RS66234B1 - Anti-ccr8 antitela - Google Patents

Description

Opis

3. Tehnička oblast

Predmetna prijava se odnosi na nova anti-CCR8 antitela koja sadrže (i) VH lanac koji sadrži tri CDR; i (ii) VL lanac koji sadrži tri CDR, pri čemu:

VH CDR#1 je GFIFSNAVMY (SEQ ID NO: 1);

VH CDR#2 je RIKTKFNNYATYYADAVKG (SEQ ID NO: 2); VH CDR#3 je GDRNKPFAY (SEQ ID NO: 3);

VL CDR#1 je RASTSVITLLH (SEQ ID NO: 4);

VL CDR#2 je GASNLES (SEQ ID NO:5); i

VL CDR#3 je QQSWNDPYT (SEQ ID NO: 6);

pri čemu antitelo sadrži IgG1 Fc konstantni region koji je afukozilovan. Pronalazak dalje obezbeđuje sastav koji sadrži mnoštvo anti-CCR8 antitela koja sadrže (i) VH lanac koji sadrži tri CDR; i (ii) VL lanac koji sadrži tri CDR, pri čemu:

VH CDR#1 je GFIFSNAVMY (SEQ ID NO: 1);

VH CDR#2 je RIKTKFNNYATYYADAVKG (SEQ ID NO: 2); VH CDR#3 je GDRNKPFAY (SEQ ID NO: 3);

VL CDR#1 je RASTSVITLLH (SEQ ID NO: 4);

VL CDR#2 je GASNLES (SEQ ID NO:5); i

VL CDR#3 je QQSWNDPYT (SEQ ID NO: 6); i

pri čemu je više od 80% anti-CCR8 antitela u sastavu afukozilovano.

4. Pozadina

Unutar tumora, regulatorne T ćelije (Treg) su ključna supresivna populacija za koju se zna da sprečava anti-tumorske imune odgovore. Povećano prisustvo intratumoralnih Treg-ova povezano je sa lošijim ishodima pacijenata kod nekoliko karcinoma (Shang i sar., Nature Sci. Reports, 2015; Fridman i sar., Nat Rev Clin Oncol.2017; Bruni i sar., Nat Rev Cancer.2020). Receptor hemokina 8 (CCR8) je protein ćelijske površine jedinstveno izražen intratumoralnim Tregovima u nekoliko ljudskih karcinoma (Plitas i sar., Immunity 2016; De Simone i sar., Immunity 2016). Ovo čini CCR8 privlačnim ciljem za posredovanje selektivnog intratumorskog iscrpljivanja Treg-a preko ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC) da bi se pojačao anti-tumorski imunitet.

WO2021/142002 antitela ili delovi istih koji se vežu za antigen koji specifično veže ljudski CCR8, polinukleotide i vektore koji kodiraju iste, i farmaceutske sastave koje sadrže iste. WO2020/138489 takođe otkriva anti-CCR8 antitelo i korišćenje pomenutog antitela za tretiranje ili sprečavanje kancera.

EP3431105 otkriva farmaceutski sastav za tretiranje kancera koji sadrži antitelo protiv CCR8.

Dok je iscrpljivanje Treg-a dugo istraživano, većina ovih tretmana ima ograničenu efikasnost zbog ciljnog izraza na populacijama efektorskih T ćelija koje infiltriraju tumor i/ili Treg-ovima izvan okruženja tumora. U predmetnoj oblasti ostaje potreba za terapijom monoklonskim antitelima koja pokreće smrt intratumoralnih imunosupresivnih Treg-ova bez iscrpljivanja drugih ključnih populacija efektorskih T-ćelija u mikrookruženju tumora ili perifernim Treg-ovima.

5. Sažetak pronalaska

Pokazalo se da anti-CCR8 monoklonska antitela posreduju u selektivnom intratumoralnom iscrpljivanju Treg-a preko ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC). Pošto je CCR8 prvenstveno izražen Treg-ovima koji infiltriraju tumor i nije visoko izražen u Treg-ovima periferne krvi ili korisnim efektorskim T-ćelijskim populacijama, anti-CCR8 antitelo bi iscrpilo intratumoralne Treg-ove i pojačalo anti-tumorski imunitet. Dok je monoterapija anti-CCR8 antitelom nezavisno efektivna, specifično uklanjanje Treg-ova unutar tumora obezbeđuje pogodno okruženje za odgovarajuće pristupe kombinovane terapije koji imaju za cilj istovremeno stimulisanje anti-tumorskog imunog odgovora. Na primer, može biti potrebna kombinacija sa inhibitorom kontrolne tačke kao što je anti-PD-1 da bi se u potpunosti pokrenuo snažan anti-tumorski imunitet nakon iscrpljivanja Treg-a.

Shodno tome, obezbeđena je sekvenca aminokiselina za monoklonsko, humanizovano antitelo koje specifično veže CCR8 i posreduje ADCC od CCR8 koji izražava Treg-ove. Antitelo se strukturno sastoji od promenljivog teškog i promenljivog lakog lanca koji sadrži komplementarne određujuće regione (CDR) koji specifično vežu CCR8. Antitelo takođe uključuje ljudski konstantni region teškog lanca koji sadrži region koji može da kristališe fragment (Fc) i konstantni region lakog lanca. Ovi strukturni elementi, kao što su kodirani sekvencom aminokiselina antitela, sadrže farmaceutski sastav koji je efektivan u tretiranju solidnih tumora kod pacijenata, bilo kao monoterapija ili u kombinaciji sa drugim terapeuticima.

6. Kratak opis crteža

SL. 1 pokazuje vezivanje himernih rat/hIgG1 ljudskih CCR8 specifičnih himernih mAbs za Jurkat ćelije koje izražavaju ljudski ili cinomolgus CCR8.

SL. 2 pokazuje rezultate eksperimenata spajanja epitopa.

SL. 3 pokazuje sekvence teškog i lakog lanca ABBV-514.

SL. 4A pokazuje vezivanje krivih odnosa doze i efekta za afukozilovani ABBV-514 za TALL-1 ćelije koje izražavaju endogene CCR8 ili TALL-1 CCR8 nokaut ćelije i za Jurkat roditeljske ćelije ili ćelije koje prekomerno izražavaju ljudski ili cino CCR8. SL.4B pokazuje vezivanje fukozilovanih (WT PR-1925514) naspram afukozilovanog ABBV-514 za TALL-1 ćelije.

SL. 5A-D pokazuju podatke ADCC reporterskog biotesta za fukozilovani (WT PR-1925514) naspram afukozilovanog ABBV-514.

SL. 6 pokazuje rezultate ADCC testa sa prečišćenim NK efektorskim ćelijama i TALL-1 ciljnim ćelijama.

SL. 7 pokazuje rezultate CCR8 beta-arestin reporterskog testa koji pokazuje efekat ABBV-514 na vezivanje CCL1 za CCR8.

7. Detaljni opis

Treg-ovi su podskup CD4+ T-ćelija sa intratumoralnim imunosupresivnim efektima. Treg-ovi suzbijaju aktivaciju, proliferaciju i proizvodnju citokina CD4+ T-ćelija i CD8+ T-ćelija, sprečavajući štetne autoimune odgovore. Međutim, Treg-ovi takođe suzbijaju imunitet tumora, i visoki intratumoralni nivoi Treg-a su povezani sa negativnim ishodima kod nekoliko karcinoma.

CCR8 je hemokinski receptor C-C motiva koji se sastoji od transmembranskog proteina sa sedam prolaza koji posreduje u hemotaksiji i interakcijama ćelija/ćelija u kontekstu imunih odgovora limfocita T-pomoćnika tipa 2 (Th2) i prometa T-ćelija na kožu. Miševi sa nedostatkom CCR8 su održivi, plodni i uglavnom normalni, osim što ne mogu uspostaviti robusne Th2 odgovore u određenim pretkliničkim modelima povezanim sa Th2 (Chensue i sar., J Exp Med 5, 2001). Ligand prvenstveno povezan sa CCR8 je CCL1, iako su CCL18 (ljudski) i CCL8 (mišji) takođe ligandi za ovaj receptor.

Treg-ovi koji izražavaju CCR8 i koji infiltriraju tumore pokazuju visoko aktiviran i imunosupresivan fenotip. Studije tumora kod CCR8 nokaut miševa pokazuju da gubitak izraza CCR8 ne utiče na regrutovanje Treg-a u mikrookruženje tumora, status aktivacije ili supresivni kapacitet (Van Damme i sar., J Immunother Cancer.9(2), 2021). Umesto toga, izraz CCR8 je marker visoko supresivnih Treg-ova. Stoga, iscrpljivanje Treg-ova koji izražavaju CCR8 obezbeđuje anti-tumorske benefite.

Surogat antitela specifična za CCR8 posreduju selektivnom intratumoralnom iscrpljivanju Treg-a preko ADCC-a. Dodatno, anti-CCR8 surogat antitela značajno jačaju frekvenciju cirkulisanja CD8+ efektorskih T-limfocita specifičnih za tumor. Ovi efekti su povezani sa efikasnošću kod mišjih singenih modela tumora. (Campbell i sar., Cancer Research 81, 2021).

Predmetni pronalazači su razvili terapeutska monoklonska antitela, kao što je definisano u patentnim zahtevima, koja specifično vežu CCR8 izražen na površini ćelija, na primer, intratumoralni Treg-ovi. Antitelo se sastoji od dva promenljiva lanca, jednog teškog i jednog lakog, kao što je definisano u patentnim zahtevima. Na svakom promenljivom lancu postoje tri CDR-a koji dozvoljavaju antitelu da se veže za CCR8, kao što je definisano u patentnim zahtevima. Na oba promenljiva lanca, postoji ukupno šest različitih CDR-ova, kao što je definisano u patentnim zahtevima. Dodatno, antitelo sadrži ljudski konstantni region teškog lanca koji sadrži ljudski Fc imunoglobulinske klase G1 (IgG1), kao što je definisano u patentnim zahtevima. Opisana anti-CCR8 antitela sadrže IgG1 Fc konstantni region koji je afukozilovan i pokazuje in vitro funkcionalnost, imunobezbednost i svojstva slična leku.

Antitelo sadrži IgG1 Fc konstantni region koji je afukozilovan. Afukozilacija se može izvesti tehnikama poznatim u predmetnoj oblasti. Videti, npr., Mol Cancer Ther (2020) 19 (5): 1102–1109) i PNAS (2013)110(14) 5404– 5409. Na primer, proizvodnja antitela u ćelijskim linijama defektnim u formiranju GDP-fukoze zbog, na primer, nedostatka GDP-manoze 4,6-dehidrataze; proizvodnja antitela u ćelijama koje imaju smanjen nivo fukoziltransferaze; proizvodnja antitela u ćelijama koje imaju smanjen nivo transportera GDP-fukoze; proizvodnja antitela u ćelijama koje prekomerno izražavaju β-1,4-manozilglikoprotein 4-β-N-acetilglukozaminiltransferazu (GnT-III); ili proizvodnja antitela u ćelijama koje izražavaju bakterijsku GDP-6-deoksi-D-likso-4-heksulozu reduktazu (RMD). Ćelije koje se koriste za proizvodnju afukozilovanih anti-CCR8 antitela pronalaska mogu biti CHO ćelije projektovane da izražavaju Pseudomonas RMD. Stepen afukozilacije antitela može se odrediti pomoću tehnika poznatih u predmetnoj oblasti.

Da bi se dobila anti-CCR8 antitela koja unakrsno reaguju sa ljudskim i cinomolgus CCR8, procenjena je sposobnost himernih antitela miša i čoveka (rat/hIgG1) da vežu Jurkat ćelije koje prekomerno izražavaju ili ljudski ili cinomolgus CCR8. Rezultati su analizirani pomoću protočne citometrije koja je izvedena tehnikama poznatim u predmetnoj oblasti. Kao rezultat, konačno anti-CCR8 antitelo unakrsno reaguje sa ljudskim i cinomolgus CCR8 i posreduje ADCC kod obe vrste, ali ne veže CCR8 miša, pacova ili zeca.

U određenim otelotvorenjima, afukozilovano antitelo pronalaska ima veći afinitet za aktiviranje receptora za IgG, kao i pojačanu aktivnost u ADCC testovima prečišćenih prirodnih ćelija ubica ili mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) u poređenju sa fukozilovanim oblikom tog antitela. ADCC aktivnost anti-CCR8 antitela može da se demonstrira korišćenjem tehnika ADCC biotesta poznatih u predmetnoj oblasti. Na primer, u reporterskim linijama ljudskih FciRIIIa V158 ili F158 alelnih varijanti koje su kultivisane sa Jurkat ćelijama koje izražavaju ljudski ili cinomolgus CCR8, anti-CCR8 antitela su pokrenula ADCC kao što je mereno putem indukcije luminiscencije korišćenjem tehnika poznatih u predmetnoj oblasti.

Pored toga, ovde opisana antitela ometaju efikasnost drugih prirodno prisutnih liganada, kao što je CCL1, koji takođe vežu CCR8, ali samo pri znatno višim EC50 nego za aktivnost vezivanja ili ADCC. Ovo testiranje je izvedeno tehnikama poznatim u predmetnoj oblasti, na primer putem beta-arestina reporterskih testova.

Kako se ovde koristi, termin „antitelo“ (Ab) se odnosi na molekul imunoglobulina koji se specifično veže za CCR8, kao što je definisano u patentnim zahtevima. Anti-CCR8 antitela prema obelodanjivanju, kao što je definisano u patentnim zahtevima, vežu se za ljudski CCR8 na Treg-ovima i na taj način modulišu imuni sistem. Anti-CCR8 antitela prema obelodanjivanju, kao što je definisano u patentnim zahtevima, sadrže regione koji određuju komplementarnost (CDR), takođe poznate kao hiperpromenljivi regioni, u promenljivim domenima i lakog i teškog lanca. Više očuvani delovi promenljivih domena nazivaju se okvir (FR). Kao što je poznato u predmetnoj oblasti, pozicija/granica amino kiseline koja ocrtava hiperpromenljivi region antitela može da varira u zavisnosti od konteksta i različitih definicija poznatih u predmetnoj oblasti. Neke pozicije unutar promenljivog domena se mogu posmatrati kao hibridne hiperpromenljive pozicije u tome što se ove pozicije mogu smatrati unutar hiperpromenljivog regiona prema jednom skupu kriterijuma, dok se smatraju izvan hiperpromenljivog regiona prema drugom skupu kriterijuma. Jedna ili više ovih pozicija se takođe mogu naći u proširenim hiperpromenljivim regionima. Obelodanjivanje obezbeđuje antitela koja sadrže modifikacije u ovim hibridnim hiperpromenljivim pozicijama. Svaki promenljivi domen nativnih teških i lakih lanaca sadrži četiri FR regiona, uglavnom usvajanjem konfiguracije β-listova, povezanih sa tri CDR-a, koji formiraju petlje koje povezuju, a u nekim slučajevima i čine deo strukture β-listova. CDR-ovi se u svakom lancu drže zajedno u neposrednoj blizini FR regiona i, sa CDR-ovima iz drugog lanca, doprinose formiranju ciljnog mesta vezivanja antitela. Videti Kabat i sar., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, Md.1987).

Antitela kao što su definisana u patentnim zahtevima mogu biti poliklonska, monoklonska, genetski modifikovana i/ili drugačije modifikovana po prirodi, uključujući, ali ne ograničavajući se na himerna antitela, humanizovana antitela, ljudska antitela, jednolančana antitela itd. U različitim otelotvorenjima, antitela sadrže ceo ili deo konstantnog regiona antitela. Ovde opisana anti-CCR8 antitela sadrže IgG1 kao što je definisano u patentnim zahtevima. Kako se ovde koristi, „konstantni region“ antitela uključuje prirodni konstantni region, alotipove ili varijante.

Svetlosni konstantni region anti-CCR8 antitela može biti kapa (κ) svetlosni region ili lambda (λ) region. λ svetlosni region može biti bilo koji od poznatih podtipova, npr. λ1, λ2, λ3 ili λ4. U nekim otelotvorenjima, anti-CCR8 antitelo sadrži kapa (κ) svetlosni region.

Termin „monoklonsko antitelo“ kako se ovde koristi nije ograničen na antitela proizvedena tehnologijom hibridoma. Monoklonsko antitelo je izvedeno iz jednog klona, uključujući bilo koji eukariotski, prokariotski ili fag klon, na bilo koji način koji je dostupan ili poznat u predmetnoj oblasti. Monoklonska antitela korisna sa predmetnim obelodanjivanjem se mogu pripremiti korišćenjem širokog spektra tehnika poznatih u predmetnoj oblasti, uključujući korišćenje hibridoma, rekombinantnih i tehnologija prikaza faga, ili kombinacije istih.

Termin „himerno“ antitelo kako se ovde koristi odnosi se na antitelo koje ima promenljive sekvence izvedene iz neljudskog imunoglobulina, kao što je antitelo pacova ili miša, i konstantne regione ljudskog imunoglobulina, tipično izabrane iz šablona ljudskog imunoglobulina.

„Humanizovani“ oblici neljudskih (npr. mišjih) antitela sadrže uglavnom sva od najmanje jednog, i tipično dva, promenljiva domena, u kojima svi ili suštinski svi CDR regioni odgovaraju onima neljudskog imunoglobulina i svi ili suštinski svi FR regioni su oni sekvence ljudskog imunoglobulina. Humanizovano antitelo takođe može da sadrži bar deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično onaj sekvence konsenzusa ljudskog imunoglobulina.

„Ljudska antitela“ uključuju antitela koja imaju sekvencu aminokiselina ljudskog imunoglobulina i uključuju antitela izolovana iz biblioteka ljudskih imunoglobulina ili iz životinja transgenih za jedan ili više ljudskih imunoglobulina i koja ne izražavaju endogene funkcionalne imunoglobuline. Ljudska antitela se mogu napraviti različitim postupcima poznatim u predmetnoj oblasti, uključujući postupke prikaza faga korišćenjem biblioteka antitela izvedenih iz sekvenci ljudskog imunoglobulina.

Anti-CCR8 antitela prema obelodanjivanu uključuju molekule antitela pune dužine (neoštećene).

Anti-CCR8 antitela kao što su definisana u patentnim zahtevima mogu biti antitela čije su sekvence modifikovane tako da menjaju najmanje jednu biološko efektorsku funkciju posredovanu konstantnim regionom. Na primer, ovde opisana anti-CCR8 antitela uključuju antitela koja su modifikovana da bi stekla ili poboljšala najmanje jednu biološku efektorsku funkciju posredovanu konstantnim regionom u odnosu na nemodifikovano antitelo, npr. da bi se pojačale FciR interakcije (videti, npr., SAD patentnu prijavu br.2006/0134709) ili da bi se pojačale sposobnosti antitela da posreduju ADCC. Na primer, anti-CCR8 antitelo prema obelodanjivanju kao što je definisano u patentnim zahtevima može imati konstantni region koji veže FciRt, FciRIIA, FciRIIB, FciRIIIA i/ili FciRIIIB sa većim afinitetom od odgovarajućeg nemodifikovanog konstantnog regiona. Anti-CCR8 antitelo prema obelodanjivanju kao što je definisano u patentnim zahtevima može biti ono koje ima modifikovani Fc region i posreduje u pojačanom ADCC odgovoru, pri čemu je ADCC odgovor pojačan u odnosu na antitelo koje ima iste promenljive regione (tj. VH i VL) i divlji tip IgG1 Fc regiona (tj. divlji tip CL, CH1, CH2 i CH3). Fc modifikacije koje mogu da poboljšaju ADCC, kao što su mutacije sekvence aminokiselina, poznate su u predmetnoj oblasti i mogu uključivati sledeće skupove mutacija: S239D/I332E; F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L; S239D/I332E/A330L; i S298A/E333A/K334A.

Anti-CCR8 antitela koja sadrže ljudski IgG4 konstantni region mogu sadržati mutaciju S228P, za koju se navodi da sprečava razmenu Fab krakova. Videti, npr., Silva, JP i sar. Journal of Biological Chemistry, 290(9), 5462–5469 (2015).

U nekim otelotvorenjima, anti-CCR8 antitela kao što su definisana u patentnim zahtevima uključuju modifikacije koje povećavaju ili smanjuju njihov afinitet vezanja za fetalni Fc receptor, FcRn, na primer, mutacijom segmenta konstantnog regiona imunoglobulina u određenim regionima uključenim u FcRn interakcije. U određenim otelotvorenjima, anti-CCR8 antitelo IgG klase je mutirano tako da je najmanje jedan od taloga aminokiselina 250, 314 i 428 konstantnog regiona teškog lanca zamenjen sam, ili u bilo kojoj kombinaciji istih. Za poziciju 250, zamenski talog aminokiselina može biti bilo koji talog aminokiselina osim treonina, uključujući, ali ne ograničavajući se na, alanin, cistein, asparaginsku kiselinu, glutaminsku kiselinu, fenilalanin, glicin, histidin, izoleucin, lizin, leucin, metionin, asparagin, prolin, glutamin, arginin, serin, valin, triptofan ili tirozin. Za poziciju 314, zamenski talog aminokiselina može biti bilo koji talog aminokiselina osim leucina, uključujući, ali ne ograničavajući se na, alanin, cistein, asparaginsku kiselinu, glutaminsku kiselinu, fenilalanin, glicin, histidin, izoleucin, lizin, metionin, asparagin, prolin, glutamin, arginin, serin, treonin, valin, triptofan ili tirozin. Za poziciju 428, zamenski talog aminokiselina može biti bilo koji talog aminokiselina osim metionina, uključujući, ali ne ograničavajući se na, alanin, cistein, asparaginsku kiselinu, glutaminsku kiselinu, fenilalanin, glicin, histidin, izoleucin, lizin, leucin, asparagin, prolin, glutamin, arginin, serin, treonin, valin, triptofan ili tirozin. Primer zamene za koju se zna da modifikuje Fc efektorsku funkciju je Fc zamena M428L, koja se može javiti u kombinaciji sa Fc zamenom T250Q.

Dodatne specifične kombinacije pogodnih zamena aminokiselina su identifikovane u tabeli 1 u SAD patenta br.7,217,797. Takve mutacije povećavaju vezanje za FcRn, što štiti antitelo od razgradnje i produžava njegov poluživot.

Anti-CCR8 antitela sa visokim afinitetom za ljudski CCR8 mogu biti poželjna za terapeutsko i dijagnostičko korišćenje. Shodno tome, predmetno obelodanjivanje razmatra antitela koja imaju visok afinitet vezanja za ljudski CCR8. U specifičnim rešenjima, anti-CCR8 antitela se vežu za ljudski CCR8 sa afinitetom od najmanje oko 100 nM, ali mogu da ispolje veći afinitet, na primer, najmanje oko 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0,1 nM, 0,01 ili čak više. U nekim otelotvorenjima, antitela vežu ljudski CCR8 sa afinitetom u opsegu od oko 1 pM do oko 10 nM, od oko 100 pM do oko 10 nM, oko 100 pM do oko 1 nM, ili afinitetom koji se kreće između bilo koje od prethodno navedenih vrednosti.

U nekim otelotvorenjima, pronalazak obezbeđuje monoklonsko anti-CCR8 antitelo, kao što je definisano u patentnim zahtevima, koje sadrži dva skupa od šest različitih regiona koji određuju komplementarnost (CDR), dva skupa od dva različita promenljiva regiona, dva puna teška lanca, dva puna laka lanca i ljudski konstantni region teškog lanca.

U nekim otelotvorenjima, antitelo kao što je definisano u patentnim zahtevima je rekombinantno, afukozilovano, humanizovano, IgG1 kapa monoklonsko antitelo koje se veže za hemokinski receptor 8.

Antitelo sadrži šest CDR-ova koji sadrže sledeće sekvence:

CDR-H1: GFIFSNAVMY (SEQ ID NO: 1)

CDR-H2: RIKTKFNNYATYYADAVKG (SEQ ID NO: 2)

CDR-H3: GDRNKPFAY (SEQ ID NO: 3)

CDR-L1: RASTSVITLLH (SEQ ID NO: 4)

CDR-L2: GASNLES (SEQ ID NO: 5)

CDR-L3: QQSWNDPYT (SEQ ID NO: 6)

Antitelo ovog obelodanjivanja sadrži CDR-H1 koji ima sekvencu aminokiselina prikazanu kao SEQ ID NO: 1, CDR-H2 koji ima sekvencu aminokiselina prikazanu kao SEQ ID NO: 2; CDR-H3 koji ima sekvencu aminokiselina prikazanu kao SEQ ID NO: 3, CDR-L1 koji ima sekvencu aminokiselina prikazanu kao SEQ ID NO: 4; CDR-L2 koji ima sekvencu aminokiselina prikazanu kao SEQ ID NO: 5; i CDR-L3 koji ima sekvencu aminokiselina prikazanu kao SEQ ID NO: 6; i sadrži IgG Fc konstantni region koji je afukozilovan.

U nekim otelotvorenjima, antitelo ovog obelodanjivanja sadrži promenljivi region teškog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina prikazanu kao SEQ ID NO: 7:

EVQLVESGGGLVQPGGSLKL SCAASGFIFSNAVMYWVRQA

SGKGLEWVARIKTKFNNYAT YYADAVKGRFTISRDDSKNM VYLQMNSLKTEDTAVYYCTA GDRNKPFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 7); i promenljivi region lakog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina prikazanu kao SEQ ID NO: 8: ETVVTQSPATLSLSPGERAT LSCRASTSVITLLHWFQQKP GQAPRLLIHGASNLESRVPA RFSGSGSGTDFTLTISSLEP EDFATYFCQQSWNDPYTFGQ GTKLEIK (SEQ ID NO: 8).

U nekim otelotvorenjima, antitelo ovog obelodanjivanja sadrži promenljivi region koji sadrži sekvencu aminokiselina prikazanu kao SEQ ID NO: 9 (konstantni regioni su podebljani; promenljivi teški domen je podvučen; CDR-ovi su podvučeni podebljani u kurzivu (otkriveni kao SEQ ID NO: 1–3, respektivno, po redosledu pojavljivanja)):

EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFIFSNAVMYWVRQASGKGLE WVARIKTKFNNYATY YADAVKGRFTISRDDSKNMVYLQMNSLKTEDTAVYYCTAGDRNKPFAYWGQGT LVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE LLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSRE EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (sekvenca pune dužine otkrivena kao SEQ ID NO: 9) i laki lanac koji sadrži sekvencu aminokiselina prikazanu kao SEQ ID NO: 10 (konstantni regioni su podebljani; promenljivi laki domen je podvučen; CDR-ovi su podvučeni podebljani u kurzivu (CDR sekvence otkrivene kao SEQ ID NO: 4–6, respektivno, po redosledu pojavljivanja)):

ETVVTQSPATLSLSPGERATLSCRASTSVITLLHWFQQKPGQAPRLLI HGASNLESRVPARFSG SGSGTDFTLTISSLEPEDFATYFCQQSWNDPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPP SDEQLKSG TASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL SKADYE KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (sekvenca pune dužine otkrivena kao SEQ ID NO: 10).

U jednom otelotvorenju, antitelo obelodanjivanja sadrži laki lanac prema SEQ ID NO: 10, i teški lanac koji ima skraćeni C-terminalni lizin, na primer, teški lanac prema SEQ ID NO: 9 sa skraćenim C-terminalnim lizinom:

EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFIFSNAVMYWVRQASGKGLE WVARIKTKFNNYATY

YADAVKGRFTISRDDSKNMVYLQMNSLKTEDTAVYYCTAGDRNKPFAYWGQGT

LVTVSSAS

TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA

VLQSSGL

YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE

LLGGPS

VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE

EQYN

STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL

PPSRE

EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK

LTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (sekvenca skraćenog terminalnog lizina otkrivena kao SEQ ID NO: 11)

Teški lanac antitela iz ovog obelodanjivanja može biti kodiran sledećom sekvencom nukleotida (sekvenca pune dužine otkrivena kao SEQ ID NO: 12):

Sekrecijski signalni peptid u kurzivu; uključuje konačni stop kodon (TGA); konstantni region je podebljan; CDR-ovi su podvučeni.

Laki lanac antitela iz ovog obelodanjivanja može biti kodiran sledećom sekvencom nukleotida (sekvenca pune dužine otkrivena kao SEQ ID NO: 13):

Sekrecijski signalni peptid u kurzivu; uključuje konačni stop kodon (TAG); konstantni region je podebljan; CDR-ovi su podvučeni.

U nekim otelotvorenjima, antitelo kao što je definisano u patentnim zahtevima sadrži konstantni region ljudskog teškog lanca koji sadrži ljudski CH1, ljudski zglob, ljudski CH2 i ljudski CH3 domen. U nekim otelotvorenjima, kodirani konstantni region teškog lanca sadrži Fc deo, gde je Fc deo ljudski IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 ili IgM izotip. U jednom otelotvorenju, Fc je IgG1, a alotip je z non a. U jednom otelotvorenju, laki lanac je kapa laki lanac.

U nekim otelotvorenjima, antitelo kao što je definisano u patentnim zahtevima sadrži IgG1 Fc konstantni region koji je afukozilovan. Afukozilacija se može izvesti tehnikama poznatim u predmetnoj oblasti. Na primer, proizvodnja antitela u ćelijskim linijama defektnim u formiranju GDP-fukoze zbog, na primer, nedostatka GDP-manoze 4,6-dehidrataze; proizvodnja antitela u ćelijama koje imaju smanjen nivo fukoziltransferaze; proizvodnja antitela u ćelijama koje imaju smanjen nivo transportera GDP-fukoze; proizvodnja antitela u ćelijama koje prekomerno izražavaju β-1,4-manozilglikoprotein 4-β-N-acetilglukozaminiltransferazu (GnT-III); ili proizvodnja antitela u ćelijama koje izražavaju bakterijsku GDP-6-deoksi-D-likso-4-heksulozu reduktazu (RMD). Ćelije koje se koriste za proizvodnju afukozilovanih anti-CCR8 antitela pronalaska kao što su definisane u patentnim zahtevima su CHO ćelije projektovane da izražavaju Pseudomonas RMD. Stepen afukozilacije antitela može se odrediti pomoću tehnika poznatih u predmetnoj oblasti. Tipično, antitelo je 70% ili više, 80% ili više, 90% ili više, ili oko 99% ili oko 100% afukozilovano. Poželjno, stepen afukozilacije je jednak ili veći od 80%. U nekim otelotvorenjima, antitelo je 70% ili više, 80% ili više, 90% ili više, ili oko 100% afukozilovano na poziciji ASN-300 (EU: ASN-297). Afukozulijacija se može odrediti pomoću tehnika ispitivanja hidrofilne interakcijske hromatografije (HILIC), u kojima se stepen afukozilacije određuje odvajanjem fragmentovanih antitela zavisnim od polariteta.

U jednom otelotvorenju, ukupne afukozilovane glikanske vrste se određuju analizom oslobođenih N-vezanih glikana pomoću HILIC-a sa fluorescentnom detekcijom. Glikani se oslobađaju korišćenjem peptida N-glikozidaze F (PNGaseF) i zatim se obeležavaju fluorescentnom oznakom.

Fluorescentno obeleženi N-vezani glikani se analiziraju pomoću HILIC-a sa detekcijom fluorescencije. Procenat afukozilovanih glikanskih vrsta se određuje na osnovu zbira površina na vrhuncu svih vrhunaca afukozilovanih glikana u odnosu na ukupne površine na vrhuncu svih vrhunaca glikana u hromatogramu. Svi vrhunci sa relativnom zastupljenošću od 0,5% ili više uključeni su u određivanje procenta afukozilovanih glikanskih vrsta.

7.1. Polinukleotidi koji kodiraju anti-CCR8 antitela, sistemi izraza i postupci pravljenja antitela

Predmetno obelodanjivanje sadrži polinukleotidne molekule koje kodiraju gene lakog i teškog lanca imunoglobulina za anti-CCR8 antitela, vektore koji sadrže takve polinukleotide i ćelije domaćine sposobne da proizvode anti-CCR8 antitela kao što je definisano u patentnim zahtevima.

Anti-CCR8 antitelo kao što je definisano u patentnim zahtevima može se pripremiti rekombinantnim izrazom gena lakog i teškog lanca imunoglobulina u ćeliji domaćinu. Za rekombinantni izraz antitela, ćelija domaćin se transfektuje sa jednim ili više rekombinantnih vektora izraza koji nose fragmente DNK koji kodiraju lake i teške lance imunoglobulina antitela tako da se laki i teški lanci izražavaju u ćeliji domaćinu i, opciono, sekretuju u medijum u kome su ćelije domaćini kultivisane, iz kojeg se antitela mogu povratiti.

Da bi se generisali polinukleotidi koji kodiraju takva anti-CCR8 antitela, prvo se dobijaju fragmenti DNK koji kodiraju promenljive regione lakog i teškog lanca. Ove DNK se mogu dobiti amplifikacijom i modifikacijom DNK ili cDNK zametne linije koja kodira promenljive sekvence lakog i teškog lanca, na primer korišćenjem lančane reakcije polimeraze (PCR).

Jednom kada se dobiju fragmenti DNK koji kodiraju VH i VL segmente povezane sa anti-CCR8 antitelom, ovim fragmentima DNK se može dalje manipulisati standardnim tehnikama rekombinantne DNK, na primer da se geni promenljivog regiona konvertuju u gene lanca antitela pune dužine, u gene Fab fragmenta ili u scFv gen. U ovim manipulacijama, fragment DNK koji kodira VL ili VH je operativno povezan za drugi fragment DNK koji kodira drugi protein, kao što je konstantni region antitela ili fleksibilni linker. Termin „operativno povezan“, kako se koristi u ovom kontekstu, treba da znači da su dva fragmenta DNK spojena tako da sekvence aminokiselina kodirane sa dva fragmenta DNK ostaju u okviru.

Izolovana DNK koja kodira VH region može se konvertovati u gen teškog lanca pune dužine operativnim povezivanjem DNK koja kodira VH sa drugim molekulom DNK koji kodira konstantne regione teškog lanca (CH1, CH2, CH3 i, opciono, CH4). Sekvence gena konstantnog regiona teškog lanca čoveka su poznate u tehnici (videti, npr., Kabat, E.A., i sar., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91–3242) i fragmenti DNK koji obuhvataju ove regione mogu se dobiti standardnom PCR amplifikacijom. Konstantni region teškog lanca može biti IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ili IgD konstantni region, ali u određenim otelotvorenjima je IgG1 ili IgG4. Za gen teškog lanca Fab fragmenta, DNK koja kodira VH može biti operativno povezana sa drugim molekulom DNK koji kodira samo konstantni region teškog lanca CH1.

Izolovana DNK koja kodira VL region može se konvertovati u gen lakog lanca pune dužine (kao i u Fab gen lakog lanca) operativnim povezivanjem DNK koja kodira VL sa drugim molekulom DNK koji kodira konstantni region lakog lanca, CL. Sekvence gena konstantnog regiona lakog lanca čoveka su poznate u tehnici (videti, npr., Kabat., i sar., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91–3242) i fragmenti DNK koji obuhvataju ove regione mogu se dobiti standardnom PCR amplifikacijom. Konstantni region lakog lanca može biti kapa ili lambda konstantni region, ali u određenim otelotvorenjima je kapa konstantni region.

Za izraz anti-CCR8 antitela kao što je definisano u patentnim zahtevima, DNK koje kodiraju delimične ili pune lake i teške lance, dobijene kao što je gore opisano, se unose u izrazne vektore tako da su geni operativno povezani sa transkripcionim i translacionim kontrolnim sekvencama. U ovom kontekstu, termin „operativno povezan“ treba da znači da je gen antitela vezan u vektor tako da kontrolne sekvence transkripcije i translacije unutar vektora služe svojoj predviđenoj funkciji regulacije transkripcije i translacije gena antitela. Vektor izraza i kontrolne sekvence izraza su izabrane da budu kompatibilne sa korišćenom ćelijom domaćinom izraza. Gen lakog lanca antitela i gen teškog lanca antitela mogu biti uneseni u odvojene vektore ili, tipičnije, oba gena su unesena u isti vektor izraza.

Geni antitela se unose u vektor izraza standardnim postupcima (npr. ligacija komplementarnih restrikcionih mesta na fragmentu gena antitela i vektoru, ili ligacija tupim krajem ako nema restrikcionih mesta). Pre unošenja sekvenci lakog ili teškog lanca u vezi sa anti-CCR8 antitelom, vektor izraza već može da nosi sekvence konstantnog regiona antitela. Na primer, jedan pristup pretvaranju VH i VL sekvenci povezanih sa anti-CCR8 monoklonalnim antitelom u gene antitela pune dužine je da se oni unesu u vektore izraza koji već kodiraju konstantne regione teškog lanca i konstantne regione lakog lanca, respektivno, tako da je VH segment operativno vezan za CH segment(e) unutar vektora i VL segment je operativno vezan za CL segment unutar vektora. Dodatno ili alternativno, rekombinantni vektor izraza može da kodira signalni peptid koji olakšava sekreciju lanca antitela iz ćelije domaćina. Gen lanca antitela može da se klonira u vektor tako da je signalni peptid vezan u okviru za amino terminus gena lanca antitela. Signalni peptid može biti signalni peptid imunoglobulina ili heterologni signalni peptid (tj. signalni peptid iz ne-imunoglobulinskog proteina).

Pored gena lanca antitela, rekombinantni vektori izraza prema pronalasku nose regulatorne sekvence koje kontrolišu izraz gena lanca antitela u ćeliji domaćinu. Termin „regulatorna sekvenca“ treba da uključi promotere, pojačivače i druge elemente kontrole izraza (npr. signale poliadenilacije) koji kontrolišu transkripciju ili translaciju gena lanca antitela.

Pored gena lanca antitela i regulatornih sekvenci, rekombinantni vektori izraza iz ovog obelodanjivanja mogu da nose dodatne sekvence, kao što su sekvence koje regulišu replikaciju vektora u ćelijama domaćinima (npr. poreklo replikacije) i selektivne markerske gene. Selektivni markerski gen olakšava selekciju ćelija domaćina u koje je vektor uveden. Za izraz lakih i teških lanaca, vektor(i) izraza koji kodira teške i lake lance se transfektuje u ćeliju domaćina standardnim tehnikama. Različiti oblici termina „transfekcija“ imaju za cilj da obuhvate širok spektar tehnika koje se obično koriste za uvođenje egzogene DNK u prokariotsku ili eukariotsku ćeliju domaćina, npr. elektroporaciju, lipofekciju, taloženje kalcijum-fosfata, DEAE-dekstransku transfekciju i slično.

Moguć je izraz antitela prema obelodanjivanju bilo u prokariotskim ili eukariotskim ćelijama domaćinima. U određenim otelotvorenjima, izraz antitela se vrši u eukariotskim ćelijama, na primer, ćelijama domaćina sisara, optimalnog lučenja pravilno savijenog i imunološki aktivnog antitela. Primeri ćelija domaćina sisara za izraz rekombinantnih antitela prema pronalasku uključuju jajnik kineskog hrčka (CHO ćelije) (uključujući DHFR-CHO ćelije, opisane u Urlaub i Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 77:4216–4220, koji se koristi sa DHFR selektivnim markerom, npr., kao što je opisano u Kaufman i Sharp, 1982, Mol. Biol. 159:601–621), NSO ćelije mijeloma, COS ćelije i SP2 ćelije. Kada se rekombinantni vektori izraza koji kodiraju gene antitela unesu u ćelije domaćina sisara, antitela se proizvode kultivisanjem ćelija domaćina tokom vremenskog perioda koji je dovoljan da omogući izraz antitela u ćelijama domaćina ili izlučivanje antitela u medijum kulture u kojima se gaje ćelije domaćina. Antitela se mogu dobiti iz medijuma kulture korišćenjem standardnih postupaka prečišćavanja proteina. Ćelije domaćini se takođe mogu koristiti za proizvodnju delova intaktnih antitela, kao što su Fab fragmenti ili scFv molekuli. Podrazumeva se da su varijacije gornje procedure unutar obima predmetnog obelodanjivanja. Na primer, može biti poželjno da se ćelija domaćina transfektuje sa DNK koja kodira ili laki ili teški lanac (ali ne oba) anti-CCR8 antitela iz ovog obelodanjivanja.

Tehnologija rekombinantne DNK se takođe može koristiti za uklanjanje neke ili cele DNK koja kodira jedan ili oba laka i teška lanca, a koja nije neophodna za vezanje za ljudski CCR8. Molekuli izraženi iz takvih skraćenih molekula DNK takođe su obuhvaćeni antitelima iz ovog obelodanjivanja.

Za rekombinantni izraz anti-CCR8 antitela prema obelodanjivanju, ćelija domaćin može biti ko-transfektovana sa dva vektora izraza prema pronalasku, prvi vektor koji kodira polipeptid izveden iz teškog lanca i drugi vektor koji kodira polipeptid izveden iz lakog lanca. Dva vektora mogu da sadrže identične markere koji se mogu birati, ili svaki od njih može da sadrži poseban marker koji se može birati. Alternativno, može se koristiti jedan vektor koji kodira polipeptide i teškog i lakog lanca.

Jednom kada se dobije polinukleotid koji kodira jedan ili više delova anti-CCR8 antitela, dalje promene ili mutacije se mogu uvesti u kodirajuću sekvencu, na primer da bi se generisali polinukleotidi koji kodiraju antitela sa različitim CDR sekvencama, antitela sa smanjenim afinitetom prema Fc receptoru, ili antitela različitih podklasa.

Anti-CCR8 antitela kao što su definisana u patentnim zahtevima takođe se mogu proizvesti hemijskom sintezom ili korišćenjem platforme bez ćelija.

7.2. Prečišćavanje anti-CCR8 antitela

Jednom kada je polipeptid prema obelodanjivanju proizveden rekombinantnim izrazom, može se prečistiti bilo kojim postupkom poznatim u tehnici za prečišćavanje proteina. Jednom izolovano, anti-CCR8 antitelo se može dalje prečistiti.

7.3. Sastavi

Antitela kao što su definisana u patentnim zahtevima mogu biti obezbeđena kao sastav pogodan za davanje subjektu. U nekim otelotvorenjima, sastav antitela je farmaceutski sastav, koji sadrži antitelo prema ovom obelodanjivanju i farmaceutski prihvatljiv nosač.

U jednom otelotvorenju, obezbeđen je farmaceutski sastav koji sadrži mnoštvo anti-CCR8 antitela i farmaceutski prihvatljiv nosač, kao što je definisano u patentnim zahtevima. Mnoštvo anti-CCR8 antitela farmaceutskog sastava je afukozilovano. Tipično, mnoštvo antitela je 80% ili više, 90% ili više, ili oko 99% ili oko 100% afukozilovano. Poželjno, stepen afukozilacije je jednak ili veći od 90%. U nekim otelotvorenjima, mnoštvo antitela je 80% ili više, 90% ili više, ili oko 100% afukozilovano na poziciji ASN-300 (EU: ASN-297). Stepen afukozilacije antitela može se odrediti pomoću tehnika poznatih u predmetnoj oblasti. Afukozilacija se može odrediti pomoću tehnika ispitivanja hidrofilne interakcijske hromatografije (HILIC), u kojima se stepen afukozilacije određuje odvajanjem fragmentovanih antitela zavisnim od polariteta. U jednom otelotvorenju, ukupne afukozilovane glikanske vrste se određuju analizom oslobođenih N-vezanih glikana pomoću HILIC-a sa fluorescentnom detekcijom. Glikani se oslobađaju korišćenjem peptida N-glikozidaze F (PNGaseF) i zatim se obeležavaju fluorescentnom oznakom. Fluorescentno obeleženi N-vezani glikani se analiziraju pomoću HILIC-a sa detekcijom fluorescencije. Procenat afukozilovanih glikanskih vrsta se određuje na osnovu zbira površina na vrhuncu svih vrhunaca afukozilovanih glikana u odnosu na ukupne površine na vrhuncu svih vrhunaca glikana u hromatogramu. Svi vrhunci sa relativnom zastupljenošću od 0,5% ili više uključeni su u određivanje procenta afukozilovanih glikanskih vrsta.

7.4. Sažetak svojstava subjektnih antitela

Osobine predmetnih antitela, kao primer, ali bez ograničenja na ABBV-514, uključuju sledeće:

Vezanje visokog afiniteta za CCR8, na primer, FACS srednja vrednost vezanja EC50 od 2 µg/ml ili niže, 1 µg/ml ili niže, od 0,3 do 0,7 µg/ml, 0,4 do 0,6 µg/ml, oko 0,5 µg/ml, ili 0,55 µg/ml određeno sa endogeno izraženim CCR8 na TALL-1 ćelijama (ljudski odrasli T-ALL; RRID: CVCL 1736); ili FACS srednja vrednost vezanja EC50 za ljudski CCR8 prekomerno izražen na Jurkat ćelijama od 2 µg/ml ili niže, 1 µg/ml ili niže, od 0,3 do 0,8 µg/ml, 0,4 do 0,7 µg/ml, oko

0,5 µg/ml 0,6 µg/ml; ili FACS srednja vrednost vezanja EC50 za CCR8 izražena na CD45RA niskim Treg-ovima u ljudskoj krvi od 2 µg/ml ili niže, 1 µg/ml ili niže, od 0,2 do 0,6 µg/ml, 0,3 do 0,5 µg/ml, oko 0,5 µg/ml, ili 0,48 µg/ml.

Visoka specifičnost vezanja za ljudski CCR8, npr. nema specifičnog FACS vezanja za TALL-1 CCR8 nokaut ćelije ili roditeljske Jurkat ćelije.

Unakrsna reaktivnost sa cinomolgus CCR8, npr. FACS srednja vrednost vezanja EC50 za cino CCR8 prekomerno izražena na Jurkat ćelijama od 5 µg/ml ili niže, 3 µg/ml ili niže, 2 µg/ml ili niže, približno 1,5 µg/ml, ili 1,82 µg/ml; ili za CCR8 izražen na CD45RA niskim Treg-ovima u cino krvi od 5 µg/ml ili niže, 3 µg/ml ili niže, 2 µg/ml ili niže, približno 1,5 µg/ml ili 1,62 µg/ml.

Slaba sposobnost blokiranja interakcije CCL1/CCR8, npr. EC50 CCL1/CCR8 blokirajuće aktivnosti najmanje 30x veća, najmanje 40x veća, između 30x i 70x veća, najmanje 50x veća, ili najmanje oko 50x veća od EC50 vezanja za ljudski CCR8.

Pojačana sposobnost indukcije ADCC u odnosu na antitelo sa istim promenljivim regionima i divljim tipom, fukozilovanim IgG1.

Pojačano vezivanje za Fci receptore u odnosu na antitelo sa istim promenljivim regionima i divljim tipom, fukozilovanim IgG1.

Dobra imunološka sigurnost određena testom oslobađanja citokina.

7.5. Postupci korišćenja

Antitelo kao što je definisano u patentnim zahtevima može se koristiti za tretiranje pacijenata koji imaju solidne tumore. Sastav koji sadrži anti-CCR8 antitela može se davati subjektu kome je to potrebno.

U PD-1 vatrostalnom Pan02 modelu miša, kombinacija CCR8 i PD-1 ciljanih antitela pokazala je poboljšanu efikasnost in vivo u odnosu na monoterapiju sa bilo kojim od antitela. Iscrpljivanje imunosupresivnih CCR8+ Tregova može sinergovati sa blokadom PD-1/PD liganda 1 (PD-L1) da bi se promovisao jači CD8+ efektorski T-ćelijski odgovor i pojačao anti-tumorski imunitet. U jednom aspektu, sastav koji sadrži anti-CCR8 antitela se primenjuje kao deo kombinovane terapije koja sadrži primenu PD-1 ili PD-L1 ciljanog antitela. U jednom otelotvorenju, sastav koji sadrži anti-CCR8 antitela se primenjuje kao kombinovana terapija sa pembrolizumabom, budigalimabom, nivolumabom, cemiplimabom ili dostarlimabom. U jednom otelotvorenju, sastav koji sadrži anti-CCR8 antitela se primenjuje kao kombinovana terapija sa atezolizumabom, avelumabom, durvalumabom.

8. Primeri

Sledeći primeri, koji naglašavaju određene karakteristike i svojstva primernih otelotvorenja antitela i vezajućih fragmenata opisanih ovde, obezbeđeni su u svrhu ilustracije.

8.1. Primer 1: Proizvodnja hibridoma pacova

Pacovi su imunizovani sa 2 različita ljudska CCR8 cDNK vektora pune dužine (6 pacova za svaki vektor). Ćelije limfnih čvorova su izolovane i spojene sa NS0 da bi se generisali hibridomi. Nakon ekspanzije, supernatanti hibridoma su testirani na vezanje za ljudski ili cinomolgus („cino“ ili „ci“) CCR8 prekomerno izražen na ćelijama HEK293.46 rat/hIgG1 himernih mAb je izraženo kroz proizvodnju antitela visoke propusnosti, a za 21 je potvrđeno da se vežu za humani CCR8 (SL.1). Četiri himerna mAbs AC-254290, AC-254532, AC-254546 i AC-254259 su odabrana za punu humanizaciju na osnovu najveće cino unakrsne reaktivnosti u Jurkat CCR8 linijama prekomernog izraza.

8.2. Primer 2: Mapiranje epitopa putem vezanja konkurencije za huCCR8

Odabrana himerna antitela su testirana na vezanje za ljudski CCR8 na Jurkat ćelijama kroz testove mapiranja ćelijskog epitopa zajedno sa ljudskim CCR8 antitelima iz BD Biosciences (klon 433H) i Biolegend (klon L263G8).

Prijavljeno je da su oba komercijalna antitela nastala imunizacijom miševa ljudskim CCR8 transfektantima, i nijedno nije unakrsno reaktivno sa cino CCR8. Antitela su testirana u paru sa ćelijama obojenim zasićenim koncentracijama antitela 1, isprane, a zatim obojene antitelom 2 ili obrnuto.

mAbs AC-254290 i AC-254532 ometaju vezanje u bilo kom redosledu što sugeriše da se vežu za isti epitop (Epitop A) (SL.2). AC-254546 pokazuje umerenu interferenciju vezanja epitopa sa AC-254290 i AC-254532, ali nema dokaza vezanja za isti epitop; stoga se AC-254546 veže za epitop B koji je jedinstven, ali blizak epitopu A. AC-254259 nije imao interferencije vezanja ni sa jednim drugim antitelom i verovatno je jedinstven epitop (epitop C). BD Biosciences klon 433H je imao isto vezanje epitopa kao AC-254290 i izvesno vezanje interferencije sa AC-254532, AC-254546 i Biolegend klonom L263G8, pa je stoga povezan sa epitopom A. Na osnovu podataka o interferenciji sa BD Bioscience klonom 433H i drugim antitelima, Biolegend klon L263G8 se veže kao epitop D, koji je jedinstven, ali blizak epitopu A, ali ne i epitopu B.

8.3. Primer 3: Humanizacija himera promenljivog domena pacova/ljudskih IgG1 Fc

Četiri himerna antitela AC-254290, AC-254532, AC-254546 i AC-254259 su humanizovana (i) identifikacijom sekvence antitela glodara; (ii) identifikacijom CDR-ova i okvira antitela; (iii) kreiranjem VH-VL strukturnog modela; (iv) identifikacijom okvirnog taloga za povratnu mutaciju, da bi se održala funkcija antitela glodara; (v) odabirom ljudskih zametnih linija sa visokim identitetom, najsličnijim kanonskim strukturama CDR-a i najmanje potrebnim povratnim mutacijama. i (iv) generisanjem VH/VL sekvence CDR kalemljenjem i inkorporiranje odabranih povratnih mutacija.

Četiri humanizovana antitela su stvorena za svako odabrano antitelo. AC-254290 je zahtevao i pristup zasnovan na sekvenci i na strukturi za humanizaciju. Pravo CDR kalemljenje je dovelo do slabog vezanja antitela za ljudske CCR8 koje izražavaju Jurkat ćelije. Testirane su povratne mutacije zasnovane na predviđenoj VH/VL strukturi/interfejsu glodara. Triplet taloga pre HCDR3 je bio CTA, što je netipično. Pozicija 94 (A u CTA) je skoro uvek arginin (R). Dve humanizovane verzije sa CTR su pokazale slabo vezanje za ljudske CCR8 koje izražavaju Jurkat ćelije, sa EC50 od 3,96 i 5,61 µg/ml. Nasuprot tome, dve humanizovane verzije sa CTA pre HCDR3 (CTAGDRNKPFAI (SEQ ID NO: 14)), od kojih je jedna AC-264700, pokazale su snažno vezanje, sa EC50 od 0,2559 i 0,2302 µg/ml, u poređenju sa AC-254290 roditeljskim antitelom (EC50 od 0,4538 µg/ml).

Humanizovana antitela su procenjena na njihovu sposobnost da vežu ljudski ili cinomolgus CCR8. EC50 je određen testiranjem 8 koncentracija antitela počevši od 30 µg/ml sa 5x razblaženja za vezanje za ljudske ili cinomolgus CCR8 ćelije koje prekomerno izražavaju Jurkat ćelije. Posle inkubacije sa testnim CCR8 antitelima, ćelije su isprane i inkubirane sa sekundarnim antitelima obeleženim fluorohromom, isprane i analizirane protočnom citometrijom.

AC-254259 i AC-254532 su pokazali smanjeno vezanje za cinoCCR8 i visoko nespecifično vezanje za ćelije HEK293, respektivno. ljudskiAC-264711 (humanizovani AC-254546) i AC-264700 (humanizovani AC-254290) su bili napredni zbog njihovog superiornog ciljnog vezanja, odsustva nespecifičnog vezanja i ograničenih zahteva za inženjering odgovornosti.

8.4. Primer 4: Inženjering odgovornosti AC-264700

AC-264700 je imao DS motive u HCDR2 i LCDR1 na aminokiselinama 61–62 i 27–28, respektivno (kabat) koji predstavljaju rizik od izomerizacije i DP motiv na pozicijama aminokiselina 94–95 (kabat) u LCDR3 koji ga je napravio podložnim potencijalnoj fragmentaciji. Odgovornost HCDR2 DS je mutirana u DA na osnovu iskustva sa prethodnim antitelima. Uklanjanje DP motiva je poremetilo vezanje, ali fragmentacija antitela koja zadržavaju DP motiv nije se manifestovala pod stresnim testiranjem. Stvorena su 22 LCDR1 DS varijantna antitela, a njihova svojstva vezanja su procenjena korišćenjem protočne citometrije protiv prekomerno izraženih huCCR8 ili ciCCR8 Jurkat ćelija. Nespecifično vezanje za Jurkat roditeljske ćelije je procenjeno protočnom citometrijom. Deset varijanti antitela je odabrano za dalju karakterizaciju na osnovu povoljnih funkcionalnih svojstava i svojstava sličnih lekovima. Dva su izabrana za napredak na osnovu njihove ukupne kombinacije svojstava, uključujući vezanje, smanjenu samointerakciju, nedostatak nespecifičnosti, cino unakrsnu reaktivnost i aktivnost u ADCC reporterskom biotestu hFciRIIIa V varijante (Promega).

Kandidatski molekuli su procenjeni na kapacitet vezanja korišćenjem protočne citometrije putem poznatih postupaka protiv prekomerno izraženog huCCR8 ili ciCCR8 na površini Jurkat ćelija. Primeri antitela su testirani na njihovu sposobnost samointerakcije, vezanja za huCCR8 i ciCCR8, kapaciteta za ADCC korišćenjem reporterskog biotesta i nespecifičnog vezanja za ćelije HEK293. AC-277357 je imao superiorni kapacitet vezanja i za huCCR8 i za ciCCR8 Jurkat ćelije u poređenju sa roditeljskim i drugim kandidatskim antitelima (Tabela 1). AC-SINS rezultati samointerakcije za svakog kandidata bili su <1. Pri 100 µg/ml, maksimumi nespecifičnog vezanja su se kretali od 97 do 144 GMFI. Pri 10 µg/ml, maksimumi nespecifičnog vezanja su se kretali od 94 do 111 GMFI. Pri 1 µg/ml, maksimumi nespecifičnog vezanja su se kretali od 87 do 102 GMFI. AC-277357 je imao najniži maksimum nespecifičnog vezanja za ćelije HEK293 pri 100 µg/ml, najjače vezanje za huCCR8 i ciCCR8 Jurkat ćelije i najveći stepen indukcije sa huCCR8 i ciCCR8 Jurkat ciljnim ćelijama u ADCC reporterskom biotestu. Dodatno, AC-277357 je imao jedan od najnižih rezultata samointerakcije u poređenju sa roditeljskim antitelom.

Tabela 1: Poređenje AC-264700 varijanti

8,5 Primer 5: Inženjering odgovornosti AC-264711

AC-264711 je imao NS motiv na aminokiselinama 60–61 (kabat) u HCDR2 regionu, što je predstavljalo rizik za deaminaciju. Dodatno, talog M100c u HCDR3 pokazao je visok nivo oksidacije tokom stresnog testiranja.

Kandidatne AC-264711 varijante sa NS mutacijama za uklanjanje obaveza testirane su na njihov kapacitet samointerakcije, da se nespecifično vežu za HEK293 ćelije, da se vežu za huCCR8 i ciCCR8 Jurkat ćelije i indukuju signal u ADDC reporterski biotest sa huCCR8 koji izražavaj Jurkat ćelije kao ciljeve.

Uklanjanje NS motiva se tolerisalo. Stvoreno je 29 NS varijanti, a njihova svojstva vezanja su procenjena korišćenjem protočne citometrije protiv Jurkat roditeljskih ćelija i prekomerno izraženih huCCR8 ili ciCCR8 Jurkat ćelija. Pet antitela sa najboljim profilima vezanja i svojstava sličnih lekovima je testirano u ADCC reporterskom biotestu, a tri antitela sa najboljom kombinacijom svojstava, AC-275889, AC-275896 i AC-275898, unapređena su za M100c mutacije kako bi se sprečila oksidacija.

Varijante AC-275889, AC-275896 i AC-275898 sa M100c mutacijama su generisane i testirane u istim testovima kao i NS mutanti. Podaci iz ovih testova su korišćeni za određivanje prioriteta osam antitela za testiranje svojstava sličnih lekovima. AC-291774 i AC-291790 su imali najviše rezultate AC-SINS za samointerakciju sa 8,38 i 6,75, respektivno. Preostali kandidati su imali uporedive AC-SINS rezultate u rasponu od 1,73 do 2,79. AC-275896 i AC-275898 su imali najveće nespecifično vezanje za ćelije HEK293 na 1780 i 1065, GFMI respektivno. AC-291790, AC-275889 i AC-275898 su imali nespecifične maksimume vezanja od 335, 148 i 141, respektivno. Pri 10 i 1 µg/ml, svi kandidatski molekuli su imali uporedive maksimume nespecifičnog vezanja u rasponu od 61 do 67 i 57 do 60, respektivno. AC-291774 i AC-291790 su imali najniže nespecifično vezanje kao što je naznačeno vezanjem za Jurkat roditeljske ćelije i hromatografijom hidrofobne interakcije, dok su održavali snažno vezanje za huCCR8 i ciCCR8 koje izražavaju Jurkat ćelije i uporedivi EC50 i indukciju signala ADCC reporterskog biotesta pri čemu i huCCR8 i ciCCR8 izražavaju Jurkat ćelije u poređenju sa AC-275889, AC-275896 i AC-275898 (Tabela 2).

Tabela 2. In vitro testovi AC-264711 varijanti

8,6 Primer 6: Konačna selekcija kandidata za antitela

AC-277357, AC-277371, AC-291774 i AC-291790 su odabrani da budu dalje procenjeni u dodatnim svojstvima sličnim lekovima i in vitro eksperimentima imunobezbednosti. Da bi se stvorila afukozilovana varijanta za karakterizaciju, ćelije koje izražavaju AC-277357 su transfektovane plazmidom za izražavanje enzima Pseudomonas GDP-6-deoksi-D-likso-4-heksuloza reduktaze (RMD), koji konvertuje intermedijer u de novo sintezi fukoze u produkt ćorsokaka, što rezultira proizvodnjom afukozilovanog AC-277357.

Kandidatski molekuli su procenjeni na aktivnost vezanja Jurkat huCCR8, Jurkat ciCCR8 i TALL-1, hPBMC ADCC aktivnost sa TALL-1 kao ciljevima, ADCC aktivnost u F158 efektorskim ćelijama sa huCCR8 koji prekomerno izražava Jurkat ćelije kao ciljeve, i V158 efektorskim ćelijama sa huCCR8 koji prekomerno izražava Jurkat ćelije kao ciljeve. AC-277357 (koji se takođe naziva PR-1925514), pokazao je poboljšano vezanje za endogene nivoe izraza CCR8 na TALL-1 ćelijama i afukozilovana verzija je bila aktivnija u ADCC testovima primarnih ćelija (podaci nisu pokazani). AC-277357/PR-1925514 se snažnije veže za CCR8 na ljudskim Treg-ovima i ima bolji profil u testovima oslobađanja citokina od AC-291774 (koji se takođe naziva PR-1928444) (podaci nisu pokazani). AC-277357/PR-1925514 sa afukozilovanim ljudskim IgG1 Fc izabran je kao vodeće antitelo jer je imalo najbolji in vitro funkcionalni i in vitro imunobezbednosni profil (IVIS), kao i odlična svojstva slična leku.

8.7. Primer 7: Testovi vezanja i funkcionalne potencije

Antitela su pregledana protočnom citometrijom u jednoj tački da bi se procenilo vezanje za Jurkat ćelijske linije koje prekomerno izražavaju ljudski ili cinomolgus CCR8 majmuna. EC50 je određen testiranjem osam koncentracija antitela počevši od 30 µg/ml sa 5x razblaženja za vezanje za Jurkat ljudski CCR8, Jurkat cino CCR8 i roditeljske Jurkat ćelije putem protočne citometrije. Posle inkubacije sa testnim CCR8 antitelima, ćelije su isprane i inkubirane sa sekundarnim antitelima obeleženim fluorohromom, isprane i analizirane protočnom citometrijom.

Human FciRIIIa V Variant Core Kit ili Human FciRIIIa F Variant Cell Propagation Model su kupljeni od Promega i korišćeni prema uputstvima. Jurkat ciljne ćelijske linije koje prekomerno izražavaju CCR8 ljudskog ili cinomolgus majmuna ili roditeljske Jurkat kontrolne ćelije su jednom isprane u ADCC puferu za test, razblažene do 6 × 10<6>ćelija po ml u ADCC puferu za test i postavljene na 25 µl po jažici u testne ploče sa 96 jažica sa belim zidovima (Costar). Antitela su razblažena do 3x krajnje koncentracije u ADCC puferu za test za dodavanje sa 25 µl po jažici (testirana su razblaženja od 1:5 puta u 7 tačaka u rasponu od 1 µg/ml do 0,000064 µg/ml). Efektorske ćelije (koje stabilno izražavaju ili ljudsku FciRIIIa V158 varijantu, ljudsku varijantu FciRIIIa F158, ili mišji FcγRIV i element odgovora NFAT koji pokreće izraz luciferaze svitaca) su odmrznute i dodane u konačnom odnosu efektora i cilja od 1:2,5. Posle inkubacije na 37 °C, 5% CO2 tokom 6 sati, BioGlo reagens (Promega) je pomešan i dodat prema uputstvima i meren je signal luminiscencije.

8.8. Primer 8: Krive odnosa doze i efekta za ABBV-514

Fukozilovane i afukozilovane (preimenovane u ABBV-514) verzije AC-277357/PR-1925514 su procenjene na vezanje ćelija za Jurkat ćelijske linije koje prekomerno izražavaju ljudski ili cino CCR8 i za TALL-1 ćelije koje izražavaju endogene nivoe CCR8. Vezanje ćelija je procenjeno kroz protočnu citometriju korišćenjem sličnih postupaka razmatranih gore. Dodatno, procenjeno je vezanje za roditeljske Jurkat (bez izraza CCR8) i CCR8 nokaut (KO) TALL-1 kontrolne linije. ABBV-514 je pokazao vezanje i za ljudski i za cino CCR8 prekomerno izražen u Jurkat ćelijama, ali ne i za roditeljske Jurkat ili CCR8 KO TALL-1 ćelije (SL. 4A). ABBV-514 se takođe veže za endogeni CCR8 na TALL-1 ćelijama slično onom fukozilovanog (WT) AC-277357/PR-1925514 (SL.4B).

Oba fukozilovana WT PR-1925514 i ABBV-514 posreduju ADCC merenu luminiscencijom indukcije u ljudskom FciRIIIa biotestu zasnovanom na reporterskim ćelijama koristeći reporterske linije ili FciRIIIa V158 (SL.5A, 5C) ili F158 (SL.5B, 5D) alelnih varijanti koje su kultivisane sa Jurkat ćelijama koje prekomerno izražavaju ljudski (SL.5A, 5B) ili cino (SL.5C, 5D) CCR8. Stepen promene u luminiscenciji u poređenju sa netretiranim kokulturama je predstavljena kao srednja vrednost ± SEM za 2–5 nezavisnih eksperimenata. ABBV-514 je pokazao povećanu ADCC aktivnost kao što je naznačeno ADCC reporterskim biotestom u poređenju sa fukozilovanim WT PR-1925514. Za potrebe poređenja sa koncentracijama izraženim u µg/ml, koncentracija od 1 µg/ml antitela je 6,76 nM.

8.9. Primer 9: Podaci o ADCC testu primarne ćelije za ABBV-514

Aktivnost ABBV-514 je dalje procenjena u ADCC testu zasnovanom na ćelijskoj citotoksičnosti koristeći TALL-1 ćelije kao ciljeve i ljudske primarne NK ćelije kao efektore. Šest donatorskih izvora NK ćelija je korišćeno kao ciljne ćelije i ćelijska smrt TALL-1 ciljnih ćelija je procenjena pomoću protočne citometrije korišćenjem sličnih postupaka ramatranih gore. ABBV-514 posredovan ADCC-om CCR8 koji izražava TALL-1 ćelije sa svih šest uzoraka NK ćelija donatora (SL.6). ADCC aktivnost u ljudskim kulturama pune krvi je procenjena pomoću protočne citometrije korišćenjem prilagođenih procedura opisanih iznad. Posle 48 sati, analizirana je ljudska kultura pune krvi sa ABBV-514 da bi se procenila frakcija CD45RA niskih Treg-ova ukupnih CD45+ hematopoetskih ćelija. CD45RA niski Treg-ovi uključuju žive CD45+, CD3+, CD4+, CD25+, CD127 niske, Foxp3+, CD45RA niske ćelije, za koje je poznato da su obogaćene izrazom CCR8.

Procenjeni su podaci o ćelijama ljudske pune krvi od 11 zdravih donatora. Kod svakog donatora, ABBV-514 je smanjio procenat količine CD45RA niskih Treg-ova živih CD45+ ćelija (podaci nisu pokazani).

8.10. Primer 10: Procena blokade CCL1 liganda od strane ABBV-514

CCR8 beta-arestin reporterski test je korišćen da se utvrdi da li ABBV-514 blokira interakciju CCR8 sa njegovim ligandom, CCL1 (SL.7). Inhibicija aktivacije reportera posredovane CCL1 u prisustvu ABBV-514 primećena je samo pri znatno višim koncentracijama antitela od onih pri kojima je primećena aktivnost vezanja ili ADCC-a, sa EC50 blokade CCL1 primećenogna 23,1 µg/ml.

Claims (4)

PATENTNI ZAHTEVI

1. Anti-CCR8 antitelo koje sadrži (i) VH lanac koji sadrži tri CDR; i (ii) VL lanac koji sadrži tri CDR, pri čemu:

VH CDR#1 je GFIFSNAVMY (SEQ ID NO: 1);

VH CDR#2 je RIKTKFNNYATYYADAVKG (SEQ ID NO: 2);

VH CDR#3 je GDRNKPFAY (SEQ ID NO: 3);

VL CDR#1 je RASTSVITLLH (SEQ ID NO: 4);

VL CDR#2 je GASNLES (SEQ ID NO:5); i

VL CDR#3 je QQSWNDPYT (SEQ ID NO: 6);

pri čemu antitelo sadrži IgG1 Fc konstantni region koji je afukozilovan.

2. Anti-CCR8 antitelo prema patentnom zahtevu 1, pri čemu antitelo sadrži promenljivi region teškog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina navedenu kao SEQ ID NO: 7 i promenljivi region lakog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina navedenu kao SEQ ID NO: 8.

3. Anti-CCR8 antitelo prema patentnom zahtevu 1, pri čemu antitelo sadrži teški lanac koji sadrži sekvencu aminokiselina navedenu kao SEQ ID NO: 9 i laki lanac koji sadrži sekvencu aminokiselina navedenu kao SEQ ID NO: 10.

4. Sastav koji sadrži mnoštvo anti-CCR8 antitela prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je više od 80% anti-CCR8 antitela u sastavu afukozilovano.