RS64845B1 - Kombinacija koja se sastoji od stabilnog kristala 4-oksohinolinskog jedinjenja - Google Patents

Description

Opis

OBLAST TEHNIKE

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži stabilan kristal (oblik II ili oblik III) 6-(3-hloro-2-fluorobenzil)-1-[(S)-1-hidroksimetil-2-metilpropil]-7-metoksi-4-okso-1,4-dihidrohinolin-3-karboksilne kiseline

(u daljem tekstu takođe nazvano jedinjenje A) ili njegov mešani kristal (oblik II i oblik III) i GS-7340.

OSNOVA TEHNIKE

[0002] Predmetni prijavioc je u Japanese Patent No. 3567162 koju je podneo isti podnosilac otkrio da gore pomenuto jedinjenje A ima inhibitorno dejstvo na integrazu koja je esencijalni enzim za rast HIV (virus humane imunodeficijencije), koji je uzročnik virusa AIDS (sindrom stečene imunodeficijencije), i pokazuje anti-HIV efekat (posebno Primer 4-32 i Eksperimentalni primer).

[0003] Generalno, kada se jedinjenje koristi kao farmaceutski proizvod, potrebna je hemijska i fizička stabilnost jedinjenja kako bi se održao kvalitet i/ili olakšalo očuvanje. Ne samo konačna farmaceutska kompozicija već i jedinjenje kao sintetički početni materijal je poželjno hemijski i fizički stabilno iz istih razloga.

[0004] Prema tome, takvo jedinjenje je poželjno kristal, posebno poželjno stabilan kristal. Kada jedinjenje ima kristalni polimorfizam, generalno se bira najstabilniji kristal.

[0005] Dok gore pomenuta prijava opisuje jedinjenje A, nije pronađen konkretan opis koji se odnosi na kristalni oblik jedinjenja A.

REZIME PRONALASKA

[0006] Stoga su predmetni pronalazači proučavali različite kristalne oblike jedinjenja A u pokušaju da pronađu stabilan kristal jedinjenja A. Kao rezultat toga, otkrili su da jedinjenje A ima kristalni polimorfizam, a kristal jedinjenja A koje ima određeni kristalni oblik je koristan kao stabilan kristal, i na osnovu ovih nalaza, upotpunili su predmetni pronalazak.

[0007] Ovaj pronalazak je kao što je definisano u priloženim zahtevima.

[0008] Pronalazak se posebno odnosi na:

1. Farmaceutsku kompoziciju koja sadrži (a) kristalni oblik II jedinjenja A, ili (b) kristalni oblik III jedinjenja A, ili (c) mešani kristal koji sadrži kristal gore pomenutog (a) i kristal jedinjenja A gore pomenutog (b) i GS-7340.

2. Farmaceutsku kompoziciju koja dalje sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač.

3. Farmaceutsku kompoziciju za upotrebu u lečenju HIV.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0009]

Slika 1 prikazuje višestruke zapise obrazaca difrakcije rendgenskih zraka praha, pri čemu gornja linija prikazuje obrazac difrakcije kristalnog oblika III, srednja linija prikazuje obrazac difrakcije kristalnog oblika I, donja linija prikazuje obrazac difrakcione kristalnog oblika II , vertikalna osa pokazuje intenzitet difrakcije (cps: broj u sekundi: intervali skale su 2500 cps), a poprečna osa pokazuje ugao difrakcije 2θ (°).

Slika 2 prikazuje višestruke zapise obrazaca difrakcije rendgenskih zraka praha dobijenih iz uzorka nakon 3-dnevnog čuvanja u testu stabilnosti kristalnog oblika I. Za poređenje, najgornja linija prikazuje obrazac difrakcije (početni uslovi) kristalnog oblika II, a najdonja linija prikazuje obrazac difrakcije (početni uslovi) kristalnog oblika I. Iz druge linije su prikazani obrasci difrakcije u uslovima skladištenja #6 (60°C/75% R.H., otvorena posuda, 3 nedelje skladištenja), uslovima skladištenja # 4 (60°C, kontejner sa čepom, 3 nedelje skladištenja), uslovima skladištenja #5 (60°C, otvoren kontejner, 3 nedelje skladištenja), uslovima skladištenja #3 (80°C, otvoren kontejner, 3 dana skladištenja) i uslovima skladištenja #2 (80°C, kontejner sa čepom, 3 dana skladištenja). Vertikalna osa pokazuje intenzitet difrakcije (cps: broj u sekundi: intervali skale su 2500 cps), a poprečna osa pokazuje ugao difrakcije 2θ(°).

EFEKAT PRONALASKA

[0010] Kristalni ili mešani kristal jedinjenja A koji leži u osnovi ovog pronalaska ima određeni kristalni oblik II ili III opisan u nastavku i superioran je po fizičkoj i hemijskoj stabilnosti, što zauzvrat ima prednost da održavanje kvaliteta jedinjenja A na duži rok postaje moguće, što olakšava skladištenje. Pored toga, prednost im je što je rukovanje tokom proizvodnje različitih farmaceutskih kompozicija i rinfuza lako, što smanjuje troškove proizvodnje.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0011] Ovaj pronalazak je detaljno objašnjen u nastavku.

[0012] U ovom pronalasku, "kristalni oblik II" jedinjenja A označava kristal jedinjenja A, koji ima rendgensku difrakciju praha sa karakterističnim difrakcionim pikovima pri uglovima difrakcije 2θ(°) od 6.56, 13.20, 19.86, 20.84, 21.22, 25.22° mereno rendgenskim difraktometrom na prahu.

[0013] U ovom pronalasku, "kristalni oblik III" jedinjenja A označava kristal jedinjenja A, koji ima rendgensku difrakciju praha sa karakterističnim difrakcionim pikovima pri uglovima difrakcije 2θ(°) od 8.54, 14.02, 15.68, 17.06, 17.24, 24.16, 25.74° mereno rendgenskim difraktometrom na prahu.

[0014] Maksimalna vrednost difrakcije pri gore pomenutom uglu difrakcije 2θ(°) može pokazati malu grešku merenja zbog mernih instrumenata ili uslova merenja i slično. Radi preciznosti, greška merenja može biti u opsegu od ±0.2, poželjno ±0.1, poželjnije ±0.06.

[0015] Kristal jedinjenja A koji leži u osnovi ovog pronalaska je takođe karakterisan termičkom analizom. Na primer, kada se kristalni oblik III jedinjenja A koji leži u osnovi ovog pronalaska podvrgne diferencijalnoj skenirajućoj kalorimetriji (DSC), entalpija endotermnog pika je oko 81 J/g, a ekstrapolirana početna temperatura je 162.1±5.0°C, poželjno 162.1 ±3.0°C, poželjnije 162.1±1.0°C, pri čemu "ekstrapolirana početna temperatura" znači, kako je definisano JIS K 7121 (metoda merenja temperaturnog transfera plastike), temperatura na preseku ekstrapolirane osnovne linije donje temperaturne strane prema strani sa više temperature sa tangentnom linijom povučenom u tački pokazuje najveći nagib na prednjoj ivici vrha topljenja na strani niže temperature u DSC krivoj. Kada su entalpija i ekstrapolirana početna temperatura endotermnog pika unutar gore navedenog opsega, kristal jedinjenja A je stabilan.

[0016] Kristal jedinjenja A koji leži u osnovi ovog pronalaska može biti ili kristalni oblik II ili kristalni oblik III, ili mešani kristal kristalnog oblika II i kristalnog oblika III. Za upotrebu u farmaceutskom proizvodu jedinjenja A i slično, kristalni oblik II ili kristalni oblik III je poželjniji jer su stabilni kristali, a kristalni oblik III je poželjniji jer je najstabilniji kristal. Pored toga, kristalni oblik II je poželjniji s obzirom na sposobnost apsorpcije živih organizama nakon primene kao farmaceutske kompozicije.

[0017] U ovom pronalasku, "čistoća kristala" označava čistoću kristalnog oblika II ili kristalnog oblika III jedinjenja A. U slučaju mešanog kristala kristalnog oblika II i kristalnog oblika III, to znači odnos kristal u odnosu na ukupnu količinu supstance kristalnog oblika II i kristalnog oblika III. Čistoća kristala koji leži u osnovi ovog pronalaska može se odrediti, na primer, poznatim postupcima kao što su difraktometrija rendgenskog praha, termička analiza i slično. Čistoća kristala ili mešanog kristala koji leži u osnovi ovog pronalaska ne mora da bude 100%, i može biti najmanje 70%, poželjno ne manja od 80%, poželjnije ne manja od 90%, poželjnije ne manja od 95 %, a najpoželjnije ne manje od 98%. Čistoća unutar ovog opsega je poželjna za garantovanje kvaliteta.

[0018] Kristalni ili mešani kristal jedinjenja A koji leži u osnovi ovog pronalaska može se davati sisaru (čovek, miš, pacov, hrčak, zec, mačka, pas, goveda, ovca, majmun itd.) raznim farmaceutskim preparatima, kao što su anti-HIV agensi, inhibitori HIV integraze, antivirusni agensi i slično koji se koriste za, na primer, profilaksu i/ili lečenje AIDS.

[0019] Kada se kristal ili mešani kristal jedinjenja A koji leži u osnovi ovog pronalaska koristi kao farmaceutska kompozicija, on se meša sa farmaceutski prihvatljivim nosačima, ekscipijentima, razblaživačima, ekstenzivnim agensima, dezintegrantima, stabilizatorima, konzervansima, puferima, emulgatorima, aromama, agensima za bojenje, zaslađivačima, zgušnjivačima, korektivima, pomoćnim sredstvima za rastvaranje i drugim aditivima, koji su opšte poznati sami po sebi, kao što su voda, biljno ulje, alkohol (npr. etanol ili benzil alkohol itd.), polietilen glikol, glicerol triacetat, želatin, ugljeni hidrati (npr. laktoza, skrob itd.), magnezijum stearat, talk, lanolin, petrolatum i slično, formirani u tablete, pilule, prah, granule, supozitorije, injekcije, kapi za oči, tečnost, kapsule, trohe, aerosol, eliksir, suspenziju , emulzija, sirup i slično uobičajenim postupkom, i primenjeni sistemski ili lokalno, i oralno ili parenteralno.

[0020] Dok doza varira u zavisnosti od starosti, telesne težine, simptoma, efekta lečenja, metode primene i slično, ona je generalno 0.01 mg do 1 g po primeni za odraslu osobu, koja se daje jednom do nekoliko puta dnevno oralno ili u dozama za oblik injekcije kao što je intravenska injekcija i slično.

[0021] Anti-HIV agens je generalno neophodan da bi održao svoj efekat dugo vremena, tako da može biti efikasan ne samo za privremenu supresiju rasta virusa, već i za sprečavanje ponovnog razvoja virusa. To znači da je neophodna produžena primena i da visoka pojedinačna doza često može biti neizbežna za održavanje efekta tokom dužeg perioda tokom noći i slično. Ovako produžena i visoka primena doza povećava rizik od neželjenih efekata.

[0022] S obzirom na ovo, jedan od poželjnih načina ovog pronalaska je takvo jedinjenje koje dozvoljava visoku apsorpciju oralnom primenom, i takvo jedinjenje je sposobno da održi koncentraciju primenjenog jedinjenja u krvi tokom dužeg vremenskog perioda.

[0023] Pod "profilaksom AIDS" se podrazumeva, na primer, davanje farmaceutskog agensa osobi koja je bila HIV pozitivna, ali još nije razvila bolesno stanje AIDS, davanje farmaceutskog agensa osobi koja pokazuje poboljšano bolesno stanje AIDS nakon lečenja, ali koja nosi HIV koji tek treba da iskoreni i gde postoji rizik od relapsa AIDS, i davanje farmaceutskog agensa usled rizika od moguće infekcije.

[0024] Kompozicija ovog pronalaska sadrži GS-7340 i koristi se za, na primer, kombinovanu terapiju AIDS sa više lekova. Ova anti-HIV kompozicija može da sadrži druge aktivne supstance protiv HIV kao aktivne sastojke.

[0025] Primeri "druge anti-HIV aktivne supstance" koja se koristi za anti-HIV kompoziciju uključuju anti-HIV antitelo, HIV vakcinu, imunostimulante kao što je interferon i slično, HIV ribozim, HIV antisens lek, HIV inhibitor reverzne transkriptaze, inhibitor HIV proteaze, inhibitor veze između receptora veze (CD4, CKSCR4, CCR5 i slično) ćelije domaćina koju prepoznaju virus i virusa, i slično.

[0026] Specifični primeri inhibitora reverzne transkriptaze HIV-a uključuju Retrovir(R) (zidovudin), Epivir(R) (lamivudin), Zerit(R) (sanilvudin), Videk(R) (didanozin), Hivid(R) (zalcitabin), Ziagen (R) (abakavir sulfat),

[0027] Viramune(R) (nevirapin), Stocrin(R) (efavirenz), Rescriptor(R) (delavirdin mezilat), Combivir(R) (zidovudin+lamivudin), Trizivir(R) (abakavir sulfat+lamivudin+zidovudin), Coactinon( R) (emivirin), fosfonovir(R), Coviracil(R), alovudin (3'-fluoro-3'-deoksitimidin), tiovir (tiofosfonomravlja kiselina), kapravirin (5-[(3.5-dihlorofenil)tio]- 4-izopropil-1-(4-piridilmetil)imidazol-2-metanol karbaminska kiselina), tenofovir dizoproksil fumarat ((R)-[[2-(6-amino-9H-purin-9-il)-1-metiletoksi] metil]fosfonska kiselina bis(izopropoksikarboniloksimetil)estar fumarat), DPC-083 ((4S)-6-hloro-4-[(1E)-ciklopropiletenil]-3.4-dihidro-4-trifluorometil-2(1H)-hinazolinon ), DPC-961 ((4S)-6-hloro-4-(ciklopropiletinil)-3.4-dihidro-4-(trifluorometil)-2(1H)-hinazolinon), DAPD ((-)-p-D-2, 6-diaminopurin dioksolan), Immunocal, MSK-055, MSA-254, MSH-143, NV-01, TMC-120, DPC-817, TMC-125, SPD-754, D-A4FC, kapravirin, UC-781, emtricitabin, alovudin, fosfazid, UC-781, BCH-10618, DPC-083, etravirin, BCH-13520, MIV-210, abakavir sulfat/lamivudin, GV-5634, GV-695634 i slično, pri čemu (R) označava registrovani žig (u daljem tekstu isti) i nazivi drugih farmaceutskih agenasa su opšti nazivi.

[0028] Specifični primeri inhibitora HIV proteaze uključuju Crikivan® (indinavir sulfat etanolat), sakvinavir, Invirase® (sakvinavir mezilat), Norvir® (ritonavir), Viracept® (nelfinavir mezilat), lopinavir, Prozei( R) (amprenavir), Kaletra(R) (ritonavir+lopinavir), mozenavir dimezilat ([4R-(4α.5α,6β)]-1.3-bis[(3-aminofenil)metil]-heksahidro-5.6 -dihidroksi-4.7-bis(fenilmetil)-2H-1.3-diazepin-2-on dimetansulfonat), tipranavir (3'-[(1R)-1-[(6R)-5.6-dihidro-4 -hidroksi-2-okso-6-feniletil-6-propil-2H-piran-3-il]propil]-S-(trifluorometil)-2-piridinsulfonamid), lasinavir (N-[5(S)-(terc-butoksikarbonilamino)-4(S)-hidroksi-6-fenil-2(R)-(2.3,4-trimetoksibenzil)heksanoil]-L-valin 2-metoksietilenamid), KNI-272 ((R)-N-tert -butil-3-[(2S.3S)-2-hidroksi-3-N-[(R)-2-N-(izohinolin-5-iloksiacetil)amino-3-metiltiopropanoil]amino-4-fenilbutanoil]-5 .5-dimetil-1.3-tiazolidin-4-karboksamid), GV-433908, TMC-126, DPC-681, bakminsterfuleren, MK-944A (MK944 (N-(2(R)-hidroksi-1(S)) -indanil)-2(R)-fenilmetil-4(S)-hidroksi-5-[4-(2-benzo[b]furanilmetil)-2(S)-(tercbutilkarbamoil)piperazin-1-il]pentanamid )+indinavir sulfat), JE-2147 ([2(S)-okso-4-fenilmetil-3(S)-[(2-metil-3-oksi)fenilkarbonilamino]-1-oksabutil]-4-[(2) -metilfenil)metilamino]karbonil-4(R)-5.5-dimetil-1.3-tiazol), BMS-232632 ((3S.8S,9S.12S)-3.12-bis(1.1-dimetiletil) )-8-hidroksi-4.11-diokso-9-(fenilmetil)-6-[[4-(2-piridinil)fenil]metil]-2.5,6.10,13-pentaazatetradekandikarboksilna kiselina dimetil estar), DMP-850 ((4R.5S,6S.7R)-1-(3-amino-1H-indazol-5-ilmetil)-4.7-dibenzil-3-butil-5.6-dihidroksiperhidro-1.3- diazepin-2-on), DMP-851, RO-0334649, Nar-DG-35, R-944, VKS-385, TMC-114, tipranavir, fosamprenavir natrijum, fosamprenavir kalcijum, darunavir, GV-0385, R-944 , RO-033-4649, AG-1859 i sl.

[0029] Primer inhibitora HIV integraze je S-1360, L-870810 i slično, inhibitor DNK polimeraze ili inhibitor sinteze DNK sa primerima Foscavir®, ACH-126443 (L-2'.3'-didehidro-dideoksi-5-fluorocitidin), entekavir ((1S.3S,4S)-9-[4-hidroksi-3-(hidroksimetil)-2-metilenciklopentil]gvanin), kalanolid A ([10R-(10α.11β,12α)]- 11.12-dihidro-12-hidroksi-6.6,10.11-tetrametil-4-propil-2H.6H,10H-benzo[1.2-b:3.4-b':5.6-b"]tripiran-2-on), kalanolid B, NSC-674447 (1.1'-azobisformamid), Iscador (ekstrakt Viscum alubm), Rubitecan i slično, HIV antisens lek je ilustrovan sa HGTV-43, GEM-92 i slično, antitelo protiv HIV-a ili drugo antitelo sa primerima NM-01, PRO-367, KD-247, Citolin®, TNKS-355 (CD4 antitelo), AGT-1, PRO-140 (CCR5 antitelo ), Anti-CTLA-4MAb i slično, HIV vakcina ili druga vakcina sa primerima ALVAC(R), AIDSVAKS(R), Remune (R), HIVgp41 vakcina, HIVgp120 vakcina, HIVgp140 vakcina, HIVgpl60 vakcina, HIVnep17 vakcina HIVp24 vakcina, HIVp55 vakcina, AlphaVax Vector System, vakcina protiv boginja kod kanarinaca gp160 vakcina, AntiTat, MVA-F6 Nef vakcina, HIVrev vakcina, C4-V3 peptid, p2249f, VIR-201, HGP-30V, PARTIC-30V, TBBC , Antiferon (interferon-α vakcina) i slično, interferon ili agonist interferona su primeri Sumiferon®, MultiFeron®, interferon-τ, Retikuloza, humani leukocitni interferon α i slično, antagonist CCR5 je prikazan kao SCH-351125 i slično, farmaceutski agens koji deluje na HIV p24 je primer GPG-NH2 (glicil-prolil-glicinamid) i slično, inhibitor fuzije HIV sa primerima FP-21399 (1,4-bis[3- [(2,4-dihlorofenil)karbonilamino]-2-okso-5.8-dinatrijum sulfonil]naftil-2.5-dimetoksifenil-1,4-dihidrazon), T-1249, sintetička polimerna konstrukcija br.3, pentafuzid, FP- 21399, PRO-542, Enfuvirtid i slično, IL-2 agonist ili antagonist je ilustrovan sa interleukin-2, Imunace®, Proleukin®, Multikine®, Ontak® i slično, TNF -α, antagonist je ilustrovan sa Thalomid® (talidomid), Remicade® (infliksimab), kurdlan sulfat, inhibitor α-glukozidaze sa primerima Bucast® i slično, inhibitor purin nukleozid fosforilaze sa primerima peldezin (2-amino-4-okso-3H.5H-7-[(3-piridil)metil]pirolo[3.2-d]pirimidin) i slično, agonist ili inhibitor apoptoze sa primerima Arkin Z(R ), Panavir(R), koenzim K10 (2-deka(3-metil-2-butenilen)-5.6-dimetoksi-3-metil-p-benzohinon) i slično, inhibitor holinesteraze sa primerima Cognek(R ) i slično, a primeri imunomodulatora su Imunox®, Prokine®, Met-enkefalin (6-de-L-arginin-7-de-L-arginin-8-de-L-valinamid-adrenorfin ), VF-10 (10 puta razblažen rastvor tetrahlorodekaoksida), Perthon, PRO-542, SCH-D, UK-427857, AMD-070, AK-602 i slično.

[0030] Pored toga, Neurotropin(R), Lidakol(R), Ancer 20(R), Ampligen(R), Anticort(R), Inactivin(R) i slično, PRO-2000, Rev M10 gen, HIV specifična citotoksična T ćelijska (CTL imunoterapija, terapija ACTG protokolom 080, CD4-ζ genska terapija), SCA vezujući protein, RBC-CD4 kompleks, Moteksafin gadolinijum, GEM-92, CNI-1493, (±)-FTC, Ushercell, D2S, BufferGel(R), primeri su VivaGel®, Gliminok vaginalni gel, natrijum lauril sulfat, 2F5, 2F5/2G12, VRKS-496, Ad5gag2, BG-777, IGIV-C, BILR-255 i slično.

[0031] Kao "druga supstanca protiv HIV" koja će se koristiti za anti-HIV kompoziciju ovog pronalaska, koja obavezno sadrži GS-7340, u kombinovanoj terapiji više lekova, poželjni su inhibitori reverzne transkriptaze HIV i inhibitori HIV proteaze. Dva ili tri, ili čak veći broj farmaceutskih agenasa se mogu koristiti u kombinaciji, pri čemu je kombinacija farmaceutskih agenasa koji imaju različite mehanizme delovanja jedan od poželjnih primera izvođenja. Pored toga, poželjan je izbor farmaceutskih agenasa bez dupliranja neželjenih efekata.

[0032] Metoda proizvodnje kristala ili mešanog kristala jedinjenja A koji leži u osnovi ovog pronalaska nije posebno ograničena, a kristal se može proizvesti postupkom koji je poznat sam po sebi ili postupkom prikazanim u sledećim Primerima i slično.

Primeri

Referentni primer 1: Proizvodnja kristalnog oblika I

jedinjenje A

Korak 1

[0033]

[0034] 2,4-Difluorobenzojeva kiselina (50 g, 316 mmol) je rastvorena u koncentrovanoj sumpornoj kiselini (200 ml), a N-jodosukcinimid (68 g, 300 mmol) je dodat u porcijama na ne više od 5°C. Po završetku dodavanja, smeša je mešana na istoj temperaturi 4.5 h. Reakciona smeša je sipana u ledenu vodu (oko 600 ml), zatim je dodat 10% vodeni rastvor natrijum sulfita i smeša je mešana. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom, isprana vodom i osušena pod vakuumom da bi se dobili sirovi kristali (85 g). Sirovi kristali dobijeni na isti način su kombinovani (ukupna količina 205 g) i rekristalizovani iz 50% vodenog rastvora etanola (820 ml) da bi se dobila 2,4-difluoro-5-jodobenzojeva kiselina (148 g, prinos 73%) kao bela čvrsta susptanca.<1>H NMR (CDCl3300MHz) (σ) ppm: 6.94 (1H, dd, J=10.3, 10.3Hz), 8.46 (1H, d, J=7.5Hz)

Korak 2

[0035]

[0036] Jedinjenje (148 g, 521 mmol) dobijeno u koraku 1 je rastvoreno u toluenu (750 ml), dodati su tionil hlorid (76 ml, 1.04 mol) i dimetilformamid (katalitička količina), i smeša je zagrevana pod refluksom 2 h. Nerastvorni materijal je filtriran na 60°C, a filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom i azeotropovan sa toluenom (330 ml). Ostatak je rastvoren u tetrahidrofuranu (400 ml) i ovaj rastvor je dodat u kapima u rastvor etil 3,3-dimetilaminoakrilata (82 g, 573 mmol) i trietilamina (87 ml, 625 mmol) u tetrahidrofuranu (400 ml), i smeša je zagrevana pod refluksom 7 h. Reakciona smeša je ostavljena da se ohladi do sobne temperature i koncentrovana pod sniženim pritiskom. Dodati su voda (700 ml) i etil acetat (800 ml) za razdvajanje. Organski sloj je uzastopno ispran zasićenim vodenim rastvorom natrijum hidrogen karbonata (250 ml, X2), vodom (300 ml) i zasićenim rastvorom soli (300 ml), i osušen iznad natrijum sulfata. Posle filtracije nerastvornog materijala, filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobio sirovi proizvod (210 g) etil estra 2-(2,4-difluoro-5-jodobenzoil)-3-dimetilaminoakrilne kiseline kao braon čvrsta supstanca.

Korak 3

[0037]

[0038] Sirovi proizvod (210 g) dobijen u koraku 2 rastvoren je u tetrahidrofuranu (500 ml), dodat je (S)-(+)-valinol (54 g, 521 mmol) i smeša je mešana na sobnoj temperaturi 30 min. . Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom, a ostatak je rastvoren u dimetilformamidu (600 ml). Dodat je kalijum karbonat (144 g, 1.04 mol) i smeša je mešana uz zagrevanje na 70°C tokom 2 h. Reakciona smeša je ostavljena da se ohladi, pa je dodata u vodu (1500 ml) i mešana. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i dobijena čvrsta supstanca je isprana uzastopno sa 30% vodenim etanolom (500 ml) i mešanim rastvaračem dietil etra (150 ml) i heksana (150 ml) i osušena pod vakuumom da bi se dobio etil estar 7-fluoro-1-((S)-1-hidroksimetil-2-metilpropil)-6-jodo-4-okso-1,4-dihidrohinolin-3-karboksilne kiseline (178 g, prinos 76%) kao čvrsta supstanca bež boje.

<1>H NMR (DMSO-d6300MHz) (δ) ppm: 0.72 (3H, d, J=6.6Hz), 1.10 (3H, d, J=6.6Hz), 1.28(3H, t, J=7.0Hz), 2.27 (1H, br), 3.77 (1H, br), 3.86 (1H, br), 4.23 (2H, k, J=7.0Hz), 4.56(1H, br), 5.12 (1H, t, J=4.9Hz), 8.09 (1H, d , J=11.1Hz), 8.62 (1H, d, J=7.5Hz), 8.68 (1H, s) MS(ESI): M+ 448

Korak 4

[0039]

1

pri čemu TBDMS označava terc-butildimetilsilil grupu.

[0040] Jedinjenje (80 g, 179 mmol) dobijeno u koraku 3 je rastvoreno u dimetilformamidu (320 ml), dodati su imidazol (16 g, 233 mmol) i terc-butildimetilsilil hlorid (30 g, 197 mmol), i smeša je mešana. na sobnoj temperaturi 1.5 h. U reakcionu smešu je dodata voda i smeša je ekstrahovana etil acetatom. Organski sloj je uzastopno ispran zasićenim vodenim rastvorom amonijum hlorida i zasićenim rastvorom soli, i osušen iznad natrijum sulfata. Organski sloj je filtriran i filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Dobijeni ostatak je prečišćen hromatografijom na silika gelu (etil acetat:heksan=1:3 do 1:2) da bi se dobio etil estar 1-((S)-1-terc-butildimetilsililoksimetil-2-metilpropil)-7-fluoro-6-jodo -4-okso-1,4-dihidrohinolin-3-karbonske kiseline (77 g, prinos 77%) kao bezbojni amorfni oblik.

<1>H NMR (CDCl3400MHz) (δ) ppm: -0.07 (3H, s), -0.05 (3H, s), 0.77 (9H, s), 0.84 (3H, d, J=6.5Hz), 1.18 (3H, d, J= 6.5 Hz), 1.40 (3H, t, J=7.2Hz), 2.35-2.50 (1H, m), 3.85-3.95 (1H, m), 3.98-4.10 (2H, m), 4.30-4.40 (2H, m) ), 7.26 (1 H, s), 8.64 (1 H, s), 8.94 (1 H, d, J=7.2 Hz) MS(ESI): M+ 562

Korak 5

[0041]

(Priprema rastvora 3-hloro-2-fluorobenzilcink bromida u tetrahidrofuranu)

[0042] Pod strujom argona, cink u prahu (11 g, 267 mmol) je suspendovan u tetrahidrofuranu (30 ml), dodati su 1.2-dibromoetan (0.15 ml, 1.8 mmol) i trimetilsilil hlorid (0.45 ml, 3.6 mmol) na 65°C, i smeša je mešana uz zagrevanje 30 min. Rastvor 3-hloro-2-fluorobenzil bromida (41 g, 178 mmol) u tetrahidrofuranu (100 ml) je dodat u kapima na 65°C, i smeša je mešana uz zagrevanje tokom 2 sata i ostavljena da se ohladi do sobne temperature da bi se dobio rastvor 1M 3-hloro-2-fluorobenzilcink bromida u tetrahidrofuranu. Ovo je korišćeno u sledećem glavnom koraku.

(Glavni korak)

[0043] Jedinjenje (76 g, 136 mmol) dobijeno u koraku 4 je rastvoreno u tetrahidrofuranu (600 ml) i, pod strujom argona, dodati su dibenzilidenacetonpaladijum(II) (3.2 g, 5.5 mmol) i trifurilfosfin (2.6 g, 11.0 mmol) i rastvor gore pomenutog 1M 3-hloro-2-fluorobenzilcink bromida u tetrahidrofuranu (178 ml, 178 mmol) je dodat u kapima na 60°C. Po završetku dodavanja kap po kap, smeša je mešana uz zagrevanje na istoj temperaturi 2 h. Reakciona smeša je ostavljena da se ohladi do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor amonijum hlorida i smeša je filtrirana kroz celit. Filtrat je ekstrahovan dva puta sa etil acetatom. Organski sloj je uzastopno ispran vodom (dvaput) i zasićenim rastvorom soli, i osušen iznad magnezijum sulfata. Organski sloj je filtriran i filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom, a dobijeni ostatak je prečišćen hromatografijom na silika gelu (hloroform:aceton=40:1) da bi se dobio 1-((S)-1-terc-butildimetilsililoksimetil-2- metilpropil)-6-(3-hloro-2-fluorobenzil)-7-fluoro-4-okso-1,4-dihidrohinolin-3-karboksilna kiselina etil estar (68 g, prinos 84%) kao bezbojni amorfni oblik.<1>H NMR (CDCl3400MHz) (δ) ppm: -0.09(3H, s), -0.05(3H, s), 0.75(9H, s), 0.85(3H,d, J=6.7Hz), 1.18(3H, d, 6.7Hz) ), 1.39 (3H, t, J=7.1 Hz), 2.45 (1H, br), 3.89-3.92 (1H, m), 3.98-4.02 (1H, m), 4.07-4.12 (1H, m), 4.12( 2H, s), 4.34-4.41 (2H, m), 6.96-7.00 (1H, m), 7.03-7.05 (1H, m), 7.21-7.24 (1H, m), 7.26-7.29 (1H, m), 8.39 (1H, d, J=8.8 Hz), 8.63 (1H, s)

Korak 5

[0044]

[0045] Jedinjenje (48 g, 86 mmol) dobijeno u koraku 5 je rastvoreno u metanolu (300 ml), dodata je voda (5 ml) i 28% rastvor metanola natrijum metoksida (176 ml, 862 mmol), i smeša je zagrevana pod refluksom 24 h. Reakciona smeša je ostavljena da se ohladi do sobne temperature i smeša je neutralizovana dodavanjem 6N hlorovodonične kiseline. Metanol je uparen pod sniženim pritiskom. U dobijeni rastvor je dodata voda i smeša je mešana. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i dobijena čvrsta supstanca je rastvorena u etil acetatu.

Smeša je isprana vodom i osušena iznad natrijum sulfata. Rastvor je filtriran i filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Dobijeni ostatak je rekristalizovan iz etil acetat-heksana da bi se dobilo jedinjenje (32 g, prinos 86%) kao bela čvrsta supstanca. Dobijeno jedinjenje (32 g) je rastvoreno u butil acetatu (160 ml) zagrevanjem pod refluksom, a kristalni oblik II je zasejan na 75°C. Smeša je mešana 3.5 h dok je ostavljena da se ohladi. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom, isprana butil acetatom (25 ml) i osušena u vakuumu da bi se dobilo jedinjenje (25 g, prinos 77%) u vidu bele čvrste supstance. Dobijeno jedinjenje (4.0 g) je rastvoreno u metanolu (40 ml) zagrevanjem pod refluksom na 50°C i dodato u kapima u vodu (40 ml) na sobnoj temperaturi. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi 16 h, filtrirana, a preostala čvrsta supstanca je isprana sa 66% vodenim metanolom i osušena u vakuumu da bi se dobio kristal jedinjenja A (kristalni oblik I) (3.9 g, prinos 97%) kao bela čvrsta materija. m.p. 151-152°C

<1>H NMR (DMSO-d6300MHz) (δ) ppm: 0.72 (3H, d, J=6.5Hz), 1.16 (3H, d, J=6.5Hz), 2.30-2.50 (1H, m), 3.70-3.90 (1H, m), 3.90 -4.00 (1H, m), 4.03 (3H, s), 4.12 (2H, s), 4.80-4.90 (1H, m), 5.19 (1H, t), 7.19-7.25 (2H, m), 7.46-7.51 (2H, m), 8.04 (1H, s), 8.88 (1H, s), 15.44 (1H, s) MS (ESI): M+ 448

Primer 1: Proizvodnja kristalnog oblika II jedinjenja A

Korak 1

[0046]

[0047] 2,4-Difluorobenzojeva kiselina (50 g, 0.316 mmol) je rastvorena u koncentrovanoj sumpornoj kiselini (200 ml) i dodat je N-jodosukcinimid (68 g, 300 mmol) u porcijama na temperaturi ne više od 5°C. Po završetku dodavanja, smeša je mešana na istoj temperaturi 4.5 h. Reakciona smeša je sipana u ledenu vodu (oko 600 ml), zatim je dodat 10% vodeni rastvor natrijum sulfita i smeša je mešana. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom, isprana vodom i osušena pod vakuumom da bi se dobili sirovi kristali (85 g). Sirovi kristali dobijeni na isti način su kombinovani (ukupna količina 205 g) i rekristalizovani iz 50% vodenog rastvora etanola (820 ml) da bi se dobila 2,4-difluoro-5-jodobenzojeva kiselina (148 g, prinos 73%) kao bela čvrsta materija.

<1>H NMR (CDCl3300MHz) (σ) ppm: 6.94 (1H, dd, J=10.3, 10.3Hz), 8.46 (1H, d, J=7.5Hz)

1

Korak 2

[0048]

[0049] Jedinjenje (148 g, 521 mmol) dobijeno u koraku 1 je rastvoreno u toluenu (750 ml), dodati su tionil hlorid (76 ml, 1.04 mol) i dimetilformamid (katalitička količina), i smeša je zagrevana pod refluksom 2 h. Nerastvorni materijal je filtriran na 60°C, a filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom i azeotropovan sa toluenom (330 ml). Ostatak je rastvoren u tetrahidrofuranu (400 ml) i ovaj rastvor je dodat u kapima u rastvor etil 3,3-dimetilaminoakrilata (82 g, 573 mmol) i trietilamina (87 ml, 625 mmol) u tetrahidrofuranu (400 ml), i smeša je zagrevana pod refluksom 7 h. Reakciona smeša je ostavljena da se ohladi do sobne temperature i koncentrovana pod sniženim pritiskom. Dodati su voda (700 ml) i etil acetat (800 ml) da bi se omogućilo razdvajanje. Organski sloj je dva puta ispran zasićenim vodenim rastvorom natrijum hidrogen karbonata (250 ml), vodom (300 ml) i zasićenim rastvorom soli (300 ml), i osušen iznad natrijum sulfata. Smeša je filtrirana, a filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobio sirovi proizvod (210 g) etil estra 2-(2,4-difluoro-5-jodobenzoil)-3-dimetilaminoakrilne kiseline kao braon čvrsta supstanca.

Korak 3

[0050]

[0051] Sirovi proizvod (210 g) dobijen u koraku 2 rastvoren je u tetrahidrofuranu (500 ml), dodat je (S)-(+)-valinol (54 g, 0.521 mmol) i smeša je mešana na sobnoj temperaturi 30 min. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom, a ostatak je rastvoren u dimetilformamidu (600 ml). Dodat je kalijum karbonat (144 g, 1.04 mol), i smeša je mešana uz zagrevanje na 70°C tokom 2 h. Reakciona smeša je ostavljena da se ohladi do sobne temperature, dodata je voda (1500 ml) i smeša je mešana. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom. Dobijena čvrsta supstanca je isprana uzastopno sa 30% vodenim rastvorom etanola (500 ml) i smešom rastvarača dietil etra (150 ml) i heksana (150 ml), i osušena u vakuumu da bi se dobio etil estar 7-fluoro-1-((S)-l -hidroksimetil-2-metilpropil)-6-jodo-4-okso-1,4-dihidrohinolin-3-karboksilne kiseline (178 g, prinos 76% (u odnosu na Korak 2)) kao čvrsta supstanca bež boje.

<1>H NMR (DMSO-d6300MHz) (δ) ppm: 0.72 (3H, d, J=6.6Hz), 1.10 (3H, d, J=6.6Hz), 1.28(3H, t, J=7.0Hz), 2.27 (1H, br), 3.77 (1H, br), 3.86 (1H, br), 4.23 (2H, k, J=7.0Hz), 4.56(1H, br), 5.12 (1H, t, J=4.9Hz), 8.09 (1H, d , J=11.1Hz), 8.62 (1H, d, J=7.5Hz), 8.68(1H, s) MS(ESI): M+ 448

Korak 4

[0052]

[0053] Jedinjenje (150 g, 335 mmol) dobijeno u koraku 3 je rastvoreno u dimetilformamidu (500 ml), dodati su imidazol (30 g, 0.436 mmol) i terc-butildimetilsilil hlorid (56 g, 369 mmol), i smeša je mešana. na sobnoj temperaturi 1.5 h. U reakcionu smešu je dodata voda i ekstrahovana etil acetatom. Organski sloj je uzastopno ispran vodom, zasićenim vodenim rastvorom amonijum hlorida i zasićenim rastvorom soli, i osušen iznad natrijum sulfata. Organski sloj je filtriran i filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom, a dobijeni ostatak je prečišćen hromatografijom na silika gelu (etil acetat:heksan=1:3 do 1:2) da bi se dobio etil estar 1-((S)-1-terc-butildimetilsililoksimetil-2-metilpropil)-7-fluoro-6-jodo-4-okso-1,4-dihidrohinolin-3-karboksilne kiseline (173 g, prinos 92%) kao bezbojni amorfni oblik.<1>H NMR (CDCl3400MHz) (δ) ppm: -0.07(3H, s), -0.05(3H, s), 0.77(9H, s), 0.84(3H,d, J=6.5Hz), 1.18(3H, d, J= 6.5 Hz), 1.40 (3H, t, J=7.2Hz), 2.35-2.50 (1H, m), 3.85-3.95 (1H, m), 3.98-4.10 (2H, m), 4.30-4.40 (2H, m) ), 7.26 (1 H, s), 8.64 (1 H, s), 8.94 (1 H, d, J=7.2 Hz) MS (ESI): M+ 562

Korak 5

[0054]

1

(Priprema rastvora 3-hloro-2-fluorobenzilcink bromida u tetrahidrofuranu)

[0055] Pod strujom argona, cink prah (11 g, 175 mmol) je suspendovan u tetrahidrofuranu (30 ml), dodati su 1.2-dibromoetan (0.1 ml, 1.20 mmol) i trimetilsilil hlorid (0.29 ml, 2.4 mmol) na 60°C, i smeša je mešana uz zagrevanje 30 min. Ukapavanjem je dodat rastvor 3-hloro-2-fluorobenzil bromida (27 g, 119 mmol) u tetrahidrofuranu (60 ml) na 60°C. Smeša je mešana uz zagrevanje 1 sat i ostavljena da se ohladi do sobne temperature da bi se dobio rastvor 1M 3-hloro-2-fluorobenzilcink bromida u tetrahidrofuranu. Ovo je korišćeno u sledećem glavnom koraku.

(Glavni korak)

[0056] Jedinjenje (50 g, 89 mmol) dobijeno u koraku 4 je rastvoreno u tetrahidrofuranu (400 ml) i, pod strujom argona, dodat je dihlorobis(trifenilfosfin)paladijum(II) (2.1 g, 3.6 mmol) i rastvor gore pomenutog 1M 3-hloro-2-fluorobenzilcink bromida u tetrahidrofuranu je dodat u kapima na 60°C. Po završetku dodavanja kap po kap, smeša je mešana uz zagrevanje na istoj temperaturi 1.5 h. Reakciona smeša je ostavljena da se ohladi do sobne temperature, dodata je 1N hlorovodonična kiselina i smeša je ekstrahovana 3 puta etil acetatom. Organski sloj je uzastopno ispran vodom i zasićenim rastvorom soli, i osušen iznad magnezijum sulfata. Organski sloj je filtriran i filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom, a dobijeni ostatak je prečišćen hromatografijom na silika gelu (etil acetat:heksan=1:2 do 1:1) da bi se dobio etil estar 1-((S)-1-terc-butildimetilsililoksimetil-2-metilpropil)-6-(3-hloro-2-fluorobenzil)-7-fluoro-4-okso-1,4-dihidrohinolin-3-karboksilne kiseline (43 g, prinos 83%) kao braon amorfni oblik.<1>H NMR (CDCl3400MHz) (δ) ppm: -0.09(3H, s), -0.05(3H, s), 0.75(9H, s), 0.85(3H,d, J=6.7Hz), 1.18(3H, d, 6.7Hz) ), 1.39 (3H, t, J=7.1 Hz), 2.45 (1H, br), 3.89-3.92 (1H, m), 3.98-4.02 (1H, m), 4.07-4.12 (1H, m), 4.12( 2H, s), 4.34-4.41 (2H, m), 6.96-7.00 (1H, m), 7.03-7.05 (1H, m), 7.21-7.24 (1H, m), 7.26-7.29 (1H, m), 8.39 (1H, d, J=8.8 Hz), 8.63 (1H, s)

Korak 6

1

[0058] Jedinjenje (43 g, 74 mmol) dobijeno u koraku 5 je rastvoreno u metanolu (280 ml), dodati su 28% rastvor metanola natrijum metoksida (151 ml, 742 mmol) i voda (4.3 ml), i smeša je zagrevana pod refluksom 20 h. Reakciona smeša je filtrirana kroz celit. Filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatku je dodata voda (400 ml) i smeša je isprana heksanom (100 ml). Vodeni sloj je zakiseljen dodavanjem koncentrovane hlorovodonične kiseline (65 ml) i smeša je ekstrahovana etil acetatom. Organski sloj je uzastopno ispran vodom i zasićenim rastvorom soli, i osušen iznad natrijum sulfata. Rastvor je filtriran i filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Dobijeni sirovi proizvod (35 g, smeđe ulje) je rastvoren u etil acetatu (49 ml) zagrevanjem pod refluksom, dodat je heksan (30 ml) dok je ostavljen da se ohladi, i smeša je mešana 18.5 h. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom, isprana mešanim rastvaračem etil acetata i heksana (1:1) i osušena pod vakuumom da bi se dobio kristal jedinjenja A (kristalni oblik II) (27 g, prinos 82%) kao bela čvrsta supstanca. t.t. 153.7-153.9°C

<1>H NMR (DMSO-d6300MHz) (δ) ppm: 0<.>72 (3H, d, J=6.5Hz), 1.16 (3H, d, J=6.5Hz), 2.30-2.50 (1H, m), 3.70-3.90 (1H, m), 3.90 -4.00 (1H, m), 4.03 (3H, s), 4.12 (2H, s), 4.80-4.90 (1H, m), 5.19 (1H, t), 7.19-7.25 (2H, m), 7.46-7.51 (2H, m), 8.04 (1H, s), 8.88 (1H, s), 15.44 (1H, s) MS (ESI): M+ 448

Primer 2: Proizvodnja kristalnog oblika II jedinjenja A

Primer 2-1: Proizvodnja kristalnog oblika II jedinjenja A

Korak 1

[0059]

[0060] 2,4-Difluorobenzojeva kiselina (100 g, 633 mmol) je rastvorena u koncentrovanoj sumpornoj kiselini (400 ml), a N-jodosukcinimid (142 g, 601 mol) je dodat u porcijama na ne

1

više od 5°C. Nakon završetka dodavanja, smeša je mešana na istoj temperaturi 6 h. Reakciona smeša je sipana u ledenu vodu (oko 2400 ml), zatim je dodat zasićeni vodeni rastvor natrijum sulfita i smeša je mešana. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom, isprana vodom i osušena pod vakuumom da bi se dobili sirovi kristali (188 g). Sirovi kristali dobijeni na isti način su kombinovani (ukupna količina 568 g) i rekristalizovani iz 50% vodenog etanola (2600 ml) da bi se dobila 2,4-difluoro-5-jodobenzoeva kiselina (388 g, prinos 68%) kao bela čvrsta supstanca.

<1>H NMR (CDCl3300MHz) (σ) ppm: 6.94 (1H, dd, J=10.3, 10.3Hz), 8.46 (1H, d, J=7.5Hz)

Korak 2

[0061]

[0062] Jedinjenje (200 g, 704 mmol) dobijeno u koraku 1 je rastvoreno u toluenu (1000 ml), dodati su tionil hlorid (103 ml, 408 mmol) i dimetilformamid (katalitička količina), i smeša je zagrevana pod refluksom 2 h. Nerastvorni materijal je odfiltriran, a filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom i azeotropovan sa toluenom. Ostatak je rastvoren u tetrahidrofuranu (500 ml), ovaj rastvor je dodat u kapima u rastvor etil 3,3-dimetilaminoakrilata (111 g, 775 mmol) i trietilamina (118 ml, 845 mmol) u tetrahidrofuranu (500 ml), i smeša je zagrevana pod refluksom 3 h. Reakciona smeša je ostavljena da se ohladi do sobne temperature i filtrirana, a filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Dodati su voda (500 ml) i etil acetat (800 ml) da bi se omogućilo razdvajanje. Organski sloj je uzastopno ispran zasićenim vodenim rastvorom natrijum hidrogen karbonata (200 ml), vodom (200 ml) i zasićenim rastvorom soli, i osušen iznad natrijum sulfata. Organski sloj je filtriran, a filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobio sirovi proizvod (273 g) etil estra 2-(2,4-difluoro-5-jodobenzoil)-3-dimetilaminoakrilne kiseline kao braon čvrsta supstanca.

Korak 3

[0063]

1

[0064] Sirovi proizvod (273 g) dobijen u koraku 2 je rastvoren u tetrahidrofuranu (650 ml), dodat je (S)-(+)-valinol (73 g, 708 mmol) i smeša je mešana na sobnoj temperaturi 2 h. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom i ostatak je rastvoren u dimetilformamidu (800 ml). Dodat je kalijum karbonat (195 g 1.41 mol), i smeša je mešana uz zagrevanje na 70°C tokom 2.5 h. Reakciona smeša je ostavljena da se ohladi do sobne temperature, dodata je u vodu (2000 ml) i smeša je mešana. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom. Dobijena čvrsta supstanca je podvrgnuta sukcesivnom ispiranju sa vodom i 30% vodenim rastvorom etanola (650 ml) i osušena u vakuumu da bi se dobio sirovi proizvod (217 g). Dobijeni sirovi proizvod (217 g) je podvrgnut ispiranju suspenzije sa mešanim rastvaračem etil acetata (650 ml) i heksana (440 ml) uz zagrevanje pod refluksom. Smeša je filtrirana, a preostala čvrsta supstanca je osušena u vakuumu da bi se dobio etil estar 7-fluoro-1-((S)-1-hidroksimetil-2-metilpropil)-6-jodo-4-okso-1,4-dihidrohinolin-3-karboksilne kiseline (207 g, prinos 66% (u odnosu na Korak 2)) kao bledo-braon čvrsta supstanca.

<1>H NMR (DMSO-d6300MHz) (δ) ppm: 0.72 (3H, d, J=6.6Hz), 1.10 (3H, d, J=6.6Hz), 1.28(3H, t, J=7.0Hz), 2.27 (1H, br), 3.77 (1H, br), 3.86 (1H, br), 4.23 (2H, k, J=7.0Hz), 4.56 (1H, br), 5.12 (1H, t, J=4.9Hz), 8.09 (1H, d , J=11.1Hz), 8.62 (1H, d, J=7.5Hz), 8.68(1H, s) MS(ESI): M+ 448

Korak 4

[0065]

[0066] Jedinjenje (150 g, 335 mmol) dobijeno u koraku 3 je rastvoreno u dimetilformamidu (450 ml), dodati su imidazol (27 g, 397 mmol) i terc-butildimetilsilil hlorid (58 g, 385 mmol), i smeša je mešana preko noći na sobnoj temperaturi. U reakcionu smešu je dodata voda (900 ml) i smeša je ekstrahovana etil acetatom (680 ml). Organski sloj je uzastopno ispran vodom

1

(450 ml, 3 puta) i zasićenim rastvorom soli (200 ml) i osušen preko natrijum sulfata. Organski sloj je filtriran, a filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobio sirovi proizvod (192 g) etil estar 1-((S)-1-terc-butildimetilsililoksimetil-2-metilpropil)-7-fluoro-6-jodo-4-okso-1,4-dihidrohinolin-3-karboksilne kiseline kao bledožuti amorfni oblik.

Korak 5

[0067]

[0068] Sirovi proizvod (162 g) dobijen u koraku 4 rastvoren je u tetrahidrofuranu (160 ml) i, pod strujom argona, dodati su dibenzilidenaceton paladijum(II) (1.7 g, 2.9 mmol) i trifurilfosfin (1.3 g, 5.8 mmol). Ovoj smeši je u kapima na 60°C dodat rastvor (375 ml, 375 mmol) 1M 3-hloro-2-fluorobenzilcink bromida u tetrahidrofuranu dobijen na isti način kao u Primeru 1, korak 5 i nakon završetka dodavanjem u kapima, smeša je mešana uz zagrevanje na istoj temperaturi 3.5 h. Reakciona smeša je ostavljena da se ohladi do sobne temperature, dodati su etil acetat (640 ml) i 10% vodeni rastvor limunske kiseline (400 ml), i smeša je filtrirana kroz celit, a filtrat je podeljen. Organski sloj je uzastopno ispran vodom (200 ml), zasićenim vodenim rastvorom natrijum hidrogen karbonata (400 ml) i zasićenim rastvorom soli (200 ml), i osušen preko natrijum sulfata. Organski sloj je filtriran, a filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobio sirovi proizvod (186 g) etil estar 1-((S)-1-tercbutildimetilsililoksimetil-2-metilpropil)-6-(3-hloro-2)-fluorobenzil)-7-fluoro-4-okso-1,4-dihidrohinolin-3-karboksilne kiseline kao smeđe ulje.

Korak 6

[0069]

2

[0070] Sirovi proizvod (193 g) dobijen u koraku 5 rastvoren je u izopropanolu (650 ml), dodat je 1N vodeni rastvor natrijum hidroksida (1290 ml, 1.29 mol), i smeša je zagrevana pod refluksom 2 h. Reakciona smeša je ostavljena da se ohladi do sobne temperature i filtrirana kroz celit. Filtrat je zakiseljen dodavanjem koncentrovane hlorovodonične kiseline i smeša je mešana. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom, i osušena pod vakuumom da bi se dobio sirovi proizvod (132 g) kao bledo žuta čvrsta supstanca. Sirovi proizvodi dobijeni na isti način su kombinovani (ukupna količina 143 g), suspendovani u butil acetatu (430 ml) i podvrgnuti mešanju suspenzije uz zagrevanje pod refluksom 1 sat. Suspenzija je ostavljena da se ohladi do sobne temperature i filtrirana i osušena pod vakuumom da bi se dobila 6-(3-hloro-2-fluorobenzil)-7-fluoro-1-((S)-1-hidroksimetil-2-metilpropil)-4-okso-1,4-dihidrohinolin-3-karboksilna kiselina (99 g, prinos 74% (u odnosu na korak 3)) kao siva čvrsta supstanca.

<1>H NMR (DMSO-d6400MHz) (δ) ppm: 0.71 (3H, d, J=6.5Hz), 1.13 (3H, d, J=6.5Hz), 2.36 (1H, br), 3.77 (1H, br), 3.94 (1H, br ), 4.25 (2H, s), 4.77 (1H, br), 5.16 (1H, t, J=2.4Hz), 7.19-7.23 (1H, m), 7.32-7.35 (1H, m), 7.48-7.52( 1H, m), 8.24-8.28 (2H, m), 9.00 (1H, s), 15.00 (1H, s) MS(ESI): M+ 436

Korak 7

[0071]

[0072] Jedinjenje (99 g, 227 mmmol) dobijeno u koraku 6 je rastvoreno u metanolu (530 ml), dodat je 28% rastvor natrijum metoksida u metanolu (465 ml, 2.28 mol) i smeša je zagrevana pod refluksom 20 h. Reakciona smeša je ostavljena da se ohladi do sobne temperature i filtrirana kroz celit. Filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je zakiseljen dodavanjem vode (200 ml) i koncentrovane hlorovodonične kiseline (190 ml), i ekstrahovan sa etil acetatom (500 ml). Organski sloj je dva puta ispran vodom (200 ml) i osušen preko natrijum sulfata. Smeša je filtrirana, a filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobio sirovi proizvod (108 g). Dobijeni sirovi proizvod (108 g) je rastvoren u izobutil acetatu (330 ml) uz zagrevanje i smeša je mešana dok je ostavljena da se ohladi 24 h. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom, i osušena u vakuumu da bi se dobilo jedinjenje A (71 g, prinos 69%) kao bela čvrsta supstanca. Sirovi kristali dobijeni na isti način su kombinovani (ukupna količina 233 g), rastvoreni u izobutil acetatu (470 ml) zagrevanjem pod refluksom, i smeša je mešana preko noći dok je ostavljena da se ohladi. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom, i osušena u vakuumu da bi se dobio kristal jedinjenja A (kristalni oblik II) (206 g, prinos 88%) u vidu bele čvrste supstance.

<1>H NMR (DMSO-d6300MHz) (δ) ppm: 0.72 (3H, d, J=6.5Hz), 1.16 (3H, d, J=6.5Hz), 2.30-2.50 (1H, m), 3.70-3.90 (1H, m), 3.90 -4.00 (1H, m), 4.03 (3H, s), 4.12 (2H, s), 4.80-4.90 (1H, m), 5.19 (1H, t), 7.19-7.25 (2H, m), 7.46-7.51 (2H, m), 8.04 (1H, s), 8.88 (1H, s), 15.44 (1H, s) MS (ESI): M+ 448

Primer 2-2: Proizvodnja kristalnog oblika II jedinjenja A

Korak 1

[0073]

[0074] 5-bromo-2,4-difluorobenzojeva kiselina (82.7 kg, 349 mol) je rastvorena u toluenu (420 L), dodati su tionil hlorid (62.3 kg, 523 mol) i dimetilformamid (katalitička količina), i smeša je mešana na 70°C tokom 6 h. Reakciona smeša je ostavljena da se ohladi do sobne temperature, koncentrovana pod sniženim pritiskom i ponovo azeotropovana sa toluenom (420 L).

[0075] Ostatak je rastvoren u toluenu (220 L), ovaj rastvor je dodat u kapima u rastvor etil 3,3-dimetilaminoakrilata (55.0 kg, 384 mol) i diizopropiletilamina (58.6 kg, 523 mol) u toluenu (220 L), i smeša je mešana uz zagrevanje na 70°C tokom 21 h. Reakciona smeša je ostavljena da se ohladi na sobnu temperaturu, dodat je (S)-(+)-valinol (36.0 kg, 349 mol), i smeša je mešana na sobnoj temperaturi 1.5 h. Voda (420 L) je dodata u reakcionu smešu da bi se omogućila podela, a organski sloj je ispran uzastopno sa 1N hlorovodoničnom kiselinom (250 L, dva puta), vodom (420 L), 5% vodenim rastvorom natrijum hidrogenkarbonata (250 L, dva puta), vodom (420 L) i 10% slanim rastvorom (250 L). Ekstrakt je koncentrovan pod sniženim pritiskom i azeotropovan sa dimetilformamidom (420 L) da bi se dobio koncentracioni ostatak (330 L) koji sadrži sirovi proizvod etil estar 2-(5-bromo-2,4-difluorobenzoil)-3-((S)-1-hidroksimetil-2-metilpropilmetilamino)akrilne kiseline.

Korak 2

[0077] U rastvor (330 L) sirovog proizvoda dobijenog u koraku 1 u dimetilformamidu dodat je 1.8-diazabiciklo[5.4.0]undekan (105 kg, 349 mol) i smeša je mešana na sobnoj temperaturi 23 h. U reakcionu smešu je dodat dimetilformamid (330 L), a zatim voda (170 L) i, posle mešanja tokom 2 h, dodata je voda (170 L) u kapima. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i isprana smešom dimetilformamida (170 L)-vode (170 L), a zatim mešanim rastvorom etanol (460 L)-voda (200 L). Dobijena čvrsta supstanca je osušena u vakuumu, suspendovana u smeši etil acetat (330 L)-n-heptan (330 L) i podvrgnuta ispiranju suspenzije. Suspenzija je filtrirana, a preostala čvrsta supstanca je osušena u vakuumu da bi se dobio etil estar 6-bromo-7-fluoro-1-((S)-1-hidroksimetil-2-metilpropil)-4-okso-1,4-dihidrohinolin-3-karboksilne kiseline (102 kg, prinos 73%) kao žuta bela čvrsta supstanca. Analizom tečne hromatografije visokih performansi (HPLC) potvrđeno je da je ovo jedinjenje ekvivalentno standardnom proizvodu jedinjenja.

Korak 3

[0078]

[0079] Jedinjenje (45.0 kg, 112 mol) dobijeno u koraku 2 i imidazol (9.95 kg, 146 mol) su suspendovani u toluenu (180 L), rastvoru terc-butildimetilsilil hlorida (17.8 kg, 118 mol) u toluenu (45 L ) je dodat na 50°C, i smeša je mešana na istoj temperaturi 3 h. Toluen (230 L) je dodat u reakcionu smešu, i ispran uzastopno sa vodom (450 L, dva puta) i 20% slanim rastvorom (450 L). Ekstrakt je koncentrovan pod sniženim pritiskom i azeotropovan tetrahidrofuranom (320 L) da bi se dobio koncentrovani ostatak (390 L) koji sadrži sirovi proizvod etil estar 6-bromo-1-((S)-1-terc-butildimetilsililoksimetil-2-metilpropil)-7-fluoro-4-okso-1,4-dihidrohinolin-3-karboksilne kiseline.

2

Korak 4

[0080]

(Priprema rastvora 3-hloro-2-fluorobenzilcink bromida u tetrahidrofuranu)

[0081] Pod strujom azota, cink u prahu (18.8 kg, 287 mol) je suspendovan u tetrahidrofuranu (130 L), dodat je 1.2-dibromoetan (470 g, 2.50 mol) na 60°C, i smeša je mešana na istoj temperaturi 30 min. Trimetilsilil hlorid (560 g, 3.10 mol) je dodat ovoj suspenziji na sobnoj temperaturi, i smeša je mešana uz zagrevanje 30 min. Rastvor 3-hloro-2-fluorobenzil bromida (54.0 kg, 242 mol) u tetrahidrofuranu (65 L) je dodat u kapima na 0°C, i smeša je mešana na 20°C tokom 3 h. Preostali cink je filtriran da bi se dobio rastvor 1M 3-hloro-2-fluorobenzilcink bromida u tetrahidrofuranu. Ovo je korišćeno u sledećem glavnom koraku.

(Glavni korak)

[0082] Pod strujom azota, tris(dibenzilidenaceton)dipaladijum(0) (1.96 kg, 3.36 mol) i trifenilfosfin (1.77 kg, 6.72 mol) rastvoreni su u tetrahidrofuranu (180 L), i smeša je mešana na sobnoj temperaturi 1 sat. Rastvor (390 L) sirovog proizvoda dobijenog u koraku 3 u tetrahidrofuranu je dodat u kapima na sobnoj temperaturi i ispran tetrahidrofuranom (45 L). Rastvor (164 kg, 157 mol) prethodno pripremljenog 1M 3-hloro-2-fluorobenzilcink bromida u tetrahidrofuranu je dodat u kapima na sobnoj temperaturi, i smeša je mešana uz zagrevanje na 55°C tokom 5 h. Reakciona smeša je ostavljena da se ohladi do sobne temperature, dodati su toluen (230 L) i 25% vodeni rastvor amonijum hlorida (230 L) i smeša je mešana. Posle filtracije, smeša je podeljena. Organski sloj je uzastopno ispran sa 25% vodenim rastvorom amonijum hlorida (230 L), vodom (230 L), 5% vodenim rastvorom natrijum hidrogen karbonata (230 L, 3 puta) i 10% rastvorom soli (230 L). Ekstrakt je koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobio sirovi proizvod (80 L) 6-(3-hloro-2-fluorobenzil)-7-fluoro-1-((S)-1-hidroksimetil-2-metilpropil)-4 -okso-1,4-dihidrohinolin-3-karboksilna kiselina kao smeđe ulje. Korak 5

[0083] Sirovi proizvod (80 L) dobijen u Koraku 4 je rastvoren u izopropanolu (180 L), dodat je 1N vodeni rastvor natrijum hidroksida (180 L, 180 mol), i smeša je mešana uz zagrevanje na 50°C tokom 9 h. U reakcionu smešu je dodat aktivni ugalj (4.5 kg). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi 30 min, filtrirana kroz celulozni prah i dobro isprana smešom izopropanol (45 L)-voda (45 L). U filtrat su dodati voda (180 L) i n-heptan (230 L) i, nakon mešanja, smeša je podeljena. Vodeni sloj je ponovo ispran sa n-heptanom (230 L). 4N hlorovodonična kiselina (45 L, 180 mol) i metil izopropil keton (450 L) su dodati u organski sloj i, posle mešanja, smeša je podeljena. Organski sloj je uzastopno ispran sa 10% rastvorom soli (230 L), dva puta sa 8.5% vodenim rastvorom natrijum hidrogen karbonata (230 L), 0.5N hlorovodoničnom kiselinom (230 L) i vodom (230 L). Ekstrakt je koncentrovan pod sniženim pritiskom, azeotropovan 3 puta sa toluenom (230 L). Ostatak je mešan na 100°C 1.5 h, ostavljen da se ohladi do sobne temperature i mešan 3 h. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i dobijena čvrsta supstanca je isprana toluenom (45 L) i osušena pod vakuumom da bi se dobila 6-(3-hloro-2-fluorobenzil)-7-fluoro-1-[(S)-1-hidroksimetil-2-metilpropil]-4-okso-1,4-dihidrohinolin-3-karboksilna kiselina (42.5 kg, prinos 87%) kao bledo žuta čvrsta supstanca. HPLC analizom je potvrđeno da je ovo jedinjenje ekvivalentno standardnom proizvodu.

Korak 6

[0084]

[0085] Jedinjenje (39.2 kg, 89.9 mol) dobijeno u koraku 5 je rastvoreno u metanolu (240 L), 28% rastvor natrijum metoksida u metanolu (173 kg, 899 mol) je dodat u kapima na 10°C, i smeša je mešana uz zagrevanje. na 70°C tokom 21 h. U reakcionu smešu je dodat aktivni ugalj (3.9 kg). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi 1 sat, filtrirana kroz celulozni prah i dobro isprana metanolom (80 L). U filtrat je dodata voda (29 kg, 1620 mol) i smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je azeotropovan dva puta sa izopropanolom (240 L, 120 L). Ostatku su dodati 15% rastvor soli (200 L) i toluen (200 L) i, nakon mešanja, smeša je podeljena. Organski sloj je uzastopno ispran sa 20% slanim rastvorom (200 L, 3 puta), 0.5N hlorovodoničnom kiselinom (200 L) koja sadrži natrijum hlorid (10 kg) i 20% slanim rastvorom

2

(200 L). Organski sloj je koncentrovan pod sniženim pritiskom i azeotropiran sa etil acetatom (200 L). U ostatak su dodati etil acetat (320 L) i voda (200 L) i, nakon mešanja, smeša je podeljena. Organski sloj je koncentrovan pod sniženim pritiskom i dva puta azeotropovan sa izobutil acetatom (200 L). Ostatak je rastvoren zagrevanjem, filtriran dok je bio vruć, i temeljno ispran sa izobutil acetatom (20 L). U filtrat na 60°C dodat je kristal (kristalni oblik II jedinjenja A, 39 g) i smeša je mešana na istoj temperaturi 1.5 h. Smeša je mešana uz zagrevanje na 80°C tokom 2 h, ostavljena da se ohladi do sobne temperature i dalje mešana 6 h. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom. Dobijena čvrsta supstanca je isprana sa izobutil acetatom (40 L) i osušena u vakuumu da bi se dobio kristal jedinjenja A (kristalni oblik II) (29.0 kg, prinos 72%) u vidu bele čvrste supstance. Potvrđeno je da je ovaj kristal ekvivalentan standardnom proizvodu kristala (kristalni oblik II jedinjenja A dobijenog u Primeru 2-1) pomoću HPLC i analize difrakcije X zraka praha (XRPD).

Primer 2-3: Proizvodnja kristalnog oblika II jedinjenja A

[0086] Kristalni oblik II se takođe može dobiti kristalizacijom prema postupcima opisanim u Primerima 2-3-1 do 2-3-26.

Primer 2-3-1

[0087] Jedinjenje A (200 mg) dobijeno u Primeru 1 je rastvoreno u 1-butanolu (2 ml) uz zagrevanje pod refluksom. Smeša je mešana 17 h uz ostavljanje da se ohladi. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i osušena pod vakuumom da bi se dobio kristalni oblik II (125 mg, prinos 63%) jedinjenja A kao bela čvrsta supstanca.

Primer 2-3-2

[0088] Jedinjenje A (200 mg) dobijeno u Primeru 1 je rastvoreno u butil acetatu (2 ml) uz zagrevanje pod refluksom. Smeša je mešana 17 h uz ostavljanje da se ohladi. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i osušena u vakuumu da bi se dobio kristalni oblik II (102 mg, prinos 51%) jedinjenja A kao bela čvrsta supstanca.

Primer 2-3-3

2

[0089] Jedinjenje A (200 mg) dobijeno u Primeru 1 je rastvoreno u metil izobutil ketonu (2 ml) uz zagrevanje pod refluksom. U kapima je dodat heptan (2 ml) i smeša je mešana 6 h uz ostavljanje da se ohladi. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i osušena pod vakuumom da bi se dobio kristalni oblik II (168 mg, prinos 84%) jedinjenja A kao bela čvrsta supstanca.

Primer 2-3-4

[0090] Jedinjenje A (200 mg) dobijeno u Primeru 1 je rastvoreno u etanolu (2 ml) uz zagrevanje pod refluksom. Smeša je mešana 17 h uz ostavljanje da se ohladi. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i osušena pod vakuumom da bi se dobio kristalni oblik II (56 mg, prinos 28%) jedinjenja A kao bela čvrsta supstanca.

Primer 2-3-5

[0091] Jedinjenje A (200 mg) dobijeno u Primeru 1 je rastvoreno u etil acetatu (2 ml) uz zagrevanje pod refluksom. U kapima je dodat heptan (1.6 ml) i smeša je mešana 6 h uz ostavljanje da se ohladi. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i osušena u vakuumu da bi se dobio kristalni oblik II (166 mg, prinos 83%) jedinjenja A kao bela čvrsta supstanca.

Primer 2-3-6

[0092] Jedinjenje A (200 mg) dobijeno u Primeru 1 je rastvoreno u metil etil ketonu (2 ml) uz zagrevanje pod refluksom. U kapima je dodat heptan (4 ml) i smeša je mešana 6 h uz ostavljanje da se ohladi. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i osušena pod vakuumom da bi se dobio kristalni oblik II (123 mg, prinos 62%) jedinjenja A kao bela čvrsta supstanca.

Primer 2-3-7

[0093] Jedinjenje A (200 mg) dobijeno u Primeru 1 je rastvoreno u 1-propanolu (2 ml) uz zagrevanje pod refluksom. Smeša je mešana 17 h uz ostavljanje da se ohladi. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i osušena u vakuumu da bi se dobio kristalni oblik II (91 mg, prinos 46%) jedinjenja A kao bela čvrsta supstanca.

2

Primer 2-3-8

[0094] Jedinjenje A (200 mg) dobijeno u Primeru 1 je rastvoreno u izopropanolu (2 ml) uz zagrevanje pod refluksom. Smeša je mešana 17 h uz ostavljanje da se ohladi. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i osušena pod vakuumom da bi se dobio kristalni oblik II (88 mg, prinos 44%) jedinjenja A kao bela čvrsta supstanca.

Primer 2-3-9

[0095] Jedinjenje A (200 mg) dobijeno u Primeru 1 je rastvoreno u kumenu (2 ml) uz zagrevanje pod refluksom. Smeša je mešana 17 h uz ostavljanje da se ohladi. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i osušena pod vakuumom da bi se dobio kristalni oblik II (188 mg, prinos 94%) jedinjenja A kao bela čvrsta supstanca.

Primer 2-3-10

[0096] Jedinjenje A (200 mg) dobijeno u Primeru 1 je rastvoreno u anizolu (2 ml) uz zagrevanje pod refluksom. Smeša je mešana 17 h uz ostavljanje da se ohladi. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i osušena u vakuumu da bi se dobio kristalni oblik II (107 mg, prinos 54%) jedinjenja A kao bela čvrsta supstanca.

Primer 2-3-11

[0097] Jedinjenje A (200 mg) dobijeno u Primeru 1 je rastvoreno u acetonu (2 ml) uz zagrevanje pod refluksom. U kapima je dodat heptan (2 ml) i smeša je mešana 16.5 h uz ostavljanje da se ohladi. Dodatno je dodat heptan (4 ml) i smeša je dalje mešana 24 h. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i osušena pod vakuumom da bi se dobio kristalni oblik II (134 mg, prinos 67%) jedinjenja A kao bela čvrsta supstanca.

Primer 2-3-12

[0098] Jedinjenje A (200 mg) dobijeno u Primeru 1 je rastvoreno u etanolu (2 ml) uz zagrevanje pod refluksom. U kapima je dodat heptan (4 ml) i smeša je mešana 19 h uz ostavljanje da se

2

ohladi. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i osušena u vakuumu da bi se dobio kristalni oblik II (129 mg, prinos 65%) jedinjenja A kao bela čvrsta supstanca.

Primer 2-3-13

[0099] Jedinjenje A (200 mg) dobijeno u Primeru 1 je rastvoreno u izopropanolu (2 ml) uz zagrevanje pod refluksom. U kapima je dodat heptan (4 ml) i smeša je mešana 19 h uz ostavljanje da se ohladi. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i osušena u vakuumu da bi se dobio kristalni oblik II (166 mg, prinos 83%) jedinjenja A kao bela čvrsta supstanca.

Primer 2-3-14

[0100] Jedinjenje A (200 mg) dobijeno u Primeru 1 je rastvoreno u 1-propanolu (2 ml) uz zagrevanje pod refluksom. U kapima je dodat heptan (4 ml) i smeša je mešana 19 h uz ostavljanje da se ohladi. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i osušena u vakuumu da bi se dobio kristalni oblik II (158 mg, prinos 79%) jedinjenja A kao bela čvrsta supstanca.

Primer 2-3-15

[0101] Jedinjenje A (200 mg) dobijeno u Primeru 1 je rastvoreno u izobutanolu (2 ml) uz zagrevanje pod refluksom. Smeša je mešana 21 h uz ostavljanje da se ohladi. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i osušena pod vakuumom da bi se dobio kristalni oblik II (131 mg, prinos 66%) jedinjenja A kao bela čvrsta supstanca.

Primer 2-3-16

[0102] Jedinjenje A (200 mg) dobijeno u Primeru 1 je rastvoreno u toluenu (2 ml) uz zagrevanje na 100°C. Smeša je mešana 37 h uz ostavljanje da se ohladi. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i osušena u vakuumu da bi se dobio kristalni oblik II (190 mg, prinos 95%) jedinjenja A kao bela čvrsta supstanca.

Primer 2-3-17

2

[0103] Jedinjenje A (200 mg) dobijeno u Primeru 1 je rastvoreno u metil butil ketonu (2 ml) uz zagrevanje na 60°C. U kapima je dodat heptan (1.8 ml) i smeša je mešana 37 h uz ostavljanje da se ohladi. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i osušena pod vakuumom da bi se dobio kristalni oblik II (191 mg, prinos 96%) jedinjenja A kao bela čvrsta supstanca.

Primer 2-3-18

[0104] Jedinjenje A (200 mg) dobijeno u Primeru 1 je rastvoreno u hloroformu (1 ml) uz zagrevanje na 60°C. Ukapavanjem je dodat izopropil etar (1.8 ml) i smeša je mešana 37 h uz ostavljanje da se ohladi. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i osušena pod vakuumom da bi se dobio kristalni oblik II (184 mg, prinos 92%) jedinjenja A kao bela čvrsta supstanca.

Primer 2-3-19

[0105] Jedinjenje A (200 mg) dobijeno u Primeru 1 je rastvoreno u tetrahidrofuranu (1 ml) zagrevanjem na 60°C. Ukapavanjem je dodat izopropil etar (2 ml) i smeša je mešana 41 h uz ostavljanje da se ohladi. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i osušena pod vakuumom da bi se dobio kristalni oblik II (144 mg, prinos 72%) jedinjenja A kao bela čvrsta supstanca.

Primer 2-3-20

[0106] Jedinjenje A (200 mg) dobijeno u Primeru 1 je rastvoreno u izobutanolu (2 ml) uz zagrevanje pod refluksom. U kapima je dodat heptan (2 ml) i smeša je mešana 21 h dok je ostavljena da se ohladi. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i osušena pod vakuumom da bi se dobio kristalni oblik II (160 mg, prinos 80%) jedinjenja A kao bela čvrsta supstanca.

Primer 2-3-21

[0107] Jedinjenje A (200 mg) dobijeno u Primeru 1 je rastvoreno u butanolu. (2 ml) uz zagrevanje pod refluksom. U kapima je dodat heptan (2 ml) i smeša je mešana 21 h uz ostavljanje da se ohladi. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i osušena pod vakuumom da bi se dobio kristalni oblik II (152 mg, prinos 76%) jedinjenja A kao bela čvrsta supstanca.

Primer 2-3-22

[0108] Jedinjenje A (200 mg) dobijeno u Primeru 1 je rastvoreno u izobutil acetatu (2 ml) uz zagrevanje pod refluksom. Smeša je mešana 21 h uz ostavljanje da se ohladi. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i osušena u vakuumu da bi se dobio kristalni oblik II (140 mg, prinos 70%) jedinjenja A kao bela čvrsta supstanca.

Primer 2-3-23

[0109] Jedinjenje A (200 mg) dobijeno u Primeru 1 je rastvoreno u izobutil acetatu (2 ml) uz zagrevanje pod refluksom. U kapima je dodat heptan (2 ml) i smeša je mešana 21 h uz ostavljanje da se ohladi. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i osušena pod vakuumom da bi se dobio kristalni oblik II (178 mg, prinos 89%) jedinjenja A kao bela čvrsta supstanca.

Primer 2-3-24

[0110] Jedinjenje A (200 mg) dobijeno u Primeru 1 je rastvoreno u butil acetatu (2 ml) uz zagrevanje pod refluksom. U kapima je dodat heptan (1.5 ml) i smeša je mešana 21 h uz ostavljanje da se ohladi. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i osušena u vakuumu da bi se dobio kristalni oblik II (158 mg, prinos 78%) jedinjenja A kao bela čvrsta supstanca.

Primer 2-3-25

[0111] Jedinjenje A (200 mg) dobijeno u Primeru 1 je rastvoreno u anizolu (2 ml) zagrevanjem na 110°C. U kapima je dodat heptan (2 ml) i smeša je mešana 21 h uz ostavljanje da se ohladi. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i osušena pod vakuumom da bi se dobio kristalni oblik II (187 mg, prinos 89%) jedinjenja A kao bela čvrsta supstanca.

1

Primer 2-3-26

[0112] Jedinjenje A (200 mg) dobijeno u Primeru 1 je rastvoreno u butil acetatu (2 ml) uz zagrevanje pod refluksom. Posle brzog hlađenja, smeša je mešana 2 h. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i osušena pod vakuumom da bi se dobio kristalni oblik II (131 mg, prinos 66%) jedinjenja A kao bela čvrsta supstanca.

Primer 2-4: Proizvodnja kristalnog oblika II jedinjenja A

Korak 1

[0113] Etil estar 1-((S)-1-terc-butildimetilsililoksimetil-2-metilpropil)-6-(3-hloro-2-fluorobenzil)-7-fluoro-4-okso-1,4-dihidrohinolin-3-karboksilne kiseline (48 g, 86 mmol) dobijen u Primeru 1, Korak 5 je rastvoren u metanolu (300 ml), dodata je voda (5 ml) i 28% rastvor natrijum metoksida u metanolu (176 ml, 862 mmol), i smeša je zagrejana. pod refluksom 24 h. Reakciona smeša je ostavljena da se ohladi do sobne temperature, neutralizovana sa 6N hlorovodoničnom kiselinom i metanol je uparen pod sniženim pritiskom. U dobijeni rastvor je dodata voda i, posle mešanja, istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom. Dobijena čvrsta supstanca je rastvorena u etil acetatu, isprana vodom i osušena preko natrijum sulfata. Smeša je filtrirana i filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Dobijeni ostatak je rekristalizovan iz etil acetat-heksana da bi se dobilo jedinjenje A (primarni kristal 29.5 g, sekundarni kristal 2.8 g, ukupno 32.3 g, prinos 86%) kao bela čvrsta supstanca.

m.p. 151-152°C

<1>H NMR (DMSO-d6300MHz) (δ) ppm: 0.72 (3H, d, J=6.5Hz), 1.16 (3H, d, J=6.5Hz), 2.30-2.50 (1H, m), 3.70-3.90 (1H, m), 3.90 -4.00 (1H, m), 4.03 (3H, s), 4.12 (2H, s), 4.80-4.90 (1H, m), 5.19 (1H, t), 7.19-7.25 (2H, m), 7.46-7.51 (2H, m), 8.04 (1H, s), 8.88 (1H, s), 15.44 (1H, s) MS (ESI): M+ 448

Korak 2

[0114] Jedinjenje A (32.3 g) dobijeno u koraku 1 je rastvoreno u butil acetatu (160 ml) uz zagrevanje pod refluksom. Kristalni oblik II Primera 2 je zasejan na 63°C i smeša je mešana 3 h uz ostavljanje da se ohladi. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i osušena u vakuumu da bi se dobio kristal jedinjenja A (kristalni oblik II) (24.79 g, prinos 77%) u vidu

2

bele čvrste supstance.

Primer 2-5: Proizvodnja kristalnog oblika II jedinjenja A

Korak 1

[0115]

[0116] Etil estar 1-((S)-1-terc-butildimetilsililoksimetil-2-metilpropil)-6-(3-hloro-2-fluorobenzil)-7-fluoro-4-okso-1,4-dihidrohinolin-3-karboksilne kiseline (19 g, 33 mmol) dobijen u Primeru 1, Korak 5 je rastvoren u izopropanolu (100 ml), dodat je 1N vodeni rastvor natrijum hidroksida (200 ml, 200 mmol) i smeša je zagrevana pod refluksom 2.5 h. Reakciona smeša je ostavljena da se ohladi do sobne temperature i smeša je filtrirana kroz celit. Filtrat je zakiseljen dodavanjem koncentrovane hlorovodonične kiseline i mešan na sobnoj temperaturi 2 h. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i osušena pod vakuumom da bi se dobila 6-(3-hloro-2-fluorobenzil)-7-fluoro-1-((S)-1-hidroksimetil-2-metilpropil)-4-okso-1, 4-dihidrohinolin-3-karboksilna kiselina (12 g, prinos 82%) kao bledo žuta čvrsta supstanca.<1>H NMR (DMSO-d6400MHz) (δ) ppm: 0.71(3H, d, J=6.5Hz), 1.13(3H, d, J=6.5Hz), 2.36(1H, br), 3.77(1H, br), 3.94(1H, br ), 4.25 (2H, s), 4.77 (1H, br), 5.16 (1H, t, J=2.4Hz), 7.19-7.23 (1H, m), 7.32-7.35 (1H, m), 7.48-7.52( 1H, m), 8.24-8.28 (2H, m), 9.00 (1H, s), 15.00 (1H, s)

Korak 2

[0117]

[0118] Jedinjenje (12 g, 27 mmol) dobijeno u koraku 1 je rastvoreno u metanolu (64 ml), dodat je 28% rastvor natrijum metoksida u metanolu (52 ml, 256 mmol) i smeša je zagrevana pod refluksom 24 h. Reakciona smeša je ostavljena da se ohladi do sobne temperature i filtrirana kroz celit. Filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je zakiseljen dodavanjem vode (360 ml) i koncentrovane hlorovodonične kiseline, i ekstrahovan etil acetatom. Organski sloj je uzastopno ispran vodom i zasićenim rastvorom soli i osušen preko natrijum sulfata. Smeša je filtrirana, a filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobio sirovi proizvod (13 g) kao smeđe ulje. Dobijeni sirovi proizvod (13 g) je rastvoren u izobutil acetatu (60 ml) zagrevanjem i, nakon zasejavanja, smeša je mešana 23 h uz ostavljanje da se ohladi. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom, i osušena u vakuumu da bi se dobilo jedinjenje A (9.2 g, prinos 75%) kao bela čvrsta supstanca.

<1>H NMR (DMSO-d6300MHz) (δ) ppm: 0.72 (3H, d, J=6.5Hz), 1.16 (3H, d, J=6.5Hz), 2.30-2.50 (1H, m), 3.70-3.90 (1H, m), 3.90 -4.00 (1H, m), 4.03 (3H, s), 4.12 (2H, s), 4.80-4.90 (1H, m), 5.19 (1H, t), 7.19-7.25 (2H, m), 7.46-7.51 (2H, m), $ 0.04 (1H, s), 8.88 (1H, s), 15.44 (1H, s)

MS (ESI): M+ 448

Korak 3

[0119]

[0120] Etil estar 2-(2,4-difluoro-5-jodobenzoil)-3-dimetilaminoakrilne kiseline (20 g) dobijen u Primeru 1, Korak 2 je podvrgnut ispiranju suspenzije mešanim rastvaračem etil acetata (60 ml) i heksana ( 40 ml) i zagrevan pod refluksom. Smeša je filtrirana, a preostala čvrsta supstanca je osušena u vakuumu da bi se dobio etil estar 7-fluoro-1-((S)-1-hidroksimetil-2-metilpropil)-6-jodo-4-okso-1,4-dihidrohinolin-3-karboksilne kiseline (18 g, prinos 94%) kao čvrsta supstanca bež boje.

<1>H NMR (DMSO-d6300MHz) (δ) ppm: 0.72 (3H, d, J=6.6Hz), 1.10 (3H, d, J=6.6Hz), 1.28 (3H, t, J=7.0Hz), 2.27 (1H, br), 3.77 (1H, br), 3.86 (1H, br), 4.23 (2H, k, J=7.0Hz), 4.56(1H, br), 5.12 (IH, t, J=4.9Hz), 8.09 (1H, d , J=11.1Hz), 8.62 (1H, d, J=7.5Hz), 8.68 (1H, s) MS(ESI): M+ 448

Korak 4

[0121]

4

[0122] Jedinjenje (19 g, 42 mmol) dobijeno u koraku 3 je rastvoreno u dimetilformamidu (65 ml), dodati su imidazol (3.4 g, 49.9 mmol) i terc-butildimetilsilil hlorid (7.2 g, 47.8 mmol), i smeša je mešana na sobnoj temperaturi 1.5 h. U reakcionu smešu je dodata voda i smeša je ekstrahovana etil acetatom. Organski sloj je uzastopno ispran vodom, zasićenim vodenim rastvorom amonijum hlorida i zasićenim rastvorom soli, i osušen iznad natrijum sulfata. Organski sloj je filtriran, a filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobio sirovi proizvod (24 g) etil estar 1-((S)-1-terc-butildimetilsililoksimetil-2-metilpropil) 7-fluoro-6-jodo-4 -okso-1,4-dihidrohinolin-3-karboksilna kiselina kao bež amorfni oblik.

<1>H NMR (CDCl3400MHz) (δ) ppm: -0.07 (3H, s), -0.05 (3H, s), 0.77 (9H, s), 0.84 (3H, d, J=6.5Hz), 1.18 (3H, d, J= 6.5 Hz), 1.40 (3H, t, J=7.2Hz), 2.35-2.50 (1H, m), 3.85-3.95 (1H, m), 3.98-4.10 (2H, m), 4.30-4.40 (2H, m) ), 7.26 (1H, s), $.64 (1H, s), 8.94 (1H, d, J=7.2Hz) MS(ESI): M+ 562

Korak 5

[0123]

[0124] Sirovi proizvod (24 g) dobijen u koraku 4 rastvoren je u tetrahidrofuranu (200 ml) i, pod strujom argona, dodati su dibenzilidenacetonpaladijum(II) (984 mg, 1.7 mmol) i trifurilfosfin (795 mg, 3.4 mmol), i rastvor (56 ml, 56 mmol) 1M 3-hloro-2-fluorobenzilcink bromida dobijen na isti način kao u Primeru 1, Korak 5 u tetrahidrofuranu je dodat u kapima na 60°C. Po završetku dodavanja kap po kap, smeša je mešana uz zagrevanje na istoj temperaturi 2 h. Reakciona smeša je ostavljena da se ohladi do sobne temperature, dodat je zasićeni vodeni rastvor amonijum hlorida i filtriran kroz celit, a filtrat je ekstrahovan dva puta etil acetatom. Organski sloj je uzastopno ispran vodom (dvaput) i zasićenim rastvorom soli, i osušen iznad magnezijum sulfata. Organski sloj je filtriran, a filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobio sirovi proizvod (30 g) etil estar 1-((S)-1-terc-butildimetilsililoksimetil-2-metilpropil)-6-(3-hloro-2)-fluorobenzil)-7-fluoro-4-okso-1,4-dihidrohinolin-3-karboksilne kiseline kao smeđa pasta.

Korak 6

[0125]

[0126] Sirovi proizvod (30 g) dobijen u koraku 5 je rastvoren u izopropanolu (150 ml), dodat je 1N vodeni rastvor natrijum hidroksida (300 ml, 300 mmol) i smeša je zagrevana pod refluksom 2.5 h. Reakciona smeša je ostavljena da se ohladi do sobne temperature i smeša je filtrirana kroz celit. Filtrat je zakiseljen dodavanjem koncentrovane hlorovodonične kiseline, i smeša je mešana na sobnoj temperaturi 2 h. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i osušena u vakuumu da bi se dobio sirovi proizvod (18 g) kao čvrsta supstanca bež boje. Dobijeni sirovi proizvod (18 g) je suspendovan u butil acetatu (90 ml) i podvrgnut mešanju suspenzije uz zagrevanje pod refluksom 1 sat. Suspenzija je ostavljena da se ohladi na sobnu temperaturu, filtrirana i osušena pod vakuumom da bi se dobio 6-(3-hloro-2-fluorobenzil)-7-fluoro-1-((S)-1-hidroksimetil-2-metilpropil)-4- okso-1,4-dihidrohinolin-3-karboksilna kiselina (11 g, prinos 62% (u odnosu na korak 3)) kao bela čvrsta supstanca.

<1>H NMR (DMSO-d6400MHz) (δ) ppm: 0.71 (3H, d, J=6.5Hz), 1.13 (3H, d, J=6.5Hz), 2.36 (1H, br), 3.77 (1H, br), 3.94 (1H, br ), 4.25 (2H, s), 4.77 (1H, br), 5.16 (1H,t, J=2.4Hz), 7.19-7.23 (1H, m), 7.32-7.35 (1H, m), 7.48-7.52( 1H, m), 8.24-8.28 (2H, m), 9.00 (1H, s), 15.00 (1H, s)

MS(ESI): M+ 436

Korak 7

[0127]

[0128] Jedinjenje (11 g, 26 mmol) dobijeno u koraku 6 je rastvoreno u metanolu (60 ml), dodat je 28% rastvor natrijum metoksida u metanolu (52 ml, 256 mmol) i smeša je zagrevana pod refluksom 24 h. Reakciona smeša je ostavljena da se ohladi do sobne temperature i filtrirana kroz celit, a filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je zakiseljen dodavanjem vode (330 ml) i koncentrovane hlorovodonične kiseline, a smeša je ekstrahovana etil acetatom. Organski sloj je uzastopno ispran vodom i zasićenim rastvorom soli, i osušen iznad natrijum sulfata. Smeša je filtrirana, a filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobio sirovi proizvod (12 g) kao smeđe ulje. Dobijeni sirovi proizvod (12 g) je rastvoren u izobutil acetatu (60 ml) zagrevanjem pod refluksom. Zasejani kristal (kristalni oblik II jedinjenja A) je zasejan, i smeša je mešana 23 h uz ostavljanje da se ohladi. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i osušena pod vakuumom da bi se dobilo jedinjenje A (8.2 g, prinos 71%) u vidu bele čvrste supstance.

<1>H NMR (DMSO-d6300MHz) (δ) ppm: 0.72 (3H, d, J=6.5Hz), 1.16 (3H, d, J=6.5Hz), 2.30-2.50 (1H, m), 3.70-3.90 (1H, m), 3.90 -4.00 (1H, m), 4.03 (3H, s), 4.12 (2H, s), 4.80-4.90 (1H, m), 5.19 (1H, t), 7.19-7.25 (2H, m), 7.46-7.51 (2H, m), 8.04 (1H, s), 8.88 (1H, s), 15.44 (1H, s) MS (ESI): M+ 448

Korak 8

[0129] Jedinjenje A (7.66 g) dobijeno u Koraku 7 i jedinjenje A (9.17 g) dobijeno u Koraku 2 rastvoreno je u izobutil acetatu (84 ml) zagrevanjem pod refluksom i smeša je mešana 16 h uz ostavljanje da se ohladi. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i osušena u vakuumu da bi se dobio kristalni oblik II (14.73 g, prinos 88%) jedinjenja A kao bela čvrsta supstanca.

Primer 2-6: Proizvodnja kristalnog oblika II jedinjenja A

Korak 1

[0130]

[0131] 2,4-Difluorobenzojeva kiselina (100 g, 633 mmol) je rastvorena u trifluorometansulfonskoj kiselini (400 ml) i dodat je N-jodosukcinimid (157 g, 696 mmol) u porcijama na temperaturi ne većoj od 5°C. Po završetku dodavanja, smeša je mešana na 50°C tokom 1.5 h. Reakciona smeša je sipana u ledenu vodu, i smeša je mešana 1 sat. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom, isprana uzastopno sa vodom i heksanom, i osušena u vakuumu da bi se dobila 2,4-difluoro-5-jodobenzojeva kiselina (prinos kvantitativno 179 g) kao bela čvrsta supstanca.

<1>H NMR (CDCl3300MHz) (σ) ppm: 6.94 (1H, dd, J=10.3, 10.3Hz), 8.46 (1H, d, J=7.5Hz)

Korak 2

[0132]

[0133] Jedinjenje (28 g, 100 mmol) dobijeno u koraku 1 je rastvoreno u etil acetatu (300 ml), dodati su oksalil hlorid (11 ml, 122 mmol) i dimetilformamid (katalitička količina), i smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 h. Filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom i azeotropovan sa toluenom. Ostatak je rastvoren u tetrahidrofuranu (100 ml), ovaj rastvor je dodat u kapima u rastvor etil 3,3-dimetilaminoakrilata (17 g, 120 mmol) i trietilamina (21 ml, 150 mmol) u tetrahidrofuranu (100 ml), i smeša je zagrevana pod refluksom 3 h. Reakciona smeša je ostavljena da se ohladi i dodat je etil acetat (200 ml). Smeša je isprana uzastopno vodom (dvaput) i zasićenim rastvorom soli, i osušena preko natrijum sulfata. Smeša je filtrirana i filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Dobijeni ostatak je podvrgnut mešanju suspenzije sa mešanim rastvaračem dietil etra (50 ml) i heksana (50 ml). Smeša je filtrirana i preostala čvrsta supstanca je osušena u vakuumu da bi se dobio sirovi proizvod (26 g, prinos 63%) etil estra 2-(2,4-difluoro-5-jodobenzoil)-3-dimetilaminoakrilne kiseline kao žute čvrste supstance.

Korak 3

[0134]

[0135] Sirovi proizvod (22 g, 55 mmol) dobijen u koraku 2 rastvoren je u tetrahidrofuranu (110 ml), dodat je (S)-(+)-valinol (6.8 g, 65.8 mmol) i smeša je mešana uz zagrevanje na 50°C 30 min. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom, a ostatak je rastvoren u etil acetatu (100 ml), ispran uzastopno sa vodom i zasićenim rastvorom soli, i osušen preko magnezijum sulfata. Smeša je filtrirana i filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Dobijeni ostatak je rastvoren u dimetilformamidu (80 ml), dodat je kalijum karbonat (19 g, 137 mmol) i smeša je mešana uz zagrevanje na 50°C tokom 1.5 h. Reakciona smeša je ostavljena da se ohladi do sobne temperature i koncentrovana pod sniženim pritiskom. Dobijenom ostatku je dodata voda (250 ml) i smeša je mešana na sobnoj temperaturi 30 min. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom. Dobijena čvrsta supstanca je isprana sukcesivno sa mešanim rastvaračem vode (100 ml), etil acetata (10 ml) i heksana (40 ml) i osušena pod vakuumom da bi se dobio 7-fluoro-1-((S)-1-hidroksimetil-2 -metilpropil)-6-jodo-4-okso-1,4-dihidrohinolin-3-karboksilna kiselina etil estar (22 g, prinos 88%) kao bledo žuta čvrsta supstanca.

<1>H NMR (DMSO-d6300MHz) (δ) ppm: 0.72 (3H, d, J=6.6Hz), 1.10 (3H, d, J=6.6Hz), 1.28 (3H, t, J=7.0Hz), 2.27 (1H, br), 3.77 (1H, br), 3.86 (1H, br), 4.23 (2H, k, J=7.0Hz), 4.56(1H, br), 5.12 (IH, t, J=4.9Hz), 8.09 (1H, d , J=11.1Hz), 8.62 (1H, d, J=7.5Hz), 8.68 (1H, s) MS(ESI): M+ 448

Korak 4

[0136]

[0137] Jedinjenje (22 g, 48 mmol) dobijeno u koraku 3 je rastvoreno u dimetilformamidu (60 ml), dodati su imidazol (3.9 g, 57.7 mmol) i terc-butildimetilsilil hlorid (8.0 g, 53.0 mmol), i smeša je mešana. na sobnoj temperaturi 1.5 h. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom, a dobijeni ostatak je rastvoren u etil acetatu (200 ml), ispran uzastopno vodom (dva puta) i zasićenim rastvorom soli, i osušen iznad natrijum sulfata. Smeša je filtrirana i filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Dobijeni ostatak je prečišćen hromatografijom na silika gelu (etil acetat:heksan=3:7 do 4:6) da bi se dobio 1-((S)-1-terc-butildimetilsililoksimetil-2-metilpropil)-7-fluoro-6-jodo Etil estar -4-okso-1,4-dihidrohinolin-3-karboksilne kiseline (25 g, prinos 92%) kao beli vosak.

<1>H NMR (CDCl3400MHz) (δ) ppm: -0.07(3H, s), -0.05(3H, s), 0.77(9H, s), 0.84(3H,d, J=6.5Hz), 1.18(3H, d, J= 6.5 Hz), 1.40 (3H, t, J=7.2Hz), 2.35-2.50 (1H, m), 3.85-3.95 (1H, m), 3.98-4.10 (2H, m), 4.30-4.40 (2H, m) ), 7.26 (1 H, s), 8.64 (1 H, s), 8.94 (1 H, d, J=7.2 Hz) MS (ESI): M+ 562

Korak 5

[0138]

[0139] Jedinjenje (25 g, 44 mmol) dobijeno u koraku 4 je rastvoreno u tetrahidrofuranu (200 ml) i, pod strujom argona, dodati su dibenzilidenacetonpaladijum(II) (1.0 g, 1.8 mmol) i trifurilfosfin (824 mg, 3.5 mmol). Rastvor (58 ml, 58 mmol) 1M 3-hloro-2-fluorobenzilcink bromida dobijen na isti način kao u Primeru 1, korak 5 u tetrahidrofuranu je dodat u kapima na 60°C. Nakon završetka dodavanja kap po kap, smeša je zagrevana pod refluksom 3 h. Reakciona smeša je ostavljena da se ohladi do sobne temperature, dodat je etil acetat (200 ml), ispran uzastopno sa 1N hlorovodoničnom kiselinom, vodom, zasićenim vodenim rastvorom natrijum hidrogen karbonata, vodom i zasićenim rastvorom soli, i osušen preko natrijum sulfata. Smeša je filtrirana i filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Dobijeni ostatak je prečišćen hromatografijom na silika gelu (etil acetat:heksan=4:6 do 1:1) da bi se dobio 1-((S)-1-terc-butildimetilsililoksimetil-2-metilpropil)-6-(3-hloro- Etil estar 2-fluorobenzil)-7-fluoro-4-okso-1,4-dihidrohinolin-3-karboksilne kiseline (17 g, prinos 68%) kao bledo žuto ulje.<1>H NMR (CDCl3400MHz) (δ) ppm: -0.09(3H, s), -0.05(3H, s), 0.75(9H, s), 0.85(3H,d, J=6.7Hz), 1.18(3H, d, 6.7Hz) ), 1.39 (3H, t, J=7.1 Hz), 2.45 (1H, br), 3.89-3.92 (1H, m), 3.98-4.02 (1H, m), 4.07-4.12 (1H, m), 4.12( 2H, s), 4.34-4.41 (2H, m), 6.96-7.00 (1H, m), 7.03-7.05 (1H, m), 7.21-7.24 (1H, m), 7.26-7.29 (1H, m), 8.39 (1H, d, J=8.8 Hz), 8.63 (1H, s)

Korak 6

[0140]

[0141] Jedinjenje (17 g, 30 mmol) dobijeno u koraku 5 je rastvoreno u metanolu (120 ml), dodat

4

je 28% rastvor metanola natrijum metoksida (62 ml, 304 mmol) i smeša je zagrevana pod refluksom 19 h. Reakciona smeša je ostavljena da se ohladi do sobne temperature, dodata je voda (200 ml) i metanol je uparen pod sniženim pritiskom. Ostatak je zakiseljen dodavanjem koncentrovane hlorovodonične kiseline, ekstrahovan etil acetatom i osušen preko natrijum sulfata. Smeša je filtrirana, a filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobio sirovi proizvod (14 g) jedinjenja A kao bledo žuto ulje.

Korak 7

[0142] Jedinjenje A (14.11 g) dobijeno u koraku 6 je suspendovano u mešanom rastvaraču etil acetata (20 ml) i heksana (20 ml) na sobnoj temperaturi, zasejani kristal (kristalni oblik II jedinjenja A) je zasejan i smeša je mešana 1 h. Suspenzija je filtrirana, a preostala čvrsta supstanca je osušena u vakuumu da bi se dobilo jedinjenje A (kristalni oblik II, 10.40 g, prinos 77%) u vidu bele čvrste supstance.

Primer 3: Proizvodnja kristalnog oblika III jedinjenja A

Primer 3-1: Proizvodnja kristalnog oblika III jedinjenja A

[0143] Kristalni oblik II jedinjenja A (10.0 g, 22.3 mmol) dobijen u Primeru 2-2 je dodat u izobutil acetat (30 mL) i kristal je rastvoren zagrevanjem pod refluksom. Rastvor je ohlađen na 90°C i mešan 5 h da bi se omogućilo taloženje kristala. Ovaj rastvor je dalje ostavljen da se ohladi do sobne temperature i dalje mešan 12 h. Istaloženi kristal je sakupljen filtracijom. Dobijeni kristal je ispran izobutil acetatom (10 mL) i osušen u vakuumu da bi se dobio beli kristal (9.85 g, prinos 98.5%). Pošto je XRPD analizom potvrđeno da se ovaj kristal razlikuje od kristalnog oblika II, kristal koji prikazuje XRPD grafikon (slika 1) jer je ovaj kristal uzet kao kristalni oblik III.

Primer 3-2: Proizvodnja kristalnog oblika III jedinjenja A

[0144] Kristalni oblik II jedinjenja A (250 g, 558 mmol) dobijen u Primeru 2-2 je dodat u izobutil acetat (750 mL). Klica kristala (12.5 g) kristalnog oblika III jedinjenja A dobijenog u Primeru 3 je dodata na sobnoj temperaturi i smeša je mešana 17 h. Istaloženi kristal je sakupljen filtracijom. Dobijeni kristal je ispran izobutil acetatom (250 mL) i osušen u vakuumu da bi se dobio ciljni proizvod (kristalni oblik III, 259 g, prinos 98.6%) kao beli kristal. XRPD analizom je potvrđeno da je ovaj kristal ekvivalentan standardnom proizvodu kristala (kristalni oblik III jedinjenja A dobijenog u Primeru 3-1).

Primer 3-3: Proizvodnja kristalnog oblika III jedinjenja A

[0145] Jedinjenje A (kristalni oblik II, 10.0 g, 22.3 mmol) dobijeno u Primeru 2-2 je dodato u izopropanol (30 mL), i smeša je zagrevana pod refluksom da bi se kristal rastvorio. Rastvor je ohlađen na 70°C, dodat je kristal (10 mg) kristalnog oblika III jedinjenja A dobijenog u Primeru 3-1, i smeša je mešana 5 h. Ova smeša je dalje ostavljena da se ohladi do sobne temperature, mešana 12 h, a kristal je sakupljen filtracijom. Dobijeni kristal je ispran izopropanolom (10 mL) i osušen u vakuumu da bi se dobio ciljni proizvod (kristalni oblik III, 9.72 g, prinos 97.2%) u vidu belog kristala. XRPD analizom je potvrđeno da je ovaj kristal ekvivalentan standardnom proizvodu kristala (kristalni oblik III jedinjenja A dobijenog u Primeru 3-1).

Primer 3-4: Proizvodnja kristalnog oblika III jedinjenja A

[0146] Kristalni oblik II jedinjenja A (7.00 g, 15.6 mmol) dobijen u Primeru 2-2 je dodat u mešani rastvor etanola (52.5 mL) i vode (7 mL) i rastvoren zagrevanjem. Dodata je voda (28 mL), dodat je kristal (10 mg) ciljnog proizvoda na 70°C i smeša je mešana 4 h. Nakon što je ostavljena da se ohladi na sobnu temperaturu, smeša je ohlađena ledom i dalje mešana 2 sata, a kristali su sakupljeni filtracijom. Dobijeni kristali su isprani mešanim rastvorom hladnog etanola (8.4 mL) i vode (5.6 mL) i osušeni u vakuumu da bi se dobio ciljni proizvod u obliku belih kristala (kristalni oblik III, 6.77 g, prinos 96.8%). XRPD analizom je potvrđeno da je ovaj kristal ekvivalentan standardnom proizvodu (Primer 3-1).

Eksperimentalni primer

[0147] Vrednosti svojstava svakog kristalnog oblika određene su sledećim testovima analize, a test stabilnosti svakog kristalnog oblika je izveden korišćenjem njih kao indeksa.

Uzorak

[0148] Osim ako nije drugačije naznačeno, kao uzorci su korišćeni gore pomenuti kristal (kristalni oblik I) dobijen u Referentnom primeru 1, kristal (kristalni oblik II) dobijen u Primeru 1 i kristal (kristalni oblik III) dobijen u Primeru 3-1.

Test analize

2. Rendgenska difraktometrija praha

[0149] Ovaj test ima za cilj dobijanje uzoraka difrakcije rendgenskih zraka na prahu da bi se odredio kristalni oblik kristala dobijenih u Referentnom primeru 1, Primeru 1 i Primeru 3-1. Difrakcioni obrasci se koriste za specifikaciju kristalnog oblika, procenu stabilnosti, određivanje čistoće i slično.

[0150] Uzorak je fiksiran na aluminijumsku ćeliju, a merenje je obavljeno pomoću rendgenskog difraktometra na prahu (RINT 2000/PC Ultima<+>, proizvođača Rigaku Corporation, izvor rendgenskih zraka: Cu-Kα1 zraka, napon cevi: 40 kV, električna struja cevi: 40 mA, brzina skeniranja: 5° u minuti, širina koraka: 0.02°, ugao difrakcije: 5-40°), na osnovu čega su dobijeni difrakcioni uzorci. Dobijeni dijagrami difrakcije prikazani su na slici 1.

[0151] Kao što je prikazano na slici 1, uzorci difrakcije rendgenskih zraka na prahu dobijeni iz odgovarajućih uzoraka bili su različiti.

[0152] Zbog toga je potvrđeno da se kristali dobijeni u Referentnom primeru 1, Primeru 1 i Primeru 3-1 međusobno razlikuju i da pokazuju karakteristične difrakcione obrasce kao što je prikazano u obrascu difrakcije rendgenskih zraka na prahu. Stoga, u ovoj specifikaciji, oni su imenovani kao kristalni oblik I, kristalni oblik II i kristalni oblik III, na osnovu ovih uzoraka difrakcije rendgenskog praha.

[0153] Za specifikaciju oblika kristala, karakteristika pika difrakcije svakog kristala može se proceniti na sveobuhvatan način na osnovu difrakcionog grafikona na slici 1.

[0154] Glavni difrakcioni pikovi i karakteristični difrakcioni pikovi navedeni iz difrakcionih obrazaca na slici 1 su prikazani ispod.

[Kristalni oblik I]

[0155]

Glavni difrakcioni pik: 20=6.58, 14.40, 14.64, 15.24, 16.48, 19.16, 20.90, 21.14, 22.24, 24.74, 25.64, 26.20, 27.20°;

Karakteristični pik difrakcije: 2θ=6.58, 14.40, 19.16, 20.90, 21.24°.

4

[Kristalni oblik III

[0156] Glavni difrakcioni pik: 2θ=6.56, 9.04, 13.20, 14.62, 15.24, 16.48, 19.86, 20.84, 21.22, 22.24, 25.22, 25.96, 26.93°, 26.27°; Karakteristični pik difrakcije: 2θ=6.56, 13.20, 19.86, 20.84, 21.22, 25.22°.

[Kristalni oblik III)

[0157]

Glavni difrakcioni pik: 2θ=8.54, 14.02, 15.68, 15.90, 16.00, 17.06, 17.24, 17.84, 18.12, 19.50, 19.90, 22.26, 16.2, 62.4, 62.4, 62.425.18, 25.74, 25.98, 27.50, 28.80, 30.38, 30.72, 32.54°; Karakteristični pik difrakcije: 2θ=8.54, 14.02, 15.68, 17.06, 17.24, 24.16, 25.74°.

2. Termička analiza

[0158] Ovaj test ima za cilj merenje entalpije i ekstrapolirane početne temperature na endotermnom piku na krivoj merenja diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC). Ove vrednosti su među indeksima stabilnosti gore pomenutog kristalnog oblika I, kristalnog oblika II i kristalnog oblika III, i mogu se koristiti kao indeks za specifikaciju kristalnog oblika.

2.1. Entalpija i ekstrapolirana početna temperatura kristalnog oblika I i kristalnog oblika II

[0159] Kristalni oblik I i kristalni oblik II su podvrgnuti merenju pomoću aparata za merenje diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC) (DSC8240, proizvođača Rigaku Corporation), pod atmosferom, merni uzorak 5±1 mg, brzina porasta temperature: 10°C/min, aluminijumski otvoreni tiganj i aluminijum oksid kao referenca. Određene su entalpija i ekstrapolirana početna temperatura na endotermnom piku na dobijenoj DSC krivoj.

2.2. Entalpija i ekstrapolirana temperatura početka kristalnog oblika III

[0160] Kristalni oblik III je podvrgnut merenju korišćenjem DSC mernog aparata (DSC8240, proizvođača Rigaku Corporation), u atmosferi, merni uzorak 5.0±0.5 mg, brzina porasta temperature: 5°C/min, aluminijumski zatvoreni tiganj i aluminijum oksid kao referenca. Određene su entalpija i ekstrapolirana početna temperatura na endotermnom piku na dobijenoj DSC krivoj.

[0161] Rezultati su prikazani u tabeli 1.

Tabela 1

[0162] Kao što je prikazano u tabeli 1, kristalni oblik III pokazuje najveću entalpiju i najvišu ekstrapoliranu početnu temperaturu među tri kristalna oblika. Tako je potvrđeno da je kristalni oblik III najstabilniji oblik.

3. Test čistoće

[0163] Ovaj test ima za cilj merenje čistoće jedinjenja A. Čistoća se može koristiti kao indeks hemijske stabilnosti.

3.1. Čistoća jedinjenja kristalnog oblika I i kristalnog oblika II

[0164] Svaki uzorak (kristalni oblik I i kristalni oblik II, oko 10 mg) je rastvoren u acetonitrilu da bi se dobila količina od 10 mL i korišćen kao rastvor uzorka. Ovaj rastvor (10 uL) je primenjen na tečnu hromatografiju visokih performansi (HPLC) pod sledećim uslovima. Površina pika svakog rastvora uzorka je merena automatskom integracijom, a čistoća je određena sledećom formulom. Čistoća je prikazana u tabelama 5 i 6 ispod.

Čistoća (%)=100-(Asum/As) X 100

As: ukupna površina pikova dobijenih iz rastvora uzorka

Asum: ukupna površina pikova za pikove osim glavnog pika dobijenog iz rastvora uzorka

4

Uslovi ispitivanja

[0165]

Detektor: UV apsorpciometar (talasna dužina: 259 nm)

Kolona: CAPCELL PAK MG (unutrašnji prečnik 4.6 cm, dužina 15 cm, veličina čestica 5 µm, proizvođača Shiseido Co., Ltd.

Temperatura kolone: konstantna temperatura oko 40°C

Mobilna faza A: rastvor trifluorosirćetne kiseline (1:1000)

Mobilna faza B: rastvor trifluorosirćetne kiseline u acetonitrilu (1:1000)

Program gradijenta: Kao što je prikazano u sledećoj tabeli 2, odnos mešanja mobilne faze A i mobilne faze B se menja da bi se kontrolisao gradijent koncentracije.

Tabela 2

3.2. Čistoća jedinjenja kristalnog oblika III

[0166] Uzorak (kristalni oblik III, oko 50 mg) je rastvoren u smeši (4:1) mobilne faze B i mobilne faze A da bi se dobila količina od 50 mL, koja je korišćena kao rastvor uzorka. Ovaj rastvor (1 mL) je precizno izmeren i dodata je smeša (4:1) mobilne faze B i mobilne faze A da se precizno dobije količina od 100 mL, koja je korišćena kao standardni rastvor. Rastvor uzorka i standardni rastvor (15 µL) su primenjeni na tečnu hromatografiju visokih performansi (HPLC) pod sledećim uslovima. Površina pika svakog rastvora je merena automatskom integracijom, a čistoća je određena sledećom formulom. Čistoća je prikazana u tabeli 7 ispod.

Čistoća (%)=100-(Asum-Ar)

Ar: površina pika glavnog pika dobijenog iz standardnog rastvora

Asum: ukupna površina pikova za pikove osim glavnog pika dobijenog iz rastvora uzorka

4

Uslovi ispitivanja

[0167]

Detektor: UV apsorpciometar (talasna dužina: 259 nm)

Kolona: Waters XTerra MC C18 (unutrašnji prečnik 4.6 cm, dužina 5 cm, prečnik čestica 2.5 µm, proizvođač Waters)

Temperatura kolone: konstantna temperatura oko 40°C

Mobilna faza A: fosforna kiselina se dodaje rastvoru dikalijum hidrogenfosfata (1→1149) da bi se pH podesio na 7.0

Mobilna faza B: acetonitril

Program gradijenta: Kao što je prikazano u sledećoj tabeli 3, odnos mešanja mobilne faze A i mobilne faze B se menja da bi se kontrolisao gradijent koncentracije.

Tabela 3

4. Test rastvorljivosti

[0168] Ovaj test ima za cilj merenje rastvorljivosti kristala u različitim test rastvorima i pod različitim pH vrednostima. Rastvorljivost je jedan od indeksa stabilnosti gore pomenutog kristalnog oblika I, kristalnog oblika II i kristalnog oblika III i može se koristiti i kao referentni indeks apsorpcije kristalnog oblika od strane živih organizama.

[0169] Svaki uzorak (kristalna forma I tip I, kristalna forma II i kristalna forma III, oko 10 mg) je stavljena u epruvetu za centrifugiranje od 10 mL zajedno sa sledećim test rastvorom (5 mL) i promućkana mešalicom (SR-1M); proizvođača Tietech Co., Ltd.) tokom 14 h. Posle mućkanja, smeša je centrifugirana (3000 rpm, 20 min) i supernatant je filtriran kroz pore veličine 0.2 µm - politetrafluoroetilenski disk filter prečnika 13 mm (Millex-LG; proizvođača Millipore Corporation). Merenje je izvedeno tečnom hromatografijom visokih performansi

4

(HPLC). Rezultati su prikazani u tabeli 4.

Tabela 4 Test rastvorljivosti

[0170] Iz gore navedenih rezultata, potvrđeno je da kristalni oblik II ima veću rastvorljivost od kristalnog oblika III.

4

. Test stabilnosti

[0171] Test stabilnosti svakog uzorka je izveden pod sledećim uslovima čuvanja. Rezultati kristalnog oblika I prikazani su u tabeli 5, rezultati kristalnog oblika II su prikazani u tabeli 6, a rezultati kristalnog oblika III su prikazani u tabeli 7.

[0172] Kao što je prikazano u Tabeli 6 i Tabeli 7, kristalni oblik II i kristalni oblik III nisu pokazali nikakvu razliku u rezultatima testa pod svim uslovima čuvanja, u poređenju sa početnim uzorkom. Nasuprot tome, kao što je prikazano u tabeli 5, kristalni oblik I pokazao je promene u dijagramu difrakcije rendgenskog praha dobijenom iz uzorka nakon skladištenja u uslovima skladištenja #3 (80°C, čuvanje u otvorenom kontejneru 3 dana) i uslovima skladištenja # 5 (60°C, skladištenje u otvorenom kontejneru 3 nedelje), a primećeno je da se uzorak difrakcije rendgenskih zraka kristalnog oblika I preklapa sa uzorkom difrakcije rendgenskog praha izvedenom iz kristalnog oblika II. Tako je ocenjeno da deo uzorka tokom konzervacije pokazuje kristalni prelaz u kristalni oblik II. Difrakcioni uzorci rendgenskog praha uzorka za skladištenja uzoraka u uslovima skladištenja #1-6 kristalnog oblika I prikazani su na slici 2.

Tabela 5

4

Tabela 6

Tabela 7

1

[0173] Iz rezultata gore pomenutog testa stabilnosti, primećeno je da je kristalni oblik I nestabilan, ali kristalni oblik II i kristalni oblik III su izuzetno stabilni pod različitim uslovima čuvanja. Stoga je dokazano da su kristalni oblik II i kristalni oblik III poželjniji za upotrebu kao farmaceutski proizvod i slično.

2

[0174] Što se tiče apsorpcije živih organizama, kristalni oblik II je poželjniji, a kristalni oblik III je poželjniji jer je najstabilniji kristal.

[0175] Pošto su kristalni oblik II i kristalni oblik III stabilni, njihov mešani kristal se može koristiti za ovaj pronalazak.

Eksperimentalni primer

[0176] U nastavku se objašnjavaju postupci procene inhibitorne aktivnosti HIV integraze kristala ili mešanog kristala jedinjenja A ovog pronalaska.

(i) Konstrukcija sistema ekspresije gena rekombinantne integraze

[0177] 185. po redu fenilalanin gena pune dužine HIV integraze (J. Virol., 67, 425-437 (1993.).)) je supstituisan histidinom i umetnut u mesta restrikcionog enzima NdeI i XhoI plazmida pET21a(+) (proizvođača Novagen), pri čemu je konstruisan ekspresioni vektor integraze pET21a-IN-F185H.

(ii) Proizvodnja i prečišćavanje proteina integraze

[0178] Escherichia coli rekombinantni BL21(DE3) transformisan sa plazmidom pET21a-IN-F185H dobijenim u (i) je uz šejkiranje kultivisan na 30°C u tečnom medijumu koji sadrži ampicilin. Kada je kultura dostigla fazu logaritamskog rasta, dodat je izopropil-β-D-tiogalaktopiranozid da bi se promovisala ekspresija gena integraze. Kultura je nastavljena 3 sata da bi se podstakla akumulacija proteina integraze. Rekombinantna E. coli je sakupljena u pelete centrifugalnim odvajanjem i sačuvana na -80°C.

[0179] E. coli je suspendovana u puferu za lizu (20 mM HEPES (pH 7.5), 5 mM DTT, 10 mM CHAPS, 10% glicerol) koji sadrži 1M natrijum hlorid i podvrgnuta je ponavljanom stavljanju pod pritisak i smanjenju pritiska radi rupture i centrifugalnog odvajanja na 4° C, 40.000×g, 60 min da se povrati frakcija rastvorljiva u vodi (supernatant). Ovo je razblaženo 10 puta sa puferom za lizu bez natrijum hlorida, pomešano sa SP-Sepharose (proizvođača Pharmacia Corporation) i mešano na 4°C tokom 60 min da bi se omogućila adsorpcija proteina integraze na smolu. Smola je isprana puferom za Lysis koji sadrži 100 mM natrijum hlorida, a protein integraze je eluiran sa Lysis puferom koji sadrži 1M natrijum hlorida.

[0180] Eluirani rastvor proteina integraze je primenjen na Superdex 75 (Pharmacia Corporation) kolonu za gel filtraciju. Protein je eluiran puferom za lizu koji sadrži 1M natrijum hlorid.

[0181] Dobijene frakcije proteina integraze su sakupljene i sačuvane na -80°C.

(iii) Priprema DNK rastvora

[0182] Sledeća DNK koju je Greiner sintetizovao rastvorena je u TE puferu (10 mM Trishlorovodonična kiselina (pH 8.0), 1 mM EDTA) i pomešana sa donorskom DNK, ciljnom DNK i svakim komplementarnim lancem (+ i - lanci) do 1 µM. Smeša je zagrevana na 95°C 5 min, 80°C 10 min, 70°C 10 min, 60°C 10 min, 50°C 10 min i 40°C 10 min i čuvana na 25°C. °C da bi se dobila dvolančana DNK, koja je korišćena za test.

DNK donora (- lanac koji ima biotin vezan za 5' terminal)

Donor lanac: 5'-Biotin-ACC CTT TTA GTC AGT GTG GAA AAT CTC TAG CA-3' (SEK ID NO:1)

Donator - lanac: 5'-ACT GCT AGA GAT TTT CCA CAC TGA CTA AAA G-3' (SEK ID NO:2)

Ciljna DNK (+, - lanci oba imaju dodat digoksigenin na 3' terminalu)

Cilj lanac: 5'-TGA CCA AGG GCT AAT TCA CT-Dig-3' (SEK ID NO:3)

Cilj - lanac: 5'-AGT GAA TTA GCC CTT GGT CA-Dig-3' (SEK ID NO:4)

(iv) Određivanje inhibitorne aktivnosti enzima (HIV integraze).

[0183] Donatorska DNK je razblažena sa TE puferom do 10 nM, od čega je 50 µl dodato u svaki bunar mikrotitarske ploče obložene streptavidinom (proizvođača Roche) i ostavljeno da se adsorbuje na 37°C tokom 60 min. DNK je zatim isprana fosfatnim puferom (Dulbecco PBS, Sanko Junyaku Co., Ltd.) koji sadrži 0.1% Tween 20 i fosfatni pufer. Zatim, reakciona smeša (70 µl, videti sledeće * za kompoziciju), test supstanca (10 µl) razblažena sa reakcionom smešom i 100 µg/ml proteina integraze (10 µl) su dodati u svaki bunar i reagovati na 37°C 60 min.

[0184] Zatim je dodato 50 nM ciljne DNK (10 ul), reagovano na 37°C tokom 10 min i isprano fosfatnim puferom koji sadrži 0.1% Tween 20 da bi se reakcija zaustavila.

[0185] Zatim je dodat 100 mU/ml rastvor anti-digoksigenin obeleženog peroksidazom (proizvođač Roche, 100 µl) i smeša je reagovala na 37°C tokom 60 minuta, nakon čega je usledilo ispiranje fosfatnim puferom koji sadrži 0.1% Tween 20.

4

[0186] Dodat je rastvor boje peroksidaze (proizvođača Bio Rad, 100 ul) i ostavljen da reaguje na sobnoj temperaturi 4 min. Reakcija boje je zaustavljena dodavanjem 1N sumporne kiseline (100 ul). Izmerena je apsorbanca na 450 nm.

[0187] Inhibiciona aktivnost HIV integraze (IC50) jedinjenja A ovog pronalaska je izračunata iz brzine inhibicije prema sledećoj formuli. Rezultati su prikazani u tabeli 8.

Stopa inhibicije (%)=[1/*(Objekat-Blank)/(Kontrola-Blank)] X 100 Objekat; apsorpcija bunaračića u prisustvu test jedinjenja Kontrola; apsorpcija bunarčića u odsustvu test jedinjenja Blank; apsorpcija bunarčića u odsustvu test jedinjenja, u odsustvu proteina integraze

*Sastav reakcione smeše: 30 mM morfolinopropansulfonska kiselina (MOPS), 5 mM MgCl2, 3 mM ditiotreitol (DTT), 0.1 mg/mL goveđi serum albumin (BSA), 5% glicerol, 10% dimetil sulfoksid (DMSO), 0.01% Tween 20

Tabela 8

Procena antivirusne aktivnosti

[0188] Efekat kombinovane upotrebe kristala ili mešanog kristala jedinjenja A ovog pronalaska i postojećih anti-HIV agenasa može se odrediti na sledeći način.

[0189] Na primer, efekat kombinovane upotrebe dva agensa iz postojećih nukleozidnih inhibitora reverzne transkriptaze (zidovudin, lamivudin, tenofovir), nenukleozidnih inhibitora reverzne transkriptaze (efavirenz) ili inhibitora proteaze (indinavir, nelfinavir) i kristala ili mešanog kristala jedinjenja A i slično se procenjuju XTT metodom korišćenjem CEM-SS ćelija inficiranih sa HIV-1 IIIB.

[0190] Pored toga, procenjuje se efekat kombinovane upotrebe tri agensa kristala ili mešanog kristala jedinjenja A, zidovudina i lamivudina, ili kristala ili mešanog kristala jedinjenja A, tenofovira i lamivudina i slično.

[0191] Pre testa kombinovane upotrebe, IC50i CC50svakog farmaceutskog agensa se mere. 5 koncentracija farmaceutskog agensa a i 9 koncentracija farmaceutskog agensa b, utvrđenih na osnovu ovih rezultata, kombinuju se da bi se procenio efekat kombinovane upotrebe dva agensa. Za kombinovanu upotrebu tri agensa, farmaceutski agens visoke koncentracije b i farmaceutski agens c se mešaju i farmaceutski agens a i koncentracija se kombinuju radi evaluacije.

[0192] Rezultati ispitivanja kristalnog ili mešanog kristala jedinjenja A i kombinovanog leka samog ili u kombinaciji istih analiziraju se na osnovu programa Prichard i Shipman MacSynergy II verzija 2.01 i Deltagraph verzija 1.5d.

[0193] Trodimenzionalni grafikon je izvučen iz % inhibicije pri koncentracijama svakog kombinovanog farmaceutskog agensa, dobijenih 3 puta iz testova, sa 95% (ili 68%, 99%) granicama poverenja, a efekat kombinovane upotrebe se procenjuje u odnosu na numeričke vrednosti µM<2>% izračunato na osnovu toga. Kriterijumi ocenjivanja prikazani su u nastavku.

INDUSTRIJSKA PRIMENLJIVOST

[0194] Kristal jedinjenja A koji je u osnovi ovog pronalaska, koji ima gore pomenuti određeni kristalni oblik II ili III, pokazuje anti-HIV efekat kao i superiornu stabilnost kristala. Zbog toga je koristan kao početni materijal farmaceutske kompozicije, posebno različitih farmaceutskih kompozicija za profilaksu i/ili lečenje AIDS.

Claims (3)

Patentni zahtevi

1. Farmaceutska kompozicija, koji sadrži:

(a) kristal (kristalni oblik II) 6-(3-hloro-2-fluorobenzil)-1-[(S)-1-hidroksimetil-2-metilpropil]-7-metoksi-4-okso-1.4-dihidrohinolin-3-karboksilne kiseline, koji ima obrazac difrakcije rendgenskih zraka praha koji ima karakteristične pikove difrakcije pri uglovima difrakcije 2θ (°) od 6.56, 13.20, 19.86, 20.84, 21.22, 25.22, kao što je izmereno rendgenskim difraktometrom na prahu

(b) kristal (kristalni oblik III) 6-(3-hloro-2-fluorobenzil)-1-[(S)-1-hidroksimetil-2-metilpropil]-7-metoksi-4-okso-1.4-dihidrohinolin-3-karboksilne kiseline, koji ima obrazac difrakcije rendgenskih zraka praha koji ima karakteristične difrakcione pikove pri uglovima difrakcije 20 (°) od 8.54, 14.02, 15.68, 17.06, 17.24, 24.16, ao što je izmereno rendgenskim difraktometrom na prahu, ili

(c) mešoviti kristal koji se sastoji od kristala gore pomenutog (a) i kristala gore pomenutog (b), i

GS-7340.

2. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 1, koja dalje sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač.

3. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 1 ili 2 za upotrebu u lečenju HIV.