WO2024248037A1

WO2024248037A1 - Ｃｃｒ８を抗原として認識する二重特異性抗体

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Publication number: WO2024248037A1
Application number: PCT/JP2024/019695
Authority: WO
Inventors: 哲也吉田; 柾萩原; 美弥春名; 永也大倉; 志文坂口; 尚和田
Original assignee: Osaka University NUC; Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd; University of Osaka NUC
Priority date: 2023-05-30
Filing date: 2024-05-29
Publication date: 2024-12-05
Anticipated expiration: 2025-11-30

Abstract

ＣＣＲ８を抗原として認識する二重特異性抗体を開示する。該二重特異性抗体が、ＣＣＲ８発現細胞に対して細胞傷害活性を有することを見出した。

Description

ＣＣＲ８を抗原として認識する二重特異性抗体

　本発明は、ＣＣＲ８を抗原として認識する二重特異性抗体及び該二重特異性抗体を含有する医薬組成物に関する。

　ＣＣＲ８はＣＹ６、ＣＫＲ―Ｌ１又はＴＥＲ１とも呼ばれていた胸腺や脾臓等で発現しているＧ蛋白共役型７回膜貫通型のＣＣケモカイン受容体タンパク質であり、その遺伝子はヒトクロモゾームでは３ｐ２１に存在する。ヒトＣＣＲ８は３５５アミノ酸からなる（非特許文献１）。ＣＣＲ８に対する内因性リガンドとしてはＣＣＬ１が知られている（非特許文献２）。ヒトＣＣＲ８　ｃＤＮＡはＧｅｎｂａｎｋ　ＡＣＣ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００５２０１．３に示される塩基配列で構成され、マウスＣＣＲ８　ｃＤＮＡはＧｅｎｂａｎｋ　ＡＣＣ　Ｎｏ．ＮＭ＿００７７２０．２に示される塩基配列で構成される。

　ＣＣＲ８は、腫瘍内浸潤Ｔｒｅｇ細胞に特異的に発現しており、ＣＣＲ８欠損マウスと野生型マウスに乳癌細胞を移植したところ、ＣＣＲ８欠損マウスにおける乳癌の増殖と転移が野生型マウスと比較して抑制されていたことが示されている（特許文献１及び非特許文献３）。非特許文献４～８にも、ＣＣＲ８が癌の病態に関与していることが記載されている。さらに、抗ＣＣＲ８抗体を癌モデル動物に投与することにより抗腫瘍効果を示したことが開示されている（特許文献２～２４及び３１～４８）。

　また、多くの血液癌やメラノーマでは、腫瘍細胞自体にＣＣＲ８が発現していることが開示されている（特許文献２５及び２６、非特許文献９～１１）。しかし、腫瘍細胞にＣＣＲ８が発現している癌に対する抗ＣＣＲ８抗体の治療効果は、これまでに実験結果としては具体的に示されていない。

　腫瘍細胞の表面マーカーとエフェクター細胞の表面マーカーを認識する二重特異性抗体は癌治療に有用であることが知られている（非特許文献１２）。該二重特異性抗体は、標的細胞とエフェクター細胞を結びつけることにより、エフェクター細胞により標的細胞に対して強い細胞傷害活性を示す。Ｔ細胞の表面マーカーであるＣＤ３を認識する二重特異性抗体の例としては、特許文献２７～２９に開示されている。また、ＮＫ細胞の表面マーカーであるＣＤ１６を認識する二重特異性抗体の例としては、特許文献３０に開示されている。

　しかし、ＣＣＲ８を抗原として認識する二重特異性抗体が癌治療に有用であることは、これまでに示されていない。また、腫瘍内浸潤Ｔｒｅｇ細胞の表面マーカーとエフェクター細胞の表面マーカーを認識する二重特異性抗体が癌治療に有用であることも、これまでに示されていない。ＣＣＲ８を抗原として認識する二重特異性抗体は特許文献２０に記載されているが、薬理活性については全く開示されていない。

米国特許第１００８７２５９号明細書国際公開第２０１８／１８１４２５号国際公開第２０１８／１１２０３２号国際公開第２０２０／１３８４８９号国際公開第２０２１／１４２００２号国際公開第２０２１／１５２１８６号国際公開第２０２１／１６３０６４号国際公開第２０２１／１７８７４９号国際公開第２０２１／１９４９４２号国際公開第２０２１／２６０２０８号国際公開第２０２１／２６０２０９号国際公開第２０２１／２６０２１０号国際公開第２０２２／０４２６９０号国際公開第２０２２／０７８２７７号国際公開第２０２２／０８１７１８号国際公開第２０２２／１１７５６９号国際公開第２０２２／１３６６４７号国際公開第２０２２／１３６６４９号国際公開第２０２２／１３６６５０号国際公開第２０２２／２５６５６３号国際公開第２０２２／２６８１９２号国際公開第２０２３／２８８２４１号国際公開第２０２３／０１００５４号国際公開第２０２３／０２０６２１号国際公開第２０２２／２００３０３号国際公開第２０１３／１３１０１０号国際公開第９９／５４４４０号国際公開第２０１６／１８２７５１号国際公開第２０１７／１３４１５８号国際公開第２０２０／０８１８４１号国際公開第２０２３／０９８８８８号国際公開第２０２３／１１６８８０号国際公開第２０２３／１３７４６６号国際公開第２０２３／１７４３９６号国際公開第２０２３／１９３７３２号国際公開第２０２３／２０６３５０号国際公開第２０２３／２０８１８２号国際公開第２０２４／００８１１０号国際公開第２０２４／０４０２１６号国際公開第２０２４／０５９９０９号国際公開第２０２４／０６２０１９号国際公開第２０２４／０６２０７２号国際公開第２０２４／０６２０７６号国際公開第２０２４／０６２０８２号国際公開第２０２４／０７６５１４号国際公開第２０２４／０８６６８４号国際公開第２０２４／０８８３４６号国際公開第２０２４／０９４００３号

J. Immunol.、１９９６年、第１５７巻、第７号、p.2759-63 J. Biol. Chem.、１９９７年、第２７２巻、第２８号、p.17251-4 Cancer Res.、２０１６年、第７６巻、第４号、Supp.1, P4-04-11 Immunity、２０１６年、第４５巻、p1122-1134 Immunity、２０１６年、第４５巻、p1135-1147 Proc. Natl. Acad. Sci. USA、２０１８年、第１１５巻、第４５号、p10672-10681 Targeting of CCR8 induces antitumor activity as a monotherapy that is further enhanced in combination with a Listeria-based immunotherapy, ASCO 2018, Daniel O Villarreal, et al. https://www.advaxis.com/wp-content/uploads/2018/04/KeystonePosterCCR8-combo-posterFINAL.pdf Cancer Res.、２０１８年、第７８巻、第１８号、p5340-5348 Leuk. Lymphoma.、２００６年、第４７巻、第１０号、p2163-73 Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol.、２０１５年、第２３巻、第８号、p580－589 Modern Pathology、２０１３年、第２６巻、p182－194 Exp. Hematol.、２０２１年、10:56

　本発明の目的は、ＣＣＲ８を抗原として認識する二重特異性抗体を提供することである。さらには、癌の治療及び予防に有用な、ＣＣＲ８を抗原として認識する二重特異性抗体を提供することである。

　本発明者らは、鋭意研究の結果、ＣＣＲ８を抗原として認識する二重特異性抗体を見出した。さらに、本発明のＣＣＲ８を抗原として認識する二重特異性抗体が抗腫瘍効果を示すことを見出した。すなわち、本発明のＣＣＲ８を抗原として認識する二重特異性抗体は、癌の治療及び予防に有用である。

　本発明は、以下に関する。
（１）抗ＣＣＲ８抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む抗ＣＣＲ８－ｓｃＦｖ領域、並びに、
エフェクター細胞の表面マーカーを認識する抗体の軽鎖又は重鎖の可変領域を１以上含む領域
を含む、二重特異性抗体。
（２）抗ＣＣＲ８－ｓｃＦｖ領域が、
１）配列番号５７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号５８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号５９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号６０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号６１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号６２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
２）配列番号５７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号６３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号５９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号６４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号６１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号６５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
３）配列番号６６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号６７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号６８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号６９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号７０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号７１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
４）配列番号７２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号６７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号７３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号７４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号７５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号７６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；又は
５）配列番号７７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号７８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号７９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号８０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号８１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号８２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域
を含む、（１）記載の二重特異性抗体。
（３）抗ＣＣＲ８－ｓｃＦｖ領域が、
１）配列番号４５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号４６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
２）配列番号４７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号４８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
３）配列番号４９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号５０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
４）配列番号５１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号５２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
５）配列番号５３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号５４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；又は
６）配列番号５５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号５６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
を含む、（１）記載の二重特異性抗体。
（４）抗ＣＣＲ８－ｓｃＦｖ領域において、軽鎖可変領域と重鎖可変領域が配列番号２のリンカー配列を介して連結している、（１）～（３）のいずれか一項記載の二重特異性抗体。
（５）Ｎ末端にＣＤ８Ａシグナル配列領域が連結されている、（１）～（４）のいずれか一項記載の二重特異性抗体。
（６）ＣＤ８Ａシグナル配列領域が抗ＣＣＲ８－ｓｃＦｖ領域のＮ末端側に存在する、（５）記載の二重特異性抗体。
（７）ＣＤ８Ａシグナル配列領域が配列番号１のアミノ酸配列を有する、（５）または（６）記載の二重特異性抗体。
（８）抗ＣＣＲ８－ｓｃＦｖ領域が配列番号３９～４４のいずれかのアミノ酸配列を有する、（１）～（７）のいずれか一項記載の二重特異性抗体。
（９）エフェクター細胞がＴ細胞である、（１）～（８）のいずれか一項記載の二重特異性抗体。
（１０）Ｔ細胞の表面マーカーがＣＤ３であり、ＣＤ３を認識する抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域を含む、（９）記載の二重特異性抗体。
（１１）抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域が、
１）配列番号１６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号１７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号１８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号１９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号２０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号２１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
２）配列番号２２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号２３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号２４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号２５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号２６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号２７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
３）配列番号２８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号２９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号３０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号３１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号３２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号３３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；又は
４）配列番号８７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号８８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号８９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号９０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号９１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号９２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域
を含む、（１０）記載の二重特異性抗体。
（１２）抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域が、
１）配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
２）配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
３）配列番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；又は
４）配列番号８５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号８６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域
を含む、（１０）記載の二重特異性抗体。
（１３）抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域が配列番号７、８、９又は８４のアミノ酸配列を有する、（１０）記載の二重特異性抗体。
（１４）Ｔ細胞の表面マーカーがＣＤ３であり、ＣＤ３を認識するＶＨＨ抗体の重鎖可変領域を含む抗ＣＤ３－ＶＨＨ領域を含む、（９）記載の二重特異性抗体。
（１５）エフェクター細胞がＮＫ細胞である、（１）～（８）のいずれか一項記載の二重特異性抗体。
（１６）ＮＫ細胞の表面マーカーがＣＤ１６であり、ＣＤ１６を認識する抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む抗ＣＤ１６－ｓｃＦｖ領域を含む、（１５）記載の二重特異性抗体。
（１７）ＮＫ細胞の表面マーカーがＣＤ１６であり、ＣＤ１６を認識するＶＨＨ抗体の重鎖可変領域を含む抗ＣＤ１６－ＶＨＨ領域を含む、（１５）記載の二重特異性抗体。
（１８）抗ＣＤ１６－ＶＨＨ領域が、
配列番号３５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号３６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号３７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域
を含む、（１７）記載の二重特異性抗体。
（１９）抗ＣＤ１６－ＶＨＨ領域が配列番号３４のアミノ酸配列を有する、（１７）記載の二重特異性抗体。
（２０）抗ＣＣＲ８抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む抗ＣＣＲ８－ｓｃＦｖ領域と、エフェクター細胞の表面マーカーを認識する抗体の軽鎖又は重鎖の可変領域を１以上含む領域が、配列番号３～６のいずれかのｓｃＦｖリンカー配列を介して連結している、（１）～（１９）のいずれか一項記載の二重特異性抗体。
（２１）Ｃ末端に配列番号３８のアミノ酸配列を有するヒスチジンタグが付加している、（１）～（２０）のいずれか一項記載の二重特異性抗体。
（２２）Ｆｃ領域を有する、（１）～（２１）のいずれか一項記載の二重特異性抗体。
（２３）（１）～（２２）のいずれかに記載の二重特異性抗体を含有する医薬組成物。
（２４）癌を治療するために用いる、（２３）記載の医薬組成物。
（２５）ＣＣＲ８を発現する腫瘍内浸潤Ｔｒｅｇ細胞の除去作用を有する、（２４）記載の医薬組成物。
（２６）腫瘍細胞にＣＣＲ８が発現していない癌を治療するために用いる、（２４）記載の医薬組成物。
（２７）腫瘍細胞にＣＣＲ８が発現している癌を治療するために用いる、（２４）記載の医薬組成物。
（２８）（１）～（２２）のいずれかに記載の二重特異性抗体のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
（２９）（２８）記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。

　本発明のＣＣＲ８を抗原として認識する二重特異性抗体は抗腫瘍効果を有するので、医薬品、特に、癌の治療及び予防のための医薬として非常に有用である。

ＰＢＭＣをエフェクター細胞とする、ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体のヒトＣＣＲ８発現細胞に対する細胞傷害活性。ヒトＣＣＲ８発現Ｒａｔ－１細胞（ｈＣＣＲ８／Ｒａｔ－１細胞）を標的細胞として用いて評価した。未刺激ＰＢＭＣをエフェクター細胞とする、ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体のヒトＣＣＲ８発現細胞に対する細胞傷害活性。ホタルルシフェラーゼ発現ｈＣＣＲ８／Ｒａｔ－１細胞（ｈＣＣＲ８／ＦＬｕｃ／Ｒａｔ－１細胞）を標的細胞として用いて評価した。ＣＤ８陽性Ｔ細胞をエフェクター細胞とする、ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体の濃度依存的なヒトＣＣＲ８発現細胞に対する細胞傷害活性。ｈＣＣＲ８／ＦＬｕｃ／Ｒａｔ－１細胞を標的細胞として用いて評価した。ヒト成人Ｔ細胞白血病リンパ腫（ＡＴＬＬ）細胞株におけるＦｏｘｐ３及びＣＣＲ８発現解析。ＡＴＬＬ細胞株としてはＡＴＮ－１細胞を用いた。ＣＤ８陽性Ｔ細胞をエフェクター細胞とする、ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体のＡＴＬＬ細胞株に対する細胞傷害活性。ホタルルシフェラーゼ発現ＡＴＮ－１細胞（ＦＬｕｃ／ＡＴＮ－１細胞）を標的細胞として用いて評価した。なお、図中、「Ｂ１」、「Ｂ２」、「Ｂ３」、「Ｂ４」、「Ｂ５」、「Ｂ６」は、それぞれＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体のＢ１－ＣＤ３－１、Ｂ２－ＣＤ３－１、Ｂ３－ＣＤ３－１、Ｂ４－ＣＤ３－１、Ｂ５－ＣＤ３－１、Ｂ６－ＣＤ３－１を意味する。ＣＤ８陽性Ｔ細胞をエフェクター細胞とする、ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体の濃度依存的なＡＴＬＬ細胞株に対する細胞傷害活性。ＦＬｕｃ／ＡＴＮ－１細胞を標的細胞として用いて評価した。Ｊｕｒｋａｔ細胞をエフェクター細胞とする、ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体のＮＦＡＴ活性化能。ＦＬｕｃ／ＡＴＮ－１細胞を標的細胞として用いて評価した。該Ｊｕｒｋａｔ細胞は、ＮＦＡＴプロモーターの下流にＬｕｃｉａルシフェラーゼ遺伝子を連結した遺伝子を導入しているため、ＮＦＡＴ活性化によりＬｕｃｉａルシフェラーゼが発現する。ＰＢＭＣをエフェクター細胞とする、抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域が異なるＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体のヒトＣＣＲ８発現細胞に対する細胞傷害活性。ｈＣＣＲ８／ＦＬｕｃ／Ｒａｔ－１細胞を標的細胞として用いて評価した。ＰＢＭＣをエフェクター細胞とする、ｓｃＦｖリンカーの長さが異なるＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体のヒトＣＣＲ８発現細胞に対する細胞傷害活性。ｈＣＣＲ８／ＦＬｕｃ／Ｒａｔ－１細胞を標的細胞として用いて評価した。ＣＤ８陽性Ｔ細胞をエフェクター細胞とする、ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体の成熟Ｔｒｅｇ細胞に対する細胞傷害活性。ヒトＰＢＭＣから分離したｎａｉｖｅ　Ｔｒｅｇ細胞を拡大培養して得た成熟Ｔｒｅｇ細胞を標的細胞として用いて評価した。なお、図中、「Ｂ５」、「Ｂ６」は、それぞれＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体のＢ５－ＣＤ３－１、Ｂ６－ＣＤ３－１を意味する。ＣＤ８陽性Ｔ細胞をエフェクター細胞とする、ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体のヒト腫瘍内浸潤Ｔｒｅｇ細胞に対する細胞傷害活性。卵巣癌患者由来の腫瘍内浸潤細胞を標的細胞として用い、アッセイ後の細胞を回収してフローサイトメトリー解析を行うことにより評価した。なお、図中、「Ｂ５」、「Ｂ６」は、それぞれＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体のＢ５－ＣＤ３－１、Ｂ６－ＣＤ３－１を意味する。ＣＤ８陽性Ｔ細胞をエフェクター細胞とする、ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体のＣＤ８陽性Ｔ細胞に対する細胞傷害活性。卵巣癌患者由来の腫瘍内浸潤細胞を標的細胞として用い、アッセイ後の細胞を回収してフローサイトメトリー解析を行うことにより評価した。なお、図中、「Ｂ５」、「Ｂ６」は、それぞれＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体のＢ５－ＣＤ３－１、Ｂ６－ＣＤ３－１を意味する。ＣＤ８陽性Ｔ細胞をエフェクター細胞とする、ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体のＣＤ４陽性Ｔｃｏｎｖ細胞に対する細胞傷害活性。卵巣癌患者由来の腫瘍内浸潤細胞を標的細胞として用い、アッセイ後の細胞を回収してフローサイトメトリー解析を行うことにより評価した。なお、図中、「Ｂ５」、「Ｂ６」は、それぞれＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体のＢ５－ＣＤ３－１、Ｂ６－ＣＤ３－１を意味する。ヒト末梢血由来ＮＫ細胞をエフェクター細胞とする、ＣＣＲ８－ＣＤ１６二重特異性抗体のヒトＣＣＲ８発現細胞に対する細胞傷害活性。ｈＣＣＲ８／ＦＬｕｃ／Ｒａｔ－１細胞を標的細胞として用いて評価した。なお、図中、「Ｂ１」、「Ｂ２」、「Ｂ３」、「Ｂ４」、「Ｂ５」、「Ｂ６」は、それぞれＣＣＲ８－ＣＤ１６二重特異性抗体のＢ１－ＣＤ１６－ＶＨＨ、Ｂ２－ＣＤ１６－ＶＨＨ、Ｂ３－ＣＤ１６－ＶＨＨ、Ｂ４－ＣＤ１６－ＶＨＨ、Ｂ５－ＣＤ１６－ＶＨＨ、Ｂ６－ＣＤ１６－ＶＨＨを意味する。ヒトＮＫ細胞株であるＫＨＹＧ－１細胞をエフェクター細胞とする、ＣＣＲ８－ＣＤ１６二重特異性抗体のＡＴＬＬ細胞株に対する細胞傷害活性。ＡＴＮ－１細胞を標的細胞として用いて評価した。ヒトＮＫ細胞株であるＫＨＹＧ－１細胞をエフェクター細胞とする、ＣＣＲ８－ＣＤ１６二重特異性抗体の成熟Ｔｒｅｇ細胞に対する細胞傷害活性。ヒトＰＢＭＣから分離したｎａｉｖｅ　Ｔｒｅｇ細胞を拡大培養して得た成熟Ｔｒｅｇ細胞を標的細胞として用いて評価した。ヒトＮＫ細胞株であるＫＨＹＧ－１細胞をエフェクター細胞とする、ｈＣＣＲ８／Ｒａｔ－１細胞及びＣＣＲ８を発現しないＲａｔ－１細胞に対する細胞傷害活性。マウス脾臓由来ＣＤ８陽性Ｔ細胞をエフェクター細胞とする、抗マウスＣＤ３－ｓｃＦｖ領域を含むＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体のヒトＣＣＲ８発現細胞に対する細胞傷害活性。ｈＣＣＲ８／ＦＬｕｃ／Ｒａｔ－１細胞を標的細胞として用いて評価した。マウス脾臓由来ＣＤ８陽性Ｔ細胞をエフェクター細胞とする、抗マウスＣＤ３－ｓｃＦｖ領域を含むＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体のヒトＣＣＲ８発現細胞に対する細胞傷害活性。ｈＣＣＲ８／ＦＬｕｃ／Ｒａｔ－１細胞を標的細胞として用いて評価した。最大殺傷率を１００％とした場合の比活性で示している。マウス脾臓由来ＣＤ８陽性Ｔ細胞をエフェクター細胞とする、抗マウスＣＤ３－ｓｃＦｖ領域を含むＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体の、ｈＣＣＲ８／Ｆｌｕｃ／Ｒａｔ－１細胞移植マウスにおける抗腫瘍活性。発光強度はｈＣＣＲ８／Ｆｌｕｃ／Ｒａｔ－１細胞数を反映している。ＰＢＭＣ及びＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体を腹腔内投与したｈＣＣＲ８／Ｆｌｕｃ／Ｒａｔ－１細胞移植マウスにおける抗腫瘍活性を、発光イメージングデータで示した。ＰＢＭＣをエフェクター細胞とする、ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体のｈＣＣＲ８／Ｆｌｕｃ／Ｒａｔ－１細胞移植マウスにおける抗腫瘍活性。発光強度はｈＣＣＲ８／Ｆｌｕｃ／Ｒａｔ－１細胞数を反映している。ＰＢＭＣ及びＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体を腹腔内投与したＦＬｕｃ／ＡＴＮ－１細胞移植マウスにおける抗腫瘍活性を、発光イメージングデータで示した。ＰＢＭＣをエフェクター細胞とする、ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体のＦＬｕｃ／ＡＴＮ－１細胞移植マウスにおける抗腫瘍活性。発光強度はＦＬｕｃ／ＡＴＮ－１細胞数を反映している。ＰＢＭＣをエフェクター細胞とする、ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体のＦＬｕｃ／ＡＴＮ－１細胞移植マウスにおける抗腫瘍活性。発光強度はＦＬｕｃ／ＡＴＮ－１細胞数を反映している。ＰＢＭＣをエフェクター細胞とする、ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体及びＣＤ３－ＣＣＲ８二重特異性抗体のＡＴＬＬ細胞株に対する細胞傷害活性。ＦＬｕｃ／ＡＴＮ－１細胞を標的細胞として用いて評価した。ＰＢＭＣをエフェクター細胞とする、ｓｃＦｖリンカーの長さが異なるＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体のヒトＣＣＲ８発現細胞に対する細胞傷害活性。ｈＣＣＲ８／ＦＬｕｃ／Ｒａｔ－１細胞を標的細胞として用いて評価した。ＰＢＭＣをエフェクター細胞とする、Ｆｃ領域を付加したＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体のヒトＣＣＲ８発現細胞に対する細胞傷害活性。ｈＣＣＲ８／ＦＬｕｃ／Ｒａｔ－１細胞を標的細胞として用いて評価した。ＰＢＭＣをエフェクター細胞とする、Ｆｃ領域を付加したＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体のＡＴＬＬ細胞株に対する細胞傷害活性。ＦＬｕｃ／ＡＴＮ－１細胞を標的細胞として用いて評価した。特許文献２０に基づいたＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体とのＮＦ－ＡＴプロモーター誘導活性の比較。特許文献２０に基づいたＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体とのｈＣＣＲ８／ＦＬｕｃ／Ｒａｔ－１細胞に対する細胞傷害活性の比較。特許文献２０に基づいたＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体とのＦＬｕｃ／ＡＴＮ－１細胞に対する細胞傷害活性の比較。

　本明細書において使用される用語は、特に言及する場合を除いて、当該分野で通常用いられる意味で用いられる。

　本発明の二重特異性抗体は、抗ＣＣＲ８抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む抗ＣＣＲ８－ｓｃＦｖ領域、並びに、エフェクター細胞の表面マーカーを認識する抗体の軽鎖又は重鎖の可変領域を１以上含む領域を含む。

　本発明の二重特異性抗体は、抗ＣＣＲ８抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む抗ＣＣＲ８－ｓｃＦｖ領域及びエフェクター細胞の表面マーカーを認識する抗体の軽鎖又は重鎖の可変領域を１以上含む領域のアミノ酸配列情報をもとに全体のアミノ酸配列を決定し、発現ベクターを構築することにより、該発現ベクターを用いて細胞等に発現させることによって得ることができる。発現ベクターには、任意のプロモーターを使用してもよい。

　本発明の二重特異性抗体を発現させる細胞としては、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞等の脊椎動物細胞、原核細胞、酵母等が挙げられる。形質転換体は、当業者に周知の方法に従って培養することができ、該培養により、形質転換体細胞内又は細胞外に本発明の二重特異性抗体が産生される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば、ＲＰＭＩ－１６４０培地やダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地に、必要に応じウシ胎児血清（ＦＣＳ）等の血清成分を添加したものを使用できる。当該培地には、ペニシリン、ストレプトマイシン、カナマイシンなどの抗生物質を適宜添加してもよい。また、薬剤選択のため、ジェネティシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシンなどの選択用抗生物質を適宜添加してもよい。該形質転換体の培養の際の培養温度は、細胞内のタンパク質合成能を著しく低下させない温度であればいずれでもよいが、好適には３２～４２℃、最も好適には３７℃で培養することが好ましい。また必要に応じて、１～１０％（ｖ／ｖ）の炭酸ガスを含む空気中で培養することができる。

　上記により細胞内又は細胞外に生産される本発明の二重特異性抗体を含む画分は、該タンパク質の物理的性質や化学的性質等を利用した各種公知の分離操作法により、分離・精製することができる。かかる方法としては、具体的には例えば通常のタンパク質沈澱剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種クロマトグラフィー、透析法、及びこれらの組み合わせ等を採用できる。該方法により、容易に高収率、高純度で本発明の二重特異性抗体を製造できる。

　抗ＣＣＲ８抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む抗ＣＣＲ８－ｓｃＦｖ領域とは、抗ＣＣＲ８抗体由来のｓｃＦｖ断片であって、該抗体と同様にＣＣＲ８に特異的に結合可能な領域を意味する。

　エフェクター細胞の表面マーカーを認識する抗体の軽鎖又は重鎖の可変領域を１以上含む領域とは、エフェクター細胞の表面マーカーを認識する抗体由来の断片であって、該抗体と同様にエフェクター細胞の表面マーカーに特異的に結合可能な領域を意味する。該領域は、例としてｓｃＦｖ、ＶＨＨ等の断片があげられるが、これらに限られない。

　ｓｃＦｖは、一本の重鎖可変領域（ＶＨ）と一本の軽鎖可変領域（ＶＬ）とを適当なリンカー配列（以下、Ｐと表記する）を用いて連結した、ＶＨ－Ｐ－ＶＬ又はＶＬ－Ｐ－ＶＨポリペプチドである。好ましくは、ＶＨ－Ｐ－ＶＬポリペプチドである。本発明で使用されるｓｃＦｖに含まれるＶＨ及びＶＬは、本発明に係る抗体のものであればよい。本発明で使用されるｓｃＦｖは、本発明に係る抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを用いて、ｓｃＦｖ発現ベクターを構築し、大腸菌、酵母又は動物細胞へ導入することにより発現させることによって製造することができる。

　ＶＨＨは、ラマ、ラクダ、アルパカ等のラクダ科動物等の動物から得られた重鎖のみで構成される抗体（ＶＨＨ抗体）における重鎖可変領域であり、ナノボディともいう。本発明で使用されるＶＨＨは、本発明に係るＶＨＨ抗体のＶＨＨをコードするｃＤＮＡを用いて、ＶＨＨ発現ベクターを構築し、大腸菌、酵母又は動物細胞へ導入することにより発現させることによって製造することができる。

　ｓｃＦｖ、ＶＨＨなど、ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨ又はＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲは、直接又は適当なリンカー配列を介して結合させることができる。本発明で使用されるＣＤＲを含むペプチドは、本発明に係るモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを用いて、ＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを動物細胞用発現ベクターに挿入し、該ベクターを大腸菌、酵母又は動物細胞へ導入することにより発現させることにより、製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ－ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によって製造することもできる。

　特異的結合は、少なくとも約１×１０^-6Ｍ又はそれ未満の平衡解離定数（例えば、Ｋｄが小さいほど、より緊密な結合を表す）を特徴とすることができる。Ｋｄ値は、好ましくは１×１０^-7Ｍ以下、より好ましくは１×１０^-8Ｍ以下、さらに好ましくは１×１０^-9Ｍ以下である。２つの分子が特異的に結合するかどうかを測定する方法は、当該技術分野で周知であり、競合ＥＬＩＳＡ法、表面プラズモン共鳴及び同様のものが挙げられる。

　抗ＣＣＲ８抗体は、当該分野で公知の抗体作製手法が利用可能である。例えば、Immunochemistry in Practice (Blackwell Scientific Publications)に記載された方法等が挙げられる。

　また、当該分野で公知の遺伝子操作的手法が利用可能である。例えば、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012),Current Protocols Essential Laboratory Techniques, Current Protocols (2012)に記載された方法等が挙げられる。

　ヒトＣＣＲ８のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｐ５１６８５に示されている（配列番号８３）。ヒトＣＣＲ８の膜外ドメインは、１～３５位アミノ酸からなるＮ末領域、９４～１０７位アミノ酸からなるｌｏｏｐ１領域、１７２～２０２位アミノ酸からなるｌｏｏｐ２領域、２６４～２８０位アミノ酸からなるｌｏｏｐ３領域が該当する。

　抗ＣＣＲ８抗体を産生するハイブリドーマは、ヒトＣＣＲ８タンパク質、ヒトＣＣＲ８の全長をコードする遺伝子、ヒトＣＣＲ８発現細胞等を免疫原として作製することができる。ヒトＣＣＲ８の全長をコードする遺伝子を免疫原とする場合は、例えば、該遺伝子を抗原としてＤＮＡ免疫したマウスの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞を融合させることにより、抗ＣＣＲ８抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。

　抗ＣＣＲ８抗体の一つの態様としては、本明細書記載のＣＤＲ又は重鎖可変領域／軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体が挙げられる。該抗体又は抗体断片は、免疫グロブリン分子の任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ若しくはＩｇＡ。好ましくは、ＩｇＧ。）又はサブクラス由来であり得、例えば、マウス、ラット、サメ、ウサギ、ブタ、ハムスター、ラクダ、ラマ、ヤギ又はヒトを含む任意の種から取得されてもよい。該抗体又は抗体断片として、好ましくは、マウス由来モノクローナル抗体又はヒト化モノクローナル抗体である。

　抗ＣＣＲ８抗体は、ＣＣＲ８とＣＣＲ８リガンドのいずれかとの結合を阻害することが特徴である。「ＣＣＲ８リガンド」とは、ＣＣＬ１、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１８等、ＣＣＲ８に結合する物質であれば特に限られないが、好ましくは、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１８であり、特に好ましくはＣＣＬ１である。

　ＣＣＲ８とＣＣＲ８リガンドの結合阻害能については、例えば、ヒトＣＣＬ１の場合、ヒトＣＣＲ８発現２９３細胞を用い、ヒトＣＣＬ１添加によるＣａ²⁺流入を測定し、ヒトＣＣＬ１非添加時のシグナルを阻害率１００％、ヒトＣＣＬ１添加及び抗体非添加時のシグナルを阻害率０％として、ＩＣ５０値を計算することにより決定することができる。他のＣＣＲ８リガンドの結合阻害能についても、上記ヒトＣＣＬ１の場合と同様に、決定することができる。

　ヒトＣＣＬ１は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ　Ｎｏ．Ｐ２２３６２などに示されるアミノ酸配列を有する。ヒトＣＣＬ８は、ＧｅｎＢａｎｋ　Ｎｏ．ＡＡＩ２６２４３．１などに示されるアミノ酸配列を有する。ヒトＣＣＬ１８は、ＧｅｎＢａｎｋ　Ｎｏ．ＥＡＷ８０１０２．１などに示されるアミノ酸配列を有する。

　抗ＣＣＲ８抗体は、キメラ、ヒト化、完全ヒト抗体も含む。ヒト化モノクローナル抗体はヒト体内における抗原性が低下しているため、治療目的等でヒトに投与する場合に有用である。ヒト化モノクローナル抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体のフレームワーク領域（ＦＲ；ｆｒａｍｅｗｏｒｋ　ｒｅｇｉｏｎ）へ移植したものである。従って、ヒト化モノクローナル抗体のＦＲは、ヒト由来のものである。適当なＦＲは、Ｋａｂａｔ　Ｅ．Ａ．らの文献を参照すれば選択できる。この場合のＦＲとしては、ＣＤＲが良好な抗原結合部位を形成することができるものが選択される。必要に応じ、再構成したヒト化モノクローナル抗体のＣＤＲが適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域のＦＲのアミノ酸を置換してもよい（Sato, K.ら、Cancer Res.、１９９３年、第５３巻、８５１ページ）。置換されるＦＲのアミノ酸の割合は、全ＦＲ領域の０～１５％、好ましくは０～５％である。

　抗ＣＣＲ８抗体は、ＣＣＲ８の中和抗体が好ましい。ＣＣＲ８の中和抗体とは、ＣＣＲ８に対する中和活性を有する抗体を意味する。ＣＣＲ８に対する中和活性を有するか否かは、例えば、ＣＣＲ８リガンドのいずれか（例えば、ＣＣＬ１）のＣＣＲ８に対する生理作用を抑制するか否かを測定することにより判別できる。

　抗ＣＣＲ８抗体は、ヒトＣＣＲ８を強く認識する抗体が好ましい。ヒトＣＣＲ８を強く認識する抗体を選択する際に、中和活性の強度を指標にして、抗体又はその抗体断片を選択することで、より強くヒトＣＣＲ８を認識する抗体又はその抗体断片を選択することができる。

　抗ＣＣＲ８－ｓｃＦｖ領域は、抗ＣＣＲ８抗体のＣＤＲ又は重鎖可変領域／軽鎖可変領域のアミノ酸配列情報を用いてアミノ酸配列を決定することができる。抗ＣＣＲ８－ｓｃＦｖ領域における軽鎖可変領域と重鎖可変領域は、リンカー配列を介して連結されていてもよい。リンカー配列の例としては、配列番号２の配列が挙げられる。抗ＣＣＲ８－ｓｃＦｖ領域のアミノ酸配列の例としては、配列番号３９～４４の配列が挙げられる。

　抗ＣＣＲ８－ｓｃＦｖ領域は、好ましくは、以下のいずれかの配列を含む。
１）配列番号５７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号５８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号５９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号６０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号６１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号６２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
２）配列番号５７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号６３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号５９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号６４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号６１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号６５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
３）配列番号６６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号６７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号６８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号６９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号７０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号７１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
４）配列番号７２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号６７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号７３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号７４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号７５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号７６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；又は
５）配列番号７７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号７８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号７９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号８０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号８１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号８２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域。

　抗ＣＣＲ８－ｓｃＦｖ領域は、より好ましくは、以下のいずれかの配列を含む。
１）配列番号４５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号４６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
２）配列番号４７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号４８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
３）配列番号４９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号５０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
４）配列番号５１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号５２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
５）配列番号５３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号５４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；又は
６）配列番号５５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号５６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域。

　「エフェクター細胞の表面マーカーを認識する抗体の軽鎖又は重鎖の可変領域を１以上含む領域」のエフェクター細胞としては、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージなどが例示されるが、Ｔ細胞又はＮＫ細胞が好ましい。Ｔ細胞の表面マーカーとしてはＣＤ３、ＯＸ４０、ＣＤ４０、４－１ＢＢ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ及びＣＤ２８などの免疫チェックポイント分子、ＮＫ細胞の表面マーカーとしてはＣＤ１６、ＴＩＧＩＴ、４－１ＢＢ及びＬＡＧ３、マクロファージの表面マーカーとしてはＣＤ６４、ＣＤ４０および４－１ＢＢが例示される。該エフェクター細胞の表面マーカーとしては、ＣＤ３又はＣＤ１６が好ましい。

　エフェクター細胞の表面マーカーを認識する抗体の軽鎖又は重鎖の可変領域を１以上含む領域のアミノ酸配列の例としては、表面マーカーがヒトＣＤ３である場合、特許文献２７に記載された配列番号７の配列、特許文献２８に記載された配列番号９の配列、特許文献２９に記載された配列番号８の配列が挙げられ、表面マーカーがマウスＣＤ３である場合、Fernandesらの論文（J. Biol. Chem., (2012), 287(16), 13324-13335）に記載された配列番号８４の配列が挙げられ、表面マーカーがヒトＣＤ１６である場合、特許文献３０に記載された配列番号３４の配列が挙げられる。

　抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域は、ＣＤ３を認識する抗体由来のｓｃＦｖ断片であるが、好ましくは、以下のいずれかの配列を含む。
１）配列番号１６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号１７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号１８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号１９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号２０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号２１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
２）配列番号２２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号２３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号２４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号２５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号２６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号２７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
３）配列番号２８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号２９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号３０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号３１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号３２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号３３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；又は
４）配列番号８７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号８８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号８９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号９０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号９１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号９２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域。

　抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域は、より好ましくは、以下のいずれかの配列を含む。
１）配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
２）配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
３）配列番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；又は
４）配列番号８５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号８６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域。

　また、抗ＣＤ３－ＶＨＨ領域は、ＣＤ３を認識するＶＨＨ抗体由来のＶＨＨ断片である。

　抗ＣＤ１６－ｓｃＦｖ領域は、ＣＤ１６を認識する抗体由来のｓｃＦｖ断片である。また、抗ＣＤ１６－ＶＨＨ領域は、ＣＤ１６を認識するＶＨＨ抗体由来のＶＨＨ断片であるが、好ましくは、配列番号３５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号３６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号３７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む。

　抗ＣＤ６４－ｓｃＦｖ領域は、ＣＤ６４を認識する抗体由来のｓｃＦｖ断片である。また、抗ＣＤ６４－ＶＨＨ領域は、ＣＤ６４を認識するＶＨＨ抗体由来のＶＨＨ断片である。

　本発明の二重特異性抗体は、Ｎ末端にシグナル配列領域を含んでいてもよい。シグナル配列としてはＣＤ８Ａシグナル配列が好ましく、ＣＤ８Ａシグナル配列領域は抗ＣＣＲ８－ｓｃＦｖ領域のＮ末端側に存在していてもよい。さらに、ＣＤ８Ａシグナル配列領域は配列番号１のアミノ酸配列を有するのが好ましい。

　「抗ＣＣＲ８抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む抗ＣＣＲ８－ｓｃＦｖ領域」及び「エフェクター細胞の表面マーカーを認識する抗体の軽鎖又は重鎖の可変領域を１以上含む領域」は、ｓｃＦｖリンカー配列を介して連結されていてもよい。ｓｃＦｖリンカー配列の例としては、配列番号３～６の配列が挙げられる。

　本発明の二重特異性抗体は、Ｎ末端又はＣ末端にタグが付加されていてもよいが、タグが付加される場合はＣ末端に付加されているのが好ましい。付加されるタグとしては、ヒスチジン、ＦＬＡＧ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、ヘマグルチニンなどが例示されるが、ヒスチジンタグが好ましい。さらに、ヒスチジンタグは配列番号３８のアミノ酸配列を有するのが好ましい。

　本発明の二重特異性抗体は、Ｎ末端側より、ＣＤ８Ａシグナル配列領域、抗ＣＣＲ８－ｓｃＦｖ領域、ｓｃＦｖリンカー、エフェクター細胞の表面マーカーを認識する抗体の軽鎖又は重鎖の可変領域を１以上含む領域、ヒスチジンタグの順に連結されているのが好ましい。

　本発明の二重特異性抗体は、Ｆｃ領域を有していてもよい。Ｆｃ領域は、一本鎖が好ましく、ヒトＩｇＧ２抗体やヒトＩｇＧ４抗体のＦｃ領域のように抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性誘導が低いものが好ましく、ヒスチジンタグの直前に挿入するのが好ましい。Ｆｃ領域としては、ＡＤＣＣ活性を低下させるように変異させた抗体変異体（例、ヒトＩｇＧ１抗体変異体）も好ましい。Ｆｃ領域の例としては、配列番号９５のアミノ酸配列を有するＦｃ領域が挙げられる。

　本発明の二重特異性抗体は、ＣＣＲ８及びＣＤ３を抗原として認識する二重特異性抗体（ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体）、ＣＣＲ８及びＣＤ１６を抗原として認識する二重特異性抗体（ＣＣＲ８－ＣＤ１６二重特異性抗体）、ＣＣＲ８及びＣＤ６４を抗原として認識する二重特異性抗体（ＣＣＲ８－ＣＤ６４二重特異性抗体）等が例示されるが、これらに限られない。

　本発明の二重特異性抗体に含まれる各領域は、それぞれアミノ酸配列が９０％以上の同一性があれば、好ましくは、９５％以上の同一性があれば、同様の効果を示すことができる。

　本発明の二重特異性抗体は、標的細胞とエフェクター細胞を結びつけることにより、エフェクター細胞により標的細胞に対して強い細胞傷害活性を示す。なお、「細胞傷害活性」には、マクロファージ等による細胞貪食活性を含むものとする。

　本発明の二重特異性抗体が細胞傷害活性を示すＣＣＲ８発現細胞としては、腫瘍内浸潤Ｔｒｅｇ細胞等のＴｒｅｇ細胞や腫瘍細胞が例示される。

　ＣＣＲ８発現細胞が腫瘍内浸潤Ｔｒｅｇ細胞の場合は、該腫瘍は固形癌が好ましい。具体的には、乳癌、子宮体癌、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、胃（胃腺）癌、非小細胞肺癌、膵臓癌、頭頚部扁平上皮癌、食道癌、膀胱癌、メラノーマ、大腸癌、腎癌、非ホジキンリンパ腫、尿路上皮癌、肉腫、胆管癌、胆のう癌、甲状腺癌、精巣癌、胸腺癌、肝臓癌、皮膚癌、脳腫瘍、等が挙げられる。好ましくは乳癌、子宮体癌、卵巣癌、肺癌、膀胱癌、大腸癌、腎癌、肉腫、肝臓癌、皮膚癌及び脳腫瘍が挙げられる。ＣＣＲ８発現細胞が腫瘍内浸潤Ｔｒｅｇ細胞の場合は、腫瘍細胞にＣＣＲ８が発現していなくてもよい。

　ＣＣＲ８発現細胞が腫瘍細胞の場合は、該腫瘍はメラノーマ又は血液癌が好ましい。ＣＣＲ８を発現する血液癌としては、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）などの白血病や成人Ｔ細胞白血病リンパ腫（ＡＴＬＬ）、末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、ホジキンリンパ腫などのリンパ腫が例示される。

　本発明の二重特異性抗体は、医薬組成物として有用である。本発明の医薬組成物は、経口的又は非経口的に全身あるいは局所的に投与することができる。非経口的投与としては、例えば、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、鼻腔内投与、吸入などを選択することができる。

　本発明の医薬組成物は、ＣＣＲ８関連疾患の治療及び／又は予防のための医薬として非常に有用である。特に、ＣＣＲ８発現Ｔｒｅｇ細胞の腫瘍内浸潤が生じている癌又は腫瘍細胞にＣＣＲ８が発現している癌を治療及び／又は予防するための医薬として非常に有用である。例えば、乳癌、子宮体癌、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、胃（胃腺）癌、非小細胞肺癌、膵臓癌、頭頚部扁平上皮癌、食道癌、膀胱癌、メラノーマ、大腸癌、腎癌、非ホジキンリンパ腫、尿路上皮癌、肉腫、胆管癌、胆のう癌、甲状腺癌、精巣癌、胸腺癌、肝臓癌、皮膚癌、脳腫瘍、等の癌、好ましくは乳癌、子宮体癌、卵巣癌、肺癌、膀胱癌、大腸癌、腎癌、肉腫、肝臓癌、皮膚癌及び脳腫瘍を治療及び／又は予防するための医薬として非常に有用である。また、メラノーマ、白血病及びリンパ腫を治療及び／又は予防するための医薬としても非常に有用である。

　本発明に係る癌には、すべての固形癌及び血液癌が含まれる。具体的には、乳癌、子宮体癌、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、胃（胃腺）癌、非小細胞肺癌、膵臓癌、頭頚部扁平上皮癌、食道癌、膀胱癌、メラノーマ、大腸癌、腎癌、非ホジキンリンパ腫、尿路上皮癌、肉腫、血球癌（白血病、リンパ腫等）、胆管癌、胆のう癌、甲状腺癌、精巣癌、胸腺癌、肝臓癌、皮膚癌、脳腫瘍、等が挙げられる。好ましくは乳癌、子宮体癌、卵巣癌、肺癌、膀胱癌、大腸癌、腎癌、肉腫、肝臓癌、皮膚癌及び脳腫瘍が挙げられる。また、メラノーマ、白血病及びリンパ腫も好ましい。

　なお、本発明に係る癌は、卵巣癌、胃癌等の上皮性の悪性腫瘍のみならず、慢性リンパ性白血病やホジキンリンパ腫等の造血器がんを含む非上皮性の悪性腫瘍も意味するものとし、本明細書において、「がん（ｃａｎｃｅｒ）」、「癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）」、「腫瘍（ｔｕｍｏｒ）」、「新生物（ｎｅｏｐｌａｓｍ）」等の用語は互いに区別されず、相互に交換可能である。

　本発明の二重特異性抗体は、
（１）本発明の医薬組成物の治療効果の補完及び／又は増強、
（２）本発明の医薬組成物の動態、吸収改善、投与量の低減及び／又は、
（３）本発明の医薬組成物の副作用の軽減、
のために他の薬剤と組み合わせて、併用剤として投与してもよい。

　本発明の二重特異性抗体と他の薬剤の併用剤は、１つの製剤中に両成分を配合した配合剤の形態で投与してもよく、また別々の製剤にして投与する形態をとってもよい。この別々の製剤にして投与する場合には、同時投与及び時間差による投与が含まれる。また、時間差による投与は、本発明の二重特異性抗体を先に投与し、他の薬剤を後に投与してもよいし、他の薬剤を先に投与し、本発明の二重特異性抗体を後に投与してもかまわず、それぞれの投与方法は同じでも異なっていてもよい。

　本発明の医薬組成物の対象患者は癌患者であるか又はその疑いがあることが想定される。本発明の医薬組成物の有効投与量は、一回につき体重１ｋｇあたり０．０１ｍｇから１００ｍｇの範囲から選ばれる。あるいは、患者あたり５～５０００ｍｇ、好ましくは１０～５００ｍｇの投与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明の二重特異性抗体を含む医薬組成物はこれらの投与量に制限されるものではない。また、投与期間は、患者の年齢、症状により適宜選択することができる。本発明の医薬組成物は、投与経路次第で医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。このような担体及び添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、カゼイン、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。使用される添加物は、剤型に応じて上記の中から適宜あるいは組合せて選択されるが、これらに限定されるものではない。

　本発明は、本発明の二重特異性抗体のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを包含する。本発明は、さらに、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを包含する。

　該ポリヌクレオチドは、本発明の二重特異性抗体をコードする限り、特に限定されず、複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）等のヌクレオチドからなる重合体である。天然以外の塩基を含んでいてよい。本発明のポリヌクレオチドは、本発明の二重特異性抗体を遺伝子工学的な手法により製造するために使用することができる。

　以下に本発明の実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。

　各抗体のＣＤＲ配列については、抗体の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列について抗体配列解析ソフトウェアａｂＹｓｉｓを用いたＫａｂａｔ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇを実施することにより同定した。

　各細胞培地には、ペニシリン、ストレプトマイシン、カナマイシンなどの抗生物質を適宜添加した。

実施例１：抗ヒトＣＣＲ８抗体及び抗ＣＣＲ８－ｓｃＦｖ領域の作製
　ＷＯ２０２０／１３８４８９号公報の実施例１～２、４～７及び９記載の方法に基づき、抗ヒトＣＣＲ８抗体を得た。さらに、抗ヒトＣＣＲ８抗体の重鎖可変領域、Ｇ４Ｓペプチドリンカー（配列番号２）及び軽鎖可変領域の順に連結し、抗ＣＣＲ８－ｓｃＦｖ領域を作製した。得られた抗ヒトＣＣＲ８抗体の軽鎖可変領域、重鎖可変領域及びＣＤＲの配列番号、並びに各抗体より作製した抗ＣＣＲ８－ｓｃＦｖ領域の配列番号を表１に示す。

　ここで、αＣＣＲ８－Ｂ１はヒト化モノクローナル抗体、αＣＣＲ８－Ｂ２～４はマウス由来モノクローナル抗体、αＣＣＲ８－Ｂ５及びＢ６はラット由来モノクローナル抗体である。なお、αＣＣＲ８－Ｂ１、Ｂ４及びＢ６はＷＯ２０２０／１３８４８９号公報、αＣＣＲ８－Ｂ２及びＢ３はＷＯ２０２２／２１１０４６号公報の実施例に記載された抗体である。各抗体の軽鎖可変領域、重鎖可変領域及びＣＤＲのアミノ酸配列も、対応する上記特許文献の配列表に収録されており、公知である。

実施例２：抗ＣＣＲ８－ｓｃＦｖ領域及び抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域を含む二重特異性抗体の作製
（１）抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域
　表２の抗ヒトＣＤ３抗体又は表３の抗マウスＣＤ３抗体における軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域を二重特異性抗体の作製に使用した。

　なお、表２の抗ヒトＣＤ３抗体における軽鎖可変領域、重鎖可変領域及び抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域のアミノ酸配列は、αＣＤ３－１に関してはＷＯ９９／５４４４０号公報に、αＣＤ３－２に関してはＷＯ２０１７／１３４１５８号公報に、αＣＤ３－３に関してはＷＯ２０１６／１８２７５１号公報に記載されている。表３の抗マウスＣＤ３抗体は、Fernandesらの論文（J. Biol. Chem., (2012), 287(16), 13324-13335）に記載されており、重鎖可変領域、Ｇ４Ｓペプチドリンカー（配列番号２）及び軽鎖可変領域の順に連結して抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域を作製した。

（２）二重特異性抗体の作製
　抗ＣＣＲ８－ｓｃＦｖ領域及び抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域を含む二重特異性抗体（ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体）は、Ｎ末端側より、ＣＤ８Ａシグナル配列領域（配列番号１）、実施例１の抗ＣＣＲ８－ｓｃＦｖ領域、ｓｃＦｖリンカー（配列番号３）、（１）の抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域、ヒスチジンタグ（配列番号３８）の順に連結して作製した。なお、抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域が配列番号８、９又は８４の配列の場合は、ｓｃＦｖリンカーとして配列番号３の代わりに配列番号４の配列を使用した。

　各二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを哺乳類発現ベクター（タカラバイオ社のｐＱＣＸＩＰベクターのＣＭＶプロモーターをヒトＥＦプロモーターに変更したベクター）に導入し、２９３Ｔ細胞にリポフェクタミン３０００を用いて形質転換を行った。導入３日後にピューロマイシン（１μｇ／ｍｌ）で薬剤選択を１週間行った。薬剤耐性細胞を拡大培養し、２９３Ｔ細胞がコンフルエントになった状態でさらに２日間培養し、５０ｍｌの細胞培地を回収した。回収した培地を０．４５μｍのフィルターに通した後、ミリポア社のＡｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－４遠心式フィルター（１０ｋＤカットオフ）で濃縮した。ピューロマイシンを完全に除去するために、濃縮後さらにＰＢＳによる１０倍希釈とその後の遠心濃縮の操作を３回繰り返した。最終的に液量は２５～５０倍に濃縮された。この濃縮された細胞培地に含まれる二重特異性抗体のタンパク質量を、ＨｉｓタグＥＬＩＳＡ検出キット（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）を用いて定量した。

（３）二重特異性抗体の精製
　実施例１８－２３において作製した二重特異性抗体については、以下の方法で精製を行った。
　（２）で得られた薬剤選択後の細胞培養液を回収し、アミコンウルトラ－１５（ミリポア）を用いて３０ｋＤａのカットオフで限外濾過により３５倍に濃縮した。濃縮後にＨＩＳタグレジン（ＴＡＬＯＮ、Ｔａｋａｒａ）を用いて、業者のプロトコールに従いタンパク質を精製した。その後、アミコンウルトラ－１５によりバッファーをＰＢＳに置換して定量した。得られたタンパク質を、ＨＩＳ―ＴＡＧ定量キット（ＨＩＳ　ｔａｇ　ＥＬＩＳＡ検出キット、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社）を用いて、業者のプロトコールに従い定量した。得られた二重特異性抗体をウエスタンブロッティング法により分析することにより、目的の大きさの場所（５５ｋＤａ）に特異的バンドを検出し、タンパク質が分解されることなく生成できることを確認した。

実施例３：抗ＣＣＲ８－ｓｃＦｖ領域及び抗ＣＤ１６－ＶＨＨ領域を含む二重特異性抗体の作製
（１）抗ＣＤ１６－ＶＨＨ領域
　ＷＯ２０２０／０８１８４１に記載された抗ＣＤ１６－ＶＨＨ領域を二重特異性抗体の作製に使用した。なお、抗ＣＤ１６－ＶＨＨ領域は配列番号３４の配列を有し、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３５、３６、３７の配列を有する。

（２）二重特異性抗体の作製
　抗ＣＣＲ８－ｓｃＦｖ領域及び抗ＣＤ１６－ＶＨＨ領域を含む二重特異性抗体（ＣＣＲ８－ＣＤ１６二重特異性抗体）は、実施例２（２）と同様の方法で、抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域を抗ＣＤ１６－ＶＨＨ領域に置き換えて作製した。なお、ｓｃＦｖリンカーとしては配列番号４の配列を使用した。

実施例４：ＰＢＭＣをエフェクター細胞とする、ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体のヒトＣＣＲ８発現細胞に対する細胞傷害活性
（１）エフェクター細胞の調製
　ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｈｕｍａｎ　Ｔ－ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ＣＤ３／２８、ＧＩＢＣＯ）及びヒトＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、終濃度１００Ｕ／ｍｌ）を用いて３日間刺激し、超低温冷凍庫でストックした。この細胞を起こし、さらに同様の条件で５日間刺激し、増殖させた。その後細胞を２群にわけて、一方はビーズを除去し、ＩＬ－２のみを１００Ｕ／ｍｌで添加してさらに２４時間培養した。もう一方はビーズ除去せず、刺激状態のままでさらにＩＬ－２存在下で２４時間培養した。これら細胞を２回アッセイバッファー（４％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ（フェノールレッド不含有））で洗浄し、細胞傷害活性評価に使用した。

（２）標的細胞の調製
　ヒトＣＣＲ８遺伝子をＣＭＶプロモーターにより強制発現するＲａｔ－１細胞（ｈＣＣＲ８／Ｒａｔ－１）及びその母細胞であるＲａｔ－１細胞を用いた。これら細胞は１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ培養液中で培養した。両細胞を１×１０⁶／ｍｌの濃度で、カルセインを添加し細胞標識した。３０分間３７℃で培養し、アッセイバッファーで２回洗浄した。この細胞を細胞傷害活性評価に使用した。

（３）細胞傷害活性評価
　ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体としては、αＣＣＲ８－Ｂ１由来の抗ＣＣＲ８－ｓｃＦｖ領域及びαＣＤ３－１由来の抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域を有する二重特異性抗体（Ｂ１－ＣＤ３－１とする）を用いて細胞傷害活性評価を行った。

　エフェクター細胞は５×１０⁴／１５０μＬ／ウェル、標的細胞は５×１０³／ウェル／１５０μＬ、ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体は最終濃度が１．７ｎＭあるいは０ｎＭとなるように９６穴プレートに混合した。５時間後に細胞培養液３５μＬを分取し、培地中のカルセイン量を蛍光光度計で定量した。各標的細胞のみの場合の５時間後のカルセイン自然放出量を０％とし、５時間後の全カルセイン量を１００％として、殺傷率（％）を算出した（Ｎ＝１）。

　その結果を図１に示す。エフェクター細胞及びＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体の両方を添加した場合にのみ、ｈＣＣＲ８／Ｒａｔ－１細胞の傷害が認められた。以上より、ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体がエフェクター細胞及びＣＣＲ８発現依存的に標的細胞に対して細胞傷害活性を有することが判明した。

実施例５：未刺激ＰＢＭＣをエフェクター細胞とする、ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体のヒトＣＣＲ８発現細胞に対する細胞傷害活性
（１）エフェクター細胞の調製
　ヒトＰＢＭＣ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）を、ヒトＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、終濃度１００Ｕ／ｍｌ）を用いて３日間培養し、細胞の状態を安定化した。

（２）標的細胞の調製
　ヒトＣＣＲ８及びホタルルシフェラーゼ遺伝子をＣＭＶプロモーターにより発現するＲａｔ－１細胞（ｈＣＣＲ８／ＦＬｕｃ／Ｒａｔ－１細胞）を使用した。

（３）細胞傷害活性評価
　ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体としては、Ｂ１－ＣＤ３－１及びＢ５－ＣＤ３－１（αＣＣＲ８－Ｂ５由来の抗ＣＣＲ８－ｓｃＦｖ領域及びαＣＤ３－１由来の抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域を有する二重特異性抗体）を用いて細胞傷害活性評価を行った。なお、陰性対照としてブリナツモマブを用いた。

　エフェクター細胞は１×１０⁴／ウェル／６０μＬ、標的細胞は１×１０³／ウェル／６０μＬとし、エフェクター細胞と標的細胞の比率（Ｅ／Ｔ細胞比率）は１０：１になるように使用した。ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体は最終濃度が１．６ｎＭ、ブリナツモマブは０．３ｎＭで使用した。アッセイバッファーに懸濁したエフェクター細胞及び標的細胞とＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体を混合し、２４時間（Ｎ＝１）、４８時間（Ｎ＝２）の間、９６穴プレートで培養した。その後、１４０μＬのアッセイバッファーを添加し、遠心後、１００μＬの上清を除く操作を行い、細胞培地を置換した。細胞に５０μＬのホタルルシフェラーゼの基質（Ｂｉｏ－Ｇｌｏ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ、プロメガ）を添加して白色遮光プレートに移し、１５分後にルシフェラーゼ活性を測定した。細胞培地を置換することで、細胞死により培地に放出されたルシフェラーゼタンパク質を除去することができ、生細胞内に存在するルシフェラーゼ活性のみを定量評価した。

　エフェクター細胞及び標的細胞を混合し、ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体なしの場合のルシフェラーゼの値をＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体による殺傷率０％とし、完全に殺傷された場合を殺傷率１００％として、殺傷率（％）を算出した。

　その結果を図２に示す。ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体未添加及びブリナツモマブを添加した場合は、２４、４８時間どちらの場合も細胞傷害活性はほとんど認められなかった。一方、Ｂ１－ＣＤ３－１およびＢ５－ＣＤ３－１ではどちらの時間でも７０～１００％近い細胞傷害活性を示した。以上より、未刺激ＰＢＭＣを用いた場合も、ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体が抗ＣＣＲ８－ｓｃＦｖ領域依存的に標的細胞に対して細胞傷害活性を示すことが判明した。

実施例６：ＣＤ８陽性Ｔ細胞をエフェクター細胞とする、ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体のヒトＣＣＲ８発現細胞に対する細胞傷害活性
（１）エフェクター細胞の調製
　ヒト凍結ＰＢＭＣ（ＡＣＣＵＣＥＬＬ）より、ＭｏｊｏＳｏｒｔ^TM　Ｈｕｍａｎ　ＣＤ８　Ｔ　Ｃｅｌｌ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用いて、ＣＤ８陽性Ｔ細胞をプロトコールに従い分離した。この細胞をＤｙｎａｂｅａｄｓ　Ｈｕｍａｎ　Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ＣＤ３／ＣＤ２８（ＧＩＢＣＯ）およびヒトＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ）を用いて８日間刺激した。ビーズ：細胞比は１：５で添加した。刺激した細胞はそのまま凍結保存し、以後の実験の都度に使用した。細胞を起こしてビーズをマグネットで除去し、ＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ）で５日間培養した。

（２）細胞傷害活性評価
　標的細胞としては、実施例５の標的細胞と同じｈＣＣＲ８／ＦＬｕｃ／Ｒａｔ－１細胞を用いた。ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体としては表４の二重特異性抗体を用いて細胞傷害活性評価を行った。

　エフェクター細胞は３×１０⁴／ウェル／６０μＬ、標的細胞は３×１０³／ウェル／６０μＬとし、エフェクター細胞と標的細胞の比率（Ｅ／Ｔ細胞比率）は１０：１になるように使用した。ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体の濃度は１５．９ｐＭから３倍希釈系列で評価した（Ｎ＝２）。各細胞及びＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体を混合し、６時間３７℃で培養し、実施例５と同様の方法で細胞を洗浄し、同様に細胞のルシフェラーゼ活性を測定した。殺傷率も実施例５と同様の方法で算出した。

　その結果を図３に示す。さらに各濃度における２つの測定値の平均値によるＥＣ５０値を算出した。解析はＲソフトのｄｒｃパッケージ（Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｄｏｓｅ－Ｒｅｓｐｏｎｓｅ　Ｃｕｒｖｅｓ）を使用した。ＥＣ５０値は３変数ログロジスティック解析で推定した。殺傷率の最大値も同パッケージで推定した。その結果、表５に示す通り、ＥＣ５０値はＢ２－ＣＤ３－１、Ｂ３－ＣＤ３－１及びＢ６－ＣＤ３－１のＥＣ５０が同程度であり、Ｂ１－ＣＤ３－１及びＢ５－ＣＤ３－１がそれらより高く、さらにＢ４－ＣＤ３－１が最も高かった。６時間のアッセイ時間での殺傷率最大値は、ＥＣ５０値と同じような傾向であった。

実施例７：ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体のＡＴＬＬ細胞株に対する細胞傷害活性
（１）ＡＴＬＬ細胞株ＡＴＮ－１細胞におけるＦｏｘｐ３及びＣＣＲ８発現解析
　ヒト成人Ｔ細胞白血病リンパ腫（ＡＴＬＬ）細胞株ＡＴＮ－１細胞を１×１０⁵／ウェルで９６穴プレートに播種した。各ウェルにＨｕｍａｎ　ＴｒｕＳｔａｉｎ　ＦｃＸ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を１／２０量、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（サーモフィッシャー）を１／５００量含んだＨＢＳＳ／２％ＦＣＳ／１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳバッファーを添加し、１５分間室温に静置した。その後ＨＢＳＳ／２％ＦＣＳ／１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳバッファーで１回洗浄を行い、１００μＬの同バッファーにサスペンドした後、　Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　７００標識抗ヒトＣＤ３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰＥ標識抗ヒトＣＣＲ８抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、または各蛍光標識アイソタイプコントロール抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用いて４℃で３０分間染色した。ＨＢＳＳ／２％ＦＣＳ／１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳバッファーで２回洗浄を行った後、Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｓｅｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、細胞固定操作を行った。ＡＰＣ標識抗ＦＯＸＰ３抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、またはＡＰＣ標識アイソタイプコントロール抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）を用いて４℃で３０分間染色した。２回洗浄を行った後、フローサイトメーターで各分子の発現を測定した。

　その結果を図４に示す。ＡＴＮ－１細胞はＣＤ４陽性Ｔ細胞であり、Ｆｏｘｐ３を大量に発現していることからヒトＴｒｅｇ細胞由来のガン細胞株であると考えられた。さらに、ＣＣＲ８がＡＴＮ－１細胞の９０％程度で発現していることを確認した。

（２）細胞傷害活性評価
　ＡＴＮ－１細胞はヒト腫瘍内Ｔｒｅｇ細胞と同様にＣＣＲ８及びＣＤ３分子の両方を同一細胞が発現しているため、ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体が同一細胞上のＣＣＲ８及びＣＤ３分子に結合し、ＡＴＮ－１細胞をＣＤ３分子からのシグナルにより活性化させる可能性が考えられ、そのため細胞の活性化にともないＣＭＶプロモーター等の活性化や細胞増殖に対する影響が懸念された。その懸念を排除するため、以下の実験を実施した。

　標的細胞はＡＴＮ－１細胞にＣＭＶプロモーターで発現するホタルルシフェラーゼ遺伝子を安定的に導入したＦＬｕｃ／ＡＴＮ－１細胞を使用した。ルシフェラーゼ活性が細胞数と相関することを確認し、５×１０³／ウェル／６０μＬで使用した。エフェクター細胞として、実施例６と同様の方法で培養したＣＤ８陽性Ｔ細胞を、５×１０⁴／ウェル／６０μＬで使用した（Ｅ／Ｔ細胞比率＝１０：１）（Ｎ＝３）。ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体は表４の６種を評価した。全て濃度を１７５ｐＭに設定し、エフェクター細胞を入れた場合と入れない場合での２４時間後の殺傷率を、実施例５と同様の方法で算出した。エフェクター細胞ありの場合となしの場合でそれぞれ、二重特異性抗体を入れていない場合の値を殺傷率０％とし、ルシフェラーゼ活性が０の場合を殺傷率１００％として算出した。

　その結果を図５に示す。エフェクター細胞を入れていない場合には、各ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体の影響は、二重特異性抗体なしと比較して±１０％程度の範囲内であった。この結果から、二重特異性抗体のみでは標的細胞に対して細胞傷害活性を示さず、あるいは活性化せず、またＣＭＶプロモーターを活性化させるようなルシフェラーゼ遺伝子の発現上昇も認められないと判断した。エフェクター細胞を添加した場合には、二重特異性抗体を添加した場合にのみ標的細胞数の減少が認められ、特にＢ２－ＣＤ３－１及びＢ６－ＣＤ３－１の細胞傷害活性が特に高かった。

　次に、ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体の濃度を５３０ｐＭから順次３倍希釈し、同様に殺傷率を評価した。

　その結果を図６に示す。Ｂ６－ＣＤ３－１が最も細胞傷害活性が強いことが判明した（Ｎ＝２）。各濃度での殺傷率の値の平均値を用いてＲソフトのｄｒｃパッケージ（Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｄｏｓｅ－Ｒｅｓｐｏｎｓｅ　Ｃｕｒｖｅｓ）を使用し、各ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体のＥＣ５０値（４変数ログロジスティック解析）を推定した。またＥＣ５０値での９５％信頼区間は同パッケージのｔｆｌｓ法により推定した。アッセイ２４時間後での殺傷率の最大値も同パッケージで推定した（表６）。ＥＣ５０値については、Ｂ６－ＣＤ３－１が最もＥＣ５０値が有意に低く、１．８８ｐＭであった。他の二重特異性抗体は、Ｂ６－ＣＤ３－１と比較して３０倍以上ＥＣ５０値が高かった。また、２４時間での最大殺傷率はＢ６－ＣＤ３－１とＢ２－ＣＤ３－１が同程度であり、かつ６種中でこれらが特に高かった。以上より、今回評価した６種のＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体のうち、Ｂ６－ＣＤ３－１が最も細胞傷害活性が強いことが判明した。

　この実験により、Ｂ６－ＣＤ３－１は、ＣＤ３分子を発現していないＲａｔ－１細胞のような標的細胞に対しては他の二重特異性抗体と同程度の細胞傷害活性しか示さないが、ＣＤ３分子を発現するＡＴＮ－１のような標的細胞に対して、他の二重特異性抗体よりも強力な細胞傷害活性を示す。この結果は、他の二重特異性抗体と比較して、Ｂ６－ＣＤ３－１がシス結合（同一細胞の細胞膜上に存在するＣＣＲ８とＣＤ３分子間の結合）よりもトランス結合（異なる細胞間でのＣＣＲ８とＣＤ３分子の結合）の方がより生じやすいことを強力に示唆している。つまり、Ｂ６－ＣＤ３－１のＣＣＲ８結合様式がよりトランスに存在するＣＤ３との結合を生じやすく、従ってエフェクター細胞によってよりＣＣＲ８発現Ｔｒｅｇ細胞が傷害されやすいことを示しており、抗ＣＣＲ８と抗ＣＤ３抗体の配列の組み合わせがこのようなトランス優位な組み合わせであることは、当業者に予測困難と考えられる。

（３）ＣＤ３分子からのシグナル伝達による標的細胞の活性化評価
　各ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体が、Ｔ細胞上のＣＤ３分子からのシグナル伝達によって細胞の活性化が認められるか、認められる場合にはその活性化能はどの二重特異性抗体が最も優れているか評価した。

　エフェクター細胞として、ＮＦＡＴプロモーターの下流にＬｕｃｉａルシフェラーゼ遺伝子をつないで、ＮＦＡＴプロモーターの活性化の程度をＬｕｃｉａルシフェラーゼ遺伝子の活性で評価できるヒトＴ細胞株Ｊｕｒｋａｔ（Ｊｕｒｋａｔ－Ｌｕｃｉ　ＮＦＡＴ　Ｃｅｌｌｓ　Ｋｉｔ、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）細胞を用いた。標的細胞として（２）と同じＦＬｕｃ／ＡＴＮ－１細胞を用いた。このエフェクター細胞と標的細胞（両細胞とも２×１０⁴／ウェル／１００μＬ）を１：１で９６穴プレート中にて混合し、ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体を最終濃度５３ｐＭから３倍希釈系列で添加した（Ｎ＝３）。１６時間後のＬｕｃｉａルシフェラーゼ活性を上記キットのプロトコールに従い定量した。

　その結果を図７に示す。Ｂ６－ＣＤ３－１の活性は二重特異性抗体未添加の活性を１とした場合、５３ｐＭで１１．４倍、１７．５ｐＭで５．６倍、５．８ｐＭで２．６倍に上昇した。それ以外のＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体は、どの濃度においても２倍以下であり、Ｂ６－ＣＤ３－１は他の二重特異性抗体よりも１０倍程度低い濃度でも、ほかの二重特異性抗体よりもＮＦＡＴ活性化能が高かった。また、Ｂ６－ＣＤ３－１の次に活性が高かったのがＢ２－ＣＤ３－１であり、各二重特異性抗体の細胞傷害活性とＮＦＡＴ活性化能はほぼ正相関していた。また、各二重特異性抗体の濃度におけるＢ６－ＣＤ３－１、それ以外のＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体及び二重特異性抗体無し間での有意差検定（Ｔ検定）を実施した。その結果、すべての濃度域で、Ｂ６－ＣＤ３－１が他のＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体及び二重特異性抗体無しに対して有意差があった（有意水準：５３ｐＭが０．０１、１７．５ｐＭでは０．００１、５．８ｐＭでは０．０５）。以上より、Ｂ６－ＣＤ３－１が細胞傷害活性及びＣＤ３からのＮＦＡＴ活性化能の両方で最も優れていることが判明した。

実施例８：ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体における抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域のアミノ酸配列最適化
　Ｂ６－ＣＤ３－１の抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域を置き換えた、表７のＢ６－ＣＤ３－２およびＢ６－ＣＤ３－３を作製した。

　標的細胞として実施例５で用いたｈＣＣＲ８／ＦＬｕｃ／Ｒａｔ－１細胞（５×１０³／ウェル／１００μＬ）を、エフェクター細胞として実施例４と同様の方法で活性化したＰＢＭＣ細胞を、Ｅ／Ｔ細胞比率３：１で９６穴プレートにて混合し、表７の各ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体を、Ｂ６－ＣＤ３－１は１７．１ｐＭ，Ｂ６－ＣＤ３－２ｈａ１５．９ｐＭ、Ｂ６－ＣＤ３－３は１５．９ｐＭから３倍希釈系列で添加した。殺傷率は実施例７と同様の方法で算出した。

　その結果を図８に示す。どのＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体を用いた場合にも濃度依存的な細胞傷害活性が認められた。実施例７と同様の３変数ログロジスティック解析により、ＥＣ５０値、その時の９５％信頼区間及び６時間での殺傷率最大値を推定した（表８）。その結果、Ｂ６－ＣＤ３－１のＥＣ５０値での９５％信頼区間はＢ６－ＣＤ３－２の９５％ＣＩと重なっていないため、両者のＥＣ５０値に有意差があると判断した。以上より、Ｂ６－ＣＤ３－１が最も細胞傷害活性が高いことが判明した。

実施例９：ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体における抗ＣＣＲ８－ｓｃＦｖ領域と抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域の位置最適化（１）
　ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体における抗ＣＣＲ８－ｓｃＦｖ領域と抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域の相対的な位置最適化を行うために、ｓｃＦｖリンカーとして配列番号３の配列のかわりに配列番号５（１×Ｐリンカー）又は配列番号６（６×Ｐリンカー）の配列を使用したＢ６－ＣＤ３－１を作製した（Ｂ６－１×Ｐ－ＣＤ３－１、Ｂ６－６×Ｐ－ＣＤ３－１）。

　Ｂ６－１×Ｐ－ＣＤ３－１及びＢ６－６×Ｐ－ＣＤ３－１、並びにＢ６－ＣＤ３－１の細胞傷害活性を以下の方法で評価した。標的細胞として実施例５で用いたｈＣＣＲ８／ＦＬｕｃ／Ｒａｔ－１細胞（５×１０³／ウェル／１００μＬ）を、エフェクター細胞として実施例４と同様の方法で活性化したＰＢＭＣ細胞を、Ｅ／Ｔ細胞比率２０：１で９６穴プレートにて混合し、上記ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体を、Ｂ６－ＣＤ３－１は１５９ｐＭ，Ｂ６－１×Ｐ－ＣＤ３－１は１５０ｐＭ、Ｂ６－６×Ｐ－ＣＤ３－１は１５３ｐＭから５倍希釈系列で添加した（Ｎ＝３）。１６時間後に実施例５と同様の方法で培地を置換し、ルシフェラーゼアッセイを行った。殺傷率の算出方法は実施例７と同様で、二重特異性抗体未添加での殺傷率を０％にしている。

　その結果を図９に示す。また、実施例７と同様の３変数ログロジスティック解析により、ＥＣ５０値、その時の９５％信頼区間及び６時間での殺傷率最大値を推定した（表９）。Ｂ６－ＣＤ３－１が最も細胞傷害活性が高く、ＣＣＲ８およびＣＤ３抗体領域の相対的位置が最も優れていることが判明した。Ｂ６－１×Ｐ－ＣＤ３－１及びＢ６－６×Ｐ－ＣＤ３－１は活性が低下した。以上の結果より、抗ＣＣＲ８－ｓｃＦｖ領域と抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域の間の長さは、Ｂ６－ＣＤ３－１が最適であることが判明した。

実施例１０：ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体の成熟Ｔｒｅｇ細胞に対する細胞傷害活性
（１）成熟Ｔｒｅｇ細胞の調製
　ヒト末梢血よりフィコールパック（Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ　ＰＬＵＳ、ＧＥＷ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＰＢＭＣを分離した後、ＣＤ４＋　Ｔ　Ｃｅｌｌ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてＣＤ４陽性細胞を精製した。ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ４、ＰｅｒＣＰ＿Ｃｙ５．５標識抗ヒトＣＤ４５ＲＡ、ＰＥＣｙ７標識抗ヒトＣＤ２５、Ｂｖ５１０標識抗ヒトＣＤ１２７抗体を用いて、ＣＤ４陽性細胞からｎａｉｖｅ　Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ１２７陰性、ＣＤ４・ＣＤ４５ＲＡ・ＣＤ２５陽性画分）をＦＡＣＳ　Ａｒｉａ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）にて分離した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｈｕｍａｎ　Ｔｒｅｇ　Ｅｘｐａｎｄｅｒ（Ｖｅｒｉｔａｓ）のプロトコール通りに、分離したｎａｉｖｅ　Ｔｒｅｇ細胞を拡大培養し、成熟Ｔｒｅｇ細胞を調製した。

　抗ヒトＣＣＲ８抗体を用いて、成熟Ｔｒｅｇ細胞の細胞表面上ＣＣＲ８発現をフローサイトメーターで測定した結果、誘導した成熟Ｔｒｅｇ細胞中のＣＣＲ８陽性率は５０％であった。

（２）エフェクター細胞の調製
　ヒト末梢血よりフィコールパック（Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ　ＰＬＵＳ、ＧＥＷ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＰＢＭＣを分離した後、ＣＤ８＋　Ｔ　Ｃｅｌｌ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてＣＤ８陽性Ｔ細胞を精製した。この細胞をＦｒｅｓｈエフェクター細胞としてアッセイに使用した。

　また、分離したＣＤ８陽性Ｔ細胞をＩＬ－２（塩野義）１００Ｕ／ｍＬ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｈｕｍａｎ　Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｖｅｒｉｔａｓ）存在下、ＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳ培地で３７℃、５％ＣＯ₂中で１０日間培養した。その後、Ｄｙｎａｂｅａｄｓを除去し、ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ１（ゼノジェンファーマ）を用いて凍結保存を行った。アッセイ２日前に凍結細胞を起眠し、ＩＬ－２　１００Ｕ／ｍＬ添加したＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳ培地で３７℃、５％ＣＯ₂中で２日間培養し、Ａｃｔｉｖａｔｅエフェクター細胞としてアッセイに使用した。

（３）細胞傷害活性評価
　Ｃｅｌｌ　Ｔｒａｃｅ　Ｖｉｏｌｅｔ（サーモフィッシャー）でラベルした成熟Ｔｒｅｇ細胞を１×１０⁴／ウェル、エフェクター細胞を１×１０⁵／ウェル（Ｅ／Ｔ細胞比率＝１０：１）、ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体（Ｂ５－ＣＤ３－１、Ｂ６－ＣＤ３－１、どちらも最終濃度が５３０ｐＭ）存在下、ＩＬ－２を１０Ｕ／ｍＬ添加したＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳ培地で３７℃、５％ＣＯ₂中で２４時間または４８時間、９６穴プレート中で培養した。培養後の細胞をＨＢＳＳ／２％ＦＣＳ／１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳバッファーで１回洗浄し、１００μＬの同バッファーに懸濁した後、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（サーモフィッシャー）を用いて４℃で３０分染色した。同バッファーで２回洗浄し、フローサイトメーターにより生存している成熟Ｔｒｅｇ細胞数を測定した。標的細胞のみを入れたウェルでのＣＣＲ８陽性細胞率を１００％として算出した。

　その結果を図１０に示す。コントロールと比較して、Ｂ５－ＣＤ３－１及びＢ６－ＣＤ３－１の細胞傷害活性が有意に認められた（Ｔ検定）。以上より、ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体がＣＣＲ８を発現する成熟Ｔｒｅｇ細胞に対して細胞傷害活性を示すことが確認できた。

実施例１１：ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体のヒト腫瘍内浸潤Ｔｒｅｇ細胞に対する細胞傷害活性
（１）ヒト腫瘍内浸潤細胞の調製
　卵巣癌患者由来腫瘍組織をＴｕｍｏｒＤｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎＫｉｔ, ｈｕｍａｎ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を用いて分散し、腫瘍内に浸潤したＴｒｅｇ細胞、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ細胞以外のＣＤ４陽性Ｔ細胞を含む細胞集団を調製した。実験には凍結保存後の細胞を使用した。

（２）ヒト腫瘍内浸潤Ｔｒｅｇ細胞のＣＣＲ８陽性率測定
　（１）で得られた細胞集団について、フローサイトメトリーを用いて腫瘍内浸潤Ｔｒｅｇ細胞中のＣＣＲ８陽性率を測定した。

　Ｈｕｍａｎ　ＴｒｕＳｔａｉｎ　ＦｃＸ　（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびＺｏｍｂｉｅ　ＮＩＲ^TM　Ｆｉｘａｂｌｅ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ｋｉｔ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を添加したＨＢＳＳ／２％ＦＣＳ／１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳバッファーに細胞を懸濁し、４℃に３０分間静置した。洗浄後、各種抗体を添加して４℃に３０分間静置した（Ｂｖ７８５標識抗ヒトＣＤ４５抗体、ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ７００標識抗ヒトＣＤ３抗体、Ｂｖ７１１標識抗ヒトＣＤ４抗体、ＰＥ標識抗ヒトＣＣＲ８抗体、ＰＥ‐Ｄａｚｚｌｅ５９４標識抗ヒトＣＤ５６抗体、Ｂｖ５１０標識抗ヒトＣＤ８抗体（全てＢｉｏｌｅｇｅｎｄ））。洗浄後、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ^TM　Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｓｅｔ（サーモフィッシャー）を用いて固定および膜透過処理後、ＡＰＣ標識抗ヒトＦｏｘｐ３（サーモフィッシャー）を添加して４℃に３０分間静置した。洗浄後、フローサイトメーターを用いて、腫瘍内浸潤Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ４５・ＣＤ３・ＣＤ４・Ｆｏｘｐ３陽性かつ、Ｚｏｍｂｉｅ　ＮＩＲ・ＣＤ８・ＣＤ５６陰性画分）中のＣＣＲ８陽性率を測定した。

（３）細胞傷害活性評価
　（２）で得られた卵巣癌由来ヒト腫瘍内浸潤Ｔｒｅｇ細胞を標的細胞、実施例１０で得られた末梢血由来ＣＤ８陽性Ｔ細胞をエフェクター細胞として用いた。

　９６穴プレートにエフェクター細胞、およびＣｙｔｏＴｅｌｌ　ＵｌｔｒａＧｒｅｅｎ（ＡＡＴ　ＢＩＯＱＵＥＳＴ）で標識した標的細胞を１×１０⁵個／ウェルずつ播種し、ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体（Ｂ５－ＣＤ３－１、Ｂ６－ＣＤ３－１、どちらも最終濃度が５３０ｐＭ）存在下、ＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳ／ヒトＩＬ‐２（１００　Ｕ／ｍＬ）を用いて培養した。評価開始２４時間後に細胞を回収、Ｈｕｍａｎ　ＴｒｕＳｔａｉｎ　ＦｃＸ　（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびＺｏｍｂｉｅ　ＮＩＲ^TM　Ｆｉｘａｂｌｅ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ｋｉｔ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を添加したＨＢＳＳ／２％ＦＣＳ／１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳバッファーに懸濁し、４℃に３０分間静置した。洗浄後、各種抗体を添加して４℃に３０分間静置した（Ｂｖ７８５標識抗ヒトＣＤ４５抗体、ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ７００標識抗ヒトＣＤ３抗体、ＰＥ‐Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ５６抗体、Ｂｖ７１１標識抗ヒトＣＤ４、Ｂｖ５１０標識抗ヒトＣＤ８抗体（全てＢｉｏｌｅｇｅｎｄ社）およびヒトＣＣＲ８抗体）。ヒトＣＣＲ８抗体は、Ｂ５－ＣＤ３－１の評価時はＡＰＣ標識ＣＣＲ８抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｂ６－ＣＤ３－１の評価時は非標識ＣＣＲ８抗体（ＩＴＭ）とＡｌｅｘａ６４７標識Ｄｏｎｋｅｙ　Ａｎｔｉ－Ｒａｔ　ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を用いた。洗浄後、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ^TM　Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｓｅｔ（サーモフィッシャー）を用いて固定および膜透過処理後、ＰＥ標識抗ヒトＦｏｘｐ３（サーモフィッシャー）を添加して４℃に３０分間静置した。洗浄後、フローサイトメーターを用いて、生存しているＣＤ４５陽性細胞中のＣＣＲ８陽性Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ４５・ＣＤ３・ＣＤ４・Ｆｏｘｐ３・ＣＣＲ８陽性かつ、Ｚｏｍｂｉｅ　ＮＩＲ・ＣＤ８・ＣＤ５６陰性画分）、ＣＤ８陽性Ｔ細胞及びＣＤ４陽性Ｔｃｏｎｖ細胞の割合を定量した。

　その結果を図１１に示す。二重特異性抗体を添加していないコントロール群に比べ、ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体添加群ではヒト腫瘍内浸潤ＣＣＲ８陽性Ｔｒｅｇ細胞の有意な減少が認められた。減少率は、Ｂ５－ＣＤ３－１がドナー１：７１％、ドナー２：９１％、ドナー３：９６％、Ｂ６－ＣＤ３－１がドナー２：９６％、ドナー３：９７％であった。（Ｄｕｎｎｅｔ’ｓ　ｔｅｓｔ、Ｐ＜０．０００５）。一方、ＣＤ８陽性Ｔ細胞はどのドナーでも有意な減少を認めなかった（図１２）。ＣＤ４陽性Ｔｃｏｎｖ細胞については、ドナー１およびドナー３では有意な減少を認めなかった（図１３）。以上より、ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体が腫瘍内浸潤Ｔｒｅｇ細胞に対して、特異的に強力な細胞傷害活性を有することが確認できた。

実施例１２：ヒト末梢血由来ＮＫ細胞をエフェクター細胞とする、ＣＣＲ８－ＣＤ１６二重特異性抗体のヒトＣＣＲ８発現細胞に対する細胞傷害活性
　実施例５のｈＣＣＲ８／Ｆｌｕｃ／Ｒａｔ－１細胞を用いて、表１０のＣＣＲ８－ＣＤ１６二重特異性抗体を用いた細胞傷害活性試験を実施した。

　標的細胞として用いるｈＣＣＲ８／Ｆｌｕｃ／Ｒａｔ－１細胞と、エフェクター細胞として用いるヒト末梢血由来ＮＫ細胞（バイオセラピー研究所）を、Ｅ／Ｔ細胞比率１０：１（エフェクター細胞：１×１０⁵／ウェル、標的細胞：１×１０⁴／ウェル）になるようにアッセイバッファーに混合して９６穴プレートに播種した。その後、ＣＣＲ８－ＣＤ１６二重特異性抗体を最終濃度４４０ｐＭになるように各ウェルに添加した。コントロールとして、二重特異性抗体無添加のウェルを設定した。細胞と抗体を添加した後で、プレート遠心機を用いて１０００ｒｐｍで２分間遠心し、細胞を沈下させた。遠心後３７℃、５％ＣＯ₂で１６時間培養した。培養後、１００μＬのアッセイバッファーを加え、１０００ｒｐｍで２分間遠心し、１００μＬの上清を捨てるという洗浄操作を３回繰り返した。最後に、１００μＬの上清を捨てたのちに、５０μＬのルシフェリンを添加し、３０分以内に発光測定器を用いて各ウェルの発光量を定量した。ルシフェラーゼ発光量を指標とした細胞傷害活性評価は、二重特異性抗体無添加ウェルの値を細胞が傷害されていない（１００％生存）として、以下の計算式で計算した。
｛１-（二重特異性抗体添加ウェルの発光値／二重特異性抗体無添加ウェルの発光値）｝×１００（％）

　その結果を図１４に示す。種々のＣＣＲ８－ＣＤ１６二重特異性抗体で細胞傷害活性が認められた。特にＢ１－ＣＤ１６－ＶＨＨとＢ３－ＣＤ１６－ＶＨＨを用いたＣＣＲ８－ＣＤ１６二重特異性抗体では高い活性が認められ、Ｂ１－ＣＤ１６－ＶＨＨが最も高い細胞傷害活性を持つことが示唆された。以上より、ＣＣＲ８－ＣＤ１６二重特異性抗体が細胞傷害活性を示すことと、Ｂ１－ＣＤ１６－ＶＨＨが最も高い細胞傷害活性を示すことが明らかになった

実施例１３：ＣＣＲ８－ＣＤ１６二重特異性抗体のＡＴＬＬ細胞株に対する細胞傷害活性
　ＣＣＲ８－ＣＤ１６二重特異性抗体としてＢ１－ＣＤ１６－ＶＨＨを用いて、ＡＴＬＬ細胞株であるＡＴＮ－１細胞に対する細胞傷害活性を評価した。

　標的細胞としてカルセイン標識したＡＴＮ－１細胞、エフェクター細胞としてヒトＮＫ細胞株であるＫＨＹＧ－１細胞を用いた。Ｅ／Ｔ細胞比率を１０：１、３：１、１：１（標的細胞：１×１０⁴／ウェル）としてアッセイバッファーに混合し、９６穴プレートに播種した。その後、Ｂ１－ＣＤ１６－ＶＨＨを最終濃度４．４ｎＭになるように添加した。コントロールとして、二重特異性抗体無添加ウェルを設定した。細胞と抗体を添加した後で、プレート遠心機を用いて１０００ｒｐｍで２分間遠心し、細胞を沈下させた。遠心後３７℃、５％ＣＯ２で２時間培養した。培養後、５０μＬのアッセイバッファーを添加して細胞上清７０μＬを分取した。分取した上清は、蛍光測定器を用いて上清中に含まれる蛍光量を定量した。カルセインのＡＴＮ－１細胞からの自然放出量（ＢＧ）は、標的細胞のみのウェルの上清を同様に測定することで決定した。また、全カルセイン放出量（ＴＯＴＡＬ）はアッセイバッファー添加後に細胞懸濁液７０μＬを分取し、測定することで決定した。カルセイン放出を指標にした殺傷率の計算方法は、
｛（各ウェルの蛍光値－ＢＧ蛍光値）／（（ＴＯＴＡＬ蛍光値－ＢＧ蛍光値）｝×１００（％）
で算出した。ＢＧを差し引いて、全細胞が殺傷された場合の上清中蛍光量を１００％として、殺傷率（％）を算出した。

　その結果を図１５に示す。最終濃度が４．４ｎＭのＢ１－ＣＤ１６－ＶＨＨを添加したウェルにおいて、コントロールと比較して高い細胞傷害活性が認められた。以上の結果から、ＣＣＲ８－ＣＤ１６二重特異性抗体はＡＴＬＬ細胞株に対し細胞傷害活性を示すことが明らかになった。

実施例１４：ＣＣＲ８－ＣＤ１６二重特異性抗体の成熟Ｔｒｅｇ細胞に対する細胞傷害活性
　ＣＣＲ８－ＣＤ１６二重特異性抗体としてＢ１－ＣＤ１６－ＶＨＨを用いて、ヒト末梢血から誘導された成熟Ｔｒｅｇ細胞に対して細胞傷害活性を示すか否かを検証した。標的細胞として実施例１０の成熟Ｔｒｅｇ細胞、エフェクター細胞として実施例１３のＫＨＹＧ－１細胞を用いて、実施例１３と同様の方法で細胞傷害活性評価を行った。

　その結果を図１６に示す。最終濃度が４．４ｎＭのＢ１－ＣＤ１６－ＶＨＨを添加することで、コントロールと比較して高い細胞傷害活性が認められた。以上の結果から、ＣＣＲ８－ＣＤ１６二重特異性抗体はヒト末梢血から誘導された成熟Ｔｒｅｇ細胞に対し細胞傷害活性を示すことが判明した。

実施例１５：ＣＣＲ８－ＣＤ１６二重特異性抗体の細胞傷害活性における、標的細胞中のＣＣＲ８発現有無の影響
　ＣＣＲ８－ＣＤ１６二重特異性抗体としてＢ１－ＣＤ１６－ＶＨＨを用いて、細胞傷害活性がＣＣＲ８発現に依存するのか否かを検証した。標的細胞として実施例４のＣＣＲ８発現Ｒａｔ－１細胞（ｈＣＣＲ８／Ｒａｔ－１細胞）とＣＣＲ８非発現Ｒａｔ－１細胞株、エフェクター細胞として実施例１３のＫＨＹＧ－１細胞を用いて、実施例１３と同様の方法で細胞傷害活性評価を行った。なお、カルセイン放出を指標にした殺傷率の計算方法は、
｛（各ウェルの蛍光値－二重特異性抗体添加なしウェルの蛍光値）／（（ＴＯＴＡＬ蛍光値－二重特異性抗体添加なしウェルの蛍光値）｝×１００（％）
で算出した。

　その結果を図１７に示す。ＣＣＲ８発現細胞Ｒａｔ－１において、ＣＣＲ８非発現Ｒａｔ－１に比べてＢ１－ＣＤ１６－ＶＨＨの細胞傷害活性の上昇が認められた。

実施例１６：マウス脾臓由来ＣＤ８陽性Ｔ細胞をエフェクター細胞とする、抗マウスＣＤ３－ｓｃＦｖ領域を含むＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体のヒトＣＣＲ８発現細胞に対する細胞傷害活性
（１）マウス脾臓由来ＣＤ８陽性Ｔ細胞の調製
　野生型マウスの脾臓を摘出し、７０μｍフィルターを通し、溶血処理を施して細胞懸濁液にした。その後、ＣＤ８ａ＋　Ｔ　Ｃｅｌｌ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を調製した。得られたＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ヒトＩＬ－２とａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＣＤ３／２８　Ｄｙｎａｂｅａｄｓで１日以上培養して活性化した後にエフェクター細胞として用いた。

（２）細胞傷害活性評価
　抗マウスＣＤ３－ｓｃＦｖ領域を含むＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体としては、αＣＣＲ８－Ｂ６由来の抗ＣＣＲ８－ｓｃＦｖ領域及びαｍＣＤ３由来の抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域を有する二重特異性抗体（Ｂ６－ｍＣＤ３）を用いて、ルシフェラーゼアッセイ系で細胞傷害活性を評価した。

　標的細胞として実施例５のｈＣＣＲ８／Ｆｌｕｃ／Ｒａｔ－１細胞、エフェクター細胞としてマウス脾臓由来のＣＤ８Ｔ細胞を用いた。Ｅ／Ｔ細胞比率が１０：１（エフェクター細胞：１×１０⁵／ウェル、標的細胞：１×１０⁴／ウェル）になるようにアッセイバッファーに混合し、９６穴プレートに播種した。その後、各ウェルに最終濃度が３６０ｐＭ、３６ｐＭ又は３．６ｐＭのＢ６－ｍＣＤ３を添加した。コントロールとして、二重特異性抗体無添加ウェルを設定した。

　細胞と抗体を添加した後で、プレート遠心機を用いて１０００ｒｐｍで２分間遠心し、細胞を沈下させた。遠心後３７℃、５％ＣＯ₂で１６時間培養した。その後、１００μＬのアッセイバッファーを加え、１０００ｒｐｍで２分間遠心して上清を捨てるという洗浄操作を３回繰り返した。最後に上清を捨てたのちに、５０μＬのルシフェリンを添加し、発光測定器を用いて各ウェルの発光量を定量した。

　その結果を図１８－１に示す。Ｂ６－ｍＣＤ３を３６０ｐＭ添加した場合に、コントロールに比べて細胞傷害活性が認められた。さらに、二重特異性抗体の濃度依存的に細胞傷害活性が変化することも確認された。以上の結果から、抗マウスＣＤ３－ｓｃＦｖ領域を含むＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体が細胞傷害活性を示すことが明らかになった。

　さらに、Ｂ６－ｍＣＤ３を最終濃度１０ｐＭ－１０ｎＭで５０μＬ／ウェルずつ添加し、上記と同様の方法で細胞傷害活性評価を行った結果を図１８－２に示す。Ｂ６－ｍＣＤ３を添加したウェルにおいて、コントロールに比べて濃度依存的な細胞傷害活性が認められた。ＥＣ５０としては６２．３ｐＭと算出された。

実施例１７：マウス脾臓由来ＣＤ８陽性Ｔ細胞をエフェクター細胞とする、抗マウスＣＤ３－ｓｃＦｖ領域を含むＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体の、ヒトＣＣＲ８発現細胞移植マウスにおける抗腫瘍活性
　標的細胞として実施例５のｈＣＣＲ８／Ｆｌｕｃ／Ｒａｔ－１細胞、エフェクター細胞としてマウス脾臓由来のＣＤ８Ｔ細胞を用い、Ｅ／Ｔ細胞比率２：１（エフェクター細胞：７×１０⁶、標的細胞：３．５×１０⁶）になるように１００μＬのＰＢＳに混合し、ＮＳＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ　／ＳｚＪ、ジャクソンラボラトリー社）の腹腔内に投与した。その後、各マウスに二重特異性抗体（Ｂ６－ｍＣＤ３）を移植時に２μｇ、移植後１及び２日目に１μｇずつ投与した。また、コントロールとして、ＰＢＳ投与マウスを設定した。

　移植後２、５及び９日目に腹腔内のＲａｔ－１細胞の増殖を測定した。測定時には、ルシフェラーゼ基質（Ｄ－Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ、３０ｍｇ／ｍＬ）を１５０μＬ腹腔内に投与し、１０分後にＩＶＩＳ　Ｌｕｍｉｎａ発光検出装置を用いて、腹腔内における腫瘍体積の指標となる発光強度を測定した。

　その結果を図１９に示す。Ｂ６－ｍＣＤ３を投与した群において、コントロールに比べて抗腫瘍活性が認められた。以上の結果から、抗マウスＣＤ３－ｓｃＦｖ領域を含むＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体がｉｎ　ｖｉｖｏにおいても活性を示すことが明らかになった。

実施例１８：ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体のヒトＣＣＲ８発現細胞移植マウスにおける抗腫瘍活性
　標的細胞として実施例５のｈＣＣＲ８／ＦＬｕｃ／Ｒａｔ－１細胞（３．５×１０⁶）を、エフェクター細胞として実施例４と同様の方法で活性化したヒトＰＢＭＣ（７×１０⁶）を２００μＬのＰＢＳに混合し、ＮＳＧマウスの腹腔内に投与した。１５分後に２００μＬのＰＢＳに溶解したＢ６－ＣＤ３－１（１μｇ）又は陰性コントロールとして２００μＬのＰＢＳを腹腔内に投与した（Ｎ＝４）。Ｂ６－ＣＤ３－１及びコントロールＰＢＳはさらに移植後２及び３日目にも同様に１μｇを２００ｕＬのＰＢＳに溶解して腹腔内に投与した。

　移植後４、７、１１及び１５日目に、ＩＶＩＳ　Ｌｕｍｉｎａ発光検出装置により実施例１７と同様の方法で発光強度を測定した。測定は、マウス縦幅はマウスの口から尾部付根まで、横幅は全て入る領域の体躯領域について同一面積中に放出された光量をＴｏｔａｌ　Ｆｌｕｘ（ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃｏｎｄ）として、１秒あたりのＰｈｏｔｏｎ量として算出した。

　その結果を図２０及び図２１に示す。図２１のグラフは、各群４匹の発光強度の平均値及び標準偏差（ＳＤ）をグラフ化したものである。移植後１５日まで測定し、各群間の有意差検定はＡＮＯＶＡ（分散分析の中の２要因混合計画）で検定を行い、有意水準Ｐ＜０．０１で有意差が認められた。以上の結果から、ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体は、ヒトＣＣＲ８発現細胞をマウス腹腔内で殺傷できることが示され、マウスにおいて有意な抗腫瘍活性が認められた。

実施例１９：ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体のＡＴＬＬ細胞株移植マウスにおける抗腫瘍活性
　標的細胞として実施例７のＦＬｕｃ／ＡＴＮ－１細胞（２×１０⁶）を、エフェクター細胞として実施例４と同様の方法で活性化したヒトＰＢＭＣ（３×１０⁶）を１５０μＬのＰＢＳに混合し、氷冷したマトリゲル３５４２３０（コーニング）を１００μＬ添加し、ＮＳＧマウスの腹腔内に投与した。その後、ＰＢＳ又はＰＢＳに溶解したＢ６－ＣＤ３－１を１５０μＬ投与（０．７５μｇ）した。さらに移植後２日目、３日目にも同様にＰＢＳを２００μＬあるいは０．７５μｇのＢ６－ＣＤ３－１を２００μＬ量のＰＢＳに溶解して腹腔内に投与した。

　移植後４、８及び１１日目に、ＩＶＩＳ　Ｌｕｍｉｎａ発光検出装置により実施例１７と同様の方法で発光強度を測定した。

　その結果を図２２及び図２３に示す。図２３－１のグラフは各群４匹の発光強度の平均値及び標準偏差（ＳＤ）をグラフ化したものである。移植後１１日目まで測定し、各群間の有意差検定は各測定日の平均値についてＳｔｕｄｅｎｔ－Ｔで検定を行い、移植後４日目、及び１１日目の２点について有意水準Ｐ＜０．０５で有意差が認められた。さらにマウスごとの当該グラフとＸ軸との間の面積（ＡＵＣ、ａｒｅａ　ｕｎｄｅｒ　ｃｕｒｖｅ）を算出し、各群の面積の平均値及び標準偏差（ＳＤ）を算出したのが図２３－２である。この面積について両群間の有意差検定をマンホイットニーＵ検定で行った。その結果有意水準Ｐ＜０．０５で両群間に有意差が認められた。以上の結果から、ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体は、ＡＴＬＬ細胞株であるＡＴＮ－１細胞をマウス腹腔内で殺傷できることが示され、マウスにおいて有意な抗腫瘍活性が認められた。

実施例２０：ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体とＣＤ３－ＣＣＲ８二重特異性抗体の細胞傷害活性比較
（１）ＣＤ３－ＣＣＲ８二重特異性抗体の作製
　ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体より抗ＣＣＲ８－ｓｃＦｖ領域を抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域の順序を入れ替えたＣＤ３－ＣＣＲ８二重特異性抗体を作製した。具体的には、Ｎ末端側より、ＣＤ８Ａシグナル配列領域（配列番号１）、αＣＤ３－１の抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域（配列番号７）、ｓｃＦｖリンカー（配列番号３）、αＣＣＲ８－Ｂ６の抗ＣＣＲ８－ｓｃＦｖ領域（配列番号４４）、ヒスチジンタグ（配列番号３８）の順に連結し、Ｂ６－ＣＤ３－１の抗ＣＣＲ８抗体領域を抗ＣＤ３領域の順序を入れ替えたＣＤ３－ＣＣＲ８二重特異性抗体を作製した（ＣＤ３－１－Ｂ６）。タンパク質は実施例２と同様の方法で作製及び精製した。

（２）細胞傷害活性評価
　標的細胞として実施例７のＦＬｕｃ／ＡＴＮ－１細胞、エフェクター細胞として実施例４と同様の方法で活性化したヒトヒトＰＢＭＣ細胞を用いた。９６穴丸底シャーレに標的細胞（３×１０³／ウェル）を播種し、Ｅ／Ｔ細胞比率が２：１となるようにエフェクター細胞を添加、さらに二重特異性抗体を最終濃度１０００ｐＭから３倍希釈で１．４ｐＭになるように添加した。１穴あたりの最終液量は１５０μＬ。アッセイバッファーはＤＭＥＭ／４％ＦＣＳである。１６時間後に圧制バッファーで２回洗浄し、細胞に５０μＬのルシフェラーゼ基質を添加して、その全量を１０分後に発光測定装置を用いてウェルごとのルシフェラーゼ発光量を測定した。殺傷率は実施例７と同様の方法で算出した

　その結果を図２４に示す。ＣＤ３－１－Ｂ６のＥＣ５０値は７．２ｐＭ±０．９６ｐＭ（標準誤差）、ＥＣ５０値での９５％信頼区間は５．１ｐＭから９．３ｐＭであった。一方、Ｂ６－ＣＤ３－１のＥＣ５０値は０．０８ｐＭ±０．１６ｐＭ（標準偏差）、ＥＣ５０値での９５％信頼区間は－０．２７ｐＭから０．４２ｐＭであった。以上より、ｓｃＦｖ領域の順番を変えたＣＤ３－１－Ｂ６は正方向のＢ６－ＣＤ３－１と比較して有意に細胞傷害活性が低下しており、抗ＣＣＲ８－ｓｃＦｖ領域、抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域の順番の方が、細胞傷害活性が高くなることが判明した。

実施例２１：ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体における抗ＣＣＲ８－ｓｃＦｖ領域と抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域の位置最適化（２）
　ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体のｓｃＦｖ領域の距離が細胞傷害活性に影響が有るかどうか、最適な距離はどの程度かを見極めるため、抗ＣＣＲ８－ｓｃＦｖ領域と抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域の間にＡＮＡＳ＋４ｘＧ４Ｓリンカー（配列番号９３）を挿入したＢ６－Ｌ１－ＣＤ３－１を作製した。タンパク質は実施例２と同様の方法で作製及び精製した。なお、Ｂ６－ＣＤ３－１は１つのＧ４Ｓが挿入されている。

　Ｂ６－ＣＤ３－１及びＢ６－Ｌ１－ＣＤ３－１の細胞傷害活性について、実施例２０と同様の系で評価した結果を図２５に示す。Ｂ６－ＣＤ３－１及びＢ６－Ｌ１－ＣＤ３－１のＥＣ５０値はそれぞれ０．５４ｐＭ±０．１２ｐＭ（標準誤差）、０．９１ｐＭ±０．２４ｐＭ（標準誤差）であり、Ｂ６－ＣＤ３－１の方が低いＥＣ５０値であった。

実施例２２：Ｆｃ領域を付加したＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体の細胞傷害活性
　ＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体のＣ末端側に一本鎖のＦｃ領域を結合させた二重特異性抗体を作成した。当該Ｆｃ領域は、特許文献２９記載の二重特異性抗体におけるＦｃ領域であり、配列番号９５のアミノ酸配列を有する。Ｂ６－ＣＤ３－１の抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域とヒスチジンタグの間に配列番号９４のＧＳＧＧＧＧリンカー及び配列番号９５のＦｃ領域をこの順番で挿入することにより作製した（Ｂ６－ＣＤ３－１－Ｆｃ）。タンパク質は実施例２と同様の方法で作製及び精製した。

　Ｂ６－ＣＤ３－１－Ｆｃの細胞傷害活性について、標的細胞を実施例５のｈＣＣＲ８／Ｆｌｕｃ／Ｒａｔ－１細胞又は実施例７のＦＬｕｃ／ＡＴＮ－１細胞として、実施例２０と同様の系で細胞殺傷活性を評価した結果を図２６（ｈＣＣＲ８／Ｆｌｕｃ／Ｒａｔ－１細胞）及び図２７（ＦＬｕｃ／ＡＴＮ－１細胞）に示す。ｈＣＣＲ８／ＦＬｕｃ／Ｒａｔ－１細胞に対しては、ＥＣ５０値は９．６ｐＭ±２４．６ｐＭ（標準誤差）、ＦＬｕｃ／ＡＴＮ－１に対しては、ＥＣ５０値は１３．４ｎＭ±５２．４ｎＭ（標準誤差）であった。以上より、Ｆｃ領域を付加したＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体は十分な細胞傷害活性を保持することが判明した。

実施例２３：特許文献２０に基づいたＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体とのＮＦ－ＡＴプロモーター誘導活性及び細胞傷害活性の比較
（１）特許文献２０に基づいたＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体の作製
　特許文献２０の記載に基づき、配列番号９６のアミノ酸配列を有するＣＣＲ８－ＣＤ３二重特異性抗体（５６３－ＣＣＲ８－ＣＤ３（配列番号９６））を作製した。なお、特許文献２０の実施例４に基づき、５６３－ＣＣＲ８－ＣＤ３における抗ＣＣＲ８－ｓｃＦｖ領域はＡｎｔｉｂｏｄｙ１の可変領域配列を引用し、抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域はＩ２Ｅ抗体の可変領域配列を引用して構築した。タンパク質は実施例２と同様の方法で作製及び精製した。

（２）ＮＦ－ＡＴプロモーター誘導活性評価
　５６３－ＣＣＲ８－ＣＤ３がヒトＣＣＲ８に結合し、かつヒトＣＤ３にも結合することで、ＣＤ３の複合体であるＴ細胞受容体シグナルが活性化し、その下流のＮＦ－ＡＴプロモーターを活性化できるか検証した。細胞間でのトランスに働く活性化のみならず、同一細胞膜上に存在するＣＣＲ８およびＣＤ３の結合によってＣＤ３が活性化される、いわゆるシスに働くことによるＮＦＡＴの活性化も検出できる系を構築した。ＮＦ－ＡＴプロモーター下流にレポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだレポータープラスミドを安定的にゲノムに組み込んだヒトＴ細胞株であるＪｕｒｋａｔ細胞株（ＮＦＡＴ－Ｊｕｒｋａｔ）を使用した（ＢＰＳ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、ＮＦＡＴ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ（Ｌｕｃ）－Ｊｕｒｋａｔ　Ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ）。当該細胞にヒトＣＣＲ８を発現するｐＱＥＦ－ｈＣＣＲ８プラスミド（ｐＱＣＸＩＰのＣＭＶプロモーターをＥＦプロモーターに置換した発現ベクター）を形質転換し、１μｇ／ｍＬのピューロマイシンで薬剤選択を行い、ヒトＣＣＲ８を安定的に発現する細胞を樹立した（ｈＣＣＲ８／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ／Ｊｕｒｋａｔ）。

　この細胞にＢ６－ＣＤ３－１又は５６３－ＣＣＲ８－ＣＤ３を終濃度３３０ｐＭ及び１１０ｐＭで添加し、１６時間後のルシフェラーゼ活性を比較評価した（Ｎ＝１）。二重特異性抗体を添加していない場合のルシフェラーゼ活性を１としたときの、二重特異性抗体を添加した場合の誘導倍率を算出した。

　その結果を図２８に示す。Ｂ６－ＣＤ３－１では３３０ｐＭ及び１１０ｐＭの時にそれぞれルシフェラーゼ活性の誘導倍率は１０．７倍と２７倍であった。一方、５６３－ＣＣＲ８－ＣＤ３ではそれぞれ１．９倍、１．３倍であった。以上より、特許文献２０に基づいて構築した５６３－ＣＣＲ８－ＣＤ３は、Ｂ６－ＣＤ３－１と比較してＮＦＡＴプロモーター誘導能力が低いことが示された。

（３）細胞傷害活性評価
　Ｂ６－ＣＤ３－１及び５６３－ＣＣＲ８－ＣＤ３の細胞傷害活性について、標的細胞を実施例５のｈＣＣＲ８／Ｆｌｕｃ／Ｒａｔ－１細胞として、実施例２０と同様の系で細胞殺傷活性を評価した（Ｎ＝１）。二重特異性抗体の濃度は４．１ｐＭと１．３７ｐＭで実施した。Ｅ／Ｔ細胞比率は５：１とした。

　その結果を図２９に示す。Ｂ６－ＣＤ３－１はどちらの濃度においても６０％以上の殺傷活性を示したが、５６３－ＣＣＲ８－ＣＤ３では４．１ｐＭで１４．７％、１．３７ｐＭでは１．３３％の殺傷率であった。

　次にＦＬｕｃ／ＡＴＮ－１細胞を標的細胞として、実施例２０と同様の系で細胞殺傷活性を評価した（Ｎ＝３）。二重特異性抗体の濃度は３２ｐＭから０．１２５ｐＭまで３倍希釈で実施した。Ｅ／Ｔ細胞比率は５：１とした。

　その結果を図３０に示す。Ｂ６－ＣＤ３－１はＥＣ５０値が１．６ｐＭ±０．２５ｐＭの細胞傷害活性を示したが、５６３－ＣＣＲ８－ＣＤ３では濃度依存的な殺傷は認められなかった。スチューデントＴ検定を全ての測定点で実施した結果、０．４１ｐＭ以上の濃度の全ての測定点において、Ｂ６－ＣＤ３－１が５６３－ＣＣＲ８－ＣＤ３と比較して有意（Ｐ＜０．０５）に高い細胞傷害活性を示した。また、５６３－ＣＣＲ８－ＣＤ３の細胞傷害活性はどの濃度においても１０％以下であった。以上より、特許文献２０に基づいて構築した５６３－ＣＣＲ８－ＣＤ３は、Ｂ６－ＣＤ３－１と比較して細胞傷害活性が低いことが示された。

　本発明のＣＣＲ８を抗原として認識する二重特異性抗体は、ＣＣＲ８発現細胞に対して細胞傷害活性を有する。さらに、本発明のＣＣＲ８を抗原として認識する二重特異性抗体が抗腫瘍効果を示す。すなわち、本発明のＣＣＲ８を抗原として認識する二重特異性抗体は、癌の治療及び予防に有用である。

Claims

抗ＣＣＲ８抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む抗ＣＣＲ８－ｓｃＦｖ領域、並びに、
エフェクター細胞の表面マーカーを認識する抗体の軽鎖又は重鎖の可変領域を１以上含む領域
を含む、二重特異性抗体。
抗ＣＣＲ８－ｓｃＦｖ領域が、
１）配列番号５７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号５８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号５９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号６０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号６１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号６２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
２）配列番号５７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号６３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号５９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号６４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号６１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号６５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
３）配列番号６６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号６７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号６８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号６９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号７０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号７１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
４）配列番号７２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号６７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号７３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号７４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号７５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号７６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；又は
５）配列番号７７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号７８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号７９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号８０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号８１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号８２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域
を含む、請求項１記載の二重特異性抗体。
抗ＣＣＲ８－ｓｃＦｖ領域が、
１）配列番号４５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号４６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
２）配列番号４７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号４８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
３）配列番号４９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号５０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
４）配列番号５１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号５２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
５）配列番号５３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号５４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；又は
６）配列番号５５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号５６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域
を含む、請求項１記載の二重特異性抗体。
抗ＣＣＲ８－ｓｃＦｖ領域において、軽鎖可変領域と重鎖可変領域が配列番号２のリンカー配列を介して連結している、請求項１～３のいずれか一項記載の二重特異性抗体。
Ｎ末端にＣＤ８Ａシグナル配列領域が連結されている、請求項１～4のいずれか一項記載の二重特異性抗体。
ＣＤ８Ａシグナル配列領域が抗ＣＣＲ８－ｓｃＦｖ領域のＮ末端側に存在する、請求項５記載の二重特異性抗体。
ＣＤ８Ａシグナル配列領域が配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項５または６記載の二重特異性抗体。
抗ＣＣＲ８－ｓｃＦｖ領域が配列番号３９～４４のいずれかのアミノ酸配列を有する、請求項１～７のいずれか一項記載の二重特異性抗体。
エフェクター細胞がＴ細胞である、請求項１～８のいずれか一項記載の二重特異性抗体。
Ｔ細胞の表面マーカーがＣＤ３であり、ＣＤ３を認識する抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域を含む、請求項９記載の二重特異性抗体。
抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域が、
１）配列番号１６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号１７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号１８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号１９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号２０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号２１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
２）配列番号２２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号２３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号２４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号２５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号２６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号２７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
３）配列番号２８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号２９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号３０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号３１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号３２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号３３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；又は
４）配列番号８７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号８８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号８９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域並びに
配列番号９０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号９１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号９２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域
を含む、請求項１０記載の二重特異性抗体。
抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域が、
１）配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
２）配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
３）配列番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；又は
４）配列番号８５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び、
配列番号８６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域
を含む、請求項１０記載の二重特異性抗体。
抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域が配列番号７、８、９又は８４のアミノ酸配列を有する、請求項１０記載の二重特異性抗体。
Ｔ細胞の表面マーカーがＣＤ３であり、ＣＤ３を認識するＶＨＨ抗体の重鎖可変領域を含む抗ＣＤ３－ＶＨＨ領域を含む、請求項９記載の二重特異性抗体。
エフェクター細胞がＮＫ細胞である、請求項１～８のいずれか一項記載の二重特異性抗体。
ＮＫ細胞の表面マーカーがＣＤ１６であり、ＣＤ１６を認識する抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む抗ＣＤ１６－ｓｃＦｖ領域を含む、請求項１５記載の二重特異性抗体。
ＮＫ細胞の表面マーカーがＣＤ１６であり、ＣＤ１６を認識するＶＨＨ抗体の重鎖可変領域を含む抗ＣＤ１６－ＶＨＨ領域を含む、請求項１５記載の二重特異性抗体。
抗ＣＤ１６－ＶＨＨ領域が、
配列番号３５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
配列番号３６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び
配列番号３７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域
を含む、請求項１７記載の二重特異性抗体。
抗ＣＤ１６－ＶＨＨ領域が配列番号３４のアミノ酸配列を有する、請求項１７記載の二重特異性抗体。
抗ＣＣＲ８抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む抗ＣＣＲ８－ｓｃＦｖ領域と、エフェクター細胞の表面マーカーを認識する抗体の軽鎖又は重鎖の可変領域を１以上含む領域が、配列番号３～６のいずれかのｓｃＦｖリンカー配列を介して連結している、請求項１～１９のいずれか一項記載の二重特異性抗体。
Ｃ末端に配列番号３８のアミノ酸配列を有するヒスチジンタグが付加している、請求項１～２０のいずれか一項記載の二重特異性抗体。
Ｆｃ領域を有する、請求項１～２１のいずれか一項記載の二重特異性抗体。
請求項１～２２のいずれかに記載の二重特異性抗体を含有する医薬組成物。
癌を治療するために用いる、請求項２３記載の医薬組成物。
ＣＣＲ８を発現する腫瘍内浸潤Ｔｒｅｇ細胞の除去作用を有する、請求項２４記載の医薬組成物。
腫瘍細胞にＣＣＲ８が発現していない癌を治療するために用いる、請求項２４記載の医薬組成物。
腫瘍細胞にＣＣＲ８が発現している癌を治療するために用いる、請求項２４記載の医薬組成物。
請求項１～２２のいずれかに記載の二重特異性抗体のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
請求項２８記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。