[go: up one dir, main page]

RS61854B1 - Konjugati il-2 dela i polimera - Google Patents

Konjugati il-2 dela i polimera

Info

Publication number
RS61854B1
RS61854B1 RS20210612A RSP20210612A RS61854B1 RS 61854 B1 RS61854 B1 RS 61854B1 RS 20210612 A RS20210612 A RS 20210612A RS P20210612 A RSP20210612 A RS P20210612A RS 61854 B1 RS61854 B1 RS 61854B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
moiety
poly
conjugate
polymer
water
Prior art date
Application number
RS20210612A
Other languages
English (en)
Inventor
Mary J Bossard
Cherie F Ali
Xiaofeng Liu
Deborah H Charych
Yujun Wang
Original Assignee
Nektar Therapeutics
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nektar Therapeutics filed Critical Nektar Therapeutics
Publication of RS61854B1 publication Critical patent/RS61854B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2013—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/12—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Između ostalog, jedno ili više otelotvorenja predmetnog pronalaska se odnose na konjugate koji sadrže IL-2 deo (tj., deo koji ima bar neku aktivnost sličnu humanom IL-2) i polimer, kako je definisano u patentnim zahtevima. Pored toga, pronalazak se odnosi (između ostalog) na sastave koji sadrže konjugate, postupke za sintezu konjugata i farmaceutske sastave za upotrebu u terapiji, kako je definisano u patentnim zahtevima.
POZADINA PRONALASKA
[0002] Kod zdravih ljudi imuni sistem može da razlikuje zdrave ćelije od ćelija karcinoma. Nakon identifikovanja date ćelije kao kancerogene, imuni sistem je obično eliminiše. Dakle, kada se imuni sistem slomi ili je preplavljen, karcinomi se mogu razviti kao rezultat nesposobnosti ugroženog imunološkog sistema da diferencira, a zatim i eliminiše ćelije raka. Kod pacijenta koji pati od raka, primena imuno modularnog proteina pacijentu može pomoći u vraćanju (barem delimično) imunološkog sistema tog pacijenta u normalu, tako da se sposobnost njenog imunog sistema da eliminiše ćelije karcinoma vrati. Na ovaj način, rak se može usporiti ili čak eliminisati.
[0003] Jedan od takvih imuno modulatrnih proteina koji se koristi u lečenju pacijenata koji pate od određenih karcinoma je interleukin-2. Interleukin-2 (IL-2) je citokin koji se prirodno javlja i ima aktivnost i kao stimulator prirodnih ćelija ubica (NK ćelija) i kao induktor proliferacije T-ćelija. U neglikoziliranom obliku, IL-2 ima molekulsku težinu od oko 15.300 daltona (iako se IL-2 nalazi in vivo u promenljivo glikoziliranim oblicima).
[0004] Komercijalno dostupan neglikozilirani humani rekombinantni IL-2 proizvod, aldesleukin (dostupan kao PROLEUKIN® marka des-alanil-1, serin-125 humani interleukin-2, kompanije Prometheus Laboratories Inc., San Diego, CA), odobren je za davanje pacijenti koji pate od metastatskog karcinoma bubrežnih ćelija i metastatskog melanoma. IL-2 je takođe predložen za davanje kod pacijenata koji pate ili su zaraženi virusom hepatitisa C (HCV), virusom humane imunodeficijencije (HIV), akutnom mijeloidnom leukemijom, ne-Hodgkinovim limfomom, kožnim limfomom T-ćelija, juvenilnim reumatoidnim artritisom, atopijskim dermatitis, raka dojke i raka bešike.
[0005] Čak i preporučene doze aldesleukina, međutim, mogu izazvati ozbiljne neželjene efekte, uključujući sindrom kapilarnog curenja (CLS) i oštećenu funkciju neutrofila. S obzirom na potencijal za ove ozbiljne neželjene efekte i s obzirom da preporučeni ciklus lečenja uključuje intravensku infuziju tokom petnaest minuta na svakih osam sati tokom četrnaest doza, davanje aldesleukina se dešava u kliničkom okruženju. Štaviše, komercijalna formulacija aldesleukina uključuje prisustvo natrijum dodecil sulfata, supstance za koju se čini da je potrebna za održavanje optimalne aktivnosti kroz konformacionu stabilnost. Videti Arakawa i dr. (1994) Int. J. Peptide Protein Res.43:583-587.
[0006] Pokušano je da se reše zabrinutosti za toksičnost IL-2. U jednom pristupu su pokušani pristupi formulaciji. Videti, na primer, patent SAD br.6,706,289 i međunarodnu objavu patentnih prijava br. WO 02/00243 i WO 99/60128. U drugim pristupima su predloženi određeni konjugati IL-2. Videti, na primer, patent SAD br.4,766,106, 5,206,344, 5,089,261 i 4,902,502.
[0007] Objava kineske patente prijave br. CN101104077 opisuje linearne monometoksi(polietilen glikol) ("mPEG") konjugate IL-2, pri čemu mPEG ima molekulsku težinu od 5000 do 40000 daltona i kovalentno je vezan za slobodnu amino grupu IL-2 preko stabilnog oligopeptida ili aminokiselinskog veziva. Međunarodna patentna prijava br. WO 2010/033207 opisuje peptide koji su hemijski modifikovani kovalentnim vezivanjem oligomera rastvorljivog u vodi. Američka patentna prijava br. US 2006/0293499 opisuje konjugate koji imaju deljivu vezu i polimerne reagense korisne u pripremi takvih konjugata.
[0008] Bez obzira na ove pristupe, ostaje potreba za konjugatima IL-2. Između ostalog, jedno ili više otelotvorenja prema predmetnom pronalasku su prema tome usmereni na takve konjugate kao i na sastave koji sadrže konjugate i srodne postupke kako su ovde opisani.
REZIME PRONALASKA
[0009] Pronalazak je definisan patentnim zahtevima. Bilo koji predmet koji nije obuhvaćen patentnim zahtevima naveden je samo u informativne svrhe. Bilo koja referenca u opisu postupaka lečenja odnosi se na jedinjenja, farmaceutske sastave i lekove predmetnog pronalaska za upotrebu u postupku lečenja humanog ili životinjskog tela terapijom.
[0010] Predmetni pronalazak obezbeđuje konjugat koji sadrži jedan, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam ili osam razgrananih u vodi rastvorljivih poli(etilen glikol) polimera, kovalentno vezanih preko deljive karbamatske veze na amino grupu interleukin-2 ostatak, svaki razgranat poli(etilen glikol) rastvorljiv u vodi, koji ima ukupnu prosečnu molekulsku težinu u opsegu od 500 Daltona do 100000 Daltona,
pri čemu se po oslobađanju razgranati u vodi rastvorljivi poli(etilen glikol) polimer odvaja od interleukin-2 dela in vivo ne ostavljajući fragment vezan za ostatak interleukin-2, konjugat koji ima formulu
gde je POLY<1>prvi poli(etilen glikol); POLY<2>je drugi poli(etilen glikol); X<1>je prvi razdelnički deo; X<2>je drugi razdelnički deo; Hα je atom vodonika koji se jonizuje; R<1>je H ili organski radikal; R<2>je H ili organski radikal; (a) je ili nula ili jedan; (b) je ili nula ili jedan; R<e1>, kada je prisutan, je prva grupa koja menja elektrone; R<e2>, kada je prisutan, je druga grupa koja menja elektrone; Y<1>je O; Y<2>je O; n je ceo broj od 1-8; i (IL-2) je interleukin-2 deo koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3 ili koji ima 95% ili veću identičnost sekvence sa SEQ ID NO:3.
[0011] U skladu sa patentnim zahtevima, pronalazak obezbeđuje konjugat koji sadrži ostatak dela IL-2 koji je kovalentno vezan za polimer rastvorljiv u vodi.
[0012] U skladu sa patentnim zahtevima, pronalazak obezbeđuje konjugat koji sadrži ostatak dela IL-2 koji je kovalentno vezan za polimer rastvorljiv u vodi, pri čemu je ostatak dela IL-2 kovalentno vezan za polimer rastvorljiv u vodi putem sredstva za otpuštanje povezivanje.
[0013] U skladu sa patentnim zahtevima, pronalazak obezbeđuje konjugat koji sadrži ostatak dela IL-2, kovalentno vezan za polimer rastvorljiv u vodi, pri čemu je deo IL-2 deo koji nije prekursor IL-2.
KRATAK OPIS SLIKA
[0014]
Sl. 1 daje DNK sekvencu i rezultujuću aminokiselinsku sekvencu gena dalje opisanog u Primeru 1.
Sl. 2.1 je prikaz tipičnog hromatograma nakon katjonoizmenjivačke hromatografije [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] pripremljen prema proceduri izloženoj u Primeru 2.
Sl. 2.2 je prikaz hromatograma nakon analize HPLC reverzne faze [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2], kako je dalje opisano u Primeru 2.
Sl. 2.3 je grafik profila oslobađanja različitih konjugata pripremljenih u skladu sa postupkom navedenim u Primeru 2.
Sl. 3.1 je prikaz tipičnog hromatograma nakon katjonoizmenjivačke hromatografije [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] pripremljen prema procedurama izloženim u Primeru 3.
Sl. 3.2 je prikaz hromatograma nakon analize HPLC reverzne faze [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2], kako je dalje opisano u Primeru 3.
Sl. 3.3 predstavlja prikaz rezultata koji slede nakon MALDI-TOF analize različitih konjugata pripremljenih u skladu sa procedurama izloženim u Primeru 3.
Sl. 4.1 je prikaz tipičnog hromatograma nakon katjonoizmenjivačke hromatografije [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] pripremljen prema procedurama izloženim u Primeru 4. Sl. 4.2 je prikaz hromatograma nakon analize HPLC reverzne faze [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2], kako je dalje opisano u Primeru 4.
Sl. 5 je prikaz hromatograma nakon katjonoizmenjivačke hromatografije [mPEG2-ru-40K]-[rIL-2], kako je dalje opisano u Primeru 5.
Sl. 6 je prikaz hromatograma nakon katjonoizmenjivačke hromatografije [mPEG2-ru-4K]-[rIL-2], kako je dalje opisano u Primeru 6.
Sl. 7 prikazuje grafikon proliferacije ćelija CTLL-2 kao odgovor na aldesleukin i stabilni [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2], kako je dalje opisano u Primeru 11. Tačke podataka su sredstvo jednog eksperimenta u trostrukim određivanjima. Trake grešaka predstavljaju standardnu grešku srednje vrednosti.
Sl. 8 prikazuje grafikon proliferacije CTLL-2 ćelija kao odgovor na aldesleukin, oslobođen i neobjavljen [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] i [mPEG2-CAC-fmoc-20K][rIL-2], kako je dalje opisano u Primeru 11. Tačke podataka su sredstvo jednog eksperimenta u trostrukim određivanjima. Trake grešaka predstavljaju standardnu grešku srednje vrednosti.
Sl. 9 prikazuje grafik krive koncentracije i vremena nakon pojedinačne injekcije u miševe, kao što je dalje opisano u Primeru 12.
Sl. 10 prikazuje grafik ukupne površine lezije (mm<2>) za nekoliko ispitivanih jedinjenja kako je dalje opisano u Primeru 13.
Sl. 11A i Sl.11B su grafici koji prikazuju vreme do kriva napredovanja tumora za testirane proizvode pri različitim šemama davanja, kao što je dalje opisano u Primeru 14.
DETALJNI OPIS PRONALASKA
[0015] Pre detaljnog opisivanja jedne ili više otelotvorenja prema predmetnom pronalasku, treba razumeti da je predmetni pronalazak ograničen na obim dodatih zahteva.
[0016] Mora se primetiti da, kao što se koristi u ovoj specifikaciji i predviđenim patentnim zahtevima, oblici jednine „a“, „an“ i „the“ uključuju množinske reference, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije. Tako, na primer, referenca na "polimer" uključuje pojedinačni polimer kao i dva ili više istih ili različitih polimera, a referenca na "opcioni ekscipijens" odnosi se na jedan opciono ekscipijens, kao i na dve ili više istih ili različitih opcionih ekscipijenasa.
[0017] U opisivanju i zahtevanju jednog ili više otelotvorenja predmetnog pronalaska, koristiće se sledeća terminologija u skladu sa definicijama opisanim u nastavku.
[0018] "PEG", "polietilen glikol" i "poli(etilen glikol)" kako su ovde korišćeni, zamenljivi su i obuhvataju bilo koji nepeptidni poli(etilen oksid) rastvorljiv u vodi. Tipično, PEG za upotrebu u skladu sa pronalaskom sadrže sledeću strukturu "- (OCH2CH2)n-" gde je (n) 2 do 4000. Kako se ovde koristi, PEG takođe uključuje "-CH2CH2-O(CH2CH2O)n-CH2CH2-" i "-(OCH2CH2)nO-", u zavisnosti od toga da li su krajnji kiseonici postavljeni, na primer, tokom sintetičke transformacije. Kroz specifikaciju i patentne zahteve, treba imati na umu da termin "PEG" uključuje strukture koje imaju različite terminalne ili "krajnje ograničene" grupe i tako dalje. Termin "PEG" takođe označava polimer koji sadrži većinu, odnosno veću od 50% podjedinica -OCH2CH2- S obzirom na određene oblike, PEG može poprimiti bilo koji broj različitih molekulskih težina, kao i struktura ili geometrija kao što su „razgranati“, „linearni“, „račvasti“ i „multifunkcionalni“, da bi bili detaljnije opisani ispod.
[0019] Termini "završni poklopac" i "krajnji poklopac" ovde se naizmenično koriste za označavanje terminala ili krajnje tačke polimera koji ima završni poklopac. Tipično, iako ne nužno, ostatak koji pokriva kraj sadrži hidroksi ili C1-20alkoksi grupu, još poželjnije C1-10alkoksi grupu, i još poželjnije C1-5alkoksi grupu. Prema tome, primeri ostataka sa završnim poklopcem uključuju alkoksi (npr., metoksi, etoksi i benziloksi), kao i aril, heteroaril, ciklo i heterociklo. Mora se zapamtiti da ostatak sa završnim poklopcem može sadržati jedan ili više atoma krajnjeg monomera u polimeru [npr., ostatak sa završnim poklopcem „metoksi“ u CH3O(CH2CH2O)n- i CH3(OCH2CH2)n-]. Pored toga, predviđeni su zasićeni, nezasićeni, supstituisani i nesupstituisani oblici svakog od prethodnih. Štaviše, grupa sa završnim poklopcem takođe može biti silan. Grupa sa završnim poklopcem takođe može povoljno da sadrži etiketu koja se može prepoznati. Kada polimer ima završnu grupu koja sadrži detektujuću etiketu, količina ili mesto polimera i/ili dela (npr., aktivnog sredstva) na koji je polimer vezan može se odrediti korišćenjem odgovarajućeg detektora. Takve oznake uključuju, bez ograničenja, fluorescere, hemiluminescere, delove koji se koriste u enzimskom obeležavanju, kolorimetrijske (npr., boje), metalne jone i radioaktivne delove. Pogodni detektori uključuju fotometre, filmove i spektrometre. Grupa sa završnim poklopcem takođe može povoljno da sadrži fosfolipid. Kada polimer ima završnu grupu koja sadrži fosfolipid, polimeru i rezultujućem konjugatu daju se jedinstvena svojstva. Primeri fosfolipida uključuju, bez ograničenja, one koji su izabrani iz klase fosfolipida nazvanih fosfatidilholini. Specifični fosfolipidi uključuju, bez ograničenja, one koji su izabrani iz grupe koja se sastoji od dilauroilfosfatidilholina, dioleilfosfatidilholina, dipalmitoilfosfatidilholina, disteroilfosfatidilholina, behenoilfosfatidilholina, arahidoilfosfatidilholin i lecitin. Grupa sa završnim poklopcem takođe može da sadrži ciljani deo, tako da polimer - kao i bilo šta, npr., IL-2 deo, koji je za njega vezan - može preferencijalno da se lokalizuje u području od interesa.
[0020] "Ne pojavljuje se u prirodi" u odnosu na polimer kako je ovde opisan, znači polimer koji u celini nije pronađen u prirodi. Polimer koji se ne pojavljuje u prirodi može, međutim, da sadrži jedan ili više monomera ili segmenata monomera koji se javljaju u prirodi, sve dok se ukupna struktura polimera ne nalazi u prirodi.
[0021] Termin „rastvorljiv u vodi“ kao u „polimer rastvorljiv u vodi“ je svaki polimer koji je rastvorljiv u vodi na sobnoj temperaturi. Tipično, polimer rastvorljiv u vodi će propustiti najmanje oko 75%, poželjnije najmanje oko 95% svetlosti koja se propušta istim rastvorom nakon filtriranja. Na osnovu mase, rastvorljiv u vodi polimer će biti poželjno najmanje oko 35% (maseno) rastvorljiv u vodi, još poželjnije najmanje oko 50% (maseno) rastvorljiv u vodi, još poželjnije oko 70% (maseno) rastvorljiv u vodi, a još poželjnije oko 85% (maseno) rastvorljiv u vodi. Međutim, najpoželjnije je da je polimer rastvorljiv u vodi oko 95% (maseno) rastvorljiv u vodi ili potpuno rastvorljiv u vodi.
[0022] Molekulska težina u kontekstu vodo rastvorljivog polimera, kao što je PEG, može se izraziti ili prosečnom molekulskom masom ili prosečnom molekulskom masom. Ukoliko nije drugačije naznačeno, sve reference na molekulsku masu ovde se odnose na prosečnu molekulsku masu. Oba određivanja molekularne mase, prosek broja i prosek težine, mogu se meriti primenom gel propustljive hromatografije ili drugih tehnika tečne hromatografije. Takođe se mogu koristiti i drugi postupci za merenje vrednosti molekulske težine, poput upotrebe analize krajnje grupe ili merenja svojstava (npr., depresija tačke zamrzavanja, povišenje tačke ključanja ili osmotski pritisak) za određivanje prosečne molekulske mase ili upotreba tehnika rasejanja svetlosti, ultracentrifugiranja ili viskometrije za određivanje prosečne molekulske mase. Polimeri pronalaska su tipično polidisperzni (tj., prosečna molekulska masa i prosečna molekulska masa polimera nisu jednake), posedujući niske vrednosti polidisperznosti, poželjno manje od oko 1,2, poželjnije manje od oko 1,15, još poželjnije manje od oko 1,10, ali još poželjnije manje od oko 1,05, a najpoželjnije manje od oko 1,03.
[0023] Termini „aktivan“, „reaktivan“ ili „aktiviran“ kada se koriste zajedno sa određenom funkcionalnom grupom, odnose se na reaktivnu funkcionalnu grupu koja lako reaguje sa elektrofilom ili nukleofilom na drugom molekulu. Ovo je za razliku od onih grupa kojima su potrebni jaki katalizatori ili krajnje nepraktični reakcioni uslovi da bi se reagovalo (tj.
„nereaktivna“ ili „inertna“ grupa).
[0024] Kako se ovde koristi, termin "funkcionalna grupa" ili bilo koji njegov sinonim podrazumeva da obuhvata zaštićene oblike kao i nezaštićene oblike.
[0025] Termini "razdelnički deo", "veza" i "veznik" ovde se koriste da bi se odnosili na vezu ili atom ili kolekciju atoma koji se opciono koriste za povezivanje međusobno povezanih delova, kao što je kraj polimernog segmenta i IL-2 deo ili elektrofil ili nukleofil neke grupe IL-2. Razdelnički deo može biti hidrolitički stabilan ili može sadržati fiziološki hidrolizujuću ili enzimski deljivu vezu. Osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije, razdelnički deo opciono postoji između bilo koja dva elementa jedinjenja (npr., obezbeđeni konjugati koji sadrže ostatak dela IL-2 i polimeri rastvorljivi u vodi mogu se direktno ili indirektno prikačiti kroz razdelnički deo).
[0026] "Alkil" se odnosi na lanac ugljovodonika, obično u rasponu od oko 1 do 15 atoma. Takvi lanci ugljovodonika su poželjno, ali ne nužno zasićeni i mogu biti razgranati ili ravni lanci, mada je tipično ravni lanac poželjniji. Primeri alkil grupa uključuju metil, etil, propil, butil, pentil, 1-metilbutil, 1-etilpropil i 3-metilpentil. Kako se ovde koristi, "alkil" uključuje cikloalkil kao i alkil koji sadrži cikloalkilen.
[0027] "Niži alkil" se odnosi na alkil grupu koja sadrži od 1 do 6 atoma ugljenika i može biti ravan lanac ili razgranat, kao što su primeri metila, etila, n-butila, i-butila i t-butila.
[0028] "Cikloalkil" se odnosi na zasićeni ili nezasićeni ciklični ugljovodonični lanac, uključujući premošćena, spojena ili spiro ciklična jedinjenja, poželjno sačinjena od 3 do oko 12 atoma ugljenika, još poželjnije 3 do oko 8 atoma ugljenika. "Cikloalkilen" se odnosi na cikloalkil grupu koja je umetnuta u alkilni lanac vezivanjem lanca na bilo koja dva ugljenika u cikličnom prstenastom sistemu.
[0029] "Alkoksi" se odnosi na -OR grupu, gde je R alkil ili supstituisani alkil, poželjno C1-6alkil (npr., metoksi, etoksi, propiloksi, i tako dalje).
[0030] Termin "supstituisani" kao, na primer, "supstituisani alkil", odnosi se na deo (npr., alkil grupu) supstituisan sa jednim ili više nesmetanih supstituenata, kao što su, ali nisu ograničeni na: alkil; C3-8cikloalkil, npr., ciklopropil i ciklobutil; halo, npr., fluoro, hloro, bromo i jodo; cijano; alkoksi; niži fenil; i supstituisani fenil. "Supstituisani aril" je aril koji ima jednu ili više neometanih grupa kao supstituent. Za supstitucije na fenilnom prstenu, supstituenti mogu biti u bilo kojoj orijentaciji (tj., orto, meta ili para).
[0031] „Nesmetani supstituenti“ su one grupe koje, kada su prisutne u molekulu, obično ne reaguju sa ostalim funkcionalnim grupama koje su sadržane u molekulu.
[0032] "Aril" označava jedan ili više aromatičnih prstenova, svaki od 5 ili 6 jezgra ugljenikovih atoma. Aril uključuje više arilnih prstenova koji mogu biti fuzionisani, kao u naftilu ili kondenzovani, kao u bifenilu. Arilni prstenovi takođe mogu biti spojeni ili ne spojeni jednim ili više cikličnih ugljovodonika, heteroarila ili heterocikličnih prstenova. Kako se ovde koristi, "aril" uključuje heteroaril.
[0033] "Heteroaril" je aril grupa koja sadrži jedan do četiri heteroatoma, poželjno sumpor, kiseonik ili azot, ili njihovu kombinaciju. Heteroarilni prstenovi takođe mogu biti fuzionisani sa jednim ili više cikličnih ugljovodoničnih, heterocikličnih, arilnih ili heteroarilnih prstenova.
[0034] "Heterocikl" ili "heterociklični" označava jedan ili više prstenova sa 5-12 atoma, poželjno 5-7 atoma, sa ili bez nezasićenja ili aromatičnog karaktera i koji imaju najmanje jedan atom u prstenu koji nije ugljenik. Poželjni heteroatomi uključuju sumpor, kiseonik i azot.
[0035] "Supstituisani heteroaril" je heteroaril koji ima jednu ili više neometajućih grupa kao supstituenata.
[0036] "Supstituisani heterocikl" je heterocikl koji ima jedan ili više bočnih lanaca formiranih od neometanih supstituenata.
[0037] "Organski radikal" kako se ovde koristi uključuje alkil, supstituisani alkil, aril i supstituisani aril.
[0038] "Elektrofil" i "elektrofilna grupa" se odnose na jon ili atom ili kolekciju atoma, koji mogu biti jonski, koji imaju elektrofilni centar, tj., centar koji traži elektrone, sposoban da reaguje sa nukleofilom.
[0039] "Nukleofil" i "nukleofilna grupa" se odnosi na jon ili atom ili kolekciju atoma koji mogu biti jonski koji imaju nukleofilni centar, tj., centar koji traži elektrofilni centar ili sposoban da reaguje sa elektrofilom.
1
[0040] "Fiziološki deljiva" ili "hidrolizujuća" ili "razgradiva" veza je veza koja reaguje sa vodom (tj. hidrolizuje se) u fiziološkim uslovima. Tendencija veze da hidrolizuje u vodi zavisiće ne samo od opšteg tipa veze koja povezuje dva centralna atoma, već i od supstituenata vezanih za te centralne atome. Odgovarajuće hidrolitički nestabilne ili slabe veze uključuju, ali nisu ograničene na, karboksilatni estar, fosfatni estar, anhidride, acetale, ketale, aciloksialkil etar, imine, ortoestre, peptide i oligonukleotide.
[0041] „Enzimski razgradiva veza“ označava vezu koja je podložna razgradnji od strane jednog ili više enzima.
[0042] "Hidrolitički stabilna" veza ili veza odnosi se na hemijsku vezu, tipično kovalentnu vezu, koja je u osnovi stabilna u vodi, to jest, ne podvrgava se hidrolizi u fiziološkim uslovima ni u jednoj primetnoj meri tokom dužeg vremenskog perioda. Primeri hidrolitički stabilnih veza uključuju, ali nisu ograničeni na sledeće: veze ugljenik-ugljenik (npr., u alifatskim lancima), etri, amidi i uretani. Generalno, hidrolitički stabilna veza je ona koja pokazuje brzinu hidrolize manju od oko 1-2% dnevno pod fiziološkim uslovima. Stope hidrolize reprezentativnih hemijskih veza mogu se naći u većini standardnih udžbenika hemije.
[0043] "Farmaceutski prihvatljiv ekscipijens ili nosač" odnosi se na ekscipijens koja po izboru može biti uključena u sastave prema pronalasku i koja ne uzrokuje značajne štetne toksikološke efekte na pacijenta. "Farmakološki efikasna količina", "fiziološki efikasna količina" i "terapeutski efikasna količina" ovde se koriste naizmenično da označavaju količinu polimera-(IL-2) dela konjugata koja je potrebna da se obezbedi željeni nivo konjugata (ili odgovarajući nekonjugovani deo IL-2) u krvotoku ili u ciljnom tkivu. Precizna količina zavisiće od brojnih faktora, npr., određenog dela IL-2, komponenti i fizičkih karakteristika terapijskog sastava, predviđene populacije pacijenta i pojedinačnih razmatranja pacijenta, a stručnjak može lako odrediti na osnovu ovde date informacije.
[0044] "Višenamenski" označava polimer koji sadrži tri ili više funkcionalnih grupa sadržanih u njemu, pri čemu funkcionalne grupe mogu biti iste ili različite. Multifunkcionalni polimerni reagensi obično sadrže od oko 3-100 funkcionalnih grupa, ili od 3-50 funkcionalnih grupa, ili od 3-25 funkcionalnih grupa, ili od 3-15 funkcionalnih grupa, ili od 3 do 10 funkcionalnih grupa, ili će sadrže 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 funkcionalnih grupa unutar polimernog glavnog lanca.
[0045] Termin "IL-2 ostatak", kako se ovde koristi, odnosi se na deo koji ima humanu IL-2 aktivnost. IL-2 deo će takođe imati najmanje jednu elektrofilnu grupu ili nukleofilnu grupu pogodnu za reakciju sa polimernim reagensom. Pored toga, termin "IL-2 ostatak" obuhvata i ostatak IL-2 pre konjugacije, kao i ostatak IL-2 dela nakon konjugacije. Kao što će biti detaljnije objašnjeno u daljem tekstu, prosečan čovek u ovoj oblasti može utvrditi da li bilo koji dati deo ima aktivnost IL-2. Protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja odgovara bilo kojoj od SEQ ID NO:1 do 4 je IL-2 ostatak, kao i bilo koji protein ili polipeptid koji je u osnovi homologan njemu. Kako se ovde koristi, termin "IL-2 deo" uključuje takve proteine koji su namerno modifikovani, na primer, mutagenezom usmerenom ka mestu ili slučajno putem mutacija. Ovi termini takođe uključuju analoge koji imaju od 1 do 6 dodatnih mesta glikozilacije, analoge koji imaju najmanje jednu dodatnu aminokiselinu na karboksi terminalnom kraju proteina, pri čemu dodatne aminokiseline uključuju najmanje jedno mesto glikozilacije, i analoge koji imaju amino sekvenca kiseline koja uključuje najmanje jedno mesto glikozilacije. Termin uključuje i prirodne i rekombinantno proizvedene ostatke.
[0046] Termin "u osnovi homologan" znači da se određena predmetna sekvenca, na primer, mutantna sekvenca, razlikuje od referentne sekvence jednom ili više supstitucija, delecija ili dodavanja, čiji neto efekat ne rezultira nepovoljnom funkcionalnom različitošću između referentne i predmetne sekvence. Za potrebe predmetnog pronalaska, sekvence koje imaju više od 80 procenata (poželjnije veće od 85 procenata, još poželjnije veće od 90 procenata, pri čemu je najpoželjnije više od 95 procenata) homologije, ekvivalentne biološke aktivnosti (mada ne nužno ekvivalentne jačine biološka aktivnost), a ekvivalentne karakteristike ekspresije smatraju se u osnovi homolognim. U svrhu utvrđivanja homologije, odsecanje zrele sekvence treba zanemariti. Primeri IL-2 ostataka koji se ovde koriste uključuju one sekvence koje su u osnovi homologne SEQ ID NO:2.
[0047] Termin "fragment" označava bilo koji protein ili polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu dela ili fragmenta dela IL-2 i koji ima biološku aktivnost IL-2. Fragmenti uključuju proteine ili polipeptide proizvedene proteolitičkom razgradnjom dela IL-2, kao i proteine ili polipeptide proizvedene metodama hemijske sinteze uobičajenim u struci.
[0048] Termin "pacijent" odnosi se na živi organizam koji pati ili je sklon stanju koje se može sprečiti ili izlečiti davanjem aktivnog sredstva (npr., konjugata), a uključuje ljude i životinje.
[0049] „Neobavezno“ ili „opciono“ znači da se naknadno opisana okolnost može dogoditi ili ne, tako da opis uključuje slučajeve u kojima se okolnost javlja i slučajeve u kojima se to ne dogodi.
[0050] „Suštinski“ znači gotovo potpuno ili u potpunosti, na primer, zadovoljavajući jedno ili više od sledećeg: više od 50%, 51% ili više, 75% ili više, 80% ili više, 90% ili više i 95% ili više stanja.
[0051] Kako se ovde koristi, „identitet sekvence“ određuje se upoređivanjem sekvence referentne DNK sekvence sa onim delom druge sekvence DNK tako poravnate tako da se maksimalizuje preklapanje između dve sekvence uz minimiziranje praznina sekvenci, pri čemu bilo koja prekomerna sekvenca između dve sekvence se ignorišu. Što se tiče bilo kog identičnosti sekvence koji je ovde opisan, poželjno je da najmanje 80%, poželjnije 85%, a još poželjnije 90%, još poželjnije 95% identičnosti sekvence, sa 96%, 97%, 98% i 99 % identičnosti sekvence je najpoželjniji.
[0052] Ostaci aminokiselina u peptidima skraćeni su kako sledi: Fenilalanin je Phe ili F; Leucin je Leu ili L; Izoleucin je Ile ili I; Metionin je Met ili M; Valin je Val ili V; Serin je Ser ili S; Prolin je Pro ili P; Treonin je Thr ili T; Alanin je Ala ili A; Tirozin je Tyr ili Y; Histidin je His ili H; Glutamin je Gln ili Q; Asparagin je Asn ili N; Lizin je Lys ili K; Asparaginska kiselina je Asp ili D; Glutaminska kiselina je Glu ili E; Cistein je Cys ili C; Triptofan je Trp ili W; Arginin je Arg ili R; i Glicin je Gly ili G.
[0053] Osvrćući se na jedno ili više ostvarenja pronalaska, konjugat je obezbeđen u skladu sa patentnim zahtevima, naznačen time što konjugat sadrži ostatak dela IL-2 koji je kovalentno vezan kroz razdelnički deo za polimer rastvorljiv u vodi. Konjugati pronalaska će imati jednu ili više sledećih karakteristika.
IL-2 deo
[0054] Kao što je prethodno rečeno, konjugat generički sadrži ostatak dela IL-2 koji je
1
kovalentno vezan kroz razdelnički deo za polimer rastvorljiv u vodi kako je definisano u patentnim zahtevima. Kako se ovde koristi, termin "IL-2 ostatak" odnosiće se na ostatak IL-2 pre konjugacije, kao i na ostatak IL-2 nakon vezivanja za nepeptidni, u vodi rastvorljiv polimer. Razumeće se, međutim, da kada je originalni IL-2 deo vezan za nepeptidni, u vodi rastvorljiv polimer, IL-2 deo je malo izmenjen zbog prisustva jedne ili više kovalentnih veza povezanih sa vezom na polimer(e). Često se ovaj malo izmenjeni oblik IL-2 dela koji je vezan za drugi molekul odnosi na "ostatak" dela IL-2.
[0055] IL-2 deo može biti izveden iz nerekombinantnih postupaka i iz rekombinantnih postupaka i pronalazak nije ograničen u tom pogledu. Pored toga, ostatak IL-2 može se dobiti iz ljudskih, životinjskih i biljnih izvora.
[0056] IL-2 ostatak može se dobiti nerekombinantno. Na primer, moguće je izolovati IL-2 iz bioloških sistema i na drugi način dobiti IL-2 iz kultivisanih podloga. Videti, na primer, postupke opisane u patentu SAD br.4,401,756 i u Pauly i dr. (1984) J. Immunol Methods 75(1):73-84.
[0057] IL-2 ostatak može se dobiti iz rekombinantnih postupaka. Videti, na primer, patent SAD br.5,614,185, ovde objavljeni opis i eksperimentalni odeljak.
[0058] Bilo koji IL-2 deo dobijen nerekombinantnim i rekombinantnim pristupima može se koristiti kao IL-2 deo u pripremi ovde opisanih konjugata.
[0059] IL-2 ostatak može se izraziti u bakterijskim [npr., E. coli, videti, na primer, Fischer i dr. (1995) Biotechnol. prijava. Biochem. 21(3):295-311], sisarskim [videti na primer, Kronman i dr. (1992) Gene 121:295-304], kvaščevim [npr., Pichia pastoris, videti na primer, Morel i dr. (1997) Biochem.328(1):121-129], sisarskim [videti na primer, Kronman i dr. (2001) Biotechnol. Bioeng. 75(3):259-266] ekspresionim sistemima. Do ekspresije može doći egzogenom ekspresijom (kada ćelija domaćin prirodno sadrži željeno genetsko kodiranje) ili endogenom ekspresijom.
[0060] Iako se postupci za pripremu proteina zasnovane na rekombinantima mogu obično razlikovati, rekombinantne postupke obično uključuju konstrukciju nukleinske kiseline koja kodira željeni polipeptid ili fragment, kloniranje nukleinske kiseline u ekspresijski vektor, transformišući ćeliju domaćina (npr., biljku, bakterije, kvasac, transgene životinje ćelija ili ćelija sisara kao što je ćelija jajnika kineskog hrčka ili ćelija bubrega beba hrčka) i ekspresijom nukleinske kiseline da bi se dobio željeni polipeptid ili fragment. Postupci za proizvodnju i ekspresiju rekombinantnih polipeptida in vitro i u prokariotskim i eukariotskim ćelijama domaćinima poznati su stručnjacima iz ove oblasti.
[0061] Da bi se olakšala identifikacija i prečišćavanje rekombinantnog polipeptida, sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju epitopsku oznaku ili drugu vezujuću afinitetnu sekvencu mogu se umetnuti ili dodati u okvir sa kodirajućom sekvencom, čime se proizvodi fuzioni protein koji se sastoji od željenog polipeptida i polipeptida koji odgovara za vezivanje.
Fuzioni proteini se mogu identifikovati i prečistiti prevođenjem smeše koja sadrži fuzioni protein kroz afinitetnu kolonu koja nosi vezne delove (npr., antitela) usmerene na epitopnu oznaku ili drugu vezujuću sekvencu u fuzionim proteinima, čime se fuzioni protein vezuje u koloni. Posle toga, fuzioni protein se može povratiti pranjem kolone odgovarajućim rastvorom (npr., kiselinom) da bi se oslobodio vezani fuzioni protein. Rekombinantni polipeptid se takođe može prečistiti liziranjem ćelija domaćina, odvajanjem polipeptida, npr., jonoizmenjivačkom hromatografijom, pristupima vezivanja afiniteta, pristupima hidrofobne interakcije, i nakon toga identifikovanjem pomoću MALDI ili vestern blota, i sakupljanjem polipeptida. Ovi i drugi postupci za identifikovanje i prečišćavanje rekombinantnih polipeptida poznati su stručnjacima iz ove oblasti. U jednom ili više otelotvorenja pronalaska, međutim, ostatak IL-2 nije u obliku fuzionog proteina.
[0062] U zavisnosti od sistema koji se koristi za ekspresiju proteina koji imaju IL-2 aktivnost, IL-2 deo može biti neglikoziliran ili glikoziliran i može se koristiti. Odnosno, IL-2 deo može biti neglikoziliran ili IL-2 deo može biti glikoziliran. U jednom ili više otelotvorenja pronalaska, ostatak IL-2 je neglikozilovan.
[0063] Poželjno je da se IL-2 ostatak modifikuje tako da uključuje i/ili supstituiše jedan ili više aminokiselinskih ostataka kao što su, na primer, lizin, cistein i/ili arginin, kako bi se obezbedilo lagano vezivanje polimera za atom unutar bočne strane. lanac aminokiseline. Primer supstitucije dela IL-2 je opisan u patentu SAD br.5,206,344. Pored toga, IL-2 deo može biti modifikovan tako da uključuje aminokiselinski ostatak koji se ne pojavljuje u prirodi. Tehnike za dodavanje aminokiselinskih ostataka i aminokiselinskih ostataka koji se ne pojavljuju u prirodi dobro su poznati stručnjacima u ovoj oblasti. Poziva se na J. March,
1
Advanced Organic Chemistry: Reactions Mechanisms and Structure, 4th Ed. (New York: Wiley-Interscience, 1992).
[0064] Pored toga, IL-2 deo može se povoljno modifikovati tako da uključuje vezivanje funkcionalne grupe (osim dodavanjem aminokiselinskog ostatka koji sadrži funkcionalnu grupu). Na primer, IL-2 deo može biti modifikovan tako da uključuje tiol grupu. Pored toga, IL-2 deo može biti modifikovan tako da uključuje N-terminalni alfa ugljenik. Pored toga, IL-2 deo može biti modifikovan tako da uključuje jedan ili više ugljenih hidrata. Pored toga, IL-2 deo može biti modifikovan tako da uključuje aldehidnu grupu. Pored toga, IL-2 deo može biti modifikovan tako da uključuje ketonsku grupu. U nekim otelotvorenjima pronalaska, poželjno je da IL-2 deo nije modifikovan tako da uključuje jednu ili više tiolne grupe, N-terminalni alfa ugljenik, ugljene hidrate, aldehidnu grupu i ketonsku grupu.
[0065] Primeri IL-2 ostataka opisani su u literaturi i na primer, patentima SAD br.5,116,943, 5,153,310, 5,635,597, 7,101,965 i 7,567,215 i objavi patentne prijave SAD br.2010/0036097 i 2004/0175337. Opisani IL-2 ostaci uključuju one koji imaju aminokiselinsku sekvencu koja sadrži sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:1 do 4, i sekvence koje su im u osnovi homologne. U skladu sa patentnim zahtevima, deo IL-2 ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara SEQ ID NO:3 ili sekvenca aminokiselina koja ima 95% ili veću identičnost sekvence u SEQ ID NO:3.
[0066] U nekim slučajevima, IL-2 ostatak će biti u "monomernom" obliku, pri čemu je pojedinačna ekspresija odgovarajućeg peptida organizovana u diskretnu jedinicu. U drugim slučajevima, IL-2 ostatak će biti u obliku "dimera" (npr., dimera rekombinantnog IL-2) gde su dva monomerna oblika proteina povezana (npr., disulfidnom vezom) jedni sa drugima. Na primer, u kontekstu dimera rekombinantnog humanog IL-2, dimer može biti u obliku dva monomera koja su međusobno povezana disulfidnom vezom koja se formira iz ostataka Cys125 svakog monomera.
[0067] Pored toga, oblici prekursora IL-2 mogu se koristiti kao ostatak IL-2. Primer obrasca prekursora IL-2 ima sekvencu SEQ ID NO:1.
[0068] Skraćene verzije, hibridne varijante i mimetičari peptida bilo koje od prethodnih sekvenci takođe mogu poslužiti kao IL-2 deo. Biološki aktivni fragmenti, varijacije brisanja,
1
supstitucione varijante ili varijacije dodavanja bilo kog od prethodno navedenih koji održavaju bar neki stepen aktivnosti IL-2 takođe mogu poslužiti kao IL-2 deo.
[0069] Za bilo koji dati peptid ili proteinski deo, moguće je utvrditi da li taj deo ima aktivnost IL-2. U struci su opisani različiti postupci za određivanje in vitro aktivnosti IL-2. Primeran pristup je test proliferacije ćelija CTTL-2 opisan u donjem eksperimentalnom odeljku.
Uzoran pristup opisan je u Moreau i dr. (1995) Mol. Immunol. 32:1047-1056). Ukratko, u testu nespecifičnog vezivanja, predloženom delu IL-2 se dozvoljava da predinkubira jedan sat na 4° C u prisustvu ćelijske linije koja nosi receptor IL-2. Posle toga, IL-2 obeleženom sa<125>I dozvoljeno je da se inkubira u sistemu tri sata na 4° C. Podaci su izraženi kao % inhibitornog kapaciteta predložene aktivnosti dela IL-2 u odnosu na divlji tip IL-2. Druge metodologije poznate u tehnici takođe se mogu koristiti za procenu funkcije IL-2, uključujući elektrometriju, spektrofotometriju, hromatografiju i radiometrijske metodologije.
Polimer rastvorljiv u vodi
[0070] Kao što je prethodno diskutovano, svaki konjugat sadrži IL-2 deo vezan za polimer rastvorljiv u vodi. U odnosu na polimer rastvorljiv u vodi, polimer rastvorljiv u vodi je nepeptidan, netoksičan, ne-prirodan i biokompatibilan. Što se tiče biokompatibilnosti, supstanca se smatra biokompatibilnom ako su blagotvorni efekti povezani sa upotrebom same supstance ili sa drugom supstancom (npr., aktivnim sredstvom kao što je ostatak IL-2) u vezi sa živim tkivima (npr., primena u pacijent) nadmašuje sve štetne efekte prema proceni kliničara, npr., lekara. U pogledu neimunogenosti, supstanca se smatra neimunogenom ako namena upotrebe supstance in vivo ne daje neželjeni imunološki odgovor (npr., stvaranje antitela) ili, ako se imuni odgovor proizvede, da takav odgovor se ne smatra klinički značajnim ili važnim kako ga je procenio kliničar. Naročito je poželjno da je nepeptidni polimer rastvorljiv u vodi biokompatibilan i neimunogen.
[0071] Dalje, polimer je tipično naznačen kao da ima od 2 do oko 300 krajeva. U okviru konjugata pronalaska, polimer je poli(etilen glikol)("PEG"). Ostali opisani polimeri uključuju poli(propilen glikol)("PPG"), kopolimeri etilen glikola i propilen glikola, poli(oksietilirani poliol), poli(olefinski alkohol), poli(vinilpirolidon), poli(hidroksialkilmetakrilamid), poli(hidroksialkilmetakrilat), poli(saharidi), poli(α-hidroksi kiselina), poli(vinil alkohol), polifosfazin, polioksazolin („POZ“) (koji su opisani u međunarodnoj objavi patentne prijave br. WO 2008/106186), poli(N-akriloilmorfolin) i kombinacije bilo čega od prethodno
1
navedenog.
[0072] U skladu sa pronalaskom, konjugat sadrži jedan, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam ili osam razgranatih u vodi rastvorljivih polimera etilen glikola. Ovde opisani polimer rastvorljiv u vodi može biti linearan (npr., završni poklopac, npr., alkoksi PEG ili bifunkcionalni PEG), razgranat ili višekraki (npr., račvasti PEG ili PEG pričvršćen za poliolsko jezgro), dendritične (ili zvezda) arhitekture, svaka sa ili bez jedne ili više razgradivih veza. Štaviše, unutrašnja struktura polimera rastvorljivog u vodi može biti organizovana u bilo koji broj različitih obrazaca ponavljanja i može se odabrati iz grupe koju čine homopolimer, naizmenični kopolimer, slučajni kopolimer, blok kopolimer, naizmenični tripolimer, slučajni tripolimer i blok tripolimer.
[0073] Tipično, aktivirani PEG i drugi aktivirani vodorastvorni polimeri (tj., polimerni reagensi) aktiviraju se odgovarajućom aktivirajućom grupom koja je pogodna za spajanje sa željenim mestom na ostatku IL-2. Tako će polimerni reagens imati reaktivnu grupu za reakciju sa ostatkom IL-2. Reprezentativni polimerni reagensi i postupci za konjugovanje ovih polimera u aktivni deo poznati su u struci i dalje su opisani u Zalipsky, S., i dr., "Use of Functionalized Poly(Ethylene Glycols) for Modification of Polypeptides" in Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. M. Harris, Plenus Press, New York (1992), i u Zalipsky (1995) Advanced Drug Reviews 16:157-182. Primer aktivacionih grupa pogodnih za spajanje sa IL-2 delom uključuje hidroksil, maleimid, estar, acetal, ketal, amin, karboksil, aldehid, aldehid hidrat, keton, vinil keton, tion, tiol, vinil sulfon i hidrazin.
[0074] Poželjno je da se polimerni reagens koji se koristi za pripremu ovde opisanih konjugata priprema bez upotrebe fosgena. Takav pristup stoji u suprotnosti sa, na primer, obelodanjivanjem izloženim u U.S. Patent No.4,902,502, koji posebno opisuje formiranje hloroformata i naknadnu upotrebu za formiranje PEG aktivnog estra, koji zatim reaguje sa IL-2. Upotreba fosgena dovodi do stvaranja hlorovodonika, što može dovesti do cepanja lanca u polimeru, povećavajući time nečistoće, koje možda neće biti moguće ukloniti konvencionalnim tehnikama. Prema tome, bez želje da se teorijski vezuju, konjugati ostataka IL-2 pripremljeni od polimernih reagenasa nastalih bez upotrebe fosgena pružaju kompozicije višeg kvaliteta u suštini odsutne od proizvoda razgradnje polimernih lanaca.
1
[0075] U skladu sa patentnim zahtevima, PEG imaju prosečnu molekulsku masu u proseku od 500 daltona do 100000 daltona. Uzorni opsezi, međutim, uključuju prosečne molekulske mase u opsegu većem od 5000 daltona do oko 100000 daltona, u rasponu od oko 6000 daltona do oko 90000 daltona, u rasponu od oko 10000 daltona do oko 85000 daltona, u opsegu većem od 10000 daltona do oko 85000 daltona, u rasponu od oko 20000 daltona do oko 85000 daltona, i u rasponu od oko 53000 daltona do oko 85000 daltona.
[0076] Primerne prosečne molekulske mase polimera rastvorljivih u vodi uključuju oko 500 Daltona, oko 600 Daltona, oko 700 Daltona, oko 750 Daltona, oko 800 Daltona, oko 900 Daltona, oko 1000 Daltona, oko 1500 Daltona, oko 2000 Daltona, oko 2500 Daltona, oko 3000 Daltona, oko 4000 Daltona, oko 4400 Daltona, oko 4500 Daltona, oko 5000 Daltona, oko 5500 Daltona, oko 6000 Daltona, oko 7000 Daltona, oko 7500 Daltona, oko 8000 Daltona, oko 9000 Daltona, oko 10000 Daltona, oko 11000 Daltona, oko 12000 Daltona, oko 13000 daltona, oko 14000 Daltona, oko 15000 Daltona, oko 20000 Daltona, oko 22500 Daltona, oko 25000 Daltona, oko 30000 Daltona, oko 35000 Daltona, oko 40000 Daltona, oko 4500 Daltona, oko 50000 Daltona, oko 55000 Daltona, oko 60000 Daltona, oko 65000 Daltona, oko 70000 Daltona, i oko 75000 Daltona. Takođe se mogu koristiti i razgranate verzije polimera rastvorljivog u bodi (npr., razgranati 40000 Daltona polimera rastvorljivih u vodi koji se sastoje od dva 20000 Daltona polimera) sa ukupnom molekulskom masom bilo kog od prethodno navedenih. Ovde opisani konjugati možda neće imati bilo koji PEG ostatak vezan, bilo direktno ili indirektno, sa PEG koji ima prosečnu molekulsku masu manju od oko 6000 Daltona.
[0077] Kada se koriste kao polimer, PEG obično sadrže određeni broj (OCH2CH2) monomera [ili (CH2CH2O) monomera, u zavisnosti od toga kako je PEG definisan]. Kako se koristi u opisu, broj ponavljajućih jedinica identifikuje se indeksom „n“ u "(OCH2CH2)n". Dakle, vrednost (n) obično spada u jedan ili više sledećih opsega: od 2 do oko 3400, od oko 100 do oko 2300, od oko 100 do oko 2270, od oko 136 do oko 2050, od oko 225 do oko 1930, od oko 450 do oko 1930, od oko 1200 do oko 1930, od oko 568 do oko 2727, od oko 660 do oko 2730, od oko 795 do oko 2730, od oko 795 do oko 2730, od oko 909 do oko 2730 i od oko 1200 do oko 1900. Za bilo koji dati polimer u kome je poznata molekularna masa, moguće je odrediti broj ponavljajućih jedinica (tj., „n“) deljenjem ukupne prosečne molekulske mase polimera sa molekulskom masom monomera koja se ponavlja.
1
[0078] Jedan posebno poželjan polimer za upotrebu u pronalasku je polimer sa završnim poklopcem, to jest polimer koji ima najmanje jedan kraj završen sa relativno inertnom grupom, kao što je niža C1-6alkoksi grupa, mada hidroksilna grupa takođe može biti koristi. Na primer, kada je polimer PEG, poželjno je koristiti metoksi-PEG (obično se naziva mPEG), što je linearni oblik PEG, pri čemu je jedan kraj polimera metoksi (-OCH3) grupa, dok drugi kraj je hidroksil ili druga funkcionalna grupa koja se može opciono hemijski modifikovati.
[0079] U jednom obliku, korisnom u jednom ili više ostvarenja ovog pronalaska, slobodni ili nevezani PEG je linearni polimer završen na svakom kraju hidroksilnim grupama:
HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH,
pri čemu (n) se obično kreće od nula do oko 4000.
[0080] Gornji polimer, alfa-, omega-dihidroksilpol(etilen glikol), može se u kratkom obliku predstaviti kao HO-PEG-OH, pri čemu se podrazumeva da simbol -PEG- može predstavljati sledeću strukturnu celinu:
-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH,
pri čemu je (n) definisano kao iznad.
[0081] Druga vrsta PEG korisna u jednoj ili više otelotvorenja predmetnog pronalaska je metoksi-PEG-OH ili ukratko mPEG, u kojoj je jedan kraj relativno inertna metoksi grupa, dok je drugi kraj hidroksilna grupa. Struktura mPEG-a je data ispod:
CH3O-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH
pri čemu je (n) definisano kao iznad.
[0082] Višestruko naoružani ili razgranati PEG molekuli, kao što su oni opisani un patentu SAD br.5,932,462, takođe se mogu koristiti kao PEG polimer. Na primer, PEG može imati strukturu:
2
gde:
poliai polibsu PEG glavni lanci (bilo iste ili različite), kao što je metoksi poli(etilen glikol);
R" je nereaktivni deo, kao što je H, metil ili PEG glavni lanac; i
P i Q su nereaktivne veze. U poželjnom otelotvorenju, razgranati PEG polimer je metoksi poli(etilen glikol) disupstituisani lizin. U zavisnosti od specifičnog korišćenog dela IL-2, funkcionalna grupa reaktivnog estra disupstituisanog lizina može se dalje modifikovati da bi se formirala funkcionalna grupa pogodna za reakciju sa ciljnom grupom u okviru grupe IL-2.
[0083] Pored toga, PEG može sadržati račvasti PEG. Primer račvastog PEG-a predstavljen je sledećom strukturom:
gde: X je razdelnički deo jednog ili više atoma, a svaki Z je aktivirana terminalna grupa povezana sa CH lancem atoma definisane dužine. Međunarodna objava patenta WO 99/45964 obelodanjuje različite račvaste PEG strukture sposobne za upotrebu u jednom ili više otelotvorenja predmetnog pronalaska. Lanac atoma koji povezuje Z funkcionalne grupe sa razgranatim atomom ugljenika služi kao vezana grupa i može sadržati, na primer, alkilne lance, etarske lance, estarske lance, amidne lance i njihove kombinacije.
[0084] PEG polimer može sadržati privezani PEG molekul koji ima reaktivne grupe, kao što je karboksil, kovalentno vezan duž dužine PEG, a ne na kraju lanca PEG. Reaktivne grupe mogu se prikačiti za PEG direktno ili preko razdelničkog dela, kao što je alkilenska grupa.
[0085] Pored iznad opisanih oblika PEG, polimer se takođe može pripremiti sa jednom ili više slabih ili razgradivih veza u polimeru, uključujući bilo koji od iznad opisanih polimera. Na primer, PEG se može pripremiti sa estarskim vezama u polimeru koje su podložne hidrolizi. Kao što je prikazano ispod, ova hidroliza rezultira cepanjem polimera na fragmente niže molekulske mase:
-PEG-CO2-PEG- H2O → -PEG-CO2H HO-PEG-
[0086] Ostale hidrolitički razgradive veze, korisne kao razgradiva veza u polimernom glavnom lancu i/ili kao razgradiva veza na ostatak IL-2, uključuju: karbonatne veze; iminske veze koje nastaju, na primer, reakcijom amina i aldehida (videti, npr., Ouchi i dr. (1997) Polymer Preprints 38(1):582-3); veze fosfatnog estra nastale, na primer, reakcijom alkohola sa fosfatnom grupom; hidrazonske veze koje se obično formiraju reakcijom hidrazida i aldehida; acetalne veze koje se obično formiraju reakcijom između aldehida i alkohola; ortoesterske veze koje se, na primer, formiraju reakcijom između formata i alkohola; amidne veze formirane od aminske grupe, npr., na kraju polimera kao što je PEG, i karboksilne grupe drugog PEG lanca; uretanske veze nastale reakcijom, na primer, PEG sa terminalnom izocijanatnom grupom i PEG alkoholom; peptidne veze formirane od aminske grupe, npr., na kraju polimera kao što je PEG, i karboksilna grupa peptida; i oligonukleotidne veze formirane od, na primer, fosforamiditne grupe, npr., na kraju polimera, i 5' hidroksilne grupe oligonukleotida.
[0087] Kao što je dalje opisano, uvođenje jedne ili više razgradivih veza u polimerni lanac ili na ostatak IL-2 može obezbediti dodatnu kontrolu nad konačnim željenim farmakološkim svojstvima konjugata nakon davanja. Na primer, veliki i relativno inertni konjugat (tj., koji ima jedan ili više PEG lanaca velike molekulske težine, na primer, jedan ili više PEG lanaca molekulske mase veće od oko 10000 daltona, pri čemu konjugat u suštini nema bioaktivnost) može se primeniti, koji se oslobađa da bi se stvorio bioaktivni konjugat koji poseduje deo originalnog PEG lanca. Na ovaj način, svojstva konjugata mogu se efikasnije prilagoditi tako da uravnoteže bioaktivnost konjugata tokom vremena.
[0088] U skladu sa patentnim zahtevima, polimer rastvorljiv u vodi povezan sa konjugatom se „može osloboditi“. Odnosno, polimer rastvorljiv u vodi se oslobađa (bilo hidrolizom, enzimskim procesima, katalitičkim procesima ili na neki drugi način), što rezultira nekonjugovanim delom IL-2. U skladu sa patentnim zahtevima, oslobađajući polimeri se odvajaju od ostatka IL-2 in vivo bez ostavljanja bilo kog fragmenta polimera rastvorljivog u vodi koji je vezan za ostatak IL-2. U drugim ovde opisanim primerima, oslobađajući polimeri se odvajaju od dela IL-2 in vivo, ostavljajući relativno mali fragment (npr., sukcinatnu pločicu) iz polimera rastvorljivog u vodi. Primer polimera koji se može cepati uključuje onaj koji se vezuje za ostatak IL-2 preko karbonatne veze. Prema pronalasku, veza je oslobađajuća karbamatna veza za amino grupu interleukin-2 dela.
[0089] Oni koji su prosečno upućeni u ovu oblast shvatiće da prethodna diskusija o nepeptidnim i u vodi rastvorljivim polimerima ni u kom slučaju nije iscrpna i samo je ilustrativna i da se razmatraju svi polimerni materijali koji imaju iznad opisane kvalitete. Kako se ovde koristi, termin "polimerni reagens" generalno se odnosi na ceo molekul, koji može sadržati vodorastvorni polimerni segment i funkcionalnu grupu.
[0090] Kao što je iznad opisano, konjugat pronalaska sadrži polimer rastvorljiv u vodi kovalentno vezan za IL-2 deo kako je definisano u patentnim zahtevima. U skladu sa patentnim zahtevima, konjugat ima 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 razgrananih u vodi rastvorljivih polimera (etilen glikol) polimera pojedinačno vezanih za IL-2 deo. Bilo koji dati polimer rastvorljiv u vodi može biti kovalentno vezan ili za aminokiselinu IL-2 dela, ili, kada je IL-2 deo (na primer) glikoprotein, za ugljeni hidrat dela IL-2. Vezivanje na ugljene hidrate može se izvršiti, na primer, korišćenjem metaboličke funkcionalizacije primenom hemije sijalne kiseline i azida [Luchansky i dr. (2004) Biochemistry 43(38):12358-12366] ili drugi pogodni pristupi kao što je upotreba glicidola za olakšavanje uvođenja aldehidnih grupa [Heldt i dr. (2007) European Journal of Organic Chemistry 32:5429-5433].
[0091] Određena veza unutar ostatka koji ima aktivnost IL-2 i polimera zavisi od niza faktora. Takvi faktori uključuju, na primer, određenu hemiju vezanja koja se koristi, određeni deo IL-2, raspoložive funkcionalne grupe unutar dela IL-2 (bilo za vezivanje za polimer ili konverziju u odgovarajuće mesto vezivanja) i prisustvo dodatne reaktivne funkcionalne grupe unutar dela IL-2.
[0092] Konjugati pronalaska su prolekovi, što znači da je veza između polimera i dela IL-2 labava da omogući oslobađanje matičnog dela. Primerne veze koje se mogu osloboditi uključuju karboksilatni estar, fosfatni estar, tiol estar, anhidride, acetale, ketale, aciloksialkil etar, imine, ortoestre, peptide i oligonukleotide. Takve veze se mogu lako pripremiti odgovarajućom modifikacijom ili dela IL-2 (npr., završetak karboksilne grupe C proteina, ili hidroksilna grupa bočnog lanca aminokiseline, poput serina ili treonina sadržanih u proteinu, ili slična funkcionalnost unutar ugljenih hidrata) i/ili polimernog reagensa korišćenjem postupka spajanja koje se obično koriste u tehnici. Međutim, najpoželjnije su veze koje se
2
mogu osloboditi i koje se lako formiraju reakcijom odgovarajuće aktiviranog polimera sa nemodifikovanom funkcionalnom grupom sadržanom u delu koji ima IL-2 aktivnost.
[0093] Alternativno, hidrolitički stabilna veza, kao što je amid, uretan (poznat i kao karbamat), amin, tioeter (poznat i kao sulfid) ili urea (poznat i kao karbamid), takođe se može koristiti kao veza za spajanje IL -2 polovina. Opet, poželjna hidrolitički stabilna veza je amid. U jednom pristupu, polimer rastvorljiv u vodi koji nosi aktivirani estar može da reaguje sa aminskom grupom na IL-2 delu tako da rezultira amidnom vezom.
[0094] Konjugati (za razliku od nekonjugovanog dela IL-2) mogu ili ne moraju imati merljiv stepen aktivnosti IL-2. To će reći, konjugat polimer-IL-2 ostatka u skladu sa pronalaskom poseduje bilo gde od oko 0,1% do oko 100% bioaktivnosti nemodifikovanog matičnog dela IL-2. U nekim slučajevima, konjugati polimera-IL-2 ostatka mogu imati veću od 100% bioaktivnost nemodifikovanog matičnog dela IL-2. Poželjno, konjugati koji imaju malu ili nikakvu aktivnost IL-2 sadrže hidrolizujuću vezu koja povezuje polimer sa ostatkom, tako da bez obzira na nedostatak (ili relativno nedostatak) aktivnosti u konjugatu, aktivni matični molekul (ili njegov derivat) je oslobođenog deljenjem hidrolizovane veze izazvanog vodenom razlikom. Takva aktivnost se može odrediti korišćenjem pogodnog in-vivo ili invitro modela, u zavisnosti od poznate aktivnosti određenog dela koji ima primenjenu aktivnost IL-2.
[0095] Za konjugate koji poseduju hidrolitički stabilnu vezu koja spaja ostatak koji ima aktivnost IL-2 sa polimerom, konjugat će obično imati merljiv stepen bioaktivnosti. Na primer, takvi konjugati se obično karakterišu kao da imaju bioaktivnost koja zadovoljava jedan ili više sledećih procenata u odnosu na nekonjugovani deo IL-2: najmanje oko 2%, najmanje oko 5%, najmanje oko 10%, najmanje oko 15%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 97%, najmanje oko 100% i više od 105% (kada se meri u pogodan model, poput onih koji su dobro poznati u struci). Poželjno je da konjugati koji imaju hidrolitički stabilnu vezu (npr., amidna veza) poseduju bar izvestan stepen bioaktivnosti nemodifikovanog roditeljskog dela koji ima aktivnost IL-2.
[0096] Sada će biti opisani primerni konjugati. Tipično se očekuje da takav IL-2 deo deli (bar delimično) sličnu aminokiselinsku sekvencu kao sekvenca data u najmanje jednoj od SEQ ID NO:1 do 4. Dakle, dok će se pozivati na određene lokacije ili atome u okviru SEQ ID NO:1 do 4, takva referenca je samo za praktičnost i onaj ko ima uobičajene veštine u ovoj oblasti biće u stanju da lako odredi odgovarajuće mesto ili atom u ostalim delovima koji imaju aktivnost IL-2. Konkretno, ovde dat opis za izvorni humani IL-2 često je primenljiv na fragmente, varijacije delecije, varijante supstitucije ili varijacije dodavanja bilo čega od prethodno navedenog.
[0097] Amino grupe na IL-2 delovima obezbeđuju mesto vezivanja između dela IL-2 i polimera rastvorljivog u vodi. Korišćenje aminokiselinske sekvence date u SEQ ID NO:1 do 4, očigledno je da u svakom postoji nekoliko ostataka lizina koji imaju ε-aminokiselinu koja može biti dostupna za konjugaciju. Dalje, N-terminalni amin bilo kog proteina takođe može poslužiti kao tačka vezivanja.
[0098] Postoji niz primera pogodnih polimernih reagensa korisnih za formiranje kovalentnih veza sa raspoloživim aminima IL-2 dela. Konkretni primeri, zajedno sa odgovarajućim konjugatom, dati su u Tabeli 1 ispod. U tabeli, promenljiva (n) predstavlja broj ponavljajućih monomernih jedinica, a "-NH-(IL-2)" predstavlja ostatak dela IL-2 nakon konjugacije sa polimernim reagensom. Dok se svaki polimerni deo [npr. (OCH2CH2)nili (CH2CH2O)n] predstavljen u Tabeli 1 završava u "CH3" grupi, druge grupe (kao što su H i benzil) mogu biti supstituisane njima.
Tabela 1
2
2
2
2
2
1
2
[0099] Konjugacija polimernog reagensa sa amino grupom IL-2 dela može se postići različitim tehnikama. U jednom pristupu, ostatak IL-2 može se konjugovati sa polimernim reagensom funkcionalizovanim sa sukcinimidilnim derivatom (ili drugom aktiviranom estarskom grupom, pri čemu se mogu koristiti pristupi slični onima opisanim za ove alternativne polimerne reagense koji sadrže aktivnu estersku grupu). U ovom pristupu, polimer koji nosi derivat sukcinimidila može biti vezan za ostatak IL-2 u vodenom medijumu pri pH od 7 do 9,0, mada koristeći različite reakcione uslove (npr., niži pH kao što je 6 do 7, ili različit temperature i/ili manje od 15 °C) mogu rezultirati vezivanjem polimera na drugo mesto na IL-2 delu. Pored toga, amidna veza može da se formira reakcijom amin-završenog nepeptidnog, u vodi rastvorljivog polimera sa IL-2 delom koji nosi aktiviranu grupu karboksilne kiseline.
[0100] Primeri konjugata obuhvaćeni su sledećom strukturom
gde:
(n) je ceo broj koji ima vrednost od 2 do 4000;
X je razdelnički deo;
R<1>je organski radikal; i
IL-2 je ostatak IL-2 dela.
[0101] Primeri konjugata obuhvaćeni su sledećom strukturom:
pri čemu (n) ceo broj koji ima vrednost od 2 do 4000 i IL-2 je ostatak IL-2 dela.
[0102] Tipično za drugi pristup koristan za konjugaciju dela IL-2 sa polimernim reagensom je upotreba reduktivnog amina za konjugovanje primarnog amina dela IL-2 sa polimernim reagensom funkcionalizovanim sa ketonom, aldehidom ili njegovim hidratisanim oblikom (npr., keton hidrat, aldehid hidrat). U ovom pristupu, primarni amin iz dela IL-2 reaguje sa karbonilnom grupom aldehida ili ketona (ili odgovarajućom grupom hidratisanog aldehida ili ketona koja sadrži hidroksil), stvarajući tako Šifovu bazu. Šifova baza se, zauzvrat, može reduktivno pretvoriti u stabilni konjugat upotrebom redukcionog sredstva kao što je natrijum borohidrid. Moguće su selektivne reakcije (npr., N-terminalu), naročito sa polimerom koji je funkcionalizovan sa ketonom ili alfa-metil razgranatim aldehidom i/ili pod određenim reakcionim uslovima (npr., smanjena pH).
[0103] Primeri konjugata u kojima je polimer rastvorljiv u vodi u razgranatom obliku uključuju one u kojima je polimer rastvorljiv u vodi obuhvaćen sledećom strukturom:
pri čemu je svaki (n) nezavisno ceo broj koji ima vrednost od 2 do 4000.
[0104] Primeri konjugata obuhvaćeni su sledećom strukturom:
gde:
svako (n) je nezavisan ceo broj koji ima vrednost od 2 do 4000;
X je razdelnički deo;
(b) je ceo broj koji ima vrednost od 2 do 6;
(c) je ceo broj koji ima vrednost od 2 do 6;
R<2>je, u svakom slučaju, nezavisno H ili niži alkil; i
4
IL-2 je ostatak IL-2 dela.
[0105] Primeri konjugata obuhvaćeni su sledećom strukturom:
gde:
svako (n) je nezavisan ceo broj koji ima vrednost od 2 do 4000; i
IL-2 je ostatak IL-2 dela.
[0106] Drugi primeri konjugata obuhvaćeni su sledećom strukturom:
gde:
svako (n) je nezavisan ceo broj koji ima vrednost od 2 do 4000;
(a) je ili nula ili jedan;
X, kada je prisutan, je razdelnički deo koji se sastoji iz jednog ili više atoma;
(b') je nula ili ceo broj koji ima vrednost od jedan do deset;
(c) je ceo broj koji ima vrednost od jedan do deset;
R<2>je u svakom slučaju nezavisno H ili organski radikal;
R<3>je u svakom slučaju nezavisno H ili organski radikal; i
IL-2 je ostatak IL-2 dela.
[0107] Još sledeći primerni konjugati obuhvaćeni su sledećom strukturom:
gde:
svako (n) je nezavisan ceo broj koji ima vrednost od 2 do 4000; i
IL-2 je ostatak IL-2 dela.
[0108] Primeri konjugata koji uključuju vezu koja se može osloboditi uključuju one u kojima je deo IL-2 konjugovan sa polimernim reagensom obuhvaćenim u sledećoj formuli:
gde:
POLY<1>je prvi polimer rastvorljiv u vodi;
POLY<2>je drugi polimer rastvorljiv u vodi;
X<1>je prvi razdelnički deo;
X<2>je drugi razdelnički deo;
Hαje atom vodonika koji se jonizuje;
R<1>je H ili organski radikal;
R<2>je H ili organski radikal;
(a) je ili nula ili jedan;
(b) je ili nula ili jedan;
R<e1>, kada je prisutan, je prva grupa koja menja elektrone;
R<e2>, kada je prisutan, je druga grupa koja menja elektrone; i
(FG) je funkcionalna grupa sposobna da reaguje sa amino grupom aktivnog sredstva da formira vezu koja se može osloboditi, poput karbamatne veze. U okviru ove formule su predviđeni polimerni reagensi sa definisanijom strukturom:
pri čemu je svaki od POLY<1>, POLY<2>, X<1>, X<2>, R<1>, R<2>, Hαi (FG) kako je prethodno definisano, R<e1>je prva grupa koja menja elektrone, a R<e2>je druga grupa koja menja elektrone.
[0109] Još dalji primerni polimerni reagensi spadaju u sledeće formule:
pri čemu je za svaku strukturu i u svakoj instanci (n) nezavisno ceo broj od 4 do 1500.
[0110] Ovi polimerni reagensi koji oslobađaju vezu mogu se pripremiti u skladu sa postupcima navedenim u objavi patentne prijave SAD br.2006/0293499.
[0111] Primeri konjugata nastalih upotrebom polimernih reagenasa koji omogućavaju vezu, uključuju one sledećih formula:
gde:
POLY<1>je prvi polimer rastvorljiv u vodi;
POLY<2>je drugi polimer rastvorljiv u vodi;
X<1>je prvi razdelnički deo;
X<2>je drugi razdelnički deo;
Hαje atom vodonika koji se jonizuje;
R<1>je H ili organski radikal;
R<2>je H ili organski radikal;
(a) je ili nula ili jedan;
(b) je ili nula ili jedan;
R<e1>, kada je prisutan, je prva grupa koja menja elektrone;
R<e2>, kada je prisutan, je druga grupa koja menja elektrone;
Y<1>je O ili S;
Y<2>je O ili S; i
(IL-2) je ostatak IL-2 dela.
[0112] Primerni konjugati imaju sledeće strukture:
pri čemu je za svaku strukturu i u svakom slučaju (n) nezavisno ceo broj od 4 do 1500, a (IL-2) je ostatak IL-2 dela.
[0113] Karboksilne grupe predstavljaju još jednu funkcionalnu grupu koja može da posluži kao tačka vezivanja na ostatku IL-2. Strukturno, konjugat će sadržati sledeće:
gde (IL-2) i susedna karbonilna grupa odgovaraju IL-2 ostatku koji sadrži karboksil, X je veza, poželjno heteroatom odabran od O, N(H) i S, a POLY je rastvorljiv u vodi polimer kao što je PEG, koji se opciono završava u završnom poklopcu.
[0114] Veza C(O)-X je rezultat reakcije između polimernog derivata koji nosi terminalnu funkcionalnu grupu i ostatka IL-2 koji sadrži karboksil. Kao što je iznad rečeno, specifična povezanost zavisiće od vrste funkcionalne grupe koja se koristi. Ako je polimer na kraju funkcionalizovan ili „aktiviran“ hidroksilnom grupom, rezultujuća veza će biti estar karboksilne kiseline, a X će biti O. Ako je polimerna okosnica funkcionalizovana sa tiolnom grupom, rezultujuća veza će biti tioester i X će biti S. Kada se koriste određeni višekraki, razgranati ili račvasti polimeri, C(O)X ostatak, a posebno X deo, može biti relativno složeniji i može sadržati dužu strukturu veze.
[0115] Derivati rastvorljivi u vodi koji sadrže hidrazidni deo su takođe korisni za konjugaciju na karbonilnoj i karboksilnoj kiselini. U meri u kojoj IL-2 deo ne sadrži karbonilni deo ili karboksilnu kiselinu, on se može dodati upotrebom tehnika poznatih prosečnom stručnjaku u ovoj oblasti. Na primer, karbonilni deo može da se uvede redukcijom karboksilne kiseline (npr., C-terminalne karboksilne kiseline) i/ili davanjem glikoziliranih ili glikovanih (pri čemu
4
dodati šećeri imaju karbonilni deo) verzija IL-2 dela. U vezi sa IL-2 delovima koji sadrže karboksilnu kiselinu, PEG-hidrazinski reagens može, u prisustvu vezivnog sredstva (npr., DCC), kovalentno da se vezuje za IL-2 deo [npr., mPEG-OCH2C(O)NHNH2+ HOC(O)-(IL-2) rezultuje u mPEG-OCH2C(O)NHNHC(O)-IL-2]. Konkretni primeri vodo rastvorljivih derivata koji sadrže hidrazidni deo, zajedno sa odgovarajućim konjugatima, dati su u Tabeli 2, ispod. Pored toga, bilo koji derivat rastvorljiv u vodi koji sadrži aktivirani estar (npr., sukcinimidilna grupa) može se pretvoriti da sadrži hidrazidni deo reakcijom u vodi rastvorljivog polimernog derivata koji sadrži aktivirani estar sa hidrazinom (NH2-NH2) ili terc-butilom karbazat [NH2NHCO2C(CH3)3]. U Tabeli, promenljiva (n) predstavlja broj ponavljajućih monomernih jedinica, a "-C(O)-(IL-2)" predstavlja ostatak dela IL-2 nakon konjugacije sa polimernim reagensom. Opcionalno, hidrazonska veza se može smanjiti korišćenjem odgovarajućeg redukcionog sredstva. Dok se svaki polimerni deo [npr.
(OCH2CH2)nili (CH2CH2O)n] predstavljen u Tabeli 2 završava u "CH3" grupi, druge grupe (kao što su H i benzil) mogu biti supstituisane njima.
Tabela 2
[0116] Tiol grupe sadržane u IL-2 delu mogu poslužiti kao efikasna mesta vezivanja za polimer rastvorljiv u vodi. Konkretno, ostaci cisteina daju tiolne grupe kada je ostatak IL-2 protein. Tiol grupe u takvim cisteinskim ostacima mogu zatim reagovati sa aktiviranim PEG-om koji je specifičan za reakciju sa tiol-grupama, npr., N-maleimidil polimerom ili drugim derivatom kako je opisano u patentu SAD br.5,739,208 i u Međunarodnoj objavi patenta WO 01/62827. Pored toga, zaštićeni tiol može biti ugrađen u bočni lanac oligosaharida aktiviranog glikoproteina, nakon čega sledi uklanjanje zaštite sa tiolom reaktivnim polimerom rastvorljivim u vodi.
[0117] Konkretni primeri reagenasa, zajedno sa odgovarajućim konjugatom, dati su u Tabeli 3 ispod. U tabeli, promenljiva (n) predstavlja broj ponavljajućih monomernih jedinica, a "-S-(IL-2)" predstavlja ostatak IL-2 dela nakon konjugacije sa polimerom rastvorljivim u vodi. Dok se svaki polimerni deo [npr. (OCH2CH2)nili (CH2CH2O)n] predstavljen u Tabeli 3 završava u "CH3" grupi, druge grupe (kao što su H i benzil) mogu biti supstituisane njima.
[0118] U odnosu na SEQ ID NO:1 i 2 koji odgovaraju primercima IL-2, može se videti da na položaju 125 postoji ostatak cisteina. Stoga je primerno mesto vezivanja tiola cistein smešten na položaju 125. Iako je poželjno da se ne prekidaju bilo kakve disulfidne veze povezane sa datim delom IL-2, možda će biti moguće povezati polimer unutar bočnog lanca jednog ili više ovih ostataka cisteina i zadržati određeni nivo aktivnosti. Pored toga, moguće je dodati ostatak cisteina u ostatak IL-2 koristeći konvencionalne sintetičke tehnike. Videti, na primer, postupak opisan u Međunarodnoj objavi patentne prijave br. WO 90/12874 za dodavanje ostataka cisteina, pri čemu se takav postupak može prilagoditi za IL-2 ostatak. Pored toga, konvencionalni procesi genetskog inženjeringa takođe se mogu koristiti za uvođenje ostatka cisteina u ostatak IL-2. U nekim otelotvorenjima, međutim, poželjno je da se ne uvodi dodatni ostatak cisteina i/ili tiol grupa.
Tabela 3
4
4
[0119] Što se tiče konjugata nastalih od polimera rastvorljivih u vodi koji nose jednu ili više funkcionalnih grupa maleimida (bez obzira na to da li maleimid reaguje sa aminskom ili tiolnom grupom na ostatku IL-2), odgovarajući oblik (oblici) maleaminske kiseline polimera rastvorljivog u vodi takođe može da reaguje sa IL-2 delom. Pod određenim uslovima (npr., PH od oko 7-9 i u prisustvu vode), maleimidni prsten će se „otvoriti“ da bi stvorio odgovarajuću maleaminsku kiselinu. Maleaminska kiselina zauzvrat može da reaguje sa aminskom ili tiolnom grupom IL-2 dela. Primeri reakcija zasnovanih na maleaminskoj kiselini su šematski prikazani u nastavku. POLY predstavlja polimer rastvorljiv u vodi, a (IL-2) predstavlja IL-2 deo.
[0120] Reprezentativni konjugat može imati sledeću strukturu:
POLY-L0,1-C(C))Z-Y-S-S-(IL-2)
gde je POLY polimer rastvorljiv u vodi, L je opcioni veznik, Z je heteroatom odabran iz grupe koju čine O, NH i S, a Y je odabran iz grupe koju čine C2-10alkil, C2-10supstituisani alkil, aril i supstituisani aril, a (IL-2) je IL-2 deo. Polimerni reagensi koji mogu da reaguju sa ostatkom IL-2 i rezultiraju ovom vrstom konjugata opisani su u objavi patentne prijave SAD br. 2005/0014903.
[0121] Kao što je prethodno naznačeno, primerni konjugati u kojima je polimer rastvorljiv u
4
vodi u razgranatom obliku, imaće razgranati oblik u vodi rastvorljivog polimera koji sadrži sledeću strukturu:
pri čemu je svaki (n) nezavisno ceo broj koji ima vrednost od 2 do 4000.
[0122] Primeri konjugata koji imaju polimer rastvorljiv u vodi u razgranatom obliku su pripremljeni koristeći sledeći reagens:
čime se formira konjugat koji ima sledeću strukturu:
gde:
(za svaku strukturu) svaki (n) je nezavisno ceo broj koji ima vrednost od 2 do 4000; i IL-2 je ostatak IL-2 dela.
[0123] Dodatni primerni konjugat može se dobiti pomoću reagensa:
čime se formira konjugat koji ima sledeću strukturu:
gde:
(za svaku strukturu) (n) je nezavisno ceo broj koji ima vrednost od 2 do 4000; i IL-2 je ostatak IL-2 dela.
[0124] Konjugati se mogu formirati korišćenjem tiol-selektivnih polimernih reagensa na više
4
načina. Na primer, ostatak IL-2 - opciono u pogodnom puferu (uključujući pufere koji sadrže amine, ako se želi) - stavlja se u vodeni medij sa pH oko 7-8 i dodaje se tiol-selektivni polimerni reagens kod molarnog viška. Reakcija se može odvijati oko 0,5 do 2 sata, mada reakciona vremena veća od 2 sata (npr., 5 sati, 10 sati, 12 sati i 24 sata) mogu biti korisna ako se utvrdi da su prinosi PEGilacije relativno niski. Primeri polimernih reagenasa koji se mogu koristiti u ovom pristupu su polimerni reagensi koji nose reaktivnu grupu odabranu iz grupe koja se sastoji od maleimida, sulfona (npr., vinil sulfona) i tiola (npr., funkcionalizovani tioli kao što je orto piridinil ili "OPSS") .
[0125] Što se tiče polimernih reagensa, oni ovde opisani i drugde mogu se kupiti iz komercijalnih izvora ili pripremiti od komercijalno dostupnih polaznih materijala. Pored toga, u literaturi su opisani postupci za pripremu polimernih reagensa.
[0126] Kao što je navedeno u patentnim zahtevima, veza između ostatka IL-2 i nepeptidnog polimera rastvorljivog u vodi je indirektna, pri čemu se jedan ili više atoma koji čine oslobađajuću karbamatnu vezu nalaze između dela IL-2 i polimera. Što se tiče indirektnog vezivanja, "razdelnički deo" služi kao veza između ostatka IL-2 dela i polimera rastvorljivog u vodi. Jedan ili više atoma koji čine razdelnički deo mogu da uključuju jedan ili više atoma ugljenika, atoma azota, atoma sumpora, atoma kiseonika i njihove kombinacije. Razdelnički deo može da sadrži amid, sekundarni amin, karbamat, tioeter i/ili disulfidnu grupu.
Neograničavajući primeri specifičnih razdelničkih delova uključuju one odabrane iz grupe koju čine -O-, -S-, -S-S-, -C(O)-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-NH-, -O-C(O)-NH-, -C(S)-, -CH2-, -CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-, -O-CH2-, -CH2-O-, -O-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-O-, -O-CH2-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-CH2-, -CH2-CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-CH2-O-, -O-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-O-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-O-, -C(O)-NH-CH2-, -C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-NH-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-, -C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-, -C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-, -C(O)-O-CH2-, -CH2-C(O)-O-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-O-CH2-, -C(O)-O-CH2-CH2-, -NH-C(O)-CH2-, -CH2-NH-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-, -NH-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-, -C(O)-NH-CH2-, -C(O)-NH-CH2-CH2-, -O-C(O)-NH-CH2-, -O-C(O)-NH-CH2-CH2-, -NH-CH2-, -NH-CH2-CH2-, -CH2-NH-
4
CH2-, -CH2-CH2-NH-CH2-, -C(O)-CH2-, -C(O)-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-, -O-C(O)-NH-[CH2]h-(OCH2CH2)j-, bivalentna cikloalkil grupa, -O-, -S-, aminokiselina, -N(R<6>)- i kombinacije dva ili više bilo čega od prethodno navedenog, pri čemu je R<6>H ili organski radikal odabran iz grupe koju čine alkil, supstituisani alkil, alkenil, supstituisani alkenil, alkinil, supstituisani alkinil, aril i supstituisani aril, (h) je nula do šest, a (j) je nula do 20. Ostali specifični razdelnički delovi imaju sledeće strukture: -C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-, -NH-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-, i -O-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-, pri čemu vrednosti indeksa nakon svakog metilena ukazuju na broj metilena sadržanih u strukturi, npr. (CH2)1-6znači da struktura može sadržati 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 metilena. Pored toga, bilo koji od gornjih razdelničkih delova može dalje da uključuje oligomerni lanac etilen oksida koji sadrži 1 do 20 monomernih jedinica etilen oksida [tj., -(CH2CH2O)1-20]. Odnosno, lanac etilen oksidnog oligomera može se pojaviti pre ili posle razdelničkog dela, a opciono i između bilo koja dva atoma razdelničkog dela koji se sastoji od dva ili više atoma. Takođe, oligomerni lanac ne bi se smatrao delom razdelničkog dela ako je oligomer susedan polimernom segmentu i samo predstavlja produženje polimernog segmenta.
Sastavi
[0127] Konjugati su obično deo sastava. Generalno, sastav sadrži mnoštvo konjugata, poželjno, mada ne nužno, svaki konjugat se sastoji od istog dela IL-2 (tj., u celom sastavu se nalazi samo jedan tip dela IL-2). Pored toga, sastav može sadržati veći broj konjugata, pri čemu se bilo koji dati konjugat sastoji od dela odabranog iz grupe koja se sastoji od dva ili više različitih IL-2 dela (tj., u okviru celokupne smeše, pronađena su dva ili više različitih IL-2 dela). Optimalno je, međutim, da se u osnovi svi konjugati u smeši (npr., 85% ili više od više konjugata u smeši) sastoje od istog dela IL-2.
[0128] Sastav može sadržati jednu konjugovanu vrstu (npr., monoPEGilirani konjugat u kojoj je pojedinačni polimer vezan na istom mestu za uglavnom sve konjugate u smeši) ili smešu konjugovanih vrsta (npr., smešu monoPEGiliranih konjugata gde vezivanje polimer se javlja na različitim mestima i/ili smeša monoPEGiliranih, diPEGiliranih i triPEGiliranih konjugata). Sastavi mogu takođe da sadrže druge konjugate koji imaju četiri, pet, šest, sedam, osam ili više polimera vezanih za bilo koji dati deo koji ima IL-2 aktivnost. Pored toga, pronalazak uključuje primere u kojima sastav sadrži mnoštvo konjugata, pri čemu svaki konjugat sadrži
4
jedan polimer rastvorljiv u vodi kovalentno vezan za jedan deo IL-2, kao i sastave koji sadrže dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam ili više polimera rastvorljivih u vodi kovalentno vezanih za jedan deo IL-2.
[0129] S obzirom na konjugate u sastavu, sastav će zadovoljiti jednu ili više sledećih karakteristika: najmanje oko 85% konjugata u sastavu imaće od jednog do četiri polimera vezanih za ostatak IL-2; najmanje oko 85% konjugata u sastavu imaće od jednog do tri polimera vezanih za ostatak IL-2; najmanje oko 85% konjugata u sastavu imaće od jednog do dva polimera vezanih za ostatak IL-2; najmanje oko 85% konjugata u sastavu će imati jedan polimer vezan za ostatak IL-2; najmanje oko 95% konjugata u sastavu imaće od jednog do pet polimera vezanih za ostatak IL-2; najmanje oko 95% konjugata u sastavu imaće od jednog do četiri polimera vezanih za ostatak IL-2; najmanje oko 95% konjugata u sastavu imaće od jednog do tri polimera vezanih za ostatak IL-2; najmanje oko 95% konjugata u sastavu imaće od jednog do dva polimera vezanih za ostatak IL-2; najmanje oko 95% konjugata u sastavu će imati jedan polimer vezan za ostatak IL-2; najmanje oko 99% konjugata u sastavu imaće od jednog do pet polimera vezanih za ostatak IL-2; najmanje oko 99% konjugata u sastavu imaće od jednog do četiri polimera vezanih za ostatak IL-2; najmanje oko 99% konjugata u sastavu imaće od jednog do tri polimera vezanih za ostatak IL-2; najmanje oko 99% konjugata u sastavu imaće od jednog do dva polimera vezanih za ostatak IL-2; najmanje oko 99% konjugata u sastavu će imati jedan polimer vezan za ostatak IL-2. Podrazumeva se da upućivanje na niz polimera, na primer, „od x do y polimera“, podrazumeva određeni broj polimera x do y, uključujući (na primer, „od jednog do tri polimera“ razmatra jedan polimer, dva polimera i tri polimera, "od jednog do dva polimera" podrazumeva jedan polimer i dva polimera, i tako dalje).
[0130] U jednom ili više otelotvorenja, poželjno je da sastav koji sadrži konjugat bude slobodan ili u osnovi bez albumina. Takođe je poželjno da je sastav slobodan ili u osnovi bez proteina koji nemaju aktivnost IL-2. Prema tome, poželjno je da je sastav 85%, još poželjnije 95%, a najpoželjnije 99% bez albumina. Pored toga, poželjno je da je kompozicija 85%, još poželjnije 95%, a najpoželjnije 99% bez bilo kakvog proteina koji nema aktivnost IL-2. U meri u kojoj je albumin prisutan u sastavu, primerni sastavi pronalaska su u osnovi bez konjugata koji sadrže poli(etilen glikol) polimer koji povezuje ostatak dela IL-2 sa albuminom.
[0131] U marki PROLEUKIN® aldesleukin (dostupan od Prometheus Laboratories Inc., San Diego, CA), IL-2 se isporučuje u kombinaciji sa natrijum dodecil sulfatom ("SDS").
Suprotno tome, sastavi prema predmetnom pronalasku povoljno ne zahtevaju SDS i stoga su bez (ili u suštini) bez SDS-a, kao i generalno od deterdženata (npr., Tween 20 i Tween 80). Shodno tome, sastav i konjugati predmetnog pronalaska mogu se pripremiti bez izvođenja koraka dodavanja SDS, Tween 20 i Tween 80. Pored toga, smeše i konjugati iz predmetnog pronalaska mogu se pripremiti bez izvođenja koraka dodavanja deterdženta ili drugog ekscipijensa. Dalje, sastavi predmetnog pronalaska su bez ili suštinski bez (npr., manje od oko 20%, poželjnije manje od oko 15%, još poželjnije manje od oko 10%, ali još poželjnije manje od oko 9%, ali još poželjnije manje od oko 8%, ali još poželjnije manje od oko 7%, ali još poželjnije manje od oko 6%, ali još poželjnije manje od oko 5%, ali još poželjnije manje od oko 4%, ali još poželjnije manje od oko 3%, ali još poželjnije manje od oko 2%, ali još poželjnije manje od oko 1%, ali još poželjnije manje od oko 0,5%, pri čemu je najpoželjnije manje od 0,001%) deterdženata kao što su SDS, Tween 20 i Tween 80. Pored toga, sastavi i konjugati iz predmetnog pronalaska mogu se pripremiti bez izvođenja koraka uklanjanja (pomoću, na primer, ultrafiltracije) deterdženata kao što su SDS, Tween 20 i Tween 80.
Dalje, sastavi i konjugati iz predmetnog pronalaska mogu se pripremiti bez izvođenja koraka uklanjanja (na primer, ultra-filtracijom) deterdženta.
[0132] Kontrola željenog broja polimera za bilo koji dati deo može se postići odabirom odgovarajućeg polimernog reagensa, odnosa polimernog reagensa prema IL-2 delu, temperature, pH uslova i drugih aspekata reakcije konjugacije. Pored toga, smanjenje ili uklanjanje neželjenih konjugata (npr., oni konjugati koji imaju četiri ili više vezanih polimera) može se postići sredstvima za prečišćavanje.
[0133] Na primer, polimeri-IL-2 konjugati ostataka mogu se prečistiti da bi se dobili/izolovali različite konjugovane vrste. Konkretno, smeša proizvoda može se prečistiti da bi se dobio prosek bilo gde od jednog, dva, tri, četiri, pet ili više PEG po IL-2 delu, tipično jedan, dva ili tri PEG-a po IL-2 delu. Strategija prečišćavanja konačne konjugovane reakcione smeše zavisiće od brojnih faktora, uključujući, na primer, molekularnu masu korišćenog polimernog reagensa, određeni deo IL-2, željeni režim doziranja i zaostalu aktivnost in vivo svojstva pojedinačnih konjugata.
[0134] Ako se želi, mogu se izolovati konjugati različite molekulske mase pomoću gel
1
filtracione hromatografije i/ili jonoizmenjivačke hromatografije. To će reći, gel filtraciona hromatografija se koristi za frakcionisanje različito numerisanih odnosa polimera-IL-2 (npr., 1-mer, 2-mer, 3-mer i tako dalje, pri čemu "1-mer" označava 1 polimer za IL-2 ostatak, „2-mer“ označava dva polimera za ostatak IL-2 i tako dalje) na osnovu njihove različite molekulske težine (gde razlika u osnovi odgovara prosečnoj molekulskoj masi porcije polimera rastvorljivog u vodi). Na primer, u primernoj reakciji gde je 35000 Daltona proteina nasumično konjugovano sa polimernim reagensom molekulske mase oko 20000 Daltona, rezultujuća reakciona smeša može sadržati nemodifikovani protein (koji ima molekulsku masu oko 35000 Daltona), monoPEGilirani protein koji imaju molekulsku masu od oko 55000 Daltona), diPEGilirani protein (koji ima molekulsku masu od oko 75000 Daltona), i tako dalje.
[0135] Iako se ovaj pristup može koristiti za odvajanje PEG i ostalih konjugata polimer-IL-2 ostataka koji imaju različite molekulske mase, ovaj pristup je generalno neefikasan za odvajanje pozicionih izoformi koje imaju različita mesta vezivanja polimera unutar dela IL-2. Na primer, gel filtraciona hromatografija može da se koristi za odvajanje jedne od drugih smeša PEG 1-mer, 2-mer, 3-mer i tako dalje, mada svaka od oporavljenih konjugovanih kompozicija može sadržati PEG vezane za različite reaktivne grupe (npr., lizinski ostaci) u okviru IL-2 dela.
[0136] Kolone za filtriranje gela pogodne za sprovođenje ove vrste odvajanja uključuju Superdex™ i Sephadex™ kolone dostupne od Amersham Biosciences (Piscataway, NJ). Izbor određene kolone zavisiće od željenog opsega frakcionisanja. Elucija se generalno vrši pomoću pogodnog pufera, kao što je fosfat ili acetat. Prikupljene frakcije mogu se analizirati nizom različitih postupaka, na primer, (i) apsorbancija na 280 nm za sadržaj proteina, (ii) analiza proteina na bazi boje, koristeći goveđi serumski albumin (BSA) kao standard, (iii) jod testiranje PEG sadržaja (Sims i dr. (1980) Anal. Biochem, 107:60-63), (iv) elektroforeza u natrijum-dodecil-sulfatu u poliakrilamidnom gelu (SDS PAGE), praćeno bojenjem barijumjodidom i (v) tečnom hromatografijom visokih performansi (HPLC).
[0137] Odvajanje pozicionih izoformi vrši se hromatografijom reverzne faze korišćenjem tečne hromatografije reverzne faze visokih performansi (RP-HPLC) koristeći odgovarajuću kolonu (npr., kolonu C18 ili kolonu C3, komercijalno dostupnu od kompanija kao što su Amersham Biosciences ili Vydac) ili hromatografijom za jonsku razmenu, koristeći
2
jonoizmenjivačku kolonu, npr., jonoizmenjivačku kolonu Sepharose™ dostupnu od Amersham Biosciences. Bilo koji pristup se može koristiti za odvajanje izomera polimerno aktivnih sredstava koji imaju istu molekulsku težinu (tj., položajne izoforme).
[0138] Sastavi su poželjno u osnovi bez proteina koji nemaju aktivnost IL-2. Pored toga, sastavi su poželjno u osnovi bez svih ostalih nekovalentno vezanih polimera rastvorljivih u vodi. U nekim okolnostima, međutim, sastav može sadržati mešavinu konjugata polimer-IL-2 dela i nekonjugovanog dela IL-2.
[0139] Po želji, sastav pronalaska dalje sadrži farmaceutski prihvatljiv ekscipijens. Po želji, farmaceutski prihvatljivi ekscipijens se može dodati konjugatu da bi se dobio sastav.
[0140] Primeri ekscipijensa uključuju, bez ograničenja, one koji su izabrani iz grupe koju čine ugljeni hidrati, neorganske soli, antimikrobna sredstva, antioksidanti, tenzidi, puferi, kiseline, baze, aminokiseline i njihove kombinacije.
[0141] Kao pomoćna supstanca mogu biti ugljeni hidrati kao što je šećer, derivatizovani šećer kao što je alditol, aldonska kiselina, esterifikovani šećer i/ili polimer šećera. Specifične pomoćne supstance ugljenih hidrata uključuju, na primer: monosaharidi, poput fruktoze, maltoze, galaktoze, glukoze, D-manoze i sorboze; disaharidi, poput laktoze, saharoze, trehaloze i celobioze; polisaharidi, poput rafinoze, melezitoze, maltodekstrina, dekstrana i skroba; i alditoli, kao što su manitol, ksilitol, maltitol, laktitol, ksilitol, sorbitol (glucitol), piranozil sorbitol, mioinositol i ciklodekstrini.
[0142] Ekscipijens takođe može da sadrži anorgansku so ili pufer, kao što su limunska kiselina, natrijum hlorid, kalijum hlorid, natrijum sulfat, kalijum nitrat, natrijum fosfat monobazni, natrijum fosfat dvobazni, i njihove kombinacije.
[0143] Sastav može takođe da sadrži antimikrobno sredstvo za sprečavanje ili odvraćanje rasta mikroba. Neograničavajući primeri antimikrobnih sredstava pogodnih za jedno ili više otelotvorenja predmetnog pronalaska uključuju benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid, benzil alkohol, cetilpiridinijum hlorid, hlorobutanol, fenol, feniletil alkohol, fenilmerkurni nitrat, timersol i njihove kombinacije.
[0144] U sastavu može biti prisutan i antioksidant. Antioksidanti se koriste za sprečavanje oksidacije, čime se sprečava propadanje konjugata ili drugih komponenti preparata. Pogodni antioksidanti za upotrebu u jednom ili više ostvarenja ovog pronalaska uključuju, na primer, askorbil palmitat, butilirani hidroksianizol, butilirani hidroksitoluen, hipofosfornu kiselinu, monotioglicerol, propil galat, natrijum bisulfit, natrijum formaldehid sulfoksilat, natrijum metabisulfit i njihove kombinacije.
[0145] Surfaktant može biti prisutan kao pomoćna supstanca. Primeri surfakanata uključuju: polisorbati, kao što su „TWEEN 20“ i „TWEEN 80“, i pluronika kao što su F68 i F88 (oba dostupna u BASF-u, Mount Olive, New Jersey); sorbitan estri; lipidi, poput fosfolipida kao što su lecitin i drugi fosfatidilholini, fosfatidiletanolamini (iako poželjno da nisu u lipozomskom obliku), masne kiseline i masni estri; steroidi, kao što je holesterol; i helatna sredstva, kao što su EDTA, cink i drugi takvi pogodni katjoni.
[0146] Kiseline ili baze mogu biti prisutne kao pomoćne supstance u sastavu.
Neograničavajući primeri kiselina koje se mogu koristiti uključuju one kiseline izabrane iz grupe koja se sastoji od hlorovodonične kiseline, sirćetne kiseline, fosforne kiseline, limunske kiseline, jabučne kiseline, mlečne kiseline, mravlje kiseline, trihlorosirćetne kiseline, azotne kiseline, perhlorne kiseline, fosforne kiseline, sumporna kiselina, fumarna kiselina i njihove kombinacije. Primeri pogodnih baza uključuju, bez ograničenja, baze odabrane iz grupe koju čine natrijum hidroksid, natrijum acetat, amonijum hidroksid, kalijum hidroksid, amonijum acetat, kalijum acetat, natrijum fosfat, kalijum fosfat, natrijum citrat, natrijum format, natrijum sulfat, kalijum sulfat, kalijum fumarat i njihove kombinacije.
[0147] Jedna ili više aminokiselina mogu biti prisutne kao pomoćne supstance u ovde opisanim sastavima. Primeri aminokiselina u ovom pogledu uključuju arginin, lizin i glicin.
[0148] Količina konjugata (tj., konjugata koji nastaje između aktivnog agensa i polimernog reagensa) u kompoziciji variraće u zavisnosti od niza faktora, ali optimalno će biti terapeutski efikasna doza kada se sastav čuva u ambalaži za jedinične doze (npr., bočica). Pored toga, farmaceutski preparat se može smestiti u špric. Terapeutski efikasna doza se može odrediti eksperimentalno ponovljenim davanjem sve većih količina konjugata kako bi se utvrdilo koja količina daje klinički željenu krajnju tačku.
4
[0149] Količina bilo kog ekscipijensa u sastavu variraće u zavisnosti od aktivnosti ekscipijensa i posebnih potreba sastava. Obično se optimalna količina bilo koje pomoćne supstance određuje rutinskim eksperimentisanjem, tj., pripremom sastava koji sadrže različite količine pomoćne supstance (u rasponu od niskih do visokih), ispitivanjem stabilnosti i drugih parametara, a zatim određivanjem opsega u kojem optimalne performanse se postiže bez značajnih štetnih efekata.
[0150] Generalno, međutim, ekscipijens će biti prisutan u smeši u količini od oko 1% do oko 99% mase, poželjno od oko 5% do oko 98% mase, još poželjnije od oko 15% do oko 95% mase ekscipijensa, sa najpoželjnijim koncentracijama manjim od 30 mas.%.
[0151] Ovi prethodno navedeni farmaceutski ekscipijensi zajedno sa drugim ekscipijensima su opisani u "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19th ed., Williams & Williams, (1995), "Physician's Desk Reference", 52nd ed., Medical Economics, Montvale, NJ (1998), i Kibbe, A.H., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Edition, American Pharmaceutical Association, Washington, D.C., 2000.
[0152] Sastavi obuhvataju sve vrste formulacija, posebno one koje su pogodne za injekcije, npr., praškove ili liofilate koji se mogu rekonstituisati, kao i tečnosti. Primeri pogodnih razblaživača za rekonstrukciju čvrstih sastava pre injekcije uključuju bakteriostatsku vodu za injekcije, dekstrozu 5% u vodi, fiziološki rastvor puferisan fosfatom, Ringerov rastvor, fiziološki rastvor, sterilna voda, dejonizovana voda i njihove kombinacije. U pogledu tečnih farmaceutskih sastava, predviđeni su rastvori i suspenzije.
[0153] Sastavi jednog ili više otelotvorenja predmetnog pronalaska se tipično, mada ne nužno, daju injekcijom i prema tome su generalno tečni rastvori ili suspenzije neposredno pre davanja. Farmaceutski sastavi mogu imati i druge oblike kao što su sirupi, kreme, masti, tablete i praškovi. Takođe su uključeni i drugi načini davanja, kao što su plućni, rektalni, transdermalni, transmukozni, oralni, intratekalni, intratumoralni, peritumoralni, intraperitonealno, potkožni i intraarterijski.
[0154] Pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutski sastav za upotrebu u terapiji, koja može uključivati davanje konjugata pacijentu koji pati od stanja koje reaguje na lečenje konjugatom. Postupak može obuhvatati davanje pacijentu, obično injekcijom, terapeutski efikasne količine konjugata. Kao što je prethodno opisano, konjugati se mogu injektirati (npr., intramuskularno, subkutano i parenteralno). Pogodni tipovi formulacija za parenteralno davanje uključuju rastvore spremne za injekcije, suve praškove za kombinaciju sa rastvaračem pre upotrebe, suspenzije spremne za injekcije, suve nerastvorne smeše za kombinaciju sa nosačem pre upotrebe i emulzije i tečne koncentrate za razblaživanje pre davanja.
[0155] Postupak može obuhvatati davanje konjugata (poželjno obezbeđenog kao deo farmaceutskog sastava) i može se opciono sprovesti tako da se konjugat lokalizuje na određeno područje. Na primer, tečne, gelske i čvrste formulacije koje sadrže konjugat mogu se hirurški implantirati u bolesno područje (kao što je tumor, blizu tumora, u upaljenom području i blizu upaljenog područja). Pogodno je i da se organi i tkiva takođe slikaju kako bi se osiguralo da je željena lokacija bolje izložena konjugatu.
[0156] Farmaceutski sastav za upotrebu u terapiji može se koristiti za lečenje bilo kog stanja koje se može popraviti ili sprečiti davanjem konjugata. Oni koji imaju uobičajenu veštinu u ovoj oblasti procenjuju koja stanja određeni konjugat može efikasno lečiti. Na primer, konjugati se mogu koristiti ili sami ili u kombinaciji sa drugom farmakoterapijom za lečenje pacijenata koji boluju od bolesti izabrane iz grupe koju čine karcinom bubrežnih ćelija, metastatski melanom, virus hepatitisa C (HCV), virus humane imunodeficijencije (HIV), akutna mijeloidna leukemija, ne-Hodgkinov limfom, kožni limfom T-ćelija, juvenilni reumatoidni artritis, atopijski dermatitis, rak dojke i rak bešike. Poželjno je da se konjugat može davati kod pacijenta pre, istovremeno sa ili posle davanja drugog aktivnog sredstva.
[0157] Stvarna doza koja se daje variraće u zavisnosti od starosti, težine i opšteg stanja ispitanika, kao i težine stanja koje se leči, procene zdravstvenog radnika i konjugata koji se daje. Terapeutski efikasne količine su poznate stručnjacima i/ili su opisane u odgovarajućim referentnim tekstovima i literaturi. Generalno, terapeutski efikasna količina kretaće se od oko 0,001 mg do 100 mg, poželjno u dozama od 0,01 mg/dan do 75 mg/dan, a poželjnije u dozama od 0,10 mg/dan do 50 mg/dan. Data doza se može periodično davati sve dok se, na primer, simptomi trovanja organofosfatima ne umanje i/ili potpuno eliminišu.
[0158] Jedinična doza bilo kog datog konjugata (opet poželjno obezbeđena kao deo farmaceutskog preparata) može se primenjivati u različitim režimima doziranja, u zavisnosti od procene kliničara, potreba pacijenta, i tako dalje. Specifičan raspored doziranja biće poznat stručnjacima iz struke ili se eksperimentalno može odrediti rutinskim metodama. Primeri rasporeda doziranja uključuju, bez ograničenja, davanje jednom dnevno, tri puta nedeljno, dva puta nedeljno, jednom nedeljno, dva puta mesečno, jednom mesečno i bilo koju njihovu kombinaciju. Kada se postigne klinička krajnja tačka, doziranje smeše se zaustavlja.
EKSPERIMENTALNO
[0159] Praksa pronalaska koristiće, ukoliko nije drugačije naznačeno, konvencionalne tehnike organske sinteze, biohemije i prečišćavanja proteina, koje su u okviru veštine tehnike. Takve tehnike su u potpunosti objašnjene u literaturi. Videti na primer, J. March, Advanced Organic Chemistry: Reactions Mechanisms and Structure, 4th Ed. (New York: Wiley-Interscience, 1992), supra.
[0160] U sledećim primerima su učinjeni napori da se osigura tačnost u odnosu na korišćene brojeve (npr., količine, temperature itd.), ali treba uzeti u obzir neke eksperimentalne greške i odstupanja. Ako nije drugačije naznačeno, temperatura je u stepenima C, a pritisak je na ili blizu atmosferskog pritiska na nivou mora. Svaki od sledećih primera smatra se uputnim za one koji imaju uobičajenu veštinu u tehnici za izvođenje jedne ili više ovde opisanih otelotvorenja.
[0161] Vodeni rastvor ("osnovni rastvor") koji sadrži rekombinantni IL-2 ("rIL-2") koji odgovara aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:3, zrela sekvenca proteina, dobijena je od Myoderma (Norristown PA) za upotrebu u primerima ili je pripremljena u skladu sa Primerom 1. Koncentracija osnovnog rastvora varirala je između 1 i 100 mg/mL.
SDS-PAGE analiza
[0162] Uzorci su analizirani elektroforezom natrijum dodecil sulfat-poliakrilamid gela (SDS-PAGE) primenom sistema Invitrogen NuPAGE i prethodno odlivenih gela Novex 4-10% Bis-Tris (Invitrogen, Carlsbad, CA). Pripremljeni su uzorci, naloženi na gel i izvršena elektroforeza kako je opisao proizvođač.
Katjonoizmenjivačka hromatografija
[0163] Katjonoizmenjivačka kolona SP-HP Sepharose (GE Healthcare) sa zapreminom sloja od približno 100 ml pripremljena je standardnim postupcima. Kolona je povezana sa GE Healthcare (Chalfont St. Giles, UK) AKTA Explorer100 radi pročišćavanja pripremljenih PEG-rIL-2 konjugata. Detalji za postupak prečišćavanja opisani su u nastavku.
RP- HPLC Analiza
[0164] Analiza reverzne faze hromatografije (RP-HPLC) izvedena je na Agilent (Santa Clara, CA) 1100 HPLC sistemu. Uzorci su analizirani koristeći Silverton (Japan) Intrada WP-RP kolonu (veličina čestica 3 um, 2,1 X 150 mm). Brzina protoka kolone bila je 0,5 ml/min. Pokretne faze su bile 0,09% TFA u vodi (rastvarač A) i 0,04% TFA u acetonitrilu (rastvarač B).
Primer 1
Kloniranje gena IL-2 i ekspresija rIL-2
[0165] Sekvenca humanog IL-2 cDNA možda neće biti optimalno izražena u prokariotima poput E. coli zbog značajnih razlika u upotrebi kodona različitih organizama. Umesto da se izvrše mnoge tačkaste mutacije postojeće sekvence cDNK izvedene od čoveka da bi se maksimizovala upotreba kodona E. coli, korišćena je PCR tehnika za potpunu sintezu gena.
[0166] Postupak za sintezu gena iz preklapajućih prajmera bila je u osnovi kombinacija dva postupka sa manjim modifikacijama. Osnovna rasprava o svakom pojedinačnom postupku data je u Young i dr. (2004) Nucleic Acids Research 32(7):e59 i Devlin i dr. (1988) Gene 65:13-22. Ukratko, DNK sekvenca je podeljena na prednje i reverzne oligonukleotide manje od 35 bp sa nekoliko izuzetaka i nije bilo praznina između oligonukleotida. Svaki oligonukleotid je preklopio dva susedna na suprotnom lancu za najmanje 10 nukleotida na 3' krajevima i najmanje 15 nukleotida na 5' krajevima. Dvostruka asimetrična PCR je korišćena za sastavljanje pod-fragmenata gena i oni su kombinovani za sastavljanje celokupnog gena korišćenjem PCR preklapanja. Zatim je korišten korak selekcije T7 endonukleaze I za uklanjanje neusklađenih dupleksa kako su opisali Young i dr. Videti Young i dr. (2004) Nucleic Acids Research 32(7):e59. Mesto restrikcionih enzima je uključeno na završetke gena i konačni fragment gena je kloniran u komercijalno dostupan ekspresijski vektor za E. coli. Analiza DNK sekvence je korišćena za potvrđivanje sekvence dobijene kao što je prikazano na Sl.1 i SEQ ID NO:5.
[0167] Koristeći ovaj pristup, aminokiselinska sekvenca isključuje aminokiselinsku poziciju #1 (alanin) u poređenju sa izvornom zrelom humanom sekvencom i uključuje mutaciju C → S aminokiselina na aminokiselinskoj poziciji #125 za sekvencu kao što je prikazano. Prva aminokiselina u ovoj sekvenci je metionin za direktnu bakterijsku ekspresiju (bez kodiranog signalnog peptida). Nakon ekspresije, međutim, početni metionin se uklanja pomoću metionin amino peptidaze domaćina.
[0168] Gen je kloniran u jedan od vektora ekspresije pET (T7). Protein je eksprimiran u soju E. coli BL21 (DE3), jednom od sojeva koji se tipično koristi za sistem ekspresije T7. Ovaj sistem ekspresije dostupan je komercijalno, a postupci ekspresije dostupne su kod EMD Biosciences, Merck KGaA, Darmstadt, Nemačka. Korišćenje ovog sistema izvršeno je pod licencom za istraživanje Nacionalne laboratorije Brookhaven. Vektor je rezultirao da se protein izražava kao inkluzijska tela u E. coli. Tipični recepti koji se koriste za izražavanje mogu se naći u literaturi i na Protein Production by Auto-Induction in High-Density Shaking Cultures, by F. William Studier, Biology Department, Brookhaven National Laboratory, Upton, NY 11973 (December 20, 2007).
[0169] Nakon fermentacije, ćelije su sakupljene centrifugiranjem. Pelet ćelijske mase čuvan je na -80°C za buduću homogenizaciju. Zamrznuta peleta ćelijske mase je ponovo suspendovana u puferu za ispiranje ćelija (50 mM Tris, 5 mM EDTA, pH 8,0) do koncentracije od 10% (W/V) i centrifugirana na 13860 x g tokom 30 minuta. Supernatant je odbačen. Isprani pelet je ponovo suspendovan u puferu za homogenizaciju (50 mM Tris, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF, pH 8,0) i homogenizovan mikrofluidizatorom (M-110P iz Microfluidics, Newton, Massachusetts, USA) na 4-15 °C za jedan prolaz. Homogenat je razblažen dvostruko upotrebom pufera za ispiranje ćelija (50 mM Tris, 5 mM EDTA, pH 8,0) i centrifugiran na 13860 x g tokom 60 minuta. Supernatant je odbačen. Kuglica sa inkluzivnim telom je isprana u tri koraka upotrebom pufera u sekvenci od 50 mM Tris, 5 mM EDTA, 2% Triton X-100, pH 8,0; 50 mM Tris, 5 mM EDTA, 1% natrijum dezoksiholat, pH 8,0; i 50 mM Tris, 5 mM EDTA, 1M NaCl, pH 8,0. Posle pranja dobijena su sirova tela za uključivanje IL-2.
[0170] Sirova tela za uključivanje IL-2 rastvorena su u 6M gvanidinu, 100 mM Tris, pH 8 puferu. EDTA je dodat krajnjoj koncentraciji 2 mM. Ditiotreitol (DTT) je zatim dodat do krajnje koncentracije od 50 mM. Smeša je inkubirana na 50 °C tokom 30 minuta. Posle redukcije, smeši je dodata voda da bi se koncentracija gvanidina smanjila na 4,8 M. Posle jednog sata centrifugiranja na 13860 x g, rezultujuća gelasta kuglica je odbačena.
Koncentracija gvanidina u supernatantu je dalje smanjena na 3,5 M dodavanjem vode. PH je podešen na 5 titracijom 100% sirćetne kiseline. Smeša je inkubirana na sobnoj temperaturi 60 minuta i centrifugirana na 13860 x g tokom jednog sata. Dobijena peleta je suspendovana u 3,5 M gvanidinu, 20 mM acetata, 5 mM DTT, puferu pH 5 i centrifugirana na 13860 x g tokom jednog sata. Ovaj korak pranja ponovljen je još jednom.
[0171] Čista i redukovana tela za uključivanje IL-2 rastvorena su u 6M gvanidinu, 100 mM Tris pH 8 puferu. Dodato je 100 mM CuCl2da bi se postigla konačna koncentracija Cu<2+>0,1 mM. Smeša je inkubirana preko noći na 4°C.
[0172] Ovde je takođe opisan poboljšani postupak koji omogućava proteinima da dobiju tercijarnu strukturu. S tim u vezi, prethodni postupci su se često oslanjali na stepenasto razblaživanje, koje je često surovo za proteine. Prema tome, u poboljšanom pristupu koji omogućava savijanje proteina pod blažim uslovima, opisan je postupak u kojoj postupak sadrži korak postavljanja eksprimiranog proteina (npr., IL-2 ostatka, kao što je IL-2, pripremljen u skladu sa ovim primerom) u vrećici za dijalizu koja ima veličinu pora manju od veličine izraženog proteina i dodavanjem (poželjno tokom nekoliko sati, npr., tokom 6 sati, još poželjnije tokom 10 sati, a još poželjnije preko 15 sati) rastvor bez proteinskih denaturanata (npr., voda). Primerni rastvori bez proteinskih denaturanata prepoznati su onima koji su stručni u ovoj oblasti i uključuju, na primer, rešenja (npr., pufere i vodu) kojima nedostaje (ili im u osnovi nedostaje) gvanidina, uree, litijum perhlorata, 2-merkaptoetanola, ditiotreitola i deterdženti. Prema tome, u skladu sa ovim postupkom, izraženi rastvor IL-2 stavljen je u vreće za dijalizu (veličine pora molekulske mase 3,5 kilodaltona). Vreće za dijalizu stavljene su u rezervoar koji je sadržavao 4,8 M gvanidina, 0,1 M Tris, pufer pH 8. Posle tri sata uravnoteženja, koncentracija gvanidina u rezervoaru polako je smanjena na 2 M pumpanjem vode u rezervoar tokom perioda od 15 sati. Čitav postupak ponovnog sklapanja završen je na 4°C. Ponovo uloženi IL-2 proveren je pomoću SEC-HPLC.
[0173] Ponovno složeni IL-2 je centrifugiran na 13860 x g tokom 60 minuta da bi se uklonili talozi. Supernatant je koncentrovan sa membranskim sistemom Pellicon XL TFF (Millipore Corporation, SAD).
[0174] Ponovno savijeni i koncentrovani IL-2 napunjen je na BPG kolonu (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala Švedska), napunjenu smolom Sephacryl S-100 HR. Tekući pufer je bio 2 M gvanidina, 20 mM Tris pH 8 i brzina protoka je bila 25 mL/min. Frakcije ispod pika monomera IL-2 su objedinjene. Treba napomenuti da se mogu koristiti i druge pogodne metode prečišćavanja, kao što su jonoizmenjivačka hromatografija i hidrofobna interakciona hromatografija (HIC hromatografija).
[0175] Skupina monomernih frakcija IL-2 koncentrovana je na oko 1-2 mg/mL upotrebom membranskog sistema Pellicon XL TFF (Millipore Corporation, SAD) na 4°C i radnim pritiskom od 30-40 psi. Koncentrovani rastvor monomera IL-2 je dijalizovan u konačnom puferu za formulaciju (10 mM acetat-Na, 5% trehaloza, pH 4,5) da bi se koncentracija gvanidina spustila ispod 0,1 mM promenom formulacijskog pufera nekoliko puta (4-5 puta u normalno). Formulirani rastvor IL-2 je učinjen sterilnim propuštanjem kroz filter od 0,22 µm i čuvan na -80°C za dalju upotrebu.
Primer 2
PEGilacija rIL-2 sa mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS
[0176]
mPEG2-C2-fmoc-20K-N-Hidroksisukcinimid derivacioni, 20kDa, ("mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS")
[0177] mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS, čuvan na -80°C pod argonom, zagrejan je do sobne temperature pod prečišćavanjem azota. Štok rastvora (200 mg/mL) mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS je pripremljen u 2 mM HCl, i mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS je dodat u rIL-2 u količini dovoljnoj da dostigne molarni odnos od mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS do rIL-2100:1.
Konačna koncentracija rIL-2 u smeši bila je 0,5 mg/mL (0,035 mM). U smešu je dodat pufer natrijum bikarbonata (1 M, pH 9,0) da bi se postigla konačna koncentracija od 20 mM, a konjugacija je ostavljena da traje trideset minuta da se dobiju [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] konjugati. Posle trideset minuta, postignuto je gašenje dodavanjem 1 M glicina (pH 6,0) u reakcionu smešu da bi se postigla konačna koncentracija od 100 mM. Ugašena reakciona smeša je zatim razblažena sa H2O kako bi se obezbedila provodljivost ispod 0,5 mS/cm (25°C). PH je podešena na 4,0 korišćenjem ledene sirćetne kiseline pre prečišćavanja
1
hromatografijom na koloni.
[0178] Tipičan profil prečišćavanja katjonoizmenjivačkom hromatografijom [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] je dat na Sl.2.1. [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] i nereagovani PEG su naznačeni i linije odgovaraju apsorbanciji na različitim talasnim dužinama (npr., 280 nm i 225 nm). Analiza čistoće [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] HPLC analizom reverzne faze otkrila je čistoću prečišćenog konjugata od 100% na 280 nm. Videti Sl.2.2. Čistoća nije bila manja od 95%, kako je određeno 4-12% NuPage Bis-Tris SDS-PAGE gela sa Coomassie Blue bojenjem (gel nije prikazan) sa 20 µg prečišćenog [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2]. Smatralo se da je prividna velika molekulska masa konjugata, veća od 200 kDa, rezultat sporosti pokretljivosti konjugata kroz gel zbog visokog stepena PEG hidratacije i rezultujućeg relativno velikog hidrodinamičkog radijusa. Kroz ove testove je potvrđeno da su proizvedena četiri konjugata: 4-mer, 3-mer, 2-mer i 1-mer, tj., [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] od kojih je četiri "[mPEG2-C2-fmoc-20K]" spojeno sa jednim "[rIL-2]" za 4-mer, tri "[mPEG2-C2-fmoc-20K]" je spojeno sa jednim "[rIL-2]" za 3-mer, dva "[mPEG2-C2-fmoc-20K]" je spojeno sa jednim [rIL-2] za 2-mer, i jedan "[mPEG2-C2-fmoc-20K]" je spojen sa jednim [rIL-2] za 1-mer.
[0179] Deljiva priroda [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] za oslobađanje rIL-2 prikazano je otkrivanjem promene vrsta pomoću HPLC reverzne faze. Ukratko, prečišćen [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] inkubiran je u 100 mM rastvoru NaHCO3, na pH 9,0, 37°C, nekoliko sati. Povremeno su dobijeni i testirani alikvoti sistema za otkrivanje nestanka [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] konjugat i prisustvo oslobođenog rIL-2. Pojava rIL-2 platoirala je desetak sati nakon inkubacije, uz postepeno smanjenje verovatno zbog padavina. Podaci su dati na Sl.2.3.
Primer 3
PEGilacija rIL-2 sa mPEG2-CAC-fmoc-20K-NHS
[0180]
2
mPEG2-CAC-fmoc-20K-N-Hidroksisukcinimid derivacioni, 20kDa, ("mPEG2-CAC-fmoc-20K-NHS")
[0181] mPEG2-CAC-fmoc-20K-NHS, čuvan na -80°C pod argonom, zagrejan je do sobne temperature pod prečišćavanjem azota. Štok rastvora (200 mg/mL) mPEG2-CAC-fmoc-20K-NHS je pripremljen u 2 mM HCl, i mPEG2-CAC-fmoc-20K-NHS je dodat u rIL-2 u količini dovoljnoj da dostigne molarni odnos od mPEG2-CAC-fmoc-20K-NHS do rIL-2100:1. Konačna koncentracija rIL-2 u smeši bila je 0,5 mg/mL (0,035 mM). U smešu je dodat pufer natrijum bikarbonata (1 M, pH 9,0) da bi se postigla konačna koncentracija od 20 mM, a konjugacija je ostavljena da traje trideset minuta da se dobiju [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] konjugati. Posle trideset minuta, postignuto je gašenje dodavanjem 1 M glicina (pH 6,0) u reakcionu smešu da bi se postigla konačna koncentracija od 100 mM. Ugašena reakciona smeša je zatim razblažena sa H2O kako bi se obezbedila provodljivost ispod 0,5 mS/cm (25°C). PH je podešena na 4,0 korišćenjem ledene sirćetne kiseline pre prečišćavanja hromatografijom na koloni.
[0182] Tipičan profil prečišćavanja katjonoizmenjivačkom hromatografijom [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] je dat na Sl.3.1. [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] je naznačeno i linije odgovaraju apsorbanciji na različitim talasnim dužinama. Analiza čistoće [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] HPLC analizom reverzne faze otkrila je čistoću prečišćenog konjugata od 98,5% na 280 nm. Vrhunac u 19,6 minutu predstavlja nereagovani mPEG2-CAC-fmoc-20K-NHS (koji čini <0,1%). Videti Sl.3.2. Čistoća nije bila manja od 95%, kako je određeno 4-12% NuPage Bis-Tris SDS-PAGE gela sa Coomassie Blue bojenjem (gel nije prikazan) sa 20 µg prečišćenog [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2]. Smatralo se da je prividna velika molekulska masa konjugata, veća od 200 kDa, rezultat sporosti pokretljivosti konjugata kroz gel zbog visokog stepena PEG hidratacije. Molekulska masa prečišćenog [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] konjugata takođe je određena MALDI-TOF spektrofotometrijom. Kao što se vidi na Sl.3.3, glavni vrh pri 79,6 kDa je unutar očekivanog opsega za molekularnu masu [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] konjugata. Vrhunac na 100,8 kDa je unutar očekivanog opsega za molekularnu masu [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2]. Vrhovi sa MW 40 kDa i 58,7 kDa mogu predstavljati dvostruko naelektrisane 3-mer IL-2 konjugate i 4-mer IL-2 konjugate.
Primer 4 (referenca)
PEGilacija rIL-2 sa razgranatim derivatom mPEG-N-hidroksisukcinimidila, 20kDa
mPEG2-ru-20K-N-Hidroksilsulcinimidil derivacioni, 20kDa, ("mPEG2-ru-20K-NHS")
[0184] mPEG2-ru-20K-NHS, čuvan na -80°C pod argonom, zagrejan je do sobne temperature pod prečišćavanjem azota. Štok rastvora (200 mg/mL) mPEG2-ru-20K-NHS je pripremljen u 2 mM HCl, i mPEG2-ru-20K-NHS je dodat u rIL-2 u količini dovoljnoj da dostigne molarni odnos od mPEG2-ru-20K-NHS do rIL-2100:1. Konačna koncentracija rIL-2 u smeši bila je 0,5 mg/mL (0,035 mM). U smešu je dodat pufer natrijum bikarbonata (1 M, pH 9,0) da bi se postigla konačna koncentracija od 20 mM, a konjugacija je ostavljena da traje trideset minuta da se dobiju [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] konjugati. Posle trideset minuta, postignuto je gašenje dodavanjem 1 M glicina (pH 6,0) u reakcionu smešu da bi se postigla konačna koncentracija od 100 mM. Ugašena reakciona smeša je zatim razblažena sa H2O kako bi se obezbedila provodljivost ispod 0,5 mS/cm (25 °C). PH je podešena na 4,0 korišćenjem ledene sirćetne kiseline pre prečišćavanja hromatografijom na koloni.
[0185] Tipičan profil prečišćavanja katjonoizmenjivačkom hromatografijom [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] je dat na Sl.4.1. [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] i nereagovani mPEG2-ru-20K-NHS su naznačeni i linije odgovaraju apsorbanciji na različitim talasnim dužinama (npr., 280 nm i 225 nm). Analiza čistoće [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] HPLC analizom reverzne faze otkrila je čistoću prečišćenog konjugata od 100% na 280 nm. Videti Sl.4.2. Čistoća nije bila manja od 95%, kako je određeno 4-12% NuPage Bis-Tris SDS-PAGE gela sa Coomassie Blue bojenjem (gel nije prikazan) sa 20 µg prečišćenog [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2]. Prividna velika molekulska masa konjugata, veća od 200 kDa, rezultat je sporosti pokretljivosti konjugata kroz gel zbog visokog stepena PEG hidratacije.
Primer 5 (referenca)
PEGilacija rIL-2 sa razgranatim derivatom mPEG-N-hidroksisukcinimidila, 40kDa [0186]
4
mPEG2-ru-40K-N-Hidroksilsulcinimidil derivacioni, 40kDa, ("mPEG2-ru-40K-NHS")
[0187] mPEG2-ru-40K-NHS, čuvan na -80 °C pod argonom, zagrejan je do sobne temperature pod prečišćavanjem azota. Štok rastvora (200 mg/mL) mPEG2-ru-40K-NHS je pripremljen u 2 mM HCl, i mPEG2-ru-40K-NHS je dodat u rIL-2 u količini dovoljnoj da dostigne molarni odnos od mPEG2-ru-40K-NHS do rIL-2100:1. Konačna koncentracija rIL-2 u smeši bila je 0,5 mg/mL (0,035 mM). U smešu je dodat pufer natrijum bikarbonata (1 M, pH 9,0) da bi se postigla konačna koncentracija od 20 mM, a konjugacija je ostavljena da traje trideset minuta da se dobiju [mPEG2-ru-40K]-[rIL-2] konjugati. Posle trideset minuta, postignuto je gašenje dodavanjem 1 M glicina (pH 4,0) u reakcionu smešu da bi se postigla konačna koncentracija od 100 mM. Ugašena reakciona smeša je zatim razblažena sa H2O kako bi se obezbedila provodljivost ispod 0,5 mS/cm (25 °C). PH je podešena na 4,0 korišćenjem ledene sirćetne kiseline pre prečišćavanja hromatografijom na koloni.
[0188] Tipičan profil prečišćavanja katjonoizmenjivačkom hromatografijom [mPEG2-ru-40K]-[rIL-2] je dat na Sl.5. [mPEG2-ru-40K]-[rIL-2] i nereagovani PEG su naznačeni i linije odgovaraju apsorbanciji. Analiza čistoće [mPEG2-ru-40K]-[rIL-2] HPLC analizom reverzne faze otkrila je čistoću prečišćenog konjugata od 100% na 280 nm. Čistoća nije bila manja od 95%, kako je određeno 4-12% NuPage Bis-Tris SDS-PAGE gela sa Coomassie Blue bojenjem (gel nije prikazan) sa 20 µg prečišćenog [mPEG2-ru-40K]-[rIL-2]. Očigledna velika molekulska masa konjugata (verovatno 3-mer verzija [mPEG2-ru-40K]-[rIL-2]), veća od 200 kDa, rezultat je spore pokretljivosti konjugata kroz gel zbog do visokog stepena PEG hidratacije. Nereagovani mPEG2-ru-40K-NHS je u početku eluiran kroz kolonu praćenu konjugati.
Primer 6 (referenca)
PEGilacija rIL-2 sa razgranatim derivatom mPEG-N-hidroksisukcinimidila, 4k Da [0189]
mPEG2-ru-20K-N-Hidroksilsulcinimidil derivacioni, 4kDa, ("mPEG2-ru-4K-NHS") [0190] mPEG2-ru-4K-NHS, čuvan na -80°C pod argonom, zagrejan je do sobne temperature pod prečišćavanjem azota. Štok rastvora (200 mg/mL) mPEG2-ru-4K-NHS je pripremljen u 2 mM HCl, i mPEG2-ru-4K-NHS je dodat u rIL-2 u količini dovoljnoj da dostigne molarni odnos od mPEG2-ru-4K-NHS do rIL-2100:1. Konačna koncentracija rIL-2 u smeši bila je 0,5 mg/mL (0,035 mM) rastvoren sa 0,015 % SDS. U smešu je dodat pufer natrijum bikarbonata (1 M, pH 9,0) da bi se postigla konačna koncentracija od 100 mM, a konjugacija je ostavljena da traje trideset minuta da se dobiju [mPEG2-ru-4K]-[rIL-2] konjugati. Posle trideset minuta, postignuto je gašenje dodavanjem 1 M glicina (pH 4,0) u reakcionu smešu da bi se postigla konačna koncentracija od 100 mM. Ugašena reakciona smeša je zatim razblažena sa H2O kako bi se obezbedila provodljivost ispod 0,5 mS/cm (25 °C). PH je podešena na 4,0 korišćenjem ledene sirćetne kiseline pre prečišćavanja hromatografijom na koloni.
[0191] Tipičan profil prečišćavanja katjonoizmenjivačkom hromatografijom [mPEG2-ru-4K]-[rIL-2] je dat na Sl.6. Eluirani [mPEG2-ru-4K]-[rIL-2] konjugati su pokazali smešu 3-mer, 2-mer i 1-mer [mPEG2-ru-4K]-[rIL-2] konjugati u elucionim frakcijama. Frakcije koje sadrže smešu 3-/2-mer [mPEG2-ru-4K]-[rIL2], kao i frakcije koje sadrže smešu 2-/1-mer [mPEG2-ru-4K]-[rIL2] su udruženi odvojeno, kao što je prikazano na Sl.6.
Primer 7 (referenca)
PEGilacija rIL-2 sa linearnim derivatom mPEG-butiraldehida, 30kDa
[0192]
Linearni derivat mPEG-butiraldehida, 30 kDa („mPEG-butirALD“)
[0193] Reakcije PEGilacije dizajnirane su tako da nakon dodavanja svih reakcionih komponenata i pufera, konačna koncentracija rIL-2 iznosi 2,5 mg/ml. mPEG-ButirALD, 30kDa, čuvan na -20 °C pod argonom, zagreva se na sobnu temperaturu. Količina PEG reagensa jednaka 10 - 50 mol ekvivalenata rIL-2 za PEGilaciju se izmeri i rastvori u 20 mM puferu natrijum fosfata (pH 7,5) i 1 mM EDTA da bi se dobio 12% rastvor reagensa. 12% rastvor PEG reagensa se dodaje alikvotu osnovnog rastvora rIL-2 i meša 15 - 30 minuta. Zatim se dodaje redukciono sredstvo, natrijum cijanoborohidrid (NaCNBH3) pri 10 - 100 molarnom višku u odnosu na PEG reagens i reakcija se meša 5 - 18 sati na sobnoj temperaturi kako bi se osiguralo sprezanje putem sekundarne aminske veze da bi se tako formirao konjugovani rastvor.
[0194] Utvrđeno je da aldehidna grupa mPEG-ButirALD reaguje sa primarnim aminima povezanim sa rIL-2 i kovalentno se vezuje za njih putem sekundarnog amina nakon redukcije redukcionim reagensom kao što je natrijum cijanoborohidrid. Selektivnost za koju se amin(i) vezuju sa polimerom može se modulisati podešavanjem pH uslova konjugacije. Uslovi relativno niskog pH (npr., oko pH od 5,5) usmeriće konjugaciju ka N-terminusu. U relativno neutralnim pH uslovima (npr., oko 7,5 i nešto iznad), kovalentno vezivanje postaje češće na drugim lokacijama (tj., na aminskim bočnim lancima ostataka lizina sadržanih u proteinu). Prilagođavanje pH uslova konjugacije omogućiće određeni stepen kontrole na kojim lokacijama dolazi do konjugacije, a samim tim i bolju sposobnost da se dođe do željenih položajnih izomera.
[0195] Koristeći isti pristup, drugi konjugati su pripremljeni upotrebom mPEG-ButirALD koji imaju druge prosečne molekulske težine.
Primer 8 (referenca)
PEGilacija rIL-2 sa razgranatim derivatom mPEG-butiraldehida, 40kDa
[0196]
Razgranati derivat mPEG-butiraldehida, 40 kDa („mPEG2-butirALD“)
[0197] Reakcije PEGilacije dizajnirane su tako da nakon dodavanja svih reakcionih komponenata i pufera, konačna koncentracija rIL-2 iznosi 2,5 mg/ml. mPEG2-ButirALD, 40kDa, čuvan na -20°C pod argonom, zagreva se na sobnu temperaturu. Količina PEG reagensa jednaka 10 - 50 mol ekvivalenata rIL-2 za PEGilaciju se izmeri i rastvori u 20mM puferu natrijum fosfata (pH 7,5) i 1 mM EDTA da bi se dobio 12% rastvor reagensa.12% rastvor PEG reagensa se dodaje alikvotu osnovnog rastvora rIL-2 i meša 15 - 30 minuta. Zatim se dodaje redukciono sredstvo, natrijum cijanoborohidrid (NaCNBH3) pri 10 - 100 molarnom višku u odnosu na PEG reagens i reakcija se meša 5 - 18 sati na sobnoj temperaturi kako bi se osiguralo sprezanje putem sekundarne aminske veze da bi se tako formirao konjugovani rastvor.
[0198] Utvrđeno je da aldehidna grupa mPEG2-ButirALD reaguje sa primarnim aminima povezanim sa rIL-2 i kovalentno se vezuje za njih putem sekundarnog amina nakon redukcije redukcionim reagensom kao što je natrijum cijanoborohidrid.
[0199] Koristeći isti pristup, drugi konjugati su pripremljeni upotrebom mPEG2-ButirALD koji imaju druge prosečne molekulske težine.
Primer 9 (referenca)
PEGilacija rIL-2 sa
Linearnim derivatom mPEG-sukcinimidil α-metilbutanoata, 30kDa
[0200]
Linearni derivat mPEG-sukcinimidil α-metilbutanoata, 30kDa („mPEG-SMB“)
[0201] Reakcije PEGilacije dizajnirane su tako da nakon dodavanja svih reakcionih komponenata i pufera, konačna koncentracija rIL-2 iznosi 2,5 mg/ml. mPEG-SMB, 30kDa, čuvan na -20 °C pod argonom, zagreva se na sobnu temperaturu. Količina PEG reagensa jednaka 10 - 50 mol ekvivalenata rIL-2 za PEGilaciju se izmeri i rastvori u 20 mM puferu natrijum fosfata (pH 7,5) i 1 mM EDTA da bi se dobio 12% rastvor reagensa.12% rastvor PEG reagensa se dodaje alikvotu osnovnog rastvora rIL-2 i meša 5 - 18 sati na sobnoj temperaturi, čime se dobija konjugovani rastvor. Konjugovani rastvor se gasi rastvorom lizina (pH 7,5) tako da je konačna molarna koncentracija lizina 10 - 100 puta veća od molarne koncentracije PEG reagensa.
[0202] Otkriveno je da mPEG-SMB derivat obezbeđuje sterički ometani aktivni NHS estar, koji selektivno reaguje sa lizinom i terminalnim aminima.
[0203] Koristeći isti pristup, drugi konjugati su pripremljeni upotrebom mPEG-SMB koji imaju druge prosečne molekulske težine.
Primer 10 (referenca)
PEGilacija rIL-2 sa mPEG-PIP, 20kDa
[0204] Osnovna struktura polimernog reagensa data je u nastavku:
[0205] Reakcije PEGilacije dizajnirane su tako da nakon dodavanja svih reakcionih komponenata i pufera, konačna koncentracija rIL-2 iznosi 2,5 mg/ml. mPEG-PIP, 20kDa, čuvan na -20 °C pod argonom, zagreva se na sobnu temperaturu. Količina PEG reagensa jednaka 10 - 50 mol ekvivalenata rIL-2 za PEGilaciju se izmeri i rastvori u 20 mM puferu natrijum fosfata (pH 7,5) i 1 mM EDTA da bi se dobio 12% rastvor reagensa.12% rastvor PEG reagensa se dodaje alikvotu osnovnog rastvora rIL-2 i meša 15 - 30 minuta. Zatim se dodaje redukciono sredstvo, natrijum cijanoborohidrid (NaCNBH3) pri 10 - 100 molarnom višku u odnosu na PEG reagens i reakcija se meša 5 - 18 sati na sobnoj temperaturi kako bi se osiguralo sprezanje putem sekundarne aminske veze (sa sekundarnim ugljenikom) da bi se tako formirao konjugovani rastvor. Konjugovani rastvor se gasi rastvorom lizina (pH 7,5) tako da je konačna molarna koncentracija lizina 10 - 100 puta veća od molarne koncentracije PEG reagensa.
[0206] Utvrđeno je da ketonska grupa mPEG-PIP reaguje sa primarnim aminima povezanim sa rIL-2 i kovalentno se vezuje za njih putem sekundarnog amina nakon redukcije redukcionim reagensom kao što je natrijum cijanoborohidrid.
[0207] Koristeći isti pristup, drugi konjugati su pripremljeni upotrebom mPEG-PIP koji imaju druge prosečne molekulske težine.
Primer 11
Aktivnost uzornih (rIL-2)-PEG konjugata
[0208] Aktivnost aldesleukina (kontrola), [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] iz Primera 2, [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] iz Primera 3, i [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] iz Primera 4 (referenca) su procenjeni u testu proliferacije ćelija primenom CTLL-2 ćelija.
[0209] CTLL-2 ćelije (mišja citotoksična ćelijska linija limfocita T) održavane su u kompletnom RPMI 1640 medijumu, dopunjenom sa 2 mM L-glutamina, 1 mM natrijum piruvata, 10% fetalnog goveđeg seruma i 10% dodatka IL-2 za kulturu (T-STIM™ sa ConA (konkanavalin-A)) na 37°C u atmosferi od 5% CO2. Ćelije su kultivisane u suspenziji sve dok nisu dostigle gustinu ćelija od 2-3 x 10<5>ćelija/mL pre cepanja.
[0210] Za ispitivanje aktivnosti, 3-4 dana nakon poslednjeg razdvajanja, ćelije su isprane tri puta u Dulbekovom rastvoru puferisanom sa fosfatom. Ćelije su zatim suspendovane u dopunjenom medijumu bez T-STIM ™ pri ćelijskoj gustini od ∼2 x 10<5>ćelije/mL i presvučene u mikro-pločice sa belim zidom od 96 udubljenja sa 90 ml/udubljenju.
Eksperimenti su takođe sprovedeni na dopunjenom medijumu (bez T-STIM™) prilagođenom na pH 6,7-7, kako bi se smanjilo oslobađanje konjugata tokom inkubacije. Zatim je dodato 10 µl 10X koncentracija ispitivanog jedinjenja, razblaženog u dopunjenom medijumu bez T-STIM ™. Ćelije su inkubirane na 37°C u atmosferi od 5% CO2tokom 24 sata. Posle 24-časovne inkubacije, u svako udubljenje je dodato 100 µL Promega CellTiter-Glo® reagensa. Pločice su mešane dva minuta na orbitalnom mućkalici, a zatim inkubirane na sobnoj temperaturi deset minuta. Zatim je zabeležena luminiscencija pomoću Perkin Elmerovog instrumenta TopCount® u vremenu integracije od jedne sekunde/udubljenju.
[0211] Za [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] oslobađajući konjugati iz Primera 2 i [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] oslobađajući konjugati iz Primera 3, ispitivana je aktivnost i oslobođenih IL-2 i neobjavljenih konjugata. Test jedinjenja su čuvana pod kiselim uslovima (10 mM natrijum acetatni pufer, pH 4) da bi se stabilizovala konjugacija. Da bi se testirala aktivnost konjugata, uzorak je razblažen iz pufera za skladištenje u dopunjeni medijum ∼ jedan sat pre testa. Da bi se testirala aktivnost oslobođenog IL-2, oslobađajući konjugati {tj., [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] konjugati iz Primera 2 i [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] konjugati iz Primera 3} su razblaženi desetostruko u 100 mM (konačna koncentracija) natrijum bikarbonatnom puferu, pH 9 i prethodno inkubirani na 37°C tokom osam sati pre početka ispitivanja.
[0212] Vrednosti EC50(koncentracija ispitivanog jedinjenja potrebna da pokaže 50% maksimalnog odgovora) za proliferaciju ćelija dobijene su nelinearnom regresionom analizom krivih doza-odgovor, korišćenjem softvera GraphPad Prism 5.01.
[0213] Aktivnosti aldesleukina i konjugata izmerene su pomoću testa proliferacije ćelija, a rezime rezultata prikazan je u Tabeli 4. Svi članci za ispitivanje indukovali su rast ćelija CTLL-2 na način koji zavisi od doze. S obzirom da se oslobađajući konjugati prethodno inkubiraju pod uslovima za prinudno oslobađanje proteina, aldesleukin je takođe prethodno inkubiran kao kontrola za ispitivanje stabilnosti samog proteina u uslovima tretmana sa prinudnim oslobađanjem. Kao što je prikazano u Tabeli 4, aldesleukin je ostao stabilan nakon predinkubacije pod uslovima oslobađanja (8 sati na 37°C, pH 9) i pokazivao je relativnu snagu prema aldesleukinu uskladištenom u preporučenim uslovima. Nakon predinkubacije [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] iz Primera 2 i [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] iz Primera 3 pod uslovima da se indukuje oslobađanje IL-2, aktivnost je vraćena kao što je prikazano na Sl. 8; IL-2 oslobođen iz ovih konjugata pokazao je relativnu snagu u odnosu na kontrolni aldesleukin, dok su neki od neotpuštenih konjugata bili manje moćni u odnosu na aldesleukin. Stabilni 3-mer [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] konjugati pokazuju najmanju snagu (SL. 7) i pokazao 0,04% potencije u odnosu na aldesleukin, ali 1-mer [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] pokazao je ekvivalentnu snagu aldesleukinu s obzirom na poznatu standardnu devijaciju testa.
Tabela 4
1
Primer 12
Farmakokinetici uzornih (rIL-2)-PEG konjugata
[0214] Farmakokinetički profili aldesleukina (kontrola), [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] iz Primera 2, [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] iz Primera 3, i [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] iz Primera 4 (referenca) su procenjeni u ELISA nakon pojedinačne injekcije u miševe.
[0215] Koncentracije aldesleukina su merene heterogenim sendvičem ELISA. Ukratko, mikrotitarske ploče sa 96 udubljenja prevučene su mišjim monoklonskim antitelom na IL-2 i blokirane. Uzorci i standard su pripremljeni u urednoj plazmi, a zatim su razblaženi do 10% plazme puferom koji sadrži biotinilovana zečja poliklonska antitela na IL-2 pre inkubacije na pločama za testiranje. Za otkrivanje IL-2 korišćena je streptavidin-hrenova peroksidaza praćena kolorimetrijskim supstratom, 3, 3', 5, 5'-tetrametilbenzidinom (TMB). Dodat je zaustavni rastvor i očitana je apsorbancija na 450 nm uz oduzimanje pozadine na 650 nm. Standardna kriva je generisana ponderisanim algoritmom sa 4 parametra, a koncentracije uzoraka određene interpolacijom na standardnu krivu. Donja granica kvantitacije bila je 0,05 ng/mL.
[0216] Udruženi 1-mer/2-mer [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] koncentracije su merene homogenim HTRF® testom (Cisbio US, Bedford MA). Reakciona smeša (15 µL, mišjeg monoklonskog antitela konjugovanog sa evropijum hromatom na IL-2, streptavidin-d2 i biotinilovanog zečjeg monoklonskog antitela na PEG) dodata je u bele mikrotitarske ploče sa malim volumenom, sa 384 udubljenja. Dodati su uzorci i standardi (5 uL) razblaženi u urednoj plazmi i ploče inkubirane. Ploče su očitane na fluorescentnom čitaču na 615 i 665 nm, a izračunato je Delta F. Standardna kriva je generisana ponderisanim algoritmom sa 5 parametra, a koncentracije uzoraka određene interpolacijom na standardnu krivu. Donja granica kvantitacije bila je 0,5 ng/mL.
2
[0217] 3-mer [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] i 3-mer [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] izmereni su u ukupnom testu IL-2. Od [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] i [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] konjugati su oslobađajući konjugati, različite vrste molekula će biti prisutne u uzorku što otežava pojedinačnu kvantifikaciju; stoga su izmereni ukupni nivoi IL-2. Komponenta konjugata koja sadrži polimer se silom oslobađa iz konjugata razređivanjem uzoraka i standardnih zaliha, pripremljenih u urednoj plazmi, 1:1 puferom za oslobađanje (100 mM HEPES/100 mM Tris-HCL, pH 9) i inkubacijom na 37°C tokom 30 do 36 sati. Posle inkubacija, dodato je 25% zapremine 0,1M sirćetne kiseline da bi se neutralisao visok pH. Oslobođeni IL-2 je meren pomoću ELISA opisane iznad.
[0218] Sl.9 prikazuje grafik koncentracije i vremena ispitivanih predmeta kod miševa C57BL/6 nakon jedne, intra-mišićne injekcije (1 mg/kg). Uzorci plazme sa heparinizovanim natrijumom sakupljani su za deset minuta i za 1, 6, 24, 48, 72, 96, 120, 168 i 336 sati.
Geomejske koncentracije su izračunate od 3 miša po vremenskoj tački. Kao što je prikazano na Sl.9, aldesleukin je imao kratak 1⁄2 životni vek i nije mogao da se otkrije posle 6 sati (< 0,05 ng/ml), dok su konjugati imali produženi 1⁄2 vek trajanja i dalje su detektovani u 336 sati.
Primer 13
Ispitivanje efikasnosti plućnih metastatskih melanoma
[0219] Da bi se procenila efikasnost jedinjenja sa navodnom IL-2 aktivnošću, metastatski model pluća melanoma je široko korišćen i razvijen je kod miševa C57BL/6. U ovom modelu, miševima se prvo intravenozno daju ćelije melanoma B 16F10, što uzrokuje razvoj čvorova na plućima različitog broja i veličine. Brojevi plućnih čvorova kao i ukupna površina ovih lezija varira u zavisnosti od koncentracije implantiranih ćelija. Zatim se test jedinjenje od interesa daje tretiranoj grupi miševa, a druga grupa miševa ostaje neobrađena da služi kao kontrola. Efikasnost test jedinjenja može se odrediti kao procenat smanjenja broja i veličine plućnih čvorova i ukupne površine lezija za svako plućno krilo između tretirane i nelečene grupe.
[0220] U ovom ispitivanju, injekcijama repne vene ugrađeno je 100000 ćelija B 16F10 (prolaz koji ne prelazi P8). Trećeg dana od datuma implantacije ćelija, primenjena su ispitivana jedinjenja od interesa (ili nosač), kako je naznačeno u tabeli 5, sledeći IP (intraperitonealni) ili IV (intravenski) način primene. Ispitno jedinjenje u grupi E je prema pronalasku.
Tabela 5
[0221] 14. dana od dana implantacije ćelija, miševi su žrtvovani dok su dan-dva izolovali i fiksirali pluća u Bovenovom rastvoru koji je sadržavao formaldehid. Pluća (koja su fiksirana u Bovenovom rastvoru) ispitana su pod stereomikroskopom i određen je broj i veličina lezija za svako plućno krilo.
[0222] Kao što je prikazano na Sl.10, 14. dana od dana implantacije ćelija, miševi su žrtvovani i njihova izolovana pluća su fiksirana u Bovenovom rastvoru. Čvorovi tumora i njihove veličine izbrojani su za svaki od aldesleukina (Prometheus Laboratories Inc., San Diego CA), IL-2 ostatak Primera 1, udruženi 3-mer/4-mer [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2], udruženi 3-mer/4-mer [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] (referenca), i udruženi 1-mer/2-mer [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] (referenca).
Primer 14
4
Subkutana ispitivanja efikasnosti melanoma B16F10
[0223] Da bi se procenila efikasnost jedinjenja koja imaju navodnu aktivnost IL-2, korišćen je visoko robusni model potkožnog melanoma kod sintetičkih miševa, tj., miševa C57BL/6. Ukratko, milion ćelija B16F10 ugrađeno je subkutano za svakog 5-6 nedelja starog miša C57BL/6 u srednjem delu leđa. Tumorima je omogućeno da narastu do opipljive veličine, tj., 70-120 cu mm pre nasumičnog postavljanja i dodeljivanja grupa, kao što je prikazano u Tabeli 6. Miševima su davana test jedinjenja, tj., aldesleukin (Prometheus Laboratories Inc., San Diego CA), rIL-2-polimerni konjugati ili nosač u različitim koncentracijama doze i režimima doziranja. Telesne mase i zapremine tumora merene su svakog alternativnog dana. Krajnja tačka ovog ispitivanja je vreme da se dostigne srednji volumen tumora od 1500 cu mm za datu grupu ili 45 dana koji god da je ranije.
Tabela 6
[0224] Krive doze-odgovora za inhibiciju rasta tumora nakon primene aldesleukina (Prometheus Laboratories Inc.) i rIL-2-polimernih konjugata u različitim šemama primene date su na sl.
11A i Sl.11A i Sl.11B. Ovi rezultati ukazuju da su testirani rIL-2-polimerni konjugati dokazali bolju efikasnost u jednoj dozi u odnosu na aldesleukin (Prometheus Laboratories Inc.), koja je dozirana po 3 mg/kg dva puta dnevno tokom pet dana.
[0225] Sl.11A prikazuje vreme do napredovanja tumora nakon primene jedne doze rIL-2-polimernih konjugata da bi se postigla srednja zapremina tumora od 1500 mm<3>. Utvrđeno je da kašnjenje rasta tumora (TGD) iz krivih napredovanja tumora iznosi 4,6, odnosno 6,2 dana za udruženi 3-mer/4-mer [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] pri koncentracijama doze od 2 mg/kg i 4 mg/kg. Za objedinjene 3-mer/4-mer [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2], utvrđeno je da TGD iznosi 6,4, odnosno 7,6 dana, pri koncentraciji doze od 2 mg/kg i 4 mg/kg.
[0226] Sl.11B prikazuje vreme do napredovanja tumora nakon davanja jedne doze rIL-2-polimernih konjugata da bi se postigla srednja zapremina tumora od 1500 mm<3>. Utvrđeno je da TGD iz krivih progresije tumora iznosi 3,6, odnosno 4,6 dana za udruženi 1-mer/2-mer [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] pri koncentracijama doze od 6 mg/kg i 8 mg/kg. Za udruženi 1-mer/2-mer [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] (referenca), utvrđeno je da je TGD 3,8 pri 2 mg/kg, dok je utvrđeno da je koncentracija doze od 4 mg/kg toksična po prirodi. Utvrđeno je da TGD iz krivih progresije tumora iznosi 2,2, odnosno 3,6 dana za udruženi 1-mer/2-mer [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] pri koncentracijama doze od 2 mg/kg i 4 mg/kg.
[0227] Ukratko, efikasnost i u modelu metastaziranja lezija pluća (Primer 13) i u modelu potkožnog melanoma miša (Primer 14) postignuta je sa konjugatima rIL-2 polimera pri znatno nižoj učestalosti doziranja i nižoj ukupnoj količini proteina u poređenju sa aldesleukinom (Prometheus Laboratories Inc.).
SEQ ID NO:1
SEQ ID NO:2

Claims (15)

  1. Patentni zahtevi 1. Konjugat koji sadrži jedan, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam ili osam rastvorljivih poli(etilen glikol) polimera razgranatih u vodi, kovalentno vezanih preko deljive karbamatske veze na amino grupu interleukin-2 dela, svaki razgranati poli(etilen glikol) rastvorljiv u vodi, koji ima ukupnu prosečnu molekulsku masu u opsegu od 500 Daltona do 100000 Daltona, pri čemu se po oslobađanju razgranati u vodi rastvorljivi poli(etilen glikol) polimer odvaja od interleukin-2 dela in vivo ne ostavljajući fragment vezan za deo interleukin-2, konjugat koji ima formulu
    gde je POLY<1>prvi poli(etilen glikol); POLY<2>je drugi poli(etilen glikol); X<1>je prvi razdelnički deo; X<2>je drugi razdelnički deo; Hα je atom vodonika koji se jonizuje; R<1>je H ili organski radikal; R<2>je H ili organski radikal; (a) je ili nula ili jedan; (b) je ili nula ili jedan; R<e1>, kada je prisutna, je prva grupa koja menja elektrone; R<e2>, kada je prisutna, je druga grupa koja menja elektrone; Y<1>je O; Y<2>je O; n je ceo broj od 1-8; i (IL-2) je interleukin-2 deo koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3 ili koji ima 95% ili veću identičnost sekvence sa SEQ ID NO:3.
  2. 2. Konjugat prema patentnom zahtevu 1, gde su POLY<1>i POLY<2>na kraju završno zatvoreni alkoksi krajnjim poklopcem.
  3. 3. Konjugat prema patentnom zahtevu 2, gde je alkoksi ostatak koji pokriva kraj C1-6alkoksi grupe.
  4. 4. Konjugat prema patentnom zahtevu 1, gde svaki razgranati, u vodi rastvorljivi poli(etilen glikol) polimer ima prosečnu molekulsku masu u opsegu od 20000 Daltona do 85000 Daltona.
  5. 5. Konjugat prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, gde su jedan, dva, tri ili četiri razgranata, u vodi rastvorljiva poli(etilen glikol) polimera kovalentno vezana za interleukin-2 deo.
  6. 6. Farmaceutski sastav koji sadrži konjugat prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5 i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.
  7. 7. Farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 6 za upotrebu u terapiji.
  8. 8. Postupak za dobijanje konjugata interleukin-2, postupak koji uključuje kontakt, pod uslovima konjugacije, interleukin-2 dela koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3 ili koji ima 95% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO:3 i sadrži amino grupe dostupne za kovalentno vezivanje za polimer, sa razgranatim, u vodi rastvorljivim poli(etilen glikol) polimeru aktiviranim sukcinimidil estrom formule,
    gde je POLY<1>prvi poli(etilen glikol); POLY<2>je drugi poli(etilen glikol); X<1>je prvi razdelnički deo; X<2>je drugi razdelnički deo; Hαje atom vodonika koji se jonizuje; R<1>je H ili organski radikal; R<2>je H ili organski radikal; (a) je ili nula ili jedan; (b) je ili nula ili jedan; R<e1>, kada je prisutan, je prva grupa koja menja elektrone; R<e2>, kada je prisutna, je druga grupa za promenu elektrona, a (FG) je sukcinimidil estar, efikasan da formira oslobađajuću vezu karbamata kada je kovalentno vezan za amino grupu interleukin-2 dela, pri čemu navedeni uslovi konjugacije sadrže vodeni medijum koji ima pH od 7 do 9,0.
  9. 9. Konjugat prema patentnom zahtevu 1, gde svaki razgranati, u vodi rastvorljivi poli(etilen glikol) polimer ima prosečnu molekulsku masu od oko 20000 Daltona.
  10. 10. Sastav koji sadrži smešu konjugata prema patentnom zahtevu 1.
  11. 11. Farmaceutski sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 7, gde sastav poseduje malu ili nikakvu aktivnost interleukina-2.
  12. 12. Farmaceutski sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 7, gde je sastav za lečenje stanja izabranog iz grupe koji se sastoji od karcinoma bubrežnih ćelija, metastatskog melanoma, virusa hepatitisa C (HCV), virusa humane imunodeficijencije (HIV), akutne mijeloidne leukemije , ne-Hodgkinov limfom, kožni limfom T-ćelija, juvenilni reumatoidni artritis, atopijski dermatitis, rak dojke i rak bešike.
  13. 13. Farmaceutski sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 7 u obliku pogodnom za parenteralno davanje.
  14. 14. Sastav prema patentnom zahtevu 10, gde konjugati sadržani u smeši imaju četiri, pet, šest, sedam ili osam razgranatih, u vodi rastvorljivih poli(etilen glikol) polimera kovalentno vezanih za interleukin-2 deo.
  15. 15. Sastav prema patentnom zahtevu 10, gde konjugati koji se nalaze u sastavu imaju u proseku od jednog, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam ili osam razgranatih, u vodi rastvorljivih poli(etilen glikol) polimera po delu interleukina-2.
RS20210612A 2010-11-12 2011-11-11 Konjugati il-2 dela i polimera RS61854B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US41323610P 2010-11-12 2010-11-12
EP11840401.1A EP2637694B1 (en) 2010-11-12 2011-11-11 Conjugates of an il-2 moiety and a polymer
PCT/US2011/060408 WO2012065086A1 (en) 2010-11-12 2011-11-11 Conjugates of an il-2 moiety and a polymer

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS61854B1 true RS61854B1 (sr) 2021-06-30

Family

ID=46051324

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210612A RS61854B1 (sr) 2010-11-12 2011-11-11 Konjugati il-2 dela i polimera

Country Status (22)

Country Link
US (6) US9861705B2 (sr)
EP (2) EP2637694B1 (sr)
JP (7) JP2014506116A (sr)
KR (5) KR20200070407A (sr)
CN (2) CN110812488A (sr)
AU (7) AU2011325990C1 (sr)
CA (1) CA2816722C (sr)
CY (1) CY1124659T1 (sr)
DK (1) DK2637694T3 (sr)
EA (2) EA202092025A1 (sr)
ES (1) ES2866674T3 (sr)
HR (1) HRP20210642T1 (sr)
HU (1) HUE054318T2 (sr)
IL (2) IL226267B (sr)
LT (1) LT2637694T (sr)
MX (2) MX358399B (sr)
PL (1) PL2637694T3 (sr)
PT (1) PT2637694T (sr)
RS (1) RS61854B1 (sr)
SI (1) SI2637694T1 (sr)
SM (1) SMT202100314T1 (sr)
WO (1) WO2012065086A1 (sr)

Families Citing this family (192)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200070407A (ko) 2010-11-12 2020-06-17 넥타르 테라퓨틱스 Ｉｌ-2 부분 및 중합체의 접합체
BR102013017626A2 (pt) * 2013-06-14 2015-02-10 Univ Rio De Janeiro Bioconjugados não aglomerantes de amilinomiméticos com polietilenoglicol, uso de bioconjugados não aglomerantes de amilinomiméticos com polietilenoglicol, composições farmacêuticas de baixa toxicidade, adjuvante para a prevenção ou tratamento das doenças, medicamento, método de tratamento ou prevenção de doenças.
HRP20200250T1 (hr) 2013-08-08 2020-05-29 The Scripps Research Institute Metoda site-specifično enzimsko obilježavanje nukleinskih kiselina in vitro ugradnjom neprirodnih nukleotida
EP3834838A1 (en) * 2014-02-21 2021-06-16 Nektar Therapeutics (India) Pvt. Ltd. Il-2rbeta-selective agonists in combination with an anti-pd-1 antibody
MA39711A (fr) * 2014-04-03 2015-10-08 Nektar Therapeutics Conjugués d'une fraction d'il-15 et d'un polymère
TWI638047B (zh) 2014-04-09 2018-10-11 史基普研究協會 藉由核酸三磷酸酯轉運子將非天然或經修飾的核苷三磷酸酯輸入至細胞中
ES2980788T3 (es) 2014-04-10 2024-10-03 H Lee Moffitt Cancer Ct & Res Expansión mejorada de linfocitos infiltrantes de tumores para terapia celular adoptiva
EP3482766B1 (en) 2014-08-11 2020-05-20 Delinia, Inc. Modified il-2 variants that selectively activate regulatory t cells for the treatment of autoimmune diseases
JP2018510863A (ja) * 2015-03-11 2018-04-19 ネクター セラピューティクス Ｉｌ−７部分とポリマーとのコンジュゲート
MA47290A (fr) * 2015-10-08 2019-11-27 Nektar Therapeutics Combinaison d'un agoniste sélectif de l'il-2rbeta et d'un agoniste de l'il-15 à action prolongée
US11761007B2 (en) 2015-12-18 2023-09-19 The Scripps Research Institute Production of unnatural nucleotides using a CRISPR/Cas9 system
US20170204154A1 (en) 2016-01-20 2017-07-20 Delinia, Inc. Molecules that selectively activate regulatory t cells for the treatment of autoimmune diseases
US20190218257A1 (en) 2016-06-24 2019-07-18 The Scripps Research Institute Novel nucleoside triphosphate transporter and uses thereof
ES3000676T3 (en) 2016-07-07 2025-03-03 Iovance Biotherapeutics Inc Programmed death 1 ligand 1 (pd-l1) binding proteins and methods of use thereof
AU2017335771A1 (en) 2016-09-28 2019-02-28 Musc Foundation For Research Development Antibodies that bind interleukin-2 and uses thereof
MX2019004707A (es) 2016-10-26 2019-08-12 Iovance Biotherapeutics Inc Reestimulacion de linfocitos infiltrantes de tumor crioconservados.
TWI788307B (zh) 2016-10-31 2023-01-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞之工程化人造抗原呈現細胞
WO2018089420A1 (en) 2016-11-08 2018-05-17 Delinia, Inc. Il-2 variants for the treatment of autoimmune diseases
EP3538130A4 (en) * 2016-11-10 2020-06-03 Nektar Therapeutics IMMUNOTHERAPEUTIC TUMOR TREATMENT PROCEDURE
US11401507B2 (en) 2016-11-17 2022-08-02 Iovance Biotherapeutics, Inc. Remnant tumor infiltrating lymphocytes and methods of preparing and using the same
WO2018129336A1 (en) 2017-01-06 2018-07-12 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tumor infiltrating lymphocytes with potassium channel agonists and therapeutic uses thereof
AU2018205234B2 (en) 2017-01-06 2024-09-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tumor infiltrating lymphocytes (TILs) with tumor necrosis factor receptor superfamily (TNFRSF) agonists and therapeutic combinations of TILs and TNFRSF agonists
WO2018132496A1 (en) 2017-01-10 2018-07-19 Nektar Therapeutics Multi-arm polymer conjugates of tlr agonist compounds and related immunotherapeutic treatment methods
JP2020509018A (ja) * 2017-03-01 2020-03-26 ネクター セラピューティクス 養子細胞移植療法と併せてインターロイキン−２受容体α，β−選択的作動薬を用いる免疫療法的治療方法
JP7165717B2 (ja) 2017-03-15 2022-11-04 パンディオン・オペレーションズ・インコーポレイテッド 標的免疫寛容
US11254913B1 (en) 2017-03-29 2022-02-22 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
JOP20190224A1 (ar) 2017-03-29 2019-09-26 Iovance Biotherapeutics Inc عمليات من أجل إنتاج الخلايا اللمفاوية المرتشحة للأورام واستخداماتها في العلاج المناعي
TWI788340B (zh) 2017-04-07 2023-01-01 美商必治妥美雅史谷比公司 抗icos促效劑抗體及其用途
WO2018204528A1 (en) 2017-05-02 2018-11-08 Nektar Therapeutics Immunotherapeutic tumor treatment method
MX2019013202A (es) 2017-05-10 2020-01-21 Iovance Biotherapeutics Inc Expansion de linfocitos de infiltracion de tumor a partir de tumores liquidos y usos terapeuticos de los mismos.
US12036283B2 (en) 2017-05-15 2024-07-16 Nektar Therapeutics Long-acting interleukin-15 receptor agonists and related immunotherapeutic compositions and methods
US10676516B2 (en) 2017-05-24 2020-06-09 Pandion Therapeutics, Inc. Targeted immunotolerance
TW201919662A (zh) 2017-06-05 2019-06-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 對雙重難治性黑色素瘤使用腫瘤浸潤性淋巴細胞之方法
MA49578A (fr) 2017-07-11 2021-04-07 Synthorx Inc Incorporation de nucléotides non naturels et procédés associés
WO2019014262A1 (en) 2017-07-11 2019-01-17 The Scripps Research Institute INCORPORATION OF NON-NATURAL NUCLEOTIDES AND METHODS OF IN VIVO USE THEREOF
IL322312A (en) 2017-08-03 2025-09-01 Synthorx Inc Cytokine conjugates for the treatment of infectious diseases and cell proliferation
WO2019036031A2 (en) 2017-08-17 2019-02-21 Nektar Therapeutics IMMUNOTHERAPEUTIC METHOD FOR TUMOR TREATMENT
WO2019036855A1 (en) 2017-08-21 2019-02-28 Adagene Inc. Anti-cd137 molecules and use thereof
US20210292415A1 (en) 2017-11-06 2021-09-23 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating a tumor
CN111670051B (zh) * 2017-11-08 2024-06-25 亚飞（上海）生物医药科技有限公司 生物分子偶联物及其用途
BR112020009663A2 (pt) 2017-11-17 2020-11-10 Iovance Biotherapeutics, Inc. método para a expansão de linfócitos infiltrantes de tumor (tils) em uma população terapêutica de tils, método para o tratamento de um indivíduo com câncer, composição
PH12020550661A1 (en) * 2017-11-21 2021-04-19 Univ Leland Stanford Junior Partial agonists of interleukin-2
CA3083118A1 (en) 2017-11-22 2019-05-31 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of peripheral blood lymphocytes (pbls) from peripheral blood
US10946068B2 (en) 2017-12-06 2021-03-16 Pandion Operations, Inc. IL-2 muteins and uses thereof
US10174092B1 (en) 2017-12-06 2019-01-08 Pandion Therapeutics, Inc. IL-2 muteins
USRE50550E1 (en) 2017-12-06 2025-08-26 Pandion Operations, Inc. IL-2 muteins and uses thereof
US20210369775A1 (en) 2017-12-15 2021-12-02 Iovance Biotherapeutics, Inc. Systems and methods for determining the beneficial administration of tumor infiltrating lymphocytes, and methods of use thereof and beneficial administration of tumor infiltrating lymphocytes, and methods of use thereof
WO2019131964A1 (ja) * 2017-12-27 2019-07-04 協和発酵キリン株式会社 Ｉｌ－２改変体
EP3732187A4 (en) 2017-12-29 2021-11-10 The Scripps Research Institute INNATURAL BASE PAIR COMPOSITIONS AND METHODS OF USE
WO2019136459A1 (en) 2018-01-08 2019-07-11 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating til products enriched for tumor antigen-specific t-cells
SG11202006541UA (en) 2018-01-08 2020-08-28 Iovance Biotherapeutics Inc Processes for generating til products enriched for tumor antigen-specific t-cells
US11713446B2 (en) 2018-01-08 2023-08-01 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating TIL products enriched for tumor antigen-specific T-cells
WO2019148445A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Precision/context-dependent activatable antibodies, and methods of making and using the same
JP2021512962A (ja) 2018-02-13 2021-05-20 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド アデノシンａ２ａ受容体アンタゴニストによる腫瘍浸潤性リンパ球（ｔｉｌ）の拡大培養並びにｔｉｌ及びアデノシンａ２ａ受容体アンタゴニストの治療的組み合わせ
EP3752178A1 (en) 2018-02-16 2020-12-23 Iltoo Pharma Use of interleukin 2 for treating sjögren's syndrome
CA3115461A1 (en) 2018-03-09 2019-09-12 AskGene Pharma, Inc. Novel cytokine prodrugs
US11242393B2 (en) 2018-03-23 2022-02-08 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against MICA and/or MICB and uses thereof
JP7490563B2 (ja) 2018-03-28 2024-05-27 アセンディス ファーマ オンコロジー ディヴィジョン エー／エス Ｉｌ－２コンジュゲート
ES2982509T3 (es) 2018-03-29 2024-10-16 Iovance Biotherapeutics Inc Procedimientos para la preparación de linfocitos infiltrantes de tumor y usos de los mismos en inmunoterapia
MA52533A (fr) 2018-04-27 2021-03-03 Iovance Biotherapeutics Inc Procédé en circuit fermé pour l'amplification et l'edition de gènes de lymphocytes d'infiltration des tumeurs et leurs utilisations en immunothérapie
US12473532B2 (en) 2018-05-10 2025-11-18 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
WO2019222294A1 (en) 2018-05-14 2019-11-21 Werewolf Therapeutics, Inc. Activatable cytokine polypeptides and methods of use thereof
CN113840832A (zh) 2018-05-14 2021-12-24 狼人治疗公司 可活化白介素-2多肽及其使用方法
CN112399859B (zh) * 2018-05-21 2024-11-29 尼克塔治疗公司 选择性TREG刺激剂RUR20kD-IL-2和相关组合物
WO2020007937A1 (en) 2018-07-03 2020-01-09 Iltoo Pharma Use of interleukin-2 for treating systemic sclerosis
CN112534052B (zh) 2018-07-25 2024-09-20 奥美药业有限公司 全新il-21前药及使用方法
EP3833679A1 (en) 2018-08-06 2021-06-16 Medikine, Inc. Il-2 receptor binding compounds
ES3030707T3 (en) 2018-08-13 2025-07-01 Iltoo Pharma Combination of interleukin-2 with an interleukin 1 inhibitor, conjugates and therapeutic uses thereof
TW202031273A (zh) 2018-08-31 2020-09-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 抗ｐｄ－１抗體難治療性之非小細胞肺癌（ｎｓｃｌｃ）病患的治療
SG11202102427XA (en) 2018-09-11 2021-04-29 Ambrx Inc Interleukin-2 polypeptide conjugates and their uses
AU2019342749B2 (en) 2018-09-20 2025-07-10 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tils from cryopreserved tumor samples
CA3118634A1 (en) 2018-11-05 2020-05-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients refractory for anti-pd-1 antibody
JP2022506508A (ja) 2018-11-05 2022-01-17 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド Ａｋｔ経路阻害剤を利用したｔｉｌの拡大培養
BR112021008266A2 (pt) 2018-11-05 2022-01-04 Iovance Biotherapeutics Inc Métodos para expandir linfócitos infiltrantes de tumor em uma população terapêutica de linfócitos infiltrantes de tumor e para tratar um sujeito com câncer, e, população terapêutica de linfócitos infiltrantes de tumor
EP3876940A1 (en) 2018-11-05 2021-09-15 Pfizer Inc. Combinations for treating cancer
KR20210091213A (ko) 2018-11-05 2021-07-21 이오반스 바이오테라퓨틱스, 인크. 종양 침윤 림프구의 생성 방법 및 면역치료법에서 이의 용도
JP2022509917A (ja) 2018-11-05 2022-01-25 ファイザー・インク がんを処置するための組合せ
MA54195A (fr) 2018-11-08 2022-02-16 Synthorx Inc Conjugués d'interleukine 10 et leurs utilisations
JP7520003B2 (ja) 2018-11-16 2024-07-22 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 抗ｎｋｇ２ａ抗体およびその使用
EP3898949A1 (en) 2018-12-19 2021-10-27 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of expanding tumor infiltrating lymphocytes using engineered cytokine receptor pairs and uses thereof
CA3127689A1 (en) * 2019-02-06 2020-08-13 Synthorx, Inc. Il-2 conjugates and methods of use thereof
WO2020180733A1 (en) 2019-03-01 2020-09-10 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tumor infiltrating lymphocytes from liquid tumors and therapeutic uses thereof
WO2020232029A1 (en) 2019-05-13 2020-11-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods and compositions for selecting tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy
SG11202112541RA (en) 2019-05-14 2021-12-30 Werewolf Therapeutics Inc Separation moieties and methods and use thereof
CN114679909A (zh) 2019-05-20 2022-06-28 潘迪恩运营公司 MAdCAM靶向的免疫耐受
CA3136241A1 (en) 2019-05-20 2020-11-26 Ulrich Moebius Il-2/il-15r.beta.y agonist dosing regimens for treating cancer or infectious diseases
WO2020247598A1 (en) * 2019-06-05 2020-12-10 Emory University Photolysis to unlock caged protein therapeutics
US11845801B2 (en) 2019-06-12 2023-12-19 AskGene Pharma, Inc. IL-15 prodrugs and methods of use thereof
TW202544247A (zh) 2019-06-14 2025-11-16 美商史基普研究協會 於半合成生物體中複製、轉錄及轉譯之試劑及方法
GB201911066D0 (en) 2019-08-02 2019-09-18 Achilles Therapeutics Ltd T cell therapy
CA3148135A1 (en) 2019-08-23 2021-03-04 Carolina E. CAFFARO Il-15 conjugates and uses thereof
CN114746122A (zh) * 2019-09-10 2022-07-12 新索思股份有限公司 Il-2缀合物和治疗自身免疫性疾病的使用方法
EP4034551A1 (en) 2019-09-28 2022-08-03 AskGene Pharma, Inc. Cytokine prodrugs and dual-prodrugs
WO2021081378A1 (en) 2019-10-25 2021-04-29 Iovance Biotherapeutics, Inc. Gene editing of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
JP7427286B2 (ja) 2019-11-05 2024-02-05 メディカイン、インコーポレイテッド ＩＬ－２ＲβγＣ結合化合物
MX2022005404A (es) 2019-11-05 2022-09-09 Medikine Inc Compuestos de fijación a il-2r e il-7r dual.
JP2023503258A (ja) 2019-11-14 2023-01-27 ウェアウルフ セラピューティクス， インコーポレイテッド 活性化可能サイトカインポリペプチド及びその使用方法
WO2021118990A1 (en) 2019-12-11 2021-06-17 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for the production of tumor infiltrating lymphocytes (tils) and methods of using the same
CN115244173A (zh) 2019-12-20 2022-10-25 英研生物(英国)有限公司 用于分离肿瘤浸润淋巴细胞的装置及方法及其用途
KR20220140514A (ko) 2020-01-10 2022-10-18 브라이트 피크 테라퓨틱스 아게 변형된 il-2 폴리펩타이드 및 그의 용도
WO2021146487A2 (en) 2020-01-14 2021-07-22 Synthekine, Inc. Il2 orthologs and methods of use
CN115362168A (zh) 2020-01-14 2022-11-18 辛德凯因股份有限公司 偏向化il2突变蛋白方法和组合物
US20230102464A1 (en) * 2020-01-15 2023-03-30 Jenkem Technology Co., Ltd. (Tianjin) Method for preparing pegylated biomolecule with controllable binding sites
CN113121670B (zh) * 2020-01-15 2022-11-22 天津键凯科技有限公司 二取代peg化白细胞介素2及其制备方法、应用
WO2021158619A1 (en) 2020-02-03 2021-08-12 Medikine, Inc. IL-7Rα BINDING COMPOUNDS
MX2022009390A (es) 2020-02-03 2022-11-16 Medikine Inc Compuestos de unión a il-7r¿¿c.
US11981715B2 (en) 2020-02-21 2024-05-14 Pandion Operations, Inc. Tissue targeted immunotolerance with a CD39 effector
TWI839476B (zh) * 2020-02-26 2024-04-21 大陸商北京泰德製藥股份有限公司 介白素-2多肽共軛物及其用途
WO2021202923A1 (en) 2020-04-02 2021-10-07 Nektar Therapeutics Immunomodulator for the prevention and treatment of coronovirus infection and other conditions
CA3176515A1 (en) 2020-04-22 2021-10-28 Merck Sharp & Dohme Llc Human interleukin-2 conjugates biased for the interleukin-2 receptor beta gammac dimer and conjugated to a nonpeptidic, water-soluble polymer
US12159700B2 (en) 2020-04-22 2024-12-03 Iovance Biotherapeutics, Inc. Systems and methods for coordinating manufacturing of cells for patient-specific immunotherapy
CN111499746B (zh) * 2020-04-28 2020-11-24 优睿赛思(武汉)生物科技有限公司 一种针对人白介素-2的高亲和力兔单克隆抗体及其应用
CN115461062A (zh) 2020-04-28 2022-12-09 阿基里斯治疗英国有限公司 T细胞疗法
WO2021226061A1 (en) 2020-05-04 2021-11-11 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy
US20230293685A1 (en) 2020-05-04 2023-09-21 Iovance Biotherapeutics, Inc. Selection of improved tumor reactive t-cells
MX2022014082A (es) 2020-06-03 2022-12-07 Ascendis Pharma Oncology Div A/S Secuencias de interleucina (il-2) y usos de las mismas.
US20230372397A1 (en) 2020-10-06 2023-11-23 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
WO2022076606A1 (en) 2020-10-06 2022-04-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
US20230398185A1 (en) 2020-10-26 2023-12-14 Cytune Pharma Il-2/il-15r-beta-gamma agonist for treating non-melanoma skin cancer
IL302321B2 (en) 2020-10-26 2025-09-01 Cytune Pharma IL-2/IL-15RβY agonist for the treatment of squamous cell carcinoma
WO2022125941A1 (en) 2020-12-11 2022-06-16 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with braf inhibitors and/or mek inhibitors
CA3202483A1 (en) 2020-12-17 2022-06-23 Maria Fardis Treatment with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with ctla-4 and pd-1 inhibitors
US20240123067A1 (en) 2020-12-17 2024-04-18 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancers with tumor infiltrating lymphocyte therapies
AU2021400069A1 (en) 2020-12-18 2023-07-06 Instil Bio (Uk) Limited Processing of tumor infiltrating lymphocytes
WO2022130016A1 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Instil Bio (Uk) Limited Tumor infiltrating lymphocytes and anti-cd47 therapeutics
AU2021404204A1 (en) 2020-12-18 2023-07-06 Instil Bio (Uk) Limited Processing of tumor infiltrating lymphocytes
MX2023007734A (es) 2020-12-28 2023-08-21 Bristol Myers Squibb Co Composiciones de anticuerpos y metodos de uso de las mismas.
MX2023007650A (es) 2020-12-28 2023-09-11 Bristol Myers Squibb Co Metodos de tratamiento de tumores.
TW202242085A (zh) 2020-12-31 2022-11-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 供自動生產腫瘤浸潤淋巴球的裝置和方法
CA3206549A1 (en) 2021-01-29 2022-08-04 Frederick G. Vogt Methods of making modified tumor infiltrating lymphocytes and their use in adoptive cell therapy
EP4288140A1 (en) 2021-02-05 2023-12-13 Iovance Biotherapeutics, Inc. Adjuvant therapy for cancer
CN117279506A (zh) 2021-03-05 2023-12-22 艾欧凡斯生物治疗公司 肿瘤储存及细胞培养组合物
JP2024510505A (ja) 2021-03-19 2024-03-07 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド Ｃｄ３９／ｃｄ６９選択に関連した腫瘍浸潤リンパ球（ｔｉｌ）拡張及びｔｉｌにおける遺伝子ノックアウトのための方法
WO2022204155A1 (en) 2021-03-23 2022-09-29 Iovance Biotherapeutics, Inc. Cish gene editing of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
IL306072A (en) 2021-03-25 2023-11-01 Iovance Biotherapeutics Inc Methods and preparations for T-cell coculture potency assays and use with cellular therapy products
TW202304517A (zh) * 2021-03-29 2023-02-01 大陸商北京軒義醫藥科技有限公司 蛋白—大分子綴合物及其使用方法
JP2024514530A (ja) 2021-04-02 2024-04-02 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 切断型ｃｄｃｐ１に対する抗体およびその使用
EP4326287A2 (en) 2021-04-19 2024-02-28 Iovance Biotherapeutics, Inc. Chimeric costimulatory receptors, chemokine receptors, and the use of same in cellular immunotherapies
JP2024519029A (ja) 2021-05-17 2024-05-08 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド Ｐｄ－１遺伝子編集された腫瘍浸潤リンパ球及び免疫療法におけるその使用
EP4352087A4 (en) * 2021-06-08 2025-05-14 Merck Sharp & Dohme LLC FUNCTIONAL CELL-BASED BIOLOGICAL ACTIVITY ASSAY FOR MEASURING THE BIOLOGICAL ACTIVITY OF INTERLEUKIN 2 (IL-2) ANALOGUES
WO2022269250A1 (en) 2021-06-22 2022-12-29 Achilles Therapeutics Uk Limited A method for producing antigen-specific t cells
AU2022306788A1 (en) 2021-07-09 2024-01-04 Bright Peak Therapeutics Ag Conjugates of checkpoint inhibitors with il-2, and uses thereof
CA3224147A1 (en) 2021-07-09 2023-01-12 Vijaya Raghavan PATTABIRAMAN Antibody conjugates and manufacture thereof
US20230201365A1 (en) 2021-07-09 2023-06-29 Bright Peak Therapeutics Ag Modified cd20 antibodies and uses thereof
WO2023281484A1 (en) 2021-07-09 2023-01-12 Bright Peak Therapeutics Ag Synthetic il-7 and il-7 immunocytokines
JP2024526898A (ja) 2021-07-22 2024-07-19 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 固形腫瘍断片の凍結保存のための方法
CA3226942A1 (en) 2021-07-28 2023-02-02 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with kras inhibitors
AU2022325498A1 (en) 2021-08-13 2024-02-01 Cytune Pharma Il-2/il-15rbetagamma agonist combination with antibody-drug conjugates for treating cancer
WO2023039488A1 (en) 2021-09-09 2023-03-16 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating til products using pd-1 talen knockdown
JP2024534581A (ja) 2021-09-24 2024-09-20 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 腫瘍浸潤リンパ球のための拡張プロセス及び薬剤
EP4423755A2 (en) 2021-10-27 2024-09-04 Iovance Biotherapeutics, Inc. Systems and methods for coordinating manufacturing of cells for patient-specific immunotherapy
AU2022388729A1 (en) 2021-11-10 2024-05-16 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of expansion treatment utilizing cd8 tumor infiltrating lymphocytes
MX2024007345A (es) 2021-12-14 2024-09-30 Nektar Therapeutics Pautas posologicas para el estimulador de treg selectivo rur20kd-il-2 y composiciones relacionadas.
US20250082777A1 (en) 2022-01-10 2025-03-13 Sana Biotechnology, Inc. Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
JP2025504908A (ja) 2022-01-28 2025-02-19 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド サイトカイン関連腫瘍浸潤リンパ球組成物及び方法
WO2023147486A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 Iovance Biotherapeutics, Inc. Tumor infiltrating lymphocytes engineered to express payloads
WO2023150562A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 Alaunos Therapeutics, Inc. Methods for activation and expansion of t cells
US20250154217A1 (en) * 2022-02-18 2025-05-15 Zonhon Biopharma Institute, Inc. Method for realizing controlled release and sustained release of activity of bioactive molecules and use for drugs
US20240132563A1 (en) 2022-02-23 2024-04-25 Bright Peak Therapeutics Ag Bifunctional cytokine compositions
WO2023193015A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Sana Biotechnology, Inc. Cytokine receptor agonist and viral vector combination therapies
EP4504220A1 (en) 2022-04-06 2025-02-12 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
US11999771B2 (en) 2022-04-07 2024-06-04 Medikine, Inc. IL-7Rαγc ligand immunoglobulin fusion proteins
EP4507704A1 (en) 2022-04-15 2025-02-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Til expansion processes using specific cytokine combinations and/or akti treatment
EP4512845A1 (en) 2022-04-22 2025-02-26 NOF Corporation Acetal-type releasable polyoxyethylene derivative, production method thereof and acetal-type releasable polyoxyethylene conjugate
EP4522202A1 (en) 2022-05-10 2025-03-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with an il-15r agonist
CA3258064A1 (en) 2022-06-02 2023-12-07 Bristol-Myers Squibb Company ANTIBODY COMPOSITIONS AND THEIR METHODS OF USE
EP4551681A1 (en) 2022-07-06 2025-05-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Devices and processes for automated production of tumor infiltrating lymphocytes
AU2023308064A1 (en) 2022-07-11 2025-02-27 Genuv Inc. Cytokine fusion protein
EP4565683A1 (en) 2022-08-01 2025-06-11 Iovance Biotherapeutics, Inc. Chimeric costimulatory receptors, chemokine receptors, and the use of same in cellular immunotherapies
WO2024055018A1 (en) 2022-09-09 2024-03-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating til products using pd-1/tigit talen double knockdown
EP4583889A1 (en) 2022-09-09 2025-07-16 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating til products using pd-1/tigit talen double knockdown
IL319435A (en) 2022-09-12 2025-05-01 Inserm Institut National De La Sant? Et De La Rech M?Dicale Interleukin-2 for use in the treatment of autism spectrum disorder
WO2024098024A1 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tumor infiltrating lymphocytes from liquid tumors and therapeutic uses thereof
WO2024098027A1 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods for tumor infiltrating lymphocyte (til) expansion related to cd39/cd103 selection
EP4623072A2 (en) 2022-11-21 2025-10-01 Iovance Biotherapeutics, Inc. Two-dimensional processes for the expansion of tumor infiltrating lymphocytes and therapies therefrom
WO2024118836A1 (en) 2022-11-30 2024-06-06 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes with shortened rep step
WO2024119193A2 (en) 2022-12-02 2024-06-06 AskGene Pharma, Inc. Mutant il-2 polypeptides and il-2 prodrugs
WO2024150175A1 (en) 2023-01-11 2024-07-18 Bright Peak Therapeutics Ag Conditionally activated proteins and methods of use
US20240417436A1 (en) 2023-01-11 2024-12-19 Bright Peak Therapeutics Ag Conditionally activated immunocytokines and methods of use
WO2024151885A1 (en) 2023-01-13 2024-07-18 Iovance Biotherapeutics, Inc. Use of til as maintenance therapy for nsclc patients who achieved pr/cr after prior therapy
WO2024215989A1 (en) 2023-04-14 2024-10-17 Sotio Biotech Inc. ENGINEERED IMMUNE CELLS FOR TREATING CANCER IN COMBINATION WITH IL-2/IL-15 RECEPTOR βγ AGONISTS
GB202307096D0 (en) 2023-05-12 2023-06-28 Achilles Therapeutics Uk Ltd Method
WO2025015318A2 (en) 2023-07-13 2025-01-16 Iovance Biotherapeutics, Inc. Cytokine encoding lentiviral vectors and uses thereof for making tumor infiltrating lymphocytes
AU2024292473A1 (en) 2023-07-19 2026-01-29 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with trop-2 targeting adc
WO2025054540A1 (en) 2023-09-08 2025-03-13 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of gene-editing using programmable nucleases
WO2025080865A1 (en) 2023-10-11 2025-04-17 Turnstone Biologics Corp. Combination of tumor infiltrating lymphocytes (til) and low dose radiation
WO2025083398A1 (en) 2023-10-16 2025-04-24 Cell Therapy Catapult Limited Co-culture
WO2025096638A2 (en) 2023-10-30 2025-05-08 Turnstone Biologics Corp. Genetically modified tumor infilitrating lymphocytes and methods of producing and using the same
WO2025101484A1 (en) 2023-11-06 2025-05-15 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of endometrial cancers with tumor infiltrating lymphocyte therapies
WO2025145207A1 (en) 2023-12-29 2025-07-03 Bristol-Myers Squibb Company Combination therapy of kras inhibitor and treg-depleting agent
WO2025171182A1 (en) 2024-02-08 2025-08-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with cancer vaccine
WO2026006784A1 (en) 2024-06-28 2026-01-02 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of making tumor reactive peripheral blood lymphocytes (trpbl)

Family Cites Families (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4401756A (en) 1981-04-14 1983-08-30 Immunex Corporation Process for preparing human interleukin 2
US4518584A (en) * 1983-04-15 1985-05-21 Cetus Corporation Human recombinant interleukin-2 muteins
JPS60502136A (ja) * 1983-08-10 1985-12-12 アムジエン　インコーポレイテツド 微生物によるインタ−ル−キン２の形質発現
JPS60115528A (ja) * 1983-11-28 1985-06-22 Takeda Chem Ind Ltd ヒトインタ―ロイキン―２蛋白質を含有する抗腫瘍用または免疫機能低下疾患治療用組成物
US4569790A (en) 1984-03-28 1986-02-11 Cetus Corporation Process for recovering microbially produced interleukin-2 and purified recombinant interleukin-2 compositions
US5116943A (en) 1985-01-18 1992-05-26 Cetus Corporation Oxidation-resistant muteins of Il-2 and other protein
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
US4766106A (en) * 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
DE3676670D1 (de) * 1985-06-26 1991-02-07 Cetus Corp Solubilisierung von proteinen fuer pharmazeutische zusammensetzungen mittels polymerkonjugierung.
US4705848A (en) * 1986-06-02 1987-11-10 International Minerals & Chemical Corp. Isolation of bioactive, monomeric growth hormone
US5078997A (en) 1988-07-13 1992-01-07 Cetus Corporation Pharmaceutical composition for interleukin-2 containing physiologically compatible stabilizers
US4902502A (en) 1989-01-23 1990-02-20 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US5089261A (en) * 1989-01-23 1992-02-18 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US5153310A (en) 1989-02-28 1992-10-06 Du Pont Merck Pharmaceutical Company Il-2 analogs containing n-linked glycosylation sites
US5166322A (en) 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
IE912365A1 (en) 1990-07-23 1992-01-29 Zeneca Ltd Continuous release pharmaceutical compositions
US5595732A (en) 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
US5446090A (en) 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
US5635597A (en) 1994-05-27 1997-06-03 Affymax Technologies, N.V. Peptides that bind IL-2 receptors
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US6034072A (en) * 1997-02-10 2000-03-07 Genemedicine, Inc. IL-2 gene expression and delivery systems and uses
US6180095B1 (en) * 1997-12-17 2001-01-30 Enzon, Inc. Polymeric prodrugs of amino- and hydroxyl-containing bioactive agents
ES2222689T3 (es) 1998-03-12 2005-02-01 Nektar Therapeutics Al, Corporation Derivados del polietilenglicol con grupos reactivos proximales.
DZ2788A1 (fr) 1998-05-15 2003-12-01 Bayer Ag Agonistes et antagonistes selectifs à IL-2.
US6168785B1 (en) 1998-07-16 2001-01-02 Institut Pasteur Biological applications of new peptides of IL-2 and derivatives and use as therapeutic agents
WO2001062827A2 (en) 2000-02-22 2001-08-30 Shearwater Corporation N-maleimidyl polymer derivatives
US6689353B1 (en) 2000-06-28 2004-02-10 Bayer Pharmaceuticals Corporation Stabilized interleukin 2
JP2004534721A (ja) 2000-10-31 2004-11-18 ピーアール ファーマシューティカルズ，インク． 生理活性分子の向上した送達のための方法及び組成物
FR2826365B1 (fr) 2001-06-20 2003-09-26 Oreal Compositions cosmetiques photoprotectrices contenant des derives amides, sulfonamides ou carbamates aromatiques d'acrylonitrile et nouveaux derives amides, sulfonamides ou carbamates d'acrylonitrile
AP2005003249A0 (en) * 2002-09-09 2005-03-31 Nektar Therapeutics Al Corp Water-soluble polymer alkanals.
ZA200505394B (en) * 2002-12-26 2007-03-28 Mountain View Pharmaceuticals Polymer conjugates of interferon-beta with enhanced biological potency
KR101162908B1 (ko) * 2002-12-26 2012-07-06 마운틴 뷰 파마슈티컬즈, 인크. 수용체-결합 활성이 보존된, 사이토카인, 케모카인,성장인자, 폴리펩티드 호르몬 및 이들의 길항제의 중합체접합체
KR101177340B1 (ko) 2003-01-06 2012-08-30 넥타르 테라퓨틱스 티올-선택성 수용성 중합체 유도체
WO2004089280A2 (en) 2003-04-08 2004-10-21 Yeda Research And Development Co. Ltd. Reversible pegylated drugs
HUE043911T2 (hu) 2003-05-23 2019-09-30 Nektar Therapeutics Két PEG láncot tartalmazó PEG származékok
US7569215B2 (en) 2003-07-18 2009-08-04 Massachusetts Institute Of Technology Mutant interleukin-2 (IL-2) polypeptides
AU2004298996A1 (en) * 2003-12-10 2005-06-30 Nektar Therapeutics Al, Corporation Compositions comprising two different populations of polymer-active agent conjugates
PL1688146T3 (pl) 2005-02-07 2007-12-31 Novartis Vaccines & Diagnostics Inc Przygotowywanie aldesleukiny do zastosowania farmaceutycznego
EP3260465A1 (en) 2005-06-07 2017-12-27 ESBATech, an Alcon Biomedical Research Unit LLC Stable and soluble antibodies inhibiting tnf-alpha
MX2007016314A (es) 2005-06-16 2008-03-10 Nektar Therapeutics Al Corp Conjugados que tienen un enlace degradable y reactivos polimericos utiles en la preparacion de tales conjugados.
WO2007019331A2 (en) * 2005-08-04 2007-02-15 Nektar Therapeutics Al, Corporation Conjugates of a g-csf moiety and a polymer
AU2006326404B2 (en) * 2005-12-14 2011-11-03 Ambrx, Inc. Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides
JP5096363B2 (ja) 2005-12-16 2012-12-12 ネクター セラピューティックス Ｇｌｐ−１のポリマ複合体
CA2648582C (en) 2006-04-07 2016-12-06 Nektar Therapeutics Al, Corporation Conjugates of an anti-tnf-alpha antibody
CN101104077A (zh) * 2006-07-12 2008-01-16 北京紫辰医药生物技术研究所 重组人白介素-2与聚乙二醇的偶合物
WO2008082669A2 (en) 2006-12-27 2008-07-10 Nektar Therapeutics Al, Corporation Von willebrand factor- and factor viii-polymer conjugates having a releasable linkage
EP2134181A4 (en) 2007-02-28 2011-09-28 Serina Therapeutics Inc ACTIVATED POLYOXAZOLINES AND COMPOSITION COMPRISING THE SAME
US7567215B1 (en) 2007-10-23 2009-07-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Portable and inflatable antenna device
KR20090103209A (ko) * 2008-03-27 2009-10-01 (주)한국비엠아이 사람 인터루킨-2 동종체
CN102036687A (zh) 2008-05-16 2011-04-27 尼克塔治疗公司 胆碱酯酶部分与聚合物的共轭物
WO2010014258A2 (en) * 2008-08-01 2010-02-04 Nektar Therapeutics Al, Corporation Conjugates having a releasable linkage
US8680263B2 (en) * 2008-09-19 2014-03-25 Nektar Therapeutics Carbohydrate-based drug delivery polymers and conjugates thereof
KR20200070407A (ko) 2010-11-12 2020-06-17 넥타르 테라퓨틱스 Ｉｌ-2 부분 및 중합체의 접합체

Also Published As

Publication number Publication date
AU2021225133A1 (en) 2021-09-30
HUE054318T2 (hu) 2021-08-30
KR20230148396A (ko) 2023-10-24
ES2866674T3 (es) 2021-10-19
KR20130116888A (ko) 2013-10-24
CA2816722A1 (en) 2012-05-18
US9861705B2 (en) 2018-01-09
EA201390697A1 (ru) 2013-08-30
EP2637694A1 (en) 2013-09-18
AU2022268401B2 (en) 2024-08-08
AU2017200931A1 (en) 2017-03-02
US20250304641A1 (en) 2025-10-02
US20180085468A1 (en) 2018-03-29
SI2637694T1 (sl) 2021-06-30
KR102591732B1 (ko) 2023-10-19
IL295201A (en) 2022-10-01
CA2816722C (en) 2022-03-15
EA037083B1 (ru) 2021-02-03
US20140328791A1 (en) 2014-11-06
SMT202100314T1 (it) 2021-07-12
PL2637694T3 (pl) 2021-10-18
KR20220008387A (ko) 2022-01-20
KR102349549B1 (ko) 2022-01-11
LT2637694T (lt) 2021-05-25
EP2637694A4 (en) 2016-10-19
DK2637694T3 (da) 2021-06-07
KR102472497B1 (ko) 2022-11-29
JP2018154644A (ja) 2018-10-04
AU2011325990C1 (en) 2017-06-08
AU2024227552A1 (en) 2024-11-28
EP3895735A1 (en) 2021-10-20
US20190008978A1 (en) 2019-01-10
EP2637694B1 (en) 2021-04-07
MX2013005363A (es) 2013-11-04
AU2011325990B2 (en) 2017-03-09
KR20200070407A (ko) 2020-06-17
CN110812488A (zh) 2020-02-21
MX358399B (es) 2018-08-16
AU2022268401A1 (en) 2023-01-05
US10960079B2 (en) 2021-03-30
US11091525B2 (en) 2021-08-17
US20210023230A1 (en) 2021-01-28
JP2024001309A (ja) 2024-01-09
IL226267B (en) 2022-09-01
US20210340210A1 (en) 2021-11-04
AU2018253463A1 (en) 2018-11-15
JP7104735B2 (ja) 2022-07-21
JP2014506116A (ja) 2014-03-13
PT2637694T (pt) 2021-05-05
JP2020097626A (ja) 2020-06-25
JP2016202187A (ja) 2016-12-08
WO2012065086A1 (en) 2012-05-18
AU2011325990A1 (en) 2013-05-23
IL226267A0 (en) 2013-07-31
JP2025111741A (ja) 2025-07-30
KR20220163518A (ko) 2022-12-09
JP2022000043A (ja) 2022-01-04
HRP20210642T1 (hr) 2021-05-28
US12247059B2 (en) 2025-03-11
CA3144697A1 (en) 2012-05-18
AU2020202673A1 (en) 2020-05-14
MX388465B (es) 2025-03-20
EA202092025A1 (ru) 2021-05-31
CY1124659T1 (el) 2022-07-22
CN103517718A (zh) 2014-01-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12247059B2 (en) Conjugates of an IL-2 moiety and a polymer
WO2013020079A2 (en) Conjugates of an il-11 moiety and a polymer
HK40053166A (en) Conjugates of an il-2 moiety and a polymer
CA3144697C (en) Conjugates of an il-2 moiety and a polymer