamicin, respectively 0.02% and 0.125% concentration (A.A. Kasparov et al., 1990 ) Then the cadaver eyes were rinsed twice in a sterile physiological solution, after which a corneoscleral flap was cut out of them, which was placed in a sterile container with a hermetically sealed lid containing 20 ml of nutrient medium with acetone.

Законсервированные роговицы хранились при тем-ре 4^oC в холодильнике. Все манипуляции осуществлялись в стерильном боксе с соблюдением всех правил асептики и проведением посевов на стерильность в бактериологической лаборатории заготовленных роговиц. Полученные трансплантаты хранились в среде с адгелоном в течение 1 - 7 дней, после чего использовались для СКП больным с разнообразной патологией роговицы. За время переживания роговицы в жидкой питательной среде кровь этого донора тестировалась на гепатоциты B и C, СПИД и сифилис.Preserved corneas were stored at a temperature of 4 ^° C in a refrigerator. All manipulations were carried out in a sterile box in compliance with all aseptic rules and conducting sterility culture in the bacteriological laboratory of harvested corneas. The obtained grafts were stored in an adheson medium for 1–7 days, after which they were used for UPC for patients with various corneal pathologies. During the experience of the cornea in a liquid nutrient medium, the blood of this donor was tested for hepatocytes B and C, AIDS and syphilis.

Перед СКП эндотелиальный монослой консервированной парной роговицы исследовался в световом микроскопе на плоскостных пленочных препаратах, импрегнированных азотнокислым серебром и окрашенных гематоксилином, что позволяло осуществлять качественную и количественную оценку состояния ЗЭР. Before SKP, the endothelial monolayer of the canned paired cornea was examined under a light microscope on planar film preparations impregnated with silver nitrate and stained with hematoxylin, which made it possible to carry out a qualitative and quantitative assessment of the state of ZER.

В послеоперационном периоде трансплантаты реципиентов изучались с помощью зеркального микроскопа в сроки 1 неделя и 3 месяца после СКП. In the postoperative period, recipient transplants were examined using a mirror microscope at 1 week and 3 months after UPC.

Примеры характеристик донорских роговиц, консервированных в жидкой питательной среде с адгелоном, использованных для СКП. Examples of characteristics of donor corneas, preserved in a liquid nutrient medium with adheson, used for UPC.

Пример 1. Донор - муж. 30 лет, скончался в результате механической асфиксии (повешение). Срок после смерти до аутопсии (выделения глазных яблок) - 10 часов; срок после смерти до консервации роговиц в питательной среде с адгелоном - 12 часов. Example 1. A donor is a husband. 30 years old, died as a result of mechanical asphyxiation (hanging). The term after death before autopsy (eyeball discharge) is 10 hours; the period after death to preservation of the cornea in a nutrient medium with adheson is 12 hours.

Количество ЭК в 1 мм² при зеркальной микроскопии глаз донора перед консервацией: OD - 2900; OS - 3000. Срок консервации роговиц в питательной среде - 4 суток. Состояние ЭК на плоскостном пленочном препарате правой роговицы спустя 4 суток хранения оставалось без изменений по сравнению нормой (фиг. 1-а). На фиг. 1-б - эндотелий роговицы, хранившейся в среде М-К в течение 4-х дней: видны участки с усиленной аргирофилией ЭК (некробиотические изменения клеток).The number of EC in 1 mm ² by specular microscopy of the eyes of the donor before conservation: OD - 2900; OS - 3000. The term of preservation of the cornea in a nutrient medium is 4 days. The EC state on the planar film preparation of the right cornea after 4 days of storage remained unchanged compared to the norm (Fig. 1-a). In FIG. 1-b - endothelium of the cornea, stored in MK medium for 4 days: areas with enhanced EC argyrophilia (necrobiotic cell changes) are visible.

Произведена субтотальная кератопластика реципиенту 47 лет с герпетическим кератитом, микроперфорацией роговицы, десцементоцеле. Для операции была использована роговица левого глаза донора, хранившаяся в среде с адгелоном в течение 4 суток. Операционный и послеоперационный периоды - без осложнений. Сквозной трансплантат роговицы с 1-х суток до 3-х месяцев оставался прозрачным; количество ЭК к 3-му месяцу послеоперационного периода - 2500. Subtotal keratoplasty was performed for a 47-year-old recipient with herpetic keratitis, microperforation of the cornea, and descementocele. For the operation, the cornea of the donor’s left eye was used, which was stored in the medium with adheson for 4 days. Surgical and postoperative periods - without complications. Through corneal transplant from 1 day to 3 months remained transparent; the amount of EC by the 3rd month of the postoperative period is 2500.

Пример 2. Донор - муж. 28 лет, скончался от отравления этиловым спиртом. Срок после смерти до вскрытия - 11 часов; срок после смерти до консервации роговиц в питательной среде с адгелоном - 12 часов. Example 2. The donor is a husband. 28 years old, died of ethyl alcohol poisoning. The term after death to autopsy is 11 hours; the period after death to preservation of the cornea in a nutrient medium with adheson is 12 hours.

Количество ЭК в 1 мм² при зеркальной микроскопии глаз донора перед консервацией роговицы: OD - 3100; OS - 3100. Срок консервации роговиц в питательной среде - 7 суток. В правой роговице спустя 7 суток ее хранения целостность эндотелиального монослоя была сохранена; в отдельных полях зрения можно было видеть единичные крупные моноядерные ЭК, которые свидетельствовали о регенерационных процессах и новообразовании монослоя (фиг. 2-а). На фиг. 2-б - эндотелий роговицы, хранившейся в среде K-Sol в течение 7 дней: видна деструкция ЭК (до 20%).The number of EC in 1 mm ² by specular microscopy of the eyes of the donor before preservation of the cornea: OD - 3100; OS - 3100. The term of preservation of the cornea in a nutrient medium is 7 days. In the right cornea, after 7 days of its storage, the integrity of the endothelial monolayer was preserved; in separate fields of view, one could see single large mononuclear ECs, which indicated regeneration processes and neoplasm of the monolayer (Fig. 2-a). In FIG. 2-b - endothelium of the cornea, stored in K-Sol medium for 7 days: destruction of EC is visible (up to 20%).

Произведена ургентная СКП больной 56 лет с гнойным кератоиридоциклитом, начинающимся эндофтальмитом. Для СКП была использована роговица левого глаза донора, хранившаяся в среде с адгелоном в течение 7 суток. Операционный и послеоперационный периоды без осложнений. Сквозной трансплантат роговицы в первые сутки был полупрозрачным, а через 3 месяца - прозрачный; количество ЭК к 3-му месяцу послеоперационного периода - 2210. An urgent UPC of a 56-year-old patient with purulent keratoiridocyclitis beginning with endophthalmitis was performed. For SKP, the cornea of the donor’s left eye was used, which was stored in the medium with adheson for 7 days. Surgical and postoperative periods without complications. The through corneal transplant on the first day was translucent, and after 3 months it was transparent; the amount of EC by the 3rd month of the postoperative period is 2210.

Изобретение поясняется микрофотографиями. The invention is illustrated by micrographs.

Claims

A medium for preserving the cornea of the donor containing the culture medium of tissue culture T-199, HEPES buffer to stabilize the pH of the medium to 7.3; dextran -40, an antibiotic, characterized in that it additionally contains vitamins: glycine, nicotinic acid, pyridoxine chloride, thiamine chloride, biotin, folic acid; electrolytes: calcium chloride (anhydrous), magnesium sulfate (anhydrous), potassium phosphate, as well as a mixture of antibiotics: ampicillin, penicillin, streptomycin, neomycin; glucose and adheson in the following ratio of components per 1 liter of T-199:
Glycine - 2.0 mg
Vitamins:
Nicotinic acid (0.5 mg / l), pyridoxine chloride (0.5 mg / l) and thiamine chloride (0.5 mg / l) - 1 ml
Biotin - 0.05 mg
Folic Acid - 0.5 mg
Electrolytes:
Calcium Chloride (Anhydrous) (Ca ⁺⁺ ) - 332 mg
Magnesium Sulfate (Anhydrous) (Mg ⁺⁺ ) - 180 mg
Potassium Phosphate (K ⁺ ) - 170 mg
A mixture of antibiotics:
Ampicillin - 100 mg
Penicillin (5000 U / ml), streptomycin (5 mg / ml) and neomycin (10 mg / ml) - 10 ml
Glucose (450 g, 45%) and adheson (10 ^-13 M / ml solution) - 5 ml