RU2023121263A

RU2023121263A - Вектор на основе рнк-содержащего аденоассоциированного вируса (raav) и пути его применения

Info

Publication number: RU2023121263A
Application number: RU2023121263A
Authority: RU
Inventors: Линью ШИ; Вейя БАЙ
Original assignee: Хуидагене Терапьютикс (Сингапур) Пти. Лтд.
Priority date: 2021-02-07
Filing date: 2022-02-07
Publication date: 2023-10-03

Claims

1. Рибонуклеотидная (РНК) последовательность, способная к упаковке в вирусную частицу ДНК-содержащего вируса, при этом указанная последовательность РНК содержит:

(1) представляющую интерес последовательность РНК (RSI), например, последовательность РНК, кодирующую представляющий интерес ген (GOI), РНК, кодирующую белок (например, терапевтический белок, антигенный белок или белок для редактирования гена, такой как эффекторный фермент CRISPR/Cas ("белок Cas" для краткости), белок ZFN, белок TALEN), такую как mRNA, или некодирующую функциональную РНК (такую как транспортная РНК (tRNA), рибосомальная РНК (rRNA), малая интерферирующая РНК (siRNA), короткая шпилечная РНК (shRNA), антисмысловая РНК, антисмысловой олигонуклеотид, микро-РНК (miRNA) или РНК-компонент системы CRISPR-Cas (например, Cas9, Cas12, Cas13), включая направляющую РНК (или gRNA), такую как одиночная направляющая РНК (или sgRNA, химерная РНК, РНК-химера), РНК CRISPR (crRNA) и tracrRNA) или ее предшественник, и

(2) сигнал упаковки РНК (RPS), способный взаимодействовать, например, связываться, непосредственно или опосредованно, со взаимодействующей с РPS молекулой, что облегчает упаковку последовательности РНК в вирусную частицу ДНК-содержащего вируса;

при этом необязательно последовательность ДНК, кодирующая указанную последовательность РНК или соответствующая ей, или последовательность, обратно комплементарная указанной последовательности ДНК, характеризуется сниженной, уменьшенной способностью или по сути не характеризуется способностью к упаковке в вирусную частицу ДНК-содержащего вируса (например, последовательность ДНК или обратно комплементарная ей последовательность не содержит сигнала упаковки ДНК, такого как функциональный ITR AAV для упаковки AAV).

2. Последовательность РНК по п. 1, где вирусная частица ДНК-содержащего вируса представляет собой вирусную частицу AAV или онколитическую вирусную частицу.

3. Последовательность РНК по п. 1 или 2, где RPS расположен на 5’-конце RSI или рядом с ним, на 3’-конце RSI или рядом с ним или внутри RSI (например, внутри интрона mRNA).

4. Последовательность РНК по любому из пп. 1-3, содержащая более одного (например, 1, 2, 3 или больше) RPS, которые являются идентичными или разными.

5. Последовательность РНК по п. 4, где два или более (например, 3) из указанных более чем одного RPS примыкают друг к другу или находятся в тандеме посредством одинаковых или разных линкеров.

6. Последовательность РНК по п. 4 или 5, содержащая два или более RPS, которые не примыкают друг к другу (например, по одному, каждый из которых расположен на одном конце представляющей интерес последовательности РНК (RSI) или рядом с ним).

7. Последовательность РНК по любому из пп. 2-6, где RPS содержит транскрибированный модифицированный инвертированный концевой повтор (ITR) AAV, где указанный транскрибированный модифицированный ITR AAV

(a) содержит транскрибированный функциональный Rep-связывающий элемент (RBE), необязательно дополнительно содержащий транскрибированный функциональный RBE’, и

(b) не содержит либо транскрибированного сайта концевого разрешения (TRS), либо транскрибированного обратно комплементарного TRS (rcTRS), либо их обоих;

необязательно указанный транскрибированный модифицированный ITR AAV дополнительно содержит транскрибированную последовательность D-области (D-последовательность или D’-последовательность), и/или

необязательно взаимодействующая с RPS молекула представляет собой Rep78, Rep68, Rep52 и/или Rep40.

8. Последовательность РНК по п. 7, где транскрибированный модифицированный ITR AAV находится в пределах 1000 нуклеотидов, 800 нуклеотидов, 500 нуклеотидов, 300 нуклеотидов или 200 нуклеотидов 3’-конца РНК; необязательно транскрибированный модифицированный ITR AAV расположен в направлении 5’ относительно последовательности поли-А, сигнальной последовательности поли-А (например, AAUAAA) или последовательности терминации транскрипции РНК (например, гистонового нижележащего элемента).

9. Последовательность РНК по любому из пп. 7, 8, где транскрибированный модифицированный ITR AAV модифицирован на основе транскрибированного флип- или флоп-ITR дикого типа; необязательно указанный флип- или флоп-ITR дикого типа происходит из AAV1, AAV2, AAV3A, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAVrh74, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12 или AAV13 (необязательно указанный флоп-ITR дикого типа характеризуется нуклеотидной последовательностью под SEQ ID NO: 1).

10. Последовательность РНК по любому из пп. 7-9, где транскрибированный модифицированный ITR AAV не содержит ни транскрибированного TRS, ни транскрибированного rcTRS.

11. Последовательность РНК по любому из пп. 7-10, где транскрибированный модифицированный ITR AAV содержит транскрибированную последовательность D-области (необязательно указанный модифицированный ITR AAV характеризуется нуклеотидной последовательностью под SEQ ID NO: 3).

12. Последовательность РНК по любому из пп. 7-10, где транскрибированный модифицированный ITR AAV не содержит транскрибированную последовательность D-области (необязательно указанный модифицированный ITR AAV характеризуется нуклеотидной последовательностью под SEQ ID NO: 2).

13. Последовательность РНК по любому из пп. 7-12, дополнительно содержащая второй транскрибированный модифицированный ITR AAV, содержащий последовательность второго транскрибированного функционального RBE, но не содержащий либо второго транскрибированного TRS, либо второго транскрибированного rcTRS, либо их обоих; необязательно указанный второй транскрибированный модифицированный ITR AAV дополнительно содержит последовательность второй транскрибированной D-области.

14. Последовательность РНК по п. 13, где транскрибированный модифицированный ITR AAV и второй транскрибированный модифицированный ITR AAV являются идентичными (или разными).

15. Последовательность РНК по любому из пп. 7-14, где транскрибированный модифицированный ITR AAV и второй транскрибированный модифицированный ITR AAV (если присутствует) предусматривают делецию в соответствующей последовательности D-области транскрибированного ITR AAV дикого типа или соответствующего транскрибированного TRS/rcTRS дикого типа, мутацию в них или вставку в них.

16. Последовательность РНК по любому из пп. 13-15, где второй транскрибированный модифицированный ITR AAV находится в пределах 1000 нуклеотидов, 800 нуклеотидов, 500 нуклеотидов, 250 нуклеотидов или 150 нуклеотидов 5’-конца последовательности РНК.

17. Последовательность РНК по любому из пп. 2-6, где RPS содержит последовательность MS2, PP7-связывающий сайт или com-связывающий сайт, и взаимодействующая с RPS молекула содержит взаимодействующий с RPS белок (RPSIP), способный взаимодействовать, например, связываться, непосредственно или опосредованно, с RPS, такой как происходящий из бактериофага белок оболочки MS2 (MCP) для последовательности MS2, белок оболочки бактериофага РР7 (PCP) для PP7-связывающего сайта или фаговый белок COM (COM) для com-связывающего сайта.

18. Последовательность РНК по п. 17, где RPSIP ассоциирован, непосредственно или опосредованно, с (например, слит с) белковым компонентом вирусной системы упаковки для вирусной частицы ДНК-содержащего вируса (таким как Rep78 и/или Rep68 аденоассоциированного вируса 2 (AAV2) или активирующий сборку белок (AAP)).

19. Последовательность РНК по любому из пп. 1-18, где последовательность РНК содержит или предпочтительно не содержит транскрибированный сигнал упаковки ДНК, например, транскрибированную последовательность ITR AAV дикого типа (например, последовательность РНК содержит транскрибированную модифицированную последовательность ITR AAV, предусматривающую добавление, делецию и/или замену нуклеотида соответствующей последовательности транскрибированного ITR AAV дикого типа для снижения способности вирусной частицы ДНК-содержащего вируса к упаковке ДНК).

20. Последовательность РНК по любому из пп. 1-19, дополнительно содержащая:

(1) транскрибированный энхансер транскрипции;

(2) транскрибированную последовательность интрона или последовательность экзона (такую как последовательность для усиления экспрессии белка);

(3) последовательность 5’-UTR;

(4) последовательность 3’-UTR;

(5) последовательность поли-A или последовательность сигнала полиаденилирования (поли-A) и необязательно GU-богатую область ниже сигнальной последовательности поли-A;

(6) посттранскрипционный регуляторный элемент или последовательность, такую как транскрибированная последовательность посттранскрипционного регуляторного элемента вируса гепатита сурка (WHP) (WPRE), и/или

(7) последовательность терминации транскрипции (такую как гистоновый нижележащий элемент),

необязательно последовательность РНК содержит RPS, расположенный в направлении 3’ относительно посттранскрипционного регуляторного элемента или последовательности и в направлении 5’ относительно последовательности поли-A или сигнальной последовательности поли-A.

21. Последовательность РНК по п. 20, содержащая, в ориентации 5’-3’, RSI, необязательную транскрибированную последовательность WPRE; RPS (такой как транскрибированный модифицированный ITR AAV, последовательность MS2, PP7-связывающий сайт или com-связывающий сайт) и последовательность поли-A или сигнальную последовательность поли-A.

22. Последовательность РНК по любому из пп. 1-21, где GOI предусматривает белок (например, флуоресцентный белок, терапевтический белок, антигенный белок или белок для редактирования гена, такой как белок Cas, белок ZFN, белок TALEN), фермент (такой как белок Cre или эффекторный фермент CRISPR/Cas, например, Cas9, Cas12, Cas13 или их вариант), структурный белок, mRNA, некодирующую РНК (ncRNA), siRNA, piRNA, короткую шпилечную РНК или shRNA, микро-РНК (miRNA) или ее предшественника (включая pre-miRNA и pri-miRNA), рибосомальную РНК (rRNA), антисмысловую последовательность или олигонуклеотид (ASO), РНК-компонент системы CRISPR-Cas, в том числе направляющую РНК (или gRNA), такую как одиночная направляющая РНК (или sgRNA, химерная РНК, РНК-химера), РНК CRISPR (crRNA) и tracrRNA, направляющая РНК или gRNA для эффекторного фермента CRISPR/Cas, rRNA, tRNA, snoRNA, snRNA, exRNA, scaRNA, lncRNA, Xist и HOTAIR.

23. Последовательность РНК по любому из пп. 1-22, которая представляет собой однонитевую РНК длиной менее чем приблизительно 8900 нуклеотидов, длиной менее чем приблизительно 8000 нуклеотидов, длиной менее чем приблизительно 7000 нуклеотидов, длиной менее чем приблизительно 6000 нуклеотидов, длиной менее чем приблизительно 5200 нуклеотидов, длиной менее чем приблизительно 4000 нуклеотидов, длиной менее чем приблизительно 3000 нуклеотидов, длиной менее чем приблизительно 2000 нуклеотидов, длиной приблизительно 4700-5200 нуклеотидов, длиной приблизительно 4700-5000 нуклеотидов, длиной приблизительно 4700-4800 нуклеотидов или длиной приблизительно 4700 нуклеотидов.

24. Полинуклеотид, содержащий кассету, кодирующую последовательность РНК по любому из пп. 1-23; необязательно полинуклеотид представляет собой последовательность ДНК (например, ДНК-плазмиду), необязательно содержащую заполняющую последовательность в остове ДНК-плазмиды и/или необязательно не содержащую функциональный сигнал упаковки ДНК, такой как ITR AAV.

25. Полинуклеотид по п. 24, дополнительно содержащий промотор, функционально связанный с последовательностью РНК, кодируемой кассетой, и управляющий ее транскрипцией.

26. Полинуклеотид по п. 25, где промотор представляет собой универсальный промотор.

27. Полинуклеотид по п. 25, где промотор представляет собой тканеспецифический промотор.

28. Полинуклеотид по любому из пп. 25-27, где промотор представляет собой конститутивный промотор.

29. Полинуклеотид по любому из пп. 25-27, где промотор представляет собой индуцируемый промотор.

30. Полинуклеотид по любому из пп. 25-29, дополнительно содержащий энхансер, который усиливает транскрипцию последовательности РНК, управляемой промотором.

31. Вирусная частица рекомбинантного ДНК-содержащего вируса, содержащая РНК-геном (такой как последовательность РНК по любому из пп. 1-23 или последовательность РНК, транскрибированная с полинуклеотида по любому из пп. 24-30), упакованный в белковую оболочку (такую как капсид) ДНК-содержащего вируса (такого как вирус AAV или онколитический вирус).

32. Вирусная частица рекомбинантного ДНК-содержащего вируса по п. 31, где ДНК-содержащий вирус представляет собой AAV, и вирусная частица рекомбинантного ДНК-содержащего вируса представляет собой частицу рекомбинантного РНК-содержащего аденоассоциированного вируса (rRAAV), содержащую:

(1) капсид AAV и

(2) последовательность РНК по любому из пп. 1-23 или последовательность РНК, транскрибированную с полинуклеотида по любому из пп. 24-30, упакованную в указанный капсид AAV.

33. Вирусная частица рекомбинантного ДНК-содержащего вируса по п. 32, где капсид AAV включает капсид из AAV серотипа AAV1, AAV2, AAV3A, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV-DJ, AAV PHP.eB, Anc80L65, Anc80L65AAP, AAVrh74 или 7m8.

34. Популяция вирусных частиц рекомбинантного ДНК-содержащего вируса (например, частиц rRAAV), содержащая множество вирусных частиц рекомбинантного ДНК-содержащего вируса (например, частиц rRAAV) по любому из пп. 31-33, где по меньшей мере приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше вирусных частиц рекомбинантного ДНК-содержащего вируса (например, частиц rRAAV) в указанной популяции содержат последовательность РНК по любому из пп. 1-23 или последовательность РНК, транскрибированную с полинуклеотида по любому из пп. 24-30, упакованную в них.

35. Клетка-хозяин, содержащая последовательность РНК по любому из пп. 1-23, полинуклеотид по любому из пп. 24-30, последовательность РНК, транскрибированную с полинуклеотида по любому из пп. 24-30, вирусную частицу рекомбинантного ДНК-содержащего вируса (например, частицу rRAAV) по любому из пп. 31-33 и/или популяцию вирусных частиц рекомбинантного ДНК-содержащего вируса (например, частиц rRAAV) по п. 34.

36. Клетка-хозяин по п. 35, дополнительно содержащая вирусную систему упаковки, которая облегчает упаковку последовательности РНК по любому из пп. 1-23 или последовательности РНК, транскрибированной с полинуклеотида по любому из пп. 24-30, в вирусную частицу ДНК-содержащего вируса.

37. Клетка-хозяин по п. 36, где вирусная система упаковки содержит:

(1) ген rep AAV (например, последовательность, кодирующая Rep78, Rep68, Rep52 и/или Rep40) и ген cap AAV (например, последовательность, кодирующая VP1, VP2, VP3, AAP и/или MAAP) под транскрипционным контролем одного или нескольких промоторов, которые управляют транскрипцией указанного гена rep и гена cap, или продукты их экспрессии;

(2) одну или несколько последовательностей, кодирующих один или несколько белков, необходимых для упаковки AAV, например, гены E2A, E4 и VA аденовируса, или указанные один или несколько белков, и

(3) взаимодействующую с RPS молекулу или кодирующую ее последовательность;

при этом необязательно способность вирусной системы упаковки упаковывать последовательность ДНК в вирусную частицу ДНК-содержащего вируса снижается, уменьшается или по сути устраняется, например, (1) удалением части или всех сигналов упаковки ДНК, таких как ITR AAV, в полинуклеотиде, кодирующем последовательность РНК по любому из пп. 1-23, или в полинуклеотиде по любому из пп. 24-30, (2) модификацией, например, мутацией, указанного гена rep AAV, указанного гена cap AAV и/или указанных одной или нескольких последовательностей, кодирующих один или несколько белков, необходимых для упаковки AAV, со снижением, уменьшением или по сути устранением способности соответствующего транслированного белка облегчать упаковку последовательности ДНК в вирусную частицу ДНК-содержащего вируса (например, мутация Y156F в обычной последовательности белков Rep78 и Rep68, KDE-mu или EKE-mu), и/или (3) увеличением размера полинуклеотида, кодирующего последовательность РНК по любому из пп. 1-23, или полинуклеотида по любому из пп. 24-30.

38. Клетка-хозяин по любому из пп. 35-37, которая представляет собой клетку млекопитающего (такую как клетки HEK293) или клетку насекомого (такую как клетки Sf9 или Sf21).

39. Способ получения вирусной частицы рекомбинантного ДНК-содержащего вируса (например, частицы rRAAV) по любому из пп. 31-33 или популяции вирусных частиц рекомбинантного ДНК-содержащего вируса (например, частиц rRAAV) по п. 34, при этом способ включает:

a) культивирование клетки-хозяина по любому из пп. 35-38 в течение достаточного времени и

b) сбор рекомбинантной вирусной частицы ДНК-содержащего вируса или популяции рекомбинантных вирусных частиц ДНК-содержащего вируса.

40. Способ по п. 39, дополнительно включающий выделение или очистку указанной вирусной частицы рекомбинантного ДНК-содержащего вируса или указанной популяции вирусных частиц рекомбинантного ДНК-содержащего вируса.

41. Способ получения вирусной частицы рекомбинантного ДНК-содержащего вируса (например, частицы rRAAV) или популяции вирусных частиц рекомбинантного ДНК-содержащего вируса, при этом способ включает:

a) обеспечение контакта вирусной системы упаковки (например, системы упаковки AAV) с последовательностью РНК по любому из пп. 1-23 или последовательностью РНК, транскрибированной с полинуклеотида по любому из пп. 24-30, в течение периода времени, достаточного для получения вирусной частицы рекомбинантного ДНК-содержащего вируса или популяции вирусных частиц рекомбинантного ДНК-содержащего вируса, и

b) сбор рекомбинантной вирусной частицы ДНК-содержащего вируса или популяции рекомбинантных вирусных частиц ДНК-содержащего вируса и необязательно

c) выделение или очистку собранной вирусной частицы рекомбинантного ДНК-содержащего вируса или популяции вирусных частиц рекомбинантного ДНК-содержащего вируса.

42. Способ по п. 41, где вирусная система упаковки (например, система упаковки AAV) содержит:

(1) один или несколько белков для сборки белковой оболочки (например, VP1, VP2 и/или VP3 для сборки капсида AAV) вирусной частицы ДНК-содержащего вируса для упаковки последовательности РНК или одну или несколько кодирующих их последовательностей;

(2) один или несколько белков (например, Rep78, Rep68, Rep52 и/или Rep40 для упаковки AAV) для облегчения сборки белковой оболочки и/или упаковки последовательности РНК в белковую оболочку вирусной частицы ДНК-содержащего вируса или одну или несколько кодирующих их последовательностей (например, генов E2a, E4 и VA аденовируса) и

при этом необязательно способность вирусной системы упаковки упаковывать последовательность ДНК в вирусную частицу ДНК-содержащего вируса снижается, уменьшается или по сути устраняется, например, (1) удалением части или всех сигналов упаковки ДНК, таких как ITR AAV, в полинуклеотиде, кодирующем последовательность РНК по любому из пп. 1-23, или в полинуклеотиде по любому из пп. 24-30, (2) модификацией, например, мутацией, указанного гена rep AAV, указанного гена cap AAV и/или указанных одной или нескольких последовательностей, кодирующих один или несколько белков, необходимых для упаковки AAV, со снижением, уменьшением или по сути устранением способности соответствующего транслированного белка облегчать упаковку последовательности ДНК в вирусную частицу ДНК-содержащего вируса (например, мутация Y156F в обычной последовательности белков Rep78 и Rep68, KDE-mu или EKE-mu), и/или (3) увеличением размера полинуклеотида, кодирующего последовательность РНК по любому из пп. 1-23 или полинуклеотида по любому из пп. 24-30.

43. Система упаковки последовательности РНК по любому из пп. 1-23 или последовательности РНК, транскрибированной с полинуклеотида по любому из пп. 24-30, в вирусную частицу ДНК-содержащего вируса, содержащую:

44. Способ доставки представляющего интерес гена (GOI) в клетку, растение или животное, при этом способ включает обеспечение контакта клетки, растения или животного с вирусной частицей рекомбинантного ДНК-содержащего вируса (например, частицей rRAAV) по любому из пп. 31-33, популяцией вирусных частиц рекомбинантного ДНК-содержащего вируса (например, частиц rRAAV) по п. 34 или вирусной частицей рекомбинантного ДНК-содержащего вируса (например, частицей rRAAV) или популяцией вирусных частиц рекомбинантного ДНК-содержащего вируса (например, частиц rRAAV), полученных способом по любому из пп. 39-42, где указанный GOI кодируется указанной последовательностью РНК (по любому из пп. 1-23).

45. Способ доставки представляющей интерес последовательности РНК (RSI) в клетку, растение или животное, при этом способ включает обеспечение контакта клетки, растения или животного с вирусной частицей рекомбинантного ДНК-содержащего вируса (например, частицей rRAAV) по любому из пп. 31-33, популяцией вирусных частиц рекомбинантного ДНК-содержащего вируса (например, частиц rRAAV) по п. 34 или вирусной частицей рекомбинантного ДНК-содержащего вируса (например, частицей rRAAV) или популяцией вирусных частиц рекомбинантного ДНК-содержащего вируса (например, частиц rRAAV), полученных способом по любому из пп. 39-42.

46. Способ осуществления диагностики, предупреждения или лечения заболевания или нарушения у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества или дозы популяции вирусных частиц рекомбинантного ДНК-содержащего вируса (например, частиц rRAAV) по п. 34 или полученных способом по любому из пп. 39-42.

47. Применение вирусной частицы рекомбинантного ДНК-содержащего вируса (например, частицы rRAAV) по любому из пп. 31-33, популяции вирусных частиц рекомбинантного ДНК-содержащего вируса (например, частиц rRAAV) по п. 34 или вирусной частицы рекомбинантного ДНК-содержащего вируса (например, частицы rRAAV) или популяции вирусных частиц рекомбинантного ДНК-содержащего вируса (например, частиц rRAAV), полученных способом по любому из пп. 39-42, в изготовлении лекарственного препарата для диагностики, предупреждения или лечения заболевания или нарушения у субъекта, нуждающегося в этом.