RS65522B1 - Brzi postupci za pripremu ekstrakata žitarica - Google Patents

Description

Opis

Oblast tehnike

[0001] Ovo otkriće se generalno odnosi na klijanje i pripremu vodenih ekstrakata žitarica (npr. pripremljenih ukomljavanjem), uključujući postupke koji se koriste za proizvodnju piva. Otkriće stoga obezbeđuje postupke za brzo klijanje i pripremu vodenih ekstrakata žitarica i postupke za proizvodnju napitka, koji obuhvataju brzo klijanje i pripremu vodenih ekstrakata žitarica. Postupci značajno ubrzavaju postupak pripremanja sladovine za proizvodnju napitaka na bazi žitarica, uz istovremeno očuvanje potencijala za pripremu pomenute sladovine sa visokim nivoima fermentabilnih šećera, poželjno sa niskim nivoima β-glukana i ksilana.

Osnov pronalaska

[0002] U komercijalnim postupcima sladovanja, zrna ječma se podvrgavaju klijanju, odnosno sladovanju, pod kontrolisanim uslovima koji omogućavaju delimičnu mobilizaciju skroba i proteinskih rezervi skrobnog endosperma u periodu od 4-6 dana. Postupak sladovanja obično se inicira potapanjem suvog ječmenog zrna u vodu. Ovaj postupak je poznat kao močenje, čiji cilj nije samo čišćenje zrna, već i povećanje njegove vlažnosti na oko 40-45% (tež./tež.) kako bi se naredni korak mobilizacije endosperma brže odvijao. Tokom močenja, voda se jednom ispušta kako bi se omogućila ponovna aeracija zrna. Ovaj korak je poznat kao „odležavanje na vazduhu“ i smatra se neophodnim, prvenstveno zato što potopljeno zrno ostaje bez kiseonika nakon oko 16 h. Nakon 8 h „odležavanja na vazduhu“, zrno se ponovo potapa u vodu da bi se završio tretman močenja tokom još jednog perioda od 8 h - ili u nizu koraka ponovnog močenja. Postupak močenja u dva koraka za povećanje količine vlažnosti u suvom zrnu na 40%, ili više, traje ukupno oko 32 h. U nekim sladarama koriste se tehnike močenja prskanjem.

[0003] Namočeno zrno se širi pri klijanju, tokom kojeg enzimi izlučeni iz aleurona i epitelnih ćelija skuteluma - zajedno sa nekim koji već postoje u ćelijama skrobnog endosperma - razgrađuju ćelijske zidove, skrob i proteine. U normalnim uslovima klijanja, veruje se da se fitohormon giberelinska kiselina (GA) sintetiše u nodalnom regionu, ili negde drugde u embrionu, odakle difunduje duž gradijenta vode (Fincher, 2011).

[0004] Proizvođač slada obično ima za cilj da brzo indukuje sintezu što većeg broja enzima koji razgrađuju skrob u zrnu. U mnogim komercijalnim programima sladovanja, GA se dodaje kako bi se ubrzao proces lučenja enzima iz aleuronskog sloja. Enzimi koji razgrađuju skrob – koji uključuju α- i β-amilaze, enzime za razlaganje grana skroba i α-glukozidaze – delimično depolimerizuju rezerve skroba u zrnu do monosaharida, oligosaharida i glukoze (Smith et al., 2005; kada su u pitanju pomenute β-amilaze, primetno je da se one deponuju u skrobnom endospermu tokom razvoja zrna). Ćelije kvasca zatim koriste proizvode depolimerizacije skroba kao izvor ugljenika i fermentišu ih u pivski etanol. Dijastatska snaga je parametar kvaliteta sladovanja koji se odnosi na nivoe aktivnosti baterije enzima koji razgrađuju skrob, sa visokim vrednostima poželjnim za pravljenje piva.

[0005] Sledeće glavne komponente zrna ječma uključuju uskladištene proteine, koji se takođe nalaze u mrtvim ćelijama skrobnog endosperma i uključuju hordeine, kao i proteine rastvorljive u vodi i soli. Njihova depolimerizacija takođe počinje prirodno u postupku sladovanja, ali proizvođač piva može da upravlja stepenom razgradnje ovih proteina, kako bi se oslobodila dovoljna količina peptida i aminokiselina da se podrži rast kvasca tokom sledećeg koraka klijanja u pivari. Međutim, ako se razgradnja uskladištenih proteina odvija u prevelikoj meri, oslobođeni proteini mogu da stvore poteškoće u postupku proizvodnje piva. Konkretno, rastvorljivi protein oslobođen u velikim količinama može da se taloži i formira nepoželjno zamućenje u finalnom pivskom proizvodu, ili da poveća potencijal za stvaranje Streckerovih aldehida tokom skladištenja piva. U specifikacijama kvaliteta slada, adekvatan nivo slobodnog amino azota (FAN) je poželjan za rast kvasca tokom fermentacije. Kolbachov broj je mera odnosa rastvorljivih i ukupnih proteina, pri čemu je generalno poželjan slad koji ima adekvatan Kolbachov broj. Stepen razgradnje proteina je stoga stalni izazov za proizvođače slada. Pored problema sa taloženjem piva koji može da bude povezan sa prekomernim ekstrahovanim proteinima, veoma visoki nivoi FAN takođe mogu dovesti do poteškoća, zbog mogućnosti stvaranja neprijatnog ukusa.

[0006] Proizvođači slada takođe pokušavaju da indukuju visoke nivoe enzima koji razgrađuju polisaharide ćelijskog zida u zrnu ječma, posebno (1,3;1,4)-β-glukane i arabinoksilane. Nepotpuno razgrađeni (1,3;1,4)-β-glukani mogu da budu posebno problematični za proizvođače piva, jer se mogu ekstrahovati iz slada u rastvorljivim oblicima koji formiraju visoko viskozne vodene rastvore koji usporavaju postupke filtracije u pivari i doprinose neželjenoj zamućenosti finalnog piva. Dakle, niski nivoi rastvorljivog (1,3;1,4)-β-glukana predstavljaju važan parametar kvaliteta sladovanja, dok visoki nivoi enzima (1,3;1,4)-β-glukanaze ostaju značajna mera kvaliteta slada.

[0007] Nakon koraka kontrolisanog klijanja, vlažni slad se suši sa oko 40% sadržaja vlage na 4 do 5%. Ovaj postupak sušenja, koji se naziva i sušenje u peći, veoma je energetski zahtevan i predstavlja veliki trošak za industriju. Ceo postupak, uključujući sušenje u peći, obično traje 6-7 dana.

[0008] Sušenje u peći se dugo smatralo važnim delom proizvodnje piva iz nekoliko razloga. Jedan značajan razlog je to što se tokom klijanja formiraju korenčići (takođe nazvani „stabljičice“). Korenčići imaju gorak ukus, što utiče na zaostali ukus piva, i osim toga, korenčići mogu da daju pivu nepoželjnu boju (videti Beer Brewing Technology (1999): 183, izdavača Shokuhin Sangyo Shimbun, kao i US9,326,542). Kada se zeleni slad osuši u peći, korenčići mogu lako da se uklone, npr. pomoću aparata za uklanjanje korenčića. Prema udžbeniku „Malts and Malting“ autora D.E. Briggs tada „stabljičice moraju da se uklone [...] jer su izuzetno hidroskopne, bogate rastvorljivim azotnim materijama, sadrže materije koje su lošeg ukusa i gorke, i mogu da budu bogate sumpor dioksidom i/ili nitrozaminima. Uklanjanje stabljičica treba uraditi ubrzo nakon vađenja slada iz peći da bi se ohladio i pre nego što korenčići pokupe vlagu iz vazduha, postanu labavi i savitljivi (manje krti), i njihovo lomljenje i odvajanje time teže“ (D.E. Briggs, Malts and Malting; p695 First Edition, 1998 Published by Blackie & Professionals, London, ISBN0412 29800).

[0009] Slad sušen u peći uglavnom ima nivo vlage od 4.5-5.0%. Slad koji je sušen u peći se zatim transportuje od sladare do pivare drumom, železnicom ili morem. Ovo se odnosi na činjenicu da se postupci sladovanja i pripremanja piva tradicionalno obavljaju na različitim lokacijama i često ih sprovode različiti privredni subjekti.

[0010] U pivari, slad sušen u peći se melje kako bi se razbilo zrno, a dobijeni sadržaj se ekstrahuje toplom vodom u postupku poznatom kao ukomljavanje. Ekstrahovani materijal uključuje delimično razgrađeni skrob, proteine i molekule ćelijskog zida kao što je gore opisano, a oni se dalje razgrađuju endogenim enzimima zrna koji su ekstrahovani iz slada. U ovoj fazi, neki proizvođači piva ubacuju dodatne – i uglavnom jeftinije izvore ugljenika (pomoćne sastojke) – koji pomažu naredni postupak fermentacije pomoću kvasca i umanjuju velike troškove pripremanja slada. Pomenuti pomoćni sastojci mogu biti ječmeno, pirinčano, pšenično ili neko drugo brašno od žitarica neproklijalog zrna, ali njihovo dodavanje može da zahteva istovremeno dodavanje hidrolitičkih enzima, jer u sladu nema dovoljno endogenih enzima da razgrade komponente pomoćnog sastojka. Dodati enzimi su obično iz neprečišćenih i relativno jeftinih ekstrakata gljivičnih i/ili bakterijskih kultura. Dodavanje egzogenih enzima nije legalno u nekim državama, posebno tamo gde pivo mora da se proizvodi u strogo regulisanim uslovima.

[0011] Dalja razgradnja skroba i drugih komponenti endosperma ekstrahovanih u toploj vodi, odvija se u postupku poznatom kao saharifikacija. Nakon ukomljavanja, ekstrakti se filtriraju, često u rezervoaru za filtraciju sladovine (lauter tun), i hlade. Ekstrakt može da se kuva u prisustvu hmelja ili ekstrakata hmelja, a nakon hlađenja, dodaju se kulture kvasca za fermentaciju oslobođenih šećera u etanol. Tako proizvedeno pivo se obično podvrgava odležavanju i filtrira pre flaširanja. Pivo takođe može da se gazira pre flaširanja.

[0012] GB 1121 394 A opisuje postupak za pripremu koncentrovane sladovine, posebno kvasne sladovine. Očišćena i sortirana raž se namače u vodi, poželjno prskanjem, na temperaturi do 12 °C tokom 20 do 24 sata, dok sadržaj vlage ne dostigne 42% do 44% i niknu klice. Namočena raž se sladuje, a klijanje se vrši na temperaturi od 12 do 15 °C tokom 4 do 5 dana. Za to vreme, zrno se meša kako bi se omogućio pristup atmosferskom kiseoniku i dozvolilo da ugljen-dioksid izađe. Zrno se takođe vlaži po potrebi. Sveže proklijali slad može da se usitnjava u mlinu sa vodom u odnosu 1:3 do 1:4 i tako se pretvara u sladno mleko koje se zatim izliva u kominu. Pre ukomljavanja, ražano brašno se prvo kuva do kaše, sa vodom, pod pritiskom od oko dve atmosfere, oko 1 do 2 sata, dok skrob ne dobije konzistenciju poput paste. Zatim se hladi na oko 40 °C i meša sa sladnim mlekom.

[0013] US 4052 795 A opisuje postupak sladovanja koji obuhvata: (i) maceraciju zrna žitarica sa sadržajem vlage koji nije dovoljan da omogući rast korena suve tež. >0.5% suve tež. zrna uz držanje 4 do 6 dana na vazduhu na 16 °C, (ii) lomljenje površine maceriranih zrna propuštanjem između fiksnih cilindara tako da se zrna deformišu bez značajnih trajnih promena, (iii) tretiranje zrna giberelinskom kiselinom, (iv) izlaganje zrna vazduhu i (v) sušenje. WO 2011/127372 A1 opisuje postupak za poboljšanje prinosa postupka sladovanja koji obuhvata: nanošenje kondicionirane vode na klijavo zrno žitarice u fazi klijanja u postupku sladovanja, pri čemu kondicionirana voda sadrži od 0.025% do 2% hloridne soli.

[0014] WO 2010/140563 A1 otkriva postupak za pripremu ječmenog brašna koje se koristi kao funkcionalna hrana i hrana za stoku i za proizvodnju alkohola, koji uključuje mlevenje golog ječma sa nedostatkom beta-glukana (sa mutacijom gena HvCslF6 ječma) korišćenjem mlina sa valjcima. Postupak je koristan za pripremu ječmenog brašna koje se koristi kao funkcionalna hrana i hrana za stoku i za proizvodnju alkohola.

[0015] GB 1384 292 A opisuje postupak za pripremu kompozicija za upotrebu u ukomljavanju za pripremu pivske sladovine koji uključuje korake natapanja barem delimično oljuštenog zrna žitarica u vodi, tako da sadržaj vode u zrnu bude najmanje 30% težinski na bazi ukupne težine natopljenog zrna, oceđivanje viška vode, drobljenje zrna i sušenje zdrobljenog natopljenog zrna.

[0016] EP 0743 361 A1 opisuje postupak za sladovanje ječma i poboljšani slad dobijen na taj način, koji uključuje (a) fazu natapanja, (b) fazu klijanja i (c) fazu sušenja u peći.

[0017] US 3446 708 A opisuje postupak koji obuhvata: usitnjavanje celih potpuno proklijalih ili modifikovanih zrna zelenog slada u fragmente; prekomponovanje fragmenata, bez prethodnog zagrevanja, u pelete; i sušenje u peći peleta do suva da bi se dobio kompletan materijal za proizvodnju piva.

[0018] GB 1 316 226 A otkriva postupak za smanjenje vremena potrebnog za izvođenje kontinuiranih i diskontinuiranih postupaka sladovanja zrna, tačnije pivarskog ječma.

[0019] WO 2018/001882 A1 opisuje postupak za proizvodnju vodenog ekstrakta žitarica, pri čemu pomenuti postupak obuhvata sledeće korake: a. obezbeđivanje zrna žitarica; b. podvrgavanje zrna žitarica koraku klijanja; c. fino usitnjavanje pomenutih proklijalih zrna, dok pomenuta proklijala zrna imaju sadržaj vode od najmanje 20%, s tim da pomenuta zrna žitarica nemaju sadržaj vode ispod 20 u bilo kom trenutku između koraka b) i c); d. pripremu vodenog ekstrakta pomenutih mlevenih proklijalih zrna, čime se proizvodi vodeni ekstrakt žitarice.

Izlaganje suštine pronalaska

[0020] Pronalazak je definisan ovde priloženim zahtevima. Svaki predmet koji ne spada u obim patentnih zahteva je dat samo u informativne svrhe.

[0021] Ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za proizvodnju napitka prema zahtevu 1 i postupak za proizvodnju vodenog ekstrakta žitarica prema zahtevu 12.

[0022] Ovo otkriće obezbeđuje postupke za proizvodnju napitaka od vodenog ekstrakta žitarica koji uključuju brze postupke za klijanje i pripremu vodenih ekstrakata žitarica. Postupci značajno ubrzavaju postupak pripremanja sladovine za proizvodnju napitaka na bazi žitarica, uz istovremeno očuvanje potencijala za pripremu pomenute sladovine sa visokim nivoima fermentabilnih šećera, poželjno sa niskim nivoima β-glukana i ksilana. Konkretno, napici pripremljeni od pomenute sladovine mogu da se okarakterišu niskim nivoom oporog ukusa.

[0023] Kao što se može videti u ovde datim primerima, posebno u primeru 7, nekoliko važnih karakteristika sladovina i piva pripremljenih prema ovim postupcima ostaje nepromenjeno u poređenju sa tradicionalnim postupkom koji obuhvata sušenje u peći. Na primer, nivo alkohola i stvarni stepen fermentacije piva dobijenog bez sušenja u peći su slični onima kod piva dobijenog sušenjem u peći. Isto tako, nije primećena značajna razlika u boji i nivou pene. Pronalazači time pokazuju da je moguće dobiti vodeni ekstrakt žitarice bez sušenja u peći, pri čemu pomenuti ekstrakt može dalje da se preradi u napitak koji ima karakteristike uporedive sa karakteristikama napitka dobijenog sušenjem u peći.

[0024] Kao što je stručnjaku poznato, i kao što je gore pomenuto, korak sušenja u peći se smatra važnim delom proizvodnje piva iz više razloga, uključujući uklanjanje korenčića i smanjenje neprijatnih ukusa. Pre ovog otkrića, bilo je nepoznato da se korak sušenja u peći može izostaviti. Stoga postupci koji su ovde opisani prevazilaze predrasude u struci i rešavaju problem koji je odavno poznat u struci.

[0025] Jedan aspekt ovog otkrića se odnosi na postupak za proizvodnju napitka, pri čemu pomenuti postupak obuhvata korake:

i. pripremanja vodenog ekstrakta postupkom koji obuhvata sledeće korake:

a) obezbeđivanje zrna žitarica;

b) podvrgavanje zrna žitarica koraku klijanja tokom vremenskog raspona od 48 do 108 h, čime se dobijaju proklijala zrna;

c) fino usitnjavanje pomenutih proklijalih zrna, dok pomenuta proklijala zrna imaju sadržaj vode od najmanje 20%; i

d) pripremanje vodenog ekstrakta pomenutih fino usitnjenih proklijalih zrna, pod uslovom da pomenuta zrna žitarica nemaju sadržaj vode ispod 20% u bilo kom trenutku između koraka b) i d);

čime se dobija vodeni ekstrakt žitarice; i

ii. prerade pomenutog vodenog ekstrakta u napitak.

[0026] U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje postupke za proizvodnju vodenog ekstrakta žitarica, pri čemu pomenuti postupak obuhvata sledeće korake:

a) obezbeđivanje zrna žitarica;

b) podvrgavanje zrna žitarica koraku klijanja tokom vremenskog raspona od 48 do 108 h čime se dobijaju proklijala zrna, pri čemu pomenuti korak klijanja obuhvata inkubaciju pomenutih zrna u vodenom rastvoru sve dok zrna ne budu imala sadržaj vode od najmanje 30%, pri čemu se najmanje 2 L O2 po kg suve težine zrna žitarica propušta kroz pomenuti vodeni rastvor na sat;

c) fino usitnjavanje pomenutih proklijalih zrna, dok pomenuta proklijala zrna imaju sadržaj vode od najmanje 20%; i

d) pripremanje vodenog ekstrakta pomenutih mlevenih fino usitnjenih proklijalih zrna, pod uslovom da pomenuta zrna žitarica nemaju sadržaj vode ispod 20% u bilo kom trenutku između koraka b) i d);

čime se proizvodi vodeni ekstrakt žitarice.

[0027] U nekim primerima izvođenja gornjih postupaka, trajanje celog koraka klijanja može da ne traje duže od 96 h, pri čemu se trajanje klijanja meri od inicijacije klijanja. Korak klijanja može da se izvede tokom vremenskog raspona od 72 do 108 h, kao što je približno 96 h. Alternativno, korak klijanja može da se izvede tokom vremenskog raspona od 65 do 80 h, kao što je približno 72 h.

[0028] Nakon koraka klijanja, postupci prema ovom otkriću obuhvataju korak finog usitnjavanja proklijalih zrna žitarica. Posebno interesantan aspekt otkrića je to što postupci otkrića omogućavaju da se finom usitnjavanju proklijalih zrna žitarica pristupi odmah nakon klijanja. Shodno tome, postupci uopšteno ne obuhvataju korak sušenja proklijalih zrna žitarica. Konkretno, postupci ne obuhvataju korak sušenja proklijalih zrna žitarica u peći. Kao što je gore opisano, jedan važan aspekt sušenja u peći je da se omogući lako uklanjanje korenčića. Pre sušenja, uklanjanje korenčića se teško obavlja. Međutim, proklijala zrna žitarica pripremljena prema postupcima ovog otkrića imaju značajno redukovane korenčiće (obično manje od 6 g na 100 g proklijalog ječma (suve težine)), a kao što je prikazano ovim otkrićem, korak sušenja u peći nije potreban kod žitarica proklijalih prema postupcima ovog otkrića. Prema tome, u poželjnim primerima izvođenja, postupci za proizvodnju napitka ne zahtevaju korak sušenja proklijalih zrna u peći. U poželjnim primerima izvođenja, postupci za proizvodnju vodenog ekstrakta žitarica ne zahtevaju korak sušenja proklijalih zrna u peći.

[0029] Proklijala zrna žitarica mogu da se fino usitne, na primer, podvrgavanjem proklijalih zrna žitarica mokrom mlevenju, nakon čega sledi korak pripremanja vodenog ekstrakta, na primer, ukomljavanjem na unapred određenoj temperaturi tokom bilo kog pogodnog vremena kao što je opisano u nastavku u odeljku „Pripremanje vodenog ekstrakta“. Konverzija oslobođenih saharida, npr. polisaharida, i proteina može da se olakša tokom ukomljavanja dodavanjem smeša egzogenih enzima koji katalizuju razgradnju skroba, uskladištenih proteina i polisaharida ćelijskog zida. Enzimi mogu da budu delimično prečišćeni iz samog ječma, iz slada ili iz drugih izvora - ili, alternativno, iz gljivičnih i/ili bakterijskih enzimskih mešavina koje mogu da se nabave iz komercijalnih izvora.

[0030] Otkriće na taj način može da obezbedi značajne uštede vode kroz eliminaciju sušenja slada kao i značajne uštede energije, npr. izostavljanjem koraka sušenja u peći. Pored toga, ukupno vreme potrebno za pripremu vodenog ekstrakta zrna žitarica, a time i za pripremu napitka nakon obrade pomenutog vodenog ekstrakta, može se značajno smanjiti. Uštede troškova energije do 50% mogu da se postignu kroz brze postupke otkrića, što može u velikoj meri da smanji ugljenični otisak u industriji. Ovo je od značaja zbog toga što širom sveta postoji sve veći zakonodavni i poreski pritisak u većini država da se smanji karbonski otisak u industriji proizvodnje slada i piva.

[0031] Dalje, u kontekstu održivosti, ovo otkriće omogućava da se celokupna proizvodnja piva obavlja u već postojećoj opremi za pivaru, tako da je potrebno malo dodatnih kapitalnih izdataka.

Opis crteža

[0032]

Slika 1 prikazuje šematski prikaz primera mikropostupaka sladovanja.

Slika 2 prikazuje upijanje vode u mutantnim i referentnim zrnima ječma tokom sladovanja.

Slika 3 prikazuje rast korena zrna ječma tokom sladovanja. Rast korena je takođe meren u uzorku koji je upijao vodu pod aeracijom 24 h i potom klijao na vazduhu 24 h (24+24).

Slika 4 prikazuju ekspresiju gena koji kodiraju hidrolitičke enzime u mutantnom i referentnom zrelom zrnu ječma (0.) i u zelenom sladu 1, 2, 3, 4, 5, 6. dana, kao i u sladu sušenom u peći (7. dana). Aktivnost enzima je takođe merena u uzorku koji je upijao vodu tokom 24 h i potom klijao na vazduhu 24 h (24+24).

Slika 5 prikazuje aktivnosti α-amilaze (a), β-amilaze (b) i slobodne granične dekstrinaze (c) merene u mutantnim i referentnim zrnima tokom sladovanja.

Slika 6 prikazuje sadržaj (1-3;1-4)-β-glukana u mutantnom i referentnom zrelom zrnu ječma (0. dan) i u zelenom sladu 1, 2, 3, 4, 5, 6. dana, kao i u sladu sušenom u peći. (7. dana)

Definicije

[0033] Kako se ovde koristi, jednina može da označava jedno ili više, u zavisnosti od konteksta u kojem se koristi.

[0034] Termini „približno“ i „oko“ kada se ovde koriste u odnosu na numeričke vrednosti poželjno znače ± 10%, poželjnije ± 5%, a još poželjnije ± 1%.

[0035] Termin „aminokiselina“, kako se ovde koristi, odnosi se na proteinogenu aminokiselinu. Poželjno, proteinogena aminokiselina je jedna od 20 aminokiselina kodiranih standardnim genetskim kodom. Za imenovanje aminokiselina koriste se IUPAC kodovi od jednog i tri slova.

[0036] Termin „aminokiselina koja odgovara X“ se ovde koristi da opiše aminokiseline datog polipeptida (npr. mutantni polipeptid CslF6) u odnosu na aminokiseline referentnog polipeptida (npr. CslF6 sekvence SEQ ID NO: 1). Nakon poravnanja pomenutog polipeptida i referentnog polipeptida, aminokiselina odgovara X ako je na istoj poziciji kao X u pomenutom poravnanju.

[0037] Pod „koja kodira“ ili „kodiran“, u kontekstu određene nukleinske kiseline, podrazumeva se sadržavanje informacije za translaciju u specifikovani protein. Nukleinska kiselina ili polinukleotid koji kodira protein može da sadrži netranslatirane sekvence, npr. introne, unutar translatiranih regiona nukleinske kiseline, ili mogu da mu nedostaju takve umetnute netranslatirane sekvence, npr. u cDNK. Informacije kojima je protein kodiran određene su upotrebom kodona.

[0038] Termin „gen“ označava segment DNK uključen u proizvodnju polipeptidnog lanca; uključuje regione koji se nalaze pre i posle kodirajućeg regiona (promotor i terminator). Štaviše, biljni geni se uglavnom sastoje od egzona prekinutih intronima.

[0039] Sušenje pomoću peći (ili sušenje u peći) je deo postupaka sladovanja i odnosi se na korak sušenja proklijalih zrna; pomenuta zrna su takođe mogla da budu podvrgnuta koraku močenja pre klijanja. Sušenje u peći se može izvoditi na uobičajenim temperaturama, kao što je najmanje 75 °C, na primer u rasponu od 80 do 90 °C, kao što je u rasponu od 80 do 85 °C. Sušenje u peći se obično izvodi na povišenim temperaturama. Primer postupaka sušenja u peći je sledeći: 12 h na 60 °C; 3 h na 68 °C; 4 h na 74 °C; 3 h na 80 °C. Korak sušenja u peći smanjuje sadržaj vlage ili vode u vlažnom sladu sa oko 40% na 4 do 5%. Dakle, slad sušen u peći ima sadržaj vode od oko 4 do 5%.

[0040] „Mutacije“ uključuju delecije, insercije, supstitucije, transverzije i tačkaste mutacije u kodirajućim i nekodirajućim regionima gena. Delecije mogu da budu delecije celog gena ili samo dela gena. Tačkaste mutacije mogu da se odnose na promene jednog para baza i mogu na primer da rezultuju preranom pojavom stop kodona, mutacijama pomeranja okvira čitanja, mutacijama mesta splajsovanja ili supstitucijama aminokiselina. Gen koji sadrži mutaciju može da se označi kao „mutantni gen“. Ako pomenuti mutantni gen sadrži mutaciju i na taj način kodira polipeptid sa sekvencom različitom od divljeg tipa, pomenuti polipeptid se može nazvati „mutantnim polipeptidom“.

[0041] Termin „pomoćni sastojak“, kako se ovde koristi, odnosi se na izvore sirovina bogatih ugljenikom koje se dodaju tokom pripremanja piva. Pomoćni sastojak može da bude neproklijalo zrno žitarica, koje se može samleti zajedno sa proklijalim zrnima pripremljenim prema otkriću. Pomoćni sastojak može takođe da bude sirup, šećer ili slično.

[0042] Termin „klica“, kako se ovde koristi, odnosi se na rastući embrionalni pupoljak koji je vidljiv tokom faze klijanja zrna žitarica.

[0043] Termin „sadržaj vode“ u zrnu, kako se ovde koristi, odnosi se na % H2O tež./tež. u pomenutom zrnu.

[0044] Termin „proklijalo zrno“, kako se ovde koristi, odnosi se na zrna koja su razvila vidljivu klicu, poželjno klicu od najmanje 1 mm, kao što je najmanje 2 mm, i vidljivu stabljiku.

[0045] Termin „inicijacija klijanja“, kako se ovde koristi, odnosi se na vremensku tačku u kojoj se zrna ječma sa sadržajem vode manjim od 15% dovode u kontakt sa dovoljno vode za inicijaciju klijanja.

[0046] Termin „β-glukan“, kako se ovde koristi, osim ako nije drugačije naznačeno, odnosi se na polimer ćelijskog zida žitarica „(1,3;1,4)-β-glukan“.

[0047] Termin „(1,3;1,4)-β-glukan sintaza“, kako se ovde koristi, treba smatrati bilo kojim enzimom koji katalizuje sintezu (1,3;1,4)-β-glukana i, opciono, katalizuje polimerizaciju monomera glukopiranozila. Na primer, (1,3;1,4)-β-glukan sintaza može da bude polipeptid kodiran genom CslF ili njegov funkcionalni homolog.

[0048] Slično, izraz „ksilan“, kako se ovde koristi, osim ako nije drugačije naznačeno, odnosi se na polimer ćelijskog zida žitarica „arabinoksilan“.

[0049] Izrazi „slad sušen u peći“ i „sušeni slad“, kako se ovde koriste, odnose se na proklijala zrna žitarica, koja su sušena sušenjem u peći. Slad sušen u peći obično ima sadržaj vode od oko 4 do 5%. Slad koji nije bio podvrgnut sušenju u peći označava se kao „zeleni slad“.

[0050] Termin „močenje“, kako se ovde koristi, odnosi se na postupak povećanja sadržaja vode u zrnu žitarica.

[0051] Termin „β-glukanaza“, kako se ovde koristi, odnosi se na enzime sa potencijalom da depolimerizuju β-glukan žitarica. Shodno tome, osim ako nije drugačije naznačeno, termin „βglukanaza“ se odnosi na endo- ili egzo-enzim ili njihovu mešavinu koju karakteriše aktivnost (1,3;1,4)-β- i/ili (1,4)-β-glukanaze.

[0052] Termin „ksilanaza“, kako se ovde koristi, odnosi se na enzime sa potencijalom da razgrađuju glavne i bočne lance ksilana i arabinoksilana. Shodno tome, osim ako nije drugačije naznačeno, termin „ksilanaza“ se odnosi na enzim ili mešavinu enzima koju karakterišu enzimske aktivnosti poreklom iz jedne ili više od sledećih klasa enzima: endo-1,4-ksilanaza; egzo-1,4-ksilanaza; arabinfuranozidaza; esteraza ferulne kiseline.

[0053] Aktivnosti enzima zrna žitarica, kako se ovde koriste, odnose se na aktivnosti merene u brašnu pripremljenom od specificirane vrste zrna. Na primer, 10 U/g aktivnosti α-amilaze po gramu zrna žitarica odnosi se na pomenutu aktivnost α-amilaze (10 U) merenu u vodenom ekstraktu dobijenom od 1 g brašna (suve materije) pomenute žitarice. Aktivnost α-amilaze je određena pomoću K-CERA 01/12 (protokol i komplet dostupni kod Megazyme, Irska). Aktivnost β-amilaze je određena pomoću K-BETA3 (protokol i komplet dostupni kod Megazyme, Irska). Aktivnost granične dekstrinaze je određena pomoću T-LDZ1000 (protokol i komplet dostupni kod Megazyme, Irska).

[0054] Zapremina gasa, kako je ovde naznačeno, odnosi se na zapreminu pomenutog gasa na 1 atm i 20 °C.

[0055] Zapremina O2, kako je ovde naznačeno, odnosi se na zapreminu O2na 1 atm i 20 °C. U primerima izvođenja otkrića gde je O2uključen u smešu gasova, može da se odredi ukupna zapremina smeše gasova, a zapremina O2može da se izračuna kao procenat ukupne zapremine koju čini O2. Na primer, atmosferski vazduh sadrži 21% O2. Prema tome, zapremina O2unutar atmosferskog vazduha, kako se ovde koristi, iznosi 21% ukupne zapremine atmosferskog vazduha.

Detaljan opis

Zrna žitarica

[0056] Postupci prema ovom otkriću obuhvataju korak klijanja zrna žitarica.

[0057] U primerima izvođenja otkrića zrna žitarica su zrna ječma. Pomenuta zrna mogu biti zrna bilo koje sorte ječma, kao što je bilo koja od sorti ječma opisanih u nastavku u odeljku „Ječam“.

[0058] Zrna žitarica mogu da imaju relativno nizak sadržaj vode pre klijanja. Na primer, zrna žitarica mogu da imaju sadržaj vode od najviše 30%, poželjno najviše 20%, kao što je najviše 15%, na primer u rasponu od 5 do 15%.

[0059] Pre klijanja, zrno žitarica može da bude podvrgnuto jednom ili većem broju koraka antimikrobnog tretmana. Pomenuti antimikrobni tretman može da bude bilo koji koristan antimikrobni tretman, koji ne umanjuje potencijal zrna za klijanje. Antimikrobni tretman može na primer da bude tretman pomoću jednog ili više antimikrobnih agenasa. Pomenuti antimikrobni agensi mogu da budu bilo koji antimikrobni agens, koji u korišćenim koncentracijama nije toksičan za zrna žitarica. Na primer, antimikrobni agens može da bude jedinjenje koje sadrži hlor, npr.

hipohlorit. Antimikrobni agens može takođe da bude peroksid, npr. vodonik peroksid i/ili persirćetna kiselina. Neograničavajući primeri korisnih komercijalnih antimikrobnih agenasa uključuju P3-Hypochloran<®>, P3-peroxysan<®>ili P3-oxonia active 150<®>. Zrna žitarica se mogu tretirati hipohloranom u koncentraciji u rasponu od 0.1 do 10%, kao što je u rasponu od 0.5 do 5%, na primer približno 1%, kao što je 1%. Zrna žitarica se mogu tretirati pomenutim hipohloranom tokom vremenskog raspona od 15 min. do 10 h, kao što je u rasponu od 1 do 5 h, na primer tokom vremenskog raspona od 2 do 4 h. Nakon tretmana, zrna žitarica se mogu oprati jednom ili više puta.

[0060] U nekim primerima izvođenja otkrića, antimikrobni tretman se izvodi inkubacijom zrna žitarica u vodenom rastvoru koji sadrži antimikrobni agens, i stoga antimikrobni tretman može da se izvede kao deo koraka močenja. Odmah nakon pomenute inkubacije, može da se inicira korak klijanja. Prema tome, u takvim primerima izvođenja, nije potrebno menjati vodeni rastvor, i isti vodeni rastvor može da se koristi za antimikrobni tretman i korak močenja. Ovo posebno može da bude slučaj kada je antimikrobni agens peroksid, npr. vodonik peroksid.

[0061] Može da bude poželjno da pomenuta zrna žitarica nisu bila podvrgnuta klijanju pre koraka klijanja prema otkriću. Shodno tome, može da bude poželjno da zrna žitarica nisu bila podvrgnuta koraku predklijanja.

[0062] Neka zrna žitarica imaju plevice, dok su druga zrna žitarica golozrna. Plevičasta zrna žitarica mogu da budu tretirana da bi se uklonio bar deo plevica pre koraka klijanja. Uopšteno govoreći, tretman uklanjanja plevica nije potreban ako se koristi zrno golozrne žitarice. Golozrne žitarice uključuju na primer sorte golozrnog ječma.

[0063] Plevičasta zrna žitarica mogu da se tretiraju da bi se uklonile plevice podvrgavanjem zrna žitarica fizičkom tretmanu uklanjanja plevica. Pomenuti fizički tretman može se, na primer, izabrati iz grupe koja se sastoji od poliranja, brušenja, ljuštenja i zaglađivanja. Poželjno je da fizički tretman rezultuje gubitkom plevica. Gubitak plevica može da se odredi kao ukupni gubitak težine. Dakle, fizički tretman poželjno dovodi do gubitka od najmanje 2%, kao što je u rasponu od 2 do 7%, poželjno gubitka od najmanje 3%, kao što je gubitak u rasponu od 3 do 6% ukupne težine zrna žitarica.

[0064] U nekim primerima izvođenja žitarice koje se koriste u postupcima ovog otkrića nisu isključivo dobijene pomoću suštinski biološkog postupaka. Ovde se smatra da potomstvo biljke dobijene tehničkim postupkom nije isključivo dobijeno suštinski biološkim postupkom, jer je matična biljka dobijena tehničkim postupkom.

[0065] U nekim primerima izvođenja zrna žitarica su dobijena od mutiranih biljaka koje sadrže jednu ili više mutacija, pri čemu su pomenute mutacije izazvane hemijskim i/ili fizičkim agensima.

Ječam

[0066] U primerima izvođenja otkrića zrna žitarica koja će se koristiti sa postupcima otkrića su zrna ječma.

[0067] Pomenuta zrna mogu da budu zrna bilo koje biljke ječma. Međutim, u nekim primerima izvođenja, biljka ječma može da sadrži jednu ili više specifičnih karakteristika, na primer, jednu ili više karakteristika kao što je opisano u nastavku. Iako su različite karakteristike pojedinačno diskutovane u nastavku ovog teksta, biljka ječma prema otkriću može da ima kombinaciju ovih karakteristika.

[0068] U jednom primeru izvođenja otkrića, ječam može da bude sorta (eng. – variety, var.) golozrnog ječma. Obimom otkrića je takođe obuhvaćeno da je ječam var. ječma sa prirodno tankom ljuskom, kao što je var. Admiral. Na primer, ljuska može da čini manje od 7% ukupne težine zrna i ljuske.

[0069] Biljka ječma takođe može da bude biljka ječma koja ima nizak nivo aktivnosti LOX. Takve biljke ječma su poznate u tehnici i uključuju, na primer, biljke ječma koje nose mutaciju u genu koji kodira LOX-1. Na primer, biljka ječma može da bude biljka ječma koja nosi bilo koju od mutacija u genu LOX-1 opisanih u WO 02/053721, WO 2005/087934 i WO 2004/085652.

[0070] Biljka ječma takođe može da bude biljka ječma koja nosi mutaciju u genu koji kodira lipoksigenazu 1 (LOX-1) i/ili u genu koji kodira LOX-2. Na primer, biljka ječma može da bude biljka ječma koja nosi bilo koju od mutacija u genima LOX-1 i LOX-2 opisanu u WO 2010/075860.

[0071] Biljka ječma takođe može da bude biljka ječma koja ima nizak nivo MMT aktivnosti. Takve biljke ječma su poznate u tehnici i uključuju, na primer, biljke ječma koje nose mutaciju u genu koji kodira MMT. Konkretno, biljka ječma može da bude biljka ječma koja nosi bilo koju od mutacija u genu MMT opisanu u WO 2010/063288. Biljka ječma takođe može da bude bilo koja od biljaka ječma opisanih u WO 2011/150933.

[0072] Biljka ječma takođe može da bude biljka ječma koju karakteriše povećana GA signalizacija. Konkretno, biljka ječma može da bude biljka ječma koja nosi mutaciju u genu Slender1, koji kodira protein DELLA. Na primer, biljka ječma može da bude biljka ječma koja nosi bilo koju od mutacija koje su opisali Chandler et al., 2013, npr. u tabeli 1 u tom tekstu. Na primer, biljka ječma može da nosi mutaciju u genu Slender1, koja rezultuje mutantnim genom Slender1 koji kodira mutantni protein DELLA, pri čemu pomenuti mutantni protein DELLA nosi mutaciju u jednoj ili više aminokiselina broj 46, 490, 280, 268, 271, 277, 231, 481, 282, 277, 227, 485 ili 237, na primer mutaciju izabranu iz grupe koja se sastoji od G46E, S490F, R268H, G271D, A277T, V231M, R481H, V282F, A277T, G227E, S485F i C237Y. Numeracija aminokiselina je data u odnosu na sekvencu proteina DELLA dostupnu pod Genbank pristupnim br. AK372064 ili AF035820 (verzija od 4. februara 2013.).

Biljke ječma sa niskim nivoom β-glukana

[0073] Kao što je gore pomenuto, poželjno je da vodeni ekstrakt dobijen tokom ukomljavanja ima dovoljno nizak viskozitet da omogući dobru filtrabilnost smeše komine. Kao što je gore takođe detaljno opisano, rastvorljivi β-glukani mogu da doprinesu visokom viskozitetu vodenog ekstrakta. Shodno tome, u nekim primerima izvođenja otkrića, može da bude poželjno da se koristi biljka ječma koja ima nizak nivo β-glukana.

[0074] U jednom primeru izvođenja, biljku ječma koja se koristi sa postupcima otkrića karakteriše nizak nivo β-glukana u zrnima. U jednom primeru izvođenja, pomenuti nivo β-glukana u zrnima je najviše 5%, kao što je u rasponu od 1-5% tež./tež. na bazi suve težine. U poželjnom primeru izvođenja, nivo β-glukana u zrnima je najviše 3%, kao što je u rasponu od 1-3% tež./tež. na bazi suve težine.

[0075] U jednom primeru izvođenja, biljku ječma koja se koristi sa postupcima otkrića karakteriše nizak nivo β-glukana u zrnima. U jednom primeru izvođenja, pomenuti nivo β-glukana u zrnima je najviše 60%, kao što je najviše 55%, na primer u rasponu od 30 do 60% sadržaja β-glukana u zrnima biljke ječma divljeg tipa, na primer, inače slične biljke ječma divljeg tipa, npr. biljke ječma kultivara (cv.) Paustian.

[0076] U jednom primeru izvođenja, biljka ječma može da ima nivo β-glukana koji je ispod nivoa detekcije, na primer da ne sadrži β-glukan.

[0077] U jednom primeru izvođenja, biljka ječma koja će se koristiti sa postupcima otkrića nosi mutaciju u bilo kom genu koji kodira β-glukan sintazu. Pomenuti gen može na primer da bude gen koji kodira polipeptid SEQ ID NO: 2 dat u US2012/0030784. Na primer, biljka ječma može da bude ječam koji sadrži β-glukan-deficijentni gen, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 18 u US2012/0030784.

[0078] U jednom primeru izvođenja, biljka ječma koja će se koristiti sa postupcima otkrića može da nosi mutaciju u genu CslF6 koja rezultuje smanjenim sadržajem (1,3;1,4)-β-glukana. Sekvenca polipeptidne sekvence celuloznoj sintazi-sličnog CslF6 divljeg tipa iz ječma Hordeum vulgare kultivar Sloop je ovde data kao sekvenca SEQ ID NO: 1. Sekvenca kompletne kodirajuće sekvence celuloznoj sintazi-sličnog CslF6 (CslF6) divljeg tipa iz ječma Hordeum vulgare kultivar Sloop je ovde data kao SEQ ID NO: 2. Pored sekvence koja je ovde data kao SEQ ID NO: 1, divlji tip polipeptida CslF6 može takođe da ima sekvencu SEQ ID NO: 1, u kojoj je aminokiselina na poziciji 590 zamenjena sa Thr. Dakle, polipeptid sekvence SEQ ID NO: 1 koji nosi polimorfizam A590T može se takođe smatrati divljim tipom polipeptida CslF6 (Taketa et al. (2012)).

[0079] U jednom primeru izvođenja, biljka ječma nosi mutaciju u genu CslF6. Mutacija može da bude mutacija koja utiče na nivo ekspresije bilo iRNK CslF6 i/ili proteina CslF6. U jednom primeru izvođenja, mutacija može da bude mutacija koja dovodi do pomenute mutacije gena CslF6 koji kodira mutantni polipeptid CslF6. Mutacija u genu CslF6 može da bude bilo koja mutacija gena CslF6, na primer delecija, insercija ili tačkasta mutacija. U jednom primeru izvođenja otkrića, mutacija je tačkasta mutacija u kodirajućem regionu gena CslF6. U jednom primeru izvođenja mutacija dovodi do pojave prevremenog stop kodona. Mutantni polipeptid CslF6 kodiran pomenutim mutantnim genom CslF6 može da bude bilo koji mutantni polipeptid CslF6. Konkretno, mutantni polipeptid CslF6 može da sadrži supstituciju jedne aminokiseline u bilo kom od membranski lokalizovanih domena CslF6. Mutantni polipeptid CslF6 može poželjno da sadrži jednu ili više sledećih supstitucija u membranski lokalizovanom domenu:

• supstituciju nepolarne aminokiseline za naelektrisanu aminokiselinu, tj. nepolarna aminokiselina je zamenjena naelektrisanom aminokiselinom; i

• supstituciju polarne aminokiseline za nepolarnu aminokiselinu, tj. polarna aminokiselina je zamenjena nepolarnom aminokiselinom.

[0080] U jednom primeru izvođenja otkrića, mutantni polipeptid CslF6 može da sadrži supstituciju jedne aminokiseline u bilo kom od membranski lokalizovanih domena CslF6, tj. aminokiselina u bilo kom od membranski lokalizovanih domena može da bude zamenjena drugom aminokiselinom. Membranski lokalizovani domeni CslF6 prikazani su ovde u tabeli 1.

Tabela 1. Lokalizacija membranski lokalizovanih sekvenci aminokiselina u proteinu CslF6 Pozicija AA u SEQ ID NO: 1 Sekvenca AA Funkcionalnost

109-128 RVLIFVRLIAFTLFVIWRIS Transmembranska 137-158 LWVTSICGEFWFGFSWLLDQLP Transmembranska 700-711 LQRVAYINITTY Deo transmembranske 712-714 PTF Spiralni linker u membrani, dovodi do pojave pregiba

715-731 AIFLIFYTTVPALUFVT Deo transmembranske 741-758 TMFYVYLGIVLSTLLVIA Transmembranska 835-857 ITPIIIIFVNIIGSAVAFAKVLD Transmembranska 864-882 LKVAGGVFFNFWVLFHLYPF Transmembranska [0081] Na primer, mutantni polipeptid CslF6 može da bude CslF6 sekvence SEQ ID NO: 1, osim što mutantni CslF6 sadrži supstituciju aminokiseline 847 u naelektrisanu aminokiselinu, tj. aminokiselina 847 je zamenjena naelektrisanom aminokiselinom. Na primer, pomenuta supstitucija može da bude supstitucija glicina (G) na poziciji 847 za negativno naelektrisanu aminokiselinu, npr. Glu ili Asp; drugim rečima, glicin (G) na poziciji 847 može da bude zamenjen negativno naelektrisanom aminokiselinom, npr. Gly ili Asp. Poželjno, mutantni polipeptid CslF6 može da bude CslF6 sekvence SEQ ID NO: 1, osim što mutant CslF6 sadrži supstituciju aminokiseline 847, pri čemu pomenuta supstitucija predstavlja supstituciju glicina (G) na poziciji 847 za glutaminsku kiselinu (E), tj. glicin (G) na poziciji 847 je zamenjen glutaminskom kiselinom (E). Pored toga, pomenuti mutant CslF6 može opciono da nosi polimorfizam A590T.

[0082] Na primer, mutantni polipeptid CslF6 može da bude CslF6 sekvence SEQ ID NO: 1, osim što mutantni CslF6 sadrži supstituciju aminokiseline 748 u naelektrisanu aminokiselinu. tj. aminokiselina 748 je zamenjena naelektrisanom aminokiselinom. Na primer, pomenuta supstitucija može da bude supstitucija glicina (G) na poziciji 748 za negativno naelektrisanu aminokiselinu, npr. Glu ili Asp, tj. glicin (G) na poziciji 748 može da bude zamenjen negativno naelektrisanom aminokiselinom, npr. Glu ili Asp. Poželjno, mutantni polipeptid CslF6 može da bude CslF6 sekvence SEQ ID NO: 1, osim što mutantni CslF6 sadrži supstituciju aminokiseline 748, pri čemu pomenuta supstitucija predstavlja supstituciju glicina (G) na poziciji 748 za asparaginsku kiselinu (D). tj. glicin (G) na poziciji 748 je zamenjen asparaginskom kiselinom (D). Pored toga, pomenuti mutant CslF6 može opciono da nosi polimorfizam A590T.

[0083] Na primer, mutantni polipeptid CslF6 može da bude CslF6 sekvence SEQ ID NO: 1, osim što mutantni CslF6 sadrži supstituciju aminokiseline 709 u nepolarnu aminokiselinu, tj. aminokiselina 709 je zamenjena nepolarnom aminokiselinom. Na primer, pomenuta supstitucija može da bude supstitucija treonina (T) na poziciji 709 za nepolarnu aminokiselinu, npr. Leu ili Ile, tj. treonin (T) na poziciji 709 može da bude zamenjen nepolarnom aminokiselinom, npr. Leu ili Ile. Pored toga, pomenuti mutant CslF6 može opciono da nosi polimorfizam A590T.

[0084] Poželjno, mutantni polipeptid CslF6 može da bude CslF6 sekvence SEQ ID NO: 1, osim što mutantni CslF6 sadrži supstituciju aminokiseline 709, pri čemu pomenuta supstitucija predstavlja supstituciju treonina (T) na poziciji 709 za izoleucin (I), tj. treonin (T) na poziciji 709 je zamenjen izoleucinom.

[0085] Mutantni polipeptid CslF6 može takođe da bude fragment polipeptida CslF6 pune dužine. Na primer, mutantni polipeptid CslF6 može da bude CslF6 sekvence SEQ ID NO: 1, osim što mutantni gen CslF6 sadrži prevremeni stop kodon, pa stoga kodira skraćeni polipeptid CslF6. Poželjno, mutantni polipeptid CslF6 može da bude kodiran mutantnim genom CslF6, pri čemu mutantni gen CslF6 ima sekvencu SEQ ID NO: 2, osim što mutantni gen CslF6 sadrži supstituciju nukleotida guanina (G) na poziciji 2028 kodirajuće sekvence u adenin (A), čime se stvara stop kodon; drugim rečima, guanin (G) na poziciji 2028 je zamenjen adeninom (A). Dobijeni mutantni polipeptid CslF6 na taj način obuhvata supstituciju treonina (T) na poziciji 676 u stop kodon (T676Stop), tj. treonin (T) na poziciji 676. Pored toga, pomenuti mutant CslF6 može opciono da nosi polimorfizam A590T.

[0086] Biljka ječma može da nosi bilo koju mutaciju u genu CslF6. Takva mutacija bi, na primer, mogla da dovede do utišavanja gena CslF6, što rezultuje zrnima ječma sa veoma niskim nivoima (1,3;1,4)-β-glukana (kao što su opisali Taketa et al., 2011). Biljka ječma takođe može da bude mutant m351 (kao što su opisali Hu et al. (2014)) koji sadrži mutaciju u genu CslF6 koja rezultuje veoma niskim nivoima (1-3,1-4) β-glukana (<1.6%).

[0087] Za potrebe ove patentne prijave, seme biljke ječma (Hordeum vulgare) označeno kao „Mutant 2“ deponovano je kod NCIMB Ltd. Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA Škotska, prema odredbama Budimpeštanskog sporazuma. Biljka ječma Mutant 2 deponovana je 12. novembra 2018. i dobila je pristupni broj NCIMB 43273. U jednom primeru izvođenja, biljka ječma je biljka ječma (Hordeum vulgare) deponovana 12.11. 2018. kod NCIMB pod pristupnim brojem NCIMB 43273 i nazvana „Mutant 2“; ili njeno potomstvo. Dakle, biljka ječma može da bude biljka ječma Mutant 2 deponovana 12. 11. 2018. kod NCIMB pod pristupnim brojem NCIMB 43273, ili bilo koja potomačka biljka ječma, pri čemu biljka ječma nosi G->A mutaciju nukleotida 2243 kodirajuće sekvence gena HvCslF6 (SEQ ID NO: 2) i/ili pri čemu gen HvCslF6 pomenute biljke ječma kodira mutantni protein HvCslF6 koji sadrži mutaciju Gly → Asp aminokiseline 748 sekvence SEQ ID NO: 1.

[0088] Zrna žitarica takođe mogu da budu potomstvo biljke kao što je mutirana biljka. U nekim primerima izvođenja, zrna ječma koja se koriste u postupcima otkrića su zrna iz biljke ječma koja nije dobijena isključivo pomoću suštinski biološkog postupaka. Ovde se smatra da potomstvo biljke ječma dobijene tehničkim postupkom nije isključivo dobijeno suštinski biološkim postupkom, jer je matična biljka dobijena tehničkim postupkom.

[0089] Postupci za dobijanje takvih biljaka opisani su u WO 2019/129736.

[0090] Biljka ječma takođe može da nosi mutaciju u bilo kom drugom genu, kao što je regulatorni gen, koja rezultuje niskim nivoom β-glukana.

Klijanje

[0091] Postupci ovog otkrića koji se odnose na proizvodnju vodenog ekstrakta žitarica ili na proizvodnju napitka pripremljenog od takvih ekstrakata žitarica obuhvataju korak klijanja zrna žitarica.

[0092] Zrna žitarica mogu da budu bilo koje od zrna žitarica opisanih ovde gore u odeljcima „Zrna žitarica“, „Ječam“ i „biljke ječma sa niskim nivoom β-glukana“.

[0093] Korak klijanja može da sadrži jedan ili više koraka močenja pomenutih zrna žitarica i jedan ili više koraka klijanja pomenutih zrna žitarica. Koraci močenja i klijanja se takođe mogu kombinovati ili delimično kombinovati, tako da se močenje i klijanje odvijaju istovremeno ili barem delimično istovremeno.

[0094] Pre inicijacije klijanja, postupci takođe mogu da sadrže početni korak ljuštenja pomenutih zrna žitarica, kao što je gore opisano u odeljku „zrna žitarica“. Pomenuto ljuštenje može da bude korisno za povećanje uzimanja vode u zrna žitarica i naknadnu indukciju klijanja, kao i za uklanjanje potencijalnih mikroorganizama na površini zrna žitarica. Dodatno ili kao alternativa, mikroorganizmi na zrnima žitarica mogu takođe da budu uklonjeni pre klijanja podvrgavanjem zrna žitarica jednom ili većem broju koraka antimikrobnog tretmana, kao što je opisano gore u odeljku „zrna žitarica“.

[0095] Močenje može da se izvede bilo kojim konvencionalnim postupkom poznatim stručnjaku. Močenje se vrši kako bi se povećao sadržaj vode u zrnima i time iniciralo klijanje. Močenje tipično obuhvata jedan ili više koraka inkubacije zrna žitarica u vlažnim uslovima, npr. potapanjem zrna žitarica u vodeni rastvor.

[0096] Jedan neograničavajući primer uključuje močenje u naizmenično suvim i vlažnim uslovima. Močenje se može izvesti na bilo kojoj korisnoj temperaturi, na primer na temperaturi u rasponu od 10 do 25 °C, kao što je pribl.15 °C.

[0097] Tokom močenja, na primer, zrna žitarica mogu da se inkubiraju u vlažnim uslovima tokom vremenskog raspona od 30 min. do 10 h, nakon čega se inkubiraju u suvim uslovima tokom vremenskog raspona od 30 min. do 24 h i opciono sa ponavljanjem pomenute inkubacije u vlažnim i/ili suvim uslovima u rasponu od 2 do 5 puta. Finalni sadržaj vode nakon močenja može, na primer, da bude u rasponu od 40 do 50%.

[0098] Drugi neograničavajući primer uključuje močenje u kome se zrna žitarica inkubiraju u vlažnim uslovima da bi se dobio sadržaj vode u rasponu od 32 do 37%, kao što je oko 35%. Takva inkubacija u vlažnim uslovima može, na primer, da bude tokom vremenskog raspona od 5 do 12 h, kao što je u rasponu od 5 do 10 h, nakon čega sledi inkubacija u suvim uslovima tokom vremenskog raspona od 12 do 30 h, kao što je u rasponu od 15 do 20 h. Zrna žitarica mogu se zatim inkubirati u vlažnim uslovima da bi se dobio sadržaj vode od oko 37 do 43%, kao što je pribl. 40%. Ovo može da se postigne inkubacijom u vlažnim uslovima tokom vremenskog raspona od 2 do 10 h, kao što je u rasponu od 3 do 7 h. Inkubacija u vlažnim uslovima može da bude praćena još jednom inkubacijom u suvim uslovima tokom vremenskog raspona od 10 do 30 h, kao što je u rasponu od 15 do 25 h. Konačno, zrna žitarica mogu da se inkubiraju u vlažnim uslovima da bi se postigao sadržaj vode u rasponu od 43 do 47%, kao što je oko 45%. Ovo može da se postigne inkubacijom u vlažnim uslovima tokom vremenskog raspona od 1 do 10 h, na primer u rasponu od 1 do 5 h. Neograničavajući primer postupka močenja prikazan je na slici 1.

[0099] U jednom primeru izvođenja pomenuto močenje ili pomenuta inkubacija u vlažnim uslovima može da se izvede bar delimično pod aeracijom. Prema tome, pomenuta zrna žitarica mogu da budu inkubirana u vodenom rastvoru sa protokom vazduha, npr. dok se O2propušta kroz vodeni rastvor. Protok vazduha može na primer da bude bilo koji od dole opisanih protoka vazduha. U drugom primeru izvođenja, pomenuto močenje se izvodi u odsustvu aeracije.

[0100] Klijanje zrna može da se izvede bilo kojim konvencionalnim postupkom poznatim stručnjaku. Jedan neograničavajući primer uključuje klijanje na temperaturi u rasponu od 10 do 25 °C, na primer u rasponu od 13 do 18 °C, opciono uz promenu temperature, tokom vremenskog raspona od 1 do 4 dana. Tokom klijanja, zrna žitarica mogu da budu podvrgnuta vlažnim uslovima kako bi se održao željeni sadržaj vode, na primer sadržaj vode u rasponu od 40 do 45%.

[0101] Pored toga, zrna žitarica mogu da budu podvrgnuta strujanju vazduha tokom klijanja, na primer kao što je detaljnije opisano u nastavku.

[0102] Neograničavajući primer klijanja prikazan je na slici 1. Pomenuti vlažni uslovi se mogu postići prskanjem vodenog rastvora na pomenuta zrna žitarica. Vlažni uslovi se takođe mogu postići propuštanjem toka vlažnog vazduha kroz zrna žitarica koja klijaju.

[0103] Pomenuti protok vazduha može da bude bilo koji adekvatan protok vazduha, koji može podržati klijanje. Stručnjak će moći da odredi adekvatan protok vazduha, npr. na osnovu Briggs et al., 1998 ili Kunze, 2014, Technology Brewing and Malting. Protok vazduha može da bude protok bilo kog gasa koji sadrži ili se čak sastoji od O2. U jednom primeru izvođenja, protok vazduha može da bude najmanje 2 L, poželjno najmanje 3 L, poželjnije najmanje 4 L, još poželjnije najmanje 5 L, čak još poželjnije najmanje 6 L O2po kg zrna žitarica na sat. Težina pomenutih zrna žitarica je suva težina. Na primer, protok vazduha može da bude u rasponu od 2 do 100 L, na primer u rasponu od 2 do 75 L, kao što je u rasponu od 2 do 50 L, na primer u rasponu od 4 do 100 L, za na primer u rasponu od 4 do 75 L, kao što je u rasponu od 4 do 50 L, na primer u rasponu od 6 do 100 L, na primer u rasponu od 6 do 75 L, kao što je u rasponu od 6 do 50 L O2po kg zrna žitarica (suva težina) na sat. Protok vazduha često može da bude u obliku atmosferskog vazduha. Prema tome, protok vazduha može da bude najmanje 10 L, poželjno najmanje 15 L, poželjnije najmanje 20 L, još poželjnije najmanje 25 L, čak još poželjnije najmanje 30 L atmosferskog vazduha po kg zrna žitarica na sat. Težina pomenutih zrna žitarica je suva težina. Na primer, protok vazduha može da bude u rasponu od 10 do 500 L, na primer u rasponu od 10 do 375 L, kao što je u rasponu od 10 do 250 L, na primer u rasponu od 20 do 500 L, na primer u rasponu od 20 do 375 L, kao što je u rasponu od 20 do 250 L, na primer u rasponu od 30 do 500 L, na primer u rasponu od 30 do 375 L, kao što je u rasponu od 30 do 250 L atmosferskog vazduha po kg zrna žitarica (suve težine) na sat.

[0104] U jednom primeru izvođenja, trajanje čitavog koraka klijanja postupaka za proizvodnju vodenog ekstrakta žitarica ili za proizvodnju napitka dobijenog od njega, kako je ovde opisano, nije duže od 108 h. U jednom primeru izvođenja, korak klijanja nije duži od 96 h. U jednom primeru izvođenja, korak klijanja se izvodi tokom vremenskog raspona od 48 do 108 h. U jednom primeru izvođenja, korak klijanja se izvodi tokom vremenskog raspona od 72 do 108 h, kao što je približno 96 h. U jednom primeru izvođenja, korak klijanja se izvodi tokom vremenskog raspona od 65 do 80 h, kao što je približno 72 h.

[0105] Aspekt otkrića je da se trajanje klijanja meri od inicijacije klijanja, na primer, trajanje klijanja može da se meri od inicijacije klijanja i do početka finog usitnjavanja proklijalih zrna žitarica.

[0106] U nekim primerima izvođenja, nakon klijanja, zrna žitarica imaju sadržaj vode od najmanje 30%, poželjno najmanje 35%, poželjnije od najmanje 40%, na primer u rasponu od 40 do 45%. U nekim primerima izvođenja, zrna žitarica imaju sadržaj vode od najmanje 30% nakon klijanja, kao što je najmanje 31%, kao što je najmanje 32%, kao što je najmanje 33%, kao što je najmanje 34%, kao što je na najmanje 35%, kao što je najmanje 36%, kao što je najmanje 37%, kao što je najmanje 38%, kao što je najmanje 39%, kao što je najmanje 40%, kao što je najmanje 45%, kao što je najmanje 46%, kao što je najmanje 47%, kao što je najmanje 48%, kao što je najmanje 49%, kao što je najmanje 50%.

[0107] Sadržaj vode u zrnu žitarica može da se utvrdi određivanjem težine zrna žitarica, nakon čega sledi sušenje pomenutih zrna žitarica i određivanje težine osušenih zrna žitarica. Razlika u težini vlažnih i suvih zrna žitarica smatra se vodom, a sadržaj vode se daje kao težina vode podeljena sa ukupnom težinom zrna žitarica (vlažnih zrna žitarica). Sadržaj vode se takođe može odrediti upoređivanjem težine zrna žitarica pre inicijacije klijanja sa težinom zrna žitarica tokom ili posle klijanja, pri čemu su proklijala zrna žitarica bila podvrgnuta kratkom centrifugiranju kako bi se uklonila sva površinska voda. Sadržaj vode dat u % je stoga tež./tež. %.

[0108] Klijanje zrna žitarica može se vršiti na bilo kojoj korisnoj temperaturi. Međutim, može da bude poželjno da zrna žitarica klijaju na temperaturi od najmanje 10 °C. Konkretno, zrna žitarica mogu da klijaju u rasponu od 10 do 25 °C, poželjno u rasponu od 12 do 25 °C, kao što je u rasponu od 15 do 20 °C.

[0109] U nekim primerima izvođenja jedan ili više egzogenih enzima može da bude dodat tokom koraka klijanja, npr. kako je opisano u WO2016/071463. Postupak klijanja se opciono može skratiti dodavanjem jednog ili više jedinjenja koja mogu da ubrzaju klijanje. Na primer, može da se doda fitohormon giberelinska kiselina (GA) - bilo na početku ili tokom inkubacije. GA „aktivira“ ekspresiju gena u svojim ciljnim ćelijama, odnosno u aleuronu i epitelu skuteluma ječmenog zrna, uključujući gene koji kodiraju endogene enzime neophodne za hidrolizu skroba, uskladištenih proteina i polisaharida ćelijskog zida.

[0110] Poželjno je da se zrna žitarica fino usitnjavaju odmah nakon klijanja. Shodno tome, postupci ovog otkrića poželjno ne sadrže korak sušenja između koraka klijanja i finog usitnjavanja zrna žitarica. Poželjno je da postupak prema otkriću ne sadrži korak sušenja u peći pomenutih proklijalih zrna žitarica.

Proklijala zrna žitarica

[0111] Otkriće se odnosi na postupak za proizvodnju napitka i postupak za proizvodnju vodenog ekstrakta žitarica, pri čemu pomenuti postupak obuhvata korak proizvodnje proklijalih zrna žitarica.

[0112] Proklijala zrna žitarica poželjno se odlikuju aktivnošću jednog ili više hidrolitičkih enzima, koje obezbeđuju na primer α-amilaze, β-amilaze, enzimi za razlaganje grana skroba (kao što su granične dekstrinaze), α-glukozidaze i proteaze.

[0113] Početak aktivnosti hidrolitičkih enzima često može da se javlja na vremenski koordinisan način, pa se aktivnost nekih hidrolitičkih enzima može koristiti kao marker za aktivnost drugih hidrolitičkih enzima.

[0114] Shodno tome, poželjno je da proklijala zrna žitarica imaju adekvatan nivo merljive aktivnosti α-amilaze. Poželjno je da proklijala zrna žitarica imaju merljivu aktivnost α-amilaze od najmanje 30 U/g, kao što je najmanje 50 U/g, na primer najmanje 100 U/g zrna žitarica (suve težine). Aktivnost α-amilaze se poželjno određuje prema standardnim postupcima, npr. korišćenjem kompleta Ceralpha (K-CERA) kompanije Megazyme, Irska. Konkretno, aktivnost αamilaze se može odrediti kao što je opisano u primeru 5 u nastavku.

[0115] Takođe može da bude poželjno da proklijala zrna žitarica imaju adekvatan nivo merljive aktivnosti β-amilaze. Poželjno je da proklijala zrna žitarica imaju merljivu aktivnost β-amilaze od najmanje 5 U/g, kao što je najmanje 10 U/g zrna žitarica (suve težine). Poželjno, aktivnost βamilaze se određuje prema standardnim postupcima, npr. korišćenjem kompleta Betamyl (K-BETA3) kompanije Megazyme, Irska. Konkretno, aktivnost β-amilaze se može odrediti kao što je opisano u primeru 5 u nastavku.

[0116] Takođe je poželjno da proklijala zrna žitarica imaju adekvatan nivo aktivnosti granične dekstrinaze. Poželjno je da proklijala zrna žitarica imaju aktivnost granične dekstrinaze od najmanje 2 mU/g, kao što je najmanje 5 U/g, na primer najmanje 10 U/g, kao što je na primer najmanje 20 U/g zrna žitarica (suve težine). Poželjno, aktivnost granične dekstrinaze se određuje prema standardnim postupcima, npr. korišćenjem kompleta Limit Dextrizyme T-LDZ1000 kompanije Megazyme, Irska. Konkretno, aktivnost granične dekstrinaze se može odrediti kao što je opisano u primeru 5 u nastavku.

[0117] Zanimljivo je da proklijala zrna žitarica prema otkriću imaju značajno smanjene korenčiće u poređenju sa konvencionalnim zelenim sladom. Dakle, proklijala zrna žitarica prema otkriću poželjno sadrže najviše 10 g korenčića na 100 g proklijalog ječma, kao što je najviše 8 g korenčića na 100 g proklijalog ječma, poželjno najviše 6 g korenčića na 100 g proklijalog ječma, još poželjnije najviše 4 g korenčića na 100 g proklijalog ječma, pri čemu se i masa korenčića i masa proklijalog ječma daju kao suva težina. Poželjno je da se masa korenčića odredi kao što je opisano u primeru 3 u nastavku.

[0118] Kao što je gore pomenuto, poželjno je da vodeni ekstrakt dobijen tokom ukomljavanja ima dovoljno nizak viskozitet da omogući dobru filtrabilnost smeše komine. Kao što je gore takođe detaljno opisano, rastvorljivi β-glukani mogu da doprinesu visokom viskozitetu vodenog ekstrakta. Filtrabilnost često može da zavisi od nivoa β-glukana. Shodno tome, može da bude poželjno da nivo β-glukana u proklijalim zrnima žitarica nije previsok.

[0119] Poželjno, proklijala zrna žitarica imaju sadržaj β-glukana ispod 5%, na primer ispod 3% tež./tež., kao što je ispod 2% tež./tež., na primer ispod 1.5% tež./tež., poželjno ispod 1.0% tež./tež. na bazi suve težine.

Fino usitnjavanje proklijalih zrna žitarica

[0120] Postupci prema otkriću za proizvodnju napitka i postupak za proizvodnju vodenog ekstrakta žitarica, gde pomenuti postupci obuhvataju korak finog usitnjavanja proklijalih zrna žitarica.

[0121] U vreme kada se pomenuta zrna žitarica fino usitnjavaju, poželjno je da još uvek imaju visok sadržaj vode, poželjno, pomenuta zrna žitarica imaju sadržaj vode od najmanje 20%, na primer ne manje od 25%, kao što je ne manje od 30%, poželjno ne manje od 35%, na primer ne manje od 40%. U nekim primerima izvođenja, zrna žitarica imaju sadržaj vode od ne manje od 30% u bilo kom trenutku nakon klijanja i do finog usitnjavanja zrna žitarica, kao što je ne manje od 31%, kao što je ne manje od 32%, kao što je ne manje od 33%, kao što je ne manje od 34%, kao što je ne manje od 35%, kao što je ne manje od 36%, kao što je ne manje od 37%, kao što je ne manje od 38%, kao što je ne manje od 39 %, kao što je ne manje od 40%, kao što je ne manje od 45%, kao što je ne manje od 46%, kao što je ne manje od 47%, kao što je ne manje od 48%, kao što je ne manje od 49%, kao što je ne manje od 50%.

[0122] Na primer, proklijala zrna žitarica mogu se direktno preneti sa klijanja u opremu za fino deljenje zrna žitarica. Shodno tome, proklijala zrna žitarica mogu imati isti sadržaj vode u trenutku finog usitnjavanja kao zrna žitarica neposredno nakon klijanja, na primer sadržaj vode koji je gore opisan u odeljku „Klijanje“. Konkretno, postupci generalno ne obuhvataju korak sušenja proklijalih zrna žitarica podvrgavanjem povišenim temperaturama. Poželjno je da proklijala zrna žitarica nemaju sadržaj vode manji od 20%, na primer ne manji od 25%, kao što je ne manji od 30%, poželjno ne manji od 35%, na primer ne manji od 40% u bilo kom trenutku nakon klijanja, a pre finog usitnjavanja pomenutih zrna žitarica. Prema tome, postupci poželjno ne sadrže korak sušenja proklijalih zrna žitarica u peći.

[0123] Proklijala zrna žitarica mogu se fino usitniti korišćenjem bilo koje opreme pogodne za fino usitnjavanje zrna žitarica sa sadržajem vode većim od 20%, na primer ne manjim od 25%, kao što je ne manjim od 30%, poželjno ne manjim od 35%, čak poželjnije ne manjim od 40%, još poželjnije ne manjim od 45%. Na primer, proklijala zrna žitarica mogu da budu podvrgnuta mlevenju, na primer mokrom mlevenju. Korisni mlinovi za mlevenje proklijalih zrna žitarica uključuju mlinove dostupne kod Millstar, SAD. Proklijala zrna žitarica takođe mogu da budu podvrgnuta drobljenju.

[0124] Zrna žitarica su, generalno, fino usitnjena do te mere da se može napraviti vodeni ekstrakt fermentabilnih šećera zrna žitarica. Dakle, zrna žitarica su dovoljno usitnjena, tako da 7 L vodenog ekstrakta od 1 kg pomenutih fino usitnjenih zrna žitarica ima specifičnu težinu od najmanje 8°Plato.

[0125] U primerima izvođenja otkrića, kada je vodeni ekstrakt napravljen od proklijalih zrna žitarica i jednog ili više pomoćnih sastojaka, pomenuti pomoćni sastojci takođe mogu da budu fino usitnjeni. Konkretno, ovo može da bude slučaj kada pomenuti pomoćni sastojci sadrže neproklijala zrna žitarica. Pomenuti pomoćni sastojci mogu da budu fino usitnjeni, npr. mleveni u odvojenim postupcima.

[0126] Međutim, otkrićem je takođe obuhvaćeno fino usitnjavanje pomoćnih sastojaka zajedno sa proklijalim zrnima žitarica. Slično, ako je vodeni ekstrakt napravljen od proklijalih zrna žitarica i slada sušenog u peći, tada pomenuti slad sušen u peći može da bude fino usitnjen, npr. mleven u odvojenim postupcima. Međutim, otkrićem je takođe obuhvaćeno fino usitnjavanje slada sušenog u peći zajedno sa proklijalim zrnima žitarica.

Pripremanje vodenog ekstrakta

[0127] Postupci prema otkriću takođe obuhvataju korak pripremanja vodenog ekstrakta fino usitnjenih proklijalih zrna žitarica. Pomenuti korak može, na primer, da bude korak ukomljavanja.

[0128] Gore pomenuti vodeni ekstrakt može se, uopšteno, pripremiti inkubacijom fino usitnjenih zrna žitarica u vodi ili u vodenom rastvoru, koji se ovde takođe naziva „rastvor za ukomljavanje“. Rastvor za ukomljavanje može da bude bilo koji vodeni rastvor, ali se obično sastoji od vode, kao što je voda iz slavine kojoj se može dodati jedan ili više dodatnih agenasa. Da bi se napravila razlika između dodatnih agenasa koji se dodaju tokom klijanja, ovi dodatni agensi se mogu nazvati „dodatnim agensima za ukomljavanje“. Prema tome, rastvor za ukomljavanje može da se sastoji od vode (npr. vode iz slavine) kojoj se dodaje jedan ili više dodatnih agenasa za ukomljavanje. Agensi za ukomljavanje mogu da budu prisutni u rastvoru za ukomljavanje od samog početka ili mogu da se dodaju tokom postupaka pripremanja vodenog ekstrakta.

[0129] Pomenuti dodatni agensi za ukomljavanje mogu da budu enzimi. Prema tome, rastvor za ukomljavanje može da sadrži jedan ili više enzima. Pomenuti enzimi mogu da se dodaju rastvoru za ukomljavanje na početku, ili kasnije, tokom postupaka.

[0130] Pomenuti enzimi mogu, na primer, da budu jedan ili više hidrolitičkih enzima. Pogodni enzimi uključuju lipaze, enzime koji razgrađuju skrob (npr. amilaze), glukanaze [poželjno (1-4)-i/ili (1,3;1,4)-β-glukanaze] i/ili ksilanaze (kao što su arabinoksilanaze), i/ili proteaze, ili smeše enzima koje sadrže jedan ili više od gore pomenutih enzima, npr. Cereflo, Ultraflo ili Ondea Pro (Novozymes). Na primer, rastvor za ukomljavanje može da sadrži jedan ili više hidrolitičkih enzima pri čemu je najmanje jedan hidrolitički enzim izabran iz grupe koja se sastoji od α-amilaze, β-amilaze, granične dekstrinaze, pululanaze, β-glukanaze, ksilanaze, glukoamilaze i proteaze.

[0131] U jednom primeru izvođenja otkrića rastvor za ukomljavanje sadrži jedan ili više od sledećih enzima:

⁃ β -glukanaza, kao što je endo-(1,3;1,4)-β-glukanaza ili endo-1,4-β-glukanaza.

⁃ ksilanaza, kao što je endo- ili egzo-1,4-ksilanaza, arabinofuranozidaza ili esteraza ferulne kiseline

⁃ α-amilaza

⁃ pululanaza ili granična dekstrinaza

⁃ glukoamilaza.

[0132] Odluke o tome da li dodati enzime u rastvor za ukomljavanje, kao i koje enzime dodati, mogu da zavise od zrna žitarica koja se koriste. Prema tome, u primerima izvođenja otkrića, kada je žitarica biljka ječma sa niskim nivoima β-glukana (npr. kao što je gore opisano u odeljku „Ječam“), tada u rastvor za ukomljavanje može da se doda malo ili nimalo β-glukanaze.

[0133] U jednom primeru izvođenja poželjno je da se tokom ukomljavanja ne dodaje egzogena proteaza. Dodavanje proteaze može da bude manje poželjno, jer proteaze mogu da utiču na aktivnost enzima. U jednom primeru izvođenja poželjno je da se tokom ukomljavanja ne dodaje egzogena lipaza.

[0134] U jednom primeru izvođenja poželjno je da se tokom pripremanja vodenog ekstrakta koristi najviše 700 U, poželjno najviše 350 U egzogene glukoamilaze po g proklijalih zrna žitarica (suve materije).

[0135] U jednom primeru izvođenja poželjno je da se tokom pripremanja vodenog ekstrakta koristi najviše 400 AGU, poželjno najviše 200 AGU egzogene glukoamilaze po kg proklijalih zrna žitarica (suve materije). Određivanje AGU može da se izvede kao što je opisano u US7060468.

[0136] U drugom primeru izvođenja poželjno je da kombinacija egzogene glukoamilaze i αamilaze koja se koristi tokom pripremanja vodenog ekstrakta ne prelazi 700 U, poželjno ne prelazi 350 U po g proklijalih zrna žitarica (suve materije). Kombinovana aktivnost glukoamilaze i αamilaze može da se odredi na primer korišćenjem K-CERA 01/12 (protokol i komplet dostupni kod Megazyme, Irska).

[0137] U jednom primeru izvođenja poželjno je da se tokom pripremanja vodenog ekstrakta koristi najviše 20 U egzogene pululanaze ili granične dekstrinaze po kg proklijalih zrna žitarica (suve materije).

[0138] U jednom primeru izvođenja poželjno je da se tokom pripremanja vodenog ekstrakta koristi najviše 100 PUN pululanaze po kg proklijalih zrna žitarica (suve materije). Određivanje PUN može da se izvede kao što je opisano u US7060468.

[0139] Pomenuti dodatni agensi za ukomljavanje mogu takođe da budu pomoćni sastojci, na primer neproklijala zrna žitarica, sirupi ili šećeri. Ako se pomoćni sastojci dodaju, oni takođe mogu da budu fino usitnjeni, npr. mlevenjem ili drobljenjem. Ako je pomoćni sastojak zrno žitarica, na primer zrno žitarica koje nije bilo podvrgnuto klijanju, ono tipično može da bude fino usitnjeno ili samleveno. Ako su pomoćni sastojci sirupi, šećeri ili slično, oni uglavnom neće biti samleveni. Pomoćni sastojci kao što su šećeri ili sirupi mogu se dodati u rastvor za ukomljavanje u bilo kom trenutku u postupku; međutim, takvi pomoćni sastojci se takođe mogu dodati u vodeni ekstrakt, ili kasnije tokom postupka za pripremu napitka, kao što je opisano u nastavku. Uglavnom, pomoćni sastojci se dodaju u manjim količinama nego proklijala zrna žitarica. Dakle, najmanje 50%, poželjno najmanje 70%, na primer, najmanje 90% ugljenih hidrata vodenog ekstrakta potiče iz proklijalih zrna žitarica, dok pomoćni sastojci poželjno čine samo manji deo ugljenih hidrata. Ako je pomoćni sastojak neproklijalo zrno žitarica, onda je poželjno da proklijala zrna žitarica čine najmanje 50% (tež./tež.), poželjno najmanje 70% (tež./tež.), poželjnije najmanje 90% (tež./tež.) ukupnih zrna žitarica određeno prema suvoj težini.

[0140] Dodatni agensi za ukomljavanje mogu takođe biti slad sušen u peći. Ako se dodaje slad sušen u peći, i on može da bude fino usitnjen, npr. mlevenjem ili drobljenjem. Uglavnom, slad sušen u peći se dodaje u manjim količinama nego proklijala zrna žitarica. Dakle, proklijala zrna žitarica (tj. proklijala zrna žitarica koja nisu sušena u peći) čine najmanje 80% (tež./tež.), poželjno najmanje 90% (tež./tež.), poželjnije najmanje 95% (tež./tež.) ukupnih zrna žitarica i slada određeno prema suvoj težini. U poželjnim primerima izvođenja, ne dodaje se slad sušen u peći.

[0141] Pomenuti dodatni agensi za ukomljavanje, poželjno prehrambenog kvaliteta, takođe mogu da budu so, na primer CaCl2.

[0142] Pomenuti dodatni agensi za ukomljavanje mogu takođe da budu kiselina, poželjno kiselina prehrambenog kvaliteta, na primer H3PO4.

[0143] Vodeni ekstrakt se generalno pripremanje inkubacijom fino usitnjenih proklijalih zrna žitarica u rastvoru za ukomljavanje na jednoj ili više unapred određenih temperatura. Pomenuta unapred određena temperatura može ovde da se nazove i „temperaturom ukomljavanja“. Pomenute temperature ukomljavanja mogu na primer da budu uobičajene temperature koje se koriste za ukomljavanje.

[0144] Temperatura ukomljavanja se generalno ili održava konstantnom (izotermno ukomljavanje), ili se postepeno povećava, na primer povećava se na sekvencijalan način. U oba slučaja, rastvorljive supstance u fino usitnjenim proklijalim zrnima žitarica se oslobađaju u pomenuti rastvor za ukomljavanje čime se formira vodeni ekstrakt.

[0145] Temperatura(e) ukomljavanja su tipično temperatura(e) u rasponu od 30 do 90 °C, kao što je u rasponu od 40 do 85 °C, na primer u rasponu od 50 do 80 °C. Temperature ukomljavanja se mogu odabrati prema vrsti žitarice koja se koristi. Shodno tome, u primerima izvođenja otkrića, kada su zrna žitarica ječam sa niskim nivoima ili odsustvom aktivnosti lipoksigenaze (LOX) i/ili aktivnosti metil metionin transferaze (MMT) (videti detalje u nastavku u odeljku „Ječam“), temperatura ukomljavanja može da bude niža, na primer u rasponu od 35 do 69 °C.

[0146] Inkubacija u rastvoru za ukomljavanje može da se izvoditi tokom bilo kog pogodnog vremena. Vreme inkubacije u rastvoru za ukomljavanje u posudi za ukomljavanje može, npr. da bude tokom vremenskog raspona od 60 do 300 min, kao što je u rasponu od 60 do 240 min, na primer u rasponu od 90 do 300 min, kao što je u rasponu od 90 do 240 min, na primer u rasponu od 90 do 270 min. Na primer, pomenuto vreme za inkubaciju u rastvoru za ukomljavanje može da bude bilo koje vreme koje se koristi kod konvencionalnog ukomljavanja. Jedan neograničavajući primer odgovarajućeg ukomljavanja je:

(1) Ukomljavanje na temperaturi u rasponu od 50-60 °C, kao što je približno 55 °C, u rasponu od 10 do 30 min, kao što je približno 15 min.

(2) Zagrevanje do temperature u rasponu od 60 do 70 °C, poželjno u rasponu od 60 do 65 °C, kao što je približno 62 °C, u rasponu od 30 do 90 min, kao što je približno 60 min. (3) Zagrevanje do temperature u rasponu od 70 do 75 °C, kao što je približno 72 °C, u rasponu od 5 do 30 min, kao što je približno 15 min.

(4) Zagrevanje do temperature u rasponu od 75 do 80 °C, poželjno u rasponu od 75 do 78 °C, kao što je približno 78 °C, u rasponu od 5 do 15 min, kao što je približno 10 min.

[0147] Nakon inkubacije u rastvoru za ukomljavanje u posudi za ukomljavanje, fino usitnjena proklijala zrna žitarica u rastvoru za ukomljavanje mogu da se prenesu u drugi kontejner, npr. rezervoar za filtraciju i inkubiraju dodatno vreme na povišenoj temperaturi, npr. u rasponu od 70 do 78 °C tokom vremenskog raspona od 30 do 120 min.

[0148] Dakle, inkubacija u rastvoru za ukomljavanje može pored gore pomenutih koraka takođe da uključuje korak (5):

(5) Zagrevanje do temperature u rasponu od 70 do 78 °C, poželjno u rasponu od 75 do 78 °C, kao što je približno 78 °C, u rasponu od 30 do 120 min, kao što je približno 60 min.

[0149] Neograničavajući primeri mogu se naći u literaturi o pivarstvu, npr. u Briggs et al. (iznad) i Hough et al. (iznad).

[0150] Poželjno je da korak ukomljavanja ne uključuje ključanje fino usitnjenih zrna žitarica. Drugim rečima, tokom inkubacije ekstrakta fino usitnjenih žitarica u vodi ili vodenom rastvoru, temperatura se sve vreme održava ispod tačke ključanja. Međutim, nakon odvajanja vodenog ekstrakta od tropa, vodeni ekstrakt može da se prokuva. Tipično, korak pripremanja vodenog ekstrakta fino usitnjenih proklijalih zrna žitarica se izvodi na temperaturama znatno ispod temperature ključanja, tipično na temperaturama ispod 90 °C, kao što je ispod 85 °C, na primer ispod 80 °C.

[0151] Posle inkubacije u rastvoru za ukomljavanje, vodeni ekstrakt tipično može da se odvoji, npr. putem filtracije, na vodeni ekstrakt i zaostale nerastvorene čvrste čestice, ove poslednje takođe označene kao „trop“. Filtriranje se može, na primer, izvesti u rezervoaru za filtraciju. Alternativno, filtriranje može da bude filtriranje kroz filter za kominu. Tako dobijeni vodeni ekstrakt može se takođe označiti kao „prva sladovina“.

[0152] Dodatna tečnost, kao što je voda, može da se doda tropu tokom postupaka koji se naziva i ispiranje. Posle ispiranja i filtriranja, može da se dobije „druga sladovina“. Dalje sladovine mogu da se pripremanja ponavljanjem postupka.

[0153] Prema tome, vodeni ekstrakt može da bude sladovina, npr. prva sladovina, druga sladovina, dalja sladovina ili njihova kombinacija.

Vodeni ekstrakt

[0154] Vodeni ekstrakt pripremljen postupcima prema otkriću može da ima niz korisnih svojstava, uključujući - ali ne ograničavajući se na - svojstva opisana u ovom odeljku. Vodeni ekstrakt pripremljen ovim postupcima može dalje da se obradi u napitak kako je ovde opisano.

[0155] Kao što je gore pomenuto, vodeni ekstrakt može da se podvrgne koraku filtracije. Shodno tome, može da bude poželjno da sladovina ima dobru filtrabilnost. Na primer, može da bude tehnički izazovno filtrirati tečnost visoke viskoznosti - razlog zbog kojeg može da bude poželjno da vodeni ekstrakt ima nizak viskozitet.

[0156] Filtrabilnost se može odrediti na više načina. U jednom primeru izvođenja, filtrabilnost se određuje kao količina tečnosti dobijene nakon filtriranja kroz filter- levak opremljen filter papirom tokom 1 sata. U jednom primeru izvođenja, vodeni ekstrakt može imati filtrabilnost od najmanje 250 mL, kada se 400 mL rastvora za ukomljavanje koji sadrži 100 g fino usitnjenih zrna žitarica doda u pomenuti filter-levak. Filtrabilnost se takođe može odrediti kao procenat zapremine tečnosti dobijene posle filtracije tokom 60 min, kao što je gore opisano, u poređenju sa zapreminom tečnosti vodenog ekstrakta dodatog u pomenuti levak. Tako, u jednom primeru izvođenja, filtrabilnost može na primer da bude najmanje 50%, kao što je najmanje 60% (zapr./zapr.). Konkretno, filtrabilnost se može odrediti kao što je opisano u primeru 3 međunarodne prijave patenta PCT/EP2017/065498.

[0157] Filtrabilnost može često da zavisi od nivoa β-glukana. Shodno tome, može da bude poželjno da nivo β-glukana nije previsok. Na primer, u jednom primeru izvođenja vodeni ekstrakt može da sadrži najviše 200 mg/L, poželjno najviše 150 mg/L β-glukana.

[0158] U nekim primerima izvođenja, vodeni ekstrakt žitarice ne sadrži melanoidine.

Postupak za dobijanje vodenog ekstrakta zrna žitarica

[0159] U jednom primeru izvođenja, otkriće se odnosi na postupak za proizvodnju vodenog ekstrakta žitarica, pri čemu pomenuti postupak obuhvata sledeće korake:

a) obezbeđivanje zrna žitarica;

b) podvrgavanje zrna žitarica koraku klijanja tokom vremenskog raspona od 48 do 108 h čime se dobijaju proklijala zrna, pri čemu pomenuti korak klijanja obuhvata inkubaciju pomenutih zrna u vodenom rastvoru sve dok zrna ne budu imala sadržaj vode od najmanje 30%, pri čemu se najmanje 2 L O2 po kg suve težine zrna žitarica propušta kroz pomenuti vodeni rastvor na sat;

c) fino usitnjavanje pomenutih proklijalih zrna, dok pomenuta proklijala zrna imaju sadržaj vode od najmanje 20%; i

d) pripremanje vodenog ekstrakta pomenutih mlevenih fino usitnjenih proklijalih zrna, pod uslovom da pomenuta zrna žitarica nemaju sadržaj vode ispod 20% u bilo kom trenutku između koraka b) i d);

čime se proizvodi vodeni ekstrakt žitarice.

[0160] U jednom primeru izvođenja, korak klijanja može da sadrži jedan ili više koraka močenja. Može da bude poželjno da trajanje čitavog koraka klijanja ne bude duže od 108 h, na primer, može da ne bude duže od 96 h. U jednom primeru izvođenja, korak klijanja se izvodi tokom vremenskog raspona od 72 do 108 h, kao što je približno 96 h. U jednom primeru izvođenja, korak klijanja se izvodi tokom vremenskog raspona od 65 do 80 h, kao što je približno 72 h.

[0161] Aspekt otkrića je da se trajanje klijanja meri od inicijacije klijanja.

[0162] U jednom primeru izvođenja, kraj klijanja može da bude početak finog usitnjavanja proklijalih zrna.

[0163] Podrazumeva se da fraza „pomenuta zrna žitarica nemaju sadržaj vode ispod 20% u bilo kom trenutku između koraka b) i d)“ uključuje, na primer, da pomenuta zrna žitarica mogu imati sadržaj vode iznad 20% u bilo kom trenutku od završetka koraka b) do inicijacije koraka d).

[0164] Predmetni postupci za pripremu vodenog ekstrakta žitarica ne sadrže korak sušenja u peći u bilo kom trenutku između koraka b) i d) iznad. U nekim primerima izvođenja, postupci ne sadrže korak sušenja u peći u bilo kom trenutku između koraka b) i c) iznad. U drugim primerima izvođenja, postupci ne sadrže korak sušenja u peći u bilo kom trenutku između koraka c) i d). Kao što je gore objašnjeno, ovo je zato što su pronalazači ovog otkrića iznenađujuće otkrili da se korak sušenja u peći može izostaviti i da se vodeni ekstrakti žitarica, posebno ekstrakti pogodni za proizvodnju napitka, mogu dobiti bez sušenja proklijalog zrna u peći. Kao što se može videti u primeru 3, rast korena zrna ječma proklijalog prema predmetnim postupcima je iznenađujuće značajno smanjen; stoga se korak sušenja u peći može izostaviti.

[0165] Zrna žitarica mogu da budu bilo koja od zrna žitarica opisanih u tekstu iznad. U jednom primeru izvođenja, biljka ječma je biljka ječma (Hordeum vulgare) deponovana 12.11. 2018. kod NCIMB pod pristupnim brojem NCIMB 43273 i nazvana „Mutant 2“; ili njeno potomstvo. Dakle, biljka ječma može da bude biljka ječma Mutant 2 deponovana 12. 11. 2018. kod NCIMB pod pristupnim brojem NCIMB 43273, ili bilo koja njena potomačka biljka ječma, pri čemu biljka ječma nosi G->A mutaciju nukleotida 2243 kodirajuće sekvence gena HvCslF6 (SEQ ID NO: 2) i/ili pri čemu gen HvCslF6 pomenute biljke ječma kodira mutantni protein HvCslF6 koji sadrži mutaciju Gly→Asp aminokiseline 748 sekvence SEQ ID NO: 1.

[0166] Zrna žitarica takođe mogu da budu potomstvo biljke kao što je mutirana biljka. U nekim primerima izvođenja, zrna ječma koja se koriste u postupcima otkrića su zrna iz biljke ječma koja nije dobijena isključivo pomoću suštinski biološkog postupaka. Ovde se smatra da potomstvo biljke ječma dobijene tehničkim postupkom nije isključivo dobijeno suštinski biološkim postupkom, jer je matična biljka dobijena tehničkim postupkom.

[0167] Postupci za dobijanje takvih biljaka opisani su u WO 2019/129736.

[0168] Važno je da ovi postupci ne zahtevaju korak sušenja u peći u bilo kom trenutku nakon klijanja, tj. sušenje u peći se ne vrši nakon klijanja, posle mlevenja ili finog usitnjavanja proklijalih zrna, ili nakon pripremanja vodenog ekstrakta. Shodno tome, u poželjnim primerima izvođenja predmetni postupci ne obuhvataju korak sušenja u peći u bilo kom trenutku do dobijanja vodenog ekstrakta žitarica koji se može koristiti za pripremu napitka, na primer pripremanjem piva.

[0169] U nekim primerima izvođenja, nivo aminokiselina sadržanih u vodenom ekstraktu žitarica, kao što je sladovina, pripremljenom prema ovim postupcima je uporediv sa nivoom aminokiselina sadržanih u vodenom ekstraktu žitarica, kao što je sladovina, pripremljenom konvencionalnim postupcima koji obuhvataju korak sušenja u peći. U nekim primerima izvođenja, nivo aminokiselina u vodenom ekstraktu žitarica, kao što je sladovina, pripremljenom prema ovim postupcima je u rasponu od 500 do 3000 mg/L, kao što je između 600 i 2900 mg/L, kao što je između 700 i 2800 mg/L, kao što je između 800 i 2700 mg/L, kao što je između 900 i 2600 mg/L, kao što je između 1000 i 2500 mg/L, kao što je između 1100 i 2400 mg/L, kao što je između 1200 i 2200 mg/L, kao što je između 1300 i 2100 mg/L, kao što je između 1400 i 2000 mg/L. U nekim primerima izvođenja, nivo aminokiselina u vodenom ekstraktu žitarica, kao što je sladovina, pripremljenom prema ovim postupcima je najmanje 500 mg/L, kao što je najmanje 600 mg/L, kao što je najmanje 700 mg/L, kao što je najmanje 800 mg/L, kao što je najmanje 900 mg/L, kao što je najmanje 1000 mg/L, kao što je najmanje 1250 mg/L, kao što je najmanje 1500 mg/L, kao što je najmanje 1600 mg/L, kao što je najmanje 1700 mg/L, kao što je najmanje 1800 mg/L, kao što je najmanje 1900 mg/L, kao što je najmanje 2000 mg/L. Nivo aminokiselina predstavlja nivo ukupnih aminokiselina u vodenom ekstraktu žitarica, kao što je sladovina, na primer izmeren posle 24 h, 48 h, 72 h, 96 h ili 108 h klijanja, poželjno izmeren posle 48 h do 108 h klijanja kao što je gore opisano. Stručnjaku su poznati postupci za merenje nivoa aminokiselina.

[0170] Nivoi fermentabilnih ugljenih hidrata prisutnih u vodenom ekstraktu žitarica, kao što je sladovina, pripremljenom prema ovim postupcima su poželjno nepromenjeni u poređenju sa nivoima fermentabilnih ugljenih hidrata prisutnih u vodenom ekstraktu žitarica, kao što je sladovina, pripremljenom konvencionalnim postupcima koji uključuju korak sušenja u peći. U nekim primerima izvođenja, nivoi fermentabilnih ugljenih hidrata (tj. zbir svih fermentabilnih ugljenih hidrata) je u rasponu od 5 do 20 mg/100 mL, kao što je između 6 i 19 mg/100 mL, kao što je između 7 i 18 mg/100 mL, kao što je između 8 i 17 mg/100 mL, kao što je između 9 i 16 mg/100 mL, kao što je između 10 i 15 mg/100 mL, kao što je između 10 i 14 mg/100 mL, kao što je između 11 i 13 mg/100 mL, kao što je oko 12 mg/100 mL. U nekim primerima izvođenja, nivoi fermentabilnih ugljenih hidrata u sladovini pripremljenoj ovim postupcima su najmanje 5 mg/100 mL, kao što je najmanje 6 mg/100 mL, kao što je najmanje 7 mg/100 mL, kao što je najmanje 8 mg/100 mL, kao što je najmanje 9 mg/100 mL, kao što je najmanje 10 mg/100 mL, kao što je najmanje 11 mg/100 mL, kao što je najmanje 12 mg/100 mL, ili više. Nivo fermentabilnih ugljenih hidrata predstavlja nivo ukupnih fermentabilnih ugljenih hidrata u vodenom ekstraktu žitarica, kao što je sladovina, na primer izmeren posle 24 h, 48 h, 72 h, 96 h ili 108 h klijanja, poželjno izmereno posle 48 h do 108 h klijanja kao što je gore opisano. Stručnjaku su poznati postupci za merenje nivoa fermentabilnih ugljenih hidrata.

[0171] Nivoi invertnih šećera u vodenom ekstraktu žitarica, kao što je sladovina, dobijenom ovim postupcima su poželjno nepromenjeni u poređenju sa nivoima u vodenom ekstraktu žitarica, kao što je sladovina, dobijenom konvencionalnim postupcima koji uključuju korak sušenja u peći. U nekim primerima izvođenja, nivoi invertnih šećera u vodenom ekstraktu žitarica, kao što je sladovina, dobijenom ovim postupcima su u rasponu od 1 do 5 g/100 mL, kao što je između 1.5 i 4 g/100 mL, kao što je između 1.75 i 3.25 g/100 mL, kao što je između 2 i 3 g/100 mL, kao što je između 2.1 i 2.9 g/100 mL, kao što je između 2.3 i 2.8 g/100 mL, kao što je između 2.4 i 2.7 g/100 mL, kao što je između 2.5 i 2.6 mg/100 mL. U nekim primerima izvođenja, nivoi invertnih šećera su najmanje 1 mg/100 mL, kao što je najmanje 1.5 mg/100 mL, kao što je najmanje 1.6 mg/100 mL, kao što je najmanje 1.7 mg/100 mL, kao što je najmanje 1.8 mg/100 mL, kao što je najmanje 1.9 mg/100 mL, kao što je najmanje 2.0 mg/100 mL, kao što je najmanje 2.1 mg/100 mL, kao što je najmanje 2.2 mg/100 mL, kao što je najmanje 2.3 mg/100 mL, kao što je najmanje 2.4 mg/100 mL, kao što je najmanje 2.5 mg/100 mL. Nivo invertnih šećera predstavlja nivo ukupnih invertnih šećera u vodenom ekstraktu žitarica, kao što je sladovina, na primer izmeren posle 24 h, 48 h, 72 h, 96 h ili 108 h klijanja, poželjno izmeren posle 48 h do 108 h klijanja kao što je gore opisano. Stručnjaku su poznati postupci za merenje nivoa invertnih šećera.

Pripremanje napitaka

[0172] U nekim primerima izvođenja, postupci otkrića takođe obuhvataju korak prerade vodenog ekstrakta pripremljenog gornjim postupcima otkrića u napitak.

[0173] Dakle, u jednom aspektu je obezbeđen postupak za proizvodnju napitka, pri čemu pomenuti postupak obuhvata korake:

i. pripremanja vodenog ekstrakta postupkom koji obuhvata sledeće korake:

a) obezbeđivanje zrna žitarica;

b) podvrgavanje zrna žitarica koraku klijanja tokom vremenskog raspona od 48 do 108 h, čime se dobijaju proklijala zrna;

c) fino usitnjavanje pomenutih proklijalih zrna, dok pomenuta proklijala zrna imaju sadržaj vode od najmanje 20%; i

d) pripremanje vodenog ekstrakta pomenutih fino usitnjenih proklijalih zrna, pod uslovom da pomenuta zrna žitarica nemaju sadržaj vode ispod 20% u bilo kom trenutku između koraka b) i d);

čime se dobija vodeni ekstrakt žitarice;

i

ii. prerade pomenutog vodenog ekstrakta u napitak.

[0174] Vodeni ekstrakt se može kuvati sa ili bez hmelja, pri čemu se nakon toga može nazvati kuvanom sladovinom.

[0175] Prva, druga i dalje sladovine mogu da se kombinuju, a zatim podvrgnu zagrevanju ili kuvanju. Vodeni ekstrakt može da se zagreva ili kuva tokom bilo kog pogodnog vremena, npr. u rasponu od 60 min. do 120 min. Tokom zagrevanja ili kuvanja zapremina vodenog ekstrakta može da se smanji usled isparavanja. Može da bude poželjno da se zapremina vodenog ekstrakta smanji za manje od 8%, poželjno za manje od 5%. Ovo može značajno da smanji potrošnju energije.

[0176] Napitak može da se pripremi fermentacijom vodenog ekstrakta, npr. fermentacijom sladovine. Dakle, napitak može da se pripremi fermentacijom vodenog ekstrakta pomoću kvasca.

[0177] U jednom primeru izvođenja, napitak može da bude alkoholni napitak, kao što je pivo. U drugim primerima izvođenja, napitak može da bude bezalkoholni napitak na bazi proklijalih zrna žitarica. Bezalkoholni napitak, na primer, može da bude bezalkoholno pivo ili druge vrste bezalkoholnih napitaka, kao što je maltina. Poželjno je da napitak nije kvasna sladovina.

[0178] U jednom poželjnom izvođenju, napitak je pivo.

[0179] Vodeni ekstrakt prema otkriću se pripremanje od proklijalih zrna žitarica, koja nisu bila podvrgnuta sušenju u peći. Proklijala zrna žitarica, koja nisu sušena u peći, generalno imaju svetliju boju, i prema tome, postupci otkrića su posebno korisni za pripremu svetlijih piva, posebno za pripremu lager piva. Tamnija piva se takođe mogu pripremiti postupcima otkrića, npr. dodavanjem jednog ili više sladova sušenih u peći tokom ukomljavanja kao što je opisano u odeljku „Pripremanje napitaka“.

[0180] Dakle, otkriće se takođe odnosi na postupke za proizvodnju napitaka koji obuhvataju korake:

⁃ Pripremanja vodenog ekstrakta postupcima prema otkriću.

⁃ Prerade pomenutog ekstrakta u napitak.

[0181] Alkoholni napici - kao što je pivo - mogu se, prema postupcima ovog otkrića, proizvoditi od proklijalih zrna žitarica. Proklijala zrna žitarica, pored hmelja i kvasca, doprinose ukusu i boji piva.

[0182] Kada je vodeni ekstrakt pripremljen, on može da se preradi u pivo bilo kojim postupkom, uključujući konvencionalne postupke pripremanja piva. Neograničeni opisi primera pogodnih postupaka za proizvodnju piva mogu se naći, na primer, u publikacijama Briggs et al. (1981) i Hough et al. (1982). Brojne, redovno ažurirane postupke za analizu proizvoda od ječma i piva obezbeđuju, na primer, ali bez ograničenja, Američko udruženje hemičara za žitarice (1995), Američko društvo hemičara pivarstva (1992), Evropska konvencija o pivu (1998) i Institut za pivarstvo (1997). Poznato je da se u svakoj konkretnoj pivari primenjuju mnoge specifične procedure, sa najznačajnijim varijacijama koje se odnose na preferencije lokalnih potrošača. Bilo koji takav postupak za proizvodnju piva može da se koristi sa ovim otkrićem.

[0183] Prvi korak proizvodnje piva iz vodenog ekstrakta poželjno uključuje zagrevanje pomenutog vodenog ekstrakta kao što je gore opisano, nakon čega sledi sledeća faza hlađenja i opciono vrtloženja. Jedno ili više dodatnih jedinjenja može se dodati u vodeni ekstrakt, npr. jedno ili više dodatnih jedinjenja opisanih u nastavku u odeljku „Dodatna jedinjenja“. Nakon hlađenja, vodeni ekstrakt se može preneti u rezervoare za fermentaciju koji sadrže kvasac, npr. pivski kvasac, kao što je S. pastorianus ili S. cerevisiae. Vodeni ekstrakt može da se fermentiše tokom bilo kog pogodnog vremenskog perioda, generalno u rasponu od 1 do 20, kao što je 1 do 10 dana. Fermentacija se vrši na bilo kojoj korisnoj temperaturi, npr. na temperaturi u rasponu od 10 do 20 °C. Postupci takođe mogu da sadrže dodavanje jednog ili više enzima, npr. jedan ili više enzima može da se doda sladovini pre ili tokom fermentacije. Konkretno, pomenuti enzim može da bude endoproteaza specifična za prolin. Neograničavajući primer endoproteaze specifične za prolin je „Brewer's Clarex“ dostupan kod DSM. U drugim primerima izvođenja, tokom postupaka se ne dodaju nikakvi egzogeni enzimi.

[0184] Tokom višednevnog postupaka fermentacije, šećer se pretvara u alkohol i CO2istovremeno sa razvojem nekih aromatičnih supstanci. Fermentacija može da se prekine u bilo koje željeno vreme, npr. u trenutku kada nema daljeg pada %P.

[0185] Nakon toga, pivo može dalje da se prerađuje, na primer, rashlađuje. Takođe može da se filtrira i/ili lageruje - postupak koji razvija prijatnu aromu i ukus manje sličan kvascu. Mogu da se dodaju i aditivi. Dalje, može da se doda CO2. Konačno, pivo može da se pasterizuje i/ili filtrira pre pakovanja (npr. prebacivanjem u kontejnere ili burad, boce ili limenke). Pivo takođe može da bude pasterizovano standardnim postupcima.

[0186] Piva proizvedena postupcima prema otkriću obično imaju prijatan ukus i nemaju nimalo, ili imaju vrlo malo oporosti. Ukus može da se analizira, na primer, pomoću specijalizovanog panela za ukus piva.

Napitak

[0187] Napici pripremljeni preradom vodenog ekstrakta u skladu sa otkrićem u napitak mogu da imaju niz korisnih svojstava, uključujući - ali ne ograničavajući se na - svojstva opisana u ovom odeljku.

[0188] Generalno je poželjno da napici prema otkriću sadrže što je moguće manje diacetila. Shodno tome, može da bude poželjno da napitak sadrži diacetil na nivou koji je ispod praga koji se smatra neprijatnim ukusom u lager pivu. Poželjno, napitak sadrži najviše 30 ppb (eng. - parts per billion, milijarditih delova) diacetila, poželjnije najviše 25 ppb diacetila, još poželjnije najviše 20 ppb diacetila. Ovo je posebno slučaj ako je napitak pivo, na primer lager pivo.

[0189] Napitak prema ovom otkriću može na primer da bude vodeni ekstrakt kao što je ovde opisano, koji je opciono fermentisan. Prema tome, napitak može da sadrži ili da se sastoji od pomenutog vodenog ekstrakta ili fermentisanog vodenog ekstrakta i opciono jednog ili više dodatnih jedinjenja. Pomenuta dodatna jedinjenja mogu na primer da budu bilo koja od dodatnih jedinjenja koja su ovde opisana u nastavku u odeljku „Dodatna jedinjenja“.

[0190] U nekim primerima izvođenja, karakteristike napitka kao što je pivo dobijeno ovim postupcima su u suštini slične karakteristikama napitka kao što je pivo dobijeno konvencionalnim postupcima uključujući korak sušenja u peći. Napitak može da bude sveže pivo, tj. karakteristike se određuju odmah nakon proizvodnje, ili pivo koje je bilo skladišteno određeno vreme. Takve karakteristike mogu da budu bilo koja ili više od nivoa alkohola, stvarnog stepena fermentacije (RDF), pH, formiranja pene, nivoa poželjnih jedinjenja i/ili nivoa nepoželjnih jedinjenja (npr. acetaldehid, etilacetat, izobutilacetat, propanol, izoamilacetat, izoamil alkohol, trans-2-nonenal (T2N), Streckerovi aldehidi, 2-metil-propanol, 2-metil-butanol, 3-metilbutanol, fenilacetaldehid, dimetilsufid (DMS)). Karakteristike mogu da budu, na primer, merene posle 24 h, 48 h, 72 h, 96 h ili 108 h klijanja, poželjno izmerene posle 48 h do 108 h klijanja, kao što je gore opisano.

[0191] Konkretno, nivoi T2N u napitku kao što je pivo dobijeno ovim postupcima, pre i/ili posle skladištenja, su slični nivoima T2N u napitku kao što je pivo dobijeno konvencionalnim postupcima koji obuhvataju korak sušenja u peći. Konkretno, nivoi T2N su ispod senzornog praga, koji iznosi 0.05 mg/L. Prema tome, u nekim primerima izvođenja, nivoi T2N u pivu pripremljenom prema ovim postupcima, pre i/ili posle skladištenja, na primer skladištenja tokom 2 nedelje na 37 °C, su ispod 1 mg/L, kao što je ispod 0.09 mg/L, kao što je ispod 0.08 mg/L, kao što je ispod 0.07 mg/L, kao što je ispod 0.06 mg/L, kao što je ispod 0.05 mg/L, kao što je ispod 0.04 mg/L, kao što je ispod 0.03 mg/L, kao što je ispod 0.02 mg/L, kao što je oko 0.01 mg/L ili manje.

[0192] U nekim primerima izvođenja, nivoi Streckerovih aldehida u napitku kao što je pivo dobijeno ovim postupcima, pre i/ili posle skladištenja, slični su nivoima Streckerovih aldehida u napitku kao što je pivo dobijeno konvencionalnim postupcima koji sadrže korak sušenja u peći. U nekim primerima izvođenja, nivoi Streckerovih aldehida su između 5 i 25 mg/L, kao što je između 6 i 24 mg/L, kao što je između 7 i 23 mg/L, kao što je između 8 i 22 mg/L, kao što je između 9 i 21 mg/L, kao što je između 10 i 20 mg/L. Poželjno, nivoi Streckerovih aldehida su ispod 25 mg/L, kao što je ispod 24 mg/L, kao što je ispod 23 mg/L, kao što je ispod 22 mg/L, kao što je ispod 21 mg/L, kao što je ispod 20 mg/L.

Dodatna jedinjenja

[0193] Postupci prema otkriću mogu da obuhvataju korak dodavanja jednog ili više dodatnih jedinjenja. Pomenuta dodatna jedinjenja mogu na primer da budu aromatično jedinjenje, konzervans, funkcionalni sastojak, boja, zaslađivač, agens za regulaciju pH ili so. Agens za regulaciju pH može na primer da bude pufer ili kiselina, kao što je fosforna kiselina.

[0194] Funkcionalni sastojci mogu da budu bilo koji sastojak koji se dodaje da bi se dobila data funkcija. Poželjno je da funkcionalni sastojak čini napitak zdravijim. Neograničavajući primeri funkcionalnih sastojaka uključuju vitamine ili minerale.

[0195] Konzervans može da bude bilo koji prehrambeni konzervans, na primer može da bude benzojeva kiselina, sorbinska kiselina, sorbati (npr. kalijum sorbat), sulfiti i/ili njihove soli.

[0196] Dodatno jedinjenje takođe može da bude CO2. Konkretno, CO2može da se doda da bi se dobio gazirani napitak.

[0197] Aromatično jedinjenje koje se koristi u ovom otkriću može da bude bilo koje korisno aromatično jedinjenje. Aromatično jedinjenje može, na primer, da se izabere iz grupe koja se sastoji od aroma, biljnih ekstrakata, biljnih koncentrata, delova biljaka i biljnih infuzija. Konkretno, aromatična jedinjenja mogu da budu hmelj.

Sekvence

[0198]

>SEQ ID NO: 1, Sekvenca celuloznoj sintazi-sličnog CslF6 (na osnovu broja NCBI u GenBank: EU267181.1)

>SEQ ID NO: 2, Celuloznoj sintazi-sličan CslF6 (CslF6) Hordeum vulgare, kompletna kodirajuća sekvenca (na osnovu broja NCBI u GenBank: EU267181.1)

mp ue neo o BGL2 Dir. TACCAGAACCTGTTCGAC

NO: 6 transkripata (1-3;1-4)-β

SEQ ID

RefA Rev. GATGACCGAAGCCTTAAC HORVU5Hr1G041120

NO: 16

Proba

(HEX)

Primeri

Primer 1: Mikropostupak sladovanja

[0199] Uzorci ječma su obrađeni u tri primerka, po 50 g svakog uzorka. Uzorci stavljeni u čaše od nerđajućeg čelika su namočeni, prema šemi prikazanoj na slici 1, u vidu prinudnog potapanja u svežoj vodi na 15 °C oko 7 sati prvog dana, 3 sata drugog dana i jedan sat trećeg dana, kako bi se dostigao sadržaj vode od 35%, 40 %, odnosno 45%, na kraju svakog močenja. Nakon svakog močenja, čaše od nerđajućeg čelika koje sadrže uzorke su premeštene u kutiju za klijanje na 15 °C i tamo držane do sledećeg koraka u postupku. Na kraju poslednjeg odlivanja vode za močenje, uzorci su držani 120 sati (3-7. dan) u kutijama za klijanje uravnoteženi na 45% vode i prskani da bi se nadoknadio respiratorni gubitak vode.

[0200] Na kraju postupaka klijanja (7. dan), uzorci su sušeni u peći u kutijama od nerđajućeg čelika u inkubatoru Termaks 21 sat uz primenu sledećeg programa temperaturne rampe:

25 °C - 55 °C (2 °C/sat)

55 °C - 85 °C (4 °C/sat)

85 °C tokom 1.5 sata

[0201] Koraci klijanja i sušenja u peći su izvedeni uz recirkulaciju vazduha od 80% svežeg vazduha.

[0202] Na kraju svakog dana mikropostupka sladovanja, uzorci su sakupljeni za analizu, u tri primerka, i osušeni zamrzavanjem od 48 sati.

[0203] Primenom ovog postupka klijanja proučavane su dve linije ječma, jedna uobičajena linija ječma cv. Paustian (referentna) i jedna linija ječma sa niskim sadržajem β-glukana (mutant). Linija ječma sa niskim sadržajem β-glukana je biljka ječma cv. Paustian, koja nosi mutaciju u genu CslF6 koja rezultuje mutantnim genom Cslf6 koji kodira mutantni polipeptid CslF6 sa mutacijom Gly→Asp na poziciji 748. Sekvenca divljeg tipa polipeptida CslF6 ječma (SEQ ID NO: 1) dostupna je pod NCBI pristupnim brojem EU267181.1 u bazi podataka GenBank.

Primer 2: Upijanje vode

[0204] Brzina upijanja vode tokom prvih 6 sati klijanja određena je merenjem tačnih razlika u težini zrna žitarica u poređenju sa početnom težinom nakon brzog centrifugiranja čaša da bi se uklonila površinska voda.

Rezultati:

[0205] Pokazalo se da je upijanje vode tokom prvih 6 sati imbibicije kod mutantne linije nešto brže nego kod referentne linije (Slika 2).

Primer 3: Rast korena

[0206] Uzorak proklijalog ječma je osušen zamrzavanjem nakon svakog dana klijanja, kao što je opisano u primeru 1. Uzorak osušen zamrzavanjem je izmeren i formirani korenčići su ručno uklonjeni i proklijali ječam je ponovo izmeren. Rast korena je izračunat kao procenat težine pre i posle tretmana.

Rezultati:

[0207] Rast korena mutantne i referentne linije bio je sličan tokom perioda sladovanja, ali značajno snižen četvrtog dana u poređenju sa sladom sušenim u peći (Slika 3).

Primer 4: Ekspresija gena koji kodiraju hidrolitičke enzime tokom sladovanja Izolovanje RNK:

[0208] Za svaki uzorak pripremljena je epruveta Eppendorf od 2 mL koja sadrži dve metalne kuglice. Približno 80 mg brašna osušenog zamrzavanjem odmereno je u epruvete Eppendorf koje su sadržale metalne kuglice. Uzorci su prethodno navlaženi sa 100 µL vode bez RNaze, nakon čega je dodat 1 mL reagensa Tri-Reagent. Uzorci su zatim snažno protreseni. Posle 5 min. inkubacije na sobnoj temperaturi, uzorci su centrifugirani na 12000 × g tokom 10 min. na 4 °C. Supernatant je dekantovan u epruvetu PhaseLock od 2 mL (centrifugiranje 30 s, Qiagen br.

129056) i dodato je 0.2 mL hloroforma. Epruveta je snažno protresena rukom 10-15 sekundi da bi se hloroform i Tri-Reagent pomešali. Uzorci su inkubirani 5-15 minuta na sobnoj temperaturi, a zatim centrifugirani na 12000 × g tokom 5 minuta na 4 °C. Vodena faza uzorka je dekantovana u novu epruvetu Eppendorf i dodato je 500 µL 2-propanola. RNK je istaložena u zamrzivaču preko noći. Uzorak je centrifugiran na 12000 × g tokom 5 minuta na 4 °C i supernatant izopropanola je uklonjen. Za prečišćavanje RNK, pelet je resuspendovan direktno u 350 µL pufera za lizu kompleta Aurum Total RNA mini kit (BioRad br.7326820). Dodato je 350 µL 70% etanola da bi se RNK ponovo istaložila. Rastvor je prebačen na kolonu za vezivanje RNK koja je smeštena u epruvetu za ispiranje bez poklopca od 2 mL (isporučena u kompletu) i centrifugirana 30 sekundi. Kolona za vezivanje RNK je uklonjena i filtrat je odbačen. Na kolonu za vezivanje RNK je dodato 700 µL rastvora za ispiranje u uslovima niske strogosti i centrifugirano 30 sekundi. Rastvor za ispiranje u uslovima niske strogosti je odliven iz epruvete za ispiranje i kolona za vezivanje je ponovo stavljena u istu epruvetu za ispiranje.

Tretman DNazom na koloni:

[0209] Dostavljena liofilizovana DNaza I je rekonstituisana dodavanjem 250 µL 10 mM Tris, pH 7.5 u bočicu i izmešana pipetiranjem gore-dole, u skladu sa priloženim priručnikom (Biorad Aurum Total RNA mini kit br.7326820). U membranski niz na dnu svake kolone dodato je 80 µL razblažene DNaze I i ostavljeno na sobnoj temperaturi 15 min za odvijanje digestije. Na kolonu za vezivanje RNK je dodato 700 µL rastvora za ispiranje u uslovima visoke strogosti i centrifugirano 30 sekundi. Filtrat je odbačen i kolona je ponovo stavljena u istu epruvetu za ispiranje. Na kolonu za vezivanje RNK je dodato 700 µL rastvora za ispiranje u uslovima niske strogosti i centrifugirano 30 sekundi. Filtrat je odbačen i kolona je ponovo stavljena u istu epruvetu za ispiranje. Epruveta za ispiranje i kolona su centrifugirane još 2 min. da bi se uklonio preostali rastvor za ispiranje. Kolona za vezivanje RNK je prebačena u epruvetu za mikrocentrifugu sa poklopcem od 1.5 mL i 80 µL pufera za eluiranje je dodato u membranski niz na dnu kolone za vezivanje RNK. Rastvor je ostavljen da zasiti membrane tokom 1 min. pre centrifugiranja tokom 2 min. da bi se eluirala ukupna RNK. Konačno, koncentracija RNK je kvantifikovana pomoću NanoDrop (Thermo Scientific).

Sinteza cDNK i postavka ddPCR:

[0210] cDNK je sintetizovana korišćenjem kompleta iScript™ cDNA Synthesis Kit kompanije BioRad (br. 1708891). Pre sinteze cDNK, ukupna koncentracija RNK je procenjena pomoću NanoDrop (Thermo Scientific) i normalizovana na 50 ng/µL sa vodom bez RNaze. Za sintezu cDNK, korišćeno je 200 ng RNK prema sledećem protokolu:

Komponenta sinteze cDNK Zapremina po reakciji (µl)

5x iScript Reaction Mix 4

Reverzna transkriptaza iScript 1

RNK matrica, 200 ng 4

Voda bez nukleaze 11

Ukupna zapremina: 20

[0211] Za kontrolne uzorke NoRT, umesto reverzne transkriptaze (RT) dodata je voda. Kompletna reakciona smeša je inkubirana u aparatu Thermal cycler korišćenjem sledećeg protokola:

Program za sintezu cDNK

Prajming 5 min. na 25 °C

Reverzna transkripcija 20 min. na 46 °C

Inaktivacija RT 1 min. na 95 °C

Održavanje ∞ na 4 °C

[0212] Za analizu ddPCR, svaki uzorak je analiziran na gen od interesa, kao i na jedan referentni gen. ddPCR je izvedena korišćenjem uređaja QX200 Droplet Generator i QX200 Droplet Reader kompanije BioRad prema uputstvima proizvođača. U ovom slučaju, HORVU5Hr1G041120, protein familije citosolne piruvat kinaze koji se stabilno eksprimira tokom klijanja, korišćen je kao referentni gen. Tabela 2 iznad u odeljku „sekvence“ daje detalje o prajmerima i probama.

[0213] Pre analize, cDNK je razblažena 20 puta u vodi, a svaka reakciona mešavina je napravljena prema sledećem protokolu:

Komponenta reakcije ddPCR 1x

ddPCR Supermix (bez dUTP) 1X 11

Proba FAM (20X) 450nM/250nM 0.95 Proba HEX (20X) 450nM/250nM 0.95 cDNK x 5

Voda y 4.1

[0214] Uzorci su dobro pomešani u pločama sa 96 bunarčića i centrifugirani 1 min. na 4000 o/min. pre stvaranja kapljica (Automatizovani generator kapljica BioRad QX200™). Ploča sa kapljicama je inkubirana u aparatu Thermal cycler prema sledećem programu:

PCR program ddPCR Temp. Vreme Rampa Ciklusi Zagrevanje poklopca 105 °C 2°C/s

Korak 1 95 °C 10 min. 1

Korak 2 94 °C 30 s

40

Korak 3 55 °C 1 min.

Korak 4 98 °C 10 min. 1

Korak 5 8 °C ∞

[0215] Prisustvo kapljica pozitivnih na FAM i HEX je detektovano pomoću čitača kapljica BioRad QX200™ i analizirano korišćenjem softvera Quantasoft kompanije BioRad. Prag je postavljen ručno u 2D dijagramu i vrednosti koncentracije su naknadno unete u program Exel za normalizaciju na izabrani referentni gen.

Rezultati:

[0216] Ekspresija odabranih gena; amilaze (AMY1), (1-3;1-4)-β-glukanaze (BGL2), alfaglukozidaze sa visokim pI (AGL97) i granične dekstrinaze (LD) analizirana je korišćenjem ddPCR. AGL97 je bila eksprimirana na najvišem nivou već 2. dana, dok tri preostala gena pokazuju maksimalnu ekspresiju 4. dana (Slika 4). I mutantne i referentne linije ječma pokazuju sličan obrazac ekspresije odabranih gena potvrđujući da mutant sa niskim (1-3;1-4)-β-glukanom ima i optimalnu ekspresiju gena koji kodiraju enzime koji razgrađuju (1-3;1-4)-β-glukan.

Primer 5: Aktivnost hidrolitičkih enzima u uzorcima slada

[0217] Pre analize enzimske aktivnosti, uzorci slada su mleveni korišćenjem standardnog mlina Foss Cyclotech opremljenog prstenom za mlevenje od volfram karbida (Foss 10004463), niklovanim radnim kolom (Foss 1000 2666) i izlaznom sitom od 1 mm (Foss 10001989). Sva merenja enzimske aktivnosti ječmenog slada vršena su u roku od 48 h nakon mlevenja suvog uzorka. Merenja u testovima aktivnosti alfa-amilaze su urađena korišćenjem kompleta Ceralpha (K-CERA) kompanije Megazyme korišćenjem standardne laboratorijske opreme. Testovi amilaze su urađeni prema protokolu proizvođača (K-CERA 01/12). Proračun aktivnosti amilaze je zasnovan na formuli u protokolu Megazyme (K-CERA 01/12). Merenja u testovima aktivnosti beta-amilaze su urađena korišćenjem kompleta Betamyl (K-BETA3) kompanije Megazyme korišćenjem standardne laboratorijske opreme. Testovi amilaze su urađeni prema protokolu proizvođača (K-BETA3 10/10). Proračun aktivnosti beta-amilaze je zasnovan na formuli u protokolu Megazyme (K-BETA310/10). Merenja u testovima aktivnosti granične dekstrinaze su urađena korišćenjem kompleta Pullulanase/Limit Dextrinase Assay kit (PullG6 Method) komplet (K-PullG6) kompanije Megazyme korišćenjem standardne laboratorijske opreme. Testovi granične dekstrinaze su urađeni prema protokolu proizvođača (K-PullG6 05/17). Proračun aktivnosti granične dekstrinaze je zasnovan na formuli u protokolu Megazyme (K-PullG605/17). Rezultati:

[0218] Ukupne enzimske aktivnosti merene za α-amilazu, β-amilazu i slobodnu graničnu dekstrinazu prate isti obrazac u mutantnim i referentnim linijama ječma (Slika 5). Iznenađujuće, pokazalo se da je aktivnost granične dekstrinaze nešto viša kod mutanta počevši već od 3. dana, iako je ekspresija gena granične dekstrinaze bila nešto niža (Slika 4).

Primer 6: sadržaj (1-3;1-4)-β-glukana

[0219] Proklijala zrna su analizirana na ukupan sadržaj (1,3;1,4)-β-glukana. Deset mL zrna ječma je mleveno u ciklonskom mlinu Retch. Svi uzorci su analizirani u tri primerka. Dvadeset mg brašna je odmereno u epruvete Eppendorf od 2 mL, zagrevano 2 sata na 100 °C u pećnici, nakon čega je ohlađeno na sobnu temperaturu. Ukupno je dodato 500 µL 50% vodenog metanola i uzorci su mućkani na 1400 o/min. tokom 1 sata. Nakon centrifugiranja na 16000 × g tokom 10 minuta, supernatant je odbačen i uzorci su osušeni preko noći. Zatim je dodato 400 µL 20 mM NaHPO4na pH 6.5 sa 1U/mL lihenaze (Megazyme, International, Irska) na 10 mg brašna i inkubirano na 50 °C tokom 2.5 sata. Uzorak je centrifugiran na 16000 × g 10 minuta i supernatant je filtriran kroz filtere od 0.45 µm i oslobođeni oligomeri Glc-β-(1->4)-Glc-β-(1->3)-Glc (DP3) i Glc-β-(1->4)-Glc-β-(1->4)-Glc-β-(1->3)-Glc (DP4) su kvantifikovani hromatografijom visokih performansi anjonske izmene sa pulsnom amperometrijskom detekcijom (HPAEC-PAD). Oligomeri Glc-β-(1->4)-Glc-β-(1->3)-Glc (DP3) i Glc-β-(1->4)-Glc-β-(1->4)-Glc-β-(1->3)-Glc (DP4) su kvantifikovani pomoću HPAEC-PAD korišćenjem Dionex ICS 5000+ DC sistema opremljenog kolonom SA-10 od 4 µm dimenzija 2x250 mm i pred-kolonom. Uslovi rada su bili 0.4 mL/min, temperatura kolone 40 °C, izokratski eluent od 100 mM NaOH tokom 15 min. Standard za kvantifikaciju dobijen je digestijom sa 1 U/mL lihenaze (Megazyme International, Irska) poznatih količina srednje viskoznih (1,3;1,4)-β-glukana (Megazyme International, Irska) u 20 mM NaHPO4pH 6.5 pod pretpostavkom da je molarni odnos PAD odgovora između DP3 i DP4 jednak. Ukupan sadržaj (1,3;1,4)-β -glukana izračunat je kao zbir oligomera DP3 i DP4. Rezultati:

[0220] Sadržaj (1-3;1-4)-β-glukana u mutantnoj i referentnoj liniji praćen je u ječmu i u zelenom sladu 1, 2, 3, 4, 5, 6. dana postupka sladovanja (Slika 1), kao i u sladu sušenom u peći (7. dan na slici 1). Tokom čitavog postupaka sladovanja, sadržaj (1-3;1-4)-β-glukana u mutantu je bio samo 50% od referentnog, a 5. dana sadržaj (1-3;1-4)-β-glukana u mutantu je bio sličan referentnom sladu sušenom u peći.

Primer 7: analiza ispitivanja zelenog slada, sladovine i piva

[0221] Karakteristike sladovine i piva pripremljenih od ječma koji je klijao 1, 2, 3, 4 ili 5 dana prema predmetnim postupcima, tj. bez sušenja u peći, ili uz sušenje u peći („Pilot“ sušenje u peći u tabelama 3-8), kao i ječma koji je klijao 5 dana i podvrgnut je sušenju u peći u kasnijoj fazi („Industrijsko“ sušenje u peći u tabelama 3-8) prikazani su u tabelama 3 i 4. Pre klijanja, močenje je vršeno približno 36 sati. Eksperiment je osmišljen tako da se na nivou svakog dana uporedi proizvodnja piva direktno od zelenog slada i proizvodnja piva od slada proizvedenog sušenjem u peći. Proizvodnja piva od slada sušenog u peći („Industrijski“ u tabelama) urađena je u kasnijem stadijumu. Korišćen je ječam cv. Congo.

[0222] Šećeri sladovine su određeni pomoću HPLC sa elektrohemijskom detekcijom. Streckerovi aldehidi su određeni pomoću GC-MS nakon derivatizacije karbonila sa O-(2,3,4,5,6-pentafluorobenzil)-hidrozilaminom, u suštini kao što su opisali Groenqvist et al, 1993. Estri sa niskom tačkom ključanja i viši alkoholi u pivu su bili određeni pomoću gasne hromatografije HeadSpace sa FID detekcijom. Estri sa visokom tačkom ključanja i viši alkoholi i masne kiseline ekstrahovani su iz piva pomoću CS2 i analizirani gasnom hromatografijom (ubrizgavanje tečnosti) sa FID detekcijom. Sadržaj aminokiselina u sladovini i pivu određen je kako je opisano u EP3237601 korišćenjem UPLC sa detektorom sa fotodiodnim nizom pomoću kompleta za derivatizaciju AccQ-Tag Ultra kompanije Waters, u suštini kako je opisao dobavljač. T2N u pivu je određen pomoću GC-MS nakon derivatizacije karbonila sa O-(2,3,4,5,6-pentafluorobenzil)-hidrozilaminom, u suštini kako su opisali Groenqvist et al, 1993. Stvarni stepen fermentacije (RDF), alkohol, ekstrakt i boja su mereni korišćenjem sistema Alcolyzer Beer Analyzing System kompanije Anton Paar kako je opisao dobavljač. Pena je merena korišćenjem uređaja za ispitivanje pene FT-003 Foam Tester (Lg-automatic aps, Undalsvej 6, 3300 Frederiksvӕrk, Danska) kako je opisao dobavljač.

[0223] Kao što se može videti u tabeli 3, odsustvo sušenja u peći nije značajno uticalo ni na pH, ni na aminokiseline sladovine. Razlika u beta-glukanima sladovine dobijene nakon klijanja tokom 3, 4 ili 5 dana ne smatra se značajnom. Otuda, sladovina pripremljena predmetnim postupcima iznenađujuće sadrži dovoljno aminokiselina da posluže kao izvor hranljivih materija za kvasac u kasnijoj fermentaciji, uprkos odsustvu koraka sušenja u peći. Tabela 4 pokazuje da odsustvo koraka sušenja u peći ne menja značajno koncentraciju fermentabilnih ugljenih hidrata.

Tabela 3.

Dan u kutiji Sušenje u pH Betaglukani sladovine, Aminokiseline

za klijanje peći sladovine Maltlab (mg/L) sladovine (zbir, mg/L)

1 Ne 5.1 172.7 967

Tabela 4: šećeri. Fru: fruktoza; Fru %P: % fruktoze na Plato skali; Glu; glukoza; Suc: saharoza; Mal: maltoza; Maltt: maltotrioza; Sum FC: zbir fermentabilnih ugljenih hidrata; Sum IS: zbir invertnih šećera. Fru %P je u %; preostali podaci su u g/100 mL.

[0224] Pivo pripremljeno od vodenih ekstrakata žitarica dobijenih postupcima otkrića, tj. bez sušenja u peći, upoređeno je sa pivom pripremljenim od vodenih ekstrakata žitarica dobijenih tradicionalnim postupcima, tj. sušenjem u peći, nakon klijanja tokom 1, 2, 3, 4 ili 5 dana. Karakteristike piva su prikazane u tabelama 5-8.

[0225] Tabela 5 pokazuje da je zapreminski % alkohola u pivu pripremljenom bez sušenja u peći sličan onom dobijenom u pivu pripremljenom sa sušenjem u peći. Isto tako, nema značajne razlike u stvarnom stepenu fermentacije (RDF) ili formiranju pene. Konkretno, poželjno je da se dobije formiranje visoke pene. Tabela 6 pokazuje da odsustvo sušenja u peći uglavnom ne utiče na koncentracije acetaldehida (od 2 dana klijanja), etilacetata, izobutilacetata, propanola, izoamilacetata i izoamil akohola.

Tabela 5: finalno pivo. RDF: Stvarni stepen fermentacije.

Tabela 6: finalno pivo. Koncentracije su u mg/L. NA: nije dostupno.

[0226] Koncentracije nekoliko jedinjenja neprijatnog ukusa analizirane su u svežem pivu (Tabela 7) i u pivu koje je skladišteno 2 nedelje na 37 °C (Tabela 8). U svežem pivu (Tabela 7) nije primećena značajna razlika kada su u pitanju aldehidi 2-metil-propanal, 2-metil-butanal, 3-metilbutanal, fenil-acetaldehid i ukupni Streckerovi aldehidi, koji se smatraju važnim sastojcima arome odležalog piva. Nasuprot tome, u nekim slučajevima primećuje se tendencija smanjenja jedinjenja neprijatnog ukusa. Sušenje slada u peći se smatra važnim za smanjenje nivoa nekih neprijatnih ukusa, npr. nivoa trans-2-nonenala (T2N), inaktivacijom enzima lipoksigenaze koji iniciraju formiranje T2N. Nivoi T2N su nešto viši u pivu pripremljenom bez sušenja u peći; međutim, izmereni nivoi su još uvek ispod senzornog praga od 0.05 mg/L, pa se očekuje da neprijatni ukusi koji proizilaze iz T2N ostanu nepromenjeni u pivu pripremljenom bez sušenja u peći.

[0227] Slično tome, koncentracije jedinjenja neprijatnog ukusa u pivu skladištenom 2 nedelje na 37 °C (Tabela 8) pripremljenom bez sušenja u peći pokazuju malu razliku u odnosu na koncentracije uočene u pivu pripremljenom sušenjem u peći i uskladištenom pod istim uslovima.

Tabela 7. Sveže pivo.2-Me-Pr: 2-metil-propanal; 2-Me-Bu: 2-metil-butanal; 3-Me-Bu: 3-metilbutanal; PheAcal: fenil-acetaldehid; T2N: trans-2-nonenal; St. al.: zbir Streckerovih aldehida.

Koncentracije su u mg/L.

Tabela 8. Pivo skladišteno 2 nedelje na 37 °C.2-Me-Pr: 2-metil-propanal; 2-Me-Bu: 2-metilbutanal; 3-Me-Bu: 3-metil-butanal; PheAcal: fenil-acetaldehid; T2N: trans-2-nonenal.

Koncentracije su u mg/L.

[0228] Ukupno uzevši, gornji podaci pokazuju da odsustvo koraka sušenja u peći u iznenađujuće velikoj meri ne utiče na karakteristike sladovine i svežeg ili uskladištenog piva pripremljenog prema postupcima ovog otkrića.

Reference

[0229]

D.E. Briggs, Malts and Malting; p695 First Edition, 1998 Published by Blackie & Professionals, London, ISBN0412 29800

Chandler et al., Journal of Experimental Botany, Vol. 64, No. 6, pp. 1603-1613, 2013, doi:10.1093/jxb/ert022

Fincher GB (2011) Biochemistry, Physiology and Genetics of Endosperm Mobilization in Germinated Barley Grain. In: Barley: Production, Improvements and Uses. Ed. Ullrich SE, Wiley-Blackwell, Chapter 14, pp 449-477.

Groenqvist, A. et al., "Carbonyl compounds during beer production in beer." Proceedings of the 24th EBC Congress, Oslo, pp.421-428 (1993).

Hough, J.S. et al. "Malting and brewing science. Volume II Hopped wort and beer." Chapman and Hall, New York, USA. ISBN 0412165902, 1982.

Hu G, Burton C, Hong Z and Jackson E (2014). A mutation of the cellulose-synthaselike (CslF6) gene in barley (Hordeum vulgare L.) partially affects the b-glucan content in grains. Journal of Cereal Science 59, 189-195.

Wolfgang Kunze, Technology Brewing and Malting, Versuchs- u. Lehranstalt f. Brauerei, 2014 ISBN 3921690773, 9783921690772

Smith AM, Zeeman S.C, Smith SM (2005) Starch Degradation. Annual Review of Plant Biology 56: 73-98.

Taketa S, Yuo T, Tonooka T, Tsumuraya Y, Inagaki Y, Haruyama N, Larroque O and Jobling SA (2012). Functional characterization of barley betaglucanless mutants demonstrates a unique role for CslF6 in (1,3;1 ,4)-β-D-glucan biosynthesis. J Exp Bot.

63(1):381-92.

Claims (14)

Patentni zahtevi

1. Postupak za proizvodnju napitka, gde pomenuti postupak obuhvata korake:

i. pripremanja vodenog ekstrakta postupkom prema zahtevu 12, koji obuhvata sledeće korake:

a) obezbeđivanje zrna žitarica, pri čemu je žitarica ječam;

b) podvrgavanje zrna žitarica koraku klijanja tokom vremenskog raspona od 48 do 108 h, čime se dobijaju proklijala zrna, pri čemu korak klijanja obuhvata korak močenja koji sadrži inkubaciju u vlažnim uslovima tokom vremenskog raspona od 30 min. do 10 h praćenu inkubacijom u suvim uslovima tokom vremenskog raspona od 30 min. do 24 h,

i pri čemu se trajanje klijanja meri od inicijacije klijanja, i gde je inicijacija klijanja vremenska tačka u kojoj se ječam sa sadržajem vode manjim od 15% dovodi u kontakt sa dovoljno vode da se inicira klijanje;

c) fino usitnjavanje pomenutih proklijalih zrna, dok pomenuta proklijala zrna imaju sadržaj vode od najmanje 20%; i

d) pripremanje vodenog ekstrakta pomenutih fino usitnjenih proklijalih zrna, pod uslovom da pomenuta zrna žitarica nemaju sadržaj vode ispod 20% u bilo kom trenutku između koraka b) i d),

čime se dobija vodeni ekstrakt žitarice;

i

ii. prerade pomenutog vodenog ekstrakta u napitak.

2. Postupak prema zahtevu 1, gde korak ii. obuhvata sledeće korake:

e) zagrevanje pomenutog vodenog ekstrakta opciono u prisustvu hmelja ili ekstrakta hmelja;

f) hlađenje vodenog ekstrakta;

g) fermentaciju pomenutog vodenog ekstrakta pomoću kvasca, čime se dobija fermentisani napitak.

3. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, gde je napitak pivo, na primer pivo svetle boje, na primer izabrano iz grupe koja se sastoji od lager piva i piva pale ale.

4. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, gde korak klijanja nije duži od 96 h.

5. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, gde se korak klijanja izvodi tokom vremenskog raspona od 72 do 108 h, kao što je približno 96 h.

6. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, gde proklijala zrna žitarica imaju sadržaj vode od najmanje 20%, na primer ne manji od 25%, kao što je ne manji od 30%, poželjno ne manji od 35%, čak poželjnije ne manji od 40%, još poželjnije ne manji od 45%, u vreme finog usitnjavanja pomenutih zrna žitarica.

7. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, gde postupak ne sadrži korak sušenja proklijalih zrna u peći.

8. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, gde proklijala zrna sadrže najviše 10 g, kao što je najviše 8 g, na primer najviše 6 g, poželjno najviše 4 g korenčića (suve materije) na 100 g proklijalih zrna žitarica (suve materije).

9. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, gde je žitarica plevičasti ječam, i gde postupak obuhvata korak uklanjanja najmanje dela pomenutih plevica pre inicijacije klijanja; ili je žitarica golozrni ječam.

10. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, gde je žitarica ječam naznačen niskim nivoom β-glukana u zrnu, na primer nivo β-glukana u zrnu je najviše 5%, kao što je u rasponu od 1-5% tež./tež. na bazi suve težine.

11. Postupak prema zahtevu 10, gde je ječam naznačen time što nosi mutaciju u genu koji kodira CslF6.

12. Postupak za proizvodnju vodenog ekstrakta žitarica, pri čemu pomenuti postupak obuhvata sledeće korake:

a) obezbeđivanje zrna žitarica, pri čemu je žitarica ječam;

b) podvrgavanje zrna žitarica koraku klijanja tokom vremenskog raspona od 48 do 108 h čime se dobijaju proklijala zrna, pri čemu korak klijanja obuhvata korak močenja koji sadrži

i. inkubaciju u vlažnim uslovima tokom vremenskog raspona od 30 min. do 10 h, praćenu inkubacijom u suvim uslovima tokom vremenskog raspona od 30 min. do 24 h, ili

ii. inkubaciju u vlažnim uslovima tokom vremenskog raspona od 5 h do 12 h, praćenu inkubacijom u suvim uslovima tokom vremenskog raspona od 12 h do 30 h, i pri čemu se trajanje klijanja meri od inicijacije klijanja, i gde je inicijacija klijanja vremenska tačka u kojoj se ječam sa sadržajem vode manjim od 15% dovodi u kontakt sa dovoljno vode da se inicira klijanje;

c) fino usitnjavanje pomenutih proklijalih zrna, dok pomenuta proklijala zrna imaju sadržaj vode od najmanje 20%; i

d) pripremanje vodenog ekstrakta pomenutih fino usitnjenih proklijalih zrna,

pod uslovom da pomenuta zrna žitarica nemaju sadržaj vode ispod 20% u bilo kom trenutku između koraka b) i d);

čime se proizvodi vodeni ekstrakt žitarice.

13. Postupak prema zahtevu 12, gde su koraci a), b), c) i/ili d) kao što je definisano u bilo kom od zahteva 1 do 11, i/ili gde su zrna obezbeđena u koraku a), i/ili proklijala zrna žitarica, i/ili žitarica, i/ili vodeni ekstrakt žitarice, kao što je definisano u bilo kom od zahteva 1 do 11.

14. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, gde korak klijanja ne obuhvata korak potapanja zrna žitarica u vodeni rastvor pod aeracijom.