[go: up one dir, main page]

RS63044B1 - Varijante antitela i njihove upotrebe - Google Patents

Varijante antitela i njihove upotrebe

Info

Publication number
RS63044B1
RS63044B1 RS20220267A RSP20220267A RS63044B1 RS 63044 B1 RS63044 B1 RS 63044B1 RS 20220267 A RS20220267 A RS 20220267A RS P20220267 A RSP20220267 A RS P20220267A RS 63044 B1 RS63044 B1 RS 63044B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
amino acid
mutation
region
variant
Prior art date
Application number
RS20220267A
Other languages
English (en)
Inventor
Paul Parren
Frank Beurskens
Jong Rob N De
Aran Frank Labrijn
Janine Schuurman
Original Assignee
Genmab Bv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genmab Bv filed Critical Genmab Bv
Publication of RS63044B1 publication Critical patent/RS63044B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/36—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood coagulation factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na polipeptide i povezana antitela koja sadrže varijantu Fc domena. Određenije, predmetni pronalazak se odnosi na antitela koja sadrže Fc domen ili polipeptide koji imaju modifikovanu efektorsku funkciju koja se dobija iz jedne ili više aminokiselinskih modifikacija u Fc-domenu.
STANJE TEHNIKE PRONALASKA
[0002] Efektorske funkcije koje su posredovane sa Fc regionom antitela omogućuju destrukciju stranih entiteta, kao što je ubijanje patogena i uklanjanje i degradacija antigena. Citotoksičnost posredovana ćelijama koja zavisi od antigena (ADCC) i ćelijski posredovana fagocitoza koja zavisi od antigena (ADCP) inicirana je vezivanjem Fc regiona sa ćelijama koje nose Fc receptor (FcR), pri čemu je citotoksičnost koja zavisi od komplementa (CDC) inicirana vezivanjem Fc regiona sa C1q, koji inicira klasični put aktivacije komplementa.
[0003] Svako IgG antitelo sadrži dva mesta vezivanja C1q, jedno u svakom konstantnom regionu teškog lanca (Fc). Pojedinačni molekul IgG u rastvoru, međutim, ne aktivira komplement kao što je afinitet monomernog IgG za C1q je dosta slab (Kd∼10<-4>M) (Sledge et al., 1973 J. Biol. Chem. 248,2818-13; Hughes-Jones et al., 1979 Mol. Immunol. 16,697-701). Povezivanje IgG vođeno antigenom može dovesti do mnogo čvršćeg vezivanja multivalentnog molekula C1q (Kd∼10<-8>M) i aktivacije komplementa (Burton et al., 1990 Mol. Immunol.22, 161-206). Suprotno tome, IgM se prirodno nalazi u kovalentno vezanim penta-ili heksamerima, i nakon vezivanja ćelijski eksprimiranog ili imobilizovanog antigena pentameri i heksameri IgM mogu efikasno pokrenuti CDC. Vezivanje antigena je neophodno da bi se indukovala konformaciona promena u IgM da bi se izložila mesta vezivanja C1q (Feinstein et al., 1986, Immunology Today, 169-174).
[0004] Takođe je predloženo da IgG može postići aktivaciju komplementa obrazovanjem heksamernih struktura prstena, kroz interakciju CH2/CH3 domena Fc regiona (Burton et al., 1990 Trends in Biochem. Sci. 15, 64-69). Dokaz koji podržava postojanje takvih heksamernih IgG struktura je pronađen u dvodimenzionim (Reidler et al., 1986 I Handbook of Experimental Immunology 4th edit. (Weir, D. M. ed.), pp17.1-17.5. Blackwell, Edinburgh; Pinteric et al., 1971 Immunochem.8, 1041-5) i trodimenzionim kristalima, kao i za IgG1, IgG2a i IgG4 i humani Fc u rastvoru (Kuznetsov et al., 2000 J Struct. Biol.131, 108-115). Obrazovanje heksamernog prstena je takođe uočeno u strukturi kristala b12 humanog IgG1κ antitela koje je usmereno protiv HIV-1 gp120 (1HZH in PDB) (Saphire et al., Science 2001 Aug 10;293(5532),1155-9). U prstenu b12 heksamera, šest dostupnih mesta vezivanja C1q je prisutno na površini heksamera, jedan iz svakog od šest heksamera, dok je drugih šest mesta vezivanja usmereno nadole.
[0005] C1q podseća na gomilu lala sa šest globularnih glava, koji sadrže regione za kombinovanje antitela, koji su ukotvljeni za šest kolagenih stubaca [Perkins et al., 1985 Biochem J.228, 13-26; Poon et al., 1983 J Mol Biol.168, 563-77; Reid et al., 1983 Biochem Soc Trans 11, 1-12; Weiss et al., 1986 J. Mol. Biol. 189, 573-81]. Pronađeno je da se C1q uklapa na b12 heksamerni sklop 1HZH strukture kristala, tako da je svaka od šest globularnih glava u kontaktu sa jednim od šest mesta vezivanja C1q (Parren, FASEB Summer Research Conference, Snowmass, Co., 5-10 July 2010; "Crystal Structure of an intact human IgG: implications for HIV-1 neutralization and effector Function", Thesis by Erica Ollmann Saphire, for the Scripps Research Institute, La Jolla, California. November 2000). Uočeno je da mutacije u odabranim aminokiselinama u Fc površinama na kojima se ostvaruje kontakt koje su uočene između srodnih prema simetriji b12 antitelima u strukturi kristala su smanjuju aviditet vezivanja C1q, što ukazuje na doprinos ovih aminokiselina intermolekularnoj Fc:Fc interakciji.
[0006] US 2011/0123440 opisuje izmenjene regione Fc-antitela i njiove upotrebe. Izmenjeni Fc-regioni imaju jednu ili više aminokiselinskih supstitucija.
[0007] US 2008/0089892 opisuje varijante Fc-regiona polipeptida i kompozicije koje sadrže takve varijante Fc-regiona.
[0008] US 2010/0184959 opisuje postupke za dobijanje varijante Fc polipeptida sa izmenjenim prepoznavanjem Fc liganda i/ili efektorskom funkcijom.
[0009] US 2010/015133 opisuje postupke za dobijanje polipeptida regulisanjem polipeptidnog povezivanja.
[0010] US 2010/105873 opisuje integrisani pristup za generisanje multidomenskih proteinskih terapeutika.
[0011] US 6,737,056 opisuje varijante polipeptida sa izmenjenom efektorskom funkcijom.
[0012] Prethodni napori su učinjeni da bi se identifikovale Fc-varijante antitela sa pojačanom efektorskom funkcijom ili drugim svojstvima modifikacije. Takva ispitivanja bila su usmerena na, npr., izmenu segmenata između IgG izotipova da bi se generisali himerni IgG molekuli (Natsume et al., 2008 Cancer Res 68(10), 3863-72) ili aminokiselinske supstitucije u regionu zgloba (Dall’Acqua et al., 2006 J Immunol 177, 1129-1138) ili u ili blizu mesta vezivanja C1q u CH2 domenu, centriranog oko ostataka D270, K322, P329, i P331 (Idusogie et al., 2001 J Immunol 166, 2571-2575; Michaelsen et al., 2009 Scand J Immunol 70, 553-564 and WO 99/51642). Na primer, Moore et al. (2010 mAbs 2(2), 181-189)) opisuje ispitivanje različitih kombinacija S267E, H268F, S324T, S239D, I332E, G236A i I332E za pojačanu efektorsku funkciju preko CDC ili ADCC. Takođe su predložene druge mutacije Fc koje utiču na vezivanje sa Fc-receptorima (WO 2006/105062, WO 00/42072, U.S. Patent 6,737,056 i U.S. Patent 7,083,784) ili fiziološka svojstva antitela (WO 2007/005612 A1).
[0013] US 7,740847B2 opisuje varijante Fc regiona koje sadrže bar jednu aminokiselinsku supstituciju, kao što je E430G prikazana kao rastući CDC i K439E i S440K mutacije prikazane kao opadajući CDC.
[0014] Uprkos ovim i drugim napredovanjima u oblasti tehnike, ipak, ostaje potreba za novim i unapređenim terapeuticima koji su zasnovani na antitelima.
SUŠTINA PRONALASKA
[0015] Predmetni pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži prvu varijantu matičnog antitela, pri čemu je prva varijanta humano antitelo pune dužine, i drugu varijantu matičnog antitela, pri čemu je druga varijanta humano antitelo pune dužine, pri čemu prva varijanta sadrži prvi Fc-domen imunoglobulina i region koji veže antigen, pri čemu druga varijanta sadrži drugi Fc-domen imunoglobulina i region koji veže antigen, i pri čemu prva varijanta i druga varijanta sadrži mutaciju koja odgovara E430G u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1 i pomenuta prva varijanta sadrži mutaciju koja odgovara K439E u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, i pomenuta druga varijanta sadrži mutaciju koja odgovara S440K u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, pri čemu su položaji aminokiselina numerisani u skladu sa Eu-indeksom i pri čemu prva i druga varijanta sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je bar 95 % stepeni identična sa aminokiselinskim ostacima 130 do 330 SEQ ID NO 1 ili 5, pri čemu su prve i druge varijante sposobne za uparivanje jedna sa drugom; obezbeđivanje obnovljenog ili uvećanog vezivanja C1q, aktivacije komplementa, i/ili CDC, za par specifičnih varijanti antitela, u poređenju sa svakom varijantom zasebno ili mešavinom matičnog antitela ili matičnih antitela u jednom aspektu, ovde je poznato kao "mešoviti-mutant", varijanta obezbeđuje povećanu efektorsku funkciju kada se koristi u kombinaciji sa drugom varijantom istog ili različitog polipeptida ili antitela koje sadrži mutaciju u različitom aminokiselinskom ostatku u pomenutom segmentu, u poređenju sa jednom ili više varijanti, drugom varijantom, i matičnim antitelom ili posebnim antitelom.
[0016] Obično, mutacija je supstitucija aminokiselina, kao što je mutacija koja zamenjuje matični aminokiselinski ostatak za onaj koji je različite veličine i/ili fizičkohemijskih osobina koji promoviše obrazovanje nove intramolekulske Fc:Fc veze ili povećava jačinu interakcije postojećeg para. Primeri aminokiselinskih ostataka za mutaciju u skladu sa predmetnim pronalaskom su prikazani u Tabelama 1 i 2A u B, pored primera aminokiselinskih supstitucija. Ne-ograničavajući primeri različitih aspekata iz prikaza su obezbeđeni na Slici 1.
[0017] Ovaj i drugi aspekti iz prikaza, posebno različite upotrebe i terapeutske primene za varijante antitela, detaljnije su opisani u tekstu ispod.
Kratak opis nacrta
[0018]
Slika 1: (A) Šematski prikaz IgG molekula u formaciji heksamera. Istačkani krug ilustruje dva susedna para Fc:Fc interakcije dva susedna molekula IgG. Strelica u okviru ilustruje pravac iz kog su ilustracije pod B, C i D pregledane: dva susedna Fc molekula su 90° rotirana (u ravni nacrta) i posmatrano sa Fab-krakova u pravcu CH3 domena. (B) Uočeni efekat mutacija koje pojačavaju efekat oligomerizacije na CDC. Šematski prikaz ilustracije Fc:Fc parova interakcije sa povećanom efikasnosti prema aspektima jednog mutanta i dvostrukog mutanta iz prikaza. (C) Uočeni efekat mutacija koje inhibiraju oligomerizaciju na CDC. Šematski prikaz koji ilustruje kako bar dve mutacije koje inhibiraju oligomerizaciju koje nadoknađuju (tj. kompenzuju) jedna drugu mogu biti, ili kombinovane u jedan molekul (aspekt dvostrukog mutanta), ili razdvojene preko dva molekula (aspekt mešovitog mutanta), da bi se obnovila ili povećala Fc:Fc interakcija prema dvostrukom mutantu i aspektima mešavina mutanata iz prikaza. Mešavine mutanata postižu aktivaciju specifične efektorske funkcije koja zavisi od vezivanja oba antitela, koji mogu prepoznati različite mete. (D) Teoretski efekat mutacija koje inhibiraju vezivanje C1q na CDC. Šematski prikaz interakcije Fc:C1q, ilustruje da ukoliko mutacije koje inhibiraju vezivanje C1q, oni se ne mogu kombinovati ili mešati da bi se obnovila aktivnost CDC, zbog toga C1q ne može nadomestiti za defekt koji je uveden u antitelo.
Slika 2: Poravnanje sekvenci humanih IgG1, IgG1f, IgG2, IgG3 i IgG4 Fc segmenata koji odgovaraju ostacima P247 do K447 u IgG1 teškom lancu, korišćenjem Clustal 2.1 softvera, kao što je numerisano sa EU indeksom kao što je predstavljeno po Kabat-u. Prikazane sekvence predstavljaju ostatke 130 do 330 konstantnog regiona teškog lanca humanog IgG1 (SEQ ID NO:1; UniProt pristupni br. P01857) i alotipske varijante IgG1m(f); ostaci 126 do 326 konstantnog regiona teškog lanca IgG2 (SEQ ID NO:2; UniProt pristupni Br. P01859); i ostaci 177 do 377 konstantnog regiona teškog lanca IgG3 (SEQ ID NO:2; UniProt pristupni br. P01860); i ostaci 127 do 327 konstantnog regiona teškog lanca IgG4 (SEQ ID NO:4; UniProt pristupni br. P01861).
Slika 3A i B: Poravnanje sekvenci anti-EGFr antitela 2F8 u IgG1 (SEQ ID NO:3), IgG4 (SEQ ID NO:5) i (parcijalni) IgG3 (SEQ ID NO:6) bočni lanac. Numerisanje aminokiselina po Kabat-u i prema EU-indeksu su prikazani (oba su opisana u Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)).
Slika 4: Detaljni pregled K439/S440 interakcija između Fc susednih molekula (Fc i Fc’, redom) u uređenju multimera (npr., heksameri), ilustracija interakcije između divljeg tipa, nemodifikovanih Fc i Fc’ molekula.
Slika 5: Detaljni pregled K439/S440 interakcija između Fc susednih molekula (Fc i Fc’, redom) u uređenju multimera (npr., heksameri) ilustracija interakcije između varijante Fc i Fc’ molekula koji sadrže K439E i S440K mutacije.
Slika 6: ELISA vezivanja C1q sa 7D8 Fc:Fc mutantima. Serije koncentracija navedenih antitela su obložene na bunariće mikrotitarske ploče i inkubirane su sa fiksnom koncentracijom C1q. Efikasnost vezivanja sa C1q je upoređena sa divljim tipom 7D8 za sve obložene mutante, osim I253D. Predstavljen je prikaz najmanje 3 eksperimenta.
Slika 7: CDC posredovano sa 7D8 varijantama na CD20-pozitivnim Raji ćelijama. Raji ćelije su inkubirane sa 7D8 mutantima (K439E, S440K, K439E/S440K Dupli mutant, K439E S440K mešavina) i koncentracionim serijama C1q kako bi se ispitala efikasnost CDC preko merenja ćelijske lize. Reprezentativni grafik ponovljenih eksperimenata je prikazan.
Slika 8: CDC posredovano sa 7D8 mutantima (7D8-WT, K439E, S440K, K439E/S440K dvostruki mutant, K439E S440K mešavina) na CD20-pozitivne Daudi ćelije. Serije koncentracija 7D8 mutanata su ispitivane za njihovu efikasnost da bi se indukovao CDC.
Slika 9: CDC posredovano sa mutantima CD38 antitela HuMAb 005 na CD38-pozitivnim ćelijama. (A) CDC efikasnost na Daudi ćelijama sa serijama koncentracija 005 mutanata. (B) CDC efikasnost Raji ćelija sa serijama koncentracija HuMAb 005 mutanata. (C) CDC efikasnost E345R mutanta HuMAb 005 sa ili 20% ili 50% NHS na Wien133 ćelijama. (D) CDC efikasnost E345R mutanta HuMAb 005 i 7D8 sa ili 20% ili 50% NHS na Raji ćelijama. Uzorci neprečišćenih antitela koji su izolovani iz privremenih transfekcija su ispitani. Kao negativna kontrola, supernatant lažno (eng. mock)-transfektovanih ćelija je korišćen.
Slika 10: CDC sa divljim tipom i E345R mutantima CD38 antitela HuMAb 005, (A) i CD20 antitela HuMAb 7D8 (B) u eksperimentu kompeticije sa Fc-vezujućim peptidom. Ćelijska liza je izmerena nakon CDC na Daudi-ćelijama koje su opsonizovane sa antitelom inkubiranim sa serijama koncentracija Fc-vezujućeg DCAWHLGELVWCT peptida (SEQ ID NO:7). Uzorci neprečišćenih antitela koji su izolovani iz privremenih transfekcija su korišćeni. Kao negativna kontrola, supernatant lažnotransfektovanih ćelija je korišćen.
Slika 11: ADCC Daudi ćelija koje eksprmiraju CD38 sa divljim tipom CD38 antitela HuMAb 005 i mutantom IgG1-005-E345R. ADCC PBMC jednog donora je prikazan, predstavljeno kao % lize.
Slika 12: Vezivanje divljeg tipa IgG1-7D8 i mutanta IgG1-7D8-E345R za humani, cinomolgus i mišji FcRn, kao što je određeno sa ELISA na pH 6.
Slika 13: Koncentracije u plazmi divljeg tipa IgG1-7D8 i -E354R, -S440K i K322A varijanti nakon intravenoznog ubrizgavanja SCID miševima.
Slika 14A, B, C, i D: CDC na CD20-i CD38-pozitivnim Wien133 ćelijama.
Slika 15A i B: Procena in vivo efikasnosti IgG1-7D8-E345R u subkutanoznom modelu ksenografta sa Raji-luc #2D1 ćelijama.
Slika 16A i B: Procena in vivo efikasnosti IgG1-005-E345R u subkutanoznom modelu ksenografta sa Raji-luc #2D1 ćelijama.
Slika 17: CDC na CD38-pozitivnim, EGFR-negativnim Wien133 ćelijama sa CD38/EGFR bispecifičnim antitelom sa E345R mutacijom.
Slika 18A i B: CDC na CD20-pozitivnim, CD38-negativnim Wien133 ćelijama ili Raji ćelijama sa CD20/CD38 bispecifičnim antitelom sa i bez E345R mutacije.
Slika 19: CDC na EGFR-pozitivnim A431 ćelijama sa EGFR antitelom 2F8 sa E345R mutacijom. Slika 20A i B: CDC posredovano sa E345R mutantima antitela.
Slika 21: Analiza kolokalizacije antitela na TF (FITC) sa lizozomalnim markerom LAMP1 (APC). Slika 22A-D: Uvođenje E345R rezultivalo je u pojačanom CDC-posredovanom ubijanju u poređenju sa divljim tipom rituksimaba koji je ispitan na različitim B ćelijskim linijama.
Slika 22E: Uvođenje E345R rezultovalo je u povećanom maksimalnom CDC-posredovanom ubijanju u poređenju sa divljim tipom rituksimaba, nezavisno od nivoa ekspresije regulatornih proteina komplementa CD46 (A), CD55 (B) ili CD59
(C) u različitim B ćelijskim linijama sa uporedivim nivoima ekspresije CD20
Slika 23: Kinetike CDC. E345R antitela dovode do brže i značajnije lize ciljanih ćelija sa CDC u poređenju sa antitelima divljeg tipa.
Slika 24: Kinetike CDC. Uvođenje E345R mutacije u bispecifičnom CD38xCD20 antitelu dovodi do brže i značajnije CDC-posredovane lize ciljne ćelije.
Slika 25 A-B: Kinetike CDC. Uvođenje E345R mutacije u bispecifičnom antitelu CD38xEGFR (A) i CD20xEGFR (B) koje se monovalentno veže za EGFR-negativne Raji ćelije, dovodi do brže i značajnije CDC-posredovane lize ciljne ćelije.
Slika 26A-F: CDC na Wien133 ćelijama sa kombinacijom antitela divljeg tipa sa mutantom antitela koji sadrži (A-C) E345R i Q386K ili (D-F) E345R, E430G i Q386K. IgG1-b12 mutanti ne vežu Wien133 ćelije i korićeni su kao negativna kontrolna antitela.
Slika 27: CDC efikasnost IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4 izotipova antitela koji sadrže E345R mutaciju. Slika 28: Uvođenje E345R mutacije koja stabilizuje Fc:Fc u divljem tipu CD38 antitela 005 rezultuje u pojačanom ubijanju primarnih CLL ćelija u ex vivo CDC testu (srednja vrednost ± standardna greška srednje vrednosti).
DETALJNI OPIS PRONALASKA
[0019] Kao što je ovde opisano, iznenađujuće, mutacije u aminokiselinama koje nisu direktno uključene u Fc:C1q vezivanje mogu ipak povećati CDC antitela, i mogu takođe unaprediti efektorske funkcije antitela koje su posredovane sa Fc. Ovo podržava hipotezu da molekuli antitela kao što su IgG1 antitela mogu obrazovati oligomerne strukture koje su kasnije vezane sa C1q. Dalje, dok je pronađeno da neke mutacije smanjuju indukovanje CDC, neke kombinacije takvih mutacija u istim ili različitim molekulima antitela dovode do obnavljanja indukovanja CDC, i dalje su pokazale specifičnost za oligomerizaciju antitela, i stoga promovišu specifičniju indukciju CDC. Posebne mutacije kojima se povećava odgovor CDC takođe su karakterisane sa unapređenim ADCC odgovorom, povećanim aviditetom, povećanom internalizacijom i efikasnosti in vivo u mišjem sistemu modela tumora kao što je prikazano u Primerima. Ova otkrića dozvoljavaju nove terapeutike koji su zasnovani na antitelu sa pojačanom sposobnosti indukovanja CDC, selektivnijim indukovanjem CDC, i/ili druge unapređene efektorske funkcije.
[0020] Sve varijante antitela iz prikaza sadrže region koji veže antigen i Fc region pune dužine ili deo koji sadrži bar jednu mutaciju u segmentu koji odgovara aminokiselinskim ostacima P247 do K447 u IgG1. Bez ograničavanja teorijom, veruje se da identifikovane mutacije dovode do efektivnije i/ili specifičnije indukcije CDC na osnovu tri različita principa, šematski predstavljena na Slici 1, i ovde naznačena kao "jedan mutant", "dvostruki mutant" i "mešoviti mutant".
[0021] Unapređeni C1q i/ili CDC efekti iz varijanti prikaza primarno se mogu detektovati samo u testovima koji dozvoljavaju nastajanje oligomera antitela, kao što je u testovima koji su zasnovani na ćelijama gde antigen nije fiksiran ali je prisutan na fluidnoj membrani. Dalje, da ovi efekti proističu iz stabilnijeg oligomera antitela a ne iz modifikacije direktnog mesta vezivanja C1q može se verifikovati u skladu sa principima koji su prikazani na Slici 1C.
Definicije
[0022] Termin "pojedinačni-mutant", treba razumeti kao varijantu predmetnog prikaza koja ima pojačanu efektorsku funkciju u poređenju sa matičnim (eng. parent) polipeptidom ili antitelom.
[0023] Termin "dvostruki-mutant", treba razumeti kao varijantu koja obuhvata bar dve mutacije u pomenutom segmentu, i ima unapređenu efektorsku funkciju u poređenju sa varijantom koja sadrži samo jednu od dve mutacije, matičnog polipeptida ili antitela, ili oba.
[0024] Termin "mešoviti-mutant", treba razumeti kao varijantu koja obezbeđuje povećanu efektorsku funkciju kada je korišćena u kombinaciji sa drugom varijantom istog ili različitog polipeptida ili antitela koje sadrži mutaciju u različitom aminokiselinskom ostatku u pomenutom segmentu, u poređenju sa jednom ili više varijanti, drugom varijantom, i matičnim polipeptidom ili samim antitelom.
[0025] Termin "polipeptid koji sadrži Fc-domen imunoglobulina i region vezivanja" odnosi se u kontekstu predmetnog pronalaska na polipeptid koji sadrži Fc-domen imunoglobulina i region za vezivanje koji se sposoban da se veže za bilo koji molekul, kao što je polipeptid, npr. koji se nalazi na ćeliji, bakteriji, ili virionu. Fc-domen imunoglobulina je definisan kao fragment antitela koji bi se obično dobio nakon digestije anitela sa papainom (koji je poznat stručnjaku iz oblasti tehnike) koji uključuje dva CH2-CH3 regiona imunoglobulina i region za spajanje, npr. region zgloba. Konstantni domen teškog lanca antitela definiše izotip antitela, npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgE. Fc-domen posreduje u efektorskim funkcijama antitela sa ćelijskim površinskim receptorima koji su poznati pod imenom Fc receptori i proteini sistema komplementa. Region za vezivanje može biti polipeptidna sekvenca, kao što je protein, proteinski ligand, receptor, region koji veže antigen, ili region koji veže ligand koji je sposoban da se veže za ćeliju, bakteriju, virion. Ukoliko je region za vezivanje npr. receptor "polipeptid koji sadrži Fc-domen imunoglobulina i region za vezivanje" mogu se dobiti kao fuzioni (tj. spojeni) protein Fc-domena imunoglobulina i pomenutog regiona za vezivanje. Ukoliko je region za vezivanje region koji veže antigen "polipeptida koji sadrži Fc-domen imunoglobulina i region za vezivanje" može biti antitelo, kao što je humano antitelo ili samo teški lanac antitela ili ScFv-Fc-fuzija. Polipeptid koji sadrži Fc-domen imunoglobulina i region za vezivanje može obično sadržati region za spajanje, npr. region zgloba, i dva CH2-CH3 regiona teškog lanca imunoglobulina, prema tome "polipeptid koji sadrži Fc-domen imunoglobulina i region za vezivanje" može biti "polipeptid koji sadrži bar Fc-domen imunoglobulina i region za vezivanje". Termin "Fc-domen imunoglobulina" znači u kontekstu predmetnog pronalaska da su prisutni region za spajanje, npr. zglob u zavisnosti od podtipa antitela, i CH2 i CH3 regiona imunoglobulina, npr. humani IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA1, IgGA2 ili IgE.
[0026] Termin "CH2 region" ili "CH2 domen" kao što se ovde koristi je namenjen da se odnosi na CH2 region imunoglobulina. Prema tome na primer CH2 region humanog IgG1 antitela odgovara aminokiselinama 228-340 u skladu sa EU sistemom numerisanja. Međutim, CH2 region može takođe biti bilo koji od drugih podtipova kao što su ovde opisani.
[0027] Termin "CH3 region" ili "CH3 domen" kao što se ovde koristi je namenjen da se odnosi na CH3 region imunoglobulina. Prema tome na primer CH3 region humanog IgG1 antitela odgovara aminokiselinama 341-447 u skladu sa EU sistemom numerisanja. Međutim, CH2 region može takođe biti bilo koji od drugih podtipova kao što su ovde opisani.
[0028] Termin "imunoglobulin" odnosi se na klasu strukturalno srodnih glikoproteina koji se sastoje iz dva para polipeptidnih lanaca, jedan par lakih (L) lanaca niske molekulske težine i jedan par teških (H) lanaca, sva četiri potencijalno međusobno povezana disulfidnim vezama. Struktura imunoglobulina je dobro definisana. Videti za primer Fundamental Immunology Ch.7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)). Ukratko, svaki teški lanac obično se sastoji iz varijabilnog regiona teškog lanca (ovde skraćeno kao VH) i konstantnog regiona teškog lanca. Konstantni region teškog lanca obično se sastoji iz tri domena, CH1, CH2, i CH3. Teški lanci su međusobno povezani preko disulfidnih veza u takozvanom "regionu zgloba". Svaki laki lanac obično se sastoji iz varijabilnog regiona lakog lanca (ovde skraćeno kao VL) i konstantnog regiona lakog lanca. Konstantni region lakog lanca obično se sastoji iz jednog domena, CL. VH i VL regioni mogu dalje biti podeljeni u regione hipervarijabilnosti (ili hipervarijabilni regioni koji mogu biti hipervarijabilni u sekvenci i/ili obliku strukturalno definisanih petlji), takođe poznati kao regioni za određivanje komplementarnosti (CDRs), rasuti sa regionima koji su više konzervisani, poznati kao regioni okvira (FRs). Svaki VH i VL obično se sastoji iz tri CDRs i četiri FRs, koji su uređeni od amino-kraja prema karboksi kraju u sledećem nizu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (videti takođe Chothia i Lesk J. Mol. Biol. 196, 901 917 (1987)). Osim ukoliko nije drugačije označeno ili ukazano kontekstom, aminokiseline sekvenci konstantnog regiona ovde su numerisane u skladu sa EU-indeksom (opisano u Kabat, E.A. et al., Sequences of proteins of immunological interest.
5th Edition-US Department of Health and Human Services, NIH publication No. 91-3242, pp 662,680,689 (1991)).
[0029] Termin "antitelo" (At) u kontekstu iz predmetnog prikaza odnosi se na molekul imunoglobulina, fragment molekula imunoglobulina, ili derivat bilo kojeg od njih, koji ima sposobnost da se specifično veže za antigen pod uobičajenim fiziološkim uslovima sa značajnim vremenskim periodima polu-života, kao što je bar oko 30 minuta, bar oko 45 minuta, bar oko jednog sata, bar oko dva sata, bar oko četiri sata, bar oko osam sati, bar oko 12 sati, oko 24 sati ili više, oko 48 sati ili više, oko tri, četiri, pet, šest, sedam ili više dana, npr., ili bilo koji drugi relevantni funkcionalno definisani period (kao što je vreme koje je dovoljno da bi se indukovao, promovisao, pojačao, i/ili modulirao fiziološki odgovor koji je povezan sa vezivanjem antitela za antigen i/ili vreme dovoljno da bi antitelo regrutovalo efektorsku aktivnost). Antitelo iz predmetnog prikaza sadrži Fc-domen imunoglobulina i region koji veže antigen. Antitelo generalno sadrži dva CH2-CH3 regiona i region za povezivanje, npr. region zgloba, npr. bar Fcdomen. Prema tome, antitelo iz predmetnog prikaza može sadržati Fc region i region koji veže antigen. Varijabilni regioni teških i lakih lanaca molekula imunoglobulina sadrže domen za vezivanje koji stupa u interakciju sa antigenom. Konstantni ili "Fc" regioni antitela mogu posredovati vezivanju imunoglobulina sa tkvima domaćina ili faktorima, uključujući različite ćelije imunog sistema (kao što su efektorske ćelije) i komponente sistema komplementa kao što je C1q, prva komponenta klasičnog puta aktivacije komplementa. Antitelo takođe može biti multispecifično antitelo, kao što je bispecifično antitelo ili sličan molekul. Termin "bispecifično antitelo" odnosi se na antitelo koje ima specifičnosti za bar dva različita, obično ne-preklapajuća, epitopa. Takvi epitopi mogu biti na istim ili različitim metama. Ukoliko su epitopi na različitim metama, takve mete mogu biti na istoj ćeliji ili različitim ćelijama ili vrstama ćelija. Kao što je gore naznačeno, osim ukoliko nije drugačije navedeno ili jasno kontradiktovano kontekstom, termin antitelo ovde uključuje fragmente antitela koji sadrže bar deo Fcregiona i koji zadržavaju sposobnost specifičnog vezivanja za antigen. Takvi fragmenti se mogu dobiti bilo kojim postupkom, kao što je enzimsko cepanje, sinteza peptida i postupci rekombinantne ekspresije. Pokazano je da funkcija vezivanja antigena od strane antitela može da se izvede pomoću fragmentata antitela pune dužine. Primeri fragmenata za vezivanje obuhvaćeni terminom "At" ili "antitelo" uključuju, bez ograničenja, monovalentna antitela (opisana u WO2007059782 od strane Genmab); antitela teškog lanca, koja se sastoje samo iz dva teška lanca i prirodno se nalaze kod npr. kamila (e.g., Hamers-Casterman (1993) Nature 363:446); ThioMabs (Roche, WO2011069104), modifikovani domen za izmenu lanaca (SEED ili Seed-body) koji su asimetrični i bispecifični molekuli slični antitelima (Merck, WO2007110205); Triomab (Fresenius, Lindhofer et al. (1995 J Immunol 155:219); FcΔAdp (Regeneron, WO2010151792), Azymetric Scafold (Zymeworks/Merck, WO2012/058768), mAb-Fv (Xencor, WO2011/028952), immunoglobulin sa dvostrukim varijabilnim domenom (Abbott, DVD-Ig,U.S. Patent br. 7,612,181); dvodomenska antitela sa dvostrukom glavom (Unilever; Sanofi Aventis, WO20100226923), Di-diatela (ImClone/Eli Lilly), formati “Knobs-into-holes” antitela (Genentech, WO9850431); DuoBody (Genmab, WO 2011/131746); formati antiela sa eletrostatičkim upravljanjem (eng. Electrostatic steering antibody) (Amgen, EP1870459 i WO 2009089004; Chugai, US201000155133; Oncomed, WO2010129304A2); bispecifični IgG1 i IgG2 (Rinat neurosciences Corporation, WO11143545), CrossMAbs (Roche, WO2011117329), LUZ-Y (Genentech), Biclonic (Merus), antitela sa dvostrukim domenom ciljanja (GSK/Domantis), Antitela dva u jedan koji prepoznaju dve mete (Genentech, NovImmune), Unakrsno povezana Mabs (Karmanos Cancer Center), CovX-telo (CovX/Pfizer), IgG-sličan Bispecifik (ImClone/Eli Lilly, Shen, J., et al. J Immunol Methods, 2007. 318(1-2): p. 65-74), i DIG-telo i PIG-telo (Pharmabcine), , i molekuli za ponovno ciljanje sa dvostrukom afinitetom (eng. Dual-affinity retargeting molecules)(Fc-DART ili Ig-DART, od Macrogenics, WO/2008/157379, WO/2010/080538), Zybodies (Zyngenia), pristup sa zajedničkim lakim lancem (Crucell/ Merus, US7262028) ili zajedničkim teškim lancima (κλ Bodies od NovImmune), kao i spojeni proteini koji sadrže polipeptidnu sekvencu koja je spojena sa fragmentom antitela koji sadrži Fc-domen slične scFv-fuzije, kao što je BsAb od ZymoGenetics/BMS), HERCULES od Biogen Idec (US007951918), SCORPIONS od Emergent BioSolutions/Trubion, Ts2Ab (MedImmune/AZ (Dimasi, N., et al. J Mol Biol, 2009. 393(3): p.672-92), scFv fuzija spojenog molekula od Novartis, scFv fuzija od Changzhou Adam Biotech Inc (CN 102250246), TvAb od Roche (WO 2012025525, WO 2012025530), mAb<2>od f-Star (WO2008/003116), i dvostruke scFv-fuzije. Takođe treba razumeti da termin antitelo, osim ukoliko nije drugačije naznačeno, takođe uključuje poliklonska antitela, monoklonska antitela (kao što su humana monoklonska antitela), mešovita antitela (rekombinantna poliklonska) na primer koja su dobijena postupcima koji su korišćeni od strane Symphogen i Merus (Oligoclonics), i polipeptidi slični antitelu, kao što su himerna antitela i humanizovana antitela. Dobijeno antitelo potencijalno može biti kog izotipa.
[0030] Termin "antitelo pune dužine" kao što je ovde korišćen, odnosi se na antitelo (npr., matično ili varijantu antitela) koje sadrži sve konstantne i varijabilne domene teškog i lakog lanca koji odgovaraju onima koji se normalno mogu naći u divljem tipu antitela ili njegovom izotipu.
[0031] Termin "humano antitelo", kao što se ovde koristi, je namenjen da uključi anitela koja imaju varijabilne i konstantne regione koji su nastali iz humanih germinativnih imunoglobulinskih sekvenci. Humana antitela iz prikaza mogu uključiti aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani sa humanim germinativnim imunoglobulinskim sekvencama (npr., mutacije, insercije ili delecije koje su uvedene slučajnom ili mutagenezom koja je specifična za mesto in vitro ili somatskom mutacijom in vivo). Međutim, termin "humano antitelo", kao što se ovde koristi, nije namenjen da uključi antitela u kojima su sekvence CDR izvedene iz germinativnih drugih vrsta sisara, kao što je miš, su prenete na humane sekvence okvira.
[0032] Termini "monoklonsko antitelo", "monoklonsko At", "kompozicija monoklonskog antitela", "mAt", ili slično, kao što se ovde koristi odnosi se na dobijanje molekula At iz pojedinačne molekulske kompozicije. Kompozicija monoklonskog antitela ispoljava pojedinačnu specifičnost vezivanja i afinitet za određeni epitop. Prema tome, termin "humano monoklonsko antitelo" odnosi se na At-a koja ispoljavaju pojedinačnu specifičnost vezivanja koja imaju varijabilne i konstantne regione koji su izvedeni iz humanih germinativnih imunoglobulinskih sekvenci. Humana mAt-a mogu se dobiti pomoću hibridoma koji uključuje B ćeliju dobijenu iz transgene ili transhumane nehumane životinje, kao što je transgeni miš, koji ima genom koji sadrži repertoar transgena humanog teškog lanca i repertoar transgena lakog lanca, koji su uređeni tako da proizvode funkcionalno humano antitelo i spojeni su sa imortalizovanom ćelijom.
[0033] Kao što se ovde koristi, "izotip" se odnosi na klasu imunoglobulina (na primer IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA1, IgGA2, IgE, ili IgM ili njihove bilo koje alotipove kao što su IgGlm(za) i IgG1m(f)) koji je kodiran sa genima za konstantni region teškog lanca. Dalje, svaki izotip teškog lanca može se kombinovati ili sa kapa (κ) ili lambda (λ) lakim lancem.
[0034] Termin "monovalentno antitelo" znači u kontekstu iz predmetnog prikaza da je molekul antitela molekula sposoban da se veže sa samo jednim od domena za vezivanje antitela sa antigenom, npr. ima interakciju pojedinačnog antigena-antitela, i prema tome nije sposoban za unakrsno vezivnje antigena.
[0035] Kao što se ovde korisiti, termin "meta" kontekstu iz predmetnog prikaza treba razumeti kao molekul za koji se region vezivanja polipeptida koji sadrži Fc domen i region vezivanja, kada su korišćeni u kontekstu vezivanja antitela uključuje bilo koji antigen prema kom je dobijeno antitelo usmereno. Termin "antigen" i "meta" mogu se u vezi sa antitelom koristiti naizmenično i predstavljaju isto značenje i svrhu u odnosu na bilo koji aspekt izvođenja iz predmetnog prikaza.
[0036] Kao što se ovde koristi, termin "vezivanje" u kontekstu vezivanja antitela sa prethodno određenim antigenom obično je vezivanje sa afinitetom kome odgovara KDod oko 10<-6>M ili manje, npr.
10<-7>M ili manje, kao što je oko 10<-8>M ili manje, kao što je oko 10<-9>M ili manje, oko 10<-10>M ili manje, ili oko 10<-11>M ili još manje kada se na primer određuje sa tehnologijom površinske plazmonske rezonance (SPR) u BIAcore 3000 instrumentu korišćenjem antigena kao liganda i antitela kao analita, i veže se za prethodno određeni antigen sa afinitetom koji odgovara KDkoja je bar deset-puta niža, kao što je bar 100 puta niža, na primer bar 1,000 puta niža, kao što je bar 10,000 puta niža, na primer bar 100,000 puta niža od njegovog afiniteta za vezivanje sa ne-specifičnim antigenom (npr., BSA, kazein) osim prethodno definisanog antigena ili blisko povezanih antigena. Količina sa kojom je afinitet niži je zavisna od KDantitela, tako da kada KDantitela je veoma niska (zapravo, antitelo je visoko specifično), onda količina sa kojom je afinitet za antigen niži onda afinitet za ne-specifični antigen može biti bar 10,000 puta. Termin "KD" (M), kao što se ovde koristi, odnosi se na konstantu ravnoteže disocijacije određene interakcije antitela sa antigenom.
[0037] "Varijanta" ili "varijanta antitela" ili "varijanta matičnog antitela" iz predmetnog prikaza je molekul antitela ili koji sadrži jednu ili više mutacija u poređenju sa "matičnim antitelom". Slično tome, "varijanta" ili "polipeptid varijante koji sadrži Fc-domen imunoglobulina i region vezivanja" ili "varijanta matičnog polipeptida koji sadrži Fc-domen imunoglobulina i region vezivanja" iz predmetnog prikaza je "polipeptid koji sadrži Fc-domen imunoglobulina i region vezivanja ", koji sadrži jednu ili više mutacija u poređenju sa "matičnim polipeptidom koji sadrži Fc-domen imunoglobulina i region vezivanja".
1
Različiti termini se mogu koristiti naizmenično i imaju isto značenje i svrhu u odnosu na bilo koji aspekt izvođenja iz predmetnog prikaza. Primer formata matičnog antitela uključuju, bez ograničenja, divlji tip antitela, antitelo pune dužine ili fragment antitela koji sadrži Fc, bispecifično antitelo, humano antitelo, ili bilo koja njihova kombinacija. Primeri mutacija uključuju delecije aminokiselina, insercije, i supstitucije aminokiselina u sekvenci matičnog antitela. Aminokiselinske supstitucije mogu zameniti prirodnu aminokiselinu za drugu aminokiselinu koja se nalazi u prirodi ili derivat aminokiseline koja se ne nalazi u prirodi. Aminokiselinska supstitucija može biti konzervativna ili ne-konzervativna. U kontekstu iz predmetnog prikaza, konzervativne supstitucije mogu se definisati suptitucijama sa klasama aminokiselina izraženim u jednoj ili više od sledećih tri tabela:
Klase aminokiselinskih ostataka za konzervativne supstitucije
Alternativne konzervativne klase supstitucija aminokiselinskih ostataka
Alternativna fizička i funkcionalna klasifikacija aminokiselinskih ostataka
[0038] U kontekstu iz predmetnog prikaza, supstitucija u varijanti je naznačena kao:
Originalna aminokiselina - položaj - supstituisana aminokiselina;
[0039] Kod od tri slova, ili kod jednog slova, su korišćeni, uključujući kodove Xaa i X da bi se označio aminokiselinski ostatak. Prema tome, oznaka "E345R" ili "Glu345Arg" znači, da varijanta sadrži supstituciju Glutaminske kiseline sa Argininom u položaju varijante aminokiseline koji odgovara aminokiselini u položaju 345 u matičnom antitelu. , kada su oba poravnata kao što je navedeno u nastavku.
[0040] Gde se položaj kao takav ne nalazi u antitelu, ali varijanta sadrži inserciju aminokiseline, na primer:
Položaj - substituisana aminokiselina; oznaka, npr., "448E" je korišćena.
[0041] Takva oznaka je posebno važna u vezi sa modifikacijom(ama) u serijama homolognih polipeptida ili antitela.
[0042] Slično tome kada je identitet supstitucijskih ostat(a)ka aminokiselina nebitan:
Originalna aminokiselina - položaj; ili "E345".
[0043] Za modifikaciju gde originalne aminokiselin(a)e i/ili substituisane aminokiselin(a)e mogu sadržati više od jedne, ali ne sve aminokiselin(e)a, supstitucija Glutaminske kiseline za Arginin, Lizin ili Triptofan u položaju 345: "Glu345Arg,Lys,Trp" ili "E345R,K,W" ili "E345R/K/W" ili "E345 u R, K ili W" mogu se naizmenično koristiti u kontekstu iz prikaza.
[0044] Osim toga, termin "supstitucija" obuhvata supstituciju u jednu od drugih dvetnaest prirodnih aminokiselina, ili u druge aminokiseline, kao što su ne-prirodne aminokiseline. Na primer, supstitucija aminokiseline E u položaju 345 uključuje svaku od sledećih supstitucija: 345A, 345C, 345D, 345G, 345H, 345F, 3451, 345K, 345L, 345M, 345N, 345Q, 345R, 345S, 345T, 345V, 345W, i 345Y. Što je, inače, ekvivalentan oznaci 345X, gde X označava bilo koju aminokiselinu. Ove supstitucije mogu takođe biti naznačene sa E345A, E345C, itd, ili E345A,C,ect, ili E345A/C/ect. Isto se primenjuje na analogiju sa svakim i svakim ovde pomenutim položajem, da bi se ovde posebno uključila bilo koja od takvih supstitucija.
[0045] Aminokiselina ili segment u jednoj sekvenci koja "odgovara" aminokiselini ili segmentu u drugoj sekvenci je ona koja se (i) poravna sa drugom aminokiselinom ili segmentom korišćenjem standardnog programa za poravnanje sekvenci kao što je ALIGN, ClustalW ili slično, obično sa podrazumevanim parametrima i (ii) ima identitet u sekvenci SEQ ID NO:1 od bar 50%, bar 80%, bar 90%, ili bar 95%. Na primer, poravnanja u sekvenci su prikazana na Slikama 2 i 3 mogu se koristiti da bi se identifikovala bilo koja aminokiselina u IgG2, IgG3 ili IgG4 Fc sekvenci koja odgovara određenoj aminokiselini u sekvenci IgG1 Fc.
[0046] Predmetni prikaz se odnosi na varijante, viz. matična antitela, i/ili varijante anitela, koji imaju određeni stepen identiteta sa aminokiselinama P247 do K447 SEQ ID Nos:1, 2, 3, 4, i 5, takvo matično i/ili varijanta anitela ovde su naznačeni kao "homologna antitela".
[0047] Zа svrhe iz predmetnog prikaza stepen identiteta između dve aminokiselinske sekvence, kao i stepen identiteta između dve nukleotidne sekvence, definisan je programom "align" koje je Needleman-Wunsch-ovo poravnanje (tj. globalno poravnanje). Program je korišćen za poravnanje polipeptida, kao i nukleotidnih sekvenci. Podrazumevana matrica bodovanja BLOSUM50 je korišena za polipeptidna poravnanje, i podrazumeva matrica identiteta je korišćena za nukleotidna poravnanja, kazna za prvi “gap” ostatak je -12 za polipeptide i -16 za nukleotide. Kazne za ostale “gap” ostatke su -2 za polipeptide, i -4 za nukleotide.
[0048] "Poravnanje" je deo FASTA paketa verzije v20u6 (videti W. R. Pearson i D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448, i W. R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparaison saFASTP and FASTA", Methods in Enzymology 183:63-98). FASTA poravnanja proteina koriste Smith-Waterman-ov algoritam bez ograničenja za “gap” veličinu (videti "Smith-Waterman algorithm", T. F. Smith and M. S. Waterman (1981) J. Mol. Biolo.147:195-197).
[0049] Kao što se ovde koristi, termin "efektorska ćelija" odnosi se na imunsku ćeliju koja je uključena u efektorsku fazu imunog odgovora, za razliku od faza prepoznavanja i aktivacije imunog odgovora. Primeri imunskih ćelija uključuju ćeliju mijeloidnog ili limfoidnog porekla, na primer limfocite (kao što su B ćelije i T ćelije uključujući citolitičke T ćelije (CTLs)), ćelije ubice, prirodne ćelije ubice, makrofage, monocite, eozinofile, polimorfonuklearne ćelije, kao što su neutrofili, granulociti, mast ćelije, i bazofili. Neke efektorske ćelije eksprimiraju Fc receptore (FcRs) ili receptore komplementa i izvode specifične imunske funkcije. U nekim izvođenjima, efektorska ćelija kao što je, npr., prirodna ćelija ubice, je sposobna da indukuje ADCC. Na primer, monociti, makrofagi, neutrofili, dendritične ćelije i Kupferove ćelije koje eksprimiraju FcRs, su uključene u specifično ubijanje ciljnih ćelija i prezentovanje antigena drugim komponentama imunog sistema, ili vezivanje za ćelije koje prezentuju antigene. U nekim izvođenjima ADCC može dalje biti pojačana sa aktivacijom klasičnog puta komplementa vođenog antitelom što dovodi do deponovanja aktiviranih fragmenata C3 na ciljnoj ćeliji. Proizvodi cepanja C3 su ligandi za receptore komplementa (CRs), kao što je CR3, koji je eksprimiran na mijeloidnim ćelijama. Prepoznavanje fragmenata komplementa sa CRs na efektorskim ćelijama može promovisati pojačani Fc receptorom-posredovani ADCC. U nekim izvođenjima aktivacija klasičnog puta komplementa vođena antitelom dovodi do fragmenata C3 na ciljnoj ćeliji. Ovi proizvodi cepanja C3 mogu promovisati ćelijsku citotoksičnost usmerenu komplementom (CDCC). U nekim izvođenjima, efektorska ćelija može fagocitovati ciljni antigen, ciljnu česticu ili ciljnu ćeliju. Ekspresija određenog FcR ili receptora komplementa na efektorskoj ćeliji može se regulisati humoralnim faktorima kao što su citokini. Na primer, pronađeno je da je ekspresija FcyRI pojačano regulisana sa interferonom γ (IFN γ) i/ili G-CSF. Ova pojačana ekspresija pojačava citotokičnu aktivnost ćelija koje nose FcyRI protiv ciljnih meta. Efektorska ćelija može fagocitovati ciljni antigen ili fagocitovati ili lizirati ciljnu ćeliju. U nekim izvođenjima aktivacija klasičnog puta komplementa vođena antitelom dovodi do C3 fragmenata na ciljnoj ćeliji. Ovi proizvodi cepanja C3 mogu promovisati direktnu fagocitozu od strane efektorskih ćelija ili indirektno pojačavanjem preko fagocitoze koja je posredovana antitelom.
[0050] Termin "vektor," kao što se ovde koristi, namenjen je da se odnosi na molekul nukleinske kiseline koji je sposoban da indukuje transkripciju segmenta nukleinske kiseline koji je spojen sa vektorom. Jedna vrsta vektora je "plazmid", koji ima oblik kružne dvolančane petlje DNK. Druga vrsta vektora je virusni vektor, u kome segment nukleinske kiseline može biti spojen u virusnom genomu. Određeni vektori su sposobni za autonomnu replikaciju u ćeliji domaćinu u kojoj su uvedeni (na primer bakterijski vektori koji imaju bakterijski početak replikacije i epizomalni sisarski vektori). Drugi vektori (kao što su ne-epizomalni sisarski vektori) mogu se integrisati u genom ćelije domaćina nakon uvođenja u ćeliju domaćina, i prema tome se umnožavaju zajedno sa genomom domaćina. Osim toga, određeni vektori su sposobni da usmere ekspresiju gena sa kojima su operativno vezani. Takvi vektori su ovde naznačeni sa "rekombinantni ekspresioni vektori" (ili jednostavnije, "ekspresioni vektori"). Generalno, ekspresioni vektori koji se koriste u postupcima rekombinantne DNK često su u obliku plazmida. U predmetnoj specifikaciji, "plazmid" i "vektor" mogu se koristiti naizmenično kao što je plazmid najviše uobičajeni oblik vektora. Međutim, predmetni prikaz je namenjen da uključi takve druge oblike ekspresionih vektora, kao što su virusni vektori (kao što su retrovirusi sa defektom replikacije, adenovirusi i adeno-povezani virusi), koji služe ekvivalentim funkcijama.
[0051] Termin "rekombinantna ćelija domaćina" (ili jednostavno "ćelija domaćina"), kao što se ovde koristi, je namenjena da se odnosi na ćeliju u koju je uveden ekspresioni vektor. Treba razumeti da su takvi termini namenjeni da se odnose ne samo na određeni subjekt ćelije, ali takođe na potomstvo takve ćelije. Zbog toga što određene mutacije mogu da se pojave u narednim generacijama ili zbog
1
mutacije ili uticaja iz okruženja, kao što je potomstvo ne moraju, u suštini, biti identične sa matičnom ćelijom, ali su i dalje uključene obimom termina "ćelija domaćina" kao što se ovde koristi. Rekombinantne ćelije domaćina uključuju, na primer, transfektome, kao što su CHO ćelije, HEK-293 ćelije, PER.C6, NS0 ćelije, i limfocitne ćelije, i prokariotske ćelije kao što su E. coli i drugi eukariotski domaćini kao što su biljne ćelije i gljive.
[0052] Termin "transfektom", kao što se ovde koristi, uključuje rekombinantne eukariotske ćelije domaćina koje eksprimiraju At ili ciljni antigen, kao što su CHO ćelije, PER.C6, NS0 ćelije, HEK-293 ćelije, biljne ćelije, ili gljive, uključujući ćelije kvasca.
[0053] Termin "priprema" odnosi se na dobijanje varijanti antitela i mešavina različitih varijanti antitela koja imaju povećanu sposobnost da obrazuju oligomere kada interaguju sa antigenom koji je povezan sa ćelijom (npr., antigen koji je eksprimiran na površini ćelije), ćelijskoj membrani, virionu ili drugoj strukturi, tako omogućujući povećano vezivanje C1q, aktivaciju komplementa, CDC, ADCC, ADCP, drugu funkciju koja je posredovana sa Fc, internalizaciju, smanjenu regulaciju, apoptozu, unos konjugata antitelo-lek (ADC), aviditet ili bilo koju njihovu kombinaciju. Primeri testova su obezbeđeni u Primerima za, npr., aviditet vezivanja C1q (Primer 4), CDC (Primeri 5, 6 and 10, 16, 19, 22, 23, 24, 25); ADCC (Primer 12) i in vivo efikasnost (Primer 20, 21). Varijante prema ovde navedenim aspektima označene su kao "pojedinačni-mutant", "dvostruki-mutant", i "mešoviti-mutanat", opisani su detaljnije u tekstu ispod, zajedno sa primerima postupaka za njihovo dobijanje i postupaka za upotrebu.
[0054] Kao što se ovde koristi, termin "afinitet" je jačina vezivanja jednog molekula, npr. antitela, za drugo, npr. ciljni antigen, na jednom mestu, kao što je monovalentno vezivanje zasebnog mesta vezivanja antigena u antitelu za antigen.
[0055] Kao što se ovde koristi, termin "aviditet" odnosi se na kombinovanu jačinu višestrukog mesta vezivanja između dve strukture, kao što je između višestrukih mesta vezivanja antigena antitela koji istovremeno interaguju sa metom ili npr. između antitela i C1q. Kada je prisutno više od jedne interakcije vezivanja, dve structure će se razdvojiti samo kada se sva mesta vezivanja razdvoje, i prema tome, brzina razdvajanja će biti sporija u odnosu na zasebna mesta vezivanja, čime se obezbeđuje veća efektivna ukupna jačina vezivanja (aviditet) u poređenju sa jačinom vezivanja zasebnih mesta vezivanja (afinitet).
[0056] Kao što se ovde koristi, termin "oligomer" odnosi se molekul koji se sastoji iz više od jednog ali na ograničen broj jedinica monomera (npr. antitela) suprotno sa polimerom koji, bar u principu, sastoji se iz neograničenog broja monomera. Primeri oligomera su dimeri, trimeri, tetrameri, pentameri i heksameri. Grčki prefiksi se često koriste da bi se označio broj jedinica monomera u oligomeru, na primer tetramer koji se sastoji iz četiri jedinice i heksamer koji se sastoji iz šest jedinica.
[0057] Termin "oligomerizacija", kao što se ovde koristi, namenjen je da se odnosi na postupak koji pretvara monomere u konačni stepen polimerizacije. Ovde, je uočeno, da se oligomerizacija Fcdomena dešava nakon ciljnog vezivanja sa polipeptidima koji sadrže Fc-domen, kao što su antitela, poželjno ali ne ograničeno na ćelijskoj površini. Oligomerizacija antitela može se na primer, proceniti korišćenjem testa vezivanja C1q na površini ćelije (kao što je opisano u primerima 4 i 9), test efikasnosti C1q (kao što je opisano u primeru 5) i citotoksičnost koja zavisi od komplementa koja je opisana u Primeru 6, 10 i 19).
[0058] Termin "vezivanje C1q", kao što se ovde koristi, je namenjen da se odnosi na vezivanje C1q u kontekstu vezivanja C1q za antitelo koje je vezano za svoj antigen. Antitelo koje je vezano za svoj antigen treba razumeti da se događa i in vivo i in vitro u ovde opisanom kontekstu. Vezivanje C1q se može proceniti na primer korišćenjem imobilizovanog antitela na veštačkoj površini (npr. plastici na pločama za ELISA, kao što je opisano u primeru 3) ili korišćenjem vezivanja za prethodno određeni antigen na ćelijskoj ili površini viriona (kao što je opisano u primerima 4 i 9). Vezivanje C1q za oligomer antitela treba ovde razumeti kao multivalentnu interakciju kojom se dobija visokoafinitetno vezivanje.
[0059] Kao što se ovde koristi, termin "aktivacija komplementa" odnosi se na aktivaciju klasičnog puta komplementa, koji je pokrenut vezivanjem komponente komplementa C1q za antitelo koje je vezano sa njegovim antigenom. C1q je prvi protein u ranim događajima klasične kaskade komplementa koja uključuje niz reakcija cepanja koja za rezultat imaju obrazovanje enzimske aktivnosti poznate pod imenom C3 konvertaza, koja cepa C3 komponentu komplementa u C3b i C3a. C3b kovalentno veže C5 na membrane da bi se obrazovao C5b koji sa druge strane pokreće kasnije događaje aktivacije komplementa u kojoj krajnje komponente komplementa C5b, C6, C7, C8 i C9 se sklapaju u kompleks kojim se vrši napad na membranu (MAC). Kaskada aktivacije komplementa dovodi do nastajanja pora kojim se uzrokuje ćelijska liza, takođe poznata kao CDC. Aktivacija komplementa se može proceniti preko efikasnosti C1q (kao što je opisano u primeru 5), CDC kinetike (kao što je opisano u primerima 28, 29, i 30), CDC testovi (kao što je opisano u primerima 6, 10, 19, 25, 27, i 33) ili pomoću postupka ćelijskog deponovanja C3b i C4b opisanom u Beurskens et al April 1, 2012vol.188 br.73532-3541.
[0060] Termin "citotoksičnost koja zavisi od komplementa" ("CDC"), kao što se ovde koristi, namenjen je da se odnosi na postupak akivacije komplementa koji je posredovan antitelom koji dovodi do lize antitela vezanog za njegovu metu na ćeliji ili virionu kao rezultat nastajanja pora u membrani koje su kreirane sklapanjem MAC kompleksa. CDC se može proceniti in vitro testom kao što je CDC testom u kome je korišćen normalni humani serum kao izvor komplementa, kao što je opisano u primeru 6, 10, 19, 25, 27, i 33 ili u testu efikasnosti C1q, kao što je opisano u primeru 5, u kome je normalni humani serum ograničen na C1q.
[0061] Termin "ćelijski posredovana citotoksičnost koja zavisi od antitela" ("ADCC") kao što se ovde koristi, je namenjen da se odnosi na mehanizam ubijanja ciljnih ćelija obloženih antitelom ili viriona sa ćelijama koje eksprimiraju Fc receptore koji prepoznaju konstantni region vezanog antitela. ADCC se može odrediti korišćenjem postupaka kao što su, npr., ADCC test koji je opisan u primeru 12.
[0062] Termin "ćelijska fagocitoza koja zavisi od antitela" ("ADCP") kao što se ovde koristi je namenjen da se odnosi na mehanizam uklanjanja ciljnih ćelija koje su obložene antitelom ili viriona sa internalizacijom pomoću fagocita. Internalizovane ciljne ćelije koje su obložene antitelom ili virioni se nalaze u vezikuli koja se naziva fagozom, koja se zatim spaja sa jednim ili više lizozoma da bi se obrazovao fagoliozom. ADCP se može proceniti korišćenjem in vitro testa citotoksičnosti sa makrofagima kao efektorskim ćelijama i video mikroskopski kao što je opisano u van Bij et al. in Journal of Hepatology Volume 53, Issue 4, October 2010, stranice 677-685. Ili kao što je opisano u primeru 14 za npr. S. aureus fagocitozu od PMN.
[0063] Termin "ćelijska citotoksičnost koja zavisi od antitela" ("CDCC") kao što se ovde koristi je namenjena da se odnosi na mehanizam ubijanja ciljnih ćelija ili viriona od strane ćelija koje eksprimiraju receptore komplementa koji prepoznaju proizvode cepanja komplementa 3 (C3) koji su kovalentno vezani za ciljne ćelije ili virione kao rezultat aktivacije komplementa koja je posredovana sa antitelom. CDCC se može proceniti na sličan način kao što je opisano za ADCC.
[0064] Termin "smanjena regulacija", kao što se ovde koristi, namenjen je da se odnosi na proces kojim se smanjuje broj molekula, kao što su antigeni ili receptori, na ćelijskoj površini, npr. vezivanjem antitela za receptor.
[0065] Termin "internalizacija", kao što se ovde koristi, namenjen je da se odnosi na bilo koji mehanizam pomoću koga antitelo ili polipeptid koji sadrži Fc je internalizovan u ciljnu eksprimirajuću
1
ćeliju sa ćelijske površine i/ili iz medijuma u okruženju, npr., preko endocitoze. Internalizacija antitela se može proceniti korišćenjem direktnog merenja u testu količine internalizovanog antitela (kao što je, npr., test kolokalizacije lizozoma koji je opisan u Primeru 26).
[0066] Termin "konjugat antitelo-lek", kao što se ovde koristi odnosi se na antitelo ili polipeptid koji sadrži Fc koji ima specifičnost za najmanje jednu vrstu maligne ćelije, lek, i linker koji spaja lek sa npr. antitelom. Linker se može cepati ili nije moguće cepati u prisustvu maligne ćelije; pri čemu konjugat antitela sa lekom ubija malignu ćeliju.
[0067] Termin "unos konjugata antitelo-lek", kao što se ovde koristi odnosi se na postupak u kome su konjugati antitelo-lek vezani za metu na ćeliji nakon čega sledi unos/gutanje od strane ćelijske membrane i time se unosi u ćeliju. Unos konjugata antitelo-lek može se proceniti kao "internalizacija koja je posredovana antitelom i ćelijsko ubijanje sa anti-TF ADC u in vitro testu ubijanja" kao što je opisano u WO 2011/157741.
[0068] Termin "apoptoza", kao što se ovde koristi odnosi se na proces programirane ćelijske smrti (PCD) koji se može desiti u ćeliji. Biohemijski događaji dovode do karakterističnih promena u ćeliji (morfologija) i smrti. Ove promene uključuju nastajanje mehura, skupljanje ćelija, nukleusna fragmentacija, kondenzovanje hromatina, i degradacija hromozomalne DNK. Vezivanje antitela za određeni receptor može indukovati apoptozu.
[0069] Vezivanje za Fc-receptor se može izmeriti indirektno kao što je opisano u Primeru 12.
[0070] Termin "FcRn", kao što se ovde koristi je namenjen da se odnosi na neonatalni Fc receptor koji je Fc receptor. Prvo je otkriven kod glodara kao jedinistveni receptor koji je sposoban za transport IgG iz majčinog mleka kroz epitel creva novorođenih glodara u krvotok novorođenča. Ostale studije su pokazale da postoji sličan receptor kod ljudi. Kod ljudi, međutim, pronađeno je da placenta olakšava transport majčinih IgG u fetus koji se razvija i takođe je pokazno da igraju ulogu u praćenju prometa (eng. turmover) IgG. FcRn veže IgG na kiseloj pH od 6.0-6.5 ali ne na neutralnoj ili većoj pH. Prema tome, FcRn može vezati IgG iz lumena creva (unutrašnjost creva) na blago kiseloj pH i osigurati efikasni jednosmerni transport prema bazolateralnoj strani (unutrašnjost tela) gde pH je neutralna do bazna (pH 7.0-7.5). Ovaj receptor takođe ima ulogu u spasavanju IgG kod adulta kroz njegovo pojavljivanje u putu endocitoze u endotelnim ćelijama. FcRn receptori u kiselim endozomima vežu se za IgG koji je internalizovan kroz pinocitozu, reciklirajući ga ne ćelijsku površinu, oslobađajući na baznoj pH krvi, time sprečavajući da podlegne lizozomalnoj degradaciji. Ovaj mehanizam može obezbediti objašnjenje za veći polu-život IgG u krvi u poređenju sa drugim izotipovima. Primer 13 opisuje test koji pokazuje vezivanje IgG sa FcRn na pH 6.0 u ELISA.
[0071] Termin "Protein A", kao što je ovde korišćen namenjen je da se donosu na 56 kDa MSCRAMM površinski protein koji se originalno nalazi u ćelijskom zidu bakterije Staphylococcus aureus. Kodiran je sa spa genom i njegova regulacija je kontrolosana sa topologijom DNK, ćelijskim osmolaritetom, i sistemom iz dve komponente koji se naziva ArlS-ArlR. Pronašao je upotrebu u biohemijskom ispitivanju zbog njegove sposobnosti da se veže za imunoglobuline. Sastoji se iz pet homolognih Ig-vezujućih domena koji su savijeni u snop sa tri heliksa. Svaki domen je sposoban da veže proteine iz raznih sisarskih vrsta, pre svega IgGs. Veže teško lanac Fc regiona većine imunoglobulina (koji se preklapaju na konzervisanom mestu vezivanja FcRn receptora) i takođe interaguju sa Fab regionom familije humanih VH3. Preko ovih interakcija u serumu, IgG molekuli vežu bakteriju preko njihovog Fc regiona umesto samo preko njihovih Fab regiona, pomoću kojih bakterija narušava opsonizaciju, aktivaciju komplemetna i fagocitozu.
1
[0072] Termin "Protein G", kao što se ovde koristi je namenjen da se odnosi na imunoglobulin-vezujući protein koji je eksprimiran u grupi C i G Streptococcal bacteria slično kao Protein A ali sa različitim specifičnostima. To je 65-kDa (G148 protein G) i 58 kDa (C40 protein G) protein ćelijske površine koji je našao primenu u antitelima za prečišćavanje preko njegovog vezivanja za Fc region.
[0073] Termin "CH2 region" ili "CH2 domen" kao što se ovde koristi namenjen je da se odnosi na CH2 region imunoglobulina. Prema tome na primer CH2 region humanog IgG1 antitela odgovara aminokiselinama 228-340 prema EU sistemu numerisanja.
[0074] Termin "CH3 region" ili "CH3 domein" kao što se ovde koristi namenjen je da se odnosi na CH3 region imunoglobulina. Prema tome na primer CH3 region humanog IgG1 antitela odgovara aminokiselinama 341-447 prema EU sistemu numerisanja.
[0075] Termin "alosterne mutacije", kao što je ovde korišćen, namenjen je da se odnosi na modifikacije, npr insercije, supstitucije i delecije, aminokiselina P247, i E430, u Fc-domenu koji sadrži polipeptide, kao što je numerisano sa EU indeksom kako je predstavljeno po Kabat-u.
[0076] Termin "mutacije hidrofobnih čvorića (eng. knob) ", kao što je ovde korišćen, namenjen je da se odnosi na modifikacije, npr insercije, supstitucije i delecije, aminokiselina 1253, i S254, i Q311, u polipeptidima koji sadrže Fc-domen, kao što je numerisano sa EU indeksom kako je predstavljeno po Kabat-u. Hidrofobni čvorići su opisani od strane Delano WL, et al., Science 287, (2000), stranice 1279-1283, npr. na stranici 1281.
[0077] Termin "mutacije N-terminalne CH3 zavojnice", kao što je ovde korišćen, namenjen je da se odnosi na modifikacije, npr insercije, supstitucije i delecije, aminokiselina R355, i D356, i E356, i E357, i M358, i L358, i T359, specifičnije D356, i E356, i T359, u polipeptidima koji sadrže Fc-domen, kao što je numerisano sa EU indeksom kako je predstavljeno po Kabat-u.
[0078] Termin "mutacije C-terminalnog CH3 beta lanca", kao što je ovde korišćen, namenjen je da se odnosi na modifikacije, npr insercije, supstitucije i delecije, aminokiselina Y436, i T437, i Q438, i K439, i S440, i L441, specifičnije Y436, i K439, i S440, u polipeptidima koji sadrže Fc-domen, kao što je numerisano sa EU indeksom kako je predstavljeno po Kabat-u.
Metode uticaja na efektorsku funkciju antitela
[0079] Treba razumeti da sva ovde opisana izvođenja sa pozivanjem na matično antitelo, prvo matično antitelo i drugo matično antitelo takođe treba razumeti kao izvođenja koja se odnose na matični, prvi matični ili drugi matični polipeptid koji se sastoji iz Fc-domena imunoglobulina i regiona za vezivanje.
[0080] Predmetni prikaz se takođe odnosi na postupak za povećanje efektorske funkcije matičnog polipeptida koji sadrži Fc-domen imunoglobulina i regiona vezivanja, gde postupak obuhvata indukovanje mutacije u matičnom polipeptidu u bar jednom aminokiselinskom ostatku koji je odabran iz onih koji odgovaraju E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436, i K447 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 je S440Y ili S440W.
[0081] U jednom izvođenju matični polipeptid može biti antitelo.
[0082] Prema tome, predmetni prikaz se takođe odnosi na postupak za povećanje efektorske funkcije matičnog antitela, koji obuhvata uvođenje mutacije u matično antitelo u bar jednom aminokiselinskom ostatku koji je izabran od onih koji odgovaraju E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436, i K447 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 je S440Y ili S440W.
1
[0083] Referenca na "D/E356" odnosi se u predmetnom kontekstu na alotipske varijante u sekvenci humanog IgG1. IgGlm(za) alotip humanog IgG1 položaj aminokiseline 356 je D, dok u IgG1m(f) alotipu humanog IgG1 aminokiselina u položaju 356 je E.
[0084] Uvođenje mutacije u matično antitelo prema postupku ili upotrebi iz predmetnog prikaza rezultuje u varijanti ili varijanti antitela. Prema tome postuopak(ci) iz predmetnog prikaza mogu se sprovesti tako da se dobije bilo koja varijanta ili varijanta antitela koje je ovde opisano.
[0085] Varijanta antitela koja je dobijena iz postupka ili upotrebe predmetnog prikaza ima povećanu efektorsku funkciju u poređenju sa matičnim antitelom. Obično, efekat antitela na efektorsku funkciju može se odrediti sa vrednosti EC50, koja je koncentracija antitela koje je neophodno da se dobije polovina vrednosti maksimalne lize.
[0086] Maksimalna liza je liza koja je dobijena kada je korišćena zasićena količina antitela, u kojoj je zasićenje namenjeno da se odnosi na količinu antitela u kojoj sus vi antigeni za antitelo vezani sa antitelom.
[0087] Termin "povećanje efektorske funkcije" ili "unapređenje efektorske funkcije" odnosi se u kontekstu predmetnog prikaza da je prisutno smanjenje u EC50 vrednosti varijante antitela u poređenju sa matičnim antitelom. Smanjenje u EC50 vrednosti može npr. biti bar ili oko 2-puta, kao što je bar ili oko 3-puta, ili bar ili oko oko 5puta, ili bar ili oko oko 10-puta. Alternativno, "povećanje efektorske funkcije" ili "unapređenje efektorske funkcije" znači da je pristutno povećanje u maksimalnoj količini liziranih ćelija (gde je ukupna količina ćelija postavljena na 100%) sa npr. od 10% do 100% svih ćelija, kao što je za oko 10%, oko 20%, oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 90%, i oko 100% pod uslovima u kojima matično antitelo lizira manje od 100% svih ćelija.
[0088] Varijanta se može ispitati za povećanu ili unapređenu efektorsku funkciju kloniranjem varijabilnog domena teškog lanca IgG1-005 ili IgG1-7D8 u varijantu i ispitivanjem njegove efikasnosti u CDC testovima, kao što je opisano za Daudi (Primer 6) i Wien (Primer 10). Korišćenjem varijabilnog domena IgG1-7D8 HC i Daudi ćelija, povećanje bi bilo definisano za više od 2 puta nižu EC50 u odnosu na EC50 IgG1-7D8 pod ispitivanim uslovima, kao što je oko 2-puta, oko 3-puta, oko 5-puta, oko 10-puta ili više od 10-puta nižu EC50 vrednost, koncentracije na kojoj je uočena polovina maksimalne lize. Korišćenjem varijabilnog domena IgG1-005 HC i Daudi ćelija, povećanje će biti definisano za više od 2 puta nižu EC50 od EC50 IgG1-005 pod ispitivanim uslovima, kao što je oko 2-puta, oko 3-puta, oko 5-puta, oko 10-puta ili više od 10-puta nižu EC50 vrednost, koncentracija na kojoj je polovina maksimalne lize uočena. Korišćenjem IgG1-7D8 HC varijabilnog domena i Wien133 ćelija, povećanje će biti definisano sa više od 2 puta nižom EC50 od EC50 IgG1-7D8 pod ispitivanim uslovima, kao što je oko 2-puta, oko 3-puta, oko 5-puta, oko 10-puta ili više od 10-puta niža EC50 vrednost, koncentracija na kojoj je polovina maksimalne lize uočena. Korišćenjem IgG1-005 HC varijabilnog domena i Wien133 ćelija, povećanje bi bilo definisano sa povećanjem u maksimalnoj lizi u opsegu od 10% do 100% svih ćelija, kao što je za oko 10%, oko 20%, oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 90%, i oko 100%. Povećanje u efikasnosti CDC takođe bi bilo definisano za više od 2-puta nižom EC50 od EC50 IgG1-005 pod ispitivanim uslovima, kao što je oko 2-puta, oko 3-puta, oko 5-puta, oko 10-puta ili više od 10-puta nižom EC50 vrednosti, koncentracija na kojoj je uočena polovina maksimalne lize pod uslovima u kojima se detektuje liza Wien133 ćelija.
[0089] Prikaz se takođe odnosi na mutacije u ovim specifičnim položajima koji imaju unapređeni efekat na efektorske funkcije varijantnog antitela, koje je dobijeno iz uvođenja mutacije u matično antitelo prema postupku iz predmetnog prikaza (npr. kao što je prikazano u Primeru 19). Bez vezivanja za teoriju, veruje se da je supstitucijom bar jedne aminokiselie iz gore pomenute grupe položaja stimulisana oligomerizacija. Antitela vezuju sa većim aviditetom (predstavljeno primerom 2; direktno
1
obeležavanje IgG-7D8-E345R rezultovalo je u povećanom vezivanju za Daudi ćelije u poređenju sa IgG-7D8-WT) što dovodi do toga da se antitela vežu u dužem periodu za ćelije i stoga su omogućene različite efektorske funkcije, npr. povećano C1q vezivanje, C1q efikasnost CDC, ADCC, internalizacija, ADCP, i/ili in vivo efikasnost. Ovi efekti su predstavljeni primerom 4 (C1q vezivanje na ćelijama), primer 5 (C1q efikasnost u CDC testu), primer 6, 7, 27, 28 i 29 (CDC testu), primer 12 (ADCC), primer 26 (internalizacija) i primer 21 i 22 (in vivo efikasnost).
[0090] Prema tome mutacija aminokiselinskog ostatka koji je izabran iz onih koji odgovaraju E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436, u K447 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1 može takođe biti označena kao "pojedinačni mutant" aspekt ili "mutacije koje pojačavaju efektorsku funkciju" u kontekstu predmetnog prikaza.
[0091] U drugom aspektu, predmetni prikaz takođe obezbeđuje upotrebu jedne ili više mutacija u Tabeli 1, kao što je mutacija u aminokiselinskom ostatku koja je izabrana iz onih koje odgovaraju E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436, i K447 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, da bi se povećala efektorska funkcija, npr. jedan ili više od (i) C1q-vezivanja, (ii) aktivacije komplementa, (iii) CDC, (iv) obrazovanja oligomera, (v) stabilnosti oligomera, (vi) citotoksičnosti posredovane ćelijama koja zavisi od antitela (ADCC), (vii) FcRn-vezivanja, (viii) vezivanja Fc-gama receptora, (ix) Protein A-vezivanja, (x) Protein G-vezivanja, (xi) ćelijske fagocitoze koja zavisi od antitela (ADCP), (xii) ćelijske citotoksičnosti koja zavisi od antitela (CDCC), (xiii) citotoksičnosti koja je pojačana komplementom, (xiv) vezivanje za receptor komplementa opsonizovanog antitela posredovano sa antitelom, (xv) internalizacija, (xvi) smanjena modulacija, (xvii) indukcija apoptoze, (xviii) opsonizacija u (xix) kombinovanje bilo kod od (i) do (xviii), antitelo kada je vezano za njegov antigen na ćeliji, ćelijskoj membrani, na virionu, ili na drugoj čestici. U jednom izvođenju pod (iv) ili (v), oligomer je heksamer. U jednom izvođenju, bar jedna druga efektorska funkcija antitela, kao što je C1q-vezivanje, aktivacija komplementa, citotoksičnost koja zavisi od komplementa (CDC), citotoksičnost koja je posredovana ćelijama koja zavisi od antitela (ADCC), FcRn-vezivanje, vezivanje Fc-gama receptora, Protein A-vezivanja, Protein G-vezivanja, ADCP, ćelijska citotoksičnost koja zavisi od komplementa (CD-CC), citotoksičnost koja je pojačana komplementom, vezivanje za receptor komplementa opsonizovanog antitela posredovano sa antitelom, fagocitoza posredovana sa antitelom (ADCP), internalizacije, apoptoza, i/ili vezivanje za receptor komplementa opsonizovanog antitela je takođe ili alternativno povećano, kao što je u posebnom FcRn vezivanju, ADCC, vezivanje Fc gama receptora, Protein A vezivanje, Protein G vezivanje, ADCP, CDCC, citotoksičnost koja je pojačana komplementom, opsonizacija i bilo koje njihove kombinacije.
[0092] U jednom izvođenju, efektorska funkcija matičnog antitela je povećana kada je matično antitelo vezano sa njegovim antigenom na ćeliji koja eksprimira antigen, na ćelijskoj membani, ili na virionu.
[0093] Predmetni prikaz se takođe odnosi na uvođenje mutacije u matično antitelo u aminokiselinskom ostatku koji odgovara ili K439 ili S440 u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1 koja smanjuje efektorsku funkciju matičnog antitela (primeri 5, 6 i 10).
[0094] U drugom aspektu predmetni prikaz se odnosi na postupak za smanjenje efektorske funkcije matičnog polipeptida koji sadrži Fc-domen imunoglobulina i region vezivanja, gde postupak obuhvata uvođenje mutacije u matični polipeptid u jednom aminokiselinskom ostatku koji je izabran iz onih koji odgovaraju K439 i S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 nije S440Y ili S440W, kao što gde mutacija u položaju koji odgovara K439 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1 je K439D/E, i/ili mutacija u položaju koji odgovara S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1 je S440K/H/R.
[0095] U jednom izvođenju matični polipeptid može biti antitelo.
1
[0096] Stoga u drugom aspektu, predmetni prikaz se odnosi takođe na postupak za smanjenje efektorske funkcije matičnog antitela koji obuhvata uvođenje mutacije u matično antitelo u jednom aminokiselinskom ostatku koji je izabran iz onih koji odgovaraju K439 i S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 nije S440Y ili S440W, kao što gde mutacija u položaju koji odgovara K439 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1 je K439D/E, i/ili mutacija u položaju koji odgovara S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1 je S440K/H/R.
[0097] Kao što je prikazano u Primeru 6, aminokiselinska supstitucija u položaju K439E ili S440K kao "pojedinačni mutanti" smanjena CDC u poređenju sa bilo kojom od prvih mutacija prema postupku iz predmetnog prikaza.
[0098] Varijanta antitela koje je dobijeno iz pomenutog postupka smanjenja efektorske funkcije ima smanjenu efektorsku funkciju u poređenju sa matičnim antitelom. Obično, efekat antitela na efektorsku funkciju može se izmeriti pomoću EC50 vrednosti, koja je koncentracija antitela koja je neophodna da bi se dobila polovina vrednosti maksimalne lize.
[0099] Maksimalna liza je liza koja je dobijena kada je korišćena zasićena količina antitela, u kojoj je zasićenje namenjeno da se odnosi na količinu antitela u kojoj su svi antigeni za antitelo vezani sa antitelom.
[0100] Termin "smanjenje efektorske funkcije" odnosi se u kontekstu predmetnog prikaza da postoji povećanje u vrednosti EC50 varijante antitela u poređenju sa matičnim antitelom. Povećanje u EC50 vrednosti može npr. biti bar oko 2-puta, kao što je bar ili oko 3-puta, ili bar ili oko 5-puta, ili bar ili oko 10-puta. Alternativno, "smanjenje efektorske funkcije" znači da postoji smanjenje u maksimalnoj količini liziranih ćelija za npr. od 10% do 100% svih ćelija, kao što je oko 10%, oko 20%, oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 90%, i oko 100% pod uslovima u kojima matično antitelo lizira manje od 100% svih ćelija.
[0101] Varijanta se može ispitati za smanjenu efektorsku funkciju kloniranjem varijabilnog domena IgG1-005 ili IgG1-7D8 teškog lanca u varijantu i ispitivanjem njegove efikasnosti u CDC testovima, kao što je opisano za Daudi (Primer 6) i Wien (Primer 10). Korišćenjem IgG1-7D8 HC varijabilnog domena i Daudi ćelija, povećanje bi se moglo definisati za više od 2 puta niže EC50 u odnosu na EC50 IgG1-7D8 pod ispitivanim uslovom, kao što je oko 2-puta, oko 3-puta, oko 5-puta, oko 10-puta ili više od 10-puta niža EC50 vrednost, koncentracija na kojoj je uočena polovina maksimalne lize. Korišćenjem IgG1-005 HC varijabilnog domena i Daudi ćelija, povećanje bi se moglo definisati za više od 2 puta niža EC50 od EC50 IgG1-005 pod ispitivanim uslovom, kao što je oko 2-puta, oko 3-puta, oko 5-puta, oko 10-puta ili više od 10-puta niža EC50 vrednost, koncentracija na kojoj je uočena polovina maksimalne lize. Korišćenjem IgG1-7D8 HC varijabilnog domena i Wien133 ćelija, smanjenje bi se moglo definisati za više od 2 puta niža EC50 u odnosu na EC50 IgG1-7D8 pod ispitivanim uslovom, kao što je oko 2-puta, oko 3-puta, oko 5-puta, oko 10-puta ili više od 10-puta niža EC50 vrednost, koncentracija na kojoj je uočena polovina maksimalne lize. Korišćenjem IgG1-005 HC varijabilnog domena i Wien133 ćelija, smanjenje bi se moglo definisati kao smanjenje u maksimalnoj lizi u opsegu od 10% do 100% svih ćelija, kao što je oko 10%, oko 20%, oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 90%, i oko 100%. Smanjenje u efikasnosti CDC takođe bi se moglo definisati sa više od 2-puta niža EC50 od EC50 IgG1-005 pod ispitivanim uslovom, kao što je oko 2-puta, oko 3-puta, oko 5-puta, oko 10-puta ili više od 10-puta niža EC50 vrednost, koncentracija na kojoj je uočena polovina maksimalne lize pod uslovima gde se može detektovati liza Wien133 ćelija.
[0102] U jednom izvođenju, efektorska funkcija je smanjena, pri čemu je matično antitelo vezano za njegov antigen na ćeliji koja eksprimira antigen, na ćelijskoj membrani, ili na virionu.
2
[0103] Prema tome u drugom aspektu, prikaz se odnosi na upotrebi bar druge mutacije u varijanti antitela koja sadrži mutaciju u jednom aminokiselinskom ostatku koji je izabran iz onih koji odgovaraju K439 i S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 nije S440Y ili S440W, da bi se obnovila efektorska funkcija varijante antitela kada se veže za njegov antigen na ćeliji koja eksprimira antigen, na ćelijskoj membrani, ili na virionu, gde
prva mutacija je u aminokiselinskom ostatku koji odgovara K439 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1 i druga mutacija je u aminokiselinskom ostatku koji odgovara S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, ili
prva mutacija je u aminokiselinskom ostatku koji odgovara S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1 i druga mutacija je u aminokiselinskom ostatku koji odgovara K439 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1.
[0104] U jednom izvođenju, matično antitelo je monospecifično, bispecifično, ili multispecifično antitelo.
[0105] Ukoliko je matično antitelo monospecifično antitelo koje se sastoji iz dva CH2-CH3 regiona, mutacija prema predmetnom prikazu može u principu da se nalazi samo u jednom od CH2-CH3 regiona, iako u najpraktičniju svrhu mutacija kojom se povećava ili smanjuje efektorska funkcija prema predmetnom prikazu se nalazi na oba CH2-CH3 regiona.
[0106] Ukoliko je matično antitelo bispecifično antitelo koje sadrži dva CH2-CH3 regiona, mutacija prema predmetnom prikazu može u principu da se nalazi samo u jednom od CH2-CH3 regiona; tj. u prvom ili u drugom CH2CH3 regionu, iako u najpraktičniju svrhu mutacija kojom se povećava ili smanjuje efektorska funkcija prema predmetnom prikazu se nalazi u oba, prvom i drugom CH2-CH3 regionu bispecifičnog antitela.
[0107] Pogodni primeri monospecifičnog, bispecifičnog, ili multispecifičnih antitela uključuju bilo koju od onih koji su ovde opisani.
[0108] U posebnom izvođenju matično ili prvo i/ili drugo antitelo može biti bispecifično antitelo kao što je heterodimerni protein koji je opisan u WO 11/131746, koji je ovde uključen referencom.
[0109] U jednom izvođenju, matično antitelo je bispecifično antitelo koje sadrži prvi polipeptid koji sadrži prvi CH2-CH3 region imunoglobulina i prvi region koji veže antigen, i drugi polipeptid koji sadrži drugi CH2-CH3 region imunoglobulina i drugi region koji veže antigen, pri čemu prvi i drugi regioni koji vežu antigen vežu različite epitope na istom antigenu ili na različitim antigenima.
[0110] U drugom izvođenju pomenuti prvi CH2-CH3 region sadrži drugu aminokiselinsku supstituciju na položaju koji je izabran iz onih koji odgovaraju K409, T366, L368, K370, D399, F405, i Y407 u Fcregionu teškog lanca humanog IgG1; i pri čemu pomenuti drugi CH2-CH3 region sadrži drugu aminokiselinsku supstituciju u položaju koji je izabran iz onih koji odgovaraju F405, T366, L368, K370, D399, Y407, i K409 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, i pri čemu pomenuta druga aminokiselinska supstitucija u prvom CH2-CH3 regionu je različita od pomenute druge aminokiselinske supstitucije u drugom CH2-CH3 regionu.
[0111] U drugom izvođenju pomenuti prvi CH2-CH3 region sadrži aminokiselinsku supstituciju u položaju koji odgovara K409 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1; i pomenuti drugi CH2-CH3 region sadrži aminokiselinsku supstituciju u položaju koji odgovara F405 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1.
[0112] U jednom izvođenju pomenuti postupak sadrži uvođenje u svaki od prvog i drugog CH2-CH3 regiona mutaciju u bar jednom aminokiselinskom ostatku koji je izabran iz onih koji odgovaraju E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436, i K447 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 je S440Y ili S440W.
[0113] U drugom izvođenju mutacija koja je uvedena u prvom i drugom CH2-CH3 regionu u bar jednom aminokiselinskom ostatku izabrana je iz onih koji odgovaraju E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436, i K447 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 je S440Y ili S440W, može biti u istom položaju aminokiselinskog ostatka ili u različitom položaju. U drugom izvođenju može biti ista ili različita mutacija u istom aminokiselinskom položaju.
[0114] U drugom izvođenju pomenuti postupak obuhvata uvođenje u prvi ili drugi CH2-CH3 region mutacije u bar jednom aminokiselinskom ostatku koji je izabran iz onih koji odgovaraju E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436, i K447 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 je S440Y ili S440W.
[0115] Bilo koja od mutacija koje se navode u Tabeli 1 mogu biti uključene u bispecifično antitelo. Primer 24, pokazuje da uvođenje E345R mutacije u bispecifično CD20xEGFR antitelo pojačava efikasnost CDC. Primeri 23, 29 i 30 takođe opisuju neka od različitih bispecifičnih antitela koja sadrže mutaciju u skladu sa predmetnim prikazom.
[0116] U jednom izvođenju pomenuti postupak obuhvata uvođenje mutacije u jedan ili više položaja koji nisu S440 i K447, i dalje uvođenje mutacije
(i) u svakom od aminokiselinskih ostataka koji odgovara K439 i S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 nije S440Y ili S440W,
(ii) u svakom od aminokiselinskih ostataka koji odgovara K447 i 448 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, kao što je K447K/R/H i 448E/D u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, poželjno K447K i 448E u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, ili
(iii) u svakom od aminokiselinskih ostataka koji odgovaraju K447, 448 i 449 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, kao što je K447D/E, 448K/R/H i 449P u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, poželjno K447E, 448K i 449P u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1.
[0117] U jednom izvođenju, pomenuti postupak obuhvata uvođenje mutacije u jedan ili više položaja koji nije S440, i dalje uvođenje mutacije u svaki od aminokiselinskih ostataka koji odgovaraju K439 i S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, pod uslovom da druga mutacija u S440 nije S440Y ili S440W.
[0118] Uvođenje mutacije u oba aminokiselinska ostatka koji odgovaraju K439 i S440 u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1 u matičnom antitelu, pod uslovom da mutacija u S440 nije S440Y ili S440W ovde je takođe naznačen kao aspekt "dvostrukog mutanta". S440Y i S440W mutacije kao što su ovde na drugom mestu opisane pronađeno je da povećavaju efektorsku funkciju kada su uvedene u matično antitelo.
[0119] Kao što je ovde takođe na drugom mestu opisano predmetni prikaz se odnosi na uvođenje identifikovanih mutacija u aminokiselinskom ostatku koji odgovara ili K439 ili S440 u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1 rezultuje u smanjenju u efektorskoj funkciji (primeri 5, 6, 10). Međutim, kada su uvedene mutacije koje inhibiraju u oba od aminokiselinskih ostataka koji odgovaraju K439 i S440 u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1 obnovljeno je smanjenje u efektorskoj funkciji, pri čemu postaje sličan efektorskoj funkciji matičnog antitela bez mutacije u K439 i S440 mutacijama. Međutim, prisustvo K439 i S440 mutacija je, bez vezivanja za bilo koju teoriju, se veruje da ograničava indukciju efektorskih funkcija na oligomerne komplekse koji se isključivo sastoje iz isključivo antitela koja sadrže i K439 i S440 mutacije. Prema tome ukoliko K439 i S440 mutacije su uključene u terapeutskom antitelu, veruje se, bez vezivanja za teoriju, da kada su takva terapeutska antitela davana pacijentu indukovanje efektorskih funkcija je ograničeno na oligomerne komplekse antitela koji sadrže terapeutska antitela koja sadrže K439/S440 mutacije ali ne sadrže pacijentova sopstvena antitela, koja ne sadrže K439 i S440 mutacije, time ograničavajući bilo koje moguće neželjene efekte koji su uzrokovani interakcijom terapeutskog antitela sa pacijentovim sopstvenim antitelima.
[0120] Kada se kombinuju mutacije u položaju K439 i/ili S440 sa prvom mutacijom, dobijena je pojačana CDC i pojačana je specifičnost CDC.
[0121] Prema tome u drugom aspektu predmetni prikaz se odnosi na postupak za povećanje specifičnosti kombinacije od bar prvog i drugog matičnog polipeptida koji sadrže Fc-domen imunoglobulina i regiona za vezivanje, koji sadrži
A)
(i) uvođenje u prvi matični polipeptid mutacije u ostatku aminokiseline u položaju koji odgovara K439 u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1; i
(ii) uvođenje u drugi matični polipeptid mutacije u ostatku aminokiseline u položaju koji odgovara S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 nije S440Y ili S440W,
B)
(i) uvođenje u prvi matični polipeptid mutacije u ostatku aminokiseline u položaju koji odgovara K447D/E u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1; i
(ii) uvođenje u drugi matični polipeptid mutacije u ostatku aminokiseline u položaju koji odgovara K447K/R/H i 448P u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1; ili
C)
(i) uvođenje u prvi matični polipeptid mutacije u ostatku aminokiseline u položaju koji odgovara K447D/E u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1; i
(ii) uvođenje u drugi matični polipeptid mutacije u ostatku aminokiseline u položaju koji odgovara K447K/R/H, 448K/R/H i 449P u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1.
[0122] U jednom izvođenju matičnog polipeptida, prvi matični polipeptid i drugi matični polipeptid mogu svaki biti antitelo.
[0123] Prema tome u drugom aspektu predmetni prikaz takođe se odnosi na postupak za povećanje specifičnosti kombinacije prvog i drugog matičnog antitela, koji sadrži
(i) uvođenje u prvo matično antitelo mutacije u ostatku aminokiseline u položaju koji odgovara K439 u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1; i
(ii) uvođenja u drugo matično antitelo mutacije u ostatku aminokiseline u položaju koji odgovara S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 nije S440Y ili S440W.
2
[0124] Prva i druga varijanta antitela imaće prednost za oligomerizaciju jedno sa drugim u poređenju sa bilo kojim divljim tipom ili antitelom koji se nalazi u prirodi kao što je prikazano u Primeru 10.
[0125] Povećanje u specifičnosti je u odnosu na "indukciju efektorske funkcije". Prema tome pomenuti postupak je u jednom izvođenju postupak za povećanje specifičnosti indukcije efektorske funkcije sa kombinovanjem bar prvog i drugog matičnog antitela.
[0126] Izvođenjem postupka za povećanje specifičnosti, ili specifičnosti indukovanja efektorske funkcije, kombinovanjem bar prvog i drugog matičnog antitela, dobijena je kombinacija prve varijante i druge varijante antitela.
[0127] Uvođenjem mutacije bilo u K439 ili S440 matičnog antitela, tako dobijena varijanta antitela ima smanjenu efektorsku funkciju u poređenju sa matičnim antitelom. Međutim, kao što je ovde takođe na drugom mestu opisano, mutacija u K439 i S440 su sposobne da dopune jedna drugu ili obnove efektorsku funkciju antitela koje sadrži obe mutacije. Ova sposobnost mutacija u K439 i S440 da dopune jedna drugu može na sličan način da se koristi u dva antitela. Prema tome, kada je mutacija u K439 uvedena u prvo matično antitelo i mutacija u S440 je uvedena u drugo matično antitelo, ili vice versa, smanjenje u efektorskoj funkciji više se ne može uočiti kao što prva i druga varijanta antitela su korišćena u kombinaciji. Termin "povećanje specifičnosti" ili "unapređenje specifičnosti" u ovom kontekstu se odnosi na efektorski odgovor koji je indukovan sa bilo kojom kombinacijom prve varijante antitela koja sadrži mutaciju u K439 i druge varijante antitela koja sadrži mutaciju u S440 je veća od efektorskog odgovora koji je indukovan sa ili prvom varijantom antitela koja sadrži mutaciju u K439 ili drugom varijantom antitela koja sadrži mutaciju u S440.
[0128] Uvođenjem obe supstitucije aminokiselina u K439 i S440 specifičnost oligomerizacije je povećana.
[0129] Kada se kombinuju mutacije u položaju K439 i/ili S440 sa prvom mutacijom, pojačano CDC je dobijeno i specifičnost CDC je povećana.
[0130] U jednom izvođenju bar prva i druga matična antitela vežu se za isti epitop.
[0131] U jednom izvođenju bar prvo i drugo matično antitelo vežu se za različite epitope na istom antigenu.
[0132] U jednom izvođenju bar prvo i drugo matično antitelo vežu se za različite epitope na različitim metama.
[0133] U jednom izvođenju prvo i drugo matično antitelo imaju iste ili različite VL i VH sekvence.
[0134] U jednom izvođenju kombinacija bar prvog i drugog matičnog antitela sadrži jedno prvo matično antitelo i jedno drugo antitelo.
[0135] U jednom izvođenju, specifičnost je povećana, kada kombinacija prvog i drugog matičnog antitela je vezana za svoj antigen na ćeliji koja eksprimuje antigen, na ćelijskoj membrani, ili na virionu.
[0136] Stoga u drugom aspektu predmetni prikaz takođe se odnosi na upotrebu mutacije u dva ili više aminokiselinska ostatka antitela da bi se povećala specifičnost, npr. efektorske funkcije koja je indukovana sa, antitelom koje je vezano za njegov antigen ili ćeliju koja eksprimira antigen, na ćelijskoj membrani, ili na virionu, gde
prva mutacija je u aminokiselinskom ostatku koji odgovara K439 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1;
druga mutacija je u aminokiselinskom ostatku koji odgovara S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1.
[0137] U daljem aspektu predmetni prikaz odnosi se na postupak za povećanje efektorske funkcije kombinacije bar prvog i drugog matičnog polipeptida, pri čemu bar prvi i drugi matični polipeptid svaki sadrži Fc-domen imunoglobulina i region za vezivanje, pri čemu pomenuti postupak obuhvata
(i) uvođenje u bar prvi i/ili drugi matični polipeptid mutacije u jednom ili više ostataka aminokiselina koji su izabrane iz grupe koja se sastoji iz:
(a) aminokiselinskog ostatka u CH2-CH3 regionu koji obezbeđuje alosterne mutacije,
(b) aminokiselinskog ostatka u hidrofobnim čvorićima CH2-CH3 regiona,
(c) aminokiselinskog ostatka u N-terminaloj CH3 zavojnici,
(d) aminokiselinskog ostatka u C-terminalnom CH3 beta-lancu, pod uslovom da u slučaju mutacije koja odgovara S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1 mutacija je S440Y ili S440W, i (e) aminokiselinskog ostatka koji odgovara E345, E382 ili Q386 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1.
[0138] U jednom izvođenju prvi i/ili drugi matični polipeptid mogu svaki biti antitelo.
[0139] Prema tome u jednom izvođenju predmetni prikaz se odnosi na postupak za povećanje efektorske funkcije kombinacije bar prvog i drugog matičnog antitela, pri čemu bar prvo i drugo matično antitelo svako sadrži Fc-domen imunoglobulina i regiona koji veže antigen, pri čemu pomenuti postupak obuhvata
(i) uvođenje u bar prvo i/ili drugo matično antitelo mutacije u jednom ili više aminokiselinskih ostataka koji su izabrane iz grupe koja se sastoji iz:
(a) aminokiselinskog ostatka sa CH2-CH3 regionom koji obezbeđuje alosterne mutacije,
(b) aminokiselinskog ostatka u hidrofobnim čvorićima CH2-CH3 regiona,
(c) aminokiselinskog ostatka u N-terminalnoj CH3 zavojnici,
(d) aminokiselinskog ostatka u C-terminalom CH3 beta-lancu, pod uslovom da u slučaju mutacije koja odgovara S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1 je S440Y ili S440W, i
(e) aminokiselinski ostatak koji odgovara E345, E382 ili Q386 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1.
[0140] Izvođenjem ovog postupka dobijena je kombinacija bar prvog i drugog varijantnog antitela. Bar prvo i drugo varijantno antitelo koje je dobijeno ovim postupkom su kombinovani da povećavaju efektorsku funkciju u poređenju sa kombinacijom prvog i drugog matičnog antitela.
[0141] Termin "povećana efektorska funkcija" treba razumeti kao što je ovde opisano.
[0142] Prvo i/ili drugo matično antitelo može biti bilo koje matično antitelo kao što je ovde opisano.
[0143] Postupci za povećanje efektorske funkcije kombinacije prvog i drugog matičnog antitela mogu posebno biti sprovedeni tako da se dobije prvo i/ili drugo varijantno antitelo koji ima bilo koju od karakteristika varijanta antitela kao što je ovde opisano. Predmetni prikaz se takođe odnosi na uvođenje mutacije u aminokiselinskom ostatku koji je izabran od (a), (b), (c), (d) i/ili (e) rezultuje u kombinaciji prve i druge varijante antitela sa povećanom efektorskom funkcijom u poređenju sa kombinacijom prvog i drugog matičnog antitela.
[0144] U jednom izvođenju bar prvo i drugo matično antitelo vežu se za isti epitop.
2
[0145] U jednom izvođenju bar prvo i drugo matično antitelo vežu se za različite epitope na istom antigenu.
[0146] U jednom izvođenju bar prvo i drugo matično antitelo vežu se za različite epitope na različitim metama.
[0147] U jednom izvođenju prvo i drugo matično antitelo imaju iste ili različite VL i VH sekvence.
[0148] U jednom izvođenju kombinacija bar prvog i drugog matičnog antitela sadrži jedno prvo matično antitelo i drugo antitelo.
[0149] U jednom izvođenju kombinacija bar prvog i drugog matičnog antitela sadrži druga matična antitela, kao što je treće, četvrto ili peto matično antitelo.
[0150] U jednom izvođenju (a) aminokiselinski ostatak u CH2-CH3 regionu obezbeđuje alosterne mutacije u aminokiselinskom ostatku odabranom od onih koji odgovaraju P247 ili E430 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1.
[0151] U jednom izvođenju (b) aminokiselinski ostatak u hudrofobnim čvorićima CH2-CH3 regiona u aminokiselinskom ostatku koji je izabran iz onih koji odgovaraju 1253, S254 i Q311 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1.
[0152] U jednom izvođenju (c) aminokiselinski ostatak u N-terminalnoj CH3 zavojnici je aminokiselinski ostatak koji je izabran iz onih koji odgovaraju D/E356 i T359 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1.
[0153] U jednom izvođenju (d) aminokiselinski ostatak u C-terminalom CH3 beta-lancu je aminokiselinski ostatak koji je izabran iz onih koji odgovaraju Y436 i S440.
[0154] Aminokiselinski ostaci u (b), (c), (d) i (e) su aminokiselinski ostaci koji su locirani na Fc:Fc površini interakcije dva antitela, prema tome Fc deo antitela koji može interagovati sa Fc delom drugog antitela dva antitela su u blizini jedno drugom.
[0155] Prema tome u drugom izvođenju mutacija u bar prvom i/ili drugom matičnom antitelu je u bar jednom aminokiselinskom ostatku koji je izabran iz onih koji odgovaraju E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436, i K447 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 je S440Y ili S440W.
[0156] U jednom izvođenju (i) sadrži uvođenje mutacije i u prvo i drugo matično antitelo.
[0157] U drugom izvođenju pomenuti postupak obuhvata:
(i) uvođenje mutacije u prvom matičnom antitelu u bar jednom aminokiselinskom ostatku koji je izabran od onih koji odgovaraju E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436, i K447 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 je S440Y ili S440W,
(ii) obezbeđivanje drugog matičnog antitela koje ne sadrži mutaciju u aminokiselinskom ostatku koji je izabran iz onih koji odgovaraju E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436, i K447 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1.
[0158] U jednom izvođenju pomenuti postupak obuhvata uvođenje mutacije u bar jedan aminokiselinski ostatk koji nije S440, pri čemu pomenuti postupak dalje obuhvata korake uvođenja mutacija u jednom ili više položaja koji nisu S440, i pri čemu pomenuti postupak dalje obuhvata korake
2
(i) uvođenje u prvo matično antitelo druge mutacije u aminokiselinskom ostatku koji odgovara položaju K439 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1; i
(ii) uvođenje u drugo matično antitelo druge mutacije u aminokiselinskom ostatku koji odgovara položaju S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 nije S440Y ili S440W; pri čemu koraci (ii) i (iii) mogu alternativno biti
(i) uvođenje u prvo matično antitelo druge mutacije u aminokiselinskom ostatku koji odgovara položaju S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 nije S440Y ili S440W; i
(ii) uvođenje u drugo matično antitelo druge mutacije u aminokiselinskom ostatku koji odgovara položaju K439 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1.
[0159] Za ona izvođenja koja su ovde prikazana u kojima drugi matični ne sadrži mutaciju u ostatku aminokiselina koji je izabran iz onih koji odgovaraju E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436, i K447 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, termin "druga mutacija" u koraku (ii) može biti prva mutacija, npr. drugo matično antitelo ne mora sadržati druge mutacije osim mutacije koje su uvedene u koraku pod (ii). Termin "druga mutacija" u koracima (i) i (ii) takođe nisu namenjene da ograniče broj mutacija koje se mogu uvesti u prvo i/ili drugo matično antitelo.
[0160] U jednom izvođenju matično antitelo, prvo matično antitelo i drugo matično antitelo mogu svaki biti odabrani iz grupe koja se sastoji iz ali nije ograničena na monospecifična, bispecifična i multispecifična antitela. Bispecifični može biti npr. heterodimerni protein.
[0161] U jednom izvođenju prvo i drugo matično antitelo su monospecifična antitela, koja mogu npr. da se vežu za isti ili različite epitope. Ukoliko prvo i drugo matično antitelo se vežu za različite epitope oni mogu biti na istom ili različitom antigenu.
[0162] U drugom izvođenju prvo matično antitelo je monospecifično antitelo i drugo matično antitelo je bispecifično ili multispecifično antitelo, ili vice versa.
[0163] U drugom izvođenju prvo i drugo matično antitelo su bispecifična ili multispecifična antitela. U jednom izvođenju prvo i drugo bispecifično ili multispecifično matično antitelo su ista ili različita antitela. U jednom izvođenju prvo i drugo bispecifično ili multispecifično matično antitelo vežu se za različite epitope na istom ili različitom antigenu. Prema tome u jednom izvođenju pomenuto bar prvo i drugo matično antitelo su bispecifična ili multispecifična antitela koja vežu različite epitope na istom antigenu ili različim antigenima.
[0164] U drugom izvođenju prvo matično je monospecifično antitelo i drugo matično antitelo je bispecifično antitelo, ili vice versa. Monospecifično može vezati isti epitop kao bispecifično (jedan deo bispecifičnog) ili monospecifično i bispecifično antitelo može vezati različite epitope na istom ili različitim antigenima. Bispecifično antitelo može vezati različite epitope na istom ili različitim antigenima.
[0165] U jednom izvođenju pomenuto bar prvo i drugo matično antitelo su svaki bispecifično antitelo koje sadrži prvi polipeptid koji se sastoji iz prvog CH2-CH3 regiona imunoglobulina i prvog regiona koji veže antigen, i drugi polipeptid koji sadrži drugi CH2-CH3 region imunoglobulina i drugi region koji veže antigen, pri čemu prvi i drugi regioni koji vežu antigen vežu različite epitope na istom antigenu ili različitim antigenima, i pri čemu pomenuti prvi CH2-CH3 region sadrži drugu supstituciju aminokiseline u položaju koja je izabrana iz onih koji odgovaraju K409, T366, L368, K370, D399, F405, i Y407 u Fcregionu teškog lanca humanog IgG1; i pri čemu pomenuti drugi CH2-CH3 region sadrži drugu
2
supstituciju aminokiseline na položaju koji je odabran od onog koji odgovara F405, T366, L368, K370, D399, Y407, i K409 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, i pri čem pomenuta druga supstitucija aminokiselina u prvom CH2-CH3 regionu je različita od pomenute druge supstitucije aminokiselina u drugom CH2-CH3 regionu.
[0166] U drugom izvođenju pomenuti prvi CH2-CH3 region sadrži supstituciju aminokiseline u položaju koji odgovara K409 u Fc-regionu teškog lanca huamnog IgG1; i pomenuti drugi CH2-CH3 region sadrži supstituciju aminokiseline u položaju koji odgovara F405 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1.
[0167] U jednom izvođenju postupci i/ili upotrebe koji su ovde prikazani matičnog antitela, bilo da je matično antitelo, prvo matično antitelo ili drugo matično antitelo, može sadržati druge mutacije osim onih iz predmetnog prikaza za koje je pronađeno da utiču na efektorsku funkciju. Takve druge mutacije mogu biti uvedene istovremeno kao i mutacije iz predmetnog pronalaska koje utiču na efektorsku funkciju ili se mogu uvesti sekvencionalno, postupci ili upotrebe iz predmetnog prikaza nisu ograničeni na ili istovremeno ili sekvencijalno uvođenje mutacija. Bispecifično antitelo može biti bilo koje bispecifično antitelo i postupci i upotrebe iz predmetnog prikaza nisu ograničeni na bilo koji poseban bispecifični format kao što je predviđeno da se mogu koristiti različiti formati.
[0168] Postupak kombinovanja prvog antitela koje sadrži jednu od pomenutih mutacija koje su sposobne da povećaju efektorsku funkciju i drugo antitelo koje ne sadrži takvu mutaciju mogu se prikazati u Primeru 31 povećavaju efektorsku funkciju kombinacije. Prema tome, bez vezivanja za teoriju, veruje se da npr. ovaj postupak može da se koristi da se kombinuje terapeutsko antitelo, kao drugo antitelo, za koje dokazano da je bezbedno ali nedovoljno efikasno sa prvim antitelom koje sadrži mutaciju, i stoga rezultuje u kombinaciji koja je efikasna.
[0169] Prema tome u jednom izvođenju drugo matično antitelo koje ne sadrži mutaciju u ostatku aminokiseline koja je izabrana iz onih koje odgovaraju E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436, i K447 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, je terapeutsko antitelo. U posebnom izvođenju terapeutsko antitelo je ono koje ima odgovarajući profil bezbednosti. U jednom izvođenju može biti terapeutsko antitelo koje ima odgovarajući profil bezbednosti ali koje nije dovoljno efikasno.
[0170] Primeri pogodnih drugih antitela koja ne sadrže mutaciju u ostatku aminokiselina koje su izabrane iz onih koji odgovaraju E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436, i K447 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, uključuju ali nisu ograničeni na bilo koju od sledećih; (90Y) klivatuzumab tetraksetan; (90Y) tacatuzumab tetraksetan; (99mTc) fanolesomab; (99mTc) nofetumomab Merpentan; (99mTc) pintumomab; 3F8; 8H9; abagovomab; abatacept; abciksimab; Actoksumab; adalimumab; adecatumumab; afelimomab; aflibercept; Afutuzumab; alacizumab pegol; albiglutid; ALD518; alefacept; alemtuzumab; Alirocumab; altumomab; Altumomab pentetat; alvircept sudotoks; amatuksimab; AMG714/HuMax-IL15; anatumomab mafenatoks; Anrukinzumab (= IMA-638); apolizumab; arcitumomab; aselizumab; atacicept; atinumab; Atlizumab (= tocilizumab); atorolimumab; baminercept; Bapineuzumab; basiliksimab; bavituksimab; bectumomab; belatacept; belimumab; benralizumab; bertilimumab; besilesomab; bevacizumab; Bezlotoksumab; biciromab; bifarcept; bivatuzumab; Bivatuzumab mertansin; blinatumomab; blosozumab; brentuksimab vedotin; briakinumab; briobacept; brodalumab; canakinumab; cantuzumab mertansin; cantuzumab ravtansin; caplacizumab; capromab; Capromab pendetid; carlumab; catumaksomab; CC49; cedelizumab; certolizumab pegol; cetuksimab; Ch.14.18; citatuzumab bogatoks; ciksutumumab; Clazakizumab; clenoliksimab; Clivatuzumab tetraksetan; conatumumab; conbercept; CR6261; crenezumab; dacetuzumab; daclizumab; dalantercept; dalotuzumab; daratumumab; Demcizumab; denosumab; Detumomab; Dorlimomab aritoks; drozitumab; dulaglutid; ecromeksimab; eculizumab;
2
edobacomab; edrecolomab; efalizumab; efungumab; elotuzumab; elsilimomab; enavatuzumab; enlimomab; enlimomab pegol; enokizumab; ensituksimab; epitumomab; epitumomab cituksetan; epratuzumab; erlizumab; ertumaksomab; etanercept; etaracizumab; etrolizumab; eksbivirumab; Fanolesomab; faralimomab; farletuzumab; Fasinumab; FBTA05; felvizumab; Fezakinumab; ficlatuzumab; figitumumab; flanvolumab; fontolizumab; foralumab; foravirumab; fresolimumab; fulranumab; galiksimab; ganitumab; gantenerumab; gavilimomab; gemtuzumab; Gemtuzumab ozogamicin; gevokizumab; girentuksimab; glembatumumab; Glembatumumab vedotin; golimumab; Gomiliksimab; GS6624; anti-CD74 antitela; anti-cMet antitela kao što je prikazano u WO 2011/110642; anti-Her2 antitela kao što je prikazano u WO 2011/147986 ili WO 2011/147982; anti-IL8 antitela kao što je prikazano u WO 2004/058797; anti-TAC antitela kao što je prikazano u WO 2004/045512; antitela protiv tkivnog faktora (TF) kao što su prikazana u WO 2010/066803 ili WO 2011/157741; ibalizumab; ibritumomab tiuksetan; icrucumab; igovomab; Imciromab; inclacumab; indatuksimab ravtansin; infliksimab; inolimomab; inotuzumab ozogamicin; intetumumab; jod (1241) girentuksimab; ipilimumab; iratumumab; itolizumab; iksekizumab; keliksimab; labetuzumab; lebrikizumab; lemalesomab; lenercept; lerdelimumab; leksatumumab; libivirumab; lintuzumab; lorvotuzumab mertansin; lucatumumab; lumiliksimab; mapatumumab; maslimomab; matuzumab; mavrilimumab; mepolizumab; metelimumab; milatuzumab; minretumomab; mirococept; mitumomab; mogamulizumab; morolimumab; motavizumab; moksetumomab; pasudotoks; muromonab-CD3; nacolomab tafenatoks; namilumab; naptumomab estafenatoks; narnatumab; natalizumab; nebacumab; necitumumab; nerelimomab; nimotuzumab; Nivolumab; Nofetumomab; merpentan; obinutuzumab; Ocaratuzumab; ocrelizumab; odulimomab; ofatumumab; olaratumab; olokizumab; omalizumab; onartuzumab; onercept; oportuzumab monatoks; oregovomab; oteliksizumab; okselumab; ozoralizumab; pagibaksimab; palivizumab; panitumumab; panobacumab; pascolizumab; pateclizumab; patritumab; pegsunercept; Pemtumomab; pertuzumab; pekselizumab; Pintumomab; Placulumab; ponezumab; priliksimab; pritumumab; PRO 140; kvilizumab; racotumomab; radretumab; rafivirumab; ramucirumab; ranibizumab; raksibacumab; regavirumab; reslizumab; RG1507/HuMax-IGF1R; RG1512/HuMax-pSelectin; rilonacept; rilotumumab; rituksimab; robatumumab; roledumab; romosozumab; rontalizumab; rovelizumab; ruplizumab; samalizumab; sarilumab; satumomab; Satumomab pendetid; secukinumab; sevirumab; sibrotuzumab; sifalimumab; siltuximab; siplizumab; sirukumab; solanezumab; solitomab; Sonepcizumab; sontuzumab; sotatercept; stamulumab; sulesomab; suvizumab; tabalumab; Tacatuzumab tetraksetan; tadocizumab; talizumab; tanezumab; taplitumomab paptoks; tefibazumab; telimomab aritoks; tenatumomab; teneliksimab; teplizumab; teprotumumab; TGN1412; Ticilimumab (= tremelimumab); tigatuzumab; TNX-650; Tocilizumab (= atlizumab); toralizumab; torapsel; tositumomab; tralokinumab; trastuzumab; trastuzumab emtansin; TRBS07; trebananib; tregalizumab; tremelimumab; tucotuzumab celmoleukin; tuvirumab; ublituksimab; urelumab; urtoksazumab; ustekinumab; vapaliksimab; vatelizumab; vedolizumab; veltuzumab; vepalimomab; vesencumab; visilizumab; volociximab; Vorsetuzumab mafodotin; votumumab; zalutumumab; zanolimumab; ziralimumab; i zolimomab aritoks.
[0171] U jednom izvođenju postupaka i upotreba predmetnog pronalazaka mutacija u bar jednom aminokiselinskom ostatku, ili u jednom ili više aminokiselinskih ostataka, koji odgovaraju E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436, i K447 u Fc-regionu teškog lanca huamnog IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 je S440Y ili S440W, može biti u bilo kom od primera i poželjno pozicije aminokiselina koje su navedene u Tabeli 1. Prema tome svaka od pozicija aminokiselina koje su navedene u Tabeli 1 u odvojenom i ne-ograničavajućem izvođenju mutacije u bar jednoj aminokiselini.
[0172] Bilo koja od mutacija ili njihovih kombinacija koje su ovde opisane mogu se uvesti prema postupku iz predmetnog prikaza.
2
[0173] Mutacije koje su izabrane iz primera ili poželjne supstitucije aminokiselina mogu se ispitati u odgovarajućim testovima koji omogućavaju obrazovanje oligomera antitela koja su vezala antigen i detekciju pojačanog vezivanja C1q, aktivaciju komplementa, CDC, ADCC i/ili internalizaciju, kao što su oni koji su napisani u Primerima. Na primer, aviditet vezivanja C1q se može odrediti prema testu koji je sličan sa onim koji se opisuje u Primeru 4, korišćenjem ćelija koje eksprimiraju antigen za varijantu antitela. Primeri CDC testova su obezbeđeni u Primerima 5, 6, 10, 16, 19, 22, 23, 24, ili 25. Primer ADCC testa je obezbeđen u Primeru 12. Primer testa internalizacije je obezbeđen u Primeru 26. Konačno, da bi se napravila razlika između mutacija u aminokiselinskim ostacima koje su direktno uključene u vezivanju C1q iz mutacija koje pogađaju obrazovanje oligomera, vezivanje C1q u ELISA testu prema, npr., Primeru 3 može se uporediti sa vezivanjem C1q u testu koji je zasnovan na ćelijama prema, npr., Primeru 4.
[0174] U drugom izvođenju pomenuta mutacija je odabrana od onih koje odgovaraju E345, E430, S440 i Q386 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, pod uslovom da je mutacija u S440 je S440Y ili S440W.
[0175] U alternativnom izvođenju mutacija u bar jednom aminokiselinskom ostatku, ili jednom ili više ostataka aminokiselina, je u aminokiselinskom ostatku koji odgovara E382 i H433 u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1.
[0176] U posebnom izvođenju jedna mutacija je u aminokiselinskom ostatku koji odgovara E345 u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1.
[0177] U posebnom izvođenju jedna mutacija je u aminokiselinskom ostatku koji odgovara E430 u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1.
[0178] U posebnom izvođenju jedna mutacija je u aminokiselinskom ostatku koji odgovara S440 u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1, pod uslovom da je mutacija S440Y ili S440W.
[0179] U posebnom izvođenju jedna mutacija je u aminokiselinskom ostatku koji odgovara Q386 u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1.
[0180] U alternativnom izvođenju jedna mutacija je u aminokiselinskom ostatku koji odgovara E382 ili H433 u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1.
[0181] U jednom izvođenju mutacija u bar jednom aminokiselinskom ostatku može biti supstitucija aminokiseline, delecija aminokiseline ili insercija aminokiseline.
[0182] U jednom izvođenju mutacija u bar jednom aminokiselinskom ostatku je delecija aminokiseline.
[0183] U jednom izvođenju mutacija u bar jednom aminokiselinskom ostatku je insercija aminokiseline.
[0184] U posebnom izvođenju mutacija u bar jednom aminokiselinskom ostatku je supstitucija aminokiseline.
[0185] U jednom izvođenju mutacija u bar jednom aminokiselinskom ostatku može biti izabrana iz bilo koje od aminokiselinskih supstitucija, delecija aminokiselina koje su navedene u Tabeli 1. Dalje, svaka poželjna aminokiselinska supstitucija u svakom specifičnom aminokiselinskom ostatku navedena u Tabeli 1 je odvojeno i specifično ne-ograničavajuće izvođenje za ovu upotrebu. Primer aminokiselinskih supstitucija uključuje izmenu E ostatka za R ostatak, i izmenu H ostatka za R ostatak.
[0186] U drugom izvođenju mutacija u bar jednom aminokiselinskom ostatku je aminokiselinska supstitucija izabrana iz one koja odgovara E345X, E430X, S440Y ili W, i Q386K u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, pri čemu se X odnosi na bilo koju aminokiselinu, npr. bilo koju prirodnu aminokiselinu ili aminokiselinu koja se ne pojavljuje u prirodi. X može posebno da se odnosi na bilo koji od aminokiselina koje se nalaze u prirodi 20.
[0187] Prema tome u jednom izvođenju mutacija je u bar jednom aminokiselinskom ostatku izabrana iz onih koji odgovaraju E345, E430, S440 do Y ili W, i Q386 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, poželjno pri čemu je mutacija bar jedna supstitucija aminokiselina od sledećih: E345 do R, Q, N, ili K, E430 do T, S, ili G, S440 do Y ili W, ili Q386 do K.
[0188] Prema tome u jednom izvođenju E345X može biti E345R, Q, N, K, Y, A, C, D, F, G, H, I, L, M, P, S, T, V, W, ili Y; posebno E345A, D, G, H, K, N, Q, R, S, T, Y ili W, ili određenije E345D, K, N, Q, R, ili W; ili još određenije E345R, Q, N, K, ili Y,. U drugom daljem izvođenju E430X može biti E430T, S, G, F, H, A, C, D, I, K, L, M, N, P, Q, R, V, W, ili Y; posebno E430T, S, G, F, ili H. U poželjnom izvođenju supstitucija aminokiselina je izabrana iz grupe koja sadrži E345R, E345Q, E345N, E345K, E345Y, E430T, E430S, E430G, E430F, E430H, S440W i S440Y. U drugom izvođenju mutacija u bar jednom aminokiselinskom ostatku je odabrana od E345R i E430G. U drugom izvođenju mutacija u bar jednom aminokiselinskom ostatku je E345R. U drugom izvođenju mutacija u bar jednom aminokiselinskom ostatku je E430G.
[0189] U alternativnom izvođenju mutacija u bar jednom aminokiselinskom ostatku je izabrana od onih koji odgovaraju 1253, H310, Q311, E382, G385, H433, N434, Y436, i Q438 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, kao što je E382 ili H433. U drugom alternativnom izvođenju mutacija u bar jednom aminokiselinskom ostatku može biti supstitucija aminokiselina izabrana od onih koje odgovaraju I253E, N, Q, S ili T, npr. I253N ili Q; H310N, Q, W ili Y, npr. H310Q; Q311E ili R, E382D, H, K, R, N, Q, S, T, W ili Y, npr. E382D, Q, K, ili R; G385E, H, K, N, Q, R, S, T, W ili Y, npr. G385D, E, K ili R; H433R; N434D, E, H, K, Q, R, S, T, W ili Y, npr. N434H, K, Q ili R; Y436A, E, F, H, I, K, L,M,N,Q, R, S, T ili V, npr. Y436N, Q, S ili T; Q438A, E, G, H, K, N,Q,R, S, T, W ili Y, ili npr. Q438 N,S ili T.
[0190] Prema tome u još drugom alternativnom izvođenju mutacija u bar jednom aminokiselinskom ostatku može biti supstitucija aminokiselina izabrana od onih koje odgovaraju P247G, I253V, S254L/V, Q311L/W, D/E356G/R, T359R, E382L/V, i Y436I u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, npr. posebno E382L, V, D, Q, K, ili R ili H433R. U drugom alternativnom izvođenju mutacija u bar jednom aminokiselinskom ostatku je izabrana od E382R i H433R. U alternativnom izvođenju, mutacija je E382R. U drugom alternativnom izvođenju, mutacija je H433R.
[0191] U drugom izvođenju, mutacija nije u aminokiselinskom ostatku direktno uključena u vezivanju C1q, opciono kao što je određeno upoređivanjem vezivanja C1q u ELISA testu u skladu sa Primerom 3 sa vezivanjem C1q u ćelijski zasnovanom testu prema Primeru 4.
[0192] U jednom izvođenju, mutacija nije u aminokiselinskom ostatku koji odgovara 1253, N434, ili Q311, i opciono nije u aminokiselinskom ostatku koji odgovara H433, ili supstitucija aminokiseline nije u H433A.
[0193] U jednom izvođenju, bar jedna mutacija je jedna mutacija, tj. ne više od jedne mutacije je uvedena u matičnom antitelu.
[0194] U drugom izvođenju, postupak ili upotreba u skladu sa predmetnim pronalaskom obuhvata uvođenje mutacije u bar dva, kao što su dva, tri, četiri, pet, ili više aminokiselinskih ostataka u Tabeli 1.
[0195] Bilo koja od kombinacija mutacija koje su ovde opisane mogu se uvesti u skladu sa postupkom iz predmetnog pronalaska.
1
[0196] U jednom izvođenju postupak ili upotrebe prema predmetnom pronalasku sadrži uvođenje u matično antitelo mutacije u bar dva aminokiselinska ostatka koji su izabrnani od onih koji odgovaraju E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436, i K447 u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 je S440Y ili S440W.
[0197] U jednom izvođenju postupak ili upotrebe prema predmetnom pronalasku sadrži uvođenje u matično antitelo mutacije u bar dva aminokiselinska ostatka izabrana od onih koji odgovaraju E345, E430, Q386, i S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 je S440Y ili S440W, kao što je mutacija u bar dve aminokiselne su izabrane od sledećih: E345 do R, Q, N, ili K, E430 do T, S, ili G, S440 do Y ili W, ili Q386 do K.
[0198] U alternativnom izvođenju položaji prve mutacije mogu biti izabrane iz grupe koja se sastoji iz položaja 1253, H310, Q311, E345, E382, G385, H433, N434, Y436, i Q438.
[0199] U jednom izvođenju, postupak dalje sadrži uvođenje u antitelo druge/treće mutacije u aminokiselinskom ostatku koji odgovara E345, E430, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Q386, Y436, ili K447 i u prvim i/ili drugim Fc-regionima.
[0200] Na primer više od jedne, kao što su dve, tri, četiri, ili pet, posebno dve ili tri mutacija su uvedene u matričnom antitelu u aminokiselinskim ostacima koji su izabrani iz onih koji odgovaraju E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436, i K447 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1. Na primer, bar jedan od aminokiselinskih ostataka koji odgovara E345, E430 i S440 u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1, može biti mutiran, kao što su dve ili svaka od E345, E430 i S440, opciono u kombinaciji sa mutacijom u jednoj ili više drugih aminokiselina koje su navedene u Tabeli 1. Bar dve mutacije može biti bilo koja supstitucija ostatka aminokiseline u položaju E345 u kombinaciji sa supstitucijom bilo kog ostatka aminokiselina u položaju E430 ili S440, ili može biti bilo koja supstitucija aminokiselina u položaju E430 u kombinaciji sa bilo kojim ostatkom aminokiseline u položaju S440.
[0201] U drugom izvođenju dve ili tri mutacije su uvedene u matično antitelo u aminokiselinskim ostacima koji su izabrani iz onih koji odgovaraju E345, E430, S440 i Q386 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1.
[0202] U jednom izvođenju više od jedna mutacija može posebno biti aminokiselinska supstitucija.
[0203] Stoga prema predmenom prikazu, postupak ili upotreba, sadrži uvođenje u antitelo bar jedne, kao što je jedna, dve, tri, četiri, pet, ili šest, aminokiselinskih supstitucija koje su izabrane iz sledeće grupe koja se sastoji iz P247G, I253V, S254L, Q311L/W, E345X, D/E356G/R, T359R, E382L/V, Q386K, E430X, Y436I, i S440Y/W. U poželjnim izvođenjima, aminokiselinska supstitucija je izabrana iz grupe koja se sastoji iz E345X, E430X, S440Y/W, i Q386K.
[0204] U alternativnom izvođenju, bar dve mutacije, kao što su dve, tri, četiri ili pet mutacija, su u aminokiselinskim ostacima koji su izabrani iz onih koji odgovaraju H310, G385, H433, N434, i Q438 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1.
[0205] U drugom alternativnom izvođenju, bar jedna mutacija, opciono dve ili tri mutacije, su izabrane iz grupe koja se sastoji iz E345R, E382R, i H433R. U drugom alternativnom izvođenju, bar jedan od aminokiselinskih ostataka koji odgovara E382 i H433 u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1 može biti mutiran, kao što su oba, opciono u kombinaciji sa mutacijom u jednoj ili više drugih aminokiselina koje su navedene u Tabeli 1.
2
[0206] U nekim izvođenjima postupaka i/ili upotreba iz predmetnog prikaza uvedena je mutacija u aminokiselinskom ostatku koji odgovara K439 i/ili S440 u antitelu koje je odabrano iz grupe koja se sastoji iz matičnog antitela, prvog matičnog antitela, drugog matičnog antitela i njihovih kombinacija. Kao što je opisano gore u tekstu uvođenje mutacije u aminokiselinske ostatke koji odgovaraju K439 i S440 u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1, je pokazalo da ograničava intermolekularne interakcije između antitela na one koje obuhvataju takve mutacije (Primer 4, 5, 6, 10). U zavisnosti od toga da li K439 i S440 su uvedeni u isto matično antitelo ili u prvom i drugom matičnom antitelu, redom, ovi aspekti su takođe naznačeni kao aspekt "dvostruki mutant" i "mešoviti mutant".
[0207] U jednom izvođenju iz predmetnog prikaza, mutacija u aminokiselinskom ostatku koji odgovara K439 u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1 je amiokiselinska supstitucija.
[0208] U jednom izvođenju iz predmetnog prikaza, mutacija u aminokiselinskom ostatku koji odgovara S440 u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1 je amiokiselinska supstitucija.
[0209] U svim izvođenjima iz predmetnog prikaza gde je mutacija u položaju koji odgovara K439 i S440 u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1, bilo da je u istom polipeptidu ili antitelu, ili u prvom i drugom polipeptidu ili antitelu može se zameniti sa mutacijom u:
(i) u svakom od aminokiselinskih ostataka koji odgovara K447 i 448 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, kao što je K447K/R/H i 448E/D u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, poželjno K447K i 448E u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, ili
(ii) u svakom od aminokiselinskih ostataka koji odgovara K447, 448 i 449 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, kao što su K447D/E, 448K/R/H i 449P u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, poželjno K447E, 448K i 449P u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1.
[0210] Prema tome kombinacije takvih mutacija uključuju bilo koju od onih koje su opisane u Tabeli 2A i 2B.
[0211] U jednom izvođenju iz predmetnog prikaza, mutacije u aminokiselinskom ostatku koji odgovara K439 i S440 u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1 su obe aminokiselinska supstitucija.
[0212] U jednom izvođenju, mutacija u aminokiselinskom ostatku koji odgovara K439 u Fc region teškog lanca humanog IgG1 je aminokiselinska supstitucija u aminokiselini koja je izabrana iz E i D.
[0213] U drugom izvođenju, mutacija je K439E.
[0214] U jednom izvođenju, mutacija u aminokiselinskom ostatku koji odgovara S440 u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1 je aminokiselinska supstitucija u aminokiselini koja je izabrana iz K, R i H.
[0215] U drugom izvođenju, mutacija je S440K.
[0216] Prema tome u drugom izvođenju mutacije koje su uvedene u matično antitelo u aminokiselinama odgovaraju K439 i S440 u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1 su aminokiselinske supstitucije koje su izabrane od K439E i D i S440K, R i H.
[0217] Prema tome u drugom izvođenju mutacije koje su uvedene u matično antitelo u aminokiselinskim ostacima koji odgovaraju K439 i S440 u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1 su aminokiselinske supstitucije K439E i S440K.
[0218] Nei postupci i upotrebe iz predmetnog prikaza sadrže prvo i drugo matično antitelo.
[0219] Prema tome u drugom izvođenju mutacija koja je uvedena u prvo matično antitelo u aminokiselinskom ostatku koji odgovara K439 u aminokiselinskoj supstituciji koja je izabrana iz K439E i D, npr. K439E i mutacija koja je uvedena u drugo matično antitelo u aminokiselinskom ostatku koji odgovara S440 je aminokiselinska supstitucija koja je izabrana od S440K, R i H, npr. S440K. Mutacije u prvom i drugom matičnom antitelu mogu se uvesti vice versa, tj. može takođe biti da mutacija u aminokiselinskom ostatku koji odgovara S440 je uvedena u prvo matično antitelo, dok mutacija u aminokiselinskom ostatku koji odgovara K439 je uvedena u drugom matičnom antitelu pri čemu mutacije mogu biti poželjne aminokiselinske supstitucije kao što je opisano gore u tekstu.
[0220] U jednom izvođenju postupaka ili upotreba prema predmetnom prikazu, efektorska funkcija je povećana kada je antitelo vezano sa njegovim antigenom.
[0221] U drugom izvođenju efektorska funkcija je povećana kada je antitelo vezano sa njegovim antigenom, pri čemu je antigen ćelija koja eksprimira antigen, ćelijska membrana, ili virion. U jednom izvođenju, Fc-region teškog lanca IgG1 sadrži sekvencu ostataka 130 do 330 SEQ ID NO:1.
[0222] Matično antitelo može biti bilo koje matično antitelo kao što je ovde opisano. Matično antitelo u ovom kontektu je namenjeno da bude takođe prvo matično i drugo matično antitelo.
[0223] U jednom izvođenju, matično antitelo je humano IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4, IgA1, IgA2, IgD ili IgE antitelo.
[0224] U jednom izvođenju matično antitelo je humano antitelo pune dužine, kao što je humano IgG1 antitelo pune dužine.
[0225] U jednom izvođenju, matično antitelo, prvo matično antitelo i drugo matično antitelo je humanog IgG1 antitelo, npr. IgGlm(za) ili IgG1m(f) alotipa, opciono sadrži Fc-region koji obuhvara SEQ ID NO:1 ili 5.
[0226] U jednom izvođenju, matično antitelo je humano IgG2 antitelo, opciono sadrži Fc-region koji obuhvata SEQ ID NO:2.
[0227] U jednom izvođenju, matično antitelo je humano IgG3 antitelo, opciono sadrži Fc-region koji obuhvata SEQ ID NO:3.
[0228] U jednom izvođenju, matično antitelo je humano IgG4 antitelo, opciono sadrži Fc-region koji obuhvata SEQ ID NO:4.
[0229] U jednom izvođenju, matično antitelo je bispecifično antitelo.
[0230] U jednom izvođenju, matično antitelo je bilo koje antitelo kao što je ovde opisano, npr. fragment antitela koje sadrži bar deo Fc-regiona, monovalentna antitela (koja su opisana u WO2007059782 od Genmab); težak lanac antitela, koji se sastoji samo iz dva teška lanca i prirodno se nalazi kod npr. kamila (npr., Hamers-Casterman (1993) Nature 363:446); ThioMabs (Roche, WO2011069104), modifikovani domen sa izmenjenim lancem (SEED or Seed-body) koji su asimetrični i bispecifični molekuli slični antitelu (Merck, WO2007110205); Triomab (Fresenius, Lindhofer et al. (1995 J Immunol 155:219); FcΔAdp (Regeneron, WO2010151792), Azymetric Scafputa (Zymeworks/Merck, WO2012/058768), mAb-Fv (Xencor, WO2011/028952), immunoglobulin sa dvostrukim varijabilnim domenom (Abbott, DVD-Ig,U.S. Patent No. 7,612,181); antitela “dvostruki head” sa dvostrukim domenom (Unilever; Sanofi Aventis, WO20100226923), Di-diatelo (ImClone/Eli Lilly), “Knobs-into-holes” formati antitela (Genentech, WO9850431); DuoBody (Genmab, WO 2011/131746); “Electrostatic steering” formati antitela (Amgen, EP1870459 and WO 2009089004; Chugai, US201000155133; Oncomed, WO2010129304A2); bispecifični IgG1 i IgG2 (Rinat neurosciences Corporation, WO11143545), CrossMAbs (Roche, WO2011117329), LUZ-Y (Genentech), Biclonic (Merus), antitela sa domenom dvostrukog ciljanja (GSK/Domantis), dva-u-jedan antitela koja
4
prepoznaju dve mete (Genentech, NovImmune), Unakrsno vezana Mabs (Karmanos Cancer Center), CovX-body (CovX/Pfizer), IgG-slična Bispecifična (ImClone/Eli Lilly, Shen, J., et al. J Immunol Methods, 2007. 318(1-2): p. 65-74), i DIG-body i PIG-body (Pharmabcine), , i molekuli za ponovno ciljanje sa dvostrukim afinitetom (Fc-DART ili Ig-DART, sa Macrogenics, WO/2008/157379, WO/2010/080538), Zybodies (Zyngenia), pristup sa zajedničkim lakim lancem (Crucell/ Merus, US7262028) ili zajedničkim teškim lancima (κλBodies od NovImmune), kao i fuzioni protein koji sadrže polipeptidnu sekvencu koja je spojena za fragment antitela koji sadrži scFv-fuzije slične Fc domenu, kao što je BsAb sa ZymoGenetics/BMS), HERCULES od Biogen Idec (US007951918), SCORPIONS sa Emergent BioSolutions/Trubion, Ts2Ab (MedImmune/AZ (Dimasi, N., et al. J Mol Biol, 2009.393(3): p.672-92), scFv fuziju od Novartis, scFv fuziju od Changzhou Adam Biotech Inc (CN 102250246), TvAb od Roche (WO 2012025525, WO 2012025530), mAb<2>od f-Star (WO2008/003116), i dvostruke scFv-fuzije. Takođ treba razumeti da termin antitelo, osim ukoliko nije drugačije označen, takođe uključuje poliklonska antitela, monoklonska antitela (kao što su humana monoklonska antitela), mešavine antitela (rekombinantna poliklonalna) koja su na primer dobijena tehnologijama koje su korišćene od Symphogen and Merus (Oligoclonics), i polipeptidi slični antitelu, kao što su himerna antitela i humanizovana antitela. Antitelo kako je dobijeno potencijalno može imati bilo koji izooblik. po potrebi odabran iz grupe koja se sastoji iz monovalentnog antitela, teškog lanca antitela, modifikovanog domena za izmenu lanca (SEED), triomab-a, imunoglobulina sa dvostrukim varijabilnim domenom (DVD-Ig), “knob-into-holes” antitela, mini-antitela, molekula za ponovno ciljanje sa dvostrukim afinitetom (Fc-DART ili Ig-DART); LUZ-Y antitela, Biclonic antitela, (DT)-Ig antitela sa dvostrukim ciljanjem (eng. Dual Targeting), dva-u-jedan antitela, unakrsno vezani Mab, mAb<2>, CovX-body, IgG-slično bispecifično antitelo, Ts2Ab, BsAb, HERCULES antitelo, TvAb, ScFv/Fc Fuziono antitelo, SCORPION, scFv fragment spojen sa Fc domenom, i dvostruki scFv fragment spojen sa Fc domenom.
[0231] U drugom izvođenju, antigen je eksprimiran na ćelijskoj površini.
[0232] U drugom izvođenju, ćelija je ćelija humanog tumora.
[0233] U drugom izvođenju, antigen je odabran iz grupe koja se sastoji iz erbB1 (EGFR), erbB2 (HER2), erbB3, erbB4, MUC-1, CD4, CD19, CD20, CD38, CD138, CXCR5, c-Met, HERV-proteina omotača, periostina, Bigh3, SPARC, BCR, CD79, CD37, EGFrvIII, IGFr, L1-CAM, AXL, Tkivnog faktora (TF), CD74, EpCAM i MRP3.
[0234] U drugom izvođenju, antigen je povezan sa ćelijskom membranom.
[0235] U drugom izvođenju, antigen je povezan sa virionom, opciono gde se antigen nalazi u proteinskom omotaču ili lipidnom omotaču viriona.
[0236] U drugom izvođenju, antitelo je humano antitelo, koje se opciono veže za bar jedan antigen koji je odabran od CD20 i CD38.
[0237] U drugom izvođenju, antitelo se veže za isti epitop kao bar jedan od 7D8 i 005, po potrebi sadrži region varijabilnog teškog i/ili varijabilnog lakog lanca bar jednog od 7D8 i 005.
[0238] U bilo kojoj upotrebi prema predmentom pronalasku antitelo be bilo koje mutacije iz predmetnog prikaza može biti bilo koje matično antitelo. Prema tome, ovde navedene upotrebe obezbeđuju bilo koje varijante takvih matičnih antitela.
[0239] U drugom izvođenju iz predmetnog prikaza , efektorska funkcija je Fc-posredovana efektorska funkcija koja je izabrana od vezivanja C1q, aktivacije komplementa, citotoksičnosti koja zavisi od komplementa (CDC), ćelijski posredovane citotoksičnosti koja zavisi od antitela (ADCC), FcRn-vezivanja, vezivanja Fc-receptora uključujući vezivanje Fc-gama receptora, Protein A-vezivanje, Protein Gvezivanje, ćelijska fagocitoza koja je zavisna od antitela (ADCP), ćelijska citotoksičnost koja zavisi od komplementa (CD-CC), komplementom pojačana citotoksičnost, opsonizacija, internalizacija polipeptida koji sadrži Fc, ciljna smanjena modulacija, ADC unos, indukcija apoptoze, ćelijska smrt, zaustavljanje ćelijskog ciklusa, i bilo koja njihova kombinacija.
[0240] U posebnom izvođenju efektorska funkcija je vezivanje C1q, aktivacija komplementa (C1q efikasnost) citotoksičnost koja zavisi od komplementa (CDC), ćelijski posredovana citotoksičnost koja zavisi od antitela (ADCC), vezivanje Fc-receptora, npr vezivanje Fc-gama receptora, internalizacija polipeptida koji sadrži Fc ili bilo koja njihova kombinacija.
[0241] U jednom izvođenju efektorska funkcija je vezivanje C1q.
[0242] U jednom izvođenju efektorska funkcija je aktivacija komplementa (C1q efikasnost).
[0243] U jednom izvođenju efektorska funkcija je citotoksičnost koja zavisi od komplementa (CDC).
[0244] U jednom izvođenju efektorska funkcija je ćelijski posredovana citotoksičnost koja zavisi od antitela (ADCC).
[0245] U jednom izvođenju efektorska funkcija je vezivanje Fc-receptora, npr. uključujući vezivanje Fcgama receptora.
[0246] U jednom izvođenju efektorska funkcija je internalizacija polipeptida koji sadrži Fc.
[0247] U jednom izvođenju efektorska funkcija je kombinacija citotoksičnosti koja zavisi od komplementa (CDC) i ćelijski posredovane citotokičnosti koja zavisi od antitela (ADCC).
[0248] U drugom izvođenju, jedna ili više mutacija povećavaju dalju efektorsku funkciju koja je izabrana od vezivanja FcRn, ADCC, vezivanja Fc-gama receptora, Protein A-vezivanja, Protein G-vezivanja, ADCP, ćelijske citotoksičnosti koja zavisi od komplementa (CDCC), citotoksičnosti koja je pojačana komplementom, vezivanja za receptor komplementa opsonizovanog antitela posredovano sa antitelom, i bilo koja njihova kombinacija.
[0249] U drugom aspektu, prikaz se odnosi na postupak za povećanje aviditeta preparata matičnog antitela za C1q, koji obuhvata korak mutiranja bar jedne aminokiseline u Fc-regionu antitela, pri čemu je bar jedna aminokiselina izabrana iz grupe koja se sastoji od E345, E430, S440, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Q386, Y436, i K447.
[0250] Kao što se ovde koristi, termin "vezivanje-C1q", kada je korišćen u kontekstu varijante ili antitela matičnog antitela uključuje bilo koji mehanizam prve komponente u klasičnom putu aktivacije komplementa posredovano sa vezivanjem varijante ili antitela za tkiva domaćina ili faktore, uključujući različite ćelije imunog sistema (kao što su efektorske ćelije). C1q-vezivanje antitela može se proceniti korišćenjem ELISA (kao što je npr. ELISA vezivanja C1q korišćeno u Primerima 3 i 4), ili C1q efikasnost može biti ispitana pomoću testa CDC (kao što je npr. CDC test koji je korišćen u Primeru 5). U drugom izvođenju, aviditet vezivanja C1q antitela je određen prema testu koji je opisan u Primeru 4.
[0251] U svim postupcima prema predmetnom prikazu antitelo bez bilo kojih mutacija iz predmetnog prikaza može biti bilo koje matično antitelo. Prema tome, ovde navedeni postupci obezbeđuju bilo koje varijante takvih matičnih antitela.
[0252] Matično antitelo, prvo matično antitelo, drugo matično antitelo, ili njihove varijante koje su dobijene postupcima i/ili upotrebama iz predmetnog prikaza mogu se vezati za bilo koju metu kao što je ovde opisano.
[0253] Primeri antitela ili meta koji su ovde takođe prikazani su; 5T4; ADAM-10; ADAM-12; ADAM17; AFP; AXL; ANGPT2 anthrax antigen; BSG; CAIX; CAXII; CA 72-4; antigen koji je povezn sa karcinomom CTAA16.88; CCL11; CCL2; CCR4; CCR5; CCR6; CD2; CD3E; CD4; CD5; CD6; CD15; CD18; CD19; CD20; CD22; CD24; CD25; CD29; CD30; CD32B; CD33; CD37; CD38; CD40; CD40LG; CD44; CD47; CD52; CD56; CD66E; CD72; CD74; CD79a; CD79b; CD80; CD86; CD98; CD137; CD147; CD138; CD168; CD200; CD248; CD254; CD257; CDH3; CEA; CEACAM5; CEACAM6; CEACAM8; Claudin4; CS-1; CSF2RA; CSPG-4; CTLA4; Cripto; DLL4; ED-B; EFNA2; EGFR; Endotelin B receptor; ENPP3; EPCAM; ERBB2; ERBB3; FAP alfa; Fc gama RI; FCER2; FGFR3; fibrin II beta lanac; FLT1; FOLH1; FOLR1; FRP-1; GD3 gangliozid; GDF2; GLP1R; Glipikan-3; GPNMB; HBV (hepatitis B virus); HCMV (humani citomegalovirus); homolog proteina toplotnog šoka 90 homolog [Candida albicans]; gD glikoprotein hepes simpleks virusa; HGF; HIV-1; HIV-1 IIIB gp120 V3 loop; HLA-DRB (HLA-DR beta); humani respiratorni sincicijalni virus, glikoprotein F; ICAM1; IFNA1; IFNA1; IFNB1 bispecifični; IgE Fc; IGF1R; IGHE region za povezivanje; IL12B; IL13; IL15; IL17A; IL1A; IL1B; IL2RA; IL4; IL5; IL5RA; IL6; IL6R; IL9; interleukin-2 receptor beta podjedinica; ITGA2; ITGA2B ITGB3; ITGA4 ITGB7; ITGA5; ITGAL; ITGAV_ITGB3; ITGB2; KDR; L1CAM; Lewis-y; lipid A, domen lipopolisaharida LPS; LTA; MET; MMP14; MMp15; MST1R; MSTN; MUC1; MUC4; MUC16; MUC5AC; NCA-90 granulocitni ćelijski antigen; Nektin 4; NGF; NRP; NY-ESO-1; OX40L; PLAC1; PLGF; PDGFRA; PD1; PDL1; PSCA; fosfatidilserin; PTK-7; Pseudomonas aeruginosa serotip IATS O11; RSV (humani respiratorni sincicijalni virus, glikoprotein F); ROR1; RTN4; SELL; SELP; STEAP1; Shiga-sličan toksin II B pojedinica [Escherichia coli]; SLAM7; SLC44A4; SOST; Staphylococcus epidermidis lipoteihoična kiselina; T ćelijski receptor alfa_beta; TF; TGFB1; TGFB2; TMEFF2; TNC; TNF; TNFRSF10A; TNFRSF10B; TNFRSF12A; TNFSF13; TNFSF14; TNFSF2; TNFSF7; TRAILR2; TROP2; TYRP1; VAP-1; i Vimentin.
Postupci pokretanja efektorskog odgovora
[0254] Treba razumeti da svako od ovde opisanih izvođenja sa referencom na matično antitelo, prvo matično antitelo ili i drugo matično antitelo takođe treba razumeti kao izvođenja koja se odnose na matični, prvi matični ili drugi matični polipeptid koji sadrži Fc-domen imunoglobulina i region za vezivanje.
[0255] U daljem glavnom aspektu predmetni prikaz se odnosi na postupak za indukciju efektorskog odgovora, protiv ćelije, ćelijske membrane, ili viriona koji eksprimiraju metu za koju se veže matični polipepid koji sadrži Fc-domen imunoglobulina i regione za vezivanje, koji sadrže
(i) obezbeđivanje matičnog polipeptida ili kombinacije od bar prvog matičnog polipeptida i drugog matičnog polipeptida koji je mutiran prema bilo kom od zahteva 1 do 24; i
(ii) dovođenje u kontakt mutiranog matičnog polipeptida iz koraka (i) ili mutirana kombinacija bar prvog matičnog polipeptida i drugog matičnog polipeptida u koraku (i) sa ćelijom, ćelijskom membranom, ili virionom koji eksprimira antigen u prisustvu humanog komplementa ili efektorske ćelije.
[0256] U jednom izvođenju bilo koji ili svaki od polipeptida, prvog matičnog polipeptida i drugog matičnog polipeptida može biti antitelo.
[0257] Prema tome u jednom izvođenju predmetni prikaz odnosi se na postupke korišćenja varijante antitela koje su ovde opisane za indukovanje efektorskog odogovra, npr. aktivacije komplementa, CDC ili drugi efektorski odgovor protiv ćelije, ćelijske membrane, virion ili druga čestica koja je povezana sa antigenom ili antigenima. Predmetni prikaz se takođe odnosi na postupak za indukovanje efektorskog odgovora, protiv ćelije, ćelijske membrane, ili virion koji eksprimira antigen za koje se matično antitelo antitelo veže, koji obuhvata
(i) obezbeđivanje matičnog antitela ili kombinacije bar prvog matičnog antitela i drugog matičnog antitela koje je mutirano prema bilo kom od postupaka koji su ovde opisani; i
(ii) dovođenja u kontakt preparata mutiranog matičnog antitela prema koraku (i) ili mutirana kombinacija bar prvog matičnog antitela i drugog matičnog antitela prema koraku (i) sa ćelijom, ćelijskom membranom, ili virionom koji je eksprimiran u prisustvu humanog komplementa ili efektorske ćelije.
[0258] Matično antitelo, prvo matično antitelo i drugo matično antitelo može svako da bude izabrano iz bilo kog matičnog antitela koje je ovde opisano, posebno bilo koje gore opisano u vezi sa postupcima koji pogađaju efektorsku funkciju antitela. U jednom izvođenju, antigen je eksprimiran na ćelijskoj površini.
[0259] U jednom izvođenju, ćelija je humana tumorska ćelija.
[0260] U drugom izvođenju, antigen je izabran iz grupe koja se sastoji iz erbB1 (EGFR), erbB2 (HER2), erbB3, erbB4, MUC-1, CD4, CD19, CD20, CD38, CD138, CXCR5, c-Met, HERV-proteina omotača, periostina, Bigh3, SPARC, BCR, CD79, CD37, EGFrvIII, IGFr, L1-CAM, AXL, Tkivnog faktora (TF), CD74, EpCAM i MRP3.
[0261] U drugom izvođenju, antigen je povezan sa ćelijskom membranom.
[0262] U drugom izvođenju, antigen je povezan sa virionom, opciono gde se antigen nalazi u proteinskom omotaču ili lipidnom omotaču viriona.
[0263] U drugom izvođenju, the antitelo je humano antitelo, koje se opciono veže za najmanje jedan antigen koji je izabran od CD20 i CD38.
[0264] U drugom izvođenju, antitelo se veže za isti epitop kao bar jedan od 7D8 i 005, opciono koji sadrži region varijabilnog teškog i/ili varijabilnog lakog lanca bar jednog od 7D8 i 005.
[0265] U drugom izvođenju iz predmetnog prikaza, indukovani efektorski odgovor je citotoksičnost koja je zavisna od komplementa (CDC), efektorski odgovor koji je posredovan sa Fc koji je izabran od efektorskog odgovora koji je posredovan sa Fc koji je odabran između vezivanja C1q, aktivacije komplementa, citotoksičnosti koja zavisi od komplementa (CDC), ćelijski posredovane citotoksičnosti koja zavisi od antitela (ADCC), vezivanja FcRn, vezivanja Fc-receptora uključujući vezivanje Fc-gama receptora, Protein A-vezivanje, Protein G-vezivanje, ćelijska fagocitoza koja zavisi od antitela (ADCP), ćelijska citotoksičnost koja zavisi od antitela (CDCC), citotoksičnost koja je pojačana komplementom, opsonizacija, internalizacija polipeptida koji sadrži Fc, ciljna smanjena regulacija, unos ADC, indukcija apoptoze, ćelijska smrt, zastoj u ćelijskom ciklusu, i bilo koja njihova kombinacija.
[0266] U posebnom izvođenju efektorski odgovor je vezivanje C1q, aktivacija komplementa (C1q efikasnost), citotoksičnost koja zavisi od komplementa (CDC), citotoksičnost koja je posredovana ćelijama koja zavisi od antitela (ADCC), vezivanje Fc-receptora, npr. vezivanje Fc-gama receptora, internalizacija polipeptida koji sadrži Fc ili bilo koja njihova kombinacija.
[0267] U jednom izvođenju efektorski odgovor je vezivanje C1q.
[0268] U jednom izvođenju efektorski odgovor je aktivacija komplementa (C1q efikasnost).
[0269] U jednom izvođenju efektorski odgovor je citotoksičnost koja zavisi od komplementa (CDC).
[0270] U jednom izvođenju efektorski odgovor je ćelijski posredovana citotoksičnost koja zavisi od antitela (ADCC).
[0271] U jednom izvođenju efektorski odgovor je vezivanje Fc-receptora, npr. uključujući vezivanje Fcgama receptora.
[0272] U jednom izvođenju efektorski odgovor je internalizacija polipeptida koji sadrži Fc.
[0273] U jednom izvođenju efektorski odgovor je kombinacija citotoksičnosti koja zavisi od komplement (CDC) i ćelijski posredovane citotoksičnosti koja zavisi od antitela (ADCC).
[0274] U drugom izvođenju, postupak povećava dalji efektorski odgovor koji je izabran od vezivanja FcRn, ADCC, vezivanja Fc-gama receptora, Protein A-vezivanja, Protein G-vezivanja, ADCP, ćelijske citotoksičnosti koja zavisi od komplementa (CDCC), citotoksičnosti pojačane komplementom, vezivanje za receptor komplementa opsonizovanog antitela posredovanog sa antitelom, i bilo koja njihova kombinacija.
[0275] U drugom aspektu, prikaz se odnosi na postupak za povećanje aviditeta preparata matičnog antitela za C1q, koji obuhvata korak mutiranja bar jedne aminokiseline u Fc-regionu antitela, pri čemu je bar jedna aminokiselina izabrana iz grupe koja se sastoji iz E345, E430, S440, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Q386, Y436, i K447.
[0276] Primeri antigena ili meta koji su ovde takođe prikazani i mogu biti usmereni protiv su; 5T4; ADAM-10; ADAM-12; ADAM17; AFP; AXL; ANGPT2 anthrax antigen; BSG; CAIX; CAXII; CA 72-4; antigen povezan sa karcinomom CTAA16.88; CCL11; CCL2; CCR4; CCR5; CCR6; CD2; CD3E; CD4; CD5; CD6; CD15; CD18; CD19; CD20; CD22; CD24; CD25; CD29; CD30; CD32B; CD33; CD37; CD38; CD40; CD40LG; CD44; CD47; CD52; CD56; CD66E; CD72; CD74; CD79a; CD79b; CD80; CD86; CD98; CD137; CD147; CD138; CD168; CD200; CD248; CD254; CD257; CDH3; CEA; CEACAM5; CEACAM6; CEACAM8; Klaudin4; CS-1; CSF2RA; CSPG-4; CTLA4; Cripto; DLL4; ED-B; EFNA2; EGFR; Endothelin B receptor; ENPP3; EPCAM; ERBB2; ERBB3; FAP alfa; Fc gama RI; FCER2; FGFR3; fibrin II beta lanac; FLT1; FOLH1; FOLR1; FRP-1; GD3 gangliozid; GDF2; GLP1R; Glipikan-3; GPNMB; HBV (hepatitis B virus); HCMV (humani citomegalovirus); homolog toplotnog proteina 90 [Candida albicans]; herpes simpleks virus gD glikoprotein; HGF; HIV-1; HIV-1 IIIB gp120 V3 petlja; HLA-DRB (HLA-DR beta); humani respiratorni sincicijalni virus, glikoprotein F; ICAM1; IFNA1; IFNA1; IFNB1 bispecifični; IgE Fc; IGF1R; IGHE region za povezivanje; IL12B; IL13; IL15; IL17A; IL1A; IL1B; IL2RA; IL4; IL5; IL5RA; IL6; IL6R; IL9; interleukin-2 receptor beta podjedinica; ITGA2; ITGA2B ITGB3; ITGA4 ITGB7; ITGA5; ITGAL; ITGAV_ITGB3; ITGB2; KDR; L1CAM; Lewis-y; lipid A, domain lipopolisaharida LPS; LTA; MET; MMP14; MMp15; MST1R; MSTN; MUC1; MUC4; MUC16; MUC5AC; NCA-90 granulocitni ćelijski antigen; Nectin 4; NGF; NRP; NY-ESO-1; OX40L; PLAC-1; PLGF; PDGFRA; PD1; PDL1; PSCA; fosfatidilserin; PTK-7; Pseudomonas aeruginosa serotip IATS O11; RSV (humani respiratorni sincicijalni virus, glikoprotein F); ROR1; RTN4; SELL; SELP; STEAP1; Shiga-slični toksin II B pojedinica [Escherichia coli]; SLAM7; SLC44A4; SOST; Staphylococcus epidermidis lipoteihoična kiselina; T ćelijski receptor alfa_beta; Tkivni faktor (TF); TGFB1; TGFB2; TMEFF2; TNC; TNF; TNFRSF10A; TNFRSF10B; TNFRSF12A; TNFSF13; TNFSF14; TNFSF2; TNFSF7; TRAILR2; TROP2; TYRP1; VAP-1; i Vimentin.
[0277] U jednom izvođenju, ćelija je humana tumorska ćelija ili bakterijska ćelija.
[0278] U drugom izvođenju, antigen je izabran iz grupe koja se sastoji iz erbB1 (EGFR), erbB2 (HER2), erbB3, erbB4, MUC-1, CD4, CD19, CD20, CD25, CD32, CD37, CD38, CD74, CD138, CXCR5, c-Met, HERV-proteina omotača, periostina, Bigh3, SPARC, BCR, CD79, EGFrvIII, IGFr, L1-CAM, EpCAM i MRP3.
[0279] U drugom izvođenju, antigen je CD20 ili CD38.
[0280] U drugom izvođenju, IgG1 matično antitelo je humano IgG1 antitelo.
[0281] U drugom izvođenju, matično antitelo je izabrano od 7D8 i 005.
[0282] U jednom izvođenju, ćelija je humana tumorska ćelija.
[0283] U drugom izvođenju, prvi i drugi antigeni su odvojeno odabrani iz grupe koja se sastoji iz erbB1 (EGFR), erbB2 (HER2), erbB3, erbB4, MUC-1, CD4, CD19, CD20, CD25, CD32, CD37, CD38, CD74, CD138, CXCR5, c-Met, HERV-proteina omotača, periostina, Bigh3, SPARC, BCR, CD79, EGFrvIII, IGFr, L1-CAM, AXL, Tkivnog faktora (TF), EpCAM i MRP3.
[0284] U drugom izvođenju, prvo i drugo matično antitelo su potpuno humana, opciono gde prvo I drugo matično antitelo vežu antigene koji su zasebno odabrani od CD20 i CD38.
[0285] U drugom izvođenju, prvo i drugo matično antitelo su zasebno odabrani od 7D8 i 005.
[0286] U još drugom izvođenju, ćelija je bakterijska ćelija.
[0287] U drugom izvođenju, bakterijska ćelija je izabrana iz grupe koja se sastoji iz S. aureus, S.Epidermidis, S. pneumonia, Bacillus anthracis, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia, E. coli, Salmonella, Shigella, Yersinia, S. typhimurium, Neisseria meningitides i Mycobacterium tuberculosis.
[0288] U drugom izvođenju, prvi i/ili drugi antigen je Lipoteihoična kiselina (LTA), opciono gde bar jedno od prvog i drugog matičnog antitela je pagibaksimab.
[0289] U drugom izvođenju, antigen je eksprimiran na virionu.
[0290] U drugom izvođenju, prvo i drugo antitelo veže isti antigen.
[0291] U drugom izvođenju, prvo i drugo antitelo sadrži istu VH sekvencu, VL sekvencu, ili obe VH i VL sekvencu.
[0292] Za svrhu predmetnog prikaza, ciljna ćelija koja eksprimira ili je na drugi način povezana sa antigenom može biti bilo koja prokariotska ili eukariotska ćelija. Primer ćelija koje eksprimiraju antigen uključuje, ali nisu ograničene na, sisarske ćelije, posebno humane ćelije, kao što su ćelije kancera kod ljudi; i jednoćelijski organizmi kao što su bakterije, protozoe, i jednoćelijske gljive kao što su ćelije kvasca. Ćelijske membrane koje sadrže ili su na drugi način povezane sa antigenom uključuju parcijalnu i/ili narušene ćelijske membrane koje su nastale iz ćelije koja eksprimira antigen. Antigen koji je povezan sa virionom ili česticom virusa može se sastojati iz ili na drugi način biti povezan sa proteinskim omotačem i/ili lipidnim omotačem viriona.
[0293] Ciljna ćelija može, na primer, biti ćelija tumora kod čoveka. Odgovarajući tumorski antigeni uključuju bilo koju metu ili antigen koji je ovde opisan, ali nisu ograničeni na, erbB1 (EGFR), erbB2 (HER2), erbB3, erbB4, MUC-1, CD4, CD19, CD20, CD25, CD32, CD37, CD38, CD74, CD138, CXCR5, c-Met, HERV-protein omotača, periostin, Bigh3, SPARC, BCR, CD79, EGFrvIII, IGFR, L1-CAM, AXL, Tkivni faktor (TF), EpCAM i MRP3. Poželjni antigeni uključuju CD20, CD38, HER2, EGFR, IGFR, CD25, CD74 i CD32. Primeri antitela uključiju anti-CD20 antitelo 7D8 kao što je prikazano u WO 2004/035607, anti-CD38 antitelo 005 kao što je prikazano u WO 06/099875, anti-CD20 antitelo 11B8 kao što je prikazano u WO 2004/035607, anti-CD38 antitelo 003 kao što je prikazano u WO 06/099875, anti-EGFr antitelo 2F8 kao što je prikazano u WO 02/100348. Ovde su takođe obezbeđeni primeri drugih posebnih antitela.
[0294] Alternativno, ciljna ćelija može biti bakterijska ćelija, kao što je, npr., S. aureus, S. epidermidis, S. pneumonia, Bacillus anthracis, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia, E. coli, Salmonella, Shigella, Yersinia, S. typhimurium, Neisseria meningitides i Mycobacterium tuberculosis. Primeri antigena uključuju Lipoteihoičnu kiselinu (LTA), i primeri antitela uključuju pagibaksimab.
4
[0295] Alternativno, meta se može naći na površini virua, ćelije gljive ili druge čestice, kao što su, npr., virus zapadnog nila, denga virus, hepatitis C-virus (HCV), virus humane imunodeficijencije (HIV), humani papilomavirus, Epštajn-Barov virus, Herpesvirusi, virusi malih boginja, ptičji virus gripa, RVS, Aspergillus, Candida albicans, Cryptococcus, i Histoplasma.
[0296] U jednom izvođenju, korak dovođenja u kontakt (ii) odvija se in vitro.
[0297] U jednom izvođenju, korak dovođenja u kontakt (ii) odvija se in vivo.
[0298] U drugom izvođenju, korak (ii) obuhvata davanje varijanti subjektu.
[0299] U drugom izvođenju, subjekat pati od kancera, bakterijske infekcije, ili virusne infekcije. Korak dovođenja u kontakt (ii) gore pomenutih izvođenja može se odvijati in vitro ili in vivo. U posledenjem slučaju, korak (ii) može dalje obuhvatiti davanje jednog preparata ili više subjektu, pri čemu subjekat opciono pati od kancera ili bakterijske infekcije. Ostali detalji na terapeutskim primenama su obezbeđeni u tekstu ispod.
[0300] Prvo i drugo antitelo sadrži regione koji vežu antigen koji se mogu vezati za isti ili različiti epitop. Takvi epitopi mogu biti na istoj ili različitoj meti.
[0301] U izvođenju, prvo i drugo antitelo veže različite epitope na različitim metama. Takve mete mogu biti eksprimirane na istoj ćeliji ili ćelijskom tipu, ili mogu biti eksprimirane na različitim ćelijama ili ćelijskim tipovima. U takvom izvođenju, pojačanje efektorske funkcije je usmereno samo prema ćelijama ili ćelijskim tipovima koji eksprimiraju obe mete, pri čemu se smanjuje rizik od bilo kojeg kolateralnog oštećenja ćelija ili ćelijskih tipova koja nisu uzrok bolesti koja se leči.
[0302] Bez vezivanja za bilo koju teoriju, veruje se da pojačanje CDC može biti ograničeno na ciljne ćelije koje eksprimiraju dve specifične mete/antigene istovremeno obezbeđujući da prvo i drugo antitelo vežu epitope koji se nalaze na istoj ćeliji, na taj način koristeći kombinovanu ekspresiju meta da bi se poboljšala selektivnost indukcija CDC sadržaja.
[0303] U slučajima u kojima su mete eksprimirane na različitim ćelijama ili ćelijskim tipovima, veruje se bez vezivanja za teoriju, da će se davanjem bilo kojim redom prvog i drugog antitela poboljšati pojačanje CDC i moguće takođe druge efektorske funkcije "regrutovanja" druge ćelije ili ćelijskog tipa koji eksprimira drugu metu.
[0304] U jednom izvođenju kada je korišena kombinacija prvog i drugog antitela, korak (ii) se može izvesti istovremeno, odvojeno, ili sekvencijalno dovođenjem u kontakt ćelije sa mutiranim prvim i drugim matičnim antitelima u prisustvu humanog komplementa i/ili efektorske ćelije.
[0305] U još drugom aspektu, prikaz se odnosi na postupak unapređenja sposobnosti indukovanja CDC-preparata matičnog antitela, koji sadrži korak mutiranja bar jedne aminokiseline u Fc-regionu antitela, pri čemu je poslednja aminokiselina izabrana iz grupe koja se sastoji iz E345, E430, S440, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Q386, Y436, i K447.
[0306] U alternativnom aspektu, predmetni prikaz se odnosi na postupak indukovanja efektorskog odgovora, opciono CDC-odgovora, protiv ćelije, ćelijske membrane, ili viriona koji eksprimira antigen za koji se veže IgG1 matično antitelo, koji obuhvata
(i) obezbeđivanje antitela koje sadrži mutaciju u bar jednom aminokiselinskom ostatku izabranom iz grupe koja se sastoji iz E345, E430, S440, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Q386, Y436, i K447 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1; i
(ii) dovođenja u kontakt preparata antitela sa ćelijom, ćelijskom membranom, ili virionom u prisustvu humanog komplementa ili efektorske ćelije.
[0307] U drugom alternativnom izvođenju , postupak dalje obuhvata davanje prvog antitela koje sadrži prvu mutaciju u bar jednom aminokiselinskom ostatku izabranom iz onog koji odgovara E345, E430, S440, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Q386, Y436, i K447 u Fc-regionu prvog antitela; davanje drugog antitela koje sadrži drugu mutaciju u bar jednom aminokiselinskom ostatku izabranom iz onih koji odgovaraju E345, E430, S440, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Q386, Y436, i K447 u Fc-regionu drugog antitela; pri čemu se prva i druga antitela mogu davati istovremeno, odvojeno ili sekvencijalno. Prvo i drugo antitelo mogu da se vežu za isti ili različiti epitope na istoj ili različitoj meti. Met(a)e se mogu nalaziti na istoj ili različitoj ćeliji ili ćelijskim tipovima.
[0308] U drugom alternativnom aspektu, prikaz se odnosi na postupak poboljšanja sposobnosti indukovanja CDC od strane IgG1 matičnog antitela, koji obuhvata mutacijuat bar jedne aminokiseline u Fc-regionu antitela, pri čemu je bar jedna aminokiselina izabrana iz grupe koja se sastoji iz E345, E382 i H433.
[0309] U drugom alternativnom aspektu, prikaz se odnosi na postupak indukovanja efektorskog odgovora, opciono CDC-odgovora, protiv ćelije, ćelijske membrane, ili viriona koji eksprimira antigen za koji se veže IgG1 matično antitelo, obuhvatajući korake
(i) obezbeđivanja varijante matičnog antitela koja sadrži mutaciju u bar jednoj aminokiselini u Fcregionu antitela, bar jedna aminokiselina je izabrana i grupe koja se sastoji iz E345, E382 i H433; i
(ii) dovođenja u kontakt preparata varijante sa ćelijom u prisustvu humanog komplementa ili efektorske ćelije.
[0310] U drugom alternativnom aspektu, prikaz se odnosi na postupak indukovanja efektorskog odgovora, opciono CDC-odgovora, protiv ćelije koja eksprimira antigen za koji se veže matično IgG1 antitelo, obuhvatajući korake
(i) obezbeđivanja varijante matičnog antitela koja sadrži K439E i S440K mutacije u Fc-regionu of antitela; i
(ii) dovođenja u kontakt preparata varijante sa ćelijom u prisustvu humanog komplementa ili efektorske ćelije.
[0311] U drugom alternativnom aspektu, prikaz se odnosi na postupak indukovanja CDC-odgovora protiv ćelije, ćelijske membrane ili viriona koji eksprimira prvi antigen za koji se veže IgG1 matično antitelo i drugi antigen za koji se veže drugo matično antitelo, obuhvatajući korake
(i) obezbeđivanja prve varijante prvog matičnog antitela koja sadrži K439E mutaciju i druge varijante drugog matičnog antitela koje sadrži S440K mutaciju; i
(ii) istovremeno, odvojeno ili sekvencijalno dovođenje u kontakt ćelije sa prvim i drugim varijantama u prisustvu humanog komplementa i/ili efektorske ćelije.
[0312] U drugom alternativnom aspektu, prikaz obezbeđuje za postupak indukovanja CDC-ili drugog efektorskog odgovora protiv ciljne ćelije, ćelijske membrane, viriona ili druge čestice koja je povezana sa antigenom za koji se veže IgG1 ili IgG3 antitelo, koji obuhvata korake (i) obezbeđivanja varijante antitela koja sadrži mutaciju u bar jednoj aminokiselini koji odgovara E345, E430 ili S440 u Fc-regionu IgG1 antitela; i (ii) dovođenja u kontakt preparata varijante sa ćelijom u prisustvu humanog komplementa i/ili efektorske ćelije.
[0313] U daljem alternativnom aspektu, prikaz obezbeđuje za postupak indukovanja ADCC ili ADCP protiv, ili fagocitozu, ciljne ćelije, ćelijske membrane, viriona ili druge čestice koja je povezana sa antigenom za koji se veže IgG1 ili IgG3 antitelo, koji obuhvata korake (i) obezbeđivanja varijante antitela koja sadrži mutaciju u bar jednoj aminokiselini koja odgovara E345, E430 ili S440 u Fc-regionu IgG1 antitela; i (ii) dovođenja u kontakt preparata varijante sa ćelijom u prisustvu efektorske ćelije.
[0314] Prikaz takođe obezbeđuje za postupak indukovanja CDC ili drugog efektorskog odgovora protiv ciljne ćelije, ćelijske membrane, viriona ili druge čestice koja je povezana sa antigenom za koji se veže IgG1 ili IgG3 antitelo, koji obuhvata korake (i) obezbeđivanja varijante antitela koja sadrži mutaciju u K439 koja je K439E i mutaciju u S440 koja je S440K ili S440R u Fc-regionu antitela; i (ii) dovođenja u kontakt preparata varijante sa ćelijom u prisustvu humanog komplementa i/ili efektorske ćelije
[0315] Prikaz takođe obezbeđuje za postupak indukovanja CDC ili drugog efektorskog odgovora protiv ciljne ćelije, ćelijske membrane, viriona koji eksprimira prvi antigen za koji se veže prvo IgG1 antitelo I drugi antigen za koji se veže drugo antitelo, koji obuhvata korake (i) obezbeđivanja prve varijante koja je prvo antitelo koje sadrži K439E mutaciju i druge varijante koja je drugo antitelo koje sadrži S440K ili S440R mutaciju; i (ii) istovremeno, odvojeno ili sekvencijalno dovođenje u kontakt ćelije sa preparatima prvih i drugih varijanti u prisustvu humanog komplementa ili efektorske ćelije.
[0316] U odvojenim i specifičnim izvođenjima, prva i druga antitela se vežu za (i) različite antigene; (ii) različite epitope na istom antigenu, (iii) isti epitop na antigenu, i (iv) isti epitope na antigenu i sadrže iste VH i/ili VL sekvence.
[0317] U jednom izvođenju, prva i druga antitela dalje sadrže mutaciju u jednom ili više E345, E430 i S440, kao što je E345R. U jednom izvođenju, prva i druga antitela dalje sadrže mutaciju u jednom ili više E345, E382 i H433, kao što je E345R.
Drugi postupci
[0318] U drugom glavnom aspektu, prikaz se odnosi na postupak identifikovanja mutacije u antitelu koja pojačava efektorsku funkciju antitela za vezivanje sa C1q, koji se sastoji iz koraka
(i) pripreme bar jednog antitela koje sadrži mutaciju u bar jednoj aminokiselini koja je izabrana iz grupe koja se sastoji iz E345, E430, S440, K439, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Q386, Y436, i K447;
(ii) ispitivanja aktivnosti C1q antitela kada se veže za površinu ćelije koja eksprimira antigen u poređenju sa matičnim antitelom; i
(iii) odabir mutacije iz bilo koje varijante koja ima povećan aviditet za C1q.
[0319] U jednom izvođenju, bar jedno antitelo sadrži bar jednu aminokiselinsku supstituciju koja je izabrana iz grupe E345R, E345Q, E345N, E345K, E345Y, E430T, E430S, E430G, E430F, E430H, S440W i S440Y.
[0320] U još drugom glavnom aspektu, prikaz se odnosi na postupak identifikovanja mutacije u matičnom antitelu koja povećava sposobnost antitela da indukuje CDC-odgovor, obuhvatajući korake
(i) pripreme bar jedne varijante matičnog antitela koja sadrži mutaciju u bar jednoj aminokiselini koja je izabrana iz grupe koja se sastoji iz E345, E430, S440, K439, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Q386, Y436, i K447;
4
(ii) ispitivanja odgovora CDC koji se indukuje varijantom kada je vezana za površinu ćelije koja eksprimira antigen, u prisustvu efektorskih ćelija ili komplementa, u poređenju sa matičnim antitelom; i
(iii) odabira mutacije iz bilo koje varijante sa povećanim odgovorom CDC.
[0321] U jednom izvođenju, bar jedna aminokiselina je izabrana od E345, E382 i H433.
[0322] U jednom izvođenju, bar jedno antitelo sadrži bar jednu aminokiselinsku supstituciju koja je izabrana iz grupe E345R, E345Q, E345N, E345K, E345Y, E430T, E430S, E430G, E430F, E430H, S440W i S440Y.
[0323] U drugom aspektu, prikaz se odnosi na, postupak povećanja aviditeta preparata IgG1 matičnog antitela za C1q, koji obuhvata mutiranje bar jedne aminokiseline u Fc-regionu antitela, pri čemu je bar jedno antitelo izabrano iz grupe koja se sastoji iz E345, E382 i H433.
Antitela iz predmetnog prikaza
Matična antitela
[0324] Kao što je ovde opisano, predmetni pronalazak inter alia se odnosi na varijante matičnih antitela koje sadrže jednu ili više mutacija u CH2 i/ili CH3 regionu imunoglobulina, npr. u teškom lancu antitela. "Matična" antitela, koja mogu biti divlji tip antitela, koriste se kao polazni materijal predmetnog pronalaska pre modifikovanja mogu se npr. proizvesti korišćenjem postupka hibridoma koji je prvobitno opisan od strane Kohler et al., Nature 256, 495 (1975), ili se mogu proizvesti korišćenjem postupaka rekominantne DNK. Monoklonska antitela se takođe mogu izolovati iz fagnih biblioteka antitela korišćenjem ovde opisanih postupaka, na primer, Clackson et al., Nature 352, 624628 (1991) i Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 597 (1991). Monoklonska antitela se mogu dobiti iz bilo kog odgovarajućeg izvora. Prema tome, na primer, monoklonska antitela se mogu dobiti iz hibridoma dobijenih iz B ćelija slezine miša koje se dobijaju iz miševa koji su imunizovani sa antigenom od interesa, na primer u obliku ćelija koje eksprimiraju antigen na površini, ili nukleinska kiselina koja kodira antigen od interesa. Monoklonska antitela se takođe mogu dobiti iz hibridoma koji su dobijeni iz ćelija koje eksprimiraju antitelo imunizovanih humanih bića ili ne-humanih sisara kao što su zečevi, pacovi, psi, primati, itd.
[0325] Matična antitela mogu biti npr. himerna ili humanizovana antitela. U drugom izvođenju, antitelo je humano antitelo. Humana monoklonska antitela se mogu dobiti korišćenjem transgenih ili transhromozomalnih miševa, npr. HuMAb miševa, koji nose delove humanog imunog sistema pre nego mišjeg sistema. HuMAb miš sadrži minilokus humanog imunoglobulinog gena koji kodira neuređene imunoglobulinske sekvence humanog teškog (µ i γ) i κ lakog lanaca, zajedno sa ciljanim mutacijama koje inaktiviraju endogeni lokus µ i κ lanca (Lonberg, N. et al., Nature 368, 856-859 (1994)). Prema tome, miševi ispoljavaju smanjenu ekspresiju mišjeg IgM ili κ i u odgovoru na imunizaciju, uvedeni transgeni humanog teškog i lakog lanca, prolaze kroz promenu klase i somatsku mutaciju da bi se dobila visoko afinitetna humana IgG,κ monoklonska antitela (Lonberg, N. et al. (1994), supra; pregled u Lonberg, N. Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49101 (1994), Lonberg, N. and Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. Vol.136593 (1995) i Harding, F. and Lonberg, N. Ann. N.Y. Acad. Sci 764536 546 (1995)). Dobijianje HuMAb miševa je detaljno opisano u Taylor, L. et al., Nucleic Acids Research 20, 62876295 (1992), Chen, J. et al., International Immunology 5, 647656 (1993), Tuaillon et al., J. Immunol. 152, 2912 2920 (1994), Taylor, L. et al., International Immunology 6, 579 591 (1994), Fishwild, D. et al., Nature Biotechnology 14, 845851 (1996). See also US 5,545,806, US 5,569,825, US 5,625,126, US 5,633,425, US 5,789,650, US 5,877,397, US 5,661,016, US 5,814,318, US 5,874,299, US 5,770,429, US 5,545,807, WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 i WO 01/09187. Splenociti iz ovih transgenih miševa se mogu koristiti za dobijanje hibridoma koji luče humana monoklonska antitela u skladu sa dobro poznatim postupcima.
[0326] Dalje, humana antitela iz predmetnog prikaza ili antitela iz predmetnog prikaza iz drugih vrsta mogu se identifikovati preko postupaka koji prikazuju vrstu, uključujući, bez ograničenja, fagni prikaz, retrovirusni prikaz, ribozomalni prikaz, sisarski prikaz, kvaščev prikaz i drugi postupci koji su oznati u oblasti tehnike, i dobijeni molekuli se mogu podvrgnuti dodatnom sazrevanju, kao što je sazrevanje afiniteta, kao što su postupci koji su poznati u oblasti tehnike. Posebna strategija, kao što je opisano u Primeru 17, može se primeniti na bilo koje antitelo da bi se pripremila i dobila varijanta iz pronalaska korišćenjem fagnog prikaza.
[0327] Matično antitelo nije ograničeno na antitela koja imaju prirodni, npr. humani Fc domen već takođe može biti antitelo koje ima druge mutacije osim onih u predmetnom pronalasku, kao što su npr. mutacije koje pogađaju glikozilaciju ili omogućuju da antitelo bude bispecifično antitelo. Pod terminom "prirodno antitelo" označeno je bilo koje antitelo koje ne sadrži bilo koju genetski uvedene mutacije. Antitelo koje sadrži modifikacije koje se nalaze u prirodi, npr. različiti alotipovi, takođe treba razumeti kao "prirodno antitelo" u smislu predmetnog pronalaska, i mogu se prema tome razumeti kao matično antitelo. Takva antitela mogu poslužiti kao matrica za jednu ili više mutacija prema predmetnom prikazu, i pomoću toga se obezbeđuju varijante antitela iz prikaza. Primer matičnog antitela koje sadrži druge mutacije od onih koje se navode u predmetnom pronalasku je bispecifično antitelo kao što je opisano u WO2011/131746 (Genmab), korišćenjem redukujućih uslova da se promoviše izmena polovine molekula dva antitela koja sadrže IgG4-slične CH3 regione, na taj način obrazujući bispecifična antitela bez istovremenog stvaranja agregata. Drugi primeri matičnih antitela uključuju ali nisu ograničeni na bispecifična antitela kao što su heterodimerni bispecifici: Triomabs (Fresenius); bispecifični IgG1 i IgG2 (Rinat neurosciences Corporation); FcΔAdp (Regeneron); “Knobsinto-holes” (Genentech); “Electrostatic steering” (Amgen, Chugai, Oncomed); SEEDbodies (Merck); Azymetric scaffold (Zymeworks); mAb-Fv (Xencor); i LUZ-Y (Genentch). Drugi primeri fromata matičnog antitela uključuju, bez ograničenja, divlji tip antitela, antitelo pune dužine ili fragment antitela koji sadrži Fc, humano antitelo, ili bilo koju njihovu kombinaciju.
[0328] Matično antitelo može vezati bilo koju metu, primeri takvih meta ili antigeni mogu biti, i bez ograničenja na, protiv kojih su usmereni; 5T4; ADAM-10; ADAM-12; ADAM17; AFP; AXL; ANGPT2 antigen antraksa; BSG; CAIX; CAXII; CA 72-4; antigen povezan sa karcinomom CTAA16.88; CCL11; CCL2; CCR4; CCR5; CCR6; CD2; CD3E; CD4; CD5; CD6; CD15; CD18; CD19; CD20; CD22; CD24; CD25; CD29; CD30; CD32B; CD33; CD37; CD38; CD40; CD40LG; CD44; CD47; CD52; CD56; CD66E; CD72; CD74; CD79a; CD79b; CD80; CD86; CD98; CD137; CD147; CD138; CD168; CD200; CD248; CD254; CD257; CDH3; CEA; CEACAM5; CEACAM6; CEACAM8; Claudin4; CS-1; CSF2RA; CSPG4; CTLA4; Cripto; DLL4; ED-B; EFNA2; EGFR; Endotelin B receptor; ENPP3; EPCAM; ERBB2; ERBB3; FAP alfa; Fc gama RI; FCER2; FGFR3; fibrin II beta lanac; FLT1; FOLH1; FOLR1; FRP-1; GD3 gangliozid; GDF2; GLP1R; Glipikan-3; GPNMB; HBV (hepatitis B virus); HCMV (humani citomegalovirus); homolog proteina toplotnog šoka 90 [Candida albicans]; herpes simpleks virus gD glikoprotein; HGF; HIV-1; HIV-1 IIIB gp120 V3 petlja; HLA-DRB (HLA-DR beta); humani respiratorni sincicijalni virus, glikoprotein F; ICAM1; IFNA1; IFNA1; IFNB1 bispecifični; IgE Fc; IGF1R; IGHE region za vezivanje; IL12B; IL13; IL15; IL17A; IL1A; IL1B; IL2RA; IL4; IL5; IL5RA; IL6; IL6R; IL9; interleukin-2 receptor beta podjedinica; ITGA2; ITGA2B ITGB3; ITGA4 ITGB7; ITGA5; ITGAL; ITGAV_ITGB3; ITGB2; KDR; L1CAM; Lewis-y; lipid A, domen lipopolisaharida LPS; LTA; MET; MMP14; MMp15; MST1R; MSTN; MUC1; MUC4; MUC16; MUC5AC; NCA-90 granulocitni ćelijski antigen; Nektin 4; NGF; NRP; NY-ESO-1; OX40L; PLAC-1; PLGF; PDGFRA; PD1; PDL1; PSCA; fosfatidilserin; PTK-7; Pseudomonas aeruginosa serotipa IATS O11; RSV (humani respiratorni sincicijalni
4
virus, glikoprotein F); ROR1; RTN4; SELL; SELP; STEAP1; Shiga-slični toksin II B podjedinica [Escherichia coli]; SLAM7; SLC44A4; SOST; Staphylococcus epidermidis lipoteihoična kiselina; T ćelijski receptor alfa_beta; TF; TGFB1; TGFB2; TMEFF2; TNC; TNF; TNFRSF10A; TNFRSF10B; TNFRSF12A; TNFSF13; TNFSF14; TNFSF2; TNFSF7; TRAILR2; TROP2; TYRP1; VAP-1; i Vimentin.
[0329] Matično antitelo može biti bilo koje humano antitelo bilo kog izotipa, npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgE, i IgD, opciono humano antitelo pune dužine, kao što je humano IgG1 antitelo pune dužine. Matično antitelo može imati sekvencu prema bilo kojoj od SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, i 5.
[0330] Monoklonska antitela, kao što je matično i/ili varijante, za upotrebu u predmetnom pronalasku, mogu se proizvesti, npr., postupkom hibridoma koji je prvobitno opisan od strane Kohler et al., Nature 256, 495 (1975), ili se mogu proizvesti postupcima rekombinantne DNK. Monoklonska antitela mogu se takođe izolovati iz fagnih biblioteka antitela korišćenjem ovde opisanih postupaka, na primer, Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991) i Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991). Monoklonska antitela se mogu dobiti iz bilo kog odgovarajućeg izvora. Prema tome, na primer, monoklonska antitela se mogu dobiti iz hibridoma dobijenih iz B ćelija slezine miša koje se dobijaju iz miševa koji su imunizovani sa antigenom od interesa, na primer u obliku ćelija koje eksprimiraju antigen na površini, ili nukleinska kiselina koja kodira antigen od interesa. Monoklonska antitela se takođe mogu dobiti iz hibridoma koji su dobijeni iz ćelija koje eksprimiraju antitelo imunizovanih humanih bića ili ne-humanih sisara kao što su zečevi, pacovi, psi, primati, itd.
[0331] U jednom izvođenju, antitelo je humano antitelo. Humana monoklonska antitela koja su usmerena protiv bilo kog antigena mogu se dobiti korišćenjem transgenih ili transhromozomalnih miševa koji nose delove humanog imunog sistema pre nego mišjeg sistema. Takvi transgeni i transhromozomalni miševi uključuju miševe koji su ovde naznačeni sa HuMAb<®>miševi i KM miševi, redom, i kolektivno su ovde naznačeni sa "transgeni miševi".
[0332] HuMAb<®>miš sadrži minilokus humanog imunoglobulinog gena koji kodira neuređene imunoglobulinske sekvence humanog teškog (µ i γ) i κ lakog lanaca, zajedno sa ciljanim mutacijama koje inaktiviraju endogeni lokus µ i κ lanca (Lonberg, N. et al., Nature 368, 856-859 (1994)). Prema tome, miševi ispoljavaju smanjenu ekspresiju mišjeg IgM ili κ i u odgovoru na imunizaciju, uvedeni transgeni humanog teškog i lakog lanca, prolaze kroz promenu klase i somatsku mutaciju da bi se dobila visoko afinitetna humana IgG,κ monoklonska antitela (Lonberg, N. et al. (1994), supra; pregled u Lonberg, N. Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49-101 (1994), Lonberg, N. and Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. Vol.1365-93 (1995) i Harding, F. and Lonberg, N. Ann. N.Y. Acad. Sci 764536-546 (1995)). Dobijanje HuMAb<®>miševa detaljno je opisano u Taylor, L. et al., Nucleic Acids Research 20, 6287-6295 (1992), Chen, J. et al., International Immunology 5, 647-656 (1993), Tuaillon et al., J. Immunol. 152, 2912-2920 (1994), Taylor, L. et al., International Immunology 6, 579-591 (1994), Fishwild, D. et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). Videti takođe US 5,545,806, US 5,569,825, US 5,625,126, US 5,633,425, US 5,789,650, US 5,877,397, US 5,661,016, US 5,814,318, US 5,874,299, US 5,770,429, US 5,545,807, WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 i WO 01/09187.
[0333] HCo7, HCo12, HCo17 i HCo20 miševi imaju narušenu JKD u njihovim genima za endogeni laki lanac (kapa) (kao što je opisano u Chen et al., EMBO J.12, 821-830 (1993)), narušeni CMD u njihovim genima za endogeni teški lanac (kao što je opisano u Primeru 1 WO 01/14424), i transgen KCo5 humanog kapa lakog lanca (kao što je opisano u Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)). Dodatno, Hco7 miševi imaju HCo7 transgen humanog teškog lanca (kao što je opisano u US 5,770,429), HCo12 miševi imaju HCo12 transgen humanog teškog lanca (kao što je opisano u Primeru 2 WO 01/14424), HCo17 miševi imaju HCo17 transgen humanog teškog lanca (kao što je opisano u
4
Primeru 2 WO 01/09187) i HCo20 miševi imaju transgen HCo20 humanog teškog lanca. Dobijeni miševi eksprimiraju transgene humanog imunoglobulina teškog i kapa lakog lanca u pozadini homozigotnog za narušavanje endogenih lokusa mišjeg teškog i kapa lakog lanca.
[0334] U KM soju miša, gen za endogeni mišji kapa laki lanac homozigotno je narušen kao što je opisano u Chen et al., EMBO J.12, 811-820 (1993) i gen za endogeni mišji težak lanac je homozigotno narušen kao što je opisano u Primeru 1 WO 01/09187. Ovaj mišji soj nosi transgen humanog kapa lakog lanca, KCo5, kao što je opisano u Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). Ovaj mišji soj takođe nosi transhromozom humanog teškog lanca koji se sastoji iz fragmenta hromozoma 14 hCF (SC20) kao što je opisano u WO 02/43478. HCo12-Balb/C miševi se mogu dobiti ukrštanjam HCo12 so KCo5[J/K](Balb) kao što je opisano u WO/2009/097006. Splenociti iz ovih transgenih miševa se mogu korisititi za dobijanje hibridoma koji luče humana monoklonska antitela u skladu sa dobro poznatim postupcima.
[0335] Dalje, bilo koji regioni koji vežu antigen se mogu dobiti iz humanih antitela ili iz drugih vrsta identifikovanih preko postupaka koji prikazuju vrstu, uključujući, bez ograničenja, fagni prikaz, retrovirusni prikaz, ribozomalni prikaz, i ostale postupke, upotrebom dobro poznatih postupaka iz oblasti tehnike i dobijeni molekuli mogu biti izloženi dodatnom sazrevanju, kao što je sazrevanje afiniteta, kao što su dobro poznati postupci iz oblasti tehnike (videti na primer Hoogenboom et al., J. Mol. Biol.227, 381 (1991) (fagni prikaz), Vaughan et al., Nature Biotech 14, 309 (1996) (fagni prikaz), Hanes and Plucthau, PNAS USA 94, 4937-4942 (1997) (ribozomalni prikaz), Parmley and Smith, Gene 73, 305-318 (1988) (fagni prikaz), Scott TIBS 17, 241-245 (1992), Cwirla et al., PNAS USA 87, 6378-6382 (1990), Russel et al., Nucl. Acids Research 21, 1081-1085 (1993), Hogenboom et al., Immunol. Reviews 130, 43-68 (1992), Chiswell and McCafferty TIBTECH 10, 80-84 (1992), i US 5,733,743). Ukoliko su korišćeni postupci prikaza da bi se proizvela antitela koja nisu humana, takva antitela mogu biti humanizovana.
[0336] U drugom aspektu, prikaz se odnosi na matični polipeptid koji sadrži Fc domen i region za vezivanje. Razume se da se u kontekstu predmetnog pronalaska sva izvođenja odnose na matično antitelo što se slično primenjuje na "matični polipeptid".
[0337] Mutacija prema predmetnom prikazu može biti, ali nije ograničena na, deleciju, inserciju ili supstituciju jedne ili više aminokiselna. Takva supstitucija aminokiselina može biti sa bilo kojom aminokiselinom koja se nalazi u prirodi ili koja se ne nalazi u prirodi.
"Pojedinačni-mutanti"
[0338] Treba razumeti da sva ovde opisana izvođenja sa referencom na matično antitelo, prvo matično antitelo ili i drugo matično antitelo takođe treba razumeti kao izvođenja koja se odnose na matični, prvi matični ili drugi matični polipeptid koji sadrži Fc-domen imunoglobulina i region za vezivanje.
[0339] Antitelo ili varijanta polipeptida prema aspektu "pojedinačni-mutant" iz predmetnog prikaza sadrži mutaciju, obično aminokiselinsku supstituciju, u bar jednom aminokiselinskom ostatku prikazanom u Tabeli 1, koja navodi svaki aminokiselinski ostatak, numerisan prema EU indeksu u humanom IgG1 antitelu, zajedno sa aminokiselinom u odgovarajućem položaju u IgG2, IgG3, i IgG4 matičnom antitelu i "Primeru" i "Poželjnim" aminokiselinskim supstitucijama. IgG2 segment koji odgovara ostacima P247 do K447, IgG3 Fc-segment koji odgovara ostacima P247 do K447 i IgG4 segment koji odgovara ostacima P247 do K447 u IgG1 su prikazani na Slici 2.
4
Tabela 1: Primer mesta mutacija i aminokiselinskih supstitucija za aspekt "pojedinačnog mutanta"
(nastavak)
4
[0340] Kao što se vidi u Tabeli 1, aminokiselinske supstitucije koje rezultuju povećanjem ćelijske lize Wien133 ćelija u Primeru 19 uključene su kao "Poželjne supstitucije".
[0341] U jednom aspektu predmetni prikaz se odnosi na varijantu matičnog polipeptida koji sadrži Fcdomen imunoglobulina i region za vezivanje, pri čemu varijanta sadrži mutaciju u bar jednom aminokiselinskom ostatku koji je izabran iz onih koji odgovaraju E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436, i K447 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 je S440Y ili S440W.
[0342] U jednom izvođenju iz prikaza varijanta polipeptida može biti varijanta antitela.
[0343] Prema tome u drugom aspektu, prikaz se odnosi na varijantu matičnog antitela koji sadrži region za vezivanje antigena i Fc-domen imunoglobulina, pri čemu varijanta sadrži mutaciju u bar jednom aminokiselinskom ostatku koji je izabran iz onih koji odgovaraju E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436, i K447 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 je S440Y ili S440W. Alternativno, aminokiselinski ostatak je izabran is onih koji odgovaraju H310, G385, H433, N434, Q438, i K439 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1.
[0344] Svaki od aminokiselinskog ostatka koji odgovara E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436, u K447 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1 može biti grupisan prema sledećem kao što je opisano u tekstu ispod:
(a) aminokiselinski ostatak u CH2-CH3 regionu koji obezbeđuje alosterne mutacije,
(b) aminokiselinski ostatak u hidrofobnim čvorićima CH2-CH3 regiona,
(c) aminokiselinski ostatak u N-terminalnoj CH3 zavojnici,
(d) aminokiselinski ostatak u C-terminalnom CH3 beta-lancu, pod uslovom da u slučaju mutacije koja odgovara S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1 mutacija je S440Y ili S440W, i (e) aminokiselinski ostatak koji odgovara E345, E382 ili Q386 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1.
[0345] Mutacija prema predmetnom prikazu može biti, ali nije ograničena na, deleciju, inserciju ili supstituciju jedne ili više aminokiselina. Takva supstitucija aminokiselina može biti sa bilo kojom koja se nalazi u prirodi ili aminokiselinom koja ne postoji u prirodi. Prema tome, u jednom izvođenju iz prikaza, mutacija u bar jednom aminokiselinskom ostatku je delecija. U drugom izvođenju iz prikaza, mutacija u bar jednom aminokiselinskom ostatku je insercija. U drugom izvođenju, mutacija u bar jednom aminokiselinskom ostatku je supstitucija.
[0346] U drugom izvođenju iz prikaza, mutacija u bar jednom aminokiselinskom ostatku je aminokiselinska supstitucija izabrana iz onih koje odgovaraju E345X, E430X, S440W/Y, Q386K, u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1, pri čemu X je bilo koja aminokiselina, kao što je aminokiselina koja se nalazi u prirodi.
[0347] U poželjnom izvođenju iz prikaza, mutacija u bar jednom aminokiselinskom ostatku je aminokiselinska supstitucija koja je izabrana iz onih koje odgovaraju E345R,Q,N,K,A,C,D,F,G,H,I,L,M,P,S,T,V,W,Y; E430T,S,G,A,C,D,F,H,I,L,K,M,N,P,Q,R,V,W,Y; S440W,Y, i Q386K u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1.
[0348] U daljem poželjnom izvođenju iz prikaza, mutacija u bar jednom aminokiselinskom ostatku je aminokiselinska supstitucija izabrana iz onih koje odgovaraju E345R/Q/N/K, E430T/S/G, S440Y/W, i Q386K u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1.
[0349] Alternativno, bar jedan aminokiselinski ostatak je izabran od E382 i H433. Posebno alternativne aminokiselinske supstitucije uključuju E345Y, D, W; i E430F, H. Alternativno, E382D,Q,K,R; i H433R.
4
[0350] U jednom specifičnom izvođenju iz prikaza, aminokiselinska supstitucija je E345R. U alternativnom izvođenju, mutacija je izabrana iz grupe koja se sastoji iz 1253 u E, N, Q, S ili T; H310 u N, Q, W ili Y; Q311 u E ili R; E382 u D, H, K, R, N, Q, S, T, W ili Y; G385 u E, H, K, N, Q, R, S, T, W ili Y; H433 u R; N434 u D, E, H, K, Q, R, S, T,W ili Y; Y436 u A,E, F,H, I, K,L,M,N, Q,R, S,T ili V;Q438 u A, E,G, H, K, N, Q,R, S,T, W ili Y;K439 u D,H, Q, R, W ili Y; i S440 u D,E, H, F, N, Q, W ili Y.
[0351] U drugom alternativnom izvođenju iz prikaza, mutacija je izabrana iz grupe koja se sastoji od 1253 u N ili Q; H310 u Q; Q311 u E ili R; E382 u D, Q, K, ili R; G385 u D, E, K ili R; H433 u R; N434 u H, K, Q ili R; Y436 u N,Q,S ili T; Q438 u N, S ili T;K439 u Q; i S440 u D, E ili Q.
[0352] U drugom alternativnom izvođenju iz prikaza, mutacija je izabrana iz grupe koja se sastoji od E382 u D, Q, K, ili R; i H433 u R.
[0353] U jednom izvođenju iz prikaza, varijanta sadrži E382R mutaciju.
[0354] U jednom izvođenju iz prikaza, varijanta sadrži H433R mutaciju.
[0355] Kao što je prikazano u primerima, varijante CD38 antitela HuMab-005 i -003 i/ili CD20 antitela HuMab-7D8 i -11B8 i rituksimaba i/ili EGFR antitelo HuMab-2F8 koji sadrže jednu od ovih aminokiselinskih supstitucija imaju veće vezivanje C1q, aktivaciju komplementa i/ili CDC u odnosu na divlji tip HuMab 005 i 7D8, redom.
[0356] Treba razumeti da varijanta može takođe samo sadržati jednu mutaciju prema "Primerima supstitucija" koji su navedeni u Tabeli 1. Varijanta takođe može sadržati više od jedne mutacije, kao što su dve, tri, četiri, pet ili šest bilo kojih mutacija koje su navedene u Tabeli 1.
[0357] Poželjno izvođenje iz predmetnog pronalaska, prema tome, obezbeđuje varijantu koja sadrži jednu mutaciju u aminokiselinskom ostatku koja je izabrana iz gore navedenog aspekta. Posebne aminokiselinske mutacije mogu biti aminokiselinska supstitucija koja odgovara bilo kojoj u grupi koja se sastoji iz P247G, I253V, S254L, Q311L, Q311W, E345A, E345C, E345D, E345F, E345G, E345H, E345I, E345K, E345L, E345M, E345N, E345P, E345Q, E345R, E345S, E345T, E345V, E345W, E345Y, D/E356G, D/E356R, T359R, E382L, E382V, Q386K, E430A, E430C, E430D, E430F, E430G, E430H, E430I, E430K, E430L, E430M, E430N, E430P, E430Q, E430R, E430S, E430T, E430V, E430W, E430Y, Y436I, S440Y i S440W. Navedene imaju povećanu ćelijsku lizu (>39% na Wien133 ćelijama) kao što je prikazano u Primeru 19, Tabela 17.
[0358] U alternativnom izvođenju iz prikaza, varijanta sadrži mutaciju u jednom aminokiselinskom ostatku koji je izabran iz onih koji odgovaraju E382R, H433R, H435R, i H435A.
[0359] Pored naznačenih mutacija, varijanta može imati bilo koju od karakteristika kao što su opisane za matično antitelo. Posebno, može biti humano antitelo. Varijanta dalje može biti, osim mutacija, bilo koji podtip IgG1.
[0360] Kada je vezan za njegov antigen na površini ćelije koja eksprimira antigen, na ćelijskoj membrani, na virionu, ili na drugoj čestici, ili je antigen povezan sa virionom, opciono gde se antigen nalazi u proteinkom omotaču ili lipidnom omotaču viriona, takva varijanta antitela se mogla uporediti sa matičnim antitelom u bar jednom od povećanog (i) C1q-vezivanja, (ii) aktivacije komplementa posredovane sa antitelom, (iii) CDC posredovane sa antitelom, (iv) obrazovanje oligomera, (v) stabilnost oligomera, ili kombinacija bilo kog pod (i) do (v). U jednom izvođenju pod (iv) ili (v), oligomer je heksamer. U jednom izvođenju, varijanta je takođe ili alternativno zadržala ili unapredila drugu efektorsku funkciju, kao što je vezivanje C1q, aktivacija komplementa, citotokičnost koja zavisi od komplementa (CDC), ćelijski posredovana citotokičnost koja zavisi od antitela (ADCC), FcRn-vezivanje, vezivanje za Fc-receptor uključujući vezivanje za Fc-gama receptor, Protein A-vezivanje, Protein G-vezivanje, ćelijska fagocitoza koja zavisi od antitela (ADCP), ćelijska citotoksičnost koja zavisi od komplementa (CD-CC), citotoksičnost pojačana komplementom, opsonizacija, internalizacija polipeptida koji sadrži Fc, ciljna smanjena regulacija, ADC unos, indukcija apoptoze, ćelijska smrt, zastoj u ćelijskom ciklusu, i bilo koja njihova kombinacija.
[0361] Bez ograničenja bilo kojom određenom teorijom, efekat koji je uzrokovan sa supstitucijom aminokiselina u naznačenim položajima, sa aminokiselinskim ostacima u Tabeli 1 može, na primer, uzrokujući efekat sam po sebi, da budu uključene u kontakt Fc domena drugog molekula direktno, ili može biti mutirano da interaguje sa drugim Fc domenom direktno ili indirektno pogađa intermolekularnu Fc:Fc interakciju. Prema tome, veruje se da supstitucije, bez vezivanja za teoriju, direktno ili indirektno pojačavaju jačinu vezivanja između molekula antitela u obliku oligomera, pojačavanjem stabilnosti strukture oligomera, npr. kao što je heksamerna, pentamerna, tetramerna, trimerna, ili dimerna struktura. Na primer, aminokiselinska supstitucija može biti ona koja promoviše ili jača obrazovanje novih intermolekularnih Fc:Fc veza, kao što su, ali nisu ograničene na, Van der Waals-ove interakcije, vodonične veze, interakcije naelektrisanje-naelektrisanje, ili “aromatic stacking” interakcije aromatičnog slaganja, ili ona koja promoviše povećanu entropiju nakon interakcije Fc:Fc oslobađanjem molekula vode. Sa pozivanjem na Tabelu 1, "Primeri supstitucija" mogu biti odabrani na osnovu veličine I fizičko hemijskih svojstava koji su uključeni u ili promovišu intermolekularne Fc:Fc interakcije ili intramolekularne interakcije (alosterne mutacije). "Poželjne supstitucije" mogu biti odabrane na osnovu veličine i fiičkohemijskih svojstava optimalnih za uključivanje u ili stimulisanje intermolekularnih Fc:Fc interakcija ili intramolekularnih interakcija (alosterne mutacije).
[0362] "Primeri supstitucija" aminokiselina koje su navedene u Tabeli 1, uključuju izmenu E ostatka za R ostatak, i izmenu H ostatka za R ostatak. Svaki "Primer supstitucije" aminokiselina u svakom specifičnom aminokiselinskom ostaku koji je naveden u Tabeli 1 je odvojeno i specifično neograničavajuće izvođenje prema pronalasku. Dalje, svaka "Poželjna supstitucija" u svakom specifičnom aminokiselinskom ostatku koji je naveden u Tabeli 1 je odvojeno i specifično ne-ograničavajuće izvođenje prema pronalasku.
[0363] U drugom aspektu predmetni prikaz se odnosi na varijantu matičnog antitela koja sadrži Fcdomen imunoglobulina i region za vezivanje, pri čemu varijanta sadrži mutaciju u bar dva aminokiselinska ostatka koja su izabrana iz grupe
(a) aminokiselinski ostatak u CH2-CH3 regionu koji obezbeđuje alosterne mutacije,
(b) aminokiselinski ostatak u hidrofobnim čvorićima CH2-CH3 regiona,
(c) aminokiselinski ostatak u N-terminaloj CH3 zavojnici,
(d) aminokiselinski ostatak u C-terminalnom CH3 beta-lancu, pod uslovom da u slučaju mutacije koja odgovara S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1 mutacija je S440Y ili S440W, i (e) aminokiselinski ostatak koji odgovara E345, E382 ili Q386 u Fc-regionu teškog lanca humanog
IgG1,
gde su bar dve mutacije aminokiselina različite.
[0364] U jednom izvođenju iz prikaza matični polipeptid i prema tome takođe i njegova varijanta, može biti antitelo.
[0365] Prema tome predmetni prikaz se takođe odnosi na varijantu matičnog antitela koja sadrži region koji veže antigen i Fc-domen, pri čemu varijanta sadrži mutaciju u bar dva aminokiselinska ostatka koja su izabrana iz grupe
1
(a) aminokiselinski ostatak u CH2-CH3 regionu koji obezbeđuje alosterne mutacije, (b) aminokiselinski ostatak u hidrofobnim čvorićima CH2-CH3 regiona,
(c) aminokiselinski ostatak u N-terminaloj CH3 zavojnici,
(d) aminokiselinski ostatak u C-terminalom CH3 beta-lancu, pod uslovom da u slučaju mutacije koja odgovara S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1 mutacija je S440Y ili S440W, i
(e) aminokiselinski ostatak koji odgovara E345, E382 ili Q386 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1,
gde su bar dve mutacije aminokiselina različite.
[0366] Prema tome, varijanta gore navedenog izvođenja može sadržati mutaciju u bar dva, kao što su dva, tri, četiri, pet, ili više aminokiselina u Tabeli 1.
[0367] U bilo kojim izvođenjima iz prikaza gde takva mutacija u bar dve aminokiseline se nalazi u varijanti, može se naći u svakom od teških lanaca varijante, ili se jedna od dve može naći u jednom teškom lancu i druga se može naći u drugom teškom lancu, redom, ili obrnuto.
[0368] U jednom izvođenju iz prikaza, varijanta sadrži mutaciju u bar dva aminokiselinska ostatka koji su izabrani iz onih koji odgovaraju E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436, i K447 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 je S440Y ili S440W. Alternativno, varijanta dalje obuhvata mutaciju u bar jednom ostatku koji je izabran iz grupe koja se sastoji iz H310, G385, H433, N434, Q438, i K439.
[0369] U jednom izvođenju iz prikaza, varijanta sadrži mutaciju u bar dva aminokiselinska ostatka koji su izabrani iz onih koji odgovaraju E345X, E430X, S440W/Y, Q386K, P247G, I253V, S254L, Q311L/W, D/E356R, E382V, i Y436I u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1, pri čemu je X bilo koja aminokiselina, kao što je aminokiselina koja se pojavljuje u prirodi.
[0370] Na primer, varijanta antitela može sadržai mutaciju u bar jednom od E345, E430, S440, i Q386, alternativno E382 i H433, kao što su sve ili svaka od E345, E430, S440, i Q386, alternativno E382 i H433, opciono dalje sadrži mutaciju u jednoj ili više drugih aminokiselina koje su navedene u Tabeli 1. Prema tome, u drugom izvođenju, varijanta sadrži mutaciju u bar dva aminokiselinska ostatka koja su izabrana iz grupe koja odgovara onim u E345X, E430X, S440W/Y, i Q386K u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, pri čemu je X bilo koja aminokiselina, kao što je aminokiselina koja se pojavljuje u prirodi.
[0371] Primeri kombinacija mutacija u bar dva aminokiselinska ostatka su E345X/E430X, E345X/S440Y ili W, E345X/Q386K, E430X/S440Y ili W, i E430X/Q386K.
[0372] U jednom izvođenju iz prikaza, mutacija u bar dva aminokiselinska ostatka je delecija, insercija ili supstitucija. Takva supstitucija aminokiselina može biti sa bilo kojim aminokiselinama koje se nalaze u prirodi ili veštačkim aminokiselinama.
[0373] U posebnom izvođenju iz prikaza, mutacija u bar dva aminokiselinska ostatka može biti aminokiselinska supstitucija koji odgovara bilo kojoj iz grupe koja se sastoji iz P247G, I253V, S254L, Q311L, Q311W, E345A, E345C, E345D, E345F, E345G, E345H, E345I, E345K, E345L, E345M, E345N, E345P, E345Q, E345R, E345S, E345T, E345V, E345W, E345Y, D/E356G, D/E356R, T359R, E382L, E382V, Q386K, E430A, E430C, E430D, E430F, E430G, E430H, E430I, E430K E430L, E430M, E430N, E430P, E430Q, E430R, E430S, E430T, E430V, E430W, E430Y, Y436I, S440Y i S440W.
[0374] U poželjnom izvođenju iz prikaza, varijanta sadrži mutaciju u bar dva aminokiselinska ostatka s aminokiselinske supstitucije izabrane iz onih koje odgovaraju E345R,Q,N,K,A,C,D,F,G,H,I,L,M,P,S,T,V,W,Y; E430T,S,G,A,C,D,F,H,I,L,K,M,N,P,Q,R,V,W,Y; S440W,Y; i Q386K, u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1.
2
[0375] Alternativno dalja mutacija je izabrana iz onih koje odgovaraju I253E,N,Q,S,T; H310N,Q,W,Y; Q311E,R; E382D,H,K,R,N,Q,S,T,W,Y; G385E,H,K,N,Q,R,S,T,W,Y; H433R; N434D,E,H,K,Q,R,S,T,W,Y; Y436,A,E,F,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V; Q438A,E,G,H,K,N,Q,R,S,T,W,Y; K439D,H,Q,R,W,Y; i S440D,E,H,F,N,Q
[0376] U poželjnom izvođenju iz prikaza, mutacija mutacije u bar dva aminokiselinska ostatka su amiokiselinske supstitucije izabrane iz onih koje odgovaraju E345R/Q/N/K, E430T/S/G, S440Y/W, i Q386K u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1. Alternativno druga mutacija je izabrana iz onih koje odgovaraju I253N,Q; H310Q; Q311E,R; E382D,Q,K,R; G385D,E,K,R; H433R; N434H,K,Q,R; Y436N,Q,S,T; Q438N,S,T; K439Q; i S440D,E,Q.
[0377] Primeri specifičnih kombinacija mutacije u bar dva aminokiselinska ostatka su E345R/E430T, E345R/S440Y, E345R/S440W, E345R/Q386K, E345R/E430G, E345Q/E430T, E345Q/S440Y, E345Q/S440W, E430T/S440Y, E430T/S440W, E430T/Q386K, i S440Y/Q386K.
[0378] U jednom specifičnom izvođenju iz prikaza, mutacija nije u aminokiselinskom ostatku koji odgovara 1253, N434, ili Q311. U jednom dodatnom ili alternativnom izvođenju, mutacija nije u H433, ili aminokiselinska supstitucija nije H433A.
[0379] U jednom izvođenju, predmetni prikaz se odnosi na varijantu koja sadrži mutaciju u bar tri aminokiselinska ostatka koja su izabrana iz grupe
(a) aminokiselinski ostatak u CH2-CH3 regionu koji obezbeđuje alosterne mutacije,
(b) aminokiselinski ostatak u hidrofobnim čvorićima CH2-CH3 regiona,
(c) aminokiselinski ostatak u N-terminaloj CH3 zavojnici,
(d) aminokiselinski ostatak u C-terminalnom CH3 beta-lancu, pod uslovom da ne sadrži mutaciju koja odgovara S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, i
(e) aminokiselinski ostatak koji odgovara E345, E382 ili Q386 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1.
gde su bar tri mutacije aminokiselina različite.
[0380] U jednom posebnom izvođenju nt iz prikaza, varijanta sadrži mutaciju u aminokiselinskim ostacima, koje su aminokiselinske supstitucije koje odgovaraju E345R, Q396K Ii E430G, koje mogu biti ili u jednom ili u oba teška lanca varijante.
[0381] Mutacija u bar tri aminokiselinska ostatka može biti zasebno odabrana od supstitucija koje su navedene u Tabeli 1. Ne-ograničavajući primeri varijanti koje sadrže bar tri mutacije su; E345R/E430G/S440Y, E345R/E430G/S440W, E345K/E430G/S440Y, E345K/E430G/S440W, E345Q/E430G/S440Y, E345Q/E430G/S440W, E345N/E430G/S440Y, E345N/E430G/S440W, E345R/E430T/S440Y, E345R/E430T/S440W, E345K/E430T/S440Y, E345K/E430T/S440W, E345Q/E430T/S440Y, E345Q/E430T/S440W, E345N/E430T/S440Y, E345N/E430T/S440W, E345R/E430S/S440Y, E345R/E430S/S440W, E345K/E430S/S440Y, E345K/E430S/S440W, E345Q/E430S/S440Y, E345Q/E430S/S440W, E345N/E430S/S440Y, E345N/E430S/S440W, E345R/E430F/S440Y, E345R/E430F/S440W, E345K/E430F/S440Y, E345K/E430F/S440W, E345Q/E430F/S440Y, E345Q/E430F/S440W, E345N/E430F/S440Y, i E345N/E430F/S440W.
[0382] Pored mutacija u jednoj ili više aminokiselina u Tabelama 1 ili 2A i B, težak lanac IgG može sadržati dodatne mutacije koje su poznate u oblasti tehnike, npr., mutacije koje dalje unapređuju efektorske funkcije. Takve dodatne mutacije uključuju poznate mutacije koje pojačavaju CDC, vezivanje Fc-gama receptora ili vezivanje FcRn i/ili unapređenje efektorskih funkcija koje su posredovane sa Fcgama receptorom.
[0383] U jednom izvođenju iz prikaza, varijanta prema prikazu dalje obuhvata poznatu modifikaciju koja pojačava CDC npr., izmena u segmentima između IgG izotipova da se dobiju himerni IgG molekuli (Natsume et al., 2008 Cancer Res 68(10), 3863-72); jedna ili više aminokiselinskih supstitucija u regionu zgloba (Dall’Acqua et al., 2006 J Immunol 177, 1129-1138), i/ili jedna ili više aminokiselinskih supstitucija u ili blizu mesta vezivanja C1q u CH2 domenu, centerirano oko ostataka D270,K322, P329, i P331 (Idusogie etal., 2001 J Immunol166,2571-2575; Michaelsen et al., 2009 Scand J Immunol 70, 553-564 i WO 99/51642). Na primer, u jednom izvođenju, varijanta prema prikazu dalje obuhvata kombinaciju bilo koje od aminokiselinskih supstitucija S267E, H268F, S324T, S239D, G236A i I332E, koje obezbeđuju pojačanu efektorsku funkciju preko CDC ili ADCC (Moore et al., 2010 mAbs 2(2), 181-189)). Druge Fc mutacije koje pogađaju vezivanje sa Fc-receptorima (opisano u WO 2006/105062, WO 00/42072, U.S. Patent 6,737,056 i U.S. Patent 7,083,784) ili fizička svojstva antitela (opisano u WO 2007/005612 A1) takođe se mogu koristiti u varijantama pronalaska.
[0384] U jednom izvođenju, varijanta prema prikazu dalje obuhvata modifikacije koje poboljšavaju vezivanje Fc-gama receptora i/ili efektorsku funkciju posredovanu sa Fc-gama receptorom. Takve modifikacije uključuju (i) smanjenje količine fukoze u CH2 vezanom glikozilacijom (gliko-modifikovanje) (Umana P, et al., Nat Biotechnol 1999; 17: 176-80; Niwa R, et al., Clin Cancer Res 2004; 10: 6248-55.)), i (ii) mutagenezu aminokiselina koja je usmerena prema mestu u regionu zgloba ili CH2 regionima antitela (proteinsko-modifikovanje) (Lazar GA, et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2006; 103: 4005-10).
[0385] U jednom izvođenju, varijanta prema prikazu je dalje modifikovana u FcRn mestu vezivanja, npr., da bi se produžio polu-život (t1/2) IgG antitela. Takve modifikacije uključuju (i) N434A i T307A/E380A/N434A mutacije (Petcova et al. Int Immunol. 2006 Dec;18(12):1759); (ii) supstituciju jedne ili više Pro238, Thr256, Thr307, Gln311, Asp312, Glu380, Glu382, i Asn434 u ostatak alanina pri čemu se povećava vezivanje FcRn (Shields RL, et al. J. Biol. Chem. 2001;276:6591); i (iii) supstituciju aminokiselina ili kombinaciju aminokiselinskih supstitucija koje su izabrane od M252Y/S254T/T256E, M252W, M252Y, M252Y/T256Q, M252F/T256D, V308T/L309P/Q311S, G385D/Q386P/N389S, G385R/Q386T/P387R/N389P, H433K/N434F/Y436H, N434F/Y436H, H433R/N434Y/Y436H, M252Y/S254T/T256EH433K/N434F/Y436H ili M252Y/S254T/T256EG385R/Q386T/P387R/N389P u IgG1, povećavanjem afiniteta za FcRn (Dall’Acqua et al., supra).
"Dvostruki-mutant"
[0386] Treba razumeti da sva izvođenja iz prikaza koja su ovde opisana sa pozivanjem na matično antitelo, prvo matično antitelo ili drugo matično antitelo takođe treba razumeti kao izvođenja koja se odnose na matični, prvi matični ili drugi matični polipeptid koji se sastoji iz Fc-domena imunoglobulina i regiona za vezivanje.
[0387] Kao što je gore opisano i dalje u tekstu ispod, predmetni prikaz se takođe odnosi na aspekt "duplog-mutanta", gde dve mutacije zasebno svaka smanjuje efektorsku funkciju ali zajendno obnavljaju uspostavljaju efektorsku funkciju do nivoa matičnog antitela. Kada se zajedno koriste specifičnost varijante je povećana. Varijante antitela prema aspektu "duplog mutanta" sadrže dve mutacije, obično aminokiselinske supstitucije, specifičnu interakciju para aminokiselinskih ostataka K439 i S440.
[0388] Prema tome u jednom aspektu predmetni prikaz se takođe odnosi na varijantu matičnog polipeptida koji sadrži Fc-domen imunoglobulina i region za vezivanje, pri čemu varijanta sadrži mutaciju
4
(i) u bar jednom aminokiselinskom ostatku koji je izabran iz onih koji odgovaraju K439 i S440 u Fcregionu teškog lanca humanog IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 nije S440Y ili S440W, kao što pri čemu mutacija u položaju koji odgovara K439 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1 je K439D/E, i/ili mutacija u položaju koji odgovara S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1 je S440K/H/R;
(ii) u bar jednom aminokiselinskom ostatku koji odgovara K447D/E ili koji odgovara K447K/R/H i 448P u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1; ili
(iii) u bar jednom aminokiselinskom ostatku koji odgovara K447D/E ili koji odgovara K447K/R/H i 448K/R/H i 449P u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1.
[0389] U jednom izvođenju iz prikaza matični polipeptid, i prema tome takođe njegova varijanta, može biti antitelo.
[0390] Prema tome, u jednom aspektu, predmetni prikaz se odnosi na varijantu matičnog antitela koji sadrži region koji veže antigen i Fc-domen imunoglobulina, pri čemu varijanta sadrži mutaciju u bar jednom aminokiselinskom ostatku koji je izabran iz onih koji odgovaraju K439 i S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, pod uslovom sa mutacija u S440 nije S440Y ili S440W, kao što gde mutacija u položaju koji odgovara K439 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1 je K439D/E, i/ili mutacija u položaju koji odgovara S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1 je S440K/H/R. Tabela 2A i B pokazuje aspekte "Primer" i "Poželjne supstitucije" za "dvostruki-mutant" (Tabela A) i "mešoviti mutant" (Tabela 2B).
Tabela 2A: Primer mesta mutacija i supstitucija aminokiselina za "dvostruki-mutant" aspekte
Tabela 2B: Primer mesta mutacija i supstitucija aminokiselina za aspekte "mešovitih-mutanata" (Ab1 Ab2)
[0391] U jednom izvođenju iz prikaza varijanta, gde je mutacija na položaju(ima) koji nisu S440 i K447, i pri čemu varijanta dalje sadrži mutaciju
(i) u bar jednom aminokiselinskom ostatku koji odgovara K439 ili S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 nije S440W ili S440Y;
(ii) u bar jednom aminokiselinskom ostatku koji odgovara K447D/E ili koji odgovara K447K/R/H i 448P u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1; ili
(iii) u bar jednom aminokiselinskom ostatku koji odgovara K447D/E ili koji odgovara K447K/R/H i 448K/R/H i 449P u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1.
[0392] Prema tome, prikaz obezbeđuje varijantu antitela koje sadrži prvu mutaciju u ostatku u CH2 i/ili CH3 regionu teškog lanca humanog IgG1 koji odgovara K439, i drugu mutaciju u ostatku u CH2 i/ili CH3 regionu teškog lanca humanog IgG1 koji odgovara S440.
[0393] U predmetnom pronalasku je razmotreno da varijanta takođe može sadržati samo jednu od supstitucija aminokiselinskog ostatka, kao što je ili K439E ili S440K, kao što varijanta sadrži mutaciju u K439, opciono bez mutacije u S440.
[0394] U jednom izvođenju, prikaz se odnosi na varijantu, pri čemu mutacija u K439 je supstitucija aminokiseline u aminokiselinu koja je odabrana od E i D, kao što je K439E.
[0395] U drugom izvođenju, prikaz sadrži mutaciju u S440, opciono bez mutacije u K439.
[0396] U jednom izvođenju, prikaz se odnosi na varijantu, pri čemu mutacija u S440 je supstitucija aminokiseline u aminokiselinu koja je izabrana od K, R i H, kao što je S440K.
[0397] U jednom izvođenju, prikaz sadrži mutacije u oba K439 i S440.
[0398] U drugom izvođenju iz prikaza, mutacija u K439 je izabrana od K439 u D, E ili R, i mutacija u S440 je izabrana od S440 u D, E, K, H i R.
[0399] U drugom izvođenju iz prikaza, mutacija u K439 je izabrana od K439D i K439E, i mutacija u S440 je izabrana od S440K, S440R, i S440H.
[0400] U drugom izvođenju iz prikaza, varijanta sadrži K439E i S440K mutacije.
[0401] Kao što je opisano u Primerima 4-6, varijante antitela koje sadrže samo jednu od K439E i S440K mutacija imale su značajno povećanu KDza C1q, što odrašava smanjenu aktivaciju komplementa i/ili spsobnost CDC. Iznenađujuće, pronađeno je da su varijante antitela HuMAb 7D8 ili 005 koje imaju obe mutacije imale obnovljeno ili povećano vezivanje C1q ili CDC. Bez vezivanja za bilo koju specifičnu teoriju, mehanizam koji se nalazi u osnovi mogao bi se možda objasniti odgovarajućim mutacijama koje sterno nadomešćuju jedna drugu, kao što je ilustrovano na Slikama 4 i 5.
[0402] Bilo koji "dvostruki-mutant" kao što je ovde opisano može se takođe korisiti u kombinaciji sa mutacijom koja sama može da poveća efektorsku funkciju. Prema tome, aspekt "dvostrukog-mutanta" može se kombinovati sa aspektom "pojedinačnog-mutanta", npr. varijanta može dalje sadržati mutaciju u bilo kom položaju aminokiselina koji je naveden u Tabeli 1 ili bilo kojim drugim izvođenjima koji su gore opisani za aspekt "pojedinačni-mutant". Prema tome, u jednom izvođenju, mutacija je u položaju(ima) koji nisu S440, i gde varijanta dalje obuhvata mutaciju u bar jednom aminokiselinskom ostatku koji odgovara K439 ili S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 nije S440W ili S440Y.
[0403] U jednom aspektu predmetni prikaz se odnosi na varijantu matičnog polipeptida koja sadrži Fcdomen imunoglobulina i region vezivanja, u kome varijanta sadrži mutaciju u bar jednom od aminokiselinskih ostataka koji je odabran iz grupe
(a) aminokiselinski ostatak u CH2-CH3 regionu koji obezbeđuje alosterne mutacije,
(b) aminokiselinski ostatak u hidrofobnim čvorićima CH2-CH3 regiona,
(c) aminokiselinski ostatak u N-terminalnoj CH3 zavojnici,
(d) aminokiselinski ostatak u C-terminalnom CH3 beta-lancu, pod uslovom da ne sadrži mutaciju koja odgovara S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, i
(e) aminokiselinski ostatak koji odgovara E345, E382 ili Q386 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, i gde varijanta dalje sadrži mutaciju
(i) u bar jednom aminokiselinskom ostatku koji odgovara K439 ili S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 nije S440W ili S440Y;
(ii) u bar jednom aminokiselinskom ostatku koji odgovara K447D/E ili koji odgovara K447K/R/H i 448P u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1; ili
(iii) u bar jednom aminokiselinskom ostatku koji odgovara K447D/E ili koji odgovara K447K/R/H i 448K/R/H i 449P u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1.
[0404] U jednom izvođenju iz prikaza matični polipeptid, i prema tome njegova varijanta, može biti antitelo.
[0405] Prema tome u jednom aspektu, predmetni prikaz se odnosi na varijantu matičnog antitela koja sadrži region koji veže antigen i Fc-domen imunoglobulina, gde varijanta sadrži mutaciju u bar jednom od aminokiselinskih ostataka koji je odabran iz grupe
(a) aminokiselinski ostatak u CH2-CH3 regionu koji obezbeđuje alosterne mutacije,
(b) aminokiselinski ostatak u hidrofobnim čvorićima CH2-CH3 regiona,
(c) aminokiselinski ostatak u N-terminalnoj CH3 zavojnici,
(d) aminokiselinski ostatak u C-terminalnom CH3 beta-lancu, pod uslovom da ne sadrži mutaciju koja odgovara S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, i
(e) aminokiselinski ostatak koji odgovara E345, E382 ili Q386 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, i
gde varijanta dalje sadrži mutaciju
(i) u bar jednom aminokiselinskom ostatku koji odgovara K439 ili S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 nije S440W ili S440Y,
(ii) u bar jednom aminokiselinskom ostatku koji odgovara K447D/E ili koji odgovara K447K/R/H i 448P u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1; ili
(iii) u bar jednom aminokiselinskom ostatku koji odgovara K447D/E ili koji odgovara K447K/R/H i 448K/R/H i 449P u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1.
[0406] U jednom izvođenju iz prikaza, varijanta sadrži mutaciju u bar aminokiselinskom ostatku koji je odabran iz onih koji odgovaraju E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436, i K447 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 je S440Y ili S440W, varijanta dalje sadrži mutaciju u bar jednom aminokiselinskom ostatku koji odgovara K439 ili S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 nije S440W ili S440Y.
[0407] U drugom izvođenju iz prikaza, varijanta koja sadrži mutaciju u bar jednom aminokiselinskom ostatku je aminokiselinska supstitucija koja je odabrana iz onih koji odgovaraju E345X, E430X, S440W/Y, Q386K, u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1 , gde X je bilo koja aminokiselina, kao što je aminokiselina koja se nalazi u prirodi, i varijanta dalje sadrži mutaciju u bar jednom aminokiselinskom ostatku koji odgovara K439 ili S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 nije S440W ili S440Y.
[0408] U jednom izvođenju iz prikaza, varijanta sadrži mutaciju aminokiseline u oba položaja koji odgovaraju K439 i S440 u Fc-regionu teškog lanca IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 nije S440Y ili S440W.
[0409] U drugom izvođenju iz prikaza, mutacija u položaju koji odgovara K439 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1 je K439D/E, i/ili mutacija u položaju koji odgovara S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1 je S440K/H/R.
[0410] U drugom izvođenju iz prikaza, prva mutacija je u aminokiselinskim ostacima koji su odabrani iz onih koji odgovaraju E345, E430, Q386, i S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 je S440Y ili S440W; i druga i treća mutacija je aminokiselinska supstitucija u položaju K439E ili S440K.
[0411] U jednom izvođenju iz prikaza, prva mutacija je delecija, insercija ili supstitucija. Takva supstitucija može biti bilo koja aminokiselina koja se nalazi ili se ne nalazi u prirodi.
[0412] U drugom izvođenju iz prikaza, prva mutacija je odabrana iz grupe E345R,Q,N,K,A,F,G,H,I,L,M,P,S,T,V,W,Y,C,D; E430T,S,G,A,F,H,L,P,R,V,C,D,I,K,M,N,Q,W,Y; i S440W,Y,D; i druga i treća mutacija je aminokiselinsa supstitucija u položaju K439E ili S440K.
[0413] U poželjnom izvođenju iz prikaza, jedna mutacija je odabrana iz grupe E345R,Q,N,K,Y; E430T,S,G,F,H; S440W,Y; i Q386K.
[0414] Drugi primer, u jednom izvođenju iz predmetnog prikaza, varijanta sadrži E345R, K439E i S440K mutacije, time se obezbeđuje i povećano i specifičnije posredovanje u CDC-odgovoru.
[0415] U jednom izvođenju iz prikaza, varijanta sadrži mutaciju u bar dva aminokiselinska ostatka koji su odabrani iz onih koji odgovaraju E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436, i K447 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 je S440Y ili S440W, i varijanta dalje sadrži mutaciju u bar jednom aminokiselinskom ostatku koji odgovara K439 ili S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 nije S440W ili S440Y.
[0416] U drugom izvođenju iz prikaza, varijanta sadrži mutaciju u bar dva aminokiselinska ostatka je aminokiselinska supstitucija koja je odabrana iz onih koji odgovaraju E345X, E430X, S440W/Y, Q386K, u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1, gde X je blo koja aminokiselna, kao što je aminokiselina koja se nalazi u prirodi, i varijanta dalje sadrži mutaciju u bar jednom aminokiselinskom ostatku koji odgovara K439 ili S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 nije S440W ili S440Y.
[0417] U jednom izvođenju iz prikaza, varijanta sadrži mutaciju aminokiselina i oba položaja koji odgovaraju K439 i S440 u Fc-regionu teškog lanca IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 nije S440Y ili S440W.
[0418] U drugom izvođenju iz prikaza, mutacija u položaju koji odgovara K439 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1 je K439D/E, i/ili mutacija u položaju koji odgovara S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1 je S440K/H/R.
[0419] U drugom izvođenju iz prikaza, prva i druga mutacija je u aminokiselinskim ostacima koji su odabrani iz onih koji odgovaraju E345, E430, Q386, i S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 je S440Y ili S440W; i treća i četvrta mutacija je aminokiselinska supstitucija u položaju K439E ili S440K.
[0420] U drugom izvođenju iz prikaza, varijanta koja sadrži mutaciju u oba položaja K439 i S440 kao što je ovde opisano ima povećanje u Fc-posredovanoj efektorskoj funkciji koja je odabrana iz C1qvezivanja, aktivacije komplementa, citotoksičnosti koja zavisi od komplementa (CDC), citotoksičnost koja se posredovana ćelijama koja zavisi od antitela (ADCC), FcRn-vezivanje, vezivanje Fc-receptora koje uključuje vezivanje Fc-gama receptora, Protein A-vezivanje, Protein G-vezivanje, ćelijska fagocitoza koja zavisi od antitela (ADCP), ćelijska citotoksičnost koja zavisi od komplementa (CDCC), citotoksičnost koja je pojačana komplementom, opsonizacija, internalizacija polipeptida koji sadrži Fc, ciljna smanjena modulacija, ADC unos, indukcija apoptoze, ćelijska smrt, zaustavljanje ćelijskog ciklusa, i bilo koja njihova kombinacija, u poređenju sa matičnim antitelom ili varijantom antitela koja sadrži mutaciju u samo jednoj od K439 i S440.
[0421] Prikaz takođe obezbeđuje za upotrebu K439E i S440K mutacija u antitelu da bi se obnovila jedna ili više od (i) aviditet vezivanja C1q, (ii) aktivacija komplementa posredovana antitelomm, (iii) CDC posredovana antitelom, (iv) obrazovanje oligomera, (v) stabilnost oligomera, ili kombinacija bilo kog (i) do (v), u poređenju sa matičnim antitelom, koje može, npr., biti antitelo divljeg tipa ili varijanta antitela koja sadrži samo jednu od K439E ili S440K mutacija. U jednom izvođenju (iv) ili (v), oligomer je hekasamer.
[0422] U jednom izvođenju iz prikaza, varijanta je odabrana iz monospecifičnog antitela, bispecifičnog antitela ili multispecifičnog antitela.
Mešavine mutanata
[0423] Treba razumeti da sva gore navedena izvođenja koja su ovde opisana sa referencom na matično antitelo, prvo matično antitelo ili i drugo matično antitelo takođe treba razumeti kao izvođenja koja se odnose na matični, prvi matični ili drugi matični polipeptid koji sadrži Fc-domen imunoglobulina i region vezivanja.
[0424] Kao što je gore opisano, pronalazači iz predmetnog pronalaska takođe su pronašli da postoje mutacije koje same po sebi smanjuju efektorsku funkciju ali kada se koriste zajedno efektorska funkcija je obnovljena, npr. mutacije u položajima K439 i S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1. Ovaj koncednpt takođe se može koristiti da bi se osiguralo uparivanje dva različita antitela, prema tome, uvođenjem K439 u jednom antitelu i S440 u drugom. Prema tome, varijante antitela prema aspektu "mešoviti-mutant" sadrže mutaciju, ali onu koja obično dovodi do smanjene ili dosta smanjene Fc:Fc interakcije između identičnih molekula Fc. Međutim, kako "mešoviti-mutant" varijante antitela iz pronalaska su sposobne za uparivanje jedna sa drugom; obezbeđujući obnovljeno ili čak povećano vezivanje C1q, aktivaciju komplementa, CDC, obrazovanje oligomera, i/ili stabilnost oligomera za specifičan par varijante antitela, u poređenju sa, npr., svakom varijantom zasebno ili mešavinom matičnog antitela ili matičnih antitela. U jednom izvođenju iz prikaza, oligomer je heksamer. U jednom izvođenju, par varijante antitela takođe ili alternativno je zadržalo ili poboljšalo drugu efektorsku funkciju, kao što je vezivanje C1q, aktivaciju komplementa, citoksičnost koja zavisi od komplementa (CDC), ćelijski posredovanu citotoksičnost koja zavisi od antitela (ADCC), vezivanje FcRn, vezivanje Fcreceptora koje uključuje vezivanje Fc-gama receptora, Protein A-vezivanje, Protein G-vezivanje, ćelijsku fagocitozu koja zavisi od antitela (ADCP), ćelijsku citotoksičnost koja zavisi od antitela (CDCC), citotoksičnost koja je pojačana komplementom, opsonizaciju, internalizaciju polipeptida koja sadrži Fc, ciljnu smanjenu modulaciju, unos ADC, indukciju apoptoze, ćelijsku smrt, zaustavljanje ćelijskog ciklusa, i bilo koju njihovu kombinaciju. Ovak apekt iz pronalaska obezbeđuje brojne primene u kojima ne samo jačina već selektivnost vezivanja C1q, aktivacija komplementa, CDC ili druge efektorske funkcije mogu biti regulisane.
[0425] Primeri mesta mutacija za svaku varijantu antitela u "mešoviti-mutant" paru su prikazani u Tabeli 2. Specifično, pronalazak obezbeđuje varijantu antitela koja sadrži region koji veže antigen i Fcdomen imunoglobulina, gde varijanta sadrži mutaciju u ostatku u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1 koji odgovara jednom od K439 i S440. U jednom izvođenju, mutacija je u K439, i to je aminokiselinska supstitucija u aminokiselinu koja je odabrana iz E ili D, kao što je K439E. U jednom izvođenju, mutacija je u S440, i to je aminokiselinska supstitucija u aminokiselinu koja je izabrana od K, R ili H, kao što je S440K.
[0426] Prema tome u jednom izvođenju predmetni prikaz takođe se odnosi na varijantu koja sadrži mutaciju u bar jednom aminokiselinskom ostatku koji je odabran iz:
(a) aminokiselinski ostatak u CH2-CH3 regionu koji obezbeđuje alosterne mutacije,
(b) aminokiselinski ostatak u hidrofobnim čvorićima CH2-CH3 regiona,
(c) aminokiselinski ostatak u N-terminalnoj CH3 zavojnici,
(d) aminokiselinski ostatak u C-terminalnom CH3 beta-lancu, pod uslovom da u slučaju mutacije koja odgovara S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1 mutacija je S440Y ili S440W, i (e) aminokiselinski ostatak koji odgovara E345, E382 ili Q386 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1;
i u aminokiselinskom ostatku koji odgovara K439 u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1.
[0427] U drugom izvođenju predmetni prikaz takođe se odnosi na varijantu koja sadrži mutaciju u bar jednom aminokiselinskom ostatku koji je odabran iz:
(a) aminokiselinski ostatak u CH2-CH3 regionu koji obezbeđuje alosterne mutacije,
(b) aminokiselinski ostatak u hidrofobnim čvorićima CH2-CH3 regiona,
(c) aminokiselinski ostatak u N-terminalnoj CH3 zavojnici,
(d) aminokiselinski ostatak u C-terminalnom CH3 beta-lancu, pod uslovom da u slučaju mutacije koja odgovara S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1 mutacija je S440Y ili S440W, i (e) aminokiselinski ostatak koji odgovara E345, E382 ili Q386 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1;
i u aminokiselinskom ostatku koji odgovara S440 u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1.
[0428] U jednom izvođenju iz prikaza, dva gore navedena opisana izvođenja mogu se kombinovati u "mešavina-mutant" paru aspekta prema predmetnom pronalasku.
[0429] Svaka varijanta u "mešoviti-mutant" paru može dalje sadržati mutaciju u aminokiselini koja je navedena u Tabeli 1.
[0430] U jednom izvođenju iz predmetnog prikaza, "mešoviti-mutant" par sadrži prvu varijantu matičnog antitela i drugu varijantu matičnog antitela, gde prva varijanta sadrži prvi Fc-domen imunoglobulina i region koji veže antigen, gde pomenuta prva varijanta sadrži (i) prvu mutaciju u bar jednom aminokiselinskom ostatku koja nije mutacija u K439 koji je odabran iz grupe
(a) aminokiselinski ostatak u CH2-CH3 regionu koji obezbeđuje alosterne mutacije,
(b) aminokiselinski ostatak u hidrofobnim čvorićima CH2-CH3 regiona,
(c) aminokiselinski ostatak u N-terminalnoj CH3 zavojnici,
(d) aminokiselinski ostatak u tom C-terminalnom CH3 beta-lancu, pod uslovom da u slučaju mutacije koji odgovara S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1 mutacija je S440Y ili S440W, i
(e) aminokiselinski ostatak koji odgovara E345, E382 ili Q386 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, i
(ii) druga mutacija u položaju koji odgovara K439 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1; i gde druga varijanta sadrži drugi Fc-domen imunoglobulina i region koji veže antigen, gde pomenuta druga varijanta sadrži (i) prvu mutaciju u bar jednom aminokiselinskom ostatku koji nije mutacija u S440 koji je odabran iz grupe
(a) aminokiselinski ostatak u CH2-CH3 regionu koji obezbeđuje alosterne mutacije,
(b) aminokiselinski ostatak u hidrofobnim čvorićima CH2-CH3 regiona,
(c) aminokiselinski ostatak u N-terminalnoj CH3 zavojnici,
(d) aminokiselinski ostatak u tom C-terminalnom CH3 beta-lancu, i
(e) aminokiselinski ostatak koji odgovara E345, E382 ili Q386 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, i
(ii) druga mutacija u položaju koji odgovara S440 u Fc regionu teškog lanca IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 nije S440Y ili S440W.
[0431] Drugi primer "mešoviti-mutant" parova može dalje sadržati, i nije ograničen na, bilo koji od sledećih parova; ; prva varijanta koja sadrži mutaciju K447E i druga varijanta koja sadrži mutaciju K447/P448; prva varijanta koja sadrži mutaciju K447E i druga varijanta koja sadrži mutaciju K447/K448/P449.
[0432] U jednom izvođenju iz prikaza, mutacija je delecija, insercija ili supstitucija. Takva supstitucija aminokiselina može biti bilo koja aminokiselina koja se nalazi u prirodi ili se ne nalazi u prirodi. U jednom izvođenju, mutacija je delecija. U drugom izvođenju, mutacija je insercija. U drugom izvođenju, mutacija je supstitucija aminokiseline.
[0433] U posebnom izvođenju iz prikaza, prva varijanta i/ili druga varijanta sadrži mutaciju u bar jednom aminokiselinskom ostatku koji je odabran iz onih koji odgovaraju E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436, i K447 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 je S440Y ili S440W.
[0434] U posebnom izvođenju iz prikaza, prva varijanta i/ili druga varijanta sadrži mutaciju u bar jednom aminokiselinskom ostatku može biti aminokiselinska supstitucija koja odgovara bilo kojoj iz grupe koja se sastoji iz P247G, I253V, S254L, Q311L, Q311W, E345A, E345C, E345D, E345F, E345G, E345H, E345I, E345K, E345L, E345M, E345N, E345P, E345Q, E345R, E345S, E345T, E345V, E345W, E345Y, D/E356G, D/E356R, T359R, E382L, E382V, Q386K, E430A, E430C, E430D, E430F, E430G, E430H, E430I, E430K, E430L, E430M, E430N, E430P, E430Q, E430R, E430S, E430T, E430V, E430W, E430Y, Y436I, S440Y i S440W, i prva varijanta sadrži drugu mutaciju u položaju koji odgovara K439 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1; i druga varijanta sadrži drugu mutaciju u položaju koji odgovara S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1.
[0435] Na primer, u jednom izvođenju iz prikaza, jedna varijanta u "mešoviti-mutant" paru sadrži E345R i K439E mutacije, dok druga varijanta sadrži E345R i S440K mutacije, time obezbeđujući oba povećanjem i specifičnijem aviditetu vezivanja C1q, aktivaciju komplementa, CDC, obrazovanje oligomera, stabilnost oligomera, i/ili druge funkcije povezane sa efektorskom kao što je vezivanje FcRn, ADCC, vezivanje Fc-gama receptora, Protein A-vezivanje, Protein G-vezivanje, ADCP, CDCC, citotokisičnost koja je pojačana sa komplementom, fagocitoza posredovana antitelom, internalizacija, apoptoza, vezivanje za receptor komplementa opsonizovanog antitela, i/ili njihove kombinacije.
[0436] Aspekt "mešoviti-mutant", može takođe sadržati dve varijante koje sadrže svaka više od jedne mutacije koja je navedena u Tabeli 1, u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, kao što je prva varijanta koja sadrži mutacije S440K/K447E, i druga varijanta koja sadrži mutaciju K439E/K447/P448; kao što je prva varijanta koja sadrži mutacije K439E/K447E, i druga varijanta koja sadrži mutaciju S440K/K447/P448.
1
[0437] Varijante u paru "mešoviti-mutant" kao što je ovde opisano mogu se dobiti iz istih ili iz različitih matičnih antitela. Dalje, aspekt "mešoviti-mutant" može se takođe koristiti u bispecifičnim ili asimetričnim antitelima. Dalje, prvo, drugo i treće antitelo mogu vezati različite epitope, na istim ili različitim metama.
[0438] Dalje, aspekt "mešoviti-mutant" može obezbediti za CDC ili drugi efektorski odgovor koji je specifičnije usmeren prema tumorskim ćelijama koje eksprimiraju dva specifična antigena tumora, korišćenjem prvog antitela protiv prvog antigena sa K439E mutacijom i drugog antitela protiv drugog antigena sa S440K ili S440R mutacijom. Korišćenjem aspekta "mešoviti-mutant" koji sadrži tri varijante, opciono su bispecifična antitela, mogu obezbediti za CDC ili drugi efektorski odgovor koji je specifičnije usmeren prema tumorskim ćelijama koje eksprimiraju bar dva, kao što su dva, tri, četiri, pet ili šest, specifičnih antigena tumora.
[0439] U jednom izvođenju bilo koji od "pojedinačni-mutant", "dvostruki-mutant" i "mešoviti-mutant" aspekata iz prikaza, varijanta je odabrana iz monospecifičnog antitela, bispecifičng antitela ili multispecifičnog antitela.
[0440] U bilo kom izvođenju aspekta "mešoviti-mutant" iz prikaza, the prvo, drugo i/ili treća varijanta mogu sadržati istu ili različitu mutaciju bilo koje od aminokiselinskih supstitucija koje su navedene u Tabeli 1.
Multispecifična antitela
[0441] Treba razumeti da sva gore navedena izvođenja koja su ovde opisana sa referencom na matično antitelo, prvo matično antitelo ili i drugo matično antitelo takođe treba razumeti kao izvođenja koja se odnose na matično, prvi matični ili drugi matični polipeptid koji sadrži Fc-domen imunoglobulina i region vezivanja.
[0442] Treba razumeti da bilo koje izvođenje aspekata "pojedinačni-mutant", "dvostruki-mutant" i "mešoviti-mutant" koji su ovde opisani mogu da se koriste u aspektu multispecifičnog antitela kao što je opisano gore u tekstu.
[0443] U jednom glavnom aspektu, prikaz se odnosi na varijantu, koje je bispecifično antitelo koje sadrži prvi polipeptid koji sadrži prvi CH2-CH3 region imunoglobulina i prvi region koji veže antigen, i drugi polipeptid koji sadrži drugi CH2-CH3 region imunoglobulina i drugi region koji veže antigen, gde prvi i drugi regioni koji vežu antigen vežu različite epitope na istom antigenu ili na različitim antigenima, i gde prvi i drugi CH2-CH3 region svaki sadrži prvu mutaciju u bar jednom aminokiselinskom ostatku koja je izabrana iz onih koje odgovaraju E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436, i K447 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 je S440Y ili S440W.
[0444] U jednom izvođenju iz prikaza, mutacija je delecija, insercija ili supstitucija. Takva supstitucija aminokiselina može biti sa bilo kojim kiselinama koje se nalaze u prirodi ili se ne nalaze u prirodi.
[0445] Bispecifično antitelo iz predmetnog prikaza nije ograničeno na poseban format bilo koje od onih koji su ovde i gore u tekstu opisani.
[0446] U jednom izvođenju iz predmetnog prikaza, prvi i drugi polipeptid sadrži jednu prvu mutaciju u aminokiselinskom ostatku koji je izabran iz onih koji odgovaraju E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436, i K447 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1.
[0447] U posebnom izvođenju iz prikaza, mutacija u bar jednom aminokiselinskom ostatku može biti aminokiselinska supstitucija koji odgovara bilo kojoj grupi koja se sastoji iz P247G, I253V, S254L, Q311L,
2
Q311W, E345A, E345C, E345D, E345F, E345G, E345H, E345I, E345K, E345L, E345M, E345N, E345P, E345Q, E345R, E345S, E345T, E345V, E345W, E345Y, D/E356G, D/E356R, T359R, E382L, E382V, Q386K, E430A, E430C, E430D, E430F, E430G, E430H, E430I, E430L, E430M, E430N, E430P, E430Q, E430R, E430S, E430T, E430V, E430W, E430Y, Y436I, S440Y i S440W.
[0448] U posebnom izvođenju iz prikaza, bispecifično antitelo ima format koji je opisan u WO 2011/131746. Prema tome, u jednom izvođenju iz prikaza, varijanta koja je bispecifično antitelo, gde prvopolipeptid sadrži dalje mutaciju u aminokiselinskom ostatku koji je izabran iz onih koji odgovaraju K409, T366, L368, K370, D399, F405, i Y407 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1; i drugi polipeptid sadrži dalje mutaciju u aminokiselinskom ostatku koji je izabran iz onih koji odgovaraju F405, T366, L368, K370, D399, Y407 i K409 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, i gde pomenuta druga mutacija u prvom polipeptidu je različita od pomenute druge mutacije u drugom polipeptidu.
[0449] U posebnom izvođenju iz prikaza, bispecifično antitelo ima prvi polipeptid koji sadrži drugu mutaciju u aminokiselinskom ostatku koji odgovara K409 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, i drugi polipeptid sadrži drugi polipeptid u aminokiselinskom ostatku koji odgovara F405 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1. Takva bispecifična antitela prema prikazu se mogu dobiti kao što je opisano u Primeru 22. Osim toga, efekat na ubijanje CDC sa generisanjem heterodimernih proteina može se ispitati korišćenjem testa kao što je korišćen u Primeru 23.
[0450] U posebnom izvođenju iz prikaza, bispecifično antitelo koje sadrži prvi i drugi polipeptid, gde prvi polipeptid sadrži mutaciju u aminokiselinskom ostatku koji odgovara K409 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1; drugi polipeptid sadrži mutaciju u aminokiselinskom ostatku koji odgovara F405 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1; i prvi i/drugi polipeptid sadrži dalje mutaciju u aminokiselinskom ostatku koji odgovara aminokiselinskoj supstituciji E345R u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1.
[0451] U posebnom izvođenju iz prikaza, bispecifično antitelo koje sadrži prvi i drugi polipeptid, gde prvi polipeptid sadrži mutaciju u aminokiselinskom ostatku koji odgovara K409 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1; drugi polipeptid sadrži mutaciju u aminokiselinskom ostatku koji odgovara F405 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1; prvi i/drugi polipeptid svaki sadrži dalje mutaciju u aminokiselinskim ostacima koji odgovaraju aminokiselinskoj supstituciji E345R i Q386K u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1. Pomenute druge mutacije mogu biti u prvom i drugom polipeptidu, ili E345R može biti u prvom polipeptidu i Q386K u drugom polipeptidu; ili obrnuto.
[0452] U posebnom izvođenju iz prikaza, the bispecifično antitelo koje sadrži prvi i drugi polipeptid , gde prvi polipeptid sadrži mutaciju u aminokiselinskom ostatku koji odgovara K409 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1; drugi polipeptid sadrži mutaciju u aminokiselinskom ostatku koji odgovara F405 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1; i prvi i/ili drugi polipeptid svaki sadrži dalje mutaciju u aminokiselinskim ostacima koji odgovaraju aminokiselinskoj supstituciji E345R, Q386K, i E430G u Fcregionu teškog lanca humanog IgG1. Pomenute druge mutacije mogu biti u prvom i drugom polipeptidu, ili prvi polipeptid može sadržati mutacije E345R i E430G, i drugi polipeptid može sadržati mutaciju Q386K; ili obrnuto.
[0453] Bispecifično antitelo može, na primer, sadržati region koji veže antigen CD20 antitela i region koji veže antigen CD38 antitela, i aminokiselinsku supstituciju u jednoj ili više aminokiselina koje su navedene u Tabelama 1 i/ili 2. Primer regiona koji vežu CD20 uključuju one kod ofatumumaba (2F2), 7D8 i 11B8, opisane u WO2004/035607, i rituksimab (WO 2005/103081). Primer regiona koji veže CD38 uključuje one od 003 i daratumumab (005), koji su opisani u WO2006/099875.
[0454] U jednom izvođenju iz prikaza, the bispecifično antitelo se veže za različite epitope na istoj ili različitoj meti.
[0455] U drugom izvođenju iz prikaza, prva mutacija u prvom i drugom polipeptidu može biti ista ili različita.
[0456] U jednom izvođenju aspekta "pojedinačni-mutant", "dvostruki-mutant", "mešoviti-mutant" i multispecifičnog antitela iz prikaza, varijanta je humano IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD ili IgE antitelo, opciono humano antitelo pune dužine, kao što je humano IgG1 antitelo pune dužine.
[0457] Ukoliko bilo koji "pojedinačni-mutant", "dvostruki-mutant", "mešoviti-mutant" aspekt, i aspekti multispecifičnog antitela iz prikaza vezivanje C1q antitela je određeno prema testu koji je opisan u Primeru 4, CDC je određen prema testu koji je opisan u Primeru 5, 6 ili 10, mutacija nije u aminokiselinskom ostatku direktno uključena u vezivanje C1q, opciono kao što je određeno poređenjem vezivanja C1q u ELISA testu prema Primeru 3 sa vezivanjem C1q u ćelijski zasnovanom testu prema Primeru 4, i ADCC je određen prema testu koji je opisan u Primeru 12.
[0458] Dodatno, prikaz obezbeđuje za dobijanje varijante bilo kog "pojedinačnog-mutanta", "dvostrukog-mutant", "mešovitog-mutanta" i aspekta multispecifičnog antitela ili gore opisanog pronalaska. Prikaz takođe obezbeđuje kompoziciju koja sadrži varijantu bilo kog aspekta od "dvostrukog-mutanta" i izvođenja kao što je gore opisano, npr., farmaceutske kompozicije. Prikaz takođe obezbeđuje za upotrebu bilo koje takve varijante, preparata, ili kompozicije kao leka.
[0459] Gore navedeni "pojedinačni-mutant", "dvostruki-mutant", "mešoviti mutanta" i aspekti multispecifičnog antitela iz prikaza posebno se mogu primeniti na molekule humanog antitela koji imaju težak lanac IgG1 koji obuhvata relevantni segment, P247 do K447, koji odgovara podvučenim ostacima 130 do 330 konstantnog regiona teškog lanca humanog IgG1 (UniProt pristupni br. P01857; SEQ ID NO:1):
[0460] Predmetni prikaz može se takođe primeniti na molekule antitela koji imaju deo teškog lanca humanog IgG2. Aminokiselinski ostaci P247 do K447 teškog lanca IgG1 odgovaraju podvučenim ostacima 126 do 326 konstantnog regiona teškog lanca IgG2 (pristupni broj P01859; SEQ ID NO:2)
4
[0461] Predmetni prikaz može se takođe primeniti na molekule antitela koji imaju deo teškog lanca humanog IgG3. Aminokiselinski ostaci P247 do K447 teškog lanca IgG1 odgovaraju ostacima 177 do 377 konstantnog regiona teškog lanca IgG3 (UniProt pristupni br. P01860, SEQ ID NO:3), podvučeno kako što sledi:
[0462] Predmetni prikaz može se takođe primeniti na molekule antitela koji imaju deo teškog lanca humanog IgG4. Aminokiselinski ostaci P247 do K447 teškog lanca IgG1 odgovaraju podvučenim ostacima 127 do 327 konstantnog regiona teškog lanca IgG4 (pristupni broj P01859, SEQ ID NO:4)
[0463] Predmetni prikaz se može takođe primeniti na antitelo koje ima deo alotipa IgG1m(f) humanog teškog lanca. Aminokiselinska sekvenca IgG1m(f) alotipa (CH3 sekvenca je podvučena) -SEQ ID NO:5
[0464] Poravnanje u odgovarajućim segmentima IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, i konstantnim regionima IgG1m(f) je prikazano na Slici 2. Prema tome, bilo koja mutacija u aminokiselini koja je opisana u Tabeli 1 ili Tabeli 2A i B može se uvesti na njenom ekvivalentnom položaju u IgG2, IgG3, IgG4, i/ili IgG1m(f) kao što je definisano poravnanjem da bi se dobila varijanta u skladi sa ovim pronalaskom.
[0465] U jednom izvođenju iz prikaza, pronalazak obezbeđuje varijantu IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4 antitela pune dužine, koji sadrže jednu ili više aminokiselinskih supstitucija prema bilo kom gore opisanom aspektu.
[0466] Ukoliko bilo koji aspekti "pojedinačni-mutant", "dvostruki-mutant", "mešoviti-mutant" iz prikaza i multispecifično antitelo, Fc-region teškog lanca IgG1 može sadržati sekvencu ostataka 130 do 330 SEQ ID NO:1, ostaci 126 do 326 SEQ ID NO:2, ostaci 177 do 377 SEQ ID NO:3, ili ostataka 127 do 327 SEQ ID NO:4.
[0467] U jednom izvođenju iz prikaza, matično antitelo sadrži sekvencu koja je izabrana od SEQ ID No.: 1-5, kao šo je SEQ ID No.:1, SEQ ID No.:2, SEQ ID No.:3, SEQ ID No.:4, ili SEQ ID No.:5.
[0468] U jednom izvođenju iz prikaza, Fc-region teškog lanca IgG1 sadrži sekvencu ostataka 130 do 330 SEQ ID NO:1.
[0469] Matično antitelo može biti bilo koje matično antitelo kao što je ovde opisano. Matično antitelo je u ovom kontekstu takođe namenjeno da bude prvo matično i drugo matično antitelo.
[0470] U jednom izvođenju iz prikaza, matično antitelo je humano IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4, IgA1, IgA2, IgD ili IgE antitelo.
[0471] U jednom izvođenju iz prikaza, matično antitelo is humano antitelo pune dužine, kao što je humano IgG1 antitelo pune dužine.
[0472] U jednom izvođenju iz prikaza, matično antitelo, prvo matično antitelo i drugo matično antitelo je humano IgG1 antitelo, npr. IgG1m(za) ili IgG1m(f) alotip, opciono sadrži Fc-region koji sadrži SEQ ID NO:1 ili 5.
[0473] U jednom izvođenju iz prikaza, matično antitelo je humano IgG2 antitelo, opciono sadrži Fcregion koji se sastoji iz SEQ ID NO:2.
[0474] U jednom izvođenju iz prikaza, matično antitelo je humano IgG3 antitelo, opciono sadrži Fcregion koji se sastoji iz SEQ ID NO:3.
[0475] U jednom izvođenju iz prikaza, matično antitelo je humano IgG4 antitelo, opciono sadrži Fcregion koji se sastoji iz SEQ ID NO:4.
[0476] U posebnim izvođenjima bilo koji od "pojedinačnog-mutanta", "dvostrukog-mutanta", "mešoviti-mutant" i aspekata multispecifičnog antitela prikaza, varijanta sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima stepen identičnosti sa aminokiselinama P247 do K447 SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, i 5 od bar 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili bar oko 99%, izuzev za mutacije koje su uvedene u skladu sa predmetnim pronalaskom.
[0477] Prema tome, varijanta može sadržati sekvencu prema SEQ ID No:1, SEQ ID No:2, SEQ ID No:3, SEQ ID No: 4, ili SEQ ID No:5 izuzev za bilo koju mutaciju koja je ovde definisana.
[0478] U bilo kom od gore pomenutih "pojedinačni-mutant", "dvostruki-mutant", "mešoviti-mutant" i multispecifični aspekti prema predmetnom prikazu mogu se razumeti tako da uključe navedena izvođenja.
[0479] U jednom izvođenju iz prikaza, prvo i/ili drugo matično antitelo je fragment antitela, opciono odabran iz grupe koja se sastoji iz monovalentnog antitela, teškog lanca antitela, modifikovanog domena za izmenu lanca (SEED), triomab-a, imunoglobulina sa dvostrukim varijabilnim domenom (DVD-Ig), “knob-into-holes” antitelo, mini-antitelo, molekul za ponovno ciljanje sa dvostrukim afinitetom (Fc-DART ili Ig-DART); LUZ-Y antitelo, Biclonic antitelo, Dual Targeting (DT)-Ig antitelo, dva u jedan antitelo, unakrsno vezani Mab, mAb<2>, CovX-telo, IgG-slično bispecifično antitelo, Ts2Ab, BsAb, HERCULES antitelo, TvAb, ScFv/Fc Fuziono antitelo, SCORPION, scFv fragment spojen sa Fc domenom, I dvostruki scFv fragment spojen sa Fc domenom.
[0480] U drugom izvođenju iz prikaza, oba, prvo i drugo matično antitelo vežu antigen koji je eksprimiran na površini ćelije humanog tumora.
[0481] U drugom izvođenju iz prikaza, antigeni za prvo i drugo matično antitelo su odvojeno odabrani iz grupe koja se sastoji iz erbB1 (EGFR), erbB2 (HER2), erbB3, erbB4, MUC-1, CD4, CD19, CD20, CD38, CD138, CXCR5, c-Met, HERV-proteina omotača, periostina, Bigh3, SPARC, BCR, CD79, CD37, EGFrvIII, L1-CAM, AXL, Tkivnog faktora (TF), CD74, EpCAM i MRP3.
[0482] U drugom izvođenju iz prikaza, prva i druga matična antitela su potpuno humana.
[0483] U drugom izvođenju iz prikaza, antigeni za prvo i drugo matično antitelo su, bilo kojim redom, izabrani od CD20 i CD38, opciono gde prva i druga matična antitela su, bilo kojim redom, izabrana od 7D8 i 005.
[0484] U drugom izvođenju iz prikaza, oba, prvo i drugo matično antitelo vežu antigene koji su eksprimirani na površini bakterijske ćelije ili virionu.
[0485] U drugom izvođenju iz prikaza, bakterijska ćelija je izabrana iz grupe koja se sastoji od S. aureus, S. epidermidis, S. pneumonia, Bacillus anthracis, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia trachomatis, E. coli, Salmonella, Shigella, Yersinia, S. typhimurium, Neisseria meningitides, i Mycobacterium tuberculosis.
[0486] U drugom izvođenju iz prikaza, prvo i drugo matično antitelo veže isti antigen.
[0487] U drugom izvođenju iz prikaza, prva i druga matična antitela su isto antitelo.
[0488] U drugom izvođenju iz prikaza, matično antitelo je izabrano od 7D8 i 005.
Kompozicije
[0489] Treba razumeti da sva ovde opisana izvođenja sa referencom na matično antitelo, prvo matično antitelo ili i drugo matično antitelo takođe treba razumeti kao izvođenja koja se odnose na matični, prvi matični ili drugi matični polipeptid koji sadrži Fc-domen imunoglobulina i region vezivanja.
[0490] Predmetni pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži prvu varijantu matičnog antitela, gde prva varijanta je humano antitelo pune dužine, i druga varijanta matičnog antitela, gde druga varijanta je humano antitelo pune dužine, gde prva varijanta sadrži prvi Fc-domen imunoglobulina i region koji veže antigen, gde druga varijanta sadrži drugi Fc-domen imunoglobulina i region koji veže antigen, i gde pomenuta prva varijanta i druga varijanta sadrži mutaciju koji odgovara E430G u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1 i pomenuta prva varijanta sadrži mutaciju koji odgovara K439E u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, i pomenuta druga varijanta sadrži mutaciju koji odgovara S440K u Fcregionu teškog lanca humanog IgG1, gde su položaji aminokiselina numerisani prema Eu-indeksu i gde prva i druga varijanta sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je bar 95 % stepeni identična sa aminokiseliskim ostacima 130 do 330 SEQ ID NO 1 ili 5, gde su prve i druge varijante sposobne da se međusobno upare; pri čemu se obezbeđuje obnovljeno ili povećano vezivanje C1q, aktivacija komplementa, i/ili CDC, za specifični par varijanti antitela, u poređenju sa svakom varijantom zasebno ili mešavinom matičnog antitela ili matičnih antitela.
[0491] U kompoziciji prema pronalasku prva varijanta i druga varijanta mogu svaka biti humano IgG1 antitelo pune dužine.
[0492] U kompoziciji prema pronalasku prva varijanta i druga varijanta mogu biti izabrane od monospecifičnog antitela, bispecifičnog antitela ili multispecifičnog antitela.
[0493] U kompoziciji prema pronalasku, prva i druga varijanta mogu vezati različite epitope na istom antigenu ili različitim antigenima.
[0494] U kompoziciji prema pronalasku, jedna ili obe od prve varijante i druga varijanta je konjugovana sa lekom, toksinom ili radioobeležena, kao što je gde jedna ili obe od prve varijante i druga varijanta je konjugovana sa toksinom preko linkera.
[0495] Drugi aspekt iz pronalaska obezbeđuje kompoziciju kao što je gore opisano i farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0496] Događaj drugog aspekta iz pronalaska obezbeđuje kompoziciju kao što je gore opisano za upotrebu u postupku lečenja bolesti, kao što je kancer.
[0497] Prikaz se takođe odnosi na kompozicije koje sadrže varijante i matična antitela može biti bilo koja varijanta i matično antitelo kao što je ovde opisano. U tekstu ispod će biti opisani specifični aspekti i izvođenja. Osim toga, takve varijante se mogu dobiti prema bilo kom ovde opisanom postupku.
[0498] U jednom aspektu predmetni prikaz se odnosi na kompoziciju koja sadrži prvu varijantu matičnog polipeptida i drugu varijantu matičnog polipeptida, gde prva varijanta sadrži prvi Fc-domen imunoglobulina i region vezivanja, gde druga varijanta sadrži drugi Fc-domen imunoglobulina i region vezivanja, i gde
(i) pomenuta prva varijanta sadrži mutaciju u položaju koji odgovara K439 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, i pomenuta druga varijanta sadrži mutaciju u položaju koji odgovara S440 u Fcregionu teškog lanca humanog IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 nije S440Y ili S440W, (ii) pomenuta prva varijanta sadrži mutaciju u položaju koji odgovara K447D/E u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1; i pomenuta druga varijanta sadrži mutaciju u položaju koji odgovara K447K/R/H i 448P u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, ili
(iii) pomenuta prva varijanta sadrži mutaciju u položaju koji odgovara K447D/E u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1; i pomenuta druga varijanta sadrži mutaciju u položaju koji odgovara K447K/R/H, 448K/R/H i 449P u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1.
[0499] U jednom izvođenju iz prikaza prva ili obe varijante matičnog polipeptida i druga varijanta matičnog polipeptida može biti antitelo.
[0500] Prema tome u jednom aspektu, prikaz se odnosi na kompoziciju koja sadrži prvu varijantu matičnog antitela i drugu varijantu matičnog antitela, pri čemu prva varijanta sadrži prvi Fc-domen imunoglobulina i regiona koji veže antigen, pri čemu druga varijanta sadrži drugi Fc-domen imunoglobulina i regiona koji veže antigen, i gde
(i) pomenuta prva varijnata sadrži mutaciju u položaju koji odgovara K439 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, i pomenuta druga varijanta sadrži mutaciju u položaju koji odgovara S440 u Fcregionu teškog lanca humanog IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 nije S440Y ili S440W, (ii) pomenuta prva varijanta sadrži mutaciju u položaju koji odgovara K447D/E u Fc region teškog lanca humanog IgG1; i pomenuta druga varijanta sadrži mutaciju u položaju koji odgovara K447K/R/H i 448P u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, ili
(iii) pomenuta prva varijanta sadrži mutaciju u položaju koji odgovara K447D/E u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1; i pomenuta druga varijanta sadrži mutaciju u položaju koji odgovara K447K/R/H, 448K/R/H i 449P u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1.
[0501] U jednom izvođenju iz prikaza kompozicija sadrži a prvu varijantu matičnog antitela i drugu varijantu matičnog antitela, gde prva varijanta sadrži prvi Fc-domen imunoglobulina i region koji veže antigen, gde druga varijanta sadrži drugi Fc-domen imunoglobulina i region koji veže antigen, i gde pomenuta prva varijanta sadrži mutaciju u položaju koji odgovara K439 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, i gde druga varijanta sadrži mutaciju u položaju koji odgovara S440, pod uslovom da mutacija u S440 nije S440Y ili S440W.
[0502] U jednom izvođenju iz prikaza, kompozicija obuhvata prvu varijantu matičnog antitela i drugu varijantu matičnog antitela, gde prva varijanta sadrži prvi Fc-domen imunoglobulina i region koji veže antigen, pri čemu prva varijanta sadrži (i) prvu mutaciju u bar jednom aminokiselinskom ostatku koja nije mutacija u K439 izabrana iz grupe
(a) aminokiselinski ostatak u CH2-CH3 regionu koji obezbeđuje alosterne mutacije,
(b) aminokiselinski ostatak u hidrofobnim čvorićima CH2-CH3 regiona,
(c) aminokiselinski ostatak u N-terminalnoj CH3 zavojnici,
(d) aminokiselinski ostatak u C-terminalnom CH3 beta-lancu, pod uslovom da u slučaju mutacije koja odgovara S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1 mutacija je S440Y ili S440W, i (e) aminokiselinski ostatak koji odgovara E345, E382 ili Q386 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, i
(ii) druga mutacija u položaju koji odgovara K439 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1; i gde druga varijanta sadrži drugi Fc-domen imunoglobulina i region koji veže antigen, pri čemu pomenuta druga varijanta sadrži (i) prvu mutaciju u bar jednom aminokiselinskom ostatku koja nije mutacija u S440 odabrana iz grupe
(a) aminokiselinski ostatak u CH2-CH3 regionu koji obezbeđuje alosterne mutacije,
(b) aminokiselinski ostatak u hidrofobnim čvorićima CH2-CH3 regiona,
(c) aminokiselinski ostatak u N-terminaloj CH3 zavojnici,
(d) aminokiselinski ostatak u C-terminalom CH3 beta-lancu, i
(e) aminokiselinski ostatak koji odgovara E345, E382 ili Q386 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, i
(ii) druga mutacija u položaju koji odgovara S440 u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 nije S440Y ili S440W.
[0503] U drugom izvođenju iz prikaza, kompozicija sadrži prvu varijantu antitela i drugu varijantu matičnog antitela, gde prva varijanta sadrži (i) prvu mutaciju u bar jednom aminokiselinskom ostatku koja nije mutacija u K439 koji je odabran iz grupe
(a) aminokiselinski ostatak u CH2-CH3 regionu koji obezbeđuje alosterne mutacije,
(b) aminokiselinski ostatak u hidrofobnim čvorićima CH2-CH3 regiona,
(c) aminokiselinski ostatak u N-terminalnoj CH3 zavojnici,
(d) aminokiselinski ostatak u C-terminalnom CH3 beta-lancu, pod uslovom da u slučaju mutacije koji odgovara S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1 mutacija je S440Y ili S440W, i
(e) aminokiselinski ostatak koji odgovara E345, E382 ili Q386 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1 , i
(ii) druga mutacija u položaju koji odgovara K439 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, i gde druga varijanta sadrži mutaciju u položaju koji odgovara S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, koja nije nije S440Y ili S440W.
[0504] U drugom izvođenju iz prikaza, kompozicija sadrži prvu varijantu matičnog antitela i drugu varijantu matičnog antitela,
gde prva varijanta sadrži mutaciju u položaju koji odgovara K439 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1; i gde druga varijanta sadrži drugi Fc-domen imunoglobulina i region koji veže antigen, gde pomenuta druga varijanta sadrži (i) prvu mutaciju u bar jednom aminokiselinskom ostatku koji nije mutacija u S440 koji je odabran iz grupe
(a) aminokiselinski ostatak u CH2-CH3 regionu koji obezbeđuje alosterne mutacije,
(b) aminokiselinski ostatak u hidrofobnim čvorićima CH2-CH3 regiona,
(c) aminokiselinski ostatak u N-terminalnoj CH3 zavojnici,
(d) aminokiselinski ostatak u C-terminalnom CH3 beta-lancu, i
(e) aminokiselinski ostatak koji odgovara E345, E382 ili Q386 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1,
i (ii) druga mutacija u položaju koji odgovara S440 u Fc regionu teškog lanca IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 nije S440Y ili S440W.
[0505] U jednom izvođenju iz prikaza, mutacija u položaju koji odgovara K439 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1 je K439D/E, i/ili mutacija u položaju koji odgovara S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1 je S440K/H/R.
[0506] U drugom aspektu predmetni prikaz se odnosi na kompoziciju koja sadrži prvu varijantu matičnog polipeptida koji sadrži Fc-domen imunoglobulina i region vezivanja i drugu varijantu matičnog polipeptida koji sadrži Fc-domen imunoglobulina i region vezivanja, gde prva varijanta sadrži prvi Fc-domen imunoglobulina i prvo mesto vezivanja antigena, gde prva varijanta sadrži prvu mutaciju u bar aminokiselinskom ostatku koji je odabran iz grupe
(a) aminokiselinski ostatak u CH2-CH3 regionu koji obezbeđuje alosterne mutacije,
(b) aminokiselinski ostatak u hidrofobnim čvorićima CH2-CH3 regiona,
(c) aminokiselinski ostatak u N-terminalnoj CH3 zavojnici,
(d) aminokiselinski ostatak u C-terminalnom CH3 beta-lancu, pod uslovom da u slučaju mutacije koji odgovara S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1 mutacija je S440Y ili S440W, i
(e) aminokiselinski ostatak koji odgovara E345, E382 ili Q386 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, i gde
druga varijanta ne sadrži mutaciju u aminokiselinskom ostatku koji je odabran iz grupe
(a) aminokiselinski ostatak u CH2-CH3 regionu koji obezbeđuje alosterne mutacije,
(b) aminokiselinski ostatak u hidrofobnim čvorićima CH2-CH3 regiona,
(c) aminokiselinski ostatak u N-terminalnoj CH3 zavojnici,
(d) aminokiselinski ostatak u C-terminalnom CH3 beta-lancu, pod uslovom da u slučaju mutacije koja odgovara S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1 mutacija je S440Y ili S440W, i (e) aminokiselinski ostatak koji odgovara E345, E382 ili Q386 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1.
[0507] U jednom izvođenju iz prikaza prvi i/ili drugi matični polipeptid može biti antitelo.
[0508] Predmetni prikaz se takođe odnosi na izvođenje kompozicije, gde prva varijanta sadrži (i) prvu mutaciju u bar jednom aminokiselinskom ostatku koji njie mutacija u K439 koja je odabrana iz grupe
(a) aminokiselinski ostatak u CH2-CH3 regionu koji obezbeđuje alosterne mutacije, (b) aminokiselinski ostatak u hidrofobnim čvorićima CH2-CH3 regiona,
(c) aminokiselinski ostatak u N-terminalnoj CH3 zavojnici,
(d) aminokiselinski ostatak u C-terminalnom CH3 beta-lancu, pod uslovom da u slučaju mutacije koji odgovara S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1 mutacija je S440Y ili S440W, i
(e) aminokiselinski ostatak koji odgovara E345, E382 ili Q386 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, i
(ii) drugu mutaciju u položaju koji odgovara K439 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, i gde druga varijanta sadrži mutaciju u položaju koji odgovara S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1 , koja nije nije S440Y ili S440W.
[0509] Predmetni prikaz takođe se odnosi na izvođenje kompozicije, gde prva varijanta sadrži mutaciju u položaju koji odgovara K439 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1; i gde druga varijanta sadrži drugi Fc-domen imunoglobulina i region koji veže antigen, gde pomenuta druga varijanta sadrži (i) prvu mutaciju u bar jednom aminokiselinskom ostatku koji nije mutacija u S440 koji je odabran iz grupe
(a) aminokiselinski ostatak u CH2-CH3 regionu koji obezbeđuje alosterne mutacije,
(b) aminokiselinski ostatak u hidrofobnim čvorićima CH2-CH3 regiona,
(c) aminokiselinski ostatak u N-terminalnoj CH3 zavojnici,
(d) aminokiselinski ostatak u C-terminalnom CH3 beta-lancu, i
(e) aminokiselinski ostatak koji odgovara E345, E382 ili Q386 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1,
i (ii) druga mutacija u položaju koji odgovara S440 u Fc regionu teškog lanca IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 nije S440Y ili S440W.
[0510] U drugom aspektu, predmetni prikaz se odnosi na kompoziciju koja sadrži prvu varijantu antitela i drugu varijantu matičnog antitela, gde prva varijanta sadrži prvi Fc-domen imunoglobulina i prvi region koji veže antigen, gde prva varijanta sadrži prvu mutaciju u bar aminokiselinskom ostatku koji je odabran iz grupe
(a) aminokiselinski ostatak u CH2-CH3 regionu koji obezbeđuje alosterne mutacije,
(b) aminokiselinski ostatak u hidrofobnim čvorićima CH2-CH3 regiona,
(c) aminokiselinski ostatak u N-terminalnoj CH3 zavojnici,
(d) aminokiselinski ostatak u C-terminalnom CH3 beta-lancu, pod uslovom da u slučaju mutacije koji odgovara S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1 mutacija je S440Y ili S440W, i
(e) aminokiselinski ostatak koji odgovara E345, E382 ili Q386 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, i
gde druga varijanta sadrži drugi Fc-domen imunoglobulina i drugi region koji veže antigen, gde pomenuta druga varijanta ne sadrži mutaciju u aminokiselinskom ostatku koji je odabran iz grupe
(a) aminokiselinski ostatak u CH2-CH3 regionu koji obezbeđuje alosterne mutacije,
(b) aminokiselinski ostatak u hidrofobnim čvorićima CH2-CH3 regiona,
(c) aminokiselinski ostatak u N-terminalnoj CH3 zavojnici,
(d) aminokiselinski ostatak u C-terminalnom CH3 beta-lancu, pod uslovom da u slučaju mutacije koja odgovara S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1 mutacija je S440Y ili S440W, i (e) aminokiselinski ostatak koji odgovara E345, E382 ili Q386 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1.
1
[0511] U izvođenjima iz prikaza, gde druga varijanta ne sadrži bilo koju od navedenih mutacija koje se ovde opisuju, takva druga varijanta može uključiti bilo koje od pogodnih primera drugog antitela koja se navode gore u tekstu u odnosu na postupke efektorskih funkcija.
[0512] U jednom izvođenju iz prikaza, prva i druga varijanta sadrži prvu mutaciju u bar jednom aminokiselinskom ostatku koji je odabran iz onih koji odgovaraju E345, E430, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436, i K447 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1.
[0513] U jednom izvođenju iz prikaza, prva varijanta sadrži mutaciju u bar jednom aminokiselinskom ostatku koji je odabran iz onih koji odgovaraju E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436, i K447 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 je S440Y ili S440W.
[0514] U jednom posebnom izvođenju iz prikaza, prva varijanta sadrži mutaciju u aminokiselinskim ostacima koji odgovaraju E345R i Q386K u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, i druga varijanta ne sadrži takve mutacije.
[0515] U jednom posebnom izvođenju, iz prikaza prva varijanta sadrži mutaciju u aminokiselinskim ostacima koja odgovara E345R, Q386K i E430G u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, i druga varijanta ne sadrži takve pomenute mutacije.
[0516] U jednom izvođenju iz prikaza, bar jedna prva mutacija u prvoj i drugoj varijanti se razlikuje.
[0517] U jednom izvođenju iz prikaza, prva varijanta i druga varijanta u svakom humanom IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD ili IgE antitelu, opciono svako humano antitelo pune dužine, kao što je svako IgG1 antitelo je humano antitelo pune dužine.
[0518] U jednom izvođenju iz prikaza, prva varijanta i druga varijanta je odabrana iz monospecifičnog antitela, bispecifičnog antitela ili multispecifičnog antitela.
[0519] U drugom izvođenju iz prikaza, prva i druga varijanta vežu različite epitope na istom antigenu ili na različitim antigenima. Prema tome, u izvođenju, gde prvo i drugo antitelo su bispecifična antitela mogu se svaki vezati za dva različita epitopa. Bar dva bispecifična antitela mogu biti ista ili različita. Ukoliko su bispecifična antitela različita, kompozicija, prema tome, obuhvata ciljanje do četiri različita epitopa bilo na istim ili različitim metama.
[0520] U drugom izvođenju iz prikaza, jedna ili oba od prve varijante i druge varijanta je konjugovana sa lekom, toksinom ili radioobeleživačem, kao što gde jedna ili obe od prve varijante i druga varijanta je konjugovana sa toksinom preko linkera.
[0521] U drugom izvođenju iz prikaza, jedna ili obe od prve varijante i druge varijante je deo spojenog proteina.
[0522] U drugom aspektu iz prikaza, pronalazak se odnosi na kompoziciju koja sadrži bilo koju varijantu, bilo koje bispecifično antitelo ili bilo koju kompoziciju koja se ovde opisuje i farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0523] Smatra se da bilo koje od izvođenja prema "mešavina-mutant" aspektu takođe može da se nalazi u bilo kojoj od kompozicija izvođenja.
[0524] U jednom izvođenju iz prikaza, varijante prvog i drugog matičnog antitela vežu se za antigene koji su eksprimirani na istoj ćeliji.
2
[0525] U drugom izvođenju iz prikaza, varijanta prvog matičnog antitelа sadrži aminokiselinsku supstituciju K439 u aminokiselinu koja je odabrana iz E i D.
[0526] U drugom izvođenju iz prikaza, aminokiselinska supstitucija u varijanti prvog matičnog antitela je K439E.
[0527] U drugom izvođenju iz prikaza, varijanta drugog matičnog antitela sadrži aminokiselinsku supstituciju S440 u aminokiselini koja je odabrana iz K, R i H.
[0528] U drugom izvođenju iz prikaza, aminokiselinska supstitucija u varijanti drugog matičnog antitela varijante je S440K.
[0529] U alternativnom izvođenju iz prikaza, varijanta prvog i/ili drugog antitela dalje obuhvata mutaciju u ostatku koji je odabran iz grupe koja se sastoji iz H310, G385, H433, N434, i Q438.
[0530] U daljem alternativnom izvođenju iz prikaza, varijanta prvog i/ili drugog matičnog antitela dalje sadrži mutaciju koja je odabrana iz E345 u D, K, N, Q, R, ili W; E382 u D, Q, K, ili R; i H433 u R.
[0531] U drugom izvođenju iz prikaza, varijanta prvog i drugog matičnog antitela dalje sadrže mutaciju koja je odabrana iz E345R, E382R i H433R, kao što je E345R.
[0532] U drugom aspektu iz prikaza, pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži varijantu prvog matičnog antitela i varijantu drugog matičnog antitela prema bilo kom od gore navedenih izvođenja.
[0533] Farmaceutske kompozicije mogu biti formulisane u skladu sa uobičajenim postupcima koji su prikazani u Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995. Farmaceutska kompozicija iz predmetnog pronalaska može npr. uključiti razblaživače, sredstva za punjenje, soli, pufere, deterdžente (npr., nejonski deterdžent, kao što je Tween-20 ili Tween-80), stabilizatore (npr., šećere ili aminokiseline bez proteina), konzervanse, sredstva za izotoničnost, antioksidanse, sredstva za fiksiranje tkiva, solubilizatore, i/ili druge materijale koji su pogodni za uključivanje u farmaceutsku kompoziciju. Primeri pogodnih vodenih i ne-vodenih nosača koji se mogu koristiti u farmaceutskim kompozicijama iz predmetnog pronalaska uključuju vodu, rastvor soli, rastvor soli puferovan fosfatom, etanol, dekstroza, polioli (kao što je glicerol, propilen glikol, polietilen glikol).
[0534] Farmaceutska kompozicija se može primenti bilo kojim putem i načinom davanja. U jednom izvođenju, farmacutska kompozicija iz predmetnog pronalaska je davana parenteralno. Termin "parenteralno davanje" kao što se ovde koristi označava načine davanja koji nisu enteralno i lokalno davanje, obično injekcijom, i uključuje epidermalno, intravenozno, intramuskularno, intraarterijalno, intratekalno, intrakapsulatno, intraorbitalno, intrakardijalno, intrademalno, intraperitonealno, intratendiozno, transtrahealno, subkutanozono, subkutikularno, intraartikularno, subkapsularno, subarahnoidno, intraspinalno, intrakranijalno, intratorakalno, epiduralno i intrasternalno davanje injekcijom i infuzijom.
Komplet delova
[0535] Treba razumeti da sva gore navedena izvođenja koja su ovde opisana sa referencom na matično antitelo, prvo matično antitelo ili drugo matično antitelo takođe treba razumeti kao izvođenja koja se odnose na matični, prvi matični ili drugi matični polipeptid koji sadrži Fc-domen imunoglobulina i region vezivanja.
[0536] Prikaz se takođe odnosi na komplet iz delova za istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu upotrebu u terapiji koja sadrži varijantu u matična antitela, gde bilo koja varijanta i matično antitelo može biti kao što je ovde opisano. Specifični aspekti i izvođenja iz prikaza će biti opisani u tekstu ispod. Osim toga, takve varijante se mogu dobiti prema bilo kom ovde opisanom postupku.
[0537] Prikaz se takođe odnosi na komplet iz delova za istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu upotrebu u terapiji koji sadrži varijante i matična antitela može biti bilo koja varijanta i matično antitelo kao što je ovde opisano. Specifični aspekti i izvođenja će biti opisani u tekstu ispod. Osim toga, takve varijante se mogu dobiti prema bilo kom ovde opisanom postupku.
[0538] U jednom aspektu predmetni prikaz se odnosi na komplet iz delova za istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu upotrebu u terapiji koji sadrži prvu varijantu matičnog polipeptida i drugu varijantu matičnog polipeptida, gde prva varijanta sadrži prvi Fc-domen imunoglobulina i region vezivanja, gde druga varijanta sadrži drugi Fc-domen imunoglobulina i region vezivanja, i gde
(i) pomenuta prva varijanta sadrži mutaciju u položaju koji odgovara K439 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, i pomenuta druga varijanta sadrži mutaciju u položaju koji odgovara S440 u Fcregionu teškog lanca humanog IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 nije S440Y ili S440W, (ii) pomenuta prva varijanta sadrži mutaciju u položaju koji odgovara K447D/E u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1; i pomenuta druga varijanta sadrži mutaciju u položaju koji odgovara K447K/R/H i 448P u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, ili
(iii) pomenuta prva varijanta sadrži mutaciju u položaju koji odgovara K447D/E u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1; i pomenuta druga varijanta sadrži mutaciju u položaju koji odgovara K447K/R/H, 448K/R/H i 449P u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1.
[0539] U jednom izvođenju iz prikaza prva ili obe varijante matičnog polipeptida i druga varijanta matičnog polipeptida može biti.
[0540] Prema tome u jednom aspektu, prikaz se odnosi na komplet iz delova za istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu upotrebu u terapiji koji sadrži prvu varijantu matičnog antitela i drugu varijantu matičnog antitela, gde prva varijanta sadrži prvi Fc-domen imunoglobulina i region koji veže antigen, gde druga varijanta sadrži drugi Fc-domen imunoglobulina i region koji veže antigen, i gde
(i) pomenuta prva varijanta sadrži mutaciju u položaju koji odgovara K439 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, i pomenuta druga varijanta sadrži mutaciju u položaju koji odgovara S440 u Fcregionu teškog lanca humanog IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 nije S440Y ili S440W, (ii) pomenuta prva varijanta sadrži mutaciju u položaju koji odgovara K447D/E u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1; i pomenuta druga varijanta sadrži mutaciju u položaju koji odgovara K447K/R/H i 448P u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, ili
(iii) pomenuta prva varijanta sadrži mutaciju u položaju koji odgovara K447D/E u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1; i pomenuta druga varijanta sadrži mutaciju u položaju koji odgovara K447K/R/H, 448K/R/H i 449P u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1.
[0541] U jednom izvođenju iz prikaza komplet iz delova za istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu upotrebu u terapiji koji sadrži prvu varijantu matičnog antitela i drugu varijantu matičnog antitela, gde prva varijanta sadrži prvi Fc-domen imunoglobulina i region koji veže antigen, gde druga varijanta sadrži drugi Fc-domen imunoglobulina i region koji veže antigen, i gde pomenuta prva varijanta sadrži mutaciju u položaju koji odgovara K439 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, i gde druga varijanta sadrži mutaciju u položaju koji odgovara S440, pod uslovom da mutacija u S440 nije S440Y ili S440W.
[0542] U jednom izvođenju iz prikaza, komplet iz delova za istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu upotrebu u terapiji, sadrži prvu varijantu matičnog antitela i drugu varijantu matičnog antitela, gde
4
prva varijanta sadrži prvi Fc-domen imunoglobulina i region koji veže antigen, gde pomenuta prva varijanta sadrži (i) prvu mutaciju u bar jednom aminokiselinskom ostatku koja nije mutacija u K439 koji je odabran iz grupe
(a) aminokiselinski ostatak u CH2-CH3 region koji obezbeđuje alosterne mutacije,
(b) aminokiselinski ostatak u hidrofobnim čvorićima CH2-CH3 regiona,
(c) aminokiselinski ostatak u N-terminalnoj CH3 zavojnici,
(d) aminokiselinski ostatak u C-terminalnom CH3 beta-lancu, pod uslovom da u slučaju mutacije koji odgovara S440 u Fc-region teškog lanca humanog IgG1 mutacija je S440Y ili S440W, i
(e) aminokiselinski ostatak koji odgovara E345, E382 ili Q386 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, i
(ii) druga mutacija u položaju koji odgovara K439 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1; i gde druga varijanta sadrži drugi Fc-domen imunoglobulina i region koji veže antigen, gde pomenuta druga varijanta sadrži (i) prvu mutaciju u bar jednom aminokiselinskom ostatku koja nije mutacija u S440 koji je odabran iz grupe
(a) aminokiselinski ostatak u CH2-CH3 regionu koji obezbeđuje alosterne mutacije,
(b) aminokiselinski ostatak u hidrofobnim čvorićima CH2-CH3 regina,
(c) aminokiselinski ostatak u N-terminalnoj CH3 zavojnici,
(d) aminokiselinski ostatak u C-terminalnom CH3 beta-lancu, i
(e) aminokiselinski ostatak koji odgovara E345, E382 ili Q386 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, i
(ii) druga mutacija u položaju koji odgovara S440 u Fc regionu teškog lanca IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 nije S440Y ili S440W.
[0543] U drugom izvođenju iz prikaza, komplet iz delova za istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu upotrebu u terapiji, koji sadrži prvu varijantu antitela i drugu varijantu matičnog antitela, gde prva varijanta sadrži
(i) prvu mutaciju u bar jednom aminokiselinskom ostatku koja nije mutacija u K439 koji je odabran iz grupe
(a) aminokiselinski ostatak u CH2-CH3 regionu koji obezbeđuje alosterne mutacije,
(b) aminokiselinski ostatak u hidrofobnim čvorićima CH2-CH3 regiona,
(c) aminokiselinski ostatak u N-terminalnoj CH3 zavojnici,
(d) aminokiselinski ostatak u C-terminalnom CH3 beta-lancu, pod uslovom da u slučaju mutacije koji odgovara S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1 mutacija je S440Y ili S440W, i
(e) aminokiselinski ostatak koji odgovara E345, E382 ili Q386 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, i
(ii) druga mutacija u položaju koji odgovara K439 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, i
gde druga varijanta sadrži mutaciju u položaju koji odgovara S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, koja nije nije S440Y ili S440W.
[0544] U drugom izvođenju iz prikaza, komplet iz delova za istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu upotrebu u terapiji, koji sadrži prvu varijantu matičnog antitela i drugu varijantu matičnog antitela,
gde prva varijanta sadrži mutaciju u položaju koji odgovara K439 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1; i gde druga varijanta sadrži drugi Fc-domen imunoglobulina i region koji veže antigen, gde pomenuta druga varijanta sadrži (i) prvu mutaciju u bar jednom aminokiselinskom ostatku koji nije nije mutacija u S440 koji je odabran iz grupe
(a) aminokiselinski ostatak u CH2-CH3 regionu koji obezbeđuje alosterne mutacije,
(b) aminokiselinski ostatak u hidrofobnim čvorićima CH2-CH3 regiona,
(c) aminokiselinski ostatak u N-terminalnoj CH3 zavojnici,
(d) aminokiselinski ostatak u C-terminalnom CH3 beta-lancu, i
(e) aminokiselinski ostatak koji odgovara E345, E382 ili Q386 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1,
i (ii) druga mutacija u položaju koji odgovara S440 u Fc regionu teškog lanca IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 nije S440Y ili S440W.
[0545] U jednom izvođenju iz prikaza, mutacija u položaju koji odgovara K439 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1 je K439D/E, i/ili mutacija u položaju koji odgovara S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1 je S440K/H/R.
[0546] U drugom aspektu predmetni prikaz se odnosi na komplet iz delova za istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu upotrebu u terapiji, koji sadrži prvu varijantu matičnog polipeptida koji sadrži Fcdomen imunoglobulina i region vezivanja i drugu varijantu matičnog polipeptida koji sadrži Fc-domen imunoglobulina i region vezivanja, gde prva varijanta sadrži prvi Fc-domen imunoglobulina i prvi region koji veže antigen, gde prva varijanta sadrži prvu mutaciju u bar aminokiselinskom ostatku koji je odabran iz grupe
(a) aminokiselinski ostatak u CH2-CH3 regionu koji obezbeđuje alosterne mutacije,
(b) aminokiselinski ostatak u hidrofobnim čvorićima CH2-CH3 regionu,
(c) aminokiselinski ostatak u N-terminalnoj CH3 zavojnici,
(d) aminokiselinski ostatak u C-terminalnom CH3 beta-lancu, pod uslovom da u slučaju mutacije koji odgovara S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1 mutacija je S440Y ili S440W, i
(e) aminokiselinski ostatak koji odgovara E345, E382 ili Q386 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, i gde
druga varijanta ne sadrži mutaciju in aminokiselinskom ostatku koji je odabran iz grupe
(a) aminokiselinski ostatak u CH2-CH3 regionu koji obezbeđuje alosterne mutacije,
(b) aminokiselinski ostatak u hidrofobnim čvorićima CH2-CH3 regiona,
(c) aminokiselinski ostatak u N-terminalnoj CH3 zavojnici,
(d) aminokiselinski ostatak u C-terminalnom CH3 beta-lancu, pod uslovom da u slučaju mutacije koji odgovara S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1 mutacija je S440Y ili S440W, i
(e) aminokiselinski ostatak koji odgovara E345, E382 ili Q386 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1.
[0547] U jednom izvođenju iz prikaza prvi i/ili drugi matični polipeptid može biti antitelo.
[0548] Predmetni prikaz takođe se odnosi na izvođenje kompleta iz delova za istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu upotrebu u terapiji, gde prva varijanta sadrži (i) prvu mutaciju u bar jednom aminokiselinskom ostatku koja nije mutacija u K439 koji je odabran iz grupe
(a) aminokiselinski ostatak u CH2-CH3 regionu koji obezbeđuje alosterne mutacije,
(b) aminokiselinski ostatak u hidrofobnim čvorićima CH2-CH3 regiona,
(c) aminokiselinski ostatak u N-terminalnoj CH3 zavojnici,
(d) aminokiselinski ostatak u C-terminalnom CH3 beta-lancu, pod uslovom da u slučaju mutacije koji odgovara S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1 mutacija je S440Y ili S440W, i
(e) aminokiselinski ostatak koji odgovara E345, E382 ili Q386 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, i
(ii) druga mutacija u položaju koji odgovara K439 u Fc-region teškog lanca humanog IgG1, i gde druga varijanta sadrži mutaciju u položaju koji odgovara S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, koja nije nije S440Y ili S440W.
[0549] Predmetni prikaz takođe se odnosi na izvođenje kompleta iz delova za istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu upotrebu u terapiji, gde prva varijanta sadrži mutaciju u položaju koji odgovara K439 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1; i gde druga varijanta sadrži drugi Fc-domen imunoglobulina i region koji veže antigen, gde pomenuta druga varijanta sadrži (i) prvu mutaciju u bar jednom aminokiselinskom ostatku koja nije mutacija u S440 koji je odabran iz grupe
(a) aminokiselinski ostatak u CH2-CH3 regionu koji obezbeđuje alosterne mutacije,
(b) aminokiselinski ostatak u hidrofobnim čvorićima CH2-CH3 regiona,
(c) aminokiselinski ostatak u N-terminalnoj CH3 zavojnici,
(d) aminokiselinski ostatak u C-terminalnom CH3 beta-lancu, i
(e) aminokiselinski ostatak koji odgovara E345, E382 ili Q386 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1,
i (ii) druga mutacija u položaju koji odgovara S440 u Fc regionu teškog lanca IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 nije S440Y ili S440W.
[0550] U drugom aspektu, predmetni prikaz se odnosi na komplet iz delova za istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu upotrebu u terapiji, koji sadrži prvu varijantu antitela i drugu varijantu matičnog antitela, gde prva varijanta sadrži prvi Fc-domen imunoglobulina i prvi region koji veže antigen, gde prva varijanta sadrži prvu mutaciju u bar aminokiselinskom ostatku koji je odabran iz grupe
(a) aminokiselinski ostatak u CH2-CH3 regionu koji obezbeđuje alosterne mutacije,
(b) aminokiselinski ostatak u hidrofobnim čvorićima CH2-CH3 regiona,
(c) aminokiselinski ostatak u N-terminalnoj CH3 zavojnici,
(d) aminokiselinski ostatak u C-terminalnom CH3 beta-lancu, pod uslovom da u slučaju mutacije koji odgovara S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1 mutacija je S440Y ili S440W, i
(e) aminokiselinski ostatak koji odgovara E345, E382 ili Q386 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, i
gde druga varijanta sadrži drugi Fc-domen imunoglobulina i drugi region koji veže antigen, gde pomenuta druga varijanta ne sadrži mutaciju u aminokiselinskom ostatku koji je odabran iz grupe
(a) aminokiselinski ostatak u CH2-CH3 regionu koji obezbeđuje alosterne mutacije,
(b) aminokiselinski ostatak u hidrofobnim čvorićima CH2-CH3 regiona,
(c) aminokiselinski ostatak u N-terminalnoj CH3 zavojnici,
(d) aminokiselinski ostatak u C-terminalnom CH3 beta-lancu, pod uslovom da u slučaju mutacije koji odgovara S440 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1 mutacija je S440Y ili S440W, i
(e) aminokiselinski ostatak koji odgovara E345, E382 ili Q386 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1.
[0551] U izvođenjima iz prikaza, gde druga varijanta ne sadrži bilo koju od ovde navedenih mutacija koje su opisane, takva druga varijanta može uključiti bilo koje od pogodnih primera drugog antitela koji su navedeni gore u tekstu koji se odnose na postupke efektorskih funkcija.
[0552] U jednom izvođenju iz prikaza, prva i druga varijanta sadrže prvu mutaciju u bar jednom aminokiselinskom ostatku koji je odabran iz onih koji odgovaraju E345, E430, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436, i K447 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1.
[0553] U jednom izvođenju iz prikaza, prva varijanta sadrži mutaciju u bar jednom aminokiselinskom ostatku koji je odabran iz onih koji odgovaraju E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436, i K447 u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, pod uslovom da mutacija u S440 je S440Y ili S440W.
[0554] U jednom posebnom izvođenju iz prikaza, prva varijanta sadrži mutaciju u aminokiselinskim ostacima koji odgovaraju E345R i Q386K u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, i druga varijanta ne sadrži takve mutacije.
[0555] U jednom posebnom izvođenju iz prikaza, prva varijanta sadrži mutaciju u aminokiselinskim ostacima koja odgovara E345R, Q386K i E430G u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, i druga varijanta ne sadrži takve mutacije.
[0556] U jednom izvođenju iz prikaza, bar jedna prva mutacija u prvoj i drugoj varijanti se razlikuje.
[0557] U jednom izvođenju iz prikaza, prva varijanta i druga varijanta je svaka humano IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD ili IgE antitelo, opciono svako humano antitelo pune dužine, kao što je svako humano IgG1 antitelo pune dužine.
[0558] U jednom izvođenju iz prikaza, prva varijanta i druga varijanta je odabrana iz monospecifičnog antitela, bispecifičnog antitela ili multispecifičnog antitela.
[0559] U drugom izvođenju iz prikaza, prva i druga varijanta vežu različite epitope na istom antigen ili na različitim antigenima. Prema tome, u izvođenju, gde su prvo i drugo antitelo bispecifična antitela mogu se svaki vezati za dva različita epitopa. Bar dva bispecifična antitela mogu biti ista ili različita. Ukoliko su bispecifična antitela različita, komplet iz delova za istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu upotrebu u terapiji, prema tome, obuhvata ciljanje do četiri različita epitopa na ili istim ili različitim metama.
[0560] U drugom izvođenju iz prikaza, jedno ili oba od prve varijante i druge varijante je konjugovana sa lekom, toksinom ili radioobeleživačem, kao što su gde je jedna ili obe od prve varijante i druge varijante konjugovana sa toksinom preko linkera.
[0561] U drugom izvođenju iz prikaza, jedno ili oba od prve varijante i druge varijante je deo spojenog proteina.
[0562] Podrazumeva se da bilo koje izvođenje prema aspektu "mešovitog-mutanta" iz prikaza takođe može da se nalazi u bilo kom kompletu iz delova za istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu upotrebu u terapiji, u izvođenjima.
[0563] U jednom izvođenju iz prikaza, varijante prvog i drugog matičnog antitela vežu se za antigene koji su eksprimirani na istoj ćeliji.
[0564] U drugom izvođenju iz prikaza, varijanta prvog matičnog antitela sadrži aminokiselinsku supstituciju K439 u aminokiselini koja je odabrana iz E i D.
[0565] U drugom izvođenju iz prikaza, aminokiselinska supstitucija u varijanti prvog matičnog antitela je K439E.
[0566] U drugom izvođenju iz prikaza, varijanta drugog matičnog antitela sadrži aminokiselinsku supstituciju S440 u aminokiselini koja je odabrana iz K, R i H.
[0567] U drugom izvođenju iz prikaza, aminokiselinska supstitucija u varijanti drugog matičnog antitela varijante je S440K.
[0568] U alternativnom izvođenju iz prikaza, varijanta prvog i/ili drugog antitela dalje obuhvata mutaciju u ostatku koji je odabran iz grupe koja se sastoji iz H310, G385, H433, N434, i Q438.
[0569] U daljem alternativnom izvođenju iz prikaza, varijanta prvog i/ili drugog matičnog antitela dalje sadrži mutaciju koja je odabrana iz E345 u D, K, N, Q, R, ili W; E382 u D, Q, K, ili R; i H433 u R.
[0570] U drugom izvođenju iz prikaza, varijante prvog i drugog matičnog antitela dalje sadrže mutaciju koja je odabrana iz E345R, E382R i H433R, kao što je E345R.
[0571] U drugom aspektu, prikaz se odnosi na farmaceutski komplet iz delova za istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu upotrebu u terapiji, koji sadrži varijantu prvog matičnog antitela i varijantu drugog matičnog antitela prema bilo kom od gore navedenih izvođenja.
[0572] Farmaceutski komplet iz delova za istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu upotrebu u terapiji, može primenti bilo kojim putem i načinom davanja. U jednom izvođenju, farmacutski komplet iz delova za istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu upotrebu u terapiji, iz predmetnog pronakaska primenjuje se parenteralno. Termin "parenteralno davanje" kao što se ovde koristi označava načine davanja koji nisu enteralno i lokalno davanje, obično injekcijom, i uključuje epidermalno, intravenozno, intramuskularno, intraarterijalno, intratekalno, intrakapsularno, intraorbitalno, intrakardijalno, intrademalno, intraperitonealno, intratendiozno, transtrahealno, subkutanozono, subkutikularno, intraartikularno, subkapsularno, subarahnoidno, intraspinalno, intrakranijalno, intratorakalno, epiduralno i intrasternalno davanje injekcijom i infuzijom.
Kombinacije
[0573] Treba razumeti da sva gore navedena izvođenja koja su ovde opisana sa referencom na matično antitelo, prvo matično antitelo ili drugo matično antitelo takođe treba razumeti kao izvođenja koja se odnose na matični, prvi matični ili drugi matični polipeptid koji sadrži Fc-domen imunoglobulina i region vezivanja.
[0574] Dodatno, prikaz obezbeđuje za preparat varijante aspekta bilo kog od "pojedinačnog mutanta" ili gore opisanog izvođenja, tj., preparate koji sadrže višestruke kopije varijante. Prikaz takođe obezbeđuje za kompoziciju koja sadrži varijantu aspekta bilo kog "pojedinačnog-mutanta" i gore opisanog izvođenja, npr., farmaceutska kompozicija. Prikaz takođe obezbeđuje za upotrebu bilo kog takvog "pojedinačnog-mutanta" varijante, preparata, ili kompozicije kao leka.
[0575] Prikaz takođe obezbeđuje kombinacije varijanti, gde jedna varijanta sadrži bar jednu mutaciju koja je nezavisno odabrana od onih u Tabeli 1 i jedna varijanta sadrži bar jednu drugu mutaciju koja je nezavisno odabrana od onih u Tabeli 1, kao i preparate i farmaceutske kompozicije takvih kompozicija varijanti i njihova upotreba kao leka. Poželjno, dve varijante vežu isti antigen ili različite antigene koji su obično eksprimirani na površini iste ćelije, ćelijske membrane, viriona i/ili druge čestice.
Konjugati
[0576] Treba razumeti da sva gore navedena izvođenja koja su ovde opisana sa referencom na matično antitelo, prvo matično antitelo ili drugo matično antitelo takođe treba razumeti kao izvođenja koja se odnose na matični, prvi matični ili drugi matični polipeptid koji sadrži Fc-domen imunoglobulina i region vezivanja.
[0577] U jednom aspektu, predmetni prikaz se odnosi na varijantu, u kome je pomenuta varijanta konjugovana sa lekom, toksinom ili je radioaktivno obeležen kao što gde je varijanta konjugovana sa toksinom preko linkera.
[0578] U jednom izvođenju iz prikaza pomenuta varijanta je deo fuzionog proteina.
[0579] U drugom aspektu, varijanta iz pronalaska nije konjugovana na C-kraju sa drugim molekulom, kao što je toksin ili obeleživač. U jednom izvođenju, varijanta je konjugovana sa drugim molekulom na drrugom mestu, obično na mestu koje ne interferira sa obrazovanjem oligomera. Na primer, varijanta antitela može, na drugom mestu, biti povezana na jedinjenjem koje je odabrano iz grupe koja se sastoji iz toksina (uključujući radioizotop) proleka ili lek. Takvo jedinjenje može učiniti ubijanje ubijanje ciljnih ćelija efektnijim, npr. u terapiji kancera. Dobijena varijanta je prema tome imunokonjugat.
[0580] Prema tome, u daljem aspektu, predmetni prikaz obezbeđuje antitelo koje je spojeno sa ili je konjugovano sa jednim ili više terapeutskih ostataka, kao što je citotoksin, hemoterapeutski lek, citokin, imunosupresant, i/ili radioizotop. Takvi konjugati su ovde naznačeni kao "imunokonjugati" ili "konjugati leka". Imunokonjugati koji uključuju jedan ili više citotoksina naznačeni su kao "imunotoksini".
[0581] Citotoksin ili citotoksično sredstvo uključuje bilo koje sredstvo koje oštećije (npr., ubija) ćelije. Pogodna terapeutska sredstva za obrazovanje imunokonjugata iz predmetnog prikaza uključuju taksol, citohalasin B, gramicidin D, etidijum bromid, emetin, mitomicin, etoposid, tenoposid, vinkristin, vinblastin, kolhicin, doksorubicin, daunorubicin, dihidroksi antracin dion, maitansin ili analog ili njegov derivat, enedijenske antitumorske antibiotike uključujućo neokarzinostatin, kaliheamicine, esperamicine, dinemicine, lidamicin, kedarcidin ili njegove analoge ili derivate, antracikline, mitoksantron, mitramicin, aktinomicin D, 1-dehidrotestosteron, glukortikosteroide, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol, i puromicin, antimetabolite (kao što su metotreksat, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, citarabin, fludarabin, 5-fluorouracil, dekarbazin, hidroksiurea, asparaginaza, gemcitabin, cladribin), alkilujuća sredstva (kao što je mehloretamin, tioepa, hlorambucil, melfalan, karmustin (BSNU), lomustin (CCNU), ciklofosfamid, busulfan, dibromomanitol, streptozotocin, dakarbazin (DTIC), prokarbazin, mitomicin C, cisplatin i drugi derivati platine, kao što je karboplatina; kao i duokarmicin A, duokarmicin SA, CC-1065 (a.k.a. rahelmicin), ili analozi ili derivati CC-1065), dolastatin, pirolo[2,1-c][1,4] benzodiazepini (PDBs) ili njihovi analozi, antibiotici (kao što je daktinomicin (prethodno aktinomicin), bleomicin, daunorubicin (prethodno daunomicin), doksorubicin, idarubicin, mitramicin, mitomicin, mitoksantron, plicamicin, antramicin (AMC)), anti-mitotička sredstva (npr., inhibitori tubulina) kao što je monometil auristatin E, monometil auristatin F, ili drugi analozi ili derivati dolastatina 10; Inhibitori histon deacetilaze kao što je trihostatin A hidroksiaminske kiseline, vorinostat (SAHA), belinostat, LAQ824, i panobinostat kao i benzamidi, entinostat, CI994, mocetinostat i jedinjenja alifatične kiseline kao što je fenilbutirat i valproinska kiselina, inhibitori proteazoma kao što su Danoprevir, bortezomib, amatoksini kao što su α-amantin, toksin difterije i srodni molekuli (kao što je A lanac difterije i njegovi aktivni fragmenti i hibridni molekuli); toksin ricina (kao što je ricin A ili deglikozilovani A lanac ricina toksina), toksin kolere, Shiga-sličan toksin (SLT-I, SLT-II, SLT-IIV), LT toksin, C3 toksin, Shiga toksin, pertussis toksin, tetanus toksin, Bowman-Birk proteazni inhibitor soje, Pseudomonas egzootoksin, alorin, saporin, modecin, gelanin, abrin A lanac, modecin A lanac, alfasarcin, Aleurites fordii proteini, diantin proteini, Phytolacca americana proteini (PAPI, PAPII, i PAP-S), momordica charantia inhibitor, curcin, krotin, sapaonaria officinalis inhibitor, gelonin, mitogelin, restriktocin, fenomicin, i enomicin toksini. Drugi pogodni konjugovani molekuli uključuju antimikroben/litičke peptide kao što su CLIP, Magainin 2, melitin, Cecropin, i P18; ribonukleaza (RNaza), DNaza I, Stafilokokni enterotoksin-A, antivirusni protein kermera, difterin toksin, i Pseudomonas endotoksin. Videti, na primer, Pastan et al., Cell 47, 641 (1986) i Goldenberg, Calif. A Cancer Journal for Clinicians 44, 43 (1994). Terapeutska sredstva se mogu davati u kombinaciji sa antitelom iz predmetnog pronalaska kao što je ovde na drugom mestu opisano, kao što su, npe., antikancerogeni citokini ili hemokini, takođe su kandidati za terapeutske ostatke koji su korisni za konjugaciju sa antitelom iz predmetnog pronalaska.
[0582] U jednom izvođenju iz prikaza, konjugat leka iz predmetnog pronalaska sadrži antitelo kao što je ovde prikazano konjugovano sa auristatinima ili analozima i derivatima peptide auristatina (US5635483; US5780588). Pokazano je da auristatini interferiraju sa dinamikama mikrotubula, hidrolizom GTP i nukleusnom i ćelijskom deobom (Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12): 3580-3584) i imaju aktivnost protiv kancera (US5663149) i protiv gljiva (Pettit et al., (1998) Antimicrob. Agents and Chemother.42:2961-2965. Ostatak leka auristatina može biti vezan za antitelo preko linkera, kroz N (amino) kraj ili C (kraj) ostatka peptidnog leka.
[0583] Primeri izvođenja auristatina iz prikaza uključuju N-kraj-vezane ostatke DE i DF monometil auristatin leka, prikazane u Senter et al., Proceedings of the American Association for Cancer Research. Volume 45, broj apstrakta 623, prezentovano 28 marta, 2004 i opisano u US 2005/0238649).
[0584] Primer izvođenja auristatina iz prikaza je MMAE (monometil auristatin E). Drugi primer izvođenja auristatina je MMAF (monometil auristatin F).
[0585] U jednom izvođenju, an antitelo iz predmetnog prikaza sadrži konjugovanu nukleinsku kiselinu ili molekul koji je povezan sa nukleinskom kiselinom. U jednom takvom izvođenju iz prikaza, konjugovana nukleinska kiselina je citotoksična ribonukleaza, antisens nukleinska kiselina, inhibitorni RNK molekul (npr., siRNK molekul) ili imunostimulatorna nukleinska kiselina (npr., DNK molekul sa imunostimulatornim CpG motivom). U drugom izvođenju iz prikaza, antitelo iz predmetnog pronalaska je konjugovano sa aptamerom ili ribozimom.
[0586] U jednom izvođenju iz prikaza, obezbeđena su antitela koja sadrže jednu ili više radioaktivno obeležnih aminokiselina. Radioaktivno obeležena varijanta može se koristiti i dijagnostičke i terapeutske svrhe (konjugacija sa radioaktivno obeleženim molekulima je druga moguća karakteristika). Ne-ograničavajući primeri obeleživača za polipeptide uključuju 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, i 1251, 1311, i 186Re. Postupci za dobijanje radioaktivno obeleženih aminokiselina i derivate srodnih peptide su poznati u oblasti tehnike, (videti, na primer Junghans et al., in Cancer Chemotherapy i Biotherapy 655-686 (2nd Ed., Chafner i Longo, eds., Lippincott Raven (1996)) i U.S. 4,681,581, U.S.
4,735,210, U.S. 5,101,827, U.S. 5,102,990 (US RE35,500), U.S. 5,648,471 i U.S.5,697,902. Na primer, radioizotop može biti konjugovan sa hloramin-T postupkom.
[0587] U jednom izvođenju iz prikaza, varijanta iz predmetnog prikaza je konjugovana sa radioizotopom ili sa helatom koji sadrži radioizotop. Na primer, varijanta može biti konjugovana sa linkerom helatora, npr. DOTA, DTPA ili tiuksetan, što omogućava antitelu da kompleksira sa radioizotopom. Varijanta može takođe ili alternativno sadržati ili biti konjugovana sa jednom ili više radioaktivno obeleženih aminokiselona ili drugim radioaktivno obeleženim molekulima. Radioaktivno obeležena varijanta može se korisiti i za dijagnostičke i za terapeuutske svrhe. U jednom izvođenju varijanta iz predmetnog pronalaska je konjugovana sa alfa-emiterom. Ne-ograničavajući primeri radioizotipa uključuju<3>H,<14>C,<15>N,<35>S,<90>Y,<99>Tc,<125>I,<111>In,<131>I,<186>Re,<213>Bs,<225>Ac i<227>Th.
1
[0588] U jednom izvođenju varijanta iz predmetnog prikaza može se konjugovati za citokin koji je odabran iz grupe koja se sastoji iz IL2, IL4, IL6, IL7, IL10, IL12, IL13, IL15, IL18, IL23, IL24, IL27, IL28a, IL28b, IL29, KGF, IFNα, IPNβ, IFNγ, GMCSF, CD40L, Flt3 liganda, faktora matičnih ćelija, ancestima, i TNFα.
[0589] Varijante iz predmetnog prikaza mogu takođe biti hemijski modifikovane kovalentnom konjugacijom sa polimerom da bi se na primer povećao njihov polu-život u krvotoku. Primeri polimera, i postupci koji ih vezuju za peptide, ilustrovani su na primer u US 4,766,106, US 4,179,337, US 4,495,285 i US 4,609,546. Dodatni polimeri uključuju polioksietilovane poliole i polietilen glikole (PEG) (npr., PEG sa molekulskom težinom od između oko 1,000 i oko 40,000, kao što je između oko 2,000 i oko 20,000).
[0590] Bilo koji postupak koji je u oblasti tehnike poznat za konjugovanje varijante iz predmetnog prikaza da konjugovanim molekulom(ima), kao što su oni koji su opisani gore u tekstu, mogu se koristiti, uključujući postupke koji su opisani kod Hunter et al., Nature 144, 945 (1962), David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974), Pain et al., J. Immunol. Meth.40, 219 (1981) i Nygren, J. Histochem. i Cytochem.30, 407 (1982). Takve varijante se mogu proizvesti hemijskim konjugovanjem drugog ostatka sa -Nterminalom stranom ili -Cterminalnom stranom varijante ili njenog fragmenta (npr., H ili L lanac antitela) (videti, npr., Antibody Engineering Handbook, editovano od Osamu Kanemitsu, objavljeno od Chijin Shokan (1994)). Takvi derivati konjugovane varijante mogu se takođe dobiti konjugovanjem po potrebi, na unutrašnjim ostacima ili šećerima.
[0591] Sredstva mogu biti spojena ili direktno ili indirektno sa varijantom iz predmetnog pronalaska. Jedan primer indirektnog spajanja drugog sredstva je spajanje preko grupe koja povezuje ili ostatka linkera sa ostacima cisteina ili lizina u bispecifičnom antitelu. U jednom izvođenju iz prikaza, varijanta je konjugovana sa molekulom proleka koja se može aktivirati in vivo sa terapeutskim lekom preko grupe koja povezuje ili linkera. U nekim izvođenjima iz prikaza, linker se može cepati pod unutarćelijskim uslovima, kao što cepanje linkera oslobađa jedinicu leka iz antitela u unutarćelijsko okruženje. U nekim izvođenjima iz prikaza, linker se može cepati pomoću sredstva za cepanje koje se nalazi u unutarćelijskom okruženju (npr. u lizozomu ili endozomu ili kaveoli). Na primer, grupe koje povezuju ili linkeri mogu se cepati pomoću enzima koji su povezani sa ćelijom tumora ili drugim uslovima koji su specifični za tumor, kojim se obrazuje aktivni lek. Primeri takvih postupaka za dobijanje proleka i linkeri opisani su u WO02083180, WO2004043493, WO2007018431, WO2007089149, WO2009017394 i WO201062171 od strane Syntarga BV, et al. Pogodna antitelo-prolek tehnologija i analozi duokarmicina mogu se takođe naći u U.S. Patent br. 6,989,452 (Medarex), kao što je ovde ukljčeno referencom. Linker može takođe ili alternativno biti, npr. peptidil linker koji se cepa pomoću unutarćelijske peptidaze ili enzima proteaze, uključujući ali bez ograničenja na, lizozomalnu ili endozomalnu proteazu. U nekim izvođenjima, peptidil linker je dužine bar dve aminokiseline ili dužine bar tri aminokiseline. Sredstva za cepanje mogu uključiti katepsine B i D i plazmin, za koje je poznato da svi hidrolizuju derivate dipeptidnog leka što dovodi do oslobađanja aktivnog leka u ciljnim ćelijama (videti npr. Dubowchik i Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123). U specifičnom izvođenju iz prikaza, peptidil linker koji se može cepati sa intracelularnom proteazom je Val-Cit (valin-citrullin) linker ili Phe-Lys (fenilalanin-lizin) linker (videti npr. US6214345, koji opisuje sintezu doksorubicina sa Val-Cit linkerom i različite primere Phe-Lys linkera). Primeri struktura Val-Cit i Phe-Lys linkera uključuju ali nisu ograničeni na MC-vc-PAB kao što je opisano u tekstu ispod, MC-vc-GABA, MC-Phe-Lys-PAB ili MC-Phe-Lys-GABA, gde MC je skraćenica za maleimido kaproil, vc je skraćenica za Val-Cit, PAB je skraćenica za p-aminobenzilkarbamat i GABA je skraćenica za γ-aminobuternu kiselinu. Prednost korišćenja unutarćelijskog proteolitičkog oslobađanja terapeutskog sredstva je u tome što je sredstvo obično atenuirano kada je konjugovano i stabilnosti konjugata u serumu su obično visoke.
2
[0592] U još drugom izvođenju iz prikaza, jedinica linkera se ne može cepati i lek se oslobađa degradiranjem antitela (videti US 2005/0238649). Obično, takav linker u suštini ne reaguje na vanćelijsko okruženje. Kao što je ovde korišćeno, "ne reaguje u suštini na vanćelijsko okruženje" u kontekstu linkera znači da ne više od 20%, obično ne više od oko 15%, uobičajeno ne više od oko 10%, i još uobičajnije ne više od oko 5%, ne više od oko 3%, ili ne više od oko 1% linkera, u uzorku jedinjenja konjugata varijante antitela sa lekom, su cepani kada se varijanta jedinjenja konjugata antitela sa lekom nalazi u vanćelijskom okruženju (npr. plazmi). Bilo da linker u suštini ne reaguje vanćelijsko okruženje može se odrediti na primer inkubacijom jedinjenja konjugata varijante antitela sa lekom sa plazmom za prethodno određeni vremenski perion (npr. 2, 4, 8, 16 ili 24 h) i zatim kvantifikovanjem količine slobodnog leka koji se nalazi u plazmi. Primeri izvođenja koji sadrže MMAE ili MMAF i različite komponente linkera imaju sledeće strukture (gde At označava antitelo i p, predstavlja nanošenje leka (ili srednji broj citostatika ili citotoksičnih lekova po molekulu antitela), je 1 do oko 8, npr. p može biti od 4-6, kao što je ovde od 3-5, ili p može biti 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8).
[0593] Primeri u kojima linker koji se može cepati je kombinovan sa auristatinom uključuje MC-vc-PAB-MMAF (takođe naznačen kao vcMMAF) i MC-vc-PAB-MMAF (takođe naznačen kao vcMMAE), gde je MC skraćenica za maleimido kaproil, vc je skraćenica za Val-Cit (valin-citrulin) zasnovanog linkera, i PAB je skraćenica za p-aminobenzilkarbamata.
[0594] Drugi primeri uključuju auristatine koji su kombinovani sa linkerom koji se ne može cepati, kao što je mcMMAF (mc (MC je u ovom kontekstu isto kao mc) je skraćenica maleimido kaproil).
[0595] U jednom izvođenju iz prikaza, ostatak koji povezuje lek je vcMMAE. vcMMAE ostatak koji povezuje lek i postupci za spajanje su prikazani u WO2004010957, US7659241, US7829531, US7851437 i US 11/833,028 (Seattle Genetics, Inc.), (koji su ovde uključeni referencom), i vcMMAE ostatak koji povezuje lek je vezan sa antitelima u cisteinima korišćenjem postupka koji je sličam sa onim koji je ovde opisan.
[0596] U jednom izvođenju iz prikaza, ostatak koji povezuje lek je mcMMAF. mcMMAF ostatak koji povezuje lek i postupci spajanja su prikazani u US7498298, US 11/833,954, i WO2005081711 (Seattle Genetics, Inc.), (koji su ovde uključeni referencom), i mcMMAF ostatak linkera leka je vezan za varijante u cisteinima korišćenjem postupka koji je sličan sa onim koji je ovde opisan.
[0597] U jednom izvođenju iz prikaza, varijanta iz predmetnog pronalaska je vezana sa linkerom helatorom, npr. tiuksetan, koji omogućava da bispecifično antitelo bude spojeno sa radioizotopom.
[0598] U jednom izvođenju iz prikaza, svaki krak (ili Fab-krak) varijante je direktno ili indirektno spojen sa istim jednim ili više terapeutskih ostataka.
[0599] U jednom izvođenju iz prikaza, samo jedan krak varijante je direktno ili indirektno spojen sa jednim ili više terapeutskih ostataka.
[0600] U jednom izvođenju iz prikaza, svaki kraj varijante je direktno ili indirektno spojen sa različitim terapeutskim ostacima. Na primer, u izvođenjima gde je varijanta bispecifično antitelo i dobijeno je kontrolisanom izmenom Fab-kraka dva različita mnospecifična antitela, npr. prvo i drugo antitelo, kao što je ovde opisano, kao što su bispecifična antitela mogu se dobiti korišćenjem monospecifičnih antitela koja su konjugovana ili povezana sa različitim terapeutskim ostacima.
Ostale upotrebe
[0601] Treba razumeti da sva gore navedena izvođenja koja su ovde opisana sa referencom na matično antitelo, prvo matično antitelo ili drugo matično antitelo takođe treba razumeti kao izvođenja koja se odnose na matični, prvi matični ili drugi matični polipeptid koji sadrži Fc-domen imunoglobulina i region vezivanja.
[0602] U daljem aspektu, prikaz se odnosi na varijantu iz pronalaska kao što je opisaana gore u tekstu za upotrebu kao lek, posebno za upotrebu kao lek za lečenje bolesti ili poremećaja, gde CDC-posredovano ubijanje ciljne ćelije (npr., tumor, bakterijska ili ćelija gljive) ili ciljnog organizma (npr., virusa) je poželjna ili ćeliju koja je inficirana bakterijom ili virusom. Primeri takvih bolesti i poremećaja ukljućuju, bez ograničenja, kancer i bakterijske, virusne ili gljivične infekcije.
[0603] U drugom aspektu, predmetni prikaz se odnosi na varijante, bispecifična antitela, kompozicije i ovde opisani komplet iz delova, za lečenje bolesti, kao što je kancer.
[0604] U drugom aspektu, predmetni prikaz se odnosi na postupak za lečenje čoveka koji obuhvata davanje varijante, kompozicije ili kompleta iz delova koji je ovde opisan.
[0605] U drugom aspektu, predmetni prikaz se odnosi na postupak za lečenje kancera kod čoveka koji obuhvata davanje varijante, kompozicije ili kompleta iz delova
[0606] "Tretman" se odnosi na davanje efikasne količine terapeutski aktivnog jedinjenja iz predmetnog pronalaska u svrhu olakšanja, ublažavanja, zaustavljanja ili uklanjanja (izlečenja) simptoma ili stanja bolesti.
[0607] "Efikasna količina" ili "terapeutski efikasna količina" odnosi se na količinu koja je efikasna, u dozama i potrebnim vremenskim periodima, da bi se postigao željeni terapeutski rezultat. Terapeutski efikasna količina antitela se može razlikovati prema fakorima kao što su stadijum bolesti, starosna dob, pol, i težina individue, i sposobnost antitela da pokrene željeni odgovor kod individue. Terapeutski efikasna količina je takođe ona u kojoj bilo koji toksični ili oštećujući efekti antitela ili dela antitela nadmašuju terapeutski korisne efekte.
[0608] Bez vezivanja za teoriju, efikasna količina terapeutski aktivnog jedinjenja može se smanjiti kada aspekt bilo kojeg "pojedinačnog-mutanta" ili izvođenja prema predmetnom pronalasku je uključen u takvo terapeutski aktivno jedinjenje.
[0609] Pogodni antigeni za antitela protiv kancera mogu biti isti kao što se ove opisuju. Primeri 15 do 18 opisuju specifične primere za obezbeđivanje pojačane i/ili specifičnije aktivacije komplementa ili CDC tumorskih ćelija. Na primer, antitelo protiv tumora prema aspektu "pojedinačnog-mutanta", sadrži, npr., E345R mutacija, može obezbediti za pojačani CDC ili ADCC, ADCP odgovor protiv tumorskih ćelija. Dalje, u varijanti ovog postupka, mutacija prema aspektu "pojedinačnog-mutanta", kao što je, npr., E345R, E430, S440, ili Q386, alternativno E382 ili H433R, ili bilo koja druga mutacija kao što je navedena u Tabeli 1, može se dodati u svako antitelo, time se obezbeđuje pojačani CDC i/ili ADCC odgovor specifično usmeren prema tumorskim ćelijama koje eksprimiraju bar dva antigena.
[0610] Pogodna antitela za bakterijske infekcije uključuju, bez ograničenja, ona koja ciljaju S. aureus, kao što je himerni monoklonski IgG1 pagibaksimab (BSYX-A110; Biosynexus), ciljaju lipoteihoičnu kiselinu (LTA) koja je ugrađena u ćelijski zid staphylococci, i opisana u Baker (Nat Biotechnol. 2006 Dec;24(12):1491-3) i Weisman et al. (Int Immunopharmacol.2009 May;9(5):639-44). Primer 14 opisuje specifično izvođenje korišćenjem S. aureus varijanti antitela koja sadrži E345R mutaciju. Međutim, druge mutacije u Tabeli 1, uključujući ali nije ograničeno na E430G i S440W, alternativno E382R i
4
H433R, mogu biti primenjene na sličan način da bi se pojačala CDC-posredovana sposobnost antitela protiv bakterijskog antigen.
[0611] Pogodni antigeni za virusne ili gljivične infekcije mogu biti bilo koji od ovde opisanih.
[0612] U jednom izvođenju iz prikaza, antigen za koji se varijanta veže nije nije humani EphA2. U drugom izvođenju, varijanta nije izvedena iz humanog EphA2 mAt 12G3H11 (opisano u Dall’Acqua et al., supra). U drugom izvođenju iz prikaza, antigen za koji se varijanta veže nije IL-9. U drugom izvođenju, varijanta nije izvedena iz Fa-hG1 ili Fa-hG4 antitela opisanog u WO2007005612, ili bilo koja njegova varijanta. U jednom izvođenju iz pronalaska, antigen za koji se varijanta veže nije HIV-1 gp120. U drugom izvođenju iz pronalaska, varijanta nije izvedena iz b12 humanog IgG1κ antitela usmerenog protiv gp120.
[0613] U posebnom izvođenju iz prikaza, varijanta je izvedena iz bispecifičnog matičnog antitela. Bispecifično antitelo može biti bilo koji izotip, kao što je, npr., IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4, i može biti anitelo pune dužine ili njegov fragment koji sadrži Fc. Primer postupka za dobijanje bispecifičnog antitela je opisan u WO 2008/119353 (Genmab).
Doze
[0614] Treba razumeti da sva gore navedena izvođenja koja su ovde opisana sa referencom na matično antitelo, prvo matično antitelo ili drugo matično antitelo takođe treba razumeti kao izvođenja koja se odnose na matični, prvi matični ili drugi matični polipeptid koji sadrži Fc-domen imunoglobulina i region vezivanja.
[0615] Efikasne doze i dozni režimi za antitelo zavise od bolesti ili stanja koje treba lečiti to be treated i mogu da ih odrede lica koja su stručna iz odgovarajuće oblasti. Primer, ne-ograničavajućeg opsega za terapeutski efikasnu količinu antitela iz predmetnog pronalaska je oko 0.1 to 100 mg/kg, kao što je oko 0.1 do 50 mg/kg, na primer oko 0.1 to 20 mg/kg, kao što je oko 0.1 do 10 mg/kg, na primer oko 0.5, oko kao što je 0.3, oko 1, oko 3, oko 5, ili oko 8 mg/kg.
[0616] Varijante antitela iz predmetnog prikaza mogu se takođe davati u kombinaciji sa jednim ili više faktora komplementa ili povezanim komponentama da bi se pojačala terapeutska efikasnost varijante i/ili da nadoknadi potrošnju komplementa. Takvi faktori komplementa i povezana jedinjenja uključuju, ali nisu ograničeni na, C1q, C4, C2, C3, C5, C6, C7, C8, C9, MBL, i faktor B. Kombinovano davanje može biti istovremeno, odvojeno ili sekvencijalno. U posebnom izvođenju, pronalazak obezbeđuje komplet koji sadrži farmaceutsku kompoziciju koja sadrži varijantu iz pronalaska, i bar jedan faktor komplementa ili bar povezano jedinjenje u istoj ili različitoj farmaceutskoj kompoziciji, zajedno sa uputstvima za upotrebu.
[0617] Varijante antitela iz predmetnog prikaza mogu se takođe davati u kombinovanoj terapiji, tj., kombinovano sa drugim terapeutskim sredstvima koja su relevantna za bolest ili stanje koje se leči. Prema tome, u jednom izvođenju iz prikaza, lek koji sadrži antitelo je za kombinaciju sa jednim ili više drugih terapeutskih sredstava, kao što su citotoksična, hemoterapeutska ili anti-angiogena sredstva. Takvo kombinovano davanje može biti istovremeno, odvojeno ili sekvencijalno.
[0618] U drugom izvođenju iz prikaza, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za lečenje ili sprečavanje bolesti, kao što je kance, gde postupak obuhvata davanje subjektu kome je potrebno terapetuski efikasne količine varijante ili farmaceutske kompozicije iz predmetnog pronalaska, u kombinaciji sa terapijom zračenjem i/ili operacijom.
Postupci za dobijanje
[0619] Treba razumeti da sva gore navedena izvođenja koja su ovde opisana sa referencom na matično antitelo, prvo matično antitelo ili drugo matično antitelo takođe treba razumeti kao izvođenja koja se odnose na matični, prvi matični ili drugi matični polipeptid koji sadrži Fc-domen imunoglobulina i region vezivanja.
[0620] Prikaz takođe obezbeđuje izolovane nukleinske kiseline i vektore koji kodiraju varijantu prema bilo kom od gore opisanih aspektat, kao vektore i sisteme za ekspresiju koji kodiraju varijantu. Pogodni konstrukti nukleinske kiseline, vektori i ekspresioni sistemi za antitela i njihove varijante poznati su u oblasti tehnike, i opisani su u primerima. U izvođenjima gde varijanta sadrži ne samo težak lanac (ili njegov fragment koji sadrži Fc) već takođe laki lanac, nukleotidne sekvence koje kodiraju delove teškog i lakog lanca mogu se nalaziti na istim ili različitim nukleinskim kiselinama ili vektorima.
[0621] Prikaz takođe obezbeđuje postupak za dobijanje, u ćeliji domaćina, varijantu antitela prema bilo kom od gore opisanih aspekata, gde pomenuta varijanta sadrži bar Fc regiona teškog lanca, pomenuti postupak sadrži sledeće korake:
a) obezbeđivanje nukleotidnog konstrukta koji kodira pomenuti Fc region pomenute varijante, b) ekspresiju pomenutog nukleotidnog konstrukta u ćeliju domaćina,
i
c) obnavljanje pomenute varijante antitela iz ćelijske kulture pomenute ćelije domaćina.
[0622] U nekim izvođenjima iz prikaza, antitelo je težak lanac antitela. U većini izvođenja, međutim, antitelo će takođe sadržati laki lanac i prema tome pomenuta ćelija domaćina dalje eksprimira konstrukt koji kodira laki lanac, ili na istom ili na različitom vektoru.
[0623] Ćelije domaćina koje su pogodne za rekombinantnu ekspresiju antitela su dobro poznata u oblasti tehnike, i uključuju CHO, HEK-293, PER-C6, NS/0 i Sp2/0 ćelije. U jednom izvođenju iz prikaza, pomenuta ćelija domaćina je ćelija koja je sposobna za Asn-vezanu glikozilaciju proteina, npr. eukariotska ćelija, kao što je ćelija sisara, npr. humana ćelija. U drugom izvođenju iz prikaza, pomenuta ćelija domaćina je ne-humana ćelija koja je genetski modifikovana da proizvede glikoproteine koji imaju glikozilaciju sličnu humanoj ili humanu. Primeri takvih ćelija su genetski modifikovana Pichia pastoris (Hamilton et al., Science 301 (2003) 1244-1246; Potgieter et al., J. Biotechnology 139 (2009) 318-325) i genetski modifikovana Lemna minor (Cox et al., Nature Biotechnology 12 (2006) 1591-1597).
[0624] U jednom izvođenju iz prikaza, pomenuta ćelija domaćina je ćelija domaćina koja je sposobna za efikasno uklanjanje ostataka C-terminalnog lizina K447 iz teških lanaca antitela. Na primer, Tabela 2 u Liu et al. (2008) J Pharm Sci 97: 2426 (ovde ukljućena referencom) navodi broj takvih sistema za proizvodnju antitela, npr. Sp2/0, NS/0 ili transgenu sisarsku žlezdu (kozju), gde je dobijeno samo delimično uklanjanje C-terminalnih lizina. U jednom izvođenju iz prikaza, ćelija domaćina je ćelija domaćina sa izmenjenom mašinerijom glikozilacije. Takve ćelije su opisane u oblasti tehnike i mogu se koristiti kao ćelije domaćina u kojima se eksprimiraju varijante iz pronalaska kako bi se na taj način proizvelo antitelo sa izmenjenom glikozilacijom. Videti, na primer, Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem.277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech.17:176-1, kao i EP1176195; WO03/035835; i WO99/54342. Dodatni postupci za dobijanje modifikovanih glikooblika su poznati u oblasti tehnike, i uključuju ali nisu ograničeni na one koji su opisani u Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473), US6602684, WO00/61739A1; WO01/292246A1; WO02/311140A1; WO 02/30954A1; Potelligent™ technology (Biowa, Inc. Princeton, N.J.); GlycoMAb™ glycosylation engineering technology (GLYCART biotechnology AG, Zurich, Switzerland); US 20030115614; Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239-49.
[0625] Prikaz se takođe odnosi na antitelo koje je dobijeno ili koje se može dobiti postupkom iz ovde opisanog pronalaska.
[0626] U daljem aspektu, pronalazak se odnosi na ćeliju domaćina koja je sposobna da proizvede varijantu antitel iz pronalaska. U jednom izvođenju iz prikaza, ćelija domaćina je transformisana ili je transfektovana sa nukleotidnim konstruktom iz pronalaska.
[0627] Predmetni pronalazak je dalje ilustrovan sa sledećim Primerima koje ne treba tumačiti kao dodatno ograničavajuće.
PRIMERI
Primer 1
Planiranje i dobijanje 7D8 mutanata
[0628] Humano monoklonsko antitelo HuMab-7D8 (opisano u WO 2004/035607) je korišćeno kao model antitela. Pripada grupi humanih anti-CD20 IgG1 antitela, uključujući ofatumumab (HuMax-CD20, 2F2). Ova antitela ciljaju jedinstveni epitope blizu membrane na CD20 molekulu i pokazuje snažno CDC.
[0629] Da bi se ispitao funkcionalni značaj oligomernih Fc-Fc interakcija u aktivaciji komplementa i CDC, aminokiseline u hidrofobnom delu na Fc:Fc površini interakcije su mutirane da potencijalno naruše Fc-Fc stranu interakcije i CDC efikasnost 7D8. U prvoj postavci mutanata (Tabela 3), mutacije su uvedene da bi se promenilo naelektrisanje u položajima koji su izabrani na osnovu 1HZH strukture kristala i opisano je da su izloženi u hidrofobnim delovima u CH2CH3 domenu (Burton Mol Immunol 1985 Mar;22(3):161-206)).
[0630] Iz prve postavke mutacija, pronađeno je da I253D i H433A indukuju najjači efekat na gubitak CDC od 7D8 (npr., Primer 5). 1HZH struktura kristala pokazuje da 1253 i H433 vežu dva različita udubljenja na suprotnim Fc položajima partnerskog antitela. Na osnovu ovih podataka, druga postavka mutacija je sintetizovana, oko 1253 i H433 položaja u strukturi kristala kako bi se dalje ispitao značaj ostataka u Fc:Fc strain interakcije za CDC. Druga postavka mutacija oko 1253 i H433 pozicija koja je potencijalno destabilizovala Fc:Fc površinu interakcije i zatim CDC se navodi u Tabeli 4.
[0631] Da bi se isključila mogućnost da narušavanje direktnih mesta vezivanje C1q su uzrok uočenih efekata na CDC, dvostruki mutant je gererisan na osnovu dva pojedinačna mutanta koja su pokazala gubitak CDC, da bi se ispitala njegova sposobnost da povrati gubitak CDC sa pojedinačnim mutantima. Ovaj princip šematski je predstavljen u Slici 1D Dvostruki mutant je naveden u Tabeli 5 i strukturni prikaz je naveden na Slici 4 i Slici 5.
[0632] Mutanti su dobijeni korišćenjem Quikchange site-kompleta za usmerenu mutagenezu (Stratagene, US). Ukratko, prednji i reverzni prajmer koji kodiraju željenu mutaciju su korišćeni da bi se replicirao DNK templejt plazmida pune dužine koji kodira 7D8 težak lanac sa IgG1m(f) alotipom. Dobijena mešavina DNK je digestirana korišćenjem DpnI da bi se uklonio izvor plazmidne DNK i koristio za transformaciju E. coli. Mutant plazmidne DNK koji je izolovan iz nastalih klonova proveren je sekvenciranjem DNK (Agowa, Germany). Mešavine plazmidne DNK koje kodiraju i teške i lake lance antitela su privremeno transfektovane u Freestyle HEK293F ćelije (Invitrogen, US) korišćenjem 293fectin (Invitrogen, US) u suštini kao što je opisano od strane proizvođača.
Tabela 3: Mutacije u postavci 1 uvedene su u CH2-CH3 domenu 7D8.
Tabela 4: Mutacije u postavci 2 uvedene su u CH2-CH3 domenu 7D8.
(nastavak)
Tabela 5: Dvostruke mutacije su uvedene u CH2-CH3 domenu 7D8 da bi se kombinovale dve pojedinačne mutacije gde svaka pokazuje gubitak u CDC.
Primer 2
CD20 vezivanje na ćelije od 7D8 mutanata
[0633] Vezivanje uzoraka prečišćenog antitela na CD20-pozitivne ćelije analizirano je pomoću FACS analize. Prva postavka mutacija (Tabela 3) je ispitana na Daudi ćelijama i druga postavka mutacija (Tabela 4) je ispitana na Raji ćelijama.10<5>ćelija je inkubirano u 50 µL u polistirenskim pločama sa 96 bunarića sa okruglim dnom (Greiner bio-one 650101) sa serijskim razblaženjima preparate antitela (opseg 0.04 do 10 µg/mL u 3-strukim razblaženjima za 1-u postavku na Daudi i opsegom 0.003 do 10 µg/mL u 3-strukim razblaženjima za 2-u postavku na Raji) u RPMI1640/0.1% BSA na 4°C tokom 30 min. Nakon ispiranja dva puta u RPMI1640/0.1% BSA, ćelije su inkubirane u 100 µL sa sekundarnim antitelom na 4°C u trajanju od 30 min. Kao sekundarno antitelo, fluorescein izotiocijanat (FITC)-konjugovano zečje-anti-humano IgG (F0056, Dako, Glostrup, Denmark; 1/100) je korišćeno za sve eksperimente na Daudi ćelijama i za eksperimente sa 7D8 antitelima na Raji ćelijama. Za eksperimente sa prečišćenim 7D8 antitelima na Raji ćelijama, R-fikoeritrin (R-PE)-konjugovano kozje F(ab’)2antihumani kapa laki lanac (2062-09, SouthernBiotech; 1/500) je korišćeno kao sekundarno antitelo. Sledeće, ćelije su isprane dva puta sa PBS/0.1% BSA/0.02% azidom, resuspendovane u 100 µL PBS/0.1% BSA/0.02% azida i analizirane na FACS Cantoll (BD Biosciences). Krive vezivanja su analizirane korišćenjem ne-linearne regresije (sigmoidalna doza-odgovor sa različitim nagibom) korišćenjem GraphPad Prism V5.01 softvera (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
[0634] Vezivanje 7D8 antitela sa Daudi ćelijama nije pogođeno uvođenjem tačkastih mutacija u CH2-CH3 domen i bilo je identično za sve ispitane mutante i divlji tip 7D8. Dalje, vezivanje 7D8 antitela sa Raji ćelijama nije bilo značajno pogođeno uvođenjem tačkastih mutacija u CH2-CH3 domenu u poređenju sa divljim tipom 7D8, osim za E345R. Smanjeno vezivanje IgG1-7D8-E345R je uočeno na CD20-pozitivnim Raji ćelijama na ispitivanim koncentracijama iznad 0.3 µg/mL. Takođe za H433D i H433R je uočeno smanjeno vezivanje na najvećoj ispitanoj koncentraciji antitela (10 µg/mL). Smanjeno vezivanje sa IgG1-7D8-E345R, H433D i H433R može da se objasni ometanjem epitopa sekundarnim antitelom s obzirom da direktno vezivanje E345R i H433R dovodi do sličnog ili čak povećanog vezivanja za Daudi ćelije. Povećani aviditet se može objasniti povećanim Fc-Fc bočnim vezivanjem sa E345R i H433R u poređenju sa divljim tipom IgG1-7D8.
[0635] Kombinovanje K439E i S440K mutacija nije pogodilo vezivanje 7D8 antitela sa Raji ćelijama i bilo je identično onom kod pojedinačnih mutanata i divljem tipu 7D8.
Primer 3
ELISA vezivanja C1q od strane 7D8 mutanata
[0636] Vezivanje C1q od strane 7D8 mutanata ispitano je korišćenjem ELISA, u kojoj su prečišćena antitela obložena na plastičnoj površini, što je dovelo do nasumične multimerizacije antitela. Skupljeni humani serum je korišćen kao izvor C1q.
[0637] Microlon ELISA ploče sa 96 bunarića (Greiner, Germany) obložene su preko noći na 4°C sa serijama razblaženja antitela u PBS (opseg 0.58-10.0 µg/mL u 1.5-strukim razblaženjima). Ploče su isprane i blokirane sa 200 µL/bunariću 0.5x PBS dopunjenom sa 0.025% Tween 20 i 0.1% želatinom. Sa ispiranjima između inkubacije, ploče su sekvencijalno inkubirane sa 3% sakupljenim humanim serumom (Sanquin, proizvod# M0008) tokom 1 h na 37°C, sa 100 µL/bunariću zečjim anti-humanim C1q (DAKO, proizvod# A0136, 1/4.000) tokom 1 h na ST, i sa 100 µL/bunarići svinjskim anti-zečjim IgG-HRP (DAKO, P0399, 1:10.000) kao antitelom za detekciju tokom 1 h na ST. Razvijanje je sprovedeno za oko 30 min sa 1 mg/mL 2,2’-azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kiselina) (ABTS; Roche, Mannheim, Germany). Reakcija je zaustavljena dodavanjem 100 µL 2% oksalne kiseline. Apsorbanca je merena na 405 nm u čitaču mikroploča (Biotek, Winooski, VT). Log transformisani podaci su analizirani uklapanjem sigmoidalnih kriva doza-odgovora sa različitim nagibom korišćenjem GraphPad Prism softvera. EC50vrednosti mutanata su normalizovani po ploči protiv divljeg tipa IgG1-7D8 i pomnoženi sa srednjom vrednosti svih podataka za divlji tip IgG1-7D8.
[0638] Kao što je prikazano na Slici 6 i Tabela 6, ispitane tačkaste (eng. point) mutacije imale su minimalni efekat na C1q vezivanje kao što je mereno sa ELISA. Za IgG1-7D8-I253D mutant, nešto manje efikasno C1q vezivanje je izmereno u ELISA (veća EC50vrednost). Efikasnost oblaganja je ispitana za svako antitelo i pronađeno je da je slična za sva antitela.
Tabela 6: EC50za C1q vezivanje u ELISA
Primer 4
Vezivanje C1q na ćelijama od strane 7D8 mutanata
[0639] Oblaganje plastične površine antitelima dovodi do veštačkog statičkog sistema vezivanja antitela i prezentacije Fc-repa. Prema tome, vezivanje komplementa je takođe ispitano u testu koji se zasniva na ćelijama, u kome je FACS analizom mereno C1q vezivanje sa CD20-pozitivnim B ćelijama koje su opsonizovane antitelom. U eksperimentima sa postavkom 1 mutanata, Daudi ili Raji ćelije su suspendovane na ledu u 90 µL RPMI 1640 medijumu sa 10% FBS (2 x 10<6>ćelija/mL). Koncentracione serije od 10 µL serija koncentracija C1q (Complement Technologies, Tyler, TX) je dodato (finalni koncentracioni opseg se razlikuje između 0-60 µg/mL i 0-140 µg/mL u zavisnosti od maksimalnog vezivanja). Zatim, dodato je 10 µL prečišćenog antitela (10 µg/mL finalna koncentracija, tj. uslovi zasićenja) i reakcione smeše su odmah prebačene na 37°C u vodeno kupatilo i inkubirane su jedan sat. U eksperimentima sa postavkom 2 mutanata, mAt koje se ispituje je obimno dodato Daudi ćelijama, zatim su dodate različite koncentracije C1q u alikvotama i smeše su inkubirane kao što je gore navedeno. Ćelije su tri puta isprane sa PBS/1% BSA i inkubirane tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi sa zečjim FITC-obeleženim anti-C1q antitelom (DakoCytomation, 10 ug/mL). Ćelije su isprane sa PBS/1%BSA i resuspendovane u PBS ili fiksirane u 2% formaldehidu u PBS-u. Protočna citometrija je sprovedena na FACSCalibur protočnom citometru (BD Biosciences) i srednje vrednosti intenziteta fluorescencije su pretvorene u molekule ili ekvivalent rastvorljivu fluorescenciju (MESF) korišćenjem kalibrisanih perli (Spherotech).
[0640] Konstante disocijacije (KDvrednosti) za vezivanje C1q sa CD20-pozitivnim ćelijama koje su opsonizovane sa naznačenim 7D8 antitelom su izračunate korišćenjem SigmaPlot<®>softvera (Systat Software Inc., Washington). Srednje KDvrednosti su izračunate iz ponovljenih eksperimenata vezivanja (4 puta na Daudi ćelijama, 3 puta na Raji ćelijama) i upoređene su sa KDvrednosti za C1q vezivanje na ćelijama koje su opsonizovane sa divljim tipom 7D8 (Tabela 7 i Tabela 8).
[0641] Postavka 1 mutanta je testirana i na Daudi i Raji ćelijama i dobijeni su isti rezultati. Suprotno sa C1q ELISA rezultatima, većina ispitanih mutana je pokazala smanjeni aviditet C1q vezivanja (povećana KD) i na Daudi ćelijama koje su opsonizovane antitelom (Tabela 7A) i Raji ćelijama (Tabela 8). U poređenju sa divljim tipom 7D8, IgG1-7D8-Q311A i H435A pokazali su malo do bez smanjenja, I253A, I253Y i N434A izraženije smanjenje, i I253D i H433A veoma drastično smanjenje u aviditetu C1q vezivanja na opsonizovanim Daudi ili Raji ćelijama. IgG1-7D8-H435R pokazao je nešto veći aviditet (niža KD) za C1q vezivanje u odnosu na divlji tip 7D8 na oba tipa ćelija, koji, međutim, nije bio značajan.
[0642] Postavka 2 mutanta je testirana na Daudi ćelijama. U poređenju sa divljim tipom 7D8, IgG1-7D8-E345R, E382R i H433R pokazali su povećani aviditet vezivanja na opsonizovanim Daudi ćelijama, što je odraženo sa nižim KDvrednostima (Tabela 7B). Sve druge postavke 2 mutanta pokazale su smanjeni aviditet vezivanja u poređenju sa divljim tipom 7D8, sa G385D, Y436D, Q438D, K439E i S440K koji pokazuje značajno povećane vrednosti KD(Tabela 7B) i H433D i Y436C pokazuju tako drastično smanjeno vezivanje tako da se ne može izmeriti pouzdana KDvrednost.
[0643] Dvostruki mutant IgG1-7D8-K439E/S440K pokazao je obnovljeno C1q vezivanje na antitelomopsonizovanim Daudi ćelijama, dok oba pojedinačna mutanta pokazuju smanjeno C1q vezivanje u poređenju sa divljim tipom 7D8. Aviditet vezivanja K439E/S440K dvostrukog mutanta zapravo je bio nešto povećan u poređenju sa divljim tipom 7D8 (Tabela 7C). Mešavine pojedinačnih mutanata IgG1-7D8-K439E i IgG1-7D8-K440E bile su sposobne da u potpunosti obnove C1q vezivanje koje je bilo uporedivo sa C1q vezivanjem od divljeg tipa 7D8 (Tabela 7C).
[0644] Nepodudaranje između nepromenjenog C1q vezivanja u ELISA (Primer 3) i pogođenog C1q vezivanja u testu koji je zasnovan na ćelijama sa IgG1-7D8 mutantima, pokazuje da ispitani CH3 položaju koji su uključeni u Fc:Fc interakciju između molekula antitela, ne utiču direktno na C1q vezivanje, ali su važne determinante koje pogađaju dinamiku pozicioniranja Fc-vrhova antitela sa vezivanjem na ćeliji, i prema tome na jačinu vezivanja C1q.
1
Tabela 7A: KDvrednosti C1q vezivanja sa Daudi ćelijama koje su opsonizovane antitelom (postavka 1 mutanta)
2
Tabela 7B: KD vrednosti C1q vezivanja sa Daudi ćelijama koje su opsonizovane antitelom (postavka 2 mutanta)
Tabela 7C: KDvrednosti C1q vezivanja sa Daudi ćelijama koje su opsonizovane antitelom (dvostruki mutant)
Tabela 8: KD vrednosti C1q vezivanja sa Raji ćelijama koje su opsonizovane antitelom (postavka 1 mutanta)
Primer 5
C1q efikasnost sa 7D8 mutantima u CDC testu na CD20-pozitivnim Raii ćelijama
[0645] Efikasnost C1q je ispitana korišćenjem ćelija koje su opsonizovane sa IgG1-7D8 mutantima u CDC testu da bi se ispitao uticaj uočenih promena u aviditetu vezivanja C1q na aktivnost CDC. Prema tome, CDC test je izveden korišćenjem normalnog humanog seruma osiromašenog za C1q koji je dopunjen sa definisanim koncentracionim serijama C1q.0.1 x 10<6>Raji ćelije su prethodno inkubirane u pločama sa 96-bunarića sa okruglim dnom (Nunc, Rochester, NY) sa 10 µg/mL prečišćenog antitela i koncentracionim serijama humanog C1q (0.005, 0.025, 0.1, 0.3, 1.0, 5.0, 30.0 µg/mL) na ST tokom 15 min u ukupnoj zapremini od 100 µL RPMI1640 medijumu, dopunjenom sa 0.1% BSA. Sledeće, 25 µL seruma koji je osiromašen za C1q (Quidel, San Diego, CA) je dodato i inkubirano na 37°C u vodenom kupatilu tokom 30 min ili u inkubatoru tokom 45 min. Nakon inkubacije, reakcija je zaustavljena postavljanjem uzoraka na led. Ćelijska liza je određena na FACS korišćenjem propidijum jodida (PI, Sigma Aldrich, Zwijndrecht, the Netherlands) testom isključivanja vijabilnih ćelija. % lize je određen prema sledećem: % lize = (broj PI poz. ćelija/ukupan broj ćelija) x 100%.
[0646] Liza divljeg tipa 7D8 u prisustvu 30 µg/mL C1q minus liza kada nije dodavan C1q, je podešena na to 100%. CH50vrednosti (koncentracija C1q koja dovodi do 50% lize) izračunate su iz uklapanja sigmoidalnih kriva doza-odgovora na log-transformisanim podacima korišćenjem GraphPad Prism softvera. CH50vrednosti mutanata su normalizovane sa divljim tipom 7D8 (Tabela 9).
[0647] Podaci u Tabeli 9 pokazali su da, u skladu sa merenjima aviditeta vezivanja C1q, IgG1-7D8-Q311A, E382R i H435A nisu pokazali povećanje u efikasnosti C1q; I253A, I253Y, G385D, N434A i Y436C značajno smanjenje u efikasnosti C1q; i I253D, H310K, K322A, H433A, H433D, Y436D, Q438D, K439E i S440K skoro potpuno su izgubili kapacitet da indukuju CDC sa svim ispitivanim koncentracijama C1q.
[0648] IgG1-7D8-H435R i H433R koristili su C1q malo efikasnije što je dovelo do efektivnije CDC u odnosu na divlji tip 7D8. IgG1-7D8-E345R je pokazalo drastično povećanje u efikasnosti C1q, što je dovelo do značajno veće lize CDC u poređenju sa divljim tipom 7D8 (Tabela 9).
[0649] Slika 7 pokazuje da kombinovanje K439E i S440K mutacije, gde oboje rezultuju gubitkom CDC kao pojedinačni mutant, obnavljaju CDC testu efikasnosti C1q kada su obe mutacije kombinovane u
4
jednom molekulu (K439E/S440K dvostruki mutant) ili kada su oba pojedinačna mutanta kombinovana (K439E S440K miks).
Tabela 9: CH50za efikasnost C1q u CDC testu na Raji ćelijama
(nastavak)
Primer 6
CDC sa 7D8 mutantima u CDC testu na CD20-pozitivne ćelije
[0650] 0.1 x 10<6>ćelija je prethodno-inkubirano u pločama sa 96-bunarića sa okruglim dnom (Nunc, Rochester, NY) sa kontentracionim serijama antitela (0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1.0, 3.0, 10.0, 30.0 µg/mL) u ukupnoj zapremini 80 µL za 15 min na mućkalici na ST. Sledeće, 20 µL normalnog humanog seruma je dodato kao izvor C1q (20% finalna koncentracija) i inkubirano je 37°C u inkubatoru tokom 45 min. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 30 µL ledeno hladnog RPMI medijuma, koji je dopunjen sa 0.1% BSA. Ćelijska liza je određivana sa FACS upotrebom propidijum jodida.
[0651] Za CDC testove na Daudi ćelijama, EC50vrednosti (koncentracija antitela koja dovodi do 50% lize) izračunate su iz uklapanja sigmoidalnih kriva doza-odgovora na log-transformisanim podacima korišćenjem GraphPad Prism softvera. EC50vrednosti mutanata su normalizovane sa divljim tipom 7D8 (Tabela 10 i Tabela 11).
[0652] Tabela 10 pokazuje da na Daudi ćelijama, IgG1-7D8-I253A, Q311A, E382R, H433R i H435A nisu pokazali razliku u CDC u poređenju sa divljim tipom 7D8; značajno gora CDC (veća EC50) u odnosu na divlji tip 7D8 je pronađena za IgG1-7D8I253D, I253Y, H310K, G385D, H433A, H433D, N434A, Y436C, Y436D, Q438D, K439E, S440K i I253D/H433A, koje samo indukuje CDC na većim koncentracijama antitela; Mutant IgG1-7D8-K322A deficijentan u C1q vezivanju, koji je bio uključen kao kontrola, skoro u potpunosti je izgubio sposobnost indukcije CDC i nije dostigao EC50na ispitivanim koncentracijama; IgG1-7D8-H435R je pokazao efikasnije CDC u odnosu na divlji tip 7D8 na Daudi ćelijama. Važno, u skladu sa CDC testom efikasnosti C1q, E345R je pokazao značajno bolju CDC u odnosu na divlji tip 7D8 sa 10-puta nižom EC50vrednosti na Daudi ćelijama (Tabela 10). Slika 8 pokazuje da kombinovanje K439E i S440K mutacije, gde obe dovode do gubitka CDC kao pojedinačni mutant, obnavlja CDC kada su obe mutacije kombinovane u jednom molekulu (K439E/S440K dvostruki mutant) ili kada su kombinovana oba pojedinačna mutanta (K439E S440K mešavina).
[0653] Tabela 11 pokazuje da su slični podaci pronađeni za IgG1-7D8 mutante na Raji ćelijama.
Tabela 10: EC50 izračunato iz CDC testa na Daudi ćelijama
Tabela 11: EC50izračunato iz CDC testa na Raji ćelijama
(nastavak)
Primer 7
Rangiranje 7D8 mutanata prema njihovom kapacitetu za indukovanje CDC
[0654] Za ispitane 7D8 mutante, pronađena je korelacija između vezivanja C1q. na Daudi ćelijama (opisano u Primeru 4) i testovima za efikasnost C1q na Raji ćelijama (opisano u Primeru 5), i između vezivanja C1q na Daudi ćelijama i CDC testovima na Daudi i Raji ćelijama (opisano u Primeru 6) (podaci korelacije Tabele 13). Prema tome, KDvrednosti za testove vezivanja C1q na Daudi ćelijama su korišćene da bi se rangirali svi ispitani 7D8 mutanti prema njihovom kapacitetu za indukovanje CDC, kao što je prikazano u Tabeli 12.
Tabela 12: Rangiranje svih ispitanih 7D8 mutanata prema opadajućim KD vrednostima za vezivanje C1q na Daudi ćelijama, koji služi kao predstavnik za njihov kapacitet da indukuju CDC.
(nastavak)
Tabela 13: korelacija između vezivanja C1q na Daudi ćelijama (Primer 4) i testovi efikasnosti C1q na Raji ćelijama (Primer 5), i između vezivanja C1q na Daudi ćelijama i CDC testovima na Daudi i Raji ćelijama (Primer 06). Podaci su log transformisani pre analiziranja korelacije.
Primer 8
Planiranje i dobijanje mutanata CD38 antitela 005
[0655] Humano monoklonsko antitelo HuMab 005 je puno humano IgG1,κ antitelo koje je opisano u WO/2006/099875. Ovde, korišćeno je kao model antitelo za validaciju identifikovanih Fc mutacija da bi se pojačala CDC aktivnost. Ispitane mutacije su navedene u Tabeli 14.
[0656] DNK konstrukti za različite mutante su dobijeni i prolazno transfektovani kao što je opisano u Primeru 1, korišćenjem teškog lanca HuMab 005 sa IgG1m(f) alotipom kao templejtom za reakcije mutageneze.
Tabela 14: postavka mutacija koje su uključene u CH2-CH3 domen 005 (HuMax-CD38).
Primer 9
Vezivanje CD38 na ćelijama pomoću HuMab-005 mutanata
[0657] Vezivanje neprečišćenih uzoraka antitela za CD38-pozitivne Daudi i Raji ćelije analizirano je pomoću FACS analize. 10<5>ćelija je inkubirano u 100 µL u polistirenskim pločama sa 96 bunarića sa okruglim dnom sa serijski razblaženim preparatima antitela (0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1.0, 3.0, 10.0, 30.0 µg/mL) u RPMI1640/0.1% BSA na 4°C tokom 30 min. Nakon ispiranja dva puta u RPMI1640/0.1% BSA, ćelije su inkubirane u 50 µL sa FITC-konjugovanim zečjim F(ab’)2anti-humanim IgG (kat.br. F0056;
1
DAKO; 1:150) na 4°C tokom 30 min. Sledeće, ćelije su isprane dva puta u PBS/0.1% BSA/0.02% azidu, resuspendovane u 100 µL PBS/0.1% BSA/0.02% azidu i analizirane na FACS Cantoll (BD Biosciences). Krive vezivanja su analizirane korišćenjem GraphPad Prism V5.01 softvera. Kao negativna kontrola, korišćen je supernatant lažno (eng. mock) transfektovanih ćelija.
[0658] Vezivanje HuMab 005 sa Daudi ćelijama nije mnogo bilo pogođeno uvođenjem tačkastih mutacija u CH2-CH3 domen. Sva ispitana antitela vezala su Daudi ćelije na način koji zavisi od doze. Vezivanje je bilo slično sa divljim tipom HuMab-005 za sve ispitane mutante, sa izuzetkom 005-E345R, koji je pokazao nešto slabije vezivanje. Međutim, bez vezivanja za bilo koju teoriju, niže vezivanje može biti rezultat smanjenog vezivanja sekundarnog antitela, analogno sa IgG1-7D8-E345 u Primeru 2. Stvarni aviditet vezivanja 005-E345R može biti sličan ili čak povećan u poređenju sa 005-WT, međutim nije ovo nije bilo moguće potvrditi zbog nedostatka direktno vezanih antitela.
[0659] Vezivanje HuMab-005 sa Raji ćelijama takođe nije mnogo pogođano sa uvođenjem tačkastih mutacija u CH2-CH3 domen. Sva ispitana antitela vezala su Raji ćelije na način koji zavisi od doze. Maksimalno vezivanje bilo je slično sa onim kod divljeg tipa 005 za 005-I253D i H433A mutante i niže za 005-E435R, K439E, S440K mutante i kombinaciju 005-K439E 005-S440K. Međutim, bez vezivanja za bilo koju teoriju, niže vezivanje može biti rezultat smanjenog vezivanja sekundarnog antitela, analogno sa IgG1-7D8-E345R u Primeru 2 (zaštita epitopa).
Primer 10
CDC test na CD38-pozitivnim ćelijama sa mutantima CD38 antitela 005
[0660] 0.1 x 10<6>Daudi ili Raji ćelije su prethodno inkubirane u pločama sa 96 bunarića sa okruglim dnom sa serijom koncentracija neprečišćenih antitela (0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1.0, 3.0, 10.0, 30.0 µg/mL) u ukupnoj zapremini od 100 µL tokom 15 min na mućkalici na ST. Sledeće, 25 µL normalnog humanog seruma je dodato kao izvor C1q (20% finalna koncentracija) i inkubirano je na 37°C u inkubatoru tokom 45 min. Ova reakcija je zaustavljena postavljanjem ploča na led.10 µL propidijum jodida je dodato i liza ćelija je određivana pomoću FACS.
[0661] Kapacitet za pojačanje CDC mutacije E435R, za koju je pokazano da pojačava CDC aktivnost i 7D8 i 005 antitela na Daudi i Raji ćelija, dalje je analizirana na Wien133 ćelijama sa različitim koncentracijama normalnog humanog seruma (NHS).0.1 x 10<6>Wien133 ćelije su prethodno inkubirane na 15 min na mućkalici na ST u pločama sa 96 bunarića sa okruglim dnom sa serijama koncentracija neprečišćenih antitela (0.001, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1.0, 3.0, 10.0, 30.0 µg/mL) u ukupnoj zapremini od 50 µL. Sledeće, dodat je NHS kao izvor C1q da bi se dostigla finalna koncentracija od 20% ili 50% NHS u ukupnoj zapremini od 100 µL. Reakciona smeša je inkubirana u 37°C inkubatoru tokom 45 min. Reakcija je zaustavljena postavljanjem ploča na led. 10 µL propidijum jodida je dodato i liza ćelija je određivana pomoću FACS.
[0662] Identifikovane mutacije u CH2-CH3 regionu koje su dovele ili do gubitka ili povećane aktivnosti CDC za CD20 antitelo 7D8, pronađeno je da imaju određeni efekat na 005 antitelo koje prepoznaje CD38. Slika 9 pokazuje da su 005-I253D, H443A, K439E i S440K pokazali potpuni gubitak aktivnosti CDC i na Daudi (Slika 9A) i Raji (Slika 9B) ćelija, pri čemu je 005-E345R mutant pokazao snažno pojačanu CDC aktivnost na obe ćelijske linije. Upoređenju sa 7D8 podacima, kombinacija 005-K439E 005-S440K, gde i jedna i druga rezultira gubitkom CDC kao pojedinačni mutant, dovelo je do obnovljene CDC. Iznenađujuće, 005-E435R još jače je indukovao CDC na Wien133 ćelijama, za svaki divlji tip 005 nije sposoban za indukovanje CDC (Slika 9C). Ubijanje CDC od strane 005-E345R na Wien133 ćelijama je uočeno i za 20% i 50% koncentracije seruma (Slika 9C). Takođe na Raji ćelijama, oba 7D8-E345R i
1 1
005-E345R pokazala su pojačano CDC in vitro u 50% serumu, sa sličnom efikasnosti kao u 20% serumu (Slika 9D).
[0663] Kao E345R mutacija u CH2-CH3 regionu dovela je do pojačane CDC aktivnosti u oba, testiranom CD20 antitelu 7D8 i CD38 antitelu 005, E345R mutacija se smatra opštom modifikacijom antitela koja se može primeniti da bi se indukovala ili pojačala CDC.
Primer 11
IgG1 antitela koja sadrže E345R mutaciju koja pojačava CDC su manje osetljiva na inhibiciju CDC sa peptidom DCAWHLGELVWCT koji veže Fc u odnosu na divlji tip antitela
[0664] Mutiranje aminokiselina u položajima u hidrofobnom delu u Fc:Fc površini interakcije IgG, pronađeno je da je CDC efikasnost bila ili narušena ili pojačana. Uključivanje interakcija na Fc-Fc površini interakcija, i prema tome moguće je obrazovanje oligomerne (npr., heksamerni prsten) strukture kao što je uočeno u b12 strukturi kristala, u efikаsnosti CDC je dalje ispitivana. Prema tome, korišćen je peptid sa 13 ostataka (DCAWHLGELVWCT (SEQ ID NO:7)) koji cilja mesto konsenzusnog vezivanja u hidrofobnom delu regiona na površini divljeg tipa IgG Fc (Delano et al., Science 2000 Feb 18;287(5456):1279-83). Zaista, identifikacija konsenzusnog mesta vezivanja na površini IgG Fc kao adaptivnog regiona koji je pripremljen za interakciju sa brojnim različitim molekulima (Delano et al., Science 2000 Feb 18;287(5456):1279-83), je u skladu sa identifikacijom jezgra aminokiselina u hidrofobnom delu koje su uključene u Fc-Fc interakciju u IgG1 b12 strukturi kristala (Saphire et al., Science 2001 Aug 10;293(5532):1155-9). Interakcije koje su prisutne u svim površima interakcije vezivanja posredovane su zajedničkim nizom od šest aminokiselina (Met-252, Ile-253, Ser-254, Asn-434,His-435, i Tyr-436), kao i zajedničkim kontaktima okosnice (Delano et al., Science 2000 Feb 18;287(5456):1279-83). Prema tome, očekuje se da će Fc vezujujći peptid uticati na Fc-Fc interakciju i posledično na efikasnost CDC.
[0665] 0.1 x 10<6>Daudi ćelije su prethodno inkubirane u 75 µL sa 1.0 µg/mL neprečićenim antitelom u ploče sa 96 bunarića sa okruglim dnom tokom 10 min na sobnoj temperaturi na mućkalici.25 µL serija koncentracija (opsega 0.06-60 µg/mL finalna koncentracija) Fc vezujućeg peptida DCAWHLGELVWCT je dodato opsonizovanim ćelijama i inkubirano tokom 10 min na mućkalici na ST. Sledeće, 25 µL NHS je dodato kao izvor komplementa (20% finalna koncentracija) i inkubirano je na 37°C u inkubatoru tokom 45 min. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 25 µL ledeno hladnog RPMI medijuma, dopunjenog sa 0.1% BSA.15 µmL propidijum jodida je dodato i liza ćelija je određena pomoću FACS analize.
[0666] Pronađeno je da je CDC posredovana sa divljim tipom 005 (Slika 10A) ili 7D8 (Slika 10B) inhibirana sa Fc-vezujućim peptidom DCAWHLGELVWCT na način koji zavisi od doze. Ovi kompetitivni podaci ponovo ukazuju na uključivanje Fc-Fc interakcija na hidrofobnom delu IgG u efikasnosti CDC y. Oba IgG1-005-E345R i IgG1-7D8-E345R mutanta koji pojačavaju CDC su bila manje osetljiva na kompeticiju sa Fc-vezujućim peptidom u poređenju sa njihovim odgovarajućim antitelima divljeg tipa, ukazujući na to da E345R mutacija dovodi do povećane stabilnosti interakcije Fc-Fc, i posledićno povećane CDC.
Primer 12
1 2
Citotoksičnost posredovana ćelijama koja zavisi od antitela (ADCC) na ćelijama koje eksprimiraju CD38 sa varijantama CD38 antitela HuMAb 005
[0667] Daudi ćelije su sakupljene (5x10<6>ćelija/ml), isprane (dva puta u PBS, 1200 oum, 5 min) i sakupljene u 1 mL RPMI 1640 medijumu koji je dopunjen sa 10% kozmičkim telećim serumom (CCS) (HyClone, Logan, UT, USA), u koji je dodat 200 µCi<51>Cr (hromijum-51; Amersham Biosciences Europe GmbH, Roosendaal, The Netherlands). Smeša je inkubirana u mešanom vodenom kupatilu tokom 1 sata na 37°C. Nakon ispiranja ćelija (dva puta u PBS, 1200 oum, 5 min), ćelije su resuspendovane u RPMI 1640 medijumu koji je dopunjen sa 10% CCS, izbrojane sa triptan plavim isključivanjem i razblažene do koncentracije 1x10<5>ćelija/mL.
[0668] U međuvremenu, mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMCs) izolovane su iz svežih leukocitino-trombocitnih slojeva dobijenih nakon centrifugiranja (eng. buffy coats) (Sanquin, Amsterdam, The Netherlands) korišćenjem standarda centrifugiranja na Ficoll gustini gradijenta u skladu sa uputstvima proizvođača (medijum za razdvajanje limfocita; Lonza, Verviers, France). Nakon resuspenzije limfocita u RPMI 1640 medijumu koji je dopunjen sa 10% CCS, ćelije su izbrojane sa triptan plavim isključivanjem i koncentrovane su do 1x10<7>ćelije/mL.
[0669] Za ADCC eksperiment, 50 µmL<51>Cr-obeležene Daudi ćelije (5.000 ćelija) su prethodno inkubirane sa 15 µg/mL CD38 antitelom IgG1-005 ili mutantom IgG1-005-E345R u ukupnoj zapremini 100 µL RPMI medijuma koji je dopunjen sa10% CCS u mikrotitarskoj ploči sa 96 bunarića. Nakon 10 min na ST, 50 µL PBMCs (500.000 ćelija) je dodato, dovodeći do odnosa efektora prema meti od 100:1. Maksimalna količina ćelijske lize je određena inkubiranjem 50 µL<51>Cr-obeleženih Daudi ćelija (5,000 ćelija ) sa 100 µL 5% Triton-X100. Količina spontane lize je određena inkubacijom 5,000<51>Cr-obeleženih Daudi ćelija u 150 µL medijuma, bez bilo kog antitela ili efektorskih ćelija. Nivo antitelo-nezavisne ćelije lize je određen inkubiranjem 5,000 Daudi ćelija sa 500,000 PBMCs bez antitela. Nakon toga, ćelije su inkubirane 4 hr na 37°C, 5% CO2. Da bi se odredila količina ćelijske lize ćelije su centrifugirane (1200 oum, 3 min) i 75 µL supernatanta je preneto u mikronske epruvete, nakon čega je izbrojan oslobođen<51>Cr korišćenjem gama brojača. Izmerene jedinice po minuti (cpm) su korišćene da bi se izračunao procenat lize koja je posredovana sa antitelom kao što sledi:
(cmp uzorka – cmp At nezavisna liza)/(cmp. maks. liza – cmp spontana liza)X100%
[0670] Tabela 15 pokazuje izračunate vrednosti EC50 za IgG1-005-wt i IgG1-005-E345R u izvedenom ADCC testu. Ispitana su četiri uzorka. IgG1-005-E345R pokazuje značajno nižu EC50vrednost od IgG1-005-wt od sva četiri ispitana uzorka.
1
Tabela 15 Izračunate EC50 vrednosti za sva četiri izvedena eksperimenta.
[0671] Slika 11 pokazuje da u poređenju sa divljim tipom antitiela HuMab-005, mutant IgG1-005-E345R pokazao je pojačanu efikasnost ADCC kapacitet, koji je sposoban da indukuje ADCC na nižim koncentracijama.
Primer 13
FcRn vezivanje i farmakokinetička analiza 7D8 mutanata u poređenju sa divljim tipom 7D8
[0672] Neonatalni Fc receptor (FcRn) je odgovoran za duži polu-život IgG u plazmi preko zaštite IgG od degradacije. Nakon internalizacije antitela, FcRn veže se za Fc regione antitela u endozomima, gde je interakcija stabilna u blagom kiselom okruženju (pH 6.0). Nakon recikliranja do plazma memebrane, gde je okruženje neutralno (pH7.4), interakcija je izgubljena i antitelo je oslobođeno nazad u krvotok. Ovo ima uticaj na polu-život IgG u plazmi.
[0673] Sposobnost 7D8 mutanta IgG1-7D8-E354R da interaguje sa FcRn iz miša, cinomolgus majmuna i čoveka ispitana je sa ELISA. Sve inkubacije su izvedene na sobnoj temperaturi. Ploče sa 96 bunarića su obložene sa 5 µg/mL (100 µL/bunariću) rekombinantno proizvedenog biotinilovanog vanćelijskog domena FcRn (miš, čovek ili cinomolgus) (FcR-nECDHis-B2M-BIO), razblaženog u PBST plus 0.2% BSA; 1 sat. Ploče su isprane 3 puta sa PBST, i 3-struko serijski razblažene (u PBST/0.2% BSA, pH 6.0) dodat je divlji tip IgG1-7D8 ili IgG1-7D8-E354R, i ploče su inkubirane tokom 1 sata. Ploče su isprane sa PBST/0.2% BSA, pH 6.0. kozjumt-anti-humanim IgG(Fab’2)-HRP (Jackson Immuno Research, kat br: 109-035-097) razblaženim u PBST/0.2% BSA, pH 6.0 je dodato, i ploče su inkubirane tokom 1 h. Nakon ispiranja, ABTS je dodat kao supstrat i ploče su inkubirane u mraku tokom 30 minuta. Apsorbanca je čitana na 405, korišćenjem EL808 ELISA čitača.
[0674] Miševi u ovoj studiji su gajeni u jedinici barijere Centralnog objekta za laboratorijske životinje (Utreht, Holandija) i držani su u kavezima sa filterom na vrhu sa slobodnim prisupom obezbeđenoj vodi i hrani. Svi eksperimenti su odobreni od strane komiteta za etiku životnja Univerziteta u Utrehtu.
[0675] Da bi se analizirale farmakokinetike 7D8 mutanata in vivo, SCID miševi (C.B-17/IcrCrl-scid-BR, Charles-River) su primili intravenozno 100 µg (5 µg/kg) divlji tip 7D8, IgG1-7D8-E354R, -S440K ili K322A; 3 miša po grupi.
1 4
[0676] Uzorci krvi po 50 µL su sakupljeni iz safenozne vene tokom 10 minuta, 4 sata, 24 sata, 2 dana, 7 dana, 14 dana u 21 dan nakon davanja antiteka. Krv je sakupljena u bočice koje sadrže heparin i centrifugirana je u trajanju od 5 minuta na 10,000 g. Plazma je skladištena na -20°C do određivanja koncentracija mAt.
[0677] Koncentracije humanog IgG određivane su korišćenjem sendvič ELISA. Mišje mAt anti-humani IgG-kapa klon MH16 (#M1268, CLB Sanquin, Holandija), obloženo na Microlon ELISA ploče sa 96-bunarića (Greiner, Germany) u koncentraciji od 2 µg/mL je korišćeno kao antitelo za hvatanje. Nakon blokiranja ploča sa PBS dopunjenim sa 2% kokošjim serumom, dodati su uzorci, serijski razblaženi u ELISA puferu (PBS dopunjen sa 0.05% Tween 20 i 2% kokošjim serumom), i inkubirani su na ploči koja se meša 1 h na sobnoj temperaturi (ST). Ploče su nakon toga inkubirane sa kozjim anti-humanim IgG imunoglobulinom (#109-035-098, Jackson, West Grace, PA) i razvijene su sa 2,2’-azino-bis (3-etilbenztiazolin-6-sulfonskom kiselinom) (ABTS; Roche, Mannheim, Germany). Aposrbanca je merena u čitaču mikroploča (Biotek, Winooski, VT) na 405 nm.
[0678] SCID miševi su izabrani zbog toga što imaju niske koncentracije IgG u plazmi i prema tome relativno brzo uklanjaju IgG. Ovo obezbeđuje PK model koji je veoma osetljiv za detekciju promena u uklanjanju zbog smanjenog vezivanja Fcγ-dela sa neonatalnim Fc receptorom (FcRn).
[0679] Statističko ispitivanje je sprovedeno korišćenjem GraphPad PRISM verzije 4 (Graphpad Software).
[0680] Slika 12 pokazuje da se i divlji tip HuMab-7D8 i IgG1-7D8-E345R dobro vežu za mišji, humani i cinomolgus FcRn. Vezivanje IgG1-7D8-E345R bilo je nešto bolje u odnosu na ono kod divljeg tipa 7D8.
[0681] Slika 13 pokazuje koncentracije u plazmi tokom vremena. Nije bilo razlika u promeni koncentracija u plazmi (uklanjanje) tokom vremena za divlji tip HuMab-7D8 u odnosu na bilo koji od IgG1-7D8-E345R, -S440K ili K322A.
Primer 14
Upotreba mutacije E345R za stabilizovanje Fc-Fc za povećanu baktericidnu aktivnost IgG antitela protiv bakterija koje eksprimiraju Fc-vezujuće površinske proteine
[0682] Sistem sistema komplementa je važan mehanizam odbrane domaćina protiv patogena i može se podeliti u tri različita puta aktivacije kojima se mogu prepoznati patogeni: i) klasičan put posredovan antitelom, koji se aktivira nakon vezivanja C1q od strane antitela vezanog za patogen, ii) lektinski i iii) alternativni put, u kome sistem komplementa direktno prepoznaje a pokreće ga patogen u odsustvu antitela. Sva tri puta konvergiraju ka C3 cepanju i deponovanju C3b. Mikroorganizmi su razvili brojne mehanizme za izbegavanje komplementa, od kojih je jedan posredovan sa Proteinom A (Joiner Ann. Rev. Microbiol. (1988) 42:201-30; Foster Nat Rev Microbiol (2005) Dec;3(12):948-58). Protein A jes prvo identifikovan u ćelijskom zidu Staphylococcus aureus i dobro je poznat zbog njegovog vezivanja za Fc region IgG (Deisenhofer et al., Biochem (1981) 20, 2361-70; Uhlen et al., J. Biol. Chem (1984) 259,1695-1702). Do sada, antifagocitozni efekat Proteina A i njegova uloga u patogenezi S. aureus je objašnjena interakcijom između Proteina A i IgG, koja rezultuje nepravilnoj orijentaciji antitela koje treba da prepozna Fc receptor neutrofila (Foster Nat Rev Microbiol (2005) Dec;3(12):948-58).
[0683] Primer 11 pokazuje da je CDC posredovano sa IgG1 antitelima specifičnim za B ćelije was inhibirano sa kompetitivnim Fc-vezujućim peptidom DCAWHLGELVWCT. Peptid cilja na konsenzusno mesto vezivanja na IgG Fc koje se poklapa sa mestom vezivanja za Protein A, Protein G i reumatoidni faktor (Delano et al., Science 2000 Feb 18;287(5456):1279-83). Na osnovu ovih podataka, veruje se da mehanizam bakterijskog izbegavanja komplementa posredovanog sa Proteinom A može delovati
1
pomoću kompeticije za vezivanje Fc, dovodeći do destabilizacije Fc-Fc interakcije antitela koje je specifično za mikrob, i shodno tome inhibicije aktivacije komplementa koja je posredovana antitelom. Osim toga, Primer 11 takođe je pokazao da IgG1 antitela specifična za B ćeliju sadrže E345R mutaciju koja pojačava CDC su manje osetljiva (manje reaguju) na inhibiciju CDC sa kompetitivnim Fc-vezujućim peptidom DCAWHLGELVWCT u odnosu na divlji tip matičnog antitela. Ekstrapolacijom ovih rezultata na Fc vezujuće proteine koji su eksprimirani na mikrobima, povećana stabilizacija IgG1 Fc-Fc interakcija sa E345R mutacijom bi učinila antitela koja su specifična za mikrobe manje podložnim inhibiciji komplementa pomoću strategije izbegavanja patogena preko kompeticije Fc vezivanja sa mikrobnim površinskim proteinima, kao što je Protein A. Stoga, uvođenje E345R mutacije u IgG antitela koja je usmerena protiv bakterije dovela bi do povećanog deponovanja C3b na bakteriji i smanjenoj baktericidnoj aktivnosti u poređenju sa matičnim divljim tipom antitela.
[0684] Kao in vitro mera za ubijanje bakterija posredovano komplementom, i fagocitoza od strane neutrofila i nastajanje C3a u plazmi, koje se podudara sa deponovanjem C3b na bakteriji, može se odrediti kao što je opisano u tekstu ispod. Zaista, opisano je da deponovanje C3b na S. aureus dovodi do pojačane fagocitoze i poklapa se sa ubijanjem bakterija (Rooijakkers et. al., Nature Immunology 2005: 6,920-927).
[0685] S. aureus će biti obeležena sa FITC inkubacijom bakterijske kulture sa eksponencijalnim rastom sa 100 µg/mL FITC tokom 1h na 37°C u 0.1 M karbonatnom puferu (pH 9.6). Humane polimorfne nuklearne ćelije (PMN) će biti izolovane korišćenjem Ficoll gradijenta. FITC-obeležene bakterije će biti opsonizovane sa serijom koncentracija specifičnih antitela sa ili bez mutacije E345R. Fagocitoza će se sprovesti in vitro inkubiranjem 1X10<8>opsonizovanih FITC-obeleženih bakterija sa humanim PMN u prisustvu 25% seruma osiromašenog za IgG kao izvorom komplementa u trajanju od 25 min na 37°C u ukupnoj zapremini od 200 µL pod intenzivnim mešanjem. Ćelije će biti fiksirane i eritrociti lizirani inkubacijom sa BD FACS rastvorom za lizu tokom 15 min na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja, fagocitoza će biti izmerena sa FACS. Populacija neutrofila će biti odabrana kroz prednje i bočno rasejanje “gating” i fagocitoza će se izraziti kao srednja vrednost fluorescencije u populaciji neutrofila. Alternativno, stvaranje C3a će se izmeriti u uzorcima pomoću ELISA kao mera za aktivaciju komplementa i deponovanje C3b.
[0686] Očekuje se da će antitela koja su specifična za S. aureus sadrže E345R mutaciju indukovati veću aktivaciju komplementa i fagocitozu od strane neutrofila u odnosu na matična antitela divljeg tipa. Primer antitela koje se može koristiti u takvim eksperimentima je himerni monoklonski IgG1 pagibaksimab (BSYX-A110; Biosynexus), koji cilja lipoteihoičnu kiselinu (LTA) koja je ugrađena u ćelijski zid staphylococci (Baker, Nat Biotechnol. 2006 Dec;24(12):1491-3; Weisman et al., Int Immunopharmacol.2009 May;9(5):639-44).
Primer 15
Upotreba mutacija koje inhibiraju CDC koje ograničavaju aktivaciju CDC prema ciljnim ćelijama koje su istovremeno vezane sa mešavinom dva različita terapeutska monoklonska antitela
[0687] Kao što je opisano u Primeru 6, CD20 antitelo 7D8 mutacije K439E i S440K smanjuju CDC efikasnost kao monoklonska antitela. Mešanjem 7D8 antitela koja sadrže ove mutacije ponovo uspostavlja CDC. Efikasno CDC je prema tome ograničeno na istovremeno vezivanje oba mutirana antitela. Kao što je opisano u Primeru 10, CD38 antitelo 005 mutacije K439E i S440K smanjuju CDC efikasnost kao monoklonska antitela. Mešanjem 005 a antitela koja sadrže ove mutacije ponovo uspostavlja CDC. je prema tome ograničeno na istovremeno vezivanje oba mutirana antitela.
1
[0688] Može predstavljati prednost da se ograniči indukovanje efikasnog CDC prema ciljnim ćelijama koje eksprimiraju istovremeno dva specifična antigen, iskorišćavanjem njihove kombinovane ekspresije da bi se poboljšala selektivnost indukovanja CDC. Da bi se ograničilo indukovanje CDC na ćelijama koje su vezane istovremeno i sa CD20 i CD38 antitela, par 7D8-K439E i 005-S440K ili par 7D8-S440K i 005-K439E će biti dodat odvojeno ili u mešavini 1:1 u CDC eksperimentima kao što sledi.0.1 x 10<6>Daudi ili Raji ćelije će se prethodno inkubirati na pločama sa 96 bunarića sa okruglim dnom sa serijama koncentracija neprečišćenih antitela ili mešavina antitela (0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1.0, 3.0, 10.0, 30.0 µg/mL) u ukupnoj zapremini od 100 µL tokom 15 min na mućkalici na ST. Sledeće, 25 µL normalnog humanog seruma će biti dodato kao izvor komplementa (20% finalna koncentracija) i inkubirano je na 37°C u inkubatoru tokom 45 min. Reakcija će biti zaustavljena postavljanjem ploča na led. 10 µL propidijum jodida će se dodati i liza ćelija će se odrediti pomoću FACS. Očekuje se, da će 7D8-K439E, 005-S440K, 7D8-S440K i 005-K439E ispoljiti ograničenu efikasnost CDC. Očekuje se, da će istovremeno davanje 7D8-K439E i 005-S440K ponovo uspostaviti efikasno CDC specifično na ćelijama koje eksprimiraju i CD20 i CD38. Slično tome, očekuje se da će mešavina 7D8-S440K i 005-K439E ponovo uspostaviti efikasno CDC specifično na ćelijama koje eksprimiraju i CD20 i CD38.
Primer 16
Povećana specifičnost povećanog CDC kombinovanjem E345R sa komplementarnim K439E i S440K mutacija koje inhibiraju u mešavini dva monoklonska antitela
[0689] Kao što je opisano u Primeru 6, CD20 antitelo 7D8 mutacije K439E i S440K smanjuju efikasnost CDC kao monoklonska antitela. Mešanjem 7D8 antitela koje sadrže ove mutacije ponovo uspostavlja CDC. Efikasno CDC je prema tome ograničeno na ćelije koje su istovremeno vezane sa oba mutirana antitela. Kao što je opisano u Primeru 10, CD38 antitelo 005 mutacije K439E i S440K smanjuju efikasnost CDC kao monoklonska antitela. Mešanjem 005 antitela koje sadrže ove mutacije ponovo uspostavlja CDC. Efikasno CDC je prema tome ograničeno na ćelije koje su istovremeno vezane sa oba mutirana antitela.
[0690] Može predstavljati prednost da se ograniči pojačanje indukovanja CDC prema ciljnim ćelijama koje istovremeno eksprimiraju dva specifična antitela, iskorišćavanjem njihove kombinovane ekspresije da bi se poboljšala selektivnost pojačanog indukovanja CDC. Takođe može predstavljati prednost da se ograniči pojačanje indukovanja CDC prema ciljnim ćelijama koje su vezane istovremeno sa mešavinama bar dva različita antitela, pomenta antitela koja vežu identični antigen na ćelijskoj površini istovremeno na dva različita epitopa, ili na dva unakrsno konkurentna, slična, ili identična epitopa.
[0691] Prema tome, da bi se ograničila pojačana indukcija CDC prema ćelijama koje su istovremeno vezane ili sa CD20 i CD38 antitela, mutacija E345R koja pojačava CD je kombinovana sa mutacijama koje inhibiraju CDC u antitelima 7D8-E345R/K439E, 7D8-E345R/S440K, 005-E345R/S440K i 005-E345R/K439E. Ova antitela su dodata odvojeno ili u mešavini 1:1 u CDC eksperimentima kao što sledi.
0.1 x 10<6>Wien133 ćelije (takođe se mogu koristiti ostali ćelijski tipovi kao što su Daudi ili Raji ćelije) su prethodno inkubirane na pločama sa 96 bunarića sa okruglim dnom sa serijom koncentracija neprečišćenih antitela (finalna koncentracija 0.056-10,000 ng/mL u 3-strukim razblaženjima za 7D8-E345R/K439E, 7D8-E345R/S440K, 005-E345R/S440K ili 005-E345R/K439E) ili mešavinama antitela (finalne koncentracije 0.01 µg/mL CD20 antitelo mešavina sa 0-333 ng/mL u 3-strukim razblaženjima CD38 antitela; ili 3.3 µg/mL CD38 antitelo mešavina sa 0.0056-1,000 ng/mL u 3-strukim razblaženjima CD20 antitela) u ukupnoj zapremini od 100 µmL tokom 15 min na mućkalici na ST. Sledeće, 25 µL normalnog humanog seruma je dodato kao izvor komplementa (20% finalna koncentracija) i
1
inkubirano je na 37°C u inkubatoru tokom 45 min. Reakcija je zaustavljena postavljanjem ploča na led.
10 µL propidijum jodida je dodato i liza ćelija je određena pomoću FACS.
[0692] Serija koncentracija 005-E345R/K439E ili 005-E345R/S440K antitela je mešana sa fiksnom koncentracijom 0.01 µg/mL 7D8 dvostrukog mutanta antitela (maksimalna koncentacija sa minimalnim CDC na Wien133 ćelijama kao pojedinačno sredstvo kao što je određeno sa Slike 14A) da bi se dobile komplementarne kombinacije 005-E345R/K439E 7D8E345R/S440K ili 005-E345R/S440K 7D8-E345R/K439E. Slika 14C pokazuje da 005 dvostruki mutant CD38 antitela inukuje CDC u zavisnosti od doze u prisustvu fiksnih koncentracija komplementarnog 7D8-E345R/K439E ili 7D8-E345R/S440K CD20 antitela, redom. Efikasnost CDC ovih komplementarnih kombinacija (Slika 14C) je uporediva sa 005-E345R pojedinačnim mutantom (pojačivač) antitela kao pojedinačnim sredstvom (Slika 14B).
Suprotno, u prisustvu irelevantnog antitela b12, i 005-E345R/K439E i 005-E345R/S440K su retko pokazali CDC u serijama ispitanih koncentracija (uporedivo sa 005-E345R/K439E ili 005-E345R/S440K kao pojedinačnim sredstvima prikazanim na Slici 14B).
[0693] Serija koncentracija 7D8-E345R/K439E ili 7D8-E345R/S440K antitela je mešana sa fiksnom koncentracijom 3.3 µg/mL 005 dvostrukog mutanta antitela (pokazujući malo ali ograničeno CDC na Wien133 ćelijama kao pojedinačno sredstvo kao što je određeno iz Slike 14B) da bi se napravile komplementarne kombinacije 7D8-E345R/K439E 005-E345R/S440K ili 7D8-E345R/S440K 005-E345R/K439E. Slika 14D pokazuje da 7D8 dvostruki mutant CD20 antitela indukuje CDC veoma efikasno u prisustvu komplementarnog 005-E345R/K439E ili 005-E345R/S440K CD38 antitela redom, čak i na najnižim ispitivanim koncentracijama, nalik ne više od nekoliko molekula 7D8 dvostrukog mutanta antitela po ćeliji. Da bi se eliminisao doprinos povećane gustine Fc-vrha na ćelijskoj membrani prema uočenom povećanom CDC sa mešavinom 7D8 i 005 antitela sa komplementarnim mutacijama K439E i S440K, takođe su ispitane kombinacije antitela sa ne-komplementarnim mutacijama. Slika 14D pokazuje da su ne-komplementarne kombinacije pokazale mnogo nižu efikasnost CDC u odnosu na komplementarne kombinacije, kao rezultat manje efikasne Fc-Fc interakcije od komplementarnih kombinacija.
[0694] Ovi podaci ukazuju na to da indukovanje (pojačanje) CDC sa terapetuskim antitelima može biti ograničeno na ćelije koje istovremeno vežu mešavinu dva komplementarna antitela, u ovom slučaju sa različitim specifičnostima prema antigenu, na taj način povećavajući ciljnu specifičnost prema ćeliji zahtevajući istovremenu ekspresiju oba antigena.
[0695] Kao što se može uočiti na Slici 14A i 14B, 7D8-E345R/K439E, 005-E345R/S440K, 7D8-E345R/S440K i 005-E345R/K439E su pokazali ograničenu efikasnost CDC u poređenju samo sa 7D8-E345R. Dalje se uočava, da mešavina 7D8-E345R/K439E i 7D8-E345R/S440K omogućava CDC sa pojačanom efikasnoću u poređenju sa divljim tipom 7D8 antitela kao pojedinačnim sredstvom. Slično tome, uočeno je da mešavina 005-E345R/K439E i 005-E345R/S440K omogućava CDC sa pojačanom efikasnošću u poređenju sa divljim tipom 005 antitela kao pojedinačnim sredstvom (podaci nisu prikazani).
Primer 17
Upotreba mutacija koje inhibiraju CDC koje ograničavaju efikasnu aktivaciju CDC na kompleksima antitela koji se isključivo sastoje iz antitela koja se terapeutski primenjuju
[0696] Kao što je opisano Primeru 6, CD20 antitelo 7D8 dvostruki mutant K439E/S440K ponovo uspostavlja CDC efikasnost koja je umanjena sa K439E ili S440K pojedinačnim pojedinačnim tačkastim mutantima. Kao što je opisano u Primeru 10, CD38 antitelo 005 dvostruki mutant K439E/S440K ponovo je uspostavio CDC efikasnost koja je inhibirana sa K439E ili S440K pojedinačnim tačkastim mutantima.
1
Kao što se uočava, pojedinačne tačkaste mutacije narušavaju interakciju Fc:Fc sa nemutiranim aminokiselinama na okrenutoj strani Fc:Fc površine gde se ostvaruje interakcija. Uvođenje kompenzatorne mutacije na okrenutoj strain the Fc:Fc površine gde se ostvaruje interakcija ponovo je obnovilo CDC efikasnost. Efikasan CDC je stoga očigledno bio ograničen na komplekse antitela koji se sastoje isključivo iz antitela koja sadrže obe mutacije.
[0697] U drugom primeru, indukovanje CDC je ograničeno na komplekse antitela koji se isključivo sastoje iz antitela koja se primenjuju terapeutski. Da bi se ograničila indukcija CDC na ćelije koje su vezane terapeutski sa CD20 ili CD38 antitelima isključivo, mutacije K439E i S440K koje inhibiraju CDC će se kombinovati u antitelima 7D8-K439E/S440K ili 005-K439E/S440K. Ova antitela će se dodati odvojeno u CDC eksperimentima u odsustvu ili prisustvu ne-ciljnih specifičnih IgG kao što sledi.0.1 X 10<6>Daudi ili Raji ćelija će prethodno biti inkubirano na pločama sa 96 bunarića sa okruglim dnom sa serijom koncentracija neprečišćenih antitela ili mešavinom antitela (0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1.0, 3.0, 10.0, 30.0 µg/mL) u ukupnoj zapremini od 100 µL za 15 min na mućkalici na ST. Sledeće, 25 µL normalnog humanog seruma će biti dodato kao izvor komplementa (20% finalna koncentracija) i inkubirani su na 37°C u inkubatoru tokom 45 min. Reakcija će biti zaustavljena postavljanjem ploča na led. 10 µl propidijum jodida je dodato i liza ćelija će biti određena sa FACS.
[0698] Očekivano je, da će 7D8-K439E/S440K indukovati CDC sa eikasnosti koja je slična sa divljim tipom 7D8 antitela. Očekivano je da dodavanje nespecifičnog IgG 7D8-K439E/S440K ne utiče na efikasnost indukovanja CDC za ovo antitelo. Slično tome, očekuje se da će 005-K439E/S440K omogućiti CDC sa efikasnosti koja je slična sa divljim tipom HuMAb 005. Očekivano je da dodavanje nespecifičnog IgG 005-K439E/S440K nema uticaj na efikasnost indukovanja CDC za ovo antitelo.
Primer 18
Upotreba mutacija koje inhibiraju CDC koje ograničavaju pojačanu aktivaciju CDC na kompleksima antitela koji se isključivo sastoje iz antitela koja se terapeutski primenjuju
[0699] Kao što je opisano u primeru 6, CD20 antitelo 7D8 dvostruki mutant K439E/S440K obnovio je CDC efikasnost koja je umanjena sa K439E ili S440K pojedinačnim tačkastim mutacijama. Kao što je opisano u primeru 10, CD38 antitelo HuMAb 005 dvostruki mutant K439E/S440K obnovio je CDC efikasnost koja je bila inhibirana sa K439E ili S440K pojedinačnim tačkastim mutacijama. Kao što je uočeno, pojedinačne tačkaste mutacije narušavaju Fc:Fc interakciju sa nemutiranom aminokiselinom na prednjoj strani Fc:Fc površine za interakciju. Uvođenje kompenzatorne mutacije na prednoj strani Fc:Fc površine za interakciju obnovilo je efikasnost CDC. Efikasan CDC je stoga očigledno bio ograničen na komplekse antitela koji se sastoje isključivo iz antitela koja sadrže obe mutacije.
[0700] U drugom primeru, pojačanje CDC indukcije je ograničeno na komplekse antitela koji se isključivo sastoje iz antitela koja se primenjuju terapeutski. Skrinigom i odabirom mutacija koji stimulišu Fc:Fc interakcije korišćeno za stimulaciju CDC, mogu se identifikovati mutacije koje obrazuju komplekse antitela koja indukuju CDC sa serumskim antitelima koja nisu specifična za ciljni antigen od interesa. Da bi se ograničila pojačana indukcija CDC prema ćelijama koje su vezane sa kompleksima CD20 ili sa CD38 antitelima isključivo, mutacija E345R koja pojačava će biti kombinovana sa mutacijama koje inhibiraju CDC u antitelima 7D8-E345R/K439E/S440K ili 005-E345R/K439E/S440K. Ova antitela će se dodati odvojeno u CDC eksperimentima u odsustvu ili prisustvu ne-ciljnih specifičnih IgG kao što sledi.0.1 x 10<6>Daudi ili Raji ćelije će biti prethodno inkubirane na pločama sa 96 bunarića sa okruglim dnom sa serijama koncentracija neprečišćenih antitela ili mešavine antitela (0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1.0, 3.0, 10.0, 30.0 µg/mL) u ukupnoj zapremini 100 µL tokom 15 min na mućkalici na ST. Sledće, 25 µL normalnog humanog seruma će se dodati kao izvor komplementa (20% finalna koncentracija) i
1
inkubirano je na 37°C u inkubatoru tokom 45 min. Reakcija će biti zaustavljena postavljanjem ploča na led. 10 µL propidijum jodida je dodato i liza ćelija će biti određena pomoću FACS.
[0701] Očekuje se da će 7D8-E345R/K439E/S440K indukovati CDC sa pojačanom efikasnosti u poređenju sa divljim tipm HuMAb 7D8. Očekuje se da dodavanje ne-specifičnog IgG 7D8-E345R/K439E/S440K nema uticaj na specifičnost indukovanja CDC u poređenju sa divljim tipom 7D8 antitela. Slično tome, očekuje se da će 005-E345R/K439E/S440K omogućti CDC sa pojačanom efikasnosti u poređenju sa divljim tipom 005 antitela. Očekuje se da dodavanje ne-specifičnog IgG 005-E345R/K439E/S440K nema uticaj na specifičnost indukovanja CDC poređenju sa divljim tipom 005 antitela.
Primer 19
Upotreba pristupa skrininga mutanta da bi se identifikovale mutacije koje stimulišu oligomerizaciju antitela posredovanu Fc:Fc interakcijom koja se detektuje sa CDC testom
[0702] Kao što je opisano u Primerima 6 i 10, identifikovane su aminokiselinske mutacije koje su stimulisale CDC za antitela koja prepoznaju dva različita ciljna antigena, CD20 i CD38, na brojnim ćelijskim linijama koje eksprimiraju različite nivoe pomenutih antigena. Iznenađujuće, pojedinačna tačkasta mutacija E345R pokazala se dovoljnom za dobijanje CDC-zavisne ćelijske lize Wien133 ćelija sa anti-CD38 antiteloom 005, koje nije uspelo da lizira ove ćelije sa CDC u formatu IgG1 divljeg tipa.
[0703] Druge mutacije na ili periferiji Fc:Fc površine za interakciju mogle bi stimulisati oligomerizaciju i CDC na analogni način. Alternativno, mutacije bi mogle indirektno da stimulišu oligomerizaciju, na primer alosterijskim indukovanjem Fc:Fc interakcija.
[0704] Kako bi se odredilo da li druge aminokiselinske mutacije mogu stimulisati oligomerizaciju antitela posredovanu sa Fc, izvršen je skrining bibliotetke anti-CD38 IgG1-005 mutanata korišćenjem CDC testova, i individualno i mešavina na način u paru da bi se odabrale na primer aminokiselinski parovi koji interaguju preko Fc:Fc površine interakcije. Međutim, ista strategija se može primeniti na druga antitela, kao što je drugo IgG1 ili IgG3 antitelo.
[0705] Dobijena je fokusirana biblioteka mutacija na položajima koji su naznačeni u Tabeli 15. Mutacije su uvedene u IgG1-005 Fc region korišćenjem Quikchange site-directed kompleta za mutagenezu (Stratagene, US). Ukratko, za svaki željeni položaj mutacije, prednji i reverzni prajmer koji kodira degenerisani kodon na željenoj poziciji su korišćeni da bi se replicirao templejt pune dužine DNK plazmida 005 teškog lanca saIgG1m(f) alotipa. Dobijene mešavine DNK su digestirane korišćenjem DpnI da bi se uklonio izvor plazmidne DNK i koristio za transformaciju E. coli. Dobijene kolonije su sakupljene i kultivisane i plazmidna DNK je izolovana iz ovih količina i retransformisana u E. coli da bi se dobile kolonije klonova. Mutant plazmidne DNK koja je izolovana iz nastalih kolonija je proverena sekvenciranjem DNK (LGC genomics, Berlin, Germany). Ekspresione kasete su umnožene sa plazmidnom DNK sa PCR i mešavinama DNK koje sadrže i mutirani teški i divlji tip lakog lanca IgG1-005 privremeno su transfektovane sa Freestyle HEK293F ćelijama (Invitrogen, US) korišćenjem 293fektina (Invitrogen, US) u suštini prema opisu proizvođača. Sakupljeni su supernatanti transfektovanih ćelija koje sadrže mutante antitela. Izvršen je skrining supernatanata mutanta antitela u CDC testovima i individualno i u mešavinama u paru na sledeći način.
[0706] 0.1 x 10<6>Daudi ili Wien-133 ćelija (mogu se koristiti drugi tipovi ćelija kao što su Raji ćelije) su prethodno inkubirane u pločama sa 96 bunarića sa okruglim dnom sa1.0 ug/ml neprečišćenih antitela u ukupnoj zapremini od 100 µL tokom 15 min na mućkalici na ST. Sledeće, 30 µL normalnog humanog seruma je dodato kao izvor komplementa (30% finalna koncentracija) i inkubirano na na 37°C u
11
inkubatoru tokom 45 min. Reakcija je zaustavljena postavljanjem ploča na led.10 µl propidijum jodida je dodato i liza ćelija je određena pomoću FACS.
[0707] Mutacije koje su opisane u Tabeli 16, Tabeli 17 i Tabeli 18 su odabrane zbog njihove sposobnosti pa pojačaju oligomerizaciju kao što se detektuje sa efikasnosti CDC, ili kao pojedinačni mutant ili kada su pomešani sa drugim mutantima na primer suočavajući se sa mutacijom preko Fc:Fc površine interakcije. Opciono, dalje se može vršiti skrining mutacija za njihovu sposobnost da ne ugroze FcRn, vezivanje Proteina-A ili Proteina-G, ADCC, ADCP ili druge efektorske funkcije koje su posredovane sa Fc domenom. Kombinovanjem takvih stimulišućih tačkastih mutacija u jedan Fc domen može još više stimulisati oligomerizaciju i efikasnost CDC.
[0708] Mutacije u CH2-CH3 regionu koje su uključene u CD38 antitelo 005 su ispitane za njihovu sposobnost da inhibiraju oligomerizaciju kao što je određeno sa CDC na Daudi ćelijama. Liza od mutanta antitela je upoređena sa divljim tipom 005, za koje je postavljena liza 100%. Granica za inhibiciju je podešena na ≤ 66% lize. Mereno na ovaj način, većina ispitanih mutacija inhibirala je CDC (videti Tabelu 16).
[0709] Mutacije u CH2-CH3 regionu koje su uključene u CD38 antitelo 005 ispitane su za njihovu sposobnost pojačaju oligomerizaciju kao što se detektuje sa CDC na Wien133 ćelijama (Tabela 17). Divlji tip CD38 antitela 005 nije sposoban da indukuje CDC na Wien133 ćelijama. Mutanti koji pikazuju ≥39% ćelijske lize su bodovani kao pojačavajući. Potpuno neočekivano, praktično sve dobijene supstitucije aminokiselina E345 i E430 stimulisale su ćelijsku lizu sa CDC. Da bi se ovaj rezultat potvrdio, aminokiseline E345, E430 i S440 su supstituisane sa svakom mogućom mutacijom mutagenezom usmerenom na mesto ispitane su za njihovu sposobnost da pojačaju oligomerizaciju kao što je određeno sa CDC na Wien133 ćelijama korićenjem nove količine humanog seruma, pri čemu se dobija nešto efikasnija liza (Tabela 18). Ponovo, sve supstitucije E345 i E430 su indukovale efikasno CDC Wien133 ćelija.
[0710] Sledeće poželjne mutacije dovele su do ≥39% ćelijske lize Wien133 ćelija: P247G, I253V, S254L, Q311L, Q311W, E345A, E345C, E345D, E345F, E345G, E345H, E345I, E345K, E345L, E345M, E345N, E345P, E345Q, E345R, E345S, E345T, E345V, E345W, E345Y, D/E356G, D/E356R, T359R, E382L, E382V, Q386K, E430A, E430C, E430D, E430F, E430G, E430H, E430I, E430L, E430M, E430N, E430P, E430Q, E430R, E430S, E430T, E430V, E430W, E430Y, Y436I, S440Y i S440W.
[0711] Tabela 16 Procenat lize daudi ćelija u prisustvu 1.0 µg/ml tačkastih mutacija IgG1-005 antitela. Divlji tip IgG1-005 lizirao je 66% ćelija pod ovakvim uslovima. Za svaki od pojedinačnih položaja koji je supstituisan sa drugom aminokiselinom predstavljeni su u spoljnoj levoj koloni. Supstituisana aminokiselina za svaki pojedinačni položaj je data praćena izmerenim procentom lize naznačenim u zagradama () u horizontalnim redovima za pojedinačne položaje.
[0712] Tabela 17 Procenat lize Wien-133 ćelija u prisustvu 1.0 µg/ml tačkastih mutacija IgG1-005 antitela. Divlji tip IgG1-005 lizirao je 3% ćelija pod ovakvim uslovima. Za svaki od pojedinačnih položaja koji je supstituisan sa drugom aminokiselinom predstavljeni su u spoljnoj levoj koloni. Supstituisana aminokiselina za svaki pojedinačni položaj je data praćena izmerenim procentom lize naznačenim u zagradama () u horizontalnim redovima za pojedinačne položaje.
11
[0713] Tabela 18 Procenat lize Wien-133 ćelija u prisustvu 1.0 µg/ml tačkastih mutacija IgG1-005 antitela. Divlji tip IgG1-005 lizirao je 12% ćelija pod ovakvim uslovima. Za svaki od pojedinačnih položaja koji je supstituisan sa drugom aminokiselinom predstavljeni su u spoljnoj levoj koloni. Supstituisana aminokiselina za svaki pojedinačni položaj je data praćena izmerenim procentom lize naznačenim u zagradama () u horizontalnim redovima za pojedinačne položaje.
11
Primer 20
In vivo efikasnost IgG1-7D8-E345R u modelu ksenografta subkutanog B ćelijskog limfoma
[0714] Efikasnost protiv tumora IgG1-7D8-E345R antitela in vivo je procenjena u subkutanoznom modelu sa Raji-luc #2D1 ćelijama. Ove ćelije pokazuju ∼300,000 CD20 molekula po ćeliji (određeno sa QIFIKIT analizom, podaci nisu prikazani) i visoku ekspresiju receptora odbrane komplementa. Ćelije su kultivisane u RPMI sa 10% kozmičkim telećim serumom (HyClone, Logan, UT), penicilinom i streptomicinom, 1% (v/v) natrijum piruvatom i 1 µg/mL puromicinom (P-8833, Sigma, Zwijndrecht). Ćelije su sakupljene u log-fazi (konfluentnost približno 70%). Šest do sedam nedelja stari ženski SCID miševi (C.B-17/IcrPrkdc-scid/CRL) su korišćeni (Charles-River). U danu 0, 5x10<6>Raji-luc #2D1 ćelija u 200 µL PBS je subkutanozno ubrizgano u desni bok svakog miša. Razvoj tumora je praćen merenjem pomoću kalipera. Kada je prosečna zapremina tumora bila 100 µm<3>(oko dana 7), miševi su raspoređeni u grupe (n=9) i tretirani su intraperitonealnom (i.p.) injekcijom u pojedinačnoj dozi od 50 µg antitela po mišu (2.5 mg/kg). Svi uzorci antitela su dopunjeni sa irelevantnim antitelom b12 da bi se dobila ukupna koncentracija antitela od 0.5 mg/mL. Grupe koje su primale tretman prikazane su u Tabeli 18. Sedam dana nakon tretmana, dobijeni su uzorci krvi da bi se odredili nivoi humanog IgG u serumu da bi se proverila tačna primena antitela. Tumori su mereni bar dva puta nedeljno pomoću kalipera (PLEXX) do krajnje tačke zapremine tumora od 1500 mm<3>, tumora koji pokazuju ulceracije ili dok nisu zapaženi ozbiljni klinički znakovi.
Tabela 18: Grupe koje primaju tretman i doziranje.
[0715] Slika 15A pokazuje srednju vrednost rasta tumora u danu 22, kada su sve grupe još uvek potpune. Divlji tip antitela IgG1-7D8 je blago inhibirao rast tumora u poređenju sa negativnom kontrolom antitela IgG1-b12, iako ovo nije imalo statistički značaj. Samo IgG1-7D8-E345R je značajno inhibiralo tumorski rast u poređenju sa negativnim kontrolnim antitelom IgGl-b12 (ANOVA analiza jednog smera p< 0.01).
[0716] Slika 15B prikazuje Kaplan-Meier dijagram procenata miševa sa veličinama tumora manjim od 700 mm<3>. U poređenju sa miševima koji su tretirani sa negativnim kontrolnim antitelom IgG1-b12, obrazovanje tumora je značajno odloženo kod miševa koji su tretirani sa IgG1-7D8-E345R antitelom (Mantel-Cox analiza p< 0.01), ali ne kod miševa tretiranih sa divljim tipom IgG1-7D8.
[0717] Ovi podaci pokazuju da E345R mutacija pojačava in vivo efikasnost protiv tumora CD20 antitela 7D8.
Primer 21
In vivo efikasnost IgG1-005-E345R u modelu ksenografta subkutanog B ćelijskog limfoma
[0718] Efikasnost protiv tumora IgG1-005-E345R antitela in vivo je procenjena u subkutanoznom modelu sa Raji-luc #2D1 ćelijma. Ove ćelije pokazuju ∼150,000 CD38 molekula po ćeliji (određeno sa QIFIKIT analizom, podaci nisu prikazani) i visoku ekspresiju receptora odbrane komplementa. Protokol za inokulaciju tumora i merenje je u suštini isti kao što je opisano u Primeru 20. U danu 0, 5x10<6>Raji-
11
luc #2D1 ćelija u 200 µL PBS je s.c. ubrizgano u desni bok SCID miševa. Kada je srednja vrednost zapremine tumora dostigla 100 mm<3>(oko dana 7), miševi su raspodeljeni u grupe (n=7) i tretirani sa i.p. injekcijom pojedinačne doze od 500 µg antitela po mišu (25 mg/kg). Grupe koje su primile tretman su prikazane u Tabeli 19. Tumori su mereni do krajnje tačke zapremine tumora od 1500 mm<3>ili sve dok tumora koji pokazuju ulceracije ili dok nisu zapaženi ozbiljni klinički znakovi da bi se izbegla velika neprijatnost.
[0719] Slika 16A pokazuje srednju vrednost rasta tumora u danu 21, kada su sve grupe još uvek potpune. Divlji tip antitela IgG1-005 blago je inhibirao tumorski rast, iako ovo nije imalo statistički značaj. Samo IgG1-005-E345R je značajno inhibirao tumorski rast u poređenju sa irelevantnom kontrolom antitela u danu 21 (ANOVA analiza jednog smera p< 0.05).
[0720] Slika 16B prikazuje Kaplan-Meier dijagram procenata miševa sa veličinama tumora manjim od 500 µm<3>. obrazovanje tumora je značajno odloženo kod miševa koji su tretirani sa IgG1-005-E345R antitelom u poređenju sa miševima koji su tretirani sa negativnom kontrolom antitela IgGl-b12 (Mantel-Cox analiza p<0.001) ili divlji tip IgG1-005 (p<0.05).
[0721] Ovi podaci pokazuju da ubođenje E345R mutacije u CD38 antitelo 005 dovodi do pojačane in vivo aktivnosti protiv tumora.
Tabela 19: Grupe koje primaju tretman i doziranje.
Primer 22
Monovalentno ciljno vezivanje dalje pojačava CDC efikasnost E345R antitela
[0722] Molekularna površina heksamernog prsten IgG1 koja se uočava u b12 strukturi kristala pokazuje da za svaki IgG u prstenu heksamera, jedan od dva mesta vezivanja C1q je okrenuto na gore i druga sstrana je okrenuta prema dole u strukturi prstena, i takođe jedan Fab-krak svakog antitela je orijentisan prema gore i jedan je orijentisan nadole, što rezultuje da samo jedan Fab-kraka po antitelu učestvuje u vezivanju antigena, što ukazuje na monovalentno vezivanje po molekulu antitela u heksamernom prstenu antitela. Monovalencija može dovesti do stvaranja antitela nakon vezivanja antigena u orijentaciju koja je kompatibilna sa heksamerizacijom. Da bi se ova hipoteza proverila, CDC efikasnost bispecifičnog CD38/EGFR antitela sa E345R mutacijom je ispitana na CD38-pozitivnom, EGFR-negativnim Wien133 ćelijama, za koje se ovo bispecifično antitelo može samo monovalentno vezati preko CD38, i u poređenju sa CDC efikasnosti bivalentnog vezujućeg CD38 antitela, takođe sa E345R mutacijom. Humano monoklonsko antitelo HuMax-EGFr (2F8, opisano u WO 2004/056847) je korišćeno kao osnova za EGFR antitela koja su opisana u ovom primeru.
[0723] Bispecifična antitela su dobijena in vitro u skladu sa DuoBody™ platformom, tj. 2-MEA-indukovanom izmenom Fab-kraka kao što je opisano u WO 2011/147986. Osnova za ovaj postupak je upotreba komplementarnih CH3 domena, koji promovišu nastajanje heterodimera pod specifičnim uslovima u testu. Da bi se omogućila proizvodnja bispecifičnih antitela pomoću ovog postupka, IgG1 molekuli koji nose određene mutacije u CH3 domenu su generisani: u jednom matičnom IgG1 antitelu F405L mutacija, u drugom matičnom IgG1 antitelu K409R mutacija. Da bi se generisala bispecifična
11
antitela, ova dva matična antitela, svako antitelo u finalnoj koncentraciji od 0.5 mg/mL, su inkubirana sa 25 mM 2-merkaptoetilamin-HCl (2-MEA) u ukupnoj zapremini od 100 µL TE na 37°C tokom 90 min. Reakcija redukcije je zaustavljena kada je redukciono sredstvo 2-MEA uklonjeno korišćenjem spin kolona (Microcon centrifugal filters, 30k, Millipore) prema protokolu proizvođača.
[0724] Za CDC test, 0.1 x 10<6>Wien133 ćelije su prethodno inkubirane u pločama sa 96 bunarića sa okruglim dnom sa serijama koncentracija antitela (0.01 do 10.0 µg/mL) u ukupnoj zapremini od 100 µmL tokom 15 min na mućkalici na ST. Sledeće, 25 µL normalnog humanog seruma je dodato kao izvpr komplementa (20% finalna koncentracija) i inkubirano je na 37°C u inkubatoru tokom 45 min. Reakcija je zaustavljena postavljanjem ploča na led.10 µL propidijum jodida je dodato i liza ćelija je određena pomoću FACS.
[0725] Slika 17 pokazuje da, kao što je očekivano, CD38 antitela bez E345R mutacije (divlji tip IgG1-005 i IgG-b12-K409R x IgG1-005-F405L) nije indukovao ubijanje Wien133 ćelija. Takođe EGFR antitelo IgG1-2F8-E345R/F405L, koje nije vezalo EGFR-negativne Wien133 ćelije (podaci nisu prikazani), nije indukovao CDC, kao što je očekivano. Uvođenje K409R mutacije nije uticalo na kapacitet IgG1-005-E345R antitela da indukuje ∼60% ubijanje na Wien133 ćelijama (opisano u Primeru 10). Zanimljivo, bispecifično CD38/EGFR antitelo IgG1-005-E345R/K409R x IgG1-2F8-E345R/F405L, koje se samo monovalentno može vezati za CD38-pozitivne, EGFR-negativne Wien133 ćelije, pokazalo je povećano maksimalno CDC ubijanje (od ∼60% do ∼100% ubijanje).
[0726] Ovi podaci pokazuju da monovalentno ciljanje može dalje pojačati maksimalni kapacitet ubijanja antitela koje sadrže E345R mutaciju koja pojačava CDC. Osim toga, ovi podaci pokazuju da mutacija E345R koja pojačava oligomerizaciju, kao što je mereno sa pojačanom aktivnosti CDC, može da se primeni na drugi format antitela, kao što je DuoBody.
Primer 23
E345R mutacija koja pojačava oligomerizaciju može da se primeni na druge formate antitela kao što je such as DuoBody™
[0727] Efekat E345R mutacije je ispitan u bispecifičnom antitelu DuoBody formata. CDC testovi su sprovedeni sa CD20/CD38 bispecifičnim antitelim na CD20-pozitivnim, CD38-pozitivnim Wien133 i Raji ćelijama.
[0728] Bispecifična antitela su generisana kao što je opisano u Primeru 22. Za CDC test, 0.1 x 10<6>Wien133 ili Raji ćelije su prethodno inkubirane u pločama sa 96 bunarića sa okruglim dnom sa serijama koncentracija antitela (0.01 do 30.0µg/mL) u ukupnoj zapremini od 100 µL tokom 15 min na mućkalici na ST. Sledeće, 25 µL normalnog humanog seruma je dodat kao izvor komplementa (20% finalna koncentacija) i inkubiran je na 37°C u inkubatoru tokom 45 min. Reakcija je zaustavljena postavljanjem ploča na led.10 µL propidijum jodida je dodato i liza ćelija je određena pomoću FACS.
[0729] Slika 18 pokazuje da uvođenje E345R mutacije pojačava CDC bispecifičnog IgG1-005-F405L x IgG1-7D8-K409R antitela na Wien 133 (Slika 18A) i Raji (Slika 18B) ćelijama. Ovi podaci pokazuju da mutacija E345R koja pojačava oligomerizaciju može da se primeni na druge formate antitela da bi se pojačala aktivnost CDC.
11
Primer 24
E345R spasava CDC pomoću EGFR antitela 2F8, koja dalje može biti pojačana sa monovalentnim ciljnim vezivanjem
[0730] Kao što je opisano u Primerima 6, 10 i 26, E345R pojačana ili spašena CDC za antitela koja prepoznaju različite ciljne hematološke markere tumora (CD20 i CD38). Da bi se analiza proširila na solidni tumorski antigen, efekat E345R na kapacitet CDC EGFR antitela 2F8 je ispitan na A431 epidermoidnim ćelijama karcinoma. Osim toga, efekat monovalentnog EGFR ciljanja na E345R-posredovanu indukciju CDC je ispitan korišćenjem bispecifičnog EGFRxCD20 antitela (IgG1-2F8-E345R/F405L x IgG1-7D8-E345R/K409R) na EGFR-pozitivnim, CD20-negativnim A431 ćelijama.
[0731] Bispecifična antitela su dobijena kao što je opisano u Primeru 22. Za CDC test, 5 x 10<6>A431 ćelija/mL je obeleženo sa 100 µCi<51>Cr tokom 1h na 37°C. Ćelije su isprane tri puta sa PBS i resuspendovane u medijumu u koncentraciji od 1 x 10<5>ćelija/mL.25,000 obeleženih ćelija je inkubirano u pločama sa 96 bunarića sa okruglim dnom sa serijama koncentracija neprečišćenih antitela (0-30 µg/mL u 3-strukim razblaženjima) u ukupnoj zapremini od 100 µL tokom 15 min na ST. Sledeće, 50 µL normalnog razblaženog humanog seruma je dodato kao izvor komplementa (25% finalna koncentracija) i inkubirane su na 37°C u inkubatoru tokom 1h. Ćelije su oborene (3 min na 300xg) i 25 µL supernatanta je dodato u 100 µL microscint-a u beloj optiploči sa 96 bunarića (PerkinElmer) za inkubaciju na mućkalici (750 oum) tokom 15 min.<51>Cr oslobađanje je određeno kao broj u minuti na (cpm) na scintilacionom brojaču. Maksimum lize (100%) je određena sa<51>Cr novoom koji je izmeren u supernatantu Triton X-100-tretiranih ćelija. Spontana liza je određena sa<51>Cr nivoom izmerenom u supernatantima ćelija koje su inkubirane bez antitela. Specifična ćelijska liza je izračunata prema formuli: Specifična liza = 100 x (cpm uzorka -cpm spont) / (cpm maks. -cpm spont).
[0732] Slika 19 pokazuje da je IgG1-2F8-E345R/F405L sposoban da lizira A431 ćelije preko CDC, dok divlji tip 2F8 nije sposoban da ubije A431 ćelije. Ovi podaci pokazuju da aktivnost CDC može biti obnovljena u EGFR antitelu 2F8 preko uvođenja E345R mutacije. Ovo potencijalno proširuje primenjivost CDC pojačanu E345R mutacijom na antitela koja ciljaju antigene solidnog tumora.
[0733] Bispecifično EGFRxCD20 antitelo IgG-2F8-E345R/F405L x IgG1-7D8-E345R/K409R, je pokazalo dalje pojačanje CDC na EGFR-pozitivnim, CD20-negativnim A431 ćelijama.
[0734] Ovi podaci dalje podržavaju hipotezu da monovalencija olakšava obrazovanje Fc-Fc interakcija i nakon toga indukciju CDC kao što je pretpostavljeno za CD38 vezujuće antitelo koje je opisano u Primeru 22.
Primer 25
E345R pojačava ili spašava CDC sa CD38 antitelom 003 i CD20 antitelima 11B8 i rituksimab
[0735] Kao što je opisano u Primerima 6, 10 and 24, E345R pojačava ili indukuje CDC aktivnost nekoliko antigena sa različitim ciljnim specifičnostima (CD20, CD38 i EGFR), kao što je ispitano na brojnim ćelijskim linijama koje eksprimiraju varijabilne nivoe pomenutih antigena. Prema tome, smatra se da je uvođenje E345R mutacije bio generalni mehanizam da bi se poboljšao ili spasio CDC za postojeća antitela. Kako bi se ovo dalje podržalo, efekt E345R mutacije na CDC je ispitan za više antitela sa varijabilnom unutrašnjom CDC efikasnosti na Daudi i Wien133 ćelijama: CD38 antitelo 003, koji su opisani u WO 2006/099875 i CD20 antitelima rituksimab (tip I) i 11B8 (tip II), koji su opisani u WO 2005/103081. CD20 antitela mogu biti podeljena u dve podgrupe (Beers et al. Seminars in Hematology 47, (2) 2010, 107-114). Tip I CD20 antitela pokazuje izuzetnu sposobnost da aktivira komplement i pokrene CDC preraspodelom CD20 molekula u plazma membrani na lipidnim ostrvcima, koja dalje
12
grupišu Fc regione antitela i omogućuju poboljšano C1q vezivanje. Tip II CD20 antitela ne menja značajno distribuciju CD20 i bez istovremenog grupisanja, relativno su neefikasna kod CDC.
[0736] 0.1 x 10<6>Daudi ili Raji ćelije su prethodno inkubirane u pločama sa 96 bunarića sa okruglim dnom sa serijama koncentracija neprečišćenih antitela (0.001, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1.0, 3.0, 10.0 µg/mL) u ukupnoj zapremini od 70 µL tokom 15 min na mućkalici na ST. Sledeće, 30 µL normalnog humanog seruma je dodato kao izvor C1q (30% finalna koncentracija) i inkubirano je na 37°C u inkubatoru tokom 45 min. Reakcija je zaustavljena postavljanjem ploča na led.10 µL propidijum jodida je dodato i liza ćelija je određena pomoću FACS.
[0737] Slika 20 pokazuje da je E345R mutacija pojačala CDC za sva ispitivana antitela i na (A) Daudi i (B) Wien133 ćelijama. Zanimljivo, na korišćenim koncentracijama sva antitela koja nisu indukovala CDC u formatu divljeg tipa, indukovala su CDC efikasno nakon uvođenja E345R mutacije: CD38 mAb 003 i CD20 tip II mAt 11B8 na Daudi ćelijama, i CD38 mAt-a 005 i 003 i CD20 tip II mAt 11B8 na Wien133 ćelijama. Ovi podaci ukazuju na to da je poboljšanje oligomerizacije antitela, specifičnije sa uvođenjem E345R mutacije, generalni mehanizam za poboljšanje ili spasavanje CDC sa postojećim antitelima.
Primer 26
E345R pojačava internalizaciju antitela na tkivni faktor
[0738] Da bi se ispitalo da li povećana oligomerizacija može indukovati povećanu internalizaciju antitela, ispitivanja kolokalizacije divljeg tipa i E345R mutiranih antitela na tkivni faktor (TF) sa lizozomalnim markerom LAMP1 su sprovedena korišćenjem konfokalne mikroskopije.
[0739] SK-OV-3 ćelije su uzgajane na staklenim pokrovnim stakalcima (debljine 1.5 mikrona, Thermo Fisher Scientific, Braunschweig, Germany) u standardnom medijumu za kulturu tkiva na 37°C tokom 1 dana. Ćelije su prethodno inkubirane tokom 1 sata sa 50 µg/mL leupeptina (Sigma) da bi se blokirala aktivnost lizozoma, nakon čega je dodato 10 µg/mL antitela na tkivni faktor (TF) (WO 2010/066803). Ćelije su inkubirane dodatnih 1, 3 ili 16 sati na 37°C. Nakon toga, ćelije su isprane sa PBS i inkubirane su u trajanju od 30 minuta na sobnoj temperaturi (ST) sa 4% formaldehidom (Klinipath). Pločice su isprane sa puferom za blokiranje (PBS dopunjen sa sa 0.1% saponinom [Roche] i 2% BSA [Roche]) ii inkubirane su u trajanju od 20 minuta sa puferom za blokiranje koji sadrži 20 mM NH4Cl da bi se zaustavio formaldehid. Pločice su ponovo isprane sa puferom za blokiranje i inkubirane su tokom 45 minuta na ST sa koktelom mišjeg-anti-humanog CD107a-APC (BD Pharmingen) da bi se identifikovao lizozomalni LAMP1 i kozjim-anti-humanim IgG-FITC (Jackson) da bi se identifikovala antitela na TF. Pločice su ponovo isprane sa puferom za blokiranje i montirane su preko noći na mikroskopske pločice koristeći 20 µL medijuma za montiranje (6 grama Glicerol [Sigma] i 2.4 grama Mowiol 4-88 [Omnilabo] je rastvoreno u 6 µL destilovane vode u koju je dodato 12 mL 0.2M Tris [Sigma] pH8.5 nakon inkubacije od 10 min na 50-60°C; medijum za montiranje je alikvotiran i skladišten na -20°C). Slajdovi su snimljeni sa Leica SPE-II konfokalnim mikroskopom (Leica Microsystems) opremljenim sa 63x 1.32-0.6 objektivnom sa sočivima sa uljanom imerzijom i LAS-AF sofverom.
[0740] TIFF slike od 12-bita u nijansama sive boje analizirane su za kolokalizaciju korišćenjem MetaMorph<®>softvera (verzija Meta Series 6.1, Molecular Devices Inc, Sunnyvale California, USA). Slke su uvezene kao celine i pozadina je oduzeta. Korišćene su identične postavke granica (manuelna postavka) za sve FITC slike i sve APC slike. Kolokalizacija je prikazana kao intenzitet piksela FITC u regionu od interesa (ROI), gde se ROI sastoji od svih APC pozitivnih regiona. Da bi se uporedili različiti slajdovi obojeni sa različitim antitelima na TF, slike su normalizovane korišćenjem intenziteta piksela APC. Mišji-anti-humani CD107a-APC je korišćen za bojenje lizozomalnog markera LAMP1 (CD107a). Intenzitet piksela LAMP1 ne treba da bude različit između različitih snimljenih antitela na TF.
[0741] Normalizovane vrednosti za kolokalizaciju FITC i APC su eksprimirane kao arbitrarne jedinice u skladu sa formulom [(TPI FITC x procenat kolokalizacije)/100] x [1/TPI APC] TPI, ukupni intenzitet piksela
Procenat kolokalizacije = TPI FITC koji kolokalizuje sa APC pikselom / TPI APC
TPI, ukupan ntenzitet piksela
[0742] Slika 21 prikazuje količinu FITC intenziteta piksela divljeg tipa i E345R mutiranih antitela na TF koja se poklapaju sa APC-obeleženim lizozomalnim markerom. Za svako antitelo ili ispitivano stanje, tri različite slike su analizirane sa jednog slajda koji sadrži ∼ 1, 3 ili >5 ćelija. Varijacija je uočena između različitih slika unutar svakog slajda. Ipak, očigledno je da E345R mutacija za antitela 011 i 098 rezultuje u povećanoj lizozomalnoj kolokalizaciji nakon 1 sata inkubacije, kada se uporedi sa divljim tipom 011 i 098. Ovi rezultati uklazuju na to da mutacija E345R indukuje bržu internalizaciju i lizozomalnu kolokalizaciju i stoga može potencirati conjugate antitela.
Primer 27
Pojačana CDC sa E345R mutacijom u rituksimabu u različiti B ćelijskim linijama sa sličnom ekspresijom CD20 ali različitim nivoima regulatornih proteina komplementa vezanih za membranu
[0743] Primeri 25 i 28 pokazuju da je CDC efikasnost divljeg tipa rituksimaba na Daudi i Wien133 ćelijama pojačana uvođenjem E345R mutacije. Ova pojačana efikasnost CDC nastaje iz E345R-posredovane stabilizacije Fc-Fc interakcija. Istovremeno obrazovana heksamerna prstenata struktura antitela na ciljnoj ćelijskoj membrani može zatim promovisati efikasno nastajanje kompleksa koji napada membranu olakšavanjem hvatanja i koncentrovanja aktiviranih komponenti komplementa blizu ćelijske membrane. Kao rezultat ovde efikasne aktivacije komplementa, inhibitorni efekti regulatornih proteina komplementa koji su vezani za membranu (mCRP) mogu delom biti prevaziđeni. Prekomerna ekspresija mCRPs, kao što je CD55, CD46 i CD59, je smatrana kao barijera za uspeđnu imunoterapiju sa monoklonalnim antitelima protiv tumora (Jurianz et al., Mol Immunol 199936:929-39; Fishelson et al. Mol Immunol 200340:109-23, Gorter et al., Immunol Today 199920:576-82, Zell et al., Clin Exp Immunol. 2007 Dec 150(3):576-84). Prema tome, efikasnost rituksimab-E345R je upoređena sa onom kod divljeg tipa rituksimaba na serijama B ćelijskih linija sa različitim nivoima mCRPs CD46, CD55 i CD59, ali uporedivim nivoima ciljno eksprimiranog CD20.
[0744] B ćelijske linije Daudi, WIL2-S, WSU-NHL, MEC-2 i ARH-77 eksprimiraju uporedivu količinu CD20 molekula (∼250.000 specifičnog kapaciteta vezivanja antitela - sABC) kao što je određeno sa QIFIKIT analizom (podaci nisu prikazani). Da bi se uporedili nivoi ekspresije regulatornih proteina komplementa između ovih ćelijskih linija, QIFIKIT analiza je sprovedena da bi se odredili nivoi CD46 (mišje antihumano CD46, CBL488, klon J4.48 Chemicon), CD55 (mišje anti-humano CD55, CBL511, Klon BRIC216, Chemicon), i CD59 (mišje anti-humano CD59, MCA1054x, klon MEM-43, Serotec).
[0745] Za CDC test, 0.1 x 10<6>ćelija su prethodno inkubirane u pločama sa 96 bunarića sa okruglim dnom sa serijom koncentracija zasićenih antitela (0.002-40.0 µg/mL u 4-strukim razblaženjima) u ukupnoj zapremini od 100 µL tokom 15 min na mućkalici na ST. Sledeće, 25 µL normalnog humanog seruma je dodato kao izvor komplementa (20% finalna koncentracija) i inkubirano je na 37°C u inkubatoru u trajanju od 45 min. Reakcija je zaustavljena postavljanjem ploča na led. 10 µL propidijum jodida je dodato i liza ćelija je određena pomoću FACS. Maksimalno CDC-posredovano ubijanje je izračunato iz dva nezavisna eksperimenta korišćenjem vrha vrednosti najboljeg uklapanja ne-linearnog uklapanja u GraphPad PRISM 5.
[0746] Slika 22A-D pokazuje da uvođenje E345R u divlji tip rituksimaba rezultuje u povećanoj efikasnosti CDC kao što je uočeno sa povećanom maksimalnom lizom i smanjenim EC50za sve ispitane B ćelijske linije.
[0747] Slika 22E pokazuje da maksimalno CDC-posredovano ubijanje indukovano sa rituksimab-E345R mutantom je uvek bilo veće u odnosu na divlji tip rituksimaba, nezavisno od nivoa ekspresije regulatornih proteina komplementa koji su vezani za membranu. Ovi podaci ukazuju na to da uvođenje E345R pojačava terapeutski potencijal monoklonalnih antitela što su ćelije tumora manje uspešne u izbegavanju napada komplementom posredovano sa antitelom sa antitelima koja sadrže E345R.
Primer 28
Poređenje CDC kinetika za divlji tip i E345R antitela
[0748] Pokazano je da uvođenje E345R mutacije koje stabilizuje Fc:Fc interakciju pojačava ili spasava CDC kao što je uočeno sa smanjenim EC50vrednostima i maksimalnom lizom za različita anitela na različitim ćelijskim linijama opisanim u Primeru 6 (CD20 antitelo 7D8 na Daudi i Raji), Primeru 10 (CD38 antitelo 005 na Daudi, Raji i Wien133) i Primeru 25 (CD38 antitelo 003 i CD20 antitela rituksimab i 11B8 na Daudi i Wien133). Sledeće, kinetike CDC reakcija su analizirane da bi se dalje otkrila razlika u efikasnosti CDC između divljeg tipa i E345R antitela.
[0749] 0.1 x 10<6>Raji ćelije su prethodno inkubirane u pločama sa 96 bunarića sa okruglim dnom sa antitelom u koncentraciji zasićenja (10.0 µg/mL) u ukupnoj zapremini od 100 µL tokom 15 min na mućkalici na ST. Sledeće, 25 µL normalnog humanog seruma je dodato kao izvor komplementa (20% finalna koncentracija) i inkubirano je na 37°C u inkubatoru u različitim vremenskim periodima, varirajući između 0 i 60 min. Reakcija je zaustavljena postavljanjem ploča na led. 10 µL propidijum jodida je dodato i liza ćelija je određena pomoću FACS.
[0750] Slika 23A pokazuje da je divlji tip CD20 antitela IgG1-7D8 pokazao maksimalno CDC-posredovano ubijanje 80% Raji ćelija, koje je već dostignuto nakon 5 min pod ispitivanim uslovima. Međutim, za IgG-7D8-E345R, 80% ubijanje Raji ćelija je uočeno još brže, nakon 3 min. Maksimalna liza sa IgG-7D8-E345R (95%) je takođe dostignuta nakon 5 minuta.
[0751] Slika 23B pokazuje da takođe za divlji tip CD20 antitela rituskimab, koji je manje potentan od 7D8 da indukuje CDC na korišćenim Raji ćelijama, uvođenje E345R mutacije rezulatovalo je u bržem ubijanju ciljnih ćelija. Divlji tip rituksimaba pokazao je maksimalno CDC-posredovano ubijanje od 32%, koje je dostignuto nakon 20 minuta. Rituksimab-E345R je dostigao 32% ubijanje već nakon približno 3 minuta i izuzetno, maksimalna liza sa rituksimab-E345R (85%) je takođe dostignuta nakon 20 minuta.
[0752] Slika 23C+D pokazuje da korišćene Raji ćelije, koje su rezistentne na CDC-posredovano ubijanje sa divljim tipom CD38 antitela IgG1-003 i IgG1-005, mogu biti brže ubijene sa uvođenjem E345R mutacije. IgG1-003-E345R i IgG1-005-E345R su pokazali maksimalno CDC (50% i 60%, redom) već nakon 5 min.
[0753] Ukratko, E345R antitela su potentnija od svojih parnjaka divljeg tipa, koji nastaju iz kombinovanja visoke efikasnosti (niža EC50), povećane maksimalne lize i bržih kinetika CDC reakcije.
12
Primer 29
Poređenje CDC kinetika za bispecifična antitela sa ili bez mutacije E345R
[0754] U primer 23 opisano je da E345R mutacija može biti primenjena na CD38xCD20 bispecifično antitelo IgG1-005-F405L x IgG1-7D8-K409R koje je generisano sa DuoBody platformom, rezultujući u pojačanom kapacitetu ubijanja kao što se uočava sa smanjenom EC50u CDC testovima na Raji i Wien133 ćelijama. Sledeće, kinetike CDC reakcije je analizirana da bi se dalje otkrila razlika u CDC efikasnosti između CD38xCD20 bispecifičnih antitela sa i bez E345R.
[0755] 0.1 x 10<6>Raji cells su prethodno inkubirane u pločana sa 96 bunarića sa okruglim dnom sa antitelom u koncentraciji zasićenja (10.0 µg/mL) u ukupnoj zapremini od 100 µL tokom 15 min na mućkalici na ST. Sledeće, 25 µL normalnog humanog seruma je dodato kao izvor komplementa (20% finalna koncentracija) i inkubirano je na 37°C u inkubatoru u različitim vremenskim periodima, varirajući između 0 i 60 min. Reakcija je zaustavljena postavljanjem ploča na led. 10 µL propidijum jodida je dodato i liza ćelija je određena pomoću FACS.
[0756] Slika 24 pokazuje da bispecifično antitelo IgG1-005-F405L x IgG1-7D8-K409R indukuje maksimalno CDC-posredovano ubijanje od 83%, koje je dostignuto nakon 10 minuta. Uvođenje E345R rezultovalo je u povećanom maksimalnom ubijanju za IgG1-005-E345R-F405L x IgG1-7D8-E345R-K409R (98%), koje je već dostignuto nakon 2 minuta. Ovi podaci ukazuju na to da uvođenje E345R mutacije koja stabilizuje Fc-Fc u bispecifičnom antitelu rezultuje u povećanom CDC-posredovanom ubijanju ciljne ćelije.
Primer 30
Poređenje CDC kinetika za monovalentna vezujuća antitela sa i bez E345R
[0757] Primer 22 pokazuje da monovalentno ciljano vezivanje dalje pojačava CDC efikasnost E345R antitlea kao što je uočeno sa povećanom maksimalnom lizom sa CD38xEGFR bispecifičnim antitelom na CD38-pozitivnim, EGFR-negativnim Wien133 ćelijama. Sledeće, kinetika CDC reakcije je analizirana da se dalje otkrije razlija u CDC-posredovanom kapacitetu ubijanja između monovalentnih vezujućih antitela sa i bez E345R.
[0758] Bispecifična CD38xEGFR i CD20xEGFR antitela, sa ili bez mutacije E345R, generisana su in vitro u skladu sa DuoBody platformom kao što je opisano u Primeru 22. CDC efikasnost CD38xEGFR bispecifičnih antitela je ispitana na CD38-pozitivnim, EGFR-negativnim Raji ćelijama, za koje se bispecifična antitela mogu vezati samo monovalentno preko CD38.0.1 x 10<6>Raji ćelija su prethodno inkubirane u pločama sa 96 bunarića sa okruglim dnom sa antitelom na zasićenoj koncentraciji (10.0 µg/mL) u ukupnoj za premini od 100 µL tokom 15 min na mućkalici na ST. Sledeće, 25 mL normalnog humanog seruma je dodato kao izvor komplementa (20% finalna koncentracija) i inkubirano je na 37°C u inkubatoru u različitim vremenskim periodima, varirajući između 0 i 60 min. Reakcija je zaustavljena postavljanjem ploča na led.10 µL propidijum jodida je dodato i liza ćelija je određena pomoću FACS.
[0759] Slika 25 pokazuje da je bispecifično antitelo CD38xEGFR (IgG1-005-K409R x IgG1-2F8-F405L) indukovalo maksimalno CDC-posredovano ubijanje od 55%, koje se dostiže nakon približno 10 minuta. Introdukcija E345R rezultovala je u povećanom maksimalnom ubijanju (96%), koje je već dostignuto nakon 5 minuta.
[0760] Slika 25 pokazuje da bispecifično antitelo CD20xEGFR (IgG1-7D8-K409R x IgG1-2F8-F405L) indukovalo maksimalno CDC-posredovano ubijanje od 85%, koje se dostiže nakon približno 5 minuta.
Međutim, sa CD20xEGFR antitelom sa uvedenom E345R, 85% liza je brže uočena, nakon 2 minuta. Maksimalna liza sa E345R CD20xEGFR antitelom (97%) je takođe dostignuta nakon 5 minuta.
[0761] Ukratko, uvođenje E345R mutacije u ovim monovalentnim vezujućim antitelima rezultovalo je u potentnijim antitelima, koja su dobijena iz kombinacije povećane maksimalne lize i bržih kinetika CDC reakcije.
Primer 31
CDC sa kombinacijom terapeutskih i E345R/Q386K antitela
[0762] Kao što je opisano u Primeru 19, mutant CD38 antitela koji je izveden iz IgG1-005 mogao bi indukovati efikasni CDC na Wien133 ćelijama kada je E345 položaj divljeg tipa antitela supstituisan sa bilo kojom aminokiselinom koja nije Glutamat (E). Ovu ukazuje na to da je oligomerizacija, kao preduslov za CDC, ometana prisustvom bočnog lanca Glutamata u položaju 345 antitela. S obzirom da je E345 na jednom Fc u blizini sa Q386 na okrenutom drugom Fc ostatku u strukturi prstena heksamera antitela, E345-posredovano ometanje oligomerizacije u prvom antitelu moglo bi se eventualno ukloniti sa supstitucijama na Q386 položaju drugog antitela. Ovo bi zatim omogućilo E345 u prvom antitelu da bolje interaguje sa mutiranim položajem 386 u drugom antitelu u slučaju da su oba antitela kombinovana. Da bi se ispitala ova hipoteza, CDC testovi su sprovedeni na Wien133, u kojima su divlji tipovi antitela (IgG1-003, IgG1-005 ili IgG1-11B8) bili mešavine sa IgG1-005-E345R/Q386K ili IgG1-005-E345R/Q386K/E430G kao primer.
[0763] 0.1 x 10<6>Wien133 ćelije su prethodno inkubirane u pločama sa 96 bunarića sa okruglim dnom sa serijama koncentracija neprečišćenog IgG1-005-E345R/Q386K, IgG1-005-E345R/Q386K/E430G ili kontrolnim antitelom (0.0001-20.0 µg/mL u 3.33-strukim razblaženjima) u prisustvu ili odsustvu 1.0 ili 10.0 µg/mL divljeg tipa IgG1-003, IgG1-005 ili IgG1-11B8 antitela u ukupnoj zapremini od 100 mL tokom 15 min na mućkalici na ST. Sledeće, 25 µL normalnog humanog seruma je dodato kao izvor komplementa (20% finalna koncentracija) i inkubirano je na 37°C u inkubatoru tokom 45 min. Reakcija je zaustavljena postavljanjem ploča na led.10 µL propidijum jodida je dodato i liza ćelija je određena pomoću FACS.
[0764] Slika 26A/B/C pokazuje da je CD38 antitelo IgG1-005-E345R/Q386K indukovalo CDC-posredovanu lizu na Wien133 ćelijama na način koji zavisi od doze (isprekidana linija). Kombinovanjem IgG1-005-E345R/Q386K sa 1 ili 10 µg/mL divljeg tipa CD38 antitela IgG1-003 (Slika 26A) ili divljim tipom CD20 antitela IgG1-11B8 (Slika 26B) rezultovalo je u povećanoj maksimalnoj ćelijskoj lizi. Kombinovanje IgG1-005-E345R/Q386K sa divljim tipom IgG1-005 inhibiralo je CDC na način koji zavisi od doze, moguće kompeticijom za mesto vezivanja (Slika 26C).
[0765] Slika 26D/E/F pokazuje slične rezultate za CD38 antitelo IgG1-005-E345R/Q386K/E430G.
[0766] Ovi podaci ukazuju na to da divlji tip antitela IgG1-003 i IgG1-11B8 učestvuje u oligomerizaciji antitela i aktivaciji CDC kada su kombinovani sa IgG1-005-E345R/Q386K ili IgG1-005-E345R/Q386K/E430G. U takvim kombinacijama, ometanje oligomerizacije sa E345-položajem koji se nalazi u divljem tipu antitela mogao bi biti, bar delom, uklonjen sa Q386K supstitucijom u mutantu antitela. Ova primena je posebno od interesa da bi se unapredile terapije sa antitelima koja su divlji tip u položaju E345, kao što je rituksimab, ofatumumab, daratumumab ili trastuzumab. Takođe, takva antitela koja indukuju oligomerizaciju mogla bi promovisati nastajanje kompleksa koji su vezani za ćeliju sa sopstvenim antitelima pacijenta koja su usmerena protiv ciljne ćelije kao što su ćelije tumora ili bakterije.
12
[0767] Primer 19 opisuje više aminokiselina pored E345 koje pojačavaju CDC nakon mutacije, na primer E430 i S440, od kojih su specifične mutacije indukovale efikasno CDC na Wien133 ćelijama kada su uključene u CD38 antitelo IgG1-005. Sa izuzetkom 1253 i Y436 mutanata, identifikovane mutacije koje pojačavaju oligomerizaciju kontaktiraju nemutirane aminokiseline na okrenutom drugom Fc ostatku u strukturi heksamernog prstena. Prema tome, identifikovane mutacije koje pojačavaju oligomerizaciju, i zasebno i kombinovano, može se očekivati da takođe promovišu oligomerizaciju sa nemutiranim antitelima, i dalja optimizacija takvih mutanata bi se mogla postići korišćenjem strategije za odabir koja je slična onoj koja se primenjuje u primeru 19.
Primer 32
E345R indukuje CDC u IgG2, IgG3 i IgG4 izotipovima antitela
[0768] Da bi se ispitalo da li uvođenje mutacija koje promovišu oligomerizaciju može stimulisati CDC aktivnost ne-IgGl izotipova antitela, izotipske varijante CD38 antitela IgG1-005 su generisane sa konstantnim domenima humanog IgG2, IgG3 ili IgG4 pri čemu se dobija IgG2-005, IgG3-005 i IgG4-005 korišćenjem postupaka koji su poznati u oblasti tehnike. Osim toga, E345R mutacija koja pojačava oligomerizaciju uvedena je u svaki od ovih antitela, dajući IgG2-005-E345R, IgG3-005-E345R i IgG4-005-E345R. Na sličan način, takođe IgG2-003 i IgG2-003-E345R su generisani iz CD38 antiteloa IgG1-003. CDC efikasnost različitih izotipova upoređena je u in vitro CDC testu.
[0769] 0.1 x 10<6>Wien133 ćelija su prethodno inkubirane na pločama sa 96 bunarića sa okruglim dnom sa 10 µg/mL neprečišćenih antitela u ukupnoj zapremini od 100 µL tokom 15 min na mućkalici na ST. IgG1-005-E345R je dodato na 3.0 µg/mL. Sledeće, 25 µL normalnog humaog seruma je dodato kao izvor komplementa (20% finalna koncentracija) i inkubirano je na 37°C u inkubatoru tokom 45 min. Reakcija je zaustavljena postavljanjem ploča na led.10 µL propidijum jodida je dodato i liza ćelija je određena pomoću FACS.
[0770] Slika 27 pokazuje da IgG2-005, IgG2-003, IgG3-005 i IgG4-005 nisu bili sposobni da liziraju ili (A) Daudi ili (B) Wien133 ćelije efikasno pod ispitivanim uslovima (uočena ∼20% liza je smatrana kao pozadinska). Uvođenje E345R mutacije omogućio ne potentnu CDC na Daudi ćelijama sa svim ispitivanim izotipovima IgG. Ovi rezultati su potvrđeni korišćenjem CDC na Wien133 ćelijama, iako je IgG3-005-E345R ispoljio ograničeni CDC aktivnost u odnosu na druge varijante izotipova. Ovi podaci ukazuju na to da osim IgG1, mutacija koja pojačava oligomerizaciju kao što je E345R može takođe da e primeni da bi se promovisala CDC aktivnost IgG2, IgG3 i IgG4 antitela.
Primer 33
CDC sa IgG1-005 i IgG1-005-E345R u ex vivo CDC testu na CD38-pozitivnim B ćelijama hronične limfocitne leukemije (CLL) dobijenim iz pacijenta.
[0771] Kriosačuvane primarne ćelije iz uzoraka pacijenata sa CLL dobijeni su iz hematopatološke biobanke CDB-IDIBAPS-Hospital Clínic (Dr. Elias Campo, Hematopatološka jedinica, Odeljenje za patologiju, Klinika bolnice, Institut d’Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS), Univerzitet u Barseloni, Španija), ili iz kliničkih ispitivanja od strane National Heart, Lung, i Blood Institute (NHLBI) (Dr. Adrian Wiestner, NHLBI, Ogranak za hematologiju Nacionalnog instituta za zdravlje (NIH), Bethesda). Od svih pacijenata je dobijen informisani pristanak u skladu sa Institucionalnim Etičkim Komitetom klinike bolnice (Barcelona, Spain) ili Institucionalnim odborom za reviziju NIH u Helsinškom deklaracijom. Svi uzorci su genetski i imunofenotipski karakterisani.
12
[0772] CLL uzorci su kategorisani u dve grupe prema njihovoj ekspresiji CD38 kao što je određeno sa FACS: pet uzoraka je podeljeno u CD38 visoko grupu (između 50% i 98% od ekspresije CD38 na Daudi ćelijama) i četiri uzorka su uključena u CD38 nisko grupu (između 0.5% i 3% od ekspresije CD38 na Daudi ćelijama).
[0773] Fluorescentno obležene CLL ćelije (obležene sa 5 mM Calcein AM) inkubirane su sa serijama koncentracija antitela (0.01-10 µg/mL u 10-strukim razblaženjima). Sledeće, normalnih humani serum je dodat na ćelije koje su opsonizovane antitelom (100,000 ćelija/bunariću) kao izvor komplementa (10% finalna koncentracija) i inkubirane su u trajanju od 45 min na 37°C. Supernatanti su dobijeni were i fluorescencija je čitana u Synergy™ HT fluorometru kao mera ćelijske lize. Ubijanje ćelija je određeno kao što sledi: Specifična liza = 100 x (uzorak-spontana liza)/(maks. liza -spontana liza) gde je maksimalna liza određena iz uzorka ćelija koji je tretiran sa 1% Triton, i spontana liza je određena iz uzorka gde su ćelije inkubirane u prisustvu 10% NHS bez antitela.
[0774] Slika 28 pokazuje da IgG1-005-E345R snažno pojačava CDC efikasnost u poređenju sa divljim tipo IgG1-005 i na CLL primarni ćelijama sa visokom ekspresijom CD38 i CLL primarnim ćelijama sa niskom ekspresijom CD38.
12
��
12
�
11
��
1
��
1
�
�

Claims (7)

Patentni zahtevi
1. Kompozicija koja sadrži prvu varijantu matičnog antitela, gde je prva varijanta humano antitelo pune dužine, i drugu varijantu matičnog antitela, pri čemu druga varijanta je humano antitelo pune dužine, gde prva varijanta sadrži prvi Fc-domen imunoglobulina i region koji veže antigen, gde druga varijanta sadrži drugi Fc-domen imunoglobulina i region koji veže antigen, i gde pomenuta prva varijanta i druga varijanta sadrži mutaciju koji odgovara E430G u Fc regionu teškog lanca humanog IgG1 i pomenuta prva varijanta sadrži mutaciju koji odgovara K439E u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, i pomenuta druga varijanta sadrži mutaciju koji odgovara S440K u Fc-regionu teškog lanca humanog IgG1, pri čemu su aminokiselinske pozicije numerisane prema Eu-indeksu i gde prva i druga varijanta sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je bar 95 % stepeni identična sa aminokiselinskim ostacima 130 do 330 od SEQ ID NO 1 ili 5, gde prva i druga varijanta su sposobne za uparivanje jedna sa drugom; obezbeđujući obnovljeno ili povećano vezivanje C1q, aktivaciju komplementa, i/ili CDC, za par varijanti specifičnog antitela, u poređenju sa svakom varijantom pojedinačno ili mešavinom matičnog antitela ili matičnih antitela.
2. Kompozicija prema zahtevu 1, pri čemu je svaka prva varijanta i druga varijanta humano IgG1 antitelo pune dužine.
3. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 2, pri čemu je prva varijanta i druga varijanta odabrana između monospecifičnog antitela, bispecifičnog antitela ili multispecifičnog antitela.
4. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 3, pri čemu prva i druga varijanta vežu različite epitope na istom antigenu ili na različitim antigenima.
5. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 4, pri čemu jedna ili obe od prve varijante i druge varijante je konjugovana sa lekom, toksinom ili radiobeleživačem, tako što je jedna ili obe prve varijante i druge varijante konjugovana sa toksinom preko linkera.
6. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 5 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
7. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 6 za upotrebu u postupku lečenja bolesti, kao što je kancer.
RS20220267A 2011-07-06 2012-07-06 Varijante antitela i njihove upotrebe RS63044B1 (sr)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161504994P 2011-07-06 2011-07-06
DKPA201100519 2011-07-06
DKPA201200371 2012-05-30
PCT/EP2012/063339 WO2013004842A2 (en) 2011-07-06 2012-07-06 Antibody variants and uses thereof
EP12740092.7A EP2729170B1 (en) 2011-07-06 2012-07-06 Antibody variants and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS63044B1 true RS63044B1 (sr) 2022-04-29

Family

ID=47437504

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20220267A RS63044B1 (sr) 2011-07-06 2012-07-06 Varijante antitela i njihove upotrebe

Country Status (22)

Country Link
US (4) US10759867B2 (sr)
EP (2) EP3970746A3 (sr)
JP (3) JP6243330B2 (sr)
KR (2) KR102163669B1 (sr)
CN (4) CN104220093B (sr)
AU (5) AU2012280222B8 (sr)
BR (1) BR112014000264A2 (sr)
CA (1) CA2840147A1 (sr)
DK (1) DK2729170T3 (sr)
EA (1) EA201400108A1 (sr)
ES (1) ES2908876T3 (sr)
IN (1) IN2014CN00807A (sr)
MX (1) MX357944B (sr)
NZ (1) NZ812025A (sr)
PL (1) PL2729170T3 (sr)
PT (1) PT2729170T (sr)
RS (1) RS63044B1 (sr)
SG (1) SG10201605572TA (sr)
SI (1) SI2729170T1 (sr)
UA (2) UA117901C2 (sr)
WO (1) WO2013004842A2 (sr)
ZA (1) ZA201309499B (sr)

Families Citing this family (138)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2006381T3 (en) 2006-03-31 2016-02-22 Chugai Pharmaceutical Co Ltd PROCEDURE FOR REGULATING ANTIBODIES BLOOD PHARMACOKINETICS
DK2202245T3 (en) 2007-09-26 2016-11-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd A method of modifying an antibody isoelectric point VIA amino acid substitution in CDR
UA121453C2 (uk) 2008-04-11 2020-06-10 Чугей Сейяку Кабусікі Кайся Спосіб одержання фармацевтичної композиції, яка містить антитіло
CA2801210C (en) 2010-06-19 2020-07-21 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Anti-gd2 antibodies
KR102385507B1 (ko) 2010-11-30 2022-04-12 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 복수 분자의 항원에 반복해서 결합하는 항원 결합 분자
CA2827923C (en) 2011-02-25 2021-11-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fc.gamma.riib-specific fc antibody
UA117901C2 (uk) 2011-07-06 2018-10-25 Ґенмаб Б.В. Спосіб посилення ефекторної функції вихідного поліпептиду, його варіанти та їх застосування
US10323081B2 (en) * 2011-07-06 2019-06-18 Genmag A/S Modulation of complement-dependent cytotoxicity through modifications of the C-terminus of antibody heavy chains
IL282122B2 (en) * 2011-07-06 2025-10-01 Genmab Bv Antibody variants and their uses
JP6322411B2 (ja) 2011-09-30 2018-05-09 中外製薬株式会社 複数の生理活性を有する抗原の消失を促進する抗原結合分子
TW201817745A (zh) * 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
SG10201609301QA (en) 2011-11-30 2016-12-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Drug containing carrier into cell for forming immune complex
KR102041412B1 (ko) * 2011-12-30 2019-11-11 한미사이언스 주식회사 면역글로불린 Ｆｃ 단편 유도체
SG10201704849PA (en) 2012-02-09 2017-07-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Modified fc region of antibody
US20130236890A1 (en) * 2012-03-08 2013-09-12 HI-STEM Heidelberg Institute for Stem Cell Technology and Experimental Medicine gGmbH Novel method for analyzing circulating tumor cells of a patient for the presence of metastasis-initiating cells
MX2019001355A (es) 2012-05-10 2023-01-17 Bioatla Llc Anticuerpos monoclonales multiespecíficos.
BR112015000167B1 (pt) * 2012-07-06 2021-11-23 Genmab B.V. Proteína dimérica, proteína, composição, kit de partes e seus usos, bem como método para aumentar a oligomerização em solução de uma proteína dimérica compreendendo um primeiro e segundo polipeptídeo, cada um compreendendo pelo menos as regiões ch2 e ch3 de uma cadeia pesada de igg1 humana e proteína dimérica variante
ES2758979T3 (es) * 2012-07-06 2020-05-07 Genmab Bv Proteína dimérica con mutaciones triples
EP3632462A1 (en) * 2012-07-06 2020-04-08 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations
EP2684896A1 (en) * 2012-07-09 2014-01-15 International-Drug-Development-Biotech Anti-DR5 family antibodies, bispecific or multivalent anti-DR5 family antibodies and methods of use thereof
AU2013306700B2 (en) 2012-08-24 2019-05-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha FcgammaRIIb-specific Fc region variant
EA201500741A1 (ru) * 2013-01-10 2016-01-29 Генмаб Б.В. ВАРИАНТЫ Fc-ОБЛАСТИ IGG1 ЧЕЛОВЕКА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
US10201614B2 (en) 2013-03-15 2019-02-12 Zymeworks Inc. Cytotoxic and anti-mitotic compounds, and methods of using the same
CA2903576C (en) * 2013-03-15 2021-06-08 Nai-Kong V. Cheung High affinity anti-gd2 antibodies
WO2014145159A2 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Permeon Biologics, Inc. Charge-engineered antibodies or compositions of penetration-enhanced targeting proteins and methods of use
WO2014163101A1 (ja) 2013-04-02 2014-10-09 中外製薬株式会社 Ｆｃ領域改変体
HK1213578A1 (zh) 2013-04-29 2016-07-08 豪夫迈‧罗氏有限公司 结合人fcrn的修饰的抗体和使用方法
EP3086815B1 (en) 2013-12-27 2022-02-09 Zymeworks Inc. Sulfonamide-containing linkage systems for drug conjugates
WO2015105973A1 (en) 2014-01-08 2015-07-16 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services ANTIBODY TARGETING CELL SURFACE DEPOSITED COMPLEMENT PROTEIN C3d AND USE THEREOF
CA2931986A1 (en) 2014-01-15 2015-07-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Fc-region variants with modified fcrn- and maintained protein a-binding properties
CN105916880B (zh) * 2014-01-15 2020-01-17 豪夫迈·罗氏有限公司 具有改善的蛋白A结合作用的Fc区变体
CN105873948B (zh) * 2014-01-15 2021-04-13 豪夫迈·罗氏有限公司 具有修饰的FCRN结合性质的Fc区变体
MX2016010951A (es) 2014-03-05 2016-11-29 Ucb Biopharma Sprl Proteinas de fc multimericas.
AP2016009586A0 (en) 2014-05-29 2016-11-30 Macrogenics Inc Tri-specific binding molecules and methods of use thereof
US10450378B2 (en) 2014-09-17 2019-10-22 Zymeworks Inc. Cytotoxic and anti-mitotic compounds, and methods of using the same
WO2016097300A1 (en) * 2014-12-19 2016-06-23 Genmab A/S Rodent bispecific heterodimeric proteins
EP3280736A1 (en) 2015-04-07 2018-02-14 F. Hoffmann-La Roche AG Antigen binding complex having agonistic activity and methods of use
BR112017024899A2 (pt) 2015-05-21 2018-11-13 Harpoon Therapeutics, Inc. proteínas de ligação trispecíficas e métodos de uso.
CN107743494B (zh) 2015-06-02 2022-04-29 诺和诺德股份有限公司 具有极性重组延伸体的胰岛素
MA43348A (fr) 2015-10-01 2018-08-08 Novo Nordisk As Conjugués de protéines
SG11201803956UA (en) * 2015-12-01 2018-06-28 Genmab Bv Anti-dr5 antibodies and methods of use thereof
CN106883297B (zh) * 2015-12-16 2019-12-13 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 基于ch3结构域的异二聚体分子、其制备方法及用途
MA46681A (fr) * 2016-01-28 2019-09-11 Janssen Biotech Inc Anticorps bispécifiques anti-tnf-alpha/il-17a antibodies et anticorps anti-tnf-alpha et leurs procédés d'utilisation
WO2017165464A1 (en) 2016-03-21 2017-09-28 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific and multifunctional molecules and uses thereof
WO2017177175A1 (en) * 2016-04-07 2017-10-12 The George Washington University Methods and compositions targeting retroviral latency
KR20230021765A (ko) * 2016-05-18 2023-02-14 젠맵 비. 브이 항체 및 감염성 질환의 치료에서의 그의 사용 방법
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
JP7101621B2 (ja) 2016-05-20 2022-07-15 ハープーン セラピューティクス，インク． 単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質
JP2019527678A (ja) 2016-06-28 2019-10-03 ユーエムセー・ユトレヒト・ホールディング・ベー・フェー ＣＤ３８に特異的に結合する抗体によるＩｇＥ媒介疾患の治療
US20180044430A1 (en) * 2016-08-12 2018-02-15 Janssen Biotech, Inc. FC Engineered Anti-TNFR Superfamily Member Antibodies Having Enhanced Atonistic Activity and Methods of Using Them
EP3848392A1 (en) 2016-10-07 2021-07-14 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
WO2018083126A1 (en) * 2016-11-01 2018-05-11 Genmab B.V. Polypeptide variants and uses thereof
KR20190087539A (ko) 2016-11-23 2019-07-24 하푼 테라퓨틱스, 인크. Psma 표적화 삼중특이성 단백질 및 사용 방법
WO2018098354A1 (en) 2016-11-23 2018-05-31 Harpoon Therapeutics, Inc. Prostate specific membrane antigen binding protein
US10440535B2 (en) 2017-01-25 2019-10-08 The George Washington University System and method for asset-agnostic wireless monitoring and predictive maintenance of deployed assets
CN110945021B (zh) 2017-02-10 2025-09-12 根马布私人有限公司 多肽变体及其用途
US20200291089A1 (en) 2017-02-16 2020-09-17 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules comprising a trimeric ligand and uses thereof
EP3589662A4 (en) 2017-02-28 2020-12-30 Harpoon Therapeutics, Inc. INDUCTIBLE MONOVALENT ANTIGEN BINDING PROTEIN
SG11201907867TA (en) * 2017-02-28 2019-09-27 Bristol Myers Squibb Co Use of anti-ctla-4 antibodies with enhanced adcc to enhance immune response to a vaccine
CN113201071A (zh) * 2017-03-28 2021-08-03 礼进生物医药科技（上海）有限公司 用于增强肿瘤微环境中免疫应答的治疗剂和方法
US20200270359A1 (en) 2017-03-31 2020-08-27 Genmab Holding B.V. Bispecific anti-cd37 antibodies, monoclonal anti-cd37 antibodies and methods of use thereof
US11471537B2 (en) 2017-04-05 2022-10-18 Novo Nordisk A/S Oligomer extended insulin-Fc conjugates
CA3063359A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 Harpoon Therapeutics, Inc. Mesothelin binding proteins
US20210246227A1 (en) 2017-05-31 2021-08-12 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific molecules that bind to myeloproliferative leukemia (mpl) protein and uses thereof
JP2020522543A (ja) 2017-06-07 2020-07-30 ゲンマブ ビー．ブイ． 変異ＩｇＧ六量体に基づく治療用抗体
WO2019035938A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Elstar Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC MOLECULES BINDING TO BCMA AND USES THEREOF
US11883503B2 (en) 2017-09-25 2024-01-30 Dingfu Biotarget Co., Ltd. Methods and compositions for cancer treatment
KR102425983B1 (ko) 2017-10-13 2022-07-29 하푼 테라퓨틱스, 인크. 삼중특이적 단백질 및 사용 방법
IL315737A (en) 2017-10-13 2024-11-01 Harpoon Therapeutics Inc B-cell maturation antigen-binding proteins
EP3737692A4 (en) 2018-01-09 2021-09-29 Elstar Therapeutics, Inc. CALRETICULIN AND MODIFIED T-LYMPHOCYTES BINDING CONSTRUCTIONS FOR THE TREATMENT OF DISEASES
EP3743440A1 (en) * 2018-01-24 2020-12-02 Genmab B.V. Polypeptide variants and uses thereof
JP2018138022A (ja) * 2018-02-23 2018-09-06 ゲンマブ ビー．ブイ． ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域変異体およびその使用
WO2019178362A1 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
WO2019178364A2 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules and uses thereof
MA52485A (fr) 2018-05-03 2021-03-10 Genmab Bv Combinaisons de variants d'anticorps et utilisations associées
BR112020023330A2 (pt) 2018-05-14 2021-04-20 Harpoon Therapeutics, Inc. porção de ligação para ativação condicional de moléculas de imunoglobulina
SG11202012405WA (en) 2018-06-14 2021-01-28 Bioatla Inc Multi-specific antibody constructs
JP7513530B2 (ja) * 2018-06-22 2024-07-09 ジェンマブ ホールディング ビー．ブイ． 抗ｃｄ３７抗体および抗ｃｄ２０抗体、組成物、ならびにそれらの使用方法
CN112513074A (zh) 2018-06-22 2021-03-16 健玛保 生产两种或更多种不同抗体的受控混合物的方法
WO2020002592A1 (en) 2018-06-29 2020-01-02 Stichting Het Nederlands Kanker Instituut - Antoni Van Leeuwenhoek Ziekenhuis Traf2 inhibitors for use in the treatment of a cancer
CN112955465A (zh) 2018-07-03 2021-06-11 马伦戈治疗公司 抗tcr抗体分子及其用途
MA53122A (fr) * 2018-07-13 2021-05-19 Genmab As Variants d'anticorps cd38 et leurs utilisations
WO2020012038A1 (en) 2018-07-13 2020-01-16 Genmab A/S Trogocytosis-mediated therapy using cd38 antibodies
WO2020022262A1 (en) * 2018-07-23 2020-01-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Target cell specific cytosol-penetrating antigen-binding molecules
US12195544B2 (en) 2018-09-21 2025-01-14 Harpoon Therapeutics, Inc. EGFR binding proteins and methods of use
US20210355219A1 (en) * 2018-09-21 2021-11-18 Harpoon Therapeutics, Inc. Conditionally activated target-binding molecules
EP3856771A4 (en) 2018-09-25 2022-06-29 Harpoon Therapeutics, Inc. Dll3 binding proteins and methods of use
TW202028467A (zh) * 2018-09-28 2020-08-01 日商協和麒麟股份有限公司 抗體組合物
JP7785284B2 (ja) * 2018-11-16 2025-12-15 ヴァーチュオウソウ ビンコ，インク． Ｃｄ３８抗体とｉｃａｍ１抗体およびそれらの使用
TWI874341B (zh) 2018-12-18 2025-03-01 美商健生生物科技公司 產生異二聚體抗體之方法
MX2021007680A (es) * 2018-12-27 2021-10-13 Kindred Biosciences Inc Variantes de igg fc para uso veterinario.
CA3131014A1 (en) 2019-02-21 2020-08-27 Andreas Loew Anti-tcr antibody molecules and uses thereof
CN114127113A (zh) 2019-02-21 2022-03-01 马伦戈治疗公司 与钙网蛋白结合的多功能分子及其用途
CA3130628A1 (en) 2019-02-21 2020-08-27 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to t cells and uses thereof to treat autoimmune disorders
CN114026122B (zh) 2019-02-21 2024-12-31 马伦戈治疗公司 结合t细胞相关癌细胞的多功能分子及其用途
WO2020172605A1 (en) 2019-02-21 2020-08-27 Elstar Therapeutics, Inc. Antibody molecules that bind to nkp30 and uses thereof
WO2020225456A1 (en) 2019-05-09 2020-11-12 Genmab B.V. Dosage regimens for a combination of anti-dr5 antibodies for use in treating cancer
KR20220008866A (ko) 2019-05-14 2022-01-21 하푼 테라퓨틱스, 인크. EpCAM 결합 단백질 및 사용 방법
GB201910900D0 (en) 2019-07-31 2019-09-11 Scancell Ltd Modified fc-regions to enhance functional affinity of antibodies and antigen binding fragments thereof
US20220411529A1 (en) 2019-11-06 2022-12-29 Genmab B.V. Antibody variant combinations and uses thereof
EP4072683A1 (en) 2019-12-09 2022-10-19 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Antibodies targeting cell surface deposited complement protein c3d and use thereof
CN113121677B (zh) * 2019-12-31 2023-06-27 周易 一种得到高纯度异源抗体的方法
EP4084821A4 (en) 2020-01-03 2024-04-24 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to cd33 and uses thereof
EP4084823A4 (en) 2020-01-03 2024-05-15 Marengo Therapeutics, Inc. ANTI-TCR ANTIBODY MOLECULES AND THEIR USES
BR112022013553A2 (pt) 2020-01-16 2022-09-06 Genmab As Composição farmacêutica, anticorpo, e, método para tratar uma doença
CN114945597A (zh) * 2020-01-17 2022-08-26 艾提欧生物疗法有限公司 降低脱靶毒性的前抗体
KR20220144841A (ko) 2020-02-21 2022-10-27 하푼 테라퓨틱스, 인크. Flt3 결합 단백질 및 사용 방법
KR20230028242A (ko) 2020-04-24 2023-02-28 마렝고 테라퓨틱스, 인크. T 세포 관련 암 세포에 결합하는 다중기능성 분자 및 그것의 용도
CN115461078A (zh) * 2020-05-11 2022-12-09 神州细胞工程有限公司 通过与改变的Fc片段形成融合蛋白增强蛋白/肽抗原免疫原性的方法
JP7048665B2 (ja) * 2020-05-22 2022-04-05 ゲンマブ ビー．ブイ． ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域変異体およびその使用
WO2022000136A1 (en) * 2020-06-28 2022-01-06 Dingfu Biotarget Co., Ltd. Methods and compositions for cancer treatment
US20230293680A1 (en) 2020-07-23 2023-09-21 Genmab B.V. A composition of anti-dr5 antibodies and an immunomodulatory imide drug for use in treating multiple myeloma
WO2022047046A1 (en) 2020-08-26 2022-03-03 Marengo Therapeutics, Inc. Methods of detecting trbc1 or trbc2
CN116249718A (zh) 2020-08-26 2023-06-09 马伦戈治疗公司 结合至钙网蛋白的多功能性分子及其用途
CA3190766A1 (en) 2020-08-26 2022-03-03 Marengo Therapeutics, Inc. Antibody molecules that bind to nkp30 and uses thereof
CA3193914A1 (en) 2020-10-02 2022-04-07 Louise KOOPMAN Antibodies capable of binding to ror2 and bispecific antibodies binding to ror2 and cd3
US20220275090A1 (en) 2021-02-22 2022-09-01 Janssen Biotech, Inc. Combination Therapies with Anti-CD38 Antibodies and PARP or Adenosine Receptor Inhibitors
WO2022216993A2 (en) 2021-04-08 2022-10-13 Marengo Therapeutics, Inc. Multifuntional molecules binding to tcr and uses thereof
CN115572331A (zh) * 2021-07-06 2023-01-06 联邦生物科技(珠海横琴)有限公司 一种具有增强FcRn受体结合的突变子
CA3225254A1 (en) 2021-07-13 2023-01-19 BioNTech SE Multispecific binding agents against cd40 and cd137 in combination therapy for cancer
AU2022338208A1 (en) 2021-09-06 2024-03-21 Genmab A/S Antibodies capable of binding to cd27, variants thereof and uses thereof
IL311771A (en) 2021-10-06 2024-05-01 BioNTech SE Multispecific binding agents against pd-l1 and cd137 in combination
CA3237175A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 Janssen Biotech, Inc. Corticosteriod reduction in treatment with anti-cd38 antibodies
WO2023218051A1 (en) 2022-05-12 2023-11-16 Genmab A/S Binding agents capable of binding to cd27 in combination therapy
AU2023269545A1 (en) 2022-05-12 2024-11-14 BioNTech SE Binding agents capable of binding to cd27 in combination therapy
WO2023217987A1 (en) 2022-05-12 2023-11-16 BioNTech SE Monoclonal antibodies directed against programmed death-1 protein and their use in medicine
KR20250021337A (ko) * 2022-06-01 2025-02-12 율리우스-막시밀리안스 우니버지태트 뷔르츠부르크 FcγR-비의존성 활성을 갖는 항체-기반 가용성 및 막-결합된 TWEAK 모방 효능제
CN117430710B (zh) * 2022-07-21 2025-07-04 中国医学科学院医药生物技术研究所 一种针对Trop2的单克隆抗体及其应用
WO2024094660A1 (en) 2022-10-31 2024-05-10 Genmab A/S Cd38 antibodies and uses thereof
EP4626479A1 (en) * 2022-12-02 2025-10-08 Lytica Therapeutics, Inc. Compositions and methods for protein internalization
WO2024209072A1 (en) 2023-04-06 2024-10-10 Genmab A/S Multispecific binding agents against pd-l1 and cd137 for treating cancer
CN121285385A (zh) 2023-05-12 2026-01-06 金麦安博股份有限公司 能够与ox40结合的抗体、其变体及其用途
TW202540189A (zh) 2023-11-30 2025-10-16 德商生物新技術公司 在組合療法中能夠結合ｏｘ４０之抗體
US20250296989A1 (en) 2024-03-20 2025-09-25 The United States Of America,As Represented By The Secretary,Department Of Health And Human Services ANTIBODIES TARGETING CELL SURFACE DEPOSITED COMPLEMENT PROTEIN C3d AND USE THEREOF
WO2025221933A1 (en) * 2024-04-17 2025-10-23 Vial Health Technology Inc. Antibodies and polypeptides comprising variant fc regions
WO2025228542A1 (en) 2024-05-03 2025-11-06 Genmab B.V. Method for co-expression of a plurality of antibodies
EP4644413A1 (en) 2024-05-03 2025-11-05 Genmab B.V. Binding agents having altered fc-mediated effector functions
WO2026011013A1 (en) 2024-07-02 2026-01-08 Epibiologics, Inc. Binding agents and uses thereof

Family Cites Families (118)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS5896026A (ja) 1981-10-30 1983-06-07 Nippon Chemiphar Co Ltd 新規ウロキナ−ゼ誘導体およびその製造法ならびにそれを含有する血栓溶解剤
US4609546A (en) 1982-06-24 1986-09-02 Japan Chemical Research Co., Ltd. Long-acting composition
US4681581A (en) 1983-12-05 1987-07-21 Coates Fredrica V Adjustable size diaper and folding method therefor
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US5101827A (en) 1985-07-05 1992-04-07 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US4735210A (en) 1985-07-05 1988-04-05 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US5776093A (en) 1985-07-05 1998-07-07 Immunomedics, Inc. Method for imaging and treating organs and tissues
US5648471A (en) 1987-12-03 1997-07-15 Centocor, Inc. One vial method for labeling antibodies with Technetium-99m
US5843708A (en) * 1988-01-05 1998-12-01 Ciba-Geigy Corporation Chimeric antibodies
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
WO1991001754A1 (en) 1989-08-09 1991-02-21 Rhodes Buck A Direct radiolabeling of antibodies and other proteins with technetium or rhenium
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
JP2938569B2 (ja) 1990-08-29 1999-08-23 ジェンファーム インターナショナル，インコーポレイティド 異種免疫グロブリンを作る方法及びトランスジェニックマウス
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
AU2235992A (en) 1991-06-14 1993-01-12 Genpharm International, Inc. Transgenic immunodeficient non-human animals
DE69224906T2 (de) 1991-07-08 1998-10-29 Univ Massachusetts Thermotropes flüssig-kristallines segment-blockcopolymer
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
CA2161351C (en) 1993-04-26 2010-12-21 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
US5663149A (en) 1994-12-13 1997-09-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide heterocyclic and halophenyl amides
IL132560A0 (en) 1997-05-02 2001-03-19 Genentech Inc A method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
ATE375365T1 (de) 1998-04-02 2007-10-15 Genentech Inc Antikörper varianten und fragmente davon
PT1071700E (pt) 1998-04-20 2010-04-23 Glycart Biotechnology Ag Modificação por glicosilação de anticorpos para melhorar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos
EP1141024B1 (en) * 1999-01-15 2018-08-08 Genentech, Inc. POLYPEPTIDE COMPRISING A VARIANT HUMAN IgG1 Fc REGION
US6737056B1 (en) * 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
ES2601882T5 (es) 1999-04-09 2021-06-07 Kyowa Kirin Co Ltd Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional
AU6375000A (en) 1999-07-29 2001-02-19 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies to her2/neu
ATE354655T1 (de) 1999-08-24 2007-03-15 Medarex Inc Humane antikörper gegen ctla-4 und deren verwendungen
CA2388245C (en) 1999-10-19 2012-01-10 Tatsuya Ogawa The use of serum-free adapted rat cells for producing heterologous polypeptides
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
JPWO2002030954A1 (ja) 2000-10-06 2004-02-19 協和醗酵工業株式会社 抗体を精製する方法
HU231090B1 (hu) 2000-10-06 2020-07-28 Kyowa Kirin Co., Ltd. Antitest-kompozíciót termelő sejt
EP1916303B1 (en) 2000-11-30 2013-02-27 Medarex, Inc. Nucleic acids encoding rearranged human immunoglobulin sequences from transgenic transchromosomal mice
EP1355919B1 (en) 2000-12-12 2010-11-24 MedImmune, LLC Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
EP1243276A1 (en) 2001-03-23 2002-09-25 Franciscus Marinus Hendrikus De Groot Elongated and multiple spacers containing activatible prodrugs
US7129261B2 (en) 2001-05-31 2006-10-31 Medarex, Inc. Cytotoxic agents
CN100497389C (zh) 2001-06-13 2009-06-10 根马布股份公司 表皮生长因子受体(egfr)的人单克隆抗体
US7595378B2 (en) 2001-06-13 2009-09-29 Genmab A/S Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor (EGFR)
HUP0600342A3 (en) 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
US20040132101A1 (en) * 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
AU2003217912A1 (en) * 2002-03-01 2003-09-16 Xencor Antibody optimization
CA2872136C (en) 2002-07-18 2017-06-20 Merus B.V. Recombinant production of mixtures of antibodies
EP2353611B1 (en) 2002-07-31 2015-05-13 Seattle Genetics, Inc. Drug conjugates and their use for treating cancer, an autoimmune disease or an infectious disease
NZ568769A (en) 2002-10-17 2010-04-30 Genmab As Human monoclonal antibodies against CD20
AU2003282624A1 (en) 2002-11-14 2004-06-03 Syntarga B.V. Prodrugs built as multiple self-elimination-release spacers
ES2401136T3 (es) 2002-11-15 2013-04-17 Genmab A/S Anticuerpos monoclonales humanos contra CD25
JP4739763B2 (ja) 2002-12-16 2011-08-03 ゲンマブ エー／エス インターロイキン８（ｉｌ−８）に対するヒトモノクローナル抗体
PT2489364E (pt) 2003-11-06 2015-04-16 Seattle Genetics Inc Compostos de monometilvalina conjugados com anticorpos
CA2545603A1 (en) * 2003-11-12 2005-05-26 Biogen Idec Ma Inc. Neonatal fc receptor (fcrn)-binding polypeptide variants, dimeric fc binding proteins and methods related thereto
CN101124245A (zh) * 2003-11-12 2008-02-13 比奥根艾迪克Ma公司 新生儿Fc受体(FcRn)-结合多肽变体、二聚体Fc结合蛋白及其相关方法
BRPI0506771A (pt) * 2004-01-12 2007-05-22 Applied Molecular Evolution anticorpo, e, composição farmacêutica
JP5848861B2 (ja) 2004-04-20 2016-01-27 ジェンマブ エー／エスＧｅｎｍａｂ Ａ／Ｓ Ｃｄ２０に対するヒトモノクローナル抗体
JP5055603B2 (ja) * 2004-08-04 2012-10-24 メントリック・バイオテック・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー 変異Ｆｃ領域
AU2005304624B2 (en) 2004-11-12 2010-10-07 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US7741568B2 (en) 2005-01-13 2010-06-22 The Wiremold Company Downward facing receptacle assembly for cable raceway
JP5225069B2 (ja) 2005-03-23 2013-07-03 ゲンマブ エー／エス 多発性骨髄腫の治療のためのｃｄ３８に対する抗体
US20100104564A1 (en) 2005-03-29 2010-04-29 Genevieve Hansen Altered Antibody Fc Regions and Uses Thereof
WO2006106905A1 (ja) 2005-03-31 2006-10-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 会合制御によるポリペプチド製造方法
WO2008157379A2 (en) 2007-06-21 2008-12-24 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
MX2007013924A (es) 2005-05-09 2008-01-28 Glycart Biotechnology Ag Moleculas que unen antigeno que tienen regiones fc modificadas y union alterada a receptores fc.
CA2614181A1 (en) 2005-07-01 2007-01-11 Medimmune, Inc. An integrated approach for generating multidomain protein therapeutics
US8158590B2 (en) 2005-08-05 2012-04-17 Syntarga B.V. Triazole-containing releasable linkers, conjugates thereof, and methods of preparation
US7612181B2 (en) * 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
WO2007059782A1 (en) 2005-11-28 2007-05-31 Genmab A/S Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof
MX2008009956A (es) 2006-02-02 2008-12-12 Syntarga Bv Analogos de cc-1065 solubles en agua y sus conjugados.
NZ591252A (en) 2006-03-17 2012-06-29 Biogen Idec Inc Methods of designing antibody or antigen binding fragments thereof with substituted non-covarying amino acids
PT1999154E (pt) 2006-03-24 2013-01-24 Merck Patent Gmbh Domínios proteicos heterodiméricos modificados
AT503902B1 (de) 2006-07-05 2008-06-15 F Star Biotech Forsch & Entw Verfahren zur manipulation von immunglobulinen
WO2008090958A1 (ja) 2007-01-24 2008-07-31 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. ドメイン交換された遺伝子組換え抗体組成物
EP2087111A2 (en) 2007-03-19 2009-08-12 Medimmune Limited Polypeptide variants
MX2009010282A (es) 2007-03-29 2009-10-12 Genmab As Anticuerpos biespecificos y metodos para su produccion.
US20110077383A1 (en) 2007-07-03 2011-03-31 Medimmune, Llc Hinge domain engineering
ES2433379T3 (es) 2007-08-01 2013-12-10 Syntarga B.V. Análogos de CC-1065 sustituidos y sus conjugados
EP3255144A1 (en) 2007-08-10 2017-12-13 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Recombineering construct for preparing transgenic mice capable of producing human immunoglobulin
SI2235064T1 (sl) 2008-01-07 2016-04-29 Amgen Inc. Metoda za izdelavo heterodimernih molekul - protitelesa fc z uporabo elektrostatičnih usmerjevalnih učinkov
DE102008039957A1 (de) 2008-08-27 2010-03-04 Continental Automotive Gmbh Verfahren zur Ermittlung eines Unfallschwerekriteriums mittels eines Beschleunigungssignals und eines Körperschallsignals
JP5397668B2 (ja) 2008-09-02 2014-01-22 ソニー株式会社 記憶素子および記憶装置
CN110317272A (zh) 2008-10-14 2019-10-11 霍夫曼-拉罗奇有限公司 免疫球蛋白变体及其用途
US8889868B2 (en) 2008-11-03 2014-11-18 Syntarga Bv CC-1065 analogs and their conjugates
UA109633C2 (uk) 2008-12-09 2015-09-25 Антитіло людини проти тканинного фактора
KR20110104032A (ko) 2008-12-19 2011-09-21 마크로제닉스, 인크. 공유결합형 디아바디 및 이의 용도
EP2233500A1 (en) * 2009-03-20 2010-09-29 LFB Biotechnologies Optimized Fc variants
WO2010129304A2 (en) 2009-04-27 2010-11-11 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules
CA2766220C (en) 2009-06-26 2021-02-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Readily isolated bispecific antibodies with native immunoglobulin format
WO2011028952A1 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
EP3778917A3 (en) 2009-12-04 2021-06-09 F. Hoffmann-La Roche AG Multispecific antibodies, antibody analogs, compositions, and methods
WO2011091078A2 (en) 2010-01-19 2011-07-28 Xencor, Inc. Antibody fc variants with enhanced complement activity
CA3254586A1 (en) 2010-03-10 2025-11-29 Genmab A/S Monoclonal anti bodi es against c-met
TWI426920B (zh) 2010-03-26 2014-02-21 Hoffmann La Roche 雙專一性、雙價抗－ｖｅｇｆ／抗－ａｎｇ－２抗體
ES2989108T3 (es) 2010-04-20 2024-11-25 Genmab As Proteínas que contienen FC de anticuerpos heterodiméricos y métodos para producir las mismas
US9527926B2 (en) 2010-05-14 2016-12-27 Rinat Neuroscience Corp. Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
CA2800769C (en) 2010-05-27 2021-11-02 Genmab A/S Monoclonal antibodies against her2 epitope
CA2800785C (en) 2010-05-27 2019-09-24 Genmab A/S Monoclonal antibodies against her2
CA2802782C (en) 2010-06-15 2018-03-13 Genmab A/S Human antibody drug conjugates against tissue factor
KR101612999B1 (ko) 2010-08-24 2016-04-15 로슈 글리카트 아게 활성화가능 이중특이적 항체
EP2609111B1 (en) 2010-08-24 2017-11-01 F. Hoffmann-La Roche AG Bispecific antibodies comprising a disulfide stabilized-fv fragment
AU2011325833C1 (en) 2010-11-05 2017-07-13 Zymeworks Bc Inc. Stable heterodimeric antibody design with mutations in the Fc domain
CA2830254C (en) * 2011-03-16 2019-09-10 Amgen Inc. Fc variants
CN102250246A (zh) 2011-06-10 2011-11-23 常州亚当生物技术有限公司 抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体及其应用
UA117901C2 (uk) * 2011-07-06 2018-10-25 Ґенмаб Б.В. Спосіб посилення ефекторної функції вихідного поліпептиду, його варіанти та їх застосування
ES2758979T3 (es) 2012-07-06 2020-05-07 Genmab Bv Proteína dimérica con mutaciones triples
BR112015000167B1 (pt) 2012-07-06 2021-11-23 Genmab B.V. Proteína dimérica, proteína, composição, kit de partes e seus usos, bem como método para aumentar a oligomerização em solução de uma proteína dimérica compreendendo um primeiro e segundo polipeptídeo, cada um compreendendo pelo menos as regiões ch2 e ch3 de uma cadeia pesada de igg1 humana e proteína dimérica variante
EA201500741A1 (ru) * 2013-01-10 2016-01-29 Генмаб Б.В. ВАРИАНТЫ Fc-ОБЛАСТИ IGG1 ЧЕЛОВЕКА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
SG11201803956UA (en) 2015-12-01 2018-06-28 Genmab Bv Anti-dr5 antibodies and methods of use thereof
WO2018083126A1 (en) 2016-11-01 2018-05-11 Genmab B.V. Polypeptide variants and uses thereof
CN110945021B (zh) 2017-02-10 2025-09-12 根马布私人有限公司 多肽变体及其用途
US20200270359A1 (en) * 2017-03-31 2020-08-27 Genmab Holding B.V. Bispecific anti-cd37 antibodies, monoclonal anti-cd37 antibodies and methods of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
JP2024116396A (ja) 2024-08-27
MX357944B (es) 2018-07-31
WO2013004842A3 (en) 2013-04-04
WO2013004842A2 (en) 2013-01-10
BR112014000264A2 (pt) 2017-02-14
KR102163669B1 (ko) 2020-10-12
JP6586442B2 (ja) 2019-10-02
PL2729170T3 (pl) 2022-04-11
AU2022200869A1 (en) 2022-03-03
US20250223374A1 (en) 2025-07-10
US10759867B2 (en) 2020-09-01
EA201400108A1 (ru) 2014-05-30
AU2012280222B2 (en) 2017-09-14
UA117901C2 (uk) 2018-10-25
ZA201309499B (en) 2017-09-27
IN2014CN00807A (sr) 2015-04-03
UA128600C2 (uk) 2024-08-28
JP6243330B2 (ja) 2017-12-06
CN104220093B (zh) 2020-06-16
SI2729170T1 (sl) 2022-10-28
US20250043018A1 (en) 2025-02-06
CN106084039B (zh) 2020-09-11
AU2012280222B8 (en) 2017-12-07
AU2025204452A1 (en) 2025-09-04
EP2729170A2 (en) 2014-05-14
CN112239496B (zh) 2024-11-29
SG10201605572TA (en) 2016-09-29
KR20220158849A (ko) 2022-12-01
US12049512B2 (en) 2024-07-30
PT2729170T (pt) 2022-03-21
CN119954941A (zh) 2025-05-09
CA2840147A1 (en) 2013-01-10
ES2908876T3 (es) 2022-05-04
JP2014520788A (ja) 2014-08-25
US20210163619A1 (en) 2021-06-03
US20140242075A1 (en) 2014-08-28
CN104220093A (zh) 2014-12-17
CN106084039A (zh) 2016-11-09
NZ812025A (en) 2026-01-30
CN112239496A (zh) 2021-01-19
AU2017272140B2 (en) 2019-09-26
EP3970746A2 (en) 2022-03-23
DK2729170T3 (en) 2022-03-21
JP2018035140A (ja) 2018-03-08
AU2019283809A1 (en) 2020-01-16
KR20140146040A (ko) 2014-12-24
AU2017272140A1 (en) 2017-12-21
EP2729170B1 (en) 2021-12-15
AU2012280222A8 (en) 2017-12-07
EP3970746A3 (en) 2022-08-03
AU2012280222A1 (en) 2014-01-23
MX2013014961A (es) 2014-08-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20250223374A1 (en) Antibody variants and uses thereof
US20250145720A1 (en) Human igg1 fc region variants and uses thereof
JP7509716B2 (ja) 抗体変異体およびその使用
HK40074883A (en) Polypeptide variants and uses thereof
HK40116842A (en) Human igg1 fc region variants and uses thereof
HK1197885B (en) Antibody variants and uses thereof
HK1217719B (en) Human igg1 fc region variants and uses thereof
BR122022020571B1 (pt) Método para aumentar a citotoxicidade dependente de complemento