RS66721B1 - Novi derivati metilhinazolinona - Google Patents

Description

OPIS

Predmetni pronalazak obezbeđuje novo jedinjenje, njegovu proizvodnju, farmaceutske kompozicije koje ga sadrže i njegovu upotrebu kao terapeutski aktivne supstance. Jedinjenje iz predmetnog pronalaska je BRAF inhibitor i ima svojstva prekidanja paradoksa

Predmetni pronalazak konkretno daje novo jedinjenje formule (I)

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

Klasa RAF (Rapidly Accelerated Fibrosarcoma) serin-treonin kinaze se sastoji od tri člana (ARAF, BRAF, RAF1) koji čine prvi čvor signalnog puta MAP kinaze. Uprkos očiglednoj redundantnosti tri izooblika RAF u širenju signala kroz fosforilaciju MEK1 i 2, česte onkogene aktivirajuće mutacije se obično nalaze samo za BRAF. Konkretno, supstitucija V600 glutaminskom kiselinom ili lizinom čini kinazu visoko aktiviranom uz posledičnu hiperstimulaciju MAPK puta, nezavisno od spoljnih stimulacija (Cell. 2015 Jun 18; 161(7): 1681-1696).

Mutantni BRAF je onkogeni pokretač na koji može da se cilja, i tri BRAF inhibitora (vemurafenib, dabrafenib i enkorafenib) koji su do danas dostupni na tržištu pokazali su efikasnost kod BRAFV600E-pozitivnog melanoma. Međutim, brzo sticanje rezistencije na lekove je primećeno gotovo uvek, a trajanje terapeutskih koristi za ciljanu terapiju ostaje ograničeno.

Pored toga, razvijeni BRAF inhibitori su pokazali neočekivanu i „paradoksalnu“ sposobnost da potisnu MAPK signalizaciju kod tumora koje pokreće BRAFV600E, dok su isti inhibitori pokazali MAPK stimulišuće aktivnosti na BRAF modelima divljeg tipa (WT) (N Engl J Med 2012; 366:271-273; i British Journal of Cancer sveska 111, strane 640-645(2014)).

Mehanističke studije RAF paradoksa su zatim razjasnile da onkogeni BRAFV600E fosforiluje MEK 1/2 u svom monomernom citosolnom obliku, dok aktivacija WT BRAF i RAF1 zahteva složeni korak događaja, uključujući translokaciju ćelijske membrane i homodimerizaciju i/ili heterodimerizaciju koju podstiče aktivirani RAS (KRAS, NRAS, HRAS) (Nature Reviews Cancer sveska 14, strane 455-467(2014)).

Vezivanje inhibitora poput vemurafeniba, dabrafeniba ili enkorafeniba za WT BRAF ili RAF1 protomer brzo indukuje RAF homodimerizaciju i/ili heterodimerizaciju i membransko povezivanje novoformiranog RAF dimera. U dimernoj konformaciji, jedan RAF protomer potpuno osterično indukuje konformacione promene drugog, što dovodi do aktivnog statusa kinaze i, što je važno, konformacije koja je nepovoljna za vezivanje inhibitora. Usled toga, dimer indukovan tretmanom lekovima podstiče fosforilaciju MEK putem katalize kojom upravlja nevezani protomer uz hiperaktivaciju puta.

RAF paradoks dovodi do dve klinički relevantne posledice: 1) ubrzanog rasta sekundarnih tumora nakon BRAFi monoterapije (prvenstveno keratokantoma i karcinoma skvamoznih ćelija) (N Engl J Med 2012; 366:271-273) i 2) sticanja rezistencije na lekove u uslovima BRAFi monoterapije kao i sa kombinacijama BRAFi+MEKi predstavlja aktivaciju signalizacije RAF posredovane dimerom putem genetski vođenih događaja, uključujući RAS mutacije, BRAF amplifikacije, ekspresiju splajsovanih varijanti BRAF koje imaju dimerno dejstvo (Nature Reviews Cancer sveska 14, strane 455-467(2014)). Stoga postoji potreba za RAF inhibitorima koji su sposobni da prekinu taj paradoks.

Osim toga, svi trenutno odobreni klasični BRAF inhibitori vemurafenib (Mol. Pharmaceutics 2012, 9, 11, 3236-3245), dabrafenib (J Pharmacol Ex Ther 2013, 344 (3) 655-664) i enkorafenib (Pharmacol Res. 2018;129:414-423) veoma slabo prolaze kroz krvnomoždanu barijeru. Ovo je glavno ograničenje za upotrebu tih klasičnih BRAF inhibitora za lečenje kancera mozga ili metastaza na mozgu. Stoga postoji potreba za BRAF inhibitorima koji imaju veću sposobnost prolaska kroz krvno-moždanu barijeru.

Predmetni pronalazak se odnosi na neočekivano otkriće da je BRAF inhibitor formule (I) snažniji i selektivniji BRAF inhibitor koji pokazuje znatno manje paradoksalnu aktivaciju puta MAPK signalizacije, pri čemu zadržava visoku potentnost. Ovo jedinjenje se stoga može nazvati prekidačem paradoksa ili prekidačem RAF paradoksa, za razliku od jedinjenja koja indukuju RAF paradoks (i koja bi se mogla nazvati induktorima paradoksa ili induktorima RAF paradoksa). Osim što prekida paradoks, jedinjenje formule (I) takođe ima vrlo potentna svojstva prodiranja u mozak, pružajući tako hitno potrebnu alternativnu terapiju za lečenje kancera mozga.

Kratak opis slika:

Slika 1 otkriva krivu inhibicije P-ERK indukovanu primerom 1 u BRAF mutantnoj ćelijskoj liniji A375.

Slika 2 otkriva krivu inhibicije P-ERK indukovanu primerom 2 u BRAF mutantnoj ćelijskoj liniji A375.

Slika 3 otkriva krivu inhibicije P-ERK indukovanu referentnim jedinjenjem AR-25 u BRAF mutantnoj ćelijskoj liniji A375.

Slika 4 otkriva krivu aktivacije P-ERK indukovanu primerom 1 u WT BRAF ćelijskoj liniji HCT-116. Radi poređenja takođe su prikazani podaci dobijeni lečenjem kontrolnim jedinjenjima dabrafenibom (induktor paradoksa) i PLX-8394 (prekidač paradoksa).

Slika 5 otkriva krivu aktivacije P-ERK indukovanu primerom 2 u WT BRAF ćelijskoj liniji HCT-116. Radi poređenja takođe su prikazani podaci dobijeni lečenjem kontrolnim jedinjenjima dabrafenibom (induktor paradoksa) i PLX-8394 (prekidač paradoksa).

Slika 6 otkriva krivu aktivacije P-ERK indukovanu referentnim jedinjenjem AR-25 u WT BRAF ćelijskoj liniji HCT-116. Radi poređenja takođe su prikazani podaci dobijeni lečenjem kontrolnim jedinjenjima dabrafenibom (induktor paradoksa) i PLX-8394 (prekidač paradoksa).

Slika 7 prikazuje paradoksalnu aktivaciju puta MAP kinaze izazvanu BRAF inhibitorima prve generacije. BRAF je deo prvog čvora signalnog puta MAP kinaze, a mutantni BRAF je onkogeni pokretač (levo). U BRAF V600E/K mutiranim tumorima BRAF se signalizira kao monomer, što je stanje u kome je protein inhibiran BRAF inhibitorima prve generacije (sredina). Prva generacija BRAF inhibitora podstiče homodimerizaciju i/ili heterodimerizaciju BRAF WT (gore, desno). U ovom kontekstu protomer koji nije zauzet BRAF inhibitorom dobija konformaciju nepovoljnu za vezivanje inhibitora (sredina, desno). Ishod tretmana BRAF inhibitorom prve generacije, u ovom kontekstu, je paradoksalno povećana aktivacija MAPK i posledični rast tumora u BRAF WT ćelijama (dole, desno).

Slika 8 otkriva da je jedinjenje iz primera 1 pokrenulo antitumorsko delovanje zavisno od doze počev od 1 mg/kg dnevno, što dokazuje potentnu efikasnost posredovanu moždanom propustljivošću.

WO2012/118492 otkriva referentna jedinjenja AR-25 kao primer 25, AR-30 kao primer 30 i AR-31 kao primer 31.

Termin „farmaceutski prihvatljiva so“ odnosi se na one soli jedinjenja formule (I) koje zadržavaju biološku efikasnost i svojstva slobodnih baza ili slobodnih kiselina, koje nisu biološki ili na neki drugi način nepoželjne. Soli se formiraju sa neorganskim kiselinama, kao što je hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, sumporna kiselina, azotna kiselina, fosforna kiselina i slično, posebno hlorovodonična kiselina, i organskim kiselinama, kao što je sirćetna kiselina, propionska kiselina, glikolna kiselina, piruvinska kiselina, oksalna kiselina, maleinska kiselina, malonska kiselina, ćilibarna kiselina, fumarna kiselina, vinska kiselina, limunska kiselina, benzojeva kiselina, cimetna kiselina, bademova kiselina, metansulfonska kiselina, etansulfonska kiselina, p-toluensulfonska kiselina, salicilna kiselina, N-acetilcistein i slično. Pored toga, ove soli mogu biti pripremljene dodavanjem neorganske baze ili organske baze u slobodnu kiselinu. Soli izvedene iz neorganske baze obuhvataju, bez ograničenja, soli natrijuma, kalijuma, litijuma, amonijuma, kalcijuma, magnezijuma i slično. Soli izvedene iz organskih baza obuhvataju, bez ograničenja, soli primarnih, sekundarnih i tercijarnih amina, supstituisane amine, uključujući i supstituisane amine koji se nalaze u prirodi, ciklične amine i bazne jonoizmenjivačke smole, kao što je izopropilamin, trimetilamin, dietilamin, trietilamin, tripropilamin, etanolamin, lizin, arginin, N-etilpiperidin, piperidin, poliiminske smole i slično Specifične farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja formule (I) su soli hlorovodonične kiseline, soli metansulfonske kiseline i soli limunske kiseline.

Jedinjenje formule (I) sadrži jedan asimetrični centar, i može da bude prisutno u obliku optički čistih enantiomera ili smeše enantiomera, kao što su, na primer, racemati.

Prema Kan-Ingold-Prelogovoj konvenciji, asimetrični atom ugljenika može biti konfiguracije "R" ili "S".

Jedno otelotvorenje predmetnog pronalaska takođe je jedinjenje prema formuli (I), kao što je ovde opisano, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, konkretno jedinjenje formule (I), kao što je ovde opisano, preciznije jedinjenje formule (Ia) ili (Ib), kao što je ovde opisano.

Predmetni pronalazak se takođe odnosi na farmaceutski prihvatljivu so jedinjenja formule (I), i pri čemu se farmaceutski prihvatljiva so može izabrati od hidrohlorida, soli metansulfonske kiseline i soli limunske kiseline.

Jedno otelotvorenje predmetnog pronalaska je takođe jedinjenje prema formuli (Ia).

Jedno otelotvorenje predmetnog pronalaska je takođe jedinjenje prema formuli (Ib).

Procesi proizvodnje jedinjenja formule (Ia) i (Ib) kao što su ovde opisani takođe predstavljaju predmet pronalaska.

Priprema jedinjenja formule (I) prema predmetnom pronalasku može se izvesti sekvencijalnim ili konvergentnim sintetičkim putevima. Sinteze iz predmetnog pronalaska prikazane su na sledećoj opštoj šemi. Veštine koje su potrebne za izvođenje reakcija i prečišćavanje dobijenih proizvoda su poznate stručnim licima iz ove oblasti.

Detaljnije, jedinjenje formule (I) se može proizvoditi postupcima datim u nastavku, postupcima datim u primerima ili analognim postupcima. Odgovarajući reakcioni uslovi za pojedine korake reakcije su poznati stručnim licima iz ove oblasti. Reakciona sekvenca nije ograničena na onu koja je prikazana na šemi 1, međutim, u zavisnosti od polaznih supstanci i njihove reaktivnosti, sekvenca reakcionih koraka može da se menja po nahođenju. Polazne supstance su komercijalno dostupne ili se mogu pripremiti postupcima koje su analogne postupcima datim u nastavku, postupcima opisanim u referencama navedenim u opisu ili u primerima, ili postupcima poznatim u struci.

Treba uzeti u obzir da jedinjenje formule (I) iz predmetnog pronalaska može biti derivatizovano na funkcionalnim grupama kako bi se obezbedili derivati koji su sposobni za konverziju nazad u matično jedinjenje in vivo.

Predmetni pronalazak se takođe odnosi na proces za pripremu jedinjenja prema predmetnom pronalasku, koji obuhvata reakciju jedinjenja formule (B1)

sa jedinjenjem formule (B2)

u prisustvu baze.

Reakcija se pogodno može izvesti u rastvaraču. Rastvarač može biti, na primer, DMF. Reakcija se pogodno može izvesti u prisustvu baze. Baza može biti, na primer, cezijum karbonat.

Pogodni uslovi za reakciju mogu biti od oko 30 °C do oko 150 °C, konkretno od oko 50 °C do oko 130 °C, konkretnije od oko 70 °C do oko 120 °C. Pogodni uslovi su oko 100 °C u periodu od oko 1 sata do oko 48 sati, naročito od oko 2 sata do oko 20 sati.

Predmetni pronalazak se takođe odnosi naročito na:

Jedinjenje formule (I) kao što je ovde opisano ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, za upotrebu kao terapeutski aktivna supstanca;

Farmaceutsku kompoziciju koja sadrži jedinjenje formule (I) kao što je ovde opisano ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i terapeutski inertni nosač;

Jedinjenje formule (I) kao što je ovde opisano ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so za upotrebu u lečenju ili profilaksi kancera;

Jedinjenje formule (I) kao što je ovde opisano ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so za upotrebu u lečenju ili profilaksi kancera štitne žlezde, kolorektalnog kancera, kancera mozga, melanoma ili nemikrocelularnog kancera pluća (NSCLC);

Određeno otelotvorenje predmetnog pronalaska odnosi se na jedinjenje formule (I), kao što je ovde opisano, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, za upotrebu u terapeutskom i/ili profilaktičkom lečenju kancera, naročito kancera izazvanog BRAF mutacijom, konkretnije kancera štitne žlezde, kolorektalnog kancera, kancera mozga, melanoma ili NSCLC.

Određeno otelotvorenje predmetnog pronalaska odnosi se na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži jedinjenje formule (I), kao što je ovde opisano, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.

Određeno otelotvorenje predmetnog pronalaska odnosi se na jedinjenje formule (I), kao što je ovde opisano, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, za upotrebu kao lek u terapeutskom i/ili profilaktičkom lečenju pacijenta sa kancerom izazvanim mutacijom BRAF, naročito sa kancerom štitne žlezde, kolorektalnim kancerom, kancerom mozga, melanomom ili NSCLC, što obuhvata određivanje statusa mutacije BRAF kod pomenutog pacijenta i zatim primenu jedinjenja formule (I) kao što je ovde opisano ili njegove farmaceutski prihvatljive soli na pomenutom pacijentu.

Određeno otelotvorenje predmetnog pronalaska odnosi se na jedinjenje formule (I) kao što je ovde opisano ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, za upotrebu kao leka u terapeutskom i/ili profilaktičkom lečenju metastaza na mozgu.

Nadalje, predmetni pronalazak obuhvata sve supstituente u njihovom odgovarajućem deuterisanom obliku, gde god je primenljivo, jedinjenja formule (I).

Nadalje, predmetni pronalazak obuhvata sve supstituente u njihovom odgovarajućem tricijumskom obliku, gde god je primenljivo, jedinjenja formule (I).

Određeno otelotvorenje predmetnog pronalaska odnosi se na jedinjenje formule (I), kao što je ovde opisano, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, pri čemu najmanje jedan supstituent sadrži najmanje jedan radioizotop. Konkretni primeri radioizotopa su<2>H,<3>H,<13>C,<14>C i<18>F.

Osim toga, predmetni pronalazak obuhvata sve optičke izomere, npr. dijastereoizomere, dijastereomerne smeše, racemske smeše, sve njihove povezane enantiomere i/ili tautomere, kao i njihove solvate, gde god je primenljivo, jedinjenja formule (I).

Po želji, racemske smeše jedinjenja iz predmetnog pronalaska se mogu razdvojiti tako da se izoluju pojedinačni enantiomeri. Separacija se izvodi pomoću postupaka poznatih u struci, kao što je kuplovanje racemske smeše jedinjenja sa enantiomerno čistim jedinjenjem da bi se dobila dijastereomerna smeša, nakon čega sledi separacija pojedinačnih dijastereomera pomoću standardnih postupaka, kao što je frakciona kristalizacija ili hromatografija.

U otelotvorenjima u kojima je obezbeđen optički čist enantiomer, optički čist enantiomer znači da jedinjenje sadrži > 90% masenih željenog izomera, naročito > 95% mas. željenog izomera, ili konkretnije > 99% mas. željenog izomera, pri čemu se pomenuti maseni procenat zasniva na ukupnoj masi izomera jedinjenja. Hiralno čisto ili hiralno obogaćeno jedinjenje se može pripremiti hiralno selektivnom sintezom ili razdvajanjem enantiomera. Razdvajanje enantiomera se može izvršiti na finalnom proizvodu ili alternativno na odgovarajućem međuproizvodu.

Drugo otelotvorenje predmetnog pronalaska obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju ili lek koji sadrži jedinjenje iz predmetnog pronalaska i terapeutski inertan nosač, razblaživač ili ekscipijens, kao i postupak za korišćenje jedinjenja iz predmetnog pronalaska za pripremu takve kompozicije i leka. U jednom primeru, jedinjenje formule (I) se može formulisati mešanjem na temperaturi okoline pri odgovarajućoj pH vrednosti i pri željenom stepenu čistoće sa fiziološki prihvatljivim nosačima, tj. nosačima koji nisu toksični za primaoce u dozi i koncentraciji primenjenoj u vidu galenskog preparata za primenu. pH vrednost formulacije zavisi uglavnom od konkretne upotrebe i koncentracije jedinjenja, ali se poželjno nalazi u opsegu od oko 3 do oko 8. U jednom primeru, jedinjenje formule (I) je formulisano u acetatnom puferu, na pH 5. U drugom otelotvorenju, jedinjenje formule (I) je sterilno. Jedinjenje može da se čuva, na primer, kao čvrsta ili amorfna kompozicija, kao liofilizovana formulacija ili kao vodeni rastvor.

Kompozicije se formulišu, doziraju i primenjuju na način koji je u skladu sa dobrom medicinskom praksom. U ovom kontekstu se mogu razmatrati faktori kao što su konkretni poremećaj koji se leči, konkretni sisar koji se leči, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzrok poremećaja, mesto isporuke agensa, postupak primene, raspored primene, i drugi faktori poznati lekarima.

Procedure testova

Materijali

DMEM medijum bez fenol crvenog sa dodatkom L-glutamina kupljen je od kompanije (Thermo Fisher Scientific). Fetalni goveđi serum (FBS) kupljen je od kompanije VWR. Advanced ERK phospho-T202 /Y204 komplet - 10.000 testova je kupljen od kompanije Cisbio, kat. br. 64AERPEH. Ćelije A375 i HCT116 su prvobitno nabavljene od organizacije ATCC i sačuvane u Roche repozitorijumu. Mikrotitarske ploče sa 384 bunarčića su kupljene od kompanije Greiner Bio-One, sa 384 bunarčića, (sa poklopcem, HiBase, mala zapremina, kat. br.784-080).

HTRF test za određivanje P-ERK u ćelijama A375 ili HCT116

A375 je ćelijski model kancera koji eksprimira V600E mutirani BRAF, a HCT116 je ćelijski model kancera koji eksprimira WT BRAF. Prva generacija BRAF inhibitora, kao što je npr. dabrafenib, indukuje paradoksalni efekat na tumorske ćelije tako što inhibira rast V600E mutiranih BRAF ćelija (kao što je npr. A375), pošto aktiviraju rast u WT BRAF ćelijama (kao što je npr. HCT 116). ERK 1,2 fosforilacija (terminalni član kaskade fosforilacije MAPK puta) dalje se navodi kao glavno očitavanje statusa aktivacije MAPK puta. Pre testa, ćelijske linije A375 i HCT116 su održavane na DMEM medijumu bez fenol crvenog sa dodatkom 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS). Nakon tretmana jedinjenjem, nivoi P-ERK su određeni merenjem FRET fluorescentnog signala koji se indukuje selektivnim vezivanjem 2 antitela koja su obezbeđena u pomenutom kompletu (Cisbio kat. br. 64AERPEH) za ERK protein kada je fosforilovan na Thr202/Tyr204. Ukratko, 8000 ćelija/bunarčiću u 12 µl medijuma/bunarčiću je pzasejano na ploču sa 384 bunarčića i ostavljeno preko noći u inkubatoru (na 37 °C u vlažnoj atmosferi sa 5% CO2). Ploča je sutradan u duplikatu tretirana ispitivanim jedinjenjima, dabrafenibom i PLX8394 (poslednja dva kao kontrole) sa sledećim konačnim koncentracijama leka: 10 µМ-3 µМ-1 µМ-0,3 µМ-0,1 µМ-0,03 µМ-0,01 µМ-0,003 µМ-0,001 µМ, svi bunarčići su podvrgnuti normalizaciji sa DMSO i inkubacija leka je trajala 1 sat. Zatim je u bunarčiće dodato 4 µl pufera za lizu 4X koji se isporučuje sa kompletom, ploča je zatim centrifugirana tokom 30 sekundi (300 ref) i inkubirana na tresilici za ploče tokom 1 h na sobnoj temperaturi.

Na kraju inkubacije, u ispitivane bunarčiće je dodato 4 µl/bunarčiću usavršenog rastvora P-ERK antitela (pripremljenog prema uputstvu proizvođača), a zatim 4 µl/mbunarčiću kriptatnog rastvora P-ERK antitela (pripremljenog prema uputstvu proizvođača) (Cisbio kat. br. 64AERPEH).

Da bi se omogućila pravilna normalizacija podataka, kontrolni bunarčići koji nisu tretirani lekovima navedeni u sledećoj tabeli uvek su uključeni u svaku ploču (prema uputstvu proizvođača):

p-ERK HTRF kompozicija bunarčića (µl):

Mikrotitarska ploča je zatim centrifugirana na 300 rcf tokom 30 sekundi, zaptivena da bi se sprečilo isparavanje i inkubirana preko noći u mraku na sobnoj temperaturi.

Mikrotitarska ploča je zatim analizirana, a vrednost emisije fluorescencije je prikupljena pomoću aparata Pherastast FSX (BMG Labtech) na 665 i 620 nM.

Dobijene vrednosti fluorescencije su obrađene prema formuli odnos=signal(620 nm)/signal(625 nm)* 10.000, a zatim je od svih vrednosti oduzeta prosečna vrednost odnosa na slepoj probi.

Podaci su normalizovani u slučaju ćelija A375 (BRAF inhibicija) uzimajući prosečnu vrednost odnosa (nakon oduzimanja slepe probe) dobijenog od ćelija tretiranih samo DMSO-om kao 100% i uzimajući prosečnu vrednost odnosa (nakon oduzimanja slepe probe) dobijen od ćelija tretiranih 10 µM dabrafenibom kao 0%. Srednja vrednost normalizovanih tačaka je uklopljena u sigmoidalnu krivu i određen je IC50. Rezultati su prikazani u tabelama 1-2 i na slikama 1-3.

Podaci su normalizovani u slučaju ćelija HCT116 (BRAF aktivacija) uzimajući prosečnu vrednost odnosa (nakon oduzimanja slepe probenakon oduzimanja slepe probe) dobijenog od ćelija tretiranih samo DMSO-om kao 0% i uzimajući prosečnu vrednost odnosa () dobijenog od ćelija tretiranih dabrafenibom u koncentraciji koja daje najveći signal kao 100%. Pojedinačne tačke su uklopljene u sigmoidalnu ili zvonastu krivu i određen je procenat aktivacije u poređenju sa maksimalnom aktivacijom posredovanom dabrafenibom. EC50 je koncentracija pri kojoj se postiže aktivacija jednaka 50% maksimuma postignutog dabrafenibom. Rezultati su prikazani u tabeli 2 i na slikama 4-6.

U slučaju da aktivacija ne dostigne 50% maksimuma postignutog dabrafenibom, tada izračunavanje EC50 nije primenljivo.

Procenat maksimalnog efekta indukovanja paradoksa putem dabrafeniba određen je procenom procenta pri kome testirano jedinjenje indukuje svoj maksimalni P-ERK signal kao procenat najvišeg signala koji proizvodi dabrafenib u okviru testiranog doznog opsega.

Tabela 1: Primer 1 i Primer 2 imaju veliki afinitet prema RAF kinazama i visoku selektivnost u odnosu na C-terminalnu Src kinazu (CSK) i limfocitno-specifičnu tirozin protein kinazu (LCK), u poređenju sa AR-30 i AR-31.

Tabela 2: Primer 1 i primer 2 prekidaju paradoksalnu RAF aktivaciju u ćelijama kancera HCT-116 koje eksprimiraju WT BRAF. U poređenju sa dabrafenibom ili sa AR-25, maksimalni efekat indukovanja paradoksa smanjen je na manje od 50%.

Merenje CSF Kp,uuza procenu potencijala prolaska u mozak

CSF Kp,uupredstavlja odnos koncentracije u cerebrospinalnoj tečnosti (CSF): izloženost nevezanoj plazmi dok vrednosti Kp,uu≥1 ukazuju na dobar prolazak u mozak. Za jedinjenje iz primera 1, studije pojedinačnih oralnih doza na miševima i pacovima, sekvencijalne koncentracije u plazmi i likvoru (do 24 sata nakon doze) izmerene su pomoću LC-MS/MS radi izračunavanja Kp,uulikvora. Za studije višestrukih oralnih doza na pacovima i patuljastim svinjama, koncentracije u plazmi i likvoru približne Tmax (3 h nakon poslednje doze) izmerene su pomoću LC-MS/MS i korišćene za izračunavanje Kp,uulikvora

Ćelijska linija LLC-PK1 transficirana sa MDR1, procenjena u prisustvu/odsustvu P-gp inhibitora

Tabela 3: Fizičko-hemijska i ADME svojstva jedinjenja iz primera 1. Vrednosti CSF Kp,uu≥1 ukazuju na dobar prolazak u mozak za primer 1. Pored toga, vremenski odnos plazme i CSF je procenjen do 24 h nakon doze u farmakokinetičkoj (PK) studiji pojedinačne doze na pacovima i ukazao je na brzu i ekstenzivnu distribuciju u CSF.

Intrakranijalno implantirani A375-Luc

Ćelije kancera A375 BRAF V600E koje konstitutivno eksprimiraju luciferazu injektovane su intrakranijalno u imunokompromitovane miševe. Lečenje jedinjenjem iz primera 1 je započeto 7. dana od intrakranijalne injekcije i nastavljeno tokom 2 nedelje. Različite grupe su podvrgnute dnevnoj oralnoj primeni doze od 1 mg/kg, 5 mg/kg, odnosno 20 mg/kg primera 1. Rezultati su prikazani na slici 8.

Jedinjenje formule (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so mogu da se koriste kao lek (npr. u obliku farmaceutskog preparata). Farmaceutski preparat se može primenjivati interno, na primer oralno (npr. u obliku tableta, obloženih tableta, dražeja, tvrdih i mekih želatinskih kapsula, rastvora, emulzija ili suspenzija), nazalno (npr. u obliku nazalnih sprejeva), rektalno (npr. u obliku supozitorija) ili lokalno za oči (npr. u obliku rastvora, masti, gela ili polimernih umetaka rastvorljivih u vodi). Međutim, primena se takođe može izvršiti parenteralno, a primer intramuskularno, intravenozno ili intraokularno (npr. u obliku sterilnih rastvora za injekciju).

Jedinjenje formule (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so mogu se obrađivati sa farmaceutski inertnim, neorganskim ili organskim adjuvansima za proizvodnju tableta, obloženih tableta, dražeja, tvrdih želatinskih kapsula, injekcionih rastvora ili topikalnih formulacija. Laktoza, kukuruzni skrob ili njegovi derivati, talk, stearinska kiselina ili njene soli itd. mogu se koristiti, na primer, kao takvi adjuvansi za tablete, dražeje i tvrde želatinske kapsule.

Odgovarajući adjuvansi za meke želatinske kapsule su, na primer, biljna ulja, voskovi, masti, polučvrste supstance i tečni polioli itd.

Pogodni adjuvansi za proizvodnju rastvora i sirupa su, na primer, voda, polioli, saharoza, invertni šećer, glukoza i slično.

Pogodni adjuvansi za injekcione rastvore su, na primer, voda, alkoholi, polioli, glicerol, biljna ulja, i slično.

Pogodni adjuvansi za čepiće su, na primer, prirodna ili otvrdnuta ulja, voskovi, masti, polučvrsti ili tečni polioli, i slično.

Pogodni adjuvansi za aktuelne očne formulacije su, na primer, ciklodekstrini, manitol ili mnogi drugi nosači i ekscipijensi poznati u struci.

Pored toga, farmaceutski preparati mogu da sadrže konzervanse, solubilizatore, supstance koje povećavaju viskoznost, stabilizatore, agense za kvašenje, emulgatore, zaslađivače, boje, arome, soli za izmenu osmotskog pritiska, pufere, agense za maskiranje ili antioksidanse. Oni mogu da sadrže i druge terapeutski korisne supstance.

Doze mogu da variraju u širokom opsegu i biće, naravno, prilagođene individualnim potrebama u svakom posebnom slučaju. Generalno, u slučaju oralne primene dnevne doze od oko 0,1 mg do 20 mg po kilogramu telesne težine, poželjno od oko 0,5 mg do 4 mg po kilogramu telesne težine (npr. oko 300 mg po osobi), poželjno podeljeno u 1-3 pojedinačne doze, koje mogu da se sastoje od, na primer, jednakih količina, ako je to odgovarajuće. U slučaju topikalne primene, formulacija može da sadrži 0,001% do 15% masenih leka i potrebnu dozu, koja može biti od 0,1 do 25 mg i može se primenjivati bilo kao jedna doza dnevno ili nedeljno, ili višestruke doze (2 do 4) dnevno, ili višestruke doze nedeljno. Tada će, međutim, biti jasno da ovde data gornja ili donja granica može biti prekoračena kada se pokaže da za to postoje indikacije.

Farmaceutske kompozicije

Jedinjenje formule (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so može da se koristi kao terapeutski aktivna supstanca, npr. u obliku farmaceutskog preparata. Ovaj farmaceutski preparat se može primenjivati oralno, npr. u obliku tableta, obloženih tableta, dražeja, tvrdih i mekih želatinskih kapsula, rastvora, emulzija ili suspenzija. Međutim, primena može da se obavlja i rektalno, npr. u obliku supozitorija ili parenteralno, npr. u obliku injekcionih rastvora.

Jedinjenje formule (I) i njegova farmaceutski prihvatljiva so mogu se prerađivati sa farmaceutski inertnim, neorganskim ili organskim nosačima u proizvodnji farmaceutskog preparata. Laktoza, kukuruzni skrob ili njiegovi derivati, talk, stearinska kiselina ili njene soli i slično mogu se koristiti, na primer, kao nosači za tablete, obložene tablete, dražeje i tvrde želatinske kapsule. Odgovarajući nosači lekovitih supstanci za meke želatinske kapsule su, na primer, biljna ulja, voskovi, masti, polučvrsti i tečni polioli i slično. Međutim, u zavisnosti od prirode aktivnih supstanci, u slučaju mekih želatinskih kapsula obično nisu potrebni nosači. Pogodni nosači za proizvodnju rastvora i sirupa su, na primer, voda, polioli, glicerol, biljna ulja i slično. Odgovarajući nosači supozitorija su, na primer, prirodna ili čvrsta ulja, voskovi, masti, polučvrsti ili tečni polioli i slično.

Pored toga, farmaceutski preparat može da sadrži farmaceutski prihvatljive pomoćne supstance, kao što su konzervansi, solubilizatori, stabilizatori, sredstva za kvašenje, emulgatori, zaslađivači, boje, arome, soli za izmenu osmotskog pritiska, puferi, agensi za maskiranje ili antioksidansi. Oni mogu da sadrže i druge terapeutski korisne supstance.

Medikamenti koji sadrže jedinjenje formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i terapeutski inertan nosač takođe su obuhvaćeni predmetnim pronalaskom, kao i proces njihove proizvodnje, koji se sastoji od uvođenja jednog ili više jedinjenja formule (I) i/ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, kao i, po želji, jedne ili više terapeutski vrednih supstanci, u oblik za galensku primenu zajedno sa jednim ili više terapeutski inertnih nosača.

Doza može da varira u širokim granicama, te se svakako prilagođava individualnim potrebama u svakom pojedinačnom slučaju. U slučaju oralne primene, doza za odrasle osobe može da varira od oko 0,01 mg do oko 1000 mg po danu jedinjenja opšte formule (I) ili odgovarajuće količine njegove farmaceutski prihvatljive soli. Dnevna doza može da se daje u jednoj dozi ili podeljenim dozama i, takođe, gornja granica može da se premaši ako se utvrdi da za to postoje indikacije.

Niženavedeni primeri predstavljaju predmetni pronalazak bez ograničenja, ali služe isključivo kao primer. Farmaceutski preparati obično sadrže oko 1-500 mg, konkretno 1-100 mg, jedinjenja fomule (I). Primeri kompozicija prema predmetnom pronalasku su:

Primer A

Tablete sledeće kompozicije se proizvode na uobičajeni način:

Tabela 4: moguća kompozicija tableta

Proizvodni postupak

1. Izmešati sastojke 1, 2, 3 i 4 i granulisati sa prečišćenom vodom.

2. Osušiti granule na 50 °C.

3. Propustiti granule kroz odgovarajuću opremu za mlevenje.

4. Dodati sastojak 5 i mešati tri minuta; komprimovati odgovarajućom presom.

Primer B-1

Kapsule sledeće kompozicije se proizvode:

Tabela 5: moguća kompozicija sastojaka kapsula

Proizvodni postupak

1. Mešati sastojke 1, 2 i 3 u odgovarajućem aparatu za mešanje 30 minuta.

2. Dodati sastojke 4 i 5, pa mešati 3 minuta.

3. Napuniti odgovarajuće kapsule.

Jedinjenje formule (I), laktoza i kukuruzni skrob se prvo mešaju u aparatu za mešanje, a zatim se prebacuju u mašinu za usitnjavanje. Smeša se vraća u aparat za mešanje; dodaje se talk i temeljito meša. Smeša se mašinski ubacuje u odgovarajuće kapsule, npr. tvrde želatinske kapsule.

Primer B-2

Meke želatinske kapsule sledeće kompozicije se proizvode:

Tabela 6: moguća kompozicija sastojaka meke želatinske kapsula

Tabela 7: moguća kompozicija sastojaka meke želatinske kapsula

Proizvodni postupak

Jedinjenje formule (I) se rastvara u toplom rastvoru drugih sastojaka, pa se smešom pune meke želatinske kapsule odgovarajuće veličine. Punjene meke želatinske kapsule se tretiraju u skladu sa uobičajenim procedurama.

Primer C

Supozitorije sledeće kompozicije se proizvode:

Tabela 8: moguća kompozicija supozitorije

Proizvodni postupak

Sadržaj supozitorije se topi u staklenoj ili čeličnoj posudi, temeljno se meša, pa se hladi na 45 °C. Nakon toga, u to se dodaje fino sprašeno jedinjenje formule (I), i meša dok se potpuno ne disperguje. Smeša se sipa u kalupe za supozitorije odgovarajuće veličine, ostavlja se da se hladi; supozitorije se zatim vade iz kalupa i pojedinačno pakuju u voštani papir ili metalnu foliju.

Primer D

Injekcioni rastvori sledeće kompozicije se proizvode:

Tabela 9: moguća kompozicija injekcionog rastvora

Proizvodni postupak

Jedinjenje formule (I) se rastvara u smeši polietilen glikola 400 i (dela) vode za injekcije. pH se podešava na 5,0 dodavanjem sirćetne kiseline. Zapremina se podešava na 1,0 ml dodavanjem preostale količine vode. Rastvor se filtrira, puni u bočice uz potrebni višak, i sterilizuje.

Primer E

Kesice sledeće kompozicije se proizvode:

Tabela 10: moguća kompozicija kesice

Proizvodni postupak

Jedinjenje formule (I) se meša sa laktozom, mikrokristalnom celulozom i natrijum karboksimetil celulozom, pa se granulira sa smešom polivinilpirolidona u vodi. Granulat se meša sa magnezijum stearatom i aromama, pa se puni u kesice.

Primeri

Skraćenice

DCM = dihlormetan; DMF = dimetilformamid; DMSO = dimetil sulfoksid; DRF = pronalaženje opsega doze; ESI = elektrosprej jonizacija; EtOAc = etil acetat; LC-MS/MS = tečna hromatografija-maseno/masena spektrometrija; MeOH = metanol; MS = masena spektrometrija; rt = sobna temperatura; P-gp = P-glikoprotein; SFC = SFC = superkritična fluidna hromatografija.

Referentna jedinjenja AR-25, AR-30 i AR-31 su pripremljena prema sintezi otkrivenoj u WO2012/118492 u primeru 25, primeru 30, odnosno primeru 31.

6-hidroksi-3-metil-hinazolin-4-on

2-amino-5-hidroksibenzojeva kiselina (10 g, 65,3 mmol, ekv: 1,0) i N-metilformamid (30 g, 29,9 ml, 503 mmol, ekv: 7,7) zagrevani su na 145 °C tokom 21 h 45 min, a zatim ohlađeni na sobnu temperaturu. Reakciona smeša je razblažena sa 50 ml H2O i mešana 20 min na sobnoj temperaturi. Dobijeni talog je sakupljen filtracijom. Svetlosmeđa čvrsta supstanca je isprana 3 x sa 20 ml vode. Čvrsta supstanca je preneta u toluen i uparena do suva (3 x). Čvrsta supstanca je osušena pod vakuumom na 40 °C preko noći pod visokim vakuumom dajući naslovno jedinjenje u obliku svetlosmeđe čvrste supstance (10,3 g, prinos 89%). MS (ESI) m/z: 177,1 [M+H]<+>.

3,6-difluor-2-(3-metil-4-okso-hinazolin-6-il)oksi-benzonitril

Cezijum karbonat (3,22 g, 9,79 mmol, ekv: 1,15) dodat je na sobnoj temperaturi u rastvor 6-hidroksi-3-metilhinazolin-4-ona (1500 mg, 8,51 mmol, ekv: 1,0) u N,N-dimetilformamidu (35 ml). Smeša je mešana 30 min. na sobnoj temperaturi, a zatim je dodat 2,3,6-trifluorbenzonitril (1,47 g, 1,08 ml, 9,37 mmol, ekv: 1,1). Nakon 1 h, reakcija je ohlađena na ledu i razblažena vodom (120 ml). Dobijena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom, isprana ledenom vodom (100 ml) i heptanom (100 ml) i osušena usisavanjem. Čvrsta supstanca je preneta u toluen i uparena do suva (3 x), a zatim osušena preko noći pod vakuumom dajući naslovno jedinjenje u obliku svetlosmeđe čvrste supstance (2,58 g, prinos 97%). MS (ESI) m/z: 314,1 [M+H]<+>.

(3R)3-fluorpirolidin-1-sulfonamid

(R)-3-fluorpirolidin hidrohlorid (1,8 g, 14,3 mmol, ekv: 1,2) dodat je u rastvor sumpor diamida (1,148 g, 11,9 mmol, ekv: 1,0) i trietilamina (2,42 g, 3,33 ml, 23,9 mmol, ekv: 2) u dioksanu (10 ml). Reakcija je mešana u zaptivenoj epruveti na 115 °C tokom 15,5 h, a zatim ohlađena na sobnu temperaturu i koncentrovana pod vakuumom. Ostatak je razblažen DCM-om, uparen sa silika gelom do suva i prebačen na kolonu. Prečišćavanje fleš hromatografijom (40 g silicijum dioksida, 80% EtOAc) dalo je naslovno jedinjenje u obliku bele kristalne čvrste supstance (1,82 g, prinos 91%). MS (ESI) m/z: 169,1 [M+H]<+>.

(3S)-3-fluorpirolidin-1-sulfonamid

Trietilamin (304 mg, 419 µl, 3,01 mmol, ekv: 2,0) dodat je u rastvor sumpor diamida (146 mg, 1,5 mmol, ekv: 1,0) i (S)-3-fluorpirolidin hidrohlorida (234 mg, 1,8 mmol, ekv: 1,2) u dioksanu (1,3 ml). Reakcija je mešana u zaptivenoj epruveti na 115 °C tokom 16 h i 35 min, a zatim koncentrovana pod vakuumom. Ostatak je razblažen pomoću MeOH i uparen sa silika gelom do suva i prebačen na kolonu. Prečišćavanje fleš hromatografijom (40 g silicijum dioksida, 0-8% MeOH/DCM) dalo je naslovno jedinjenje u obliku svetložute čvrste supstance (193 mg, prinos 75%). MS (ESI) m/z: 169,1 [M+H]<+>.

(3R)-N-[2-cijano-4-fluor-3-(3-metil-4-okso-hinazolin-6-il)oksi-fenil]-3-fluorpirolidin-1-sulfonamid (Primer 1)

(R)-3-fluorpirolidin-1-sulfonamid (1,26 g, 7,51 mmol, ekv: 2,1) i cezijum karbonat (2,56 g, 7,87 mmol, ekv: 2,2) suspendovani su u suvom DMF-u (10,2 ml) pod atmosferom argona. Reakcija je mešana na 50 °C tokom 30 min. Reakciona smeša je ohlađena na sobnu temperaturu i dodat je rastvor 3,6-difluor-2-((3-metil-4-okso-3,4-dihidrohinazolin-6-il)oksi)benzonitrila (1,12 g, 3,58 mmol, ekv: 1,0) u DMF-u (25,5 ml). Reakciona smeša je mešana na 100 °C tokom 15 h, a zatim koncentrovana pod vakuumom. Ostatak je stavljen u zas. vod. rastvor NH4Cl (100 ml) i EtOAc (100 ml). Faze su odvojene, i vodeni sloj je dalje ekstrahovan pomoću 2 x 100 ml EtOAc. Kombinovani organski slojevi su isprani vodom (200 ml) i slanim rastvorom (200 ml), osušeni (Na2SO4), filtrirani i koncentrovani pod vakuumom. Vodeni sloj je zatim ponovo ekstrahovan pomoću EtOAc (3 x 100 ml). Kombinovani organski ekstrakti su isprani slanim rastvorom (200 ml), osušeni (Na2SO4), filtrirani i koncentrovani pod vakuumom. Ostatak je razblažen pomoću DCM i MeOH i koncentrovan na silicijum dioksidu. Prečišćavanje fleš hromatografijom (120 g, 0,5-2% MeOH/DCM) dalo je beličastu čvrstu supstancu koja je triturirana sa heptanom/DCM-om u razmeri 1:1 (20 ml) uz sonifikaciju, zatim osušena pod vakuumom dajući naslovno jedinjenje u obliku bezbojne čvrste supstance (1,087 g, prinos 66%). MS (ESI) m/z: 426,2 [M+H]<+>. Hiralna SFC: RT = 4,594 min [Chiralpak IC kolona, 4,6 x 250 mm, veličina čestica 5 µm (Daicel); gradijent 20 - 40% MeOH koji sadrži 0,2% NHEt2tokom 8 min; protok: 2,5 ml/min; povratni pritisak 140 bar].

(3S)-N-[2-cijano-4-fluor-3-(3-metil-4-okso-hinazolin-6-il)oksi-fenil]-3-fluorpirolidin-1-sulfonamid (Primer 2)

(S)-3-fluorpirolidin-1-sulfonamid (181 mg, 1,08 mmol, ekv: 2,1) je rastvoren u DMF-u (1,6 ml). Na sobnoj temperaturi, dodat je cezijum karbonat (368 mg, 1,13 mmol, ekv: 2,2) i reakciona smeša je mešana na 50 °C tokom 30 min. Reakciona smeša je ohlađena na sobnu temperaturu i dodat je rastvor 3,6-difluor-2-((3-metil-4-okso-3,4-dihidrohinazolin-6-il)oksi)benzonitrila (160,8 mg, 513 µmol, ekv: 1,0) u DMF-u (4 ml). Reakciona smeša je mešana na 105 °C tokom 2 h i 50 min, a zatim koncentrovana pod vakuumom. Ostatak je prenet u DCM i ispran zas. vod. rastvorom NH4Cl. Vodeni sloj je dva puta ekstrahovan pomoću DCM. Spojeni organski slojevi su osušeni iznad Na2SO4, filtrirani i upareni. Ostatak (smeđe ulje) razblažen je pomoću DCM i prebačen na kolonu. Prečišćavanje fleš hromatografijom (80 g, 0-100% EtOAc u DCM-u) dalo je čvrstu supstancu koja je dalje prečišćena pomoću SFC dajući naslovno jedinjenje u obliku svetložute čvrste supstance (119 mg, prinos 50%). MS (ESI) m/z: 426,2 [M+H]<+>. Hiralna SFC: RT = 4,411 min [Chiralpak IC kolona, 4,6 x 250 mm, veličina čestica 5 µm (Daicel); gradijent 20 - 40% MeOH koji sadrži 0,2% NHEt2tokom 8 min; protok: 2,5 ml/min; povratni pritisak 140 bar].

Claims (9)

1. PATENTNI ZAHTEVI 1. Jedinjenje formule (I)

   ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.
2. 2. Jedinjenje prema zahtevu 1, pri čemu, jedinjenje je jedinjenje formule (I).
3. 3. Jedinjenje prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu, jedinjenje je jedinjenje formule (Ia).
4. 4. Jedinjenje prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu, jedinjenje je jedinjenje formule (Ib).
5. 5. Postupak za pripremu jedinjenja prema bilo kom od zahteva 1 do 4, koji uključuje reakciju jedinjenja formule (B1)

   (B2) u prisustvu baze.
6. 6. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1 do 4 za upotrebu u vidu terapeutski aktivne supstance.
7. 7. Farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1 do 4 i terapeutski inertan nosač.
8. 8. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1 do 4 za upotrebu u lečenju ili profilaksi kancera.
9. 9. Jedinjenje za upotrebu prema zahtevu 8, pri čemu, kancer je kancer štitne žlezde, kolorektalni kancer, kancer mozga, melanom ili nemikrocelularni kancer.