[go: up one dir, main page]

RS66986B1 - Antisense lečenje angelmanovog sindroma - Google Patents

Antisense lečenje angelmanovog sindroma

Info

Publication number
RS66986B1
RS66986B1 RS20250666A RSP20250666A RS66986B1 RS 66986 B1 RS66986 B1 RS 66986B1 RS 20250666 A RS20250666 A RS 20250666A RS P20250666 A RSP20250666 A RS P20250666A RS 66986 B1 RS66986 B1 RS 66986B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
aso
ube3a
antisense oligonucleotide
seq
nucleic acid
Prior art date
Application number
RS20250666A
Other languages
English (en)
Inventor
Scott Victor Dindot
Original Assignee
Texas A & M Univ Sys
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Texas A & M Univ Sys filed Critical Texas A & M Univ Sys
Publication of RS66986B1 publication Critical patent/RS66986B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/113—Antisense targeting other non-coding nucleic acids, e.g. antagomirs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/334—Modified C
    • C12N2310/3341—5-Methylcytosine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/341—Gapmers, i.e. of the type ===---===
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3521—Methyl
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3525—MOE, methoxyethoxy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

Opis
Pozadina
Angelmanov sindrom (AS) je neurološki razvojni poremećaj koji je povezan sa ozbiljnim kognitivnim i motornim nedostacima, epilepsijom, poremećajem spavanja i atipičnim „srećnim“ stavom. Osobama se AS često dijagnostikuje sa 2–3 godine starosti i imaju normalan životni vek. Tokom celog života su im potrebni život uz podršku i medicinska nega. Trenutno postoji nekoliko opcija lečenja za osobe sa AS-om, od kojih većina uključuje lekove protiv epilepsije za lečenje napada.
Angelmanov sindrom izazivaju mutacije koje utiču na ispoljavanje ili funkciju maternalno nasleđenog gena ubikvitin-proteinske ligaze E3A (UBE3A). Za razliku od većine gena, UBE3A je podložan genomskom utiskivanju, što je redak, fenomen koji se pojavljuje u prirodi, koji isključuje jedan alel gena dok drugi ostavlja uključenim. U neuronima centralnog nervnog sistema (CNS), paternalni UBE3A alel je isključen, dok su u svim drugim tipovima ćelija tela oba alela UBE3A uključena. Zbog toga, AS je uvek uzrokovan mutacijama koje utiču na maternalno nasleđene UBE3A alele.
Paternalni UBE3A alel je isključen UBE3A antisense
transkriptom (UBE3A-AS), koji je komponenta dugog RNK transkripta koji ispoljava nekoliko transkripta koji kodiraju proteine i koji ih ne kodiraju. UBE3A-AS se ispoljava iz paternalnog alela i samo u neuronima CNS-a i dovoljan je i neophodan za isključivanje ispoljavanja paternalnog UBE3A alela. Nejasno je zašto je UBE3A utisnut u neurone, ali stvara jedinstvenu priliku za lečenje pojedinaca sa AS-om, jer postoji funkcionalna, iako neaktivna, kopija UBE3A na paternalnom hromozomu. Dosadašnja istraživanja pokazuju da je uključivanje paternalnog UBE3A alela održiva terapija za lečenje AS-a.
WO2014/004572 opisuje postupke i jedinjenja za inhibiciju UBE3A-ATS, endogenog antisense transkripta ubikvitin-proteinske ligaze E3A (UBE3A). Takvi postupci i jedinjenja su korisni za induciranje ispoljavanja paternalnog UBE3A u ćelijama i životinjama. Linyan Meng i sar. (2014 „Towards a therapy for Angelman syndrome by targeting a long non-coding RNA“, Nature, Tom 518, br.
7539, stranice 409–412) otkrivaju antisense oligonukleotide koji ciljaju mišiji UBESA-ATS i povećavaju ispoljavanje UBESA kao životinjski modelski sistem za terapiju za Angelmanov sindrom.. Tan Wen-Hann i sar. (2016 „Pharmacological therapies for Angelman syndrome“, Wiener Medizinische Wochenschrift, Tom 167, br. 9, stranice 205–218) otkrivaju pristup antisense oligonukleotidima posredovanog ciljanje UBESA-ATS za povećavanje ispoljavanja UBESA, za terapiju za Angelmanov sindrom.
Sažetak
Predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja se sastoji od jednog ili više antisense oligonukleotida u farmaceutski prihvatljivom razblaživaču, rastvaraču, nosaču, soli i/ili adjuvansu za upotrebu u lečenju ili prevenciji Angelmanovog sindroma kod subjekta, pri čemu jedan ili više antisense oligonukleotida sadrži sekvencu nukleotida dužine od 10 do 30 nukleotida sa 100% komplementarnosti spram neprekidnog dela sekvence nukleinske kiseline odabranog između SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 i SEQ ID NO:5, pri čemu je antisense oligonukleotid u stanju da cilja 5' kraj UBE3A-AS transkripta.
Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje antisense oligonukleotid koji sadrži sekvencu nukleotida dužine od 17 do 20 nukleotida sa 100% komplementarnosti spram neprekidnog dela SEQ ID NO:2, pri čemu je antisense oligonukleotid u stanju da cilja 5' kraj UBE3A-AS transkripta.
Ovde je otkriven region u 5' kraju UBE3A-AS transkripta koji je važan za njegovu stabilnost. Na osnovu ovih nalaza, antisense oligonukleotidi (ASO-ovi) su dizajnirani da ciljaju ovaj region kako bi okončali transkripciju UBE3A-AS i ponovo aktivirali ispoljavanje paternalnog UBE3A alela. Ovi ASO-ovi ciljaju 5' kraj UBE3A-AS su sposobni da zaustave transkripciju UBE3A-AS i uključe
paternalni UBE3A alel. SNHG14 je policistronski transkript koji kodira više različitih RNK-ova, uključujući UBE3A-AS.
U skladu s tim, ovde su otkriveni ASO-ovi koji sadrže neprekidnu sekvencu nukleotida dužine od 10 do 30 nukleotida (tj., 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ili 30) sa najmanje 98% (tj.98%, 99% ili 100%) komplementarnosti spram ciljnih eksona između 3'
kraja SNORD115 i 5' kraja SNORD109B, za koji se smatra da predstavlja 5' kraj UBE3A antisense transkripta (UBE3A-AS). Posebno, ciljni egzoni mogu da budu na 5' kraju UBE3A-AS, što odgovara poziciji 25,511,577 do 25,516,681 na ljudskom hromozomu 15 sklopa ljudskih genoma hg19. U nekim otelotvorenjima, ciljna nukleinska kiselina je jedan od pet eksona koji se nalaze na 5' kraju UBE3A-AS, što može odgovarati pozicijama 25,511,577 do 25,511,761 (ekson 1), 25,512,059 do 25,512,191 (ekson 2), 25,513,476 do 25,513,600 (ekson 3), 25,514,752 do 25,514,880 (ekson 4) i 25,516,565 do 25,516,681 (ekson 5). Stoga, ciljna nukleinska kiselina može da bude neprekidna sekvenca nukleinske kiseline od 10 do 30 nukleotida unutar SEQ ID NO:1, 2, 3, 4 ili 5.
U nekim otelotvorenjima, ciljna sekvenca je eksonska granica koja uključuje UBE3A-AS eksone 1–5, UBE3A-AS ekson 5 i SNORD109B ekson 1 i/ili SNORD109B eksone 1–2.
Postupci i strategije za dizajniranje ASO-ova su poznate u predmetnoj oblasti. U nekim otelotvorenjima, ASO je dizajniran da cilja sekvence koje su očuvane među ljudskim subjektima. U nekim otelotvorenjima, ASO je dizajniran da cilja sekvence koje su očuvane među primatskim subjektima.
Oligonukleotid može da bude antisense oligonukleotid (tj., kao što će razumeti osoba sa uobičajenim znanjem u predmetnoj oblasti – antisense svojoj ciljnoj nukleinskoj kiselini), na primer, sa gepmer dizajnom. Otkriveni oligonukleotid je u stanju da indukuje ispoljavanje paternalnog UBE3A u neuronu putem degradacije, redukcije ili uklanjanja UBE3A-AS transkripta. To čini tako što cilja 5' kraj UBE3A-AS na lokaciji uzvodno od SNORD109B snoRNK. Primeri ASO-ova dizajniranih za ciljanje eksona 1–5 su obezbeđeni u Tabelama 1, 2, 3, 4 ili 5. Na primer, u nekim otelotvorenjima, ASO se sadrži sekvencu nukleinske kiseline SEQ ID NO: 7, 8, 9 ili 10.
Otkriveni ASO-ovi takođe mogu imati jednu ili više modifikacija za poboljšavanje stabilnosti, rastvorljivosti, aktivnosti, ćelijske distribucije i/ili ćelijskog unosa. Na primer, otkriveni ASO može da sadrži jedan ili više nukleozida modifikovanih šećerom i/ili modifikovanih internukleozidnih veza. Na primer, u nekim otelotvorenjima, oligonukleotid sadrži jednu ili više internukleozidnih veza modifikovanih od prirodnog fosfodiestra u vezu koja je, na primer, otpornija na napad nukleaze. U nekim otelotvorenjima, ASO sadrži jednu ili više modifikovanih nukleobaza koje se razlikuju od nukleobaza koje se pojavljuju u prirodi, ali su funkcionalne tokom hibridizacije nukleinske kiseline.
U nekim otelotvorenjima, ASO je DNK oligonukleotid. U nekim otelotvorenjima, ASO je RNK oligonukleotid. U drugim otelotvorenjima, ASO sadrži i dezoksinukleotide i ribonukleotide. Na primer, ASO može da bude gepmer, hedmer ili tejlmer oligonukleotid. U nekim otelotvorenjima, centralni blok gepmera je okružen blokovima modifikovanih ribonukleotida koji štite unutrašnji blok od degradacije nukleaze. Na primer, ASO može da sadrži 7, 8, 9, 10 ili više prirodnih DNK monomera da bi aktivirao RNaza H cepanje ciljnog RNK-a, zajedno sa 3, 4 ili 5 modifikovanih ribonukleotidnih monomera na 3' i 5' krajevima radi zaštite od egzonukleaza. U nekim slučajevima, modifikovani ribonukleotidi su 2'-O-metil (OMe) RNK nukleotidi, 2'-O-metoksietil (MOE) modifikovani nukleotidi ili 2' zaključane nukleinske kiseline (LNK). Primeri gepmer ASO-ova su obezbeđeni u Tabelama 7, 11 i 17. Stoga, u nekim otelotvorenjima otkriveni ASO ima sekvencu nukleinske kiseline odabranu između SEQ ID NO:363 do 392.
Takođe su otkrivene farmaceutske kompozicije koje sadrže jedan ili više ASO-ova koji su ovde navedeni i farmaceutski prihvatljive rastvarače, nosače, soli i/ili adjuvanse.
Takođe su otkriveni postupci za in vitro indukciju ispoljavanja UBE3A u ciljnoj ćeliji naznačeni time što se ispoljavanje paternalnog UBE3A suzbija primenom jednog ili više otkrivenih ASO-ova ili ovde otkrivenih kompozicija u efektivnoj količini na navedenu ćeliju.
Takođe su otkrivene farmaceutske kompozicije pronalaska za korišćenje postupaka za lečenje ili sprečavanje Angelmanovog sindroma koje sadrže primenu terapijski ili profilaktički efektivne količine jednog ili više otkrivenih ASO-ova na subjekta koji boluje od ili je podložan Angelmanovom sindromu.
Detalji jednog ili više otelotvorenja pronalaska izloženi su u propratnim crtežima i u opisu u nastavku. Ostale karakteristike, ciljevi i prednosti pronalaska biće vidljivi iz opisa i crteža i iz patentnih zahteva. Na primer, stručnjaci u predmetnoj oblasti će, čitajući specifikaciju, ceniti da predmetno obelodanjivanje pokazuje korisnost određenih sekvenci kao što je ovde opisano za uticanje na ispoljavanje UBE3A i nadalje podučava korisnost oligonukleotidnih formata koji su, ili ciljaju (npr. komplementarni su spram), takve sekvence. Stručnjaci u predmetnoj oblasti će ceniti da predmetno obelodanjivanje nije ograničeno na bilo koji poseban mehanizam delovanja – pod uslovom da oligonukleotidi mogu da budu korisni bez obzira na to da li deluju putem antisense mehanizma koji, na primer, uključuje aktivnost RNaze H i druge terapijske formate (npr. siRNK, shRNK, nukleaza gRNK itd.) oligonunukleotida koji takođe jesu ili ciljaju takve sekvence su takođe obezbeđeni. Analogno tome, stručnjaci u predmetnoj oblasti će ceniti da predmetno obelodanjivanje, definisanjem korisnih sekvenci kao što je ovde opisano, takođe opisuje različite formate za takve sekvence (npr. kao deo vektora nukleinske kiseline, kao što je vektor iz kojeg se mogu ispoljiti (npr. in vivo, in vitro ili oba itd.). Tako će stručnjaci u predmetnoj oblasti, čitajući ovo obelodanjivanje, ceniti da je referisanje na „ASO-ove“ ovde primerno i da odgovarajuće nukleinske kiseline (npr. oligonunukleotidi) mogu da se koriste bez obzira na mehanizam delovanja; stručnjaci u predmetnoj oblasti su svesni opsežne literature u pogledu pogodnog formata i strukture nukleinskih kiselina (npr. oligonunukleotidi) koje deluju putem bilo kog od raznih mehanizama, (npr. siRNK, shRNK, nukleaza gRNK itd.). U nekim otelotvorenjima, pod uslovom da nukleinske kiseline inkorporiraju format i/ili strukturalne karakteristike poznate u predmetnoj oblasti da budu korisne u jednom ili više mehanističkih konteksta (npr. u koje je uključen RNaza H, RISC, nukleinskom kiselinom usmerena nukleaza kao što je Cas itd.).
Opis crteža
SL. Od 1A do 1D ilustruju Prader-Willi/Angelmanovim sindromom (PWS/AS) utisnuti region u ljudskom biću i mišu. SL.1A prikazuje RefSeq oznaku ljudskog PWS/AS utisnutog regiona. SL.1B prikazuje RefSeq oznaku ljudskog PWS/AS utisnutog ortolognog regiona u mišu. SL.1C prikazuje UBE3A-AS i 3' kraj UBE3A. SL.1D prikazuje poravnanje lanca koje pokazuje ortologne regione između čoveka, makaka (makaki rakojed), svinje, slona, miša, i pacova. Ciljni region je očuvan među neljudskim primatima, ali ne i među glodarima. SL.1D takođe prikazuje graf genomske evolucione stope profilisanja (GERP) regiona. Pozitivne vrednosti predstavljaju evoluciono ograničenje na specifičnim DNK bazama.
SL.2A do 2E prikazuje analizu ASO-ova koji ciljaju mišiji Ube3a-AS. SL.
2A je šema mišijeg Ube3a-AS transkripta i približne lokacije ASO-ova specifičnih za miša. Okviri i linije predstavljaju eksone i introne, respektivno. Strelica predstavlja smer transkripcije. SL.2B je šema Ube3aYFP reporterskog alela koji se koristi za merenje nivoa proteina paternalnog Ube3a. Model mišijeg Ube3aYFP je generisan ciljanjem žutog fluorescentnog proteina (yellow fluorescent protein, YFP) prema 3' kraju endogenog Ube3a lokusa. Ispoljavanje Ube3a-AS inhibira transkripciju paternalnog Ube3aYFP alela i gubitak Ube3a-AS ponovo aktivira ispoljavanje paternalnog Ube3aYFP, koji se može detektovati imunofluorescentnim dijagnostičkim slikanjem uz upotrebu antitela protiv YFP-a. SL.2C je šema eksperimentalnog vremenskog toka za ispitivanje ASO-ova u mišijim primarnim neuronima hipokampusa. Mišiji primarni neuroni hipokampusa generisani su od novorođenih miševa sa paternalno nasleđenim Ube3aYFP alelom (0 DIV) i lečeni posle 7 dana in vitro (7 DIV). Tri dana nakon tretmana (10 DIV), izmereni su nivoi Ube3aYFP proteina u pojedinačnim ćelijama. SL.2D sadrži imunofluorescentne slike koje pokazuju parenteralni Ube3aYFP protein u primarnim neuronima lečenih vehikulumom (veh), negativnom kontrolom ASO (ASO-C), topotekanom (Topo), ASO-B i ASO 1,1. SL.2E prikazuje srednje vrednosti nivoa intenziteta paternalnog Ube3aYFP u pojedinačnim neuronskim ćelijama lečenim vehikulumom (veh, 1% DMSO; n = 3), kontrolnim ASO (ASO-C, 15 µM; n = 3), topotekanom (Topo, 0,3 µM; n = 3), ASO-B (1, 5, 15 µM; n = 3), ASO-1.1 (1, 5, 15 µM), ASO-1.2 (1, 5, 15 µM) i ASO 3.1 (1, 5, 15 µM). Skraćenice: YFP, žuti fluorescentni protein; Tx, lečenje; DIV, dana u vitro; n.s., nije značajno. Trake grešaka predstavljaju standardnu grešku srednje vrednosti.
SL. 3A do 3D prikazuje analizu ASO-ova koji ciljaju ljudski UBE3A-AS. SL.3A je šematski prikaz ljudskog UBE3A-AS i približne lokacije ASO-ova specifičnih za ljude (ASO-ovi 1–6). ASO-7 se nalazi u intronu UBE3A-AS. Okviri i linije predstavljaju eksone i introne, respektivno. SL.3B je šema eksperimentalnog vremenskog toka za ispitivanje ASO-ova u neuronima izvedenim iz ljudskih GABAergički indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija (engl. induced pluripotent stem cell, iPSC) iz karotipično normalne osobe. Ljudski neuroni izvedeni iz iPSC-a lečeni su nakon 14 DIV i zatim obrađeni za izolaciju RNK na 20 DIV. SL.3C i 3D prikazuju relativne RNK nivoe u stabilnom stanju (normalizovane za ASO-C) za UBE3A-AS (SL.3C) i UBE3A (SL.3D) u neuronima izvedenim iz iPSC-a koji se tretiraju kontrolnim ASO-om (ASO-C, 10 µM), i ASO-ovima 1–7 (10 µM), i topotekanom (Topo, 1 µM). Skraćenice: Tx, lečenje; DIV, dana in vitro. Trake grešaka predstavljaju standardnu grešku srednje vrednosti.
SL. 4A do 4I prikazuju analizu ljudskog ASO-4 i topotekana u GABAergičkim neuronima izvedenim iz iPSC-a. SL.4A do 4F prikazuju relativno ispoljavanje (normalizovano na 1 nM) za UBE3A-AS (SL.4A), SNORD116 (SL. 4B), IPW (SL.4C), SNORD115 (SL.4D), SNORD109A/B (SL.4E) i UBE3A (SL.
4F) RNK nivoe u stabilnom stanju neurona izvedenih iz iPSC-a lečenih 1⁄2 log krivuljom doze u 10 tačaka ASO-4 i topotekana (1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM, 300 nM, 1 µM, 3 µM, 10 µM i 30 µM). SL.4G je šema eksperimentalnog vremenskog toka za ispitivanje ASO-4 u GABAergičkim neuronima izvedenim iz iPSC-a lečenim na 59 DIV.. SL.4H do 4I prikazuju relativno ispoljavanje (normalizovano za ASO-C) za UBE3A-AS (SL.4H) i UBE3A (SL.4I) RNK nivoe u stabilnom stanju u neuronima izvedenim iz iPSC-a lečenih sa ASO-C (10 µM) i ASO-4 (1, 5 i 10 µM). Skraćenice: Tx, lečenje. Trake grešaka predstavljaju standardnu grešku srednje vrednosti.
SL. 5A do 5F prikazuju analizu optimizovanih ASO-ova u ljudskim GABAergičkim i glutamatergičkim neuronima izvedenim iz iPSC-a. SL.5A je šema eksperimentalnog vremenskog toka za ispitivanje ASO-ova u GABAergičkim neuronima izvedenim iz iPSC-a. SL.5B prikazuje relativno ispoljavanje (normalizovano za vodenu kontrolu) UBE3A-AS RNK nivoa u stabilnom stanju u neuronima izvedenim iz iPSC-a lečenih 1⁄2 log krivuljom doze u 5 tačaka (30 nM, 100 nM, 300 nM, 1 µM, 3 µM; n = 6) ASO-3.1, ASO-3.2, ASO-4.1, ASO-4.2, ASO-4.3, ASO-4.4, ASO-6.1, ASO-4.I i ASO-4.S. ASO-4.I i ASO-4.S predstavljaju ASO4 proizveden od strane dve kompanije (ASO-4.I, Integrated DNA Technologies; ASO-4.S, Sigma-Aldrich). SL.5C je šema eksperimentalnog vremenskog toka za ispitivanje ASO-4 i ASO-6.1 u GABAergičkim neuronima izvedenim iz iPSC-a. SL.
5D prikazuje relativno ispoljavanje (normalizovano na 1 nM) UBE3A-AS i UBE3A RNK nivoa u stabilnom stanju u neuronima izvedenim iz iPSC-a lečenim 1⁄2 log krivuljom doze u 10 tačaka (1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM, 300 nM, 1 µM, 3 µM, 10 µM i 30 µM; n = 3) ASO-4 (ASO-4.I i ASO-4.S) i ASO-6.1. SL. 5E je šema eksperimentalnog vremenskog toka za ispitivanje ASO-4 i ASO-6.1 u GABAergičkim neuronima izvedenim iz iPSC-a. SL.5F prikazuje relativno ispoljavanje (normalizovano za vodenu kontrolu) UBE3A-AS i UBE3A RNK nivoa u stabilnom stanju u neuronima izvedenim iz iPSC-a lečenim 1⁄2 log krivuljom doze u 10 točaka (1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM, 300 nM, 1 µM, 3 µM, 10 µM i 30 uM; n = 3) ASO-4 (ASO-4.I i ASO-4.S) i ASO-6.1. Trake grešaka predstavljaju standardnu grešku srednje vrednosti.
SL. 6A do 6D prikazuju identifikaciju ASO ciljnog regiona u PWS/AS utisnutom regionu. SL.6A prikazuje RefSeq oznaku ortolognog PWS/AS utisnutog regiona na mišijem hromozomu 7C. SL.6B ilustruje sklop transkript generisan iz podataka sekvenciranja RNK (RNK-seq) iz mišijeg mozga. SL.6C prikazuje ASO ciljni region koji pokazuje Snord115 snoRNK-ove zadržanih u eksonima transkriptu gena-domaćina Snord115 / 5' kraju Ube3a-AS. Poravnata očitavanja RNK-seq su oslikana ispod sklopljenih transkripta. Eksoni i introni su predstavljeni okvirima i linijama, respektivno. SL.6D je poravnanje sekvenci snoRNK-ova u zadržanim eksonima Snord115_ENSMUST00000101836 (SEQ ID NO:490), Snord115_ENSMUST00000101936 (SEQ ID NO:491), Snord115_ENSMUST00000104493 (SEQ ID NO:492), Snord115_ENSMUST00000082443 (SEQ ID NO:493) i Snord115_ENSMUST00000104427 (SEQ ID NO:494), koje prikazuje da zadržani snoRNK-ovi imaju degenerisani C boks, koji je potreban za formiranje funkcionalnog snoRNK.
SL. SL.7A do 7G prikazuju identifikaciju ASO ciljnog regiona u ljudskim PWS/AS utisnutom regionu. SL.7A prikazuje RefSeq oznaku ljudskog Prader-Willi/Angelmanovim sindromom (PWS/AS) utisnutog regiona. SL.7B prikazuje RNK-seq sklop ljudskog PWS policistronskog transkripta. SL.7C pokazuje da je SNORD115-45 zadržan u eksonu na 3' kraju transkript gena
domaćina SNORD115 / 5' kraju UBE3A-AS. Poravnata RNK-seq očitavanja generisana iz odraslog ljudskog mozga pokazuju da je L1 LINIJA transkribovana. SL. 7D prikazuje RefSeq oznake 3' kraja SNORD115 klastera (SNORD115-39-48 i SNORD109B). SL.7E prikazuje lokaciju elementa L1 LINIJE
između SNORD115-44 i SNORD115-45. SL.7F prikazuje poravnanje lanaca placentnih sisara koji predstavljaju glavne klade koje pokazuju očuvanje
u SNORD115-45-48 regionu, iako je kod glodara smanjeno. SL.7G prikazuje poravnjanje sekvence snoRNK-ova u ciljnom regionu prema SNORD115-44 (funkcionalni snoRNK) (SEQ ID NO:495), SNORD115-48 (SEQ ID NO:496), SNORD115-45 (SEQ ID NO:497), SNORD115-46 (SEQ ID NO:498) i SNORD115-47 (SEQ ID NO:499), koje pokazuje da SNORD115-45 (zadržani), SNORD115-46 (delomično zadržani) i SNORD116-47 imaju degenerisani C boks, koji je potreban za formiranje funkcionalnog snoRNK.
SL. 8A do 8C prikazuju farmakodinamičku analizu kandidatskih ASO-ova. SL.8A prikazuje prilagođenu krivulju odgovora na dozu
normalizovanih UBE3A-AS RNK nivoa u stabilnom stanju u GABAergičkim neuronima izvedenim iz iPSC-a lečenih sa 1⁄2 log krivuljom doze u 10 tačaka (1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM, 300 nM, 1 µM, 3 µM, 10 µM i 30 µM; n = 2) ASO-4 i ASO-6.1 sa različitim dizajnima kičmenih i RNK modifikacija. Krivulje odgovora na dozu su prilagođene pomoću modela logističke regresije od 4 parametra (Hill). Grafikoni predstavljaju prilagođene modele i standardnu grešku. Y osa predstavlja relativne UBE3A-AS RNK nivoe i X osa predstavlja log molarne (M) koncentracije ASO-a. SL.8B i 8C su grafikoni hijerarhijskog grupisanja dendrograma i konstelacija prilagođenih krivulja odgovora na dozu koji prikazuju odnos između kandidatskih ASO-ova i grupisanje u 3 klastera.
SL. 9 prikazuje farmakodinamičku analizu ASO-6.1.PO-1.O i ASO-4.4.PS.L u Angelmanovom sindromu neurona izvedenih iz iPSC-a. Model logističke regresije od 4 parametra (Hill) normalizovanih UBE3A-AS RNK nivoa u stabilnom stanju u neuronima izvedenim iz iPSC-a sa Angelmanovim sindromom sa 1⁄2 log krivuljom doze u 10 tačaka (1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM, 300 nM, 1 µM, 3 µM, 10 µM, i 30 µM; n = 3) ASO-6.1.PO-1.O i ASO-4.4.PS.L.
SL. 10 prikazuje analizu ispoljavanja RNK-ova kodiranih od strane PWS policistronskih transkripta u iPSC neuronima sa Angelmanovim sindromom lečenim sa ASO-6.1-PO-1.O i ASO-4.4.PS.L. Prikazani su normalizovani RNK nivoi u stabilnom stanju za SNURF, SNRPN, SNHG116, SNORD116 snoRNK-ova, IPW, SNHG115, SNORD115 snoRNK-ova, UBE3A-AS, i UBE3A u AS neuronima izvedenim iz iPSC-a lečenim vehikulumom (1% H2O; n = 3), ASO-6.1.PO-1.O (30 µM; n = 3) i ASO-4.4.PS.L (30 µM; n =3). Podaci predstavljaju srednju vrednost procenta RNK u odnosu na vehikulum. Trake grešaka predstavljaju standardnu grešku srednje vrednosti. Asterisk (*) označava statistički značajne razlike (p < 0,05) koristeći jednosmerni ANOVA test sa Dunnett višestrukim upoređivanjem u odnosu na vehikulum. ;;SL. 11 prikazuje farmakodinamičku analizu ASO-6.1.PO-1.O i ASO-4.4.PS.L u makaki rakojedu. Prikazani su RNK nivoi u stabilnom stanju za UBE3A-AS u regionima CNS-a makaka lečenim vehikulumom (0,9% fiziološkog rastvora; n = 5), ASO-6.1.PO-1.O (10 mg; n = 3) i ASO-4.4.PS.L (10 mg; n = 3). Podaci predstavljaju srednju vrednosti procenta UBE3A-AS RNK u odnosu na vehikulum. Trake grešaka predstavljaju standardnu grešku srednje vrednosti. Asterisk (*) označava statistički značajne razlike (p < 0,05) koristeći jednosmerni ANOVA test sa Dunnett višestrukim upoređivanjem u odnosu na vehikulum.
Detaljan opis
UBE3A-AS/Ube3a-AS transkript, poznat i kao ubikvitin-proteinska ligaza E3A antisense transkript i UBE3A-AS/Ube3a-AS je naziv za transkript generisan transkripcijom UBE3A-AS transkripta, koji je na antisense nitima DNK u odnosu na UBE3A gen. Imajte u vidu da imena gena ispisana velikim slovima ukazuju na ljudske gene (npr. UBE3A) a nazivi gena sa samo prvim velikim slovom ukazuju na mišije gene (npr. Ube3a). UBE3A-AS transkript je transkribovan kao deo velike policistronske transkripcione jedinice koja
kodira SNURF-SNRPN, klaster malih nuklearnih RNK-ova C/D boksa neutvrđenog cilja (SNORD-ovi) i više nekarakterisanih dugih nekodirajućih RNK-ova. Kod miša kao i kod čoveka, UBE3A/Ube3a gen je utisnut u neurone centralnog nervnog sistema, gde se ispoljava samo iz maternalnog alela. UBE3A-AS/Ube3a-AS transkript je neophodan i dovoljan za utišavanje transkripcije
paternalnog UBE3A/Ube3a alela i inhibicija UBE3A-AS/Ube3a-AS ponovo aktivira transkripciju paternalnog UBE3A/Ube3a alela. Mutacije koje utiču na funkciju ili ispoljavanje maternalno nasleđenog UBE3A alela uzrokuju Angelmanov sindrom (AS). U AS-u, paternalni alel je funkcionalan ali epigenetski utišan. Ako se njegovo utišavanje poništi u pacijentima sa AS-om, paternalni UBE3A alel bi mogao da bude izvor funkcionalnog UBE3A u neuronima.
Policistronska transkripciona jedinica (u nastavku PTU) koja kodira UBE3A-AS ima dužinu od oko 450.000 baznih parova. Transkripcija PTU-a počinje na uzvodnim eksonima (u-eksoni) u SNURF-SNRPN lokusu i zaustavlja se ka 5' kraju UBE3A. PTU je organizovan (5'-3') kako sledi: SNURF-SNRPN, SNORD107, SNORD64, SNORD109A, SNORD116 (29 kopija), IPW, SNORD115 (48 kopija), SNORD109B i UBE3A, koji je orijentisan u smeru suprotnom spram uzvodnog transkripta. Polisistronski transkript je alternativno splajsovan i podložan je alternativnoj 3'-obradi. SNURF-SNRPN kodira dva polipeptida. SNORD su u intronima transkripta gena domaćina (SNHG14) i generišu se egzonukleolitskim uklanjanjem grana splajsovanih introna. UBE3A-AS predstavlja 3' kraj transkripta koji preklapa UBE3A gen. Većina C/D boks snoRNK-ova igra ulogu u ribozomnoj biogenezi naznačeno time što usmeravaju 2'-O-metilaciju ribozomalnih RNK-ova (rRNK); međutim, snoRNK-ovi koji se nalaze u PWS/AS regionu nemaju nikakvu komplementarnost sekvenci spram poznatih rRNK-ova; međutim, utvrđeno je da SNORD115 snoRNK menja alternativno splajsovanje receptora serotonina 2C pre-mRNK.
Ovde su otkriveni dokazi da je 5' kraj UBE3A-AS transkripta važan za njegovu stabilnost. Kao što je ovde otkriveno, ASO-ovi koji ciljaju 5' kraj UBE3A-AS su sposobni da umanje nivoe UBE3A-AS, pretpostavlja se, zaustavljanjem transkripcije UBE3A-AS i da uključe paternalni UBE3A alel.
Izraz „oligonukleotid“, kako se ovde koristi, definisan je kao što ga stručnjak razume, kao molekul koji sadrži dva ili više kovalentno povezanih nukleozida. Takvi kovalentno vezani nukleozidi se takođe mogu nazvati molekulima nukleinske kiseline ili oligomerima. Oligonunukleotidi se obično prave u laboratoriji, hemijskom sintezom čvrste faze praćenom prečišćavanjem. U referisanju na sekvence oligonukleotida, referiše se na sekvencu ili red nukleobaznih delova ili njihovih modifikacija, kovalentno povezanih nukleotida ili nukleozida. Oligonukleotid koji je ovde otkriven je veštački napravljen, npr. hemijski sintetisan. Oligonukleotid koji je ovde otkriven može takođe da sadrži jedan ili više modifikovanih nukleozida ili nukleotida.
Izrac „antisense oligonukleotid“, kako se ovde koristi, definisan je kao oligonukleotidi sposobni da moduliraju ispoljavanje ciljnog gena hibridizacijom ka ciljnoj nukleinskoj kiselini, posebno ka neprekidnoj sekvenci na ciljnoj nukleinskoj kiselini. U nekim otelotvorenjima, antisense ovde otkriveni oligonukleotidi imaju jednu nit.
Izraz „neprekidna sekvenca nukleotida“ se odnosi na region oligonukleotida koji je komplementaran spram ciljne nukleinske kiseline. Izraz se ovde koristi istoznačno sa izrazom „neprekidna sekvenca nukleobaza“ i izrazom „sekvenca motiva oligonukleotida“. U nekim otelotvorenjima su svi nukleotidi oligonunukleotida prisutni u neprekidnoj sekvenci nukleotida. U nekim otelotvorenjima oligonukleotid sadrži neprekidnu sekvencu nukleotida i opciono može da obuhvata dodatni nukleotid / dodatne nukleotide, na primer linker region nukleotida koji se može koristiti za pričvršćivanje funkcionalne grupe za neprekidnu sekvencu nukleotida. Linker region nukleotida može da bude ili da ne bude komplementaran spram ciljne nukleinske kiseline.
Nukleotidi su gradivni blokovi oligonukleotida i polinukleotida i mogu uključivati nukleotide koji se pojavljuju u prirodi i one koji se ne pojavljuju u prirodi. U prirodi, nukleotidi, kao što su DNK i RNK nukleotidi, sadrže šećerni deo riboze, nukleobazni deo i jednu ili više fosfatnih grupa (koje su odsutne u nukleozidima). Nukleozidi i nukleotidi se takođe mogu istoznačno nazivati „jedinicama“
ili „monomerima“.
Izraz „modifikovani nukleozid“ ili „modifikacija nukleozida“ kako se ovde koristi odnosi se na nukleozide modifikovane u poređenju sa ekvivalentnim DNK ili RNK nukleozidom uvođenjem jedne ili više modifikacija šećernog dela ili (nukleo)baznog dela. U nekim otelotvorenjima, modifikovani nukleozid sadrži modifikovani šećerni deo. Izraz modifikovani nukleozid se ovde takođe može koristiti istoznačno sa izrazom „analog nukleozida“ ili modifikovane „jedinice“ ili modifikovani „monomeri“.
Izraz „modifikovana internukleozidna veza“ je definisan kako ga generalno razume stručnjak, kao veza koja se razlikuje od fosfodiestarskih (PO) veza ili prirodnih fosfatnih veza koje kovalentno spajaju dva nukleozida. Nukleotidi sa modifikovanim internukleotidnim vezama se takođe nazivaju „modifikovani nukleotidi“. U nekim otelotvorenjima, modifikovane internukleotidne veze povećavaju otpornost oligonunukleotida na nukleazu u poređenju sa fosfodiestarskim vezama. Za oligonukleotide koji se pojavljuju u prirodi, internukleozidna veza uključuje fosfatne grupe koje stvaraju fosfodiestarsku vezu između susednih nukleozida. Modifikovane internukleozidne veze su posebno korisne u stabilizaciji oligonunukleotida za in vivo upotrebu i mogu da služe za zaštitu od cepanja nukleazom u regionima DNK ili RNK nukleozida u oligonukleotidima koji su ovde otkriveni, na primer, u regionu gepmer oligonukleotida, kao i u regionima modifikovanih nukleotida.
U nekim otelotvorenjima, oligonukleotid sadrži jednu ili više internukleozidnih veza modifikovanih od prirodnog fosfodiestra u vezu koja je, na primer, otpornija na napad nukleaze. Otpornost na nukleazu može da se utvrdi inkubacijom oligonukleotida u krvnom serumu ili upotrebom testa otpornosti na nukleazu [e.g., fosfodiesterazu iz zmijskog otrova (engl. snake venom phosphodiesterase, SVPD)], što je oboje dobro poznato u predmetnoj oblasti. Internukleozidne veze koje su sposobni da poboljšaju otpornost oligonukleotida na nukleazu se nazivaju internukleozidnim vezama otpornim na nukleazu.
U nekim otelotvorenjima najmanje 50% internukleozidnih veza u oligonukleotidu ili njegovoj neprekidnoj sekvenci nukleotida je modifikovano, kao što je najmanje 60%, kao što je najmanje 70%, kao što je najmanje 80% ili kao što je najmanje 90% internukleozidnih veza u oligonukleotidu ili njegovoj neprekidnoj sekvenci nukleotida je modifikovano. U nekim otelotvorenjima su sve internukleozidne veze oligonukleotida ili njegove neprekidne sekvence nukleotida modifikovane.
Prepoznaće se da, u nekim otelotvorenjima, internukleozidne veze koje povezuju oligonukleotid sa nenukleotidnom funkcionalnom grupom, kao što je konjugat, mogu biti fosfodiester. Prepoznaće se da su, u nekim otelotvorenjima, internukleozidne veze koje povezuju oligonukleotid sa nenukleotidnom funkcionalnom grupom modifikovane.
U nekim otelotvorenjima su sve internukleozidne veze oligonukleotida ili njegove neprekidne sekvence nukleotida internukleozidne veze otporne na nukleazu.
Modifikovane internukleozidne veze mogu, na primer, biti odabrane iz grupe koja sadrži fosfotiotioat, difosfotioat i boranofosfat. U nekim otelotvorenjima, modifikovane internukleozidne veze su kompatibilne sa regrutacijom RNaze H oligonukleotida koji je ovde otkriven, na primer fosforotioata, difosforotioata, ili boranofosfata.
U nekim otelotvorenjima internukleozidna veza sadrži sumpor (S), kao što je fosforotioatna internukleozidna veza.
Fosforotioatna internukleozidna veza je posebno korisna zbog otpornosti na nukleazu, korisne farmakokinetike i lakoće proizvodnje. U poželjnim otelotvorenjima najmanje 50% internukleozidnih veza u oligonukleotidu ili njegovoj neprekidnoj sekvenci nukleotida je fosforotioat, kao što je najmanje 60%, kao što je najmanje 70%, kao što je najmanje 80% ili kao što je najmanje 90% internukleozidnih veza u oligonukleotidu ili njegovoj neprekidnoj sekvenci nukleotida je fosforotioat. U nekim otelotvorenjima su sve internukleozidne veze oligonukleotida ili njegove neprekidne sekvence nukleotida fosforotioat.
U nekim otelotvorenjima, oligonunukleotid sadrži jednu ili više neutralnih internukleozidnih veza, posebno internukleozidnu vezu odabranu između fosfotriestra, metilfosfonata, MMI, amida-3, formacetala ili tioformacetala. Dodatne internukleotidne veze su otkrivene u WO2009/124238. U jednom otelotvorenju internukleozidna veza se bira između linkera otkrivenih u WO2007/031091.
Veze otporne na nukleazu, kao što su fosforotiatne veze, su posebno korisne u regionima oligonukleotida sposobnim da regrutuju nukleazu prilikom formiranja dvojne spirale sa ciljnom nukleinskom kiselinom, kao što je region G za gepmere, ili nemodifikovani nukleozidni region hedmera i tejlmera. Međutim, fosforotioatne veze mogu biti korisne i u regionima koji ne regrutuju nukleaze i/ili u regionima za poboljšanje afiniteta, kao što su regioni F i F' za gepmere ili region modifikovanog nukleozida hedmera i tejlmera.
Svaki od regiona dizajna može, međutim, da sadrži internukleozidne veze koje nisu fosforotioat, kao što su fosfodiestarske veze, posebno u regionima naznačenim time što modifikovani nukleozidi, kao što je LNK, štite vezu od degradacije nukleazom. Uključivanje fosfodiestarskih veza, kao što su jedna ili dve veze, posebno između ili susedno jedinicama modifikovanog nukleozida (obično u regionima koji ne regrutuju nukleazu) može da modifikuje biološku raspoloživost i/ili biološku distribuciju oligonukleotida. WO2008/113832 obezbeđuje učenje oligonukleotida koji imaju fosfodiestarske veze.
U nekim otelotvorenjima su sve internukleozidne veze u oligonukleotidu fosforotioatne i/ili boranofosfatne veze. U nekim otelotvorenjima su sve internukleozidne veze u oligonukleotidu fosforotioatne veze.
Izraz nukleobaza uključuje purinski (npr. adenin i guanin) i pirimidinski (npr. uracil, timin i citozin) deo prisutan u nukleozidima i nukleotidima koji formira vodonične veze u hibridizaciji nukleinske kiseline. Izraz nukleobaza takođe obuhvata modifikovane nukleobaze koje mogu da se razlikuju od nukleobaza koje se pojavljuju u prirodi ali su funkcionalne tokom hibridizacije nukleinske kiseline. U ovom kontekstu, „nukleobaza“ se odnosi na nukleobaze koje se pojavljuju u prirodi, kao što su adenin, guanin, citozin, timidin, uracil, ksantin i hipoksantin, kao i varijante koje se ne pojavljuju u prirodi.
U nekim otelotvorenjima, nukleobazni deo se modifikuje menjanjem purina ili pirimidina u modifikovani purin ili pirimidin, kao što je supstituisani purin ili supstituisani pirimidin, kao što je nukleobaza odabrana između izocitozina, pseudoizocitozina, 5-metil-citozina, 5-tiozolo-citozina, 5-propinil-citozina, 5-propinil-uracila, 5-bromouracil 5-tiazolo-uracila, 2-tio-uracila, 2'tio-timina, inozina, diaminopurina, 6-aminopurina, 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina i 2-hloro-6-aminopurina.
Nukleobazni delovi mogu biti označeni šifrom slova za svaku odgovarajuću nukleobazu, npr. A, T, G, C ili U, naznačenom time što svako slovo opciono može da uključuje modifikovane nukleobaze ekvivalentne funkcije. Na primer, u primernim oligonukleotidima, nukleobazni delovi se biraju između A, T, G, C i 5-metil citozina (5mC). Takođe mogu da se koriste i kombinacije ovih modifikacija. Na primer, mogu da se koriste 5mC LNK nukleozidi. Isto tako, može da se koristi 2'-hidroksimetil (2'-OMe) 5mC.
Izraz „komplementarnost“ opisuje kapacitet za uparivanje baza nukleozida/nukleotida prema Votsonu i Kriku. Bazni parovi prema Votsonu i Kriku su guanin (G)-citozin (C) i adenin (A)-timin (T)/uracil (U). Razumeće se da oligonunukleotidi mogu da sadrže nukleotid sa modifikovanim nukleobazama, na primer, 5-metil citozin se često koristi umesto citozina i kao takav izraz komplementarnosti obuhvata uparivanje baza prema Votsonu i Kriku između nemodifikovanih i modifikovanih nukleobaza.
Izraz „% komplementaran“, kako se ovde koristi, odnosi se na broj nukleotida u procentima neprekidne sekvence nukleotida u molekulu nukleinske kiseline (npr. oligonukleotida) koji su u datoj poziciji komplementarni spram (tj. formiraju bazni par prema Votsonu i Kriku sa) neprekidne sekvence nukleotida u datoj poziciji molekula nukleinske kiseline (npr. ciljne nukleinske kiseline).
Procenat se izračunava brojanjem poravnatih baza koje formiraju parove između dve sekvence, deljenjem sa ukupnim brojem nukleotida u oligonukliotidu i množenjem sa 100. Kod ovakvog poređenja, nukleobaza/nukleotid koji se ne poravna (ne formira bazni par) se naziva neusklađenim.
Izraz „hibridizirajući“ ili „hibridizuje“ kako se ovde koristi treba razumeti kao dve niti nukleinske kiseline (npr. oligonunukleotid i ciljna nukleinska kiselina) koje formiraju vodonične veze između baznih parova na suprotnim nitima, čime se formira dvojna spirala. Afinitet vezivanja između dve niti nukleinske kiseline je snaga hibridizacije. Često opisuje u smislu temperature topljenja (Tm) koja se definiše kao temperatura na kojoj polovina oligonunukleotida formira dvojne spirale sa ciljnom nukleinskom kiselinom. U fiziološkim uslovima, Tm nije strogo proporcionalan afinitetu (Mergny i Lacroix, 2003, Oligonucleotides 13:515–537). Gibsova slobodna energija u standardnom stanju ΔG° je tačniji prikaz afiniteta vezivanja i povezana je sa konstantom disocijacije (Kd) reakcije ΔG°=-RTIn(Kd), gde je R gasna konstanta, a T apsolutna temperatura. Stoga, veoma nizak ΔG° reakcije između oligonukleotida i ciljne nukleinske kiseline odražava jaku hibridizaciju između oligonunukleotida i ciljne nukleinske kiseline. ΔG° je energija povezana sa reakcijom gde su vodene koncentracije 1M, pH je 7 i temperatura je 37 °C. Hibridizacija oligonukleotida do ciljne nukleinske kiseline je spontana reakcija i za spontane reakcije ΔG° je manji od nule. ΔG° može da se izmeri eksperimentalno, na primer, upotrebom postupka izotermalne titracione kalimetrije (ITC) kako je opisan u Hansen i sar., 1965, Chem. Comm.36–38 i Holdgate i sar., 2005, Drug Discov Today. Stručnjak će znati da je dostupna komercijalna oprema za merenja ΔG°. ΔG° se takođe može proceniti numerički korišćenjem modela najbližeg suseda kako opisuje SantaLucia, 1998, Proc Natl Acad Sci USA.95: 1460–1465 koristeći odgovarajuće izvedene termodinamičke parametre opisane u Sugimoto i sar., 1995, Biochemistry 34:11211–11216 i McTigue i sar., 2004, Biochemistry 43:5388–5405. Da bi imali mogućnost da moduliraju svoju ciljanu nukleinsku kiselinu hibridizacijom, oligonunukleotidi koji se ovde otkrivaju hibridiziraju sa ciljnom nukleinskom kiselinom sa procenjenim vrednostima ΔG° ispod -10 kcal za oligonunukleotide koji su dužine 10–30 nukleotida. U nekim otelotvorenjima stepen ili snaga hibridizacije se meri Gibsovom slobodnom energijom standardnog stanja ΔG°. Oligonukleotidi se mogu hibridizovati sa ciljnom nukleinskom kiselinom sa procenjenim vrednostima ΔG° manjim od -10 kcal, na primer manjim od -15 kcal, na primer manjim od -20 kcal i na primer manjim od -25 kcal, za oligonukleotide dužine od 8–30 nukleotida. U nekim otelotvorenjima oligonukleotidi se hibridizuju sa ciljnom nukleinskom kiselinom sa procenjenom vrednošću ΔG° od -10 do -60 kcal, kao što je -12 do -40, kao što je od -15 do -30 kcal ili -16 do -27 kcal kao što je -18 do -25 kcal.
U nekim otelotvorenjima, otkriveni oligonunukleotid sadrži neprekidnu sekvencu nukleotida od najmanje 8 nukleotida koji su komplementarni spram ili hibridizovani sa ciljnom sekvencom prisutnom u molekulu ciljne nukleinske kiseline. Neprekidna sekvenca nukleotida (i stoga ciljna sekvenca) se sastoji od najmanje 8 uzastopnih nukleotida, kao što je 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ili 30 uzastopnih nukleotida, kao što je od 12–25, kao što je od 14–18 uzastopnih nukleotida.
U nekim otelotvorenjima, otkriveni oligonunukleotid je funkcionalna nukleinska kiselina, kao što je siRNK, shRNK, ili nukleaza gRNK, koja inhibira, mutira, ili briše ciljnu sekvencu nukleinske kiseline.
Izraz „modulacija ispoljavanja“ kako se ovde koristi treba razumeti kao opšti izraz za sposobnost oligonukleotida da promeni količinu UBE3A RNK/proteina u poređenju sa količinom UBE3A pre primene oligonukleotida.
Alternativno, modulacija ispoljavanja može da se odredi referisanjem na kontrolni eksperiment gde se otkriveni oligonukleotid ne primenjuje. Modulacija koju uzrokuje oligonukleotid je povezana sa njegovom sposobnošću da umanji, ukloni, spreči, smanji, snizi ili prekine suzbijanje paternalnog UBE3A-AS transkripta, tj. ciljajući 5' kraj UBE3A-AS, koji je nizvodno od SNORD115-45 snoRNK. Modulacija se takođe može posmatrati kao sposobnost oligonukleotida da obnovi, poveća ili poboljša ispoljavanje papternalnog UBE3A, npr. uklanjanjem ili blokiranjem inhibitornih mehanizama na koje utiče UBE3A-AS.
Otkriveni oligonukleotid može da sadrži jedan ili više nukleotida koji imaju modifikovani šećerni deo, tj. modifikaciju šećernog dela u poređenju sa šećera delom riboze koji se nalazi u DNK-u i RNK-u. Napravljeni su brojni nukleotidi sa modifikacijom šećernog dela riboze, prvenstveno sa ciljem poboljšanja određenih svojstava oligonukleotida, kao što je afinitet i/ili otpor na nukleazu. Takve modifikacije uključuju one naznačene time što je struktura prstena riboze modifikovana, npr. zamenom sa prstenom heksoze (HNK), ili bicikličkim prstenom, koji obično ima most sa dva radikala između C2 i C4 ugljenika na prstenu riboze (LNK), ili nepovezanim prstenom riboze kojem tipično nedostaje veza između C2 i C3 ugljenika (npr. UNK). Drugi nukleozidi modifikovani šećerom uključuju, na primer, nukleozide bicikloheksoze (WO2011/017521) ili tricikličke nukleozide (WO2013/154798). Modifikovani nukleozidi takođe uključuju nukleozide naznačene time što se šećerni deo zamenjuje nešećernim delom, na primer, u slučaju peptidnih nukleinskih kiselina (PNK) ili morfolino nukleinskih kiselina.
Modifikacije šećera takođe uključuju modifikacije koje se vrše menjanjem supstituentskih grupa na prstenu riboze u grupe koje nisu vodonik, ili 2'-OH grupa koja se prirodno nalazi u DNK i RNK nukleozidima. Supstituenti mogu, na primer, biti uvedeni u položajima 2', 3', 4' ili 5'. Nukleozidi sa modifikovanim šećernim delovima takođe uključuju 2' supstituisane nukleozide, kao što su 2' supstituisani nukleozidi. Zaista je mnogo fokusa stavljeno na razvijanje 2' supstituisanih nukleozida i ustanovljeno je da brojni 2' supstituisani nukleozidi imaju korisna svojstva kada se ugrade u oligonukleotide, kao što je poboljšana otpornost na nukleozide i poboljšan afinitet.
Nukleozid modifikovan 2' šećerom je nukleozid koji ima supstituent drugačiji od H ili -OH na poziciji 2' (2' supstituisani nukleozid) ili sadrži 2' povezani biradikal i uključuje 2' supstituisane nukleozide i LNK (2'–4' biradikalom premošćene) nukleozide. Na primer, 2' modifikovani šećer može da obezbedi poboljšani afinitet vezivanja i/ili povećanu otpornost na nukleazu za oligonukleotid. Primeri 2' supstituisanih modifikovanih nukleozida su 2'-O-alkil-RNK, 2'-O-metil-RNK (O-Me), 2'-alkoksi-RNK, 2'-O-metoksietil-RNK (MOE), 2'-amino-DNK, 2'-Fluoro-RNK i 2'-fluoro-ANK (F-ANK). Za više primera, pogledajte Freier i Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429–4443 i Uhlman; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293–213; i Deleavey i Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937.
Nukleozidi zaključane nukleinske kiseline (LNK) su modifikovani nukleozidi koji čine linker grupu (koja se naziva biradikal ili most) između C2' i C4' šećernog prstena riboze jednog nukleotida. Ovi nukleozidi se takođe nazivaju premošćenom nukleinskom kiselinom ili bicikličkom nukleinskom kiselinom (BNK) u literaturi.
Nukleazom posredovana degradacija se odnosi na oligonukleotid koji je sposoban da posreduje u degradaciji komplementarne sekvence nukleotida prilikom formiranja dvojne spirale sa takvom sekvencom.
U nekim otelotvorenjima, oligonukleotid može da funkcioniše putem nukleazom posredovane degradacije ciljne nukleinske kiseline, naznačene time što su otkriveni oligonukleotidi sposobni da regrutuju nukleazu, posebno i endonukleazu, poželjno endoribonukleazu (RNazu), kao što je RNaza H. Primeri dizajna oligonukleotida koje deluju putem nukleazom posredovanog mehanizma su oligonukleotidi koji tipično sadrže region od najmanje 5 ili 6 DNK nukleozida i sa njihovog boka na jednoj ili na obe strane se nalaze nukleozidi koji poboljšavaju afinitet, na primer gepmeri, hedmeri i tejlmeri.
Izraz „gepmer“ kako se ovde koristi se odnosi na antisense oligonukleotid koji sadrži region oligonukleotida koji regrutuju RNazu H (gep) na čijim se bokovima u 5' i 3' nalaze jedan ili više modifikovanih nukleozida koji poboljšavaju afinitet (bokovi). Ovde su opisani različiti dizajni gepmera. Hedmeri i tejlmeri su oligonukleotidi sposobni da regrutuju RNazu H naznačene time što im nedostaje jedan od bokova, tj. samo jedan od krajeva oligonukleotida sadrži modifikovane nukleozide koji poboljšavaju afinitet. Hedmerima nedostaje 3' bok (tj.5' bok sadrži modifikovane nukleozide koji poboljšavaju afinitet) i tejlmerima nedostaje 5' bok (tj.3' bok sadrži modifikovane nukleozide koji poboljšavaju afinitet).
Konjugacija otkrivenog oligonunukleotida sa jednim ili više nenukleotidnih delova može poboljšati farmakologiju oligonukleotida, npr. uticanjem na aktivnost, ćelijsku distribuciju, ćelijski unos ili stabilnost oligonucleotida. U nekim otelotvorenjima, konjugatni deo modifikuje ili poboljšava farmakokinetička svojstva oligonukleotida poboljšavanjem ćelijske distribucije, biološke raspoloživosti, metabolizma, izlučivanja, permeabilnosti i/ili ćelijskog unosa oligonukleotida. Konjugat posebno može ciljati oligonukleotid na određeni organ, tkivo ili tip ćelija i time povećati efektivnost oligonukleotida u tom organu, tkivu ili tipu ćelija. U isto vreme konjugat može da služi za umanjivanje aktivnosti oligonukleotida u neciljnim tipovima ćelija, tkivima ili organima, npr. izvan ciljne aktivnosti ili aktivnosti u neciljnim tipovima ćelija, tkivima ili organima. WO 93/07883 i WO 2013/033230 obezbeđuju pogodne konjugatne delove. WO 2012/143379 obezbeđuje postupak isporuke leka preko krvno-moždane barijere konjugacijom sa fragmentom antitela sa afinitetom za transferinski receptor.
U nekim otelotvorenjima, nenukleotidni deo (konjugatni deo) je odabran iz grupe koja se sastoji od ugljenih hidrata, liganda receptora ćelijske površine, lekovitih supstanci, hormona, lipofilnih supstanci, polimera, proteina, peptida, toksina (npr. bakterijskih toksina), vitamina, virusnih proteina (npr. kapisida) ili njihove kombinacije. U nekim otelotvorenjima nenukleotidni deo je antitelo ili fragment antitela, kao što je antitelo ili fragment antitela koji olakšava isporuku kroz krvno-moždanu barijeru, posebno antitelo ili fragment antitela koji cilja transferinski receptor.
Izraz „subjekt“ odnosi se na svaku osobu koja je meta primene ili lečenja. Subjekt može biti kičmenjak, na primer, sisar. Tako subjekat može da bude ljudski ili veterinarski pacijent. Izraz „pacijent“ se odnosi na subjekta kojeg leči kliničar, npr. lekar.
Izraz „terapijski efikasan“ odnosi se na količinu korišćene kompozicije koja je dovoljna da se ublaži jedan ili više uzroka ili simptoma bolesti ili poremećaja. Takvo ublažavanje zahteva samo smanjenje ili izmenu, ne nužno eliminaciju.
Izraz „farmaceutski prihvatljiv“ odnosi se na ona jedinjenja, materijale, kompozicije i/ili oblike doziranja koji su unutar okvira razumne medicinske procene, pogodne za upotrebu u kontaktu sa tkivima ljudskih bića i životinja bez preterane toksičnosti, iritacije, alergijske reakcije ili drugih problema ili komplikacija srazmerno sa razumnim odnosom koristi/rizika.
Izraz „lečenje“ odnosi se na medicinsko upravljanje pacijentom sa namerom da se izleči, ublaži, stabilizuje ili spreči bolest, patološko stanje ili poremećaj. Ovaj izraz uključuje aktivno lečenje, odnosno lečenje usmereno posebno ka poboljšanju bolesti, patološkog stanja ili poremećaja i takođe uključuje i kauzalno lečenje, odnosno lečenje usmereno ka uklanjanju uzroka bolesti, patološkog stanja ili poremećaja. Dodatno tome, ovaj izraz uključuje palijativno lečenje, to jest, lečenje dizajnirano za olakšavanje simptoma, a ne lečenje bolesti, patološkog stanja ili poremećaja; preventivno lečenje, to jest, lečenje usmereno na minimiziranje ili delimično ili potpuno inhibiranje razvoja povezane bolesti, patološkog stanja ili poremećaja; i pomoćno lečenje, to jest, lečenje korišćeno za dopunjavanje specifične terapije usmereno ka poboljšanju povezane bolesti, patološkog stanja ili poremećaja.
Izraz „inhibirati“ se odnosi na smanjenje aktivnosti, reakcije, stanja, bolesti ili drugog biološkog parametra, za koje će stručnjaci u predmetnoj oblasti ceniti da može da se proceni u određenom trenutku, tako da u nekim otelotvorenjima inhibicija može biti ili može da sadrži odlaganje početka ili umanjenja frekvencije. U nekim otelotvorenjima inhibicija može da uključuje, ali nije ograničena na, potpunu ablaciju aktivnosti, reakcije, stanja ili bolesti. Ovo takođe može da uključuje, na primer, smanjenje aktivnosti, reakcije, stanja ili bolesti od 10% u odnosu na izvorni ili kontrolni nivo. Dakle, smanjenje može biti 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% ili bilo koji stepen smanjenja između, u odnosu na izvorni ili kontrolni nivo.
Antisense nukleotidi (ASO-ovi) su dizajnirani da ciljaju eksone na 5' kraju SNORD115 transkripta gena domaćina (AF400500), koji
obuhvata SNORD115-46, SNORD115-47, SNORD115-48 i SNORD109B snoRNK-ove i za koji se smatra da predstavlja 5'
kraj UBE3A antisense transkripta (UBE3A-AS). Posebno, ciljna nukleinska kiselina može da bude 5' kraj UBE3A-AS koji odgovara položaju 25,511,577 do 25,516,681 na ljudskom hromozomu 15 sklopa ljudskih genoma hg19. U nekim otelotvorenjima, ciljna nukleinska kiselina je jedan od pet eksona koji se nalaze na 5' kraju UBE3A-AS, što može odgovarati pozicijama 25,511,577 do 25,511,761 (ekson 1), 25,512,059 do 25,512,191 (ekson 2), 25,513,476 do 25,513,600 (ekson 3), 25,514,752 do 25,514,880 (ekson 4) i 25,516,565 do 25,516,681 (ekson 5).
Dakle, u nekim otelotvorenjima, ciljna nukleinska kiselina je
U nekim otelotvorenjima, ciljna nukleinska kiselina je
U nekim otelotvorenjima, ciljna nukleinska kiselina je
U nekim otelotvorenjima, ciljna nukleinska kiselina je
U nekim otelotvorenjima, ciljna nukleinska kiselina je
U nekim otelotvorenjima otkriveni ASO ima sekvencu nukleinske kiselineTAGAGGTGAAGGCCAGGCAC (ASO-1, SEQ ID NO:6).
U nekim otelotvorenjima ASO ima sekvencu nukleinske kiselineGTACTCTTCCTCAGTCATCC (ASO-2, SEQ ID NO:7).
U nekim otelotvorenjima otkriveni ASO ima sekvencu nukleinske kiselineTGTCAGTTTCTCCCTGAACA (ASO-3, SEQ ID NO:8).
U nekim otelotvorenjima otkriveni ASO ima sekvencu nukleinske kiselineTAGAATGGCACATCTCTTGG (ASO-4, SEQ ID NO:9).
U nekim otelotvorenjima otkriveni ASO ima sekvencu nukleinske kiselineGTTTTCTTCCTCCACAGTCT (ASO-6, SEQ ID NO:10).
U nekim otelotvorenjima otkriveni ASO ima sekvencu nukleinske kiselineCTGGTGTCAACAAGCCAAAG (ASO-7, SEQ ID NO:11).
Dodatni ASO-ovi koji mogu ciljati ekson 1 na 3'
kraju SNORD115 regiona su obezbeđeni u nastavku, u Tabeli 1. Dodatni ASO-ovi koji mogu ciljati ekson 2 na 3' kraju SNORD115 regiona su obezbeđeni u nastavku, u Tabeli 2. Dodatni ASO-ovi koji mogu ciljati ekson 3 na 3'
kraju SNORD115 regiona su obezbeđeni u nastavku, u Tabeli 3. Dodatni ASO-ovi koji mogu ciljati ekson 4 na 3' kraju SNORD115 regiona su obezbeđeni u nastavku, u Tabeli 4. Dodatni ASO-ovi koji mogu ciljati ekson 5 na 3'
kraju SNORD115 regiona su obezbeđeni u nastavku, u Tabeli 5.
Otkriveni oligonukleotid je sposoban da modulira ispoljavanje paternalnog UBE3A, posebno za indukciju ili uzlaznu regulaciju paternalno ispoljenog UBE3A u neuronskim ćelijama. Modulacija se postiže hibridizacijom sa 5' krajem UBE3A-AS. U određenim otelotvorenjima, ovde otkriveni oligonukleotid hibridizira sa subsekvencom ciljne nukleinske kiseline SEQ ID NO:1 sa ΔG° ispod -10 kcal, kao što je sa ΔG° između -10 do -60 kcal, kao što je -12 do -40, kao što je od -15 do -30 kcal ili -16 do -27 kcal kao što je -18 do -25 kcal.
U nekim otelotvorenjima otkriveni oligonukleotidi su sposobni povećati ispoljavanje UBE3A za najmanje 20% u poređenju sa nivoom
ispoljavanja UBE3A u neuronskoj ćeliji lečenoj fiziološkim rastvorom ili neciljajućim oligonukleotidom, poželjnije za najmanje 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 80%, 100%, 120%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240% ili 250% u poređenju sa nivoom ispoljavanja UBE3A u neuronskoj ćeliji lečenoj fiziološkim rastvorom ili neciljajućim oligonukleotidom. U nekim otelotvorenjima, otkriveni oligonukleotidi su sposobni smanjiti
nivo SNHG14 transkripta nizvodno od SNORD115-45 za najmanje 20% u poređenju sa nivoom SNHG14 transkripta nizvodno od SNORD1115-45 u neuronskoj ćeliji lečenoj fiziološkim rastvorom ili neciljajućim oligonukleotidom, poželjnije za najmanje 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 95% u poređenju sa nivoom SNHG14 transkripta nizvodno od SNORD115-45 u neuronskoj ćeliji lečenoj fiziološkim rastvorom ili neciljajućim oligonukleotidom.
Ciljana modulacija otkrivenim oligonunukleotidom se izaziva hibridizacijom između neprekidne sekvence nukleotida oligonunukleotida i ciljne nukleinske kiseline. U nekim otelotvorenjima, otkriveni oligonukleotid sadrži neusaglašenosti između oligonukleotida i ciljne nukleinske kiseline. Uprkos neusaglašenostima hibridizacija sa ciljnom nukleinskom kiselinom može i dalje biti dovoljna da pokaže željenu modulaciju ispoljavanja UBE3A. Smanjeni afinitet vezivanja koji nastaje usled neusaglašenosti može povoljno da se nadoknadi povećanim brojem nukleotida u oligonukleotidu i/ili povećanim brojem modifikovanih nukleozida sposobnih da povećaju afinitet vezivanja sa ciljem, kao što su 2' modifikovani nukleozidi, uključujući LNK, koji su prisutni u sekvenci oligonukleotida.
Otkriveni antisense oligonukleotid može imati neprekidnu sekvencu nukleotida dužine od 10 do 30 nukleotida sa najmanje 90% komplementarnosti, kao što je najmanje 91%, kao što je najmanje 92%, kao što je najmanje 93%, kao što je najmanje 94%, kao što je najmanje 95%, kao što je najmanje 96%, kao što je najmanje 97%, kao što je najmanje 98% ili 100% komplementarnosti sa jednim od pet eksona koji se nalaze na 5' kraju UBE3A-AS koji je ovde otkriven.
Dizajn oligonukleotida se odnosi na obrazac šećernih modifikacija nukleozida u sekvenci oligonukleotida. Otkriveni antisense oligonukleotid sadrži nukleozide modifikovanog šećera može takođe sadržati nukleozide DNK, RNK ili arabino nukleinske kiseline (ANK). U nekim otelotvorenjima, oligonukleotid sadrži nukleozide modifikovanog šećera i DNK nukleozide. U nekim otelotvorenjima, oligonunukleotid sadrži nukleozide modifikovanog šećera i RNK nukleozide. U nekim otelotvorenjima, oligonunukleotid sadrži nukleozide modifikovanog šećera i ANK nukleozide.
U nekim otelotvorenjima, oligonukleotid sadrži najmanje 1 modifikovani nukleozid, kao što je najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7, najmanje 8, najmanje 9, najmanje 10, najmanje 11, najmanje 12, najmanje 13, najmanje 14, najmanje 15 ili najmanje 16 modifikovanih nukleozida. U jednom otelotvorenju, oligonukleotid sadrži od 1 do 10 modifikovanih nukleozida, kao što je od 2 do 9 modifikovanih nukleozida, kao što je od 3 do 8 modifikovanih nukleozida, kao što je od 4 do 7 modifikovanih nukleozida, kao što je 6 ili 7 modifikovanih nukleozida.
U nekim otelotvorenjima, oligonunukleotid sadrži najmanje jednu modifikovanu internukleozidnu vezu. U nekim otelotvorenjima, internukleozidne veze unutar neprekidne sekvence nukleotida su fosforotioatne ili boranofosfatne internukleozidne veze.
U nekim otelotvorenjima, otkriveni antisense oligonukleotid sadrži jedan ili više nukleozida modifikovanog šećera, kao što je 2' nukleozid modifikovanog šećera. Poželjno, otkriveni antisense oligonukleotidi sadrže jedan ili više LNK nukleozida ili 2' nucleoside modifikovanog šećera, pri čemu je 2' položaj zamenjen supstituentom nezavisno odabranim iz grupe koja se sastoji od, -F; -CF3, -CN, -N3, -NO, -NO2, -O-(C1-C10 alkila), -S-(C1-C10 alkila), -NH-(C1-C10 alkila) ili -N(C1-C10 alkila)2; -O-(C2-C10 alkenila), -S-(C2-C10 alkenila), -NH-(C2-C10 alkenila) ili -N(C2-C10 alkenila)2; -O-(C2-C10 alkinila), -S-(C2-C10 alkinila), -NH-(C2-C10 alkinila), -N(C2-C10 alkinila)2, -O-(C1-C10 alkilena)-O-(C1-C10 alkila), -O-(C1-C10 alkilena)-NH-(C1-C10 alkila), -O-(C1-C10 alkilena)-NH(C1-C10 alkila)2, -NH-(C1-C10 alkilena)-O-(C1-C10 alkila) i -N(C1-C10 alkila)-(C1-C10 alkilena)-O-(C1-C10 alkila).
U nekim otelotvorenjima, otkriveni oligonukleotidi sadrže najmanje jednu LNK jedinicu, kao što je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 LNK jedinica, kao što je od 2 do 6 LNK jedinica, kao što je od 3 do 7 LNK jedinica, 4 do 8 LNK jedinica ili 3, 4, 5, 6 ili 7 LNK jedinica. U nekim otelotvorenjima, svi modifikovani nukleozidi su LNK nukleozidi. U nekim otelotvorenjima, LNK sadrži 2'-4' biradikalni most -L-, pri čemu -L- jeste -O-CH2-, pri čemu je -CH2- opciono supstituisan. U nekim otelotvorenjima, LNK sadrži 2'-4' biradikalni most -L-, pri čemu -L- jeste -O-CH2-. U nekim otelotvorenjima, LNK sadrži 2'-4' biradikalni most -L-, pri čemu -L- jeste -O-CH(Et)-. U daljem otelotvorenju, oligonukleotid može sadržati i beta-D-oksi-LNK i jednu ili više od sledećih LNK jedinica: tio-LNK, amino-LNK, oksi-LNK i/ili ENK ili u beta-D ili u alpha-L konfiguracijama ili njihove kombinacije. U daljem otelotvorenju, sve LNK citozinske jedinice su 5-metil-citozin. U nekim otelotvorenjima, oligonukleotid ili neprekidna sekvenca nukleotida ima najmanje 1 LNK jedinicu na 5' kraju i najmanje 2 LNK jedinice na 3' kraju sekvence nukleotida.
U nekim otelotvorenjima, otkriveni oligonukleotid je sposoban da regrutuje RNazu H. U nekim otelotvorenjima, oligonukleotid ima gepmerski dizajn ili strukturu koja se ovde takođe naziva samo „gepmer“. U gepmerskoj strukturi, oligonukleotid sadrži najmanje tri različita strukturna regiona 5' bok, gep i 3' bok, F-G-F' u '5->3' orijentaciji. U ovom dizajnu, bočni regioni F i F' (koji se takođe nazivaju krilni regioni) sadrže neprekidni raspon modifikovanih nukleozida, koji su komplementarni spram UBE3A-AS ciljne nukleinske kiseline, dok region gepa, G, sadrži neprekidni raspon nukleotida koji su sposobni da regrutuju nukleazu, poželjno endonukleazu kao što je RNaza, na primer, RNaza H, kada je oligonukleotid u dvojnoj spirali sa ciljnom nukleinskom kiselinom. Nukleozidi koji su sposobni da regrutuju nukleazu, posebno RNazu H, mogu da budu odabrani iz grupe koja se sastoji od DNK, alfa-L-oksi-LNK, 2'-fluoro-ANK i UNK. Regioni F i F', na bokovima 5' i 3' krajeva regiona G, poželjno sadrže nukleozide koji ne regrutuju nukleaze (nukleaze sa 3' endo strukturom), poželjnije jedan ili više modifikovanih nukleozida koji poboljšavaju afinitet. U nekim otelotvorenjima, 3' bok sadrži najmanje jedan LNK nukleozid, poželjno najmanje 2 LNK nukleozida. U nekim otelotvorenjima, 5' bok sadrži najmanje jedan LNK nukleozid. U nekim otelotvorenjima, obe bočne regije 5' i 3' sadrže LNK nukleozid. U nekim otelotvorenjima, svi nukleozidi u bočnim regionima su LNK nukleozidi. U nekim otelotvorenjima, bočni regioni mogu da sadrže i LNK nukleozide i druge nukleozide (mešoviti bokovi), kao što su DNK nukleozidi i/ili modifikovani nukleozidi koji nisu LNK nukleozidi, kao što su 2' supstituisani nukleozidi. U ovom slučaju gep je definisan kao neprekidna sekvenca najmanje 5 nukleozida koji regrutuju RNazu H (nukleozidi sa 2' endo strukturom, poželjno DNK) okruženi sa bokova na 5' i 3' kraju modifikovanim nukleozidom kooji poboljšava afinitet, poželjno LNK, kao što je beta-D-oksi-LNK. Posledično, nukleozidi 5' bočnog regiona i 3' bočnog regiona koji su susedni gep regionu su modifikovani nukleozidi, poželjno nukleozidi koji ne regrutuju nukleaze. U oligonukleotidima sa mešovitim bokovima naznačenim time što bočne strane sadrže DNK, 5' i 3' nukleozid isu modifikovani nukleozidi.
Postupci za proizvodnju otkrivenih oligonukleotida su poznate. U nekim slučajevima, postupak koristi hemiju fosforamidita (pogledajte na primer Caruthers i sar, 1987, Methods in Enzymology, Tom.154, stranice 287–313). U daljem otelotvorenju, postupak dodatno sadrži reakciju neprekidne sekvence nukleotida sa konjugirajućim delom (ligandom).
U nekim otelotvorenjima, koriste se metodologije sinteze oligonukleotida koje obezbeđuju kontrolu stereohemije na jednom ili više modifikovanih internukleozidnih veza koji uključuje / koji uključuju hiralni atom. Ove metodologije potražite u, na
primer, WO2010/064146, WO2014/012081, WO2015/107425, WO2016/079183, WO2016/079181, WO2016/096938, WO2017/194498 i WO2018/177825.
Stručnjaci u predmetnoj oblasti će ceniti da korisne nukleinske kiseline koje su obezbeđene predmetnim obelodanjivanjem uključuju one koji čuvaju i/ili ispoljavaju sekvence oligonukleotida koje su ovde opisane. U nekim otelotvorenjima, takve nukleinske kiseline mogu da budu ili da sadrže vektore koji su prigodni za isporučivanje u i/ili replikaciju i/ili ispoljavanje u ćeliji (npr. mikrobna ćelija, na primer za produkciju i/ili ćelija sisara, na primer za lečenje). Stručnjaci u predmetnoj oblasti su svesni raznih tehnologija (npr. tehnologije rekombinantnih nukleinskih kiselina kao što je, na primer, one koje koriste jedno ili više pojačanja kao što je putem lančane reakcije polimeraze, cepljenja kao što je putem restrikcione digestije, vezivanja kao što je putem ligacije – bilo°in vitro npr. gep popravkom itd.)
Takođe su otkrivene farmaceutske kompozicije koje sadrže bilo koji od prethodno pomenutih oligonukleotida i/ili konjugate oligonukleotida i farmaceutski prihvatljiv razblaživač, nosač, so i/ili adjuvant. Farmaceutski prihvatljiv razblaživač uključuje fosfatom puferovani fiziološki rastvor (engl. phosphate-buffered saline, PBS) i farmaceutski prihvatljive soli uključuju, ali nisu ograničene na, soli natrijuma i kalijuma. U nekim otelotvorenjima, razblaživač je veštačka cerebrospinalna tečnost (engl. artificial cerebrospinal fluid, aCSF).
Otkriveni oligonukliotidi mogu se mešati sa farmaceutski prihvatljivim aktivnim ili inertnim supstancama za pripremanje farmaceutskih kompozicija ili formulacija. Kompozicije i postupci za formulisanje farmaceutskih kompozicija zavise od niza kriterijuma, uključujući, ali ne ograničavajući se na, način primene, razmeru bolesti ili dozu koja treba da se primeni.
Stručnjaci u predmetnoj oblasti su svesni raznih formulacija koje su korisne za čuvanje i/ili primenu terapijskih nukleinskih kiselina kao što su oligonuklidna terapijska sredstva. Pogledajte, na primer, Pushpendra i sar. „Nucleic Acids as Therapeutics“ u From Nucleic Acid Sequences to Molecular Medicines, urednici Erdmann and Barciszewski, Springer-Verlag, 2012; Juliano „The Delivery of Therapeutic Oligonucleotides“ Nuc. Acids. Res.44:6518, 2016; itd.
U nekim otelotvorenjima, oligonukleotid je formulisan kao prolek.
Posebno u pogledu konjugata oligonukleotida, konjugatni deo može da se otcepi sa oligonukleotida nakon što se prolek isporuči do mesta delovanja, tj. ciljne ćelije.
Otkrivene faramceutske kompozicije se mogu koristiti u postupcima za lečenje ili prevenciju Angelmanovog sindroma, koji sadrže primenu terapijski ili profilaktički efektivne količine ovde otkrivene farmaceutske kompozicije na subjekta koji pati od ili je podložan Angelmanovom sindromu.
Takođe je otkrivena upotreba otkrivenih oligonukleotida za proizvodnju leka za lečenje Angelmanovog sindroma kako je ovde referisana ili za postupak lečenja Angelmanovog sindroma kako je ovde referisan.
Otkrivene farmaceutske kompozicije mogu biti primenjene topikalnom (kao što je na kožu, inhalacija, oftalmološka ili otička) ili enteralnom (kao što je oralna ili kroz gastrointestinalni trakt) ili parenteralnom (kao što je intravenska, subkutana, intramuskularna, intracebralna, intracerebroventrikularna ili intratekalna) primenom. U nekim otelotvorenjima, otkrivene farmaceutske kompozicije se primenjuju parenteralnom rutom, uključujući intravensku, intraarterijsku, subkutanu, intraperitonealnu ili intramuskularnu injekciju ili infuziju, intratekalnu ili intrakranijalnu, npr. intracerebralnu ili intraventrikularnu, primenu. U nekim otelotvorenjima, oligonukleotid se primenjuje intracerebralnom ili intracerebroventrikularnom injekcijom. U drugom otelotvorenju aktivni oligonukleotid ili konjugat oligonukleotida se primenjuje intratekalno. U nekim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija se primenjuje intracisternae magna injekcijom.
U nekim otelotvorenjima, AS terapija sa ovde opisanim farmaceutskim kompozicijama se primenjuje na subjekta/subjekte koji boluju ili su podložni AS-u. U nekim otelotvorenjima, utvrđeno je da subjekt ima genetsku karakteristiku vezanu za defekt u maternalnom UBE3A genu. U nekim otelotvorenjima, genetska karakteristika povezana sa AS-om jeste ili sadrži maternalnu deleciju. U nekim otelotvorenjima, genetska karakteristika povezana sa AS-om jeste ili sadrži unipaternalnu disomiju. U nekim otelotvorenjima, genetska karakteristika povezana sa AS-om jeste ili sadrži mutaciju UBE3A. U nekim otelotvorenjima, genetska karakteristika povezana sa AS-om jeste ili sadrži defekt utiskivanja.
U nekim otelotvorenjima, utvrđeno je da subjekt ima jednu ili više karakteristika razvojne istorije i/ili laboratorijskih nalaza koje su povezane sa AS-om, kao što su, na primer, jedna ili više od sledećih:
(i) normalna prenatalna i porođajna istorije sa normalnim obimom glave i odsustvom velikih urođenih defekata;
(ii) teškoće pri hranjenju kao novorođenčeta i/ili kao odojčeta;
(iii) kašnjenje razvoja koje je evidentno sa 6–12 meseci starosti, ponekad povezano sa torakalnim hiptonusom;
(iv) nestabilni pokreti udova i/ili povećano smešenje;
(v) odložen razvoj, ali s napretkom (bez gubitka veština);
(vi) normalni metabolički, hematološki i hemijski laboratorijski profili;
(vii) strukturno normalan mozak kada se procenjuje pomoću MR-a ili CT-a (može imati blagu kortikalnu atrofiju ili dismijelinaciju).
Alternativno ili dodatno tome, u nekim otelotvorenjima, utvrđeno je da subjekt pokazuje jednu ili više kliničkih karakteristika koje se dosledno povezuju sa AS-om, kao što je, na primer, jedna ili više od sledećih:
(i) kašnjenje razvoja, funkcionalno teško
(ii) poremećaj kretanja ili ravnoteže, obično ataksija hoda i/ili podrhtavanje u kretanju udova. U nekim otelotvorenjima, takav poremećaj kretanja može biti blag. U nekim otelotvorenjima, takav poremećaj kretanja može da se ne pojavi kao otvorena ataksija, već da bude ili da uključuje, na primer, posrtanje prema napred, nestabilnost, nespretnost ili brzo, trzajno kretanje;
(iii) jedinstvenost u ponašanju: bilo koja kombinacija čestog smeha/smešenja; prividno srećno ponašanje; ličnost podložna uzbuđenju, često sa kretnjama pljeskanja ili mahanja podignutim rukama; hipermotoričko ponašanje
(iv) oštećenje govora, kao na primer odsutnost ili minimalna upotreba reči;
alternativno ili dodatno tome, receptivne i neverbalne komunikacijske veštine su veće od verbalnih.
Alternativno ili dodatno tome, u nekim otelotvorenjima, utvrđeno je da subjekt pokazuje jednu ili više kliničkih karakteristika koje se često (npr. u oko 80% slučajeva) povezuju sa AS-om, kao što je, na primer, jedna ili više od sledećih:
(i) odložen, nesrazmeran rast obima glave, koji obično dovodi do mikrocefalije (≤2 S.D. normalnog OFC-a) do starosti od 2 godine. U nekim otelotvorenjima, mikrocefalija je izraženija u onima sa delecijama 15q11.2-q13;
(ii) napadi, obično s početkom < 3 godine starosti. U nekim otelotvorenjima, težina napada može da se smanji sa godinama, ali bez obzira na to, u nekim otelotvorenjima poremećaj napada traje tokom celog odraslog doba.
(iv) abnormalni EEG, sa karakterističnim obrascem, kao što je poznato u predmetnoj oblasti. U nekim otelotvorenjima, abnormalnosti EEG-a mogu da se pojave u prve 2 godine života i mogu da prethode kliničkim karakteristikama i mogu da ne budu u korelaciji sa kliničkim događajima napada.
Alternativno ili dodatno tome, u nekim otelotvorenjima, utvrđeno je da subjekt pokazuje jednu ili više kliničkih karakteristika koje se ponekad (npr. u oko 20– 80% slučajeva) povezuju sa AS-om, kao što je, na primer, jedna ili više od sledećih: (i) ravan okciput
(ii) okcipitalni žleb
(iii) istureni jezik
(iv) izbacivanje jezika; poremećaji sisanja/gutanja
(v) problemi sa hranjenjem i/ili torakalna hipotonija tokom detinjstva (vi) prognatija
(vii) široka usta, širok razmak između zuba
(viii) često slinjenje
(ix) ponašanja preteranog žvakanja / opipavanja ustima
(x) strabizam
(xi) hipopigmentirana koža, svetla kosa i boja očiju, u nekim otelotvorenjima utvrđeno u odnosu na porodicu i tipično uočena samo u slučajevima delecije
(xii) hiperaktivni refleksi dubokih tetiva donjih ekstremiteta
(xiii) podignut, savijen položaj ruke, posebno tokom hoda
(xiv) hod sa širokom osnovom, sa pronacijom ili valgus
položajem gležnjeva
(xv) povećana osetljivost na toplotu
(xvi) abnormalni ciklusi spavanja i buđenja i smanjena potreba za spavanjem
(xvii) privlačnost/fascinacija vodom; fascinacija pogužvanim predmetima kao što su određeni papiri i plastike
(xviii) abnormalna ponašanja vezana za hranu
(xix) gojaznost (kod starije dece)
(xx) skolioza
(xxi) zatvor
U nekim otelotvorenjima, terapijski režim za lečenje AS-a sa terapijskim sredstvom nukleinske kiseline (npr. oligonukleotidno terapijsko sredstvo kao što je ASO), kako je ovde opisano, jeste ili obuhvata primenu jedne ili više doza farmaceutske kompozicije koja obuhvata i/ili isporučuje oligonunukleotid kako je ovde opisano.
U nekim otelotvorenjima, subjekt na kog se primenjuje određeni terapijski režim prima ili je primio jedno ili više terapijskih sredstava uključujući, na primer, jedno ili više drugih terapijskih sredstava nukleinske kiseline (npr. jedan ili više drugih oligonukliotida koji ciljaju UBE3A-AS). Pogledajte, na
primer, WO2014004572A3, US9617539B2, US20170362592A1 i EP2864479B1.
U nekim otelotvorenjima, subjekt na kog se primenjuje određeni terapijski režim patio je ili pati od jednog ili više napada i/ili prima ili je primao terapiju protiv napada. Na primer. U nekim otelotvorenjima, moguće je da je subjekt primio ili da prima jedno ili više od valproinske kiseline, klonazepama, fenobarbitala, topiramata, karbamazepina, lamotrigina, leveltiracetama, fenitoina, zonisamida, etosuksamida, gabapentina, felbatama, okskarbazepina, tranksena, ACTS-a., nitrazepama, pregabalina, misolina, vigabatrina itd. U nekim otelotvorenjima, moguće je da je subjekt primio ili da prima jedno ili više od valproinske kiseline, klonazepama, fenobarbitala, topiramata, karbamazepina, lamotrigina, i/ili leveltiracetama.
Alternativno ili dodatno tome, u nekim otelotvorenjima moguće je da je subjekt primio ili da prima terapiju ishrane, kao što je, na primer, ketogena ishrana, terapija sa niskim glikemijskim indeksom itd.
Dalje alternativno ili dodatno tome, u nekim otelotvorenjima moguće je da je subjekt primio ili da prima lečenje sa stimulatorom vagus živca.
Kao što će biti očigledno stručnjacima u predmetnoj oblasti po čitanju predmetnog obelodanjivanja, pod uslovom da postupci lečenja uključuju davanje jednog ili oboje od oligonukliotida kako je ovde opisan i dodatne terapiju (npr. alternativnog oligonukleotida i/ili anti-epileptička terapija i/ili jednu ili više drugih terapijskih intervencija), tako da subjekt dobija kombinovanu terapiju (na primer, istovremeno im je izložen, na primer putem preklapanja doziranja itd.). Takođe je otkrivena upotreba oligonukleotida koji je ovde otkriven za proizvodnju leka, pri čemu je lek u doznom obliku za intratekalnu primenu.
Takođe je otkrivena upotreba ovde otkrivenog oligonukleotida za proizvodnju leka, pri čemu je lek u doznom obliku za intracerebralnu ili intraventrikularnu primenu.
Takođe je otkrivena upotreba ovde otkrivenog oligonukleotida za proizvodnju leka, pri čemu je lek u doznom obliku za
intracerebroventrikularnu primenu.
U nekim otelotvorenjima, oligonukleotid koji je ovde opisan je za upotrebu u kombinovanom lečenju sa drugim terapijskim agensom. Terapijski agens može biti, na primer, lek protiv konvulzija.
Primeri
Primer 1:
Rezultati
Analizom sekvenciranja RNK mišijeg i ljudskog CNS-a identifikovan je region za koji se veruje da je važan za stabilnost i/ili transkripciju UBE3A-AS. Dodatna analiza regiona pokazala je nizak nivo očuvanja sekvenci između miša i čoveka (Slike 1A–1D).
Na osnovu ovih nalaza, ASO-ovi specifični za miševe su dizajnirani tako da ciljaju specifični region u transkriptu Ube3a-AS (Tabela 6 i Slika 2A). Da bi se utvrdilo da li ASO-ovi koji ciljaju na ovaj region ponovo aktiviraju ispoljavanje paternalnog Ube3a alela, primarne kulture neurona hipokampusa su generisane iz Ube3aYFP reporterskog mišijeg modela (Ube3a+/YFP; Slika 2B) i lečene na 7 dana in vitro (DIV) sa kontrolnim ASO-om [ASO-C (10 uM, n = 3)], tri ASO-a koji ciljaju Ube3a-AS [ASO-1.1, ASO-1.2, ASO-3.1 (1 µM, 5 µM i 15 µM, n = 3)] i ASO-B (1 µM, 5 µM i 15 µM, n = 3)]. Kao pozitivna kontrola, neuroni su takođe lečeni topotekanom [Topo (300 nm, n = 3)] i negativnom kontrolom vehikuluma [Veh (1%, n = 3); Slika 2 C]. Tri dana nakon lečenja (10 DIV), imunofluorescentno dijagnostičko slikanje je korišćeno za kvantifikaciju nivoa Ube3aYFP proteina u pojedinačnim ćelijama. U poređenju sa kontrolama (ASO-C i Veh), svako lečenje je značajno povećalo nivo paternalnog Ube3aYFP proteina, sa sličnim nivoima postignutim u lečenjima sa ASO-1.1 (15 µM), ASO-3.1 (15 µM) i topotekanom (Slike 2D i 2E).
ASO-ovi specifični za ljude su onda dizajnirani da ciljaju ovaj region, koji je uključivao četiri ASO-a koja ciljaju nepolimorfne regione u čoveku i očuvanih regiona (100%) sa makakom (Rezus i rakojed) (Tabela 7 i Slika 3A). Ljudske neuronske prekursorske ćelije od induciranih pluripotentnih matičnih ćelija (iPSC) su diferencirane u GABAergičke neurone tokom 14 DIV i zatim lečene sa kontrolnim ASO-om [ASO-C (10 µM, n = 3)], topotekanom [Topo (1 µM, n = 2)] i šest ASO-ova koji ciljaju UBE3A-AS [ASO-1, ASO-2, ASO-3, ASO-4, ASO-5 i ASO-6 (10 µM, n = 3)]. Dodatno tome, uključen je ASO koji cilja intronski region nizvodno od SNORD109B (ASO-7). Šest dana nakon lečenja (20 DIV), RNK je izolovan iz neurona i procenjeni su RNK nivoi u stabilnom stanju za UBE3A-AS i UBE3A u odnosu na kontrolno lečenje (Slika 3B). Sa izuzetkom ASO-7, svaki ASO je značajno smanjio RNK nivoe za UBE3A-AS, s tim da su ASO-2 i ASO-4 imali najveći efekat (Tabela 8 i Slika 3C). RNK nivoi za UBE3A su takođe povećani nakon lečenja sa svakim ASO-om (Slika 3D).
Snaga ASO-4 je dodatno ispitana s obzirom na njegov efekat na RNK nivoe za UBE3A-AS. GABAergički neuroni izvedeni iz iPSC-a su lečeni na 14 DIV sa 1⁄2 log krivuljom odgovora na dozu u 10 tačaka ASO-4 i topokana, kao pozitivna kontrola i za poređenje između lečenja [1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM, 300 nM, 1 µM, 3 µM, 10 µM i 30 µM (ASO-4, n = 6; Topotekan, n = 2)]. Na 20 DIV, izmereni su RNK nivoi u stabilnom stanju za UBE3A-AS i krivulje odgovora na dozu su prilagođene da bi se procenio IC50 i Emax (tj., maksimum UBE3A-AS inhibicije) (Tabela 9 i Slika 4A). Krivulje odgovora na dozu za ASO-4 i topotekan su značajno različite (test paralelizma: F(3,145) = 11,2, p < 0,0001), tako da relativne snage nisu procenjene. Test ekvivalencije je pokazao da IC50 i Emax ASO-4 i topotekana nisu bili ekvivalentni [ASO-4/topotekan odnos IC50: = 1,2 (donja granica pouzdanosti = 1,1; Gornja granica pouzdanosti = 1,3); Odnos Emax = -4,1 (donja granica pouzdanosti = -12,9; Gornja granica pouzdanosti = 4,8);
Efekti ASO-4 i topotekana su zatim ispitani na SNORD116, IPW, SNORD115 i SNORD109A RNK-ovima, koji se nalaze uzvodno od ASO-4 ciljnog regiona (pogledajte Sliku 1A). Sa izuzetkom SNORD116, ASO-4 je imao značajan uticaj na RNK nivoe za IPW, SNORD115 i SNORD109A/B, ali ne na način zavisan od doze. Nasuprot tome, topotekan je imao značajan uticaj na SNORD116, IPW, SNORD115 i SNORD109A/B RNK nivoe koji je bio zavisan od doze (Tabela 10 i Slike 4B–4E). I ASO-4 i topotekan su povećali ukupne UBE3A RNK nivoe na način zavisan od doze, osim topotekana na višim koncentracijama (3 µM, 10 µM i 30 µM; Slika 4F).
Snaga ASO-4 je dodatno ispitana u neuronima izvedenim iz iPSC-a u kasnijoj vremenskoj tački u diferencijaciji. GABAergički neuroni izvedeni iz iPSC-a su lečeni na 59 DIV sa kontrolnim ASO [ASO-C, 10 µM (n = 3)] i ASO-4 [1 uM, 5 µM, i 10 µM (n = 3)] RNK nivoi u stabilnom stanju za UBE3A-AS i UBE3A su izmereni kako je u prethodnome opisano (Slika 4G). Za razliku od neurona lečenih sa ASO-4 u ranijoj vremenskoj tački, RNK nivoi za UBE3A i UBE3A-AS su bili u snažnoj inverznoj korelaciji (Slike 4H i 4I). Na primer, efekat ASO-4 (10 µM) na UBE3A-AS RNK nivoe bio je sličan između neurona lečenih na 14 i 59 DIV [20 DIV: UBE3A-AS: ↓87% (95% intervali pouzdanosti (CI): 80 do 95%); 65 DIV: ↓81% (95% CI: 74 do 88%)], dok je efekat ASO-4 na UBE3A RNK nivoe bio suštinski veći u neuronima lečenim na 59 DIV [20 DIV: ↑30% (95% CI: 16 do 44%); 65 DIV: ↑86% (95% CI: 59% do 113%)].
Dodatni ASO-ovi koji ciljaju 5' kraj UBE3A-AS su zatim dizajnirani za optimizaciju ciljnih sekvenci ASO-4 (ASO-4.1, ASO-4.2, ASO-4.3 i ASO-4.4) kao i dva druga ciljna regiona, ASO-3 (ASO-3.1 i ASO-3.2) i ASO-6 (ASO-6.1) (Tabela 11). Dodatno tome, ASO-4 je proizveden kod dva različita proizvođača u svrhe upoređivanja (ASO-4.S, Sigma; ASO-4.I, Integrated DNA Technologies). Ljudski neuroni izvedeni iz iPSC-a (GABAergički) su lečeni na 14 DIV sa 1⁄2 log krivuljom doze u 5 tačaka ASO-3.1, ASO-3.2, ASO-4.S, ASO-4.I, ASO-4.1, ASO-4.2, ASO-4.3, ASO-4.4 i ASO-6.1 [30 nM, 100 nM, 300 nM, 1 µM (n = 6)]. Na 20 DIV, IC50 i Emax svakog ASO-a su utvrđeni kako je u prethodnome opisano (Slika 5 A–B i Tabela 12). Krivulje odgovora na dozu bile su slične među ASO-ovima (test paralelizma: F(16,513) = 1,6, p = 0,06), s tim da su ASO-4 i ASO-6.1 imali najveću relativnu snagu (Tabela 13). Nije primećena značajna razlika između ASO-4.S i ASO-4.I.
Snaga ASO-4 i ASO-6.1 je dodanto ispitana u neuronima izvedenim iz iPSC-a u kasnijoj vremenskoj tački u diferencijaciji. GABAergički neuroni izvedeni iz iPSC-a su lečeni na 29 DIV sa 1⁄2 log krivuljom odgovora na dozu u 10 tačaka ASO-4 i ASO-6.1 [1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM, 300 nM, 1 µM, 3 µM, 10 µM i 30 µM (n = 3)]. Na 35 DIV, IC50 i Emax svakog ASO-a su procenjeni kako je u prethodnome opisano (Slika 5 C–D i Tabela 14). Krivulje odgovora na dozu ASO-4 i ASO-6.1 nisu bile slične (test paralelizma: F(3,172) = 22,7, p < 0,0001). Test ekvivalencije je pokazao da su ASO-4 i ASO-6.1 imali ekvivalentnu snagu ali različite Emax vrednosti [ASO-6.1/ASO-4 odnos: IC50 = 1,03 (donja granica pouzdanosti = 1,0; Gornja granica pouzdanosti = 1,1); Emax = -1,3 (donja granica pouzdanosti = -2,6; Gornja granica pouzdanosti = - 0,08)], s tim da je ASO-6.1 imao najveću inhibiciju UBE3A-AS nivoa. Efekat ASO-4 i ASO-6.1 na UBE3A RNK nivoe je bio sličan, s tim da je svako lečenje povećavalo RNK nivoe na način zavisan od doze (Slika 5D).
ASO-4 i ASO-6.1 su takođe ispitani u glutamatergkičkim neuronima izvedenim iz iPSC-a. Glutamatergički neuroni izvedeni iz iPSC-a su lečeni na 14 DIV sa 1⁄2 log krivuljom odgovora na dozu u 10 tačaka ASO-4 i ASO-6.1 [1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM, 300 nM, 1 µM, 3 µM, 10 µM i 30 µM (n = 3)]. Na 20 DIV, IC50 i Emax svakog ASO-a su procenjeni kako je u prethodnome opisano (Slika 5E–F i Tabela 15). Krivulje odgovora na dozu ASO-4 i ASO-6.1 su bile slične i nisu se značajno razlikovale (test paralelizma: F(3,165) = 1,9, p = 0,1), s tim da je ASO-6.1 imao najveću relativno snagu (Tabela 16). Kao što se očekivalo, ASO-4 i ASO-6.1 povećali su UBE3A RNK nivo na način zavisan od doze (Slika 5F); međutim, postojao je visok stepen varijacije za svaku koncentraciju koja se nije mogla pripisati lečenju (R<2>= 0,17).
Zaključci
U cilju razvoja terapije za AS, sprovedeni su eksperimenti da bi se utvrdilo da li ASO-ovi koji ciljaju na određeni region inhibiraju Ube3a-ASIUBE3A-AS i ponovo aktiviraju ispoljavanje paternalnog Ube3a/UBE3A alela u mišijim i ljudskim neuronima. Sveukupno, nalazi pokazuju da ASO-ovi koji ciljaju ovaj region u mišijim i ljudskim neuronima ima snažnu antisense aktivnost i obrnuto utiskivanje Ube3a/UBE3A.
Dva od tri ASO-a (ASO-1.1 i ASO-3.1) koji ciljaju Ube3a-AS ponovo je aktiviralo ispoljavanje paternalnog Ube3a alela u mišijim neuronima na nivo sličan onom koji se postiže optimalnom koncentracijom topotekana (300 nm).
Isto tako, svaki od ASO-ova specifičnih za ljude značajno su smanjili RNK nivoe u stabilnom stanju za UBE3A-AS u ljudskim neuronima izvedenim iz iPSC-a, s tim da su visoke koncentracije ASO-4 i ASO-6.1 skoro potpuno ukinule ispoljavanje UBE3A-AS. S obzirom da su ASO-4 i ASO-6.1 ciljni regioni koji su 100% očuvani između čoveka i makaka, efektivnost ovih ASO-ova može da se ispita in vivo ili u makaku rakojedu ili u rezus makaku. Za razliku od topotekana, ASO-4 ima mali, ako ga uopšte ima, efekat na uzvodne SNORD116, IPW, SNORD115 ili SNORD109A/B RNK-ove, dosledno ideji da ASO ukida transkripciju u ciljnom regionu ili nizvodno od njega.
Niske koncentracije (3 nM) ASO-4 i ASO-6.1 značajno su
smanjile UBE3A-AS RNK nivoe; međutim, visoke koncentracije (≥ 100 nM) ASO-a su bile neophodne za povećanje UBE3A RNK nivoa. Moguće je da ovo oslikava određeni prag potreban da bi UBE3A-AS inhibirao transkripciju UBE3A ili zaostatak između vremena u kojem deaktivacija UBE3A-AS vodi do ponovne aktivacije paternalnog UBE3A ili osetljivost testa korišćenog za
kvantifikaciju UBE3A RNK nivoa.
Zajedno, nalazi sugerišu da ASO-ovi koji ciljaju kandidatski region u UBE3A-AS skoro u potpunosti ukidaju utiskivanje UBE3A u neuronima i otkrivaju najmanje dva ASO-a za budući klinički razvoj.
Derivati ASO-4 i ASO-6.1 koji se sastoje od različitih RNK modifikacija [2'-hidroksimetila (2'-OMe), 2'-metoksi-etila 2'-MOE i zaključane nukleinske kiseline (LNK)] i kičme [fosforotioat (PS) i fosfodiester (PO)] su takođe dizajnirane (Tabela 17)
Materijali i postupci
Dizajn antisense oligonukleotida
Antisense oligonukleotidi (ASO-ovi) su dizajnirani korišćenjem programa Soligo (softver za statističko savijanje nukleinskih kiselina i istraživanje regulatornih RNK-ova). Ukratko, kandidatski ASO-ovi (20–18-mer) sa najnižom energijom za disrupciju mesta vezivanja i energiju za slobodno vezivanje su identifikovani za svaku ciljnu sekvencu i zatim inspicirani na motive sa povećanom efektivnošću. ASO-ovi su dodatno filtrirani na osnovu dostupnosti unutar predviđenih sekundarne strukture centroida najniže slobodne energije ciljne sekvence generisane programom Soligo. U nekim slučajevima, modeli sekundarne strukture su upoređeni korišćenjem struktura najniže slobodne energije generisanih programima RNAfold i Mfold.
Ljudski ASO-ovi su filtrirani korišćenjem sledećih kriterijuma: 1) ciljna sekvenca je bila polimorfična [dbSNP138, dbSNP150 i 1000 Genomes faze 3 poziva integrisanih varijanti (SNV, INDEL i SV)]; 2) ciljna sekvenca nije bila 100% očuvana sa rezus makakom i makakom rakojedom; 3) ciljna sekvenca se nalazila uzvodno od zadržanog Snord115/SNORD115 snoRNK (po eksonu). Preostali ASO-ovi su zatim ocenjeni prema slobodnoj energiji (<= -8 kcal/mol), srednjoj neuparenoj verovatnoći za nukleotide ciljnog mesta, energiji za disrupciju mesta vezivanja (niska > visoka), lokacije unutar sekundarne strukture (Ensembl centroid) i prisustvu/odsustvu motiva sekvence povezanih sa visokom/niskom efektivnošću.
Mišiji primarni neuroni hipokampusa
Primarne kulture neurona hipokampusa su generisane iz P0-P1 mladunčadi (Ube3a<m+/p+>i Ube3a<m+/pYFP>) ukrštanjem Ube3a<m+/pYFP>mužjaka sa ženkama divljeg tipa C57BL/6J. Genotipovi su utvrđeni korišćenjem prethodno opisanih postupaka. Ukratko, neuroni hipokampusa su kultivisani u medijumu Neurobasal A (Invitrogen, San Diego, CA) nadopunjenom sa B27 (Invitrogen) i penicilinom/streptomicinom (Invitrogen) na pločama sa providnim dnom od 96 bunarića obloženim sa poli-D-lisinom (152028, Thermo Fisher Scientific) i lammininom (23017-01, Thermo Fisher Scientific). Kulture su održavane na 37 °C u 5% CO2 do upotrebe.
Dijagnostičko slikanje mišijih neurona
Mišiji primarni neuroni hipokampusa su fiksirani na 10 DIV (3 dana nakon lečenja) sa 4% paraformaldehida. Kulture su zatim isprane dvaput sa 1X PBS-om, fiksirane u 4% paraformaldehida u PBS-u tokom 15 min i zatim isprane tri puta u 1X PBS-u. Ćelije su podeljene u blokove u 0,3% Triton-X100 u PBS-u (T-PBS) plus 5% kozijeg ili magarećeg seruma tokom 1–2 časa pri sobnoj temperaturi uz nežno pomeranje. Ćelije su inkubirane sa anti-GFP [Novus Biologicals, NB 600-308 (zečijim)] i anti-NeuN (Millipore, 05-557 (mišijim)] antitelima tokom 24 časa pri 4 °C uz nežno pomeranje. Ćelije su isprane 3 puta u 0,1% Tween 201X PBS-a tokom 15 min svaka zatim inkubirane sa anti-zečijim 488 (Jackson ImmunoResearch, 111-545-144) i anti-mišijim Cy3 (Jackson ImmunoResearch, 115-165-166) sekundarnim antitelima tokom 24 časa pri 4 °C u tami. Ćelije su zatim isprane 4 puta 0,1% Tween 201X PBS-a tokom 15 min svaka. Nukleusi su obeleženi korišćenjem Hoechst boje (Thermo Fisher Scientific) pri razređenosti od 1:1000 u trećem ispiranju.
Ploče su uslikane pomoću softvera Cytation 5 i Gen5 Image+ (BioTek, Winooski, VT). Ukratko, 4X invertirani cilj je korišćen za generisanje montažnih slika svakog bunarića pribavljanjem 5x4 slike sa automatskim fokusom sa pločicama koje se preklapaju za automatsko šivenje slika. Korišćeni filteri su bili DAPI (377, 477), GFP (469, 525) i RFP (531, 593). Vreme izlaganja i pojačanje su podešeni za svaku ploču korišćenjem negativne i pozitivne kontrole. Automatsko fokusiranje je izvršeno na nukleusu (Hoechst fleka, DAPI) za svaki bunarić, sa istom žižnom visinom koja se koristi za GFP i RFP filtere. Slike su spojene pomoću softvera Gen5 Image+.
Analiza slike jedne ćelije izvršena je pomoću programa IN Cell Developer 6.0 (GE Healthcare Life Sciences, Pitsburg, PA). Ukratko, maske pojedinačnih traka su generisane ili za nukleuse (Hoechst boja, DAPI) ili za zrele neurone (NeuN, RFP) optimizacijom parametara uključivanja i isključivanja na osnovu veličine i intenziteta nasumično odabranih ćelija na dobijenim slikama. Vrednosti srednjeg i medijane intenziteta GFP-a su zatim pribavljene unutar granica odabrane maske, generišući vrednosti intenziteta za Ube3aYFP unutar svake ćelije.
Ljudski neuroni izvedeni iz pluripotentnih matičnih ćelija
GABAergičke i glutamatergičke prekursorske neuronske ćelije izvedene iz induciranih pluripotentnih matičnih ćelija (iPSC) (NRC-100-010-001 i GNC-301-030-001, Cellular Dynamics International, Madison WI) su diferencirane u neurone prema protokolima proizvođača. Ukratko, prekursorske neuronske ćelije su odmrznute i ponovo suspendovane u hemijski definisanom medijumu i dodane u sterilne ploče za kultivisanje premazane sa poli-D-lizinom i lamininom. Medijum je zamenjen 24 časa nakon smeštanje u ploču i zatim je jedna polovina medijuma menjana svakih 3–5 dana nakon toga.
Izolacija RNK
Za kultivisane neurone izvedene iz iPSC-a, izolacija RNK i sinteza cDNK su izvedene korišćenjem kompleta Cell-to-CT (Thermo Fisher Scientific) u lizatu zapremine 55 µl.
Analiza RNK nivoa
RNK nivoi u stabilnom stanju ciljnih transkripta izmereni su korišćenjem TaqMAN PCR testova za kvantitativnu obrnutu transkripciju (QRT-PCR). Ukupna količina je bila 10 uL, uključujući 2 µl cDNA, 1X Gene Expression Master smeša (4369016, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) i 1X TaqMan prajmer test (Thermo Fisher Scientific). Uslovi cikliranja su bili 2 minutes pri 50 °C, 10 minutes pri 95 °C i 40 ciklusa od 15 sekundi pri 95 °C i 1 minutu pri 60 °C, s tim da su očitavanja uzimana na koraku od 60 °C svakog ciklusa. Reakcije su vršene na BIO-RAD T1000 CFX96 uređaju za termocikliranje (Bio-Rad Laboratories, Hercules CA) sa unutrašnjom kontrolom (PPIA, Hs99999904_m1, Thermo Fisher Scientific) i ciljem [UBE3A-AS, Hs01372957_m1; SNORD116-11, Hs04275268_gH; SNORD115, Hs04275288_gH; IPW, Hs03455409_s1;
SNORD109A/B, AP47WVR (Thermo Fisher Scientific); UBE3A: prosleđivanje ATATGTGGAAGCCGGAATCT (SEQ ID NO:500); obrnuto:
CCCAGAACTCCCTAATCAGAA (SEQ ID NO:501); i sonda:
ATGACGGTGGCTATACCAGG (SEQ ID NO:502)] reakcije su izvršene zajedno. Podaci su preuzeti i analizirani sa BIORAD CFX Maestro softverom (Bio-Rad Laboratories). Uzorci sa Cq vrednostima unutrašnje kontrole ≥ 30 su filtrirani. Kvalitet podataka je vizuelno pregledan da bi se identifikovale diskrepancije između tehničkih i/ili replikata u ploči. Merenja za inferencijsku statistiku i opisnu statistiku se sastoji od ΔΔCq vrednosti (2<-ΔΔCq>= 2<-(Cq[ci j]>-<Cq[unutrašnja kontrola])>-<(Cq[target]>-<Cq[unutrašnja kontrola])>).
Primer 2: Identifikacija ASO ciljnog regiona
Analiza podataka sekvenciranja RNK generisanih iz mišijih tkiva i ćelija otkrila je region koji se nalazi između 3' kraja Snord115 klastera i 5'
kraja Ube3a antisense (Ube3a-AS) transkripta koji sadrži genetske elemente za koje se veruje da su važni za obradu Snord115 transkripta gena domaćina i transkripciju Ube3a-AS (Slike 6A–6D). Analiza podataka sekvenciranja RNK generisanih iz ljudskih tkiva otkrila je region koji se nalazi između 3' kraja SNORD115 klastera i SNORD109B (Slike 7A–7G) koji je sadržao elemente slične onima uočenim u mišijim; međutim, uporedna analiza ovog regiona je pokazala da je održavanje sekvence bilo malo ili nepostojeće između ljudi i glodara.
Materijali i postupci
Sekvenciranje RNK
RNK je izolovana korišćenjem kompleta Qiagen RNAeasy Plus (74136, Qiagen, Hilden, Nemačka). Koncentracija RNK je utvrđena korišćenjem postupka Qubit Fluorometric Quantitation (Thermo Fisher Scientific) i kvaliteta RNK je procenjena korišćenjem sistema 4200 Agilent TapeStation (Agilent, Santa Clara, CA). Biblioteke sekvenciranja RNK su generisane korišćenjem kompleta Illumina TruSeq Stranded Total RNA (20020597, Illumina, Inc., San Diego, CA) prema protokolu proizvođača. Sekvenciranje 75 baznih parova sa uparenim krajevima je izvršeno korišćenjem rešenja NextSeq 500 (Illumina, San Diego, CA) u centralnoj zgradi Texas A&M Instituta za genomske nauke i drušvenu genomiju. Očitavanja sirovog sekvenciranja su obrađena korišćenjem programa CASAVA. Dobijene FASTQ sekvence su ispitane korišćenjem programa FASTQC.
FASTQ sekvence su prilagoeđene spram ljudskog referentnog sklopa (hg19) korišćenjem programa Hisat2 (verzija 2.1.0), sa sledećim postavkama: --fr. Poravnate SAM sekvence su zatim promenjene u binarne BAM sekvence, indeksirane i sortirane korišćenjem programa Samtools. BAM datoteke pojedinačnih uzoraka su objedinjene i indeksirane korišćenjem programa Samtools. Poravnate sekvence su filtriranje korišćenjem komande pogleda u programu Samtools za uklanjanje nejedinstveno poravnatih očitavanja (kvaliteta > 1).
Sklop transkripta je generisan za objedinjene uzorke korišćenjem programa Stingtie (verzija 1.3.4.d), sa sledećim opcijama: (podeljeno u niti) --rf -f 0–j 2. Transkripti pojedinačnih eksona su isključeni iz sklopljenih transkripta korišćenjem programa gffread (GFF utilities, Johns Hopkins University, Center for Computational Biology).
Primer 3: Identifikacija vodećih ASO-ova
Osamnaest ASO-ova koji ciljaju ASO-4 i ASO-6.1 ciljne sekvence i koji se sastoje od različitih dizajna kičme i RNK modifikacija, dizajnirano je tako da identifikuju potencijalne vodeće ASO-ove (Tabela 17). Normalni neuroni izvedeni iz iPSC-a (GABAergički) su lečeni sa 1⁄2 log krivuljom reakcije na dozu u 10 tačaka svakog ASO-a da bi se uporedile IC50 i Emax vrednosti. Prekursorske neuronske ćelije su diferencirane u neurone na 18 DIV i zatim lečene sa 1⁄2 log odgovora na dozu u 10 tačaka ASO-ova [1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM, 300 nM, 1 µM, 3 µM, 10 µM i 30 µM (n = 2)]. Na 24 DIV, RNK nivoi u stabilnom stanju za UBE3A-AS su izmereni i krivulje odgovora na dozu su prilagođene kako je opisano u prethodnome (Slika 8A i Tabela 18)l. Krivulje odgovora na dozu su bile značajno drugačije (test paralelizma: F(51,606) = 7,86; p < 0,0001; R<2>= 0,90), tako da relativna snaga nije procenjena. Hijerarhijsko grupisanje prilagođenih krivulja otkrilo je 3 klastera ASO-ova, s tim da klaster 1 predstavlja 9 najsnažnijih ASO-ova (Slike 8B i 8C). Analiza klastera 1 je ukazala da su ASO-ovi imali slične krivulje (test paralelizma: F(24,299) = 1,01; p = 0,5; R<2>= 0,93), a taj ASO-4.4.PS.L je bio najmanje 3 puta jači od ostalih ASOS (tabela 19). Dalja je analiza, međutim, pokazala da ASO-4.4.PS.L, ASO-6.1.PS.M i ASO-6.1.PO-1.M imaju ekvivalentne IC50 vrednosti, dok su drugi ASO-ovi bili nešto manje snažni (Tabela 20). Na osnovu relativne snage i unutrašnjeg kriterija izbora, ASO-4.4.PS.L i ASO-6.1.PO-1.O su dodatno istraženi.
Materijali i postupci
Postupci su bili slični onima opisanim u Primeru 2, osim ako je navedeno drugačije.
Primer 4: Farmakodinamička analiza ASO-6.1-PO-1.O i ASO-4.4.PS.L u iPSC neuronima sa Angelmanovim sindromom
Snage ASO-6.1.PS.O i ASO-4.4.PS.L su ispitane u neuronima izvedenim iz iPSC-a od pacijenta sa Angelmanovim sindromom sa maternalno izvedenom delecijom 15q11-q13 regiona. Inducirane pluripotentne matične ćelije su diferencirane u neurone i zatim lečene sa 1⁄2 log krivuljom odgovora na dozu u 10 tačaka ASO-6.1.PO-1.O i ASO-4.4.PS.L [1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM, 300 nM, 1 µM, 3 µM, 10 µM i 30 µM (n = 3)]. Šest sati nakon lečenja, RNK nivoi u stabilnom stanju za UBE3A-AS su izmereni i krivulje odgovora na dozu su prilagođene kako je opisano u prethodnome (Slika 9A). Krivulje odgovora na dozu su bile slične među ASO-ovima (test paralelizma: F(3,132) = 1,07, p = 0,4, R<2>= 0,82), s tim da je ASO-4.4.PS.L (437 nM) bio približno 2,7-struko snažniji od ASO-6.1.PO-1.O (1,22 uM). Vrednosti IC50 su bile ekvivalentne [ASO-6.1.PO-1.O /ASO-4.4.PS.L odnos IC50: = 0,96 (donja granica pouzdanosti = 0,9; Gornja granica pouzdanosti = 1,0)]. Vrednosti Emax su bile slične (30 µM: ASO-4.4.PS.L = 0,01 ± 0,0007; ASO-6.1.PO-1.O = 0,05 ± 0,004) ali se nisu smatrale ekvivalentnima zbog intervala pouzdanosti [ASO-6.1.PO-1.O /ASO-4.4.PS.L odnos Emax: = -9,1 (donja granica pouzdanosti = -224; Gornja granica pouzdanosti = 205)].
Materijali i postupci
Postupci su bili slični onima opisanim u Primeru 2, osim ako je navedeno drugačije.
Neuroni izvedeni iz induciranih pluripotentnih matičnih ćelija sa Angelmanovim sindromom
iPS ćelije sa Angelmanovim sindromom (AG1-0 iPSC-ovi) (ECN001, Kerafast, Boston, MA) su zajedno kultivisane na ozračenim murinskim embrijskim fibroblastima u medijumu ljudskih embrijskih matičnih ćelija [DMEM/F12 (11330-057, Gibco Biosciences, Dublin, Irska), 20% sredstva Knockout Serum Replacement (10828-028, Thermo Fisher Scientific), 1X neesencijalnih amino kiselina, 2 mM L-glutamina, 7 µl/mL 2-merkaptoetanola i 4 µg/mL bazičnog faktora rasta fibroblasta]. Za prvo propuštanje, AG1-0 ćelije su propuštene prema uputstvu za upotrebu proizvoda PluriSTEM Human ES/iPS Medium (SCM130, Millipore Sigma, Burlington, MA), koji je bez hranilice i koristi sredstvo Dispase II (SCM133, Millipore Sigma) za disocijaciju ćelija. Matrigel<™>hESC-kvalifikovana matrica (354277, Corning BD Biosciences, Corning, NY) je korišćena kao vanjćelijska matrica. U drugom propuštanju, matrica je promenjena na vitronektin (CC130, Millipore Sigma). Tokom naknadnih propuštanja, predeli diferencijacije su ručno uklanjane do tačke u kojoj su diferencirane ćelije predstavljale približno < 5% kolonija. Posle četiri naknadna propuštanja, AG1-0 ćelije su diferencirane korišćenjem kompleta Millipore ES/iPS Neurogenesis (SCR603, SCM110 i SCM111), ali bez vitronektina kao vanćelijske matrice. Prvo propuštanje je izvršeno korišćenjem sredstva EZ-LiFT (SCM139, Millipore Sigma) da bi se dobile visokokvalitetne iPS ćelije. Progenitorske neuronske ćelije su zamrznute u nultoj fazi (P0) i naknadno odmrznute radi diferencijacije. Diferencijacija je izvršena na sterilnim pločama za kultivisanje premazanim sa poli-D-lizina (10 µg/mL) i laminina [10 µg/mL (23017-015, Gibco) u medijumu za diferencijaciju (SCM111) tokom 10 dana diferencijacije. U nekim slučajevima, ćelije su diferencirane u Cellular Dynamics Maintenance medijumu (NRM-100-121-001, Cellular Dynamics International, Madison, WI).
Primer 5: Analiza ispoljavanja PWS policistroničkog transkripta u
iPSC neuronima sa Angelmanovim sindromom lečenim sa ASO-6.1-PO-1.O i ASO-4.4.PS.L
Da bi se utvrdilo da li ASO-4.4.PS.L i ASO-6.1.PO-1.O utiču na RNK nivoe transkripta kodiranih od strane PWS policistroničkih transkripta, sekvenciranje RNK je izvršeno na AS iPS ćelijama lečenim sa svakim ASO i RNK nivoi u stabilnom stanju za SNURF, SNRPN, SNORD116 transkript gena domaćina (SNHG116), SNORD116 snoRNK-ove, IPW, SNORD115 transkript gena domaćina (SNHG 115), SNORD115 snoRNK-ove i UBE3A-AS su kvantifikovani. RNK nivoi u stabilnom stanju za UBE3A su takođe izmereni. iPS ćelije sa Angelmanovim sindromom su diferencirane u neurone kako je opisano u prethodnome i zatim lečene sa vehikulumom (1% H2O, n = 3), ASO-4.4.PS.L (30 u µM, n = 3) i ASO-6.1.PO-1.O (30 µM, n = 3). Šest dana posle tretmana, sekvenciranje RNK je izvedeno na totalnoj RNK (osiromašena rRNK) izolovanoj iz kultura. Da bi se generisale oznake SNHG116, SNHG115, i UBE3A-AS transkripta, sklopljen je transkriptom od podataka sekvenciranja RNK za vehikulum i zatim ugrađeni u oznaku referentnog gena. Relativno spram vehikuluma, RNK nivoi u stabilnom stanju za SNURF, SNRPN, SNHG116, SNORD116 snoRNK-ove i SNORD115 snoRNK-ove su bili slični i nisu bili značajno različiti. ASO-4.4.PS.L, ali ne i ASO-6.1.PO-1.O, je umanjio
nivoe IPW (1,5-struko), ali efekat nije bio značajan. ASO-6.1.PO-1.O i ASO-4.4.PS.L su značajno umanjili SNHG115 i UBE3A-AS RNK nivoe. ASO-6.1.PO-1.O i ASO-4.4.PS.L su imali sličan efekat na SNHG115 nivoe; međutim, ASO-4.4.PS.L je imao mnogo veći efekat na UBE3A-AS RNK nivoe nego ASO-6.1.PO-1.O (ASO-4.4.PS.L: -6,1-struka promena; ASO-6.1. PO-1.O: -2,8-struka promena). ASO lečenje je povećalo UBE3A RNK nivoe približno 1,2-struko, ali efekat nije bio značajan (Slika 10 i Tabela 21).
Materijali i postupci
Postupci su bili slični onima opisanim u Primeru 4, osim ako je navedeno drugačije.
Diferencijalna analiza ispoljavanja PWS RNK-ova
Normalizovane FPKM (fragmenti po hiljadi po milionu) vrednosti RefSeq oznake gena će biti procenjene korišćenjem Cuffnorma sa standardnim postavkama i sledećom opcijom: -u. FPKM vrednosti svake oznake gena su utvrđene za svaki uzorak iz izlazne datoteke i korišćene su za opisnu i inferencijsku statistiku.
Primer 6: Farmakodinamička analiza ASO-6.1-PO-1.O i ASO-4.4.PS.L u makakima rakojedima
ASO-4 i ASO-6 ciljni regioni su očuvani u više vrsta nečovečijih primata (NHP), čime su omogućene bezbednosna i istraživanja efektivnosti u velikom životinjskom modelu. Da bi se ispitala efektivnost ASO-4.4.PS.L i ASO-6.1.PO-1.O u centralnom nervnom sistemu (CNS), ASO-ovi su isporučeni makakima rakojedima intratekalnom lumbalnom punkcijom. Na životinje je primenjena jedna bolus injekcija vehikuluma (0,9% fiziološkog rastvora, n = 5), ASO-6.1.PO-1.O (10 mg, n = 3) i ASO.4.4.PS.L (10 mg, n = 3). Dvadeset i osam dana nakon lečenja, tkiva centralnog nervnog sistema (CNS) su sakupljena i RNK nivoi u stabilnom stanju za UBE3A-AS su izmereni. Sveukupno, ASO-4.4.PS.L je imao veći efekat na UBE3A-AS RNK nivoe nego ASO-6.1.PO-1.O (Tabela 22). ASO-4.4.PS.L je umanjio UBE3A-AS RNK u većini regiona CNS-a, sa velikim efektom u temporalnom režnju, primarnom motoričkom korteksu, ponsu, meduli, hipokampusu, globusu palidusu, frontalnom korteksu (corona radiata), prefrontalnom korteksu i lumbalnoj kičmenoj moždini. Slično tome, ASO-6.1.PO-1.O je smanjio UBE3A-AS RNK nivoe u većini regiona CNS-a, sa velikim efektima uočenim u ponsu, okulomotornom jedru i lumbalnoj kičmenoj moždini (Slika 11 i Tabela 23).
Materijali i postupci
Primena ASO-ova
NHP istraživanja su sprovedena u Northern Biomedical Research and Charles River laboratorijama koriščćenjem protokola odobrenih od strane respektivnih Institucijskih komisija za brigu o životinjama i za korišćenje životinja te institucije. Mužjaci i ženke makaka rakojeda (Macaca fascicularis) težine 2–4 kg su anestetizirani i jedna doza od 1 ml ASO-a ili vehikuluma je primenjena putem intratekalne lumbalne punkcije. Rastvor za doziranje je pripremljen rastvaranjem liofiliziranog ASO-a u kontrolnom artiklu vehikuluma (0,9% natrijum hlorida) i filtriran je kroz filter od 0,2 µm. Uzeti su uzorci CNS-a i kičmene moždine, a CNS je podeljen na koronalne režnjeve od 4 mm. Uzorci tkiva su brzo zamrznuti i čuvani na -80 °C do izolacije RNK.
Izolacija RNK
Isečak tkiva od 4 mm je izuzet iz svakog regiona od interesa, od kojih je pribliđžno pola iskorišćeno za izolaciju RNK. Izolacija RNK je izvršena korišćenjem kompleta Qiagen RNeasy Mini (74136, Qiagen) s tim da su disrupcija tkiva i liza izvršene sa kuglicama od nerđajućeg čelika od 5 mm u uređaju TissueLyser II. RNK je eluiran u dve zapremine od 30 µl, za ukupnu zapreminu elucije od 60 µl. RNK je kvantifikovan korišćenjem Qubita sa RNK XR testom (Q33224, Thermo Fisher Scientific). cDNK je sintetiziran iz 2 µg ulaznog RNK korišćenjem RNA-tocDNA kompleta visokog kapaciteta (4387406, Thermo Fisher Scientific) u ukupnoj zapremini reakcije od 50 µl.
Analiza UBE3A-AS RNK nivoa u tkivima
Kod makaka rakojeda UBE3A-AS RNK nivoi su procenjeni korišćenjem SYBR Green PCR testa kvantitativne obrnute transkripcije (qRT-PCR). Ukupna zapremina reakcije je bila 10 µl, uključujući 2 µl cDNK, 1X PowerUp SYBR Green Master smeše (A25741, Thermo Fisher Scientific) i 500 nM svakog prajmera (napred i obrnutog). Uslovi cikliranja su bili 2 minute pri 50 °C, 2 minute pri 95 °C i 40 ciklusa od 15 sekundi pri 95 °C i 1 minute pri 60 °C, s tim da su očitanja uzimana u koraku od 60 °C svakog ciklusa. Reakcije su vršene na BIO-RAD T1000 CFX96 uređaju za termocikliranje, sa unutrašnjom kontrolom (PPIA, napred: GTCTCCTTCGAGCTGTTTGC (SEQ ID NO:503); obrnuto:CCTTTCTCTCCAGTGCTCAGA (SEQ ID NO:504)) i ciljem (UBE3A-AS, napred: CCTGTGAACTTTCAACCAGGA (SEQ ID NO:505); obrnuto:GGATCAGACTCCAGGCCTTC (SEQ ID NO:506)) reakcije su vršene odvojeno. Podaci su preuzeti i prvobitna analiza je izvršena sa BIORAD CFX Maestro softverom, s tim da su dubinske statističke analize vršene korišćenjem programa Excel i JMP.
Primer 7: ASO-ovi koji ciljaju eksonske granice splajsovanih UBE3A-AS transkripta
U nekim otelotvorenjima, ciljna sekvenca je eksonska granica koja uključuje UBE3A-AS eksone 1–5 i SNORD109B eksone 1–2. Ciljne sekvence se sastoje od 38 nukleotida (19 nukleotida svakog eksona) centriranih na eksonskoj granici svakog eksona (19 nukleotida koji predstavljaju 5' i 3' krajeve susednih eksona). Bilo je 12 segmenta sekvenci, s tim da su eksonske granice uključivale segmente 1–2, 2–3, 3–4, 5–6, 7–8, 9–10 i 11–12. Koordinate hromozoma su obezbeđene u Tabeli 24. Kreirana je jedna spojena čvorišna sekvenca koja prikazuje splajsovane eksone (|, eksonsonsko čvorište) i intervenirajuće eksonske sekvence ([]). ASO-ovi (20-, 19 i 18-mer) koji ciljaju eksonska čvorišta su obezbeđeni u Tabeli 25.
Spojena čvorišna sekvenca
| = 3'-5' eksonsko čvorište
[] = intervenirajuća eksonska sekvenca
Example 8: siRNK, shRNK, i CRISPR vodički RNK-ovi koji ciljaju UBE3a-AS eksone 1–5
Kao što je u prethodnome pomenuto, u nekim otelotvorenjima, otkriveni oligonukleotid je funkcionalna nukleinska kiselina, kao što je siRNK, shRNK i nukleaza gRNK, koja inhibira, mutira ili briše ciljanu sekvencu nuklearne kiseline.
Primeri siRNK koji cilja UBE3a-AS eksone 1–5 su obezbeđeni u Tabeli 26. Primeri shRNK koji cilja UBE3a-AS eksone 1–5 su obezbeđeni u Tabeli 27. Primeri gRNK koji cilja UBE3a-AS eksone 1–5 su obezbeđeni u Tabeli 28.
Osim ako je definisano drugačije, svi tehnički i naučni izrazi koji su ovde korišćeni imaju ista značenja kako ga razume stručnjak u predmetnoj oblasti kojoj otkriveni pronalazak pripada.

Claims (17)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Farmaceutska kompozicija koja sadrži jedan ili više antisense oligonukleotida u farmaceutski prihvatljivom razblaživaču, rastvaraču, nosaču, soli i/ili adjuvantu za upotrebu u lečenju ili sprečavanju Angelmanovog sindroma kod subjekta, pri čemu jedan ili više antisense oligonukleotida sadrže sekvencu nukleotida dužine od 10 do 30 nukleotida sa 100% komplementarnosti spram neprekidnog dela sekvence nukleinske kiseline odabrane između SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 i SEQ ID NO:5, pri čemu je antisense oligonukleotid sposoban da cilja 5' kraj UBE3A-AS transkripta.
2. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu antisense oligonukleotid sadrži sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 7, 8, 9 i 10.
3. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili 2, pri čemu antisense oligonukleotid sadrži modifikovani nukleozid.
4. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, pri čemu je jedan ili više modifikovanih nukleozida 2' nukleozid modifikovanog šećera.
5. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 4, pri čemu je 2' nukleozid modifikovanog šećera nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od nukleozida 2'-O-alkil-RNK, 2'-O-metil-RNK, 2'-alkoksi-RNK, 2'-O-metoksietil-RNK, 2'-amino-DNK, 2'-fluoro-DNK, arabino nukleinske kiseline (ANK), 2'-fluoro-ANK i zaključane nukleinske kiseline (LNK).
6. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 5, pri čemu je jedan ili više nukleozida nukleozid zaključane nukleinske kiseline (LNK).
7. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu antisense oligonukleotid sadrži modifikovanu internukleozidnu vezu.
8. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 7, pri čemu je modifikovana internukleozidna veza fosforotioatna internukleozidna veza.
9. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je antisense oligonukleotid sposoban da regrutuje RNazu H.
10. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 9, pri čemu je antisense oligonukleotid gepmer.
11. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, pri čemu je antisense oligonukleotid sekvenca nukleinske kiseline odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ iD BR: 363 do 392.
12. Antisense oligonukleotid koji sadrži sekvencu nukleotida dužine od 17 do 20 nukleotida sa 100% komplementarnosti spram neprekidnog dela SEQ ID NO:2, pri čemu je antisense oligonukleotid sposoban da cilja 5' kraj UBE3A-AS transkripta.
13. Antisense oligonukleotid prema patentnom zahtevu 12, pri čemu antisense oligonukleotid sadrži sekvencu nukleinske kiseline odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 67 do 115.
14. Antisense oligonukleotid prema patentnom zahtevu 13, pri čemu antisense oligonukleotid sadrži sekvencu nukleinske kiseline izloženu u SEQ ID NO: 89.
15. Antisense oligonukleotid prema patentnom zahtevu 13, pri čemu je antisense oligonukleotid odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 365, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382 i 383.
16. Antisense oligonukleotid prema patentnom zahtevu 13, pri čemu je antisense oligonukleotid komplementaran spram nukleinske kiseline odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 18–66.
17. Antisense oligonukleotid prema patentnom zahtevu 16, pri čemu je antisense oligonukleotid komplementaran spram sekvence nukleinske kiseline izložene u SEQ ID NO: 40.
RS20250666A 2017-12-01 2018-11-30 Antisense lečenje angelmanovog sindroma RS66986B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762593431P 2017-12-01 2017-12-01
US201862676034P 2018-05-24 2018-05-24
PCT/US2018/063416 WO2019109001A1 (en) 2017-12-01 2018-11-30 Angelman syndrome antisense treatment
EP18883102.8A EP3717646B1 (en) 2017-12-01 2018-11-30 Angelman syndrome antisense treatment

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS66986B1 true RS66986B1 (sr) 2025-07-31

Family

ID=66664231

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20250666A RS66986B1 (sr) 2017-12-01 2018-11-30 Antisense lečenje angelmanovog sindroma

Country Status (26)

Country Link
US (5) US11198869B2 (sr)
EP (2) EP3717646B1 (sr)
JP (3) JP7297320B2 (sr)
KR (2) KR102723989B1 (sr)
CN (2) CN111433361B (sr)
AU (1) AU2018375807B2 (sr)
BR (1) BR112020009431A2 (sr)
CA (1) CA3079755A1 (sr)
CL (1) CL2020001344A1 (sr)
CO (1) CO2020006361A2 (sr)
DK (1) DK3717646T3 (sr)
ES (1) ES3032315T3 (sr)
FI (1) FI3717646T3 (sr)
HR (1) HRP20250804T1 (sr)
IL (1) IL274146B2 (sr)
LT (1) LT3717646T (sr)
MX (2) MX2020005680A (sr)
PE (1) PE20211238A1 (sr)
PL (1) PL3717646T3 (sr)
PT (1) PT3717646T (sr)
RS (1) RS66986B1 (sr)
RU (1) RU2020121752A (sr)
SG (1) SG11202003596WA (sr)
SI (1) SI3717646T1 (sr)
SM (1) SMT202500334T1 (sr)
WO (1) WO2019109001A1 (sr)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CR20220077A (es) 2015-11-12 2023-04-11 Hoffmann La Roche Oligonucleótidos para inducir la expresión paterna de ube3a (divisional 2020-118)
JP2021513866A (ja) * 2018-02-27 2021-06-03 ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル アンジェルマン症候群を処置する方法および組成物
BR112021019427A2 (pt) 2019-03-29 2021-11-30 Ionis Pharmaceuticals Inc Compostos e métodos para modular ube3a-ats
EP4172338A4 (en) * 2020-06-29 2025-06-11 Ionis Pharmaceuticals, Inc. COMPOUNDS AND METHODS FOR MODULATING PLP1
WO2022076415A1 (en) * 2020-10-06 2022-04-14 University Of Maryland, Baltimore Rapid diagnostic electrochemical biosensing targeted with antisense oligonucleotides
KR20240155345A (ko) * 2022-03-07 2024-10-28 유니버시티 오브 코네티컷 안젤만 증후군에서 부계 UBE3A 유전자 발현을 회복하기 위한 SNORD115 위치를 표적으로 하는 shRNA
JPWO2024162126A1 (sr) 2023-01-31 2024-08-08
WO2025100980A1 (ko) * 2023-11-08 2025-05-15 한국과학기술원 Ube3a를 표적으로 하여 발현증강을 유도하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 이의 용도
WO2025217466A1 (en) * 2024-04-11 2025-10-16 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Dosing regimens for antisense treatment of angelman syndrome

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2122030C (en) 1991-10-24 1997-03-04 Muthiah Manoharan Derivatized oligonucleotides having improved uptake and other properties
PL218876B1 (pl) * 2000-12-01 2015-02-27 Europaisches Lab Für Molekularbiologie Embl Wyizolowana cząsteczka dwuniciowego RNA, sposób wytwarzania cząsteczki dwuniciowego RNA, zastosowanie cząsteczki dwuniciowego RNA do wytwarzania leku do modulowania działania genu związanego z patogenem, genu związanego z nowotworem, oraz genu związanego z chorobą autoimmunologiczną, sposób in vitro kierowania miejscowo specyficznymi interferencjami RNA w komórce, zastosowanie sposobu in vitro do ustalania działania genu w komórce oraz do modulowania działania genu w komórce, środek farmaceutyczny, komórka eukariotyczna transfekowana cząsteczką RNA lub cząsteczką DNA kodującą tę cząsteczkę RNA, oraz zastosowanie komórki eukariotycznej w procedurach analitycznych oraz w procedurach preparatywnych
JP2008513507A (ja) * 2004-09-17 2008-05-01 アイシス ファーマシューティカルズ インコーポレイティッド 増強されたアンチセンスオリゴヌクレオチド
EP1676834A1 (en) 2004-12-30 2006-07-05 Sanofi-Aventis Deutschland GmbH Fused bicyclic carboxamide derivates for use as CXCR2 inhibitors in the treatment of inflammation
WO2007031091A2 (en) 2005-09-15 2007-03-22 Santaris Pharma A/S Rna antagonist compounds for the modulation of p21 ras expression
US8178503B2 (en) * 2006-03-03 2012-05-15 International Business Machines Corporation Ribonucleic acid interference molecules and binding sites derived by analyzing intergenic and intronic regions of genomes
US20080299659A1 (en) * 2007-03-02 2008-12-04 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting apob gene expression and uses thereof
US8580756B2 (en) 2007-03-22 2013-11-12 Santaris Pharma A/S Short oligomer antagonist compounds for the modulation of target mRNA
US9290534B2 (en) 2008-04-04 2016-03-22 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds having at least one neutrally linked terminal bicyclic nucleoside
US9394333B2 (en) 2008-12-02 2016-07-19 Wave Life Sciences Japan Method for the synthesis of phosphorus atom modified nucleic acids
EP2462153B1 (en) 2009-08-06 2015-07-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic cyclohexose nucleic acid analogs
EP2699600A1 (en) 2011-04-20 2014-02-26 Roche Glycart AG Method and constructs for the ph dependent passage of the blood-brain-barrier
WO2013033230A1 (en) 2011-08-29 2013-03-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomer-conjugate complexes and their use
WO2013154798A1 (en) 2012-04-09 2013-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Tricyclic nucleic acid analogs
WO2013173637A1 (en) * 2012-05-16 2013-11-21 Rana Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating gene expression
WO2013173645A1 (en) * 2012-05-16 2013-11-21 Rana Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating utrn expression
DK3461895T3 (da) * 2012-06-25 2020-07-20 Ionis Pharmaceuticals Inc Modulation af ube3a-ats-ekspression
RU2015104762A (ru) 2012-07-13 2018-08-31 Уэйв Лайф Сайенсес Лтд. Хиральный контроль
MX2016009290A (es) 2014-01-16 2017-02-28 Wave Life Sciences Ltd Diseño quiral.
WO2016079183A1 (en) 2014-11-19 2016-05-26 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Lna chiral phosphorothioates
US10400243B2 (en) 2014-11-25 2019-09-03 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of UBE3A-ATS expression
DK3234131T3 (da) 2014-12-16 2020-06-29 Roche Innovation Ct Copenhagen As Fremgangsmåde til screening af kiral toksicitet
DK3253875T3 (da) * 2015-02-04 2020-04-14 H Hoffmann La Roche Ag Tau-antisense-oligomerer og anvendelser deraf
JP2018512876A (ja) * 2015-04-22 2018-05-24 ミナ セラピューティクス リミテッド ｓａＲＮＡ組成物および使用方法
CR20220077A (es) 2015-11-12 2023-04-11 Hoffmann La Roche Oligonucleótidos para inducir la expresión paterna de ube3a (divisional 2020-118)
DK3455232T3 (da) 2016-05-12 2020-07-06 Roche Innovation Ct Copenhagen As Forbedret kobling af stereodefinerede oxazaphospholidin-phosphoramidit-monomerer til nukleosid eller oligonukleotid
KR102312721B1 (ko) 2016-10-04 2021-10-13 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 STING 효능제로서의 벤조[b]티오펜 화합물
EP3601309A1 (en) 2017-03-29 2020-02-05 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Orthogonal protecting groups for the preparation of stereodefined phosphorothioate oligonucleotides
WO2018234807A1 (en) 2017-06-22 2018-12-27 Curadev Pharma Limited Heterocyclic small molecule modulators of human sting

Also Published As

Publication number Publication date
US20220090075A1 (en) 2022-03-24
PE20211238A1 (es) 2021-07-09
JP7601441B2 (ja) 2024-12-17
US20200370046A1 (en) 2020-11-26
WO2019109001A1 (en) 2019-06-06
IL274146B2 (en) 2024-11-01
BR112020009431A2 (pt) 2020-10-13
JP7297320B2 (ja) 2023-06-26
US20230112629A1 (en) 2023-04-13
CA3079755A1 (en) 2019-06-06
MX2025009778A (es) 2025-09-02
IL274146B1 (en) 2024-07-01
KR20240161203A (ko) 2024-11-12
EP4328306A2 (en) 2024-02-28
KR102723989B1 (ko) 2024-11-01
US20230332152A1 (en) 2023-10-19
HRP20250804T1 (hr) 2025-09-12
AU2018375807A1 (en) 2020-05-07
SI3717646T1 (sl) 2025-08-29
CO2020006361A2 (es) 2020-08-10
JP2025041632A (ja) 2025-03-26
FI3717646T3 (fi) 2025-07-17
JP2023123517A (ja) 2023-09-05
ES3032315T3 (en) 2025-07-17
US20250066786A1 (en) 2025-02-27
MX2020005680A (es) 2020-08-20
DK3717646T3 (en) 2025-05-19
EP3717646A4 (en) 2021-12-01
AU2018375807B2 (en) 2025-04-10
US11198869B2 (en) 2021-12-14
CN111433361A (zh) 2020-07-17
IL274146A (en) 2020-06-30
JP2021505129A (ja) 2021-02-18
LT3717646T (lt) 2025-06-10
US11739328B2 (en) 2023-08-29
PL3717646T3 (pl) 2025-10-27
US11685920B2 (en) 2023-06-27
KR20200094152A (ko) 2020-08-06
CN111433361B (zh) 2024-03-29
CL2020001344A1 (es) 2020-09-21
SG11202003596WA (en) 2020-05-28
CN118291458A (zh) 2024-07-05
RU2020121752A (ru) 2021-12-30
EP3717646A1 (en) 2020-10-07
SMT202500334T1 (it) 2025-11-10
EP4328306A3 (en) 2025-05-21
PT3717646T (pt) 2025-07-28
EP3717646B1 (en) 2025-04-23
US12180480B2 (en) 2024-12-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12180480B2 (en) Angelman syndrome antisense treatment
US12084657B2 (en) Oligonucleotides targeting RNA binding protein sites
JP2021513861A (ja) Ｃａｍｋ２ｄアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその使用
TW201200138A (en) Treatment of Atonal homolog 1 (ATOH1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to ATOH1
WO2019181946A1 (ja) 毒性が軽減した核酸
CN113785060A (zh) 用于调节atxn2表达的寡核苷酸
CA3206925A1 (en) Antisense oligonucleotides increasing foxg1 expression
HK40029701A (en) Angelman syndrome antisense treatment
EP3793685A1 (en) Pharmaceutical compositions for treatment of microrna related diseases
CN118613268A (zh) 用于调节tmem106b表达的反义寡核苷酸
WO2025090254A1 (en) Adnp syndrome antisense treatment
HK40060810A (en) Oligonucleotides for modulating atxn2 expression
EA046329B1 (ru) Антисмысловые олигонуклеотиды camk2d и их применение