RS61152B1 - Terapeutski i dijagnostički postupci za lečenje raka - Google Patents

Description

[0001] OPIS

[0002] OBLAST PRONALASKA

[0003] Ovde se nalaze dijagnostički postupci i terapeutske kompozicije za nemikroćelijski karcinom pluća.

[0004] OSNOVA

[0005] Rak ostaje jedna od najsmrtonosnijih pretnji po ljudsko zdravlje. U SAD, skoro 1,3 miliona novih pacijenata svake godine dobije rak, i to je drugi vodeći uzrok smrti posle srčane bolesti, što je otprilike 1 u 4 slučaja. Na primer, rak pluća je najčešći oblik raka i vodeći ubica među ženama u Americi. Takođe se predviđa da bi rak mogao da premaši kardiovaskularne bolesti kao glavni uzrok smrti u roku od pet godina. Čvrsti tumori su odgovorni za većinu tih smrti. Iako je došlo do značajnog napretka u lečenju određenih vrsta raka, ukupna 5-godišnja stopa preživljavanja za sve vrste raka se popravila za samo 10% u proteklih 20 godina. Rak, ili maligni tumori, metastazira i raste brzo na nekontrolisan način, čineći blagovremeno otkrivanje i lečenje izuzetno teškim.

[0006] Ligand programirane smrti 1 (PD-L1) je protein koji je umešan u suzbijanje odgovora imunskog sistema tokom hroničnih infekcija, trudnoće, alografta tkiva, autoimunskih bolesti i raka. PD-L1 reguliše imunski odgovor povezivanjem na inhibitorni receptor, poznat kao programirana smrt 1 (PD-1), koji je eksprimiran na površini T-ćelija, B ćelija i monocita. PD-L1 takođe negativno reguliše funkciju T-ćelija kroz interakciju sa drugim receptorom, B7-1. Formiranje kompleksa PD-L1/PD-1 i PD-L1/B7-1 negativno reguliše signalizaciju receptora T-ćelija, što dovodi do smanjivanja regulacije aktiviranja T-ćelija i suzbijanja antitumorske imunske aktivnosti.

[0007] WO 2014/151006 otkriva da ekspresija PD-L1 ukazuje na veću verovatnoću reagovanja pacijenata obolelih od raka na lečenje anti-PD-L1 osom.

[0008] Uprkos značajnom napretku u lečenju raka, još uvek se traže bolje terapije i dijagnostički postupci.

[0009] SAŽETAK PRONALASKA

[0010] Sadašnji pronalazak pruža dijagnostičke postupke i terapeutske kompozicije za nemikroćelijski karcinom pluća (NSCLC).

[0011] U jednom aspektu, pronalazak sadrži antagonist vezivanja PD-L1 za korišćenje u lečenju pacijenta koji boluje od nemikroćelijskog karcinoma pluća, pri čemu je utvrđeno da uzorak tumora dobijen od pacijenta ima detektabilni nivo ekspresije PD-L1 u 50% ili više ćelija tumora u uzorku, i pri čemu, antagonist vezivanja PD-L1 je antitelo. U nekim otelotvorenjima, uzorak tumora dobijen od pacijenta ima detektabilni nivo ekspresije PD-L1 u infiltratima imunoćelija u tumoru, koje čine manje od 10% uzorka.

[0012] U drugom aspektu, pronalazak sadrži postupak za utvrđivanje da li će pacijent koji pati od nemikroćelijskog karcinoma pluća verovatno da reaguje na lečenje koje sadrži antagonist vezivanja PD-L1, i postupak se sastoji od: određivanja nivoa ekspresije PD-L1 u ćelijama tumora u uzorku tumora dobijenom od pacijenta, pri čemu detektabilni nivo ekspresije PD-L1 u 50% ili više ćelija tumora u uzorku tumora ukazuje na to da će pacijent verovatno reagovati na lečenje koje sadrži antagonist vezivanja PD-L1, i pri čemu, povezujući antagonist PD-L1 je antitelo.

[0013] U drugom aspektu, pronalazak sadrži postupak za predviđanje reakcije pacijenta koji boluje od nemikroćelijskog karcinoma pluća na lečenje koje obuhvata antagonist vezivanja PD-L1, i postupak se sastoji od: određivanja nivoa ekspresije PD-L1 u ćelijama tumora u uzorku tumora dobijenom od pacijenta, pri čemu detektabilni nivo ekspresije PD-L1 u 50% ili više ćelija tumora u uzorku tumora ukazuje na to da će pacijent verovatno reagovati na lečenje koje sadrži antagonist vezivanja PD-L1, i pri čemu, antagonist vezivanja PD-L1 je antitelo.

[0014] U nekim otelotvorenjima, postupak se dodatno sastoji od određivanja nivoa ekspresije PD-L1 u infiltratima imunoćelija u tumoru, u uzorku tumora dobijenom od pacijenta. U nekim otelotvorenjima, uzorak tumora dobijen od pacijenta ima detektabilni nivo ekspresije PD-L1 u infiltratima imunoćelija u tumoru, koje čine manje od 10% uzorka.

[0015] U nekim otelotvorenjima bilo kog od prethodnih aspekata, određeno je da uzorak tumora dobijen od pacijenta ima detektabilni nivo ekspresije PD-L1 u infiltratima imunoćelija u tumoru, koje čine 10% ili više uzorka tumora.

[0016] U drugom aspektu, pronalazak sadrži postupak za izbor terapije za pacijenta koji boluje od nemikroćelijskog karcinoma pluća, i postupak se sastoji od: određivanja nivoa ekspresije PD-L1 u ćelijama tumora u uzorku tumora dobijenom od pacijenta, i izbora terapije za pacijenta koja sastoji od antagonista vezivanja PD-L1 na osnovu detektabilnog nivoa ekspresije PD-L1 u 50% ili više ćelija tumora u uzorku tumora, i pri čemu, antagonist vezivanja PD-L1 je antitelo. U nekim otelotvorenjima, postupak se dodatno sastoji od određivanja nivoa ekspresije PD-L1 u infiltratima imunoćelija u tumoru, u uzorku tumora dobijenom od pacijenta. U nekim otelotvorenjima, uzorak tumora dobijen od pacijenta ima detektabilni nivo ekspresije PD-L1 u infiltratima imunoćelija u tumoru, koje čine manje od 10% uzorka.

[0017] U nekim otelotvorenjima bilo kog od prethodnih aspekata, uzorak tumora dobijen od pacijenta sadrži populaciju fibroblasta i/ili miofibroblasta. U nekim otelotvorenjima, uzorak tumora dobijen od pacijenta se sastoji od ćelijski siromašne i/ili kolagenizovane strome. U nekim otelotvorenjima, uzorak tumora ima povećan nivo ekspresije kolagena, STAT1 ili MEK u odnosu na referentni uzorak tumora.

[0018] U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-L1 inhibira vezivanje PD-L1 za jedan ili više njegovih partnera za vezivanje liganda. U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-L1 inhibira vezivanje PD-L1 za PD-1. U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-L1 inhibira vezivanje PD-L1 za B7-1. U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-L1 inhibira vezivanje PD-L1 i za PD-1 i za B7-1. U nekim otelotvorenjima, antitelo je izabrano iz grupe koja se sastoji od: MPDL3280A (atezolizumab), MDX-1105, MEDI4736 (durvalmab) i MSB0010718C (avelumab). U nekim otelotvorenjima, antitelo se sastoji od teškog lanca koji sadrži HVR-H1 sekvencu SEQ ID NO:19, HVR-H2 sekvencu SEQ ID NO:20, i HVR-H3 sekvencu SEQ ID NO:21; i lakog lanca koji sadrži HVR-L1 sekvencu SEQ ID NO:22, HVR-L2 sekvencu SEQ ID NO:23, i HVR-L3 sekvencu SEQ ID NO:24. U jednom otelotvorenju, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4.

[0019] U nekim otelotvorenjima bilo kog od prethodnih postupaka, postupak dalje uključuje davanje pacijentu efikasne količine drugog terapeutskog sredstva. U nekim otelotvorenjima, drugi terapeutski agens je izabran iz grupe koja se sastoji od citotoksičnog agensa, agensa inhibitora rasta, agensa za terapiju radijacijom, antiangiogenog agensa, i njihovih kombinacija. U nekim otelotvorenjima, nemikroćelijski karcinom pluća je lokalno uznapredovali ili metastatski nemikroćelijski karcinom pluća.

[0020] U nekim otelotvorenjima prethodnih aspekata, uzorak tumora je uzorak tumora fiksiran u formalinu i ugrađen u parafin (FFPE), uzorak tumora iz arhive, svež uzorak tumora ili zamrznuti uzorak tumora. U nekim otelotvorenjima, nivo ekspresije PD-L1 je nivo ekspresije proteina. U nekim otelotvorenjima, nivo ekspresije proteina PD-L1 se određuje korišćenjem postupaka izabranih iz grupe koja se sastoji od imunohistohemije (IHC), imunofluorescencije, protočne citometrije i vestern blota. U nekim otelotvorenjima, nivo ekspresije proteina PD-L1 se određuje koristeći IHC. U nekim otelotvorenjima, nivo ekspresije proteina PD-L1 je detektovan pomoću anti-PD-L1 antitela.

[0021] U nekim otelotvorenjima bilo kog od prethodnih aspekata, nivo ekspresije PD-L1 predstavlja nivo ekspresije mRNK. U nekim otelotvorenjima, nivo ekspresije mRNK PD-L1 se određuje pomoću postupka izabranog iz grupe koja se sastoji od kvantitativne lančane reakcije polimeraze (qPCR), reverzne transkripcije qPCR (RT-qPCR), sekvenciranja RNK, analize pomoću mikročipa, hibridizacije in situ i serijske analize ekspresije gena (SAGE).

[0022] KRATAK OPIS SLIKA SLIKA 1A je tabela koja pokazuje da je PD-L1 široko eksprimiran u raznim vrstama kancera kod ljudi. Ekspresija PD-L1 se ocenjuje imunohistohemijom (IHC) u infiltratima imunoćelija u tumoru („IC“) i u ćelijama tumora („TC“). IC2/3 ukazuje na IC IHC rezultat od 2 ili 3 (pogledajte Tabelu 2). TC2/3 ukazuje na TC IHC rezultat od 2 ili 3 (pogledajte Tabelu 3).

[0023] SLIKE 1B-1D su slike koje prikazuju delove tumora nemikroćelijskog karcinoma pluća (NSCLC) koji su analizirani putem IHC na ekspresiju PD-L1. Slika 1B pokazuje uzorak koji je PD-L1-pozitivan u ćelijama tumora, Slika 1C pokazuje uzorak koji je PD-L1-pozitivan u ćelijama tumora i u infiltratima imunoćelija u tumor, a Slika 1D pokazuje uzorak koji je PD-L1-pozitivan u imunskim ćelijama koje se infiltriraju u tumor.

[0024] SLIKA 2A je tabela koja pokazuje da je došlo do minimalnog preklapanja IC3 i TC3 IHC dijagnostičkih kriterijuma (pogledajte Tabelu 2 i Tabelu 3) u uzorcima tumora NSCLC, kao što je utvrđeno u tekućoj fazi II kliničkog ispitivanja. N=287.

[0025] SLIKA 2B je serija Venovih dijagrama koji prikazuju rasprostranjenost i preklapanje IC i TC IHC dijagnostičkih kriterijuma pri različitim presecima uzoraka tumora NSCLC u tekućoj fazi II ispitivanja (II-2). IC2/3 ukazuje na IC IHC rezultat od 2 ili 3 (pogledajte Tabelu 2). TC2/3 ukazuje na TC IHC rezultat od 2 ili 3 (pogledajte Tabelu 3). IC1/2/3 ukazuje na IC IHC rezultat od 1, 2 ili 3 (pogledajte Tabelu 2). TC1/2/3 ukazuje na TC IHC rezultat od 1, 2 ili 3 (pogledajte Tabelu 3).

[0026] SLIKA 3A je tabela koja prikazuje da je ekspresija PD-L1 (po proceni IHC pomoću dijagnostičkog anti-PD-L1 antitela) u infiltratima imunoćelija ili u ćelijama tumoranezavisno predvidela rezultate lečenja anti-PD-L1 antitelom MPDL3280A kod nemikroćelijskog karcinoma pluća u tekućoj Ia fazi kliničkog ispitivanja. Prikazana je ukupna stopa odgovora (ORR) za pacijente koji imaju navedeni rezultat PD-L1 IHC.

ukazuje na pacijente čiji su tumori ocenjeni kao IC3 i mogu da sadrže bilo koju vrednost TC (tj. TC0/1/2/3). „TC3“ ukazuje na pacijente čiji su tumori ocenjeni kao TC3 i mogu da sadrže bilo koju vrednost IC (tj. IC0/1/2/3). „TC3 ili IC3“ ukazuje na pacijente čiji tumori su ocenjeni kao TC3 ili IC3. Uzorak tumora jednog pacijenta je imao rezultat TC3 i IC3.

[0027] SLIKA 3B predstavlja tabelu koja prikazuje rezultate efikasnosti iz tekuće faze II kliničkog ispitivanja (faza II-1) određene putem mRECIST. Prikazani su potvrđeni ORR, trajanje odgovora (DOR) i 6-mesečno preživljavanje bez progresije (PFS) za navedene kohorte.<a>Dva pacijenta su imala nepoznat IC/TC status.<b>Osim ako nije navedeno, medijana još nije dostignuta.

[0028] SLIKA 3C predstavlja tabelu koja prikazuje rezultate efikasnosti iz tekuće faze II kliničkog ispitivanja (faza II-1) određene putem RECIST v1.1. Prikazani su potvrđeni ORR, trajanje odgovora (DOR) i 6-mesečno preživljavanje bez progresije (PFS) za navedene kohorte.<a>Dva pacijenta su imala nepoznat IC/TC status.<b>Medijane još nisu dostignute. Met, metastaze.

[0029] SLIKA 3D je tabela koja prikazuje da ekspresija PD-L1 (prema IHC proceni pomoću dijagnostičkog anti-PD-L1 antitela) u infiltratima imunoćelija u tumoru ili u ćelijama tumora, predviđa poboljšanje ukupnog preživljavanja pacijenata sa NSCLC-om koji se leče atezolizumabom (MDPL3280A) u tekućoj fazi II kliničkog ispitivanja (faza II-2). ITT, planiran za lečenje.

[0030] SLIKA 3E je tabela koja prikazuje da ekspresija PD-L1 (prema IHC proceni pomoću dijagnostičkog anti-PD-L1 antitela) u infiltratima imunoćelija u tumoru ili u ćelijama tumora, predviđa poboljšano preživljavanje bez progresije kod pacijenata sa NSCLC-om koji se leče atezolizumabom (MPDL3280A). Prikazuje se poređenje sa pacijentima sa NSCLC-om na testiranju koji su lečeni docetakselom.

[0031] SLIKA 3F je tabela koja prikazuje da je ekspresija PD-L1 u infiltratima imunoćelija u tumoru ili u ćelijama tumora u uzorcima pacijenata sa NSCLC-om, predvidela reakciju (prema proceni ORR) pacijenata sa NSCLC-om na lečenje anti-PD-L1 antitelom MPDL3280A u tekućoj fazi II kliničkog ispitivanja (faza II-2).

[0032] SLIKA 4 je grafikon koji prikazuje da je prisustvo infiltrata imunoćelija u tumoru neophodno, ali nije dovoljno da odražava PD-L1 pozitivnost u IC IHC dijagnostičkim kriterijumima.

[0033] SLIKA 5A je grafikon koji prikazuje da je infiltrat imunoćelija prisutan u TC3 pacijentima, ali je uglavnom PD-L1-negativan prema IHC analizi. Grafikon pokazuje procenat ukupnog infiltrata imunoćelija u odnosu na masu tumora. Slika sa leve strane je reprezentativni deo koji je kao rezultat imao TC3, dok je slika sa desne strane grafikona reprezentativni deo koji je kao rezultat imao IC3.

[0034] SLIKE 5B-5C su grafikoni koji prikazuju nivo ekspresije mRNK CD68 (slika 5B) i CD8 (slika 5C) kod pacijenata sa NSCLC-om uključenim u tekuću Ia fazu kliničkog ispitivanja i tekuću fazu 2 kliničkog ispitivanja. Neg, PD-L1-negativna.

[0035] SLIKE 6A-6B su grafikoni koji prikazuju da TC3 i IC3 NSCLC tumori imaju izraženu histopatologiju, kao što je procenjeno pomoću bojenja hematoksilinom i eozinom (H&E). Slika 6A prikazuje histopatološke ocene za TC3 tumore, dok slika 6B pokazuje histopatološke ocene za IC3 tumore. TC3 tumori su pokazali mikrookruženje dezmoplastičnog tumora, sa niskim intraepitelnim i stromalnim infiltratima imunoćelija u tumoru, dok su IC3 tumori pokazali prisustvo intraepitelnih ili stromalnih imunih ćelija koje se infiltriraju u tumor. „IC aktivnost interfejsa“ ukazuje na infiltrate imunoćelija u interfejs tumor/stroma. „Intraepitelni IC ukazuje na prisustvo intraepitelnih infiltrata imunoćelija. „IC TLS“ ukazuje na prisustvo tercijarnih limfoidnih folikula. „Drugi stromalni IC“ ukazuje na prisustvo imunoćelija u stromi. „Dezmoplazija“ ukazuje na prisustvo ćelijske i „aktivirane“ populacije fibroblasta (miofibroblasti). „Sklerotična reakcija“ ukazuje na prisustvo ćelijski siromašne/kolagenizovane strome. „Povećani sudovi/kvalitativno“ ukazuje na prisustvo krvnih sudova ocenjenih kvalitativno. Uzorci su korišćeni iz tekuće faze II kliničkog ispitivanja.

[0036] SLIKA 7 je grafikon koji prikazuje da TC3 NSCLC tumori imaju veću ekspresiju kolagena (COL6A1) u poređenju sa PD-L1-negativnim („negativnim“) tumorima, IC3 tumorima ili TC3 i IC3 tumorima. Slike ispod grafikona predstavljaju delove PD-L1 TC3 uzoraka tumora.

[0037] SLIKA 8 je toplotna mapa koja prikazuje hijerarhijsko grupisanje ekspresije grupe imunskog gena u podvrstama PD-L1 TC/IC.

[0038] SLIKE 9A-9B predstavljaju niz grafikona koji prikazuju povećane nivoe ekspresije mRNK CD8 (slika 9A) i CXCL9 (slika 9B) u IC3 NSCLC tumorima u poređenju sa TC3 tumorima i PD-L1-negativnim (TC0 i IC0) tumorima.

[0039] SLIKE 10A-10B su niz grafikona koji prikazuju povećane nivoe ekspresije STAT1 i MEK u TC3 tumorima u poređenju sa PD-L1-negativnim tumorima, IC3 tumorima i TC3 i IC3 tumorima. Podaci su uzeti od pacijenata upisanih u tekuću Ia fazu kliničkog ispitivanja i II fazu kliničkog ispitivanja.

[0040] SLIKA 10C je grafikon koji prikazuje da su nivoi ekspresije JAK1 veći u PD-L1-pozitivnim tumorima u poređenju sa PD-L1-negativnim tumorima.

[0041] SLIKA 10D je slika vestern blota koja prikazuje da, uprkos aktivnoj signalizaciji STAT-a, neke linije tumora nisu dodatno ushodno regulisale PD-L1 kao reakcija na interferon gama (IFΝγ).

[0042] SLIKA 11 je tabela koja prikazuje rasprostranjenost navedenih IHC dijagnostičkih kriterijuma za PD-L1 (pogledajte Tabelu 2 i Tabelu 3) u adjuvantnom, 1L i 2L+ NSCLC. Venov dijagram ispod grafikona prikazuje da TC3 i IC3 tumori predstavljaju odvojene potpopulacije u NSCLC-u, sa manje od 1% preklapanja.

[0043] SLIKE 12A-12B su grafikoni koji prikazuju da su IC3 NSCLC tumori okarakterisani većom ekspresijom potpisa B-ćelija (slika 12A) i potpisa ćelija prirodnih ubica (NK) (slika 12B). Ovi podaci su dobijeni od pacijenata u tekućoj Ia fazi kliničkog ispitivanja i tekućoj II fazi kliničkog ispitivanja.

[0044] SLIKE 13A-13C su grafikoni koji prikazuju da su PD-L1-pozitivni NSCLC tumori pokazali povećanu ekspresiju potpisa efektorskog gena T ćelije T(<eff>) u poređenju sa PD-L1-negativnim tumorima.

[0045] SLIKA 13D je grafikon koji prikazuje da su IC3 NSCLC tumori okarakterisani povećanom ekspresijom potpisa T<eff>gena, kao što je utvrđeno sekvenciranjem RNK. U ovoj analizi, TC3 podgrupa isključuje IC2/3 tumore, dok je IC3 podgrupa isključivala TC2/3 tumore.

[0046] SLIKE 13E-13G su niz grafikona koji prikazuju da su IC3 NSCLC tumori okarakterisani povećanom ekspresijom IFNG (Slika 13E), GZMB (Slika 13F) i CXCCL9 (Slika 13G), kao što je utvrđeno sekvenciranjem RNK. U ovoj analizi, TC3 podgrupa isključuje IC2/3 tumore, dok je IC3 podgrupa isključivala TC2/3 tumore.

[0047] SLIKE 14A-14B su grafikoni koji prikazuju da je lečenje pacijenata sa NSCLC-om sa anti-PD-L1 antitelom MPDL3280A dovelo do povećanog nivoa u plazmi IFΝγ povezanih markera interleukina-18 (IL-18) (Slika 14A) i ITAC (Slika 14B). Grafikoni prikazuju promenu umnoška log<2>u odnosu na C1D1 pre doziranja. C ukazuje na ciklus, a D ukazuje na dan.

[0048] SLIKE 15A-15C predstavljaju grafikone koji prikazuju poređenje između povećane bazne linije PD-L1 (Slika 15A), PD-L2 (Slika 15B) i PD-1 (Slika 15C) nivoa ekspresije mRNK (kao što je utvrđeno korišćenjem testa NanoString) u perifernim mononuklearnim ćelijama krvi (PMBC) i odgovor pacijenata sa NSCLC-om na lečenje anti-PD-L1 antitelom MPDL3280A.

[0049] SLIKE 16A-16B predstavljaju grafike koji prikazuju da su bazni nivoi ekspresije mRNK gena sa potpisom NK ćelije (Slika 16A) i mijeloidne ćelije (Slika 16B) u PBMC povezani sa odgovorom pacijenata sa NSCLC-om na lečenje anti-PD-L1 antitelom MPDL3280A. Povećani nivoi imunosupresivnog gena mijeloidne ćelije povezani su sa progresijom, dok su povećani nivoi ekspresije citotoksičnih NK ćelija povezani sa odgovorom na MPDL3280A.

[0050] SLIKE 17A-17B prikazuju ekspresiju PD-L1 (Slika 17A) i PD-L2 (Slika 17B) u uzorcima tumora NSCLC kod pacijenata sa TC0 i IC0 tumorima, IC3 tumorima i TC3 tumorima, kao što je utvrđeno sekvenciranjem RNK. Pacijenti su bili deo faze II-2 ispitivanja i kohorte koja nije deo ispitivanja (N=162). RPKM, očitavanja po kilobazama po milion mapiranih očitavanja.

[0051] SLIKE 18A-18B su grafikoni koji prikazuju da TC3 tumori eksprimiraju visoke nivoe molekulskih markera dezmoplastične/sklerotične strome kao što je određeno sekvenciranjem RNK. Slika 18A pokazuje povećanu ekspresiju gena kolagena COL6A1 u TC3 tumorima u poređenju sa IC3 tumorima i TC0 i IC0 tumorima. Slika 18B pokazuje povećanu ekspresiju gena kolagena COL6A2 u TC3 tumorima u poređenju sa IC3 tumorima i TC0 i IC0. U ovoj analizi, TC3 podgrupa isključuje IC2/3 tumore, dok je IC3 podgrupa isključivala TC2/3 tumore.

[0052] DETALJAN OPIS OTELOTVORENJA PRONALASKA

[0053] I. Uvod

[0054] Sadašnji pronalazak pruža dijagnostičke postupke i terapeutske kompozicije za nemikroćelijski karcinom pluća. Pronalazak je zasnovan, barem delimično, na otkriću da je određivanje nivoa ekspresije biomarkera iz pronalaska, na primer, PD-L1, u uzorcima dobijenim od pacijenta (npr. u ćelijama tumora i u infiltratima imunoćelija u uzorku tumora dobijenog od pacijenta) korisno za lečenje pacijenta obolelog od raka, za dijagnozu pacijenta koji boluje od raka, za utvrđivanje da li će pacijent koji ima rak reagovati na lečenje antikancerogenom terapijom koja uključuje antagonist vezivanja PD-L1 ose (npr. anti-PD-L1 antitelo, npr. MPDL3280A), za optimizovanje terapeutske efikasnosti terapije protiv raka koja uključuje antagonist vezivanja PD-L1 ose (npr. anti-PD-L1 antitelo, npr. MPDL3280A) i/ili za izbor pacijenata za terapiju protiv raka koja uključuje antagonist vezivanja PD-L1 ose (npr. anti-PD-L1 antitelo, npr. MPDL3280A).

[0055] II. Definicije

[0056] Podrazumeva se da aspekti i otelotvorenja pronalaska koji su ovde opisani, obuhvataju aspekte i otelotvorenja koji „sadrže“, „sastoje se“ i „sastoje se u suštini od“. Kako se ovde koristi, oblici jednine uključuju reference za množinu, osim ako nije drugačije naznačeno.

[0057] Izraz „oko“ koji se ovde koristi odnosi se na uobičajeni opseg grešaka za odgovarajuću vrednost dobro poznatu stručnjaku u ovom tehničkom području. Upotreba reči „oko“ za vrednosti ili parametre u ovom dokumentu obuhvata (i opisuje) otelotvorenja koja se odnose na tu vrednost ili parametar. Na primer, opis koji sadrži „oko X“ uključuje opis „X“.

[0058] Izraz „antagonist vezivanja PD-L1 ose“ se odnosi na molekul koji inhibira interakciju partnera za vezivanje PD-L1 ose sa jednim ili više njegovih partnera za vezivanje, kako bi se uklonila disfunkcija T-ćelije koja je rezultat signalizacije na PD-1 signalnoj osi, a rezultat je obnavljanje ili poboljšanje funkcije T-ćelija. Kao što se ovde koristi, antagonist vezivanja PD-L1 ose uključuje antagonist vezivanja PD-L1 i antagonist vezivanja PD-1, kao i molekule koji ometaju interakciju između PD-L1 i PD-1 (npr. fuzija PD-L2-Fc).

[0059] Izraz „disfunkcija“, u kontekstu imunske disfunkcije, odnosi se na stanje smanjene imunske reakcije na antigensku stimulaciju. Ovaj izraz se odnosi na uobičajene elemente „iscrpljenosti“ i/ili „anergije“ u kojima se može dogoditi prepoznavanje antigena, ali nastala imunska reakcija nije efikasna u kontroli infekcije ili rasta tumora.

[0060] Izraz „disfunkcionalan“, kako se ovde koristi, odnosi se i na refraktornost ili odsustvo odgovora pri prepoznavanju antigena, posebno na umanjenu sposobnost translacije prepoznavanja antigena u nishodne efektorske funkcije T ćelija, kao što je proliferacija, proizvodnja citokina (npr. IL-2) i/ili ubijanje ciljnih ćelija.

[0061] Izraz „anergija“ se odnosi na stanje odsustva odgovora na antigensku stimulaciju, koje je posledica nepotpunih ili nedovoljnih signala isporučenih putem T ćelijskog receptora (npr. porast intraćelijskog Ca<2+>u odsustvu aktivacije Ras). Anergija T ćelija može da nastane i stimulacijom pomoću antigena u odsustvu kostimulacije, što dovodi do toga da ćelija postane refraktorna za dalju aktivaciju antigenom čak i u kontekstu kostimulacije. Stanje odsustva odgovora se često može nadjačati prisustvom interleukina-2. Anergične T ćelije ne prolaze kroz klonsku ekspanziju i/ili ne stiču efektorske funkcije.

[0062] Izraz „iscrpljenost“ se odnosi na iscrpljenost T ćelija kao stanje disfunkcije T ćelija koje nastaje zbog produžene TCR signalizacije koja se javlja tokom mnogih hroničnih infekcija i raka. Od anergije se razlikuje po tome što ne nastaje zbog nepotpune ili neispravne signalizacije, već zbog produžene signalizacije. Odlikuje se lošom efektorskom funkcijom, produženom ekspresijom inhibitornih receptora i transkripcionim stanjem različitim od stanja funkcionalnih efektorskih ili memorijskih T ćelija. Iscrpljenost sprečava optimalnu kontrolu infekcije i tumora. Iscrpljenost može nastati i zbog spoljašnjih negativnih regulatornih puteva (npr. imunoregulacionih citokina) i zbog ćelijskih intrinzičnih negativnih regulatornih (kostimulatornih) puteva (PD-1, B7-H3, B7-H4, itd.).

[0063] „Poboljšanje funkcije T ćelija“ podrazumeva podsticanje, izazivanje ili stimulisanje T ćelije da ima produženu ili pojačanu biološku funkciju, ili obnavljanje ili ponovno aktiviranje iscrpljene ili neaktivne T ćelije. Primeri poboljšanja funkcije T ćelija obuhvataju: povećanu sekreciju γ-interferona iz CD8+ T ćelija, pojačanu proliferaciju, povećanu sposobnost odgovora na antigene (npr. klirens virusa, patogena ili tumora) u odnosu na iste nivoe pre intervencije. U jednom otkriću, nivo poboljšanja je najmanje 50%, alternativno 60%, 70%,

[0066] 1

[0067] 80%, 90%, 100%, 120%, 150% ili 200% poboljšanja. Postupak merenja ovog poboljšanja poznat je stručnim licima za ovu oblast.

[0068] „Imunitet tumora“ odnosi se na postupak u kojem tumori izbegavaju imunsko prepoznavanje i klirens. Tako, kao terapeutski koncept, imunitet tumora se „leči“ kada je takvo izbegavanje oslabljeno, a imunski sistem prepoznaje i napada tumore. Primeri prepoznavanja tumora uključuju vezivanje tumora, skupljanje tumora i klirens tumora.

[0069] „Imunogenost“ se odnosi na sposobnost određene supstance da izazove imunološki odgovor. Tumori su imunogeni, i pojačavanje imunogenosti tumora pomaže u klirensu tumorskih ćelija imunskim odgovorom. Primeri pojačane imunogenosti tumora uključuju tretman sa antagonistom vezivanja PD-L1 ose.

[0070] Kako se ovde koristi, „antagonist vezivanja PD-L1“ je molekul koji smanjuje, blokira, inhibira, ukida ili ometa transdukciju signala koji nastaje usled interakcije PD-L1 sa jednim partnerom ili više njegovih partnera za vezivanje, kao što je PD-1 i/ili B7-1. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 je molekul koji inhibira vezivanje PD-L1 za njegove partnere za vezivanje. U specifičnom aspektu, antagonist vezivanja PD-L1 inhibira vezivanje PD-L1 za PD-1 i/ili B7-1. U nekim otkrićima, u antagoniste vezivanja PD-L1 spadaju anti-PD-L1 antitela, njihovi antigen vezujući fragmenti, imunoadhezini, fuzioni proteini, oligopeptidi, mali molekuli antagonista, polinukleotidni antagonisti i drugi molekuli koji blokiraju, inhibiraju, ukidaju ili ometaju transdukciju signala koji nastaje usled interakcije PD-L1 sa jednim ili više njegovih partnera za vezivanje, kao što je PD-1 i/ili B7-1. U jednom otkriću, antagonist vezivanja PD-L1 smanjuje negativan signal posredstvom ili putem proteina površine ćelija eksprimiran na T limfocitima, i drugim ćelijama, posredovanjem u signalizaciji putem PD-L1 ili PD-1, tako da se disfunkcionalna T-ćelija učini manje disfunkcionalnom. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 je anti-PD-L1 antitelo. U specifičnom aspektu, anti-PD-L1 antitelo je YW243.55.S70, opisano u ovom dokumentu. U sledećem specifičnom aspektu, anti-PD-L1 antitelo je MDX-1105, opisano u ovom dokumentu. U još jednom specifičnom aspektu, anti-PD-L1 antitelo je MPDL3280A (atezolizumab), opisano u ovom dokumentu. U još jednom specifičnom aspektu, anti-PD-L1 antitelo je MEDI4736 (durvalumab), opisano u ovom dokumentu. U još jednom specifičnom aspektu, anti-PD-L1 antitelo je MSB0010718C (avelumab), opisano u ovom dokumentu.

[0071] Kao što se ovde koristi, „antagonist vezivanja PD-1“ se odnosi na molekul koji smanjuje, blokira, inhibira, ukida ili ometa transdukciju signala koji nastaje usled interakcije PD-1 sa jednim partnerom ili više partnera za vezivanje, kao što je PD-L1 i/ili PD-L2. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-1 je molekul koji inhibira vezivanje PD-1 za njegove partnere za vezivanje. U specifičnom aspektu, antagonist vezivanja PD-1 inhibira vezivanje PD-1 za PD-L1 i/ili PD-L2. Na primer, antagonist vezivanja PD-1 uključuje anti-PD-1 antitela i njihove fragmente koji vezuju antigen, imunoadhezine, fuzione proteine, oligopeptide, antagoniste malih molekula, polinukleotidne antagoniste i druge molekule koji smanjuju, blokiraju, inhibiraju, ukidaju ili ometaju transdukciju signala koji nastaje usled interakcije PD-1 sa PD-L1 i/ili PD-L2. U jednom otkriću, antagonist vezivanja PD-1 smanjuje negativan signal posredstvom ili putem proteina površine ćelija eksprimiran na T limfocitima, i drugim ćelijama, posredovanjem u signalizaciji putem PD-1 ili PD-L1, tako da se disfunkcionalna T-ćelija učini manje disfunkcionalnom. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-1 je anti-PD-1 antitelo. U specifičnom aspektu, antagonist vezivanja PD-1 je MDX-1106 (nivolumab), opisan u ovom dokumentu. U sledećem specifičnom aspektu, antagonist vezivanja PD-1 je MK-3475 (pembrolizumab), opisan u ovom dokumentu. U sledećem specifičnom aspektu, antagonist vezivanja PD-1 je CT-011 (pidilizumab), opisan u ovom dokumentu. U sledećem specifičnom aspektu, antagonist vezivanja PD-1 je MEDI-0680 (AMP-514), opisan u ovom dokumentu. U sledećem specifičnom aspektu, antagonist vezivanja PD-1 je PDR001, opisan u ovom dokumentu. U sledećem specifičnom aspektu, antagonist vezivanja PD-1 je REGN2810, opisan u ovom dokumentu. U sledećem specifičnom aspektu, antagonist vezivanja PD-1 je BGB-108, opisan u ovom dokumentu. U sledećem specifičnom aspektu, antagonist vezivanja PD-1 je AMP-224, opisan u ovom dokumentu.

[0072] Izrazi „ligand programirane smrti 1“ i „PD-L1“ ovde se odnose na nativnu sekvencu PD-L1 polipeptida, polipeptidne varijante, i fragmente nativne sekvence polipeptida i polipeptidne varijante (koje su ovde dodatno definisane). PD-L1 polipeptid, opisan u ovom dokumentu, može biti onaj koji je izolovan iz različitih izvora, kao što su neke vrste humanog tkiva, ili iz drugih izvora, ili se pripremaju rekombinantnim ili sintetičkim postupcima.

[0073] „Nativna sekvenca PD-L1 polipeptida“ sadrži polipeptid koji ima istu aminokiselinsku sekvencu kao odgovarajući PD-L1 polipeptid dobijen iz prirode.

[0074] „Varijanta PD-L1 polipeptida“ ili njegove varijacije, znače PD-L1 polipeptid, generalno aktivan PD-L1 polipeptid, kao što je ovde definisan, koji ima identičnost aminokiselinske sekvence od najmanje oko 80% sa bilo kojom od nativnih sekvenci PD-L1 polipeptida, kao što je ovde otkriveno. Takve varijante PD-L1 polipeptida uključuju, na primer, PD-L1 polipeptide, naznačene time što se dodaje jedan ili više aminokiselinskih ostataka, ili se brišu, na N ili C-terminalnom kraju nativne aminokiselinske sekvence. Obično, varijanta PD-L1 polipeptida ima identičnost aminokiselinske sekvence najmanje oko 80%, alternativno najmanje oko 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti aminokiselinske sekvence, u odnosu na nativnu sekvencu PD-L1 polipeptida kao što je ovde otkriveno. Obično je varijanta PD-L1 polipeptida dužine najmanje oko 10 aminokiselina, alternativno najmanje oko 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288 ili 289 aminokiselina, ili više. Opciono, varijanta PD-L1 polipeptida neće imati više od jedne konzervativne aminokiselinske supstitucije u poređenju sa nativnom polipeptidnom sekvencom PD-L1, alternativno ne više od 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 konzervativnih aminokiselinskih supstitucija u poređenju sa nativnom polipeptidnom sekvencom PD-L1.

[0075] „Polinukleotid“, ili „nukleinska kiselina“, kako se ovde naizmenično koristi, odnosi se na polimere nukleotida bilo koje dužine, i obuhvata DNK i RNK. Nukleotidi mogu da budu dezoksiribonukleotidi, ribonukleotidi, modifikovani nukleotidi ili baze i/ili njihovi analozi ili bilo koji supstrat koji se može uključiti u polimer putem DNK ili RNK polimeraze, ili sintetičkom reakcijom. Tako, na primer, polinukleotidi kao što su ovde definisani uključuju, bez ograničenja, jednolančanu i dvolančanu DNK, DNK koja obuhvata jedno- i dvolančane regione, jedno- i dvolančanu RNK, i RNK koja obuhvata jedno- i dvolančane regione, hibridne molekule koji sadrže DNK i RNK koje mogu biti jednolančane ili, češće, dvolančane, ili uključuju jedno- i dvolančane regione. Pored toga, izraz „polinukleotid“, kako se ovde koristi, odnosi se na trolančane regione koji sadrže RNK ili DNK, ili i RNK i DNK. Lanci u takvim regionima mogu biti iz istog molekula ili iz različitih molekula. Regioni mogu uključivati sve od jednog ili više molekula, ali uobičajeno uključuju samo region nekih molekula. Jedan od molekula regiona trojne spirale je često oligonukleotid. Izraz „polinukleotid“ specifično uključuje kDNK.

[0076] Polinukleotid može da sadrži modifikovane nukleotide, kao što su metilovani nukleotidi i njihovi analozi. Ako postoji, modifikacija nukleotidne strukture može da se prenese pre ili posle sklapanja polimera. Sekvenca nukleotida može biti prekinuta nenukleotidnim komponentama. Polinukleotid se može dalje modifikovati nakon sinteze, na primer konjugacijom sa oznakom. Drugi tipovi izmena su, na primer, „završeci“, zamena nekih nukleotida koji se pojavljuju u prirodi analogom, internukleotidnim izmenama, kao što su, na primer, one sa nenalektrisanim vezama (npr. metil fosfonati, fosfotriestri, fosfoamidati, karbamati, i slično) i sa naelektrisanim vezama (npr. fosforotioati, fosforoditioati, i slično), oni koji sadrže viseće ostatke, kao što su, na primer, proteini (npr. nukleaze, toksini, antitela, signalni peptidi, poli-L-lizin, i slično), oni sa interkalatorima (npr. akridin, psoralen, i slično),

[0079] 1

[0080] oni koji sadrže helatore (npr. metali, radioaktivni metali, bor, oksidativni metali, i slično), oni koji sadrže alkilatore, oni sa modifikovanim vezama (npr. alfa anomerne nukleinske kiseline), kao i nemodifikovani oblici polinukleotida. Pored toga, bilo koja hidroksi grupa obično prisutna u šećeru može biti zamenjena, na primer, fosfonatnim grupama, fosfatnim grupama, zaštićena standardnim zaštitnim grupama ili aktivirana da bi se pripremile dodatne veze za dodatne nukleotide, ili se može konjugovati na čvrste ili polučvrste podloge. Terminalna 5’ i 3’ OH grupa može da se fosforiluje ili zameni aminima ili organskim završnim grupama od 1 do 20 ugljeničnih atoma. Drugi hidroksili takođe mogu da se derivatizuju u standardne grupe za zaštitu. Polinukleotidi takođe mogu da sadrže analogne oblike šećera riboze ili dezoksiriboze koji su generalno poznati u struci, uključujući, na primer, 2’-metil-, 2’-O-alil-, 2’-fluor-, ili 2’-azido-ribozu, karbociklične analoge šećera, α-anomerne šećere, epimerne šećere kao što su arabinoza, ksiloze ili liksoze, piranozne šećere, furanozne šećere, sedoheptuloze, aciklične analoge i abazne nukleozidne analoge, kao što je metil ribozid. Neke od fosfodiestarskih veza mogu biti zamenjene alternativnim grupama za vezivanje. Ove alternativne grupe za vezivanje uključuju, ali nisu ograničene na, otkrića gde je fosfat zamenjen sa P(O)S („tioat“), P(S)S („ditioat“), „(O)NR<2>(„amidat“), P(O)R, P(O)OR, CO ili CH<2>(„formacetal“) u kojima su pojedinačno R ili R’ nezavisno H ili supstituisani ili nesupstituisani alkil (1-20 C) koji opciono sadrži etarsku (-O-) vezu, aril, alkenil, cikloalkil, cikloalkenil ili araldil. Nije potrebno da sve veze u polinukleotidu budu identične. Prethodni opis se odnosi na sve polinukleotide koji se ovde spominju, uključujući RNK i DNK.

[0081] „Oligonukleotid“, kao što se ovde koristi, generalno se odnosi na kratke, jednolančane, polinukleotide koji su, ali ne nužno, dužine manje od 250 nukleotida. Oligonukleotidi mogu da budu sintetički. Izrazi „oligonukleotid“ i „polinukleotid“ nisu međusobno isključivi. Gornji opis polinukleotida je podjednako i potpuno primenljiv na oligonukleotide.

[0082] Izraz „prajmer“ se odnosi na jednolančani polinukleotid koji je u stanju da hibridizuje nukleinsku kiselinu i omogućava polimerizaciju komplementarne nukleinske kiseline, generalno tako što će obezbediti slobodnu 3’-OH grupu.

[0083] Izraz „mali molekul“ se odnosi na bilo koji molekul sa molekulskom masom od oko 2000 daltona ili manje, po mogućnosti od oko 500 daltona ili manje.

[0084] Izrazi „ćelija domaćin“, „linija ćelije domaćina“ i „kultura ćelije domaćina“ koriste se naizmenično, i ukazuju na ćelije u koje je uvedena egzogena nukleinska kiselina, uključujući potomstvo takvih ćelija. Ćelije domaćini uključuju „transformante“ i „transformisane ćelije“, koje uključuju primarne transformisane ćelije i potomstvo dobijeno od njih, bez obzira na broj presejavanja. Potomstvo ne mora biti po sadržaju nukleinskih kiselina sasvim istovetno matičnoj ćeliji, već može da sadrži mutacije. Ovde se uključuje mutantno potomstvo koje ima istu funkciju ili biološku aktivnost kao što je ispitano ili odabrano u originalno transformisanoj ćeliji.

[0085] Izraz „vektor“, kao što se ovde koristi, ukazuje na molekul nukleinske kiseline koji može da propagira drugu nukleinsku kiselinu za koju je vezan. Izraz uključuje vektor kao samoumnožavajuću strukturu nukleinske kiseline, kao i vektor ugrađen u genom ćelije domaćina u koju je uveden. Pojedini vektori mogu da upravljaju ekspresijom nukleinskih kiselina za koje su operativno vezani. Takvi vektori se ovde pominju kao „ekspresioni vektori“.

[0086] „Izolovana“ nukleinska kiselina ukazuje na molekul nukleinske kiseline koji je odvojen od komponenata svog prirodnog okruženja. Izolovana nukleinska kiselina uključuje molekul nukleinske kiseline koji se nalazi u ćelijama koje uobičajeno sadrže molekul nukleinske kiseline, ali je molekul nukleinske kiseline prisutan ekstrahromozomski, ili na hromozomskoj lokaciji koja se razlikuje od njegove prirodne hromozomske lokacije.

[0087] Izraz „antitelo“ ovde je upotrebljen u najširem smislu, i obuhvata različite strukture antitela, uključujući, ali se ne ograničavajući na monoklonska antitela, poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela) i fragmente antitela, dokle god oni pokazuju željenu antigen-vezujuću aktivnost.

[0088] „Izolovano“ antitelo je ono koje je identifikovano i odvojeno i/ili se obnavlja iz komponente njegove prirodne sredine. Komponente zagađivača njegove prirodne sredine su materijali koji bi ometali istraživanje, dijagnostiku i/ili terapeutsku upotrebu antitela, i mogu uključivati enzime, hormone i druge proteinske ili neproteinske rastvorljive supstance. U nekim otkrićima, antitelo se prečišćava (1) do više od 95% masenog udela antitela, kao što je određeno, na primer, Lorijevim postupkom, a u nekim otkrićima do više od 99% masenih; (2) do stepena koji je dovoljan da se dobije najmanje 15 ostataka N-terminalne ili interne aminokiselinske sekvence korišćenjem, na primer, uređaja za sekvenciranje sa rotacionom posudom ili (3) do homogenosti pomoću SDS-PAGE pod redukcionim ili neredukcionim uslovima korišćenjem, na primer, bojenja bojom Coomassie blue ili bojenja srebrom. Izolovano antitelo obuhvata antitelo in situ u rekombinantnim ćelijama, jer barem jedna komponenta prirodnog okruženja antitela neće biti prisutna. Međutim, izolovano antitelo će se obično pripremiti najmanje jednim korakom prečišćavanja.

[0089] „Nativna antitela“ su obično heterotetramerni glikoproteini od oko 150.000 daltona, sastavljeni od dva identična laka (L) lanca i dva identična teška (H) lanca. Svaki laki lanac je

[0092] 1

[0093] povezan sa teškim lancem pomoću jedne kovalentne disulfidne veze, dok broj disulfidnih veza između teških lanaca različitih imunoglobulinskih izotipova varira. Svaki teški i laki lanac takođe ima pravilno razmaknute intralančane disulfidne mostove. Svaki teški lanac ima na jednom kraju varijabilni domen (VH), praćen nizom konstantnih domena. Svaki laki lanac ima varijabilni domen na jednom kraju (VL) i konstantni domen na drugom kraju; konstantni domen lakog lanca je poravnat sa prvim konstantnim domenom teškog lanca, a varijabilni domen lakog lanca je poravnat sa varijabilnim domenom teškog lanca. Veruje se da određeni aminokiselinski ostaci formiraju interfejs između varijabilnih domena lakog i teškog lanca.

[0094] „Laki lanci“ antitela (imunoglobulini) iz bilo koje vrste sisara mogu se svrstati u jedan od dva jasno odvojena tipa, koji se nazivaju kapa („κ“) i lambda („λ“), na osnovu aminokiselinskih sekvenci njihovih konstantnih domena.

[0095] Izraz „konstantni domen“ se odnosi na deo molekula imunoglobulina koji ima očuvaniju aminokiselinsku sekvencu u odnosu na drugi deo imunoglobulina, varijabilni domen, koji sadrži mesto vezivanja antigena. Konstantni domen sadrži CH1, CH2 i CH3 domene (zajednički, CH) teškog lanca i CHL (ili CL) domen lakog lanca.

[0096] „Varijabilni region“ ili „varijabilni domen“ antitela se odnosi na aminoterminalne domene teškog ili lakog lanca antitela. Varijabilni domen teškog lanca može se nazvati „VH“. Varijabilni domen lakog lanca može se nazvati „VL“. Ti domeni su uglavnom najvarijabilniji delovi antitela i sadrže antigen-vezujuća mesta.

[0097] Izraz „varijabilan“ se odnosi na činjenicu da se određeni delovi varijabilnih domena znatno razlikuju po sekvenci između antitela i koriste se za vezivanje i specifičnost svakog pojedinačnog antitela za njegov specifični antigen. Međutim, varijabilnost nije ravnomerno raspoređena po varijabilnim domenima antitela. Koncentrisana je u tri segmenta koji se nazivaju hipervarijabilni regioni (HVR) u varijabilnim domenima lakog i teškog lanca. Više konzervirani delovi varijabilnih domena nazivaju se okvirni regioni (FR). Svaki varijabilni domen nativnih teških i lakih lanaca obuhvata četiri FR regiona, koji u velikoj meri zauzimaju konfiguraciju beta-ravni, povezanu sa tri HVR regiona, koji formiraju petlje koje povezuju, a u nekim slučajevima i formiraju, deo konfiguracije beta-ravni. HVR regioni u svakom lancu se drže zajedno u neposrednoj blizini FR regiona, a sa HVR regionima iz drugog lanca doprinose stvaranju antigen-vezujućih mesta (videti Kabat i sar. Sequences of Proteins of Immunological Interest, peto izdanje, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)). Konstantni domeni nisu direktno uključeni u vezivanje antitela za antigen, ali pokazuju različite efektorske funkcije, kao što je učešće antitela u ćelijskoj citotoksičnosti zavisnoj od antitela.

[0100] 1

[0101] Izrazi „hipervarijabilni region“, „HVR“ ili „HV“, kada se ovde koristi, odnosi se na regione varijabilnog domena antitela koji su hipervarijabilni u sekvenci i/ili formiraju strukturno definisane petlje. Generalno, antitela obuhvataju šest HVR regiona, tri u VH (H1, H2, H3) i tri u VL (L1, L2, L3). U nativnim antitelima, H3 i L3 pokazuju najviše raznolikosti od šest HVR regiona, a veruje se da naročito H3 ima jedinstvenu ulogu u dodeli fine specifičnosti antitelima. Pogledajte, na primer, Xu i sar. Immunity 13:37-45 (2000); Johnson i Wu, u Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, izd. Human Press, Totowa, NY, 2003). Zapravo, antitela koja se prirodno pojavljuju kod vrsta iz porodice kamelida, koja se sastoje samo od teškog lanca su funkcionalna i stabilna u odsustvu lakog lanca. Pogledajte, na primer, Hamers-Casterman i sar. Nature 363:446-448 (1993); Sheriff i sar. Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996).

[0102] U upotrebi je određeni broj razgraničenja HVR regiona i ona su ovde obuhvaćena. Kabatovi regioni za određivanje komplementarnosti (CDR) bazirani su na varijabilnosti sekvence i najčešće se koriste (Kabat i sar. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Umesto toga, Čotija se odnosi na lokaciju strukturnih petlji (Chothia i Lesk J. Mol. Biol.196:901-917 (1987)). HVR regioni AbM predstavljaju kompromis između Kabatovih HVR regiona i Čotijinih strukturnih petlji, a koristi ih softver za modelovanje AbM antitela kompanije Oxford Molecular. HVR regioni „kontakta“ su bazirani na analizi raspoloživih kompleksnih kristalnih struktura. Ostaci iz svakog od ovih HVR regiona su navedeni u nastavku.

[0103] Petlja Kabat AbM Čotija Kontakt

[0104] L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36

[0105] L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55

[0106] L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96

[0107] H1 H31-H35b H26-H35b H26-H32 H30-H35b (Kabatova numeracija)

[0108] H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Čotijina numeracija)

[0109] H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58

[0110] H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101

[0111] HVR regioni mogu sadržati sledeće „proširene HVR regione“: 24-36 ili 24-34 (L1), 46-56 ili 50-56 (L2) i 89-97 ili 89-96 (L3) u VL lancu i 26-35 (H1), 50-65 ili 49-65 (H2) i 93-102, 94-102 ili 95-102 (H3) u VH lancu. Ostaci varijabilnog domena su numerisani prema Kabatu i sar., supra, za svaku od ovih definicija.

[0114] 1

[0115] Ostaci „okvirnih“ ili „FR“ regiona su oni ostaci varijabilnog domena koji nisu ostaci HVR regiona, kao što su ovde definisani.

[0116] Izraz „numerisanje ostataka varijabilnog domena kao u Kabatu“ ili „numerisanje pozicije aminokiselina kao u Kabatu“, i njegove varijacije, odnose se na sistem numeracije koji se koristi za varijabilne domene teškog lanca ili varijabilne domene lakog lanca kompilacije antitela u Kabatu i sar., supra. Pri korišćenju ovog sistema numeracije, stvarna linearna aminokiselinska sekvenca može sadržati manje ili više aminokiselina što odgovara skraćivanju, odnosno umetanju u FR ili HVR varijabilnog domena. Na primer, varijabilni domen teškog lanca može da uključuje jedan pojedinačni aminokiselinski unos (ostatak 52a prema Kabatu) nakon ostatka 52 od H2 i ubačenih ostataka (npr. ostaci 82a, 82b i 82c, itd. prema Kabatu) nakon ostatka FR teškog lanca 82. Numeracija ostataka prema Kabatu se može odrediti za dato antitelo poravnavanjem u oblastima homologije sekvence antitela sa „standardnom“ numerisanom Kabatovom sekvencom.

[0117] Sistem numerisanja prema Kabatu se generalno koristi kada se govori o ostatku u varijabilnom domenu (otprilike ostaci od 1-107 lakog lanca i ostaci od 1-113 teškog lanca) (npr. Kabat i sar. Sequences of Immunological Interest. 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). „EU sistem numerisanja“ ili „EU indeks“ se generalno koristi kada se ukazuje na ostatak u konstantnom regionu teškog lanca imunoglobulina (npr. EU indeks koji su objavili Kabat i sar., supra). „EU indeks kao u Kabatu“ odnosi se na brojanje ostataka humanog IgG1 EU antitela.

[0118] Izrazi „antitelo pune dužine“, „netaknuto antitelo“ i „celo antitelo“ se u ovom dokumentu naizmenično koriste za označavanje antitela u njegovom uglavnom netaknutom obliku, a ne za fragmente antitela kako je definisano u nastavku. Izrazi se posebno odnose na antitelo sa teškim lancima koje sadrži Fc region.

[0119] „Fragmenti antitela“ obuhvataju deo netaknutog antitela, poželjno sadrže njegov antigen-vezujući region. U nekim otkrićima, fragment antitela koji je ovde opisan je antigenvezujući fragment. Primeri fragmenata antitela uključuju Fab, Fab’, F(ab’)<2>i Fv fragmente; dvojna antitela; linearna antitela; jednolančane molekule antitela; i multispecifična antitela nastala od fragmenata antitela.

[0120] Digestija antitela papainom dala je dva identična fragmenta za vezivanje antigena, pod nazivom „Fab“ fragmenti, svaki sa jednim mestom za vezivanje antigena, a ostatak je „Fc“ fragment, čije ime odražava njegovu sposobnost lake kristalizacije. Tretman pepsinom daje F(ab’)<2>fragment koji ima dva mesta za kombinovanje antigena i još uvek je sposoban za umrežavanje antigena.

[0123] 1

[0124] „Fv“ je minimalni fragment antitela koji sadrži kompletno antigen-vezujuće mesto. U jednom otkriću, dvolančana vrsta Fv se sastoji od dimera varijabilnog domena jednog teškog i jednog lakog lanca u čvrstoj, nekovalentnoj vezi. U jednolančanoj vrsti Fv (scFv), varijabilni domen jednog teškog i jednog lakog lanca može biti kovalentno vezan sa fleksibilnim peptidnim linkerom tako da se laki i teški lanac mogu povezati u „dimernoj“ strukturi analognoj onoj kod dvolančane vrste Fv. U ovoj konfiguraciji, tri HVR regiona svakog varijabilnog domena vrše interakciju i definišu antigen-vezujuće mesto na površini VH-VL dimera. Zajedno, šest HVR regiona daje antigen-vezujuću specifičnost antitelu. Međutim, čak i jedan varijabilni domen (ili polovina Fv koja sadrži samo tri HVR regiona specifična za antigen) ima sposobnost prepoznavanja i vezivanja antigena, ali sa nižim afinitetom od celog mesta vezivanja.

[0125] Fab fragment sadrži varijabilne domene teškog i lakog lanca i takođe sadrži konstantni domen lakog lanca i prvi konstantni domen (CH1) teškog lanca. Fab’ fragmenti se razlikuju od Fab fragmenata po dodavanju nekoliko ostataka na karboksi terminusu CH1 domena teškog lanca, uključujući jedan ili više cisteina iz regiona šarke antitela. Fab’-SH je ovde oznaka za Fab’ u kome ostatak cisteina konstantnih domena nosi slobodnu tiol grupu. F(ab’)<2>fragmenti antitela su prvobitno proizvedeni kao parovi Fab’ fragmenata koji imaju između sebe šarke cisteina. Takođe su poznati i drugi hemijski sklopovi fragmenata antitela.

[0126] Fragmenti „jednolančanog Fv“ ili „scFv“ antitela obuhvataju VH i VL domene antitela, pri čemu su ovi domeni prisutni u jednom polipeptidnom lancu. Generalno, scFv polipeptid dalje sadrži polipeptidni linker između VH i VL domena koji omogućava da scFv formira željenu strukturu za vezivanje antigena. Za pregled scFv, pogledajte, npr. Pluckthün, u The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, tom 113, Rosenburg i Moore izd. (Springer-Verlag, New York, 1994), str.269-315.

[0127] Izraz „dijatela“ se odnosi na fragmente antitela sa dva antigen-vezujuća mesta, i ti fragmenti sadrže varijabilni domen teškog lanca (VH) koji je povezan sa varijabilnim domenom lakog lanca (VL) u istom polipeptidnom lancu (VH-VL). Koristeći linker koji je prekratak da omogući uparivanje između dva domena na istom lancu, domeni su prisiljeni da se uparuju sa komplementarnim domenima drugog lanca i stvaraju dva antigen-vezujuća mesta. Dijatela mogu biti dvovalentna ili bispecifična. Dijatela su detaljnije opisana, na primer, u EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson i sar. Nat. Med. 9:129-134 (2003); i Hollinger i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Trijatela i tetratela su takođe opisana u članku Hudson i sar, Nat. Med. 9:129-134 (2003).

[0128] „Klasa“ antitela ukazuje na vrstu konstantnog domena ili konstantnog regiona koju

[0131] 1

[0132] ima njegov teški lanac. Postoji pet glavnih klasa antitela: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a neke od njih mogu biti dalje podeljene na potklase (izotipove), npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama antitela zovu se α, δ, ε, γ, odnosno μ.

[0133] Izraz „monoklonsko antitelo“, kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo dobijeno od populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela koja sadrže populaciju su identična osim mogućih mutacija, npr. prirodnih mutacija koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Tako reč „monoklonsko“ ukazuje na karakter antitela, koje nije smeša diskretnih antitela. U određenim otkrićima, takvo monoklonsko antitelo tipično uključuje antitelo koje sadrži polipeptidnu sekvencu koja vezuje cilj, naznačeno time što je ciljna sekvenca vezivanja polipeptida dobijena procesom koji uključuje selekciju jedne ciljne vezne sekvence iz mnoštva sekvenci polipeptida. Na primer, proces selekcije može biti selekcija jedinstvenog klona iz mnoštva klonova, kao što je skup klonova hibridoma, klonova faga ili klonova rekombinantne DNK. Treba razumeti da izabrana ciljna sekvenca vezivanja može biti dodatno izmenjena, na primer, radi poboljšanja afiniteta prema cilju, humanizacije ciljne sekvence vezivanja, poboljšanja njene proizvodnje u ćelijskoj kulturi, smanjivanja njene imunogenosti in vivo, stvaranja multispecifičnog antitela, itd., a da antitelo koje sadrži promenjenu ciljnu sekvencu vezivanja takođe bude monoklonsko antitelo ovog pronalaska. Nasuprot preparatima poliklonskih antitela, koji tipično uključuju različita antitela, usmerena prema različitim determinantama (epitopima), svako monoklonsko antitelo iz preparata monoklonskog antitela je usmereno na pojedinačnu determinantu na antigenu. Pored njihove specifičnosti, prednost preparata monoklonskih antitela je ta što po pravilu nisu kontaminirani drugim imunoglobulinima.

[0134] Reč „monoklonsko“ ukazuje na karakter antitela koje je dobijeno iz suštinski homogene populacije antitela, i ne treba da se tumači tako da se zahteva proizvodnja antitela nekim određenim postupkom. Na primer, monoklonska antitela koja se koriste shodno pronalasku se mogu proizvesti različitim tehnikama, uključujući, na primer, postupak hibridoma (npr. Kohler i Milstein. Nature 256:495-97 (1975); Hongo i sar. Hybridoma 14 (3): 253-260 (1995), Harlow i sar. Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. izd. 1988); Hammerling i sar. u: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, NY, 1981), rekombinantni postupci DNK (pogledajte, npr. US Pat. br.4,816,567), tehnologije displeja faga (pogledajte, npr. Clackson i sar. Nature, 352: 624-628 (1991); Marks i sar. J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu i sar. J. Mol. Biol.

[0135] 338(2): 299-310 (2004); Lee i sar. J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc.

[0138] 2

[0139] Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); i Lee i sar. J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004), i tehnologije za proizvodnju humanih antitela ili antitela poput humanih kod životinja koje imaju delove ili sve humane imunoglobulinske lokuse ili gene koji kodiraju ljudske imunoglobulinske sekvence (videti npr. WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits i sar. Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann i sar. Year in Immunol.

[0140] 7:33 (1993); U.S. Pat. br. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; i 5,661,016; Marks i sar. Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg i sar. Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild i sar. Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); i Lonberg i sar. Intern. Rev. imunol. 13: 65-93 (1995).

[0141] Monoklonska antitela ovde specifično uključuju „himerna“ antitela, kod kojih je deo teškog i/ili lakog lanca identičan ili homolog sa odgovarajućim sekvencama antitela dobijenih od naročitih vrsta, ili koji pripadaju naročitoj klasi ili potklasi antitela, dok je ostatak lan(a)ca identičan ili homolog sa odgovarajućim sekvencama antitela dobijenih od drugih vrsta, ili koje pripadaju drugoj klasi ili potklasi antitela, kao i fragmente takvih antitela, sve dok oni ispoljavaju željenu biološku aktivnost (pogledajte npr. U.S. Pat. br. 4,816,567; i Morrison i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). Himerna antitela uključuju PRIMATIZED® antitela naznačena time da je antigen-vezujući region antitela izveden iz antitela koja se proizvode, npr. imunizacijom makaki majmuna antigenom od interesa.

[0142] „Humano antitelo“ je ono koje ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara aminokiselinskoj sekvenci koju proizvodi čovek ili humana ćelija, ili ono dobijeno iz nehumanog izvora koji koristi humani repertoar antitela ili druge sekvence za kodiranje humanog antitela. Ova definicija humanog antitela specifično isključuje humanizovano antitelo koje sadrži antigen-vezujuće ostatke koji nisu ljudskog porekla.

[0143] „Humanizovano“ antitelo ukazuje na himerno antitelo koje obuhvata aminokiselinske ostatke od ne-humanih HVR-ova i aminokiselinske ostatke od humanih okvirnih regiona (FR). U određenim otkrićima, humanizovano antitelo će obuhvatati u suštini sve, ili najmanje jedan, a tipično dva varijabilna domena, u kojima svi, ili suštinski svi FR-ovi (npr. CDR), odgovaraju onima iz ne-humanog antitela, a svi, ili suštinski svi FR-ovi, odgovaraju onima iz humanog antitela. Humanizovano antitelo opciono može da sadrži najmanje deo konstantnog regiona antitela dobijenog od humanog antitela. „Humanizovani oblik“ antitela, npr. nehumanog antitela, ukazuje na antitelo koje je pretrpelo humanizaciju.

[0144] Izraz „anti-PD-L1 antitelo“ i „antitelo koje se vezuje za PD-L1“ odnosi se na antitelo koje je sposobno da veže PD-L1 sa dovoljnim afinitetom, na takav način da antitelo bude korisno kao dijagnostički i/ili terapeutski agens za ciljanje PD-L1. U jednom otkriću, obim vezivanja anti-PD-L1 antitela za nepovezani protein koji nije PD-L1 je manji od oko 10% vezivanja antitela za PD-L1 kao što je izmereno, na primer radioimunotestom (RIA). U određenim otkrićima, anti-PD-L1 antitelo se vezuje za epitop PD-L1 koji je konzerviran među PD-L1 različitih vrsta.

[0145] Izraz „anti-PD-1 antitelo“ i „antitelo koje se vezuje za PD-1“ odnosi se na antitelo koje je sposobno da veže PD-1 sa dovoljnim afinitetom, na takav način da antitelo bude korisno kao dijagnostički i/ili terapeutski agens za ciljanje PD-1. U jednom otkriću, obim vezivanja anti-PD-1 antitela za nepovezani protein koji nije PD-1 je manji od oko 10% vezivanja antitela za PD-1 kao što je izmereno, na primer radioimunotestom (RIA). U određenim otkrićima, anti-PD-1 antitelo se vezuje za epitop PD-1 koji je konzerviran među PD-1 različitih vrsta.

[0146] „Blokirajuće“ antitelo ili „antagonističko“ antitelo je ono koje inhibira ili smanjuje biološku aktivnost antigena sa kojim se vezuje. Poželjna blokirajuća antitela ili antagonistička antitela suštinski ili u potpunosti inhibiraju biološku aktivnost antigena.

[0147] „Afinitet“ se odnosi na snagu zbira ukupnih nekovalentnih interakcija između pojedinačnog mesta vezivanja molekula (npr. antitela) i njegovog partnera u vezivanju (npr. antigena). Ukoliko nije drugačije naznačeno, kao što je ovde upotrebljeno, „afinitet vezivanja“ se odnosi na suštinski afinitet vezivanja, koji odražava 1:1 interakciju između članova vezujućeg para (npr. antitela i antigena). Afinitet molekula X prema svom partneru Y može generalno da se predstavi putem konstante disocijacije (Kd). Afinitet može da se izmeri uobičajenim postupcima poznatim u struci, uključujući one opisane u ovom dokumentu. Specifična otkrića data kao ilustracija i primer za merenje afiniteta vezivanja opisane su u nastavku.

[0148] Kako se ovde koristi, pojam „vezuje“, „specifično se vezuje za“ ili je „specifičan za“ odnosi se na merljive i reproduktivne interakcije, kao što je vezivanje između cilja i antitela, što je odlučujuće za prisustvo cilja u prisustvu heterogene populacije molekula, uključujući biološke molekule. Na primer, antitelo koje se vezuje ili specifično vezuje za cilj (što može biti epitop) je antitelo koje vezuje ovaj cilj sa većim afinitetom, težnjom, spremnošću i/ili u dužem trajanju nego što se vezuje za druge ciljeve. U jednom otkriću, obim vezivanja antitela za nepovezani protein je manji od oko 10% vezivanja antitela za cilj što je izmereno, npr. radioimunotestom (RIA). U određenim otkrićima, antitelo koje se specifično vezuje za cilj ima konstantu disocijacije (Kd) od ≤ 1 µM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ili ≤ 0,1 nM. U određenim otkrićima, antitelo se specifično vezuje za epitop na proteinu koji je konzerviran među proteinima različitih vrsta. U drugom otkriću, specifično vezivanje može da podrazumeva, ali ne zahteva isključivo vezivanje.

[0149] Izraz „afinitetno zrelo“ antitelo se odnosi na antitelo sa jednom ili više izmena u jednom ili više hipervarijabilnih regiona (HVR), u poređenju sa matičnim antitelom koje nema takve izmene, pri čemu takve izmene dovode do poboljšanja afiniteta antitela prema antigenu.

[0150] „Antitelo koje se vezuje za isti epitop“ kao referentno antitelo se odnosi na antitelo koje blokira vezivanje referentnog antitela za njegov antigen u kompetitivnom testu za 50% ili više, i obrnuto, referentno antitelo blokira vezivanje antitela za njegov antigen u kompetitivnom testu za 50% ili više. Ovde je dat primer kompetitivnog testa.

[0151] „Imunokonjugat“ je antitelo konjugovano sa jednim heterologim molekulom ili sa više heterologih molekula, uključujući, bez ograničenja, citotoksični agens.

[0152] Kako se ovde koristi, izraz „imunoadhezin“ označava molekule slične antitelima koji kombinuju specifičnost vezivanja heterologog proteina („adhezin“) sa efektorskim funkcijama konstantnih domena imunoglobulina. Strukturno, imunoadhezini obuhvataju fuziju neke aminokiselinske sekvence sa željenom specifičnošću vezivanja koja je drugačija od mesta prepoznavanja i vezivanja antigena antitela (tj. „heterologi“) i sekvence konstantnog domena imunoglobulina. Adhezinski deo imunoadhezinskog molekula tipično je susedna aminokiselinska sekvenca koja sadrži najmanje mesto vezivanja receptora ili liganda. Sekvenca konstantnog domena imunoglobulina u imunoadhezinu može se dobiti iz bilo kog imunoglobulina, kao što su podvrste IgG1, IgG2 (uključujući IgG2A i IgG2B), IgG3, ili IgG4, IgA (uključujući IgA1 i IgA2), IgE, IgD ili IgM. Ig fuzije poželjno sadrže supstituciju domena ovde opisanog polipeptida ili antitela umesto najmanje jednog varijabilnog regiona u molekulu Ig. U jednom otkriću, fuzija imunoglobulina sadrži region šarke, CH2 i CH3, ili region šarke, CH1, CH2 i CH3 molekula IgG1. Za proizvodnju fuzija imunoglobulina vidi i US Patent br. 5,428,130. Na primer, korisni imunoadhezini kao medikamenti korisni za terapiju ovde obuhvataju polipeptide koji sadrže vanćelijski domen (ECD) ili PD-1 vezujuće delove PD-L1 ili PD-L2, ili vanćelijske delove ili PD-L1 ili PD-L2 vezujuće delove PD-1, fuzionisane u konstantni domen imunoglobulinske sekvence, kao što je PD-L1 ECD-Fc, PD-L2 ECD-Fc, odnosno PD-1 ECD-Fc. Kombinacije imunoadhezina Ig Fc i ECD receptora ćelijske površine ponekad se nazivaju i rastvorljivim receptorima.

[0153] „Fuzioni protein“ i „fuzioni polipeptid“ odnosi se na polipeptid koji ima dva dela koja su kovalentno vezana, pri čemu, svaki deo je polipeptid koji ima neko različito svojstvo.

[0156] 2

[0157] Svojstvo može biti biološko, poput aktivnosti in vitro ili in vivo. Svojstvo može biti i jednostavno hemijsko ili fizičko svojstvo, kao što je vezivanje za ciljni molekul, kataliza reakcije, i slično. Ta dva dela mogu da se povežu direktno putem jedne peptidne veze ili putem peptidnog linkera, ali su u okviru za čitanje jedan sa drugim.

[0158] „Procenat (%) identičnosti sekvence aminokiselina“ u odnosu na sekvence polipeptida koji je ovde naveden definisan je kao procenat aminokiselinskih ostataka u sekvenci kandidatu koji su identični aminokiselinskim ostacima u sekvenci polipeptida koji se upoređuje, nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalni procenat identičnosti sekvence, ne uzimajući u obzir nikakve konzervativne supstitucije kao deo identičnosti sekvence. Poravnavanje radi određivanja procenta identičnosti aminokiselinske sekvence može se postići na različite načine koji su poznati u okviru struke, na primer, pomoću javno dostupnog kompjuterskog softvera, kao što je BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) softver. Stručnjaci za ovu oblast mogu da odrede odgovarajuće parametre za merenje poravnanja, uključujući sve potrebne algoritme za postizanje maksimalnog poravnavanja u kompletnoj dužini sekvenci koje se porede. Međutim, ovde su u tu svrhu vrednosti za % identičnosti sekvence aminokiselina dobijene pomoću računarskog programa za poređenje sekvenci ALIGN-2. Računarski program za poređenje sekvenci ALIGN-2 delo je kompanije „Genentech, Inc.“ a izvorni kôd je podnet sa korisničkom dokumentacijom u Patentni zavod SAD, Vašington D.C.20559, gde je registrovan pod patentnim brojem U.S. Copyright Registration No. TXU510087. Program ALIGN-2 je javno dostupan preko „Genentech, Inc.“ South San Francisco, Kalifornija. Program ALIGN-2 treba da se kompilira za primenu na operativnom sistemu UNIX, po mogućnosti digitalnom UNIX V4.0D. Sve parametre poređenja sekvenci je postavio program ALIGN-2 i nisu se menjali.

[0159] U slučajevima kada je ALIGN-2 korišćen za poređenja sekvenci aminokiselina, % identičnosti aminokiselinske sekvence date aminokiselinske sekvence A sa datom aminokiselinskom sekvencom B, ili u odnosu na nju (što alternativno može da se izrazi kao data aminokiselinska sekvenca A koja ima ili sadrži određeni % identičnosti aminokiselinske sekvence prema, sa ili u odnosu na datu aminokiselinsku sekvencu B) izračunava se na sledeći način:

[0160] 100 puta količnik X/Y

[0161] gde je X broj aminokiselinskih ostataka za koje je dobijen rezultat da su identični putem programa za poređenje sekvenci ALIGN-2 pri poravnavanju A i B u tom programu, i gde je Y ukupan broj aminokiselinskih ostataka u B. Treba shvatiti da, u slučaju da dužina aminokiselinske sekvence A nije jednaka dužini aminokiselinske sekvence B, % identičnosti sekvence aminokiseline A u odnosu na B neće biti isti kao % identičnosti sekvence aminokiseline B u odnosu na A. Osim ako nije drugačije navedeno, sve ovde upotrebljene vrednosti % identičnosti sekvence aminokiseline dobijene su, kao što je opisano u prethodnom paragrafu, pomoću računarskog programa ALIGN-2.

[0162] Izraz „detekcija“ uključuje svaki način detektovanja, uključujući direktnu i indirektnu detekciju.

[0163] Izraz „biomarker“ kao što se ovde koristi, odnosi se na indikator, npr. prediktivni, dijagnostički i/ili prognostički, koji se može detektovati u uzorku. Biomarker može da služi kao indikator određenog podtipa bolesti ili poremećaja (npr. raka) koji karakterišu određene, molekulske, patološke, histološke i/ili kliničke funkcije. U nekim otkrićima, biomarker je gen. Biomarkeri uključuju, ali nisu ograničeni na, polinukleotide (npr. DNK i/ili RNK), promene kopiranih brojeva polinukleotida (npr. kopirane brojeve DNK), polipeptide, modifikacije polipeptida i polinukleotida (npr. posttranslacione promene), ugljene hidrate i/ili molekulske markere na bazi glikolipida.

[0164] Izrazi „potpis biomarkera“, „potpis“, „potpis ekspresije biomarkera“ ili „potpis ekspresije“ ovde se upotrebljavaju naizmenično i upućuju na jedan biomarker ili kombinaciju biomarkera čija ekspresija je indikator, npr. prediktivni, dijagnostički i/ili prognostički. Potpis biomarkera može da posluži kao indikator određenog podtipa bolesti ili poremećaja (npr. raka) koje karakterišu određene molekulske, patološke, histološke i/ili kliničke funkcije. U nekim otkrićima, potpis biomarkera je „genetski potpis“. Izraz „genetski potpis“ se koristi naizmenično sa „potpisom genske ekspresije“ i odnosi se na jedan polinukleotid ili njihovu kombinaciju čija ekspresija je indikator, npr. prediktivni, dijagnostički i/ili prognostički. U nekim otkrićima, potpis biomarkera je „proteinski potpis“. Izraz „proteinski potpis“ se koristi naizmenično sa „potpisom proteinske ekspresije“ i odnosi se na jedan polipeptid ili kombinaciju polipeptida čija ekspresija je indikator, npr. prediktivni, dijagnostički i/ili prognostički.

[0165] „Iznos“ ili „nivo“ biomarkera povezanog sa povećanom kliničkom korišću za pojedinca je detektabilni nivo u biološkom uzorku. To se može meriti postupcima poznatim stručnjacima i takođe se otkriva ovde. Nivo ekspresije ili količina ocenjenog biomarkera može da se koristi za određivanje odgovora na tretman.

[0166] Izrazi „nivo ekspresije“ ili „ekspresioni nivo“ se generalno naizmenično koriste, i generalno se odnose na količinu biomarkera u biološkom uzorku. „Ekspresija“ se generalno odnosi na proces kojim se informacije (npr. genetski kodirane i/ili epigenetičke informacije)

[0169] 2

[0170] konvertuju u strukture koje postoje i funkcionišu u ćeliji. Zato, kao što se ovde koristi, „ekspresija“ može da se odnosi na transkripciju u polinukleotid, translaciju u polipeptid, ili čak modifikacije polinukleotida i/ili polipeptida (npr. posttranslacionu modifikaciju polipeptida). Fragmenti transkribovanog polinukleotida, translatovanog polipeptida ili polinukleotida i/ili polipeptidne modifikacije (npr. posttranslaciona modifikacija polipeptida) takođe će se smatrati eksprimiranim bilo da potiču iz transkripta generisanog alternativnim splajsovanjem ili degradiranim transkriptom, ili iz posttranslacione obrade polipeptida, na primer, proteolizom. „Eksprimirani geni“ uključuju one koji se transkribuju u polinukleotid kao mRNK, a zatim prevode u polipeptid, kao i one koji su transkribovani u RNK, ali nisu prevedeni u polipeptid (na primer, transportna i ribozomska RNK).

[0171] „Pojačana ekspresija“, „povišeni nivoi ekspresije“ ili „povišeni nivoi“ se odnose na povećanu ekspresiju ili povišen nivo biomarkera u pojedincu u odnosu na kontrolu, kao što je pojedinac ili pojedinci koji ne boluju od bolesti ili poremećaja (npr. rak) ili unutrašnja kontrola (npr. domaćinski biomarker).

[0172] „Smanjena ekspresija“, „smanjeni nivoi ekspresije“ ili „smanjeni nivoi“ se odnose na smanjenu ekspresiju ili snižen nivo biomarkera u pojedincu u odnosu na kontrolu, kao što je pojedinac ili pojedinci koji ne boluju od bolesti ili poremećaja (npr. rak) ili unutrašnja kontrola (npr. domaćinski biomarker). U nekim otkrićima, smanjenje ekspresije je mala ekspresija ili nema ekspresije.

[0173] Izraz „domaćinski biomarker“ se odnosi na biomarker ili grupu biomarkera (npr. polinukleotida i/ili polipeptida) koji su obično slični u svim vrstama ćelija. U nekim otkrićima, domaćinski biomarker je „domaćinski gen“. „Domaćinski gen“ se ovde odnosi na gen ili grupu gena, koji kodiraju proteine čije su aktivnosti neophodne za održavanje funkcije ćelija i koji su obično slični u svim tipovima ćelija.

[0174] „Amplifikacija“, kao što se ovde uglavnom koristi, odnosi se na proces proizvodnje više kopija željene sekvence. „Više kopija“ znači najmanje dve kopije. „Kopija“ ne znači nužno savršenu komplementarnost sekvence ili identičnost sa sekvencom predloška. Na primer, kopije mogu da uključuju nukleotidne analoge kao što su dezoksinoinozin, namerno menjanje sekvenci (kao što su izmene sekvence uvedene pomoću prajmera koji sadrži sekvencu koja može da se hibridizuje, ali nije i komplementarna predlošku) i/ili greške u sekvenci koje se pojavljuju tokom amplifikacije.

[0175] Izraz „multipleks-PCR“ se odnosi na jedinstvenu PCR reakciju koja se sprovodi na nukleinskoj kiselini dobijenoj od jednog izvora (npr. pojedinca) koristeći više od jednog kompleta prajmera u cilju amplifikacije dve ili više sekvenci DNK u jednoj reakciji.

[0178] 2

[0179] Tehnika „lančane reakcije polimeraze“ ili „PCR“ kao što se ovde koristi generalno se odnosi na proceduru u kojoj se veoma male količine specifičnog dela nukleinske kiseline, RNK i/ili DNK, amplifikuju kao što je opisano, na primer, u US Pat. br. 4,683,195. Generalno, informacije o sekvenci sa krajeva željenog regiona ili van njih moraju da budu dostupne, tako da oligonukleotidni prajmeri mogu da se dizajniraju; ovi prajmeri će da budu identični ili slični po sekvenci sa suprotnim lancima predloška koji će biti amplifikovan. 5’ terminalni nukleotidi dva prajmera mogli bi da se podudaraju sa krajevima amplifikovanog materijala. PCR može da se koristi za amplifikaciju specifičnih sekvenci RNK, specifičnih sekvenci DNK iz ukupne genomske DNK i cDNK transkribovanih iz ukupne ćelijske RNK, bakteriofaga ili sekvenci plazmida, itd. Pogledajte Mullis i sar. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263 (1987) i Erlich, izd. PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989). Kao što se ovde koristi, smatra se da je PCR jedan, ali ne i jedini primer za postupak reakcije polimeraze nukleinske kiseline za amplifikaciju uzorka nukleinskih kiselina, koji obuhvata korišćenje poznate nukleinske kiseline (DNK ili RNK) kao prajmera i koji koristi polimerazu nukleinskih kiselina za amplifikaciju ili generisanje specifičnog dela nukleinske kiseline, ili da se amplifikuje ili generiše određeni deo nukleinske kiseline koji je komplementaran određenoj nukleinskoj kiselini.

[0180] „Kvantitativna reakcija polimeraze u realnom vremenu“ ili „qRT-PCR“ se odnosi na oblik PCR-a u kojem se količina PCR proizvoda meri na svakom koraku u PCR reakciji. Ova tehnika je opisana u raznim publikacijama, uključujući, na primer, Cronin i sar. Am. J. Pathol. 164(1):35-42 (2004) i Ma i sar. Cancer Cell 5:607-616 (2004).

[0181] Izraz „mikročip“ se odnosi na uređeni raspored hibridizabilnih elemenata u nizu, po mogućnosti polinukleotidne sonde, na podlozi.

[0182] Izraz „dijagnoza“ se ovde koristi za identifikaciju ili klasifikaciju molekulskog ili patološkog statusa, bolesti ili stanja (npr. raka). Na primer, „dijagnoza“ može da se odnosi na identifikaciju određene vrste raka. „Dijagnoza“ može da se odnosi i na klasifikaciju određenog podtipa raka, na primer, prema histopatološkim kriterijumima, ili molekulskim karakteristikama (npr. podtip koji se karakteriše ekspresijom jednog, ili kombinacije biomarkera (npr. određenih gena ili proteina kodiranih od strane pomenutih gena)).

[0183] Izraz „pomoćna dijagnoza“ se ovde koristi za postupke koje pomažu u donošenju kliničke odluke u vezi sa prisustvom ili prirodom određenog tipa simptoma ili stanja bolesti ili poremećaja (npr. rak). Na primer, postupak pomoćne dijagnoze bolesti ili stanja (npr. rak) može da se sastoji od merenja određenih biomarkera (npr. PD-L1) u biološkom uzorku pojedinca.

[0186] 2

[0187] Izraz „uzorak“, kao što se koristi ovde, odnosi se na kompoziciju koja je nabavljena ili izvedena od ispitanika /ili pojedinca od interesa koja sadrži ćelijski i/ili drugi molekulski entitet koji bi trebalo da bude okarakterisan i/ili identifikovan, na primer, na osnovu fizičke, biohemijske, hemijske i/ili fiziološke karakteristike. Na primer, fraza „uzorak bolesti“ i njene varijacije se odnose na bilo koji uzorak dobijen od željenog ispitanika koji će se očekivati ili za koji se zna da sadrži ćelijski i/ili molekulski entitet koji bi trebalo okarakterisati. Uzorci uključuju, ali nisu ograničeni na, uzorke tkiva, primarne ili uzgajane ćelije ili linije ćelija, ćelijske supernatante, lizate ćelija, trombocite, serum, plazmu, tečnost staklastog tela, limfnu tečnost, sinovijalnu tečnost, folikularnu tečnost, semensku tečnost, amniotsku tečnost, mleko, punu krv, ćelije izvedene iz krvi, urin, cerebrospinalnu tečnost, pljuvačku, sputum, suze, znoj, sluz, lizate tumora i podlogu za kulturu tkiva, ekstrakte tkiva kao što je homogenizovano tkivo, tkivo tumora, ćelijski ekstrakti, i njihove kombinacije.

[0188] „Uzorak tkiva“ ili „uzorak ćelije“ znači kolekcija sličnih ćelija dobijenih iz tkiva ispitanika ili pojedinca. Izvor uzorka tkiva ili ćelije može biti čvrsto tkivo poput onog iz svežeg, zamrznutog i/ili sačuvanog uzorka organa, tkiva, biopsije i/ili aspirata, krv ili bilo koji sastojak krvi kao što je plazma, telesne tečnosti kao što je cerebrospinalna tečnost, amnionska tečnost, peritonealna tečnost ili intersticijalna tečnost, ćelije iz bilo kog trenutka gestacije ili razvoja ispitanika. Uzorak tkiva takođe može da bude primarna ili uzgajana ćelija ili linija ćelija. Opciono, tkivo ili uzorak ćelije se nabavlja od obolelog tkiva/organa. Na primer, „uzorak tumora“ je uzorak tkiva dobijen od tumora ili drugog kancerogenog tkiva. Uzorak tkiva može da sadrži jedinjenja koja nisu prirodno mešana sa tkivom u prirodi, kao što su konzervansi, antikoagulansi, puferi, fiksatori, nutrijenti, antibiotici, ili slično.

[0189] „Infiltrat imunoćelija u tumoru“ kao što se ovde koristi, odnosi se na bilo koje imunoćelije prisutne u tumoru ili njihov uzorak. Infiltrat imunoćelija u tumoru uključuje, ali nije ograničen na, intratumorske imune ćelije, peritumorske imune ćelije, druge ćelije tumora stroma (npr. fibroblaste) ili bilo koju njihovu kombinaciju. Takav infiltrat imunoćelija u tumoru mogu da budu, na primer, T limfociti (kao što su CD8+ T limfociti i/ili CD4+ T limfociti), B limfociti ili druge ćelije koštane srži, uključujući granulocite (npr, neutrofili, eozinofili i bazofili), monocite, makrofage, dendritične ćelije (npr. interdigitacione dendritične ćelije), histiociti i ćelije prirodne ubice.

[0190] „Ćelija tumora“, kao što se ovde koristi, odnosi se na bilo koju ćeliju tumora prisutnu u tumoru ili njen uzorak. Ćelije tumora se mogu razlikovati od drugih ćelija koje mogu biti prisutne u uzorku tumora, na primer, stromalnim ćelijama i imunološkim ćelijama koje se infiltriraju u tumor, koristeći postupke poznate u struci i/ili opisane ovde.

[0193] 2

[0194] „Referentni uzorak“, „referentna ćelija“, „referentno tkivo“, „kontrolni uzorak“, „kontrolna ćelija“ ili „kontrolno tkivo“, kao što se ovde koristi, odnosi se na uzorak, ćeliju, tkivo, standard ili nivo koji se koristi u svrhe poređenja. U jednom otkriću, referentni uzorak, referentna ćelija, referentno tkivo, kontrolni uzorak, kontrolna ćelija ili kontrolno tkivo dobijeni su iz zdravog i/ili neobolelog dela tela (npr. tkiva ili ćelija) istog ispitanika ili pojedinca. Na primer, referentni uzorak, referentna ćelija, referentno tkivo, kontrolni uzorak, kontrolna ćelija ili kontrolno tkivo mogu biti zdrave i/ili neobolele ćelije ili tkivo pored obolelih ćelija ili tkiva (npr. ćelije ili tkivo pored tumora). U drugom otkriću, referentni uzorak je dobijen od nelečenog tkiva i/ili ćelije tela istog ispitanika ili pojedinca. U još jednom otkriću, referentni uzorak, referentna ćelija, referentno tkivo, kontrolni uzorak, kontrolna ćelija ili kontrolno tkivo su dobijeni iz zdravog i/ili neobolelog dela tela (npr. tkiva ili ćelija) pojedinca koji nije ispitanik ili pojedinac. U još jednom otkriću, referentni uzorak, referentna ćelija, referentno tkivo, kontrolni uzorak, kontrolna ćelija ili kontrolno tkivo su dobijeni od nelečenog tkiva i/ili ćelije tela pojedinca koji nije ispitanik ili pojedinac.

[0195] Za ove svrhe, „deo“ tkiva znači jedan deo ili deo uzorka tkiva, na primer, tanko parče tkiva ili ćelija isečena iz uzorka tkiva (npr. uzorak tumora). Potrebno je da se razume da se višestruki delovi uzorka tkiva mogu uzeti i podvrgnuti analizi, pod uslovom da se razume da isti deo uzorka tkiva može da se analizira i na morfološkom i molekularnom nivou ili da se analizira u pogledu polipeptida (npr., imunohistohemijski) i/ili polinukleotida (npr. in situ hibridizacijom).

[0196] „U skladu“ ili „u skladu sa“ znači poređenje, u svakom slučaju, performansi i/ili rezultata prve analize ili protokola sa performansama i/ili rezultatima druge analize ili protokola. Na primer, može da se koristi rezultat prve analize ili protokola u izvršavanju drugog protokola i/ili neki mogu da koriste rezultate prve analize ili protokola da bi se utvrdilo da li treba izvršiti drugu analizu ili protokol. Kada je u pitanju otkrivanje analize ili protokola polipeptida, mogu da se koriste rezultati analize ekspresije ili protokola polipeptida kako bi se utvrdilo da li je potrebno da se izvrši određeni terapeutski režim. Kada je u pitanju otkrivanje polinukleotidne analize ili protokola, mogu da se koriste rezultati analize ekspresije ili protokola polinukleotida da bi se utvrdilo da li je potrebno da se izvrši određeni terapeutski režim.

[0197] „Individualni odgovor“ ili „odgovor“ može da se proceni korišćenjem bilo koje krajnje tačke koja ukazuje na korist pojedinca, uključujući, bez ograničenja, (1) inhibiciju, u određenoj meri, progresije bolesti (npr. progresije raka), uključujući usporavanje i potpuni prekid; (2) smanjenje veličine tumora; (3) inhibiciju (tj. smanjenje, usporavanje ili potpuno

[0200] 2

[0201] zaustavljanje) infiltracije ćelija sa rakom u susedne periferne organe i/ili tkiva; (4) inhibiciju (npr. redukciju, usporavanje ili potpuno zaustavljanje) metastaze; (5) olakšanje, u određenoj meri, nekih simptoma povezanih sa bolešću ili poremećajem (npr. rak); (6) povećanje ili produženje preživljavanja, uključujući ukupno preživljavanje i preživljavanje bez progresije; i/ili (9) smanjenje smrtnosti u datom trenutku nakon lečenja.

[0202] „Efikasni odgovor“ pacijenta ili „sposobnost odgovora“ pacijenta na lečenje lekom i slično sročeno, odnosi se na kliničku ili terapeutsku korist koja se pruža pacijentu kojem preti bolest ili koji boluje od bolesti ili poremećaja, poput raka. U jednom otkriću, takva korist uključuje jedno ili više od: produžavanja preživljavanja (uključujući ukupno preživljavanje i preživljavanje bez progresije), postizanja objektivnog odgovora (uključujući kompletni odgovor ili delimični odgovor) ili poboljšanja znakova ili simptoma raka. U jednom otkriću, biomarker (npr. ekspresija PD-L1, na primer, kao što je utvrđeno korišćenjem IHC-a) koristi se za identifikaciju pacijenta za koga je predviđeno da ima povećanu verovatnoću odgovora na lečenje pomoću lekova (npr. tretmana koji sadrži antagonist vezivanja PD-L1 ose, npr. anti-PD1 antitelo) u odnosu na pacijenta koji ne eksprimira biomarker. U jednom otkriću, biomarker (npr. ekspresija PD-L1, kao što je utvrđeno korišćenjem IHC-a) koristi se za identifikaciju pacijenta za koga je predviđeno da ima povećanu verovatnoću odgovora na lečenje pomoću lekova (npr. anti-PD-L1 antitela), u odnosu na pacijenta koji ne eksprimira biomarker na istom nivou. U jednom otkriću, prisustvo biomarkera se koristi da se identifikuje pacijent koji će najverovatnije imati odgovor na lečenje lekom, u odnosu na pacijenta koji nema prisustvo biomarkera. U drugom otkriću, prisustvo biomarkera se koristi da se utvrdi da će pacijent imati veću verovatnoću koristi od lečenja lekom, u odnosu na pacijenta koji nema prisustvo biomarkera.

[0203] „Objektivni odgovor“ odnosi se na merljivu reakciju, uključujući kompletan odgovor (CR) ili delimičan odgovor (PR). U nekim otkrićima, objektivna stopa odgovora (ORR) se odnosi na zbir stope kompletnog odgovora (CR) i stope delimičnog odgovora (PR).

[0204] Pod „kompletnim odgovorom“ ili „CR“ podrazumeva se nestanak svih znakova raka (npr. nestanak svih ciljnih lezija) kao odgovor na lečenje. To ne znači uvek da je kancer izlečen.

[0205] „Odloženi odgovor“ se odnosi na produženi efekat na smanjenje rasta tumora nakon prestanka lečenja. Na primer, veličina tumora može ostati ista ili se smanjiti u odnosu na veličinu na početku faze primene leka. U nekim otkrićima, odloženi odgovor ima trajanje najmanje isto kao i trajanje lečenja, najmanje 1,5x, 2,0x, 2,5x ili 3,0x dužina trajanja lečenja ili duže.

[0206] Kako se ovde koristi, „smanjenje ili inhibicija relapsa raka“ znači smanjenje ili inhibiciju recidiva tumora ili raka, ili progresije tumora ili raka. Kako se ovde objavljuje, relaps i/ili progresija raka uključuju, bez ograničenja, metastazu raka.

[0207] Kako se ovde koristi, „delimični odgovor“ ili „PR“ se odnosi na smanjenje veličine jednog ili više tumora ili lezija ili obima kancera u telu, kao odgovor na lečenje. Na primer, u nekim otkrićima, PR se odnosi na smanjenje zbira najdužih prečnika (SLD) ciljnih lezija od najmanje 30%, uzimajući u obzir osnovnu vrednost SLD.

[0208] Kako se ovde koristi, „stabilna bolest“ ili „SD“ se ne odnosi na dovoljno smanjenje ciljnih lezija da bi se kvalifikovalo za PR, niti na dovoljno povećanje da bi se kvalifikovalo za PD, uzimajući kao referencu najmanji SLD od početka tretmana.

[0209] Kako se ovde koristi, „progresivna bolest“ ili „PD“ se odnosi na povećanja SLD ciljnih lezija od najmanje 20%, uzimajući kao referencu najmanji SLD zabeležen od početka lečenja, ili prisutnost jedne ili više novih lezija.

[0210] Izraz „preživljavanje“ se odnosi na pacijenta koji ostaje živ, i uključuje opšte preživljavanje, kao i preživljavanje bez progresije

[0211] Kako se ovde koristi, „preživljavanje bez progresije“ (PFS) odnosi se na dužinu vremena tokom i nakon lečenja kada se bolest koja se leči (npr. kancer) ne pogoršava. Preživljavanje bez progresije može uključivati količinu vremena u kome su pacijenti doživeli kompletni ili delimični odgovor, kao i količinu vremena u kome su pacijenti doživeli stabilnu bolest.

[0212] Kako se ovde koristi, „ukupno preživljavanje“ (OS) se odnosi na procenat pojedinaca u grupi koji će verovatno biti živi nakon određenog vremena.

[0213] Pod „produžavanjem preživljavanja“ podrazumeva se porast ukupnog preživljavanja ili preživljavanja bez progresije kod lečenog pacijenta u odnosu na nelečenog pacijenta (tj. u odnosu na pacijenta koji nije lečen lekom), ili u odnosu na pacijenta koji ne eksprimira biomarker na određenom nivou i/ili u odnosu na pacijenta koji je lečen odobrenim sredstvom protiv raka.

[0214] Izraz „u suštini isti“, kako se ovde koristi, označava dovoljno veliki stepen sličnosti između dve numeričke vrednosti tako da bi stručnjak smatrao da je razlika između dve vrednosti mala ili bez biološke i/ili statističke značajnosti u kontekstu biološke karakteristike merene navedenim vrednostima (npr. Kd vrednosti ili nivoi ekspresije). Razlika između pomenute dve vrednosti je, na primer, manja od oko 50%, manja od oko 40%, manja od oko 30%, manja od oko 20%, i/ili manja od oko 10% kao funkcija referentne/komparativne vrednosti.

[0217] 1

[0218] Izraz „u suštini drugačiji“, kako se ovde koristi, označava dovoljno veliki stepen razlike između dve numeričke vrednosti da stručnjak smatra razliku između dve vrednosti statistički značajnom u kontekstu biološke karakteristike merene navedenim vrednostima (npr. Kd vrednosti ili nivoi ekspresije). Razlika između pomenute dve vrednosti je, na primer, veća od oko 10%, veća od oko 20%, veća od oko 30%, veća od oko 40% i/ili veća od oko 50% kao funkcija vrednosti za referentni/komparativni molekul.

[0219] Reč „oznaka“ kada se ovde koristi odnosi se na jedinjenje ili kompoziciju direktno ili indirektno konjugovane ili spojene sa reagensom , kao što je polinukleotidna sonda ili antitelo, i olakšava otkrivanje reagensa sa kojim su konjugovani ili spojeni. Oznaka može sama da bude detektabilna (npr. oznake radioizotopa ili fluorescentne oznake) ili, u slučaju enzimske oznake, može da katalizuje hemijsku izmenu supstratnog jedinjenja ili kompozicije koja je detektabilna. Cilj izraza je da se obuhvati direktna oznaka sonde ili antitela spajanjem (tj. fizičkim povezivanjem) supstance koja može da se otkrije pomoću sonde ili antitela, kao i indirektno označavanje sonde ili antitela reaktivnošću sa drugim reagensom koji je direktno označen. Primeri indirektnih oznaka uključuju detekciju primarnog antitela koristeći fluorescentno označeno sekundarno antitelo i konačno označavanje DNK sonde biotinom, tako da se može otkriti pomoću fluorescentno označenog streptavidina.

[0220] Izraz „terapeutski efikasna količina“ se odnosi na količinu terapeutskog agensa za lečenje ili prevenciju bolesti ili poremećaja kod sisara. U slučaju kancera, terapeutski efikasna količina terapeutskog agensa može smanjiti broj ćelija kancera, smanjiti veličinu primarnog tumora, inhibirati (tj. usporiti do izvesnog stepena i poželjno zaustaviti) infiltraciju ćelija kancera u periferne organe, inhibirati (tj. usporiti do izvesnog stepena i poželjno zaustaviti) metastaze tumora, inhibirati, do određenog stepena, rast tumora; i/ili ublažiti do izvesnog stepena jedan ili više simptoma vezanih za poremećaj. Prema stepenu do koga lek može sprečiti rast i/ili uništiti postojeće ćelije kancera, on može biti citostatični i/ili citotoksični lek. Za terapiju raka, efikasnost in vivo se može, na primer, meriti procenom trajanja preživljavanja, vremena do progresije bolesti (TTP), stope odgovora (npr. CR i PR), trajanja odgovora i/ili kvaliteta života.

[0221] „Poremećaj“ je svako stanje koje bi imalo koristi od lečenja, uključujući, ali se ne ograničavajući na hronične i akutne poremećaje ili bolesti, uključujući i ona patološka stanja koja predstavljaju predispoziciju sisara za odgovarajući poremećaj.

[0222] Izraz i „kancer“ i „kancerogeni“ odnose se na fiziološko stanje sisara koje se tipično karakteriše neregulisanim rastom ćelija, ili ga opisuje. U ovu definiciju spadaju benigni i maligni kanceri. Rana faza raka ili „tumor u ranoj fazi“ znači rak koji nije invazivan ili

[0225] 2

[0226] metastatski ili je klasifikovan kao rak 0, 1. ili II faze. Primeri kancera uključuju, ali nisu ograničeni na, karcinom, limfom, blastom (uključujući meduloblastom i retinoblastom), sarkom (uključujući liposarkom i sarkom sinovijalnih ćelija), neuroendokrine tumore (uključujući karcinoidne tumore, gastrinom, i rak ćelija ostrvaca), mezoteliom, švanom (uključujući akustični neurom), meningiom, adenokarcinom, melanom i leukemiju ili limfoidne malignitete. Konkretniji primeri za takve kancere uključuju rak skvamoznih ćelija (npr. rak skvamoznih ćelija epitela), rak pluća, uključujući mikroćelijski karcinom pluća (SCLC), nemikroćelijski karcinom pluća (NSCLC), adenokarcinom pluća i skvamozni rak pluća, rak peritoneuma, hepatocelularni kancer, gastrični rak ili rak želuca, uključujući gastrointestinalni kancer, rak pankreasa, glioblastom, rak cerviksa, rak jajnika, rak jetre, rak bešike, hepatom, rak dojke (uključujući metastatski rak dojke), rak kolona, rak rektuma, kolorektalni kancer, rak endometrijuma ili materice, rak pljuvačnih žlezda, rak bubrega ili renalni kancer, rak prostate, rak vulve, tiroidni kancer, rak jetre, analni rak, kancer penisa, rak Merkelovih ćelija, mikoze fungoidi, rak testisa, rak jednjaka, tumori bilijarnog trakta, kao i rak glave i vrata i hematološke malignitete. U nekim otkrićima, kancer je trostruko negativan metastatski rak dojke, uključujući bilo koji histološki potvrđeni trostruko negativni (ER-, PR-, HER2-) adenokarcinom dojke sa lokalno ponavljajućom ili metastatskom bolešću (gde lokalno ponavljajuća bolest nije podložna resekciji sa namerom lečenja). U nekim otkrićima, rak je NSCLC, uključujući skvamozni NSCLC i neskvamozni NSCLC.

[0227] Izraz „tumor“, koji se ovde koristi, odnosi se na rast i proliferaciju svih neoplastičnih ćelija, bilo malignih ili benignih, i svih prekancerogenih i kancerogenih ćelija i tkiva. Izraz „rak“, „kancerogeni“ i „tumor“ međusobno se ne isključuju prilikom pominjanja u ovom dokumentu.

[0228] Izraz „farmaceutska formulacija“ se odnosi na preparat koji je u takvom obliku koji omogućava da biološka aktivnost aktivnog sastojka koji se u njoj sadrži bude efikasna, i koji ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksične za ispitanika na kome će formulacija biti primenjena.

[0229] „Farmaceutski prihvatljiv nosač“ upućuje na sastojak farmaceutske formulacije koji nije aktivni sastojak, i koji je netoksičan za ispitanika. Farmaceutski prihvatljiv nosač uključuje, ali nije ograničen na pufer, ekscipijens, stabilizator ili konzervans.

[0230] U smislu ovog dokumenta, „lečenje“ (i njegovi gramatički oblici, kao što je „lečiti“) se odnosi na kliničku intervenciju u pokušaju da se izmeni prirodni tok bolesti kod pojedinca koji se leči, a može se primenjivati radi profilakse ili tokom kliničke patologije. Poželjni efekti lečenja uključuju, bez ograničenja, sprečavanje pojave ili recidiva bolesti, ublažavanje simptoma, smanjenje svih direktnih ili indirektnih patoloških posledica bolesti, sprečavanje metastaze, usporavanje stope napredovanja bolesti, poboljšavanje ili ublažavanje stanja bolesti i remisiju ili poboljšanu prognozu. U nekim otkrićima, antitela (npr. anti-PD-L1 antitela i/ili anti-PD-1 antitela) koriste se za odlaganje razvoja bolesti ili za usporavanje napredovanja bolesti.

[0231] Izraz „antikancerogena terapija“ odnosi se na terapiju korisnu u lečenju raka. Primeri antikancerogenih terapeutskih agenasa uključuju, ali su ograničeni na, citotoksične agense, hemoterapeutske agense, inhibitorne agense za rast, agense koji se koriste u terapiji zračenjem, agense protiv angiogeneze, apoptotske agense, antitubulinske agense i druge agense za lečenje raka, na primer, anti-CD20 antitela, inhibitore faktora rasta izvedene iz trombocita (npr. GLEVEC™ (imatinib mezilat)), COX-2 inhibitor (npr. celekoksib), interferone, citokine, antagoniste (npr. neutrališuća antitela) koji se povezuju sa jednim ili više od sledećih ciljeva PDGFR-β, BliS, APRIL, BCMA, receptor(i) TRAIL/Apo2, druge bioaktivne i organske hemijske agense, i slično. Njihove kombinacije sadržane su i u otkriću.

[0232] Izraz „citotoksični agens“, kako se ovde koristi, odnosi se na supstancu koja inhibira ili sprečava funkciju ćelija i/ili prouzrokuje destrukciju ćelija. Izraz uključuje radioaktivne izotope (npr. At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>, i radioaktivne izotope Lu), hemoterapeutske agense, npr. metotreksat, adriamicin, vinka alkaloide (vinkristin, vinblastin, etopozid), doksorubicin, melfalan, mitomicin C, hlorambucil, daunorubicin ili druge interkalirajuće agense, enzime i njihove fragmente, kao što su nukleolitički enzimi; antibiotike; toksine, kao što su toksini malog molekula ili enzimski aktivni toksini bakterijskog, fungalnog, biljnog ili životinjskog porekla, uključujući njihove fragmente i/ili varijante, kao i različite antitumorske ili antikancerogene agense koji su objavljeni dole. Drugi citotoksični agensi su opisani ispod. Tumoricidni agens prouzrokuje uništenje ćelija tumora.

[0233] „Hemoterapeutski agens“ je hemijsko jedinjenje koje je od koristi u lečenju raka. Primeri hemoterapeutskih agenasa uključuju alkilujuće agense, kao što je tiotepa i CYTOXAN® ciklosfosfamid; alkil sulfonate kao što je busulfan, improsulfan i piposulfan; aziridine kao što je benzodopa, karbokvon, meturedopa i uredopa; etilenimine i metilamelamine, uključujući altretamin, trietilenmelamin, trietilenfosforamid, trietiilentiofosforamid i trimetilolomelamin; acetogenine (naročito bulatacin i bulatacinon); delta-9-tetrahidrokanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapahon; lapahol; kolhicine; betulinsku kiselinu; kamptotecin (uključujući sintetičke analoge topotekan (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotekan, CAMPTOSAR®), acetilkamptotecin, skopolektin i 9-

[0236] 4

[0237] aminokamptotecin); briostatin; kalistatin; CC-1065 (uključujući njegove sintetičke analoge adozelesin, karzelesin i bizelesin); podofilotoksin; podofilinsku kiselinu; tenipozid; kriptoficine (naročito kriptoficin 1 i kriptoficin 8); dolastatin; duokarmicin (uključujući sintetičke analoge, KW-2189 i CB1-TM1); eleuterobin; pankratistatin; sarkodiktin; spongistatin; azotne iperite kao što je hlorambucil, hlornafazin, holofosfamid, estramustin, ifosfamid, mehloretamin, mehloretamin oksid hidrohlorid, melfalan, novembicin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, uracil iperit; nitrozouree kao što je karmustin, hlorozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin i ranimnustin; antibiotike kao što su endiinski antibiotici (npr. kaliheamicin, posebno kaliheamicin γ1I i kaliheamicin ω1I (pogledajte, npr. Nicolaou i sar. Angew. Chem Inti. Ed. Engl. 33:183-186 (1994)); dinemicin, uključujući dinemicin A; esperamicin; kao i neokarzinostatin hromofor i povezane hromofore hromoproteina endiinskih antibiotika), aklacinomisine, aktinomicin, autramicin, azaserin, bleomicine, kaktinomicin, karabicin, karminomicin, karzinofilin, hromomicine, daktinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleucin, ADRIAMYCIN® doksorubicin (uključujući morfolino-doksorubicin, cijanomorfolino-doksorubicin, 2-pirolino-doksorubicin i deoksidoksorubicin), epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcelomicin, mitomicine kao što je mitomicin C, mikofenolnu kiselinu, nogalamicin, olivomicine, peplomicin, potfiromicin, puromicin, kvelamicin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimeks, zinostatin, zorubicin; antimetabolite kao što je metotreksat i 5-fluoruracil (5-FU); analoge folne kiseline kao što je denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat; purinske analoge kao što je fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanin; pirimidinske analoge kao što je ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, citarabin, dideoksiuridin, doksifluridin, enocitabin, floksuridin; androgene kao što je kalusteron, dromostanolon propionat, epitiostanol, mepitiostan, testolakton; anti-adrenale kao što je aminoglutetimid, mitotan, trilostan; obnavljač folne kiseline kao što je frolinska kiselina; aceglaton; aldofosfamid glikozid; aminolevulinska kiselina; eniluracil; amsakrin; bestrabucil; bisantren; edatraksat; defofamin; demekolcin; diazikvon; elfornitin; eliptinijum acetat; epotilon; etoglucid; galijum nitrat; hidroksiureu; lentinan; lonidainin; majtanzinoide kao što je majtanzin i ansamitocini; mitoguazon; mitoksantron; mopidanmol; nitraerin; pentostatin; fenamet; pirarubicin; lozoksantron; 2-etilhidrazid; prokarbazin; PSK® polisaharidni kompleks (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoksan; rizoksin; sizofiran; spirogermanijum; tenuazonsku kiselinu; triazikvon; 2,2’,2”-trihlortrietilamin; trihotecene (naročito T-2 toksin, verakurin A, roridin A i anguidin); uretan; vindezin (ELDISINE®, FILDESIN®); dakarbazin; manomustin; mitobronitol; mitolaktol; pipobroman; gacitozin; arabinozid („Ara-C“); tiotepa; taksoide, na primer taksane, uključujući TAXOL® paklitaksel (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE™ bez kremofora, nanočestičnu formulaciju paklitaksela dizajniranu pomoću albumina (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) i TAXOTERE® docetaksel (Rhône-Poulenc Rorer, Antony, Francuska); hloranbucil; gemcitabin (GEMZAR®); 6-tioguanin; merkaptopurin; metotreksat; platinske analoge kao što je cisplatin i karboplatin; vinblastin (VELBAN®); platinu; etopozid (VP-16); ifosfamid; mitoksantron; vinkristin (ONCOVIN®); oksaliplatin; leukovovin; vinorelbin (NAVELBINE®); novantron; edatreksat; daunomicin; aminopterin; ibandronat; inhibitor topoizomeraze RFS 2000; difluormetlilornitin (DMFO); retinoide kao što je retinonska kiselina; kapecitabin (XELODA®); farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivate svega gore nabrojanog; kao i kombinacije dva ili više gorepomenutih jedinjenja, kao što je CHOP, što je skraćenica za kombinovanu terapiju ciklofosfamidom, doksorubicinom, vinkristinom i prednizolonom, i FOLFOX, što je skraćenica za režim lečenja oksaliplatinom (ELOXATIN™) u kombinaciji sa 5-FU i leukovorinom. Dodatni hemoterapeutski agensi uključuju citotoksične agense korisne kao konjugati antitelo-lek, kao što su majtanzinoidi (DM1, na primer) i, na primer, auristatine MMAE i MMAF.

[0238] „Hemoterapeutski agensi“ takođe uključuju „antihormonska sredstva“ ili „endokrine terapeutike“ koji deluju tako što regulišu, smanjuju, blokiraju ili inhibiraju efekte hormona koji mogu da pospešuju rast karcinoma, a često su u obliku sistemskih lečenja ili lečenja celog tela. Oni i sami mogu biti hormoni. Primeri uključuju antiestrogene i selektivne modulatore estrogenskog receptora (SERM), uključujući, na primer, tamoksifen (uključujući NOLVADEX® tamoksifen), EVISTA® raloksifen, droloksifen, 4-hidroksitamoksifen, trioksifen, keoksifen, LY117018, onapriston i FARESTON® toremifen; antiprogesterone; regulatore smanjenja estrogenskog receptora (ERD); agense koji deluju tako što suzbijaju ili zatvaraju jajnike, na primer, agoniste hormona za oslobađanje luteinizujućeg hormona (LHRH) kao što je LUPRON® iELIGARD® leuprolid acetat, goserelin acetat, buserelin acetat i tripterelin; druge antiandrogene, kao što je flutamid, nilutamid i bikalutamid; i inhibitore aromataze koji inhibiraju enzim aromatazu, koji reguliše proizvodnju estrogena u nadbubrežnim žlezdama, kao što su, na primer, 4(5)-imidazoli, aminoglutetimid, MEGASE® megestrol acetat, AROMASIN® eksemestan, formestanie, fadrozol, RIVISOR® vorozol, FEMARA® letrozol i ARIMIDEX® anastrozol. Pored toga, takva definicija hemoterapeutskih agenasa uključuje bisfosfonate kao što je klodronat (na primer, BONEFOS® ili OSTAC®), DIDROCAL® etidronat, NE-58095, ZOMETA® zoledronsku kiselinu/zoledronat, FOSAMAX® alendronat, AREDIA® pamidronat, SKELID® tiludronat ili ACTONEL® risedronat; kao i troksacitabin (citozinski analog 1,3-dioksolanskog nukleozida); antisens oligonukleotide, naročito one koji inhibiraju ekspresiju gena na signalnim putevima koji učestvuju u aberantnoj ćelijskoj proliferaciji, kao što je, na primer, PKC-alfa, Raf, H-Ras i receptor epidermalnog faktora rasta (EGFR); vakcine, kao što je THERATOPE® vakcina i vakcine za gensku terapiju, na primer, ALLOVECTIN® vakcina, LEUVECTIN® vakcina i VAXID® vakcina; LURTOTECAN® inhibitor topoizomeraze 1; ABARELIX® rmRH; lapatinib ditozilat (ErbB-2 i EGFR dvojna tirozin kinaza inhibitor malih molekula, takođe poznata kao GW572016); i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivate svega gore navedenog.

[0239] Hemoterapeutska sredstva takođe uključuju i antitela kao što su alemtuzumab (Campath), bevacizumab (AVASTIN®, Genentech); cetuksimab (ERBITUX®, Imclone); panitumumab (VECTIBIX®, Amgen), rituksimab (RITUXAN®, Genentech/Biogen Idee), pertuzumab (OMNITARG®, 2C4, Genentech), trastuzumab (HERCEPTIN®, Genentech), tositumomab (Bexxar, Corixia), i konjugat antitelo lek, gemtuzumab ozogamicin (MYLOTARG®, Wyeth). Dodatna humanizovana monoklonska antitela sa terapeutskim potencijalom kao agensi u kombinaciji sa jedinjenjima iz ovog otkrića uključuju: apolizumab, aselizumab, atlizumab, bapineuzumab, bivatuzumab mertansin, kantuzumab mertansin, cedelizumab, certolizumab pegol, cidfusituzumab, cidtuzumab, daklizumab, ekulizumab, efalizumab, epratuzumab, erlizumab, felvizumab, fontolizumab, gemtuzumab ozogamicin, inotuzumab ozogamicin, ipilimumab, labetuzumab, lintuzumab, matuzumab, mepolizumab, motavizumab, motovizumab, natalizumab, nimotuzumab, nolovizumab, numavizumab, okrelizumab, omalizumab, palivizumab, paskolizumab, pifuzituzumab, pektuzumab, pekselizumab, ralivizumab, ranibizumab, reslivizumab, reslizumab, resivizumab, rovelizumab, ruplizumab, sibrotuzumab, siplizumab, sontuzumab, takatuzumab tetraksetan, tadocizumab, talizumab, tefibazumab, tocilizumab, toralizumab, tukotuzumab celmoleukin, tukuzituzumab, umavizumab, urtoksazumab, ustekinumab, visilizumab, i anti-interleukin-12 (ABT-874/J695, Wyeth Research i Abbott Laboratories) koji je rekombinantno antitelo IgG1 λ kompletne dužine sa isključivo humanom sekvencom, genetski modifikovano da prepoznaje protein interleukin-12 p40.

[0240] Hemoterapeutski agensi uključuju i „EGFR inhibitore“, što se odnosi na jedinjenja koja se vezuju ili na drugi način direktno interaguju sa EGFR-om i sprečavaju ili smanjuju njegovu signalnu aktivnost, i alternativno se nazivaju „EGFR antagonisti“. Primeri za takva sredstva uključuju antitela i male molekule koji se vezuju za EGFR. Primeri antitela koja se vezuju za EGFR uključuju MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (vidi, US patent br.

[0241] 4,943,533, Mendelsohn i sar.) i njihove varijante, kao što su himerizovani 225 (C225 ili cetuksimab; ERBUTIX®) i preoblikovani humani 225 (H225) (videti, WO 96/40210, „Imclone Systems Inc.“); IMC-11F8, potpuno humano antitelo ciljano na EGFR (Imclone); antitela koja vezuju mutant tipa II EGFR (US patent br.5,212,290); humanizovana i himerna antitela koja vezuju EGFR kako je opisano u US patentu br.5,891,996; i humana antitela koja vezuju EGFR, kao što su ABKS-EGF ili panitumumab (videti WO98/50433, Abgenix/Amgen); EMD 55900 (Stragliotto i sar. Eur. J. Cancer 32A:636-640 (1996)); EMD7200 (matuzumab) humanizovano EGFR antitelo usmereno protiv EGFR koji se takmiči i sa EGF i TGF-alfa u vezivanju EGFR (EMD/Merck); humanizovano EGFR antitelo, HuMax-EGFR (GenMab); potpuno humanizovana antitela poznata kao E1.1, E2.4, E2.5, E6.2, E6.4, E2.11, E6.3, i E7.6.3 i opisana u US 6,235,883; MDX-447 (Medarex Inc); i mAb 806 ili humanizovana mAb 806 (Johns i sar. J. Biol. Chem. 279(29):30375-30384 (2004)). Anti-EGFR antitelo se može konjugovati sa citotoksičnim agensom, stvarajući tako imunokonjugat (vidi, npr. EP659,439A2, Merck Patent GmbH). EGFR antagonisti uključuju male molekule, kao što su jedinjenja opisana u US patentima br: 5,616,582, 5,457,105, 5,475,001,5,654,307, 5,679,683, 6,084,095, 6,265,410, 6,455,534, 6,521,620, 6,596,726, 6,713,484, 5,770,599, 6,140,332, 5,866,572, 6,399,602, 6,344,459, 6,602,863, 6,391,874, 6,344,455, 5,760,041, 6,002,008 i 5,747,498, kao i u sledećim PCT publikacijama: WO98/14451, WO98/50038, WO99/09016 i WO99/24037. Konkretni mali molekuli EGFR antagonista uključuju OSI-774 (CP-358774, erlotinib, TARCEVA® Genentech/OSI Pharmaceuticals); PD 183805 (CI 1033, 2-propenamid, N-[4-[(3-hlor-4-fluorfenil)amino]-7-[3-(4-morfolinil)propoksi]-6-hinazolinil]-, dihidrohlorid, Pfizer Inc.); ZD1839, gefitinib (IRESSA®) 4-(3’-hlor-4’-fluoranilino)-7-metoksi-6-(3-morfolinopropoksi)hinazolin, AstraZeneca); ZM 105180 ((6-amino-4-(3-metilfenil-amino)-hinazolin, Zeneca); BIBX-1382 (N8-(3-hlor-4-fluor-fenil)-N2-(1-metil-piperidin-4-il)-pirimido[5,4−d]pirimidin-2,8-diamin, Boehringer Ingelheim); PKI-166 ((R)-4-[4-[(1-feniletil)amino]-1H-pirolo[2,3−d]pirimidin-6-il]-fenol); (R)-6-(4-hidroksifenil)-4-[(1-feniletil)amino]-7H-pirolo[2,3−d]pirimidin); CL-387785 (N-[4-[(3-bromfenil)amino]-6-hinazolinil]-2-butinamid); EKB-569 (N-[4-[(3-hlor-4-fluorfenil)amino]-3-cijano-7-etoksi-6-hinolinil]-4-(dimetilamino)-2-butenamid) (Wyeth); AG1478 (Pfizer); AG1571 (SU 5271; Pfizer); dvojne EGFR/HER2 inhibitore tirozin kinaze kao što je lapatinib (TYKERB®, GSK572016 ili N-[3-hlor-4-[(3 fluorfenil)metoksi]fenil]-6[5[[[2metilsulfonil)etil]amino]metil]-2-furanil]-4-hinazolinamin).

[0242] Hemoterapeutski agensi takođe uključuju “inhibitore tirozin kinaze“, uključujući EGFR-ciljane lekove navedene u prethodnom paragrafu; male molekule HER2 inhibitore tirozin kinaze kao što je TAK165 dostupan od kompanije Takeda; CP-724,714, oralni selektivni inhibitor ErbB2 receptorske tirozin kinaze (Pfizer i OSI); dvojne HER inhibitore kao što je EKB-569 (dostupne od kompanije Wyeth) koji preferencijalno vezuju EGFR ali inhibiraju i HER2 i ćelije koje prekomerno eksprimiraju EGFR; lapatinib (GSK572016; dostupan od kompanije Glaxo-SmithKIine), oralni HER2 i EGFR inhibitor tirozin kinaze; PKI-166 (dostupan od kompanije Novartis); pan-HER inhibitore kao što je kanertinib (CI-1033; Pharmacia); Raf-1 inhibitore kao što je antisens agens ISIS-5132 dostupan od kompanije ISIS Pharmaceuticals koji inhibira Raf-1 signalizaciju; ne-HER ciljane TK inhibitore kao što je imatinib mezilat (GLEEVEC®, dostupan od kompanije Glaxo SmithKline); multi-ciljane inhibitore tirozin kinaze kao što je sunitinib (SUTENT®, dostupan od kompanije Pfizer); VEGF inhibitore receptorske tirozin kinaze kao što je vatalanib (PTK787/ZK222584, dostupan od kompanije Novartis/Schering AG); MAPK ekstracelularno regulisani inhibitor kinaze I CI-1040 (dostupan od kompanije Pharmacia); hinazoline, kao što je PD 153035,4-(3-hloranilino) hinazolin; piridopirimidine; pirimidopirimidine; pirolopirimidine, kao što je CGP 59326, CGP 60261 i CGP 62706; pirazolopirimidine, 4-(fenilamino)-7H-pirolo[2,3−d] pirimidine; kurkumin (diferuloil metan, 4,5-bis (4-fluoranilino)ftalimid); tirfostine koji sadrže ostatke nitrotiofena; PD-0183805 (Warner-Lamber); antisens molekule (npr. one koji se vezuju za HER-kodirajuću nukleinsku kiselinu); hinoksaline (US Patent br. 5,804,396); trifostine (US Patent br. 5,804,396); ZD6474 (Astra Zeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); pan-HER inhibitore kao što je CI-1033 (Pfizer); afinitak (ISIS 3521; Isis/Lilly); imatinib mezilat (GLEEVEC®); PKI 166 (Novartis); GW2016 (Glaxo SmithKline); CI-1033 (Pfizer); EKB-569 (Wyeth); semaksinib (Pfizer); ZD6474 (AstraZeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); INC-1C11 (Imclone), rapamicin (sirolimus, RAPAMUNE®); ili kao što je opisano u bilo kojoj od sledećih patentnih publikacija: US Patent br. 5,804,396; WO 1999/09016 (American Cyanamid); WO 1998/43960 (American Cyanamid); WO 1997/38983 (Warner Lambert); WO 1999/06378 (Warner Lambert); WO 1999/06396 (Warner Lambert); WO 1996/30347 (Pfizer, Inc); WO 1996/33978 (Zeneca); WO 1996/3397 (Zeneca) i WO 1996/33980 (Zeneca).

[0243] Hemoterapeutski agensi takođe uključuju deksametazon, interferone, kolhicin, metoprin, ciklosporin, amfotericin, metronidazol, alemtuzumab, alitretinoin, alopurinol, amifostin, arsen trioksid, asparaginazu, BCG živu vakcinu, bevacuzimab, beksaroten, kladribin, klofarabin, darbepoetin alfa, denileukin, deksrazoksan, epoetin alfa, elotinib, filgrastim, histrelin acetat, ibritumomab, interferon alfa-2a, interferon alfa-2b, lenalidomid, levamisol, mesna, metksalen, nandrolon, nelarabin, nofetumomab, oprelvekin, palifermin, pamidronat, pegademas, pegaspargazu, pegfilgrastim, pemetreksed dinatrijum, plikamicin, porfimer natrijum, hinakrin, rasburikazu, sargramostim, temozolomid, VM-26, 6-TG, toremifen, tretinoin, ATRA, valrubicin, zoledronat i zoledronsku kiselinu, i njihove farmaceutski prihvatljive soli.

[0244] Hemoterapeutski agensi takođe uključuju hidrokortizon, hidrokortizon acetat, kortizon acetat, tiksokortol pivalat, triamcinolon acetonid, triamcinolon alkohol, mometazon, amcinonid, budesonid, desonid, fluocinonid, fluocinolon acetonid, betametazon, betametazon natrijum fosfat, deksametazon, deksametazon natrijum fosfat, fluokortolon, hidrokortizon-17-butirat, hidrokortizon-17-valerat, aklometazon dipropionat, betametazon valerat, betametazon dipropionat, prednikarbat, klobetazon-17-butirat, klobetazol-17-propionat, fluokortolon kaproat, fluokortolon pivalat i flupredniden acetat; imunoselektivne antiinflamatorne peptide (ImSAID) kao što je fenilalanin-glutamin-glicin (FEG) i njegov D-izomerni oblik (feG) (IMULAN BioTherapeutics, LLC); antireumatske lekove kao što je azatioprin, ciklosporin (ciklosporin A), D-penicilamin, soli zlata, hidroksihlorohin, leflunomidminociklin, sulfasalazin, blokatore faktora nekroze tumora-alfa (TNFα) kao što je etanercept (ENBREL®), infliksimab (REMICADE®), adalimumab (HUMIRA®), certolizumab pegol (CIMZIA®), golimumab (SIMPONI®), blokatore Interleukina 1 (IL-1) kao što je anakinra (KINERET®), blokatore kostimulacije T ćelija kao što je abatacept (ORENCIA®), blokatore Interleukina 6 (IL-6) kao što je tocilizumab (ACTEMERA®); blokatore Interleukina 13 (IL-13) kao što je lebrikizumab; blokatore Interferona alfa (IFN) kao što je rontalizumab; blokatore Beta 7 integrina kao što je rhuMAb Beta7; blokatore IgE puta kao što je Anti-M1 prime; sekretovani homotrimerni LTa3 i blokere membranski vezanog heterotrimera LTa1/β2 kao što je antilimfotoksin alfa (LTa); razne ispitivane agense kao što je tioplatin, PS-341, fenilbutirat, ET-18-OCH3 ili inhibitori farnezil transferaze (L-739749, L-744832); polifenole kao što je kvercetin, resveratrol, piceatanol, epigalokatehin galat, teaflavini, flavanoli, procijanidini, betulinska kiselina i njeni derivati; inhibitore autofagije kao što je hlorohin; delta-9-tetrahidrokanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapahon; lapahol; kolhicine; betulinsku kiselinu; acetilkamptotecin, skopolektin, i 9-aminokamptotecin); podofilotoksin; tegafur (UFTORAL®); beksaroten (TARGRETIN®); bisfosfonate kao što je klodronat (na primer, BONEFOS® ili OSTAC®), etidronat (DIDROCAL®), NE-58095, zoledronska kiselina/zoledronat (ZOMETA®), alendronat (FOSAMAX®), pamidronat (AREDIA®), tiludronat (SKELID®), ili risedronat (ACTONEL®); i receptor epidermalnog faktora rasta

[0247] 4

[0248] (EGF-R); vakcine kao što je THERATOPE® vakcina; perifosin, inhibitor COX-2 (npr. celekoksib ili etorikoksib), inhibitor proteozoma (npr. PS341); CCI-779; tipifarnib (R11577); orafenib, ABT510; inhibitor Bcl-2 kao što je oblimersen natrijum (GENASENSE®); piksantron; inhibitore farnezil transferaze kao što je lonafarnib (SCH 6636, SARASAR™); i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivate bilo čega od gore navedenog.

[0249] Izraz „prolek“, kao što se ovde koristi, odnosi se na prekursorski ili derivativni oblik farmaceutski aktivne supstance koja je manje citotoksična za ćelije tumora u poređenju sa matičnim lekom i sposobna je da bude enzimski aktivirana ili pretvorena u aktivniji matični oblik. Vidite, na primer, Vilman, “Prodrugs in Cancer Chemotherapy” Biochemical Society Transactions 14, str. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) i Stella i sar. „Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery”, Directed Drug Delivery, Borchardt i sar. (izd.) str. 247-267, Humana Press (1985). Prolekovi ovog otkrića uključuju, ali nisu ograničeni na prolekove koji sadrže fosfat, prolekove koje sadrže tiofosfat, prolekove koji sadrže sulfat, prolekove koji sadrže peptid, prolekove sa modifikovanom D-aminokiselinom, glikozilovane prolekove, prolekove koji sadrže β-laktam, prolekove koji sadrže opciono supstituisani fenoksiacetamid ili prolekove koji sadrže opciono supstituisani fenilacetamid, 5-fluorcitozin i druge 5-fluoruridinske prolekove koji se mogu pretvoriti u aktivniji lek bez citotoksičnosti. Primeri citotoksičnih lekova koji mogu da se derivatizuju u formu proleka za upotrebu u ovom otkriću uključuju, ali nisu ograničeni na hemoterapeutske agense koji su opisani iznad.

[0250] „Agens za inhibiciju rasta“, kada se ovde koristi, odnosi se na jedinjenje ili kompoziciju koji onemogućavaju rast i/ili širenje ćelije (npr. ćelija čiji rast zavisi od ekspresije PD-L1) in vitro ili in vivo. Tako, agens za inhibiciju rasta može biti onaj koji značajno smanjuje procenat ćelija u S fazi. Primeri agensa za inhibiciju rasta obuhvataju sredstva koja blokiraju napredak ćelijskog ciklusa (na mestu koje nije S faza), kao što su sredstva koja indukuju zastoj G1 i zastoj M-faze. Klasični blokatori M-faze uključuju vinke (vinkristin i vinblastin), taksane i inhibitore topoizomeraze II kao što je antraciklinski antibiotik doksorubicin ((8S-cis)-10-[(3-amino-2,3,6-tridezoksi-α-likso-heksapiranozil)oksi]-7,8,9,10-tetrahidro-6,8,11-trihidroksi-8-(hidroksiacetil)-1-metoksi-5,12-naftacendion), epirubicin, daunorubicin, etopozid i bleomicin. Ona sredstva koja zaustavljaju G1, isto tako, prelivaju se u zastoj S-faze, na primer, DNK alkilujući agensi, kao što su: tamoksifen, prednizon, dakarbazin, mehloretamin, cisplatin, metotreksat, 5-fluoruracil i ara-C. Dalje informacije se mogu videti u: „The Molecular Basis of Cancer“ Mendelsohn i Israel, izd. poglavlje 1, naslovljeno: „Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs“, Murakami i sar. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), posebno str. 13. Taksani (paklitaksel i docetaksel) su lekovi protiv kancera koji su dobijeni iz drveta tise. Docetaksel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), dobijen iz evropske tise, je polusintetički analog paklitaksela (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). Paklitaksel i docetaksel podstiču obrazovanje mikrotubula iz dimera tubulina i stabilizuju mikrotubule sprečavanjem depolimerizacije, što dovodi do inhibicije mitoze u ćelijama.

[0251] Pod „zračnom terapijom“ se podrazumeva upotreba usmerenih gama zraka ili beta zraka kako bi se izazvalo dovoljno oštećenje na ćeliji koje će da ograniči njenu sposobnost da normalno funkcioniše ili da se potpuno uništi ćelija. Podrazumeva se da će postojati mnogo poznatih načina u struci za određivanje doze i trajanja lečenja. Tipične terapije se daju kao jednokratna primena, a tipične doze su u opsegu od 10 do 200 jedinica (greja) dnevno.

[0252] Kao što se ovde koriste, izrazi „pacijent“ ili „ispitanik“ se koriste naizmenično i upućuju na bilo koju životinju, poželjnije sisara (uključujući i one neljudske životinje kao što su, na primer, psi, mačke, konji, zečevi, životinje iz zoološkog vrta, krave, svinje, ovce i neljudski primati) za koje je potrebno lečenje. U nekim otkrićima, pacijent je čovek.

[0253] Kao što se ovde koristi, „primena“ znači postupak davanja doze jedinjenja (npr. antagonista) ili farmaceutske kompozicije (npr. farmaceutska kompozicija koja uključuje antagonist) ispitaniku (npr. pacijentu). Primena može da se vrši na bilo koji odgovarajući način, uključujući parenteralnu, intrapulmonarnu i intranazalnu, i, ako se zatraži lokalni tretman, intralezionu primenu. Parenteralne infuzije uključuju, na primer, intramuskularnu, intravensku, intraarterijsku, intraperitonealnu ili supkutanu primenu. Doziranje može biti bilo kojim prikladnim načinom, npr. putem injekcija, kao što su intravenske ili supkutane injekcije, što delimično zavisi od toga da li je primena kratkotrajna ili hronična. Ovde su razmatrani različiti rasporedi doziranja, uključujući, bez ograničenja, pojedinačnu ili višestruku primenu u različitim terminima, bolusnu primenu i pulsnu infuziju.

[0254] Izraz „konkurentno“ se koristi za primenu dva terapeutska agensa ili više njih, pri čemu se najmanje deo primene preklapa u vremenu. U skladu s tim, istovremena primena uključuje režim doziranja kada se jedno ili više sredstava nastavljaju nakon prekida primene jednog ili više drugih sredstava.

[0255] Pod „smanjiti ili inhibirati“ podrazumeva se sposobnost da se uzrokuje opšte smanjenje, na primer, od 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili više. Smanjenje ili inhibiranje mogu da se odnose na simptome poremećaja koji se leči, prisustvo ili veličinu metastaza, ili veličinu primarnog tumora.

[0256] Izraz „uputstvo za upotrebu“ se odnosi na uputstvo koje se uobičajeno nalazi u komercijalnim pakovanjima terapeutskih proizvoda, koje sadrži informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, primeni, kombinovanoj terapiji, kontraindikacijama i/ili upozorenjima u vezi sa upotrebom takvih terapeutskih proizvoda.

[0257] „Sterilna“ formulacija je aseptična ili oslobođena prisustva svih živih mikroorganizama i njihovih spora.

[0258] „Proizvod“ je bilo koja proizvodnja (npr. paket ili kontejner) ili komplet koji sadrži najmanje jedan reagens, npr. lek za lečenje bolesti ili poremećaja (npr. raka) ili sondu za specifično otkrivanje biomarkera (npr. PD-L1) koji je ovde opisan. U određenim otkrićima, proizvodnja ili oprema se promoviše, distribuira ili prodaje kao jedinica za obavljanje ovde opisanih postupaka.

[0259] Fraza „zasnovano na“ kada se ovde koristi, znači da se informacije o nekim biomarkerima koriste za informisane odluke o tretmanu, informacije dobijene na paketu za umetanje, marketing/promotivno upravljanje itd.

[0260] III. Postupci

[0261] A. Dijagnostički postupci

[0262] Ovde su obezbeđeni postupci za utvrđivanje da li će pacijent koji boluje od raka (npr., nemikroćelijskog karcinoma pluća) verovatno reagovati na lečenje koje sadrži antagonist vezivanja PD-L1 ose. Takođe su ovde obezbeđeni postupci za predviđanje odgovora pacijenta koji boluje od raka (npr. nemikroćelijskog karcinoma pluća) na lečenje koje sadrži antagonist vezivanja PD-L1 ose. Dalje, ovde su obezbeđeni postupci za izbor terapije za pacijenta koji boluje od raka (npr. nemikroćelijskog karcinoma pluća). Bilo koji od prethodnih postupaka može da bude zasnovana na nivou ekspresije biomarkera koji se ovde obezbeđuje, na primer, ekspresije PD-L1 u uzorku tumora, npr. u imunološkim ćelijama koje se infiltriraju u tumor i/ili u ćelijama tumora. Svaki od postupaka takođe može da uključuje primenu antagonista vezivanja PD-L1 ose na pacijentu (na primer, kao što je opisano u odeljku C, „Antagonist vezivanja PD-L1 ose“). Svaki od postupaka takođe može da uključuje davanje efikasne količine drugog terapeutskog agensa pacijentu.

[0263] Ovo otkriće pruža postupak za utvrđivanje da li će pacijent koji boluje od nemikroćelijskog karcinoma pluća reagovati na lečenje koje sadrži antagonist vezivanja PD-L1 ose, i postupak uključuje: utvrđivanje nivoa ekspresije PD-L1 u ćelijama tumora u uzorku tumora dobijenom od pacijenta, pri čemu detektabilni nivo PD-L1 u oko 1% ili više (npr. oko 1%, oko 2%, oko 3%, oko 4%, oko 5% ili više, oko 10% ili više, oko 15% ili više, oko 20% ili više, oko 25% ili više, oko 30% ili više, oko 35% ili više, oko 40% ili više, oko 50% ili više, oko 55% ili više, oko 60% ili više, oko 65% ili više, oko 70% ili više, oko 80% ili više,

[0266] 4

[0267] oko 85% ili više, oko 90% ili više, oko 95% ili više, ili oko 99% ili više) ćelija tumora u uzorku tumora ukazuje da će pacijent verovatno da reaguje na lečenje koji se sastoji od antagonista vezivanja PD-L1 ose. Na primer, u nekim slučajevima, detektabilni nivo ekspresije PD-L1 u 5% ili više ćelija tumora u uzorku tumora ukazuje na to da će pacijent verovatno reagovati na lečenje koje sadrži antagonist vezivanja PD-L1 ose. U drugim slučajevima, detektabilni nivo ekspresije PD-L1 u 10% ili više ćelija tumora u uzorku tumora ukazuje na to da će pacijent verovatno reagovati na lečenje koje sadrži antagonist vezivanja PD-L1 ose. U drugim slučajevima, detektabilni nivo ekspresije PD-L1 u 20% ili više ćelija tumora u uzorku tumora ukazuje na to da će pacijent verovatno reagovati na lečenje koje sadrži antagonist vezivanja PD-L1 ose. U drugim slučajevima, detektabilni nivo ekspresije PD-L1 u 30% ili više ćelija tumora u uzorku tumora ukazuje na to da će pacijent verovatno reagovati na lečenje koje sadrži antagonist vezivanja PD-L1 ose. U drugim slučajevima, detektabilni nivo ekspresije PD-L1 u 50% ili više ćelija tumora u uzorku tumora ukazuje na to da će pacijent verovatno reagovati na lečenje koje sadrži antagonist vezivanja PD-L1 ose.

[0268] Ovo otkriće takođe pruža postupak za predviđanje odgovora pacijenta koji boluje od nemikroćelijskog karcinoma pluća, a koja obuhvata antagonist vezivanja PD-L1 ose, i uključuje: utvrđivanje nivoa ekspresije PD-L1 u ćelijama tumora u uzorku tumora dobijenom od pacijenta, pri čemu detektabilni nivo PD-L1 u oko 1% ili više (npr. oko 1%, oko 2%, oko 3%, oko 4%, oko 5% ili više, oko 10% ili više, oko 15% ili više, oko 20% ili više, oko 25% ili više, oko 30% ili više, oko 35% ili više, oko 40% ili više, oko 50% ili više, oko 55% ili više, oko 60% ili više, oko 65% ili više, oko 70% ili više, oko 80% ili više, oko 85% ili više, oko 90% ili više, oko 95% ili više, ili oko 99% ili više) ćelija tumora u uzorku tumora ukazuje da će pacijent verovatno da reaguje na lečenje koje se sastoji od antagonista vezivanja PD-L1 ose. Na primer, u nekim slučajevima, detektabilni nivo ekspresije PD-L1 u 5% ili više ćelija tumora u uzorku tumora ukazuje na to da će pacijent verovatno reagovati na lečenje koje sadrži antagonist vezivanja PD-L1 ose. U drugim slučajevima, detektabilni nivo ekspresije PD-L1 u 10% ili više ćelija tumora u uzorku tumora ukazuje na to da će pacijent verovatno reagovati na lečenje koje sadrži antagonist vezivanja PD-L1 ose. U drugim slučajevima, detektabilni nivo ekspresije PD-L1 u 20% ili više ćelija tumora u uzorku tumora ukazuje na to da će pacijent verovatno reagovati na lečenje koje sadrži antagonist vezivanja PD-L1 ose. U drugim slučajevima, detektabilni nivo ekspresije PD-L1 u 30% ili više ćelija tumora u uzorku tumora ukazuje na to da će pacijent verovatno reagovati na lečenje koje sadrži antagonist vezivanja PD-L1 ose. U drugim slučajevima, detektabilni nivo ekspresije PD-L1 u 50% ili više ćelija tumora u uzorku tumora ukazuje na to da će pacijent verovatno reagovati na lečenje koje sadrži antagonist vezivanja PD-L1 ose.

[0269] U nekim otkrićima bilo kog od prethodnih postupaka, deetektabilni nivo ekspresije PD-L1 za oko 5% do oko 99% (npr. za oko 5% do oko 99%, za oko 5% do oko 90%, za oko 5% do oko 85%, za oko 5% do oko 80%, za oko 5% do oko 75%, za oko 5% do oko 70%, za oko 5% do oko 65%, za oko 5% do oko 60%, za oko 5% do oko 55%, za oko 5% do oko 50%, za oko 5% do oko 45%, za oko 5% do oko 40%, za oko 5% do oko 35%, za oko 5% do oko 30%, za oko 5% do oko 25%, za oko 5% do oko 20%, za oko 5% do oko 15%, za oko 50% do oko 99%, za oko 50% do oko 95%, za oko 50% do oko 90%, za oko 50% do oko 85%, za oko 50% do oko 80%, za oko 50% do oko 75%, za oko 50% do oko 70%, za oko 50% do oko 65%, za oko 50% do oko 60% ili za oko 50% do oko 55%) ćelija tumora u uzorku tumora ukazuje da će pacijent verovatno da reaguje na lečenje antagonistom vezivanja PD-L1 ose.

[0270] Otkriće dalje pruža postupak za izbor terapije za pacijenta koji boluje od nemikroćelijskog karcinoma pluća, i postupak se sastoji od: utvrđivanja nivoa ekspresije PD-L1 u ćelijama tumora u uzorku tumora dobijenom od pacijenta i izbor terapije za pacijenta koja obuhvata antagonist vezivanja PD-L1 ose na osnovu detektabilnog nivoa PD-L1 u oko 1% ili više (npr. oko 1%, oko 2%, oko 3%, oko 4%, oko 5% ili više, oko 10% ili više, oko 15% ili više, oko 20% ili više, oko 25% ili više, oko 30% ili više, oko 35% ili više, oko 40% ili više, oko 50% ili više, oko 55% ili više, oko 60% ili više, oko 65% ili više, oko 70% ili više, oko 80% ili više, oko 85% ili više, oko 90% ili više, oko 95% ili više, ili oko 99% ili više) ćelija tumora u uzorku tumora. Na primer, u nekim slučajevima, postupak uključuje izbor terapije za pacijenta koja obuhvata antagonist vezivanja PD-L1 ose na osnovu detektabilnog nivoa ekspresije PD-L1 u 5% ili više ćelija tumora u uzorku tumora. U nekim slučajevima, postupak uključuje izbor terapije za pacijenta koja obuhvata antagonist vezivanja PD-L1 ose na osnovu detektabilnog nivoa ekspresije PD-L1 u 10% ili više ćelija tumora u uzorku tumora. U nekim slučajevima, postupak uključuje izbor terapije za pacijenta koja obuhvata antagonist vezivanja PD-L1 ose na osnovu detektabilnog nivoa ekspresije PD-L1 u 20% ili više ćelija tumora u uzorku tumora. U nekim slučajevima, postupak uključuje izbor terapije koja obuhvata antagonist vezivanja PD-L1 ose za pacijenta na osnovu detektabilnog nivoa ekspresije PD-L1 u 30% ili više ćelija tumora u uzorku tumora. U nekim otkrićima, postupak uključuje izbor terapije za pacijenta koja obuhvata antagonist vezivanja PD-L1 ose, na osnovu detektabilnog nivoa ekspresije PD-L1 u 50% ili više ćelija tumora u uzorku tumora.

[0271] U bilo kom od prethodnih postupaka, postupak bi takođe mogao da uključuje

[0274] 4

[0275] utvrđivanje detektabilnog nivoa ekspresije PD-L1 u infiltriranim imunoćelijama u tumoru, u uzorku dobijenom od pacijenta. U nekim otkrićima, uzorak tumora dobijen od pacijenta ima detektabilni nivo ekspresije PD-L1 u infiltriranim imunoćelijama u tumoru, koje čine manje od 10% (npr. manje od 10%, manje od 9%, manje od 8%, manje od 7%, manje od 6%, manje od 5%, manje od 4%, manje od 3%, manje od 2% ili manje od 1%) uzorka tumora. Na primer, u nekim otkrićima, uzorak tumora dobijen od pacijenta ima detektabilni nivo ekspresije PD-L1 u infiltriranim imunoćelijama u tumoru koje obuhvataju manje od 10% tumora (npr. manje od 10% površine tumora, manje od 9% površine tumora, manje od 8% površine tumora, manje od 7% površine tumora, manje od 6% površine tumora, manje od 5% površine tumora, manje od 4% površine tumora, manje od 3% površine tumora, manje od 2% površine tumora ili manje od 1% površine tumora) u delu uzorka tumora, na primer, određeno imunohistohemijski pomoću anti-PD-L1 antitela.

[0276] U bilo kom od prethodnih postupaka, uzorak tumora dobijen od pacijenta može da ima dezmoplaziju. Na primer, u nekim slučajevima, uzorak tumora dobijen od pacijenta može da sadrži populaciju fibroblasta i/ili miofibroblasta. U svakom od postupaka, uzorak tumora dobijen od pacijenta može imati sklerotičnu reakciju. U nekim slučajevima, uzorak tumora dobijen od pacijenta može da sadrži ćelijski siromašnu i/ili kolagenizovanu stromu. U bilo kojoj od prethodnih postupaka, uzorak tumora može da sadrži povišen nivo ekspresije kolagena, STAT1 i/ili MEK u odnosu na referentni uzorak tumora.

[0277] Ovo otkriće takođe pruža postupak za utvrđivanje da li će pacijent koji boluje od nemikroćelijskog karcinoma pluća reagovati na lečenje koje obuhvata antagonist vezivanja PD-L1 ose, gde postupak sadrži: utvrđivanje nivoa ekspresije PD-L1 u infiltriranim imunoćelijama u tumoru i u ćelijama tumora u uzorku tumora dobijenom od pacijenta, pri čemu je detektabilni nivo ekspresije PD-L1 u infiltriranim imunoćelijama u tumoru, koje čine oko 1% ili više (npr. oko 1% ili više, oko 2% ili više, oko 3% ili više, oko 4% ili više, oko 5% ili više, oko 6% ili više oko 7% ili više, oko 8% ili više, oko 10% ili više, oko 11% ili više, oko 12% ili više, oko 13% ili više, oko 14% ili više, oko 15% ili više, oko 20% ili više, oko 25% ili više, oko 30% ili više, oko 35% ili više, oko 40% ili više oko 50% ili više, oko 45% ili više, ili oko 50% ili više) uzorka tumora i detektabilni nivo PD-L1 za manje od 50% (npr. manje od 50%, manje od 45%, manje od 40%, manje od 35%, manje od 30%, manje od 25%, manje od 20%, manje od 15%, manje od 10% ili manje od 5%) ćelija tumora u uzorku tumora, ukazuje na to da će pacijent verovatno reagovati na lečenje koje uključuje antagonist vezivanja PD-L1 ose. Na primer, u nekim otkrićima, detektabilni nivo ekspresije PD-L1 u infiltriranim imunoćelijama u tumoru koje čine oko 5% ili više uzorka tumora, i detektabilni

[0280] 4

[0281] nivo ekspresije PD-L1 u manje od 50% ćelija tumora u uzorku tumora, ukazuje na to da će pacijent verovatno reagovati na lečenje koje uključuje antagonist vezivanja PD-L1 ose. U drugim otkrićima, detektabilni nivo ekspresije PD-L1 u infiltriranim imunoćelijama u tumoru koje čine oko 10% ili više uzorka tumora, i detektabilni nivo ekspresije PD-L1 u manje od 50% ćelija tumora u uzorku tumora, ukazuje na to da će pacijent verovatno reagovati na lečenje koje uključuje antagonist vezivanja PD-L1 ose.

[0282] Otkriće dalje pruža postupak za predviđanje sposobnosti odgovora pacijenta koji boluje od nemikroćelijskog karcinoma pluća za lečenje koje uključuje antagonist vezivanja PD-L1 ose, gde postupak sadrži: utvrđivanje nivoa ekspresije PD-L1 u infiltriranim imunoćelijama u tumoru i u ćelijama tumora u uzorku tumora dobijenom od pacijenta, pri čemu detektabilni nivo ekspresije PD-L1 u infiltriranim imunoćelijama u tumoru, koje čine 1% ili više (npr. oko 1% ili više, oko 2% ili više, oko 3% ili više, oko 4% ili više, oko 5% ili više, oko 6% ili više 7% ili više, oko 8% ili više, oko 10% ili više, oko 11% ili više, oko 12% ili više, oko 13% ili više, oko 14% ili više, oko 15% ili više, oko 20% ili više, oko 25% ili više, oko 30% ili više, oko 40% ili više 50% ili više, oko 45% ili više, ili oko 50% ili više) uzorka tumora, i detektabilni nivo PD-L1 u manje od 50% ćelija tumora (npr. manje od 50%, manje od 45%, manje od 40%, manje od 35%, manje od 35%, manje od 30%, manje od 25% od 20%, manje od 15%, manje od 10%, ili manje od 5%) u uzorku tumora, ukazuju na to da će pacijent verovatno reagovati na lečenje koje uključuje antagonist vezivanja PD-L1 ose. Na primer, u nekim otkrićima, detektabilni nivo ekspresije PD-L1 u infiltriranim imunoćelijama u tumoru koje čine oko 5% ili više uzorka tumora, i detektabilni nivo ekspresije PD-L1 u manje od 50% ćelija tumora u uzorku tumora, ukazuje na to da će pacijent verovatno reagovati na lečenje koje uključuje antagonist vezivanja PD-L1 ose. U drugim otkrićima, detektabilni nivo ekspresije PD-L1 u infiltriranim imunoćelijama u tumoru koje čine oko 10% ili više uzorka tumora, i detektabilni nivo ekspresije PD-L1 u manje od 50% ćelija tumora u uzorku tumora, ukazuje na to da će pacijent verovatno reagovati na lečenje koje uključuje antagonist vezivanja PD-L1 ose.

[0283] Otkriće takođe pruža i postupak za odabir terapije za pacijenta koji boluje od nemikroćelijskog karcinoma pluća, koja se sastoji od: utvrđivanja nivoa ekspresije PD-L1 u infiltriranim imunskim ćelijama u tumoru i u ćelijama tumora u uzorku tumora dobijenom od pacijenta, kao i izbor terapije koja sadrži antagonist vezivanja PD-L1 ose za pacijenta, na osnovu detektabilnog nivoa PD-L1u infiltriranim imunoćelijama u tumoru koje sadrže 1% ili više (npr. oko 1% ili više, oko 2% ili više, oko 3% ili više, oko 4% ili više, oko 5% ili više, oko 6% ili više, oko 7% ili više, oko 8% ili više, oko 10% ili više, oko 11% ili više, oko 12%

[0286] 4

[0287] ili više, oko 13% ili više, oko 14% ili više, oko 15% ili više, oko 20% ili više, oko 25% ili više, oko 30% ili više, oko 35% ili više, oko 40% ili više, oko 50% ili više, oko 45% ili više, ili oko 50% ili više) uzorka tumora, i detektabilni nivo PD-L1 u manje od 50% (npr. manje od 50%, manje od 45%, manje od 40%. manje od 35%, manje od 30%, manje od 25%, manje od 20%, manje od 15%, manje od 10%, ili manje od 5%) ćelija tumora u uzorku tumora. Na primer, u nekim otkrićima, postupak uključuje izbor terapije koja sadrži antagonist vezivanja PD-L1 ose zasnovane na detektabilnom nivou ekspresije PD-L1 u infiltriranim imunoćelijama u tumoru koje čine oko 5% ili više uzorka tumora, kao i detektabilnom nivou ekspresije PD-L1 u manje od 50% ćelija tumora u uzorku tumora. U drugim otkrićima, postupak uključuje izbor terapije koja sadrži antagonist vezivanja PD-L1 ose zasnovane na detektabilnom nivou ekspresije PD-L1 u infiltriranim imunoćelijama u tumoru koje čine oko 10% ili više uzorka tumora, kao i detektabilnom nivou ekspresije PD-L1 u manje od 50% ćelija tumora u uzorku tumora.

[0288] U bilo kom od prethodnih postupaka, infiltrirane imunoćelije u tumoru mogu da pokriju oko 1% ili više (npr. oko 1% ili više, oko 2% ili više, oko 3% ili više, oko 4% ili više, oko 5% ili više, oko 6% ili više, oko 7% ili više, oko 8% ili više, oko 10% ili više, oko 11% ili više, oko 12% ili više, oko 13% ili više, oko 14% ili više, oko 15% ili više, oko 20% ili više, oko 25% ili više, oko 30% ili više, oko 35% ili više, oko 40% ili više, oko 50% ili više, oko 45% ili više, ili oko 50% ili više) područja tumora u delu uzorka tumora dobijenom od pacijenta. Na primer, u nekim slučajevima, infiltrirane imunoćelije u tumoru mogu da pokriju oko 1% ili više područja tumora u delu uzorka tumora. U nekim slučajevima, infiltrirane imunoćelije u tumoru mogu da pokriju oko 5% ili više područja tumora u delu uzorka tumora. U drugim slučajevima, infiltrirane imunoćelije u tumoru mogu da pokriju oko 10% ili više područja tumora u delu uzorka tumora. U nekim slučajevima, infiltrirane imunoćelije u tumoru mogu da pokriju oko 15% ili više područja tumora u delu uzorka tumora. U drugim slučajevima, infiltrirane imunoćelije u tumoru mogu da pokriju oko 20% ili više područja tumora u delu uzorka tumora. U daljim slučajevima, infiltrirane imunoćelije u tumoru mogu da pokriju oko 25% ili više područja tumora u delu uzorka tumora. U nekim slučajevima, infiltrirane imunoćelije u tumoru mogu da pokriju oko 30% ili više područja tumora u delu uzorka tumora. U nekim slučajevima, infiltrirane imunoćelije u tumoru mogu da pokriju oko 35% ili više područja tumora u delu uzorka tumora. U nekim slučajevima, infiltrirane imunoćelije u tumoru mogu da pokriju oko 40% ili više područja tumora u delu uzorka tumora. U nekim slučajevima, infiltrirane imunoćelije u tumoru mogu da pokriju oko 50% ili više područja tumora u delu uzorka tumora.

[0291] 4

[0292] U bilo kom od prethodnih postupaka, uzorak tumora dobijen od pacijenta može da sadrži veći broj intraepitelnih i/ili stromalnih imunih ćelija u odnosu na referentni uzorak tumora. U bilo kom od prethodnih postupaka, uzorak tumora dobijen od pacijenta može da sadrži veći broj CD8+ T-ćelija u odnosu na uzorak tumora. U nekim slučajevima, uzorak tumora dobijen od pacijenta ima povećan nivo ekspresije jednog ili više gena povezanih sa B-ćelijom ili gena povezanih sa prirodnim ubicom (NK), u odnosu na referentni uzorak tumora. U nekim slučajevima, jedan ili više gena povezanih sa B-ćelijama se bira iz grupe koju čine CD19, MS4A1 i CD79A. U nekim slučajevima se jedan ili više gena povezanih sa NK ćelijama bira iz grupe koju čine KLRB1, KLRC1, KLRC2, KLRC3, KLRD1, KLRF1, KLRG1, KLRK1, NCAM1, PRF1, NCR1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DS2, KIR3DL1, FCGR3A, MICA, i MICB.

[0293] U nekim otkrićima, postupci uključuju određivanje nivoa ekspresije jednog ili više dodatnih biomarkera. U nekim otkrićima, dodatni biomarker je imunološki povezan marker. Imunološki povezan marker odnosi se na marker koji je eksprimiran imunim ćelijama ili drugim ćelijama (npr. ćelije tumora, endotelne ćelije, fibroblasti ili druge stromalne ćelije). Ako je eksprimiran ćelijama koje nisu imunološke ćelije, taj marker može da bude uključen u regulisanje biologije i funkcije imunoćelija, uključujući, na primer, aktiviranje, pripremu, prepoznavanje antigena i prezentaciju, proizvodnju citokina i hemokina, proliferaciju, migraciju, opstanak ili proizvodnju antitela. U nekim otkrićima, imunski povezani marker je marker povezan sa T-ćelijom. U nekim otkrićima, marker povezan sa T-ćelijom je izabran iz grupe koja se sastoji od CD8A, IFN-γ, EOMES, granzima-A, CXCL9 i svih njihovih kombinacija. U nekim otkrićima, imunski povezan marker je izabran iz grupe koja se sastoji od CX3CL1, CD45RO, IDOI, galektina 9, MIC-A, MIC-B, CTLA-4 i svih njihovih kombinacija. U nekim otkrićima, dodatni biomarker je gen povezan sa NK ćelijama. U nekim otkrićima, gen povezan sa NK ćelijama uključuje, ali nije ograničen na, KLRB1, KLRC1, KLRC2, KLRC3, KLRD1, KLRF1, KLRG1, KLRK1, NCAM1, PRF1, NCR1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DS2, KIR3DL1, FCGR3A, MICA, MICB, i sve njihove kombinacije. U nekim otkrićima, dodatni biomarker je gen vezan za mijeloidne ćelije. U nekim otkrićima, gen povezan sa mijeloidnim ćelijama uključuje, ali nije ograničen na, IL1B, IL8, CCL2, i sve njihove kombinacije. U nekim otkrićima, dodatni biomarker je gen povezan sa B ćelijom. U nekim otkrićima, gen povezan sa B ćelijom uključuje, ali nije ograničen na CD19, MS4A1, CD79A, i sve njihove kombinacije. U nekim otkrićima, dodatni biomarker je gen povezan sa efektorskom T-ćelijom (T<eff>). U nekim otkrićima, gen povezan sa T<eff>uključuje, ali nije ograničen na, CD8A, GZMA, GZMB, IFNG, EOMES, PRF1, CXCL9,

[0296] 4

[0297] CXCXCL10, TBX21, i sve njihove kombinacije. U nekim otkrićima, gen povezan sa Teff je IFNG, GZMB, ili CXCL9. U nekim otkrićima, dodatni biomarker je gen kolagena. U nekim otkrićima, gen kolagena je COL6A1 ili COL6A2.

[0298] U bilo kom od prethodnih postupaka, postupak bi takođe mogao da obuhvati terapeutsko davanje pacijentu efikasne količine antagonista vezivanja PD-L1 ose zasnovanog na nivou ekspresije PD-L1 u ćelijama tumora ili u infiltriranim imunoćelijama u uzorku tumora. Antagonist vezivanja PD-L1 ose može biti bilo koji antagonist vezivanja PD-L1 ose poznat u struci ili opisan ovde, na primer, u odeljku C, „Antagonist vezivanja PD-L1 ose“ ispod.

[0299] Na primer, u nekim slučajevima, antagonist vezivanja PD-L1 ose je izabran iz grupe koja se sastoji od antagonista vezivanja PD-L1, antagonista vezivanja PD-1 i antagonista vezivanja PD-L2. U nekim slučajevima, antagonist vezivanja PD-L1 ose je antagonist vezivanja PD-L1. U nekim slučajevima, antagonist vezivanja PD-L1 je molekul koji inhibira vezivanje PD-L1 za jednog ili više njegovih partnera za vezivanje liganda. U drugim slučajevima, antagonist vezivanja PD-L1 inhibira vezivanje PD-L1 za PD-1. U nekim slučajevima, antagonist vezivanja PD-L1 inhibira vezivanje PD-L1 za B7-1. U nekim slučajevima, antagonist vezivanja PD-L1 inhibira vezivanje PD-L1 i za PD-1 i za B7-1. U nekim slučajevima, antagonist vezivanja PD-L1 je antitelo. U nekim otkrićima, antitelo se bira iz grupe koja se sastoji od: YW243.55.S70, MPDL3280A (atezolizumab), MDX-1105, MEDI4736 (durvalumab), i MSB0010718C (avelumab). U nekim otkrićima, antitelo se sastoji od teškog lanca koji sadrži HVR-H1 sekvencu SEQ ID NO:19, HVR-H2 sekvencu SEQ ID NO:20, i HVR-H3 sekvencu SEQ ID NO:21; i laki lanac koji sadrži HVR-L1 sekvencu SEQ ID NO:22, HVR-L2 sekvencu SEQ ID NO:23, i HVR-L3 sekvencu SEQ ID NO:24. U nekim otkrićima, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:26, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4.

[0300] U nekim slučajevima, antagonist vezivanja PD-L1 ose je antagonist vezivanja PD-1. Na primer, u nekim slučajevima, antagonist vezivanja PD-1 inhibira vezivanje PD-1 za jednog ili više njegovih partnera za vezivanje liganda. U nekim slučajevima, antagonist vezivanja PD-1 inhibira vezivanje PD-1 za PD-L1. U drugim slučajevima, antagonist vezivanja PD-1 inhibira vezivanje PD-1 za PD-L2. U drugim slučajevima, antagonist vezivanja PD-1 inhibira vezivanje PD-1 i za PD-L1 i za PD-L2. U nekim slučajevima, antagonist vezivanja PD-1 je antitelo. U nekim slučajevima, antitelo se bira iz grupe koja se sastoji od: MDX 1106 (nivolumab), MK-3475 (pembrolizumab), CT-011 (pidilizumab), MEDI-0680 (AMP-514), PDR001, REGN2810, i BGB-108. U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-1 je Fc-fuzioni protein. Na primer, u nekim slučajevima, Fc-fuzioni protein je AMP-224.

[0301] U nekim slučajevima, taj postupak dalje uključuje davanje pacijentu efikasne količine drugog terapeutskog agensa. U nekim slučajevima, drugi terapeutski agens je izabran iz grupe koja se sastoji od citotoksičnog agensa, agensa inhibitora rasta, agensa za terapiju radijacijom, antiangiogenog agensa i njihovih kombinacija.

[0302] U bilo kom od prethodnih slučajeva, nemikroćelijski karcinom pluća može da bude lokalno uznapredovali ili metastatski nemikroćelijski karcinom pluća. U bilo kom od prethodnih slučajeva, nemikroćelijski karcinom pluća bi mogao da bude skvamozni NSCLC ili neskvamozni NSCLC.

[0303] Prisustvo i/ili nivoi ekspresije/količina biomarkera (npr. PD-L1) mogu da se utvrde kvalitativno i/ili kvantitativno na osnovu bilo kojeg odgovarajućeg kriterijuma poznatog u struci, uključujući, ali ne ograničavajući se na DNK, mRNK, cDNK, proteine, fragmente proteina i/ili broj genetske kopije.

[0304] U bilo kom od prethodnih postupaka, uzorak dobijen od pacijenta je izabran iz grupe koja se sastoji od tkiva, pune krvi, plazme, seruma i njihovih kombinacija. U nekim otkrićima, uzorak je uzorak tkiva. U nekim otkrićima, uzorak tkiva je uzorak tumora. U nekim otkrićima, uzorak tumora sastoji se od ćelija tumora, infiltriranih imunoloških ćelija u tumoru, stromalnih ćelija ili bilo koje njihove kombinacije. U bilo kojem od prethodnih otkrića, uzorak tumora može da bude uzorak tumora fiksiran u formalinu i ugrađen u parafin (FFPE), uzorak tumora iz arhive, sveži uzorak tumora ili zamrznuti uzorak tumora.

[0305] Prisustvo i/ili nivo ekspresije /količina različitih ovde opisanih biomarkera u uzorku može da se analizira putem nekoliko metodologija, od kojih su mnoge poznate u struci i razumeju ih stručnjaci, uključujući, ali ne ograničavajući se na imunohistohemiju

[0306] vestern blot analizu, imunoprecipitaciju, testove molekulskog vezivanja, ELISA, ELIFA, sortiranje ćelija aktivirano fluorescencijom („FACS“), MassARRAY, proteomiku, kvantitativne testove na bazi krvi (npr. ELISA iz seruma), testove biohemijske enzimske aktivnosti, hibridizacije in situ, fluorescentnu in situ hibridizaciju (FISH), sadern analizu, nortern analizu, sekvenciranje celog genoma, lančanu reakciju polimeraze (PCR), uključujući kvantitativni PCR u realnom vremenu (qRT-PCR) i druge postupke detekcije putem amplifikacije, kao što su, na primer, razgranata DNK, SISBA, TMA i slično, RNK-Seq, analiza na mikročipu, profilisanje ekspresije gena i/ili serijska analiza ekspresije gena („SAGE“), kao i bilo koji iz široke lepeze testova koji se mogu izvršiti analizom proteina,

[0309] 1

[0310] gena i/ili tkiva. Tipični protokoli za procenu statusa gena i proizvoda gena se mogu naći, na primer, u Ausubel i sar. izd. 1995, Current Protocols In Molecular Biology jedinice 2 (nortern bloting), 4 (sadern bloting), 15 (imunobloting) i 18 (PCR analiza). Mogu se koristiti takvi multipleksni imunotestovi koji su dostupni u medicini zasnovanoj na pravilima ili otkrivanju meso skale („MSD“).

[0311] U bilo kom od prethodnih postupaka, prisustvo i/ili nivo ekspresije/količina biomarkera (npr. PD-L1) se meri utvrđivanjem nivoa ekspresije proteina biomarkera. U određenim otkrićima, postupak se sastoji od kontaktiranja biološkog uzorka sa antitelima koja se posebno vezuju za biomarker (npr. anti-PD-L1 antitela), koji je ovde opisan pod uslovima koji su dozvoljeni za vezivanje biomarkera i otkrivanje da li se formira kompleks između antitela i biomarkera. Takav postupak može biti in vitro ili in vivo postupak. U nekim slučajevima, antitelo se koristi za izbor ispitanika koji su kvalifikovani za terapiju antagonistom vezivanja PD-L1 ose, npr. biomarker za izbor pojedinaca. Može da se koristi svaki postupak za merenje nivoa ekspresije proteina poznat u struci ili ovde obezbeđen. Na primer, u nekim otkrićima, nivo ekspresije proteina biomarkera (npr. PD-L1) utvrđen je pomoću postupka izabranog iz grupe koja se sastoji od protočne citometrije (npr. sortiranje ćelija aktivirano fluorescencijom (FACS™)), vestern blota, testa sa imunosorbentom vezanim za enzim (ELISA), imunoprecipitacije, imunohistohemije (IHC), imunofluorescencije, radioimunološkog testa, tačkastog blota, postupak imunodetekcije, HPLC, površinske plazmonske rezonance, optičke spektroskopije, masene spektrometrije i HPLC. U nekim otkrićima, nivo ekspresije proteina biomarkera (npr. PD-L1) određen je u infiltriranim imunoćelijama u tumoru. U nekim otkrićima nivo ekspresije proteina biomarkera (npr. PD-L1) određen je u ćelijama tumora. U nekim otkrićima, nivo ekspresije proteina biomarkera (npr. PD-L1) određen je u infiltriranim imunoćelijama u tumoru i u ćelijama tumora.

[0312] U određenim otkrićima, prisustvo i/ili nivo ekspresije/količina proteina biomarkera (npr. PD-L1) u uzorku se ispituje koristeći IHC i protokole za bojenje. Pokazalo se da je IHC bojenje delova tkiva pouzdan postupak za utvrđivanje ili detekciju prisustva proteina u uzorku. U nekim otkrićima bilo kog postupka, testa i/ili kompleta, biomarker je PD-L1. U jednom otkriću, nivo ekspresije biomarkera određuje se postupkom koja se sastoji od: (a) obavljanja IHC analize uzorka (kao što je uzorak tumora dobijen od pacijenta) sa antititelom; i (b) određivanja nivoa ekspresije biomarkera u uzorku. U nekim otkrićima, intenzitet IHC bojenja je određen u odnosu na referencu. U nekim otkrićima, referenca predstavlja referentnu vrednost. U nekim otkrićima, referenca je referentni uzorak (npr. uzorak za

[0315] 2

[0316] bojenje kontrolne ćelijske linije, uzorak tkiva nekancerogenog pacijenta ili uzorak tumora negativan na PD-L1).

[0317] IHC može da se izvrši u kombinaciji sa dodatnim tehnikama kao što su morfološko bojenje i/ili in situ hibridizacija (npr. FISH). Na raspolaganju su dva opšta postupka IHC-a; direktni i indirektni test. Prema prvom testu, povezivanje antitela sa ciljnim antigenom se određuje direktno. Ovaj direktni test koristi reagens sa oznakom, kao što je fluorescentna oznaka ili primarno antitelo označeno enzimom, koja se može vizuelizovati bez dalje interakcije antitela. U tipičnom indirektnom testu, nekonjugovano primarno antitelo se povezuje sa antigenom, a zatim se označeno sekundarno antitelo vezuje za primarno antitelo. Tamo gde je sekundarno antitelo konjugovano sa enzimskom oznakom, dodaje se hromogeni ili fluorogeni supstrat da bi se obezbedila vizuelizacija antigena. Do pojačavanja signala dolazi zato što nekoliko sekundarnih antitela može da reaguje sa različitim epitopima na primarnom antitelu.

[0318] Primarno i/ili sekundarno antitelo koje se koristi za IHC obično će biti označeno detektabilnim ostatkom. Dostupne su brojne oznake koje se mogu uopšteno grupisati u sledeće kategorije: (a) radioizotopi, kao što su<35>S,<14>C,<125>1,<3>H i<131>I; (b) koloidne čestice zlata; (c) fluorescentne oznake, uključujući, ali se ne ograničavajući na, helate retkih zemalja (helati evropijuma), Teksas crveno, rodamin, fluorescein, dansil, lisamin, umbeliferon, fikokriterin, fikocijanin, ili komercijalno dostupne fluorofore kao što su SPECTRUM ORANGE7 i SPECTRUM ili SPECTRUM GREEN7 i/ili derivati bilo kog od ovih ili više njih; (d) dostupne su razne oznake enzim-supstrat, i US Patent br. 4,275,149 daje pregled nekih od njih. Primeri enzimskih oznaka obuhvataju luciferaze (npr. luciferaza svica i bakterijska luciferaza; videti npr. US Patent br. 4,737,456), luciferin, 2,3-dihidroftalazindione, malat dehidrogenazu, ureazu, peroksidaze kao što je peroksidaza rena (HRPO), alkalnu fosfatazu, β-galaktozidazu, lizozim, saharidne oksidaze (npr. glukoza oksidaza, galaktoza oksidaza i glukoza-6-fosfat dehidrogenaza), heterociklične oksidaze (kao što je urikaza i ksantin oksidaza), laktoperoksidazu, mikroperoksidazu, i slično.

[0319] Primeri kombinacija enzima i supstrata uključuju, na primer, peroksidazu rena (HRPO) sa vodonik peroksidazom kao supstratom; alkalnu fosfatazu (AP) sa paranitrofenil fosfatom kao hromogenim supstratom; i β-D-galaktozidazu (β-D-Gal) sa hromogenim supstratom (npr. p-nitrofenil-β-D-galaktozidaza) ili fluorogenim supstratom (npr. 4-metilumbeliferil-β-D-galaktozidaza). Za opšti pregled vidite, na primer, U.S. Patent br.

[0320] 4,275,149 i 4,318,980.

[0321] Uzorci mogu da se pripreme, na primer, ručno ili pomoću automatizovanog instrumenta za bojenje (npr. Ventana BenchMark XT ili Benchmark ULTRA; vidite, npr. primer 1 ispod). Tako pripremljeni uzorci mogu da se postave i pokriju. Zatim se vrši procena slajdova, na primer, korišćenjem mikroskopa, i mogu se koristiti kriterijumi za intenzitet mrlje koji se rutinski koriste u struci. U jednom otkriću, potrebno je razumeti da kada se ćelije i/ili tkivo tumora ispituju pomoću IHC-a, bojenje se generalno utvrđuje ili procenjuje u ćelijama tumora i/ili tkivu (nasuprot stromalnom ili okolnom tkivu koje može biti prisutno u uzorku). U nekim otkrićima, podrazumeva se da, kada se ćelije i/ili tkivo tumora ispituju koristeći IHC, bojenje uključuje određivanje ili procenu infiltriranih imunoćelija u tumoru, uključujući intratumorske ili peritumorske imunske ćelije. U nekim otkrićima, prisustvo biomarkera (npr. PD-L1) je detektovano putem IHC u >0% uzorka, u najmanje 1% uzorka, najmanje 5% uzorka, u najmanje 10% uzorka, u najmanje 15% uzorka, u najmanje 15% uzorka, u najmanje 20% uzorka, u najmanje 25% uzorka, u najmanje 30% uzorka, u najmanje 35% uzorka, u najmanje 40% uzorka, u najmanje 45% uzorka, u najmanje 50% uzorka, u najmanje 55% uzorka, u najmanje 60% uzorka, u najmanje 65% uzorka, u najmanje 70% uzorka, u najmanje 75% uzorka, u najmanje 80% uzorka, u najmanje 85% uzorka, u najmanje 90% uzorka, u najmanje 95% uzorka, ili više. Uzorci mogu da se ocene koristeći bilo koji kriterijum koji je ovde opisan (pogledajte, npr. Tabelu 2 i 3), na primer od strane patologa ili automatizovane analize slika.

[0322] U nekim otkrićima bilo kog postupka, PD-L1 je detektovan imunohistohemijom pomoću anti-PD-L1 dijagnostičkog antitela (tj. primarnog antitela). U nekim otkrićima, PD-L1 dijagnostičko antitelo specifično vezuje ljudski PD-L1. U nekim otkrićima, PD-L1 dijagnostičko antitelo je neljudsko antitelo. U nekim otkrićima, PD-L1 dijagnostičko antitelo je antitelo pacova, miša ili zeca. U nekim otkrićima, PD-L1 dijagnostičko antitelo je antitelo zeca. U nekim otkrićima, PD-L1 dijagnostičko antitelo je monoklonsko antitelo. U nekim otkrićima, PD-L1 dijagnostički antitelo je direktno označeno. U drugim otkrićima, PD-L1 dijagnostičko telo je indirektno označeno.

[0323] U nekim otkrićima prethodnih postupaka, nivo ekspresije PD-L1 je detektovan u ćelijama tumora, infiltriranim imunološkim ćelijama u tumoru ili kombinacijama koje se koriste u IHC-u. Infiltrirane imunološke ćelije u tumoru uključuju, ali nisu ograničene na, intratumorske imunološke ćelije, peritumorske imunološke ćelije ili njihove kombinacije, kao i druge ćelije stroma (npr. fibroblaste). Takve ćelije koje se infiltriraju u tumore mogu biti T limfociti (kao što su CD8+ T limfociti i/ili CD4+ T limfociti), B limfociti ili druge ćelije poreklom iz koštane srži, uključujući granulocite (neutrofili, eozinofili, bazofili), monocite, makrofage, dendritične ćelije (npr. interdigitacione dendritične ćelije), histiocite i ćelije

[0326] 4

[0327] prirodne ubice. U nekim otkrićima, bojenje PD-L1 se detektuje kao bojenje membrane, bojenje citoplazme i njihove kombinacije. U drugim otkrićima, odsustvo PD-L1 je detektovano kao odsustvo bojenja ili nema bojenja u uzorku.

[0328] U bilo kom od prethodnih postupaka, nivo ekspresije biomarkera (npr. PD-L1) može da bude nivo ekspresije nukleinske kiseline. U nekim otkrićima se određuje nivo ekspresije nukleinskih kiselina koristeći qPCR, rtPCR, RNK-seq, multipleks qPCR ili RT-qPCR, analize pomoću mikročipova, SAGE, MassARRAY tehniku ili in situ hibridizaciju (npr. FISH). U nekim otkrićima, nivo ekspresije biomarkera (npr. PD-L1) utvrđuje se u ćelijama tumora, infiltriranim imunoćelijama u tumoru, stromalnim ćelijama ili njihovim kombinacijama. U nekim otkrićima, nivo ekspresije biomarkera (npr. PD-L1) određen je u ćelijama tumora. U nekim otkrićima, nivo ekspresije biomarkera (npr. PD-L1) određen je u infiltriranim imunološkim ćelijama u tumoru.

[0329] Postupci za procenu mRNK u ćelijama su dobro poznate i uključuju, na primer, hibridizacione testove pomoću sonde komplementarne DNK (kao što je hibridizacija in situ pomoću obeleženih ribosondi specifičnih za jedan ili više gena, nortern blot, i slične tehnike) i razni testovi sa amplifikacijom nukleinske kiseline (kao što su RT-PCR sa komplementarnim prajmerima specifičnim za jedan ili više gena i drugi postupci za detektovanje amplifikacijom, kao što su, na primer, razgranata DNK, SISBA, TMA, i slično). Pored toga, takvi postupci mogu da uključuju jedan ili više koraka koji omogućavaju da se odredi nivo ciljne mRNK u biološkom uzorku (npr. istovremenim ispitivanjem nivoa komparativne kontrole mRNK sekvence „domaćinskog“ gena, kao što je član porodice aktina). Opciono, sekvenca amplifikovane ciljne cDNK može da se utvrdi. Opcioni postupci uključuju protokole koji ispituju ili detektuju mRNK, kao što su ciljane mRNK, u tkivu ili ćelijskom uzorku tehnologijama mikročipa. Koristeći testove sa mikročipovima nukleinske kiseline, test i kontrolni uzorci mRNK iz test i kontrolnih uzoraka tkiva se obrnuto transkribuju i obeležavaju da bi se stvorile sonde kDNK. Zatim se sonde hibridizuju u niz nukleinskih kiselina imobilisanih na čvrstom nosaču. Test je konfigurisan tako da su poznati redosled i položaj svakog člana niza. Na primer, izbor gena čija ekspresija koreliše sa povećanom ili smanjenim kliničkom koristi od tretmana koji sadrži antagonist vezivanja PD-L1 ose, može biti postavljen na čvrstu podlogu. Hibridizacija označene sonde sa određenim članom niza ukazuje na to da uzorak iz kojeg je sonda izvedena eksprimira taj gen.

[0330] U nekim otkrićima, prisustvo i/ili nivoi ekspresije/količina biomarkera u prvom uzorku se povećava ili je povišena u poređenju sa prisustvom/odsustvom i/ili nivoom ekspresije/količinom u drugom uzorku. U određenim otkrićima, prisustvo/odsustvo i/ili nivo ekspresije/količina biomarkera u prvom uzorku je smanjeno ili je sniženo u poređenju sa prisustvom/odsustvom i/ili nivoom ekspresije/količinom u drugom uzorku. U nekim otkrićima, drugi uzorak je referentni uzorak, referentna ćelija, referentno tkivo, kontrolni uzorak, kontrolna ćelija ili kontrolno tkivo. Dodatna otkrića za određivanje prisustva/odsustva i/ili nivoa ekspresije/količine gena se opisuju ovde.

[0331] U nekim otkrićima, referentni uzorak, referentna ćelija, referentno tkivo, kontrolni uzorak, kontrolna ćelija ili kontrolno tkivo predstavlja jedan uzorak ili kombinaciju više uzoraka iz istog ispitanika ili pojedinca koji se dobijaju u jednom ili više različitih termina nego kada se dobije test uzorak. Na primer, referentni uzorak, referentna ćelija, referentno tkivo, kontrolni uzorak, kontrolna ćelija ili kontrolno tkivo dobijeni su u ranijem terminu od istog ispitanika ili pojedinca nego kada se dobije test uzorak. Takav referentni uzorak, referentna ćelija, referentno tkivo, kontrolni uzorak, kontrolna ćelija ili kontrolno tkivo mogu biti korisni ako se referentni uzorak nabavi tokom početne dijagnoze raka, a test uzorak se kasnije nabavlja kada rak postane metastatski.

[0332] U nekim otkrićima, referentni uzorak, referentna ćelija, referentno tkivo, kontrolni uzorak, kontrolna ćelija ili kontrolno tkivo su nekoliko kombinovanih uzoraka od jednog ili više zdravih pojedinaca koji nisu pacijenti. U nekim otkrićima, referentni uzorak, referentna ćelija, referentno tkivo, kontrolni uzorak, kontrolna ćelija ili kontrolno tkivo je kombinacija više uzoraka od jednog ili više pojedinaca sa bolešću ili poremećajem (npr. rak) koji nisu ispitanik ili pojedinac. U određenim otkrićima, referentni uzorak, referentna ćelija, referentno tkivo, kontrolni uzorak, kontrolna ćelija ili kontrolno tkivo su objedinjeni uzorci RNK normalnih tkiva ili objedinjeni uzorci plazme ili seruma nekih pojedinaca koji nisu pacijenti. U nekim otkrićima, referentni uzorak, referentna ćelija, referentno tkivo, kontrolni uzorak, kontrolna ćelija ili kontrolno tkivo su objedinjeni uzorci RNK tkiva tumora ili objedinjeni uzorci plazme ili seruma jednog ili više sa bolešću ili poremećajem (npr. rak) koji nisu pacijenti.

[0333] U nekim otkrićima bilo kog postupka, povišena ili povećana ekspresija odnosi se na ukupno povećanje od oko 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više, nivoa biomarkera (npr. proteina ili nukleinske kiseline (npr. gen ili mRNK)), detektovano standardnim postupcima poznatim u struci kao što su one opisane ovde, u poređenju sa referentnim uzorkom, referentnom ćelijom, referentnim tkivom, kontrolnim uzorkom, kontrolnom ćelijom ili kontrolnim tkivom. U nekim otkrićima, povišena ekspresija se odnosi na povećanje nivoa ekspresije/količine biomarkera u uzorku, pri čemu je povećanje najmanje 1,5X, 1,75X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 25X, 50X, 75X ili 100X nivo ekspresije/količina odgovarajućeg biomarkera u referentnom uzorku, referentnoj ćeliji, referentnom tkivu, kontrolnom uzorku, kontrolnoj ćeliji ili kontrolnom tkivu. U nekim otkrićima, povišena ekspresija se odnosi na ukupni porast veći od oko 1,5 puta, oko 1,75 puta, oko 2 puta, oko 2,25 puta, oko 2,5 puta, oko 2,75 puta, oko 3,0 puta ili oko 3,25 puta u poređenju sa referentnim uzorkom, referentnom ćelijom, referentnim tkivom, kontrolnim uzorkom, kontrolnom ćelijom, kontrolnim tkivom ili internom kontrolom (npr. domaćinski gen).

[0334] U nekim otkrićima bilo kog od postupaka, smanjena ekspresija se odnosi na ukupno smanjenje od oko 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više, nivoa biomarkera (npr. proteina ili nukleinske kiseline (npr. gena ili mRNK)), detektovano standardnim postupcima poznatim u struci, kao što su one ovde opisane, u poređenju sa referentnim uzorkom, referentnom ćelijom, referentnim tkivom, kontrolnim uzorkom, kontrolnom ćelijom ili kontrolnim tkivom. U određenim otkrićima, smanjena ekspresija se odnosi na smanjenje nivoa ekspresije/količine biomarkera u uzorku, pri čemu je smanjenje najmanje oko 0,9X, 0,8X, 0,7X, 0,6X, 0,5X, 0,4X, 0,3X, 0,2X, 0,1X, 0,05X ili 0,01X nivoa ekspresije/količine odgovarajućeg biomarkera u referentnom uzorku, referentnoj ćeliji, referentnom tkivu, kontrolnom uzorku, kontrolnoj ćeliji ili kontrolnom tkivu.

[0335] B. Terapeutski postupci

[0336] Ovo otkriće pruža postupke za lečenje pacijenta koji boluje od raka (na primer, nemikroćelijskog karcinoma pluća). U nekim slučajevima, postupci otkrivanja uključuju davanje pacijentu terapije protiv raka koja uključuje antagonist vezivanja PD-L1 ose. Bilo koji od ovde opisanih antagonista vezivanja PD-L1 ose (vidite, na primer, odeljak C, „Antagonist vezivanja PD-L1 ose.“) ili onaj poznat u struci može da se koristi u postupcima. U nekim slučajevima, postupci uključuju utvrđivanje prisustva i/ili nivoa ekspresije biomarkera koji se ovde opisuje u uzorku dobijenom od pacijenta i davanje pacijentu terapije protiv raka na osnovu prisustva i/ili nivoa ekspresije biomarkera u uzorku, na primer, uz korišćenje bilo kojih postupaka opisanih ovde (na primer, onih opisanih u odeljku A, „Dijagnostički postupci“ ili u primerima ispod) ili postupaka poznatih u struci. U nekim otkrićima, biomarker je PD-L1.

[0337] Ovo otkriće pruža postupak za lečenje pacijenta koji boluje od nemikroćelijskog karcinoma pluća, a postupak uključuje terapeutsko davanje pacijentu efikasne količine antagonista vezivanja PD-L1 ose, pri čemu je određeno da uzorak tumora dobijen od pacijenta ima detektabilni nivo ekspresije PD-L1 u 1% ili više (npr. oko 1%, oko 2%, oko 3%, oko 4%, oko 5% ili više, oko 10% ili više, oko 15% ili više, oko 20% ili više, oko 25% ili više, oko 30% ili više, oko 35% ili više, oko 40% ili više, oko 50% ili više, oko 55% ili više, oko 60% ili više, oko 65% ili više, oko 70% ili više, oko 80% ili više, oko 85% ili više, oko 90% ili više, oko 95% ili više ili oko 99% ili više) tumorskih ćelija u uzorku tumora.

[0338] Na primer, u nekim otkrićima, za uzorak tumora koji je dobijen od pacijenta je utvrđeno da ima detektabilni nivo ekspresije PD-L1 u 5% ili više ćelija tumora u uzorku tumora. U drugim otkrićima, za uzorak tumora koji je dobijen od pacijenta je utvrđeno da ima detektabilni nivo ekspresije PD-L1 u 10% ili više ćelija tumora u uzorku tumora. U drugim otkrićima, za uzorak tumora koji je dobijen od pacijenta je utvrđeno da ima detektabilni nivo ekspresije PD-L1 u 15% ili više ćelija tumora u uzorku tumora. U drugim otkrićima, za uzorak tumora koji je dobijen od pacijenta je utvrđeno da ima detektabilni nivo ekspresije PD-L1 u 20% ili više ćelija tumora u uzorku tumora. U drugim otkrićima, za uzorak tumora koji je dobijen od pacijenta je utvrđeno da ima detektabilni nivo ekspresije PD-L1 u 30% ili više ćelija tumora u uzorku tumora. U drugim otkrićima, za uzorak tumora koji je dobijen od pacijenta je utvrđeno da ima detektabilni nivo ekspresije PD-L1 u 50% ili više ćelija tumora u uzorku tumora. U nekim otkrićima, uzorak tumora dobijen od pacijenta ima detektabilni nivo ekspresije PD-L1 u infiltriranim imunoćelijama u tumoru, koje čine manje od 10% (npr. manje od 10%, manje od 9%, manje od 8%, manje od 7%, manje od 6%, manje od 5%, manje od 4%, manje od 3%, manje od 2% ili manje od 1%) uzorka tumora. Na primer, u nekim otkrićima, uzorak tumora dobijen od pacijenta ima detektabilni nivo ekspresije PD-L1 u infiltriranim imunoćelijama u tumoru koje obuhvataju manje od 10% tumora (npr. manje od 10% površine tumora, manje od 9% površine tumora, manje od 8% površine tumora, manje od 7% površine tumora, manje od 6% površine tumora, manje od 5% površine tumora, manje od 4% površine tumora, manje od 3% površine tumora, manje od 2% površine tumora ili manje od 1% površine tumora) u delu uzorka tumora dobijenog od pacijenta, na primer, kao što je utvrđeno imunohistohemijom pomoću anti-PD-L1 antitela. U nekim otkrićima, uzorak tumora dobijen od pacijenta nema detektabilni nivo ekspresije PD-L1 u infiltriranim imunoćelijama u tumoru.

[0339] Ovo otkriće takođe pruža postupak lečenja pacijenta koji boluje od nemikroćelijskog karcinoma pluća, koji uključuje davanje pacijentu terapeutski efikasne količine antagonista vezivanja PD-L1 ose, pri čemu je za uzorak tumora dobijenog od pacijenta utvrđeno da ima detektabilni nivo ekspresije PD-L1 u infiltriranim imunoćelijama u tumoru koje sadrže 1% ili više (npr. oko 1% ili više, oko 2% ili više, oko 3% ili više, oko 4% ili više, oko 5% ili više, oko 6% ili više, oko 7% ili više, oko 8% ili više, oko 10% ili više, oko 11% ili više, oko 12% ili više, oko 13% ili više, oko 14% ili više, oko 15% ili više, oko 20% ili više, oko 25% ili više, oko 30% ili više, oko 35% ili više, oko 40% ili više, oko 50% ili više, oko 45% ili više, ili oko 50% ili više) uzorka tumora i detektabilni nivo ekspresije PD-L1 kod manje od 50% (npr. manje od 50%, manje od 45%, manje od 40%, manje od 35%, manje od 30%, manje od 25%, manje od 20%, manje od 15%, manje od 10% ili manje od 5%) tumorskih ćelija u uzorku tumora.

[0340] U bilo kom od prethodnih postupaka, infiltrirane imunoćelije u tumoru mogu da pokriju oko 1% ili više (npr. oko 1% ili više, oko 2% ili više, oko 3% ili više, oko 4% ili više, oko 5% ili više, oko 6% ili više, oko 7% ili više, oko 8% ili više, oko 10% ili više, oko 11% ili više, oko 12% ili više, oko 13% ili više, oko 14% ili više, oko 15% ili više, oko 20% ili više, oko 25% ili više, oko 30% ili više, oko 35% ili više, oko 40% ili više, oko 50% ili više, oko 45% ili više, ili oko 50% ili više) područja tumora u delu uzorka tumora dobijenom od pacijenta. Na primer, u nekim slučajevima, infiltrirane imunoćelije u tumoru mogu da pokriju oko 1% ili više područja tumora u delu uzorka tumora. U nekim slučajevima, infiltrirane imunoćelije u tumoru mogu da pokriju oko 5% ili više područja tumora u delu uzorka tumora. U drugim slučajevima, infiltrirane imunoćelije u tumoru mogu da pokriju oko 10% ili više područja tumora u delu uzorka tumora. U nekim slučajevima, infiltrirane imunoćelije u tumoru mogu da pokriju oko 15% ili više područja tumora u delu uzorka tumora. U drugim slučajevima, infiltrirane imunoćelije u tumoru mogu da pokriju oko 20% ili više područja tumora u delu uzorka tumora. U daljim slučajevima, infiltrirane imunoćelije u tumoru mogu da pokriju oko 25% ili više područja tumora u delu uzorka tumora. U nekim slučajevima, infiltrirane imunoćelije u tumoru mogu da pokriju oko 30% ili više područja tumora u delu uzorka tumora. U nekim slučajevima, infiltrirane imunoćelije u tumoru mogu da pokriju oko 35% ili više područja tumora u delu uzorka tumora. U nekim slučajevima, infiltrirane imunoćelije u tumoru mogu da pokriju oko 40% ili više područja tumora u delu uzorka tumora. U nekim slučajevima, infiltrirane imunoćelije u tumoru mogu da pokriju oko 50% ili više područja tumora u delu uzorka tumora.

[0341] U bilo kom od prethodnih postupaka, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da bude bilo koji antagonist vezivanja PD-L1 ose poznat u struci ili opisan ovde, na primer, u odeljku C, „Antagonist vezivanja PD-L1 ose“ ispod.

[0342] Na primer, u nekim slučajevima, antagonist vezivanja PD-L1 ose je izabran iz grupe koja se sastoji od antagonista vezivanja PD-L1, antagonista vezivanja PD-1 i antagonista vezivanja PD-L2. U nekim slučajevima, antagonist vezivanja PD-L1 ose je antagonist vezivanja PD-L1. U nekim slučajevima, antagonist vezivanja PD-L1 je molekul koji inhibira vezivanje PD-L1 za jednog ili više njegovih partnera za vezivanje liganda. U drugim slučajevima, antagonist vezivanja PD-L1 inhibira vezivanje PD-L1 za PD-1. U nekim slučajevima, antagonist vezivanja PD-L1 inhibira vezivanje PD-L1 za B7-1. U nekim slučajevima, antagonist vezivanja PD-L1 inhibira vezivanje PD-L1 i za PD-1 i za B7-1. U nekim slučajevima, antagonist vezivanja PD-L1 je antitelo. U nekim otkrićima, antitelo se bira iz grupe koja se sastoji od: YW243.55.S70, MPDL3280A (atezolizumab), MDX-1105, MEDI4736 (durvalumab), i MSB0010718C (avelumab). U nekim otkrićima, antitelo se sastoji od teškog lanca koji sadrži HVR-H1 sekvencu SEQ ID NO:19, HVR-H2 sekvencu SEQ ID NO:20, i HVR-H3 sekvencu SEQ ID NO:21; i laki lanac koji sadrži HVR-L1 sekvencu SEQ ID NO:22, HVR-L2 sekvencu SEQ ID NO:23, i HVR-L3 sekvencu SEQ ID NO:24. U nekim otkrićima, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:26, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4.

[0343] U nekim slučajevima, antagonist vezivanja PD-L1 ose je antagonist vezivanja PD-1. Na primer, u nekim slučajevima, antagonist vezivanja PD-1 inhibira vezivanje PD-1 za jednog ili više njegovih partnera za vezivanje liganda. U nekim slučajevima, antagonist vezivanja PD-1 inhibira vezivanje PD-1 za PD-L1. U drugim slučajevima, antagonist vezivanja PD-1 inhibira vezivanje PD-1 za PD-L2. U drugim slučajevima, antagonist vezivanja PD-1 inhibira vezivanje PD-1 i za PD-L1 i za PD-L2. U nekim slučajevima, antagonist vezivanja PD-1 je antitelo. U nekim slučajevima, antitelo se bira iz grupe koja se sastoji od: MDX 1106 (nivolumab), MK-3475 (pembrolizumab), CT-011 (pidilizumab), MEDI-0680 (AMP-514), PDR001, REGN2810, i BGB-108. U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-1 je Fc-fuzioni protein. Na primer, u nekim slučajevima, Fc-fuzioni protein je AMP-224.

[0344] U nekim slučajevima, taj postupak dalje uključuje davanje pacijentu efikasne količine drugog terapeutskog agensa. U nekim slučajevima, drugi terapeutski agens je izabran iz grupe koja se sastoji od citotoksičnog agensa, agensa inhibitora rasta, agensa za terapiju radijacijom, antiangiogenog agensa i njihovih kombinacija.

[0345] U bilo kom od prethodnih slučajeva, nemikroćelijski karcinom pluća može da bude lokalno uznapredovali ili metastatski nemikroćelijski karcinom pluća. U bilo kom od prethodnih slučajeva, nemikroćelijski karcinom pluća bi mogao da bude skvamozni NSCLC ili neskvamozni NSCLC.

[0346] U daljem aspektu, otkriće predviđa upotrebu antagonista vezivanja PD-L1 ose u proizvodnji ili pripremi leka. U jednom otkriću, lek služi za terapiju kancera. U drugom otkriću, lek služi za upotrebu u postupku lečenja karcinoma, koja uključuje davanje efikasne količine leka pacijentu koji boluje od raka (npr. NSCLC). U jednom takvom otkriću, postupak dalje uključuje davanje pojedincu efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, npr. kao što je opisano u nastavku.

[0347] Kompozicije koji se koriste u ovde opisanim postupcima (npr. antagonisti vezivanja PD-L1 ose) mogu da se primenjuju bilo kojim pogodnim postupkom, uključujući, na primer, intravenski, intramuskularno, supkutano, intradermalno, perkutano, intraarterijski, intraperitonealno, intraleziono, intrakranijalno, intraartikularno, intraprostatički, intrapleuralno, intratrahealrno, intratekalno, intranazalno, intravaginalno, intrarektalno, topikalno, intratumorski, peritonealno, subkonjunktivno, intravezikularno, mukozno, intraperikardijalno, intraumbilikalno, intraokularno, intraorbitalno, oralno, topikalno, transdermalno, intravitrealno (npr intravitrealnom injekcijom), putem kapi za oči, inhalacijom, injekcijom, implantacijom, infuzijom, kontinuiranom infuzijom, lokalizovanim perfuzionim pranjem ciljnih ćelija direktno, kateterom, ispiranjem, u kremama, ili u lipidnim kompozicijama. Kompozicije koje se koriste u ovde opisanim postupcima takođe mogu da se daju sistemski ili lokalno. Postupak primene može da varira u zavisnosti od različitih faktora (npr. jedinjenje ili kompozicija koji se primenjuje i ozbiljnost stanja, bolesti ili poremećaja koji se leči). U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose se daje intravenski, intramuskularno, supkutano, topikalno, oralno, transdermalno, intraperitonealno, intraorbitalno, implantacijom, inhalacijom, intratekalno, intraventrikularno ili intranazalno. Doziranje može biti bilo kojim prikladnim načinom, npr. putem injekcija, kao što su intravenske ili supkutane injekcije, što delimično zavisi od toga da li je primena kratkotrajna ili hronična. Ovde su razmatrani različiti rasporedi doziranja uključujući, bez ograničenja, pojedinačnu ili višestruku primenu u različitim terminima, bolusnu primenu i pulsnu infuziju.

[0348] Antagonisti vezivanja PD-L1 ose (npr. antitelo, vezujući polipeptid i/ili mali molekul) koji su ovde opisani (svaki dodatni terapeutski agens) može da se formuliše, dozira i primeni na način konzistentan sa dobrom medicinskom praksom. Faktori za razmatranje u ovom kontekstu uključuju konkretni poremećaj koji se leči, konkretnog sisara koji se leči, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzrok poremećaja, mesto isporuke agensa, postupak primene, raspored primene i druge faktore poznate lekarima. Antagonist vezivanja PD-L1 ose ne mora biti, ali je opciono formulisan i/ili primenjen istovremeno sa jednim ili više agenasa koji se trenutno koriste za sprečavanje ili lečenje predmetnog poremećaja. Efikasna količina takvih drugih agenasa zavisi od količine antagonista vezivanja PD-L1 ose prisutnog u formulaciji, vrste poremećaja ili lečenja, kao i drugih faktora koji su razmatrani u gornjem tekstu. Oni se generalno koriste u istim dozama i sa istim načinom primene kao što je gore opisano, ili od

[0351] 1

[0352] oko 1 do 99% doza koje su ovde opisane, ili u bilo kojoj dozi i sa bilo kojim načinom primene za koje je empirijski/klinički dokazano da su odgovarajući.

[0353] Za sprečavanje ili lečenje raka (npr. nemikroćelijskog karcinoma pluća), odgovarajuća doza ovde opisanog antagonista vezivanja PD-L1 ose (kada se koristi samostalno ili u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapeutskih agenasa) zavisi od vrste bolesti koja se leči, težine i toka bolesti, od toga da li se antagonist vezivanja PD-L1 ose primenjuje u preventivne ili terapeutske svrhe, prethodnih terapija, kliničke istorije pacijenta i reakcije na antagonist vezivanja PD-L1 ose, i procene nadležnog lekara. Antagonist vezivanja PD-L1 ose se daje pacijentu odjednom ili tokom niza tretmana. Jedna tipična dnevna doza može biti u opsegu od oko 1 µg/kg do 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od gore pomenutih faktora. Kod ponovljene primene tokom nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje će generalno biti nastavljeno sve do željenog suzbijanja simptoma bolesti. Takve doze mogu da se daju sa prekidima, npr. svake nedelje ili svake tri nedelje (npr. da pacijent prima, na primer, od oko dve do dvadeset, ili npr. oko šest doza antagonista vezivanja PD-L1 ose). Može se primeniti veća početna doza, a nakon toga jedna ili više manjih doza. Međutim, mogu biti korisni i drugi dozni režimi. Napredak ove terapije jednostavno se prati klasičnim tehnikama i testovima.

[0354] Na primer, kao opšti predlog, terapeutski efikasna količina antitela antagonista vezivanja PD-L1 ose, data čoveku, biće u opsegu od oko 0,01 do oko 50 mg/kg telesne težine pacijenta, putem jedne ili više primena. U nekim otkrićima, korišćeno antitelo je davano u količini oko 0,01 mg/kg do oko 45 mg/kg, oko 0,01 mg/kg do oko 40 mg/kg, oko 0,01 mg/kg do oko 35 mg/kg, oko 0,01 mg/kg do oko 30 mg/kg, oko 0,01 mg/kg do oko 25 mg/kg, oko 0,01 mg/kg do oko 20 mg/kg, oko 0,01 mg/kg do oko 15 mg/kg, oko 0,01 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 0,01 mg/kg do oko 5 mg/kg, ili oko 0,01 mg/kg do oko 1 mg/kg, na primer dnevno, nedeljno, svake dve nedelje, svake tri nedelje ili mesečno. U nekim otkrićima, antitelo se daje u dozi od 15 mg/kg. Međutim, mogu biti korisni i drugi dozni režimi. U jednom otkriću, ovde opisano anti-PD-L1 antitelo se daje čoveku u dozi od oko 100 mg, oko 200 mg, oko 300 mg, oko 400 mg, oko 500 mg, oko 600 mg, oko 700 mg, oko 800 mg, oko 900 mg, oko 1000 mg, oko 1100 mg, oko 1200 mg, oko 1300 mg, oko 1400 mg, oko 1500 mg, oko 1600 mg, oko 1700 mg ili oko 1800 mg 1. dana svakodnevnog ciklusa koji traje 21 dan (svake tri nedelje, q3w). U nekim otkrićima, 1200 mg anti-PD-L1 antitela MPDL3280A se daje intravenski svake tri nedelje (q3w). Doza se može primeniti kao pojedinačna doza ili kao višestruke doze (npr.2 ili 3 doze), kao što su infuzije. Doza antitela primenjena u kombinovanom tretmanu se može smanjiti u poređenju sa jednim tretmanom.

[0357] 2

[0358] Napredak ove terapije jednostavno se prati klasičnim tehnikama.

[0359] U nekim otkrićima, postupci uključuju i davanje pacijentu efikasne količine drugog terapeutskog agensa. U nekim otkrićima, drugi terapeutski agens je izabran iz grupe koja se sastoji od citotoksičnog agensa, hemoterapeutskog agensa, agensa za inhibiciju rasta, agensa za terapiju radijacijom, antiangiogenog agensa i njihovih kombinacija. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se daje zajedno sa hemoterapijom ili hemoterapeutskim agensom. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se daje zajedno sa agensom za terapiju radijacijom. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se daje zajedno sa ciljanom terapijom ili agensom za ciljanu terapiju. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se daje zajedno sa imunoterapijom ili imunoterapeutskim agensom, na primer monoklonskim antitelom. U nekim otkrićima, drugi terapeutski agens je agonist usmeren protiv aktivirajućeg kostimulatornog molekula. U nekim otkrićima, drugi terapeutski agens je antagonist koji je usmeren protiv inhibitornog kostimulatornog molekula.

[0360] Takve kombinovane terapije koje su gore pomenute obuhvataju kombinovanu primenu (gde su dva ili više terapeutskih agenasa obuhvaćeni istom formulacijom, ili različitim formulacijama), i odvojenu primenu, u kom slučaju primena antagonista vezivanja PD-L1 ose može da se odigra pre primene dodatnog terapeutskog agensa ili agenasa, istovremeno sa njim i/ili nakon njegove primene. U jednom otkriću, primena antagonista vezivanja PD-L1 ose i primena dodatnog terapeutskog agensa se dešavaju približno u roku od jednog meseca, ili približno u roku od jedne, dve ili tri nedelje, ili približno u roku od jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest dana, jedna od druge.

[0361] Bez vezivanja za teoriju, smatra se da bi unapređivanje stimulacije T-ćelija, promovisanjem aktivirajućeg molekula za kostimulaciju ili inhibiranjem negativnog molekula za kostimulaciju, moglo da promoviše smrt ćelija tumora, time lečeći ili odlažući progresiju raka. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa agonistom usmerenim protiv aktivirajućeg kostimulacionog molekula. U nekim otkrićima, aktivirajući kostimulacioni molekul može uključivati CD40, CD226, CD28, OX40, GITR, CD137, CD27, HVEM ili CD127. U nekim otkrićima, agonist usmeren protiv aktivirajućeg kostimulišućeg molekula je agonističko antitelo koje se vezuje za CD40, CD226, CD28, OX40, GITR, CD137, CD27, HVEM ili CD127. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa antagonistom usmerenim protiv inhibitorskog kostimulišućeg molekula. U nekim otkrićima, inhibitorski kostimulišući molekul može uključivati CTLA-4 (poznat i kao CD152), TIM-3, BTLA, VISTA, LAG-3, B7-H3, B7-H4, IDO, TIGIT, MICA/B ili arginazu. U nekim otkrićima, antagonist usmeren protiv inhibitorskog kostimulišućeg molekula je antagonističko antitelo koje se vezuje za CTLA-4, TIM-3, BTLA, VISTA, LAG-3, B7-H3, B7-H4, IDO, TIGIT, MICA/B ili arginazu.

[0362] U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa antagonistom usmerenim protiv CTLA-4 (takođe poznatim kao CD152), npr. blokirajućim antitelom. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa ipilimumabom (takođe poznatim kao MDX-010, MDX-101 ili YERVOY®). U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa tremelimumabom (takođe poznatim kao ticilimumab ili CP-675,206). U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa antagonistom usmerenim protiv B7-H3 (takođe poznatim kao CD276), npr. blokirajućim antitelom. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa MGA271. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa antagonistom usmerenim protiv TGF-beta, npr. metelimumabom (takođe poznatim kao CAT-192), fresolimumabom (takođe poznatim kao GC1008) ili LI2157299.

[0363] U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa tretmanom koji uključuje adoptivni transfer T-ćelije (npr. citotoksične T-ćelije ili CTL) koja eksprimira himerni receptor antigena (CAR). U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa tretmanom koji uključuje adoptivni transfer T-ćelije koja sadrži dominantno negativni TGF beta receptor, na primer, dominantno negativni TGF beta receptor tip II. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa tretmanom koji sadrži HERCREEM protokol (vidi, na primer, ClinicalTrials.gov identifikator NCT00889954).

[0364] U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa agonistom usmerenim protiv CD137 (takođe poznatim kao TNFRSF9, 4-1BB ili ILA), npr. aktivirajućim antitelom. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa urelumabom (takođe poznatim kao BMS-663513). U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa agonistom usmerenim protiv CD40, na primer, aktivirajućim antitelom. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa CP-870893. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa agonistom usmerenim protiv OX40 (takođe poznat kao CD134), npr. aktivirajućim antitelom. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa antitelom protiv OX40 (npr. AgonOX). U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa agonistom usmerenim protiv

[0367] 4

[0368] CD27, na primer, aktivirajućim antitelom. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa CDX-1127. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa antagonistom usmerenim protiv indolamin-2,3-dioksigenaze (IDO). U nekim otkrićima, antagonist IDO je 1-metil-D-triptofan (poznat i kao 1-D-MT).

[0369] U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa konjugatom antitelo-lek. U nekim otkrićima, konjugat antitelo-lek sadrži mertansin ili monometil auristatin E (MMAE). U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa konjugatom anti-NaPi2b antitelo-MMAE (takođe poznatim kao DNIB0600A ili RG7599). U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa trastuzumab emtansinom (takođe poznatim kao T-DM1, ado-trastuzumab emtansin ili KADCILA®, Genentech). U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa DMUC5754A. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa konjugatom antitelo-lek usmerenim protiv receptora endotelina B (EDNBR), npr. antitelom usmerenim protiv EDNBR konjugovanog sa MMAE.

[0370] U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa antiangiogeneznim agensom. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa antitelom usmerenim protiv VEGF, npr. VEGF-A. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa bevacizumabom (takođe poznatim kao AVASTIN®, Genentech). U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa antitelom usmerenim na angiopoetin 2 (takođe poznatim kao Ang2). U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa MEDI3617.

[0371] U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa antineoplastičnim agensom. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa agensom usmerenim protiv CSF-1R (takođe poznatim kao M-CSFR ili CD115). U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa anti-CSF-1R (takođe poznatim kao IMC-CS4). U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa interferonom, na primer interferonom alfa ili interferonom gama. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa roferonom-A (takođe poznatim kao rekombinantni interferon alfa-2a). U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa GM-CSF (takođe poznatim kao rekombinantni faktor stimulisanja kolonije humanog granulocita makrofaga, rhu GM-CSF, sargramostim ili LEUKINE®). U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD L1 ose može da se primeni zajedno sa IL-2 (takođe poznatim kao aldesleukin ili PROLEUKIN®). U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa IL-12. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa antitelom usmerenim protiv CD20. U nekim otkrićima, antitelo usmereno protiv CD20 je obinutuzumab (poznat i kao GA101 ili GAZYVA®) ili rituksimab. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa antitelom usmerenim protiv GITR. U nekim otkrićima, antitelo usmereno protiv GITR je TRX518.

[0372] U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa vakcinom protiv raka. U nekim otkrićima, vakcina za kancer je peptidna vakcina za kancer, koja je u nekim otkrićima personalizovana peptidna vakcina. U nekim otkrićima, peptidna vakcina za kancer je vakcina sa multivalentnim dugačkim peptidom, multipeptidom, koktelom peptida, hibridnim peptidom ili dendritskim ćelijama pulsiranim peptidom (vidi, npr. Yamada i sar. Cancer Sci. 104:14-21,2013). U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa adjuvansom. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa tretmanom koji sadrži TLR agonist, npr. Poli-ICLC (takođe poznat kao HILTONOL®), LPS, MPL ili CpG ODN. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa faktorom nekroze tumora alfa (TNF). U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa IL-1. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa HMGB1. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa antagonistom IL-10. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa antagonistom IL-4. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa antagonistom IL-13. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa HVEM antagonistom. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa ICOS agonistom, npr. davanjem ICOS-L ili agonističkog antitela usmerenog protiv ICOS. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa tretmanom usmerenim na CX3CL1. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa tretmanom usmerenim na CXCL9. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa tretmanom usmerenim na CXCL10. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa tretmanom usmerenim na CCL5. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa LFA-1 ili ICAM1 agonistom. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa selektin agonistom.

[0373] U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa ciljanom terapijom. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa inhibitorom B-Raf. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa vemurafenibom (takođe poznatim kao ZELBORAF®). U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa dabrafenibom (takođe poznatim kao TAFINLAR®). U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa erlotinibom (takođe poznatim kao TARCEVA®). U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa inhibitorom MEK, kao što je MEK1 (takođe poznatim kao MAP2K1) ili MEK2 (takođe poznatim kao MAP2K2). U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa kobimetinibom (takođe poznatim kao GDC-0973 ili XL-518). U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa trametinibom (takođe poznatim kao MEKINIST®). U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa inhibitorom K-Ras. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa inhibitorom c-Met. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa onartuzumabom (takođe poznatim kao MetMAb). U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa inhibitorom Alk. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa AF802 (takođe poznatim kao CH5424802 ili alektinib). U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa inhibitorom fosfatidilinozitol 3-kinaze (PI3K). U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa BKM120. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa idelalisibom (takođe poznatim kao GS-1101 ili CAL-101). U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa perifosinom (takođe poznatim kao KRKS-0401). U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa inhibitorom Akt. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa MK2206. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa GSK690693. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa GDC-0941. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa inhibitorom mTOR. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa sirolimusom (takođe poznatim kao rapamicin). U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa temsirolimusom (takođe poznatim kao CCI-779 ili Torisel®). U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa everolimusom (takođe poznatim kao RAD001). U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa ridaforolimusom (takođe poznatim kao AP-23573, MK-8669 ili deforolimus). U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa OSI-027. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa AZD8055. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa INK128. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa dvostrukim inhibitorom PI3K/mTOR. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa XL765. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa GDC-0980. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa BEZ235 (poznat i kao NVP-BEZ235). U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa BGT226. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa GSK2126458. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa PF-04691502. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose može da se primeni zajedno sa PF-05212384 (takođe poznat i kao PKI-587).

[0374] C. Antagonist vezivanja PD-L1 ose za upotrebu u postupcima pronalaska Ovde su dati postupci lečenja ili odlaganja progresije raka (npr. nemikroćelijskog karcinoma pluća) kod pacijenta, koje se sastoje od davanja terapeutski efikasne količine antagonista vezivanja PD-L1 ose pacijentu. Ovde su obezbeđeni postupci za utvrđivanje da li će pacijent koji boluje od raka (npr., nemikroćelijskog karcinoma pluća) verovatno reagovati na lečenje koje sadrži antagonist vezivanja PD-L1 ose. Ovde su dati postupci za predviđanje odgovora pacijenta koji boluje od raka (na primer, nemikroćelijskog karcinoma pluća) na tretman koji sadrži antagonist vezivanja PD-L1 ose. Ovde su dati postupci za odabir terapije za pacijenta koji boluje od raka (na primer, nemikroćelijskog karcinoma pluća). Bilo koji od prethodnih postupaka može da bude zasnovana na nivou ekspresije biomarkera koji se ovde obezbeđuje, na primer, ekspresije PD-L1 u uzorku tumora, npr. u imunološkim ćelijama koje se infiltriraju u tumor i/ili u ćelijama tumora.

[0375] Na primer, antagonist vezivanja PD-L1 ose uključuje antagonist vezivanja PD-1, antagonist vezivanja PD-L1 i antagonist vezivanja PD-L2. PD-1 (programirana smrt 1) se takođe u struci naziva „programirana ćelijska smrt 1“, „PDCD1“, „CD279“ i „SLEB2“. Primer za humani PD-1 prikazan je u UniProtKB/Swiss-Prot pristupni br. Q15116. PD-L1 (programirani ligand smrti 1) u struci se takođe naziva „ligand 1 programirane ćelijske smrti 1“, „PDCD1LG1“, „CD274“, „B7-H“ i „PDL1“. Primer za humani PD-L1 je prikazan u UniProtKB/Swiss-Prot pristupni br. Q9NZQ7.1. PD-L2 (programirani ligand smrti 2) u struci se takođe naziva „ligand 2 programirane ćelijske smrti 1“, „PDCD1LG2“, „CD273“, „B7-DC“, „Btdc“ i „PDL2“. Primer za humani PD-L2 prikazan je u UniProtKB/Swiss-Prot pristupni br. Q9BQ51. U nekim otkrićima, PD-1, PD-L1 i PD-L2 su humani PD-1, PD-L1 i PD-L2.

[0376] U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-1 je molekul koji inhibira vezivanje PD-1 za njegove partnere za vezivanje liganda. U specifičnom aspektu, partneri PD-1 za vezivanje liganda su PD-L1 i/ili PD-L2. U još jednom otkriću, antagonist vezivanja PD-L1 je molekul koji inhibira vezivanje PD-L1 za njegove vezujuće ligande. U specifičnom aspektu, partneri PD-L1 za vezivanje su PD-1 i/ili B7-1. U drugom otkriću, antagonist vezivanja PD-L2 je molekul koji inhibira vezivanje PD-L2 za njegove partnere za vezivanje liganda. U specifičnom aspektu, ligand PD-L2 za vezivanje je PD-1. Antagonist može biti antitelo, njegov fragment koji vezuje antigen, imunoadhezin, fuzioni protein ili oligopeptid.

[0377] U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-1 je anti-PD-1 antitelo (npr. humano antitelo, humanizovano antitelo ili himerno antitelo), kao na primer kao što je opisano ispod. U nekim otkrićima, anti-PD-1 antitelo je izabrano iz grupe koju čine MDX-1106 (nivolumab), MK-3475 (pembrolizumab), CT-011 (pidilizumab), MEDI-0680 (AMP-514), PDR001, REGN2810 i BGB-108. MDX-1106, poznat i kao MDX-1106-04, ONO-4538, BMS-936558 ili nivolumab, je anti-PD-1 antitelo opisano u WO2006/121168. MK-3475, takođe poznat kao pembrolizumab ili lambrolizumab, je anti-PD-1 antitelo opisano u WO 2009/114335. CT-011, poznat i kao hBAT, hBAT-1 ili pidilizumab, je anti-PD-1 antitelo opisano u WO 2009/101611. U nekim otkrićima, antagonist koji vezuje PD-1 je imunoadhezin (npr. imunoadhezin koji sadrži ekstracelularni ili PD-1 vezujući deo PD-L1 ili PD-L2 fuzionisan sa konstantnim regionom (npr. Fc region imunoglobulinske sekvence). U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-1 je AMP-224. AMP-224, poznat i kao B7-DCIg, je PD-L2-Fc fuzioni rastvorljivi receptor opisan u WO 2010/027827 i WO 2011/066342.

[0378] U nekim otkrićima, anti-PD-1 antitelo je MDX-1106. Među alternativnim imenima za „MDX-1106“ su MDX-1106-04, ONO-4538, BMS-936558 i nivolumab. U nekim otkrićima, anti-PD-1 antitelo je nivolumab (CAS registarski broj: 946414-94-4). U sledećem otkriću, dato je izolovano anti-PD-1 antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 1 i/ili varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 2. U još jednom otkriću, obezbeđuje se izolovano anti-PD-1 antitelo koje sadrži sekvencu teškog lanca i/ili lakog lanca, pri čemu:

[0379] (a) sekvenca teškog lanca ima najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% identičnosti sa sekvencom teškog lanca:

[0381]

[0383] (b) sekvence lakog lanca imaju najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% identičnosti sa sekvencom lakog lanca:

[0386]

[0388] U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 ose je antagonist vezivanja PD-L2. U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L2 je anti-PD-L2 antitelo (npr. humano antitelo, humanizovano antitelo ili himerno antitelo). U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L2 je imunoadhezin.

[0389] U nekim otkrićima, antagonist vezivanja PD-L1 je anti-PD-L1 antitelo, kao što je opisano ispod. U nekim otkrićima, anti-PD-L1 antitelo je sposobno da inhibira vezivanje između PD-L1 i PD-1 i/ili između PD-L1 i B7-1. U nekim otkrićima, anti-PD-L1 antitelo je monoklonsko antitelo. U nekim otkrićima, anti-PD-L1 antitelo je fragment antitela izabran iz grupe koja sadrži Fab, Fab’-SH, Fv, scFv i (Fab')<2>fragmente. U nekim otkrićima, anti-PD-L1 antitelo je humanizovano antitelo. U nekim otkrićima, anti-PD-L1 antitelo je humano antitelo. U nekim otkrićima, anti-PD-L1 antitelo je izabrano iz grupe koju čine YV243.55.S70, MPDL3280A (atezolizumab), MDX-1105, MEDI4736 (durvalumab) i MSB0010718C (avelumab). Antitelo YW243.55.S70 je anti-PD-L1 opisano u WO 2010/077634. MDX-1105, poznat i kao BMS-936559, je anti-PD-L1 antitelo opisano u WO2007/005874. MEDI4736 (durvalumab) je anti-PD-L1 monoklonsko antitelo opisano u WO2011/066389 i US2013/034559. Primeri anti-PD-L1 antitela korisnih za postupke ovog pronalaska i postupke za njihovo dobijanje opisani su u PCT prijavi patenta WO 2010/077634, WO 2007/005874, 2011/066389, U.S. pat. br.8,217,149, i US 2013/034559.

[0390] Anti-PD-L1 antitela opisana u WO 2010/077634 A1 i US 8,217,149 mogu da se koriste u ovde opisanim postupcima. U nekim otkrićima, anti-PD-L1 antitelo sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 3 i/ili sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 4.

[0391] U još jednom otkriću, obezbeđuje se izolovano anti-PD-L1 antitelo koje sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca, pri čemu:

[0392] (a) sekvenca teškog lanca ima najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% identičnosti sa sekvencom teškog lanca:

[0394]

[0396] (b) sekvenca lakog lanca ima najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% identičnosti sa sekvencom lakog lanca:

[0399]

[0401] U jednom otkriću, anti-PD-L1 antitelo sadrži polipeptid varijabilnog regiona teškog lanca koji sadrži HVR-H1, HVR-H2 i HVR-H3 sekvencu, pri čemu:

[0402] (a) HVR-H1 sekvenca je GFTFSX<1>SWIH (SEQ ID NO: 5);

[0403] (b) HVR-H2 sekvenca je AWIX<2>PYGGSX<3>YYADSVKG (SEQ ID NO:6);

[0404] (c) HVR-H3 sekvenca j

[0405] i pri čemu: X<1>je D ili G; X<2>je S ili L; X<3>je T ili S. U jednom specifičnom aspektu, X<1>je D; X<2>je S i X<3>je T. U drugom aspektu, polipeptid dalje sadrži okvir sekvence varijabilnog regiona teškog lanca postavljen između HVR-a prema formuli: (FR-H1)-(HVR-H1)-(FR-H2)-(HVR-H2)-(FR-H3)-(HVR-H3)-(FR-H4). U još jednom aspektu, okvirne sekvence su izvedene iz sekvenci humanog okvira konsenzusa. U još jednom aspektu, okvirne sekvence su okvir konsenzusa VH podgrupe III. U još jednom aspektu, barem jedna od okvirnih sekvenci je sledeća:

[0407]

[0409] U još jednom aspektu, polipeptid teškog lanca se nadalje kombinuje sa varijabilnim regionom lakog lanca koji sadrži HVR-L1, HVR-L2 i HVR-L3, pri čemu:

[0412] 1

[0413] (a) HVR-L1 sekvenca je RASQX<4>X<5>X<6>TX<7>X<8>A (SEQ ID NO:12);

[0414] (b) HVR-L2 sekvenca je SASX<9>LX<10>S, (SEQ ID NO:13);

[0415] (c) HVR-L3 sekvenca je QQX<11>X<12>X<13>X<14>PX<15>T (SEQ ID NO:14);

[0416] pri čemu: X<4>je D ili V; X<5>je V ili I; X<6>je S ili N; X<7>je A ili F; X<8>je V ili L; X<9>je F ili T; X<10>je Y ili A; X<11>je Y, G, F, ili S; X<12>je L, Y, F ili W; X<13>je Y, N, A, T, G, F ili I; X<14>je H, V, P, T ili I; X<15>je A, W, R, P ili T. U kasnijem aspektu, X<4>je D; X<5>je V; X<6>je S; X<7>je A; X<8>je V; X<9>je F; X<10>je Y; X<11>je Y; X<12>je L; X<13>je Y; X<13>je H; X<15>je A.

[0417] U još daljem aspektu, laki lanac dalje sadrži okvir sekvence varijabilnog regiona lakog lanca postavljene između HVR-a prema formuli: (FR-L1)-(HVR-L1)-(FR-L2)-(HVR-L2)-(FR-L3)-(HVR-L3)-(FR-L4). U još jednom aspektu, okvirne sekvence su izvedene iz sekvenci humanog okvira konsenzusa. U još jednom aspektu, okvirne sekvence su VL kapa I okvir konsenzusa. U još jednom aspektu, bar jedna od okvirnih sekvenci je sledeća:

[0418] FR-L1 je (SEQ ID NO:15)

[0421]

[0423] U drugom otkriću, obezbeđuje se izolovano anti-PD-L1 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i lakog lanca, pri čemu:

[0424] (a) teški lanac sadrži HVR-H1, HVR-H2 i HVR-H3, i pri čemu:

[0425] (i) HVR-H1 sekvenca je GFTFSX<1>SWIH; (SEQ ID NO:5)

[0426] (ii) HVR-H2 sekvenca je AWIX<2>PYGGSX<3>YYADSVKG (SEQ ID NO:6) (iii) HVR-H3 sekvenca je RHWPGGFDY, i (SEQ ID NO:7)

[0427] (b) laki lanac sadrži HVR-L1, HVR-L2 i HVR-L3, i pri čemu:

[0428] (i) HVR-L1 sekvenca je RASQX<4>X<5>X<6>TX<7>X<8>A (SEQ ID NO:12)

[0429] (ii) HVR-L2 sekvenca je SASX<9>LX<10>S; i (SEQ ID NO:13)

[0430] (iii) HVR-L3 sekvenca je QQX<11>X<12>X<13>X<14>PX<15>T; (SEQ ID NO:14)

[0431] pri čemu: X<1>je D ili G; X<2>je S ili L; X<3>je T ili S; X<4>je D ili V; X<5>je V ili I; X<6>je S ili N; X<7>je A ili F; X<8>je V ili L; X<9>je F ili T; X<10>je Y ili A; X<11>je Y, G, F, ili S; X<12>je L, Y, F ili W; X<13>je Y, N, A, T, G, F ili I; X<14>je H, V, P, T ili I; X<15>je A, W, R, P ili T. U posebnom aspektu, X<1>je D; X<2>je S i X<3>je T. U drugom aspektu, X<4>je D; X<5>je V; X<6>je S; X<7>je A; X<8>je V; X<9>je F; X<10>je Y; X<11>je Y; X<12>je L; X<13>je Y; X<14>je H; X<15>je A. U još jednom aspektu, X<1>je D; X<2>je S i X<3>je T, X<4>je D; X<5>je V; X<6>je S; X<7>je A; X<8>je V; X<9>je F; X<10>je Y; X<11>je Y; X<12>je L; X<13>je Y; X<14>je H i X<15>je A.

[0434] 2

[0435] U još jednom aspektu, varijabilni region teškog lanca sadrži jednu ili više okvirnih sekvenci smeštenih uporedo između HVR-a kao: (FR-H1)-(HVR-H1)-(FR-H2)-(HVR-H2)-(FR-H3)-(HVR-H3)-(FR-H4), a varijabilni regioni lakog lanca sadrže jednu ili više okvirnih sekvenci smeštenih uporedo između HVR-a kao: (FR-L1)-(HVR-L1)-(FR-L2)-(HVR-L2)-(FR-L3)-(HVR-L3)-(FR-L4). U još jednom aspektu, okvirne sekvence su izvedene iz sekvenci humanog okvira konsenzusa. U još jednom aspektu, okvirne sekvence teških lanaca izvedene su iz Kabatove sekvence podgrupe I, II ili III. U još jednom aspektu, okvirna sekvenca teškog lanca je okvir konsenzusa VH podgrupe III. U još jednom aspektu, jedna ili više sekvenci okvira teškog lanca predstavljene su kao SEQ ID NO: 8, 9, 10 i 11. U još jednom aspektu, okvirne sekvence lakog lanca izvedene su iz sekvenci Kabatovih podgrupa kapa I, II, II ili IV. U još jednom aspektu, okvirne sekvence lakog lanca su okvir konsenzusa VL kapa I. U još jednom aspektu, neke od sekvenci okvira lakog lanca predstavljene su kao SEQ ID NO:15, 16, 17 i 18.

[0436] U još jednom specifičnom aspektu, antitelo nadalje obuhvata humani ili mišji konstantni region. U nekim aspektima, humani konstantni region je odabran iz grupe koja se sastoji od IgG1, IgG2, IgG2, IgG3 i IgG4. U još jednom specifičnom aspektu, humani konstantni region je IgG1. U još jednom aspektu, mišji konstantni region je odabran iz grupe koja se sastoji od IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. U još jednom aspektu, mišji konstantni region je IgG2A. U još jednom specifičnom aspektu, antitelo ima smanjenu ili minimalnu efektorsku funkciju. U još jednom specifičnom aspektu, minimalna efektorska funkcija rezultat je „Fc mutacije bez efektora“ ili aglikozilacije. U još jednom otkriću, Fc mutacija bez efektora je supstitucija N297A ili D265A/N297A u konstantnom regionu.

[0437] U još jednom otkriću, obezbeđuje se anti-PD-L1 antitelo koje sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog i lakog lanca, pri čemu:

[0438] (a) teški lanac nadalje sadrži HVR-H1, HVR-H2 i HVR-H3 sekvencu koja je najmanje 85% identična sekvencama (SEQ ID NO: 19), ili (b) laki lanac nadalje sadrži HVR-L1, HVR-L2 i HVR-L3 sekvencu koja je najmanje 85% identična sekvencama

[0439] ovim redosledom.

[0440] U jednom specifičnom aspektu, identičnost sekvenci je 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100%.

[0441] U još jednom aspektu, varijabilni region teškog lanca sadrži jednu ili više okvirnih sekvenci smeštenih uporedno između HVR-a kao: (FR-H1)-(HVR-H1)-(FR-H2)-(HVR-H2) (FR-H3)-(HVR-H3)-(FR-H4), a varijabilni regioni lakog lanca sadrže jednu ili više okvirnih sekvenci smeštenih uporedo između HVR-a kao: (FR-L1)-(HVR-L1)-(FR-L2)-(HVR-L2)-(FR-L3)-(HVR-L3)-(FR-L4). U još jednom aspektu, okvirne sekvence su izvedene iz sekvenci humanog okvira konsenzusa. U još jednom aspektu, okvirne sekvence teških lanaca izvedene su iz Kabatove sekvence podgrupe I, II ili III. U još jednom aspektu, okvirna sekvenca teškog lanca je okvir konsenzusa VH podgrupe III. U još jednom aspektu, jedna ili više sekvenci okvira teškog lanca predstavljene su kao SEQ ID NO: 8, 9, 10 i 11. U još jednom aspektu, okvirne sekvence lakog lanca izvedene su iz sekvenci Kabatovih podgrupa kapa I, II, II ili IV. U još jednom aspektu, okvirne sekvence lakog lanca su okvir konsenzusa VL kapa I. U još jednom aspektu, neke od sekvenci okvira lakog lanca predstavljene su kao SEQ ID NO:15, 16, 17 i 18.

[0442] U još jednom specifičnom aspektu, antitelo nadalje obuhvata humani ili mišji konstantni region. U nekim aspektima, humani konstantni region je odabran iz grupe koja se sastoji od IgG1, IgG2, IgG2, IgG3 i IgG4. U još jednom specifičnom aspektu, humani konstantni region je IgG1. U još jednom aspektu, mišji konstantni region je odabran iz grupe koja se sastoji od IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. U još jednom aspektu, mišji konstantni region je IgG2A. U još jednom specifičnom aspektu, antitelo ima smanjenu ili minimalnu efektorsku funkciju. U još jednom specifičnom aspektu, minimalna efektorska funkcija rezultat je „Fc mutacije bez efektora“ ili aglikozilacije. U još jednom otkriću, Fc mutacija bez efektora je supstitucija N297A ili D265A/N297A u konstantnom regionu.

[0443] U još jednom otkriću, obezbeđuje se izolovano anti-PD-L1 antitelo koje sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog i lakog lanca, pri čemu:

[0444] (a) sekvenca teškog lanca je najmanje 85% identična sekvenci teškog lanca:

[0446]

[0448] i/ili

[0449] (b) sekvence lakog lanca su najmanje 85% identične sekvenci lakog lanca:

[0452]

[0454] U jednom specifičnom aspektu, identičnost sekvenci je 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100%. U još jednom aspektu, varijabilni region teškog lanca sadrži jednu ili više okvirnih sekvenci smeštenih uporedno između HVR-a kao: (FR-H1)-(HVR-H1)-(FR-H2)-(HVR-H2)-(FR-H3)-(HVR-H3)-(FR-H4), a varijabilni regioni lakog lanca sadrže jednu ili više okvirnih sekvenci smeštenih uporedo

[0457] 4

[0458] između HVR-a kao: (FR-L1)-(HVR-L1)-(FR-L2)-(HVR-L2)-(FR-L3)-(HVR-L3)-(FR-L4). U još jednom aspektu, okvirne sekvence su izvedene iz sekvenci humanog okvira konsenzusa. U još jednom aspektu, okvirne sekvence teškog lanca izvedene su iz sekvence Kabatove podgrupe I, II ili III. U još jednom aspektu, okvirna sekvenca teškog lanca je okvir konsenzusa VH podgrupe III. U još jednom aspektu, jedna ili više sekvenci okvira teškog lanca predstavljene su kao SEQ ID NO: 8, 9, 10 i (SEQ ID NO:27).

[0459] U još jednom aspektu, okvirne sekvence lakog lanca izvedene su iz sekvenci Kabatovih podgrupa kapa I, II, II ili IV. U još jednom aspektu, okvirne sekvence lakog lanca su okvir konsenzusa VL kapa I. U još jednom aspektu, neke od sekvenci okvira lakog lanca predstavljene su kao SEQ ID NO:15, 16, 17 i 18.

[0460] U još jednom specifičnom aspektu, antitelo nadalje obuhvata humani ili mišji konstantni region. U nekim aspektima, humani konstantni region je odabran iz grupe koja se sastoji od IgG1, IgG2, IgG2, IgG3 i IgG4. U još jednom specifičnom aspektu, humani konstantni region je IgG1. U još jednom aspektu, mišji konstantni region je odabran iz grupe koja se sastoji od IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. U još jednom aspektu, mišji konstantni region je IgG2A. U još jednom specifičnom aspektu, antitelo ima smanjenu ili minimalnu efektorsku funkciju. U još jednom specifičnom aspektu, minimalna efektorska funkcija nastaje stvaranjem u prokariotskim ćelijama. U još jednom specifičnom aspektu, minimalna efektorska funkcija rezultat je „Fc mutacije bez efektora“ ili aglikozilacije. U još jednom otkriću, Fc mutacija bez efektora je supstitucija N297A ili D265A/N297A u konstantnom regionu.

[0461] U još jednom aspektu, varijabilni region teškog lanca sadrži jednu ili više okvirnih sekvenci smeštenih uporedo između HVR-a kao: (FR-H1)-(HVR-H1)-(FR-H2)-(HVR-H2)-(FR-H3)-(HVR-H3)-(FR-H4), a varijabilni regioni lakog lanca sadrže jednu ili više okvirnih sekvenci smeštenih uporedo između HVR-a kao: (FR-L1)-(HVR-L1)-(FR-L2)-(HVR-L2)-(FR-L3)-(HVR-L3)-(FR-L4). U još jednom aspektu, okvirne sekvence su izvedene iz sekvenci humanog okvira konsenzusa. U još jednom aspektu, okvirne sekvence teških lanaca izvedene su iz Kabatove sekvence podgrupe I, II ili III. U još jednom aspektu, okvirna sekvenca teškog lanca je okvir konsenzusa VH podgrupe III. U još jednom aspektu, jedna ili više okvirnih sekvenci teškog lanca je sledeća:

[0464]

[0465] U još jednom aspektu, okvirne sekvence lakog lanca izvedene su iz sekvenci Kabatovih podgrupa kapa I, II, II ili IV. U još jednom aspektu, okvirne sekvence lakog lanca su okvir konsenzusa VL kapa I. U još jednom aspektu, jedna ili više okvirnih sekvenci lakog lanca je sledeća:

[0468]

[0470] U još jednom specifičnom aspektu, antitelo nadalje obuhvata humani ili mišji konstantni region. U nekim aspektima, humani konstantni region je odabran iz grupe koja se sastoji od IgG1, IgG2, IgG2, IgG3 i IgG4. U još jednom specifičnom aspektu, humani konstantni region je IgG1. U još jednom aspektu, mišji konstantni region je odabran iz grupe koja se sastoji od IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. U još jednom aspektu, mišji konstantni region je IgG2A. U još jednom specifičnom aspektu, antitelo ima smanjenu ili minimalnu efektorsku funkciju. U još jednom specifičnom aspektu, minimalna efektorska funkcija rezultat je „Fc mutacije bez efektora“ ili aglikozilacije. U još jednom otkriću, Fc mutacija bez efektora je supstitucija N297A ili D265A/N297A u konstantnom regionu.

[0471] U još jednom otkriću, obezbeđuje se anti-PD-L1 antitelo koje sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog i lakog lanca, pri čemu:

[0472] (c) teški lanac nadalje sadrži HVR-H1, HVR-H2 i HVR-H3 sekvencu koja je najmanje 85% identična sekvencama

(SEQ ID NO:19),

[0474] (d) laki lanac nadalje sadrži HVR-L1, HVR-L2 i HVR-L3 sekvencu koja je najmanje 85% identična sekvencama

[0475] odnosno

[0476] U jednom specifičnom aspektu, identičnost sekvenci je 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100%.

[0477] U još jednom aspektu, varijabilni region teškog lanca sadrži jednu ili više okvirnih sekvenci smeštenih uporedno između HVR-a kao: (FR-H1)-(HVR-H1)-(FR-H2)-(HVR-H2)-(FR-H3)-(HVR-H3)-(FR-H4), a varijabilni regioni lakog lanca sadrže jednu ili više okvirnih sekvenci smeštenih uporedo između HVR-a kao: (FR-L1)-(HVR-L1)-(FR-L2)-(HVR-L2)-(FR-L3)-(HVR-L3)-(FR-L4). U još jednom aspektu, okvirne sekvence su izvedene iz sekvenci humanog okvira konsenzusa. U još jednom aspektu, okvirne sekvence teških lanaca izvedene su iz Kabatove sekvence podgrupe I, II ili III. U još jednom aspektu, okvirna sekvenca teškog lanca je okvir konsenzusa VH podgrupe III. U još jednom aspektu, jedna ili više sekvenci okvira teškog lanca predstavljene su kao SEQ ID NO:8, 9, 10 i

[0479] U još jednom aspektu, okvirne sekvence lakog lanca izvedene su iz sekvenci Kabatovih podgrupa kapa I, II, II ili IV. U još jednom aspektu, okvirne sekvence lakog lanca su okvir konsenzusa VL kapa I. U još jednom aspektu, neke od sekvenci okvira lakog lanca predstavljene su kao SEQ ID NO:15, 16, 17 i 18. U još jednom specifičnom aspektu, antitelo nadalje obuhvata humani ili mišji konstantni region. U nekim aspektima, humani konstantni region je odabran iz grupe koja se sastoji od IgG1, IgG2, IgG2, IgG3 i IgG4. U još jednom specifičnom aspektu, humani konstantni region je IgG1. U još jednom aspektu, mišji konstantni region je odabran iz grupe koja se sastoji od IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. U još jednom aspektu, mišji konstantni region je IgG2A. U još jednom specifičnom aspektu, antitelo ima smanjenu ili minimalnu efektorsku funkciju. U još jednom specifičnom aspektu, minimalna efektorska funkcija rezultat je „Fc mutacije bez efektora“ ili aglikozilacije. U još jednom otkriću, Fc mutacija bez efektora je supstitucija N297A ili D265A/N297A u konstantnom regionu.

[0480] U još jednom otkriću, obezbeđuje se izolovano anti-PD-L1 antitelo koje sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog i lakog lanca, pri čemu:

[0481] (a) sekvenca teškog lanca je najmanje 85% identična sekvenci teškog lanca:

[0483]

[0485] NO:26), ili

[0486] (b) sekvence lakog lanca su najmanje 85% identične sekvenci lakog lanca:

[0488]

[0490] U nekim otkrićima, obezbeđuje se izolovano anti-PD-L1 antitelo koje sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog i lakog lanca, pri čemu je sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca najmanje 85%, najmanje 86%, najmanje 87%, najmanje 88%, najmanje 89%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili najmanje 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:4. U nekim otkrićima, obezbeđuje se izolovano anti-PD-L1 antitelo koje sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog i lakog lanca, pri čemu je sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca najmanje 85%, najmanje 86%, najmanje 87%, najmanje 88%, najmanje 89%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili najmanje 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:26. U nekim otkrićima, obezbeđuje se izolovano anti-PD-L1 antitelo koje sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog i lakog lanca, pri čemu je sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca najmanje 85%, najmanje 86%, najmanje 87%, najmanje 88%, najmanje 89%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili najmanje 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:4, a sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca je najmanje 85%, najmanje 86%, najmanje 87%, najmanje 88%, najmanje 89%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili najmanje 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:26. U nekim otkrićima, jedan, dva, tri, četiri ili pet aminokiselinskih ostataka na N-terminusu teškog i/ili lakog lanca mogu biti izbrisani, zamenjeni ili modifikovani.

[0491] U još jednom otkriću, obezbeđuje se izolovano anti-PD-L1 antitelo koje sadrži sekvencu teškog lanca i lakog lanca, pri čemu:

[0492] (a) sekvenca teškog lanca je najmanje 85% identična sekvenci teškog lanca:

[0494]

[0496] (b) sekvence lakog lanca su najmanje 85% identične sekvenci lakog lanca:

[0498]

[0500] U nekim otkrićima, obezbeđuje se izolovano anti-PD-L1 antitelo koje sadrži sekvencu teškog i lakog lanca, pri čemu je sekvenca lakog lanca najmanje 85%, najmanje 86%, najmanje 87%, najmanje 88%, najmanje 89%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:33. U nekim otkrićima, obezbeđuje se izolovano anti-PD-L1 antitelo koje sadrži sekvencu teškog i lakog lanca, pri čemu je sekvenca teškog lanca najmanje 85%, najmanje 86%, najmanje 87%, najmanje 88%, najmanje 89%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:32. U nekim otkrićima, obezbeđuje se izolovano anti-PD-L1 antitelo koje sadrži sekvencu teškog i lakog lanca, pri čemu je sekvenca lakog lanca najmanje 85%, najmanje 86%, najmanje 87%, najmanje 88%, najmanje 89%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:33, a sekvenca teškog lanca je najmanje 85%, najmanje 86%, najmanje 87%, najmanje 88%, najmanje 89%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:32.

[0501] U nekim otkrićima, izolovano anti-PD-L1 antitelo je neglikozilovano. Glikozilacija antitela je tipično N-vezana ili O-vezana. N-vezana se odnosi na vezivanje ugljenohidratne grupe za bočni lanac ostatka asparagina. Tripeptidne sekvence asparagin-X-serin i asparagin-X-treonin, gde je X bilo koja aminokiselina osim prolina, sekvence su prepoznavanja za enzimsko vezivanje ugljenohidratne grupe u bočni lanac asparagina. Stoga, prisustvo bilo koje od ovih tripeptidnih sekvenci u polipeptidu stvara potencijalno mesto glikozilacije. O-vezana glikozilacija se odnosi na vezivanje jednog od šećera N-acetilgalaktozamina, galaktoze ili ksiloze za hidroksiaminokiselinu, najčešće serin ili treonin, mada se mogu koristiti i 5-hidroksiprolin ili 5-hidroksilizin. Uklanjanje mesta glikozilacije sa antitela se pogodno postiže promenom aminokiselinske sekvence tako da se ukloni jedna od gore opisanih tripeptidnih sekvenci (za N-vezana mesta glikozilacije). Izmena se može izvršiti supstitucijom ostatka asparagina, serina ili treonina unutar mesta glikozilacije drugim aminokiselinskim ostatkom (npr. glicin, alanin ili konzervativna supstitucija).

[0502] U bilo kojem otkriću ovog dokumenta, izolovano anti-PD-L1 antitelo se može vezati za humani PD-L1, na primer, humani PD-L1 kao što je prikazano u UniProtKB/Swiss-Prot pristupni br.Q9NZQ7.1, ili njegovoj varijanti.

[0503] U još jednoj daljem otkriću, pružena je izolovana nukleinska kiselina koja kodira bilo koje antitelo opisano u ovom dokumentu. U nekim otkrićima, nukleinska kiselina dalje sadrži vektor pogodan za ekspresiju nukleinske kiseline koja kodira bilo koje od prethodno opisanih anti-PD-L1 antitela. U još jednom specifičnom aspektu, vektor je u ćeliji domaćinu pogodnoj za ekspresiju nukleinske kiseline. U još jednom specifičnom aspektu, ćelija domaćin je eukariotska ili prokariotska ćelija. U još jednom specifičnom aspektu, eukariotska ćelija je ćelija sisara, poput ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO).

[0504] Antitelo ili njegov antigen vezujući fragment se mogu proizvesti pomoću postupaka poznatih u struci, na primer, procesom koji podrazumeva kultivaciju ćelije domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira bilo koje od prethodno opisanih anti-PD-L1 antitela ili njihov antigen vezujući fragment u obliku pogodnom za ekspresiju, pod pogodnim uslovima za proizvodnju takvog antitela ili fragmenta, i izolovanje tog antitela ili fragmenta.

[0505] Izričito je razmatrano da takav antagonist vezivanja PD-L1 ose (npr. anti-PD-L1 antitela, anti-PD-1 antitela i anti-PD-L2 antitela) ili druga antitela opisana ovde (npr. anti-PD-L1 antitela za detektovanje nivoa ekspresije PD-L1) za upotrebu u bilo kom gore navedenom otkriću može da ima neku od funkcija, pojedinačno ili u kombinaciji, opisanu u odeljcima 1-7 ispod.

[0506] 1. Afinitet antitela

[0507] U određenim otkrićima, ovde dato antitelo (npr. anti-PD-L1 antitelo ili anti-PD-1 antitelo) ima konstantu disocijacije (Kd) od ≤ 1 µM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM, ili ≤ 0,001 nM (npr. 10<-8>M ili manje, npr. od 10<-8>M do 10<-13>M, npr. od 10<-9>M do 10<-13>M).

[0508] U jednom otkriću, Kd se meri testom vezivanja radioaktivno označenog antigena (RIA). U jednom otkriću, RIA se izvodi sa Fab verzijom željenog antitela i njegovog antigena. Na primer, afinitet vezivanja Fab u rastvoru za antigen se meri uravnotežavanjem Fab sa minimalnom koncentracijom antigena obeleženog sa (<125>I) u prisustvu titracionih serija neobeleženog antigena, a zatim hvatanjem vezanog antigena pomoću ploče prevučene anti-Fab antitelom (videti npr. Chen i sar. J. Mol. Biol.293:865-881 (1999)). Da bi se utvrdili uslovi za test, MICROTITER® ploče sa više bunarčića (Thermo Scientific) preko noći su prevučene sa 5 μg/ml anti-Fab antitela za hvatanje (Cappel Labs) u 50 mM natrijum karbonatu (pH 9,6) i nakon toga su blokirane 2% (m/V) albuminom goveđeg seruma u PBS-u tokom dva do pet sati na sobnoj temperaturi (oko 23 °C). Na neapsorbujućoj ploči (Nunc br.

[0509] 269620), 100 pM ili 26 pM [<125>I]-antigeni su pomešani sa serijskim razblaženjima željenog Fab (npr. u skladu sa procenom anti-VEGF antitela, Fab-12 u radu Presta i sar. Cancer Res.

[0510] 57:4593-4599 (1997)). Željeni Fab se zatim inkubira tokom noći; međutim, inkubacija može da se nastavi u dužem periodu (npr. oko 65 sati) kako bi se obezbedilo uspostavljanje ravnoteže. Nakon toga, smeše se prenose na ploču za hvatanje i inkubiraju se na sobnoj temperaturi (npr. jedan sat). Rastvor se zatim ukloni i ploča se ispere osam puta 0,1% polisorbatom 20 (TWEEN-20®) u PBS-u. Kada se ploče osuše, dodaje se 150 μl scintilansa po bunarčiću (MICROSCINT-20™; Packard), a zatim se ploče mere na TOPCOUNT™ gama brojaču (Packard) tokom deset minuta. Koncentracije svakog Fab koji daje manje od ili jednako 20% maksimalnog vezivanja, izabrane su za primenu u analizama kompetitivnog vezivanja.

[0511] Prema drugom otkriću, Kd se meri pomoću testa površinske plazmonske rezonance BIACORE®. Na primer, analiza pomoću uređaja BIACORE®-2000 ili BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc. Piscataway, NJ) obavljena je na 25°C sa CM5 čipovima sa imobilisanim antigenom uz ~10 jedinica odgovora (response units, RU). U jednom otkriću, biosenzorski čipovi sa karboksimetilovanim dekstranom (CM5, BIACORE, Inc.) aktivirani su pomoću N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidrohlorida (EDC) i N-hidroksisukcinimida (NHS) prema uputstvu dobavljača. Antigen je razblažen pomoću 10 mM natrijum acetata, pH 4,8, do 5 μg/ml (~0,2 μM) pre injektovanja pri protoku od 5 μl/min da bi se dobilo oko 10 jedinica odgovora (RU) kuplovanog proteina. Nakon injektovanja antigena, injektovan je 1 M etanolamin da bi se blokirale neproreagovale grupe. Za merenja kinetike, injektovane su dvostruke serije razblaženja Fab (0,78 nM do 500 nM) u PBS-u sa 0,05% polisorbatom 20 (TWEEN-20™) surfaktantom (PBST) na 25°C pri protoku od oko 25 pl/min. Brzine asocijacije (k<on>) i brzine disocijacije (k<off>) izračunate su pomoću jednostavnog jedan-na-jedan Lengmirovog modela vezivanja (BIACORE® Evaluation Software verzija 3.2) simultanim podešavanjem senzorgrama asocijacije i disocijacije. Ravnotežna konstanta disocijacije (Kd) izračunata je kao odnos k<off>/k<on>. Pogledajte, na primer Chen i sar. J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Ako brzina asocijacije pređe 10<6>M<-1>s<-1>prema gore opisanom testu površinske plazmonske rezonance, onda brzina asocijacije može da se odredi primenom tehnike fluorescentnog prigušivanja, koja meri porast ili opadanje intenziteta fluorescentne emisije (ekscitacija = 295 nm; emisija = 340 nm, 16 nm širina trake) na 25°C kod 20 nM anti-antigen antitela (Fab oblik) u PBS-u, pH 7,2, u prisustvu rastućih koncentracija antigena, određeno spektrometrom, kao što je spektrofotometar sa mogućnošću zaustavljanja toka (Aviv Instruments) ili spektrofotometar serije 8000 SLM-AMINCO™ (ThermoSpectronic) sa kivetom sa mešanjem.

[0512] 2. Fragmenti antitela

[0513] U određenim otkrićima, ovde obezbeđeno antitelo (npr., anti-PD-L1 antitelo ili anti-PD-1 antitelo) je fragment antitela. Fragmenti antitela uključuju, bez ograničenja, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)<2>, Fv i scFv fragmente, kao i druge fragmente opisane u nastavku. Za pregled određenih fragmenata antitela, videti Hudson i sar. Nat. Med.9:129-134 (2003). Pregled scFv fragmenata potražite, npr. u: Pluckthün, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.

[0514] 113, Rosenburg i Moore izd. (Springer-Verlag, New York), str. 269-315 (1994); pogledajte

[0517] 1

[0518] takođe WO 93/16185; i U.S. Patent br. 5,571,894 i 5,587,458. Raspravu o Fab i F(ab’)<2>fragmentima koji sadrže regenerisane ostatke epitopa koji vezuju receptore i koji imaju produžen poluživot in vivo pogledajte u U.S. Patentu br.5,869,046.

[0519] Dijatela su fragmenti antitela sa dva mesta za vezivanje antigena koja mogu biti dvovalentna ili bispecifična. Pogledajte, na primer, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson i sar. Nat. Med.9:129-134 (2003); i Hollinger i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Trijatela i tetratela su takođe opisana u članku Hudson i sar. Nat. Med. 9:129-134 (2003).

[0520] Antitela sa jednim domenom su fragmenti antitela koji sadrže kompletan varijabilni domen teškog lanca antitela ili njegov deo, ili kompletan varijabilni domen lakog lanca antitela ili njegov deo. U pojedinim otkrićima, antitelo sa jednim domenom je humano antitelo sa jednim domenom (Domantis, Inc. Waltham, MA; pogledajte, npr. U.S. Patent br. 6,248,516 B1).

[0521] Fragmenti antitela se mogu dobiti različitim tehnikama, uključujući, bez ograničenja, proteolitičku digestiju netaknutog antitela, kao i proizvodnju pomoću rekombinantnih ćelija domaćina (npr. E. coli ili faga), prema opisu iz ovog dokumenta.

[0522] 3. Himerna i humanizovana antitela

[0523] U određenim otkrićima, ovde obezbeđeno antitelo (npr., anti-PD-L1 antitelo ili anti-PD-1 antitelo) je himerno antitelo. Pojedina himerna antitela su opisana npr. u U.S. Patentu br. 4,816,567; i Morrison i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). U jednom primeru, himerno antitelo sadrži nehumani varijabilni region (npr. varijabilni region dobijen od miša, pacova, hrčka, zeca ili nehumanog primata, kao što je majmun) i humani konstantni region. U daljem primeru, himerno antitelo je antitelo „sa zamenjenom klasom“, kod koga je klasa ili potklasa zamenjena klasom ili potklasom matičnog antitela. Himerna antitela uključuju njihove antigen-vezujuće fragmente.

[0524] U određenim otkrićima, himerno antitelo je humanizovano antitelo. Tipično, nehumano antitelo je humanizovano da bi se smanjila imunogenost za ljude, pri čemu zadržava specifičnost i afinitet matičnog nehumanog antitela. Generalno, humanizovano antitelo sadrži jedan ili više varijabilnih domena kod kojih su HVR-ovi, npr. CDR-ovi (ili njihovi delovi) dobijeni od nehumanog antitela, a FR-ovi (ili njihovi delovi) su dobijeni od sekvenci humanog antitela. Humanizovano antitelo opciono takođe sadrži najmanje deo humanog konstantnog regiona. U nekim otkrićima, neki FR ostaci u humanizovanom antitelu su zamenjeni odgovarajućim ostacima nehumanog antitela (npr. antitela sa koga su dobijeni HVR ostaci), npr. da bi se povratila ili poboljšala specifičnost antitela ili njegov afinitet.

[0527] 2

[0528] Pregled humanizovanih antitela i postupaka za njihovo dobijanje dali su, npr. Almagro i Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008), i dalje su opisani, npr. u Riechmann i sar. Nature 332:323-329 (1988); Queen i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); US Patent br. 5, 821,337, 7,527,791,6,982,321 i 7,087,409; Kashmiri i sar. Methods 36:25-34 (2005) (opisujući kalemljenje regiona koji određuje specifičnost (SDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (opisuje „površinske promene“); Dall’Acqua i sar. Methods 36:43-60 (2005) (opisuje „FR mešanje“); i Osbourn i sar. Methods 36:61-68 (2005) i Klimka i sar. Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (opisuje pristup „vođene selekcije“ FR mešanja).

[0529] Humani okvirni regioni koji mogu da se koriste za humanizaciju uključuju, ali se ne ograničavaju na: okvirne regione izabrane postupkom „najboljeg slaganja“ (pogledajte, npr. Sims i sar. J. immunol. 151:2296 (1993)); okvirne regione dobijene od sekvence konsenzusa humanih antitela konkretne podgrupe varijabilnih regiona lakog ili teškog lanca (pogledajte, npr. Carter i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); i Presta i sar. J. Immunol.

[0530] 151:2623 (1993)); humane zrele (somatski mutirane) okvirne regione ili okvirne regione humanog embriona (pogledajte, npr. Almagro i Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); i okvirne regione dobijene pregledanjem FR biblioteka (pogledajte, npr. Baca i sar. J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) i Rosok i sar. J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)).

[0531] 4. Humana antitela

[0532] U određenim otkrićima, ovde dato antitelo (npr. anti-PD-L1 antitelo ili anti-PD-1 antitelo) je humano antitelo. Humana antitela se mogu dobiti primenom različitih tehnika poznatih u struci. Humana antitela su generalno opisali van Dijk i van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) i Lonberg, Curr. Opin. Immunol.20:450-459 (2008).

[0533] Humana antitela se mogu dobiti primenom imunogena na transgenu životinju koja je modifikovana da proizvodi netaknuta humana antitela ili netaknuta antitela sa humanim varijabilnim regionima kao odgovor na antigenski izazov. Takve životinje tipično sadrže kompletne lokuse humanog imunoglobulina ili njihov deo, koji zamenjuju lokuse endogenog imunoglobulina, ili koji su prisutni ekstrahromozomski ili nasumično integrisani u životinjske hromozome. U takvim transgenim miševima, lokusi endogenog imunoglobulina su generalno inaktivirani. Pogledajte pregled postupaka za dobijanje humanih antitela od transgenih životinja u: Lonberg, Nat. Biotech.23:1117-1125 (2005). Pogledajte takođe, npr. U.S. Patent br. 6,075,181 i 6,150,584 koji opisuju tehnologiju XENOMOUSE™; U.S. Patent br.

[0534] 5,770,429 koji opisuje tehnologiju HUMAB®; U.S. Patent br. 7,041,870 koji opisuje tehnologiju K-M MOUSE®, i Publikaciju U.S. Patentne prijave br. US 2007/0061900, koja opisuje tehnologiju VELOCIMOUSE®). Humani varijabilni regioni netaknutih antitela koja stvaraju takve životinje mogu se dalje modifikovati, npr. kombinovanjem sa različitim humanim konstantnim regionom.

[0535] Humana antitela se takođe mogu dobiti postupcima na bazi hibridoma. Opisane su ćelijske linije humanog mijeloma i mišje-humanog heteromijeloma za proizvodnju humanih monoklonskih antitela. (Pogledajte, npr. Kozbor J. Immunol.133: 3001 (1984); Brodeur i sar. Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, str. 51-63 (Marcel Dekker, Inc. Njujork, 1987); i Boerner i sar. J. Immunol. 147: 86 (1991).) Humana antitela proizvedena putem tehnologije hibridoma humane B-ćelije takođe su opisali Li i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Dodatni postupci uključuju one opisane, na primer, u U.S. Patentu br. 7,189,826 (opisuje proizvodnju monoklonskih humanih IgM antitela iz ćelijskih linija hibridoma) i Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (opisuje humano-humane hibridome). Tehnologiju humanih hibridoma (Trioma tehnologija) takođe su opisali Vollmers i Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) i Vollmers i Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005).

[0536] Humana antitela takođe mogu da se proizvedu izolovanjem sekvenci varijabilnog domena Fv klona izabranih iz biblioteka displeja faga humanog porekla. Takve sekvence varijabilnog domena mogu onda da se kombinuju sa željenim humanim konstantnim domenom. Tehnike za izbor humanih antitela iz biblioteka antitela su opisane u nastavku.

[0537] 5. Antitela dobijena iz biblioteke

[0538] Antitela iz otkrića (npr. anti-PD-L1 antitela i anti-PD-1 antitela) mogla bi da budu izolovana pretragom kombinatornih biblioteka za antitela sa željenom aktivnošću ili aktivnostima. Na primer, veliki broj postupaka je poznat u struci za stvaranje biblioteka prikaza faga i pretraživanje takvih biblioteka za antitela koja imaju željene karakteristike vezivanja. Pregled takvih postupaka daju, npr. Hoogenboom i sar. u Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien i sar. izd. Human Press, Totowa, NJ, 2001) a dalje su opisane, npr. u McCafferty i sar. Nature 348:552-554; Clackson i sar. Nature 352: 624-628 (1991); Marks i sar. J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks i Bradbury, u Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo i sar. Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu i sar. J. Mol. Biol.

[0539] 338(2): 299-310 (2004); Lee i sar. J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); i Lee i sar. J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004).

[0542] 4

[0543] Kod pojedinih postupaka displeja faga, repertoari VH i VL gena su odvojeno klonirani putem lančane reakcije polimeraze (PCR) i nasumično rekombinovani u bibliotekama faga, koje zatim mogu da se pretražuju na antigen-vezujuće fage, kao što opisuju Winter i sar. Ann. Rev. Immunol. 12: 433-455 (1994). Fagi tipično vrše displej fragmenata antitela, bilo kao Fv (scFv) fragmenti s jednim lancem ili kao Fab fragmenti. Biblioteke iz imunizovanih izvora daju antitela velikog afiniteta prema imunogenu, ne zahtevajući konstruisanje hibridoma. Alternativno, naivni repertoar može biti kloniran (npr. od ljudi) da bi se dobio jedan izvor antitela za širok spektar nesvojstvenih, kao i svojstvenih antigena bez ikakve imunizacije, kao što opisuju Griffiths i sar. EMBO J, 12: 725-734 (1993). Najzad, naivne biblioteke mogu takođe da se naprave sintetički, kloniranjem nepreuređenih segmenata V-gena iz matičnih ćelija, i upotrebom PCR prajmera koji sadrže nasumične sekvence za kodiranje veoma varijabilnih CDR3 regiona, i za postizanje premeštanja in vitro, kao što opisuju Hoogenboom i Winter, J. Mol. Biol. 227: 381-388 (1992). Patentne publikacije koje opisuju biblioteke faga humanih antitela uključuju, na primer: US Patent br.

[0544] 5,750,373, i US Patent Publication br. 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 i 2009/0002360.

[0545] Antitela ili fragmenti antitela izolovani iz biblioteka humanih antitela se ovde smatraju humanim antitelima ili fragmentima humanih antitela.

[0546] 6. Multispecifična antitela

[0547] U bilo kom od navedenih aspekata, antitelo (npr. anti-PD-L1 antitelo ili anti-PD-1 antitelo) koje je ovde navedeno može biti multispecifično antitelo, na primer, bispecifično antitelo. Multispecifična antitela su monoklonska antitela koja imaju sposobnost specifičnog vezivanja za najmanje dva različita mesta. U pojedinim otkriću, ovde dato antitelo je multispecifično antitelo, npr. bispecifično antitelo. U određenim otkrićima, jedna od specifičnosti vezivanja je za PD-L1, a druga je za bilo koji drugi antigen. U određenim otkrićima, bispecifična antitela mogu da se vežu za dva različita epitopa PD-L1. Bispecifična antitela mogu takođe da se upotrebe za lokalizaciju citotoksičnih agenasa na ćelije koje eksprimiraju PD-L1. Bispecifična antitela mogu da se dobiju kao antitela kompletne dužine ili kao fragmenti antitela.

[0548] Tehnike za dobijanje multispecifičnih antitela uključuju, ali se ne ograničavaju na, rekombinantnu koekspresiju dva imunoglobulinska para teški lanac-laki lanac koji imaju različite specifičnosti (pogledajte: Milstein i Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829 i Traunecker i sar. EMBO J.10: 3655 (1991)) i inženjerstvo „dugme u rupici“ (pogledajte npr. U.S. Patent br. 5,731,168). Multispecifična antitela mogu takođe da se dobiju dizajniranjem efekata elektrostatičkog upravljanja za dobijanje Fc-heterodimernih molekula antitela (pogledajte, npr. WO 2009/089004A1); ukrštanja dva ili više antitela ili fragmenata (pogledajte, npr. US Patent br. 4,676,980, i Brennan i sar. Science 229: 81 (1985)); korišćenjem leucinskih zatvarača za proizvodnju bispecifičnih antitela (pogledajte, npr. Kostelny i sar. J. Immunol. 148(5): 1547-1553 (1992)); korišćenje tehnologije „dijatela“ za dobijanje bispecifičnih fragmenata antitela (pogledajte, npr. Hollinger i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)); i koristeći dimere jednolančanog Fv (sFv) (pogledajte, npr. Gruber i sar. J. Immunol. 152:5368 (1994)); i pripremom trispecifičnih antitela kao što je opisano, npr. u Tutt i sar. J. immunol.147: 60 (1991).

[0549] Dizajnirana antitela sa tri ili više funkcionalnih mesta vezivanja antigena, uključujući „antitela hobotnice“, ovde su takođe obuhvaćena (pogledajte, npr. US 2006/0025576A1).

[0550] Ovde antitelo ili fragment takođe uključuje „dvojno delujuće FAb“ ili „DAF“, koje sadrži mesto vezivanja antigena koji se vezuje za PD-L1, kao i za drugi, različit antigen.

[0551] 7. Varijante antitela

[0552] U određenim otkrićima, razmatrane su varijante sekvenci aminokiselina antitela (npr. anti-PD-L1 antitela i anti-PD-1 antitela). Na primer, može biti poželjno da se poboljša afinitet vezivanja i/ili druga biološka svojstva antitela. Varijante aminokiselinskih sekvenci antitela se mogu dobiti uvođenjem odgovarajućih modifikacija u sekvencu nukleotida koja kodira antitelo ili putem sinteze peptida. Takve modifikacije uključuju, na primer, uklanjanja, i/ili umetanja, i/ili supstitucije ostataka u aminokiselinskim sekvencama antitela. Svaka kombinacija izbacivanja, ubacivanja i supstitucije može se dovesti do finalnog konstrukta, pod uslovom da finalni konstrukt ima željene karakteristike, na primer da je antigen-vezujući.

[0553] I. Varijante supstitucije, ubacivanja i izbacivanja

[0554] U pojedinim otkrićima, date su varijante antitela koje imaju jednu ili više supstitucija aminokiselina. Mesta od interesa za supstitucionu mutagenezu uključuju HVR-ove i FR-ove. Konzervativne supstitucije su prikazane u Tabeli 1 pod naslovom „poželjne supstitucije“. Konkretnije izmene su date u Tabeli 1 pod naslovom „primeri supstitucija“ i kako je opisano u nastavku, prema klasama bočnih nizova aminokiselina. Supstitucije aminokiselina mogu biti uvedene u željeno antitelo i proizvodi ispitani na željenu aktivnost, na primer zadržano / poboljšano vezivanje antigena, smanjena imunogenost, ili poboljšan ADCC ili CDC.

[0555] Tabela 1. Primeri i poželjne supstitucije aminokiselina

[0557]

[0558]

[0560] Aminokiseline mogu da se grupišu prema zajedničkim osobinama bočnog lanca: (1) hidrofobne: norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

[0561] (2) neutralne hidrofilne: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

[0562] (3) kisele: Asp, Glu;

[0563] (4) bazne: His, Lys, Arg;

[0564] (5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: Gly, Pro;

[0565] (6) aromatične: Trp, Tyr, Phe.

[0566] Nekonzervativne supstitucije zahtevaju zamenu člana jedne od ovih klasa drugom klasom.

[0567] Jedna vrsta supstitucionih varijanti uključuje supstituciju jednog ili više ostataka hipervarijabilnog regiona matičnog antitela (npr. humanizovanog ili humanog antitela). Generalno, rezultujuće varijante izabrane za dalje ispitivanje će imati modifikacije (npr. poboljšanja) izvesnih bioloških osobina (npr. povećan afinitet i/ili smanjenu imunogenost) u odnosu na matično antitelo i/ili će imati suštinski zadržane izvesne biološke osobine matičnog antitela. Primer supstitucione varijante je afinitetno zrelo antitelo, koje može biti stvoreno na pogodan način, na primer korišćenjem tehnika afinitetnog sazrevanja na osnovu displeja faga, kao što su one ovde opisane. Ukratko, jedan HVR ostatak ili više HVR ostataka je mutirano, a varijantna antitela su izložena na fagu i ispitana u pogledu određene biološke aktivnosti (npr. afiniteta vezivanja).

[0568] Izmene (npr. supstitucije) mogu se napraviti u HVR-ima, npr. radi poboljšanja afiniteta antitela. Takve izmene mogu biti napravljene na „vrućim tačkama“ HVR, tj. na ostacima koje kodiraju kodoni koji učestalo trpe mutaciju tokom procesa somatskog sazrevanja (pogledajte, npr. Chowdhury, Methods Mol. Biol.207:179-196 (2008)), i/ili ostaci koji dolaze u kontakt sa antigenom, pri čemu se rezultujuća varijanta VH ili VL testira na afinitet vezivanja. Afinitetno sazrevanje putem konstruisanja i ponovnog izbora iz sekundarnih biblioteka opisano je, npr. u Hoogenboom i sar. u Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien i sar. izd. Human Press, Totowa, NJ, (2001)). U nekim otkrićima afinitetnog sazrevanja, raznovrsnost se uvodi u varijabilne gene izabrane za sazrevanje putem bilo kojeg od raznovrsnih postupaka (npr. PCR koji favorizuje greške, mešanje lanaca ili mutageneza kontrolisana oligonukleotidima). Zatim se kreira sekundarna biblioteka. Biblioteka se zatim pretražuje radi identifikovanja varijanti antitela sa željenim afinitetom. Drugi postupak za uvođenje raznovrsnosti uključuje pristup usmeren na HVR, gde je nekoliko HVR ostataka randomizovano (npr. 4-6 ostataka istovremeno). HVR ostaci uključeni u vezivanje antigena mogu biti specifično identifikovani, npr. primenom skenirajuće mutageneze sa alaninom ili modelovanja. Posebno su često ciljani CDR-H3 i CDR-L3.

[0569] U pojedinim otkrićima, supstitucije, ubacivanja ili izbacivanja mogu da se dese u jednom ili više HVR regiona, dokle god takve izmene u značajnoj meri ne umanjuju sposobnost antitela da vezuje antigen. Na primer, u HVR regionima se mogu načiniti konzervativne izmene (npr. konzervativne supstitucije kao što su ovde date) koje znatno ne umanjuju afinitet vezivanja. Takve izmene mogu, na primer, biti izvan ostataka koji ostvaruju kontakt sa antigenom u HVR-ima. U pojedinim otkrićima varijanti VH i VL sekvenci datih iznad, svaki HVR je ili neizmenjen, ili sadrži najviše jednu, dve ili tri supstitucije aminokiselina.

[0570] Korisni postupak za identifikovanje ostataka ili regiona antitela koji mogu biti ciljani za mutagenezu zove se „ciljana mutageneza sa alaninom“, a opisana je u radu Cunningham i Wells (1989) Science 244:1081-1085. U tom postupku, ostatak ili grupa ciljanih ostataka (npr. naelektrisani ostaci, kao Arg, Asp, His, Lys i Glu) se identifikuju i zamene neutralnom ili negativno naelektrisanom aminokiselinom (npr. alaninom ili polialaninom) da bi se odredilo da li to utiče na interakciju antitela sa antigenom. Dalje supstitucije mogu biti uvedene na lokacijama aminokiselina koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na inicijalne zamene. Alternativno, ili pored toga, kristalna struktura kompleksa antigen–antitelo služi za identifikovanje tačaka kontakta antitela sa antigenom. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci mogu biti ciljani, ili eliminisani kao kandidati za supstituciju. Mogu se pregledati varijante da bi se odredilo da li imaju željena svojstva.

[0571] Ubacivanja aminokiselinskih sekvenci uključuju fuzije amino- i/ili karboksi-kraja, pri čemu se dužina kreće od jednog ostatka do polipeptida koji sadrže sto ili više ostataka, kao i ubacivanja u sekvencu jednog ostatka aminokiselina, ili većeg broja. Primeri terminalnih umetanja uključuju antitelo sa N-terminalnim metionil ostatkom. Druge varijante umetanja kod molekula antitela uključuju fuziju sa N ili C krajem antitela sa enzimom (npr. za ADEPT) ili polipeptidom, što povećava poluživot antitela u serumu.

[0572] II. Varijante glikozilacije

[0573] U određenim otkrićima, antitela se mogu menjati kako bi se povećao ili smanjio stepen do kojeg je antitelo glikozilovano. Dodavanje ili uklanjanje mesta glikozilacije antitela ovog otkrića može se pogodno postići izmenom aminokiselinske sekvence, tako da jedno ili više mesta glikozilacije nastane ili se ukloni.

[0574] Kada antitelo sadrži Fc region, može biti izmenjen ugljovodonik vezan za njega. Nativna antitela koja proizvode ćelije sisara tipično sadrže razgranati, biantenarni oligosaharid koji je obično vezan N-vezom za Asn297 CH2 domena Fc regiona. Pogledajte npr. Wright i sar. TIBTECH 15:26-32 (1997). Oligosaharid može da uključuje različite ugljovodonike, npr. manozu, N-acetil glukozamin (GIcNAc), galaktozu i sijalinsku kiselinu, kao i fukozu vezanu za GIcNAc u „osnovi“ biantenarne oligosaharidne strukture. U nekim otkrićima, modifikacije oligosaharida u antitelu mogu biti načinjene da bi se dobile varijante antitela sa određenim poboljšanim osobinama.

[0575] U jednom otkriću, date su varijante antitela koja imaju ugljovodoničnu strukturu kojoj nedostaje fukoza vezana (direktno ili indirektno) za Fc region. Na primer, količina fukoze u tom antitelu može biti od 1% do 80%, od 1% do 65%, od 5% do 65% ili od 20% do 40%. Količina fukoze se određuje izračunavanjem prosečne količine fukoze u šećernom lancu na Asn297, u odnosu na zbir svih glikostruktura vezanih za Asn297 (npr. kompleksne, hibridne ili strukture sa visokim sadržajem manoze), kao što je određeno MALDI-TOF masenom spektrometrijom, npr. kao što je opisano u WO 2008/077546. Asn297 se odnosi na asparaginski ostatak koji se nalazi oko položaja 297 u Fc regionu (prema EU numeraciji ostataka Fc regiona); međutim, Asn297 takođe može da se nalazi oko ± 3 aminokiseline više ili niže od položaja 297, tj. između položaja 294 i 300, usled manjih varijacija sekvenci kod antitela. Takve varijante fukozilacije mogu da imaju poboljšanu ADCC funkciju. Vidite, na primer, US publikaciju patenta br. US 2003/0157108; US 2004/0093621. Primeri publikacija vezanih za „defukozilovane“ ili varijante antitela „sa manjkom fukoze“ uključuju: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO2002/031140; Okazaki i sar. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki i sar. Biotech. Bioeng.87: 614 (2004). Primeri ćelijskih linija koje mogu da proizvedu defukozilovana antitela uključuju Lec13 CFIO ćelije sa manjkom fukozilacije proteina (Ripka i sar. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); U.S. Pat. Appl. br. US 2003/0157108 A1; i WO 2004/056312 A1, Adams i sar. posebno za primer 11), i nokaut ćelijske linije, kao što je gen alfa-1,6-fukoziltransferaze, FUT8, nokaut CFIO ćelije (pogledajte, npr. Yamane-Ohnuki i sar. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. i sar. Biotechnol. Bioeng.94(4):680-688 (2006); i WO2003/085107).

[0576] Varijante antitela su dalje obezbeđene sa prepolovljenim oligosaharidima, na primer kod kojih je biantenarni oligosaharid vezan za Fc region antitela bisektovan pomoću GIcNAc. Takve varijante antitela mogu da imaju smanjenu fukozilaciju i/ili poboljšanu ADCC funkciju. Primeri takvih varijanti antitela su opisani, npr. u WO 2003/011878, US patent br. 6,602,684 i US 2005/0123546. Varijante antitela sa najmanje jednim ostatkom galaktoze u oligosaharidu vezanom za Fc region takođe su obezbeđene. Takve varijante antitela mogu da imaju poboljšanu CDC funkciju. Takve varijante antitela su opisane, npr. u WO 1997/30087, WO 1998/58964 i WO 1999/22764.

[0577] III. Varijante Fc regiona

[0578] U određenim otkrićima, jedna ili više modifikacija aminokiselina može biti uvedena u Fc region antitela, time stvarajući varijantu Fc regiona. Varijanta Fc regiona može da sadrži sekvencu humanog Fc regiona (npr. humani Fc region IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4) koji sadrži modifikaciju aminokiseline (npr. supstituciju) na jednom ili više mesta aminokiselina.

[0579] U pojedinim otkrićima, otkriće razmatra varijantu antitela koja ima neke, ali ne sve efektorske funkcije, što ga čini pogodnim kandidatom za primene kod kojih je poluživot antitela in vivo važan, ali su pojedine efektorske funkcije (kao što je komplementna i ADCC) nepotrebne ili štetne. In vitro i/ili in vivo testovi citotoksičnosti se mogu sprovesti radi potvrde smanjenja/sniženja CDC i/ili ADCC aktivnosti. Na primer, testovi vezivanja Fc receptora (FcR) se mogu sprovesti kako bi se obezbedilo da antitelo nema FcγR vezivanje (stoga, verovatno nema ADCC aktivnost), ali zadržava sposobnost vezivanja FcRn. Primarne ćelije za posredovanje ADCC, NK ćelije, eksprimiraju samo FcγRIII, dok monociti eksprimiraju FcγRI, FcγRII i FcγRIII. Ekspresija FcR na hematopoetskim ćelijama je rezimirana u Tabeli 3 na strani 464 Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol.9:457-492 (1991). Neograničavajući primeri in vitro testova za određivanje ADCC aktivnosti željenog molekula opisani su u U.S. patentu br.5,500,362 (pogledajte, npr. Hellstrom, I. i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) i Hellstrom i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (pogledajte Bruggemann, M. i sar. J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). Alternativno, za testove možda mogu da se koriste neradioaktivni postupci (pogledajte, na primer, ACTI™ neradioaktivni test citotoksičnosti za protočnu citometriju (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; i CYTOTOX 96® neradioaktivni test citotoksičnosti (Promega, Madison, WI)). Korisne efektorske ćelije za takve testove uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodne ubice (NK). Alternativno, ili dodatno, ADCC aktivnost željenog molekula se može odrediti in vivo, npr. na životinjskom modelu, kao što je onaj koji su objavili Clynes i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). Testovi vezivanja C1q mogu takođe da se izvedu kako bi se potvrdilo da antitelo ne može da veže C1q i da, stoga, nema CDC aktivnost. Videti, npr. ELISA test vezivanja C1q i C3c u WO 2006/029879 i WO 2005/100402. Da bi se odredila komplementarna aktivacija, može da se obavi CDC test (pogledajte, na primer Gazzano-Santoro i sar. J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg i sar. Blood. 101:1045-1052 (2003); i Cragg i sar. Blood. 103:2738-2743 (2004)). FcRn vezivanje i in vivo određivanje klirensa/poluživota može takođe da se izvrši pomoću postupaka poznatih u struci (pogledajte, npr. Petkova i sar. Int’l. Immunol.

[0580] 18(12):1759-1769 (2006)).

[0581] Antitela sa redukovanom efektorskom funkcijom uključuju ona sa supstitucijom jednog ili više ostataka Fc regiona 238, 265, 269, 270, 297, 327 i 329 (U.S. patent br.

[0582] 6,737,056 i 8,219,149). Takvi Fc mutanti uključuju Fc mutante sa zamenama na dva ili više položaja aminokiselina 265, 269, 270, 297 i 327, uključujući takozvani „DANA“ Fc mutant

[0585] 1

[0586] sa supstitucijom ostataka 265 i 297 alaninom (US Patent br.7,332,581 i 8,219,149).

[0587] Opisane su pojedine varijante antitela sa poboljšanim ili smanjenim vezivanjem za FcR. (Pogledajte, npr. U.S. patent br. 6,737,056; WO 2004/056312 i Shields i sar. J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).)

[0588] U pojedinim otkrićima, varijanta antitela sadrži Fc region sa jednom ili više supstitucija aminokiselina koje poboljšavaju ADCC, npr. supstitucije na položajima 298, 333 i/ili 334 Fc regiona (EU numeracija ostataka).

[0589] U pojedinim otkrićima, napravljene su izmene u Fc regionu koje imaju za rezultat izmenjeno (tj. poboljšano ili smanjeno) C1q vezivanje i/ili komplementno zavisnu citotoksičnost (CDC), npr. kao što opisuje US patent br.6,194,551, WO 99/51642, i Idusogie i sar. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

[0590] Antitela sa povećanim poluživotom i poboljšanim vezivanjem za neonatalni Fc receptor (FcRn), koji je odgovoran za transfer IgG-ova majke na fetus (Guyer i sar. J. Immunol. 117:587 (1976) i Kim i sar. J. Immunol. 24:249 (1994)), opisani su u US2005/0014934A1 (Hinton i sar.). Ta antitela sadrže Fc region sa jednom ili više supstitucija koje poboljšavaju vezivanje Fc regiona za FcRn. Takve Fc varijante uključuju one sa supstitucijama na ostatku ili više ostataka Fc regiona: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311,312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ili 434, npr. supstitucija ostatka Fc regiona 434 (US patent br.7,371,826).

[0591] Pogledajte takođe Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); U.S. Patent br.

[0592] 5,648,260; U.S. Patent br.5,624,821; i WO 94/29351 koji se tiču drugih primera za varijante Fc regiona.

[0593] IV. Varijante antitela projektovane sa cisteinom

[0594] U pojedinim otkrićima, može biti poželjno da se naprave antitela projektovana sa cisteinom, npr. „tioMAb“, kod kojih je jedan ili više ostataka antitela zamenjen ostacima cisteina. U pojedinim otkrićima, zamenjeni ostaci se nalaze na pristupačnim mestima na antitelu. Zamenom tih ostataka cisteinom, reaktivne tiolske grupe se time postavljaju na pristupačna mesta na antitelu, i mogu se koristiti za konjugovanje antitela sa drugim funkcionalnim ostacima, kao što su funkcionalni ostaci lekova ili funkcionalni ostaci linkerlek, da bi se dobio imunokonjugat, kao što je opisano ovde. U pojedinim otkrićima, bilo koji, ili više ostataka navedenih u nastavku mogu biti zamenjeni cisteinom: V205 (Kabatova numeracija) lakog lanca; A118 (EU numeracija) teškog lanca; i S400 (EU numeracija) teškog lanca Fc regiona. Antitela projektovana sa cisteinom mogu se dobiti kao što je opisano, npr. u U.S. Patentu br.7,521,541.

[0597] 2

[0598] V. Derivati antitela

[0599] U pojedinim otkrićima, ovde dato antitelo može se dalje modifikovati da sadrži dodatne neproteinske funkcionalne ostatke koji su poznati u struci i dostupni su. Funkcionalni ostaci pogodni za derivatizaciju antitela uključuju, bez ograničenja, polimere rastvorljive u vodi. Neograničavajući primeri hidrosolubilnih polimera uključuju, ali nisu ograničeni na polietilen glikol (PEG), kopolimere etilen glikol/propilen glikol, karboksimetilcelulozu, dekstran, polivinil alkohol, polivinil pirolidon, poli-1,3-dioksolan, poli-1,3,6-trioksan, kopolimer etilen/anhidrid maleinske kiseline, poliaminokiseline (homopolimere ili nasumične kopolimere), i dekstran ili poli(n-vinil pirolidon)polietilen glikol, propropilen glikol homopolimere, prolipropilen oksid/etilen oksid kopolimere, polioksietilovane poliole (npr. glicerol), polivinil alkohol, i njihove smeše. Polietilen glikol propionaldehid može imati prednosti u proizvodnji zbog svoje stabilnosti u vodi. Polimer može imati bilo koju molekulsku masu, a može biti razgranat ili sa ravnim nizom. Broj polimera vezanih za antitelo može da varira i, ako je više od jednog polimera vezano, to mogu biti isti ili različiti molekuli. U suštini, broj i/ili vrsta polimera korišćenih za derivatizaciju može se odrediti na osnovu razmatranja, uključujući, bez ograničenja, naročite osobine ili funkcije antitela koje treba poboljšati i da li će derivat antitela biti korišćen u terapiji pod definisanim uslovima, itd.

[0600] U drugom otkriću, dati su konjugati antitela i neproteinskog ostatka koji mogu selektivno da se zagrevaju izlaganjem radijaciji. U jednom otkriću, neproteinski ostatak je ugljenična nanocevčica (Kam i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:11600-11605 (2005)). Radijacija može biti bilo koje talasne dužine i uključuje, bez ograničenja, talasne dužine koje ne oštećuju obične ćelije, ali koje zagrevaju neproteinski funkcionalni ostatak na temperaturu na kojoj stradaju ćelije u blizini neproteinskog funkcionalnog ostatka antitela.

[0601] VI. Imunokonjugati

[0602] Otkriće takođe daje imunokonjugate koje sačinjavaju ovde opisano antitelo (npr. anti-PD-L1 antitelo ili anti-PD-1 antitelo) konjugovano sa jednim ili više citotoksičnih agenasa, kao što su hemoterapeutski agensi ili lekovi, agensi za inhibiciju rasta, toksini (npr. proteinski toksini, enzimski aktivni toksini bakterijskog, fungalnog, biljnog ili životinjskog porekla, ili njihovi fragmenti), ili radioaktivni izotopi.

[0603] U jednom otkriću, imunokonjugat je konjugat antitelo-lek (ADC) u kome je antitelo vezano za jedan ili više lekova, uključujući, ali se ne ograničavajući na majtanzinoid (pogledajte US patent br. 5,208,020, 5,416,064 i evropski patent EP 0 425 235 B1); auristatin, kao što su funkcionalni ostaci monometilauristatina DE i DF (MMAE i MMAF) (pogledajte US patent br. 5,635,483 i 5,780,588 i 7,498,298); dolastatin; kaliheamicin ili njegov derivat (pogledajte US patent br. 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, i 5,877,296; Hinman i sar. Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); i Lode i sar. Cancer Res.58:2925-2928 (1998)); antraciklin, kao što je daunomicin ili doksorubicin (pogledajte Kratz i sar. Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey i sar. Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov i sar. Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik i sar. Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King i sar. J. Med. Chem.45:4336-4343 (2002); i US patent br. 6,630,579); metotreksat; vindesin; taksan kao što je docetaksel, paklitaksel, larotaksel, tesetaksel i ortataksel; trihotecen; i CC1065.

[0604] U drugom otkriću, imunokonjugat uključuje antitelo kao što je ovde opisano, konjugovano sa enzimski aktivnim toksinom ili njegovim fragmentom, uključujući, ali se ne ograničavajući na A lanac difterije, nevezujuće aktivne fragmente toksina difterije, A lanac egzotoksina (iz Pseudomonas aeruginosa), A lanac ricina, A lanac abrina, A lanac modecina, alfa-sarcin, proteine Aleurites fordii, proteine diantina, proteine vinobojke (PAPI, PAPII i PAP-S), inhibitor iz gorke dinje, kursin, krotin, inhibitor iz sapunjače, gelonin, mitogelin, restriktocin, fenomicin, enomicin i trikotecene.

[0605] U drugom otkriću, imunokonjugat uključuje antitelo kao što je ovde opisano, konjugovano sa radioaktivnim atomom, dajući radiokonjugat. Dostupni su raznovrsni radioizotopi za proizvodnju radiokonjugata. Primeri uključuju At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>, Pb<212>i radioaktivne izotope Lu. Kada se radiokonjugat koristi za detekciju, on može da sadrži radioaktivni atom za scintigrafske studije, na primer tc99m ili 1123, ili spin oznaku za snimanje nuklearnom magnetnom rezonancom (NMR) (takođe poznato kao snimanje magnetnom rezonancom, MR), kao što je ponovo jod-123, jod-131, indijum-111, fluor-19, ugljenik-13, azot-15, kiseonik-17, gadolinijum, mangan ili gvožđe. Konjugati antitela i citotoksičnog agensa se mogu napraviti pomoću različitih agenasa za vezivanje bifunkcionalnih proteina, kao što je N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio) propionat (SPDP), sukcinimidil-4-(N-maleimidometil) cikloheksan-1-karboksilat (SMCC), iminotiolan (IT), bifunkcionalni derivati imidoestara (kao što je dimetil adipimidat HCl), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao što je glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis (p-azidobenzoil) heksandiamin), bis-diazonijum derivati (kao što je bis-(pdiazonijumbenzoil)-etilendiamin), diizocijanati (kao što je toluen 2,6-diizocijanat), i bisaktivna jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). Na primer, imunotoksin ricina se može dobiti na način opisan u radu Vitetta i sar. Science 238:1098 (1987). Ugljenikom-14 obeležena 1-izotiocijanatobenzil-3-metildietilen triamin pentasirćetna kiselina

[0608] 4

[0609] (MX-DTPA) primer je helatnog agensa za konjugaciju radionukleotida za antitelo. Pogledajte WO94/11026. Linker može biti „raskidivi linker“ koji olakšava oslobađanje citotoksičnog leka u ćeliji. Na primer, može da se koristi kiselo-labilni linker, linker osetljiv na peptidazu, fotolabilni linker, dimetil linker ili linker koji sadrži disulfid (Chari i sar. Cancer Res.52:127-131 (1992); US Patent br.5,208,020).

[0610] Imunokonjugati iliADC koji su ovde izričito razmatrani, ali nisu ograničeni na takve konjugate pripremljene sa reagensima za biokonjugaciju uključujući, bez ograničenja BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC i sulfo-SMPB i SVSB (sukcinimidil-(4-vinilsulfon)benzoat) koji su komercijalno dostupni (npr. Pierce Biotechnology, Inc. Rockford, IL., SAD).

[0611] V. Farmaceutske formulacije

[0612] Terapeutske formule antagonista vezivanja PD-L1 ose koje se koriste u skladu sa trenutnim otkrićem (npr. anti-PD-L1 antitelo (npr. MPDL3280A)) pripremljene su za skladištenje mešanjem antagonista koji ima željeni stepen čistoće sa opcionim farmaceutski prihvatljivim nosačima, ekscipijensima ili stabilizatorima u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora. Za opšte informacije o formulacijama, pogledajte npr. Gilman i sar. (izd.) The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8. izd. Pergamon Press, 1990; A. Gennaro (izd.), Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18. izdanje, Mack Publishing Co., Pennsylvania, 1990; Avis i sar. (izd.) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, New York, 1993; Lieberman i sar. (izd.) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, New York, 1990; Lieberman i sar. (izd.), Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, New York, 1990; i Walters (izd.) Dermatological and Transdermal Formulations (Drugs and the Pharmaceutical Sciences), tom 119, Marcel Dekker, 2002.

[0613] Prihvatljivi nosači, ekscipijensi ili stabilizatori su netoksični za primaoca u primenjenim dozama i koncentracijama, i uključuju pufere, kao što je fosfatni, citratni i puferi drugih organskih kiselina; antioksidanse, uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što je oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabene, kao što je metil ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide male molekulske mase (manje od 10 ostataka); proteine, kao što je albumin iz seruma, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere, kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline, kao što je glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate, uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatne agense, kao što je EDTA; šećere, kao što je saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontrajone koji grade soli, kao što je natrijum; komplekse metala (npr. kompleksi Zn-protein); i/ili nejonske surfaktante, kao što je TWEEN™, PLURONICS™ ili polietilen glikol (PEG).

[0614] Ovde formulacije mogu takođe da sadrže više od jednog aktivnog jedinjenja, po mogućnosti sa komplementarnim aktivnostima, koja nemaju suprotan efekat jedno na drugo. Vrsta i efikasne količine takvih lekova, na primer, zavise od količine i vrste antagonista koji se nalaze u formulaciji i kliničkih parametara ispitanika.

[0615] Aktivni sastojci mogu takođe da se nalaze u mikrokapsulama pripremljenim, na primer, tehnikama koacervacije ili međupovršinske polimerizacije, na primer, hidroksimetilceluloza, odnosno želatinske mikrokapsule i poli-(metilmetakrilat) mikrokapsule, u koloidnim sistemima za isporuku leka (na primer, lipozomima, albuminskim mikrosferama, mikroemulzijama, nanočesticama i nanokapsulama) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su objavljene u Remington’s Pharmaceutical Sciences 16. izd, Osol, A. izd. (1980).

[0616] Mogu se pripremiti preparati sa produženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju polupropustljive matrice čvrstih hidrofobnih polimera koje sadrže antagonist, a te matrice su u određenom obliku, npr. film ili mikrokapsule. Primeri matrica sa produženim oslobađanjem obuhvataju poliestre, hidrogelove (na primer, poli(2-hidroksietil-metakrilat), ili poli(vinilalkohol)), polilaktide (U.S. Pat. br. 3,773,919), kopolimere L-glutaminske kiseline i γ etil-L-glutamat, nedegradabilni etilen-vinil acetat, degradabilne kopolimere mlečna kiselina-glikolna kiselina, kao što je LUPRON DEPOT™ (injektabilne mikrosfere sastavljene od kopolimera mlečna kiselina-glikolna kiselina i leuprolid acetata) i poli-D-(-)-3-hidroksibuternu kiselinu.

[0617] Formulacije za primenu in vivo moraju biti sterilne. To se lako postiže filtracijom kroz sterilne filtracione membrane.

[0618] Podrazumeva se da svaki od proizvoda pomenutih u prethodnom tekstu može da sadrži imunokonjugat iz otkrića, kao što je opisano, umesto ili pored antagonista vezivanja PD-L1 ose.

[0619] VI. Dijagnostički kompleti i predmeti za proizvodnju

[0620] Ovde su obezbeđeni dijagnostički kompleti koji sadrže jedan ili više reagensa za utvrđivanje prisustva biomarkera (npr. nivo ekspresije PD-L1, na primer u ćelijama tumora i/ili infiltriranim imunološkim ćelijama u tumoru), u uzorku pojedinca ili pacijenta sa bolešću ili poremećajem (npr. rak, uključujući nemikroćelijski karcinom pluća). U nekim slučajevima, prisustvo biomarkera u uzorku ukazuje na veću verovatnoću efikasnosti kada se pojedinac leči antagonistom vezivanja PD-L1 ose. U nekim slučajevima, odsustvo biomarkera u uzorku ukazuje na manju verovatnoću efikasnosti kada se osoba sa bolešću leči antagonistom vezivanja PD-L1 ose. Opciono, komplet može da sadrži i uputstvo za korišćenje kompleta radi izbora leka (npr. antagonist vezivanja PD-L1 ose, kao što je anti-PD-L1 antitelo, na primer MPDL3280A) za lečenje bolesti ili poremećaja ako pojedinac eksprimira biomarker u uzorku. U drugom primeru, uputstvo je za upotrebu kompleta kako biste izabrali lek koji nije antagonist vezivanja PD-L1 ose ako osoba ne eksprimira biomarker u uzorku.

[0621] Ovde su takođe uključeni proizvodi, zapakovani zajedno, antagonist vezivanja PD-L1 ose (npr., anti-PD-L1 antitelo) u farmaceutski prihvatljivom nosaču i uputstvo u pakovanju koje ukazuje da antagonist vezivanja PD-L1 ose (npr. anti-PD-L1 antitelo) služi za lečenje pacijenata sa bolešću ili poremećajem (npr. rak) zasnovano na ekspresiji biomarkera. Postupci lečenja uključuju bilo koji od postupaka lečenja koje su ovde opisane. Dalje je dato otkriće koje se odnosi na postupak za proizvodnju proizvoda koji uključuje kombinovanje u pakovanju farmaceutske kompozicije koja sadrži antagonist vezivanja PD-L1 ose (npr. anti-PD-L1 antitelo) i uputstvo u pakovanju koje ukazuje da je farmaceutska kompozicija za lečenje pacijenta sa bolešću ili poremećajem na osnovu ekspresije biomarkera (npr. nivoa ekspresije PD-L1, na primer u ćelijama tumora i/ili infiltriranim imunoćelijama u tumoru).

[0622] Proizvod može da uključuje, na primer, pakovanje i etiketu ili uputstvo za upotrebu, na pakovanju ili uz njega. Odgovarajuće pakovanje uključuje, na primer, boce, bočice, špriceve, i slično. Pakovanje može biti od različitih materijala, kao što je staklo ili plastika. U pakovanju se nalazi kompozicija koja sadrži lek za rak kao aktivno sredstvo, i može da ima sterilni pristupni otvor (npr. pakovanje može da bude kesa za intravenski rastvor ili bočica koja ima čep koji se može probosti iglom za hipodermijsku injekciju).

[0623] Proizvod može dalje da sadrži drugo pakovanje koje sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer za razblaživanje, kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BVFI), fiziološki rastvor puferisan fosfatom, Ringerov rastvor i/ili rastvor dekstroze. Proizvod može dalje da obuhvati druge materijale poželjne sa komercijalnog i korisničkog aspekta, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.

[0624] Predmet ovog otkrića takođe uključuje informacije, na primer, u obliku uputstva u pakovanju, koje ukazuju na to da se kompozicija koristi za lečenje raka na osnovu nivoa ekspresije biomarkera. Uputstvo ili etiketa može imati bilo koji oblik, poput papirnog ili na elektronskim medijima, kao što je magnetno snimljeni medij (npr. disketa), CD-ROM, fleš disk sa univerzalnom serijskim busom (USB), i slično. Etiketa ili uputstvo mogu takođe uključivati i druge informacije koje se odnose na farmaceutske kompozicije i oblike doziranja u kompletu ili proizvodu.

[0625] PRIMERI

[0626] Sledeći primeri su navedeni da ilustruju, ali ne i da ograniče trenutno pronađeni pronalazak.

[0627] Primer 1: Imunohistohemijska (IHC) analiza ekspresije PD-L1 u uzorcima tumora

[0628] Imunohistohemija (IHC): Delovi tkiva fiksirani u formalinu i ugrađeni u parafin su deparafinisani pre vraćanja, blokiranja i inkubacije antigena sa primarnim anti-PD-L1 antitelom. Nakon inkubacije sa sekundarnim antitelom i enzimskim razvojem boje, preseci su kontrastno obojeni i dehidrirani u seriji alkohola i ksilena pre pokrivanja.

[0629] Sledeći protokol je korišćen za IHC. Ventana Benchmark KST ili Benchmark Ultra sistem korišćen je za izvođenje PD-L1 IHC bojenja koristeći sledeće reagense i materijale:

[0630] Primarno antitelo: primarno zečje monoklonsko anti-PD-L1 antitelo

[0631] Vrsta uzorka: fiksiran u formalinu i ugrađen u parafin (FFPE) deo uzoraka tumora Uslovi oporavka epitopa: kondicioniranje ćelije, standard 1 (CC1, Ventana, kat. br.

[0632] 950-124)

[0633] Uslovi za primarno antitelo: 1/100, 6,5 µg/ml tokom 16 minuta na 36 °C Razblaživač: pufer za razblaživanje antitela (fiziološki rastvor sa Tris puferom koji sadrži noseći protein i BRIJ™-35)

[0634] Negativna kontrola: naivni zečji IgG pri 6,5 µg/ml (ćelijska signalizacija) ili sam razblaživač

[0635] Detekcija: Optiview ili ultra View Universal DAB komplet za detekciju (Ventana) i komplet za amplifikaciju (ako je primenljivo) korišćeni su u skladu sa uputstvom proizvođača (Ventana).

[0636] Kontrastno bojenje: Ventana Hematoxylin II (kat. br. 790-2208)/ sa reagensom za bojenje u plavo(kat br.760-2037) (4 minuta, odnosno 4 minuta)

[0637] Ventana Benchmark protokol bio je sledeći:

[0638] 1. parafin (izabrano)

[0639] 2. Deparafinizacija (izabrano)

[0640] 3. Kondicioniranje ćelije (izabrano)

[0641] 4. Sredstvo za kondicioniranje br.1 (izabrano)

[0642] 5. Standardni CC1 (izabrano)

[0643] 6. Temperature inkubacije Ab (izabrano)

[0644] 7. 36C Ab uklj. (izabrano)

[0645] 8. Titracija (izabrano)

[0646] 9. Automatska distribucija (primarno antitelo) i inkubacija (16 minuta)

[0647] 10. Kontrastno bojenje (izabrano)

[0648] 11. Nanesite jednu kap (Hematoksilin II) (kontrastno bojenje), nanesite pokrivnu pločicu i inkubirajte (4 minuta)

[0649] 12. Nakon kontrastnog bojenja (izabrano)

[0650] 13. Nanesite jednu kap (REAGENS ZA BOJENJE U PLAVO) (nakon kontrastnog bojenja), nanesite pokrivnu pločicu i inkubirajte (4 minuta)

[0651] 14. Operite slajdove u sapunici da biste uklonili ulje

[0652] 15. Isperite slajdove vodom

[0653] 16. Dehidrirajte slajdove kroz 95% etanol, 100% etanol do ksilena (Leica autostainer program br.9)

[0654] 17. Pokrivna pločica.

[0655] Primer 2: Ekspresija PD-L1 u infiltriranim imunološkim ćelijama u tumoru i u ćelijama tumora su nezavisni prediktori za reakciju na lečenje anti-PD-L1 antitelom kod nemikroćelijskog karcinoma pluća

[0656] Procenjena je korelacija između ekspresije PD-L1 u različitim vrstama ćelija prisutnih u tumorima sa odgovorom na lečenje antagonistima vezivanja PD-L1 ose.

[0657] Ekspresija PD-L1 u uzorcima tumora pre lečenja je procenjena primenom imunohistohemije (IHC), kako je opisano u primeru 1, u nekoliko tekućih kliničkih ispitivanja za lečenje pacijenata obolelih od kancera sa MPDL3280A koji uključuju kohorte pacijenata sa NSCLC-om, uključujući la fazu kliničkog ispitivanja i dve faze II kliničkog ispitivanja. Uzorci tumora su ocenjeni za pozitivnost na PD-L1 u infiltriranim imunološkim ćelijama u tumoru i u ćelijama tumora prema oba kriterijuma za dijagnostičku procenu prikazana u Tabeli 2, odnosno Tabeli 3. Tekuća la faza ispitivanja se sprovodi kod pacijenata sa uznapredovalim solidnim tumorima i hematološkim malignim bolestima radi procene bezbednosti i podnošljivosti antitela na PD-L1 antitelo (MPDL3280A) koje se daje intravenskom infuzijom svake 3 nedelje u dozi od 1200 mg. Studija sadrži veliku kohortu pacijenata sa NSCLC-om (n = 88). Oba tekuća ispitivanja u II fazi (ovde se nazivaju „faza II-1“ i „faza II-2“) uključuju lokalno uznapredovale i metastatske pacijente sa NSCLC-om kojima je davan MPDL3280A u istom režimu doziranja kao i kliničko ispitivanje faze Ia (1200 mg IV svake 3 nedelje).

[0658] Tabela 2: Dijagnostički kriterijumi IHC infiltriranih imunoćelija u tumoru (IC)

[0659]

[0661] Tabela 3: Dijagnostički kriterijumi IHC tumorske ćelije (TC)

[0662]

[0665] 1

[0666]

[0668] PD-L1 je široko eksprimiran u mnogim slučajevima raka kod čoveka, uključujući NSCLC, rak bešike, rak bubrežnih ćelija, melanom, rak skvamoznih ćelija glave i vrata (HNSCC), rak želuca, rak pankreasa, trostruko negativni rak dojke i rak prostate, kao što je određeno IHC-om koristeći anti-PD-L1 dijagnostičko antitelo, kao što je opisano u primeru 1 (Slika 1 A). Uzorci NSCLC iz oba ispitivanja tumora pre lečenja iz ispitivanja MPDL3280A (n = 498) i kohorte koje nisu u ispitivanju (n = 706) procenjeni su na ekspresiju PD-L1 u ćelijama tumora i u infiltriranim imunoćelijama u tumoru koristeći anti-PD-L1 IHC test, kako je opisano u primeru 1. Uzorci su ocenjeni kao TC0-3 i IC0-3 na osnovu povećane ekspresije PD-L1 u ćelijama tumora, odnosno u infiltriranim imunoćelijama u tumoru. TC3 ili IC3, TC2/3 ili IC2/3 i TC1/2/3 ili IC1/2/3 tumori predstavljali su približno 20%, 40% i 65% uzoraka NSCLC-a.

[0669] Identifikovane su izrazite potpopulacije pacijenata sa NSCLC-om na osnovu ekspresije PD-L1 u infiltriranim imunoćelijama u tumoru i ćelijama tumora u uzorcima tumora pacijenta (slike 1B-1D; slike 2A-2B). TC3 tumori i IC3 tumori predstavljali su dve različite potpopulacije; bilo je manje od 1% preklapanja uzoraka tumora koji su ocenjeni kao TC3 i koji su ocenjeni kao IC3 koristeći kriterijume opisane u Tabelama 2 i 3. Uzorci tumora TC3 ili IC3 predstavljali su značajan deo NSCLC tumora (pogledajte, na primer, Slike 2A-2B i Sliku 11).

[0670] Šabloni ekspresije PD-L1 u infiltriranim imunoćelijama u tumoru i u ćelijama tumora u uzorcima tumora dobijenim od pacijenata sa NSCLC-om uključenih u gore opisana klinička ispitivanja korelisani su sa odgovorom pacijenata na lečenje. Tokom svakog kliničkog ispitivanja, ekspresija PD-L1 u infiltriranim imunoćelijama u tumoru i u ćelijama tumora nezavisno je predviđala ishod lečenja MPDL3280 kod pacijenata sa NSCLC-om (Slike 3A-3B). Na primer, pacijenti čiji uzorci tumora su imali za rezultat IC3 PD-L1 IHC, imali su

[0673] 1 1

[0674] ukupnu stopu odgovora (ORR) 44% u fazi la kliničkog ispitivanja, a pacijenti čiji su uzorci tumora imali za rezultat TC3 PD-L1 IHC imali su ORR 50% (Slika 3A). Nasuprot tome, pacijenti sa NSCLC-om čiji uzorci tumora nisu ocenjeni kao TC3 ili IC3 imali su ORR 14%.

[0675] Slični rezultati su primećeni u oba klinička ispitivanja u II fazi. U kliničkom ispitivanju u fazi II-1, mRECIST (Slika 3B) i RECIST v1.1 (Slika 3C) korišćeni su za određivanje rezultata efikasnosti. Ispitivanje je obuhvatilo 3 kohorte pacijenata: kohorta 1 obuhvatala je pacijente sa 1L NSCLC; kohorta 2 obuhvatala je pacijente sa ≥2L NSCLC bez metastaza u mozgu; i kohorta 3 obuhvatala je pacijente sa ≥2L NSCLC sa lečenim metastazama u mozgu. Konkretno, pacijenti u kohortama 2 i 3 čiji su uzorci tumora ocenjeni kao TC3 ili IC3 pokazali su povećani ORR i 6-mesečno preživljavanje bez progresije (PFS) u poređenju sa celokupnom populacijom pacijenata nakon lečenja atezolizumabom (MPDL3280A) (Slike 3B 3C).

[0676] U kliničkoj studiji u fazi II-2, rezultati IC i TC IHC su predviđali poboljšanje ukupnog preživljavanja, preživljavanja bez progresije i ukupne stope reakcije pacijenata sa NSCLC-om lečenih atezolizumabom (MPDL3280A) (Slike 3D-3F). Ekspresija PD-L1 u ćelijama tumora i u infiltriranim imunoćelijama u tumoru povezana je sa poboljšanim ukupnim preživljavanjem nakon lečenja sa MPDL3280A u poređenju sa pacijentima čiji su uzorci tumora TC0 i IC0 (Slika 3D). Pacijenti čiji su uzorci tumora ocenjeni kao TC3 ili IC3 pokazali su povećano celokupno preživljavanje nakon lečenja sa MPDL3280A u poređenju sa pacijentima čiji su uzorci tumora ocenjeni kao TC0 i IC0 (Slika 3D). Niža granična vrednost TC2/3 ili IC2/3 takođe je mogla da predvidi ukupno preživljavanje (Slika 3D).

[0677] Ekspresija PD-L1 u ćelijama tumora i u infiltriranim imunoćelijama u tumoru povezana je sa poboljšanim preživljavanjem bez progresije nakon lečenja sa MPDL3280A u poređenju sa pacijentima čiji su uzorci tumora ocenjeni kao TC0 i IC0 (Slika 3E). Pacijenti čiji su uzorci tumora ocenjeni kao TC3 ili IC3 pokazali su poboljšano preživljavanje bez progresije nakon lečenja sa MPDL3280A u poređenju sa pacijentima čiji uzorci tumora su ocenjeni kao TC0 i IC0 (Slika 3E).

[0678] Ekspresija PD-L1 u ćelijama tumora i u infiltriranim imunoćelijama u tumoru takođe je povezana sa povećanim ORR u ispitivanju u fazi II-2 (Slika 3F). Pacijenti čiji su uzorci tumora imali IHC rezultat PD-L1 TC3 ili IC3 imali su ORR 38% nakon lečenja atezolizumabom (MPDL3280A), u poređenju sa ORR 13% nakon tretmana docetakselom (Slika 3F). ORR pacijenata sa tumorima koji su ocenjeni kao IC3 ili TC3 lečenih sa MPDL3280A takođe je bio veći nego kod pacijenata čiji su uzorci tumora ocenjeni kao TC0 i IC0 (Slika 3F).

[0681] 1 2

[0682] Prema tome, ekspresija PD-L1 u infiltriranim imunoćelijama u tumoru i ekspresija PD-L1 u ćelijama tumora predstavljaju nezavisne prediktivne biomarkere za odgovor na lečenje antagonistima vezivanja PD-L1 ose, uključujući anti-PD-L1 antitela, kao što je MPDL3280A. Ekspresija PD-L1 u infiltriranim imunoćelijama u tumoru i u ćelijama tumora bila je povezana sa OS, PFS i ORR kod pacijenata sa NSCLC-om lečenih sa MPDL3280A. Na primer, na osnovu ovih rezultata, pacijent bi mogao biti izabran za lečenje antagonistom vezivanja PD-L1 ose na osnovu ekspresije PD-L1 u infiltriranim imunoćelijama u tumoru i/ili ćelijama tumora. Naročito se predviđa da će pacijenti sa klasifikacijom TC3 ili IC3 IHC reagovati na lečenje antagonistom vezivanja PD-L1 ose.

[0683] Primer 3: Tumori koje karakterišu PD-L1-pozitivne infiltrirane imunoćelije u tumoru i tumori koje karakterišu PD-L1-pozitivne tumorske ćelije predstavljaju biološki različite potpopulacije NSCLC

[0684] Da bi se razumelo kako ekspresija PD-L1 u infiltriranim imunoćelijama u tumoru i u ćelijama tumora predviđaju odgovor na lečenje antagonistima vezivanja PD-L1 ose, kao što je anti-PD-L1 antitelo MPDL3280A, proučavane su potpopulacije IC3 i TC3 histopatološkom analizom i analizom ekspresije gena.

[0685] Prisustvo infiltriranih imunoćelija u tumoru je bilo neophodno, ali nedovoljno da odrazi pozitivnost PD-L1 u dijagnostičkim kriterijumima IC IHC (Slika 4). Infiltrirane imunoćelije su primećene kod pacijenata čiji su tumori klasifikovani kao TC3 na osnovu IHC PD-L1, mada u manjoj meri u poređenju sa tumorima koji su klasifikovani kao IC3 na osnovu IHC PD-L1 (Slika 5A). Infiltrirane imunoćelije prisutne kod TC3 pacijenata, iako su prisutne, u velikoj meri su bile PD-L1-negativne (Slika 5A). TC3 potpopulacija bi se nadalje mogla podeliti na populacije koje su pokazale visok nivo ekspresije CD68 mRNK ili nizak nivo ekspresije CD68 mRNK (Slika 5B). Ekspresija CD8 mRNK je povećana u uzorcima tumora TC3 i IC3 u poređenju sa uzorcima tumora negativnog na PD-L1 (Slika 5C).

[0686] Uzorci NSCLC tumora sa TC3 IHC klasifikacijom pokazali su različite histopatološke karakteristike u poređenju sa uzorcima tumora sa IC3 IHC klasifikacijom (Slike 6A-6B). Uzorci tumora su analizirani korišćenjem bojenja hematoksilinom i eozinom (H&E). TC3 tumori su pokazali mikrookruženje dezmoplastičnog i sklerotičnog tumora sa niskim intraepitelnim i stromalnim infiltriranim imunoćelijama u tumoru, dok su IC3 tumori pokazali visoku učestalost infiltriranih imunoćelija u tumoru, stromi i interfejsu tumor/stroma, sa minimalnom do nikakvom sklerotičnom reakcijom (Slike 6A-6B). Kada su bili prisutne, infiltrirane imunoćelije su bile primarno smeštene u okolnoj stromi. U skladu sa histopatologijom, TC3 tumori su pokazali povećan nivo ekspresije gena kolagena (COL6A1 i

[0689] 1

[0690] COL6A2) u poređenju sa PD-L1-negativnim tumorima i IC3 tumorima (Slike 718A i 18B). Tumori koji su ocenjeni sa TC0 i IC0 (približno 35% NSCLC uzoraka) pokazali su malo ili nimalo dokaza o infiltraciji ili aktiviranju imunoćelija, u skladu sa imunološkom ignorancijom.

[0691] Analiza ekspresije gena korišćenjem prilagođenog NanoString imunološkog panela koji sadrži 798 gena sa prilagođenim imenima povezanih sa imunološkim sistemom, izvedena je da bi se utvrdili obrasci ekspresije imunskih potpisa u uzorcima NSCLC tumora u podvrstama IC i TC (Slika 8). Uzorci NSCLC tumora sa klasifikacijom IC3 IHC imali su povećane nivoe ekspresije mRNK CDS CXCL9 (Slike 9A-9B). Uzorci NSCLC tumora sa IC3 IHC klasifikacijom takođe su imali povećanu ekspresiju potpisa gena B-ćelija (Slika 12A), kao i potpisa gena ćelija prirodnih ubica (NK) (Slika 12B). Potpisi gena B ćelija uključivali su gene CD19, MS4A1, i CD79A. Potpisi gena NK ćelija uključivali su KLRB1, KLRC1, KLRC2, KLRC3, KLRD1, KLRF1, KLRG1, KLRK1, NCAM1, PRF1, NCR1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DS2, KIR3DL1, FCGR3A, MICA, i MICB, Stoga, uzorci IC3 tumora karakterišu se povećanim nivoom ekspresije kompleta biomarkera koji uključuje CD8, CXCL9, gene B ćelije i gene NK ćelije.

[0692] Uzorci NSCLC tumora sa TC3 IHC klasifikacijom imali su povećane nivoe ekspresije STAT1 i MEK u poređenju sa tumorima negativnim na PD-L1 i IC3 tumorima (Slike 10A-10B). Utvrđeno je da su nivoi ekspresije JAK1 veći kod tumora pozitivnih na PD-L1 u poređenju sa tumorima negativnim na PD-L1 (Slika 10C). Ipak, uprkos aktivnoj STAT signalizaciji, neke ćelijske linije tumora ne povećavaju PD-L1 kao odgovor na interferon gama (IFNγ) (Slika 10D). Stoga, uzorke TC3 NSCLC tumora karakteriše povećani nivo ekspresije STAT, MEK i JAK1.

[0693] Uzorci NSCLC tumora sa ocenom TC3 IHC su imali značajno povećane nivoe ekspresije PD-L1 u poređenju sa uzorcima tumora IC3 i uzorcima tumora TC0 i IC0, procenjenim sekvenciranjem RNK (Slika 17A). Ekspresija PD-L2 bila je konzistentna među populacijom sa TC3 i IC3 tumorima, kako je procenjeno sekvenciranjem RNK (Slika 17B).

[0694] NanoString analiza je takođe pokazala da PD-L1 pozitivni uzorci tumora (uključujući TC3 i IC3) imaju povišene nivoe ekspresije gena u potpisu T<eff>gena koji uključuje CD8A, GZMA, GZMB, IFNG, EOMES, PRF1, CXCL9, CXCL10, i TBX21, u poređenju sa uzorcima tumora negativnog na PD-L1 (Slika 13A). Sekvenciranje RNK pokazalo je da su posebno IC3 tumori okarakterisani visokom ekspresijom T<eff>markera sa potpisom (Slika 13D). Sekvenciranje RNK potvrdilo je da su IC3 tumori povećali ekspresiju IFNG, GZMB, i CXCL9 (Slike 13E-13F). Bez ograničavanja teorijom, ovi rezultati sugerišu da je ekspresija

[0697] 1 4

[0698] PD-L1 u IC regulisana prilagodljivim mehanizmima posredovanim interferonom gama (IFNG), što odražava već postojeći imunitet. Takođe je utvrđen nivo ekspresije potpisa MDSC gena (koji je uključivao ITGAM, CD33, ARG1, NOS1, CD68, CD163, LAIR1, i IL34) (Slika 13B). Takođe je utvrđen nivo ekspresije potpisa Th2 gena ( koji je uključivao IL13, IL4, GATA3, IL5, CXCR4, CCR3 i CCR4) (Slika 13C).

[0699] Na osnovu ovih podataka, NSCLC može da se klasifikuje u različite molekulske i histopatološke podskupove koji definišu osetljivost na lečenje terapijom ciljanom za PD-L1. Iako ekspresija PD-L1 u infiltriranim imunoćelijama u tumoru i/ili imunskim ćelijama može da doprinose osetljivosti na MPDL3280A, imunološki kontekst i odgovor na lečenje mogu da se razlikuju.

[0700] Primer 4: Surogat biomarkeri za predviđanje odgovora pacijenata sa NSCLC-om na antagoniste vezivanja PD-L1 ose

[0701] Procenjeni su cirkulišući farmakodinamički i prediktivni biomarkeri za lečenje antagonistima vezivanja PD-L1 ose (npr. anti-PD-L1 antitela kao što je MPDL3280A).

[0702] Markeri povezani sa interferonom gama (IFNγ), interleukin-18 i ITAC, pokazali su povećane nivoe ekspresije nakon lečenja pacijenata obolelih od NSCLC sa MPDL3280A (Slike 14A-14B). Prema tome, ovi proteini predstavljaju farmakodinamičke biomarkere odgovora na antagoniste vezivanja PD-L1 ose.

[0703] NanoString imunološki panel koji sadrži 798 gena sa prilagođenim imenima povezanih sa imunološkim sistemom, korišćen je za procenu da li je nivo ekspresije biomarkera u mononuklearnim ćelijama periferne krvi (PBMC) povezan sa lečenjem antagonistima vezivanja PD-L1 ose (npr. antitela protiv PD-L1 kao što je MPDL3280A). Među pacijentima u ovoj studiji su pacijenti sa NSCLC, kao i sa kancerom urotelijalne bešike (UBC), melanomom, rakom dojke i rakom bubrežnih ćelija (RCC) koji se leče sa MPDL3280A. Procenjena je povezanost između početne ekspresije PD-L1 i PD-1 mRNK u PBMC sa odgovorom na lečenje sa MDP3280A kod pacijenata sa NSCLC-om (Slike 15A-15C). Početni nivoi ekspresije mRNK za NK ćelije (Slika 16A) i mijeloidne ćelije (Slika 16B) u PBMC su bili povezani sa odgovorom pacijenata obolelih od NSCLC na lečenje sa MPDL3280A. Potpis gena za NK ćelije obuhvatao je gene KLRB1, KLRC1, KLRC2, KLRC3, KLRD1, KLRF1, KLRG1, KLRK1, NCAM1, PRF1, NCR1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DS2, KIR3DL1, FCGR3A, MICA, i MICB, Potpisi gena mijeloidnih ćelija su uključivali gene IL1B, IL8 i CCL2. Povećani nivoi ekspresije potpisa imunosupresivnih gena mijeloidnih ćelija su bili povezani sa progresijom, dok su povećani nivoi citotoksičnih NK ćelija bili povezani sa odgovorom na MPDL3280A.

[0706] 1

[0707] Prema tome, geni u potpisu gena NK ćelija predstavljaju biomarkere koji predviđaju odgovor pacijenata obolelih od NSCLC na lečenje antagonistom vezivanja PD-L1 ose, sa povećanim nivoom ekspresije koji ukazuje na povećanu verovatnoću odgovora na lečenje. Geni u potpisu gena mijeloidnih ćelija predstavljaju biomarkere koji predviđaju odgovor pacijenata obolelih od NSCLC na lečenje antagonistom vezivanja PD-L1 ose, sa povećanim nivoom ekspresije koji ukazuje na smanjenu verovatnoću odgovora na lečenje.

[0710] 1

[0711]

[0713] 1

[0714]

[0716] 

[0717]

[0719] 

[0720]

[0722] 11

[0723]

[0724]

[0725]

[0727] 11

[0728]

[0729]

[0731] 11

[0732]

[0734] 11

[0735]

[0737] 11

[0738]

[0740] 11

[0741]

[0743] 11

[0744]

[0746] 12

[0747]

[0748]

[0749]

[0751] 12

[0752]

[0753]

[0755] 12

[0756]

[0758] 12

[0759]

[0761] 12

[0762]

[0764] 

[0765]

[0767] 12

[0768]

[0770] 

Claims (15)

1. PATENTNI ZAHTEVI

1. Antagonist vezivanja PD-L1 za upotrebu u lečenju pacijenta obolelog od nemikroćelijskog kancera pluća, pri čemu, utvrđeno je da uzorak tumora dobijen od pacijenta ima detektabilni nivo ekspresije PD-L1 u 50% ili više ćelija tumora u uzorku tumora, i pri čemu, antagonist vezivanja PD-L1 je antitelo.

2. Antagonist vezivanja PD-L1 za upotrebu prema zahtevu 1, pri čemu, uzorak tumora dobijen od pacijenta ima detektabilni nivo ekspresije PD-L1 u imunoćelijama infiltriranim u tumor koje sadrže manje od 10% uzorka.

3. Antagonist vezivanja PD-L1 za upotrebu prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu, antagonist vezivanja PD-L1 je formulisan za upotrebu u kombinaciji sa drugim terapeutskim agensom, opciono pri čemu je drugi terapeutski agens odabran iz grupe koju čine citotoksični agens, agens za inhibiciju rasta, agens za terapiju zračenjem, antiangiogeni agens, i njihove kombinacije.

4. Postupak za (i) određivanje da li će pacijent koji boluje od nemikroćelijskog kancera pluća verovatno odgovoriti na lečenje koje sadrži antagonist vezivanja PD-L1 ili (ii) predviđanje responsivnosti pacijenta koji boluje od nemikroćelijskog kancera pluća na lečenje koje sadrži antagonist vezivanja PD-L1, gde postupak obuhvata:

određivanje nivoa ekspresije PD-L1 u ćelijama tumora u uzorku tumora dobijenom od pacijenta,

pri čemu, nivo ekspresije PD-L1 koji može da se detektuje u 50% ili više tumorskih ćelija u uzorku tumora ukazuje na to da će pacijent verovatno da reaguje na lečenje koje sadrži antagonist vezivanja PD-L1, i pri čemu, antagonist vezivanja je PD-L1 antitelo.

5. Postupak prema zahtevu 4, pri čemu, postupak dalje uključuje određivanje nivoa ekspresije PD-L1 u imunoćelijama infitriranim u tumor u uzorku tumora dobijenom od pacijenta, pri čemu opciono:

uzorak tumora dobijen od pacijenta ima nivo ekspresije PD-L1 koji može da se detektuje u imunoćelijama infiltriranim u tumor koje sadrže manje od 10% uzorka; ili utvrđeno je da uzorak tumora dobijen od pacijenta ima nivo ekspresije PD-L1 koji može da se detektuje u imunoćelijama infiltriranim u tumor koje sadrže 10% ili više uzorka tumora.

6. Postupak za odabir terapije za pacijenta obolelog od nemikroćelijskog kancera pluća, koji obuhvata:

određivanje nivoa ekspresije PD-L1 u ćelijama tumora u uzorku tumora dobijenom od pacijenta, i

odabir terapije za pacijenta koja sadrži antagonist vezivanja PD-L1 na osnovu ekspresije PD-L1 koji može da se detektuje u 50% ili više tumorskih ćelija u uzorku tumora, pri čemu, antagonist vezivanja PD-L1 je antitelo.

7. Postupak prema zahtevu 6, pri čemu, postupak dalje uključuje određivanje nivoa ekspresije PD-L1 u imunoćelijama infiltriranim u tumor u uzorku tumora dobijenom od pacijenta, pri čemu opciono uzorak tumora dobijen od pacijenta ima nivo ekspresije PD-L1 koji može da se detektuje u imunoćelijama infiltriranim u tumor koje sadrže manje od 10% uzorka.

8. Antagonist vezivanja PD-L1 za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1-3, ili postupak prema bilo kom od zahteva 4-7, pri čemu:

(i) uzorak tumora dobijen od pacijenta obuhvata populaciju fibroblasta i/ili miofibroblasta;

(ii) uzorak tumora dobijen od pacijenta se sastoji od ćelijski siromašne i/ili kolagenizovane strome; i/ili

(iii) uzorak tumora ima povećani nivo ekspresije kolagena, STAT1 ili MEK u odnosu na referentni uzorak tumora.

9. Antagonist vezivanja PD-L1 za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1-3 i 8 ili postupak prema bilo kom od zahteva 4-8, pri čemu, antagonist vezivanja PD-L1 inhibira vezivanje PD-L1 za jedan ili više njegovih partnera za vezivanje liganda, u kome opciono antagonist vezivanja PD-L1 inhibira vezivanje PD-L1 za PD-1, B7-1, ili i PD-1 i B7-1.

10. Antagonist vezivanja PD-L1 za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1-3, 8 i 9 ili postupak prema bilo kom od zahteva 4-9, pri čemu, antitelo je izabrano iz grupe koju čine: MPDL3280A (atezolizumab), MDX-1105, MEDI4736 (durvalmab) i MSB0010718C (avelumab).

11. Antagonist vezivanja PD-L1 za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1-3 i 8-10 ili postupak prema bilo kom od zahteva 4-10, pri čemu, antitelo sadrži teški lanac koji sadrži HVR-H1 sekvencu SEQ ID NO:19, HVR-H2 sekvencu SEQ ID NO:20 i HVR-H3 sekvencu SEQ ID NO:21; i laki lanac koji sadrži HVR-L1 sekvencu SEQ ID NO:22, HVR-L2 sekvencu SEQ ID NO:23 i HVR-L3 sekvencu SEQ ID NO:24.

12. Antagonist vezivanja PD-L1 za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1-3 i 8-11 ili postupak prema bilo kom od zahteva 4-11, pri čemu, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:25 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4.

13. Antagonist vezivanja PD-L1 za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1-3 i 8-12 ili

postupak prema bilo kom od zahteva 4-12, pri čemu, nemikroćelijski kancer pluća je lokalno uznapredovali ili metastatski nemikroćelijski kancer pluća.

14. Antagonist vezivanja PD-L1 za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1-3 i 8-13 ili postupak prema bilo kom od zahteva 4-13, pri čemu, uzorak tumora je uzorak tumora koji je fiksiran u formalinu i ugrađen u parafin (FFPE), arhivski uzorak tumora, sveži uzorak tumora ili smrznuti uzorak tumora.

15. Antagonist vezivanja PD-L1 za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1-3 i 8-14 ili postupak prema bilo kom od zahteva 4-14, pri čemu:

(i) nivo ekspresije PD-L1 je nivo ekspresije proteina, pri čemu, opciono se nivo ekspresije proteina PD-L1 određuje korišćenjem postupka izabranog iz grupe koja se sastoji od imunohistohemije (IHC), imunofluorescencije, protočne citometrije i vestern blota; pri čemu se nadalje opciono nivo ekspresije proteina PD-L1 detektuje korišćenjem anti-PD-L1 antitela; ili

(ii) nivo ekspresije PD-L1 je nivo ekspresije mRNK, u kome se opciono nivo ekspresije mRNK PD-L1 određuje korišćenjem postupka izabranog iz grupe koja se sastoji od kvantitativne lančane reakcije polimeraze (qPCR), reverzne transkripcije qPCR (RT-qPCR), sekvenciranja RNK, analize mikročipa, hibridizacije in situ i serijske analize ekspresije gena (SAGE).

1