[go: up one dir, main page]

RS63980B1 - Metode i sastavi za selektivnu regulaciju ekspresije proteina - Google Patents

Metode i sastavi za selektivnu regulaciju ekspresije proteina

Info

Publication number
RS63980B1
RS63980B1 RS20230123A RSP20230123A RS63980B1 RS 63980 B1 RS63980 B1 RS 63980B1 RS 20230123 A RS20230123 A RS 20230123A RS P20230123 A RSP20230123 A RS P20230123A RS 63980 B1 RS63980 B1 RS 63980B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
mts
seq
sirna
plant
glyphosate
Prior art date
Application number
RS20230123A
Other languages
English (en)
Inventor
Jintai Huang
Youlin Qi
Heping Yang
Yuanji Zhang
Original Assignee
Monsanto Technology Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Monsanto Technology Llc filed Critical Monsanto Technology Llc
Publication of RS63980B1 publication Critical patent/RS63980B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/02—Methods or apparatus for hybridisation; Artificial pollination ; Fertility
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/12—Processes for modifying agronomic input traits, e.g. crop yield
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H3/00—Processes for modifying phenotypes, e.g. symbiosis with bacteria
    • A01H3/04—Processes for modifying phenotypes, e.g. symbiosis with bacteria by treatment with chemicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/823—Reproductive tissue-specific promoters
    • C12N15/8231—Male-specific, e.g. anther, tapetum, pollen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C12N15/8275—Glyphosate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
    • C12N15/8289—Male sterility
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C12N9/1092—3-Phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase (2.5.1.19), i.e. 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
    • C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
    • C12Y205/01019—3-Phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase (2.5.1.19), i.e. 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Dentistry (AREA)

Description

Opis
SТАNJЕ ТЕHNIKЕ
Oblast pronalaska
[0001] Pronalazak se generalno odnosi na oblasti poljoprivrede, oplemenjivanja biljaka i molekularne biologije. Preciznije, pronalazak se odnosi na metode i sastave za selektivnu regulaciju ekspresije proteina u muškom reproduktivnom tkivu transgenih biljaka i njihovu upotrebu.
Opis tehničkog problema
[0002] Hibridno seme se proizvodi hibridizacijom ili unakrsnom oplodnjom srodnih biljaka i može se uzgajati u potomstvo hibridnih biljaka koje poseduju poželjnu kombinaciju osobina koje ne poseduje nijedna roditeljska biljka. Hibridne biljke mogu pokazati superiorne agronomske karakteristike kao što su poboljšanje veličine biljke, prinosa, nutritivnog sastava, otpornosti na bolesti, tolerancije na herbicide, tolerancije na stres, klimatske adaptacije i druge poželjne osobine. Efikasna proizvodnja hibridnog semena zahteva da sopstvenom polenu biljke ne bude dozvoljeno da sam oplodi biljku. Glavno ograničenje u proizvodnji hibridnog semena za mnoge useve je nedostatak jednostavnih, pouzdanih i ekonomičnih metoda dobijanja muški-sterilnih biljaka i nesposobnih za samooplodnju.
[0003] U proizvodnji hibridnog semena, proizvodnja polena i oslobađanje polena mogu se sprečiti u ženskoj roditeljskoj biljci kako bi se olakšalo unakrsno oprašivanje ženke, a ne samooprašivanje. Takva prevencija se može postići, na primer, ručnim uklanjanjem struktura koje sadrže polen (na primer, ručnim ili mehaničkim odvajanjem kod kukuruza), upotrebom genetskih sredstava za kontrolu oprašivanja (na primer, korišćenjem citoplazmatske muškisterilne ili nuklearne muški-sterilne tehnologije), upotrebom hemijskog agensa ili bilo koje kombinacije ovih. To može biti radno intenzivan i stoga skup proces. Kod kukuruza, na primer, detaširanje se obično vrši u dva koraka: mašinsko detaširanje praćeno ručnim detaširanjem. Komercijalna proizvodnja hibridnog semena korišćenjem isključivo hemijskih gametocida je ograničena prvenstveno njihovim opštim nedostatkom selektivnosti za gamete i njihovim efektom na druge delove biljke. Stoga su metode za poboljšanje efikasnosti proizvodnje hibridnog semena veoma poželjne.
KRATAK REZIME PRONALASKA
[0004] Pronalazak je naveden u priloženim patentnim zahtevima.
[0005] Ostala specifična otelotvorenja pronalaska obelodanjena su u sledećem detaljnom opisu. U celoj ovoj specifikaciji i patentnim zahtevima, osim ako kontekst ne zahteva drugačije, reč „obuhvatati“ i njene varijacije, kao što su „obuhvata“ i „obuhvatajući“, podrazumevaće se da znači uključivanje navedenog celog broja, elementa ili koraka ili grupe celih brojeva, elemenata ili koraka, ali ne i isključivanje bilo kog drugog celog broja, elementa ili koraka ili grupe celih brojeva, elemenata ili koraka.
KRАТАK ОPIS CRТЕŽА
[0006]
Slika 1. Ilustracija razvojnih faza metlice V7 pri T2, V8/V9 pri T4, V10/V11 pri T5, V12 pri T6, i VT pri T7 sa prikazom veličine metlice i morfologije sa donjim panel fotografijama poprečnih preseka prašnica koje prikazuju razvojnu fazu polena.
Prethodne faze (V10/V11 i V12) koje se koriste u struci za izolovanje malih RNK molekula za identifikaciju mts-siRNK molekula označene su okvirom sa punom linijom; faze (V7, V8/V9, V10/V11 i V12) opisane ovde za izolovanje malih RNK molekula označene su okvirom sa isprekidanom linijom.
Slika 2. Grafički prikaz poravnanja mts-siRNK sekvenci na cDNK sekvenci datoj kao SEQ ID NO: 17. Sekvenca cDNK je naznačena od nukleotida 1 do 1826, a kratke linije predstavljaju poravnanje komplementarnog lanca pojedinačnih mts-siRNK sekvenci, ili segmenata susednih mts-siRNK sekvenci ili preklapajućih mts-siRNK sekvenci (relativno duže linije) sa cDNK sekvencom. Sekvence mts-siRNK koje su isto lančane kao cDNK nisu prikazane. Normalizovani relativni nivo ekspresije mtssiRNK je naznačen na levoj strani. Uokvirena površina predstavlja region cDNK sekvence bogate mts-siRNK ciljevima.
Slika 3. Dijagram koji ilustruje dvolančanu mts-siRNK, jednolančanu mts-siRNK, mts-siRNK ciljnu sekvencu unutar mRNK, i region mRNK sa velikim brojem mtssiRNK ciljnih sekvenci upotrebivih kao mts-siRNK ciljni element.
Slika 4. Fotografija metlice i polena R0 kukuruza obojene Alexander bojom iz dvostruko kopiranih transgenih biljaka koje sadrže rekombinantni DNK molekul koji sadrži transgen koji kodira protein EPSPS tolerantan na glifosat, a koji je operabilno povezan sa ciljnim elementom mts-siRNK (SEQ ID NO: 2). Slučajevi od 1 do 4 su poprskani sa 0,75 lb ae/acre glifosat herbicidom pri V5, praćeno V8 fazom i pokazali su metlice sa potpunom muškom sterilnošću kako je definisano bez anteze i bilo nevijabilnih polenovih zrna ili bez polenovih zrna detektovanih u prašnicama.
Kontrolne biljke nisu dobile nanošenje glifosata i pokazale su normalnu antezu i oslobađanje polena, a mikroskopsko posmatranje otkrilo je normalna zrnca polena.
KRATAK OPIS SEKVENCI
[0007] SEQ ID NO: 1 - Sekvenca mts-siRNK ciljnog elementa koja ima 95% identičnosti sekvence sa pozicijama 1429 do 1628 nukleotida cDNK sekvence navedene u ovom dokumentu kao SEQ ID NO: 17.
[0008] SEQ ID NO: 2 - Sekvenca ciljnog elementa mts-siRNK koja ima 95% identičnosti sekvence sa pozicijama 1429 do 1628 nukleotida cDNK sekvence koja je ovde data kao SEQ ID NO: 17 i ima jednu promenu nukleotida (T69A) u odnosu na SEQ ID NO: 1.
[0009] SEQ ID NO: 3 - Sekvenca mts-siRNK ciljnog elementa koja odgovara pozicijama 239 do 433 nukleotida cDNK sekvence navedene u ovom dokumentu kao SEQ ID NO: 18.
[0010] SEQ ID NO: 4 - Sekvenca ciljnog elementa mts-siRNK koja odgovara pozicijama 477 do 697 nukleotida cDNK sekvence navedene u ovom dokumentu kao SEQ ID NO: 18.
[0011] SEQ ID NO: 5 - Sekvenca mts-siRNK ciljnog elementa koja odgovara pozicijama 239 do 433 nukleotida cDNK sekvence navedene u ovom dokumentu kao SEQ ID NO: 19.
[0012] SEQ ID NO: 6 - Sekvenca mts-siRNK ciljnog elementa koja odgovara pozicijama 370 do 477 nukleotida cDNK sekvence navedene u ovom dokumentu kao SEQ ID NO: 19.
[0013] SEQ ID NO: 7 - Sekvenca mts-siRNK ciljnog elementa koja odgovara pozicijama 1357 do 1562 nukleotida cDNK sekvence navedene u ovom dokumentu kao SEQ ID NO: 20.
[0014] SEQ ID NO: 8 - Sekvenca mts-siRNK ciljnog elementa koja odgovara pozicijama 247 do 441 nukleotida cDNK sekvence navedene u ovom dokumentu kao SEQ ID NO: 21.
[0015] SEQ ID NO: 9 - Reverzni komplement sekvence mts-siRNK ciljnog elementa koja ima 99% identičnosti sa pozicijama 191 do 490 nukleotida cDNK sekvence navedene u ovom dokumentu kao SEQ ID NO: 22 sa tri nepodudarnosti nukleotida (C314A, A350G i G408A).
[0016] SEQ ID NO: 10-16 - Sekvence rekombinantnog mts-siRNK ciljnog elementa.
[0017] SEQ ID NO: 17 - cDNK sekvenca koja sadrži najmanje jedan region bogat ciljnom sekvencom mts-siRNK. Sadrži sekvence mts-siRNK ciljnog elementa predstavljene putem SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2 i poravnava se sa mts-siRNK sekvencama SEQ ID NO: 23-31.
[0018] SEQ ID NO: 18 - cDNK sekvenca koja sadrži najmanje jedan region bogat mtssiRNK ciljnom sekvencom. Sadrži sekvence mts-siRNK ciljnog elementa predstavljene putem SEQ ID NO: 3 i SEQ ID NO: 4 i poravnava se sa sekvencama mts-siRNK SEQ ID NO: 32-42.
[0019] SEQ ID NO: 19 - cDNK sekvenca koja sadrži najmanje jedan region bogat mtssiRNK ciljnom sekvencom. Sadrži sekvence mts-siRNK ciljnih elemenata predstavljene putem SEQ ID NO: 5 i SEQ ID NO: 6 i poravnava se sa sekvencama mts-siRNK SEQ ID NO: 43-52.
[0020] SEQ ID NO: 20 - cDNK sekvenca koja sadrži najmanje jedan region bogat mtssiRNK ciljnom sekvencom. Sadrži sekvencu mts-siRNK ciljnog elementa predstavljenu putem SEQ ID NO: 7 i poravnava se sa sekvencama mts-siRNK SEQ ID NO: 53-60.
[0021] SEQ ID NO: 21 - cDNK sekvenca koja sadrži najmanje jedan region bogat mtssiRNK ciljnom sekvencom. Sadrži sekvencu mts-siRNK ciljnog elementa predstavljenu putem SEQ ID NO: 8 i poravnava se sa sekvencama mts-siRNK SEQ ID NO: 61-69.
[0022] SEQ ID NO: 22 - cDNK sekvenca koja sadrži najmanje jedan region bogat mtssiRNK ciljnom sekvencom. Sadrži sekvencu mts-siRNK ciljnog elementa predstavljenu putem SEQ ID NO: 9 i poravnava se sa sekvencama mts-siRNK SEQ ID NO: 70-87.
[0023] SEQ ID NO: 23-92 - DNK sekvence koje odgovaraju mts-siRNK sekvencama pronalaska, koje se poravnavaju sa cDNK sekvencama koje su ovde navedene kao SEQ ID NO: 17-22.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0024] Pronalazak pruža rekombinantni DNK molekul koji uključuje ciljni element male interferirajuće RNK specifičan za muško tkivo (mts-siRNK) koji se sastoji od SEQ ID NO: 1 ili 2 ili komplemenata operabilno povezanih sa heterolognim transkribabilnim polinukleotidom. Takvi rekombinantni DNK molekuli su korisni za selektivnu regulaciju ekspresije heterolognog transkribabilnog polinukleotida u muškom reproduktivnom tkivu transgene biljke. Sekvence nukleinskih kiselina mogu biti date kao DNK ili kao RNK, kao što je navedeno; obelodanjivanje jedne nužno definiše drugu, kao što je poznato prosečnom stručnjaku u ovoj oblasti. Nadalje, obelodanjivanje date sekvence nukleinske kiseline nužno definiše i uključuje komplement te sekvence, kao što je poznato prosečnom stručnjaku u ovoj oblasti.
[0025] Mala interferirajuća RNK (siRNK) je klasa RNK molekula dužine oko 18-26 nukleotida (nt) (na primer, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ili 26 nt). siRNK sekvenca može biti predstavljena korišćenjem RNK nukleotidne sekvence koja se sastoji od gvanina (G), citozina (C), adenina (A) i uracila (U) ili korišćenjem ekvivalentne DNK nukleotidne sekvence gvanina (G), citozina (C), adenina (A) i timina (T). siRNK funkcije unutar RNK-indukovanih kompleksa za utišavanje (RISC) da se aktivira degradacija informacione RNK (iRNK) specifična za sekvencu, što dovodi do poremećaja ekspresije gena i negativne regulacije proteina kodiranog genom.
[0026] "siRNK specifična za muško tkivo" ili "mts-siRNK" je siRNK obogaćena ili specifično eksprimirana u muškom reproduktivnom tkivu(ima) (na primer, muškom cvatu) biljke, tako da ima šemu ekspresije specifičnu za muško tkivo. siRNK specifična za muško tkivo je identifikovana u biljkama i može se detektovati korišćenjem tehnika koje su poznate u struci, kao što je analiza Northern blot male molekulske mase. "mts-siRNK sekvenca" je sekvenca nukleinske kiseline mts-siRNK. Egzemplarne mts-siRNK sekvence u obliku odgovarajuće DNK sekvence dvolančanog mts-siRNK molekula su ovde date kao SEQ ID NO: 23-92.
[0027] DNK sekvenca koja je komplementarna mts-siRNK sekvenci se ovde naziva "mtssiRNK cilj". Mts-siRNK cilj je sadržan u DNK sekvenci gena i transkribuje se u RNK sekvencu odgovarajućeg mRNK molekula. Jedan lanac dvolančanog mts-siRNK molekula se zatim može vezati ili hibridizovati pod tipičnim fiziološkim uslovima za mts-siRNK cilj u mRNK molekulu. Vidi Sliku 3. Sekvenca nukleinske kiseline je komplementarna sekvenci mts-siRNK ako poravnanje dve sekvence nukleinske kiseline proizvodi tačnu podudarnost (bez nepodudarnosti, tj. potpunog komplementa), jednu nepodudarnost, dve nepodudarnosti ili tri nepodudarnosti po dužini sekvence mts-siRNK. Komplementarne sekvence mogu da se uparuju međusobno u skladu sa standardnim Watson-Crick pravilima komplementarnosti (odnosno, gvanin parovi sa citozinom (G:C) i adenin parovi sa timinom (A:T) ili uracilom (A:U). "mts-siRNK ciljna sekvenca" je sekvenca nukleinske kiseline mts-siRNK cilja.
Egzemplarne mts-siRNK ciljne sekvence su ovde date kao SEQ ID NO: 23-92.
[0028] Više od jednog mts-siRNK cilja može se grupisati zajedno ili čak preklapati unutar jednog DNK molekula. Molekul DNK koji se sastoji od više od jednog mts-siRNK cilja se ovde naziva "mts-siRNK ciljni element". Ciljni element mts-siRNK sastoji se od najmanje dva ili više mts-siRNK ciljeva u okviru prozora sekvence od 500 nukleotida. Ciljni element mts-siRNK može biti bilo koje dužine, kao što je oko 30 nukleotida (nt), oko 40 nt, oko 50 nt, oko 60 nt, oko 70 nt, oko 80 nt, oko 90 nt, oko 100 nt, oko 150 nt, oko 200 nt, oko 250 nt, oko 300 nt, oko 350 nt, oko 400 nt, oko 450 nt ili oko 500 nt. "Sekvenca mts-siRNK ciljnog elementa" je sekvenca nukleinske kiseline mts-siRNK. Egzemplarne sekvence mts-siRNK ciljnog elementa su ovde date kao SEQ ID NO: 1-16.
[0029] Kao što se ovde koristi, "rekombinantni" DNK molekul, polipeptid, protein, ćelija ili organizam može biti ljudska ili kreacija koja se ne pojavljuje u prirodi koristeći alate genetskog inženjeringa i kao takav je proizvod ljudske aktivnosti i inače se ne bi normalno javljao u prirodi. "Rekombinantni DNK molekul" se odnosi na DNK molekul koji se sastoji od kombinacije DNK sekvenci ili molekula koji se ne bi prirodno pojavili zajedno bez ljudske intervencije. Na primer, rekombinantni DNK molekul može biti DNK molekul koji se sastoji od najmanje dva međusobno heterologna DNK molekula, DNK molekul koji se sastoji od DNK sekvence koja odstupa od DNK sekvenci koje postoje u prirodi, ili DNK molekul koji je integrisan u DNK ćelije domaćina putem genetske transformacije. U jednom otelotvorenju, rekombinantni DNK molekul pronalaska je DNK molekul koji se sastoji od mts-siRNK ciljnog elementa operabilno povezanog sa najmanje jednim transkribabilnim polinukleotidnim molekulom, na primer, gde je transkribabilni molekul polinukleotida heterologan sa mts-siRNK ciljnim elementom. Kao što se ovde koristi, "rekombinantni" molekul ili ćelija ili organizam mogu se odnositi na veštački.
[0030] Kao što se ovde koristi, termin "heterologni" se odnosi na kombinaciju dva ili više DNK molekula ili proteina kada se takva kombinacija obično ne nalazi u prirodi ili kada je takva kombinacija pružena u orijentaciji ili redosledu koji se razlikuje od onog koji se nalazi u prirodi. Na primer, dva DNK molekula mogu biti izvedena iz različitih vrsta ili stvorena sintetički i/ili dva DNK molekula mogu biti izvedena iz različitih gena, npr., različitih gena iz iste vrste ili istih gena iz različitih vrsta. U jednom primeru, regulatorni element ili mtssiRNK ciljni element može biti heterologan u pogledu operabilno povezanog transkribabilnog polinukleotidnog molekula ako se takva kombinacija obično ne nalazi u
prirodi, odnosno, transkribabilni molekul polinukleotida se prirodno ne javlja operabilno povezan sa regulatornim elementom ili mts-siRNK ciljnim elementom. Takva heterologna kombinacija može da sadrži mts-siRNK ciljni element koji može biti izveden iz biljke ili hemijski sintetisan i može biti operabilno povezan sa transkribabilnim molekulom polinukleotida, kao što je bakterijski transgen koji kodira protein za toleranciju herbicida, kao što je cp4-EPSPS (na primer, kao što je ovde dato kao SEQ ID NO:93). Pored toga, određena sekvenca može biti "heterologna" u odnosu na ćeliju ili organizam u koji se unosi (na primer, sekvenca koja se prirodno ne javlja u toj određenoj ćeliji ili organizmu).
[0031] Kao što se ovde koristi, termin "izolovan" znači odvojen od drugih molekula koji su obično asocirani sa njim u njegovom prirodnom stanju. Na primer, izolovani DNK molekul je onaj koji je prisutan sam ili u kombinaciji sa drugim sastavima, ali nije u svom prirodnom genomskom položaju ili stanju. Termin "izolovani" se može odnositi na DNK molekul koji je separisan iz nukleinskih kiselina koje normalno okružuju DNK molekul u njegovom prirodnom stanju. Na primer, izolovani DNK molekul može biti DNK molekul koji se sastoji od najmanje dva međusobno heterologna DNK molekula. U drugom primeru, izolovani DNK molekul može biti DNK molekul koji je inkorporiran u novu genomsku lokaciju u ćeliji domaćinu putem genetske transformacije. Dakle, DNK molekul fuzionisan ili operabilno povezan sa jednim ili više drugih DNK molekula sa kojima ne bi bio asociran u prirodi, na primer kao rezultat rekombinantne DNK ili tehnika transformacije biljaka, smatra se izolovanim ovde. Takvi molekuli se smatraju izolovanim čak i kada su integrisani u hromozom ćelije domaćina ili prisutni u rastvoru nukleinske kiseline sa drugim molekulima DNK.
[0032] Termin "operabilno povezan" odnosi se na najmanje dva molekula nukleotida raspoređenih ili povezanih na način tako da jedan može da utiče na funkciju drugog. Dva molekula nukleotida mogu biti deo jednog dodirnog molekula nukleotida i mogu biti susedni ili razdvojeni. Na primer, mts-siRNK ciljni element može biti operabilno povezan sa transkribabilnim polinukleotidnim molekulom. Operabilno povezani mts-siRNK molekul može uticati na transkripciju, translaciju ili ekspresiju transkribabilnog polinukleotidnog molekula. Na primer, mts-siRNK ciljni element je operabilno povezan sa transkribabilnim polinukleotidnim molekulom ako, nakon transkripcije u ćeliji muškog reproduktivnog tkiva, prisustvo mts-siRNK ciljnog elementa u mRNK molekulu dovodi do regulacije ekspresije transkribabilnog polinukleotidnog molekula u ćeliji, indukovane endogenim mts-siRNK i RISC putem. Operabilna povezanost ciljnog elementa mts-siRNK i transkribabilnog molekula polinukleotida može se postići, na primer, kroz ugradnju mts-siRNK ciljnog elementa pored transkribabilnog molekula polinukleotida (kao što je locirano 5' ili 3' u odnosu na transkribabilni polinukleotidni molekul, ali ne nužno u dodirnom povezivanju), u ili pored netransliranog regiona (UTR) molekula polinukleotida (kao što se nalazi u ili pored 5' UTR ili 3' UTR), i/ili 3' u odnosu na transkribabilni polinukleotidni molekul i 5' u odnosu na signal poliadenilacije. mts-siRNK ciljni element može se nalaziti između transkribabilnog molekula polinukleotida i sekvence poliadenilacije, to je 3' u odnosu na i pored transkribabilnog molekula polinukleotida. mts-siRNK ciljni element se može locirati između zaustavnog kodona transkribabilnog polinukleotidnog molekula i sekvence poliadenilacije. Ciljni element mts-siRNK može se nalaziti unutar 3' UTR sekvence pored transkribabilnog polinukleotidnog molekula.
[0033] Ovde su navedeni primeri identifikacije mts-siRNK, mts-siRNK ciljeva i mts-siRNK ciljnih elemenata i mogu se identifikovati metodama koje su poznate stručnjacima u ovoj oblasti, na primer bioinformatičkom analizom biljnih sRNK i cDNK biblioteka. Konkretno, mts-siRNK se može identifikovati iz sRNK biblioteka i sekvencirati. Identifikovane mtssiRNK sekvence mogu se uporediti sa kolekcijama cDNK i/ili genomskih sekvenci kako bi se identifikovali mts-siRNK ciljevi i mts-siRNK ciljni elementi koji su korisni za razvoj rekombinantnih DNK molekula i konstrukata kao što je ovde opisano.
[0034] mts-siRNK ciljni elementi se mogu kreirati, sintetizovati ili modifikovati in vitro. Na primer, mts-siRNK ciljni elementi mogu biti modifikovani tako da sadrže više, manje ili različite mts-siRNK ciljne sekvence ili da preurede relativni položaj jedne ili više mts-siRNK ciljnih sekvenci. Takva modifikacija može biti korisna u povećanju ili smanjenju efekta ciljnog elementa mts-siRNK. Metode za kreiranje, sintezu ili in vitro modifikaciju mtssiRNK ciljnog elementa i za određivanje optimalne varijacije za željeni nivo regulacije poznate su stručnjacima u ovoj oblasti. Egzemplarni rekombinantni mts-siRNK ciljni elementi mogu se kreirati kombinovanjem DNK sekvenci, ili njihovih fragmenata, od dva ili više mts-siRNK cilja, dva ili više mts-siRNK ciljnih elemenata, dva ili više cDNK regiona bogatih mts-siRNK ciljem, ili jednog ili više mts-siRNK ciljeva i fragmenata dva ili više cDNK regiona bogatih mts-siRNK ciljem, kao što je kombinovanjem svih ili fragmenata od dva ili više mts-siRNK ciljnih elemenata koji su ovde navedeni kao SEQ ID NO: 1-9, kombinovanjem dve ili više mts-siRNK sekvenci koje su ovde navedene kao SEQ ID NO: 23-92, ili kombinovanjem svih ili fragmenata dva ili više mts-siRNK ciljnih elemenata koji su ovde navedeni kao SEQ ID NO: 1-9 sa jednom ili više mts-siRNK sekvenci koje su ovde navedene kao SEQ ID NO: 23-92. Takvi egzemplarni rekombinantni mts-siRNK ciljni elementi su ovde navedeni kao SEQ ID NO: 10-16.
[0035] DNK sekvenca mts-siRNK ciljnog elementa takođe može biti promenjena uključivanjem 1-3 nukleotidnih nepodudarnosti u mts-siRNK ciljnu sekvencu (u odnosu na datu mts-siRNK sekvencu). Rekombinantni DNK molekuli ili mts-siRNK ciljni elementi koji imaju najmanje oko 80% (procenata) identičnosti sekvence, oko 85% identičnosti sekvence, oko 90% identičnosti sekvence, oko 91% identičnosti sekvence, oko 92% identičnosti sekvence, oko 93% identičnosti sekvence, oko 94% identičnosti sekvence, oko 95% identičnosti sekvence, oko 96% identičnosti sekvence, oko 97% identičnosti sekvence, oko 98% identičnosti sekvence i oko 99% identičnosti sekvence sa bilo kojim od DNK molekula, mts-siRNK ciljni elementi (kao što su SEQ ID NO: 1-9), rekombinantni mts-siRNK ciljni elementi (kao što su SEQ ID NO: 10-16), ili cDNK sekvence (kao što su SEQ ID NO: 17-22) su ovde opisani.
1
[0036] Takođe su opisani fragmenti ovde opisanog DNK molekula. Takvi fragmenti mogu biti korisni kao mts-siRNK ciljni elementi ili se mogu kombinovati sa drugim mts-siRNK ciljnim elementima, mt-siRNK sekvencama ili njihovim fragmentima za izgradnju rekombinantnih mts-siRNK ciljnih elemenata, kao što je gore opisano. U specifičnim otelotvorenjima, takvi fragmenti mogu sadržati najmanje oko 20, najmanje oko 30, najmanje oko 40, najmanje oko 50, najmanje oko 60, najmanje oko 70, najmanje oko 80, najmanje oko 90, najmanje oko 100, najmanje oko 110, najmanje oko 120, najmanje oko 130, najmanje oko 140, najmanje oko 150, najmanje oko 160, najmanje oko 170, najmanje oko 180, najmanje oko 190, najmanje oko 200, najmanje oko 210, najmanje oko 220, najmanje oko 230, najmanje oko 240, najmanje oko 250, najmanje oko 260, najmanje oko 270, najmanje oko 280, najmanje oko 290, najmanje oko 300, najmanje oko 350, najmanje oko 400, najmanje oko 450, najmanje oko 500 dodirnih nukleotida, ili duže, DNK molekula ovde opisanog, kao što je mts-siRNK ciljni element ili cDNK sekvenca kao opisana ovde. Metode za proizvodnju takvih fragmenata iz početnog DNK molekula su dobro poznate u struci.
[0037] Efikasnost modifikacija, duplikacija, delecija ili preuređenja opisanih ovde na željenim aspektima ekspresije određenog transkribabilnog polinukleotidnog molekula može se empirijski testirati u stabilnim i prolaznim testovima biljke, kao što su oni opisani u radnim primerima ovde, kako bi se validirali rezultati koji mogu varirati u zavisnosti od napravljenih promena i cilja promene u početnom molekulu DNK.
[0038] mts-siRNK cilj i mts-siRNK ciljni element mogu funkcionisati u bilo kom smeru, što znači da nisu usmereni, i kao takvi mogu se koristiti ili u 5' do 3' orijentaciji ili u 3' do 5' orijentaciji u rekombinantnom DNK molekulu ili DNK konstruktu.
[0039] Kao što se ovde koristi, "ekspresija transkribabilnog molekula polinukleotida" ili "ekspresija proteina" odnosi se na proizvodnju proteina iz transkribabilnog molekula polinukleotida i rezultirajućeg transkripta (mRNK) u ćeliji. Termin "ekspresija proteina" se stoga odnosi na bilo koju šemu translacije transkribovanog molekula RNK u molekul proteina. Ekspresija proteina može biti karakterisana njegovim vremenskim, prostornim, razvojnim ili morfološkim kvalitetima, kao i kvantitativnim ili kvalitativnim indikacijama. Rekombinantni DNK molekuli pronalaska mogu se koristiti za selektivnu regulaciju ekspresije proteina ili transkribabilnog polinukleotidnog molekula u muškim reproduktivnim tkivima transgene biljke.
[0040] Ekspresija rekombinantnog DNK molekula u transgenoj biljci može dovesti do ekspresije operabilno povezanog transkribabilnog molekula polinukleotida u najmanje vegetativnim tkivima ali ne i u muškim reproduktivnim tkivima. Regulacija ekspresije proteina može se odnositi na suzbijanje ili smanjenje; na primer, suzbijanje ili smanjenje nivoa proteina proizvedenog u ćeliji, na primer kroz regulaciju post-transkripcionog gena posredovanu sa RNKi.
[0041] Selektivna regulacija ekspresije proteina kako se ovde koristi odnosi se na smanjenje proizvodnje proteina u ćeliji ili tkivu u poređenju sa referentnom ćelijom ili tkivom za najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 99% ili 100% smanjenja (tj. potpunog smanjenja). Referentna ćelija ili tkivo može biti, na primer, vegetativna ćelija ili tkivo iz iste ili slične transgene biljke koja eksprimira protein ili ćeliju ili tkivo iz transgene biljke koja ima sličan transgen koji kodira protein, ali nema operabilno povezan mts-siRNK ciljni element. Regulacija ekspresije proteina može se odrediti korišćenjem bilo koje tehnike poznate stručnjaku u ovoj oblasti, kao što je direktno merenje akumuliranja proteina u uzorku ćelije ili tkiva koristeći tehniku kao što je ELISA ili analiza Western blot, merenjem enzimske aktivnosti proteina ili fenotipskim određivanjem ekspresije proteina. Selektivna regulacija ekspresije proteina može se odnositi na dovoljno smanjenje ekspresije proteina koji može dati toleranciju herbicida u muškom tkivu transgene biljke kako bi se dobio detektabilni fenotip izmenjene muške plodnosti u transgenoj biljci na koju je herbicid primenjen kao sprej za indukovanu sterilnost. Detektovanje izmenjene muške fertilnosti u takvoj transgenoj biljci bi stoga ukazalo na selektivnu regulaciju ekspresije proteina.
[0042] Kao što se ovde koristi, termin "transgen koji kodira rekombinantni protein" ili "transkribabilni polinukleotidni molekul" odnosi se na bilo koji molekul nukleotida koji se može transkribovati u molekul RNK, uključujući, ali ne ograničavajući se na, one koji imaju nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptidnu sekvencu. U zavisnosti od uslova, nukleotidna sekvenca može ili ne mora biti translirana u polipeptidni molekul u ćeliji. Granice transgena ili transkribabilnog polinukleotidnog molekula su obično definisane start kodonom translacije na 5'-terminusu i kodonom za zaustavljanje translacije na 3'-terminusu.
[0043] Termin "transgen" se odnosi na DNK molekul veštački inkorporiran u genom organizma ili ćelije domaćina, u tekućoj ili bilo kojoj prethodnoj generaciji organizma ili ćelije, kao rezultat ljudske intervencije, kao što su metode transformacije biljaka. Kao što se ovde koristi, pojam „transgeni“ znači da obuhvata transgen, na primer „transgena biljka“ se odnosi na biljku koja sadrži transgen u svom genomu, a „transgeno svojstvo“ se odnosi na karakteristiku ili fenotip koji je prenet ili dodeljen prisustvom transgena inkorporiranog u genom biljke. Kao rezultat takve genomske promene, transgena biljka je nešto što se izrazito razlikuje od srodne divlje biljke, a transgeno svojstvo je osobina koja se prirodno ne nalazi u divljoj biljci. Transgene biljke pronalaska sadrže molekul rekombinantne DNK koji pruža pronalazak.
[0044] Transgen ili transkribabilni molekul polinukleotida iz pronalaska uključuje, ali nije ograničen na, transgen ili transkribabilni polinukleotidni molekul koji pruža poželjnu karakteristiku povezanu sa morfologijom biljke, fiziologijom, rastom, razvojem, prinosom, nutritivnim svojstvima, otpornošću na bolesti, otpornošću na štetočine, tolerancijom na herbicide, tolerancijom na stres, tolerancijom na stres u životnoj sredini ili hemijskom tolerancijom. U jednom otelotvorenju, transkribabilni polinukleotidni molekul pronalaska kodira protein koji, kada je eksprimiran u transgenoj biljci, daje toleranciju na herbicide bar u ćeliji i/ili tkivu u kome se eksprimirani protein javlja; selektivna regulacija proteina tolerancije na herbicide u muškom reproduktivnom tkivu transgene biljke u vezi sa blagovremenom primenom herbicida dovodi do bar smanjenog muškog fertiliteta ili indukovane muške sterilnosti.
[0045] Takva inducibilna muška sterilnost u kombinaciji sa vegetativnom tolerancijom na herbicide može se koristiti za povećanje efikasnosti sa kojom se proizvodi hibridno seme, na primer eliminacijom ili smanjenjem potrebe za fizičkom emaskulacijom biljke kukuruza koja se koristi kao ženka u datom hibridu tokom proizvodnje hibridnog semena. Opisani su sistemi muške sterilnosti koji se mogu indukovati herbicidom, na primer u SAD patentu br.
6,762,344; SAD patentu br.8,618,358; i SAD patent publikaciji 2013/0007908. Primeri herbicida korisnih u praktikovanju pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na, inhibitore acetil koenzim A karboksilaze (ACCaze) (na primer, fops i dims), inhibitore acetolaktat sintaze (ALS) (na primer, sulfoniluree (SU) i imidazolinona (IMI)), inhibitore fotosistema II (PSII) (na primer, triazine i fenil etre), inhibitore protoporfirinogen oksidaze (PPO) (na primer, flumioksazin i fomesafen), inhibitore 4-hidroksifenil piruvat-dioksigenaze (HPPD)
1
(na primer, izoksaflutol i triketoni kao što je mezotrion), inhibitori 5-enolipiruvil šikimat 3-fosfat sintaze (EPSPS) (na primer, glifosat), inhibitore glutamin sintetaze (GS) (npr., glufosinat i fosfinotricin), sintetičke oksine (npr., 2,4-D i dikamba). Primeri transgena ili transkribabilnih polinukleotidnih molekula za upotrebu u praktikovanju pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na gene koji kodiraju proteine koji pospešuju toleranciju na HPPD inhibitore (kao što je herbicid-nesenzitivni HPPD), gene koji kodiraju proteine koji daju toleranciju na glufosinat (kao što su pat i bar), gene koji kodiraju proteine kojima se daje tolerancija na glifosat (kao što je glifosat-tolerantni EPSPS, kao što je cp4-epsps, naveden ovde kao SEQ ID NO: 93), i gene koji kodiraju proteine koji daju toleranciju na sintetički oksin kao što je dikamba (kao što je dikamba monooksigenaza (DMO)) i 2,4-D (kao što je (R)-dihlorprop dioksigenaza gen (rdpA)).
[0046] Rekombinantni DNK konstrukti pronalaska mogu uključivati rekombinantne DNK molekule pronalaska i napravljeni su tehnikama poznatim u struci i u različitim otelotvorenjima su uključeni u vektore transformacije biljaka, plazmide ili plastid DNK. Takvi rekombinantni DNK konstrukti su korisni za proizvodnju transgenih biljaka i/ili ćelija i kao takvi se takođe mogu nalaziti u genomskoj DNK transgene biljke, semena, ćelije ili biljnog dela. Ovaj pronalazak stoga uključuje otelotvorenja u kojima je rekombinantni DNK konstrukt lociran u vektoru transformacije biljke, ili na biolističkoj čestici za transformaciju biljne ćelije, ili u hromozomu ili plastidu transgene biljne ćelije, ili u transgenoj ćeliji, transgenom biljnom tkivu, transgenom biljnom semenu, transgenom zrnu polena, ili transgenoj ili delimično transgenoj (na primer, presađenoj) biljci. Vektor je bilo koji DNK molekul koji se može koristiti u svrhu transformacije biljaka, tj. uvođenja DNK u ćeliju. Rekombinantni DNK konstrukti pronalaska mogu se, na primer, insertovati u vektor transformacije biljaka i koristiti za transformaciju biljaka za proizvodnju transgenih biljaka, semena i ćelija. Metode za konstruisanje vektora transformacije biljaka dobro su poznate u struci. Vektori transformacije biljke pronalaska generalno uključuju, ali nisu ograničeni na: pogodan promotor za ekspresiju operabilno povezane DNK, operabilno povezanog rekombinantnog DNK konstrukta i poliadenilacionog signala (koji može biti uključen u 3'UTR sekvencu). Promotori korisni u praktikovanju ovog pronalaska uključuju one koji funkcionišu u biljci za ekspresiju operabilno povezanog polinukleotida. Takvi promotori su raznovrsni i dobro poznati u struci i uključuju one koji su inducibilni, virusni, sintetički, konstitutivni, vremenski regulisani, prostorno regulisani i/ili prostorno-vremenski regulisani. Dodatne opcione komponente uključuju, ali nisu ograničene na, jedan ili više sledećih ciljeva: 5' UTR, pojačivač, cis-delujući cilj, intron, signalnu sekvencu, tranzitnu peptidnu sekvencu i jedan ili više selektivnih marker gena. U jednom otelotvorenju, vektor transformacije biljke sadrži rekombinantni DNK konstrukt.
[0047] Rekombinantni DNK konstrukti i vektori transformacije biljaka ovog pronalaska napravljeni su bilo kojom metodom pogodnom za predviđenu primenu, uzimajući u obzir, na primer, poželjni tip ekspresije, poželjne transgene ili transkribabilne polinukleotidne molekule, kao i pogodnost upotrebe u biljci u kojoj rekombinantni DNK konstrukt treba da se eksprimira. Opšte metode korisne za manipulaciju DNK molekula za izradu i korišćenje rekombinantnih DNK konstrukata i vektora transformacije biljaka su dobro poznate u struci i detaljno opisane u, na primer, laboratorijskim priručnicima, uključujući priručnik: Michael R. Green and Joseph Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (Fourth Edition) ISBN: 978-1-936113-42-2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (2012).
[0048] Molekuli rekombinantne DNK i konstrukti pronalaska mogu se modifikovati metodama poznatim u struci, bilo potpuno ili delimično, na primer, radi veće pogodnosti manipulacije DNK (kao što su mesta za prepoznavanje restriktivnih enzima ili mesta za kloniranje na bazi rekombinacije), ili za uključivanje biljnih preferencijalnih sekvenci (kao što su upotreba biljnog kodona ili Kozak konsenzus sekvence), ili za uključivanje sekvenci korisnih za rekombinantni DNK molekul i dizajn konstrukta (kao što su razdvajačke ili linker sekvence). U određenim otelotvorenjima, DNK sekvenca rekombinantnog DNK molekula i konstrukta uključuje DNK sekvencu koja je optimizovana kodonom za biljku u kojoj se rekombinantni DNK molekul ili konstrukt treba eksprimirati. Na primer, rekombinantni DNK molekul ili konstrukt koji treba da bude eksprimiran u biljci može imati sve ili delove svoje sekvence optimizovane kodonom za ekspresiju u biljci metodama poznatim u struci. Rekombinantni DNK molekuli ili konstrukti pronalaska mogu se složiti sa drugim rekombinantnim DNK molekulima ili transgenim slučajevima za prenošenje dodatnih osobina (na primer, u slučaju transformisanih biljaka, osobine uključujući otpornost na herbicide, otpornost na štetočine, toleranciju na hladno klijanje, toleranciju na deficit vode) na primer, ekspresijom ili regulacijom drugih gena.
[0049] Jedan vid pronalaska uključuje transgene biljne ćelije, transgena biljna tkiva i transgene biljke ili semena koja uključuju rekombinantni DNK molekul pronalaska. Dalji vid pronalaska uključuje veštačke ili rekombinantne biljne hromozome koji uključuju
1
rekombinantni DNK molekul pronalaska. Pogodne metode za transformaciju biljnih ćelija domaćina za upotrebu sa sadašnjim pronalaskom obuhvataju praktično svaku metodu kojom se DNK može uvesti u ćeliju (na primer, gde je rekombinantni DNK molekul stabilno integrisan u biljni hromozom) i dobro su poznati u struci. Egzemplarna i široko korišćena metoda za uvođenje rekombinantnog DNK konstrukta u biljke je Agrobacterium transformation sistem, koja je dobro poznata stručnjacima u ovoj oblasti. Još jedna egzemplarna metoda za uvođenje rekombinantnog DNK molekula u biljke je insercija rekombinantnog DNK molekula u biljni genom na unapred određenom mestu metodama mesto-usmerene integracije. Mesto-usmerena integracija može se postići bilo kojom metodom poznatom u struci, na primer, korišćenjem cinkov prst nukleaze, projektovanih ili nativnih meganukleaza, TALE-endonukleaza ili RNK-vođene endonukleaze (na primer CRISPR/Cas9 sistem). Transgene biljke se mogu regenerisati iz transformisane biljne ćelije metodama biljne ćelijske kulture. Transgena biljka homozigotna u odnosu na transgen može se dobiti polnim razmnožavanjem (samooprašivanje) nezavisne segregantne transgene biljke koja sadrži jednu egzogenu gen sekvencu za sebe, na primer R0 ili F0 biljku, za proizvodnju R1 ili F1 semena. Četvrtina proizvedenog semena R1 ili F1 će biti homozigotna u odnosu na transgen. Biljke uzgajane iz klijavog semena R1 ili F1 mogu se testirati na heterozigotnost, obično koristeći SNP test ili test termičke amplifikacije koji omogućava razlikovanje između heterozigota i homozigota (tj., test zigotnosti)
[0050] Pronalazak pruža transgenu biljku koja u svom genomu ima molekul rekombinantne DNK pronalaska, uključujući, bez ograničenja, lucerku, pamuk, kukuruz, repicu, pirinač, soju i pšenicu, između ostalog. Pronalazak takođe obezbeđuje transgene biljne ćelije, biljne delove i potomstvo takve transgene biljke. Kao što se ovde koristi "potomstvo" uključuje bilo koju biljku, seme, biljnu ćeliju i/ili biljni deo proizveden od ili regenerisan od biljke, semena, biljne ćelije i/ili biljnog dela koji uključuje rekombinantni DNK molekul pronalaska.
Transgene biljke, ćelije, delovi, biljke potomci i seme proizvedeno iz takvih biljaka mogu biti homozigotne ili heterozigotne za rekombinantni DNK molekul pronalaska. Biljni delovi ovog pronalaska mogu uključivati, ali nisu ograničeni na, lišće, stabljike, korenje, seme, endospermu, jajnu ćeliju i polen. Biljni delovi pronalaska mogu biti vijabilni, nevijabilni, regenerabilni ili neregenerabilni. Pronalazak takođe uključuje i obezbeđuje transformisane biljne ćelije koje se sastoje od DNK molekula pronalaska. Transformisane ili transgene biljne ćelije pronalaska uključuju regenerabilne i neregenerabilne biljne ćelije.
1
[0051] Takođe opisana je metoda indukovanja muškog steriliteta u transgenenoj biljci koja se sastoji od (a) uzgajanja transgene biljke koja se sastoji od rekombinantnog DNK molekula koji se sastoji od heterolognog transkribabilnog molekula polinukleotida koji daje toleranciju na herbicid, koji je operabilno povezan sa ciljnim elementom mts-siRNK koji se sastoji od SEQ ID NO: 1 ili 2 ili komplementa i (b) primene efikasne količine herbicida na transgenu biljku kako bi se indukovala muška sterilnost. Efikasna količina herbicida je količina dovoljna da transgenu biljku koja sadrži rekombinantni DNK molekul pronalaska učini muški sterilnom. U jednom otelotvorenju, efikasna količina glifosata je oko 0,125 funti kiselinskog ekvivalenta po akru do oko 8 funti kiselinskog ekvivalenta po akru. Nanošenje herbicida se može primeniti pre ili tokom razvoja muškog reproduktivnog tkiva, kao što je u fazi odabranoj iz grupe koja se sastoji od V4, V5, V6, V7, V8, V9, V10, V11, V12, V13 i V14 faze razvoja biljaka kukuruza i može sprečiti najmanje razvoj polena, oslobađanja polena ili ekstruziju prašnice.
[0052] U jednom otelotvorenju, sprečavanje razvoja polena, oslobađanje polena ili ekstruzija prašnice može biti rezultat muškog steriliteta i samim tim odsustvo razvoja polena, oslobađanje polena ili ekstruzija prašnice može biti pokazatelj muškog steriliteta. Međutim, u nekim slučajevima, muške sterilne biljke i dalje mogu razviti male količine polena. Stoga, kod određenih otelotvorenja, prisustvo male količine polena ne ukazuje nužno na muške fertilne biljke ili na nedostatak muškog steriliteta.
[0053] Razvoj biljaka se često određuje pomoću skale faza koja je zasnovana na razvoju biljaka. Za kukuruz, uobičajena skala razvoja biljaka koja se koristi u struci poznata je kao V-faze. V-faze su definisane prema najgornjem listu u kome je lisni prelom vidljiv. VE odgovara pojavi, V1 odgovara prvom listu, V2 odgovara drugom listu, V3 odgovara trećem listu, V(n) odgovara n-tom listu. VT se javlja kada je vidljiva poslednja grana metlice, ali pre nego što se pojavi svila. Prilikom faziranja polja kukuruza, svaka specifična V-faza se definiše samo kada je 50% ili više biljaka u toj fazi ili iza nje. Druge razvojne skale poznate stručnjacima u ovoj oblasti mogu se koristiti sa metodama pronalaska.
[0054] Još jedan uobičajeni alat za predviđanje i procenu faza rasta i razvoja kukuruza su Jedinice stepena rasta (Growing Degree Units - GDU). Faktor rasta i razvoja kukuruza je toplota. Toplota se obično meri u jednom trenutku i izražava se kao temperatura, ali se takođe može meriti tokom određenog vremenskog perioda i izražavati kao toplotne jedinice. Ove
1
toplotne jedinice se obično nazivaju GDU. GDU se može definisati kao razlika između prosečne dnevne temperature i izabrane osnovne temperature koja podleže određenim ograničenjima. GDU se izračunavaju korišćenjem sledeće jednačine: Jedinica stepena rasta = { (H L ) / 2 } - B gde je H dnevna visoka (ali ne više od 86°F), L je dnevna niska temperatura (ali ne niže od 50° F), a B je osnova od 50°F. Pošto je rast kukuruza neznatan kada su temperature više od 86° F ili niže od 50° F, granice se postavljaju na dnevne visoke i niske temperature koje se koriste u formuli. Donji prekid dnevne temperature takođe sprečava izračunavanje negativnih vrednosti. Stoga, ako dnevna visoka temperatura prelazi 86° F, dnevna visoka temperatura koja se koristi u GDU formuli bila bi postavljena na 86° F.
Nasuprot tome, ako dnevna niska temperatura padne ispod 50° F, dnevna niska temperatura koja se koristi u GDU formuli bila bi postavljena na 50° F. Ako dnevna visoka temperatura ne prelazi 50° F, onda nije zabeležen nijedan GDU za taj dan. Maksimalni GDU koji biljka kukuruza može akumulirati u jednom danu je 36, minimum je nula. Ocena zrelosti biljke kukuruza identifikuje se zbirom dnevnih vrednosti GDU tokom određenog vremenskog perioda. Vremenski period koji većina proizvođača semena kukuruza koristi je od tačke sadnje do fiziološke zrelosti ili tačke u kojoj je nalivanje zrna praktično završeno. U većini američkih država, na primer, akumulirani GDU se čuvaju za većinu geografskih područja i dostupni su u USDA službi za izveštavanje o usevima (USDA Crop Reporting Service) ili Državnoj savetodavnoj službi (State Extension Services). Pored toga, instrument za dobijanje GDU informacija na određenoj lokaciji takođe je opisan u SAD patentu br.6.967.656.
[0055] Druga metoda predviđanja razvoja metlice za određivanje vremena primene herbicida koji indukuje muška sterilnost opisana je u SAD patentu br.8.618.358.
[0056] Herbicidi za upotrebu sa pronalaskom uključuju bilo koji herbicid, uključujući one koji su aktivni protiv acetil koenzim A karboksilaze (ACCaza), inhibitore acetolaktat sintaze (ALS), inhibitore fotosistema II (PSII), inhibitore protoporfirinogen oksidaze (PPO), inhibitore 4-hidroksifenil piruvat dioksigenaze (HPPD), inhibitore 5-enolipiruvil šikimat 3-fosfat sintetaze (EPSPS), inhibitore glutamin sintetaze (GS) i sintetičke oksine. Herbicidi su dobro poznati u struci i opisani su, na primer, u "Modern Crop Protection Compounds, Volumes 1 (Second Edition), edited by Wolfgang Krämer, Ulrich Schirmer, Peter Jeschke, Matthias Witschel, ISBN: 9783527329656, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Germany (2012). U jednom otelotvorenju, herbicid je glifosat.
1
[0057] Hibridno seme se može proizvesti korišćenjem metode koja obuhvata (a) primenu herbicida na transgenu biljku, uključujući molekul rekombinantne DNK koji uključuje heterologni transkribabilni molekul polinukleotida koji daje toleranciju na herbicid u skladu sa pronalaskom, pri čemu se primena herbicida izvodi tokom razvoja muškog reproduktivnog tkiva transgene biljke, čime se indukuje muška sterilnost u transgenoj biljci; (b) oplodnju transgene biljke polenom iz druge biljke; i (c) žetvu hibridnog semena iz transgene biljke. U jednom otelotvorenju, transgena biljka je kukuruz. U jednom otelotvorenju, herbicid je glifosat, a protein kodiran heterolognim transkribabilnim polinukleotidnim molekulom je EPSPS tolerantan na glifosat. U jednom otelotvorenju, glifosat se primenjuje tokom razvoja u efikasnoj količini od oko 0,125 funti ekvivalenta kiseline po akru do oko 8 funti ekvivalenta kiseline po akru. U drugom otelotvorenju, korak oplodnje može se postići dozvoljavanjem prirodne oplodnje, na primer putem oprašivanja vetrom, ili može uključivati mehaničko ili ručno oprašivanje.
[0058] Hibridno seme se može ubrati iz muški sterilne transgene biljke koja je oplođena polenom iz druge biljke, pri čemu muški sterilna transgena biljka sadrži rekombinantni molekul DNK, uključujući heterologni transkribabilni polinukleotid koji daje toleranciju na herbicide prema pronalasku, i pri čemu je transgena biljka indukovana da bude muški sterilna primenom efikasne količine herbicida tokom razvoja muškog reproduktivnog tkiva. U jednom primeru, herbicid je glifosat i primenjuje se tokom razvoja u efikasnoj količini od oko 0,125 funti ekvivalenta kiseline po akru do oko 8 funti ekvivalenta kiseline po akru i sprečava najmanje razvoj polena, oslobađanje polena, ili ekstruziju prašnice.
Primeri
[0059] Sledeći primeri opisuju poboljšanja u proizvodnji hibridnog semena u odnosu na ona navedena u struci. Takva poboljšanja uključuju nove mts-siRNK ciljeve i mts-siRNK ciljne elemente za upotrebu u molekulima rekombinantne DNK i transgenim biljkama za obezbeđivanje zaustavljanja razvoja polena u ranoj fazi, što dovodi do odsustva vijabilnih zrna polena u širokom spektru germplazme i srodnih metoda upotrebe.
1
Primer 1: Identifikacija mts-siRNK ciljeva (samo za referencu)
[0060] Mala RNK je izolovana iz četiri odvojene faze rasta metlice kukuruza i tri odvojene faze rasta kukuruznog klasa. Vidi Tabelu 1. Metlica-obogaćena mala RNK bila je izolovana u veoma ranim fazama razvoja metlice (V7, V8/V9, V10/V11 i V12) (Vidi Sliku 1). Ovo je proizvelo malu RNK iz muških tkiva mlađih od onog koji je ranije korišćen u struci za dobijanje metlica-obogaćenih malih RNK sekvenci.
[0061] Biblioteke male RNK su pripremljene koristeći izolovanu malu RNK, a na bibliotekama je izvršeno sekvenciranje male RNK visoke propusnosti. Bioinformatička analiza je korišćena za poređenje sekvenci u ovim bibliotekama metlice i klasa sa sekvencama u bibliotekama malih RNK pripremljenim iz drugih tkiva kukuruza, uključujući list sakupljen u različitim fazama rasta, celu sadnicu, koren sakupljen u različitim fazama rasta, endospermu i jezgro. Ova različita bioinformatička analiza identifikovala je hiljade metlica-obogaćenih malih RNK sekvenci sa normalizovanom ekspresijom koja se kreće od 10 do 665 transkripta na četvrt miliona (tpq). Identifikovane metlica-obogaćene male RNK sekvence verovatno su siRNK zbog njihove dužine (18-26 nukleotida) i očekivanog porekla iz prekursora dsRNK. Zbog specifičnosti muškog tkiva, ove metlica-obogaćene male RNK se ovde nazivaju siRNK-specifične za muška tkiva (mts-siRNK).
Tabela 1. Opis biblioteka malih RNK metlice i klasa
2
[0062] Za identifikaciju i potvrdu da su mts-siRNK sekvence specifično eksprimirane u metlici korišćena je PCR metoda u realnom vremenu. Ukupna RNK, uključujući obogaćenu malu RNK, ekstrahovana je iz tkiva navedenih u Tabeli 1 i korišćena za sintezu cDNK sa prajmerima reverzne transkripcije koji se sastoje od 8 nt komplementarnih sa mts-siRNK sekvencom na 3' kraju i 35 nt univerzalne sekvence na 5' kraju. Nakon sinteze cDNK, PCR u realnom vremenu je izvršen tamo gde je sekvenca (14 do 18 nt) jednog od ushodnih prajmera bila identična 5'-kraju mts-siRNK sekvence i nishodni prajmer je bio univerzalni prajmer. Kao interna kontrola, 18S RNK je amplifikovana i to je korišćeno za normalizaciju mtssiRNK nivoa. Podaci iz PCR u realnom vremenu korišćeni su da suze broj mts-siRNK sekvenci koje su obogaćene u metlici.
[0063] Mikromrežni test profilisanja siRNK izvršen je pomoću µParaflo<®>Microfluidics čipova koje je obezbedio LC Sciences LLC (Houston, Texas, USA) sa 1.200 sekvenci izabranih iz hiljada mts-siRNK sekvenci identifikovanih iz diferencijalne bioinformatičke analize. Mikromrežni čipovi su sadržali trostruke sonde komplementarne sekvence za svaku od 1200 mts-siRNK sekvenci. Ukupna RNK je prečišćena iz 26 bazena sa kukuruznim tkivom (duplirani ili triplikati bazeni tkiva) iz LH244 (ATCC depozitni broj PTA-1173) ili 01DKD2 (1294213) (ATCC depozitni broj PTA-7859) samooplodnih biljaka. Vidi Tabelu 2. Svaki od 26 uzoraka RNK je hibridizovan mikročipovima koji sadrže sonde za 1200 mtssiRNK. Slike hibridizacije prikupljene su pomoću GenePix<®>4000B laserskog skenera (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) i digitalizovane pomoću Array-Pro<®>Analyzer softvera za analizu slika (Media Cybernetics, Rockville, MD). Relativne vrednosti signala izvedene su oduzimanjem i normalizacijom pozadine. Diferencijalno eksprimirani signali određeni su ttestom sa p <0,05. Na osnovu mikromrežne analize, oko 500 mts-siRNK od 1.200 je identifikovano kao veoma specifično za metlicu.
Tabela 2. Opis uzoraka tkiva koji se koriste u mikromrežnom testu.
[0064] Bioinformatička analiza je potom urađena pomoću alatki za poravnavanje sekvenci kao što su Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) ili SHort Read Mapping Package (SHRiMP) (Rumble, 2009) da bi se uporedile sekvence 500 mts-siRNK identifikovane kao visoko specifične za metlicu u odnosu na unigen kolekcije cDNK sekvenci kukuruza. Ova BLAST analiza otkrila je cDNK sekvence kukuruza sa kojima su poravnate mnoge mtssiRNK sekvence, što je dovelo do prepoznatljivih regiona DNK sekvenci koji imaju grupisana, preklapajuća poravnanja višestrukih mts-siRNK sekvenci sa savršenim ili skoro savršenim podudaranjima. Iz ove analize identifikovano je šest cDNK sekvenci koje sadrže jedan ili više takvih regiona bogatih mts-siRNK ciljnim sekvencama. Ovih šest cDNK sekvenci su ovde navedene kao SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21; i SEQ ID NO: 22. Kao primer, na Slici 2 prikazan je grafički prikaz poravnanja višestrukih mts-siRNK sekvenci na cDNK koja je data kao SEQ ID NO: 17. Višestruke kratke linije predstavljaju relativnu poziciju mts-siRNK ciljnih sekvenci (a samim tim i lokaciju mesta vezivanja mts-siRNK u transkribovanom mRNK molekulu) koje se poravnavaju sa cDNK. Y-osa predstavlja normalizovane nivoe ekspresije mts-siRNK u muškim tkivima kao što je otkriveno u mikromrežnoj analizi. Okvir predstavlja region cDNK SEQ ID NO: 17 koji odgovara sekvencama mts-siRNK ciljnih elemenata SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2.
[0065] Izabrane mts-siRNK sekvence koje se poravnavaju sa jednom od šest cDNK sekvenci korišćene su za dalju mikromrežnu analizu za utvrđivanje različite ekspresije u tkivima kukuruza. Mikromrežna analiza za mts-siRNK sekvence normalizovanih vrednosti signala za metlicu V8-V9, metlicu V10-V12, ili kombinovane signale iz drugog tkiva za kukuruznu mikroplazmu LH244 i 01DKD2 prikazana je u Tabelama 3-10. Svaka tabela prikazuje podskup mts-siRNK sekvenci koje su identifikovane kao poravnanje sa jednom od šest cDNK sekvenci koje su ovde navedene kao SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO:
2
19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21; i SEQ ID NO: 22. Rezultati vrednosti signala su mereni kao relativne vrednosti signala, a standardna greška (p<0.05) je predstavljena kao (STDR). Rezultati mikromreže ilustruju da reprezentativne mts-siRNK sekvence daju visok signal u metlici (V8-V9 i V10-V12) i nizak signal u drugom tkivu što ukazuje da je endogena ekspresija ovih mts-siRNK visoko obogaćena u metlici. Sekvenca mts-siRNK odgovara sens ili antisens nizu odgovarajuće ciljne sekvence mts-siRNK u cDNK sekvenci. mts-siRNK sekvenca može imati jedno nukleotidno, dva nukleotidna ili tri nukleotidna nepodudaranja sa poravnatim delom cDNK sekvence, a mts-siRNK sekvenca može da se poravna sa sens lancem ili antisens lancem cDNK sekvence. Ovde navedene mts-siRNK sekvence se nalaze u različitim germplazmama kukuruza.
[0066] Tabela 3 prikazuje rezultate relativnog signala mikromreže za reprezentativne mtssiRNK sekvence (ovde date kao SEQ ID NO: 23 - 31) koje se poravnavaju sa cDNK sekvencom datom ovde kao SEQ ID NO: 17, koja sadrži sekvence mts-siRNK ciljnih elemenata predstavljene sa SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2. I za germplazmu LH244 i za 01DKD2, signali za ove mts-siRNK sekvence u V8-V9 metlici i V10-V12 metlici su veći od signala za ove mts-siRNK sekvence za ostale uzorke tkiva. Rezultati mikromreže prikazani u Tabeli 3 ukazuju na to da se cDNK sekvenca koja je ovde data kao SEQ ID NO: 17 može koristiti kao izvor za projektovanje mts-siRNK ciljnih elemenata za rekombinantne DNK molekule.
Tabela 3. Mikromrežni rezultati za cDNK SEQ ID NO: 17
[0067] Tabela 4 prikazuje rezultate relativnog signala mikromreže za reprezentativne mtssiRNK sekvence (ovde date kao SEQ ID NO: 32 - 38) koje se poravnavaju sa cDNK sekvencom datom ovde kao SEQ ID NO: 18, koja sadrži mts-siRNK sekvence ciljnih elemenata predstavljene sa SEQ ID NO: 3. Za germplazmu LH244 signali za ove mts-siRNK sekvence u V8-V9 metlici i V10-V12 metlici su veći od signala za ove mts-siRNK sekvence za ostale uzorke tkiva. Za germplazmu 01DKD2, signali za ove mts-siRNK sekvence su veće u V10-V12 metlici od signala za ove mts-siRNK sekvence za V8-V9 metlicu ili uzorke drugih tkiva.
Tabela 4. Mikromrežni rezultati za cDNK SEQ ID NO: 18
2
[0068] Tabela 5 prikazuje rezultate relativnog signala mikromreže za reprezentativne mtssiRNK sekvence (ovde date kao SEQ ID NO: 39 - 42) koje se poravnavaju sa cDNK sekvencom datom ovde kao SEQ ID NO: 18, koja sadrži sekvence mts-siRNK ciljnih elemenata predstavljene sa SEQ ID NO: 4. Za germplazmu LH244 signali za ove mts-siRNK sekvence u V8-V9 metlici i V10-V12 metlici su veći od signala za ove mts-siRNK sekvence za uzorke ostalih tkiva. Za germplazmu 01DKD2, signali za ove mts-siRNK sekvence su veći u V10-V12 metlici od signala za ove mts-siRNK sekvence za V8-V9 metlicu ili uzorke drugih tkiva. Rezultati mikromreže prikazani u Tabeli 4 i Tabeli 5 ukazuju na to da se cDNK sekvenca koja je ovde data kao SEQ ID NO: 18 može koristiti kao izvor za projektovanje mts-siRNK ciljnih elemenata za rekombinantne DNK molekule.
Tabela 5. Mikromrežni rezultati za cDNK SEQ ID NO: 18
2
[0069] Tabela 6 prikazuje rezultate relativnog signala mikromreže za reprezentativne mtssiRNK sekvence (ovde date kao SEQ ID NO: 43 - 46) koje se poravnavaju sa cDNK sekvencom datom ovde kao SEQ ID NO: 19, koja sadrži sekvence mts-siRNK ciljnih elemenata predstavljene sa SEQ ID NO: 5. Za germplazmu LH244, signali za ove mts-siRNK sekvence u V8-V9 metlici i V10-V12 metlici su veći od signala za ove mts-siRNK sekvence za uzorke ostalih tkiva. Za germplazmu 01DKD2, signal za mts-siRNK sekvence (SEQ ID NO: 43 - 44) je viši u V10-V12 metlici od signala za ove mts-siRNK sekvence za V8-V9 metlicu ili uzorke drugih tkiva; i signali za mts-siRNK sekvence (SEQ ID NO: 45 - 46) su viši od signala za ove mts-siRNK sekvence u obe - V8-V9 metlici i V10-V12 metlici u poređenju sa uzorkom drugog tkiva.
Tabela 6. Mikromrežni rezultati za cDNK SEQ ID NO: 19
[0070] Tabela 7 prikazuje rezultate relativnog signala mikromreže za reprezentativne mtssiRNK sekvence (ovde date kao SEQ ID NO: 47 - 52) koje se poravnavaju sa cDNK sekvencom datom ovde kao SEQ ID NO: 19, koja sadrži sekvencu mts-siRNK ciljnog elementa predstavljenu sa SEQ ID NO: 6. Za germplazmu LH244, signali za ove mts-siRNK sekvence u V8-V9 metlici i V10-V12 metlici su veći od signala za ove mts-siRNK sekvence za uzorke ostalog tkiva. Za germplazmu 01DKD2, signali za mts-siRNK sekvence su viši u V10-V12 metlici od signala za ove mts-siRNK sekvence u V8-V9 metlici ili uzorcima drugih tkiva; signali za mts-siRNK sekvence (SEQ ID NO: 47 i SEQ ID NO: 48) su umereno viši u
2
V8-V9 metlici u odnosu na signal za ove mts-siRNK sekvence za uzorak drugih tkiva; signal za mts-siRNK sekvencu (SEQ ID NO: 52) je znatno veći u V8-V9 metlici u odnosu na signal za ovu mts-siRNK sekvencu za uzorak drugih tkiva; a signali za mts-siRNK sekvence (SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, i SEQ ID NO: 51) se ne razlikuju značajno od signala za ove mts-siRNK sekvence za ostale uzorke tkiva. Rezultati mikromreže prikazani u Tabeli 6 i Tabeli 7 ukazuju na to da se cDNK sekvenca koja je ovde data kao SEQ ID NO: 19 može koristiti kao izvor za projektovanje mts-siRNK ciljnih elemenata za rekombinantne DNK molekule.
Tabela 7. Mikromrežni rezultati za cDNK SEQ ID NO: 19
[0071] Tabela 8 prikazuje rezultate relativnog signala mikromreže za reprezentativne mtssiRNK sekvence (ovde date kao SEQ ID NO: 53 - 60) koje se poravnavaju sa cDNK sekvencom datom ovde kao SEQ ID NO: 20, koja sadrži sekvencu mts-siRNK ciljnih elemenata predstavljenu sa SEQ ID NO: 7. Za obe germplazme LH244 i za 01DKD2, signali za ove mts-siRNK sekvence u V8-V9 metlici i V10-V12 metlici su veći od signala za ove mts-siRNK sekvence za uzorke ostalih tkiva. Rezultati mikromreže prikazani u Tabeli 8
2
ukazuju na to da se cDNK sekvenca koja je ovde data kao SEQ ID NO: 20 može koristiti kao izvor za projektovanje mts-siRNK ciljnih elemenata za rekombinantne DNK molekule.
Tabela 8. Mikromrežni rezultati za cDNK SEQ ID NO: 20
[0072] Tabela 9 prikazuje rezultate relativnog signala mikromreže za reprezentativne mtssiRNK sekvence (ovde date kao SEQ ID NO: 61 - 69) koje se poravnavaju sa cDNK sekvencom datom ovde kao SEQ ID NO: 21, koja sadrži sekvence mts-siRNK ciljnih elemenata predstavljene sa SEQ ID NO: 8. I za germplazmu LH244 i za 01DKD2, signali za mts-siRNK sekvence u V8-V9 metlici i V10-V12 metlici su veći od signala za ove mtssiRNK sekvence za uzorke drugih tkiva. Rezultati mikromreže prikazani u Tabeli 9 ukazuju
2
na to da se cDNK sekvenca koja je ovde data kao SEQ ID NO: 21 može koristiti kao izvor za projektovanje mts-siRNK ciljnih elemenata za rekombinantne DNK molekule.
Tabela 9. Mikromrežni rezultati za cDNK SEQ ID NO: 21
[0073] Tabela 10 prikazuje rezultate relativnog signala mikromreže za reprezentativne mtssiRNK sekvence (ovde date kao SEQ ID NO: 70 - 87) koje se poravnavaju sa cDNK sekvencom datom ovde kao SEQ ID NO: 22, koja sadrži sekvencu mts-siRNK ciljnih elemenata predstavljenu sa SEQ ID NO: 9. Za germplazmu LH244, signali za mts-siRNK sekvence (SEQ ID NO: 70, 71, 73, 75 - 81, 83-87) u V8-V9 metlici i V10-V12 metlici su veći od signala za ove mts-siRNK sekvence za uzorke drugih tkiva; a signali za mts-siRNK sekvence (SEQ ID NO: 72, 74, 82) u drugom tkivu bili su veći od signala za ove mts-siRNK sekvence bilo u V8-V9 metlici ili V10-V12 metlici. Za germplazmu 01DKD2, signali za ove mts-siRNK sekvence (SEQ ID NO: 70 - 87) su veći u V10-V12 metlici od signala za ove mts-siRNK sekvence u V8-V9 metlici ili uzorcima drugih tkiva. Rezultati mikromreže prikazani u Tabeli 10 ukazuju na to da se cDNK sekvenca koja je ovde data kao SEQ ID NO: 22 može koristiti kao izvor za projektovanje mts-siRNK ciljnih elemenata za rekombinantne DNK molekule.
Tabela 10. Mikromrežni rezultati za cDNK SEQ ID NO: 22
1
[0074] Ove analize su potvrdile da je šest cDNK sekvenci (SEQ ID NO: 17 - 22) bilo bogato mts-siRNK ciljnim sekvencama i da je odgovarajuća mts-siRNK pokazala visoku specifičnost metlice. Ove cDNK sekvence stoga sadrže sekvence korisne sa metodama molekularne biologije za stvaranje rekombinantnih DNK molekula koji sadrže mts-siRNK ciljne elemente koji mogu dati mts-siRNK-posredovano utišavanje transgena.
[0075] Analiza odgovarajuće genomske sekvence koja sadrži mts-siRNK ciljne elemente sprovedena je za trideset dve različite germplazme kukuruza (sa relativnom zrelošću (RM) u rasponu od 80 do 120 dana) koje se obično koriste kao ženka u hibridnom ukrštanju da bi se potvrdilo prisustvo i bilo kakva varijacija sekvence mts-siRNK ciljnih elemenata. Za mtssiRNK ciljne elemente date kao SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2, tri seta parova prajmera termičkog pojačanja su dizajnirana da pojačaju odgovarajuću sekvencu unutar cDNK sekvence date ovde kao SEQ ID NO: 17. Ovi prajmeri su korišćeni za generisanje PCR amplikona u genomskoj DNK izdvojenoj iz tkiva svake germplazme. Amplikoni su proizvedeni od svih testiranih germplazmi. Sekvenca amplikona širom trideset dve germplazme bila je ili 100% identična sekvenci mts-siRNK ciljnog elementa ili je sadržala minimalni broj jednostrukih nukleotidnih polimorfizama (do 95% identičnih). Ovi podaci ukazuju na to da bi transgene biljke generisane sa rekombinantnim DNK konstruktom koji
2
sadrži transgen koji kodira rekombinantni protein operabilno povezan sa mts-siRNK ciljnim elementom koji je dat kao SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 imale muško tkivo-specifičnu regulaciju ekspresije rekombinantnog proteina u većini kukuruznih germplazmi. Ako transgen kodira rekombinantni protein koji daje toleranciju na glifosat, onda bi metlice u većini kukuruzne germplazme imale mušku sterilnost indukovanu glifosatom.
Primer 2: Rekombinantni DNK konstrukti i vektori transformacije biljaka
[0076] Rekombinantni DNK konstrukti i vektori transformacije biljaka su kreirani korišćenjem DNK sekvenci koje odgovaraju regionima šest cDNK sekvenci koje su identifikovane kao bogate ciljnim sekvencama mts-siRNK. Konstrukti rekombinantne DNK i vektori transformacije biljaka dizajnirani su da budu korisni za proizvodnju transgenih biljaka u kojima bi se putem mts-siRNK-posredovanog utišavanja došlo do utišavanja transgena specifičnog za metlicu, a koji je operabilno povezan sa mts-siRNK ciljnim elementom.
[0077] Devet mts-siRNK ciljnih elemenata je dizajnirano korišćenjem rezultata analize šest cDNK sekvenci. Svaki mts-siRNK ciljni element je dizajniran da ima DNK sekvencu koja se sastoji od mnogih preklapajućih mts-siRNK ciljnih sekvenci na koje se može vezati različita mts-siRNK. Sekvenca mts-siRNK ciljnog elementa koja je ovde data kao SEQ ID NO: 1 ima 95% identičnosti sekvence u odnosu na nukleotidnu poziciju 1429 do 1628 cDNK sekvence koja je ovde data kao SEQ ID NO: 17. Sekvenca mts-siRNK ciljnog elementa koja je ovde data kao SEQ ID NO: 2 ima jednu nt promenu (T69A) u odnosu na SEQ ID NO: 1. Sekvenca mts-siRNK ciljnog elementa koja je ovde data kao SEQ ID NO: 3 odgovara nukleotidnoj poziciji 239 do 433 cDNK sekvence koja je ovde data kao SEQ ID NO: 18. Sekvenca mtssiRNK ciljnog elementa koja je ovde data kao SEQ ID NO: 4 odgovara nukleotidnoj poziciji 477 do 697 cDNK sekvence koja je ovde data kao SEQ ID NO: 18. Sekvenca mts-siRNK ciljnog elementa koja je ovde data kao SEQ ID NO: 5 odgovara nukleotidnoj poziciji 239 do 433 cDNK sekvence koja je ovde data kao SEQ ID NO: 19. Sekvenca mts-siRNK ciljnog elementa koja je ovde data kao SEQ ID NO: 6 odgovara nukleotidnoj poziciji 370 do 477 cDNK sekvence koja je ovde data kao SEQ ID NO: 19. Sekvenca mts-siRNK ciljnog elementa koja je ovde data kao SEQ ID NO: 7 odgovara nukleotidnoj poziciji 1357 do 1562 sekvence cDNK koja je ovde data kao SEQ ID NO: 20. Sekvenca mts-siRNK ciljnog elementa koja je ovde data kao SEQ ID NO: 8 odgovara nukleotidnoj poziciji 247 do 441 cDNK sekvence koja je ovde data kao SEQ ID NO: 21. Reverzni komplement mts-siRNK ciljnog elementa predstavljen sa SEQ ID NO: 9 ima 99% identičnosti sekvence u odnosu na nukleotidnu poziciju 191 do 490 cDNK sekvence koja je ovde data kao SEQ ID NO: 22 sa tri nt nepodudarnosti (C314A, A350G i G408A) SEQ ID NO: 22 u odnosu na sekvencu reverznog komplementa SEQ ID NO: 9. Dodatni mts-siRNK ciljni elementi se mogu kreirati kombinovanjem DNK sekvenci različitih mts-siRNK ciljnih elemenata ili fragmenata dva ili više cDNK regiona bogatih sa mts-siRNK ciljem, kao što je kombinovanjem svih ili fragmenata od dva ili više mts-siRNK ciljnih elemenata koji su ovde dati kao SEQ ID NO: 1-9 i/ili jedne ili više mts-siRNK sekvenci koje su ovde navedene kao SEQ ID NO: 23 - 92. Kombinovani su različiti fragmenti ovih mts-siRNK ciljnih elemenata u dužini od 21 do 170 nukleotida, a novi mts-siRNK ciljni elementi su proizvedeni metodama sinteze DNK poznate u struci i dati su kao SEQ ID NO: 10 - 16.
[0078] Ciljni elementi mts-siRNK su subklonirani u rekombinantne DNK konstrukte sa ciljnim elementom mts-siRNK operabilno povezanim sa 3' krajem otvorenog okvira čitanja gena cp4-epsps (SEQ ID NO: 93), koji kodira protein CP4-EPSPS za toleranciju na glifosat, i 5' sa operabilno povezanim 3'-netransliranim regionom (3'-UTR). Konstrukti rekombinantne DNK takođe su sadržali operabilno povezane kombinacije jedne od tri različite kombinacije promotora/introna/pojačivača i sekvence hloroplastnih tranzitnih peptida. Konfiguracije ekspresijske kasete sadržane su u vektorima transformacije za testiranje efikasnosti mtssiRNK cilja.
Primer 3: Testiranje transformacije biljke i efikasnosti
[0079] Vektori transformacije koji sadrže rekombinantne DNK konstrukte korišćeni su sa metodom transformacije zasnovanom na Agrobacterium i nezrelim embrionima kukuruza i tehnikama poznatim u struci. Prikupljeni su uzorci listova R0 biljaka i sprovedena je molekularna analiza kako bi se selektovale transgene biljke koje sadrže jednu kopiju (jednu inserciju) ili dvostruku kopiju (dve nezavisne insercije) rekombinantnog DNK konstrukta i bez prisustva okosnice vektora. Slučajevi jedne kopije nisu poprskani glifosatom i bili su samo-oprašeni i odmakli za sakupljanje semena R1, dok su slučajevi dvostruke kopije korišćeni za prskanje R0 glifosatom da bi se procenila vegetativna tolerancija i indukovana muška sterilnost. Transgene biljke koje nisu poprskane glifosatom imale su normalnu antezu, normalno oslobađanje polena i normalan razvoj polena kako je određeno putem Alexander bojenja i mikroskopskim posmatranjem.
4
[0080] Slučajevi R0 dvostruke kopije korišćeni su u testiranju za aproksimiranje homozigotnog slučaja jedne kopije. Biljke su prskane glifosatom u dve različite faze rasta kako bi se utvrdilo da li prisustvo mts-siRNK ciljnog elementa u rekombinantnom DNK konstruktu obezbeđuje vegetativnu toleranciju glifosata i sterilnost metlice indukovanu glifosatom. Biljke su prskane u stakleniku sa 1X glifosatom (0,75 lb ae/acre) primenjenim u fazi V5, nakon čega je usledio 1X glifosat (0,75 lb ae/acre) primenjen u fazi V8. Sedam dana nakon primene glifosata u V5 fazi, biljke su bodovane na vegetativnu povredu sa rezultatom ≤10% povrede za koju se smatra da pokazuje vegetativnu toleranciju glifosata (% vegetativne tolerancije). Muška sterilnost je merena na dva načina. Biljke koje su pokazale vegetativnu toleranciju glifosata bodovane su nakon primene glifosata u V8 fazi za potpunu mušku sterilnost indukovanu glifosatom, izmerenu kao bez ekstruzije prašnice do faze S90 12 (% potpuno muški-sterilno). Prašnice su potom prikupljene i secirane za mikroskopsko posmatranje razvoja polena. Prašnice za svaki slučaj testirane su na "bez proizvedenih vijabilnih zrna polena" kao što je detektovano putem Alexandar bojenja pod mikroskopskim posmatranjem i bodovano je kao da ne proizvode nikakav vijabilni polen (% bez polena). Kod biljaka koje nisu prskane glifosatom, razvoj metlice, ekstruzija prašnice i razvoj polena bili su normalni.
[0081] mts-siRNK ciljni elementi testirani su u konfiguracijama vektora višestruke transformacije. Svaki vektor transformacije je korišćen za proizvodnju više R0 biljaka, pri čemu svaka R0 biljka predstavlja jedinstveni transgeni slučaj napravljen korišćenjem istog vektora transformacije. Podaci za tri različite konfiguracije vektora transformacije dati su u Tabelama 11 i 12.
[0082] Dvanaest mts-siRNK ciljnih elemenata testirano je u prvoj konfiguraciji vektora (A) sa rezultatima prikazanim u Tabeli 11. Iznenađujuće, procenat biljaka koje pokazuju vegetativnu toleranciju glifosata kretao se od 80-100%, ali procenat koji pokazuje potpunu mušku sterilnost indukovanu glifosatom (indukovana muška sterilnost je uključivala i nevijabilni polen i bez proizvodnje polena) kretao se od 0-100%. Vidi Tabelu 11. Na primer, biljke proizvedene pomoću vektora transformacije koji sadrži mts-siRNK ciljni element kodiran od strane SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, ili SEQ ID NO: 15 su imale visoke brojeve koji pokazuju vegetativnu toleranciju glifosata (u rasponu od 90-100% testiranih biljaka), ali nijedan od transgenih slučaja nije pokazao potpunu mušku sterilnost indukovanu glifosatom; biljke proizvedene pomoću vektora transformacije koji sadrži mts-siRNK ciljni element kodiran od SEQ ID NO: 5 ili SEQ ID NO: 9 su imale visoke brojeve koji pokazuju vegetativnu toleranciju glifosata (u rasponu od 90-100% testiranih biljaka) i umerene brojeve koji pokazuju mušku sterilnost indukovanu glifosatom (u rasponu od 50-40% testiranih biljaka); i biljke proizvedene pomoću vektora transformacije koji sadrže mts-siRNK ciljni element kodiran od SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 ili SEQ ID NO: 8 imale su visoke brojeve koji pokazuju visoku toleranciju glifosata (u rasponu od 88-100 % testiranih biljaka) i visoke brojeve koji pokazuju mušku sterilnost indukovanu glifosatom (82 -100 % testiranih biljaka). Razvoj polena je procenjen putem Alexandar bojenja. Biljke koje sadrže četiri slučaja napravljena sa vektorom transformacije koji sadrži mts-siRNK ciljni element dat kao SEQ ID NO: 2 i poprskan glifosatom da izazove mušku sterilnost pokazale su da je detektovano vrlo malo abortiranih polenskih zrna ili da nisu detektovana polenska zrna. Biljke koje nisu dobile glifosat su imale normalan polen. Vidi Sliku 4.
Таbela 11. Evaluacija R0 biljaka
[0083] Četiri druga mts-siRNK ciljna elementa testirana su u drugoj i trećoj vektorskoj konfiguraciji (B, odnosno C) sa rezultatima prikazanim u Tabeli 12. Uočene su razlike i u procentu biljaka koje pokazuju vegetativnu toleranciju glifosata i u procentu koji pokazuje potpunu mušku sterilnost izazvanu glifosatom između dve vektorske konfiguracije.
Vektorska konfiguracija B obezbedila je povećan procenat biljaka koje pokazuju vegetativnu toleranciju glifosata za sve testirane mts-siRNK ciljne elemente. Za procenat koji pokazuje potpunu mušku sterilnost izazvanu glifosatom, dva testirana mts-siRNK ciljna elementa (SEQ ID NO: 10 i SEQ ID NO: 11) pokazala su se bolje u vektorskoj konfiguraciji C, jedan od ciljnih elemenata mts-siRNK (SEQ ID NO: 12) pokazao se bolje u vektorskoj konfiguraciji B, a jedan od ciljnih elemenata mts-siRNK (SEQ ID NO: 1) pružio je 100% potpune muške sterilnosti izazvane glifosatom u obe konfiguracije B i C.
Tabela 12. Evaluacija R0 biljaka
[0084] Od biljaka koje pokazuju vegetativnu toleranciju glifosata, procenat glifosatom indukovanih muški-sterilnih biljaka bez vijabilnog polena kretao se od 0-100%. Za biljke proizvedene pomoću vektora transformacije koji je imao više od 60% testiranih biljaka koje pokazuju vegetativnu glifosat toleranciju i potpunu mušku sterilnost izazvanu glifosatom, procenat biljaka bez vijabilnog polena kretao se od 0-100%. Dva mts-siRNK ciljna elementa (SEQ ID NO: 1 u vektorskoj konfiguraciji B i SEQ ID NO: 2 u vektorskoj konfiguraciji A) su imali 100%, odnosno 82% bez vijabilnog polena. Ova dva mts-siRNK ciljna elementa (SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2) razlikuju se za jedan nukleotid i izvedeni su iz iste cDNK sekvence (SEQ ID NO: 17).
Primer 4: Imunolokalizacija proteina CP4-EPSPS u metlici
[0085] Imunolokalizacija proteina CP4-EPSPS u metlici transgenih biljaka korišćena je za analizu ekspresije proteina na nivou ćelija i tkiva kako bi se potvrdio gubitak ekspresije proteina CP4-EPSPS u polenu zbog prisustva operabilno povezanog mts-siRNK ciljnog elementa. Transgene biljke R3 generacije koje sadrže transgene cp4-epsps operabilno povezane sa SEQ ID NO: 1 ili kao kontrolni cp4-epsps transgen bez operabilno povezanog mts-siRNK ciljnog elementa uzgajane su u plasteniku. Biljke su prskane sa 1X glifosatom (0,75 lb ae/acre) u fazi V2 kako bi se potvrdila vegetativna tolerancija. Metlice na 1 cm do 17 cm su ubrane u fazama V8 do V12 kada bi tkivo prašnice bilo u fazi matične ćelije mikrospore i slobodne mikrospore. Prašnice su uklonjene sa muškog klasića koristeći pincetu za seciranje i odmah fiksirani u 3,7% formaldehida u fosfatom puferisanom fiziološkom rastvoru (PBS) pod malim vakuumom. Nakon pranja u PBS, tkiva su stavljena u medijum za ugradnju i odmah zamrznuta. Blokovi zamrznutog tkiva čuvani su na -80°C dok nisu mikrosekcirani u mikrotomu na -20°C i naneti na mikroskopske pločice.
[0086] Sekcije tkiva su bile blokirane blokatorima (10% normalnog kozjeg seruma, 5% albumina goveđeg seruma, 0,1% Triton X-100 u PBS) dva sata. Sekcije su inkubirane sa anti-CP4-EPSPS antitelom (1/500 u PBS). Nakon pranja sekcija tri puta u PBS, sekcije tkiva su inkubirane sa sekundarnim antitelom, kozji anti-mišji IgG konjugovan sa Alexa Flour<®>488 (Invitrogen, Eugene, Oregon). Negativna kontrola pripremljena je izostavljanjem inkubacije CP4-EPSPS antitela. I primarna i sekundarna antitela su bila inkubirana na sobnoj temperaturi dva do četiri sata, a zatim su dodatno inkubirana tokom noći na 4°C. Nakon pranja, tkiva su snimljena konfokalnim mikroskopom Zeiss Laser Scanning Microscope (LSM) 510 META koristeći laser od 488 nm za ekscitaciju i 500-550 nm (zeleni kanal) za set filtera emisije. Isti parametar obrade slika primenjen je na sve uzorke, uključujući kontrole. Slike fluorescentnog i svetlog polja skenirane su iz svake sekcije, a nakon toga objedinjene pomoću LSM softvera za prikazivanje strukturnih informacija. Podaci za negativne kontrole pokazali su očekivano odsustvo signala. Podaci za transgene biljke koje sadrže cp4-epsps transgen operabilno povezan sa SEQ ID NO: 1 pokazali su nizak fluorescentni signal koji ukazuje na nisku ekspresiju CP4-EPSPS proteina u zidu prašnice, tapetumu i polenskim mikrosporama u razvoju iz prašnice. Podaci za kontrolu transgenih biljaka (onih koje sadrže cp4-epsps transgen bez operabilno povezanog mts-siRNK ciljnog elementa) pokazali su visok fluorescentni signal koji ukazuje na visoku ekspresiju proteina CP4-EPSPS u zidu prašnice, tapetumu i polenskim mikrosporama u razvoju iz prašnice.
[0087] Gubitak ekspresije proteina CP4-EPSPS u polenu u biljkama koje sadrže cp4-epsps transgen operabilno povezan sa ciljnim elementom mts-siRNK koji je dat kao SEQ ID NO: 1 je u korelaciji sa zapaženim potpunim glifosat-indukovanim muškim sterilitetom u ovim biljkama. Ovi podaci su potvrdili da je zapažena potpuna muška sterilnost indukovana glifosatom rezultat gubitka ekspresije CP4-EPSPS proteina u polenu zbog prisustva operabilno povezanog mts-siRNK ciljnog elementa koji je dat kao SEQ ID NO: 1.
Primer 5: Terenska ispitivanja
[0088] Za optimalnu upotrebu u proizvodnji hibrida poželjno je imati veoma nisku ekstruziju prašnice u terenskim uslovima nakon primene herbicida u kombinaciji sa vegetativnom tolerancijom na herbicid (mereno niskim oštećenjem useva). Poželjni su i drugi aspekti proizvodnje hibrida kukuruza, kao što su visina biljke i prinos. Da bi se to procenilo, transgene biljke koje sadrža cp4-epsps transgen operabilno povezan sa mts-siRNK ciljnim elementom testirane su kod naprednih generacija u terenskim uslovima i izmereno je više parametara.
[0089] Terenska ispitivanja biljaka generacije R3 koje sadrže transgen cp4-epsps operabilno povezan sa ciljnim elementom mts-siRNK koji je dat kao SEQ ID NO: 1 sprovedena su na više lokacija kako bi se procenila vegetativna tolerancija glifosata i osetljivost na glifosat specifičnu za metlicu. Terenskim ispitivanjima testirane su biljke R3 generacije koje sadrže isti transgeni insert na različitim genomskim lokacijama. Ispitane biljke su sadržale jednu kopiju jednog od četiri jedinstvena transgena slučaja stvorena korišćenjem istog vektora transformacije biljaka koji sadrži transgen cp4-epsps operabilno povezan sa ciljnim elementom mts-siRNK koji je dat kao SEQ ID NO: 1. Ispitivanja su sprovedena korišćenjem dizajna randomizovanog kompletnog bloka. Višestruka efikasnost osobina i agronomski parametri bodovani su tokom sezone terenskog ispitivanja, a na kraju sezone određen je prinos. Terenska ispitivanja efikasnosti svojstava sprovedena su primenom herbicida glifosata na 0,75 lb ae/acre pri V7, nakon čega je usledilo 0,75 lb ae/acre pri V9 i ocena procenta oštećenja useva u VT fazi (CIPVT), procenat prosečne ekstruzije prašnice u S90+8 fazi (AES9E) i prinos (meren kao bušeli po akru (bu/acre)) na kraju sezone. Terenska ispitivanja uključivala su glifosat-tolerantni transgeni slučaj NK603 (ATCC depozitni broj PTA-24780) kao negativnu kontrolu za mušku sterilnost indukovanu glifosatom i kao pozitivnu kontrolu za vegetativnu tolerancije na glifosat. Biljke koje sadrže slučaj NK603 pokazuju komercijalni nivo vegetativne tolerancije glifosata i proizvode metlicu potpuno tolerantnu na glifosat. Svi podaci su bili podvrgnuti analizi varijance i srednje vrednosti (LSD) separisane pri p< 0,05. Tabela 13. Rezultati efikasnosti osobina za terenska ispitivanja sa biljkama koje sadrže SEQ
ID NO: 1
[0090] Prosečno oštećenje useva u VT fazi za kontrolne biljke koje sadrže slučaj NK603 bilo je 1,25. Prosečno oštećenje useva za biljke koje sadrže Slučaj 1, Slučaj 2, Slučaj 3 i Slučaj 4 bilo je 1,25, 3,75, 0, odnosno 0. Najmanja značajna razlika (LSD) pri 0,05 bila je 10,25 za sve testirane slučajeve. Ovi rezultati ukazuju na to da su biljke koje sadrže četiri transgena slučaja koji sadrže mts-siRNK ciljni element SEQ ID NO: 1 imale nulto do veoma nisko vegetativno oštećenje uz primenu 0,75 lb ae/acre glifosata u V7 nakon čega sledi V9, slično kontrolnim biljkama koje sadrže NK603 slučaj.
[0091] Prosečna ekstruzija prašnice u fazi S90+8 za kontrolne biljke koje sadrže slučaj NK603 bila je 95. Prosečna ekstruzija prašnice na S90+8 za biljke koje sadrže Slučaj 1, Slučaj 2, Slučaj 3 i Slučaj 4 bila je 0, 3,25, 4, odnosno 1,75. Prosečna ekstruzija prašnice u S90+8 LSD pri 0,05 bila je 42,71 za sve testirane slučajeve. Ovi rezultati ukazuju da su biljke koje sadrže četiri transgena slučaja koji sadrže mts-siRNK ciljni element SEQ ID NO: 1 imale nultu do veoma nisku ekstruziju prašnice sa primenom od 0,75 lb ae/acre glifosata u V7, nakon čega sledi V9, za razliku od kontrolnih biljaka koje sadrže NK603 slučaj, koje su bile potpuno muški-fertilne nakon primene glifosata.
[0092] Na kraju sezone kukuruz je ubran iz ovih terenskih ispitivanja i utvrđen je prinos. Prosečan prinos za kontrolne biljke koje sadrže slučaj NK603 bio je 96,74 bu/ara. Prosečan prinos biljaka koje sadrže Slučaj 1, Slučaj 2, Slučaj 3 i Slučaj 4 bio je 102,17 bu/acre, 96,48 bu/acre, 97,59 bu/acre, odnosno 95,8 bu/acre. LSD prinos pri 0,05 je bio 26,25 bu/acre za sve
4
testirane slučajeve. Vidi Tabelu 14. Ovi rezultati ukazuju da su biljke koje sadrže četiri transgena slučaja koji sadrže mts-siRNK ciljni element SEQ ID NO: 1 imale paritet prinosa sa NK603.
Tabela 14. Rezultati prinosa za terenska ispitivanja sa biljkama koje sadrže SEQ ID NO: 1
[0093] Terenska ispitivanja inbred biljaka R2 ili više generacije, koje sadrže transgen cp4-epsps operabilno povezan sa različitim mts-siRNK ciljnim elementima sprovedena su na više lokacija kako bi se procenila vegetativna tolerancija glifosata i osetljivost glifosata specifična za metlicu. Terenske probe su testirale inbred biljke R2 ili više generacije, koje sadrže jedan primerak transgen cp4-epsps koji je operabilno povezan sa ciljnim elementom MTS-siRNK SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, ili SEQ ID NO: 8, svaki u konfiguraciji A vektora transformacije. Ispitivanja su sprovedena koristeći grupni blok dizajn sa faktorom grupisanja koji je ili vektor transformacije, ili grupu vektora transformacije ako su brojevi slučaja za određeni vektor transformacije bili niski. Višestruka efikasnost osobina i agronomski parametri bodovani su tokom sezone terenskog ispitivanja, a na kraju sezone određen je prinos. Terenska ispitivanja efikasnosti svojstava sprovedena su primenom glifosata na 1,5 lbs ae/acre primenjenog na kukuruz V2, nakon čega je sledio glifosat na 0,75 lbs ae/acre primenjen na kukuruz V8 (875 dana stepena rasta), nakon čega je sledio glifosat na 0,75 lbs ae/acre primenjen na kukuruz V10 (1025 dana stepena rasta). Ocena procenta povrede useva u VT fazi (CIPVT), prosečan procenat ekstruzije prašnice u fazi S90+8 (AES90+8), prosečna visina biljke (inči) i prinos (mereno kao bušeli po akru (bu/acre)) na kraju sezone. Terenska ispitivanja uključivala su glifosat-tolerantni transgeni slučaj NK603 (ATCC depozitni broj PTA-24780) kao negativnu kontrolu muškog steriliteta izazvanog glifosatom i kao pozitivnu kontrolu vegetativne tolerancije na glifosat. Glifosat tolerantna mešavina muških oprašivača koja se sastoji od tri hibridne podloge germplazme postavljena je na svaku treću parcelu i zaokružuje celo ispitivanje kako bi služila kao izvor polena za test unose. Tretmani herbicidom su primenjeni korišćenjem CO2ranca ili traktorski montirane prskalice kalibrisane da isporuči 15 galona po akru (GPA) koristeći vazdušno indukovane Teejet<®>TTI mlaznice (TeeJet Technologies, Springfield, IL) sa vodom kao nosačem herbicida. Svi podaci su bili podvrgnuti analizi varijance i srednje vrednosti (LSD) separisane pri p< 0,05. Rezultati su navedeni u Tabeli 15.
[0094] Nije uočena značajna razlika u procentima oštećenja useva pri VT (CIPVT) ili u prosečnoj visini biljke u poređenju sa kontrolom NK603 za testirane biljke koje sadrže mtssiRNK ciljni element SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 ili SEQ ID NO: 8. Biljke koje sadrže mts-siRNK ciljni element SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 ili SEQ ID NO: 7 takođe nisu imale značajno smanjenje prinosa semena u odnosu na kontrolu NK603. Biljke koje sadrže mts-siRNK ciljni element SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 7 imale su veoma nisku ili nikakvu ekstruziju prašnice sa vrednostima AES90 8 od 0-2,75%, odnosno 0-1,5%. Biljke koje sadrže mts-siRNK ciljni element SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 ili SEQ ID NO: 8 imale su značajno smanjenu ekstruziju prašnice u poređenju sa kontrolnim biljkama, sa vrednostima AES90 8 u rasponu od 10% do 25%.
Таbela 15. Različite mts-siRNK u istoj konfiguraciji A vektora transformacije
Primer 6: Proizvodnja hibridnog semena
[0095] Transgene biljke i seme pronalaska mogu se koristiti u svrhu oplemenjivanja, uključujući tu i u proizvodnji hibridnog semena. Transgene biljke kukuruza koje sadrže rekombinantni DNK konstrukt koji sadrži transgen koji kodira EPSPS protein otporan na glifosat koji je operabilno povezan sa mts-siRNK ciljnim elementom, zasađene su na jednoj površini, kao što je otvoreno polje. Druge matične biljke kukuruza mogu ili ne moraju biti prisutne na istoj površini. Za kontrolu korova tokom proizvodnje semena, glifosat se može primeniti na transgene biljke kukuruza u vegetativnim fazama kao što je navedeno na oznakama poljoprivrednih proizvoda Roundup<®>.
[0096] Proizvodnja hibridnog semena može se sprovoditi primenom glifosata na transgene biljke kukuruza (ženske), koja počinje neposredno pre ili tokom razvoja metlice u fazama vegetativnog rasta kukuruza u rasponu od V7 do V13. Primena glifosata će proizvesti indukovani muški-sterilni fenotip putem tkivo-selektivne tolerancije na glifosat kod transgenih biljaka kukuruza. Transgene biljke kukuruza sa indukovanom muškom sterilnošću mogu biti oprašene drugim biljkama donorima polena (muške), što dovodi do vijabilnog hibridnog semena kukuruza koje nosi rekombinantni DNK konstrukt za tkivo-selektivnu toleranciju na glifosat. Biljke donori polena mogu, ali i ne moraju biti prisutne na istoj površini i mogu, ali i ne moraju biti transgene biljke kukuruza. Oprašivanje se može postići bilo kojim sredstvom poznatim u struci, uključujući postavljanje biljaka u blizini ili ručno oprašivanje. Hibridno seme je ubrano iz transgenih biljaka kukuruza.
4

Claims (14)

Patentni zahtevi
1. Rekombinantni DNK molekul koji se sastoji od mts-siRNK ciljnog elementa koji se sastoji od sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, 2, i njihovih komplemenata, pri čemu je mts-siRNK ciljni element operabilno povezan sa heterolognim polinukleotidnim molekulom koji se može transkribovati u RNK molekul.
2. Rekombinantni DNK molekul prema zahtevu 1, pri čemu:
heterologni polinukleotidni molekul sposoban da bude transkribovan, kodira protein koji daje toleranciju na herbicid u biljkama.
3. Rekombinantni DNK molekul prema zahtevu 2, pri čemu je navedeni herbicid izabran iz grupe koja se sastoji od inhibitora acetil koenzim A karboksilaze (ACCaze), inhibitora acetolaktat sintaze (ALS), inhibitora fotosistema II (PSII), inhibitora protoporfirinogen oksidaze (PPO), inhibitora 4-hidroksifenil dioksigenaze (HPPD), inhibitora 5-enolipiruvil šikimat 3-fosfat sintaze (EPSPS), inhibitora glutamin sintaze (GS) i sintetičkih oksina.
4. Rekombinantni DNK molekul prema zahtevu 1, pri čemu navedeni heterologni polinukleotidni molekul sposoban da bude transkribovan, kodira glifosat-tolerantnu 5-enolipiruvil šikimat 3-fosfat sintazu (EPSPS).
5. Transgena biljka, njen deo ili seme koje u svom genomu sadrži rekombinantni DNK molekul prema zahtevu 1.
6. Biljka prema zahtevu 5, pri čemu je navedena biljka monokotiledona biljka.
7. Biljka prema zahtevu 6, pri čemu je navedena biljka kukuruzna biljka.
8. Metoda selektivne regulacije ekspresije proteina u muškom reproduktivnom tkivu transgene biljke, koja se sastoji od ekspresije rekombinantnog DNK molekula u navedenoj transgenoj biljci prema zahtevu 1.
9. Metoda prema zahtevu 8, pri čemu navedeni protein sadrži glifosat-tolerantnu 5-enolipiruvil šikimat 3-fosfat sintazu (EPSPS).
10. Metoda indukovanja muške sterilnosti u transgenoj biljci, koja se sastoji od: a) gajenja transgene biljke koja sadrži rekombinantni DNK molekul koji sadrži mtssiRNK ciljni element koji se sastoji od sekvence izabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1, 2 i njihovi komplementi, pri čemu je mts-siRNK ciljni element operabilno povezan sa heterolognim molekulom polinukleotida koji kodira protein koji daje toleranciju na najmanje prvi herbicid; i
b) primene efikasne količine navedenog herbicida na navedenu transgenu biljku, pri čemu se primena herbicida sprovodi pre ili istovremeno sa razvojem muškog reproduktivnog tkiva navedene transgene biljke, čime se indukuje muška sterilnost u transgenoj biljci.
11. Metoda prema zahtevu 10, pri čemu:
(a) pomenuti heterologni polinukleotidni molekul kodira glifosat-tolerantnu 5-enolipiruvil šikimat 3-fosfat sintazu (EPSPS); ili
b) navedeni herbicid je glifosat; ili
(c) navedena efikasna količina herbicida je primenjena u razvojnoj fazi izabranoj iz grupe koja se sastoji od faze V4, VS, V6, V7, V8, V9, V10, V11, V12, V13 i V14.
12. Metoda prema zahtevu 11, pri čemu je navedena efikasna količina herbicida oko 0,125 funti kiselinskog ekvivalenta po akru do oko 8 funti kiselinskog ekvivalenta glifosata po akru.
13. Hibridno seme proizvedeno metodom koja se sastoji od:
(a) primena efikasne količine herbicida na transgenu biljku, koja se sastoji od rekombinantnog DNK molekula koji se sastoji od mts-siRNK ciljnog elementa koji se sastoji od sekvence izabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1, 2, i njihovi komplementi, pri čemu je mts-siRNK ciljni element operabilno povezan sa heterolognim polinukleotidnim molekulom koji kodira protein koji daje toleranciju na bar prvi herbicid, pri čemu se primena herbicida sprovodi pre ili uporedo sa razvojem muškog reproduktivnog tkiva transgene biljke, čime se indukuje muška sterilnost u navedenoj transgenoj biljci;
b) oplodnja navedene transgene biljke polenom iz druge biljke; i
c) omogućavanje hibridnom semenu da se formira iz pomenute transgene biljke gde hibridno seme sadrži rekombinantni DNK molekul.
4
14. Hibridno seme prema zahtevu 13, pri čemu:
(a) navedena oplodnja sastoji se od omogućavanja oprašivanja vetrom; ili b) navedeni heterologni transkribabilni polinukleotidni molekul kodira 5-enolipiruvil šikimat 3-fosfat sintazu (EPSPS) tolerantnu na glifosat; ili
(c) navedeni herbicid je glifosat, koji glifosat je poželjno primenjen istovremeno sa razvojem u efikasnoj količini od oko 0,125 funti kiselinskog ekvivalenta po akru do oko 8 funti kiselinskog ekvivalenta po akru.
4
RS20230123A 2015-07-22 2016-07-14 Metode i sastavi za selektivnu regulaciju ekspresije proteina RS63980B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562195546P 2015-07-22 2015-07-22
PCT/US2016/042217 WO2017015043A1 (en) 2015-07-22 2016-07-14 Methods and compositions for selective regulation of protein expression
EP16828263.0A EP3324732B1 (en) 2015-07-22 2016-07-14 Methods and compositions for selective regulation of protein expression

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS63980B1 true RS63980B1 (sr) 2023-03-31

Family

ID=57835207

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20230123A RS63980B1 (sr) 2015-07-22 2016-07-14 Metode i sastavi za selektivnu regulaciju ekspresije proteina

Country Status (27)

Country Link
US (3) US10704057B2 (sr)
EP (1) EP3324732B1 (sr)
JP (1) JP6930960B2 (sr)
KR (1) KR102689259B1 (sr)
CN (2) CN114891758B (sr)
AR (2) AR105374A1 (sr)
AU (3) AU2016296468B2 (sr)
BR (1) BR112018001192B1 (sr)
CA (1) CA2992113A1 (sr)
CL (1) CL2018000165A1 (sr)
CO (1) CO2018000499A2 (sr)
EA (1) EA037898B1 (sr)
EC (1) ECSP18003799A (sr)
ES (1) ES2938362T3 (sr)
HR (1) HRP20230022T1 (sr)
HU (1) HUE061144T2 (sr)
MA (1) MA42497A (sr)
MX (2) MX391762B (sr)
PE (2) PE20231848A1 (sr)
PH (1) PH12018500119A1 (sr)
PL (1) PL3324732T3 (sr)
PT (1) PT3324732T (sr)
RS (1) RS63980B1 (sr)
UA (1) UA126893C2 (sr)
UY (1) UY40325A (sr)
WO (1) WO2017015043A1 (sr)
ZA (1) ZA201800175B (sr)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013006472A1 (en) 2011-07-01 2013-01-10 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for selective regulation of protein expression
MX391762B (es) 2015-07-22 2025-03-21 Monsanto Technology Llc Métodos y composiciones para la regulación selectiva de la expresión de proteínas.
MX2020008124A (es) 2018-02-02 2020-09-18 Monsanto Technology Llc Evento de maiz mon87429 y metodos para su uso.
MY195997A (en) * 2018-04-18 2023-02-27 Kimagri Corp Sdn Bhd Recombinant Gene
AR130457A1 (es) * 2022-09-14 2024-12-11 Monsanto Technology Llc Métodos y composiciones para la regulación selectiva de la expresión de proteínas

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5583210A (en) 1993-03-18 1996-12-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for controlling plant development
US5750868A (en) 1994-12-08 1998-05-12 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Reversible nuclear genetic system for male sterility in transgenic plants
US6271439B1 (en) 1998-03-04 2001-08-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for regulating cell death and enhancing disease resistance to plant pathogens
WO1999046396A2 (en) 1998-03-09 1999-09-16 Monsanto Company Glyphosate as a gametocide
CN1249133A (zh) * 1998-12-25 2000-04-05 北京大学 获得雄性不育植物的分子方法
AR044724A1 (es) 2000-03-27 2005-10-05 Syngenta Participations Ag Promotores del virus de la rizadura amarilla del cestrum
US20020062499A1 (en) 2000-05-08 2002-05-23 Conner Timothy W. Methods for translational repression of gene expression in plants
US6646186B1 (en) 2000-07-26 2003-11-11 Stine Seed Farm Inc. Hybrid soybeans and methods of production
GB0108048D0 (en) 2001-03-30 2001-05-23 Isis Innovation Specification of meiocyte and tapetal cell layers in plants
US7977046B2 (en) * 2002-05-10 2011-07-12 Monsanto Technology Llc Method of selecting DNA constructs for herbicide tolerance in plants
US7230168B2 (en) 2001-12-20 2007-06-12 The Curators Of The University Of Missouri Reversible male sterility in transgenic plants by expression of cytokinin oxidase
US6967656B2 (en) 2002-10-28 2005-11-22 Syngenta Participations Ag Growing degree unit meter and method
AU2003903132A0 (en) 2003-06-20 2003-07-03 Molecular Plant Breeding Nominees Ltd. Plant promoter
CA2574791A1 (en) 2004-07-20 2006-02-09 Genentech, Inc. Compositions and methods of using angiopoietin-like 4 protein
US7750207B2 (en) 2004-09-01 2010-07-06 Monsanto Technology Llc Zea mays ribulose bisphosphate carboxylase activase promoter
US20060200878A1 (en) 2004-12-21 2006-09-07 Linda Lutfiyya Recombinant DNA constructs and methods for controlling gene expression
ZA200803234B (en) * 2005-10-13 2009-01-28 Monsanto Technology Llc Methods for producing hybrid seed
AU2006302969B2 (en) 2005-10-13 2011-09-22 Monsanto Technology, Llc Methods for producing hybrid seed
US8158850B2 (en) 2007-12-19 2012-04-17 Monsanto Technology Llc Method to enhance yield and purity of hybrid crops
CA2710221A1 (en) * 2007-12-21 2009-07-09 E. I. Du Pont De Nemours And Company Drought tolerant plants and related constructs and methods involving genes encoding mir827
US20120017338A1 (en) 2008-01-15 2012-01-19 Wei Wu Isolated novel nucleic acid and protein molecules from corn and methods of using those molecules to generate transgenic plant with enhanced agronomic traits
EA201071408A1 (ru) * 2008-06-03 2011-06-30 Нордзаат Заатцухтгезелльшафт Мбх Способ получения однодольных растений с мужской стерильностью
US20120210458A9 (en) 2009-02-27 2012-08-16 Yongwei Cao Isolated Novel Nucleic Acid and Protein Molecules from Corn and Methods of Using Thereof
UA115762C2 (uk) 2009-11-23 2017-12-26 Монсанто Текнолоджи Ллс Рекомбінантна молекула днк, яка вказує на присутність трансгенної події mon 87427 маїсу
SG181881A1 (en) 2009-12-23 2012-07-30 Gradalis Inc Furin-knockdown bi-functional rna
WO2013006472A1 (en) 2011-07-01 2013-01-10 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for selective regulation of protein expression
MX391762B (es) 2015-07-22 2025-03-21 Monsanto Technology Llc Métodos y composiciones para la regulación selectiva de la expresión de proteínas.
MX2020008124A (es) 2018-02-02 2020-09-18 Monsanto Technology Llc Evento de maiz mon87429 y metodos para su uso.

Also Published As

Publication number Publication date
HRP20230022T1 (hr) 2023-03-03
AU2023229538A1 (en) 2023-10-05
CN114891758A (zh) 2022-08-12
HUE061144T2 (hu) 2023-05-28
BR112018001192B1 (pt) 2024-02-06
BR112018001192A2 (pt) 2018-09-25
PT3324732T (pt) 2023-02-14
KR20180026777A (ko) 2018-03-13
CN107846856A (zh) 2018-03-27
PE20231848A1 (es) 2023-11-21
AU2016296468A1 (en) 2018-02-08
ES2938362T3 (es) 2023-04-10
CO2018000499A2 (es) 2018-05-31
JP6930960B2 (ja) 2021-09-01
EP3324732A4 (en) 2019-05-15
EA037898B1 (ru) 2021-06-03
PL3324732T3 (pl) 2023-03-13
MX391762B (es) 2025-03-21
AU2020273330B2 (en) 2023-07-20
CA2992113A1 (en) 2017-01-26
AU2023229538B2 (en) 2025-05-22
CN107846856B (zh) 2022-05-24
PH12018500119A1 (en) 2018-07-23
ECSP18003799A (es) 2018-03-31
UY40325A (es) 2023-08-31
EP3324732A1 (en) 2018-05-30
US11866721B2 (en) 2024-01-09
US10704057B2 (en) 2020-07-07
US20170029841A1 (en) 2017-02-02
AR122346A2 (es) 2022-09-07
US20200283790A1 (en) 2020-09-10
KR102689259B1 (ko) 2024-07-30
MA42497A (fr) 2018-05-30
EP3324732B1 (en) 2022-11-23
PE20180465A1 (es) 2018-03-06
US20240102042A1 (en) 2024-03-28
MX2018000890A (es) 2018-05-15
EA201890328A1 (ru) 2018-06-29
CN114891758B (zh) 2024-02-13
AR105374A1 (es) 2017-09-27
WO2017015043A1 (en) 2017-01-26
ZA201800175B (en) 2018-12-19
UA126893C2 (uk) 2023-02-22
MX2021000869A (es) 2021-03-29
AU2020273330A1 (en) 2020-12-17
AU2016296468B2 (en) 2020-08-27
JP2018521658A (ja) 2018-08-09
CL2018000165A1 (es) 2018-04-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230392162A1 (en) Methods and Compositions for Selective Regulation of Protein Expression
US20240102042A1 (en) Methods and compositions for selective regulation of protein expression
Chahal et al. Phylogenetically distant BABY BOOM genes from Setaria italica induce parthenogenesis in rice
Chahal Evaluation of phylogenetically distant baby boom genes for their ability to Induce Parthenogenesis in Rice
BR122020010665B1 (pt) Molécula de dna recombinante, método para regular seletivamente a expressão de uma proteína em um tecido reprodutivo masculino de uma planta transgênica, e uso de uma planta ou semente compreendendo a referida molécula de dna recombinante