[go: up one dir, main page]

RS61118B1 - Sredstva i postupci za lečenje hbv - Google Patents

Sredstva i postupci za lečenje hbv

Info

Publication number
RS61118B1
RS61118B1 RS20201424A RSP20201424A RS61118B1 RS 61118 B1 RS61118 B1 RS 61118B1 RS 20201424 A RS20201424 A RS 20201424A RS P20201424 A RSP20201424 A RS P20201424A RS 61118 B1 RS61118 B1 RS 61118B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
virus
hepatitis
protein
mva
envelope protein
Prior art date
Application number
RS20201424A
Other languages
English (en)
Inventor
Ulrike Protzer
Tanja Bauer
Anna Kosinska
Martin Mueck-Haeusl
Original Assignee
Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum Gesundheit & Umwelt Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum Gesundheit & Umwelt Gmbh filed Critical Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum Gesundheit & Umwelt Gmbh
Publication of RS61118B1 publication Critical patent/RS61118B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/29—Hepatitis virus
    • A61K39/292—Serum hepatitis virus, hepatitis B virus, e.g. Australia antigen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/30—Cellular immunotherapy characterised by the recombinant expression of specific molecules in the cells of the immune system
    • A61K40/34—Antigenic peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/31—Combination therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/023—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from a poxvirus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Catalysts (AREA)
  • Photoreceptors In Electrophotography (AREA)
  • Chemical Or Physical Treatment Of Fibers (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na poboljšan rekombinantni vektor vakcinacije za lečenje ili vakcinaciju protiv virusa hepatitisa B (HBV) kao i farmaceutske kompozicije ili vakcine koje obuhvataju pomenutu rekombinaciju. Ovaj pronalazak, takođe, odnosi se na rekombinantni vektor vakcinacije za upotrebu u postupku vakcinacije protiv HBV, kao i komplete za vakcinaciju protiv HBV.
STANJE TEHNIKE
[0002] Više od 240 miliona ljudi boluje od hronične infekcije virusom hepatitisa B (HBV). Odobrene mogućnosti lečenja su analozi nukleozida(nukleotida) i interferon α. Analozi nukleozida(nukleotida) kontrolišu ali ne leče hepatitis B i zahtevaju skup dugotrajan tretman moguće povezan sa pojavom rezistentnih virusa. Terapija interferonom α je ograničena neželjenim efektima i samo je lekovita kod 15-20% pacijenata.
[0003] Virus je podeljen u četiri glavna serotipa (adr, adw, ayr, ayw) koji indukuju diferencijalne odgovore antitela bazirane na epitopima antigena prisutnim na njegovim proteinima omotača, i u (najmanje) osam genotipova (A-I) prema ukupnoj varijaciji nukleotidne sekvence genoma. Genotipovi imaju posebnu geografsku distribuciju i koriste se u praćenju evolucije i transmisije virusa. Razlike između genotipova utiču na ozbiljnost bolesti, tok i verovatnoću komplikacija, i odgovor na lečenje i moguću vakcinaciju. Osim toga, postoje subgenotipovi, npr. A1-5. U Centralnoj Evropi i Sjedinjenim Državama, pretežni genotip je A2. Međutim, samo 1 % zaraženih ljudi nosi A2 subgenotip, dok većina pacijenata nosi HBV genotipa B, C ili D. Pokazalo se da konvencionalne HBV vakcine obezbeđuju bolju zaštitu protiv HBV istog (sub)genotipa kao HBV antigeni sadržani u vakcini nego ostalih (sub)genotipova.
[0004] Dobro je poznato da je adaptivni imuni sistem domaćina od suštinskog značaja za efikasnu HBV kontrolu. Neutralizujuća antitela usmerena protiv HBV antigena male površine (HBsAg) sprečavaju širenje virusa na nezaražene hepatocite i serokonverzija od HBsAg u anti-HBs predstavlja kliničku krajnju tačku HBV-infekcije (Rehermann and Nascimben, Nat Rev Immunol 2005; 5:215-29). Pacijenti čišćenjem od virusa razvijaju snažne poliklonalne i multispecifične CD8+ i CD4+ T-ćelijske odgovore dok je hronična infekcija povezana sa deplecijom i progresivnom disfunkcijom antivirusnih T-ćelija (Rehermann et al., J Exp Med 1995; 181:1047-58). Kliničko zapažanje da hronična HBV-infekcija određena kod primalaca transplatacije koštane srži koji su dobili koštanu srž od HBV imunih donora, podržava snažnu ulogu Tćelija u kontroli infekcije (Ilan et al., Gastroenterology 1993; 104:1818-21). Na osnovu ovih zapažanja, terapeutske vakcinacije dizajnirane su da aktiviraju endogene HBV-specifične T-ćelijske odgovore.
Međutim, brojni klinički pokušaji kod hronično inficiranih pacijenata imali su samo prolazne efekte na anti-HBV imune odgovore i nisu uspeli da kontrolišu HBV (Kutscher et al,. Microb Biotechnol 2012; 5:270-82). Čini se da je kontinuirana izloženost visokim nivoima cirkulišućih virusnih antigena glavna prepreka imunoterapeutskim pristupima jer oni indukuju toleranciju i disfunkciju efektorskih ćelija.
[0005] Takođe, kombinovanje terapeutske vakcinacije sa antivirusnim tretmanom, što kontroliše viremiju ali nema efekta na cirkulišuće nivoe antigena, nije poboljšala efikasnost vakcine i klinički ishod (Michel et al., J Hepatol 2011; 54:1286-96).
[0006] Kako bi se olakšao razvoj novih imunoterapeutskih strategija, HBV-transgeni miševi (HBVtg), razvijen je model vertikalno transmitovane hronične HBV-infekcije (Guidotti et al., J Virol 1995; 69:6158-69). HBVtg miševi repliciraju HBV u hepatocitima, proizvode HBcAg, HBsAg i hepatitis B e antigen (HBeAg) i oslobađaju zarazni virus u krv (Guidotti et al., J Virol 1995; 69:6158-69). Ekspresija HBV antigena započinje oko rođenja i miševi su imunološki tolerantni na HBV-enkodirane proteine (Shimizu et al., J Immunol 1998; 161:4520-9), ali ova tolerancija može da se ošteti (Buchmann et al., Vaccine 2013; 31:1197-203).
[0007] Modifikovani virus vakcinije Ankara (MVA) povezan je sa virusom vakcinije, član roda Orthopoxvirus, u familiji Poxviridae. MVA generisan je sa 516 serijskih pasaža na fibroblastima pilećih embriona Ankara soja virusa vakcinije (CVA) (za pregled videti Mayr, A., et al. Infection 3, 6-14 (1975)). Kao posledica ovih dugotrajnih pasaža, genom dobijenog MVA virusa imao je oko 31 kilobaza njegove genomske sekvence izbrisane i, zbog toga, opisan je kao ćelija domaćina visoko ograničena za replikaciju na ptičje ćelije (Meyer, H. et al., J. Gen. Virol.72, 1031-1038 (1991)). U raznim životinjskim modelima pokazalo se da je dobijeni MVA bio značajno avirulentan (Mayr, A. & Danner, K., Dev. Biol. Stand.41: 225-34 (1978)) ali je i dalje podigao zaštitne imune odgovore protiv poksvirusa. Zbog toga je ovaj MVA soj ispitivan u kliničkim probama kao vakcina za imunizaciju protiv humanih velikih boginja (Mayr et al., Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375-390 (1987); Stickl et al., Dtsch. med. Wschr.99, 2386-2392 (1974)). Ove studije uključile su preko 120000 ljudi, uključujući visokorizične pacijente, i dokazale su, u poređenju sa vakcinama na bazi vakcinije, da je MVA smanjio virulenciju i bio dobro tolerisan, dok je i dalje indukovao dobar specifični imuni odgovor.
[0008] Tokom sledećih dekada, MVA je konstruisan za upotrebu kao virusni vektor za rekombinantnu gensku ekspresiju ili kao rekombinantna vakcina (Sutter, G. et al., Vaccine 12: 1032-40 (1994)). Opisani su sojevi MVA za razvoj vakcina ili farmaceutika. Videti U.S. Pat. Br.6,761,893 i 6,193,752. Ti sojevi sposobni su za reproduktivnu replikaciju kod posebnih ne-humanih ćelija i ćelijskih linija, naročito u fibroblastima pilećih embriona (CEF), ali nisu sposobni za značajnu reproduktivnu replikaciju kod humanih ćelijskih linija za koje je poznato da omogućavaju replikaciju drugih poznatih sojeva vakcinije.
[0009] Na osnovu prethodno navedenog, postoji potreba u ovoj tehnici za poboljšanim sredstvima i postupcima koji mogu da se koriste u terapeutskoj vakcinaciji protiv HBV. Ova sredstva i postupci treba paralelno da indukuju odgovore neutralizujućih antitela i multispecifični T ćelijski odgovor usmeren na više subtipova HBV.
DETALJAN OPIS
[0010] Ovaj pronalazak odnosi se na novi rekombinantni vektor vakcinacije za lečenje ili vakcinaciju protiv virusa hepatitisa B (HBV) kao i farmaceutske kompozicije ili vakcine koje obuhvataju pomenuti MVA. Ovaj pronalazak takođe se odnosi na postupak vakcinacije protiv HBV koji koristi rekombinantni MVA. Sredstva i postupci ovog pronalaska predviđeni su da indukuju i odgovor antitela kao i T ćelijski odgovor protiv HBV kod subjekta, a dalje je predviđeno da je indukovani imuni odgovor efektivan protiv velike raznolikosti HBV genotipova i serotipova.
[0011] "Rekombinantni vektor vakcinacije" kako se ovde koristi odnosi se na oslabljen virus ili bakteriju. U ovom kontekstu, "vektor" se odnosi na virus ili bakteriju korišćenu kao nosač. Uobičajeno, ovaj oslabljen virus ili bakterija koristi se za uvođenje nukleinske kiseline koja kodira antigene u ćelije subjekta.
Rekombinantni vektor vakcinacije ovog pronalaska može biti oslabljen Salmonella soj. Međutim, alternativno, mogu da se koriste drugi prokariotski mikroorganizmi kao što su oslabljeni sojevi Escherichia coli, Shigella, Yersinia, Lactobacillus, Mycobacteria, Listeria ili Vibrio . Primeri pogodnih sojeva mikroorganizama uključuju Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Salmonella dublin, Salmonella enteretidis, Shigella flexeneri, Shigella sonnel. Oslabljeni Salmonella sojevi su jedan od najbolje okarakterisanih mukoznih nosača vakcine. Rekombinantni Salmonella sojevi koji su oslabljeni, ali i dalje invazivni, koriste se kao vektori oralne vakcine za nošenje zaštitnih epitopa nekoliko patogena u mukozno povezano limfoidno tkivo čime se indukuju mukozni, sistemski i CTL imuni odgovori i protiv nosača i protiv stranih antigena.
[0012] Dalje, rekombinantni vektor vakcinacije ovog pronalaska može biti oslabljen Salmonella soj, CMV-, VSV-baziran vektor, adenovirusni vektor ili vektor malih boginja.
[0013] Rekombinantni vektor vakcinacije ovog pronalaska može biti virusni vektor koji može biti virusna čestica sa infektivnošću, koji je takođe nosač za uvođenje gena u ćeliju. Virusni vektori vakcinacije poznati su stručnjaku u ovoj tehnici. Ovaj pronalazak posebno razmatra vektor poksvirusa.
Rekombinantni poksvirus može biti poksvirus koji je proizveden standardnim postupcima genetičkog inženjeringa. U poželjnom načinu ostvarivanja, rekombinantni vektor vakcinacije ovog pronalaska je MVA.
[0014] MVA je naročito pogodan kao vektorski sistem. Demonstrirana je njegova moć da bude efektivan u indukovanju i humoralnih i ćelijskih imunih odgovora u kratkom vremenskom periodu posle vakcinacije protiv, na primer, virusa velikih boginja. Njegova bezbednost je ustanovljena. Poznata je njegova moć da čak indukuje imuni odgovor kod subjekata sa ugroženim imunim sistemom.
[0015] Međutim, osim prednosti koje MVA ima za upotrebu kao vakcina protiv HBV, najveći izazov za HBV vakcinu je da može da indukuje i humoralni kao i ćelijski imuni odgovor i da je ovaj imuni odgovor poželjno usmeren na više genotipova i/ili serotipova HBV. Izbor vektora, šeme vakcinacije i HBV antigena mogu svi da doprinesu efektivnosti vakcinacije.
[0016] Ovaj pronalazak obuhvata upotrebu kombinacije HBV antigena od različitih HBV genotipova i/ili serotipova. Ova kombinacija ne samo da dovodi do opšteg imunog odgovora protiv više HBV sojeva već i do jačeg imunog odgovora protiv svakog HBV genotipa u poređenju sa vakcinama koje obuhvataju samo antigene iz jednog HBV genotipa. Ustvari, upotrebom sredstava i postupaka ovog pronalaska, pronalazači su čak mogli da prevaziđu imunološku toleranciju kod subjekata sa niskim, srednjim i čak visokim nivoima antigena.
[0017] MVA-bazirane vakcine su povoljne iz nekoliko razloga. Na primer, poželjan MVA soj, MVA-F6 (Sutter and Staib, 2003. Curr. Drug Targets Infect. Disord.3:263-271), razvijaju se dobro u primarnim ćelijama fibroblasta pilećih embriona (CEF) i ne replikuju se u humanim ćelijama. U humanim ćelijama eksprimiraju se virusni geni kao i konstruisani transgen, ali se ne proizvodi infektivni virus. Ograničeni opseg domaćina za MVA može da objasni ne-virulentni fenotip primećen in vivo kod širokog spektra vrsta sisara uključujući ljude. Pokazalo se da je MVA bezbedan u brojnim studijama toksičnosti.
Konstrukcija, proizvodnja i upotreba rekombinantnog MVA opisana je u tehnici, na primer u WO 97/02355, Sutter and Staib, 2003 (supra), i WO 2003/008533.
[0018] Ovaj pronalazak predviđa rekombinantni vektor vakcinacije, poželjno modifikovani virus vakcinije Ankara (MVA), koji eksprimira jedan ili više antigena iz virusa hepatitisa B (HBV). Jedan ili više antigena mogu da se odaberu od proteina omotača (HBs-antigen) iz HBV-a, proteina jezgra (HBc-antigen) iz HBV-a ili RT domen polimeraze iz HBV-a. Protein omotača može, na primer, da bude protein omotača adw serotipa HBV-a kao što je adw serotipa genotipa A HBV-a, kao što je adw2 serotipa genotipa A2 HBV-a. Protein jezgra može, na primer, biti protein jezgra ayw serotipa HBV-a, kao što je ayw serotipa genotipa D HBV-a.
[0019] Rekombinantni vektor vakcinacije, poželjno MVA, ovog pronalaska može da eksprimira više od jednog proteina omotača, pri čemu više od jednog proteina omotača mogu biti od različitih genotipova ili serotipova HBV-a. Na primer, MVA ovog pronalaska može da eksprimira protein omotača adw serotipa genotipa A HBV-a kao i protein omotača genotipa C. Slično, MVA ovog pronalaska može da eksprimira više od jednog proteina jezgra, dok više od jednog proteina jezgra može biti od različitih genotipova ili serotipova HBV-a. Na primer, MVA ovog pronalaska može da eksprimira protein jezgra ayw serotipa genotipa D HBV-a kao i protein jezgra genotipa C.
[0020] Rekombinantni vektor vakcinacije, poželjno MVA, ovog pronalaska može takođe da eksprimira polimerazu iz HBV-a ili RT domen HBV polimeraze. Ova polimeraza može biti bilo kog genotipa ili serotipa. Polimeraza može poželjno da bude polimeraza iz genotipa D HBV-a.
[0021] Rekombinantni vektor vakcinacije, poželjno MVA, ovog pronalaska može da eksprimira (a) protein omotača (HBs-antigen) iz adw serotipa virusa hepatitisa B, pri čemu je protein omotača poželjno veliki ili mali protein omotača iz adw serotipa genotipa A virusa hepatitisa B; poželjno mali protein omotača i (b) protein jezgra (HBc-antigen) iz ayw serotipa virusa hepatitisa B, pri čemu je protein jezgra poželjno iz ayw serotipa genotipa D virusa hepatitisa B; i najmanje jedan od sledećeg: (c) proteina omotača (HBs-antigen) iz virusa hepatitisa B sa najmanje 90 % identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom navedenoj u SEQ ID NO: 1, (d) proteina jezgra (HBc-antigen) iz virusa hepatitisa B sa najmanje 90 % identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom navedenoj u SEQ ID NO: 2, i/ili (e) RT domena polimeraze iz virusa hepatitisa B sa najmanje 90 % identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom navedenoj u SEQ ID NO: 3. Podrazumeva se da MVA ovog pronalaska može da eksprimira tri, poželjno četiri ili najpoželjnije pet antigena HBV-a, kao što su antigeni (a), (b), (c), antigeni (a), (b), (d), ili antigeni (a), (b), (e), antigeni (a), (b), (c), (d), antigeni (a), (b), (c), (e), antigeni (a), (b), (d), (e) ili antigeni (a), (b), (c), (d), (e).
[0022] Kako se ovde koristi "protein omotača", "HBs-antigen" ili "HBsAg" HBV-a odnosi se na površinski antigen virusa hepatitisa B (HBV). "Protein omotača", "HBs-antigen" ili "HBsAg" može da se odnosi na bilo koju od tri varijante, mali, srednji i veliki protein omotača, koji su prevedeni od posebnih mRNK. Zajedničko za sve tri varijante, je "a" determinantni epitop smešten je na kodonskim pozicijama 124 do 147 unutar glavnog hidrofilnog regiona (MHR) S gena. Ova "a" determinanta je jedan od glavnih meta anti-HBs antitela tokom početnog imunog odgovora kod akutnog hepatitisa B. Izraz "protein omotača", "HBs-antigen" ili "HBsAg" može opciono da se odnosi na imunogenski fragment proteina omotača. Imunogenski fragment proteina omotača odnosi se na proteine ili peptide dobijene od bilo kog proteina omotača pune dužine koji je N-terminalno i/ili C-terminalno skraćen, tj. nedostaje mu najmanje jedna od N-terminalnih i/ili C-terminalnih aminokiselina. Takav fragment obuhvata poželjno najmanje 70, poželjno najmanje 80, poželjno najmanje 90, poželjno najmanje 100, poželjnije najmanje 125, najpoželjnije najmanje 150 uzastopnih aminokiselina primarne sekvence proteina omotača i obično je imunogeni. Uobičajeno, takav imunogeni fragment obuhvata, u odnosu na protein pune dužine, najmanje aminokiseline 99 do 168 koje odgovaraju položajima aminokiselina malog proteina omotača.
[0023] Kako se ovde koristi, "protein jezgra" ili "HBc-antigen" HBV-a odnosi se na strukturni protein nukleokapsida. Protein jezgra pune dužine je dužine 183 aminokiselina i sastoji se od domena sklopa (aminokiseline 1 do 149) i nukleinska kiselina-vezujućeg domena (aminokiseline 150 do 183). Nukleinska kiselina-vezujući domen od 34 ostataka je veoma bazan, sa 17 arginina, u skladu sa njegovom funkcijom. Protein jezgra je dimerni u rastvoru; ovi dimeri se sami sastavljaju u ikosaedrične kapside. Podrazumeva se da takođe skraćeni proteini jezgra, koji obuhvataju samo aminokiseline 1 do 149 mogu da formiraju kapside. Izraz "protein jezgra" ili "HBc-antigen" može opciono da se odnosi na imunogeni fragment proteina jezgra. Imunogeni fragment proteina jezgra odnosi se na proteine ili peptide dobijene od bilo kog proteina jezgra pune dužine koji je N-terminalno i/ili C-terminalno skraćen, tj. nedostaje mu najmanje jedna od N-terminalnih i/ili C-terminalnih aminokiselina. Takav fragment obuhvata poželjno najmanje 100, poželjnije 125, najpoželjnije 149 ili više uzastopnih aminokiselina primarne sekvence proteina jezgra i obično je imunogeni. Uobičajeno, takav imunogeni fragment obuhvata, u odnosu na protein jezgra pune dužine, najmanje aminokiseline 18 do 143 koje odgovaraju položajima sekvenci navedenim u SEQ ID NO: 11. Tipičan primer je fragment proteina jezgra koji se sastoji od aminokiselina 1 do 149 proteina jezgra pune dužine navedenim u SEQ ID NO: 11.
[0024] Kako se ovde koristi, "imunogeni" odnosi se na sposobnost određene supstance, kao što je antigen ili epitop, da izazove imuni odgovor u telu čoveka ili životinje. Drugim rečima, imunogenost je sposobnost da se indukuje humoralno i/ili ćelijski posredovan imuni odgovor. Sposobnost nekog antigena da izazove imune odgovore naziva se imunogenost, koji mogu biti humoralno i/ili ćelijski posredovani imuni odgovori. Bez želje vezivanja za teoriju, pretpostavlja se da je imunogeni bilo koji HBs-antigen, HBc-antigen ili polimeraza iz HBV-a koji se prirodno javljaju. Takođe, pretpostavlja se da mnoge varijante HBs-antigena, HBc-antigena ili polimeraze iz HBV-a koji se prirodno javljaju, u kojima je jedna ili više aminokiselina zamenjena, obrisana ili umetnuta u odnosu na sekvencu koja se prirodno javlja. Kao ilustrativni primer, imunogena varijanta HBs-antigena koji se prirodno javlja je HBs-antigen, u kom je "a" determinantni epitop zamenjen sa "a" determinantom HBs-antigena drugog serotipa.
Uobičajeno, imunogena varijanta HBs-antigena, HBc-antigena ili polimeraze koji se prirodno javljaju može da ima 90 % identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom HBs-antigena, HBc-antigena ili polimeraze koji se prirodno javljaju.
[0025] Rekombinantni vektor vakcinacije, poželjno MVA, ovog pronalaska, obuhvata protein omotača iz adw serotipa virusa hepatitisa B. Takav protein omotača može biti mali, srednji ili veliki protein omotača, pri čemu je poželjan mali ili veliki protein omotača, a najpoželjniji je mali protein omotača. Protein omotača je poželjno genotipa A, adw serotipa (A/adw), poželjno A2/adw2 HBV-a. Međutim, bilo koji protein omotača koji se prirodno javlja ili je konstruisan, koji ima imunogenost proteina omotača koji se prirodno javlja od adw HBV-a, je pogodan za ovaj pronalazak. Poželjni proteini omotača obuhvataju sekvencu sa najmanje oko 90 %, poželjno najmanje oko 91 %, poželjno najmanje oko 92 %, poželjno najmanje oko 93 %, poželjno najmanje oko 94 %, poželjno najmanje oko 95 %, poželjno najmanje oko 96 %, poželjno najmanje oko 97 %, poželjno najmanje oko 98 %, poželjno najmanje oko 99 %, poželjno oko 100 % identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom navedenoj u SEQ ID NO: 08, ili poželjno obuhvata ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 08. Protein omotača može takođe da ima dodatne aminokiseline na N- ili C-terminalnom kraju. Poželjno, protein omotača ima 30 ili manje, poželjno 25 ili manje, poželjno 20 ili manje, poželjno 15 ili manje, poželjno 10 ili manje, poželjno 5 ili manje, poželjno 4 ili manje, poželjno 3 ili manje, poželjno 2 ili manje, poželjno 1 ili manje, dodatnih aminokiselina na N- i/ili C terminalnom kraju. Ove aminokiseline su poželjno fragmenti mesta samocepanja, kao što su P2A ili T2A, koji su opisani u Kim et al.2011, PLoS ONE, 6(4):e18556. Tako, protein omotača opciono obuhvata na N-terminalnom kraju dodatni prolin i/ili na svom C terminalnom kraju dodatnu sekvencu GSGATNFSLLKQAGDVEENPG (SEQ ID NO: 09). Protein omotača može, prema tome, da ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 10.
[0026] Rekombinantni vektor vakcinacije, poželjno MVA, ovog pronalaska obuhvata protein jezgra iz ayw serotipa virusa hepatitisa B. Protein jezgra je poželjno genotipa D/ayw HBV-a. Bilo koji protein jezgra koji se prirodno javlja ili je konstruisan, koji ima imunogenost proteina jezgra koji se prirodno javlja od ayw HBV-a, je pogodan za ovaj pronalazak. U poželjnim načinima ostvarivanja, protein jezgra je fragment proteina jezgra pune dužine koji se sastoji od aminokiselina 1 do 149 proteina pune dužine. Poželjni proteini jezgra obuhvataju sekvencu sa najmanje oko 90 %, poželjno najmanje oko 91 %, poželjno najmanje oko 92 %, poželjno najmanje oko 93 %, poželjno najmanje oko 94 %, poželjno najmanje oko 95 %, poželjno najmanje oko 96 %, poželjno najmanje oko 97 %, poželjno najmanje oko 98 %, poželjno najmanje oko 99 %, poželjno oko 100 % identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom navedenoj u SEQ ID NO: 11, ili poželjno obuhvata ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 11. Protein jezgra može takođe da ima dodatne aminokiseline na N- ili C-terminalnom kraju. Poželjno, protein jezgra ima 30 ili manje, poželjno 25 ili manje, poželjno 20 ili manje, poželjno 15 ili manje, poželjno 10 ili manje, poželjno 5 ili manje, poželjno 4 ili manje, poželjno 3 ili manje, poželjno 2 ili manje, poželjno 1 ili manje, dodatne aminokiseline na N- i/ili C terminalnom kraju. Ove aminokiseline su poželjno fragmenti mesta samocepanja, kao što su P2A ili T2A. Tako, protein jezgra opciono obuhvata na N-terminalnom kraju dodatni prolin i/ili na svom C terminalnom kraju dodatnu sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 12. Fragment proteina jezgra koji se sastoji od aminokiselina pune dužine 1 do 149 i koji ima C terminalnu sekvencu kao što je opisano ovde smatra se da i dalje ima sposobnost da se sklopi u kapside, a dodatna C-terminalna sekvenca treba da ne ometa formiranje kapsida.
[0027] Rekombinantni vektor vakcinacije, poželjno MVA, ovog pronalaska može da obuhvata imunogeni protein omotača (HBs-antigen) iz virusa hepatitisa B sa najmanje oko 90 %, poželjno najmanje oko 91 %, poželjno najmanje oko 92 %, poželjno najmanje oko 93 %, poželjno najmanje oko 94 %, poželjno najmanje oko 95 %, poželjno najmanje oko 96 %, poželjno najmanje oko 97 %, poželjno najmanje oko 98 %, poželjno najmanje oko 99 %, poželjno oko 100 % identiteta sekvence identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom navedenoj u SEQ ID NO: 01. SEQ ID NO: 01 je konsenzus sekvenca velikih proteina omotača sojeva genotipa C, koja je generisana na osnovu poravnanja 500 HBV sekvenci što predstavlja distribuciju HBV sojeva širom sveta. Ilustrativni primer imunogenog proteina omotača sa najmanje oko 90 % identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom navedenoj u SEQ ID NO: 04, koji ima 99% identiteta sekvence sa SEQ ID NO: 1, koja odgovara sekvenci navedenoj u izvedenoj iz putativnog prepre-S proteina HBV-a sa GenBank pristupnim brojem ABV02797 (verzija ABV02797.1 GI:157057635 od 12. Septembra 2007.), u kom je A-determinanta (najvažnija targetna sekvenca za anti-HBs antitela) modifikovana u ayw (za formiranje antitela usmerenih protiv ayw serotipa) razmenom 2 aminokiseline. Postojanje HBV-soja sa suštinski istom sekvencom kao SEQ ID NO: 04 osigurava da su suštinski procesi (savijanje / prerada / prezentacija) funkcionalni za kodiran protein. Stoga, takođe je razmatrano ovim pronalaskom da imunogeni protein omotača sa najmanje oko 90 % identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom navedenoj u SEQ ID NO: 1 predstavlja protein omotača sa najmanje oko 90 %, poželjno najmanje oko 91 %, poželjno najmanje oko 92 %, poželjno najmanje oko 93 %, poželjno najmanje oko 94 %, poželjno najmanje oko 95 %, poželjno najmanje oko 96 %, poželjno najmanje oko 97 %, poželjno najmanje oko 98 %, poželjno najmanje oko 99 %, poželjno oko 100 % identiteta sekvence identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom navedenoj u SEQ ID NO: 04. Štaviše, konsenzus sekvenca za proteine omotača sojeva genotipa C je veoma slična konsenzus sekvenci za proteine omotača sojeva genotipa B. Budući da je imunogeni protein omotača baziran na konsenzus sekvenci proteina omotača za sojeve genotipa C, koja je istovremeno veoma slična konsenzus sekvenci za protein omotača sojeva genotipa B, ovaj imunogeni protein omotača može da indukuje imuni odgovor protiv širokog spektra najmanje sojeva genotipa B i genotipa C. Podrazumeva se da se imunogeni protein omotača sa najmanje 90 % identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom navedenoj u SEQ ID NO: 1 opciono takođe odnosi na njegov imunogeni fragment koji ima najmanje 90 %, poželjno najmanje oko 91 %, poželjno najmanje oko 92 %, poželjno najmanje oko 93 %, poželjno najmanje oko 94 %, poželjno najmanje oko 95 %, poželjno najmanje oko 96 %, poželjno najmanje oko 97 %, poželjno najmanje oko 98 %, poželjno najmanje oko 99 %, poželjno oko 100 % identiteta sekvence sa odgovarajućim fragmentom iz SEQ ID NO: 1. Protein omotača može takođe da ima dodatne aminokiseline na N- ili C-terminalnom kraju. Poželjno, protein omotača ima 30 ili manje, poželjno 25 ili manje, poželjno 20 ili manje, poželjno 15 ili manje, poželjno 10 ili manje, poželjno 5 ili manje, poželjno 4 ili manje, poželjno 3 ili manje, poželjno 2 ili manje, poželjno 1 ili manje, dodatnih aminokiselina na N- i/ili C terminalnom kraju. Ove aminokiseline su poželjno fragmenti mesta samocepanja, kao što su P2A ili T2A. Tako, protein omotača opciono obuhvata na N-terminalnom kraju dodatni prolin i/ili na svom C terminalnom kraju dodatnu sekvencu GSGEGRGSLLTCGDVEENPG (SEQ ID NO: 13). Protein omotača može, tako, da ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 14.
[0028] Rekombinantni vektor vakcinacije, poželjno MVA, ovog pronalaska može takođe da obuhvata imunogeni protein jezgra (HBc-antigen) iz virusa hepatitisa B sa najmanje oko 90 %, poželjno najmanje oko 91 %, poželjno najmanje oko 92 %, poželjno najmanje oko 93 %, poželjno najmanje oko 94 %, poželjno najmanje oko 95 %, poželjno najmanje oko 96 %, poželjno najmanje oko 97 %, poželjno najmanje oko 98 %, poželjno najmanje oko 99 %, poželjno oko 100 % identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom navedenoj u SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO: 2 je konsenzus sekvenca proteina jezgra sojeva genotipa C koja je generisana na osnovu poravnanja 500 HBV-sekvenci što predstavlja distribuciju HBV sojeva širom sveta. Ilustrativni primer imunogenog proteina jezgra sa najmanje oko 90 % identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom navedenoj u SEQ ID NO: 05, koja ima 100% identiteta sekvence sa SEQ ID NO: 2, koja je suštinski identična sekvenci izvedenoj iz proteina kapsida HBV-a sa GenBank pristupnim brojem NP_647607 (verzija NP_647607.1 GI:21326588 od 9. Jula 2015.). Stoga, ovim pronalaskom takođe je razmatrano da imunogeni protein jezgra sa najmanje oko 90 % identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom navedenoj u SEQ ID NO: 2 predstavlja protein omotača sa najmanje oko 90 %, poželjno najmanje oko 91 %, poželjno najmanje oko 92 %, poželjno najmanje oko 93 %, poželjno najmanje oko 94 %, poželjno najmanje oko 95 %, poželjno najmanje oko 96 %, poželjno najmanje oko 97 %, poželjno najmanje oko 98 %, poželjno najmanje oko 99 %, poželjno oko 100 % identiteta sekvence identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom navedenoj u SEQ ID NO: 05. Pored toga, konsenzus sekvenca za sojeve genotipa C je identična konsenzus sekvenci sojeva genotipa B. Budući da je imunogeni protein omotača baziran na konsenzus sekvenci proteina omotača za sojeve genotipa C, koja je identična konsenzus sekvenci za protein omotača sojeva genotipa B, ovaj imunogeni protein omotača može da indukuje imuni odgovor protiv širokog spektra najmanje sojeva genotipa B i genotipa C. Podrazumeva se da se imunogeni protein jezgra sa najmanje oko 90 % identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom navedenoj u SEQ ID NO: 2 opciono takođe odnosi na njegov imunogeni fragment koji ima najmanje 90 % poželjno najmanje oko 91 %, poželjno najmanje oko 92 %, poželjno najmanje oko 93 %, poželjno najmanje oko 94 %, poželjno najmanje oko 95 %, poželjno najmanje oko 96 %, poželjno najmanje oko 97 %, poželjno najmanje oko 98 %, poželjno najmanje oko 99 %, poželjno oko 100 % identiteta sekvence sa odgovarajućim fragmentom iz SEQ ID NO: 2. Kao ilustrativni primer, takav imunogeni fragment može biti fragment koji ima 90 % identiteta sekvence sa aminokiselinama 1 do 149 iz SEQ ID NO: 2. Protein jezgra može takođe da ima dodatne aminokiseline na N- ili C-terminalnom kraju. Poželjno, protein jezgra ima 30 ili manje, poželjno 25 ili manje, poželjno 20 ili manje, poželjno 15 ili manje, poželjno 10 ili manje, poželjno 5 ili manje, poželjno 4 ili manje, poželjno 3 ili manje, poželjno 2 ili manje, poželjno 1 ili manje, dodatnih aminokiselina na N- i/ili C terminalnom kraju. Ove aminokiseline su poželjno fragmenti mesta samocepanja, kao što su P2A ili T2A. Tako, protein jezgra opciono obuhvata na N-terminalnom kraju dodatni prolin. Protein jezgra može dalje opciono da obuhvata svom C terminalnom kraju dodatnu sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 09 ili 13. Protein jezgra može, tako, da ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 15.
1
[0029] Rekombinantni vektor vakcinacije, poželjno MVA, ovog pronalaska može takođe da obuhvata imunogeni RT domen polimeraze iz virusa hepatitisa B sa najmanje oko 90 % poželjno najmanje oko 91 %, poželjno najmanje oko 92 %, poželjno najmanje oko 93 %, poželjno najmanje oko 94 %, poželjno najmanje oko 95 %, poželjno najmanje oko 96 %, poželjno najmanje oko 97 %, poželjno najmanje oko 98 %, poželjno najmanje oko 99 %, poželjno oko 100 % identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom navedenoj u SEQ ID NO: 3. SEQ ID NO: 3 je konsenzus sekvenca RT domena sojeva genotipa A, B, C i D koja je generisana na osnovu poravnanja 500 HBV-sekvenci što predstavlja distribuciju HBV sojeva širom sveta. Ilustrativni primer za takav imunogeni RT domen polimeraze je protein sa aminokiselinskom sekvencom navedenoj u SEQ ID NO: 6, koja ima 97 % identiteta sekvence sa SEQ ID NO: 3. SEQ ID NO: 6 odgovara aminokiselinskoj sekvenci RT domena polimeraze izvedenog iz delimične polimeraze HBV-a sa GenBank pristupnim brojem AFY09280 (verzija AFY09280.1 GI:425891330 od 31. Januara 2013.). SEQ ID NO: 6 je tipičan primer jer je RT domen polimeraze koji se prirodno javlja, a koji ima najveću sličnost sa generisanom konsenzus sekvencom genotipova A, B, C i D. Postojanje HBV-soja sa ovom sekvencom osigurava da su suštinski procesi (savijanje / prerada / prezentacija) funkcionalni za kodiran RT-domen. Stoga, ovim pronalaskom takođe je razmatrano da imunogeni RT domen sa najmanje oko 90 % identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom navedenoj u SEQ ID NO: 3 predstavlja protein omotača sa najmanje oko 90 %, poželjno najmanje oko 91 %, poželjno najmanje oko 92 %, poželjno najmanje oko 93 %, poželjno najmanje oko 94 %, poželjno najmanje oko 95 %, poželjno najmanje oko 96 %, poželjno najmanje oko 97 %, poželjno najmanje oko 98 %, poželjno najmanje oko 99 %, poželjno oko 100 % identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom navedenoj u SEQ ID NO: 06. Budući da RT domen polimeraze obuhvata nekoliko visoko očuvanih epitopa i budući da je RT domen polimeraze obuhvaćene u MVA ovog pronalaska baziran na konsenzus sekvenci RT domena za sojeve genotipa A, B, C i D, ovaj imunogeni RT domen polimeraze može da indukuje imuni odgovor protiv širokog spektra najmanje sojeva genotipa A, B, C i D. Ovaj pronalazak takođe predviđa da RT domen polimeraze može da bude obuhvaćen u polimerazi pune dužine. Tako, takođe polimeraza pune dužine ili skraćena polimeraza pune dužine koja obuhvata imunogeni RT domen je unutar obima ovog pronalaska. Podrazumeva se da se imunogeni RT domen polimeraze sa najmanje 90 % identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom navedenoj u SEQ ID NO: 3 opciono takođe odnosi na njegov imunogeni fragment koji ima najmanje oko 90 % poželjno najmanje oko 91 %, poželjno najmanje oko 92 %, poželjno najmanje oko 93 %, poželjno najmanje oko 94 %, poželjno najmanje oko 95 %, poželjno najmanje oko 96 %, poželjno najmanje oko 97 %, poželjno najmanje oko 98 %, poželjno najmanje oko 99 %, poželjno oko 100 % identiteta sekvence sa odgovarajućim fragmentom iz SEQ ID NO: 3. RT domen polimeraze može takođe da ima dodatne aminokiseline na N- ili C-terminalnom kraju. Poželjno, RT domen ima 30 ili manje, poželjno 25 ili manje, poželjno 20 ili manje, poželjno 15 ili manje, poželjno 10 ili manje, poželjno 5 ili manje, poželjno 4 ili manje, poželjno 3 ili manje, poželjno 2 ili manje, poželjno 1 ili manje, dodatnih aminokiselina na N- i/ili C terminalnom kraju. Ove aminokiseline su poželjno fragmenti mesta samocepanja, kao što su P2A ili T2A. Tako, RT domen opciono obuhvata na N-terminalnom kraju dodatni prolin. Protein jezgra može dalje opciono da obuhvata svom C terminalnom kraju dodatnu sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 13. RT domen može, tako, da ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 16.
[0030] Rekombinantni vektor vakcinacije kao što je opisan ovde, poželjno MVA, može takođe da obuhvata ili dalje eksprimira CD70 molekul. Poželjno CD70 je humani CD70.
[0031] CD70 je ligand za CD27, a takođe je poznat kao CD27L. To je transmembranski protein II tipa i eksprimira se na visoko aktiviranim limfocitima (kao u T- i B-ćelijskim limfomima). Dalje se eksprimira na karcinomu bubrežnih ćelija i procenjuje se kao tumorski cilj). Ekspresija CD70 liganda je normalno usko regulisana, međutim kada je CD27L konstitutivno eksprimiran na B ćelijama, razvija se obiman i efektivan memorijski T ćelijski pul (Arens, R. et al 2004 J Exp Med 199(11) 1595-605). U hroničnim virusnim infekcijama, CD70 signalizacija može biti relevantna za ishod.
[0032] CD27/CD70 je član superfamilije receptor faktora nekroze tumora /faktor nekroze tumora ("TNFR/TNF") dobro poznate po njenim svojstvima T-ćelijskog oblikovanja. Među CD27/CD70, ova familija uključuje CD30/CD30L, CD40/CD40L, OX40/OX40L, 4-1BB/4-1BBL, GITR/GITRL i Fas/FasL.
Uloga CD70, između ostalih kao što su OX40L i 4-1BBL za primarne i sekundarne T-ćelijske odgovore ispitivana je u širokom opsegu modela infektivne bolesti [Hendrick et al., "CD27 is required for generation and long-term maintenance of T-cell immunity," Nature Immunol.1(5):433-440 (2000); Matter et al., " Virus-induced polyclonal B-cell activation improves protective CTL memory via retained CD27 expression on memory CTL," Eur. J. Immunol.35(11):3229-3239 (2005); A. Schildknecht et al., "Priming of CD8+ T-cell responses by pathogens typically depends on CD70-mediated interactions with dendritic cells," Eur. J. Immunol.37(3):716-728 (2007)]. Interesantno, uzvodna regulacija kostimulatornih molekula uključujući, između ostalih, CD70 na dendričnim ćelijama ("DC") može biti indukovana kombinovanom TLR/CD40 stimulacijom [Sanchez et al., "Combined TLR/CD40 stimulation mediates potent cellular immunity by regulating dendritic cell expression of CD70 in vivo," J. Immunol.
178(3):1564-1572 (2007)].
[0033] Stoga, ovim pronalaskom takođe je razmatrano da CD70 ima najmanje oko 90 %, poželjno najmanje oko 91 %, poželjno najmanje oko 92 %, poželjno najmanje oko 93 %, poželjno najmanje oko 94 %, poželjno najmanje oko 95 %, poželjno najmanje oko 96 %, poželjno najmanje oko 97 %, poželjno najmanje oko 98 %, poželjno najmanje oko 99 %, poželjno oko 100 % identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom navedenoj u SEQ ID NO: 26.
[0034] Rekombinantni vektor vakcinacije, poželjno MVA, ovog pronalaska optimizovan je za terapeutsku vakcinaciju protiv širokog HBV spektra i obuhvata antigene sekvence iz nekoliko HBV genotipova koji se često javljaju. Ovaj MVA je, prema tome, sposoban da indukuje imuni odgovor protiv HBV različitih genotipova i serotipova. Pronalazači ovog pronalaska neočekivano su otkrili da u odnosu na MVA vakcinu koja samo obuhvata HBV D/ayw antigen(e), kombinacija HBs-antigena iz A/adw HBV-a sa HBcantigenom iz D/ayw HBV-a neće samo da indukuje širok imuni odgovor protiv HBV genotipova A i D, već će takođe da indukuje još jači T ćelijski odgovor protiv D/ayw HBV-a. Osim toga, MVA ovog pronalaska može takođe da eksprimira HBs-antigen ili HBc-antigen koji se baziraju na konsenzus sekvenci HBV sojeva genotipa C. Ove konsenzus sekvence HBV sojeva genotipa C su, osim toga, ili veoma slične ili čak identične konsenzus sekvenci sojeva genotipa B. Ovo znači da će MVA ovog pronalaska koji obuhvata jednu ili obe ove sekvence dalje da indukuje širok imuni odgovor protiv najmanje sojeva genotipa B i genotipa C. Pored toga, MVA ovog pronalaska može da eksprimira RT domen polimeraze koji se bazira na konsenzus sekvenci sojeva genotipa A, B, C i D i koji sadrži visoko očuvane antigene. Tako, uvođenje ovog RT domena u MVA dalje će promovisati indukovanje širokog imunog odgovora protiv HBV najmanje genotipova A, B, C i D. MVA ovog pronalaska je, osim toga, efektivna vakcina protiv MBV najmanje genotipova A, B, C i D.
[0035] Pojam "antigen" odnosi se na molekul koji sadrži jedan ili više epitopa koji stimulišu imuni sistem domaćina da napravi ćelijski antigen-specifični imuni odgovor, ili humoralni odgovor antitela. Antigeni mogu da uključuju proteine, polipeptide, fragmente antigenih proteina i slično. Osim toga, antigen može biti izveden iz bilo kog poznatog virusa, bakterije, parazita, priona, biljaka, protozoa ili gljiva i može biti ceo organizam. Pojam takođe uključuje tumorske antigene. Sintetički antigeni kao što su poliepitopi, epitopi flankiranja, i ostali rekombinantni ili sintetički izvedeni antigeni takođe su uključeni u ovoj prijavi. U poželjnom načinu ostvarivanja, antigen u ovom pronalasku je polipeptid ili protein.
[0036] U vezi pojma "epitop", pojam "antigen" odnosi se na (dužu) sekvencu, određenije (dužu) aminokiselinsku sekvencu ili proteinsku sekvencu, dok izraz "antigeni epitop" ili "epitop antigena" obuhvata pružanje kraće sekvence iz duže sekvence. Pojam "antigen", prema tome, obuhvata epitope. Pojam "antigen" takođe uključuje varijante proteina, polipeptida i fragmente antigenih proteina kao što su opisani ovde. Takođe, pojam "antigen" obuhvata sekvence identične prirodnoj sekvenci kao i modifikaciju prirodne sekvence, kao što su delecije, dodavanja, umetanja i supstitucije. Poželjno, varijanta antigena ima najmanje oko 50%, najmanje oko 60% ili 65%, najmanje oko 70% ili 75%, najmanje oko 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% ili 89%, češće, najmanje oko 90%, 91%, 92%, 93% ili 94%, a još više tipično najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%, najčešće, najmanje oko 99% aminokiselinskog identiteta sa referentnim antigenom (tj. antigen iz kog je izvedena).
[0037] Epitop, koji se ovde naziva "antigeni epitop", formira deo antigena koji i dalje izaziva imuni odgovor kod domaćina. Epitop, međutim, nije ograničen na određenu sekvencu antigena iz koje je izveden. Tako, pojam "epitop" obuhvata sekvence identične prirodnoj sekvenci kao i modifikaciju prirodne sekvence, kao što su delecije, dodavanja, umetanja i supstitucije. Poželjno, varijanta epitopa ima najmanje oko 50%, najmanje oko 60% ili 65%, najmanje oko 70% ili 75%, najmanje oko 80%, 81%,
1
82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% ili 89%, češće, najmanje oko 90%, 91%, 92%, 93% ili 94% i još češće najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%, najčešće, najmanje oko 99% aminokiselinskog identiteta sa referentnim epitopom (tj. epitop iz kog je izvedena).
[0038] Tehnike za određivanje identiteta sekvence između dve nukleinske kiseline i aminokiselina poznati su u tehnici. Dve ili više sekvenci (polinukleotid ili aminokiselina) mogu da se porede određivanjem njihovog "procentnog identiteta." Procentni identitet dve sekvence, bilo sekvence nukleinske kiseline ili aminokiselinske sekvence, je broj tačnih podudaranja između dve poravnane sekvence izvedene pomoću dužine kraćih sekvenci i množenjem sa 100.
[0039] "Procentni (%) identitet aminokiselinske sekvence" u odnosu na antigene ili epitope opisane ovde definisan je kao procenat aminokiselinskih ostataka u kandidatnoj sekvenci koji su identični sa aminokiselinskim ostacima u referentnoj sekvenci (tj. antigen ili epitop iz kog je izvedena), posle poravnanja sekvenci i uvođenja praznina, po potrebi, da bi se postigao maksimalni procentni identitet sekvence, a ne uzimajući u obzir bilo koje konzervativne supstitucije kao deo identiteta sekvence.
Poravnanje za svrhe određivanja procentnog identiteta aminokiselinske sekvence može se postići na razne načine koji su u okviru veštine u tehnici, na primer, korišćenje javno dostupnog kompjuterskog softvera kao što je BLAST, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) softver. Stručnjaci u tehnici mogu da odrede odgovarajuće parametre za merenje poravnanja, uključujući bilo koje algoritme potrebne da se postigne maksimalno poravnanje po celoj dužini sekvenci koje se porede.
[0040] Isto je primenljivo na "procentni (%) identitet nukleotidne sekvence", mutatis mutandis.
[0041] Na primer, odgovarajuće poravnanje za sekvence nukleinske kiseline obezbeđeno je lokalnim algoritmom za homologiju od Smith i Waterman, (1981), Advances in Applied Mathematics 2: 482-489. Ovaj algoritam može da se primeni na aminokiselinske sekvence upotrebom matrice bodovanja razvijene od strane Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl.3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., SAD, i normalizovane od strane Gribskov (1986), Nucl. Acids Res.14(6): 6745-6763. Egzemplarna primena ovog algoritma za određivanje procentnog identiteta sekvence obezbeđena je od strane Genetics Computer Group (Madison, Wis.) u "BestFit" korisnoj aplikaciji. Zadati parametri za ovaj postupak opisani su u Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual, Verzija 8 (1995) (dostupna od Genetics Computer Group, Madison, Wis.). Poželjan postupak uspostavljenog procentnog identiteta u kontekstu ovog pronalaska je da se koristi MPSRCH paket programa zaštićen autorskim pravom od strane University of Edinburgh, razvijen od strane John F. Collins i Shane S. Sturrok, a distribuiran od strane IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, Calif). Iz ove grupe paketa, Smith-Waterman algoritam može da se koristi gde se zadati parametri koriste za tabelu bodovanja (na primer, vrednost otvaranja praznine 12, vrednost produženja praznine jedan, i praznina šest). Iz generisanih podataka "Match" vrednost odražava "identitet sekvence." Ostali pogodni programi za izračunavanje procentnog identiteta ili sličnosti između sekvenci su opšte poznati u tehnici, na primer, drugi program za poravnanje je BLAST, korišćen sa zadatim parametrima. Na primer, BLASTN i BLASTP mogu da se koriste korišćenjem sledećih zadatih parametara: genetski kod=standardan; filter=nema; lanac=oba; prekid=60; očekivati=10; Matrica=BLOSUM62; Opisi=50 sekvence; sortiraj po=VISOKA OCENA; Baze podataka=nepotrebne, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+ GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR. Detalji ovih programa mogu se naći na sledećoj internet adresi: http://wvw.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST.
[0042] Kodiranje nukleinske kiseline za HBV antigene u MVA ovog pronalaska može biti sadržano u pojedinačnim ekspresionim kasetama, ili poželjno sve zajedno u jednoj ekspresionoj kaseti. Izraz "ekspresiona kaseta" kao što se ovde koristi obuhvata DNK kao i RNK sekvence koje mogu da usmeravaju ekspresiju određene nukleotidne sekvence u odgovarajućoj ćeliji domaćina. Uopšteno, ona obuhvata promoter radno vezan za polinukleotid od interesa, koji je opciono radno vezan za terminacioni signal i/ili ostale regulatorne elemente. Ekspresiona kaseta može da obuhvata nukleotidnu sekvencu regulisanja transkripcije. Ekspresiona kaseta može takođe da obuhvata sekvence potrebne za pravilnu translaciju nukleotidne sekvence. Ekspresiona kaseta može biti ona, koja se prirodno javlja, ali je dobijena u rekombinantnom obliku korisnom za heterolognu ekspresiju. Kodirajući region obično kodira protein od interesa. Ekspresiona kaseta koja obuhvata polinukleotidnu sekvencu od interesa može takođe da bude himerna, što znači da je najmanje jedna od njenih komponenti heterologna u odnosu na najmanje jednu drugu njenu komponentu. Tipično, ovde, ekspresiona kaseta ne javlja se prirodno (tj., heterologna ili egzogena ili strana) u MVA genomu i sposobna je za transkripciju u zaraženim ćlijama.
[0043] Ekspresija nukleotidne sekvence u ekspresionoj kaseti može biti pod kontrolom konstitutivnog promotera ili inducibilnog promotera, koji inicira transkripciju samo kada je ćelija domaćina izložena nekom određenom spoljašnem stimulansu. U ekspresionim kasetama ovog pronalaska, promoter je poželjno poksvirusni promoter. Takav poksvirusni promoter može biti promoter koji se prirodno javlja ili sintetički promoter. Kao ilustrativni primer, promoter poksvirusa je Pr7.5 promoter, hibridni rani/kasni promoter, PrS promoter, sintetički ili prirodni rani ili kasni promoter kao što je jedan od promotera opisanih u WO 2010/102822 ili u WO 2005/054484, ili ATI promoter virusa goveđih boginja. Na primer, poksvirusni promoter je P7.5 (SEQ ID NO: 17) (Endo et al. J Gen Virol.1991 Mar;72 (Pt 3):699-703). Poželjni promoteri, međutim, su promoteri koji su snažniji od P7.5, na primer promoter PH5 kao što je opisan u US 2011/0064769, koji ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 18.
[0044] Sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju antigen ili neki njegov epitop su poželjno kodonoptimizovane. "Kodon-optimizovana" sekvenca nukleinske kiseline odnosi se na sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži kodone koji su zamenjeni kodonima poželjnim od strane željene ćelije domaćina, poželjno humane ćelije domaćina. Sekvenca nukleinske kiseline konvertuje se u kodon-optimizovanu sekvencu nukleinske kiseline koja ima identično prevedenu polipeptidnu sekvencu, ali sa alternativnom
1
upotrebom kodona, određenije korišćenjem najčešćih kodona ciljanog organizma. Postupak stvaranja kodon-optimizovane sekvence nukleinske kiseline nekog antigena uopšteno uključuje identifikovanje kodona u sekvenci koja se prirodno javlja nekog antigena koji su obično n17ot povezani sa visoko eksprimirajućim genima u ciljnom organizmu i njihovu zamenu sa kodonima za koje je poznato da se veoma koriste u genskoj ekspresiji ciljnog organizma. Kodon-optimizovana sekvenca nukleinske kiseline može da pokazuje poboljšanu ekspresiju u odnosu na sekvencu koja se prirodno javlja u željenoj ćeliji domaćina. Stručnjak može da ispita da li će kodon-optimizovana sekvenca indukovati poboljšanje u proizvodnji proteina u odnosu na ne-optimizovanu sekvencu.
[0045] Optimizacijom kodona izbegava se upotreba retkih kodona za željenog domaćina, budući da retki kodoni mogu blokirati ili smanjiti ekspresiju kodiranog proteina. Takođe, poželjno su izbegnute supstitucije koje mogu uvesti signale nukleinske kiseline za željenog domaćina. Takvi signali uključuju, ali nisu ograničeni na, signale splajsovanja, terminacione signale i signale inicijacije. Poželjno, sledeći motivi sekvence izbegnuti su zavisno od tipa korišćenog vektora, npr., terminacioni signal rane transkripcije virusa vakcinije ne mora da se izbegne u mnogim drugim vektorima, unutrašnji TATA-boksovi, chi-mesta, i ribozomalna ulazna mesta; pružanja AT-bogate i GC-bogate sekvence; ARE, INS i CRS elementi sekvence; ponavljajuće sekvence i RNK sekundarne strukture; (kriptična) splajsna donorska i akceptorska mesta, i tačke grananja; i terminacioni signali rane transkripcije vakcinije: (TTTTTNT).
[0046] Tehnike za optimizaciju kodona poznate su u tehnici. Supstitucija nukleotida sa različitim nukleotidima odnosi se na tehničku ili veštačku zamenu nukleotida drugim nukleotidima. Poželjno, supstituisani nukleotidi ne menjaju kodiranu aminokiselinsku sekvencu. Supstitucija može da se izvede identifikovanjem kodona u dvema homolognim nukleotidnim sekvencama koje kodiraju iste aminokiseline i menjajući kodone u jednoj od dve homologne nukleotidne sekvence tako da kodoni i dalje kodiraju iste aminokiseline. Izmene mogu da se izvedu u jednoj, obe ili svim homolognim nukleotidnim sekvencama.
[0047] Ovaj pronalazak predviđa da su svi HBV antigeni poželjno prevedeni kao jedan pojedinačni polipeptidni lanac koji obuhvata nekoliko antigena. Na polipeptidnom lancu, sekvence antigena poželjno su razdvojene sekvencama mesta samocepanja. Tako, polipeptidni lanac koji obuhvata nekoliko antigena biće post-translaciono iscepan na višestruke polipeptidne lance, dok svaki od višestrukih polipeptidnih lanaca može da obuhvata jedan HBV antigen. Ovaj pristup ima prednost da su svi HBV antigeni eksprimirani na oko ekvimolarnim nivoima. Poželjan raspored polipeptidnog lanca koji obuhvata nekoliko antigena je - od N-kraja do C-kraja - protein omotača od A/adw HBV-a, P2A mesto, protein jezgra iz D/ayw HBV-a, P2A mesto, imunogeni RT domen polimeraze iz virusa hepatitisa B kao što je opisana ovde, T2A mesto, imunogeni protein omotača (HBs-antigen) iz hepatitisa B kao što je opisan ovde, T2A mesto, imunogeni protein jezgra (HBs-antigen) iz hepatitisa B kao što je opisan ovde. U poželjnom načinu ostvarivanja, polipeptidni lanac koji obuhvata nekoliko antigena obuhvata sekvencu
1
navedenu u SEQ ID NO: 07. Kao što je prikazano na Fig.16B, dva različita proteina omotača biće smeštena u ćelijskoj membrani i mogu da se izluče kao subvirusne čestice. Ove subvirusne čestice mogu da obuhvataju i proteine omotača koji su od različitih HBV genotipova i mogu biti uzete od strane antigen-prezentujućih ćelija, koje mogu da povećaju indukovani imuni odgovor. Čestice jezgra mogu da formiraju prazne kapside, pri čemu prazne kapside mogu slično da obuhvataju proteine jezgra koji su od različitih HBV genotipova. Takav kapsid pokrenuće imuni odgovor protiv višestrukih HBV genotipova. Polimeraza biće razgrađena u proteazomu i prezentovana u HLA kontekstu. Ovde opisan sklop ima dalje prednost da će većina od samo delimično obrađenih proteina, tj. proteina gde mesto samocepanja nije iscepano, biti inkorporirana u izlučene čestice slične virusu koje će, pretpostavlja se, povećati imuni odgovor, posebno poboljšati i proširiti adaptivni imuni odgovor (uporedi sa Fig.18).
[0048] Ovaj pronalazak obuhvata rekombinantni MVA koji obuhvata HBV gen inkorporiran u raznim mestima umetanja u MVA genomu. "Razna mesta umetanja" znači HBV geni koji kodiraju HBV antigene, respektivno, mogu da budu umetnuti u neko ili jedno ili više različitih mesta umetanja u MVA genomu, pri čemu je poželjno isto mesto umetanja. Različito znači da, na primer, prvo mesto umetanja nije isto kao drugo mesto umetanja.
[0049] Kao ilustrativni primer, HBV geni mogu da se umetnu u intergene regione (IGR) MVA-a. Takav IGR može biti odabran od IGR07/08, IGR 44/45, IGR 64/65, IGR 88/89, IGR 136/137 i IGR 148/149. Međutim, poželjno je da se HBV geni umetnu u mesta delecije koja se prirodno javljaju I, II, III, IV, V ili VI MVA-a, pri čemu je poželjno da se najmanje jedan ili poželjno svi HBV gen(i) umetnu u mesto delecije III koje se prirodno javlja. Kao ilustrativni primer, svi HBV geni mogu biti obuhvaćeni u jednoj ekspresionoj kaseti na jednom otvorenom okviru čitanja kao što je opisan ovde, pri čemu je jedna ekspresiona kaseta umetnuta u mesto delecije III koje se prirodno javlja.
[0050] Rekombinantni MVA virus može se generisati rutinskim postupcima poznatim u tehnici. Postupci za dobijanje rekombinantnih poksvirusa ili za umetanje egzogenih kodirajućih sekvenci u poksvirusni genom dobro su poznati stručnjaku u tehnici. Na primer, postupci su opisani u sledećim referencama: Molecular Cloning, A laboratory Manual. Second Edition. By J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis. Cold Spring Harbor Laboratory Press.2003: opisuje tehnike za standardne tehnike molekularne biologije kao što su kloniranje DNK, DNK i RNK izolovanje, western blot analiza, RT-PCR i tehnike PCR amplifikacije. Virology Methods Manual. Uređeno od strane Brian W J Mahy i Hillar O Kangro. Academic Press.1996: opisuje tehnike za rukovanje i manipulaciju virusima. Molecular Virology: A Practical Approach. Uređeno od strane AJ Davison i RM Elliott. The Practical Approach Series. IRL Press at Oxford University Press. Oxford 1993. Poglavlje 9: Expression of genes by Vaccinia virus vectors. Current Protocols in Molecular Biology. Izdavač: John Wiley and Son Inc.1998. Poglavlje 16, odeljak IV:
Expression of proteins in mammalian cells using vaccinia viral vector: opisuje tehnike i znati-kako za rukovanje, manipulaciju i genetički inženjering MVA-a.
1
[0051] Za generisanje rekombinantnih poksvirusa prema ovom pronalasku, mogu da se primene različiti postupci. DNK sekvenca koja se umeće u virus može biti smeštena u E. coli plazmidni konstrukt u kom je umetnuta DNK homologna delu DNK-a poksvirusa. Odvojeno, DNK sekvenca koja se umeće može biti povezana sa promoterom. Promoter-gen veza može biti pozicionirana u plazmidnom konstruktu tako da je promoter-gen veza flankirana na oba kraja sa DNK homolognom DNK sekvenci koja flankira region poksvirusne DNK koji sadrži ne-esencijalni lokus. Dobijeni plazmidni konstrukt može biti amplifikovan propagacijom unutar E. coli bakterija i izolovan. Izolovani plazmid koji sadrži DNK gensku sekvencu koja se umeće može biti transfektovan u ćelijsku kulturu, npr., fibroblasti pilećih embriona (CEF), zajedno sa infekcijom ove kulture poksvirusom. Rekombinacija između homologne poksvirusne DNK u plazmidu i virusnog genoma, respektivno, može da generiše poksvirus modifikovan prisustvom stranih DNK sekvenci.
[0052] Ćelija pogodne ćelijske kulture kao, npr., CEF ćelije, može biti inficirana poksvirusom. Inficirana ćelija može biti, naknadno, transfektovana sa prvim plazmidnim vektorom koji obuhvata strani(e) gen ili gene, poželjno pod transkripcionom kontrolom elementa kontrole ekspresije poksvirusa. Kao što je prethodno objašnjeno, plazmidni vektor takođe obuhvata sekvence koje mogu da usmere umetanje egzogene sekvence u odabrani deo poksvirusnog genoma. Opciono, plazmidni vektor takođe sadrži kasetu koja obuhvata marker i/ili selekcioni gen radno vezan za poksvirusni promoter. Pogodni marker ili selekcioni geni su, npr., geni koji kodiraju zeleni fluorescentni protein, β-galaktozidaza, neomicinfosforiboziltransferaza ili drugi markeri. Upotreba selekcionih ili marker kaseta pojednostavljuje identifikaciju i izolovanje generisanog rekombinantnog poksvirusa. Međutim, rekombinantni poksvirus može takođe da bude identifikovan PCR tehnologijom. Naknadno, dalja ćelija može biti inficirana rekombinantnim poksvirusom dobijenim kako je prethodno opisano i transfektovana drugim vektorom koji obuhvata drugi strani(e) gen ili gene. U slučaju da ovaj gen može biti uveden u različito mesto umetanja poksvirusnog genoma, drugi vektor se takođe razlikuje u poksvirus-homolognim sekvencama koje usmeravaju integraciju drugog stranog gena ili gena u genom poksvirusa. Nakon što je došlo do homologne rekombinacije, može da se izoluje rekombinantni virus koji obuhvata dva ili više stranih gena. Za uvođenje dodatnih stranih gena u rekombinantni virus, faze infekcije i transfekcije mogu se ponoviti upotrebom rekombinantnog virusa izolovanog u prethodnim fazama za infekciju i upotrebom daljeg vektora koji obuhvata dalji strani gen ili gene za transfekciju.
[0053] Alternativno, faze infekcije i transfekcije kao što su prethodno opisane su naizmenične, tj., pogodna ćelija može prvo da bude transfektovana plazmidnim vektorom koji obuhvata strani gen a, potom, inficirana poksvirusom. Kao dalja alternativa, takođe je moguće da se uvede svaki strani gen u različite viruse, ko-inficira ćeliju svim dobijenim rekombinantnim virusima i proveri za rekombinantu uključujući sve strane gene. Treća alternativa je vezivanje DNK genoma i strane sekvence in vitro i rekonstitucija rekombinovanog DNK genoma virusa vakcinije pomoću pomoćnog virusa. Četvrta
1
alternativa je homologna rekombinacija u E.coli ili drugim bakterijskim vrstama između genoma virusa vakcinije kloniranog kao bakterijski veštački hromozom (BAC) i linearne strane sekvence flankirane DNK sekvencama homolognim sa sekvencama koje flankiraju željeno mesto integracije u genomu virusa vakcinije.
[0054] Budući da je rekombinantni MVA virus prema ovom pronalasku veoma ograničene replikacije a, time, veoma oslabljen, on je idealan kandidat za lečenje širokog spektra sisara uključujući ljude, a čak ljude sa ugroženim imunitetom. Štaviše, proizvodnja MVA-baziranih vakcina je više ili manje nezavisna od postojećeg kapaciteta proizvodnje konvencionalnih vakcina, budući da MVA može da se povoljno kultiviše u CEF ćelijama. Tako, MVA-bazirana vakcina ovog pronalaska može da se proizvede u velikim količinama u kratkom vremenskom periodu. Osim toga, MVA vektor vakcine ovog pronalaska može da isporuči višestruke HBV antigene i, na taj način, omogući istovremeno indukovanje humoralnog i ćelijskog imuniteta visokog nivoa. Stoga, ovaj pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju i takođe vakcinu za izazivanje imunog odgovora u telu živih životinja, uključujući čoveka.
[0055] Vakcina poželjno obuhvata MVA viruse u opsegu koncentracija od 10<4>do 10<9>TCID50/ml, poželjno u opsegu koncentracija od 10<5>do 5x10<8>TCID50/ml, poželjnije u opsegu koncentracija od 10<6>do
10<8>TCID50/ml, a najpoželjnije u opsegu koncentracija od 10<7>do 10<8>TCID50/ml.
[0056] Poželjna doza vakcinacije za ljude obuhvata 10<6>do 10<9>TCID50, najpoželjnije doza od 10<6>TCID50ili 10<7>TCID50ili 10<8>TCID50.
[0057] Farmaceutska kompozicija može uopšteno da uključuje jedan ili više farmaceutski prihvatljivih i/ili dozvoljenih aditiva kao što su nosači, antibiotici, konzervansi, adjuvansi, razblaživači i/ili stabilizatori. Takve pomoćne supstance mogu biti voda, fiziološki rastvor, glicerol, etanol, ovlaživači ili emulgatori, pH puferujuće supstance, ili slično. Pogodni nosači obično su veliki molekuli koji sporo metabolišu kao što su proteini, polisaharidi, polimlečne kiseline, poliglikolne kiseline, polimerne aminokiseline, kopolimeri aminokiselina, agregati lipida, ili slično.
[0058] Izraz "farmaceutski prihvatljiv" znači netoksični materijal koji ne ometa efektivnost biološke aktivnosti MVA-a prema ovom pronalasku. Karakteristike nosača zavisiće od puta davanja. Farmaceutska kompozicija može dalje da sadrži ostale agense koji ili poboljšavaju aktivnost ili upotrebu u lečenju. Ti dodatni faktori i/ili agensi mogu biti uključeni u farmaceutsku kompoziciju koja će se primeniti za postupak imunizacije prema ovom pronalasku da bi se proizveo sinergistički efekat ili da se minimiziraju neželjeni efekti. Tehnike za formulisanje i davanje MVA-a prema ovom pronalasku mogu se naći u "Remington's Pharmaceutical Sciences", (Muck Publishing Gompany, Easton, PA, poslednje izdanje).
[0059] Za pripremu vakcina, rekombinantni MVA prema ovom pronalasku mogu da se konvertuju u fiziološki prihvatljivi oblik. Ovo se može izvesti na osnovu iskustva u pripremi poksvirus vakcine korišćene za vakcinaciju protiv velikih boginja (kao što je opisano od strane Stickl, H. et al. [1974] Dtsch. med. Wschr.99, 2386-2392).
1
[0060] Na primer, prečišćen virus može biti čuvan na -80°C sa titrom od 5x10<8>TCID50/ml formulisan u oko 10 mM Tris, 140 mM NaCl pH 7.4. Za pripremu injekcija vakcine, npr., 10<2>-10<8>čestica virusa može biti liofilizirano u 100 ml fosfat-puferisanog fiziološkog rastvora (PBS) u prisustvu 2% peptona i 1% humanog albumina u ampuli, poželjno staklenoj ampuli. Alternativno, injekcije vakcine mogu se proizvesti postepenim zamrzavanjem-sušenjem virusa u formulaciji. Ova formulacija može da sadrži dodatne aditive kao što su manitol, dekstran, šećer, glicin, laktoza ili polivinilpirolidon ili druge pomoćne supstance kao što su antioksidansi ili inertni gas, stabilizatori ili rekombinantni proteini (npr. humani serum albumin) pogodan za in vivo davanje. Staklena ampula zatim se zapečati i može da se čuva između 4 °C i sobne temperature nekoliko meseci. Međutim, dokle god ne postoji potreba, ampula se čuva poželjno na temperaturama ispod -20 °C.
[0061] Za vakcinaciju ili terapiju, liofilizat može da se rastvori u vodenom rastvoru, poželjno fiziološkom slanom rastvoru ili Tris puferu, i da se da ili sistemski ili lokalno, tj. parenteralno, subkutano, intravenski, intramuskularno, ili bilo kojim drugim putem davanja koji je poznat stručnjaku. Režim davanja, doza i broj davanja može biti optimizovan od strane stručnjaka u tehnici na poznat način.
[0062] Podrazumeva se da poželjna vakcina ili farmaceutska kompozicija obuhvata rekombinantni MVA ovog pronalaska kao što je opisan ovde. Takođe se podrazumeva da rekombinantni MVA ovog pronalaska može da se koristi u terapiji ili vakcinaciji, poželjno terapeutskoj vakcinaciji, poželjno protiv HBV.
[0063] Rekombinantni MVA ovog pronalaska može povoljno da se koristi za proizvodnju leka ili vakcine koja je korisna za lečenje i/ili sprečavanje patološkog stanja kao što je infektivna bolest ili hepatitis B.
[0064] Ovaj pronalazak dalje predviđa postupak vakcinacije protiv hepatitisa B. Postupak vakcinacije može biti postupak terapeutske vakcinacije, tj. za lečenje neke bolesti. U postupku vakcinacije ovog pronalaska, MVA virus koji eksprimira protein omotača iz adw HBV-a kao što je opisan ovde i MVA virus koji eksprimira protein jezgra iz ayw HBV-a kao što je opisan ovde daju se subjektu. Subjekat može biti bilo koji subjekat kao što je definisan ovde, poželjno humani subjekat. Subjektu je poželjno potrebno davanje. U postupku vakcinacije ovog pronalaska, protein omotača iz adw HBV-a i protein jezgra iz ayw HBV-a može biti eksprimiran od strane dva različita MVA, pri čemu svaki od MVA eksprimira ili protein omotača ili protein jezgra. U ovom slučaju, oba MVA moraju da se daju subjektu. Protein omotača iz adw HBV-a i protein jezgra iz ayw HBV-a mogu, međutim, takođe da se eksprimiraju od strane istog MVA. U ovom slučaju, samo jedan MVA mora da se da subjektu. Podrazumeva se da je drugi način ostvarivanja poželjan.
[0065] Dalje, ovaj pronalazak obuhvata MVA virus koji eksprimira protein omotača iz adw HBV-a kao što je opisan ovde koji dalje eksprimira CD70 molekul i MVA virus koji eksprimira protein jezgra iz ayw HBV-a kao što je opisan ovde koji dalje eksprimira CD70 molekul koji se daje subjektu. Subjekat može da bude bilo koji subjekat kako je definisano ovde, poželjno humani subjekat. Subjektu je poželjno potrebno
2
davanje. Dalje, subjekat je poželjno pacijent sa hroničnim hepatitisom B kom je potreban lekoviti tretman. U postupku vakcinacije ovog pronalaska, protein omotača iz adw HBV-a i CD70 molekul i protein jezgra iz ayw HBV-a i CD70 molekul mogu da se eksprimiraju od strane dva različita MVA, pri čemu svaki od MVA eksprimira ili protein omotača i CD70 ili protein jezgra i CD70. U ovom slučaju, oba MVA treba da se daju subjektu. Protein omotača iz adw HBV-a i protein jezgra iz ayw HBV-a i CD70 molekul mogu, međutim, takođe da se eksprimiraju od strane istog MVA. U ovom slučaju, samo jedan MVA mora da se da subjektu. Podrazumeva se da je poželjan drugi način ostvarivanja.
[0066] Dalje se podrazumeva da postupak vakcinacije ovog pronalaska obuhvata davanje MVA ovog pronalaska subjektu i da je MVA poželjno u efektivnoj dozi.
[0067] Postupak vakcinacije ovog pronalaska može da obuhvata najmanje dve faze vakcinacije. Ovde, imuni odgovor je izazvan primarnim/pojačanim režimima u kojima "slobodni" proteini, kao što je protein omotača iz a/adw HBV-a i/ili protein jezgra iz D/ayw HBV-a, koriste se za primarnu vakcinaciju, pri čemu se jedan ili više rekombinantnih MVA ovog pronalaska koristi(e) za najmanje jednu pojačanu vakcinaciju.
[0068] Stoga, u prvoj fazi (primarna), "proteinska vakcina" može se dati subjektu. Izraz "proteinska vakcina" kako se ovde koristi odnosi se na kompoziciju koja obuhvata protein omotača iz A/adw HBV-a i/ili protein jezgra iz D/ayw HBV-a, poželjno protein omotača i protein jezgra. Oba, protein omotača i protein jezgra, su poželjno "slobodni" proteini, što znači da poželjno nisu obuhvaćeni u virusnim česticama. Protein omotača i protein jezgra mogu biti prisutni u dve kompozicije koje se daju same ili u međusobnoj kombinaciji. Protein omotača i protein jezgra mogu takođe da budu obuhvaćeni u jednoj kompoziciji. Protein omotača ili protein jezgra obuhvaćen u "proteinskoj vakcini" može biti rekombinantno proizveden od strane nekog mikroorganizma, na primer, od strane ćelije neke bakterije ili neke gljive.
[0069] Podrazumeva se da je "proteinska vakcina" poželjno suštinski bez virusnih čestica, posebno suštinski bez MVA. "Suštinski bez" u ovom kontekstu znači da proteinska vakcina obuhvata manje od 10<3>TCID50/ml, poželjno manje od 10<2>TCID50/ml, poželjno manje od 10<1>TCID50/ml, poželjno manje od 10° TCID50/ml, poželjno manje od 10<-1>TCID50/ml, poželjno manje od 10<-2>TCID50/ml. Proteinska vakcina može dalje da obuhvata pogodan adjuvans. Kako se ovde koristi, "adjuvans" se odnosi na supstancu koja poboljšava, uvećava ili potencira imuni odgovor domaćina (antitelo i/ili ćelija-posredovan) na antigen ili njegov fragment. Pogodni adjuvansi poznati su stručnjaku. Poželjan adjuvans odabran je iz grupe koju čine poli[di(natrijum karboksilatoetilfenoksi)]fosfazen (PCEP), oligonukleotid koji je stimulator imuniteta, agonist toličnog receptora (TLR), saponin ili njihove kombinacije, pri čemu je TLR agonist poželjno TLR 3 agonist, TLR 4 agonist, TLR 7 agonist, TLR 8 agonist ili TLR 9 agonist, i pri čemu je oligonukleotid koji je stimulator imuniteta poželjno poli I/C, poli ICLC (stabilizovani oblik poli I/C) CpG, Rig-I ligand, STING ligand, ciklični di-AMP, ciklični di-CMP, ciklični di-GMP, TLR 7 agonist, TLR8 agonist, CTA1DD, ili dmLT, ili njihove kombinacije. Međutim, pronalazači ovog pronalaska otkrili su da ako proteinska vakcina obuhvata adjuvans bez aluminijuma, kao što je, na primer, CpG adjuvans ili PCEP, snažniji T ćelijski odgovor biće izazvan postupkom vakcinacije ovog pronalaska. Ovo otkriće je neočekivano budući da konvencionalne vakcine koje obuhvataju HBV antigene, kao što su Engerix-B obično obuhvataju adjuvans koji sadrži aluminijum kao što je aluminijum hidroksid. Zbog toga, proteinska vakcina opisana ovde poželjno obuhvata CpG adjuvans ili PCEP ili oba. Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje virusni vektor, poželjno MVA virusni vektor, gde je adjuvans ciklični di-AMP.
[0070] U daljoj fazi (pojačanje), jedan ili više rekombinantnih MVA kao što su opisani ovde se daje(u) subjektu. Jedan ili više rekombinantnih MVA mogu biti sadržani u farmaceutskoj kompoziciji ili vakcini kao što je opisano ovde.
[0071] Tipično, rekombinantni MVA daje se najmanje oko 1 dana posle primarne vakcinacije, poželjno najmanje oko 5 dana, poželjno najmanje oko 1 nedelje, poželjno oko 1 nedelje do oko 8 nedelja, poželjno oko 2 nedelje do oko 5 nedelja, poželjno oko 3 nedelje do oko 4 nedelja.
[0072] Takođe je obuhvaćeno ovim pronalaskom, da režim vakcinacije obuhvata dve ili više pojačane vakcinacije posle primarnih vakcinacija. U poželjnom načinu ostvarivanja, proteinska vakcina koristi se za primarnu vakcinaciju i za prvu pojačanu vakcinaciju. Ovim pronalaskom takođe je predviđeno da može da se izvede druga, treća ili dalja faza pojačane vakcinacije koja koristi proteinsku vakcinu. Nakon pojačane vakcinacije proteinskim vakcinama, izvodi se pojačana vakcinacija davanjem jednog ili više rekombinantnih MVA kao što je opisano ovde. Ovim pronalaskom takođe je obuhvaćeno ovde da prvo davanje rekombinantnog MVA može biti praćeno drugim, trećim ili daljim davanjima (dalje pojačane vakcinacije).
[0073] U takvom slučaju, prva pojačana vakcinacija proteinskom vakcinom izvodi se najmanje oko 1 dana posle prethodne faze vakcinacije, poželjno najmanje oko 5 dana, poželjno najmanje oko 1 nedelje, poželjno oko 1 nedelje do oko 8 nedelja, poželjno oko 2 nedelje do oko 5 nedelja, poželjno oko 3 nedelje do oko 4 nedelja. Svaka naredna pojačana vakcinacija ili rekombinantnim MVA ili proteinskom vakcinom zatim se sprovodi najmanje oko 1 dana nakon prethodne vakcinacije, poželjno najmanje oko 5 dana, poželjno najmanje oko 1 nedelje, poželjno oko 1 nedelje do oko 8 nedelja, poželjno oko 2 nedelje do oko 5 nedelja, poželjno oko 3 nedelje do oko 4 nedelja.
[0074] Postupak vakcinacije ovog pronalaska može dalje da obuhvata tretiranje subjekta sa siRNK i/ili shRNK pre primarne-pojačane vakcinacije. Takve siRNK ili shRNK predviđene su za ciljanje HBV gena i, time, smanjuju ekspresiju ciljanih HBV gena u subjektu inficiranom sa HBV. Poželjno, siRNK i/ili shRNK ciljaju 3' regione RNK-a koji kodiraju ciljane HBV gene. U poželjnom načinu ostvarivanja ciljani 3' regioni RNK-a koji kodiraju ciljane HBV gene smešteni su uzvodno od poli A krajeva RNK-a (tj. ciljani region je 5' na poli A kraju, ili drugim rečima u 5' ka 3' smeru ciljani region nailazi prvi, praćeno poli A krajem). Ako se siRNK koriste, predviđeno je da je najmanje jedan HBV gen ciljan. Međutim, u poželjnom načinu ostvarivanja svi HBV geni su ciljani. Jedna siRNK ili shRNK može da se koristi za ciljanje HBV gena.
Međutim, takođe više od jedne siRNK i/ili shRNK može da se koristi za ciljanje HBV gena. Predviđeno je da takvo tretiranje sa siRNK i/ili shRNK smanjuje ekspresiju (tj. translaciju) ciljanog/ih gena za najmanje oko 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% ili 85%, poželjno najmanje oko 90%. Takvo tretiranje subjekta sa siRNK i/ili shRNK može biti sprovedeno između 1 dana i 20 nedelja, 1 nedelje i 19 nedelja, 2 nedelje i 18 nedelja, 3 nedelje i 17 nedelja, 4 nedelje i 16 nedelja, 5 nedelja i 15 nedelja, 6 nedelja i 14 nedelja, 7 nedelja i 13 nedelja, poželjno oko 8 nedelja pre početka primarne-pojačane vakcinacije. Pronalazači su neočekivano otkrili da takvo tretiranje sa siRNK i/ili shRNK pre početka primarne-pojačane vakcinacije povećava generisani T ćelijski odgovor posle primarne-pojačane vakcinacije.
[0075] Postupak za imunizaciju prema ovom pronalasku činiće upotrebu terapeutski efektivne količine proteinske vakcine ili rekombinantnog MVA. Terapeutski efektivna doza dalje se odnosi na onu količinu jedinjenja/sastojka dovoljnu da dovede do ublažavanja simptoma, npr. tretman, lečenje, prevencija ili ublažavanje takvih stanja. U poželjnom načinu ostvarivanja imunizacija može biti i profilaktička i/ili terapeutska. Efektivne doze prema ovom pronalasku za pobuđivanje imunog odgovora variraju zavisno od mnogih različitih faktora, uključujući vrstu antigena ili vakcine, sredstva davanja, ciljno mesto, da li je subjekat čovek ili životinja, i da li je tretman profilaktički ili terapeutski. Poželjne doze rekombinantnog MVA opisane su ovde.
[0076] Ovaj pronalazak obezbeđuje postupke za imunizaciju subjekta životinje, uključujući ptice.
Poželjno, životinja je sisar, uključujući pacove, zečeve, svinje, miševe i ljude, obuhvatajući davanje doze MVA subjektu. Najpoželjnije, subjekat je čovek. U jednom načinu ostvarivanja, subjekat je odrasla osoba.
[0077] Davanje može da se izvodi bilo kojim poznatim putem davanja kako odredi stručnjak. Poželjno, davanje je parenteralno, enteralno mukozno, poželjno intramuskularno, intravensko, subkutano (npr., skarifikacijom ili injekcijom), nazalno (npr., inhalacijom) ili oralno. Poželjni režimi davanja su parenteralni ili mukozni.
[0078] Dalje, ovaj pronalazak obezbeđuje davanje koje je intramuskularno, a gde davanje obuhvata davanje nekog adjuvansa. Poželjno, adjuvans obuhvata ciklični di-AMP.
[0079] Pored toga, ovaj pronalazak takođe obuhvata davanje koje je subkutano ili intramuskularno, a gde davanje obuhvata davanje nekog adjuvansa. Poželjno, adjuvans obuhvata poli I/C ili Rig-I-ligand.
[0080] Ovaj pronalazak takođe razmatra postupke vakcinacije kao što su opisani gore, gde vektor vakcinacije nije MVA već jedan ili više Salmonella soj(eva) koji eksprimira isti antigen(e) kao MVA. Stoga, postupak vakcinacije opisan ovde primenjuje mutatis mutandis za postupke vakcinacije koji koriste Salmonella soj. Takav postupak vakcinacije poželjno je postupak mukozne vakcinacije, u kom je proteinska vakcina poželjno adjuvansirana sa CTA1DD ili dmLT.
2
[0081] Ovaj pronalazak takođe obuhvata bilo koje jedinjenje opisano u postupcima ovde za upotrebu u ovim postupcima. Na primer, ovaj pronalazak obuhvata rekombinantni MVA za upotrebu u postupku vakcinacije kao što je opisan ovde.
[0082] Ovaj pronalazak takođe razmatra farmaceutsku kompoziciju ili vakcinu koja obuhvata jedan ili više od rekombinantnih vektora vakcinacije ovog pronalaska. Kao što je već navedeno, "vakcina" može da se koristi za sprečavanje ili lečenje patološkog stanja kod subjekta. Pojam obuhvata obe subjedinične vakcine, tj. kompozicije vakcine koje sadrže antigene koji su odvojeni i izolovani iz celog organizma sa kojim je antigen povezan u prirodi, kao i kompozicije koje sadrže rekombinantni poksvirus ovog pronalaska koji nosi, inter alia, antigen i/ili njegov epitop. Vakcina može ili ne mora da uključuje jednu ili više dodatnih komponenata koje poboljšavaju imunološku aktivnost aktivne komponente. Vakcina može, pored toga, da obuhvata dalje komponente uobičajene u farmaceutskim kompozicijama. Vakcina ovog pronalaska je, poželjno, za humanu i/ili veterinarsku upotrebu.
[0083] Vakcina ili kompozicija ovog pronalaska, npr. vakcina koja obuhvata MVA virus, može uopšteno da uključuje jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, aditiva, antibiotika, konzervanasa, adjuvanasa, razblaživača i/ili stabilizatora. Te pomoćne supstance mogu biti voda, fiziološki rastvor, glicerol, etanol, ovlaživači ili emulgatori, pH puferujuće supstance, ili slično. Pogodni nosači su obično veliki molekuli koji sporo metabolišu, kao što su proteini, polisaharidi, polimlečne kiseline, poliglikolne kiseline, polimerne aminokiseline, kopolimeri aminokiselina, agregati lipida ili slično. Ostali nosači kao što je opisano u US 2011/0052627 Col.7 mogu, takođe, da se dodaju u kompoziciju.
[0084] Ovaj pronalazak takođe obuhvata komplet koji obuhvata najmanje dve fiolice/kontejnera za primarnu/pojačanu imunizaciju, pri čemu najmanje jedna fiolica/kontejner obuhvata proteinsku vakcinu opisanu ovde za prvu inokulaciju (primarna inokulacija) i opciono dodatne fiolice za dalje inokulacije (pojačane inokulacije), gde dodatna fiolica poželjno obuhvata rekombinantni vektor vakcinacije ovog pronalaska. Komplet takođe obuhvata najmanje jednu dodatnu fiolicu/kontejner koji obuhvata rekombinantni vektor vakcinacije kao što je opisan ovde za najmanje dalju inokulaciju ("pojačana inokulacija"). Komplet može dalje da obuhvata instrukcije za davanje rekombinantnog vektora vakcinacije subjektu.
[0085] Ovaj pronalazak razmatra da je poželjan subjekat čovek. Instrukcije mogu da naznačavaju da se proteinska vakcina kako je definisana ovde i ili rekombinantni vektor vakcinacije daje subjektu u višestrukim (tj., 2, 3, 4, 5, 6, itd.) dozama u određenim vremenskim tačkama (npr., najmanje 4 nedelje, najmanje 6 nedelja, najmanje 8 nedelja nakon prethodnog davanja). Poželjno, instrukcije naznačavaju da će se proteinska vakcina i/ili rekombinantni vektor vakcinacije dati u najmanje 3 ili najmanje 4 doze.
[0086] Ovim pronalaskom je predviđen komplet opisan ovde, pri čemu vakcina(e) obuhvaćena(e) u kompletu je/su pogodna(e) za parenteralno davanje. U takvom kompletu, proteinska vakcina može poželjno da bude adjuvansirana sa PCEP i/ili CpG vakcinom, a rekombinantni vektor vakcinacije može poželjno da bude MVA ovog pronalaska.
[0087] Ovim pronalaskom takođe je predviđen komplet opisan ovde, pri čemu vakcina(e) obuhvaćena(e) u kompletu je/su pogodna(e) za mukozno davanje. U takvom kompletu, proteinska vakcina može poželjno da bude adjuvansirana sa CTA1DD, dmLT, PCEP, c-di-AMP, c-di-CMP, c-diGMP ili njihovim kombinacijama, a rekombinantni vektor vakcinacije može poželjno da bude Salmonella soj, CMV-, VSV-baziran vektor, adenovirusni vektor, ili vektor malih boginja, poželjno Salmonella soj ovog pronalaska.
[0088] Pored toga, ovim pronalaskom takođe je predviđen komplet opisan ovde, pri čemu vakcina(e) obuhvaćena(e) u kompletu je/su pogodna(e) za mukozno davanje. U takvom kompletu, proteinska vakcina može poželjno da bude adjuvansirana sa CTA1DD, dmLT, PCEP, poli I/C, Rig-I-ligand, c-di-AMP, cdi-CMP, c-diGMP ili njihovim kombinacijama, a rekombinantni vektor vakcinacije može poželjno da bude Salmonella soj ovog pronalaska, ili poželjno Salmonella soj, CMV-, VSV-baziran vektor, adenovirusni vektor, ili vektor malih boginja.
[0089] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje komplet, pri čemu je proteinska kompozicija pogodna za intramuskularno davanje. Poželjno, kompozicija obuhvata najmanje jedan adjuvans koji je ciklični-di-AMP.
[0090] Ovime je takođe predviđen komplet, pri čemu je proteinska kompozicija pogodna za subkutano ili intramuskularno daanje. Poželjno, kompozicija obuhvata najmanje jedan adjuvans koji je poli I/C.
[0091] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje ćeliju (domaćina) koja obuhvata rekombinantni MVA opisan ovde. Primeri ćelija koje su permisivne prema poksvirusima uključuju, ali nisu ograničene na, COS, HEK-293, BHK, CHO, TM4, CVI, VERO-76, HELA, MDCK, BRL 3A i NIH/3T3 ćelije. Za MVA, poželjne ćelije su CEF i BHK ćelije. Dodatne ćelijske linije poznate su prosečnim stručnjacima u tehnici. Na uvođenje konstrukta poksvirusa u ćeliju može uticati transfekcija kalcijum fosfatom, elektroporacija, infekcija i ostali postupci poznati u tehnici i opisani u standardnim laboratorijskim priručnicima, kao što je Current Protocols in Molecular Biology John Wiley & Sons, Inc. New York.
[0092] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje ćeliju (domaćina) inficiranu rekombinantnim poksvirusom. Prema tome, ćelija (domaćina) može biti inficirana MVA virusnim vektorom, i transfektovana daljim vektorom, npr., plazmidnim vektorom, koji obuhvata gen koji se umeće, poželjno pod transkripcionom kontrolom MVA, ili elementa ili promotera kontrole ekspresije poksvirusa, kao što je sintetički PrS promoter. Kao što je prethodno objašnjeno, plazmidni vektor obuhvata sekvence koje mogu da usmere umetanje heterologne sekvence u odabrani deo genoma poksvirusa, kao što su one koje flankiraju jedno od mesta delecije ili intergenih regiona koji se prirodno javljaju.
[0093] Pojam "oko" ili "približno" kao što se ovde koristi znači unutar odstupanja od 20%, kao što je unutar odstupanja od 10% ili unutar 5% date vrednosti ili opsega.
2
KRATAK OPIS NACRTA
[0094]
Fig.1: Proteinska-primarna / MVA-pojačana vakcinacija je visoko imunogena. (A) S i jezgarni otvoreni okviri čitanja ayw subtipa HBV-a umetnuti su u deleciju III (del III) MVA genoma pod kontrolom poksvirusnih promotera P7.5 i PH5, respektivno. (B) Miševi divljeg tipa (n=3) vakcinisani su jedanput (dan 0; ispunjeni stubići) ili dvaput (dan 0 i 21; prugasti stubići) sa MVA-S (1x10<8>i. u.), MVA-jezgro (1x10<8>i. u.) ili MVAwt (1x10<8>i. u.).8. dana (posle primarne) ili 27. dana (posle pojačane), splenociti su stimulisani HBsAg (S190i S208)- ili HBcAg (C93)- izvedenim peptidima i analizirani za IFNy ekspresiju intracelularnim bojenjem citokina. (C) C57BL/6 miševi su vakcinisani sa 12 µg rekombinantnog HBsAg ili HBcAg. CpG korišćen je kao adjuvans.8. dana, splenociti su stimulisani HBsAg- ili HBcAg-izvedenim peptidima i analizirani za IFNγ ekspresiju pomoću ICS. (D) C57BL/6 miševi su primarno vakcinisani sa 12 µg rekombinantnim, CpG adjuvansiranim HBcAg ili HBsAg, i 21. dana, pojačani sa MVA-jezgro (1x10<8>i. u.) ili MVA-S (1x10<8>i. u.).27. dana, splenociti su stimulisani HBsAg- ili HBcAg-izvedenim peptidima i analizirani za IFNγ ekspresiju pomoću ICS. Serumi su analizirani za anti-HBs imunotestom (srednji panel) ili anti-HBc kompetitivnom ELISA (desni panel). Prikazane frekvencije T-ćelija koje proizvode IFNγ su izvedene oduzimanjem pozadine. S/CO signal prema prekidu; i. u. infektivne jedinice.
Fig.2: Vakcinacijom-idukovani HBV-specifično antitelo- i CD4+ T-ćelijski odgovori u obrnutoj su korelaciji sa antigenemijom. (A-D) HBVtg miševi niske, srednje i visoke antigenemije (n=4) imunizovani su sa CpG adjuvansiranim HBsAg ili HBcAg.21. dana, miševi su pojačani sa MVA-S (1x10<8>i. u.) ili MVA- jezgro (1x10<8>i. u.), respektivno.27. dana (6. dan posle pojačana), serumi su analizirani za (A) anti- HBs i (B) anti-HBc antitela. (C) Splenociti i (D) jetra-povezani limfociti HBVtg miševa niske antigenemije su stimulisani sa HBsAg i analizirani za IFNy-eksprimirajuće CD4+ T-ćelije intracelularnim bojenjem citokina. Prikazane frekvencije T-ćelija koje proizvode IFNy su izvedene oduzimanjem pozadine. S/CO signal prema prekidu; neg. = negativne; i. u. infektivne jedinice.
Fig.3: Vakcinacijom-idukovane HBV-specifične CD8+ T-ćelijske frekvencije u obrnutoj su korelaciji sa antigenemijom. HBVtg miševi niske, srednje i visoke antigenemije (n=4) imunizovani su sa 12 µg CpG adjuvansiranog HBsAg ili HBcAg.21. dana, miševi su pojačani sa MVA-S (1x10<8>i. u.) ili MVA- jezgro (1x10<8>i. u.).27. dana posle pojačana, splenociti (A) i jetrapovezani limfociti (B) su stimulisani sa HBsAg (S109i S208)- ili HBcAg (C93)-specifičnim peptidima i analizirani za IFNγ ekspresiju intracelularnim bojenjem citokina. Gornji i srednji paneli prikazuju
2
egzemplarne životinje, najniži panel daje frekvencije T-ćelija koje proizvode IFNγ posle oduzimanja pozadine. i. u. infektivne jedinice.
Fig.4: Funkcionalnost vakcinacijom-idukovanih HBV-specifičnih CD8+ T-ćelija. Miševi divljeg tipa kao i HBVtg miševi niske i srednje antigenemije su imunizovani sa CpG adjuvansiranim HBsAg.21. dana, miševi su pojačani sa MVA-S (1x10<8>i. u.).6. dana posle pojačanja, S-specifične CD8+ T-ćelije izvedene iz slezine su analizirane (A) za CD107a i IFNγ ekspresiju.(B) S-specifične CD8+ T-ćelije izvedene iz slezine ili jetre su analizirane za IFNγ-, IL-2- i TNFa-ekspresiju posle stimulacije peptidom S190. (C) Multimerno bojenje S190-specifičnih CD8+ T ćelija i zajedničko bojenje za CD127 i KLRG-1 površinsku ekspresiju. i. u. infektivne jedinice.
Fig.5: Heterologna vakcinacija prekida T-ćelijsku toleranciju kod HBVtg miševa visoke antigenemije. (A) S otvoreni okviri čitanja ayw i adw subtipa su smešteni u deleciji III (del III) MVA genoma pod kontrolom snažnog poksvirusnog promotera PH5. (B) do (D) HBVtg miševi visoke antigenemije (n>4) su vakcinisani sa 16 µg HBsAg (ayw ili adw subtip) i 16 µg HBcAg (ayw subtip) zajedno sa naznačenim adjuvansima 0. i 14. dana.28. dana, miševi su pojačani sa MVA-PH5-S (5x10<7>i. u.; ayw ili adw subtip) i MVA-jezgro (5x10<7>i. u.).6. dana posle pojačanja (B) splenociti (levi panel) i jetra-povezani limfociti (LAL, desni panel) su izolovani i stimulisani peptidima S109i S208(adw subtip ako je naznačen) ili C93i analizirani za IFNγ ekspresiju intracelularnim bojenjem citokina. (C) Splenociti i LAL su stimulisani sa C-terminalnim pulom HBsAg -specifičnih 15-mernih peptida (što pokriva aminokiseline 145 do 226, ayw subtip) i analizirani za IFNγ-eksprimirajuće CD4+ T-ćelije pomoću ICS. (D) Reprezentativni FACS dijagram S208-specifičnih CD8+ T-ćelija koje eksprimiraju IFNγ su analizirane za TNFα i IL-2 ekspresiju. Srednja vrednost ± SEM frekvencija T ćelija koje proizvode IFNγ prikazano je oduzimanjem pozadine. ns: bez značaja. *p<0.05, **p<0.01 studentov t-test; i. u. infektivne jedinice.
Fig.6: Heterologna vakcinacija indukuje serokonverziju kod HBVtg miševa visoke antigenemije. (A) do (D) HBVtg miševi visoke antigenemije (n>4) su vakcinisani sa 16 µg HBcAg (ayw subtip) i 16 µg HBsAg (ayw ili adw subtip kao što je naznačeno) adjuvansiranim sa CpG i PCEP, 0. i 14. dana.28. dana, miševi su pojačani sa MVA-PH5-S (5x10<7>i.u.; ayw ili adw subtip) i MVA-jezgro (5x10<7>i.u.). Kao kontrola, 0. i 14. dana 5 HBVtg miševa visoke antigenemije je vakcinisano sa adjuvansima CpG i PCEP, praćeno pojačanjem sa 1x10<8>MVA-wt.6. dana posle pojačanja, serumi su analizirani na prisustvo (A) anti-HBs ili (B) anti-HBc antitela. (C) Anti- HBs pozitivni serumi iz HBVtg miševa su analizirani za kapacitet neutralizacije HBsAg ayw subtipa. (D) prikazuje HBsAg nivoe u serumu pre i posle vakcinacije. Srednja vrednost ± SEM je prikazana. ns: bez značaja S/CO signal prema prekidu. **p<0.01 studentov t-test.
Fig.7: Ekspresija HBV antigena MVA vektorima. (A) i (B) Mišje NIH-3T3 ćelije su inficirane sa MVA-S, MVA-jezgro ili MVAwt (MOI od 10).16 h posle infekcije (A) ukupni ćelijski lizati su
2
analizirani za HBsAg i HBcAg ekspresiju pomoću Western blot-a. (B) izlučeni HBsAg u supernatant određen je pomoću HBsAg-specifične ELISA. S/CO: signal prema prekidu.
Fig.8: Vakcinacija CpG adjuvansiranim HBsAg. HBVtg miševi visoke antigenemije imunizovani su sa 12 µg HBsAg koji sadrži CpG kao adjuvans.21. dana, miševi su pojačani sa MVA-S.0., 27., 35., 42., 49. i 56. dana posle primarne imunizacije, serumi su analizirani za nivoe HBsAg i anti-HBs. S/CO: signal prema prekidu.
Fig.9: Poređenje adjuvanasa za proteinsku-primarnu vakcinaciju. (A) do (C) Miševi divljeg tipa vakcinisani su sa 16 µg HBsAg (ayw subtip) i 16 µg HBcAg (ayw subtip) zajedno sa naznačenim adjuvansom(ima) 0. dana.28. dana, miševi su pojačani sa MVA-PH5-S (5x10<7>i.u.; ayw subtip) i MVA-jezgro (5x10<7>i.u.).6. dana posle pojačanja serumi su analizirani na prisustvo (A) anti-HBs i (B) anti-HBc. (C) 6. dana posle pojačanja splenociti su analizirani pomoću ICS posle stimulacije sa HBsAg (S190i S208adw)- ili HBcAg (C93)-specifičnim peptidima. Stubići prikazuju procenat (srednja vrednost ± SEM) CD8+ ćelija koje su obojene pozitivno za IFNy posle oduzimanja pozadine. i. u. infektivne jedinice.
Fig.10: Podela u grupe HBVtg miševa.
Miševi su podeljeni u grupe prema njihovim nivoima antigena koji su u korelaciji u slučaju HBVtg miševa blisko titru virusa određenom u serumu.
Fig.11: Peptidi korišćeni za stimulisanje T-ćelija.
Tabela daje sekvence peptida korišćene za određivanje CD8+ T ćelijskih odgovora ograničenih mišjim K<b>/K<d>MHS-I alelima. S pul je korišćen da se naširoko odrede CD4+ i CD8+ T ćelijski odgovori miševa i ljudi.
Fig.12: Grafički pregled šeme vakcinacije Primera 4. HBVtg miševi visoke antigenemije
vakcinisani su sa 16 µg HBsAg (ayw ili adw subtip) i 16 µg HBcAg (ayw subtip) zajedno sa naznačenim adjuvansima 0. i 14. dana.28. dana, miševi su pojačani sa MVA-PH5-S (5x10e7 i.u.; ayw ili adw subtip) i MVA-jezgro (5x10e7 i.u.).6. dana posle pojačanja, (B) splenociti (levi panel) i jetra-povezani limfociti (LAL, desni panel) su izolovani i stimulisani peptidima S109 i S208 (adw subtip ako je naznačen) ili C93 i analizirani za IFNγ ekspresiju intracelularnim bojenjem citokina (ICS).
Fig.13: Korelacija multimernog bojenja i intracelularnog bojenja citokina HBV specifičnih CD8+ T ćelija. HBVtg miševi su imunizovani sa 12 µg HBsAg koji sadrži CpG kao adjuvans.21. dana, miševi su pojačani sa MVA-S. HBV-specifični T ćelijski odgovori su detektovani 28. dana ili S190 multimernim bojenjem ili pomoću ICS posle ex vivo ponovne stimulacije peptidom S190.
Fig.14: Detekcija serumskih imunih kompleksa. HBVtg miševi su imunizovani CpG adjuvansiranim HBsAg.21. dana, miševi su pojačani sa MVA-S (1x10<8>i. u.).6. dana posle
2
pojačanja, serumi su analizirani za anti-HBs, HBsAg i HBsAg u istaloženim imunim kompleksima. i. u.; infektivne jedinice; nd; ne može se detektovati
Fig.15: Poređenje različitih adjuvanasa vakcine. CH57BI/6 miševi divljeg tipa su imunizovani sa HBcAg i HBsAg kompleksiran u različitim formulacijama adjuvanasa.1:CpG plus alumn hidroksid; 2: polifosfazen PCEP plus alum; 3: PCEP plus CpG plus alumn; 4: CpG samo; 5: PCEP samo; 6: CpG plus PCEP.28. dana, sve životinje su pojačane sa MVA koji eksprimira jezgarni i S adw subtip. Fig. 15A-B prikazuje odgovore anti-HBs (Fig.15A) i anti-HBc (Fig.15B) antitela posle 28 (proteinska primarna samo) i 34 dana (proteinska primarna plus MVA pojačana). Fig.15C-D prikazuje CD8+ T ćelijske odgovore protiv S i jezgarnih epitopa posle primarne (Fig.15C) i posle MVA-pojačane (Fig.15D) Fig.15E prikazuje test neutralizacije u kom je ayw subtip HBV-a inkubiran sa naznačenim razblaženjima seruma pre infekcije i HBsAg izlučivanja od strane inficiranih ćelija izmeren posle 4, 7 i 10 dana.
Fig.16: Multiantigeni otvoreni okvir čitanja. Fig.16A prikazuje strukturu multiantigenog polipeptidnog lanca predstavljenog sa SEQ ID NO: 07. Fig.16B šematski prikazuje formiranje subvirusnih čestica koje obuhvataju HBs A/adw i C/ayw antigene. Fig.16C šematski prikazuje formiranje praznih kapsida koji obuhvataju HBc D/ayw i C/ayw antigene.
Fig.17: Šematska ilustracija potpuno prerađenih proteina izvedenih iz multiantigenog polipeptidnog lanca predstavljenog sa SEQ ID NO: 07 i njihova sudbina.
Fig.18: Šematska ilustracija delimično neprerađenih proteina izvedenih iz multiantigenog polipeptidnog lanca predstavljenog sa SEQ ID NO: 07 i njihova očekivana sudbina. Za većinu delimično neprerađenih pretpostavlja se da će povećati imuni odgovor (naročito poboljšati i proširiti adaptivni imuni odgovor) zbog inkorporiranja u izlučene čestice / filamente slične virusu:
Fig.19: Aminokiselinska sekvenca malog proteina omotača iz A2/adw2 HBV-a koja uključuje C-terminalni prepust (SEQ ID NO: 10). Podvučena sekvenca odgovara aminokiselinskoj sekvenci malog proteina omotača iz A2/adw2 HBV-a bez C-terminalnog prepusta (SEQ ID NO: 08). C-terminalni prepust je P2A fragment cepanja koji odgovara SEQ ID NO: 09.
Fig.20: Aminokiselinska sekvenca fragmenta 1-149 proteina jezgra iz D/ayw HBV-a uključujući N- i C-terminalne prepuste (SEQ ID NO: 12). Podvučena sekvenca odgovara aminokiselinskoj sekvenci fragmenta 1-149 proteina jezgra iz D/ayw HBV-a bez N- i C-terminalnih prepusta (SEQ ID NO: 11). C-terminalni prepust je P2A fragment cepanja koji odgovara SEQ ID NO: 09.
Fig.21: Aminokiselinska sekvenca RT domena HBV polimeraze uključujući N- i C-terminalne prepuste (SEQ ID NO: 16). Podvučena sekvenca odgovara aminokiselinskoj sekvenci RT domena HBV polimeraze bez N- i C-terminalnih prepusta (SEQ ID NO: 06). C-terminalni prepust je T2A fragment cepanja koji odgovara SEQ ID NO: 13.
2
Fig.22: Aminokiselinska sekvenca velikog proteina omotača iz C/ayw HBV-a uključujući N- i C-terminalne prepuste (SEQ ID NO: 14). Podvučena sekvenca odgovara aminokiselinskoj sekvenci velikog proteina omotača iz C/ayw HBV-a bez N-i C-terminalnih prepusta (SEQ ID NO: 04). C-terminalni prepust je T2A fragment cepanja koji odgovara SEQ ID NO: 13.
Fig.23: Aminokiselinska sekvenca proteina jezgra iz C/ayw HBV-a uključujući N-terminalni prepust (SEQ ID NO: 15). Podvučena sekvenca odgovara aminokiselinskoj sekvenci proteina jezgra iz C/ayw HBV-a bez N-terminalnih prepusta (SEQ ID NO: 05).
Fig.24: Aminokiselinska sekvenca konsenzus sekvence RT-domena HBV polimeraze (SEQ ID NO: 03)
Fig.25: Aminokiselinska sekvenca konsenzus sekvence velikih proteina omotača HBV sojeva genotipa C (SEQ ID NO: 01).
Fig.26: Aminokiselinska sekvenca konsenzus sekvence proteina jezgra HBV sojeva genotipa C (SEQ ID NO: 02).
Fig.27: Kombinacija RNKi i terapeutske vakcinacije. (A) Eksperimentalna postavka. HBVxfs transgeni miševi primili su HBV-specifičnu siRNK (siHBV), beznačajnu siRNK (siNEG) ili nisu tretirani. Osam nedelja kasnije, svi miševi primili su proteinsku primarnu - MVA pojačanu terapeutsku imunizaciju sa HBV jezgarnim i površinskim antigenima (HBcAg i HBsAg). (B) Šematska ilustracija HBV-specifičnog siRNK/shRNK dizajna.
Fig.28: Nivoi HBV antigena i odgovor antitela i CD8+ T ćelijski odgovori. (A) Kinetika HBeAg i HBeAg nivoa u serumu. (B) Anti-HBs antitela u serumu miševa u vremenskoj tački žrtvovanja (91. dan, (W)13. nedelja). (C) CD8+ T ćelijski odgovori izmereni su u jetri i slezini posle primarnepojačane vakcinacije.
Fig.29: Procena optimalne MVA doze.
HBVtg miševi niske i srednje antigenemije podeljeni su u grupe prema HBeAg nivoima u serumu. (A) Grupe HBVtg miševa (n=3-4) su imunizovane dvaput u dvonedeljnim intervalima sa 15µg čestičnog HBcAg adjuvansiranog sa c-di-AMP.28. dana, miševi su pojačani sa 4 različite doze MVA-jezgra (3x10<6>, 1x10<7>, 3x10<7>, 1x10<8>PFU, respektivno). Serumi miševa od 0. i 35. dana (7 dana posle pojačanja) analizirane su za HBsAg, HBeAg, anti-HBs i anti-HBc antitela (B), i ALT nivoe (C). (D) 35. dana splenociti i jetra-povezani limfociti HBVtg miševa su izolovani, stimulisani sa MVA-izvedenim peptidom B8R ili HBcAg-izvedenim peptidom c93 i analizirani za IFNyeksprimirajuće CD8+ T-ćelije intracelularnim bojenjem citokina. Prikazane frekvencije T-ćelija koje proizvode IFNy su izvedene oduzimanjem pozadine. i.m. - intramuskularna imunizacija; S/CO - signal prema prekidu; PFU - jedinice formiranja plaka; U-jedinice; IU-internacionalne jedinice.
Fig.30: Ocena c-di-AMP kao adjuvansa za proteinsko prajmiranje.
HBVtg miševi srednje i visoke antigenemije podeljeni su u grupe prema HBeAg nivoima u serumu. (A) Grupe HBVtg miševa (n=7) su imunizovane u dvonedeljnim intervalima sa mešavinom 15µg čestičnog HBsAg i 15µg HBcAg adjuvansiranih sa c-di-AMP, ili kombinacijom CpG/PCEP.28. dana, miševi su pojačani sa 10<8>MVA-S/jezgro. HBVtg miševi (n=4) injektirani dvaput sa c-di-AMP i pojačani sa 'praznim' MVA (MVAwt) korišćeni su kao kontrole. Serumi miševa od 0. i 34. dana (6 dana posle pojačanja) analizirani su za ALT nivoe (B), HBsAg, HBeAg, anti-HBs i anti-HBc antitela (C-D). (E) 34. dana splenociti i jetra-povezani limfociti HBVtg miševa (n=4) su izolovani, stimulisani sa HBcAg-izvedenim peptidom c93 ili HBsAg-izvedenim peptidom s208 i analizirani za IFNy-eksprimirajuće CD8+ T-ćelije intracelularnim bojenjem citokina.
Prikazane frekvencije T-ćelija koje proizvode IFNy su izvedene oduzimanjem pozadine. i.m. -intramuskularna imunizacija; S/CO - signal prema prekidu; PFU - jedinice formiranja plaka; IU-internacionalne jedinice.
Fig.31: Procena optimalnog puta isporuke za različite adjuvanse: c-di-AMP, poli-IC i RIG-I ligand.
HBVtg miševi niske i srednje antigenemije podeljeni su u grupe prema HBeAg nivoima u serumu. (A) Grupe HBVtg miševa (n=5) su imunizovane u dvonedeljnim intervalima sa mešavinom 15µg čestičnog HBsAg i 15µg HBcAg adjuvansiranim sa c-di-AMP, poli-IC, ili RIG-I ligandom.28. dana, miševi su pojačani sa 6x10<7>MVA-S/jezgro. Imunizacije su izvedene ili isključivo intramuskularnim putem, ili je proteinsko prajmiranje dato subkutano praćeno intraperitonealnim pojačanjem. Serumi miševa od 0. i 34. dana (6 dana posle pojačanja) analizirani su za HBsAg, HBeAg, anti-HBs i anti-HBc antitela (A). Masa HBVtg miševa praćena je svake nedelje tokom eksperimenta (B). (C) 34. dana, splenociti i jetra-povezani limfociti HBVtg miševa su izolovani i stimulisani sa MVA-izvedenim peptidom B8R, HBsAg-izvedenim peptidom s208 ili HBcAg-izvedenim peptidom c93. Ćelije su zatim analizirane za IFNγ-eksprimirajuće CD8+ T-ćelije intracelularnim bojenjem citokina. Frekvencije T-ćelija koje proizvode IFNγ prikazane su oduzimanjem pozadine. i.m., s.c., i.p.-intramuskularna, subkutana, intraperitonealna imunizacija, respektivno; S/CO - signal prema prekidu; PFU - jedinice formiranja plaka; IU-internacionalne jedinice.
Fig.32: Ocena novog MVA konstrukta (MVA HBVvac) u C57BL/6 miševima.
(A) Šematski prikaz MVA-S/jezgro i MVA-HBWac. B) Western blot analiza lizata iz ćelija koje proizvode naznačene MVA-klonove. Bojenje za ne-glikozilirani i glikozilirani S pomoću poliklonalnih antitela. (C) Grupe C57BL/6 miševa (n=5) su prajmirane jedanput mešavinom 20µg čestičnog HBsAg i 20µg HBcAg adjuvansiranih sa c-di-AMP. Dve nedelje kasnije, miševi su pojačani ili sa 6x10<7>MVA-S/jezgro ili sa 6x10<7>MVA-HBVvac, koji eksprimiraju HBsAg, HBcAg i RT domen HBV polimeraze. (D) Serumi miševa od i 21 (7 dana posle pojačanja) analizirani su za
1
anti-HBs i anti-HBc antitela. (E) 21. dana, splenociti su izolovani i stimulisani sa MVA-izvedenim peptidom B8R, HBsAg-, HBcAg- i HBV RT-specifičnim peptidima i pulovima peptida. Ovalbuminizveden petid SIINFEKL služi kao negativna kontrola. Ćelije su zatim analizirane za IFNγeksprimirajuće CD8+ T-ćelije intracelularnim bojenjem citokina. Crvene strelice označavaju pozitivne RT-specifične CD8+ T ćelijske odgovore. i.m. -intramuskularna imunizacija, respektivno; S/CO - signal prema prekidu; PFU - jedinice formiranja plaka; IU-internacionalne jedinice.
Fig.33: Nukleotidna sekvenca konstrukta rekombinantnog vektora vakcinacije (rMVA) koji dalje eksprimira CD70 (SEQ ID NO: 27).
Različiti domeni pomenutog konstrukta prikazani su kao što sledi: Del III-flankirajuća sekvenca 1, mH5 promoter, HBjezgarni protein. P2A, humani CD70 molekul, IRES (EMCV), eGFP, Del III-flankirajuća sekvenca 2.
Fig.34: Ocena MVA koji eksprimira CD70 u C57BL/6 miševima.
(A) Šematski prikaz MVAjezgro i MVAjezgro-CD70. Oba vektora eksprimiraju sekvencu i GFP jezgra genotipa D HBV-a da bi se omogućilo jednostavnije prečišćavanje. MVAjezgro-CD70 dodatno eksprimira CD70 gen. (B) Grupe C57BL/6 miševa (n=6-7) su prajmirane jedanput intramuskularno sa 20µg čestičnog HBcAg adjuvansiranog sa PCEP i CpG. Tri nedelje kasnije, miševi su pojačani ili sa 10<8>i.u. MVAjezgro ili 10<8>MVAjezgro-CD70 ili 10<8>MVA-divljeg tipa (MVAwt) injektiranim intraperitonealno. (C) 35. dana, splenociti su izolovani i stimulisani sa MVA-izvedenim peptidom B8R, ili jezgarnim-peptidom C93. Ovalbumin-izvedeni peptid SIINFEKL služi kao negativna kontrola. Ćelije su zatim analizirane za IFNγ-eksprimirajuće CD8+ T-ćelije intracelularnim bojenjem citokina. Podaci su dati kao srednja vrednost ± SD po grupi. Tačke označavaju vrednosti određene kod pojedinačnih miševa. i.u.-infektivne jedinice.
Fig.35: Ocena MVA koji eksprimira CD70 kod HBV transgenih miševa. (A) Šematski prikaz MVAjezgro i MVAjezgro-CD70. Oba vektora eksprimiraju sekvencu i GFP jezgra genotipa D HBV-a da bi se omogućilo jednostavnije prečišćavanje. MVAjezgro-CD70 dodatno eksprimira CD70 gen. (B) Grupe transgenih miševa koji nose 1.3-puta duži genom (n=5-6) prajmirane su jedanput intramuskularno sa 20µg čestičnog HBcAg adjuvansiranog sa PCEP i CpG i tri nedelje kasnije, pojačane ili sa 10<8>i.u. MVAjezgro ili sa 10<8>MVAjezgro-CD70 injektiranim intraperitonealno.2 miša tretirana, prema tome, sa 10<8>MVA-divljeg tipa (MVAwt) služili su kao kontrola. (C) 35. dana jetra-povezani limfociti (LAL) su izolovani i stimulisani sa MVA-izvedenim peptidom B8R, ili jezgarnim-peptidom C93. Nestimulisane ćelije služe kao negativna kontrola. Ćelije su analizirane protočnom citometrijom posle intracelularnog bojenja citokina za IFNγ (crveno) i IL-2 (plavo). FACS dijagrami za tri reprezentativne životinje su prikazani.
PRIMERI
2
Miševi i vakcinacije
[0095] C57BL/6 miševi divljeg tipa (wt) i HBV-transgeni miševi (Soj HBV1.3.32 (Guidotti et al., J Virol 1995; 69:6158-69) (ayw subtip genotipa D HBV-a), ljubazno isporučeni od strane F. Chisari, The Scripps Institute, La Jolla, CA, SAD) izvedeni su iz kućnog uzgoja pod specifičnim uslovima bez patogena prema institucionalnim smernicama. Za proteinske vakcinacije, miševi su imunizovani subkutano sa rekombinantnim HBsAg kvasca ili E. coli HBcAg (APP Latvijas BiomedicT nas, Riga, Letonija) umešanim sa 31.91 µg sintetičkog fosforotioiranog CpG ODN 1668 i/ili 25 ili 50 µg poli[di(natrijumkarboksilatoetilfenoksi)fosfazena] (PCEP) u 50 µl PBS. Za MVA vakcinaciju, miševi su vakcinisani intraperitonealno sa 1x10<8>infektivne jedinice odgovarjućeg rekombinantnog MVA u 500 µl PBS.
Intracelularno bojenje citokina, multimerno bojenje i test degranulacije
[0096] Splenociti i jetra-povezani limfociti (LAL) su izolovanu kao što je prethodno opisano (Stross et al., Hepatology 2012; 56:873-83) i stimulisani sa H2-k<b>- ili H-2D<b>-ograničenim peptidima (Fig.10) (jpt Peptide Technologies, Berlin, Nemačka) ili rekombinantnim HBsAg (ljubazno isporučen od strane Rheinbiotech-Dynavax, Dusseldorf, Nemačka) tokom 5 h u prisustvu 1 mg/ml Brefeldina A (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Nemačka). Ćelije su žive/mrtve-obojene etidijum monoazid bromidom (Invitrogen, Karlsruhe, Nemačka) i blokirane sa anti-CD16/CD32-Fc-Block (BD Biosciences, Heidelberg, Nemačka). Površinski markeri su obojeni PB-konjugovanim anti-CD8a i PE-konjugovanim anti-CD4 (eBiosciences, Eching, Nemačka). Intracelularno bojenje citokina (ICS) izvedeno je sa FITC anti-IFNγ (XMG1.2), PE-Cy7 anti-TNFa i APC anti-IL-2 (eBiosciences, Eching, Nemačka) pomoću Cytofix/Cytoperm kompleta (BD Biosciences, Heidelberg, Nemačka) prema uputstvima proizvođača.
[0097] Za test degranulacije, splenociti su stimulisani peptidom u prisustvu Monensina, Brefeldina A, FITC-konjugovanog anti-CD107a antitela i APC-konjugovanog anti-CD107b antitela tokom 5 h praćeno površinskim Pacific Blue CD8a bojenjem i ICS sa PerCP-Cy5.5 IFNγ (eBiosciences, Eching, Nemačka) pomoću Cytofix/Cytoperm kompleta (BD Biosciences, Heidelberg, Nemačka) prema uputstvima proizvođača.
[0098] Za multimerno bojenje, splenociti i LAL su obojeni PE-konjugovanim S190(VWLSVIWM, SEQ ID NO: 19) ili MVA B8R (TSYKFESV, SEQ ID NO: 20) multimerima tokom 20 minuta praćeno bojenjem sa Pacific Blue CD8a , FITC KLRG1 i APC CD127 (eBiosciences, Eching, Nemačka) u prisustvu anti-Fc receptorskog antitela (klon 2.4G2) tokom 20 minuta. Podaci su pribavljeni pomoću FACS analize na aFACSCanto II (BD Biosciences, Heidelberg, Nemačka) i analizirani pomoću FlowJo softvera (Treestar, Ashland, SAD).
Serološka analiza
[0099] Nivoi HBsAg, HBeAg, anti-HBs i anti-HBc u serumu određeni su u 1:20 razblaženjima pomoću AXSYM™ testova (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, SAD). Kvantifikacija HBV titara u serumu pomoću lančane reakcije polimeraze u stvarnom vremenu izvedena je kao što je prethodno opisano (Untergasser et al., Hepatology 2006; 43:539-47).
Test neutralizacije
[0100] HepaRG ćelije diferencirane i kultivisane kao što je opisano (Lucifora et al., J Hepatol 2011;
55:996-1003) inficirane su 200 DNK- sadržavajućim, obmotanim HBV česticama/ćelijom (ayw subtip) u duplikatu u prisustvu serijskog razblaženja seruma iz vakcinisanih miševa (1:33, 1:100, 1:333 i 1:1000). Kao pozitivna kontrola korišćene su 0.8 internacionalne jedinice Hepatect™ CP antitela (Biotest Pharma GmbH, Dreieich, Nemačka).24 sata posle infekcije, ćelije su isprane tri puta sa PBS i dodato je 1 ml medijuma za diferencijaciju. Supernatanti su prikupljani 4., 7. i 10. dana posle infekcije, a HBsAg je detektovan imunotestom u 1:20 razblaženjima.
Statistička analiza
[0101] Statističke analize izvedene su upotrebom Prism5 softvera (GraphPad, San Diego, SAD). Rezultati su izraženi kao srednja vrednost ± standardna greška srednje vrednosti. Razlike između grupa su analizirane za statističku značajnost pomoću dvostranih Studentovih t-testova.
Generisanje MVA vakcina
[0102] Rekombinantni MVA su generisani homolognom rekombinacijom i izborom opsega domaćina kao što je prethodno opisano (Staib et al., Biotechniques 2003; 34:694-6, 698, 700). Celokupni HBcAg (genotip D, ayw subtip) i HBsAg otvoreni okviri čitanja (genotip D, ayw ili adw subtip) klonirani su u MVA transferne plazmide pIIIΔHR-PH5 ili pIIIΔHR-P7.5, čime se HBV proteini stavljaju pod kontrolu ranih/kasnih virus vakcinije-specifičnih promotera PH5 (HBcAg ayw /HBsAg ayw/HBsAg adw) ili P7.5 (HBsAg ayw). Posle konstrukcije svakog virusa, verifikovani su ekspresija gena, sekvenca umetnute DNK i čistoća virusa. Za generisanje preparata vakcina, MVA su rutinski razmnožavani u CEF, prečišćeni ultracentrifugiranjem kroz saharozu, rekonstituisani u 1 mM Tris-HCL pH 9.0 i titrirani prema standardnoj metodologiji (Staib et al., Methods Mol Biol 2004; 269:77-100).
Imunoblot
[0103] NIH-3T3 mišji fibroblasti (CRL-1658) kultivisani su u RPMI 1640 podlozi obogaćenoj sa 10% FCS, 100 U/ml penicilina i 100 µg/ml streptomicina. Ćelije su sakupljene u puferu za lizu (50 mM Tris-HCl [pH
4
8.0], 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0.02% NaN3i 100 µg/ml fenilmetilsulfonil fluorida) 16 h posle infekcije, rastvorene na elektroforezi na gelu 12% natrijumdodecil sulfat-poliakrilamida (SDS-PAGE), i blotirane na nitroceluloznoj membrani (0.45 µM; Bio-Rad, Munich, Nemačka). Membrane su inkubirane na 4°C sa anti-HBc (antiserum H800; ljubazno isporučen od strane H. Schaller), anti-HBs (Murex HBsAg verzija 3; Abbott, Abbott Park, IL, SAD) ili anti-aktin (Sigma, Munich, Nemačka) antitelima sa 1:10000, 1:50 i 1:10000 razblaženjima, respektivno. Sekundarna mišja i zečija antitela obeležna peroksidazom iz rena (Dianova, Hamburg, Nemačka) korišćena su u 1:5000 razblaženju tokom 1 h na 21°C. Antitela su razblažena u fosfat-puferisanom fiziološkom rastvoru koji sadrži 5% obrano mleko. Pojačana hemiluminescencija je korišćena prema uputstvima (Roche, Mannheim, Nemačka).
[0104] Izlučeni HBsAg u supernatantu kultivisanih ćelija je određen pomoću Abbott AxSYM HBsAg testa (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, SAD).
Primer 1: Proteinska-primarna / MVA-pojačana vakcinacija indukuje snažan anti-HBV imunitet
[0105] Dve MVA vakcine koje eksprimiraju ili HBs (MVA-S) ili HBc (MVA-jezgro) generisane su iz ayw subtipa genotipa D HBV-a (Fig.1A). Western blotiranje i HBsAg ELISA potvrdile su ispravnu ekspresiju proteina od oba MVA (Fig.7A, B).
[0106] Radi ispitivanja imunogenosti, C57BL/6 (wt) miševi su imunizovani sa MVA-S, MVA-jezgro ili MVAwt (10<8>infektivne jedinice) i.p. i frekvencije CD8+ T-ćelija koje proizvode IFNy određene su intracelularnim bojenjem citokina (ICS) 8. dana posle imunizacije. Korišćen je i.p. put jer je bila predodređena sistemska MVA distribucija. MVA-S, MVA-jezgro i MVAwt imunizacija indukovala je uporedive CD8+ T-ćelijske odgovore na MVA-izvedeni imunodominantni B8R peptid, koji je pojačan posle druge imunizacije (Fig.1B). Nasuprot tome, nisu detektovani HBV-specifični CD8+ T- ćelijski odgovori (Fig.1B).
[0107] Da bi se indukovao HBV-specifični imunitet, izvedene su heterologne primarne-pojačane vakcinacije. Miševi su primili 12 µg rekombinantnog, čestičnog HBsAg ili HBcAg (ayw subtip) sa CpG kao adjuvansom.8. dana posle HBsAg vakcinacije, frekvencije CD8+ T-ćelija slezine koje izlučuju IFNy kao odgovor na stimulaciju S190i S208peptidima bile su oko 0.6% dok su bilo koji CD8+ T-ćelijski odgovori protiv C93jedva mogli da se detektuju posle HBcAg imunizacije (Fig.1C). Pojačana vakcinacija 21. dana ili sa MVA-S ili sa MVA-jezgro mogla je da indukuje visoke frekvencije HBsAg- ili HBcAg-specifičnih CD8+ T-ćelija kao i visoke anti-HBs ili anti-HBc titre, respektivno (Fig.1D). Uzeti zajedno, ovi podaci ukazuju da je heterologna primarna-pojačana vakcinacija bila potrebna da bi se indukovale HBV-specifične T-ćelije.
Primer 2: Visoka antigenemija sprečava indukciju anti-HBV imuniteta
[0108] Da bi se ispitao uticaj opterećenja HBV antigena na indukciju HBV-specifičnih imunih odgovora, HBV1.3.32 transgeni (HBVtg) miševi podeljeni su u grupe niske, srednje i visoke antigenemije prema njihovim HBeAg nivoima u serumu pre vakcinacije (Fig.10).6 dana posle pojačanja, anti-HBs titri kod miševa koji su primili HBsAg/MVA-S bili su viši u grupi niske antigenemije u odnosu na miševe iz grupe srednje antigenemije, a ostali su nedetektabilni kod miševa visoke antigenemije (Fig.2A). Čak i kada su praćeni tokom 35 dana posle MVA-S pojačana, miševi visoke antigenemije nisu razvili detektabilne anti-HBs titre, a HBsAg je uporno ostao na niskim nivoima (Fig.11). Radi ispitivanja da li anti-HBs može biti kompleksiran količinama HBsAg u višku i time da izbegne detekciju, rastvoreno je istaloženih 131 proteinskih kompleksa sa ureom i ponovljen je imunotest. Na ovaj način, pronađeni su HBsAg-anti-HBs imuni kompleksi kod vakcinisanih HBVtg miševa visoke i srednje, ali ne i niske antigenemije (Fig.14). HBcAg-specifična antitela, međutim, detektovana su u serumima HBcAg/MVA-jezgro vakcinisanih miševa iz svih grupa, ali titri su ponovo pokazali tendenciju da budu u obrnutoj korelaciji sa antigenemijom (Fig.2B). Radi analize vakcinacija-idukovanog CD4+ T-ćelijskog odgovora, stimulisani su splenociti i jetra-povezani limfociti (LAL) sa HBsAg. Iako su pronađene visoke frekvencije HBsAgspecifičnih CD4+ T-ćelija kod wt miševa, nisu detektovane HBV-specifične CD4+ T-ćelije kod HBVtg miševa u bilo kojoj od grupa (Fig.2C, D).
[0109] Slično titrima antitela, primećena je obrnuta korelacija između antigenemije i HBV- specifičnih CD8+ T-ćelijskih odgovora. Kod miševa visoke antigenemije, HBsAg/MVA-S kao i HBcAg/MVA-jezgro imunizacija nije uspela da indukuje detektabilne HBsAg- ili HBcAg-specifične CD8+ T- ćelije – niti u periferiji (slezina) niti u jetri, mesto HBV-replikacije (Fig.3A, B). Miševi sa srednjim ili niskim HBeAg opterećenjem razvili su S190- i S208-specifične CD8+ T-ćelijske odgovore na HBsAg/MVA-S, i C93-specifične T-ćelijske odgovore na HBcAg/MVA-C vakcinaciju. HBV-specifične CD8+ T-ćelijske frekvencije detektovane kod miševa niske antigenemije bile su više od onih pronađenih kod miševa srednje antigenemije. Značajno, MVA B8R-specifične CD8+ T-ćelijske frekvencije bile su nezavisne od antigenemije i uporedive među svim grupama koje su indukovale jednake efikasnosti vakcinacije (Fig. 3A,B).
[0110] Tokom hronične infekcije i antigenske upornosti, CD8+ T-ćelije mogu razviti iscrpljeni, nefunkcionalni fenotip. U tim uslovima, broj antigen-specifičnih T-ćelija je u velikoj meri loše procenjen funkcionalnim testovima kao što je IFNγ proizvodnja. Prema tome, izvedeno je S190-, C93- i B8R-specifično multimerno bojenje, koje nije detektovalo HBV-specifične CD8+ T-ćelije u slezinama ili jetrama imunizovanih miševa visoke antigenemije dok su B8R-multimerno pozitivne CD8+ T-ćelije bile jasno detektabilne. Ovo ukazuje da vakcina zaista nije uspela da indukuje HBV-specifične T-ćelije u ovoj grupi. U grupama niske i srednje antigenemije, HBV-S190- specifični i MVA-B8R-specifični odgovori pokazali su sličan odnos multimerno-pozitivnih i IFNy-pozitivnih CD8+ T-ćelija (Fig.13). Uzeti zajedno, HBV antigenski nivoi utiču na to koliko efikasno HBV-specifično antitelo kao i T-ćelijski odgovori mogu biti idukovani heterolognom primarnom-pojačanom vakcinacijom.
Primer 3: Antigenemija utiče na kvalitet vakcinacijom-idukovanih odgovora
[0111] Značajne efektorske funkcije CD8+ T-ćelija uključuju proizvodnju IL-2 i TNFα pored IFNγ kao i sposobnost da degranulišu kao odgovor na peptidnu stimulaciju, što može biti analizirano površinskom ekspresijom CD107a. Usled S190 peptidne stimulacije, IFNγ+ S190- specifične CD8+ T-ćelije slezine idukovane kod miševa divljeg tipa i HBVtg miševa niske antigenemije pomoću HBsAg/MVA-S imunizacije degranulisale su do sličnih odnosa (72.3% i 73.4%, respektivno) (Fig.4A). Pokazale su i uporedivu ekspresiju IL-2 i TNFα u CD8+ T-ćelijama slezine i jetre izvedenim iz miševa srednje antigenemije, koji su takođe mogli da degranulišu usled peptidne stimulacije iako u manjoj meri (62 %), ali bez IL-2 ekspresije (Fig.4B).
[0112] Da bi se odredio status diferencijacije multimerno-vezujućih ćelija da se razmnožavaju, obojene su CD127 i KLRG-1. Vakcinacija wt i HBVtg miševa niske antigenemije idukovala je visok procenat S190-specifičnih CD127+ KLRG-1- multimerno-vezujućih ćelija u jetrama i slezinama, koje se smatraju prelaznim prekursorima dugovečnih ćelija sa potencijalom da se razmnožavaju i da dovedu do novog potomstva efektorskih ćelija (Fig.4C). Kod miševa srednje antigenemije, ove ćelije, međutim, bile su teško detektabilne (Fig.4C). Ovi podaci ukazuju da ekspresija HBV antigena smanjuje polifunkcionalnost CD8+ T-ćelija, a posebno izlučivanje IL-2 efektorskih ćelija i kapacitet umnožavanja.
Primer 4: Poređenje adjuvanasa za proteinsku-primarnu vakcinaciju.
[0113] Da bi se ispitalo da li će polifosfazen adjuvans PCEP povećati imuni stimulatorni efekat CpG, PCEP je korišćen umesto CpG ili je dodat CpG-u za formulisanje proteinske vakcine i kombinovani su HBsAg i HBcAg.
[0114] Miševi divljeg tipa su vakcinisani sa 16 µg HBsAg (ayw subtip) i 16 µg HBcAg (ayw subtip) zajedno sa odgovarajućim adjuvansom(ima) 0. dana.28. dana, miševi su pojačani sa MVA-PH5-S (5x10<7>i.u.; ayw subtip) i MVA-jezgro (5x10<7>i.u.).6. dana posle pojačanja, serumi su analizirani na prisustvo anti-HBs(Fig. 9A) i anti-HBc (Fig.9B).6. dana posle pojačanja splenociti su analizirani pomoću ICS posle stimulacije sa HBsAg (S190i S208adw)- ili HBcAg (C93)-specifičnim peptidima (Fig.9C). Stubići pokazuju procenat (srednja vrednost ± SEM) CD8+ ćelija koje su obojene pozitivno za IFNy posle oduzimanja pozadine. i. u. infektivne jedinice.
[0115] Upotreba PCEP (sam ili u kombinaciji sa CpG) bila je superiorna u indukciji odgovora anti- HBs i anti-HBc antitela na sam CpG posle proteinske-primarne / MVA-pojačane vakcinacije kod wt miševa, dok su CD8+ T-ćelijski odgovori bili uporedivi (Fig.9A-C).
Primer 5: Poređenje kombinacija adjuvanasa
[0116] Dalje je bio cilj određivanje efekta različitih adjuvanasa na humoralne i ćelijske imune odgovore. Prema tome, CH57BI/6 miševi divljeg tipa su prajmirani sa čestičnim HBcAg i HBsAg kompleksiranim u različitim formulacijama adjuvanasa. U grupama 1 do 3 (n=3) HBsAg je kompleksiran sa alumn hidroksidom i kombinovan sa HBcAg, CpG ili polifosfazen adjuvansom ili oba. Grupe 4 do 6 (n=3) su vakcinisane upotrebom čestičnih HBcAg i HBsAg adjuvansiranih ili sa CpG ili sa polifosfazenom ili oba bez bilo kakvog alumna.28. dana, sve životinje su pojačane sa MVA eksprimirajućim jezgrom i S adw subtipom.
[0117] Odgovori antitela protiv HBs i HBc određeni su posle 28 dana (proteinska primarna samo) i posle 34 dana (proteinska primarna plus MVA pojačana). Fig.15A i 15B prikazuju da su odgovori antitela, posebno protiv HBs, bili neočekivano mnogo više izraženi kada je izbegnut alum. Fig.15C-D prikazuje CD8+ T ćelijske odgovore protiv S i jezgarnih epitopa posle primarne (Fig.15C) i posle MVA-pojačane (Fig.15D).
[0118] T ćelijski odgovori bili su detektabilni već posle primarne kada formulacije vakcine nisu sadržavale alumn. Interesantno, posle MVA pojačana sa jednakom efikasnošću u svim grupama (naznačen B8R-specifičnim odgovorima), svi miševi razvili su jezgro-specifične T ćelijske odgovore, dok su ponovo životinje vakcinisane bez alumna razvile mnogo više izražene S-specifične CD8+ T ćelijske odgovore.
Primer 6: Vakcinacija sa heterolognim HBsAg subtipom prekida T-ćelijsku toleranciju i indukuje snažnu proizvodnju antitela kod HBVtg miševa visoke antigenemije
[0119] Mišji serumi su analizirani za njihov kapacitet neutralizacije posle vakcinacije. Miševi vakcinisani sa HBsAg adw subtipom, mogli su da unakrsno neutrališu ayw subtip HBV-a čak i u visokim razblaženjima do 1:1000 (Fig.15E).
[0120] Dalje, cilj je bio poboljšanje imunogenosti heterologne proteinske-primarne / MVA-pojačane vakcinacije da bi se prekinula tolerancija u prisustvu višeg HBV antigenskog opterećenja.
[0121] Da bi se ispitalo da li će snažniji okidač antigena poboljšati efikasnost vakcinacije, novi MVA koji eksprimira HBsAg konstruisani su takođe pod kontrolom snažnijeg promotera PH5 (Fig.5A), a druga proteinska vakcinacija izvedena je 14. dana (Fig.12). Pored toga, HBsAg ayw (identičan HBVtg miševima) i adw subtipa upoređeni su. Pored toga, PCEP je dodat CpG-u za formulaciju proteinske vakcine i kombinovani su HBsAg i HBcAg tokom primarne i pojačane kako bi se postigli imuni odgovori na višestruke HBV antigene. Kada je primenjen ovaj izmenjeni režim vakcinacije (kombinovana HBsAg/HBcAg primarna adjuvansirana sa CpG i PCEP 0. i 14. dana praćeno pojačanjem 28. dana korišćenjem MVA-S / MVA-jezgro koji eksprimiraju antigene usled snažnijeg PH5 promotera), postojala je sposobnost da se prekine tolerancija kod HBVtg miševa visoke antigenemije i idukovanih HBsAg- i HBcAg-specifičnih CD8+ i CD4+ T-ćelija (Fig.5B, C).
[0122] Dalje, ispitano je da li će delimična neusklađenost između vakcine i ciljnog antigena poboljšati efikasnost vakcine (Schirmbeck et al., Eur J Immunol 2003; 33:3342-52). Jedan ili drugi antigen vakcine, Saywili Sadw, idukovao je CD8+ T-ćelije protiv oba subtipa (Fig.5B) kao što je određeno subtip-specifičnim peptidom S208(Fig.11). Međutim, heterologna vakcina koja sadrži Sadwidukovala je snažnije CD8+ i detektabilne CD4+ T-ćelijske odgovore (Fig.5B, C). Slično onome što je primećeno za S-specifične CD8+ T-ćelije izvedene iz miševa srednje antigenemije (Fig.4B), pronađeno je da S208-specifične CD8+ T-ćelije slezine izlučuju IFNγ i do određene mere TNFa , ali pokazale su samo marginalnu ekspresiju IL-2 (Fig.5D).
[0123] Značajno, samo Sadw, ali ne i formulacija vakcine koja sadrži Saywmogla je da indukuje detektabilne odgovore anti- HBs antitela kod miševa visoke antigenemije (Fig.6A), dok su anti-HBc antitela idukovana pomoću obe formulacije (Fig.6B). Značajno, anti-HBs antitela generisana pomoću Sadwmogla su da neutrališu HBV čestice ayw subtipa (Fig.6C). Istovremeno sa indukcijom neutralizujućih anti-HBs u grupi Sadwvakcinacije, nivoi HBsAg značajno su pali na niske nivoe (Fig.6D). Uzeti zajedno, ovo je ukazalo da je izmenjena šema vakcinacije zaista omogućila prekidanje B- i T-ćelijske tolerancije kod HBVtg miševa.
Primer 7: Širok imuni odgovor idukovan multi-antigenim MVA
[0124] Dalje, cilj je bio da se uporedi indukcija imunih odgovora protiv jednog, dva i nekoliko HBV antigena korišćenjem multi-antigenog MVA. Neočekivano, humoralni kao i ćelijski imuni odgovori protiv ili S ili S i Pol poboljšani su kada je jezgro zajednički eksprimirano MVA vektorom vakcine.
Primer 8: Kombinacija RNKi i terapeutske vakcinacije
[0125] HBV transgeni miševi, soj HBVxfs, koji eksprimiraju visoke titarske HBV antigene tretirani su HBV-specifičnim siRNK koje ciljaju 3' region svih RNK HBV-a. siRNK tretiranje smanjilo je HBeAg i HBsAg nivoe za 90%. Posle 8 nedelja, životinje su vakcinisane proteinskom primarnom - MVA-HBV pojačanom vakcinom da bi se indukovala anti-HBs antitela i HBV-specifične T ćelije (Fig.27). Kao proteinska vakcina, čestični HBsAg i HBcAg su adjuvansirani sa CpG i PCEP. MVA vektor vakcine eksprimirao je celokupni otvoreni okvir čitanja S i jezgarnih proteina HBV-a. Kontrole su bile bez siRNK, bez vakcinacije i njihove kombinacije.
[0126] 6 dana posle pojačane vakcinacije, miševi su žrtvovani i HBeAg i HBsAg nivoi kao i anti-HBs titri su određeni (Fig.28A, B). Iz jetri i slezine, T ćelije su izolovane, ex vivo stimulisane HBV-specifičnim peptidima, obojene za ekspresiju interferona gama intracelularnim bojenjem citokina i analizirane protočnom citometrijom (Fig.28C).
Primer 9: Procena optimalne MVA doze
[0127] U prvim skupovima eksperimenata, cilj je bio da se odredi najniža MVA doza za heterolognu proteinsku-primarnu / MVA-pojačanu vakcinaciju koja će pokazati zadovoljavajuću imunogenost i koja će moći da prekine imunu toleranciju kod HBVtg miševa. Prema tome, grupe HBVtg miševa niske i srednje antigenemije su imunizovane dvaput u dvonedeljnim intervalima sa 15µg čestičnog HBcAg adjuvansiranog sa bis-(3',5')-cikličnim dimernim adenozin monofosfatom (c-di-AMP).28. dana, miševi su pojačani sa 4 različite doze MVA-jezgra (3x10<6>, 1x10<7>, 3x10<7>, 1x10<8>PFU, respektivno) (Fig.29A).
Humoralni i ćelijski imuni odgovori izazvani režimima imunizacije korišćenjem različitih MVA doza ocenjeni su 7 dana posle pojačane imunizacije (35. dan).
[0128] Serumi miševa od 0. i 35. dana (7. dana posle pojačanja) analizirani su za HBsAg, HBeAg, anti-HBs i anti-HBc antitela (Fig.29B). Svi režimi imunizacije izazvali su slične nivoe anti-HBc antitela detektovane u serumu HBVtg miševa 35. dana. Pored toga, sve grupe miševa pokazale su značajno smanjenje HBsAg u krvi. Ovaj efekat nije posredovan anti-HBs antitelima jer režim imunizacije nije uključivao HBsAg, ključan za HBsAg serokonverziju u HBVtg modelu. Interesantno, HBVtg miševi iz grupa koje su primile veće doze MVA-jezgra (3x10<7>i 1x10<8>PFU) kao pojačane pokazale su znatno smanjenje nivoa HBeAg u serumu (Fig.29B). Štaviše, blagi porast alanin transferaze (ALT) jetre primećen je takođe u grupama miševa koji su primili veće doze MVA-jezgro (3x10<7>i 1x10<8>PFU) (Fig.29C). Ovi podaci ukazuju da su protokoli imunizacije u ovim dvema grupama miševa doveli do potisnute HBV replikacije u jetru moguće zbog poboljšane aktivnosti HBcAg-specifičnih T ćelija. Zaista, intracelularno IFNγ bojenje jetra-povezanih limfocita (LAL) i splenocita pokazalo je da su HBVtg miševi koji su imunizovani sa višim dozama MVA-jezgro mogli da postave efektivnije HBV-specifične CD8+ T ćelijske odgovore, naročito u jetri (Fig.29D). Istovremeno, MVA-specifični CD8+ T ćelijski odgovori nisu se značajno povećali sa većom MVA dozom korišćenom za imunizaciju.
[0129] Na osnovu ovih rezultata može se zaključiti da je MVA-jezgro doza od 3x10<7>PFU za heterolognu proteinsku-primarnu / MVA-pojačanu vakcinaciju dovoljna da se prekine imuna tolerancija kod HBVtg miševa niske i srednje antigenemije.
Primer 10: Ocena c-di-AMP kao adjuvansa za proteinsko prajmiranje.
[0130] Nedostatak bezbednog i efektivnog adjuvansa koji indukuje balansiran Th1/Th2 CD4+ T ćelijski odgovor može biti prepreka za započinjanje kliničkih proba. Štaviše, aktiviranje novoidentifikovanog citoplazmatičnog receptor prepoznavanja obrazaca STING je interesantna alternativa za terapeutsku vakcinaciju. Zbog toga, bio je cilj da se ispita efikasnost c-di-AMP kao mogućeg novog adjuvansa za terapeutsku vakcinu protiv hepatitisa B. Za ovu svrhu, grupe HBVtg miševa srednje i visoke antigenemije (n=7) miševi primili su dve proteinske primarne i MVA pojačanu imunizaciju. Čestični HBsAg i HBcAg za
4
proteinsko prajmiranje su kombinovani i adjuvansirani sa c-di-AMP ili prethodno ustanovljena kombinacija CpG sa polifosfazenima (PCEP).28. dana, miševi su pojačani sa mešavinom MVA-S/jezgro (Fig.30A). HBVtg miševi (n=4) koji su primili c-di-AMP injekciju i 'prazan' MVA (MVAwt) korišćeni su kao kontrole. Efikasnost formulacija vakcine da indukuje humoralne i ćelijske imune odgovore upoređena je 34. dana (6 dana posle pojačana).
[0131] Niti c-di-AMP niti CpG/PCEP protokol imunizacije nije imao uticaj na HBeAg nivoe u serumu kod HBVtg miševa visoke antigenemije (Fig.30C). Obe testirane formulacije vakcine idukovale su značajne anti-HBc odgovore. Međutim, imunizacija sa c-di-AMP idukovala je značajno više titre anti-HBc antitela, u odnosu na CpG/PCEP režim (p < 0.05) (Fig.30C). Interesantno, oba protokola imunizacije rezultovala su u HBsAg do anti-HBs serokonverzije kod svih ispitanih HBVtg miševa (Fig.30D). Visoki nivoi anti-HBs antitela izazvani c-di-AMP- ili CpG/PCEP-adjuvansiranim vakcinama kompleksirali su cirkulišući HBsAg i uklonili ga iz seruma miševa. Za razliku od toga, HBVtg miševi koji su primili c-di-AMP samo praćen MVAwt pojačanjem nisu razvili bilo kakav anti-HBs, a nivoi HBsAg u serumu ovih miševa ostali su nepromenjeni. Značajno, obe formulacije vakcine idukovale su značajne HBsAg-specifične (s208) i HBcAg-specifične (c93) CD8+ T-ćelijske odgovore detektabilne u slezini (p < 0.05) a, posebno, jetrapovezane limfocite kod HBVtg miševa (p < 0.05) (Fig.30E), praćeno blagim T-ćelijski-idukovanim oštećenjem jetre zbog povećanja ALT (Fig.30B). Nije bilo statistički značajne razlike u veličini HBV-specifičnih CD8+ T ćelijskih odgovora izazvanih c-di-AMP ili CpG/PCEP režimima.
[0132] Što se tiče ovih podataka, smatra se da je c-di-AMP potentan adjuvans za terapeutsku proteinsku primarnu-MVA pojačanu vakcinaciju čak i kod HBVtg miševa visoke antigenemije.
Primer 11: Procena optimalnog puta isporuke za razne adjuvanse: c-di-AMP, poli-LCIC i RIG-I ligand.
[0133] Za odgovarajući adjuvans za proteinsko prajmiranje za terapeutske heterologne proteinskeprimarne / MVA-pojačane vakcinacije, skrining je proširen. Cilj je bio upoređivanje efikasnosti c-di-AMP sa dva moguća nova adjuvansa za terapeutsku vakcinu protiv hepatitisa B: poli-LCIC i RIG-I ligand. Štaviše, ispitivani su razni protokoli imunizacije radi pronalaženja najefikasnijeg puta primene. Za ovu svrhu, grupe HBVtg miševa niske i srednje antigenemije (n=5) primili su dve proteinske primarne i MVA pojačanu imunizaciju (Fig.30A). Čestični HBsAg i HBcAg za proteinsko prajmiranje kombinovani su i adjuvansirani sa c-di-AMP, poli-LCIC ili RIG-I ligandom.28. dana, miševi su pojačani sa mešavinom MVA-sAg i MVA-jezgro. Imunizacije su izvedene ili isključivo intramuskularnim (i.m.) putem ili je proteinsko prajmiranje dato subkutano (s.c.) praćeno intraperitonealnim (i.p.) pojačanjem. Efikasnost različitih formulacija vakcine i puteva primene upoređeni su u odnosu na indukujuće humoralne i ćelijske imune odgovore 34. dana (6 dana posle pojačanja).
[0134] Svi protokoli vakcinacije snažno su smanjili HBsAg nivoe u serumima HBVtg miševa. Ovo je bilo zbog činjenice da su svi ispitani adjuvansi i putevi isporuke mogli da izazovu visoke titre anti-HBs antitela koji su kompleksirali HBsAg u krvi miševa. Slično tome, nivoi idukovanih anti-HBc antitela bili su uporedivi između grupa miševa, sa blagom tendencijom da je intramuskularni put imunizacije bio snažniji u indukovanju anti-HBc. Ipak, niža HBV replikacija, detektovana posredno pomoću HBeAg nivoa, primećena je samo u grupama HBVtg miševa koji su primili c-di-AMP i.m. ili s.c./i.p. putevima, ili poli-LCIC i.m. putem (Fig.31A). Nažalost, imunizacija sa poli-LCIC na intramuskularni način bio je jedini ispitivan protokol koji je doveo do značajnog gubitka telesne mase kod HBVtg miševa (Fig.31B). C-di-AMP može se smatrati kao da je takođe superioran u indukovanju oba HBcAg-specifična (c93) i HBsAgspecifična (s208) CD8+ T ćelijska odgovora u slezinama i naročito u jetrama imunizovanih HBVtg miševa, nezavisno od toga koji se put davanja koristi (Fig.31C). Interesantno, poli-LCIC rezultirao je snažnim intrahepatičnim HBcAg-specifičnim CD8+ T ćelijskim odgovorom kada je isporučen intramuskularno, a kada je isporučen s.c. / i.p. putem pretežno je izazvao HBsAg-specifične (s208) CD8+ T ćelijske odgovore. RIG-I ligand mogao je da indukuje HBV-specifične humoralne odgovore, ali nije uspeo da indukuje primarne HBV-specifične CD8+ T ćelijske odgovore. MVA-specifični CD8+ T ćelijski odgovori, korišćeni kao kontrole, bili su uporedivi kod svih imunizovanih grupa u slezini i jetri, što ukazuje na jednaku efikasnost vakcinacija.
[0135] Ovi podaci demonstriraju da je c-di-AMP veoma potentan adjuvans, da poli-LCIC prikazuje srednju efikasnost, a da RIG-I ligand nije dovoljno efikasan za terapeutsku proteinsku primarnu-MVA pojačanu vakcinaciju. C-di-AMP bio je podjednako efektivan i kod i.m. i kod s.c./i.p. puteva primene.
Primer 12: Ocena novog MVA konstrukta (MVA-HBVvac) kod C57BL/6 miševa.
[0136] Dalje, ocenjena je in vivo imunogenost novo konstruisanih policistronskih MVA eksprimirajućih HBsAg, HBcAg (sekvence koje pokrivaju glavne genotipove A, B, C, D HBV-a) i RT domena HBV polimeraze (MVA-HBVvac). Šematski prikaz dva policistronska konstrukta vakcinacije je generisan: HBWac koja pokriva HBV jezgro i S svih glavnih genotipova HBV-a kao i RT domen HBV polimeraze, i C/S (C/S) eksprimirajuće HBV jezgro i S (Fig.32A). Proteinska ekspresija potvrđena je Western blotiranjem. Fig.32B prikazuje S-ekspresiju od strane različitih rekombinantnih MVA-klonova koji eksprimiraju ili HBVVAc ili S/C.
[0137] Grupe C57BL/6 miševa (n=5) su prajmirane jedanput mešavinom čestičnih HBsAg i HBcAg adjuvansiranih sa c-di-AMP. Dve nedelje kasnije, miševi su pojačani ili sa mešavinom MVA-S i MVA-jezgro, ili sa jednakom količinom nove MVA-HBVvac. Miševi su žrtvovani 21. dana da bi se ocenili HBV-specifični humoralni i ćelijski imuni odgovori (Fig.32C).
[0138] Novi policistronski MVA izazvao je značajne anti-HBs i anti-HBc odgovore antitela, uporediv sa mešavinom kombinacije MVA-S i MVA-jezgro konstruktima (Fig.32D). Štaviše, imunizacija sa MVA-HBVvac izazvala je snažne HBsAg-specifične (s190, s208 i Spul) i HBcAg-specifične (c93, Cpul) CD8+ T ćelijske odgovore (određene analizom splenocita) koji su bili slični u veličini onima idukovanim mešavinom MVA-S i MVA-jezgro (Fig.32E). Dodatno, imunizacija sa MVA-HBVvac rezultirala je detekcijom RT-specifičnih CD8+ T ćelijskih odgovora za peptide RT61, RT333 i RT peptidni pul 2 (označeni strelicama) na niskim nivoima, iako nije korišćen RT protein za prajmiranje.
[0139] Ovi podaci pokazali su da je policistronska MVA (MVA-HBVvac) eksprimirala sve očekivane proteine, a pokazali su odličnu in vivo imunogenost kod C57BL/6 miševa.
Primer 13: Povećanje imunogenosti MVA konstrukata ko-ekspresijom CD70.
[0140] Da bi se poboljšala in vivo imunogenost MVA-baziranih vektora vakcine, MVA vektor koji eksprimira CD70 na bicistronski način je konstruisan (Fig.34A).
[0141] Grupe C57BL/6 miševa (n=6-7) su prajmirane jedanput sa čestičnim HBcAg adjuvansiranim sa CpG i PCEP. Dve nedelje kasnije, miševi su pojačani ili sa MVA-jezgro ili sa jednakom količinom MVAjezgro-CD70 koji eksprimira CD70 dodatno ili sa MVA divljeg tipa kao kontrola (Fig.34B). Miševi su žrtvovani 35. dana radi ocenjivanja HBV-specifičnih humoralnih i ćelijskih imunih odgovora. Dok su humoralni imuni odgovori bili identični posle MVAjezgro i MVAjezgro-CD70 pojačanog, CD8+ T ćelijski odgovori protiv MVA(B8R)-specifičnog citokina bili su blagi, a protiv HBV(C93)-specifičnog citokina bili su značajno povećani kod miševa pojačanih sa MVAjezgro-CD70 (Fig.34C). Ponovljeni eksperiment dao je identične rezultate.
[0142] U trećem eksperimentu, grupe HBV-transgenih miševa uzgajani na C57BL/6 pozadini (n=5-6) su vakcinisane. Kod ovih životinja, imuna tolerancija može biti prekinuta zbog terapeutske vakcinacije. Posle prajmiranja jedanput sa čestičnim HBcAg adjuvansiranim sa CpG i PCEP, miševi su pojačani ili sa MVA-jezgro ili sa jednakom količinom MVAjezgro-CD70 koji eksprimira CD70 (Fig.35A i B). Miševi su vakcinisani sa MVA divljeg tipa koji je služio kao kontrola. Miševi su žrtvovani 35. dana radi ocenjivanja MVA- i HBV-specifičnih T ćelijskih odgovora. CD8+ T ćelije zatvorene na u jetra-povezanim limfocitima pokazale su izraženije izlučivanje IFNg i IL2 posle ponovne stimulacije sa MVA- i HBVjezgro-specifičnim peptidima, respektivno, kada su miševi vakcinisani sa MVAjezgro-CD70 u odnosu na miševe vakcinisane sa MVAjezgro. Kod miševa pojačanih sa MVAwt, MVA-specifični, ali ne i HBV-specifični T ćelijski odgovori su detektovanu (Fig.35C).
[0143] Što se tiče prethodnih rezultata, može se zaključiti da je koekspresija CD70 sa HBV-specifičnim antigenom značajno povećala MVA- kao HBV-specifične T ćelijske odgovore in vivo.
4
[0144] Ovaj pronalazak, ilustrativno opisan ovde, može pogodno da se praktikuje u odsustvu bilo kog elementa ili elemenata, ograničenja ili ograničenja, koji nisu specifično opisani ovde. Tako, na primer, pojmovi "koji obuhvata", "koji uključuje," koji sadrži", itd. čitaće se opširno i bez ograničenja.
[0145] Ovaj pronalazak opisan je potpuno i generički ovde. Svaka od užih vrsta i subgeneričkih grupacija koje potpadaju unutar generičkog otkrivanja takođe formiraju deo ovog pronalaska. Ovo uključuje generički opis ovog pronalaska sa uslovljavanjem ili negativnim ograničenjem uklanjajući bilo koji predmet iz roda, bez obzira na to da li je izrezani materijal ovde posebno naveden ili ne.
[0146] Drugi načini ostvarivanja unutar su sledećih patentnih zahteva. Pored toga, gde su karakteristike ili aspekti ovog pronalaska opisani u pogledu Markush-ovih grupa, stručnjaci u tehnici prepoznaće da je ovaj pronalazak takođe time opisan u pogledu bilo kog pojedinačnog člana ili podgrupe članova Markush-ove grupe.
4
4
4
4
4
1
2
�
1
2
4
1
2
�

Claims (16)

  1. Patentni zahtevi 1. Rekombinantni vektor vakcinacije koji eksprimira (a) protein omotača (HBs-antigen) iz adw serotipa virusa hepatitisa B, pri čemu je taj protein omotača poželjno neki mali ili veliki protein omotača iz adw serotipa genotipa A virusa hepatitisa B, gde je taj mali ili veliki protein omotača poželjno mali protein omotača; i (b) protein jezgra (HBc-antigen) iz ayw serotipa virusa hepatitisa B, pri čemu je taj protein jezgra poželjno iz ayw serotipa genotipa D virusa hepatitisa B; i najmanje jedan od sledećih: (c) imunogeni protein omotača (HBs-antigen) iz virusa hepatitisa B sa najmanje 90% identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom navedenoj u SEQ ID NO: 1; i/ili (d) imunogeni protein jezgra (HBc-antigen) iz virusa hepatitisa B sa najmanje 90% identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom navedenoj u SEQ ID NO: 2; i/ili (e) imunogeni RT domen polimeraze iz virusa hepatitisa B sa najmanje 90 % identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom navedenoj u SEQ ID NO: 3.
  2. 2. Rekombinantni vektor vakcinacije prema zahtevu 1, (I) pri čemu HBs-antigen u (c) i/ili HBc-antigen u (d) je/su iz genotipa C virusa hepatitisa B; (II) pri čemu imunogeni HBs-antigen u (c) ima najmanje 90% identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom navedenoj u SEQ ID NO: 4 i/ili imunogeni HBc-antigen u (d) ima najmanje 90% identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom navedenoj u SEQ ID NO: 5 i/ili imunogeni RT domen polimeraze u (e) ima najmanje 90% identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom navedenoj u SEQ ID NO: 6; (III) pri čemu protein jezgra iz ayw serotipa virusa hepatitisa B u (b) je C-terminalno skraćen protein jezgra koji obuhvata ili koji sadrži aminokiseline 1-149 HBc-antigena iz ayw serotipa genotipa D virusa hepatitisa B; (IV) koji dalje eksprimira (f) CD70, pri čemu je CD70 poželjno humani CD70 ili gde CD70 poželjno ima najmanje 90% identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom navedenoj u SEQ ID NO: 26; (V) pri čemu rekombinantni vektor vakcinacije predstavlja neki virus, neku česticu sličnu virusu ili neku bakteriju; ili (VI) pri čemu rekombinantni vektor predstavlja neki oslabljeni Salmonella soj, CMV-, VSV-bazirani vektor, adenovirusni vektor ili vektor malih boginja.
  3. 3. Rekombinantni vektor vakcinacije prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu je rekombinantni vektor vakcinacije MVA virus, (I) gde poželjno najmanje jedna, poželjno najmanje dve, poželjno najmanje tri, poželjno najmanje četiri, poželjno pet sekvenca(i) nukleinske kiseline koja(e) kodira(ju) za (a), (b), (c), (d) i/ili (e) je/su poželjno obuhvaćena(e) u jednoj ekspresionoj kaseti, pri čemu ta ekspresiona kaseta poželjno kodira aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 7; (II) gde najmanje jedna od nukleinskih kiselina koje kodiraju (a), (b), (c), (d) i/ili (e) je/su poželjno pod kontrolom poksvirusnog promotera, pri čemu je poksvirusni promoter poželjno P7.5 ili PH5, gde ekspresiona kaseta poželjno kodira aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 7; ili (III) gde je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira najmanje jedan od (a), (b), (c), (d) i/ili (e) poželjno umetnuta u deleciju I (del I), deleciju II (del II), deleciju III (del III), deleciju IV (del IV), deleciju V (del V) ili deleciju VI (del VI), poželjno deleciju III (del III) MVA genoma.
  4. 4. MVA virus koji eksprimira (a) protein omotača (HBs-antigen) iz adw serotipa virusa hepatitisa B, pri čemu je protein omotača poželjno neki mali ili veliki protein omotača iz adw serotipa genotipa A virusa hepatitisa B, gde je taj mali ili veliki protein omotača poželjno mali protein omotača; i MVA virus koji eksprimira (b) protein jezgra (HBc-antigen) iz ayw serotipa virusa hepatitisa B, pri čemu je protein jezgra poželjno iz ayw serotipa genotipa D virusa hepatitisa B; za upotrebu u postupku vakcinacije protiv hepatitisa B, pri čemu taj postupak obuhvata: (i) davanje subjektu (a') proteina omotača iz adw serotipa virusa hepatitisa B, pri čemu je taj protein omotača poželjno neki mali ili veliki protein omotača iz adw serotipa genotipa A virusa hepatitisa B, gde je taj mali ili veliki protein omotača poželjno mali protein omotača; i/ili (b') proteina jezgra (HBc-antigen) iz ayw serotipa virusa hepatitisa B, pri čemu je taj protein jezgra poželjno iz ayw serotipa genotipa D virusa hepatitisa B; i (ii) davanje MVA virusa koji eksprimira (a) i MVA virusa koji eksprimira (b), subjektu.
  5. 5. MVA virus za upotrebu prema zahtevu 4, pri čemu MVA virus koji eksprimira (a) i/ili MVA virus koji eksprimira (b) dalje eksprimira CD70.
  6. 6. MVA virus koji eksprimira (a) protein omotača (HBs-antigen) iz adw serotipa virusa hepatitisa B, pri čemu je taj protein omotača poželjno neki mali ili veliki protein omotača iz adw serotipa genotipa A virusa hepatitisa B, gde je taj mali ili veliki protein omotača poželjno mali protein omotača; i (b) protein jezgra (HBc-antigen) iz ayw serotipa virusa hepatitisa B, pri čemu je taj protein jezgra poželjno iz ayw serotipa genotipa D virusa hepatitisa B; za upotrebu u postupku vakcinacije protiv hepatitisa B, pri čemu taj postupak obuhvata: (i) davanje subjektu (a') proteina omotača iz adw serotipa virusa hepatitisa B, pri čemu je taj protein omotača poželjno neki mali ili veliki protein omotača iz adw serotipa genotipa A virusa hepatitisa B, gde je taj mali ili veliki protein omotača poželjno mali protein omotača; i/ili (b') proteina jezgra (HBc-antigen) iz ayw serotipa virusa hepatitisa B, pri čemu je taj protein jezgra poželjno iz ayw serotipa genotipa D virusa hepatitisa B; i (ii) davanje MVA virusa subjektu.
  7. 7. MVA virus za upotrebu prema zahtevu 6, pri čemu taj MVA virus dalje eksprimira CD70.
  8. 8. Rekombinantni vektor vakcinacije prema zahtevu 3 za upotrebu u terapiji ili vakcinaciji.
  9. 9. Rekombinantni vektor vakcinacije za upotrebu prema zahtevu 8, pri čemu upotreba predstavlja postupak vakcinacije protiv hepatitisa B, gde ta upotreba obuhvata (i) davanje subjektu (a') proteina omotača iz adw serotipa virusa hepatitisa B, pri čemu je taj protein omotača poželjno neki mali ili veliki protein omotača iz adw serotipa genotipa A virusa hepatitisa B, gde je taj mali ili veliki protein omotača poželjno mali protein omotača; i/ili (b') proteina jezgra (HBc-antigen) iz ayw serotipa virusa hepatitisa B, pri čemu je taj protein jezgra poželjno iz ayw serotipa genotipa D virusa hepatitisa B; i (ii) davanje MVA virusa subjektu.
  10. 10. MVA virus ili rekombinantni vektor vakcinacije za upotrebu prema bilo kom od zahteva 4 do 9, (I) pri čemu postupak vakcinacije predstavlja postupak za terapeutsku vakcinaciju; (II) pri čemu (i) postupka vakcinacije je faza prajmiranja i (ii) postupka vakcinacije je faza pojačanja; (III) pri čemu protein omotača i/ili protein jezgra u (i) se zajednički daje sa najmanje jednim adjuvansom, gde je adjuvans poželjno odabran iz grupe koju čine poli[di(natrijum karboksilatoetilfenoksi)]fosfazen (PCEP), oligonukleotid koji je stimulator imuniteta, agonist toličnog receptora (TLR), saponin ili njihove kombinacije, pri čemu je TLR agonist poželjno TLR 3 agonist, TLR 4 agonist, TLR 7 agonist, TLR 8 agonist ili TLR 9 agonist, dok je je oligonukleotid koji je stimulator imuniteta poželjno poli I/C, CpG, RIG-I ligand, STING ligand, ciklični di-AMP, ciklični di-CMP, ciklični di-GMP, TLR 7 agonist, TLR 8 agonist, CTA1DD ili dmLT, pri čemu je adjuvans poželjno PCEP i/ili CpG adjuvans ili gde je adjuvans poželjno ciklični di-AMP; (IV) pri čemu se (i) izvodi najmanje oko 1 dana pre izvođenja (ii), poželjno najmanje oko 5 dana, poželjno najmanje oko 1 nedelje, poželjno oko 1 nedelje do oko 8 nedelja, poželjno oko 2 nedelje do oko 5 nedelja, poželjno oko 3 nedelje do oko 4 nedelja; ili (V) pri čemu postupak vakcinacije dalje obuhvata posle (i), a pre (ii): (i') davanje subjektu (a') proteina omotača iz genotipa A virusa hepatitisa B, pri čemu je taj protein omotača poželjno neki mali ili veliki protein omotača iz adw serotipa genotipa A virusa hepatitisa B, gde je taj mali ili veliki protein omotača poželjno mali protein omotača; i/ili (b') proteina jezgra (HBc-antigen) iz genotipa D virusa hepatitisa B, pri čemu je taj protein jezgra poželjno iz ayw serotipa genotipa D virusa hepatitisa B, pri čemu je (i') poželjno faza pojačanja, gde se (i) poželjno izvodi najmanje oko 1 dana pre izvođenja (i'), poželjno najmanje oko 5 dana, poželjno najmanje oko 1 nedelje, poželjno oko 1 nedelje do oko 8 nedelja, poželjno oko 2 nedelje do oko 5 nedelja, poželjno oko 3 nedelje do oko 4 nedelje, i pri čemu se (i') poželjno izvodi najmanje oko 1 dana pre izvođenja (ii), poželjno najmanje oko 5 dana, poželjno najmanje oko 1 nedelje, poželjno oko 1 nedelje do oko 8 nedelja, poželjno oko 2 nedelje do oko 5 nedelja, poželjno oko 3 nedelje do oko 4 nedelje; ili.
  11. 11. MVA virus za upotrebu prema bilo kom od zahteva 4 do 10, pri čemu je davanje parenteralnim ili mukoznim putem, (I) pri čemu je davanje poželjno intramuskularno, i gde faza (i) i/ili (i') obuhvata davanje nekog adjuvansa, gde taj adjuvans obuhvata ciklični di-AMP; ili (II) pri čemu je davanje poželjno subkutano ili intramuskularno, i gde faza (i) i/ili (i') obuhvata davanje nekog adjuvansa, gde taj adjuvans obuhvata poli I/C ili RIG-I-ligand.
  12. 12. Vakcina ili farmaceutska kompozicija koja obuhvata rekombinantni vektor vakcinacije ili MVA virus prema bilo kom od zahteva 1 do 3.
  13. 13. Vakcina prema zahtevu 12, u kojoj rekombinantni vektor vakcinacije predstavlja rekombinantni vektor vakcinacije prema zahtevu 3 ili rekombinantni vektor vakcinacije prema zahtevu 1 koji je neki oslabljeni Salmonella soj, ili gde vakcina predstavlja parenteralnu ili mukoznu vakcinu.
  14. 14. Komplet koji obuhvata: (i) proteinsku kompoziciju koja obuhvata: (a) protein omotača iz genotipa A virusa hepatitisa B, pri čemu je taj protein omotača poželjno neki mali ili veliki protein omotača iz adw serotipa genotipa A virusa hepatitisa B, gde je taj mali ili veliki protein omotača poželjno mali protein omotača; i/ili (b) protein jezgra (HBc-antigen) iz genotipa D virusa hepatitisa B, pri čemu je taj protein jezgra poželjno iz ayw serotipa genotipa D virusa hepatitisa B; (ii) vakcinu prema bilo kom od zahteva 12 ili 13.
  15. 15. Komplet prema zahtevu 14, (I) pri čemu je proteinska kompozicija pogodna za parenteralno davanje, gde ta kompozicija poželjno obuhvata najmanje jedan adjuvans koji je PCEP i/ili CpG adjuvans; (II) pri čemu je proteinska kompozicija pogodna za mukozno davanje, gde ta kompozicija poželjno obuhvata neki adjuvans izabran iz grupe koju čine CTA1DD, dmLT, PCEP, poli I/C, RIG-I-ligand, c-di-AMP, c-di-CMP i c-diGMP ili njihove kombinacije; (III) pri čemu je ta proteinska kompozicija pogodna za intramuskularno davanje, gde ta kompozicija poželjno obuhvata najmanje jedan adjuvans koji je ciklični di-AMP; ili (IV) pri čemu je proteinska kompozicija pogodna za subkutano ili intramuskularno davanje, gde ta kompozicija poželjno obuhvata najmanje jedan adjuvans koji je poli I/C.
  16. 16. Ekspresiona kaseta koja obuhvata nukleinske kiseline koje kodiraju: (a) protein omotača (HBs-antigen) iz adw serotipa virusa hepatitisa B, pri čemu je taj protein omotača poželjno neki mali ili veliki protein omotača iz adw serotipa genotipa A virusa hepatitisa B, gde je taj mali ili veliki protein omotača poželjno mali protein omotača; i (b) protein jezgra (HBc-antigen) iz ayw serotipa virusa hepatitisa B, pri čemu je taj protein jezgra poželjno iz ayw serotipa genotipa D virusa hepatitisa B; i najmanje jedan od sledećih: (c) imunogeni protein omotača (HBs-antigen) iz virusa hepatitisa B sa najmanje 90% identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom navedenoj u SEQ ID NO: 1; i/ili (d) imunogeni protein jezgra (HBc-antigen) iz virusa hepatitisa B sa najmanje 90% identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom navedenoj u SEQ ID NO: 2; i/ili (e) imunogeni RT domen polimeraze iz virusa hepatitisa B sa najmanje 90 % identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom navedenoj u SEQ ID NO: 3.
RS20201424A 2016-01-12 2017-01-12 Sredstva i postupci za lečenje hbv RS61118B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
LU92942 2016-01-12
EP17701067.5A EP3402888B1 (en) 2016-01-12 2017-01-12 Means and methods for treating hbv
PCT/EP2017/050553 WO2017121791A1 (en) 2016-01-12 2017-01-12 Means and methods for treating hbv

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS61118B1 true RS61118B1 (sr) 2020-12-31

Family

ID=55237880

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20201424A RS61118B1 (sr) 2016-01-12 2017-01-12 Sredstva i postupci za lečenje hbv

Country Status (20)

Country Link
US (1) US10912827B2 (sr)
EP (1) EP3402888B1 (sr)
JP (1) JP6743154B2 (sr)
KR (1) KR102873711B1 (sr)
CN (2) CN116732101A (sr)
AU (1) AU2017207764B2 (sr)
CA (1) CA3002508A1 (sr)
DK (1) DK3402888T3 (sr)
ES (1) ES2834698T3 (sr)
HR (1) HRP20201873T1 (sr)
HU (1) HUE052104T2 (sr)
IL (1) IL260525B (sr)
PL (1) PL3402888T3 (sr)
PT (1) PT3402888T (sr)
RS (1) RS61118B1 (sr)
RU (1) RU2740802C2 (sr)
SG (1) SG11201805229YA (sr)
SI (1) SI3402888T1 (sr)
WO (1) WO2017121791A1 (sr)
ZA (1) ZA201802644B (sr)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JOP20200092A1 (ar) 2014-11-10 2017-06-16 Alnylam Pharmaceuticals Inc تركيبات iRNA لفيروس الكبد B (HBV) وطرق لاستخدامها
CA3026054A1 (en) 2016-05-30 2017-12-07 Geovax Inc. Compositions and methods for generating an immune response to hepatitis b virus
KR102672900B1 (ko) * 2016-09-01 2024-06-10 (주)아모레퍼시픽 2,4-디클로로-a-(3,4-디하이드로-4-옥소-2(1H)-퀴나졸리닐리덴)-β-옥소-벤젠프로판니트릴을 포함하는 멜라닌 증진용 조성물
WO2018195165A1 (en) * 2017-04-18 2018-10-25 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods for the treatment of subjects having a hepatitis b virus (hbv) infection
JP7688480B2 (ja) * 2017-04-18 2025-06-04 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド Ｂ型肝炎ウイルス（ｈｂｖ）感染を有する対象を処置する方法
US11324820B2 (en) 2017-04-18 2022-05-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods for the treatment of subjects having a hepatitis b virus (HBV) infection
EP3638774B1 (en) * 2017-06-14 2024-08-07 Helmholtz Zentrum München - Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Methods for purifying endoderm and pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells
GB201721068D0 (en) * 2017-12-15 2018-01-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis B immunisation regimen and compositions
GB201721069D0 (en) * 2017-12-15 2018-01-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis B Immunisation regimen and compositions
WO2019123250A1 (en) * 2017-12-19 2019-06-27 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Methods and compositions for inducing an immune response against hepatitis b virus (hbv)
CA3106701A1 (en) 2018-08-13 2020-02-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Hepatitis b virus (hbv) dsrna agent compositions and methods of use thereof
CA3112600A1 (en) * 2018-09-20 2020-03-26 University Of Saskatchewan Mucoadhesive lipidic delivery system
CN113939527B (zh) * 2019-01-11 2025-10-28 新加坡科技研究局 Hla-a*11:01限制性乙型肝炎病毒(hbv)肽用于鉴别hbv特异性cd8+ t细胞的用途
CN113573730A (zh) * 2019-03-05 2021-10-29 葛兰素史密斯克莱生物公司 乙型肝炎免疫方案和组合物
WO2020210628A1 (en) * 2019-04-10 2020-10-15 Emv Enhance (Hk) Limited Compositions and methods for improving vaccination of hyporesponsive individuals
AU2020342385A1 (en) 2019-08-29 2022-03-31 Triad National Security, Llc Hepatitis B virus vaccines
EP4074336A4 (en) * 2019-12-13 2024-09-04 Grand Theravac Life Science (Nanjing) Co., Ltd. PHARMACEUTICAL COMPOSITION AND ITS USE
BR112022014884A2 (pt) * 2020-02-14 2022-10-11 Geovax Inc Vetor viral de vaccinia ankara modificado recombinante, vaccinia ankara modificado recombinante, e, método para reduzir ou prevenir uma infecção por coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave
BR112022027038A2 (pt) * 2020-07-08 2023-01-24 Janssen Sciences Ireland Unlimited Co Vacinas de replicon de rna contra hbv
WO2023085956A1 (en) * 2021-11-09 2023-05-19 Avalia Immunotherapies Limited Novel therapeutic vaccines
CN118660708A (zh) * 2022-01-25 2024-09-17 公益财团法人川崎市产业振兴财团 用于经皮给药的含有rna的组合物和该组合物的给药方法
WO2023250522A2 (en) * 2022-06-25 2023-12-28 Administrators Of The Tulane Educational Fund Vaccine adjuvants and methods
CN115747174B (zh) * 2022-09-15 2026-02-03 武汉大学 重组溶瘤病毒rVSVM51R-C在乙肝性肝癌中的应用
TW202436622A (zh) 2023-03-06 2024-09-16 美商英特利亞醫療公司 用於ｂ型肝炎病毒（ｈｂｖ）基因體編輯之組合物及方法
WO2024193905A1 (en) * 2023-03-17 2024-09-26 Helmholtz Zentrum München - Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Hbv antigen formulation for treating hepatitis b
WO2025172435A1 (en) * 2024-02-13 2025-08-21 Helmholtz Zentrum München - Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Hbv antigen formulation for treating hepatitis b

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6235288B1 (en) 1992-08-26 2001-05-22 The Scripps Research Institute Peptides for inducing cytotoxic T lymphocyte responses to hepatitis B virus
WO2006125983A1 (en) 2005-05-23 2006-11-30 Oxxon Therapeutics Ltd Compositions for inducing an immune response against hepatitis b
US20110110974A1 (en) 2007-10-29 2011-05-12 Erik Depla Methods and kits for inducing a ctl response using a prime boost regimen
SG178254A1 (en) * 2009-08-07 2012-03-29 Transgene Sa Composition for treating hbv infection
US8877205B2 (en) * 2011-02-12 2014-11-04 Globeimmune, Inc. Yeast-based therapeutic for chronic hepatitis B infection
KR101281098B1 (ko) * 2011-06-30 2013-07-02 주식회사 녹십자 Ｂ형 간염 바이러스 표면 항원상의 에피토프 및 이의 용도
CA2948181A1 (en) * 2014-05-16 2015-11-19 Yale University Virus like vesicles (vlvs) based vaccines to prevent or treat chronic hepatitis b virus (hbv) infection

Also Published As

Publication number Publication date
SI3402888T1 (sl) 2021-02-26
KR102873711B1 (ko) 2025-10-21
KR20180100228A (ko) 2018-09-07
AU2017207764B2 (en) 2023-04-27
RU2018114308A3 (sr) 2020-02-13
US20190030158A1 (en) 2019-01-31
CA3002508A1 (en) 2017-07-20
US10912827B2 (en) 2021-02-09
JP6743154B2 (ja) 2020-08-19
EP3402888A1 (en) 2018-11-21
ZA201802644B (en) 2023-07-26
HUE052104T2 (hu) 2021-04-28
RU2018114308A (ru) 2020-02-13
RU2740802C2 (ru) 2021-01-21
IL260525B (en) 2022-02-01
CN109154004B (zh) 2023-06-06
SG11201805229YA (en) 2018-07-30
PL3402888T3 (pl) 2021-04-19
AU2017207764A1 (en) 2018-05-10
BR112018013387A2 (pt) 2019-03-06
NZ743654A (en) 2025-06-27
EP3402888B1 (en) 2020-08-26
WO2017121791A1 (en) 2017-07-20
ES2834698T3 (es) 2021-06-18
CN116732101A (zh) 2023-09-12
CN109154004A (zh) 2019-01-04
JP2019505205A (ja) 2019-02-28
PT3402888T (pt) 2020-12-04
DK3402888T3 (da) 2020-11-30
HRP20201873T1 (hr) 2021-01-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3402888B1 (en) Means and methods for treating hbv
JP7113924B2 (ja) 組み換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ｍｖａ）フィロウイルスワクチン
CN103998604B (zh) Hbv聚合酶突变体
US11020476B2 (en) Methods and compositions for inducing an immune response against Hepatitis B Virus (HBV)
CN111787982A (zh) 乙型肝炎免疫方案和组合物
US20230406889A1 (en) Live-attenuated flaviviruses with heterologous antigens
BR112020012273A2 (pt) métodos e composições para induzir uma resposta imune contra o vírus da hepatite b (hbv)
CN111836640A (zh) 乙型肝炎免疫方案和组合物
HK40099982A (zh) 用於治疗hbv的手段和方法
BR112018013387B1 (pt) Vetor de vacinação recombinante, usos de um vetor de vacinação recombinante, vacina ou composição farmacêutica e kit
US20250387463A1 (en) Recombinant Modified saRNA (VRP) and Vaccinia Virus Ankara (MVA) Prime-Boost Regimen
EA039715B1 (ru) Филовирусная вакцина на основе рекомбинантного модифицированного вируса осповакцины анкара (mva)
NZ620867B2 (en) Hbv polymerase mutants
BR112017003908B1 (pt) Vacina contra filovírus de vírus de vaccinia modificado recombinante ankara (mva)