RU2120740C1 - Способ получения таксола и таксанов из эмбриональных культур растений рода taxus - Google Patents
Способ получения таксола и таксанов из эмбриональных культур растений рода taxus Download PDFInfo
- Publication number
- RU2120740C1 RU2120740C1 RU95109640A RU95109640A RU2120740C1 RU 2120740 C1 RU2120740 C1 RU 2120740C1 RU 95109640 A RU95109640 A RU 95109640A RU 95109640 A RU95109640 A RU 95109640A RU 2120740 C1 RU2120740 C1 RU 2120740C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- medium
- callus
- taxol
- embryos
- ppm
- Prior art date
Links
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 title claims abstract description 84
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 title claims abstract description 83
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 title claims abstract description 83
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 41
- 241001116500 Taxus Species 0.000 title claims abstract description 26
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 title description 10
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 title description 5
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 claims abstract description 90
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 claims abstract description 81
- 230000000408 embryogenic effect Effects 0.000 claims abstract description 44
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 claims abstract description 41
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 21
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 13
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 8
- 244000162450 Taxus cuspidata Species 0.000 claims abstract description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 58
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 30
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 24
- 229940123237 Taxane Drugs 0.000 claims description 20
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 12
- FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N Kinetin Natural products N=1C=NC=2N=CNC=2C=1N(C)C1=CC=CO1 FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N kinetin Chemical compound N=1C=NC=2N=CNC=2C=1NCC1=CC=CO1 QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 229960001669 kinetin Drugs 0.000 claims description 9
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 5
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 4
- 241001505931 Pestalotiopsis sp. Species 0.000 claims description 4
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 4
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- UZKQTCBAMSWPJD-UQCOIBPSSA-N trans-Zeatin Natural products OCC(/C)=C\CNC1=NC=NC2=C1N=CN2 UZKQTCBAMSWPJD-UQCOIBPSSA-N 0.000 claims description 3
- UZKQTCBAMSWPJD-FARCUNLSSA-N trans-zeatin Chemical compound OCC(/C)=C/CNC1=NC=NC2=C1N=CN2 UZKQTCBAMSWPJD-FARCUNLSSA-N 0.000 claims description 3
- 229940023877 zeatin Drugs 0.000 claims description 3
- NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N N-benzyladenine Chemical compound N=1C=NC=2NC=NC=2C=1NCC1=CC=CC=C1 NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000000249 desinfective effect Effects 0.000 claims description 2
- IXORZMNAPKEEDV-OBDJNFEBSA-N gibberellin A3 Chemical compound C([C@@]1(O)C(=C)C[C@@]2(C1)[C@H]1C(O)=O)C[C@H]2[C@]2(C=C[C@@H]3O)[C@H]1[C@]3(C)C(=O)O2 IXORZMNAPKEEDV-OBDJNFEBSA-N 0.000 claims description 2
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 claims description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims 2
- IACYWWCJHKORTO-UHFFFAOYSA-N CC(=C)CCNn1cnc2ncnc2c1 Chemical compound CC(=C)CCNn1cnc2ncnc2c1 IACYWWCJHKORTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N cytokinin Natural products C1=NC=2C(NCC=C(CO)C)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(CO)O1 UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000004062 cytokinin Substances 0.000 claims 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 abstract 3
- PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 1-naphthaleneacetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CC=CC2=C1 PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract 2
- OVSKIKFHRZPJSS-UHFFFAOYSA-N 2,4-D Chemical compound OC(=O)COC1=CC=C(Cl)C=C1Cl OVSKIKFHRZPJSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 45
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 241001116498 Taxus baccata Species 0.000 description 8
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 235000009065 Taxus cuspidata Nutrition 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 5
- YWLXLRUDGLRYDR-ZHPRIASZSA-N 5beta,20-epoxy-1,7beta,10beta,13alpha-tetrahydroxy-9-oxotax-11-ene-2alpha,4alpha-diyl 4-acetate 2-benzoate Chemical compound O([C@H]1[C@H]2[C@@](C([C@H](O)C3=C(C)[C@@H](O)C[C@]1(O)C3(C)C)=O)(C)[C@@H](O)C[C@H]1OC[C@]12OC(=O)C)C(=O)C1=CC=CC=C1 YWLXLRUDGLRYDR-ZHPRIASZSA-N 0.000 description 4
- OVMSOCFBDVBLFW-VHLOTGQHSA-N 5beta,20-epoxy-1,7beta,13alpha-trihydroxy-9-oxotax-11-ene-2alpha,4alpha,10beta-triyl 4,10-diacetate 2-benzoate Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@H](O)C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 OVMSOCFBDVBLFW-VHLOTGQHSA-N 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O[Si](C)(C)C(C)(C)C)C1 QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 0.000 description 3
- 150000003797 alkaloid derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- TYLVGQKNNUHXIP-MHHARFCSSA-N 10-deacetyltaxol Chemical compound O([C@H]1[C@H]2[C@@](C([C@H](O)C3=C(C)[C@@H](OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=4C=CC=CC=4)C=4C=CC=CC=4)C[C@]1(O)C3(C)C)=O)(C)[C@@H](O)C[C@H]1OC[C@]12OC(=O)C)C(=O)C1=CC=CC=C1 TYLVGQKNNUHXIP-MHHARFCSSA-N 0.000 description 2
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- ZDZOTLJHXYCWBA-VCVYQWHSSA-N N-debenzoyl-N-(tert-butoxycarbonyl)-10-deacetyltaxol Chemical compound O([C@H]1[C@H]2[C@@](C([C@H](O)C3=C(C)[C@@H](OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C=4C=CC=CC=4)C[C@]1(O)C3(C)C)=O)(C)[C@@H](O)C[C@H]1OC[C@]12OC(=O)C)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZDZOTLJHXYCWBA-VCVYQWHSSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 2
- 229930014667 baccatin III Natural products 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 239000005648 plant growth regulator Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 2
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 229940063683 taxotere Drugs 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 2
- WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 1,2-Dichloroethane Chemical compound ClCCCl WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LIKMAJRDDDTEIG-UHFFFAOYSA-N 1-hexene Chemical compound CCCCC=C LIKMAJRDDDTEIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005971 1-naphthylacetic acid Substances 0.000 description 1
- TYLVGQKNNUHXIP-IDZUEFMLSA-N 10-Deacetyl-7-epi-taxol Natural products O=C(O[C@@H]1C(C)=C2[C@@H](O)C(=O)[C@@]3(C)[C@H](O)C[C@@H]4[C@@](OC(=O)C)([C@H]3[C@H](OC(=O)c3ccccc3)[C@](O)(C2(C)C)C1)CO4)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)c1ccccc1)c1ccccc1 TYLVGQKNNUHXIP-IDZUEFMLSA-N 0.000 description 1
- 229930182986 10-Deacetyltaxol Natural products 0.000 description 1
- IIDAJRNSZSFFCB-UHFFFAOYSA-N 4-amino-5-methoxy-2-methylbenzenesulfonamide Chemical compound COC1=CC(S(N)(=O)=O)=C(C)C=C1N IIDAJRNSZSFFCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TYLVGQKNNUHXIP-DIYBZAJCSA-N 7-epi 10-desacetyl paclitaxel Chemical compound O([C@H]1[C@H]2[C@@](C([C@H](O)C3=C(C)[C@@H](OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=4C=CC=CC=4)C=4C=CC=CC=4)C[C@]1(O)C3(C)C)=O)(C)[C@H](O)C[C@H]1OC[C@]12OC(=O)C)C(=O)C1=CC=CC=C1 TYLVGQKNNUHXIP-DIYBZAJCSA-N 0.000 description 1
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 241001345884 Cytospora abietis Species 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 239000005980 Gibberellic acid Substances 0.000 description 1
- 101000838579 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase TAO1 Proteins 0.000 description 1
- 101000838578 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase TAO2 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- OTCCIMWXFLJLIA-BYPYZUCNSA-N N-acetyl-L-aspartic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O OTCCIMWXFLJLIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 241001523629 Pestalotiopsis Species 0.000 description 1
- 101100536359 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) TAO3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100028948 Serine/threonine-protein kinase TAO1 Human genes 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241001136556 Talaromyces minioluteus Species 0.000 description 1
- 241000202349 Taxus brevifolia Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- YXEGKKOWBPNNEY-UHFFFAOYSA-N acetic acid;naphthalene Chemical compound CC(O)=O.C1=CC=CC2=CC=CC=C21 YXEGKKOWBPNNEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000002363 auxin Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- IXORZMNAPKEEDV-UHFFFAOYSA-N gibberellic acid GA3 Natural products OC(=O)C1C2(C3)CC(=C)C3(O)CCC2C2(C=CC3O)C1C3(C)C(=O)O2 IXORZMNAPKEEDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 239000003630 growth substance Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000010907 mechanical stirring Methods 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- WXMKPNITSTVMEF-UHFFFAOYSA-M sodium benzoate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 WXMKPNITSTVMEF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004299 sodium benzoate Substances 0.000 description 1
- 235000010234 sodium benzoate Nutrition 0.000 description 1
- 230000030118 somatic embryogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000013337 sub-cultivation Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- DKPFODGZWDEEBT-QFIAKTPHSA-N taxane Chemical class C([C@]1(C)CCC[C@@H](C)[C@H]1C1)C[C@H]2[C@H](C)CC[C@@H]1C2(C)C DKPFODGZWDEEBT-QFIAKTPHSA-N 0.000 description 1
- 150000004579 taxol derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/04—Plant cells or tissues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
- C12N5/0025—Culture media for plant cell or plant tissue culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Epoxy Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и предназначено для получения таксола в промышленном масштабе. Способ предусматривает использовать в качестве эксплантов вычлененные зиготные эмбрионы из семян Тисса вида Taxus cuspidata. Культивируют каллусную ткань до образования соматических эмбриоидов, затем до получения эмбриогенного каллуса. Последний пассируют в жидкую питательную среду и культивируют на среде Гамборга m B5, содержащей 2-4 ppm 2,4 D (2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты) для увеличения клеточной массы. После чего продолжают культивирование на среде Мурасиге и Скуга MS или Гамборга m B5, содержащих 1-2 ppm N AA (α- нафтилуксусной кислоты, стимулирующей выход целевого продукта. Выделение целевого продукта ведут экстракцией из соматических эмбрионов на стадии культивирования каллуса или из эмбриогенного каллуса на стадии культивирования дезинфицированных эмбрионов. Можно выделить целевой продукт из клеточной суспензионной массы и культуральной среды. Способ обеспечивает более высокий выход таксола и таксонов. 6 з.п.ф-лы, 4 ил, 3 табл.
Description
Область использования изобретения.
Изобретение относится к способу получения таксола и его производных из соматических эмбрионов и/или культуральной среды и в особенности касается способа культивирования зиготных эмбрионов или соматических эмбрионов для получения полиэмбрионов или эмбриогенного каллуса.
Известный уровень техники.
Таксол представляет собой алкалоид, выделенный из растений рода Taxus (тисс) и обладающий значительной противоопухолевой активностью по отношению к различным линиям клеток злокачественных опухолей, в том числе линии меланомных клеток B16. Известно, что в основном таксол содержится в коре растения Taxus brevifolia (тисс коротколистный) в количестве 0,02% на грамм сухого веса.
Несмотря на то, что был успешно осуществлен общий синтез таксола, этот процесс, по-видимому, не может быть использован для крупномасштабного коммерческого получения данного вещества из-за своей высокой стоимости. Кроме того, был успешно осуществлен частичный синтез таксол-подобного соединения (например, таксотера, taxotere) при использовании баккатина III или 10-деацетилбаккатина III. Однако эти достижения столкнулись с указанным выше ограничением.
Таким образом, таксол может быть получен только из редко встречающихся природных источников, например сырой древесины тиссового дерева. Поскольку содержание таксола в древесине тисса очень не велико, для получения 1 кг таксола необходимо срубить 2000-4000 деревьев, и производство таксола из природных источников в нужном объеме нанесет существенный урон лесным экосистемам. Соответственно, были предприняты попытки получения таксола и родственных ему соединений из клеток и тканевых культур растений рода Taxus species.
Например, в патенте США 5019504 описан способ получения таксола или таксол-подобных алкалоидов путем культивирования тканей коры, камбия, иголок и корней различных видов тисса в питательной среде для получения каллуса или суспензионных клеточных культур с последующим выделением таксола или таксол-подобных алкалоидов. Однако с помощью описанного метода можно получить только 1,0 - 3,0 мг таксола из 1 л культуральной среды, в которой выращивалась суспензия клеток. В указанном патенте отмечается, что из коры тиссового дерева можно непосредственным образом получить оптимальный выход таксола, а также производить данный алкалоид путем индукции недифференцированной клеточной массы (каллуса) и/или получения суспензионных клеточных культур из пролиферирующего каллуса и культивирования данных тканей.
До настоящего времени вышеуказанный метод, подразумевающий использование различных тканей тиссового дерева, не применяется в коммерческих целях из-за низкой таксолообразующей способности соответствующих клеток и непригодности различных этапов способа для крупномасштабного получения вторичных метаболитов.
В Заявке РСТ WO 92/013961 раскрывается способ получения таксола путем культивирования тканей различных видов тисса (Taxus) преимущественно женских гаметофитов, и выделения указанного алкалоида из каллуса или суспензионных клеточных культур, полученных на основе гаметофитов. Данный способ обеспечивает получение 0,05% таксола по сухому весу суспензионных клеточных культур.
Описанные способы не позволяют получать достаточное количество таксола в промышленном масштабе и до сих пор их пытаются усовершенствовать с целью повышения выхода таксола. Поэтому можно предположить, что существует необходимость в разработке улучшенного метода повышения содержания таксола в клетках и/или культуральной среде, а также отбора таксолообразующих клеточных линий с целью решения проблемы промышленного получения таксола в больших количествах.
В данных обстоятельствах авторы изобретения занимались разработкой способы получения таксола в промышленном масштабе и в первую очередь неожиданно обнаружили, что зиготные эмбрионы содержат гораздо больше таксола в пересчете на сухой вес по сравнению с другими тканями, как это сообщалось раннее.
Авторы изобретения провели дальнейшие исследования, направленные на разработку способа увеличения массы эмбрионов, поскольку их размеры сами по себе очень малы, чтобы эмбрионы можно было использовать для коммерческого получения таксола. В результате авторы неожиданно обнаружили, что масса эмбрионов увеличивается в несколько сотен тысяч раз по сравнению с первоначальной, при культивировании эмбрионов в питательной среде с целью индукции соматических эмбрионов или эмбриогенного каллуса.
В основе настоящего изобретения лежат вышеприведенные положения.
Сущность изобретения.
Таким образом, задача изобретения заключается в разработке способа получения таксола путем экстрагирования тканей растений рода Taxus, характеризующегося тем, что указанные ткани представляют собой зиготные эмбрионы.
Изобретение заключается в разработке способа получения таксола и таксанов, состоящего из следующих этапов:
(а) получения живых зиготных эмбрионов растений различных видов тисса (Taxus) и дезинфицирования их;
(б) культивирования указанных дезинфицированных эмбрионов в культуральной среде для получения каллуса из эмбрионов;
(в) культивирования каллуса, полученного, как указано в (б) для получения соматических эмбрионов из каллуса;
(г) культивирования дезинфицированных эмбрионов (а) или соматических эмбрионов, полученных как указано на стадии (в), для получения эмбриогенного каллуса;
(д) культивирования соматических эмбрионов (в) или эмбриогенного каллуса (г); и
(е) выделения таксола и таксанов из культуральной среды и клеточной суспензионной массы.
(а) получения живых зиготных эмбрионов растений различных видов тисса (Taxus) и дезинфицирования их;
(б) культивирования указанных дезинфицированных эмбрионов в культуральной среде для получения каллуса из эмбрионов;
(в) культивирования каллуса, полученного, как указано в (б) для получения соматических эмбрионов из каллуса;
(г) культивирования дезинфицированных эмбрионов (а) или соматических эмбрионов, полученных как указано на стадии (в), для получения эмбриогенного каллуса;
(д) культивирования соматических эмбрионов (в) или эмбриогенного каллуса (г); и
(е) выделения таксола и таксанов из культуральной среды и клеточной суспензионной массы.
Настоящее изобретение отличается от известных, указанных выше технических решений тем, что основано на открытии авторов, которое заключается в том, что зиготные эмбрионы содержат неожиданно большое количество таксола и дальнейшее увеличение массы эмбрионов происходит за счет индукции соматических эмбрионов или эмбриогенного каллуса. Соответственно, преимущество предложенного технического решения по сравнению с известными заключается в возможности его использования для получения таксола в промышленном масштабе путем культивирования соматических эмбрионов или эмбриогенного каллуса в жидкой питательной среде.
Другие воплощения настоящего изобретения могут быть легко осуществимы специалистами в данной области исследований на основе приведенного ниже описания.
На фиг. 1 (А) приведена храматограмма стандартных таксанов, полученная методом жидкостной хроматографии высокого разрешения (HPLC); на фиг.1(B) - HPLC- хроматограмма очищенной культуральной среды, полученной как описано в примере 7; на фиг.2 (А) - фотография злокачественных опухолевых клеток крысы без обработки экстрактом, полученным согласно примеру 7 (см. экспериментальный пример 1); на фиг 2(B) - фотография злокачественных опухолевых клеток крысы, обработанных экстрактом, полученным согласно примеру 7 (см.экспериментальный пример 1); на фиг.3(А) показана стандартная кривая, полученная методом ELISA; на фиг. 3(B) - кривая, полученная методом ELISA, как описано в экспериментальном примере 2; на фиг.4 приведена диаграмма, отражающая влияние различных сред, предназначенных для образования продукта, на выход таксола (см. пример 8).
Подробное описание изобретения.
Авторы изобретения анализировали содержание таксола в 24000 деревьев тисса остроконечного (Taxus cuspidata), произрастающих в национальном лесном массиве Кореи. Несмотря на то, что содержание таксола значительно варьировало от дерева к дереву, авторы обнаружили, что при использовании наиболее продуктивных деревьев в 100 г высушенных иголок и коры получают 2,0 мг и 4,5 мг таксола соответственно.
Таким образом, в первую очередь задача изобретения заключается в разработке способа получения таксола, причем таксол экстрагируют из эмбрионов растений различных видов тисса (Taxus). Использование деревьев тисса не ограничивается каким-либо определенным видом, и могут быть использованы все растения, принадлежащие к роду Taxus. Тем не менее преимущество отдается тиссу остроконечному (Taxus cuspidata).
Для экстракции таксола из эмбрионов в принципе может быть применен любой метод. Однако, в основном, экстракцию таксола из эмбрионов можно осуществить путем помещения лиофилизированного порошка эмбрионов в спирт, преимущественно метанол.
К сожалению, размеры зиготных эмбрионов очень невелики и эмбрионы содержат более 90% воды. Огромное количество эмбрионов необходимо для получения чрезвычайно малого количества таксола, и экстракция таксола непосредственно из эмбрионов нецелесообразна с экономической точки зрения.
Соответственно, авторы изобретения провели интенсивные исследования по разработке способа получения таксола в промышленном масштабе, решающего указанные выше проблемы, и в результате добились увеличения массы эмбрионов в сотни тысяч раз при использовании технологии культивирования тканей, в особенности посредством индукции соматических эмбрионов и эмбриогенного каллуса. Таким образом, вторая задача изобретения состоит в разработке способа получения таксола или его производных путем индукции соматических эмбрионов или эмбриогенного каллуса из зиготных эмбрионов растений различных видов тисса (Taxus), культивирования указанных соматических эмбрионов или эмбриогенного каллуса в жидкой питательной среде с помощью шейкера или биореактора и выделения таксола из культуральной среды и клеток.
Одним из отличительных признаков настоящего изобретения является увеличение массы эмбрионов в десятки и сотни тысяч раз путем индукции соматических эмбрионов или эмбриогенного каллуса, в то время как простой индукцией каллуса из различных тканей, за исключением эмбрионов, трудно добиться такого увеличения массы, возможно благодаря различной способности к делению меристемных клеток. Индукция эмбриогенного каллуса позволяет увеличить массу эмбрионов в сотни тысяч раз и таким образом является очень важным обстоятельством.
Индукция соматических эмбрионов или эмбриогенного каллуса из зиготных эмбрионов и получение таксола или его производных будет описано ниже.
Для асептического культивирования эмбрионов зрелые или незрелые семена различных видов тисса (Taxus), собранные в период времени с августа по ноябрь, следует дезинфицировать или поверхностно стерилизовать. Дезинфекция или поверхностная стерилизация семян может быть осуществлена известными методами. Например, семена помещают в 70%-ный этанол на 30-60 секунд, затем 2-3 раза промывают стерилизованной водой и поверхностно стерилизуют 1-3%-ным (по объему) раствором гипохлорита натрия в течение 24 ч. Поверхностно стерилизованные семена промывают более 5 раз стерилизованной водой и отделяют эмбрионы.
Эмбрионы могут быть использованы для экстракции таксола описанными выше методами.
Кроме того, эмбрионы помещают на твердую питательную среду для индукции каллуса. Индукцию соматических эмбрионов можно проводить с помощью методов преэмбриогенных детерминированных клеток(P E D C , от англ. Pre-Embryogenic Determined Cell) или индуцированных эмбриогенных детерминированных клеток (IEDC, от англ. Induced Embryogenic Determined Cell).
Индукция соматических эмбрионов методом PEDC осуществляется следующим образом.
Эмбрионы культивируют на твердой питательной среде с добавлением 1-нафтален-уксусной кислоты (NAA, от англ. naphtalene acetic acid), кинетина и 2,4-D для индукции каллуса. После этого небольшие кусочки каллуса размножают путем субкультивирования на питательной среде, содержащей необходимое количество макро- и микроэлементов и витаминов.
С целью индукции и размножения каллуса без ограничений могут быть использованы обычные для культивирования растительных тканей. Например, среды B5 (модифицированная среда Гамборга B5), Дурзан, MS (среда Мурашиге и Скуг), WPM (Ллоид и МакКоун), DKW (Драйвер-Волнат), GO (Грессхофф и Доу), SH (среда Шенка и Хилдебрандта) или LP (Куорин и Лепиовер).
Понятно, что могут иметь место различные модификации указанных питательных сред, например добавления или исключения каких-либо компонентов, а также изменения их количественного соотношения. Среди прочих других предпочтительно используются среды mB5 или Дурзан. На промежуточном этапе соматического эмбриогенеза для индукции может быть использована та же самая среда, что и для быстрого выращивания каллуса, или же среда, отличная от ростовой. Для получения наибольшего количества соматических эмбрионов преимущественно используется среда mB5.
Поскольку большинство перечисленных выше питательных сред коммерчески доступны и хорошо известны, их приобретение заинтересованными лицами не вызывает сложностей. Таким образом, любой специалист в данной области исследований может подобрать и/или оптимизировать подходящую культуральную среду для индукции и быстрого выращивания каллуса. Например, это может быть среда mB5, преимущественно используемая согласно настоящему изобретению, которая представляет собой модифицированную среду B5 Гамборга. Ее состав приведен в табл. 1.
Помимо этого, методика IEDC для получения соматических эмбрионов может осуществляться путем культивирования эмбрионов в описанной выше среде, в которую альтернативно добавлены различные гормоны роста растений.
В первоначальные культуры добавляют 2-4 ppm (фемтомоля -10-16 мол 2,4-D. Когда на поверхности эмбрионов формируется каллус и клеточная масса увеличивается в 10-20 раз, субкультивирование обычно продолжают в той же самой среде, содержащей половинную концентрацию ауксина.
Поскольку большая часть каллуса теряет ростовые свойства из-за выделения непролиферирующими клетками фенольных соединений, в питательную среду добавляют 0,5% (вес на объем) активированного угля или 1-2% (вес на объем) поливинилпирролидона. Каллус субкультивируют на среде, свободной от регулятора роста, в течение 2-4 месяцев для формирования соматических эмбрионов из меристемных тканей каллуса.
Сформированные таким образом соматические эмбрионы содержат большое количество таксола или его производных (далее таксанов) и могут быть непосредственно использованы для экстракции таксанов которую осуществляют известными методами, в особенности методом, описанным ниже.
Однако соматические эмбрионы преимущественно используются для индукции эмбриогенного каллуса с целью дальнейшего увеличения клеточной массы.
Согласно настоящему изобретению, относительно большое количество таксанов может быть получено путем экстракции эмбриогенного каллуса, так же как и соматических эмбрионов. Эмбриогенный каллус может быть получен при культивировании соматических эмбрионов, полученных методом PEDC или IEDC, как описано выше, или при культивировании зиготных эмбрионов. Методика получения эмбриогенного каллуса заключается в следующем. Дезинфицированные эмбрионы или соматические эмбрионы культивируют в течение 2-4 месяцев на твердой питательной среде, пригодной для индукции каллуса, в которую добавляют 1,0-4,0 ppm NAA и 0,5-2,0 ppm кинетина, предпочтительно 2,0 ppm NAA и 1,0 ppm кинетина. Вместо NAA и кинетина в среду может быть добавлено 1,4 ppm 2,4-D. Индуцированный каллус затем культивируют на той же самой среде с добавлением 1-5 ppm цитокина, например бензиламинопурина, кинетина или зеатина, в течение 1-2 месяцев для формирования эмбриоидов на поверхности каллуса. Далее эмбриоиды культивируют на той же самой питательной среде с 2-10 ppm 2,4-D при t около 26oC в течение 2-3 месяцев в условиях светового режима 16 ч света/8 ч темноты. Указанная процедура позволяет получить эмбриогенный каллус в чрезвычайно большом количестве, которое в сотни тысяч раз превышает первоначальную массу эмбрионов. Эмбриогенный каллус имеет разнообразную окраску, например от желтой и коричневой до зеленой.
Для индукции и пролиферации эмбриогенного каллуса могут быть использованы различные тканевые культуры и соответствующие определенным растительным клеткам питательные среды.
Полученный, как описано выше, эмбриогенный каллус содержит большое количество таксола и может быть непосредственно использован для экстракции таксола и таксанов.
Экстракцию эмбриогенного каллуса осуществляют известными методами, предпочтительно методом, описанным ниже.
С целью увеличения массы эмбриогенного каллуса в процессе промышленного производства, эмбриогенный каллус асептически нарезают для получения отдельных клеток или небольших клеточных агрегатов. Чтобы получить суспензионные культуры, 10% /по объему/ указанных клеток вносят в 250-мл конические флаконы, содержащие 50 мл жидкой питательной среды с добавлением 2 ppm 2,4-D. Для длительного культивирования преимущественно используют биореакторы с воздушным или механическим перемешиванием.
Культивирование в биореакторах осуществляют при использовании двух различных культуральных сред: одной для роста клеток (ростовая среда) и другой - для получения таксанов (среда для получения продукта). В качестве ростовой среды преимущественно используют среду mB5 с добавлением 2-4 ppm 2,4-D, а в качестве среды для получения продукта - MS с добавлением 2-10 ppm NAA.
Следует отметить, что среда для получения продукта предпочтительно содержит стимуляторы для увеличения выхода таксола, которые могут быть получены из грибов, а также представлять собой экстракт женских гаметофитов (1,5 мл/л), фенилаланин (50-300 мМ) и GA3 (0,5-1,0 ppm). Примерами грибов, из которых получают стимуляторы, служат Cytospora аbietis ATCC N 38688 и Penicillium minioluteum (Dierckx) NRRL 18467. Клетки грибов растирают в порошок и последовательно экстрагируют для получения экстракта. Кроме того, предпочтительно использование экстракта из культивируемых грибов рода Pestalotiopsis, который добавляют в питательную среду в количестве 0,5-1,0 мл/л.
Таксол обнаруживается в самих клетках и, кроме того, секретируется в культуральную среду. Соответственно, после завершения этапа культивирования в жидкой питательной среде таксол и таксаны выделяют из культур или среды с помощью хорошо известных методик. Отделение клеток от культуральной среды осуществляют путем центрифугирования (например, при 1000 g в течение 5-10 мин) или декантирования. В последнем случае культуры оставляют на 24 ч для осаждения клеток и сливают культуральную среду. Остатки среды отсасывают пастеровской пипеткой с помощью вакуумного насоса.
Таксаны получают из соматических эмбрионов или эмбриогенного каллуса, а также из культуральной среды путем экстракции с помощью спирта или смеси метанола и метиленхлорида в соотношении 1:1. Осадок клеток, образовавшийся в результате центрифугирования, может быть разрушен ультразвуком (Branson 250) и использован для экстракции. Согласно настоящему изобретению могут быть получены как таксол, так и различные производные таксола. К последним относятся 10-деацетилбаккатин III, баккатин III, 10-деацетил таксол, цефанолманнин и 7-эпи-10-деацетил таксол /см. фиг. 1(B)/. Производные таксола могут быть использованы как сами по себе, так и в качестве исходных компонентов для синтеза таксола, если это необходимо.
Свойства таксанов, выделенных из соматических эмбрионов и эмбриогенного каллуса, полученных путем индукции при культивировании зиготных эмбрионов, исследуют с помощью HPLC, теста цитотоксичности и твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) при использовании таксола и шести его производных, которые являются стандартами NCI.
Настоящее изобретение более подробно описано в нижеследующих примерах, но не ограничивается ими.
Пример 1. Получение таксола из зиготных эмбрионов различных видов тисса (Taxus).
Собирают семена с лучших деревьев Taxus cuspidata. Эмбрионы высушивают в ваккумной печи при температуре около 40oC в течение трех дней, чтобы содержание воды составляло менее 10%, и взвешивают. Затем эмбрионы замораживают в жидком азоте и растирают в порошок, который помещают в инкубатор, содержащий в 100 раз большее количество метанола /по весу/, и выдерживают при температуре около 28oC в течение 7 дней. Полученный экстракт пропускают через мембранный фильтр с размерами пор 0,2 мкм и анализируют на содержание таксола с помощью HPLC.
С тех же самых деревьев собирают иголки и кору, полученный материал обрабатывают и анализируют на содержание таксола согласно описанной выше методике.
Полученные результаты приведены в табл. 2.
Пример 2. соматические эмбрионы получают из эмбрионов с помощью методики PEDC.
Семена Taxus cuspidata поверхностно стерилизуют, помещая их в 700-ный этанол и 2%-ный гипохлорит натрия на 50 с и 24 ч соответственно и затем 3-5 раз отмывая дистиллированной водой.
В качестве культуральной среды используют среду mB5 /состав и соотношение компонентов приведены в табл. 1/ с добавлением 2,0 ppm NAA, 0,5 ppm кинетина и 0,5 ppm 2,4-D. In vitro культуры выращивают в специальной комнате при to 26oC в течение 8 недель.
За это время эмбрионы увеличиваются в размерах, и на поверхности большинства из них индуцируется каллус. Зеленые кусочки каллуса вырезают и культивируют в среде mB5 без добавления каких-либо регуляторов роста растений в течение 3 месяцев для индукции соматических эмбрионов.
Пример 3. Соматические эмбрионы получают из зиготных эмбрионов с помощью методики IEDC.
Семена Taxus cuspidata стерилизуют согласно методике, описанной в примере 2, и выделяют из них эмбрионы, которые затем культивируют в среде Дурзан с добавлением 2 ppm 2,4-D при 23-28oC в течение 2 недель. Через 2 недели культивирования все эмбрионы полностью покрываются индуцированным из них каллусом. Через 4 недели масса каллуса увеличивается в несколько десятков раз по сравнению с первоначальной.
Чтобы избежать ингибирования роста каллуса и гибели клеток под воздействием секретируемого ими фенола, проводят пересев каллуса при использовании той же самой ростовой среды, но в которую добавлено около 1% поливинилпирролидона. После 8 недель культивирования, когда средний диаметр каллусной массы достигает 1-1,5 см, каллус помещают в среду mB5, не содержащую регуляторов роста растений, в которой каллус подращивают с целью индукции соматических эмбрионов. В некоторых из них наблюдается индукция корней.
Пример 4. Для индукции эмбриогенного каллуса в качестве исходного материала используют стерилизованные зиготные эмбрионы (пример 2) и соматические эмбрионы (примеры 3, 4).
Указанные выше эмбрионы культивируют при 23-28oC около 2,5 месяцев в среде mB5 с добавлением 2,0 ppm NAA и 1,0 ppm кинетина для индукции каллуса. После завершения индукции каллуса проводят субкультивирование каллуса примерно в течение 6 недель в этой питательной среде с добавлением 3 ppm зеатина и получают желтовато-зеленые эмбриоиды.
Эмбриоиды культивируют в указанной питательной среде, содержащей 3 ppm 2,4-D при 26oC около 2 месяцев при световом режиме 16/8 ч (свет/темнота) для образования эмбриогенного каллуса, масса которого в сотни тысяч раз превышает первоначальную массу эмбрионов. Эмбриогенный каллус по морфологии отличается от обычного каллуса, полученного из различных тканей тисса, и иногда выглядит как зиготные эмбрионы.
Однако поверхность эмбриогенного каллуса состоит из разнообразных по цвету участков: красных, желтых, темно-зеленых, светло-коричневых, темно-зеленых и черных. Клеточную массу каждого цвета разрезают лезвием для получения небольших клеточных агрегатов, которые затем субкультивируют в жидкой среде в течение 2-4 недель. После удаления крупных скоплений клеток из указанных культур отдельные клетки и/или небольшие клеточные агрегаты вносят в пластмассовые чашки Петри, содержащие 20 мл культуральной среды. Через 4 недели жидкостного культивирования отбирают различным образом окрашенные клетки. Такая визуальная селекция для получения клеточных линий, имеющих различную цветовую окраску, является обычной процедурой в данной области исследований.
Пример 5. Соматические эмбрионы, полученные, как описано в примерах 2 и 3 или эмбриогенный каллус, полученный как описано в примере 4, высушивают при 25oC и растворяют в 1 мкл метиленхлорида. Добавляют 1 мкл дистиллированной воды, перемешивают в течение 10 с и затем центрифугируют при 25000 g. Осадок высушивают при 25oC, растворяют в 50 мкл метанола и пропускают раствор через фильтр с размером пор 0,2 мкм для получения экстракта.
Экстракты анализируют методом HPLC при использовании обратно-фазовой микропористой колонки в сравнении с контрольной кривой (коэффициент корреляции 0,999), построенной с помощью известных стандартных препаратов. Результаты HPLC показывают, что пик стандартных таксанов и тех, которые содержатся в опытных экстрактах (см. выше), выявляется при одном и том же времени задержки (14,3 мин).
Пример 6. Соматические эмбрионы (примеры 2 и 3) и эмбриогенный каллус (пример 4) экстрагируют для получения таксанов, как описано ниже.
Каждые 0,5 г соматических эмбрионов (пример 2 и 3) и эмбриогенного каллуса (пример 4) помещают в центрифужную пробирку и добавляют 2 мкл гексена. Смесь хорошо перемешивают с помощью стеклянной палочки, хранят при -20oC в течение 12 ч и центрифугируют при 25oC и 25000 g 20 мин.
К преципитатам добавляют смесь метанола и этиленхлорида и обрабатывают ультразвуком в соникаторе Branson 250.
Полученный раствор центрифугируют при 25000 g и преципитаты высушивают при 60oC до полной потери влажности с целью получения экстрактов.
Экстракты анализируют на содержание таксола и получают следующие результаты: экстракт соматических эмбрионов (пример 2) содержит 0,21-0,27 мг таксола на 1 г сухих клеток (общее содержание таксола составляет 0,5-1,2 мг), экстракт соматических эмбрионов по примеру 3 содержит 0,20-0,27 мг таксола на 1 г сухих клеток (общее содержание таксола - 0,55-1,1 мг) и экстракт эмбриогенного каллуса (пример 4) содержит 0,23-0,28 мг таксола на 1 г сухого веса (общее содержание таксола - 0,6-1,4 мг).
Пример 7. Для получения большой массы эмбриогенного каллуса, полученного, как описано в примере 4, его культивируют в биореакторе с лопастным перемешиванием.
Эмбриогенный каллус, полученный согласно примеру 4, вносят в количестве до 10% (по объему) в 250-мл колбу Эрленмейера, содержащую 50 мл жидкой среды mB5 с добавлением 2 ppm 2,4-D. После 18 дней культивирования при 25-28oC в стерильных условиях устанавливается стационарная фаза. Культуры помещают в пятилитровый биореактор с лопастным перемешиванием, содержащий среду MS с добавлением 2 ppm NAA (среда для получения продукта). Культивирование проводят при 25-28oC в течение 30 дней в аэробных условиях. По истечении этого срока культуральную суспензию оставляют на 24 ч для осаждения клеток и отделяют клетки от культуральной среды. Для наиболее полного удаления среды используют пастеровскую пипетку.
Полученные клетки и культуральную среду подвергают экстракции для выделения таксола и его производных, как описано в примере 5.
Результаты HPLC показывают, что пики стандартного препарата таксола и его производных /фиг 1(А)/, а также таксола и его производных, полученных в результате экстракции /фиг.1 (А)/, выявляются при одном и том же времени задержки, что свидетельствует об идентичности известных и полученных путем экстракции веществ.
Установлено, что содержание таксола составляет 0,09 мг на 1 г высушенных клеток, в то время как в культуральной среде выявляется около 8 мг таксола на 1 л среды.
Пример 8. Для определения зависимости выхода таксола от типа культуральной среды, культуры, полученные как описано в примере 7, помещают в различные питательные среды, такие как MS, mB5, WPM, OKW, Дурзан, Уайт, LP, GO, B5, DCR или SH. Во все исследуемые среды добавляют 2ppm NAA и в сбалансированных количествах факторы микроокружения. Время культивирования составляют около 20 дней.
Результаты исследований приведены на фиг.4. Как видно из представленной диаграммы, образование таксола существенно зависит от типа культуральной среды, и наибольшей выход таксола наблюдается при использовании сред MS и mB5.
Пример 9. С целью выхода увеличения таксола и таксанов в среду для получения продукта могут быть добавлены различные стимуляторы. Влияние стимуляторов на образование таксола оценивают следующим образом.
(1) Согласно настоящему изобретению, в среду для получения продукта в качестве стимулятора образования таксола добавляют экстракт гриба Pestalotiopsis sp., который встречается на различных видах тисса.
Ткани растений, например семена или внутренний слой коры, помещают в 70%-ный этанол, поверхностно стерилизуют с помощью 15%-ного H2O2 в течение 15 мин и затем опять помещают в 70%-ный этанол. После этого ткани четыре или более раз отмывают стерильной дистиллированной водой для удаления химических веществ. Таким образом поверхностно-стерилизованные ткани помещают на следующие среды: агаровую среду с солодовым экстрактом (20,0 г солодового экстракта, 5,0 г пептона и 1 л дистиллированной воды), ростовую агаровую среду (40 г глюкозы, 10 г бактосоутона, 1 г ацетата натрия, 50 мг бензоата натрия, 20,0 г агара и 1 л дистиллированной воды) и водную среду (20,0 г агара на 1 л дистиллированной воды). Культуры помещают в термостат, контролирующий рост клеток, при использовании светового режима 12 ч темноты/12 ч дня.
После того как в течение трех дней обнаруживается рост грибов Pestalotiopsis sp., их далее культивируют на солодовом экстракте и ростовой агаровой среде (3 г дрожжевого экстракта, 5 г бактосоутона, 0,5 Mg SO4, 5 г глюкозы и 10 г/л сахарозы) в течение 4 дней. В определенное время культуральную среду центрифугируют для отделения клеток. Клетки высушивают, размельчают в порошок и экстрагируют метанолом для получения углеводной фракции.
Полученный, как описано выше, углеводный экстракт Pestalotiopsis sp. добавляют к среде для получения продукта в количестве 1 ppm и осуществляют культивирование и анализ полученных результатов, согласно примеру 7. Результаты исследований приведены в табл. 3.
(2) Процедуру, описанную в примере 7, повторяют, за тем исключением, что в качестве стимуляторов в среду для получения продукта добавляют экстракт женских гаметофитов (2 мл/л, (фенилаланин (100 мМ) или гиббереллиновую кислоту. Результаты исследований приведены в табл. 3.
Экспериментальный пример 1. Биологические свойства таксола, полученного с помощью эмбриональных культур тиссового дерева, исследуют в цитотоксическом тесте при использовании раковых клеток крысы.
Указанная методика обычно основывается на том, что таксол способен вызывать гибель отдельных раковых клеток на стадии метафазы клеточного деления. Раковые клетки крысы, полученные из Центрального исследовательского центра Пасифик Корпорейшн в г. Сигнале, Куонгги-до, Корея, помещают в пластиковые флаконы, содержащие среду для культивирования животных клеток. На ранней стадии культивирования, когда наступает деление клеток, в одну партию флаконов добавляют каплю экстракта, полученного, как описано в примере 7, в то время как в другие флаконы экстракта не добавляют (контроль). Затем исследуют процесс клеточного деления и жизнеспособность раковых клеток. Результаты исследований приведены на фиг. 2(A) и 2(B).
Как видно из фиг. 2(A) и 2(B), в контрольных флаконах выявляется эффективный рост раковых клеток фиг. 2(A)), в то время как во флаконах, содержащих опытный экстракт, наблюдается гибель раковых клеток (фиг. 2(B), которая начинается через 3 ч после добавления экстракта и полностью завершается в течение последующих 24 ч.
Экспериментальный пример 2. Идентификацию таксанов, полученных из эмбриональных культур тиссового дерева, осуществляют с помощью твердофазного иммуноферментного метода (ELISA) при использовании моноклональных антител, как описано ниже.
Набор антител TAO1, специфичных к таксолу, и набор антител TAO3, специфичных к таксанам, купленные у Биотехнологической группы в Гавайях, применяют следующим образом. Антигенные препараты таксола и таксанов разводят в 100 раз фосфатным буферным раствором (PBS) и по 100 мкл раствора вносят в лунки планшета для постановки ELISA. После инкубирования в течение 1 ч при 25oC планшет отмывают раствором TBS-T (отмывающий раствор) по крайней мере 4 раза и добавляют в лунки 50 мкл PBST (фосфатный буферный раствор с твином). Готовят последовательные трехкратные разведения стандартных препаратов таксола, таксанов и экстрактов, полученных согласно примеру 7, и добавляют в соответствующие лунки. Антитела к таксолу и таксанам разводят PBST в 100 и 1000 раз соответственно, и по 50 мкл каждого разведения вносят в лунки. После инкубирования при 25oC в течение 1 ч планшет отмывают с помощью TBS-T четыре раза. 100 мкл пероксидазы хрена разводят PBST в 2000 раз и вносят в лунки, планшет инкубируют при 25oC в течение 1 ч и затем отмывают TBS-T 4 раза. Далее в лунки добавляют 200 мкл OPD ( 
-фенилендиамина) и планшет инкубируют при 25oC в течение 1 ч до развития окраски. С помощью автоматического считывающего устройства измеряют поглощение при 490 нм. Результаты исследований приведены на фиг. 3(A) для стандартного препарата таксола и на фиг. 3(B) - для культуральной среды, полученной согласно примеру 7. Приведенные данные свидетельствуют о том, что в эмбриональных культурах различных видов тисса (Taxus) обнаруживается активность таксола. Очевидно, что приведенное выше детальное описание изобретения лишь иллюстрирует его, и могут иметь место другие модификации и варианты изобретения, не выходящие за его пределы и не меняющие его сущность.
Claims (7)
1. Способ получения таксола и таксанов из эмбриональных культур растений Taxus, включающий вычленение экспланта, его дезинфицирование и культивирование на твердой питательной среде до индукции каллуса, пересадку каллуса в жидкую питательную среду для последующего получения клеточной суспензионной культуры, выделение целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве экспланта вычленяют зиготные эмбрионы из семян, каллусную ткань культивируют до образования соматических эмбриоидов, после чего культивируют до получения эмбриогенного каллуса, который пассируют в жидкую питательную среду и культивируют вначале на питательной среде до увеличения клеточной массы, а затем на среде, стимулирующей выход целевого продукта, при этом выделение целевого продукта осуществляют из соматических эмбрионов на стадии культивирования каллуса или из эмбриогенного каллуса на стадии культивирования дезинфицированных эмбрионов или из клеточной суспензионной массы и культуральной среды.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что индуцирование соматических эмбрионов осуществляют по методике PEDC-преэмбриогенных детерминированных клеток или IEDC-индуцированных эмбриогенных детерминированных клеток.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, среда для увеличения клеточной массы представляет собой модифицированную среду Гамборга mB5, содержащую 2-4 ppm 2,4 D, а среда для стимуляции выхода целевого продукта представляет собой среду Мурасиге и Скуга MS или Гамборга mB5, содержащие 1-2 ppmNAA.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что среда для стимуляции выхода целевого продукта содержит в качестве стимулятора углеводную фракцию, полученную экстракцией грибов, растущих на различных видах Тисса, или экстракт женских гаметофитов различных видов Тисса или фенилаланин или гибберелин.
5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что в качестве стимулятора используют экстракт грибов рода Pestalotiopsis sp.
6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что культивирование зиготных и соматических эмбрионов для получения каллусной ткани осуществляют на твердой питательной среде, содержащей 1,0-4,0 ppm NAA и 0,5-2,0 ppm кинетина, а культивирование полученной каллусной ткани осуществляют на той же среде, содержащей 1-5 ppm цитокинина, бензиламинопурина, или N-изопентениламинопурина, или кинетина, или зеатина, до формирования эмбриоидов, которые культивируют на той же среде, содержащей 2-10 ppm 2,4D до образования эмбриогенного каллуса.
7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что экспланты вычленяют от Тисса вида Taxus cuspidata.
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR930012641 | 1993-07-06 | ||
| KR1993-12641 | 1993-07-06 | ||
| KR12641/93 | 1993-07-06 | ||
| KR1994-13914 | 1994-06-20 | ||
| KR13914/94 | 1994-06-20 | ||
| KR1019940013914A KR950005081B1 (ko) | 1993-07-06 | 1994-06-20 | 주목 종자의 씨눈 유래의 체세포배 및 체세포배성세포 혹은 그 배양배지로부터 택솔(Taxol) 및 그 유도체를 생산하는 방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU95109640A RU95109640A (ru) | 1997-06-10 |
| RU2120740C1 true RU2120740C1 (ru) | 1998-10-27 |
Family
ID=26629770
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU95109640A RU2120740C1 (ru) | 1993-07-06 | 1994-07-06 | Способ получения таксола и таксанов из эмбриональных культур растений рода taxus |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0662144A1 (ru) |
| JP (1) | JP2795542B2 (ru) |
| KR (1) | KR950005081B1 (ru) |
| CN (1) | CN1047795C (ru) |
| AU (1) | AU675147B2 (ru) |
| CA (1) | CA2143455C (ru) |
| RU (1) | RU2120740C1 (ru) |
| WO (1) | WO1995002063A1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2380894C2 (ru) * | 2008-03-26 | 2010-02-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Инновационная биологическая компания" | СПОСОБ СТЕРИЛИЗАЦИИ ЭКСПЛАНТОВ ЛИШАЙНИКА ИСЛАНДСКИЙ МОХ (Cetraria islandica (L.) ACH.) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7264951B1 (en) | 1992-02-20 | 2007-09-04 | Phyton, Inc. | Enhanced production of taxol and taxanes by cell cultures of Taxus species |
| KR20140062179A (ko) | 1996-05-24 | 2014-05-22 | 디에프비 바이오테크 인코포레이티드 | 탁수스종의 세포 배양에 의한 탁산의 생산 증진 방법 |
| CN1055120C (zh) * | 1996-11-27 | 2000-08-02 | 天津大学 | 提高红豆杉细胞中紫杉醇含量与释放的方法 |
| KR100287465B1 (ko) * | 1997-06-25 | 2001-05-02 | 나까니시 히로유끼 | 탁산형 디테르펜의 제조방법 |
| KR100432426B1 (ko) * | 2001-07-11 | 2004-05-22 | 엔프라니 주식회사 | 주목 씨앗 추출물의 제조방법, 주목 씨앗 오일의제조방법, 및 이들을 함유하는 화장료 조성물 |
| KR20030066162A (ko) * | 2002-02-04 | 2003-08-09 | (주)하나이피에스 | Dha가 함유된 참치포 |
| AU2008202078B2 (en) * | 2007-10-10 | 2012-05-31 | Wellkey Holdings Limited | Stability of secondary metabolite mass production through synchronized plant cell cultures |
| KR20100127727A (ko) * | 2009-05-26 | 2010-12-06 | 주식회사 운화 | 버드나무과의 형성층 유래 식물줄기세포 및 이의 분리배양방법 |
| RU2011152866A (ru) * | 2009-05-26 | 2013-07-10 | Юнхва Корпорейшн | Растительная стволовая клетка, происходящая из камбия семейства asteraceae, способ ее выделения и культивирования |
| EP2436759A2 (en) * | 2009-05-28 | 2012-04-04 | Unhwa Corporation | Plant stem cell derived from cambium of family solanaceae, and method for isolating and culturing same |
| JP2012217441A (ja) * | 2011-04-14 | 2012-11-12 | Housetec Inc | タキサン類の生産方法、およびカルス誘導方法 |
| CN103923873A (zh) * | 2014-03-18 | 2014-07-16 | 上海交通大学 | 利用硅胶吸附醌类物质降低植物细胞褐化风险的方法 |
| KR20180080487A (ko) * | 2017-01-04 | 2018-07-12 | 대한민국(산림청 국립산림과학원장) | 갈변 억제제 또는 폴리아민 처리에 의한 일본잎갈나무의 배발생 조직 생장 증진방법 |
| CN114788496B (zh) * | 2022-04-07 | 2023-07-21 | 江苏省中国科学院植物研究所 | 一种固液交替培养诱导落羽杉高效体胚发生的方法 |
| KR102519385B1 (ko) * | 2022-10-07 | 2023-04-06 | 유성근 | 가리비 외투막을 이용한 조미건포의 제조방법 |
| CN116425767A (zh) * | 2023-04-18 | 2023-07-14 | 西南医科大学 | 一种海洋真菌来源的甾体衍生物及其制备方法和应用 |
| CN118236411A (zh) * | 2024-03-26 | 2024-06-25 | 重庆紫杉生物工程有限公司 | 一种红豆杉籽提取物及其制备方法和应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992013961A1 (en) * | 1991-02-12 | 1992-08-20 | Nippon Steel Corporation | Process for producing taxol by cell culture of taxus species |
| WO1993019585A1 (en) * | 1992-04-01 | 1993-10-14 | Union Camp Corporation | Induction of somatic embryogenesis in taxus, and the production of taxane-ring containing alkaloids therefrom |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5019504A (en) * | 1989-03-23 | 1991-05-28 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Production of taxol or taxol-like compounds in cell culture |
| US5344775A (en) * | 1991-11-15 | 1994-09-06 | Escagenetics Corporation | Synthesis of taxanes in culture using pseudocalluscells |
| US5407816A (en) * | 1992-02-20 | 1995-04-18 | Phyton Catalytic, Inc. | Enhanced production of taxol and taxanes by cell cultures of taxus species |
| US5322779A (en) * | 1992-04-16 | 1994-06-21 | The Research And Development Institute, Inc. At Montana State University | Taxol production by taxomyces andreanae |
| AU4242993A (en) * | 1992-05-21 | 1993-12-13 | Penn State Research Foundation, The | Cultured (taxus) tissues as a source of taxol, related taxanes and other novel anti-tumor/anti-viral compounds |
-
1994
- 1994-06-20 KR KR1019940013914A patent/KR950005081B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1994-07-06 WO PCT/KR1994/000088 patent/WO1995002063A1/en not_active Ceased
- 1994-07-06 CN CN94190464A patent/CN1047795C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1994-07-06 JP JP7503966A patent/JP2795542B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1994-07-06 EP EP94919904A patent/EP0662144A1/en not_active Withdrawn
- 1994-07-06 RU RU95109640A patent/RU2120740C1/ru active
- 1994-07-06 AU AU70859/94A patent/AU675147B2/en not_active Ceased
- 1994-07-06 CA CA002143455A patent/CA2143455C/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992013961A1 (en) * | 1991-02-12 | 1992-08-20 | Nippon Steel Corporation | Process for producing taxol by cell culture of taxus species |
| WO1993019585A1 (en) * | 1992-04-01 | 1993-10-14 | Union Camp Corporation | Induction of somatic embryogenesis in taxus, and the production of taxane-ring containing alkaloids therefrom |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2380894C2 (ru) * | 2008-03-26 | 2010-02-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Инновационная биологическая компания" | СПОСОБ СТЕРИЛИЗАЦИИ ЭКСПЛАНТОВ ЛИШАЙНИКА ИСЛАНДСКИЙ МОХ (Cetraria islandica (L.) ACH.) |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2795542B2 (ja) | 1998-09-10 |
| CN1111911A (zh) | 1995-11-15 |
| KR950005081B1 (ko) | 1995-05-18 |
| WO1995002063A1 (en) | 1995-01-19 |
| CA2143455A1 (en) | 1995-01-19 |
| JPH08503618A (ja) | 1996-04-23 |
| CN1047795C (zh) | 1999-12-29 |
| CA2143455C (en) | 1999-09-07 |
| RU95109640A (ru) | 1997-06-10 |
| EP0662144A1 (en) | 1995-07-12 |
| AU675147B2 (en) | 1997-01-23 |
| AU7085994A (en) | 1995-02-06 |
| KR950002782A (ko) | 1995-02-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2120740C1 (ru) | Способ получения таксола и таксанов из эмбриональных культур растений рода taxus | |
| Gibson et al. | Initiation and growth of cell lines of Taxus brevifolia (Pacific yew) | |
| Shohael et al. | Application of bioreactor system for large-scale production of Eleutherococcus sessiliflorus somatic embryos in an air-lift bioreactor and production of eleutherosides | |
| JPH08500973A (ja) | タキソール、関連タキサン及び他の新規な抗癌／抗ウイルス性化合物原料としてのイチイ培養組織 | |
| Gibson et al. | Potential of plant cell culture for taxane production | |
| JPH07508163A (ja) | イチイ属の体細胞胚形成の誘導及びそれからのタキサン環含有アルカロイドの生産 | |
| US5547866A (en) | Taxane production in haploid-derived cell cultures | |
| Zhiri et al. | Factors affecting the in vitro rapid germination of Taxus embryos and the evaluation of taxol content in the plantlets | |
| Cheng et al. | Somatic embryogenesis and triterpenoid saponin production in Aralia elata (Miq.) Seem | |
| US6365407B1 (en) | Culture medium composition useful for induction and proliferation of Taxus calli | |
| US5057424A (en) | Flavor composition and method | |
| EP0568821A1 (en) | Callus cell induction and the preparation of taxanes | |
| RU2360964C1 (ru) | КУЛЬТУРА КОРНЯ Hed.th. (Hedysarum theinum Krasnob.) - ПРОДУЦЕНТ ИЗОФЛАВОНОВ | |
| CN103146638B (zh) | 一种珊瑚菜毛状根的诱导增殖方法 | |
| KR101467661B1 (ko) | 생리활성물질의 함량이 증가된 섬오갈피 부정근의 배양방법 | |
| JPH0822225B2 (ja) | メグスリノキカルスの生産方法 | |
| RU2605912C1 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КУЛЬТУРЫ ИЗОЛИРОВАННЫХ КОРНЕЙ Silene linicola К1601 - ПРОДУЦЕНТА ЭКДИСТЕРОИДОВ | |
| EA020503B1 (ru) | Штамм культуры корня шлемника андрахновидного (scutellaria andrachnoides vved.) scut. andr. (hrc) - продуцент вогонозида и актеозида | |
| Ewald et al. | Formation of embryo-like structures in tissue cultures of different yew species | |
| US12022786B2 (en) | Method of isolating secondary metabolites from cambium derived callus cultures | |
| RU2771960C1 (ru) | Способ введения в культуру in vitro, получения каллусов и растений-регенерантов вздутоплодника сибирского (phlojodicarpus sibiricus (steph.) к.-pol.), с использованием в качестве первичных эксплантов вегетативных и генеративных органов | |
| SU1639534A1 (ru) | Способ размножени вишни IN VIтRо | |
| SU1704715A1 (ru) | Способ размножени гречихи IN VIтRо | |
| Hiraoka et al. | Micropropagation of Corydalis ambigua through embryogenesis of tuber sections and chemical evaluation of the ramets | |
| Yogananth et al. | Indirect Organogenesis from Stem Derived Callus of Dregea Volubilis (LF) Benth |