RU2010144036A

RU2010144036A - Способ амплифицирования локусов в бактериальной клетке

Info

Publication number: RU2010144036A
Application number: RU2010144036/10A
Authority: RU
Inventors: Эудженио ФЕРРАРИ (US); Эудженио ФЕРРАРИ; Каролин ПЕРЕ (US); Каролин ПЕРЕ
Original assignee: ДАНИСКО ЮЭс ИНК. (US); ДАНИСКО ЮЭс ИНК.
Priority date: 2008-03-28
Filing date: 2009-03-27
Publication date: 2012-05-10
Also published as: CA2719314A1; AU2009228165A1; JP2011516044A; WO2009120929A1; MX2010010310A; EP2257629A1; KR20100138969A; KR101683302B1; CN101981193B; NZ587540A; EP2257629B1; US9528114B2; CN101981193A; BRPI0909373A2; JP5659143B2; US20110229938A1; AU2009228165B2; DK2257629T3; RU2577985C2; WO2009120929A8

Abstract

1. Способ амплифицирования геномного локуса, включающий: ! (a) приведение популяции бактериальных клеток-хозяев, содержащих геномный локус со структурой ! A1-P-M-A2, ! где А1 и А2 являются прямыми повторами, Р содержит кодирующую последовательность для белка, представляющего интерес, и М содержит кодирующую последовательность для необходимого фермента, в контакт с ингибитором указанного необходимого фермента; и ! б) отбор клеток, которые являются устойчивыми к указанному ингибитору; ! где клетки, которые являются устойчивыми к указанному ингибитору, имеют множество копий указанной амплификационной единицы. ! 2. Способ по п.1, где указанная бактериальная клетка-хозяин является клеткой Bacillus sp. ! 3. Способ по п.1 или 2, где указанный необходимый фермент является ферментом дикого типа, который является эндогенным для указанной клетки. ! 4. Способ по п.1 или 2, где указанные бактериальные клетки-хозяева дополнительно содержат инактивированный ген, кодирующий указанный необходимый фермент, где указанный инактивированный ген является эндогенным для указанной клетки и находится в геномном локусе, отличном от указанного геномного локуса со структурой A1-P-M-A2. ! 5. Способ по п.1 или 2, где Р содержит экспрессионную кассету. ! 6. Способ по п.1 или 2, где A1 содержит промотер, который является функционально связанным с кодирующей последовательностью из Р. ! 7. Способ по п.1 или 2, где указанная кодирующая последовательность для указанного необходимого фермента является связанной с промотером, который является эндогенным для указанной кодирующей последовательности. ! 8. Способ по п.1 или 2, где указанный белок, представляющий интерес, предста�

Claims

1. Способ амплифицирования геномного локуса, включающий:

(a) приведение популяции бактериальных клеток-хозяев, содержащих геномный локус со структурой

A₁-P-M-A₂,

где А₁ и А₂ являются прямыми повторами, Р содержит кодирующую последовательность для белка, представляющего интерес, и М содержит кодирующую последовательность для необходимого фермента, в контакт с ингибитором указанного необходимого фермента; и

б) отбор клеток, которые являются устойчивыми к указанному ингибитору;

где клетки, которые являются устойчивыми к указанному ингибитору, имеют множество копий указанной амплификационной единицы.

2. Способ по п.1, где указанная бактериальная клетка-хозяин является клеткой Bacillus sp.

3. Способ по п.1 или 2, где указанный необходимый фермент является ферментом дикого типа, который является эндогенным для указанной клетки.

4. Способ по п.1 или 2, где указанные бактериальные клетки-хозяева дополнительно содержат инактивированный ген, кодирующий указанный необходимый фермент, где указанный инактивированный ген является эндогенным для указанной клетки и находится в геномном локусе, отличном от указанного геномного локуса со структурой A₁-P-M-A₂.

5. Способ по п.1 или 2, где Р содержит экспрессионную кассету.

6. Способ по п.1 или 2, где A₁ содержит промотер, который является функционально связанным с кодирующей последовательностью из Р.

7. Способ по п.1 или 2, где указанная кодирующая последовательность для указанного необходимого фермента является связанной с промотером, который является эндогенным для указанной кодирующей последовательности.

8. Способ по п.1 или 2, где указанный белок, представляющий интерес, представляет собой субтилизин.

9. Способ по п.1, где указанный необходимый фермент представляет собой D-аланин рацемазу.

10. Способ по п.1 или 2, где указанный необходимый фермент представляет собой D-аланин рацемазу, и указанный ингибитор представляет собой β-хлор-D-аланин.

11. Бактериальная клетка-хозяин, содержащая геномный локус, включающий амплификационную единицу со структурой:

A₁-P-M-A₂,

где А₁ и А₂ являются прямыми повторами, Р содержит кодирующую последовательность для белка, представляющего интерес, и М содержит кодирующую последовательность для необходимого фермента.

12. Бактериальная клетка-хозяин, содержащая геномный локус, включающий множественные копии амплификационной единицы со структурой:

A₁-P-M-A₂,

где А₁ и А₂ являются прямыми повторами, Р содержит первую кодирующую последовательность для белка, представляющего интерес, и М содержит вторую кодирующую последовательность для необходимого фермента, где указанная первая кодирующая последовательность является функционально связанной с промотером, который находится в прямом повторе А₁.

13. Бактериальная клетка-хозяин по п.11 или 12, где указанный белок, представляющий интерес, представляет собой субтилизин, и указанный необходимый фермент представляет собой аланин-рацемазу.

14. Бактериальная клетка-хозяин по п.11 или 12, где указанная амплификационная единица имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7.

15. Культура бактериальных клеток, содержащая:

среду для выращивания; и

популяцию бактериальных клеток по любому из пп.11-14.

16. Способ, включающий поддержание культуры клеток по п.15 в условиях, подходящих для продуцирования указанного белка, представляющего интерес.

17. Способ по п.16, дополнительно включающий выделение указанного белка, представляющего интерес, из указанной среды для выращивания.