[go: up one dir, main page]

RS61297B1 - Transtiretinske (ttr) kompozicije irnk i postupci za njihovu primenu u lečenju ili prevenciji bolesti povezanih sa ttr-om - Google Patents

Transtiretinske (ttr) kompozicije irnk i postupci za njihovu primenu u lečenju ili prevenciji bolesti povezanih sa ttr-om

Info

Publication number
RS61297B1
RS61297B1 RS20210015A RSP20210015A RS61297B1 RS 61297 B1 RS61297 B1 RS 61297B1 RS 20210015 A RS20210015 A RS 20210015A RS P20210015 A RSP20210015 A RS P20210015A RS 61297 B1 RS61297 B1 RS 61297B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
ttr
nucleotides
double
nucleotide
subject
Prior art date
Application number
RS20210015A
Other languages
English (en)
Inventor
Tracy Zimmermann
Amy Chan
Vasant Jadhav
Martin Maier
Kallanthottathil G Rajeev
Original Assignee
Alnylam Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Alnylam Pharmaceuticals Inc filed Critical Alnylam Pharmaceuticals Inc
Publication of RS61297B1 publication Critical patent/RS61297B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/344—Position-specific modifications, e.g. on every purine, at the 3'-end
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/353—Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
    • C12N2310/3533—Halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/22—Haematology
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)

Description

Opis
Osnova pronalaska
[0001] Transtiretin (TTR) (poznat i kao prealbumin) nalazi se u serumu i cerebrospinalnoj tečnosti (CSF). TTR transportuje retinol-vezujući protein (RBP) i tiroksin (T4) i takođe deluje kao nosač retinola (vitamin A) putem svoje povezanosti sa RBP u krvi i CSF.
Transtiretin je dobio ime po svom transportu tiroksina i retinola. TTR takođe deluje kao proteaza i može da cepa proteine, uključujući apoA-I (glavni HDL apolipoprotein), amiloid β-peptid i neuropeptid Y. Vidite Liz, M.A. i sar. (2010) IUBMB Life, 62(6):429-435.
[0002] TTR je tetramer četiri identične podjedinice od 127 aminokiselina (monomeri) koje su bogate strukturom beta ravni. Svaki monomer ima dve 4-lančane beta ravni i oblik izduženog elipsoida. Antiparalelne interakcije u beta ravni povezuju monomere u dimere. Kratka petlja od svakog monomera čini glavnu dimer-dimer interakciju. Ova dva para petlji razdvajaju suprotne, konveksne beta ravni dimera dajući interni kanal.
[0003] Jetra je značajno mesto ekspresije TTR. Druga bitna mesta ekspresije uključuju horoidni pleksus, mrežnjaču (posebno epitelijum pigmenta mrežnjače) i pankreas.
[0004] Transtiretin je jedan od najmanje 27 različitih vrsta proteina koji je prekursorski protein u nastajanju amiloidnih filamenata. Vidite Guan, J. i sar. (Nov.4, 2011) Current perspectives on cardiac amyloidosis, Am J Physiol Heart Circ Physiol, doi:10.1152/ajpheart.00815.2011. Vanćelijsko taloženje amiloidnih filamenata u organima i tkivima je pokazatelj amiloidoze. Amiloidni filamenti su sastavljeni od pogrešno presavijenih agregata proteina, koji mogu biti posledica prekomerne proizvodnje ili specifičnih mutacija u prekursorskim proteinima. Amiloidogeni potencijal TTR može biti povezan sa njegovom razvijenom strukturom beta ravni; studije rendgenske kristalografije pokazuju da određene amiloidogene mutacije destabilizuju tetramernu strukturu proteina. Vidite, npr. Saraiva M.J.M. (2002) Expert Reviews in Molecular Medicine, 4(12): 1-11.
[0005] Amiloidoza je opšti termin za grupu amiloidnih bolesti koje su okarakterisane amiloidnim naslagama. Amiloidne bolesti se klasifikuju na osnovu njihovog prekursorskog proteina, na primer, naziv počinje sa „A“ što označava amiloid, praćeno skraćenicom za prekursorski protein, npr. ATTR za amiloidogeni transtiretin.
Ibid.
[0006] Postoje brojne bolesti povezane sa TTR-om, i većinom su amiloidne bolesti. TTR normalne sekvence je povezan sa srčanom amiloidozom kod starijih osoba, i naziva se senilna sistemska amiloidoza (SSA) (takođe se naziva i senilna srčana amiloidoza (SCA) ili srčana amiloidoza). SSA je često praćena mikroskopskim naslagama u mnogim drugim organima. TTR amiloidoza se manifestuje u različitim oblicima. Kada je periferni nervni sistem jače pogođen, bolest se naziva familijarna amiloidna polineuropatija (FAP). Kada je primarno pogođeno srce, ali ne i nervni sistem, bolest se naziva familijarna amiloidna kardiomiopatija (FAC). Treća značajna vrsta TTR amiloidoze je leptomeningealna amiloidoza, poznata i kao leptomeningealna ili meningocerebrovaskularna amiloidoza, amiloidoza centralnog nervnog sistema (CNS) ili amiloidoza VII oblika. Mutacije u TTR takođe mogu da izazovu amiloidna zamućenja staklastog tela, sindrom karpalnog tunela i eutiroidnu hipertiroksinemiju, koja je neamiloidna bolest za koju se smatra da prati povećano povezivanje tiroksina sa TTR-om usled mutantnog molekula TTR sa povećanim afinitetom prema tiroksinu. Vidite, npr. Moses i sar. (1982) J. Clin. Invest., 86, 2025-2033.
[0007] Abnormalni amiloidogeni proteini mogu biti nasleđeni ili stečeni putem somatskih mutacija. Guan, J. i sar. (Nov.4, 2011) Current perspectives on cardiac amyloidosis, Am J Physiol Heart Circ Physiol, doi: 10.1152/ajpheart.00815.2011. ATTR povezan sa transtiretinom je najčešći oblik nasledne sistemske amiloidoze. Lobato, L. (2003) J. Nephrol., 16:438-442. Mutacije TTR ubrzavaju proces amiloidnog nastajanja TTR i najznačajniji su faktor rizika pojave ATTR. Za više od 85 varijanti amiloidogenih TTR je poznato da izazivaju sistemsku familijarnu amiloidozu. Mutacije TTR obično dovode do sistemskog amiloidnog taloženja, uz posebno učešće perifernog nervnog sistema, mada su neke mutacije povezane sa kardiomiopatijom ili zamućenjem staklastog tela. Ibid.
[0008] Mutacija V30M je najzastupljenija TTR mutacija. Vidite, npr. Lobato, L. (2003) J. Nephrol, 16:438-442. Mutaciju V122I nosi 3,9% populacije Afroamerikanaca, i najčešći je uzrok FAC. Jacobson, D.R. i sar. (1997) N. Engl. J. Med.336 (7): 466-73. Procenjeno je da se SSA javlja kod više od 25% populacije starijih od 80 godina. Westermark, P. i sar. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.87 (7): 2843-5.
[0009] Shodno tome, u struci postoji potreba za delotvornim lečenjima bolesti povezanih sa TTR-om.
Sažetak pronalaska
[0010] Predmetni pronalazak je definisan patentnim zahtevima. Predmetno otkriće obezbeđuje agense RNKi, npr. agense dvolančane RNKi, i kompozicije koje ciljaju gen transtiretina (TTR). Predmetno otkriće takođe obezbeđuje postupke za inhibiciju ekspresije TTR i postupke za lečenje ili prevenciju bolesti povezanih sa TTR-om kod ispitanika korišćenjem agenasa RNKi, npr. agenasa dvolančane RNKi, iz pronalaska. Predmetno otkriće se zasniva, barem delimično, na otkriću da je za agense RNKi kod kojih su suštinski svi nukleotidi na sens lancu i suštinski svi nukleotidi na antisens lancu modifikovani nukleotidi i sadrže ne više od 82'-fluor modifikacija na sens lancu, ne više od 62'-fluor modifikacija na antisens lancu, dve fosforotioatne veze na 5'-kraju sens lanca, dve fosforotioatne veze na 5'-kraju antisens lanca i ligand, npr. GalNAc3ligand, ovde dokazano da su delotvorni u utišavanju aktivnosti TTR gena. Ovi agensi pokazuju iznenađujuće pojačanu aktivnost utišavanja TTR gena. Bez namere da se ograničimo teorijom, veruje se da kombinacija ili potkombinacija prethodnih modifikacija i specifičnih ciljnih mesta u ovim agensima RNKi daje agensima RNKi iz pronalaska poboljšanu delotvornost, stabilnost, potentnost i trajnost.
[0011] Shodno tome, u jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje agense dvolančane ribonukleinske kiseline (RNKi) za inhibiciju ekspresije transtiretina (TTR) u ćeliji, pri čemu agens RNKi sadrži sens lanac komplementaran sa antisens lancem, pri čemu antisens lanac ima region komplementaran sa SEQ ID NO:2 (5'-UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA -3'), pri čemu svaki lanac ima dužinu od oko 14 do oko 30 nukleotida, pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, pri čemu sens lanac sadrži ne više od 82'-fluor modifikacija; pri čemu antisens lanac sadrži ne više od 62'-fluor modifikacija; pri čemu sens lanac i antisens lanac nezavisno sadrže dve fosforotioatne veze na 5'-terminusu; i pri čemu je sens lanac konjugovan sa najmanje jednim ligandom.
[0012] U jednom otelotvorenju, i pri čemu je agens dvolančane RNKi predstavljen formulom (IIIe):
pri čemu:
np' je prepust od 2 nukleotida i svaki nukleotid u np' je povezan sa susednim nukleotidom putem fosforotioatne veze;
svaki Na, Nb, Na' i Nb' nezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 0-25 nukleotida koji su modifikovani ili nemodifikovani ili kombinacija prethodnog, i svaka sekvenca sadrži najmanje dva različito modifikovana nukleotida;
svaki YYY i Y'Y'Y' nezavisno predstavlja jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida.
[0013] U jednom otelotvorenju, motiv YYY se javlja na mestu cepanja sens lanca ili blizu njega. U jednom otelotvorenju, motiv Y'Y'Y' se javlja na pozicijama 11, 12 i 13 antisens lanca od 5'-kraja.
[0014] U jednom otelotvorenju, Y nukleotidi sadrže 2'-fluor modifikaciju.
[0015] U jednom otelotvorenju, Y' nukleotidi sadrže 2'-O-metil modifikaciju.
[0016] Dvolančani region može imati dužinu od 15-30 parova nukleotida, 17-23 parova nukleotida, 17-25 parova nukleotida, 23-27 parova nukleotida, 19-21 par nukleotida ili 21-23 para nukleotida.
[0017] Svaki lanac agensa dvolančane RNKi može imati 15-30 nukleotida ili 19-30 nukleotida.
[0018] U jednom otelotvorenju, modifikacije na nukleotidima su izabrane iz grupe koja se sastoji od dezoksi nukleotida, 3'-terminalnog nukleotida dezoksitimina (dT), 2'-O-metil modifikovanog nukleotida, 2'-fluor modifikovanog nukleotida, 2'-dezoksi-modifikovanog nukleotida, zaključanog nukleotida, otključanog nukleotida, konformaciono ograničenog nukleotida, ograničenog etil nukleotida, abaznog nukleotida, 2'-amino-modifikovanog nukleotida, 2'-O-alil-modifikovanog nukleotida, 2'-C-alkil-modifikovanog nukleotida, 2'-hidroksil-modifikovanog nukleotida, 2'-metoksietil modifikovanog nukleotida, a 2'-O-alkilmodifikovanog nukleotida, morfolino nukleotida, fosforamidata, nukleotida koji sadrži neprirodnu bazu, tetrahidropiranom modifikovanog nukleotida, 1,5-anhidroheksitolom modifikovanog nukleotida, cikloheksenilom modifikovanog nukleotida, nukleotida koji sadrži fosforotioatnu grupu, nukleotida koji sadrži metilfosfonatnu grupu, nukleotida koji sadrži 5'-fosfat i nukleotida koji sadrži imitaciju 5'-fosfata, i njihovih kombinacija.
[0019] U jednom otelotvorenju, modifikacije na nukleotidima su 2'-O-metil ili 2'-fluor modifikacije.
[0020] Sens lanac može da sadrži ne više od 72'-fluor modifikacija, ne više od 62'-fluor modifikacija, ne više od 52'-fluor modifikacija, ne više od 42'-fluor modifikacije, ne više od 3 2'-fluor modifikacije ili ne više od 22'-fluor modifikacije.
[0021] Antisens lanac može da sadrži ne više od 52'-fluor modifikacija, ne više od 42'-fluor modifikacije, ne više od 32'-fluor modifikacije ili ne više od 22'-fluor modifikacije.
[0022] U jednom otelotvorenju, agens dvolančane RNKi dalje sadrži 5'-fosfat ili imitaciju 5'-fosfata na 5' nukleotidu antisens lanca. U drugom otelotvorenju, agens dvolančane RNKi dalje sadrži imitaciju 5'-fosfata na 5' nukleotidu antisens lanca.
[0023] U jednom otelotvorenju, imitacija 5'-fosfata je 5'-vinil fosfat (5'-VP).
[0024] U jednom otelotvorenju, ligand je jedan ili više derivata GalNAc povezanih dvovalentnim ili trovalentnim razgranatim linkerom. U drugom otelotvorenju, ligand je
[0025] U jednom otelotvorenju, ligand je spojen za 3' kraj sens lanca.
[0026] U jednom otelotvorenju, agens dvolančane RNKi je konjugovan sa ligandom kako je prikazano u sledećem šematskom prikazu
pri čemu, X je O ili S.
[0027] U jednom otelotvorenju, antisens lanci sadrže sekvencu nukleotida odabranu iz grupe koja se sastoji od 5'- usCfsuugguuacaugAfaaucccasusc - 3' (SEQ ID NO: 6), 5'-usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc - 3' (SEQ ID NO:7), 5'-UfsCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc - 3' (SEQ ID NO: 8) i 5'-VPusCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc - 3' (SEQ ID NO: 9), pri čemu, a, c, g, i u su 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G, ili U; Af, Cf, Gf i Uf su 2'-fluor A, C, G, ili U; i s je fosforotioatna veza; a VP je imitacija 5'-fosfata.
[0028] U jednom otelotvorenju, sens i antisens lanci sadrže sekvence nukleotida odabrane iz grupe koja se sastoji od 5'- usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga - 3' (SEQ ID NO: 10) i 5'-usCfsuugguuacaugAfaaucccasusc - 3' (SEQ ID NO: 6); 5'- usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga -3' (SEQ ID NO: 10) i 5'- usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc - 3' (SEQ ID NO: 7); 5'usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga - 3' (SEQ ID NO: 10) i 5'-UfsCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc - 3' (SEQ ID NO: 8); i 5'-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga - 3' (SEQ ID NO: 10) i 5'-VPusCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc - 3' (SEQ ID NO: 9), pri čemu, a, c, g, i u su 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G, ili U; Af, Cf, Gf i Uf su 2'-fluor A, C, G, ili U; i s je fosforotioatna veza; a VP je imitacija 5'-fosfata. U drugom otelotvorenju, sens i antisens lanci sadrže sekvence nukleotida 5'-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga - 3' (SEQ ID NO: 10) i 5'-usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc - 3' (SEQ ID NO: 7), pri čemu, a, c, g, i u su 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G, ili U; Af, Cf, Gf i Uf su 2'-fluor A, C, G, ili U; i s je fosforotioatna veza. U još jednom otelotvorenju, agens RNKi je odabran iz grupe od bilo kog od agenasa RNKi koji su navedeni u bilo kojoj tabeli 1 i 3. U još jednom otelotvorenju, agens RNKi je AD-65492.
[0029] U jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje agense dvolančane ribonukleinske kiseline (RNKi) za inhibiciju ekspresije transtiretina (TTR) u ćeliji, pri čemu agens RNKi sadrži sens lanac komplementaran sa antisens lancem, pri čemu antisens lanac ima region u potpunosti komplementaran sa SEQ ID NO:2 (5'-UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA -3'), pri čemu svaki lanac ima dužinu od oko 14 do oko 30 nukleotida, pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, pri čemu sens lanac sadrži ne više od 82'-fluor modifikacija; pri čemu antisens lanac sadrži ne više od 62'-fluor modifikacija; pri čemu sens lanac i antisens lanac nezavisno sadrže dve fosforotioatne veze na 5'-terminusu; i pri čemu je sens lanac konjugovan sa najmanje jednim ligandom, pri čemu, ligand je jedan ili više derivata GalNAc povezanih dvovalentnim ili trovalentnim razgranatim linkerom.
[0030] U jednom otelotvorenju, agens dvolančane RNKi je predstavljen formulom (IIIe):
pri čemu:
np' je prepust od 2 nukleotida i svaki nukleotid u np' je povezan sa susednim nukleotidom putem fosforotioatne veze;
svaki Na, Nb, Na' i Nb' nezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 8-10 nukleotida koji su modifikovani ili nemodifikovani ili kombinacija prethodnog, i svaka sekvenca sadrži najmanje dva različito modifikovana nukleotida;
YYY i Y'Y'Y' svaki nezavisno predstavlja jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, i pri čemu, modifikacije su 2'-O-metil ili 2'-fluor modifikacije.
[0031] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje ćelije koje sadrže agense dvolančane RNKi iz pronalaska i farmaceutske kompozicije koje sadrže agense dvolančane RNKi iz pronalaska. Ovde su takođe otkrivene ćelije i farmaceutske kompozicije koje sadrže vektore iz otkrića.
[0032] U jednom otelotvorenju, agens dvolančane RNKi se primenjuje u nepuferovanom rastvoru, npr. fiziološkom rastvoru ili vodi.
[0033] U drugom otelotvorenju, agens dvolančane RNKi se primenjuje sa puferskim rastvorom. U jednom otelotvorenju, puferski rastvor može da sadrži acetat, citrat, prolamin, karbonat ili fosfat, ili bilo koju njihovu kombinaciju. U drugom otelotvorenju, puferovani rastvor je fiziološki rastvor puferovan fosfatom (PBS).
[0034] U drugom aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje postupke za inhibiciju ekspresije transtiretina (TTR) u ćeliji. Postupci obuhvataju (a) dovođenje ćelije u kontakt sa agensima dvolančane RNKi iz pronalaska, vektorima iz otkrića ili farmaceutskim kompozicijama iz otkrića; i (b) održavanje ćelije proizvedene u koraku (a) u periodu koji je dovoljan da dođe do degradacije transkripta mRNK TTR gena, čime se inhibira ekspresija TTR gena u ćeliji.
[0035] U jednom otelotvorenju, ćelija se nalazi u ispitaniku.
[0036] U jednom otelotvorenju, ispitanik je čovek.
[0037] U jednom otelotvorenju, ispitanik boluje od bolesti povezane sa TTR-om.
[0038] U jednom otelotvorenju, ekspresija TTR je inhibirana za najmanje oko 10%, oko 15%, oko 20%, oko 25%, oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 90%, oko 95%, oko 98% ili oko 100%.
[0039] U još jednom aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje postupke za lečenje ispitanika koji ima poremećaj povezan sa transtiretinom (TTR), putem primene na ispitaniku terapeutski delotvorne količine agensa dvolančane RNKi iz pronalaska ili vektora iz otkrića ili farmaceutskih kompozicija iz pronalaska, čime se ispitanik leči.
[0040] U još jednom aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje postupke za profilaktičko lečenje ispitanika kod koga postoji rizik od pojave poremećaja povezanog sa transtiretinom (TTR), putem primene na ispitaniku profilaktički delotvorne količine agensa dvolančane RNKi iz pronalaska ili vektora iz otkrića, ili farmaceutskih kompozicija iz pronalaska, čime se ispitanik profilaktički leči.
[0041] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje postupke lečenja ispitanika koji ima poremećaj povezan sa transtiretinom (TTR). Postupci obuhvataju primenu terapeutski delotvorne količine agensa dvolančane RNKi na ispitaniku, pri čemu agens dvolančane RNKi sadrži sens lanac komplementaran sa antisens lancem, pri čemu antisens lanac ima region komplementaran sa SEQ ID NO:2 (5'- UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA -3'), pri čemu svaki lanac ima dužinu od oko 14 do oko 30 nukleotida, pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, pri čemu sens lanac sadrži ne više od 82'-fluor modifikacija; pri čemu antisens lanac sadrži ne više od 62'-fluor modifikacija; pri čemu sens lanac i antisens lanac nezavisno sadrže dve fosforotioatne veze na 5'-terminusu; i pri čemu je sens lanac konjugovan sa najmanje jednim ligandom.
[0042] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje postupke za profilaktičko lečenje ispitanika kod kog postoji rizik od pojave poremećaja povezanog sa transtiretinom (TTR). Postupci obuhvataju primenu profilaktički delotvorne količine agensa dvolančane RNKi na ispitaniku, pri čemu agens dvolančane RNKi sadrži sens lanac komplementaran sa antisens lancem, pri čemu antisens lanac ima region komplementaran sa SEQ ID NO:2 (5'-UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA-3'), pri čemu svaki lanac ima dužinu od oko 14 do oko 30 nukleotida, pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, pri čemu sens lanac sadrži ne više od 82'-fluor modifikacija; pri čemu antisens lanac sadrži ne više od 62'-fluor modifikacija; pri čemu sens lanac i antisens lanac nezavisno sadrže dve fosforotioatne veze na 5'-terminusu; i pri čemu je sens lanac konjugovan sa najmanje jednim ligandom.
[0043] U jednom aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje postupke za smanjivanje, usporavanje ili zaustavljanje skora neuropatskog oštećenja (Neuropathy Impairment Score,
1
NIS) ili modifikovanog NIS (mNIS+7) kod ispitanika koji ima poremećaj povezan sa transtiretinom (TTR). Postupci obuhvataju primenu na ispitaniku terapeutski delotvorne količine agenasa dvolančane RNKi iz pronalaska ili vektora iz otkrića ili farmaceutskih kompozicija iz pronalaska, čime se smanjuje, usporava ili zaustavlja skor neuropatskog oštećenja (NIS) ili modifikovani NIS (mNIS+7) kod ispitanika.
[0044] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje postupke za smanjivanje, usporavanje ili zaustavljanje skora neuropatskog oštećenja (NIS) ili modifikovanog NIS (mNIS+7) kod ispitanika koji ima poremećaj povezan sa transtiretinom (TTR). Postupci obuhvataju primenu terapeutski delotvorne količine agensa dvolančane RNKi na ispitaniku, pri čemu agens dvolančane RNKi sadrži sens lanac komplementaran sa antisens lancem, pri čemu pomenuti antisens lanac ima region komplementaran sa SEQ ID NO:2, pri čemu svaki lanac ima dužinu od oko 14 do oko 30 nukleotida, pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, pri čemu sens lanac sadrži ne više od 82'-fluor modifikacija; pri čemu antisens lanac sadrži ne više od 62'-fluor modifikacija; pri čemu sens lanac i antisens lanac nezavisno sadrže dve fosforotioatne veze na 5'-terminusu; i pri čemu je sens lanac konjugovan sa najmanje jednim ligandom.
[0045] U jednom aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje postupak za poboljšanje 6-minutnog testa hoda (6MWT) kod ispitanika koji ima poremećaj povezan sa transtiretinom (TTR). Postupci obuhvataju primenu na ispitaniku terapeutski delotvorne količine agenasa dvolančane RNKi iz pronalaska ili vektora iz otkrića ili farmaceutskih kompozicija iz pronalaska, čime se poboljšava 6-minutni test hoda (6MWT) kod ispitanika.
[0046] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje postupke za poboljšanje 6-minutnog testa hoda (6MWT) kod ispitanika koji ima poremećaj povezan sa transtiretinom (TTR). Postupci obuhvataju primenu terapeutski delotvorne količine agensa dvolančane RNKi na ispitaniku, pri čemu agens dvolančane RNKi sadrži sens lanac komplementaran sa antisens lancem, pri čemu pomenuti antisens lanac ima region komplementaran sa SEQ ID NO:2, pri čemu svaki lanac ima dužinu od oko 14 do oko 30 nukleotida, pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, pri čemu sens lanac sadrži ne više od 82'-fluor modifikacija; pri čemu antisens lanac sadrži ne više od 62'-fluor modifikacija; pri čemu sens lanac i antisens lanac nezavisno sadrže dve fosforotioatne veze na 5'-terminusu; i pri čemu je sens lanac konjugovan sa najmanje jednim ligandom.
[0047] U jednom otelotvorenju, agens dvolančane RNKi je predstavljen formulom (IIIe):
pri čemu:
np' je prepust od 2 nukleotida i svaki nukleotid u np' je povezan sa susednim nukleotidom putem fosforotioatne veze;
svaki Na, Nb, Nbi Nb' nezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 0-25 nukleotida koji su modifikovani ili nemodifikovani ili kombinacija prethodnog, i svaka sekvenca sadrži najmanje dva različito modifikovana nukleotida;
svaki YYY i Y'Y'Y' nezavisno predstavlja jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida.
[0048] U jednom otelotvorenju, ispitanik je čovek.
[0049] U jednom otelotvorenju, ispitanik je ispitanik koji boluje od bolesti povezane sa TTR-om. U drugom otelotvorenju, ispitanik je ispitanik kod koga postoji rizik od nastanka bolesti povezane sa TTR-om. U jednom otelotvorenju, ispitanik pod rizikom od nastanka bolesti povezane sa TTR-om nosi gensku mutaciju TTR koja je povezana sa nastankom bolesti povezane sa TTR-om, ili ispitanik sa porodičnom istorijom bolesti povezane sa TTR-om, ili ispitanik koji ima znake ili simptome koji ukazuju na nastanak TTR amiloidoze.
[0050] U jednom otelotvorenju, bolest povezana sa TTR-om je izabrana iz grupe koja se sastoji od senilne sistemske amiloidoze (SSA), sistemske familijarne amiloidoze, familijarne amiloidne polineuropatije (FAP), familijarne amiloidne kardiomiopatije (FAC), leptomeningealne amiloidoze/amiloidoze centralnog nervnog sistema (CNS) i hipertiroksinemije.
[0051] U jednom otelotvorenju, ispitanik ima amiloidozu povezanu sa TTR-om, i postupak smanjuje amiloidne naslage TTR kod ispitanika.
[0052] U jednom otelotvorenju, agens dvolančane RNKi se primenjuje na ispitaniku putem načina primene koji je izabran iz grupe koja se sastoji od supkutane, intravenske, intramuskularne, intrabronhijalne, intrapleuralne, intraperitonealne, intraarterijske, limfne, cerebrospinalne primene, i bilo koje njihove kombinacije. U drugom otelotvorenju, agens dvolančane RNKi se primenjuje na ispitaniku putem supkutane, intramuskularne ili intravenske primene. U još jednom otelotvorenju, agens dvolančane RNKi se primenjuje na ispitaniku putem supkutane primene.
[0053] U jednom otelotvorenju, postupci dalje obuhvataju procenu nivoa ekspresije TTR mRNK ili ekspresije TTR proteina u uzorku dobijenom od ispitanika.
[0054] U jednom otelotvorenju, primena agensa dvolančane RNKi ne dovodi do inflamatornog odgovora kod ispitanika, kako je procenjeno na osnovu nivoa citokina ili hemokina izabranog iz grupe koja se sastoji od G-CSF, IFN-γ, IL-10, IL-12 (p70), IL1β, IL-1ra, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, TNFα, i svih njihovih kombinacija, u uzorku ispitanika.
[0055] U jednom aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje postupke za lečenje ispitanika koji ima poremećaj povezan sa transtiretinom (TTR). Postupci obuhvataju primenu na ispitaniku fiksne doze od oko 12,5 mg do oko 200 mg (npr. oko 12,5 mg, oko 25 mg, oko 50 mg, oko 75 mg, oko 100 mg, oko 125 mg, oko 150 mg, oko 175 mg, ili oko 200 mg) agensa dvolančane RNKi, pri čemu agens dvolančane RNKi sadrži sens lanac komplementaran sa antisens lancem, pri čemu antisens lanac ima region komplementaran sa SEQ ID NO:2 (5'-UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA -3'), pri čemu svaki lanac ima dužinu od oko 14 do oko 30 nukleotida, pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, pri čemu sens lanac sadrži ne više od 82'-fluor modifikacija; pri čemu antisens lanac sadrži ne više od 62'-fluor modifikacija; pri čemu sens lanac i antisens lanac nezavisno sadrže dve fosforotioatne veze na 5'-terminusu; i pri čemu je sens lanac konjugovan sa najmanje jednim ligandom.
[0056] U drugom aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje postupke profilaktičkog lečenja ispitanika kod koga postoji rizik od pojave poremećaja povezanog sa transtiretinom (TTR). Postupci obuhvataju primenu fiksne doze od oko 12,5 mg do oko 200 mg (npr. oko 12,5 mg, oko 25 mg, oko 50 mg, oko 75 mg, oko 100 mg, oko 125 mg, oko 150 mg, oko 175 mg, ili
1
oko 200 mg) agensa dvolančane RNKi na ispitaniku, pri čemu agens dvolančane RNKi sadrži sens lanac komplementaran sa antisens lancem, pri čemu antisens lanac ima region komplementaran sa SEQ ID NO:2 (5'- UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA -3'), pri čemu svaki lanac ima dužinu od oko 14 do oko 30 nukleotida, pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, pri čemu sens lanac sadrži ne više od 82'-fluor modifikacija; pri čemu antisens lanac sadrži ne više od 62'-fluor modifikacija; pri čemu sens lanac i antisens lanac nezavisno sadrže dve fosforotioatne veze na 5'-terminusu; i pri čemu je sens lanac konjugovan sa najmanje jednim ligandom.
[0057] U jednom aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje postupke za lečenje ispitanika koji ima poremećaj povezan sa transtiretinom (TTR). Postupci obuhvataju primenu na ispitaniku doze od oko 0,15 mg/kg do oko 2,5 mg/kg (npr. oko 0,15 mg/kg, oko 0,3 mg/kg, oko 0,6 mg/kg, oko 1 mg/kg, oko 1,25 mg/kg, oko 2 mg/kg, oko 2,5 mg/kg, ili oko 3 mg/kg) agensa dvolančane RNKi, pri čemu agens dvolančane RNKi sadrži sens lanac komplementaran sa antisens lancem, pri čemu antisens lanac ima region komplementaran sa SEQ ID NO:2 (5'-UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA -3'), pri čemu svaki lanac ima dužinu od oko 14 do oko 30 nukleotida, pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, pri čemu sens lanac sadrži ne više od 82'-fluor modifikacija; pri čemu antisens lanac sadrži ne više od 62'-fluor modifikacija; pri čemu sens lanac i antisens lanac nezavisno sadrže dve fosforotioatne veze na 5'-terminusu; i pri čemu je sens lanac konjugovan sa najmanje jednim ligandom.
[0058] U jednom aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje postupke profilaktičkog lečenja ispitanika kod koga postoji rizik od nastanka poremećaja povezanog sa transtiretinom (TTR). Postupci obuhvataju primenu na ispitaniku doze od oko 0,15 mg/kg do oko 2,5 mg/kg (npr. oko 0,15 mg/kg, oko 0,3 mg/kg, oko 0,6 mg/kg, oko 1 mg/kg, oko 1,25 mg/kg, oko 2 mg/kg, oko 2,5 mg/kg, ili oko 3 mg/kg) agensa dvolančane RNKi, pri čemu agens dvolančane RNKi sadrži sens lanac komplementaran sa antisens lancem, pri čemu antisens lanac ima region komplementaran sa SEQ ID NO:2 (5'- UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA -3'), pri čemu svaki lanac ima dužinu od oko 14 do oko 30 nukleotida, pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, pri čemu sens lanac sadrži ne više od 82'-fluor modifikacija; pri čemu antisens lanac sadrži ne više od 62'-fluor modifikacija; pri čemu sens lanac i antisens lanac nezavisno sadrže dve fosforotioatne veze na 5'-terminusu; i pri čemu je sens lanac konjugovan sa najmanje jednim ligandom.
[0059] U drugom aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje postupke za smanjivanje, usporavanje ili zaustavljanje skora neuropatskog oštećenja (NIS) ili modifikovanog NIS (mNIS+7) kod ispitanika koji ima poremećaj povezan sa transtiretinom (TTR). Postupci obuhvataju primenu na ispitaniku doze od oko 0,15 mg/kg do oko 2,5 mg/kg (npr. oko 0,15 mg/kg, oko 0,3 mg/kg, oko 0,6 mg/kg, oko 1 mg/kg, oko 1,25 mg/kg, oko 2 mg/kg, oko 2,5 mg/kg, ili oko 3 mg/kg) agensa dvolančane RNKi, pri čemu agens dvolančane RNKi sadrži sens lanac komplementaran sa antisens lancem, pri čemu antisens lanac ima region komplementaran sa SEQ ID NO:2 (5'- UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA -3'), pri čemu svaki lanac ima dužinu od oko 14 do oko 30 nukleotida, pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, pri čemu sens lanac sadrži ne više od 82'-fluor modifikacija; pri čemu antisens lanac sadrži ne više od 62'-fluor modifikacija; pri čemu sens lanac i antisens lanac nezavisno sadrže dve fosforotioatne veze na 5'-terminusu; i pri čemu je sens lanac konjugovan sa najmanje jednim ligandom.
[0060] U još jednom aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje postupke za poboljšanje 6-minutnog testa hoda (6MWT) kod ispitanika koji ima poremećaj povezan sa transtiretinom (TTR). Postupci obuhvataju primenu na ispitaniku doze od oko 0,15 mg/kg do oko 2,5 mg/kg (npr. oko 0,15 mg/kg, oko 0,3 mg/kg, oko 0,6 mg/kg, oko 1 mg/kg, oko 1,25 mg/kg, oko 2 mg/kg, oko 2,5 mg/kg, ili oko 3 mg/kg) agensa dvolančane RNKi, pri čemu agens dvolančane RNKi sadrži sens lanac komplementaran sa antisens lancem, pri čemu antisens lanac ima region komplementaran sa SEQ ID NO:2 (5'- UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA -3'), pri čemu svaki lanac ima dužinu od oko 14 do oko 30 nukleotida, pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, pri čemu sens lanac sadrži ne više od 82'-fluor modifikacija; pri čemu antisens lanac sadrži ne više od 62'-fluor modifikacija; pri čemu sens lanac i antisens lanac nezavisno sadrže dve fosforotioatne veze na 5'-terminusu; i pri čemu je sens lanac konjugovan sa najmanje jednim ligandom.
[0061] U jednom aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje postupke za lečenje ispitanika koji ima poremećaj povezan sa transtiretinom (TTR). Postupci obuhvataju primenu na ispitaniku fiksne doze od oko 10 mg do oko 600 mg, oko 25 mg do oko 500 mg, oko 50 mg do oko 500 mg, ili oko 80 mg do oko 500 mg, oko 25 mg do oko 300 mg, oko 50 mg do oko 300 mg, ili oko 80 mg do oko 300 mg (npr. oko 10, oko 20, oko 30, oko 40, oko 50, oko 60, oko 70, oko
1
75, oko 80, oko 90, oko 100, oko 110, oko 120, oko 125, oko 130, oko 140, oko 150, oko 160, oko 170, oko 175, oko 180, oko 190, oko 200, oko 210, oko 220, oko 225, oko 230, oko 240, oko 250 mg, oko 260, oko 270, oko 275, oko 280, oko 290, oko 300, oko 310, oko 320, oko 325, oko 330, oko 340, oko 350, oko 360, oko 370, oko 375, oko 380, oko 390, oko 400, oko 410, oko 420, oko 425, oko 430, oko 440, oko 450 mg, oko 460, oko 470, oko 475, oko 480, oko 490, oko 500, oko 510, oko 520, oko 525, oko 530, oko 540, oko 550, oko 560, oko 570, oko 575, oko 580, oko 590, ili oko 600 mg) agensa dvolančane RNKi, pri čemu agens dvolančane RNKi sadrži sens lanac komplementaran sa antisens lancem, pri čemu antisens lanac ima region komplementaran sa SEQ ID NO:2 (5'- UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA -3'), pri čemu svaki lanac ima dužinu od oko 14 do oko 30 nukleotida, pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, pri čemu sens lanac sadrži ne više od 82'-fluor modifikacija; pri čemu antisens lanac sadrži ne više od 62'-fluor modifikacija; pri čemu sens lanac i antisens lanac nezavisno sadrže dve fosforotioatne veze na 5'-terminusu; i pri čemu je sens lanac konjugovan sa najmanje jednim ligandom.
[0062] U jednom aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje postupke profilaktičkog lečenja ispitanika kod koga postoji rizik od nastanka poremećaja povezanog sa transtiretinom (TTR). Postupci obuhvataju primenu na ispitaniku fiksne doze od oko 10 mg do oko 600 mg, oko 25 mg do oko 500 mg, oko 50 mg do oko 500 mg, ili oko 80 mg do oko 500 mg, oko 25 mg do oko 300 mg, oko 50 mg do oko 300 mg, ili oko 80 mg do oko 300 mg (npr. oko 10, oko 20, oko 30, oko 40, oko 50, oko 60, oko 70, oko 75, oko 80, oko 90, oko 100, oko 110, oko 120, oko 125, oko 130, oko 140, oko 150, oko 160, oko 170, oko 175, oko 180, oko 190, oko 200, oko 210, oko 220, oko 225, oko 230, oko 240, oko 250 mg, oko 260, oko 270, oko 275, oko 280, oko 290, oko 300, oko 310, oko 320, oko 325, oko 330, oko 340, oko 350, oko 360, oko 370, oko 375, oko 380, oko 390, oko 400, oko 410, oko 420, oko 425, oko 430, oko 440, oko 450 mg, oko 460, oko 470, oko 475, oko 480, oko 490, oko 500, oko 510, oko 520, oko 525, oko 530, oko 540, oko 550, oko 560, oko 570, oko 575, oko 580, oko 590, ili oko 600 mg) agensa dvolančane RNKi, pri čemu agens dvolančane RNKi sadrži sens lanac komplementaran sa antisens lancem, pri čemu antisens lanac ima region komplementaran sa SEQ ID NO:2 (5'-UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA -3'), pri čemu svaki lanac ima dužinu od oko 14 do oko 30 nukleotida, pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, pri čemu sens lanac sadrži ne više od 82'-fluor modifikacija; pri čemu antisens lanac sadrži ne više od 62'-fluor modifikacija; pri čemu
1
sens lanac i antisens lanac nezavisno sadrže dve fosforotioatne veze na 5'-terminusu; i pri čemu je sens lanac konjugovan sa najmanje jednim ligandom.
[0063] U drugom aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje postupke za smanjivanje, usporavanje ili zaustavljanje skora neuropatskog oštećenja (NIS) ili modifikovanog NIS (mNIS+7) kod ispitanika koji ima poremećaj povezan sa transtiretinom (TTR). Postupci obuhvataju primenu na ispitaniku fiksne doze od oko 10 mg do oko 600 mg, oko 25 mg do oko 500 mg, oko 50 mg do oko 500 mg, ili oko 80 mg do oko 500 mg, oko 25 mg do oko 300 mg, oko 50 mg do oko 300 mg, ili oko 80 mg do oko 300 mg (npr. oko 10, oko 20, oko 30, oko 40, oko 50, oko 60, oko 70, oko 75, oko 80, oko 90, oko 100, oko 110, oko 120, oko 125, oko 130, oko 140, oko 150, oko 160, oko 170, oko 175, oko 180, oko 190, oko 200, oko 210, oko 220, oko 225, oko 230, oko 240, oko 250, oko 260, oko 270, oko 275, oko 280, oko 290, oko 300, oko 310, oko 320, oko 325, oko 330, oko 340, oko 350, oko 360, oko 370, oko 375, oko 380, oko 390, oko 400, oko 410, oko 420, oko 425, oko 430, oko 440, oko 450, oko 460, oko 470, oko 475, oko 480, oko 490, oko 500, oko 510, oko 520, oko 525, oko 530, oko 540, oko 550, oko 560, oko 570, oko 575, oko 580, oko 590, ili oko 600 mg) agensa dvolančane RNKi, pri čemu agens dvolančane RNKi sadrži sens lanac komplementaran sa antisens lancem, pri čemu antisens lanac ima region komplementaran sa SEQ ID NO:2 (5'-UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA -3'), pri čemu svaki lanac ima dužinu od oko 14 do oko 30 nukleotida, pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, pri čemu sens lanac sadrži ne više od 82'-fluor modifikacija; pri čemu antisens lanac sadrži ne više od 62'-fluor modifikacija; pri čemu sens lanac i antisens lanac nezavisno sadrže dve fosforotioatne veze na 5'-terminusu; i pri čemu je sens lanac konjugovan sa najmanje jednim ligandom.
[0064] U još jednom aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje postupke za poboljšanje 6-minutnog testa hoda (6MWT) kod ispitanika koji ima poremećaj povezan sa transtiretinom (TTR). Postupci obuhvataju primenu na ispitaniku fiksne doze od oko 10 mg do oko 600 mg, oko 25 mg do oko 500 mg, oko 50 mg do oko 500 mg, ili oko 80 mg do oko 500 mg, oko 25 mg do oko 300 mg, oko 50 mg do oko 300 mg, ili oko 80 mg do oko 300 mg (npr. oko 10, oko 20, oko 30, oko 40, oko 50, oko 60, oko 70, oko 75, oko 80, oko 90, oko 100, oko 110, oko 120, oko 125, oko 130, oko 140, oko 150, oko 160, oko 170, oko 175, oko 180, oko 190, oko 200, oko 210, oko 220, oko 225, oko 230, oko 240, oko 250, oko 260, oko 270, oko 275, oko 280, oko 290, oko 300, oko 310, oko 320, oko 325, oko 330, oko 340, oko 350, oko 360,
1
oko 370, oko 375, oko 380, oko 390, oko 400, oko 410, oko 420, oko 425, oko 430, oko 440, oko 450, oko 460, oko 470, oko 475, oko 480, oko 490, oko 500, oko 510, oko 520, oko 525, oko 530, oko 540, oko 550, oko 560, oko 570, oko 575, oko 580, oko 590, ili oko 600 mg) agensa dvolančane RNKi, pri čemu agens dvolančane RNKi sadrži sens lanac komplementaran sa antisens lancem, pri čemu antisens lanac ima region komplementaran sa SEQ ID NO:2 (5'-UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA -3'), pri čemu svaki lanac ima dužinu od oko 14 do oko 30 nukleotida, pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, pri čemu sens lanac sadrži ne više od 82'-fluor modifikacija; pri čemu antisens lanac sadrži ne više od 62'-fluor modifikacija; pri čemu sens lanac i antisens lanac nezavisno sadrže dve fosforotioatne veze na 5'-terminusu; i pri čemu je sens lanac konjugovan sa najmanje jednim ligandom.
[0065] U jednom otelotvorenju, agens dvolančane RNKi je predstavljen formulom (IIIe):
pri čemu:
np' je prepust od 2 nukleotida i svaki nukleotid u np' je povezan sa susednim nukleotidom putem fosforotioatne veze;
svaki Na, Nb, Nbi Nb' nezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 0-25 nukleotida koji su modifikovani ili nemodifikovani ili kombinacija prethodnog, i svaka sekvenca sadrži najmanje dva različito modifikovana nukleotida;
svaki YYY i Y'Y'Y' nezavisno predstavlja jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida.
[0066] U jednom otelotvorenju, antisens lanac sadrži sekvencu nukleotida odabranu iz grupe koja se sastoji od 5'- usCfsuugguuacaugAfaaucccasusc - 3' (SEQ ID NO: 6), 5'-usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc - 3'(SEQ ID NO: 7), 5'-UfsCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc - 3' (SEQ ID NO: 8) i 5'-VPusCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc - 3' (SEQ ID NO: 9), pri čemu, a, c, g, i u su 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G, ili U; Af, Cf, Gf i Uf su 2'-fluor A, C, G, ili U; s je fosforotioatna veza; a VP je imitacija 5'-fosfata.
1
[0067] U jednom otelotvorenju, sens i antisens lanci sadrže sekvence nukleotida odabrane iz grupe koja se sastoji od 5'- usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga - 3' (SEQ ID NO: 10) i 5'-usCfsuugguuacaugAfaaucccasusc - 3' (SEQ ID NO: 6); 5'- usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga -3' (SEQ ID NO: 10) i 5'- usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc - 3' (SEQ ID NO: 7); 5'-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga - 3' (SEQ ID NO: 10) i 5'-UfsCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc - 3'(SEQ ID NO: 8); i 5'-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga - 3' (SEQ ID NO: 10) i 5'-VPusCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc - 3' (SEQ ID NO: 9), pri čemu, a, c, g, i u su 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G, ili U; Af, Cf, Gf i Uf su 2'-fluor A, C, G, ili U; i s je fosforotioatna veza; a VP je imitacija 5'-fosfata.
[0068] U jednom otelotvorenju, sens i antisens lanci sadrže sekvence nukleotida
5'- usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga - 3' (SEQ ID NO: 10) i
5'- usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc - 3' (SEQ ID NO: 7),
pri čemu, a, c, g i u su 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G, ili U; Af, Cf, Gf i Uf su 2'-fluor A, C, G, ili U; a s je fosforotioatna veza.
[0069] Fiksna doza agensa dvolančane RNKi može da se primenjuje na ispitaniku jednom na oko svake 4 nedelje, svakih 5 nedelja, svakih šest nedelja, svakih osam nedelja ili kvartalno.
[0070] Doza agensa dvolančane RNKi može da se primenjuje na ispitaniku jednom na oko svake 4 nedelje, svakih 5 nedelja, svakih šest nedelja, svakih osam nedelja ili kvartalno.
[0071] U jednom otelotvorenju, agens dvolančane RNKi se primenjuje na ispitaniku otprilike jednom u svakom kvartalu.
[0072] U jednom otelotvorenju, agens dvolančane RNKi se hronično primenjuje na ispitaniku.
[0073] U jednom otelotvorenju, ispitanik je čovek.
[0074] U jednom otelotvorenju, ispitanik je ispitanik koji boluje od bolesti povezane sa TTR-om. U drugom otelotvorenju, ispitanik je ispitanik kod koga postoji rizik od nastanka bolesti povezane sa TTR-om. U jednom otelotvorenju, ispitanik pod rizikom od nastanka bolesti
1
povezane sa TTR-om nosi gensku mutaciju TTR koja je povezana sa nastankom bolesti povezane sa TTR-om, ili ispitanik sa porodičnom istorijom bolesti povezane sa TTR-om, ili ispitanik koji ima znake ili simptome koji ukazuju na nastanak TTR amiloidoze.
[0075] U jednom otelotvorenju, bolest povezana sa TTR-om je izabrana iz grupe koja se sastoji od senilne sistemske amiloidoze (SSA), sistemske familijarne amiloidoze, familijarne amiloidne polineuropatije (FAP), familijarne amiloidne kardiomiopatije (FAC), leptomeningealne amiloidoze/amiloidoze centralnog nervnog sistema (CNS) i hipertiroksinemije.
[0076] U jednom otelotvorenju, ispitanik ima amiloidozu povezanu sa TTR-om, i postupak smanjuje amiloidne naslage TTR kod ispitanika.
[0077] U jednom otelotvorenju, agens dvolančane RNKi se primenjuje na ispitaniku putem načina primene koji je izabran iz grupe koja se sastoji od supkutane, intravenske, intramuskularne, intrabronhijalne, intrapleuralne, intraperitonealne, intraarterijske, limfne, cerebrospinalne primene, i bilo koje njihove kombinacije. U drugom otelotvorenju, agens dvolančane RNKi se primenjuje na ispitaniku putem supkutane, intramuskularne ili intravenske primene. U još jednom otelotvorenju, agens dvolančane RNKi se primenjuje na ispitaniku putem supkutane primene, npr. samoprimenom, npr. putem prethodno napunjenog šprica ili šprica sa automatskim injektovanjem.
[0078] U jednom otelotvorenju, postupci dalje obuhvataju procenjivanje nivoa ekspresije TTR iRNK ili ekspresije TTR proteina u uzorku dobijenom od ispitanika.
[0079] U jednom otelotvorenju, primena agensa dvolančane RNKi ne dovodi do inflamatornog odgovora kod ispitanika kako je procenjeno na osnovu nivoa citokina ili hemokina izabranog iz grupe koja se sastoji od G-CSF, IFN-γ, IL-10, IL-12 (p70), IL1β, IL-1ra, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, TNFα, i svih njihovih kombinacija, u uzorku ispitanika.
[0080] U jednom otelotvorenju, agens pogodan za upotrebu u postupcima iz pronalaska je AD-65492. AD-65492 može hronično da se primenjuje na ispitaniku na svake 4 nedelje, svakih 5 nedelja, ili svakih šest nedelja, ili svakog kvartala.
2
[0081] U jednom aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje agense dvolančane ribonukleinske kiseline (RNKi) za upotrebu u inhibiciji ekspresije transtiretina (TTR) u ćeliji. Agensi uključuju sens lanac komplementaran sa antisens lancem, pri čemu sens i antisens lanac sadrže sekvence nukleotida odabrane iz grupe koja se sastoji od bilo kojih sekvenci nukleotida u Tabeli 5.
[0082] U drugom aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje agense dvolančane ribonukleinske kiseline (RNKi) za upotrebu u inhibiciji ekspresije transtiretina (TTR) u ćeliji. Agensi uključuju sens lanac komplementaran sa antisens lancem, antisens lanac koji sadrži region komplementarnosti koji sadrži najmanje 15 uzastopnih nukleotida koji se razlikuju za ne više od 3 nukleotida od bilo koje od antisens sekvenci u Tabeli 6, pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi; i pri čemu je sens lanac konjugovan sa najmanje jednim ligandom.
[0083] Sens i antisens lanac mogu da sadrže sekvence nukleotida odabrane iz grupe koja se sastoji od bilo koje od sekvenci nukleotida u Tabeli 6 ili Tabeli 7.
[0084] U jednom aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje agense dvolančane ribonukleinske kiseline (RNKi) za upotrebu u inhibiciji ekspresije transtiretina (TTR) u ćeliji, pri čemu agensi RNKi sadrže sens lanac komplementaran sa antisens lancem, pri čemu sens lanac sadrži sekvencu nukleotida 5'- usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga - 3' (SEQ ID NO: 10), a antisens lanac sadrži sekvencu nukleotida 5'-usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc - 3' (SEQ ID NO: 7), pri čemu, a, c, g, i u su 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G, ili U; Af, Cf, Gf i Uf su 2'-fluor A, C, G, ili U; i s je fosforotioatna veza.
[0085] U drugom aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje postupke lečenja ispitanika koji boluje od bolesti povezane sa TTR-om. Postupci obuhvataju primenu na ispitaniku doze od oko 50 mg do oko 300 mg agensa dvolančane RNKi, pri čemu agens RNKi sadrži sens lanac komplementaran sa antisens lancem, pri čemu sens lanac sadrži sekvencu nukleotida 5'-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga - 3' (SEQ ID NO: 10), a antisens lanac sadrži sekvencu nukleotida 5'- usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc - 3' (SEQ ID NO: 7), pri čemu, a, c, g, i u su 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G, ili U; Af, Cf, Gf i Uf su 2'-fluor A, C, G, ili U; i s je fosforotioatna veza, čime se leči ispitanik koji boluje od bolesti povezane sa TTR-om.
[0086] U još jednom aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje postupke za profilaktičko lečenje ispitanika kod koga postoji rizik od nastanka bolesti povezane sa TTR-om. Postupci obuhvataju primenu na ispitaniku doze od oko 50 mg do oko 300 mg agensa dvolančane RNKi, pri čemu agens RNKi sadrži sens lanac komplementaran sa antisens lancem, pri čemu sens lanac sadrži sekvencu nukleotida 5'-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga - 3' (SEQ ID NO: 10), a antisens lanac sadrži sekvencu nukleotida 5'- usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc - 3' (SEQ ID NO: 7), pri čemu, a, c, g, i u su 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G, ili U; Af, Cf, Gf i Uf su 2'-fluor A, C, G, ili U; i s je fosforotioatna veza, čime se profilaktički leči ispitanik kod koga postoji rizik od nastanka bolesti povezane sa TTR-om.
[0087] U jednom aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje postupke za smanjivanje, usporavanje ili zaustavljanje skora neuropatskog oštećenja (NIS) ili modifikovanog NIS (mNIS+7) kod ispitanika koji boluje od bolesti povezane sa TTR-om ili je pod rizikom od nastanka bolesti povezane sa TTR-om. Postupci obuhvataju primenu na ispitaniku doze od oko 50 mg do oko 300 mg agensa dvolančane RNKi, pri čemu agens RNKi sadrži sens lanac komplementaran sa antisens lancem, pri čemu sens lanac sadrži sekvencu nukleotida 5'-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga - 3' (SEQ ID NO: 10), a antisens lanac sadrži sekvencu nukleotida 5'-usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc - 3' (SEQ ID NO: 7), pri čemu, a, c, g, i u su 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G, ili U; Af, Cf, Gf i Uf su 2'-fluor A, C, G, ili U; i s je fosforotioatna veza, čime se smanjuje, usporava ili zaustavlja skor neuropatskog oštećenja (NIS) ili modifikovani NIS (mNIS+7) kod ispitanika.
[0088] U drugom aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje postupke za poboljšanje 6-minutnog testa hoda (6MWT) kod ispitanika koji boluje od bolesti povezane sa TTR-om ili je pod rizikom od nastanka bolesti povezane sa TTR-om. Postupci obuhvataju primenu na ispitaniku doze od oko 50 mg do oko 300 mg agensa dvolančane RNKi, pri čemu agens RNKi sadrži sens lanac komplementaran sa antisens lancem, pri čemu sens lanac sadrži sekvencu nukleotida 5'-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga - 3' (SEQ ID NO: 10), a antisens lanac sadrži sekvencu nukleotida 5'- usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc - 3' (SEQ ID NO: 7), pri čemu, a, c, g, i u su 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G, ili U; Af, Cf, Gf i Uf su 2'-fluor A, C, G, ili U; i s je fosforotioatna veza, čime se poboljšava 6-minutni test hoda (6MWT) kod ispitanika koji boluje od bolesti povezane sa TTR-om ili je pod rizikom od nastanka bolesti povezane sa TTR-om.
[0089] Predmetno otkriće je dalje ilustrovano sledećim detaljnim opisima i slikama.
Kratak opis slika
[0090]
Slika 1 je grafikon koji prikazuje stabilnost naznačenih agenasa RNKi na 24-časovnom testu tristozomske stabilnosti.
Slika 2A je grafikon koji prikazuje stabilnost naznačenih agenasa RNKi na 24-časovnom testu stabilnosti citozola pacova, a Slika 2B je grafikon koji prikazuje stabilnost naznačenih agenasa RNKi na 24-časovnom testu tristozomske stabilnosti.
Slika 3 je grafikon koji prikazuje supresiju TTR proteina kod transgenih miševa koji eksprimiraju V30M varijantu humanog TTR (V30M hTTR) nakon primene jedne supkutane doze od 1 mg/kg naznačenih agenasa RNKi.
Slika 4 je grafikon koji prikazuje supresiju TTR proteina kod transgenih miševa koji eksprimiraju hTTR V30M nakon primene jedne supkutane doze od 2,5 mg/kg naznačenih agenasa RNKi.
Slika 5 je grafikon koji prikazuje supresiju TTR proteina kod transgenih miševa koji eksprimiraju hTTR V30M nakon primene nedeljne doze AD-65492 od 2 mg/kg tokom tri nedelje (QWx3).
Slika 6A je grafikon koji prikazuje supresiju TTR proteina kod transgenih miševa koji eksprimiraju hTTR V30M nakon supkutane primene mesečne doze naznačenih agenasa RNKi od 0,3 mg/kg tokom četiri meseca (QMx4 sa 0,3 mg/kg). Slika 6B je grafikon koji prikazuje supresiju TTR proteina kod transgenih miševa koji eksprimiraju hTTR V30M nakon supkutane primene mesečne doze naznačenih agenasa RNKi od 1 mg/kg tokom četiri meseca (QMx4 sa 1 mg/kg). Slika 6C je grafikon koji prikazuje supresiju TTR proteina kod transgenih miševa koji eksprimiraju hTTR V30M nakon supkutane primene mesečne doze naznačenih agenasa RNKi od 3 mg/kg tokom četiri meseca (QMx4 sa 3 mg/kg).
Slika 7 prikazuje dizajn studije supkutane primene AD-65492 i AD-66017 na majmunima cynomologous.
Slika 8A je grafikon koji prikazuje supresiju TTR proteina kod majmuna Cynomologous nakon primene jedne supkutane doze od 0,3 mg/kg naznačenih agenasa RNKi. Slika 8B je grafikon koji prikazuje supresiju TTR proteina kod majmuna Cynomologous nakon primene jedne supkutane doze od 1 mg/kg AD-65492, jedne supkutane doze od 1 mg/kg AD-66017,
2
ili jedne supkutane doze 2,5 mg/kg AD-51547. Slika 8C je grafikon koji prikazuje supresiju TTR proteina kod Cynomologous majmuna nakon primene jedne supkutane doze od 3 mg/kg AD-65492, jedne supkutane doze od 3 mg/kg AD-66017, ili jedne supkutane doze 5 mg/kg AD-51547.
Slika 9A je grafikon koji prikazuje supresiju TTR proteina kod majmuna Cynomologous nakon primene mesečne supkutane doze AD-65492 od 1 mg/kg tokom četiri meseca (QMx4), mesečne supkutane doze AD-66017 od 1 mg/kg tokom četiri meseca (QMx4) ili dnevne doze od 5 mg/kg tokom pet dana, nakon čega sledi nedeljna doza od 5 mg/kg tokom četiri nedelje (QDx5, QWx4) AD-51547. Slika 9B je grafikon koji prikazuje supresiju TTR proteina kod majmuna Cynomologous nakon primene mesečne supkutane doze od 3 mg/kg tokom četiri meseca (QMx4) naznačenih agenasa RNKi.
Slika 10A je grafikon koji prikazuje održavanje supresije TTR putem supkutane primene mesečne doze AD-65492 od 1 mg/kg tokom četiri meseca (QMx4; puna linija) u poređenju sa supresijom TTR nakon jedne supkutane doze AD-65492 od 1 mg/kg (isprekidana linija) kod majmuna Cynomologous.
Slika 10B je grafikon koji prikazuje zbirno dejstvo supkutane primene mesečne doze AD-66017 od 1 mg/kg tokom četiri meseca (QMx4; puna linija) na supresiju TTR proteina u poređenju sa jednom supkutanom dozom AD-66017 od 1 mg/kg (isprekidana linija) kod majmuna Cynomologous.
Slika 11 je grafikon koji prikazuje produženu serumsku supresiju TTR kod majmuna Cynomologous nakon mesečne supkutane primene doze AD-65492 od 1 mg/kg tokom četiri meseca (QMx4) ili mesečne supkutane primene doze AD-65492 od 3 mg/kg tokom četiri meseca (QMx4) u poređenju sa jednom supkutano primenjenom dozom AD-65492 od 1 mg/kg ili jednom supkutano primenjenom dozom AD-65492 od 0,3 mg/kg.
Slika 12 prikazuje dizajn studije supkutane primene AD-65492 na majmunima Cynomologous.
Slika 13 je grafikon koji prikazuje robusnu serumsku supresiju TTR kod majmuna Cynomologous nakon mesečne supkutane primene doze AD-65492 od 0,3 mg/kg tokom šest meseci (QMx6) ili mesečne supkutane primene doze AD-65492 od 0,6 mg/kg tokom šest meseci (QMx6) ili primene jedne inicijalne doze AD-65492 (QMx1) od 1 mg/kg koja je praćena mesečnom dozom AD-65492 od 0,3 mg/kg počevši od 28. dana nakon inicijalne doze tokom pet meseci (QMx5).
Detaljan opis pronalaska
[0091] Predmetno otkriće obezbeđuje agense RNKi, npr. agense dvolančane RNKi i kompozicije koje ciljaju gen transtiretina (TTR). Otkriće takođe obezbeđuje postupke za inhibiciju ekspresije TTR i postupke za lečenje ili prevenciju bolesti povezane sa TTR-om kod ispitanika koji koristi agense RNKi, npr. agense dvolančane RNKi, iz pronalaska.
Predmetni pronalazak se zasniva, barem delimično, na otkriću da je za agense RNKi kod kojih su suštinski svi nukleotidi na sens lancu i suštinski svi nukleotidi na antisens lancu modifikovani nukleotidi i koji sadrži ne više od 82'-fluor modifikacija (npr. ne više od 72'-fluor modifikacija, ne više od 62'-fluor modifikacija, ne više od 52'-fluor modifikacija, ne više od 42'-fluor modifikacije, ne više od 52'-fluor modifikacija, ne više od 42'-fluor modifikacije, ne više od 32'-fluor modifikacije, ili ne više od 22'-fluor modifikacije) na sens lancu, ne više od 62'-fluor modifikacija (npr. ne više od 52'-fluor modifikacija, ne više od 4 2'-fluor modifikacije, ne više od 32'-fluor modifikacije, ili ne više od 22'-fluor modifikacije) na antisens lancu, dve fosforotioatne veze na 5'-kraju sens lanca, dve fosforotioatne veze na 5'-kraju antisens lanca i ligand, npr. GalNAc3ligand, ovde pokazano da su delotvorni u utišavanju aktivnosti TTR gena. Ovi agensi pokazuju iznenađujuće pojačanu aktivnost utišavanja TTR gena. Bez namere da se ograničimo teorijom, veruje se da kombinacija ili potkombinacija prethodnih modifikacija i specifičnih ciljnih mesta u ovim agensima RNKi daje agensima RNKi iz pronalaska poboljšanu delotvornost, stabilnost, potentnost i trajnost.
[0092] Sledeći detaljan opis otkriva kako da se naprave i koriste kompozicije koje sadrže iRNK za selektivnu inhibiciju ekspresije TTR gena, kao i kompozicije, upotrebe i postupke za lečenje ispitanika sa bolestima i poremećajima koji bi imali korist od inhibicije i/ili smanjenja ekspresije TTR gena.
I. Definicije
[0093] Kako bi se predmetni pronalazak lakše razumeo, prvo se definišu određeni pojmovi. Pored toga, treba imati u vidu da svaki put kada se navodi vrednost ili raspon vrednosti za parametar, namera je da vrednosti i rasponi između navedenih vrednosti takođe budu deo ovog pronalaska.
2
[0094] Odrednice za jedninu se ovde koriste da se označi jedan ili više od jednog (tj. najmanje jedan) gramatičkih predmeta odrednice. Na primer, „element“ znači jedan element ili više od jednog elementa, npr. množina elemenata.
[0095] Termin „uključujući“ se ovde koristi da znači „uključujući ali bez ograničenja“, i koristi se naizmenično sa tom frazom.
[0096] Termin „ili“ se ovde koristi da znači „i/ili“, i koristi se naizmenično sa tim terminom, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije.
[0097] Termin „oko“ se ovde koristi da znači u okviru uobičajenih raspona tolerancije u struci. Na primer, „oko“ može da se razume kao u okviru od oko 2 standardne devijacije od aritmetičke sredine. U određenim otelotvorenjima, oko znači 10%. U određenim otelotvorenjima, oko znači 5%. Kada je „oko“ prisutno pre niza brojeva ili raspona, jasno je da „oko“ može da modifikuje svaki od brojeva u nizu ili rasponu.
[0098] Kako se ovde koristi, „transtiretin“ („TTR“) označava dobro poznati gen i protein. TTR je poznat i kao prealbumin, HsT2651, PALB i TBPA. TTR deluje kao transporter retinol-vezujućeg proteina (RBP), tiroksina (T4) i retinola, a takođe deluje i kao proteaza. Jetra izlučuje TTR u krv, a horoidni pleksus izlučuje TTR u cerebrospinalnu tečnost. TTR se takođe eksprimira u pankreasu i epitelu retinalnog pigmenta. Najveći klinički značaj TTR je što i normalni i mutantni protein TTR mogu da grade amiloidne filamente koji se talože u vanćelijskim naslagama, izazivajući amiloidozu. Vidite, npr. Saraiva M.J.M. (2002) Expert Reviews in Molecular Medicine, 4(12):1-11 za pregled. Molekulsko kloniranje i nukleotidne sekvence transtiretina pacova, kao i distribuciju ekspresije mRNK, opisali su Dickson, P.W. i sar. (1985) J. Biol. Chem.260(13)8214-8219. Rendgenska kristalna struktura humanog TTR je opisana u Blake, C.C. i sar. (1974) J Mol Biol 88, 1-12. Sekvenca transkripta iRNK humanog TTR može se naći pod RefSeq pristupnim brojem Nacionalnog centra za biotehnološke informacije (NCBI) NM_000371 (npr. SEQ ID NO:1 i 5). Sekvenca mRNK mišjeg TTR može se naći pod RefSeq pristupnim brojem NM_013697.2, a sekvenca mRNK pacovskog TTR može se naći pod RefSeq pristupnim brojem NM_012681.1. Dodatni primeri mRNK sekvenci TTR su lako dostupni koristeći javno dostupne baze podataka, npr.
GenBank, UniProt i OMIM.
2
[0099] Kako se ovde koristi, „ciljna sekvenca“ označava uzastopni deo sekvence nukleotida molekula mRNK nastao tokom transkripcije TTR gena, uključujući mRNK koja je proizvod RNK obrade primarnog proizvoda transkripcije. U jednom otelotvorenju, ciljni deo sekvence će biti dugačak najmanje dovoljno da služi kao supstrat za iRNK-usmereno cepanje na tom delu sekvence nukleotida molekula mRNK nastalog tokom transkripcije TTR gena, ili blizu njega. U jednom otelotvorenju, ciljna sekvenca je u regionu TTR gena koji kodira protein. U drugom otelotvorenju, ciljna sekvenca je u 3' UTR TTR gena.
[0100] Ciljna sekvenca može imati dužinu od oko 9-36 nukleotida, npr. dužinu od oko 15-30 nukleotida. Na primer, ciljna sekvenca može imati dužinu od oko 15-30 nukleotida, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, ili 21-22 nukleotida. U nekim otelotvorenjima, ciljna sekvenca ima dužinu od oko 19 do oko 30 nukleotida. U drugim otelotvorenjima, ciljna sekvenca ima dužinu od oko 19 do oko 25 nukleotida. U još daljim otelotvorenjima, ciljna sekvenca ima dužinu od oko 19 do oko 23 nukleotida. U nekim otelotvorenjima, ciljna sekvenca ima dužinu od oko 21 do oko 23 nukleotida. Rasponi i dužine između prethodno navedenih raspona i dužina su takođe razmatrani kao deo ovog otkrića.
[0101] U nekim otelotvorenjima otkrića, ciljna sekvenca TTR gena sadrži nukleotide 615-637 SEQ ID NO:1 ili nukleotide 505-527 SEQ ID NO:5 (tj.5'-GATGGGATTTCATGTAACCAAGA - 3'; SEQ ID NO:4).
[0102] Kako se ovde koristi, termin „lanac koji sadrži sekvencu“ označava oligonukleotid koji sadrži lanac nukleotida koji je opisan sekvencom koja se označava koristeći standardnu nomenklaturu za nukleotide.
[0103] „G“, „C“, „A“, „T“ i „U“ generalno označavaju nukleotid koji sadrži guanin, citozin, adenin, timidin, odnosno uracil kao bazu. Međutim, biće jasno da termin „ribonukleotid“ ili „nukleotid“ može takođe da označava modifikovani nukleotid, kao što je detaljnije opisano u nastavku, ili surogatski zamenjeni ostatak (vidite, npr. Tabelu 2). Stručnjaku je poznato da guanin, citozin, adenin i uracil mogu da se zamene drugim ostacima bez značajne izmene
2
svojstava baznog para oligonukleotida koji sadrži nukleotid sa takvim zamenjenim ostatkom. Na primer, bez ograničenja, nukleotid koji kao bazu sadrži inozin može bazno da se spari sa nukleotidima koji sadrže adenin, citozin ili uracil. Stoga, nukleotidi koji sadrže uracil, guanin ili adenin mogu da se zamene u sekvencama nukleotida dsRNK koje se javljaju u pronalasku, nukleotidom koji sadrži, na primer, inozin. U drugom primeru, adenin i citozin bilo gde u oligonukleotidu mogu da se zamene guaninom, odnosno uracilom radi nastanka G-U klimavog baznog sparivanja sa ciljnom mRNK. Sekvence koje sadrže takve zamenjene ostatke pogodne su za kompozicije i postupke prikazane u pronalasku.
[0104] Termini „iRNK“, „agens RNKi“, „agens RNK interferencije“, koji se ovde naizmenično koriste, označavaju agens koji sadrži RNK, kako je taj pojam ovde definisan, i koji posreduje u ciljanom cepanju transkripta RNK putem puta RNK-indukovanog utišavajućeg kompleksa (RISC). iRNK usmerava degradaciju mRNK specifičnu za sekvencu putem procesa koji je poznat kao RNK interferencija (RNKi). iRNK moduliše, npr. inhibira, ekspresiju TTR gena u ćeliji, npr. ćeliji u ispitaniku, kao što je ispitanik sisar.
[0105] U jednom otelotvorenju, agens RNKi iz otkrića uključuje jednolančanu RNK koja interaguje sa ciljnom sekvencom RNK, npr. ciljnom sekvencom mRNK TTR, radi usmeravanja cepanja ciljne RNK. Bez želje da se ograničimo teorijom, veruje se da se dugačka dvolančana RNK uvedena u ćelije razbija na dvolančane kratke interferirajuće RNK (siRNK) koje sadrže sens lanac i antisens lanac putem endonukleaze tipa III koja je poznata kao dajser (Sharp i sar. (2001) Genes Dev.15:485). Dajser, enzim sličan ribonukleazi III, obrađuje ove dsRNK u kratke interferirajuće RNK od 19-23 bazna para sa karakterističnim 3' prepustima od dve baze (Bernstein, i sar. (2001) Nature 409:363). Ove siRNK se zatim inkorporiraju u RNK-indukovani utišavajući kompleks (RISC) gde jedna ili više helikaza raspliće dvojnu spiralu siRNK, što omogućava komplementarnom antisens lancu da navodi prepoznavanje cilja (Nykanen, i sar. (2001) Cell 107:309). Nakon vezivanja za odgovarajuću ciljnu mRNK, jedna ili više endonukleaza u RISC cepa cilj radi indukovanja utišavanja (Elbashir, i sar. (2001) Genes Dev.15:188). Tako, u jednom aspektu, otkriće se odnosi na jednolančanu siRNK (ssRNK) (antisens lanac dvojne spirale siRNK) nastalu u ćeliji, koja promoviše nastanak RISC kompleksa radi utišavanja ciljnog gena, tj. TTR gena. Shodno tome, termin „siRNK“ se ovde takođe koristi da označi RNKi kako je prethodno opisana.
2
[0106] U drugom otelotvorenju, agens RNKi može biti jednolančana RNK koja je uvedena u ćeliju ili organizam radi inhibicije ciljne mRNK. Agens jednolančane RNKi se vezuje za RISC endonukleazu, argonaut 2, koja zatim cepa ciljnu mRNK. Jednolančane siRNK su uopšteno 15-30 nukleotida, i hemijski su modifikovane. Dizajn i testiranje jednolančanih siRNK su opisani u U.S. patentu br.8,101,348 i u Lima i sar. (2012) Cell 150:883-894. Bilo koja od ovde opisanih sekvenci antisens nukleotida može da se koristi kao jednolančana RNK, kao što je ovde opisano, ili kao hemijski modifikovana putem postupaka koji su opisani u Lima i sar. (2012) Cell 150:883-894.
[0107] U drugom otelotvorenju, „iRNK“ za upotrebu u kompozicijama, primenama i postupcima iz pronalaska je dvolančana RNK i ovde se naziva „agens dvolančane RNKi“, „molekul dvolančane RNK (dsRNK)“, „agens dsRNK“ ili „dsRNK“. Termin
„dsRNK“ označava kompleks molekula ribonukleinske kiseline koji ima strukturu dvojne spirale koja sadrži dva antiparalelna i u velikoj meri komplementarna lanca nukleinske kiseline, za koje se kaže da imaju „sens“ i „antisens“ orijentaciju u odnosu na ciljnu RNK, tj. TTR gen. U nekim otelotvorenjima pronalaska, dvolančana RNK (dsRNK) pokreće degradaciju ciljne RNK, npr. mRNK, putem mehanizma posttranskripcionog utišavanja gena koji se ovde naziva RNK interferencija ili RNKi.
[0108] Uopšteno, većina nukleotida svakog lanca molekula dsRNK su ribonukleotidi, ali kao što je ovde detaljno opisano, svaki pojedinačni, ili oba lanca mogu takođe da uključuju jedan ili više nukleotida koji nisu ribonukleotid, npr. dezoksiribonukleotid i/ili modifikovani nukleotid. Dodatno, kako se koristi u ovoj specifikaciji, „agens RNKi“ može da uključuje ribonukleotide sa hemijskim modifikacijama; agens RNKi može da sadrži značajne modifikacije više nukleotida.
[0109] Kako se ovde koristi, termin „modifikovani nukleotid“ označava nukleotid koji nezavisno ima modifikovani ostatak šećera, modifikovanu internukleotidnu vezu i/ili modifikovanu nukleobazu. Tako, termin modifikovani nukleotid obuhvata supstitucije, adicije ili uklanjanje, npr. funkcionalne grupe ili atoma, za internukleotidne veze, ostatke šećera ili nukleobaze. Modifikacije pogodne za upotrebu u agensima iz pronalaska uključuju sve vrste modifikacija koje su ovde prikazane ili su poznate u struci. Sve takve modifikacije, kako se koriste u molekulu tipa siRNK, obuhvaćene su sa „agens RNKi“ za svrhe ove specifikacije i zahteva.
2
[0110] Region dvojne spirale može biti bilo koje dužine koja dopušta specifičnu degradaciju željene ciljne RNK preko RISC puta, i može imati dužinu u rasponu od oko 9 do 36 baznih parova, npr. dužine oko 15-30 baznih parova, na primer, dužine oko 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, ili 36 baznih parova, recimo dužine oko 15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, ili 21-22 baznih parova. Rasponi i dužine između prethodno navedenih raspona i dužina su takođe razmatrani kao deo ovog otkrića.
[0111] Dva lanca koja grade strukturu dvojne spirale mogu biti različiti delovi jednog većeg molekula RNK, ili mogu biti odvojeni molekuli RNK. Kada su dva lanca deo jednog većeg molekula, te tako luk povezan putem neprekinutog lanca nukleotida između 3'-kraja jednog lanca i 5'-kraja odgovarajućeg drugog lanca koji grade strukturu dvojne spirale, povezujući lanac RNK se naziva „petlja ukosnice“. Petlja ukosnice može da sadrži najmanje jedan nespareni nukleotid. U nekim otelotvorenjima, petlja ukosnice može da sadrži najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7, najmanje 8, najmanje 9, najmanje 10, najmanje 20, najmanje 23 ili više nesparenih nukleotida. U nekim otelotvorenjima, petlja ukosnice može biti 10 ili manje nukleotida. U nekim otelotvorenjima, petlja ukosnice može biti 8 ili manje nesparenih nukleotida. U nekim otelotvorenjima, petlja ukosnice može biti 4-10 nesparenih nukleotida. U nekim otelotvorenjima, petlja ukosnice može biti 4-8 nukleotida.
[0112] Kada su dva suštinski komplementarna lanca dsRNK sadržana u različitim molekulima RNK, ti molekuli ne moraju, ali mogu biti kovalentno vezani. Kada su dva lanca povezana kovalentno drugim načinom sem neprekinutog lanca nukleotida između 3'-kraja jednog lanca i 5'-kraja odgovarajućeg drugog lanca koji formira dupleks strukturu, povezujuća struktura se naziva „linker“. Lanci RNK mogu imati isti ili različiti broj nukleotida. Maksimalni broj baznih parova je broj nukleotida u najkraćem lancu dsRNK umanjen za prepuste koji su prisutni u dupleksu. Pored strukture dvojne spirale, RNKi može da sadrži jedan ili više nukleotidnih prepusta.
[0113] U jednom otelotvorenju, agens RNKi iz otkrića je dsRNK, čiji svaki lanac je dužine 24-30 nukleotida, koja interaguje sa ciljnom sekvencom RNK, npr. ciljnom sekvencom mRNK TTR, radi usmeravanja cepanja ciljne RNK. Bez želje da se ograničimo teorijom, dugačka dvolančana RNK uvedena u ćelije se razbija na siRNK putem endonukleaze tipa III poznate kao dajser (Sharp i sar. (2001) Genes Dev.15:485). Dajser, enzim sličan ribonukleazi III, obrađuje ove dsRNK u kratke interferirajuće RNK od 19-23 bazna para sa karakterističnim 3' prepustima od dve baze (Bernstein, i sar. (2001) Nature 409:363). Ove siRNK se zatim inkorporiraju u RNK-indukovani utišavajući kompleks (RISC) gde jedna ili više helikaza raspliće dvojnu spiralu siRNK, što omogućava komplementarnom antisens lancu da navodi prepoznavanje cilja (Nykanen, i sar. (2001) Cell 107:309). Nakon vezivanja za odgovarajuću ciljnu mRNK, jedna ili više endonukleaza u RISC cepa cilj radi indukovanja utišavanja (Elbashir, i sar. (2001) Genes Dev.15:188). U jednom otelotvorenju agensa RNKi, najmanje jedan lanac sadrži 3' prepust od najmanje 1 nukleotida. U drugom otelotvorenju, najmanje 1 lanac sadrži 3' prepust od najmanje 2 nukleotida, npr.2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 nukleotida. U drugim otelotvorenjima, najmanje jedan lanac agensa RNKi sadrži 5' prepust od najmanje 1 nukleotida. U određenim otelotvorenjima, najmanje jedan lanac sadrži 5' prepust od najmanje 2 nukleotida, npr.2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 nukleotida. U još nekim otelotvorenjima, i 3' i 5' kraj jednog lanca agensa RNKi sadrže prepust od najmanje 1 nukleotida.
[0114] U jednom otelotvorenju, agens RNKi iz otkrića je agens dsRNK, čiji svaki lanac sadrži 19-23 nukleotida koji interaguju sa RNK sekvencom aTTR radi usmeravanja cepanja ciljne RNK. Bez želje da se ograničimo teorijom, dugačka dvolančana RNK uvedena u ćelije se razbija na siRNK putem endonukleaze tipa III poznate kao dajser (Sharp i sar. (2001) Genes Dev. 15:485). Dajser, enzim sličan ribonukleazi III, obrađuje ove dsRNK u kratke interferirajuće RNK od 19-23 bazna para sa karakterističnim 3' prepustima od dve baze (Bernstein, i sar. (2001) Nature 409:363). Ove siRNK se zatim inkorporiraju u RNK-indukovani utišavajući kompleks (RISC) gde jedna ili više helikaza raspliće dvojnu spiralu siRNK, što omogućava komplementarnom antisens lancu da navodi prepoznavanje cilja (Nykanen, i sar. (2001) Cell 107:309). Nakon vezivanja za odgovarajuću ciljnu mRNK, jedna ili više endonukleaza u RISC cepa cilj radi indukovanja utišavanja (Elbashir, i sar. (2001) Genes Dev. 15:188). U jednom otelotvorenju, agens RNKi iz pronalaska je dsRNK od 24-30 nukleotida koja interaguje sa RNK sekvencom TTR radi usmeravanja cepanja ciljne RNK.
1
[0115] Kako se ovde koristi, termin „nukleotidni prepust“ odnosi se na najmanje jedan nespareni nukleotid koji izviruje iz strukture dupleksa iRNK, npr. dsRNK. Na primer, kada se 3'-kraj jednog lanca dsRNK pruža dalje od 5'-kraja drugog lanca, ili obrnuto, postoji nukleotidni prepust. dsRNK može da sadrži prepust od najmanje jednog nukleotida, alternativno, prepust može da sadrži najmanje dva nukleotida, najmanje tri nukleotida, najmanje četiri nukleotida, najmanje pet nukleotida, ili više. Nukleotidni prepust može da sadrži ili da se sastoji od analoga nukleotida/nukleozida, uključujući dezoksinukleotid/nukleozid. Prepusti mogu biti na sens lancu, antisens lancu ili bilo kojoj njihovoj kombinaciji. Nadalje, nukleotidi prepusta mogu biti prisutni na 5'-kraju, 3'-kraju ili oba kraja antisens ili sens lanca dsRNK. U jednom otelotvorenju dsRNK, najmanje jedan lanac sadrži 3' prepust od najmanje 1 nukleotida. U drugom otelotvorenju, najmanje jedan lanac sadrži 3' prepust od najmanje 2 nukleotida, npr. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 nukleotida. U drugim otelotvorenjima, najmanje jedan lanac agensa RNKi sadrži 5' prepust od najmanje 1 nukleotida. U određenim otelotvorenjima, najmanje jedan lanac sadrži 5' prepust od najmanje 2 nukleotida, npr.2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 nukleotida. U još nekim otelotvorenjima, i 3' i 5' kraj jednog lanca agensa RNKi sadrže prepust od najmanje 1 nukleotida.
[0116] U jednom otelotvorenju, antisens lanac dsRNK ima prepust od 1-10 nukleotida, npr.
0-3, 1-3, 2-4, 2-5, 4-10, 5-10, npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 nukleotida na 3'-kraju i/ili 5'-kraju. U jednom otelotvorenju, sens lanac dsRNK ima prepust od 1-10 nukleotida, npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 nukleotida na 3'-kraju i/ili 5'-kraju. U jednom otelotvorenju, jedan ili više nukleotida u prepustu je zamenjeno nukleozid tiofosfatom.
[0117] U određenim otelotvorenjima, prepust na sens lancu ili antisens lancu, ili oba, može da uključuje produžene dužine veće od 10 nukleotida, npr. dužinu od 1-30 nukleotida, 2-30 nukleotida, 10-30 nukleotida ili 10-15 nukleotida. U određenim otelotvorenjima, produženi prepust je na sens lancu dvojne spirale. U određenim otelotvorenjima, produženi prepust je na 3'kraju sens lanca dvojne spirale. U određenim otelotvorenjima, produženi prepust je na 5'kraju sens lanca dvojne spirale. U određenim otelotvorenjima, produženi prepust je na antisens lancu dvojne spirale. U određenim otelotvorenjima, produženi prepust je na 3'kraju antisens lanca dvojne spirale. U određenim otelotvorenjima, produženi prepust je na 5'kraju antisens lanca dvojne spirale. U određenim otelotvorenjima, jedan ili više nukleotida u prepustu je zamenjeno nukleozid tiofosfatom. U određenim otelotvorenjima, prepust
2
uključuje samo-komplementarni deo tako da prepust može da gradi strukturu ukosnice koja je stabilna u fiziološkim uslovima.
[0118] „Tupi kraj“ znači da nema nesparenih nukleotida na tom kraju agensa dvolančane RNKi, tj. nema nukleotidnog prepusta. Agens RNKi sa „tupim krajem“ je dsRNK koja je dvolančana celom svojom dužinom, tj. nema nukleotidnog prepusta ni na jednom kraju molekula. Agensi RNKi iz otkrića uključuju agense RNKi sa nukleotidnim prepustima na jednom kraju (tj. agense sa jednim prepustom i jednim tupim krajem) ili sa nukleotidnim prepustima na oba kraja.
[0119] Termin „antisens lanac“ ili „lanac vodič“ označava lanac iRNK, npr. dsRNK, koji uključuje region koji je suštinski komplementaran sa ciljnom sekvencom, npr. mRNK TTR. Kako se ovde koristi, termin „region komplementarnosti“ odnosi se na region na antisens lancu koji je suštinski komplementaran sa sekvencom, na primer ciljnom sekvencom, npr. nukleotidnom sekvencom TTR, kako je ovde definisano. Kada region komplementarnosti nije u potpunosti komplementaran sa ciljnom sekvencom, nepoklapanja mogu biti u unutrašnjim ili terminalnim regionima molekula. Uopšteno, nepoklapanja koja se najviše tolerišu su u terminalnim regionima, npr. u okviru od 5, 4, 3, 2 ili 1 nukleotida od 5'- i/ili 3'-terminusa iRNK. U jednom otelotvorenju, agens dvolančane RNKi iz otkrića uključuje nepoklapanje nukleotida u antisens lancu. U drugom otelotvorenju, agens dvolančane RNKi iz otkrića uključuje nepoklapanje nukleotida u sens lancu. U jednom otelotvorenju, nepoklapanje nukleotida je, na primer, u okviru od 5, 4, 3, 2 ili 1 nukleotida od 3'-terminusa iRNK. U drugom otelotvorenju, nepoklapanje nukleotida je, na primer, u 3'-terminalnom nukleotidu iRNK.
[0120] Termin „sens lanac“ ili „lanac putnik“, kako se ovde koristi, odnosi se na lanac iRNK koji uključuje region koji je suštinski komplementaran sa regionom antisens lanca kako je taj termin ovde definisan.
[0121] Kako se ovde koristi, termin „region cepanja“ odnosi se na region koji je lociran neposredno pored mesta cepanja. Mesto cepanja je mesto na cilju na kome dolazi do cepanja. U nekim otelotvorenjima, region cepanja sadrži tri baze na bilo kom kraju mesta cepanja, i neposredno pored njega. U nekim otelotvorenjima, region cepanja sadrži dve baze na bilo kom kraju, i odmah pored, mesta cepanja. U nekim otelotvorenjima, mesto cepanja specifično nastaje na mestu koje je vezano nukleotidima 10 i 11 antisens lanca, i region cepanja sadrži nukleotide 11, 12 i 13.
[0122] Kako se ovde koristi, i ako nije drugačije naznačeno, termin „komplementarna“, kada se koristi da opiše prvu sekvencu nukleotida u odnosu na drugu sekvencu nukleotida, odnosi se na sposobnost oligonukleotida ili polinukleotida koji sadrži prvu sekvencu nukleotida da se hibridizuje i gradi strukturu dupleksa u određenim uslovima sa oligonukleotidom ili polinukleotidom koji sadrži drugu sekvencu nukleotida, kao što će biti jasno stručnjaku. Takvi uslovi mogu biti, na primer, oskudni uslovi, gde oskudni uslovi mogu da uključuju: 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6,4, 1 mM EDTA, 50°C ili 70°C tokom 12-16 sati nakon čega sledi ispiranje (vidite, npr. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, i sar. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). Drugi uslovi, kao što su fiziološki relevantni uslovi koji se mogu naći u organizmu, mogu da se primenjuju. Osoba sa veštinama će znati da odredi set uslova koji su najpogodniji za test komplementarnosti dve sekvence u skladu sa krajnjom primenom hibridizovanih nukleotida.
[0123] Komplementarne sekvence u iRNK, npr. u dsRNK kako je ovde opisana, uključuju bazno sparivanje oligonukleotida ili polinukleotida koji sadrži prvu sekvencu nukleotida sa oligonukleotidom ili polinukleotidom koji sadrži drugu sekvencu nukleotida celom dužinom jedne ili obe sekvence nukleotida. Takve sekvence ovde mogu da se označe kao „potpuno komplementarne“ u odnosu jedna na drugu. Međutim, kada se prva sekvenca naziva „suštinski komplementarnom“ u odnosu na drugu ovde datu sekvencu, dve sekvence mogu biti potpuno komplementarne, ili mogu da grade jedan ili više, ali uopšteno ne više od 5, 4, 3 ili 2 neusklađena bazna para nakon hibridizacije radi dobijanja dvojne spirale do 30 baznih parova, pri čemu zadržavaju sposobnost da se hibridizuju pod uslovima koji su najrelevantniji za krajnju primenu, npr. inhibiciju ekspresije gena preko RISC puta. Međutim, kada su dva oligonukleotida konstruisana da grade, nakon hibridizacije, jedan ili više jednolančanih prepusta, takvi prepusti će se posmatrati kao neusklađeni parovi kada se utvrđuje komplementarnost. Na primer, dsRNK koja sadrži jedan oligonukleotid dužine 21 nukleotida i drugi oligonukleotid dužine 23 nukleotida, pri čemu duži oligonukleotid sadrži sekvencu od 21 nukleotida koja je u potpunosti komplementarna sa kraćim oligonukleotidom, ipak može da se naziva „potpuno komplementarnom“ za svrhe koje su ovde opisane.
4
[0124] „Komplementarne“ sekvence, kako se ovde koriste, mogu takođe da uključuju, ili da budu u potpunosti sačinjene od baznih parova koji nisu po Votsonu i Kriku i/ili baznih parova nastalih od neprirodnih i modifikovanih nukleotida, u toj meri da su ispunjeni prethodni zahtevi u pogledu njihove sposobnosti da se hibridizuju. Takvi bazni parovi koji nisu po Votsonu i Kriku uključuju, ali nisu ograničeni na, G:U klimajuće ili Hugstinovo bazno sparivanje.
[0125] Termini „komplementaran“, „potpuno komplementaran“ i „suštinski komplementaran“ ovde mogu da se koriste u odnosu na bazno sparivanje između sens lanca i antisens lanca dsRNK, ili između antisens lanca agensa iRNK i ciljne sekvence, kao što će biti jasno iz konteksta njihove primene.
[0126] Kako se ovde koristi, polinukleotid koji je „suštinski komplementaran sa“ barem delom informacione RNK (mRNK) odnosi se na polinukleotid koji je suštinski komplementaran sa uzastopnim delom željene mRNK (npr. mRNK koja kodira TTR gen). Na primer, polinukleotid je komplementaran sa najmanje delom mRNK TTR ako je sekvenca suštinski komplementarna sa neprekinutim delom mRNK koja kodira TTR gen.
[0127] Shodno tome, u nekim otelotvorenjima, ovde otkriveni antisens polinukleotidi su u potpunosti komplementarni sa ciljnom sekvencom TTR. U drugim otelotvorenjima, ovde otkriveni antisens polinukleotid je u potpunosti komplementaran sa SEQ ID NO:2 (5'-UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA -3'). U jednom otelotvorenju, antisens sekvenca polinukleotida je 5'- UCUUGGUUACAUGAAAUCCCAUC -3' (SEQ ID NO:3).
[0128] U drugim otelotvorenjima, ovde otkriveni antisens polinukleotidi su suštinski komplementarni sa ciljnom sekvencom TTR i sadrže neprekinutu sekvencu nukleotida koja je najmanje oko 80% komplementarna na celoj svojoj dužini sa ekvivalentnim regionom sekvence nukleotida bilo koje od SEQ ID NO:2 (5'-UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA -3'), ili fragmenta bilo koje od SEQ ID NO:1, 2 i 5, recimo oko 85%, oko 86%, oko 87%, oko 88%, oko 89%, oko 90%, oko % 91%, oko 92%, oko 93%, oko 94%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, ili oko 99% komplementarna.
[0129] U jednom otelotvorenju, agens RNKi iz pronalaska uključuje sens lanac koji je suštinski komplementaran sa antisens polinukleotidom koji je, zauzvrat, komplementaran sa ciljnom sekvencom TTR, i pri čemu sens lanac polinukleotida sadrži neprekinutu sekvencu nukleotida koja je najmanje oko 80% komplementarna na celoj svojoj dužini sa ekvivalentnim regionom sekvence nukleotida bilo koje od sekvenci u tabelama 1, 3, 5, 6 i 7, recimo oko 85%, oko 86%, oko 87%, oko 88%, oko 89%, oko 90%, oko % 91%, oko 92%, oko 93%, oko 94%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, ili oko 99% komplementarna.
[0130] U drugom otelotvorenju, agens RNKi iz pronalaska uključuje antisens lanac koji je suštinski komplementaran sa ciljnom sekvencom TTR i sadrži neprekinutu sekvencu nukleotida koja je najmanje oko 80% komplementarna na celoj svojoj dužini sa ekvivalentnim regionom sekvence nukleotida bilo koje od sekvenci u tabelama 1 i 3, recimo oko 85%, oko 86%, oko 87%, oko 88%, oko 89%, oko 90%, oko % 91%, oko 92%, oko 93%, oko 94%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, ili oko 99% komplementarna.
[0131] U nekim otelotvorenjima, većina nukleotida svakog lanca su ribonukleotidi, ali kao što je ovde detaljno opisano, svaki ili oba lanca takođe mogu uključivati jedan ili više nukleotida koji nisu ribonukleotidi, npr. dezoksiribonukleotid i/ili modifikovani nukleotid. Pored toga, „iRNK“ može da uključuje ribonukleotide sa hemijskim modifikacijama. Takve modifikacije mogu da uključuju sve vrste modifikacija koje su otkrivene ovde ili poznate u struci. Sve takve modifikacije, kao što se koriste u molekulu iRNK, obuhvaćene su sa „iRNK“ za svrhe ove specifikacije.
[0132] U jednom aspektu otkrića, agens za upotrebu u postupcima i kompozicijama iz pronalaska je molekul jednolančane antisens nukleinske kiseline koji inhibira ciljnu mRNK putem antisens mehanizma inhibicije. Molekul jednolančane antisens RNK je komplementaran sa sekvencom u ciljnoj mRNK. Jednolančani antisens oligonukleotidi mogu da inhibiraju translaciju na stehiometrijski način putem baznog sparivanja sa mRNK i fizičkog ometanja translacionog mehanizma, vidite Dias, N. i sar. (2002) Mol Cancer Ther 1:347-355. Molekul jednolančane antisens RNK može biti dužine od oko 15 do oko 30 nukleotida i može imati sekvencu koja je komplementarna sa ciljnom sekvencom. Na primer, molekul jednolančane antisens RNK može da sadrži sekvencu koja je najmanje oko 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili više uzastopnih nukleotida iz bilo koje od ovde opisanih antisens sekvenci.
[0133] „Bolest povezana sa TTR-om“, kako se ovde koristi, treba da uključuje svaku bolest povezanu sa genom ili proteinom TTR. Takva bolest može biti izazvana, na primer, prekomernom proizvodnjom proteina TTR, mutacijama gena TTR, abnormalnim cepanjem proteina TTR, abnormalnim interakcijama između TTR i drugih proteina ili drugih endogenih ili egzogenih supstanci. „Bolest povezana sa TTR-om“ uključuje sve vrste amiloidoza povezanih sa TTR-om (ATTR), pri čemu TTR ima ulogu u nastanku abnormalnih vanćelijskih agregata ili amiloidnih naslaga. Bolesti povezane sa TTR-om uključuju senilnu sistemsku amiloidozu (SSA), sistemsku familijarnu amiloidozu, familijarnu amiloidnu polineuropatiju (FAP), familijarnu amiloidnu kardiomiopatiju (FAC), leptomeningealnu amiloidozu/amiloidozu centralnog nervnog sistema (CNS), amiloidna zamućenja staklastog tela, sindrom karpalnog tunela i hipertiroksinemiju. Simptomi TTR amiloidoze uključuju senzornu neuropatiju (npr. paresteziju, hipesteziju u distalnim udovima), autonomnu neuropatiju (npr. gastrointestinalnu disfunkciju, kao što je čir na želucu, ili ortostatska hipotenzija), motornu neuropatiju, epileptičke napade, demenciju, mijelopatiju, polineuropatiju, sindrom karpalnog tunela, autonomnu insuficijenciju, kardiomiopatiju, zamućenja staklastog tela, bubrežnu insuficijenciju, nefropatiju, značajno smanjeni mBMI (modifikovani indeks telesne mase), disfunkciju kranijalnog nerva i distrofiju rešetke rožnjače.
II. iRNK iz pronalaska
[0134] Predmetno otkriće obezbeđuje iRNK koje selektivno inhibiraju ekspresiju jednog ili više gena TTR. U jednom otelotvorenju, agens iRNK uključuje molekule dvolančane ribonukleinske kiseline (dsRNK) za inhibiciju ekspresije gena TTR u ćeliji, kao što je ćelija u ispitaniku, npr. sisaru, kao što je čovek koji ima bolest povezanu sa TTR-om. Te dsRNK uključuju antisens lanac koji ima region komplementarnosti koji je komplementaran sa najmanje delom mRNK nastalom u ekspresiji gena TTR. Region komplementarnosti ima dužinu od oko 30 nukleotida ili manje (npr. dužinu oko 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, ili 18 nukleotida). Nakon kontakta sa ćelijom koja eksprimira gen TTR, iRNK selektivno inhibira ekspresiju gena TTR (npr. gen TTR čoveka, primata, životinje koja nije primat, ili ptice) za najmanje oko 10% kako je procenjeno, na primer, putem PCR ili postupka zasnovanog na razgranatoj DNK (bDNK), ili putem postupka zasnovanog na proteinu, kao što je imunofluorescentna analiza, koristeći, na primer, vestern blot ili tehnike protočne citometrije.
[0135] dsRNK uključuje dva lanca RNK koja su komplementarna i hibridizuju se da grade strukturu dvojne spirale u uslovima u kojima će se dsRNK koristiti. Jedan lanac dsRNK (antisens lanac) uključuje region komplementarnosti koji je suštinski komplementaran, i generalno u potpunosti komplementaran, sa ciljnom sekvencom. Ciljna sekvenca može biti dobijena od sekvence mRNK nastale tokom ekspresije gena TTR. Drugi lanac (sens lanac) uključuje region koji je komplementaran sa antisens lancem, tako da se dva lanca hibridizuju i grade strukturu dvojne spirale kada se kombinuju u odgovarajućim uslovima. Kao što je opisano na drugom mestu u ovom dokumentu i poznato u struci, komplementarne sekvence dsRNK takođe mogu biti obuhvaćene kao samo-komplementarni regioni molekula jedne nukleinske kiseline, umesto da budu na odvojenim oligonukleotidima.
[0136] Uopšteno, struktura dvojne spirale ima dužinu između 15 i 30 baznih parova, npr. dužinu između 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21.19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, ili 21-22 bazna para. Rasponi i dužine između prethodno navedenih raspona i dužina su takođe razmatrani kao deo ovog otkrića.
[0137] Slično tome, region komplementarnosti sa ciljnom sekvencom ima dužinu između 15 i 30 nukleotida, npr. dužinu između 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, ili 21-22 nukleotida. Rasponi i dužine između prethodno navedenih raspona i dužina su takođe razmatrani kao deo ovog otkrića.
[0138] U nekim otelotvorenjima, dsRNK ima dužinu oko 15 do oko 20 nukleotida, ili dužinu oko 25 do oko 30 nukleotida. Uopšteno, dsRNK je dovoljno dugačka da služi kao supstrat za dajser enzim. Na primer, u struci je dobro poznato da dsRNK duže od oko 21-23 nukleotida mogu da služe kao supstrati za dajser. Kao što će osoba sa uobičajenim veštinama takođe prepoznati, region RNK koji je ciljan za cepanje će najčešće biti deo većeg molekula RNK, često molekula mRNK. Kada je to relevantno, „deo“ cilja mRNK je neprekinuta sekvenca cilja mRNK dovoljno dugačka da bude supstrat za RNKi-usmereno cepanje (tj. cepanje putem RISC puta).
[0139] Osoba sa veštinama u struci će takođe prepoznati da je region dupleksa primarni funkcionalni deo dsRNK, npr. region dupleksa od oko 9 do 36 baznih parova, npr. oko 10-36, 11-36, 12-36, 13-36, 14-36, 15-36, 9-35, 10-35, 11-35, 12-35, 13-35, 14-35, 15-35, 9-34, 10-34, 11-34, 12-34, 13-34, 14-34, 15-34, 9-33, 10-33, 11-33, 12-33, 13-33, 14-33, 15-33, 9-32, 10-32, 11-32, 12-32, 13-32, 14-32, 15-32, 9-31, 10-31, 11-31, 12-31, 13-32, 14-31, 15-31, 15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, ili 21-22 bazna para. Tako, u jednom otelotvorenju, u meri u kojoj je obrađen do funkcionalne dvojne spirale od, npr.15-30 baznih parova, koja cilja željenu RNK za cepanje, molekul RNK ili kompleks molekula RNK sa regionom dvojne spirale većim od 30 baznih parova je dsRNK. Tako, stručnjak sa uobičajenim veštinama će prepoznati da, u jednom otelotvorenju, miRNK je dsRNK. U drugom otelotvorenju, dsRNK nije miRNK koja se javlja u prirodi. U drugom otelotvorenju, agens iRNK koristan za ciljanje ekspresije gena TTR nije nastao u ciljnoj ćeliji cepanjem veće dsRNK.
[0140] dsRNK, kako je ovde opisana, može dalje da uključuje jedan ili više jednolančanih nukleotidnih prepusta, npr.1, 2, 3 ili 4 nukleotida. dsRNK koje imaju najmanje jedan nukleotidni prepust mogu imati neočekivano superiorna inhibitorska svojstva u poređenju sa svojim parnjacima sa tupim krajem. Nukleotidni prepust može da sadrži ili da se sastoji od analoga nukleotida/nukleozida, uključujući dezoksinukleotid/nukleozid. Prepusti mogu biti na sens lancu, antisens lancu ili bilo kojoj njihovoj kombinaciji. Nadalje, nukleotidi prepusta mogu biti prisutni na 5'-kraju, 3'-kraju ili oba kraja antisens ili sens lanca dsRNK. U određenim otelotvorenjima, mogući su duži, produženi prepusti.
[0141] dsRNK može da se sintetiše standardnim postupcima koji su poznati u struci kako je dalje razmotreno u nastavku, npr. koristeći automatizovani sintetizator DNK, poput onih koji su komercijalno dostupni, na primer, od kompanije Biosearch, Applied Biosystems, Inc.
[0142] Jedinjenja iRNK iz otkrića mogu da se pripreme koristeći proceduru u dva koraka. Prvo, pojedinačni lanci molekula dvolančane RNK su odvojeno pripremljeni. Zatim su sastavni lanci spojeni. Pojedinačni lanci jedinjenja siRNK mogu da se pripreme koristeći organsku sintezu u fazi rastvora ili u čvrstoj fazi, ili obe. Organska sinteza pruža tu prednost da lanci oligonukleotida koji sadrže neprirodne ili modifikovane nukleotide mogu lako da se pripreme. Jednolančani oligonukleotidi iz pronalaska mogu da se pripreme koristeći organsku sintezu u fazi rastvora ili u čvrstoj fazi, ili obe.
[0143] U jednom aspektu, dsRNK iz otkrića uključuje najmanje dve sekvence nukleotida, sens sekvencu i antisens sekvencu. Sens lanac je odabran iz grupe sekvenci koje su date u bilo kojoj od Tabela 1, 3, 5, 6 i 7, a odgovarajući antisens lanac sens lanca je odabran iz grupe sekvenci iz bilo koje od Tabela 1, 3, 5, 6 i 7. U ovom aspektu, jedna od dve sekvence je komplementarna sa drugom od dve sekvence, dok je jedna od sekvenci suštinski komplementarna sa sekvencom mRNK nastalom u ekspresiji gena TTR. Tako, u ovom aspektu, dsRNK će uključivati dva oligonukleotida, gde je jedan oligonukleotid opisan kao sens lanac u bilo kojoj od Tabela 1, 3, 5, 6 i 7, a drugi oligonukleotid je opisan kao odgovarajući antisens lanac sens lanca u bilo kojoj od Tabela 1, 3, 5, 6 i 7. U jednom otelotvorenju, suštinski komplementarne sekvence dsRNK su sadržane na odvojenim oligonukleotidima. U drugom otelotvorenju, suštinski komplementarne sekvence dsRNK su sadržane na jednom oligonukleotidu.
[0144] Biće jasno da, iako su neke od sekvenci u Tabelama 1, 3, 5, 6 i 7 opisane kao modifikovane i/ili konjugovane sekvence, RNK iz iRNK iz pronalaska, npr. dsRNK iz pronalaska, može da sadrži bilo koju od sekvenci datih u Tabelama 1, 3, 5, 6 i 7 koja je nemodifikovana, nekonjugovana i/ili modifikovana i/ili konjugovana drugačije nego što je ovde opisano.
[0145] Stručnjaku je dobro poznato da su dsRNK koje imaju strukturu dvojne spirale od između oko 20 i 23 bazna para, npr.21 baznog para, poznate kao naročito delotvorne u indukovanju interferencije RNK (Elbashir i sar. EMBO 2001, 20:6877-6888). Međutim, drugi su otkrili da kraće ili duže strukture dvojne spirale RNK mogu takođe biti delotvorne (Chu i Rana (2007) RNA 14:1714-1719; Kim i sar. (2005) Nat Biotech 23:222-226). U prethodno opisanim otelotvorenjima, usled prirode sekvenci oligonukleotida koje su date u bilo kojoj od Tabela 1, 3, 5, 6 i 7, dsRNK koje su ovde opisane mogu da uključuju najmanje
4
jedan lanac dužine od najmanje 21 nukleotida. Može se razumno očekivati da kraće dvojne spirale koje imaju jednu od sekvenci iz bilo koje od Tabela 1, 3, 5, 6 i 7 umanjene za samo nekoliko nukleotida na jednom ili oba kraja mogu biti slično delotvorne u poređenju sa prethodno opisanim dsRNK. Stoga, dsRNK koje imaju sekvencu od najmanje 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili više uzastopnih nukleotida dobijenu od jedne od sekvenci iz bilo koje od Tabela 1, 3, 5, 6 i 7, i koje se razlikuju po svojoj sposobnosti da inhibiraju ekspresiju gena TTR za ne više od oko 5, 10, 15, 20, 25 ili 30% inhibicije u odnosu na dsRNK koja sadrži kompletnu sekvencu, razmatrane su u opsegu predmetnog otkrića.
[0146] Pored toga, RNK koje su date u bilo kojoj od Tabela 1, 3, 5, 6 i 7 identifikuju mesto (ili mesta) u transkriptu TTR koja su podložna cepanju posredstvom RISC. Tako, predmetni pronalazak dalje sadrži iRNK koje ciljaju jedno od tih mesta. Kako se ovde koristi, za iRNK se kaže da cilja jedno konkretno mesto transkripta RNK ako iRNK promoviše cepanje transkripta bilo gde u okviru tog konkretnog mesta. Takva iRNK će uopšteno obuhvatati najmanje oko 15 uzastopnih nukleotida iz jedne od sekvenci koje su date u bilo kojoj od Tabela 1, 3, 5, 6 i 7 kuplovane sa dodatnim sekvencama nukleotida koje su uzete iz regiona koji je uzastopan sa odabranom sekvencom gena TTR.
[0147] Dok ciljna sekvenca uopšteno ima dužinu od oko 15-30 nukleotida, postoji velika varijacija u pogodnosti konkretnih sekvenci u ovom opsegu za usmeravanje cepanja bilo koje date ciljne RNK. Različiti softverski paketi i ovde date smernice daju uputstva za identifikovanje optimalnih ciljnih sekvenci za svaki dati ciljni gen, ali takođe se može uzeti empirijski pristup u kome se „prozor“ ili „maska“ date veličine (kao neograničavajući primer, 21 nukleotid) bukvalno ili figurativno (uključujući, npr. kompjutersku simulaciju) stavlja na sekvencu ciljne RNK radi identifikovanja sekvence u opsegu veličina koje mogu da služe kao ciljne sekvence. Pomeranjem „prozora“ sekvence progresivno za jedan nukleotid ushodno ili nishodno od inicijalne lokacije ciljne sekvence, može se identifikovati sledeća potencijalna ciljna sekvenca, sve dok se ne identifikuje potpuni skup mogućih sekvenci za bilo koju datu veličinu cilja. Ovim procesom, zajedno sa sistematskom sintezom i testiranjem identifikovanih sekvenci (koristeći testove koji su ovde opisani ili poznati u struci) radi identifikovanja onih sekvenci koje optimalno deluju, mogu se identifikovati one sekvence RNK koje, kada se ciljaju sa agensom iRNK, posreduju u najboljoj inhibiciji ekspresije ciljnog gena. Tako, pošto sekvence koje su identifikovane, na primer, u bilo kojoj od Tabela 1, 3, 5, 6 i 7 predstavljaju delotvorne ciljne sekvence, razmatra se da se dalja optimizacija delotvornosti inhibicije može postići progresivnim „šetanjem prozora“ za jedan nukleotid ushodno ili nishodno od date sekvence radi identifikovanja sekvenci sa istim ili boljim karakteristikama inhibicije.
[0148] Nadalje, razmatra se da se za bilo koju identifikovanu sekvencu, npr. u bilo kojoj od Tabela 1, 3, 5, 6 i 7, dalja optimizacija može ostvariti sistematskim dodavanjem ili uklanjanjem nukleotida radi stvaranja dužih ili kraćih sekvenci i testiranjem tih nastalih sekvenci putem šetanja prozora duže ili kraće veličine nagore ili nadole duž ciljne RNK od te tačke. Ponovo, spajanje ovog pristupa za stvaranje novih ciljeva kandidata sa testiranjem na delotvornost iRNK zasnovanih na tim ciljnim sekvencama u testu inhibicije kako je poznato u struci i/ili opisano ovde može dovesti do daljih poboljšanja delotvornosti inhibicije.
Nadalje, takve optimizovane sekvence mogu da se prilagode, npr. putem uvođenja modifikovanih nukleotida kao što je ovde opisano ili kao što je poznato u struci, dodavanja ili promena u prepustu, ili drugih modifikacija kao što je poznato u struci i/ili je ovde razmotreno radi dalje optimizacije molekula (npr. povećanja stabilnosti u serumu ili poluživota u krvotoku, povećanja toplotne stabilnosti, pojačavanja transmembranske isporuke, ciljanja na konkretnu lokaciju ili vrstu ćelije, povećanja interakcije sa enzimima puta utišavanja, povećanja otpuštanja iz endozoma) kao inhibitora ekspresije.
[0149] iRNK, kako je ovde opisana, može da sadrži jedan ili više neusklađenih parova sa ciljnom sekvencom. U jednom otelotvorenju, iRNK, kako je ovde opisana, sadrži ne više od 3 neusklađena para. Ako antisens lanac iRNK sadrži neusklađene parove sa ciljnom sekvencom, poželjno je da oblast neusklađenosti ne bude locirana u središtu regiona komplementarnosti. Ako antisens lanac iRNK sadrži neusklađene parove sa ciljnom sekvencom, poželjno je da neusklađenost bude ograničena u okviru poslednjih 5 nukleotida od 5'- ili 3'-kraja regiona komplementarnosti. Na primer, za agens iRNK od 23 nukleotida lanac koji je komplementaran sa regionom gena TTR uopšteno ne sadrži nijedan neusklađeni par u okviru 13 središnjih nukleotida. Ovde opisani postupci ili postupci poznati u struci mogu da se koriste da se odredi da li je iRNK koja sadrži neusklađeni par sa ciljnom sekvencom delotvoran u inhibiciji ekspresije gena TTR. Razmatranje delotvornosti iRNK sa neusklađenim parovima u inhibiciji ekspresije gena TTR je važno, naročito ako je za konkretan region komplementarnosti u genu TTR poznato da ima polimorfnu varijaciju sekvence u populaciji.
III. Modifikovane iRNK iz pronalaska
[0150] U jednom otelotvorenju, RNK iz iRNK iz otkrića, npr. dsRNK, je nemodifikovana i ne sadrži, npr. hemijske modifikacije i/ili konjugacije poznate u struci i opisane ovde. U drugom otelotvorenju, RNK iz iRNK iz otkrića, npr. dsRNK, je hemijski modifikovana da pojača stabilnost ili druge korisne karakteristike. U određenim otelotvorenjima pronalaska, suštinski svi nukleotidi iRNK iz pronalaska su modifikovani. U drugim otelotvorenjima otkrića, svi nukleotidi iRNK iz pronalaska su modifikovani. U nekim otelotvorenjima, suštinski svi nukleotidi iRNK iz pronalaska su modifikovani i iRNK sadrži ne više od 82'-fluor modifikacija (npr. ne više od 72'-fluor modifikacija, ne više od 62'-fluor modifikacija, ne više od 52'-fluor modifikacija, ne više od 42'-fluor modifikacije, ne više od 32'-fluor modifikacije, ili ne više od 22'-fluor modifikacije) na sens lancu i ne više od 62'-fluor modifikacija (npr. ne više od 52'-fluor modifikacija, ne više od 42'-fluor modifikacije, ne više od 32'-fluor modifikacije, ili ne više od 22'-fluor modifikacije) na antisens lancu. U drugim otelotvorenjima, svi nukleotidi iRNK iz pronalaska su modifikovani i iRNK sadrži ne više od 82'-fluor modifikacija (npr. ne više od 72'-fluor modifikacija, ne više od 62'-fluor modifikacija, ne više od 52'-fluor modifikacija, ne više od 42'-fluor modifikacije, ne više od 3 2'-fluor modifikacije, ili ne više od 22'-fluor modifikacije) na sens lancu i ne više od 62'-fluor modifikacija (npr. ne više od 52'-fluor modifikacija, ne više od 42'-fluor modifikacije, ne više od 32'-fluor modifikacije, ili ne više od 22'-fluor modifikacije) na antisens lancu. iRNK iz pronalaska u kojima su „suštinski svi nukleotidi modifikovani“ su suštinski, ali ne u potpunosti, modifikovane i mogu da uključuju ne više od 5, 4, 3, 2 ili 1 nemodifikovani nukleotid.
[0151] Nukleinske kiseline korišćene u pronalasku takođe mogu da se sintetišu i/ili modifikuju postupcima koji su dobro poznati u struci, kao što su oni opisani u "Current protocols in nucleic acid chemistry," Beaucage, S.L. i sar. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, SAD. Modifikacije uključuju, na primer, modifikacije krajeva, npr. modifikacije 5'-kraja (fosforilacija, konjugacija, invertovane veze) ili modifikacije 3'-kraja (konjugacija, DNK nukleotidi, invertovane veze, itd.); modifikacije baza, npr. zamena stabilizujućim bazama, destabilizujućim bazama ili bazama koje se bazno sparuju sa proširenim repertoarom partnera, uklanjanje baza (abazni nukleotidi) ili konjugovane baze; modifikacije šećera (npr. na 2'-poziciji ili 4'-poziciji) ili zamena šećera; i/ili modifikacije skeleta, uključujući modifikaciju ili zamenu fosfodiestarskih veza. Specifični primeri
4
jedinjenja iRNK koja su korisna u ovde opisanim otelotvorenjima uključuju, ali nisu ograničena na, RNK koje sadrže modifikovane skelete ili nemaju prirodne internukleozidne veze. RNK koje imaju modifikovane skelete uključuju, između ostalog, one koje nemaju atom fosfora u skeletu. Za svrhe ove specifikacije, i kao što se nekad nazivaju u struci, modifikovane RNK koje nemaju atom fosfora u svom internukleozidnom skeletu takođe mogu da se smatraju oligonukleozidima. U nekim otelotvorenjima, modifikovane iRNK će imati atom fosfora u svom internukleozidnom skeletu.
[0152] Skeleti modifikovane RNK uključuju, na primer, fosforotioate, hiralne fosforotioate, fosforoditioate, fosfotriestre, aminoalkilfosfotriestre, metil i druge alkil fosfonate uključujući 3'-alkilen fosfonate i hiralne fosfonate, fosfinate, fosforamidate uključujući 3'-amino fosforamidate i aminoalkilfosforamidate, tionofosforamidate, tionoalkilfosfonate, tionoalkilfosfotriestre i boranofosfate koji imaju normalne 3'-5' veze, njihove 2'-5'-povezane analoge, i one koji imaju obrnutu polarnost pri čemu su susedni parovi jedinica nukleozida povezani 3'-5' za 5'-3' ili 2'-5' za 5'-2'. Takođe su uključene različite soli, mešovite soli i slobodni kiseli oblici.
[0153] Primeri U.S. patenata koji objašnjavaju pripremu prethodnih veza koje sadrže fosfor uključuju, ali nisu ograničeni na, U.S. patente br.3,687,808; 4,469,863; 4,476,301;
5,023,243; 5,177,195; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,316; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; 5,625,050; 6,028,188; 6,124,445; 6,160,109; 6,169,170; 6,172,209; 6, 239,265; 6,277,603; 6,326,199; 6,346,614; 6,444,423; 6,531,590; 6,534,639; 6,608,035; 6,683,167; 6,858,715; 6,867,294; 6,878,805; 7,015,315; 7,041,816; 7,273,933; 7,321,029; i US Pat RE39464.
[0154] Modifikovani skeleti RNK koji u sebi ne sadrže atom fosfora imaju skelete koji su nastali od internukleozidnih veza kratkog lanca alkila ili cikloalkila, mešovitih heteroatoma i alkil ili cikloalkil internukleozidnih veza, ili jedne ili više heteroatomskih ili heterocikličnih internukleozidnih veza kratkog lanca. To uključuje one koji imaju morfolino veze (delimično nastale od šećernog dela nukleozida), siloksanske skelete, sulfidne, sulfoksidne i sulfonske skelete, formacetilne i tioformacetilne skelete; metilen formacetilne i tioformacetilne skelete; skelete koji sadrže alken; sulfamatne skelete; metilenimino i metilenhidrazino skelete; sulfonatne i sulfonamidne skelete; amidne skelete; i druge koji imaju mešovite N, O, S i CH2sastavne delove.
[0155] Primeri U.S. patenata koji objašnjavaju pripremu prethodnih oligonukleozida uključuju, ali nisu ograničeni na, U.S. patente br.5,034,506; 5,166,315; 5,185,444;
5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,64,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; i 5,677,439.
[0156] U drugim otelotvorenjima razmatrani su odgovarajući mimetici RNK za upotrebu u iRNK, gde su i šećer i internukleozidna veza, tj. skelet, jedinica nukleotida zamenjeni novim grupama. Bazne jedinice se održavaju za hibridizaciju sa odgovarajućim jedinjenjem ciljne nukleinske kiseline. Jedno takvo oligomerno jedinjenje, mimetik RNK za koji je pokazano da ima izvrsna svojstva hibridizacije, naziva se peptidna nukleinska kiselina (PNK). U jedinjenjima PNK, šećerni skelet RNK je zamenjen skeletom koji sadrži amid, naročito aminoetilglicinskim skeletom. Nukleobaze su zadržane i vezuju se neposredno ili posredno za aza atome azota amidnog dela skeleta. Primeri U.S. patenata koji objašnjavaju pripremu jedinjenja PNK uključuju, ali nisu ograničeni na, U.S. patente br.5,539,082; 5,714,331; i 5,719,262. Dodatna jedinjenja PNK koja su pogodna za upotrebu u iRNK iz pronalaska su opisana, na primer, u Nielsen i sar. Science, 1991, 254, 1497-1500.
[0157] Neka otelotvorenja prikazana u pronalasku uključuju RNK sa fosforotioatnim skeletima i oligonukleozide sa heteroatomskim skeletima, a naročito --CH2--NH--CH2-, --CH,--N(CH3)--O--CH2-- [poznato kao metilenski (metilimino) ili MMI skelet], --CH2--O--N(CH3)--CH2--, --CH2--N(CH3)--N(CH3)- -CH2-- i --N(CH3)--CH2--CH2--[pri čemu je nativni fosfodiestarski skelet predstavljen kao --O--P--O--CH2--] iz prethodno navedenog U.S. patenta br.5,489,677 i amidne skelete iz prethodno navedenog U.S. patenta br.
5,602,240. U nekim otelotvorenjima, ovde prikazane RNK imaju morfolino strukture skeleta iz prethodno navedenog U.S. patenta br.5,034,506.
[0158] Modifikovane RNK takođe mogu da sadrže jedan ili više ostataka supstituisanog šećera. Te iRNK, npr. dsRNK, prikazane ovde mogu da uključuju jedno od sledećeg na 2'-poziciji: OH; F; O-, S-, ili N-alkil; O-, S-, ili N-alkenil; O-, S- ili N-alkinil; ili O-alkil-O-alkil, pri čemu alkil, alkenil i alkinil mogu biti supstituisani ili nesupstituisani C1do C10alkil ili C2
4
do C10alkenil i alkinil. Primeri odgovarajućih modifikacija uključuju O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)-nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, i O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2, pri čemu su n i m od 1 do oko 10. U drugim otelotvorenjima, dsRNK uključuju jedno od sledećeg na 2' poziciji: C1do C10niži alkil, supstituisani niži alkil, alkaril, aralkil, O-alkaril ili O-aralkil, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocikloalkil, heterocikloalkaril, aminoalkilamino, polialkilamino, supstituisani silil, RNK cepajuću grupu, reportersku grupu, interkalator, grupu za poboljšanje farmakokinetičkih svojstava iRNK, ili grupu za poboljšanje farmakodinamičkih svojstava iRNK i druge supstituente koji imaju slična svojstva. U nekim otelotvorenjima, modifikacija uključuje 2'-metoksietoksi (2'-O--CH2CH2OCH3, poznat i kao 2'-O-(2-metoksietil) ili 2'-MOE) (Martin i sar. Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504) tj. alkoksi-alkoksi grupu. Još jedan primer modifikacije je 2'-dimetilaminooksietoksi, tj. O(CH2)2ON(CH3)2grupa, poznata i kao 2'-DMAOE, kao što je ovde opisano u primerima u nastavku, i 2'-dimetilaminoetoksietoksi (u struci poznat i kao 2'-O-dimetilaminoetoksietil ili 2'-DMAEOE), tj.2'-O--CH2--O--CH2-N(CH2)2.
[0159] Druge modifikacije uključuju 2'-metoksi (2'-OCH3), 2'-aminopropoksi (2'-OCH2CH2CH2NH2) i 2'-fluor (2'-F). Slične modifikacije takođe mogu da se načine na drugim pozicijama na RNK iz iRNK, naročito 3' poziciji šećera na 3' terminalnom nukleotidu ili u 2'-5' povezanim dsRNK i 5' poziciji 5' terminalnog nukleotida. iRNK takođe mogu da imaju mimetike šećera kao što su ciklobutil ostaci na mestu pentofuranozil šećera. Primeri U.S. patenata koji objašnjavaju pripremu takvih modifikovanih struktura šećera uključuju, ali nisu ograničeni na, U.S. pat. br.4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878;
5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; i 5,700,920.
[0160] RNK iz iRNK iz pronalaska takođe može da uključuje modifikacije ili supstitucije nukleobaze (u struci se često naziva samo „baza“) Kako se ovde koristi, „nemodifikovane“ ili „prirodne nukleobaze“ uključuju purinske baze adenin (A) i guanin (G) i pirimidinske baze timin (T), citozin (C) i uracil (U). Modifikovane nukleobaze uključuju druge sintetičke i prirodne nukleobaze kao što su dezoksi timin (dT), 5-metilcitozin (5-me-C), 5-hidroksimetil citozin, ksantin, hipoksantin, 2-aminoadenin, 6-metil i druge alkil derivate adenina i guanina, 2-propil i druge alkil derivate adenina i guanina, 2-tiouracil, 2-tiotimin i 2-tiocitozin, 5-halouracil i citozin, 5-propinil uracil i citozin, 6-azo uracil, citozin i timin, 5-uracil
4
(pseudouracil), 4-tiouracil, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalkil, 8-hidroksil i druge 8-supstituisane adenine i guanine, 5-halo, naročito 5-brom, 5-trifluormetil i druge 5-supstituisane uracile i citozine, 7-metilguanin i 7-metiladenin, 8-azaguanin i 8-azaadenin, 7-deazaguanin i 7-deazaadenin i 3-deazaguanin i 3-deazaadenin. Dalje nukleobaze uključuju one opisane u U.S. pat. br.3,687,808, one opisane u Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008; one opisane u The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, strane 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990, one opisane u Englisch i sar. Angewandte Chemie, međunarodno izdanje, 1991, 30, 613, i one opisane u Sanghvi, Y S., poglavlje 15, dsRNA Research and Applications, strane 289-302, Crooke, S. T. i Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993. Neke od tih nukleobaza su naročito korisne za povećanje afiniteta vezivanja oligomernih jedinjenja koja su prikazana u pronalasku. One uključuju 5-supstituisane pirimidine, 6-azapirimidine i N-2, N-6 i 0-6 supstituisane purine, uključujući 2-aminopropiladenin, 5-propiniluracil i 5-propinilcitozin. Pokazalo se da 5-metilcitozinske supstitucije povećavaju stabilnost dvojne spirale nukleinske kiseline za 0,6-1,2°C (Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. i Lebleu, B., izdav., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, str. 276-278) i predstavljaju primer baznih supstitucija, još i više kada se kombinuju sa 2'-O-metoksietil modifikacijama šećera.
[0161] Primeri U.S. patenata koji objašnjavaju pripremu nekih od prethodno navedenih modifikovanih nukleobaza kao i drugih modifikovanih nukleobaza uključuju, ali nisu ograničeni na, prethodno navedene U.S. patente br.3,687,808, 4,845,205; 5,130,30;
5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; 5,681,941; 5,750,692; 6,015,886; 6,147,200; 6,166,197; 6,222,025; 6,235,887; 6,380,368; 6,528,640; 6,639,062; 6,617,438; 7,045,610; 7,427,672; i 7,495,088.
[0162] RNK iz iRNK takođe može da se modifikuje da uključuje jedan ili više ostataka bicikličnog šećera. „Biciklični šećer“ je furanozil prsten modifikovan premošćavanjem dva atoma. „Biciklični nukleozid“ („BNA“) je nukleozid koji ima ostatak šećera koji sadrži most koji povezuje dva atoma ugljenika prstena šećera, čime nastaje sistem bicikličnih prstenova. U određenim otelotvorenjima, most povezuje 4'-ugljenik i 2'-ugljenik prstena šećera. Tako, u nekim otelotvorenjima, agens iz pronalaska može da uključuje jednu ili više zaključanih nukleinskih kiselina (LNK). Zaključana nukleinska kiselina je nukleotid koji ima ostatak
4
modifikovane riboze u kome ostatak riboze sadrži dodatni most koji povezuje 2' i 4' ugljenike. Drugim rečima, LNK je nukleotid koji sadrži ostatak bicikličnog šećera koji sadrži 4'-CH2-O-2' most. Ta struktura suštinski „zaključava“ ribozu u 3'-endo strukturnoj konformaciji. Pokazalo se da dodatak zaključanih nukleinskih kiselina u siRNK povećava stabilnost siRNK u serumu i da smanjuje dejstvo van cilja (Elmen, J. i sar. (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. i sar. (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843;
Grunweller, A. i sar. (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193). Primeri bicikličnih nukleozida za upotrebu u polinukleotidima iz pronalaska uključuju, bez ograničenja, nukleozide koji sadrže most između 4' i 2' atoma prstena ribozila. U određenim otelotvorenjima, agensi antisens polinukleotida iz pronalaska uključuju jedan ili više bicikličnih nukleozida koji sadrže 4' do 2' most. Primeri takvih 4' do 2' premošćenih bicikličnih nukleozida uključuju, ali nisu ograničeni na, 4'-(CH2)-O-2' (LNK); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2' (ENA); 4'-CH(CH3)-O-2' (takođe se naziva „ograničeni etil“ ili „cEt“) i 4'-CH(CH2OCH3)-O-2' (i njegove analoge; vidite, npr. U.S. pat. br.7,399,845); 4'-C(CH3)(CH3)-O-2' (i njegove analoge; vidite, npr. US patent br.8,278,283); 4'-CH2-N(OCH3)-2' (i njegove analoge; vidite, npr. US patent br.8,278,425); 4'-CH2-O-N(CH3)-2' (vidite, npr. U.S. patentnu publikaciju br.2004/0171570); 4'-CH2-N(R)-O-2', pri čemu, R je H, C1-C12 alkil, ili zaštitna grupa (vidite, npr., U.S. Pat. br.7,427,672); 4'-CH2-C(H)(CH3)-2' (vidite, npr. Chattopadhyaya i sar. J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134); i 4'-CH2-C(=CH2)-2' (i njegove analoge; vidite, npr. US patent br.8,278,426).
[0163] Dodatni primeri U.S. patenata i US patentnih publikacija koje objašnjavaju pripremu nukleotida zaključane nukleinske kiseline uključuju, ali nisu ograničeni na, sledeće: U.S. patente br.6,268,490; 6,525,191; 6,670,461; 6,770,748; 6,794,499; 6,998,484; 7,053,207; 7,034,133;7,084,125; 7,399,845; 7,427,672; 7,569,686; 7,741,457; 8,022,193; 8,030,467; 8,278,425; 8,278,426; 8,278,283; US 2008/0039618; i US 2009/0012281.
[0164] Bilo koji od prethodnih bicikličnih nukleozida može da se pripremi sa jednom ili više stereohemijskih konfiguracija šećera uključujući, na primer, α-L-ribofuranozu i β-D-ribofuranozu (vidite WO 99/14226).
[0165] RNK iz iRNK takođe može da se modifikuje da uključuje jedan ili više ograničenih etil nukleotida. Kako se ovde koristi, „ograničeni etil nukleotid“ ili „cEt“ je zaključana nukleinska kiselina koja sadrži ostatak bicikličnog šećera koji sadrži 4'-CH(CH3)-0-2' most.
4
U jednom otelotvorenju, ograničeni etil nukleotid je u S konformaciji i ovde se naziva „S-cEt“.
[0166] iRNK iz pronalaska takođe može da uključuje jedan ili više „konformaciono ograničenih nukleotida“ („CRN“). CRN su analozi nukleotida sa linkerom koji povezuje C2' i C4' ugljenike riboze ili C3 i -C5' ugljenike riboze. CRN zaključava prsten riboze u stabilnu konformaciju i povećava afinitet prema hibridizaciji u mRNK. Linker je dovoljne dužine da stavi kiseonik u optimalnu poziciju za stabilnost i afinitet koji dovode do manjeg nabiranja prstena riboze.
[0167] Reprezentativne publikacije koje objašnjavaju pripremu nekih od prethodno navedenih CRN uključuju, ali nisu ograničene na, U.S. patentnu publikaciju br.
2013/0190383; i PCT publikaciju WO 2013/036868.
[0168] Jedan ili više nukleotida iRNK iz pronalaska može takođe da uključuje hidroksimetil supstituisani nukleotid. „Hidroksimetil supstituisani nukleotid“ je aciklični 2'-3'-sekonukleotid, koji se takođe naziva modifikacijom „otključane nukleinske kiseline“ („UNK“).
[0169] Reprezentativne U.S. publikacije koje objašnjavaju pripremu UNK uključuju, ali nisu ograničene na, US patent br.8,314,227; i US patentne publikacije br.2013/0096289;
2013/0011922; i 2011/0313020.
[0170] Potencijalno stabilizujuće modifikacije krajeva molekula RNK mogu da uključuju N-(acetilaminokaproil)-4-hidroksiprolinol (Hyp-C6-NHAc), N-(kaproil-4-hidroksiprolinol(Hyp-C6), N-(acetil-4-hidroksiprolinol(Hyp-NHAc), timidin-2'-0-dezoksitimidin (etar), N-(aminokaproil)-4-hidroksiprolinol (Hyp-C6-amino), 2-dokozanoil-uridin-3"- fosfat, invertovanu bazu dT (idT) i druge. Otkriće ovih modifikacija može se naći u PCT publikaciji br. WO 2011/005861.
[0171] Druge modifikacije nukleotida iRNK iz pronalaska uključuju 5' fosfat ili imitaciju 5' fosfata, npr.5'-terminalni fosfat ili imitacija fosfata na antisens lancu agensa RNKi.
Odgovarajuće imitacije fosfata su otkrivene, na primer, u US patentnoj publikaciji br.
2012/0157511.
A. Modifikovane iRNK koje sadrže motive iz pronalaska
4
[0172] U određenim aspektima pronalaska, agens dvolančane RNKi iz pronalaska uključuje hemijske modifikacije kao što je otkriveno, na primer, u U.S. privremenoj prijavi br.
61/561,710, koja je podneta 18. novembra 2011, ili u PCT/US2012/065691, podnetoj 16. novembra 2012.
[0173] Specifičnije, iznenađujuće je otkriveno da kada su sens lanac i antisens lanac agensa dvolančane RNKi modifikovani da imaju jedan ili više motiva tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida na mestu cepanja najmanje jednog lanca agensa RNKi ili blizu njega, aktivnost utišavanja gena agensa RNKi je superiorno pojačana.
[0174] Shodno tome, otkriće obezbeđuje agens dvolančane RNKi koji je sposoban da inhibira ekspresiju ciljnog gena (tj. gena TTR) in vivo. Agens RNKi sadrži sens lanac i antisens lanac. Svaki lanac agensa RNKi može imati dužinu u rasponu od 12-30 nukleotida. Na primer, svaki lanac može imati dužinu između 14-30 nukleotida, dužinu 17-30 nukleotida, dužinu 25-30 nukleotida, dužinu 27-30 nukleotida, dužinu 17-23 nukleotida, dužinu 17-21 nukleotida, dužinu 17-19 nukleotida, dužinu 19-25 nukleotida, dužinu 19-23 nukleotida, dužinu 19-21 nukleotida, dužinu 21-25 nukleotida ili dužinu 21-23 nukleotida.
[0175] Sens lanac i antisens lanac obično grade dvojnu spiralu dvolančane RNK („dsRNK“), koja se ovde naziva i „agens RNKi“. Region dvojne spirale agensa RNKi može imati dužinu 12-30 parova nukleotida. Na primer, region dvojne spirale može biti dužine između 14-30 parova nukleotida, dužine 17-30 parova nukleotida, dužine 27-30 parova nukleotida, dužine 17-23 parova nukleotida, dužine 17-21 parova nukleotida, dužine 17-19 parova nukleotida, dužine 19-25 parova nukleotida, dužine 19-23 parova nukleotida, dužine 19- 21 parova nukleotida, dužine 21-25 parova nukleotida, ili dužine 21-23 parova nukleotida. U drugom primeru, region dvojne spirale je odabran od dužine od 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 i 27 nukleotida.
[0176] U jednom otelotvorenju, agens RNKi može da sadrži jedan ili više regiona prepusta i/ili grupa za ograničavanje na 3'-kraju, 5'-kraju ili oba kraja jednog ili oba lanca. Prepust može biti dužine 1-6 nukleotida, na primer dužine 2-6 nukleotida, dužine 1-5 nukleotida, dužine 2-5 nukleotida, dužine 1-4 nukleotida, dužine 2-4 nukleotida, dužine 1-3 nukleotida, dužine 2-3 nukleotida, ili dužine 1-2 nukleotida. Prepusti mogu biti posledica toga što je jedan lanac duži od drugog, ili posledica toga što su dva lanca iste dužine raspoređena.
Prepust može da gradi neusklađeni par sa ciljnom mRNK ili može biti komplementaran sa sekvencom gena koja se cilja ili može biti druga sekvenca. Prvi i drugi lanac takođe mogu biti spojeni, npr. putem dodatnih baza kako bi gradile ukosnicu, ili putem drugih nebaznih linkera.
[0177] U jednom otelotvorenju, nukleotidi u regionu prepusta agensa RNKi mogu svaki nezavisno biti modifikovani ili nemodifikovani nukleotid uključujući, ali ne ograničavajući se na modifikacije 2'-šećera, kao što su, 2-F, 2'-O-metil, timidin (T), 2'-O-metoksietil-5-metiluridin (Teo), 2'-O-metoksietiladenozin (Aeo), 2'-O-metoksietil-5-metilcitidin (m5Ceo) i bilo koje njihove kombinacije. Na primer, TT može biti sekvenca prepusta za bilo koji kraj na bilo kojem lancu. Prepust može da gradi neusklađeni par sa ciljnom mRNK ili može biti komplementaran sa sekvencom gena koja se cilja ili može biti druga sekvenca.
[0178] 5'- ili 3'- prepusti na sens lancu, antisens lancu ili na oba lanca agensa RNKi mogu biti fosforilovani. U nekim otelotvorenjima, regioni prepusta sadrže dva nukleotida koji imaju fosforotioat između dva nukleotida, pri čemu dva nukleotida mogu biti isti ili različiti. U jednom otelotvorenju, prepust je prisutan na 3'-kraju sens lanca, antisens lanca, ili oba lanca. U jednom otelotvorenju, ovaj 3' prepust je prisutan u antisens lancu. U jednom otelotvorenju, ovaj 3' prepust je prisutan u sens lancu.
[0179] Agens RNKi može da sadrži jedan prepust, koji može da ojača interferentnu aktivnost RNKi, bez uticaja na njenu ukupnu stabilnost. Na primer, jednolančani prepust može biti lociran na 3'-terminalnom kraju sens lanca ili, alternativno, na 3'-terminalnom kraju antisens lanca. RNKi takođe može da ima tup kraj, lociran na 5'-kraju antisens lanca (ili na 3'-kraju sens lanca) ili obrnuto. Uopšteno, antisens lanac RNKi ima nukleotidni prepust na 3' kraju, a 5' kraj je tup. Ne želeći da se ograničimo teorijom, asimetrični tupi kraj na 5'-kraju antisens lanca i prepust na 3'-kraju antisens lanca pogoduju vodećem lancu koji se unosi u proces RISC.
[0180] U jednom otelotvorenju, agens RNKi sadrži sens lanac od 21 nukleotida i antisens lanac od 23 nukleotida, pri čemu sens lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-F modifikacije na tri uzastopna nukleotida na pozicijama 9, 10, 11 od 5'-kraja; antisens lanac
1
sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-O-metil modifikacije na tri uzastopna nukleotida na pozicijama 11, 12, 13 od 5'-kraja, pri čemu je jedan kraj agensa RNKi tup, dok drugi kraj sadrži prepust od 2 nukleotida. Poželjno, prepust od 2 nukleotida je na 3'-kraju antisens lanca.
[0181] Kada je prepust od 2 nukleotida na 3'-kraju antisens lanca, može biti dve fosforotioatne internukleotidne veze između tri terminalna nukleotida, pri čemu su dva od tri nukleotida nukleotidi prepusta, a treći nukleotid je spareni nukleotid pored nukleotida prepusta. U jednom otelotvorenju, agens RNKi dodatno ima dve fosforotioatne internukleotidne veze između tri terminalna nukleotida na 5'-kraju sens lanca i na 5'-kraju antisens lanca. U jednom otelotvorenju, svaki nukleotid u sens lancu i antisens lancu agensa RNKi, uključujući nukleotide koji su deo motiva, je modifikovani nukleotid. U jednom otelotvorenju, svaki ostatak je nezavisno modifikovan sa 2'-O-metil ili 3'-fluor, npr. u naizmeničnom motivu. U jednom otelotvorenju, svi nukleotidi iRNK iz pronalaska su modifikovani i iRNK sadrži ne više od 82'-fluor modifikacija (npr. ne više od 72'-fluor modifikacija, ne više od 62'-fluor modifikacija, ne više od 52'-fluor modifikacija, ne više od 4 2'-fluor modifikacije, ne više od 32'-fluor modifikacije ili ne više od 22'-fluor modifikacije) na sens lancu i ne više od 62'-fluor modifikacija (npr. ne više od 52'-fluor modifikacija, ne više od 42'-fluor modifikacije, ne više od 32'-fluor modifikacije ili ne više od 22'-fluor modifikacije) na antisens lancu. Opciono, agens RNKi dalje sadrži ligand (poželjno GalNAc3).
[0182] U jednom otelotvorenju, sens lanac agensa RNKi sadrži najmanje jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, pri čemu se jedan od motiva javlja na mestu cepanja u sens lancu.
[0183] U jednom otelotvorenju, antisens lanac agensa RNKi može takođe da sadrži najmanje jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, pri čemu se jedan od motiva javlja na mestu cepanja antisens lanca ili blizu njega.
[0184] Kod agensa RNKi koji ima region dvojne spirale dužine od 17-23 nukleotida, mesto cepanja antisens lanca je obično oko pozicija 10, 11 i 12 od 5'-kraja. Tako, motivi od tri identične modifikacije mogu da se jave na pozicijama 9, 10, 11; pozicijama 10, 11, 12; pozicijama 11, 12, 13; pozicijama 12, 13, 14; ili pozicijama 13, 14, 15 na antisens lancu, pri čemu brojanje počinje od 1. nukleotida od 5'-kraja antisens lanca, ili, brojanje počinje od 1.
2
uparenog nukleotida u regionu dvojne spirale od 5'-kraja antisens lanca. Mesto cepanja u antisens lancu se takođe može promeniti u skladu sa dužinom regiona dvojne spirale RNKi od 5' kraja.
[0185] Sens lanac agensa RNKi može da sadrži najmanje jedan motiv tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida na mestu cepanja lanca; a antisens lanac može da ima najmanje jedan motiv tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida na mestu cepanja lanca ili blizu njega. Kada sens lanac i antisens lanac grade dvojnu spiralu dsRNK, sens lanac i antisens lanac mogu biti poravnati tako da jedan motiv tri nukleotida na sens lancu i jedan motiv tri nukleotida na antisens lancu imaju bar jedan nukleotid preklapanja, tj. najmanje jedan od tri nukleotida motiva u sens lancu gradi bazni par sa najmanje jednim od tri nukleotida motiva u antisens lancu. Alternativno, najmanje dva nukleotida mogu da se preklapaju, ili sva tri nukleotida mogu da se preklapaju.
[0186] U jednom otelotvorenju, svaki nukleotid u sens lancu i antisens lancu agensa RNKi, uključujući nukleotide koji su deo motiva, može biti modifikovan. Svaki nukleotid može biti modifikovan sa istom ili različitom modifikacijom koja može da uključuje jednu ili više izmena jednog ili oba nevezujuća fosfatna kiseonika i/ili jednog ili više vezujućih fosfatnih kiseonika; izmenu sastavnog dela šećera riboze, npr.2' hidroksila na šećeru ribozi; potpunu zamenu fosfatnog ostatka „defosfo“ linkerima; modifkaciju ili zamenu baze koja se javlja u prirodi; i zamenu ili modifikaciju skeleta riboza-fosfat.
[0187] Pošto su nukleinske kiseline polimeri podjedinica, mnoge od modifikacija se javljaju na poziciji koja je ponovljena u nukleinskoj kiselini, npr. modifikacija baza, ili fosfatni ostatak ili nevezujući O fosfatnog ostatka. U nekim slučajevima, modifikacije će se javiti na svim podložnim pozicijama u nukleinskoj kiselini, ali u mnogim slučajevima neće. Na primer, modifikacija se može javiti samo na 3' ili 5' terminalnoj poziciji, može se javiti samo u terminalnom regionu, npr. na poziciji na terminalnom nukleotidu ili kod poslednjih 2, 3, 4, 5 ili 10 nukleotida lanca. Modifikacija se može javiti u dvolančanom regionu, jednolančanom regionu, ili u oba. Modifikacija se može javiti samo u dvolančanom regionu RNK ili se može javiti samo u jednolančanom regionu RNK. Na primer, fosforotioatna modifikacija na poziciji nevezujućeg O može se javiti samo na jednom ili na oba terminusa, može se javiti samo u terminalnom regionu, npr. na poziciji na terminalnom nukleotidu ili na poslednjih 2, 3, 4, 5 ili 10 nukleotida lanca, ili se može javiti na dvolančanim i jednolančanim regionima, naročito na terminusima. 5' kraj ili krajevi mogu biti fosforilovani.
[0188] Može biti moguće, npr. radi povećanja stabilnosti, da se u prepuste uključe određene baze, ili da se uključe modifikovani nukleotidi ili surogati nukleotida, u jednolančane prepuste, npr. u 5' ili 3' prepust, ili u oba. Na primer, može biti poželjno da se purinski nukleotidi uključe u prepuste. U nekim otelotvorenjima, sve ili neke od baza u 3' ili 5' prepustu mogu biti modifikovane, npr. sa ovde opisanom modifikacijom. Modifikacije mogu da uključuju, npr. upotrebu modifikacija na 2' poziciji šećera riboze sa modifikacijama koje su poznate u struci, npr. upotreba dezoksiribonukleotida, 2'-dezoksi-2'-fluor (2'-F) ili 2'-O-metil modifikovanih umesto ribošećera nukleobaze, i modifikacija u fosfatnoj grupi, npr. fosforotioatne modifikacije. Prepusti ne moraju da budu homologi sa ciljnom sekvencom.
[0189] U jednom otelotvorenju, svaki ostatak sens lanca i antisens lanca je nezavisno modifikovan sa LNK, CRN, cET, UNK, HNA, CeNA, 2'-metoksietil, 2'- O-metil, 2'-O-alil, 2'-C- alil, 2'-dezoksi, 2'-hidroksil ili 2'-fluor. Lanci mogu da sadrže više od jedne modifikacije. U jednom otelotvorenju, svaki lanac sens lanca i antisens lanca je nezavisno modifikovan sa 2'- O-metil ili 2'-fluor.
[0190] Najmanje dve različite modifikacije su obično prisutne na sens lancu i antisens lancu. Te dve modifikacije mogu biti 2'-O-metil ili 2'-fluor modifikacija, ili druge.
[0191] U jednom otelotvorenju, Nai/ili Nbsadrže modifikacije naizmeničnog obrasca.
Termin „naizmenični motiv“, kako se ovde koristi, odnosi se na motiv koji ima jednu ili više modifikacija, pri čemu se svaka modifikacija javlja na naizmeničnim nukleotidima jednog lanca. Naizmenični nukleotid može da se odnosi na jedan na svaka dva nukleotida ili na jedan na svaka tri nukleotida, ili na sličan šablon. Na primer, ako svaki od A, B i C predstavlja jednu vrstu modifikacije nukleotida, naizmenični motiv može biti „ABABABABABAB...“, „AABBAABBAABB...“, „AABAABAABAAB...“, „AAABAAABAAAB...“, „AAABBBAAABBB...“ ili „ABCABCABCABC...“, itd.
[0192] Vrste modifikacija koje su sadržane u naizmeničnom motivu mogu biti iste ili različite. Na primer, ako svaki A, B, C, D predstavlja jednu vrstu modifikacije na nukleotidu, naizmenični obrazac, tj. modifikacije na svakom drugom nukleotidu, može biti isti, ali svaki
4
od sens lanca ili antisens lanca može biti odabran od nekoliko mogućih modifikacija u naizmeničnom motivu poput „ABABAB...“, „ACACAC...“ „BDBDBD...“ ili „CDCDCD...“, itd.
[0193] U jednom otelotvorenju, agens RNKi iz otkrića sadrži obrazac modifikacije za naizmenični motiv na sens lancu koji je pomeren u odnosu na obrazac modifikacije za naizmenični motiv na antisens lancu. Pomeranje može biti takvo da modifikovana grupa nukleotida sens lanca odgovara različito modifikovanoj grupi nukleotida antisens lanca i obrnuto. Na primer, kada je sens lanac uparen sa antisens lancem u dupleksu dsRNK, naizmenični motiv sens lanca može početi sa „ABABAB“ od 5'-3' lanca, a naizmenični motiv antisens lanca može početi sa „BABABA“ od 5'-3' lanca u regionu dupleksa. Kao drugi primer, naizmenični motiv sens lanca može početi sa „AABBAABB“ od 5'-3' lanca, a naizmenični motiv antisens lanca može početi sa „BBAABBAA“ od 5'-3' lanca u regionu dupleksa, tako da dođe do potpunog ili delimičnog pomeranja šablona modifikacije između sens i antisens lanca.
[0194] U jednom otelotvorenju, agens RNKi sadrži obrazac naizmeničnog motiva 2'-O-metil modifikacije i 2'-F modifikacije na sens lancu i inicijalno ima pomak u odnosu na obrazac naizmeničnog motiva 2'-O-metil modifikacije i 2'-F modifikacije na antisens lancu inicijalno, tj. 2'-O-metil modifikovani nukleotid na sens lancu formira bazni par sa 2'-F modifikovanim nukleotidom na antisens lancu, i obrnuto. Pozicija 1 sens lanca može početi sa 2'-F modifikacijom, a pozicija 1 antisens lanca može početi sa 2'-O-metil modifikacijom.
[0195] Uvođenje jednog ili više motiva tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida na sens lanac i/ili antisens lanac prekida prvobitni obrazac modifikacije prisutan u sens lancu i/ili antisens lancu. Ovo prekidanje šablona modifikacije na sens i/ili antisens lancu uvođenjem jednog ili više motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida u sens i/ili antisens lancu iznenađujuće je pojačalo aktivnost utišavanja ciljnog gena.
[0196] U jednom otelotvorenju, kada je motiv tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida uveden u bilo koji od lanaca, modifikacija nukleotida pored motiva je različita modifikacija od modifikacije motiva. Na primer, deo sekvence koji sadrži motiv je „...NaYYYNb...“, gde Y predstavlja modifikaciju motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, a „Na“ i „Nb“ predstavljaju modifikaciju nukleotida koji je pored motiva „YYY“ koja je različita od modifikacije Y, i pri čemu Nai Nbmogu biti različite ili iste modifikacije. Alternativno, Nai/ili Nbmogu biti prisutni ili odsutni kada je prisutna bočna modifikacija.
[0197] Agens RNKi može dalje da sadrži najmanje jednu fosforotioatnu ili metilfosfonatnu internukleotidnu vezu. Modifikacija fosforotioatne ili metilfosfonatne veze može da se javi na bilo kom nukleotidu sens lanca ili antisens lanca ili oba lanca na bilo kojoj poziciji lanca. Na primer, modifikacija internukleotidne veze može da se javi na svakom nukleotidu na sens lancu i/ili antisens lancu; svaka modifikacija internukleotidne veze može da se javi u naizmeničnom obrascu na sens lancu i/ili antisens lancu; ili sens lanac ili antisens lanac mogu da sadrže obe modifikacije internukleotidne veze u naizmeničnom obrascu. Naizmenični šablon modifikacije internukleotidne veze na sens lancu može biti isti ili različit od onog na antisens lancu, i naizmenični šablon modifikacije internukleotidne veze na sens lancu može imati pomeranje u odnosu na naizmenični šablon modifikacije internukleotidne veze na antisens lancu. U jednom otelotvorenju, agens dvolančane RNKi sadrži 6-8 fosforotioatnih internukleotidnih veza. U jednom otelotvorenju, antisens lanac sadrži dve fosforotioatne internukleotidne veze na 5'-terminusu i dve fosforotioatne internukleotidne veze na 3'-terminusu, a sens lanac sadrži najmanje dve fosforotioatne internukleotidne veze na 5'-terminusu ili 3'-terminusu.
[0198] U jednom otelotvorenju, RNKi sadrži modifikaciju fosforotioatne ili metilfosfonatne internukleotidne veze u regionu prepusta. Na primer, region prepusta može da sadrži dva nukleotida sa fosforotioatnom ili metilfosfonatnom internukleotidnom vezom između dva nukleotida. Modifikacije internukleotidne veze takođe mogu da se načine da povežu nukleotide prepusta sa terminalno sparenim nukleotidima u regionu dvojne spirale. Na primer, najmanje 2, 3, 4 ili svi nukleotidi prepusta mogu biti povezani putem fosforotioatne ili metilfosfonatne internukleotidne veze, i opciono mogu postojati dodatne fosforotioatne ili metilfosfonatne internukleotidne veze koje povezuju nukleotid prepusta sa sparenim nukleotidom koji se nalazi pored nukleotida prepusta. Na primer, može biti najmanje dve fosforotioatne internukleotidne veze između tri terminalna nukleotida, gde su dva od tri nukleotida nukleotidi prepusta, a treći je spareni nukleotid pored nukleotida prepusta. Ta tri terminalna nukleotida mogu biti na 3'-kraju antisens lanca, 3'-kraju sens lanca, 5'-kraju antisens lanca i/ili 5'kraju antisens lanca.
[0199] U jednom otelotvorenju, prepust od 2 nukleotida je na 3'-kraju antisens lanca, i ima dve fosforotioatne internukleotidne veze između tri terminalna nukleotida, pri čemu su dva od tri nukleotida nukleotidi prepusta, a treći nukleotid je spareni nukleotid pored nukleotida prepusta. Opciono, agens RNKi može dodatno da ima dve fosforotioatne internukleotidne veze između tri terminalna nukleotida na 5'-kraju sens lanca i na 5'-kraju antisens lanca.
[0200] U jednom otelotvorenju, agens RNKi sadrži neusklađene parove sa ciljem, u dvojnoj spirali, ili kombinaciju prethodnog. Neusklađeni par može da se javi u regionu prepusta ili regionu dvojne spirale. Bazni par može da se rangira na bazi njihove sklonosti da promovišu disocijaciju ili topljenje (npr. na slobodnoj energiji asocijacije ili disocijacije konkretnog para, najjednostavniji pristup je da se ispitaju parovi na osnovu pojedinačnog para, mada se mogu koristiti sledeći sused ili slična analiza). Što se tiče promovisanja disocijacije: A:U je poželjno u odnosu na G:C; G:U je poželjno u odnosu na G:C; a I:C je poželjno u odnosu na G:C (I=inozin). Neusklađeni parovi, npr. nekanonski ili parovi osim kanonskih (kao što je opisano u drugom delu ovog teksta) poželjniji su u odnosu na kanonske (A:T, A:U, G:C) parove; a parovi koji uključuju univerzalnu bazu su poželjniji u odnosu na kanonske parove.
[0201] U jednom otelotvorenju, agens RNKi sadrži najmanje jedan od prvih 1, 2, 3, 4 ili 5 baznih parova u regionima dvojne spirale od 5'-kraja antisens lanca nezavisno odabranih iz grupe: A:U, G:U, I:C i neusklađenih parova, npr. nekanonskih, ili parova osim kanonskih, ili parova koji uključuju univerzalnu bazu, radi promovisanja disocijacije antisens lanca na 5'-kraju dvojne spirale.
[0202] U jednom otelotvorenju, nukleotid na poziciji 1 u regionu dvojne spirale od 5'-kraja antisens lanca odabran je iz grupe koja se sastoji od A, dA, dU, U i dT. Alternativno, najmanje jedan od prvih 1, 2, ili 3 baznih parova u regionu dvojne spirale od 5'-kraja antisens lanca je bazni par AU. Na primer, prvi bazni bar u regionu dvojne spirale od 5'-kraja antisens lanca je bazni par AU.
[0203] U jednom otelotvorenju, sekvenca sens lanca može biti predstavljena formulom (I):
5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq3' (I)
pri čemu:
i i j su svaki nezavisno 0 ili 1;
p i q su svaki nezavisno 0-6;
svako Nanezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 0-25 modifikovanih nukleotida, svaka sekvenca sadrži najmanje dva različito modifikovana nukleotida; svako Nbnezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida sa 0-10 modifikovanih nukleotida; svako npi nqnezavisno predstavlja nukleotid prepusta;
pri čemu Nb i Y nemaju istu modifikaciju; i
XXX, YYY i ZZZ nezavisno predstavljaju jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida. Poželjno, YYY su svi 2'-F modifikovani nukleotidi.
[0204] U jednom otelotvorenju, Nai/ili Nbsadrže modifikacije naizmeničnog obrasca.
[0205] U jednom otelotvorenju, motiv YYY se javlja na mestu cepanja sens lanca ili blizu njega. Na primer, kada agens RNKi ima region dvojne spirale dužine od 17-23 nukleotida, YYY motiv može da se javi na mestu cepanja ili u njegovoj blizini (npr. može da se javi na pozicijama 6, 7, 8, 7, 8, 9, 8, 9, 10, 9, 10, 11, 10, 11,12 ili 11, 12, 13) sens lanca, pri čemu brojanje počinje od 1. nukleotida od 5'-kraja; ili, opciono, brojanje počinje od 1. sparenog nukleotida u regionu dvojne spirale, od 5'-kraja.
[0206] U jednom otelotvorenju, i je 1, a j je 0, ili i je 0, a j je 1, ili i i j su 1. Sens lanac stoga može biti predstavljen sledećim formulama:
5' np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3' (Ib);
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq3' (Ic);
ili
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3' (Id).
[0207] Kada je sens lanac predstavljen formulom (Ib), Nbpredstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida. Svako Namože nezavisno da predstavlja sekvencu oligonukleotida sa 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0208] Kada je sens lanac predstavljen kao formula (Ic), Nbpredstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida. Svako Namože nezavisno da predstavlja sekvencu oligonukleotida sa 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0209] Kada je sens lanac predstavljen kao formula (Id), svaki Nbnezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida. Poželjno, svako Naje 0, 1, 2, 3, 4, 5 ili 6. Svako Namože nezavisno da predstavlja sekvencu oligonukleotida sa 2-20, 2-15 ili 2-10 modifikovanih nukleotida. X, Y i Z mogu biti isti ili međusobno različiti.
[0210] U drugim otelotvorenjima, i je 0 i j je 0, a sens lanac može biti predstavljen formulom:
5' np-Na-YYY-Na-nq3' (Ia).
[0211] Kada je sens lanac predstavljen formulom (Ia), svaki Nanezavisno može da predstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 2-20, 2-15 ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0212] U jednom otelotvorenju, sekvenca antisens lanca RNKi može biti predstavljena formulom (II):
5' nq'-Na'-(Z'Z'Z')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(X'X'X')l-N'a-np' 3' (II)
pri čemu:
k i l su svaki nezavisno 0 ili 1;
p' i q' su svaki nezavisno 0-6;
svako Na' nezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 0-25 modifikovanih nukleotida, svaka sekvenca sadrži najmanje dva različito modifikovana nukleotida; svako Nb' nezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida sa 0-10 modifikovanih nukleotida; svako np' i nq' nezavisno predstavlja nukleotid prepusta;
pri čemu Nb' i Y' nemaju istu modifikaciju; i
X'X'X', Y'Y'Y' i Z'Z'Z' svaki nezavisno predstavlja jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida.
[0213] U jednom otelotvorenju, Na' i/ili Nb' sadrže modifikacije naizmeničnog obrasca.
[0214] Motiv Y'Y'Y' se javlja na mestu cepanja antisens lanca ili blizu njega. Na primer, kada agens RNKi ima region dvojne spirale dužine 17-23 nukleotida, motiv Y'Y'Y' može da se javi na pozicijama 9, 10, 11; 10, 11, 12; 11, 12, 13; 12, 13, 14; ili 13, 14, 15 antisens lanca, pri čemu brojanje počinje od 1. nukleotida od 5'-kraja; ili, opciono, brojanje počinje od 1. sparenog nukleotida u regionu dvojne spirale od 5'-kraja. Poželjno, motiv Y'Y'Y' se javlja na pozicijama 11, 12, 13.
[0215] U jednom otelotvorenju, Y'Y'Y' motiv čine samo 2'-OMe modifikovani nukleotidi.
[0216] U jednom otelotvorenju, k je 1 i l je 0, ili je k 0 i l je 1, ili su i k i l jednaki 1.
[0217] Antisens lanac stoga može biti predstavljen sledećim formulama:
5' nq'-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Na'-np'3' (IIb);
5' nq'-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-X'X'X'-np'3' (IIc);
ili
5' nq'-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-X'X'X'-Na'-np'3' (IId).
[0218] Kada je antisens lanac predstavljen formulom (IIb), Nbpredstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida. Svako Na' nezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida sa 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0219] Kada je antisens lanac predstavljen formulom (IIc), Nb' predstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida. Svako Na' nezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida sa 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0220] Kada je antisens lanac predstavljen formulom (IId), svaki Nb' nezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida. Svako Na' nezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida sa 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida. Poželjno, Nbje 0, 1, 2, 3, 4, 5 ili 6.
[0221] U drugim otelotvorenjima, k je 0 i l je 0 i antisens lanac može biti predstavljen formulom:
5' np'-Na'-Y'Y'Y'-Na'-nq'3' (Ia).
[0222] Kada je antisens lanac predstavljen kao formula (IIa), svaki Na' nezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 2-20, 2-15 ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
X', Y' i Z' mogu biti isti ili međusobno različiti.
Svaki nukleotid iz sens lanca i antisens lanca može biti nezavisno modifikovan sa LNK, CRN, UNK, cEt, HNA, CeNA, 2'-metoksietil, 2'-O-metil, 2'-O-alil, 2'-C-alil, 2'-hidroksil ili 2'-fluor. Na primer, svaki nukleotid sens lanca i antisens lanca je nezavisno modifikovan sa 2'-O-metil ili 2'-fluor. Svaki X, Y, Z, X', Y' i Z', naročito, može da predstavlja 2'-O-metil modifikaciju ili 2'-fluor modifikaciju.
[0223] U jednom otelotvorenju, sens lanac agensa RNKi može da sadrži YYY motiv koji se javlja na pozicijama 9, 10 i 11 lanca kada region dvojne spirale ima 21 nt, brojanje počinje od 1. nukleotida od 5'-kraja, ili, opciono, brojanje počinje od 1. sparenog nukleotida u regionu dvojne spirale, od 5'-kraja; a Y predstavlja 2'-F modifikaciju.
[0224] U jednom otelotvorenju, antisens lanac može da sadrži Y'Y'Y' motiv koji se javlja na pozicijama 11, 12, 13 lanca, pri čemu brojanje počinje od 1. nukleotida od 5'-kraja, ili,
1
opciono, brojanje počinje od 1. sparenog nukleotida u regionu dvojne spirale od 5'-kraja; a Y' predstavlja 2'-O-metil modifikaciju.
[0225] Sens lanac predstavljen bilo kojom od prethodnih formula (Ia), (Ib), (Ic) i (Id) gradi dvojnu spiralu sa antisens lancem koji je predstavljen bilo kojom od formula (IIa), (IIb), (IIc), odnosno (IId).
[0226] Shodno tome, agensi RNKi za upotrebu u postupcima iz pronalaska mogu da sadrže sens lanac i antisens lanac, od kojih svaki ima 14 do 30 nukleotida, dvojna spirala RNKi je predstavljena formulom (III):
pri čemu:
i, j, k i l su svaki nezavisno 0 ili 1;
p, p', q, i q' su svaki nezavisno 0-6;
svaki Nai Nanezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 0-25 modifikovanih nukleotida, i svaka sekvenca sadrži najmanje dva različito modifikovana nukleotida; svaki Nbi Nbnezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 0-10 modifikovanih nukleotida;
pri čemu svaki np', np, nq' i nq, od kojih svaki može ali ne mora biti prisutan, nezavisno predstavlja nukleotid prepusta; i
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' i Z'Z'Z' svaki nezavisno predstavlja jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida.
[0227] U jednom otelotvorenju, i je 0 i j je 0; ili i je 1 i j je 0; ili i je 0 i j je 1; ili su i i j oba 0; ili su i i j oba 1. U drugom otelotvorenju, k je 0 i l je 0; ili k je 1 i l je 0; k je 0 i l je 1; ili su k i l oba 0; ili su k i l oba 1.
[0228] Primeri kombinacija sens lanca i antisens lanca koji grade dvojnu spiralu RNKi uključuju formule u nastavku:
2
[0229] Kada je agens RNKi predstavljen formulom (IIIa), svaki Nanezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 2-20, 2-15 ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0230] Kada je agens RNKi predstavljen formulom (IIIb), svaki Nbnezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 1-10, 1-7, 1-5 ili 1-4 modifikovanih nukleotida. Svako Nanezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida sa 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0231] Kada je agens RNKi predstavljen kao formula (IIIc), svaki Nb, Nb' nezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida. Svako Nanezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida sa 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0232] Kada je agens RNKi predstavljen kao formula (IIId), svaki Nb, Nb' nezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida. Svaki Na, Nanezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 2-20, 2-15 ili 2-10 modifikovanih nukleotida. Svako Na, Na', Nbi Nb' nezavisno sadrži modifikaciju naizmeničnih šablona.
[0233] Kada je agens RNKi predstavljen kao formula (IIIe), svaki Na, Na', Nb, i Nb' nezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 0-25 nukleotida koji su modifikovani ili nemodifikovani ili njihove kombinacije, pri čemu svaka sekvenca sadrži najmanje dva različito modifikovana nukleotida.
[0234] Svaki X, Y i Z u formulama (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), (IIId) i (IIIe) može biti isti ili različit.
[0235] Kada je agens RNKi predstavljen formulom (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), (IIId) i (IIIe), najmanje jedan od Y nukleotida može da gradi bazni par sa jednim od Y' nukleotida.
Alternativno, najmanje dva Y nukleotida grade bazne parove sa odgovarajućim Y' nukleotidima, ili sva tri Y nukleotida grade bazne parove sa odgovarajućim Y' nukleotidima.
[0236] Kada je agens RNKi predstavljen formulom (IIb) ili (IId), najmanje jedan od Z nukleotida može da gradi bazni par sa jednim od Z' nukleotida. Alternativno, najmanje dva Z nukleotida grade bazne parove sa odgovarajućim Z' nukleotidima; ili sva tri Z nukleotida grade bazne parove sa odgovarajućim Z' nukleotidima.
[0237] Kada je agens RNKi predstavljen kao formula (IIIc) ili (IIId), najmanje jedan od X nukleotida može da gradi bazni par sa jednim od X' nukleotida. Alternativno, najmanje dva X nukleotida grade bazne parove sa odgovarajućim X' nukleotidima, ili sva tri X nukleotida grade bazne parove sa odgovarajućim X' nukleotidima.
[0238] U jednom otelotvorenju, modifikacija na Y nukleotidu je različita od modifikacije na Y' nukleotidu, modifikacija na Z nukleotidu je različita od modifikacije na Z' nukleotidu i/ili modifikacija na X nukleotidu je različita od modifikacije na X' nukleotidu.
[0239] U jednom otelotvorenju, kada je agens RNKi predstavljen formulom (IIId), Namodifikacije su 2'-O-metil ili 2'-fluor modifikacije. U drugom otelotvorenju, kada je agens RNKi predstavljen formulom (IIId), Namodifikacije su 2'-O-metil ili 2'-fluor modifikacije i np' >0, a najmanje jedan np' je povezan sa susednim nukleotidom putem fosforotioatne veze.
4
U još jednom otelotvorenju, kada je agens RNKi predstavljen formulom (IIId), Namodifikacije su 2'-O-metil ili 2'-fluor modifikacije, np' >0, i najmanje jedan np' je povezan sa susednim nukleotidom putem fosforotioatne veze i sens lanac je konjugovan sa jednim ili više derivata GalNAc povezanih dvovalentnim ili trovalentnim razgranatim linkerom (opisano u nastavku). U drugom otelotvorenju, kada je agens RNKi predstavljen formulom (IIId), Namodifikacije su 2'-O-metil ili 2'-fluor modifikacije, np' >0 i najmanje jedan np' je povezan sa susednim nukleotidom putem fosforotioatne veze, sens lanac sadrži najmanje jednu fosforotioatnu vezu i sens lanac je konjugovan sa jednim ili više derivata GalNAc povezanih dvovalentnim ili trovalentnim razgranatim linkerom.
[0240] U jednom otelotvorenju, kada je agens RNKi predstavljen formulom (IIIa), Namodifikacije su 2'-O-metil ili 2'-fluor modifikacije, np' >0 i najmanje jedan np' je povezan sa susednim nukleotidom putem fosforotioatne veze, sens lanac sadrži najmanje jednu fosforotioatnu vezu i sens lanac je konjugovan sa jednim ili više derivata GalNAc povezanih dvovalentnim ili trovalentnim razgranatim linkerom.
[0241] U jednom otelotvorenju, dva agensa RNKi predstavljena formulom (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), (IIId) i (IIIe) su međusobno povezana na 5' kraju, a jedan ili oba 3' kraja su opciono konjugovana sa ligandom. Svaki agens može da cilja isti gen ili dva različita gena; ili svaki agens može da cilja isti gen na dva različita ciljna mesta.
[0242] Različite publikacije opisuju multimerne agense RNKi koji mogu da se koriste u postupcima iz pronalaska. Takve publikacije uključuju WO2007/091269, US Patent br. 7858769, WO2010/141511, WO2007/117686, WO2009/014887 i WO2011/031520.
[0243] Kao što je detaljnije opisano u nastavku, agens RNKi koji sadrži konjugacije jednog ili više ugljovodoničnih ostataka sa agensom RNKi može da optimizuje jedno ili više svojstava agensa RNKi. U mnogim slučajevima, ostatak ugljenog hidrata će biti vezan za modifikovanu podjedinicu agensa RNKi. Na primer, šećer riboza iz jedne ili više podjedinica ribonukleotida agensa dsRNK može biti zamenjen drugim ostatkom, npr. neugljovodoničnim (poželjno cikličnim) nosačem za koji je vezan ugljovodonični ligand. Ribonukleotidna podjedinica u kojoj je šećer riboza podjedinice tako zamenjen ovde se naziva podjedinica sa modifikacijom zamene riboze (ribose replacement modification subunit, RRMS). Ciklični nosač može biti karbociklični sistem prstena, tj. svi atomi prstena su atomi ugljenika, ili heterociklični sistem prstena, tj. jedan ili više atoma prstena može biti heteroatom, npr. azot, kiseonik, sumpor. Ciklični nosač može biti monociklični sistem prstena ili može da sadrži dva ili više prstenova, npr. kondenzovanih prstenova. Ciklični nosač može biti potpuno zasićeni sistem prstena, ili može da sadrži jednu ili više dvostrukih veza.
[0244] Ligand može biti povezan sa polinukleotidom putem nosača. Nosači uključuju (i) najmanje jednu „tačku vezivanja skeleta“, poželjno dve „tačke vezivanja skeleta“ i (ii) najmanje jednu „vezujuću tačku kačenja“. „Tačka vezivanja skeleta“, kako se ovde koristi, odnosi se na funkcionalnu grupu, npr. hidroksilnu grupu, ili generalno vezu koja je dostupna i koja je pogodna za uključivanje nosača u skelet, npr. fosfata ili modifikovanog fosfata, npr. koji sadrži sumpor, skeleta, ribonukleinske kiseline. „Vezujuća tačka kačenja“ (tethering attachment point, TAP) u nekim otelotvorenjima ukazuje na sastavni atom prstena cikličnog nosača, npr. atom ugljenika ili heteroatom (različit od atoma koji obezbeđuje tačku vezivanja skeleta) koji povezuje odabrani ostatak. Ostatak može biti, npr. ugljeni hidrat, npr. monosaharid, disaharid, trisaharid, tetrasaharid, oligosaharid i polisaharid. Opciono, izabrani ostatak je povezan interventnom vezom sa cikličnim nosačem. Tako, ciklično nosač često će uključivati funkcionalnu grupu, npr. amino grupu, ili uopšteno, pružati vezu koja je pogodna za inkorporisanje ili vezivanje drugog hemijskog entiteta, npr. ligand za sastavni prsten.
[0245] Agensi RNKi mogu biti konjugovani sa ligandom putem nosača, pri čemu nosač može biti ciklična grupa ili aciklična grupa; poželjno, ciklična grupa je izabrana od pirolidinila, pirazolinila, pirazolidinila, imidazolinila, imidazolidinila, piperidinila, piperazinila,
[1,3]dioksolana, oksazolidinila, izoksazolidinila, morfolinila, tiazolidinila, izotiazolidinila, hinoksalinila, piridazinonila, tetrahidrofurila i dekalina; poželjno, aciklična grupa je izabrana od serinolskog skeleta ili dietanolaminskog skeleta.
[0246] U određenim specifičnim otelotvorenjima, agens RNKi, npr. za upotrebu u postupcima iz pronalaska, jeste agens izabran iz grupe agenasa navedenih u bilo kojoj od tabela 1, 3, 5, 6 i 7. Ti agensi mogu dalje da sadrže ligand.
[0247] U određenim otelotvorenjima, agens RNKi iz otkrića je agens izabran iz grupe koja se sastoji od AD-66016, AD-65492, AD-66017 i AD-66018.
IV. iRNK konjugovane sa ligandima
[0248] Još jedna modifikacija RNK iz iRNK iz otkrića obuhvata hemijsko povezivanje sa RNK jednog ili više liganada, ostataka ili konjugata koji pojačavaju aktivnost, ćelijsku distribuciju ili ćelijsko preuzimanje iRNK. Takvi ostaci uključuju, ali nisu ograničeni na lipidne ostatke kao što su ostatak holesterola (Letsinger i sar. Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556), holna kiselina (Manoharan i sar. Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060), tioetar, npr. beril-S-tritiltiol (Manoharan i sar. Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309; Manoharan i sar. Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770), tioholesterol (Oberhauser i sar. Nucl. Acids Res., 1992, 20:533-538), alifatični lanac, npr. dodekandiol ili undecil ostaci (Saison-Behmoaras i sar. EMBO J, 1991, 10:1111-1118; Kabanov i sar. FEBS Lett., 1990, 259:327-330; Svinarchuk i sar. Biochimie, 1993, 75:49-54), fosfolipid, npr. diheksadecil-rac-glicerol ili trietil-amonijum 1,2-di-O-heksadecil-rac-glicero-3-fosfonat (Manoharan i sar. Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654; Shea i sar. Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783), lanac poliamina ili polietilen glikola (Manoharan i sar. Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973), ili adamantan sirćetnu kiselinu (Manoharan i sar.
Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654), palmitil ostatak (Mishra i sar. Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237), ili oktadecilamin ili ostatak heksilamino-karboniloksiholesterola (Crooke i sar. J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937).
[0249] U jednom otelotvorenju, ligand menja distribuciju, ciljanje ili životni vek agensa iRNK u koji je inkorporisan. U poželjnim otelotvorenjima, ligand pruža povećani afinitet prema odabranom cilju, npr. molekulu, ćeliji ili vrsti ćelije, odeljku, npr. odeljku ćelije ili organa, tkivu, organu ili regionu telu, u poređenju, npr. sa vrstom koja nema takav ligand. Poželjni ligandi neće učestvovati u sparivanju dvojne spirale u dupleks nukleinskoj kiselini.
[0250] Ligandi mogu da uključuju supstance koje se javljaju u prirodi, kao što je protein (npr. albumin ljudskog seruma (HSA), lipoprotein male gustine (LDL) ili globulin); ugljeni hidrat (npr. dekstran, pululan, hitin, hitozan, inulin, ciklodekstrin, N-acetilgalaktozamin ili hijaluronska kiselina); ili lipid. Ligand takođe može biti rekombinantni ili sintetički molekul, kao što je sintetički polimer, npr. sintetička poliamino kiselina. Primeri za poliaminokiseline uključuju polilizin (PLL), poli L-asparaginsku kiselinu, poli L-glutaminsku kiselinu, kopolimer stirena-anhidrida maleinske kiseline, poli(L-laktid-ko-glikolizovani) kopolimer, kopolimer divinil etra-anhidrida maleinske kiseline, N-(2-hidroksipropil)metakrilamid kopolimer (HMPA), polietilen glikol (PEG), polivinil alkohol (PVA), poliuretan, poli(2etilakrilnu kiselinu), polimere N-izopropilakrilamida, ili polifosfazin. Primeri za poliamin uključuju: polietilenimin, polilizin (PLL), spermin, spermidin, poliamin, pseudopeptidpoliamin, peptidomimetski poliamin, dendrimer poliamin, arginin, amidin, protamin, katjonski lipid, katjonski porfirin, kvaternernu so poliamina, ili alfa heliksni peptid.
[0251] Ligandi takođe mogu da uključuju ciljajuće grupe, npr. agens za ciljanje ćelije ili tkiva, npr. lektin, glikoprotein, lipid ili protein, npr. antitelo koje se vezuje za naznačenu vrstu ćelije, kao što je bubrežna ćelija. Ciljajuća grupa može biti tirotropin, melanotropin, lektin, glikoprotein, surfaktantski protein A, ugljeni hidrat mucin, polivalentna laktoza, jednovalentna galaktoza, N-acetil-galaktozamin, N-acetil-glukozamin polivalentna manoza, polivalentna fukoza, glikozilovane poliaminokiseline, polivalentna galaktoza, transferin, bisfosfonat, poliglutamat, poliaspartat, lipid, holesterol, steroid, žučna kiselina, folat, vitamin B12, vitamin A, biotin ili RGD peptid ili mimetik RGD peptida. U određenim otelotvorenjima, ligandi uključuju jednovalentnu ili polivalentnu galaktozu. U određenim otelotvorenjima, ligandi uključuju holesterol.
[0252] Drugi primeri za ligande uključuju boje, interkalirajuće agense (npr. akridine), kroslinkere (npr. psoralen, mitomicin C), porfirine (TPPC4, teksafirin, Sapfirin), policiklične aromatične ugljene hidrate (npr. fenazin, dihidrofenazin), veštačke endonukleaze (npr.
EDTA), lipofilne molekule, npr. holesterol, holnu kiselinu, adamantan sirćetnu kiselinu, 1-piren buternu kiselinu, dihidrotestosteron, 1,3-bis-O(heksadecil)glicerol, geraniloksiheksil grupu, heksadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3-propandiol, heptadecil grupu, palmitinsku kiselinu, miristinsku kiselinu, O3-(oleoil)litoholnu kiselinu, O3-(oleoil)holensku kiselinu, dimetoksitritil ili fenoksazin) i peptidne konjugate (npr. antennapedia peptid, Tat peptid), alkilujuće agense, fosfat, amino, merkapto, PEG (npr. PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, poliamino, alkil, supstituisani alkil, radiološki obeležene markere, enzime, haptene (npr. biotin), facilitatore transporta/apsorpcije (npr. aspirin, vitamin E, folna kiselina), sintetičke ribonukleaze (npr. imidazol, bisimidazol, histamin, klasteri imidazola, konjugati akridinimidazol, Eu3+ kompleksi tetraazamakrocikala), dinitrofenil, HRP ili AP.
[0253] Ligandi mogu biti proteini, npr. glikoproteini, ili peptidi, npr. molekuli koji imaju određeni afinitet prema koligandu, ili antitela, npr. antitelo koje se vezuje za naznačenu vrstu ćelije kao što je ćelija jetre. Ligandi takođe mogu da uključuju hormone i hormonske receptore. Takođe mogu da uključuju nepeptidne vrste, kao što su lipidi, lektini, ugljeni hidrati, vitamini, kofaktori, polivalentna laktoza, polivalentna galaktoza, N-acetilgalaktozamin, N-acetil-glukozamin polivalentna manoza ili polivalentna fukoza. Ligand može biti, na primer, lipopolisaharid, aktivator p38 MAP kinaze ili aktivator NF-κB.
[0254] Ligand može biti supstanca, npr. lek, koja može da povećava preuzimanje agensa iRNK u ćeliju, na primer, ometanjem ćelijskog citoskeleta, npr. ometanjem ćelijskih mikrotubula, mikrofilamenata i/ili intermedijernih filamenata. Lek može biti, na primer, takson, vinkristin, vinblastin, citohalazin, nokodazol, japlakinolid, latrunkulin A, faloidin, svinholid A, indanocin ili mioservin.
[0255] U nekim otelotvorenjima, ligand vezan za iRNK, kako je ovde opisan, deluje kao farmakokinetički modulator (PK modulator). PK modulatori uključuju lipofile, žučne kiseline, steroide, analoge fosfolipida, peptide, agense koji vezuju protein, PEG, vitamine, itd. Primeri za PK modulatore uključuju, ali nisu ograničeni na, holesterol, masne kiseline, holnu kiselinu, litoholnu kiselinu, dialkilgliceride, diacilglicerid, fosfolipide, sfingolipide, naproksen, ibuprofen, vitamin E, biotin, itd. Takođe je poznato da se oligonukleotidi koji sadrže određeni broj fosforotioatnih veza vezuju za serumski protein, te su kratki oligonukleotidi, npr. oligonukleotidi od oko 5 baza, 10 baza, 15 baza ili 20 baza, koji sadrže više fosforotioatnih veza u skeletu takođe pogodni za predmetni pronalazak kao ligandi (npr. kao PK modulišući ligandi). Pored toga, aptameri koji vezuju serumske komponente (npr. serumske proteine) takođe su pogodni za upotrebu kao PK modulišući ligandi u ovde opisanim otelotvorenjima.
[0256] Ligand-konjugovani oligonukleotidi iz pronalaska mogu da se sintetišu koristeći oligonukleotid koji ima reaktivnu bočnu grupu, kao što je ona dobijena povezivanjem vezujućeg molekula na oligonukleotid (opisano u nastavku). Ovaj reaktivni oligonukleotid može da reaguje direktno sa komercijalno dostupnim ligandima, ligandima koji su sintetisani da imaju bilo koju od raznovrsnih zaštitnih grupa, ili ligandima koji imaju vezujući ostatak povezan sa njima.
[0257] Oligonukleotidi korišćeni u konjugatima iz predmetnog pronalaska mogu se pogodno i rutinski dobiti pomoću dobro poznate tehnike sinteze u čvrstoj fazi. Opremu za takvu sintezu prodaje nekoliko dobavljača, uključujući, na primer, Applied Biosystems (Foster City, Calif.). Bilo koje drugo sredstvo za takvu sintezu koje je poznato u struci može da se koristi pored toga, ili umesto toga. Takođe je poznato korišćenje sličnih tehnika za pripremu drugih oligonukleotida, kao što su fosforotioati i alkilovani derivati.
[0258] Kod oligonukleotida konjugovanih sa ligandom i povezanih nukleozida specifičnih za sekvencu koji imaju molekul liganda iz predmetnog otkrića, oligonukleotidi i oligonukleozidi mogu da se sklope na odgovarajućem DNK sintetizatoru koristeći standardne nukleotidne ili nukleozidne prekursore, ili nukleotidne ili nukleozidne konjugatne prekursore koji već imaju vezujući ostatak, ligand-nukleotid ili nukleozid-konjugat prekursore koji već imaju molekul liganda, ili nenukleozidne gradivne blokove sa ligandom.
[0259] Kada se koristi nukleotid-konjugat prekursor koji već ima vezujući ostatak, sinteza povezanih nukleozida specifičnih za sekvencu je obično završena, a molekul liganda zatim reaguje sa vezujućim ostatkom i gradi oligonukleotid konjugovan sa ligandom. U nekim otelotvorenjima, oligonukleotidi ili povezani nukleozidi iz predmetnog pronalaska su sintetisani u automatskom sintetizatoru koristeći fosforamidite dobijene od konjugata ligandnukleozid pored standardnih fosforamidita i nestandardnih fosforamidita koji su komercijalno dostupni i rutinski se koriste u sintezi oligonukleotida.
A. Lipidni konjugati
[0260] U jednom otelotvorenju, ligand ili konjugat je lipid ili molekul na bazi lipida. Takav lipid ili molekul na bazi lipida poželjno vezuje serumski protein, npr. albumin iz ljudskog seruma (HSA). HSA vezujući ligand omogućava distribuciju konjugata do ciljnog tkiva, npr. ciljnog tkiva organizma koje se ne nalazi u bubregu. Na primer, ciljno tkivo može biti jetra, uključujući parenhimske ćelije jetre. Drugi molekuli koji mogu da vezuju HSA takođe mogu da se koriste kao ligandi. Na primer, mogu se koristiti i naproksen ili aspirin. Lipid ili ligand na bazi lipida može (a) da poveća otpornost na razgradnju konjugata, (b) da poveća ciljanje ili transport u ciljnu ćeliju ili ćelijsku membranu i/ili (c) da se koristi da se podesi vezivanje za serumski protein, npr. HSA.
[0261] Ligand na bazi lipida može da se koristi za inhibiciju, npr. kontrolisanje vezivanja konjugata za ciljno tkivo. Na primer, za lipid ili ligand na bazi lipida koji se snažnije vezuje za HSA biće manje verovatno da cilja bubreg, i stoga manje verovatno da se brzo ukloni iz organizma. Lipid ili ligand na bazi lipida koji se snažno vezuje za HSA može da se koristi za ciljanje konjugata prema bubregu.
[0262] U poželjnom otelotvorenju, ligand na bazi lipida vezuje HSA. On poželjno vezuje HSA sa dovoljnim afinitetom tako da će konjugat poželjno biti distribuiran u nebubrežno tkivo. Međutim, poželjno je da afinitet ne bude toliko jak da se vezivanje HSA-ligand ne može preokrenuti.
[0263] U drugom poželjnom otelotvorenju, ligand na bazi lipida slabo vezuje HSA ili ga uopšte ne vezuje, tako da će konjugat poželjno biti distribuiran u bubreg. Drugi ostaci koji ciljaju ćelije bubrega takođe mogu da se koriste umesto liganda na bazi lipida, ili kao dodatak njemu.
[0264] U drugom aspektu, ligand je ostatak, npr. vitamin, koji preuzima ciljna ćelija, npr. proliferativna ćelija. Oni su naročito korisni za lečenje poremećaja koje karakteriše neželjena ćelijska proliferacija, npr. maligne ili nemaligne vrste, npr. ćelije kancera. Primeri vitamina uključuju vitamin A, E i K. Drugi primeri vitamina uključuju vitamin B, npr. folnu kiselinu, B12, riboflavin, biotin, piridoksal ili druge vitamine ili hranljive supstance koje preuzimaju ćelije poput ćelija jetre. Takođe su uključeni HSA i lipoprotein male gustine (LDL).
B. Agens za ćelijsku permeaciju
[0265] U drugom aspektu, ligand je agens za ćelijsku permeaciju, poželjno heliksni agens za ćelijsku permeaciju. Poželjno, agens je amfipatički. Primer za agens je peptid, kao što je tat ili antenopedija. Ako je agens peptid, on može biti modifikovan, uključujući peptidilmimetik, invertomere, nepeptidne ili pseudopeptidne veze, i korišćenje D-aminokiselina. Spiralni agens je poželjno alfa-heliksni agens, koji poželjno ima lipofilnu i lipofobnu fazu.
[0266] Ligand može biti peptid ili peptidomimetik. Peptidomimetik (ovde se takođe naziva oligopeptidomimetik) je molekul sposoban da se presavija u definisanu trodimenzionalnu strukturu sličnu prirodnom peptidu. Vezivanje peptida i peptidomimetika za agense iRNK može da utiče na farmakokinetičku distribuciju iRNK, recimo povećavanjem ćelijskog prepoznavanja i apsorpcije. Peptid ili peptidomimetički ostatak mogu biti dužine oko 5-50 aminokiselina, npr. dužine oko 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ili 50 aminokiselina.
1
[0267] Peptid ili peptidomimetik može biti, na primer, peptid za ćelijsku permeaciju, katjonski peptid, amfipatični peptid ili hidrofobni peptid (npr. koji se sastoji prvenstveno od Tyr, Trp ili Phe). Peptidni ostatak može biti peptidni dendrimer, ograničeni peptid ili unakrsno vezani peptid. U drugoj alternativi, peptidni ostatak može da uključuje hidrofobnu sekvencu translokacije membrane (MTS). Primer peptida koji sadrži hidrofobnu MTS je RFGF koji ima aminokiselinsku sekvencu AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO: 11). Analog RFGF (npr. aminokiselinska sekvenca AALLPVLLAAP (SEQ ID NO: 12) koji sadrži hidrofobnu MTS takođe može biti ciljajući ostatak. Peptidni ostatak može biti peptid za „isporuku“ koji može da prenosi velike polarne molekule, uključujući peptide, oligonukleotide i proteine, kroz ćelijske membrane. Na primer, za sekvence iz Tat proteina HIV (GRKKRRQRRRPPQ) (SEQ ID NO: 13) i proteina Drosophila Antennapedia (RQIKIWFQNRRMKWKK) (SEQ ID NO: 14) je otkriveno da mogu da funkcionišu kao peptidi za isporuku. Peptid ili peptidomimetik može biti kodiran nasumičnom sekvencom DNK, kao što je peptid identifikovan iz biblioteke displeja faga, ili iz kombinatorne biblioteke jedno-zrnce-jedno-jedinjenje (one-bead-one-compound, OBOC) (Lam i sar.
Nature, 354:82-84, 1991). Primeri peptida ili peptidomimetika vezanog sa agensom dsRNK putem inkorporirane monomerne jedinice za svrhe ciljanja ćelije je (RGD)-peptid argininglicin-asparaginske kiseline, ili imitacija RGD. Peptidni ostatak može imati dužinu u rasponu od oko 5 aminokiselina do oko 40 aminokiselina. Peptidni ostaci mogu imati strukturnu modifikaciju, recimo radi poboljšanja stabilnosti ili direktnih konformacionih svojstava. Može da se koristi bilo koja od strukturnih modifikacija opisanih u nastavku.
[0268] RGD peptid za upotrebu u kompozicijama i postupcima iz pronalaska može biti linearni ili ciklični, i može biti modifikovan, npr. glikozilovan ili metilovan, da olakša ciljanje specifičnih tkiva. Peptidi koji sadrže RGD i peptidomimetici mogu da uključuju D-aminokiseline, kao i sintetičke imitacije RGD. Pored RGD, mogu se koristiti drugi ostaci koji ciljaju integrinski ligand. Poželjni konjugati ovog liganda ciljaju PECAM-1 ili VEGF.
[0269] „Peptid za ćelijsku permeaciju“ je sposoban da prožme ćeliju, npr. mikrobnu ćeliju, kao što je ćelija bakterije ili gljive, ili ćeliju sisara, kao što je ljudska ćelija. Peptid koji prožima mikrobnu ćeliju može biti, na primer, α-heliksni linearni peptid (npr. LL-37 ili Ceropin PI), peptid koji sadrži disulfidnu vezu (npr. α -defensin, β-defensin ili baktenecin) ili peptid koji sadrži samo jednu ili dve dominantne aminokiseline (npr. PR-39 ili indolicidin).
2
Peptid za ćelijsku permeaciju takođe može da uključuje nuklearni lokalizacioni signal (NLS). Na primer, peptid za ćelijsku permeaciju može biti dvodelni amfipatični peptid, kao što je MPG, koji je dobijen iz fuzije peptidnog domena HIV-1 gp41 i NLS SV40 velikog T antigena (Simeoni i sar. Nucl. Acids Res. 31:2717-2724, 2003).
C. Ugljovodonični konjugati
[0270] U nekim otelotvorenjima kompozicija i postupaka iz otkrića, oligonukleotid iRNK dalje sadrži ugljeni hidrat. iRNK konjugovane sa ugljenim hidratom su pogodne za in vivo isporuku nukleinskih kiselina, kao i za kompozicije pogodne za in vivo terapeutsku upotrebu, kako je ovde opisano. Kako se ovde koristi, „ugljeni hidrat“ se odnosi na jedinjenje koje je ugljeni hidrat sam po sebi sačinjen od jedne ili više monosaharidnih jedinica koje imaju najmanje 6 atoma ugljenika (koje mogu biti linearne, razgranate ili ciklične) sa atomom kiseonika, azota ili sumpora povezanim sa svakim atomom ugljenika; ili jedinjenje koje kao svoj deo ima ugljovodonični ostatak sačinjen od jedne ili više monosaharidnih jedinica od kojih svaka ima najmanje šest atoma ugljenika (koje mogu biti linearne, razgranate ili ciklične) sa atomom kiseonika, azota ili sumpora povezanim sa svakim atomom ugljenika. Predstavnici ugljovodonika uključuju šećere (mono-, di-, tri- i oligosaharide koji sadrže od oko 4, 5, 6, 7, 8 ili 9 jedinica monosaharida) i polisaharide kao što su skrob, glikogen, celuloza i polisaharidne gume. Specifični monosaharidi uključuju TTR i prethodno (npr. TTR, C6, C7 ili C8) šećere; di- i trisaharidi uključuju šećere koji imaju dve ili tri jedinice monosaharida (npr. TTR, C6, C7 ili C8).
[0271] U jednom otelotvorenju, ugljovodonični konjugat za upotrebu u kompozicijama i postupcima iz otkrića je monosaharid. U drugom otelotvorenju, ugljovodonični konjugat za upotrebu u kompozicijama i postupcima iz pronalaska je izabran iz grupe koja se sastoji od:
�
[0272] U jednom otelotvorenju, monosaharid je N-acetilgalaktozamin, poput
[0273] Drugi predstavnik ugljovodoničnog konjugata za upotrebu u ovde opisanim jedinjenjima uključuje, ali nije ograničen na,
(Formula XXIII), gde je jedan od X i Y oligonukleotid, a drugi je vodonik.
[0274] U određenim otelotvorenjima otkrića, GalNAc ili derivat GalNAc je povezan sa agensom iRNK iz pronalaska putem jednovalentnog linkera. U nekim otelotvorenjima, GalNAc ili derivat GalNAc je povezan sa agensom iRNK iz pronalaska putem dvovalentnog linkera. U drugim otelotvorenjima iz pronalaska, GalNAc ili derivat GalNAc je povezan sa agensom iRNK iz pronalaska putem trovalentnog linkera.
[0275] U jednom otelotvorenju, agensi dvolančane RNKi iz pronalaska sadrže jedan GalNAc ili derivat GalNAc povezan sa agensom iRNK. U drugom otelotvorenju, agensi dvolančane RNKi iz otkrića sadrže više (npr.2, 3, 4, 5 ili 6) GalNac ili derivata GalNAc, od kojih je svaki nezavisno povezan sa više nukleotida na agensu dvolančane RNKi putem više jednovalentnih linkera.
[0276] U nekim otelotvorenjima, na primer, kada su dva lanca agensa iRNK iz otkrića deo jednog većeg molekula povezanog neprekinutim lancem nukleotida između 3'-kraja jednog lanca i 5'-kraja odgovarajućeg drugog lanca koji grade petlju ukosnice koja sadrži više nesparenih nukleotida, svaki nespareni nukleotid u petlji ukosnice može nezavisno da sadrži GalNAc ili derivat GalNAc povezan putem jednovalentnog linkera. Petlju ukosnice takođe može da gradi produženi prepust u jednom lancu dvojne spirale.
[0277] U nekim otelotvorenjima, ugljovodonični konjugat dalje sadrži jedan ili više dodatnih liganada kao što je prethodno opisano, kao što su, bez ograničenja, PK modulator i/ili peptid za ćelijsku permeaciju.
[0278] Dodatni ugljovodonični konjugati pogodni za upotrebu u predmetnom pronalasku uključuju one opisane u PCT publikacijama br. WO 2014/179620 i WO 2014/179627.
D. Linkeri
[0279] U nekim otelotvorenjima, ovde opisani konjugat ili ligand može biti povezan sa oligonukleotidom iRNK pomoću različitih linkera koju mogu ili ne mogu da se otcepe.
[0280] Termin „linker“ ili „vezujuća grupa“ označava organski ostatak koji povezuje dva dela jedinjenja, npr. kovalentno povezuje dva dela jedinjenja. Linkeri obično sadrže direktnu vezu ili atom poput kiseonika ili sumpora, jedinicu poput NR8, C(O), C(O)NH, SO, SO2, SO2NH ili lanac atoma, poput, bez ograničenja, supstituisanog ili nesupstituisanog alkil, supstituisanog ili nesupstituisanog alkenil, supstituisanog ili nesupstituisanog alkinil, arilalkil, arilalkenil, arilalkinil, heteroarilalkil, heteroarilalkenil, heteroarilalkinil, heterociklilalkil, heterociklilalkenil, heterociklilalkinil, aril, heteroaril, heterociklil, cikloalkil, cikloalkenil, alkilarilalkil, alkilarilalkenil, alkilarilalknil, alkenilarilalkil, alkenilarilalkenil, alkenilarilalkinil, alkinilarilalkil, alkinilarilalkenil, alkinilarilalkinil, alkilheteroarilalkil, alkilheteroarilalkenil, alkilheteroarilalkinil, alkenilheteroarilalkil, alkenilheteroarilalkenil, alkenilheteroarilalkinil, alkinilheteroarilalkil, alkinilheteroarilalkenil, alkinilheteroarilalkinil, alkilheterociklilalkil, alkilheterociklilalkenil, alkilheterociklilalkinil, alkenilheterociklilalkil, alkenilheterociklilalkenil, alkenilheterociklilalkinil, alkinilheterociklilalkil, alkinilheterociklilalkenil, alkinilheterociklilalkinil, alkilaril, alkenilaril, alkinilaril, alkilheteroaril, alkenilheteroaril, alkinilhereroaril, gde jedan ili više metilena može biti prekinuto ili završeno sa O, S, S(O), SO2, N(R8), C(O), supstituisanim ili nesupstituisanim aril, supstituisanim ili nesupstituisanim heteroaril, supstituisanim ili nesupstituisanim heterociklil; pri čemu, R8 je vodonik, acil, alifatična ili supstituisana alifatična grupa. U jednom otelotvorenju, linker je između oko 1-24 atoma, 2-24, 3-24, 4-24, 5-24, 6-24, 6-18, 7-18, 8-18 atoma, 7-17, 8-17, 6-16, 7-16 ili 8-16 atoma.
[0281] Vezujuća grupa koja može da se otcepi je ona koja je dovoljno stabilna van ćelije, ali se nakon ulaska u ciljnu ćeliju cepa da otpusti dva dela koja spaja linker. U poželjnom otelotvorenju, vezujuća grupa koja može da se otcepi se cepa najmanje oko 10 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta, 50 puta, 60 puta, 70 puta, 80 puta, 90 puta ili više, ili najmanje oko 100 puta brže u ciljnoj ćeliji ili pod prvim referentnim uslovom (koji može biti, npr. odabran da oponaša ili predstavlja intraćelijske uslove) nego u krvi ispitanika, ili pod drugim referentnim uslovom (koji može biti, npr. odabran da oponaša ili predstavlja uslove koji se mogu naći u krvi ili serumu).
[0282] Vezujuće grupe koje mogu da se otcepe su podložne agensima za cepanje, npr. pH, redoks potencijalu ili prisustvu razgrađujućih molekula. Uopšteno, agensi za cepanje su zastupljeniji, ili se mogu naći u većoj koncentraciji ili sa većom aktivnošću unutar ćelije nego u serumu ili krvi. Primeri za takve degradacione agense uključuju: redoks agense koji su izabrani zbog određenih supstrata ili koji nemaju specifičnost prema supstratu, uključujući, npr. oksidacione ili redukcione enzime ili redukcione agense poput merkaptana, koji su prisutni u ćeliji i mogu putem redukcije da razgrade vezujuće grupe koje se mogu cepati redoks potencijalom; esteraze; endozome ili agense koji mogu da stvore kiselo okruženje, npr. one koji dovode do pH od pet ili manje; enzime koji mogu da hidrolizuju ili razgrade vezujuću grupu koja se može cepati kiselinom tako što deluju kao opšta kiselina, peptidaze (koje mogu biti specifične za supstrat) i fosfataze.
[0283] Vezujuća grupa koja može da se cepa, kao što je disulfidna veza, može biti osetljiva na pH. pH ljudskog seruma je 7,4, dok je prosečni intraćelijski pH malo niži, u opsegu od oko 7,1-7,3. Endozomi imaju kiseliji pH, u opsegu od 5,5-6,0, a lizozomi imaju još kiseliji pH od oko 5,0. Neki linkeri će imati vezujuću grupu koja može da se cepa koja je otcepljena pri poželjnoj pH, čime se otpušta katjonski lipid iz liganda u ćeliju, ili u željeni deo ćelije.
[0284] Linker može da uključuje vezujuću grupu koja može da se cepa koja se otcepljuje konkretnim enzimom. Vrsta vezujuće grupe koja može da se cepa koja je inkorporisana u linker može da zavisi od ćelije koja se cilja. Na primer, ligand koji cilja jetru može biti povezan sa katjonskim lipidom putem linkera koji uključuje estarsku grupu. Ćelije jetre su bogate esterazama, te će stoga linker biti efikasnije otcepljen u ćelijama jetre nego u vrstama ćelija koje nisu bogate esterazom. Druge vrste ćelija bogatih esterazom uključuju ćelije pluća, bubrežnog korteksa i testisa.
[0285] Linkeri koji sadrže peptidne veze mogu da se koriste kada se ciljaju ćelije bogate peptidazama, kao što su ćelije jetre i sinoviociti.
[0286] Uopšteno, pogodnost kandidatske vezujuće grupe koja može da se cepa može da se proceni testiranjem sposobnosti razgrađujućeg agensa (ili stanja) da otcepi kandidatsku vezujuću grupu. Takođe će biti poželjno da se kandidatska vezujuća grupa koja može da se cepa testira i na sposobnost da se opire cepanju u krvi ili kada je u kontaktu sa drugim neciljnim tkivom. Tako, može da se utvrdi relativna podložnost cepanju između prvog i drugog uslova, kada je prvi izabran da bude indikativan za cepanje u ciljnoj ćeliji, a drugi je izabran da bude indikativan za cepanje u drugim tkivima ili biološkim tečnostima, npr. krvi ili serumu. Procene mogu da se obave u sistemima bez ćelija, u ćelijama, u ćelijskoj kulturi, u kulturi organa ili tkiva, ili u celim životinjama. Može biti korisno da se inicijalne procene načine u uslovima bez ćelija ili u kulturi, i da se potvrde daljim ispitivanjima u celim životinjama. U poželjnim otelotvorenjima, korisna kandidatska jedinjenja se cepaju najmanje oko 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ili oko 100 puta brže u ćeliji (ili u in vitro uslovima koji su izabrani da oponašaju intraćelijske uslove) u poređenju sa krvi ili serumom (ili u in vitro uslovima koji su izabrani da oponašaju vanćelijske uslove).
i. Vezujuće grupe koje mogu da se cepaju redoks potencijalom
[0287] U jednom otelotvorenju, vezujuća grupa koja može da se cepa je vezujuća grupa koja može da se cepa redoks potencijalom nakon redukcije ili oksidacije. Primer vezujuće grupe koja može da se cepa redukcijom je disulfidna vezujuća grupa (-S-S-). Kako bi se utvrdilo da li je kandidatska vezujuća grupa koja može da se cepa odgovarajuća „vezujuća grupa koja može da se cepa redukcijom“, ili je, na primer, pogodna za upotrebu sa konkretnim ostatkom iRNK i konkretnim ciljajućim agensom, možete videti postupke koji su ovde opisani. Na
1
primer, kandidat može da se ispita inkubacijom sa ditiotreitolom (DTT) ili drugim redukujućim agensom koristeći reagense poznate u struci, koji oponašaju brzinu cepanja koja bi bila uočena u ćeliji, npr. ciljnoj ćeliji. Kandidati takođe mogu da se procene u uslovima koji su izabrani da oponašaju uslove krvi ili seruma. U jednom, kandidatska jedinjenja se cepaju najviše oko 10% u krvi. U drugim otelotvorenjima, korisna kandidatska jedinjenja se razgrađuju najviše oko 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ili oko 100 puta brže u ćeliji (ili u in vitro uslovima koji su izabrani da oponašaju intraćelijske uslove) u poređenju sa krvi ili serumom (ili u in vitro uslovima koji su izabrani da oponašaju vanćelijske uslove). Brzina cepanja kandidatskih jedinjenja može da se utvrdi koristeći standardne enzimske kinetičke testove u uslovima koji su izabrani da oponašaju intraćelijske medijume i u poređenju sa uslovima koji su izabrani da oponašaju vanćelijske medijume.
ii. Vezujuće grupe koje mogu da se cepaju na bazi fosfata
[0288] U drugom otelotvorenju, linker koji može da se cepa sadrži vezujuću grupu koja može da se cepa na bazi fosfata. Vezujuća grupa koja može da se cepa na bazi fosfata se cepa agensima koji razgrađuju ili hidrolizuju fosfatnu grupu. Primer agensa koji cepa fosfatne grupe u ćelijama su enzimi poput fosfataza u ćelijama. Primeri vezujućih grupa na bazi fosfata su -O-P(O)(ORk)-O-, -O-P(S)(ORk)-O-, -OP(S)(SRk)-O-, -S-P(O)(ORk)-O-, -O-P(O)(ORk)-S-, -S-P(O)(ORk)-S-, -O-P(S)(ORk)-S-, -S-P(S)(ORk)-O-, -O-P(O)(Rk)-O-, -O-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-O-, -S-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-S-, -O-P(S)(Rk)-S-. Poželjna otelotvorenja su -O-P(O)(OH)-O-, -OP(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -O-P(O)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -OP(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O-P(O)(H)-O-, -O-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S-, -O-P(S)(H)-S-. Poželjno otelotvorenje je -O-P(O)(OH)-O-. Ovi kandidati mogu da se procene koristeći postupke analogne onima koji su prethodno opisani.
iii. Vezujuće grupe koje mogu da se cepaju kiselinom
[0289] U drugom otelotvorenju, linker koji može da se cepa sadrži vezujuću grupu koja može da se cepa kiselinom. Vezujuća grupa koja može da se cepa kiselinom je vezujuća grupa koja se cepa u kiselim uslovima. U poželjnim otelotvorenjima, vezujuće grupe koje mogu da se cepaju kiselinom se cepaju u kiselom okruženju sa pH od oko 6,5 ili manje (npr. oko 6,0, 5,75, 5,5, 5,25, 5,0, ili manje) ili putem agenasa kao što su enzimi koji mogu da deluju kao
2
opšta kiselina. U ćeliji, specifične organele sa malim pH, kao što su endozomi i lizozomi, mogu da obezbede cepajuće okruženje za vezujuće grupe koje mogu da se cepaju kiselinom. Primeri vezujućih grupa koje mogu da se cepaju kiselinom uključuju, ali nisu ograničeni na, hidrazone, estre i estre aminokiselina. Grupe koje mogu da se cepaju kiselinom mogu imati opštu formulu -C=NN-, C(O)O ili -OC(O). Poželjno otelotvorenje je kada je ugljenik povezan sa kiseonikom estra (alkoksi grupa) aril grupa, supstituisana aril grupa ili tercijarna aril grupa, kao što je dimetil pentil ili t-butil. Ovi kandidati mogu da se procene koristeći postupke analogne onima koji su prethodno opisani.
iv. Vezujuće grupe na bazi estra
[0290] U drugom otelotvorenju, linker koji može da se cepa sadrži vezujuću grupu na bazi estra koja može da se cepa. Vezujuća grupa na bazi estra koja može da se cepa se cepa pomoću enzima kao što su esteraze i amidaze u ćelijama. Primeri vezujućih grupa na bazi estra koje mogu da se cepaju uključuju, ali nisu ograničeni na, estre alkilen, alkenilen i alkinilen grupe. Estarske vezujuće grupe koje mogu da se cepaju imaju opštu formulu -C(O)O- ili -OC(O)-. Ovi kandidati mogu da se procene koristeći postupke analogne onima koji su prethodno opisani.
v. Grupe koje se cepaju na bazi peptida
[0291] U još jednom otelotvorenju, linker koji može da se cepa sadrži vezujuću grupu na bazi peptida koja može da se cepa. Vezujuća grupa na bazi peptida koja može da se cepa se cepa enzimima kao što su peptidaze i proteaze u ćelijama. Vezujuće grupe na bazi peptida koje mogu da se cepaju su peptidne veze nastale između aminokiselina radi dobijanja oligopeptida (npr. dipeptida, tripeptida, itd.) i polipeptida. Vezujuće grupe na bazi peptida koje mogu da se cepaju ne uključuju amidnu grupu (-C(O)NH-). Amidna grupa može da nastane između bilo kog alkilena, alkenilena ili alkinelena. Peptidna veza je posebna vrsta amidne veze nastala između aminokiselina radi dobijanja peptida i proteina. Grupa na bazi peptida koja može da se cepa je uopšteno ograničena na peptidnu vezu (tj. amidnu vezu) nastalu između aminokiselina koje daju peptide i proteine, i ne uključuje celu amidnu funkcionalnu grupu. Vezujuće grupe na bazi peptida koje mogu da se cepaju imaju opštu formulu -NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-, gde RA i RB predstavljaju R grupe dve susedne aminokiseline. Ovi kandidati mogu da se procene koristeći postupke analogne onima koji su prethodno opisani.
[0292] U jednom otelotvorenju, iRNK iz otkrića je konjugovana sa ugljovodonikom putem linkera. Neograničavajući primeri ugljovodoničnih konjugata iRNK sa linkerima iz kompozicija i postupaka iz pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na,
4
kada je jedan od X ili Y oligonukleotid, drugi je vodonik.
[0293] U određenim otelotvorenjima kompozicija i postupaka iz otkrića, ligand je jedan ili više derivata „GalNAc“ (N-acetilgalaktozamin) povezanih putem dvovalentnog ili trovalentnog razgranatog linkera.
[0294] U jednom otelotvorenju, dsRNK iz otkrića je konjugovana sa dvovalentnim ili trovalentnim razgranatim linkerom izabranim iz grupe struktura prikazanih u bilo kojoj od formula (XXXII) - (XXXV):
pri čemu:
q2A, q2B, q3A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B i q5C predstavljaju nezavisno u svakom slučaju q2A, q2B, q3A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B i q5C predstavljaju nezavisno u svakom slučaju 0-20 i pri čemu ponavljajuća jedinica može biti ista ili različita; P<2A>, P<2B>, P<3A>, P<3B>, P<4A>, P<4B>, P<5A>, P<5B>, P<5C>, T<2A>, T<2B>, T<3A>, T<3B>, T<4A>, T<4B>, T<4A>, T<5B>, T<5C>su svaki nezavisno u svakom slučaju odsutni, CO, NH, O, S, OC(O), NHC(O), CH2, CH2NH ili CH2O;
Q<2A>, Q<2B>, Q<3A>, Q<3B>, Q<4A>, Q<4B>Q<5A>, Q<5B>, Q<5C>su nezavisno u svakom slučaju odsutni, alkilen, supstituisani alkilen u kome jedan ili više metilena može biti prekinuto ili završeno sa jednim ili više od O, S, S(O), SO2, N(R<N>), C(R')=C(R"), C≡C ili C(O);
R<2A>, R<2B>, R<3A>, R<3B>, R<4A>, R<4B>, R<5A>, R<5B>, R<5C>su svaki nezavisno u svakom slučaju odsutni, NH,
ili heterociklil;
L<2A>, L<2B>, L<3A>, L<3B>, L<4A>, L<4B>, L<5A>, L<5b>i L<5C>predstavljaju ligand; tj. svaki nezavisno u svakom slučaju monosaharid (kao što je GalNAc), disaharid, trisaharid, tetrasaharid, oligosaharid ili polisaharid; i R<a>je H ili bočni lanac aminokiseline. Trovalentni konjugujući derivati GalNAc su naročito korisni za upotrebu sa agensima RNKi za inhibiciju ekspresije ciljnog gena, kao što su oni u formuli (XXXVI):
pri čemu L<5A>, L<5B>i L<5C>predstavljaju monosaharid, kao što je derivat GalNAc.
[0295] Primeri odgovarajućih dvovalentnih i trovalentnih razgranatih linkerskih grupa koje konjuguju derivate GalNAc uključuju, ali nisu ograničeni na, strukture koje su prethodno navedene kao formule II, VII, XI, X i XIII.
[0296] Reprezentativni U.S. patenti koji objašnjavaju pripremu konjugata RNK uključuju, ali nisu ograničeni na, U.S. pat. br.4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958.013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928 i 5,688,941; 6,294,664; 6,320,017; 6,576,752; 6,783,931; 6,900,297; 7,037,646; 8,106,022.
[0297] Nije neophodno da sve pozicije u datom jedinjenju budu uniformno modifikovane, i zapravo se više od jedne od prethodno navedenih modifikacija može inkorporisati u jedno jedinjenje ili čak u jedan nukleozid u iRNK. Predmetno otkriće takođe uključuje jedinjenja iRNK koja su himerna jedinjenja.
[0298] „Himerna“ jedinjenja iRNK ili „himere“, u kontekstu ovog otkrića, su jedinjenja iRNK, poželjno dsRNK, koja sadrže dva ili više hemijski različitih regiona, od kojih je svaki sačinjen od najmanje jedne monomerne jedinice, tj. nukleotida u slučaju jedinjenja dsRNK. Te iRNK obično sadrže najmanje jedan region u kome je RNK modifikovana tako da dodeli iRNK povećanu otpornost na razgradnju putem nukleaze, povećan ćelijski unos i/ili povećani afinitet vezivanja prema ciljnoj nukleinskoj kiselini. Dodatni region iRNK može da služi kao supstrat za enzime sposobne da cepaju hibride RNK:DNK ili RNK:RNK. Kao primer, RNaza H je ćelijska endonukleaza koja cepa lanac RNK dupleksa RNK:DNK. Aktivacija RNaze H stoga dovodi do cepanja ciljne RNK, čime se u velikoj meri povećava efikasnost iRNK inhibicije ekspresije gena. Posledično, uporedivi rezultati često mogu da se dobiju sa kraćim iRNK kada se koriste himerne dsRNK, u poređenju sa fosforotioatnim dezoksi dsRNK koje se hibridizuju sa istim ciljnim regionom. Cepanje ciljne RNK može rutinski da se detektuje gel elektroforezom i, po potrebi, povezanim tehnikama hibridizacije nukleinske kiseline koje su poznate u struci.
[0299] U određenim slučajevima, RNK iz iRNK može biti modifikovana neligandskom grupom. Određeni broj neligandskih molekula je konjugovan sa iRNK kako bi se pojačala aktivnost, ćelijska distribucija ili ćelijski unos iRNK, a postupci za vršenje takvih konjugacija su dostupni u naučnoj literaturi. Takvi neligandski ostaci imaju obuhvaćene lipidne ostatke, kao što su holesterol (Kubo, T. i sar. Biochem. Biophys. Res. Comm., 2007, 365(1):54-61; Letsinger i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553), holna kiselina (Manoharan i sar. Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053), tioetar, npr. heksil-S-tritiltiol (Manoharan i sar. Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan i sar. Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765), tioholesterol (Oberhauser i sar. Nucl. Acids Res., 1992, 20:533), alifatični lanac, npr. dodekandiol ili undecil ostaci (Saison-Behmoaras i sar. EMBO J., 1991, 10:111;
Kabanov i sar. FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk i sar. Biochimie, 1993, 75:49), fosfolipid, npr. di-heksadecil-rac-glicerol ili trietilamonijum 1,2-di-O-heksadecil-rac-glicero-3-H-fosfonat (Manoharan i sar. Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea i sar. Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777), lanac poliamina ili polietilen glikola (Manoharan i sar. Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969), ili adamantan sirćetnu kiselinu (Manoharan i sar. Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651), palmitil ostatak (Mishra i sar. Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229), ili oktadecilamin ili heksilamino-karbonil-oksiholesterol ostatak (Crooke i sar. J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923). Reprezentativni patenti Sjedinjenih Država koji objašnjavaju pripremu takvih konjugata RNK su prethodno navedeni. Tipični protokoli za konjugaciju uključuju sintezu RNK koje imaju amino linker na jednoj ili više pozicija sekvence. Amino grupa zatim reaguje sa molekulom koji se konjuguje koristeći odgovarajuće reagense za kuplovanje ili aktivaciju. Reakcija konjugacije može da se sprovede dok je RNK još vezana za čvrstu potporu ili nakon cepanja RNK u fazi rastvora. Prečišćavanje konjugata RNK putem HPLC obično daje čisti konjugat.
V. Isporuka iRNK iz pronalaska
[0300] Isporuka iRNK iz pronalaska u ćeliju, npr. ćeliju u ispitaniku, kao što je ljudski ispitanik (npr. ispitanik kome je to potrebno, kao što je ispitanik koji ima bolest, poremećaj ili stanje povezano sa TTR-om) može se postići na više različitih načina. Na primer, isporuka može da se obavi dovođenjem ćelije u kontakt sa iRNK iz pronalaska, bilo in vitro ili in vivo. In vivo isporuka takođe može da se obavi neposredno primenom kompozicije koja sadrži iRNK, npr. dsRNK, na ispitaniku. Alternativno, in vivo isporuka može da se obavi posredno primenom jednog ili više vektora koji kodiraju i usmeravaju ekspresiju iRNK. Te alternative su dalje razmotrene u nastavku.
[0301] Uopšteno, svaki postupak za isporuku molekula nukleinske kiseline (in vitro ili in vivo) može da se prilagodi za upotrebu sa iRNK iz pronalaska (vidite, npr. Akhtar S. i Julian RL. (1992) Trends Cell. Biol. 2(5):139-144 i WO94/02595). Kod in vivo isporuke, faktori koje treba razmotriti da bi se molekul iRNK isporučio uključuju, na primer, biološku stabilnost isporučenog molekula, prevenciju nespecifičnih dejstava i akumulaciju isporučenog molekula u ciljnom tkivu. Nespecifična dejstva iRNK mogu da se minimizuju lokalnom primenom, na primer, direktnim ubrizgavanjem ili implantacijom u tkivo ili topikalnom primenom preparata. Lokalna primena na mesto lečenja maksimalno povećava lokalnu koncentraciju agensa, ograničava izloženost agensa sistemskim tkivima koja bi agens inače mogao da ošteti ili koja mogu da razgrade agens, i omogućava manju ukupnu dozu molekula iRNK koja se primenjuje. Nekoliko studija je pokazalo uspešan nokdaun genskih proizvoda kada se iRNK primenjuje lokalno. Na primer, pokazalo se da intraokularna isporuka VEGF dsRNK intravitrealnom injekcijom kod majmuna cinomolgusa (Tolentino, MJ., i sar. (2004) Retina 24:132-138) i subretinalnim injekcijama kod miševa (Reich, SJ., i sar. (2003) Mol. Vis.9:210-216) sprečava neovaskularizaciju na eksperimentalnom modelu starosne degeneracije makule. Pored toga, neposredna intratumorska injekcija dsRNK kod miševa smanjuje zapreminu tumora (Pille, J., i sar. (2005) Mol. Ther.11:267-274) i može da produži preživljavanje miševa sa tumorom (Kim, WJ., i sar. (2006) Mol. Ther. 14:343-350; Li, S., i sar. (2007) Mol. Ther.15:515-523). RNK interferencija se takođe pokazala uspešnom sa lokalnom isporukom u CNS neposrednom injekcijom (Dorn, G., i sar. (2004) Nucleic Acids 32:e49; Tan, PH., i sar. (2005) Gene Ther.12:59-66; Makimura, H., i sar. (2002) BMC Neurosci. 3:18; Shishkina, GT., i sar. (2004) Neuroscience 129:521-528; Thakker, ER., i sar. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.101:17270-17275; Akaneya,Y., i sar. (2005) J.
Neurophysiol. 93:594-602) i u pluća intranazalnom primenom (Howard, KA., i sar. (2006) Mol. Ther.14:476-484; Zhang, X., i sar. (2004) J. Biol. Chem.279:10677-10684; Bitko, V., i sar. (2005) Nat. Med.11:50-55). Kod primene iRNK sistemski za lečenje bolesti, RNK može da se modifikuje ili alternativno isporuči koristeći sistem za isporuku leka; oba postupka deluju na sprečavanje brze razgradnje dsRNK putem endo- i egzonukleaza in vivo.
Modifikacija RNK ili farmaceutskog nosača takođe može da omogući usmeravanje kompozicije iRNK na ciljno tkivo i izbegavanje neželjenih dejstava van cilja. Molekuli iRNK mogu da se modifikuju hemijskom konjugacijom sa lipofilnim grupama, kao što je holesterol, radi poboljšanja ćelijskog unosa i sprečavanja razgradnje. Na primer, iRNK usmerena na ApoB konjugovan sa lipofilnim ostatkom holesterola je sistemski injektovana u miševe, i dovela je do nokdauna mRNK apoB u jetri i jejunumu (Soutschek, J., i sar. (2004) Nature 432:173-178). Pokazalo se da konjugacija iRNK sa aptamerom inhibira rast tumora i posreduje u regresiji tumora na mišjem modelu raka prostate (McNamara, JO., i sar. (2006) Nat. Biotechnol.24:1005-1015). U alternativnom otelotvorenju, iRNK može da se isporuči koristeći sisteme za isporuku lekova kao što su nanočestica, dendrimer, polimer, lipozomi ili katjonski sistem za isporuku. Pozitivno naelektrisani katjonski sistemi za isporuku olakšavaju vezivanje molekula iRNK (negativno naelektrisan) i takođe pojačavaju interakcije na negativno naelektrisanoj ćelijskoj membrani kako bi omogućili efikasno preuzimanje iRNK od strane ćelije. Katjonski lipidi, dendrimeri ili polimeri mogu ili da se vežu za iRNK ili se indukuju da grade vezikulu ili micelu (vidite, npr. Kim SH., i sar. (2008) Journal of Controlled Release 129(2):107-116) koja obuhvata iRNK. Nastanak vezikula ili micela dalje sprečava razgradnju iRNK kada se sistemski primenjuje. Postupci za pripremanje i primenu kompleksa katjonske iRNK su jednostavni za osobu sa veštinama u struci (vidite, npr.
Sorensen, DR., i sar. (2003) J. Mol. Biol 327:761-766; Verma, UN., i sar. (2003) Clin.
Cancer Res.9:1291-1300; Arnold, AS i sar. (2007) J. Hypertens.25:197-205). Neki neograničavajući primeri sistema za isporuku leka korisni za sistemsku isporuku iRNK uključuju DOTAP (Sorensen, DR., i sar. (2003), supra; Verma, UN., i sar. (2003), supra), oligofektamin, „čvrste lipidne čestice nukleinske kiseline“ (Zimmermann, TS., i sar. (2006) Nature 441:111-114), kardiolipin (Chien, PY., i sar. (2005) Cancer Gene Ther.12:321-328; Pal, A., i sar. (2005) Int J. Oncol.26:1087-1091), polietilenimin (Bonnet ME., i sar. (2008) Pharm. Res. 16. avgust elektronska publikacija pre štampane; Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659), Arg-Gly-Asp (RGD) peptide (Liu, S. (2006) Mol. Pharm. 3:472-487) i poliamidoamine (Tomalia, DA., i sar. (2007) Biochem. Soc. Trans.35:61-67; Yoo, H., i sar. (1999) Pharm. Res.16:1799-1804). U nekim otelotvorenjima, iRNK gradi kompleks sa ciklodekstrinom za sistemsku primenu. Postupci za primenu i farmaceutske kompozicije iRNK i ciklodekstrina mogu se naći u U.S. patentu br.7,427,605.
A. iRNK kodirane vektorom
[0302] iRNK koje ciljaju gen TTR mogu da se eksprimiraju iz transkripcionih jedinica ubačenih u vektore DNK ili RNK (vidite, npr. Couture, A, i sar. TIG. (1996), 12:5-10;
Skillern, A., i sar. Međunarodna PCT publikacija br. WO 00/22113, Conrad, Međunarodna PCT publikacija br. WO 00/22114, i Conrad, U.S. Pat. br.6,054,299). Ekspresija može biti prolazna (trajanje u časovima ili nedeljama) ili produžena (nedelje ili meseci ili duže) u zavisnosti od specifičnih konstrukata koji se koriste i vrste ciljnog tkiva ili ćelije. Ovi transgeni mogu da se uvedu kao linearni konstrukt, cirkularni plazmid ili virusni vektor, koji može biti integrišući ili neintegrišući vektor. Transgen takođe može biti konstruisan da omogući da se nasledi kao ekstrahromozomski plazmid (Gassmann, i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292).
[0303] Pojedinačni lanac ili lanci iRNK mogu da se transkribuju iz promotera na ekspresionom vektoru. Kada treba eksprimirati dva zasebna lanca radi stvaranja, na primer, dsRNK, dva zasebna ekspresiona vektora mogu zajedno da se uvedu (npr. transfekcijom ili infekcijom) u ciljnu ćeliju. Alternativno, svaki zasebni lanac dsRNK može da se transkribuje promoterima, pri čemu su oba promotera locirana na istom ekspresionom plazmidu. U jednom otelotvorenju, dsRNK je eksprimirana kao invertovani ponavljajući polinukleotidi povezani sekvencom polinukleotida linkera tako da dsRNK ima strukturu drške i petlje.
[0304] Ekspresioni vektori iRNK su uopšteno DNK plazmidi ili virusni vektori. Ekspresioni vektori kompatibilni sa eukariotskim ćelijama, poželjno oni koji su kompatibilni sa ćelijama kičmenjaka, mogu da se koriste za proizvodnju rekombinantnih konstrukata za ekspresiju iRNK kako je ovde opisano. Ekspresioni vektori eukariotskih ćelija su dobro poznati u struci, i dostupni su iz brojnih komercijalnih izvora. Obično su obezbeđeni takvi vektori sa pogodnim restrikcionim mestima za ubacivanje segmenta željene nukleinske kiseline.
1
Isporuka vektora koji eksprimiraju iRNK može biti sistemska, recimo intravenskom ili intramuskularnom primenom, primenom na ciljnim ćelijama koje su prenete iz pacijenta nakon čega se ponovo uvode u pacijenta, ili drugim putevima koji omogućavaju uvođenje u željenu ciljnu ćeliju.
[0305] Ekspresioni plazmidi iRNK mogu da se transficiraju u ciljne ćelije kao kompleks sa katjonskim lipidnim nosačima (npr. oligofektamin) ili nekatjonskim nosačima na bazi lipida (npr. Transit-TKO™). Višestruke lipidne transfekcije za iRNK-posredovani nokdaun koji cilja različite regione ciljne RNK tokom nedelju dana ili više, takođe su razmatrane pronalaskom. Uspešno uvođenje vektora u ćelije domaćine može da se prati koristeći različite poznate postupke. Na primer, prolazna transfekcija može da se signalizira reporterom, kao što je fluorescentni marker, kao što je zeleni fluorescentni protein (Green Fluorescent Protein, GFP). Stabilna transfekcija ćelija ex vivo može da se obezbedi koristeći markere koji transficiranoj ćeliji daju otpornost na specifične faktore okruženja (npr. antibiotike ili lekove), kao što je otpornost na higromicin B.
[0306] Sistemi virusnih vektora koji mogu da se koriste sa ovde opisanim postupcima i kompozicijama uključuju, ali nisu ograničeni na, (a) vektore adenovirusa; (b) vektore retrovirusa, uključujući bez ograničenja lentivirusne vektore, Molonijev virus leukemije miševa, itd.; (c) vektore adenoasociranih virusa; (d) vektore virusa herpes simpleks; (e) SV 40 vektore; (f) vektore polioma virusa; (G) vektore papiloma virusa; (h) vektore pikornavirusa; (i) vektore virusa boginja kao što su ortopoks, npr. vektori vakcinija virusa ili avipoks, npr. virus boginja kanarinaca ili virus boginja živine; i (j) adenovirus zavisan od pomoćnika ili lišen regiona za kodiranje virusa. Virusi sa oštećenom replikacijom takođe mogu biti korisni. Različiti vektori će biti ili neće biti inkorporisani u genom ćelija.
Konstrukti po želji mogu da uključuju virusne sekvence za transfekciju. Alternativno, konstrukt može da bude inkorporisan u vektore koji su sposobni za epizomsku replikaciju, npr. EPV i EBV vektori. Konstrukti za rekombinantnu ekspresiju iRNK će uopšteno zahtevati regulatorne elemente, npr. promotere, pojačivače, itd., radi obezbeđivanja ekspresije iRNK u ciljnim ćelijama. Drugi aspekti koje treba razmotriti za vektore i konstrukte su dalje opisani u nastavku.
2
[0307] Vektori korisni za isporuku iRNK će uključivati regulatorne elemente (promotere, pojačivače, itd.) dovoljne za ekspresiju iRNK u željenoj ciljnoj ćeliji ili tkivu. Regulatorni elementi mogu da se odaberu da pružaju konstitutivnu ili regulisanu/inducibilnu ekspresiju.
[0308] Ekspresija iRNK može precizno da se reguliše, na primer, koristeći inducibilnu regulatornu sekvencu koja je senzitivna na određene fiziološke regulatore, npr. nivoe glukoze u krvotoku ili hormone (Docherty i sar.1994, FASEB J.8:20-24). Takvi inducibilni ekspresioni sistemi pogodni za kontrolu ekspresije dsRNK u ćelijama ili sisarima uključuju, na primer, regulisanje putem ekdizona, estrogena, progesterona, tetraciklina, hemijskih induktora dimerizacije, i izopropil-beta-DI - tiogalaktopiranozida (IPTG). Osoba sa veštinama u struci je sposobna da izabere odgovarajuću regulatornu/promotersku sekvencu na osnovu nameravane upotrebe za transgen iRNK.
[0309] Mogu da se koriste virusni vektori koji sadrže sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju iRNK. Na primer, može da se koristi retrovirusni vektor (vidite Miller i sar. Meth. Enzymol. 217:581-599 (1993)). Ti retrovirusni vektori sadrže komponente neophodne za ispravno pakovanje virusnog genoma i integrisanje u DNK ćelije domaćina. Sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju iRNK su klonirane u jedan ili više vektora, što olakšava isporuku nukleinske kiseline u pacijenta. Još informacija o retrovirusnim vektorima može se naći, na primer, u Boesen i sar. Biotherapy 6:291-302 (1994), gde je opisana upotreba retrovirusnog vektora za isporuku mdr1 gena u hematopoetske matične ćelije kako bi matične ćelije postale otpornije na hemoterapiju. Druge reference koje ilustruju upotrebu retrovirusnih vektora u genskoj terapiji su: Clowes i sar. J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994); Kiem i sar. Blood 83:1467-1473 (1994); Salmons i Gunzberg, Human Gene Therapy 4:129-141 (1993); i Grossman i Wilson, Curr. Opin. in Genetics and Devel.3:110-114 (1993). Lentivirusni vektori razmatrani za upotrebu uključuju, na primer, vektore na bazi HIV opisane u U.S. patentima br.6,143,520; 5,665,557; i 5,981,276.
[0310] Adenovirusi su takođe razmatrani za upotrebu u isporuci iRNK iz otkrića.
Adenovirusi su posebno primamljivi nosači, npr. za isporuku gena u respiratorni epitel.
Adenovirusi prirodno inficiraju respiratorni epitel u kome izazivaju blagu bolest. Drugi ciljevi za sisteme isporuke na bazi adenovirusa su jetra, centralni nervni sistem, endotelne ćelije i mišić. Prednost adenovirusa je što mogu da inficiraju ćelije koje se ne dele. Kozarsky i Wilson, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503 (1993) daju pregled genske terapije na bazi adenovirusa. Bout i sar. Human Gene Therapy 5:3-10 (1994) pokazali su upotrebu vektora adenovirusa za transfer gena u respiratorni epitel rezus majmuna. Drugi primeri upotrebe adenovirusa u genskoj terapiji mogu se naći u Rosenfeld i sar. Science 252:431-434 (1991); Rosenfeld i sar. Cell 68:143-155 (1992); Mastrangeli i sar. J. Clin. Invest. 91:225-234 (1993); PCT publikaciji WO94/12649; i Wang, i sar. Gene Therapy 2:775-783 (1995). Odgovarajući vektor AV za ekspresiju iRNK korišćene u pronalasku, postupak za konstruisanje rekombinantnog vektora AV i postupak za isporuku vektora u ciljne ćelije prikazani su u Xia H i sar. (2002), Nat. Biotech.20: 1006-1010.
[0311] Vektori adenoasociranog virusa (AAV) takođe mogu da se koriste za isporuku iRNK iz otkrića (Walsh i sar. Proc. Soc. Exp. Biol. Med.204:289-300 (1993); U.S. pat. br.
5,436,146). U jednom otelotvorenju, iRNK može da se eksprimira kao dva zasebna komplementarna molekula jednolančane RNK iz rekombinantnog vektora AAV koji ima, na primer, U6 ili HI RNK promotere, ili citomegalovirusni (CMV) promoter. Odgovarajući vektori AAV za ekspresiju dsRNK korišćene u pronalasku, postupci za konstruisanje rekombinantnog vektora AV i postupci za isporuku vektora u ciljne ćelije opisani su u Samulski R i sar. (1987), J. Virol.61: 3096-3101; Fisher K J i sar. (1996), J. Virol, 70: 520-532; Samulski R i sar. (1989), J. Virol.63: 3822-3826; U.S. Pat. br.5,252,479; U.S. Pat. br.
5,139,941; Međunarodnoj patentnoj prijavi br. WO 94/13788; i Međunarodnoj patentnoj prijavi br. WO 93/24641.
[0312] Još jedan virusni vektor pogodan za isporuku iRNK iz otkrića je virus boginja, kao što je vakcinija virus, na primer, oslabljena vakcinija kao što je modifikovani Ankara virus (MVA) ili NYVAC, avipoks kao što je virus boginja živine ili virus boginja kanarinaca.
[0313] Tropizam virusnih vektora može da se modifikuje pseudotipizacijom vektora sa proteinima omotača ili drugim površinskim antigenima iz drugih virusa, ili supstitucijom različitih proteina virusnih kapsida, po potrebi. Na primer, lentivirusni vektori mogu biti pseudotipizirani sa površinskim proteinima iz virusa vezikularnog stomatitisa (VSV), besnila, ebole, mokola virusa, i slično. Vektori AAV mogu da ciljaju različite ćelije putem inženjeringa vektora da eksprimiraju serotipe različitih proteina kapsida; vidite, npr.
Rabinowitz J E i sar. (2002), J Virol 76:791-801.
4
[0314] Farmaceutska priprema vektora može da uključuje vektor u prihvatljivom razblaživaču, ili može da uključuje matricu sa sporim otpuštanjem u koju je umetnut nosač za isporuku gena. Alternativno, kada ceo vektor za isporuku gena može netaknut da se proizvede iz rekombinantnih ćelija, npr. retrovirusnih vektora, farmaceutski preparat može da uključuje jednu ili više ćelija koje proizvode sistem za isporuku gena.
VI. Farmaceutske kompozicije iz pronalaska
[0315] Predmetno otkriće takođe uključuje farmaceutske kompozicije i formulacije koje uključuju iRNK iz pronalaska. U jednom otelotvorenju, ovde su obezbeđene farmaceutske kompozicije koje sadrže iRNK, kao što je ovde opisana, i farmaceutski prihvatljiv nosač. Farmaceutske kompozicije koje sadrže iRNK su korisne za lečenje bolesti ili poremećaja povezanog sa ekspresijom ili aktivnošću gena TTR. Takve farmaceutske kompozicije su formulisane na osnovu načina isporuke. Jedan primer su kompozicije koje su formulisane za sistemsku primenu putem parenteralne isporuke, npr. supkutanom (s.c.) ili intravenskom (i.v.) isporukom. Još jedan primer su kompozicije koje su formulisane za neposrednu primenu u parenhim mozga, npr. infuzijom u mozak, kao što je infuzija kontinualnom pumpom.
Farmaceutske kompozicije iz pronalaska mogu da se primenjuju u dozama koje su dovoljne za inhibiciju ekspresije gena TTR. U jednom otelotvorenju, agensi iRNK iz pronalaska, npr. agensi dsRNK, formulisani su za supkutanu primenu u farmaceutski prihvatljivom nosaču
[0316] Farmaceutske kompozicije mogu da se primenjuju intravenskom infuzijom tokom određenog vremenskog perioda, recimo tokom perioda od 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 i 21, 22, 23, 24 ili oko 25 minuta. Primena može biti ponovljena, na primer, na redovnoj osnovi, recimo nedeljno, na dve nedelje (tj. na svake dve nedelje) tokom jednog meseca. dva meseca, tri meseca, četiri meseca ili duže. Primena takođe može biti ponovljena, na primer, na mesečnoj osnovi ili na kvartalnoj osnovi, npr. približno na svakih 12 nedelja. Nakon početnog režima lečenja, lečenja mogu da se primenjuju na manje čestoj osnovi. Na primer, nakon nedeljne ili dvonedeljne primene tokom tri meseca, primena može da se ponavlja jednom mesečno, tokom šest meseci ili godinu dana ili duže.
[0317] Farmaceutske kompozicije mogu da se primenjuju jednom dnevno, ili iRNK može da se primenjuje kao dve, tri ili više subdoza u odgovarajućim intervalima tokom dana ili čak koristeći kontinualnu infuziju ili isporuku putem formulacije sa kontrolisanim otpuštanjem. U tom slučaju, iRNK sadržana u svakoj subdozi mora biti shodno tome manja kako bi se dostigla ukupna dnevna doza. Dozna jedinica takođe može da bude načinjena za isporuku tokom nekoliko dana, npr. koristeći uobičajenu formulaciju sa produženim otpuštanjem koja obezbeđuje kontrolisano otpuštanje iRNK u periodu od nekoliko dana. Formulacije sa produženim otpuštanjem su dobro poznate u struci i naročito su korisne za isporuku agenasa na konkretno mesto, tako da bi mogle da se koriste sa agensima iz predmetnog pronalaska. U ovom otelotvorenju, dozna jedinica sadrži odgovarajuće višestruke dnevne doze.
[0318] U drugim otelotvorenjima, jedna doza farmaceutskih kompozicija može biti dugotrajna, tako da se sledeće doze primenjuju u intervalima ne većim od 3, 4 ili 5 dana, u intervalima ne većim od 1, 2, 3 ili 4 nedelje ili u intervalima ne većim od 9, 10, 11 ili 12 nedelja. U nekim otelotvorenjima pronalaska, jedna doza farmaceutskih kompozicija iz pronalaska se primenjuje jednom nedeljno. U drugim otelotvorenjima pronalaska, jedna doza farmaceutskih kompozicija iz pronalaska se primenjuje na dva meseca. U drugim otelotvorenjima, jedna doza farmaceutskih kompozicija iz pronalaska se primenjuje mesečno. U još nekim otelotvorenjima, jedna doza farmaceutskih kompozicija iz pronalaska se primenjuje kvartalno.
[0319] Stručnjaku će biti jasno da određeni faktori mogu da utiču na dozu i termin potreban za delotvorno lečenje ispitanika, uključujući, bez ograničenja, težinu bolesti ili poremećaja, prethodna lečenja, opšte zdravstveno stanje i/ili starost ispitanika i druge postojeće bolesti. Štaviše, lečenje ispitanika terapeutski delotvornom količinom kompozicije može da obuhvata jedno lečenje ili niz lečenja. Procene delotvornih doza i in vivo poluživota za pojedinačne iRNK obuhvaćene pronalaskom mogu da se načine koristeći uobičajene metodologije ili na bazi in vivo testiranja koristeći odgovarajući životinjski model, kao što je opisano u drugom delu ovog teksta.
[0320] Farmaceutske kompozicije iz predmetnog pronalaska mogu da se primenjuju na brojne načine u zavisnosti od toga da li je poželjno lokalno ili sistemsko lečenje, i od oblasti koja se leči. Primena može biti topikalna (npr. putem transdermalnog flastera), pulmonarna, npr. inhalacijom ili uduvavanjem prahova ili aerosola, uključujući putem nebulizatora; intratrahealna, intranazalna, epidermalna ili transdermalna, oralna ili parenteralna.
Parenteralna primena uključuje intravensku, intraarterijsku, supkutanu, intraperitonealnu ili intramuskularnu injekciju ili infuziju, potkožnu, npr. putem inplantiranog sredstva; ili intrakranijalnu, npr. putem intraparenhimske, intratekalne ili intraventrikularne primene.
[0321] iRNK može da se isporuči na način koji cilja konkretno tkivo, kao što je jetra (npr. hepatocite jetre).
[0322] Farmaceutske kompozicije i formulacije za topikalnu primenu mogu da uključuju transdermalne flastere, meleme, losione, kreme, gelove, kapi, supozitorije, sprejeve, tečnosti i praškove. Konvencionalni farmaceutski nosači, vodene, praškaste ili uljane baze, ugušćivači i slično mogu biti potrebni ili poželjni. Obloženi kondomi, rukavice i slično takođe mogu biti korisni. Odgovarajuće topikalne formulacije uključuju one u kojima su iRNK prikazane u pronalasku u mešavini sa agensom za topikalnu primenu poput lipida, lipozoma, masnih kiselina, estara masnih kiselina, steroida, helirajućih agenasa i surfaktanata. Odgovarajući lipidi i lipozomi uključuju neutralne (npr. dioleoilfosfatidil DOPE etanolamin, dimiristoil fosfatidil holin DMPC, distearoil fosfatidil holin), negativne (npr. dimiristoil fosfatidil glicerol DMPG) i katjonske (npr. dioleoil tetrametil aminopropil DOTAP i dioleoil fosfatidil etanolamin DOTMA). iRNK prikazane u pronalasku mogu da budu enkapsulirane u lipozomima ili mogu da grade komplekse sa njima, naročito sa katjonskim lipozomima. Alternativno, iRNK mogu da grade kompleks sa lipidima, naročito sa katjonskim lipidima. Odgovarajuće masne kiseline i estri uključuju, ali nisu ograničeni na, arahidonsku kiselinu, oleinsku kiselinu, ikosansku kiselinu, laurinsku kiselinu, kaprilnu kiselinu, kaprinsku kiselinu, miristinsku kiselinu, palmitinsku kiselinu, stearinsku kiselinu, linolnu kiselinu, linolensku kiselinu, dikaprat, trikaprat, monoolein, dilaurin, gliceril 1-monokaprat, 1-dodecilazacikloheptan-2-on, acilkarnitin, acilholin ili C1-20alkil estar (npr. izopropil miristat IPM), monoglicerid, diglicerid ili njihove farmaceutski prihvatljive soli). Topikalne formulacije su detaljno opisane u U.S. patentu br.6,747,014.
A. Formulacije iRNK koje sadrže membranske molekulske sklopove
[0323] iRNK za upotrebu u kompozicijama i postupcima iz otkrića može da se formuliše za isporuku u membranskom molekulskom sklopu, npr. lipozomu ili miceli. Kako se ovde koristi, termin „lipozom“ označava vezikulu sastavljenu od amfifilnih lipida raspoređenih u najmanje jedan dvojni sloj, npr. jedan dvojni sloj ili više dvojnih slojeva. Lipozomi uključuju unilamelarne i multilamelarne vezikule koje imaju membranu sačinjenu od lipofilne supstance i vodenu unutrašnjost. Vodeni deo sadrži kompoziciju iRNK. Lipofilna supstanca izoluje vodenu unutrašnjost od vodene spoljašnjosti, koja obično ne obuhvata kompoziciju iRNK, mada u nekim slučajevima može. Lipozomi su korisni za transfer i isporuku aktivnih sastojaka na mesto delovanja. Pošto je struktura lipozomske membrane strukturno slična biološkim membranama, kada se lipozomi primene na tkivo, lipozomski dvojni sloj se fuzioniše sa dvojnim slojem ćelijskih membrana. Sa napredovanjem spajanja lipozoma i ćelije, unutrašnji vodeni sadržaj koji obuhvata iRNK se isporučuje u ćeliju gde iRNK može specifično da se veže za ciljnu RNK i da indukuje iRNK. U nekim slučajevima, lipozomi su takođe posebno ciljani, npr. da usmeravaju iRNK na određene vrste ćelija.
[0324] Lipozom koji sadrži agens iRNK može da se pripremi različitim postupcima. U jednom primeru, lipidna komponenta lipozoma se rastvara u deterdžentu kako bi se micele formirale sa lipidnom komponentom. Na primer, lipidna komponenta može biti amfipatični katjonski lipid ili lipidni konjugat. Deterdžent može imati visoku koncentraciju kritičnih micela i može biti nejonski. Primeri deterdženata uključuju holat, CHAPS, oktilglukozid, dezoksiholat i lauroil sarkozin. Preparat agensa iRNK se zatim dodaje micelama koje uključuju lipidnu komponentu. Katjonska grupa na lipidu interaguje sa agensom iRNK i zgušnjava se oko agensa iRNK gradeći lipozom. Nakon zgušnjavanja, deterdžent se uklanja, npr. dijalizom, radi dobijanja lipozomskog preparata agensa iRNK.
[0325] Po potrebi, jedinjenje nosač koje pomaže u kondenzaciji može da se doda tokom reakcije kondenzacije, npr. kontrolisanim dodavanjem. Na primer, jedinjenje nosač može biti polimer koji nije nukleinska kiselina (npr. spermin ili spermidin). pH takođe može da se podesi da pogoduje kondenzaciji.
[0326] Postupci za proizvodnju stabilnih polinukleotidnih vehikuluma za isporuku, koji uključuju kompleks polinukleotid/katjonski lipid kao strukturnu komponentu vehikuluma za isporuku, dalje su opisani npr. u WO 96/37194. Nastanak lipozoma takođe može da uključuje jedan ili više aspekata primera postupaka opisanih u Felgner, P. L. i sar. Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8:7413-7417, 1987; U.S. Pat. br.4,897,355; U.S. Pat. br.5,171,678; Bangham, i sar. M. Mol. Biol.23:238, 1965; Olson, i sar. Biochim. Biophys. Acta 557:9, 1979; Szoka, i sar. Proc. Natl. Acad. Sci.75: 4194, 1978; Mayhew, i sar. Biochim. Biophys. Acta 775:169, 1984; Kim, i sar. Biochim. Biophys. Acta 728:339, 1983; i Fukunaga, i sar. Endocrinol. 115:757, 1984. Uobičajeno korišćene tehnike za pripremu lipidnih agregata odgovarajuće veličine za korišćenje kao vehikuluma za isporuku uključuju sonikaciju i zamrzavanjeotapanje plus istiskivanje (vidite, npr. Mayer, i sar. Biochim. Biophys. Acta 858:161, 1986). Mikrofluidizacija može da se koristi kada su poželjni konzistentno mali (50 do 200 nm) i relativno uniformni agregati (Mayhew, i sar. Biochim. Biophys. Acta 775:169, 1984). Ovi postupci se lako adaptiraju za pakovanje preparata agensa iRNK u lipozome.
[0327] Lipozomi se dele u dve široke klase. Katjonski lipozomi su pozitivno naelektrisani lipozomi koji interaguju sa negativno naelektrisanim molekulima nukleinske kiseline gradeći stabilan kompleks. Kompleks pozitivno naelektrisana nukleinska kiselina/lipozom vezuje se za negativno naelektrisanu ćelijsku površinu i internalizuje se u endozomu. Usled kiselog pH u endozomu, lipozomi pucaju, oslobađajući svoj sadržaj u citoplazmu ćelije (Wang i sar. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985).
[0328] Lipozomi koji su osetljivi na pH ili negativno naelektrisani zarobljavaju nukleinske kiseline pre nego da grade komplekse sa njima. Pošto su i nukleinska kiselina i lipid slično naelektrisani, dolazi do odbijanja, a ne do nastanka kompleksa. Bez obzira na to, izvesna količina nukleinske kiseline je zarobljena u vodenoj unutrašnjosti ovih lipozoma. Lipozomi osetljivi na pH se koriste da isporuče nukleinske kiseline koje kodiraju gen timidin kinaze u ćelijske monoslojeve u kulturi. Ekspresija egzogenog gena je detektovana u ciljnim ćelijama (Zhou i sar. Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274).
[0329] Jedna značajna vrsta lipozomskih kompozicija uključuje fosfolipide koji nisu prirodno dobijeni fosfatidilholin. Neutralne lipozomske kompozicije, na primer, mogu se formirati od dimiristoil fosfatidilholina (DMPC) ili dipalmitoil fosfatidilholina (DPPC). Anjonske lipozomske kompozicije se uopšteno grade od dimiristoil fosfatidilglicerola, dok se anjonski fuzogeni lipozomi grade prevashodno od dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE). Druga vrsta lipozomskih kompozicija nastaje od fosfatidilholina (PC) poput, na primer, sojinog PC i PC iz jaja. Druga vrsta nastaje iz smeša fosfolipida i/ili fosfatidilholina i/ili holesterola.
[0330] Primeri drugih postupaka za uvođenje lipozoma u ćelije in vitro i in vivo uključuju U.S. pat. br.5,283,185; U.S. Pat. br.5,171,678; WO 94/00569; WO 93/24640; WO 91/16024; Felgner, J. Biol. Chem. 269:2550, 1994; Nabel, Proc. Natl. Acad. Sci.90:11307, 1993; Nabel, Human Gene Ther.3:649, 1992; Gershon, Biochem. 32:7143, 1993; i Strauss EMBO J.11:417, 1992.
[0331] Nejonski lipozomski sistemi su takođe ispitani kako bi se utvrdila njihova korisnost u isporučivanju lekova u kožu, naročito sistemi koji sadrže nejonske surfaktante i holesterol. Nejonske lipozomske formulacije koje sadrže Novasome™ I (gliceril dilaurat/holesterol/poloksietilen-10-stearil etar) i Novasome™ II (gliceril distearat/holesterol/polioksietilen-10-stearil etar) korišćene su za isporuku ciklosporina A u dermis kože miša. Rezultati su pokazali da su takvi nejonski lipozomski sistemi delotvorni u olakšavanju taloženja ciklosporina A u različitim slojevima kože (Hu i sar. S.T.P.Pharma. Sci., 1994, 4(6) 466).
[0332] Lipozomi takođe uključuju „sterno stabilizovane“ lipozome, termin koji, kako se ovde koristi, označava lipozome koji sadrže jedan ili više specijalizovanih lipida koji, kada se inkorporiraju u lipozome, dovode do poboljšanog životnog veka u krvotoku u poređenju sa lipozomima koji nemaju takve specijalizovane lipide. Primeri sterno stabilizovanih lipozoma su oni u kojima deo lipidnog dela lipozoma koji gradi vezikulu (A) sadrži jedan ili više glikolipida, kao što je monosijalogangliozid GM1, ili (B) derivatizuje se sa jednim ili više hidrofilnih polimera, kao što je ostatak polietilen glikola (PEG). Ne želeći da se ograničimo bilo kojom određenom teorijom, u struci se smatra da, barem za sterno stabilizovane lipozome koji sadrže gangliozide, sfingomijelin ili PEG-derivatizovane lipide, poboljšani poluživot u krvotoku tih sterno stabilizovanih lipozoma proizilazi iz smanjenog unosa u ćelije retikuloendotelnog sistema (RES) (Allen i sar. FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu i sar., Cancer Research, 1993, 53, 3765).
[0333] Različiti lipozomi koji sadrže jedan ili više glikolipida su poznati u struci.
Papahadjopoulos i sar. (Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64) izvestili su o sposobnosti monosijalogangliozida GM1, galaktocerebrozid sulfata i fosfatidilinozitola da poboljšaju poluživot lipozoma u krvi. Na ova otkrića su se nadovezali Gabizon i sar. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949). U.S. pat. br.4,837,028 i WO 88/04924, oba Allen i sar. otkrivaju lipozome koji sadrže (1) sfingomijelin i (2) gangliozid GM1ili galaktocerebrozid sulfat estar. U.S. pat. br.5,543,152 (Webb i sar.) otkriva lipozome koji sadrže sfingomijelin. Lipozomi koji sadrže 1,2-sn-dimiristoil fosfatidilholin opisani su u WO 97/13499 (Lim i sar.).
1
[0334] U jednom otelotvorenju, koriste se katjonski lipozomi. Katjonski lipozomi imaju prednost što su sposobni da se fuzionišu sa ćelijskom membranom. Nekatjonske lipozome, mada nisu sposobni da se efikasno fuzionišu sa membranom plazme, preuzimaju makrofagi in vivo i mogu da se koriste za isporuku agensa iRNK u makrofage.
[0335] Dalje prednosti lipozoma uključuju sledeće: lipozomi dobijeni od prirodnih fosfolipida su biokompatibilni i biorazgradivi; lipozomi mogu da inkorporiraju širok raspon lekova koji se rastvaraju u vodi i lipidima; lipozomi mogu da štite enkapsulirane agense iRNK u njihovim internim odeljcima od metabolizma i razgradnje (Rosoff, u „Pharmaceutical Dosage Forms“, Lieberman, Rieger i Banker (izdav.), 1988, sveska 1, str.
245). Prilikom pripreme lipozomskih formulacija, važno je uzeti u obzir naelektrisanje površine lipida, veličinu vezikule i vodenu zapreminu lipozoma.
[0336] Pozitivno naelektrisani sintetički katjonski lipid, N-[1-(2,3-dioleiloksi)propil]-N,N,N-trimetilamonijum hlorid (DOTMA) može da se koristi da gradi male lipozome koji spontano interaguju sa nukleinskom kiselinom gradeći komplekse lipid-nukleinska kiselina koji mogu da se fuzionišu sa negativno naelektrisanim lipidima ćelijskih membrana ćelijske kulture tkiva, što dovodi do isporuke agensa iRNK (vidite, npr. Felgner, P. L. i sar. Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8:7413-7417, 1987 i U.S. Pat. br.4,897,355 za opis DOTMA i njegovog korišćenja sa DNK).
[0337] Analog DOTMA, 1,2-bis(oleoiloksi)-3-(trimetilamonijum)propan (DOTAP) može da se koristi u kombinaciji sa fosfolipidom radi nastanka vezikula za stvaranje kompleksa sa DNK. Lipofectin™ (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md.) je delotvoran agens za isporuku veoma anjonskih nukleinskih kiselina u žive ćelije kulture tkiva koje sadrže pozitivno naelektrisane DOTMA lipozome koji spontano interaguju sa negativno naelektrisanim polinukleotidima radi nastanka kompleksa. Kada se koristi dovoljno pozitivno naelektrisanih lipozoma, ukupno naelektrisanje dobijenih kompleksa je takođe pozitivno. Pozitivno naelektrisani kompleksi pripremljeni na ovaj način spontano se kače za negativno naelektrisane ćelijske površine, fuzionišu sa membranom plazme i efikasno isporučuju funkcionalne nukleinske kiseline, na primer, u ćelije kulture tkiva. Drugi komercijalno dostupni katjonski lipid, 1,2-bis(oleoiloksi)-3,3-(trimetilamonijum)propan („DOTAP“) (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) razlikuje se od DOTMA po tome što su ostaci oleila vezani estarskim, a ne etarskim vezama.
1 1
[0338] Druga objavljena jedinjenja katjonskog lipida uključuju ona koja su konjugovana sa različitim ostacima uključujući, na primer, karboksispermin koji je konjugovan sa jednom od dve vrste lipida i uključuje jedinjenja poput 5-karboksispermilglicin dioktaoleoil amida („DOGS“) (Transfectam™, Promega, Madison, Wisconsin) i dipalmitoil fosfatidil etanolamin 5-karboksispermil amida („DPPES“) (vidite, npr. U.S. pat. br.5,171,678).
[0339] Drugi konjugat katjonskog lipida uključuje derivatizaciju lipida sa holesterolom („DC-Chol“) koji je formulisan u lipozome u kombinaciji sa DOPE (vidite, Gao, X. i Huang, L., Biochim. Biophys. Res. Commun. 179:280, 1991). Objavljeno je da je lipopolilizin, nastao konjugacijom polilizina sa DOPE, delotvoran za transfekciju u prisustvu seruma (Zhou, X. i sar. Biochim. Biophys. Acta 1065:8, 1991). Za određene ćelijske linije, za ove lipozome koji sadrže konjugovane katjonske lipide je uočeno da ispoljavaju manju toksičnost i pružaju efikasniju transfekciju nego kompozicije koje sadrže DOTMA. Drugi komercijalno dostupni proizvodi katjonskih lipida uključuju DMRIE i DMRIE-HP (Vical, La Jolla, California) i Lipofektamin (DOSPA) (Life Technology, Inc., Gaithersburg, Maryland). Drugi katjonski lipidi pogodni za isporuku oligonukleotida su opisani u WO 98/39359 i WO 96/37194.
[0340] Lipozomske formulacije su naročito pogodne za topikalnu primenu, a lipozomi imaju nekoliko prednosti nad drugim formulacijama. Takve prednosti uključuju smanjena neželjena dejstva povezana sa velikom sistemskom apsorpcijom primenjenog leka, povećanu akumulaciju primenjenog leka na željenom cilju i sposobnost da se agens iRNK primeni na koži. U nekim primenama, lipozomi se koriste za isporuku agenasa iRNK u epidermalne ćelije i takođe za poboljšanje prodiranja agensa iRNK u dermalna tkiva, npr. u kožu. Na primer, lipozomi se mogu primeniti topikalno. Topikalna primena lekova koji su formulisani kao lipozomi na koži je dokumentovana (vidite, npr. Weiner i sar. Journal of Drug Targeting, 1992, sv.2,405-410 i du Plessis i sar. Antiviral Research, 18, 1992, 259-265; Mannino, R. J. i Fould-Fogerite, S., Biotechniques 6:682-690, 1988; Itani, T. i sar. Gene 56:267-276. 1987; Nicolau, C.i sar. Meth. Enz.149:157-176, 1987; Straubinger, R. M. i Papahadjopoulos, D. Meth. Enz.101:512-527, 1983; Wang, C. Y. i Huang, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851-7855, 1987).
1 2
[0341] Nejonski lipozomski sistemi su takođe ispitani kako bi se utvrdila njihova korisnost u isporučivanju lekova u kožu, naročito sistemi koji sadrže nejonske surfaktante i holesterol. Nejonske lipozomske formulacije koje sadrže novasom I (gliceril dilaurat/holesterol/polioksietilen-10-stearil etar) i novasom II (gliceril distearat/ holesterol/polioksietilen-10-stearil etar) korišćene su za isporuku leka u dermis kože miša. Takve formulacije sa agensom iRNK su korisne za lečenje dermatološkog poremećaja.
[0342] Lipozomi koji sadrže iRNK mogu da se načine da budu veoma deformabilni. Takva deformabilnost može da omogući lipozomima da se probiju kroz pore koje su manje od prosečnog poluprečnika lipozoma. Na primer, transferzomi su vrsta deformabilnih lipozoma. Transferzomi se mogu napraviti dodavanjem površinskih aktivatora ivice, obično surfaktanata, u standardnu lipozomsku kompoziciju. Transferzomi koji uključuju agens iRNK mogu da se isporuče, na primer, supkutano putem infekcije kako bi se agens iRNK isporučio u keratinocite u koži. Kako bi netaknute prošle kožu sisara, lipidne vezikule moraju proći kroz niz finih pora, od kojih svaka ima prečnik manji od 50 nm, pod uticajem pogodnog transdermalnog gradijenta. Pored toga, usled lipidnih svojstava, ovi transferzomi mogu biti samooptimizujući (prilagodljivi na oblik pora, npr. u koži), samopopravljajući, i često mogu dostići svoje mete bez fragmentisanja, i često su samoelektrišući.
[0343] Druge formulacije koje su podložne predmetnom pronalasku su opisane u PCT publikaciji br. WO 2008/042973.
[0344] Transferzomi su još jedna vrsta lipozoma, i veoma su deformabilni lipidni agregati koji su atraktivni kandidati za vehikulume za isporuku leka. Transferzomi mogu da se opišu kao lipidne kapljice koje su toliko deformabilne da lako mogu da se probiju kroz pore koje su manje od kapljica. Transferzomi se prilagođavaju na okruženje u kom se koriste, npr. oni su samooptimizujući (prilagodljivi na oblik pora u koži), samopopravljajući, često stižu do svojih meta bez fragmentisanja, i često su samoelektrišući. Kako bi se napravili transferzomi, moguće je dodati površinske aktivatore ivice, obično surfaktante, standardnim lipozomskim kompozicijama. Transferzomi su korišćeni za isporuku serumskog albumina do kože.
Pokazalo se da je transferzomski posredovana isporuka serumskog albumina delotvorna koliko i supkutana injekcija rastvora koji sadrži serumski albumin.
1
[0345] Surfaktanti imaju široku primenu u formulacijama kao što su emulzije (uključujući mikroemulzije) i lipozomi. Najčešći način klasifikovanja i rangiranja svojstava mnogih brojnih različitih vrsta surfaktanata, i prirodnih i sintetičkih, je korišćenjem hidrofilnog/lipofilnog balansa (HLB). Priroda hidrofilne grupe (poznate i kao „glava“) daje najkorisniji način za kategorizaciju različitih surfaktanata koji se koriste u formulacijama (Rieger, u „Pharmaceutical Dosage Forms“, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, str.
285).
[0346] Ako molekul surfaktanta nije jonizovan, klasifikuje se kao nejonski surfaktant.
Nejonski surfaktanti imaju široku primenu u farmaceutskim i kozmetičkim proizvodima, i mogu da se koriste u širokom rasponu pH vrednosti. Uopšteno, njihove HLB vrednosti su u rasponu od 2 do oko 18 u zavisnosti od njihove strukture. Nejonski surfaktanti uključuju nejonske estre, kao što su estri etilen glikola, estri propilen glikola, gliceril estri, poligliceril estri, sorbitanski estri, saharozni estri i etoksilovani estri. Nejonski alkanolamidi i etri, kao što su etoksilati masnih alkohola, propoksilovani alkoholi i etoksilovani/propoksilovani blok polimeri takođe su uključeni u ovu klasu. Polioksietilenski surfaktanti su najpopularniji članovi klase nejonskih surfaktnanata.
[0347] Ako molekul surfaktanta ima negativno naelektrisanje kada se rastvori ili rasprši u vodi, surfaktant se klasifikuje kao anjonski. Anjonski surfaktanti uključuju karboksilate, kao što su sapuni, acil laktilati, acil amidi aminokiselina, estri sumporne kiseline, kao što su alkil sulfati i etoksilovani alkil sulfati, sulfonati kao što su alkil benzen sulfonati, acil izetionati, acil taurati i sulfosukcinati, i fosfati. Najvažniji članovi klase anjonskih surfaktanata su alkil sulfati i sapuni.
[0348] Ako molekul surfaktanta ima pozitivno naelektrisanje kada se rastvori ili disperguje u vodi, surfaktant se klasifikuje kao katjonski. Katjonski surfaktanti uključuju kvaternerne amonijumove soli i etoksilovane amine. Kvaternerne amonijumove soli su najčešće korišćeni članovi ove klase.
[0349] Ako je molekul surfaktanta sposoban da ima pozitivno ili negativno naelektrisanje, surfaktant se klasifikuje kao amfoterni. Amfoterni surfaktanti uključuju derivate akrilne kiseline, supstituisane alkilamide, N-alkilbetaine i fosfatide.
1 4
[0350] Dat je pregled upotrebe surfaktanata u proizvedenim lekovima, formulacijama i emulzijama (Rieger, u „Pharmaceutical Dosage Forms“, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, str.285).
[0351] iRNK za upotrebu u postupcima iz pronalaska takođe može da se obezbedi kao micelarna formulacija. „Micele“ su ovde definisane kao posebna vrsta molekulskog sklopa u kojem su amfipatični molekuli organizovani u sfernoj strukturi tako da su svi hidrofobni delovi molekula okrenuti ka unutra, što ostavlja hidrofilne delove u kontaktu sa okružujućom vodenom fazom. Suprotno uređenje postoji kada je okruženje hidrofobno.
[0352] Mešovita micelarna formulacija pogodna za isporuku kroz transdermalne membrane može da se pripremi mešanjem vodenog rastvora kompozicije siRNK, alkil sulfata C8do C22alkalnog metala i jedinjenja koja grade micele. Primeri za jedinjenja koja grade micele uključuju lecitin, hijaluronsku kiselinu, farmaceutski prihvatljive soli hijaluronske kiseline, glikolnu kiselinu, mlečnu kiselinu, ekstrakt kamilice, ekstrakt krastavca, oleinsku kiselinu, linolnu kiselinu, linolensku kiselinu, monoolein, monooleate, monolaurate, ulje borača, ulje žutog noćurka, mentol, trihidroksi okso holanil glicin i njegove farmaceutski prihvatljive soli, glicerin, poliglicerin, lizin, polilizin, triolein, polioksietilen etre i njihove analoge, polidokanol alkil etre i njihove analoge, henodezoksiholat, dezoksiholat i njihove smeše. Jedinjenja koja grade micele mogu se dodati u isto vreme ili nakon dodavanja alkil sulfata alkalnog metala. Mešovite micele će nastati uz suštinski bilo koje mešanje sastojaka, ali žustro mešanje daje manje micele.
[0353] U jednom postupku, priprema se prva micelarna kompozicija koja sadrži kompoziciju siRNK i najmanje alkil sulfat alkalnog metala. Prva micelarna kompozicija se zatim meša sa najmanje tri jedinjenja koja grade micele kako bi nastala mešovita micelarna kompozicija. U drugom postupku, micelarna kompozicija se priprema mešanjem kompozicije siRNK, alkil sulfata alkalnog metala i najmanje jednog jedinjenja koje gradi micele, nakon čega sledi dodavanje ostalih jedinjenja koja grade micele, uz žustro mešanje.
[0354] Fenol i/ili m-krezol se mogu dodati u mešovitu micelarnu kompoziciju radi stabilizacije formulacije i zaštite od bakterijskog rasta. Alternativno, fenol i/ili m-krezol se mogu dodati uz sastojke koji grade micele. Izotonični agens, kao što je glicerin, takođe se može dodati nakon nastanka mešovite micelarne kompozicije.
1
[0355] Za isporuku micelarne formulacije u vidu spreja, formulacija može da se stavi u aerosolni dozator i dozator se napuni propelantom. Propelant, koji se nalazi pod pritiskom, u dozatoru se nalazi u tečnom obliku. Odnos sastojaka je podešen tako da vodena i pogonska faza postanu jedno, tj. postoji jedna faza. Ako postoji dve faze, neophodno je promućkati dozator pre ispuštanja dela sadržaja, npr. putem doznog ventila. Ispuštena doza farmaceutskog agensa se izbacuje kroz dozni ventil u vidu finog spreja.
[0356] Propelanti mogu da uključuju hlorfluorugljenike koji sadrže vodonik, fluorugljenike koji sadrže vodonik, dimetil etar i dietil etar. U određenim otelotvorenjima, može se koristiti HFA 134a (1,1,1,2 tetrafluoretan).
[0357] Specifične koncentracije esencijalnih sastojaka mogu da se odrede relativno jednostavnim eksperimentisanjem. Kod apsorpcije kroz oralne šupljine, često je poželjno da se doza poveća, npr. najmanje dvostruko ili trostruko, za injekciju ili primenu kroz gastrointestinalni trakt.
B. Lipidne čestice
[0358] iRNK, npr. dsRNK iz pronalaska, mogu u potpunosti biti enkapsulirane u lipidnoj formulaciji, npr. LNP, ili čestici nukleinska kiselina-lipid.
[0359] Kako se ovde koristi, termin „LNP“ označava stabilnu česticu nukleinska kiselinalipid. LNP obično sadrže katjonski lipid, nekatjonski lipid i lipid koji sprečava agregaciju čestice (npr. konjugata PEG-lipid). LNP su izuzetno korisni za sistemske primene, pošto pokazuju produženi životni vek u krvotoku nakon intravenske (i.v.) injekcije i akumuliraju se na distalnim mestima (npr. mestima koja su fizički razdvojena od mesta primene). LNP uključuju „pSPLP“ koji uključuju enkapsulirani kompleks kondenzujući agens-nukleinska kiselina kao što je prikazano u PCT publikaciji br. WO 00/03683. Čestice iz predmetnog pronalaska obično imaju srednji prečnik od oko 50 nm do oko 150 nm, uobičajenije oko 60 nm do oko 130 nm, uobičajenije oko 70 nm do oko 110 nm, najuobičajenije oko 70 nm do oko 90 nm, i suštinski nisu toksične. Pored toga, nukleinske kiseline, kada su prisutne u česticama nukleinska kiselina-lipid iz predmetnog pronalaska, u vodenom rastvoru su otporne na razgradnju nukleazom. Čestice nukleinska kiselina-lipid i postupci za njihovu primenu
1
opisani su npr. u U.S. patentima br.5,976,567; 5,981,501; 6,534,484; 6,586,410; 6,815,432; U.S. publikaciji br.2010/0324120 i PCT publikaciji br. WO 96/40964.
[0360] U jednom otelotvorenju, odnos lipida i leka (odnos masa/masa) (npr. odnos lipida prema dsRNK) biće u opsegu od oko 1:1 do oko 50:1, od oko 1:1 do oko 25:1, od oko 3:1 do oko 15:1, od oko 4:1 do oko 10:1, od oko 5:1 do oko 9:1 ili od oko 6:1 do oko 9:1. Opsezi između prethodno navedenih opsega će takođe biti razmatrani kao deo pronalaska.
[0361] Katjonski lipid može biti, na primer, N,N-dioleil-N,N-dimetilamonijum hlorid (DODAC), N,N-distearil-N,N-dimetilamonijum bromid (DDAB), N-(I-(2,3-dioleoiloksi)propil)-N,N,N-trimetilamonijum hlorid (DOTAP), N-(I -(2,3-dioleiloksi)propil)-N,N,N-trimetilamonijum hlorid (DOTMA), N,N-dimetil-2,3-dioleiloksi)propilamin (DODMA), 1,2-dilinoleoloksi-N,N-dimetilaminopropan (DLinDMA), 1,2-dilinoleniloksi-N,N-dimetilaminopropan (DLenDMA), 1,2-dilinoleilkarbamoiloksi-3-dimetilaminopropan (DLin-C-DAP), 1,2-dilinoleioksi-3-(dimetilamino)acetoksipropan (DLin-DAC), 1,2-dilinoleiloksi-3-morfolinopropan (DLin-MA), 1,2-dilinoleoil-3-dimetilaminopropan (DLinDAP), 1,2-dilinoleiltio-3-dimetilaminopropan (DLin-S-DMA), 1-linoleoil-2-linoleiloksi-3-dimetilaminopropan (DLin-2-DMAP), so 1,2-dilinoleiloksi-3-trimetilaminopropan hlorid (DLin-TMA.Cl), so 1,2-dilinoleoil-3-trimetilaminopropan hlorid (DLin-TAP.Cl), 1,2-dilinoleiloksi-3-(N-metilpiperazino)propan (DLin-MPZ), ili 3-(N,N-dilinoleilamino)-1,2-propandiol (DLinAP), 3-(N,N-dioleilamino)-1,2-propandio (DOAP), 1,2-dilinoleilokso-3-(2-N,N-dimetilamino)etoksipropan (DLin-EG-DMA), 1,2-dilinoleniloksi-N,N-dimetilaminopropan (DLinDMA), 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminometil-[1,3]-dioksolan (DLin-K-DMA) ili njihovi analozi, (3aR,5s,6aS)-N,N-dimetil-2,2-di((9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dienil)tetrahidro-3aH-ciklopenta[d][1,3]dioksol-5-amin (ALN100), (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriakonta-6,9,28,31-tetraen-19-il 4-(dimetilamino)butanoat (MC3), 1,1'-(2-(4-(2-((2-(bis(2-hidroksidodecil)amino)etil)(2-hidroksidodecil)amino)etil)piperazin-1-il)etilazandiil)didodekan-2-ol (Tech G1), ili njihova smeša. Katjonski lipid može da čini od oko 20 mol % do oko 50 mol % ili oko 40 mol % ukupnog lipida prisutnog u čestici.
[0362] U drugom otelotvorenju, jedinjenje 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolan može da se koristi da se pripreme nanočestice lipid-siRNK. Sinteza 2,2-dilinoleil-4-
1
dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolana je opisana u provizionoj patentnoj prijavi Sjedinjenih Država broj 61/107,998, koja je podneta 23. oktobra 2008.
[0363] U jednom otelotvorenju, čestica lipid-siRNK sadrži 40% 2, 2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolana: 10% DSPC: 40% holesterola: 10% PEG-C-DOMG (molarni procenat) sa veličinom čestice od 63,0 ± 20 nm i odnosom siRNK/lipid od 0,027.
[0364] Jonizujući/nekatjonski lipid može biti anjonski lipid ili neutralni lipid uključujući, bez ograničenja, distearoil fosfatidilholin (DSPC), dioleoil fosfatidilholin (DOPC), dipalmitoil fosfatidilholin (DPPC), dioleoil fosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoil fosfatidilglicerol (DPPG), dioleoil fosfatidiletanolamin (DOPE), palmitoil oleoilfosfatidilholin (POPC), palmitoil oleoilfosfatidiletanolamin (POPE), dioleoil fosfatidiletanolamin 4-(N-maleimidometil)-cikloheksan-1-karboksilat (DOPE-mal), dipalmitoil fosfatidil etanolamin (DPPE), dimiristoil fosfoetanolamin (DMPE), distearoil fosfatidil etanolamin (DSPE), 16-O-monometil PE, 16-0-dimetil PE, 18-1 -trans PE, 1 -stearoil-2-oleoil- fosfatidietanolamin (SOPE), holesterol, ili njihovu smešu. Nekatjonski lipid može biti od oko 5 mol % do oko 90 mol %, oko 10 mol % ili oko 58 mol %, ako je uključen holesterol, ukupnog lipida prisutnog u čestici.
[0365] Konjugovani lipid koji inhibira agregaciju čestica može biti, na primer, polietilenglikol (PEG)-lipid uključujući, bez ograničenja, PEG-diacilglicerol (DAG), PEG-dialkiloksipropil (DAA), PEG-fosfolipid, PEG-ceramid (Cer) ili njihovu smešu. Konjugat PEG-DAA može biti, na primer, PEG-dilauriloksipropil (Ci2), PEG-dimiristiloksipropil (Ci4), PEG-dipalmitiloksipropil (Ci6) ili PEG- disteariloksipropil (C]8). Konjugovani lipid koji sprečava agregaciju čestica može biti od oko 0 mol % do oko 20 mol % ili oko 2 mol % ukupnog lipida prisutnog u čestici.
[0366] U nekim otelotvorenjima, čestica nukleinska kiselina-lipid dalje uključuje holesterol pri, npr. oko 10 mol % do oko 60 mol % ili oko 48 mol % ukupnog lipida prisutnog u čestici.
[0367] U jednom otelotvorenju, lipidoid ND98·4HCl (MW 1487) (vidite U.S. patentnu prijavu br.12/056,230, podnetu 26.3.2008.), holesterol (Sigma-Aldrich) i PEG-ceramid C16 (Avanti Polar Lipids) mogu da se koriste za pripremu nanočestica lipid-dsRNK (tj. LNP01 čestica). Osnovni rastvori svakog od njih u etanolu mogu da se pripreme na sledeći način:
1
ND98, 133 mg/ml; holesterol, 25 mg/ml, PEG-ceramid C16, 100 mg/ml. ND98, holesterol i PEG-ceramid C16 osnovni rastvori zatim mogu da se kombinuju npr. u molskom odnosu 42:48:10. Kombinovani lipidni rastvor može da se meša sa vodenom dsRNK (npr. u natrijum acetatu pH 5) tako da je konačna koncentracija etanola oko 35-45%, a konačna koncentracija natrijum acetata je oko 100-300 mM. Nanočestice lipid-dsRNK obično spontano nastaju nakon mešanja. U zavisnosti od željene distribucije veličina čestica, dobijena smeša nanočestica može da se istisne kroz polikarbonatnu membranu (npr.100 nm presek) koristeći, na primer, ekstruder sa termalnim buretom, kao što je Lipex ekstruder (Northern Lipids, Inc). U nekim slučajevima, korak istiskivanja može da se preskoči. Uklanjanje etanola i simultana razmena pufera mogu da se postignu, na primer, dijalizom ili filtracijom tangencijalnog protoka. Pufer može da se razmeni, na primer, sa fiziološkim rastvorom puferovanim fosfatom (PBS) oko pH 7, npr. oko pH 6,9, oko pH 7,0, oko pH 7,1, oko pH 7,2, oko pH 7,3 ili oko pH 7,4.
[0368] Formulacije LNP01 su opisane, npr. u Publikaciji međunarodne prijave br. WO 2008/042973.
[0369] Dodatni primeri formulacija lipid-dsRNK su opisani u Tabeli 1.
Tabela A
1
11
[0370] Kompozicije i formulacije za oralnu primenu uključuju praškove ili granule, mikročestice, nanočestice, suspenzije ili rastvore u vodi ili nevodenim medijumima, kapsule, gel kapsule, vrećice, tablete ili minitablete. Sredstva za zgušnjavanje, arome, razblaživači, emulgatori, sredstva za raspršivanje ili veziva takođe mogu biti poželjni. U nekim otelotvorenjima, oralne formulacije su one u kojima se dsRNK prikazane u pronalasku primenjuju zajedno sa jednim ili više surfaktanata i helatora za pojačavanje penetracije. Odgovarajući surfaktanti uključuju masne kiseline i/ili njihove estre ili soli, žučne kiseline i/ili njihove soli. Odgovarajuće žučne kiseline/soli uključuju henodezoksiholnu kiselinu (CDCA) i ursodezoksihenodezoksiholnu kiselinu(UDCA), holnu kiselinu, dehidroholnu kiselinu, dezoksiholnu kiselinu, glikolnu kiselinu, glikodezoksiholnu kiselinu, tauroholnu kiselinu, taurodezoksiholnu kiselinu, natrijum tauro-24,25-dihidrofusidat i natrijum glikodihidrofusidat. Odgovarajuće masne kiseline uključuju arahidonsku kiselinu, undekansku kiselinu, oleinsku kiselinu, laurinsku kiselinu, kaprilnu kiselinu, kaprinsku kiselinu, miristinsku kiselinu, palmitinsku kiselinu, stearinsku kiselinu, linolnu kiselinu, linolensku kiselinu, dikaprat, trikaprat, monoolein, dilaurin, gliceril 1-monokaprat, 1-dodecilazacikloheptan-2-on, acilkarnitin, acilholin, ili monoglicerid, diglicerid ili njihove farmaceutski prihvatljive soli (npr. natrijumove). U nekim otelotvorenjima, koristi se kombinacija pojačivača penetracije, na primer, masne kiseline/soli u kombinaciji sa žučnim kiselinama/solima. Jedan primer kombinacije je natrijumova so laurinske kiseline, kaprinska kiselina i UDCA. Dalji pojačivači penetracije uključuju polioksietilen-9-lauril etar, polioksietilen-20-cetil etar. dsRNK iz pronalaska mogu da se isporučuju oralno, u granulisanom obliku, uključujući raspršene suve čestice, ili u kompleksu koji gradi mikro ili nanočestice. Agensi za stvaranje kompleksa dsRNK uključuju poliaminokiseline; poliimine; poliakrilate; polialkilakrilate, polioksetane, polialkilcijanoakrilate; katjonizovane želatine,
11
albumine, skrobove, akrilate, polietilenglikole (PEG) i skrobove; polialkilcijanoakrilate; DEAE-derivatizovane poliimine, pululane, celuloze i skrobove. Odgovarajući agensi za stvaranje kompleksa uključuju hitozan, N-trimetilhitozan, poli-L-lizin, polihistidin, poliornitin, polispermine, protamin, polivinilpiridin, politiodietilaminometiletilen P(TDAE), poliaminostiren (npr. p-amino), poli(metilcijanoakrilat), poli(etilcijanoakrilat), poli(butilcijanoakrilat), poli(izobutilcijanoakrilat), poli(izoheksilcijanoakrilat), DEAE-metakrilat, DEAE-heksilakrilat, DEAE-akrilamid, DEAE-albumin i DEAE-dekstran, polimetilakrilat, poliheksilakrilat, poli(D,L-mlečnu kiselinu), poli(DL-mlečnu-koglikolnu kiselinu (PLGA), alginat i polietilenglikol (PEG). Oralne formulacije za dsRNK i njihova priprema su detaljno opisane u U.S. patentu 6,887,906, US publ. br.20030027780, i U.S. patentu br.6,747,014.
[0371] Kompozicije i formulacije za parenteralnu, intraparenhimsku (u mozak), intratekalnu, intraventrikularnu ili intrahepatičku primenu mogu da uključuju sterilne vodene rastvore koji takođe mogu da sadrže pufere, razblaživače i druge pogodne aditive kao što su, bez ograničenja, pojačivači penetracije, jedinjenja nosači i drugi farmaceutski prihvatljivi nosači ili ekscipijensi.
[0372] Farmaceutske kompozicije iz predmetnog otkrića uključuju, ali nisu ograničene na, rastvore, emulzije i formulacije koje sadrže lipozome. Ove kompozicije mogu da se stvore iz različitih komponenti koje uključuju, ali nisu ograničene na, prethodno formirane tečnosti, samoemulgujuće čvrste supstance i samoemulgujuće polučvrste supstance. Naročito su poželjne formulacije koje ciljaju jetru prilikom lečenja hepatičnih poremećaja kao što je hepatični karcinom.otkriće
[0373] Farmaceutske formulacije iz predmetnog otkrića, koje pogodno mogu da se predstave u jediničnim doznim oblicima, mogu da se pripreme u skladu sa uobičajenim tehnikama koje su dobro poznate u farmaceutskoj industriji. Takve tehnike uključuju korak povezivanja aktivnih sastojaka sa farmaceutskim nosačima ili ekscipijensima. Uopšteno, formulacije se pripremaju uniformnim i bliskim povezivanjem aktivnih sastojaka sa tečnim nosačima ili fino podeljenim čvrstim nosačima ili oba, a zatim, po potrebi, oblikovanjem proizvoda.otkriće
[0374] Kompozicije iz predmetnog otkrića mogu da se formulišu u bilo koji od mnogih mogućih doznih oblika kao što su, bez ograničenja, tablete, kapsule, gel kapsule, tečni sirupi, meki gelovi, supozitorije i klistiri. Kompozicije iz predmetnog pronalaska takođe mogu da se formulišu kao suspenzije u vodenim, nevodenim ili mešovitim medijumima. Vodene suspenzije dalje mogu da sadrže supstance koje povećavaju viskozitet suspenzije uključujući, na primer, natrijum karboksimetilcelulozu, sorbitol i/ili dekstran. Suspenzija takođe može da sadrži stabilizatore.
C. Dodatne formulacije
i. Emulzije
[0375] Kompozicije iz predmetnog otkrića mogu da se pripreme i formulišu kao emulzije. Emulzije su obično heterogeni sistemi jedne tečnosti dispergovane u drugoj u vidu kapljica koje obično imaju prečnik veći od 0,1 µm (vidite, npr. Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., i Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8. izd.), New York, NY; Idson, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger i Banker (izdav.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., sveska 1, str. 199; Rosoff, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger i Banker (izdav.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., sveska 1, str.245; Block u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger i Banker (izdav.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., sveska 2, str.335; Higuchi i sar. u Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, str.301). Emulzije su često dvofazni sistemi koji sadrže dve nemešljive tečne faze koje su blisko pomešane i dispergovane zajedno. Uopšteno, emulzije mogu biti vrste voda u ulju (V/U) ili ulje u vodi (U/V). Kada je vodena faza fino podeljena i dispergovana kao sitne kapljice u glavnoj uljanoj fazi, dobijena kompozicija se naziva emulzija voda u ulju (V/U). Alternativno, kada je uljana faza fino podeljena i dispergovana kao sitne kapljice u glavnoj vodenoj fazi, dobijena kompozicija se naziva emulzija ulje u vodi (U/V). Emulzije mogu da sadrže dodatne komponente osim dispergovanih faza, i aktivni lek koji može biti prisutan kao rastvor u vodenoj fazi, uljanoj fazi ili sam po sebi kao odvojena faza. Farmaceutski ekscipijensi kao što su emulgatori, stabilizatori, boje i antioksidansi takođe mogu biti prisutni u emulzijama po potrebi. Farmaceutske emulzije takođe mogu biti višestruke emulzije koje su sačinjene od više od dve faze kao što su, na primer, emulzije ulje u vodi u ulju (U/V/U) i voda u ulju u vodi (V/U/V). Takve složene formulacije često pružaju određene prednosti koje proste binarne emulzije nemaju. Višestruke emulzije u kojima pojedinačne kapljice ulja emulzije U/V obuhvataju male kapljice vode čine emulziju V/U/V.
11
Slično tome, sistem kapljica ulja obuhvaćenih globulama vode stabilizovanim u uljanoj neprekidnoj fazi daje o/w/o emulziju.
[0376] Emulzije karakteriše mala termodinamička stabilnost ili njen izostanak. Često je dispergovana ili diskontinualna faza emulzije dobro dispergovana u spoljašnjoj ili kontinualnoj fazi i održava se u ovom obliku pomoću emulgatora ili viskoznosti formulacije. Bilo koja od faza emulzije može biti polučvrsta ili čvrsta supstanca, kao što je slučaj kod emulzionih baza melema i krema. Druga sredstva za stabilizaciju emulzija obuhvataju upotrebu emulgatora koji mogu biti inkorporisani u bilo koju fazu emulzije. Emulgatori se grubo mogu klasifikovati u četiri kategorije: sintetički surfaktanti, prirodni emulgatori, apsorpcione baze i fino raspršene čvrste supstance (vidite, npr. Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., i Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8. izd.), New York, NY; Idson, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger i Banker (izdav.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., sveska 1, str.199).
[0377] Sintetički surfaktanti, poznati i kao površinski aktivni agensi, imaju veliku primenljivost u formulaciji emulzija, i njihov pregled je dat u literaturi (vidite, npr. Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., i Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8. izd.), New York, NY; Rieger, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger i Banker (izdav.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., sveska 1, str.285; Idson, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger i Banker (izdav.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, sveska 1, str.199). Surfaktanti su obično amfifilni i sadrže hidrofilni i hidrofobni deo. Odnos hidrofilne i hidrofobne prirode surfaktanta se naziva hidrofilni/lipofilni balans (HLB) i predstavlja koristan alat u kategorizaciji i odabiru surfaktanata u pripremi formulacija. Surfaktanti mogu da se podele u različite klase na osnovu prirode hidrofilne grupe: nejonske, anjonski, katjonski i amfoterni (vidite, npr. Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., i Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8. izd.), New York, NY Rieger, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger i Banker (izdav.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., sveska 1, str.285).
[0378] Prirodno emulgatori koji se koriste u formulacijama emulzija uključuju lanolin, pčelinji vosak, fosfatide, lecitin i akaciju. Apsorpcione baze imaju hidrofilna svojstva tako da
11
mogu da upiju vodu i grade w/o emulzije, a ipak zadržavaju svoju polučvrstu konzistenciju, poput anhidrovanog lanolina i hidrofilnog petrolatuma. Fino podeljene čvrste supstance se takođe koriste kao dobri emulgatori, naročito u kombinaciji sa surfaktantima u viskoznim preparatima. To uključuje polarne neorganske čvrste supstance, kao što su hidroksidi teških metala, nebubreće gline, kao što su bentonit, atapulgit, hektorit, kaolin, monmorijonit, koloidni aluminijum silikat i koloidni magnezijum aluminijum silikat, pigmente i nepolarne čvrste supstance, kao što su ugljenik ili gliceril tristearat.
[0379] Širok dijapazon neemulgujućih materijala je takođe uključen u formulacije emulzija i doprinosi svojstvima emulzija. To uključuje masti, ulja, voskove, masne kiseline, masne alkohole, masne estre, humektante, hidrofilne koloide, konzervanse i antioksidanse (Block, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger i Banker (izdav.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., sveska 1, str.335; Idson, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger i Banker (izdav.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., sveska 1, str.199).
[0380] Hidrofilni koloidi ili hidrokoloidi uključuju prirodne gume i sintetičke polimere, kao što su polisaharidi (na primer, akacija, agar, alginatna kiselina, karagenan, guar guma, karaja guma i tragakant), derivate celuloze (na primer, karboksimetilcelulozu i karboksipropilcelulozu) i sintetičke polimere (na primer, karbomere, etre celuloze i karboksivinil polimere). Oni se disperguju ili bubre u vodi gradeći koloidne rastvore koji stabilizuju emulzije formiranjem snažnih međufaznih filmova oko kapljica dispergovane faze i povećavanjem viskoznosti spoljašnje faze.
[0381] Pošto emulzije često sadrže brojne sastojke kao što su ugljovodonici, proteini, steroli i fosfatidi koji lako mogu da podržavaju rast mikroba, ove formulacije često sadrže konzervanse. Uobičajeno korišćeni konzervansi sadržani u formulacijama emulzije uključuju metil paraben, propil paraben, kvaternerne amonijumove soli, benzalkonijum hlorid, estre phidroksibenzojeve kiseline i bornu kiselinu. Antioksidansi se često dodaju formulacijama emulzija kako bi se sprečilo propadanje formulacije. Korišćeni antioksidansi mogu biti čistači slobodnih radikala, kao što su tokoferoli, alkil galati, butilovani hidroksianizol, butilovani hidroksitoluen, ili redukujući agensi kao što su askorbinska kiselina i natrijum metabisulfit, i antioksidanti sinergisti kao što su limunska kiselina, vinska kiselina i lecitin.
11
[0382] Pregled primene formulacija emulzija dermatološkim, oralnim ili parenteralnim putem i postupci za njihovu proizvodnju su dati u literaturi (vidite, npr. Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., i Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8. izd.), New York, NY; Idson, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger i Banker (izdav.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., sveska 1, str.199). Formulacije emulzija za oralnu primenu se veoma rasprostranjeno koriste zbog lakoće formulisanja, kao i delotvornosti sa gledišta apsorpcije i bioraspoloživosti (vidite npr. Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., i Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8. izd.), New York, NY; Rosoff, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger i Banker (izdav.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., sveska 1, str.245; Idson, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger i Banker (izdav.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., sveska 1, str. 199). Laksativi na bazi mineralnog ulja, vitamini rastvorljivi u ulju i hranljivi preparati sa visokim sadržajem masti spadaju u supstance koje se uobičajeno primenjuju oralno kao emulzije U/V.
ii. Mikroemulzije
[0383] U jednom otelotvorenju predmetnog pronalaska, kompozicije iRNK i nukleinske kiseline su formulisane kao mikroemulzije. Mikroemulzija može da se definiše kao sistem vode, ulja i amfifila koji je jedan optički izotropski i termodinamički stabilan tečni rastvor (vidite, npr. Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., i Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8. izd.), New York, NY; Rosoff, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger i Banker (izdav.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., sveska 1, str.245). Mikroemulzije su obično sistemi koji se pripremaju početnim dispergovanjem ulja u vodenom rastvoru surfaktanta, a zatim dodavanjem dovoljne količine četvrte komponente, uopšteno alkohola sa lancem srednje dužine radi nastanka transparentnog sistema. Stoga, mikroemulzije se takođe opisuju kao termodinamički stabilne, izotropski čiste disperzije dve tečnosti koje se ne mešaju koje su stabilizovane međufaznim filmovima površinski aktivnih molekula (Leung and Shah, u: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, strane 185-215). Mikroemulzije se obično pripremaju kombinovanjem tri do pet komponenata koje uključuju ulje, vodu, surfaktant, kosurfaktant i elektrolit. Da li je mikroemulzija vrste voda u ulju (V/U) ili ulje u vodi (U/V) zavisi od svojstava ulja i
11
surfaktanta koji se koriste i od strukture i geometrijskog pakovanja polarnih glava i ugljovodoničnih repova molekula surfaktanata (Schott, u Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, str. 271).
[0384] Fenomenološki pristup koji koristi fazne dijagrame je temeljno proučen i daje opširno znanje za formulisanje mikroemulzija osobi sa veštinama u struci (vidite, npr. Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., i Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8. izd.), New York, NY; Rosoff, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger i Banker (izdav.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., sveska 1, str.245; Block, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger i Banker (izdav.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., sveska 1, str.335). U poređenju sa uobičajenim emulzijama, mikroemulzije pružaju prednost solubilizacije lekova koji su nerastvorljivi u vodi u formulaciji termodinamički stabilnih kapljica koje spontano nastaju.
[0385] Surfaktanti koji se koriste u pripremi mikroemulzija uključuju, ali nisu ograničeni na, jonske surfaktante, nejonske surfaktante, Brij 96, polioksietilen oleil etre, poliglicerolske estre masnih kiselina, tetraglicerol monolaurat (ML310), tetraglicerol monooleat (MO310), heksaglicerol monooleat (PO310), heksaglicerol pentaoleat (PO500), dekaglicerol monokaprat (MCA750), dekaglicerol monooleat (MO750), dekaglicerol sekvioleat (SO750), dekaglicerol dekaoleat (DAO750), samostalno ili u kombinaciji sa kosurfaktantima.
Kosurfaktant, obično alkohol kratkog lanca kao što je etanol, 1-propanol i 1-butanol, služi za povećanje međufazne fluidnosti tako što prodire u film surfaktanta i posledično stvara neorganizovani film zbog praznog prostora nastalog između molekula surfaktanta. Međutim, mikroemulzije mogu da se pripreme bez upotrebe kosurfaktanata, i samoemulgujući sistemi mikroemulzije bez alkohola su poznati u struci. Vodena faza može obično biti, bez ograničenja, voda, vodeni rastvor leka, glicerol, PEG300, PEG400, poligliceroli, propilen glikoli i derivati etilen glikola. Uljana faza može da uključuje, bez ograničenja, supstance kao što je Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, estri masne kiseline, mono, di i trigliceridi srednje dužine lanca (C8-C12), estri polioksietilovanih gliceril masnih kiselina, masni alkoholi, poliglikozilovani gliceridi, zasićeni poliglikozilovani C8-C10 gliceridi, biljna ulja i silikonsko ulje.
11
[0386] Mikroemulzije su naročito zanimljive sa tačke gledišta rastvorljivosti leka i pojačane apsorpcije lekova. Mikroemulzije na bazi lipida (i U/V i V/U) predložene su za poboljšanje oralne bioraspoloživosti lekova, uključujući peptide (vidite, npr. U.S. patente br.6,191,105; 7,063,860; 7,070,802; 7,157,099; Constantinides i sar. Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). Mikroemulzije pružaju prednosti poboljšane solubilizacije leka, zaštite leka od enzimske hidrolize, moguće poboljšanje apsorpcije leka usled promena fluidnosti i propustljivosti membrane indukovanih surfaktantom, lakoće pripreme, lakoće oralne primene u čvrstim doznim oblicima, poboljšane kliničke potentnosti i smanjene toksičnosti (vidite, npr. U.S. patente br.6,191,105; 7,063,860; 7,070,802; 7,157,099; Constantinides i sar. Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho i sar. J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143). Mikroemulzije često mogu da nastanu spontano kada se njihove komponente dovedu u kontakt na sobnoj temperaturi. To može biti naročito korisno prilikom formulisanja termolabilnih lekova, peptida ili iRNK. Mikroemulzije su takođe delotvorne u transdermalnoj isporuci aktivnih komponenata u kozmetičkoj i farmaceutskoj primeni. Očekuje se da će kompozicije i formulacije mikroemulzija iz predmetnog pronalaska olakšati povećanu sistemsku apsorpciju iRNK i nukleinskih kiselina iz gastrointestinalnog trakta, i poboljšati lokalni ćelijski unos iRNK i nukleinskih kiselina.
[0387] Mikroemulzije iz predmetnog otkrića takođe mogu da sadrže dodatne komponente i aditive, kao što su sorbitan monostearat (Grill 3), Labrasol i pojačivači penetracije radi unapređenja svojstava formulacije i poboljšanja apsorpcije iRNK i nukleinskih kiselina iz predmetnog pronalaska. Pojačivači penetracije koji se koriste u mikroemulzijama iz predmetnog pronalaska mogu da se klasifikuju u jednu od pet opštih kategorija--surfaktanti, masne kiseline, soli žučne kiseline, helatori i nehelirajući nesurfaktanti (Lee i sar. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, str.92). Svaka od ovih klasa je prethodno razmotrena.
iii. Mikročestice
[0388] Agens iRNK iz pronalaska može biti inkorporisan u česticu, npr. mikročesticu.
Mikročestice se mogu proizvesti putem sušenja raspršivanjem, ali se takođe mogu proizvesti drugim postupcima, uključujući liofilizaciju, uparavanje, sušenje fluidnog sloja, vakuum sušenje ili kombinaciju ovih tehnika.
iv. Pojačivači penetracije
12
[0389] U jednom otelotvorenju, predmetno otkriće koristi različite pojačivače penetracije radi postizanja delotvorne isporuke nukleinskih kiselina, naročito iRNK, u kožu životinje. Većina lekova je prisutna u rastvoru u jonizovanim i nejonizovanim oblicima. Međutim, obično samo lekovi rastvorljivi u lipidima ili lipofilni lekovi lako prolaze kroz ćelijske membrane.
Otkriveno je da čak i nelipofilni lekovi mogu da prođu kroz ćelijske membrane ako je membrana koja treba da se pređe tretirana pojačivačem penetracije. Osim što pomažu u difuziji nelipofilnih lekova kroz ćelijske membrane, pojačivači penetracije takođe poboljšavaju propustljivost lipofilnih lekova.
[0390] Pojačivači penetracije mogu da se klasifikuju u jednu od pet opštih širokih kategorija, tj. surfaktanti, masne kiseline, soli žučnih kiselina, helatori i nehelirajući nesurfaktanti (vidite, npr. Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee i sar. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, str.
92). Svaka od prethodno navedenih klasa pojačivača penetracije je detaljnije opisana u nastavku.
[0391] Surfaktanti (ili „površinski aktivni agensi“) su hemijski entiteti koji, kada se rastvore u vodenom rastvoru, smanjuju površinski napon rastvora ili međufazni napon između vodenog rastvora i druge tečnosti, što dovodi do toga da je apsorpcija iRNK kroz sluzokožu pojačana. Pored soli žučnih kiselina i masnih kiselina, ovi pojačivači penetracije uključuju, na primer, natrijum lauril sulfat, polioksietilen-9-lauril etar i polioksietilen-20-cetil etar) (vidite, npr. Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee i sar. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, str.92); i perfluorhemijske emulzije, poput FC-43. Takahashi i sar. J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252).
[0392] Različite masne kiseline i njihovi derivati koji deluju kao pojačivači penetracije uključuju, na primer, oleinsku kiselinu, laurinsku kiselinu, kaprinsku kiselinu (n-dekansku kiselinu), miristinsku kiselinu, palmitinsku kiselinu, stearinsku kiselinu, linolnu kiselinu, linolensku kiselinu, dikaprat, trikaprat, monoolein (1-monooleoil-rac-glicerol), dilaurin, kaprilnu kiselinu, arahidonsku kiselinu, glicerol 1-monokaprat, 1-dodecilazacikloheptan-2-on, acilkarnitine, acilholine, njihove C1-20 alkil estre (npr. metil, izopropil i t-butil) i njihove mono- i digliceride (tj. oleat, laurat, kaprat, miristat, palmitat, stearat, linoleat, itd.) (vidite, npr. Touitou, E., i sar. Enhancement in Drug Delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee i sar. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, str.92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri i sar. J. Pharm.
Pharmacol., 1992, 44, 651-654).
[0393] Fiziološka uloga žuči uključuje olakšavanje disperzije i apsorpcije lipida i vitamina koji se rastvaraju u mastima (vidite, npr. Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Brunton, poglavlje 38 u: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9. izd., Hardman i sar. izdav., McGraw-Hill, New York, 1996, str.934-935). Različite prirodne soli žučne kiseline i njihovi sintetički derivati deluju kao pojačivači penetracije. Tako, termin „soli žučne
kiseline“ uključuje bilo koje od komponenata žuči koje se javljaju u prirodi, kao i bilo koje njihove sintetičke derivate. Pogodne soli žučne kiseline uključuju, na primer, holnu kiselinu (ili njenu farmaceutski prihvatljivu natrijumovu so, natrijum holat), dehidroholnu kiselinu (natrijum dehidroholat), dezoksiholnu kiselinu (natrijum dezoksiholat), glikolnu kiselinu (natrijum glikoholat), glikolnu kiselinu (natrijum glikoholat), glikodezoksiholnu kiselinu (natrijum glikodezoksiholat), tauroholnu kiselinu (natrijum tauroholat), taurodezoksiholnu kiselinu (natrijum taurodezoksiholat), henodezoksiholnu kiselinu (natrijum henodezoksiholat), ursodezoksiholnu kiselinu (UDCA), natrijum tauro-24,25-dihidro-fusidat (STDHF), natrijum glikodihidrofusidat i polioksietilen-9-lauril etar (POE) (vidite, npr.
Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee i sar. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, strana 92; Swinyard, poglavlje 39 u: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. izd., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, strane 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto i sar. J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita i sar. J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583).
[0394] Helatori, kako se koriste u vezi sa predmetnim pronalaskom, mogu se definisati kao jedinjenja koja uklanjaju jone metala iz rastvora formiranjem kompleksa sa njima, a rezultat je povećana apsorpcija iRNK kroz sluzokožu. U pogledu njihove upotrebe kao pojačivača penetracije u predmetnom pronalasku, helatori imaju dodatnu prednost što takođe služe kao inhibitori DNaze, pošto većina okarakterisanih DNK nukleaza zahteva dvovalentni jon metala za katalizu te su stoga inhibirane helatorima (Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315339). Odgovarajući helatori uključuju, ali nisu ograničeni na, dinatrijum etilendiamin tetraacetat (EDTA), limunsku kiselinu, salicilate (npr. natrijum salicilat, 5-metoksisalicilat i homovanilat), N-acil derivate kolagena, lauret-9 i N-amino acil derivate beta-diketona (enamine)(vidite, npr. Katdare, A. i sar. Excipient development for pharmaceutical, biotechnology, and drug delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee i sar. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, strana 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur i sar. J. Control Rel., 1990, 14, 43-51).
[0395] Kako se ovde koriste, nehelirajuća nesurfaktantska jedinjenja koja pojačavaju penetraciju mogu da se definišu kao jedinjenja koja pokazuju beznačajnu aktivnost kao helatori ili kao surfaktanti, ali svejedno pojačavaju apsorpciju iRNK kroz sluzokožu alimentarnog trakta (vidite, npr. Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33). Ova klasa pojačivača penetracije uključuje, na primer, nezasićene ciklične uree, 1-alkil- i 1-alkenilazaciklo-alkanonske derivate (Lee i sar. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, strana 92); i nesteroidne antiinflamatorne agense poput diklofenak natrijuma, indometacina i fenilbutazona (Yamashita i sar. J. Pharm.
Pharmacol., 1987, 39, 621-626).
[0396] Agensi koji pojačavaju unos iRNK na ćelijskom nivou takođe se mogu dodati farmaceutskim i drugim kompozicijama predmetnog otkrića. Na primer, takođe je poznato da katjonski lipidi, kao što je lipofektin (Junichi i sar. U.S. Pat. br.5,705,188), katjonski derivati glicerola i polikatjonski molekuli, kao što je polilizin (Lollo i sar. PCT prijava WO 97/30731) pojačavaju ćelijski unos dsRNK. Primeri komercijalno dostupnih reagensa za transfekciju uključuju, na primer, Lipofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine 2000™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), 293fectin™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Cellfectin™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), DMRIE-C™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), FreeStyle™ MAX (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine™ 2000 CD (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), iRNAMAX (Invitrogen; Carlsbad, CA), Oligofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Optifect™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), X-tremeGENE Q2 transfekcioni reagens (Roche; Grenzacherstrasse, Švajcarska), DOTAP lipozomski transfekcioni reagens (Grenzacherstrasse, Švajcarska), DOSPER lipozomski transfekcioni reagens (Grenzacherstrasse, Švajcarska) ili Fugene (Grenzacherstrasse, Švajcarska), Transfectam® reagens (Promega; Madison, WI), TransFast™ transfekcioni reagens
12
(Promega; Madison, WI), Tfx™-20 reagens (Promega; Madison, WI), Tfx™-50 reagens (Promega; Madison, WI), DreamFect™ (OZ Biosciences; Marseille, Francuska), EcoTransfect (OZ Biosciences; Marseille, Francuska), TransPass<a>D1 transfekcioni reagens (New England Biolabs; Ipswich, MA, SAD), LyoVec™/LipoGen™ (Invitrogen; San Diego, CA, SAD), PerFectin transfekcioni reagens (Genlantis; San Diego, CA, SAD), NeuroPORTER transfekcioni reagens (Genlantis; San Diego, CA, SAD), GenePORTER transfekcioni reagens (Genlantis; San Diego, CA, SAD), GenePORTER 2 transfekcioni reagens (Genlantis; San Diego, CA, SAD), citofektin transfekcioni reagens (Genlantis; San Diego, CA, SAD), BaculoPORTER transfekcioni reagens (Genlantis; San Diego, CA, SAD), TroganPORTER™ transfekcioni reagens (Genlantis; San Diego, CA. SAD), RiboFect (Bioline; Taunton, MA, SAD), PlasFect (Bioline; Taunton, MA, SAD), UniFECTOR (B-Bridge International; Mountain View, CA, SAD), SureFECTOR (B-Bridgc International; Mountain View, CA, SAD), ili HiFect™ (B-Bridge International, Mountain View, CA, SAD), između ostalog.
[0397] Drugi agensi mogu da se koriste za pojačavanje penetracije primenjenih nukleinskih kiselina, uključujući glikole kao što su etilen glikol i propilen glikol, pirole kao što je 2-pirol, azone i terpene kao što su limonen i menton.
v. Nosači
[0398] Određene kompozicije iz predmetnog otkrića takođe uključuju jedinjenja nosače u formulaciji. Kako se ovde koristi, „jedinjenja nosač“ ili „nosač“ može da se odnosi na nukleinsku kiselinu, ili njen analog, koja je inertna (tj. nema biološku aktivnost sama po sebi) ali je prepoznata kao nukleinska kiselina u in vivo procesima koji smanjuju bioraspoloživost nukleinske kiseline koja ima biološku aktivnost, na primer, razgradnjom biološki aktivne nukleinske kiseline ili promovisanjem njenog uklanjanja iz krvotoka. Zajednička primena nukleinske kiseline i jedinjenja nosača, obično sa viškom druge supstance, može dovesti do značajnog smanjenja nukleinske kiseline izolovane u jetri, bubregu ili drugim rezervoarima van cirkulacije, verovatno usled nadmetanja između jedinjenja nosača i nukleinske kiseline za zajednički receptor. Na primer, izolovanje delimično fosforotioatne dsRNK u tkivu jetre može se smanjiti kada se primenjuje zajedno sa poliinozinskom kiselinom, dekstran sulfatom, policitidinskom kiselinom ili 4-acetamido-4'izotiocijano-stilben-2,2'-disulfonskom kiselinom (Miyao i sar. DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura i sar. DsRNA & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183.
vi. Ekscipijensi
[0399] Nasuprot jedinjenju nosaču, „farmaceutski nosač“ ili „ekscipijens“ je farmaceutski prihvatljiv rastvarač, suspendujući agens ili bilo koji drugi farmaceutski inertan vehikulum za isporuku jedne ili više nukleinskih kiselina životinji. Ekscipijens može biti tečnost ili čvrsta supstanca i bira se, uzimajući u obzir planirani način primene, tako da obezbedi željenu masu, konzistenciju, itd., kada se kombinuje sa nukleinskom kiselinom i drugim komponentama date farmaceutske kompozicije. Uobičajeni farmaceutski nosači uključuju, ali nisu ograničeni na, vezujuće agense (npr. prethodno želatinizovani kukuruzni skrob, polivinilpirolidon ili hidroksipropil metilceluloza, itd.); punioce (npr. laktoza i drugi šećeri, mikrokristalna celuloza, pektin, želatin, kalcijum sulfat, etil celuloza, poliakrilati ili kalcijum hidrogen fosfat, itd.); lubrikanse (npr. magnezijum stearat, talk, silicijum dioksid, koloidni silicijum dioksid, stearinska kiselina, metalni stearati, hidrogenovana biljna ulja, kukuruzni skrob, polietilen glikoli, natrijum benzoat, natrijum acetate, itd.); dezintegrante (npr. skrob, natrijum skrob glikolat, itd.); i kvašljivce (npr. natrijum lauril sulfat, itd.).
[0400] Farmaceutski prihvatljivi organski ili neorganski ekscipijensi pogodni za neparenteralnu primenu koji ne deluju štetno na nukleinske kiseline takođe mogu da se koriste za formulisanje kompozicija iz predmetnog pronalaska. Odgovarajući farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju, ali nisu ograničeni na, vodu, rastvore soli, alkohole, polietilen glikole, želatin, laktozu, amilozu, magnezijum stearat, talk, silicijumovu kiselinu, viskozni parafin, hidroksimetilcelulozu, polivinilpirolidone, i slično.
[0401] Formulacije za topikalnu primenu nukleinskih kiselina mogu da uključuju sterilne i nesterilne vodene rastvore, nevodene rastvore u uobičajenim rastvaračima kao što je alkohol, ili rastvore nukleinskih kiselina u tečnim ili čvrstim uljanim bazama. Rastvor takođe može da sadrži pufere, razblaživače i druge pogodne aditive. Mogu da se koriste farmaceutski prihvatljivi organski ili neorganski ekscipijensi pogodni za neparenteralnu primenu koji ne reaguju štetno sa nukleinskim kiselinama.
12
[0402] Odgovarajući farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi uključuju, ali nisu ograničeni na, vodu, rastvore soli, alkohol, polietilen glikole, želatin, laktozu, amilozu, magnezijum stearat, talk, silicijumovu kiselinu, viskozni parafin, hidroksimetilcelulozu, polivinilpirolidon, i slično.
vii. Druge komponente
[0403] Kompozicije iz predmetnog otkrića mogu dalje da sadrže druge dodatne komponente koje se pogodno mogu naći u farmaceutskim kompozicijama, pri njihovim nivoima upotrebe koji su ustanovljeni u struci. Tako, na primer, kompozicije mogu da sadrže dodatne, kompatibilne, farmaceutski aktivne supstance kao što su, na primer, antipruritici, adstringensi, lokalni anestetici ili antiinflamatorni agensi, ili može da sadrži dodatne supstance koje su korisne u fizičkom formulisanju različitih doznih oblika kompozicija iz predmetnog pronalaska, kao što su boje, arome, konzervansi, antioksidansi, zamućivači, agensi za zgušnjavanje i stabilizatori. Međutim, takve supstance, kada se dodaju, ne treba nepotrebno da ometaju biološke aktivnosti komponenti kompozicija iz predmetnog otkrića. Formulacije mogu biti sterilisane i, po želji, pomešane sa pomoćnim agensima, npr. lubrikansima, konzervansima, stabilizatorima, kvašljivcima, emulgatorima, solima za izmenu osmotskog pritiska, puferima, bojama, aromama i/ili aromatičnim supstancama i slično, koje nemaju štetnu interakciju sa nukleinskim kiselinama iz formulacije.
[0404] Vodene suspenzije mogu da sadrže supstance koje povećavaju viskozitet suspenzije, uključujući, na primer, natrijum karboksimetilcelulozu, sorbitol i/ili dekstran. Suspenzija takođe može da sadrži stabilizatore.
[0405] U nekim otelotvorenjima, farmaceutske kompozicije prikazane u otkriću uključuju (a) jedno ili više jedinjenja iRNK i (b) jedan ili više agenasa koji deluju putem mehanizma koji nije preko iRNK i koji su korisni u lečenju hemolitičkog poremećaja. Primeri takvih agenasa uključuju, ali nisu ograničeni na, antiinflamatorni agens, agens protiv steatoze, antivirusni i/ili antifibrozni agens.
[0406] Pored toga, druge supstance koje se uobičajeno koriste da zaštite jetru, kao što je silimarin, takođe mogu da se koriste u konjunkciji sa ovde opisanim iRNK. Drugi agensi koji su korisni za lečenje bolesti jetre uključuju telbivudin, entekavir i druge inhibitore proteaze
12
kao što su telaprevir i drugi otkriveni, na primer, u Tung i sar. U.S. publikacija prijave br. 2005/0148548, 2004/0167116, i 2003/0144217; i u Hale i sar. U.S. publikacija prijave br. 2004/0127488.
[0407] Toksičnost i terapeutska delotvornost takvih jedinjenja može da se odredi standardnim farmaceutskim procedurama u ćelijskim kulturama ili eksperimentalnim životinjama, npr. za utvrđivanje LD50 (doza koja je letalna za 50% populacije) i ED50 (doza koja je terapeutski delotvorna kod 50% populacije). Dozni odnos između toksičnih i terapeutskih dejstava je terapeutski indeks, i on može da se prikaže kao odnos LD50/ED50. Poželjna su jedinjenja koja pokazuju visoke terapeutske indikacije.
[0408] Podaci dobijeni iz testova ćelijske kulture i životinjskih studija mogu da se koriste u formulisanju opsega doze za upotrebu kod ljudi. Doza kompozicija koje su prikazane ovde u pronalasku uopšteno se nalazi u opsegu koncentracija u krvotoku koje uključuju ED50 sa neznatnom ili nepostojećom toksičnošću. Doza može da varira u ovom opsegu u zavisnosti od doznog oblika koji se koristi i upotrebljenog načina primene. Za bilo koje jedinjenje koje se koristi u postupcima prikazanim u pronalasku, terapeutski delotvorna doza može prvobitno da se proceni iz testa ćelijske kulture. Doza može da se formuliše na životinjskim modelima kako bi se postigao opseg cirkulišuće koncentracije jedinjenja u plazmi ili, po potrebi, polipeptidnog proizvoda ciljne sekvence (npr. postizanje smanjene koncentracije polipeptida) koji uključuje IC50 (tj. koncentracija ispitivanog jedinjenja koja postiže polovinu maksimalne inhibicije simptoma) kako je utvrđeno u ćelijskoj kulturi. Takve informacije mogu da se koriste da se preciznije utvrde korisne doze za ljude. Nivoi u plazmi mogu da se mere, na primer, tečnom hromatografijom visokih performansi.
[0409] Pored njihove primene, kako je prethodno razmatrano, iRNK prikazane u otkriću mogu da se primenjuju u kombinaciji sa drugim poznatim agensima koji su delotvorni u lečenju patoloških procesa posredovanih ekspresijom TTR. U svakom slučaju, lekar koji daje lek može da prilagodi količinu i termin primene iRNK na osnovu rezultata koji su uočeni koristeći standardne mere delotvornosti koje su poznate u struci ili ovde opisane.
VII. Postupci za inhibiciju ekspresije TTR
12
[0410] Predmetno otkriće takođe obezbeđuje postupke za inhibiciju ekspresije transtiretina (TTR) u ćeliji. Postupci obuhvataju dovođenje ćelije u kontakt sa agensom RNKi, npr. agensom dvolančane RNKi, u količini koja je delotvorna za inhibiciju ekspresije TTR u ćeliji, čime se inhibira ekspresija TTR u ćeliji.
[0411] Dovođenje ćelije u kontakt sa agensom RNKi, npr. agensom dvolančane RNKi, može se obaviti in vitro ili in vivo. Dovođenje u kontakt ćelije in vivo sa agensom RNKi uključuje dovođenje u kontakt ćelije ili grupe ćelija u ispitaniku, npr. ljudskom ispitaniku, sa agensom RNKi. Takođe su moguće kombinacije in vitro i in vivo postupaka dovođenja u kontakt ćelije ili grupe ćelija. Dovođenje u kontakt ćelije ili grupe ćelija može biti direktno ili indirektno, kako je prethodno razmotreno. Nadalje, dovođenje u kontakt ćelije ili grupe ćelija može da se ostvari putem ciljajućeg liganda, uključujući bilo koji ligand koji je ovde opisan ili poznat u struci. U poželjnim otelotvorenjima, ciljajući ligand je ugljovodonični ostatak, npr. GalNAc3ligand, ili bilo koji drugi ligand koji usmerava agens RNKi na željeno mesto, npr. jetru ispitanika.
[0412] Termin „inhibicija“, kako se ovde koristi, koristi se naizmenično sa terminima „smanjenje“, „utišavanje“, „nishodna regulacija“, „potiskivanje“ i drugim sličnim terminima, i obuhvata bilo koji nivo inhibicije. Poželjno, inhibicija uključuje statistički ili klinički značajnu inhibiciju.
[0413] Fraza „inhibicija ekspresije TTR“ treba da se odnosi na inhibiciju ekspresije bilo kog gena TTR (poput, npr. TTR gena miša, TTR gena pacova, TTR gena majmuna ili TTR gena čoveka) kao i varijanti ili mutanata gena TTR. Tako, TTR gen može biti TTR gen divljeg tipa, mutantni TTR gen (kao što je mutantni TTR gen koji uzrokuje amiloidno taloženje) ili transgeni TTR gen u kontekstu genetski manipulisane ćelije, grupe ćelija ili organizma.
[0414] „Inhibicija ekspresije gena TTR“ uključuje bilo koji nivo inhibicije gena TTR, npr. najmanje delimičnu supresiju ekspresije gena TTR. Ekspresija gena TTR može da se proceni na osnovu nivoa, ili promene nivoa, bilo koje promenljive povezane sa ekspresijom gena TTR, npr. nivo mRNK TTR, nivo proteina TTR ili broj ili opseg amiloidnih naslaga. Taj nivo može biti procenjen u pojedinačnoj ćeliji ili u grupi ćelija, uključujući, na primer, uzorak dobijen od ispitanika.
12
[0415] Inhibicija može da se proceni na osnovu smanjenja apsolutnog ili relativnog nivoa jedne ili više promenljivih koje su povezane sa ekspresijom TTR u poređenju sa kontrolnim nivoom. Kontrolni nivo može biti bilo koja vrsta kontrolnog nivoa koja se koristi u struci, npr. početni nivo pre doze ili nivo određen kod sličnog ispitanika, ćelije ili uzorka koji nije tretiran ili je tretiran kontrolom (kao što je, npr. kontrola samo sa puferom ili kontrola sa neaktivnim agensom).
[0416] U nekim otelotvorenjima postupaka iz pronalaska, ekspresija gena TTR je inhibirana za najmanje oko 5%, najmanje oko 10%, najmanje oko 15%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 45%, najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje okot 98%, najmanje oko 99%, ili do ispod nivoa detekcije testa. U nekim otelotvorenjima, inhibicija ekspresije gena TTR dovodi do normalizacije nivoa gena TTR tako da je razlika između nivoa pre lečenja i normalnog kontrolnog nivoa smanjena za najmanje 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili 95%. U nekim otelotvorenjima, inhibicija je klinički relevantna inhibicija.
[0417] Inhibicija ekspresije gena TTR može da se manifestuje kao smanjenje količine mRNK koju eksprimira prva ćelija ili grupa ćelija (takve ćelije mogu biti prisutne, na primer, u uzorku dobijenom od ispitanika) u kojoj je gen TTR transkribovan i koja je tretirana (npr. dovođenjem ćelije ili ćelija u kontakt sa agensom RNKi iz pronalaska, ili primenom agensa RNKi iz pronalaska na ispitanika u kome su ćelije prisutne) tako da je ekspresija gena TTR inhibirana, u poređenju sa drugom ćelijom ili grupom ćelija suštinski identičnom sa prvom ćelijom ili grupom ćelija ali koja nije, ili nije bila, tako tretirana (kontrolne ćelije). U poželjnim otelotvorenjima, inhibicija je procenjena eksprimiranjem nivoa mRNK u tretiranim ćelijama kao procenat nivoa mRNK u kontrolnim ćelijama, korišćenjem sledeće formule:
[0418] Alternativno, inhibicija ekspresije gena TTR može da se proceni u pogledu smanjenja parametra koji je funkcionalno povezan sa ekspresijom TTR gena, npr. ekspresija proteina
12
TTR, nivo retinol vezujućeg proteina, nivo vitamina A ili prisustvo amiloidnih naslaga koje sadrže TTR. Utišavanje TTR gena se može utvrditi u bilo kojoj ćeliji koja eksprimira TTR, bilo konstitutivno ili pomoću genomskog inženjerstva, i putem bilo kog testa poznatog u struci. Jetra je značajno mesto ekspresije TTR. Druga bitna mesta ekspresije uključuju horoidni pleksus, mrežnjaču i pankreas.
[0419] Inhibicija ekspresije proteina TTR može da se manifestuje smanjenjem nivoa proteina TTR koji eksprimira ćelija ili grupa ćelija (npr. nivo proteina eksprimiranog u uzorku dobijenom od ispitanika). Kao što je prethodno objašnjeno za procenu supresije mRNK, inhibicija nivoa ekspresije proteina u tretiranoj ćeliji ili grupi ćelija može na sličan način da se prikaže kao procenat nivoa proteina u kontrolnoj ćeliji ili grupi ćelija.
[0420] Kontrolna ćelija ili grupa ćelija koje mogu da se koriste za procenu inhibicije ekspresije gena TTR uključuju ćeliju ili grupu ćelija koje još nisu došle u kontakt sa agensom RNKi iz pronalaska. Na primer, kontrolna ćelija ili grupa ćelija može da se dobije od pojedinačnog ispitanika (npr. ljudskog ili životinjskog ispitanika) pre lečenja ispitanika agensom RNKi.
[0421] Nivo mRNK TTR koju eksprimiraju ćelija ili grupa ćelija, ili nivo mRNK TTR u cirkulaciji, može da se odredi koristeći bilo koji postupak poznat u struci za procenu ekspresije mRNK. U jednom otelotvorenju, nivo ekspresije TTR u uzorku se određuje detekcijom transkribovanog polinukleotida, ili njegovog dela, npr. mRNK TTR gena. RNK može da se ekstrahuje iz ćelija korišćenjem tehnika za ekstrakciju RNK uključujući, na primer, korišćenje kisele ekstrakcije fenolom/guanidin izotiocijanatom (RNKzol B, Biogenesis), kompleta za pripremu RNK RNeasy (Qiagen) ili PAXgene (PreAnalytix, Švajcarska). Tipični formati testa koji koristi hibridizaciju ribonukleinske kiseline uključuju testove nuklearnog ciklusa, testove protekcije RT-PCR, RNaze (Melton et al., Nuc. Acids Res. 12:7035), nortern blot, in situ hibridizaciju i analizu pomoću mikročipa. mRNK TTR u cirkulaciji može da se detektuje koristeći postupke koji su opisani u PCT/US2012/043584.
[0422] U jednom otelotvorenju, nivo ekspresije TTR se određuje koristeći probu nukleinske kiseline. Termin „proba“, kako se ovde koristi, odnosi se na svaki molekul koji je sposoban za selektivno vezivanje za specifični TTR. Osoba sa znanjem u oblasti može da sintetiše probe, ili one mogu biti dobijene iz odgovarajućih bioloških preparata. Probe se mogu
1
specifično konstruisati da budu obeležene. Primeri za molekule koji se mogu koristiti kao probe uključuju, ali nisu ograničeni na, RNK, DNK, proteine, antitela i organske molekule.
[0423] Izolovana mRNK može da se koristi u testovima hibridizacije ili amplifikacije koji uključuju, ali nisu ograničeni na, sautern ili nordern analize, analize lančane reakcije polimeraze (PCR) i testove sondom. Jedan postupak za određivanje nivoa mRNK uključuje dovođenje u kontakt izolovane mRNK sa molekulom nukleinske kiseline (proba) koji može da se hibridizuje u mRNK TTR. U jednom otelotvorenju, mRNK je imobilisana na čvrstoj površini i dovodi se u kontakt sa probom, na primer, propuštanjem izolovane mRNK na agaroznom gelu i prenošenjem mRNK sa gela na membranu, kao što je nitroceluloza. U alternativnom otelotvorenju, proba (probe) je imobilisana na čvrstoj površini, i mRNK je dovedena u kontakt sa probom (probama), na primer, na genskom mikročipu Affymetrix. Stručnjak može lako da prilagodi poznate postupke za detekciju mRNK za primenu u određivanju nivoa TTR mRNK.
[0424] Alternativni postupak za određivanje nivoa ekspresije TTR u uzorku obuhvata proces amplifikacije i/ili reversne transkriptaze nukleinske kiseline (radi pripreme kDNK), na primer mRNK u uzorku, npr. pomoću RT-PCR (eksperimentalno otelotvorenje dato u Mullis, 1987, U.S. Pat. br.4,683,202), lančane reakcije ligaze (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193), samoodržive replikacije sekvence (Guatelli i sar. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), transkripcionog sistema amplifikacije (Kwoh i sar. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-beta replikaze (Lizardi i sar. (1988) Bio/Technology 6:1197), kružne replikacije (Lizardi i sar., U.S. Pat. No.5,854,033), ili bilo kog drugog postupka amplifikacije nukleinske kiseline, praćenog detekcijom amplifikovanih molekula pomoću tehnika dobro poznatih stručnjacima. Detekcione šeme su naročito korisne za detekciju molekula nukleinskih kiselina kada su takvi molekuli prisutni u veoma malom broju. U konkretnim aspektima pronalaska, nivo ekspresije TTR je utvrđen kvantitativnom fluorogenom RT-PCR (tj. TaqMan™ System).
[0425] Nivoi ekspresije mRNK TTR mogu da se prate koristeći membranski blot (kao što se koristi u analizi hibridizacije, kao što su nordern, sautern, dot i slične), ili mikrobunarčiće, epruvete sa uzorcima, gelove, perlice ili vlakna (ili bilo koju čvrstu podlogu koja sadrži vezane nukleinske kiseline). Vidite U.S. Pat. br.5,770,722, 5,874,219, 5,744,305, 5,677,195 i
1 1
5,445,934. Određivanje nivoa ekspresije TTR takođe može da obuhvata korišćenje proba nukleinske kiseline u rastvoru.
[0426] U poželjnim otelotvorenjima, nivo ekspresije mRNK se procenjuje koristeći testove razgranate DNK (bDNK) ili PCR u realnom vremenu (qPCR). Upotreba ovih postupaka je opisana i prikazana u primerima datim u ovom tekstu.
[0427] Nivo ekspresije TTR proteina može da se odredi koristeći bilo koji postupak poznat u struci za merenje nivoa proteina. Takvi postupci uključuju, na primer, elektroforezu, kapilarnu elektroforezu, tečnu hromatografiju visokih performansi (HPLC), tankoslojnu hromatografiju (TLC), hiperdifuzionu hromatografiju, tečne ili gel precipitinske reakcije, apsorpcionu spektroskopiju, kolorimetrijske testove, spektrofotometrijske testove, protočnu citometriju, imunodifuziju (jednostruku ili dvostruku), imunoelektroforezu, vestern blot, radioimunološki test (RIA), testove sa imunosorbentom vezanim za enzim (ELISA), imunofluorescentne testove, testove elektrohemiluminescenciju, i slično.
[0428] U nekim otelotvorenjima, delotvornost postupaka iz otkrića može da se prati detektovanjem ili praćenjem smanjenja naslaga amiloidnog TTR. Smanjenje naslaga amiloidnog TTR, kako se ovde koristi, obuhvata svako smanjenje veličine, broja ili ozbiljnosti naslaga TTR, ili prevenciju ili smanjenje nastajanja naslaga TTR, u organu ili oblasti u ispitaniku, kako se može proceniti in vitro ili in vivo korišćenjem bilo kog postupka poznatog u struci. Na primer, neki postupci za procenu amiloidnih naslaga su opisani u Gertz, M.A. i Rajukumar, S.V. (urednici) (2010), Amyloidosis: Diagnosis and Treatment, New York: Humana Press. Postupci za procenu amiloidnih naslaga mogu da uključuju biohemijske analize, kao i vizuelna ili kompjuterizovane procene amiloidnih naslaga, koje postaju vidljive, npr. koristeći imunohistohemijsko bojenje, fluorescentno obeležavanje, svetlosnu mikroskopiju, elektronsku mikroskopiju, fluorescentnu mikroskopiju ili druge vrste mikroskopije. Invazivni ili neinvazivni modaliteti za snimanje, uključujući, npr. CT, PET ili NMR/MR snimanje, mogu da se koriste za procenu amiloidnih naslaga.
[0429] Postupci iz pronalaska mogu da smanje naslage TTR u bilo kom broju tkiva ili regiona u telu, uključujući, ali ne ograničavajući se na, srce, jetru, slezinu, jednjak, želudac, creva (ileum, duodenum i debelo crevo), mozak, veliki sedalni živac, spinalnu gangliju, bubreg i mrežnjaču.
1 2
[0430] Termin „uzorak“, kako se ovde koristi, odnosi se na skup sličnih tečnosti, ćelija ili tkiva izolovanih od ispitanika, kao i na tečnosti, ćelije ili tkiva prisutna u ispitaniku. Primeri za biološke tečnosti uključuju krv, serum i serumski fluid, plazmu, limfu, urin, cerebrospinalnu tečnost, pljuvačku, očnu tečnost, i slično. Uzorci tkiva mogu da uključuju uzorke iz tkiva, organa ili lokalizovanih regiona. Na primer, uzorci mogu biti dobijeni od pojedinačnih organa, delova organa, ili tečnosti ili ćelija u tim organima. U određenim otelotvorenjima, uzorci mogu biti dobijeni iz jetre (npr. cele jetre ili određenih segmenata jetre ili određene vrste ćelija u jetri, kao što su, npr. hepatociti), mrežnjače ili delova mrežnjače (npr. epitel retinalnog pigmenta), centralnog nervnog sistema ili delova centralnog nervnog sistema (npr. komore ili horoidni pleksus) ili pankreasa ili određenih delova pankreasa. U poželjnim otelotvorenjima, „uzorak dobijen od ispitanika“ odnosi se na krv uzetu od ispitanika ili na plazmu dobijenu iz nje. U daljim otelotvorenjima, „uzorak dobijen od ispitanika“ odnosi se na tkivo jetre ili tkivo mrežnjače dobijeno od ispitanika.
[0431] U nekim otelotvorenjima postupaka iz otkrića, agens RNKi se primenjuje na ispitaniku tako da se agens RNKi isporučuje u specifično mesto u ispitaniku. Inhibicija ekspresije TTR može se proceniti putem merenja nivoa ili promene nivoa mRNK TTR ili TTR proteina u uzorku dobijenom iz tečnosti ili tkiva iz specifičnog mesta u ispitaniku. U poželjnim otelotvorenjima, mesto je izabrano iz grupe koja se sastoji od jetre, horoidnog pleksusa, mrežnjače i pankreasa. Mesto takođe može biti podsekcija ili podgrupa ćelija iz bilo kog od prethodno navedenih mesta (npr. hepatociti ili epitel retinalnog pigmenta). Mesto takođe može da uključuje ćelije koje eksprimiraju konkretnu vrstu receptora (npr. hepatociti koji eksprimiraju receptor azijaloglikoproteina).
VIII. Postupci za lečenje ili prevenciju bolesti povezane sa TTR-om
[0432] Predmetno otkriće takođe obezbeđuje postupke za lečenje ili prevenciju bolesti povezane sa TTR-om kod ispitanika. Postupci uključuju davanje ispitaniku terapeutski delotvorne ili profilaktički delotvorne doze agensa RNKi iz pronalaska.
[0433] Kako se ovde koristi, „ispitanik“ je životinja, kao što je sisar, uključujući primata (kao što je čovek, nehumani primat, npr. majmun i šimpanza), neprimata (kao što su krava, svinja,
1
kamila, lama, konj, koza, zec, ovca, hrčak, zamorac, mačka, pas, pacov, miš, konj i kit) ili ptica (npr. patka ili guska). Ispitanik može da uključuje transgeni organizam.
[0434] U jednom otelotvorenju, ispitanik je čovek, kao što je čovek koji se leči ili ispituje na bolest, poremećaj ili stanje kojem bi koristilo smanjenje ekspresije gena TTR, čovek pod rizikom od bolesti, poremećaja ili stanja kojem bi koristilo smanjenje ekspresije gena TTR; čovek koji ima bolest, poremećaj ili stanje kojem bi koristilo smanjenje ekspresije gena TTR; i/ili čovek koji se leči od bolesti, poremećaja ili stanja kojem bi koristilo smanjenje ekspresije gena TTR, kao što je ovde opisano.
[0435] U nekim otelotvorenjima, ispitanik boluje od bolesti povezane sa TTR-om. U drugim otelotvorenjima, ispitanik je ispitanik pod rizikom od nastanka bolesti povezane sa TTR-om, npr. ispitanik sa mutacijom gena TTR koja je povezana sa nastankom bolesti povezane sa TTR-om (npr. pre pojave znakova ili simptoma koji ukazuju na nastanak TTR amiloidoze), ispitanik sa porodičnom istorijom bolesti povezane sa TTR-om (npr. pre pojave znakova ili simptoma koji ukazuju na nastanak TTR amiloidoze) ili ispitanik koji ima znake i simptome koji ukazuju na nastanak TTR amiloidoze.
[0436] „Bolest povezana sa TTR-om“, kako se ovde koristi, uključuje bilo koju bolest uzrokovanu ili povezanu sa nastankom amiloidnih naslaga u kojima se fibrilni prekursori sastoje od varijante ili divljeg tipa proteina TTR. Mutantni i divlji tip TTR dovode do različitih oblika amiloidnih naslaga (amiloidoza). Amiloidoza uključuje nastanak i agregaciju pogrešno savijenih proteina, što dovodi do ekstracelularnih naslaga koje ometaju rad organa. Klinički sindromi povezani sa agregacijom TTR uključuju, na primer, senilnu sistemsku amiloidozu (SSA), sistemsku familijarnu amiloidozu, familijarnu amiloidnu polineuropatiju (FAP), familijarnu amiloidnu kardiomiopatiju (FAC) i leptomeningealnu amiloidozu, poznatu i kao leptomeningealna ili meningocerebrovaskularna amiloidoza, amiloidoza centralnog nervnog sistema (CNS) ili oblik VII amiloidoze.
[0437] U jednom otelotvorenju, agensi RNKi iz pronalaska se primenjuju na ispitanicima koji boluju od familijarne amiloidne kardiomiopatije (FAC). U drugom otelotvorenju, agensi RNKi iz pronalaska se primenjuju na ispitanicima koji boluju od FAC sa mešovitim fenotipom, tj. ispitanicima koji imaju i srčana i neurološka oštećenja. U još jednom otelotvorenju, agensi RNKi iz pronalaska se primenjuju na ispitanicima koji boluju od FAP
1 4
sa mešovitim fenotipom, tj. ispitanicima koji imaju i neurološka i srčana oštećenja. U jednom otelotvorenju, agensi RNKi iz pronalaska se primenjuju na ispitanicima koji boluju od FAP koji su lečeni ortotopskom transplantacijom jetre (OLT). U drugom otelotvorenju, agensi RNKi iz pronalaska se primenjuju na ispitanicima koji boluju od senilne sistemske amiloidoze (SSA). U drugim otelotvorenjima postupaka iz pronalaska, agensi RNKi iz pronalaska se primenjuju na ispitanicima koji boluju od familijarne amiloidne kardiomiopatije (FAC) i senilne sistemske amiloidoze (SSA). TTR normalne sekvence izaziva srčanu amiloidozu kod starijih osoba, i naziva se senilna sistemska amiloidoza (SSA) (takođe se naziva i senilna srčana amiloidoza (SCA) ili srčana amiloidoza). SSA je često praćena mikroskopskim naslagama u mnogim drugim organima. Mutacije TTR ubrzavaju proces amiloidnog nastajanja TTR i najznačajniji su faktor rizika pojave klinički značajne TTR amiloidoze (naziva se i ATTR (amiloidoza transtiretinskog tipa)). Za više od 85 varijanti amiloidogenih TTR je poznato da izazivaju sistemsku familijarnu amiloidozu.
[0438] U nekim otelotvorenjima postupaka iz pronalaska, agensi RNKi iz pronalaska se primenjuju na ispitanicima koji boluju od familijarne amiloidne polineuropatije (FAP) povezane sa transtiretinom (TTR). Takvi ispitanici mogu da pate od manifestacija na oku, kao što je zamućenje staklastog tela i glaukom. Stručnjaku u ovoj oblasti je poznato da amiloidogeni transtiretin (ATTR) sintetisan od strane epitela retinalnog pigmenta (RPE) ima važnu ulogu u progresiji okularne amiloidoze. Prethodne studije su pokazale da panretinalna laserska fotokoagulacija, koja smanjuje RPE ćelije, sprečava progresiju amiloidnih naslaga u staklastom telu, što ukazuje na to da delotvorna supresija ekspresije ATTR u RPE može postati nova terapija za očnu amiloidozu (vidite, npr. Kawaji, T., i sar. Ophthalmology. (2010) 117: 552-555). Postupci iz otkrića su korisni u lečenju očnih manifestacija FAP povezane sa TTR-om, npr. očne amiloidoze. Agens RNKi može da se isporuči na način koji je pogodan za ciljanje određenog tkiva, kao što je oko. Režimi isporuke u oku uključuju retrobulbarnu injekciju, supkutanu u očni kapak, subkonjuktivnu, subtenonsku, injekciju u prednju komoru oka ili intravitrealnu injekciju (ili internu injekciju ili infuziju). Specifične formulacije za očnu isporuku uključuju kapi za oči i meleme.
[0439] Još jedna bolest povezana sa TTR-om je hipertiroksinemija, poznata i kao „distranstiretinemijska hipertiroksinemija“ ili „disprealbuminska hipertiroksinemija“. Ova vrsta hipertiroksinemije može biti posledica povećanog vezivanja tiroksina sa TTR-om usled
1
mutantnog molekula TTR sa povećanim afinitetom prema tiroksinu. Vidite, npr. Moses i sar. (1982) J. Clin. Invest., 86, 2025-2033.
[0440] Agensi RNKi iz pronalaska mogu da se primene na ispitaniku koristeći bilo koji način primene poznat u struci, uključujući, ali se ne ograničavajući na, supkutanu, intravensku, intramuskularnu, intraokularnu, intrabronhijalnu, intrapleuralnu, intraperitonealnu, intraarterijsku, limfatičnu, cerebrospinalnu primenu, i bilo koju njihovu kombinaciju.
[0441] U poželjnim otelotvorenjima, agensi se supkutano primenjuju na ispitaniku. U nekim otelotvorenjima, ispitaniku se daje jedna doza agensa RNKi putem supkutane injekcije, npr. injekcije u abdomen, butinu ili nadlakticu. U drugim otelotvorenjima, ispitaniku se daje podeljena doza agensa RNKi putem supkutane injekcije. U jednom otelotvorenju, podeljena doza agensa RNKi se primenjuje na ispitaniku putem supkutane injekcije na dve različite anatomske lokacije na ispitaniku. Na primer, ispitaniku može biti supkutano injektovana podeljena doza od oko 250 mg (npr. oko pola od doze od 500 mg) u desnu ruku i oko 250 mg u levu ruku. U nekim otelotvorenjima pronalaska, supkutana primena je samoprimena, npr. pomoću prethodno napunjenog šprica ili šprica sa automatskim injektovanjem. U nekim otelotvorenjima, doza agensa RNKi za supkutanu primenu je sadržana u zapremini koja je manja ili jednaka jednom ml, npr. farmaceutski prihvatljivog nosača.
[0442] U nekim otelotvorenjima, primena je putem depo injekcije. Depo injekcija može da otpušta agens RNKi na dosledan način tokom produženog vremenskog perioda. Tako, depo injekcija može da smanji potrebnu frekvenciju doziranja kako bi se dobilo željeno dejstvo, npr. željena inhibicija TTR ili terapeutsko ili profilaktičko dejstvo. Depo injekcija može takođe da obezbedi doslednije serumske koncentracije. Depo injekcije mogu da uključuju supkutane injekcije ili intramuskularne injekcije. U poželjnim otelotvorenjima, depo injekcija je supkutana injekcija.
[0443] U nekim otelotvorenjima, primena je putem pumpe. Pumpa može biti eksterna pumpa ili pumpa implantirana hirurškim putem. U nekim otelotvorenjima, pumpa je supkutano implantirana osmotska pumpa. U drugim otelotvorenjima, pumpa je infuziona pumpa.
Infuziona pumpa može se koristiti za intravenske, supkutane, arterijske ili epiduralne infuzije. U poželjnim otelotvorenjima, infuziona pumpa je supkutana infuziona pumpa. U drugim
1
otelotvorenjima, pumpa je pumpa implantirana hirurškim putem koja isporučuje agens RNKi u jetru.
[0444] U otelotvorenjima u kojima se agens RNKi primenjuje supkutanom infuzionom pumpom, jedna doza agensa RNKi može da se primenjuje na ispitaniku u vremenskom periodu od oko 45 minuta do oko 5 minuta, npr. oko 45 minuta, oko 40 minuta, oko 35 minuta, oko 30 minuta, oko 25 minuta, oko 20 minuta, oko 15 minuta, oko 10 minuta ili oko 5 minuta.
[0445] Drugi načini primene uključuju epiduralnu, intracerebralnu, intracerebroventrikularnu, nazalnu primenu, intraarterijsku, intrakardijalnu, intraosealnu infuziju, intratekalnu i intravitrealnu i pulmonarnu. Način primene se može odabrati na osnovu toga da li se želi lokalno ili sistemsko lečenje, i na osnovu oblasti koja se leči. Način i mesto primene se mogu izabrati da pojačaju ciljanje.
[0446] U nekim otelotvorenjima, agens RNKi se primenjuje na ispitaniku u količini koja je delotvorna za inhibiciju ekspresije TTR u ćeliji ispitanika. Količina delotvorna za inhibiciju ekspresije TTR u ćeliji ispitanika može se proceniti korišćenjem prethodno razmotrenih postupaka, uključujući postupke koji obuhvataju procenu inhibicije mRNK TTR, TTR proteina ili povezanih promenljivih, kao što su amiloidne naslage.
[0447] U nekim otelotvorenjima, agens RNKi se primenjuje na ispitaniku u terapeutski ili profilaktički delotvornoj količini.
[0448] „Terapeutski delotvorna količina“, kako se ovde koristi, treba da uključi količinu agensa RNKi koja je, kada se primeni na pacijentu za lečenje bolesti povezane sa TTR-om, dovoljna da se ostvari lečenje bolesti (npr. smanjivanjem, ublažavanjem ili održavanjem postojeće bolesti, ili jednog ili više simptoma bolesti). „Terapeutski delotvorna količina“ može da varira u zavisnosti od agensa RNKi, načina primene agensa, bolesti i njene ozbiljnosti i istorije, starosti, težine, porodične istorije, genetskog sklopa, stadijuma patoloških procesa posredovanih ekspresijom TTR, vrste prethodnih ili pratećih lečenja, ako ih ima, i svih drugih individualnih karakteristika pacijenta koji će se lečiti.
1
[0449] „Profilaktički delotvorna količina“, kako se ovde koristi, treba da uključi količinu agensa RNKi koja je, kada se primeni na ispitaniku koji još nije doživeo ili ispoljio simptome bolesti povezane sa TTR-om, ali koji možda ima predispozicije za bolest, dovoljna za prevenciju ili ublažavanje bolesti, ili jednog ili više simptoma bolesti. Simptomi koji se mogu ublažiti uključuju senzornu neuropatiju (npr. paresteziju, hipesteziju u distalnim udovima), autonomnu neuropatiju (npr. gastrointestinalnu disfunkciju, kao što je čir na želucu ili ortostatska hipotenzija), motornu neuropatiju, epi napade, demenciju, mijelopatiju, polineuropatiju, sindrom karpalnog tunela, autonomnu insuficijenciju, kardiomiopatiju, zamućenja staklastog tela, bubrežnu insuficijenciju, nefropatiju, značajno smanjeni mBMI (modifikovani indeks telesne mase), disfunkciju moždanih živaca i distrofiju strome rožnjače. Ublažavanje bolesti uključuje usporavanje toka bolesti ili smanjenje ozbiljnosti kasnije nastale bolesti. „Profilaktički delotvorna količina“ može da varira u zavisnosti od agensa RNKi, načina primene agensa, stepena rizika od bolesti i istorije, starosti, težine, porodične istorije, genetskog sklopa, vrsta prethodnih ili pratećih lečenja, ako ih ima, i drugih individualnih karakteristika pacijenta koji će se lečiti.
[0450] „Terapeutski delotvorna količina“ ili „profilaktički delotvorna količina“ takođe uključuje količinu agensa RNKi koja proizvodi željeni lokalni ili sistemski efekat sa prihvatljivim odnosom koristi/rizika primenljivim za svako lečenje. Agensi RNKi u postupcima predmetnog pronalaska mogu se primeniti u dovoljnoj količini da daju prihvatljivi odnos koristi/rizika primenljiv na takvo lečenje.
[0451] Kako se ovde koriste, fraze „terapeutski delotvorna količina“ i „profilaktički delotvorna količina“ takođe obuhvataju količinu koja pruža korist u lečenju, prevenciji ili upravljanju patološkim procesima ili simptomima patoloških procesa posredovanih ekspresijom TTR. Simptomi TTR amiloidoze uključuju senzornu neuropatiju (npr. paresteziju, hipesteziju u distalnim udovima), autonomnu neuropatiju (npr. gastrointestinalnu disfunkciju, kao što je čir na želucu ili ortostatska hipotenzija), motornu neuropatiju, epi napade, demenciju, mijelopatiju, polineuropatiju, sindrom karpalnog tunela, autonomnu insuficijenciju, kardiomiopatiju, zamućenja staklastog tela, bubrežnu insuficijenciju, nefropatiju, značajno smanjeni mBMI (modifikovani indeks telesne mase), disfunkciju moždanih živaca i distrofiju strome rožnjače.
1
[0452] U jednom otelotvorenju, na primer, kada ispitanik ima FAP, FAP sa mešovitim fenotipom, FAC sa mešovitim fenotipom ili FAP i imao je OLT, lečenje ispitanika sa agensom dsRNK iz pronalaska usporava progresiju neuropatije. U drugom otelotvorenju, na primer, kada ispitanik ima FAP, FAP sa mešovitim fenotipom, FAC sa mešovitim fenotipom, SSA ili FAP i imao je OLT, lečenje ispitanika sa agensom dsRNK iz pronalaska usporava progresiju neuropatije i kardiomiopatije.
[0453] Na primer, u jednom otelotvorenju, postupci iz otkrića usporavaju, smanjuju ili zaustavljaju neurološko oštećenje. Bilo koja odgovarajuća mera neurološkog oštećenja može da se koristi da se utvrdi da li ispitanik ima smanjeno, usporeno ili zaustavljeno neurološko oštećenje.
[0454] Jedna odgovarajuća mera je skor neuropatskog oštećenja (NIS). NIS označava sistem bodovanja koji meri slabost, osećaj i reflekse, naročito u pogledu periferne neuropatije. NIS skor procenjuje standardnu grupu mišića na slabost (1 je 25% slab, 2 je 50% slab, 3 je 75% slab, 3,25 je kretanje nasuprot gravitacije, 3,5 je kretanje kada je gravitacija eliminisana, 3,75 je podrhtavanje mišića bez kretanja, a 4 je paraliza), reflekse na istezanje standardne grupe mišića (0 je normalno, 1 je smanjeno, 2 je odsutno) i pritisak na dodir, vibraciju, položaj zglobova i pokretljivost, i ubod iglom (sve se testira na kažiprstu i palcu stopala: 0 je normalno, 1 je smanjeno, 2 je odsutno). Procene su korigovane za starost, pol i fizičku spremnost.
[0455] U jednom otelotvorenju, postupci iz otkrića smanjuju NIS za najmanje 10%. U drugim otelotvorenjima, postupci iz pronalaska dovode do smanjenja NIS za najmanje 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40 ili za najmanje 50%. U drugim otelotvorenjima, postupci zaustavljaju porast NIS skora, npr. postupak dovodi do 0% porasta NIS skora. U još nekim otelotvorenjima, postupci iz pronalaska usporavaju brzinu porasta rezultata NIS, npr. brzinu porasta NIS skora kod ispitanika lečenog agensom RNKi iz pronalaska u poređenju sa brzinom porasta NIS skora kod ispitanika koji nije lečen agensom RNKi iz pronalaska.
[0456] Postupci za utvrđivanje NIS kod ljudskog ispitanika su dobro poznati osobi sa veštinama u struci i mogu se naći, na primer, u Dyck, PJ i sar. (1997) Neurology 1997.49(1): str. 229-239); Dyck PJ. (1988) Muscle Nerve. Jan; 11(1):21-32.
1
[0457] Još jedna odgovarajuća mera neurološkog oštećenja je modifikovani skor neuropatskog oštećenja (mNIS+7). Kao što je poznato osobi sa uobičajenim veštinama u struci, mNIS+7 označava kliničku procenu neurološkog oštećenja (NIS) zasnovanu na pregledu u kombinaciji sa elektrofiziološkim merenjem funkcije vlakana malog i velikog nerva (NCS i QST) i merenjem autonomne funkcije (posturalni krvni pritisak). mNIS+7 skor je modifikacija NIS+7 skora (što predstavlja NIS plus sedam testova). NIS+7 analizira slabost i reflekse na istezanje mišića. Pet od sedam testova uključuje osobine provodljivosti nerva. Ove osobine su potencijalna amplituda dejstva složenog mišića peronealnog nerva, brzina sprovođenja motornog nerva i distalna latencija motornog nerva (MNDL), tibijalna MNDL i potencijalne amplitude dejstva suralnog senzornog nerva. Ove vrednosti su korigovane za promenljive starosti, pola, visine i težine. Preostala dva od sedam testova uključuju prag vibracione detekcije i smanjenje pulsa uz duboko disanje.
[0458] mNIS+7 skor modifikuje NIS+7 uzimajući u obzir upotrebu pametnog somatotopskog kvantitativnog testiranja osećaja (Smart Somatotopic Quantitative Sensation Testing), novog autonomnog ispitivanja, i upotrebu akcionog potencijala složenog mišića amplituda ulnarnog, peronealnog i tibijalnog nerva, i akcionih potencijala senzornog nerva za ulnarni i suralni nerv (Suanprasert, N. i sar. (2014) J. Neurol. Sci., 344(1-2): str.121-128).
[0459] U jednom otelotvorenju, postupci iz otkrića smanjuju mNIS+7 za najmanje 10%. U drugim otelotvorenjima, postupci iz pronalaska dovode do smanjenja mNIS+7 skora za najmanje 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40 ili za najmanje 50%. U drugim otelotvorenjima, postupci zaustavljaju rastući mNIS+7, npr. postupak dovodi do 0% porasta mNIS+7. U još nekim otelotvorenjima, postupci iz pronalaska usporavaju brzinu kojom NIS+7 skor raste, npr. brzinu porasta NIS+7 skora kod ispitanika lečenog agensom RNKi iz pronalaska u poređenju sa brzinom porasta NIS+7 skora kod ispitanika koji nije lečen agensom RNKi iz pronalaska.
[0460] Terapeutski i profilaktički postupci iz predmetnog otkrića mogu takođe da poboljšaju druge kliničke parametre, kao što je sposobnost hodanja, kod ispitanika koji se leči. Na primer, tokom perioda lečenja ili nakon njega ispitanik može imati povećan kapacitet za vežbanje ili aktivnost.
[0461] Bilo koja odgovarajuća mera kapaciteta za vežbanje može da se koristi da se utvrdi da li ispitanik ima povećan kapacitet za vežbanje ili aktivnost. Jedna odgovarajuća mera je 6-
14
minutni test hoda (6MWT), koji meri koliko daleko ispitanik može da hoda za 6 minuta, tj.6-minutnu hodajuću razdaljinu (6MWD). U jednom otelotvorenju, postupci iz otkrića pružaju ispitaniku porast od početne 6MWD za najmanje 10 minuta, npr. oko 10, 15, 20 ili oko 30 minuta.
[0462] Terapeutski delotvorna količina i profilaktički delotvorna količina agensa RNKi iz pronalaska takođe uključuje količinu koja poboljšava jedan ili više parametara kvaliteta života u odnosu na početne vrednosti, na primer, povećanje skora na najmanje jednoj od funkcionalnih skala zdravstvene ankete SF-36®; i/ili produžena dugovečnost; i/ili smanjena hospitalizacija.
[0463] Može da se koristi bilo koja odgovarajuća mera kvaliteta života. Na primer, zdravstvena anketa SF-36® pruža samopopunjavajuću skalu sa više stavki koja meri osam zdravstvenih parametara: fizičko funkcionisanje, ograničenja usled fizičkih zdravstvenih problema, telesni bol, opšte zdravstveno stanje, vitalnost (energija i zamor), društveno funkcionisanje, ograničenja usled emotivnih problema i mentalno zdravlje (psihološka uznemirenost i psihološko zdravlje). Anketa takođe pruža sažetak za fizičku komponentu i sažetak za mentalnu komponentu. U jednom otelotvorenju, postupci iz pronalaska ispitaniku pružaju poboljšanje u odnosu na početnu vrednost za najmanje jedan od parametara SF-36 vezanih za fizičko zdravlje (fizičko zdravlje, fizičko ograničenje, telesni bol i/ili opšte zdravstveno stanje) i/ili za najmanje jedan od parametara SF-36 vezanih za mentalno zdravlje (vitalnost, društveno funkcionisanje, emotivno ograničenje i/ili mentalno zdravlje). Tako poboljšanje može biti u vidu porasta najmanje 1, na primer, najmanje 2 ili najmanje 3 tačke, na skali za jedan ili više parametara.
[0464] Postupci iz predmetnog otkrića takođe mogu da poboljšaju prognozu za ispitanika koji se leči. Na primer, postupci iz pronalaska mogu ispitaniku pružiti smanjenje verovatnoće pojave kliničkog pogoršanja tokom perioda lečenja.
[0465] Doza agensa RNKi koja se primenjuje na ispitaniku može biti prilagođena da uravnoteži rizike i koristi od konkretne doze, na primer, da se postigne željeni nivo supresije gena TTR (kako je procenjeno, npr. na osnovu supresije mRNK TTR, ekspresije proteina TTR ili smanjenja amiloidnih naslaga, kako je prethodno definisano) ili željeno terapeutsko ili profilaktičko dejstvo, uz istovremeno izbegavanje neželjenih dejstava.
[0466] U jednom otelotvorenju, agens iRNK iz pronalaska se primenjuje na ispitaniku kao doza na bazi težine. „Doza na bazi težine“ (npr. doza u mg/kg) je doza agensa iRNK koja će se menjati u zavisnosti od ispitanikove težine. U drugom otelotvorenju, agens iRNK se primenjuje na ispitaniku kao fiksna doza. „Fiksna doza“ (npr. doza u mg) znači da se jedna doza agensa iRNK koristi za sve ispitanike bez obzira na bilo koje faktore povezane sa specifičnim ispitanikom, poput težine. U jednom konkretnom otelotvorenju, fiksna doza agensa iRNK iz pronalaska se zasniva na prethodno utvrđenoj težini ili starosti.
[0467] Ispitanicima može da se da terapeutska količina iRNK, recimo oko 0,01 mg/kg, 0,02 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,04 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,15 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,35 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,45 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,55 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,65 mg/kg, 0,7 mg/kg, 0,75 mg/kg, 0,8 mg/kg, 0,85 mg/kg, 0,9 mg/kg, 0,95 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,1 mg/kg, 1,2 mg/kg, 1,25 mg/kg, 1,3 mg/kg, 1,4 mg/kg, 1,5 mg/kg, 1,6 mg/kg, 1,7 mg/kg, 1,8 mg/kg, 1,9 mg/kg, 2,0 mg/kg, 2,1 mg/kg, 2,2 mg/kg, 2,3 mg/kg, 2,4 mg/kg, 2,5 mg/kg dsRNK, 2,6 mg/kg dsRNK, 2,7 mg/kg dsRNK, 2,8 mg/kg dsRNK, 2,9 mg/kg dsRNK, 3,0 mg/kg dsRNK, 3,1 mg/kg dsRNK, 3,2 mg/kg dsRNK, 3,3 mg/kg dsRNK, 3,4 mg/kg dsRNK, 3,5 mg/kg dsRNK, 3,6 mg/kg dsRNK, 3,7 mg/kg dsRNK, 3,8 mg/kg dsRNK, 3,9 mg/kg dsRNK, 4,0 mg/kg dsRNK, 4,1 mg/kg dsRNK, 4,2 mg/kg dsRNK, 4,3 mg/kg dsRNK, 4,4 mg/kg dsRNK, 4,5 mg/kg dsRNK, 4,6 mg/kg dsRNK, 4,7 mg/kg dsRNK, 4,8 mg/kg dsRNK, 4,9 mg/kg dsRNK, 5,0 mg/kg dsRNK, 5,1 mg/kg dsRNK, 5,2 mg/kg dsRNK, 5,3 mg/kg dsRNK, 5,4 mg/kg dsRNK, 5,5 mg/kg dsRNK, 5,6 mg/kg dsRNK, 5,7 mg/kg dsRNK, 5,8 mg/kg dsRNK, 5,9 mg/kg dsRNK, 6,0 mg/kg dsRNK, 6,1 mg/kg dsRNK, 6,2 mg/kg dsRNK, 6,3 mg/kg dsRNK, 6,4 mg/kg dsRNK, 6,5 mg/kg dsRNK, 6,6 mg/kg dsRNK, 6,7 mg/kg dsRNK, 6,8 mg/kg dsRNK, 6,9 mg/kg dsRNK, 7,0 mg/kg dsRNK, 7,1 mg/kg dsRNK, 7,2 mg/kg dsRNK, 7,3 mg/kg dsRNK, 7,4 mg/kg dsRNK, 7,5 mg/kg dsRNK, 7,6 mg/kg dsRNK, 7,7 mg/kg dsRNK, 7,8 mg/kg dsRNK, 7,9 mg/kg dsRNK, 8,0 mg/kg dsRNK, 8,1 mg/kg dsRNK, 8,2 mg/kg dsRNK, 8,3 mg/kg dsRNK, 8,4 mg/kg dsRNK, 8,5 mg/kg dsRNK, 8,6 mg/kg dsRNK, 8,7 mg/kg dsRNK, 8,8 mg/kg dsRNK, 8,9 mg/kg dsRNK, 9,0 mg/kg dsRNK, 9,1 mg/kg dsRNK, 9,2 mg/kg dsRNK, 9,3 mg/kg dsRNK, 9,4 mg/kg dsRNK, 9,5 mg/kg dsRNK, 9,6 mg/kg dsRNK, 9,7 mg/kg dsRNK, 9,8 mg/kg dsRNK, 9,9 mg/kg dsRNK, 9,0 mg/kg dsRNK, 10 mg/kg dsRNK, 15 mg/kg dsRNK, 20 mg/kg dsRNK, 25 mg/kg dsRNK, 30 mg/kg dsRNK, 35 mg/kg dsRNK, 40 mg/kg dsRNK, 45 mg/kg dsRNK ili oko 50 mg/kg dsRNK. Vrednosti i rasponi između navedenih vrednosti takođe treba da budu deo ovog otkrića.
[0468] U određenim otelotvorenjima, na primer, kada kompozicija iz otkrića sadrži dsRNK kao što je ovde opisana i lipid, ispitanicima se može dati terapeutska količina iRNK, recimo oko 0,01 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 0,01 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 0.05 mg/kg do oko 5 mg/kg, oko 0,05 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 0,1 mg/kg do oko 5 mg/kg, oko 0,1 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 0,2 mg/kg do oko 5 mg/kg, oko 0,2 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 0,3 mg/kg do oko 5 mg/kg, oko 0,3 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 0,4 mg/kg do oko 5 mg/kg, oko 0,4 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 0,5 mg/kg do oko 5 mg/kg, oko 0,5 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 1 mg/kg do oko 5 mg/kg, oko 1 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 1,5 mg/kg do oko 5 mg/kg, oko 1,5 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 2 mg/kg do oko 2,5 mg/kg, oko 2 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 3 mg/kg do oko 5 mg/kg, oko 3 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 3,5 mg/kg do oko 5 mg/kg, oko 4 mg/kg do oko 5 mg/kg, oko 4,5 mg/kg do oko 5 mg/kg, oko 4 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 4,5 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 5 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 5,5 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 6 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 6,5 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 7 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 7,5 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 8 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 8,5 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 9 mg/kg do oko 10 mg/kg ili oko 9,5 mg/kg do oko 10 mg/kg. Vrednosti i rasponi između navedenih vrednosti takođe treba da budu deo ovog otkrića.
[0469] Na primer, dsRNK može da se primenjuje u dozi od oko 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, ili oko 10 mg/kg. Vrednosti i rasponi između navedenih vrednosti takođe treba da budu deo ovog otkrića.
[0470] U nekim otelotvorenjima, na primer, kada kompozicija iz otkrića sadrži dsRNK kao što je ovde opisana i N-acetilgalaktozamin, ispitanicima se može dati terapeutska količina iRNK, recimo oko 0,01 mg/kg do oko 5 mg/kg, oko 0,01 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 0,05 mg/kg do oko 5 mg/kg, oko 0,05 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 0,15 mg/kg do oko 3 mg/kg, oko 0,1 mg/kg do oko 5 mg/kg, oko 0,1 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 0,2 mg/kg do oko 5 mg/kg, oko 0,2 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 0,3 mg/kg do oko 3 mg/kg, oko 0,3 mg/kg do
14
oko 5 mg/kg, oko 0,3 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 0,4 mg/kg do oko 5 mg/kg, oko 0,4 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 0,5 mg/kg do oko 5 mg/kg, oko 0,5 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 0,6 mg/kg do oko 3 mg/kg, oko 1 mg/kg do oko 3 mg/kg, oko 1 mg/kg do oko 5 mg/kg, oko 1 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 1,25 mg/kg do oko 3 mg/kg, oko 1,5 mg/kg do oko 5 mg/kg, oko 1,5 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 2 mg/kg do oko 2,5 mg/kg, oko 2 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 3 mg/kg do oko 5 mg/kg, oko 3 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 3,5 mg/kg do oko 5 mg/kg, oko 4 mg/kg do oko 5 mg/kg, oko 4,5 mg/kg do oko 5 mg/kg, oko 4 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 4,5 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 5 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 5,5 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 6 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 6,5 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 7 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 7,5 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 8 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 8,5 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 9 mg/kg do oko 10 mg/kg ili oko 9,5 mg/kg do oko 10 mg/kg. Vrednosti i rasponi između navedenih vrednosti takođe treba da budu deo ovog otkrića.
[0471] Na primer, dsRNK može da se primenjuje u dozi od oko 0.1, 0.15, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.25, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, ili oko 10 mg/kg. Vrednosti i rasponi između navedenih vrednosti takođe treba da budu deo ovog otkrića.
[0472] U drugim otelotvorenjima, na primer, kada kompozicija iz pronalaska sadrži dsRNK kao što je ovde opisana i N-acetilgalaktozamin, ispitanicima može biti data terapeutska količina iRNK, recimo doza od oko 0,1 do oko 50 mg/kg, oko 0,25 do oko 50 mg/kg, oko 0,5 do oko 50 mg/kg, oko 0,75 do oko 50 mg/kg, oko 1 do oko 50 mg/kg, oko 1,5 do oko 50 mg/kg, oko 2 do oko 50 mg/kg, oko 2,5 do oko 50 mg/kg, oko 3 do oko 50 mg/kg, oko 3,5 do oko 50 mg/kg, oko 4 do oko 50 mg/kg, oko 4,5 do oko 50 mg/kg, oko 5 do oko 50 mg/kg, oko 7,5 do oko 50 mg/kg, oko 10 do oko 50 mg/kg, oko 15 do oko 50 mg/kg, oko 20 do oko 50 mg/kg, oko 20 do oko 50 mg/kg, oko 25 do oko 50 mg/kg, oko 25 do oko 50 mg/kg, oko 30 do oko 50 mg/kg, oko 35 do oko 50 mg/kg, oko 40 do oko 50 mg/kg, oko 45 do oko 50 mg/kg, oko 0,1 do oko 45 mg/kg, oko 0,25 do oko 45 mg/kg, oko 0,5 do oko 45 mg/kg, oko 0,75 do oko 45 mg/kg, oko 1 do oko 45 mg/kg, oko 1,5 do oko 45 mg/kg, oko 2 do oko 45 mg/kg, oko 2,5 do oko 45 mg/kg, oko 3 do oko 45 mg/kg, oko 3,5 do oko 45 mg/kg, oko 4 do oko 45 mg/kg, oko 4,5 do oko 45 mg/kg, oko 5 do oko 45 mg/kg, oko 7,5 do oko 45 mg/kg, oko 10 do oko 45 mg/kg, oko 15 do oko 45 mg/kg, oko 20 do oko 45 mg/kg, oko 20 do oko 45 mg/kg, oko 25 do oko 45 mg/kg, oko 25 do oko 45 mg/kg, oko 30 do oko 45 mg/kg, oko 35 do oko 45 mg/kg, oko 40 do oko 45 mg/kg, oko 0,1 do oko 40 mg/kg, oko 0,25 do oko 40 mg/kg, oko 0,5 do oko 40 mg/kg, oko 0,75 do oko 40 mg/kg, oko 1 do oko 40 mg/kg, oko 1,5 do oko 40 mg/kg, oko 2 do oko 40 mg/kg, oko 2,5 do oko 40 mg/kg, oko 3 do oko 40 mg/kg, oko 3,5 do oko 40 mg/kg, oko 4 do oko 40 mg/kg, oko 4,5 do oko 40 mg/kg, oko 5 do oko 40 mg/kg, oko 7,5 do oko 40 mg/kg, oko 10 do oko 40 mg/kg, oko 15 do oko 40 mg/kg, oko 20 do oko 40 mg/kg, oko 20 do oko 40 mg/kg, oko 25 do oko 40 mg/kg, oko 25 do oko 40 mg/kg, oko 30 do oko 40 mg/kg, oko 35 do oko 40 mg/kg, oko 0,1 do oko 30 mg/kg, oko 0,25 do oko 30 mg/kg, oko 0,5 do oko 30 mg/kg, oko 0,75 do oko 30 mg/kg, oko 1 do oko 30 mg/kg, oko 1,5 do oko 30 mg/kg, oko 2 do oko 30 mg/kg, oko 2,5 do oko 30 mg/kg, oko 3 do oko 30 mg/kg, oko 3,5 do oko 30 mg/kg, oko 4 do oko 30 mg/kg, oko 4,5 do oko 30 mg/kg, oko 5 do oko 30 mg/kg, oko 7,5 do oko 30 mg/kg, oko 10 do oko 30 mg/kg, oko 15 do oko 30 mg/kg, oko 20 do oko 30 mg/kg, oko 20 do oko 30 mg/kg, oko 25 do oko 30 mg/kg, oko 0,1 do oko 20 mg/kg, oko 0,25 do oko 20 mg/kg, oko 0,5 do oko 20 mg/kg, oko 0,75 do oko 20 mg/kg, oko 1 do oko 20 mg/kg, oko 1,5 do oko 20 mg/kg, oko 2 do oko 20 mg/kg, oko 2,5 do oko 20 mg/kg, oko 3 do oko 20 mg/kg, oko 3,5 do oko 20 mg/kg, oko 4 do oko 20 mg/kg, oko 4,5 do oko 20 mg/kg, oko 5 do oko 20 mg/kg, oko 7,5 do oko 20 mg/kg, oko 10 do oko 20 mg/kg ili oko 15 do oko 20 mg/kg. U jednom otelotvorenju, kada kompozicija iz pronalaska sadrži dsRNK, kao što je ovde opisano, i N-acetilgalaktozamin, na ispitanicima može da se primeni terapeutska količina od oko 10 do oko 30 mg/kg dsRNK. Vrednosti i rasponi između navedenih vrednosti takođe treba da budu deo ovog otkrića.
[0473] Na primer, ispitanicima može biti data terapeutska količina iRNK, recimo oko 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,25, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 20,5, 21, 21,5, 22, 22,5, 23, 23,5, 24, 24,5, 25, 25,5, 26, 26,5, 27, 27,5, 28, 28,5, 29, 29,5, 30, 31, 32, 33, 34, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ili oko 50 mg/kg. Vrednosti i rasponi između navedenih vrednosti takođe treba da budu obuhvaćeni ovim otkrićem.
14
[0474] U nekim otelotvorenjima, agens RNKi se primenjuje kao fiksna doza između oko 25 mg do oko 900 mg, npr. između oko 25 mg do oko 850 mg, između oko 25 mg do oko 800 mg, između oko 25 mg do oko 750 mg, između oko 25 mg do oko 700 mg, između oko 25 mg do oko 650 mg, između oko 25 mg do oko 600 mg, između oko 25 mg do oko 550 mg, između oko 25 mg do oko 500 mg, između oko 100 mg do oko 850 mg, između oko 100 mg do oko 800 mg, između oko 100 mg do oko 750 mg, između oko 100 mg do oko 700 mg, između oko 100 mg do oko 650 mg, između oko 100 mg do oko 600 mg, između oko 100 mg do oko 550 mg, između oko 100 mg do oko 500 mg, između oko 200 mg do oko 850 mg, između oko 200 mg do oko 800 mg, između oko 200 mg do oko 750 mg, između oko 200 mg do oko 700 mg, između oko 200 mg do oko 650 mg, između oko 200 mg do oko 600 mg, između oko 200 mg do oko 550 mg, između oko 200 mg do oko 500 mg, između oko 300 mg do oko 850 mg, između oko 300 mg do oko 800 mg, između oko 300 mg do oko 750 mg, između oko 300 mg do oko 700 mg, između oko 300 mg do oko 650 mg, između oko 300 mg do oko 600 mg, između oko 300 mg do oko 550 mg, između oko 300 mg do oko 500 mg, između oko 400 mg do oko 850 mg, između oko 400 mg do oko 800 mg, između oko 400 mg do oko 750 mg, između oko 400 mg do oko 700 mg, između oko 400 mg do oko 650 mg, između oko 400 mg do oko 600 mg, između oko 400 mg do oko 550 mg ili između oko 400 mg do oko 500 mg.
[0475] U nekim otelotvorenjima, agens RNKi se primenjuje kao fiksna doza od oko 12,5 mg, oko 15 mg, oko 20 mg, oko 25 mg, oko 30 mg, oko 35 mg, oko 40 mg, oko 45 mg, oko 50 mg, oko 55 mg, oko 60 mg, oko 65 mg, oko 70 mg, oko 75 mg, oko 80 mg, oko 85 mg, oko 90 mg, oko 95 mg, oko 100 mg, oko 110 mg, oko 120 mg, oko 125 mg, oko 130 mg, oko 140 mg, oko 150 mg, oko 160 mg, oko 170 mg, oko 175 mg, oko 180 mg, oko 190 mg, 200 mg, oko 225 mg, oko 250 mg, oko 275 mg, oko 300 mg, oko 325 mg, oko 350 mg, oko 375 mg, oko 400 mg, oko 425 mg, oko 450 mg, oko 475 mg, oko 500 mg, oko 525 mg, oko 550 mg, oko 575 mg, oko 600 mg, oko 625 mg, oko 650 mg, oko 675 mg, oko 700 mg, oko 725 mg, oko 750 mg, oko 775 mg, oko 800 mg, oko 825 mg, oko 850 mg, oko 875 mg ili oko 900 mg.
[0476] U određenim otelotvorenjima, agens RNKi se primenjuje na ispitaniku kao fiksna doza od oko 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575 ili oko 600 mg jednom na svaka tri meseca (tj. jednom u kvartalu). U jednom otelotvorenju, primena je supkutana primena, npr. samoprimena putem, npr. prethodno napunjenog šprica ili šprica sa automatskim injektovanjem. U nekim
14
otelotvorenjima, doza agensa RNKi za supkutanu primenu je sadržana u zapremini koja je manja ili jednaka jednom ml, npr. farmaceutski prihvatljivog nosača.
[0477] U nekim otelotvorenjima, agens RNKi se primenjuje u dve ili više doza. Ako je poželjno da se olakšaju ponovljene ili česte infuzije, može biti preporučljiva implantacija sredstva za isporuku, npr. pumpe, polutrajnog stenta (npr. intravenskog, intraperitonealnog, intracisternalnog ili intrakapsularnog) ili rezervoara. U nekim otelotvorenjima, broj ili količina kasnijih doza zavisi od postizanja željenog dejstva, npr. supresije gena TTR, ili postizanja terapeutskog ili profilaktičkog dejstva, npr. smanjenja amiloidnih naslaga ili smanjenja simptoma bolesti povezane sa TTR-om.
[0478] U nekim otelotvorenjima, agens RNKi se primenjuje u skladu sa rasporedom. Na primer, agens RNKi može da se primenjuje dva puta nedeljno, tri puta nedeljno, četiri puta nedeljno ili pet puta nedeljno. U nekim otelotvorenjima, raspored uključuje redovno raspoređene primene, npr. na svaki sat, na svaka četiri sata, na svakih šest sati, na svakih osam sati, na svakih dvanaest sati, svakodnevno, na svaka 2 dana, na svaka 3 dana, na svaka 4 dana, na svakih 5 dana, nedeljno, dvonedeljno, mesečno ili kvartalno. U jednom otelotvorenju, doza od 0,3 mg/kg, 0,6 mg/kg, 1 mg/kg, 1,25 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2, .2,5 mg/kg ili 3 mg/kg se primenjuje svakog meseca. U drugom otelotvorenju, doza od 0,3 mg/kg, 0,6 mg/kg, 1 mg/kg, 1,25 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2.2,5 mg/kg ili 3 mg/kg se primenjuje kvartalno.
[0479] U drugim otelotvorenjima, raspored obuhvata blisko raspoređene primene praćene dužim vremenskim periodom u kome se agens ne primenjuje. Na primer, raspored može da obuhvata inicijalni skup doza koje se primenjuju u relativno kratkom vremenskom periodu (npr. oko svakih 6 sati, oko svakih 12 sati, oko svaka 24 sata, oko svakih 48 sati ili oko svaka 72 sata) nakon čega sledi duži vremenski period (npr. oko 1 nedelja, oko 2 nedelje, oko 3 nedelje, oko 4 nedelje, oko 5 nedelja, oko 6 nedelja, oko 7 nedelja, oko 8 nedelja, oko 9 nedelja, oko 10 nedelja, oko 11 nedelja ili oko 12 nedelja) tokom koga se agens RNKi ne primenjuje. U jednom otelotvorenju, agens RNKi se prvobitno primenjuje svakog sata, a kasnije se primenjuje u dužem intervalu (npr. dnevno, nedeljno, dvonedeljno, mesečno ili kvartalno). U drugom otelotvorenju, agens RNKi se prvobitno primenjuje svakog dana, a kasnije se primenjuje u dužem intervalu (npr. nedeljno, dvonedeljno, mesečno ili kvartalno). U određenim otelotvorenjima, duži interval se povećava tokom vremena ili je određen na osnovu postizanja željenog dejstva.
14
[0480] U specifičnom otelotvorenju, agens RNKi se primenjuje jednom dnevno tokom prve nedelje, nakon čega sledi nedeljno, mesečno ili kvartalno doziranje počevši od osmog dana primene. U još jednom specifičnom otelotvorenju, agens RNKi se primenjuje svakog drugog dana tokom prve nedelje, nakon čega sledi nedeljno, mesečno ili kvartalno doziranje počevši od osmog dana primene. U drugom otelotvorenju, agens RNKi se primenjuje jednom dnevno tokom pet dana prve nedelje, nakon čega sledi nedeljna, mesečna ili kvartalna primena doza.
[0481] Bilo koji od ovih rasporeda može da se ponovi jednom ili više puta. Broj ponavljanja može da zavisi od postizanja željenog dejstva, npr. supresije gena TTR, nivoa retinol vezujućeg proteina, nivoa vitamina A i/ili postizanja terapeutskog ili profilaktičkog dejstva, npr. smanjenja amiloidnih naslaga ili smanjenja simptoma bolesti povezane sa TTR-om.
[0482] U nekim otelotvorenjima, agens RNKi može da se primenjuje sa drugim terapeutskim agensima ili drugim terapeutskim režimima. Na primer, drugi agensi ili drugi terapeutski režimi pogodni za lečenje bolesti povezane sa TTR-om mogu uključivati transplantaciju jetre, što može smanjiti nivo mutantnih TTR u telu, tafamidis (Vyndaqel), koji kinetički stabilizuje tetramer TTR koji sprečava disocijaciju tetramera potrebnu za amiloidogenezu TTR; i diuretike, koji se mogu koristiti, na primer, za smanjenje edema kod TTR amiloidoze koja zahvata srce.
[0483] U jednom otelotvorenju, ispitaniku se daje inicijalna doza i jedna ili više doza za održavanje agensa RNKi. Doza ili doze za održavanje mogu biti iste ili manje od inicijalne doze, npr. jedna polovina inicijalne doze. Režim održavanja može da uključuje tretiranje ispitanika dozom ili dozama u opsegu od 0,01 µg do 15 mg/kg telesne težine dnevno, npr.1 mg/kg, 1,25 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,15 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,001 mg/kg ili 0,00001 mg/kg telesne težine dnevno, ili dozom ili dozama od oko 12,5 mg do oko 900 mg, npr. oko 25 mg, oko 30 mg oko 35 mg, oko 40 mg, oko 45 mg, oko 50 mg, oko 55 mg, oko 60 mg, oko 65 mg, oko 70 mg, oko 75 mg, oko 80 mg, oko 85 mg, oko 90 mg, oko 95 mg, oko 100 mg, oko 125 mg, oko 150 mg, oko 175 mg, 200 mg, oko 225 mg, oko 250 mg, oko 275 mg, oko 300 mg, oko 325 mg, oko 350 mg, oko 375 mg, oko 400 mg, oko 425 mg, oko 450 mg, oko 475 mg, oko 500 mg, oko 525 mg, oko 550 mg, oko 575 mg, oko 600 mg, oko 625 mg, oko 650 mg, oko 675 mg, oko 700 mg, oko 725 mg, oko 750 mg, oko 775 mg, oko 800 mg, oko 825
14
mg, oko 850 mg, oko 875 mg ili oko 900 mg nedeljno. Doze za održavanje se, na primer, primenjuju ne više od jednom na svaka 2 dana, jednom na svakih 5 dana, jednom na svakih 7 dana, jednom na svakih 10 dana, jednom na svakih 14 dana, jednom na svaki 21 dan, jednom na svakih 30 dana ili jednom na svakih 90 dana. Nadalje, režim lečenja može trajati u vremenskom periodu koji će varirati u zavisnosti od prirode konkretne bolesti, njene ozbiljnosti i sveukupnog stanja pacijenta. U određenim otelotvorenjima, doza može da se isporuči ne češće od jednom dnevno, npr. ne češće od jednom na 24, 36, 48 ili više sati, npr. ne češće od jednom na svakih 5 ili 8 dana. Nakon lečenja, pacijent može biti praćen radi uočavanja promena u njegovom/njenom stanju. Doza agensa RNKi može biti povećana u slučaju da pacijent nema značajan odgovor na trenutne dozne nivoe, ili doza može biti smanjena ako je uočeno ublažavanje simptoma bolesti, ako je bolest uklonjena operativnim putem ili su uočena neželjena dejstva.
VI. Kompleti
[0484] Predmetno otkriće takođe obezbeđuje komplete za obavljanje bilo kojih postupaka iz pronalaska. Takvi kompleti uključuju jedan ili više agenasa RNKi i uputstvo za upotrebu, npr. uputstvo za inhibiciju ekspresije TTR u ćeliji putem dovođenja ćelije u kontakt sa agensima RNKi u količini koja je delotvorna za inhibiciju ekspresije TTR. Kompleti mogu dalje opciono da sadrže sredstva za dovođenje ćelije u kontakt sa agensom RNKi (npr. sredstvo za ubrizgavanje ili infuziona pumpa), ili sredstva za merenje inhibicije TTR (npr. sredstva za merenje inhibicije mRNK TTR ili proteina TTR). Takva sredstva za merenje inhibicije TTR mogu da obuhvataju sredstva za uzimanje uzorka od ispitanika, kao što je, npr. uzorak plazme. Kompleti iz pronalaska mogu opciono dalje da sadrže sredstva za primenu agenasa RNKi na ispitaniku ili sredstva za utvrđivanje terapeutski delotvorne ili profilaktički delotvorne količine.
[0485] Odgovarajući agensi RNKi za uključenje u komplete iz otkrića uključuju bilo koji od agenasa RNKi navedenih u bilo kojoj od tabela 1, 3, 5, 6 ili 7. U jednom otelotvorenju, agens RNKi je izabran iz grupe koja se sastoji od AD-66016, AD-65492, AD-66017 i AD-66018.
[0486] Agens RNKi može da se obezbedi u bilo kom odgovarajućem obliku, kao što je rastvor u sterilnoj vodi za injekciju. Na primer, agens RNKi može da se obezbedi kao rastvor
14
sa 500 mg/ml, 450 mg/ml, 400 mg/ml, 350 mg/ml, 300 mg/ml, 250 mg/ml, 200 mg/ml, 150 mg/ml, 100 mg/ml ili 50 mg/ml u sterilnoj vodi za injekciju.
[0487] Pronalazak je dodatno ilustrovan sledećim primerima koje ne treba shvatiti kao ograničavajuće.
PRIMERI
Primer 1: In vitro stabilnost i aktivnost utišavanja hemijski modifikovanih agenasa RNKi koji ciljaju TTR
[0488] Sledeći eksperimenti su pokazali korisna dejstva određenih hemijskih modifikacija, uključujući ne više od 82'-fluor modifikacija na sens lancu, ne više od 62'-fluor modifikacija na antisens lancu, šest fosforotioatnih nukleotidnih veza i ligand, npr. GalNAc3ligand, na aktivnost utišavanja agenasa RNKi koji ciljaju TTR. Sekvence ispitivanih agenasa su obezbeđene u Tabeli 1 u nastavku.
[0489] Sekvence siRNK TTR su sintetisana na 1 µmol skali na Mermade 192 sintetizatoru (BioAutomation) koristeći fosforamiditnu hemiju posredovanu čvrstom podlogom. Čvrsta podloga je kontrolisano porozno staklo (500 A) na koje je nanet GalNAc ligand po meri ili univerzalna čvrsta podloga (AM biochemical). Pomoćni reagensi za sintezu, 2'-F i 2'-O-metil RNK i dezoksi fosforamiditi su dobijeni od Thermo-Fisher (Milwaukee, WI) i Hongene (Kina). 2'F, 2'-O-metil, GNK (glikolne nukleinske kiseline), 5'fosfat i abazne modifikacije su uvedene koristeći odgovarajuće fosforamidite. Sinteza 3' GalNAc konjugovanih pojedinačnih lanaca je obavljena na GalNAc modifikovanoj CPG podlozi. CPG univerzalna čvrsta podloga po meri korišćena je za sintezu antisens pojedinačnih lanaca. Vreme kuplovanja za sve fosforamidite (100 mM u acetonitrilu) je 5 minuta koristeći 5-etiltio-1H-tetrazol (ETT) kao aktivator (0,6 M u acetonitrilu). Fosforotioatne veze su stvorene koristeći 50 mM rastvor 3-((dimetilamino-metiliden) amino)-3H-1,2,4-ditiazol-3-tiona (DDTT, dobijen od Chemgenes (Wilmington, MA, SAD)) u anhidrovanom acetonitrilu/piridinu (1:1 V/V). Vreme oksidacije je 3 minuta. Sve sekvence su sintetisane sa konačnim uklanjanjem DMT grupe („DMT off“).
[0490] Po završetku sinteze čvrste faze, oligoribonukleotidi su otcepljeni od čvrste podloge i deprotektovani na zaptivenim pločama sa 96 dubokih bunarčića koristeći 200 µl reagensa
1
vodenog metilamina na 60°C tokom 20 minuta. Na kraju koraka cepanja i deprotekcije, ploča za sintezu je ostavljena da dostigne sobnu temperaturu i taložena je dodatkom 1 ml smeše acetonitril:etanol (9:1). Ploče su ohlađene na -80 C tokom 2 h, supernatant je pažljivo dekantovan uz pomoć višekanalne pipete. Kuglica oligonukleotida je ponovo suspendovana u 20 mM NaOAc puferu i desalinizovana je koristeći 5 ml HiTrap kolonu sa molekulskim sitima (GE Healthcare) na AKTA sistemu za prečišćavanje opremljenom A905 autosamplerom i Frac 950 frakcionim kolektorom. Desalinizovani uzorci su sakupljeni na ploče sa 96 bunarčića. Uzorci iz svake sekvence su analizirani putem LC-MS kako bi se potvrdio identitet, UV (260 nm) radi kvantifikacije, i odabrani skup uzoraka je analiziran IEX hromatografijom kako bi se utvrdila čistoća.
[0491] Spajanje pojedinačnih lanaca TTR je obavljeno na Tecan robotu za rukovanje tečnostima. Ekvimolarne smeše pojedinačnih sens i antisens lanaca su kombinovane i spojene na pločama sa 96 bunarčića. Nakon kombinovanja komplementarnih pojedinačnih lanaca, ploča sa 96 bunarčića je dobro zaptivena i zagrevana u pećnici na 100°C tokom 10 minuta i ostavljena da se polako spusti na sobnu temperaturu u periodu od 2-3 sata. Koncentracija svake dvojne spirale je normalizovana na 10 µM u 1X PBS.
[0492] Te dvojne spirale su testirane na in vitro metaboličku stabilnost koristeći test stabilnosti citozola pacova. Za takav test, citozol jetre ženke pacova (Xenotech kat. br.
R1500.C) otopljen je do sobne temperature i razblažen do 1 mg/ml u 50 mM Tris puferu: HCl pH 7,4, 5 mM MgCl2. Dvadeset četvoročasovni uzorci su pripremljeni mešanjem 100 µl 1 mg/ml citozola sa 25 µl 0,4 mg/ml uzorka siRNK u epruveti za mikrocentrifugiranje i inkubacijom tokom 24 sata u ependorf termomikseru podešenom na 37°C i 300 o/min. Nakon 24 sata inkubacije, 300 µl Phenomenex pufera za lizu za nanošenje (kat. br. ALO-8498) i 12,5 µl 0,4 mg/ml internog standarda siRNK dodato je svakom uzorku. Uzorci nakon nula časova su pripremljeni mešanjem 100 µl 1 mg/ml citozola sa 25 µl 0,4 mg/ml uzorka siRNK, 300 µl Phenomenex pufera za lizu za nanošenje i 12,5 µl 0,4 mg/ml internog standarda siRNK. siRNK je ekstrahovana iz 24-časovnih uzoraka i uzorka nakon 0 časova koristeći Phenomenex Clarity OTX Starter Kit (kat. br. KSO-8494). Nakon što su uzorci ekstrahovani, preneti su u epruvetu za mikrocentrifugiranje i osušeni koristeći Labconco CentriVap koncentrator (kat. br.7810010). Uzorci su zatim ponovo suspendovani sa 500 µl vode bez nukleaze. Pedeset µl svakog uzorka je propušteno na Agilent Technologies 1260 Infinity Binary LC sa Agilent Technologies 6130 Quadrupole LC/MS. Analiza je obavljena koristeći
1 1
postavku sa dvostrukom kolonom u režimu regeneracije. Postupak kvaternerne pumpe je pokrenut tokom 12,20 minuta sa 0,400 ml/min uz sledeći raspored:
Funkcija vremena Parametar
0,20 5% pufer A(16 mM TEA 200 mM HFIP), 95% pufer B (100% metanol)
2,50 5% pufer A(16 mM TEA 200 mM HFIP), 95% pufer B (100% metanol)
3,00 100% pufer A(16 mM TEA 200
[0493] Postupak binarne pumpe je pokrenut tokom 12,20 min sa 0,700 ml/min uz sledeći raspored:
Parametar funkcije vremena
[0494] I leva i desna kolona su postavljene na 75,00°C. UV signal je meren na talasnoj dužini od 260 nm. Procenat koji ostaje na svakom lancu je izračunat koristeći sledeću jednačinu:
[0495] Rezultati ovih 24-časovnih testova stabilnosti citozola pokazuju da su svi dupleksi veoma stabilni.
[0496] Podskup ovih agenasa je takođe procenjen na in vitro metaboličku stabilnost koristeći test stabilnosti tritozoma. Za testove stabilnosti tritozoma, tritozomi jetre pacova (Xenotech proizvod po narudžbini PR14044) otopljeni su do sobne temperature i razblaženi do 0,5 jedinica/ml kisele fosfataze u 20 mM natrijum citratnom puferu pH 5,0. Dvadeset
1 2
četvoročasovni uzorci su pripremljeni mešanjem 100 µl 0,5 jedinica/ml tritozoma kisele fosfataze sa 25 µl 0,4 mg/ml uzorka siRNK u epruveti za mikrocentrifugiranje tokom dvadeset četiri sata u ependorf termomikseru podešenom na 37°C i 300 o/min. Nakon dvadeset i četiri sata inkubacije, 300 µl Phenomenex pufera za lizu za nanošenje (kat. br. ALO-8498) i 12,5 µl 0,4 mg/ml internog standarda siRNK dodato je svakom uzorku. Uzorci nakon 0 sati su pripremljeni mešanjem 100 µl 0,5 jedinica/ml tritozoma kisele fosfataze sa 25 µl 0,4 mg/ml uzorka siRNK, 300 µl Phenomenex pufera za lizu za nanošenje i 12,5 µl 0,4 mg/ml internog standarda siRNK. siRNK je ekstrahovana iz 24-časovnih uzoraka i uzoraka nakon 0 sati koristeći Phenomenex Clarity OTX Starter Kit (kat. br. KSO-8494). Nakon što su uzorci ekstrahovani, prebačeni su u epruvetu za mikrocentrifugiranje i osušeni koristeći Labconco CentriVap koncentrator (kat. br.7810010). Uzorci su zatim ponovo suspendovani sa 500 µl vode bez nukleaze. Pedeset µl svakog uzorka je propušteno na Agilent Technologies 1260 Infinity Binary LC sa Agilent Technologies 6130 Quadrupole LC/MS. Analiza
[0497] je obavljena koristeći postavku sa dvostrukom kolonom u režimu regeneracije.
Postupak kvaternerne pumpe je pokrenut tokom 12,20 minuta sa 0,400 ml/min uz sledeći raspored:
[0498] Postupak binarne pumpe je pokrenut tokom 12,20 min sa 0,700 ml/min uz sledeći raspored:
1
[0499] I leva i desna kolona su postavljene na 75,00°C. UV signal je meren na talasnoj dužini od 260 nm. Procenat koji ostaje na svakom lancu je izračunat koristeći sledeću jednačinu:
[0500] Rezultati 24-časovnih testova stabilnosti tritozoma, dati na slici 1, pokazuju da su sve dvojne spirale veoma stabilne u tritozomima.
Tabela 1. Modifikovane sekvence sens i antisens lanca dsRNK TTR
1 4
1
Tabela 2. Skraćenice nukleotidnih monomera korišćenih u prikazu sekvenci nukleinskih kiselina. Biće jasno da su ovi monomeri, kada su prisutni u oligonukleotidu, međusobno povezani 5'-3'-fosfodiestarskim vezama.
1
1 Skraćenica Nukleotid(i)
[0501] Dizajniran je i sintetisan dodatni skup agenasa koji ciljaju TTR. Sekvence tih agenasa su date u Tabeli 3 u nastavku.
[0502] Ovi dodatni agensi su procenjeni u in vitro testovima. Naročito, IC50za svaki agens iRNK je utvrđen u Hep3B ćelijama (ćelijska linija humanog hepatoma) ili primarnim hepatocitima cinomolgusa (Life Technologies) standardnom reversnom transfekcijom koristeći Lipofectamine RNAiMAX. Hep3B ćelije su uzgajane u EMEM sa 10% FBS, dok su primarni hepatociti cinomolgusa otapani neposredno pre primene i uzgajani u WMEM sa 10% FBS. Reversna transfekcija je sprovedena dodatkom 5 µl dvojne spirale RNK po bunarčiću u ploču sa 384 bunarčića zajedno sa 4,9 µl Opti-MEM i 0,1 µl Lipofectamine RNAiMax po bunarčiću (Invitrogen, Carlsbad kat. br.13778-150) i inkubacijom na sobnoj temperaturi tokom 15-20 minuta. Nakon inkubacije, u svaki bunarčić je dodato 40 µl kompletnog medijuma za rast bez antibiotika koji sadrži 5000 ćelija Hep3B ili primarnih hepatocita cinomolgusa. Ploče premazane kolagenom su korišćene za primarne hepatocite. Ćelije su inkubirane tokom 24 sata na 37°C u atmosferi 5% CO2pre lize i analize TTR i GAPDH mRNK pomoću RT-qPCR. Osam različitih koncentracija siRNK u opsegu od 10 nM do 0,38 fM je ispitano radi utvrđivanja IC50i TTR/GAPDH za siRNK transficirane ćelije su normalizovani na ćelije transficirane sa 10 nM siRNK luciferaze.
[0503] Utišavanje slobodnog unosa u primarnim hepatocitima cinomolgusa je procenjeno nakon inkubacije sa siRNK TTR tokom 24 sata. Postupak je sličan prethodno opisanom, osim što je 5 µl kompletnog medijuma za rast zamenjeno sa 5 µl koji sadrže Lipofectamine RNAiMax i Optimem. Nishodna analiza za TTR i mRNK GAPDH je obavljena kao što je
1
prethodno opisano. Za uobičajenu krivu odgovora na dozu, siRNK su titrisane od 500 nM do 0.1.8 pM 6-strukim serijskim razblaženjima u osam tačaka.
[0504] Rezultati ovih testova (dati u Tabeli 4) pokazuju da sve dvojne spirale potencijalno inhibiraju ekspresiju mRNK TTR.
[0505] In vitro stabilnost ovih dodatnih agenasa je takođe procenjena koristeći prethodno opisane testove stabilnosti citozola i tritozoma.
[0506] Rezultati 24-časovnog testa stabilnosti citozola su dati na Slici 2A, a rezultati 24-časovnog testa stabilnosti tritozoma su dati na Slici 2B, i pokazuju da su sve dvojne spirale veoma stabilne u tritozomima i citozolu pacova.
Tabela 3. Modifikovane sekvence sens i antisens lanca dsRNK TTR
Tabela 4. In vitro aktivnost dodatnih agenasa RNKi TTR
1
Primer 2. In Vivo utišavanje TTR
[0507] In vivo efikasnost dodatnih agenasa koji su prethodno opisani procenjena je u transgenim miševima koji eksprimiraju valin 30 metionin varijantu humanog TTR (V30M hTTR) (vidite, npr. Nagata, i sar. (1995) J Biochem. 117:169-175; Kohno, i sar. (1997) Am J Pathol. 150(4):1497-508). Poznato je da V30M varijanta TTR uzrokuje amiloidnu polineuropatiju tipa I kod ljudi. Vidite, npr. Lobato, L. (2003) J Nephrol., 16(3):438-42.
[0508] Na miševima sa V30M TTR starim jedanaest do trinaest meseci je supkutano primenjena jedna doza od 1 mg/kg ili 2,5 mg/kg agenasa, i nivo TTR je utvrđen u serumu životinja pre doze i 3, 7, 10, 14, 21, 28, 35, 42, 56, 70. i 84. dana nakon doze. Ukratko, nivoi TTR su ispitani koristeći validirani TTR test sa imunosorbentom vezanim za enzim (ELISA) (vidite, npr. Coelho, i sar. (2013) N Engl J Med 369:819). Imunske mikroploče sa devedeset šest bunarčića premazane su na 4° zečjim antihumanim TTR pAB (Abcam) 24 sata pre početka ELISA testa serumskog proteina TTR. Na dan testa, ploče su isprane u TBS-T i blokirane u 1 x Powerblock (Biogenex) tokom 2 sata na sobnoj temperaturi. Uzorci seruma su razblaženi 15.000 puta u 1X Powerblock. Napravljena je standardna kriva za TTR sa 12 tačaka koja koristi standard humanog TTR proteina (Sigma-Aldrich, P1742) koristeći 1,6 x serijska razblaženja, u opsegu od 250 do 0 ng/ml. Nakon blokiranja, 100 µl zapremina standarda i uzoraka je dodato na ploču i ostavljeno da se inkubira tokom 2 sata na sobnoj
1
temperaturi. Ploče su isprane u TBS-T i inkubirane tokom 1 sata na sobnoj temperaturi sa ovčjim Anti-hTTR primarnim antitelom (AbCam) razblaženim 1:2500 u 1X Powerblock. Nakon TBS-T ispiranja, ploče su inkubirane tokom 1 sata na sobnoj temperaturi sa magarećim antiovčjim sekundarnim antitelom alkalne fosfataze (AbCam) razblaženim 3:10.000 u 1X Powerblock. Ploče su isprane u TBS-T i dodato je 100 µl pripremljenog supstrata (SIGMAFAST™ p-nitrofenil fosfat tablete) po bunarčiću i ostavljeno da reaguje tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi u mraku. Reakcije su prekinute sa 0,05 ml po bunarčiću 1 M NaOH. Apsorbanca na 405 nm je očitana na SpectraMax čitaču ploča, i podaci su uneti na krivu sa 4 parametra kako bi se odredili serumski nivoi proteina TTR u µg/ml. Nivoi proteina pojedinačnih životinja su normalizovani na njihove odgovarajuće vrednosti proteina u plazmi pre doze kako bi se odredila frakcija TTR koja ostaje u odnosu na stanje pre doze.
[0509] Rezultati eksperimenata sa pojedinačnom dozom od 1 mg/kg su dati na Slici 3, a rezultati eksperimenata sa pojedinačnom dozom od 2,5 mg/kg su dati na Slici 4. Rezultati pokazuju da svi agensi potentno i dugotrajno inhibiraju ekspresiju TTR, pri čemu je najniža tačka dostignuta oko 7 dana nakon primene. Rezultati takođe pokazuju da 42. dana nakon pojedinačne doze od 1 mg/kg AD-65492, AD-66017 ili AD-66018, ostaje više od 40% supresije TTR u serumu, a 42. dana nakon pojedinačne doze od 2,5 mg/kg AD-65492 ili AD-66018, ostaje više od 60% supresije TTR u serumu. Do povratka na početne koncentracije TTR u serumu dolazi između 56 i 84 dana nakon primene pojedinačne doze od 1 mg/kg i između 70 i 84 dana nakon primene pojedinačne doze od 2,5 mg/kg.
[0510] Delotvorna doza za 80% utišavanja kod životinja (ED80) je izračunata kao 1 mg/kg. Ovi podaci tako pokazuju da su AD-65492, AD-66016, AD-66017 i AD-66018 delotvorni za lečenje ispitanika koji ima bolest povezanu sa TTR-om u maloj dozi i/ili mesečnim doznim režimima.
Primer 3. Eksplorativne studije toksičnosti kod pacova
[0511] Pretkliničke studije toksičnosti AD-66016, AD-65492, AD-66017 i AD-66018 su takođe obavljene na pacovima. Ukratko, 1, 8. i 15. dana pet mužjaka pacova po grupi je supkutano primilo dozu AD-66016, AD-65492, AD-66017 ili AD-66018 od 30 mg/kg ili 100 mg/kg. Na kontrolnim životinjama je primenjen placebo 1, 8. i 15. dana.16. dana, sve
1 1
životinje su žrtvovane. Pre žrtvovanja, životinje su svakodnevno praćene na bilo koje kliničke simptome, i telesna težina je merena na nedeljnom nivou. Nakon žrtvovanja, na životinjama je obavljena nekropsija i uzorci su analizirani kompletnim panelima biohemije iz seruma, hematologije i koagulacije, histopatologijom jetre i bubrega, kao i na koncentraciju transaminaze jetre.
[0512] Rezultati ovih analiza pokazuju da se D-66016, AD-65492, AD-66017 i AD-66018 klinički dobro podnose, bez neželjenih kliničkih znakova ili promene telesne težine.
Primer 4. Delotvornost multidozne primene AD-65492 i AD-66017
[0513] Ispitano je dejstvo multidoznog režima AD-65492 i AD-66017 na ekspresiju proteina TTR u hTTR V30M transgenim (Tg) miševima.
[0514] U jednom skupu eksperimenata, jedanaest do trinaest meseci stari hTTR V30M miševi su supkutano primili nedeljnu dozu AD-65492 od 2 mg/kg tokom tri nedelje (QWx3), i nivo proteina TTR je utvrđen u serumu životinja pre doze i 7, 14, 17. i 21. dana nakon doze, kao što je prethodno opisano.
[0515] Slika 5 pokazuje da je primenom AD-65492 u doznom režimu QWx3 na hTTR V30M Tg miševima postignuta i održana supresija ekspresije proteina TTR u serumu veća od 90%.
[0516] U drugom skupu eksperimenata, AD-65492 i AD-66017 su supkutano primenjivani na jedanaest do trinaest meseci starim hTTR V30M Tg miševima u dozi od 0,3 mg/kg jednom mesečno tokom četiri meseca (QMx4 sa 0,3 mg/kg), u dozi od 1 mg/kg jednom mesečno tokom četiri meseca (QM4 sa 1 mg/kg) ili u dozi od 3 mg/kg jednom mesečno tokom četiri meseca (QM4 sa 3 mg/kg). Nivoi proteina TTR u serumu su utvrđeni kako je prethodno opisano pre doze i 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 84, 91, 98. i 185. dana nakon doze.
[0517] Kao što je prikazano na Slikama 6A-6C, nivoi nokdauna TTR 7. dana nakon doze su bili slični nakon druge, treće i četvrte doze, a najniža tačka ekspresije TTR postignuta sa dozom od 3 mg/kg, 1 mg/kg i 0,3 mg/kg je veća od 80%, oko 70-85%, odnosno oko 25-35%. Ovi grafikoni takođe pokazuju da AD-65492 obezbeđuje postojaniji nivo utišavanja TTR nego AD-66017, do više od 100 dana nakon poslednje doze, sa oko 60%, 40% i oko 35%
1 2
preostalog utišavanja TTR sa 3 mg/kg, 1 mg/kg, odnosno 0,3 mg/kg. Nadalje, za AD-65492, višestruko doziranje (QMx4) se sabira sa dozom od 0,3 mg/kg, što dovodi do oko 40% nokdauna TTR nakon četvrte mesečne doze u poređenju sa prvom dozom koja ima nokdaun od oko 25-35%. Pored toga, iako je došlo do određenog vraćanja nivoa proteina TTR pre svake mesečne doze na sva četiri dozna nivoa svakog agensa, kao kod pojedinačne supkutane doze, izračunata delotvorna doza za postizanje 80% nokdauna (ED80) za multidozni režim je oko 1 mg/kg. Tako, farmakodinamička aktivnost i kinetika oba jedinjenja u sva tri dozna režima je uporediva sa farmakodinamičkom aktivnošću i kinetikom istih jedinjenja kada se primenjuju kao pojedinačna doza.
Primer 5. Utišavanje TTR kod nehumanih primata
[0518] Kao što je pokazano u prethodnim primerima, AD-65492 i AD-66017 se dobro podnose, i potentno i dugotrajno potiskuju nivoe proteina TTR in vivo.
[0519] Shodno tome, delotvornost AD-65492 i AD-66017 je dalje ispitivana primenom različitih doza i različitih doznih režima ovih agenasa iRNK kod majmuna cinomolgusa. Slika 7 daje nacrt ove studije. Ukratko, četiri grupe, grupa 1, 2, 4 i 5, supkutano su primile pojedinačnu dozu od 0,3 mg/kg (grupe 1 i 4) ili pojedinačnu dozu od 1 mg/kg agensa iRNK (grupe 2 i 5). Četiri druge grupe, grupe 3 i 6-8, primile su mesečnu dozu od 1 mg/kg tokom 4 meseca (QMx4) (grupe 7 i 8) ili mesečnu dozu od 3 mg/kg tokom 4 meseca (QMx4) (grupe 3 i 6). Serum je sakupljen -7. i -1. dana pre doze i 3, 7, 10, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77, 84, 91, 105. i 119. dana nakon doze; plazma je sakupljena 1. dana pre doze i 0,5, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 96 i 168 sati nakon doze. Serumski nivo proteina TTR je određen kako je prethodno opisano.
[0520] Slika 8A daje rezultate studije pojedinačne doze od 0,3 mg/kg, Slika 8B daje rezultate studije pojedinačne doze od 1 mg/kg, a Slika 8C daje rezultate studije pojedinačne doze od 3 mg/kg. Za svrhe poređenja, Slika 8B takođe prikazuje dejstvo primene pojedinačne supkutane doze AD-51547 od 2,5 mg/kg na ekspresiju TTR kod majmuna Cynomologous, a Slika 8C takođe prikazuje dejstvo primene pojedinačne supkutane doze AD-51547 od 5 mg/kg na ekspresiju TTR kod majmuna Cynomologous. Ovi grafikoni pokazuju da je ED50za AD-65492 i AD-66017 agense iRNK oko 0,3 mg/kg, da je najniža tačka ekspresije TTR dostignuta oko 28. dana za obe doze i za oba agensa iRNK i da je AD-65492 delotvorniji u
1
potiskivanju ekspresije proteina TTR nego AD-66017 pri višem doznom nivou sa pojedinačnom dozom. Grafikoni takođe pokazuju da AD-65942 pruža više od 90% postojane supresije ekspresije TTR do 42. dana nakon pojedinačne doze od 1 mg/kg i više od 80% supresije TTR do 63. dana, sa oko 40% preostale supresije TTR do 119. dana nakon doze, i da AD-66017 pruža maksimum od 73% supresije ekspresije TTR nakon pojedinačne doze od 1 mg/kg, pri čemu vraćanje ekspresije TTR počinje pre 35. dana i vraća se na oko 20% početne vrednosti do 119. dana nakon doze.
[0521] Slika 9A daje rezultate multidozne studije sa 1 mg/kg, a Slika 9B daje rezultate multidozne studije sa 3 mg/kg za AD-65492 i AD-66017. Za svrhe poređenja, Slika 9A takođe prikazuje dejstvo primene dnevne doze AD-51547 od 5 mg/kg tokom 5 dana (prvih pet strelica 0. do 4. dana), nakon čega sledi nedeljna doza od 5 mg/kg tokom četiri nedelje (strelice 7, 14, 21. i 28. dana) (QDx5, QWx4) na ekspresiju TTR kod majmuna Cynomologous. Grafikoni pokazuju da oba agensa iRNK pružaju robusnu supresiju proteina TTR, i da oba agensa iRNK u potpunosti potiskuju ekspresiju proteina TTR između 21. i 28. dana u dozi od 3 mg/kg. Grafikoni takođe pokazuju da je AD-65492 delotvorniji od AD-66017 pri dozi od 1 mg/kg. Pored toga, grafikoni pokazuju da je najniža tačka ekspresije TTR postignuta između 35. i 42. dana za oba agensa iRNK sa 1 mg/kg, sa više od 85% supresije pre druge mesečne doze AD-65492 i oko 70% supresije pre druge mesečne doze AD-66017. Ostvareno je održavanje supresije od oko 95% i 85% nakon treće i četvrte mesečne doze AD-65492, odnosno AD-66017.
[0522] Nadalje, kako je prikazano na Slici 10A, mesečno doziranje (QMx4) AD-65492 dovelo je do održavanja supresije TTR veće od 95%, i, kako je prikazano na Slici 10B, višestruko doziranje (QMx4) AD-66017 se sabira pri dozi od 1 mg/kg. Slika 10B takođe pokazuje da postoji 85% potiskivanja ekspresije proteina TTR nakon druge mesečne doze AD-66017, i da se to potiskivanje održava sa trećom i četvrtom mesečnom dozom.
Primer 6. Dizajn i sinteza hemijski modifikovanih agenasa koji ciljaju TTR
[0523] Dodatni agensi dvolančane RNKi koji ciljaju TTR u kojima su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi i sadrže antisens lanac koji ima region komplementaran sa SEQ ID NO:2 dizajnirani su i sintetisani kao što je prethodno opisano.
1 4
[0524] Sekvence nukleotida sens i antisens lanaca ovih agenasa date su u Tabeli 5.
Primer 7. Dizajn i sinteza hemijski modifikovanih agenasa koji ciljaju TTR
[0525] Dodatni agensi dvolančane RNKi koji ciljaju TTR su dizajnirani i sintetisani kao što je prethodno opisano.
[0526] Sekvence nukleotida nemodifikovanih sens i antisens lanaca ovih agenasa date su u Tabeli 6, a sekvence nukleotida modifikovanih sens i antisens lanaca ovih agenasa date su u Tabeli 7.
Tabela 5. Modifikovane sekvence sens i antisens lanca dsRNK TTR
1
1
1
1
1
Tabela 6. Nemodifikovane sekvence sens i antisens lanca dsRNK TTR
1
O
11
12
1
Tabela 7. Modifikovane sekvence sens i antisens lanca dsRNK TTR
1 4
1
1 7
8 9 0 1 2 3 4
1
Primer 8. Primena AD-65492 na majmune Cynomologous
1
[0527] Delotvornost AD-65492 je dalje procenjena primenom na majmune Cynomologous.
[0528] U prvom skupu eksperimenata, četiri grupe (grupa 1, 2, 3 i 7) supkutano su primile pojedinačnu dozu od 0,3 mg/kg (grupa 1); pojedinačnu dozu od 1 mg/kg (grupa 2); mesečnu dozu od 1 mg/kg tokom 4 meseca (QMx4) (grupa 7); ili mesečnu dozu od 3 mg/kg tokom 4 meseca (QMx4) (grupa 3).
[0529] Serum, plazma i proređeni uzorci jetre su sakupljeni pre doze i 3, 7, 10, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77, 84, 91, 98, 112, 126, 154, 175, 203, 230, 260, 290, 310, 335. i 364. dana za grupe 3 i 4.
[0530] Za grupe 1 i 2, serum je sakupljen -7. i -1. dana pre doze i 3, 7, 10, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77, 84, 91, 105. i 119. dana nakon doze; plazma je sakupljena 1. dana pre doze i 0,5, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 96 i 168 sati nakon doze.
[0531] Za grupe 3 i 7, serum je sakupljen -7. i -1. dana pre doze i 3, 7, 10, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77, 84, 91, 98, 112, 127, 155, 176, 204, 232, 260, 288, 316, 344. i 372. dana nakon doze; plazma je sakupljena 1. dana pre doze i 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 96 i 168 sati nakon doze; plazma je takođe sakupljena 85. dana pre doze i 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 96 i 168 sati nakon doze.
[0532] Za grupu 7, proređeni uzorci jetre su sakupljeni 1. dana, osam sati pre doze (tj.8 sati pre nego što je doza AD-65492 primenjena na ispitaniku, proređeni uzorak jetre je sakupljen od ispitanika); i 7. dana nakon doze; 22. dana; 29. dana, osam sati pre doze; 57. dana, osam sati pre doze: 85. dana, osam sati pre doze; 91. dana; 106. dana; i 141. dana.
[0533] Za grupu 3, proređeni uzorci jetre su sakupljeni nakon doze 29. dana, osam sati pre doze; 57. dana, osam sati pre doze; 85. dana, osam sati pre doze; 91. dana, 106. dana i 141. dana.
[0534] Serumski nivo proteina TTR je utvrđen kao što je prethodno opisano.
1
[0535] Slika 11 daje rezultate ovih studija i pokazuje robusnu supresiju ekspresije TTR koja je ostvarena primenom AD-65492. Podaci pokazuju da AD-65492 pruža supresiju ekspresije TTR više od 90% postojanu tokom približno 6 nedelja i 17 nedelja nakon finalne doze posle mesečnog doziranja tokom četiri meseca (QMx4) sa 1 mg/kg (grupa 7) AD-65492, odnosno 3 mg/kg AD-65492 (grupa 3). Podaci takođe pokazuju oko 40% potiskivanja ekspresije TTR 17 nedelja nakon finalne doze posle mesečnog doziranja tokom četiri meseca (QMx4) sa 1 mg/kg AD-65492 (grupa 7).
[0536] Podaci pokazuju da bi kvartalno doziranje ljudskih ispitanika sa AD-65492 bilo delotvorno u potiskivanju ekspresije TTR sa doznim nivoom između 1 mg/kg i 3 mg/kg, npr.
2 mg/kg, ako se pretpostavi 1:1 translacija između majmuna Cynomologous i ljudi.
[0537] U drugom skupu eksperimenata, tri grupe (grupa 9, 10 i 11; vidite Sliku 12), supkutano su primile mesečnu dozu od 0,3 mg/kg tokom 6 meseci (QMx6) (grupa 9); mesečnu dozu od 0,6 mg/kg tokom 6 meseci (QMx6) (grupa 10); ili inicijalnu dozu od 1 mg/kg praćenu mesečnom dozom za održavanje od 0,3 mg/kg tokom jednog meseca (QMx1) nakon inicijalne doze tokom pet meseci (QMx5) (grupa 11).
[0538] Uzorci seruma su sakupljeni -7. i -1. dana pre doze i 4, 8, 11, 15, 22, 29, 36, 43, 50, 57, 64, 71, 78, 85, 92, 99, 113, 127, 155, 176. i 204, 232, 260. i 288. nakon doze. Serumski nivo proteina TTR je utvrđen kao što je prethodno opisano.
[0539] Slika 13 daje rezultate ovih studija i pokazuje robusnu supresiju TTR ostvarenu sa AD-65492 nakon mesečne doze od 0,6 mg/kg tokom dva meseca (QMx2) koja može da se uporedi sa potiskivanjem ekspresije TTR nakon inicijalne doze od 1 mg/kg. Podaci takođe pokazuju da AD-65492 obezbeđuje potiskivanje ekspresije TTR oko 80% postojano nakon mesečnog doziranja tokom dva meseca sa 0,3 mg/kg; tri od četiri majmuna su ostvarila 60%-85% supresije TTR nakon mesečnih doza AD-65492 od 0,3 mg/kg tokom dva meseca.
Pokazano je potiskivanja ekspresije TTR do 90% nakon jedne doze od 1 mg/kg, dok je druga doza od 0,3 mg/kg održala najnižu tačku tokom tri nedelje nakon druge doze.
Ekvivalenti:
1
[0540] Osobe sa veštinama u struci će prepoznati, ili će moći da utvrde uz pomoć rutinskih eksperimenata, mnoge ekvivalente specifičnih otelotvorenja i postupaka koji su ovde opisani.
1 1
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
21
21
21
21
21
21
21
22
22
22
22
22
22
22
2
21
22
2
24
2

Claims (16)

  1. Patentni zahtevi 1. Agens dvolančane ribonukleinske kiseline (RNKi) za inhibiciju ekspresije transtiretina (TTR) u ćeliji, pri čemu, navedeni agens RNKi sadrži sens lanac komplementaran sa antisens lancem, pri čemu navedeni antisens lanac sadrži region komplementaran sa SEQ ID NO:2, pri čemu je svaki lanac dužine 14 do 30 nukleotida, pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, pri čemu sens lanac sadrži ne više od 82'-fluor modifikacija; pri čemu antisens lanac sadrži ne više od 62'-fluor modifikacija; pri čemu sens lanac i antisens lanac svaki nezavisno sadrže dve fosforotioatne veze na 5'-terminusu; i pri čemu je sens lanac konjugovan sa najmanje jednim ligandom.
  2. 2. Agens dvolančane RNKi iz zahteva 1, pri čemu je pomenuti agens dvolančane RNKi predstavljen formulom (IIIe):
    pri čemu: np' je prepust od 2 nukleotida i svaki nukleotid u np' je povezan sa susednim nukleotidom putem fosforotioatne veze; svaki Na, Nb, Na' i Nb' nezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 0-25 nukleotida koji su modifikovani ili nemodifikovani ili kombinacija prethodnog, i svaka sekvenca sadrži najmanje dva različito modifikovana nukleotida; svaki YYY i Y'Y'Y' nezavisno predstavlja jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida.
  3. 3. Agens dvolančane RNKi iz zahteva 2, pri čemu: I) YYY motiv se javlja na mestu cepanja sens lanca ili blizu njega; II) Y'Y'Y' motiv se javlja na pozicijama 11, 12 i 13 antisens lanca od 5'-kraja; III) Y nukleotidi sadrže 2'-fluor modifikaciju; IV) Y' nukleotidi sadrže 2'-O-metil modifikaciju; V) dvolančani region ima dužinu od 15-30, 17-23, 17-25, 23-27, 19-21 ili 21-23 para nukleotida; ili VI) svaki lanac ima 15-30 ili 19-30 nukleotida. 2
  4. 4. Agens dvolančane RNKi iz zahteva 1, pri čemu: I) modifikacije na nukleotidima su izabrane iz grupe koja se sastoji od dezoksi nukleotida, 3'-terminalnog nukleotida dezoksitimina (dT), 2'-O-metil modifikovanog nukleotida, 2'-fluor modifikovanog nukleotida, 2'-dezoksi-modifikovanog nukleotida, zaključanog nukleotida, otključanog nukleotida, konformaciono ograničenog nukleotida, ograničenog etil nukleotida, abaznog nukleotida, 2'-amino-modifikovanog nukleotida, 2'-O-alil-modifikovanog nukleotida, 2'-C-alkil-modifikovanog nukleotida, 2'-hidroksil-modifikovanog nukleotida, 2'-metoksietil modifikovanog nukleotida, 2'-O-alkil-modifikovanog nukleotida, morfolino nukleotida, fosforamidata, nukleotida koji sadrži neprirodnu bazu, tetrahidropiranom modifikovanog nukleotida, 1,5-anhidroheksitolom modifikovanog nukleotida, cikloheksenilom modifikovanog nukleotida, nukleotida koji sadrži fosforotioatnu grupu, nukleotida koji sadrži metilfosfonatnu grupu, nukleotida koji sadrži 5'-fosfat i nukleotida koji sadrži imitaciju 5'-fosfata, i njihovih kombinacija, opciono pri čemu su modifikacije na nukleotidima 2'-O-metil ili 2'-fluor modifikacije; II) sens lanac sadrži ne više od 6, 5 ili 42'-fluor modifikacije; III) antisens lanac sadrži ne više od 5, 4, 3 ili 22'-fluor modifikacije; IV) agens dvolančane RNKi dalje sadrži 5'-fosfat ili imitaciju 5'-fosfata na 5' nukleotidu antisens lanca; V) agens dvolančane RNKi dalje sadrži imitaciju 5'-fosfata na 5' nukleotidu antisens lanca, opciono pri čemu je imitacija 5'-fosfata 5'-vinil fosfat (5'-VP); VI) ligand je jedan ili više derivata GalNAc povezanih putem dvovalentnog ili trovalentnog razgranatog linkera; VII) ligand je
    VIII) ligand je povezan sa 3' krajem sens lanca, opciono pri čemu je agens RNKi konjugovan sa ligandom kao što je prikazano na sledećoj šemi
    pri čemu, X je O ili S; IX) antisens lanac sadrži sekvencu nukleotida odabranu iz grupe koja se sastoji od 5'-usCfsuugguuacaugAfaaucccasusc-3' (SEQ ID NO: 6), 5'-usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3' (SEQ ID NO: 7), 5'-UfsCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3' (SEQ ID NO: 8) i 5'-VPusCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3' (SEQ ID NO: 9), pri čemu, a, c, g i u su 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G, odnosno U; Af, Cf, Gf i Uf su 2'-fluor A, C, G, odnosno U; s je fosforotioatna veza; i VP je imitacija 5'-fosfata; X) sens i antisens lanci sadrže sekvence nukleotida odabrane iz grupe koja se sastoji od 5'-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3' (SEQ ID NO: 10) i 5'-usCfsuugguuacaugAfaaucccasusc-3' (SEQ ID NO: 6); 5'-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3' (SEQ ID NO: 10) i 5'-usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3' (SEQ ID NO: 7); 5'-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3' (SEQ ID NO: 10) i 5'-UfsCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3' (SEQ ID NO: 8); i 5'-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3' (SEQ ID NO: 10) i 5'-VPusCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3' (SEQ ID NO: 9), pri čemu, a, c, g i u su 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G, odnosno U; Af, Cf, Gf i Uf su 2'-fluor A, C, G, odnosno U; i s je fosforotioatna veza; i VP je imitacija 5'-fosfata; ili XI) navedeni agens RNKi je odabran iz grupe agenasa RNKi koji su navedeni u bilo kojoj od Tabela 1, 3, 5, 6 ili 7.
  5. 5. Agens dvolančane RNKi iz zahteva 1, pri čemu sens i antisens lanci sadrže sekvence nukleotida 5'-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3' (SEQ ID NO: 10) i 5'-usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3' (SEQ ID NO: 7), 2 pri čemu, a, c, g i u su 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G, odnosno U; Af, Cf, Gf i Uf su 2'-fluor A, C, G, odnosno U; i s je fosforotioatna veza.
  6. 6. Agens dvolančane RNKi iz zahteva 5, pri čemu, sens i antisens lanci se sastoje od sekvenci nukleotida 5'-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3' (SEQ ID NO: 10) i 5'-usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3' (SEQ ID NO: 7), pri čemu, a, c, g i u su 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G, odnosno U; Af, Cf, Gf i Uf su 2'-fluor A, C, G, odnosno U; i s je fosforotioatna veza pri čemu je ligand povezan sa 3' krajem sens lanca, pri čemu, agens RNKi je konjugovan sa ligandom kao što je prikazano na sledećoj šemi
    pri čemu, X je O.
  7. 7. Ćelija koja sadrži agens dvolančane RNKi iz bilo kog od zahteva 1 do 6.
  8. 8. Farmaceutska kompozicija koja sadrži agens dvolančane RNKi iz bilo kog od zahteva 1 do 6, opciono, pri čemu: I) agens dvolančane RNKi se primenjuje u nepuferovanom rastvoru, opciono pri čemu je navedeni nepuferovani rastvor fiziološki rastvor ili voda; ili II) navedeni agens dvolančane RNKi se primenjuje sa puferskim rastvorom, pri čemu opciono a) navedeni puferski rastvor sadrži acetat, citrat, prolamin, karbonat ili fosfat ili bilo koju njihovu kombinaciju, ili b) navedeni puferski rastvor je fiziološki rastvor puferovan fosfatom (PBS).
  9. 9. In vitro postupak za inhibiciju ekspresije transtiretina (TTR) u ćeliji, pri čemu postupak obuhvata: 2 dovođenje ćelije u kontakt sa agensom dvolančane RNKi iz bilo kog od zahteva 1 do 6 ili sa farmaceutskom kompozicijom iz zahteva 8, čime se inhibira ekspresija gena TTR u ćeliji, pri čemu je ekspresija TTR opciono inhibirana za najmanje oko 10%, oko 15%, oko 20%, oko 25%, oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 90%, oko 95%, oko 98% ili oko 100%.
  10. 10. Agens dvolančane RNKi iz bilo kod od zahteva 1 do 6 ili kompozicija iz zahteva 8 za upotrebu u postupku za lečenje ispitanika koji boluje od bolesti povezane sa TTR-om ili je pod rizikom od nastanka bolesti povezane sa TTR-om, koji obuhvata primenu na ispitaniku terapeutski delotvorne količine ili profilaktički delotvorne količine agensa dvolančane RNKi ili farmaceutske kompozicije, čime se navedeni ispitanik leči.
  11. 11. Agens dvolančane RNKi iz bilo kog od zahteva 1 do 6 ili kompozicija iz zahteva 8 za upotrebu u: I) postupku za smanjenje, usporavanje ili zaustavljanje skora neuropatskog oštećenja (NIS) ili modifikovanog NIS (mNIS+7) kod ispitanika koji boluje od bolesti povezane sa TTR-om ili je pod rizikom od nastanka bolesti povezane sa TTR-om, koji obuhvata primenu na ispitaniku terapeutski delotvorne količine ili profilaktički delotvorne količine agensa dvolančane RNKi ili farmaceutske kompozicije, čime se smanjuje, usporava ili zaustavlja skor neuropatskog oštećenja (NIS) ili modifikovani NIS (mNIS+7) kod navedenog ispitanika; ili II) postupak za povećanje 6-minutnog testa hoda (6MWT) kod ispitanika koji boluje od bolesti povezane sa TTR-om ili je pod rizikom od nastanka bolesti povezane sa TTR-om, koji obuhvata primenu na ispitaniku terapeutski delotvorne količine ili profilaktički delotvorne količine agensa dvolančane RNKi ili farmaceutske kompozicije, čime se povećava 6-minutni test hoda (6MWT) kod navedenog ispitanika.
  12. 12. Agens ili kompozicija dvolančane RNKi za upotrebu iz zahteva 10 ili 11, pri čemu: I) ispitanik je čovek; II) navedeni ispitanik boluje od bolesti povezane sa TTR-om; III) navedeni ispitanik je ispitanik sa rizikom nastanka bolesti povezane sa TTR-om; IV) navedeni ispitanik ima mutaciju gena TTR koja je povezana sa nastankom bolesti povezana sa TTR-om; V) navedena bolest povezana sa TTR-om je izabrana iz grupe koja se sastoji od senilne sistemske amiloidoze (SSA), sistemske familijarne amiloidoze, familijarne amiloidne 24 polineuropatije (FAP), familijarne amiloidne kardiomiopatije (FAC), leptomeningealne amiloidoze/amiloidoze centralnog nervnog sistema (CNS) i hipertiroksinemije; VI) navedeni ispitanik ima amiloidozu povezanu sa TTR-om i navedeni postupak smanjuje amiloidne naslage TTR kod navedenog ispitanika; VII) navedeni agens dvolančane RNKi se primenjuje na navedenom ispitaniku načinom primene koji je izabran iz grupe koja se sastoji od supkutane, intravenske, intramuskularne, intrabronhijalne, intrapleuralne, intraperitonealne, intraarterijske, limfatične, cerebrospinalne primene i bilo kojih njihovih kombinacija; VIII) navedeni agens dvolančane RNKi se primenjuje na navedenom ispitaniku supkutanom, intramuskularnom ili intravenskom primenom; IX) navedeni agens dvolančane RNKi se primenjuje na navedenom ispitaniku supkutanom primenom, opciono pri čemu je supkutana primena samoprimena, opciono pri čemu je samoprimena pomoću prethodno napunjenog šprica ili šprica sa automatskim injektovanjem, agens dvolančane RNKi se opciono hronično primenjuje na ispitaniku na svake 4 nedelje, na svakih 5 nedelja ili na svakih šest nedelja; ili X) postupak dalje obuhvata procenu nivoa ekspresije mRNK TTR ili ekspresije proteina TTR u uzorku dobijenom od ispitanika.
  13. 13. Agens dvolančane RNKi iz bilo kog od zahteva 1 do 6 za upotrebu u: I) postupku lečenja ispitanika koji boluje od bolesti povezane sa TTR-om ili je pod rizikom od nastanka bolesti povezane sa TTR-om, koji obuhvata primenu na ispitaniku fiksne doze od oko 50 mg do oko 250 mg agensa dvolančane ribonukleinske kiseline (RNKi); II) postupku za smanjenje, usporavanje ili zaustavljanje skora neuropatskog oštećenja (NIS) ili modifikovanog NIS (mNIS+7) kod ispitanika koji boluje od bolesti povezane sa TTR-om ili je pod rizikom od nastanka bolesti povezane sa TTR-om, koji obuhvata primenu na ispitaniku fiksne doze od oko 50 mg do oko 250 mg agensa dvolančane ribonukleinske kiseline (RNKi); ili III) postupku za povećanja 6-minutnog testa hoda (6MWT) kod ispitanika koji boluje od bolesti povezane sa TTR-om ili je pod rizikom od nastanka bolesti povezane sa TTR-om, koji obuhvata primenu na ispitaniku fiksne doze od oko 50 mg do oko 250 mg agensa dvolančane ribonukleinske kiseline (RNKi)
  14. 14. Agens dvolančane RNKi za upotrebu iz zahteva 13, pri čemu: I) agens dvolančane RNKi se primenjuje na ispitaniku sa fiksnom dozom od oko 50 mg, 75 mg, 100 mg, 125 mg, 150 mg, 175 mg, 200 mg, 225 mg ili 250 mg; II) fiksna doza agensa dvolančane RNKi se primenjuje na ispitaniku jednom na svake 4 nedelje, svakih 5 nedelja, svakih 6 nedelja, svakih 8 nedelja ili kvartalno; III) fiksna doza agensa dvolančane RNKi se primenjuje na ispitaniku otprilike jednom u svakom kvartalu; IV) agens dvolančane RNKi se hronično primenjuje na ispitaniku; V) ispitanik je čovek, pri čemu je navedeni ispitanik opciono ispitanik koji boluje od bolesti povezane sa TTR-om ili je navedeni ispitanik ispitanik sa rizikom od nastanka bolesti povezane sa TTR-om; VI) navedeni ispitanik ima mutaciju gena TTR koja je povezana sa nastankom bolesti povezane sa TTR-om, pri čemu je bolest povezana sa TTR-om izabrana iz grupe koja se sastoji od senilne sistemske amiloidoze (SSA), sistemske familijarne amiloidoze, familijarne amiloidne polineuropatije (FAP), familijarne amiloidne kardiomiopatije (FAC), leptomeningealne amiloidoze/amiloidoze centralnog nervnog sistema (CNS) i hipertiroksinemije; VII) navedeni ispitanik ima amiloidozu povezanu sa TTR-om i navedeni postupak smanjuje amiloidne naslage TTR kod navedenog ispitanika; VIII) navedeni agens dvolančane RNKi se primenjuje na navedenom ispitaniku a) načinom primene koji je izabran iz grupe koja se sastoji od supkutane, intravenske, intramuskularne, intrabronhijalne, intrapleuralne, intraperitonealne, intraarterijske, limfatične, cerebrospinalne primene i bilo kojih njihovih kombinacija, b) navedeni agens dvolančane RNKi se primenjuje na navedenom ispitaniku supkutanom, intramuskularnom ili intravenskom primenom, ili c) navedeni agens dvolančane RNKi se primenjuje na navedenom ispitaniku supkutanom primenom, opciono pri čemu je supkutana primena samoprimena, opciono pri čemu je samoprimena pomoću prethodno napunjenog šprica ili šprica sa automatskim injektovanjem; ili IX) postupak dalje obuhvata procenu nivoa ekspresije mRNK TTR ili ekspresije proteina TTR u uzorku dobijenom od ispitanika.
  15. 15. Agens dvolančane RNKi za upotrebu iz bilo kog od zahteva 10 do 14, pri čemu sens i antisens lanci agensa sadrže sekvence nukleotida 5'- usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga - 3' (SEQ ID NO: 10) i 5'- usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc - 3' (SEQ ID NO: 7), pri čemu, a, c, g i u su 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G, odnosno U; Af, Cf, Gf i Uf su 2'-fluor A, C, G, odnosno U; i s je fosforotioatna veza.
  16. 16. Agens dvolančane RNKi za upotrebu iz zahteva 15, pri čemu, sens i antisens lanci se sastoje od sekvenci nukleotida 5'-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3' (SEQ ID NO: 10) i 5'-usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3' (SEQ ID NO: 7), pri čemu, a, c, g i u su 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G, odnosno U; Af, Cf, Gf i Uf su 2'-fluor A, C, G, odnosno U; i s je fosforotioatna veza pri čemu je ligand povezan sa 3' krajem sens lanca, pri čemu, agens RNKi je konjugovan sa ligandom kao što je prikazano na sledećoj šemi
    pri čemu, X je O. 24
RS20210015A 2015-07-31 2016-07-28 Transtiretinske (ttr) kompozicije irnk i postupci za njihovu primenu u lečenju ili prevenciji bolesti povezanih sa ttr-om RS61297B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562199563P 2015-07-31 2015-07-31
US201662287518P 2016-01-27 2016-01-27
PCT/US2016/044359 WO2017023660A1 (en) 2015-07-31 2016-07-28 TRANSTHYRETIN (TTR) iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF FOR TREATING OR PREVENTING TTR-ASSOCIATED DISEASES
EP16750567.6A EP3329002B1 (en) 2015-07-31 2016-07-28 Transthyretin (ttr) irna compositions and methods of use thereof for treating or preventing ttr-associated diseases

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS61297B1 true RS61297B1 (sr) 2021-02-26

Family

ID=56682264

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210015A RS61297B1 (sr) 2015-07-31 2016-07-28 Transtiretinske (ttr) kompozicije irnk i postupci za njihovu primenu u lečenju ili prevenciji bolesti povezanih sa ttr-om

Country Status (35)

Country Link
US (5) US10208307B2 (sr)
EP (1) EP3329002B1 (sr)
JP (4) JP6896703B2 (sr)
KR (2) KR20240074895A (sr)
CN (2) CN116064515A (sr)
BR (1) BR112018000542B1 (sr)
CA (1) CA2994285A1 (sr)
CL (1) CL2018000198A1 (sr)
CY (1) CY1124545T1 (sr)
DK (1) DK3329002T3 (sr)
EA (1) EA201890394A1 (sr)
ES (1) ES2842300T3 (sr)
FI (1) FIC20230006I1 (sr)
FR (1) FR23C1008I2 (sr)
HK (1) HK1256683A1 (sr)
HR (1) HRP20202082T1 (sr)
HU (2) HUE051998T2 (sr)
IL (4) IL296476B2 (sr)
LT (2) LT3329002T (sr)
LU (1) LUC00297I2 (sr)
MA (1) MA43335B1 (sr)
MX (2) MX2018000981A (sr)
MY (1) MY195720A (sr)
NL (1) NL301216I2 (sr)
NO (1) NO2023007I1 (sr)
PL (1) PL3329002T3 (sr)
PT (1) PT3329002T (sr)
RS (1) RS61297B1 (sr)
SG (1) SG10201912341SA (sr)
SI (1) SI3329002T1 (sr)
SM (1) SMT202100020T1 (sr)
TW (4) TW202532647A (sr)
UA (1) UA126276C2 (sr)
WO (1) WO2017023660A1 (sr)
ZA (2) ZA201800571B (sr)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3222620A1 (en) 2008-10-20 2010-04-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of transthyretin
EP2370451B1 (en) 2008-12-02 2016-11-16 Wave Life Sciences Japan, Inc. Method for the synthesis of phosphorus atom modified nucleic acids
KR101885383B1 (ko) 2009-07-06 2018-08-03 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 신규한 핵산 프로드러그 및 그의 사용 방법
KR20180026798A (ko) 2010-04-29 2018-03-13 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 트랜스티레틴 발현의 조절
US10428019B2 (en) 2010-09-24 2019-10-01 Wave Life Sciences Ltd. Chiral auxiliaries
EP2734208B1 (en) 2011-07-19 2017-03-01 Wave Life Sciences Ltd. Methods for the synthesis of functionalized nucleic acids
LT3366775T (lt) 2011-11-18 2022-08-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modifikuoti rnri agentai
RU2678807C2 (ru) 2011-11-18 2019-02-01 Элнилэм Фармасьютикалз, Инк. СРЕДСТВА ДЛЯ РНКи, КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ТРАНСТИРЕТИНОМ (TTR)
CN104661664B (zh) 2012-07-13 2020-07-03 波涛生命科学有限公司 手性控制
PL2872485T3 (pl) 2012-07-13 2021-05-31 Wave Life Sciences Ltd. Asymetryczna grupa pomocnicza
WO2015108047A1 (ja) 2014-01-15 2015-07-23 株式会社新日本科学 免疫誘導活性を有するキラル核酸アジュバンド及び免疫誘導活性剤
JPWO2015108048A1 (ja) 2014-01-15 2017-03-23 株式会社新日本科学 抗腫瘍作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗腫瘍剤
EP4137572A1 (en) 2014-01-16 2023-02-22 Wave Life Sciences Ltd. Chiral design
JP6896703B2 (ja) 2015-07-31 2021-06-30 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． ＴＴＲ関連疾患を治療または予防するためのトランスサイレチン（ＴＴＲ）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法
JOP20210043A1 (ar) * 2015-10-01 2017-06-16 Arrowhead Pharmaceuticals Inc تراكيب وأساليب لتثبيط تعبير جيني للـ lpa
KR20190098181A (ko) * 2016-12-16 2019-08-21 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 트랜스티레틴(TTR) iRNA 조성물을 사용하여 TTR-관련 질병을 치료하거나 예방하는 방법
US11806360B2 (en) 2017-09-19 2023-11-07 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating transthyretin (TTR) mediated amyloidosis
CA3083968C (en) * 2017-12-01 2024-04-23 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Double-stranded oligonucleotide, composition and conjugate comprising double-stranded oligonucleotide, preparation method thereof and use thereof
AU2019350765A1 (en) 2018-09-28 2021-05-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Transthyretin (TTR) iRNA compositions and methods of use thereof for treating or preventing TTR-associated ocular diseases
EP4022062A1 (en) 2019-08-30 2022-07-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Neurofilament light chain (nfl) as a biomarker for transthyretin amyloidosis polyneuropathy
EP4055165A1 (en) * 2019-11-06 2022-09-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Transthyretin (ttr) irna compositions and methods of use thereof for treating or preventing ttr-associated ocular diseases
KR20220152270A (ko) * 2020-03-06 2022-11-15 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 트랜스티레틴 (ttr)의 발현을 억제하기 위한 조성물 및 방법
JP2023548005A (ja) * 2020-10-28 2023-11-15 ノヴォ ノルディスク アー／エス 抗トランスサイレチン抗体およびその使用方法
AU2022242899A1 (en) * 2021-03-24 2023-11-09 Atalanta Therapeutics, Inc. Double-stranded sirna having patterned chemical modifications
EP4351541A2 (en) 2021-06-08 2024-04-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating or preventing stargardt's disease and/or retinal binding protein 4 (rbp4)-associated disorders
CN117795074A (zh) 2021-08-03 2024-03-29 阿尔尼拉姆医药品有限公司 转甲状腺素蛋白（TTR）iRNA组合物和其使用方法
EP4634385A2 (en) * 2022-12-16 2025-10-22 Amgen Inc. Rnai constructs for inhibiting ttr expression and methods of use thereof
WO2025072748A2 (en) 2023-09-29 2025-04-03 Insitro, Inc. Compositions and methods for treating nonalcoholic fatty liver disease
WO2025077916A1 (zh) * 2023-10-13 2025-04-17 北京安龙生物医药有限公司 靶向转甲状腺素蛋白的寡核苷酸及其用途
WO2025098117A1 (zh) * 2023-11-06 2025-05-15 成都倍特药业股份有限公司 一种抑制甲状腺素转运蛋白(TTR)表达的RNAi试剂、组合物及应用
WO2025113470A1 (en) * 2023-11-27 2025-06-05 Shanghai Argo Biopharmaceutical Co., Ltd. Compositions and methods for inhibiting expression of transthyretin (ttr)
US20250333742A1 (en) 2024-04-25 2025-10-30 Insitro, Inc. Compositions and methods for treating metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease

Family Cites Families (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030027216A1 (en) 2001-07-02 2003-02-06 Kiernan Urban A. Analysis of proteins from biological fluids using mass spectrometric immunoassay
WO2005121371A2 (en) 2004-06-03 2005-12-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double strand compositions comprising differentially modified strands for use in gene modulation
WO2001057064A2 (en) 2000-02-07 2001-08-09 Roche Diagnostics Corporation Cationic amphiphiles for use in nucleic acid transfection
US20030072794A1 (en) 2000-06-09 2003-04-17 Teni Boulikas Encapsulation of plasmid DNA (lipogenes™) and therapeutic agents with nuclear localization signal/fusogenic peptide conjugates into targeted liposome complexes
IL155991A0 (en) 2000-12-01 2003-12-23 Max Planck Gesellschaft Rna interference mediating small rna molecules
US20020160394A1 (en) 2001-01-24 2002-10-31 Bayer Corporation Regulation of transthyretin to treat obesity
EP1386004A4 (en) 2001-04-05 2005-02-16 Ribozyme Pharm Inc MODULATION OF GENE EXPRESSION ASSOCIATED WITH INFLAMMATORY PROLIFERATION AND GROWTH OF NEURITIES BY METHODS INVOLVING NUCLEIC ACID
US20030170891A1 (en) 2001-06-06 2003-09-11 Mcswiggen James A. RNA interference mediated inhibition of epidermal growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
AU2002318396A1 (en) 2001-06-21 2003-01-08 The Cleveland Clinic Foundation Homocysteinylated transthyretin
US20030191056A1 (en) 2002-04-04 2003-10-09 Kenneth Walker Use of transthyretin peptide/protein fusions to increase the serum half-life of pharmacologically active peptides/proteins
BRPI0313202A8 (pt) 2002-08-05 2016-08-16 Atugen Ag Formas adicionais para interferir com as moléculas de rna
US7956176B2 (en) 2002-09-05 2011-06-07 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
WO2004042072A2 (en) 2002-11-01 2004-05-21 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Quantitative analysis of protein isoforms using matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry
US9228186B2 (en) 2002-11-14 2016-01-05 Thermo Fisher Scientific Inc. Methods and compositions for selecting siRNA of improved functionality
EP2305813A3 (en) 2002-11-14 2012-03-28 Dharmacon, Inc. Fuctional and hyperfunctional sirna
US7250496B2 (en) 2002-11-14 2007-07-31 Rosetta Genomics Ltd. Bioinformatically detectable group of novel regulatory genes and uses thereof
US8110674B2 (en) 2003-03-07 2012-02-07 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic compositions
EP1608735A4 (en) 2003-04-03 2008-11-05 Alnylam Pharmaceuticals RNAI CONJUGATES
CN101291653B (zh) 2003-07-16 2012-06-27 普洛体维生物治疗公司 脂质包封的干扰rna
US20050244869A1 (en) 2004-04-05 2005-11-03 Brown-Driver Vickie L Modulation of transthyretin expression
WO2005120152A2 (en) 2004-06-07 2005-12-22 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods of use
EP1766035B1 (en) 2004-06-07 2011-12-07 Protiva Biotherapeutics Inc. Lipid encapsulated interfering rna
US7838561B2 (en) 2004-06-14 2010-11-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Method for preventing or treating cardiac hypertrophy
EP2289500A1 (en) 2004-12-08 2011-03-02 ReVision Therapeutics, Inc. Retinol binding protein and transthyretin modulators for treating hypertosis, Alzheimer's disease or idiopathic intracranial hypertension
CA2597724A1 (en) 2005-02-14 2007-08-02 Sirna Therapeutics, Inc. Cationic lipids and formulated molecular compositions containing them
TWI335352B (en) 2005-03-31 2011-01-01 Calando Pharmaceuticals Inc Inhibitors of ribonucleotide reductase subunit 2 and uses thereof
US7915230B2 (en) 2005-05-17 2011-03-29 Molecular Transfer, Inc. Reagents for transfection of eukaryotic cells
US9005654B2 (en) 2005-07-27 2015-04-14 Protiva Biotherapeutics, Inc. Systems and methods for manufacturing liposomes
CN101346393B (zh) 2005-11-02 2015-07-22 普洛体维生物治疗公司 修饰的siRNA分子及其应用
CA2873833A1 (en) 2006-03-31 2007-10-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of eg5 gene
US8598333B2 (en) 2006-05-26 2013-12-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. SiRNA silencing of genes expressed in cancer
AU2007303205A1 (en) 2006-10-03 2008-04-10 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Lipid containing formulations
GB0704764D0 (en) 2007-03-12 2007-04-18 Electrophoretics Ltd Isobarically labelled reagents and methods of their use
US20110046206A1 (en) 2007-06-22 2011-02-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double strand compositions comprising differentially modified strands for use in gene modulation
JP5635412B2 (ja) 2007-12-04 2014-12-03 アルニラム ファーマスーティカルズ インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 標的化脂質
EP2238251B1 (en) 2007-12-27 2015-02-11 Protiva Biotherapeutics Inc. Silencing of polo-like kinase expression using interfering rna
EP3100718B1 (en) 2008-01-02 2019-11-27 Arbutus Biopharma Corporation Improved compositions and methods for the delivery of nucleic acids
MX2010008394A (es) 2008-01-31 2010-11-12 Alnylam Pharmaceuticals Inc Metodos optimizados para administracion de arndc focalizando el gen pcsk9.
US20100323381A1 (en) 2008-02-08 2010-12-23 Bergen Iii Harold R Classifying amyloidosis
AU2009238175C1 (en) 2008-04-15 2023-11-30 Arbutus Biopharma Corporation Novel lipid formulations for nucleic acid delivery
TWI455944B (zh) 2008-07-01 2014-10-11 Daiichi Sankyo Co Ltd 雙股多核苷酸
US20110237646A1 (en) 2008-08-07 2011-09-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of transthyretin expression for the treatment of cns related disorders
EP2350043B9 (en) 2008-10-09 2014-08-20 TEKMIRA Pharmaceuticals Corporation Improved amino lipids and methods for the delivery of nucleic acids
CA3222620A1 (en) 2008-10-20 2010-04-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of transthyretin
MX353900B (es) 2008-11-07 2018-02-01 Massachusetts Inst Technology Lipidoides de aminoalcohol y usos de los mismos.
CN111909020A (zh) 2008-11-10 2020-11-10 阿布特斯生物制药公司 用于递送治疗剂的脂质和组合物
WO2010078536A1 (en) 2009-01-05 2010-07-08 Rxi Pharmaceuticals Corporation Inhibition of pcsk9 through rnai
US20120101148A1 (en) 2009-01-29 2012-04-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. lipid formulation
KR20240015723A (ko) 2009-05-05 2024-02-05 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 지질 조성물
CA2764609C (en) 2009-06-10 2018-10-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Improved cationic lipid of formula i
CN102458366B (zh) 2009-06-15 2015-02-11 阿尔尼拉姆医药品有限公司 靶向pcsk9基因的脂质配制的dsrna
WO2010147992A1 (en) 2009-06-15 2010-12-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods for increasing efficacy of lipid formulated sirna
US9101643B2 (en) 2009-11-03 2015-08-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of transthyretin (TTR)
ES2893199T3 (es) 2010-03-29 2022-02-08 Alnylam Pharmaceuticals Inc Terapia de ARNbc para amiloidosis ocular relacionada con transtiretina (TTR)
US20230340473A1 (en) 2010-03-29 2023-10-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Sirna therapy for transthyretin (ttr) related ocular amyloidosis
KR20180026798A (ko) 2010-04-29 2018-03-13 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 트랜스티레틴 발현의 조절
AU2011302152B2 (en) 2010-09-15 2015-06-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified iRNA agents
WO2012058210A1 (en) 2010-10-29 2012-05-03 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACIDS (siNA)
US9339513B2 (en) 2010-11-09 2016-05-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of Eg5 and VEGF genes
AU2012272908A1 (en) 2011-06-21 2013-12-19 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Assays and methods for determining activity of a therapeutic agent in a subject
LT3366775T (lt) 2011-11-18 2022-08-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modifikuoti rnri agentai
RU2678807C2 (ru) 2011-11-18 2019-02-01 Элнилэм Фармасьютикалз, Инк. СРЕДСТВА ДЛЯ РНКи, КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ТРАНСТИРЕТИНОМ (TTR)
WO2013166041A1 (en) 2012-05-01 2013-11-07 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Transthyretin ligands capable of inhibiting retinol-dependent rbp4-ttr interaction for treatment of age-related macular
EP2880162B1 (en) 2012-08-03 2017-07-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified rnai agents
TW201610151A (zh) * 2013-09-23 2016-03-16 阿尼拉製藥公司 治療或預防與甲狀腺素運載蛋白相關疾病之方法
WO2015085158A1 (en) 2013-12-06 2015-06-11 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the specific inhibition of transthyretin (ttr) by double-stranded rna
SG11201604692UA (en) * 2013-12-12 2016-07-28 Alnylam Pharmaceuticals Inc Complement component irna compositions and methods of use thereof
IL316808A (en) 2014-08-20 2025-01-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc Modified double-stranded RNA materials and their uses
US10060921B2 (en) 2014-08-29 2018-08-28 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating transthyretin (TTR) mediated amyloidosis
WO2016080853A1 (en) 2014-11-21 2016-05-26 Bsim2 – Biomolecular Simulations Lda 2-thioxothiazolidin-4-one derivatives active as transthyretin ligands and uses thereof
JP6896703B2 (ja) 2015-07-31 2021-06-30 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． ＴＴＲ関連疾患を治療または予防するためのトランスサイレチン（ＴＴＲ）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法
KR20190098181A (ko) 2016-12-16 2019-08-21 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 트랜스티레틴(TTR) iRNA 조성물을 사용하여 TTR-관련 질병을 치료하거나 예방하는 방법
US11806360B2 (en) 2017-09-19 2023-11-07 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating transthyretin (TTR) mediated amyloidosis
AU2019350765A1 (en) 2018-09-28 2021-05-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Transthyretin (TTR) iRNA compositions and methods of use thereof for treating or preventing TTR-associated ocular diseases
EP4022062A1 (en) 2019-08-30 2022-07-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Neurofilament light chain (nfl) as a biomarker for transthyretin amyloidosis polyneuropathy
EP4055165A1 (en) 2019-11-06 2022-09-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Transthyretin (ttr) irna compositions and methods of use thereof for treating or preventing ttr-associated ocular diseases
KR20220152270A (ko) 2020-03-06 2022-11-15 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 트랜스티레틴 (ttr)의 발현을 억제하기 위한 조성물 및 방법
WO2022235537A1 (en) 2021-05-03 2022-11-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating transthyretin (ttr) mediated amyloidosis
EP4351541A2 (en) 2021-06-08 2024-04-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating or preventing stargardt's disease and/or retinal binding protein 4 (rbp4)-associated disorders
CN117795074A (zh) 2021-08-03 2024-03-29 阿尔尼拉姆医药品有限公司 转甲状腺素蛋白（TTR）iRNA组合物和其使用方法

Also Published As

Publication number Publication date
LUC00297I2 (sr) 2025-09-22
US12049628B2 (en) 2024-07-30
US20250075211A1 (en) 2025-03-06
KR20180028537A (ko) 2018-03-16
NL301216I2 (nl) 2023-05-24
TW202130810A (zh) 2021-08-16
EA201890394A1 (ru) 2018-08-31
IL296476B1 (en) 2024-06-01
CN108138182A (zh) 2018-06-08
SI3329002T1 (sl) 2021-02-26
NO2023007I1 (no) 2023-02-07
MA43335A (fr) 2018-06-06
KR20240074895A (ko) 2024-05-28
MY195720A (en) 2023-02-07
US10208307B2 (en) 2019-02-19
IL296476A (en) 2022-11-01
US20170029817A1 (en) 2017-02-02
IL325313A (en) 2026-02-01
IL256614A (en) 2018-02-28
JP7711150B2 (ja) 2025-07-22
CN116064515A (zh) 2023-05-05
HUE051998T2 (hu) 2021-04-28
HK1256494A1 (en) 2019-09-27
HK1256683A1 (zh) 2019-10-04
TWI807302B (zh) 2023-07-01
PL3329002T3 (pl) 2021-04-19
JP2021167313A (ja) 2021-10-21
UA126276C2 (uk) 2022-09-14
IL256614B (en) 2022-10-01
MX2023012080A (es) 2023-10-25
US20190345492A1 (en) 2019-11-14
TW202532647A (zh) 2025-08-16
ES2842300T3 (es) 2021-07-13
SG10201912341SA (en) 2020-02-27
ZA201902447B (en) 2021-10-27
WO2017023660A1 (en) 2017-02-09
HUS2300007I1 (hu) 2023-02-28
NZ739169A (en) 2025-05-30
MA43335B1 (fr) 2021-01-29
LTPA2023505I1 (sr) 2023-02-27
US11286486B2 (en) 2022-03-29
FR23C1008I2 (fr) 2024-04-05
NZ778442A (en) 2025-05-30
BR112018000542B1 (pt) 2023-01-24
JP7417559B2 (ja) 2024-01-18
JP2018523655A (ja) 2018-08-23
US20200377889A1 (en) 2020-12-03
CY1124545T1 (el) 2022-07-22
IL256614B2 (en) 2023-02-01
IL296476B2 (en) 2024-10-01
MX2018000981A (es) 2018-06-11
TW202344688A (zh) 2023-11-16
IL313082A (en) 2024-07-01
EP3329002B1 (en) 2020-10-07
US10683501B2 (en) 2020-06-16
LTC3329002I2 (sr) 2024-11-11
JP6896703B2 (ja) 2021-06-30
FR23C1008I1 (fr) 2023-03-24
CN108138182B (zh) 2022-08-19
NL301216I1 (sr) 2023-02-08
CA2994285A1 (en) 2017-02-09
DK3329002T3 (da) 2021-01-11
JP2025165939A (ja) 2025-11-05
FIC20230006I1 (fi) 2023-02-06
EP3329002A1 (en) 2018-06-06
KR102667020B1 (ko) 2024-05-21
SMT202100020T1 (it) 2021-03-15
TWI727963B (zh) 2021-05-21
US20230022185A1 (en) 2023-01-26
CL2018000198A1 (es) 2018-07-20
JP2024028749A (ja) 2024-03-05
PT3329002T (pt) 2021-01-12
HRP20202082T1 (hr) 2021-02-19
TWI883468B (zh) 2025-05-11
IL313082B1 (en) 2026-02-01
TW201718855A (zh) 2017-06-01
ZA201800571B (en) 2019-07-31
BR112018000542A2 (pt) 2018-09-18
LT3329002T (lt) 2021-01-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7711150B2 (ja) ＴＴＲ関連疾患を治療または予防するためのトランスサイレチン（ＴＴＲ）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法
US11130953B2 (en) Angiopoietin-like 3 (ANGPTL3) iRNA compositions and methods of use thereof
US11136582B2 (en) Ketohexokinase (KHK) iRNA compositions and methods of use thereof
TWI790217B (zh) 使用甲狀腺素運載蛋白（ＴＴＲ）ｉＲＮＡ組成物於治療或預防ＴＴＲ相關疾病之方法
JP2023061967A (ja) Ｔｍｐｒｓｓ６ ｉｒｎａ組成物及びその使用方法
TW202129000A (zh) 含類馬鈴薯儲藏蛋白磷脂酶域３（ＰＮＰＬＡ３）ｉＲＮＡ組成物及其使用方法
RS57418B1 (sr) Serpina1 irnk sastavi i postupci njihove primene
RS62854B1 (sr) Kompozicije i postupci za inhibiciju ekspresije gena hao1 (oksidaza 1 hidroksilne kiseline (glikolat oksidaza))
EA043935B1 (ru) КОМПОЗИЦИИ НА ОСНОВЕ iRNA ДЛЯ ТРАНСТИРЕТИНА (TTR) И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИЛИ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ АССОЦИИРОВАННЫХ С TTR ЗАБОЛЕВАНИЙ
HK1256494B (en) Transthyretin (ttr) irna compositions and methods of use thereof for treating or preventing ttr-associated diseases