RS62100B1 - Postupak inaktivacije ksenoantigena u biološkim tkivima - Google Patents

Description

Opis

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na postupak inaktivacije ksenoantigena u biološkim tkivima, naročito na inaktivaciju ksenoantigena u tkivima koja se mogu koristiti za proizvodnju bioprotetičkih zamena, namenjenih za upotrebu u humanoj ili veterinarskoj kliničkoj praksi.

[0002] Pronalazak se posebno odnosi na postupak inaktivacije ksenoantigena u vezivnim tkivima koja su nativna i/ili fiksirana, heterologna ili homologna, a konkretno se odnosi na postupak inaktivacije alfa-Gal epitopa u kardiovaskularnim tkivima, primenom biološke aktivnosti otkrivene u fenolnim jedinjenjima, polifenolnim jedinjenjima i njihovim derivatima.

[0003] Proizvodnja bioprotetičkih zamena trenutno je u velikoj ekspanziji. Kliničko poboljšanje efikasnoti hirurških postupaka, smanjenje posthirurških komplikacija, razvoj i upravljanje novim lekovima koji modulišu imunski sistem, u kombinaciji sa boljim poznavanjem mehanizama interakcije između transplanta i domaćina, olakšavaju upotrebu bioloških proteza sačinjenih od životinjskog ili homolognog tkiva. U tom smislu, jedan značajan sector je kardiovaskularno tkivo, posebno imajući u vidu socijalni i zdravstveni značaj koji ima uobičajena praksa zamene srčanih zalistaka.

[0004] Današnji stepen razvoja biomedicinske tehnologije omogućava proizvodnju i hiruršku ugradnju protetičkog zaliska koji funkcionalno zamenjuje disfunkcionalne prirodne zaliske.

[0005] Idealan protetički zalistak treba da obezbedi protok koji odgovara protoku analognog, zdravog zaliska, da obezbede dug životni vek i da ne izazovu hemolitičke ili trombogenetske efekte.

[0006] Najčešće korišćeni protetički zalisci su biološke proteze proizvedene od ksenogenih tkiva, posebno od svinjskih zalistaka ili zalistaka dobijenih u goveđem ili konjskom perikardijumu.

[0007] Nedostatak ovakvih proteza i protetičkih zalistaka je što podležu degenerativnim procesima usled kalcifikacione distrofije i/ili pogoršanja usled propadanja listića, kao i to što ispoljavaju veću osetljivost na endokardiačne infekcije. Radi poboljšanja njihovih mehaničkih karakteristika, smanjavanja antigenosti i očuvanja, protetički zalisci se obično tretiraju umrežavajućim/sterilišućim hemijskim agensima, kao što je, bez oganičenja, glutaraldehid. Pored toga, protetički zalisci mogu biti podvrgnuti tretmanima dekalcifikacije ili detoksikacije.

[0008] Izraz "ksenogeno tkivo" označava tkivo koje pripada organizmu vrste koja nije ljudska; takvi biološki materijali imaju specifične površinske antigene koji se tolerišu unutar vrsta iz koje potiču, ali su nekompatibilni ako se implantiraju ljudima, kod kojih će, ako nisu adekvatno tretirani, aktivirati kaskadu komplementa sa agregacijom trombocita, izazivajući stanje slično onome koje nastaje usled nekompatibilnosti krvnih grupa.

[0009] Takav fenomen poznat je kao „hiperakutno odbacivanje". Glavni razlog početka ovog procesa je prisustvo alfa-Gal ksenoantigena. Ovaj epitop je di-galaktozid (galaktoza-alfal, 3-galaktoza), prisutan na mnogim membranskim glikoproteinima i glikolipidima (prvenstveno na membranama endotelnih ćelija), kao i na membranama različitim tipovima ćelija, kao što su monociti, granulociti i crvena krvna zrnca i u važnim odeljcima tkiva, poput miokarda i kosti. Ovaj važan antigen konstitutivno se ekspimira kod svih sisara, osim kod viših primata i ljudi.

[0010] Ljudski organizam od rođenja ekspimira antitela usmeren protiv takvog epitopa, usled kontinuirane stimulacije crevnom bakterijskom florom.

[0011] U sadašnjem trenutku biokompatibilnost ksenogenog tkiva, koja može da omogući njihovu primenu u proizvodnji bioproteza, postiže se tretiranjem tkiva pomenutim glutaraldehidom.

[0012] Međutim, i pored takvog tretmana, pokazalo se da u trenutno postojećim protetičkim zaliscima pomenuti alfa-Gal epitop i dalje ostaje aktivan, izazivajući nakon implantacije porast cirkulišućih antitela na alfa-Gal, kako kod pedijatrijskih, tako i kod odraslih pacijenata.

[0013] Veruje se da je kompleks koji se formira između navedenog antigena i odgovarajućih antitela direktno uključen u podsticanje taloženja kalcijumovih soli, što dalje favorizuje povemenu kalcifikaciju i distrofiju zalistaka.

[0014] US 2015/087611 A1 otkriva postupke stabilizacije implantata sačinjenih od vezivnog tkiva, tretiranjem vezivnog tkiva fenolnim jedinjenjima, uključujući: taninsku kiselinu, tanine, hidroksi-tirozol, oleuropein.

[0015] Cilj ovog pronalaska je da obezbedi postupak inaktivacije alfa-Gal antigena u biološkom tkivima, koji može da prevaziđe ograničenja postojećih konvencionalnih tretmana.

[0016] U okviru tog cilja, predmet pronalaska je da obezbedi postupak, kako je definisano u patentnom zahtevu 1, koji se može primeniti na nativnim i/ili fiksiranim, heterolognim ili homolognim vezivnim tkivima, koja se mogu primeniti u proizvodnji bioprotetske zamene, za upotrebu kod ljudi ili veterinarskoj kliničkoj praksi.

[0017] Naredni predmet pronalaska je obezbeđivanje postupka, kako je definisano u patentnom zahtevu 1, za inaktivaciju alfa-Gal antigena u biološkim tkivima, koji je posebno adaptiran za primenu u inaktivaciji alfa-Gal epitopa u kardiovaskularnom tkivu.

[0018] Naredni predmet pronalaska je da obezbedi postupak, kako je definisano u patentnom zahtevu 1, za inaktivaciju alfa-Gal antigena u biološkim tkivima, kojim se inaktivira gore pomenuti epitop i time obezbeđuje efikasan tretman koji se može primeniti u različitim vrstama bioprotetičkih zamena koje su trenutno u primeni.

[0019] Sledeći predmet pronalaska je da obezbedi postupak, kako je definisano u patentnom zahtevu 1, koji nakon implantiranja ne dovodi do povećanja cirkulišućih anti-alfa-Gal antitela.

[0020] Sledeći predmet pronalaska je da obezbedi postupak, kako je definisano u patentnom zahtevu 1, koji ne podstiče taloženje kalcijumovih soli, sprečavajući tako distrofiju zalistaka usled kalcifikacije.

[0021] Naredni predmet pronalaska je da obezbedi postupak, kako je definisano u patentnom zahtevu 1, koji se može izvršiti na konvencionalnim uređajima i opremi.

[0022] Cilj i predmeti pronalaska koji će u daljem tekstu biti objašnjeni, postižu se primenom postupka inaktivacije alfa-Gal antigena u biološkom tkiva, posebno u tkivima koja se mogu koristiti za proizvodnju bioprotetičke zamene i/ili u postojećim bioprotetičkim zamenama i namenjeni za kliničku primenu kod ljudi i životinja, naznačeno time što uključujea sledeće korake:

- obezbeđivanje rastvora na bazi kofeinske kiseline za inaktivaciju maker jednog dela alfa-Gal antigena u pomenutim tkivima;

- inkubiranje uzoraka koji će biti tretirani, navedenim rastvorima, pod kontrolisanim uslovima;

- serija ispiranja tretiranih tkiva.

[0023] Pronalazak se takođe odnosi na vezivno tkivo dobijeno postupkom inaktivacije alfa-Gal antigena u biološkim tkivima, prema pronalasku kao što je gore opisano, naznačeno time da je maker deo antigena u neaktivnom obliku.

[0024] Pronalazak se takođe odnosi na upotrebu vezivnog tkiva, dobijenog postupkom inaktivacije alfa-Gal antigena u biološkim tkivima prema pronalasku, kao što je gore opisano, za proizvodnju bioprotetičke zamene i/ili dela u postojećim bioprotetičkim zamenama, namenjena kliničkoj primeni kod ljudi i životinja.

[0025] Pronalazak se takođe odnosi na komplet za spovođenje postupka inaktivacije alfa-Gal antigena u biološkim tkivima prema pronalasku, kako je opisano gore, naznačen time što obuhvata najmanje:

- jedan ili više kontejnera sa puferom u kome će biti rastvorena optimalna doza kofeinske kiseline;

- jedan ili više kontejnera sa odgovarajućom dozom kofeinske kiseline u prahu, koja se kombinuje sa puferom;

- jedan ili više kontejnera koji sadrže pufere za ispiranje;

- brošuru sa uputstvima koja sadrže opis procedura i način primene postupka.

[0026] Ostale karakteristike i prednosti pronalaska postaće jasne iz narednog detaljnog opisa poželjnih, ali ne i ekskluzivnih oblika izvođenja inaktivacije alfa-Gal antigena u biološkim tkivima prema pronalasku. Na pratećim crtežima:

- Slika 1 je prikaz rezultata, izraženih u procentima, koji se odnose na primenu postupka prema pronalasku u prvoj varijanti njegove primene;

- Slika 2 je prikaz rezultata, izraženih u procentima, koji se odnose na primenu postupka prema pronalasku u drugoj varijanti njegove primene;

- Slika 3 je prikaz rezultata, izraženih u procentima, koji se odnose na primenu postupka prema pronalasku u trećoj varijanti njegove primene;

- Slika 4 je prikaz rezultata, izraženih u procentima, koji se odnose na primenu postupka prema pronalasku u četvrtoj varijanti njegove primene.

DEFINICIJE

[0027] Izraz "fenolna jedinjenja" odnosi se na molekule koji se odlikuju prisustvom barem jednim delom, aromatičnog jezgra (benzenski prsten), vezanim za jedan ili više hidroksilnih funkcionalnih grupa. Pomenuta jedinjenja uključuju, bez ograničenja: jednostavne fenole (molekuli sa jednim benzenskim prstenom, koji kao supstituente sadrži samo hidroksilne grupe, npr. fenol i hidrohinon), fenol-aldehide (koji sadrži i fenolnu grupu i aldehidnu grupa, npr. aldehid vanilin), fenolne kiseline (npr.cimetna kiselina), fenilamine (amfoterne molekule koji sadrže slabo kiselu grupu i jako baznu grupu, npr. fenilalanin), fenolna jedinjenja (fenolni prsten koji je vezan za drugi benzenski prsten, ili za druga heterociklična jedinjenja koja imaju hidroksil/lakton /keton funkcionalne grupe, npr. kumarini i ksantoni), flavonoide (sastavljene od dva benzenova prstena povezana lancem od tri atoma ugljenika koji konstituišu oksigenisani heterociklični prsten, npr. katehini, flavononi, flavoni, halkoni, flavanonoli, flavanoli, leukoantocijanidin, antocijanidin), fenilpropanoide (koji se odlikuju prisustvom aromatičnog prstena sa alifatičnim bočnim lancem sa tri atoma ugljenika, na pr. hidroksicimetna kiselina) i tanine. U ovom pronalasku temini "fenoli" i "polifenoli" mogu imati isto značenje, i mogu se koristiti zajedno ili kao međusobno zamenjivi sinonimi. U postupku i kompletu prema pronalaska koristi se kofeinska kiselina.

[0028] Termin "ksenoantigen" odnosi se na molekule životinjskog porekla koje su prepoznati od strane imunskog sistema, koji indukuje antitela/imunski/inflamatorni odgovor u ljudskom organizmu ili organizmu domaćina. U predmetnom pronalasku termin "ksenoantigen", "antigen", "ksenogeni antigen ", “epitop " i " ključni antigen " mogu imati isto značenje i mogu se koristiti kao međusobno zamenjivi sinonimi.

[0029] Temin "vezivno tkivo" obuhvata između ostalog: krvne sudove, srčane zaliske, tetive, ligamente, perikardijum, mišićne ovojnice, tvrdu moždanicu, bubnu opnu, crevnu submukozu, hrskavicu, masno tkivo i koštanog tkiva.

[0030] Izraz "fiksirana" tkiva obuhvata tkiva koja su podvrgnuta delovanju hemijskih ili bioloških fiksatora kao što su, bez ograničenja; glutaraldehid, formaldehid i kvercitin.

[0031] Izraz "fiksirana" tkiva obuhvata tkiva koja, podvrgnuta dejstvu hemijskih ili bioloških sredstava, razvijaju unakrsne veze unutar tkiva, što stabilizuje proteine, lipide i ćelijske strukture, i smanjuju potencijalno antigeno delovanje domaćina. U opisu ovog pronalaska, termini "fiksirano" i „umreženo“ označavaju tip tretmana i/ili imaju isto značenje i mogu se koristiti zajedno ili kao sinonimi.

[0032] Termin "heterologna" tkiva označava tkiva koja su poreklom od životinja, a ne od čoveka. Takva tkiva se mogu se koristiti u kliničkoj primeni kao nativna, odnosno, netretirana, umesto da su podvrgnuta tretmanima koji podstiču njihova regeneraciona svojstva (kao što su, na primer, postupci decelularizacije ili postupci oblaganja/apsorpcije ćelijskih komponenti proregenerativnim/konzervansnim sredstvima). U opisu pronalaska, pojam "heterologni" može imati isto značenje kao "ksenogeni" i oni se mogu koristiti zajedno ili kao sinonimi.

[0033] Termin "homologna" tkiva označava tkiva ljudskog porekla. Takva tkiva se mogu koristiti u kliničke svrhe kao nativna ili netretirana, umesto da su podvrgnuta tretmanu konzervansima (kao što je, na primer, krioprezervacija) ili tretmanima koji pojačavaju njihova regenerativna svojstva (kao što su, na primer, decelularizacija ili oblaganje/natapanje ćelijskih komponenti proregenerativnim/konzervansnim sredstvima).

[0034] Izraz "postupci decelularizacije" označava sve pojedinačne ili višestruke tretmane, bez ograničenja, fiziološkim rastvorom (hiper-, izo- ili hipotoničnim), rastvorima deterdženata (jonski, nejonski ili cviterijonski) i enzimima, a čiji je cilj delimično, selektivno ili potpuno uklanjanje prisutne ćelijske komponente u originalnom tkivu.

[0035] Pojam "bioprotetičke zamene" odnosi se na biološke sprave koje su prilagođene da zamene nedostajući deo organizma (ud, organ ili tkivo) ili da integrišu oštećeni deo, a koje su namenjene za kliničku primenu kod ljudi i životinja. U opisu ovog pronalaska, izrazi „bioprotetičke zamene“, „bioproteze“, „biološke proteze“ ili „uređaj“ mogu imati isto značenje i mogu se koristiti kao sinonimi.

[0036] Fraza „životinja sa genskim nokautom alfa-Gal antigena“ označava životinju kojoj je inaktiviran gen koji kodira enzim alfa-galaktoziltransferazu. Ovaj enzim je odgovoran za isecanje membranskih glikoproteina i lipoproteina u sastavu alfa-Gal epitopa. Odsustvo enzima uzrokuje nastanak tkiva kojem potpuno nedostaje pomenuti epitop i koji u tom smislu sličan tkivima u ljudskom organizmu. U ovom pronalasku, vaskularna tkiva životinja sa genskim nokautom za alfa-Gal antigen, korišćena su kao apsolutna negativna kontrola.

[0037] Slede neki neograničavajući primeri primene postupka prema pronalasku.

[0038] Postupak inaktivacije alfa-Gal antigena u biološkim tkivima, prema pronalasku, naočito u tkivima koja se mogu koristiti u proizvodnji bioprotetičke zamene i/ili u postojećim bioprotetičkim zamenama u humanoj i veterinaskoj medicini, naznačen time što obuhvata sledeće korake:

- obezbeđivanje rastvora na bazi kofeinske kiseline za inaktivaciju jednog dela alfa-Gal antigena u pomenutim tkivima;

- inkubiranje uzoraka koji će biti tretirani, navedenim rastvorima pod kontrolisanim uslovima;

- serija ispiranja tretiranih tkiva.

[0039] Postupak takođe uključuje procenu efikasnosti inaktivacije alfa-Gal epitopa, upoređivanjem tretiranog/netetiranog tkiva i tkiva svinje koja je genski nokaut za enzim alfagalaktoziltransferazu.

[0040] Takav postupak se može sprovesti, kako je obelodanjeno italijanskom patentu No.

0001409783 i u EP2626701.

[0041] Biološka tkiva su izgrađena od vezivnog tkiva, koje može biti nativno, ili nativno i fiksirano, ili fiksirano.

[0042] Biološka tkiva mogu biti heterologna ili homologna.

[0043] Kontrolisani uslovi koraka inkubacije uključuju najmanje jedan tretman na temperaturi od 40 ± 2 ° C.

[0044] Postupak inaktivacije ksenoantigena u biološkim tkivima prema pronalasku, odnosno, tkivima koja se mogu koristiti u proizvodnji bioprotetičkih zamena, primenjen je u inaktivaciji alfa-Gal epitopa u tkivima, koji sačinjavaju sledeće modele bioprotetičkih zamena:

- Hancock svinjski srčani zalistak (mod. T510, Medtronic Inc., Minneapolis, USA), označen na slikama skraćenicom „HANCK“;

- Freestile ® srčani zalistak korena aorte (mod. 995, Medtronic Inc., Minneapolis, USA) označen na slikama skraćenicom „FREE“;

- Carpentier-Edvards S.A.V. (mod. 6650, Edvards Lifesciences LCC, California, USA) označen na slikama skraćenicom „SAV“;

- Carpentier-Edvards Perimount Plus (mod. 6900P, Edvards Lifesciences LCC, Kalifornija, SAD), pomenut na slikama kao „PERI“;

- CardioCel kardiovaskularni flaster (mod. C0404, Admedus Regen Pti Ltd, Perth, Australija), označen na slikama skraćenicom

[0045] U nastavku je detaljno opisan postupak inaktivacije alfa-Gal epitopa u uzorcima bioprotetičkih zamena u poželjnim oblicima izvođenja.

[0046] Iz prethodno pomenutih modela bioprotetičkih zamena trenutno dostupnih na tržištu, uzeti su uzorci tkiva. Uzorci su izmereni (30-50 mg mase), nakon kratkog utapkavanja vlage lakim filter papirom, a zatim su isečeni na manje komadiće kako bi se povećala površina izloženosti.

[0047] Za svaku bioprotetičku zamenu, pripremljena su 4 različita seta uzoraka (n = 8 za svaki set).

[0048] Svaki set je podvrgnut različitom postupku.

[0049] Pripremljena su četiri različita rastvora na bazi derivata fenolnih kiselina, što odgovara četvorim varijantama postupka prema pronalasku, kojima će uzorci biti podvrgnuti u finalnoj zapremini od 5 ml, konkretno:

- postupak T1 (prema zahtevima): kofeinska kiselina pri koncentraciji od 5 mM do 50 mM (prema pronalasku je određena koncentracija od 20 mM), rastvorena u natrijumfosfatnom puferu, sa 600 ± 50 U/ml tirozinaze, u odnosu [1:20];

- postupak T2 (prema zahtevima): kofeinska kiselina u koncentracijama od 5 mM do 50 mM (prema pronalasku je odeđena koncentracija od 20 mM), rastvorena u 0.2 ± 0.1 M NaOH;

- postupak T3 (nije prema zahtevima): taninska kiselina u koncentracijama između 0.1 M i 1.5 M (prema pronaalsku je određena koncentracija 1M), rastvorena u natijumfosfatnom puferu;

- postupak T4 (nije prema zahtevima): hidroksitirosol u koncentraciji između 0.3 mM i 10 mM (prema pronalasku je određena koncetracija 6 mM), rastvorena u 0.2 ± 0.1 M NaOH.

[0050] Ovi rastvori su ostavljeni da deluju u uslovima umerenog konstantnog mešanja, u trajanju od 12 ± 2 sata na temperaturi od 40 ± 2 ° C.

[0051] Nakon inkubacije uzorci su dva puta ispirani izotoničnim rastvorom, u trajanju od 15 minuta svaki, dok je treće ispiranje bilo u posebnom puferu (TP) u trajanju od 15 minuta.

[0052] Procena prisustva svih aktivnih epitopa preostalih na površini tretiranih uzoraka zasniva se na modifikaciji reprezentativnog postupka istih pronalazača, koji je opisan u italijanskom patentu No.0001409783 i u EP2626701.

[0053] Ukratko, obrađeni i oprani uzorci tkiva stavljaju se u epruvete, u koje se dodaje TP pufer do finalne zapremine između 1000 μL i 1500 μL.

[0054] Zatim se dodaje specifično monoklonsko mišje antitelo na alfa-Gal epitop (u ovom primeru to je IgM klon M86), poželjno u koncentraciji [1:50], nakon čega se inkubira 120 ± 10 minuta, na 37 ± 2 °C u uslovima konstantnog i umerenog mešanja.

[0055] Na kraju se uzorci centrifugiraju na 14.750 × g, tokom 30 ± 5 minuta na sobnoj temperature.

[0056] Tokom inkubacije sa antitelom M86, pripremljena je mikrotitar ploča sa 96 bunarića, na kojoj je dno svakog bunarića obloženo sa 100 μL alfa-Gal/serumskog albumina u koncentraciji od 5 μg/ml u fosfatnom puferu. Tako pripremljena ploča se inkubira 60 ± 10 minuta na temperaturi između 30°C i 40°C, iako je poželjno da se sistem stabilizuje na 37°C. Ploča se zatim ispira 3 puta sa 300 μL fosfatnog pufera po bunariću, na sobnoj temperaturi.

[0057] Prvo ispiranje je ostavljeno da deluje 5 minuta, a dva sledeća po 3 minuta.

[0058] Blokiranje se vrši sa 300 μL po bunariću, serumskim albuminom i inkubacijom 60 ± 10 minuta na sobnoj temperaturi, u mraku. Nakon toga slede 3 ispiranja, kao što je opisano.

[0059] U svaki bunarić dodato je po 100 μL supernatanta dobijenog nakon centrifugiranja pojedinačnih uzoraka.

[0060] Uzorci se nanose na ploču, tako da se jedan uzorak nanosi u sve bunariće jedne kolone. Nakon toga sledi inkubacija ploče 120 ± 10 minuta, na temperaturi između 30 ° C - 40 ° C, iako je poželjno da se sistem stabilizuje na 37°C.

[0061] Nakon toga slede 3 ispiranja, kao što je opisano, i dodavanje 100 μL rastvora sekundarnog antitela po bunariću (poliklonsko antitelo iz zeca, protiv mišjih antigena), koje je konjugovano sa peroksidazom (optimizovana su razblaženja antitela od [1: 1000], [1: 500] i [1: 100], i odeđena je srednja koncentracija [1: 500]).

[0062] Zatim se ploča ponovo inkubira za 60 ± 10 minuta na temperaturi između 30° C - 40° C, iako je poželjno da se sistem stabilizuje na 37°C.

[0063] Zatim se izvode 3 ispiranja kao što je opisano. U svaki bunarić se dodaje po 100 μL rastvora supstrata za peroksidazu, nakon čega sledi inkubacija ploče u trajanju od 5 ± 1 minut u mraku.

[0064] Nakon toga dodaje se po 50 μl stop rastvora po bunariću, zajedno sa 2M H2SO4, a ploča zatim očitava se u čitaču mikrotitar ploča na 450 nm.

[0065] Procenat inaktivacije specifičnog epitopa utvrđuje se poređenjem broja dobijenih epitopa: u kontrolnom tkivu, sačinjenom od vaskularnog tkiva životinja koje su genski nokauti za alfa-Gal antigen, u netretiranom bioprotetičkim tkivima, i u tkivima podvrgnutim različitim tretmanima, kao što je opisano.

[0066] Na Slici 1 se jasno vidi da postupak u varijanti T1 primene pokazuje značajnu varijabilnost efekta, zavisno od tipa tretiranog bioprotetičnog tkiva.

[0067] Postupak T1 pokazao je znatno nižu efikasnost od svih ostalih testiranih protokola, pokazujući kao najbolji efekat inaktivacije od oko 43% epitopa.

[0068] Na Slici 2 se vidi da postupak u varijanti T2 primene sa kofeinskom kiselinom, ispoljava odlično inaktivirajuće dejstvo protiv antigena, tako da se procenat inaktivacije kreće između 90% i 98%, što je slično efektima u vaijanti T3 (Slika 3, gde su obuhvaćeni procenti inaktivacije kreću između 80% i 100%) i vaijante T4 (Slika 4, procenat inaktivacije se kreće između 89% i 95%).

[0069] Pronalazak se takođe odnosi na vezivno tkivo dobijeno gore opisanim postupkom.

[0070] Takvo vezivno tkivo odlikuje se time što je najmanje jedan deo antigenske komponente u neaktivnom obliku.

[0071] Pronalazak se takođe odnosi na upotrebu vezivnog tkivo kako je gore opisano, za proizvodnju bioprotetičkih zamena i/ili delova bioproteza koje su već u kliničkoj upotrebi kod ljudi i životinja.

[0072] Pronalazak se takođe odnosi na komplet za sprovođenje postupka inaktivacije ksenoantigena u biološkim tkivima, kako je definisano u zahtevu 5.

[0073] Predviđena upotreba kompleta usmerena je na autonomno tretiranje postojećih bioprostetičkih zamena, primenom postupka prema pronalasku kako je opisano, u zdravstvenim ustanovama, kao što su klinike i bolnice.

[0074] Praktično je potvrđeno da pronalazak u potpunosti postiže predviđeni cilj i namene.

[0075] Konkretno, pronalaskom je osmišljen postupak inaktivacije alfa-Gal epitopa u tkivu namenjenom za proizvodnju bioprotetičkih zamena za kliničku i/ili veterinarsku upotrebu.

[0076] Dalje, pronalaskom je osmišljen postupak inaktivacije pomenutih antigena, čime se osigurava efikasan tretman koji se može primeniti na različite vrste tkivnih bioproteza koje već postoje u upotrebi.

[0077] Prema tome, pronalaskom je osmišljen postupak, koji nakon implantacije prethodno tretiranog tkiva, ne izaziva porast cirkulišućih antitela na alfa-Gal.

[0078] Štaviše, pronalaskom je osmišljen postupak koji može da ograniči deponovanje kalcijumovih soli, pa stoga, ne favorizuje kalcifikovanih distrofičnih zalistaka.

[0079] Na kraju, ali ne najmanje važno, pronalaskom je osmišljen postupak koji se može izvesti primenom konvencionalne opreme.

[0080] Primenjene komponente i materijali u realizaciji, pod uslovom da su prilagođeni određenoj upotrebi i odgovarajućih dimenzija i oblika, mogu biti one koje ispunjavaju potrebne zahteva u stanju tehnike.

REFERENCE

[0081]

- Nkomo VT et al. Burden of valvular heart diseases: a population-based study. Lancet 2006;368:1005-1011.

- Zeng LY et al. A prompt method to quantitative assay of alpha-Gal on pig cell surface without injury. Sichuan Da XUe Xue Bao Yi Xue Ban.2005;36(3):419-421.

- Galili U et al. A sensitive assay for measuring alpha Gal epitope expression on cells by a monoclonal anti-Gal antibody. Transplantation 1998;65:1129-1132.

- Chen RH et al. alpha-Gal and beta-Gal are preferentially expressed on porcine cardiac microvascular endothelium. Transplant Proc 2000;32:877-878.

- Feng W et al. Distribution of the Alpha-Gal epitope on adult porcine bone tissue. Transplant. Proceed. 2006;38:2247-2251.

- Galili U. The alpha Gal epitope and the anti-Gal antibody in xenotransplantation and in cancer immunotherapy. Immun Cell Biol 2005;83:674-686.

- Konakci KZ et al. Alpha-Gal on bioprostheses: xenograft immune response in cardiac surgery. Eur J Clin Invest 2005;35(1): 17-23.

- Park CS et al. Anti alpha-gal immune response following porcine bioprosthesis implantation in children. J Heart Valve Dis 2010;19(1):124-30.

- Lila N et al. Gal knockout pig pericardium: new source of material for heart valve bioprostheses. J Heart Lung Transplant 2010;29(5):538-43.

- Naso F et al. First quantitative assay of alpha- Gal in soft tissues: presence and distribution of the epitope before and after cell removal from xenogeneic heart valves. Acta Biomater 2011;7(4):1728-1734.

- Naso F et al. First quantification of alpha-Gal epitope in current glutaraldehyde-fixed heart valve bioprostheses. Xenotransplantation 2013;20(4):252-261.

Claims (5)

Patentni zahtevi

1. Postupak inaktivacije alfa-Gal antigena u biološkim tkivima, posebno u tkivima koja mogu da se koriste za proizvodnju bioprotetičkih zamena i/ili u već postojećim bioprotetičkim zamenama, koji su namenjeni za kliničku primenu kod ljudi i životinja, naznačen time što uključuje naredne korake:

- obezbeđivanje rastvora na bazi kofeinske kiseline u inaktivaciju jednog dela alfa-Gal antigena u pomenutim tkivima;

- inkubiranje uzoraka koji će biti tretirani, navedenim rastvorima pod kontrolisanim uslovima;

- serija ispiranja tretiranih tkiva.

2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što su navedena biološka tkiva sačinjena od nativnih, ili nativnih i fiksiranih, ili fiksiranih vezivnih tkiva.

3. Postupak prema jednom ili više prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što su navedena biološka tkiva heterologna ili homologna.

4. Postupak prema jednom ili više prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što navedeni kontrolisani uslovi uključuju barem jedan tretman na temperaturi od 40 ± 2°C.

5. Komplet za izvođenje postupka inaktivacije alfa-Gal antigena u biološkim tkivima, prema jednom ili više patentnih zahteva 1 do 4, naznačen time što sadrži najmanje:

- jedan ili više kontejnera sa puferom u kome će biti rastvorena optimalna doza kofeinske kiseline;

- jedan ili više kontejnera sa odgovarajućom dozom kofeinske kiseline u prahu, koja se kombinuje sa puferom;

- jedan ili više kontejnera koji sadrže pufere za ispiranje;

- brošura sa uputstvima koja sadrže opis procedura i način primene postupka.