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CN117279506A - 肿瘤储存及细胞培养组合物 - Google Patents

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CN117279506A
CN117279506A CN202280033311.0A CN202280033311A CN117279506A CN 117279506 A CN117279506 A CN 117279506A CN 202280033311 A CN202280033311 A CN 202280033311A CN 117279506 A CN117279506 A CN 117279506A
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A·维普塔朗
A·纳塔拉扬
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Iovance Biotherapeutics Inc
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Abstract

本文提供了可用于制造TIL治疗剂的肿瘤储存组合物、细胞培养基及肿瘤洗涤缓冲液。这些试剂允许制造高品质的TIL治疗剂，同时降低微生物的生物负荷并在TIL制造程序中提供无菌保障。

Description

肿瘤储存及细胞培养组合物
背景技术
在癌症患者中，继宿主免疫抑制之后，利用通过快速扩增方案(REP)体外培养的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的过继性细胞疗法已成为成功的过继性细胞疗法。然而，目前的TIL制造和治疗过程受到持续时间、成本、无菌性问题以及本文所述其他因素的限制，使得治疗癌症患者的潜力受到严重限制。
无菌性是TIL成功生长的重要因素。例如，必须通过手术切除小心保持样品的无菌性以限制微生物污染的风险。在将肿瘤样品输送至TIL处理设备、在处理前储存肿瘤样本以及在处理肿瘤样本以产生高级别治疗性TIL的过程中，也必须确保无菌。因此，需要在TIL治疗剂的制造中提供无菌保障的试剂。
发明内容
本文提供了可用于制造TIL治疗剂的肿瘤储存组合物、细胞培养基及肿瘤洗涤缓冲液。这些试剂允许制造高品质的TIL治疗剂，同时降低微生物生物负荷并在TIL制造过程中提供无菌保障。具体地说，本文提供的肿瘤储存组合物有利地使细菌(例如革兰氏阴性及革兰氏阳性细菌物种)及真菌污染减到最少，同时不会明显影响细胞存活率。另外的，在所主张的细胞培养基中培养的淋巴细胞能够在具有极少细菌(例如革兰氏阳性及革兰氏阴性细菌)和/或真菌污染情况下进行分化、耗竭和/或活化。
在一方面，本文提供了一种用于低温储存肿瘤样本的组合物。该组合物包含：a)无血清、无动物组分的冷冻保存培养基；和b)抗生素组分，该抗生素组分包含：1)抗生素组合，该抗生素组合选自：i)庆大霉素(gentamicin)和万古霉素(vancomycin)；以及ii)庆大霉素和克林霉素(clindamycin)；或者2)为万古霉素的抗生素。
在一些实施方式中，万古霉素的浓度为约50-600μg/mL。在某些实施方式中，克林霉素的浓度为约400-600μg/mL。在一些实施方式中，庆大霉素的浓度为约50μg/mL。
在示例性实施方式中，该抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素及约400-600μg/mL克林霉素。在某些实施方式中，该抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素及约50-600μg/mL万古霉素。在某些实施方式中，该抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素及约100μg/mL万古霉素。
在一些实施方式中，该抗生素组分还包含抗真菌性抗生素。在某些实施方式中，该抗真菌性抗生素为双性霉素B(amphotericin B)。在一些实施方式中，该双性霉素B的浓度为约2.5-10μg/mL。
在示例性实施方式中，该冷冻保存培养基包含：i)一种以上选自钾离子、钠离子、镁离子及钙离子的电解质；以及ii)在生理条件及低温条件下有效的生物pH缓冲液。在一些实施方式中，钾离子的浓度在约35-45mM范围内，钠离子的浓度在约80-120mM范围内，镁离子的浓度在约2-10mM范围内，并且，钙离子的浓度在约0.01-0.1mM范围内。
在一些实施方式中，该组合物还包含营养有效量的至少一种单糖。在某些实施方式中，该组合物还包含不可透过细胞膜且在冷暴露期间有效抵抗细胞膨胀的不透过性阴离子，该阴离子选自以下：乳糖酸根、葡糖酸根、柠檬酸根及甘油磷酸根。在一些实施方式中，该组合物还包含对ATP再生有效的底物，该底物为选自如下的至少一个：腺苷、果糖、核糖及腺嘌呤。在某些实施方式中，该组成物还包含至少一种选自于EDTA或维生素E的调节凋亡诱导的细胞死亡的试剂。
在一些实施方式中，该冷冻保存培养基包含10％ DMSO。
在另一方面，本文提供了一种肿瘤样本组合物，其包含：a)含有多个肿瘤细胞及多个肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的肿瘤样本；以及b)低温储存培养基。该储存培养基包含：i)无血清、无动物组分的冷冻保存培养基；和ii)抗生素，该抗生素包含：1)抗生素组合，该抗生素组合选自：i)庆大霉素及万古霉素；和ii)庆大霉素及克林霉素；或2)为万古霉素的抗生素。
在一些实施方式中，该肿瘤样本为实体瘤肿瘤样本。在某些实施方式中所述肿瘤样本为如下癌症类型的一种：乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、结直肠癌、肺癌、脑癌、肾癌、胃癌、皮肤癌(包括但不限于鳞状细胞癌、基底细胞癌及黑色素瘤)、宫颈癌、头颈癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、肉瘤、膀胱癌及胶质母细胞瘤。
在一些实施方式中，所述肿瘤组织样本为液体肿瘤样本。在一些实施方式中，所述液体肿瘤样本为来自血液恶性肿瘤的液体肿瘤样本。
在一些实施方式中，所述肿瘤样本从原发性肿瘤中获得。在某些实施方式中，所述肿瘤样本是从侵袭性肿瘤中获得。在一些实施方式中，所述肿瘤样本从转移性肿瘤中获得。在一些实施方式中，所述肿瘤样本从恶性黑色素瘤中获得。
在一些实施方式中，所述多个TIL包含至少90％的活细胞。
在某些实施方式中，万古霉素的浓度为约50-600μg/mL。在某些实施方式中，万古霉素的浓度为约100μg/mL。在一些实施方式中，克林霉素的浓度为约400-600μg/mL。在某些实施方式中，庆大霉素的浓度为约50μg/mL。在一些实施方式中，所述抗生素组分包含约50μg/mL的庆大霉素和约400-600μg/mL的克林霉素。在一些实施方式中，所述抗生素组分包含约50μg/mL的庆大霉素和约50-600μg/mL的万古霉素。在一些实施方式中，所述抗生素组分包含约50μg/mL的庆大霉素和约100μg/mL的万古霉素。
在一些实施方式中，所述抗生素组分还包含抗真菌性抗生素。在一些实施方式中，所述抗真菌性抗生素为双性霉素B。在一些实施方式中，所述双性霉素B的浓度为约2.5-10μg/mL。
在一些实施方式中，所述冷冻保存培养基包含：i)一种以上选自钾离子、钠离子、镁离子和钙离子的电解质；和ii)在生理条件及低温条件下有效的生物pH缓冲液。
在一些实施方式中，所述钾离子的浓度在约35-45mM范围内，所述钠离子的浓度在约80-120mM范围内，所述镁离子的浓度在约2-10mM范围内，并且，所述钙离子的浓度在约0.01-0.1mM范围内。
在一些实施方式中，所述组合物还包含营养有效量的至少一种单糖。
在某些实施方式中，所述组合物还包含不可透过细胞膜且在冷暴露期间有效抵抗细胞膨胀的不透过性阴离子，所述阴离子选自如下：乳糖酸根、葡糖酸根、柠檬酸根和甘油磷酸根。
在一些实施方式中，所述组合物还包含对ATP再生有效的底物，所述底物为选自如下中的至少一个：腺苷、果糖、核糖和腺嘌呤。
在一些实施方式中，所述组合物还包含至少一种调节凋亡诱导的细胞死亡的试剂，所述试剂选自EDTA或维生素E。
在某些实施方式中，所述冷冻保存培养基包含10％DMSO。
在另一方面，本文提供了一种细胞培养基组合物，其包含：a)基础培养基；b)谷氨酰胺或谷氨酰胺衍生物；c)血清；以及d)抗生素组分。该基础培养基包含：i)葡萄糖、ii)多种盐，以及多种氨基酸和维生素。该抗生素组分选自：包含以下的抗生素组分：1)抗生素组合，该抗生素组合选自：i)庆大霉素和万古霉素；和ii)庆大霉素和克林霉素；或者2)为万古霉素的抗生素。
在另一方面，本文提供了一种细胞培养基组合物，其包含：a)基础培养基；b)血清白蛋白；c)胆固醇NF；d)可选的谷氨酰胺或谷氨酰胺衍生物；以及d)抗生素组分。该基础培养基包含：i)葡萄糖、ii)多种盐，以及iii)多种氨基酸和维生素。该抗生素包含：1)抗生素组合，其选自：i)庆大霉素和万古霉素；和ii)庆大霉素和克林霉素；或者2)为万古霉素的抗生素。
在另一方面，本文提供了一种细胞培养基，其包含：a)成分确定的培养基或无血清培养基；b)可选的转铁蛋白；c)可选的胰岛素；d)可选的白蛋白；e)胆固醇NF；f)可选的谷氨酰胺或谷氨酰胺衍生物；以及g)抗生素组分。该成分确定的培养基或无血清培养基包含：i)葡萄糖、ii)多种盐，以及iii)多种氨基酸和维生素。该抗生素组分包含：1)抗生素组合，其选自：i)庆大霉素和万古霉素；和ii)庆大霉素和克林霉素；或者2)为万古霉素的抗生素。
在一些实施方式中，所述细胞培养基包含(可选的重组的)转铁蛋白、(可选的重组的)胰岛素和(可选的重组的)白蛋白。
在一些实施方式中，所述成分确定的培养基或无血清培养基包含基础细胞培养基及血清补充剂和/或血清替代物。
在某些实施方式中，所述基础细胞培养基包括CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基、CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM、CTSTMAIM-V培养基，CTSTMAIM-VSFM，LymphoONETMT细胞扩增无外源物质培养基、杜尔贝科氏改良型伊格尔氏培养基(Dulbecco's ModifiedEagle's Medium，DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔氏基础培养基(Basal MediumEagle，BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)，格拉斯哥氏最低必须培养基(Glasgow's Minimal Essential Medium，G-MEM)、RPMI生长培养基或伊斯科夫氏改良型杜尔贝科氏培养基(Iscove's Modified Dulbecco'sMedium)。
在一些实施方式中，所述血清补充剂或血清替代物选自于如下：CTSTMOpTmizer T细胞扩增血清补充剂和CTSTM免疫细胞血清替代物。
在某些实施方式中，所述成分确定的培养基或无血清培养基包含一种以上白蛋白或白蛋白替代物。在一些实施方式中，所述成分确定的培养基或无血清培养基包含一种以上转铁蛋白或转铁蛋白替代物。
在某些实施方式中，所述成分确定的培养基或无血清培养基包含一种以上胰岛素或胰岛素替代物。在一些实施方式中，所述成分确定的培养基或无血清培养基包含一种以上抗氧化剂。在一些实施方式中，所述成分确定的培养基或无血清培养基包含一种以上胶原蛋白前体和一种以上微量元素。在某些实施方式中，所述成分确定的培养基或无血清培养基包含选自如下的一种以上成分：甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、硫胺素、还原型谷胱甘肽、L-抗坏血酸-2-磷酸盐、铁饱和转铁蛋白、胰岛素和含有微量元素部分的化合物，所述微量元素部分为Ag+、Al3+、Ba2+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Ge4+、Se4+、Br、T、Mn2+、P、Si4+、V5+、Mo6+、Ni2+、Rb+、Sn2+、Zr4+。在某些实施方式中，所述成分确定的培养基或无血清培养基还包含L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和/或2-巯基乙醇。
在一些实施方式中，万古霉素的浓度为约50-600μg/mL。在一些实施方式中，万古霉素的浓度为约100μg/mL。在一些实施方式中，克林霉素的浓度为约400-600μg/mL。在一些实施方式中，庆大霉素的浓度为约50μg/mL。在某些实施方式中，所述抗生素组分包含约50μg/mL的庆大霉素和约400-600μg/mL的克林霉素。在一些实施方式中，所述抗生素组分包含约50μg/mL的庆大霉素和约50-600μg/mL的万古霉素。在一些实施方式中，所述抗生素组分包含约50μg/mL的庆大霉素和约100μg/mL的万古霉素。
在某些实施方式中，所述基础培养基为RPMI 1640培养基、DMEM培养基或它们的组合。在一些实施方式中，所述基础培养基为DMEM培养基。在一些实施方式中，所述谷氨酰胺衍生物为L-丙氨酸-L-谷氨酰胺(GutaMAX)。在某些实施方式中，所述谷氨酰胺为L-谷氨酰胺。
在一些实施方式中，所述血清为人AB血清。
在一些实施方式中，所述细胞培养基还包含IL-2。在某些实施方式中，IL-2是浓度为3,000-6,000IU/mL的IL-2。
在一些实施方式中，所述细胞培养基还包含抗CD3抗体。在某些实施方式中，所述抗CD3抗体是浓度为30ng/mL的OKT-3。
在一些实施方式中，所述细胞培养基还包含抗原呈递饲养细胞。
在某些实施方式中，所述细胞培养基还包含6,000IU/mL IL-2。
在一些实施方式中，所述细胞培养基还包含3,000IU/mL IL-2和30ng/mL OKT-3。在一些实施方式中，所述细胞培养基还包含3,000IU/mL IL-2、30ng/mL OKT-3和抗原呈递饲养细胞。
在某些实施方式中，所述细胞培养基还包含6,000IU/mL IL-2、30ng/mL OKT-3和抗原呈递饲养细胞。
在一些实施方式中，所述细胞培养基还包含3,000IU/mL IL-2。
在另一方面，本文提供了一种肿瘤浸润淋巴细胞组合物，其包含多个肿瘤浸润淋巴细胞和本文提供的任何细胞培养基。在一些实施方式中，所述多个TIL展现出至少90％的活细胞。在某些实施方式中，所述多个TIL展现出与不含万古霉素和克林霉素的对照肿瘤浸润淋巴细胞组合物相似的记忆性TIL群。在一些实施方式中，所述多个TIL展现出与不含万古霉素和克林霉素的对照肿瘤浸润淋巴细胞组合物相似的分化CD3+/CD4+、活化CD3+/CD4+和耗竭CD3+/CD4+TIL群。在某些实施方式中，所述多个TIL展现出与不含万古霉素和克林霉素的对照肿瘤浸润淋巴细胞组合物相似的分化CD3+/CD8+、活化CD3+/CD8+和耗竭CD3+/CD8+TIL群。
在另一方面，本文提供了一种用于扩增T细胞的方法，其包括通过如下方式由获自受试者的肿瘤样本来扩增第一T细胞群：在包含抗生素组分的培养基中培养获自受试者的肿瘤样本中的第一T细胞群，实现所述第一T细胞群的生长，其中所述抗生素组分包含：1)抗生素组合，所述抗生素组合选自i)庆大霉素和万古霉素，以及ii)庆大霉素和克林霉素；或者2)为万古霉素的抗生素。
在一些实施方式中，所述培养基包含IL-2。在一些实施方式中，所述第一T细胞群培养约7至14天的时间段。
在另一方面，本文提供了一种用于快速扩增T细胞的方法，其包括使第一T细胞群与包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)、抗原呈递细胞(APC)和抗生素组分的细胞培养基接触，实现所述第一T细胞群的快速生长，由此产生第二T细胞群，其中所述快速扩增进行约7至14天的时间段，并且所述抗生素组分包含：1)抗生素组合，所述抗生素组合选自：i)庆大霉素和万古霉素，以及ii)庆大霉素和克林霉素；或者2)为万古霉素的抗生素。在一些实施方式中，所述培养基还包含IL-15和IL-21。在某些实施方式中，万古霉素的浓度为约50-600μg/mL。在某些实施方式中，万古霉素的浓度为约100μg/mL。在一些实施方式中，克林霉素的浓度为约400-600μg/mL。在一些实施方式中，庆大霉素的浓度为约50μg/mL。在某些实施方式中，所述抗生素组分包含约50μg/mL的庆大霉素和约400-600μg/mL的克林霉素。在一些实施方式中，所述抗生素组分包含约50μg/mL的庆大霉素和约50-600μg/mL的万古霉素。在一些实施方式中，所述抗生素组分包含约50μg/mL的庆大霉素和约100μg/mL的万古霉素。
在另一方面，本文提供了用于将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群的方法，其包括：a)提供自受试者的切除肿瘤获得的包含多个肿瘤细胞和TIL的样本；b)通过将所述样本处理成多个碎片，获得第一TIL群；c)将所述片段添加至密闭系统中；d)通过在第一细胞培养基中培养所述第一TIL群来进行第一扩增，产生第二TIL群，其中所述第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，所述第一扩增进行约3-14天以获得第二TIL群，自步骤c)至步骤d)的转变在不打开系统的情况下发生，以及所述第一细胞培养基包含IL-2和第一抗生素组分；e)通过在第二细胞培养基中培养第二TIL群来进行第二扩增，产生第三TIL群，其中，所述第二扩增进行约7-14天以获得第三TIL群，所述第三TIL群为治疗性TIL群，所述第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤d)至步骤e)的转变在不打开系统的情况下发生，所述第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3、抗原呈递细胞(APC)及可选的第二抗生素组分；f)收集自步骤e)获得的治疗性TIL群，自步骤e)至步骤f)的转变在不打开系统的情况下发生；以及g)将自步骤f)收集的TIL群中的治疗性群转移至输注袋，其中，自步骤f)至步骤g)的转移在不打开系统的情况下发生；所述第一抗生素组分和可选的第二抗生素组分包含：1)抗生素组合，所述抗生素组合选自：i)庆大霉素和万古霉素，以及ii)庆大霉素和克林霉素；或者2)为万古霉素的抗生素。
在一些实施方式中，在步骤d)之前，所述方法还包括以下步骤：(i)在包含IL-2和可选的第一抗生素组分的培养基中培养第一TIL群，获得自所述多个肿瘤碎片释放的TIL；(ii)将步骤(i)中至少多个自多个肿瘤碎片释放的TIL与多个肿瘤碎片分离，获得多个肿瘤碎片、残留在多个肿瘤碎片中的TIL和自多个肿瘤碎片释放并在分离之后保留在其中的任何TIL的混合物；以及(iii)可选地消化所述多个肿瘤碎片、残留在所述多个肿瘤碎片中的TIL和自所述多个肿瘤碎片释放且在所述分离之后保留在其中的任何TIL的混合物，产生所述混合物的消化物，其中在步骤(d)中，将所述混合物或混合物的消化物在第一细胞培养基中培养，获得所述第二TIL群。
在一些实施方式中，在步骤(d)中进行的第一扩增包括：(i)在第一细胞培养基中培养第一TIL群约3-14天，获得自所述肿瘤碎片释放的TIL；(ii)将步骤(i)中至少多个自肿瘤碎片释放的TIL与所述肿瘤碎片分离，获得第二TIL群，所述第二TIL群为所述肿瘤碎片、残留在肿瘤碎片中的TIL和自肿瘤碎片释放且在分离之后保留在其中的任何TIL的混合物形式；以及(iii)可选地消化所述肿瘤碎片、残留在所述肿瘤碎片中的TIL和自所述肿瘤碎片释放且在分离之后保留在其中的任何TIL的混合物，产生所述混合物的消化物，其中在步骤e)中，所述第二扩增通过在第二培养基中扩增呈混合物或混合物的消化物形式的第二TIL群约7-14天来进行，由此产生第三TIL群。
在另一方面，本文提供了一种用于将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群的方法，其包括：a)提供第一TIL群，该第一TIL群由手术切除、穿刺活体组织切片(needlebiopsy)、粗针活体组织切片(core biopsy)、小型活体组织切片或用于自受试者获得包含肿瘤和TIL的第一混合物的样本的其他方式获得；b)在第一细胞培养基中进行第一TIL群的起始第一扩增，获得第二TIL群，其中，所述第一细胞培养基包含IL-2、可选的OKT-3(抗CD3抗体)、可选的抗原呈递细胞(APC)和第一抗生素组分，其中所述起始第一扩增进行约1至7或8天的时间段，所述第二TIL群的数量大于第一TIL群的数量；c)在第二细胞培养基中进行第二TIL群的快速第二扩增，获得治疗性TIL群，其中所述第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3、可选的第二抗生素组分和APC；所述快速第二扩增进行约1至11天的时间段；以及d)收集治疗性TIL群，其中所述第一抗生素组分和所述第二抗生素组分包含：1)抗生素组合，所述抗生素组合选自：i)庆大霉素和万古霉素；以及ii)庆大霉素和克林霉素；或者2)为万古霉素的抗生素。
在一些实施方式中，所述快速第二扩增进行约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天的时间段。在一些实施方式中，在步骤b)中，所述第一细胞培养基还包含APC，并且步骤c)中的第二培养基中APC的数量大于步骤b)中的第一培养基中APC的数量。
在一些实施方式中，在步骤(d)之前，所述方法还包括以下步骤：(i)在包含IL-2和可选的第一抗生素组分的培养基中培养第一TIL群，获得自所述样本释放的TIL；(ii)将步骤(i)中至少多个自样本释放的TIL与样本分离，获得样本、残留在样本中的TIL和自样本释放并在分离之后保留在其中的任何TIL的第二混合物；以及(iii)可选地消化所述样本、残留在所述样本中的TIL和自所述样本释放且在所述分离之后保留在其中的任何TIL的第二混合物，产生所述第二混合物的消化物；其中步骤(b)包括在第一细胞培养基中对呈第二混合物或第二混合物的消化物形式的第一TIL群进行起始第一扩增，获得所述第二TIL群。
在一些实施方式中，步骤(a)包括通过自受试者的肿瘤中切除样本并将所述样本处理成含有来自所述受试者的肿瘤和TIL的混合物的多个肿瘤碎片，来提供第一TIL群。
在某些实施方式中，在步骤(b)之前，所述方法还包括如下步骤：(i)在包含IL-2和可选的第一抗生素组分的培养基中培养第一TIL群，获得自所述多个肿瘤碎片释放的TIL；(ii)将步骤(i)中至少多个自样本释放的TIL与所述多个肿瘤碎片分离，获得样本、残留在多个肿瘤碎片中的TIL和自多个肿瘤碎片释放且在分离之后保留在其中的任何TIL的第二混合物；以及(iii)可选地消化所述多个肿瘤碎片、残留在所述多个肿瘤碎片中的TIL和自所述多个肿瘤碎片释放且在分离之后保留在其中的任何TIL的第二混合物，产生所述第二混合物的消化物；步骤(b)包括在第一细胞培养基中对呈第二混合物或第二混合物的消化物形式的第一TIL群进行起始第一扩增，获得第二TIL群。
在另一方面，本文提供了一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其包括：a)通过在包含第一抗生素组分的第一培养基中培养第一TIL群以实现第一TIL群的生长并启动其活化，来进行第一TIL群的起始第一扩增，第一TIL群由手术切除、穿刺活体组织切片、粗针活体组织切片、小型活体组织切片或用于自受试者获得包含肿瘤和TIL的混合物的样本的其他方式获得；b)在步骤(a)中启动第一TIL群的活化之后，通过在可选的包含第二抗生素组分的第二培养基中培养第一TIL群以实现第一TIL群的生长且增强其活化，来进行第一TIL群的快速第二扩增，获得第二TIL群，其中所述第二TIL群为治疗性TIL群；以及c)收集治疗性TIL群，其中所述第一抗生素组分和所述第二抗生素组分包含：i)抗生素组合，所述抗生素组合选自：i)庆大霉素和万古霉素；以及ii)庆大霉素和克林霉素；或者2)为万古霉素的抗生素。
在一些实施方式中，在步骤(s)中，所述第一培养基还包含IL-2和OKT-3(抗CD3抗体)，以及可选的抗原呈递细胞(APC)，并且在步骤(b)中，第二培养基还包含IL-2、OKT-3及APC。
在另一方面，本文提供了一种用于将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群的方法，其包括：a)提供第一TIL群，第一TIL群由手术切除、穿刺活体组织切片、粗针活体组织切片、小型活体组织切片或用于自受试者获得包含肿瘤和TIL的第一混合物的样本的其他方式获得；b)在第一细胞培养基中进行第一TIL群的第一扩增，获得第二TIL群，其中，所述第一细胞培养基包含IL-2和第一抗生素组分，所述第一扩增进行约3至14天的时间段，所述第二TIL群的数量大于第一TIL群的数量；c)在第二细胞培养基中进行第二TIL群的第二扩增，获得治疗性TIL群，其中所述第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3、可选的第二抗生素组分和抗原呈递细胞(APC)；所述第二扩增进行约7至14天的时间段；以及d)收集治疗性TIL群，其中所述第一抗生素组分和所述第二抗生素组分包含：1)抗生素组合，所述抗生素组合选自：i)庆大霉素和万古霉素；以及庆大霉素和克林霉素；或者2)为万古霉素的抗生素。
在一些实施方式中，所述第一扩增进行约11天的时间段。在某些实施方式中，所述第二扩增进行约11天的时间段。在一些实施方式中，所述第一扩增和所述第二扩增进行约22天的时间段。在某些实施方式中，在步骤b)之前，所述方法还包括如下步骤：(i)在包含IL-2和可选的第一抗生素组分的培养基中培养第一TIL群，获得自所述样本释放的TIL；(ii)将步骤(i)中至少多个自样本释放的TIL与所述样本分离，获得样本、残留在样本中的TIL和自样本释放且在分离之后保留在其中的任何TIL的第二混合物；以及(iii)可选地消化所述样本、残留在所述样本中的TIL和自所述样本释放且在分离之后保留在其中的任何TIL的第二混合物，产生所述第二混合物的消化物；其中步骤b)包括在第一细胞培养基中对呈第二混合物或第二混合物的消化物形式的第一TIL群进行起始第一扩增，获得第二TIL群。
在一些实施方式中，在步骤b)中进行的第一扩增包括：(i)在第一细胞培养基中培养第一TIL群约3-14天，获得自所述样本释放的TIL；(ii)将步骤(i)中至少多个自样本释放的TIL与所述样本分离，获得第二TIL群，所述第二TIL群为所述样本、残留在样本中的TIL和自样本释放且在分离之后保留在其中的任何TIL的第二混合物形式；以及(iii)可选地消化所述样本、残留在所述样本中的TIL和自所述样本释放且在分离之后保留在其中的任何TIL的第二混合物，产生所述第二混合物的消化物；并且在步骤c)中，所述第二扩增通过在第二培养基中扩增呈第二混合物或第二混合物的消化物形式的第二TIL群约7-11天来进行，由此产生治疗性TIL群。
在一些实施方式中，步骤a)包括通过自受试者的肿瘤中切除样本并将所述样本处理成含有来自所述受试者的肿瘤和TIL的混合物的多个肿瘤碎片，来提供第一TIL群。
在一些实施方式中，在步骤b)之前，所述方法还包括如下步骤：(i)在包含IL-2和可选的第一抗生素组分的培养基中培养第一TIL群，获得自所述多个肿瘤碎片释放的TIL；(ii)将步骤(i)中至少多个自样本释放的TIL与所述多个肿瘤碎片分离，获得样本、残留在多个肿瘤碎片中的TIL和自多个肿瘤碎片释放且在分离之后保留在其中的任何TIL的第二混合物；以及(iii)可选地消化所述多个肿瘤碎片、残留在所述多个肿瘤碎片中的TIL和自所述多个肿瘤碎片释放且在分离之后保留在其中的任何TIL的第二混合物，产生所述第二混合物的消化物；步骤b)包括在第一细胞培养基中对呈第二混合物或第二混合物的消化物形式的第一TIL群进行第一扩增，由此产生第二TIL群。
在一些实施方式中，在步骤b)中进行的第一扩增包括：(i)在第一细胞培养基中培养第一TIL群约3-14天，获得自所述肿瘤碎片释放的TIL；(ii)将步骤(i)中至少多个自肿瘤碎片释放的TIL与所述肿瘤碎片分离，获得第二TIL群，所述第二TIL群为所述肿瘤碎片、残留在肿瘤碎片中的TIL和自肿瘤碎片释放且在分离之后保留在其中的任何TIL的第二混合物形式；以及(iii)可选地消化所述肿瘤碎片、残留在所述肿瘤碎片中的TIL和自所述肿瘤碎片释放且在分离之后保留在其中的任何TIL的第二混合物，产生所述第二混合物的消化物；在步骤c)中，所述第二扩增通过在第二培养基中扩增呈第二混合物或第二混合物的消化物形式的第二TIL群约7-14天来进行，由此产生治疗性TIL群。
在一些实施方式中，所述第一细胞培养基和/或所述第二细胞培养基还包含IL-15和IL-21。
在一些实施方式中，万古霉素的浓度为约500-600μg/mL。在一些实施方式中，万古霉素的浓度为约100μg/mL。在某些实施方式中，克林霉素的浓度为约400-600μg/mL。
在示例性实施方式中，庆大霉素的浓度为约50μg/mL。在一些实施方式中，庆大霉素的浓度为约50μg/mL。在某些实施方式中，所述抗生素组分包含约50μg/mL的庆大霉素和约400-600μg/mL的克林霉素。在一些实施方式中，所述抗生素组分包含约50μg/mL的庆大霉素和约50-600μg/mL的万古霉素。在一些实施方式中，所述抗生素组分包含约50μg/mL的庆大霉素和约100μg/mL的万古霉素。
在一些实施方式中，通过在第一细胞培养基中进行第一扩增获得的TIL群展现出至少90％的活细胞。
在某些实施方式中，与通过在不含万古霉素和克林霉素的对照细胞培养基中进行TIL扩增获得的TIL群相比，通过在第一细胞培养基中进行第一扩增获得的TIL群展现出相似的记忆性TIL群。
在一些实施方式中，与通过在不含万古霉素和克林霉素的对照细胞培养基中进行TIL扩增获得的TIL群相比，通过在第一细胞培养基中进行第一扩增获得的TIL群展现出相似的分化CD3+/CD4+、活化CD3+/CD4+和耗竭CD3+/CD4+TIL群。在一些实施方式中，与通过在不含万古霉素和克林霉素的对照细胞培养基中进行TIL扩增获得的TIL群相比，通过在第一细胞培养基中进行第一扩增获得的TIL群展现出相似的分化CD3+/CD8+、活化CD3+/CD8+和耗竭CD3+/CD8+TIL群。
在某些实施方式中，所述第一细胞培养基包含约6,000IU/mL IL-2。
在一些实施方式中，所述第一细胞培养基还包含OKT-3和抗原呈递饲养细胞。在某些实施方式中，所述第一细胞培养基包含6,000IU/mL IL-2和30ng/mL OKT-3。在一些实施方式中，第二细胞培养基包含3,000IU/mL IL-2和30ng/mL OKT-3。在某些实施方式中，第二细胞培养基包含6,000IU/mL IL-2和30ng/mL OKT-3。
在一些实施方式中，所述样本提供于低温储存培养基中，所述低温储存培养基包含：a)无血清、无动物组分的冷冻保存培养基；和b)抗生素组分，所述抗生素组分包含：1)抗生素组合，其选自：i)庆大霉素和万古霉素；以及ii)庆大霉素和克林霉素；或者2)为万古霉素的抗生素。
在某些实施方式中，所述第一TIL群自受试者的样本获得，所述样本提供于低温储存培养基中，所述低温储存培养基包含：a)无血清、无动物组分的冷冻保存培养基；和b)抗生素，所述抗生素包括：1)抗生素组合，其选自：i)庆大霉素和万古霉素；以及ii)庆大霉素和克林霉素；或者2)为万古霉素的抗生素。
在一些实施方式中，所述低温储存培养基中万古霉素的浓度为约50-600μg/mL。在一些实施方式中，所述低温储存培养基中万古霉素的浓度为约100μg/mL。在一些实施方式中，所述低温储存培养基中克林霉素的浓度为约400-600μg/mL。在某些实施方式中，所述低温储存培养基中庆大霉素的浓度为约50μg/mL。在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL的庆大霉素和约400-600μg/mL的克林霉素。在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL的庆大霉素和约50μg/mL的万古霉素。在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL的庆大霉素和约100μg/mL的万古霉素。在某些实施方式中，所述低温储存培养基中双性霉素B的浓度为约2.5-10μg/mL。
在一些实施方式中，低温储存培养基中的抗生素组分包含约50μg/mL的庆大霉素、约2.5-10μg/mL双性霉素B和约400-600μM的克林霉素。在某些实施方式中，低温储存培养基中的抗生素组分包含约50μg/mL的庆大霉素、约2.5-10μg/mL双性霉素B和约50-600μg/mL的万古霉素。在某些实施方式中，低温储存培养基中的抗生素组分包含约50μg/mL的庆大霉素、约2.5-10μg/mL双性霉素B和约100μg/mL的万古霉素。
在另一方面，本文提供了一种根据本文所述方法中任一种制得的治疗性TIL群。
在一个方面，本文提供了一种用于将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群的方法，其包括：a)通过将自受试者获得的肿瘤样本消化成肿瘤消化物而自受试者的切除肿瘤获得和/或接收第一TIL群；b)自步骤a)中呈肿瘤消化物形式的第一TIL群中选择PD-l阳性TIL，获得富含PD-l的TIL群；c)通过在包含IL-2、OKT-3、第一抗生素组分和抗原呈递细胞(APC)的第一细胞培养基中培养所述富含PD-1的TIL群来进行起始第一扩增，获得第二TIL群，其中，所述起始第一扩增在包含第一透气表面区域的容器中进行，所述起始第一扩增进行约1至7或8天的第一时间段以获得第二TIL群，所述第二TIL群的数量大于第一TIL群的数量；d)通过在包含IL-2、OKT-3、第二抗生素组分和APC的第二细胞培养基中培养第二TIL群来进行快速第二扩增，获得治疗性TIL群，其中在所述快速第二扩增中添加的APC的数量是在步骤b)中添加的APC数量的至少两倍，所述快速第二扩增进行约1至11天的第二时间段以获得治疗性TIL群，所述快速第二扩增在包含第二透气表面区域的容器中进行；e)收集自步骤d)获得的治疗性TIL群；以及f)将自步骤e)收集的TIL群转移至输注袋，其中所述第一抗生素组分和所述第二抗生素组分包含：1)抗生素组合，所述抗生素组合选自：i)庆大霉素和万古霉素；以及ii)庆大霉素和克林霉素；或者2)为万古霉素的抗生素。
在一些实施方式中，万古霉素的浓度为约50-600μg/mL。在一些实施方式中，万古霉素的浓度为约100μg/mL。在某些实施方式中，克林霉素的浓度为约400-600μg/mL。在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素及约400-600μg/mL克林霉素。在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素及约50-600μg/mL万古霉素。在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素及约100μg/mL万古霉素。在一些实施方式中，庆大霉素的浓度为约50μg/mL。在某些实施方式中，第二TIL群展示出至少90％的活细胞。
在一些实施方式中，所述第二TIL群展现出与第一TIL群在不含万古霉素和克林霉素的对照第一细胞培养基中进行扩增获得的第二TIL群相似的记忆性TIL群。
在一些实施方式中，所述第二TIL群展现出与第一TIL群在不含万古霉素和克林霉素的对照第一细胞培养基中进行扩增获得的第二TIL群相似的分化CD3+/CD4+、活化CD3+/CD4+和耗竭CD3+/CD4+TIL群。
在一些实施方式中，所述第二TIL群展现出与第一TIL群在不含万古霉素和克林霉素的对照第一细胞培养基中进行扩增获得的第二TIL群相似的分化CD3+/CD8+、活化CD3+/CD8+和耗竭CD3+/CD8+TIL群。
在某些实施方式中，第一细胞培养基包含6,000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，第一细胞培养基包含6,000IU/mL IL-2和30ng/mL OKT-3。
在某些实施方式中，第二细胞培养基包含6,000IU/mL IL-2和30ng/mL OKT-3。
在一些实施方式中，步骤a)中的肿瘤样本提供于低温储存培养基中，所述低温储存培养基包含：a)无血清、无动物组分的冷冻保存培养基；和b)抗生素组分，所述抗生素组分包含：1)抗生素组合，其选自：i)庆大霉素和万古霉素；以及ii)庆大霉素和克林霉素；或者2)为万古霉素的抗生素。
在一些实施方式中，低温储存培养基中万古霉素的浓度为约50-600μg/mL。在一些实施方式中，低温储存培养基中万古霉素的浓度为约100μg/mL。在一些实施方式中，低温储存培养基中克林霉素的浓度为约400-600μg/mL。在某些实施方式中，低温储存培养基中庆大霉素的浓度为约50μg/mL。在某些实施方式中，抗生素组分还包含双性霉素B。在示例性实施方式中，低温储存培养基中双性霉素B的浓度为约2.5-10μg/mL。
在一些实施方式中，低温储存培养基中的抗生素组分包含约50μg/mL的庆大霉素、约2.5-10μg/mL的双性霉素B和约400-600μg/mL的克林霉素。在某些实施方式中，低温储存培养基中的抗生素组分包含约50μg/mL的庆大霉素、约2.5-10μg/mL的双性霉素B和约50-600μg/mL的万古霉素。在某些实施方式中，低温储存培养基中的抗生素组分包含约50μg/mL的庆大霉素、约2.5-10μg/mL的双性霉素B和约100μg/mL的万古霉素。
在另一方面，本文提供了一种根据本文所述方法中的任一种制得的治疗性TIL群。
在一个方面，本文提供了一种用于扩增来自外周血的外周血淋巴细胞(PBL)的方法，所述方法包括以下步骤：a)自患者的外周血获得外周血单核细胞(PBMC)的样本；b)在包含第一细胞培养基的培养物中培养所述PBMC选自如下的时间段：约9天、约10天、约11天、约12天、约13天和约14天，由此实现来自所述PBMC的外周血淋巴细胞(PBL)的扩增，所述第一细胞培养基具有IL-2、抗CD3/抗CD28抗体和第一抗生素组合；以及c)自步骤b)中的培养物中收集所述PBL，其中所述第一抗生素组分包含：i)抗生素组合，所述抗生素组合选自：1)庆大霉素和万古霉素，以及2)庆大霉素和克林霉素；或者ii)为万古霉素的抗生素。
在一些实施方式中，患者用依鲁替尼(ibrutinib)或另一种白介素-2诱导性T细胞激酶(ITK)抑制剂预治疗。在某些实施方式中，患者难以用依鲁替尼或另一种ITK抑制剂治疗。
在一些实施方式中，低温储存培养基中万古霉素的浓度为约50-600μg/mL。在一些实施方式中，低温储存培养基中万古霉素的浓度为约100μg/mL。在一些实施方式中，低温储存培养基中克林霉素的浓度为约400-600μg/mL。在某些实施方式中，低温储存培养基中庆大霉素的浓度为约50μg/mL。在某些实施方式中，低温储存培养基中双性霉素B的浓度为约2.5-10μg/mL。
在一些实施方式中，低温储存培养基中的抗生素组分包含约50μg/mL的庆大霉素、约2.5-10μg/mL的双性霉素B和约400-600μg/mL的克林霉素。在某些实施方式中，低温储存培养基中的抗生素组分包含约50μg/mL的庆大霉素、约2.5-10μg/mL的双性霉素B和约50-600μg/mL的万古霉素。在某些实施方式中，低温储存培养基中的抗生素组分包含约50μg/mL的庆大霉素、约2.5-10μg/mL的双性霉素B和约100μg/mL的万古霉素。
在一些实施方式中，自步骤(c)中培养物收集的PBL展现出至少90％的活细胞。
在某些实施方式中，与在不含万古霉素和克林霉素的对照细胞培养基中进行PBMC群扩增获得的PBL群相比，自步骤(c)中培养物收集的PBL展现出相似的分化CD3+/CD4+、活化CD3+/CD4+和耗竭CD3+/CD4+TIL群。在一些实施方式中，与在不含万古霉素和克林霉素的对照细胞培养基中进行PBMC群扩增获得的PBL群相比，自步骤(c)中培养物收集的PBL展现出相似的分化CD3+/CD8+、活化CD3+/CD8+和耗竭CD3+/CD8+TIL群。
在某些实施方式中，所述第一细胞培养基包含3,000IU/mL IL-2。
在一些实施方式中，抗CD3抗体和抗CD28抗体与珠子缀合。在一些实施方式中，所述珠子与所述PBMC以3个珠子：1个PMBC细胞的比率混合于培养物中。
在某些实施方式中，步骤b)包括将PBMC和珠子的混合物以约25,000个细胞/cm2至约50,000个细胞/cm2的密度接种于透气表面上，在第一细胞培养基中培养约4天，将IL-2添加至第一细胞培养基中，培养约5天至约7天，获得扩增的PBL。
在一些实施方式中，步骤a)中的PBMC提供于低温储存培养基中，所述低温储存培养基包含：a)无血清、无动物组分的冷冻保存培养基；和b)抗生素组分，所述抗生素组分包含：1)抗生素组合，其选自：i)庆大霉素和万古霉素；以及ii)庆大霉素和克林霉素；或者2)为万古霉素的抗生素。
在某些实施方式中，低温储存培养基中万古霉素的浓度为约50-600μg/mL。在某些实施方式中，低温储存培养基中万古霉素的浓度为约100μg/mL。在一些实施方式中，低温储存培养基中克林霉素的浓度为约400-600μg/mL。在某些实施方式中，低温储存培养基中庆大霉素的浓度为约50μg/mL。在一些实施方式中，低温储存培养基还包含双性霉素B。在示例性实施方式中，低温储存培养基中双性霉素B的浓度为约2.5-10μg/mL。
在某些实施方式中，低温储存培养基中的抗生素组分包含约50μg/mL的庆大霉素、约2.5-10μg/mL的双性霉素B和约400-600μg/mL的克林霉素。
在一些实施方式中，低温储存培养基中的抗生素组分包含约50μg/mL的庆大霉素、约2.5-10μg/mL的双性霉素B和约50-600μg/mL的万古霉素。在一些实施方式中，低温储存培养基中的抗生素组分包含约50μg/mL的庆大霉素、约2.5-10μg/mL的双性霉素B和约100μg/mL的万古霉素。
在一些实施方式中，在培养第一TIL群之前，将样本在肿瘤洗涤缓冲液中洗涤至少一次，所述洗涤缓冲液包含抗生素组分，所述抗生素组分包含：1)抗生素组合，所述抗生素组合选自：i)庆大霉素和万古霉素；以及ii)庆大霉素和克林霉素；或者2)为万古霉素的抗生素。
在一些实施方式中，在所述洗涤缓冲液中的所述抗生素组分包含约100-600μg/mL浓度的万古霉素。在某些实施方式中，在所述洗涤缓冲液中的所述抗生素组分包含约400-600μg/mL浓度的克林霉素。在一些实施方式中，在所述洗涤缓冲液中的所述抗生素组分包含约100μg/mL浓度的万古霉素。在示例性实施方式中，所述抗生素组分为在所述洗涤缓冲液中约100μg/mL浓度的万古霉素。在示例性实施方式中，在所述洗涤缓冲液中的所述抗生素组分包含约50-600μg/mL浓度的万古霉素。在一些实施方式中，在所述洗涤缓冲液中的所述抗生素组分包含约50μg/mL浓度的庆大霉素。在一些实施方式中，在洗涤缓冲液中的抗生素组分包含约2.5-10μg/mL浓度的双性霉素B。在一些实施方式中，在洗涤缓冲液中的抗生素组分包含的抗生素组合，所述抗生素组合包含约100μg/mL的万古霉素和约50μg/mL的庆大霉素。在一些实施方式中，在洗涤缓冲液中的抗生素组分包含的抗生素组合，所述抗生素组合包含约50μg/mL的庆大霉素、约2.5-10μg/mL的双性霉素B和约400-600μg/mL的克林霉素。在一些实施方式中，在洗涤缓冲液中的抗生素组分包含的抗生素组合，所述抗生素组合包含约50μg/mL的庆大霉素、约2.5-10μg/mL的双性霉素B和约100-600μg/mL的万古霉素。在示例性实施方式中，样本在所述洗涤缓冲液中洗涤至少三次。
在一些实施方式中，第一抗生素组分与洗涤缓冲液的抗生素组分相同。在一些实施方式中，第一抗生素组分与洗涤缓冲液的抗生素组分不同。在一些实施方式中，第一抗生素组分与第二抗生素组分相同。在一些实施方式中，第一抗生素组分与第二抗生素组分不同。在一些实施方式中，第一抗生素组分与低温储存培养基的抗生素组分相同。在一些实施方式中，第一抗生素组分与低温储存培养基的抗生素组分不同。
在另一方面，本文提供了肿瘤样本，其包含多个肿瘤细胞和多个肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；和肿瘤洗涤缓冲液，其包含：i)一种以上选自钾离子、钠离子、镁离子和钙离子的电解质；ii)在生理条件下有效的pH缓冲液；和iii)抗生素组分，所述抗生素组分包含：1)抗生素组合，其选自：i)庆大霉素和万古霉素；以及ii)庆大霉素和克林霉素；或者2)为万古霉素的抗生素。在一些实施方式中，肿瘤洗涤缓冲液在维持生理渗透压方面是有效的。在示例性实施方式中，pH缓冲液为磷酸盐缓冲液。在一些实施方式中，肿瘤洗涤缓冲液为汉克氏平衡盐溶液(Hank's Balanced Salt Solution，HBSS)。
在某些实施方式中，肿瘤洗涤缓冲液还包含营养有效量的至少一种单糖。在一些实施方式中，所述单糖为葡萄糖。
在一些实施方式中，所述肿瘤样本为实体肿瘤样本。在示例性实施方式中，肿瘤样本为如下癌症类型之一：乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、结直肠癌、肺癌、脑癌、肾癌、胃癌、皮肤癌(包括但不限于鳞状细胞癌、基底细胞癌及黑色素瘤)、宫颈癌、头颈癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、肉瘤、膀胱癌及胶质母细胞瘤。在一些实施方式中，肿瘤样本为液体肿瘤样本。在示例性实施方式中，所述液体肿瘤样本为来自血液恶性肿瘤的液体肿瘤样本。在一些实施方式中，所述肿瘤样本从原发性肿瘤中获得。在某些实施方式中，所述肿瘤样本是从侵袭性肿瘤中获得的。在一些实施方式中，所述肿瘤样本从转移性肿瘤中获得。在一些实施方式中，所述肿瘤样本从恶性黑色素瘤中获得。
在某些实施方式中，所述抗生素组分包含约50-600μg/mL浓度的万古霉素。在一些实施方式中，抗生素组分包含约100μg/mL浓度的万古霉素。在一些实施方式中，抗生素组分包含约400-600μg/mL浓度的克林霉素。在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL浓度的庆大霉素。在一些实施方式中，抗生素组分为约100μg/mL浓度的万古霉素。在一些实施方式中，抗生素组分包含抗生素组合，所述抗生素组合包含约50μg/mL的庆大霉素和约400-600μg/mL的克林霉素。在一些实施方式中，抗生素组分包含抗生素组合，所述抗生素组合包含约50μg/mL的庆大霉素和约100-600μg/mL的万古霉素。在一些实施方式中，抗生素组分包含抗生素组合，所述抗生素组合包含约50μg/mL的庆大霉素和约100μg/mL的万古霉素。
在一些实施方式中，所述抗生素组分还包含抗真菌性抗生素。在一些实施方式中，所述抗真菌性抗生素为双性霉素B。在一些实施方式中，所述双性霉素B的浓度为约2.5-10μg/mL。
在另一方面，本文提供了一种用于洗涤肿瘤样本的组合物，所述组合物包含：i)一种以上选自钾离子、钠离子、镁离子和钙离子的电解质；ii)在生理条件下有效的pH缓冲液；以及iii)抗生素组分，所述抗生素组分包含：a)抗生素组合，其选自：i)庆大霉素和万古霉素；以及ii)庆大霉素和克林霉素；或者2)为万古霉素的抗生素。在一些实施方式中，肿瘤洗涤缓冲液在维持生理渗透压方面是有效的。在示例性实施方式中，pH缓冲液为磷酸盐缓冲液。在一些实施方式中，肿瘤洗涤缓冲液为汉克氏平衡盐溶液(HBSS)。
在某些实施方式中，肿瘤洗涤缓冲液还包含营养有效量的至少一种单糖。在一些实施方式中，所述单糖为葡萄糖。
在某些实施方式中，所述抗生素组分包含约50-600μg/mL浓度的万古霉素。在一些实施方式中，抗生素组分包含约100μg/mL浓度的万古霉素。在一些实施方式中，抗生素组分包含约400-600μg/mL浓度的克林霉素。在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL浓度的庆大霉素。在一些实施方式中，抗生素组分为约100μg/mL浓度的万古霉素。在一些实施方式中，抗生素组分包含抗生素组合，所述抗生素组合包含约50μg/mL的庆大霉素和约400-600μg/mL的克林霉素。在一些实施方式中，抗生素组分包含抗生素组合，所述抗生素组合包含约50μg/mL的庆大霉素和约100-600μg/mL的万古霉素。在一些实施方式中，抗生素组分包含抗生素组合，所述抗生素组合包含约50μg/mL的庆大霉素和约100μg/mL的万古霉素。
在一些实施方式中，抗生素组分还包含抗真菌性抗生素。在一些实施方式中，所述抗真菌性抗生素为双性霉素B。在一些实施方式中，所述双性霉素B的浓度为约2.5-10μg/mL。
在另一方面，本文提供了一种根据本文所述方法中的任一种制得的PBL。
附图说明
图1：提供步骤A至F的概述的示例性过程2A的图。
图2：过程2A-2C的过程流程图。
图3：显示冷冻保存的TIL示例性制造过程(约22天)的实施方式的图。
图4：显示过程2A的实施方式的图，该过程是用于TIL制造的22天过程。
图5：过程1C和过程2A的示例性实施方案中步骤A至步骤F的比较表。
图6：过程1C的实施方式和过程2A的实施方式的详细比较。
图7：用于肿瘤的示例性GEN 3型过程。
图8A-8F：A)显示2A过程(约22天的过程)与用于TIL制造的Gen 3过程的实施方式(约14天至16天的过程)之间的比较。B)示例性Gen3过程图，其提供步骤A至步骤F的概述(约14天至16天的过程)。C)提供三种示例性Gen 3过程的图，其概述了三种过程变化中每种各自的步骤A至步骤F(约14天至16天的过程)。D)示例性经修改的类Gen2过程，其提供步骤A至步骤F的概述(约22天的过程)。E)显示2A过程(约22天的过程)与用于TIL制造的Gen 3过程的实施方案(约14天至22天的过程)之间的比较。F)示例性PD-1Gen3过程图，其提供步骤A至步骤F的概述(约14天至22天的过程)。
图9：提供有关GEN 2(过程2A)与GEN 3之间的可比较性的实验流程图。
图10：显示各种Gen 2(2A过程)和Gen 3.1过程的实施方式之间的比较。
图11：描述Gen 2、Gen 2.1和Gen 3.0过程的实施方式的各种特征的表。
图12：Gen 3过程(称为Gen 3.1)的实施方式的培养基条件的概述。
图13：描述Gen 2、Gen 2.1及Gen 3.0过程的实施方式的各种特征的表。
图14：比较Gen 2与Gen 3.0过程的实施方式的各种特征的表。
图15：提供所述扩增过程的各种实施方式中培养基用途的表。
图16：Gen 3.0过程(16天过程)的示例性实施方式的示意图。
图17：使用Gen 3扩增平台扩增来自造血系统恶性肿瘤的T细胞的方法的示例性实施方式的示意图。
图18：提供结构I-A和I-B，圆柱体是指单个多肽结合结构域。结构I-A和I-B包含三个线性连接的衍生自例如4-1BBL或结合4-1BB的抗体的TNFRSF结合结构域，其折叠形成三价蛋白质，该三价蛋白质接着通过IgG1-Fc(包含CH3及CH2结构域)与另一个三价蛋白质连接，随后通过二硫键(小的细长椭圆形)将两个三价蛋白质连接在一起，由此使结构稳定并提供能够将六个受体的细胞内信号传导结构域与信号传导蛋白结合在一起形成信号传导复合物的激动剂。表示为圆柱体的TNFRSF结合结构域可以是包括例如由接头连接的VH和VL链的scFv结构域，该接头可包括亲水性残基和提供灵活性的Gly与Ser序列，以及提供溶解性的Glu与Lys。
图19：Gen 3过程(16天的过程)的示例性实施方式的示意图。
图20：提供Gen 3.1过程(16天的过程)的示例性实施方式(Gen 3.1测试)的过程概述。
图21：Gen 3.1测试(Gen 3.1最佳化)过程(16-17天的方法)的示例性实施方式的示意图。
图22：Gen 3过程(16天的过程)的示例性实施方式的示意图。
图23A-23B：示例性Gen 2与示例性Gen 3过程的比较表，其中突出显示示例性差异。
图24：Gen 3过程(16天或17天的过程)制备时刻表的示例性实施方式的示意图。
图25：Gen 3过程(14-16天的过程)的示例性实施方式的示意图。
图26A-26B：Gen 3过程(16天的过程)的示例性实施方式的示意图。
图27：Gen 3过程(16天的过程)的示例性实施方式的示意图。
图28：Gen 2、Gen 2.1与Gen 3过程的实施方式(16天的过程)的比较。
图29：Gen 2、Gen 2.1与Gen 3过程的实施方式(16天的过程)的比较。
图30：Gen 3实施方式组分。
图31：Gen 3实施方式流程图比较(Gen 3.0、Gen 3.1对照、Gen 3.1测试)。
图32：显示Gen 3过程(最佳化Gen 3，16-17天的过程)的示例性实施方式的组分。
图33：验收标准表。
图34：总结与各种抗生素一起孵育过夜的肿瘤中总活细胞的图。
图35：总结在各种抗生素存在下进行11天预REP程序培养的肿瘤的总活细胞的图。
序列表的简要说明
SEQ ID NO：1是莫罗单抗(muromonab)重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO：2是莫罗单抗(muromonab)轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO：3是重组人IL-2蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：4是阿地白介素(aldesleukin)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：5是一种IL-2形式。
SEQ ID NO：6是内维白介素α(nemvaleukin alfa)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：7是一种IL-2形式。
SEQ ID NO：8是粘蛋白结构域多肽。
SEQ ID NO：9是重组人IL-4蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO：10是重组人IL-7蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO：11是重组人IL-15蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO：12是重组人IL-21蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO：13是IL-2序列。
SEQ ID NO：14是IL-2突变蛋白序列。
SEQ ID NO：15是IL-2突变蛋白序列。
SEQ ID NO：16是IgG.IL2R67A.H1的HCDR1_IL-2。
SEQ ID NO：17是IgG.IL2R67A.H1的HCDR2。
SEQ ID NO：18是IgG.IL2R67A.H1的HCDR3。
SEQ ID NO：19是IgG.IL2R67A.H1的HCDR1_IL-2kabat。
SEQ ID NO：20是IgG.IL2R67A.H1的HCDR2 kabat。
SEQ ID NO：21是IgG.IL2R67A.H1的HCDR3 kabat。
SEQ ID NO：22是IgG.IL2R67A.H1的HCDR1_IL-2clothia。
SEQ ID NO：23是IgG.IL2R67A.H1的HCDR2 clothia。
SEQ ID NO：24是IgG.IL2R67A.H1的HCDR3 clothia。
SEQ ID NO：25是IgG.IL2R67A.H1的HCDR1_IL-2IMGT。
SEQ ID NO：26是IgG.IL2R67A.H1的HCDR2 IMGT。
SEQ ID NO：27是IgG.IL2R67A.H1的HCDR3 IMGT。
SEQ ID NO：28是IgG.IL2R67A.H1的VH链。
SEQ ID NO：29是IgG.IL2R67A.H1的重链。
SEQ ID NO：30是IgG.IL2R67A.H1的LCDR1 kabat。
SEQ ID NO：31是IgG.IL2R67A.H1的LCDR2 kabat。
SEQ ID NO：32是IgG.IL2R67A.H1的LCDR3 kabat。
SEQ ID NO：33是IgG.IL2R67A.H1的LCDR1 chothia。
SEQ ID NO：34是IgG.IL2R67A.H1的LCDR2 chothia。
SEQ ID NO：35是IgG.IL2R67A.H1的LCDR3 chothia。
SEQ ID NO：36是VL链。
SEQ ID NO：37是轻链。
SEQ ID NO：38是轻链。
SEQ ID NO：39是轻链。
SEQ ID NO：40是人4-1BB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：41是鼠4-1BB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：42是4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗(utomilumab)(PF-05082566)的重链。
SEQ ID NO：43是4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗(PF-05082566)的轻链。
SEQ ID NO：44是4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗(PF-05082566)的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：45是4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗(PF-05082566)的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：46是4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗(PF-05082566)的重链CDR1。
SEQ ID NO：47是4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗(PF-05082566)的重链CDR2。
SEQ ID NO：48是4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗(PF-05082566)的重链CDR3。
SEQ ID NO：49是4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗(PF-05082566)的轻链CDR1。
SEQ ID NO：50是4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗(PF-05082566)的轻链CDR2。
SEQ ID NO：51是4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗(PF-05082566)的轻链CDR3。
SEQ ID NO：52是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(urelumab)(BMS-663513)的重链。
SEQ ID NO：53是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的轻链。
SEQ ID NO：54是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：55是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：56是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的重链CDR1。
SEQ ID NO：57是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的重链CDR2。
SEQ ID NO：58是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的重链CDR3。
SEQ ID NO：59是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的轻链CDR1。
SEQ ID NO：60是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的轻链CDR2。
SEQ ID NO：61是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的轻链CDR3。
SEQ ID NO：62是TNFRSF激动剂融合蛋白的Fc结构域。
SEQ ID NO：63是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：64是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：65是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：66是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：67是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：68是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：69是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：70是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：71是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：72是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：73是TNFRSF激动剂融合蛋白的Fc结构域。
SEQ ID NO：74是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：75是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：76是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：77是4-1BB配体(4-1BBL)氨基酸序列。
SEQ ID NO：78是4-1BBL多肽的可溶部分。
SEQ ID NO：79是4-1BB激动剂抗体4B4-1-1版本1的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：80是4-1BB激动剂抗体4B4-1-1版本1的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：81是4-1BB激动剂抗体4B4-1-1版本2的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：82是4-1BB激动剂抗体4B4-1-1版本2的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：83是4-1BB激动剂抗体H39E3-2的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：84是4-1BB激动剂抗体H39E3-2的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：85是人OX40的氨基酸序列。
SEQ ID NO：86是鼠OX40的氨基酸序列。
SEQ ID NO：87是OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(tavolixizumab)(MEDI-0562)的重链。
SEQ ID NO：88是OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(MEDI-0562)的轻链。
SEQ ID NO：89是OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(MEDI-0562)的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：90是OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(MEDI-0562)的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：91是OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(MEDI-0562)的重链CDR1。
SEQ ID NO：92是OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(MEDI-0562)的重链CDR2。
SEQ ID NO：93是OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(MEDI-0562)的重链CDR3。
SEQ ID NO：94是OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(MEDI-0562)的轻链CDR1。
SEQ ID NO：95是OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(MEDI-0562)的轻链CDR2。
SEQ ID NO：96是OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(MEDI-0562)的轻链CDR3。
SEQ ID NO：97是OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链。
SEQ ID NO：98是OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链。
SEQ ID NO：99是OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：100是OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：101是OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链CDR1。
SEQ ID NO：102是OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链CDR2。
SEQ ID NO：103是OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链CDR3。
SEQ ID NO：104是OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链CDR1。
SEQ ID NO：105是OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链CDR2。
SEQ ID NO：106是OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链CDR3。
SEQ ID NO：107是OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链。
SEQ ID NO：108是OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链。
SEQ ID NO：109是OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：110是OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：111是OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链CDR1。
SEQ ID NO：112是OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链CDR2。
SEQ ID NO：113是OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链CDR3。
SEQ ID NO：114是OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链CDR1。
SEQ ID NO：115是OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链CDR2。
SEQ ID NO：116是OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链CDR3。
SEQ ID NO：117是OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：118是OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：119是OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的重链CDR1。
SEQ ID NO：120是OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的重链CDR2。
SEQ ID NO：121是OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的重链CDR3。
SEQ ID NO：122是OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的轻链CDR1。
SEQ ID NO：123是OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的轻链CDR2。
SEQ ID NO：124是OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的轻链CDR3。
SEQ ID NO：125是OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：126是OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：127是OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的重链CDR1。
SEQ ID NO：128是OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的重链CDR2。
SEQ ID NO：129是OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的重链CDR3。
SEQ ID NO：130是OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的轻链CDR1。
SEQ ID NO：131是OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的轻链CDR2。
SEQ ID NO：132是OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的轻链CDR3。
SEQ ID NO：133是OX40配体(OX40L)氨基酸序列。
SEQ ID NO：134是OX40L多肽的可溶部分。
SEQ ID NO：135是OX40L多肽的替代性可溶部分。
SEQ ID NO：136是OX40激动剂单克隆抗体008的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：137是OX40激动剂单克隆抗体008的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：138是OX40激动剂单克隆抗体011的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：139是OX40激动剂单克隆抗体011的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：140是OX40激动剂单克隆抗体021的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：141是OX40激动剂单克隆抗体021的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：142是OX40激动剂单克隆抗体023的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：143是OX40激动剂单克隆抗体023的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：144是OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：145是OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：146是OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：147是OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：148是人源化OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：149是人源化OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：150是人源化OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：151是人源化OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：152是人源化OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：153是人源化OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：154是人源化OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：155是人源化OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：156是OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：157是OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：158是PD-1抑制剂纳武单抗(nivolumab)的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO：159是PD-1抑制剂纳武单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO：160是PD-1抑制剂纳武单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO：161是PD-1抑制剂纳武单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO：162是PD-1抑制剂纳武单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：163是PD-1抑制剂纳武单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：164是PD-1抑制剂纳武单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：165是PD-1抑制剂纳武单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：166是PD-1抑制剂纳武单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：167是PD-1抑制剂纳武单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：168是PD-1抑制剂帕博利珠单抗(pembrolizumab)的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO：169是PD-1抑制剂帕博利珠单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO：170是PD-1抑制剂帕博利珠单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO：171是PD-1抑制剂帕博利珠单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO：172是PD-1抑制剂帕博利珠单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：173是PD-1抑制剂帕博利珠单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：174是PD-1抑制剂帕博利珠单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：175是PD-1抑制剂帕博利珠单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：176是PD-1抑制剂帕博利珠单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：177是PD-1抑制剂帕博利珠单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：178是PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗(durvalumab)的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO：179是PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO：180是PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO：181是PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO：182是PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：183是PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：184是PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：185是PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：186是PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：187是PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：188是PD-L1抑制剂阿维鲁单抗(avelumab)的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO：189是PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO：190是PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO：191是PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO：192是PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：193是PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：194是PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：195是PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：196是PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：197是PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：198是PD-L1抑制剂阿替利珠单抗(atezolizumab)的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO：199是PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO：200是PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO：201是PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO：202是PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：203是PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：204是PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：205是PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：206是PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：207是PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：208是CTLA-4抑制剂伊匹木单抗(ipilimumab)的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO：209是CTLA-4抑制剂伊匹木单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO：210是CTLA-4抑制剂伊匹木单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO：211是CTLA-4抑制剂伊匹木单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO：212是CTLA-4抑制剂伊匹木单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：213是CTLA-4抑制剂伊匹木单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：214是CTLA-4抑制剂伊匹木单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：215是CTLA-4抑制剂伊匹木单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：216是CTLA-4抑制剂伊匹木单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：217是CTLA-4抑制剂伊匹木单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：218是CTLA-4抑制剂曲美单抗(tremelimumab)的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO：219是CTLA-4抑制剂曲美单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO：220是CTLA-4抑制剂曲美单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO：221是CTLA-4抑制剂曲美单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO：222是CTLA-4抑制剂曲美单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：223是CTLA-4抑制剂曲美单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：224是CTLA-4抑制剂曲美单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：225是CTLA-4抑制剂曲美单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：226是CTLA-4抑制剂曲美单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：227是CTLA-4抑制剂曲美单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：228是CTLA-4抑制剂泽弗利单抗(zalifrelimab)的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO：229是CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO：230是CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO：231是CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO：232是CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：233是CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：234是CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：235是CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：236是CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：237是CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
具体实施方式
I.引言
利用通过快速扩增方案(REP)离体培养的TIL的过继性细胞疗法已在患有癌症的患者的宿主免疫抑制之后产生成功的过继性细胞疗法。当前输注接受参数依赖于TIL的组成的读数(例如CD28、CD8或CD4阳性率)以及REP产物的扩增倍数和存活率。
当前REP方案几乎不了解将被输注至患者体内的TIL的健康状况。T细胞在其自初始T细胞至效应T细胞的成熟过程中经历了深刻的代谢转变(参见Chang等人,《自然·免疫学(Nat.Immunol.)》2016,17,364，特此以全文明确地并入，尤其是关于厌氧及好氧代谢的论述及标记物)。例如，初始T细胞依赖于粒线体呼吸来产生ATP，而成熟、健康的效应T细胞，例如TIL，则为高度糖酵解的，依赖于好氧性糖酵解来提供其增殖、迁移、活化及抗肿瘤功效所需的生物能量底物。
当前的TIL制造及治疗方法受到持续时间、成本、无菌性问题及本文所述的其他因素的限制，使得治疗癌症患者的潜力受到严重限制。迫切需要提供TIL制造方法以及基于此类方法的疗法，此类方法适合用于治疗有极少或无可行的治疗选择方案的患者。
本文提供了可用于制造TIL治疗剂的肿瘤储存组合物和细胞培养基。该试剂允许制造高质量TIL治疗剂，同时降低微生物生物负荷并在TIL制造过程中提供无菌保障。具体地，本文提供的肿瘤储存组合物有利地使细菌(例如革兰氏阴性及革兰氏阳性细菌物种)及真菌污染减到最少，同时不会明显影响细胞存活率。另外的，在所主张的细胞培养基中培养的淋巴细胞能够在具有极少细菌(例如革兰氏阳性及革兰氏阴性细菌)和/或真菌污染情况下进行分化、耗竭和/或活化。
II.定义
除非另有定义，否则本文所用的所有技术及科学术语具有与本发明所属领域技术人员通常所理解的含义相同的含义。本文所提及的所有专利和出版物均以全文引用的方式并入本文中。
如本文所用，术语“共同施用”、“共同给药”、“与……组合施用”、“与……联合施用”、“同时”和“同期”涵盖向受试者施用两种以上活性药物成分(在本发明的一些实施方式中，例如多个TIL)以使得两种活性药物成分和/或其代谢物同时存在于受试者中。共同施用包括以分开的组合物形式同时施用、以分开的组合物形式在不同时间施用或以存在两种以上活性药物成分的组合物形式施用。优选地，以分开的组合物形式同时施用以及以其中存在两种试剂的组合物形式施用。
术语“体内”指在受试者身体内发生的事件。
术语“体外”指在受试者身体外发生的事件。体外分析涵盖采用活细胞或死细胞的基于细胞的分析，亦可涵盖不采用完整细胞的不含细胞的分析。
术语“离体”指涉及对已自受试者身体取出的细胞、组织和/或器官进行治疗或执行程序的事件。适当地，细胞、组织和/或器官可利用手术或治疗方法返回至受试者内。
术语“快速扩增”指抗原特异性TIL的数目在一周时间内增加至少约3倍(或4倍、5倍、6倍、7倍、8倍或9倍)，更优选地在一周时间内增加至少约10倍(或20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍或90倍)，或最优选在一周时间内增加至少约100倍。本文中描述了多种快速扩增方案。
在本文中“肿瘤浸润淋巴细胞”或“TIL”指最初作为已离开受试者血流且迁移至肿瘤中的白细胞而获得的细胞群。TIL包括(但不限于)CD8+细胞毒性T细胞(淋巴细胞)、Th1和Th17 CD4+T细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞以及M1巨噬细胞。TIL包括初代TIL和继代TIL两者。“初代TIL”是自如本文所概述的患者组织样本获得(有时称为“新鲜收集”)的细胞，“继代TIL”是如本文所论述的经扩增或增殖的任何TIL细胞群，包括但不限于主体TIL(bulkTIL)和经扩增的TIL(“REP TIL”或“post-REP TIL”)以及如本文所论述的“reREP TIL”。reREP TIL可包括例如第二扩增TIL或第二次另外的扩增TIL(例如图8的步骤D中所描述的TIL，包括称为reREP TIL的TIL)。细胞群可包含经基因修饰的TIL。
TIL一般可使用细胞表面标记物以生物化学方式定义，或根据其浸润肿瘤和实现治疗的能力以功能定义。TIL一般可通过表达以下生物标记物中的一种以上分类：CD4、CD8、TCRαβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1和CD25。另外的地和替代性地，TIL可根据其在重新引入患者体内后浸润实体肿瘤的能力以功能定义。TIL可进一步通过效力来表征，例如，若例如干扰素(IFN)释放量大于约50pg/mL、大于约100pg/mL、大于约150pg/mL或大于约200pg/mL，则可将TIL视为强效的。若例如干扰素(IFNγ)释放量大于约50pg/mL、大于约100pg/mL、大于约150pg/mL或大于约200pg/mL、大于约300pg/mL、大于约400pg/mL、大于约500pg/mL、大于约600pg/mL、大于约700pg/mL、大于约800pg/mL、大于约900pg/mL、大于约1000pg/mL，则可将TIL视为强效的。
在本文中“细胞群”(包括TIL)指许多具有共同特质的细胞。一般而言，群数目通常在1×106至1×1010的范围内，不同TIL群包含不同数目。例如，初代TIL在IL-2存在下的初始生长产生约1×108个细胞的主体TIL群。通常进行REP扩增以提供1.5×109至1.5×1010个细胞群用于输注。
本文中“冷冻保存的TIL”指在约-150℃至-60℃的范围内处理且储存TIL，无论是初代的、主体的还是经扩增的(REP TIL)。用于冷冻保存的通用方法也描述于本文别处，包括在实施例中描述。为了清楚起见，“冷冻保存的TIL”可与可用作初代TIL来源的冷冻组织样本区分。
本文中“解冻的冷冻保存的TIL”指先前经冷冻保存且随后处理以恢复至室温或更高温度(包括但不限于细胞培养温度或可向患者施用TIL的温度)的TIL群。
TIL通常可使用细胞表面标记物以生物化学方式定义，或根据其浸润肿瘤和实现治疗的能力以功能定义。TIL通常可通过表达以下生物标记物中的一种以上分类：CD4、CD8、TCRαβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1和CD25。另外的地和替代性地，TIL可根据其在重新引入患者体内后浸润实体肿瘤的能力以功能定义。
术语“冷冻保存培养基”或“冻存培养基”指可用于冷冻保存细胞的任何培养基。此类培养基可包括包含7％至10％ DMSO的培养基。示例性培养基包含CryoStor CS10、HypoThermosol以及它们的组合。术语“CS10”指获自Stemcell Technologies或BiolifeSolutions的冷冻保存培养基。CS10培养基可以商品名“CS10”来指代。CS10培养基是包含DMSO的无血清、无动物组分的培养基。
术语“中央记忆T细胞”指在人体内为CD45R0+且组成性表达CCR7(CCR7hi)和CD62L(CD62hi)的T细胞亚群。中央记忆T细胞的表面表型还包括TCR、CD3、CD127(IL-7R)和IL-15R。中央记忆T细胞的转录因子包括BCL-6、BCL-6B、MBD2和BMI1。中央记忆T细胞在TCR引发之后主要分泌IL-2和CD40L作为效应分子。中央记忆T细胞主要存在于血液的CD4隔室中，在人体中按比例富集于淋巴结和扁桃体中。
术语“效应记忆T细胞”指人或哺乳动物T细胞的亚群，如中央记忆T细胞，为CD45R0+，但已经失去对CCR7的组成性表达(CCR7lo)且对于CD62L表达而言为异质的或低的(CD62Llo)。中央记忆T细胞的表面表型还包括TCR、CD3、CD127(IL-7R)和IL-15R。中央记忆T细胞的转录因子包括BLIMP1。效应记忆T细胞在抗原刺激之后快速分泌高含量的炎性细胞因子，包括干扰素-γ、IL4-和IL-5。效应记忆T细胞主要存在于血液的CD8隔室中，在人体中按比例富集于肺、肝脏和肠道中。CD8+效应记忆T细胞携带大量的穿孔蛋白。
术语“密闭系统”指对外部环境密闭的系统。适用于细胞培养方法的任何密闭系统均可用于本发明的方法。密闭系统包括例如但不限于密闭G容器。一旦将肿瘤碎片添加至密闭系统中，该系统不对外部环境开放，直至TIL准备好向患者施用。
如本文所用，术语“破碎”、“碎片”和“破碎的”描述将肿瘤破坏的过程，包括机械破碎方法，例如压碎、切片、分割和粉碎肿瘤组织，以及任何其他用于破坏肿瘤组织的物理结构的方法。
术语“外周血单核细胞”和“PBMC”指具有圆形细胞核的外周血细胞，包括淋巴细胞(T细胞、B细胞、NK细胞)和单核细胞。当用作抗原呈递细胞(PBMC为一种类型的抗原呈递细胞)时，外周血单核细胞优选地是经辐照的同种异体外周血单核细胞。
术语“外周血淋巴细胞”和“PBL”指自外周血扩增的T细胞。在一些实施方式中，PBL从来自供体的全血或单采(apheresis)产物中分离出。在一些实施方式中，PBL通过正向或负向选择T细胞表型(例如CD3+CD45+的T细胞表型)而与来自供体的全血或单采产物分离。
术语“抗CD3抗体”指针对成熟T细胞的T细胞抗原受体中的CD3受体的抗体或其变体，例如单克隆抗体，包括人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、鼠或哺乳动物抗体。抗CD3抗体包括OKT-3，也称为莫罗单抗。抗CD3抗体还包括UHCT1克隆，也称为T3和CD3ε。其他抗CD3抗体包括例如奥昔珠单抗(otelixizumab)、替利珠单抗(teplizuma)和维西珠单抗(visilizumab)。
术语“OKT-3”(在本文中又称作“OKT3”)指针对成熟T细胞的T细胞抗原受体中的CD3受体的单克隆抗体或其生物类似物或变体，包括人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或鼠抗体，包括市售形式，例如OKT-3(30ng/mL，MACS GMP CD3纯，美国加利福尼亚州圣地亚哥美天旎生物技术有限公司(Miltenyi Biotech,Inc))和莫罗单抗或其变体、保守性氨基酸取代、糖型或生物类似物。莫罗单抗的重链和轻链的氨基酸序列在表1中给出(SEQ ID NO：1和SEQID NO：2)。能够产生OKT-3的杂交瘤保存于美国菌种保藏中心且所分配的ATCC登录号为CRL8001。能够产生OKT-3的杂交瘤也保存于欧洲认证细胞培养物保藏中心(ECACC)且所分配的目录号为86022706。
表1：莫罗单抗(示例性OKT-3抗体)的氨基酸序列
术语“IL-2”(在本文中也称为“IL2”)指称为白介素-2的T细胞生长因子，包括所有形式的IL-2，包括人和哺乳动物形式、保守性氨基酸取代、糖化形式、生物类似物及其变体。IL-2描述于例如Nelson,《免疫学杂志(J.Immunol.)》2004,172,3983-88；和Malek,《免疫学年度评论(Annu.Rev.Immunol.)》2008,26,453-79，其公开内容以引用的方式并入本文中。适用于本发明的重组人IL-2的氨基酸序列于表2中给出(SEQ ID NO：3)。例如，术语IL-2涵盖人重组形式的IL-2，例如阿地白介素(PROLEUKIN，可购自多个供应商，每单次使用小瓶含2200万IU)以及由美国新罕布什尔州次茅斯的CellGenix,Inc.或美国新泽西州东不伦瑞克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目录号CYT-209-b)供应的重组IL-2形式和来自其他供应商的其他商业等效物。阿地白介素(去丙胺酰基-1,丝氨酸-125人IL-2)是分子量为约15kDa的非糖基化人重组形式的IL-2。适用于本发明的阿地白介素的氨基酸序列于表2中给出(SEQ ID NO：4)。术语IL-2也涵盖如本文所述的聚乙二醇化形式的IL-2，包括聚乙二醇化IL2前药贝培阿地白介素(bempegaldesleukin)(NKTR-214，如SEQ ID NO：4所示的聚乙二醇化人重组IL-2，其中平均6个赖氨酸残基是经[(2,7-双{[甲基聚(氧乙烯)]氨基甲酰基}-9H-芴-9-基)甲氧基]羰基取代的N6)，其可购自美国加利福尼亚州南旧金山的NektarTherapeutics，或可通过本领域中已知的方法制备，例如国际专利申请公开第WO 2018/132496 A1号的实施例19中描述的方法或美国专利申请公开第US2019/0275133 A1号的实施例1中描述的方法，这些公开的公开内容以引用的方式并入本文中。适用于本发明的贝培阿地白介素(NKTR-214)及其他聚乙二醇化IL2分子描述于美国专利申请公开第US2014/0328791 A1号和国际专利申请公开第WO 2012/065086 A1号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。适用于本发明的替代形式的缀合的IL-2描述于美国专利第4,766,106号、第5,206,344号、第5,089,261号和第4,902,502号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。适用于本发明的IL-2制剂描述于美国专利第6,706,289号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施方式中，适用于本发明的IL-2形式为可购自Synthorx,Inc.的THOR-707。THOR-707和适用于本发明的其他替代形式的IL-2的制备和特性描述于美国专利申请公开第US2020/0181220 A1号和第US2020/0330601 A1号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施方式中，适用于本发明的IL-2形式为白介素2(IL-2)缀合物，其包含：分离纯化的IL-2多肽；以及在选自以下的氨基酸位置结合分离纯化的IL-2多肽的缀合部分：K35、T37、R38、T41、F42、K43、F44、Y45、E61、E62、E68、K64、P65、V69、L72和Y107，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO：5。在一些实施方式中，氨基酸位置选自T37、R38、T41、F42、F44、Y45、E61、E62、E68、K64、P65、V69、L72和Y107。在一些实施方式中，氨基酸位置选自T37、R38、T41、F42、F44、Y45、E61、E62、E68、P65、V69、L72和Y107。在一些实施方式中，氨基酸位置选自T37、T41、F42、F44、Y45、P65、V69、L72和Y107。在一些实施方式中，氨基酸位置选自R38和K64。在一些实施方式中，氨基酸位置选自E61、E62和E68。在一些实施方式中，氨基酸位置在E62。在一些实施方式中，选自K35、T37、R38、T41、F42、K43、F44、Y45、E61、E62、E68、K64、P65、V69、L72和Y107的氨基酸残基进一步突变成赖氨酸、半胱氨酸或组氨酸。在一些实施方式中，氨基酸残基突变成半胱氨酸。在一些实施方式中，氨基酸残基突变成赖氨酸。在一些实施方式中，选自K35、T37、R38、T41、F42、K43、F44、Y45、E61、E62、E68、K64、P65、V69、L72和Y107的氨基酸残基进一步突变成非天然氨基酸。在一些实施方式中，非天然氨基酸包括N6-叠氮基乙氧基-L-赖氨酸(AzK)、N6-炔丙基乙氧基-L-赖氨酸(PraK)、BCN-L-赖氨酸、降冰片烯赖氨酸、TCO-赖氨酸、甲基四嗪赖氨酸、烯丙氧基羰基赖氨酸、2-氨基-8-侧氧基壬酸、2-氨基-8-侧氧基辛酸、对乙酰基-L-苯丙氨酸、对叠氮基甲基-L-苯丙氨酸(pAMF)、对碘-L-苯丙氨酸、间乙酰基苯丙氨酸、2-氨基-8-侧氧基壬酸、对炔丙基氧基苯丙氨酸、对炔丙基-苯丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、L-多巴(L-Dopa)、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、O-烯丙基酪氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、磷酰基酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcp-丝氨酸、L-磷丝氨酸、磷酰基丝氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、2-氨基-3-((2-((3-(苯甲氧基)-3-侧氧基丙基)氨基)乙基)硒烷基)丙酸、2-氨基-3-(苯基硒烷基)丙酸或硒半胱氨酸。在一些实施方式中，相对于野生型IL-2多肽，IL-2缀合物与IL-2受体α(IL-2Rα)亚基的亲和力降低。在一些实施方式中，相对于野生型IL-2多肽，降低的亲和力是与IL-2Rα的结合亲和力降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或大于99％。在一些实施方式中，相对于野生型IL-2多肽，降低的亲和力是约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、30倍、50倍、100倍、200倍、300倍、500倍、1000倍或更大。在一些实施方式中，缀合部分削弱或阻断IL-2与IL-2Rα的结合。在一些实施方式中，缀合部分包括水溶性聚合物。在一些实施方式中，另外的缀合部分包括水溶性聚合物。在一些实施方式中，水溶性聚合物各自独立地包括聚乙二醇(PEG)、聚(丙二醇)(PPG)、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯吡咯啶酮)、聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)、聚(羟烷基甲基丙烯酸酯)、聚(糖)、聚(α-羟基酸)、聚(乙烯醇)、聚磷氮烯、聚恶唑啉(POZ)、聚(N-丙烯酰吗啉)或它们的组合。在一些实施方式中，水溶性聚合物各自独立地包括PEG。在一些实施方式中，PEG是线性PEG或支化PEG。在一些实施方式中，水溶性聚合物各自独立地包括多糖。在一些实施方式中，多糖包括聚葡萄糖、聚唾液酸(PSA)、玻尿酸(HA)、直链淀粉、肝素、硫酸乙酰肝素(HS)、糊精或羟乙基淀粉(HES)。在一些实施方式中，水溶性聚合物各自独立地包括聚糖。在一些实施方式中，水溶性聚合物各自独立地包括多胺。在一些实施方式中，缀合部分包括蛋白质。在一些实施方式中，另外的缀合部分包括蛋白质。在一些实施方式中，蛋白质各自独立地包括白蛋白、转铁蛋白(transferrin)或运甲状腺素蛋白(transthyretin)。在一些实施方式中，蛋白质各自独立地包括Fc部分。在一些实施方式中，蛋白质各自独立地包括IgG的Fc部分。在一些实施方式中，缀合部分包括多肽。在一些实施方式中，另外的缀合部分包括多肽。在一些实施方式中，多肽各自独立地包括XTEN肽、富甘氨酸高氨基酸聚合物(HAP)、PAS多肽、弹性蛋白样多肽(ELP)、CTP肽或明胶样蛋白质(GLK)聚合物。在一些实施方式中，分离纯化的IL-2多肽通过谷氨酰胺化修饰。在一些实施方式中，缀合部分直接结合分离纯化的IL-2多肽。在一些实施方式中，缀合部分通过接头间接结合分离纯化的IL-2多肽。在一些实施方式中，接头包括同型双官能接头。在一些实施方式中，同型双官能接头包括罗曼特氏试剂(Lomant's reagent)二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)DSP、3′3′-二硫代双(丙酸磺基琥珀酰亚胺酯)(DTSSP)、辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)、辛二酸双(磺基琥珀酰亚胺酯)(BS)、酒石酸二琥珀酰亚胺酯(DST)、酒石酸二磺基琥珀酰亚胺酯(磺基DST)、糖基双(琥珀酰亚胺基丁二酸)亚乙酯(EGS)、戊二酸二琥珀酰亚胺酯(DSG)、碳酸N,N′-二琥珀酰亚胺酯(DSC)、二亚胺代二酸二甲酯(DMA)、庚二亚胺酸二甲酯(DMP)、辛二亚胺酸二甲酯(DMS)、二甲基-3,3′-二硫代双丙酰亚胺酸酯(DTBP)、1,4-二(3′-(2′-吡啶基二硫基)丙酰胺基)丁烷(DPDPB)、双顺丁烯二酰亚胺基己烷(BMH)、含有芳基卤化物的化合物(DFDNB)(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯或1,3-二氟-4,6-二硝基苯)、4,4′-二氟-3,3′-二硝基苯基砜(DFDNPS)、双-[β-(4-叠氮基水杨基酰胺基)乙基]二硫化物(BASED)、甲醛、戊二醛、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、己二酸二酰肼、碳酰肼、邻甲苯胺、3,3′-二甲基联苯胺、联苯胺、α,α′-对二氨基联苯、二碘-对二甲苯磺酸、N,N′-亚乙基-双(碘乙酰胺)或N,N′-六亚甲基-双(碘乙酰胺)。在一些实施方式中，接头包括异型双官能接头。在一些实施方式中，异型双官能接头包括3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(sPDP)、长链3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(LC-sPDP)、水溶性长链3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(磺基-LC-sPDP)、琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫基)甲苯(sMPT)、磺基琥珀酰亚胺基-6-[α-甲基-α-(2-吡啶基二硫基)甲苯酰胺基]己酸酯(磺基-LC-sMPT)、琥珀酰亚胺基-4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(sMCC)、磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(磺基-sMCC)、间顺丁烯二酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBs)、间顺丁烯二酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-MBs)、(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯(sIAB)、(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-sIAB)、琥珀酰亚胺基-4-(对顺丁烯二酰亚胺基苯基)丁酸酯(sMPB)、磺基琥珀酰亚胺基-4-(对顺丁烯二酰亚胺基苯基)丁酸酯(磺基-sMPB)、N-(γ-顺丁烯二酰亚胺基丁酰氧基)琥珀酰亚胺酯(GMBs)、N-(γ-顺丁烯二酰亚胺基丁酰氧基)磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-GMBs)、6-((碘乙酰基)氨基)己酸琥珀酰亚胺酯(sIAX)、6-[6-(((碘乙酰基)氨基)己酰基)氨基]己酸琥珀酰亚胺酯(sIAXX)、4-(((碘乙酰基)氨基)甲基)环己烷-1-甲酸琥珀酰亚胺酯(sIAC)、6-(((((4-碘乙酰基)氨基)甲基)环己烷-1-羰基)氨基)己酸琥珀酰亚胺酯(sIACX)、碘乙酸对硝苯酯(NPIA)、羰基反应性和硫氢基反应性交联剂，例如4-(4-N-顺丁烯二酰亚胺基苯基)丁酸酰肼(MPBH)、4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-酰肼-8(M2C2H)、3-(2-吡啶基二硫基)丙酰基酰肼(PDPH)、N-羟基琥珀酰亚胺基-4-叠氮水杨酸(NHs-AsA)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮水杨酸(磺基-NHs-AsA)、磺基琥珀酰亚胺基-(4-叠氮水杨基酰胺基己酸酯(磺基-NHs-LC-AsA)、磺基琥珀酰亚胺基-2-(对叠氮水杨基酰胺基)乙基-1,3′-二硫丙酸酯(sAsD)、N-羟基琥珀酰亚胺基-4-叠氮苯甲酸酯(HsAB)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮苯甲酸酯(磺基-HsAB)、N-琥珀酰亚胺基-6-(4′-叠氮基-2′-硝基苯基氨基)己酸酯(sANPAH)、磺基琥珀酰亚胺基-6-(4'-叠氮基-2'-硝基苯基氨基)己酸酯(磺基-sANPAH)、N-5-叠氮基-2-硝基苯甲酰氧基丁二酰亚胺(ANB-NOs)、磺基琥珀酰亚胺基-2-(间叠氮基-邻硝基苯甲酰胺基)-乙基-1,3'-二硫丙酸酯(sAND)、N-琥珀酰亚胺基-4(4-叠氮苯基)1,3'-二硫丙酸酯(sADP)、(4-叠氮苯基)-1,3'-二硫丙酸N-磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-sADP)、4-(对叠氮苯基)丁酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-sAPB)、2-(7-叠氮基-4-甲基香豆素-3-乙酰胺)乙基-1,3'-二硫丙酸磺基琥珀酰亚胺酯(sAED)、7-叠氮基-4-甲基香豆素-3-乙酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-sAMCA)、重氮丙酮酸对硝苯酯(ρNPDP)、对硝苯基-2-重氮-3,3,3-三氟丙酸酯(PNP-DTP)、1-(对叠氮基水杨基酰胺基)-4-(碘乙酰胺基)丁烷(AsIB)、N-[4-(对叠氮基水杨基酰胺基)丁基]-3'-(2'-吡啶基二硫基)丙酰胺(APDP)、二苯甲酮-4-碘乙酰胺、对叠氮基苯甲酰基酰肼(ABH)、4-(对叠氮基水杨基酰胺基)丁胺(AsBA)或对叠氮苯基乙二醛(APG)。在一些实施方式中，接头包括可裂解接头，可选地包括二肽接头。在一些实施方式中，二肽接头包括Val-Cit、Phe-Lys、Val-Ala或Val-Lys。在一些实施方式中，接头包括不可裂解接头。在一些实施方式中，接头包括顺丁烯二酰亚胺基，可选地包括顺丁烯二酰亚胺基己酰基(mc)、琥珀酰亚胺基-4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(sMCC)或磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(磺基-sMCC)。在一些实施方式中，接头进一步包括间隔子。在一些实施方式中，间隔子包括对氨基苯甲基醇(PAB)、对氨基苯甲氧基羰基(PABC)、其衍生物或类似物。在一些实施方式中，缀合部分能够延长IL-2缀合物的血清半衰期。在一些实施方式中，另外的缀合部分能够延长IL-2缀合物的血清半衰期。在一些实施方式中，适用于本发明的IL-2形式为本文所述的任一种IL-2形式的片段。在一些实施方式中，适用于本发明的IL-2形式是如美国专利申请公开US2020/0181220 A1号和美国专利申请公开US2020/0330601 A1号中所公开的聚乙二醇化。在一些实施方式中，适用于本发明的IL-2形式为IL-2缀合物，其包括：IL-2多肽，其包括N6-叠氮基乙氧基-赖氨酸(AzK)，其共价连接于包括聚乙二醇(PEG)的缀合部分，其中：IL-2多肽包含与SEQ ID NO：5具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；以及参照SEQ IDNO：5中的氨基酸位置对于位置K35、F42、F44、K43、E62、P65、R38、T41、E68、Y45、V69或L72处的氨基酸的AzK取代物。在一些实施方式中，IL-2多肽包括相对于SEQ ID NO：5的一个残基的N端缺失。在一些实施方式中，适用于本发明的IL-2形式缺乏IL-2Rα链接合，但保持与中间亲和力IL-2Rβ-γ信号传导复合物的正常结合。在一些实施方式中，适用于本发明的IL-2形式为IL-2缀合物，其包括：IL-2多肽，其包括N6-叠氮基乙氧基-赖氨酸(AzK)，其共价连接至包括聚乙二醇(PEG)的缀合部分，其中：IL-2多肽包含与SEQ ID NO：5具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及参照SEQ ID NO：5中的氨基酸位置对于位置K35、F42、F44、K43、E62、P65、R38、T41、E68、Y45、V69或L72处的氨基酸的AzK取代物。在一些实施方式中，适用于本发明的IL-2形式为IL-2缀合物，其包括：IL-2多肽，其包括N6-叠氮基乙氧基-赖氨酸(AzK)，其共价连接于包括聚乙二醇(PEG)的缀合部分，其中：IL-2多肽包含与SEQ ID NO：5具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；以及参照SEQ ID NO：5中的氨基酸位置对于位置K35、F42、F44、K43、E62、P65、R38、T41、E68、Y45、V69或L72处的氨基酸的AzK取代物。在一些实施方式中，适用于本发明的IL-2形式为IL-2缀合物，其包括：IL-2多肽，其包括N6-叠氮基乙氧基-赖氨酸(AzK)，其共价连接于包括聚乙二醇(PEG)的缀合部分，其中：IL-2多肽包含与SEQ ID NO：5具有至少98％序列同一性的氨基酸序列；以及参照SEQ ID NO：570中的氨基酸位置对于位置K35、F42、F44、K43、E62、P65、R38、T41、E68、Y45、V69或L72处的氨基酸的AzK取代物。
在一些实施方式中，适用于本发明的IL-2形式的内维白介素α(也称为ALKS-4230(SEQ ID NO：571)，其购自阿尔凯默斯公司(Alkermes,Inc.))。内维白介素α也被称为人白介素2片段(1-59)变体(Cys125>Ser51)，其通过肽基接头(60GG61)融合至人白介素2片段(62-132)，通过肽基接头(133GSGGGS138)融合至人白介素2受体α链片段(139-303)，在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生，经糖基化；人白介素2(IL-2)(75-133)-肽[Cys125(51)>Ser]-突变体(1-59)，其通过G2肽接头(60-61)融合至人白介素2(IL-2)(4-74)-肽(62-132)且通过GSG3S肽接头(133-138)融合至人白介素2受体α链(IL2R亚基α、IL2Rα、IL2RA)(1-165)-肽(139-303)，在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生，糖化形式α。内维白介素α的氨基酸序列为SEQ IDNO：571中所示。在一些实施方式中，内维白介素α展现以下翻译后修饰：在以下位置处的二硫键：31-116、141-285、184-242、269-301、166-197或166-199、168-199或168-197(使用SEQID NO：571中的编号)，和使用SEQ ID NO：571中的编号在位置N187、N206、T212处的糖基化位点。内维白介素α以及适用于本发明的其他替代形式的IL-2的制备和特性描述于美国专利申请公开第US2021/0038684 A1号和美国专利第10,183,979号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施方式中，适用于本发明的IL-2形式为与SEQ ID NO：571具有至少80％、至少90％、至少95％或至少90％序列同一性的蛋白质。在一些实施方式中，适用于本发明的IL-2形式具有SEQ ID NO：571中所示的氨基酸序列或其保守性氨基酸取代。在一些实施方式中，适用于本发明的IL-2形式为包括SEQ ID NO：572的氨基酸24-452或其变体、片段或衍生物的融合蛋白。在一些实施方式中，适用于本发明的IL-2形式为包含与SEQ IDNO：572的氨基酸24-452或其变体、片段或衍生物具有至少80％、至少90％、至少95％或至少90％序列同一性的氨基酸序列的融合蛋白。适合用于本发明的其他IL-2形式描述于美国专利第10,183,979号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。可选地，在一些实施方式中，适用于本发明的IL-2形式为包含第一融合伴侣的融合蛋白，该第一融合伴侣通过粘蛋白结构域多肽接头与第二融合伴侣连接，其中该第一融合伴侣为IL-1Rα或与IL-1Rα具有至少98％氨基酸序列同一性并且具有IL-Rα的受体拮抗剂活性的蛋白质，该第二融合伴侣包括全部或部分包括Fc区的免疫球蛋白，其中该粘蛋白结构域多肽接头包括SEQ ID NO：573或与SEQ ID NO：573具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，融合蛋白的半衰期与第一融合伴侣在没有粘蛋白结构域多肽接头的情况下与第二融合伴侣的融合相比有所改善。
表2：白介素的氨基酸序列
在一些实施方式中，适用于本发明的IL-2形式包括抗体细胞因子移植蛋白，该抗体细胞因子移植蛋白包含：重链可变区(VH)，其包括互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3；轻链可变区(VL)，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3；和IL-2分子或其片段，其移植至VH或VL的CDR中，其中该抗体细胞因子移植蛋白优先于调节性T细胞扩增T效应细胞。在一些实施方式中，抗体细胞因子移植蛋白包含重链可变区(VH)，其包含互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3；轻链可变区(VL)，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3；和IL-2分子或其片段，其移植至VH或VL的CDR中，其中该IL-2分子为突变蛋白，该抗体细胞因子移植蛋白优先于调节性T细胞扩增T效应细胞。在一些实施方式中，IL-2方案包括施用美国专利申请公开第US2020/0270334 A1号中所描述的抗体，该公开的公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施方式中，抗体细胞因子移植蛋白包含：重链可变区(VH)，其包含互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3；轻链可变区(VL)，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3；和IL-2分子或其片段，其移植至VH或VL的CDR中；其中IL-2分子是突变蛋白(mutein)，相对于调节性T细胞，抗体细胞因子移植蛋白优先扩增T效应细胞，该抗体还包含IgG类重链和IgG类轻链，其选自如下：包含SEQ ID NO：39的IgG类轻链和包含SEQ IDNO：38的IgG类重链；包含SEQ ID NO：37的IgG类轻链和包含SEQ ID NO：29的IgG类重链；包含SEQ ID NO：39的IgG类轻链和包含SEQ ID NO：29的IgG类重链；以及包含SEQ ID NO：37的IgG类轻链和包含SEQ ID NO：38的IgG类重链。
在一些实施方式中，IL-2分子或其片段移植至VH的HCDR1中，其中IL-2分子为突变蛋白。在一些实施方式中，IL-2分子或其片段移植至VH的HCDR2中，其中IL-2分子为突变蛋白。在一些实施方式中，IL-2分子或其片段移植至VH的HCDR3中，其中IL-2分子为突变蛋白。在一些实施方式中，IL-2分子或其片段移植至VL的LCDR1中，其中IL-2分子为突变蛋白。在一些实施方式中，IL-2分子或其片段移植至VL的LCDR2中，其中IL-2分子为突变蛋白。在一些实施方式中，IL-2分子或其片段移植至VL的LCDR3中，其中IL-2分子为突变蛋白。
IL-2分子的插入可在CDR的N端区处或附近，在CDR的中间区中，或在CDR的C端区处或附近。在一些实施方式中，抗体细胞因子移植蛋白包含并入CDR中的IL-2分子，其中IL2序列不会将CDR序列框移。在一些实施方式中，抗体细胞因子移植蛋白包含并入CDR中的IL-2分子，其中IL-2序列置换CDR序列的全部或一部分。IL-2分子置换可在CDR的N端区处，在CDR的中间区中，或在CDR的C端区处或附近。IL-2分子置换可少至CDR序列或整个CDR序列的一或两个氨基酸。
在一些实施方式中，IL-2分子直接移植至无肽接头的CDR中，其中在CDR序列与IL-2序列之间没有另外的氨基酸。在一些实施方式中，IL-2分子间接移植至具有肽接头的CDR中，其中CDR序列与IL-2序列之间存在一个以上另外的氨基酸。
在一些实施方式中，本文所述的IL-2分子为IL-2突变蛋白。在一些情况下，IL-2突变蛋白包含R67A取代。在一些实施方式中，IL-2突变蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15。在一些实施方式中，IL-2突变蛋白包含美国专利申请公开第US2020/0270334 A1号中表1中的氨基酸序列，该公开的公开内容以引用的方式并入本文。
在一些实施方式中，抗体细胞因子移植蛋白包含选自如下的的HCDR1：SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：25。在一些实施方式中，抗体细胞因子移植蛋白质包含选自如下的的HCDR1：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：543和SEQ IDNO：16。在一些实施方式中，抗体细胞因子移植蛋白包含选自如下的HCDR1：选自SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：26的HCDR2。在一些实施方式中，抗体细胞因子移植蛋白包含选自如下的HCDR3：SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：24和SEQ IDNO：27。在一些实施方式中，抗体细胞因子移植蛋白包含VH区，其包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列。在一些实施方式中，抗体细胞因子移植蛋白包含重链，其包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列。在一些实施方式中，抗体细胞因子移植蛋白包含VL区，其包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列。在一些实施方式中，抗体细胞因子移植蛋白包含轻链，其包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列。在一些实施方式中，抗体细胞因子移植蛋白包含VH区，其包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列；和VL区，其包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列。在一些实施方式中，抗体细胞因子移植蛋白包含重链区，其包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列；以及轻链区，其包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列。在一些实施方式中，抗体细胞因子移植蛋白包含重链区，其包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列；以及轻链区，其包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列。在一些实施方式中，抗体细胞因子移植蛋白包含重链区，其包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列；以及轻链区，其包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列。在一些实施方式中，抗体细胞因子移植蛋白包含重链区，其包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列；以及轻链区，其包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列。在一些实施方式中，抗体细胞因子移植蛋白包含美国专利申请公开第2020/0270334A1号的IgG.IL2F71A.H1或IgG.IL2R67A.H1或其变体、衍生物或片段，或其保守性氨基酸取代，或与其具有至少80％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性的蛋白质。在一些实施方式中，本文所述的抗体细胞因子移植蛋白的抗体组分包含帕利珠单抗的免疫球蛋白序列、框架序列或CDR序列。在一些实施方式中，本文所述的抗体细胞因子移植蛋白的血清半衰期比野生型IL-2分子(例如但不限于阿地白介素或可比分子)长。在一些实施方式中，本文所述的抗体细胞因子移植蛋白具有如表3中所列的序列。
表3：示例性帕利珠单抗(palivizumab)抗体-IL-2移植蛋白的序列
术语“IL-4”(在本文中也称为“IL4”)指被称为白介素4的细胞因子，其由Th2T细胞和嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞产生。IL-4调节初始辅助T细胞(Th0细胞)分化成Th2 T细胞。Steinke和Borish，《呼吸研究(Respir.Res.)》2001,2,66-70。在由IL-4活化后，Th2 T细胞随后以正反馈回路产生另外的IL-4。IL-4也刺激B细胞增殖和II类MHC表达，诱导来自B细胞的类别转换为IgE和IgG1表达。适用于本发明的重组人IL-4可购自多个供应商，包括美国新泽西州东不伦瑞克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目录号CYT-211)和美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的ThermoFisher Scientific，Inc.(人IL-15重组蛋白，目录号Gibco CTP0043)。适用于本发明的重组人IL-4的氨基酸序列于表2中给出(SEQ ID NO：5)。
术“IL-7”(在本文中也称为“IL7”)指称为白介素7的糖基化的组织衍生性细胞因子，其可获自基质和上皮细胞以及树突状细胞。Fry和Mackall,《血液(Blood)》2002，99，3892-904。IL-7可以刺激T细胞的发育。IL-7与IL-7受体(一种由IL-7受体α和共同γ链受体组成的异二聚体)结合，其属于对于T细胞在胸腺内的发育和在周边内的存活而言重要的一系列信号。适用于本发明的重组人IL-7可购自多个供应商，包括美国新泽西州东不伦瑞克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目录号CYT-254)和美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的ThermoFisher Scientific,Inc.(人IL-15重组蛋白，目录号Gibco PHC0071)。适用于本发明的重组人IL-7的氨基酸序列于表2中给出(SEQ ID NO：6)。
术语“IL-15”(在本文中也称为“IL15”)指称为白介素-15的T细胞生长因子，包括所有形式的IL-2，包括人和哺乳动物形式、保守性氨基酸取代、糖化形式、生物类似物及其变体。IL-15描述于例如Fehniger和Caligiuri的《血液》2001,97,14-32中，其公开内容以引用的方式并入本文中。IL-15与IL-2共用β和γ信号传导受体亚基。重组人IL-15为分子质量为12.8kDa的含有114个氨基酸(和N端甲硫氨酸)的单一非糖基化多肽链。重组人IL-15可购自多个供应商，包括美国新泽西州东不伦瑞克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目录号CYT-230-b)和美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的ThermoFisher Scientific,Inc.(人IL-15重组蛋白，目录号34-8159-82)。适用于本发明的重组人IL-15的氨基酸序列于表2中给出(SEQID NO：7)。
术语“IL-21”(在本文中也称为“IL21”)指称为白介素-21的多效性细胞因子蛋白，包括所有形式的IL-21，包扩人和哺乳动物形式、保守性氨基酸取代、糖化形式、生物类似物及其变体。IL-21描述于例如Spolski和Leonard，《自然综述：药物发现(Nat.Rev.Drug.Disc.)》2014,13,379-95，其公开内容以引用的方式并入本文中。IL-21主要通过自然杀伤T细胞和经活化的人CD4+T细胞产生。重组人IL-21是分子质量为15.4kDa的含有132个氨基酸的单一非糖基化多肽链。重组人IL-21可购自多个供应商，包扩美国新泽西州东不伦瑞克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目录号CYT-408-b)和美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的ThermoFisher Scientific,Inc.(人IL-21重组蛋白，目录号14-8219-80)。适用于本发明的重组人IL-21的氨基酸序列于表2中给出(SEQ ID NO：8)。
当指示“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，本发明的组合物待施用的精确量可由医师考虑患者(受试者)的年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移程度和病状的个体差异来确定。通常可以说本文所述的包含肿瘤浸润淋巴细胞(例如继代TIL或经基因修饰的细胞毒性淋巴细胞)的药物组合物可以104至1011个细胞/公斤体重(例如105至106、105至1010、105至1011、106至1010、106至1011、107至1011、107至1010、108至1011、108至1010、109至1011或109至1010个细胞/公斤体重)的剂量施用，包扩在该范围内的所有整数值。肿瘤浸润淋巴细胞(在一些情况下包含经基因修饰的细胞毒性淋巴细胞)组合物也可以此剂量多次施用。肿瘤浸润淋巴细胞(在一些情况下包含经基因)可通过使用免疫疗法中通常已知的输注技术施用(参见例如Rosenberg等人，《新英格兰医学杂志(New Eng.J.of Med.)》319:1676,1988)。特定患者的最佳剂量和治疗方案可容易地由所属医药领域的技术人员通过监测患者的疾病病症且相应地调整治疗来确定。
术语“血液系统恶性肿瘤”、“恶性血液病”或有相关意义的术语指哺乳动物造血和淋巴组织(包括但不限于血液、骨髓、淋巴结和淋巴系统的组织)的癌症和肿瘤。血液系统恶性肿瘤也称为“液体肿瘤”。血液系统恶性肿瘤包括但不限于急性淋巴母细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性淋巴瘤(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性单核细胞性白血病(AMoL)、霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤。术语“B细胞恶性血液病”指影响B细胞的血液系统恶性肿瘤。
术语“液体肿瘤”指流体性的异常细胞团块。液体肿瘤癌症包括但不限于白血病、骨髓瘤和淋巴瘤，以及其他血液系统恶性肿瘤。获自液体肿瘤的TIL在本文中也可称为骨髓浸润淋巴细胞(MIL)。获自液体肿瘤(包含在外周血中循环的液体肿瘤)的TIL在本文中也可称为PBL。术语MIL、TIL和PBL在本文中可互换使用且仅基于衍生细胞的组织类型而有所不同。
如本文所用，术语“微环境”可指作为整体的实体或血液肿瘤微环境或可指在微环境内的个别细胞亚群。如本文所用，肿瘤微环境指以下的复杂混合物：“促进赘生性转化、支持肿瘤生长和侵袭、保护肿瘤不受宿主免疫力影响、鼓励治疗抗性且提供显性转移茁壮成长的生态栖位(niche)的细胞、可溶因子、信号传导分子、细胞外基质和机械信号”，如Swartz等人，《癌症研究(Cancer Res.)》,2012,72,2473中所描述。尽管肿瘤表达应由T细胞识别的抗原，但由于微环境的免疫抑制，免疫系统清除肿瘤的情况是罕见的。
在一些实施方式中，本发明包括一种用TIL群治疗癌症的方法，其中患者在输注根据本发明的TIL之前经非骨髓清除式化疗预治疗。在一些实施方式中，可提供TIL群，其中患者在输注根据本发明的TIL之前经非骨髓清除式化疗预治疗。在一些实施方式中，非骨髓清除式化疗为环磷酰胺60mg/kg/天进行2天(在TIL输注前第27天和第26天)和氟达拉滨(fludarabine)25mg/m2/天进行5天(在TIL输注前第27天至第23天)。在一些实施方式中，非骨髓清除式化疗为环磷酰胺60mg/kg/天进行2天(在TIL输注前第27天和第26天)和氟达拉滨25mg/m2/天进行3天(在TIL输注前第27至25天)。在一些实施方式中，非骨髓清除式化疗为环磷酰胺60mg/kg/天进行2天(在TIL输注前第27天和第26天)，随后氟达拉滨25mg/m2/天进行3天(在TIL输注前第25天至第23天)。在一些实施方式中，非骨髓清除式化疗为环磷酰胺60mg/kg/天进行2天(在TIL输注前第27天和第26天)和氟达拉滨25mg/m2/天进行3天(在TIL输注前第27天至第25天)。在一些实施方式中，非骨髓清除式化疗为环磷酰胺60mg/kg/天进行2天(在TIL输注前第27天和第26天)，随后氟达拉滨25mg/m2/天进行3天(在TIL输注前第25天至第23天)。在一些实施方式中，在根据本发明的非骨髓清除式化疗和TIL输注之后(第0天)，患者每8小时以720,000IU/kg静脉内接受IL-2的静脉内输注以达到生理耐受。
实验发现表明，在过继性转移肿瘤特异性T淋巴细胞之前，淋巴细胞耗尽通过消除调节性T细胞和竞争免疫系统的元件(“细胞因子库”)在增强治疗功效方面发挥关键作用。因此，本发明的一些实施方式在引入本发明的rTIL之前在患者身上采用淋巴细胞耗尽步骤(有时也称为“免疫抑制性调节”)。
术语“有效量”或“治疗有效量”指如本文所述的化合物或化合物组合的量，其足以实现所预期应用，包括但不限于疾病治疗。治疗有效量可视预期应用(体外或体内)或所治疗的受试者和疾病病状(例如，受试者的体重、年龄和性别)、疾病病状的严重程度或施用方式而变化。该术语也适用于将诱发靶细胞中的特定反应(例如血小板粘附和/或细胞迁移减少)的剂量。特定剂量将视以下而变化：所选特定化合物、所依循的给药方案、化合物是否与其他化合物组合施用、施用时间、其所施用的组织及其中携带化合物的物理递送系统。
术语“治疗”、“医治”、“处理”及其类似术语指获得所要的药理学和/或生理学效应。该效应就完全或部分预防疾病或其症状而言可具预防性，和/或就部分或完全治愈疾病和/或可归因于该疾病的不良影响而言可具治疗性。如本文所用，“治疗”涵盖哺乳动物、尤其是人的疾病的任何治疗，包括：(a)预防可能易患疾病但尚未诊断出患有该疾病的受试者中出现该疾病；(b)抑制疾病，也即遏制其发展或进展；以及(c)缓解疾病，也即使疾病消退和/或缓解一种以上疾病症状。“治疗”也意在涵盖递送试剂以便提供药理学效应，即使在不存在疾病或病状的情况下也如此。例如，“治疗”涵盖可在不存在疾病病状的情况下(例如在疫苗的情况下)引发免疫反应或赋予免疫性的组合物的递送。
当参考核酸或蛋白质的部分使用时，术语“异源”表示核酸或蛋白质包含两个以上在自然界中发现彼此之间没有相同关系的子序列。例如，通常以重组方式产生核酸，其具有两个以上来自无关基因的经布置以制造新的功能性核酸序列的序列，例如来自一个来源的启动子和来自另一来源的编码区或来自不同来源的编码区。类似地，异源蛋白表示蛋白质包含两个以上在自然界中未发现彼此呈相同关系的子序列(例如融合蛋白)。
在两个以上核酸或多肽的上下文中，术语“序列同一性”、“同一性百分比”和“序列同一性百分比”(或其同义词，例如“99％同一性”)指两个以上序列或子序列在进行比较和比对(需要时引入空位(gap))以达到最大对应性且不将任何保守性氨基酸取代视为序列同一性的部分时，该两个以上序列或子序列是相同的或具有相同的特定百分比的核苷酸或氨基酸残基。同一性百分比可使用序列比较软件或算法或通过目视检查来测量。所属领域中已知可用于获得氨基酸或核苷酸序列的比对的各种算法和软件。用以确定序列同一性百分比的合适的程序包括例如可购自美国政府的国家生物技术信息中心BLAST网站的BLAST程序包。两个序列之间的比较可使用BLASTN或BLASTP算法进行。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。ALIGN、ALIGN-2(美国加利福尼亚州南旧金山的基因泰克(Genentech))或MegAlign(可购自DNASTAR)是另外的可用于比对序列的可供大众使用的软件程序。本领域技术人员可以通过特定的比对软件来确定用于最大比对的适当参数。在某些实施方式中，使用比对软件的默认参数。
如本文所用，术语“变体”涵盖(但不限于)包含与参考抗体的氨基酸序列不同的氨基酸序列的抗体或融合蛋白，不同之处在于在参考抗体的氨基酸序列之内或相邻的某些位置有一个以上取代、缺失和/或添加。与参考抗体的氨基酸序列相比，变体可以在其氨基酸序列中包含一个以上保守取代。保守取代可涉及例如类似带电或不带电氨基酸的取代。变体保留与参考抗体的抗原特异性结合的能力。术语变体也包括聚乙二醇化抗体或蛋白质。
术语“脱氧核糖核苷酸”涵盖天然的和合成的、未经修饰的和经修饰的脱氧核糖核苷酸。修饰包括改变糖部分、碱基部分和/或寡核苷酸中各脱氧核糖核苷酸之间的连接。
术语“RNA”定义包含至少一个核糖核苷酸残基的分子。术语“核糖核苷酸”定义在b-D-呋喃核糖部分的2'位具有羟基的核苷酸。术语RNA包括双链RNA；单链RNA；经分离的RNA(例如部分纯化的RNA、基本上纯RNA、合成RNA、以重组方式产生的RNA)；以及通过添加、缺失、取代和/或改变一个以上核苷酸而不同于天然存在的RNA的经改变的RNA。本文所述的RNA分子中的核苷酸也可包含非标准核苷酸，例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可称为类似物或天然存在的RNA的类似物。
术语“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”意在包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂，以及惰性成分。此类药学上可接受的载体或药学上可接受的赋形剂用于活性药物成分的用途为本领域所熟知。除非任何常规药学上可接受的载体或药学上可接受的赋形剂与活性药物成分不相容，否则考虑其在本发明的治疗组合物中的应用。另外的活性药物成分，例如其他药物也可并入所描述的组合物和方法中。
术语“约”或“大约”指在值的统计学上有意义的范围内。此范围可在给定值或范围的一个数量级内，优选50％内，更优选20％内，再更优选10％内，甚至更优选5％内。由术语“约”或“大约”涵盖的允许差值取决于研究下的特定系统，可由所属领域中具有通常知识者容易地理解。此外，如本文所用，术语“约”和“大约”指尺寸、大小、制剂、参数、形状及其他数量和特征并不精确且不需要精确，而是可以视需要为近似值和/或更大或更小的，反映出公差、转换因子、四舍五入、测量误差等，以及本领域技术人员已知的其他因素。通常而言，无论是否如此明确说明，尺寸、大小、制剂、参数、形状或其他数量或特征皆为“约”或“大约”的。应注意，大小、形状和尺寸非常不同的实施方式可采用所描述的设置。
当以原始和修改形式用于所附权利要求中时，过渡术语“包含”、“基本上由…组成”和“由…组成”相对于未叙述的另外的权利要求要素或步骤(若存在)被排除在权利要求范围之外来定义权利要求范围。术语“包含”意在为包括性的或开放性的，不排除任何另外的、未叙述的要素、方法、步骤或材料。术语“由…组成”不包括除权利要求中指定的要素、步骤或材料以外的任何要素、步骤或材料，在后一情况中排除与指定材料一般相关的杂质。术语“基本上由…组成”将权利要求的范围限于所指定要素、步骤或材料和基本上不影响所主张发明的基础和新颖特征的要素、步骤或材料。在替代实施方式中，本文所述的体现本发明的所有组合物、方法和套件可由任何过渡术语“包含”、“基本上由…组成”和“由…组成”更具体地定义。
术语“抗体(antibody)”及其复数形式“抗体(antibodies)”指完整的免疫球蛋白和任何抗原结合片段(“抗原结合部分”)或其单链。“抗体”也指包含通过二硫键互相连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。各重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域(CH1、CH2和CH3)构成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域(CL)构成。抗体的VH和VL区可进一步细分成高变区，称为互补决定区(CDR)或高变区(HVR)，其可穿插有更保守的区域，称为框架区(FR)。各VH和VL由三个CDR和四个FR构成，自氨基端至羧基端按以下次序布置：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与一个以上表位相互作用的结合结构域。抗体恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，该宿主组织或因子包括免疫系统的多种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。
术语“抗原”指诱导免疫反应的物质。在一些实施方式中，若通过主要组织相容复合体(MHC)分子呈递，则抗原为能够与抗体或TCR结合的分子。如本文所用，术语“抗原”也涵盖T细胞表位。另外的，抗原能够被免疫系统识别。在一些实施方式中，抗原能够诱导引起B淋巴细胞和/或T淋巴细胞活化的体液免疫反应或细胞免疫反应。在一些情况下，这可能需要抗原含有或连接至Th细胞表位。抗原也可具有一个以上表位(例如B表位和T表位)。在一些实施例中，抗原优选将通常以高度特异性且选择性方式与其对应抗体或TCR反应，而不与可由其他抗原诱导的多种其他抗体或TCR反应。
术语“单克隆抗体”、“mAb”、“单克隆抗体组合物”或其复数形式指单分子组合物的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物显示出针对特定表位的单一结合特异性和亲和力。对某些受体具有特异性的单克隆抗体可使用以下技术中的知识和技术制得，即向测试受试者注射适合抗原，接着分离表达具有所需序列或功能特征的抗体的杂交瘤。编码单克隆抗体的DNA容易使用常规程序(例如通过使用能够特异性结合编码单克隆抗体的重链及轻链的基因的寡核苷酸探针)分离和测序。杂交瘤细胞充当此类DNA的优选来源。DNA一经分离，则可置于表达载体中，接着转染至原本不产生免疫球蛋白的宿主细胞，例如大肠杆菌细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞中，以在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。抗体的重组产生将在下文更详细地描述。
如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”(或简言之“抗体部分”或“片段”)指保持特异性结合抗原的能力的抗体的一个以上片段。经显示，抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段来执行。术语抗体的“抗原结合部分”范围内所涵盖的结合片段的示例包括：(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，即一种二价片段，其包含在铰链区通过二硫桥键连接的两个Fab片段；(ⅲ)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)结构域抗体(dAb)片段(Ward等人,《自然(Nature)》,1989,341,544-546),其可由一个VH或一个VL结构域组成；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由独立基因编码，但其可使用重组方法，通过合成接头接合，该合成接头能够将其制造成VL与VH区配对形成单价分子的单一蛋白质链，称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等人,《科学(Science)》1988,242,423-426；和Huston等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》1988,85,5879-5883)。此类scFv抗体也意在涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”内。这些抗体片段是使用本领域技术人员已知的常规技术获得、以与完整抗体相同的方式来筛选供使用的片段。
如本文所用，术语“人抗体”意在包括具有可变区的抗体，其中框架区和CDR区皆来源于人种系免疫球蛋白序列。另外的，若抗体含有恒定区，则该恒定区也来源于人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可包含并非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过在体外随机或位点特异性诱变或通过在体内体细胞突变引入的突变)。如本文所用，术语“人抗体”并不意在包括来源于另一哺乳动物物种(例如小鼠)种系的CDR序列已移植至人框架序列上的抗体。
术语“人单克隆抗体”指具有可变区的展现单一结合特异性的抗体，在可变区中框架与CDR区均源自人种系免疫球蛋白序列。在一些实施方式中，人单克隆抗体由杂交瘤产生，该杂交瘤包括与永生化细胞融合的自转基因非人动物(例如转基因小鼠)获得的B细胞，其具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组。
如本文所用，术语“重组人抗体”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人抗体，该人抗体例如(a)自对于人免疫球蛋白基因而言为转基因或转染色体的动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤(在下文进一步描述)分离的抗体；(b)自经转化以表达人抗体的宿主细胞，例如自转染瘤分离的抗体；(c)自重组、组合人抗体库分离的抗体；以及(d)通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他方式制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体具有可变区，其中框架区和CDR区来源于人种系免疫球蛋白序列。然而，在某些实施方式中，此类重组人抗体可进行体外诱变(或当使用人Ig序列的转基因动物时为体内体细胞诱变)，因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列为如下序列：该序列虽然来源于人种系VH和VL序列且与其相关，但可能并非在体内天然存在于人抗体种系谱系内。
如本文所用，“同种型(isotype)”指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如IgM或IgG1)。
短语“识别抗原的抗体”和“对抗原具有特异性的抗体”在本文中可与术语“特异性结合抗原的抗体”互换使用。
术语“人抗体衍生物”指人抗体的任何经修饰形式，包括抗体与另一活性药物成分或抗体的缀合物。术语“缀合物”、“抗体-药物缀合物”、“ADC”或“免疫缀合物”指与另一治疗部分缀合的抗体或其片段，该治疗部分可使用本领域中可用的方法与本文所述的抗体缀合。
术语“人源化抗体”、“人源化的抗体”及“人源化”意在指来源于另一哺乳动物物种(例如小鼠)种系的CDR序列已移植至人框架序列上的抗体。可在人框架序列内进行另外的框架区修饰。非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在大多数情况下，人源化抗体为人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中，来自接受者的高变区的残基经来自例如具有所需特异性、亲和力及能力的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的非人物种(供体抗体)的15个高变区的残基置换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基经相应非人残基置换。此外，人源化抗体可包含在接受者抗体中或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步优化抗体效能。通常而言，人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上全部的可变结构域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的区域，所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白序列的区域。人源化抗体可选地也将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。关于其他细节，参见Jones等人,《自然》1986,321,522-525；Riechmann等人,《自然》1988,332,323-329；以及Presta,《结构生物学新见(Curr.Op.Struct.Biol.)》1992,2,593-596。本文所述的抗体也可经修饰以采用已知赋予效应功能和/或FcR结合改善(例如降低)的任何Fc变体。Fc变体可包括例如以下所公开的氨基酸取代中的任一者：国际专利申请公开第WO 1988/07089A1号、第WO 1996/14339A1、第WO 1998/05787A1、第WO 1998/23289A1、第WO 1999/51642A1、第WO 99/58572A1、第WO 2000/09560A2、第WO 2000/32767A1、第WO2000/42072A2、第WO 2002/44215A2、第WO 2002/060919 A2、第WO 2003/074569 A2、第WO2004/016750A2、第WO 2004/029207 A2、第WO 2004/035752 A2、第WO 2004/063351A2、第WO2004/074455 A2、第WO 2004/099249 A2、第WO 2005/040217 A2、第WO 2005/070963A1、第WO 2005/077981 A2、第WO 2005/092925 A2、第WO 2005/123780A2、第WO 2006/019447 A1、第WO 2006/047350 A2和第WO 2006/085967 A2；和美国专利第5,648,260号；第5,739,277号；第5,834,250号；第5,869,046号；第6,096,871号；第6,121,022号；第6,194,551号；第6,242,195号；第6,277,375号；第6,528,624号；第6,538,124号；第6,737,056号；第6,821,505号；第6,998,253号；和第7,083,784号；其公开内容以引用的方式并入本文中。
术语“嵌合抗体”指可变区序列来源于一个物种且恒定区序列来源于另一物种的抗体，例如可变区序列来源于小鼠抗体且恒定区序列来源于人抗体的抗体。
“双功能抗体”是具有两个抗原结合位点的小抗体片段。片段包含连接至同一多肽链(VH-VL或VL-VH)中的轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)。通过使用过短而使得同一链上的两个可变结构域之间不能配对的接头，迫使该可变结构域与另一条链的互补结构域配对，产生两个抗原结合位点。双功能抗体更充分地描述于例如欧洲专利第EP 404,097号；国际专利公开第WO 93/11161号；和Bolliger等人,《美国国家科学院院刊》1993,90,6444-6448中。
术语“糖基化”指抗体的经修饰的衍生物。非糖基化抗体缺乏糖基化。糖基化可经改变以例如增加抗体对抗原的亲和力。此类碳水化合物修饰可通过例如改变抗体序列内的一个以上糖基化位点来完成。例如，可进行一个以上氨基酸取代，以消除一个以上可变区框架糖基化位点，由此消除该位点的糖基化。如美国专利第5,714,350号和第6,350,861号中所描述，去糖基化可增加抗体对抗原的亲和力。另外的或替代性地，可以制备糖基化类型改变的抗体，例如岩藻糖基残基量降低的低岩藻糖基化抗体或平分型GlcNac结构增加的抗体。此类经改变的糖基化模式已证明会提高抗体的能力。此类碳水化合物修饰可通过例如在糖基化机制改变的宿主细胞中表达抗体来实现。糖基化机制改变的细胞在本领域中已有描述且可用作表达本发明的重组抗体以由此产生糖基化改变的抗体的宿主细胞。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺乏岩藻糖基转移酶基因、FUT8(α(1,6)岩藻糖基转移酶)，使得Ms704、Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在其碳水化合物上缺乏岩藻糖。Ms704、Ms705和Ms709 FUT8-/-细胞系通过使用两种置换载体靶向破坏CHO/DG44细胞中的FUT8基因而产生(参见例如美国专利公开第2004/0110704号或Yamane-Ohnuki等人,《生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)》,2004,87,614-622)。作为另一实施例，欧洲专利第EP 1,176,195号描述一种具有功能破坏的编码岩藻糖基转移酶的FUT8基因的细胞系，使得此类细胞系中表达的抗体因减少或消除α1,6键相关酶而展现出低岩藻糖基化，还描述如下细胞系，该细胞系具有用于将岩藻糖添加至与抗体Fc区结合的N-乙酰基葡糖胺的低酶活性或不具有酶活性，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。国际专利公开WO 03/035835描述一种变体CHO细胞系，即Lec 13细胞，其具有减弱的将岩藻糖连接至Asn(297)-连接的碳水化合物的能力，也导致该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(也参见Shields等人,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》2002,277,26733-26740。国际专利公开WO 99/54342描述了经工程改造以表达糖蛋白修饰型糖基转移酶(例如β(1,4)-N-乙酰基葡糖氨基转移酶III(GnTIII))的细胞系，使得经工程改造的细胞系中所表达的抗体展现增加的平分型GlcNac结构，由此提高抗体的ADCC活性(也参见Umana等人,《自然·生物技术(Nat.Biotech.)》1999,17,176-180)。替代性地，抗体的岩藻糖残基可使用岩藻糖苷酶裂解。例如，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶自抗体中移除岩藻糖基残基，如Tarentino等人,《生物化学(Biochem.)》1975,14,5516-5523中所描述。
“聚乙二醇化”指经修饰的抗体或其片段，其通常在一个以上PEG基团连接至抗体或抗体片段的条件下与聚乙二醇(PEG)，例如PEG的反应性酯或醛衍生物反应。例如，聚乙二醇化可增加抗体的生物(例如血清)半衰期。优选地，聚乙二醇化通过与反应性PEG分子(或类似反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应来进行。如本文所用，术语“聚乙二醇”意在涵盖用于衍生其他蛋白质的任何PEG形式，例如单(C1-C10)烷氧基-聚乙二醇或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-顺丁烯二酰亚胺。待聚乙二醇化的抗体可以是去糖基化抗体。聚乙二醇化方法是本领域中已知的且可应用于本发明的抗体，如例如欧洲专利第EP 0154316号和欧洲专利第EP 0401384号以及美国专利第5,824,778号中所描述，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。
术语“生物类似物”指一种生物产品，包括单克隆抗体或蛋白质，与美国许可参考生物产品高度相似，尽管临床非活性组分的差异很小，生物产品与参考产品之间在产品的安全性、纯度和效力方面不存在有临床意义的差异。此外，类似生物或“生物类似”药物是一种与已被欧洲药物管理局授权使用的另一生物药物类似的生物药物。术语“生物类似物”也被其他国家和地区监管机构同义地使用。生物产品或生物药物是由生物来源(例如细菌或酵母)制成或衍生的药物。其可由相对较小分子(例如人胰岛素或红细胞生成素)或复杂分子(例如单克隆抗体)组成。例如，若参考IL-2蛋白是阿地白介素(PROLEUKIN)，则药物监管机构参照阿地白介素批准的蛋白质与阿地白介素“生物类似”或为阿地白介素的“生物类似物”。在欧洲，类似生物或“生物类似”药物是一种与已被欧洲药物管理局授权使用的另一生物药物类似的生物药物。欧洲类似生物应用的相关法律依据是法规(EC)第726/2004号第6条和经修订的指令2001/83/EC第10(4)条，因此在欧洲，生物类似物是可根据法规(EC)第726/2004号第6条和指令2001/83/EC第10(4)条授权、批准授权或作为授权申请的对象。已授权的原始生物药品在欧洲可称为“参考药品”。CHMP关于类似生物药品的指南中概述了产品被视为是生物类似物的一些要求。此外，特定产品指南，包括与单克隆抗体生物类似物相关的指南，由EMA逐项产品提供，在其网站上发布。如本文所述，生物类似物可在质量特性、生物活性、作用机制、安全概况和/或功效方面与参考药品类似。另外的，生物类似物可用于或意在用于治疗与参考药品相同的病况。因此，可认为如本文所述的生物类似物具有与参考药品类似或高度类似的质量特征。替代性地或另外的地，可认为本文所述的生物类似物具有与参考药品类似或高度类似的生物活性。替代性地或另外的地，可认为本文所述的生物类似物具有与参考药品类似或高度类似的安全概况。替代性地或另外的地，可认为本文所述的生物类似物具有与参考药品类似或高度类似的功效。如本文所述，欧洲的生物类似物与已被EMA授权的参考药品相比较。然而，在一些情况下，生物类似物在某些研究中可与在欧洲经济区以外授权的生物药品(非EEA许可的“比较物”)相比较。此类研究包括例如某些临床和体内非临床研究。如本文所用，术语“生物类似物”也关于已经授权或可与非经EEA授权的比较物比较的生物药品。某些生物类似物是蛋白质，例如抗体、抗体片段(例如抗原结合部分)和融合蛋白。蛋白质生物类似物可具有在氨基酸结构中具有少量修饰(包括例如氨基酸的缺失、添加和/或取代)的氨基酸序列，该修饰不会显著影响多肽的功能。生物类似物可包含与其参考药品的氨基酸序列具有97％以上(例如97％、98％、99％或100％)序列同一性的氨基酸序列。生物类似物可包含一个以上翻译后修饰，例如但不限于糖基化、氧化、去酰胺和/或截短，其不同于参考药品的翻译后修饰，只要差异不会引起药品的安全性和/或功效变化。生物类似物可具有与参考药品相同或不同的糖基化模式。特定地，虽然并非排他性地，但若差异解决或意在解决与参考药品相关的安全问题，则生物类似物可具有不同糖基化模式。另外的，生物类似物可在例如其强度、药物形式、制剂、赋形剂和/或呈现方式等方面偏离参考药品，只要该药品的安全性和功效不受影响。相较于参考药品，生物类似物可包含在例如药物动力学(PK)和/或药效动力学(PD)曲线方面的差异，但仍被认为与参考药品充分类似，可被授权或视为适合于授权。在某些情况下，生物类似物展现出与参考药品不同的结合特征，其中该不同结合特征被监管机构(例如EMA)认为并非类似生物产品获得授权的障碍。术语“生物类似物”也被其他国家和地区监管机构同义地使用。
III.肿瘤储存组合物
在一方面，本文提供了可用于储存和运送肿瘤样品以进行肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)制造的肿瘤储存组合物。来源于该组合物中储存的肿瘤的TIL可用于任何适合方法中，例如本文提供的TIL制造方法和例如以下中描述的方法：美国专利第10,166,257号；美国专利第10,130,659号；美国专利第10,272,113号；美国专利第10,420,799号；美国专利第10,398,734号；美国专利第10,463,697号；美国专利第10,363,273号；美国专利申请公开第2018/0325954号；美国专利申请公开第2020/0224161号；和WO 2020/096986，它们各自以全文引用的方式并入本文，特别是与TIL制造方法相关的所有教导内容。
本文提供的储存组合物使细菌(例如革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌物种)和真菌污染减到最少，同时不会明显影响TIL存活率，由此有利地允许在TIL处理之前将该肿瘤样本在无菌环境中运送和低温储存较长时间段。此类肿瘤储存组合物通常包含无血清、无动物组分的冷冻保存培养基和抗生素组分。
在一些实施方式中，肿瘤储存组合物中储存的肿瘤在该肿瘤储存组合物中储存6-48小时之后展现出至少刚好或约(at or about)50％-100％的细胞存活率。在一些实施方式中，该肿瘤储存组合物中储存的肿瘤在该肿瘤储存组合物中储存6-48小时之后展现出至少刚好或约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、、95％、97％、98％或99％的细胞存活率。在一些实施方式中，该肿瘤储存组合物中储存的肿瘤在该肿瘤储存组合物中储存6、12、18、24、32、36或48小时之后展现出至少刚好或约50％-100％的细胞存活率。在某些实施方式中，该肿瘤储存组合物中储存的肿瘤在刚好或约-10℃至10℃、-10℃至5℃、-5℃至0℃、0℃至5℃、2℃至8℃或5℃至10℃的温度下在该肿瘤储存组合物中储存6-48小时之后展现出至少约50％-100％的细胞存活率。细胞存活率可使用任何适合分析测量，包括例如染料排斥分析(例如台盼蓝、溴化乙锭、碘化丙锭、SYTOX和YO-PRO)、DNA浓缩分析(Hoechst 33258和吖啶橙)、氧化还原反应分析(MTT和XTT、阿尔玛蓝(Alamar Blue))、酯酶底物分析(例如钙黄绿素AM和细胞示踪剂(Cell Tracker))、蛋白酶底物分析(例如CellTiter-Fluor)、ATP测量(例如CellTiter Glo)和酶释放分析(例如CytoTox-ONE)。
主题肿瘤储存组合物中储存的肿瘤样本的无菌性可使用任何合适的方法评定。示例性方法包括但不限于直接接种法、膜方法(例如开放式和密闭式膜过滤系统)、ATP-发光分析、比色生长检测分析、自发荧光检测分析和细胞计数系统。
本文提供的肿瘤储存培养基中储存的肿瘤样本随后可经处理以得到TIL进行使用任何适合处理方案的基础研究或治疗用途。在一些实施方式中，将主题肿瘤储存培养基中储存的肿瘤样本随后用于本文提供的产生治疗性淋巴细胞(例如TIL、外周血淋巴细胞和骨髓浸润淋巴细胞)的方法中。
下文进一步论述肿瘤储存组合物的方面。
A.抗生素
本文公开的肿瘤储存组合物包含抗生素组分。本文提供的储存组合物中使用的抗生素使细菌和/或真菌污染的量减到最少，同时有利地对TIL展现低细胞毒性作用。在一些实施方式中，该抗生素使储存培养基中革兰氏阴性和/或革兰氏阳性细菌污染物的量减到最少。适用的抗生素包括但不限于双性霉素B、克林霉素和万古霉素。在一些实施方式中，肿瘤储存组合物培养基还包含庆大霉素。
在一些实施方式中，储存组合物包含克林霉素。在一些实施方式中，包含的克林霉素的浓度为至少刚好或约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000μg/mL。在某些实施方式中，包含的克林霉素的浓度为刚好或约0.1-1μg/mL、0.25-1μg/mL、0.1-0.5μg/mL、0.5-2μg/mL、2-8μg/mL、1-10μg/mL、4-12μg/mL、5-15μg/mL、10-20μg/mL、20-30μg/mL、30-40μg/mL、40-50μg/mL、50-60μg/mL、60-70μg/mL、70-80μg/mL、80-90μg/mL、90-100μg/mL、100-110μg/mL、110-120μg/mL、120-130μg/mL、130-140μg/mL、140-150μg/mL、50-150μg/mL、60-140μg/mL、70-130μg/mL、80-120μg/mL、90-110μg/mL、95-105μg/mL、10-90μg/mL、20-80μg/mL、30-70μg/mL、40-60μg/mL、45-55μg/mL、50-100μg/mL、100-150μg/mL、150-200μg/mL、200-250μg/mL、250-300μg/mL、300-350μg/mL、350-400μg/mL、400-450μg/mL、450-500μg/mL、500-550μg/mL、550-600μg/mL、600-650μg/mL、650-700μg/mL、700-750μg/mL、750-800μg/mL、800-850μg/mL、850-900μg/mL或950-1,000μg/mL。在一些实施方式中，包含的克林霉素的浓度为刚好或约0.1-100μg/mL、1-50μg/mL、1-100μg/mL、1-250μg/mL、1-500μg/mL、250-750μg/mL、350-450μg/mL、450-550μg/mL、550-650μg/mL、400-600μg/mL、350-650μg/mL、300-700μg/mL、200-800μg/mL、500-1,000μg/mL、750-1,250μg/mL、1,000-1,500μg/mL、1,250-1,750μg/mL或1,500-2,000μg/mL。在示例性实施方式中，克林霉素的浓度为刚好或约400-600μg/mL。
在某些实施方式中，该储存组合物包含万古霉素。在一些实施方式中，包含的万古霉素的浓度为至少刚好或约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000μg/mL。在某些实施方式中，包含的万古霉素的浓度为刚好或约0.1-1μg/mL、0.25-1μg/mL、0.1-0.5μg/mL、0.5-2μg/mL、2-8μg/mL、1-10μg/mL、4-12μg/mL、5-15μg/mL、10-20μg/mL、20-30μg/mL、30-40μg/mL、40-50μg/mL、50-60μg/mL、60-70μg/mL、70-80μg/mL、80-90μg/mL、90-100μg/mL、100-110μg/mL、110-120μg/mL、120-130μg/mL、130-140μg/mL、140-150μg/mL、50-150μg/mL、60-140μg/mL、70-130μg/mL、80-120μg/mL、90-110μg/mL、95-105μg/mL、10-90μg/mL、20-80μg/mL、30-70μg/mL、40-60μg/mL、45-55μg/mL、50-100μg/mL、100-150μg/mL、150-200μg/mL、200-250μg/mL、250-300μg/mL、300-350μg/mL、350-400μg/mL、400-450μg/mL、450-500μg/mL、500-550μg/mL、550-600μg/mL、600-650μg/mL、650-700μg/mL、700-750μg/mL、750-800μg/mL、800-850μg/mL、850-900μg/mL或950-1,000μg/mL。在一些实施方式中，包含的万古霉素的浓度为刚好或约0.1-100μg/mL、1-50μg/mL、1-100μg/mL、1-250μg/mL、1-500μg/mL、100-200μg/mL、150-250μg/mL、200-400μg/mL、350-450μg/mL、400-600μg/mL、550-650μg/mL、50-650μg/mL、100-600μg/mL、250-750μg/mL、500-1,000μg/mL、750-1,250μg/mL、1,000-1,500μg/mL、1,250-1,750μg/mL或1,500-2,000μg/mL。在示例性实施方式中，万古霉素的浓度为刚好或约50-600μg/mL。在示例性实施方式中，万古霉素的浓度为刚好或约100μg/mL。
在一些实施方式中，该储存组合物包含万古霉素和庆大霉素。在某些实施方式中，该储存组合物包含克林霉素和庆大霉素。在一些实施方式中，包含的庆大霉素的浓度为至少刚好或约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000μg/mL。在某些实施方式中，包含的庆大霉素的浓度为刚好或约0.1-1μg/mL、0.25-1μg/mL、0.1-0.5μg/mL、0.5-2μg/mL、2-8μg/mL、1-10μg/mL、4-12μg/mL、5-15μg/mL、10-20μg/mL、20-30μg/mL、30-40μg/mL、40-50μg/mL、50-60μg/mL、60-70μg/mL、70-80μg/mL、80-90μg/mL、90-100μg/mL、100-110μg/mL、110-120μg/mL、120-130μg/mL、130-140μg/mL、140-150μg/mL、150-160μg/mL、160-170μg/mL、170-180μg/mL、180-190μg/mL、190-200μg/mL、10-90μg/mL、20-80μg/mL、30-70μg/mL、40-60μg/mL、45-55μg/mL、50-150μg/mL、60-140μg/mL、70-130μg/mL、80-120μg/mL、90-110μg/mL、95-105μg/mL、50-100μg/mL、100-150μg/mL、150-200μg/mL、200-250μg/mL、250-300μg/mL、300-350μg/mL、350-400μg/mL、400-450μg/mL、450-500μg/mL、500-550μg/mL、550-600μg/mL、600-650μg/mL、650-700μg/mL、700-750μg/mL、750-800μg/mL、800-850μg/mL、850-900μg/mL或950-1,000μg/mL。在一些实施方式中，包含的庆大霉素的浓度为刚好或约0.1-100μg/mL、1-50μg/mL、25-75μg/mL、1-100μg/mL、1-250μg/mL、1-500μg/mL、250-750μg/mL、500-1,000μg/mL、750-1,250μg/mL、1,000-1,500μg/mL、1,250-1,750μg/mL或1,500-2,000μg/mL。在示例性实施方式中，庆大霉素的浓度为刚好或约50μg/mL。
在一些实施方式中，肿瘤储存培养基还包含一种以上抗真菌性抗生素。用于主题肿瘤储存培养基的抗真菌性抗生素包括但不限于多烯类、唑类、咪唑类、三唑类、噻唑类、烯丙胺类和棘白菌素(echinocandin)。示例性多烯类包括但不限于：双性霉素B、念珠菌素(candicidin)、非律平(filipin)、哈霉素(hamycin)、纳他霉素(natamycin)、制霉菌素(nystatin)和龟裂霉素(rimocidin)。示例性咪唑类包括但不限于联苯苄唑(bifonazole)、布康唑(butoconazole)、克霉唑(clotrimazole)、益康唑(econazole)、芬替康唑(fenticonazole)、异康唑(isoconazole)、酮康唑(ketoconazole)、卢立康唑(luliconazole)、咪康唑(miconazole)、奥莫康唑(omoconazole)、奥昔康唑(oxiconazole)、舍他康唑(sertaconazole)、硫康唑(sulconazole)和噻康唑(tioconazole)。适用的三唑类包括但不限于：阿巴康唑(albaconazole)、艾菲康唑(efinaconazole)、氟环唑(epoxiconazole)、氟康唑(fluconazole)、艾沙康唑(isavuconazole)、伊曲康唑(itraconazole)、泊沙康唑(posaconazole)、丙环唑(propiconazole)、雷夫康唑(ravuconazole)、特康唑(terconazole)和伏立康唑(voriconazole)。示例性棘白菌素包括但不限于：阿尼芬净(anidulafungin)、卡泊芬净(caspofungin)、米卡芬净(micafungin)。可包含在本文公开的肿瘤储存组合物中的另外的抗真菌性抗生素包括但不限于：橙酮(aurone)、苯甲酸、环吡酮(ciclopirox)、氟胞嘧啶(flucytosine)、灰黄霉素(griseofulvin)、卤丙炔氧苯(haloprogin)、托那氟利特(tolnaflate)、十一碳烯酸、三醋精、结晶紫、奥罗地美(orotomide)、米替福辛(milteofosine)、碘化钾、日光霉素(nikkomycin)、硫酸铜、二硫化硒、硫代硫酸钠、吡罗克酮乙醇胺(prioctone olamine)、双碘喹啉(iodoquinol)、吖啶琐辛(acrisorcin)、吡啶硫酮锌(zinc pyrithione)和硫。
在一些实施方式中，肿瘤储存组合物包含双性霉素B。在某些实施方式中，双性霉素B的浓度为至少刚好或约0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.4μg/mL、0.5μg/mL、0.6μg/mL、0.7μg/mL、0.8μg/mL、0.9μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、30μg/mL、35μg/mL、40μg/mL、45μg/mL和50μg/mL。在某些实施方式中，该双性霉素B的浓度为至少刚好或约0.1-0.5μg/mL、0.5-1μg/mL、0.25-2μg/mL、0.1-1μg/mL、1-5μg/mL、1-3μg/mL、2-4μg/mL、3-5μg/mL、4-6μg/mL、5-7μg/mL、6-8μg/mL、7-9μg/mL、8-10μg/mL、9-11μg/mL、1-2μg/mL、2-3μg/mL、3-4μg/mL、4-5μg/mL、5-6μg/mL、6-7μg/mL、7-8μg/mL、8-9μg/mL、9-10μg/mL、10-11μg/mL、1-10μg/mL、2-10.5μg/mL、5-15μg/mL、2-12μg/mL、1-11μg/mL、5-10μg/mL、10-20μg/mL、20-30μg/mL、30-40μg/mL或40-50μg/mL。在示例性实施方式中，该双性霉素B的浓度为刚好或约2.5-10μg/mL。
B.冷冻保存培养基
本文提供的肿瘤储存组合物包含冷冻保存培养基。任何合适的冷冻保存培养基均可包含在该储存组合物中。在一些实施方式中，冷冻保存培养基包含一种以上电解质；以及在生理和低温条件下有效的生物pH缓冲液。适用于本文所述的组合物中的示例性冷冻保存培养基包括例如美国专利第6,045,990号中所描述的，其以全文引用的方式并入本文，尤其是与冷冻保存培养基有关的相关部分。
冷冻保存培养基包含一种以上电解质。在一些实施方式中，一种以上电解质包含钾离子、钠离子和/或钙离子。在一些实施方式中，一种以上电解质包含钾离子。在特定实施方式中，包含的钾离子的浓度为刚好或约0.1-1mM、1-50mM、50-100mM、100-150mM、150-200mM。在某些实施方式中，包含的钾离子的浓度为刚好或约1-20mM、20-40mM、40-60mM、60-80mM或80-100mM。在特定实施方式中，包含的钾离子的浓度为刚好或约35-45mM。
在一些实施方式中，一种以上电解质包含钠离子。在特定实施方式中，包含的钾离子的浓度为刚好或约1-50mM、50-100mM、100-150mM、150-200mM、200-250mM或250-300mM。在某些实施方式中，包含的钾离子的浓度为刚好或约1-20mM、20-40mM、40-60mM、60-80mM或80-100mM、100-120mM、120-140mM、140-160mM、160-180mM或180-200mM。在特定实施方式中，包含的钾离子的浓度为刚好或约80-120mM。
在一些实施方式中，该一种以上电解质包含钙离子。在特定实施方式中，包含的钾离子的浓度为刚好或约0.001-0.005mM、0.005-0.01mM、0.01-0.05mM、0.05-0.10mM、0.010-0.15mM、0.15-0.20mM、0.20-0.25mM、0.25-0.50mM、0.50-1.0mM、1-5mM或5-10mM。在一些实施方式中，包含的钙离子的浓度为刚好或约0.01-0.1mM。
冷冻保存培养基包含在生理条件和低温条件下皆有效的生物pH缓冲液。可用于冷冻保存的示例性生物pH缓冲液包括但不限于MES缓冲液、Bis-Tris缓冲液、ADA缓冲液、ACES缓冲液、PIPES缓冲液、MOPSO缓冲液、Bis-6 Tris Propare缓冲液、BES缓冲液、MOPS缓冲液、TES缓冲液、HEPES缓冲液、DIPSO缓冲液、MOBS缓冲液、TAPSO缓冲液、HEPPSO缓冲液、POPSO缓冲液、EPPS(HEPPS)缓冲液、麦黄酮缓冲液、Gly-Gly缓冲液、N,N-二(羟乙基)甘氨酸(Bicine)缓冲液、TAPS缓冲液、AMPD缓冲液、TABS缓冲液、AMPSO缓冲液、CHES缓冲液、CAPSO缓冲液、AMP缓冲液、CAPS缓冲液和CABS缓冲液。在示例性实施方式中，pH缓冲液是HEPES缓冲液。
在一些实施方式中，冷冻保存培养基包含胶体渗透压剂(oncotic agent)。在示例性实施方式中，胶体渗透压剂的大小足够大以限制从循环系统漏出且有效维持与血浆相当的胶体渗透压。在示例性实施方式中，胶体渗透压剂为人血清白蛋白、多糖和胶状淀粉。
在一些实施方式中，冷冻保存培养基包含营养有效量的单糖。在示例性实施方式中，该单糖是果糖、葡萄糖或乳糖。
在示例性实施方式中，冷冻保存培养基包含不可透过细胞膜且在冷暴露期间有效抵抗细胞膨胀的不透过性阴离子。在一些实施方式中，不透过性阴离子是乳糖酸根、葡糖酸根、柠檬酸根和甘油磷酸根。
在一些实施方式中，冷冻保存培养基包含对ATP再生有效的底物。在某些实施方式中，该底物是腺苷、果糖、核糖或腺嘌呤。
在一些实施方式中，冷冻保存培养基包含或改良型 是包含以下的无细胞溶液：
(a)一种以上选自如下的电解质：钾离子、钠离子和钙离子。在示例性实施方式中，钾离子的浓度刚好或约35-45mM范围内，钠离子的浓度为约80-120mM，镁离子的浓度刚好或约2-10mM范围内，钙离子的浓度刚好或约0.01-0.1mM范围内。
(b)大小足够大以限制从循环系统漏出且有效维持与血浆相当的胶体渗透压的巨分子胶体渗透压剂，其选自如下：人血清白蛋白、多糖和胶状淀粉；
(c)在生理条件和低温条件下有效的生物pH缓冲液；
(d)营养有效量的至少一种单糖；
(e)羟基自由基清除有效量的不透过性的甘露糖醇；
(f)不可透过细胞膜且在冷暴露期间有效抵抗细胞膨胀的不透过性阴离子，该不透过性离子是至少一个选自如下的成员：乳糖酸根、葡糖酸根、柠檬酸根和甘油磷酸根；
(g)对ATP再生有效的底物，该底物是至少一个选自如下的成员：腺苷、果糖、核糖和腺嘌呤；和
(h)谷胱甘肽。
在一些实施方式中，冷冻保存培养基包含一种以上调节凋亡诱导的细胞死亡的试剂。在一些实施方式中，该调节凋亡诱导的细胞死亡的试剂是一种以上凋亡蛋白酶(caspase)蛋白酶的抑制剂。在一些实施方式中，凋亡蛋白酶抑制剂是凋亡蛋白酶1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的抑制剂。凋亡蛋白酶抑制剂包括但不限于贝纳卡杉(belnacasan)(VX-765)、普那卡生(Pralnacasan)和IDN6556。可用于本文公开的主题储存组合物中的其他凋亡蛋白酶抑制剂是Callas和Vaux,《细胞死亡与分化(Cell Death&Differentiation)》14:73-78(2007)；Poreba等人,《冷泉港实验室生物学展望(Cold Spring Harb PerspectBiol.)》5(8):a008680(2013)；以及Howley和Fearnhead,《细胞与分子医学杂志(J CellMol Med)》12(5a):1502-1516(2008)，各自并入与凋亡蛋白酶抑制剂有关的相关部分中。在一些实施方式中，调节凋亡性细胞死亡的试剂是维生素E或EDTA。
在一些实施方式中，冷冻保存培养基包含DMSO。在一些实施方式中，冷冻保存培养基包含至少刚好或约5％、10％、15％、20％、25％或30％ DMSO。在示例性实施方式中，冷冻保存培养基包含10％ DMSO。
C.示例性肿瘤储存组合物
在一些实施方式中，肿瘤储存组合物包含：
(a)抗生素组分，其选自以下：(i)万古霉素和庆大霉素；(ii)克林霉素、万古霉素和庆大霉素；以及(ⅲ)万古霉素；
(b)一种以上选自钾离子、钠离子、镁离子和钙离子的电解质；
(c)大小足够大以限制从循环系统漏出且有效维持与血浆相当的胶体渗透压的巨分子胶体渗透压剂，其选自如下：人血清白蛋白、多糖和胶状淀粉；
(d)在生理条件和低温条件下有效的生物pH缓冲液；
(e)营养有效量的至少一种单糖；
(f)羟基自由基清除有效量的不透过性的甘露糖醇；
(g)不可透过细胞膜且在冷暴露期间有效抵抗细胞膨胀的不透过性阴离子，该不透过性离子是至少一个选自如下的成员：乳糖酸根、葡糖酸根、柠檬酸根和甘油磷酸根；
(h)对ATP再生有效的底物，该底物是至少一个选自如下的成员：腺苷、果糖、核糖和腺嘌呤；和
(i)谷胱甘肽。
在一些实施方式中，肿瘤储存组合物包含：
(a)抗生素组分，其选自以下：1)抗生素组合，该抗生素组合选自：(i)浓度为刚好或约50至650μg/mL的万古霉素和浓度为刚好或约1至100μg/mL的庆大霉素；(ii)浓度为刚好或约450至650μg/mL的克林霉素和浓度为刚好或约1至100μg/mL的庆大霉素；或2)(ⅲ)浓度为刚好或约100μg/mL的万古霉素；
(b)一种以上电解质，其选自：浓度刚好或约35-45mM范围内的钾离子、浓度刚好或约80-120mM范围内的钠离子、浓度刚好或约2-10mM范围内的镁离子和浓度刚好或约0.01-0.1mM范围内的钙离子；
(c)大小足够大以限制从循环系统漏出且有效维持与血浆相当的胶体渗透压的巨分子胶体渗透压剂，其选自如下：人血清白蛋白、多糖和胶状淀粉；
(d)在生理条件和低温条件下有效的生物pH缓冲液；
(e)营养有效量的至少一种单糖；
(f)羟基自由基清除有效量的不透过性的甘露糖醇；
(g)不可透过细胞膜且在冷暴露期间有效抵抗细胞膨胀的不透过性阴离子，该不透过性离子是至少一个选自如下的成员：乳糖酸根、葡糖酸根、柠檬酸根和甘油磷酸根；
(h)对ATP再生有效的底物，该底物是至少一个选自如下的成员：腺苷、果糖、核糖和腺嘌呤；和
(i)谷胱甘肽。
在一些实施方式中，所提供的肿瘤储存组合物包含浓度为刚好或约2.0μg/mL-10.5μg/mL的双性霉素B。
在一些实施方式中，本文提供的肿瘤储存组合物包含一种以上调节凋亡诱导的细胞死亡的试剂。在一些实施方式中，该调节凋亡诱导的细胞死亡的试剂是一种以上凋亡蛋白酶蛋白酶的抑制剂。在一些实施方式中，调节凋亡性细胞死亡的试剂是维生素E或EDTA。
在一些实施方式中，肿瘤储存培养基包含10％ DMSO。
在一些实施方式中，主题肿瘤储存培养基中储存的肿瘤样本随后用于本文提供的产生治疗性淋巴细胞(例如TIL、外周血淋巴细胞和骨髓浸润淋巴细胞)的方法中。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的肿瘤储存组合物，该肿瘤储存组合物经修改以包含浓度为至少刚好或约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000μg/mL的克林霉素。在某些实施方式中，包含的克林霉素的浓度为刚好或约0.1-1μg/mL、0.25-1μg/mL、0.1-0.5μg/mL、0.5-2μg/mL、2-8μg/mL、1-10μg/mL、4-12μg/mL、5-15μg/mL、10-20μg/mL、20-30μg/mL、30-40μg/mL、40-50μg/mL、50-60μg/mL、60-70μg/mL、70-80μg/mL、80-90μg/mL、90-100μg/mL、100-110μg/mL、110-120μg/mL、120-130μg/mL、130-140μg/mL、140-150μg/mL、50-150μg/mL、60-140μg/mL、70-130μg/mL、80-120μg/mL、90-110μg/mL、95-105μg/mL、10-90μg/mL、20-80μg/mL、30-70μg/mL、40-60μg/mL、45-55μg/mL、50-100μg/mL、100-150μg/mL、150-200μg/mL、200-250μg/mL、250-300μg/mL、300-350μg/mL、350-400μg/mL、400-450μg/mL、450-500μg/mL、500-550μg/mL、550-600μg/mL、600-650μg/mL、650-700μg/mL、700-750μg/mL、750-800μg/mL、800-850μg/mL、850-900μg/mL或950-1,000μg/mL。在一些实施方式中，包含的克林霉素的浓度为刚好或约0.1-100μg/mL、1-50μg/mL、1-100μg/mL、1-250μg/mL、1-500μg/mL、250-750μg/mL、350-450μg/mL、450-550μg/mL、550-650μg/mL、400-600μg/mL、350-650μg/mL、300-700μg/mL、200-800μg/mL、500-1,000μg/mL、750-1,250μg/mL、1,000-1,500μg/mL、1,250-1,750μg/mL或1,500-2,000μg/mL。在示例性实施方式中，克林霉素的浓度为刚好或约400-600μg/mL。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的肿瘤储存组合物，该肿瘤储存组合物经修改以包含浓度为至少刚好或约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000μg/mL的万古霉素。在某些实施方式中，包含的万古霉素的浓度为刚好或约0.1-1μg/mL、0.25-1μg/mL、0.1-0.5μg/mL、0.5-2μg/mL、2-8μg/mL、1-10μg/mL、4-12μg/mL、5-15μg/mL、10-20μg/mL、20-30μg/mL、30-40μg/mL、40-50μg/mL、50-60μg/mL、60-70μg/mL、70-80μg/mL、80-90μg/mL、90-100μg/mL、100-110μg/mL、110-120μg/mL、120-130μg/mL、130-140μg/mL、140-150μg/mL、50-150μg/mL、60-140μg/mL、70-130μg/mL、80-120μg/mL、90-110μg/mL、95-105μg/mL、10-90μg/mL、20-80μg/mL、30-70μg/mL、40-60μg/mL、45-55μg/mL、50-100μg/mL、100-150μg/mL、150-200μg/mL、200-250μg/mL、250-300μg/mL、300-350μg/mL、350-400μg/mL、400-450μg/mL、450-500μg/mL、500-550μg/mL、550-600μg/mL、600-650μg/mL、650-700μg/mL、700-750μg/mL、750-800μg/mL、800-850μg/mL、850-900μg/mL或950-1,000μg/mL。在一些实施方式中，包含的万古霉素的浓度为刚好或约0.1-100μg/mL、1-50μg/mL、1-100μg/mL、1-250μg/mL、1-500μg/mL、100-200μg/mL、150-250μg/mL、200-400μg/mL、350-450μg/mL、400-600μg/mL、550-650μg/mL、50-650μg/mL、100-600μg/mL、250-750μg/mL、500-1,000μg/mL、750-1,250μg/mL、1,000-1,500μg/mL、1,250-1,750μg/mL或1,500-2,000μg/mL。在示例性实施方式中，万古霉素的浓度为刚好或约50-600μg/mL。在示例性实施方式中，万古霉素的浓度为刚好或约100μg/mL。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的肿瘤储存组合物，该肿瘤储存组合物经修改以包含浓度为至少刚好或约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000μg/mL的庆大霉素。在某些实施方式中，包含的庆大霉素的浓度为刚好或约0.1-1μg/mL、0.25-1μg/mL、0.1-0.5μg/mL、0.5-2μg/mL、2-8μg/mL、1-10μg/mL、4-12μg/mL、5-15μg/mL、10-20μg/mL、20-30μg/mL、30-40μg/mL、40-50μg/mL、50-60μg/mL、60-70μg/mL、70-80μg/mL、80-90μg/mL、90-100μg/mL、100-110μg/mL、110-120μg/mL、120-130μg/mL、130-140μg/mL、140-150μg/mL、150-160μg/mL、160-170μg/mL、170-180μg/mL、180-190μg/mL、190-200μg/mL、10-90μg/mL、20-80μg/mL、30-70μg/mL、40-60μg/mL、45-55μg/mL、50-150μg/mL、60-140μg/mL、70-130μg/mL、80-120μg/mL、90-110μg/mL、95-105μg/mL、50-100μg/mL、100-150μg/mL、150-200μg/mL、200-250μg/mL、250-300μg/mL、300-350μg/mL、350-400μg/mL、400-450μg/mL、450-500μg/mL、500-550μg/mL、550-600μg/mL、600-650μg/mL、650-700μg/mL、700-750μg/mL、750-800μg/mL、800-850μg/mL、850-900μg/mL或950-1,000μg/mL。在一些实施方式中，包含的庆大霉素的浓度为刚好或约0.1-100μg/mL、1-50μg/mL、25-75μg/mL、1-100μg/mL、1-250μg/mL、1-500μg/mL、250-750μg/mL、500-1,000μg/mL、750-1,250μg/mL、1,000-1,500μg/mL、1,250-1,750μg/mL或1,500-2,000μg/mL。在示例性实施方式中，庆大霉素的浓度为刚好或约50μg/mL。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的肿瘤储存组合物，该肿瘤储存组合物经修改以包含浓度为至少刚好或约0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.4μg/mL、0.5μg/mL、0.6μg/mL、0.7μg/mL、0.8μg/mL、0.9μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、30μg/mL、35μg/mL、40μg/mL、45μg/mL和50μg/mL的双性霉素B。在某些实施方式中，双性霉素B的浓度为至少刚好或约0.1-0.5μg/mL、0.5-1μg/mL、0.25-2μg/mL、0.1-1μg/mL、1-5μg/mL、1-3μg/mL、2-4μg/mL、3-5μg/mL、4-6μg/mL、5-7μg/mL、6-8μg/mL、7-9μg/mL、8-10μg/mL、9-11μg/mL、1-2μg/mL、2-3μg/mL、3-4μg/mL、4-5μg/mL、5-6μg/mL、6-7μg/mL、7-8μg/mL、8-9μg/mL、9-10μg/mL、10-11μg/mL、1-10μg/mL、2-10.5μg/mL、5-15μg/mL、2-12μg/mL、1-11μg/mL、5-10μg/mL、10-20μg/mL、20-30μg/mL、30-40μg/mL或40-50μg/mL。在示例性实施方式中，双性霉素B的浓度为刚好或约2.5-10μg/mL。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约50-600μg/ml万古霉素。在一些实施方式中，抗生素组分包含约100μg/ml万古霉素。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素和约400-600μg/ml克林霉素。
在一些实施方式中，抗生素组分包含抗生素组合，该抗生素组合包含约50μg/ml庆大霉素和约50-600μg/ml万古霉素。在一些实施方式中，抗生素组分包含抗生素组合，该抗生素组合包含约50μg/ml庆大霉素和约100μg/ml万古霉素。
D.肿瘤样本
在一方面，本文提供了包含肿瘤样本和任何本文所述的肿瘤储存组合物的组合物。
组合物包含任何合适的肿瘤样本，包括用于得到TIL以用于如本文所述的癌症疗法的肿瘤样本。在一些实施方式中，肿瘤样本是以下癌症类型中的一种：乳腺癌(包括三阴性乳腺癌)、胰腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肺癌、脑癌、肾癌、胃癌、皮肤癌(包括但不限于鳞状细胞癌、基底细胞癌和黑色素瘤)、宫颈癌、头颈癌、卵巢癌、肉瘤、膀胱癌、甲状腺癌和神经胶母细胞瘤。
在一些实施方式中，肿瘤组织样本是液体肿瘤样本。在特定实施方式中，液体肿瘤样本是来自血液系统恶性肿瘤的液体肿瘤样本。在一些实施方式中，样本是血液样本或骨髓样本。在一些实施方式中，样本是来自全血或骨髓的PBMC样本。
在某些实施方式中，肿瘤样本从原发性肿瘤获得。在一些实施方式中，肿瘤样本从侵袭性肿瘤获得。在某些实施方式中，肿瘤样本从转移性肿瘤获得。在一些实施方式中，肿瘤样本从恶性黑色素瘤获得。
IV.细胞培养基
本文提供了用于本文提供的制备治疗性淋巴细胞的方法的细胞培养基，其包含抗生素组分。在主题细胞培养基中培养的淋巴细胞能够在具有极少细菌(例如革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌)和/或真菌污染情况下进行分化、耗竭和/或活化。在一些实施方式中，细胞培养基中的细胞在培养基中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22天之后展现出至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的细胞存活率。在一些实施方式中，细胞培养基可用于部分VI中扩增治疗性T细胞(例如外周血淋巴细胞和骨髓浸润淋巴细胞)的方法中。在某些实施方式中，细胞培养基可用于部分VIII-X中所公开的TIL制造方法中。以下更详细地论述培养基的方面。在一些实施方式中，将细胞培养基用于本文提供的Gen 2和Gen 3TIL制造方法的第一扩增或第二扩增中。
A.抗生素
本文公开的细胞培养基包含抗生素组分。本文提供的细胞培养基中使用的抗生素使细菌和/或真菌污染的量减到最少，同时有利地对TIL展现低细胞毒性作用。在一些实施方式中，抗生素使培养基中革兰氏阴性和/或革兰氏阳性细菌污染物的量减到最少。适用的抗生素包括但不限于双性霉素B、克林霉素和万古霉素。在一些实施方式中，肿瘤储存组合物培养基还包含庆大霉素。
在一些实施方式中，细胞培养基包含克林霉素。在一些实施方式中，包含的克林霉素的浓度为至少刚好或约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000μg/mL。在某些实施方式中，包含的克林霉素的浓度为刚好或约0.1-1μg/mL、0.25-1μg/mL、0.1-0.5μg/mL、0.5-2μg/mL、2-8μg/mL、1-10μg/mL、4-12μg/mL、5-15μg/mL、10-20μg/mL、20-30μg/mL、30-40μg/mL、40-50μg/mL、50-60μg/mL、60-70μg/mL、70-80μg/mL、80-90μg/mL、90-100μg/mL、100-110μg/mL、110-120μg/mL、120-130μg/mL、130-140μg/mL、140-150μg/mL、50-150μg/mL、60-140μg/mL、70-130μg/mL、80-120μg/mL、90-110μg/mL、95-105μg/mL、10-90μg/mL、20-80μg/mL、30-70μg/mL、40-60μg/mL、45-55μg/mL、50-100μg/mL、100-150μg/mL、150-200μg/mL、200-250μg/mL、250-300μg/mL、300-350μg/mL、350-400μg/mL、400-450μg/mL、450-500μg/mL、500-550μg/mL、550-600μg/mL、600-650μg/mL、650-700μg/mL、700-750μg/mL、750-800μg/mL、800-850μg/mL、850-900μg/mL或950-1,000μg/mL。在一些实施方式中，包含的克林霉素的浓度为刚好或约0.1-100μg/mL、1-50μg/mL、1-100μg/mL、1-250μg/mL、1-500μg/mL、250-750μg/mL、350-450μg/mL、450-550μg/mL、550-650μg/mL、400-600μg/mL、350-650μg/mL、300-700μg/mL、200-800μg/mL、250-750μg/mL、500-1,000μg/mL、750-1,250μg/mL、1,000-1,500μg/mL、1,250-1,750μg/mL或1,500-2,000μg/mL。在示例性实施方式中，克林霉素的浓度为刚好或约400-600μg/mL。
在某些实施方式中，细胞培养基包含万古霉素。在示例性实施方式中，细胞培养基包含万古霉素且不含另外的抗生素。在一些实施方式中，包含的万古霉素的浓度为至少刚好或约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000μg/mL。在某些实施方式中，包含的万古霉素的浓度为刚好或约1-10μg/mL、10-20μg/mL、20-30μg/mL、30-40μg/mL、40-50μg/mL、50-60μg/mL、60-70μg/mL、70-80μg/mL、80-90μg/mL、90-100μg/mL、100-110μg/mL、110-120μg/mL、120-130μg/mL、130-140μg/mL、140-150μg/mL、50-150μg/mL、60-140μg/mL、70-130μg/mL、80-120μg/mL、90-110μg/mL、95-105μg/mL、10-90μg/mL、20-80μg/mL、30-70μg/mL、40-60μg/mL、45-55μg/mL、50-150μg/mL、60-140μg/mL、70-130μg/mL、80-120μg/mL、90-110μg/mL、95-105μg/mL、50-100μg/mL、100-150μg/mL、150-200μg/mL、200-250μg/mL、250-300μg/mL、300-350μg/mL、350-400μg/mL、400-450μg/mL、450-500μg/mL、500-550μg/mL、550-600μg/mL、600-650μg/mL、650-700μg/mL、700-750μg/mL、750-800μg/mL、800-850μg/mL、850-900μg/mL或950-1,000μg/mL。在一些实施方式中，包含的万古霉素的浓度为刚好或约0.1-100μg/mL、1-50μg/mL、1-100μg/mL、1-250μg/mL、1-500μg/mL、100-200μg/mL、150-250μg/mL、250-350μg/mL、200-400μg/mL、350-450μg/mL、400-600μg/mL、550-650μg/mL、50-650μg/mL、100-600μg/mL、250-750μg/mL、500-1,000μg/mL、750-1,250μg/mL、1,000-1,500μg/mL、1,250-1,750μg/mL或1,500-2,000μg/mL。在示例性实施方式中，万古霉素的浓度为刚好或约50-600μg/mL。在示例性实施方式中，万古霉素的浓度为刚好或约100μg/mL。
在一些实施方式中，细胞培养基包含万古霉素和庆大霉素。在某些实施方式中，储存组合物包含克林霉素和庆大霉素。在一些实施方式中，包含的庆大霉素的浓度为至少刚好或约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000μg/mL。在某些实施方式中，包含的庆大霉素的浓度为刚好或约1-10μg/mL、10-20μg/mL、20-30μg/mL、30-40μg/mL、40-50μg/mL、50-60μg/mL、60-70μg/mL、70-80μg/mL、80-90μg/mL、90-100μg/mL、100-110μg/mL、110-120μg/mL、120-130μg/mL、130-140μg/mL、140-150μg/mL、150-160μg/mL、160-170μg/mL、170-180μg/mL、180-190μg/mL、190-200μg/mL、10-90μg/mL、20-80μg/mL、30-70μg/mL、40-60μg/mL、45-55μg/mL、50-150μg/mL、60-140μg/mL、70-130μg/mL、80-120μg/mL、90-110μg/mL、95-105μg/mL、50-100μg/mL、100-150μg/mL、150-200μg/mL、200-250μg/mL、250-300μg/mL、300-350μg/mL、350-400μg/mL、400-450μg/mL、450-500μg/mL、500-550μg/mL、550-600μg/mL、600-650μg/mL、650-700μg/mL、700-750μg/mL、750-800μg/mL、800-850μg/mL、850-900μg/mL或950-1,000μg/mL。在一些实施方式中，包含的庆大霉素的浓度为刚好或约0.1-100μg/mL、1-50μg/mL、25-75μg/mL、1-100μg/mL、1-250μg/mL、1-500μg/mL、250-750μg/mL、500-1,000μg/mL、750-1,250μg/mL、1,000-1,500μg/mL、1,250-1,750μg/mL或1,500-2,000μg/mL。在示例性实施方式中，庆大霉素的浓度为刚好或约50μg/mL。
在一些实施方式中，细胞培养基还包含一种以上抗真菌性抗生素。用于主题肿瘤储存培养基的抗真菌性抗生素包括但不限于多烯类、唑类、咪唑类、三唑类、噻唑类、烯丙胺类和棘白菌素。示例性多烯类包括但不限于：双性霉素B、念珠菌素、非律平、哈霉素、纳他霉素、制霉菌素和龟裂霉素。示例性咪唑类包括但不限于联苯苄唑、布康唑、克霉唑、益康唑、芬替康唑、异康唑、酮康唑、卢立康唑、咪康唑、奥莫康唑、奥昔康唑、舍他康唑、硫康唑和噻康唑。适用的三唑类包括但不限于：阿巴康唑、艾菲康唑、氟环唑、氟康唑、艾沙康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、丙环唑、雷夫康唑、特康唑和伏立康唑。示例性棘白菌素包括但不限于：阿尼芬净、卡泊芬净、米卡芬净。可包含在本文公开的细胞培养基中的另外的抗真菌性抗生素包括但不限于：橙酮、苯甲酸、环吡酮、氟胞嘧啶、灰黄霉素、卤丙炔氧苯、托那氟利特、十一碳烯酸、三醋精、结晶紫、奥罗地美、米替福辛、碘化钾、日光霉素、硫酸铜、二硫化硒、硫代硫酸钠、吡罗克酮乙醇胺、双碘喹啉、吖啶琐辛、吡啶硫酮锌和硫。
在一些实施方式中，细胞培养基包含双性霉素B。在某些实施方式中，双性霉素B的浓度为至少刚好或约0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.4μg/mL、0.5μg/mL、0.6μg/mL、0.7μg/mL、0.8μg/mL、0.9μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、30μg/mL、35μg/mL、40μg/mL、45μg/mL和50μg/mL。在某些实施方式中，双性霉素B的浓度为至少刚好或约0.1-0.5μg/mL、0.5-1μg/mL、0.25-2μg/mL、0.1-1μg/mL、1-5μg/mL、1-3μg/mL、2-4μg/mL、3-5μg/mL、4-6μg/mL、5-7μg/mL、6-8μg/mL、7-9μg/mL、8-10μg/mL、9-11μg/mL、1-2μg/mL、2-3μg/mL、3-4μg/mL、4-5μg/mL、5-6μg/mL、6-7μg/mL、7-8μg/mL、8-9μg/mL、9-10μg/mL、10-11μg/mL、1-10μg/mL、2-10.5μg/mL、5-15μg/mL、2-12μg/mL、1-11μg/mL、5-10μg/mL、10-20μg/mL、20-30μg/mL、30-40μg/mL或40-50μg/mL。在示例性实施方式中，双性霉素B的浓度为刚好或约2.5-10μg/mL。
B.基础培养基
本文提供的细胞培养基包含基础培养基。在特定实施方式中，基础培养基为成分确定的(也即，所有化学组分已知)或无血清培养基。在一些实施方式中，基础培养基包含：a)葡萄糖、b)多种盐；以及c)多种氨基酸和维生素。在一些实施方式中，基础培养基包括以下培养基中的一种：CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基、CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM、CTSTMAIM-V培养基、CTSTMAIM-V SFM、LymphoONETMT细胞扩增无外源物质培养基、杜尔贝科氏改良型伊格尔氏培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔氏基础培养基(BME)、RPMI1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基和伊斯科夫氏改良型杜尔贝科氏培养基。
在示例性实施方式中，基础培养基是RPMI 1640培养基、DMEM培养基或它们的组合。在一些实施方式中，基础培养基包括RPMI1 640RPMI。在一些实施方式中，基础培养基包括伊格尔氏基础培养基(BME)。在一些实施方式中，基础培养基包括AIM V培养基。在一些实施方式中，基础培养基包括RPMI1640和BME。在示例性实施方式中，基础培养基包括RMPI1640、BME和AIM V培养基。
C.另外的组分
除基础培养基和抗生素外，本文提供的细胞培养基还可以包含以下一种以上组分。
在一些实施方式中，细胞培养基包含谷氨酰胺或谷氨酰胺衍生物。在一些实施方式中，该谷氨酰胺是L-谷氨酰胺。在某些实施方式中，该谷氨酰胺是D-谷氨酰胺。在某些实施方式中，该谷氨酰胺衍生物是L-丙氨酸-L-谷氨酰胺(GutaMax)。
在一些实施方式中，细胞培养基包含转铁蛋白或转铁蛋白代用物。在一些实施方式中，该转铁蛋白是重组转铁蛋白。
在一些实施方式中，细胞培养基包含一种以上胰岛素或胰岛素代用物。在某些实施方式中，该胰岛素是重组胰岛素。
在一些实施方式中，细胞培养基包含一种以上白蛋白或白蛋白代用物。在某些实施方式中，血清是人血清。在特定实施方式中，血清是人AB血清。
在一些实施方式中，细胞培养基包含胆固醇NF。
在一些实施方式中，细胞培养基包含一种以上抗氧化剂。
在示例性实施方式中，细胞培养基包含血清补充剂和/或血清替代物。在某些实施方式中，血清补充剂或血清替代物包括但不限于以下的一种以上：CTSTMOpTmizer T细胞扩增血清补充剂、CTSTM免疫细胞血清替代物、一种以上白蛋白或白蛋白代用物、一种以上氨基酸、一种以上维生素、一种以上转铁蛋白或转铁蛋白代用物、一种以上抗氧化剂、一种以上胰岛素或胰岛素代用物、一种以上胶原蛋白前体、抗生素组分和一种以上微量元素。在一些实施方式中，无血清或成分确定的培养基中的总血清替代物浓度(vol％)为总无血清或成分确定的培养基的体积的约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些实施方式中，总血清替代物浓度为无血清或成分确定的培养基的总体积的约3％。在一些实施方式中，总血清替代物浓度为无血清或成分确定的培养基的总体积的约5％。在一些实施方式中，总血清替代物浓度为无血清或成分确定的培养基的总体积的约10％。
在一些实施方式中，成分确定的培养基或无血清培养基包含一种以上选自如下的成分：甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、硫胺素、还原谷胱甘肽、L-抗坏血酸-2-磷酸盐、铁饱和转铁蛋白、胰岛素以及含有微量元素部分Ag+、Al3+、Ba2+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Ge4 +、Se4+、Br、T、Mn2+、P、Si4+、V5+、Mo6+、Ni2+、Rb+、Sn2+和Zr4+的化合物。
在一些实施方式中，成分确定的培养基或无血清培养基还包含L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和/或2-巯基乙醇。
在一些实施方式中，细胞培养基包含IL-2。在特定实施方式中，IL-2的浓度是3,000-6,000IU/mL。
在一些实施方式中，细胞培养基包含抗CD3抗体。在特定实施方式中，抗CD3抗体是OKT-3抗体。在一些实施方式中，OKT的浓度是30ng/ml。
在一些实施方式中，细胞培养基包含抗原呈递饲养细胞。
在一些实施方式中，细胞培养基还包含IL-7和/或IL-15和/或IL-12。
D.示例性细胞培养基
在示例性实施方式中，本文提供的细胞培养基包含a)基础培养基；b)IL-2；c)抗CD3抗体；d)抗原呈递细胞；和e)抗生素组分，其选自：i)万古霉素；ii)庆大霉素和万古霉素；以及iii)庆大霉素和克林霉素。在一些实施方式中，抗CD3抗体是OKT-3。
在一些实施方式中，本文提供的TIL细胞培养基被配制用于TIL制造过程中，包含例如本文所述的任何TIL制造过程。
在一些实施方式中，使用TIL细胞培养基将TIL扩增为治疗性TIL群。在某些实施方式中，TIL细胞培养基包含：a)基础培养基；b)IL-2；c)抗CD3抗体；和d)抗生素组分，其选自：i)万古霉素；ii)庆大霉素和万古霉素；以及iii)庆大霉素和克林霉素。在一些实施方式中，抗CD3抗体是OKT-3。在示例性实施方式中，TIL细胞培养基中所包含的抗生素是万古霉素。在示例性实施方式中，万古霉素的浓度为刚好或约50-600μg/mL。在示例性实施方式中，万古霉素的浓度为刚好或约100μg/mL。
在某些实施方式中，TIL细胞培养基包含：a)基础培养基，其包括葡萄糖、多种盐和多种氨基酸和/或维生素；b)谷氨酰胺或谷氨酰胺衍生物；c)血清；和d)抗生素组分，其选自：i)万古霉素；ii)庆大霉素和万古霉素；以及iii)庆大霉素和克林霉素。基础培养基可以是本文所述的基础培养基中的任一种。在一些实施方式中，基础培养基包括RPMI 1640。在一些实施方式中，基础培养基包括伊格尔氏基础培养基(BME)。在一些实施方式中，基础培养基包括AIM V培养基。在一些实施方式中，基础培养基包括RPMI 1640和BME。在示例性实施方式中，基础培养基包括RMPI 1640、BME和AIM V培养基。在一些实施方式中，血清是人血清(例如人AB血清)。在一些实施方式中，谷氨酰胺是L-谷氨酰胺。在一些实施方式中，TIL细胞培养基包含如本文所述的CM1培养基(参见例如实施例1)和抗生素组分，抗生素组分选自：i)万古霉素；ii)庆大霉素和万古霉素；以及iii)庆大霉素和克林霉素。在一些实施方式中，TIL细胞培养基包含如本文所述的CM2培养基(参见例如实施例1)和抗生素组分，该抗生素组分选自：i)万古霉素；ii)庆大霉素和万古霉素；以及iii)庆大霉素和克林霉素。在一些实施方式中，TIL细胞培养基还包含IL-7和/或IL-15和/或IL-12和/或IL-21。在一些实施方式中，TIL细胞培养基包含IL-2、饲养细胞和抗CD抗体(例如OKT-3)。在特定实施方式中，细胞培养基包含a)CM1或CM2培养基(实施例1)；b)抗生素组分，其选自：i)万古霉素；ii)庆大霉素和万古霉素；以及iii)庆大霉素和克林霉素；c)IL-2；d)抗原呈递饲养细胞；和e)抗CD3抗体(例如OKT-3)。在一些实施方式中，TIL细胞培养基包含3,000IU/mL IL2或6,000IU/mLIL-2。在一些实施方式中，TIL细胞培养基包含30ng/mL OKT-3。此类组织培养基可用于例如本文所述的TIL制造过程中的任一种。
在某些实施方式中，细胞培养基包含：a)基础培养基，其包括葡萄糖、多种盐和多种氨基酸和/或维生素；b)血清白蛋白；c)胆固醇NF；以及d)抗生素组分，其选自：i)万古霉素；ii)庆大霉素和万古霉素；以及iii)庆大霉素和克林霉素。在一些实施方式中，TIL细胞培养基也包含谷氨酰胺或谷氨酰胺衍生物。在某些实施方式中，谷氨酰胺衍生物是G1utaMAXTM。在某些实施方式中，细胞培养基包含：a)AIM V培养基；和b)抗生素组分，其选自：i)万古霉素；ii)庆大霉素和万古霉素；以及iii)庆大霉素和克林霉素。在一些实施方式中，细胞培养基包含CM3培养基(参见实施例1)和抗生素组分，该抗生素组分选自：i)万古霉素；ii)庆大霉素和万古霉素；以及iii)庆大霉素和克林霉素。在一些实施方式中，细胞培养基包含CM4培养基(参见实施例1)和抗生素组分，该抗生素组分选自：i)万古霉素；ii)庆大霉素和万古霉素；以及iii)庆大霉素和克林霉素。在示例性实施方式中，TIL细胞培养基包含IL-2。在示例性实施方式中，细胞培养基包含浓度为3,000IU/mL的IL-2。此类组织培养基可用于例如本文所述的TIL制造过程中的任一种。
在某些实施方式中，TIL细胞培养基包含：a)基础培养基；b)IL-2；和c)抗生素组分，其选自：i)万古霉素；ii)庆大霉素和万古霉素；以及iii)庆大霉素和克林霉素。在一些实施方式中，抗CD3抗体是OKT-3。在一些实施方式中，TIL细胞培养基包含：a)基础培养基；b)IL-2；c)抗CD3抗体(例如OKT-3)；d)抗生素组分，其选自：i)万古霉素；ii)庆大霉素和万古霉素；以及iii)庆大霉素和克林霉素；和e)外周血单核细胞(PBMC)。如本文所述，此类培养基可用于例如将TIL扩增为治疗性TIL群。
在某些实施方式中，TIL细胞培养基包含：a)基础培养基；b)IL-2；c)抗CD3/抗CD28抗体；以及c)抗生素组分，其选自：i)万古霉素；ii)庆大霉素和万古霉素；以及iii)庆大霉素和克林霉素。如本文所述，此类培养基可用于例如扩增来自外周血的外周血淋巴细胞(PBL)。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的细胞培养基，该细胞培养基经修改以包含浓度为至少刚好或约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000μg/mL的克林霉素。在某些实施方式中，包含的克林霉素的浓度为刚好或约0.1-1μg/mL、0.25-1μg/mL、0.1-0.5μg/mL、0.5-2μg/mL、2-8μg/mL、1-10μg/mL、4-12μg/mL、5-15μg/mL、10-20μg/mL、20-30μg/mL、30-40μg/mL、40-50μg/mL、50-60μg/mL、60-70μg/mL、70-80μg/mL、80-90μg/mL、90-100μg/mL、100-110μg/mL、110-120μg/mL、120-130μg/mL、130-140μg/mL、140-150μg/mL、50-150μg/mL、60-140μg/mL、70-130μg/mL、80-120μg/mL、90-110μg/mL、95-105μg/mL、10-90μg/mL、20-80μg/mL、30-70μg/mL、40-60μg/mL、45-55μg/mL、50-100μg/mL、100-150μg/mL、150-200μg/mL、200-250μg/mL、250-300μg/mL、300-350μg/mL、350-400μg/mL、400-450μg/mL、450-500μg/mL、500-550μg/mL、550-600μg/mL、600-650μg/mL、650-700μg/mL、700-750μg/mL、750-800μg/mL、800-850μg/mL、850-900μg/mL或950-1,000μg/mL。在一些实施方式中，包含的克林霉素的浓度为刚好或约0.1-100μg/mL、1-50μg/mL、1-100μg/mL、1-250μg/mL、1-500μg/mL、250-750μg/mL、350-450μg/mL、450-550μg/mL、550-650μg/mL、400-600μg/mL、350-650μg/mL、300-700μg/mL、200-800μg/mL、500-1,000μg/mL、750-1,250μg/mL、1,000-1,500μg/mL、1,250-1,750μg/mL或1,500-2,000μg/mL。在示例性实施方式中，克林霉素的浓度为刚好或约400-600μg/mL。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的细胞培养基，该细胞培养基经修改以包含浓度为至少刚好或约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000μg/mL的万古霉素。在某些实施方式中，包含的万古霉素的浓度为刚好或约0.1-1μg/mL、0.25-1μg/mL、0.1-0.5μg/mL、0.5-2μg/mL、2-8μg/mL、1-10μg/mL、4-12μg/mL、5-15μg/mL、10-20μg/mL、20-30μg/mL、30-40μg/mL、40-50μg/mL、50-60μg/mL、60-70μg/mL、70-80μg/mL、80-90μg/mL、90-100μg/mL、100-110μg/mL、110-120μg/mL、120-130μg/mL、130-140μg/mL、140-150μg/mL、50-150μg/mL、60-140μg/mL、70-130μg/mL、80-120μg/mL、90-110μg/mL、95-105μg/mL、10-90μg/mL、20-80μg/mL、30-70μg/mL、40-60μg/mL、45-55μg/mL、50-100μg/mL、100-150μg/mL、150-200μg/mL、200-250μg/mL、250-300μg/mL、300-350μg/mL、350-400μg/mL、400-450μg/mL、450-500μg/mL、500-550μg/mL、550-600μg/mL、600-650μg/mL、650-700μg/mL、700-750μg/mL、750-800μg/mL、800-850μg/mL、850-900μg/mL或950-1,000μg/mL。在一些实施方式中，包含的万古霉素的浓度为刚好或约0.1-100μg/mL、1-50μg/mL、1-100μg/mL、1-250μg/mL、1-500μg/mL、100-200μg/mL、150-250μg/mL、200-400μg/mL、350-450μg/mL、400-600μg/mL、550-650μg/mL、50-650μg/mL、100-600μg/mL、250-750μg/mL、500-1,000μg/mL、750-1,250μg/mL、1,000-1,500μg/mL、1,250-1,750μg/mL或1,500-2,000μg/mL。在示例性实施方式中，万古霉素的浓度为刚好或约50-600μg/mL。在一些实施方式中，经修改的细胞培养基包含浓度为刚好或约100μg/mL的万古霉素。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的细胞培养基，该细胞培养基经修改以包含浓度为至少刚好或约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000μg/mL的庆大霉素。在某些实施方式中，包含的庆大霉素的浓度为刚好或约0.1-1μg/mL、0.25-1μg/mL、0.1-0.5μg/mL、0.5-2μg/mL、2-8μg/mL、1-10μg/mL、4-12μg/mL、5-15μg/mL、10-20μg/mL、20-30μg/mL、30-40μg/mL、40-50μg/mL、50-60μg/mL、60-70μg/mL、70-80μg/mL、80-90μg/mL、90-100μg/mL、100-110μg/mL、110-120μg/mL、120-130μg/mL、130-140μg/mL、140-150μg/mL、150-160μg/mL、160-170μg/mL、170-180μg/mL、180-190μg/mL、190-200μg/mL、10-90μg/mL、20-80μg/mL、30-70μg/mL、40-60μg/mL、45-55μg/mL、50-150μg/mL、60-140μg/mL、70-130μg/mL、80-120μg/mL、90-110μg/mL、95-105μg/mL、50-100μg/mL、100-150μg/mL、150-200μg/mL、200-250μg/mL、250-300μg/mL、300-350μg/mL、350-400μg/mL、400-450μg/mL、450-500μg/mL、500-550μg/mL、550-600μg/mL、600-650μg/mL、650-700μg/mL、700-750μg/mL、750-800μg/mL、800-850μg/mL、850-900μg/mL或950-1,000μg/mL。在一些实施方式中，包含的庆大霉素的浓度为刚好或约0.1-100μg/mL、1-50μg/mL、25-75μg/mL、1-100μg/mL、1-250μg/mL、1-500μg/mL、250-750μg/mL、500-1,000μg/mL、750-1,250μg/mL、1,000-1,500μg/mL、1,250-1,750μg/mL或1,500-2,000μg/mL。在示例性实施方式中，庆大霉素的浓度为刚好或约50μg/mL。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的细胞培养基，该细胞培养基经修改以包含浓度为至少刚好或约0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.4μg/mL、0.5μg/mL、0.6μg/mL、0.7μg/mL、0.8μg/mL、0.9μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、30μg/mL、35μg/mL、40μg/mL、45μg/mL和50μg/mL的双性霉素B。在某些实施方式中，该双性霉素B的浓度为至少刚好或约0.1-0.5μg/mL、0.5-1μg/mL、0.25-2μg/mL、0.1-1μg/mL、1-5μg/mL、1-3μg/mL、2-4μg/mL、3-5μg/mL、4-6μg/mL、5-7μg/mL、6-8μg/mL、7-9μg/mL、8-10μg/mL、9-11μg/mL、1-2μg/mL、2-3μg/mL、3-4μg/mL、4-5μg/mL、5-6μg/mL、6-7μg/mL、7-8μg/mL、8-9μg/mL、9-10μg/mL、10-11μg/mL、1-10μg/mL、2-10.5μg/mL、5-15μg/mL、2-12μg/mL、1-11μg/mL、5-10μg/mL、10-20μg/mL、20-30μg/mL、30-40μg/mL或40-50μg/mL。在示例性实施方式中，该双性霉素B的浓度为刚好或约2.5-10μg/mL。
在一些实施方式中，该抗生素组分包含约50-600μg/ml万古霉素。在一些实施方式中，该抗生素组分包含约100μg/ml万古霉素。
在一些实施方式中，该抗生素组分包含约50μg/ml庆大霉素和约400-600μg/ml克林霉素。
在一些实施方式中，该抗生素组分包含抗生素组合，该抗生素组合包含约50μg/ml庆大霉素和约50-600μg/ml万古霉素。在一些实施方式中，该抗生素组分包含抗生素组合，该抗生素组合包含约50μg/ml庆大霉素和约100μg/ml万古霉素。
E.细胞组合物
在另一方面，本发明提供了一种细胞组合物，其包含任何前述段落中描述的经修改以包含细胞的细胞培养基。在一些实施方式中，细胞是来源于肿瘤样本的TIL。在一些实施方式中，TIL来源于以下癌症类型之一的样本：乳腺癌(包括三阴性乳腺癌)、胰腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肺癌、脑癌、肾癌、胃癌、皮肤癌(包括但不限于鳞状细胞癌、基底细胞癌和黑色素瘤)、宫颈癌、头颈癌、卵巢癌、肉瘤、膀胱癌和神经胶母细胞瘤。
在一些实施方式中，TIL来源于液体肿瘤样本。在特定实施方式中，液体肿瘤样本是来自血液系统恶性肿瘤的液体肿瘤样本。
在一些实施方式中，细胞来源于血液样本或骨髓样本。在一些实施方式中，细胞包含外周血淋巴细胞和/或骨髓浸润淋巴细胞。在一些实施方式中，样本是来自全血或骨髓的PBMC样本。
在某些实施方式中，细胞从肿瘤样本，即原发性肿瘤获得。在一些实施方式中，肿瘤样本从侵袭性肿瘤获得。在某些实施方式中，肿瘤样本从转移性肿瘤获得。在一些实施方式中，肿瘤样本从恶性黑色素瘤获得。
在一些实施方式中，细胞组合物中的细胞在细胞的培养基中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20天之后展现出至少刚好或约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的细胞存活率。
在一些实施方式中，细胞组合物中所包含的TIL包含记忆TIL、CD3+/CD4+和/或CD3+/CD8+细胞。本文提供的细胞培养基有利地允许CD3+/CD4+和/或CD3+/CD8+细胞的分化，同时使细菌和/或真菌污染物减到最少。在一些实施方式中，组合物中所包含的TIL展现与不含抗生素(例如万古霉素和克林霉素)的组合物类似的记忆TIL群。在示例性实施方式中，组合物中所包含的TIL展现出与不含抗生素(例如万古霉素和克林霉素)的对照组合物类似的分化CD3+/CD4+、活化CD3+/CD4+和/或耗竭CD3+/CD4+TIL群。在某些实施方式中，TIL展现出与不含抗生素(例如万古霉素和克林霉素)的对照组合物类似的分化CD3+/CD8+、活化CD3+/CD8+和/或耗竭CD3+/CD8+TIL群。
V.肿瘤洗涤缓冲液
在另一方面，本文提供了包含抗生素组分的肿瘤洗涤缓冲液。此类洗涤缓冲液适用于本文提供的方法，特别是用于在破碎或消化之前洗涤肿瘤样本、或在获得供扩增的T细胞和TIL群之前洗涤肿瘤碎片。本文提供的洗涤缓冲液中使用的抗生素使细菌和/或真菌污染的量减到最少，同时有利地对TIL展现低细胞毒性作用。在一些实施方式中，抗生素使在本文提供的方法中经历进一步处理的肿瘤和肿瘤碎片中革兰氏阴性和/或革兰氏阳性细菌污染物的量减到最少。适用的抗生素包括但不限于双性霉素B、克林霉素和万古霉素。
在一些实施方式中，细胞培养基包含克林霉素。在一些实施方式中，包含的克林霉素的浓度为至少刚好或约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000μg/mL。在某些实施方式中，包含的克林霉素的浓度为刚好或约0.1-1μg/mL、0.25-1μg/mL、0.1-0.5μg/mL、0.5-2μg/mL、2-8μg/mL、1-10μg/mL、4-12μg/mL、5-15μg/mL、10-20μg/mL、20-30μg/mL、30-40μg/mL、40-50μg/mL、50-60μg/mL、60-70μg/mL、70-80μg/mL、80-90μg/mL、90-100μg/mL、100-110μg/mL、110-120μg/mL、120-130μg/mL、130-140μg/mL、140-150μg/mL、50-150μg/mL、60-140μg/mL、70-130μg/mL、80-120μg/mL、90-110μg/mL、95-105μg/mL、10-90μg/mL、20-80μg/mL、30-70μg/mL、40-60μg/mL、45-55μg/mL、50-100μg/mL、100-150μg/mL、150-200μg/mL、200-250μg/mL、250-300μg/mL、300-350μg/mL、350-400μg/mL、400-450μg/mL、450-500μg/mL、500-550μg/mL、550-600μg/mL、600-650μg/mL、650-700μg/mL、700-750μg/mL、750-800μg/mL、800-850μg/mL、850-900μg/mL或950-1,000μg/mL。在一些实施方式中，包含的克林霉素的浓度为刚好或约0.1-100μg/mL、1-50μg/mL、1-100μg/mL、1-250μg/mL、1-500μg/mL、250-750μg/mL、350-450μg/mL、450-550μg/mL、550-650μg/mL、400-600μg/mL、350-650μg/mL、300-700μg/mL、200-800μg/mL、250-750μg/mL、500-1,000μg/mL、750-1,250μg/mL、1,000-1,500μg/mL、1,250-1,750μg/mL或1,500-2,000μg/mL。在示例性实施方式中，克林霉素的浓度为刚好或约400-600μg/mL。
在某些实施方式中，洗涤缓冲液包含万古霉素。在示例性实施方式中，洗涤缓冲液包含万古霉素且不含另外的抗生素。在一些实施方式中，包含的万古霉素的浓度为至少刚好或约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000μg/mL。在某些实施方式中，包含的万古霉素的浓度为刚好或约1-10μg/mL、10-20μg/mL、20-30μg/mL、30-40μg/mL、40-50μg/mL、50-60μg/mL、60-70μg/mL、70-80μg/mL、80-90μg/mL、90-100μg/mL、100-110μg/mL、110-120μg/mL、120-130μg/mL、130-140μg/mL、140-150μg/mL、50-150μg/mL、60-140μg/mL、70-130μg/mL、80-120μg/mL、90-110μg/mL、95-105μg/mL、10-90μg/mL、20-80μg/mL、30-70μg/mL、40-60μg/mL、45-55μg/mL、50-150μg/mL、60-140μg/mL、70-130μg/mL、80-120μg/mL、90-110μg/mL、95-105μg/mL、50-100μg/mL、100-150μg/mL、150-200μg/mL、200-250μg/mL、250-300μg/mL、300-350μg/mL、350-400μg/mL、400-450μg/mL、450-500μg/mL、500-550μg/mL、550-600μg/mL、600-650μg/mL、650-700μg/mL、700-750μg/mL、750-800μg/mL、800-850μg/mL、850-900μg/mL或950-1,000μg/mL。在一些实施方式中，包含的万古霉素的浓度为刚好或约0.1-100μg/mL、1-50μg/mL、1-100μg/mL、1-250μg/mL、1-500μg/mL、100-200μg/mL、150-250μg/mL、250-350μg/mL、200-400μg/mL、350-450μg/mL、400-600μg/mL、550-650μg/mL、50-650μg/mL、100-600μg/mL、250-750μg/mL、500-1,000μg/mL、750-1,250μg/mL、1,000-1,500μg/mL、1,250-1,750μg/mL或1,500-2,000μg/mL。在示例性实施方式中，万古霉素的浓度为刚好或约50-600μg/mL。在示例性实施方式中，万古霉素的浓度为刚好或约100μg/mL。
在一些实施方式中，洗涤缓冲液包含万古霉素和庆大霉素。在某些实施方式中，储存组合物包含克林霉素和庆大霉素。在一些实施方式中，包含的庆大霉素的浓度为至少刚好或约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000μg/mL。在某些实施方式中，包含的庆大霉素的浓度为刚好或约1-10μg/mL、10-20μg/mL、20-30μg/mL、30-40μg/mL、40-50μg/mL、50-60μg/mL、60-70μg/mL、70-80μg/mL、80-90μg/mL、90-100μg/mL、100-110μg/mL、110-120μg/mL、120-130μg/mL、130-140μg/mL、140-150μg/mL、150-160μg/mL、160-170μg/mL、170-180μg/mL、180-190μg/mL、190-200μg/mL、10-90μg/mL、20-80μg/mL、30-70μg/mL、40-60μg/mL、45-55μg/mL、50-150μg/mL、60-140μg/mL、70-130μg/mL、80-120μg/mL、90-110μg/mL、95-105μg/mL、50-100μg/mL、100-150μg/mL、150-200μg/mL、200-250μg/mL、250-300μg/mL、300-350μg/mL、350-400μg/mL、400-450μg/mL、450-500μg/mL、500-550μg/mL、550-600μg/mL、600-650μg/mL、650-700μg/mL、700-750μg/mL、750-800μg/mL、800-850μg/mL、850-900μg/mL或950-1,000μg/mL。在一些实施方式中，包含的庆大霉素的浓度为刚好或约0.1-100μg/mL、1-50μg/mL、25-75μg/mL、1-100μg/mL、1-250μg/mL、1-500μg/mL、250-750μg/mL、500-1,000μg/mL、750-1,250μg/mL、1,000-1,500μg/mL、1,250-1,750μg/mL或1,500-2,000μg/mL。在示例性实施方式中，庆大霉素的浓度为刚好或约50μg/mL。
主题洗涤缓冲液中的另外的组分包含电解质(例如钾离子、钠离子、镁离子和钙离子)。在一些实施方式中，洗涤缓冲液包含在生理条件下有效的pH缓冲液。在一些实施方式中，洗涤缓冲液还包含单糖(例如葡萄糖)。
在一些实施方式中，肿瘤洗涤缓冲液包括以下缓冲液中的一种：磷酸盐缓冲盐水(PBS)、杜尔贝科氏磷酸盐缓冲盐水(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline，DPBS)、伊格尔氏最低必需培养基(EMEM)、杜尔贝科氏改良型伊格尔氏培养基(DMEM)、伊斯科夫氏改良型伊格尔氏培养基(MEM)、洛斯维·帕克纪念研究所(Roswell Park MemorialInstitute，RPMI)、哈姆氏F12(Ham's F12)、1:1DMEM/F12或M199。
A.示例性肿瘤洗涤缓冲液
在示例性实施方式中，本文提供的肿瘤洗涤缓冲液包含：(i)一种以上电解质；(ii)在生理条件下有效的pH缓冲液；和(ⅲ)抗生素组分。在一些实施方式中，一种以上电解质选自钾离子、钠离子、镁离子和钙离子。在一些实施方式中，pH缓冲液是磷酸盐缓冲液。在一些实施方式中，洗涤缓冲液在维持生理渗透压方面有效。在一些实施方式中，洗涤缓冲液还包含单糖(例如葡萄糖)。
在一些实施方式中，肿瘤洗涤缓冲液包含以下缓冲液中的一种：磷酸盐缓冲盐水(PBS)、杜尔贝科氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)、伊格尔氏最低必需培养基(EMEM)、杜尔贝科氏改良型伊格尔氏培养基(DMEM)、伊斯科夫氏改良型伊格尔氏培养基(MEM)、洛斯维·帕克纪念研究所(RPMI)、哈姆氏F12、1:1DMEM/F12或M199，和抗生素组分。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的细胞培养基，该细胞培养基经修改以包含浓度为至少刚好或约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000μg/mL的克林霉素。在某些实施方式中，包含的克林霉素的浓度为刚好或约0.1-1μg/mL、0.25-1μg/mL、0.1-0.5μg/mL、0.5-2μg/mL、2-8μg/mL、1-10μg/mL、4-12μg/mL、5-15μg/mL、10-20μg/mL、20-30μg/mL、30-40μg/mL、40-50μg/mL、50-60μg/mL、60-70μg/mL、70-80μg/mL、80-90μg/mL、90-100μg/mL、100-110μg/mL、110-120μg/mL、120-130μg/mL、130-140μg/mL、140-150μg/mL、50-150μg/mL、60-140μg/mL、70-130μg/mL、80-120μg/mL、90-110μg/mL、95-105μg/mL、10-90μg/mL、20-80μg/mL、30-70μg/mL、40-60μg/mL、45-55μg/mL、50-100μg/mL、100-150μg/mL、150-200μg/mL、200-250μg/mL、250-300μg/mL、300-350μg/mL、350-400μg/mL、400-450μg/mL、450-500μg/mL、500-550μg/mL、550-600μg/mL、600-650μg/mL、650-700μg/mL、700-750μg/mL、750-800μg/mL、800-850μg/mL、850-900μg/mL或950-1,000μg/mL。在一些实施方式中，包含的克林霉素的浓度为刚好或约0.1-100μg/mL、1-50μg/mL、1-100μg/mL、1-250μg/mL、1-500μg/mL、250-750μg/mL、350-450μg/mL、450-550μg/mL、550-650μg/mL、400-600μg/mL、350-650μg/mL、300-700μg/mL、200-800μg/mL、500-1,000μg/mL、750-1,250μg/mL、1,000-1,500μg/mL、1,250-1,750μg/mL或1,500-2,000μg/mL。在示例性实施方式中，克林霉素的浓度为刚好或约400-600μg/mL。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的洗涤缓冲液，该洗涤缓冲液经修改以包含浓度为至少刚好或约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000μg/mL的万古霉素。在某些实施方式中，包含的万古霉素的浓度为刚好或约0.1-1μg/mL、0.25-1μg/mL、0.1-0.5μg/mL、0.5-2μg/mL、2-8μg/mL、1-10μg/mL、4-12μg/mL、5-15μg/mL、10-20μg/mL、20-30μg/mL、30-40μg/mL、40-50μg/mL、50-60μg/mL、60-70μg/mL、70-80μg/mL、80-90μg/mL、90-100μg/mL、100-110μg/mL、110-120μg/mL、120-130μg/mL、130-140μg/mL、140-150μg/mL、50-150μg/mL、60-140μg/mL、70-130μg/mL、80-120μg/mL、90-110μg/mL、95-105μg/mL、10-90μg/mL、20-80μg/mL、30-70μg/mL、40-60μg/mL、45-55μg/mL、50-100μg/mL、100-150μg/mL、150-200μg/mL、200-250μg/mL、250-300μg/mL、300-350μg/mL、350-400μg/mL、400-450μg/mL、450-500μg/mL、500-550μg/mL、550-600μg/mL、600-650μg/mL、650-700μg/mL、700-750μg/mL、750-800μg/mL、800-850μg/mL、850-900μg/mL或950-1,000μg/mL。在一些实施方式中，包含的万古霉素的浓度为刚好或约0.1-100μg/mL、1-50μg/mL、1-100μg/mL、1-250μg/mL、1-500μg/mL、100-200μg/mL、150-250μg/mL、200-400μg/mL、350-450μg/mL、400-600μg/mL、550-650μg/mL、50-650μg/mL、100-600μg/mL、250-750μg/mL、500-1,000μg/mL、750-1,250μg/mL、1,000-1,500μg/mL、1,250-1,750μg/mL或1,500-2,000μg/mL。在示例性实施方式中，万古霉素的浓度为刚好或约50-600μg/mL。在一些实施方式中，经修改的细胞培养基包含浓度为刚好或约100μg/mL的万古霉素。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的洗涤缓冲液，该洗涤缓冲液经修改以包含浓度为至少刚好或约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000μg/mL的庆大霉素。在某些实施方式中，包含的庆大霉素的浓度为刚好或约0.1-1μg/mL、0.25-1μg/mL、0.1-0.5μg/mL、0.5-2μg/mL、2-8μg/mL、1-10μg/mL、4-12μg/mL、5-15μg/mL、10-20μg/mL、20-30μg/mL、30-40μg/mL、40-50μg/mL、50-60μg/mL、60-70μg/mL、70-80μg/mL、80-90μg/mL、90-100μg/mL、100-110μg/mL、110-120μg/mL、120-130μg/mL、130-140μg/mL、140-150μg/mL、150-160μg/mL、160-170μg/mL、170-180μg/mL、180-190μg/mL、190-200μg/mL、10-90μg/mL、20-80μg/mL、30-70μg/mL、40-60μg/mL、45-55μg/mL、50-150μg/mL、60-140μg/mL、70-130μg/mL、80-120μg/mL、90-110μg/mL、95-105μg/mL、50-100μg/mL、100-150μg/mL、150-200μg/mL、200-250μg/mL、250-300μg/mL、300-350μg/mL、350-400μg/mL、400-450μg/mL、450-500μg/mL、500-550μg/mL、550-600μg/mL、600-650μg/mL、650-700μg/mL、700-750μg/mL、750-800μg/mL、800-850μg/mL、850-900μg/mL或950-1,000μg/mL。在一些实施方式中，包含的庆大霉素的浓度为刚好或约0.1-100μg/mL、1-50μg/mL、25-75μg/mL、1-100μg/mL、1-250μg/mL、1-500μg/mL、250-750μg/mL、500-1,000μg/mL、750-1,250μg/mL、1,000-1,500μg/mL、1,250-1,750μg/mL或1,500-2,000μg/mL。在示例性实施方式中，庆大霉素的浓度为刚好或约50μg/mL。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的洗涤缓冲液，该洗涤缓冲液经修改以包含浓度为至少刚好或约0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.4μg/mL、0.5μg/mL、0.6μg/mL、0.7μg/mL、0.8μg/mL、0.9μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、30μg/mL、35μg/mL、40μg/mL、45μg/mL和50μg/mL的双性霉素B。在某些实施方式中，双性霉素B的浓度为至少刚好或约0.1-0.5μg/mL、0.5-1μg/mL、0.25-2μg/mL、0.1-1μg/mL、1-5μg/mL、1-3μg/mL、2-4μg/mL、3-5μg/mL、4-6μg/mL、5-7μg/mL、6-8μg/mL、7-9μg/mL、8-10μg/mL、9-11μg/mL、1-2μg/mL、2-3μg/mL、3-4μg/mL、4-5μg/mL、5-6μg/mL、6-7μg/mL、7-8μg/mL、8-9μg/mL、9-10μg/mL、10-11μg/mL、1-10μg/mL、2-10.5μg/mL、5-15μg/mL、2-12μg/mL、1-11μg/mL、5-10μg/mL、10-20μg/mL、20-30μg/mL、30-40μg/mL或40-50μg/mL。在示例性实施方式中，双性霉素B的浓度为刚好或约2.5-10μg/mL。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约50-600μg/ml万古霉素。在一些实施方式中，抗生素组分包含约100μg/ml万古霉素。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/ml庆大霉素和约400-600μg/ml克林霉素。
在一些实施方式中，抗生素组分包含抗生素组合，该抗生素组合包含约50μg/ml庆大霉素和约50-600μg/ml万古霉素。在一些实施方式中，抗生素组分包含抗生素组合，该抗生素组合包含约50μg/ml庆大霉素和约100μg/ml万古霉素。
VI.使用细胞储存、细胞培养基和洗涤缓冲液组合物的示例性方法
如本文公开，本文提供的主题细胞储存和细胞培养基组合物可用于任何合适的TIL制造方法中。以下提供使用该主题组合物的示例性TIL制造方法。
在一方面是一种用于扩增T细胞的方法，其包含以下步骤：通过使用任何前述段落中描述的细胞培养基培养自受试者获得的肿瘤样本的T细胞群以实现第一T细胞群的生长来扩增该T细胞群。在一些实施方式中，细胞培养基包含抗生素组分，该抗生素组分包含本文公开的任何浓度的：1)抗生素组合，其选自：i)庆大霉素和万古霉素；和ii)庆大霉素和克林霉素；或2)抗生素万古霉素。在一些实施方式中，培养基还包含IL-2。在一些实施方式中，培养基还包含IL-7和/或IL-15和/或IL-21。在某些实施方式中，将T细胞群培养约3至14天的时间段。在一些实施方式中，将肿瘤样本预先储存于任何前述段落中描述的肿瘤储存组合物中。
在另一方面，本文提供了一种用于快速扩增T细胞的方法，其包括使第一T细胞群与任何前述段落中描述的细胞培养基接触以实现该第一T细胞群的快速生长，由此产生第二T细胞群，其中，快速扩增进行约7至14天的时间段。在一些实施方式中，细胞培养基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)、抗原呈递细胞(APC)和抗生素组分，其中，抗生素组分包含：1)抗生素组合，其选自本文公开的任何浓度的：i)庆大霉素和万古霉素；以及ii)庆大霉素和克林霉素；或2)抗生素万古霉素。在一些实施方式中，培养基还包含IL-7和/或IL-15和/或IL-21。
在另一方面，本文提供了一种用于将TIL扩增为治疗性TIL群的方法。在此方法的步骤a)中，提供样本，该样本包含多个来自手术切除、至少一次穿刺活体组织切片、至少一次粗针活体组织切片、至少一次小型活体组织切片或用于自受试者获得含有肿瘤和TIL的混合物的肿瘤样本的其他方式获得的肿瘤样本的肿瘤细胞和TIL。在一些实施方式中，将肿瘤样本储存于任何前述段落中描述的肿瘤储存组合物中。在步骤b)中，第一TIL群通过将肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片而获得。在步骤c)中，接着将肿瘤碎片引入密闭系统中。在步骤d)中，通过在第一细胞培养基中培养第一TIL群来进行第一扩增，产生第二TIL群，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3-14天以获得第二TIL群，自步骤c)至步骤d)的转变在不打开系统的情况下发生，第一细胞培养基包含IL-2和第一抗生素组分。在步骤e)中，接着，通过在第二细胞培养基中培养第二TIL群进行第二扩增，产生第三TIL群，其中，第二扩增进行约7 -14天以获得第三TIL群，第三TIL群是治疗性TIL群，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤d)至步骤e)的转变在不打开系统的情况下发生；第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3、抗原呈递细胞(APC)和第二抗生素组分。在步骤f)中，收集自步骤e)获得的治疗性TIL群，其中，自步骤e)至步骤f)的转变在不打开系统的情况下发生。进一步地，在步骤g)中，将自步骤f)收集的治疗性TIL群转移至输注袋，其中，自步骤f)至步骤g)的转移在不打开系统的情况下发生。在示例性实施方式中，第一抗生素组分与第二抗生素组分相同或不同。在一些实施方式中，第一抗生素组分和第二抗生素组分独立地包含：1)抗生素组合，其选自本文公开的任何浓度的：i)庆大霉素和万古霉素；以及ii)庆大霉素和克林霉素；或2)抗生素万古霉素。在其他实施方式中，第一扩增和第二扩增可进行总计约22天以下。在其他实施方式中，第一扩增可在约11天内进行。在其他实施方式中，第二扩增可在约11天内进行。在其他实施方式中，第一扩增可在约11天内进行，第二扩增可在约11天内进行。在其他实施方式中，第二扩增可分成第一时间段和第二时间段，其中，第二扩增的第一时间段通过在补充有IL-2、OKT-3、抗原呈递细胞(APC)和第二抗生素组分的第二培养基中培养第二细胞群约5天来进行，第二扩增的第二时间段通过在补充有另外的IL-2的另外的第二培养基中培养第二细胞群约6天来进行。在一些实施方式中，在第二扩增的第一时间段之后且在第二扩增的第二时间段开始之前，将第二细胞群自在第二扩增的第一时间段培养第二群细胞的具有第一透气表面区域的第一容器转移至在第二扩增的第二时间段培养第二细胞群的具有第二透气表面区域的第二容器，其中，第二透气表面区域大于第一透气表面区域，第二细胞群自第一容器转移至第二容器在不打开系统的情况下进行。在一些实施方式中，第二透气表面区域比第一透气表面区域大至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多。在一些实施方式中，第一培养基还包含IL-7和/或IL-15和/或IL-21。在一些实施方式中，第二培养基还包含IL-7和/或IL-15和/或IL-21。
在一方面，本文提供了一种用于将TIL扩增为治疗性TIL群的方法。在此方法的步骤a)中，提供自手术切除、至少一次穿刺活体组织切片、至少一次粗针活体组织切片、至少一次小型活体组织切片或用于自受试者获得含有肿瘤和TIL的混合物的样本的其他方式获得的第一TIL群。在步骤b)中，使第一TIL群与第一细胞培养基接触。在步骤c)中，第一TIL群的第一扩增(或起始第一扩增)在第一细胞培养基中进行，获得第二TIL群，其中，第一细胞培养基包含IL-2、可选的抗CD3抗体(例如OKT-3)、可选的抗原呈递细胞(例如经辐照的同种异体外周血单核细胞(PBMC))和第一抗生素组分，可选地其中第一扩增进行约8天以下的时间段，可选地第一TIL扩增可进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天。在步骤c)中，第二TIL群的第二扩增(或快速第二扩增)在第二细胞培养基中进行，获得治疗性TIL群，其中，第二细胞培养基包含IL-2、抗CD3抗体(例如OKT-3)、第二抗生素组分和可选的抗原呈递细胞(例如经辐照的同种异体外周血单核细胞(PBMC))；第二扩增进行10天以下的时间段，可选地第二扩增可在第二扩增开始之后进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。在步骤e)中，收集治疗性TIL群。在一些实施方式中，第一培养基与第二培养基中所包含的抗生素相同或不同。在一些实施方式中，第一培养基与第二培养基中所包含的抗生素独立地包含本文公开的任何浓度的：1)庆大霉素和万古霉素、2)庆大霉素和克林霉素、3)或抗生素万古霉素。在一些实施方式中，第一扩增可在约7天内进行。在一些实施方式中，第二扩增可在约9天内进行。在一些实施方式中，第一扩增和第二扩增可进行总计约16天。在一些实施方式中，将第二扩增分成第一时间段和第二时间段，其中，第二扩增的第一时间段通过在补充有IL-2、OKT-3、抗原呈递细胞(APC)和第二抗生素组分的第二培养基中培养第二细胞群约3天来进行，第二扩增的第二时间段通过在补充有另外的IL-2的另外的第二培养基中培养第二细胞群约6天来进行。在一些实施方式中，在第二扩增的第一时间段之后且在第二扩增的第二时间段开始之前，将第二细胞群自在第二扩增的第一时间段培养第二群细胞群的具有第一透气表面区域的第一容器转移至在第二扩增的第二时间段培养第二细胞群的具有第二透气表面区域的第二容器，其中，第二透气表面区域大于第一透气表面区域，第二细胞群自第一容器转移至第二容器在不打开系统的情况下进行。在一些实施方式中，第二透气表面区域比第一透气表面区域大至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的用于扩增TIL的方法，该方法经修改以使得在第二扩增的第一时间段之后且在第二扩增的第二时间段开始之前，第二细胞群自在第二扩增的第一时间段培养第二细胞群的具有第一透气表面区域的第一容器转移至在第二扩增的第二时间段用补充有IL-2和可选的第二抗生素组分的另外的第二培养基培养第二细胞群的具有第二透气表面区域的第二容器，其中，第二透气表面区域大于第一透气表面区域，第二细胞群自第一容器转移至第二容器在不打开该系统的情况下进行。在一些实施方式中，第二透气表面区域比第一透气表面区域大至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的用于扩增TIL的方法，该方法经修改以使得在第一扩增的第1天至第3天中的任一天，用OKT-3补充第一培养基。
在另一方面，本文提供了一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法。在此方法的步骤a)中，第一TIL群的起始第一扩增通过在第一培养基中培养第一T细胞群进行以实现第一TIL群的生长和起始该第一TIL群的活化，第一培养基包含IL-2、可选的抗CD3抗体(例如OKT-3)、可选的抗原呈递细胞(例如经辐照的同种异体外周血单核细胞(PBMC))和第一抗生素组分。TIL自手术切除、至少一次穿刺活体组织切片、至少一次粗针活体组织切片、至少一次小型活体组织切片或用于自受试者获得含有肿瘤和TIL的混合物的样本的其他方式获得。在步骤b)中，第一TIL群的快速第二扩增在步骤(a)中起始的第一TIL群的活化开始衰退之后进行。在此扩增步骤中，将第一TIL群培养在包含IL-2、可选的抗CD3抗体(例如OKT-3)、第二抗生素组分和可选的经辐照的同种异体外周血单核细胞(PBMC)的第二培养基中以实现第一TIL群的生长和加强其活化，由此获得第二TIL群，其中，第二TIL群是治疗性TIL群。在步骤c)中，收集治疗性TIL群。在一些方法中，第一培养基与第二培养基中所包含的抗生素相同或不同。在一些实施方式中，第一培养基和第二培养基中所包含的抗生素包含1)抗生素组合，其选自本文公开的任何浓度的：i)庆大霉素和万古霉素；以及ii)庆大霉素和克林霉素；或2)抗生素万古霉素。在一些实施方式中，将第二扩增分成第一时间段和第二时间段，其中，第二扩增的第一时间段通过在补充有IL-2、OKT-3、抗原呈递细胞(APC)和第二抗生素组分的第二培养基中培养第二细胞群约3天来进行，第二扩增的第二时间段通过在补充有另外的IL-2的另外的第二培养基中培养第二细胞群约6天来进行。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的用于扩增TIL的方法，该方法经修改以使得在第二扩增的第一时间段之后且在第二扩增的第二时间段开始之前，第二细胞群自在第二扩增的第一时间段培养第二细胞群的具有第一透气表面区域的第一容器转移至在第二扩增的第二时间段用补充有IL-2和可选的第二抗生素组分的另外的第二培养基培养第二细胞群的具有第二透气表面区域的第二容器，其中，第二透气表面区域大于第一透气表面区域，第二细胞群自第一容器转移至第二容器在不打开系统的情况下进行。在一些实施方式中，第二透气表面区域比第一透气表面区域大至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多。
在另一方面，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的用于扩增TIL的方法，该方法经修改以使得在第一扩增开始之前，自第一TIL群选择PD-1阳性TIL以获得经富集的PD-1TIL群，第一扩增用该经富集的PD-1TIL群进行。在一些实施方式中，第一TIL群通过消化获自手术切除、至少一次穿刺活体组织切片、至少一次粗针活体组织切片、至少一次小型活体组织切片或用于自受试者获得含有肿瘤和TIL的混合物的样本的其他方式的肿瘤碎片或样本(可选地对消化物进行机械解聚集)而自此类肿瘤碎片或样本获得，经富集的PD-1TIL群通过自消化物选择PD-1阳性TIL来获得。在一些实施方式中，消化使用一种以上胶原蛋白酶进行。在其他实施方式中，消化使用胶原蛋白酶和DNA酶进行。在其他实施方式中，消化使用胶原蛋白酶、DNA酶I和中性蛋白酶进行。可使用任何合适的PD-1富集方法获得PD-1阳性TIL，包括本文提供的方法中的任一种。
在另一方面，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的用于扩增TIL的方法，该方法经修改以使得在第一扩增开始之前，针对PD-1、CD39、CD38、CD103、LAG3、TIM3和/或TIGIT阳性对第一TIL群进行选择以获得呈PD-1、CD39、CD38、CD103、LAG3、TIM3和/或TIGIT阳性的经富集的TIL群，第一扩增用该经富集的TIL群进行。在一些实施方式中，第一TIL群通过消化获自手术切除、至少一次穿刺活体组织切片、至少一次粗针活体组织切片、至少一次小型活体组织切片或用于自受试者获得含有肿瘤和TIL的混合物的样本的其他方式的肿瘤碎片或样本(可选地对消化物进行机械解聚集)而自此类肿瘤碎片或样本获得，该经富集的TIL群通过自该消化物选择PD-1、CD39、CD38、CD103、LAG3、TIM3和/或TIGIT阳性的TIL来获得。在一些实施方式中，消化使用一种以上胶原蛋白酶进行。在其他实施方式中，消化使用胶原蛋白酶和DNA酶进行。在其他实施方式中，消化使用胶原蛋白酶、DNA酶I和中性蛋白酶进行。可使用任何合适的PD-1、CD39、CD38、CD103、LAG3、TIM3和/或TIGIT富集方法获得PD-1、CD39、CD38、CD103、LAG3、TIM3和/或TIGIT阳性的TIL，包括本文提供的方法中的任一种。在一些实施方式中，经富集的TIL群通过自该消化物选择PD-1、LAG3、TIM3和/或TIGIT阳性的TIL来获得。
在又一方面，本文提供了一种用于扩增来自外周血的外周血淋巴细胞(PBL)的方法。在此方法的步骤a)中，外周血单核细胞(PBMC)的样本自可选地已用依鲁替尼或另一种白介素-2诱导性T细胞激酶(ITK)抑制剂预治疗且难以用依鲁替尼或该另一种ITK抑制剂治疗的患者的外周血获得。在步骤b)中，将PBMC在包含IL-2、抗CD3/抗CD28抗体和第一抗生素组分的第一细胞培养基的培养物中培养选自如下的时间段：约9天、约10天、约11天、约12天、约13天和约14天，由此实现来自该PBMC的外周血淋巴细胞(PBL)的扩增。在步骤c)中，自步骤b)中的培养物收集PBL。在此方法中，第一抗生素组分包含：1)抗生素组合，其选自本文公开的任何浓度的：i)庆大霉素和万古霉素；以及ii)庆大霉素和克林霉素；或2)抗生素万古霉素。
在又一方面，本文提供了一种用于扩增来自患者的外周血的外周血淋巴细胞(PBL)的方法。在一些实施方式中，方法包括(a)自患者的外周血获得外周血单核细胞(PBMC)的样本，其中，该样本可选地经冷冻保存，患者可选地用ITK抑制剂预治疗；(b)可选地通过离心洗涤PBMC；(c)将对CD3和CD28具有选择性的磁珠添加至PBMC中；(d)将PBMC接种至透气容器中，将所述PBMC在包含约3000IU/mL IL-2和第一抗生素组分的第一细胞培养基中共培养约4至约6天；(e)使用包含约3000IU/mL IL-2的第一细胞培养基喂养所述PBMC，共培养所述PBMC约5天，由此使步骤(d)和步骤(e)的总培养时间段为约9至约11天；(f)自培养基收集PBMC；(g)使用磁体移除该对CD3和CD28具有选择性的磁珠；(h)使用磁活化细胞分选和CD19+珠子移除残余B细胞，提供PBL产物；(i)使用细胞收集器洗涤并浓缩PBL产物；以及(j)配制以及可选地冷冻保存该PBL产物。在此方法中，第一抗生素组分包含：1)抗生素组合，其选自本文公开的任何浓度的：i)庆大霉素和万古霉素；以及ii)庆大霉素和克林霉素；或2)抗生素万古霉素。在一些实施方式中，ITK抑制剂可选地为共价结合ITK的ITK抑制剂。在一些实施方式中，ITK抑制剂是依鲁替尼。
在又一方面，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的扩增来自外周血的外周血淋巴细胞(PBL)的方法，该方法经修改以使得PBMC样品获自患者的10mL或约10mL至50mL或约50mL的外周血。
在又一方面，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的扩增来自外周血的外周血淋巴细胞(PBL)的方法，该方法经修改以使得接种至透气容器中的PBMC的接种密度相对于透气容器的表面区域为2×105个/cm2或约2×105个/cm2至1.6×103个/cm2或约1.6×103个/cm2。
在又一方面，本发明提供了一种用于制备来自全血样品的外周血淋巴细胞(PBL)的方法，其包括以下步骤：(a)自来自具有液体肿瘤的患者的约50mL以下全血获得外周血单核细胞(PBMC)，其中该患者可选地用ITK抑制剂预治疗；(b)将对CD3和CD28具有选择性的珠子与PBMC混合，其中珠子以3个珠子:1个细胞的比率添加，形成PBMC与珠子的混合物；(c)将PBMC与珠子的混合物以25,000个细胞/cm2或约25,000个细胞/cm2至50,000个细胞/cm2或约50,000个细胞/cm2的密度在一个以上含有第一细胞培养基、IL-2和第一抗生素组分的容器的透气表面上培养约4天的时间段；(d)将IL-2、与第一细胞培养基相同或不同的第二细胞培养基和可选的与第一抗生素组分相同或不同的第二抗生素组分添加至各容器中，培养约5天至约7天的时间段以形成经扩增的PBL群；以及(e)自各容器收集经扩增的PBL群。在此方法中，第一抗生素组分包含：1)抗生素组合，其选自本文公开的任何浓度的：i)庆大霉素和万古霉素；以及ii)庆大霉素和克林霉素；或2)抗生素万古霉素，可选的第二抗生素组分包含：1)抗生素组合，其选自：i)庆大霉素万古霉素；以及ii)庆大霉素和克林霉素；或2)抗生素万古霉素。在一些实施方式中，ITK抑制剂是结合ITK的ITK抑制剂。在一些实施方式中，ITK抑制剂是依鲁替尼。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以在第一细胞培养基和/或第二细胞培养基中包含浓度为至少刚好或约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000μg/mL的克林霉素。在某些实施方式中，包含的克林霉素的浓度为刚好或约0.1-1μg/mL、0.25-1μg/mL、0.1-0.5μg/mL、0.5-2μg/mL、2-8μg/mL、1-10μg/mL、4-12μg/mL、5-15μg/mL、10-20μg/mL、20-30μg/mL、30-40μg/mL、40-50μg/mL、50-60μg/mL、60-70μg/mL、70-80μg/mL、80-90μg/mL、90-100μg/mL、100-110μg/mL、110-120μg/mL、120-130μg/mL、130-140μg/mL、140-150μg/mL、50-150μg/mL、60-140μg/mL、70-130μg/mL、80-120μg/mL、90-110μg/mL、95-105μg/mL、10-90μg/mL、20-80μg/mL、30-70μg/mL、40-60μg/mL、45-55μg/mL、50-100μg/mL、100-150μg/mL、150-200μg/mL、200-250μg/mL、250-300μg/mL、300-350μg/mL、350-400μg/mL、400-450μg/mL、450-500μg/mL、500-550μg/mL、550-600μg/mL、600-650μg/mL、650-700μg/mL、700-750μg/mL、750-800μg/mL、800-850μg/mL、850-900μg/mL或950-1,000μg/mL。在一些实施方式中，包含的克林霉素的浓度为刚好或约0.1-100μg/mL、1-50μg/mL、1-100μg/mL、1-250μg/mL、1-500μg/mL、250-750μg/mL、350-450μg/mL、450-550μg/mL、550-650μg/mL、400-600μg/mL、350-650μg/mL、300-700μg/mL、200-800μg/mL、500-1,000μg/mL、750-1,250μg/mL、1,000-1,500μg/mL、1,250-1,750μg/mL或1,500-2,000μg/mL。在示例性实施方式中，克林霉素的浓度为刚好或约400-600μg/mL。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以在第一细胞培养基和/或第二细胞培养基中包含浓度为至少刚好或约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000μg/mL的万古霉素。在某些实施方式中，包含的万古霉素的浓度为刚好或约0.1-1μg/mL、0.25-1μg/mL、0.1-0.5μg/mL、0.5-2μg/mL、2-8μg/mL、1-10μg/mL、4-12μg/mL、5-15μg/mL、10-20μg/mL、20-30μg/mL、30-40μg/mL、40-50μg/mL、50-60μg/mL、60-70μg/mL、70-80μg/mL、80-90μg/mL、90-100μg/mL、100-110μg/mL、110-120μg/mL、120-130μg/mL、130-140μg/mL、140-150μg/mL、50-150μg/mL、60-140μg/mL、70-130μg/mL、80-120μg/mL、90-110μg/mL、95-105μg/mL、10-90μg/mL、20-80μg/mL、30-70μg/mL、40-60μg/mL、45-55μg/mL、50-100μg/mL、100-150μg/mL、150-200μg/mL、200-250μg/mL、250-300μg/mL、300-350μg/mL、350-400μg/mL、400-450μg/mL、450-500μg/mL、500-550μg/mL、550-600μg/mL、600-650μg/mL、650-700μg/mL、700-750μg/mL、750-800μg/mL、800-850μg/mL、850-900μg/mL或950-1,000μg/mL。在一些实施方式中，包含的万古霉素的浓度为刚好或约0.1-100μg/mL、1-50μg/mL、1-100μg/mL、1-250μg/mL、1-500μg/mL、100-200μg/mL、150-250μg/mL、200-400μg/mL、350-450μg/mL、400-600μg/mL、550-650μg/mL、50-650μg/mL、100-600μg/mL、250-750μg/mL、500-1,000μg/mL、750-1,250μg/mL、1,000-1,500μg/mL、1,250-1,750μg/mL或1,500-2,000μg/mL。在示例性实施方式中，万古霉素的浓度为刚好或约50-600μg/mL。在示例性实施方式中，万古霉素的浓度为刚好或约100μg/mL。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以在第一细胞培养基和/或第二细胞培养基中包含浓度为至少刚好或约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000μg/mL的庆大霉素。在某些实施方式中，包含的庆大霉素的浓度为刚好或约0.1-1μg/mL、0.25-1μg/mL、0.1-0.5μg/mL、0.5-2μg/mL、2-8μg/mL、1-10μg/mL、4-12μg/mL、5-15μg/mL、10-20μg/mL、20-30μg/mL、30-40μg/mL、40-50μg/mL、50-60μg/mL、60-70μg/mL、70-80μg/mL、80-90μg/mL、90-100μg/mL、100-110μg/mL、110-120μg/mL、120-130μg/mL、130-140μg/mL、140-150μg/mL、150-160μg/mL、160-170μg/mL、170-180μg/mL、180-190μg/mL、190-200μg/mL、10-90μg/mL、20-80μg/mL、30-70μg/mL、40-60μg/mL、45-55μg/mL、50-150μg/mL、60-140μg/mL、70-130μg/mL、80-120μg/mL、90-110μg/mL、95-105μg/mL、50-100μg/mL、100-150μg/mL、150-200μg/mL、200-250μg/mL、250-300μg/mL、300-350μg/mL、350-400μg/mL、400-450μg/mL、450-500μg/mL、500-550μg/mL、550-600μg/mL、600-650μg/mL、650-700μg/mL、700-750μg/mL、750-800μg/mL、800-850μg/mL、850-900μg/mL或950-1,000μg/mL。在一些实施方式中，包含的庆大霉素的浓度为刚好或约0.1-100μg/mL、1-50μg/mL、25-75μg/mL、1-100μg/mL、1-250μg/mL、1-500μg/mL、250-750μg/mL、500-1,000μg/mL、750-1,250μg/mL、1,000-1,500μg/mL、1,250-1,750μg/mL或1,500-2,000μg/mL。在示例性实施方式中，庆大霉素的浓度为刚好或约50μg/mL。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以在第一细胞培养基和/或第二细胞培养基中包含浓度为至少刚好或约0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.4μg/mL、0.5μg/mL、0.6μg/mL、0.7μg/mL、0.8μg/mL、0.9μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、30μg/mL、35μg/mL、40μg/mL、45μg/mL和50μg/mL的双性霉素B。在某些实施方式中，该双性霉素B的浓度为至少刚好或约0.1-0.5μg/mL、0.5-1μg/mL、0.25-2μg/mL、0.1-1μg/mL、1-5μg/mL、1-3μg/mL、2-4μg/mL、3-5μg/mL、4-6μg/mL、5-7μg/mL、6-8μg/mL、7-9μg/mL、8-10μg/mL、9-11μg/mL、1-2μg/mL、2-3μg/mL、3-4μg/mL、4-5μg/mL、5-6μg/mL、6-7μg/mL、7-8μg/mL、8-9μg/mL、9-10μg/mL、10-11μg/mL、1-10μg/mL、2-10.5μg/mL、5-15μg/mL、2-12μg/mL、1-11μg/mL、5-10μg/mL、10-20μg/mL、20-30μg/mL、30-40μg/mL或40-50μg/mL。在示例性实施方式中，该双性霉素B的浓度为刚好或约2.5-10μg/mL。
在一些实施方式中，在将肿瘤样本解离或破碎成肿瘤碎片之前，将其在包含抗生素组分的洗涤缓冲液中洗涤至少一次。本文所述的任何肿瘤洗涤缓冲液均可用于洗涤肿瘤样本。在一些实施方式中，抗生素组分包含本文公开的任何浓度的：1)万古霉素；2)庆大霉素和万古霉素；或3)庆大霉素和克林霉素。在示例性实施方式中，洗涤缓冲液包含万古霉素。在示例性实施方式中，万古霉素的浓度为50μg/mL-600μg/mL。在示例性实施方式中，万古霉素的浓度为刚好或约100μg/mL。在示例性实施方式中，将肿瘤样本在洗涤缓冲液中洗涤3次以上。
在一些实施方式中，在冷冻保存或第一扩增之前，将肿瘤样本在包含抗生素组分的洗涤缓冲液中洗涤至少一次。本文所述的任何肿瘤洗涤缓冲液均可用于洗涤肿瘤碎片。在一些实施方式中，抗生素组分包含本文公开的任何浓度的：1)万古霉素；2)庆大霉素和万古霉素；或3)庆大霉素和克林霉素。在示例性实施方式中，洗涤缓冲液包含万古霉素。在示例性实施方式中，万古霉素的浓度为50μg/mL-600μg/mL。在示例性实施方式中，万古霉素的浓度是100μg/mL。在示例性实施方式中，将肿瘤样本在洗涤缓冲液中洗涤3次以上。
VII.扩增包含外周血(PBL)和/或骨髓(MIL)的治疗性T细胞的方法的实施方式A.扩增来自外周血的外周血淋巴细胞(PBL)的方法
PBL方法1.在本发明的一些实施方式中，PBL使用本文所述的方法扩增。在本发明的一些实施方式中，方法包括获得来自全血的PBMC样本。在一些实施方式中，方法包括通过使用CD3+/CD28+级分的正向选择自PBMC分离纯T细胞来富集T细胞。在37℃水浴中将冷冻保存的PBMC解冻。将解冻的PBMC转移至50mL锥形管中并充分混合。将细胞悬浮液分成两等份，置于两个经标记的15mL聚苯乙烯锥形管中。在15mL管中，通过在24℃下以400×g离心5分钟(加速度＝9，减速度＝9)使细胞沉淀。在离心期间，通过将CTSDynabeads(CD3/CD28)在摇臂上置放至少5分钟进行混合。将细胞自离心机移出并抽吸所有培养基。封盖各管并沿粗糙表面(例如管架)刮擦该管以帮助破碎细胞沉淀物。计算并记录标为方法#1的管中CD3+活细胞的数目：CD3+活细胞的数目＝CD3+细胞％*TVC(总活细胞)。使用洗涤缓冲液(无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)、1％人血清白蛋白、10U/mLDNA酶)使细胞再悬浮于标为方法#1的管中以使得活T细胞的浓度为1e7个/mL。通过转移如以上所计算的体积，以3个珠子:1个T细胞的比率添加经洗涤的CTSDynaBeads(CD3/28)。在经箔覆盖的微型管中，将样本与Dynabeads一起在摇臂(1-3RPM端至端)上在室温下于暗处孵育30分钟。在孵育30分钟后，将样本置于15mL锥形管中，用1mL CM2+IL-2(3000IU/mL)冲洗该微型管并将其转移至15mL管中。使用CM2+IL-2使体积达到10mL并使用移液器充分混合。将该管在DynaMag-15上置放一至两分钟以进行珠子结合的CD3+细胞的正向选择。将细胞悬浮液(阴性部分)倾析至经标记(方法#1—无T细胞级分)的50mL锥形管中。将10mL含IL-2(3000IU/mL)的CM2培养基立即添加至含有珠子结合的细胞的15mL管中并混合。将该管置于Dynamag-15上，保持一至两分钟。将细胞悬浮液(残余阴性部分)倾析至经标记(方法#1-无T细胞级分)的50mL锥形管中。将5mL含IL-2(3000IU/mL)的CM2培养基立即添加至含有珠子结合的细胞的15mL管中并混合。将该管重新标记为(方法#1—T细胞级分)。对阴性和阳性部分进行计数。自阴性和阳性部分中的每一个获得约5e5个细胞用于新鲜样本的流式分析(CD3/4/8/19/14)。冷冻保存剩余的阴性部分。继续培养富集阳性T细胞的部分与Dynabeads。
在第0天，分别向两个G-REX5M培养瓶中置放1e6个活T细胞。适当地标记培养瓶(例如“方法#1”)。替代性地，向每个G-REX 10M中置放最少2e6个活T细胞。缓慢使各G-REX5M培养瓶中培养基的体积达到20mL补充有3000IU/mL IL-2的CM2或在各G-REX10M中达到40mL。将培养瓶置于培养箱(37℃、5％ CO2)中。
在第4天，添加培养基。若在G-REX 5M中培养，则添加20mL CM4+IL-2(3000IU/mL)。若在G-REX 10M中培养，则添加40mL CM4+IL-2(3000IU/mL)。
在第7天，添加培养基。若在G-REX 5M中培养，则添加10mL CM4+IL-2(3000IU/mL)。若在G-REX 10M中培养，则添加20mL CM4+IL-2(3000IU/mL)。
可在第9天或第11天收集细胞。
在收集当天，自每一富集条件收集一个G-REX培养瓶。在不破坏细胞的情况下，将培养基体积缩减至约10％。将两份1mL样本储存在-20℃冷冻器中用于代谢物分析。使细胞再悬浮并收集于适当标记(例如“方法#1”)的50mL锥形管中。将约10mL血浆溶解液+1％ HSA添加至各50mL管中。将锥形管置于Dynamag-50中，保持一至两分钟，以移除珠子。使用5或10mL移液管，将细胞悬浮液移至标记为方法#1的最终的另一个50mL锥形管中。将10mL血浆溶解液+1％ HSA立即添加至Dynamag-50中的管中，将其自磁体移开并混合，接着将其放回磁体。将50mL锥形管再置于DynaMag-50上，保持2分钟进行冲洗。使用5或10mL移液管，将细胞悬浮液移至适当标记(例如“方法#1最终”)的50mL锥形管中。取出样本进行细胞计数和存活率分析以及珠子残余计数。使用冷却的冷冻培养基(例如49.9％血浆溶解液-A、0.5％HSA和50％ CS10)在小瓶中冷冻保存最终产物。
在一些实施方式中，本发明提供了一种用于扩增来自外周血的外周血淋巴细胞(PBL)的方法，其包括：
a.自患者的外周血获得外周血单核细胞(PBMC)的样本，其中，样本可选地经冷冻保存，患者可选地用ITK抑制剂预治疗；
b.可选地通过离心洗涤PBMC；
c.将对CD3和CD28具有选择性的磁珠添加至PBMC中；
d.将PBMC接种至透气容器中，将该PBMC在包含约3000IU/mL IL-2和第一抗生素组分的培养基中共培养约4至约6天；
e.使用包含约3000IU/mL IL-2和可选的第二抗生素组分的培养基喂养该等PBMC，并将该等PBMC共培养约5天，由此使步骤d和步骤e的总培养时间段为约9至约11天；
f.自培养基收集PBMC；
g.使用磁体移除对CD3和CD28具有选择性的磁珠；
h.使用磁活化细胞分选和CD19+珠子移除残余B细胞，提供PBL产物；
i.使用细胞收集器洗涤并浓缩PBL产物；以及
j.配制以及可选地冷冻保存该PBL产物，
其中，ITK抑制剂可选地为共价结合ITK的ITK抑制剂。在一些实施方式中，第一抗生素组分与第二抗生素组分相同或不同。在一些实施方式中，第一抗生素组分和第二抗生素组分独立地包含：1)抗生素组合，其选自本文公开的任何浓度的：i)庆大霉素和万古霉素；以及ii)庆大霉素和克林霉素；或2)抗生素万古霉素。
在一些实施方式中，PBMC自全血样本分离。在一些实施方式中，使用PBMC样本作为扩增PBL的起始材料。在一些实施方式中，样本在扩增过程之前经冷冻保存。在其他实施方式中，使用新鲜样本作为扩增PBL的起始材料。在本发明的一些实施方式中，使用本领域中已知的方法自PBMC分离T细胞。在一些实施方式中，使用人泛T细胞分离试剂盒和LS柱分离T细胞。在本发明的一些实施方式中，使用本领域中已知的抗体选择方法(例如CD19负向选择)自PBMC分离T细胞。
在本发明的一些实施方式中，该方法进行约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天或约14天。在一些实施方式中，该方法进行约7天。在一些实施方式中，该方法进行约14天。
在本发明的一些实施方式中，将PBMC与抗CD3/抗CD28抗体一起培养。在一些实施方式中，任何可用的抗CD3/抗CD28产物均可用于本发明中。在本发明的一些实施方式中，所使用的可商购产品是。在一些实施方式中，将与PBMC以1:1(珠子:细胞)的比率一起培养。在其他实施方式中，抗体是与PBMC以1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1或5:1(珠子:细胞)的比率一起培养的在本发明的一些实施方式中，抗体培养步骤和/或用抗体再刺激细胞的步骤进行约2至约6天、约3至约5天或约4天的时间段。在本发明的一些实施方式中，抗体培养步骤进行约2天、3天、4天、5天或6天的时间段。
在一些实施方式中，将PBMC样本与IL-2一起培养。在本发明的一些实施方式中，用于扩增来自PBMC的PBL的细胞培养基包含选自如下浓度的IL-2：约100IU/mL、约200IU/mL、约300IU/mL、约400IU/mL、约100IU/mL、约100IU/mL、约100IU/mL、约100IU/mL、约100IU/mL、约500IU/mL、约600IU/mL、约700IU/mL、约800IU/mL、约900IU/mL、约1,000IU/mL、约1,100IU/mL、约1,200IU/mL、约1,300IU/mL、约1,400IU/mL、约1,500IU/mL、约1,600IU/mL、约1,700IU/mL、约1,800IU/mL、约1,900IU/mL、约2,000IU/mL、约2,100IU/mL、约2,200IU/mL、约2,300IU/mL、约2,400IU/mL、约2,500IU/mL、约2,600IU/mL、约2,700IU/mL、约2,800IU/mL、约2,900IU/mL、约3,000IU/mL、约3,100IU/mL、约3,200IU/mL、约3,300IU/mL、约3,400IU/mL、约3,500IU/mL、约3,600IU/mL、约3,700IU/mL、约3,800IU/mL、约3,900IU/mL、约4,000IU/mL、约4,100IU/mL、约4,200IU/mL、约4,300IU/mL、约4,400IU/mL、约4,500IU/mL、约4,600IU/mL、约4,700IU/mL、约4,800IU/mL、约4,900IU/mL、约5,000IU/mL、约5,100IU/mL、约5,200IU/mL、约5,300IU/mL、约5,400IU/mL、约5,500IU/mL、约5,600IU/mL、约5,700IU/mL、约5,800IU/mL、约5,900IU/mL、约6,000IU/mL、约6,500IU/mL、约7,000IU/mL、约7,500IU/mL、约8,000IU/mL、约8,500IU/mL、约9,000IU/mL、约9,500IU/mL和约10,000IU/mL。
在本发明的一些实施方式中，用于扩增方法的PBMC的起始细胞数目是约25,000至约1,000,000、约30,000至约900,000、约35,000至约850,000、约40,000至约800,000、约45,000至约800,000、约50,000至约750,000、约55,000至约700,000、约60,000至约650,000、约65,000至约600,000、约70,000至约550,000、优选约75,000至约500,000、约80,000至约450,000、约85,000至约400,000、约90,000至约350,000、约95,000至约300,000、约100,000至约250,000、约105,000至约200,000、或约110,000至约150,000个。在本发明的一些实施方式中，PBMC的起始细胞数目是约138,000、140,000、145,000个以上。在其他实施方式中，PBMC的起始细胞数目是约28,000个。在其他实施方式中，PBMC的起始细胞数目是约62,000个。在其他实施方式中，PBMC的起始细胞数目是约338,000个。在其他实施方式中，PBMC的起始细胞数目是约336,000个。
在本发明的一些实施方式中，使细胞在GRex 24孔板中生长。在本发明的一些实施方式中，使用可比性的(comparable)孔板。在一些实施方式中，用于扩增的起始材料是约5×105个T细胞/孔。在本发明的一些实施方式中为1×106个细胞/孔。在本发明的一些实施方式中，每孔的细胞数目足以接种该孔并扩增T细胞。
在本发明的一些实施方式中，使细胞在GRex100MCS容器中生长。在本发明的一些实施方式中，使用可比性的容器。在一些实施方式中，用于扩增的起始材料是以约25,000个T细胞/cm2至约50,000个T细胞/cm2的密度接种。
在本发明的一些实施方式中，PBL的扩增倍数是约20％至约100％、25％至约95％、30％至约90％、35％至约85％、40％至约80％、45％至约75％、50％至约100％或25％至约75％。在本发明的一些实施方式中，扩增倍数是约25％。在本发明的其他实施方式中，扩增倍数是约50％。在其他实施方式中，扩增倍数是约75％。
在本发明的一些实施方式中，可在整个方法的一或多天将另外的IL-2添加至培养物中。在本发明的一些实施方式中，另外的IL-2在第4天添加。在本发明的一些实施方式中，另外的IL-2在第7天添加。在本发明的一些实施方式中，另外的IL-2在第11天添加。在其他实施方式中，另外的IL-2在第4天、第7天和/或第11天添加。在本发明的一些实施方式中，可在细胞培养程序中的一或多天更换细胞培养基。在一些实施方式中，在该程序的第4天、第7天和/或第11天更换细胞培养基。在本发明的一些实施方式中，将PBL与另外的IL-2一起培养1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天的时间段。在本发明的一些实施方式中，在每次添加IL-2之后，将PBL培养3天的时间段。
在一些实施方式中，在该方法期间，将细胞培养基更换至少一次。在一些实施方式中，在添加另外的IL-2的同时更换细胞培养基。在其他实施方式中，在第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天或第14天中的至少一天，更换细胞培养基。在本发明的一些实施方式中，在整个方法中使用的细胞培养基可以相同或不同。在本发明的一些实施方式中，细胞培养基是CM-2、CM-4或AIM-V。
在本发明的一些实施方式中，T细胞可在整个14天扩增过程的一或多天用抗CD3/抗CD28抗体再刺激。在一些实施方式中，在第7天再刺激T细胞。在一些实施方式中，将GRex10M培养瓶用于再刺激步骤。在本发明的一些实施方式中，使用可比性的培养瓶。
在本发明的一些实施方式中，使用DynaMagTM磁体移除对细胞计数，使用如以下实施例中进一步描述的表型和功能分析来分析细胞。在本发明的一些实施方式中，使用本领域中已知的方法将抗体自PBL或MIL分离。在前述实施方式中的任一个中，使用基于磁珠进行的TIL、PBL或MIL选择。
在本发明的一些实施方式中，将PBMC样本在有效鉴别非贴壁细胞所需的温度下孵育一段时间。在本发明的一些实施方式中，孵育时间为约3小时。在本发明的一些实施方式中，温度为约37℃。接着，使用以上方法扩增非贴壁细胞。
在本发明的一些实施方式中，PBMC是从已用依鲁替尼或另一种ITK或激酶抑制剂治疗的患者获得，此类ITK和激酶抑制剂如本文中别处所描述。在本发明的一些实施方式中，ITK抑制剂是共价且不可逆地结合ITK的共价ITK抑制剂。在本发明的一些实施方式中，ITK抑制剂是结合ITK的变构的ITK抑制剂。在本发明的一些实施方式中，PBMC是在获得PBMC样本用于包括PBL方法1的任何前述方法之前，从已用依鲁替尼或其他ITK抑制剂(包含如本文中别处所描述的ITK抑制剂)治疗的患者获得。在本发明的一些实施方式中，ITK抑制剂治疗已施用至少1次、至少2次或至少3次以上。在本发明的一些实施方式中，来自用依鲁替尼或其他ITK抑制剂预治疗的患者的经扩增的PBL包含的LAG3+、PD-1+细胞少于来自未用依鲁替尼或其他ITK抑制剂预治疗的患者的经扩增的PBL。在本发明的一些实施方式中，与来自未用依鲁替尼或其他ITK抑制剂预治疗的患者的经扩增的PBL相比，来自用依鲁替尼或其他ITK抑制剂预治疗的患者的经扩增的PBL具有增加的IFNγ产生水平。在本发明的一些实施方式中，与来自未用依鲁替尼或其他ITK抑制剂预治疗的患者的经扩增的PBL相比，来自用依鲁替尼或其他ITK抑制剂预治疗的患者的经扩增的PBL具有在更低的效应物:靶细胞比率下的增加的溶解活性。在本发明的一些实施方式中，与未经治疗的患者相比，用依鲁替尼或其他ITK抑制剂预治疗的患者具有更高的扩增倍数。
在本发明的一些实施方式中，方法包括将ITK抑制剂添加至细胞培养物中的步骤。在一些实施方式中，ITK抑制剂在过程的第0天、第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天或第14天中的一或多天添加。在一些实施方式中，ITK抑制剂在该方法期间更换细胞培养基的日期添加。在一些实施方式中，ITK抑制剂在第0天且在更换细胞培养基时添加。在一些实施方式中，ITK抑制剂在该方法期间添加IL-2时添加。在一些实施方式中，ITK抑制剂在该方法的第0天、第4天、第7天和可选地第11天添加。在本发明的一些实施方式中，ITK抑制剂在该方法的第0天和第7天添加。在本发明的一些实施方式中，ITK抑制剂是本领域中已知的ITK抑制剂。在本发明的一些实施方式中，ITK抑制剂是本文中别处描述的ITK抑制剂。
在本发明的一些实施方式中，将浓度为约0.1nM至约5μM的ITK抑制剂用于该方法中。在一些实施方式中，用于该方法中的ITK抑制剂的浓度为约0.1nM、0.5nM、1nM、5nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM、450nM、500nM、550nM、600nM、650nM、700nM、750nM、800nM、850nM、900nM、950nM、1μM、2μM、3μM、4μM或5μM。
在本发明的一些实施方式中，当PBMC来源于先前未暴露于ITK抑制剂(例如依鲁替尼)治疗的患者时，方法包括添加ITK抑制剂的步骤。
在一些实施方式中，PBMC样本来自可选地已经用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行预治疗的受试者或患者。在一些实施方式中，肿瘤样本来自已经用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行预治疗的受试者或患者。在一些实施方式中，PBMC样本来自已经用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行预治疗的受试者或患者，其已进行治疗至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月或1年或更长时间。在其他实施方式中，PBMC来源于当前进行ITK抑制剂方案(例如依鲁替尼)的患者。
在一些实施方式中，PBMC样本来自已用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行预治疗且难以用激酶抑制剂或ITK抑制剂(例如依鲁替尼)治疗的受试者或患者。
在一些实施方式中，PBMC样本来自已经用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行预治疗但不再进行激酶抑制剂或ITK抑制剂治疗的受试者或患者。在一些实施方式中，PBMC样本来自已经用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行预治疗但不再进行激酶抑制剂或ITK抑制剂治疗且尚未进行治疗达至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月或至少1年或更长时间的受试者或患者。在一些实施方式中，PBMC来源于先前暴露于ITK抑制剂但在至少3个月、至少6个月、至少9个月或至少1年内尚未经治疗的患者。
在本发明的一些实施方式中，在第0天，针对CD19+选择细胞且据此分选。在本发明的一些实施方式中，使用抗体结合珠子进行选择。在本发明的一些实施方式中，在第0天自PBMC分离纯T细胞。在本发明的一些实施方式中，在第0天，将CD19+B细胞和纯T细胞与抗CD3/抗CD28抗体共培养最少4天。在本发明的一些实施方式中，在第4天，将IL-2添加至培养物中。在本发明的一些实施方式中，在第7天，用抗CD3/抗CD28抗体和另外的IL-2再刺激培养物。在本发明的一些实施方式中，在第14天，收集PBL。
在本发明的一些实施方式中，对于未用依鲁替尼或其他ITK抑制剂预治疗的患者，10-15ml的白膜层(Buffy Coat)将得到约5×109个PBMC，在扩增过程结束时又将得到约5.5×107个起始细胞材料和约11×109个PBL。在本发明的一些实施方式中，约54×106个PBMC将得到约6×105个起始材料和约1.2×108个MIL(约205倍扩增)。
在本发明的一些实施方式中，对于用依鲁替尼或其他ITK抑制剂预治疗的患者，扩增过程将得到约20×109个PBL。在本发明的一些实施方式中，40.3×106个PBMC将得到约4.7×105个起始细胞材料和约1.6×108个PBL(约338倍扩增)。
在本发明的一些实施方式中，对于慢性淋巴细胞性白血病(CLL)患者，适用的本发明中的PBL的临床剂量是约0.1×109至约15×109个PBL、约0.1×109至约15×109个PBL、约0.12×109至约12×109个PBL、约0.15×109至约11×109个PBL、约0.2×109至约10×109个PBL、约0.3×109至约9×109个PBL、约0.4×109至约8×109个PBL、约0.5×109至约7×109个PBL、约0.6×109至约6×109个PBL、约0.7×109至约5×109个PBL、约0.8×109至约4×109个PBL、约0.9×109至约3×109个PBL、或约1×109至约2×109个PBL。
在任何前述实施方式中，PBMC可来源于全血样本，通过单采(apheresis)获得，来源于白膜层，或自本领域中已知的用于获得PBMC的任何其他方法获得。
在一些实施方式中，本发明提供了一种用于制备外周血淋巴细胞(PBL)的方法，其包括以下步骤：
a.自患者的外周血获得外周血单核细胞(PBMC)的样本，其中，样本可选地经冷冻保存，患者可选地用ITK抑制剂预治疗；
b.可选地通过离心洗涤PBMC；
c.将对CD3和CD28具有选择性的磁珠混合至PBMC中以形成珠子和PBMC的混合物；
d.将珠子与PBMC的混合物接种至透气容器中，在包含约3000IU/mL IL-2和第一抗生素组分的培养基中共培养该PBMC约4至约6天；
e.使用包含约3000IU/mL IL-2和可选的第二抗生素组分的培养基喂养PBMC，将PBMC共培养约5天，由此使步骤d和步骤e的总培养时间段为约9至约11天；
f.自培养基收集PBMC；
g.使用磁体自经收集的PBMC移除对CD3和CD28具有选择性的磁珠；
h.使用磁活化细胞分选和对CD19具有选择性的磁珠自经收集的PBMC移除残余B细胞，提供PBL产物；
i.使用细胞收集器洗涤并浓缩PBL产物；以及
j.配制以及可选地冷冻保存PBL产物，
其中，ITK抑制剂可选地为共价结合ITK的ITK抑制剂。在一些实施方式中，第一抗生素组分与第二抗生素组分相同或不同。在一些实施方式中，第一抗生素组分和第二抗生素组分独立地包含：1)抗生素组合，其选自本文公开的任何浓度的：i)庆大霉素和万古霉素；以及ii)庆大霉素和克林霉素；或2)抗生素万古霉素。
在一些实施方式中，本发明提供了一种用于自全血样本制备外周血淋巴细胞(PBL)的方法，方法包括以下步骤：
(a)自来自具有液体肿瘤的患者的约50mL以下全血获得外周血单核细胞(PBMC)，其中该患者可选地用ITK抑制剂预治疗；
(b)将对CD3和CD28具有选择性的珠子与PBMC混合，其中，珠子以3个珠子:1个细胞的比率添加，形成PBMC与珠子的混合物；
(c)将PBMC与珠子的混合物以约25,000个细胞/cm2至约50,000个细胞/cm2的密度在一个以上含有第一细胞培养基、IL-2和第一抗生素组分的容器的透气表面上培养约4天的时间段；
(d)将IL-2、可选的第二抗生素组分和与第一细胞培养基相同或不同的第二细胞培养基添加至步骤(c)的每容器中，培养约5至约7天的时间段以形成经扩增的PBL群；以及
(e)自每容器收集经扩增的PBL群。
在一些实施方式中，第一抗生素组分与第二抗生素组分相同或不同。在一些实施方式中，第一抗生素组分和第二抗生素组分独立地包含：1)抗生素组合，其选自本文公开的任何浓度的：i)庆大霉素和万古霉素；以及ii)庆大霉素和克林霉素；或2)抗生素万古霉素。
在一些实施方式中，本发明提供了一种用于自全血样本制备外周血淋巴细胞(PBL)的方法，方法包括以下步骤：
(a)自来自具有液体肿瘤的患者的约50mL以下全血获得外周血单核细胞(PBMC)，其中该患者可选地用ITK抑制剂预治疗；
(b)通过针对CD19进行选择，自PBMC移除B细胞，以提供B细胞耗尽的PBMC；
(c)将对CD3和CD28具有选择性的珠子与PBMC混合，其中，珠子以3个珠子:1个细胞的比率添加，形成PBMC与珠子的混合物；
(d)将PBMC与珠子混合物以约25,000个细胞/cm2至约50,000个细胞/cm2的密度在一个以上含有第一细胞培养基、IL-2和第一抗生素组分的容器的透气表面上培养约4天的时间段；
(e)将IL-2、可选的第二抗生素组分和与第一细胞培养基相同或不同的第二细胞培养基添加至步骤(d)的每容器中，培养约5天至约7天的时间段，形成经扩增的PBL群；以及
(f)自每容器收集经扩增的PBL群。
在一些实施方式中，第一抗生素组分与第二抗生素组分相同或不同。在一些实施方式中，第一抗生素组分和第二抗生素组分独立地包含本文公开的任何浓度的：1)万古霉素；2)庆大霉素和万古霉素；或3)庆大霉素和克林霉素。
在一些实施方式中，本发明提供了一种用于自全血样本制备外周血淋巴细胞(PBL)的方法，方法包括以下步骤：
(a)自来自具有液体肿瘤的患者的约50mL以下全血获得外周血单核细胞(PBMC)，其中该患者可选地用ITK抑制剂预治疗；
(b)确定B细胞占PMBC的比例作为B细胞百分比；
(c)若在步骤(b)中确定的B细胞百分比为至少约百分之七十(70％)，则通过针对CD19进行选择而自PBMC移除B细胞，提供B细胞耗尽的PBMC；
(d)将对CD3和CD28具有选择性的珠子与PBMC混合，其中，珠子以3个珠子:1个细胞的比率添加，形成PBMC与珠子的混合物；
(e)将PBMC与珠子的混合物以约25,000个细胞/cm2至约50,000个细胞/cm2的密度在一个以上含有第一细胞培养基、IL-2和第一抗生素组分的容器的透气表面上培养约4天的时间段；
(f)将IL-2、可选的第二抗生素组分和与第一细胞培养基相同或不同的第二细胞培养基添加至步骤(d)的每容器中并培养约5天至约7天的时间段，形成经扩增的PBL群；以及
(g)自每容器收集经扩增的PBL群。
在一些实施方式中，第一抗生素组分与第二抗生素组分相同或不同。在一些实施方式中，第一抗生素组分和第二抗生素组分独立地包含本文公开的任何浓度的：1)万古霉素；2)庆大霉素和万古霉素；或3)庆大霉素和克林霉素。
在本发明的一些实施方式中，B细胞移除或B细胞耗尽(BCD)在9天扩增过程的第0天或第9天发生。在一些实施方式中，BCD在9天扩增过程的第0天和第9天发生。在本发明的一些实施方式中，BCD在11天扩增过程的第0天或第11天发生。在一些实施方式中，BCD在11天扩增过程的第0天和第11天发生。
在本发明的一些实施方式中，BCD步骤对来自具有更高初始B细胞计数的患者的PBMC样本进行。在一些实施方式中，更高的初始B细胞计数为初始PBMC样本中约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％以上的B细胞。
在一些实施方式中，本发明提供了如上所述的方法中的任一种，该方法适用地经修改以使得在B细胞百分比为至少约70％时，进行B细胞移除步骤或BCD步骤。
在一些实施方式中，本发明提供了如上所述的方法中的任一种，该方法适用地经修改以使得在B细胞百分比为至少约75％时，进行B细胞移除步骤。
在一些实施方式中，本发明提供了如上所述的方法中的任一种，该方法适用地经修改以使得在B细胞百分比为至少约80％时，进行B细胞移除步骤。
在一些实施方式中，本发明提供了如上所述的方法中的任一种，该方法适用地经修改以使得在B细胞百分比为至少约85％时，进行B细胞移除步骤。
在一些实施方式中，本发明提供了如上所述的方法中的任一种，该方法适用地经修改以使得在B细胞百分比为至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％以上时，进行B细胞移除步骤。
在一些实施方式中，本发明提供了如上所述的方法中的任一种，该方法适用地经修改以使得PBMC自患者的50mL或约50mL外周血获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上所述的方法中的任一种，该方法适用地经修改以使得PBMC自患者的10mL或约10mL至50mL或约50mL外周血获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上所述的方法中的任一种，该方法适用地经修改以使得PBMC自患者的10mL或约10mL、20mL或约20mL、30mL或约30mL、40mL或约40mL或者50mL或约50mL外周血获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上所述的方法中的任一种，该方法适用地经修改以使得PBMC自患者的10mL或约10mL至100mL或约100mL外周血获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上所述的方法中的任一种，该方法适用地经修改以使得PBMC自患者的10mL或约10mL、20mL或约20mL、30mL或约30mL、40mL或约40mL、50mL或约50mL、60mL或约60mL、70mL或约70mL、80mL或约80mL、90mL或约90mL或者100mL或约100mL外周血获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上所述的方法中的任一种，该方法适用地经修改以使得将PBMC以12,500个细胞/cm2或约12,500个细胞/cm2至50,000个细胞/cm2或约50,000个细胞/cm2的密度接种于每个透气容器中。
在一些实施方式中，本发明提供了如上所述的方法中的任一种，该方法适用地经修改以使得将PBMC以6,250个细胞/cm2或约6,250个细胞/cm2至25,000个细胞/cm2或约25,000个细胞/cm2的密度接种于每个透气容器中。
在一些实施方式中，本发明提供了如上所述的方法中的任一种，该方法适用地经修改以使得将PBMC以6,250个细胞/cm2或约6,250个细胞/cm2至50,000个细胞/cm2或约50,000个细胞/cm2的密度接种于每个透气容器中。
在一些实施方式中，本发明提供了如上所述的方法中的任一种，该方法适用地经修改以使得将PBMC以25,000个细胞/cm2或约25,000个细胞/cm2至50,000个细胞/cm2或约50,000个细胞/cm2的密度接种于每个透气容器中。
在一些实施方式中，本发明提供了如上所述的方法中的任一种，该方法适用地经修改以使得将PBMC以6,250个细胞/cm2或约6,250个细胞/cm2、9,375个细胞/cm2或约9,375个细胞/cm2、12,500个细胞/cm2或约12,500个细胞/cm2、15,625个细胞/cm2或约15,625个细胞/cm2、18,750个细胞/cm2或约18,750个细胞/cm2、21,875个细胞/cm2或约21,875个细胞/cm2、25,000个细胞/cm2或约25,000个细胞/cm2、28,125个细胞/cm2或约28,125个细胞/cm2、31,250个细胞/cm2或约31,250个细胞/cm2、34,375个细胞/cm2或约34,375个细胞/cm2、37,500个细胞/cm2或约37,500个细胞/cm2、40,625个细胞/cm2或约40,625个细胞/cm2、43,750个细胞/cm2或约43,750个细胞/cm2、47,875个细胞/cm2或约47,875个细胞/cm2或者50,000个细胞/cm2或约50,000个细胞/cm2的密度接种于每个透气容器中。
在一些实施方式中，本发明提供了如上所述的方法中的任一种，该方法适用地经修改以使得将对CD3和CD28具有选择性的珠子与PBMC混合以形成珠子与PBMC的混合物的步骤被将对CD3和CD28具有选择性的珠子与PBMC混合以形成呈珠子与PBMC的混合物形式的珠子与PBMC的复合物置换，其中，培养混合物的步骤被自该混合物分离珠子与PBMC的复合物和将PBMC与珠子的复合物以约25,000个细胞/cm2至约50,000个细胞/cm2的密度在一个以上含有第一细胞培养基和IL-2的容器中的透气表面上培养约4天的时间段的步骤置换。在其他实施方式中，对CD3和CD28具有选择性的珠子是磁珠，自该混合物分离珠子与PBMC的复合物的步骤通过使用磁体自该混合物移除该复合物进行。
在一些实施方式中，本发明提供了如上所述的方法中的任一种，该方法适用地经修改以使得对CD3和CD28具有选择性的珠子是与抗CD3抗体和抗CD28抗体缀合的珠子。
在一些实施方式中，本发明提供了如上所述的方法中的任一种，该方法适用地经修改以使得自PBMC移除B细胞通过使PBMC与对CD19具有选择性的珠子接触以形成珠子-CD19+细胞复合物和移除该复合物以提供耗尽B细胞的PBMC进行。在其他实施方式中，对CD19具有选择性的珠子是磁珠，使用磁体自PBMC移除磁珠-CD19+细胞复合物。在其他实施方式中，对CD19具有选择性的珠子是与抗CD19抗体缀合的珠子。在其他实施方式中，与抗CD19抗体缀合的珠子是CliniMACSTM抗CD19珠子(Miltenyi)。
在一些实施方式中，本发明提供了如上所述的方法中的任一种，该方法适用地经修改以使得在收集经扩增的PBL群的步骤之后，方法包括进行选择以自经扩增的PBL群移除任何残余B细胞的步骤。
在一些实施方式中，本发明提供了如上所述的方法中的任一种，该方法适用地经修改以使得进行选择以自经扩增的PBL群移除任何残余B细胞通过将对CD19具有选择性的珠子与经扩增的PBL群混合以形成珠子和任何残余B细胞的复合物并自经扩增的PBL群移除该复合物来进行。
在一些实施方式中，本发明提供了如上所述的方法中的任一种，该方法适用地经修改以使得进行选择以自经扩增的PBL群移除任何残余B细胞通过将对CD19具有选择性的磁珠与经扩增的PBL群混合以形成磁珠和任何残余B细胞的复合物并使用磁体自经扩增的PBL群移除该复合物来进行。
在一些实施方式中，本发明提供了如上所述的方法中的任一种，该方法适用地经修改以使得对CD19具有选择性的珠子是与抗CD19抗体缀合的珠子。
在一些实施方式中，本发明提供了如上所述的方法中的任一种，该方法适用地经修改以使得患者用ITK抑制剂预治疗。
在一些实施方式中，本发明提供了如上所述的方法中的任一种，该方法适用地经修改以使得患者用ITK抑制剂预治疗且难以用ITK抑制剂治疗。
在一些实施方式中，本发明提供了如上所述的方法中的任一种，该方法适用地经修改以使得患者用依鲁替尼预治疗。
在一些实施方式中，本发明提供了如上所述的方法中的任一种，该方法适用地经修改以使得患者用依鲁替尼预治疗且难以用依鲁替尼治疗。
在一些实施方式中，本发明提供了如上所述的方法中的任一种，该方法适用地经修改以使得患者患有白血病。
在一些实施方式中，本发明提供了如上所述的方法中的任一种，该方法适用地经修改以使得患者患有慢性淋巴细胞性白血病。
B.扩增来自来源于骨髓的PBMC的骨髓浸润淋巴细胞(MIL)的方法
MIL方法1.在本发明的一些实施方式中，描述一种用于扩增来源于骨髓的PBMC中的MIL的方法。在本发明的一些实施方式中，该方法进行14天。在一些实施方式中，方法包括获得骨髓PBMC和冷冻保存PBMC。第0天，将PBMC与抗CD3/抗CD28抗体以1:1比率(珠子:细胞)和3000IU/mL IL-2一起培养。第4天，将另外的3000IU/mL的IL-2添加至培养物中。第7天，再用抗CD3/抗CD28抗体以1:1比率(珠子:细胞)刺激培养物，将另外的3000IU/mL的IL-2添加至培养物中。在第14天收集MIL，移除珠子，可选地对MIL进行计数和表型分析。
在本发明的一些实施方式中，MIL方法1如下进行：在第0天，将冷冻保存的来源于骨髓的PBMC样本解冻，对PBMC进行计数。将在GRex24孔板中5×105个细胞/孔的PBMC与抗CD3/抗CD28抗体以1:1比率在约8ml/孔CM-2细胞培养基(包括RPMI-1640、人AB血清、L-谷氨酰胺、2-巯基乙醇、硫酸庆大霉素、AIM-V培养基)中在3000IU/mL IL-2存在下共培养。第4天，将细胞培养基更换为补充有另外的3000IU/mL的IL-2的AIM-V。第7天，对经扩增的MIL进行计数。将1×106个细胞/孔转移至新GRex24孔板中并在3000IU/mL IL-2存在下，与抗CD3/抗CD28抗体以1:1比率在约8ml/孔AIM-V培养基中一起培养。第11天，将细胞培养基由AIM-V更换为CM-4(包含AIM-V培养基、2mM Glutamax和3000IU/mLIL2)。第14天，使用DynaMag磁体(DynaMagTM15)移除并对MIL进行计数。
MIL方法2.在本发明的一些实施方式中，该方法进行7天。在一些实施方式中，方法包括获得来源于骨髓的PBMC和冷冻保存PBMC。第0天，将PBMC与抗CD3/抗CD28抗体以3:1比率(珠子:细胞)和3000IU/mL IL-2一起培养。在第7天收集MIL，移除珠子，可选地对MIL进行计数和表型分析。
在本发明的一些实施方式中，MIL方法2如下进行：在第0天，将冷冻保存的PBMC样本解冻且对PBMC计数。将在GRex24孔板中5×105个细胞/孔的PBMC与抗CD3/抗CD28抗体以1:1比率在约8ml/孔CM-2细胞培养基(包含RPMI-1640、人AB血清、l-谷氨酰胺、2-巯基乙醇、硫酸庆大霉素、AIM-V培养基)中在3000IU/mL IL-2存在下共培养。第7天，使用DynaMag磁体(DynaMagTM15)移除并对MIL计数。
MIL方法3.在本发明的一些实施方式中，方法包括获得来自骨髓的PBMC。第0天，针对CD3+/CD33+/CD20+/CD14+选择PBMC，分选，对非CD3+/CD33+/CD20+/CD14+细胞级分进行超声处理，将一部分经超声处理的细胞级分添加回所选细胞级分中。将3000IU/mL IL-2添加至细胞培养物中。第3天，将PBMC与抗CD3/抗CD28抗体以1:1比率(珠子:细胞)和3000IU/mL IL-2一起培养。第4天，将另外的3000IU/mL的IL-2添加至培养物中。第7天，再用抗CD3/抗CD28抗体以1:1比率(珠子:细胞)刺激培养物，将另外的3000IU/mL的IL-2添加至培养物中。第11天，将3000IU/mL的IL-2添加至培养物中。在第14天收集MIL，移除珠子，可选地对MIL进行计数和表型分析。
在本发明的一些实施方式中，MIL方法3如下进行：在第0天，将冷冻保存的PBMC样本解冻，对PBMC进行计数。将细胞用CD3、CD33、CD20和CD14抗体染色，使用S3e细胞分选器(Bio-Rad)分选。将细胞分选成两种级分：免疫细胞级分(或MIL级分)(CD3+CD33+CD20+CD14+)和AML胚细胞级分(非CD3+CD33+CD20+CD14+)。将接种于Grex 24孔板上的数目大约等于来自免疫细胞级分(或MIL级分)的细胞的数目的来自AML胚细胞级分的细胞悬浮于100ul培养基中，进行超声处理。在此实施例中，获取约2.8×104至约3.38×105个来自AML胚细胞级分的细胞，使其悬浮于100ul CM2培养基中，接着超声处理30秒。在Grex 24孔板中，将100ul经超声处理的AML胚细胞级分添加至免疫细胞级分中。免疫细胞在6000IU/mL IL-2存在下以约2.8×104至约3.38×105个细胞/孔的量存在于约8ml/孔CM-2细胞培养基中，与AML胚细胞级分的部分一起培养约3天。第3天，将抗CD3/抗CD28抗体以1:1比率添加至各孔中，培养约1天。第4天，将细胞培养基更换为补充有另外的3000IU/mL的IL-2的AIM-V。第7天，对经扩增的MIL进行计数。将约1.5×105至4×105个细胞/孔转移至新GRex 24孔板中，在3000IU/mL IL-2存在下，与抗CD3/抗CD28抗体以1:1比率在约8ml/孔AIM-V培养基中一起培养。第11天，将细胞培养基由AIM-V更换为CM-4(补充有3000IU/mLIL-2)。第14天，使用DynaMag磁体(DynaMagTM15)移除可选地对MIL进行计数。
在本发明的一些实施方式中，PBMC自骨髓获得。在一些实施方式中，PBMC通过单采、抽吸、穿刺活体组织切片或本领域中已知的其他类似方式自骨髓获得。在一些实施方式中，PBMC是新鲜的。在一些实施方式中，PBMC是冷冻保存的。
在本发明的一些实施方式中，该方法进行约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天或约14天。在一些实施方式中，该方法进行约7天。在一些实施方式中，该方法进行约14天。
在本发明的一些实施方式中，将PBMC与抗CD3/抗CD28抗体一起培养。在一些实施方式中，任何可用的抗CD3/抗CD28产物均可用于本发明中。在本发明的一些实施方式中，所使用的可商购产品是在一些实施方式中，将与PBMC以1:1(珠子:细胞)的比率一起培养。在一些实施方式中，抗体是与PBMC以1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1或5:1(珠子:细胞)的比率培养的在任何前述实施方式中，使用基于磁珠的免疫细胞级分(或MIL级分)(CD3+CD33+CD20+CD14+)或AML胚细胞级分(非CD3+CD33+CD20+CD14+)选择。在本发明的一些实施方式中，抗体培养步骤和/或用抗体再刺激细胞的步骤进行约2至约6天、约3至约5天或约4天的时间段。在本发明的一些实施方式中，抗体培养步骤进行约2天、3天、4天、5天或6天的时间段。
在本发明的一些实施方式中，来自AML胚细胞级分的细胞的数目与来自免疫细胞级分(或MIL级分)的细胞的数目的比率为约0.1:1至约10:1。在一些实施方式中，该比率为约0.1:1至约5:1、约0.1:1至约2:1、或约1:1。在本发明的一些实施方式中，AML胚细胞级分可选地经破坏以破碎细胞聚集。在一些实施方式中，使用超声处理、均质化、细胞裂解、涡旋或振动来破坏AML胚细胞级分。在一些实施方式中，使用超声处理破坏AML胚细胞级分。在本发明的一些实施方式中，使用合适的裂解方法，包含高温裂解、化学裂解(例如有机醇)、酶裂解和本领域中已知的其他细胞裂解方法，将非CD3+、非CD33+、非CD20+、非CD14+细胞级分(AML胚细胞级分)裂解。
在本发明的一些实施方式中，将来自AML胚细胞级分的细胞以每100uL约0.2×105个细胞至约2×105个细胞的浓度悬浮，添加至含免疫细胞级分的细胞培养物中。在一些实施方式中，浓度为每100uL约0.5×105至约2×105个细胞、每100uL约0.7×105至约2×105个细胞、每100uL约1×105至约2×105个细胞或每100uL约1.5×105至约2×105个细胞。
在一些实施方式中，将PBMC样本与IL-2一起培养。在本发明的一些实施方式中，用于扩增MIL的细胞培养基包含选自如下浓度的IL-2：约100IU/mL、约200IU/mL、约300IU/mL、约400IU/mL、约100IU/mL、约100IU/mL、约100IU/mL、约100IU/mL、约100IU/mL、约500IU/mL、约600IU/mL、约700IU/mL、约800IU/mL、约900IU/mL、约1,000IU/mL、约1,100IU/mL、约1,200IU/mL、约1,300IU/mL、约1,400IU/mL、约1,500IU/mL、约1,600IU/mL、约1,700IU/mL、约1,800IU/mL、约1,900IU/mL、约2,000IU/mL、约2,100IU/mL、约2,200IU/mL、约2,300IU/mL、约2,400IU/mL、约2,500IU/mL、约2,600IU/mL、约2,700IU/mL、约2,800IU/mL、约2,900IU/mL、约3,000IU/mL、约3,100IU/mL、约3,200IU/mL、约3,300IU/mL、约3,400IU/mL、约3,500IU/mL、约3,600IU/mL、约3,700IU/mL、约3,800IU/mL、约3,900IU/mL、约4,000IU/mL、约4,100IU/mL、约4,200IU/mL、约4,300IU/mL、约4,400IU/mL、约4,500IU/mL、约4,600IU/mL、约4,700IU/mL、约4,800IU/mL、约4,900IU/mL、约5,000IU/mL、约5,100IU/mL、约5,200IU/mL、约5,300IU/mL、约5,400IU/mL、约5,500IU/mL、约5,600IU/mL、约5,700IU/mL、约5,800IU/mL、约5,900IU/mL、约6,000IU/mL、约6,500IU/mL、约7,000IU/mL、约7,500IU/mL、约8,000IU/mL、约8,500IU/mL、约9,000IU/mL、约9,500IU/mL和约10,000IU/mL。
在本发明的一些实施方式中，可在整个方法的一或多天将另外的IL-2添加至培养物中。在本发明的一些实施方式中，另外的IL-2在第4天添加。在本发明的一些实施方式中，另外的IL-2在第7天添加。在本发明的一些实施方式中，另外的IL-2在第11天添加。在一些实施方式中，另外的IL-2在第4天、第7天和/或第11天添加。在本发明的一些实施方式中，将MIL与另外的IL-2一起培养1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天的时间段。在本发明的一些实施方式中，在每次添加IL-2之后，将MIL培养3天的时间段。
在一些实施方式中，在该方法期间，将细胞培养基更换至少一次。在一些实施方式中，在添加另外的IL-2的同时更换细胞培养基。在一些实施方式中，在第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天或第14天中的至少一天，更换细胞培养基。在本发明的一些实施方式中，在整个方法中使用的细胞培养基可以相同或不同。在本发明的一些实施方式中，细胞培养基是CM-2、CM-4或AIM-V。在本发明的一些实施方式中，在第11天进行的细胞培养基更换步骤是可选的。在本发明的一些实施方式中，用于扩增过程的PBMC的起始细胞数目是约25,000至约1,000,000、约30,000至约900,000、约35,000至约850,000、约40,000至约800,000、约45,000至约800,000、约50,000至约750,000、约55,000至约700,000、约60,000至约650,000、约65,000至约600,000、约70,000至约550,000，优选约75,000至约500,000、约80,000至约450,000、约85,000至约400,000、约90,000至约350,000、约95,000至约300,000、约100,000至约250,000、约105,000至约200,000、或约110,000至约150,000个。在本发明的一些实施方式中，PBMC的起始细胞数目是约138,000、140,000、145,000个或更多个。在一些实施方式中，PBMC的起始细胞数目是约28,000个。在一些实施方式中，PBMC的起始细胞数目是约62,000个。在一些实施方式中，PBMC的起始细胞数目是约338,000个。在一些实施方式中，PBMC的起始细胞数目是约336,000个。
在本发明的一些实施方式中，MIL的扩增倍数是约20％至约100％、25％至约95％、30％至约90％、35％至约85％、40％至约80％、45％至约75％、50％至约100％或25％至约75％。在本发明的一些实施方式中，扩增倍数是约25％。在本发明的一些实施方式中，扩增倍数是约50％。在一些实施方式中，扩增倍数是约75％。
在本发明的一些实施方式中，MIL自10-50mL骨髓抽吸物扩增。在本发明的一些实施方式中，自患者获得10mL骨髓抽吸物。在一些实施方式中，自患者获得20mL骨髓抽吸物。在一些实施方式中，自患者获得30mL骨髓抽吸物。在一些实施方式中，自患者获得40mL骨髓抽吸物。在一些实施方式中，自患者获得50mL骨髓抽吸物。
在本发明的一些实施方式中，自约10-50ml骨髓抽吸物得到的PBMC的数目是约5×107至约10×107个PBMC。在一些实施方式中，得到的PMBC的数目是约7×107个PBMC。
在本发明的一些实施方式中，约5×107至约10×107个PBMC产生约0.5×106至约1.5×106个扩增开始细胞材料。在本发明的一些实施方式中，产生约1×106个扩增开始细胞材料。
在本发明的一些实施方式中，在扩增时间段结束时收集的MIL的总数目是约0.01×109至约1×109、约0.05×109至约0.9×109、约0.1×109至约0.85×109、约0.15×109至约0.7×109、约0.2×109至约0.65×109、约0.25×109至约0.6×109、约0.3×109至约0.55×109、约0.35×109至约0.5×109或约0.4×109至约0.45×109。
在本发明的一些实施方式中，12×106个来源于骨髓抽吸物的PBMC产生约1.4×105个起始细胞材料，该起始细胞材料在扩增过程结束时产生约1.1×107个MIL。
在本发明的一些实施方式中，与使用方法1或MIL方法2扩增的MIL相比，使用以上描述的MIL方法3自骨髓PBMC扩增的MIL包含更高比例的CD8+细胞以及更少数目的LAG3+和PD1+细胞。在本发明的一些实施方式中，与使用MIL方法1或MIL方法2扩增的PBL相比，使用以上描述的MIL方法3自血液PBMC扩增的PBL包含更高比例的CD8+细胞和增加的IFNγ产生量。
在本发明的一些实施方式中，可用于急性骨髓性白血病(AML)患者的MIL的临床剂量在约4×108至约2.5×109个MIL范围内。在一些实施方式中，本发明的药物组合物中所提供的MIL的数目是9.5×108个MIL。在一些实施方式中，本发明的药物组合物中所提供的MIL的数目是4.1×108个。在一些实施方式中，本发明的药物组合物中所提供的MIL的数目是2.2×109个。
在任何前述实施方式中，PBMC可来源于全血样本、骨髓、通过单采获得，来源于白膜层，或自本领域中已知的用于获得PBMC的任何其他方法获得。
VIII.Gen 2TIL制造过程-2A
图1和图2中描绘一个示例性TIL程序系列，称为Gen 2(又称为过程2A)，其含有这些特征中的一些。Gen 2的一个实施方式如图2中所示。
如本文所论述，本发明可包括与再刺激冷冻保存的TIL以增加其代谢活性且因此在移植至患者体内之前增加相对健康相关的步骤，和测试该代谢健康的方法。如本文大体上概述，TIL通常获自患者样本且在移植至患者体内之前进行操作以扩增其数目。在一些实施方式中，TIL可以可选地如下文所论述经基因操作。
在一些实施方式中，TIL可经冷冻保存。解冻后，其也可经再刺激以在输注至患者体内之前增加其代谢。
在一些实施方式中，将第一扩增(包括称为预REP的过程以及图1中所示的作为步骤A的过程)缩短至3至14天，将第二扩增(包括称为REP的过程以及图1中显示为步骤B的过程)缩短至7至14天，如下文以及实施例和图示中详细论述的。在一些实施方式中，将第一扩增(例如图1中步骤B所描述的扩增)缩短至11天，将第二扩增(例如图1中步骤D中所描述的扩增)缩短至11天。在一些实施方式中，将第一扩增和第二扩增的组合(例如图1中描述为步骤B和步骤D的扩增)缩短至22天，如下文以及实施方式和图示中详细论述的。在一些实施方式中，预REP和/或REP步骤使用包含第一抗生素组分的培养基进行。在示例性实施方式中，一种以上抗生素是万古霉素。在示例性实施方式中，预REP和/或REP步骤中所使用的培养基包含万古霉素且不含另外的抗生素。
以下“步骤”标识A、B、C等参考图1且参考本文所述的某些实施方式。以下步骤和图1中的步骤次序为示例性的，本申请和本文公开的方法涵盖步骤的任何组合或次序，以及另外的步骤、步骤重复和/或步骤省略。
A.步骤A：获得患者肿瘤样本
通常而言，TIL最初获自患者肿瘤样本接着扩增为用于如本文所述的进一步操作，可选地如本文所概述进行冷冻保存、再刺激，可选地评估作为TIL健康的指标的表型和代谢参数的更大群。
患者肿瘤样本可使用本领域中已知的方法获得，通常通过手术切除、穿刺活体组织切片、粗针活体组织切片、小型活体组织切片或用于获得含有肿瘤与TIL细胞的混合物的样本的其他方式获得。在一些实施方式中，使用多病灶取样。在一些实施方式中，手术切除、穿刺活体组织切片、粗针活体组织切片、小型活体组织切片或用于获得含有肿瘤与TIL细胞的混合物的样本的其他方式包括多病灶取样(即，自患者的一个以上肿瘤部位和/或位置以及在同一位置或紧密相邻的一个以上肿瘤处获得样本)。通常而言，肿瘤样本可来自任何实体肿瘤，包括原发性肿瘤、侵袭性肿瘤或转移性肿瘤。肿瘤样本也可以是液体肿瘤，例如获自血液系统恶性肿瘤的肿瘤。实体肿瘤可以是肺组织。在一些实施方式中，适用的TIL自非小细胞肺癌(NSCLC)获得。实体肿瘤可以是皮肤组织。在一些实施方式中，适用的TIL自黑色素瘤获得。
收集后，可将肿瘤样本储存于含有抗生素组分的储存组合物中。在一些实施方式中，抗生素组分是万古霉素。在一些实施方式中，储存培养基中所包含的抗生素由万古霉素组成。在一些实施方式中，抗生素组分包含：1)抗生素组合，其选自本文公开的任何浓度的：i)庆大霉素和万古霉素；以及ii)庆大霉素和克林霉素；或2)抗生素万古霉素。在一些实施方式中，储存组合物是本文所述的低温储存组合物中的任一种。
获得后，肿瘤样本通常使用锐器分割破碎成1至约8mm3之间的碎块，其中约2-3mm3特别适用。在一些实施方式中，使用酶肿瘤消化物培养来自这些碎片的TIL。此类肿瘤消化物可通过在酶培养基(例如罗斯威尔公园癌症研究生(RPMI)1640缓冲液、2mM谷氨酸、10mcg/mL庆大霉素、30个单位/mLDNA酶和1.0mg/mL胶原蛋白酶)中孵育，随后进行机械解离(例如使用组织解离器)来产生。肿瘤消化物可通过以下产生：将肿瘤置于酶培养基中且机械解离肿瘤约1分钟，随后在37℃下在5％ CO2下孵育30分钟，随后在前述条件下重复机械解离和孵育循环，直至仅存在小组织块。在此过程结束时，若细胞悬浮液含有大量红细胞或死细胞，则可使用FICOLL支化亲水性多糖进行密度梯度分离以移除该细胞。可使用本领域中已知的替代方法，例如美国专利申请公开第2012/0244133A1号中所描述的方法，该公开的公开内容以引用的方式并入本文中。任何前述方法均可用于本文所述的任何实施方式中扩增TIL的方法或治疗癌症的方法。
肿瘤解离酶混合物可包括一种以上解离(消化)酶，例如但不限于胶原蛋白酶(包括任何混合或类型的胶原蛋白酶)、AccutaseTM、AccumaxTM、玻尿酸酶(hyaluronidase)、中性蛋白酶(分散酶)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、木瓜凝乳蛋白酶(chymopapain)、胰蛋白酶(trypsin)、酪蛋白酶(caseinase)、弹性蛋白酶(elastase)、木瓜酶(papain)、XIV型蛋白酶(链蛋白酶(pronase))、DNA酶I(DNA酶)、胰蛋白酶抑制剂、任何其他解离或蛋白分解酶，以及它们的任何组合。
在一些实施方式中，解离酶自冻干酶复原(reconstitute)。在一些实施方式中，冻干酶在一定量的无菌缓冲液(例如HBSS)中复原。
在一些情况下，胶原蛋白酶(例如无动物源1型胶原蛋白酶)在10mL无菌HBSS或另一缓冲液中复原。冻干的储备酶的浓度可以是每小瓶2892PZ U。在一些实施方式中，胶原蛋白酶在5mL至15mL缓冲液中复原。在一些实施方式中，在复原之后，胶原蛋白酶储备液的范围为约100PZ U/mL-约400PZ U/mL，例如约100PZ U/mL-约400PZ U/mL、约100PZ U/mL-约350PZ U/mL、约100PZ U/mL-约300PZ U/mL、约150PZ U/mL-约400PZ U/mL、约100PZ U/mL、约150PZ U/mL、约200PZ U/mL、约210PZ U/mL、约220PZ U/mL、约230PZ U/mL、约240PZ U/mL、约250PZ U/mL、约260PZ U/mL、约270PZ U/mL、约280PZ U/mL、约289.2PZ U/mL、约300PZU/mL、约350PZ U/mL或约400PZ U/mL。
在一些实施方式中，中性蛋白酶在1mL无菌HBSS或另一缓冲液中复原。冻干的储备酶的浓度可以是每小瓶175DMC U。在一些实施方式中，在复原后，中性蛋白酶储备液的范围为约100DMC/mL-约400DMC/mL，例如约100DMC/mL-约400DMC/mL、约100DMC/mL-约350DMC/mL、约100DMC/mL-约300DMC/mL、约150DMC/mL-约400DMC/mL、约100DMC/mL、约110DMC/mL、约120DMC/mL、约130DMC/mL、约140DMC/mL、约150DMC/mL、约160DMC/mL、约170DMC/mL、约175DMC/mL、约180DMC/mL、约190DMC/mL、约200DMC/mL、约250DMC/mL、约300DMC/mL、约350DMC/mL或约400DMC/mL。
在一些实施方式中，DNA酶I在1mL无菌HBSS或另一缓冲液中复原。冻干的储备酶的浓度为每小瓶4KU。在一些实施方式中，在复原后，DNA酶I储备液的范围为约1KU/mL-10KU/mL，例如约1KU/mL、约2KU/mL、约3KU/mL、约4KU/mL、约5KU/mL、约6KU/mL、约7KU/mL、约8KU/mL、约9KU/mL或约10KU/mL。
在一些实施方式中，酶的储备液是可变的且可能需要确定浓度。在一些实施方式中，可检验冻干储备液的浓度。在一些实施方式中，添加至消化混合物中的酶的最终量基于确定的储备液的浓度进行调节。
在一些实施方式中，酶混合物包含约4.7mL无菌HBSS中的约10.2μl中性蛋白酶(0.36DMC U/mL)、21.3μL胶原蛋白酶(1.2PZ/mL)和250μlDNA酶I(200U/mL)。
如上文所指出，在一些实施方式中，TIL来源于实体肿瘤。在一些实施方式中，实体肿瘤未经破碎。在一些实施方式中，实体肿瘤未经破碎且以完整肿瘤形式进行酶消化。在一些实施方式中，肿瘤在包含胶原蛋白酶、DNA酶和玻尿酸酶的酶混合物中消化。在一些实施方式中，肿瘤在包含胶原蛋白酶、DNA酶和玻尿酸酶的酶混合物中消化1-2小时。在一些实施方式中，肿瘤在37℃、5％ CO2下在包含胶原蛋白酶、DNA酶和玻尿酸酶的酶混合物中消化1至2小时。在一些实施方式中，肿瘤在37℃、5％ CO2、旋转下在包含胶原蛋白酶、DNA酶和玻尿酸酶的酶混合物中消化1至2小时。在一些实施方式中，肿瘤在恒定旋转下消化过夜。在一些实施方式中，肿瘤在37℃、5％ CO2且恒定旋转下消化过夜。在一些实施方式中，将整个肿瘤与酶组合以形成肿瘤消化反应混合物。
在一些实施方式中，在无菌缓冲液中用冻干酶重构肿瘤。在一些实施方式中，缓冲液为无菌HBSS。
在一些实施方式中，酶混合物包含胶原蛋白酶。在一些实施方式中，胶原蛋白酶为胶原蛋白酶IV。在一些实施方式中，胶原蛋白酶的工作储备液为100mg/mL 10×工作储备液。
在一些实施方式中，酶混合物包含DNA酶。在一些实施方式中，DNA酶的工作储备液为10,000IU/mL 10×工作储备液。
在一些实施方式中，酶混合物包含玻尿酸酶。在一些实施方式中，玻尿酸酶的工作储备液为10mg/mL 10×工作储备液。
在一些实施方式中，酶混合物包含10mg/mL胶原蛋白酶、1000IU/mLDNA酶和1mg/mL玻尿酸酶。
在一些实施方式中，酶混合物包含10mg/mL胶原蛋白酶、500IU/mLDNA酶和1mg/mL玻尿酸酶。
通常而言，经收集的细胞悬浮液被称为“初代细胞群”或“新鲜收集的”细胞群。
在一些实施方式中，破碎包括物理破碎，包括例如分割以及消化。在一些实施方式中，破碎为物理破碎。在一些实施方式中，破碎为分割。在一些实施方式中，破碎通过消化实现。在一些实施方式中，TIL最初可自酶肿瘤消化物培养，肿瘤碎片由消化或破碎获自患者的肿瘤样本获得。
在一些实施方式中，在肿瘤是实体肿瘤时，肿瘤在例如步骤A(如图1中所提供)中获得肿瘤样本之后经历物理破碎。在一些实施方式中，破碎发生在冷冻保存之前。在一些实施方式中，破碎发生在冷冻保存之后。在一些实施方式中，破碎在获得肿瘤之后且在不进行任何冷冻保存的情况下进行。在一些实施方式中，将肿瘤破碎，将10、20、30、40或更多个碎片或碎块置于每容器中进行第一扩增。在一些实施方式中，将肿瘤破碎，将30或40个碎片或碎块置于每容器中进行第一扩增。在一些实施方式中，将肿瘤破碎，将40个碎片或碎块置于每容器中进行第一扩增。在一些实施方式中，多个碎片包括约4至约50个碎片，其中每个碎片的体积为约27mm3。在一些实施方式中，多个碎片包括约30至约60个碎片，其总体积为约1300mm3至约1500mm3。在一些实施方式中，多个碎片包括约50个碎片，其总体积为约1350mm3。在一些实施方式中，多个碎片包括约50个碎片，其总质量为约1克至约1.5克。在一些实施方式中，多个碎片包括约4个碎片。
在一些实施方式中，TIL自肿瘤碎片获得。在一些实施方式中，肿瘤碎片通过锐器分割获得。在一些实施方式中，肿瘤碎片在约1mm3与10mm3之间。在一些实施方式中，肿瘤碎片在约1mm3与8mm3之间。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约1mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约2mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约3mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约4mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约5mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约6mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约7mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约8mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约9mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约10mm3。在一些实施方式中，肿瘤是1-4mm×1-4mm×1-4mm。在一些实施方式中，肿瘤是1mm×1mm×1mm。在一些实施方式中，肿瘤是2mm×2mm×2mm。在一些实施方式中，肿瘤是3mm×3mm×3mm。在一些实施方式中，肿瘤是4mm×4mm×4mm。
在一些实施方式中，肿瘤经切除以使各块上出血、坏死和/或脂肪组织的量减至最小。在一些实施方式中，将肿瘤切除以便使各块上出血组织的量减至最小。在一些实施方式中，将肿瘤切除以便使各块上坏死组织的量减至最小。在一些实施方式中，将肿瘤切除以便使各块上脂肪组织的量减至最小。
在一些实施方式中，进行肿瘤破碎以维持肿瘤内部结构。在一些实施方式中，肿瘤破碎在不使用解剖刀进行锯切动作的情况下进行。在一些实施方式中，TIL获自肿瘤消化物。在一些实施方式中，通过在酶培养基(例如但不限于RPMI 1640、2mM GlutaMAX、10mg/mL庆大霉素、30U/mL DNA酶和1.0mg/mL胶原蛋白酶)中孵育，随后进行机械解离(GentleMACS，加利福尼亚州奥本的Miltenyi Biotec)来产生肿瘤消化物。在将肿瘤置于酶培养基中之后，可以机械方式将肿瘤解离约1分钟。接着，可将溶液在37℃下在5％CO2下孵育30分钟，接着再次机械破坏约1分钟。在37℃下在5％CO2中再孵育30分钟之后，可将肿瘤第三次机械破坏约1分钟。在一些实施方式中，在第三次机械破坏后，若仍存在大块组织，则向样本施加1或2次另外的机械解离，不论是否再在37℃下在5％ CO2下孵育30分钟。在一些实施方式中，在最终孵育结束时，若细胞悬浮液含有大量红细胞或死细胞，则可进行Ficoll密度梯度分离以移除该细胞。
在一些实施方式中，在第一扩增步骤之前收集的细胞悬浮液称为“初代细胞群”或“新鲜收集的”细胞群。
在一些实施方式中，细胞可以可选地在样本收集之后冷冻且在进入步骤B(其在下文进一步详细描述以及在图1以及图8中所示例)中所描述的扩增之前冷冻储存。
在一些实施方式中，在将肿瘤样本解离或破碎成肿瘤碎片之前，将其在包含抗生素组分的洗涤缓冲液中洗涤至少一次。本文所述的任何肿瘤洗涤缓冲液均可用于洗涤肿瘤样本。在一些实施方式中，抗生素组分包含本文公开的任何浓度的：1)万古霉素；2)庆大霉素和万古霉素；或3)庆大霉素和克林霉素。在示例性实施方式中，洗涤缓冲液包含万古霉素。在示例性实施方式中，万古霉素的浓度为50μg/mL-600μg/mL。在示例性实施方式中，万古霉素的浓度是100μg/mL。在示例性实施方式中，将肿瘤样本在洗涤缓冲液中洗涤3次以上。
在一些实施方式中，在冷冻保存或第一扩增之前，将肿瘤样本在包含抗生素组分的洗涤缓冲液中洗涤至少一次。本文所述的任何肿瘤洗涤缓冲液均可用于洗涤肿瘤碎片。在一些实施方式中，抗生素组分包含本文公开的任何浓度的：1)万古霉素；2)庆大霉素和万古霉素；或3)庆大霉素和克林霉素。在示例性实施方式中，洗涤缓冲液包含万古霉素。在示例性实施方式中，万古霉素的浓度为50μg/mL-600μg/mL。在示例性实施方式中，万古霉素的浓度是100μg/mL。在示例性实施方式中，将肿瘤样本在洗涤缓冲液中洗涤3次以上。
1.胸腔积液TIL
在一些实施方式中，样本是胸膜液样本。在一些实施方式中，用于本文所述的过程扩增的T细胞或TIL的来源为胸膜液样本。在一些实施方式中，样本为源于胸腔积液的样本。在一些实施方式中，根据本文所述的过程的用于扩增的T细胞或TIL的来源为来源于胸腔积液的样本。参见例如美国专利公开US2014/0295426中所描述的方法，其出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方式中，可以采用疑似含有和/或含有TIL的任何胸膜液或胸腔积液。此类样本可来源于原发性或转移性肺癌，例如NSCLC或SCLC。在一些实施方式中，样品可来源于起源自另一器官(例如乳房、卵巢、结肠或前列腺)的继发性转移性癌细胞。在一些实施方式中，用于本文所述的扩增方法中的样本为胸膜渗出物(pleural exudate)。在一些实施方式中，用于本文所述的扩增方法中的样本为胸膜溢出物(pleural transudate)。其他生物样本可包括含有TIL的其他浆液，包括例如来自腹部的腹水液或胰囊肿液。腹水液和胸膜液涉及非常类似的化学系统；腹部和肺两者在相同的恶性肿瘤事件中于胸腔和腹腔中皆具有间皮细胞系和流体形式，在一些实施方式中，此类流体含有TIL。在所公开的方法利用胸膜液的一些实施方式中，可使用含有TIL的腹水或其他囊肿液进行相同的方法，以得到类似结果。
在一些实施方式中，胸膜液呈未经处理形式，即直接自患者移除。在一些实施方式中，在进一步处理步骤之前，将未经处理的胸膜液置于标准血液收集管(例如EDTA或肝素管)中。在一些实施方式中，在进一步处理步骤之前，将未经处理的胸膜液置于标准管(Veridex)中。在一些实施方式中，在自患者收集之后立即将样本置于CellSave管中，以避免活TIL的数目减少。若保留在未经处理的胸膜液中，则即使在4℃下，活TIL的数目可能在24小时内显著降低。在一些实施方式中，样本在自患者移除之后1小时、5小时、10小时、15小时或至多24小时内置于适当收集管中。在一些实施方式中，样本在4℃下自患者移除之后1小时、5小时、10小时、15小时或至多24小时内置于适当收集管中。
在一些实施方式中，可以稀释来自所选受试者的胸膜液样本。在一些实施方式中，稀释度为1:10胸膜液比稀释剂。在其他实施方式中，稀释度为1:9胸膜液比稀释剂。在其他实施方式中，稀释度为1:8胸膜液比稀释剂。在其他实施方式中，稀释度为1:5胸膜液比稀释剂。在其他实施方式中，稀释度为1:2胸膜液比稀释剂。在其他实施方式中，稀释度为1:1胸膜液比稀释剂。在一些实施方式中，稀释剂包括盐水、磷酸盐缓冲盐水、另一缓冲液或生理学上可接受的稀释剂。在一些实施方式中，样本在自患者收集和稀释之后立即置于CellSave管中，以避免活TIL减少，若保留在未经处理的胸膜液中，则即使在4℃下，活TIL可能在24至48小时内显著减少。在一些实施方式中，胸膜液样本在自患者移除且稀释之后1小时、5小时、10小时、15小时、24小时、36小时、至多48小时内置于适当收集管中。在一些实施方式中，胸膜液样本在自患者移除且在4℃下稀释之后1小时、5小时、10小时、15小时、24小时、36小时、至多48小时内置于适当收集管中。
在另外其他实施方式中，在进一步的处理步骤之前，通过常规手段浓缩胸膜液样本。在一些实施方式中，在胸膜液必须冷冻保存以运送至进行该方法的实验室或用于后续分析(例如在收集后24至48小时之后)的情形下，优选对胸膜液进行预处理。在一些实施方式中，通过在将胸膜液样本自受试者中取出后将其离心并将离心液或沉淀物再悬浮于缓冲液中来制备胸膜液样本。在一些实施方式中，对胸膜液样本进行多次离心和再悬浮，随后将其冷冻保存以用于运输或以后的分析和/或处理。
在一些实施方式中，在进一步的处理步骤之前，通过使用过滤方法浓缩胸膜液样本。在一些实施方式中，在进一步处理中使用的胸膜液样本通过将流体经含有已知且基本上均一的孔径的过滤器过滤而制备，该孔径允许胸膜液通过膜，但保留肿瘤细胞。在一些实施方式中，膜中各孔的直径可以是至少4μM。在其他实施方式中，孔径可以是5μM以上，在其他实施方式中可以是6μM、7μM、8μM、9μM或10μM中的任一者。过滤之后，可将被膜保留的细胞(包括TIL)自膜上冲出至合适的生理学上可接受的缓冲液中。接着，可将以此方式浓缩的细胞(包括TIL)用于该方法的其他处理步骤中。
在一些实施方式中，使胸膜液样本(包括例如未经处理的胸膜液)、经稀释的胸膜液或再悬浮的细胞沉淀物与裂解试剂接触，该裂解试剂差异性地裂解样本中存在的无核红细胞。在一些实施方式中，在胸膜液含有大量RBC的情形下，此步骤在进一步的处理步骤之前进行。合适的裂解试剂包括单一裂解试剂、或裂解试剂和淬灭试剂，或裂解试剂、淬灭试剂和固定试剂。合适的裂解系统为可商购的，包括BD Pharm LyseTM系统(BectonDickenson)。其他裂解系统包括VersalyseTM系统、FACSlyseTM系统(Becton Dickenson)、ImmunoprepTM系统或Erythrolyse II系统(Beckman Coulter,Inc.)或氯化铵系统。在一些实施方式中，裂解试剂可随主要需求而变化，主要需求为红细胞的有效裂解，以及TIL的保持和胸膜液中TIL的表型特性。除采用单一试剂进行裂解之外，可用于本文所述的方法的裂解系统可包括第二试剂，例如在该方法的剩余步骤期间淬灭或延迟裂解试剂的作用的第二试剂，例如StabilyseTM试剂(Beckman Coulter,Inc.)。取决于裂解试剂的选择或方法的优选实施，也可采用常规固定试剂。
在一些实施方式中，在约-140℃的温度下冷冻保存如上文所描述的未经处理、稀释或多次离心或处理的胸膜液样本，随后如本文提供了进行进一步处理和/或扩增。
B.步骤B：第一扩增
在一些实施方式中，本发明方法提供获得年轻TIL，其能够在向受试者/患者施用时提供增加的复制循环且因此可提供优于较老TIL(即，在向受试者/患者施用之前进一步经历更多轮复制的TIL)的额外的治疗益处。年轻TIL的特征已描述于文献中，例如Donia等人,《斯堪的纳维亚免疫学杂志(Scand.J.Immunol.)》2012,75,157-167；Dudley等人,《临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)》2010,16,6122-6131；Huang等人,《免疫疗法杂志(J.Immunother.)》2005,28,258-267；Besser等人,《临床癌症研究》2013,19,OF1-OF9；Besser等人,《免疫疗法杂志》2009,32:415-423；Robbins等人,《免疫学杂志(J.Immunol.)》2004,173,7125-7130；Shen等人,《免疫疗法杂志》,2007,30,123-129；Zhou等人,《免疫疗法杂志》2005,28,53-62；和Tran等人,《免疫疗法杂志》,2008,31,742-751，其各自以引用的方式并入本文中。
T淋巴细胞和B淋巴细胞的多种抗原受体通过有限但大量的基因区段的体细胞重组产生。该基因区段：V(可变区)、D(多变区)、J(连接区)和C(恒定区)决定免疫球蛋白和T细胞受体(TCR)的结合特异性和下游应用。本发明提供了一种用于产生展现增加的T细胞贮库多样性的TIL的方法。在一些实施方式中，通过本发明方法获得的TIL展现增加的T细胞贮库多样性。在一些实施方式中，相较于新鲜收集的TIL和/或使用除本文提供的方法以外的其他方法制备的TIL，通过本发明方法获得的TIL展现增加的T细胞贮库多样性，其他方法包括例如除图1中实施的方法以外的方法。在一些实施方式中，相较于新鲜收集的TIL和/或使用如图5和/或图6中示例的称为方法1C的方法制备的TIL，通过本发明方法获得的TIL展现增加的T细胞贮库多样性。在一些实施方式中，在第一扩增中获得的TIL展现增加的T细胞贮库多样性。在一些实施方式中，多样性增加是免疫球蛋白多样性和/或T细胞受体多样性增加。在一些实施方式中，多样性存在于免疫球蛋白中，存在于免疫球蛋白重链中。在一些实施方式中，多样性存在于免疫球蛋白中，存在于免疫球蛋白轻链中。在一些实施方式中，多样性存在于T细胞受体中。在一些实施方式中，多样性存在于选自α、β、γ和δ受体的T细胞受体中的一者中。在一些实施方式中，T细胞受体(TCR)α和/或β的表达增加。在一些实施方式中，T细胞受体(TCR)α的表达增加。在一些实施方式中，T细胞受体(TCR)β的表达增加。在一些实施方式中，TCRab(也即，TCRα/β)的表达增加。
在例如图1的步骤A中所描述的肿瘤碎片的分割或消化之后，将所得到的细胞在含有IL-2的血清中在相对于肿瘤及其他细胞有利于TIL生长的条件下培养。在一些实施方式中，在2mL孔中在包含具有6000IU/mL IL-2的灭活人AB血清的培养基中孵育肿瘤消化物。将此初代细胞群培养数天的时间段，通常为3至14天，产生通常为约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群。在一些实施方式中，将此初代细胞群培养7至14天的时间段，产生通常为约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群。在一些实施方式中，将此初代细胞群培养10至14天的时间段，产生通常为约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群。在一些实施方式中，将此初代细胞群培养约11天的时间段，产生通常为约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群。
在一些实施方式中，TIL的扩增可使用如下文和本文所述的初始主体TIL扩增步骤(例如图1的步骤B中所描述的那些，其可包括称为预REP的过程)进行，随后进行如下文在步骤D下和本文所述的第二扩增(步骤D，包括称为快速扩增方案(REP)步骤的过程)，随后可选地进行冷冻保存，随后进行如下文和本文所述的第二步骤D(包括称为再刺激REP步骤的过程)。获自此过程的TIL可以可选地针对如本文所述的表型特征和代谢参数进行表征。
在24孔板(例如使用Costar 24孔平底细胞培养板(Corning Incorporated，Corning，NY))中起始TIL培养的实施方式中，各孔可接种在含有IL-2(6000IU/mL；加利福尼亚州爱莫利维尔市(Emeryville,CA)的Chiron Corp.)的2mL完全培养基(CM)中的1×106个肿瘤消化物细胞或一个肿瘤碎片。在一些实施方式中，肿瘤碎片在约1mm3至10mm3之间。
在一些实施方式中，第一扩增培养基称为“CM”(培养基的缩写)。在一些实施方式中，步骤B的CM由含GlutaMAX且补充有10％人AB血清、25mM Hepes和10mg/mL庆大霉素的RPMI 1640组成。在具有40mL容量和10cm2透气硅底的透气性培养瓶(例如G-REX10；明尼苏达州新布莱顿市(New Brighton,MN)的Wilson Wolf Manufacturing)中起始培养的实施方式中，各培养瓶装载有在10-40mL含IL-2的CM中的10-40×106个活肿瘤消化物细胞或5-30个肿瘤碎片。G-REX10和24孔板均在湿式培养箱中在37℃和5％ CO2下孵育，在培养开始后5天，移除一半培养基并更换为新鲜的CM和IL-2，在第5天之后，每2-3天更换一半培养基。
在一些实施方式中，本文公开的扩增过程中使用的培养基为无血清培养基或成分确定的培养基。在一些实施方式中，无血清或成分确定的培养基包含基础细胞培养基和血清补充剂和/或血清替代物。在一些实施方式中，无血清或成分确定的培养基用于防止和/或减少部分因含血清培养基的批次间变化所致的实验变化。
在一些实施方式中，无血清或成分确定的培养基包含基础细胞培养基和血清补充剂和/或血清替代物。在一些实施方式中，基础细胞培养基包括但不限于CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基、CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM、CTSTMAIM-V培养基、CTSTMAIM-V SFM、LymphoONETMT细胞扩增无外源物质培养基、杜尔贝科氏改良型伊格尔氏培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔氏基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基和伊斯科夫氏改良型杜尔贝科氏培养基。
在一些实施方式中，血清补充剂或血清替代物包括但不限于以下中的一种以上：CTSTMOpTmizer T细胞扩增血清补充剂、CTSTM免疫细胞血清替代物、一种以上白蛋白或白蛋白代用物、一种以上氨基酸、一种以上维生素、一种以上转铁蛋白或转铁蛋白代用物、一种以上抗氧化剂、一种以上胰岛素或胰岛素代用物、一种以上胶原蛋白前体、抗生素组分和一种以上微量元素。在一些实施方式中，成分确定的培养基包含白蛋白和一种以上选自如下的成分：甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、硫胺素、还原谷胱甘肽、L-抗坏血酸-2-磷酸盐、铁饱和转铁蛋白、胰岛素以及含有微量元素部分Ag+、Al3+、Ba2+、Cd2+、Co2+、Cr3 +、Ge4+、Se4+、Br、T、Mn2+、P、Si4+、V5+、Mo6+、Ni2+、Rb+、Sn2+和Zr4+的化合物。在一些实施方式中，成分确定的培养基进一步包含L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和/或2-巯基乙醇。
在一些实施方式中，将CTSTMOpTmizerTMT细胞免疫细胞血清替代物与常规生长培养基一起使用，该生长培养基包括但不限于CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基、CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM、CTSTMAIM-V培养基、CSTTMAIM-V SFM、LymphoONETMT细胞扩增无外源物质培养基、杜尔贝科氏改良型伊格尔氏培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔氏基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基和伊斯科夫氏改良型杜尔贝科氏培养基。
在一些实施方式中，以无血清或成分确定的培养基的总体积计，无血清或成分确定的培养基中总血清替代物的浓度(vol％)为约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些实施方式中，总血清替代物浓度为无血清或成分确定的培养基的总体积的约3％。在一些实施方式中，总血清替代物浓度为无血清或成分确定的培养基的总体积的约5％。在一些实施方式中，总血清替代物浓度为无血清或成分确定的培养基的总体积的约10％。
在一些实施方式中，无血清或成分确定的培养基为CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM(ThermoFisher Scientific)。任何CTSTMOpTmizerTM制剂皆可用于本发明。CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM为1L CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基和26mL CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂的组合，基础培养基与该补充剂在使用前混合在一起。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisherScientific)。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)以及55mM的2-巯基乙醇。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)，2-巯基乙醇在培养基中的最终浓度为55μM。
在一些实施方式中，成分确定的培养基为CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM(ThermoFisher Scientific)。任何CTSTMOpTmizerTM制剂皆可用于本发明。CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM为1L CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基和26mL CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂的组合，基础培养基与该补充剂在使用前混合在一起。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisherScientific)以及55mM 2-巯基乙醇。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)、55mM 2-巯基乙醇和2mM L-谷氨酰胺。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)、55mM 2-巯基乙醇和2mM L-谷氨酰胺，进一步包含约1000IU/mL至约8000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)、55mM2-巯基乙醇和2mM L-谷氨酰胺，进一步包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisherScientific)、55mM 2-巯基乙醇和2mM L-谷氨酰胺，进一步包含约6000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)和55mM 2-巯基乙醇，进一步包含约1000IU/mL至约8000IU/mLIL-2。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)和55mM2-巯基乙醇，进一步包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)和55mM 2-巯基乙醇，进一步包含约1000IU/mL至约6000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)和约2mM谷氨酰胺，进一步包含约1000IU/mL至约8000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)和约2mM谷氨酰胺，进一步包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)和约2mM谷氨酰胺，进一步包含约6000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)，2-巯基乙醇在培养基中的最终浓度为55μM。
在一些实施方式中，无血清培养基或成分确定的培养基补充有浓度为约0.1mM至约10mM、0.5mM至约9mM、1mM至约8mM、2mM至约7mM、3mM至约6mM或4mM至约5mM的谷氨酰胺(即，)。在一些实施方式中，无血清培养基或成分确定的培养基补充有浓度为约2mM的谷氨酰胺(即，)。
在一些实施方式中，无血清培养基或成分确定的培养基补充有浓度为约5mM至约150mM、10mM至约140mM、15mM至约130mM、20mM至约120mM、25mM至约110mM、30mM至约100mM、35mM至约95mM、40mM至约90mM、45mM至约85mM、50mM至约80mM、55mM至约75mM、60mM至约70mM或约65mM的2-巯基乙醇。在一些实施方式中，无血清培养基或成分确定的培养基补充有浓度为约55mM的2-巯基乙醇。在一些实施方式中，2-巯基乙醇在培养基中的最终浓度为55μM。
在一些实施方式中，以引用的方式并入本文中的国际PCT公开第WO/1998/030679号中所描述的成分确定的培养基可用于本发明。在该公开中，描述无血清真核细胞培养基。无血清真核细胞培养基包含补充有能够支持细胞在无血清培养中生长的无血清补充剂的基础细胞培养基。无血清真核细胞培养基补充剂包含一种以上选自如下的成分，或通过组合一种以上选自如下的成分而获得：一种以上白蛋白或白蛋白代用物、一种以上氨基酸、一种以上维生素、一种以上转铁蛋白或转铁蛋白代用物、一种以上抗氧化剂、一种以上胰岛素或胰岛素代用物、一种以上胶原蛋白前体、一种以上微量元素和抗生素组分。在一些实施方式中，成分确定的培养基进一步包含L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和/或β-巯基乙醇。在一些实施方式中，成分确定的培养基包含白蛋白或白蛋白代用物和一种以上选自如下的成分：一种以上氨基酸、一种以上维生素、一种以上转铁蛋白或转铁蛋白代用物、一种以上抗氧化剂、一种以上胰岛素或胰岛素代用物、一种以上胶原蛋白前体和一种以上微量元素。在一些实施方式中，成分确定的培养基包含白蛋白和一种以上选自如下的成分：甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、硫胺素、还原谷胱甘肽、L-抗坏血酸-2-磷酸盐、铁饱和转铁蛋白、胰岛素以及含有微量元素部分Ag+、Al3+、Ba2+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Ge4+、Se4+、Br、T、Mn2+、P、Si4 +、V5+、Mo6+、Ni2+、Rb+、Sn2+和Zr4+的化合物。在一些实施方式中，基础细胞培养基选自如下：杜尔贝科氏改良型伊格尔氏培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔氏基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基和伊斯科夫氏改良型杜尔贝科氏培养基。
在一些实施方式中，成分确定的培养基中甘氨酸的浓度在约5-200mg/L的范围内，L-组氨酸的浓度为约5-250mg/L，L-异亮氨酸的浓度为约5-300mg/L，L-甲硫氨酸的浓度为约5-200mg/L，L-苯丙氨酸的浓度为约5-400mg/L，L-脯氨酸的浓度为约1-1000mg/L，L-羟基脯氨酸的浓度为约1-45mg/L，L-丝氨酸的浓度为约1-250mg/L，L-苏氨酸的浓度为约10-500mg/L，L-色氨酸的浓度为约2-110mg/L，L-酪氨酸的浓度为约3-175mg/L，L-缬氨酸的浓度为约5-500mg/L，硫胺素的浓度为约1-20mg/L，还原谷胱甘肽的浓度为约1-20mg/L，L-抗坏血酸-2-磷酸盐的浓度为约1-200mg/L，铁饱和转铁蛋白的浓度为约1-50mg/L，胰岛素的浓度为约1-100mg/L，亚硒酸钠的浓度为约0.000001-0.0001mg/L，白蛋白(例如I)的浓度为约5000-50,000mg/L。
在一些实施方式中，成分确定的培养基中甘氨酸的浓度在约5-200mg/L的范围内，L-组氨酸的浓度为约5-250mg/L，L-异亮氨酸的浓度为约5-300mg/L，L-甲硫氨酸的浓度为约5-200mg/L，L-苯丙氨酸的浓度为约5-400mg/L，L-脯氨酸的浓度为约1-1000mg/L，L-羟基脯氨酸的浓度为约1-45mg/L，L-丝氨酸的浓度为约1-250mg/L，L-苏氨酸的浓度为约10-500mg/L，L-色氨酸的浓度为约2-110mg/L，L-酪氨酸的浓度为约3-175mg/L，L-缬氨酸的浓度为约5-500mg/L，硫胺素的浓度为约1-20mg/L，还原谷胱甘肽的浓度为约1-20mg/L，L-抗坏血酸-2-磷酸盐的浓度为约1-200mg/L，铁饱和转铁蛋白的浓度为约1-50mg/L，胰岛素的浓度为约1-100mg/L，亚硒酸钠的浓度为约0.000001-0.0001mg/L，白蛋白(例如I)的浓度为约5000-50,000mg/L。
在一些实施方式中，成分确定的培养基中的非微量元素部分成分是以下表4中标题“在1X培养基中的浓度范围”栏中列出的浓度范围存在。在其他实施方式中，成分确定的培养基中的非微量元素部分成分以表4中标题“1X培养基的优选实施方式”栏中列出的最终浓度存在。在其他实施方式中，成分确定的培养基为包含无血清补充剂的基础细胞培养基。在这些实施方式的一些中，无血清补充剂包含下表4中的类型和标题“补充剂的优选实施方式”栏中列出的浓度的非微量部分成分。
表4：非微量元素部分成分的浓度
在一些实施方式中，成分确定的培养基的渗透压介于约260与350mOsmol之间。在一些实施方式中，渗透压介于约280与310mOsmol之间。在一些实施方式中，成分确定的培养基补充有至多约3.7g/L或约2.2g/L碳酸氢钠。成分确定的培养基可进一步补充有L-谷氨酰胺(最终浓度为约2mM)、抗生素组分、非必需氨基酸(NEAA；最终浓度为约100μM)、2-巯基乙醇(最终浓度为约100μM)。
在一些实施方式中，Smith等人,《临床与转化免疫学(Clin TranslImmunology)》,4(1)2015(doi:10.1038/cti.2014.31)中所描述的成分确定的培养基可用于本发明中。简言之，使用RPMI或CTSTMOpTmizerTM作为基础细胞培养基且补充有0、2％、5％或10％ CTSTM免疫细胞血清替代物。
在一些实施方式中，第一透气容器和/或第二透气容器中的细胞培养基为未经过滤的。使用未经过滤的细胞培养基可简化扩增细胞数目所需的程序。在一些实施方式中，第一透气容器和/或第二透气容器中的细胞培养基缺乏β-巯基乙醇(BME或βME；也称为2-巯基乙醇，CAS 60-24-2)。
在一些实施方式中，第一扩增培养基还包含抗生素。在一些实施方式中，抗生素包括万古霉素。在示例性实施方式中，培养基中所包含的抗生素由万古霉素组成。
在制备肿瘤碎片之后，将所得到的细胞(即，碎片)在相对于肿瘤及其他细胞有利于TIL生长的条件下在含有IL-2和抗生素组分的血清中培养。在示例性实施方式中，抗生素组分包含万古霉素。在一些实施方式中，抗生素组分由万古霉素组成且不含另外的抗生素。在一些实施方式中，该抗生素组分包含：1)抗生素组合，其选自本文公开的任何浓度的：i)庆大霉素和万古霉素；以及ii)庆大霉素和克林霉素；或2)抗生素万古霉素。在一些实施方式中，将所得到的细胞在2mL孔中包含灭活人AB血清(或在一些情况下，如本文所概述，在APC细胞群的存在下)和6000IU/mL IL-2的培养基中孵育。将此初代细胞群培养数天的时间段，通常为10至14天，产生通常为约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群。在一些实施方式中，生长培养基在第一扩增期间包含IL-2或其变体。在一些实施方式中，IL-2为重组人IL-2(rhIL-2)。在一些实施方式中，1mg小瓶的IL-2储备液具有20-30×106IU/mg的比活性。在一些实施方式中，1mg小瓶的IL-2储备液具有20×106IU/mg的比活性。在一些实施方式中，1mg小瓶的IL-2储备液具有25×106IU/mg的比活性。在一些实施方式中，1mg小瓶的IL-2储备液具有30×106IU/mg的比活性。在一些实施方式中，IL-2储备液具有4-8×106IU/mg IL-2的最终浓度。在一些实施方式中，IL-2储备液具有5-7×106IU/mg IL-2的最终浓度。在一些实施方式中，IL-2储备液具有6×106IU/mg IL-2的最终浓度。在一些实施方式中，IL-2储备液如实施例5中所描述来制备。在一些实施方式中，第一扩增培养基包含约10,000IU/mL IL-2、约9,000IU/mL IL-2、约8,000IU/mL IL-2、约7,000IU/mL IL-2、约6000IU/mL IL-2或约5,000IU/mL的IL-2。在一些实施方式中，第一扩增培养基包含约9,000IU/mL IL-2至约5,000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，第一扩增培养基包含约8,000IU/mL IL-2至约6,000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，第一扩增培养基包含约7,000IU/mL IL-2至约6,000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，第一扩增培养基包含约6,000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，细胞培养基进一步包含IL-2。在一些实施方式中，细胞培养基包含约3000IU/mLIL-2。在一些实施方式中，细胞培养基进一步包含IL-2。在一些实施方式中，细胞培养基包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，细胞培养基包含约1000IU/mL、约1500IU/mL、约2000IU/mL、约2500IU/mL、约3000IU/mL、约3500IU/mL、约4000IU/mL、约4500IU/mL、约5000IU/mL、约5500IU/mL、约6000IU/mL、约6500IU/mL、约7000IU/mL、约7500IU/mL或约8000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，细胞培养基包含在1000与2000IU/mL之间、在2000与3000IU/mL之间、在3000与4000IU/mL之间、在4000与5000IU/mL之间、在5000与6000IU/mL之间、在6000与7000IU/mL之间、在7000与8000IU/mL之间、或约8000IU/mL的IL-2。
在一些实施方式中，第一扩增培养基包含约500IU/mL IL-15、约400IU/mL IL-15、约300IU/mL IL-15、约200IU/mL IL-15、约180IU/mL IL-15、约160IU/mL IL-15、约140IU/mL IL-15、约120IU/mL IL-15或约100IU/mL IL-15。在一些实施方式中，第一扩增培养基包含约500IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施方式中，第一扩增培养基包含约400IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施方式中，第一扩增培养基包含约300IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施方式中，第一扩增培养基包含约200IU/mL IL-15。在一些实施方式中，细胞培养基包含约180IU/mL IL-15。在一些实施方式中，细胞培养基进一步包含IL-15。在一些实施方式中，细胞培养基包含约180IU/mL IL-15。
在一些实施方式中，第一扩增培养基包含约20IU/mL IL-21、约15IU/mL IL-21、约12IU/mL IL-21、约10IU/mL IL-21、约5IU/mL IL-21、约4IU/mL IL-21、约3IU/mL IL-21、约2IU/mL IL-21、约1IU/mL IL-21或约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方式中，第一扩增培养基包含约20IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方式中，第一扩增培养基包含约15IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方式中，第一扩增培养基包含约12IU/mLIL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方式中，第一扩增培养基包含约10IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方式中，第一扩增培养基包含约5IU/mL IL-21至约1IU/mLIL-21。在一些实施方式中，第一扩增培养基包含约2IU/mL IL-21。在一些实施方式中，细胞培养基包含约1IU/mL IL-21。在一些实施方式中，细胞培养基包含约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方式中，细胞培养基进一步包含IL-21。在一些实施方式中，细胞培养基包含约1IU/mL IL-21。
在一些实施方式中，细胞培养基包含抗CD3激动剂，例如OKT-3抗体。在一些实施方式中，细胞培养基包含约30ng/mL OKT-3抗体。在一些实施方式中，细胞培养基包含约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2.5ng/mL、约5ng/mL、约7.5ng/mL、约10ng/mL、约15ng/mL、约20ng/mL、约25ng/mL、约30ng/mL、约35ng/mL、约40ng/mL、约50ng/mL、约60ng/mL、约70ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约100ng/mL、约200ng/mL、约500ng/mL和约1μg/mL OKT-3抗体。在一些实施方式中，细胞培养基包含在0.1ng/mL与1ng/mL之间、在1ng/mL与5ng/mL之间、在5ng/mL与10ng/mL之间、在10ng/mL与20ng/mL之间、在20ng/mL与30ng/mL之间、在30ng/mL与40ng/mL之间、在40ng/mL与50ng/mL之间和在50ng/mL与100ng/mL之间的OKT-3抗体。在一些实施方式中，细胞培养基不包含OKT-3抗体。在一些实施方式中，OKT-3抗体为莫罗单抗。参见例如表1。
在一些实施方式中，细胞培养基包含一种以上TNFRSF激动剂在细胞培养基中。在一些实施方式中，TNFRSF激动剂包括4-1BB激动剂。在一些实施方式中，TNFRSF激动剂为4-1BB激动剂，该4-1BB激动剂选自如下：乌瑞鲁单抗、乌图木单抗、EU-101、融合蛋白及其片段、衍生物、变体、生物类似物以及它们的组合。在一些实施方式中，添加的TNFRSF激动剂的浓度足以在细胞培养基中达成在0.1μg/mL与100μg/mL之间的浓度。在一些实施方式中，添加的TNFRSF激动剂的浓度足以在细胞培养基中达成在20μg/mL与40μg/mL之间的浓度。
在一些实施方式中，除了一种以上TNFRSF激动剂之外，细胞培养基进一步包含初始浓度为约3000IU/mL的IL-2和初始浓度为约30ng/mL的OKT-3抗体，其中该一种以上TNFRSF激动剂包括4-1BB激动剂。
在一些实施方式中，第一扩增培养基称为“CM”(培养基的缩写)。在一些实施方式中，其称为CM1(培养基1)。在一些实施方式中，CM由含GlutaMAX且补充有10％人AB血清、25mM Hepes和10mg/mL庆大霉素的RPMI 1640组成。在具有40mL容量和10cm2透气硅底的透气性培养瓶(例如G-REX10；明尼苏达州新布莱顿市的Wilson Wolf Manufacturing)中开始培养的实施方式中，各培养瓶装载有在10-40mL含IL-2的CM中的10-40×106个活肿瘤消化物细胞或5-30个肿瘤碎片。G-REX10和24孔板皆在湿式培养箱中在37℃和5％ CO2下孵育，在培养开始后5天，移除一半培养基，更换为新鲜的CM和IL-2，在第5天之后，每2-3天更换一半培养基。在一些实施方式中，CM为实施例中所描述的CM1，参见实施例1。在一些实施方式中，CM(例如CM1)包含抗生素组分。在某些示例性实施方式中，抗生素组分包含万古霉素。在示例性实施方式中，CM(例如CM1)由万古霉素组成。在一些实施方式中，第一扩增发生在初始细胞培养基或第一细胞培养基中。在一些实施方式中，初始细胞培养基或第一细胞培养基包含IL-2。在一些实施方式中，初始细胞培养基或第一细胞培养基包含抗生素组分。在示例性实施方式中，一种以上抗生素由万古霉素组成。
在一些实施方式中，第一扩增培养基包含抗生素组分。在一些实施方式中，该抗生素组分包含：1)抗生素组合，其选自本文公开的任何浓度的：i)庆大霉素和万古霉素；以及ii)庆大霉素和克林霉素；或2)抗生素万古霉素。
在一些实施方式中，初始细胞培养基或第一细胞培养基包含抗生素组分。在一些实施方式中，该抗生素组分包含：1)抗生素组合，其选自本文公开的任何浓度的：i)庆大霉素和万古霉素；以及ii)庆大霉素和克林霉素；或2)抗生素万古霉素。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约100μg/mL至约600μg/mL万古霉素。在示例性实施方式中，抗生素组分由约50μg mL至约600μg/mL万古霉素组成。在示例性实施方式中，抗生素组分由约100μg/mL万古霉素组成。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约400μg/mL至约600μg/mL克林霉素。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约2.5μg/mL至约10μg/mL双性霉素B。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素和约50μg/mL至约600μg/mL万古霉素。在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素和约100μg/mL万古霉素。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素和约400μg/mL至约600μg/mL克林霉素。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素、约100μg/mL至约600μg/mL万古霉素和约2.5μg/mL至约10μg/mL双性霉素B。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素、约400μg/mL至约600μg/mL克林霉素和约2.5μg/mL至约10μg/mL双性霉素B。
在一些实施方式中，第一扩增(包括例如描述于图1的步骤B中的过程，其可包括有时称为预REP的过程)过程缩短至3-14天，如实施例和图示中所论述。在一些实施方式中，第一扩增((包括例如图1的步骤B中所描述的过程，其可包括有时称为预REP的过程)缩短至7至14天，如实施例中所论述以及图4和图5中所展示，以及包括例如图1的步骤B中所描述的扩增。在一些实施方式中，步骤B的第一扩增缩短至10-14天。在一些实施方式中，第一扩增缩短至11天，如例如图1的步骤B中所描述的扩增中所论述。
在一些实施方式中，第一TIL扩增可进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些实施方式中，第一TIL扩增可进行1天至14天。在一些实施方式中，第一TIL扩增可进行2天至14天。在一些实施方式中，第一TIL扩增可进行3天至14天。在一些实施方式中，第一TIL扩增可进行4天至14天。在一些实施方式中，第一TIL扩增可进行5天至14天。在一些实施方式中，第一TIL扩增可进行6天至14天。在一些实施方式中，第一TIL扩增可进行7天至14天。在一些实施方式中，第一TIL扩增可进行8天至14天。在一些实施方式中，第一TIL扩增可进行9天至14天。在一些实施方式中，第一TIL扩增可进行10天至14天。在一些实施方式中，第一TIL扩增可进行11天至14天。在一些实施方式中，第一TIL扩增可进行12天至14天。在一些实施方式中，第一TIL扩增可进行13天至14天。在一些实施方式中，第一TIL扩增可进行14天。在一些实施方式中，第一TIL扩增可进行1天至11天。在一些实施方式中，第一TIL扩增可进行2天至11天。在一些实施方式中，第一TIL扩增可进行3天至11天。在一些实施方式中，第一TIL扩增可进行4天至11天。在一些实施方式中，第一TIL扩增可进行5天至11天。在一些实施方式中，第一TIL扩增可进行6天至11天。在一些实施方式中，第一TIL扩增可进行7天至11天。在一些实施方式中，第一TIL扩增可进行8天至11天。在一些实施方式中，第一TIL扩增可进行9天至11天。在一些实施方式中，第一TIL扩增可进行10天至11天。在一些实施方式中，第一TIL扩增可进行11天。
在一些实施方式中，采用IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21的组合作为在第一扩增期间的组合。在一些实施方式中，IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21以及它们的任何组合可包括在第一扩增期间，包括例如在根据图1以及本文所述的步骤B过程期间。在一些实施方式中，采用IL-2、IL-15和IL-21的组合作为在第一扩增期间的组合。在一些实施方式中，IL-2、IL-15和IL-21以及它们的任何组合可包括在根据图1以及如本文所述的步骤B过程期间。
在一些实施方式中，如实施例和图示中所论述，第一扩增(包括称为预REP的过程；例如根据图1的步骤B)过程缩短至3至14天。在一些实施方式中，步骤B的第一扩增缩短至7至14天。在一些实施方式中，步骤B的第一扩增缩短至10至14天。在一些实施方式中，第一扩增缩短至11天。
在一些实施方式中，第一扩增，例如根据图1的步骤B在密闭系统生物反应器中进行。在一些实施方式中，采用密闭系统进行如本文所述的TIL扩增。在一些实施方式中，采用单一生物反应器。在一些实施方式中，所采用的单一生物反应器为例如G-REX-10或G-REX-100。在一些实施方式中，密闭系统生物反应器为单一生物反应器。
1.细胞因子及其他添加剂
本文所述的扩增方法通常使用具有高剂量细胞因子(尤其是IL-2)的培养基，如本领域中已知。
替代性地，使用细胞因子的组合进行TIL的快速扩增和/或第二扩增也是可能的，如美国专利申请公开第US2017/0107490 A1号中所描述，使用IL-2、IL-15和IL-21中的两种以上的组合，其公开内容以引用的方式并入本文中。因此，可能的组合包括IL-2和IL-15、IL-2和IL-21、IL-15和IL-21和IL-2，或者IL-15和IL-21，后者在许多实施方式中具有特定用途。使用细胞因子的组合特别有利于产生淋巴细胞，特别是如其中所描述的T细胞。
在一些实施方式中，步骤B也可包括向培养基中添加OKT-3抗体或莫罗单抗，如本文别处所描述。在一些实施方式中，步骤B也可包括向培养基中添加4-1BB激动剂，如本文别处所描述。在一些实施方式中，步骤B也可包括向培养基中添加OX-40激动剂，如本文别处所描述。在其他实施方式中，可在步骤B期间在培养基中使用添加剂，例如过氧化物酶体增殖物活化受体γ共活化剂I-α激动剂，包括增殖物活化受体(PPAR)-γ激动剂，例如噻唑啶二酮化合物，如在美国专利申请公开第US2019/0307796A1号中所描述，其公开内容以引用的方式并入本文中。
C.步骤C：第一扩增至第二扩增的转变
在一些情况下，自第一扩增获得的主体TIL群(包括例如自例如图1中所示的步骤B获得的TIL群)可使用下文所论述的方案立即冷冻保存。替代性地，自第一扩增获得的TIL群(称为第二TIL群)可经历第二扩增(其可包括有时称为REP的扩增)接着如下文所论述的冷冻保存。类似地，在将经基因修饰的TIL用于疗法的情况下，第一TIL群(有时称为主体TIL群)或第二TIL群(在一些实施方式中，其可包括称为REP TIL群的群体)可在扩增之前或在第一扩增之后且在第二扩增之前进行基因修饰以用于适合治疗。
在一些实施方式中，将自第一扩增(例如来自如图1中所指示的步骤B)获得的TIL储存直至进行表型分析以供选择。在一些实施方式中，自第一扩增(例如来自如图1中所指示的步骤B)获得的TIL未经储存且直接进行至第二扩增。在一些实施方式中，自第一扩增获得的TIL在第一扩增之后且在第二扩增之前未经冷冻保存。在一些实施方式中，自第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后约3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天发生。在一些实施方式中，自第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后约3天至14天发生。在一些实施方式中，自第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后约4天至14天发生。在一些实施方式中，自第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后约4天至10天发生。在一些实施方式中，自第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后约7天至14天发生。在一些实施方式中，自第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后约14天发生。
在一些实施方式中，自第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天发生。在一些实施方式中，自第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后1天至14天发生。在一些实施方式中，第一TIL扩增可进行2天至14天。在一些实施方式中，自第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后3天至14天发生。在一些实施方式中，自第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后4天至14天发生。在一些实施方式中，自第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后5天至14天发生。在一些实施方式中，自第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后6天至14天发生。在一些实施方式中，自第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后7天至14天发生。在一些实施方式中，自第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后8天至14天发生。在一些实施方式中，自第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后9天至14天发生。在一些实施方式中，自第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后10天至14天发生。在一些实施方式中，自第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后11天至14天发生。在一些实施方式中，自第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后12天至14天发生。在一些实施方式中，自第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后13天至14天发生。在一些实施方式中，自第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后14天发生。在一些实施方式中，自第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后1天至11天发生。在一些实施方式中，自第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后2天至11天发生。在一些实施方式中，自第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后3天至11天发生。在一些实施方式中，自第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后4天至11天发生。在一些实施方式中，自第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后5天至11天发生。在一些实施方式中，自第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后6天至11天发生。在一些实施方式中，自第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后7天至11天发生。在一些实施方式中，自第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后8天至11天发生。在一些实施方式中，自第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后9天至11天发生。在一些实施方式中，自第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后10天至11天发生。在一些实施方式中，自第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后11天发生。
在一些实施方式中，TIL在第一扩增之后且在第二扩增之前未经储存，TIL直接进行第二扩增(例如在一些实施方式中，在如图1中所示的步骤B至步骤D的转变期间未经历储存)。在一些实施方式中，转变在如本文所述的密闭系统中发生。在一些实施方式中，来自第一扩增的TIL(即第二TIL群)在无转变时间段的情况下直接进行第二扩增。
在一些实施方式中，自第一扩增至第二扩增的转变(例如根据图1的步骤C)在密闭系统生物反应器中进行。在一些实施方式中，采用密闭系统进行如本文所述的TIL扩增。在一些实施方式中，采用单一生物反应器。在一些实施方式中，所采用的单一生物反应器为例如G-REX-10或G-REX-100。在一些实施方式中，密闭系统生物反应器为单一生物反应器。
1.细胞因子
本文所述的扩增方法通常使用具有高剂量细胞因子(尤其是IL-2)的培养基，如本领域中已知。
替代性地，使用细胞因子组合进行TIL的快速扩增和/或第二扩增也是可能的，如国际公开第WO 2015/189356号和W国际公开第WO 2015/189357号中大体上概述，使用IL-2、IL-15和IL-21中的两种以上的组合，该公开特此以全文引用的方式明确并入本文中。因此，可能的组合包括IL-2和IL-15、IL-2和IL-21、IL-15和IL-21和IL-2、IL-15和IL-21，其中，后者在许多实施方式中具有特定用途。使用细胞因子的组合特别有利于产生淋巴细胞，特别是如其中所描述的T细胞。参见表2。
2.抗生素
本文所述的第一或初始扩增方法通常使用包含抗生素组分的培养基。
在一些实施方式中，抗生素组分包含本文公开的任何浓度的：1)万古霉素；2)庆大霉素和万古霉素；或3)庆大霉素和克林霉素。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL至约600μg/mL万古霉素。在一些实施方式中，抗生素组分包含约100μg/mL万古霉素。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约400μg/mL至约600μg/mL克林霉素。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约2.5μg/mL至约10μg/mL双性霉素B。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素和约50μg/mL至约600μg/mL万古霉素。在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素和约100μg/mL万古霉素。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素和约400μg/mL至约600μg/mL克林霉素。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素、约100μg/mL至约600μg/mL万古霉素和约2.5μg/mL至约10μg/mL双性霉素B。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素、约400μg/mL至约600μg/mL克林霉素和约2.5μg/mL至约10μg/mL双性霉素B。
D.步骤D：第二扩增
在一些实施方式中，在收集和初始批量处理之后，例如在步骤A和步骤B，以及称为步骤C的转变之后，TIL细胞群的数目扩增，如图1中所指示)。此进一步扩增在本文中称为第二扩增，其可包括在本领域中通常称为快速扩增过程(REP；以及如图1的步骤D中所指示的过程)的扩增过程。第二扩增通常使用包含多种组分的培养基在透气容器中完成，该多种组分包括饲养细胞、细胞因子源、可选的抗生素组分和抗CD3抗体。在一些实施方式中，可选的抗生素组分包含本文公开的任何浓度的：1)万古霉素；2)庆大霉素和万古霉素；或3)庆大霉素和克林霉素。
在一些实施方式中，第二扩增或第二TIL扩增(其可包括有时称为REP的扩增；以及如图1的步骤D中所指示的过程)可使用本领域中本领域技术人员已知的任何TIL培养瓶或容器进行。在一些实施方式中，第二TIL扩增可进行7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些实施方式中，第二TIL扩增可进行约7天至约14天。在一些实施方式中，第二TIL扩增可进行约8天至约14天。在一些实施方式中，第二TIL扩增可进行约9天至约14天。在一些实施方式中，第二TIL扩增可进行约10天至约14天。在一些实施方式中，第二TIL扩增可进行约11天至约14天。在一些实施方式中，第二TIL扩增可进行约12天至约14天。在一些实施方式中，第二TIL扩增可进行约13天至约14天。在一些实施方式中，第二TIL扩增可进行约14天。
在一些实施方式中，第二扩增可在透气容器中使用本公开的方法(包括例如称为REP的扩增；以及如图1的步骤D中所指示的过程)进行。例如，TIL可在白介素-2(IL-2)或白介素-15(IL-15)存在下使用非特异性T细胞受体刺激而快速扩增。非特异性T细胞受体刺激物可包括例如抗CD3抗体，例如约30ng/mL OKT3、小鼠单克隆抗CD3抗体(可商购自新泽西州拉里坦市的Ortho-McNeil或加利福尼亚州奥本市的Miltenyi Biotech)或UHCT-1(可商购自美国加利福尼亚州圣地亚哥市的BioLegend)。TIL可通过在第二扩增期间包括一种以上癌症抗原(包括其抗原性部分，例如表位)来扩增以在体外诱导进一步TIL刺激，该抗原可以可选地在T细胞生长因子(例如300IU/mL IL-2或IL-15)存在下可选地由载体表达，该载体为例如人白细胞抗原A2(HLA-A2)结合肽，例如0.3μM MART-1:26-35(27L)或gpl 00:209-217(210M)。其他适合抗原可包括例如NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶癌症抗原、MAGE-A3、SSX-2和VEGFR2，或其抗原部分。TIL也可通过用脉冲至表达HLA-A2的抗原呈递细胞上的相同癌症抗原再刺激而快速扩增。替代性地，TIL可进一步用例如实施例经辐照的自体淋巴细胞或用经辐照的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2再刺激。在一些实施方式中，再刺激作为第二扩增的一部分发生。在一些实施方式中，第二扩增在经辐照的自体淋巴细胞或经辐照的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2存在下发生。
在一些实施方式中，第二扩增中的细胞培养基可选地包含抗生素组分。在一些实施方式中，抗生素组分包含本文公开的任何浓度的：1)万古霉素；2)庆大霉素和万古霉素；或3)庆大霉素和克林霉素。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约100μg/mL至约600μg/mL万古霉素。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约400μg/mL至约600μg/mL克林霉素。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约2.5μg/mL至约10μg/mL双性霉素B。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素和约100μg/mL至约600μg/mL万古霉素。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素和约400μg/mL至约600μg/mL克林霉素。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素、约100μg/mL至约600μg/mL万古霉素和约2.5μg/mL至约10μg/mL双性霉素B。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素、约400μg/mL至约600μg/mL克林霉素和约2.5μg/mL至约10μg/mL双性霉素B。
在一些实施方式中，细胞培养基进一步包含IL-2。在一些实施方式中，细胞培养基包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，细胞培养基包含约1000IU/mL、约1500IU/mL、约2000IU/mL、约2500IU/mL、约3000IU/mL、约3500IU/mL、约4000IU/mL、约4500IU/mL、约5000IU/mL、约5500IU/mL、约6000IU/mL、约6500IU/mL、约7000IU/mL、约7500IU/mL或约8000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，细胞培养基包含在1000与2000IU/mL之间、在2000与3000IU/mL之间、在3000与4000IU/mL之间、在4000与5000IU/mL之间、在5000与6000IU/mL之间、在6000与7000IU/mL之间、在7000与8000IU/mL之间、或8000IU/mL的IL-2。
在一些实施方式中，细胞培养基包含OKT-3抗体。在一些实施方式中，细胞培养基包含约30ng/mL OKT-3抗体。在一些实施方式中，细胞培养基包含约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2.5ng/mL、约5ng/mL、约7.5ng/mL、约10ng/mL、约15ng/mL、约20ng/mL、约25ng/mL、约30ng/mL、约35ng/mL、约40ng/mL、约50ng/mL、约60ng/mL、约70ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约100ng/mL、约200ng/mL、约500ng/mL和约1μg/mL OKT-3抗体。在一些实施方式中，细胞培养基包含在0.1ng/mL与1ng/mL之间、在1ng/mL与5ng/mL之间、在5ng/mL与10ng/mL之间、在10ng/mL与20ng/mL之间、在20ng/mL与30ng/mL之间、在30ng/mL与40ng/mL之间、在40ng/mL与50ng/mL之间和在50ng/mL与100ng/mL之间的OKT-3抗体。在一些实施方式中，细胞培养基不包含OKT-3抗体。在一些实施方式中，OKT-3抗体为莫罗单抗。
在一些实施方式中，细胞培养基包含一种以上TNFRSF激动剂在细胞培养基中。在一些实施方式中，TNFRSF激动剂包括4-1BB激动剂。在一些实施方式中，TNFRSF激动剂为4-1BB激动剂，4-1BB激动剂选自如下：乌瑞鲁单抗、乌图木单抗、EU-101、融合蛋白以及它们的碎片、衍生物、变体、生物类似物和组合。在一些实施方式中，添加的TNFRSF激动剂的浓度足以在细胞培养基中达成在0.1μg/mL与100μg/mL之间的浓度。在一些实施方式中，添加的TNFRSF激动剂的浓度足以在细胞培养基中达成在20μg/mL与40μg/mL之间的浓度。
在一些实施方式中，除了一种以上TNFRSF激动剂之外，细胞培养基进一步包含初始浓度为约3000IU/mL的IL-2和初始浓度为约30ng/mL的OKT-3抗体，其中该一种以上TNFRSF激动剂包括4-1BB激动剂。
在一些实施方式中，采用IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21的组合作为在第二扩增期间的组合。在一些实施方式中，在第二扩增期间，包括例如在根据图1以及本文所述的步骤D过程期间，可包括IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21以及它们的任何组合。在一些实施方式中，采用IL-2、IL-15和IL-21的组合作为在第二扩增期间的组合。在一些实施方式中，在根据图1和如本文所述的步骤D过程期间可包括IL-2、IL-15和IL-21以及它们的任何组合。
在一些实施方式中，第二扩增可在包含IL-2、OKT-3、抗原呈递饲养细胞且可选地包含TNFRSF激动剂的补充细胞培养基中进行。在一些实施方式中，第二扩增在补充细胞培养基中发生。在一些实施方式中，补充细胞培养基包含IL-2、OKT-3和抗原呈递饲养细胞。在一些实施方式中，第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC，也称为抗原呈递饲养细胞)。在一些实施方式中，第二扩增在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递饲养细胞(即，抗原呈递细胞)的细胞培养基中发生。
在一些实施方式中，第二扩增培养基包含约500IU/mL IL-15、约400IU/mL IL-15、约300IU/mL IL-15、约200IU/mL IL-15、约180IU/mL IL-15、约160IU/mL IL-15、约140IU/mL IL-15、约120IU/mL IL-15或约100IU/mL IL-15。在一些实施方式中，第二扩增培养基包含约500IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施方式中，第二扩增培养基包含约400IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施方式中，第二扩增培养基包含约300IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施方式中，第二扩增培养基包含约200IU/mL IL-15。在一些实施方式中，细胞培养基包含约180IU/mL IL-15。在一些实施方式中，细胞培养基进一步包含IL-15。在一些实施方式中，细胞培养基包含约180IU/mL IL-15。
在一些实施方式中，第二扩增培养基包含约20IU/mL IL-21、约15IU/mL IL-21、约12IU/mL IL-21、约10IU/mL IL-21、约5IU/mL IL-21、约4IU/mL IL-21、约3IU/mL IL-21、约2IU/mL IL-21、约1IU/mL IL-21或约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方式中，第二扩增培养基包含约20IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方式中，第二扩增培养基包含约15IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方式中，第二扩增培养基包含约12IU/mLIL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方式中，第二扩增培养基包含约10IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方式中，第二扩增培养基包含约5IU/mL IL-21至约1IU/mLIL-21。在一些实施方式中，第二扩增培养基包含约2IU/mL IL-21。在一些实施方式中，细胞培养基包含约1IU/mL IL-21。在一些实施方式中，细胞培养基包含约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方式中，细胞培养基进一步包含IL-21。在一些实施方式中，细胞培养基包含约1IU/mL IL-21。
在一些实施方式中，抗原呈递饲养细胞(APC)为PBMC。在一些实施方式中，在快速扩增和/或第二扩增中TIL与PBMC和/或抗原呈递细胞的比率为约1比25、约1比50、约1比100、约1比125、约1比150、约1比175、约1比200、约1比225、约1比250、约1比275、约1比300、约1比325、约1比350、约1比375、约1比400或约1比500。在一些实施方式中，在快速扩增和/或第二扩增中TIL与PBMC的比率介于1比50与1比300之间。在一些实施方式中，在快速扩增和/或第二扩增中TIL与PBMC的比率介于1比100与1比200之间。
在一些实施方式中，REP和/或第二扩增在培养瓶中进行，其中主体TIL与100倍或200倍过量的灭活饲养细胞、30mg/mL OKT3抗CD3抗体和3000IU/mL IL-2混合于150mL培养基中。进行培养基更换(通常用新鲜培养基通过抽吸更换2/3培养基)，直至细胞转移至替代生长箱室。替代生长箱室包括G-REX培养瓶和透气容器，如下文更充分地论述。
在一些实施方式中，第二扩增(其可包括称为REP程序的过程)缩短至7-14天，如实施例和图示中所论述。在一些实施方式中，第二扩增缩短至11天。
在一些实施方式中，REP和/或第二扩增可以使用先前描述的T-175培养瓶和透气袋(Tran等人,《免疫疗法杂志》2008,31,742-51；Dudley等人,《免疫疗法杂志》2003,26,332-42)或透气培养皿(G-Rex培养瓶)进行。在一些实施方式中，第二扩增(包括称为快速扩增的扩增)在T-175培养瓶中进行，可将悬浮于150mL培养基中的约1×106个TIL添加至各T-175培养瓶中。TIL可在补充有3000IU/mL IL-2和30ng/ml抗CD3的CM与AIM-V培养基的1:1混合物中培养。T-175培养瓶可在37℃下在5％ CO2下孵育。可在第5天使用具有3000IU/mLIL-2的50/50培养基更换一半培养基。在一些实施方式中，在第7天，可将来自两个T-175培养瓶的细胞合并在一个3L袋中，将300mL含5％人AB血清和3000IU/mL IL-2的AIM V添加至300mL TIL悬浮液中。每天或每两天计数各袋中的细胞数目，添加新鲜培养基以使细胞计数保持在0.5与2.0×106个细胞/mL之间。
在一些实施方式中，第二扩增(其可包括称为REP的扩增，以及在图1的步骤D中提及的扩增)可在具有100cm透气硅底的500mL容量的透气培养瓶(G-Rex 100，可商购自美国明尼苏达州新布莱顿市的Wilson Wolf Manufacturing Corporation)中进行，可将5×106或10×106个TIL与PBMC在400mL补充有5％人AB血清、3000IU/mL IL-2和30ng/mL抗CD3(OKT3)的50/50培养基中培养。G-Rex 100培养瓶可在37℃下在5％CO2下孵育。第5天，可移除250mL上清液，置于离心机瓶中，以1500rpm(491×g)离心10分钟。TIL沉淀物可用150mL含5％人AB血清、3000IU/mL IL-2的新鲜培养基再悬浮，添加回原始G-Rex 100培养瓶中。当在G-Rex 100培养瓶中连续扩增TIL时，在第7天，可使各G-Rex 100中的TIL悬浮于各培养瓶中存在的300mL培养基中，细胞悬浮液可分成3份100mL等分试样，该分试样可用于接种3个G-Rex 100培养瓶。接着，可将150mL含5％人AB血清和3000IU/mL IL-2的AIM-V添加至各培养瓶中。可将G-Rex 100培养瓶在37℃下在5％ CO2下孵育且在4天之后，可将150mL含3000IU/mL IL-2的AIM-V添加至各G-Rex 100培养瓶中。可在培养第14天收集细胞。
在一些实施方式中，第二扩增(包括称为REP的扩增)在培养瓶中进行，其中将主体TIL与100倍或200倍过量的灭活饲养细胞、30mg/mL OKT3抗CD3抗体和3000IU/mL IL-2混合于150mL培养基中。在一些实施方式中，更换培养基直至细胞转移至替代生长箱室。在一些实施方式中，用新鲜培养基通过抽吸来更换2/3的培养基。在一些实施方式中，替代生长箱室包含G-REX培养瓶和透气容器，如下文更充分论述。
在一些实施方式中，进行第二扩增(包括被称为REP的扩增)，其进一步包括选择具有优良异肿瘤反应性的TIL的步骤。可使用本领域中已知的任何选择方法。例如，可使用美国专利申请公开第2016/0010058A1号(其公开内容以引用的方式并入本文中)中所描述的方法选择具有优良肿瘤反应性的TIL。
可选地，细胞存活率分析可在第二扩增(包括称为REP扩增的扩增)之后，使用本领域中已知的标准分析进行。例如，可对主体TIL样本进行台盼蓝排除分析，台盼蓝选择性标记死亡细胞且允许进行存活率评定。在一些实施方式中，TIL样本可使用Cellometer K2自动化细胞计数器(马萨诸塞州劳伦斯市的Nexcelom Bioscience)计数和确定存活率。在一些实施方式中，存活率根据标准Cellometer K2 Image Cytometer自动细胞计数器方案确定。
在一些实施方式中，TIL的第二扩增(包括称为REP的扩增)可使用如先前所描述的T-175培养瓶和透气袋(Tran K Q,Zhou J,Durflinger K H等人,2008,《免疫疗法杂志》,31:742-751，和Dudley ME,Wunderlich J R,Shelton TE等人,2003,《免疫疗法杂志》,26:332-342)或透气G-Rex培养瓶进行。在一些实施方式中，第二扩增使用培养瓶进行。在一些实施方式中，第二扩增使用透气G-Rex培养瓶进行。在一些实施方式中，第二扩增在T-175培养瓶中进行，将约1×106个TIL悬浮于约150mL培养基中，将其添加至各T-175培养瓶中。将TIL与作为“喂养”细胞的经辐照(50Gy)同种异体PBMC以1:100的比率一起培养并将细胞在补充有3000IU/mL IL-2和30ng/mL抗CD3的CM与AIM-V培养基的1:1混合物(50/50培养基)中培养。将T-175培养瓶在37℃下在5％ CO2下孵育。在一些实施方式中，在第5天使用含3000IU/mL IL-2的50/50培养基更换一半培养基。在一些实施方式中，在第7天，将来自2个T-175培养瓶的细胞在3L袋中合并，将300mL含5％人AB血清和3000IU/mL IL-2的AIM-V添加至300mL TIL悬浮液中。可每天或每两天计数各袋中的细胞数目，可添加新鲜培养基以使细胞计数保持在约0.5与约2.0×106个细胞/mL之间。
在一些实施方式中，第二扩增(包括称为REP的扩增)在具有100cm2透气硅底的500mL容量培养瓶(G-Rex 100，Wilson Wolf)中进行(图1)，将约5×106或10×106个TIL与经辐照同种异体PBMC在400mL补充有3000IU/mL IL-2和30ng/mL抗CD3的50/50培养基中以1:100的比率培养。G-Rex 100培养瓶在37℃下在5％ CO2下孵育。在一些实施方式中，在第5天，移除250mL上清液，置于离心机瓶中，以1500rpm(491g)离心10分钟。接着，可用150mL含3000IU/mL IL-2的新鲜50/50培养基使TIL沉淀物再悬浮，添加回原始G-Rex 100培养瓶中。在G-Rex 100培养瓶中连续扩增TIL的实施方式中，在第7天，使各G-Rex 100中的TIL悬浮于各培养瓶中存在的300mL培养基中，将细胞悬浮液分成三份100mL等分试样，使用该分试样接种3个G-Rex 100培养瓶。接着，将150mL含5％人AB血清和3000IU/mL IL-2的AIM-V添加至各培养瓶中。将G-Rex 100培养瓶在37℃下在5％ CO2下孵育，在4天之后，将150mL含3000IU/mL IL-2的AIM-V添加至各G-Rex 100培养瓶中。在培养的第14天收集细胞。
T淋巴细胞和B淋巴细胞的多种抗原受体通过有限但大量基因区段的体细胞重组产生。这些基因区段：V(可变区)、D(多变区)、J(连接区)和C(恒定区)决定免疫球蛋白和T细胞受体(TCR)的结合特异性和下游应用。本发明提供了一种用于产生展现增加的T细胞贮库多样性的TIL的方法。在一些实施方式中，通过本发明方法获得的TIL展现增加的T细胞贮库多样性。在一些实施方式中，在第二扩增中获得的TIL展现增加的T细胞贮库多样性。在一些实施方式中，多样性增加是免疫球蛋白多样性和/或T细胞受体多样性增加。在一些实施方式中，多样性存在于免疫球蛋白中，存在于免疫球蛋白重链中。在一些实施方式中，多样性存在于免疫球蛋白中，存在于免疫球蛋白轻链中。在一些实施方式中，多样性存在于T细胞受体中。在一些实施方式中，多样性存在于选自由α、β、γ和δ受体组成的群组的T细胞受体中的一者中。在一些实施方式中，T细胞受体(TCR)α和/或β的表达增加。在一些实施方式中，T细胞受体(TCR)α的表达增加。在一些实施方式中，T细胞受体(TCR)β的表达增加。在一些实施方式中，TCRab(即，TCRα/β)的表达增加。
在一些实施方式中，第二扩增培养基(例如有时称为CM2或第二细胞培养基)包含IL-2、OKT-3以及抗原呈递饲养细胞(APC)，如下文更详细论述。
在一些实施方式中，第二扩增，例如根据图1的步骤D在密闭系统生物反应器中进行。在一些实施方式中，采用密闭系统进行如本文所述的TIL扩增。在一些实施方式中，采用单一生物反应器。在一些实施方式中，所采用的单一生物反应器为例如G-REX-10或G-REX-100。在一些实施方式中，密闭系统生物反应器为单一生物反应器。
1.饲养细胞和抗原呈递细胞
在一些实施方式中，本文所述的第二扩增程序(例如包含例如图1的步骤D中所描述的扩增以及称为REP的扩增)在REP TIL扩增期间和/或在第二扩增期间需要过量的饲养细胞。在许多实施方式中，饲养细胞获自健康血液供体的标准全血单位的外周血单核细胞(PBMC)。PBMC使用标准方法，例如Ficoll-Paque梯度分离法获得。
通常而言，同种异体PBMC通过辐照或热处理而灭活，如实施例中所描述用于REP程序中，其提供用于评估经辐照同种异体PBMC的复制机能不全(replication incompetence)的示例性方案。
在一些实施方式中，若第14天活细胞总数小于在REP第0天和/或第二扩增第0天(即，第二扩增的起始日)放入培养的初始活细胞数目，则认为PBMC复制机能不全且可接受其用于本文所述的TIL扩增程序。
在一些实施方式中，若第7天和第14天在OKT3和IL-2存在下培养的活细胞的总数与在REP第0天和/或第二扩增第0天(即，第二扩增的起始日)放入培养的初始活细胞数目相比并未增加，则认为PBMC复制机能不全且可接受其用于本文所述的TIL扩增程序。在一些实施方式中，PBMC在30ng/ml OKT3抗体和3000IU/ml IL-2存在下培养。
在一些实施方式中，若第7天和第14天在OKT3和IL-2存在下培养的活细胞的总数与在REP第0天和/或第二扩增第0天(即，第二扩增的起始日)放入培养的初始活细胞数目相比并未增加，则认为PBMC复制机能不全且可接受其用于本文所述的TIL扩增程序。在一些实施方式中，PBMC在5-60ng/mL OKT3抗体和1000-6000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方式中，PBMC在10-50ng/mL OKT3抗体和2000-5000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方式中，PBMC在20-40ng/mL OKT3抗体和2000-4000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方式中，PBMC在25-35ng/mL OKT3抗体和2500-3500IU/mL IL-2存在下培养。
在一些实施方式中，抗原呈递饲养细胞为PBMC。在一些实施方式中，抗原呈递饲养细胞为人工抗原呈递饲养细胞。在一些实施方式中，在第二扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率为约1比25、约1比50、约1比100、约1比125、约1比150、约1比175、约1比200、约1比225、约1比250、约1比275、约1比300、约1比325、约1比350、约1比375、约1比400或约1比500。在一些实施方式中，在第二扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率介于1比50与1比300之间。在一些实施方式中，在第二扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率介于1比100与1比200之间。
在一些实施方式中，本文所述的第二扩增程序需要约2.5×109个饲养细胞比约100×106个TIL的比率。在一些实施方式中，本文所述的第二扩增程序需要约2.5×109个饲养细胞比约50×106个TIL的比率。在一些实施方式中，本文所述的第二扩增程序需要约2.5×109个饲养细胞比约25×106个TIL的比率。
在一些实施方式中，本文所述的第二扩增程序在第二扩增期间需要过量饲养细胞。在许多实施方式中，饲养细胞自健康血液供体的标准全血单位获得的外周血单核细胞(PBMC)。PBMC使用标准方法，例如Ficoll-Paque梯度分离法获得。在一些实施方式中，使用人工抗原呈递细胞(aAPC)代替PBMC。
通常而言，同种异体PBMC通过照射或热处理而灭活，用于本文所述的TIL扩增程序，包括图示和实施例中所描述的示例性过程。
在一些实施方式中，在第二扩增中使用人工抗原呈递细胞来代替PBMC或与PBMC组合使用。
2.细胞因子
本文所述的扩增方法通常使用具有高剂量细胞因子(尤其是IL-2)的培养基，如本领域中已知。
替代性地，使用细胞因子的组合进行TIL的快速扩增和/或第二扩增也是可能的，如国际公开第WO 2015/189356号和国际公开第WO 2015/189357号中大体上概述，使用IL-2、IL-15和IL-21中的两种以上的组合，该公开特此以全文引用的方式明确并入本文中。因此，可能的组合包括IL-2和IL-15、IL-2和IL-21、IL-15和IL-21和IL-2、IL-15和IL-21，其中后者在许多实施方式中具有特定用途。使用细胞因子的组合特别有利于产生淋巴细胞，特别是如其中所描述的T细胞。
3.抗生素
本文所述的第二扩增方法通常使用包含抗生素组分的培养基。
在一些实施方式中，抗生素组分包含本文公开的任何浓度的：1)万古霉素；2)庆大霉素和万古霉素；或3)庆大霉素和克林霉素。
在一些实施方式中，一种以上抗生素包含约100μg/mL至约600μg/mL万古霉素。在一些实施方式中，一种以上抗生素由约100μg/mL至约600μg/mL万古霉素组成且无另外的抗生素。
在一些实施方式中，一种以上抗生素包含约400μg/mL至约600μg/mL克林霉素。
在一些实施方式中，一种以上抗生素包含约50μg/mL庆大霉素.
在一些实施方式中，一种以上抗生素包含约2.5μg/mL至约10μg/mL双性霉素B。
在一些实施方式中，一种以上抗生素包含约50μg/mL庆大霉素和约100μg/mL至约600μg/mL万古霉素。
在一些实施方式中，一种以上抗生素包含约50μg/mL庆大霉素和约400μg/mL至约600μg/mL克林霉素。
在一些实施方式中，一种以上抗生素包含约50μg/mL庆大霉素、约100μg/mL至约600μg/mL万古霉素和约2.5μg/mL至约10μg/mL双性霉素B。
在一些实施方式中，一种以上抗生素包含约50μg/mL庆大霉素、约400μg/mL至约600μg/mL克林霉素和约2.5至约10μg/mL双性霉素B。
E.步骤E：收集TIL
在第二扩增步骤之后，可收集细胞。在一些实施方式中，在如例如图1中所提供的一、二、三、四个或更多个扩增步骤之后收集TIL。在一些实施方式中，在两个扩增步骤之后收集TIL，如例如图1中所提供。
可以任何适当且无菌的方式，包括例如通过离心，收集TIL。用于收集TIL的方法为本领域中熟知的且任何此类已知方法均可与本发明的过程一起使用。在一些实施方式中，使用自动化系统收集TIL。
细胞收集器和/或细胞处理系统可购自各种来源，包括例如Fresenius Kabi、Tomtec Life Science、Perkin Elmer和Inotech Biosystems International,Inc.。本发明方法可采用任何基于细胞的收集器。在一些实施方式中，细胞收集器和/或细胞处理系统是基于膜的细胞收集器。在一些实施方式中，细胞收集通过细胞处理系统，例如LOVO系统(由Fresenius Kabi制造)进行。术语“LOVO细胞处理系统”也指由任何供应商制造的任何可在无菌和/或密闭系统环境中将包含细胞的溶液泵送通过膜或过滤器(例如旋转膜或旋转过滤器)的仪器或装置，从而允许连续流动和细胞处理以移除上清液或细胞培养基而不发生团块化。在一些实施方式中，细胞收集器和/或细胞处理系统可在密闭无菌系统中进行细胞分离、洗涤、流体交换、浓缩和/或其他细胞处理步骤。
在一些实施方式中，收集，例如根据图1的步骤B在密闭系统生物反应器中进行。在一些实施方式中，采用密闭系统进行如本文所述的TIL扩增。在一些实施方式中，采用单一生物反应器。在一些实施方式中，所采用的单一生物反应器为例如G-REX-10或G-REX-100。在一些实施方式中，密闭系统生物反应器为单一生物反应器。
在一些实施方式中，根据图1的步骤E是根据本文所述的过程进行。在一些实施方式中，密闭系统在无菌条件下通过注射器进入以维持系统的无菌性和密闭性质。在一些实施方式中，采用如实施例中所描述的密闭系统。
在一些实施方式中，根据实施例中所描述的方法收集TIL。在一些实施方式中，使用如本文所提及的步骤中所描述的方法在第1天与第11天之间收集TIL，例如在实施例中在第11天收集TIL。在一些实施方式中，使用如本文所提及的步骤中所描述的方法在第12天与第24天之间收集TIL，例如在实施例中在第22天收集TIL。在一些实施方式中，使用如本文所提及的步骤中所描述的方法在第12天与第22天之间收集TIL，例如在实施例中在第22天收集TIL。
F.步骤F：最终配制和转移至输注容器
在如图1中以示例性次序提供且如上文和本文中详细概述的步骤A至步骤E完成之后，将细胞转移至容器中以用于向患者施用，例如输注袋或无菌小瓶。在一些实施方式中，在使用上文所描述的扩增方法获得治疗足够数目的TIL后，立即将其转移至容器中以用于向患者施用。
在一些实施方式中，使用本公开的APC扩增的TIL是以药物组合物形式向患者施用。在一些实施方式中，药物组合物是TIL在无菌缓冲液中的悬浮液。使用本公开的PBMC扩增的TIL可通过本领域中已知的任何适合途径施用。在一些实施方式中，T细胞以单一动脉内或静脉内输注的形式施用，其优选进行约30至60分钟。其他合适的施用途径包含腹膜内、鞘内和淋巴管内施用。
IX.Gen 3TIL制造过程
在不受任何特定理论限制的情况下，认为如本发明方法中所描述的起始T细胞活化的起始第一扩增和随后的加强T细胞活化的快速第二扩增，允许制备保留“较年轻”表型的经扩增T细胞，因此预期本发明的经扩增T细胞相较于通过其他方法扩增的T细胞可对癌细胞展现更高细胞毒性。特别地，认为如本发明方法所教导的通过暴露于抗CD3抗体(例如OKT-3)、IL-2和可选的抗原呈递细胞(APC)来起始T细胞的活化，接着通过随后暴露于另外的抗CD-3抗体(例如OKT-3)、IL-2和APC加强T细胞的活化，其限制或避免培养物中T细胞的成熟，从而产生具有较不成熟表型的T细胞群，T细胞因在培养物中扩增而耗竭更少且对癌细胞展现更高细胞毒性。在一些实施方式中，快速第二扩增的步骤分为多个步骤以通过以下达成培养规模扩大(scale up)：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养T细胞约3天至4天的时间段来进行快速第二扩增；接着(b)实现将小规模培养中的T细胞转移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)，在第二容器中的较大规模培养中培养来自小规模培养的T细胞约4天至7天的时间段。在一些实施方式中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩展(scale out)：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的第一小规模培养中培养T细胞约3天至4天的时间段来进行快速第二扩增；接着(b)将来自第一小规模培养中的T细胞转移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小与第一容器相同的第二容器中，在各第二容器中，经转移至此类第二容器的来自第一小规模培养的T细胞部分于第二小规模培养中培养约4天至7天的时间段。在一些实施方式中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩展及规模扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养T细胞约3天至4天的时间段来进行快速第二扩增；接着(b)将来自小规模培养中的T细胞转移且分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，在各第二容器中，经转移至此类第二容器的来自小规模培养的T细胞部分在较大规模培养中培养约4天至7天的时间段。在一些实施方式中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩展及规模扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养T细胞约4天的时间段来进行快速第二扩增；接着(b)将来自小规模培养中的T细胞转移且分配至2、3或4个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，在各第二容器中，经转移至此类第二容器的来自小规模培养的T细胞部分在较大规模培养中培养约5天的时间段。
在一些实施方式中，在快速扩增分流时，各第二容器包含至少108个TIL。在一些实施方式中，在快速扩增分流时，各第二容器包含至少108个TIL、至少109个TIL或至少1010个TIL。在一个示例性实施方式中，各第二容器包含至少1010个TIL。
在一些实施方式中，将第一小规模TIL培养物分配成多个亚群。在一些实施方式中，将第一小规模TIL培养物分配成多个约2至5个亚群。在一些实施方式中，将第一小规模TIL培养物分配成多个约2、3、4或5个亚群。
在一些实施方式中，在完成快速扩增后，多个亚群包含治疗有效量的TIL。在一些实施方式中，在完成快速扩增后，将一个以上TIL亚群合并在一起以产生治疗有效量的TIL。在一些实施方式中，在完成快速扩增后，各TIL亚群包含治疗有效量的TIL。
在一些实施方式中，在分成多个步骤之前，快速扩增进行约1至5天的时间段。在一些实施方式中，快速扩增的分流在快速扩增开始后约第1天、第2天、第3天、第4天或第5天发生。
在一些实施方式中，快速扩增的分流在第一扩增(即，预REP扩增)开始后约第8天、第9天、第10天、第11天、第12天或第13天发生。在一个示例性实施方式中，快速扩增的分流在起始第一扩增开始后约第10天发生。在另一示例性实施方式中，快速扩增的分流在起始第一扩增开始后约第11天发生。
在一些实施方式中，在分流之后，快速扩增进一步进行约4至11天的时间段。在一些实施方式中，该快速扩增在分流之后进一步进行约3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的时间段。
在一些实施方式中，在用于分流前快速扩增的细胞培养基包含与用于分流后快速扩增的细胞培养基相同的组分。在一些实施方式中，用于分流前快速扩增的细胞培养基包含与用于分流后快速扩增的细胞培养基不同的组分。
在一些实施方式中，用于分流前快速扩增的细胞培养基包含含IL-2、可选的OKT-3和进一步可选的APC。在一些实施方式中，用于分流前快速扩增的细胞培养基包含IL-2、OKT-3和进一步可选的APC。在一些实施方式中，用于分流前快速扩增的细胞培养基包含IL-2、OKT-3和APC。
在一些实施方式中，用于分流前快速扩增的细胞培养基通过用包含IL-2、可选的OKT-3和进一步可选的APC的新鲜培养基补充第一扩增中的细胞培养基来产生。在一些实施方式中，用于分流前快速扩增的细胞培养基通过用包含IL-2、OKT-3和APC的新鲜培养基补充第一扩增中的细胞培养基来产生。在一些实施方式中，用于分流前快速扩增的细胞培养基通过用包含IL-2、可选的OKT-3和进一步可选的APC的新鲜细胞培养基替换第一扩增中的细胞培养基来产生。在一些实施方式中，用于分流前快速扩增的细胞培养基通过用包含IL-2、OKT-3和APC的新鲜细胞培养基替换第一扩增中的细胞培养基来产生。
在一些实施方式中，用于分流后快速扩增的细胞培养基包含IL-2和可选的OKT-3。在一些实施方式中，用于分流后快速扩增的细胞培养基包含IL-2和OKT-3。在一些实施方式中，用于分流后快速扩增的细胞培养基通过用包含IL-2和可选的OKT-3的新鲜培养基替换用于分流前快速扩增的细胞培养基来产生。在一些实施方式中，用于分流后快速扩增的细胞培养基通过用包含IL-2和OKT-3的新鲜细胞培养基替换用于分流前快速扩增的细胞培养基来产生。
在一些实施方式中，快速扩增的分流在密闭系统中发生。
在一些实施方式中，在快速扩增期间TIL培养的规模扩大包括将新鲜细胞培养基添加至TIL培养物中(又称为喂养TIL)。在一些实施方式中，喂养包括频繁地将新鲜细胞培养基添加至TIL培养物中。在一些实施方式中，喂养包括以规律的时间间隔将新鲜细胞培养基添加至TIL培养物中。在一些实施方式中，将新鲜细胞培养基通过恒定流动供应至TIL。在一些实施方式中，使用自动细胞扩增系统，例如Xuri W25进行快速扩增和喂养。
在一些实施方式中，快速第二扩增在通过起始第一扩增实现的T细胞活化开始降低、趋缓、衰退或消退之后进行。
在一些情况下，快速第二扩增在通过起始第一扩增实现的T细胞活化降低或降低约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％之后进行。
在一些实施方式中，快速第二扩增在通过起始第一扩增所实现的T细胞活化已降低或降低约1％至100％的范围内的百分比之后进行。
在一些实施方式中，快速第二扩增在通过起始第一扩增实现的T细胞活化已降低或降低约1％至10％、10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、80％至90％或90％至100％的范围内的百分比之后进行。
在一些实施方式中，快速第二扩增在通过起始第一扩增实现的T细胞活化已降低至少刚好或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％之后进行。
在一些情况下，快速第二扩增在通过起始第一扩增实现的T细胞活化已降低至多或至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％之后进行。
在一些实施方式中，通过起始第一扩增实现的T细胞活化的降低通过T细胞响应于抗原刺激而释放的干扰素γ的量的减少来确定。
在一些实施方式中，T细胞的起始第一扩增在至多或至多约7天或约8天的时间内进行。
在一些实施方式中，T细胞的起始第一扩增在至多或至多约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天的时间内进行。
在一些实施方式中，T细胞的起始第一扩增在1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天的时间内进行。
在一些实施方式中，T细胞的快速第二扩增在至多或至多约11天的时间内进行。
在一些实施方式中，T细胞的快速第二扩增在至多或至多约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的时间内进行。
在一些实施方式中，T细胞的快速第二扩增在1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的时间内进行。
在一些实施方式中，T细胞的起始第一扩增在刚好或约1天至刚好或约7天的时间内进行，T细胞的快速第二扩增在刚好或约1天至刚好或约11天的时间内进行。
在一些实施方式中，T细胞的起始第一扩增在至多或至多约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天的时间内进行，T细胞的快速第二扩增在至多或至多约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的时间内进行。
在一些实施方式中，T细胞的起始第一扩增在刚好或约1天至刚好或约8天的时间内进行，T细胞的快速第二扩增在刚好或约1天至刚好或约9天的时间内进行。
在一些实施方式中，T细胞的起始第一扩增在8天的时间内进行，T细胞的快速第二扩增在9天的时间内进行。
在一些实施方式中，T细胞的起始第一扩增在刚好或约1天至刚好或约7天的时间内进行，T细胞的快速第二扩增在刚好或约1天至刚好或约9天的时间内进行。
在一些实施方式中，T细胞的起始第一扩增在7天的时间内进行，T细胞的快速第二扩增在9天的时间内进行。
在一些实施方式中，T细胞为肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。
在一些实施方式中，T细胞为骨髓浸润淋巴细胞(MIL)。
在一些实施方式中，T细胞为外周血淋巴细胞(PBL)。
在一些实施方式中，T细胞自患有癌症的供体获得。
在一些实施方式中，T细胞为自患有癌症的患者所切除的肿瘤获得的TIL。
在一些实施方式中，T细胞为自患有血液系统恶性肿瘤的患者的骨髓获得的MIL。
在一些实施方式中，T细胞为自供体的外周血单核细胞(PBMC)获得的PBL。在一些实施方式中，供体患有癌症。在一些实施方式中，癌症选自如下：黑色素瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、神经胶母细胞瘤(包括GBM)、胃肠癌、肾癌和肾细胞癌。在一些实施方式中，癌症选自如下：黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、神经胶母细胞瘤(包括GBM)、胃肠癌、肾癌和肾细胞癌。在一些实施方式中，供体患有肿瘤。在一些实施方式中，肿瘤为液体肿瘤。在一些实施方式中，肿瘤为实体肿瘤。在一些实施方式中，供体患有血液系统恶性肿瘤。
在本公开的某些方面，免疫效应细胞(例如T细胞)可使用本领域技术人员已知的多种技术(例如FICOLL分离)自收集自受试者的血液单元获得。在一个优选方面，通过单采自受试者的循环血液获得细胞。单采产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他成核白细胞、红细胞和血小板。在一方面，通过单采收集的细胞可经洗涤以移除血浆级分，可选地将细胞置于适当缓冲液或培养基中以用于后续处理步骤。在一些实施方式中，细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。在一个替代实施方式中，洗涤溶液缺乏钙，可能缺乏镁或可能缺乏许多(若并非全部)二价阳离子。在一方面，通过裂解红细胞和例如通过经PERCOLL梯度离心或通过逆流离心洗脱耗尽单核细胞，自外周血淋巴细胞分离T细胞。
在一些实施方式中，T细胞自供体的全血或富含淋巴细胞的单采产物分离的PBL。在一些实施方式中，供体患有癌症。在一些实施方式中，癌症选自如下：黑色素瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、神经胶母细胞瘤(包括GBM)、胃肠癌、肾癌和肾细胞癌。在一些实施方式中，癌症选自如下：黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、神经胶母细胞瘤(包括GBM)、胃肠癌、肾癌和肾细胞癌。在一些实施方式中，供体患有肿瘤。在一些实施方式中，肿瘤为液体肿瘤。在一些实施方式中，肿瘤为实体肿瘤。在一些实施方式中，供体患有血液系统恶性肿瘤。在一些实施方式中，PBL通过使用正向或负向选择方法，即使用T细胞表型标记物(例如CD3+CD45+)移除PBL，或移除非T细胞表型细胞而留下PBL，自全血或富含淋巴细胞的单采产物分离。在其他实施方式中，PBL通过梯度离心分离。在自供体组织分离PBL后，PBL的起始第一扩增可根据本文所述的任何方法的起始第一扩增步骤，通过将适合数目的经分离PBL(在一些实施方式中，约1×107个PBL)接种于起始第一扩增培养物中来起始。
含有这些特征中的一些的称为过程3(在本文中又称为Gen 3)的示例性TIL过程描绘于图8(特别是例如图8B和/或图8C和/或图8D)中，本发明的此实施方式相对于Gen 2的一些优势描述于图1、图2、图8、图30和图31(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中。Gen 3的实施方式示于图1、图8和图30(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中。过程2A或Gen 2或Gen 2A也描述于美国专利公开第2018/0280436号中，其以全文引用的方式并入本文中。Gen 3过程也描述于国际专利公开WO 2020/096988中。
如本文所论述和大体上概述，TIL取自患者样本且在移植至患者体内之前，使用本文所述且称为Gen 3的TIL扩增过程扩增其数目。在一些实施方式中，TIL可以可选地如下文所论述经基因操作。在一些实施方式中，TIL可在扩增之前或之后经冷冻保存。解冻后，其也可经再刺激以在输注至患者体内之前增加其代谢。
在一些实施方式中，起始第一扩增(包括本文中称为预快速扩增(预REP)的过程，以及图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中显示为步骤B的过程)缩短到1至8天，快速第二扩增(包括在本文中称为快速扩增方案(REP)的过程，以及图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中显示为步骤D的过程)缩短到1至9天，如以下以及实施例和图示中详细论述。在一些实施方式中，起始第一扩增(包括本文中称为预快速扩增(预REP)的过程，以及图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中显示为步骤B的过程)缩短到1至8天，快速第二扩增(包括在本文中称为快速扩增方案(REP)的过程，以及图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中显示为步骤D的过程)缩短到1至8天，如以下和实施例和图示中详细论述。在一些实施方式中，起始第一扩增(包括本文中称为预快速扩增(预REP)的过程，以及图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中显示为步骤B的过程)缩短到1至7天，快速第二扩增(包括在本文中称为快速扩增方案(REP)的过程，以及图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中显示为步骤D的过程)缩短到1至9天，如以下以及实施例和图示中详细论述。在一些实施方式中，起始第一扩增(包括本文中称为预快速扩增(预REP)的过程，以及图8(特别是例如图1B和/或图8C)中显示为步骤B的过程)是1至7天，快速第二扩增(包括在本文中称为快速扩增方案(REP)的过程，以及图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中显示为步骤D的过程)是1至10天，如以下以及实施例和图示中详细论述。在一些实施方式中，起始第一扩增(例如在图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中描述为步骤B的扩增)缩短至8天，快速第二扩增(例如在图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中的步骤D中所描述的扩增)是7至9天。在一些实施方式中，起始第一扩增(例如在图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中描述为步骤B的扩增)是8天，快速第二扩增(例如在图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中的步骤D中所描述的扩增)是8至9天。在一些实施方式中，起始第一扩增(例如在图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中描述为步骤B的扩增)缩短至7天，快速第二扩增(例如在图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中的步骤D中所描述的扩增)是7至8天。在一些实施方式中，起始第一扩增(例如在图8(特别是例如图8B和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中描述为步骤B的扩增)缩短至8天，快速第二扩增(例如在图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中的步骤D中所描述的扩增)是8天。在一些实施方式中，起始第一扩增(例如在图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中描述为步骤B的扩增)是8天，快速第二扩增(例如在图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中的步骤D中所描述的扩增)是9天。在一些实施方式中，起始第一扩增(例如在图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中描述为步骤B的扩增)是8天，快速第二扩增(例如在图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中的步骤D中所描述的扩增)是10天。在一些实施方式中，起始第一扩增(例如在图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中描述为步骤B的扩增)是7天，快速第二扩增(例如在图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中的步骤D中所描述的扩增)是7至10天。在一些实施方式中，起始第一扩增(例如在图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中描述为步骤B的扩增)是7天，快速第二扩增(例如在图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中的步骤D中所描述的扩增)是8至10天。在一些实施方式中，起始第一扩增(例如在图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中描述为步骤B的扩增)是7天，快速第二扩增(例如在图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中的步骤D中所描述的扩增)是9至10天。在一些实施方式中，起始第一扩增(例如在图8(特别是例如图8B和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中描述为步骤B的扩增)缩短至7天，快速第二扩增(例如在图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中的步骤D中所描述的扩增)是7至9天。在一些实施方式中，起始第一扩增与快速第二扩增(例如在图8(特别是例如图1B和/或图8C)中描述为步骤B和步骤D的扩增)的组合是14-16天，如以下和实施例和图示中详细论述。特定地，认为本发明的某些实施方式包括起始第一扩增步骤，其中TIL通过在IL-2存在下暴露于抗CD3抗体(例如OKT-3)或在至少IL-2和抗CD3抗体(例如OKT-3)存在下暴露于抗原而活化。在某些实施方式中，在如上文所描述的起始第一扩增步骤中活化的TIL为第一TIL群，即，其为初代细胞群。
以下的“步骤”标识A、B、C等参考图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中的非限制性示例且参考本文所述的某些非限制性实施方式。以下和图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中的步骤次序为示例性的，本申请和本文公开的方法涵盖步骤的任何组合或次序，以及另外的步骤、步骤重复和/或步骤省略。
A.步骤A：获得患者肿瘤样本
通常而言，TIL最初获自患者肿瘤样本(“初代TIL”)或获自循环淋巴细胞，例如外周血淋巴细胞，包括具有TIL样特征的外周血淋巴细胞，接着将其扩增为较大群体以进行如本文中所描述的进一步操作，可选地经冷冻保存，可选地评估表型和作为TIL健康指标的代谢参数。
患者肿瘤样本可使用本领域中已知的方法获得，通常通过手术切除、穿刺活体组织切片或用于获得含有肿瘤与TIL细胞的混合物的样本的其他方式获得。通常而言，肿瘤样本可来自任何实体肿瘤，包括原发性肿瘤、侵袭性肿瘤或转移性肿瘤。肿瘤样本也可以是液体肿瘤，例如获自血液系统恶性肿瘤的肿瘤。实体肿瘤可以是任何癌症类型，包括但不限于乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肺癌、脑癌、肾癌、胃癌和皮肤癌(包括但不限于鳞状细胞癌、基底细胞癌和黑色素瘤)。在一些实施方式中，癌症选自宫颈癌、头颈癌(包含例如头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、神经胶母细胞瘤(GBM)、胃肠癌、卵巢癌、肉瘤、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌和非小细胞肺癌。在一些实施方式中，癌症是黑色素瘤。在一些实施方式中，适用的TIL获自恶性黑色素瘤肿瘤，因为报告指出这些肿瘤具有特别高的TIL含量。
收集后，可将肿瘤样本储存于含有抗生素组分的储存组合物中。在一些实施方式中，抗生素组分包含本文公开的任何浓度的：1)万古霉素；2)庆大霉素和万古霉素；或3)庆大霉素和克林霉素。在一些实施方式中，储存组合物是本文所述的低温储存组合物中的任一种。
获得后，肿瘤样本通常使用锐器分割破碎成1至约8mm3之间的碎块，其中约2-3mm3特别适用。TIL自这些碎片使用酶肿瘤消化物培养。此类肿瘤消化物可通过在酶培养基(例如罗斯威尔公园癌症研究所(RPMI)1640缓冲液、2mM谷氨酸、10mcg/mL庆大霉素、30个单位/mLDNA酶和1.0mg/mL胶原蛋白酶)中孵育，随后进行机械解离(例如使用组织解离器)来产生。肿瘤消化物可通过以下产生：将肿瘤置于酶培养基中且机械解离肿瘤约1分钟，随后在37℃下在5％ CO2下孵育30分钟，随后在前述条件下重复机械解离和孵育循环，直至仅存在小组织块。在此过程结束时，若细胞悬浮液含有大量红细胞或死细胞，则可使用FICOLL支化亲水性多糖进行密度梯度分离以移除该细胞。可使用本领域中已知的替代方法，例如美国专利申请公开第2012/0244133A1号中所描述的方法，该公开的公开内容以引用的方式并入本文中。任何前述方法均可用于本文所述的任何实施方式中扩增TIL的方法或治疗癌症的方法。
肿瘤解离酶混合物可包含一种以上解离(消化)酶，例如但不限于胶原蛋白酶(包括任何混合或类型的胶原蛋白酶)、AccutaseTM、AccumaxTM、玻尿酸酶、中性蛋白酶(分散酶)、胰凝乳蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、胰蛋白酶(trypsin)、酪蛋白酶、弹性蛋白酶、木瓜酶、XIV型蛋白酶(链蛋白酶)、DNA酶I(DNA酶)、胰蛋白酶抑制剂、任何其他解离或蛋白分解酶，以及它们的任何组合。
在一些实施方式中，解离酶自冻干酶复原。在一些实施方式中，冻干酶在一定量的无菌缓冲液(例如HBSS)中复原。
在一些情况下，胶原蛋白酶(例如无动物源1型胶原蛋白酶)在10mL无菌HBSS或另一缓冲液中复原。冻干的储备酶的浓度可以是每小瓶2892PZ U。在一些实施方式中，胶原蛋白酶在5mL至15mL缓冲液中复原。在一些实施方式中，在复原后，胶原蛋白酶储备液的范围为约100PZ U/mL-约400PZ U/mL，例如约100PZ U/mL-约400PZ U/mL、约100PZ U/mL-约350PZ U/mL、约100PZ U/mL-约300PZ U/mL、约150PZ U/mL-约400PZ U/mL、约100PZ U/mL、约150PZ U/mL、约200PZ U/mL,约210PZ U/mL、约220PZ U/mL、约230PZ U/mL、约240PZ U/mL、约250PZ U/mL、约260PZ U/mL、约270PZ U/mL、约280PZ U/mL、约289.2PZ U/mL、约300PZU/mL、约350PZ U/mL或约400PZ U/mL。
在一些实施方式中，中性蛋白酶在1mL无菌HBSS或另一缓冲液中复原。冻干的储备酶的浓度可以是每小瓶175DMC U。冻干的储备酶的浓度可以是175DMC/mL。在一些实施方式中，在复原后，中性蛋白酶储备液的范围为约100DMC/mL-约400DMC/mL，例如约100DMC/mL-约400DMC/mL、约100DMC/mL-约350DMC/mL、约100DMC/mL-约300DMC/mL、约150DMC/mL-约400DMC/mL、约100DMC/mL、约110DMC/mL、约120DMC/mL、约130DMC/mL、约140DMC/mL、约150DMC/mL、约160DMC/mL、约170DMC/mL、约175DMC/mL、约180DMC/mL、约190DMC/mL、约200DMC/mL、约250DMC/mL、约300DMC/mL、约350DMC/mL或约400DMC/mL。
在一些实施方式中，DNA酶I在1mL无菌HBSS或另一缓冲液中复原。冻干的储备酶的浓度为每小瓶4KU。在一些实施方式中，在复原后，DNA酶I储备液的范围为约1KU/ml-10KU/mL，例如约1KU/mL、约2KU/mL、约3KU/ml、约4KU/mL、约5KU/mL、约6KU/mL、约7KU/mL、约8KU/mL、约9KU/mL或约10KU/mL。
在一些实施方式中，酶储备液会发生变化，因此验证冻干储备液的浓度并相应地修改添加至消化混合物中酶的最终量。
在一些实施方式中，酶混合物包含在约4.7mL无菌HBSS中的约10.2μl中性蛋白酶(0.36DMC U/mL)、21.3μl胶原蛋白酶(1.2PZ/mL)和250μlDNA酶I(200U/mL)。
如上文所指出，在一些实施方式中，TIL来源于实体肿瘤。在一些实施方式中，实体肿瘤未经破碎。在一些实施方式中，实体肿瘤未经破碎且以完整肿瘤形式进行酶消化。在一些实施方式中，肿瘤在包含胶原蛋白酶、DNA酶和玻尿酸酶的酶混合物中消化。在一些实施方式中，肿瘤在包含胶原蛋白酶、DNA酶和玻尿酸酶的酶混合物中消化1-2小时。在一些实施方式中，肿瘤在37℃、5％ CO2下在包含胶原蛋白酶、DNA酶和玻尿酸酶的酶混合物中消化1-2小时。在一些实施方式中，肿瘤在37℃、5％ CO2下且在旋转下在包含胶原蛋白酶、DNA酶和玻尿酸酶的酶混合物中消化1-2小时。在一些实施方式中，肿瘤在恒定旋转下消化过夜。在一些实施方式中，肿瘤在37℃、5％ CO2下且在恒定旋转下消化过夜。在一些实施方式中，将整个肿瘤与酶组合以形成肿瘤消化反应混合物。
在一些实施方式中，在无菌缓冲液中用冻干酶复原肿瘤。在一些实施方式中，缓冲液为无菌HBSS。
在一些实施方式中，酶混合物包含胶原蛋白酶。在一些实施方式中，胶原蛋白酶为胶原蛋白酶IV。在一些实施方式中，胶原蛋白酶的工作储备液为100mg/mL 10×工作储备液。
在一些实施方式中，酶混合物包含DNA酶。在一些实施方式中，DNA酶的工作储备液为10,000IU/mL 10×工作储备液。
在一些实施方式中，酶混合物包含玻尿酸酶。在一些实施方式中，玻尿酸酶的工作储备液为10mg/mL 10×工作储备液。
在一些实施方式中，酶混合物包含10mg/mL胶原蛋白酶、1000IU/mLDNA酶和1mg/mL玻尿酸酶。
在一些实施方式中，酶混合物包含10mg/mL胶原蛋白酶、500IU/mLDNA酶和1mg/mL玻尿酸酶。
通常而言，获自肿瘤的细胞悬浮液称为“初代细胞群”或“新鲜获得的”或“新鲜分离的”细胞群。在某些实施方式中，使新鲜获得的TIL细胞群暴露于包含抗原呈递细胞、IL-12和OKT-3的细胞培养基。
在一些实施方式中，破碎包括物理破碎，包括例如分割以及消化。在一些实施方式中，破碎为物理破碎。在一些实施方式中，破碎为分割。在一些实施方式中，破碎通过消化实现。在一些实施方式中，TIL最初可自获自患者的酶肿瘤消化物和肿瘤碎片培养。在一些实施方式中，TIL最初可自获自患者的酶肿瘤消化物和肿瘤碎片培养。
在一些实施方式中，当肿瘤为实体肿瘤时，在例如步骤A(如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中所提供)中获得肿瘤样本之后，对肿瘤进行物理破碎。在一些实施方式中，破碎发生在冷冻保存之前。在一些实施方式中，破碎发生在冷冻保存之后。在一些实施方式中，破碎在获得肿瘤之后且在不进行任何冷冻保存的情况下发生。在一些实施方式中，破碎步骤是体外或离体过程。在一些实施方式中，将肿瘤破碎，将10、20、30、40或更多个碎片或碎块置于各容器中进行起始第一扩增。在一些实施方式中，将肿瘤破碎，将30或40个碎片或碎块置于各容器中进行起始第一扩增。在一些实施方式中，将肿瘤破碎，将40个碎片或碎块置于各容器中进行起始第一扩增。在一些实施方式中，多个碎片包括约4至约50个碎片，各碎片的体积为约27mm3。在一些实施方式中，多个碎片包括约30至约60个碎片，其总体积为约1300mm3至约1500mm3。在一些实施方式中，多个碎片包括约50个碎片，其总体积为约1350mm3。在一些实施方式中，多个碎片包括约50个碎片，其总质量为约1克至约1.5克。在一些实施方式中，多个碎片包括约4个碎片。
在一些实施方式中，TIL获自肿瘤碎片。在一些实施方式中，肿瘤碎片通过锐器分割获得。在一些实施方式中，肿瘤碎片在约1mm3与10mm3之间。在一些实施方式中，肿瘤碎片在约1mm3与8mm3之间。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约1mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约2mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约3mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约4mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约5mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约6mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约7mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约8mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约9mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约10mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为1-4mm×1-4mm×1-4mm。在一些实施方式中，肿瘤碎片为1mm×1mm×1mm。在一些实施方式中，肿瘤碎片为2mm×2mm×2mm。在一些实施方式中，肿瘤碎片为3mm×3mm×3mm。在一些实施方式中，肿瘤碎片为4mm×4mm×4mm。
在一些实施方式中，肿瘤经破碎以使各块上出血、坏死和/或脂肪组织的量减至最小。在一些实施方式中，肿瘤经破碎以使各块上出血组织的量减至最小。在一些实施方式中，肿瘤经破碎以使各块上坏死组织的量减至最小。在一些实施方式中，肿瘤经破碎以使各块上脂肪组织的量减至最小。在某些实施方式中，肿瘤破碎步骤是体外或离体方法。
在一些实施方式中，进行肿瘤破碎以维持肿瘤内部结构。在一些实施方式中，肿瘤破碎在不使用解剖刀进行锯切动作的情况下进行。在一些实施方式中，TIL获自肿瘤消化物。在一些实施方式中，通过在酶培养基(例如但不限于RPMI 1640、2mM GlutaMAX、10mg/mL庆大霉素、30U/mL DNA酶和1.0mg/mL胶原蛋白酶)中孵育，随后进行机械解离(GentleMACS，加利福尼亚州奥本的Miltenyi Biotec)来产生肿瘤消化物。在将肿瘤置于酶培养基中之后，可以机械方式将肿瘤解离约1分钟。接着，可将溶液在37℃下在5％CO2中孵育30分钟，接着再次机械破坏约1分钟。在37℃下在5％CO2中再孵育30分钟之后，可将肿瘤第三次机械破坏约1分钟。在一些实施方式中，在第三次机械破坏后，若仍存在大块组织，则对样本施加1或2次另外的机械解离，不论是否再在37℃下在5％ CO2中孵育30分钟。在一些实施方式中，在最终孵育结束时，若细胞悬浮液含有大量红细胞或死细胞，则可进行Ficoll密度梯度分离以移除该细胞。
在一些实施方式中，将起始第一扩增步骤之前的细胞悬浮液称为“初代细胞群”或“新鲜获得的”或“新鲜分离的”细胞群。
在一些实施方式中，细胞可以可选地在样本分离之后(例如在获得肿瘤样本后和/或在自肿瘤样本获得细胞悬浮液后)冷冻，在进入步骤B中所描述的扩增之前冷冻储存，步骤B进一步详细描述于下文且于图8(特别是例如图8B)中示例。
在一些实施方式中，在将肿瘤样本解离或破碎成肿瘤碎片之前，将其在包含抗生素组分的洗涤缓冲液中洗涤至少一次。本文所述的任何肿瘤洗涤缓冲液均可用于洗涤肿瘤样本。在一些实施方式中，抗生素组分包含本文公开的任何浓度的：1)万古霉素；2)庆大霉素和万古霉素；或3)庆大霉素和克林霉素。在示例性实施方式中，洗涤缓冲液包含万古霉素。在示例性实施方式中，万古霉素的浓度是50μg/mL-600μg/mL。在示例性实施方式中，万古霉素的浓度是100μg/mL。在示例性实施方式中，将肿瘤样本在洗涤缓冲液中洗涤3次以上。
在一些实施方式中，在冷冻保存或第一扩增之前，将肿瘤碎片在包含抗生素组分的洗涤缓冲液中洗涤至少一次。本文所述的任何肿瘤洗涤缓冲液均可用于洗涤肿瘤碎片。在一些实施方式中，抗生素组分包含本文公开的任何浓度的：1)万古霉素；2)庆大霉素和万古霉素；或3)庆大霉素和克林霉素。在示例性实施方式中，洗涤缓冲液包含万古霉素。在示例性实施方式中，万古霉素的浓度为50μg/mL-600μg/mL。在示例性实施方式中，万古霉素的浓度是100μg/mL。在示例性实施方式中，将肿瘤样本在洗涤缓冲液中洗涤3次以上。
1.粗针活体组织切片/小型活体组织切片衍生的TIL
在一些实施方式中，TIL最初获自通过粗针活体组织切片或类似程序获得的患者肿瘤样本(“初代TIL”)接着扩增为较大群体以进行如本文所述的进一步操作，可选地经冷冻保存且可选地评估表型和代谢参数。
在一些实施方式中，患者肿瘤样本可使用本领域中已知的方法获得，通常通过小型活体组织切片、粗针活体组织切片、穿刺活体组织切片或用于获得含有肿瘤与TIL细胞的混合物的样本的其他方式获得。通常而言，肿瘤样本可来自任何实体肿瘤，包括原发性肿瘤、侵袭性肿瘤或转移性肿瘤。肿瘤样本也可以是液体肿瘤，例如获自血液系统恶性肿瘤的肿瘤。在一些实施方式中，样本可来自多个小肿瘤样本或活体组织切片检查样本。在一些实施方式中，样本可包括来自同一患者的单一肿瘤的多个肿瘤样本。在一些实施方式中，样本可包括来自同一患者的一个、两个、三个或四个肿瘤的多个肿瘤样本。在一些实施方式中，样本可包括来自同一患者的多个肿瘤的多个肿瘤样本。实体肿瘤可以是肺癌和/或非小细胞肺癌(NSCLC)。
通常而言，获自肿瘤核心或碎片的细胞悬浮液称为“初代细胞群”或“新鲜获得的”或“新鲜分离的”细胞群。在某些实施方式中，使新鲜获得的TIL细胞群暴露于包含抗原呈递细胞、IL-2和OKT-3的细胞培养基。
在一些实施方式中，若肿瘤为转移性肿瘤且在过去已有效治疗/移除原发性病灶，则可能需要移除一个转移性病灶。在一些实施方式中，若可用，微创方法是移除皮肤病灶或颈部或腋窝区域上的淋巴结。在一些实施方式中，移除皮肤病灶或移除其小型活体组织切片。在一些实施方式中，移除淋巴结或其小型活体组织切片。在一些实施方式中，肿瘤为黑色素瘤。在一些实施方式中，黑色素瘤的小型活体组织切片包括黑痣或其一部分。
在一些实施方式中，小型活体组织切片为穿孔活体组织切片。在一些实施方式中，穿孔活体组织切片以圆形刀片压入皮肤中获得。在一些实施方式中，穿孔活体组织切片以圆形刀片压入可疑黑痣周围的皮肤中获得。在一些实施方式中，穿孔活体组织切片以圆形刀片压入皮肤中获得，并且移除一片圆形皮肤。在一些实施方式中，小型活体组织切片为穿孔活体组织切片且移除圆形部分的肿瘤。
在一些实施方式中，小型活体组织切片为切除式活体组织切片。在一些实施方式中，小型活体组织切片为切除式活体组织切片且移除整个黑痣或生长物。在一些实施方式中，小型活体组织切片为切除式活体组织切片且连同小边缘的正常外观皮肤移除整个黑痣或生长物。
在一些实施方式中，小型活体组织切片为切开式活体组织切片。在一些实施方式中，小型活体组织切片为切开式活体组织切片且仅采集最不规则部分的黑痣或生长物。在一些实施方式中，小型活体组织切片为切开式活体组织切片，该切开式活体组织切片在其他技术无法完成时使用，例如当可疑黑痣非常大时使用。
在一些实施方式中，小型活体组织切片为肺活体组织切片。在一些实施方式中，小型活体组织切片通过支气管镜检获得。通常而言，支气管镜检在患者麻醉下使小工具通过鼻或口、下至咽喉且进入支气管通道，其中小工具是用于移除一些组织。在一些实施方式中，在无法通过支气管镜检达到肿瘤或生长物的情况下，可以采用经胸穿刺活体组织切片。通常而言，对于经胸穿刺活体组织切片，患者也处于麻醉下且将针穿过皮肤直接插入可疑位点以移除小样本的组织。在一些实施方式中，经胸穿刺活体组织切片可能需要介入性放射线学(例如使用X射线或CT扫描引导针头)。在一些实施方式中，小型活体组织切片通过穿刺活体组织切片获得。在一些实施方式中，小型活体组织切片经内视镜超声波获得(例如内视镜附灯且经口置于食道中)。在一些实施方式中，小型活体组织切片经手术获得。
在一些实施方式中，小型活体组织切片为头颈活体组织切片。在一些实施方式中，小型活体组织切片为切开式活体组织切片。在一些实施方式中，小型活体组织切片为切开式活体组织切片，其中自外观异常区域切除一小块组织。在一些实施方式中，若容易接近异常区，则无需住院即可采集样本。在一些实施方式中，若肿瘤在口腔或咽喉内部较深处，则活体组织切片可能需要在手术室全身麻醉进行。在一些实施方式中，小型活体组织切片为切除式活体组织切片。在一些实施方式中，小型活体组织切片为切除式活体组织切片，其中移除整个区域。在一些实施方式中，小型活体组织切片为细针抽吸(FNA)。在一些实施方式中，小型活体组织切片为细针抽吸(FNA)，其中使用附接至注射器的非常细的针头自肿瘤或肿块抽取(抽吸)细胞。在一些实施方式中，小型活体组织切片为穿孔活体组织切片。在一些实施方式中，小型活体组织切片为穿孔活体组织切片，其中使用穿孔镊移除一块可疑区域。
在一些实施方式中，小型活体组织切片为子宫颈活体组织切片。在一些实施方式中，小型活体组织切片通过阴道镜获得。通常，阴道镜方法采用附接至双目放大镜的附灯放大仪器(阴道镜)，接着用于对一小部分的子宫颈进行活体组织切片检查。在一些实施方式中，小型活体组织切片为子宫颈锥状切除/锥状活体组织切片。在一些实施方式中，小型活体组织切片为子宫颈锥状切除/锥状活体组织切片，其中可能需要门诊手术以自子宫颈移除较大块组织。在一些实施方式中，锥状活体组织切片除了有助于确诊之外，锥状活体组织切片也可以用作初始治疗。
术语“实体肿瘤”指通常不含囊肿或液体区域的异常组织团块。实体肿瘤可以是良性或恶性的。术语“实体肿瘤癌症”指恶性、赘生性或癌性实体肿瘤。实体肿瘤癌症包括肺癌。在一些实施方式中，癌症为黑色素瘤。在一些实施方式中，癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。实体肿瘤的组织结构包含相互依赖的组织隔室，包括实质(癌细胞)和有癌细胞分散其中且可提供支持性微环境的支持性基质细胞。
在一些实施方式中，来自肿瘤的样本以细针抽吸物(FNA)、粗针活体组织切片、小型活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)形式获得。在一些实施方式中，先将样本置于G-REX-10中。在一些实施方式中，当有1个或2个粗针活体组织切片和/或小型活体组织切片样本时，先将样本置于G-REX-10中。在一些实施方式中，当有3个、4个、5个、6个、8个、9个或10个或更多个粗针活体组织切片和/或小型活体组织切片样本时，先将样本置于G-REX-100中。在一些实施方式中，当有3个、4个、5个、6个、8个、9个或10个或更多个粗针活体组织切片和/或小型活体组织切片样本时，先将样本置于G-REX-500中。
FNA可获自皮肤肿瘤，包括例如黑色素瘤。在一些实施方式中，FNA获自皮肤肿瘤，例如来自患有转移性黑色素瘤的患者的皮肤肿瘤。在一些情况下，黑色素瘤患者先前已经受手术治疗。
FNA可获自肺肿瘤，包括例如NSCLC。在一些实施方式中，FNA获自肺肿瘤，例如来自非小细胞肺癌(NSCLC)患者的肺肿瘤。在一些情况下，NSCLC患者先前已经受手术治疗。
本文所述的TIL可获自FNA样本。在一些情况下，FNA样本使用在18号针头至25号针头范围中的细口径针头自患者获得或分离。细口径针头可以是18号、19号、20号、21号、22号、23号、24号或25号。在一些实施方式中，来自患者的FNA样本可含有至少400,000个TIL，例如400,000个TIL、450,000个TIL、500,000个TIL、550,000个TIL、600,000个TIL、650,000个TIL、700,000个TIL、750,000个TIL、800,000个TIL、850,000个TIL、900,000个TIL、950,000个TIL或更多。
在一些情况下，本文所述的TIL获自粗针活体组织切片样本。在一些情况下，粗针活体组织切片样本使用在11号针头至16号针头范围中的外科或医用针头自患者获得或分离。针头可以是11号、12号、13号、14号、15号或16号。在一些实施方式中，来自患者的粗针活体组织切片样本可含有至少400,000个TIL，例如400,000个TIL、450,000个TIL、500,000个TIL、550,000个TIL、600,000个TIL、650,000个TIL、700,000个TIL、750,000个TIL、800,000个TIL、850,000个TIL、900,000个TIL、950,000个TIL或更多。
通常而言，经收集的细胞悬浮液被称为“初代细胞群”或“新鲜收集的”细胞群。
在一些实施方式中，TIL并非获自肿瘤消化物。在一些实施方式中，实体肿瘤核心未经破碎。
在一些实施方式中，TIL获自肿瘤消化物。在一些实施方式中，通过在酶培养基(例如但不限于RPMI 1640、2mM GlutaMAX、10mg/mL庆大霉素、30U/mL DNA酶和1.0mg/mL胶原蛋白酶)中孵育，随后进行机械解离(GentleMACS，加利福尼亚州奥本的Miltenyi Biotec)来产生肿瘤消化物。在将肿瘤置于酶培养基中之后，可以机械方式将肿瘤解离约1分钟。接着，可将溶液在37℃下在5％ CO2中孵育30分钟，接着再次机械破坏约1分钟。在37℃下在5％CO2中再孵育30分钟之后，可将肿瘤第三次机械破坏约1分钟。在一些实施方式中，在第三次机械破坏后，若仍存在大块组织，则向样本再施加1或2次另外的机械解离，不论是否再在37℃下在5％ CO2中孵育30分钟。在一些实施方式中，在最终孵育结束时，若细胞悬浮液含有大量红细胞或死细胞，则可进行Ficoll密度梯度分离以移除该细胞。
在一些实施方式中，获得第一TIL群包括多病灶取样方法。
肿瘤解离酶混合物可包含一种以上解离(消化)酶，例如但不限于胶原蛋白酶(包括任何混合或类型的胶原蛋白酶)、AccutaseTM、AccumaxTM、玻尿酸酶、中性蛋白酶(分散酶)、胰凝乳蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、酪蛋白酶、弹性蛋白酶、木瓜酶、XIV型蛋白酶(链蛋白酶)、DNA酶I(DNA酶)、胰蛋白酶抑制剂、任何其他解离或蛋白分解酶，以及它们的任何组合。
在一些实施方式中，解离酶自冻干酶复原。在一些实施方式中，冻干酶在一定量的无菌缓冲液(例如HBSS)中复原。
在一些实施方式中，解离酶自冻干酶复原。在一些实施方式中，冻干酶在一定量的无菌缓冲液(例如汉克氏平衡盐溶液(HBSS))中复原。
在一些情况下，胶原蛋白酶(例如无动物源1型胶原蛋白酶)在10mL无菌HBSS或另一缓冲液中复原。冻干的储备酶的浓度可以是每小瓶2892PZ U。在一些实施方式中，胶原蛋白酶在5mL至15mL缓冲液中复原。在一些实施方式中，在复原后，胶原蛋白酶储备液的范围为约100PZ U/mL-约400PZ U/mL，例如约100PZ U/mL-约400PZ U/mL、约100PZ U/mL-约350PZ U/mL、约100PZ U/mL-约300PZ U/mL、约150PZ U/mL-约400PZ U/mL、约100PZ U/mL、约150PZ U/mL,约200PZ U/mL、约210PZ U/mL、约220PZ U/mL、约230PZ U/mL、约240PZ U/mL、约250PZ U/mL、约260PZ U/mL、约270PZ U/mL、约280PZ U/mL、约289.2PZ U/mL、约300PZU/mL、约350PZ U/mL或约400PZ U/mL。
在一些实施方式中，中性蛋白酶在1mL无菌HBSS或另一缓冲液中复原。冻干的储备酶的浓度可以是每小瓶175DMC U。在一些实施方式中，在复原后，中性蛋白酶储备液的范围为约100DMC/mL-约400DMC/mL，例如约100DMC/mL-约400DMC/mL、约100DMC/mL-约350DMC/mL、约100DMC/mL-约300DMC/mL、约150DMC/mL-约400DMC/mL、约100DMC/mL、约110DMC/mL、约120DMC/mL、约130DMC/mL、约140DMC/mL、约150DMC/mL、约160DMC/mL、约170DMC/mL、约175DMC/mL、约180DMC/mL、约190DMC/mL、约200DMC/mL、约250DMC/mL、约300DMC/mL、约350DMC/mL或约400DMC/mL。
在一些实施方式中，DNA酶I在1mL无菌HBSS或另一缓冲液中复原。冻干的储备酶的浓度为每小瓶4KU。在一些实施方式中，在复原后，DNA酶I储备液的范围为约1KU/mL至10KU/mL，例如约1KU/mL、约2KU/mL、约3KU/mL、约4KU/mL、约5KU/mL、约6KU/mL、约7KU/mL、约8KU/mL、约9KU/mL或约10KU/mL。
在一些实施方式中，酶储备液可发生变化，因此验证冻干储备液的浓度并相应地修改添加至消化混合物中酶的最终量。
在一些实施方式中，酶混合物包含在约4.7mL无菌HBSS中的约10.2ul中性蛋白酶(0.36DMC U/mL)、21.3ul胶原蛋白酶(1.2PZ/mL)和250ulDNA酶I(200U/mL)。
2.胸腔积液T细胞和TIL
在一些实施方式中，样本是胸膜液样本。在一些实施方式中，用于根据本文所述的过程扩增的T细胞或TIL的来源为胸膜液样本。在一些实施方式中，样本为来源于胸腔积液的样本。在一些实施方式中，用于根据本文所述的过程扩增的T细胞或TIL的来源为来源于胸腔积液的样本。参见例如美国专利公开US2014/0295426中所描述的方法，其出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方式中，可以采用疑似含有和/或含有TIL的任何胸膜液或胸腔积液。此类样本可来源于原发性或转移性肺癌，例如NSCLC或SCLC。在一些实施方式中，样本可以是来源于另一器官(例如乳房、卵巢、结肠或前列腺)的继发转移性癌细胞。在一些实施方式中，用于本文所述的扩增方法中的样本为胸膜渗出物。在一些实施方式中，用于本文所述的扩增方法中的样本为胸膜溢出物。其他生物样本可包括含有TIL的其他浆液，包括例如来自腹部的腹水液或胰囊肿液。腹水液和胸膜液涉及非常类似的化学系统；腹部和肺两者在相同的恶性肿瘤事件中于胸腔和腹腔中皆具有间皮细胞系和流体形式，在一些实施方式中，此类流体含有TIL。在本公开示例胸膜液的一些实施方式中，可以使用含有TIL的腹水或其他囊肿液进行相同的方法以得到类似结果。
在一些实施方式中，胸膜液呈未经处理的形式，即直接自患者移除。在一些实施方式中，在接触步骤之前，将未经处理的胸膜液置于标准血液收集管(例如EDTA或肝素管)中。在一些实施方式中，在接触步骤之前，将未经处理的胸膜液置于标准管(Veridex)中。在一些实施方式中，在自患者收集之后立即将样本置于CellSave管中，以避免活TIL的数目减少。若保留在未经处理的胸膜液中，则即使在4℃下，活TIL的数目可能在24小时内显著降低。在一些实施方式中，样本在自患者移除之后1小时、5小时、10小时、15小时或至多24小时内置于适当收集管中。在一些实施方式中，样本在4℃下自患者移除之后1小时、5小时、10小时、15小时或至多24小时内置于适当收集管中。
在一些实施方式中，可以稀释来自所选受试者的胸膜液样本。在一些实施方式中，稀释度为1:10胸膜液比稀释剂。在其他实施方式中，稀释度为1:9胸膜液比稀释剂。在其他实施方式中，稀释度为1:8胸膜液比稀释剂。在其他实施方式中，稀释度为1:5胸膜液比稀释剂。在其他实施方式中，稀释度为1:2胸膜液比稀释剂。在其他实施方式中，稀释度为1:1胸膜液比稀释剂。在一些实施方式中，稀释剂包括盐水、磷酸盐缓冲盐水、另一缓冲液或生理学上可接受的稀释剂。在一些实施方式中，样本在自患者收集和稀释之后立即置于CellSave管中，以避免活TIL减少，若保留在未经处理的胸膜液中，则即使在4℃下，活TIL可能在24至48小时内显著减少。在一些实施方式中，胸膜液样本在自患者移除且稀释之后1小时、5小时、10小时、15小时、24小时、36小时、至多48小时内置于适当收集管中。在一些实施方式中，胸膜液样本在自患者移除且在4℃下稀释之后1小时、5小时、10小时、15小时、24小时、36小时、至多48小时内置于适当收集管中。
在另外其他实施方式中，在进一步的处理步骤之前，通过常规手段浓缩胸膜液样本。在一些实施方式中，在胸膜液必须冷冻保存以便运送至进行该方法的实验室或用于后续分析(例如在收集后24至48小时之后)的情形下，优选对胸膜液进行预处理。在一些实施方式中，通过在将胸膜液样本自受试者中取出后将其离心并将离心液或沉淀物再悬浮于缓冲液中来制备胸膜液样本。在一些实施方式中，对胸膜液样本进行多次离心和再悬浮，随后将其冷冻保存以用于运输或以后的分析和/或处理。
在一些实施方式中，在进一步的处理步骤之前，通过使用过滤方法浓缩胸膜液样本。在一些实施方式中，在接触步骤中使用的胸膜液样本通过将流体通过含有已知且基本均匀的孔径的过滤器过滤而制备，该孔径允许胸膜液通过膜但保留肿瘤细胞。在一些实施方式中，膜中各孔的直径可以是至少4μM。在其他实施方式中，孔径可以是5μM以上，在其他实施方式中，可以是6、7、8、9或10μM中的任一者。过滤之后，可将被膜保留的细胞(包括TIL)自膜上冲出至合适的生理学上可接受的缓冲液中。然后可以将以此方式浓缩的细胞(包括TIL)用于该方法的接触步骤中。
在一些实施方式中，使胸膜液样本(包括例如未经处理的胸膜液)、经稀释的胸膜液或再悬浮的细胞沉淀物与裂解试剂接触，该裂解试剂是差异性地裂解样本中存在的无核红细胞。在一些实施方式中，在胸膜液含有大量RBC的情形下，此步骤在进一步的处理步骤之前进行。合适的裂解试剂包括单一裂解试剂、或裂解试剂和淬灭试剂，或裂解试剂、淬灭试剂和固定试剂。合适的裂解系统为可商购的，包括BD Pharm LyseTM系统(BectonDickenson)。其他裂解系统包括VersalyseTM系统、FACSlyseTM系统(Becton Dickenson)、ImmunoprepTM系统或Erythrolyse II系统(Beckman Coulter,Inc.)或氯化铵系统。在一些实施方式中，裂解试剂可随主要需求而变化，主要需求为红细胞的有效裂解和TIL的保持和胸膜液中TIL的表型特性。除采用单一试剂进行裂解的外，可用于本文所述的方法的裂解系统可包括第二试剂，例如在该方法的剩余步骤期间淬灭或延迟裂解试剂的作用的第二试剂，例如StabilyseTM试剂(Beckman Coulter,Inc.)。取决于裂解试剂的选择或该方法的优选实施，也可采用常规固定试剂。
在一些实施方式中，在约-140℃的温度下冷冻保存如上文所描述的未经处理、稀释或多次离心或处理的胸膜液样本，随后如本文提供了进行进一步处理和/或扩增。
3.扩增来自外周血的外周血淋巴细胞(PBL)的方法
PBL方法1.在本发明的一些实施方式中，PBL使用本文所述的方法扩增。在本发明的一些实施方式中，方法包括获得来自全血的PBMC样本。在一些实施方式中，方法包括通过使用非CD19+级分的负向选择以自PBMC中分离纯T细胞来富集T细胞。在一些实施方式中，方法包括通过使用非CD19+级分的基于磁珠的负向选择以自PBMC中分离纯T细胞来富集T细胞。
在本发明的一些实施方式中，PBL方法1如下进行：在第0天，将冷冻保存的PBMC样本解冻且计算PBMC的数目。使用人泛T细胞分离试剂盒与LS柱(Miltenyi Biotec)分离T细胞。
PBL方法2.在本发明的一些实施方式中，PBL使用PBL方法2扩增，方法包括获得来自全血的PBMC样本。通过在37℃下孵育PBMC至少三小时，接着分离非贴壁细胞来富集来自PBMC的T细胞。
在本发明的一些实施方式中，PBL方法2如下进行：在第0天，将经冷冻保存的PMBC样本解冻，将PBMC细胞以每孔6百万个细胞接种于CM-2培养基中的6孔板中，在37℃下孵育3小时。3小时后，移除非贴壁细胞，即PBL，计算其数目。
PBL方法3.在本发明的一些实施方式中，PBL使用PBL方法3扩增，方法包括获得来自外周血的PBMC样本。B细胞使用CD19+选择分离，T细胞使用负向选择PBMC样本的非CD19+级分来选择。
在本发明的一些实施方式中，PBL方法3如下进行：在第0天，将来源于外周血的冷冻保存的PBMC解冻，计算其数目。使用人CD19多分选试剂盒(Miltenyi Biotec)分选CD19+B细胞。在非CD19+细胞级分中，使用人泛T细胞分离试剂盒和LS柱(Miltenyi Biotec)纯化T细胞。
在一些实施方式中，PBMC自全血样本分离。在一些实施方式中，使用PBMC样本作为扩增PBL的起始材料。在一些实施方式中，样本在扩增过程之前经冷冻保存。在另一实施方式中，使用新鲜样本作为扩增PBL的起始材料。在本发明的一些实施方式中，使用本领域中已知的方法自PBMC分离T细胞。在一些实施方式中，使用人泛T细胞分离试剂盒和LS柱分离T细胞。在本发明的一些实施方式中，使用本领域中已知的抗体选择方法(例如CD19负向选择)自PBMC分离T细胞。
在本发明的一些实施方式中，PBMC样本在有效鉴别非贴壁细胞的所需温度下孵育一段时间。在本发明的一些实施方式中，孵育时间为约3小时。在本发明的一些实施方式中，温度为约37℃。接着，使用上述过程扩增非贴壁细胞。
在一些实施方式中，PBMC样本来自可选地已经用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行预治疗的受试者或患者。在一些实施方式中，肿瘤样本来自已经用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行预治疗的受试者或患者。在一些实施方式中，PBMC样本来自已经用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行预治疗的受试者或患者，其已进行治疗至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月或1年或更长时间。在另一实施方式中，PBMC来源于当前进行ITK抑制剂方案(例如依鲁替尼)的患者。
在一些实施方式中，PBMC样本来自已用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行预治疗且难以用激酶抑制剂或ITK抑制剂(例如依鲁替尼)治疗的受试者或患者。
在一些实施方式中，PBMC样本来自已经用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行预治疗但不再进行激酶抑制剂或ITK抑制剂治疗的受试者或患者。在一些实施方式中，PBMC样本来自已经用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行预治疗但不再进行激酶抑制剂或ITK抑制剂治疗且尚未进行治疗达至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月或至少1年或更长时间的受试者或患者。在另一个实施方式中，PBMC来源于先前暴露于ITK抑制剂但在至少3个月、至少6个月、至少9个月或至少1年内未经治疗的患者。
在本发明的一些实施方式中，在第0天，针对CD19+选择细胞且据此分选。在本发明的一些实施方式中，使用抗体结合珠子进行选择。在本发明的一些实施方式中，在第0天自PBMC分离纯T细胞。
在本发明的一些实施方式中，对于未经依鲁替尼或其他ITK抑制剂预治疗的患者，10-15mL白膜层将产生约5×109个PBMC，该PBMC又将产生约5.5×107个PBL。
在本发明的一些实施方式中，对于经依鲁替尼或其他ITK抑制剂预治疗的患者，扩增过程将产生约20×109个PBL。在本发明的一些实施方式中，40.3×106个PBMC将产生约4.7×105个PBL。
在任何前述实施方式中，PBMC可自全血样本，通过单采获得，来源于白膜层，或自本领域中已知的用于获得PBMC的任何其他方法获得。
在一些实施方式中，PBL使用美国专利申请公开第US2020/0347350 A1号中所描述的方法制备，该公开的公开内容以引用的方式并入本文中。
4.扩增来自来源于骨髓的PBMC的骨髓浸润淋巴细胞(MIL)的方法
MIL方法3.在本发明的一些实施方式中，方法包括获得来自骨髓的PBMC。在第0天，针对CD3+/CD33+/CD20+/CD14+选择PBMC，分选，将非CD3+/CD33+/CD20+/CD14+细胞级分进行超声处理，将一部分经超声处理的细胞级分添加回所选细胞级分中。
在本发明的一些实施方式中，MIL方法3如下进行：在第0天，将冷冻保存的PBMC样本解冻，对PBMC进行计数。将细胞用CD3、CD33、CD20和CD14抗体染色，使用S3e细胞分选器(Bio-Rad)分选。将细胞分选成两种级分：免疫细胞级分(或MIL级分)(CD3+CD33+CD20+CD14+)和AML胚细胞级分(非CD3+CD33+CD20+CD14+)。
在本发明的一些实施方式中，PBMC自骨髓获得。在一些实施方式中，PBMC通过单采、抽吸、穿刺活体组织切片或本领域中已知的其他类似方式，自骨髓获得。在一些实施方式中，PBMC是新鲜的。在其他实施方式中，PBMC经冷冻保存。
在本发明的一些实施方式中，MIL自10-50mL骨髓抽吸物扩增。在本发明的一些实施方式中，自患者获得10mL骨髓抽吸物。在另一实施方式中，自患者获得20mL骨髓抽吸物。在另一实施方式中，自患者获得30mL骨髓抽吸物。在另一实施方式中，自患者获得40mL骨髓抽吸物。在另一实施方式中，自患者获得50mL骨髓抽吸物。
在本发明的一些实施方式中，自约10-50mL骨髓抽吸物产生的PBMC的数目为约5×107至约10×107个PBMC。在另一实施方式中，产生的PMBC的数目为约7×107个PBMC。
在本发明的一些实施方式中，约5×107至约10×107个PBMC产生约0.5×106至约1.5×106个MIL。在本发明的一些实施方式中，产生约1×106个MIL。
在本发明的一些实施方式中，来源于骨髓抽吸物的12×106个PBMC产生约1.4×105个MIL。
在任何前述实施方式中，PBMC可来源于全血样本、骨髓、通过单采获得，来源于白膜层，或由本领域中已知用于获得PBMC的任何其他方法获得。
在一些实施方式中，PBL使用美国专利申请公开第US2020/0347350 A1号中所描述的方法制备，该公开的公开内容以引用的方式并入本文中。
5.PD1的预选选择(如图8的步骤A2中所示例)
根据本发明的一些方法，在起始第一扩增之前，预选呈PD-1阳性(PD-1+)的TIL。
在一些实施方式中，需要将最少3,000个TIL接种至起始第一扩增中。在一些实施方式中，预选步骤产生最少3,000个TIL。在一些实施方式中，需要将最少4,000个TIL接种至起始第一扩增中。在一些实施方式中，预选步骤产生最少4,000个TIL。在一些实施方式中，需要将最少5,000个TIL接种至起始第一扩增中。在一些实施方式中，预选步骤产生最少5,000个TIL。在一些实施方式中，需要将最少6,000个TIL接种至起始第一扩增中。在一些实施方式中，预选步骤产生最少6,000个TIL。在一些实施方式中，需要将最少7,000个TIL接种至起始第一扩增中。在一些实施方式中，预选步骤产生最少7,000个TIL。在一些实施方式中，需要将最少8,000个TIL接种至起始第一扩增中。在一些实施方式中，预选步骤产生最少8,000个TIL。在一些实施方式中，需要将最少9,000个TIL接种至起始第一扩增中。在一些实施方式中，预选步骤产生最少9,000个TIL。在一些实施方式中，需要将最少10,000个TIL接种至起始第一扩增中。在一些实施方式中，预选步骤产生最少10,000个TIL。在一些实施方式中，细胞生长或扩增至200,000的密度。在一些实施方式中，细胞生长或扩增至200,000的密度，以提供约2e8个TIL来起始快速第二扩增。在一些实施方式中，细胞生长或扩增至150,000的密度。在一些实施方式中，细胞生长或扩增至150,000的密度，以提供约2e8个TIL来起始快速第二扩增。在一些实施方式中，细胞生长或扩增至250,000的密度。在一些实施方式中，细胞生长或扩增至250,000的密度，以提供约2e8个TIL来起始快速第二扩增。在一些实施方式中，最小细胞密度为10,000个细胞，以给出10e6来起始快速第二扩增。在一些实施方式中，用于起始快速第二扩增的10e6接种密度可产生大于1e9的TIL。
在一些实施方式中，用于起始第一扩增的TIL为PD-1阳性(PD-1+)(例如在预选之后且在起始第一扩增之前)。在一些实施方式中，用于起始第一扩增的TIL为至少75％ PD-1阳性、至少80％ PD-1阳性、至少85％ PD-1阳性、至少90％ PD-1阳性、至少95％ PD-1阳性、至少98％ PD-1阳性或至少99％ PD-1阳性(例如在预选之后且在起始第一扩增之前)。在一些实施方式中，PD-1群为高PD-1。在一些实施方式中，用于起始第一扩增的TIL为至少25％高PD-1、至少30％高PD-1、至少35％高PD-1、至少40％高PD-1、至少45％高PD-1、至少50％高PD-1、至少55％高PD-1、至少60％高PD-1、至少65％高PD-1、至少70％高PD-1、至少75％高PD-1、至少80％高PD-1、至少85％高PD-1、至少90％高PD-1、至少95％高PD-1、至少98％高PD-1或至少99％高PD-1(例如在预选之后且在起始第一扩增之前)。
在一些实施方式中，通过用抗PD-1抗体染色初代细胞群、完整肿瘤消化物和/或完整肿瘤细胞悬浮液TIL进行PD-1阳性TIL的预选。在一些实施方式中，抗PD-1抗体为多克隆抗体，例如小鼠抗人PD-1多克隆抗体、山羊抗人PD-1多克隆抗体等。在一些实施方式中，抗PD-1抗体为单克隆抗体。在一些实施方式中，抗PD-1抗体包括例如但不限于：EH12.2H7、PD1.3.1、M1H4、纳武单抗(BMS-936558，Bristol-Myers Squibb；)、帕博利珠单抗(兰立珠单抗(lambrolizumab)、MK03475或MK-3475，Merck；)、H12.1、PD1.3.1、NAT 105、人源化抗PD-1抗体JS001(上海君实)、单克隆抗PD-1抗体TSR-042(Tesaro,Inc.)、皮立珠单抗(抗PD-1mAb CT-011，Medivation)、抗PD-1单克隆抗体BGB-A317(BeiGene)，和/或抗PD-1抗体SHR-1210(上海恒瑞)、人单克隆抗体REGN2810(Regeneron)、人单克隆抗体MDX-1106(Bristol-Myers Squibb)，和/或人源化抗PD-1IgG4抗体PDR001(Novartis)。在一些实施方式中，PD-1抗体来自克隆：RMP1-14(大鼠IgG)-BioXcell目录号BP0146。其他用于预选用于根据本发明的方法(如本文所述的步骤A至步骤F所示例)扩增TIL的PD-1阳性TIL的适合抗体是美国专利第8,008,449号中所公开的抗PD-1抗体，该美国专利以引用的方式并入本文中。在一些实施方式中，用于预选的抗PD-1抗体与纳武单抗(BMS-936558，Bristol-Myers Squibb；)结合不同表位。在一些实施方式中，用于预选的抗PD-1抗体与帕博利珠单抗(兰立珠单抗、MK03475或MK-3475，Merck；)结合不同表位。在一些实施方式中，用于预选的抗PD-1抗体与人源化抗PD-1抗体JS001(上海君实)结合不同表位。在一些实施方式中，用于预选的抗PD-1抗体与单克隆抗PD-1抗体TSR-042(Tesaro,Inc.)结合不同表位。在一些实施方式中，用于预选的抗PD-1抗体与皮立珠单抗(抗PD-1mAbCT-011，Medivation)结合不同表位。在一些实施方式中，用于预选的抗PD-1抗体与抗PD-1单克隆抗体BGB-A317(BeiGene)结合不同表位。在一些实施方式中，用于预选的抗PD-1抗体与抗PD-1抗体SHR-1210(上海恒瑞)结合不同表位。在一些实施方式中，用于预选的抗PD-1抗体与人单克隆抗体REGN2810(Regeneron)结合不同表位。在一些实施方式中，用于预选的抗PD-1抗体与人单克隆抗体MDX-1106(Bristol-Myers Squibb)结合不同表位。在一些实施方式中，用于预选的抗PD-1抗体与人源化抗PD-1IgG4抗体PDR001(Novartis)结合不同表位。在一些实施方式中，用于预选的抗PD-1抗体与RMP1-14(大鼠IgG)-BioXcell目录号BP0146结合不同表位。纳武单抗和帕博利珠单抗与PD-1结合的结构是已知的且已描述于例如Tan,S.等人(Tan、S.等人，《自然通讯》8:14369|DOI:10.1038/ncomms14369(2017)；其出于所有目的以全文引用的方式并入本文中)。在一些实施方式中，抗PD-1抗体为EH12.2H7。在一些实施方式中，抗PD-1抗体为PD1.3.1。在一些实施方式中，抗PD-1抗体并非PD1.3.1。在一些实施方式中，抗PD-1抗体为M1H4。在一些实施方式中，抗PD-1抗体并非M1H4。
在一些实施方式中，用于预选的抗PD-1抗体与至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少100％的表达PD-1的细胞结合。
在一些实施方式中，患者已用抗PD-1抗体治疗。在一些实施方式中，受试者未接受过抗PD-1抗体治疗。在一些实施方式中，受试者尚未用抗PD-1抗体治疗。在一些实施方式中，受试者先前已用化学治疗剂治疗。在一些实施方式中，受试者先前已用化学治疗剂治疗，但目前不再用该化学治疗剂治疗。在一些实施方式中，受试者接受过化学治疗剂治疗，或接受过抗PD-1抗体治疗。在一些实施方式中，受试者接受过化学治疗剂治疗且接受过抗PD-1抗体治疗。在一些实施方式中，患者未接受过抗PD-1抗体治疗。在一些实施方式中，受试者的癌症未接受过治疗或接受过化学治疗剂治疗，但未接受过抗PD-1抗体治疗。在一些实施方式中，受试者未接受过治疗且接受过化学治疗剂治疗，但未接受过抗PD-1抗体治疗。
在患者先前已用第一抗PD-1抗体治疗的一些实施方式中，通过用第二抗PD-1抗体对初代细胞群、完整肿瘤消化物和/或完整肿瘤细胞悬浮液TIL染色来进行预选，该第二抗PD-1抗体与初代细胞群TIL的表面上PD-1的结合不会被第一抗PD-1抗体阻断。
在患者先前已用抗PD-1抗体治疗的一些实施方式中，通过用抗体(“抗Fc抗体”)对初代细胞群TIL染色来进行预选，该抗Fc抗体与初代细胞群TIL的表面上不溶性抗PD-1抗体的Fc区结合。在一些实施方式中，抗Fc抗体为多克隆抗体，例如小鼠抗人Fc多克隆抗体、山羊抗人Fc多克隆抗体等。在一些实施方式中，抗Fc抗体为单克隆抗体。在一些实施方式中，患者先前已用抗PD-1人或人源化IgG抗体治疗，初代细胞群TIL经抗人IgG抗体染色。在患者先前已用抗PD-1人或人源化IgG1抗体治疗的一些实施方式中，初代细胞群TIL经抗人IgG1抗体染色。在患者先前已用抗PD-1人或人源化IgG2抗体治疗的一些实施方式中，初代细胞群TIL经抗人IgG2抗体染色。在患者先前已用抗PD-1人或人源化IgG3抗体治疗的一些实施方式中，初代细胞群TIL经抗人IgG3抗体染色。在患者先前已用抗PD-1人或人源化IgG4抗体治疗的一些实施方式中，初代细胞群TIL经抗人IgG4抗体染色。
在患者先前已用抗PD-1抗体治疗的一些实施方式中，通过使初代细胞群TIL与相同抗PD-1抗体接触接着用抗Fc抗体对初代细胞群TIL染色来进行预选，该抗Fc抗体与初代细胞群TIL的表面上不溶性抗PD-1抗体的Fc区结合。
在一些实施方式中，预选使用细胞分选方法进行。在一些实施方式中，细胞分选方法为流式细胞术方法，例如流动式活化细胞分选(FACS)。在一些实施方式中，使用第一群和PBMC群中荧光团的强度设定FACS门(gate)以建立分别对应于PD-1阴性TIL、PD-1中等TIL和PD-1阳性TIL的低、中和高强度水平。在一些实施方式中，进行细胞分选方法，以使用PBMC、FMO对照和样本自身将门设定为高、中(也称为中间)和低(也称为阴性)以区分三个群。在一些实施方式中，PBMC用作门对照。在一些实施方式中，高PD-1群定义为超过在PBMC中观察到的PD-1阳性的细胞群。在一些实施方式中，TIL中的中间PD-1+群涵盖PBMC中的PD-1+细胞。在一些实施方式中，阴性的门基于FMO。在一些实施方式中，FACS门在通过将获自受试者的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片而获得和/或接受来自该受试者所切除的肿瘤的第一TIL群的步骤之后设定。在一些实施方式中，门经设定用于各分选。在一些实施方式中，门经设定用于各PBMC样本。在一些实施方式中，门经设定用于各PBMC样本。在一些实施方式中，门控(gating)模板每10天、20天、30天、40天、50天或60天自PBMC设定。在一些实施方式中，门控模板每60天自PBMC设定。在一些实施方式中，门控模板每10天、20天、30天、40天、50天或60天设定用于各PBMC样本。在一些实施方式中，门控模板每60天设定用于各PBMC样本。
在一些实施方式中，预选涉及自第一TIL群选择PD-1阳性TIL以获得富含PD-1的TIL群，包括自第一TIL群选择至少11.27％至74.4％呈PD-1阳性TIL的TIL群。在一些实施方式中，第一TIL群为至少20％至80％ PD-1阳性TIL、至少20％至80％ PD-1阳性TIL、至少30％至80％ PD-1阳性TIL、至少40％至80％ PD-1阳性TIL、至少50％至80％ PD-1阳性TIL、至少10％至70％ PD-1阳性TIL、至少20％至70％ PD-1阳性TIL、至少30％至70％ PD-1阳性TIL、或至少40％至70％ PD-1阳性TIL。
在一些实施方式中，选择步骤(例如预选和/或选择PD-1阳性细胞)包括以下步骤：
(i)使第一TIL群和PBMC群暴露于过量的单克隆抗PD-1IgG4抗体，该抗体通过在PD-1的IgV结构域外部的N端环与PD-1结合，
(ii)添加过量的与荧光团缀合的抗IgG4抗体，
(iii)基于如通过荧光活化细胞分选(FACS)进行的第一TIL群中PD-1阳性TIL的荧光团的强度与在PBMC群中的强度的比较，获得富含PD-1的TIL群。
在一些实施方式中，PD-1阳性TIL为高PD-1TIL。
在一些实施方式中，至少70％富含PD-1的TIL群为PD-1阳性TIL。在一些实施方式中，至少80％富含PD-1的TIL群为PD-1阳性TIL。在一些实施方式中，至少90％富含PD-1的TIL群为PD-1阳性TIL。在一些实施方式中，至少95％富含PD-1的TIL群为PD-1阳性TIL。在一些实施方式中，至少99％富含PD-1的TIL群为PD-1阳性TIL。在一些实施方式中，100％富含PD-1的TIL群为PD-1阳性TIL。
不同的抗PD-1抗体展现与PD-1内的不同表位的不同结合特征。在一些实施方式中，抗PD-1抗体与帕博利珠单抗结合不同表位。在一些实施方式中，抗PD1抗体与PD-1的IgV结构域外部的N端环中的表位结合。在一些实施方式中，抗PD1抗体通过PD-1的IgV结构域外部的N端环结合。在一些实施方式中，抗PD-1抗体为抗PD-1抗体，其通过在PD-1的IgV结构域外部的N端环与PD-1结合。在一些实施方式中，抗PD-1抗体为单克隆抗PD-1抗体，其通过在PD-1的IgV结构域外部的N端环与PD-1结合。在一些实施方式中，单克隆抗PD-1抗体为抗PD-1IgG4抗体，其通过在PD-1的IgV结构域外部的N端环与PD-1结合。参见例如Tan,S.《自然通讯》第8卷，Argicle 14369：1-10(2017)。
在一些实施方式中，图8的步骤A2所示例的选择步骤包括以下步骤：(i)使第一TIL群暴露于过量的单克隆抗PD-1IgG4抗体，该抗体通过在PD-1的IgV结构域外部的N端环与PD-1结合；(ii)添加过量的与荧光团缀合的抗IgG4抗体；和(ⅲ)基于荧光团进行流动式细胞分选以获得富含PD-1的TIL群。在一些实施方式中，单克隆抗PD-1IgG4抗体为纳武单抗或其变体、片段或缀合物。在一些实施方式中，抗IgG4抗体为抗人IgG4克隆，即HP6023克隆。在一些实施方式中，用于步骤(b)中的选择的抗PD-1抗体与EH12.2H7或纳武单抗结合相同的表位。
在一些实施方式中，采用WO2019156568的PD-1门控方法。为了确定来源于肿瘤样本的TIL是否为高PD-1，本领域技术人员可利用对应于获自一或多名健康受试者的血液样本的外周T细胞中的PD-1表达量的参考值。参考样本中的PD-1阳性细胞可使用荧光减一对照和相匹配的同型对照来定义。在一些实施方式中，测量来自健康受试者的CD3+/PD-1+外周T细胞(例如参考细胞)中的PD-1表达水平，用于建立获自肿瘤的TIL中PD-1的免疫染色强度的阈值或截止值。阈值可定义为高PD-1T细胞的PD-1免疫染色的最小强度。因此，PD-1表达等于或高于阈值的TIL可被视为高PD-1细胞。在一些情况下，高PD-1TIL表示具有最高PD-1免疫染色强度的TIL，对应于最多1％或少于1％的总CD3+细胞。在其他情况下，高PD-1TIL表示具有最高PD-1免疫染色强度的TIL，对应于最多0.75％或少于0.75％的总CD3+细胞。在一些情况下，高PD-1TIL表示具有最高PD-1免疫染色强度的TIL，对应于最多0.50％或少于0.50％的总CD3+细胞。在一种情况下，高PD-1TIL表示具有最高PD-1免疫染色强度的TIL，对应于最多0.25％或少于0.25％的总CD3+细胞。
a.荧光团
在一些实施方式中，初代细胞群TIL是经包含与荧光团连接的抗PD-1抗体和与荧光团连接的抗CD3抗体的混合物染色。在一些实施方式中，初代细胞群TIL是经包含与荧光团(例如PE、活/死紫色)连接的抗PD-1抗体和抗CD3-FITC的混合液染色。在一些实施方式中，初代细胞群TIL是经包含抗PD-1-PE、抗CD3-FITC和活/死蓝色染料(马萨诸塞州的ThermoFisher，目录号L23105)的混合液染色。在一些实施方式中，在与抗PD1抗体孵育之后，选择PD-1阳性细胞以根据本文例如在步骤B中所描述的起始第一扩增进行扩增。
在一些实施方式中，荧光团包括但不限于PE(藻红素)、APC(别藻蓝蛋白)、PerCP(甲藻黄素叶绿素蛋白质)、DyLight 405、Alexa Fluor 405、Pacific Blue、Alexa Fluor488、FITC(荧光异硫氰酸盐)、DyLight 550、Alexa Fluor 647、DyLight 650和Alexa Fluor700。在一些实施方式中，荧光团包括但不限于PE-Alexa 647、PE-Cy5、PerCP-Cy5.5、PE-Cy5.5、PE-Alexa 750、PE-Cy7和APC-Cy7。在一些实施方式中，荧光团包括但不限于荧光素染料。荧光素染料的示例包括但不限于5-羧基荧光素、荧光素-5-异硫氰酸酯和6-羧基荧光素、5,6-二羧基荧光素、5-(和6)-磺酸基荧光素、磺基荧光素、琥珀酰基荧光素、5-(和6)-羧基SNARF-1、羧基荧光素磺酸盐、羧基荧光素两性离子、羧基荧光素季铵、羧基荧光素磷酸盐、羧基荧光素GABA、5'(6')-羧基荧光素、羧基荧光素-cys-Cy5和荧光素谷胱甘肽。在一些实施方式中，荧光部分为罗丹明染料。罗丹明染料的示例包括但不限于四甲基罗丹明-6-异硫氰酸酯、5-羧基四甲基罗丹明、5-羧基对甲氨基酚衍生物、羧基罗丹明110、四甲基和四乙基罗丹明、二苯基二甲基和二苯基二乙基罗丹明、二萘基罗丹明、罗丹明101磺酰氯(以商品名TEXAS 出售)。在一些实施方式中，荧光部分为花青染料。花青染料的示例包括但不限于Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7。
B.步骤B：起始第一扩增
在一些实施方式中，本发明方法提供较年轻TIL，较年轻TIL相较于较老TIL(即，在向受试者/患者施用之前已进一步进行更多轮复制的TIL)可能提供额外的治疗益处。年轻TIL的特征已描述于文献中，例如于Donia等人,《斯堪的纳维亚免疫学杂志》2012,75,157-167；Dudley等人,《临床癌症研究》2010,16,6122-6131；Huang等人,《免疫疗法杂志》2005,28,258-267；Besser等人,《临床癌症研究》2013,19,OF1-OF9；Besser等人,《免疫疗法杂志》2009,32,415-423；Robbins等人,《免疫学杂志》2004,173,7125-7130；Shen等人,《免疫疗法杂志》,2007,30,123-129；Zhou等人,《免疫疗法杂志》2005,28,53-62；和Tran等人,《免疫疗法杂志》,2008,31,742-751，其各自以引用的方式并入本文中。
在例如图1(特别是例如图1B和/或图8C)的步骤A中所描述的进行肿瘤碎片和/或肿瘤碎片的分割或消化之后，将所得细胞在相对于肿瘤及其他细胞而有利于TIL生长的条件下培养在含有抗生素组分、IL-2、OKT-3和饲养细胞(例如抗原呈递饲养细胞)的血清中。在一些实施方式中，一种以上抗生素、IL-2、OKT-3和饲养细胞在培养起始时(例如第0天)与肿瘤消化物和/或肿瘤碎片一起添加。在一些实施方式中，抗生素组分包含本文公开的任何浓度的：1)万古霉素；2)庆大霉素和万古霉素；或3)庆大霉素和克林霉素。在一些实施方式中，肿瘤消化物和/或肿瘤碎片在容器中以每容器至多60个碎片且在6000IU/mL IL-2存在下孵育。在一些实施方式中，将此初代细胞群培养数天时间段，通常为1至8天，产生主体TIL群，通常为约1×108个主体TIL细胞。在一些实施方式中，将此初代细胞群培养数天时间段，通常为1至7天，产生主体TIL群，通常为约1×108个主体TIL细胞。在一些实施方式中，起始第一扩增发生1至8天的时间段，产生主体TIL群，通常为约1×108个主体TIL细胞。在一些实施方式中，起始第一扩增发生1至7天的时间段，产生主体TIL群，通常为约1×108个主体TIL细胞。在一些实施方式中，起始第一扩增发生5至8天的时间段，产生主体TIL群，通常为约1×108个主体TIL细胞。在一些实施方式中，起始第一扩增发生5至7天的时间段，产生主体TIL群，通常为约1×108个主体TIL细胞。在一些实施方式中，起始第一扩增发生约6至8天的时间段，产生主体TIL群，通常为约1×108个主体TIL细胞。在一些实施方式中，起始第一扩增发生约6至7天的时间段，产生主体TIL群，通常为约1×108个主体TIL细胞。在一些实施方式中，起始第一扩增发生约7至8天的时间段，产生主体TIL群，通常为约1×108个主体TIL细胞。在一些实施方式中，起始第一扩增发生约7天的时间段，产生主体TIL群，通常为约1×108个主体TIL细胞。在一些实施方式中，此起始第一扩增发生约8天的时间段，产生主体TIL群，通常为约1×108个主体TIL细胞。
在一些实施方式中，TIL的扩增可使用如下文和本文所述的起始第一扩增步骤(例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的步骤)进行，其可包括称为预REP或初始REP的过程，其自第0天和/或自培养起开始含有饲养细胞；随后进行如下文在步骤D中和本文中所描述的快速第二扩增(步骤D，包括称为快速扩增方案(REP)步骤的过程)；随后可选地进行冷冻保存，随后进行如下文和本文所述的第二步骤D(包括称为再刺激REP步骤的过程)。获自此过程的TIL可以可选地针对如本文所述的表型特征和代谢参数进行表征。在一些实施方式中，肿瘤碎片在约1mm3与10mm3之间。
在一些实施方式中，第一扩增培养基称为“CM”(培养基的缩写)。在一些实施方式中，步骤B的CM由含GlutaMAX且补充有10％人AB血清、25mM Hepes和10mg/mL庆大霉素的RPMI 1640组成。
在一些实施方式中，有少于或等于240个肿瘤碎片。在一些实施方式中，有少于或等于240个肿瘤碎片被置于少于或等于4个容器中。在一些实施方式中，容器为GREX100 MCS培养瓶。在一些实施方式中，少于或等于60个肿瘤碎片被置于1个容器中。在一些实施方式中，各容器包含少于或等于500mL培养基/容器。在一些实施方式中，培养基包含IL-2。在一些实施方式中，培养基包含6000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，培养基包含抗原呈递饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)。在一些实施方式中，培养基包含2.5×108个抗原呈递饲养细胞/容器。在一些实施方式中，培养基包含OKT-3。在一些实施方式中，培养基包含30ng/mL OKT-3/容器。在一些实施方式中，容器为GREX100 MCS培养瓶。在一些实施方式中，培养基包含6000IU/mL IL-2、30ng OKT-3和2.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施方式中，培养基包含6000IU/mL IL-2、30ng/mL OKT-3和2.5×108个抗原呈递饲养细胞/容器。
在制备肿瘤碎片之后，将所得细胞(即为初代细胞群的碎片)在相对于肿瘤及其他细胞而有利于TIL生长的条件下培养在含有抗生素组分、IL-2、抗原呈递饲养细胞和OKT-3的培养基中，其允许自第0天培养起启始TIL启动及加速生长。在一些实施方式中，抗生素组分包含本文公开的任何浓度的：1)万古霉素；2)庆大霉素和万古霉素；或3)庆大霉素和克林霉素。在一些实施方式中，将肿瘤消化物和/或肿瘤碎片与6000IU/mL IL-2以及抗原呈递饲养细胞和OKT-3一起孵育。将此初代细胞群培养数天的时间段，通常为1至8天，产生主体TIL群，通常为约1×108个主体TIL细胞。在一些实施方式中，在起始第一扩增期间的生长培养基包含IL-2或其变体以及抗原呈递饲养细胞和OKT-3。在一些实施方式中，将此初代细胞群培养数天的时间段，通常1至7天，产生主体TIL群，通常为约1×108个主体TIL细胞。
在一些实施方式中，在起始第一扩增期间的生长培养基包含抗生素组分、IL-2或其变体，以及抗原呈递饲养细胞和OKT-3。在一些实施方式中，抗生素组分包含本文公开的任何浓度的：1)万古霉素；2)庆大霉素和万古霉素；或3)庆大霉素和克林霉素。在一些实施方式中，IL-2为重组人IL-2(rhIL-2)。在一些实施方式中，1mg小瓶的IL-2储备液具有20-30×106IU/mg的比活性。在一些实施方式中，1mg小瓶的IL-2储备液具有20×106IU/mg的比活性。在一些实施方式中，1mg小瓶的IL-2储备液具有25×106IU/mg的比活性。在一些实施方式中，1mg小瓶的IL-2储备液具有30×106IU/mg的比活性。在一些实施方式中，IL-2储备液具有4-8×106IU/mg IL-2的最终浓度。在一些实施方式中，IL-2储备液具有5-7×106IU/mgIL-2的最终浓度。在一些实施方式中，IL-2储备液具有6×106IU/mg IL-2的最终浓度。在一些实施方式中，IL-2储备液如实施例中所描述来制备。在一些实施方式中，起始第一扩增培养基包含约10,000IU/mL IL-2、约9,000IU/mL IL-2、约8,000IU/mL IL-2、约7,000IU/mLIL-2、约6000IU/mL IL-2或约5,000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，起始第一扩增培养基包含约9,000IU/mL IL-2至约5,000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，起始第一扩增培养基包含约8,000IU/mL IL-2至约6,000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，起始第一扩增培养基包含约7,000IU/mL IL-2至约6,000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，起始第一扩增培养基包含约6,000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，细胞培养基进一步包含IL-2。在一些实施方式中，起始第一扩增细胞培养基包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，起始第一扩增细胞培养基进一步包含IL-2。在一些实施方式中，起始第一扩增细胞培养基包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，起始第一扩增细胞培养基包含约1000IU/mL、约1500IU/mL、约2000IU/mL、约2500IU/mL、约3000IU/mL、约3500IU/mL、约4000IU/mL、约4500IU/mL、约5000IU/mL、约5500IU/mL、约6000IU/mL、约6500IU/mL、约7000IU/mL、约7500IU/mL或约8000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，起始第一扩增细胞培养基包含1000至2000IU/mL、2000至3000IU/mL、3000至4000IU/mL、4000至5000IU/mL、5000至6000IU/mL、6000至7000IU/mL、7000至8000IU/mL或约8000IU/mL IL-2。
在一些实施方式中，起始第一扩增培养基包含约500IU/mL IL-15、约400IU/mLIL-15、约300IU/mL IL-15、约200IU/mL IL-15、约180IU/mL IL-15、约160IU/mL IL-15、约140IU/mL IL-15、约120IU/mL IL-15或约100IU/mL IL-15。在一些实施方式中，起始第一扩增培养基包含约500IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施方式中，起始第一扩增培养基包含约400IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施方式中，起始第一扩增培养基包含约300IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施方式中，起始第一扩增培养基包含约200IU/mL IL-15。在一些实施方式中，起始第一扩增细胞培养基包含约180IU/mLIL-15。在一些实施方式中，起始第一扩增细胞培养基进一步包含IL-15。在一些实施方式中，起始第一扩增细胞培养基包含约180IU/mL IL-15。
在一些实施方式中，起始第一扩增培养基包含约20IU/mL IL-21、约15IU/mL IL-21、约12IU/mL IL-21、约10IU/mL IL-21、约5IU/mL IL-21、约4IU/mL IL-21、约3IU/mL IL-21、约2IU/mL IL-21、约1IU/mL IL-21或约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方式中，起始第一扩增培养基包含约20IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方式中，起始第一扩增培养基包含约15IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方式中，起始第一扩增培养基包含约12IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方式中，起始第一扩增培养基包含约10IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方式中，起始第一扩增培养基包含约5IU/mL IL-21至约1IU/mL IL-21。在一些实施方式中，起始第一扩增培养基包含约2IU/mLIL-21。在一些实施方式中，起始第一扩增细胞培养基包含约1IU/mL IL-21。在一些实施方式中，起始第一扩增细胞培养基包含约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方式中，细胞培养基进一步包含IL-21。在一些实施方式中，起始第一扩增细胞培养基包含约1IU/mL IL-21。
在一些实施方式中，起始第一扩增细胞培养基包含OKT-3抗体。在一些实施方式中，起始第一扩增细胞培养基包含约30ng/mL OKT-3抗体。在一些实施方式中，起始第一扩增细胞培养基包含约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2.5ng/mL、约5ng/mL、约7.5ng/mL、约10ng/mL、约15ng/mL、约20ng/mL、约25ng/mL、约30ng/mL、约35ng/mL、约40ng/mL、约50ng/mL、约60ng/mL、约70ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约100ng/mL、约200ng/mL、约500ng/mL和约1μg/mL OKT-3抗体。在一些实施方式中，细胞培养基包含在0.1ng/mL与1ng/mL之间、在1ng/mL与5ng/mL之间、在5ng/mL与10ng/mL之间、在10ng/mL与20ng/mL之间、在20ng/mL与30ng/mL之间、在30ng/mL与40ng/mL之间、在40ng/mL与50ng/mL之间和在50ng/mL与100ng/mL之间的OKT-3抗体。在一些实施方式中，细胞培养基包含在15ng/mL与30ng/mL之间的OKT-3抗体。在一些实施方式中，细胞培养基包含30ng/mL OKT-3抗体。在一些实施方式中，OKT-3抗体为莫罗单抗。参见例如上表1。
在一些实施方式中，起始第一扩增细胞培养基在细胞培养基中包括一种以上TNFRSF激动剂。在一些实施方式中，TNFRSF激动剂包括4-1BB激动剂。在一些实施方式中，TNFRSF激动剂为4-1BB激动剂，该4-1BB激动剂选自如下：乌瑞鲁单抗、乌图木单抗、EU-101、融合蛋白及其片段、衍生物、变体、生物类似物以及它们的组合。在一些实施方式中，添加的TNFRSF激动剂的浓度足以在细胞培养基中达成在0.1μg/mL与100μg/mL之间的浓度。在一些实施方式中，添加的TNFRSF激动剂的浓度足以在细胞培养基中达成在20μg/mL与40μg/mL之间的浓度。
在一些实施方式中，除了一种以上TNFRSF激动剂之外，起始第一扩增细胞培养基进一步包含初始浓度为约3000IU/mL的IL-2和初始浓度为约30ng/mL的OKT-3抗体，其中该一种以上TNFRSF激动剂包括4-1BB激动剂。在一些实施方式中，除了一种以上TNFRSF激动剂之外，起始第一扩增细胞培养基进一步包含初始浓度为约6000IU/mL的IL-2和初始浓度为约30ng/mL的OKT-3抗体，其中该一种以上TNFRSF激动剂包括4-1BB激动剂。
在一些实施方式中，起始第一扩增培养基称为“CM”(培养基的缩写)。在一些实施方式中，其称为CM1(培养基1)。在一些实施方式中，CM由含GlutaMAX且补充有10％人AB血清、25mM Hepes和10mg/mL庆大霉素的RPMI 1640组成。在一些实施方式中，CM是实施例中所描述的CM1。在一些实施方式中，起始第一扩增在初始细胞培养基或第一细胞培养基中发生。在一些实施方式中，起始第一扩增培养基或初始细胞培养基或第一细胞培养基包含IL-2、OKT-3和抗原呈递饲养细胞(在本文中又称为饲养细胞)。
在一些实施方式中，本文公开的扩增过程中使用的培养基为无血清培养基或成分确定的培养基。在一些实施方式中，无血清或成分确定的培养基包含基础细胞培养基和血清补充剂和/或血清替代物。在一些实施方式中，无血清或成分确定的培养基用于防止和/或减少部分因含血清培养基的批次间变化所致的实验变化。
在一些实施方式中，无血清或成分确定的培养基包含基础细胞培养基和血清补充剂和/或血清替代物。在一些实施方式中，基础细胞培养基包括但不限于CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基、CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM、CTSTMAIM-V培养基、CTSTMAIM-V SFM、LymphoONETMT细胞扩增无外源物质培养基、杜尔贝科氏改良型伊格尔氏培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔氏基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基和伊斯科夫氏改良型杜尔贝科氏培养基。
在一些实施方式中，血清补充剂或血清替代物包括但不限于以下中的一种以上：CTSTMOpTmizer T细胞扩增血清补充剂、CTSTM免疫细胞血清替代物、一种以上白蛋白或白蛋白代用物、一种以上氨基酸、一种以上维生素、一种以上转铁蛋白或转铁蛋白代用物、一种以上抗氧化剂、一种以上胰岛素或胰岛素代用物、一种以上胶原蛋白前体、抗生素组分和一种以上微量元素。在一些实施方式中，成分确定的培养基包含白蛋白和一种以上选自如下的成分：甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、硫胺素、还原谷胱甘肽、L-抗坏血酸-2-磷酸盐、铁饱和转铁蛋白、胰岛素以及含有微量元素部分Ag+、Al3+、Ba2+、Cd2+、Co2+、Cr3 +、Ge4+、Se4+、Br、T、Mn2+、P、Si4+、V5+、Mo6+、Ni2+、Rb+、Sn2+和Zr4+的化合物。在一些实施方式中，成分确定的培养基进一步包含L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和/或2-巯基乙醇。
在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞免疫细胞血清替代物与常规生长培养基一起使用，常规生长培养基包括但不限于CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基、CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM、CTSTMAIM-V培养基、CSTTMAIM-V SFM、LymphoONETMT细胞扩增无外源物质培养基、杜尔贝科氏改良型伊格尔氏培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔氏基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基和伊斯科夫氏改良型杜尔贝科氏培养基。
在一些实施方式中，以无血清或成分确定的培养基的总体积计，无血清或成分确定的培养基中的总血清替代物浓度(vol％)为约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些实施方式中，总血清替代物浓度为无血清或成分确定的培养基的总体积的约3％。在一些实施方式中，总血清替代物浓度为无血清或成分确定的培养基的总体积的约5％。在一些实施方式中，总血清替代物浓度为无血清或成分确定的培养基的总体积的约10％。
在一些实施方式中，无血清或成分确定的培养基为CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM(ThermoFisher Scientific)。任何CTSTMOpTmizerTM制剂皆可用于本发明。CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM是1L CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基与26mL CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂在使用前混合在一起的组合。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)以及55mM的2-巯基乙醇。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisherScientific)，2-巯基乙醇在培养基中的最终浓度为55μM。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisherScientific)以及55μM 2-巯基乙醇。
在一些实施方式中，成分确定的培养基为CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM(ThermoFisher Scientific)。任何CTSTMOpTmizerTM制剂皆可用于本发明。CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM是1L CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基与26mL CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂在使用前混合在一起的组合。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)以及55mM 2-巯基乙醇。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)、55mM 2-巯基乙醇和2mM L-谷氨酰胺。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)、55mM 2-巯基乙醇和2mM L-谷氨酰胺，进一步包含约1000IU/mL至约8000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)、55mM 2-巯基乙醇和2mM L-谷氨酰胺，进一步包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)、55mM 2-巯基乙醇和2mM L-谷氨酰胺，进一步包含约6000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisherScientific)和55mM 2-巯基乙醇，进一步包含约1000IU/mL至约8000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)和55mM 2-巯基乙醇，进一步包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)和55mM 2-巯基乙醇，进一步包含约1000IU/mL至约6000IU/mLIL-2。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)和约2mM谷氨酰胺，进一步包含约1000IU/mL至约8000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)和约2mM谷氨酰胺，进一步包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)和约2mM谷氨酰胺，进一步包含约6000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)，2-巯基乙醇在培养基中的最终浓度为55μM。
在一些实施方式中，无血清培养基或成分确定的培养基补充有浓度为约0.1mM至约10mM、0.5mM至约9mM、1mM至约8mM、2mM至约7mM、3mM至约6mM、或4mM至约5mM的谷氨酰胺(即，)。在一些实施方式中，无血清培养基或成分确定的培养基补充有浓度为约2mM的谷氨酰胺(即，)。
在一些实施方式中，无血清培养基或成分确定的培养基补充有浓度为约5mM至约150mM、10mM至约140mM、15mM至约130mM、20mM至约120mM、25mM至约110mM、30mM至约100mM、35mM至约95mM、40mM至约90mM、45mM至约85mM、50mM至约80mM、55mM至约75mM、60mM至约70mM或约65mM的2-巯基乙醇。在一些实施方式中，无血清培养基或成分确定的培养基补充有浓度为约55mM的2-巯基乙醇。在一些实施方式中，2-巯基乙醇在培养基中的最终浓度为55μM。
在一些实施方式中，以引用的方式并入本文中的国际PCT公开第WO/1998/030679号中所描述的成分确定的培养基可用于本发明。在该公开中，描述无血清真核细胞培养基。无血清真核细胞培养基包括补充有能够支持细胞在无血清培养物中生长的无血清补充剂的基础细胞培养基。无血清真核细胞培养基补充剂包含一种以上选自如下的成分，或通过组合一种以上选自如下的成分而获得：一种以上白蛋白或白蛋白代用物、一种以上氨基酸、一种以上维生素、一种以上转铁蛋白或转铁蛋白代用物、一种以上抗氧化剂、一种以上胰岛素或胰岛素代用物、一种以上胶原蛋白前体、一种以上微量元素和一种以上抗生素。在一些实施方式中，成分确定的培养基进一步包含L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和/或β-巯基乙醇。在一些实施方式中，成分确定的培养基包含白蛋白或白蛋白代用物和一种以上选自如下的成分：一种以上氨基酸、一种以上维生素、一种以上转铁蛋白或转铁蛋白代用物、一种以上抗氧化剂、一种以上胰岛素或胰岛素代用物、一种以上胶原蛋白前体和一种以上微量元素。在一些实施方式中，成分确定的培养基包含白蛋白和一种以上选自如下的成分：甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、硫胺素、还原谷胱甘肽、L-抗坏血酸-2-磷酸盐、铁饱和转铁蛋白、胰岛素以及含有微量元素部分Ag+、Al3+、Ba2+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Ge4+、Se4+、Br、T、Mn2 +、P、Si4+、V5+、Mo6+、Ni2+、Rb+、Sn2+和Zr4+的化合物。在一些实施方式中，基础细胞培养基选自如下：杜尔贝科氏改良型伊格尔氏培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔氏基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基和伊斯科夫氏改良型杜尔贝科氏培养基。
在一些实施方式中，成分确定的培养基中甘氨酸的浓度在约5-200mg/L的范围内，L-组氨酸的浓度为约5-250mg/L，L-异亮氨酸的浓度为约5-300mg/L，L-甲硫氨酸的浓度为约5-200mg/L，L-苯丙氨酸的浓度为约5-400mg/L，L-脯氨酸的浓度为约1-1000mg/L，L-羟基脯氨酸的浓度为约1-45mg/L，L-丝氨酸的浓度为约1-250mg/L，L-苏氨酸的浓度为约10-500mg/L，L-色氨酸的浓度为约2-110mg/L，L-酪氨酸的浓度为约3-175mg/L，L-缬氨酸的浓度为约5-500mg/L，硫胺素的浓度为约1-20mg/L，还原谷胱甘肽的浓度为约1-20mg/L，L-抗坏血酸-2-磷酸盐的浓度为约1-200mg/L，铁饱和转铁蛋白的浓度为约1-50mg/L，胰岛素的浓度为约1-100mg/L，亚硒酸钠的浓度为约0.000001-0.0001mg/L，白蛋白(例如I)的浓度为约5000-50,000mg/L。
在一些实施方式中，成分确定的培养基中的非微量元素部分成分是以表4中标题“1X培养基中的浓度范围”栏中列出的浓度范围存在。在其他实施方式中，成分确定的培养基中的非微量元素部分成分以表4中标题“1X培养基的优选实施方式”栏中列出的最终浓度存在。在其他实施方式中，成分确定的培养基为包含无血清补充剂的基础细胞培养基。在一些该实施方式中，无血清补充剂包含表4中的类型和标题“补充剂的优选实施方式”栏中列出的浓度的非微量部分成分。
在一些实施方式中，成分确定的培养基的渗透压介于约260与350mOsmol之间。在一些实施方式中，渗透压介于约280与310mOsmol之间。在一些实施方式中，成分确定的培养基补充有至多约3.7g/L或约2.2g/L碳酸氢钠。成分确定的培养基可进一步补充有L-谷氨酰胺(最终浓度为约2mM)、抗生素组分、非必需氨基酸(NEAA；最终浓度为约100μM)、2-巯基乙醇(最终浓度为约100μM)。
在一些实施方式中，Smith等人,《临床与转化免疫学》,4(1),2015(doi:10.1038/cti.2014.31)中所描述的成分确定的培养基可用于本发明中。简言之，使用RPMI或CTSTMOpTmizerTM作为基础细胞培养基且补充有0、2％、5％或10％ CTSTM免疫细胞血清替代物。
在一些实施方式中，第一透气容器和/或第二透气容器中的细胞培养基为未经过滤的。使用未经过滤的细胞培养基可简化扩增细胞数目所需的程序。在一些实施方式中，第一透气容器和/或第二透气容器中的细胞培养基缺乏β-巯基乙醇(BME或βME；也称为2-巯基乙醇，CAS 60-24-2)。
在一些实施方式中，起始第一扩增程序(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的过程)为1至8天，如实施例和图示中所论述。在一些实施方式中，起始第一扩增程序(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的过程)为2至8天，如实施例和图示中所论述。在一些实施方式中，起始第一扩增程序(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的过程)为3至8天，如实施例和图示中所论述。在一些实施方式中，起始第一扩增程序(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的过程)为4至8天，如实施例和图示中所论述。在一些实施方式中，起始第一扩增程序(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的过程)为5至8天，如实施例和图示中所论述。在一些实施方式中，起始第一扩增程序(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的过程)为6至8天，如实施例和图示中所论述。在一些实施方式中，起始第一扩增程序(包括例如图1(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的过程)为7至8天，如实施例和图示中所论述。在一些实施方式中，起始第一扩增程序(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的过程)为8天，如实施例和图示中所论述。在一些实施方式中，起始第一扩增程序(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的过程)为1至7天，如实施例和图示中所论述。在一些实施方式中，起始第一扩增程序(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的过程)为2至7天，如实施例和图示中所论述。在一些实施方式中，起始第一扩增程序(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的过程)为3至7天，如实施例和图示中所论述。在一些实施方式中，起始第一扩增程序(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的过程)为4至7天，如实施例和图示中所论述。在一些实施方式中，起始第一扩增程序(包括例如图8(特别是例如图8B和/或图8C)的步骤B中所描述的过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的过程)为5至7天，如实施例和图示中所论述。在一些实施方式中，起始第一扩增程序(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的过程)为6至7天，如实施例和图示中所论述。在一些实施方式中，起始第一扩增程序(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的过程)为7天，如实施例和图示中所论述。
在一些实施方式中，起始第一TIL扩增可在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后进行1天至8天。在一些实施方式中，起始第一TIL扩增可在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后进行1天至7天。在一些实施方式中，起始第一TIL扩增可在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后进行2天至8天。在一些实施方式中，起始第一TIL扩增可在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后进行2天至7天。在一些实施方式中，起始第一TIL扩增可在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后进行3天至8天。在一些实施方式中，起始第一TIL扩增可在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后进行3天至7天。在一些实施方式中，起始第一TIL扩增可在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后进行4天至8天。在一些实施方式中，起始第一TIL扩增可在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后进行4天至7天。在一些实施方式中，起始第一TIL扩增可在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后进行5天至8天。在一些实施方式中，起始第一TIL扩增可在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后进行5天至7天。在一些实施方式中，起始第一TIL扩增可在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后进行6天至8天。在一些实施方式中，起始第一TIL扩增可在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后进行6天至7天。在一些实施方式中，起始第一TIL扩增可在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后进行7至8天。在一些实施方式中，起始第一TIL扩增可在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后进行8天。在一些实施方式中，起始第一TIL扩增可在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后进行7天。
在一些实施方式中，TIL的起始第一扩增可进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天。在一些实施方式中，第一TIL扩增可进行1天至8天。在一些实施方式中，第一TIL扩增可进行1天至7天。在一些实施方式中，第一TIL扩增可进行2天至8天。在一些实施方式中，第一TIL扩增可进行2天至7天。在一些实施方式中，第一TIL扩增可进行3天至8天。在一些实施方式中，第一TIL扩增可进行3天至7天。在一些实施方式中，第一TIL扩增可进行4天至8天。在一些实施方式中，第一TIL扩增可进行4天至7天。在一些实施方式中，第一TIL扩增可进行5天至8天。在一些实施方式中，第一TIL扩增可进行5天至7天。在一些实施方式中，第一TIL扩增可进行6天至8天。在一些实施方式中，第一TIL扩增可进行6天至7天。在一些实施方式中，第一TIL扩增可进行7天至8天。在一些实施方式中，第一TIL扩增可进行8天。在一些实施方式中，第一TIL扩增可进行7天。
在一些实施方式中，采用IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21的组合作为在起始第一扩增期间的组合。在一些实施方式中，在起始第一扩增期间，包括例如在根据图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)以及本文所述的步骤B过程期间，可包括IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21以及它们的任何组合。在一些实施方式中，采用IL-2、IL-15和IL-21的组合作为在起始第一扩增期间的组合。在一些实施方式中，在根据图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)以及如本文所述的步骤B过程期间可包括IL-2、IL-15和IL-21以及它们的任何组合。
在一些实施方式中，起始第一扩增，例如根据图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B，在密闭系统生物反应器中进行。在一些实施方式中，采用密闭系统进行如本文所述的TIL扩增。在一些实施方式中，采用生物反应器。在一些实施方式中，采用生物反应器作为容器。在一些实施方式中，所采用的生物反应器为例如G-REX-10或G-REX-100。在一些实施方式中，所采用的生物反应器为G-REX-100。在一些实施方式中，所采用的生物反应器为G-REX-10。
在一些实施方式中，起始第一扩增培养基(例如CM或CM1)包含抗生素组分。在一些实施方式中，抗生素组分包含本文公开的任何浓度的：1)万古霉素；2)庆大霉素和万古霉素；或3)庆大霉素和克林霉素。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL至约600μg/mL万古霉素。在一些实施方式中，抗生素组分包含约100μg/mL万古霉素。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约400μg/mL至约600μg/mL克林霉素。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约2.5μg/mL至约10μg/mL双性霉素B。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素和约100μg/mL至约600μg/mL万古霉素。在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素和约100μg/mL万古霉素。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素和约400μg/mL至约600μg/mL克林霉素。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素、约100μg/mL至约600μg/mL万古霉素和约2.5μg/mL至约10μg/mL双性霉素B。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素、约400μg/mL至约600μg/mL克林霉素和约2.5μg/mL至约10μg/mL双性霉素B。
1.饲养细胞和抗原呈递细胞
在一些实施方式中，本文所述的起始第一扩增程序(例如包括如下扩增，例如图1(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的扩增，以及称为预REP或初始REP的扩增)在TIL扩增开始时不需要饲养细胞(在本文中又称为“抗原呈递细胞”)，而在起始第一扩增期间添加。在一些实施方式中，本文所述的起始第一扩增程序(例如包括如下扩增，例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的扩增，以及称为预REP或初始REP的扩增)在TIL扩增开始时不需要饲养细胞(在本文中又称为“抗原呈递细胞”)，而在起始第一扩增期间第4-8天期间的任何时间添加。在一些实施方式中，本文所述的起始第一扩增程序(例如包括如下扩增，例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的扩增，以及称为预REP或初始REP的扩增)在TIL扩增开始时不需要饲养细胞(在本文中又称为“抗原呈递细胞”)，而在起始第一扩增期间第4-7天期间的任何时间添加。在一些实施方式中，本文所述的起始第一扩增程序(例如包括如下扩增，例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的扩增，以及称为预REP或初始REP的扩增)在TIL扩增开始时不需要饲养细胞(在本文中又称为“抗原呈递细胞”)，而在起始第一扩增期间第5-8天期间的任何时间添加。在一些实施方式中，本文所述的起始第一扩增程序(例如包括如下扩增，例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的扩增，以及称为预REP或初始REP的扩增)在TIL扩增开始时不需要饲养细胞(在本文中又称为“抗原呈递细胞”)，而在起始第一扩增期间第5-7天期间的任何时间添加。在一些实施方式中，本文所述的起始第一扩增程序(例如包括如下扩增，例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的扩增，以及称为预REP或初始REP的扩增)在TIL扩增开始时不需要饲养细胞(在本文中又称为“抗原呈递细胞”)，而在起始第一扩增期间第6-8天期间的任何时间添加。在一些实施方式中，本文所述的起始第一扩增程序(例如包括如下扩增，例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的扩增，以及称为预REP或初始REP的扩增)在TIL扩增开始时不需要饲养细胞(在本文中又称为“抗原呈递细胞”)，而在起始第一扩增期间在第6-7天期间的任何时间添加。在一些实施方式中，本文所述的起始第一扩增程序(例如包括如下扩增，例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的扩增，以及称为预REP或初始REP的扩增)在TIL扩增开始时不需要饲养细胞(在本文中又称为“抗原呈递细胞”)，而在起始第一扩增期间第7天或第8天期间的任何时间添加。在一些实施方式中，本文所述的起始第一扩增程序(例如包括如下扩增，例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的扩增，以及称为预REP或初始REP的扩增)在TIL扩增开始时不需要饲养细胞(在本文中又称为“抗原呈递细胞”)，而在起始第一扩增期间第7天期间的任何时间添加。在一些实施方式中，本文所述的起始第一扩增程序(例如包括如下扩增，例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的扩增，以及称为预REP或初始REP的扩增)在TIL扩增开始时不需要饲养细胞(在本文中又称为“抗原呈递细胞”)，而在起始第一扩增期间第8天期间的任何时间添加。
在一些实施方式中，本文所述的起始第一扩增程序(例如包括如下扩增，例如图8(特别是例如图8B)的步骤B中所描述的扩增，以及称为预REP或初始REP的扩增)在TIL扩增开始时和在起始第一扩增期间需要饲养细胞(在本文中又称为“抗原呈递细胞”)。在许多实施方式中，饲养细胞获自同种异体健康血液供体的标准全血单位的外周血单核细胞(PBMC)。PBMC使用标准方法，例如Ficoll-Paque梯度分离法获得。在一些实施方式中，在起始第一扩增期间使用2.5×108个饲养细胞。在一些实施方式中，在起始第一扩增期间使用每容器2.5×108个饲养细胞。在一些实施方式中，在起始第一扩增期间每个GREX-10使用2.5×108个饲养细胞。在一些实施方式中，在起始第一扩增期间每个GREX-100使用2.5×108个饲养细胞。
通常而言，同种异体PBMC通过辐照或热处理而灭活，如实施例中所描述用于REP程序中，其提供用于评估经辐照同种异体PBMC的复制机能不全的示例性方案。
在一些实施方式中，若第14天活细胞总数小于在起始第一扩增第0天放入培养的初始活细胞数目，则认为PBMC复制机能不全且可接受其用于本文所述的TIL扩增程序。
在一些实施方式中，若第7天在OKT3和IL-2存在下培养的活细胞总数与在起始第一扩增第0天放入培养的初始活细胞数目相比并未增加，则认为PBMC复制机能不全且可接受其用于本文所述的TIL扩增程序。在一些实施方式中，PBMC在30ng/mL OKT3抗体和3000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方式中，PBMC在30ng/mL OKT3抗体和6000IU/mLIL-2存在下培养。
在一些实施方式中，若第7天在OKT3和IL-2存在下培养的活细胞总数与在起始第一扩增第0天放入培养的初始活细胞数目相比并未增加，则认为PBMC复制机能不全且可接受其用于本文所述的TIL扩增程序。在一些实施方式中，PBMC在5-60ng/mL OKT3抗体和1000-6000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方式中，PBMC在10-50ng/mL OKT3抗体和2000-5000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方式中，PBMC在20-40ng/mL OKT3抗体和2000-4000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方式中，PBMC在25-35ng/mL OKT3抗体和2500-3500IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方式中，PBMC在30ng/mL OKT3抗体和6000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方式中，PBMC在15ng/ml OKT3抗体和3000IU/mLIL-2存在下培养。在一些实施方式中，PBMC在15ng/mL OKT3抗体和6000IU/mL IL-2存在下培养。
在一些实施方式中，抗原呈递饲养细胞为PBMC。在一些实施方式中，抗原呈递饲养细胞为人工抗原呈递饲养细胞。在一些实施方式中，在第二扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率为约1比25、约1比50、约1比100、约1比125、约1比150、约1比175、约1比200、约1比225、约1比250、约1比275、约1比300、约1比325、约1比350、约1比375、约1比400或约1比500。在一些实施方式中，在第二扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率介于1比50与1比300之间。在一些实施方式中，在第二扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率介于1比100与1比200之间。
在一些实施方式中，本文所述的起始第一扩增程序需要约2.5×108个饲养细胞比约100×106个TIL的比率。在一些实施方式中，本文所述的起始第一扩增程序需要约2.5×108个饲养细胞比约50×106个TIL的比率。在又一实施方式中，本文所述的起始第一扩增需要约2.5×108个饲养细胞比约25×106个TIL。在又一实施方式中，本文所述的起始第一扩增需要约2.5×108个饲养细胞。在又一实施方式中，起始第一扩增需要四分之一、三分之一、十二分之五或二分之一的用于快速第二扩增的饲养细胞数目。
在一些实施方式中，起始第一扩增中的培养基包含IL-2。在一些实施方式中，起始第一扩增中的培养基包含6000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，起始第一扩增中的培养基包含抗原呈递饲养细胞。在一些实施方式中，起始第一扩增中的培养基包含每容器2.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施方式中，起始第一扩增中的培养基包含OKT-3。在一些实施方式中，培养基包含每容器30ng OKT-3。在一些实施方式中，容器为GREX100 MCS培养瓶。在一些实施方式中，培养基包含6000IU/mL IL-2、30ng/mL OKT-3和2.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施方式中，培养基包含每容器6000IU/mL IL-2、30ng/mL OKT-3和2.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施方式中，培养基包含每容器每2.5×108个抗原呈递饲养细胞500mL培养基和15μg OKT-3。在一些实施方式中，培养基包含每容器500mL培养基和15μg OKT-3。在一些实施方式中，容器为GREX100 MCS培养瓶。在一些实施方式中，培养基包含500mL培养基、6000IU/mL IL-2、30ng/mL OKT-3和2.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施方式中，培养基包含每容器500mL培养基、6000IU/mL IL-2、15μg OKT-3和2.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施方式中，培养基包含每容器每2.5×108个抗原呈递饲养细胞500mL培养基和15μg OKT-3。
在一些实施方式中，本文所述的起始第一扩增程序在第二扩增期间需要多于TIL的过量饲养细胞。在许多实施方式中，饲养细胞获自同种异体健康血液供体的标准全血单位的外周血单核细胞(PBMC)。PBMC使用标准方法，例如Ficoll-Paque梯度分离法获得。在一些实施方式中，使用人工抗原呈递细胞(aAPC)代替PBMC。
通常而言，同种异体PBMC通过辐照或热处理而灭活，用于本文所述的TIL扩增程序，包括图示和实施例中所描述的示例性程序。
在一些实施方式中，在起始第一扩增中使用人工抗原呈递细胞来代替PBMC或与PBMC组合使用。
2.细胞因子及其他添加剂
本文所述的扩增方法通常使用具有高剂量细胞因子(尤其是IL-2)的培养基，如本领域中已知。
替代性地，使用细胞因子的组合进行TIL的起始第一扩增也是可能的，如美国专利申请公开第US2017/0107490 A1号中所描述，使用IL-2、IL-15和IL-21中两种以上的组合，其公开内容以引用的方式并入本文中。因此，可能的组合包括IL-2和IL-15、IL-2和IL-21、IL-15和IL-21和IL-2、IL-15和IL-21，后者在许多实施方式中具有特定用途。使用细胞因子的组合特别有利于产生淋巴细胞，特别是如其中所描述的T细胞。参见例如表2。
在一些实施方式中，步骤B也可包括向培养基中添加OKT-3抗体或莫罗单抗，如本文别处所描述。在一些实施方式中，步骤B也可包括向培养基中添加4-1BB激动剂，如本文别处所描述。在一些实施方式中，步骤B也可包括向培养基中添加OX-40激动剂，如本文别处所描述。此外，可在步骤B期间在培养基中使用添加剂，例如过氧化物酶体增殖物活化受体γ共活化剂I-α激动剂，包括增殖物活化受体(PPAR)-γ激动剂，例如噻唑啶二酮化合物，如在美国专利申请公开第US2019/0307796 A1号中所描述，其公开内容以引用的方式并入本文中。
3.抗生素
本文所述的起始第一扩增方法通常使用包含抗生素组分的培养基。
在一些实施方式中，抗生素组分包含本文公开的任何浓度的：1)万古霉素；2)庆大霉素和万古霉素；或3)庆大霉素和克林霉素。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL至约600μg/mL万古霉素。在一些实施方式中，抗生素组分包含约100μg/mL万古霉素。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约400μg/mL至约600μg/mL克林霉素。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约2.5μg/mL至约10μg/mL双性霉素B。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素和约100μg/mL至约600μg/mL万古霉素。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素和约400μg/mL至约600μg/mL克林霉素。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素、约100μg/mL至约600μg/mL万古霉素和约2.5μg/mL至约10μg/mL双性霉素B。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素、约400μg/mL至约600μg/mL克林霉素和约2.5μg/mL至约10μg/mL双性霉素B。
C.步骤C：起始第一扩增至快速第二扩增的转变
在一些情况下，获自起始第一扩增(其可包括有时称为预REP的扩增)的主体TIL群，包括例如获自例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中所指示的步骤B的TIL群，可经历快速第二扩增(其可包括有时称为快速扩增方案(REP)的扩增)接着如下文所论述进行冷冻保存。类似地，在将经基因修饰的TIL用于疗法的情况下，来自起始第一扩增的经扩增TIL群或来自快速第二扩增的经扩增TIL群可在扩增步骤之前或在起始第一扩增之后且在快速第二扩增之前进行基因修饰以用于适合治疗。
在一些实施方式中，获自起始第一扩增(例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中所指示的步骤B)的TIL经储存直至进行表型分析用于选择。在一些实施方式中，获自起始第一扩增(例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中所指示的步骤B)的TIL未经储存且直接进行快速第二扩增。在一些实施方式中，获自起始第一扩增的TIL在起始第一扩增之后且在快速第二扩增之前未经冷冻保存。在一些实施方式中，起始第一扩增至第二扩增的转变在肿瘤破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后约2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天发生。在一些实施方式中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后约3天至7天发生。在一些实施方式中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后约3天至8天发生。在一些实施方式中，起始第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后约4天至7天发生。在一些实施方式中，起始第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后约4天至8天发生。在一些实施方式中，起始第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后约5天至7天发生。在一些实施方式中，起始第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后约5天至8天发生。在一些实施方式中，起始第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后约6天至7天发生。在一些实施方式中，起始第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后约6天至8天发生。在一些实施方式中，起始第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后约7天至8天发生。在一些实施方式中，起始第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后约7天发生。在一些实施方式中，起始第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后约8天发生。
在一些实施方式中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天发生。在一些实施方式中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后1天至7天发生。在一些实施方式中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后1天至8天发生。在一些实施方式中，起始第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后2天至7天发生。在一些实施方式中，起始第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后2天至8天发生。在一些实施方式中，起始第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后3天至7天发生。在一些实施方式中，起始第一扩增至第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后3天至8天发生。在一些实施方式中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后4天至7天发生。在一些实施方式中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后4天至8天发生。在一些实施方式中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后5天至7天发生。在一些实施方式中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后5天至8天发生。在一些实施方式中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后6天至7天发生。在一些实施方式中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后6天至8天发生。在一些实施方式中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后7天至8天发生。在一些实施方式中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后7天发生在一些实施方式中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变在破碎发生后和/或第一起始扩增步骤开始后8天发生。
在一些实施方式中，TIL在初级第一扩增(primary first expansion)之后且在快速第二扩增之前未经储存，TIL直接进行快速第二扩增(例如在一些实施方式中，在如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中所显示的步骤B至步骤D的转变期间不进行储存)。在一些实施方式中，转变在如本文所述的密闭系统中发生。在一些实施方式中，来自起始第一扩增的TIL，即第二TIL群，直接进行快速第二扩增而无转变期。
在一些实施方式中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变，例如根据图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤C在密闭系统生物反应器中进行。在一些实施方式中，采用密闭系统进行如本文所述的TIL扩增。在一些实施方式中，采用单一生物反应器。在一些实施方式中，所采用的单一生物反应器为例如GREX-10或GREX-100。在一些实施方式中，密闭系统生物反应器为单一生物反应器。在一些实施方式中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变涉及容器大小的规模扩大。在一些实施方式中，与快速第二扩增相比，起始第一扩增在较小容器中进行。在一些实施方式中，起始第一扩增在GREX-100中进行且快速第二扩增在GREX-500中进行。
D.步骤D：快速第二扩增
在一些实施方式中，，TIL细胞群在如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G)中所指示的收集及起始第一扩增(步骤A和步骤B)及称为步骤C的转变之后进一步扩增数目。此进一步扩增在本文中称为快速第二扩增或快速扩增，其可包括在本领域中通常称为快速扩增过程(快速扩增方案或REP)的扩增过程；以及如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤D中所指示的过程)。该快速第二扩增通常使用包含多种组分(包含饲养细胞、细胞因子来源、可选的抗生素组分和抗CD3抗体)的培养基在透气容器中完成。在一些实施方式中，在快速第二扩增开始后1天、2天、3天或4天(即，在整体Gen 3过程的第8天、第9天、第10天或第11天)，将TIL转移至较大体积容器。在一些实施方式中，抗生素组分包含本文公开的任何浓度的：1)万古霉素；2)庆大霉素和万古霉素；或3)庆大霉素和克林霉素。在示例性实施方式中，抗生素组分由本文公开的任何浓度的万古霉素组成。
在一些实施方式中，TIL的快速第二扩增(其可包括有时称为REP的扩增；以及如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤D中所指示的过程)可使用本领域技术人员已知的任何TIL培养瓶或容器进行。在一些实施方式中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。在一些实施方式中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约1天至约9天。在一些实施方式中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约1天至约10天。在一些实施方式中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约2天至约9天。在一些实施方式中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约2天至约10天。在一些实施方式中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约3天至约9天。在一些实施方式中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约3天至约10天。在一些实施方式中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约4天至约9天。在一些实施方式中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约4天至约10天。在一些实施方式中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约5天至约9天。在一些实施方式中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约5天至约10天。在一些实施方式中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约6天至约9天。在一些实施方式中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约6天至约10天。在一些实施方式中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约7天至约9天。在一些实施方式中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约7天至约10天。在一些实施方式中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约8天至约9天。在一些实施方式中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约8天至约10天。在一些实施方式中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约9天至约10天。在一些实施方式中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约1天。在一些实施方式中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约2天。在一些实施方式中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约3天。在一些实施方式中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约4天。在一些实施方式中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约5天。在一些实施方式中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约6天。在一些实施方式中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约7天。在一些实施方式中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约8天。在一些实施方式中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约9天。在一些实施方式中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约10天。
在一些实施方式中，快速第二扩增可在透气容器中使用本公开的方法(包括例如称为REP的扩增；以及如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤D中所指示的过程)进行。在一些实施方式中，TIL在快速第二扩增中在IL-2、抗生素组分、OKT-3和饲养细胞(本文中又称为“抗原呈递细胞”)存在下扩增。在一些实施方式中，TIL在快速第二扩增中在IL-2、OKT-3和饲养细胞存在下扩增，其中添加饲养细胞达到最终浓度，该最终浓度为起始第一扩增中存在的饲养细胞的浓度的2倍、2.4倍、2.5倍、3倍、3.5倍或4倍。例如，TIL可在白介素-2(IL-2)或白介素-15(IL-15)存在下使用非特异性T细胞受体刺激而快速扩增。非特异性T细胞受体刺激物可包括例如抗CD3抗体，例如约30ng/mL OKT3、小鼠单克隆抗CD3抗体(可商购自新泽西州拉里坦市的Ortho-McNeil或加利福尼亚州奥本市的Miltenyi Biotech)或UHCT-1(可商购自美国加利福尼亚州圣地亚哥市的BioLegend)。TIL可通过在第二扩增期间包括一种以上癌症的抗原(包括其抗原部分，例如表位)来扩增以在体外诱导进一步TIL刺激，该抗原可以可选地在T细胞生长因子(例如300IU/mL IL-2或IL-15)存在下可选地由载体表达，该载体例如人白细胞抗原A2(HLA-A2)结合肽，例如0.3μMMART-1:26-35(27L)或gpl 00:209-217(210M)。其他适合抗原可包括例如NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶癌症抗原、MAGE-A3、SSX-2和VEGFR2，或其抗原部分。TIL也可通过用脉冲至表达HLA-A2的抗原呈递细胞上的相同癌症抗原再刺激而快速扩增。替代性地，TIL可进一步用例如实施例经辐照的自体淋巴细胞或用经辐照的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2再刺激。在一些实施方式中，再刺激作为第二扩增的一部分发生。在一些实施方式中，第二扩增在经辐照的自体淋巴细胞或经辐照的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2存在下发生。在一些实施方式中，抗生素组分包含本文公开的任何浓度的：1)万古霉素；2)庆大霉素和万古霉素；或3)庆大霉素和克林霉素。在示例性实施方式中，抗生素组分由本文公开的任何浓度的万古霉素组成。
在一些实施方式中，细胞培养基进一步包含IL-2。在一些实施方式中，细胞培养基包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，细胞培养基包含约1000IU/mL、约1500IU/mL、约2000IU/mL、约2500IU/mL、约3000IU/mL、约3500IU/mL、约4000IU/mL、约4500IU/mL、约5000IU/mL、约5500IU/mL、约6000IU/mL、约6500IU/mL、约7000IU/mL、约7500IU/mL或约8000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，，细胞培养基包含1000与2000IU/mL之间、2000与3000IU/mL之间、3000与4000IU/mL之间、4000与5000IU/mL之间、5000与6000IU/mL之间、6000与7000IU/mL之间、7000与8000IU/mL之间或8000IU/mL之间的IL-2。
在一些实施方式中，细胞培养基包含OKT-3抗体。在一些实施方式中，细胞培养基包含约30ng/mL OKT-3抗体。在一些实施方式中，细胞培养基包含约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2.5ng/mL、约5ng/mL、约7.5ng/mL、约10ng/mL、约15ng/mL、约20ng/mL、约25ng/mL、约30ng/mL、约35ng/mL、约40ng/mL、约50ng/mL、约60ng/mL、约70ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约100ng/mL、约200ng/mL、约500ng/mL和约1μg/mL OKT-3抗体。在一些实施方式中，细胞培养基包含在0.1ng/mL与1ng/mL之间、在1ng/mL与5ng/mL之间、在5ng/mL与10ng/mL之间、在10ng/mL与20ng/mL之间、在20ng/mL与30ng/mL之间、在30ng/mL与40ng/mL之间、在40ng/mL与50ng/mL之间和在50ng/mL与100ng/mL之间的OKT-3抗体。在一些实施方式中，细胞培养基包含在15ng/mL与30ng/mL之间的OKT-3抗体。在一些实施方式中，细胞培养基包含在30ng/mL与60ng/mL之间的OKT-3抗体。在一些实施方式中，细胞培养基包含约30ng/mLOKT-3。在一些实施方式中，细胞培养基包含约60ng/mL OKT-3。在一些实施方式中，OKT-3抗体为莫罗单抗。
在一些实施方式中，快速第二扩增中的培养基包含IL-2。在一些实施方式中，培养基包含6000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，快速第二扩增中的培养基包含抗原呈递饲养细胞。在一些实施方式中，快速第二扩增中的培养基包含每容器7.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施方式中，快速第二扩增中的培养基包含OKT-3。在一些实施方式中，快速第二扩增中的培养基包含每容器500mL培养基和30μg OKT-3。在一些实施方式中，容器为G-REX-100MCS培养瓶。在一些实施方式中，快速第二扩增中的培养基包含6000IU/mL IL-2、60ng/mL OKT-3和7.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施方式中，培养基包含每容器500mL培养基和6000IU/mL IL-2、30μg OKT-3和7.5×108个抗原呈递饲养细胞。
在一些实施方式中，快速第二扩增中的培养基包含IL-2。在一些实施方式中，培养基包含6000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，快速第二扩增中的培养基包含抗原呈递饲养细胞。在一些实施方式中，培养基包含每容器在5×108与7.5×108个之间的抗原呈递饲养细胞。在一些实施方式中，快速第二扩增中的培养基包含OKT-3。在一些实施方式中，快速第二扩增中的培养基包含每容器500mL培养基和30μg OKT-3。在一些实施方式中，容器为G-REX-100MCS培养瓶。在一些实施方式中，快速第二扩增中的培养基包含6000IU/mL IL-2、60ng/mL OKT-3和在5×108与7.5×108个之间的抗原呈递饲养细胞。在一些实施方式中，快速第二扩增中的培养基包含每容器500mL培养基和6000IU/mL IL-2、30μg OKT-3和在5×108与7.5×108个之间的抗原呈递饲养细胞。
在一些实施方式中，细胞培养基包含一种以上TNFRSF激动剂在细胞培养基中。在一些实施方式中，TNFRSF激动剂包括4-1BB激动剂。在一些实施方式中，TNFRSF激动剂为4-1BB激动剂，4-1BB激动剂选自如下：乌瑞鲁单抗、乌图木单抗、EU-101、融合蛋白及其片段、衍生物、变体、生物类似物以及它们的组合。在一些实施方式中，添加的TNFRSF激动剂的浓度足以在细胞培养基中达成在0.1μg/mL与100μg/mL之间的浓度。在一些实施方式中，添加的TNFRSF激动剂的浓度足以在细胞培养基中达成在20μg/mL与40μg/mL之间的浓度。
在一些实施方式中，除了一种以上TNFRSF激动剂之外，细胞培养基进一步包含初始浓度为约3000IU/mL的IL-2和初始浓度为约30ng/mL的OKT-3抗体，其中该一种以上TNFRSF激动剂包括4-1BB激动剂。
在一些实施方式中，采用IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21的组合作为在第二扩增期间的组合。在一些实施方式中，在第二扩增期间，包括例如在根据图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)以及本文所述的步骤D过程期间可包括IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21，以及它们的任何组合。在一些实施方式中，采用IL-2、IL-15和IL-21的组合作为在第二扩增期间的组合。在一些实施方式中，在根据图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)以及如本文所述的步骤D过程期间可包括IL-2、IL-15和IL-21以及它们的任何组合。
在一些实施方式中，第二扩增可在包含IL-2、OKT-3、抗原呈递饲养细胞且可选地包含TNFRSF激动剂的补充细胞培养基中进行。在一些实施方式中，第二扩增在补充细胞培养基中发生。在一些实施方式中，补充细胞培养基包含IL-2、OKT-3和抗原呈递饲养细胞。在一些实施方式中，第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC；又称为抗原呈递饲养细胞)。在一些实施方式中，第二扩增在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递饲养细胞(即，抗原呈递细胞)的细胞培养基中发生。
在一些实施方式中，第二扩增培养基包含约500IU/mL IL-15、约400IU/mL IL-15、约300IU/mL IL-15、约200IU/mL IL-15、约180IU/mL IL-15、约160IU/mL IL-15、约140IU/mL IL-15、约120IU/mL IL-15或约100IU/mL IL-15。在一些实施方式中，第二扩增培养基包含约500IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施方式中，第二扩增培养基包含约400IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施方式中，第二扩增培养基包含约300IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施方式中，第二扩增培养基包含约200IU/mL IL-15。在一些实施方式中，细胞培养基包含约180IU/mL IL-15。在一些实施方式中，细胞培养基进一步包含IL-15。在一些实施方式中，细胞培养基包含约180IU/mL IL-15。
在一些实施方式中，第二扩增培养基包含约20IU/mL IL-21、约15IU/mL IL-21、约12IU/mL IL-21、约10IU/mL IL-21、约5IU/mL IL-21、约4IU/mL IL-21、约3IU/mL IL-21、约2IU/mL IL-21、约1IU/mL IL-21或约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方式中，第二扩增培养基包含约20IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方式中，第二扩增培养基包含约15IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方式中，第二扩增培养基包含约12IU/mLIL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方式中，第二扩增培养基包含约10IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方式中，第二扩增培养基包含约5IU/mL IL-21至约1IU/mLIL-21。在一些实施方式中，第二扩增培养基包含约2IU/mL IL-21。在一些实施方式中，细胞培养基包含约1IU/mL IL-21。在一些实施方式中，细胞培养基包含约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方式中，细胞培养基进一步包含IL-21。在一些实施方式中，细胞培养基包含约1IU/mL IL-21。
在一些实施方式中，抗原呈递饲养细胞(APC)为PBMC。在一些实施方式中，在快速扩增和/或第二扩增中TIL与PBMC和/或抗原呈递细胞的比率为约1比10、约1比15、约1比20、约1比25、约1比30、约1比35、约1比40、约1比45、约1比50、约1比75、约1比100、约1比125、约1比150、约1比175、约1比200、约1比225、约1比250、约1比275、约1比300、约1比325、约1比350、约1比375、约1比400、或约1比500。在一些实施方式中，在快速扩增和/或第二扩增中TIL与PBMC的比率介于1比50与1比300之间。在一些实施方式中，在快速扩增和/或第二扩增中TIL与PBMC的比率介于1比100与1比200之间。
在一些实施方式中，REP和/或快速第二扩增在培养瓶中进行，其中主体TIL与100倍或200倍过量的灭活饲养细胞、30ng/mL OKT3抗CD3抗体和6000IU/mL IL-2混合于150mL培养基中，饲养细胞浓度是起始第一扩增中的饲养细胞浓度的至少1.1倍(1.1X)、1.2X、1.3X、1.4X、1.5X、1.6X、1.7X、1.8X、1.8X、2X、2.1X、2.2X、2.3X、2.4X、2.5X、2.6X、2.7X、2.8X、2.9X、3.0X、3.1X、3.2X、3.3X、3.4X、3.5X、3.6X、3.7X、3.8X、3.9X或4.0X。更换培养基(通常通过抽吸2/3用过的培养基并用相等体积的新鲜培养基更换来更换2/3培养基)直至细胞转移至替代生长箱室。替代生长箱室包括G-REX培养瓶和透气容器，如下文更充分地论述。
在一些实施方式中，快速第二扩增(其可包括称为REP程序的过程)为7至9天，如实施例和图示中所论述。在一些实施方式中，第二扩增为7天。在一些实施方式中，第二扩增为8天。在一些实施方式中，第二扩增为9天。
在一些实施方式中，第二扩增(其可包括称为REP的扩增，以及在图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤D中提及的扩增)可在500mL容量的具有100cm透气硅底的透气培养瓶(G-Rex 100，可商购自美国明尼苏达州新布莱顿市的Wilson WolfManufacturing Corporation)中进行，5×106或10×106个TIL可与PBMC一起在400mL的补充有5％人AB血清、3000IU/mL IL-2和30ng/ml抗CD3(OKT3)的50/50培养基中培养。G-REX-100培养瓶可在37℃下在5％ CO2下孵育。第5天，可移除250mL上清液，置于离心机瓶中，以1500rpm(491×g)离心10分钟。可将TIL沉淀物用150mL的含有5％人AB血清、6000IU/mL IL-2的新鲜培养基再悬浮，添加回原始GREX-100培养瓶中。当TIL在G-REX-100培养瓶中连续扩增时，在第10天或第11天可将TIL移至较大培养瓶，例如GREX-500。细胞可在培养的第14天收集。细胞可在培养的第15天收集。细胞可在培养的第16天收集。在一些实施方式中，更换培养基直至细胞转移至替代生长箱室。在一些实施方式中，通过抽吸用过的培养基并用相等体积的新鲜培养基更换来更换2/3培养基。在一些实施方式中，替代生长箱室包括GREX培养瓶和透气容器，如下文更充分地论述。
在一些实施方式中，快速第二扩增培养基可选地包含抗生素组分。在一些实施方式中，抗生素组分包含本文公开的任何浓度的：1)万古霉素；2)庆大霉素和万古霉素；或3)庆大霉素和克林霉素。在一些实施方式中，快速扩增培养基中的抗生素组分与起始第一扩增培养基中的抗生素组分相同。在其他实施方式中，快速扩增培养基中的抗生素组分与起始第一扩增培养基中的抗生素组分不同。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL至约600μg/mL万古霉素。在一些实施方式中，抗生素组分包含约100μg/mL万古霉素。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约400μg/mL至约600μg/mL克林霉素。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约2.5μg/mL至约10μg/mL双性霉素B。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素和约50μg/mL至约600μg/mL万古霉素。在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素和约100μg/mL万古霉素。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素和约400μg/mL至约600μg/mL克林霉素。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素、约50μg/mL至约600μg/mL万古霉素和约2.5μg/mL至约10μg/mL双性霉素B。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素、约400μg/mL至约600μg/mL克林霉素和约2.5μg/mL至约10μg/mL双性霉素B。
在一些实施方式中，本文公开的扩增过程中使用的培养基为无血清培养基或成分确定的培养基。在一些实施方式中，无血清或成分确定的培养基包含基础细胞培养基和血清补充剂和/或血清替代物。在一些实施方式中，无血清或成分确定的培养基用于防止和/或减少部分因含血清培养基的批次间变化所致的实验变化。
在一些实施方式中，无血清或成分确定的培养基包含基础细胞培养基和血清补充剂和/或血清替代物。在一些实施方式中，基础细胞培养基包括但不限于CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基、CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM、CTSTMAIM-V培养基、CTSTMAIM-V SFM、LymphoONETMT细胞扩增无外源物质培养基、杜尔贝科氏改良型伊格尔氏培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔氏基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基和伊斯科夫氏改良型杜尔贝科氏培养基。
在一些实施方式中，血清补充剂或血清替代物包括但不限于以下中的一种以上：CTSTMOpTmizer T细胞扩增血清补充剂、CTSTM免疫细胞血清替代物、一种以上白蛋白或白蛋白代用物、一种以上氨基酸、一种以上维生素、一种以上转铁蛋白或转铁蛋白代用物、一种以上抗氧化剂、一种以上胰岛素或胰岛素代用物、一种以上胶原蛋白前体、抗生素组分和一种以上微量元素。在一些实施方式中，成分确定的培养基包含白蛋白和一种以上选自如下的成分：甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、硫胺素、还原谷胱甘肽、L-抗坏血酸-2-磷酸盐、铁饱和转铁蛋白、胰岛素以及含有微量元素部分Ag+、Al3+、Ba2+、Cd2+、Co2+、Cr3 +、Ge4+、Se4+、Br、T、Mn2+、P、Si4+、V5+、Mo6+、Ni2+、Rb+、Sn2+和Zr4+的化合物。在一些实施方式中，成分确定的培养基进一步包含L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和/或2-巯基乙醇。
在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞免疫细胞血清替代物与常规生长培养基一起使用，该常规生长培养基包括但不限于CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基、CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM、CTSTMAIM-V培养基、CSTTMAIM-V SFM、LymphoONETMT细胞扩增无外源物质培养基、杜尔贝科氏改良型伊格尔氏培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔氏基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基和伊斯科夫氏改良型杜尔贝科氏培养基。
在一些实施方式中，以无血清或成分确定的培养基的总体积计，无血清或成分确定的培养基中的总血清替代物浓度(vol％)为约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些实施方式中，总血清替代物浓度为无血清或成分确定的培养基的总体积的约3％。在一些实施方式中，总血清替代物浓度为无血清或成分确定的培养基的总体积的约5％。在一些实施方式中，总血清替代物浓度为无血清或成分确定的培养基的总体积的约10％。
在一些实施方式中，无血清或成分确定的培养基为CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM(ThermoFisher Scientific)。任何CTSTMOpTmizerTM制剂皆可用于本发明。CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM是1L CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基与26mL CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂在使用前混合在一起的组合。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)以及55mM 2-巯基乙醇。
在一些实施方式中，成分确定的培养基为CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM(ThermoFisher Scientific)。任何CTSTMOpTmizerTM制剂皆可用于本发明。CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM是1L CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基与26mL CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂在使用前混合在一起的组合。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)以及55mM 2-巯基乙醇。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)、55mM 2-巯基乙醇和2mM L-谷氨酰胺。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)、55mM 2-巯基乙醇和2mM L-谷氨酰胺，进一步包含约1000IU/mL至约8000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)、55mM 2-巯基乙醇和2mM L-谷氨酰胺，进一步包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)、55mM 2-巯基乙醇和2mM L-谷氨酰胺，进一步包含约6000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisherScientific)和55mM 2-巯基乙醇，进一步包含约1000IU/mL至约8000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)和55mM 2-巯基乙醇，进一步包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)和55mM 2-巯基乙醇，进一步包含约1000IU/mL至约6000IU/mLIL-2。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)和约2mM谷氨酰胺，进一步包含约1000IU/mL至约8000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)和约2mM谷氨酰胺，进一步包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)和约2mM谷氨酰胺，进一步包含约6000IU/mL IL-2。
在一些实施方式中，无血清培养基或成分确定的培养基补充有浓度为约0.1mM至约10mM、0.5mM至约9mM、1mM至约8mM、2mM至约7mM、3mM至约6mM或4mM至约5mM的谷氨酰胺(即，)。在一些实施方式中，无血清培养基或成分确定的培养基补充有浓度为约2mM的谷氨酰胺(即，)。
在一些实施方式中，无血清培养基或成分确定的培养基补充有浓度为约5mM至约150mM、10mM至约140mM、15mM至约130mM、20mM至约120mM、25mM至约110mM、30mM至约100mM、35mM至约95mM、40mM至约90mM、45mM至约85mM、50mM至约80mM、55mM至约75mM、60mM至约70mM或约65mM的2-巯基乙醇。在一些实施方式中，无血清培养基或成分确定的培养基补充有浓度为约55mM的2-巯基乙醇。
在一些实施方式中，以引用的方式并入本文中的国际专利申请公开第WO 1998/030679号和美国专利申请公开第US2002/0076747 A1号中所描述的成分确定的培养基可用于本发明中。在该公开中，描述了无血清真核细胞培养基。无血清真核细胞培养基包括补充有能够支持细胞在无血清培养中生长的无血清补充剂的基础细胞培养基。无血清真核细胞培养基补充剂包含一种以上选自如下的成分，或通过组合一种以上选自如下的成分而获得：一种以上白蛋白或白蛋白代用物、一种以上氨基酸、一种以上维生素、一种以上转铁蛋白或转铁蛋白代用物、一种以上抗氧化剂、一种以上胰岛素或胰岛素代用物、一种以上胶原蛋白前体、一种以上微量元素和抗生素组分。在一些实施方式中，成分确定的培养基进一步包含L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和/或β-巯基乙醇。在一些实施方式中，成分确定的培养基包含白蛋白或白蛋白代用物和一种以上选自如下的成分：一种以上氨基酸、一种以上维生素、一种以上转铁蛋白或转铁蛋白代用物、一种以上抗氧化剂、一种以上胰岛素或胰岛素代用物、一种以上胶原蛋白前体和一种以上微量元素。在一些实施方式中，成分确定的培养基包含白蛋白和一种以上选自如下的成分：甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、硫胺素、还原谷胱甘肽、L-抗坏血酸-2-磷酸盐、铁饱和转铁蛋白、胰岛素以及含有微量元素部分Ag+、Al3+、Ba2+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Ge4+、Se4+、Br、T、Mn2+、P、Si4+、V5+、Mo6+、Ni2+、Rb+、Sn2+和Zr4+的化合物。在一些实施方式中，基础细胞培养基选自如下：杜尔贝科氏改良型伊格尔氏培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔氏基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基和伊斯科夫氏改良型杜尔贝科氏培养基。
在一些实施方式中，成分确定的培养基中甘氨酸的浓度在约5-200mg/L的范围内，L-组氨酸的浓度为约5-250mg/L，L-异亮氨酸的浓度为约5-300mg/L，L-甲硫氨酸的浓度为约5-200mg/L，L-苯丙氨酸的浓度为约5-400mg/L，L-脯氨酸的浓度为约1-1000mg/L，L-羟基脯氨酸的浓度为约1-45mg/L，L-丝氨酸的浓度为约1-250mg/L，L-苏氨酸的浓度为约10-500mg/L，L-色氨酸的浓度为约2-110mg/L，L-酪氨酸的浓度为约3-175mg/L，L-缬氨酸的浓度为约5-500mg/L，硫胺素的浓度为约1-20mg/L，还原谷胱甘肽的浓度为约1-20mg/L，L-抗坏血酸-2-磷酸盐的浓度为约1-200mg/L，铁饱和转铁蛋白的浓度为约1-50mg/L，胰岛素的浓度为约1-100mg/L，亚硒酸钠的浓度为约0.000001-0.0001mg/L，白蛋白(例如I)的浓度为约5000-50,000mg/L。
在一些实施方式中，成分确定的培养基中的非微量元素部分成分以表4中标题“1X培养基中的浓度范围”栏中列出的浓度范围存在。在其他实施方式中，成分确定的培养基中的非微量元素部分成分以表4中标题“1X培养基的优选实施方式”栏中列出的最终浓度存在。在其他实施方式中，成分确定的培养基为包含无血清补充剂的基础细胞培养基。在一些该实施方式中，无血清补充剂包含表4中的类型和标题“补充剂的优选实施方式”栏中列出的浓度的非微量部分成分。
在一些实施方式中，成分确定的培养基的渗透压介于约260与350mOsmol之间。在一些实施方式中，渗透压介于约280与310mOsmol之间。在一些实施方式中，成分确定的培养基补充有至多约3.7g/L或约2.2g/L碳酸氢钠。成分确定的培养基可进一步补充有L-谷氨酰胺(最终浓度为约2mM)、抗生素组分、非必需氨基酸(NEAA；最终浓度为约100μM)、2-巯基乙醇(最终浓度为约100μM)。
在一些实施方式中，Smith等人,《临床与转化免疫学》,4(1),2015(doi:10.1038/cti.2014.31)中所描述的成分确定的培养基可用于本发明中。简言之，使用RPMI或CTSTMOpTmizerTM作为基础细胞培养基且补充有0、2％、5％或10％ CTSTM免疫细胞血清替代物。
在一些实施方式中，第一透气容器和/或第二透气容器中的细胞培养基为未经过滤的。使用未经过滤的细胞培养基可简化扩增细胞数目所需的程序。在一些实施方式中，第一透气容器和/或第二透气容器中的细胞培养基缺乏β-巯基乙醇(BME或βME；又称为2-巯基乙醇，CAS 60-24-2)。
在一些实施方式中，进行快速第二扩增(包括称为REP的扩增)，其进一步包括其中选择具有优良肿瘤反应性的TIL的步骤。可使用本领域中已知的任何选择方法。例如，可使用美国专利申请公开第2016/0010058A1号(其公开内容以引用的方式并入本文中)中所描述的方法选择具有优良肿瘤反应性的TIL。
可选地，可在快速第二扩增(包括称为REP扩增的扩增)之后使用本领域中已知的标准分析来进行细胞存活率分析。例如，可对主体TIL样本进行台盼蓝排除分析，台盼蓝选择性标记死细胞且允许存活率评定。在一些实施方式中，TIL样本可使用Cellometer K2自动化细胞计数器(马萨诸塞州劳伦斯市的Nexcelom Bioscience)计数和确定存活率。在一些实施方式中，存活率是根据标准Cellometer K2 Image Cytometer自动细胞计数器方案确定。
T淋巴细胞和B淋巴细胞的多种抗原受体通过有限但大量的基因区段的体细胞重组产生。这些基因区段：V(可变区)、D(多变区)、J(连接区)和C(恒定区)决定免疫球蛋白和T细胞受体(TCR)的结合特异性和下游应用。本发明提供了一种用于产生展现增加的T细胞贮库多样性的TIL的方法。在一些实施方式中，通过本发明方法获得的TIL展现增加的T细胞贮库多样性。在一些实施方式中，在第二扩增中获得的TIL展现增加的T细胞贮库多样性。在一些实施方式中，多样性增加是免疫球蛋白多样性和/或T细胞受体多样性增加。在一些实施方式中，多样性存在于免疫球蛋白中，存在于免疫球蛋白重链中。在一些实施方式中，多样性存在于免疫球蛋白中，存在于免疫球蛋白轻链中。在一些实施方式中，多样性存在于T细胞受体中。在一些实施方式中，多样性存在于选自α、β、γ和δ受体的T细胞受体中的一者中。在一些实施方式中，T细胞受体(TCR)α和/或β的表达增加。在一些实施方式中，T细胞受体(TCR)α的表达增加。在一些实施方式中，T细胞受体(TCR)β的表达增加。在一些实施方式中，TCRab(即，TCRα/β)的表达增加。
在一些实施方式中，快速第二扩增培养基(例如有时称为CM2或第二细胞培养基)包含IL-2、OKT-3以及抗原呈递饲养细胞(APC)，如下文更详细论述。在一些实施方式中，快速第二扩增培养基(例如有时称为CM2或第二细胞培养基)包含6000IU/mL IL-2、30μg/培养瓶OKT-3以及7.5×108个抗原呈递饲养细胞(APC)，如下文更详细论述。在一些实施方式中，快速第二扩增培养基(例如有时称为CM2或第二细胞培养基)包含IL-2、OKT-3以及抗原呈递饲养细胞(APC)，如下文更详细论述。在一些实施方式中，快速第二扩增培养基(例如有时称为CM2或第二细胞培养基)包含6000IU/mL IL-2、30μg/培养瓶OKT-3以及5×108个抗原呈递饲养细胞(APC)，如下文更详细论述。
在一些实施方式中，快速第二扩增，例如根据图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤D，在密闭系统生物反应器中进行。在一些实施方式中，采用密闭系统进行如本文所述的TIL扩增。在一些实施方式中，采用生物反应器。在一些实施方式中，采用生物反应器作为容器。在一些实施方式中，所采用的生物反应器为例如G-REX-100或G-REX-500。在一些实施方式中，所采用的生物反应器为G-REX-100。在一些实施方式中，所采用的生物反应器为G-REX-500。
在一些实施方式中，快速第二扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养TIL约3至7天的时间段来进行快速第二扩增；接着(b)实现将小规模培养中的T细胞转移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500-MCS容器)中，在第二容器中的较大规模培养中培养来自小规模培养的TIL约4至7天的时间段。
在一些实施方式中，快速第二扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩展：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的第一小规模培养中培养TIL约3至7天的时间段来进行快速第二扩增；接着(b)将来自第一小规模培养的TIL转移且分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小与第一容器相同的第二容器中，其中，在各第二容器中，将转移至此类第二容器的来自第一小规模培养的TIL部分在第二小规模培养中培养约4至7天的时间段。
在一些实施方式中，将第一小规模TIL培养物分配成多个约2至5个TIL亚群。
在一些实施方式中，快速第二扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩展和规模扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养TIL约3至7天的时间段来进行快速第二扩增；接着(b)将来自小规模培养的TIL转移且分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，其中，在各第二容器中，将转移至此类第二容器的来自小规模培养的TIL部分在较大规模培养中培养约4至7天的时间段。
在一些实施方式中，将快速第二扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩展和规模扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养TIL约5天的时间段来进行快速第二扩增；接着(b)将来自小规模培养的T细胞转移且分配至2、3或4个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，其中，在各第二容器中，将转移至此类第二容器的来自小规模培养的TIL部分在较大规模培养中培养约6天的时间段。
在一些实施方式中，在快速第二扩增分流时，各第二容器包含至少108个TIL。在一些实施方式中，在快速或第二扩增分流时，各第二容器包含至少108个TIL、至少109个TIL或至少1010个TIL。在一个示例性实施方式中，各第二容器包含至少1010个TIL。
在一些实施方式中，将第一小规模TIL培养物分配成多个亚群。在一些实施方式中，将第一小规模TIL培养物分配成多个约2至5个亚群。在一些实施方式中，将第一小规模TIL培养物分配成多个约2、3、4或5个亚群。
在一些实施方式中，在完成快速第二扩增后，多个亚群包含治疗有效量的TIL。在一些实施方式中，在完成快速或第二扩增后，将一个以上TIL亚群合并在一起以产生治疗有效量的TIL。在一些实施方式中，在完成快速扩增后，每个TIL亚群包含治疗有效量的TIL。
在一些实施方式中，在分成多个步骤之前，快速第二扩增进行约3至7天的时间段。在一些实施方式中，快速第二扩增的分流在快速或第二扩增开始后约第3天、第4天、第5天、第6天第7天发生。
在一些实施方式中，快速第二扩增的分流在第一扩增(即，预REP扩增)开始后约第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第15天或第16天、第17天或第18天发生。在一个示例性实施方式中，快速或第二扩增的分流在第一扩增开始后约第16天发生。
在一些实施方式中，在分流之后，快速第二扩增进一步进行约7至11天的时间段。在一些实施方式中，该快速第二扩增在分流之后进一步进行约5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的时间段。
在一些实施方式中，用于分流前快速第二扩增的细胞培养基包含与用于分流后快速第二扩增的细胞培养基相同的组分。在一些实施方式中，用于分流前快速第二扩增的细胞培养基包含与用于分流后快速第二扩增的细胞培养基不同的组分。
在一些实施方式中，用于分流前快速第二扩增的细胞培养基包含IL-2、可选的OKT-3和进一步可选的APC。在一些实施方式中，用于分流前快速第二扩增的细胞培养基包含IL-2、OKT-3和进一步可选的APC。在一些实施方式中，用于分流前快速第二扩增的细胞培养基包含IL-2、OKT-3和APC。
在一些实施方式中，用于分流前快速第二扩增的细胞培养基通过用包含IL-2、可选的OKT-3和进一步可选的APC的新鲜培养基补充第一扩增中的细胞培养基来产生。在一些实施方式中，用于分流前快速第二扩增的细胞培养基通过用包含IL-2、OKT-3和APC的新鲜培养基补充第一扩增中的细胞培养基来产生。在一些实施方式中，用于分流前快速第二扩增的细胞培养基通过用包含IL-2、可选的OKT-3和进一步可选的APC的新鲜细胞培养基替换第一扩增中的细胞培养基来产生。在一些实施方式中，用于分流前快速第二扩增的细胞培养基通过用包含IL-2、OKT-3和APC的新鲜细胞培养基替换第一扩增中的细胞培养基来产生。
在一些实施方式中，用于分流后快速第二扩增的细胞培养基包含IL-2和可选的OKT-3。在一些实施方式中，用于分流后快速第二扩增的细胞培养基包含IL-2和OKT-3。在一些实施方式中，用于分流后快速第二扩增的细胞培养基通过用包含IL-2和可选的OKT-3的新鲜培养基替换用于分流前快速第二扩增的细胞培养基来产生。在一些实施方式中，用于分流后快速第二扩增的细胞培养基通过用包含IL-2和OKT-3的新鲜细胞培养基替换用于分流前快速第二扩增的细胞培养基来产生。
1.饲养细胞和抗原呈递细胞
在一些实施方式中，本文所述的快速第二扩增程序(例如包括如下扩增，例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤D中所描述的扩增，以及称为REP的扩增)在REP TIL扩增期间和/或在快速第二扩增期间需要过量的饲养细胞。在许多实施方式中，饲养细胞获自健康血液供体的标准全血单位的外周血单核细胞(PBMC)。PBMC使用标准方法，例如Ficoll-Paque梯度分离法获得。
通常而言，同种异体PBMC通过辐照或热处理而灭活，如实施例中所描述用于REP程序中，其提供用于评估经辐照同种异体PBMC的复制机能不全的示例性方案。
在一些实施方式中，若第7天或第14天活细胞总数小于在REP第0天和/或第二扩增第0天(即，第二扩增的起始日)放入培养的初始活细胞数目，则认为PBMC复制机能不全且可接受其用于本文所述的TIL扩增程序。
在一些实施方式中，若第7天和第14天在OKT3和IL-2存在下培养的活细胞总数与在REP第0天和/或第二扩增第0天(即，第二扩增的起始日)放入培养的初始活细胞数目相比并未增加，则认为PBMC复制机能不全且可接受其用于本文所述的TIL扩增程序。在一些实施方式中，PBMC在30ng/mL OKT3抗体和3000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方式中，PBMC在60ng/mL OKT3抗体和6000IU/mLlIL-2存在下培养。在一些实施方式中，PBMC在60ng/mLOKT3抗体和3000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方式中，PBMC在30ng/mL OKT3抗体和6000IU/mL IL-2存在下培养。
在一些实施方式中，若第7天和第14天在OKT3和IL-2存在下培养的活细胞总数与在REP第0天和/或第二扩增第0天(即，第二扩增的起始日)放入培养的初始活细胞数目相比并未增加，则认为PBMC复制机能不全且可接受其用于本文所述的TIL扩增程序。在一些实施方式中，PBMC在30-60ng/mL OKT3抗体和1000至6000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方式中，PBMC在30-60ng/mL OKT3抗体和2000-5000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方式中，PBMC在30-60ng/mL OKT3抗体和2000-4000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方式中，PBMC在30-60ng/mL OKT3抗体和2500-3500IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方式中，PBMC在30-60ng/mL OKT3抗体和6000IU/mL IL-2存在下培养。
在一些实施方式中，抗原呈递饲养细胞为PBMC。在一些实施方式中，抗原呈递饲养细胞为人工抗原呈递饲养细胞。在一些实施方式中，第二扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率为约1比10、约1比25、约1比50、约1比100、约1比125、约1比150、约1比175、约1比200、约1比225、约1比250、约1比275、约1比300、约1比325、约1比350、约1比375、约1比400或约1比500。在一些实施方式中，在第二扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率介于1比50与1比300之间。在一些实施方式中，在第二扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率介于1比100与1比200之间。
在一些实施方式中，本文所述的第二扩增程序需要约5×108个饲养细胞比约100×106个TIL的比率。在一些实施方式中，本文所述的第二扩增程序需要约7.5×108个饲养细胞比约100×106个TIL的比率。在一些实施方式中，本文所述的第二扩增程序需要约5×108个饲养细胞比约50×106个TIL的比率。在一些实施方式中，本文所述的第二扩增程序需要约7.5×108个饲养细胞比约50×106个TIL的比率。在又一实施方式中，本文所述的第二扩增程序需要约5×108个饲养细胞比约25×106个TIL。在又一实施方式中，本文所述的第二扩增程序需要约7.5×108个饲养细胞与约25×106个TIL。在又一实施方式中，快速第二扩增需要快速第二扩增的两倍数目的饲养细胞。在又一实施方式中，当本文所述的起始第一扩增需要约2.5×108个饲养细胞时，快速第二扩增需要约5×108个饲养细胞。在又一实施方式中，当本文所述的起始第一扩增需要约2.5×108个饲养细胞时，快速第二扩增需要约7.5×108个饲养细胞。在又一实施方式中，快速第二扩增需要起始第一扩增的两倍(2.0X)、2.5X、3.0X、3.5X或4.0X数目的饲养细胞。
在一些实施方式中，本文所述的快速第二扩增程序在快速第二扩增期间需要过量的饲养细胞。在许多实施方式中，饲养细胞获自同种异体健康血液供体的标准全血单位的外周血单核细胞(PBMC)。PBMC使用标准方法，例如Ficoll-Paque梯度分离法获得。在一些实施方式中，使用人工抗原呈递细胞(aAPC)代替PBMC。在一些实施方式中，PBMC以添加至起始第一扩增的PBMC浓度的两倍添加至快速第二扩增。
通常而言，同种异体PBMC通过辐照或热处理而灭活，用于本文所述的TIL扩增程序，包括图示和实施例中所描述的示例性过程。
在一些实施方式中，快速第二扩增中使用人工抗原呈递细胞来代替PBMC或与PBMC组合使用。
2.细胞因子及其他添加剂
本文所述的第二扩增方法通常使用具有高剂量细胞因子(尤其是IL-2)的培养基，如本领域中已知。
替代性地，使用细胞因子的组合进行TIL的快速第二扩增也是可能的，如美国专利申请公开第US2017/0107490 A1号中所描述，使用IL-2、IL-15和IL-21中两种以上的组合，其公开内容以引用的方式并入本文中。因此，可能的组合包括IL-2和IL-15、IL-2和IL-21、IL-15和IL-21和IL-2、IL-15和IL-21，后者在许多实施方式中具有特定用途。使用细胞因子的组合特别有利于产生淋巴细胞，特别是如其中所描述的T细胞。
在一些实施方式中，步骤D(特别来自例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)也可包括将OKT-3抗体或莫罗单抗添加至培养基中，如本文别处所描述。在一些实施方式中，步骤D也可包括向培养基中添加4-1BB激动剂，如本文别处所描述。在一些实施方式中，步骤D(特别来自例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)也可包括将OX-40激动剂添加至培养基中，如本文别处所描述。此外，可在步骤D(特别来自例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)期间在培养基中使用添加剂，例如过氧物酶体增殖物活化受体γ共活化剂I-α激动剂，包括增殖物活化受体(PPAR)-γ激动剂，例如噻唑啶二酮化合物，如在美国专利申请公开第US2019/0307796 A1号中所描述，其公开内容以引用的方式并入本文中。
3.抗生素
本文所述的快速第二扩增方法通常使用包含抗生素组分的培养基。在一些实施方式中，快速第二扩增中的抗生素组分与起始第一扩增中的抗生素组分相同。在其他实施方式中，快速第二扩增中的抗生素组分与起始第一扩增中的抗生素组分不同。
在一些实施方式中，抗生素组分包含本文公开的任何浓度的：1)万古霉素；2)庆大霉素和万古霉素；或3)庆大霉素和克林霉素。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约100μg/mL至约600μg/mL万古霉素。在一些实施方式中，抗生素组分包含约100μg/mL万古霉素。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约400μg/mL至约600μg/mL克林霉素。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约2.5μg/mL至约10μg/mL双性霉素B。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素和约100μg/mL至约600μg/mL万古霉素。在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素和约100μg/mL万古霉素。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素和约400μg/mL至约600μg/mL克林霉素。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素、约100μg/mL至约600μg/mL万古霉素和约2.5μg/mL至约10μg/mL双性霉素B。
在一些实施方式中，抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素、约400μg/mL至约600μg/mL克林霉素和约2.5μg/mL至约10μg/mL双性霉素B。
E.步骤E：收集TIL
在快速第二扩增步骤之后，可收集细胞。在一些实施方式中，在例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中所提供的一、二、三、四个或更多个扩增步骤之后收集TIL。在一些实施方式中，在例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中所提供的两个扩增步骤之后收集TIL。在一些实施方式中，在例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中所提供的两个扩增步骤(即一个起始第一扩增和一个快速第二扩增)之后收集TIL。
可以任何适当且无菌的方式，包括例如通过离心，收集TIL。用于收集TIL的方法为本领域中熟知的且任何此类已知方法均可与本发明过程一起使用。在一些实施方式中，使用自动化系统收集TIL。
细胞收集器和/或细胞处理系统可购自各种来源，包括例如Fresenius Kabi、Tomtec Life Science、Perkin Elmer和Inotech Biosystems International,Inc.。本发明方法可采用任何基于细胞的收集器。在一些实施方式中，细胞收集器和/或细胞处理系统为基于膜的细胞收集器。在一些实施方式中，细胞收集通过细胞处理系统，例如LOVO系统(由Fresenius Kabi制造)进行。术语“LOVO细胞处理系统”也指由任何供应商制造的任何可在无菌和/或密闭系统环境中将包含细胞的溶液泵送通过膜或过滤器(例如旋转膜或旋转过滤器)的仪器或装置，从而允许连续流动和细胞处理以移除上清液或细胞培养基而不发生团块化。在一些实施方式中，细胞收集器和/或细胞处理系统可在密闭无菌系统中进行细胞分离、洗涤、流体交换、浓缩和/或其他细胞处理步骤。
在一些实施方式中，快速第二扩增，例如根据图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤D，在密闭系统生物反应器中进行。在一些实施方式中，采用密闭系统进行如本文所述的TIL扩增。在一些实施方式中，采用生物反应器。在一些实施方式中，采用生物反应器作为容器。在一些实施方式中，所采用的生物反应器为例如G-REX-100或G-REX-500。在一些实施方式中，所采用的生物反应器为G-REX-100。在一些实施方式中，所采用的生物反应器为G-REX-500。
在一些实施方式中，根据图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤E根据本文中所描述的过程进行。在一些实施方式中，密闭系统在无菌条件下通过注射器进入以维持系统的无菌性和密闭性质。在一些实施方式中，采用如本文所述的密闭系统。
在一些实施方式中，根据本文所述的方法收集TIL。在一些实施方式中，使用如本文所述的方法收集在第14天与第16天之间的TIL。在一些实施方式中，使用如本文所述的方法在第14天收集TIL。在一些实施方式中，使用如本文所述的方法在第15天收集TIL。在一些实施方式中，使用如本文所述的方法在第16天收集TIL。
F.步骤F：最终配制以及转移至输注容器
在如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中以示例性次序提供且如上文和本文中所概述的步骤A至步骤E完成之后，将细胞转移至容器中以用于向患者施用，例如输注袋或无菌小瓶。在一些实施方式中，在使用上文所描述的扩增方法获得治疗足够数目的TIL后，立即将其转移至容器中以用于向患者施用。
在一些实施方式中，使用本公开的方法扩增的TIL以药物组合物的形式向患者施用。在一些实施方式中，药物组合物为TIL在无菌缓冲液中的悬浮液。本文公开扩增的TIL可通过如本领域中已知的任何适合途径施用。在一些实施方式中，TIL以单一动脉内或静脉内输注的形式施用，其优选进行约30至60分钟。其他合适的施用途径包括腹膜内、鞘内和淋巴管内施用。
X.其他Gen 2、Gen 3及其他TIL制造过程实施方式
A.PBMC饲养细胞比率
在一些实施方式中，用于本文所述的扩增方法(参见例如图8(特别是例如图8A和/或图B和/或图8C和/或图8D))的培养基包含抗CD3抗体，例如OKT-3。抗CD3抗体与IL-2的组合在TIL群中诱导T细胞活化和细胞分裂。此效应可见于全长抗体以及Fab和F(ab')2片段，前者通常优选；参见例如Tsoukas等人,《免疫学杂志》1985,135,1719，特此以全文引用的方式并入。
在一些实施方式中，PBMC饲养细胞层的数目如下计算：
A.T细胞体积(直径10μm)：V＝(4/3)πr3＝523.6μm3
B.具有40μm(4个细胞)高度的G-REX-100(M)柱：V＝(4/3)πr3＝4×1012μm3
C.填满柱B所需的细胞数目：4×1012μm3/523.6μm3＝7.6×108μm3*0.64＝4.86×108
D.可在4D空间中最佳活化的细胞数目：4.86×108/24＝20.25×106
E.外推至G-REX-500的饲养细胞和TIL的数目：TIL：100×106和饲养细胞：2.5×109
在此计算中，使用在具有100cm2基底的圆柱体中提供TIL活化的二十面体几何学所需的单核细胞近似数目。计算导出的T细胞临界值活化的实验结果为约5×108，其与NCI实验资料密切相关，如Jin等人,《免疫疗法杂志》2012,35,283-292。在(C)中，乘数(0.64)是等效球体的随机填充密度，由Jaeger和Nagel,《科学(Science)》,1992,255,1523-3计算得出。在(D)中，除数24是4维空间中可接触类似物体的等效球体的数目或“牛顿数(Newtonnumber)”，如Musin,《俄罗斯数学调查(Russ.Math.Surv.)》,2003,58,794-795中所描述。
在一些实施方式中，在起始第一扩增期间外源供应的抗原呈递饲养细胞数目约为在快速第二扩增期间外源供应的抗原呈递饲养细胞数目的一半。在某些实施方式中，方法包括在包括在相较于快速第二扩增的细胞培养基包含约50％较少抗原呈递细胞的细胞培养基中进行起始第一扩增。
在其他实施方式中，在快速第二扩增期间外源供应的抗原呈递饲养细胞(APC)数目大于在起始第一扩增期间外源供应的APC数目。
在其他实施方式中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约20:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约10:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约9:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约8:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约7:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约6:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约5:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约4:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约3:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.9:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.8:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.7:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.6:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.5:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.4:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.3:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.2:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.1:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约10:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约5:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约4:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约3:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.9:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.8:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.7:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.6:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.5:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.4:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.3:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.2:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.1:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率为刚好或约2:1。
在其他实施方式中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率为刚好或约1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3:1、3.1:1、3.2:1、3.3:1、3.4:1、3.5:1、3.6:1、3.7:1、3.8:1、3.9:1、4:1、4.1:1、4.2:1、4.3:1、4.4:1、4.5:1、4.6:1、4.7:1、4.8:1、4.9:1或5:1。
在其他实施方式中，在起始第一扩增期间外源供应的APC数目为刚好或约1×108、1.1×108、1.2×108、1.3×108、1.4×108、1.5×108、1.6×108、1.7×108、1.8×108、1.9×108、2×108、2.1×108、2.2×108、2.3×108、2.4×108、2.5×108、2.6×108、2.7×108、2.8×108、2.9×108、3×108、3.1×108、3.2×108、3.3×108、3.4×108或3.5×108个APC，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目为刚好或约3.5×108、3.6×108、3.7×108、3.8×108、3.9×108、4×108、4.1×108、4.2×108、4.3×108、4.4×108、4.5×108、4.6×108、4.7×108、4.8×108、4.9×108、5×108、5.1×108、5.2×108、5.3×108、5.4×108、5.5×108、5.6×108、5.7×108、5.8×108、5.9×108、6×108、6.1×108、6.2×108、6.3×108、6.4×108、6.5×108、6.6×108、6.7×108、6.8×108、6.9×108、7×108、7.1×108、7.2×108、7.3×108、7.4×108、7.5×108、7.6×108、7.7×108、7.8×108、7.9×108、8×108、8.1×108、8.2×108、8.3×108、8.4×108、8.5×108、8.6×108、8.7×108、8.8×108、8.9×108、9×108、9.1×108、9.2×108、9.3×108、9.4×108、9.5×108、9.6×108、9.7×108、9.8×108、9.9×108或1×109个APC。
在其他实施方式中，在起始第一扩增期间外源供应的APC数目选自刚好或约1.5×108个APC至刚好或约3×108个APC的范围，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目是选自刚好或约4×108个APC至刚好或约7.5×108个APC的范围。
在其他实施方式中，在起始第一扩增期间外源供应的APC数目选自刚好或约2×108个APC至刚好或约2.5×108个APC的范围，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目选自刚好或约4.5×108个APC至刚好或约5.5×108个APC的范围。
在其他实施方式中，在起始第一扩增期间外源供应的APC数目为刚好或约2.5×108个APC，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目为刚好或约5×108个APC。
在一些实施方式中，在起始第一扩增第0天添加的APC(包括例如PBMC)数目在起始第一扩增第7天(例如该方法的第7天)添加的PBMC数目的约一半。在某些实施方式中，方法包括在起始第一扩增第0天将抗原呈递细胞添加至第一TIL群且在第7天将抗原呈递细胞添加至第二TIL群，其中在第0天添加的抗原呈递细胞的数目在起始第一扩增第7天(例如该方法的第7天)添加的抗原呈递细胞数目的约50％。
在其他实施方式中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目大于在起始第一扩增第0天外源供应的PBMC数目。
在其他实施方式中，在起始第一扩增中外源供应的APC以选自刚好或约1.0×106个APC/cm2至刚好或约4.5×106个APC/cm2的范围的密度接种于培养瓶中。
在其他实施方式中，在起始第一扩增中外源供应的APC以选自刚好或约1.5×106个APC/cm2至刚好或约3.5×106个APC/cm2的范围的密度接种于培养瓶中。
在其他实施方式中，在起始第一扩增中外源供应的APC以选自刚好或约2×106个APC/cm2至刚好或约3×106个APC/cm2的范围的密度接种于培养瓶中。
在其他实施方式中，在起始第一扩增中外源供应的APC为刚好或约2×106个APC/cm2的密度接种于培养瓶中。
在其他实施方式中，在起始第一扩增中外源供应的APC为刚好或约1.0×106、1.1×106、1.2×106、1.3×106、1.4×106、1.5×106、1.6×106、1.7×106、1.8×106、1.9×106、2×106、2.1×106、2.2×106、2.3×106、2.4×106、2.5×106、2.6×106、2.7×106、2.8×106、2.9×106、3×106、3.1×106、3.2×106、3.3×106、3.4×106、3.5×106、3.6×106、3.7×106、3.8×106、3.9×106、4×106、4.1×106、4.2×106、4.3×106、4.4×106或4.5×106个APC/cm2的密度接种于培养瓶中。
在其他实施方式中，在快速第二扩增中外源供应的APC以选自刚好或约2.5×106个APC/cm2至刚好或约7.5×106个APC/cm2的范围的密度接种于培养瓶中。
在其他实施方式中，在快速第二扩增中外源供应的APC以选自刚好或约3.5×106个APC/cm2至刚好或约6.0×106个APC/cm2的范围的密度接种于培养瓶中。
在其他实施方式中，在快速第二扩增中外源供应的APC以选自刚好或约4.0×106个APC/cm2至刚好或约5.5×106个APC/cm2的范围的密度接种于培养瓶中。
在其他实施方式中，在快速第二扩增中外源供应的APC以选自刚好或约4.0×106个APC/cm2的范围的密度接种于培养瓶中。
在其他实施方式中，在快速第二扩增中外源供应的APC以刚好或约2.5×106个APC/cm2、2.6×106个APC/cm2、2.7×106个APC/cm2、2.8×106、2.9×106、3×106、3.1×106、3.2×106、3.3×106、3.4×106、3.5×106、3.6×106、3.7×106、3.8×106、3.9×106、4×106、4.1×106、4.2×106、4.3×106、4.4×106、4.5×106、4.6×106、4.7×106、4.8×106、4.9×106、5×106、5.1×106、5.2×106、5.3×106、5.4×106、5.5×106、5.6×106、5.7×106、5.8×106、5.9×106、6×106、6.1×106、6.2×106、6.3×106、6.4×106、6.5×106、6.6×106、6.7×106、6.8×106、6.9×106、7×106、7.1×106、7.2×106、7.3×106、7.4×106或7.5×106个APC/cm2的密度接种于培养瓶中。
在其他实施方式中，在起始第一扩增中外源供应的APC以刚好或约1.0×106、1.1×106、1.2×106、1.3×106、1.4×106、1.5×106、1.6×106、1.7×106、1.8×106、1.9×106、2×106、2.1×106、2.2×106、2.3×106、2.4×106、2.5×106、2.6×106、2.7×106、2.8×106、2.9×106、3×106、3.1×106、3.2×106、3.3×106、3.4×106、3.5×106、3.6×106、3.7×106、3.8×106、3.9×106、4×106、4.1×106、4.2×106、4.3×106、4.4×106或4.5×106个APC/cm2的密度接种于培养瓶中，在快速第二扩增中外源供应的APC以刚好或约2.5×106个APC/cm2、2.6×106个APC/cm2、2.7×106个APC/cm2、2.8×106、2.9×106、3×106、3.1×106、3.2×106、3.3×106、3.4×106、3.5×106、3.6×106、3.7×106、3.8×106、3.9×106、4×106、4.1×106、4.2×106、4.3×106、4.4×106、4.5×106、4.6×106、4.7×106、4.8×106、4.9×106、5×106、5.1×106、5.2×106、5.3×106、5.4×106、5.5×106、5.6×106、5.7×106、5.8×106、5.9×106、6×106、6.1×106、6.2×106、6.3×106、6.4×106、6.5×106、6.6×106、6.7×106、6.8×106、6.9×106、7×106、7.1×106、7.2×106、7.3×106、7.4×106或7.5×106个APC/cm2的密度接种于培养瓶中。
在其他实施方式中，在起始第一扩增中外源供应的APC以选自刚好或约1.0×106个APC/cm2至刚好或约4.5×106个APC/cm2的范围的密度接种于培养瓶中，在快速第二扩增中外源供应的APC以选自刚好或约2.5×106个APC/cm2至刚好或约7.5×106个APC/cm2的范围的密度接种于培养瓶中。
在其他实施方式中，在起始第一扩增中外源供应的APC以选自刚好或约1.5×106个APC/cm2至刚好或约3.5×106个APC/cm2的范围的密度接种于培养瓶中，在快速第二扩增中外源供应的APC以选自刚好或约3.5×106个APC/cm2至刚好或约6×106个APC/cm2的范围的密度接种于培养瓶中。
在其他实施方式中，在起始第一扩增中外源供应的APC以选自刚好或约2×106个APC/cm2至刚好或约3×106个APC/cm2的范围的密度接种于培养瓶中，在快速第二扩增中外源供应的APC以选自刚好或约4×106个APC/cm2至刚好或约5.5×106个APC/cm2的范围的密度接种于培养瓶中。
在其他实施方式中，在起始第一扩增中外源供应的APC以刚好或约2×106个APC/cm2的密度接种于培养瓶中，在快速第二扩增中外源供应的APC以刚好或约4×106个APC/cm2的密度接种于培养瓶中。
在其他实施方式中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的PBMC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约20:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的PBMC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约10:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的PBMC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约9:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约8:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约7:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约6:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约5:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约4:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约3:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.9:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.8:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.7:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.6:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.5:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.4:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.3:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.2:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.1:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约10:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约5:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约4:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约3:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.9:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.8:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.7:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.6:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.5:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.4:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.3:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.2:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.1:1的范围。
在其他实施方式中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率为刚好或约2:1。
在其他实施方式中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率为刚好或约1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3:1、3.1:1、3.2:1、3.3:1、3.4:1、3.5:1、3.6:1、3.7:1、3.8:1、3.9:1、4:1、4.1:1、4.2:1、4.3:1、4.4:1、4.5:1、4.6:1、4.7:1、4.8:1、4.9:1或5:1。
在其他实施方式中，在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目为刚好或约1×108、1.1×108、1.2×108、1.3×108、1.4×108、1.5×108、1.6×108、1.7×108、1.8×108、1.9×108、2×108、2.1×108、2.2×108、2.3×108、2.4×108、2.5×108、2.6×108、2.7×108、2.8×108、2.9×108、3×108、3.1×108、3.2×108、3.3×108、3.4×108或3.5×108个APC(包括例如PBMC)，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目为刚好或约3.5×108、3.6×108、3.7×108、3.8×108、3.9×108、4×108、4.1×108、4.2×108、4.3×108、4.4×108、4.5×108、4.6×108、4.7×108、4.8×108、4.9×108、5×108、5.1×108、5.2×108、5.3×108、5.4×108、5.5×108、5.6×108、5.7×108、5.8×108、5.9×108、6×108、6.1×108、6.2×108、6.3×108、6.4×108、6.5×108、6.6×108、6.7×108、6.8×108、6.9×108、7×108、7.1×108、7.2×108、7.3×108、7.4×108、7.5×108、7.6×108、7.7×108、7.8×108、7.9×108、8×108、8.1×108、8.2×108、8.3×108、8.4×108、8.5×108、8.6×108、8.7×108、8.8×108、8.9×108、9×108、9.1×108、9.2×108、9.3×108、9.4×108、9.5×108、9.6×108、9.7×108、9.8×108、9.9×108或1×109个APC(包括例如PBMC)。
在其他实施方式中，在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目选自刚好或约1×108个APC(包括例如PBMC)至刚好或约3.5×108个APC(包括例如PBMC)的范围，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目选自刚好或约3.5×108个APC(包括例如PBMC)至刚好或约1×109个APC(包括例如PBMC)的范围。
在其他实施方式中，在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目选自刚好或约1.5×108个APC至刚好或约3×108个APC(包括例如PBMC)的范围，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目选自刚好或约4×108个APC(包括例如PBMC)至刚好或约7.5×108个APC(包括例如PBMC)的范围。
在其他实施方式中，在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目选自刚好或约2×108个APC(包括例如PBMC)至刚好或约2.5×108个APC(包括例如PBMC)的范围，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目选自刚好或约4.5×108个APC(包括例如PBMC)至刚好或约5.5×108个APC(包括例如PBMC)的范围。
在其他实施方式中，在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目为刚好或约2.5×108个APC(包括例如PBMC)，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目为刚好或约5×108个APC(包括例如PBMC)。
在一些实施方式中，在起始第一扩增第0天添加的APC(包括例如PBMC)层数是在快速第二扩增第7天添加的APC(包括例如PBMC)层数的约一半。在某些实施方式中，方法包括在起始第一扩增第0天将抗原呈递细胞层添加至第一TIL群且在第7天奖抗原呈递细胞层添加至第二TIL群，其中在第0天添加的抗原呈递细胞层的数目在第7天添加的抗原呈递细胞层的数目的约50％。
在其他实施方式中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)层数大于在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)层数。
在其他实施方式中，起始第一扩增的第0天在平均厚度为刚好或约2个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在平均厚度为刚好或约4个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生。
在其他实施方式中，起始第一扩增的第0天在平均厚度为刚好或约一个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在平均厚度为刚好或约3个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生。
在其他实施方式中，起始第一扩增的第0天在平均厚度为刚好或约1.5个细胞层至刚好或约2.5个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在平均厚度为刚好或约3个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生。
在其他实施方式中，起始第一扩增的第0天在平均厚度为刚好或约一个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在平均厚度为刚好或约2个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生。
在其他实施方式中，起始第一扩增的第0天在平均厚度为刚好或约1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在平均厚度为刚好或约3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生。
在其他实施方式中，起始第一扩增的第0天在平均厚度为刚好或约1个细胞层至刚好或约2个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在平均厚度为刚好或约3个细胞层至刚好或约10个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生。
在其他实施方式中，起始第一扩增的第0天在平均厚度为刚好或约2个细胞层至刚好或约3个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在平均厚度为刚好或约4个细胞层至刚好或约8个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生。
在其他实施方式中，起始第一扩增的第0天在平均厚度为刚好或约2个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在平均厚度为刚好或约4个细胞层至刚好或约8个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生。
在其他实施方式中，起始第一扩增的第0天在平均厚度为刚好或约1、2或3个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在平均厚度为刚好或约3、4、5、6、7、8、9或10个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生。
在其他实施方式中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:10的范围。
在其他实施方式中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:8的范围。
在其他实施方式中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:7的范围。
在其他实施方式中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:6的范围。
在其他实施方式中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:5的范围。
在其他实施方式中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:4的范围。
在其他实施方式中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:3的范围。
在其他实施方式中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:2的范围。
在其他实施方式中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.2至刚好或约1:8的范围。
在其他实施方式中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.3至刚好或约1:7的范围。
在其他实施方式中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.4至刚好或约1:6的范围。
在其他实施方式中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.5至刚好或约1:5的范围。
在其他实施方式中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.6至刚好或约1:4的范围。
在其他实施方式中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.7至刚好或约1:3.5的范围。
在其他实施方式中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.8至刚好或约1:3的范围。
在其他实施方式中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.9至刚好或约1:2.5的范围。
在其他实施方式中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率为刚好或约1:2。
在其他实施方式中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.1、1:2.2、1:2.3、1:2.4、1:2.5、1:2.6、1:2.7、1:2.8、1:2.9、1:3、1:3.1、1:3.2、1:3.3、1:3.4、1:3.5、1:3.6、1:3.7、1:3.8、1:3.9、1:4、1:4.1、1:4.2、1:4.3、1:4.4、1:4.5、1:4.6、1:4.7、1:4.8、1:4.9、1:5、1:5.1、1:5.2、1:5.3、1:5.4、1:5.5、1:5.6、1:5.7、1:5.8、1:5.9、1:6、1:6.1、1:6.2、1:6.3、1:6.4、1:6.5、1:6.6、1:6.7、1:6.8、1:6.9、1:7、1:7.1、1:7.2、1:7.3、1:7.4、1:7.5、1:7.6、1:7.7、1:7.8、1:7.9、1:8、1:8.1、1:8.2、1:8.3、1:8.4、1:8.5、1:8.6、1:8.7、1:8.8、1:8.9、1:9、1:9.1、1:9.2、1:9.3、1:9.4、1:9.5、1:9.6、1:9.7、1:9.8、1:9.9或1:10。
在一些实施方式中，起始第一扩增中的APC数目选自约1.0×106个APC/cm2至约4.5×106个APC/cm2的范围，快速第二扩增中的APC数目选自约2.5×106个APC/cm2至约7.5×106个APC/cm2的范围。
在一些实施方式中，起始第一扩增中的APC数目选自约1.5×106个APC/cm2至约3.5×106个APC/cm2的范围，快速第二扩增中的APC数目选自约3.5×106个APC/cm2至约6.0×106个APC/cm2的范围。
在一些实施方式中，起始第一扩增中的APC数目选自约2.0×106个APC/cm2至约3.0×106个APC/cm2的范围，快速第二扩增中的APC数目选自约4.0×106个APC/cm2至约5.5×106个APC/cm2的范围。
B.可选的细胞培养基组分
1.抗CD3抗体
在一些实施方式中，本文所述的扩增方法(参见例如图1和图8(特别是例如图8B))中使用的培养基包含抗CD3抗体。抗CD3抗体与IL-2的组合在TIL群中诱导T细胞活化和细胞分裂。此效应可见于全长抗体以及Fab和F(ab')2片段，前者通常优选；参见例如Tsoukas等人,《免疫学杂志》1985,135,1719，特此以全文引用的方式并入。
如本领域技术人员将了解，一些合适的抗人CD3抗体可用于本发明，包含来自各种哺乳动物的抗人CD3多克隆和单克隆抗体，包括但不限于鼠、人、灵长类动物、大鼠和犬科动物抗体。在一些实施方式中，使用OKT3抗CD3抗体莫罗单抗(可购自新泽西州拉里坦市的Ortho-McNeil或加利福尼亚州奥本市的Miltenyi Biotech)。参见表1。
如本领域中本领域技术人员将了解，一些合适的抗人CD3抗体可用于本发明，包括来自各种哺乳动物的抗人CD3多克隆和单克隆抗体，包括但不限于鼠、人、灵长类动物、大鼠和犬科动物抗体。在一些实施方式中，使用OKT3抗CD3抗体莫罗单抗(可购自新泽西州拉里坦市的Ortho-McNeil或加利福尼亚州奥本市的Miltenyi Biotech)
2.4-1BB(CD137)激动剂
在一些实施方式中，起始第一扩增和/或快速第二扩增的细胞培养基包含TNFRSF激动剂。在一些实施方式中，TNFRSF激动剂为4-1BB(CD137)激动剂。4-1BB激动剂可以是本领域中已知的任何4-1BB结合分子。4-1BB结合分子可以是能够与人或哺乳动物4-1BB结合的单克隆抗体或融合蛋白。4-1BB激动剂或4-1BB结合分子可包括免疫球蛋白分子的任何同种型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或子类的免疫球蛋白重链。4-1BB激动剂或4-1BB结合分子可具有重链和轻链。如本文所用，术语结合分子也包括抗体(包括全长抗体)；单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)；多克隆抗体；多特异性抗体(例如双特异性抗体)；人、人源化或嵌合抗体；以及抗体片段，例如Fab片段、F(ab’)片段、由Fab表达文库产生的片段、任何上述者的表位结合片段，以及与4-1BB结合的抗体的经工程改造形式，例如scFv分子。在一些实施方式中，4-1BB激动剂为一种完全人抗体的抗原结合蛋白。在一些实施方式中，4-1BB激动剂为一种人源化抗体的抗原结合蛋白。在一些实施方式中，用于本发明所公开的方法和组合物中的4-1BB激动剂包括抗4-1BB抗体、人抗4-1BB抗体、小鼠抗4-1BB抗体、哺乳动物抗4-1BB抗体、单克隆抗4-1BB抗体、多克隆抗4-1BB抗体、嵌合抗4-1BB抗体、抗4-1BB阿德奈汀(adnectin)、抗4-1BB结构域抗体、单链抗4-1BB片段、重链抗4-1BB片段、轻链抗4-1BB片段、抗4-1BB融合蛋白，及其片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物。已知激动性抗4-1BB抗体诱导强烈免疫反应。Lee等人,《公共科学图书馆·综合(PLOS One)》2013,8,e69677。在一些实施方式中，4-1BB激动剂为激动性抗4-1BB人源化或完全人单克隆抗体(即，来源于单一细胞系的抗体)。在一些实施方式中，4-1BB激动剂为EU-101(Eutilex Co.Ltd.)、乌图木单抗或乌瑞鲁单抗或其片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物。在一些实施方式中，4-1BB激动剂为乌图木单抗或乌瑞鲁单抗或其片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物。
在一些实施方式中，4-1BB激动剂或4-1BB结合分子也可以是融合蛋白。在一些实施方式中，相较于通常具有两个配体结合结构域的激动性单克隆抗体，多聚4-1BB激动剂，例如三聚或六聚4-1BB激动剂(具有三个或六个配体结合结构域)可诱导优良受体(4-1BBL)聚类和内部细胞信号传导复合物形成。包含三个TNFRSF结合结构域和IgG1-Fc且可选地进一步连接两个以上这些融合蛋白的三聚(三价)或六聚(或六价)以上融合蛋白描述于例如Gieffers等人,《分子癌症治疗学》2013,12,2735-47中。
已知激动性4-1BB抗体和融合蛋白诱导强烈免疫反应。在一些实施方式中，4-1BB激动剂是以足以减少毒性的方式与4-1BB抗原特异性结合的单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方式中，4-1BB激动剂是消除抗体依赖性细胞毒性(ADCC)(例如NK细胞细胞毒性)的激动性4-1BB单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方式中，4-1BB激动剂是消除抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)的激动性4-1BB单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方式中，4-1BB激动剂是消除补体依赖性细胞毒性(CDC)的激动性4-1BB单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方式中，4-1BB激动剂是消除Fc区功能性的激动性4-1BB单克隆抗体或融合蛋白。
在一些实施方式中，4-1BB激动剂的特征在于以高亲和力和激动活性与人4-1BB(SEQ ID NO：40)结合。在一些实施方式中，4-1BB激动剂为与人4-1BB(SEQ ID NO：40)结合的结合分子。在一些实施方式中，4-1BB激动剂为与鼠4-1BB(SEQ ID NO：41)结合的结合分子。4-1BB激动剂或结合分子所结合的4-1BB抗原的氨基酸序列概述于表5中。
表5：4-1BB抗原的氨基酸序列
在一些实施方式中，所描述的组合物、过程和方法包括4-1BB激动剂，该4-1BB激动剂以约100pM以下的KD结合人或鼠4-1BB、以约90pM以下的KD结合人或鼠4-1BB、以约80pM以下的KD结合人或鼠4-1BB、以约70pM以下的KD结合人或鼠4-1BB、以约60pM以下的KD结合人或鼠4-1BB、以约50pM以下的KD结合人或鼠4-1BB、以约40pM以下的KD结合人或鼠4-1BB、或以约30pM以下的KD结合人或鼠4-1BB。
在一些实施方式中，所描述的组合物、过程和方法包括4-1BB激动剂，该4-1BB激动剂以约7.5×105 1/M·s或更快的kassoc与人或鼠4-1BB结合、以约7.5×105 1/M·s或更快的kassoc与人或鼠4-1BB结合、以约8×105l/M·s或更快的kassoc与人或鼠4-1BB结合、以约8.5×105 1/M·s或更快的kassoc与人或鼠4-1BB结合、以约9×105 1/M·s或更快的kassoc与人或鼠4-1BB结合、以约9.5×105 1/M·s或更快的kassoc与人或鼠4-1BB结合、或以约1×106 1/M·s或更快的kassoc与人或鼠4-1BB结合。
在一些实施方式中，所描述的组合物、过程和方法包括4-1BB激动剂，该4-1BB激动剂以约2×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠4-1BB结合、以约2.1×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠4-1BB结合、以约2.2×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠4-1BB结合、以约2.3×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠4-1BB结合、以约2.4×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠4-1BB结合、以约2.5×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠4-1BB结合、以约2.6×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠4-1BB结合、或以约2.7×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠4-1BB结合、以约2.8×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠4-1BB结合、以约2.9×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠4-1BB结合、或以约3×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠4-1BB结合。
在一些实施方式中，所描述的组合物、过程和方法包括4-1BB激动剂，该4-1BB激动剂以约10nM以下的IC50与人或鼠4-1BB结合、以约9nM以下的IC50与人或鼠4-1BB结合、以约8nM以下的IC50与人或鼠4-1BB结合、以约7nM以下的IC50与人或鼠4-1BB结合、以约6nM以下的IC50与人或鼠4-1BB结合、以约5nM以下的IC50与人或鼠4-1BB结合、以约4nM以下的IC50与人或鼠4-1BB结合、以约3nM以下的IC50与人或鼠4-1BB结合、以约2nM以下的IC50与人或鼠4-1BB结合、或以约1nM以下的IC50与人或鼠4-1BB结合。
在一些实施方式中，4-1BB激动剂为乌图木单抗(又称为PF-05082566或MOR-7480)或其片段、衍生物、变体或生物类似物。乌图木单抗可购自Pfizer,Inc.。乌图木单抗为免疫球蛋白G2-λ抗[智人TNFRSF9(肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员9，4-1BB，T细胞抗原ILA，CD137)]智人(完全人)单克隆抗体。乌图木单抗的氨基酸序列阐述于表6中。乌图木单抗包含位于Asn59和Asn292的糖基化位点；位于位置22-96(VH-VL)、143-199(CH1-CL)、256-316(CH2)和362-420(CH3)的重链链内二硫键；位于位置22'-87'(VH-VL)和136'-195'(CH1-CL)的轻链链内二硫键；位于IgG2A异构体(isoform)位置218-218、219-219、222-222和225-225、位于IgG2A/B异构体位置218-130、219-219、222-222和225-225以及位于IgG2B异构体位置219-130(2)、222-222和225-225的链间重链-重链二硫键；以及位于IgG2A异构体位置130-213'(2)、IgG2A/B异构体位置218-213'和130-213'以及位于IgG2B异构体位置218-213'(2)的链间重链-轻链二硫键。乌图木单抗以及其变体和片段的制备和性质描述于美国专利第8,821,867、8,337,850和9,468,678号和国际专利申请公开第WO 2012/032433 A1号中，其各自的公开内容以引用的方式并入本文中。乌图木单抗的临床前特征描述于Fisher等人,《癌症免疫学和免疫治疗(Cancer Immunolog.&Immunother.)》2012,61,1721-33中。当前乌图木单抗用于多种血液和实体肿瘤适应症的临床试验包括美国国家卫生研究院(U.S.National Institutes of Health)clinicaltrials.gov识别号NCT02444793、NCT01307267、NCT02315066和NCT02554812。
在一些实施方式中，4-1BB激动剂包含SEQ ID NO：42所示的重链和SEQ ID NO：43所示的轻链。在一些实施方式中，4-1BB激动剂包含分别具有SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43中所示序列的重链和轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施方式中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43中所示序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43中所示序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ IDNO：42和SEQ ID NO：43中所示序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43中所示序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43中所示序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一些实施方式中，4-1BB激动剂包含乌图木单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施方式中，4-1BB激动剂重链可变区(VH)包括SEQ ID NO：44中所示的序列，4-1BB激动剂轻链可变区(VL)包括SEQ ID NO：45中所示的序列，及其保守性氨基酸取代。在一些实施方式中，4-1BB激动剂包含VH和VL区，其各自分别与SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45中所示序列具有至少99％同一性。在一些实施方式中，4-1BB激动剂包含VH和VL区，其各自分别与SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45中所示序列具有至少98％同一性。在一些实施方式中，4-1BB激动剂包含VH和VL区，其各自分别与SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45中所示序列具有至少97％同一性。在一些实施方式中，4-1BB激动剂包含VH和VL区，其各自分别与SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45中所示序列具有至少96％同一性。在一些实施方式中，4-1BB激动剂包含VH和VL区，其各自分别与SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45中所示序列具有至少95％同一性。在一些实施方式中，4-1BB激动剂包含scFv抗体，该scFv抗体包含各自与SEQ ID NO：44和SEQID NO：45中所示序列具有至少99％同一性的VH和VL区。
在一些实施方式中，4-1BB激动剂包含分别具有SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：48中所示序列及其保守性氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域；以及分别具有SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：51中所示序列及其保守性氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。
在一些实施方式中，4-1BB激动剂为药物管理机构参考乌图木单抗批准的4-1BB激动剂生物类似物单克隆抗体。在一些实施方式中，生物类似物单克隆抗体包括4-1BB抗体，该4-1BB抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其与该参考药品或参考生物产品相比包含一个以上翻译后修饰，该参考药品或参考生物产品为乌图木单抗。在一些实施方式中，一个以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。在一些实施方式中，生物类似物为获得授权或申请授权的4-1BB激动剂抗体，其中该4-1BB激动剂抗体提供在一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，该参考药品或参考生物产品为乌图木单抗。4-1BB激动剂抗体可获得药物管理机构，例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施方式中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中所包含的赋形剂相同或不同，该参考药品或参考生物产品为乌图木单抗。在一些实施方式中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中所包含的赋形剂相同或不同，该参考药品或参考生物产品为乌图木单抗。
表6：与乌图木单抗相关的4-1BB激动剂抗体的氨基酸序列
在一些实施方式中，4-1BB激动剂为单克隆抗体乌瑞鲁单抗(又称为BMS-663513和20H4.9.h4a)或其片段、衍生物、变体或生物类似物。乌瑞鲁单抗可购自Bristol-MyersSquibb,Inc.和Creative Biolabs,Inc.。乌瑞鲁单抗为免疫球蛋白G4-κ抗[智人TNFRSF9(肿瘤坏死因子受体超家族成员9，4-1BB，T细胞抗原ILA，CD137)]智人(完全人)单克隆抗体。乌瑞鲁单抗的氨基酸序列阐述于表7中。乌瑞鲁单抗包含位于位置298(和298”)的N-糖基化位点；位于位置22-95(VH-VL)、148-204(CH1-CL)、262-322(CH2)和368-426(CH3)(以及位于位置22”-95”、148”-204”、262”-322”和368”-426”)的重链链内二硫键；位于位置23'-88'(VH-VL)和136'-196'(CH1-CL)(以及位于位置23”'-88”'和136”'-196”')的轻链链内二硫键；位于位置227-227”和230-230”的链间重链-重链二硫键；以及位于135-216'和135”-216”'的链间重链-轻链二硫键。乌瑞鲁单抗以及其变体和片段的制备和性质描述于美国专利第7,288,638和8,962,804号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。乌瑞鲁单抗的临床前和临床特征描述于Segal等人,《临床癌症研究》2016,请访问http:/dx.doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-16-1272。当前乌瑞鲁单抗用于多种血液和实体肿瘤适应症的临床试验包括美国国家卫生研究院clinicaltrials.gov识别号NCT01775631、NCT02110082、NCT02253992和NCT01471210。
在一些实施方式中，4-1BB激动剂包含SEQ ID NO：52所示的重链和SEQ ID NO：53所示的轻链。在一些实施方式中，4-1BB激动剂包含分别具有SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53中所示序列的重链和轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施方式中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53中所示序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53中所示序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53中所示序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53中所示序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53中所示序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一些实施方式中，4-1BB激动剂包含乌瑞鲁单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施方式中，4-1BB激动剂重链可变区(VH)包括SEQ ID NO：54中所示的序列，4-1BB激动剂轻链可变区(VL)包括SEQ ID NO：55中所示的序列，及其保守性氨基酸取代。在一些实施方式中，4-1BB激动剂包含VH和VL区，其各自分别与SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55中所示序列具有至少99％同一性。在一些实施方式中，4-1BB激动剂包含VH和VL区，其各自分别与SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55中所示序列具有至少98％同一性。在一些实施方式中，4-1BB激动剂包含VH和VL区，其各自分别与SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55中所示序列具有至少97％同一性。在一些实施方式中，4-1BB激动剂包含VH和VL区，其各自分别与SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55中所示序列具有至少96％同一性。在一些实施方式中，4-1BB激动剂包含VH和VL区，其各自分别与SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55中所示序列具有至少95％同一性。在一些实施方式中，4-1BB激动剂包含scFv抗体，该scFv抗体包含各自与SEQ ID NO：54和SEQID NO：55中所示序列具有至少99％同一性的VH和VL区。
在一些实施方式中，4-1BB激动剂包含分别具有SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：58中所示序列及其保守性氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域；以及分别具有SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：61中所示序列及其保守性氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。
在一些实施方式中，4-1BB激动剂为药物管理机构参考乌瑞鲁单抗批准的4-1BB激动剂生物类似物单克隆抗体。在一些实施方式中，生物类似物单克隆抗体包括4-1BB抗体，该4-1BB抗体包含与参考药品或参考生物学产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列且其相较于该参考药品或参考生物产品包含一个以上翻译后修饰，该参考药品或参考生物产品为乌瑞鲁单抗。在一些实施方式中，一个以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。在一些实施方式中，生物类似物为获得授权或申请授权的4-1BB激动剂抗体，其中该4-1BB激动剂抗体提供在一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，该参考药品或参考生物产品为乌瑞鲁单抗。4-1BB激动剂抗体可获得药物管理机构，例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施方式中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，该参考药品或参考生物产品为乌瑞鲁单抗。在一些实施方式中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，该参考药品或参考生物产品为乌瑞鲁单抗。
表7：与乌瑞鲁单抗相关的4-1BB激动剂抗体的氨基酸序列
在一些实施方式中，4-1BB激动剂选自如下：1D8、3Elor、4B4(BioLegend309809)、H4-1BB-M127(BD Pharmingen 552532)、BBK2(Thermo Fisher MS621PABX)、145501(LeincoTechnologies B591)、通过保藏为ATCC第HB-11248号的细胞系产生且美国专利第6,974,863号中公开的抗体、5F4(BioLegend 31 1503)、C65-485(BD Pharmingen559446)、美国专利申请公开第US2005/0095244号中公开的抗体、美国专利第7,288,638号中公开的抗体(例如20H4.9-IgGl(BMS-663031))、美国专利第6,887,673号中公开的抗体(例如4E9或BMS-554271)、美国专利第7,214,493号中公开的抗体、美国专利第6,303,121号中公开的抗体、美国专利第6,569,997号中公开的抗体、美国专利第6,905,685号中公开的抗体(例如4E9或BMS-554271)、美国专利第6,362,325号中公开的抗体(例如1D8或BMS-469492；3H3或BMS-469497；或3El)、美国专利第6,974,863号中公开的抗体(例如53A2)；美国专利第6,210,669号中公开的抗体(例如1D8、3B8或3El)、美国专利第5,928,893号中描述的抗体、美国专利第6,303,121号中公开的抗体、美国专利第6,569,997号中公开的抗体、国际专利申请公开第WO 2012/177788、WO 2015/119923和WO 2010/042433号中公开的抗体，及其片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物，其中前述专利或专利申请公开中的每一者的公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施方式中，4-1BB激动剂为以下中描述的4-1BB激动融合蛋白：国际专利申请公开第WO 2008/025516 A1号、第WO 2009/007120 A1号、第WO 2010/003766A1号、第WO2010/010051 A1号和第WO 2010/078966 A1号；美国专利申请公开第US 2011/0027218A1号、第US2015/0126709 A1号、第US2011/0111494 A1号、第US 2015/0110734A1号和第US2015/0126710 A1号；和美国专利第9,359,420号、第9,340,599,8,921,519号和第8,450,460号，其公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施方式中，4-1BB激动剂为如结构I-A(C端Fc抗体片段融合蛋白)或结构I-B(N端Fc抗体片段融合蛋白)中所描绘的4-1BB激动融合蛋白，或其片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物(参见图18)。在结构I-A和结构I-B中，圆柱体指个别多肽结合结构域。结构I-A和I-B包含三个线性连接的TNFRSF结合结构域，该TNFRSF结合结构域衍生自例如4-1BBL(4-1BB配体、CD137配体(CD137L)或肿瘤坏死因子超家族成员9(TNFSF9)或结合4-1BB的抗体，该TNFRSF结合结构域折叠形成三价蛋白质，接着该三价蛋白质通过IgG1-Fc(包含CH3和CH2结构域)与第二三价蛋白质连接，随后该IgG1-Fc用于通过二硫键(细长小椭圆)将两个三价蛋白质连接在一起，从而使结构稳定且提供能够将六个受体的细胞内信号传导结构域放在一起且信号传导蛋白质以形成信号传导复合物的激动剂。表示为圆柱体的TNFRSF结合结构域可以是包含例如由接头连接的VH和VL链的scFv结构域，该接头可包含亲水性残基和提供柔性的Gly与Ser序列以及提供溶解性的Glu与Lys。可使用任何scFv结构域设计，例如以下中描述的scFv结构域：de Marco,《微生物细胞工厂(Microbial CellFactories)》,2011,10,44；Ahmad等人,《临床和发育免疫学(Clin.&Dev.Immunol.)》2012,980250；Monnier等人,《抗体(Antibodies)》,2013,2,193-208；或本文中别处并入的参考文献。此形式的融合蛋白结构于美国专利第9,359,420号、第9,340,599号、第8,921,519号和第8,450,460号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。
图18中所提供的结构I-A的其他多肽结构域的氨基酸序列见于表8中。Fc结构域优选包含完整恒定结构域(SEQ ID NO：62的氨基酸17-230)、完整铰链结构域(SEQ ID NO：62的氨基酸1-16)或铰链结构域的一部分(例如SEQ ID NO：62的氨基酸4-16)。用于连接C端Fc抗体的优选接头可选自SEQ ID NO：63至SEQ ID NO：72中所示的实施方式，包括适合于融合另外的多肽的接头。
表8：具有C端Fc抗体片段融合蛋白设计(结构I-A)的TNFRSF激动剂融合蛋白(包括4-1BB激动剂融合蛋白)的氨基酸序列
图18中所提供的结构I-B的其他多肽结构域的氨基酸序列见于表9中。若Fc抗体片段如在结构I-B中与TNRFSF融合蛋白的N端融合，则Fc模块的序列优选为SEQ ID NO：73中所示的序列，接头序列优选选自SED ID NO:74至SEQ ID NO：76中所示的实施方式。
表9：具有N端Fc抗体片段融合蛋白设计(结构I-B)的TNFRSF激动剂融合蛋白(包括4-1BB激动剂融合蛋白)的氨基酸序列
在一些实施方式中，根据结构I-A或结构I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一个以上选自如下的4-1BB结合结构域：乌图木单抗的可变重链和可变轻链、乌瑞鲁单抗的可变重链和可变轻链、乌图木单抗的可变重链和可变轻链、选自表10中描述的可变重链和可变轻链的可变重链和可变轻链、前述可变重链和可变轻链的任何组合，及其片段、衍生物、缀合物、变体和生物类似物。
在一些实施方式中，根据结构I-A或结构I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一个以上包括4-1BBL序列的4-1BB结合结构域。在一些实施方式中，根据结构I-A或结构I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一个以上包括根据SEQ ID NO：77的序列的4-1BB结合结构域。在一些实施方式中，根据结构I-A或结构I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一个以上包括可溶性4-1BBL序列的4-1BB结合结构域。在一些实施方式中，根据结构I-A或结构I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一个以上包括根据SEQ ID NO：78的序列的4-1BB结合结构域。
在一些实施方式中，根据结构I-A或结构I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一个以上4-1BB结合结构域，该结合结构域是包含各自分别与SEQ ID NO：44SEQ ID NO：45中所示序列具有至少95％同一性的VH和VL区的scFv结构域，其中VH和VL结构域经接头连接。在一些实施方式中，根据结构I-A或结构I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一个以上4-1BB结合结构域，该结合结构域为包含各自分别与SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55中所示序列具有至少95％同一性的VH和VL区的scFv结构域，其中VH和VL结构域经接头连接。在一些实施方式中，根据结构I-A或I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一个以上4-1BB结合结构域，该结合结构域为包含各自与表10中给出的VH和VL序列至少95％同一性的VH和VL区的scFv结构域，其中VH和VL结构域经接头连接。
表10：可用作融合蛋白中的4-1BB结合结构域或可用作scFv 4-1BB激动剂抗体的另外的多肽结构域
在一些实施方式中，4-1BB激动剂为4-1BB激动单链融合多肽，其包含(i)第一可溶性4-1BB结合结构域、(ii)第一肽接头、(iii)第二可溶性4-1BB结合结构域、(iv)第二肽接头，和(v)第三可溶性4-1BB结合结构域，进一步包含在N端和/或C端的另外的结构域，其中该另外的结构域为Fab或Fc片段结构域。在一些实施方式中，4-1BB激动剂是4-1BB激动性单链融合多肽，其包括(i)第一可溶性4-1BB结合结构域、(ii)第一肽接头、(ⅲ)第二可溶性4-1BB结合结构域、(iv)第二肽接头，和(v)第三可溶性4-1BB结合结构域，进一步包含在N端和/或C端的另外的结构域，其中该另外的结构域为Fab或Fc片段结构域，各可溶性4-1BB结构域缺乏茎区(其促成三聚作用且提供与细胞膜的某一距离，但不是4-1BB结合结构域的一部分)，第一肽接头和第二肽接头独立地具有3-8个氨基酸的长度。
在一些实施方式中，4-1BB激动剂为4-1BB激动性单链融合多肽，其包含(i)第一可溶性肿瘤坏死因子(TNF)超家族细胞因子结构域、(ii)第一肽接头、(ⅲ)第二可溶性TNF超家族细胞因子结构域、(iv)第二肽接头，和(v)第三可溶性TNF超家族细胞因子结构域，其中该可溶性TNF超家族细胞因子结构域各自均缺少茎区，第一肽接头和第二肽接头独立地具有3-8个氨基酸的长度，各TNF超家族细胞因子结构域均为4-1BB结合结构域。
在一些实施方式中，4-1BB激动剂为4-1BB激动性scFv抗体，其包含连接至任一前述VL结构域的任一前述VH结构域。
在某些实施方式中，4-1BB激动剂为BPS Bioscience 4-1BB激动剂抗体目录号79097-2，可商购自美国加利福尼亚州圣地亚哥的BPS Bioscience。在某些实施方式中，4-1BB激动剂为Creative Biolabs 4-1BB激动剂抗体目录号MOM-18179，可商购自美国纽约州雪利市的Creative Biolabs。
1.OX40(CD134)激动剂
在一些实施方式中，TNFRSF激动剂为OX40(CD134)激动剂。OX40激动剂可以是本领域中已知的任何OX40结合分子。OX40结合分子可以是能够与人或哺乳动物OX40结合的单克隆抗体或融合蛋白。OX40激动剂或OX40结合分子可包括免疫球蛋白分子的任何同种型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或子类的免疫球蛋白重链。OX40激动剂或OX40结合分子可具有重链和轻链。如本文所用，术语结合分子也包括抗体(包括全长抗体)、单克隆抗体(包含全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人抗体、人源化或嵌合抗体和抗体片段，例如Fab片段、F(ab′)片段、由Fab表达文库产生的片段、任一上述的表位-结合片段和与OX40结合的抗体的经工程改造形式，例如scFv分子。在一些实施方式中，OX40激动剂为一种完全人抗体的抗原结合蛋白。在一些实施方式中，OX40激动剂为一种人源化抗体的抗原结合蛋白。在一些实施方式中，用于本公开方法和组合物中的OX40激动剂包括抗OX40抗体、人抗OX40抗体、小鼠抗OX40抗体、哺乳动物抗OX40抗体、单克隆抗OX40抗体、多克隆抗OX40抗体、嵌合抗OX40抗体、抗OX40阿德奈汀、抗OX40结构域抗体、单链抗OX40片段、重链抗OX40片段、轻链抗OX40片段、抗OX40融合蛋白，及其片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物。在一些实施方式中，OX40激动剂为激动性抗OX40人源化或完全人单克隆抗体(即，来源于单个细胞系的抗体)。
在一些实施方式中，OX40激动剂或OX40结合分子也可以是融合蛋白。包含与OX40L融合的Fc结构域的OX40融合蛋白描述于例如Sadun等人,《免疫疗法杂志》2009,182,1481-89。在一些实施方式中，相较于通常具有两个配体结合结构域的激动性单克隆抗体，多聚OX40激动剂，例如三聚或六聚OX40激动剂(具有三个或六个配体结合结构域)可诱导优良受体(OX40L)聚类和内部细胞信号传导复合物形成。包括三个TNFRSF结合结构域和IgG1-Fc且可选地进一步连接两个以上这些融合蛋白的三聚(三价)或六聚(或六价)以上融合蛋白描述于例如Gieffers等人,《分子癌症治疗学》2013,12,2735-47中。
已知激动性OX40抗体和融合蛋白可诱导强烈免疫反应。Curti等人,《癌症研究》2013,73,7189-98。在一些实施方式中，OX40激动剂为以足够减少毒性的方式与OX40抗原特异性结合的单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方式中，OX40激动剂为消除抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，例如NK细胞细胞毒性的激动性OX40单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方式中，OX40激动剂为消除抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)的激动性OX40单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方式中，OX40激动剂为消除补体依赖性细胞毒性(CDC)的激动性OX40单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方式中，OX40激动剂为消除Fc区功能的激动性OX40单克隆抗体或融合蛋白。
在一些实施方式中，OX40激动剂的特征在于以高亲和力和激动性活性与人OX40(SEQ ID NO：85)结合。在一些实施方式中，OX40激动剂为与人OX40(SEQ ID NO：85)结合的结合分子。在一些实施方式中，OX40激动剂为与鼠OX40(SEQ ID NO：86)结合的结合分子。表11中概述与OX40激动剂或结合分子结合的OX40抗原的氨基酸序列。
表11：OX40抗原的氨基酸序列
在一些实施方式中，所描述组合物、过程和方法包括如下OX40激动剂，该OX40激动剂以约100pM以下的KD结合人或鼠OX40、以约90pM以下的KD结合人或鼠OX40、以约80pM以下的KD结合人或鼠OX40、以约70pM以下的KD结合人或鼠OX40、以约60pM以下的KD结合人或鼠OX40、以约50pM以下的KD结合人或鼠OX40、以约40pM以下的KD结合人或鼠OX40或以约30pM以下的KD结合人或鼠OX40。
在一些实施方式中，所描述的组合物、过程和方法包括如下OX40激动剂，该OX40激动剂以约7.5×105 1/M·s或更快的kassoc与人或鼠OX40结合、以约7.5×105 1/M·s或更快的kassoc与人或鼠OX40结合、以约8×105 1/M·s或更快的kassoc与人或鼠OX40结合、以约8.5×105 1/M·s或更快的kassoc与人或鼠OX40结合、以约9×105 1/M·s或更快的kassoc与人或鼠OX40结合、以约9.5×105 1/M·s或更快的kassoc与人或鼠OX40结合或以约1×106 1/M·s或更快的kassoc与人或鼠OX40结合。
在一些实施方式中，所描述的组合物、过程和方法包括如下OX40激动剂，该OX40激动剂以约2×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠OX40结合、以约2.1×10-51/s或更慢的kdissoc与人或鼠OX40结合、以约2.2×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠OX40结合、以约2.3×10-51/s或更慢的kdissoc与人或鼠OX40结合、以约2.4×10-51/s或更慢的kdissoc与人或鼠OX40结合、以约2.5×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠OX40结合、以约2.6×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠OX40结合、以约2.7×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠OX40结合、以约2.8×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠OX40结合、以约2.9×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠OX40结合或以约3×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠OX40结合。
在一些实施方式中，所描述的组合物、过程和方法包括如下OX40激动剂，该OX40激动剂以约10nM以下的IC50与人或鼠OX40结合、以约9nM以下的IC50与人或鼠OX40结合、以约8nM以下的IC50与人或鼠OX40结合、以约7nM以下的IC50与人或鼠OX40结合、以约6nM以下的IC50与人或鼠OX40结合、以约5nM以下的IC50与人或鼠OX40结合、以约4nM以下的IC50与人或鼠OX40结合、以约3nM以下的IC50与人或鼠OX40结合、以约2nM以下的IC50与人或鼠OX40结合或以约1nM以下的IC50与人或鼠OX40结合。
在一些实施方式中，OX40激动剂为塔沃西单抗，又称为MEDI0562或MEDI-0562。塔沃西单抗可获自AstraZeneca公司的MedImmune子公司。塔沃西单抗为免疫球蛋白G1-κ抗[智人TNFRSF4(肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员4，OX40，CD134)]人源化和嵌合单克隆抗体。塔沃西单抗的氨基酸序列阐述于表12中。塔沃西单抗包含在位置301和301”处的N-糖基化位点，具有岩藻糖基化复合物二触角CHO型聚糖；在位置22-95(VH-VL)、148-204((CH1-CL)、265-325(CH2)和371-429(CH3)处(和在位置22”-95”、148”-204”、265”-325”和371”-429”处)的重链链内二硫键；在位置23'-88'(VH-VL)和134'-194'(CH1-CL)处(和在位置23”'-88”'和134”'-194”'处)的轻链链内二硫键；在位置230-230”和233-233”处的链间重链-重链二硫键；和在224-214'和224”-214”'处的链间重链-轻链二硫键。当前塔沃西单抗用于各种实体肿瘤适应症中的临床试验包括美国国家卫生研究院clinicaltrials.gov识别号NCT02318394和NCT02705482。
在一些实施方式中，OX40激动剂包含SEQ ID NO：87所示的重链和SEQ ID NO：88所示的轻链。在一些实施方式中，OX40激动剂包含分别具有SEQ ID NO：87和SEQ ID NO：88中所示序列的重链和轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施方式中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：87和SEQ ID NO：88中所示序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：87和SEQ ID NO：88中所示序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ IDNO：87和SEQ ID NO：88中所示序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：87和SEQ ID NO：88中所示序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：87和SEQ ID NO：88中所示序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一些实施方式中，OX40激动剂包含塔沃西单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施方式中，OX40激动剂重链可变区(VH)包括SEQ ID NO：89中所示序列，OX40激动剂轻链可变区(VL)包括SEQ ID NO：90中所示序列，及其保守性氨基酸取代。在一些实施方式中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：90中所示序列具有至少99％同一性的VH和VL区。在一些实施方式中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：89和SEQ IDNO：90中所示序列具有至少98％同一性的VH和VL区。在一些实施方式中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：90中所示序列具有至少97％同一性的VH和VL区。在一些实施方式中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：90中所示序列具有至少96％同一性的VH和VL区。在一些实施方式中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：90中所示序列具有至少95％同一性的VH和VL区。在一些实施方式中，OX40激动剂包含scFv抗体，该scFv抗体包含各自分别与SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：90中所示序列具有至少99％同一性的VH和VL区。
在一些实施方式中，OX40激动剂包含分别具有SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92和SEQID NO：93中所示的序列及其保守性氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域；以及分别具有SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95和SEQ ID NO：96中所示的序列及其保守性氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。
在一些实施方式中，OX40激动剂为药物监管机构参考塔沃西单抗批准的OX40激动剂生物类似物单克隆抗体。在一些实施方式中，生物类似物单克隆抗体包括OX40抗体，该OX40抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其相较于该参考药品或参考生物产品包含一个以上翻译后修饰，该参考药品或参考生物产品为塔沃西单抗。在一些实施方式中，一个以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。在某些实施方式中，生物类似物为获得授权或申请授权的OX40激动剂抗体，其中OX40激动剂抗体提供在一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，该参考药品或参考生物产品为塔沃西单抗。OX40激动剂抗体可获得药物管理机构，例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施方式中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，该参考药品或参考生物产品为塔沃西单抗。在一些实施方式中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，该参考药品或参考生物产品为塔沃西单抗。
表12：与塔沃西单抗相关的OX40激动剂抗体的氨基酸序列
在一些实施方式中，OX40激动剂为11D4，其为可获自Pfizer,Inc的完全人抗体。11D4的制备和特性描述于美国专利第7,960,515号、第8,236,930号和第9,028,824号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。11D4的氨基酸序列阐述于表13中。
在一些实施方式中，OX40激动剂包含SEQ ID NO：97所示的重链和SEQ ID NO：98所示的轻链。在一些实施方式中，OX40激动剂包含分别具有SEQ ID NO：97和SEQ ID NO：98中所示序列的重链和轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施方式中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：97和SEQ ID NO：98中所示序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：97和SEQ ID NO：98中所示序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：97和SEQ ID NO：98中所示序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：97和SEQ ID NO：98中所示序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：97和SEQ ID NO：98中所示序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一些实施方式中，OX40激动剂包含11D4的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施方式中，OX40激动剂重链可变区(VH)包括SEQ ID NO：99中所示序列，OX40激动剂轻链可变区(VL)包括SEQ ID NO：100中所示序列，及其保守性氨基酸取代。在一些实施方式中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：100中所示序列具有至少99％同一性的VH和VL区。在一些实施方式中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：100中所示序列具有至少98％同一性的VH和VL区。在一些实施方式中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：100中所示序列具有至少97％同一性的VH和VL区。在一些实施方式中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：100中所示序列具有至少96％同一性的VH和VL区。在一些实施方式中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：100中所示序列具有至少95％同一性的VH和VL区。
在一些实施方式中，OX40激动剂包含分别具有SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102和SEQ ID NO:103中所示的序列及其保守性氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域；以及分别具有SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105和SEQ ID NO：106中所示的序列及其保守性氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。
在一些实施方式中，OX40激动剂为药物管理机构参考11D4批准的OX40激动剂生物类似物单克隆抗体。在一些实施方式中，生物类似物单克隆抗体包括OX40抗体，该OX40抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其相较于该参考药品或参考生物产品包含一个以上翻译后修饰，该参考药品或参考生物产品为11D4。在一些实施方式中，一个以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。在一些实施方式中，生物类似物为获得授权或申请授权的OX40激动剂抗体，其中OX40激动剂抗体提供在一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，该参考药品或参考生物产品为11D4。OX40激动剂抗体可获得药物管理机构，例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施方式中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，该参考药品或参考生物产品为11D4。在一些实施方式中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，该参考药品或参考生物产品为11D4。
表13：与11D4相关的OX40激动剂抗体的氨基酸序列
在一些实施方式中，OX40激动剂为18D8，其为可获自Pfizer,Inc的完全人抗体。18D8的制备和特性描述于美国专利第7,960,515号、第8,236,930号和第9,028,824号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。18D8的氨基酸序列阐述于表14中。
在一些实施方式中，OX40激动剂包含SEQ ID NO：107所示的重链和SEQ ID NO：108所示的轻链。在一些实施方式中，OX40激动剂包含分别具有SEQ ID NO：107和SEQ ID NO：108中所示序列的重链和轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施方式中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：107和SEQ ID NO：108中所示序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：107和SEQ ID NO：108中所示序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：107和SEQ ID NO：108中所示序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，OX40激动剂包含各自分别与SEQID NO：107和SEQ ID NO：108中所示序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：107和SEQ ID NO：108中所示序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一些实施方式中，OX40激动剂包含18D8的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施方式中，OX40激动剂重链可变区(VH)包括SEQ ID NO：109中所示序列，OX40激动剂轻链可变区(VL)包括SEQ ID NO：110中所示序列，及其保守性氨基酸取代。在一些实施方式中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：109和SEQ ID NO：110中所示序列具有至少99％同一性的VH和VL区。在一些实施方式中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：109和SEQ IDNO：110中所示序列具有至少98％同一性的VH和VL区。在一些实施方式中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：109和SEQ ID NO：110中所示序列具有至少97％同一性的VH和VL区。在一些实施方式中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：109和SEQ ID NO：110中所示序列具有至少96％同一性的VH和VL区。在一些实施方式中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ IDNO：109和SEQ ID NO：110中所示序列具有至少95％同一性的VH和VL区。
在一些实施方式中，OX40激动剂包含分别具有SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：112和SEQ ID NO:113中所示的序列及其保守性氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域；以及分别具有SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：116中所示的序列及其保守性氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。
在一些实施方式中，OX40激动剂为药物管理机构参考18D8批准的OX40激动剂生物类似物单克隆抗体。在一些实施方式中，生物类似物单克隆抗体包括OX40抗体，该OX40抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其相较于该参考药品或参考生物产品包含一个以上翻译后修饰，该参考药品或参考生物产品为18D8。在一些实施方式中，一个以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。在一些实施方式中，生物类似物为获得授权或申请授权的OX40激动剂抗体，其中OX40激动剂抗体提供在一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，该参考药品或参考生物产品为18D8。OX40激动剂抗体可获得药物管理机构，例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施方式中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，该参考药品或参考生物产品为18D8。在一些实施方式中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，该参考药品或参考生物产品为18D8。
表14：与18D8相关的OX40激动剂抗体的氨基酸序列
在一些实施方式中，OX40激动剂为Hu119-122，其为可获自GlaxoSmithKline plc的人源化抗体。Hu119-122的制备和特性描述于美国专利第9,006,399号和第9,163,085号以及国际专利公开第WO 2012/027328号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。Hu119-122的氨基酸序列阐述于表15中。
在一些实施方式中，OX40激动剂包含Hu119-122的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施方式中，OX40激动剂重链可变区(VH)包括SEQ ID NO：117中所示序列，OX40激动剂轻链可变区(VL)包括SEQ ID NO：118中所示序列，及其保守性氨基酸取代。在一些实施方式中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：118中所示序列具有至少99％同一性的VH和VL区。在一些实施方式中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：118中所示序列具有至少98％同一性的VH和VL区。在一些实施方式中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：118中所示序列具有至少97％同一性的VH和VL区。在一些实施方式中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：118中所示序列具有至少96％同一性的VH和VL区。在一些实施方式中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：118中所示序列具有至少95％同一性的VH和VL区。
在一些实施方式中，OX40激动剂包含分别具有SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：120和SEQ ID NO：121中所示的序列及其保守性氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域；以及分别具有SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：123和SEQ ID NO：124中所示的序列及其保守性氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。
在一些实施方式中，OX40激动剂为药物管理机构参考Hu119-122批准的OX40激动剂生物类似物单克隆抗体。在一些实施方式中，生物类似物单克隆抗体包括OX40抗体，该OX40抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其相较于该参考药品或参考生物产品包含一个以上翻译后修饰，该参考药品或参考生物产品为Hu119-122。在一些实施方式中，一个以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。在一些实施方式中，生物类似物为获得授权或申请授权的OX40激动剂抗体，其中OX40激动剂抗体提供在一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，该参考药品或参考生物产品为Hu119-122。OX40激动剂抗体可获得药物管理机构，例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施方式中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，该参考药品或参考生物产品为Hu119-122。在一些实施方式中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，该参考药品或参考生物产品为Hu119-122。
表15：与Hu119-122相关的OX40激动剂抗体的氨基酸序列
在一些实施方式中，在一些实施方式中，OX40激动剂为Hu106-222，其为可获自GlaxoSmithKline plc的人源化抗体。Hu106-222的制备和特性描述于美国专利第9,006,399号和第9,163,085号以及国际专利公开第WO 2012/027328号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。Hu106-222的氨基酸序列阐述于表16中。
在一些实施方式中，OX40激动剂包含Hu106-222的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施方式中，OX40激动剂重链可变区(VH)包括SEQ ID NO：125中所示序列，OX40激动剂轻链可变区(VL)包括SEQ ID NO：126中所示序列，及其保守性氨基酸取代。在一些实施方式中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：125和SEQ ID NO：126中所示序列具有至少99％同一性的VH和VL区。在一些实施方式中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：125和SEQ ID NO：126中所示序列具有至少98％同一性的VH和VL区。在一些实施方式中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：125和SEQ ID NO：126中所示序列具有至少97％同一性的VH和VL区。在一些实施方式中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：125和SEQ ID NO：126中所示序列具有至少96％同一性的VH和VL区。在一些实施方式中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：125和SEQ ID NO：126中所示序列具有至少95％同一性的VH和VL区。
在一些实施方式中，OX40激动剂包含分别具有SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：128和SEQ ID NO：129所示的序列及其保守性氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域；以及分别具有SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：131和SEQ ID NO：132中所示的序列及其保守性氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。
在一些实施方式中，OX40激动剂为药物管理机构参考Hu106-222批准的OX40激动剂生物类似物单克隆抗体。在一些实施方式中，生物类似物单克隆抗体包括OX40抗体，该OX40抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其相较于该参考药品或参考生物产品包含一个以上翻译后修饰，该参考药品或参考生物产品为Hu106-222。在一些实施方式中，一个以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。在一些实施方式中，生物类似物为获得授权或申请授权的OX40激动剂抗体，其中OX40激动剂抗体提供在一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，该参考药品或参考生物产品为Hu106-222。OX40激动剂抗体可获得药物管理机构，例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施方式中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，该参考药品或参考生物产品为Hu106-222。在一些实施方式中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，该参考药品或参考生物产品为Hu106-222。
表16：与Hu106-222相关的OX40激动剂抗体的氨基酸序列.
在一些实施方式中，OX40激动剂抗体为MEDI6469(又称为9B12)。MEDI6469为鼠单克隆抗体。Weinberg等人,《免疫疗法杂志》2006,29,575-585。在一些实施方式中，OX40激动剂是由9B12杂交瘤产生，由Biovest Inc.(美国马萨诸塞州马尔文(Malvern,MA,USA))保藏的抗体，如Weinberg等人,《免疫疗法杂志》2006,29,575-585中所描述，其公开内容以全文引用的方式并入本文中。在一些实施方式中，抗体包括MEDI6469的CDR序列。在一些实施方式中，抗体包含MEDI6469的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。
在一些实施方式中，OX40激动剂为L106 BD(Pharmingen，产品号340420)。在一些实施方式中，OX40激动剂包含抗体L106(BD Pharmingen，产品号340420)的CDR。在一些实施方式中，OX40激动剂包含抗体L106(BD Pharmingen，产品号340420)的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。在一些实施方式中，OX40激动剂为ACT35(Santa Cruz Biotechnology，目录号20073)。在一些实施方式中，OX40激动剂包含抗体ACT35(Santa CruzBiotechnology，目录号20073)的CDR。在一些实施方式中，OX40激动剂包含抗体ACT35(Santa Cruz Biotechnology，目录号20073)的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。在一些实施方式中，OX40激动剂为鼠单克隆抗体抗mCD134/mOX40(克隆OX86)，可购自新罕布夏州西黎巴嫩的BioXcell Inc的InVivoMAb。
在一些实施方式中，OX40激动剂选自以下中描述的OX40激动剂：国际专利申请公开第WO 95/12673号、第WO 95/21925号、第WO 2006/121810号、第WO 2012/027328号、第WO2013/028231号、第WO 2013/038191号和第WO 2014/148895号；欧洲专利申请案EP0672141；美国专利申请公开第US2010/136030号、第US2014/377284号、第US2015/190506号和第US2015/132288号(包含克隆20E5和12H3)；和美国专利第7,504,101号、第7,550,140号、第7,622,444号、第7,696,175号、第7,960,515号、第7,961,515号、第8,133,983号、第9,006,399号和第9,163,085号，其各自的公开内容以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方式中，OX40激动剂为如结构I-A(C端Fc抗体片段融合蛋白)或结构I-B(N端Fc抗体片段融合蛋白)中所描绘的OX40激动性融合蛋白，或其片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物。结构I-A和结构I-B的特性已在上文和美国专利第9,359,420号、第9,340,599号、第8,921,519号和第8,450,460号中描述，其公开内容以引用的方式并入本文中。图18中所提供的结构I-A的多肽结构域的氨基酸序列见于表8中。Fc结构域优选包含完整恒定结构域(SEQ ID NO：62的氨基酸17-230)、完整铰链结构域(SEQ ID NO：62的氨基酸1-16)或铰链结构域的一部分(例如SEQ ID NO：62的氨基酸4-16)。用于连接C端Fc抗体的优选接头可选自SEQ ID NO：63至SEQ ID NO：72中所示的实施方式，包括适合于融合另外的多肽的接头。同样，图18中所提供的结构I-B的多肽结构域的氨基酸序列见于表9中。若Fc抗体片段如在结构I-B中与TNRFSF融合蛋白的N端融合，则Fc模块的序列优选为SEQ ID NO：73中所示的序列，接头序列优选选自SED ID NO:74至SEQ ID NO：76中所示的实施方式。
在一些实施方式中，根据结构I-A或结构I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上选自如下的OX40结合结构域：塔沃西单抗的可变重链和可变轻链、11D4的可变重链和可变轻链、18D8的可变重链和可变轻链、Hu119-122的可变重链和可变轻链、Hu106-222的可变重链和可变轻链、选自表17中描述的可变重链和可变轻链的可变重链和可变轻链、前述的可变重链和可变轻链的任何组合，及其片段、衍生物、缀合物、变体和生物类似物。
在一些实施方式中，根据结构I-A或结构I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上包含OX40L序列的OX40结合结构域。在一些实施方式中，根据结构I-A或结构I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上包含根据SEQ ID NO：133的序列的OX40结合结构域。在一些实施方式中，根据结构I-A或结构I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上包含可溶性OX40L序列的OX40结合结构域。在一些实施方式中，根据结构I-A或结构I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上包含根据SEQ ID NO：134的序列的OX40结合结构域。在一些实施方式中，根据结构I-A或结构I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上包含根据SEQ ID NO：135的序列的OX40结合结构域。
在一些实施方式中，根据结构I-A或结构I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上OX40结合结构域，该一个以上OX40结合结构域为scFv结构域，该scFv结构域包含各自分别与SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：90中所示序列具有至少95％同一性的VH和VL区，其中VH和VL结构域经接头连接。在一些实施方式中，根据结构I-A或结构I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上OX40结合结构域，该一个以上OX40结合结构域为scFv结构域，该scFv结构域包含各自分别与SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：100中所示序列具有至少95％同一性的VH和VL区，其中VH和VL结构域经接头连接。在一些实施方式中，根据结构I-A或结构I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上OX40结合结构域，该一个以上OX40结合结构域为scFv结构域，该scFv结构域包含各自分别与SEQ ID NO：109和SEQ ID NO：110中所示序列具有至少95％同一性的VH和VL区，其中VH和VL结构域经接头连接。在一些实施方式中，根据结构I-A或结构I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上OX40结合结构域，该一个以上OX40结合结构域为scFv结构域，该scFv结构域包含各自分别与SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：118中所示序列具有至少95％同一性的VH和VL区，其中VH和VL结构域经接头连接。在一些实施方式中，根据结构I-A或结构I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上OX40结合结构域，该一个以上OX40结合结构域为scFv结构域，该scFv结构域包含各自分别与SEQ ID NO：125和SEQ ID NO：126中所示序列具有至少95％同一性的VH和VL区，其中VH和VL结构域经接头连接。在一些实施方式中，根据结构I-A或结构I-B的OX40激动剂融合蛋白质包含一个以上OX40结合结构域，该一个以上结合结构域为scFv结构域，该scFv结构域包含各自与表17中所提供的VH和VL序列至少95％同一性的VH和VL区，其中VH和VL结构域经接头连接。
表17：可用作融合蛋白(例如结构I-A和I-B)中的OX40结合结构域或用作scFvOX40激动剂抗体的另外的多肽结构域
在一些实施方式中，OX40激动剂为OX40激动性单链融合多肽，其包含：(i)第一可溶性OX40结合结构域；(ii)第一肽接头；(iii)第二可溶性OX40结合结构域；(iv)第二肽接头；以及(v)第三可溶性OX40结合结构域，其进一步包含在N端和/或C端处的另外的结构域，其中该另外的结构域为Fab或Fc片段结构域。在一些实施方式中，OX40激动剂为OX40激动性单链融合多肽，其包含：(i)第一可溶性OX40结合结构域；(ii)第一肽接头；(iii)第二可溶性OX40结合结构域；(iv)第二肽接头；以及(v)第三可溶性OX40结合结构域，其进一步包含在N端和/或C端处的另外的结构域，其中该另外的结构域为Fab或Fc片段结构域，其中各可溶性OX40结合结构域缺乏茎区(其促成三聚作用且提供与细胞膜的某一距离，但不为OX40结合结构域的一部分)，第一肽接头和第二肽接头独立地具有3-8个氨基酸的长度。
在一些实施方式中，OX40激动剂为OX40激动性单链融合多肽，其包含：(i)第一可溶性肿瘤坏死因子(TNF)超家族细胞因子结构域；(ii)第一肽接头；(iii)第二可溶性TNF超家族细胞因子结构域；(iv)第二肽接头；以及(v)第三可溶性TNF超家族细胞因子结构域，其中各可溶性TNF超家族细胞因子结构域缺乏茎区，第一肽接头和第二肽接头独立地具有3-8个氨基酸的长度，TNF超家族细胞因子结构域为OX40结合结构域。
在一些实施方式中，OX40激动剂为MEDI6383。MEDI6383为OX40激动性融合蛋白且可如美国专利第6,312,700号中所描述来制备，其公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施方式中，OX40激动剂为OX40激动性scFv抗体，其包含与任何前述VL结构域连接的任何前述VH结构域。
在一些实施方式中，OX40激动剂为Creative Biolabs OX40激动剂单克隆抗体MOM-18455，可购自美国纽约州雪莉市的Creative Biolabs，Inc.。
在一些实施方式中，OX40激动剂为OX40激动性抗体克隆Ber-ACT35，可购自美国加利福尼亚州圣地亚哥的BioLegend,Inc.。
C.可选地进行的细胞存活率分析
可选地，在起始第一扩增(有时称为初始主体扩增(initial bulk expansion))之后，可使用本领域已知的标准分析进行细胞存活率分析。因此，在某些实施方式中，方法包括在起始第一扩增之后进行细胞存活率分析。例如，可在主体TIL样本上进行台盼蓝排除分析，台盼蓝选择性标记死细胞且允许存活率评定。其他用于测试存活率的分析可包括但不限于阿尔玛蓝(Alamar blue)分析和MTT分析。
2.细胞计数、存活率、流式细胞术
在一些实施方式中，测量细胞计数和/或存活率。标记物(例如但不限于CD3、CD4、CD8和CD56以及本文公开或描述的任何其他标记物)的表达可通过流式细胞术，使用FACSCantoTM流动式细胞仪(BD Biosciences)，用抗体，例如但不限于可购自BD Bio-sciences者(BD Biosciences，加利福尼亚州圣荷西)测量。细胞可使用一次性c-芯片血细胞计数器(VWR，伊利诺伊州巴达维亚)手动计数，存活率可使用本领域中已知的任何方法，包括但不限于台盼蓝染色评定。细胞存活率也可基于美国专利申请公开第2018/0282694号分析，其以全文引用的方式并入本文中。细胞存活率也可基于美国专利申请公开第2018/0280436号或国际专利申请公开第WO/2018/081473号分析，两者全文均出于所有目的并入本文中。
在一些情况下，主体TIL群可使用下文论述的方案立即冷冻保存。替代性地，主体TIL群可进行REP接着如下文所论述冷冻保存。类似地，在将经基因修饰的TIL用于疗法中的情况下，主体或REP TIL群可进行基因修饰以用于适合治疗。
3.细胞培养
在一些实施方式中，用于扩增TIL的方法(包括上文所论述以及图1和图8，特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D中示例的方法)可包括使用约5,000mL至约25,000mL的细胞培养基、约5,000mL至约10,000mL的细胞培养基或约5,800mL至约8,700mL的细胞培养基。在一些实施方式中，培养基为不含血清的培养基。在一些实施方式中，起始第一扩增中的培养基不含血清。在一些实施方式中，第二扩增中的培养基不含血清。在一些实施方式中，起始第一扩增和第二扩增(也称为快速第二扩增)中的培养基均不含血清。在一些实施方式中，扩增TIL数目使用不超过一种类型的细胞培养基。可使用任何合适的细胞培养基，例如AIM-V细胞培养基(L-谷氨酰胺、50μM链霉素硫酸盐和10μM庆大霉素硫酸盐)细胞培养基(Invitrogen，加利福尼亚州喀斯巴德(Carlsbad CA))。就此而言，本发明方法有利地减少扩增TIL数目所需的培养基的量和培养基类型的数目。在一些实施方式中，扩增TIL数目可包括频率不超过每三或四天一次地喂养细胞。在透气容器中扩增细胞数目通过减少扩增细胞所需的喂养频率，简化扩增细胞数目所需的程序。
在一些实施方式中，第一透气容器和/或第二透气容器中的细胞培养基为未经过滤的。使用未经过滤的细胞培养基可简化扩增细胞数目所需的程序。在一些实施方式中，第一透气容器和/或第二透气容器中的细胞培养基缺乏β-巯基乙醇(BME)。
在一些实施方式中，该方法期间包括自哺乳动物获得肿瘤组织样本；在第一透气容器中将肿瘤组织样本培养约1至8天的时间，例如培养约7天作为起始第一扩增或培养约8天作为起始第一扩增，该第一透气容器含有包含IL-2、1X抗原呈递饲养细胞和OKT-3的细胞培养基；将TIL转移至第二透气容器中并在第二透气容器中扩增TIL数目，持续约7至9天，例如约7天、约8天或约9天，该第二透气容器含有包含IL-2、2X抗原呈递饲养细胞和OKT-3的细胞培养基。
在一些实施方式中，该方法期间包括自哺乳动物获得肿瘤组织样本；在第一透气容器中将肿瘤组织样本培养约1至7天(例如约7天)的持续时间作为起始第一扩增，该第一透气容器含有包含IL-2、1X抗原呈递饲养细胞和OKT-3的细胞培养基；将TIL转移至第二透气容器中并在第二透气容器中扩增TIL数目，持续约7至14天或约7至9天，例如约7天、约8天或约9天、约10天或约11天，该第二透气容器含有包含IL-2、2X抗原呈递饲养细胞和OKT-3的细胞培养基。
在一些实施方式中，该方法期间包括自哺乳动物获得肿瘤组织样本；在第一透气容器中将肿瘤组织样本培养约1至7天(例如约7天)的持续时间作为起始第一扩增，该第一透气容器含有包含IL-2、1X抗原呈递饲养细胞和OKT-3的细胞培养基；将TIL转移至第二透气容器中并在第二透气容器中扩增TIL数目，持续约7至11天，例如约7天、约8天、约9天、约10天或约11天，该第二透气容器含有包含IL-2、2X抗原呈递饲养细胞和OKT-3的细胞培养基。
在一些实施方式中，TIL在透气容器中扩增。已使用透气容器来扩增TIL，使用PBMC，使用本领域中已知的方法、组合物和装置，包括美国专利申请案公开第2005/0106717A1号中描述的那些，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施方式中，TIL在透气袋中扩增。在一些实施方式中，TIL使用在透气袋中扩增TIL的细胞扩增系统，例如Xuri细胞扩增系统W25(GE Healthcare)扩增。在一些实施方式中，TIL使用在透气袋中扩增TIL的细胞扩增系统，例如WAVE生物反应器系统，又称为Xuri细胞扩增系统W5(GEHealthcare)扩增。在一些实施方式中，细胞扩增系统包括透气细胞袋，该透气细胞袋的容积选自如下：约100mL、约200mL、约300mL、约400mL、约500mL、约600mL、约700mL、约800mL、约900mL、约1L、约2L、约3L、约4L、约5L、约6L、约7L、约8L、约9L和约10L。
在一些实施方式中，TIL可在G-Rex培养瓶(可商购自Wilson WolfManufacturing)中扩增。此类实施方式允许细胞群自约5×105个细胞/cm2扩增至在10×106与30×106个细胞/cm2之间。在一些实施方式中，其为未进行喂养。在一些实施方式中，其为未进行喂养，只要G-Rex培养瓶中的培养基驻留在约10cm的高度。在一些实施方式中，其为未进行喂养但添加一种以上细胞因子。在一些实施方式中，细胞因子可作为推注添加，不需要将细胞因子与培养基混合。此类容器、装置和方法为本领域中已知的且已用于扩增TIL，包括以下中描述者：美国专利申请公开第US2014/0377739A1号、国际公开第WO 2014/210036 A1号、美国专利申请公开第us 2013/0115617A1号、国际公开第WO 2013/188427 A1号、美国专利申请公开第US2011/0136228A1号、美国专利第US 8,809,050 B2号、国际公开第WO 2011/072088 A2号、美国专利申请公开第US 2016/0208216 A1号、美国专利申请公开第US2012/0244133 A1号、国际公开第WO 2012/129201 A1号、美国专利申请公开第US2013/0102075 A1号、美国专利第US 8,956,860B2号、国际公开第WO 2013/173835 A1号、美国专利申请公开第US2015/0175966 A1号，其公开内容以引用的方式并入本文中。此类过程也描述于Jin等人,《免疫疗法杂志》,2012,35:283-292中。
D.可选地进行的TIL中基因的敲低或敲除
在一些实施方式中，本发明的经扩增的TIL在扩增步骤之前、期间或之后，包括在密闭无菌制造过程期间(各自如本文提供了)经进一步操作，以瞬时方式改变蛋白质表达。在一些实施方式中，瞬时改变的蛋白质表达是因为瞬时基因编辑。在一些实施方式中，本发明的经扩增的TIL用转录因子(TF)和/或其他能够瞬时改变TIL中的蛋白质表达的分子处理。在一些实施方式中，TF和/或其他能够瞬时改变蛋白质表达的分子提供TIL群中改变的肿瘤抗原表达和/或改变肿瘤抗原特异性T细胞的数目。
在某些实施方式中，方法包括基因编辑TIL群。在某些实施方式中，方法包括基因编辑第一TIL群、第二TIL群和/或第三TIL群。
在一些实施方式中，本发明包括通过核苷酸插入，例如通过核糖核酸(RNA)插入，包括插入信使RNA(mRNA)或小(或短)干扰RNA(siRNA)至TIL群中进行基因编辑，以促进一种以上蛋白质的表达或抑制一种以上蛋白质的表达以及同时促进一组蛋白质与抑制另一组蛋白质的组合。
在一些实施方式中，本发明的经扩增的TIL经历瞬时改变蛋白质表达。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达发生在第一扩增之前的主体TIL群，包括例如获自例如图8(特别是图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中所指示的步骤A的TIL群中。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达发生在第一扩增期间，包括例如获自例如图8(例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中所指示的步骤B的TIL群中。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达发生在第一扩增之后，包括例如在第一扩增与第二扩增之间转变的TIL群(例如本文所述的第二TIL群)中，即获自例如图8中所指示的步骤B且包括在步骤C中的TIL群中。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达发生在第二扩增之前的主体TIL群，包括例如在获自例如图8中所指示的步骤C且在步骤D中扩增之前的TIL群中。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达发生在第二扩增期间，包括例如在例如图8中所指示的步骤D中扩增的TIL群(例如第三TIL群)中。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达发生在第二扩增之后，包括例如在获自例如图8中所指示的步骤D中的扩增的TIL群中。
在一些实施方式中，瞬时改变TIL群中的蛋白质表达的方法包括电穿孔的步骤。电穿孔方法为本领域中已知的，描述于例如以下中：Tsong,《生物物理学杂志(Biophys.J.)》1991,60,297-306和美国专利申请公开第2014/0227237A1号，其各自的公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施方式中，瞬时改变TIL群中的蛋白质表达的方法包括磷酸钙转染的步骤。磷酸钙转染方法(磷酸钙DNA沉淀、细胞表面包覆和胞吞作用)为本领域中已知的且描述于以下中：Graham和van der Eb,《病毒学(Virology)》1973,52,456-467；Wigler等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)》1979,76,1373-1376；以及Chen和Okayarea,《分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)》1987,7,2745-2752；和美国专利第5,593,875号，其各自的公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施方式中，瞬时改变TIL群中的蛋白质表达的方法包括脂质体转染的步骤。脂质体转染方法，例如采用在过滤水中的阳离子脂质N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(DOTMA)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)的1:1(w/w)脂质体制剂的方法为本领域中已知的且描述于以下中：Rose等人,《生物技术(Biotechniques)》1991,10,520-525和Felgner等人,《美国国家科学院院刊》,1987,84,7413-7417，以及美国专利第5,279,833号、第5,908,635号、第6,056,938号、第6,110,490号、第6,534,484号和第7,687,070号，其各自的公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施方式中，瞬时改变TIL群中的蛋白质表达的方法包括使用以下中描述的方法的转染步骤：美国专利第5,766,902号、第6,025,337号、第6,410,517号、第6,475,994号和第7,189,705号，其各自的公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达使得记忆干T细胞(Stem Memory Tcell；TSCM)增加。TSCM为抗原经历的中枢记忆T细胞的早期前驱细胞。TSCM通常呈现定义干细胞的长期存活、自我更新和多效力能力，通常为产生有效TIL产物所需的。与过继性细胞转移小鼠模型中的其他T细胞亚群相比，TSCM显示出增强的抗肿瘤活性。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致具有包含高比例的TSCM的组成的TIL群。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达使得TSCM百分比增加至少5％、至少10％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达使得TIL群中的TSCM增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍或10倍。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致具有至少至少5％、至少10％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％ TSCM的TIL群。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致具有至少至少5％、至少10％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％ TSCM的治疗性TIL群。
在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达使得抗原经历T细胞复苏(rejuvenation)。在一些实施方式中，复苏包括例如增加增殖、增加T细胞活化和/或增加抗原识别。
在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达改变大部分T细胞的表达，以保留肿瘤衍生的TCR贮库。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达不改变肿瘤衍生的TCR贮库。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达维持肿瘤衍生的TCR贮库。
在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质引起特定基因的表达改变。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达靶向包括但不限于以下的基因：PD-1(又称为PDCD1或CC279)、TGFBR2、CCR4/5、CBLB(CBL-B)、CISH、嵌合共刺激受体(chimeric co-stimulatoryreceptor；CCR)、IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2ICD、CTLA-4、TIM3、LAG3、TIGIT、TET2、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1、胸腺细胞选择相关高迁移率组(high mobility group；HMG)盒(TOX)、锚蛋白重复结构域11(ANKRD11)、BCL6共抑制子(BCOR)和/或cAMP蛋白激酶A(PKA)。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达靶向选自如下的基因：PD-1、TGFBR2、CCR4/5、CTLA-4、CBLB(CBL-B)、CISH、嵌合共刺激受体(CCR)、IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2ICD、TIM3、LAG3、TIGIT、TET2、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1、胸腺细胞选择相关高迁移率组(HMG)盒(TOX)、锚蛋白重复结构域11(ANKRD11)、BCL6共抑制子(BCOR)和/或cAMP蛋白激酶A(PKA)。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达靶向PD-1。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达靶向TGFBR2。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达靶向CCR4/5。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达靶向CTLA-4。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达靶向CBLB。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达靶向CISH。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达靶向CCR(嵌合共刺激受体)。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达靶向IL-2。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达靶向IL-12。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达靶向IL-15。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达靶向IL-21。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达靶向NOTCH 1/2ICD。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达靶向TIM3。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达靶向LAG3。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达靶向TIGIT。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达靶向TET2。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达靶向TGFβ。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达靶向CCR1。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达靶向CCR2。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达靶向CCR4。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达靶向CCR5。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达靶向CXCR1。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达靶向CXCR2。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达靶向CSCR3。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达靶向CCL2(MCP-1)。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达靶向CCL3(MIP-1α)。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达靶向CCL4(MIP1-β)。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达靶向CCL5(RANTES)。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达靶向CXCL1。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达靶向CXCL8。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达靶向CCL22。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达靶向CCL17。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达靶向VHL。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达靶向CD44。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达靶向PIK3CD。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达靶向SOCS1。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达靶向胸腺细胞选择相关的高迁移率组(HMG)盒(TOX)。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达靶向锚蛋白重复结构域11(ANKRD11)。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达靶向BCL6辅抑制物(BCOR)。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达靶向cAMP蛋白激酶A(PKA)。
在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致趋化因子受体增加和/或过度表达。在一些实施方式中，因瞬时蛋白质表达而过度表达的趋化因子受体包括具有配体的受体，该配体包括但不限于CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1、CXCL8、CCL22和/或CCL17。
在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致PD-1、CTLA-4、CBLB、CISH、TIM-3、LAG-3、TIGIT、TET2、TGFβR2和/或TGFβ的表达降低和/或减少(包括导致例如TGFβ路径阻断)。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致PD-1的表达降低和/或减少。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致CBLB(CBL-B)的表达降低和/或减少。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致CISH的表达降低和/或减少。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致TIM-3的表达降低和/或减少。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致LAG-3的表达降低和/或减少。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致TIGIT的表达降低和/或减少。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致TET2的表达降低和/或减少。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致TGFβR2的表达降低和/或减少。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致TGFβ的表达降低和/或减少。
在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致趋化因子受体增加和/或过度表达，以例如改善TIL运输或运动至肿瘤部位。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致嵌合共刺激受体(CCR)增加和/或过度表达。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致选自如下的趋化因子受体增加和/或过度表达：CCR1、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2和/或CSCR3。
在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致白介素增加和/或过度表达。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致选自如下的白介素增加和/或过度表达：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和/或IL-21。
在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致NOTCH 1/2ICD增加和/或过度表达。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致VHL增加和/或过度表达。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致CD44增加和/或过度表达。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致PIK3CD增加和/或过度表达。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致SOCS1增加和/或过度表达，
在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致cAMP蛋白激酶A(PKA)的表达降低和/或减少。
在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致选自如下的分子的表达降低和/或减少：PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、TET2、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)以及它们的组合。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致选自如下的两种分子的表达降低和/或减少：PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、TET2、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)以及它们的组合。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致PD-1和选自如下的一种分子的表达降低和/或减少：LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、TET2、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)以及它们的组合。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致以下的表达降低和/或减少：PD-1、CTLA-4、LAG-3、CISH、CBLB、TIM3、TIGIT以及它们的组合。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致PD-1和以下中的一种的表达降低和/或减少：CTLA-4、LAG3、CISH、CBLB、TIM3、TIGIT、TET2以及它们的组合。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致PD-1和CTLA-4的表达降低和/或减少。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致PD-1和LAG3的表达降低和/或减少。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致PD-1和CISH的表达降低和/或减少。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致PD-1和CBLB的表达降低和/或减少。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致PD-1和TIM3的表达降低和/或减少。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致PD-1和TIGIT的表达降低和/或减少。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致PD-1和TET2的表达降低和/或减少。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致CTLA-4和LAG3的表达降低和/或减少。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致CTLA-4和CISH的表达降低和/或减少。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致CTLA-4和CBLB的表达降低和/或减少。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致CTLA-4和TIM3的表达降低和/或减少。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致CTLA-4和TIGIT的表达降低和/或减少。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致CTLA-4和TET2的表达降低和/或减少。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致LAG3和CISH的表达降低和/或减少。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致LAG3和CBLB的表达降低和/或减少。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致LAG3和TIM3的表达降低和/或减少。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致LAG3和TIGIT的表达降低和/或减少。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致LAG3和TET2的表达降低和/或减少。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致CISH和CBLB的表达降低和/或减少。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致CISH和TIM3的表达降低和/或减少。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致CISH和TIGIT的表达降低和/或减少。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致CISH和TET2的表达降低和/或减少。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致CBLB和TIM3的表达降低和/或减少。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致CBLB和TIGIT的表达降低和/或减少。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致CBLB和TET2的表达降低和/或减少。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致TIM3和PD-1的表达降低和/或减少。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致TIM3和LAG3的表达降低和/或减少。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致TIM3和CISH的表达降低和/或减少。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致TIM3和CBLB的表达降低和/或减少。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致TIM3和TIGIT的表达降低和/或减少。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致TIM3和TET2的表达降低和/或减少。
在一些实施方式中，选自CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1以及它们的组合的粘附分子通过γ逆转录病毒或慢病毒方法插入第一TIL群、第二TIL群或所收集TIL群中(例如粘附分子的表达增加)。
在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致选自PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、TET2、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)以及它们的组合的分子的表达降低和/或减少，以及CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1以及它们的组合的表达增加和/或增强。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达导致选自PD-1、CTLA-4、LAG3、TIM3、CISH、CBLB、TIGIT、TET2以及它们的组合的分子的表达降低和/或减少，以及，CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1以及它们的组合的表达增加和/或增强。
在一些实施方式中，表达减少约5％、约10％、约10％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方式中，表达减少至少约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方式中，表达减少至少约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方式中，表达减少至少约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方式中，表达减少至少约85％、约90％或约95％。在一些实施方式中，表达减少至少约80％。在一些实施方式中，表达减少至少约85％。在一些实施方式中，表达减少至少约90％。在一些实施方式中，表达减少至少约95％。在一些实施方式中，表达减少至少约99％。
在一些实施方式中，表达增加约5％、约10％、约10％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方式中，表达增加至少约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方式中，表达增加至少约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方式中，表达增加至少约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方式中，表达增加至少约85％、约90％或约95％。在一些实施方式中，表达增加至少约80％。在一些实施方式中，表达增加至少约85％。在一些实施方式中，表达增加至少约90％。在一些实施方式中，表达增加至少约95％。在一些实施方式中，表达增加至少约99％。
在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达通过用转录因子(TF)和/或其他能够瞬时改变TIL中的蛋白质表达的分子处理TIL来诱导。在一些实施方式中，采用无SQZ载体的微流体平台进行转录因子(TF)和/或其他能够瞬时改变蛋白质表达的分子的细胞内递送。此类方法展示了将包括转录因子在内的蛋白质递送至包括T细胞在内的多种初代人细胞的能力，已描述于以下中：美国专利申请公开第2019/0093073A1号、第US 2018/0201889A1号和US2019/0017072 A1号，其各自的公开内容以引用的方式并入本文中。此类方法可用于本发明中，以将TIL群暴露于转录因子(TF)和/或其他能够诱导瞬时蛋白质表达的分子，其中该TF和/或其他能够诱导瞬时蛋白质表达的分子使得TIL群中肿瘤抗原的表达增加和/或肿瘤抗原特异性T细胞的数目增加，由此导致TIL群重编程和重编程的TIL群的治疗功效相较于未重编程的TIL群增加。在一些实施方式中，重编程使得相对于开始或先前TIL群(即，在重编程之前)，效应T细胞和/或中枢记忆T细胞亚群增加，如本文所述。
在一些实施方式中，转录因子(TF)包括但不限于TCF-1、NOTCH 1/2ICD和/或MYB。在一些实施方式中，转录因子(TF)为TCF-1。在一些实施方式中，转录因子(TF)为NOTCH 1/2ICD。在一些实施方式中，转录因子(TF)为MYB。在一些实施方式中，转录因子(TF)与诱导性多能干细胞培养物(iPSC)，例如市售KNOCKOUT血清替代品(Gibco/ThermoFisher)一起施用，以诱导另外的TIL重编程。在一些实施方式中，转录因子(TF)与iPSC混合物一起施用，以诱导另外的TIL重编程。在一些实施方式中，转录因子(TF)不与iPSC混合物一起施用。在一些实施方式中，重编程使得TSCM的百分比增加。在一些实施方式中，重编程使得TSCM的百分比增加约5％、约10％、约10％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％的TSCM。
在一些实施方式中，如上文所描述的瞬时改变蛋白质表达的方法可与基因修饰TIL群的方法组合，包括稳定并入基因以产生一种以上蛋白质的步骤。在某些实施方式中，方法包括基因修饰TIL群的步骤。在某些实施方式中，方法包括基因修饰第一TIL群、第二TIL群和/或第三TIL群。在一些实施方式中，基因修饰TIL群的方法包括逆转录病毒转导的步骤。在一些实施方式中，基因修饰TIL群的方法包括慢病毒转导的步骤。慢病毒转导系统为本领域中已知的且描述于例如以下中：Levine等人,《美国国家科学院院刊》2006,103,17372-77；Zufferey等人,《自然生物技术学》1997,15,871-75；Dull等人,《病毒学杂志》1998,72,8463-71和美国专利第6,627,442号，其各自的公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施方式中，基因修饰TIL群的方法包括γ-逆转录病毒转导的步骤。γ-逆转录病毒转导系统为本领域中已知的且描述于例如Cepko和Pear,《分子生物学中的当前方案(Cur.Prot.Mol.Biol.)》1996,9.9.1-9.9.16，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施方式中，基因修饰TIL群的方法包括转座子介导的基因转移的步骤。转座子介导的基因转移系统为本领域中已知的，包括其中转座酶作为DNA表达载体或作为可表达的RNA或蛋白质提供，使得转座酶的长期表达不发生在转基因细胞中，例如提供为mRNA(例如包含帽和多腺苷酸尾的mRNA)的转座酶。包括类鲑鱼型Tel样转座酶(SB或睡美人转座酶)，例如SB10、SB11和SB100x；和酶活性增加的经工程改造酶的合适的转座子介导的基因转移系统描述于例如以下中：Hackett等人,《分子疗法》2010,18,674-83和美国专利第6,489,458号，其各自的公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施方式中，瞬时改变TIL中的蛋白质表达是由小干扰RNA(siRNA)诱导，该小干扰RNA有时称为短干扰RNA或沉默RNA，其为双链RNA分子，长度通常为19-25个碱基对。siRNA被用于RNA干扰(RNAi)中，其中siRNA干扰具有互补核苷酸序列的特定基因的表达。
在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达为表达减少。在一些实施方式中，瞬时改变蛋白质表达由自我递送RNA干扰(sdRNA)诱导，该自我递送RNA干扰为具有高百分比的2'-OH取代(通常为氟或-OCH3)的化学合成的不对称siRNA双螺旋，其包含20个核苷酸的反义(向导)链和使用四乙基乙二醇(TEG)接头在其3'端处与胆固醇缀合的13至15个碱基有义(随从)链。小干扰RNA(siRNA)，有时称为短干扰RNA或沉默RNA，为双链RNA分子，长度通常为19-25个碱基对。siRNA被用于RNA干扰(RNAi)中，其中siRNA干扰具有互补核苷酸序列的特定基因的表达。sdRNA是进入细胞不需要递送媒介的共价及疏水性修饰的RNAi化合物。sdRNA通常为具有极小双链区的不对称化学修饰核酸分子。sdRNA分子通常含有单链区和双链区，可在分子的单链和双链区内含有各种化学修饰。另外的，如本文所述，sdRNA分子可与疏水性缀合物，例如常规和高级固醇型分子连接。sdRNA和制备此类sdRNA的相关方法也已广泛描述于例如以下中：美国专利申请公开第US2016/0304873 A1号、第US2019/0211337A1号、第US 2009/0131360A1号和第US2019/0048341 A1号，和美国专利第10,633,654号和第10,913,948B2号，其各自的公开内容以引用的方式并入本文中。为了优化sdRNA结构、化学性质、靶向位置、序列偏好等，已开发一种算法且将其用于sdRNA效力预测。基于该分析，功能性sdRNA序列通常定义为在1μM浓度下表达减少超过70％，其中几率超过40％。
双链DNA(dsRNA)通常可用以定义包含一对互补RNA链，通常为有义(随从)和反义(向导)链的任何分子，可包含单链突出端区域。与siRNA不同，术语dsRNA通常指包含siRNA分子的序列的前体分子，siRNA分子通过裂解酶系统(包含Dicer)的作用自较大dsRNA分子释放。
在一些实施方式中，方法包括瞬时改变TIL群(包含经修饰以表达CCR的TIL)中的蛋白质表达，包括使用自我递送RNA干扰(sdRNA)，sdRNA是例如具有更高百分比的2'-OH取代(通常为氟或OCH3)的化学合成的不对称siRNA双螺旋，其包含20个核苷酸的反义(向导)链和使用四乙基乙二醇(TEG)接头在其3'端处与胆固醇缀合的13至15个碱基有义(随从)链。使用siRNA和sdRNA的方法已描述于以下中：Khvorova和Watts,《自然生物技术学(Nat.Biotechnol.)》2017,35,238-248；Byrne等人,《眼药理学与治疗学杂志(J.Ocul.Pharmacol.Ther.)》2013,29,855-864；和Ligtenberg等人,《分子疗法(Mol.Therapy)》2018,26,1482-93，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方式中，siRNA的递送使用电穿孔或细胞膜破坏(例如挤压或SQZ方法)来完成。在一些实施方式中，将sdRNA递送至TIL群无需使用电穿孔、SQZ或其他方法，实际上使用1至3天时间段使TIL群暴露于浓度为1μM/10,000个TIL在培养基中的sdRNA。在某些实施方式中，方法包括将siRNA或sdRNA递送至TIL群，包括将TIL群暴露于在培养基中浓度为1μM/10,000个TIL的sdRNA，保持在1至3天之间的时间段。在一些实施方式中，将sdRNA递送至TIL群使用1至3天时间段完成，其中使TIL群暴露于在培养基中浓度为10μM/10,000个TIL的sdRNA。在一些实施方式中，将sdRNA递送至TIL群使用1至3天时间段完成，其中使TIL群暴露于在培养基中浓度为50μM/10,000个TIL的sdRNA。在一些实施方式中，将sdRNA递送至TIL群使用1至3天时间段完成，其中将TIL群暴露于在培养基中浓度在0.1μM/10,000个TIL与50μM/10,000个TIL之间的sdRNA。在一些实施方式中，将sdRNA递送至TIL群使用1至3天时间段完成，其中使TIL群暴露于在培养基中浓度在0.1μM/10,000个TIL与50μM/10,000个TIL之间的sdRNA，其中，暴露于sdRNA通过将新鲜sdRNA添加至培养基中来进行两次、三次、四次或五次。其他适合过程描述于例如以下中：美国专利申请公开第US 2011/0039914A1号、第US2013/0131141 A1号和第US2013/0131142 A1号，以及美国专利第9,080,171号，其公开内容以引用的方式并入本文中。
在某些实施方式中，在制造期间将siRNA或sdRNA插入TIL群中。在某些实施方式中，sdRNA编码干扰NOTCH 1/2ICD、PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、TIGIT、TGFβ、TGFBR2、cAMP蛋白激酶A(PKA)、BAFF BR3、CISH和/或CBLB的RNA。在一些实施方式中，表达减少是基于例如通过流式细胞术和/或qPCR评定的基因沉默的百分比来确定。在一些实施方式中，表达减少约5％、约10％、约10％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方式中，表达减少至少约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方式中，表达减少至少约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方式中，表达减少至少约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方式中，表达减少至少约85％、约90％或约95％。在一些实施方式中，表达减少至少约80％。在一些实施方式中，表达减少至少约85％。在一些实施方式中，表达减少至少约90％。在一些实施方式中，表达减少至少约95％。在一些实施方式中，表达减少至少约99％。
基于化学修饰siRNA的自我递送RNAi技术可与本发明的方法一起使用，以将sdRNA成功递送至如本文所述的TIL。主链修饰与不对称siRNA结构和疏水性配体的组合(参见例如Ligtenberg等人,《分子疗法》2018,26,1482-93和美国专利申请公开第2016/0304873A1号，其公开内容以引用的方式并入本文中)允许sdRNA通过简单地添加至培养基中，利用sdRNA的核酸酶稳定性而穿透经培养的哺乳动物细胞，无需另外的制剂和方法。此稳定性允许仅通过维持培养基中sdRNA的活性浓度来支持恒定水平的RNAi介导的靶基因活性降低。尽管不受理论束缚，但sdRNA的主链稳定化使得基因表达减少效应延长，其在非分裂细胞中可持续数月。
在一些实施方式中，超过95％的TIL转染效率及靶标的表达减少通过各种特定siRNA或sdRNA发生。在某些实施方式中，将含有若干未经修饰核糖残基的siRNA或sdRNA替换为完全修饰的序列，以增加RNAi效应的效力和/或持久性。在一些实施方式中，表达减少效应维持12小时、24小时、36小时、48小时、5天、6天、7天或8天或更长时间。在一些实施方式中，表达减少效应在siRNA或sdRNA处理TIL后10天或更长时间时降低。在一些实施方式中，靶标表达维持超过70％的表达减少。在一些实施方式中，TIL中的靶标表达维持超过70％的表达减少。在一些实施方式中，PD-1/PD-L1路径中的表达减少允许TIL展现更强效的体内效应，在一些实施方式中是因为避免PD-1/PD-L1路径的抑制效应。在一些实施方式中，由siRNA或sdRNA引起的PD-1表达减少使得TIL增殖增加。
在一些实施方式中，本发明中使用的sdRNA序列显示出靶基因表达的70％减少。在一些实施方式中，本发明中使用的sdRNA序列显示出靶基因表达的75％减少。在一些实施方式中，本发明中使用的sdRNA序列显示出靶基因表达的80％减少。在一些实施方式中，本发明中使用的sdRNA序列显示出靶基因表达的85％减少。在一些实施方式中，本发明中使用的sdRNA序列显示出靶基因表达的90％减少。在一些实施方式中，本发明中使用的sdRNA序列显示出靶基因表达的95％减少。在一些实施方式中，本发明中使用的sdRNA序列显示出靶基因表达的99％减少。在一些实施方式中，本发明中使用的sdRNA序列当以约0.25μM至约4μM的浓度递送时显示出靶基因表达减少。在一些实施方式中，本发明中使用的sdRNA序列当以约0.25μM的浓度递送时显示出靶基因表达减少。在一些实施方式中，本发明中使用的sdRNA序列当以约0.5μM的浓度递送时显示出靶基因表达减少。在一些实施方式中，本发明中使用的sdRNA序列当以约0.75μM的浓度递送时显示出靶基因表达减少。在一些实施方式中，本发明中使用的sdRNA序列当以约1.0μM的浓度递送时显示出靶基因表达减少。在一些实施方式中，本发明中使用的sdRNA序列当以约1.25μM的浓度递送时显示出靶基因表达减少。在一些实施方式中，本发明中使用的sdRNA序列当以约1.5μM的浓度递送时显示出靶基因表达减少。在一些实施方式中，本发明中使用的sdRNA序列当以约1.75μM的浓度递送时显示出靶基因表达减少。在一些实施方式中，本发明中使用的sdRNA序列当以约2.0μM的浓度递送时显示出靶基因表达减少。在一些实施方式中，本发明中使用的sdRNA序列当以约2.25μM的浓度递送时显示出靶基因表达减少。在一些实施方式中，本发明中使用的sdRNA序列当以约2.5μM的浓度递送时显示出靶基因表达减少。在一些实施方式中，本发明中使用的sdRNA序列当以约2.75μM的浓度递送时显示出靶基因表达减少。在一些实施方式中，本发明中使用的sdRNA序列当以约3.0μM的浓度递送时显示出靶基因表达减少。在一些实施方式中，本发明中使用的sdRNA序列当以约3.25μM的浓度递送时显示出靶基因表达减少。在一些实施方式中，本发明中使用的sdRNA序列当以约3.5μM的浓度递送时显示出靶基因表达减少。在一些实施方式中，本发明中使用的sdRNA序列当以约3.75μM的浓度递送时显示出靶基因表达减少。在一些实施方式中，本发明中使用的sdRNA序列当以约4.0μM的浓度递送时显示出靶基因表达减少。
在一些实施方式中，siRNA或sdRNA寡核苷酸剂具有一种以上增加治疗剂的稳定性和/或有效性且实现寡核苷酸至待治疗细胞或组织的有效递送的修饰。此类修饰可包括2'-O-甲基修饰、2'-O-氟修饰、二硫代磷酸酯修饰、2'F修饰的核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸和/或2'脱氧核苷酸。在一些实施方式中，寡核苷酸经修饰以具有一个以上疏水性修饰，包括例如固醇、胆固醇、维生素D、萘基、异丁基、苯甲基、吲哚、色氨酸和/或苯基。在一些实施方式中，化学修饰的核苷酸为硫代磷酸酯、2'-O-甲基、2'脱氧、疏水性修饰和硫代磷酸酯的组合。在一些实施方式中，糖可经修饰且经修饰的糖可包括但不限于D-核糖、2'-O-烷基(包括2'-O-甲基和2'-0-乙基)，即2'-烷氧基、2'-氨基、2'-S-烷基、2'-卤基(包括2'-氟)、T-甲氧基乙氧基、2'-烯丙氧基(-OCH2CH＝CH2)、2'-炔丙基、2'-丙基、乙炔基、乙烯基、丙烯基和氰基，及其类似物。在一些实施方式中，糖部分可以是己糖且并入寡核苷酸中，如Augustyns等人,《核酸研究(Nucl.Acids.Res.)》1992,18,4711，其公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施方式中，本发明的双链siRNA或sdRNA寡核苷酸在其整个长度上为双链，即，在分子的任一端处皆无突出单链序列，即为平端。在一些实施方式中，个别核酸分子可具有不同长度。换言之，本发明的双链siRNA或sdRNA寡核苷酸在其整个长度上并非双链。例如，当使用两个独立的核酸分子时，其中一个分子，例如包含反义序列的第一分子，可比与其杂交的第二分子长(留下一部分的分子为单链)。在一些实施方式中，当使用单个核酸分子时，在任一端处的该分子的一部分可保持单链。
在一些实施方式中，本发明的双链siRNA或sdRNA寡核苷酸含有错配和/或环或凸起，但在该寡核苷酸的至少约70％长度上为双链的。在一些实施方式中，本发明的双链寡核苷酸在该寡核苷酸的至少约80％长度上为双链的。在其他实施方式中，本发明的双链siRNA或sdRNA寡核苷酸在该寡核苷酸的至少约90％-95％长度上为双链的。在一些实施方式中，本发明的双链siRNA或sdRNA寡核苷酸在该寡核苷酸的至少约96％-98％长度上为双链的。在一些实施方式中，本发明的双链寡核苷酸含有至少或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个错配。
在一些实施方式中，siRNA或sdRNA寡核苷酸可例如通过修饰3'或5'键联而基本上受到保护以免受核酸酶的影响，如美国专利第5,849,902号和WO 98/13526中所描述，其公开内容以引用的方式并入本文中。例如，寡核苷酸可通过纳入“阻断基团”而具有抗性。如本文所用，术语“阻断基团”指可作为用于合成的保护基或偶合基团与寡核苷酸或核单体连接的取代基(例如除OH基团以外)(例如FITC、丙基(CH2-CH2-CH3)、二醇(-0-CH2-CH2-O-)磷酸根(PO3 2")、磷酸氢根或氨基亚磷酸酯)。“阻断基团”也可包括“末端阻断基团”或“核酸外切酶阻断基团”，其保护寡核苷酸的5'和3'端，其包括经修饰的核苷酸和非核苷酸核酸外切酶抗性结构。
在一些实施方式中，siRNA或sdRNA内的至少一部分连续多核苷酸通过取代基键联，例如硫代磷酸酯键联连接。
在一些实施方式中，化学修饰可使siRNA或sdRNA的细胞摄取有至少1.5％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、110％、115％、120％、125％、130％、135％、140％、145％、150％、155％、160％、165％、170％、175％、180％、185％、190％、195％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％增强。在一些实施方式中，C或U残基中的至少一个包含疏水性修饰。在一些实施方式中，多个C和U含有疏水性修饰。在一些实施方式中，至少10％、15％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或至少95％的C和U可含有疏水性修饰。在一些实施方式中，所有C和U均含有疏水性修饰。
在一些实施方式中，siRNA或sdRNA分子通过并入可质子化胺而显示出增强的胞内体释放。在一些实施方式中，将可质子化胺并入有义链中(在RISC装载后舍弃的分子部分中)。在一些实施方式中，本发明的siRNA或sdRNA化合物包括不对称化合物，该不对称化合物包括双螺旋区(有效RISC进入所需，10-15个碱基长)和4-12个核苷酸长的单链区；具有13个核苷酸的双螺旋。在一些实施方式中，采用6个核苷酸的单链区。在一些实施方式中，siRNA或sdRNA的单链区包含2-12个硫代磷酸酯核苷酸间键联(称为硫代磷酸酯修饰)。在一些实施方式中，采用6-8个硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施方式中，本发明的siRNA或sdRNA化合物也包含独特的化学修饰模式，其提供稳定性且与RISC进入相容。例如，向导链也可通过任何证实稳定性而不干扰RISC进入的化学修饰来修饰。在一些实施方式中，向导链中的化学修饰模式包含大部分为2'F修饰且5'端经磷酸化的C和U核苷酸。
在一些实施方式中，siRNA或sdRNA中至少30％的核苷酸为经修饰的。在一些实施方式中，siRNA或sdRNA中至少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸为经修饰的。在一些实施方式中，siRNA或sdRNA中100％的核苷酸为经修饰的。
在一些实施方式中，siRNA或sdRNA分子具有极少双链区。在一些实施方式中，分子的双链区介于8-15个核苷酸长范围内。在一些实施方式中，分子的双链区为8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸长。在一些实施方式中，双链区为13个核苷酸长。向导链与随从链之间可有100％互补性，或向导链与随从链之间可存在一个以上错配。在一些实施方式中，在双链分子的一端上，分子为钝端或具有一个核苷酸的突出端。分子的单链区在一些实施方式中是介于4-12个核苷酸长。在一些实施方式中，单链区可以是4、5、6、7、8、9、10、11或12个核苷酸长。在一些实施方式中，单链区也可小于4个核苷酸或大于12个核苷酸长。在某些实施方式中，单链区为6或7个核苷酸长。
在一些实施方式中，siRNA或sdRNA分子具有增加的稳定性。在一些情况下，化学修饰的siRNA或sdRNA分子在培养基中的半衰期长于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或超过24小时，包括任何中间值。在一些实施方式中，siRNA或sd-RNA在培养基中的半衰期长于12小时。
在一些实施方式中，对siRNA或sdRNA进行优化以增加效力和/或减少毒性。在一些实施方式中，向导链和/或随从链的核苷酸长度和/或向导链和/或随从链中硫代磷酸酯修饰的数目在一些方面可影响RNA分子的效力，而用2'-0-甲基(2'OMe)修饰置换2'-氟(2'F)修饰在一些方面可影响分子的毒性。在一些实施方式中，预期减少分子的2'F含量将减少分子的毒性。在一些实施方式中，RNA分子中硫代磷酸酯修饰的数目可影响摄取分子至细胞中，例如被动摄取分子至细胞中的效率。在一些实施方式中，siRNA或sdRNA不具有2'F修饰，但其特征在于细胞摄取与组织渗透方面的功效相等。
在一些实施方式中，向导链的长度为约18-19个核苷酸且具有约2-14个磷酸酯修饰。例如，向导链可含有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或超过14个经磷酸酯修饰的核苷酸。向导链可含有一个以上赋予增加的稳定性而不干扰RISC进入的修饰。磷酸酯修饰的核苷酸，例如硫代磷酸酯修饰的核苷酸，可在3'端、5'端或遍布于整个向导链中。在一些实施方式中，向导链的3'端10个核苷酸含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个硫代磷酸酯修饰的核苷酸。向导链也可含有2'F和/或2'OMe修饰，其可位于整个分子中。在一些实施方式中，向导链中位置一的核苷酸(向导链的最5'位置中的核苷酸)经2'OMe修饰和/或磷酸化。向导链内的C和U核苷酸可经2'F修饰。例如，19个核苷酸的向导链的位置2-10(或不同长度的向导链中的对应位置)中的C和U核苷酸可经2'F修饰。向导链内的C和U核苷酸也可经2'OMe修饰。例如，l9个核苷酸的向导链的位置11-18(或不同长度的向导链中的对应位置)中的C和U核苷酸可经2'OMe修饰。在一些实施方式中，在向导链的最3'端处的核苷酸未经修饰。在某些实施方式中，向导链内的大部分C和U经2'F修饰，向导链的5'端经磷酸化。在其他实施方式中，位置1和位置11-18中的C或U经2'OMe修饰，向导链的5'端经磷酸化。在其他实施方式中，位置1和位置11-18中的C或U经2'OMe修饰，向导链的5'端经磷酸化，位置2-10中的C或U经2'F修饰。
自我可递送RNAi技术提供一种直接用RNAi剂(无论是siRNA、sdRNA或是其他RNAi剂)转染细胞而无需另外的制剂或技术的方法。转染难以转染细胞系的能力、高体内活性和使用简单为该组合物和方法的特征，其相对于基于siRNA的传统技术存在显著的功能优势，因此在关于减少本发明的TIL中靶基因表达的方法的若干实施方式中采用sdRNA方法。sdRNA方法允许将化学合成的化合物直接递送至广泛范围的离体和体内初代细胞和组织。在本文中本发明的一些实施方式中描述的sdRNA可购自美国马萨诸塞州伍斯特的AdvirnaLLC。
siRNA和sdRNA可以形成为疏水性修饰的siRNA-反义寡核苷酸杂合结构，公开于例如在Byrne等人,《眼药理学与治疗学杂志》2013,29,855-864，其公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施方式中，siRNA或sdRNA寡核苷酸可使用无菌电穿孔递送至本文所述的TIL。在某些实施方式中，方法包括无菌电穿孔TIL群以递送siRNA或sdRNA寡核苷酸。
在一些实施方式中，寡核苷酸可与跨膜递送系统组合递送至细胞。在一些实施方式中，此跨膜递送系统包含脂质、病毒载体和类似物。在一些实施方式中，寡核苷酸剂为不需要任何递送剂的自我递送RNAi剂。在某些实施方式中，方法包括使用跨膜递送系统来递送siRNA或sdRNA寡核苷酸至TIL群。
使寡核苷酸和寡核苷酸组合物与本文所述的TIL接触(例如使其接触，在本文中也称为施用或递送至)且被摄入，包括通过TIL被动摄取。sdRNA可在第一扩增期间(例如步骤B)、在第一扩增之后(例如在步骤C期间)、在第二扩增之前或期间(例如在步骤D之前或期间)、在步骤D之后且在步骤E中收集之前、在步骤F中收集期间或之后、在步骤F中最终配制和/或转移至输注袋之前或期间，以及在步骤F中任何可选地进行的冷冻保存步骤之前添加至如本文所述的TIL。另外的，sdRNA可在步骤F中自任何冷冻保存步骤解冻之后添加。在一些实施方式中，可将一种以上靶向如本文所述的基因(包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH、CTLA-4、TIGIT、TET2和CBLB)的sdRNA以选自如下的浓度添加至包含TIL及其他试剂的细胞培养基中：100nM至20mM、200nM至10mM、500nM至1mM、1μM至100μM和1μM至100μM。在一些实施方式中，可将一个以上靶向如本文所述的基因(包含PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH、CTLA-4、TIGIT、TET2和CBLB)的sdRNA以选自如下的量添加至包括TIL及其他试剂的细胞培养基中：0.1μMsdRNA/10,000个TIL/100μL培养基、0.5μM sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基、0.75μMsdRNA/10,000个TIL/100μL培养基、1μM sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基、1.25μM sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基、1.5μM sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基、2μM sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基、5μM sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基或10μM sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基。在一些实施方式中，可将一个以上靶向如本文中所描述的基因(包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH、CTLA-4、TIGIT、TET2CBLB)的sdRNA在预REP或REP阶段期间一天两次、一天一次、每两天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、每六天一次或每七天一次添加至TIL培养物。
本发明的寡核苷酸组合物，包括sdRNA，可在扩增过程期间，例如通过将高浓度sdRNA溶解于细胞培养基并允许足够时间发生被动摄取而与如本文所述的TIL接触。在某些实施方式中，本发明方法包括使TIL群与如本文所述的寡核苷酸组合物接触。在某些实施方式中，方法包括将寡核苷酸，例如sdRNA，溶解于细胞培养基中，使细胞培养基与TIL群接触。TIL可以是如本文所述的第一群、第二群和/或第三群。
在一些实施方式中，将寡核苷酸递送至细胞中可通过合适的本领域公认的方法增强，包括磷酸钙、DMSO、甘油或聚葡萄糖、电穿孔或通过转染，例如使用阳离子、阴离子或中性脂质组合物或脂质体，使用本领域中已知的方法，例如描述于以下的方法转染：美国专利第4,897,355号；第5,459,127号；第5,631,237号；第5,955,365号；第5,976,567号；第10,087,464号；和第10,155,945号；和Bergan等人,《核酸研究)》1993,21,3567，其各自的公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施方式中，使用超过一种siRNA或sdRNA来减少靶基因的表达。在一些实施方式中，将靶向PD-1、TIM-3、CBLB、LAG3、CTLA-4、TIGIT、TET2和/或CISH的siRNA或sdRNA中的一种以上一起使用。在一些实施方式中，将PD-1siRNA或sdRNA与TIM-3、CBLB、LAG3、CTLA-4、TIGIT、TET2和/或CISH中的一种以上一起使用，以减少超过一个基因靶标的表达。在一些实施方式中，将LAG3 siRNA或sdRNA与靶向CISH的siRNA或sdRNA组合使用，以减少两个靶标的基因表达。在一些实施方式中，本文中靶向PD-1、TIM-3、CBLB、LAG3、CTLA-4、TIGIT、TET2和/或CISH中的一种以上的siRNA或sdRNA可商购自美国马萨诸塞州伍斯特市(Worcester,MA,USA)的Advirna LLC或多个其他供应商。
在一些实施方式中，siRNA或sdRNA靶向选自如下的基因：PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、TET2、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)以及它们的组合。在一些实施方式中，siRNA或sdRNA靶向选自如下的基因：PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、TET2、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)以及它们的组合。在一些实施方式中，一种siRNA或sdRNA靶向PD-1，另一种siRNA或sdRNA靶向选自如下的基因：LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、TET2、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)以及它们的组合。在一些实施方式中，siRNA或sdRNA靶向选自以下的基因：PD-1、LAG-3、CISH、CBLB、TIM3、CTLA-4、TIGIT、TET2以及它们的组合。在一些实施方式中，siRNA或sdRNA靶向选自PD-1和以下中的一种的基因：LAG3、CISH、CBLB、TIM3以及它们的组合。在一些实施方式中，一种siRNA或sdRNA靶向PD-1，一种siRNA或sdRNA靶向LAG3。在一些实施方式中，一种siRNA或sdRNA靶向PD-1，一种siRNA或sdRNA靶向CISH。在一些实施方式中，一种siRNA或sdRNA靶向PD-1，一种siRNA或sdRNA靶向CBLB。在一些实施方式中，一种siRNA或sdRNA靶向PD-1，一种siRNA或sdRNA靶向TIM3。在一些实施方式中，一种siRNA或sdRNA靶向PD-1，一种siRNA或sdRNA靶向CTLA-4。在一些实施方式中，一种siRNA或sdRNA靶向PD-1，一种siRNA或sdRNA靶向TIGIT。在一些实施方式中，一种siRNA或sdRNA靶向PD-1，一种siRNA或sdRNA靶向TET2。在一些实施方式中，一种siRNA或sdRNA靶向LAG3，一种siRNA或sdRNA靶向CISH。在一些实施方式中，一种siRNA或sdRNA靶向LAG3，一种siRNA或sdRNA靶向CBLB。在一些实施方式中，一种siRNA或sdRNA靶向LAG3，一种siRNA或sdRNA靶向TIM3。在一些实施方式中，一种siRNA或sdRNA靶向LAG3，一种siRNA或sdRNA靶向CTLA-4。在一些实施方式中，一种siRNA或sdRNA靶向LAG3，一种siRNA或sdRNA靶向TIGIT。在一些实施方式中，一种siRNA或sdRNA靶向LAG3，一种siRNA或sdRNA靶向TET2。在一些实施方式中，一种siRNA或sdRNA靶向CISH，一种siRNA或sdRNA靶向CBLB。在一些实施方式中，一种siRNA或sdRNA靶向CISH，一种siRNA或sdRNA靶向TIM3。在一些实施方式中，一种siRNA或sdRNA靶向CISH，一种siRNA或sdRNA靶向CTLA-4。在一些实施方式中，一种siRNA或sdRNA靶向CISH，一种siRNA或sdRNA靶向TIGIT。在一些实施方式中，一种siRNA或sdRNA靶向CISH，一种siRNA或sdRNA靶向TET2。在一些实施方式中，一种siRNA或sdRNA靶向CBLB，一种siRNA或sdRNA靶向TIM3。在一些实施方式中，一种siRNA或sdRNA靶向CBLB，一种siRNA或sdRNA靶向CTLA-4。在一些实施方式中，一种siRNA或sdRNA靶向CBLB，一种siRNA或sdRNA靶向TIGIT。在一些实施方式中，一种siRNA或sdRNA靶向CBLB，一种siRNA或sdRNA靶向TET2。在一些实施方式中，一种siRNA或sdRNA靶向TIM3，一种siRNA或sdRNA靶向PD-1。在一些实施方式中，一种siRNA或sdRNA靶向TIM3，一种siRNA或sdRNA靶向LAG3。在一些实施方式中，一种siRNA或sdRNA靶向TIM3，一种siRNA或sdRNA靶向CISH。在一些实施方式中，一种siRNA或sdRNA靶向TIM3，一种siRNA或sdRNA靶向CBLB。在一些实施方式中，一种siRNA或sdRNA靶向TIM3，一种siRNA或sdRNA靶向CTLA-4。在一些实施方式中，一种siRNA或sdRNA靶向TIM3，一种siRNA或sdRNA靶向TIGIT。在一些实施方式中，一种siRNA或sdRNA靶向TIM3，一种siRNA或sdRNA靶向TET2。在一些实施方式中，一种siRNA或sdRNA靶向CTLA-4，一种siRNA或sdRNA靶向TIGIT。在一些实施方式中，一种siRNA或sdRNA靶向CTLA-4，一种siRNA或sdRNA靶向TET2。在一些实施方式中，一种siRNA或sdRNA靶向TIGIT，一种siRNA或sdRNA靶向TET2。
如本文所论述，本发明的实施方式提供已通过基因编辑进行基因修饰以增强其治疗效果的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。本发明的实施方式涵盖通过核苷酸插入(RNA或DNA)TIL群中进行的基因编辑，以促进一种以上蛋白质的表达和抑制一种以上蛋白质的表达以及它们的组合。本发明的实施方式也提供用于将TIL扩增为治疗性群的方法，其中方法包括基因编辑TIL。存在若干种可用于基因修饰TIL群的基因编辑技术，该基因编辑技术适合于根据本发明使用。此类方法包括下文描述的方法以及本文别处描述的病毒和转座子方法。在一些实施方式中，基因修饰TIL、MIL或PBL以表达CCR的方法也可包含通过稳定敲除此类基因或暂时敲低此类基因来抑制基因表达的修饰。
在一些实施方式中，方法包括基因修饰如本文所述的第一群、第二群和/或第三群中的TIL群的方法。在一些实施方式中，基因修饰TIL群的方法包括稳定并入用于产生或抑制(例如沉默)一种以上蛋白质的基因的步骤。在一些实施方式中，基因修饰TIL群的方法包括电穿孔的步骤。电穿孔方法为本领域中已知的，描述于例如以下中：Tsong,《生物物理杂志(Biophys.J.)》1991,60,297-306和美国专利申请公开第2014/0227237A1号，其各自的公开内容以引用的方式并入本文中。可使用本领域中已知的其他电穿孔方法，例如以下中描述的彼等电穿孔方法：美国专利第5,019,034号、第5,128,257号、第5,137,817号、第5,173,158号、第5,232,856号、第5,273,525号、第5,304,120号、第5,318,514号、第6,010,613号和第6,078,490号，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施方式中，电穿孔方法为无菌电穿孔方法。在一些实施方式中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法。在一些实施方式中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以改变、操作或引起TIL中的限定和受控制的永久性或暂时性变化的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个单一、操作者控制的独立程控的DC电脉冲的步骤，场强度等于或大于100V/cm，其中该一系列至少三个DC电脉冲具有一个、两个或三个以下特征：(1)该至少三个脉冲中的至少两者在脉冲振幅上彼此不同；(2)该至少三个脉冲中的至少两者在脉冲宽度上彼此不同；和(3)第一组该至少三个脉冲中两者的第一脉冲间隔与第二组该至少三个脉冲中两者的第二脉冲间隔不同。在一些实施方式中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以改变、操作或引起TIL中的限定和受控制的永久性或暂时性变化的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个单一、操作者控制的独立程控的DC电脉冲的步骤，场强度等于或大于100V/cm，其中该至少三个脉冲中的至少两者在脉冲振幅上彼此不同。在一些实施方式中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以改变、操作或引起TIL中的限定和受控制的永久性或暂时性变化的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个单一、操作者控制的独立程控的DC电脉冲的步骤，场强度等于或大于100V/cm，其中该至少三个脉冲中的至少两者在脉冲宽度上彼此不同。在一些实施方式中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以改变、操作或引起TIL中的限定和受控制的永久性或暂时性变化的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个单一、操作者控制的独立程控的DC电脉冲的步骤，场强度等于或大于100V/cm，其中第一组该至少三个脉冲中两者的第一脉冲间隔与第二组该至少三个脉冲中两者的第二脉冲间隔不同。在一些实施方式中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以诱导TIL中孔形成的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个DC电脉冲的步骤，场强度等于或大于100V/cm，其中该一系列至少三个DC电脉冲具有一个、两个或三个以下特征：(1)该至少三个脉冲中的至少两者在脉冲振幅上彼此不同；(2)该至少三个脉冲中的至少两者在脉冲宽度上彼此不同；和(3)第一组该至少三个脉冲中两者的第一脉冲间隔与第二组该至少三个脉冲中两者的第二脉冲间隔不同，使得所诱导的孔持续相对长的时间段，和使得维持TIL的存活率。在一些实施方式中，基因修饰TIL群的方法包括磷酸钙转染的步骤。磷酸钙转染方法(磷酸钙DNA沉淀、细胞表面包覆和胞吞作用)为本领域中已知的且描述于以下中：Graham和van der Eb,《病毒学》1973,52,456-467；Wigler等人,《美国国家科学院院刊》1979,76,1373-1376；和Chen和Okayarea,《分子细胞生物学》1987,7,2745-2752；和美国专利第5,593,875号，其各自的公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施方式中，基因修饰TIL群的方法包括脂质体转染的步骤。脂质体转染方法，例如采用在过滤水中的阳离子脂质N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(DOTMA)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)的1:1(w/w)脂质体制剂的方法为本领域中已知的且描述于以下中：Rose等人,《生物技术》1991,10,520-525和Felgner等人,《美国国家科学院院刊》,1987,84,7413-7417以及美国专利第5,279,833号、第5,908,635号、第6,056,938号、第6,110,490号、第6,534,484号和第7,687,070号，其各自的公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施方式中，基因修饰TIL群的方法包括使用以下中描述的方法进行转染的步骤：美国专利第5,766,902号、第6,025,337号、第6,410,517号、第6,475,994号和第7,189,705号，其各自的公开内容以引用的方式并入本文中。TIL可以是如本文所述的第一TIL群、第二TIL群和/或第三TIL群。
根据一实施方式，基因编辑方法可包括使用介导在一个以上免疫检查点基因处产生双链或单链断裂的可编程核酸酶。此类可编程核酸酶通过在特定基因组基因座处引入断裂而能够进行精确基因组编辑，即其依赖于识别基因组内的特定DNA序列以将核酸酶结构域靶向此位置且介导在靶序列处产生双链断裂。DNA中的双链断裂随后将内源性修复机制募集至断裂位点，以通过非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)来介导基因组编辑。因此，断裂的修复可导致引入扰乱(例如沉默、抑制或增强)靶基因产物的插入/缺失突变。
经开发而使得能够进行位点特异性基因组编辑的核酸酶的主要类别包括锌指核酸酶(zinc finger nuclease；ZFN)、转录活化因子样核酸酶(transcription activator-like nucleases；TALEN)和CRISPR相关核酸酶(例如CRISPR/Cas9)。这些核酸酶系统可基于其DNA识别模式而大致分类为两类：ZFN和TALEN通过蛋白质-DNA相互作用达成特定DNA结合，而CRISPR系统，例如Cas9，通过与靶DNA直接碱基配对的短RNA向导分子和通过蛋白质-DNA相互作用而靶向特定DNA序列。参见例如Cox等人,《自然医学(Nature Medicine)》,2015,第21卷,第2期。
可根据本发明的TIL扩增方法使用的基因编辑方法的非限制性示例包括CRISPR方法、TALE方法和ZFN方法，该方法在下文更详细地描述。根据一个实施方式，用于将TIL扩增为治疗性群的方法可根据本文所述的方法(例如Gen 2)的任何实施方式或如美国专利申请公开第US2020/0299644 A1号和第US2020/0121719 A1号以及美国专利第10,925,900号中所描述进行，其公开内容以引用的方式并入本文中，其中该方法进一步包括通过CRISPR方法、TALE方法或ZFN方法中的一种以上对至少一部分TIL进行基因编辑，以产生可使治疗效果增强的TIL。根据一个实施方式，可通过体外比较基因编辑的TIL与未经修饰的TIL，例如通过评估相较于未经修饰的TIL的体外效应功能、细胞因子概况等，来评估基因编辑的TIL的改善的治疗效果。在某些实施方式中，方法包括使用CRISPR、TALE和/或ZFN方法来基因编辑TIL群。
在本发明的一些实施方式中，使用电穿孔来递送基因编辑系统，例如CRISPR、TALEN和ZFN系统。在本发明的一些实施方式中，电穿孔系统为流式电穿孔系统。适用于本发明的一些实施方式的合适的流式电穿孔系统的示例为市售MaxCyte STX系统。有若干种可能适用于本发明的替代性市售电穿孔仪器，例如可获自BTX-Harvard Apparatus的AgilePulse系统或ECM 830、Cellaxess Elektra(Cellectricon)、Nucleofector(龙沙(Lonza)/Amaxa)、GenePulser MXcell(伯乐(BIORAD)、iPorator-96(Primax)或siPORTer96(Ambion)。在本发明的一些实施方式中，电穿孔系统与TIL扩增方法的其余部分一起形成密闭无菌系统。在本发明的一些实施方式中，电穿孔系统为如本文中所描述的脉冲电穿孔系统，与TIL扩增方法的其余部分一起形成密闭无菌系统。
用于将TIL扩增为治疗性群的方法可根据本文所述的方法(例如Gen 2)的任何实施方式或如美国专利申请公开第US2020/0299644 A1号和第US2020/0121719 A1号以及美国专利第10,925,900号中所描述进行，其公开内容以引用的方式并入本文中，其中该方法进一步包括通过CRISPR方法(例如CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1)对至少一部分TIL进行基因编辑。根据特定实施方式，在TIL扩增过程期间使用CRISPR方法引起至少一部分的治疗性TIL群中一种以上免疫检查点基因的表达沉默或减少。替代性地，在TIL扩增过程期间使用CRISPR方法引起至少一部分的治疗性TIL群中一种以上免疫检查点基因的表达增强。
CRISPR代表成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered Regularly InterspacedShort Palindromic Repeats)。使用CRISPR系统进行基因编辑的方法在本文中也称为CRISPR方法。有三种类型的并入RNA和Cas蛋白且可根据本发明使用的CRISPR系统：I、II和III型。II型CRISPR(通过Cas9示例)为最充分表征的系统之一。
CRISPR技术是改编自细菌和古菌(单细胞微生物的结构域)的天然防御机制。该生物体使用CRISPR衍生的RNA和各种Cas蛋白(包括Cas9)，通过切碎和破坏外来入侵者的DNA来阻止病毒及其他外来体的攻击。CRISPR为具有两个独特特征的DNA特化区：存在核苷酸重复序列和间隔子。核苷酸的重复序列分布在整个CRISPR区中，其中短外来DNA区段(间隔子)穿插在重复序列中。在II型CRISPR/Cas系统中，间隔子整合于CRISPR基因组基因座内且转录并加工成短CRISPR RNA(crRNA)。该crRNA退火成反式活化crRNA(tracrRNA)，引导Cas蛋白进行序列特异性裂解和沉默病原性DNA。Cas9蛋白进行的靶标识别需要crRNA内的“种子”序列和crRNA结合区上游的含有二核苷酸的保守原间隔序列相邻基序(PAM)序列。由此CRISPR/Cas系统可通过重新设计crRNA而重新靶向以裂解几乎任何DNA序列。原生系统中的crRNA和tracrRNA可简化为约100个核苷酸的单向导RNA(sgRNA)以用于基因工程改造。CRISPR/Cas系统通过共同递送表达Cas9核酸内切酶和必需crRNA组分的质体可直接携带入人细胞。可使用不同的Cas蛋白质变体来减少靶向限制(例如Cas9的异种同源物，例如Cpf1)。
可以通过用CRISPR方法对TIL进行永久性基因编辑而沉默或抑制的基因的非限制性示例包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、TET2、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11和BCOR。
可通过用CRISPR方法对TIL进行永久性基因编辑而增强的基因的非限制性示例包括CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL12、IL-15、IL-18和IL-21。
通过CRISPR方法来改变靶基因序列的表达且可根据本发明的实施方式使用的系统、方法和组合物的示例描述于美国专利第8,697,359号、第8,993,233号、第8,795,965号、第8,771,945号、第8,889,356号、第8,865,406号、第8,999,641号、第8,945,839号、第8,932,814号、第8,871,445号、第8,906,616号和第8,895,308号中，其各自的公开内容以引用的方式并入本文中。用于进行CRISPR方法的资源，例如用于表达CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1的质体，可商购自公司，例如GenScript。
在一些实施方式中，基因修饰如本文中所描述的TIL群可使用如美国专利第US9790490号中所描述的CRISPR/Cpf1系统进行，其公开内容以引用的方式并入本文中。
用于将TIL扩增为治疗性群的方法可根据本文所述的方法(例如Gen 2)的任何实施方式或如美国专利申请公开第US2020/0299644 A1号和第US2020/0121719 A1号以及美国专利第10,925,900号中所描述进行，其公开内容以引用的方式并入本文中，其中该方法进一步包括通过TALE方法对至少一部分TIL进行基因编辑。根据特定实施方式，在TIL扩增过程期间使用TALE方法引起至少一部分的治疗性TIL群中一种以上免疫检查点基因的表达沉默或减少。替代性地，在TIL扩增过程期间使用TALE方法引起至少一部分的治疗性TIL群中一种以上免疫检查点基因的表达增强。
TALE代表转录活化因子样效应蛋白，其包括转录活化因子样效应核酸酶(TALEN)。使用TALE系统进行基因编辑的方法在本文中也称为TALE方法。TALE为来自植物病原细菌黄单孢菌属(Xanthomonas)的天然存在蛋白质，含有由一系列各自识别单碱基对的33-35个氨基酸的重复结构域构成的DNA结合结构域。TALE特异性通过被称为重复可变二残基(repeat-variabledi-residue；RVD)的两个高变氨基酸确定。模块化TALE重复序列连接在一起以识别连续DNA序列。DNA结合结构域中的特异性RVD识别靶基因座中的碱基，从而提供结构特征以组装可预测的DNA结合结构域。将TALE的DNA结合结构域与IIS型FokI核酸内切酶的催化结构域融合，以制备可靶向的TALE核酸酶。为了诱导位点特异性突变，由14-20个碱基对间隔区域分开的两个个别TALEN臂将FokI单体拉近以二聚合和产生靶向的双链断裂。
若干个利用各种组装方法的大的系统性研究指示，可并入TALE重复序列以识别几乎任何使用者定义的序列。定制设计的TALE阵列也由Cellectis Bioresearch(法国巴黎)、Transposagen Biopharmaceuticals(美国肯塔基州列克星敦(Lexington,KY,USA))和LifeTechnologies(美国纽约州格兰德岛(Grand Island,NY,USA))商购。适用于本发明的TALE和TALEN方法描述于以下中：美国专利申请公开第US2011/0201118 A1号、第US2013/0117869 A1号、第US2013/0315884 A1号、第US2015/0203871 A1号和第US2016/0120906A1号，其各自的公开内容以引用的方式并入本文中。
可以通过用TALE方法对TIL进行永久性基因编辑而沉默或抑制的基因的非限制性示例包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、TET2、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11和BCOR。
可通过用TALE方法对TIL进行永久性基因编辑而增强的基因的非限制性示例包括CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL12、IL-15、IL-18和IL-21。
通过TALE方法来改变靶基因序列的表达且可根据本发明的实施方式使用的系统、方法和组合物的示例描述于美国专利第8,586,526号中，其以引用的方式并入本文中。
用于将TIL扩增为治疗性群的方法可根据本文中所描述的方法的任何实施方式或如美国专利申请公开第US2020/0299644 A1号和第US2020/0121719 A1号以及美国专利第10,925,900号中所描述的进行，其公开内容以引用的方式并入本文中，其中该方法还包括通过锌指或锌指核酸酶方法对至少一部分TIL进行基因编辑。根据特定实施方式，在TIL扩增过程期间使用锌指方法引起至少一部分的治疗性TIL群中一种以上免疫检查点基因的表达沉默或减少。替代性地，在TIL扩增过程期间使用锌指方法引起至少一部分的治疗性TIL群中一种以上免疫检查点基因的表达增强。
呈保守ββα构造的个别锌指含有约30个氨基酸。α-螺旋表面上的几个氨基酸通常以不同的选择性水平接触DNA大沟中的3bp。锌指具有两个蛋白结构域。第一结构域为DNA结合结构域，其包括真核转录因子且含有锌指。第二结构域为核酸酶结构域，其包括FokI限制酶且负责催化裂解DNA。
个别ZFN的DNA结合结构域通常含有介于三个与六个之间的个别锌指重复且各自可识别介于9个与18个之间的碱基对。若锌指结构域对其预期靶位点具有特异性，则甚至一对识别总共18个碱基对的3指ZFN理论上可靶向哺乳动物基因组中的单个基因座。一个产生新的锌指阵列的方法为组合具有已知特异性的较小锌指“模块”。最常见的模块组装过程涉及组合三个分开的可各自识别3个碱基对DNA序列的锌指，以产生可识别9个碱基对靶位点的3指阵列。替代性地，可使用基于选择的方法，例如寡聚池工程改造(oligomerized poolengineering；OPEN)，来自随机分组文库选择新的锌指阵列，该随机分组文库考虑介于邻近指之间的背景依赖性相互作用(context-dependent interaction)。工程改造的锌指可商购自Sangamo Biosciences(美国加利福尼亚州里奇蒙(Richmond,CA,USA))和Sigma-Aldrich(美国密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO,USA))。
可以通过用锌指方法对TIL进行永久性基因编辑而沉默或抑制的基因的非限制性示例包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、TET2、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11和BCOR。
可通过用锌指方法对TIL进行永久性基因编辑而增强的基因的非限制性示例包括CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL12、IL-15、IL-18和IL-21。
通过锌指方法来改变靶基因序列的表达且可根据本发明的实施方式使用的系统、方法和组合物的示例描述于以下中：美国专利第6,534,261号、第6,607,882号、第6,746,838号、第6,794,136号、第6,824,978号、第6,866,997号、第6,933,113号、第6,979,539号、第7,013,219号、第7,030,215号、第7,220,719号、第7,241,573号、第7,241,574号、第7,585,849号、第7,595,376号、第6,903,185号和第6,479,626号，其各自以引用的方式并入本文中。
通过锌指方法来改变靶基因序列的表达且可根据本发明的其他实施方式使用的系统、方法和组合物的其他示例描述于Beane等人,《分子疗法》,2015,23,1380-1390中，其公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施方式中，TIL可选地经基因工程改造以具有另外的功能，该功能包括但不限于高亲和力TCR，例如靶向肿瘤相关抗原，例如MAGE-1、HER2或NY-ESO-1的TCR；或与肿瘤相关细胞表面分子(例如间皮素)或谱系限制性细胞表面分子(例如CD19)结合的嵌合抗原受体(CAR)。在某些实施方式中，方法包括对TIL群进行基因工程改造以包含高亲和力TCR，例如靶向肿瘤相关抗原，例如MAGE-1、HER2或NY-ESO-1的TCR；或与肿瘤相关细胞表面分子(例如间皮素)或谱系限制性细胞表面分子(例如CD19)结合的嵌合抗原受体(CAR)。适当地，TIL群可以是如本文所述的第一群、第二群和/或第三群。
E.用于TIL制造的密闭系统
本发明提供了在TIL培养过程期间使用密闭系统。此类密闭系统允许预防和/或减少微生物污染、允许使用更少培养瓶且允许成本降低。在一些实施方式中，密闭系统使用两个容器。
此类密闭系统为本领域中熟知的且可见于例如http://www.fda.gov/cber/guidelines.htm和https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Blood/ucm076779.htm处。
无菌连接装置(Sterile connecting device；STCD)在两件相容性管之间产生无菌熔接部分(weld)。此程序允许无菌连接多个容器和管直径。在一些实施方式中，密闭系统包括如实施例中所描述的鲁尔锁(luer lock)和热密封系统。在一些实施方式中，密闭系统在无菌条件下通过注射器进入以维持系统的无菌性和密闭性质。在一些实施方式中，采用如实施例中所描述的密闭系统。在一些实施方式中，根据本文在实施例中所描述的方法，将TIL配制至最终产物配制容器中。
在一些实施方式中，自获得肿瘤碎片的时间至准备向患者施用TIL或冷冻保存，密闭系统使用一个容器。在一些实施方式中，当使用两个容器时，第一容器为密闭G容器，在不打开第一密闭G容器的情况下离心TIL群且将其转移至输注袋。在一些实施方式中，当使用两个容器时，输注袋为含有HypoThermosol的输注袋。密闭系统或密闭TIL细胞培养系统的特征在于，一旦已添加肿瘤样本和/或肿瘤碎片，则系统自外部紧密密封以形成密闭环境，不受细菌、真菌和/或任何其他微生物污染入侵。
在一些实施方式中，微生物污染减少介于约5％与约100％之间。在一些实施方式中，微生物污染减少介于约5％与约95％之间。在一些实施方式中，微生物污染减少介于约5％与约90％之间。在一些实施方式中，微生物污染减少介于约10％与约90％之间。在一些实施方式中，微生物污染减少介于约15％与约85％之间。在一些实施方式中，微生物污染减少为约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、约98％、约99％或约100％。
密闭系统允许TIL在不存在微生物污染下和/或在微生物污染显著减少下生长。
此外，TIL细胞培养环境的pH、二氧化碳分压和氧气分压各自随细胞培养而变化。因此，即使适合于细胞培养的培养基经循环，但密闭环境仍需要不断地维持为TIL增殖的最佳环境。为了此目的，合乎需要的是，借助于感测器监测密闭环境的培养液内的pH、二氧化碳分压和氧气分压的物理因素，其讯号用于控制安设在培养环境的入口处的气体交换器，和根据培养液中的变化实时调整密闭环境的气体分压以优化细胞培养环境。在一些实施方式中，本发明提供了密闭细胞培养系统，其在至密闭环境的入口处并入配备有测量密闭环境的pH、二氧化碳分压和氧气分压的监测装置的气体交换器，通过基于来自监测装置的讯号自动调整气体浓度来优化细胞培养环境。
在一些实施方式中，连续地或间歇地控制密闭环境内的压力。即，密闭环境中的压力可借助于例如压力维持装置来改变，从而确保空间在正压力状态下适合于TIL生长或促进在负压力状态下渗出流体且因此促进细胞增殖。此外，通过间歇性施加负压力，有可能借助于暂时性缩小密闭环境的容积而均匀且有效地置换密闭环境中的循环液体。
在一些实施方式中，可替换或添加TIL增殖的最佳培养物组分，可添加包括例如IL-2和/或OKT3以及其组合的因子。
F.可选地进行的TIL的冷冻保存
主体TIL群(例如第二TIL群)或扩增的TIL群(例如第三TIL群)可以可选地进行冷冻保存。在一些实施方式中，冷冻保存发生于治疗性TIL群。在一些实施方式中，冷冻保存发生于第二扩增后经收集的TIL。在一些实施方式中，冷冻保存发生于图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的示例性步骤F中的TIL。在一些实施方式中，TIL冷冻保存在输注袋中。在一些实施方式中，TIL在置于输注袋中之前冷冻保存。在一些实施方式中，冷冻保存TIL且不将其置于输注袋中。在一些实施方式中，使用冷冻保存培养基进行冷冻保存。在一些实施方式中，冷冻保存培养基含有二甲亚砜(DMSO)。此通常通过将TIL群放置于冷冻溶液(例如85％补体灭活AB血清和15％二甲亚砜(DMSO))中来完成。将溶液中的细胞置于低温小瓶中且储存在-80℃24小时，其中可选地转移至气态氮冷冻器用于冷冻保存。参见Sadeghi等人,《肿瘤学报(Acta Oncologica)》2013,52,978-986。
在适当时，自冷冻器取出细胞且在37℃水浴中解冻直至约4/5的溶液解冻。通常将细胞再悬浮于完全培养基中且可选地洗涤一次以上。在一些实施方式中，可计算解冻的TIL且如本领域中已知的来评定存活率。
在一些实施方式中，TIL群使用CS10冷冻保存培养基(CryoStor 10，BioLifeSolutions)冷冻保存。在一些实施方式中，TIL群使用含有二甲亚砜(DMSO)的冷冻保存培养基冷冻保存。在一些实施方式中，TIL群使用1:1(vol:vol)比率的CS10与细胞培养基冷冻保存。在一些实施方式中，TIL群使用约1:1(vol:vol)比率的CS10与细胞培养基(进一步包含另外的IL-2)冷冻保存。
如上文所论述且如图1和/或图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中所提供的步骤A至步骤E中所示例，冷冻保存可发生在TIL扩增过程中的多个时间点。在一些实施方式中，在第一扩增后经扩增的TIL群(如例如根据步骤B所提供)或在根据图1或图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤D的一次以上第二扩增后经扩增的TIL群可进行冷冻保存。冷冻保存通常可通过将TIL群置于冷冻溶液(例如85％补体灭活AB血清和15％二甲亚砜(DMSO))中来完成。将溶液中的细胞置于低温小瓶中且储存在-80℃24小时，其中可选地转移至气态氮冷冻器用于冷冻保存。参见Sadeghi等人,《肿瘤学报》2013,52,978-986。在一些实施方式中，TIL是冷冻保存于5％ DMSO中。在一些实施方式中，TIL是冷冻保存于细胞培养基加5％DMSO中。在一些实施方式中，TIL是根据实施例6中提供的方法冷冻保存。
在适当时，自冷冻器取出细胞且在37℃水浴中解冻直至约4/5的溶液解冻。通常将细胞再悬浮于完全培养基中且可选地洗涤一次以上。在一些实施方式中，可计算解冻的TIL且如本领域中已知的来评定存活率。
在某些情况下，图1或图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B的TIL群可使用下文论述的方案立即冷冻保存。替代性地，主体TIL群可经历图1或图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤C和步骤D，接着在图1或图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤D之后进行冷冻保存。类似地，在将基因修饰的TIL用于疗法中的情况下，图1或图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B或步骤D的TIL群可进行基因修饰以用于合适的治疗。
B.经扩增的TIL的表型特征
在一些实施方式中，分析TIL在扩增后多种表型标记物的表达，该标记物包括本文和实施例中所描述的那些。在一些实施方式中，检查一种以上表型标记物的表达。在一些实施方式中，在图1或图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中的第一扩增之后分析TIL的表型特征。在一些实施方式中，在图1或图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤C中的转变期间分析TIL的表型特征。在一些实施方式中，在根据图1或图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤C中的转变期间且在冷冻保存之后分析TIL的表型特征。在一些实施方式中，在图1或图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤D中的第二扩增之后分析TIL的表型特征。在一些实施方式中，在图1或图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤D的两次以上扩增之后分析TIL的表型特征。
在一些实施方式中，标记物选自CD8和CD28。在一些实施方式中，检查CD8的表达。在一些实施方式中，检查CD28的表达。在一些实施方式中，相较于其他过程(例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中提供的Gen 3过程)，相较于如例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中提供的2A过程，根据本发明过程产生的TIL的CD8和/或CD28的表达量更高。在一些实施方式中，相较于其他过程(例如图8(特别是例如图8B)中所提供的Gen 3过程，相较于如例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中所提供的2A过程，根据本发明过程产生的TIL的CD8表达量更高。在一些实施方式中，相较于其他过程(例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中所提供的Gen 3过程)，相较于如例如图8(特别是例如图8A)中所提供的2A过程)，根据本发明过程产生的TIL的CD28表达量更高。在一些实施方式中，高CD28表达量指示较年轻、更持久的TIL表型。在一些实施方式中，测量一种以上调节标记物的表达。
在一些实施方式中，在用于扩增本文所述的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法的任一步骤期间，未基于CD8和/或CD28表达选择第一TIL群、第二TIL群、第三TIL群或所收集TIL群。
在一些实施方式中，相较于其他过程(例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中提供的Gen 3过程，相较于如例如图8(特别是例如图8A)中提供的2A过程)，根据本发明过程产生的TIL的中枢记忆细胞的百分比更高。在一些实施方式中，中枢记忆细胞的记忆标记物选自CCR7和CD62L。
在一些实施方式中，CD4+和/或CD8+TIL记忆亚群可分为不同记忆亚群。在一些实施方式中，CD4+和/或CD8+TIL包括初始(CD45RA+CD62L+)TIL。在一些实施方式中，CD4+和/或CD8+TIL包括中枢记忆(central memory，CM；CD45RA-CD62L+)TIL。在一些实施方式中，CD4+和/或CD8+TIL包括效应记忆(EM；CD45RA-CD62L-)TIL。在一些实施方式中，CD4+和/或CD8+TIL包括RA+效应记忆/效应(TEMRA/TEFF；CD45RA+CD62L+)TIL。
在一些实施方式中，TIL表达一种以上选自如下的标记物：颗粒酶B、穿孔蛋白和颗粒溶解素。在一些实施方式中，TIL表达颗粒酶B。在一些实施方式中，TIL表达穿孔蛋白。在一些实施方式中，TIL表达颗粒溶解素。
在一些实施方式中，也可使用细胞因子释放分析，评估再刺激的TIL的细胞因子释放。在一些实施方式中，可评估TIL的干扰素-γ(IFN-γ)分泌。在一些实施方式中，IFN-γ分泌通过ELISA分析测量。在一些实施方式中，IFN-γ分泌在快速第二扩增步骤之后，在如例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)所提供的步骤D之后通过ELISA分析测量。在一些实施方式中，TIL健康通过IFN-γ(IFN-γ)分泌测量。在一些实施方式中，IFN-γ分泌指示活性TIL。在一些实施方式中，采用针对IFN-γ产生的效力分析。IFN-γ产生为细胞毒性潜力的另一种量度。IFN-γ产生可通过确定经抗CD3、CD28和CD137/4-1BB的抗体刺激的TIL培养基中的细胞因子IFN-γ的含量来测量。来自该受刺激TIL的培养基中的IFN-γ含量可通过测量IFN-γ释放确定。在一些实施方式中，在例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中所提供的Gen 3过程中的步骤D TIL的IFN-γ产生相较于例如图8(特别是例如图8A)中所提供的2A过程中步骤D增加，指示步骤D的TIL的细胞毒性潜力增加。在一些实施方式中，IFN-γ分泌增加一倍、两倍、三倍、四倍或五倍或更多。在一些实施方式中，IFN-γ分泌增加一倍。在一些实施方式中，IFN-γ分泌增加两倍。在一些实施方式中，IFN-γ的分泌增加三倍。在一些实施方式中，IFN-γ分泌增加四倍。在一些实施方式中，IFN-γ分泌增加五倍。在一些实施方式中，使用Quantikine ELISA试剂盒测量IFN-γ。在一些实施方式中，离体测量TIL中的IFN-γ。在一些实施方式中，离体测量TIL中的IFN-γ，包括通过本发明的方法(包括例如图8B方法)产生的TIL。
在一些实施方式中，能够分泌至少一倍、两倍、三倍、四倍或五倍或更多倍IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌高至少一倍的IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌高至少两倍的IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌高至少三倍的IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌高至少四倍的IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌高至少五倍的IFN-γ的TIL为为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。
在一些实施方式中，能够分泌至少100pg/mL至约1000pg/mL或更多IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少200pg/mL、至少250pg/mL、至少300pg/mL、至少350pg/mL、至少400pg/mL、至少450pg/mL、至少500pg/mL、至少550pg/mL、至少600pg/mL、至少650pg/mL、至少700pg/mL、至少750pg/mL、至少800pg/mL、至少850pg/mL、至少900pg/mL、至少950pg/mL或至少1000pg/mL或更多IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少200pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少200pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少300pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少400pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少500pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少600pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少700pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少800pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少900pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少1000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少2000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少3000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少4000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少5000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少6000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少7000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少8000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少9000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少10,000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少15,000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少20,000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少25,000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少30,000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少35,000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少40,000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少45,000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少50,000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。
在一些实施方式中，能够分泌至少100pg/mL/5e5个细胞至约1000pg/mL/5e5个细胞或更多IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少200pg/mL/5e5个细胞、至少250pg/mL/5e5个细胞、至少300pg/mL/5e5个细胞、至少350pg/mL/5e5个细胞、至少400pg/mL/5e5个细胞、至少450pg/mL/5e5个细胞、至少500pg/mL/5e5个细胞、至少550pg/mL/5e5个细胞、至少600pg/mL/5e5个细胞、至少650pg/mL/5e5个细胞、至少700pg/mL/5e5个细胞、至少750pg/mL/5e5个细胞、至少800pg/mL/5e5个细胞、至少850pg/mL/5e5个细胞、至少900pg/mL/5e5个细胞、至少950pg/mL/5e5个细胞或至少1000pg/mL/5e5个细胞或更多IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少200pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少200pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少300pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少400pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少500pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少600pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少700pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少800pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少900pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少1000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少2000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少3000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少4000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少5000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少6000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少7000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少8000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少9000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少10,000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少15,000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少20,000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少25,000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少30,000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少35,000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少40,000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少45,000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少50,000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。
T淋巴细胞和B淋巴细胞的多种抗原受体通过有限但大量的基因区段的体细胞重组产生。这些基因区段：V(可变区)、D(多变区)、J(连接区)和C(恒定区)决定免疫球蛋白和T细胞受体(TCR)的结合特异性和下游应用。本发明提供了一种用于产生显示出增加的T细胞贮库多样性的TIL的方法。在一些实施方式中，通过本发明方法获得的TIL显示出增加的T细胞贮库多样性。在一些实施方式中，相较于新鲜收集的TIL和/或使用除本文提供的方法以外的其他方法制备的TIL，通过本发明方法获得的TIL显示出增加的T细胞贮库多样性，其他方法包括例如除图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中体现的方法以外的方法。在一些实施方式中，相较于新鲜收集的TIL和/或使用如图8(特别是例如图8A)中示例的称为Gen 2的方法制备的TIL，通过本发明方法获得的TIL显示出增加的T细胞贮库多样性。在一些实施方式中，在第一扩增中获得的TIL显示出增加的T细胞贮库多样性。在一些实施方式中，多样性增加是免疫球蛋白多样性和/或T细胞受体多样性增加。在一些实施方式中，多样性存在于免疫球蛋白中，存在于免疫球蛋白重链中。在一些实施方式中，多样性存在于免疫球蛋白中，存在于免疫球蛋白轻链中。在一些实施方式中，多样性存在于T细胞受体中。在一些实施方式中，多样性存在于选自由α、β、γ和δ受体组成的群组的T细胞受体中的一者中。在一些实施方式中，T细胞受体(TCR)α和/或β的表达增加。在一些实施方式中，T细胞受体(TCR)α的表达增加。在一些实施方式中，T细胞受体(TCR)β的表达增加。在一些实施方式中，TCRab(即，TCRα/β)的表达增加。在一些实施方式中，基于样本内独特肽CDR的数目，相较于其他过程(例如称为Gen 2的过程)，如本文所述的过程(例如Gen 3过程)显示更高的克隆多样性。
在一些实施方式中，TIL的活化和耗竭可通过检查一种以上标记物确定。在一些实施方式中，活化和耗竭可使用多色流式细胞术确定。在一些实施方式中，标记物的活化和耗竭包括但不限于一种以上选自如下的标记物：CD3、PD-1、2B4/CD244、CD8、CD25、BTLA、KLRG、TIM-3、CD194/CCR4、CD4、TIGIT、CD183、CD69、CD95、CD127、CD103和/或LAG-3)。在一些实施方式中，标记物的活化和耗竭包括但不限于一种以上选自如下的标记物：BTLA、CTLA-4、ICOS、Ki67、LAG-3、PD-1、TIGIT和/或TIM-3。在一些实施方式中，标记物的活化和耗竭包括但不限于一种以上选自如下的标记物：BTLA、CTLA-4、ICOS、Ki67、LAG-3、CD103+/CD69+、CD103+/CD69-、PD-1、TIGIT和/或TIM-3。在一些实施方式中，可确定和/或分析T细胞标记物(包括活化和耗竭标记物)以检查T细胞活化、抑制或功能。在一些实施方式中，T细胞标记物可包括但不限于一种以上选自如下的标记物：TIGIT、CD3、FoxP3、Tim-3、PD-1、CD103、CTLA-4、LAG-3、BTLA-4、ICOS、Ki67、CD8、CD25、CD45、CD4和/或CD59。
在一些实施方式中，显示出分泌高于3000pg/106个TIL至300000pg/106个TIL或更多颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于3000pg/106个TIL、高于5000pg/106个TIL、高于7000pg/106个TIL、高于9000pg/106个TIL、高于11000pg/106个TIL、高于13000pg/106个TIL、高于15000pg/106个TIL、高于17000pg/106个TIL、高于19000pg/106个TIL、高于20000pg/106个TIL、高于40000pg/106个TIL、高于60000pg/106个TIL、高于80000pg/106个TIL、高于100000pg/106个TIL、高于120000pg/106个TIL、高于140000pg/106个TIL、高于160000pg/106个TIL、高于180000pg/106个TIL、高于200000pg/106个TIL、高于220000pg/106个TIL、高于240000pg/106个TIL、高于260000pg/106个TIL、高于280000pg/106个TIL、高于300000pg/106个TIL或更多颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于3000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于5000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于7000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于9000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于11000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于13000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于15000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于17000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于19000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于20000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于40000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于60000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于80000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于100000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于120000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于140000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于160000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于180000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于200000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于220000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于240000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于260000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于280000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于300000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于3000pg/106个TIL至300000pg/106个TIL或更多颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于3000pg/106个TIL、高于5000pg/106个TIL、高于7000pg/106个TIL、高于9000pg/106个TIL、高于11000pg/106个TIL、高于13000pg/106个TIL、高于15000pg/106个TIL、高于17000pg/106个TIL、高于19000pg/106个TIL、高于20000pg/106个TIL、高于40000pg/106个TIL、高于60000pg/106个TIL、高于80000pg/106个TIL、高于100000pg/106个TIL、高于120000pg/106个TIL、高于140000pg/106个TIL、高于160000pg/106个TIL、高于180000pg/106个TIL、高于200000pg/106个TIL、高于220000pg/106个TIL、高于240000pg/106个TIL、高于260000pg/106个TIL、高于280000pg/106个TIL、高于300000pg/106个TIL或更多颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于3000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于5000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于7000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于9000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于11000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于13000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于15000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于17000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于19000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于20000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于40000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于60000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于80000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于100000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于120000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于140000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于160000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于180000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于200000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于220000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于240000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于260000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于280000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于300000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。
在一些实施方式中，显示出分泌高于1000pg/mL至300000pg/mL或更多颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于1000pg/mL、高于2000pg/mL、高于3000pg/mL、高于4000pg/mL、高于5000pg/mL、高于6000pg/mL，更大的TIL。大于7000pg/mL、高于8000pg/mL、高于9000pg/mL、高于10000pg/mL、高于20000pg/mL、高于30000pg/mL、高于40000pg/mL、高于50000pg/mL、高于60000pg/mL、高于70000pg/mL、高于80000pg/mL、高于90000pg/mL、高于100000pg/mL或更多颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出高于1000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出高于2000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出高于3000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出高于4000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出高于5000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出高于6000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出高于7000pg/mL颗粒酶B的TIL为为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出高于8000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出高于9000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出高于10000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出高于20000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出高于30000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出高于40000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出高于50000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出高于60000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出高于70000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出高于80000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出高于90000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出高于100000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于120000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于140000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于160000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于180000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于200000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于220000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于240000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于260000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于280000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方式中，显示出分泌高于300000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。
在一些实施方式中，本发明的扩增方法产生显示出相较于非扩增TIL群增加的体外颗粒酶B分泌的经扩增TIL群，包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D中所提供的TIL。在一些实施方式中，相较于非扩增TIL群，本发明的扩增TIL群的颗粒酶B分泌增加至少一倍至五十倍或更多。在一些实施方式中，相较于非扩增TIL群，IFN-γ分泌增加至少一倍、至少两倍、至少三倍、至少四倍、至少五倍、至少六倍、至少七倍、至少八倍、至少九倍、至少十倍、至少二十倍、至少三十倍、至少四十倍、至少五十倍或更多。在一些实施方式中，相较于非扩增TIL群，本发明的扩增TIL群的颗粒酶B分泌增加至少一倍。在一些实施方式中，相较于非扩增TIL群，本发明的扩增TIL群的颗粒酶B分泌增加至少两倍。在一些实施方式中，相较于非扩增TIL群，本发明的扩增TIL群的颗粒酶B分泌增加至少三倍。在一些实施方式中，相较于非扩增TIL群，本发明的扩增TIL群的颗粒酶B分泌增加至少四倍。在一些实施方式中，相较于非扩增TIL群，本发明的扩增TIL群的颗粒酶B分泌增加至少五倍。在一些实施方式中，相较于非扩增TIL群，本发明的扩增TIL群的颗粒酶B分泌增加至少六倍。在一些实施方式中，相较于非扩增TIL群，本发明的扩增TIL群的颗粒酶B分泌增加至少七倍。在一些实施方式中，相较于非扩增TIL群，本发明的扩增TIL群的颗粒酶B分泌增加至少八倍。在一些实施方式中，相较于非扩增TIL群，本发明的扩增TIL群的颗粒酶B分泌增加至少九倍。在一些实施方式中，相较于非扩增TIL群，本发明的扩增TIL群的颗粒酶B分泌增加至少十倍。在一些实施方式中，相较于非扩增TIL群，本发明的扩增TIL群的颗粒酶B分泌增加至少二十倍。在一些实施方式中，相较于非扩增TIL群，本发明的扩增TIL群的颗粒酶B分泌增加至少三十倍。在一些实施方式中，相较于非扩增TIL群，本发明的扩增TIL群的颗粒酶B分泌增加至少四十倍。在一些实施方式中，相较于非扩增TIL群，本发明的扩增TIL群的颗粒酶B分泌增加至少五十倍。
在一些实施方式中，能够分泌比IFN-γ分泌量低至少一倍、两倍、三倍、四倍或五倍或更多的TNF-α(即，TNF-alpha)量的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌比IFN-γ分泌量低至少一倍的TNF-α量的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌比IFN-γ分泌量低至少两倍的TNF-α量的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌比IFN-γ分泌量低至少三倍的TNF-α量的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌比IFN-γ分泌量低至少四倍的TNF-α量的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌比IFN-γ分泌量低至少五倍的TNF-α量的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。
在一些实施方式中，能够分泌至少200pg/mL/5e5个细胞至约10,000pg/mL/5e5个细胞或更多TNF-α(即，TNF-alpha)的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少500pg/mL/5e5个细胞至约10,000pg/mL/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少1000pg/mL/5e5个细胞至约10,000pg/mL/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少2000pg/mL/5e5个细胞至约10,000pg/mL/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少3000pg/mL/5e5个细胞至约10,000pg/mL/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少4000pg/mL/5e5个细胞至约10,000pg/mL/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少5000pg/mL/5e5个细胞至约10,000pg/mL/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少6000pg/mL/5e5个细胞至约10,000pg/mL/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少7000pg/mL/5e5个细胞至约10,000pg/mL/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少8000pg/mL/5e5个细胞至约10,000pg/mL/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方式中，能够分泌至少9000pg/mL/5e5个细胞至约10,000pg/mL/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。
在一些实施方式中，测量IFN-γ和颗粒酶B含量以确定通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL的表型特征。在一些实施方式中，测量IFN-γ和TNF-α含量以确定通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL的表型特征。在一些实施方式中，测量颗粒酶B和TNF-α量以确定通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL的表型特征。在一些实施方式中，测量IFN-γ、颗粒酶B和TNF-α量以确定通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL的表型特征。
在一些实施方式中，表型特征在冷冻保存之后检查。
G.另外的过程实施方式
在一些实施方式中，本发明提供了一种用于将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群的方法，其包括：(a)通过将获自受试者的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片而自受试者的切除肿瘤获得第一TIL群；(b)通过在包含IL-2、抗生素组分和OKT-3的细胞培养基中培养第一TIL群来进行起始第一扩增，其中，起始第一扩增进行约1至7天或约1至8天以获得第二TIL群，第二TIL群的数目大于第一TIL群的数目；(c)通过使第二TIL群与包含IL-2、可选的第二抗生素组分、OKT-3和外源抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基接触来进行快速第二扩增，产生第三TIL群，其中，快速第二扩增进行约1至11天或约1至10天以获得第三TIL群，其中，第三TIL群为治疗性TIL群；以及(d)收集获自步骤(c)的治疗性TIL群，其中，第一抗生素组分和可选的第二抗生素组分独立地包含：1)抗生素组合，其选自本文公开的任何浓度的：i)庆大霉素和万古霉素；以及ii)庆大霉素和克林霉素；或2)抗生素万古霉素。在一些实施方式中，快速第二扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中的小规模培养中培养第二TIL群约3至4天或约2至4天的时间段来进行快速第二扩增；接着(2)实现将来自小规模培养的第二TIL群转移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)中，其中，在第二容器中，将来自小规模培养的第二TIL群在较大规模培养中培养约4至7天或约4至8天的时间段。在一些实施方式中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩展：(1)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中的第一小规模培养中培养第二TIL群约3至4天的时间段来进行快速第二扩增；接着(2)实现将来自第一小规模培养的第二TIL群转移且分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个与第一容器大小相等的第二容器中，其中，在各第二容器中，将转移至此类第二容器的来自第一小规模培养的第二TIL群部分在第二小规模培养中培养约4至7天或约4至8天的时间段。在一些实施方式中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩展和规模扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中的小规模培养中培养第二TIL群约3至4天或约2至4天的时间段来进行快速第二扩增；接着(2)实现将来自第一小规模培养的第二TIL群转移且分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)中，其中，在各第二容器中，将自小规模培养转移至此类第二容器的第二TIL群部分在较大规模培养中培养约4至7天或约4至8天的时间段。在一些实施方式中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩展和规模扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中的小规模培养中培养第二TIL群约3至4天的时间段来进行快速第二扩增；接着(2)实现将来自第一小规模培养的第二TIL群转移且分配到至少2、3或4个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)中，其中，在各第二容器中，将自小规模培养转移至此类第二容器的第二TIL群部分在较大规模培养中培养约5至7天的时间段。
在一些实施方式中，本发明提供了一种用于将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群的方法，其包括：(a)通过将获自受试者的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片而自受试者的切除肿瘤获得第一TIL群；(b)通过在包含IL-2、第一抗生素组分和OKT-3的细胞培养基中培养第一TIL群来进行起始第一扩增，其中，起始第一扩增进行约1至8天以获得第二TIL群，第二TIL群的数目大于第一TIL群的数目；(c)通过使第二TIL群与包含IL-2、可选的第二抗生素组分、OKT-3和外源抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基接触来进行快速第二扩增，产生第三TIL群，其中，快速第二扩增进行约1至8天以获得第三TIL群，其中，第三TIL群为治疗性TIL群；以及(d)收集获自步骤(c)的治疗性TIL群，其中，第一抗生素组分和可选的第二抗生素组分独立地包含：1)抗生素组合，其选自本文公开的任何浓度的：i)庆大霉素和万古霉素；以及ii)庆大霉素和克林霉素；或2)抗生素万古霉素。在一些实施方式中，将快速第二扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中的小规模培养中培养第二TIL群约2至4天的时间段来进行快速第二扩增；接着(2)实现将来自小规模培养的第二TIL群转移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)中，其中，在第二容器中，将来自小规模培养的第二TIL群在较大规模培养中培养约4至8天的时间段。在一些实施方式中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩展：(1)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中的第一小规模培养中培养第二TIL群约2至4天的时间段来进行快速第二扩增；接着(2)实现将来自第一小规模培养的第二TIL群转移且分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个与第一容器大小相等的第二容器的中，其中，在各第二容器中，将转移至此类第二容器的来自第一小规模培养的第二TIL群部分在第二小规模培养中培养约4至6天的时间段。在一些实施方式中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩展和规模扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中的小规模培养中培养第二TIL群约2至4天的时间段来进行快速第二扩增；接着(2)实现将来自第一小规模培养的第二TIL群转移且分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)中，其中，在各第二容器中，将自小规模培养物转移至此类第二容器的第二TIL群部分在较大规模培养中培养约4至6天的时间段。在一些实施方式中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩展和规模扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中的小规模培养中培养第二TIL群约3至4天的时间段来进行快速第二扩增；接着(2)实现将来自第一小规模培养的第二TIL群转移且分配到至少2、3或4个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX500MCS容器)中，其中，在各第二容器中，将自小规模培养转移至此类第二容器的第二TIL群部分在较大规模培养中培养约4至5天的时间段。
在一些实施方式中，本发明提供了一种用于将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群的方法，其包括：(a)通过将获自受试者的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片而自受试者的切除肿瘤获得第一TIL群；(b)通过在包含IL-2、第一抗生素组分和OKT-3的细胞培养基中培养第一TIL群来进行起始第一扩增，其中，起始第一扩增进行约1至7天以获得第二TIL群，第二TIL群的数目大于第一TIL群的数目；(c)通过使第二TIL群与包含IL-2、可选的第二抗生素组分、OKT-3和外源抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基接触来进行快速第二扩增，产生第三TIL群，其中，快速第二扩增进行约1至11天以获得第三TIL群，其中，第三TIL群为治疗性TIL群；以及(d)收集获自步骤(c)的治疗性TIL群，其中，第一抗生素组分和可选的第二抗生素组分独立地包含：1)抗生素组合，其选自本文公开的任何浓度的：i)庆大霉素和万古霉素；以及ii)庆大霉素和克林霉素；或2)抗生素万古霉素。在一些实施方式中，快速第二扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中的小规模培养中培养第二TIL群约3至4天的时间段来进行快速第二扩增；接着(2)实现将来自小规模培养的第二TIL群转移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)中，其中，在第二容器中，将来自小规模培养的第二TIL群在较大规模培养中培养约4至7天的时间段。在一些实施方式中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩展：(1)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中的第一小规模培养中培养第二TIL群约3至4天的时间段来进行快速第二扩增；接着(2)实现将来自第一小规模培养的第二TIL群转移且分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个与第一容器大小相等的第二容器的中，其中，在各第二容器中，将转移至此类第二容器的来自第一小规模培养的第二TIL群部分在第二小规模培养中培养约4至7天的时间段。在一些实施方式中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩展和规模扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中的小规模培养中培养第二TIL群约3至4天的时间段来进行快速第二扩增；接着(2)实现将来自第一小规模培养的第二TIL群转移且分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)中，其中，在各第二容器中，将自小规模培养转移至此类第二容器的第二TIL群部分在较大规模培养中培养约4至7天的时间段。在一些实施方式中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩展和规模扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中的小规模培养中培养第二TIL群约4天的时间段来进行快速第二扩增；接着(2)实现将来自第一小规模培养的第二TIL群转移且分配到至少2、3或4个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)中，其中，在各第二容器中，将自小规模培养转移至此类第二容器的第二TIL群部分在较大规模培养中培养约5天的时间段。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第二抗生素组分并非可选的且第一抗生素组分和第二抗生素组分独立地包含：1)抗生素组合，其选自本文公开的任何浓度的：i)庆大霉素和万古霉素；以及ii)庆大霉素和克林霉素；或2)抗生素万古霉素。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一抗生素组分与第二抗生素组分不同。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一抗生素组分与第二抗生素组分相同。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一抗生素组分和/或第二抗生素组分包含浓度为约50μg/mL至约600μg/mL的万古霉素。在示例性实施方式中，第一抗生素组分和/或第二抗生素组分包含浓度为约100μg/mL的万古霉素。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一抗生素组分和/或第二抗生素组分包含约400μg/mL至约600μg/mL克林霉素。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一抗生素组分和/或第二抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一抗生素组分和/或第二抗生素组分包含约2.5μg/mL至约10/mL双性霉素B。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一抗生素组分和/或第二抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素和约100μg/mL至约600μg/mL万古霉素。在示例性实施方式中，第一抗生素组分和/或第二抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素和约100μg/mL万古霉素。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一抗生素组分和/或第二抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素和约400μg/mL至约600μg/mL克林霉素。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一抗生素组分和/或第二抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素、约50μg/mL至约600μg/mL万古霉素和约2.5μg/mL至约10μg/mL双性霉素B。示例性实施方式中，第一抗生素组分和/或第二抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素、约100μg/mL万古霉素和约2.5μg/mL至约10μg/mL双性霉素B。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一抗生素组分和/或第二抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素、约400μg/mL至约600μg/mL克林霉素和约2.5μg/mL至约10μg/mL双性霉素B。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(b)中，初级第一扩增通过使第一TIL群与培养基接触来进行，该培养基进一步包含外源抗原呈递细胞(APC)，其中步骤(c)中的培养基中APC的数目大于步骤(b)中的培养基中APC的数目。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(c)中，该培养基补充有另外的外源APC。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在快速第二扩增中添加的APC的数目与在步骤(b)中添加的APC的数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约20:1的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在快速第二扩增中添加的APC的数目与在步骤(b)中添加的APC的数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约10:1的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在快速第二扩增中添加的APC的数目与在步骤(b)中添加的APC的数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约9:1的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在快速第二扩增中添加的APC的数目与在步骤(b)中添加的APC的数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约8:1的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在快速第二扩增中添加的APC的数目与在步骤(b)中添加的APC的数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约7:1的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在快速第二扩增中添加的APC的数目与在步骤(b)中添加的APC的数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约6:1的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在快速第二扩增中添加的APC的数目与在步骤(b)中添加的APC的数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约5:1的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在快速第二扩增中添加的APC的数目与在步骤(b)中添加的APC的数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约4:1的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在快速第二扩增中添加的APC的数目与在步骤(b)中添加的APC的数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约3:1的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在快速第二扩增中添加的APC的数目与在步骤(b)中添加的APC的数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.9:1的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在快速第二扩增中添加的APC的数目与在步骤(b)中添加的APC的数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.8:1的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在快速第二扩增中添加的APC的数目与在步骤(b)中添加的APC的数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.7:1的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在快速第二扩增中添加的APC的数目与在步骤(b)中添加的APC的数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.6:1的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在快速第二扩增中添加的APC的数目与在步骤(b)中添加的APC的数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.5:1的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在快速第二扩增中添加的APC的数目与在步骤(b)中添加的APC的数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.4:1的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在快速第二扩增中添加的APC的数目与在步骤(b)中添加的APC的数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.3:1的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在快速第二扩增中添加的APC的数目与在步骤(b)中添加的APC的数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.2:1的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在快速第二扩增中添加的APC的数目与在步骤(b)中添加的APC的数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.1:1的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在快速第二扩增中添加的APC的数目与在步骤(b)中添加的APC的数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2:1的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在快速第二扩增中添加的APC的数目与在步骤(b)中添加的APC的数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约10:1的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在快速第二扩增中添加的APC的数目与在步骤(b)中添加的APC的数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约5:1的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在快速第二扩增中添加的APC的数目与在步骤(b)中添加的APC的数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约4:1的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在快速第二扩增中添加的APC的数目与在步骤(b)中添加的APC的数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约3:1的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在快速第二扩增中添加的APC的数目与在步骤(b)中添加的APC的数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.9:1的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在快速第二扩增中添加的APC的数目与在步骤(b)中添加的APC的数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.8:1的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在快速第二扩增中添加的APC的数目与在步骤(b)中添加的APC的数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.7:1的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在快速第二扩增中添加的APC的数目与在步骤(b)中添加的APC的数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.6:1的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在快速第二扩增中添加的APC的数目与在步骤(b)中添加的APC的数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.5:1的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在快速第二扩增中添加的APC的数目与在步骤(b)中添加的APC的数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.4:1的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在快速第二扩增中添加的APC的数目与在步骤(b)中添加的APC的数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.3:1的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在快速第二扩增中添加的APC的数目与在步骤(b)中添加的APC的数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.2:1的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在快速第二扩增中添加的APC的数目与在步骤(b)中添加的APC的数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.1:1的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在快速第二扩增中添加的APC的数目与在步骤(b)中添加的APC的数目的比率为刚好或约2:1。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在快速第二扩增中添加的APC的数目与在步骤(b)中添加的APC的数目的比率为刚好或约1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3:1、3.1:1、3.2:1、3.3:1、3.4:1、3.5:1、3.6:1、3.7:1、3.8:1、3.9:1、4:1、4.1:1、4.2:1、4.3:1、4.4:1、4.5:1、4.6:1、4.7:1、4.8:1、4.9:1或5:1。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在初级第一扩增中添加的APC的数目为刚好或约1×108个、1.1×108个、1.2×108个、1.3×108个、1.4×108个、1.5×108个、1.6×108个、1.7×108个、1.8×108个、1.9×108个、2×108个、2.1×108个、2.2×108个、2.3×108个、2.4×108个、2.5×108个、2.6×108个、2.7×108个、2.8×108个、2.9×108个、3×108个、3.1×108个、3.2×108个、3.3×108个、3.4×108个或3.5×108个APC，使得在快速第二扩增中添加的APC的数目为刚好或约3.5×108个、3.6×108个、3.7×108个、3.8×108个、3.9×108个、4×108个、4.1×108个、4.2×108个、4.3×108个、4.4×108个、4.5×108个、4.6×108个、4.7×108个、4.8×108个、4.9×108个、5×108个、5.1×108个、5.2×108个、5.3×108个、5.4×108个、5.5×108个、5.6×108个、5.7×108个、5.8×108个、5.9×108个、6×108个、6.1×108个、6.2×108个、6.3×108个、6.4×108个、6.5×108个、6.6×108个、6.7×108个、6.8×108个、6.9×108个、7×108个、7.1×108个、7.2×108个、7.3×108个、7.4×108个、7.5×108个、7.6×108个、7.7×108个、7.8×108个、7.9×108个、8×108个、8.1×108个、8.2×108个、8.3×108个、8.4×108个、8.5×108个、8.6×108个、8.7×108个、8.8×108个、8.9×108个、9×108个、9.1×108个、9.2×108个、9.3×108个、9.4×108个、9.5×108个、9.6×108个、9.7×108个、9.8×108个、9.9×108个或1×109个APC。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在初级第一扩增中添加的APC的数目选自刚好或约1×108个APC至刚好或约3.5×108个APC的范围，其中，在快速第二扩增中添加的APC的数目选自刚好或约3.5×108个APC至刚好或约1×109个APC的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在初级第一扩增中添加的APC的数目选自刚好或约1.5×108个APC至刚好或约3×108个APC的范围，其中，在快速第二扩增中添加的APC的数目选自刚好或约4×108个APC至刚好或约7.5×108个APC的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在初级第一扩增中添加的APC的数目选自刚好或约2×108个APC至刚好或约2.5×108个APC的范围，其中，在快速第二扩增中添加的APC的数目选自刚好或约4.5×108个APC至刚好或约5.5×108个APC的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得将刚好或约2.5×108个APC添加至初级第一扩增中，将刚好或约5×108个APC添加至快速第二扩增中。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得抗原呈递细胞是外周血单核细胞(PBMC)。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得将多个肿瘤碎片分布至多个独立容器中，在每个独立容器中，第一TIL群在步骤(a)中获得，第二TIL群在步骤(b)中获得，第三TIL群在步骤(c)中获得，将来自步骤(c)中多个容器的治疗性TIL群合并以得到来自步骤(d)的经收集的TIL群。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得将多个肿瘤均匀分布至多个独立容器中。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得多个独立容器包括至少两个独立容器。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得多个独立容器包括二至二十个独立容器。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得多个独立容器包括二至十五个独立容器。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得多个独立容器包括二至十个独立容器。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得多个独立容器包括二至五个独立容器。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得多个独立容器包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个独立容器。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在各容器中对步骤(b)中的第一TIL群进行起始第一扩增，在同一容器中对由此类第一TIL群产生的第二TIL群进行步骤(c)中的快速第二扩增。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得每个独立容器包含第一透气表面区域。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得多个肿瘤碎片分布于单个容器中。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得单个容器包含第一透气表面区域。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群的细胞培养基来进行，其中，在步骤(c)中添加的APC的数目大于在步骤(b)中添加的APC的数目，在步骤(b)中，APC以刚好或约一个细胞层至刚好或约三个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(b)中，APC以刚好或约1.5个细胞层至刚好或约2.5个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(b)中，APC以刚好或约2个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(b)中，APC以刚好或约1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(c)中，APC以刚好或约3个细胞层至刚好或约10个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(c)中，APC以刚好或约4个细胞层至刚好或约8个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(c)中，APC以刚好或约3、4、5、6、7、8、9或10个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(c)中，APC以刚好或约4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(b)中，起始第一扩增在包含第一透气表面区域的第一容器中进行，在步骤(c)中，快速第二扩增在包含第二透气表面区域的第二容器中进行。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第二容器大于第一容器。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群的细胞培养基来进行，其中，在步骤(c)中添加的APC的数目大于在步骤(b)中添加的APC的数目，在步骤(b)中，APC以刚好或约一个细胞层至刚好或约三个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(b)中，APC以刚好或约1.5个细胞层至刚好或约2.5个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(b)中，APC以刚好或约2个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在一些实施方式中，本发明提供了适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(b)中，APC以刚好或约1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(c)中，APC以刚好或约3个细胞层至刚好或约10个细胞层的平均厚度层叠至第二透气表面区域上。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(c)中，APC以刚好或约4个细胞层至刚好或约8个细胞层的平均厚度层叠至第二透气表面区域上。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(c)中，APC以刚好或约3、4、5、6、7、8、9或10个细胞层的平均厚度层叠至第二透气表面区域上。
在一些实施方式中，本发明提供了适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(c)中，APC以刚好或约4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8个细胞层的平均厚度层叠至第二透气表面区域上。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(b)中，起始第一扩增在包含第一透气表面区域的第一容器中进行，在步骤(c)中，快速第二扩增在第一容器中进行。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群的细胞培养基来进行，其中，在步骤(c)中添加的APC的数目大于在步骤(b)中添加的APC的数目，在步骤(b)中，APC以刚好或约一个细胞层至刚好或约三个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(b)中，APC以刚好或约1.5个细胞层至刚好或约2.5个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(b)中，APC以刚好或约2个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(b)中，APC以刚好或约1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(c)中，APC以刚好或约3个细胞层至刚好或约10个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(c)中，APC以刚好或约4个细胞层至刚好或约8个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(c)中，APC以刚好或约3、4、5、6、7、8、9或10个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(c)中，APC以刚好或约4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群的细胞培养基来进行，其中，在步骤(c)中添加的APC的数目大于在步骤(b)中添加的APC的数目，在步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:10的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群的细胞培养基来进行，其中，在步骤(c)中添加的APC的数目大于在步骤(b)中添加的APC的数目，在步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:9的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群的细胞培养基来进行，其中，在步骤(c)中添加的APC的数目大于在步骤(b)中添加的APC的数目，在步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:8的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群的细胞培养基来进行，其中，在步骤(c)中添加的APC的数目大于在步骤(b)中添加的APC的数目，在步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:7的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群的细胞培养基来进行，其中，在步骤(c)中添加的APC的数目大于在步骤(b)中添加的APC的数目，在步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:6的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群的细胞培养基来进行，其中，在步骤(c)中添加的APC的数目大于在步骤(b)中添加的APC的数目，在步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:5的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群的细胞培养基来进行，其中，在步骤(c)中添加的APC的数目大于在步骤(b)中添加的APC的数目，在步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:4的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群的细胞培养基来进行，其中，在步骤(c)中添加的APC的数目大于在步骤(b)中添加的APC的数目，在步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:3的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群的细胞培养基来进行，其中，在步骤(c)中添加的APC的数目大于在步骤(b)中添加的APC的数目，在步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:2的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群的细胞培养基来进行，其中，在步骤(c)中添加的APC的数目大于在步骤(b)中添加的APC的数目，在步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.2至刚好或约1:8的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群的细胞培养基来进行，其中，在步骤(c)中添加的APC的数目大于在步骤(b)中添加的APC的数目，在步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.3至刚好或约1:7的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群的细胞培养基来进行，其中，在步骤(c)中添加的APC的数目大于在步骤(b)中添加的APC的数目，在步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.4至刚好或约1:6的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群的细胞培养基来进行，其中，在步骤(c)中添加的APC的数目大于在步骤(b)中添加的APC的数目，在步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.5至刚好或约1:5的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群的细胞培养基来进行，其中，在步骤(c)中添加的APC的数目大于在步骤(b)中添加的APC的数目，在步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.6至刚好或约1:4的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群的细胞培养基来进行，其中，在步骤(c)中添加的APC的数目大于在步骤(b)中添加的APC的数目，在步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.7至刚好或约1:3.5的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群的细胞培养基来进行，其中，在步骤(c)中添加的APC的数目大于在步骤(b)中添加的APC的数目，在步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.8至刚好或约1:3的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群的细胞培养基来进行，其中，在步骤(c)中添加的APC的数目大于在步骤(b)中添加的APC的数目，在步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.9至刚好或约1:2.5的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群的细胞培养基来进行，其中，在步骤(c)中添加的APC的数目大于在步骤(b)中添加的APC的数目，在步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:2的范围。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群的细胞培养基来进行，其中，在步骤(c)中添加的APC的数目大于在步骤(b)中添加的APC的数目，在步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.1、1:2.2、1:2.3、1:2.4、1:2.5、1:2.6、1:2.7、1:2.8、1:2.9、1:3、1:3.1、1:3.2、1:3.3、1:3.4、1:3.5、1:3.6、1:3.7、1:3.8、1:3.9、1:4、1:4.1、1:4.2、1:4.3、1:4.4、1:4.5、1:4.6、1:4.7、1:4.8、1:4.9、1:5、1:5.1、1:5.2、1:5.3、1:5.4、1:5.5、1:5.6、1:5.7、1:5.8、1:5.9、1:6、1:6.1、1:6.2、1:6.3、1:6.4、1:6.5、1:6.6、1:6.7、1:6.8、1:6.9、1:7、1:7.1、1:7.2、1:7.3、1:7.4、1:7.5、1:7.6、1:7.7、1:7.8、1:7.9、1:8、1:8.1、1:8.2、1:8.3、1:8.4、1:8.5、1:8.6、1:8.7、1:8.8、1:8.9、1:9、1:9.1、1:9.2、1:9.3、1:9.4、1:9.5、1:9.6、1:9.7、1:9.8、1:9.9或1:10。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第二TIL群中TIL的数目与第一TIL群中TIL的数目的比率为刚好或约1.5:1至刚好或约100:1。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第二TIL群中TIL的数目与第一TIL群中TIL的数目的比率为刚好或约50:1。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第二TIL群中TIL的数目与第一TIL群中TIL的数目的比率为刚好或约25:1。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第二TIL群中TIL的数目与第一TIL群中TIL的数目的比率为刚好或约20:1。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第二TIL群中TIL的数目与第一TIL群中TIL的数目的比率为刚好或约10:1。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第二TIL群的数目比第一TIL群大至少刚好或约50倍。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第二TIL群的数目比第一TIL群的数目大至少刚好或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50倍。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(c)中第二时间段开始之后刚好或约2天或刚好或约3天，向细胞培养基中补充另外的IL-2。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以进一步包括通过冷冻保存过程将步骤(d)中经收集的TIL群冷冻保存的步骤。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以包括在步骤(d)后进行另外的步骤(e)：将自步骤(d)收集的TIL群转移至可选地含有HypoThermosol的输注袋中。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以进一步包括通过冷冻保存过程将步骤(e)中包含经收集的TIL群的输注袋冷冻保存的步骤。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得冷冻保存过程使用1:1的经收集的TIL群与冷冻保存培养基的比率进行。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得抗原呈递细胞是外周血单核细胞(PBMC)。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得PBMC为经辐照且同种异体的。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(b)中添加至细胞培养物中的APC的总数目是2.5×108。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(c)中添加至细胞培养物中的APC的总数目是5×108。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得APC是PBMC。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得PBMC为经辐照且同种异体的。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得抗原呈递细胞为人工抗原呈递细胞。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(d)中的收集使用基于膜的细胞处理系统进行。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(d)中的收集使用LOVO细胞处理系统进行。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得多个碎片包括步骤(b)中每容器刚好或约5至刚好或约60个碎片。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得多个碎片包括步骤(b)中每容器刚好或约10至刚好或约60个碎片。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得多个碎片包括步骤(b)中每容器刚好或约15至刚好或约60个碎片。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得多个碎片包括步骤(b)中每容器刚好或约20至刚好或约60个碎片。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得多个碎片包括步骤(b)中每容器刚好或约25至刚好或约60个碎片。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得多个碎片包括步骤(b)中每容器刚好或约30至刚好或约60个碎片。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得多个碎片包括步骤(b)中每容器刚好或约35至刚好或约60个碎片。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得多个碎片包括步骤(b)中每容器刚好或约40至刚好或约60个碎片。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得多个碎片包括步骤(b)中每容器刚好或约45至刚好或约60个碎片。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得多个碎片包括步骤(b)中每容器刚好或约50至刚好或约60个碎片。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得多个碎片包括步骤(b)中每容器刚好或约50至刚好或约100个碎片。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得多个碎片包括步骤(b)中每容器刚好或约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个碎片。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得多个碎片包括步骤(b)中每容器刚好或约50、60、70、80、90或100个碎片。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得多个碎片包括步骤(b)中每容器100个或更多个碎片。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得每个碎片的体积为刚好或约27mm3。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得每个碎片的体积为刚好或约20mm3至刚好或约50mm3。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得每个碎片的体积为刚好或约21mm3至刚好或约30mm3。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得每个碎片的体积为刚好或约22mm3至刚好或约29.5mm3。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得每个碎片的体积为刚好或约23mm3至刚好或约29mm3。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得每个碎片的体积为刚好或约24mm3至刚好或约28.5mm3。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得每个碎片的体积为刚好或约25mm3至刚好或约28mm3。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得每个碎片的体积为刚好或约26.5mm3至刚好或约27.5mm3。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得每个碎片的体积为刚好或约21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50mm3。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得多个碎片包括刚好或约30至刚好或约60个碎片，总体积为刚好或约1300mm3至刚好或约1500mm3。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得多个碎片包括刚好或约50个碎片，总体积为刚好或约1350mm3。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得多个碎片包括刚好或约100个碎片，总体积为刚好或约2700mm3。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得多个碎片包括刚好或约50个碎片，总质量为刚好或约1克至刚好或约1.5克。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得多个碎片包括刚好或约100个碎片，总质量为刚好或约2克至刚好或约3克。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得细胞培养基在容器中提供，该容器为G容器或Xuri细胞袋。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得细胞培养基中的IL-2浓度为约10,000IU/mL至约5,000IU/mL。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得细胞培养基中的IL-2浓度为约6,000IU/mL。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得冷冻保存培养基包含二甲亚砜(DMSO)。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得冷冻保存培养基包含7％至10％ DMSO。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得步骤(b)中的第一时间段在刚好或约1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天的时间内进行。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得步骤(c)中的第二时间段在刚好或约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的时间内进行。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得步骤(b)中的第一时间段和步骤(c)中的第二时间段各自独立地在刚好或约1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天的时间内进行。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得步骤(b)中的第一时间段和步骤(c)中的第二时间段各自独立地在刚好或约5天、6天或7天的时间内进行。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得步骤(b)中的第一时间段和步骤(c)中的第二时间段各自独立地在刚好或约7天的时间内进行。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得步骤(a)至步骤(d)总共进行刚好或约14天至刚好或约18天。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得步骤(a)至步骤(d)总共进行刚好或约15天至刚好或约18天。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得步骤(a)至步骤(d)总共进行刚好或约16天至刚好或约18天。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得步骤(a)至步骤(d)总共进行刚好或约17天至刚好或约18天。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得步骤(a)至步骤(d)总共进行刚好或约14天至刚好或约17天。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得步骤(a)至步骤(d)总共进行刚好或约15天至刚好或约17天。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得步骤(a)至步骤(d)总共进行刚好或约16天至刚好或约17天。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得步骤(a)至步骤(d)总共进行刚好或约14天至刚好或约16天。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得步骤(a)至步骤(d)总共进行刚好或约15天至刚好或约16天。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得步骤(a)至步骤(d)总共进行刚好或约14天。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得步骤(a)至步骤(d)总共进行刚好或约15天。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得步骤(a)至步骤(d)总共进行刚好或约16天。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得步骤(a)至步骤(d)总共进行刚好或约17天。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得步骤(a)至步骤(d)总共进行刚好或约18天。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得步骤(a)至步骤(d)总共进行刚好或约14天以下。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得步骤(a)至步骤(d)总共进行刚好或约15天以下。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得步骤(a)至步骤(d)总共进行刚好或约16天以下。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得步骤(a)至步骤(d)总共进行刚好或约18天以下。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得步骤(d)中经收集的治疗性TIL群包含足以用于TIL的治疗有效剂量的TIL。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得足以用于治疗有效剂量的TIL的数目为刚好或约2.3×1010至刚好或约13.7×1010个。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得步骤(c)中的第三TIL群提供增加的功效、增加的干扰素-γ产生和/或增加的多克隆性。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得步骤(c)中的第三TIL群提供相较于通过长于16天的过程制备的TIL至少一倍至五倍或更多的干扰素-γ产生。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得步骤(c)中的第三TIL群提供相较于通过长于17天的过程制备的TIL至少一倍至五倍或更多的干扰素-γ产生。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得步骤(c)中的第三TIL群提供相较于通过长于18天的过程制备的TIL至少一倍至五倍或更多的干扰素-γ产生。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得获自步骤(c)的第三TIL群的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞相对于获自步骤(b)的第二细胞群的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞显示出增加的CD8和CD28表达。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得该方法中叙述的各容器为密闭容器。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得该方法中叙述的各容器为G容器。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得该方法中叙述的各容器为GREX-10。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得该方法中叙述的各容器为GREX-100。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得该方法中叙述的各容器为GREX-500。
在一些实施方式中，本发明提供了通过以上适用的任何前述段落中描述的方法制备的治疗性肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群。
在一些实施方式中，本发明提供了一种自患者的肿瘤组织制备的治疗性肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群，其中，相较于通过在无任何添加的抗原呈递细胞(APC)或OKT3的情况下进行TIL的第一扩增的过程制备的TIL，该治疗性TIL群提供增加的功效、增加的干扰素-γ产生和/或增加的多克隆性。
在一些实施方式中，本发明提供了一种自患者的肿瘤组织制备的治疗性肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群，其中，相较于通过在无任何添加的抗原呈递细胞(APC)的情况下进行TIL的第一扩增的过程制备的TIL，该治疗性TIL群提供增加的功效、增加的干扰素-γ产生和/或增加的多克隆性。
在一些实施方式中，本发明提供了一种自患者的肿瘤组织制备的治疗性肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群，其中，相较于通过在无任何添加的OKT3的情况下进行TIL的第一扩增的过程制备的TIL，该治疗性TIL群提供增加的功效、增加的干扰素-γ产生和/或增加的多克隆性。
在一些实施方式中，本发明提供了一种自患者的肿瘤组织制备的治疗性肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群，其中，相较于通过在不添加抗原呈递细胞(APC)且不添加OKT3的情况下进行TIL的第一扩增的过程制备的TIL，该治疗性TIL群提供增加的功效、增加的干扰素-γ产生和/或增加的多克隆性。
在一些实施方式中，本发明提供了一种自患者的肿瘤组织制备的治疗性肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群，其中，相较于通过过程通过长于16天的过程制备的TIL，该治疗性TIL群提供增加的功效、增加的干扰素-γ产生和/或增加的多克隆性。
在一些实施方式中，本发明提供了一种自患者的肿瘤组织制备的治疗性肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群，其中，相较于通过过程通过长于17天的过程制备的TIL，该治疗性TIL群提供增加的功效、增加的干扰素-γ产生和/或增加的多克隆性。
在一些实施方式中，本发明提供了一种自患者的肿瘤组织制备的治疗性肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群，其中，相较于通过过程通过长于18天的过程制备的TIL，该治疗性TIL群提供增加的功效、增加的干扰素-γ产生和/或增加的多克隆性。
在一些实施方式中，本发明提供了如以上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群，其提供增加的干扰素-γ产生。
在一些实施方式中，本发明提供了如以上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群，其提供增加的多克隆性。
在一些实施方式中，本发明提供了如以上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群，其提供增加的功效。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群，该治疗性TIL群经修改以使得该治疗性TIL群能够产生比通过长于16天的过程制备的TIL高至少一倍的干扰素-γ。在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群，该治疗性TIL群经修改以使得该治疗性TIL群能够产生比通过长于17天的过程制备的TIL高至少一倍的干扰素-γ。在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群，该治疗性TIL群经修改以使得该治疗性TIL群能够产生比通过长于18天的过程制备的TIL高至少一倍的干扰素-γ。在一些实施方式中，归因于本文所述的扩增过程，例如以上步骤A至步骤F中所描述或根据以上步骤A至步骤F(也如例如图8中(特别是例如图8B和/或图8C)所示)，TIL呈现为能够产生高至少一倍的干扰素-γ。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群，该治疗性TIL群经修改以使得该治疗性TIL群能够产生比通过长于16天的过程制备的TIL高至少两倍的干扰素-γ。在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群，该治疗性TIL群经修改以使得该治疗性TIL群能够产生比通过长于17天的过程制备的TIL高至少两倍的干扰素-γ。在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群，该治疗性TIL群经修改以使得该治疗性TIL群能够产生比通过长于18天的过程制备的TIL高至少两倍的干扰素-γ。在一些实施方式中，归因于本文所述的扩增过程，例如以上步骤A至步骤F中所描述或根据以上步骤A至步骤F(也如例如图8中(特别是例如图8B和/或图8C)所示)，TIL呈现为能够产生高至少两倍的干扰素-γ。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群，该治疗性TIL群经修改以使得该治疗性TIL群能够产生比通过长于16天的过程制备的TIL高至少三倍的干扰素-γ。在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群，该治疗性TIL群经修改以使得该治疗性TIL群能够产生比通过长于17天的过程制备的TIL高至少三倍的干扰素-γ。在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群，该治疗性TIL群经修改以使得该治疗性TIL群能够产生比通过长于18天的过程制备的TIL高至少三倍的干扰素-γ。在一些实施方式中，归因于本文所述的扩增过程，例如以上步骤A至步骤F中所描述或根据以上步骤A至步骤F(也如例如图8中(特别是例如图8B和/或图8C)所示)，TIL呈现为能够产生高至少三倍的干扰素-γ。
在一些实施方式中，本发明提供了治疗性肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群，其能够产生比通过在无任何添加的抗原呈递细胞(APC)的情况下进行TIL的第一扩增的过程所制备的TIL高至少一倍的干扰素-γ。在一些实施方式中，归因于本文所述的扩增过程，例如以上步骤A至步骤F中所描述或根据以上步骤A至步骤F(也如例如图8中(特别是例如图8B和/或图8C)所示)，TIL呈现为能够产生高至少一倍的干扰素-γ。
在一些实施方式中，本发明提供了一种治疗性肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群，其能够产生比通过在无任何添加的OKT3的情况下进行TIL的第一扩增的过程所制备的TIL高至少一倍的干扰素-γ。在一些实施方式中，归因于本文所述的扩增过程，例如以上步骤A至步骤F中所描述或根据以上步骤A至步骤F(也如例如图8中(特别是例如图8B和/或图8C)所示)，TIL呈现为能够产生高至少一倍的干扰素-γ。
在一些实施方式中，本发明提供了一种治疗性TIL群，其能够产生相较于通过在无任何添加的APC的情况下进行TIL的第一扩增的过程所制备的TIL高至少两倍的干扰素-γ。在一些实施方式中，归因于本文所述的扩增过程，例如以上步骤A至步骤F中所描述或根据以上步骤A至步骤F(也如例如图8中(特别是例如图8B和/或图8C)所示)，TIL呈现为能够产生高至少两倍的干扰素-γ。
在一些实施方式中，本发明提供了一种治疗性TIL群，其能够产生相较于通过在无任何添加的OKT3的情况下进行TIL的第一扩增的过程所制备的TIL高至少两倍的干扰素-γ。在一些实施方式中，归因于本文所述的扩增过程，例如以上步骤A至步骤F中所描述或根据以上步骤A至步骤F(也如例如图8中(特别是例如图8B和/或图8C)所示)，TIL呈现为能够产生高至少两倍的干扰素-γ。
在一些实施方式中，本发明提供了一种治疗性TIL群，其能够产生相较于通过在无任何添加的APC的情况下进行TIL的第一扩增的过程所制备的TIL高至少三倍的干扰素-γ。在一些实施方式中，归因于本文所述的扩增过程，例如以上步骤A至步骤F中所描述或根据以上步骤A至步骤F(也如例如图8中(特别是例如图8B和/或图8C)所示)，TIL呈现为能够产生高至少一倍的干扰素-γ。
在一些实施方式中，本发明提供了一种治疗性TIL群，其能够产生相较于通过在无任何添加的OKT3的情况下进行TIL的第一扩增的过程所制备的TIL高至少三倍的干扰素-γ。在一些实施方式中，归因于本文所述的扩增过程，例如以上步骤A至步骤F中所描述或根据以上步骤A至步骤F(也如例如图8中(特别是例如图8B和/或图8C)所示)，TIL呈现为能够产生高至少三倍的干扰素-γ。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得肿瘤碎片是小型活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)、粗针活体组织切片、芯针活体组织切片(core needle biopsy)或细针抽吸物。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得肿瘤碎片是粗针活体组织切片。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得肿瘤碎片是细针抽吸物。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得肿瘤碎片是小型活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得肿瘤碎片是芯针活体组织切片。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得(i)该方法包括自来自受试者的肿瘤组织的一个以上小型活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)、粗针活体组织切片、芯针活体组织切片或细针抽吸物获得第一TIL群，(ii)该方法包括在进行起始第一扩增步骤之前，进行在包含IL-2和第一抗生素组分的细胞培养基中培养该第一TIL群约3天的时间段的步骤，(ⅲ)该方法包括进行该起始第一扩增约8天的时间段，以及(iv)该方法包括进行快速第二扩增约11天的时间段。在一些前述实施方式中，该方法的步骤在约22天内完成。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得(i)该方法包括自来自受试者的肿瘤组织的一个以上小型活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)、粗针活体组织切片、芯针活体组织切片或细针抽吸物获得第一TIL群，(ii)该方法包括在进行起始第一扩增步骤之前，进行在包含IL-2和第一抗生素组分的细胞培养基中培养该第一TIL群约3天的时间段的步骤，(ⅲ)该方法包括进行该起始第一扩增约8天的时间段，以及(iv)该方法包括通过培养该第二TIL群的培养物约5天，将该培养物分成至多5份继代培养物，培养该继代培养物约6天来进行快速第二扩增。在一些前述实施方式中，在大小与在快速第二扩增中开始第二TIL群的培养的容器相同以上的容器中，分别培养该至多5份继代培养物。在一些前述实施方式中，第二TIL群的培养物均等地分在至多5份继代培养物中。在一些前述实施方式中，该方法的步骤在约22天内完成。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一TIL群自来自受试者的肿瘤组织的1至约20个小型活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)、粗针活体组织切片、芯针活体组织切片或细针抽吸物获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一TIL群自来自受试者的肿瘤组织的1至约10个小型活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)、粗针活体组织切片、芯针活体组织切片或细针抽吸物获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一TIL群自来自受试者的肿瘤组织的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个小型活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)、粗针活体组织切片、芯针活体组织切片或细针抽吸物获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一TIL群自来自受试者的肿瘤组织的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个小型活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)、粗针活体组织切片、芯针活体组织切片或细针抽吸物获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一TIL群自来自受试者的肿瘤组织的1至约20个粗针活体组织切片获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一TIL群自来自受试者的肿瘤组织的1至约10个粗针活体组织切片获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一TIL群自来自受试者的肿瘤组织的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个粗针活体组织切片获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一TIL群自来自受试者的肿瘤组织的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个粗针活体组织切片获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一TIL群自来自受试者的肿瘤组织的1至约20个细针抽吸物获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一TIL群自来自受试者的肿瘤组织的1至约10个细针抽吸物获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一TIL群自来自受试者的肿瘤组织的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个细针抽吸物获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一TIL群自来自受试者的肿瘤组织的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个细针抽吸物获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一TIL群自来自受试者的肿瘤组织的1至约20个芯针活体组织切片获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一TIL群自来自受试者的肿瘤组织的1至约10个芯针活体组织切片获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一TIL群自来自受试者的肿瘤组织的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个芯针活体组织切片获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一TIL群自来自受试者的肿瘤组织的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个芯针活体组织切片获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一TIL群自来自受试者的肿瘤组织的1至约20个小型活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一TIL群自来自受试者的肿瘤组织的1至约10个小型活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一TIL群自来自受试者的肿瘤组织的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个小型活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一TIL群自来自受试者的肿瘤组织的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个小型活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得(i)该方法包括自来自受试者的肿瘤组织的1至约10个粗针活体组织切片获得第一TIL群；(ii)该方法包括在进行起始第一扩增步骤之前，进行在包含IL-2和第一抗生素组分的细胞培养基中培养该第一TIL群约3天的时间段的步骤；(ⅲ)该方法包括通过在包含IL-2、第一抗生素组分、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的培养基中培养该第一TIL群约8天的时间段来进行起始第一扩增步骤，获得第二TIL群；以及(iv)该方法包括通过在包含IL-2、可选的第二抗生素组分、OKT-3和APC的培养基中培养该第二TIL群约11天的时间段来进行快速第二扩增。在一些前述实施方式中，该方法的步骤在约22天内完成。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得(i)该方法包括自来自受试者的肿瘤组织的1至约10个粗针活体组织切片获得第一TIL群；(ii)该方法包括在进行起始第一扩增步骤之前，进行在包含IL-2和第一抗生素组分的细胞培养基中培养第一TIL群约3天的时间段的步骤；(ⅲ)该方法包括通过在包含IL-2、第一抗生素组分、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的培养基中培养第一TIL群约8天的时间段来进行起始第一扩增步骤，获得第二TIL群；以及(iv)该方法包括通过在包含IL-2、可选的第二抗生素组分、OKT-3和APC的培养基中培养第二TIL群的培养物约5天，将培养物分成至多5份继代培养物，在包含IL-2和可选的第二抗生素组分的培养基中培养各继代培养物约6天来进行快速第二扩增。在一些前述实施方式中，在大小与在快速第二扩增中开始第二TIL群的培养的容器相同以上的容器中，分别培养该至多5份继代培养物。在一些前述实施方式中，第二TIL群的培养物均等地分在至多5份继代培养物中。在一些前述实施方式中，该方法的步骤在约22天内完成。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得(i)该方法包括自来自受试者的肿瘤组织的1至约10个粗针活体组织切片获得第一TIL群；(ii)该方法包括在进行起始第一扩增步骤之前进行以下步骤：在G-Rex100M培养瓶中，在0.5L CM1培养基中包含第一抗生素组分和6000IU IL-2/mL的细胞培养基中培养第一TIL群约3天的时间段；(ⅲ)该方法包括通过以下方式进行起始第一扩增：添加含有6000IU/ml IL-2、第一抗生素组分、30ng/mL OKT-3和约108个饲养细胞的0.5L CM1培养基，培养约8天的时间段；以及(iv)该方法包括通过以下方式进行快速第二扩增：(a)将第二TIL群转移至含有具有3000IU/ml IL-2、可选的第二抗生素组分、30ng/mL OKT-3和5×109个饲养细胞的5L CM2培养基的G-Rex 500MCS培养瓶中，培养约5天；(b)通过将109个TIL转移至含有具有3000IU/ml IL-2和可选的第二抗生素组分的5L AIM-V培养基的至多5个G-Rex 500MCS培养瓶中的每一个中而将培养物分成至多5份继代培养物，培养该继代培养物约6天。在一些前述实施方式中，该方法的步骤在约22天内完成。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在起始第一扩增之前，将肿瘤碎片或样本中的第一TIL群消化以产生肿瘤消化物，该消化物经历PD-1阳性预选以产生预选的第一TIL群，使用预选的第一TIL群进行起始第一扩增。在一些实施方式中，用于起始第一扩增的预选的第一TIL群为至少75％ PD-1阳性、至少80％ PD-1阳性、至少85％ PD-1阳性、至少90％ PD-1阳性、至少95％ PD-1阳性、至少98％ PD-1阳性或至少99％ PD-1阳性(例如在预选之后且在起始第一扩增之前)。在一些实施方式中，预选的第一TIL群是高PD-1。在一些实施方式中，用于起始第一扩增的预选的第一TIL群为至少25％高PD-1、至少30％高PD-1、至少35％高PD-1、至少40％高PD-1、至少45％高PD-1、至少50％高PD-1、至少55％高PD-1、至少60％高PD-1、至少65％高PD-1、至少70％高PD-1、至少75％高PD-1、至少80％高PD-1、至少85％高PD-1、至少90％高PD-1、至少95％高PD-1、至少98％高PD-1或至少99％高PD-1(例如在预选之后且在起始第一扩增之前)。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得(a)在起始第一扩增之前，(i)在含有IL-2和可选的第一抗生素组分的细胞培养基中培养肿瘤碎片或样本中的主体TIL或第一TIL群，产生自肿瘤碎片或样本释放的TIL，(ii)将至少多个自肿瘤碎片或样本释放的TIL自肿瘤碎片或样本分离以产生肿瘤碎片或样本、肿瘤碎片或样本中残留的TIL和自肿瘤碎片或样本释放且在分离之后与其保持在一起的任何TIL的混合物，和(ⅲ)可选地，将肿瘤碎片或样本、肿瘤碎片或样本中的残留TIL和自肿瘤碎片或样本释放且在分离之后与其保持在一起的任何TIL的混合物消化，产生此类混合物的消化物；以及(b)使用该混合物或该混合物的消化物进行起始第一扩增。在一些实施方式中，将至少约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更高百分比的自肿瘤碎片或样本释放的TIL自肿瘤碎片或样本分离以产生混合物。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在起始第一扩增之前进行的培养步骤进行约1天至约3天的时间段。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在起始第一扩增之前进行的培养步骤进行约1、2、3、4、5、6或7天的时间段。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得(a)在起始第一扩增之前进行的PD-1预选步骤之前，(i)在含有IL-2和可选的第一抗生素组分的细胞培养基中培养肿瘤碎片或样本中的主体TIL或第一TIL群，产生自肿瘤碎片或样本释放的TIL，(ii)将至少多个自肿瘤碎片或样本释放的TIL自肿瘤碎片或样本分离以产生肿瘤碎片或样本、肿瘤碎片或样本中残留的TIL和自肿瘤碎片或样本释放且在分离之后与其保持在一起的任何TIL的混合物，和(ⅲ)将肿瘤碎片或样本、肿瘤碎片或样本中的残留TIL和自肿瘤碎片或样本释放且在分离之后与其保持在一起的任何TIL的混合物消化以产生此类混合物的消化物；以及(b)使用该混合物的消化物进行PD-1预选步骤以产生PD-1预选的第一TIL群。在一些实施方式中，将至少约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更高百分比的自肿瘤碎片或样本释放的TIL自肿瘤碎片或样本分离以产生混合物。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在PD-1预选步骤之前进行的培养步骤进行约1天至约3天的时间段。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在PD-1预选步骤之前进行的培养步骤进行约1、2、3、4、5、6或7天的时间段。
在一些实施方式中，本发明提供了一种扩增T细胞的方法，其包括：(a)通过在第一抗生素组分存在下培养获自供体的第一T细胞群进行该第一T细胞群的起始第一扩增，以实现第一T细胞群的生长及起始其活化；(b)在步骤(a)中起始的第一T细胞群的活化开始衰退之后，通过可选地在第二抗生素组分存在下培养该第一T细胞群进行该第一T细胞群的快速第二扩增以实现第一T细胞群的生长并加强其活化，获得第二T细胞群；以及(c)收集该第二T细胞群，其中，第一抗生素组分和可选的第二抗生素组分独立地包含：1)抗生素组合，其选自本文公开的任何浓度的：i)庆大霉素和万古霉素；以及ii)庆大霉素和克林霉素；或2)抗生素万古霉素。在一些实施方式中，快速第二扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中的小规模培养中培养第一T细胞群约3至4天的时间段来进行快速第二扩增；接着(b)实现将来自小规模培养的第一T细胞群转移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)中，在该第二容器中，将来自小规模培养的第一T细胞群在较大规模培养中培养约4至7天的时间段。在一些实施方式中，快速扩增步骤分成多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩展：(a)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中的第一小规模培养中培养第一T细胞群约3至4天的时间段来进行快速第二扩增；接着(b)实现将来自第一小规模培养的第一T细胞群转移并分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小与第一容器相等的第二容器中，其中，在各第二容器中，将转移至此类第二容器的来自第一小规模培养的第一T细胞群部分在第二小规模培养中培养约4至7天的时间段。在一些实施方式中，快速扩增步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩展和规模扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中的小规模培养中培养第一T细胞群约3至4天的时间段来进行快速第二扩增；接着(b)实现将来自小规模培养的第一T细胞群转移且分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX500MCS容器)中，其中，在各第二容器中，将转移至此类第二容器的来自小规模培养的第一T细胞群部分在较大规模培养中培养约4至7天的时间段。在一些实施方式中，快速扩增步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩展和规模扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中的小规模培养中培养第一T细胞群约4天的时间段来进行快速第二扩增；接着(b)实现将来自小规模培养的第一T细胞群转移且分配到至少2、3或4个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)中，其中，在各第二容器中，将转移至此类第二容器的来自小规模培养的第一T细胞群部分在较大规模培养中培养约5天的时间段。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得将快速第二扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中的小规模培养中培养第一T细胞群约2至4天的时间段来进行快速第二扩增；接着(b)实现将来自小规模培养的第一T细胞群转移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)中，在该第二容器中，将来自小规模培养的第一T细胞群在较大规模培养中培养约5至7天的时间段。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得将快速扩增步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩展：(a)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中以第一小规模培养物培养第一T细胞群约2至4天的时间段来进行快速第二扩增；接着(b)实现将来自第一小规模培养的第一T细胞群转移且分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小与第一容器相等的第二容器的中，其中，在各第二容器中，将转移至此类第二容器的来自第一小规模培养的第一T细胞群部分在第二小规模培养中培养约5至7天的时间段。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得将快速扩增步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩展和规模扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中的小规模培养中培养第一T细胞群约2至4天的时间段来进行快速第二扩增；接着(b)实现将来自小规模培养的第一T细胞群转移且分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)中，其中，在各第二容器中，将转移至此类第二容器的来自小规模培养的第一T细胞群部分在较大规模培养中培养约5至7天的时间段。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得将快速扩增步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩展和规模扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中的小规模培养中培养第一T细胞群约3至4天的时间段来进行快速第二扩增；接着(b)实现将来自小规模培养的第一T细胞群转移且分配到至少2、3或4个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)中，其中，在各第二容器中，将转移至此类第二容器的来自小规模培养的第一T细胞群部分在较大规模培养中培养约5至6天的时间段。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得将快速扩增步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩展和规模扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中的小规模培养中培养第一T细胞群约3至4天的时间段来进行快速第二扩增；接着(b)实现将来自小规模培养的第一T细胞群转移且分配到至少2、3或4个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)中，其中，在各第二容器中，将转移至此类第二容器的来自小规模培养的第一T细胞群部分在较大规模培养中培养约5天的时间段。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得将快速扩增步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩展和规模扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中的小规模培养中培养第一T细胞群约3至4天的时间段来进行快速第二扩增；接着(b)实现将来自小规模培养的第一T细胞群转移且分配到至少2、3或4个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)中，其中，在各第二容器中，将转移至此类第二容器的来自小规模培养的第一T细胞群部分在较大规模培养中培养约6天的时间段。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得将快速扩增步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩展和规模扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中的小规模培养中培养第一T细胞群约3至4天的时间段来进行快速第二扩增；接着(b)实现将来自小规模培养的第一T细胞群转移且分配到至少2、3或4个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)中，其中，在各第二容器中，将转移至此类第二容器的来自小规模培养的第一T细胞群部分在较大规模培养中培养约7天的时间段。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得步骤(a)的起始第一扩增在至多7天的时间段期间进行。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得步骤(b)的第二扩增在至多8天的时间段期间进行。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得步骤(b)的快速第二扩增在至多9天的时间段期间进行。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得步骤(b)的快速第二扩增在至多10天的时间段期间进行。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得步骤(b)的快速第二扩增在至多11天的时间段期间进行。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得步骤(a)中的起始第一扩增在7天的时间段期间进行，步骤(b)的快速第二扩增在至多9天的时间段期间进行。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得步骤(a)中的起始第一扩增在7天的时间段期间进行，步骤(b)的快速第二扩增在至多10天的时间段期间进行。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得步骤(a)中的起始第一扩增在7天或8天的时间段期间进行，步骤(b)的快速第二扩增在至多9天的时间段期间进行。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得步骤(a)中的起始第一扩增在7天或8天的时间段期间进行，步骤(b)的快速第二扩增在至多10天的时间段期间进行。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得步骤(a)中的起始第一扩增在8天的时间段期间进行，步骤(b)的快速第二扩增在至多9天的时间段期间进行。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得步骤(a)中的起始第一扩增在8天的时间段期间进行，步骤(b)的快速第二扩增在至多8天的时间段期间进行。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(a)中，将第一T细胞群在包含OKT-3和IL-2的第一培养基中培养。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一培养基包含4-1BB激动剂、OKT-3和IL-2。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一培养基包含OKT-3、IL-2和抗原呈递细胞(APC)。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一培养基包含4-1BB激动剂、OKT-3、IL-2和抗原呈递细胞(APC)。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(b)中，将第一T细胞群在包含OKT-3、IL-2和抗原呈递细胞(APC)的第二培养基中培养。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第二培养基包含4-1BB激动剂、OKT-3、IL-2和抗原呈递细胞(APC)。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(a)中，将第一T细胞群在包含第一透气表面的容器中的第一培养基中培养，其中，第一培养基包含OKT-3、第一抗生素组分、IL-2和第一抗原呈递细胞(APC)群，第一APC群对于第一T细胞群的供体为外源性的，第一APC群层叠至第一透气表面上，在步骤(b)中，将第一T细胞群在容器中的第二培养基中培养，第二培养基包含OKT-3、可选的第二抗生素组分、IL-2和第二APC群，第二APC群对于第一T细胞群的供体为外源性的，第二APC群层叠至第一透气表面上，第二APC群比第一APC群大。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(a)中，将第一T细胞群在包含第一透气表面的容器中的第一培养基中培养，第一培养基包含4-1BB激动剂、第一抗生素组分、OKT-3、IL-2和第一抗原呈递细胞(APC)群，第一APC群对于第一T细胞群的供体为外源性的，第一APC群层叠至第一透气表面上，在步骤(b)中，将第一T细胞群在容器中的第二培养基中培养，第二培养基包含OKT-3、可选的第二抗生素组分、IL-2和第二APC群，第二APC群对于第一T细胞群的供体为外源性的，第二APC群层叠至第一透气表面上，第二APC群比第一APC群大。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(a)中，将第一T细胞群在包含第一透气表面的容器中的第一培养基中培养，第一培养基包含OKT-3、第一抗生素组分、IL-2和第一抗原呈递细胞(APC)群，第一APC群对于第一T细胞群的供体为外源性的，第一APC群层叠至第一透气表面上，在步骤(b)中，将第一T细胞群在容器中的第二培养基中培养，第二培养基包含4-1BB激动剂、OKT-3、可选的第二抗生素组分、IL-2和第二APC群，第二APC群对于第一T细胞群的供体为外源性的，第二APC群层叠至第一透气表面上，第二APC群比第一APC群大。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(a)中，将第一T细胞群在包含第一透气表面的容器中的第一培养基中培养，第一培养基包含4-1BB激动剂、OKT-3、第一抗生素组分、IL-2和第一抗原呈递细胞(APC)群，第一APC群对于第一T细胞群的供体为外源性的，第一APC群层叠至第一透气表面上，在步骤(b)中，将第一T细胞群在容器中的第二培养基中培养，第二培养基包含4-1BB激动剂、OKT-3、可选的第二抗生素组分、IL-2和第二APC群，第二APC群对于第一T细胞群的供体为外源性的，第二APC群层叠至第一透气表面上，第二APC群比第一APC群大。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第二APC群中APC的数目与第一APC群中APC的数目的比率为约2:1。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一APC群中APC的数目是约2.5×108且第二APC群中APC的数目是约5×108。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(a)中，将第一APC群以2层APC的平均厚度层叠至第一透气表面上。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(b)中，将第二APC群以选自4至8层APC的范围的平均厚度层叠至第一透气表面上。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(b)中层叠至第一透气表面上的APC的平均层数与在步骤(a)中层叠至第一透气表面上的APC的平均层数的比率是2:1。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(a)中，将第一APC群以选自刚好或约1.0×106个APC/cm2至刚好或约4.5×106个APC/cm2范围的密度接种在第一透气表面上。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(a)中，将第一APC群以选自刚好或约1.5×106个APC/cm2至刚好或约3.5×106个APC/cm2范围的密度接种在第一透气表面上。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(a)中，将第一APC群以选自刚好或约2.0×106个APC/cm2至刚好或约3.0×106个APC/cm2范围的密度接种在第一透气表面上。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(a)中，将第一APC群以刚好或约2.0×106个APC/cm2的密度接种在第一透气表面上。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(b)中，将第二APC群以选自刚好或约2.5×106个APC/cm2至刚好或约7.5×106个APC/cm2范围的密度接种在第一透气表面上。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(b)中，将第二APC群以选自刚好或约3.5×106个APC/cm2至刚好或约6.0×106个APC/cm2范围的密度接种在第一透气表面上。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(b)中，将第二APC群以选自刚好或约4.0×106个APC/cm2至刚好或约5.5×106个APC/cm2范围的密度接种在第一透气表面上。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(b)中，将第二APC群以刚好或约4.0×106个APC/cm2的密度接种在第一透气表面上。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(a)中，将第一APC群以选自刚好或约1.0×106个APC/cm2至刚好或约4.5×106个APC/cm2范围的密度接种在第一透气表面上，在步骤(b)中，将第二APC群以选自刚好或约2.5×106个APC/cm2至刚好或约7.5×106个APC/cm2范围的密度接种在第一透气表面上。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(a)中，第一APC群以选自刚好或约1.5×106个APC/cm2至刚好或约3.5×106个APC/cm2范围的密度接种在第一透气表面上，在步骤(b)中，第二APC群以选自刚好或约3.5×106个APC/cm2至刚好或约6.0×106个APC/cm2范围的密度接种在第一透气表面上。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(a)中，第一APC群以选自刚好或约2.0×106个APC/cm2至刚好或约3.0×106个APC/cm2范围的密度接种在第一透气表面上，在步骤(b)中，第二APC群以选自刚好或约4.0×106个APC/cm2至刚好或约5.5×106个APC/cm2范围的密度接种在第一透气表面上。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(a)中，第一APC群以刚好或约2.0×106个APC/cm2的密度接种在第一透气表面上，在步骤(b)中，第二APC群以刚好或约4.0×106个APC/cm2的密度接种在第一透气表面上。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得APC是外周血单核细胞(PBMC)。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得PBMC经辐照且对于第一T细胞群的供体为外源性的。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得T细胞是肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得T细胞是骨髓浸润淋巴细胞(MIL)。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得T细胞是外周血淋巴细胞(PBL)。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一T细胞群通过自供体的全血分离而获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一T细胞群通过自供体的单采产物分离而获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一T细胞群通过T细胞表型的正向或负向选择而自供体的全血或单采产物分离。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得T细胞表型是CD3+和CD45+。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在进行第一T细胞群的起始第一扩增之前，将T细胞与NK细胞分离。在一些实施方式中，通过自第一T细胞群移除CD3-CD56+细胞，将第一T细胞群中的T细胞与NK细胞分离。在一些实施方式中，通过使用移除CD3-CD56+细胞级分且回收阴性级份的门控策略对第一T细胞群进行细胞分选，自第一T细胞群移除CD3-CD56+细胞。在一些实施方式中，前述方法用于扩增以高百分比NK细胞为特征的第一T细胞群中的T细胞。在一些实施方式中，前述方法用于扩增以高百分比CD3-CD56+细胞为特征的第一T细胞群中的T细胞。在一些实施方式中，前述方法用于扩增以存在大量NK细胞为特征的肿瘤组织中的T细胞。在一些实施方式中，前述方法用于扩增以大量CD3-CD56+细胞为特征的肿瘤组织中的T细胞。在一些实施方式中，前述方法用于扩增自患有以存在大量NK细胞为特征的肿瘤的患者获得的肿瘤组织中的T细胞。在一些实施方式中，前述方法用于扩增自患有以存在大量CD3-CD56+细胞为特征的肿瘤的患者获得的肿瘤组织中的T细胞。在一些实施方式中，前述方法用于扩增自患有卵巢癌的患者获得的肿瘤组织中的T细胞。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得将来自第一T细胞群的刚好或约1×107个T细胞接种于容器中以开始在该容器中的初级第一扩增培养。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得将第一T细胞群分布至多个容器中，在各容器中接种来自第一T细胞群的刚好或约1×107个T细胞以开始在该容器中的初级第一扩增培养。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在步骤(c)中收集的第二T细胞群是治疗性TIL群。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一T细胞群自来自供体的肿瘤组织的一个以上小型活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)、粗针活体组织切片、芯针活体组织切片或细针抽吸物获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一T细胞群自来自供体的肿瘤组织的1至约20个小型活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)、粗针活体组织切片、芯针活体组织切片或细针抽吸物获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一T细胞群自来自供体的肿瘤组织的1至10个小型活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)、粗针活体组织切片、芯针活体组织切片或细针抽吸物获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一T细胞群自来自供体的肿瘤组织的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个小型活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)、粗针活体组织切片、芯针活体组织切片或细针抽吸物获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一T细胞群自来自供体的肿瘤组织的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个小型活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)、粗针活体组织切片、芯针活体组织切片或细针抽吸物获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一T细胞群自来自供体的肿瘤组织的一个以上粗针活体组织切片获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一T细胞群自来自供体的肿瘤组织的1至20个粗针活体组织切片获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一T细胞群自来自供体的肿瘤组织的1至10个粗针活体组织切片获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一T细胞群自来自供体的肿瘤组织的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个粗针活体组织切片获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一T细胞群自来自供体的肿瘤组织的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个粗针活体组织切片获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一T细胞群自来自供体的肿瘤组织的一个以上细针抽吸物获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一T细胞群自来自供体的肿瘤组织的1至20个细针抽吸物获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一T细胞群自来自供体的肿瘤组织的1至10个细针抽吸物获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一T细胞群自来自供体的肿瘤组织的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个细针抽吸物获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一T细胞群自来自供体的肿瘤组织的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个细针抽吸物获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一T细胞群自来自供体的肿瘤组织的一个以上小型活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一T细胞群自来自供体的肿瘤组织的1至20个小型活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一T细胞群自来自供体的肿瘤组织的1至10个小型活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一T细胞群自来自供体的肿瘤组织的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个小型活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一T细胞群自来自供体的肿瘤组织的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个小型活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一T细胞群自来自供体的肿瘤组织的一个以上芯针活体组织切片获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一T细胞群自来自供体的肿瘤组织的1至20个芯针活体组织切片获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一T细胞群自来自供体的肿瘤组织的1至10个芯针活体组织切片获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一T细胞群自来自供体的肿瘤组织的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个芯针活体组织切片获得。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一T细胞群自来自供体的肿瘤组织的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个芯针活体组织切片获得。
在一些实施方式中，本发明提供了一种用于将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群的方法，其包括：i)通过在包含IL-2和第一抗生素组分的第一细胞培养基中培养获自受试者的肿瘤的一个以上小型活体组织切片、粗针活体组织切片或穿刺活体组织切片的肿瘤样本约3天，自肿瘤样本获得和/或接受第一TIL群；(ii)通过在包含IL-2、第一抗生素组分、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的第二细胞培养基中培养第一TIL群来进行起始第一扩增，产生第二TIL群，其中，起始第一扩增在包含第一透气表面区域的容器中进行，其中起始第一扩增进行约7或8天的第一时间段以获得第二TIL群，第二TIL群的数目大于第一TIL群的数目；(ⅲ)通过用另外的IL-2、可选的第二抗生素组分、OKT-3和APC补充第二TIL群的第二细胞培养基来进行快速第二扩增，产生第三TIL群，其中，在快速第二扩增中添加的APC的数目为在步骤(ii)中添加的APC的数目的至少两倍，快速第二扩增进行约11天的第二时间段以获得第三TIL群，第三TIL群是治疗性TIL群，快速第二扩增在包含第二透气表面区域的容器中进行；(iv)收集获自步骤(iii)的治疗性TIL群；以及(v)将自步骤(iv)收集的TIL群转移至输注袋，其中，抗生素的第一抗生素组分和可选的第二抗生素组分独立地包含：1)抗生素组合，其选自本文公开的任何浓度的：i)庆大霉素和万古霉素；以及ii)庆大霉素和克林霉素；或2)抗生素万古霉素。
在一些实施方式中，本发明提供了一种用于将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群的方法，其包括：(i)通过在包含IL-2和第一抗生素组分的第一细胞培养基中培养获自受试者的肿瘤的一个以上小型活体组织切片、粗针活体组织切片或穿刺活体组织切片的肿瘤样本约3天，自该肿瘤样本获得和/或接受第一TIL群；(ii)通过在包含IL-2、第一抗生素组分、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的第二细胞培养基中培养第一TIL群来进行起始第一扩增，产生第二TIL群，其中起始第一扩增进行约7或8天的第一时间段以获得第二TIL群，第二TIL群的数目大于第一TIL群的数目；(ⅲ)通过使第二TIL群与包含IL-2、可选的第二抗生素组分、OKT-3和APC的第三细胞培养基接触来进行快速第二扩增，产生第三TIL群，快速第二扩增进行约11天的第二时间段以获得第三TIL群，第三TIL群是治疗性TIL群；以及(iv)收集获自步骤(iii)的治疗性TIL群，其中，第一抗生素组分和可选的第二抗生素组分独立地包含：1)抗生素组合，其选自本文公开的任何浓度的：i)庆大霉素和万古霉素；以及ii)庆大霉素和克林霉素；或2)抗生素万古霉素。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在第二时间段的第5天后，将培养物分成2份以上继代培养物，向各继代培养物补充另外的数量的第三培养基，培养约6天。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在第二时间段的第5天后，将培养物分成2份以上继代培养物，向各继代培养物补充包含IL-2的第四培养基，培养约6天。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得在第二时间段的第5天后，将培养物分成至多5份继代培养物。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得该方法中的所有步骤在约22天内完成。
在一些实施方式中，本发明提供了一种扩增T细胞的方法，其包括：(i)通过在第一抗生素组分存在下培养来自肿瘤样本的第一T细胞群来进行第一T细胞群的起始第一扩增，以实现生长及起始第一T细胞群的活化，该肿瘤样本由供体肿瘤的一个以上小型活体组织切片、粗针活体组织切片或穿刺活体组织切片获得；(ii)在步骤(a)中起始的第一T细胞群活化开始衰退之后，通过在第二抗生素组分存在下培养第一T细胞群进行第一T细胞群的快速第二扩增以实现第一T细胞群的生长且加强其活化，获得第二T细胞群；以及(iv)收集第二T细胞群。在一些实施方式中，肿瘤样本自多个粗针活体组织切片获得。在一些实施方式中，多个粗针活体组织切片选自如下：2、3、4、5、6、7、8、9和10个粗针活体组织切片，其中，第一抗生素组分和可选的第二抗生素组分独立地包含：1)抗生素组合，其选自本文公开的任何浓度的：i)庆大霉素和万古霉素；以及ii)庆大霉素和克林霉素；或2)抗生素万古霉素。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得T细胞或TIL是获自肿瘤消化物。在一些实施方式中，通过在酶培养基，例如但不限于RPMI 1640、2mM GlutaMAX、10mg/mL庆大霉素、30U/mLDNA酶和1.0mg/mL胶原蛋白酶孵育肿瘤，随后进行机械解离(GentleMACS，加利福尼亚州奥本的Miltenyi Biotec)来产生肿瘤消化物。在一些实施方式中，将肿瘤置于肿瘤解离酶混合物中，该肿瘤解离酶混合物包含一种以上解离(消化)酶，例如但不限于胶原蛋白酶(包括任何混合物或类型的胶原蛋白酶)、AccutaseTM、AccumaxTM、玻尿酸酶、中性蛋白酶(分散酶)、胰凝乳蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、酪蛋白酶、弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶型XIV(链蛋白酶)、DNA酶I(DNA酶)、胰蛋白酶抑制剂、任何其他解离或蛋白分解酶，以及它们的任何组合。在其他实施方式中，将肿瘤置于肿瘤解离酶混合物中，该肿瘤解离酶混合物包含胶原蛋白酶(包括任何混合物或类型的胶原蛋白酶)、中性蛋白酶(分散酶)和DNA酶I(DNA酶)。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第二抗生素组分并非可选的，第一抗生素组分和第二抗生素组分独立地包含：1)抗生素组合，其选自本文公开的任何浓度的：i)庆大霉素和万古霉素；以及ii)庆大霉素和克林霉素；或2)抗生素万古霉素。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一抗生素组分与第二抗生素组分不同。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一抗生素组分与第二抗生素组分相同。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一抗生素组分和/或第二抗生素组分包含浓度为约50μg/mL至约600μg/mL的抗生素万古霉素。在示例性实施方式中，第一抗生素组分和/或第二抗生素组分包含浓度为约100μg/mL的万古霉素。在示例性实施方式中，第一抗生素组分和/或抗生素组分不包含任何另外的抗生素。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一抗生素组分和/或第二抗生素组分包含约400μg/mL至约600μg/mL克林霉素。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一抗生素组分和/或第二抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一抗生素组分和/或第二抗生素组分包含约2.5μg/mL至约10μg/mL双性霉素B。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一抗生素组分和/或第二抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素和约100μg/mL至约600μg/mL万古霉素。在示例性实施方式中，第一抗生素组分和/或第二抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素和约100μg/mL万古霉素。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一抗生素组分和/或第二抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素和约400μg/mL至约600μg/mL克林霉素。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一抗生素组分和/或第二抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素、约100μg/mL至约600μg/mL万古霉素和约2.5μg/mL至约10μg/mL双性霉素B。
在一些实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的方法，该方法经修改以使得第一抗生素组分和/或第二抗生素组分包含约50μg/mL庆大霉素、约400μg/mL至约600μg/mL克林霉素和约2.5μg/mL至约10μg/mL双性霉素B。
在一些实施方式中，在将肿瘤样本解离或破碎成肿瘤碎片之前，将其在包含抗生素组分的洗涤缓冲液中洗涤至少一次。本文所述的任何肿瘤洗涤缓冲液均可用于洗涤肿瘤样本。在一些实施方式中，抗生素组分包含本文公开的任何浓度的：1)万古霉素；2)庆大霉素和万古霉素；或3)庆大霉素和克林霉素。在示例性实施方式中，洗涤缓冲液包含万古霉素。在示例性实施方式中，万古霉素的浓度为50μg/mL-600μg/mL。在示例性实施方式中，万古霉素的浓度是100μg/mL。在示例性实施方式中，将肿瘤样本在洗涤缓冲液中洗涤3次以上。
在一些实施方式中，在冷冻保存或第一扩增之前，将肿瘤碎片在包含抗生素组分的洗涤缓冲液中洗涤至少一次。本文所述的任何肿瘤洗涤缓冲液均可用于洗涤肿瘤碎片。在一些实施方式中，抗生素组分包含本文公开的任何浓度的：1)万古霉素；2)庆大霉素和万古霉素；或3)庆大霉素和克林霉素。在示例性实施方式中，洗涤缓冲液包含万古霉素。在示例性实施方式中，万古霉素的浓度为50μg/mL-600μg/mL。在示例性实施方式中，万古霉素的浓度是100μg/mL。在示例性实施方式中，将肿瘤样本在洗涤缓冲液中洗涤3次以上。
XI.治疗患者的方法
治疗方法始于原始TIL收集和TIL培养。此类方法已在本领域中有描述，例如以全文引用的方式并入本文中的Jin等人,《免疫疗法杂志》,2012,35(3):283-292。以下整个各个部分，包括实施例，描述了治疗方法的实施方式。
根据本文所述的方法，包括例如上文步骤A至步骤F中所描述或根据上文步骤A至步骤F(也如例如图1和或图8中所示)产生的经扩增的TIL特别适用于治疗癌症患者(例如Goff等人,《临床肿瘤学杂志(J.Clinical Oncology)》,2016,34(20):2389-239以及补充内容中所描述，以全文引用的方式并入本文中)。在一些实施方式中，如先前所描述，自经切除的转移性黑色素瘤保藏物生长TIL(参见Dudley等人,《免疫疗法杂志》,2003,26:332-342；以全文引用的方式并入本文中)。可在无菌条件下分割新鲜肿瘤。可收集代表样本以用于正式病理分析。可使用2mm3至3mm3的单个碎片。在一些实施方式中，自每位患者获得5、10、15、20、25或30个样本。在一些实施方式中，自每位患者获得20、25或30个样本。在一些实施方式中，自每位患者获得20、22、24、26或28个样本。在一些实施方式中，自每位患者获得24个样本。可将样本置于24孔板的个别孔中，维持于含高剂量IL-2(6,000IU/mL)的生长培养基中，并监测肿瘤破坏和/或TIL增殖。如本文所述，可将在处理后剩余活细胞的任何肿瘤酶消化成单细胞悬浮液并冷冻保存。
在一些实施方式中，可对成功生长的TIL进行取样以用于表型分析(CD3、CD4、CD8和CD56)，并在可用时针对自体肿瘤进行测试。若过夜共培养产生的干扰素-γ(IFN-γ)含量＞200pg/mL且为背景的两倍，则可认为TIL具反应性。(Goff等人,《免疫疗法杂志》,2010,33:840-847；以全文引用的方式并入本文中)。在一些实施方式中，可选择证明具有自体反应性或充足生长模式的培养物用于第二扩增(例如根据图1和/或图8的步骤D中所提供的第二扩增)，包括有时称为快速扩增(REP)的第二扩增。在一些实施方式中，选择具有高自体反应性(例如在第二扩增期间具有高增殖)的经扩增TIL用于另外的第二扩增。在一些实施方式中，选择具有高自体反应性(例如在如图1和/或图8的步骤D中所提供的第二扩增期间具有高增殖)的TIL用于根据图1和/或图8的步骤D的另外的第二扩增。
可通过针对表面标记物CD3、CD4、CD8、CCR7和CD45RA的流式细胞术(例如FlowJo)(BD BioSciences)以及通过任何本文所述的方法分析输注袋TIL的冷冻保存样本的细胞表型。通过使用标准酶联免疫吸附分析技术测量血清细胞因子。血清IFN-g的升高定义为＞100pg/mL和大于4 3的基线水平。
在一些实施方式中，通过本文提供的方法，例如图1和/或图8中示例的方法产生的TIL实现TIL的临床功效的意外改善。在一些实施方式中，与通过除本文所述的方法以外的方法(包括例如除图1中和/或图8中示例的方法以外的方法)产生的TIL相比，通过本文提供的方法，例如图1和/或图8中示例的方法产生的TIL显示出增加的临床功效。在一些实施方式中，除本文所述的方法外的方法包括称为过程1C和/或第1代(Gen 1)的方法。在一些实施方式中，通过DCR、ORR和/或其他临床反应测量增加的功效。在一些实施方式中，与通过除本文所述的方法以外的方法(包括例如除图1中和/或图8中示例的方法以外的方法)产生的TIL相比，通过本文提供的方法，例如图1中示例的方法产生的TIL显示出类似的反应时间和安全性概况。
在一些实施方式中，IFN-γ指示治疗功效和/或增加的临床功效。在一些实施方式中，用TIL治疗的受试者的血液中的IFN-γ指示活性TIL。在一些实施方式中，采用针对IFN-γ产生的效力分析。IFN-γ产生为细胞毒性潜力的另一种量度。通过确定由本发明方法制备的TIL治疗的受试者的血液、血清或离体TIL中的细胞因子IFN-γ含量，可测量IFN-γ产生，方法包括如例如图1和/或图8中所描述的方法。在一些实施方式中，IFN-γ增加指示对用通过本发明方法产生的TIL治疗的患者的治疗功效。在一些实施方式中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文提供的方法外的方法(包括例如除图1和/或图8中体现的方法外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ增加一倍、两倍、三倍、四倍或五倍或更多倍。在一些实施方式中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文提供的方法外的方法(包括例如除图1和/或图8中体现的方法外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ分泌增加一倍。在一些实施方式中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文提供的方法外的方法(包括例如除图1和/或图8中体现的方法外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ分泌增加两倍。在一些实施方式中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文提供的方法外的方法(包括例如除图1和/或图8中体现的方法外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ分泌增加三倍。在一些实施方式中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文提供的方法外的方法(包括例如除图1和/或图8中体现的方法外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ分泌增加四倍。在一些实施方式中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文提供的方法外的方法(包括例如除图1和/或图8中体现的方法外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ分泌增加五倍。在一些实施方式中，IFN-γ使用Quantikine ELISA试剂盒测量。在一些实施方式中，IFN-γ在用通过本发明方法(包括如例如图1和/或图8中所描述的方法)制备的TIL治疗的受试者的离体TIL中测量。在一些实施方式中，IFN-γ在用通过本发明方法(包括如例如图1和/或图8中所描述的方法)制备的TIL治疗的受试者的血液中测量。在一些实施方式中，IFN-γ在用通过本发明方法(包括如例如图1和/或图8中所描述的方法)制备的TIL治疗的受试者的TIL血清中测量。在一些实施方式中，IFN-γ指示在癌症治疗中的治疗功效和/或增加的临床功效。
在一些实施方式中，通过本发明的方法，包括如例如图1中所描述的方法制备的TIL在一些实施方式中，IFN-γ指示治疗功效和/或增加的临床功效。在一些实施方式中，用TIL治疗的受试者的血液中的IFN-γ指示活性TIL。在一些实施方式中，采用针对IFN-γ产生的效力分析。IFN-γ产生为细胞毒性潜力的另一种量度。通过确定由本发明方法制备的TIL治疗的受试者的血液、血清或离体TIL中的细胞因子IFN-γ含量，可测量IFN-γ产生，方法包括如例如图1和/或图8中所描述的方法。在一些实施方式中，IFN-γ增加指示对用通过本发明方法产生的TIL治疗的患者的治疗功效。在一些实施方式中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文提供了方法外的方法(包括例如图1和/或图8中体现的方法外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ增加一倍、两倍、三倍、四倍或五倍或更多倍。
在一些实施方式中，相较于通过其他方法(包括未在图1和/或图8中示例的方法，包含例如称为过程1C方法的方法)产生的TIL，通过本发明的方法(包括如例如图1和/或图8中所描述的方法)制备的TIL显示出增加的多克隆性。在一些实施方式中，显著改善的多克隆性和/或增加的多克隆性指示治疗功效和/或增加的临床功效。在一些实施方式中，多克隆性指T细胞贮库多样性。在一些实施方式中，多克隆性增加可指示关于施用通过本发明方法产生的TIL的治疗功效。在一些实施方式中，相较于使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1和/或图8中体现的方法以外的方法)制备的TIL，多克隆性增加一倍、两倍、十倍、100倍、500倍或1000倍。在一些实施方式中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1和/或图8中体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加一倍。在一些实施方式中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1和/或图8中体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加两倍。在一些实施方式中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1和/或图8中体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加十倍。在一些实施方式中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1和/或图8中体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加100倍。在一些实施方式中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1和/或图8中体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加500倍。在一些实施方式中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1和/或图8中体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加1000倍。
如本领域已知以及本文所述，功效的量度可包括疾病控制率(DCR)以及总反应率(ORR)。
A.治疗癌症的方法
本文所述的组合物和方法可用于治疗疾病的方法中。在一些实施方式中，其用于治疗成年患者或小儿患者的过度增生性病症，例如癌症。其也可用于治疗如本文和以下段落中所描述的其他病症。
在一些实施方式中，过度增生性病症为癌症。在一些实施方式中，过度增生性病症为实体肿瘤癌症。在一些实施方式中，实体肿瘤癌症选自如下：肛门癌、膀胱癌、乳腺癌(包括三阴性乳腺癌)、骨癌、由人乳头状瘤病毒(HPV)引起的癌症、中枢神经系统相关癌症(包括室管膜瘤、成神经管细胞瘤、神经母细胞瘤、松果体母细胞瘤和原始神经外胚层肿瘤)、宫颈癌(包括鳞状细胞宫颈癌、腺鳞状宫颈癌和子宫颈腺癌)、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、食管胃交界处癌症、胃癌、胃肠癌、胃肠基质瘤、神经胶母细胞瘤、神经胶质瘤、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、喉咽癌、喉癌、鼻咽癌、口咽癌和咽癌)、肾癌、肝癌、肺癌(包括非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌)、黑色素瘤(包括葡萄膜黑色素瘤、脉络膜黑色素瘤、睫状体黑色素瘤或虹膜黑色素瘤)、间皮瘤(包括恶性胸膜间皮瘤)、卵巢癌、胰腺癌(包括胰管腺癌)、阴茎癌、直肠癌、肾癌、肾细胞癌、肉瘤(包括尤文氏肉瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤以及其他骨和软组织肉瘤)、甲状腺癌(包括退行性甲状腺癌)、子宫癌和阴道癌。
在一些实施方式中，过度增生性病症是血液系统恶性肿瘤。在一些实施方式中，血液系统恶性肿瘤选自如下：慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴母细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤。在一些实施方式中，本发明包括治疗患有癌症的患者的方法，其中该癌症是血液系统恶性肿瘤。在一些实施方式中，本发明包括使用经修饰以表达一种以上CCR的TIL、MIL或PBL治疗患有癌症的患者的方法，其中该癌症是血液系统恶性肿瘤。在一些实施方式中，本发明包括使用经修饰以表达一种以上CCR的MIL或PBL治疗患有癌症的患者的方法，其中该癌症是血液系统恶性肿瘤。
在一些实施方式中，癌症是对用至少一种先前疗法(包括化学疗法、放射疗法或免疫疗法)治疗为复发性或难治性的前述癌症之一，包括实体肿瘤癌症和血液系统恶性肿瘤。在一些实施方式中，癌症是对用至少两种先前疗法(包括化学疗法、放射疗法和/或免疫疗法)治疗为复发性或难治性之前述癌症之一。在一些实施方式中，癌症是对用至少三种先前疗法(包括化学疗法、放射疗法和/或免疫疗法)治疗为复发性或难治性之前述癌症之一。
在一些实施方式中，癌症为高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷型(dMMR)癌症。MSI-H和dMMR癌症以及其检测已描述于Kawakami等人，《当前肿瘤学的治疗选择(Curr.Treat.Options Oncol.)》2015,16,30，其公开内容皆以引用的方式并入本文中。
在一些实施方式中，本发明包括使用经修饰以表达一种以上CCR的TIL、MIL或PBL治疗患有癌症的患者的方法，其中该患者是人。在一些实施方式中，本发明包括使用经修饰以表达一种以上CCR的TIL、MIL或PBL治疗患有癌症的患者的方法，其中该患者是非人。在一些实施方式中，本发明包括使用经修饰以表达一种以上CCR的TIL、MIL或PBL治疗患有癌症的患者的方法，其中该患者是伴侣动物。
在一些实施方式中，本发明包括治疗患有癌症的患者的方法，其中该癌症难以用BRAF抑制剂和/或MEK抑制剂治疗。在一些实施方式中，本发明包括治疗患有癌症的患者的方法，其中该癌症难以用选自如下的BRAF抑制剂治疗：维罗非尼(vemurafenib)、达拉非尼(dabrafenib)、恩拉非尼(encorafenib)、索拉非尼(sorafenib)及其药学上可接受的盐或溶剂合物。在一些实施方式中，本发明包括治疗患有癌症的患者的方法，其中该癌症难以用选自如下的MEK抑制剂治疗：曲美替尼(trametinib)、考比替尼(cobimetinib)、贝美替尼(binimetinib)、司美替尼(selumetinib)、匹马色替尼(pimasertinib)、瑞法替尼(refametinib)及其药学上可接受的盐或溶剂合物。在一些实施方式中，本发明包括治疗患有癌症的患者的方法，其中该癌症难以用选自如下的BRAF抑制剂治疗：维罗非尼、达拉非尼、恩拉非尼、索拉非尼及其药学上可接受的盐或溶剂合物；且难以用选自如下的MEK抑制剂治疗：曲美替尼、考比替尼、贝美替尼、司美替尼、匹马色替尼、瑞法替尼及其药学上可接受的盐或溶剂合物。
在一些实施方式中，本发明包括治疗患有癌症的患者的方法，其中该癌症是小儿癌症。
在一些实施方式中，本发明包括治疗患有癌症的患者的方法，其中该癌症是葡萄膜黑色素瘤。
在一些实施方式中，本发明包括治疗患有癌症的患者的方法，其中该葡萄膜黑色素瘤是脉络膜黑色素瘤、睫状体黑色素瘤或虹膜黑色素瘤。
在一些实施方式中，本发明包括治疗患有癌症的患者的方法，其中该小儿癌症是神经母细胞瘤。
在一些实施方式中，本发明包括治疗患有癌症的患者的方法，其中该小儿癌症是肉瘤。
在一些实施方式中，本发明包括治疗患有癌症的患者的方法，其中该肉瘤是骨肉瘤。
在一些实施方式中，本发明包括治疗患有癌症的患者的方法，其中该肉瘤是软组织肉瘤。
在一些实施方式中，本发明包括治疗患有癌症的患者的方法，其中该软组织肉瘤是横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤或原始神经外胚层肿瘤(PNET)。
在一些实施方式中，本发明包括治疗患有癌症的患者的方法，其中该小儿癌症是中枢神经系统(CNS)相关癌症。在一些实施方式中，小儿癌症难以用化学疗法治疗。在一些实施方式中，小儿癌症难以用放射疗法治疗。在一些实施方式中，小儿癌症难以用迪奴图单抗(dinutuximab)治疗。
在一些实施方式中，本发明包括治疗患有癌症的患者的方法，其中CNS相关癌症是成神经管细胞瘤、松果体母细胞瘤、神经胶质瘤、室管膜瘤或神经胶母细胞瘤。
本文所述的组合物和方法可用于治疗癌症的方法，其中，癌症难以用抗PD-1或抗PD-L1抗体治疗或对该先前治疗具有抗性。在一些实施方式中，患者是抗PD-1或抗PD-L1抗体难治性的原发性患者。在一些实施方式中，患者未显示出对抗PD-1或抗PD-L1抗体的先前反应。在一些实施方式中，患者显示出对抗PD-1或抗PD-L1抗体的先前反应，随后患者的癌症进展。在一些实施方式中，癌症难以用抗CTLA-4抗体和/或抗PD-1或抗PD-L1抗体与至少一种化学治疗剂的组合治疗。在一些实施方式中，先前化学治疗剂为卡铂、太平洋紫杉醇、培美曲塞(pemetrexed)和/或顺铂。在一些先前实施方式中，化学治疗剂是铂双重化学治疗剂。在一些实施方式中，铂双重疗法包括选自由顺铂和卡铂组成的群组的第一化学治疗剂，以及选自由长春瑞滨、吉西他滨和紫杉烷(包含例如太平洋紫杉醇、多西他赛或白蛋白结合型太平洋紫杉醇)组成的群组的第二化学治疗剂。在一些实施方式中，将铂双重化学治疗剂与培美曲塞组合。
在一些实施方式中，NSCLC为PD-L1阴性和/或来自患有表达PD-L1且肿瘤比例评分(TPS)<1％的癌症的患者，如本文别处所描述。
在一些实施方式中，NSCLC难以用包含抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体和铂双重疗法的组合疗法治疗，其中，铂双重疗法包含：
i)第一化学治疗剂，其选自顺铂和卡铂，以及
ii)第二化学治疗剂，其选自如下：长春瑞滨、吉西他滨和紫杉烷(包括例如太平洋紫杉醇、多西他赛或白蛋白结合型太平洋紫杉醇)。
在一些实施方式中，NSCLC难以用包括抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体、培美曲塞和铂双重疗法的组合疗法治疗，其中，铂双重疗法包括：
i)第一化学治疗剂，其选自顺铂和卡铂，以及
ii)第二化学治疗剂，其选自如下：长春瑞滨、吉西他滨和紫杉烷(包括例如太平洋紫杉醇、多西他赛或白蛋白结合型太平洋紫杉醇)。
在一些实施方式中，NSCLC已用抗PD-1抗体治疗。在一些实施方式中，NSCLC已用抗PD-L1抗体治疗。在一些实施方式中，NSCLC患者未曾接受治疗。在一些实施方式中，NSCLC未用抗PD-1抗体治疗。在一些实施方式中，NSCLC未用抗PD-L1抗体治疗。在一些实施方式中，NSCLC先前曾用化学治疗剂治疗。在一些实施方式中，NSCLC先前曾用化学治疗剂治疗，但不再用该化学治疗剂治疗。在一些实施方式中，NSCLC患者未接受抗PD-1/PD-L1治疗。在一些实施方式中，NSCLC患者具有低PD-L1表达。在一些实施方式中，NSCLC患者未经NSCLC治疗或在化学治疗剂治疗后，但未经抗PD-1/PD-L1治疗。在一些实施方式中，NSCLC患者未经治疗或接受化学治疗剂治疗后但未经抗PD-1/PD-L1治疗，具有低PD-L1表达。在一些实施方式中，NSCLC患者在基线时患有大病灶疾病。在一些实施方式中，受试者在基线时患有大病灶疾病，具有低PD-L1表达。在一些实施方式中，NSCLC患者无可检测的PD-L1表达。在一些实施方式中，NSCLC患者未经治疗或接受化学治疗剂治疗后但未经抗PD-1/PD-L1治疗，无可检测的PD-L1表达。在一些实施方式中，患者在基线时患有大病灶疾病且无可检测的PD-L1表达。在一些实施方式中，NSCLC患者患有未经治疗的NSCLC或接受化学疗法后(例如化学治疗剂后)但未经抗PD-1/PD-L1治疗，该患者具有低PD-L1表达和/或在基线时具有大病灶疾病。在一些实施方式中，当在横向或冠状面中测量的最大肿瘤直径大于7cm时指示为大病灶疾病。在一些实施方式中，当存在短轴直径为20mm以上的肿胀淋巴结时指示为大病灶疾病。在一些实施方式中，化学治疗剂包括NSCLC的标准护理治疗剂。
在一些实施方式中，PD-L1表达通过肿瘤比例评分确定。在一些实施方式中，患有难治性NSCLC肿瘤的受试者具有<1％的肿瘤比例评分(TPS)。在一些实施方式中，患有难治性NSCLC肿瘤的受试者具有≥1％的TPS。在一些实施方式中，患有难治性NSCLC的受试者先前曾用抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体治疗且肿瘤比例评分在该抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体治疗之前确定。在一些实施方式中，患有难治性NSCLC的受试者先前曾用抗PD-L1抗体治疗且肿瘤比例评分在该抗PD-L1抗体治疗之前确定。
在一些实施方式中，相较于通过其他方法(包括未在图1或图8中示例的方法，例如称为过程1C方法的方法)产生的TIL，通过本发明的方法(包括如例如图1或图8中所描述的方法)制备的TIL显示出增加的多克隆性。在一些实施方式中，显著改善的多克隆性和/或增加的多克隆性指示对癌症治疗的治疗功效和/或增加的临床功效。在一些实施方式中，多克隆性指T细胞贮库多样性。在一些实施方式中，多克隆性增加可指示关于施用通过本发明方法产生的TIL的治疗功效。在一些实施方式中，相较于使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1或图8中体现的方法外的方法)制备的TIL，多克隆性增加一倍、两倍、十倍、100倍、500倍或1000倍。在一些实施方式中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1或图8中体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加一倍。在一些实施方式中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1或图8中体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加两倍。在一些实施方式中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1或图8中体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加十倍。在一些实施方式中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1或图8中体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加100倍。在一些实施方式中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1或图8中体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加500倍。在一些实施方式中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1或图8中体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加1000倍。
在一些实施方式中，PD-L1表达是使用如本文所述之一种以上测试方法，通过肿瘤比例评分确定。在一些实施方式中，患有NSCLC肿瘤的受试者或患者具有<1％的肿瘤比例评分(TPS)。在一些实施方式中，NSCLC肿瘤具有≥1％的TPS。在一些实施方式中，患有NSCLC的受试者或患者先前曾用抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体治疗且肿瘤比例评分在该抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体治疗之前确定。在一些实施方式中，患有NSCLC的受试者或患者先前曾用抗PD-L1抗体治疗且肿瘤比例评分在该抗PD-L1抗体治疗之前确定。在一些实施方式中，患有难治性或耐药性NSCLC肿瘤的受试者或患者具有<1％的肿瘤比例评分(TPS)。在一些实施方式中，患有难治性或耐药性NSCLC肿瘤的受试者或患者具有≥1％的TPS。在一些实施方式中，患有难治性或耐药性NSCLC的受试者或患者先前曾用抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体治疗且肿瘤比例评分在该抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体治疗之前确定。在一些实施方式中，患有难治性或耐药性NSCLC的受试者或患者先前曾用抗PD-L1抗体治疗且肿瘤比例评分在该抗PD-L1抗体治疗之前确定。
在一些实施方式中，NSCLC是显示出肿瘤比例评分(TPS)，或在抗PD-1或抗PD-L1疗法之前自患者获取的活肿瘤细胞百分比的NSCLC，在任何强度下显示部分或完全膜染色的PD-L1蛋白的百分比低于1％(TPS<1％)。在一些实施方式中，NSCLC是显示出选自如下的TPS的NSCLC：<50％、<45％、<40％、<35％、<30％、<25％、<20％、<15％、<10％、<9％、<8％、<7％、<6％、<5％、<4％、<3％、<2％、<1％、<0.9％、<0.8％、<0.7％、<0.6％、<0.5％、<0.4％、<0.3％、<0.2％、<0.1％、<0.09％、<0.08％、<0.07％、<0.06％、<0.05％、<0.04％、<0.03％、<0.02％和<0.01％。在一些实施方式中，NSCLC是显示出选自如下的TPS的NSCLC：约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％、约0.9％、约0.8％、约0.7％、约0.6％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％、约0.1％、约0.09％、约0.08％、约0.07％、约0.06％、约0.05％、约0.04％、约0.03％、约0.02％和约0.01％。在一些实施方式中，NSCLC是显示出在0％与1％之间的TPS的NSCLC。在一些实施方式中，NSCLC是显示出在0％与0.9％之间的TPS的NSCLC。在一些实施方式中，NSCLC是显示出在0％与0.8％之间的TPS的NSCLC。在一些实施方式中，NSCLC是显示出在0％与0.7％之间的TPS的NSCLC。在一些实施方式中，NSCLC是显示出在0％与0.6％之间的TPS的NSCLC。在一些实施方式中，NSCLC是显示出在0％与0.5％之间的TPS的NSCLC。在一些实施方式中，NSCLC是显示出在0％与0.4％之间的TPS的NSCLC。在一些实施方式中，NSCLC是显示出在0％与0.3％之间的TPS的NSCLC。在一些实施方式中，NSCLC是显示出在0％与0.2％之间的TPS的NSCLC。在一些实施方式中，NSCLC是显示出在0％与0.1％之间的TPS的NSCLC。TPS可通过本领域中已知的方法测量，例如描述于Hirsch等人,《胸肿瘤学杂志(J.Thorac.Oncol.)》2017,12,208-222中的方法或用于在使用帕博利珠单抗或其他抗PD-1或抗PD-L1疗法治疗前确定TPS的方法。也可使用经美国食品与药物管理局批准的用于测量TPS的方法。在一些实施方式中，PD-L1是外泌体PD-L1。在一些实施方式中，PD-L1见于循环肿瘤细胞上。
在一些实施方式中，部分膜染色包括1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或更高百分比。在一些实施方式中，完全膜染色包含约100％膜染色。
在一些实施方式中，针对PD-L1的测试可涉及测量患者血清中PD-L1的含量。在这些实施方式中，患者血清中PD-L1的测量消除肿瘤异质性的不确定性和患者进行连续活体组织切片的不适。
在一些实施方式中，相较于基线或标准水平升高的可溶性PD-L1与NSCLC的恶化的预后相关。参见例如Okuma等人,《临床肺癌(Clinical Lung Cancer)》,2018,19,410-417；Vecchiarelli等人,《肿瘤标靶(Oncotarget)》,2018,9,17554-17563。在一些实施方式中，PD-L1是外泌体PD-L1。在一些实施方式中，PD-L1在循环肿瘤细胞上表达。
在一些实施方式中，本发明提供了一种通过向有需要的受试者或患者施用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群来治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的方法，其中该受试者或患者具有以下中的至少一者：
i.PD-L1的预定肿瘤比例评分(TPS)<1％，
ii.PD-L1的TPS评分为1％-49％，或
iii.一个以上驱动突变的预定缺失，
其中驱动突变选自如下：EGFR突变、EGFR插入、EGFR外显子20突变、KRAS突变、BRAF突变、ALK突变、c-ROS突变(ROS1突变)、ROS1融合、RET突变、RET融合、ERBB2突变、ERBB2扩增、BRCA突变、MAP2K1突变、PIK3CA、CDKN2A、PTEN突变、UMD突变、NRAS突变、KRAS突变、NF1突变、MET突变、MET剪接和/或改变的MET信号传导、TP53突变、CREBBP突变、KMT2C突变、KMT2D突变、ARID1A突变、RB1突变、ATM突变、SETD2突变、FLT3突变、PTPN11突变、FGFR1突变、EP300突变、MYC突变、EZH2突变、JAK2突变、FBXW7突变、CCND3突变和GNA11突变，其中方法包括：
(a)通过将自受试者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片而从自该受试者或患者切除的肿瘤获得和/或接受第一TIL群；
(b)将第一TIL群添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群来进行第一扩增，产生第二TIL群，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3-14天以获得第二TIL群，自步骤(b)至步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；
(d)通过用另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群，其中，第二扩增进行约7-14天以获得第三TIL群，第三TIL群是治疗性TIL群，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；
(e)收集自步骤(d)获得的治疗性TIL群，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；以及
(f)将自步骤(e)收集的TIL群转移至输注袋，其中，自步骤(e)至步骤(f)的转移在不打开系统的情况下发生；
(g)通过冷冻保存过程冷冻保存来自步骤(f)的包含经收集的TIL群的输注袋；
(h)向受试者或患者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)中的输注袋的第三TIL群。
在一些实施方式中，本发明提供了一种通过向有需要的患者施用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群来治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的方法，其中方法包括：
(a)测试患者的肿瘤中的PD-L1表达和PD-L1的肿瘤比例评分(TPS)，
(b)测试患者一个以上驱动突变的缺失，其中，驱动突变选自如下：EGFR突变、EGFR插入、EGFR外显子20突变、KRAS突变、BRAF突变、ALK突变、c-ROS突变(ROS1突变)、ROS1融合、RET突变、RET融合、ERBB2突变、ERBB2扩增、BRCA突变、MAP2K1突变、PIK3CA、CDKN2A、PTEN突变、UMD突变、NRAS突变、KRAS突变、NF1突变、MET突变、MET剪接和/或改变的MET信号传导、TP53突变、CREBBP突变、KMT2C突变、KMT2D突变、ARID1A突变、RB1突变、ATM突变、SETD2突变、FLT3突变、PTPN11突变、FGFR1突变、EP300突变、MYC突变、EZH2突变、JAK2突变、FBXW7突变、CCND3突变和GNA11突变，
(c)确定患者的PD-L1的TPS评分为约1％至约49％，确定患者也无驱动突变，
(d)通过将自受试者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片而从自该受试者或患者切除的肿瘤获得和/或接受第一TIL群；
(e)将第一TIL群添加至密闭系统中；
(f)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群来进行第一扩增，产生第二TIL群，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3-14天以获得该第二TIL群，自步骤(e)至步骤(f)的转变在不打开系统的情况下发生；
(g)通过用另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充该第二TIL群的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群，其中，第二扩增进行约7-14天以获得第三TIL群，第三TIL群是治疗性TIL群，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(f)至步骤(g)的转变在不打开系统的情况下发生；
(h)收集自步骤(d)获得的治疗性TIL群，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；和
(i)将自步骤(e)收集的TIL群转移至输注袋，其中，自步骤(e)至步骤(f)的转移在不打开系统的情况下发生；
(j)通过冷冻保存过程冷冻保存来自步骤(f)的包含经收集的TIL群的输注袋；以及
(k)向受试者或患者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)中的输注袋的第三TIL群。
在一些实施方式中，本发明提供了一种通过向有需要的患者施用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群来治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的方法，其中，方法包括：
(a)测试患者肿瘤中的PD-L1表达和PD-L1的肿瘤比例评分(TPS)，
(b)测试患者体内一个以上驱动突变的缺失，其中，该驱动突变选自如下：EGFR突变、EGFR插入、EGFR外显子20突变、KRAS突变、BRAF突变、ALK突变、c-ROS突变(ROS1突变)、ROS1融合、RET突变、RET融合、ERBB2突变、ERBB2扩增、BRCA突变、MAP2K1突变、PIK3CA、CDKN2A、PTEN突变、UMD突变、NRAS突变、KRAS突变、NF1突变、MET突变、MET剪接和/或改变的MET信号传导、TP53突变、CREBBP突变、KMT2C突变、KMT2D突变、ARID1A突变、RB1突变、ATM突变、SETD2突变、FLT3突变、PTPN11突变、FGFR1突变、EP300突变、MYC突变、EZH2突变、JAK2突变、FBXW7突变、CCND3突变和GNA11突变，
(c)确定患者的PD-L1的TPS评分小于约1％，确定患者也无驱动突变，
(d)通过将自受试者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片而从自该受试者或患者切除的肿瘤获得和/或接受第一TIL群；
(e)将第一TIL群添加至密闭系统中；
(f)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群来进行第一扩增，产生第二TIL群，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3-14天以获得该第二TIL群，自步骤(e)至步骤(f)的转变在不打开系统的情况下发生；
(g)通过用另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群，第二扩增进行约7-14天以获得第三TIL群，第三TIL群是治疗性TIL群，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(f)至步骤(g)的转变在不打开系统的情况下发生；
(h)收集自步骤(d)获得的治疗性TIL群，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；和
(i)将自步骤(e)收集的TIL群转移至输注袋，其中，自步骤(e)至步骤(f)的转移在不打开系统的情况下发生；
(j)通过冷冻保存过程冷冻保存来自步骤(f)的包含经收集的TIL群的输注袋；
(k)向该受试者或患者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)中的输注袋的第三TIL群。
在一些实施方式中，本发明提供了一种通过向有需要的患者施用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群来治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的方法，其中，方法包括：
(a)测试患者肿瘤中的PD-L1表达和PD-L1的肿瘤比例评分(TPS)，
(b)测试患者体内一个以上驱动突变的缺失，其中该驱动突变选自如下：EGFR突变、EGFR插入、KRAS突变、BRAF突变、ALK突变、c-ROS突变(ROS1突变)、ROS1融合、RET突变或RET融合，
(c)确定患者的PD-L1的TPS评分为约1％至约49％，确定患者也无驱动突变，
(d)通过将自受试者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片而从自该受试者或患者切除的肿瘤获得和/或接受第一TIL群；
(e)将第一TIL群添加至密闭系统中；
(f)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群来进行第一扩增，产生第二TIL群，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3-14天以获得该第二TIL群，自步骤(e)至步骤(f)的转变在不打开系统的情况下发生；
(g)通过用另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充该第二TIL群的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群，其中，第二扩增进行约7-14天以获得第三TIL群，第三TIL群是治疗性TIL群，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(f)至步骤(g)的转变在不打开系统的情况下发生；
(h)收集自步骤(d)获得的治疗性TIL群，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；和
(i)将自步骤(e)收集的TIL群转移至输注袋，其中，自步骤(e)至步骤(f)的转移在不打开系统的情况下发生；
(j)通过冷冻保存过程冷冻保存来自步骤(f)的包含经收集的TIL群的输注袋；
(k)向受试者或患者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)中的输注袋的第三TIL群。
在一些实施方式中，本发明提供了一种通过向有需要的患者施用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群来治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的方法，其中，方法包括：
(a)测试患者肿瘤中的PD-L1表达和PD-L1的肿瘤比例评分(TPS)，
(b)测试患者体内一个以上驱动突变的缺失，其中，该驱动突变选自如下：EGFR突变、EGFR插入、KRAS突变、BRAF突变、ALK突变、c-ROS突变(ROS1突变)、ROS1融合、RET突变或RET融合，
(c)确定患者的PD-L1的TPS评分小于约1％，确定患者也无驱动突变，
(d)通过将自受试者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片而从自该受试者或患者切除的肿瘤获得和/或接受第一TIL群；
(e)将第一TIL群添加至密闭系统中；
(f)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群来进行第一扩增，产生第二TIL群，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3-14天以获得该第二TIL群，自步骤(e)至步骤(f)的转变在不打开系统的情况下发生；
(g)通过用另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充该第二TIL群的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群，其中，第二扩增进行约7-14天以获得该第三TIL群，第三TIL群是治疗性TIL群，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(f)至步骤(g)的转变在不打开系统的情况下发生；
(h)收集自步骤(d)获得的治疗性TIL群，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；和
(i)将自步骤(e)收集的TIL群转移至输注袋，其中，自步骤(e)至步骤(f)的转移在不打开系统的情况下发生；
(j)通过冷冻保存过程冷冻保存来自步骤(f)的包含经收集的TIL群的输注袋；以及
(k)向该受试者或患者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)中的输注袋的第三TIL群。
在其他实施方式中，本发明提供了一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，其包括向该受试者施用治疗有效剂量的本文所述的治疗性TIL群。
在其他实施方式中，本发明提供了一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，其包括向受试者施用治疗有效剂量的本文所述的TIL组合物。
在其他实施方式中，本发明提供了本文所述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，该方法经修改以使得在分别施用治疗有效剂量的本文所述的治疗性TIL群和TIL组合物之前，已向受试者施用非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案。
在其他实施方式中，本发明提供了本文所述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，该方法经修改以使得非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天，随后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨五天。
在其他实施方式中，本发明提供了本文所述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，该方法经修改以进一步包括在向受试者施用TIL细胞后次日开始用高剂量IL-2方案治疗受试者的步骤。
在其他实施方式中，本发明提供了本文所述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，该方法经修改以使得高剂量IL-2方案包括每八小时以15分钟推注静脉内输注形式施用600,000或720,000IU/kg直至耐受。
在其他实施方式中，本发明提供了本文所述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，该方法经修改以使得癌症为实体肿瘤。
在其他实施方式中，本发明提供了本文所述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，该方法经修改以使得癌症为黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、由人乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、神经胶母细胞瘤(包括GBM)、胃肠癌、肾癌或肾细胞癌。
在其他实施方式中，本发明提供了本文所述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，该方法经修改以使得癌症为黑色素瘤、HNSCC、宫颈癌、NSCLC、神经胶母细胞瘤(包括GBM)和胃肠癌。
在其他实施方式中，本发明提供了本文所述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，该方法经修改以使得癌症为黑色素瘤。
在其他实施方式中，本发明提供了本文所述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，该方法经修改以使得癌症为HNSCC。
在其他实施方式中，本发明提供了本文所述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，该方法经修改以使得癌症为宫颈癌。
在其他实施方式中，本发明提供了本文所述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，该方法经修改以使得癌症为NSCLC。
在其他实施方式中，本发明提供了本文所述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，该方法经修改以使得癌症为神经胶母细胞瘤(包括GBM)。
在其他实施方式中，本发明提供了本文所述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，该方法经修改以使得癌症为胃肠癌。
在其他实施方式中，本发明提供了本文所述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，该方法经修改以使得癌症为高突变癌症。
在其他实施方式中，本发明提供了本文所述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，该方法经修改以使得癌症为小儿高突变癌症。
在其他实施方式中，本发明提供了一种用于治疗患有癌症的受试者的方法中的本文所述的治疗性TIL群，该方法包括向受试者施用治疗有效剂量的治疗性TIL群。
在其他实施方式中，本发明提供了一种用于治疗患有癌症的受试者的方法中的本文所述的TIL组合物，该方法包括向该受试者施用治疗有效剂量的TIL组合物。
在其他实施方式中，本发明提供了本文所述的治疗性TIL群或本文所述的TIL组合物，该治疗性TIL群或TIL组合物经修改以使得在向该受试者施用治疗有效剂量的本文所述的治疗性TIL群或本文所述的TIL组合物之前，已向受试者施用非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案。
在其他实施方式中，本发明提供了本文所述的治疗性TIL群或TIL组合物，该治疗性TIL群或TIL组合物经修改以使得非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天，随后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨五天。
在其他实施方式中，本发明提供了本文所述的治疗性TIL群或TIL组合物，该治疗性TIL群或TIL组合物经修改以进一步包括在向患者施用TIL细胞后次日开始用高剂量IL-2方案治疗患者的步骤。
在其他实施方式中，本发明提供了本文所述的治疗性TIL群或TIL组合物，该治疗性TIL群或TIL组合物经修改以使得高剂量IL-2方案包括每八小时以15分钟推注静脉内输注形式施用600,000或720,000IU/kg，直至耐受。
在其他实施方式中，本发明提供了本文所述的治疗性TIL群或TIL组合物，该治疗性TIL群或TIL组合物经修改以使得癌症为实体肿瘤。
在其他实施方式中，本发明提供了本文所述的治疗性TIL群或TIL组合物，该治疗性TIL群或TIL组合物经修改以使得癌症为黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、由人乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、神经胶母细胞瘤(包括GBM)、胃肠癌、肾癌或肾细胞癌。
在其他实施方式中，本发明提供了本文所述的治疗性TIL群或TIL组合物，该治疗性TIL群或TIL组合物经修改以使得癌症为黑色素瘤、HNSCC、宫颈癌、NSCLC、神经胶母细胞瘤(包括GBM)和胃肠癌。
在其他实施方式中，本发明提供了本文所述的治疗性TIL群或TIL组合物，该治疗性TIL群或TIL组合物经修改以使得癌症为黑色素瘤。
在其他实施方式中，本发明提供了本文所述的治疗性TIL群或TIL组合物，该治疗性TIL群或TIL组合物经修改以使得癌症为HNSCC。
在其他实施方式中，本发明提供了本文所述的治疗性TIL群或TIL组合物，该治疗性TIL群或TIL组合物经修改以使得癌症为宫颈癌。
在其他实施方式中，本发明提供了本文所述的治疗性TIL群或TIL组合物，该治疗性TIL群或TIL组合物经修改以使得癌症为NSCLC。
在其他实施方式中，本发明提供了本文所述的治疗性TIL群或TIL组合物，该治疗性TIL群或TIL组合物经修改以使得癌症为神经胶母细胞瘤。
在其他实施方式中，本发明提供了本文所述的治疗性TIL群或TIL组合物，该治疗性TIL群或TIL组合物经修改以使得癌症为胃肠癌。
在其他实施方式中，本发明提供了本文所述的治疗性TIL群或TIL组合物，该治疗性TIL群或TIL组合物经修改以使得癌症为高突变癌症。
在其他实施方式中，本发明提供了本文所述的治疗性TIL群或TIL组合物，该治疗性TIL群或TIL组合物经修改以使得癌症为小儿高突变癌症。
在其他实施方式中，本发明提供了本文所述的治疗性TIL群在治疗受试者的癌症的方法中的用途，方法包括向该受试者施用治疗有效剂量的治疗性TIL群。
在其他实施方式中，本发明提供了任何前述段落中描述的TIL组合物在治疗受试者的癌症的方法中的用途，方法包括向该受试者施用治疗有效剂量的TIL组合物。
在其他实施方式中，本发明提供了本文所述的治疗性TIL群或本文所述的TIL组合物在治疗患者的癌症的方法中的用途，其包括向患者施用非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案，接着向该受试者施用治疗有效剂量的任何前述段落中描述的治疗性TIL群或治疗有效剂量的本文所述的TIL组合物。
1.与PD-1和PD-L1抑制剂的组合
在一些实施方式中，向癌症患者提供的TIL疗法可包括单独用治疗性TIL群治疗，或可包括组合治疗，该组合治疗包括TIL和一种以上PD-1和/或PD-L1抑制剂。
过程性死亡蛋白1(PD-1)是由T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)T细胞、活化单核细胞和树突状细胞表达的288个氨基酸的跨膜免疫检查点受体蛋白。PD-1，又称为CD279，属于CD28家族，在人中由2号染色体上的Pdcd1基因编码。PD-1由一个免疫球蛋白(Ig)超家族结构域、跨膜区和细胞内结构域组成，该细胞内结构域含有免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)和免疫受体酪氨酸转换基序(ITSM)。已知PD-1及其配体(PD-L1和PD-L2)在免疫耐受性中起到重要作用，如Keir等人,《免疫学年度评论(Annu.Rev.Immunol.)》2008,26,677-704中所描述。PD-1提供负向调节T细胞免疫反应的抑制信号。PD-L1(又称为B7-H1或CD274)和PD-L2(又称为B7-DC或CD273)在肿瘤细胞和基质细胞上表达，其可能遇到表达PD-1的活化T细胞，导致对T细胞的免疫抑制。PD-L1是由人9号染色体上的Cd274基因编码的290个氨基酸的跨膜蛋白。使用PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂和/或PD-L2抑制剂阻断PD-1与其配体PD-L1和PD-L2之间的相互作用，可克服免疫抗性，如近期临床研究，例如Topalian等人,《新英格兰医学杂志(N.Eng.J.Med.)》2012,366,2443-54中所描述的研究所展示。PD-L1表达于许多肿瘤细胞系上，而PD-L2主要表达于树突状细胞和一些肿瘤系上。除T细胞(其在活化后诱导性表达PD-1)以外，PD-1也表达于B细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、活化单核细胞和树突状细胞上。
在一些实施方式中，TIL和PD-1抑制剂作为组合疗法或协同疗法施用以用于治疗NSCLC。
在一些实施方式中，NSCLC未经历先前疗法。在一些实施方式中，PD-1抑制剂作为一线疗法或初始疗法施用。在一些实施方式中，PD-1抑制剂作为一线疗法或初始疗法与如本文所述的TIL组合施用。
在一些实施方式中，PD-1抑制剂可以是本领域已知的任何PD-1抑制剂或PD-1阻断剂。特定地，其为在以下段落中更详细描述的PD-1抑制剂或阻断剂之一。关于PD-1抑制剂，术语“抑制剂”、“拮抗剂”和“阻断剂”在本文中可互换使用。为了避免疑问，本文中提及的作为抗体的PD-1抑制剂可指化合物或其抗原结合片段、变体、缀合物或生物类似物。为了避免疑问，本文中提及的PD-1抑制剂时也可指小分子化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物、水合物、共晶体或前药。
在一些实施方式中，PD-1抑制剂为抗体(即，抗PD-1抗体)、其片段，包括其Fab片段或单链可变片段(scFv)。在一些实施方式中，PD-1抑制剂为多克隆抗体。在一些实施方式中，PD-1抑制剂为单克隆抗体。在一些实施方式中，PD-1抑制剂竞争结合PD-1，和/或结合PD-1上的表位。在一些实施方式中，抗体竞争结合PD-1，和/或结合PD-1上的表位。
在一些实施方式中，PD-1抑制剂为如下PD-1抑制剂，该PD-1抑制剂以约100pM以下的KD结合人PD-1、以约90pM以下的KD结合人PD-1、以约80pM以下的KD结合人PD-1、以约70pM以下的KD结合人PD-1、以约60pM以下的KD结合人PD-1、以约50pM以下的KD结合人PD-1、以约40pM以下的KD结合人PD-1、以约30pM以下的KD结合人PD-1、以约20pM以下的KD结合人PD-1、以约10pM以下的KD结合人PD-1，或以约1pM以下的KD结合人PD-1。
在一些实施方式中，PD-1抑制剂为如下PD-1抑制剂，该PD-1抑制剂以约7.5×105l/M·s或更快的kassoc结合人PD-1、以约7.5×105 1/M·s或更快的kassoc结合人PD-1、以约8×105 1/M·s或更快的kassoc结合人PD-1、以约8.5×105 1/M·s或更快的kassoc结合人PD-1、以约9×105 1/M·s或更快的kassoc结合人PD-1、以约9.5×105l/M·s或更快的kassoc结合人PD-1，或以约1×106l/M·s或更快的kassoc结合人PD-1。
在一些实施方式中，PD-1抑制剂为如下PD-1抑制剂，该PD-1抑制剂以约2×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合人PD-1、以约2.1×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合人PD-1、以约2.2×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合人PD-1、以约2.3×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合人PD-1、以约2.4×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合人PD-1、以约2.5×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合人PD-1、以约2.6×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合人PD-1，或以约2.7×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合人PD-1、以约2.8×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合人PD-1、以约2.9×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合人PD-1，或以约3×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合人PD-1。
在一些实施方式中，PD-1抑制剂为如下PD-1抑制剂，该PD-1抑制剂以约10nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约9nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约8nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约7nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约6nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约5nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约4nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约3nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约2nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合，或以约1nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合。
在一些实施方式中，PD-1抑制剂为纳武单抗(可自Bristol-Myers Squibb Co.以OPDIVO商购)或其生物类似物、抗原结合片段、缀合物或变体。纳武单抗为阻断PD-1受体的完全人IgG4抗体。在一些实施方式中，抗PD-1抗体为免疫球蛋白G4κ抗(人CD274)抗体。纳武单抗被指定化学文摘社(CAS)登记号946414-94-4且也称为5C4、BMS-936558、MDX-1106和ONO-4538。纳武单抗的制备和特性描述于美国专利第8,008,449号和国际专利公开第WO2006/121168号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。纳武单抗在各种形式癌症中的临床安全性和功效已描述于Wang等人,《癌症免疫学研究(Cancer Immunol Res.)》2014,2,846-56；Page等人,《医学年度评论(Ann.Rev.Med.)》,2014,65,185-202；和Weber等人,《临床肿瘤学杂志(J.Clin.Oncology)》,2013,31,4311-4318中，其公开内容以引用的方式并入本文中。纳武单抗的氨基酸序列阐述于表18中。纳武单抗在22-96、140-196、254-314、360-418、22”-96”、140”-196”、254”-314”和360”-418”处具有重链内二硫键；在23'-88'、134'-194'、23”'-88”'和134”'-194”'处具有轻链内二硫键；在127-214'、127”-214”'处具有重链-轻链间二硫键；在219-219”和222-222”处具有重链-重链间二硫键；且在290、290”处具有N-糖基化位点(H CH2 84.4)。
在一些实施方式中，PD-1抑制剂包含SEQ ID NO：158所示的重链和SEQ ID NO：159所示的轻链。在一些实施方式中，PD-1抑制剂包含分别具有SEQ ID NO：158和SEQ ID NO：159中所示的序列的重链和轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施方式中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：158和SEQ ID NO：159中所示序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：158和SEQ ID NO：159中所示序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：158和SEQ ID NO：159中所示序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQID NO：158和SEQ ID NO：159中所示序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：158和SEQ ID NO：159中所示序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一些实施方式中，PD-1抑制剂包含纳武单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施方式中，PD-1抑制剂重链可变区(VH)包括SEQ ID NO：160中所示的序列，PD-1抑制剂轻链可变区(VL)包括SEQ ID NO：161中所示的序列，或其保守性氨基酸取代。在一些实施方式中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：160和SEQ ID NO：161中所示序列具有至少99％同一性的VH区和VL区。在一些实施方式中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：160和SEQ ID NO：161中所示序列具有至少98％同一性的VH区和VL区。在一些实施方式中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：160和SEQ ID NO：161中所示序列具有至少97％同一性的VH区和VL区。在一些实施方式中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：160和SEQ IDNO：161中所示序列具有至少96％同一性的VH区和VL区。在一些实施方式中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：160和SEQ ID NO：161中所示序列具有至少95％同一性的VH区和VL区。
在一些实施方式中，PD-L1抑制剂包含分别具有SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：163和SEQ ID NO：164中所示的序列及其保守性氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域；和分别具有SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：166和SEQ ID NO：167中所示的序列及其保守性氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。在一些实施方式中，抗体竞争以与以下结合和/或结合以下：PD-1上与任何前述抗体相同的表位。
在一些实施方式中，PD-1抑制剂为药物管理机构参考纳武单抗批准的抗PD-1生物类似物单克隆抗体。在一些实施方式中，生物类似物包括抗PD-1抗体，该抗PD-1抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其相较于该参考药品或参考生物产品包含一个以上翻译后修饰，该参考药品或参考生物产品为纳武单抗。在一些实施方式中，一个以上翻译后修饰选自以下的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。在一些实施方式中，生物类似物为获得授权或申请授权的抗PD-1抗体，其中该抗PD-1抗体提供在一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，该参考药品或参考生物产品为纳武单抗。抗PD-1抗体可获得药物管理机构，例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施方式中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，该参考药品或参考生物产品为纳武单抗。在一些实施方式中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，该参考药品或参考生物产品为纳武单抗。
表18：参考纳武单抗的PD-1抑制剂的氨基酸序列
在一些实施方式中，PD-1抑制剂为纳武单抗或其生物类似物，纳武单抗以约0.5mg/kg至约10mg/kg的剂量施用。在一些实施方式中，PD-1抑制剂为纳武单抗或其生物类似物，纳武单抗以如下剂量施用：约0.5mg/kg、约1mg/kg、约1.5mg/kg、约2mg/kg、约2.5mg/kg、约3mg/kg、约3.5mg/kg、约4mg/kg、约4.5mg/kg、约5mg/kg、约5.5mg/kg、约6mg/kg、约6.5mg/kg、约7mg/kg、约7.5mg/kg、约8mg/kg、约8.5mg/kg、约9mg/kg、约9.5mg/kg或约10mg/kg。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施方式中，PD-1抑制剂为纳武单抗或其生物类似物，纳武单抗是以约200mg至约500mg的剂量施用。在一些实施方式中，PD-1抑制剂为纳武单抗或其生物类似物，纳武单抗是以如下剂量施用：约200mg、约220mg、约240mg、约260mg、约280mg、约300mg、约320mg、约340mg、约360mg、约380mg、约400mg、约420mg、约440mg、约460mg、约480mg或约500mg。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施方式中，PD-1抑制剂为纳武单抗或其生物类似物，每2周、每3周、每4周、每5周或每6周施用纳武单抗。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施方式中，施用纳武单抗以治疗不可切除性或转移性黑色素瘤。在一些实施方式中，施用纳武单抗以治疗不可切除性或转移性黑色素瘤，每2周以约240mg进行施用。在一些实施方式中，施用纳武单抗以治疗不可切除性或转移性黑色素瘤，每4周以约480mg进行施用。在一些实施方式中，施用纳武单抗以治疗不可切除性或转移性黑色素瘤，每3周于同一天施用约1mg/kg纳武单抗，随后施用3mg/kg伊匹木单抗，持续4次剂量，随后每2周施用240mg或每4周施用480mg纳武单抗。
在一些实施方式中，施用纳武单抗以辅助治疗黑色素瘤。在一些实施方式中，每2周以约240mg施用纳武单抗以辅助治疗黑色素瘤。在一些实施方式中，每4周以约480mg施用纳武单抗以辅助治疗黑色素瘤。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施方式中，施用纳武单抗以治疗转移性非小细胞肺癌。在一些实施方式中，每2周以约3mg/kg施用纳武单抗且每6周以约1mg/kg施用伊匹木单抗，以治疗转移性非小细胞肺癌。在一些实施方式中，每3周以约360mg施用纳武单抗，加上每6周1mg/kg伊匹木单抗与2个周期的含铂双重化疗，以治疗转移性非小细胞肺癌。在一些实施方式中，每2周以约240mg或每4周以480mg施用纳武单抗以治疗转移性非小细胞肺癌。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施方式中，施用纳武单抗以治疗小细胞肺癌。在一些实施方式中，每2周以约240mg施用纳武单抗以治疗小细胞肺癌。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施方式中，每3周以约360mg施用纳武单抗且每6周施用1mg/kg伊匹木单抗，以治疗恶性胸膜间皮瘤。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施方式中，施用纳武单抗以治疗晚期肾细胞癌。在一些实施方式中，每2周以约240mg施用纳武单抗以治疗晚期肾细胞癌。在一些实施方式中，每4周以约480mg施用纳武单抗以治疗晚期肾细胞癌。在一些实施方式中，以约3mg/kg施用纳武单抗，随后每3周在同一天以约1mg/kg施用伊匹木单抗达4次剂量，随后每2周施用240mg纳武单抗，以治疗晚期肾细胞癌。在一些实施方式中，以约3mg/kg施用纳武单抗，随后每3周在同一天以约1mg/kg施用伊匹木单抗达4次剂量，随后每2周施用240mg、每4周施用480mg纳武单抗，以治疗晚期肾细胞癌。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施方式中，施用纳武单抗以治疗典型霍奇金氏淋巴瘤。在一些实施方式中，每2周以约240mg施用纳武单抗以治疗典型霍奇金氏淋巴瘤。在一些实施方式中，每4周以约480mg施用纳武单抗以治疗典型霍奇金氏淋巴瘤。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施方式中，施用纳武单抗以治疗复发性或转移性头颈鳞状细胞癌。在一些实施方式中，每2周以约240mg施用纳武单抗以治疗复发性或转移性头颈鳞状细胞癌。在一些实施方式中，每4周以约480mg施用纳武单抗以治疗复发性或转移性头颈鳞状细胞癌。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施方式中，每2周以约240mg施用纳武单抗以治疗局部晚期或转移性尿道上皮癌。在一些实施方式中，每4周以约480mg施用纳武单抗以治疗局部晚期或转移性尿道上皮癌。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施方式中，施用纳武单抗以治疗高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性结肠直肠癌。在一些实施方式中，施用纳武单抗以治疗成年和小儿患者的高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷型(dMMR)转移性结肠直肠癌。在一些实施方式中，每2周以约240mg施用纳武单抗以治疗≥40kg的成人和小儿患者的高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷型(dMMR)转移性结肠直肠癌。在一些实施方式中，每4周以约480mg施用纳武单抗以治疗≥40kg的成人和小儿患者的高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷型(dMMR)转移性结肠直肠癌。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施方式中，每2周以约3mg/kg施用纳武单抗以治疗<40kg的小儿患者的高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷型(dMMR)转移性结肠直肠癌。在一些实施方式中，以约3mg/kg施用纳武单抗，随后每3周在同一天施用1mg/kg伊匹木单抗达4次剂量，随后每2周施用240mg纳武单抗，以治疗≥40kg的成人和小儿患者的高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷型(dMMR)转移性结肠直肠癌。在一些实施方式中，以约3mg/kg施用纳武单抗，随后每3周在同一天施用1mg/kg伊匹木单抗达4次剂量，随后每4周施用480mg纳武单抗，以治疗≥40kg的成人和小儿患者的高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷型(dMMR)转移性结肠直肠癌。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施方式中，施用纳武单抗以治疗肝细胞癌。在一些实施方式中，每2周以约240mg施用纳武单抗以治疗肝细胞癌。在一些实施方式中，每4周以约480mg施用纳武单抗以治疗肝细胞癌。在一些实施方式中，以约1mg/kg施用纳武单抗，随后每3周在同一天施用3mg/kg伊匹木单抗达4次剂量，随后每2周施用纳武单抗240mg，以治疗肝细胞癌。在一些实施方式中，以约1mg/kg施用纳武单抗，随后每3周在同一天施用3mg/kg伊匹木单抗达4次剂量，随后每4周施用480mg纳武单抗，以治疗肝细胞癌。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施方式中，施用纳武单抗以治疗食道鳞状细胞癌。在一些实施方式中，每2周以约240mg施用纳武单抗以治疗食道鳞状细胞癌。在一些实施方式中，每4周以约480mg施用纳武单抗以治疗食道鳞状细胞癌。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施方式中，PD-1抑制剂包括帕博利珠单抗(可自美国新泽西州凯尼尔沃思(Kenilworth,NJ,USA)的Merck&Co.,Inc.以KEYTRUDA商购)或抗原结合片段、缀合物或变体。帕博利珠单抗被指定CAS登记号1374853-91-4且也称为兰立珠单抗、MK-3475和SCH-900475。帕博利珠单抗具有免疫球蛋白G4抗(人蛋白PDCD1(计划性细胞死亡1))抗体、含(人小家鼠单克隆重链)二硫键与人小家鼠单克隆轻链二聚体结构。帕博利珠单抗的结构也可描述为免疫球蛋白G4抗(人计划性细胞死亡1)抗体；含人源化小鼠单克隆[228-L-脯氨酸(H10-S>P)]γ4重链(134-218')二硫键与人源化小鼠单克隆κ轻链二聚体(226-226”:229-229”)双二硫键。帕博利珠单抗的特性、用途和制备描述于国际专利公开第WO 2008/156712A1号、美国专利第8,354,509号以及美国专利申请公开第US 2010/0266617A1号、第US2013/0108651 A1号和第US2013/0109843 A2号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。帕博利珠单抗在各种形式的癌症中的临床安全性和功效描述于Fuerst,《肿瘤学时报(OncologyTimes)》,2014,36,35-36；Robert等人,《柳叶刀(Lancet)》,2014,384,1109-17；和Thomas等人,《生物治疗专家意见(Exp.Opin.Biol.Ther.)》,2014,14,1061-1064中。帕博利珠单抗的氨基酸序列阐述于表19中。帕博利珠单抗包含以下二硫键：22-96、22”-96”、23'-92'、23”'-92”'、134-218'、134”-218”'、138'-198'、138”'-198”'、147-203、147”-203”、226-226”、229-229”、261-321、261”-321”、367-425和367”-425”；以及以下糖基化位点(N)：Asn-297和Asn-297”。帕博利珠单抗为在Fc区中含稳定化S228P突变的IgG4/κ同种型；IgG4铰链区中此突变的插入防止形成IgG4抗体通常观测到的半分子。帕博利珠单抗在各重链的Fc结构域内在Asn297处异质糖基化，使得完整抗体的分子量为约149kDa。帕博利珠单抗的主要糖型为岩藻糖基化去半乳糖基二触角聚糖形式(G0F)。
在一些实施方式中，PD-1抑制剂包含SEQ ID NO：168所示的重链和SEQ ID NO：169所示的轻链。在一些实施方式中，PD-1抑制剂包含分别具有SEQ ID NO：168和SEQ ID NO：169中所示的序列的重链和轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施方式中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：168和SEQ ID NO：169中所示序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：168和SEQ ID NO：169中所示序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：168和SEQ ID NO：169中所示序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQID NO：168和SEQ ID NO：169中所示序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：168和SEQ ID NO：169中所示序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一些实施方式中，PD-1抑制剂包含帕博利珠单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施方式中，PD-1抑制剂重链可变区(VH)包括SEQ ID NO：170中所示的序列，PD-1抑制剂轻链可变区(VL)包括SEQ ID NO：171中所示的序列，或其保守性氨基酸取代。在一些实施方式中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：170和SEQ ID NO：171中所示序列具有至少99％同一性的VH区和VL区。在一些实施方式中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ IDNO：170和SEQ ID NO：171中所示序列具有至少98％同一性的VH区和VL区。在一些实施方式中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：170和SEQ ID NO：171中所示序列具有至少97％同一性的VH区和VL区。在一些实施方式中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：170和SEQID NO：171中所示序列具有至少96％同一性的VH区和VL区。在一些实施方式中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：170和SEQ ID NO：171中所示序列具有至少95％同一性的VH区和VL区。
在一些实施方式中，PD-L1抑制剂包含分别具有SEQ ID NO：172、SEQ ID NO：173和SEQ ID NO：174中所示的序列或其保守性氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域；和分别具有SEQ ID NO：175、SEQ ID NO：176和SEQ ID NO：177中所示的序列或其保守性氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。在一些实施方式中，抗体竞争以与以下结合和/或结合以下：PD-1上与任何前述抗体相同的表位。
在一些实施方式中，PD-1抑制剂为药物管理机构参考帕博利珠单抗批准的抗PD-1生物类似物单克隆抗体。在一些实施方式中，生物类似物包括抗PD-1抗体，该抗PD-1抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其相较于该参考药品或参考生物产品包含一个以上翻译后修饰，该参考药品或参考生物产品为帕博利珠单抗。在一些实施方式中，一个以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。在一些实施方式中，生物类似物为获得授权或申请授权的抗PD-1抗体，其中该抗PD-1抗体提供在一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，该参考药品或参考生物产品为帕博利珠单抗。抗PD-1抗体可获得药物管理机构，例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施方式中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，该参考药品或参考生物产品为帕博利珠单抗。在一些实施方式中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，该参考药品或参考生物产品为帕博利珠单抗。
表19：参考帕博利珠单抗的PD-1抑制剂的氨基酸序列
在一些实施方式中，PD-1抑制剂为帕博利珠单抗或其生物类似物，帕博利珠单抗以约0.5mg/kg至约10mg/kg的剂量施用。在一些实施方式中，PD-1抑制剂为帕博利珠单抗或其生物类似物，帕博利珠单抗以如下剂量施用：约0.5mg/kg、约1mg/kg、约1.5mg/kg、约2mg/kg、约2.5mg/kg、约3mg/kg、约3.5mg/kg、约4mg/kg、约4.5mg/kg、约5mg/kg、约5.5mg/kg、约6mg/kg、约6.5mg/kg、约7mg/kg、约7.5mg/kg、约8mg/kg、约8.5mg/kg、约9mg/kg、约9.5mg/kg或约10mg/kg。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施方式中，PD-1抑制剂为帕博利珠单抗或其生物类似物，其中，帕博利珠单抗以约200mg至约500mg的剂量施用。在一些实施方式中，PD-1抑制剂为帕博利珠单抗或其生物类似物，纳武单抗以如下剂量施用：约200mg、约220mg、约240mg、约260mg、约280mg、约300mg、约320mg、约340mg、约360mg、约380mg、约400mg、约420mg、约440mg、约460mg、约480mg或约500mg。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施方式中，PD-1抑制剂为帕博利珠单抗或其生物类似物，其中，帕博利珠单抗每2周、每3周、每4周、每5周或每6周施用一次。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施方式中，施用帕博利珠单抗以治疗黑色素瘤。在一些实施方式中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗黑色素瘤。在一些实施方式中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗黑色素瘤。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施方式中，施用帕博利珠单抗以治疗NSCLC。在一些实施方式中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗NSCLC。在一些实施方式中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗NSCLC。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施方式中，施用帕博利珠单抗以治疗小细胞肺癌(SCLC)。在一些实施方式中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗SCLC。在一些实施方式中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗SCLC。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施方式中，施用帕博利珠单抗以治疗头颈鳞状细胞癌(HNSCC)。在一些实施方式中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗HNSCC。在一些实施方式中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗HNSCC。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施方式中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗典型霍奇金氏淋巴瘤(cHL)或原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)。在一些实施方式中，成人每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗典型霍奇金氏淋巴瘤(cHL)或原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)。在一些实施方式中，小儿每3周以约2mg/kg(至多200mg)施用帕博利珠单抗以治疗典型霍奇金氏淋巴瘤(cHL)或原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施方式中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗尿道上皮癌。在一些实施方式中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗尿道上皮癌。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施方式中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)癌。在一些实施方式中，成人每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗MSI-H或dMMR癌。在一些实施方式中，小儿每3周以约2mg/kg(至多200mg)施用帕博利珠单抗以治疗MSI-H或dMMR癌。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施方式中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷结肠直肠癌(dMMR CRC。在一些实施方式中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗MSI-H或dMMR CRC。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施方式中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗胃癌。在一些实施方式中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗胃癌。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施方式中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗食道癌。在一些实施方式中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗食道癌。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施方式中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗宫颈癌。在一些实施方式中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗宫颈癌。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施方式中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗肝细胞癌(HCC)。在一些实施方式中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗HCC。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施方式中，成人每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗默克氏细胞癌(Merkel cell carcinoma；MCC)。在一些实施方式中，成人每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗MCC。在一些实施方式中，小儿每3周以约2mg/kg(至多200mg)施用帕博利珠单抗以治疗MCC。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施方式中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗肾细胞癌(RCC)。在一些实施方式中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗且每天两次经口施用阿西替尼(axitinib)5mg以治疗RCC。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施方式中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗子宫内膜癌。在一些实施方式中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗且每天一次经口施用20mg用于非MSI-H或dMMR肿瘤的乐伐替尼(lenvatinib)以治疗子宫内膜癌。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施方式中，成人每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗高肿瘤突变负荷(TMB-H)癌症。在一些实施方式中，成人每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗TMB-H癌症。在一些实施方式中，小儿每3周以约2mg/kg(至多200mg)施用帕博利珠单抗以治疗TMB-H癌症。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施方式中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗皮肤鳞状细胞癌(cSCC)。在一些实施方式中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗cSCC。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施方式中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗三阴性乳腺癌(TNBC)。在一些实施方式中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗TNBC。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施方式中，若患者或受试者为成人，即治疗成人适应症，则可采用另外的每6周400mg的给药方案。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施方式中，PD-1抑制剂为可商购抗PD-1单克隆抗体，例如抗m-PD-1克隆J43(目录号BE0033-2)和RMP1-14(目录号BE0146)(美国新罕布夏州西黎巴嫩的Bio XCell,Inc.)。多种可商购抗PD-1抗体为本领域通常本领域技术人员所知。
在一些实施方式中，PD-1抑制剂为公开于美国专利第8,354,509号或美国专利申请公开第2010/0266617 A1号、第2013/0108651 A1号、第2013/0109843 A2号中的抗体，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施方式中，PD-1抑制剂为描述于美国专利第8,287,856号、第8,580,247号和第8,168,757号以及美国专利申请公开第2009/0028857 A1号、第2010/0285013 A1号、第2013/0022600 A1号和第2011/0008369 A1号中的抗PD-1抗体，其教导内容以引用的方式并入本文中。在其他实施方式中，PD-1抑制剂为公开于美国专利第8,735,553B1号中的抗PD-1抗体，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施方式中，PD-1抑制剂为皮立珠单抗，也称为CT-011，其描述于美国专利第8,686,119号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施方式中，PD-1抑制剂可以是小分子或肽或肽衍生物，例如美国专利第8,907,053号、第9,096,642号和第9,044,442号以及美国专利申请公开第US 2015/0087581号中所描述的小分子或肽或肽衍生物；1,2,4-恶二唑化合物和衍生物，例如美国专利申请公开第2015/0073024号中所描述的1,2,4-恶二唑化合物和衍生物；环状肽模拟化合物和衍生物，例如美国专利申请公开第US2015/0073042号中所描述的环状肽模拟化合物和衍生物；环状化合物和衍生物，例如美国专利申请公开第US2015/0125491中所描述的环状化合物和衍生物；1,3,4-恶二唑和1,3,4-噻二唑化合物和衍生物，例如国际专利申请公开第WO2015/033301号中所描述的1,3,4-恶二唑和1,3,4-噻二唑化合物和衍生物；基于肽的化合物和衍生物，例如国际专利申请公开第WO 2015/036927号和第WO 2015/04490号中所描述的基于肽的化合物和衍生物；或基于肽的巨环化合物和衍生物，例如美国专利申请公开第US2014/0294898号中所描述的基于肽的巨环化合物和衍生物；其各自的公开内容以全文引用的方式并入本文中。在一些实施方式中，PD-1抑制剂是西米普利单抗(cemiplimab)，其可商购自Regeneron,Inc.。
在一些实施方式中，TIL和PD-L1抑制剂或PD-L2抑制剂作为组合疗法或协同疗法施用以用于治疗NSCLC。
在一些实施方式中，NSCLC未经历先前疗法。在一些实施方式中，将PD-L1抑制剂或PD-L2抑制剂作为一线疗法或初始疗法施用。在一些实施方式中，将PD-L1抑制剂或PD-L2抑制剂作为一线疗法或初始疗法与如本文所述的TIL组合施用。
在一些实施方式中，PD-L1或PD-L2抑制剂可以是本领域已知的任何PD-L1或PD-L2抑制剂、拮抗剂或阻断剂。特定地，其为在以下段落中更详细描述的PD-L1或PD-L2抑制剂、拮抗剂或阻断剂之一。关于PD-L1和PD-L2抑制剂，术语“抑制剂”、“拮抗剂”和“阻断剂”在本文中可互换使用。为了避免疑问，本文中提及的作为抗体的PD-L1或PD-L2抑制剂可指化合物或其抗原结合片段、变体、缀合物或生物类似物。为了避免疑问，本文中提及的PD-L1或PD-L2抑制剂也可指化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物、水合物、共晶体或前药。
在一些实施方式中，本文所述的组合物、过程和方法包括PD-L1或PD-L2抑制剂。在一些实施方式中，PD-L1或PD-L2抑制剂为小分子。在一些实施方式中，PD-L1或PD-L2抑制剂为抗体(即，抗PD-1抗体)、其片段，包括其Fab片段或单链可变片段(scFv)。在一些实施方式中，PD-L1或PD-L2抑制剂为多克隆抗体。在一些实施方式中，PD-L1或PD-L2抑制剂为单克隆抗体。在一些实施方式中，PD-L1或PD-L2抑制剂竞争结合PD-L1或PD-L2和/或结合PD-L1或PD-L2上的表位。在一些实施方式中，抗体竞争结合PD-L1或PD-L2，和/或结合PD-L1或PD-L2上的表位。
在一些实施方式中，本文提供的PD-L1抑制剂对PD-L1具选择性，因为化合物与PD-L1结合或相互作用的浓度比其与其他受体(包括PD-L2受体的)结合或相互作用的浓度低得多。在某些实施方式中，化合物以如下结合常数结合PD-L1受体，该结合常数比结合PD-L2受体的浓度高至少约2倍的浓度、高约3倍的浓度、高约5倍的浓度、高约10倍的浓度、高约20倍的浓度、高约30倍的浓度、高约50倍的浓度、高约100倍的浓度、高约200倍的浓度、高约300倍的浓度或高约500倍的浓度。
在一些实施方式中，本文提供的PD-L2抑制剂对PD-L2具选择性，因为化合物与PD-L2结合或相互作用的浓度比其与其他受体(包括PD-L1受体)结合或相互作用的浓度低得多。在某些实施方式中，化合物以如下结合常数结合PD-L2受体，该结合常数比结合PD-L1受体的浓度高至少约2倍的浓度、高约3倍的浓度、高约5倍的浓度、高约10倍的浓度、高约20倍的浓度、高约30倍的浓度、高约50倍的浓度、高约100倍的浓度、高约200倍的浓度、高约300倍的浓度或高约500倍的浓度。
不受任何理论束缚，认为肿瘤细胞表达PD-L1，T细胞表达PD-1。然而，肿瘤细胞对PD-L1的表达不为PD-1或PD-L1抑制剂或阻断剂的功效所需。在一些实施方式中，肿瘤细胞表达PD-L1。在其他实施方式中，肿瘤细胞并不表达PD-L1。在一些实施方式中，该方法可以包括PD-1和PD-L1抗体(例如本文所述的PD-1和PD-L1抗体)与TIL的组合。可同时或依序施用PD-1和PD-L1抗体与TIL的组合。
在一些实施方式中，PD-L1和/或PD-L2抑制剂为如下PD-L1和/或PD-L2抑制剂，该PD-L1和/或PD-L2抑制剂以约100pM以下的KD结合人PD-L1和/或PD-L2、以约90pM以下的KD结合人PD-L1和/或PD-L2、以约80pM以下的KD结合人PD-L1和/或PD-L2、以约70pM以下的KD结合人PD-L1和/或PD-L2、以约60pM以下的KD结合人PD-L1和/或PD-L2、以约50pM以下的KD结合人PD-L1和/或PD-L2、以约40pM以下的KD结合人PD-L1和/或PD-L2，或以约30pM以下的KD结合人PD-L1和/或PD-L2。
在一些实施方式中，PD-L1和/或PD-L2抑制剂为如下PD-L1和/或PD-L2抑制剂，该PD-L1和/或PD-L2抑制剂以约7.5×105l/M·s或更快的kassoc结合人PD-L1和/或PD-L2、以约8×105 1/M·s或更快的kassoc结合人PD-L1和/或PD-L2、以约8.5×105 1/M·s或更快的kassoc结合人PD-L1和/或PD-L2、以约9×105 1/M·s或更快的kassoc结合人PD-L1和/或PD-L2、以约9.5×105l/M·s或更快的kassoc结合人PD-L1和/或PD-L2，或以约1×1061/M·s或更快的kassoc结合人PD-L1和/或PD-L2。
在一些实施方式中，PD-L1和/或PD-L2抑制剂为如下PD-L1和/或PD-L2抑制剂，该PD-L1和/或PD-L2抑制剂以约2×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合人PD-L1或PD-L2、以约2.1×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合人PD-1、以约2.2×10-5l/s或更慢的kdissoc结合人PD-1、以约2.3×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合人PD-1、以约2.4×10-5l/s或更慢的kdissoc结合人PD-1、以约2.5×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合人PD-1、以约2.6×10-5l/s或更慢的kdissoc结合人PD-1、以约2.7×10-5l/s或更慢的kdissoc结合人PD-L1或PD-L2，或以约3×10-5l/s或更慢的kdissoc结合人PD-L1或PD-L2。
在一些实施方式中，PD-L1和/或PD-L2抑制剂为如下PD-L1和/或PD-L2抑制剂，该PD-L1和/或PD-L2抑制剂以约10nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约9nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约8nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约7nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约6nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约5nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约4nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约3nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约2nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合，或以约1nM以下的IC50阻断人PD-1或阻断人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合。
在一些实施方式中，PD-L1抑制剂为德瓦鲁单抗，也称为MEDI4736(其可自马里兰州盖瑟斯堡(Gaithersburg,Maryland)的AstraZeneca plc.的子公司Medimmune,LLC商购)或其抗原结合片段、缀合物或变体。在一些实施方式中，PD-L1抑制剂为公开于美国专利第8,779,108号或美国专利申请公开第2013/0034559号中的抗体，其公开内容以引用的方式并入本文中。德瓦鲁单抗的临床功效已描述于Page等人,《医学年度评论》,2014,65,185-202；Brahmer等人,《临床肿瘤学杂志》2014,32,5s(增刊，摘要8021)；和McDermott等人,《癌症治疗评论》(Cancer Treatment Rev.),2014,40,1056-64中。德瓦鲁单抗的制备和特性描述于美国专利第8,779,108号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。德瓦鲁单抗的氨基酸序列阐述于表20中。德瓦鲁单抗单克隆抗体包含22-96、22”-96”、23'-89'、23”'-89”'、135'-195'、135”'-195”'、148-204、148”-204”、215'-224、215”'-224”、230-230”、233-233”、265-325、265”-325”、371-429和371”-429'处的二硫键；以及Asn-301和Asn-301”处的N-糖基化位点。
在一些实施方式中，PD-L1抑制剂包含SEQ ID NO：178所示的重链和SEQ ID NO：179所示的轻链。在一些实施方式中，PD-L1抑制剂包含分别具有SEQ ID NO：178和SEQ IDNO：179中所示的序列的重链和轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施方式中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：178和SEQ IDNO：179中所示序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：179中所示序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：179中所示序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：179中所示序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：179中所示序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一些实施方式中，PD-L1抑制剂包含德瓦鲁单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)在一些实施方式中，PD-L1抑制剂重链可变区(VH)包括SEQ ID NO：180中所示的序列，PD-L1抑制剂轻链可变区(VL)包括SEQ ID NO：181中所示的序列，或其保守性氨基酸取代。在一些实施方式中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：180和SEQ ID NO：181中所示序列具有至少99％同一性的VH区和VL区。在一些实施方式中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ IDNO：180和SEQ ID NO：181中所示序列具有至少98％同一性的VH区和VL区。在一些实施方式中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：180和SEQ ID NO：181中所示序列具有至少97％同一性的VH区和VL区。在一些实施方式中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：180和SEQ ID NO：181中所示序列具有至少96％同一性的VH区和VL区。在一些实施方式中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：180和SEQ ID NO：181中所示序列具有至少95％同一性的VH区和VL区。
在一些实施方式中，PD-L1抑制剂包含分别具有SEQ ID NO：182、SEQ ID NO：183和SEQ ID NO：184中所示的序列或其保守性氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域；和分别具有SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：186和SEQ ID NO：187中所示的序列或其保守性氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。在一些实施方式中，抗体竞争以与以下结合和/或结合以下：PD-L1上与任何前述抗体相同的表位。
在一些实施方式中，PD-L1抑制剂为药物管理机构参考德瓦鲁单抗批准的抗PD-L1生物类似物单克隆抗体。在一些实施方式中，生物类似物包括抗PD-L1抗体，该抗PD-L1抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其相较于该参考药品或参考生物产品包含一个以上翻译后修饰，该参考药品或参考生物产品为德瓦鲁单抗。在一些实施方式中，一个以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。在一些实施方式中，生物类似物为获得授权或申请授权的抗PD-L1抗体，其中该抗PD-L1抗体提供在一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，该参考药品或参考生物产品为德瓦鲁单抗。抗PD-L1抗体可获得药物管理机构，例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施方式中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，该参考药品或参考生物产品为德瓦鲁单抗。在一些实施方式中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，该参考药品或参考生物产品为德瓦鲁单抗。
表20：参考德瓦鲁单抗的PD-L1抑制剂的氨基酸序列
在一些实施方式中，PD-L1抑制剂为阿维鲁单抗，也称为MSB0010718C(可自MerckKGaA/EMD Serono商购)或其抗原结合片段、缀合物或变体。阿维鲁单抗的制备和特性描述于美国专利申请公开第US2014/0341917 A1号中，其公开内容特别以引用的方式并入本文中。阿维鲁单抗的氨基酸序列阐述于表21中。阿维鲁单抗具有22-96、147-203、264-324、370-428、22”-96”、147”-203”、264”-324”和370”-428”处的重链内二硫键(C23-C104)；22'-90'、138'-197'、22”'-90”'和138”'-197”'处的轻链内二硫键(C23-C104)；223-215'和223”-215”'处的重链-轻链内二硫键(h 5-CL 126)；229-229”和232-232”处的重链-重链内二硫键(h 11，h 14)；300、300”处的N-糖基化位点(H CH2 N84.4)；岩藻糖基化复合物二触角CHO类聚糖；和450和450'处的H CHS K2 C端赖氨酸裁剪。
在一些实施方式中，PD-L1抑制剂包含SEQ ID NO：188所示的重链和SEQ ID NO：189所示的轻链。在一些实施方式中，PD-L1抑制剂包含分别具有SEQ ID NO：188和SEQ IDNO：189中所示序列的重链和轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施方式中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：188和SEQ ID NO：189中所示序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：188和SEQ ID NO：189中所示序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：188和SEQ ID NO：189中所示序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：188和SEQ ID NO：189中所示序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：188和SEQ ID NO：189中所示序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一些实施方式中，PD-L1抑制剂包含阿维鲁单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施方式中，PD-L1抑制剂重链可变区(VH)包括SEQ ID NO：190中所示的序列，PD-L1抑制剂轻链可变区(VL)包括SEQ ID NO：191中所示的序列，或其保守性氨基酸取代。在一些实施方式中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：190和SEQ ID NO：191中所示序列具有至少99％同一性的VH区和VL区。在一些实施方式中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：190和SEQ ID NO：191中所示序列具有至少98％同一性的VH区和VL区。在一些实施方式中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：190和SEQ ID NO：191中所示序列具有至少97％同一性的VH区和VL区。在一些实施方式中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ IDNO：190和SEQ ID NO：191中所示序列具有至少96％同一性的VH区和VL区。在一些实施方式中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：190和SEQ ID NO：191中所示序列具有至少95％同一性的VH区和VL区。
在一些实施方式中，PD-L1抑制剂包含分别具有SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：193和SEQ ID NO：194中所示的序列或其保守性氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域；和分别具有SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：196和SEQ ID NO：197中所保守性氨基酸取代示的序列或其保守性氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。在一些实施方式中，抗体竞争以与以下结合和/或结合以下：PD-L1上与任何前述抗体相同的表位。
在一些实施方式中，PD-L1抑制剂为药物管理机构参考阿维鲁单抗批准的抗PD-L1生物类似物单克隆抗体。在一些实施方式中，生物类似物包括抗PD-L1抗体，该抗PD-L1抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其相较于该参考药品或参考生物产品包含一个以上翻译后修饰，该参考药品或参考生物产品为阿维鲁单抗。在一些实施方式中，一个以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。在一些实施方式中，生物类似物为获得授权或申请授权的抗PD-L1抗体，其中该抗PD-L1抗体提供在一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，该参考药品或参考生物产品为阿维鲁单抗。抗PD-L1抗体可获得药物管理机构，例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施方式中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，该参考药品或参考生物产品为阿维鲁单抗。在一些实施方式中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，该参考药品或参考生物产品为阿维鲁单抗。
表21：参考阿维鲁单抗的PD-L1抑制剂的氨基酸序列
在一些实施方式中，PD-L1抑制剂为阿替利珠单抗，也称为MPDL3280A或RG7446(其可自瑞士巴塞尔的Roche Holding AG的子公司Genentech,Inc.以TECENTRIQ商购)或其抗原结合片段、缀合物或变体。在一些实施方式中，PD-L1抑制剂为公开于美国专利第8,217,149号中的抗体，其公开内容特别以引用的方式并入本文中。在一些实施方式中，PD-L1抑制剂为公开于美国专利申请公开第2010/0203056A1号、第2013/0045200A1号、第2013/0045201A1号、第2013/0045202A1号或第2014/0065135A1号中的抗体，其公开内容特别以引用的方式并入本文中。阿替利珠单抗的制备和特性描述于美国专利第8,217,149号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。阿替利珠单抗的氨基酸序列阐述于表22中。阿替利珠单抗具有22-96、145-201、262-322、368-426、22”-96”、145”-201”、262”-322”和368”-426”处的重链内二硫键(C23-C104)；23'-88'、134'-194'、23”'-88”'和134”'-194”'处的轻链内二硫键(C23-C104)；221-214'和221”-214”'处的重链-轻链内二硫键(h 5-CL 126)；227-227”和230-230”处的重链-重链内二硫键(h 11，h 14)；以及298和298'处的N-糖基化位点(HCH2 N84.4>A)。
在一些实施方式中，PD-L1抑制剂包含SEQ ID NO：198所示的重链和SEQ ID NO：199所示的轻链。在一些实施方式中，PD-L1抑制剂包含分别具有SEQ ID NO：198和SEQ IDNO：199中所示的序列的重链和轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施方式中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：198和SEQ IDNO：199中所示序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：198和SEQ ID NO：199中所示序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：198和SEQ ID NO：199中所示序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：198和SEQ ID NO：199中所示序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：198和SEQ ID NO：199中所示序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一些实施方式中，PD-L1抑制剂包含阿替利珠单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施方式中，PD-L1抑制剂重链可变区(VH)包括SEQ ID NO：200中所示的序列，PD-L1抑制剂轻链可变区(VL)包括SEQ ID NO：201中所示的序列，或其保守性氨基酸取代。在一些实施方式中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：200和SEQ ID NO：201中所示序列具有至少99％同一性的VH区和VL区。在一些实施方式中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：200和SEQ ID NO：201中所示序列具有至少98％同一性的VH区和VL区。在一些实施方式中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：200和SEQ ID NO：201中所示序列具有至少97％同一性的VH区和VL区。在一些实施方式中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ IDNO：200和SEQ ID NO：201中所示序列具有至少96％同一性的VH区和VL区。在一些实施方式中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：200和SEQ ID NO：201中所示序列具有至少95％同一性的VH区和VL区。
在一些实施方式中，PD-L1抑制剂包含分别具有SEQ ID NO：202、SEQ ID NO：203和SEQ ID NO：204中所示的序列或其保守性氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域；以及分别具有SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：206和SEQ ID NO：207中所示的序列或其保守性氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。在一些实施方式中，抗体竞争以与以下结合和/或结合以下：PD-L1上与任何前述抗体相同的表位。
在一些实施方式中，抗PD-L1抗体为药物管理机构参考阿替利珠单抗批准的抗PD-L1生物类似物单克隆抗体。在一些实施方式中，生物类似物包括抗PD-L1抗体，该抗PD-L1抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其相较于该参考药品或参考生物产品包含一个以上翻译后修饰，该参考药品或参考生物产品为阿替利珠单抗。在一些实施方式中，一个以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。在一些实施方式中，生物类似物为获得授权或申请授权的抗PD-L1抗体，其中该抗PD-L1抗体提供在一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，该参考药品或参考生物产品为阿替利珠单抗。抗PD-L1抗体可获得药物管理机构，例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施方式中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，该参考药品或参考生物产品为阿替利珠单抗。在一些实施方式中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，该参考药品或参考生物产品为阿替利珠单抗。
表22：参考阿替利珠单抗的PD-L1抑制剂的氨基酸序列
在一些实施方式中，PD-L1抑制剂包括美国专利申请公开第US2014/0341917A1号中所描述的抗体，其公开内容以引用的方式并入本文中。在其他实施方式中，也包括与这些抗体中的任一种竞争结合PD-L1的抗体。在一些实施方式中，抗PD-L1抗体为MDX-1105，也称为BMS-935559，其公开于美国专利第US 7,943,743号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施方式中，抗PD-L1抗体选自公开于美国专利第US 7,943,743号中的抗PD-L1抗体，该专利以引用的方式并入本文中。
在一些实施方式中，PD-L1抑制剂为可商购单克隆抗体，例如INVIVOMAB抗m-PD-L1克隆10F.9G2(目录号BE0101，美国新罕布夏州西黎巴嫩的Bio X Cell,Inc.)。在一些实施方式中，抗PD-L1抗体为可商购单克隆抗体，例如AFFYMETRIX EBIOSCIENCE(MIH1)。多种可商购抗PD-L1抗体为本领域通常本领域技术人员所知。
在一些实施方式中，PD-L2抑制剂为可商购单克隆抗体，例如BIOLEGEND24F.10C12小鼠IgG2aκ同种型(目录号329602，加利福尼亚圣地亚哥Biolegend,Inc.)、SIGMA抗PD-L2抗体(目录号SAB3500395，密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich Co.)或本领域通常本领域技术人员已知的其他可商购抗PD-L2抗体。
2.与CTLA-4抑制剂组合
在一些实施方式中，提供给癌症患者的TIL疗法可包括单独用治疗性TIL群治疗，或可包括组合治疗，包括TIL和一种以上CTLA-4抑制剂。
细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)为免疫球蛋白超家族成员且表达于辅助T细胞表面上。CTLA-4为CD28依赖性T细胞活化的负向调节因子且充当适应性免疫反应的检查点。类似于T细胞共刺激蛋白CD28，CTLA-4结合抗原在细胞上呈递CD80和CD86。CTLA-4将抑制因子信号递送至T细胞，而CD28递送刺激信号。针对人CTLA-4的人抗体已描述为许多疾病病状的免疫刺激调节剂，例如治疗或预防病毒和细菌感染且治疗癌症(WO 01/14424和WO 00/37504)。已在临床试验中针对治疗各种类型的实体肿瘤研究多种完全人抗人CTLA-4单克隆抗体(mAb)，该抗体包括但不限于伊匹木单抗(MDX-010)和曲美单抗(CP-675,206)。
在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂可以是本领域已知的任何CTLA-4抑制剂或CTLA-4阻断剂。特定地，其为在以下段落中更详细描述的CTLA-4抑制剂或阻断剂之一。关于CTLA-4抑制剂，术语“抑制剂”、“拮抗剂”和“阻断剂”在本文中可互换使用。为了避免疑问，本文中提及的作为抗体的CTLA-4抑制剂可指化合物或其抗原结合片段、变体、缀合物或生物类似物。为了避免疑问，本文中提及的CTLA-4抑制剂也可指小分子化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物、水合物、共晶体或前药。
适用于本发明的方法的CTLA-4抑制剂包括但不限于抗CTLA-4抗体、人抗CTLA-4抗体、小鼠抗CTLA-4抗体、哺乳动物抗CTLA-4抗体、人源化抗CTLA-4抗体、单克隆抗CTLA-4抗体、多克隆抗CTLA-4抗体、嵌合抗CTLA-4抗体、MDX-010(伊匹木单抗)、曲美单抗、抗CD28抗体、抗CTLA-4阿德奈汀、抗CTLA-4结构域抗体、单链抗CTLA-4片段、重链抗CTLA-4片段、轻链抗CTLA-4片段、激动共刺激路径的CTLA-4抑制剂、公开于PCT公开第WO 2001/014424号中的抗体、公开于PCT公开第WO 2004/035607号中的抗体、公开于美国公开第2005/0201994号中的抗体和公开于授与欧洲专利第EP 1212422 B1号中的抗体，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。另外的CTLA-4抗体描述于美国专利第5,811,097号、第5,855,887号、第6,051,227号和第6,984,720号中；PCT公开第WO 01/14424号和第WO 00/37504号中；和美国公开第2002/0039581号和第2002/086014号中，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。可用于本发明方法中的其他抗CTLA-4抗体包括例如公开于以下中的抗体：WO 98/42752；美国专利第6,682,736号和第6,207,156号；Hurwitz等人,《美国国家科学院院刊》,95(17):10067-10071(1998)；Camacho等人,《临床肿瘤学杂志》,22(145):摘要号2505(2004)(抗体CP-675206)；Mokyr等人,《癌症研究》,58:5301-5304(1998)；和美国专利第5,977,318号、第6,682,736号、第7,109,003号和第7,132,281号，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。
另外的CTLA-4抑制剂包括但不限于以下：通常由于经活化而能够破坏CD28抗原结合其同源配体的能力、抑制CTLA-4结合其同源配体的能力、增强通过共刺激路径的T细胞反应、破坏B7结合CD28和/或CTLA-4的能力、破坏B7活化共刺激路径的能力、破坏CD80结合CD28和/或CTLA-4的能力、破坏CD80活化共刺激路径的能力、破坏CD86结合CD28和/或CTLA-4的能力、破坏CD86活化共刺激路径的能力和破坏共刺激路径的任何抑制剂。这必定包括：CD28、CD80、CD86、CTLA-4以及共刺激路径的其他成员的小分子抑制剂；针对CD28、CD80、CD86、CTLA-4以及共刺激路径的其他成员的抗体；针对CD28、CD80、CD86、CTLA-4以及共刺激路径的其他成员的反义分子；针对CD28、CD80、CD86、CTLA-4以及共刺激路径的其他成员的阿德奈汀；CD28、CD80、CD86、CTLA-4以及共刺激路径的其他成员的RNAi抑制剂(单链和双链)；以及其他CTLA-4抑制剂。
在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂以如下Kd结合CTLA-4，该Kd为约10-6M以下、10-7M以下、10-8M以下、10-9M以下、10-10M以下、10-11M以下、10-12M以下，例如在10-13M与10-16M之间，或在具有任何两个前述值作为端点的任何范围内。在一些实施方式中，当使用相同分析比较时，CTLA-4抑制剂结合CTLA-4的Kd不超过伊匹木单抗的Kd的10倍。在一些实施方式中，当使用相同分析比较时，CTLA-4抑制剂结合CTLA-4的Kd与伊匹木单抗的Kd大约相同或更小(例如低至多10倍或低至多100倍)。在一些实施方式中，当使用相同分析比较时，与CTLA-4分别与CD80或CD86结合的伊匹木单抗介导的抑制的IC50值相比，CTLA-4抑制剂抑制CTLA-4与CD80或CD86的结合的IC50值高不超过10倍。在一些实施方式中，当使用相同分析比较时，与CTLA-4分别与CD80或CD86结合的伊匹木单抗介导的抑制的IC50值相比，CTLA-4抑制剂抑制CTLA-4与CD80或CD86的结合的IC50值大约相同或更小(例如，低至多10倍或低至多100倍)。
在一些实施方式中，以如下量使用CTLA-4抑制剂，该量足以相对于适合的对照将CTLA-4的表达抑制和/或使CTLA-4的生物活性降低至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％，例如在50％与75％、75％与90％或在90％与100％之间。在一些实施方式中，以如下量使用CTLA-4路径抑制剂，该量足以通过使CTLA-4与CD80、CD86或两者的结合相对于适合的对照减少至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％，例如相对于适合对照减少在50％与75％、在75％与90％或在90％与100％之间来降低CTLA-4的生物活性。在评定或量化所关注的药剂的效应的上下文中的适合对照通常为尚未暴露于所关注的药剂(例如CTLA-4路径抑制剂)或用该药剂处理的相当的生物系统(例如细胞或受试者)(或已暴露于可忽略量或用可忽略量进行处理)。在一些实施方式中，生物系统可充当其自身的对照，例如可在暴露于药剂或用药剂处理之前评定生物系统并与开始或结束暴露或处理之后的状态进行比较。在一些实施方式中，可使用历史对照。
在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂为伊匹木单抗(可自Bristol-Myers SquibbCo.以Yervoy商购)或其生物类似物、抗原结合片段、缀合物或变体。如本领域中已知，伊匹木单抗指抗CTLA-4抗体，一种来源于具有编码重链和轻链的人基因以产生功能性人谱系的转基因小鼠的完全人IgG1κ抗体。伊匹木单抗也可通过其CAS登记号477202-00-9和在PCT公开第WO 01/14424中提及，该公开出于所有目的以全文引用的方式并入。其以抗体10DI的形式公开。特别地，伊匹木单抗含有轻链可变区和重链可变区(具有包括SEQ ID NO：211的轻链可变区，具有包括SEQ ID NO：210的重链可变区)。伊匹木单抗的药物组合物包括含有伊匹木单抗和一种以上稀释剂、媒剂或赋形剂的所有药学上可接受的组合物。含有伊匹木单抗的药物组合物的示例描述于国际专利申请公开第WO 2007/67959号中。伊匹木单抗可静脉内(IV)施用。
在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂包含SEQ ID NO：208所示的重链和SEQ ID NO：209所示的轻链。在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂包含分别具有SEQ ID NO：208和SEQ IDNO：209中所示的序列的重链和轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：208和SEQ IDNO：209中所示序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：208和SEQ ID NO：209中所示序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：208和SEQ ID NO：209中所示序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：208和SEQ ID NO：209中所示序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：208和SEQ ID NO：209中所示序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂包含伊匹木单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂重链可变区(VH)包括SEQ ID NO：210中所示的序列，CTLA-4抑制剂轻链可变区(VL)包括SEQ ID NO：211中所示的序列，或其保守性氨基酸取代。在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：211中所示序列具有至少99％同一性的VH区和VL区。在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：211中所示序列具有至少98％同一性的VH区和VL区。在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：211中所示序列具有至少97％同一性的VH区和VL区。在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQID NO：210和SEQ ID NO：211中所示序列具有至少96％同一性的VH区和VL区。在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：211中所示序列具有至少95％同一性的VH区和VL区。
在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂包含分别具有SEQ ID NO：212、SEQ ID NO：213和SEQ ID NO：214中所示的序列或其保守性氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域；和分别具有SEQ ID NO：215、SEQ ID NO：216和SEQ ID NO：217中所示的序列或其保守性氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。在一些实施方式中，抗体竞争以与以下结合和/或结合以下：CTLA-4上与任何前述抗体相同的表位。
在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂为药物管理机构参考伊匹木单抗批准的CTLA-4生物类似物单克隆抗体。在一些实施方式中，生物类似物包括抗CTLA-4抗体，该抗CTLA-4抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其相较于该参考药品或参考生物产品包含一个以上翻译后修饰，该参考药品或参考生物产品为伊匹木单抗。在一些实施方式中，一个以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。伊匹木单抗的氨基酸序列阐述于表23中。在一些实施方式中，生物类似物为获得授权或申请授权的抗CTLA-4抗体，其中该抗CTLA-4抗体提供在一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，该参考药品或参考生物产品为伊匹木单抗。抗CTLA-4抗体可获得药物管理机构，例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施方式中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，该参考药品或参考生物产品为伊匹木单抗。在一些实施方式中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，该参考药品或参考生物产品为伊匹木单抗。
表23：伊匹木单抗的氨基酸序列
在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂为伊匹木单抗或其生物类似物，伊匹木单抗以约0.5mg/kg至约10mg/kg的剂量施用。在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂为伊匹木单抗或其生物类似物，伊匹木单抗以如下剂量施用：约0.5mg/kg、约1mg/kg、约1.5mg/kg、约2mg/kg、约2.5mg/kg、约3mg/kg、约3.5mg/kg、约4mg/kg、约4.5mg/kg、约5mg/kg、约5.5mg/kg、约6mg/kg、约6.5mg/kg、约7mg/kg、约7.5mg/kg、约8mg/kg、约8.5mg/kg、约9mg/kg、约9.5mg/kg或约10mg/kg。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始伊匹木单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始伊匹木单抗施用。
在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂为伊匹木单抗或其生物类似物，其中伊匹木单抗以约200mg至约500mg的剂量施用。在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂为伊匹木单抗或其生物类似物，伊匹木单抗以如下剂量施用：约200mg、约220mg、约240mg、约260mg、约280mg、约300mg、约320mg、约340mg、约360mg、约380mg、约400mg、约420mg、约440mg、约460mg、约480mg或约500mg。在一些实施方式中，在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始伊匹木单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始伊匹木单抗施用。
在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂为伊匹木单抗或其生物类似物，每2周、每3周、每4周、每5周或每6周施用伊匹木单抗。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始伊匹木单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始伊匹木单抗施用。
在一些实施方式中，施用伊匹木单抗以治疗不可切除性或转移性黑色素瘤。在一些实施方式中，每3周以约mg/kg施用伊匹木单抗，最多4次剂量，以治疗不可切除性或转移性黑色素瘤。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始伊匹木单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始伊匹木单抗施用。
在一些实施方式中，施用伊匹木单抗以辅助治疗黑色素瘤。在一些实施方式中，每3周以约10mg/kg施用伊匹木单抗，4次剂量，随后每12周施用10mg/kg至多3年，以辅助治疗黑色素瘤。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始伊匹木单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始伊匹木单抗施用。
在一些实施方式中，施用伊匹木单抗以治疗晚期肾细胞癌。在一些实施方式中，每3周以约1mg/kg施用伊匹木单抗，紧接着在同一天施用3mg/kg纳武单抗，4次剂量，以治疗晚期肾细胞癌。在一些实施方式中，在完成组合的4次剂量之后，可根据标准给药方案针对晚期肾细胞癌和/或肾细胞癌以单一试剂形式施用纳武单抗。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始伊匹木单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始伊匹木单抗施用。
在一些实施方式中，施用伊匹木单抗以治疗高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷型(dMMR)转移性结肠直肠癌。在一些实施方式中，每3周经30分钟以约1mg/kg静脉内施用伊匹木单抗，紧接着在同一天经30分钟静脉内施用3mg/kg纳武单抗，4次剂量，以治疗高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷型(dMMR)转移性结肠直肠癌。在一些实施方式中，在完成组合物的4次剂量之后，如根据标准给药方案所推荐针对高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷型(dMMR)转移性结肠直肠癌以单一试剂形式施用纳武单抗。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始伊匹木单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始伊匹木单抗施用。
在一些实施方式中，施用伊匹木单抗以治疗肝细胞癌。在一些实施方式中，每3周经30分钟静脉内施用约3mg/kg伊匹木单抗，紧接着在同一天经30分钟静脉内施用1mg/kg纳武单抗，4次剂量，以治疗肝细胞癌。在一些实施方式中，在完成组合的4次剂量之后，根据标准给药方案针对肝细胞癌以单一试剂形式施用纳武单抗。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始伊匹木单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始伊匹木单抗施用。
在一些实施方式中，施用伊匹木单抗以治疗转移性非小细胞肺癌。在一些实施方式中，每6周施用约1mg/kg伊匹木单抗，每2周施用3mg/kg纳武单抗，以治疗转移性非小细胞肺癌。在一些实施方式中，每6周施用约1mg/kg伊匹木单抗，加上每3周360mg纳武单抗与2个周期的含铂双重化疗，以治疗转移性非小细胞肺癌。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始伊匹木单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始伊匹木单抗施用。
在一些实施方式中，施用伊匹木单抗以治疗恶性胸膜间皮瘤。在一些实施方式中，每6周施用约1mg/kg伊匹木单抗且每3周施用360mg纳武单抗，以治疗恶性胸膜间皮瘤。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始伊匹木单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始伊匹木单抗施用。
曲美单抗(也称为CP-675,206)为完全人IgG2单克隆抗体且CAS编号为745013-59-6。曲美单抗在美国专利第6,682,736号(以引用的方式并入本文中)中以抗体11.2.1公开。曲美单抗的重链和轻链的氨基酸序列分别阐述于SEQ IND NO:218和219中。已在临床试验中针对治疗包括黑色素瘤和乳腺癌的各种肿瘤研究了曲美单抗；其中，每4或12周以0.01与15mg/kg之间的剂量范围呈单次剂量或多次剂量静脉内施用曲美单抗。在本发明提供的方案中，局部施用，尤其是皮内或皮下施用曲美单抗。皮内或皮下施用的曲美单抗的有效量通常在每人5-200毫克/剂的范围内。在一些实施方式中，曲美单抗的有效量在每人每剂10-150毫克/剂的范围内。在一些特定实施方式中，曲美单抗的有效量为每人约10、25、37.5、40、50、75、100、125、150、175或200毫克/剂。
在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂包含SEQ ID NO：218所示的重链和SEQ ID NO：219所示的轻链。在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂包含分别具有SEQ ID NO：218和SEQ IDNO：219中所示的序列的重链和轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：218和SEQ IDNO：219中所示序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：218和SEQ ID NO：219中所示序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：218和SEQ ID NO：219中所示序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：218和SEQ ID NO：219中所示序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：218和SEQ ID NO：219中所示序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂包含曲美单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂重链可变区(VH)包括SEQ ID NO：220中所示的序列，CTLA-4抑制剂轻链可变区(VL)包括SEQ ID NO：221中所示的序列，或其保守性氨基酸取代。在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：220和SEQ ID NO：221中所示序列具有至少99％同一性的VH区和VL区。在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：220和SEQ ID NO：221中所示序列具有至少98％同一性的VH区和VL区。在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：220和SEQ ID NO：221中所示序列具有至少97％同一性的VH区和VL区。在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ IDNO：220和SEQ ID NO：221中所示序列具有至少96％同一性的VH区和VL区。在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：220和SEQ ID NO：221中所示序列具有至少95％同一性的VH区和VL区。
在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂包含分别具有SEQ ID NO：222、SEQ IDNO：223和SEQ ID NO：224中所示的序列或其保守性氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域；和分别具有SEQ ID NO：225、SEQ ID NO：226和SEQ ID NO：227中所示的序列或其保守性氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。在一些实施方式中，抗体竞争以与以下结合和/或结合以下：CTLA-4上与任何前述抗体相同的表位。
在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂为药物管理机构参考曲美单抗批准的抗CTLA-4生物类似物单克隆抗体。在一些实施方式中，生物类似物包括抗CTLA-4抗体，该抗CTLA-4抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其相较于该参考药品或参考生物产品包含一个以上翻译后修饰，该参考药品或参考生物产品为曲美单抗。在一些实施方式中，一个以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。曲美单抗的氨基酸序列阐述于表24中。在一些实施方式中，生物类似物为获得授权或申请授权的抗CTLA-4抗体，其中该抗CTLA-4抗体提供在一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，该参考药品或参考生物产品为曲美单抗。抗CTLA-4抗体可获得药物管理机构，例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施方式中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，该参考药品或参考生物产品为曲美单抗。在一些实施方式中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，该参考药品或参考生物产品为曲美单抗。
表24：曲美单抗的氨基酸序列
在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂为曲美单抗或其生物类似物，曲美单抗以约0.5mg/kg至约10mg/kg的剂量施用。在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂为曲美单抗或其生物类似物，曲美单抗以如下剂量施用：约0.5mg/kg、约1mg/kg、约1.5mg/kg、约2mg/kg、约2.5mg/kg、约3mg/kg、约3.5mg/kg、约4mg/kg、约4.5mg/kg、约5mg/kg、约5.5mg/kg、约6mg/kg、约6.5mg/kg、约7mg/kg、约7.5mg/kg、约8mg/kg、约8.5mg/kg、约9mg/kg、约9.5mg/kg或约10mg/kg。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始曲美单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始曲美单抗施用。
在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂为曲美单抗或其生物类似物，其中曲美单抗以约200mg至约500mg的剂量施用。在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂为曲美单抗或其生物类似物，曲美单抗以如下剂量施用：约200mg、约220mg、约240mg、约260mg、约280mg、约300mg、约320mg、约340mg、约360mg、约380mg、约400mg、约420mg、约440mg、约460mg、约480mg或约500mg。在一些实施方式中，在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始曲美单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始曲美单抗施用。
在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂为曲美单抗或其生物类似物，每2周、每3周、每4周、每5周或每6周施用曲美单抗。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始曲美单抗施用。在一些实施方式中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始曲美单抗施用。
在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂为来自Agenus的泽弗利单抗或其生物类似物、抗原结合片段、缀合物或变体。泽弗利单抗为完全人单克隆抗体。泽弗利单抗被指定化学文摘社(CAS)登记号2148321-69-9且也称为也称为AGEN1884。泽弗利单抗的制备和特性描述于美国专利第10,144,779号和美国专利申请公开第US2020/0024350A1号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂包含SEQ ID NO：228所示的重链和SEQ ID NO：229所示的轻链。在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂包含分别具有SEQ ID NO：228和SEQ IDNO：229中所示的序列的重链和轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：228和SEQ IDNO：229中所示序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：228和SEQ ID NO：229中所示序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：228和SEQ ID NO：229中所示序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：228和SEQ ID NO：229中所示序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：228和SEQ ID NO：229中所示序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂包含泽弗利单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂重链可变区(VH)包括SEQ ID NO：230中所示的序列，CTLA-4抑制剂轻链可变区(VL)包括SEQ ID NO：231中所示的序列，或其保守性氨基酸取代。在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：230和SEQ ID NO：231中所示序列具有至少99％同一性的VH区和VL区。在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：230和SEQ ID NO：231中所示序列具有至少98％同一性的VH区和VL区。在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：230和SEQ ID NO：231中所示序列具有至少97％同一性的VH区和VL区。在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQID NO：230和SEQ ID NO：231中所示序列具有至少96％同一性的VH区和VL区。在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：230和SEQ ID NO：231中所示序列具有至少95％同一性的VH区和VL区。
在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂包含分别具有SEQ ID NO：231、SEQ ID NO：233和SEQ ID NO：234中所示的序列或其保守性氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域；和分别具有SEQ ID NO：235、SEQ ID NO：236和SEQ ID NO：237中所示的序列或其保守性氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。在一些实施方式中，抗体竞争以与以下结合和/或结合以下：CTLA-4上与任何前述抗体相同的表位。
在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂为药物管理机构参考泽弗利单抗批准的CTLA-4生物类似物单克隆抗体。在一些实施方式中，生物类似物包括抗CTLA-4抗体，该抗CTLA-4抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其相较于该参考药品或参考生物产品包含一个以上翻译后修饰，该参考药品或参考生物产品为泽弗利单抗。在一些实施方式中，一个以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。泽弗利单抗的氨基酸序列阐述于表25中。在一些实施方式中，生物类似物为获得授权或申请授权的抗CTLA-4抗体，其中该抗CTLA-4抗体提供在一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，该参考药品或参考生物产品为泽弗利单抗。抗CTLA-4抗体可获得药物管理机构，例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施方式中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，该参考药品或参考生物产品为泽弗利单抗。在一些实施方式中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，该参考药品或参考生物产品为泽弗利单抗。
表25：泽弗利单抗的氨基酸序列
另外的抗CTLA-4抗体的示例包括但不限于：AGEN1181、BMS-986218、BCD-145、ONC-392、CS1002、REGN4659和ADG116，其为本领域技术人员所知。
在一些实施方式中，抗CTLA-4抗体是以下专利公开中的任一个中所公开的抗CTLA-4抗体：US2019/0048096 A1；US2020/0223907；US2019/0201334；US 2019/0201334；US2005/0201994；EP 1212422 B1；WO 2018/204760；WO 2018/204760；WO 2001/014424；WO2004/035607；WO 2003/086459；WO 2012/120125；WO 2000/037504；WO 2009/100140；WO2006/09649；WO2005092380；WO 2007/123737；WO 2006/029219；WO 2010/0979597；WO2006/12168；和WO1997020574，其各自以引用的方式并入本文中。另外的CTLA-4抗体描述于以下中：美国专利第5,811,097号、第5,855,887号、第6,051,227号和第6,984,720号；PCT公开第WO 01/14424号和第WO 00/37504号；和美国公开第2002/0039581号和第2002/086014号；和/或美国专利第5,977,318号、第6,682,736号、第7,109,003号和第7,132,281号，其各自以引用的方式并入本文中。在一些实施方式中，抗CTLA-4抗体是例如公开于以下中的抗体：WO 98/42752；美国专利第6,682,736号和第6,207,156号；Hurwitz等人,《美国国家科学院院刊》,1998,95,10067-10071(1998)；Camacho等人,《临床肿瘤学杂志》,2004,22,145(摘要编号2505(2004)(抗体CP-675206)；或Mokyr等人,《癌症研究》,1998、58,5301-5304(1998)，其各自以引用的方式并入本文中。
在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂是如WO 1996/040915(以引用的方式并入本文中)中所公开的CTLA-4配体。
在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂是CTLA-4表达的核酸抑制剂。例如，抗CTLA-4RNAi分子可呈以下中所描述的分子形式：PCT公开第WO 1999/032619号和第WO 2001/029058号；美国公开第2003/0051263号、第2003/0055020号、第2003/0056235号、第2004/265839号、第2005/0100913号、第2006/0024798号、第2008/0050342号、第2008/0081373号、第2008/0248576号和第2008/055443号；和/或美国专利第6,506,559号、第7,282,564号、第7,538,095号和第7,560,438号(以引用的方式并入本文中)。在一些情况下，抗CTLA-4RNAi分子呈在欧洲专利第EP 1309726号(以引用的方式并入本文中)中描述的双链RNAi分子形式。在一些情况下，抗CTLA-4RNAi分子呈在美国专利第7,056,704号和第7,078,196号(以引用的方式并入本文中)中描述的双链RNAi分子形式。在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂是国际专利申请公开第WO 2004/081021号(以引用的方式并入本文中)中所描述的适体。
在其他实施方式中，本发明的抗CTLA-4RNAi分子在美国专利第5,898,031号、第6,107,094号、第7,432,249号和第7,432,250号以及欧洲申请案第EP 0928290号(以引用的方式并入本文中)中描述的RNA分子。
3.患者的淋巴细胞耗尽预调节
在一些实施方式中，本发明包括一种用TIL群治疗癌症的方法，其中，患者在输注根据本公开的TIL之前经非骨髓清除式化疗预治疗。在一些实施方式中，本发明包括用于治疗已用非骨髓清除式化疗预治疗的患者的癌症的TIL群。在一些实施方式中，TIL群通过输注施用。在一些实施方式中，非骨髓清除式化疗为环磷酰胺60mg/kg/天进行2天(在TIL输注前第27天和第26天)和氟达拉滨25mg/m2/天进行5天(在TIL输注前第27天至第23天)。在一些实施方式中，在根据本公开的非骨髓清除式化疗和TIL输注(第0天)之后，患者每8小时静脉内接受720,000IU/kg IL-2(阿地白介素，可以PROLEUKIN商购)的静脉内输注以达到生理耐受。在某些实施方式中，TIL群用于与IL-2组合治疗癌症，其中IL-2在TIL群之后施用。
实验发现表明，在过继性转移肿瘤特异性T淋巴细胞之前，淋巴细胞耗尽通过消除调节性T细胞且竞争免疫系统的元件(『细胞因子库』)在增强治疗功效方面发挥关键作用。因此，本发明的一些实施方式在引入本发明的TIL之前在患者身上采用淋巴细胞耗尽步骤(有时也称为“免疫抑制性调节”)。
通常而言，使用氟达拉滨或环磷酰胺(活性形式称作马磷酰胺)以及它们的组合的施用实现淋巴细胞耗尽。此类方法描述于Gassner等人,《癌症免疫学和免疫治疗》2011,60,75-85、Muranski等人,《自然临床实践肿瘤学》,2006,3,668-681、Dudley等人,《临床肿瘤学杂志》2008,26,5233-5239和Dudley等人,《临床肿瘤学杂志》2005,23,2346-2357中，所有该文献以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方式中，氟达拉滨以0.5μg/mL至10μg/mL氟达拉滨的浓度施用。在一些实施方式中，氟达拉滨以1μg/mL氟达拉滨的浓度施用。在一些实施方式中，施用氟达拉滨治疗1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天。在一些实施方式中，氟达拉滨以10mg/kg/天、15mg/kg/天、20mg/kg/天、25mg/kg/天、30mg/kg/天、35mg/kg/天、40mg/kg/天或45mg/kg/天的剂量施用。在一些实施方式中，氟达拉滨治疗以35mg/kg/天施用2至7天。在一些实施方式中，氟达拉滨治疗以35mg/kg/天施用4至5天。在一些实施方式中，氟达拉滨治疗以25mg/kg/天施用4至5天。
在一些实施方式中，通过施用环磷酰胺获得浓度为0.5μg/mL至10μg/mL的环磷酰胺的活性形式马磷酰胺。在一些实施方式中，通过施用环磷酰胺获得浓度为1μg/mL的环磷酰胺的活性形式马磷酰胺。在一些实施方式中，施用环磷酰胺治疗1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天。在一些实施方式中，环磷酰胺以100mg/m2/天、150mg/m2/天、175mg/m2/天、200mg/m2/天、225mg/m2/天、250mg/m2/天、275mg/m2/天或300mg/m2/天的剂量施用。在一些实施方式中，环磷酰胺静脉内(即i.v.)施用。在一些实施方式中，环磷酰胺治疗以35mg/kg/天施用2至7天。在一些实施方式中，环磷酰胺治疗以250mg/m2/天静脉内施用4至5天。在一些实施方式中，环磷酰胺治疗以250mg/m2/天静脉内施用4天。
在一些实施方式中，通过将氟达拉滨和环磷酰胺一起施用给患者进行淋巴细胞耗尽。在一些实施方式中，经4天以25mg/m2/天静脉内施用氟达拉滨且以250mg/m2/天静脉内施用环磷酰胺。
在一些实施方式中，通过以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天，随后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨五天来进行淋巴细胞耗尽。
在一些实施方式中，通过以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天和以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨五天来进行淋巴细胞耗尽，其中，在前两天施用环磷酰胺和氟达拉滨两者，在总计五天中进行淋巴细胞耗尽。
在一些实施方式中，通过以约50mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天和以约25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨五天来进行淋巴细胞耗尽，其中，在前两天施用环磷酰胺和氟达拉滨两者，在总计五天中进行淋巴细胞耗尽。
在一些实施方式中，通过以约50mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天和以约20mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨五天来进行淋巴细胞耗尽，其中，在前两天施用环磷酰胺和氟达拉滨两者，在总计五天中进行淋巴细胞耗尽。
在一些实施方式中，通过以约40mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天和以约20mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨五天来进行淋巴细胞耗尽，在前两天施用环磷酰胺和氟达拉滨两者，在总计五天中进行淋巴细胞耗尽。
在一些实施方式中，通过以约40mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天和以约15mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨五天来进行淋巴细胞耗尽，其中，在前两天施用环磷酰胺和氟达拉滨两者，在总计五天中进行淋巴细胞耗尽。
在一些实施方式中，通过两天以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺和以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨，随后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨三天来进行淋巴细胞耗尽。
在一些实施方式中，环磷酰胺与美司钠(mesna)一起施用。在一些实施方式中，美司钠以15mg/kg施用。在一些实施方式中，输注美司钠，若连续输注，则历经24小时，伴随各自环磷酰胺剂量开始，美司钠可经约2小时与环磷酰胺一起输注(第-5天和/或第-4天)，随后在剩余22小时以3mg/kg/小时的速率输注。
在一些实施方式中，淋巴细胞耗尽包括以下步骤：始于在向患者施用第三TIL群之后次日，用IL-2方案治疗患者。
在一些实施方式中，淋巴细胞耗尽包括以下步骤：始于向患者施用第三TIL群当天，用IL-2方案治疗患者。
在一些实施方式中，淋巴细胞耗尽包括5天的预调节治疗。在一些实施方式中，天数指示为第-5天至第-1天，或第0天至第4天。在一些实施方式中，该方案包括第-5天和第-4天(即第0天和第1天)的环磷酰胺。在一些实施方式中，该方案包括第-5天和第-4天(即第0天和第1天)的静脉内环磷酰胺。在一些实施方式中，该方案包括第-5天和第-4天(即第0天和第1天)的60mg/kg静脉内环磷酰胺。在一些实施方式中，环磷酰胺与美司钠一起施用。在一些实施方式中，该方案进一步包括氟达拉滨。在一些实施方式中，该方案进一步包括静脉内氟达拉滨。在一些实施方式中，该方案进一步包括25mg/m2静脉内氟达拉滨。在一些实施方式中，该方案进一步包括第-5天和第-1天(即第0天至第4天)的25mg/m2静脉内氟达拉滨。在一些实施方式中，该方案进一步包括第-5天和第-1天(即第0天至第4天)的25mg/m2静脉内氟达拉滨。
在一些实施方式中，非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺和以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨两天，随后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨五天。
在一些实施方式中，非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天，随后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨五天。
在一些实施方式中，非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天，随后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨三天。
在一些实施方式中，非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺和以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨两天，随后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨三天。
在一些实施方式中，非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺和以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨两天，随后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨一天。
在一些实施方式中，非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天，随后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨三天。
在一些实施方式中，非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺和以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨两天，随后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨三天。
在一些实施方式中，非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案根据表26施用。
表26：示例性淋巴细胞耗尽和治疗方案
天 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4
环磷酰胺60mg/kg X X
美司钠(按需要) X X
氟达拉滨25mg/m2/天 X X X X X
TIL输注 X
在一些实施方式中，非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案根据表27施用。
表27：示例性淋巴细胞耗尽和治疗方案
天 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4
环磷酰胺60mg/kg X X
美司钠(按需要) X X
氟达拉滨25mg/m2/天 X X X X
TIL输注 X
在一些实施方式中，非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案根据表28施用。
表28：示例性淋巴细胞耗尽和治疗方案
天 -3 -2 -1 0 1 2 3 4
环磷酰胺60mg/kg X X
美司钠(按需要) X X
氟达拉滨25mg/m2/天 X X X
TIL输注 X
在一些实施方式中，非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案根据表29施用。
表29：示例性淋巴细胞耗尽和治疗方案
天 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4
环磷酰胺60mg/kg X X
美司钠(按需要) X X
氟达拉滨25mg/m2/天 X X X
TIL输注 X
在一些实施方式中，非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案是根据表30施用。
表30：示例性淋巴细胞耗尽和治疗方案
天 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4
环磷酰胺300mg/kg X X
美司钠(按需要) X X
氟达拉滨30mg/m2/天 X X X X X
TIL输注 X
在一些实施方式中，非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案根据表31施用。
表31：示例性淋巴细胞耗尽和治疗方案
天 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4
环磷酰胺300mg/kg X X
美司钠(按需要) X X
氟达拉滨30mg/m2/天 X X X X
TIL输注 X
在一些实施方式中，非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案根据表32施用。
表32：示例性淋巴细胞耗尽和治疗方案
在一些实施方式中，非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案根据表33施用。
表33：示例性淋巴细胞耗尽和治疗方案
天 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4
环磷酰胺300mg/kg X X
美司钠(按需要) X X
氟达拉滨30mg/m2/天 X X X
TIL输注 X
在一些实施方式中，与前述骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案的实施方式一起使用的TIL输注可以是本文所述的任何TIL组合物，以及添加IL-2疗法和施用如本文所述的协同疗法(例如PD-1和PD-L1抑制剂)。
4.IL-2方案
在一些实施方式中，IL-2方案包括高剂量IL-2方案，其中高剂量IL-2方案包括阿地白介素或其生物类似物或变体，其在施用治疗性TIL群的治疗有效部分之后次日开始静脉内施用，其中阿地白介素或其生物类似物或变体是每八小时使用15分钟推注静脉内输注以0.037mg/kg或0.044mg/kg IU/kg(患者体重)的剂量施用直至耐受，最多为14个剂量。在停药9天后，可重复此时程再施用14次剂量，最多总计28次剂量。在一些实施方式中，IL-2以1、2、3、4、5或6次剂量施用。在一些实施方式中，IL-2以至多6次剂量的最大剂量施用。
在一些实施方式中，IL-2方案包括递减IL-2方案。递减IL-2方案已描述于O'Day等人,《临床肿瘤学杂志》1999,17,2752-61和Eton等人,《癌症》2000,88,1703-9，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施方式中，递减IL-2方案包括经6小时静脉内施用18×106IU/m2，随后经12小时静脉内施用18×106IU/m2，随后经24小时静脉内施用18×106IU/m2，随后经72小时静脉内施用4.5×106IU/m2阿地白介素或其生物类似物或变体。此治疗周期可每28天重复，最多四个周期。在一些实施方式中，递减IL-2方案包括第1天18,000,000IU/m2、第2天9,000,000IU/m2以及第3天和第4天4,500,000IU/m2。
在一些实施方式中，IL-2方案包括低剂量IL-2方案。可使用本领域中已知的任何低剂量IL-2方案，包括Dominguez-Villar和Hafler，《自然免疫学(Nat.Immunology)》2000,19,665-673；Hartemann等人,《柳叶刀糖尿病与内分泌学(Lancet DiabetesEndocrinol.)》2013,1,295-305；以及Rosenzwaig等人,《风湿病年鉴(Ann.Rheum.Dis.)》2019,78,209-217中所描述的低剂量IL-2方案，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一实施方式中，低剂量IL-2方案包括每24小时18×106IU/m2的阿地白介素或其生物类似物或变体，以连续输注施用5天；随后2-6天不施用IL-2疗法；可选地随后再静脉内施用阿地白介素或其生物类似物或变体5天，以每24小时连续输注18×106IU/m2；可选地随后3周不施用IL-2疗法，其后可施用另外的周期。
在一些实施方式中，IL-2以至多6次剂量的最大剂量施用。在一些实施方式中，高剂量IL-2方案适用于小儿用途。在一些实施方式中，使用每8-12小时剂量为600,000国际单位(IU)/kg的阿地白介素，达最多6次剂量。在一些实施方式中，使用每8-12小时剂量为500,000国际单位(IU)/kg的阿地白介素，达最多6次剂量。在一些实施方式中，使用每8-12小时剂量为400,000国际单位(IU)/kg的阿地白介素，达最多6次剂量。在一些实施方式中，使用每8-12小时剂量为500,000国际单位(IU)/kg的阿地白介素，达最多6次剂量。在一些实施方式中，使用每8-12小时剂量为300,000国际单位(IU)/kg的阿地白介素，达最多6次剂量。在一些实施方式中，使用每8-12小时剂量为200,000国际单位(IU)/kg的阿地白介素，达最多6次剂量。在一些实施方式中，使用每8-12小时剂量为100,000国际单位(IU)/kg的阿地白介素，达最多6次剂量。
在一些实施方式中，IL-2方案包括每1、2、4、6、7、14或21天以0.10mg/天至50mg/天的剂量施用聚乙二醇化IL-2。在一些实施方式中，IL-2方案包括每1、2、4、6、7、14或21天以0.10mg/天至50mg/天的剂量施用贝培阿地白介素或其片段、变体或生物类似物。
在一些实施方式中，IL-2方案包括每1、2、4、6、7、14或21天以0.10mg/天至50mg/天的剂量施用THOR-707或其片段、变体或生物类似物。
在一些实施方式中，IL-2方案包括在施用TIL之后施用内维白介素α或其片段、变体或生物类似物。在某些实施方式中，每1、2、4、6、7、14或21天以0.10mg/天至50mg/天剂量向患者施用内维白介素。
在一些实施方式中，IL-2方案包括施用移植至抗体主链上的IL-2片段。在一些实施方式中，IL-2方案包括施用结合IL-2低亲和力受体的抗体细胞因子移植蛋白。在一些实施方式中，抗体细胞因子移植蛋白包含重链可变区(VH)，其包含互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3；轻链可变区(VL)，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3；和IL-2分子或其片段，其移植至VH或VL的CDR中，其中该抗体细胞因子移植蛋白优先于调节性T细胞扩增T效应细胞。在一些实施方式中，抗体细胞因子移植蛋白包含重链可变区(VH)，其包含互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3；轻链可变区(VL)，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3；和IL-2分子或其片段，其移植至VH或VL的CDR中，其中该IL-2分子为突变蛋白，该抗体细胞因子移植蛋白优先于调节性T细胞扩增T效应细胞。在一些实施方式中，IL-2方案包括每1、2、4、6、7、14或21天以0.10mg/天至50mg/天的剂量施用抗体或其片段、变体或生物类似物，该抗体包含选自SEQ ID NO：29和SEQ IDNO：38的重链和选自SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：39的轻链。
在一些实施方式中，本文所述的抗体细胞因子移植蛋白的血清半衰期比野生型IL-2分子(例如但不限于阿地白介素或相当的分子)长。
在一些实施方式中，与前述骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案的实施方式一起使用的TIL输注可以是本文所述的任何TIL组合物，也可包括代替TIL输注的MIL和PBL输注，以及添加IL-2方案和施用如本文所述的协同疗法(例如PD-1和/或PD-L1抑制剂和/或CTLA-4抑制剂)。
5.另外的治疗方法
在其他实施方式中，本发明提供了一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，其包括向该受试者施用治疗有效剂量的如上适用的前述段落中任一项所描述的治疗性TIL群。
在其他实施方式中，本发明提供了一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，其包括向该受试者施用治疗有效剂量的如上适用的前述段落中任一项所描述的TIL组合物。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，该方法经修改以使得在施用治疗有效剂量的如上适用的前述段落中任一项所描述的治疗性TIL群或治疗有效剂量的如上适用的前述段落中任一项所描述的TIL组合物之前，已向受试者施用非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，该方法经修改以使得非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天，随后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨五天。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，该方法经修改以进一步包括以下步骤：在向受试者施用TIL细胞后次日开始，用高剂量IL-2方案治疗受试者。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，该方法经修改以使得高剂量IL-2方案包括每八小时以15分钟推注静脉内输注形式施用600,000或720,000IU/kg直至耐受。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，该方法经修改以使得癌症为实体肿瘤。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的前述段落中任一项所描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，该方法经修改以使得癌症为黑色素瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、结肠直肠癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、神经胶母细胞瘤(包括GBM)、胃肠癌、肾癌或肾细胞癌。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，该方法经修改以使得癌症为黑色素瘤、HNSCC、宫颈癌、NSCLC、神经胶母细胞瘤(包括GBM)和胃肠癌。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，该方法经修改以使得癌症为黑色素瘤。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，该方法经修改以使得癌症为HNSCC。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，该方法经修改以使得癌症为宫颈癌。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，该方法经修改以使得癌症为NSCLC。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，该方法经修改以使得癌症为神经胶母细胞瘤(包括GBM)。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，该方法经修改以使得癌症为胃肠癌。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，该方法经修改以使得癌症为高突变癌症。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，该方法经修改以使得癌症为小儿高突变癌症。
在其他实施方式中，本发明提供了以上适用的任何前述段落中所描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，该方法经修改以使得癌症选自如下：肛门癌、膀胱癌、乳腺癌(包括三阴性乳腺癌)、骨癌、由人乳头状瘤病毒(HPV)引起的癌症、中枢神经系统相关癌症(包括室管膜瘤、神经管胚细胞瘤、神经母细胞瘤、松果体母细胞瘤和原始神经外胚层肿瘤)、宫颈癌(包括鳞状细胞宫颈癌、腺鳞状宫颈癌和子宫颈腺癌)、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、食管胃交界处癌症、胃癌、胃肠癌、胃肠基质瘤、神经胶母细胞瘤、神经胶质瘤、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、喉咽癌、喉癌、鼻咽癌、口咽癌和咽癌)、肾癌、肝癌、肺癌(包括非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌)、黑色素瘤(包括葡萄膜黑色素瘤、脉络膜黑色素瘤、睫状体黑色素瘤或虹膜黑色素瘤)、间皮瘤(包括恶性胸膜间皮瘤)、卵巢癌、胰腺癌(包括胰管腺癌)、阴茎癌、直肠癌、肾癌、肾细胞癌、肉瘤(包括尤文氏肉瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤以及其他骨骼和软组织肉瘤)、甲状腺癌(包含间变性甲状腺癌)、子宫癌和阴道癌。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群，其用于治疗患有癌症的受试者的方法中，方法包括向受试者施用治疗有效剂量的治疗性TIL群。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的TIL组合物，其用于治疗患有癌症的受试者的方法中，方法包括向受试者施用治疗有效剂量的TIL组合物。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群或任何前述段落中描述的TIL组合物，其经修改以使得在向受试者施用治疗有效剂量的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群或如上适用的任何前述段落中描述的TIL组合物之前，已向受试者施用非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群或TIL组合物，其经修改以使得非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天，随后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨五天。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群或任何前述段落中描述的TIL组合物，其经修改以进一步包括以下步骤：在向患者施用TIL细胞后次日开始，用高剂量IL-2方案治疗患者。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群或TIL组合物，其经修改以使得高剂量IL-2方案包括每八小时以15分钟推注静脉内输注形式施用600,000或720,000IU/kg直至耐受。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群或任何前述段落中描述的TIL组合物，其经修改以使得癌症为实体肿瘤。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群或任何前述段落中描述的TIL组合物，其经修改以使得癌症为黑色素瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、结肠直肠癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、神经胶母细胞瘤(包括GBM)、胃肠癌、肾癌或肾细胞癌。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群或任何前述段落中描述的TIL组合物，其经修改以使得癌症为黑色素瘤、HNSCC、宫颈癌、NSCLC、神经胶母细胞瘤(包括GBM)和胃肠癌。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群或任何前述段落中描述的TIL组合物，其经修改以使得癌症为黑色素瘤。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群或TIL组合物，其经修改以使得癌症为HNSCC。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群或TIL组合物，其经修改以使得癌症为宫颈癌。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群或TIL组合物，其经修改以使得癌症为NSCLC。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群或TIL组合物，其经修改以使得癌症为神经胶母细胞瘤(包括GBM)。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群或TIL组合物，其经修改以使得癌症为胃肠癌。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群或TIL组合物，其经修改以使得癌症为高突变癌症。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群或TIL组合物，其经修改以使得癌症为小儿高突变癌症。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中所描述的治疗性TIL群或如上适用的任何前述段落中所描述的TIL组合物，其经修改以使得癌症选自如下：肛门癌、膀胱癌、乳腺癌(包括三阴性乳腺癌)、骨癌、由人乳头状瘤病毒(HPV)引起的癌症、中枢神经系统相关癌症(包括室管膜瘤、神经管胚细胞瘤、神经母细胞瘤、松果体母细胞瘤和原始神经外胚层肿瘤)、宫颈癌(包括鳞状细胞宫颈癌、腺鳞状宫颈癌和子宫颈腺癌)、大肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、食管胃交界处癌症、胃癌、胃肠癌、胃肠基质瘤、神经胶母细胞瘤、神经胶质瘤、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、喉咽癌、喉癌、鼻咽癌、口咽癌和咽癌)、肾癌、肝癌、肺癌(包括非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌)、黑色素瘤(包括葡萄膜黑色素瘤、脉络膜黑色素瘤、睫状体黑色素瘤或虹膜黑色素瘤)、间皮瘤(包括恶性胸膜间皮瘤)、卵巢癌、胰腺癌(包括胰管腺癌)、阴茎癌、直肠癌、肾癌、肾细胞癌、肉瘤(包括尤文氏肉瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤以及其他骨骼和软组织肉瘤)、甲状腺癌(包括退行性甲状腺癌)、子宫癌和阴道癌。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群在治疗受试者的癌症的方法中的用途，方法包括向该受试者施用治疗有效剂量的治疗性TIL群。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的TIL组合物在治疗受试者的癌症的方法中的用途，方法包括向受试者施用治疗有效剂量的TIL组合物。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群或如上适用的任何前述段落中描述的TIL组合物在治疗受试者的癌症的方法中的用途，该方法包括向该受试者施用非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案，随后向该受试者施用治疗有效剂量的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群或治疗有效剂量的如上适用的任何前述段落中描述的TIL组合物。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群或任何前述段落中描述的TIL组合物，其经修改以使得在向受试者施用治疗有效剂量的治疗性TIL群或治疗有效剂量的TIL组合物之前，已向受试者施用非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群或TIL组合物的用途，其经修改以使得非骨髓清除式淋巴细胞耗尽方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天，随后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨五天。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群的用途或如上适用的任何前述段落中描述的TIL组合物的用途，其经修改以进一步包括以下步骤：始于在向患者施用TIL细胞后次日，用高剂量IL-2方案治疗患者。
在其他实施方式中，本发明提供了经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群或TIL组合物的用途，其经修改以使得高剂量IL-2方案包括每八小时以15分钟推注静脉内输注形式施用600,000或720,000IU/kg直至耐受。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群或TIL组合物的用途，其经修改以使得癌症为实体肿瘤。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群或如上适用的任何前述段落中描述的TIL组合物的用途，其经修改以使得癌症为黑色素瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、结肠直肠癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、神经胶母细胞瘤(包括GBM)、胃肠癌、肾癌或肾细胞癌。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群或TIL组合物的用途，其经修改以使得癌症为黑色素瘤、HNSCC、宫颈癌、NSCLC、神经胶母细胞瘤(包括GBM)和胃肠癌。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群或TIL组合物的用途，其经修改以使得癌症为黑色素瘤。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群或TIL组合物的用途，其经修改以使得癌症为HNSCC。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群或TIL组合物的用途，其经修改以使得癌症为宫颈癌。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群或TIL组合物的用途，其经修改以使得癌症为NSCLC。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群或TIL组合物的用途，其经修改以使得癌症为神经胶母细胞瘤(包括GBM)。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群或TIL组合物的用途，其经修改以使得癌症为胃肠癌。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群或TIL组合物的用途，其经修改以使得癌症为高突变癌症。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群或TIL组合物的用途，其经修改以使得癌症为小儿高突变癌症。
在其他实施方式中，本发明提供了如上适用的任何前述段落中所描述的治疗性TIL群或TIL组合物的用途，其经修改以使得癌症选自如下：肛门癌、膀胱癌、乳腺癌(包括三阴性乳腺癌)、骨癌、由人乳头状瘤病毒(HPV)引起的癌症、中枢神经系统相关癌症(包括室管膜瘤、神经管胚细胞瘤、神经母细胞瘤、松果体母细胞瘤和原始神经外胚层肿瘤)、宫颈癌(包括鳞状细胞宫颈癌、腺鳞状宫颈癌和子宫颈腺癌)、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、食管胃交界处癌症、胃癌、胃肠癌、胃肠基质瘤、神经胶母细胞瘤、神经胶质瘤、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、喉咽癌、喉癌、鼻咽癌、口咽癌和咽癌)、肾癌、肝癌、肺癌(包括非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌)、黑色素瘤(包括葡萄膜黑色素瘤、脉络膜黑色素瘤、睫状体黑色素瘤或虹膜黑色素瘤)、间皮瘤(包括恶性胸膜间皮瘤)、卵巢癌、胰腺癌(包括胰管腺癌)、阴茎癌、直肠癌、肾癌、肾细胞癌、肉瘤(包括尤文氏肉瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤以及其他骨骼和软组织肉瘤)、甲状腺癌(包括退行性甲状腺癌)、子宫癌和阴道癌。
实施例
现参考以下实施例描述本文中涵盖的实施方式。实施例仅出于说明的目的提供，本公开决不应理解为限于该实施例，而应理解为涵盖由于本文提供的教导而变得显而易见的任何和所有变化形式。
实施例1：制备用于预REP和REP程序的培养基
本实施例描述用于制备用于涉及来源于包括黑色素瘤在内的各种肿瘤类型的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的培养的方案的组织培养基的程序。此培养基可用于制备本申请和实施例中所描述的任何TIL。
制备CM1
自冷藏库取出以下试剂并使其在37℃水浴中升温：(RPMI1640、人AB血清、200mML-谷氨酰胺)。根据下表34，通过将每一成分添加至适于待过滤体积的0.2μm过滤器单元的顶部来制备CM1培养基。在4℃下储存。
表34：制备CM1
成分 最终浓度 最终体积500ml 最终体积IL
RPMI1640 NA 450mL 900mL
人AB血清，加热灭活10％ 50mL 100mL
200mM L-谷氨酰胺 2 mM 5mL 10mL
55mM BME 55μM 0.5mL 1mL
50mg/mL硫酸庆大霉素 50μg/mL 0.5mL 1mL
使用当天，将所需量的CM1在37℃水浴中预热并添加6000IU/ml IL-2。
根据表35按需要进行另外的补充。
表35：按需要对CM1进行的另外的补充
制备CM2
自冰箱取出已制备的CM1或制备新鲜CM1。自冰箱取出AIM-通过在无菌培养基瓶中混合已制备的CM1与等体积AIM-来制备所需量的CM2。在使用当天向CM2培养基中添加3000IU/mL IL-2。在使用当天用3000IU/mL IL-2制成足够量的CM2。将CM2培养基瓶标记上名称、制备者名字缩写、过滤/制备日期、两周的过期日期，在需要用于组织培养之前于4℃下储存。
制备CM3
在需要使用的当天，制备CM3。CM3与AIM-培养基相同，但在使用当天补充3000IU/mL IL-2。通过向AIM-V瓶或袋中直接添加IL-2储备液，制备满足实验需求的量的CM3。通过轻微振荡进行充分混合。添加至AIM-V之后，立即将瓶子标记上“3000IU/mL IL-2”。若存在过量CM3，则将其在瓶中于4℃下储存，标记上培养基名称、制备者名字缩写、制备培养基的日期及其过期日期(制备后7天)。在4℃下储存7天后，舍弃补充有IL-2的培养基。
制备CM4
CM4与CM3相同，但另外补充2mM GlutaMAXTM(最终浓度)。每1L CM3添加10ml的200mM GlutaMAXTM。通过向AIM-V瓶或袋直接添加IL-2储备液和GlutaMAXTM储备液，制备满足实验需求的量的CM4。通过轻微振荡进行充分混合。添加AIM-V之后，立即将瓶子标记上“3000IL/ml IL-2和GlutaMAX”。若存在过量CM4，则将其储存于处于4℃下的瓶子中，标记上培养基名称、“GlutaMAX”及其过期日期(制备后7天)。在4℃下储存7天后，舍弃补充有IL-2的培养基。
实施例2：IL-2、IL-15和IL-21细胞因子混合物的用途
本实施例描述充当另外的T细胞生长因子的IL-2、IL-15和IL-21细胞因子与实施例A至实施例G的TIL过程组合的用途。
使用本文所述的过程，在开始培养时，在一组实验中可使来自癌细胞(例如黑色素瘤细胞)的TIL在IL-2存在下生长，在另一组中可使该TIL在以IL-2、IL-15和IL-21的组合代替IL-2存在下生长。在预REP完成时，评定培养物的扩增、表型、功能(CD107a+和IFN-γ)和TCR Vβ谱系。IL-15和IL-21描述于本文中别处和Gruijl等人,IL-21促进具有高细胞毒性潜力和低调节T细胞附带扩增的CD27+CD28+肿瘤浸润淋巴细胞的扩增(IL-21promotes theexpansion of CD27+CD28+tumor infiltrating lymphocytes with high cytotoxicpotential and low collateral expansion of regulatory T cells),Santegoets,S.J.,《转化医学杂志(J Transl Med.)》,2013,11:37(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3626797/)中。
结果可表明，相对于仅IL-2条件，可观测到在IL-2、IL-15和IL-21处理条件下，CD4+和CD8+细胞中的TIL扩增增强(>20％)。相对于仅IL-2培养物，在自经IL-2、IL-15和IL-21处理的培养物获得的TIL中，存在以CD8+为主的群体的偏向以及TCR Vβ谱系偏向。与仅经IL-2处理的TIL相比，经IL-2、IL-15和IL-21处理的TIL中的IFN-γ和CD107a升高。
实施例3：对单个批次的经γ照射的外周单核细胞的鉴定
本实施例描述了用于鉴定在本文所述的示例性方法中用作同种异体饲养细胞的单个批次的经γ照射的外周单核细胞(PBMC，又称为单核细胞或MNC)的简化程序。
每个经辐照的MNC饲养细胞批次均由受试者供体制备。在经纯化抗CD3(克隆OKT3)抗体和白介素-2(IL-2)存在下，针对各批次或供体在REP中扩增TIL的能力进行单独筛选。此外，每个批次的饲养细胞均在不添加TIL的情况下进行测试，以验证所接受的γ照射剂量足以使其复制机能不全。
TIL的REP需要经γ照射、生长停滞的MNC饲养细胞。饲养细胞MNC上的膜受体与抗CD3(克隆OKT3)抗体结合且与REP培养瓶中的TIL交联，刺激TIL扩增。由自受试者供体获得的全血的白细胞清除术制备饲养细胞批次。将白细胞清除术产物在Ficoll-Hypaque上进行离心、洗涤、照射且在GMP条件下冷冻保存。
重要的是，不对接受TIL疗法的患者输注活饲养细胞，因为这可能会引起移植物抗宿主疾病(GVHD)。因此，饲养细胞因对其给予γ照射而发生生长抑制，导致双链DNA断裂和在再培养时MNC细胞的细胞存活率丧失。
根据两个准则评估饲养细胞批次：(1)其在共培养中使TIL扩增>100倍的能力，和(2)其复制机能不全。
利用在立式T25组织培养瓶中生长的两个主要预REP TIL株系，以微型REP型式测试饲养细胞批次。针对两个不同的TIL细胞系测试饲养细胞批次，因为各TIL株系具有独特的响应于REP中活化而增殖的能力。作为对照，将在历史上显示满足上述准则的经辐照的许多MNC饲养细胞与测试批次一起操作。
可获得足以测试所有条件和所有饲养细胞批次的相同预REP TIL株系的储备液，以确保在单一实验中测试的所有批次均接受等效测试。
对于测试的各批次饲养细胞，总共存在六个T25培养瓶：预REP TIL株系#1(2个培养瓶)；预REP TIL株系#2(2个培养瓶)；和饲养细胞对照(2个培养瓶)。含有TIL株系#1和#2的培养瓶用于评估饲养细胞批次扩增TIL的能力。饲养细胞对照培养瓶用于评估饲养细胞批次的复制机能不全。
A.实验方案
第-2/3天，TIL株系解冻。制备CM2培养基且使CM2在37℃水浴中保温。制备40mL补充有3000IU/mL IL-2的CM2。保持温热待用。将20mL不含IL-2的预热的CM2置于两个50mL锥形管中的每一个中，用所用TIL株系的名称标记。自LN2储存器取出两个指定的预REP TIL株系，将小瓶转移至组织培养室中。通过将小瓶放入拉链密封的储存袋内置于37℃水浴中解冻直至保留少量冰。
使用无菌移液管，将各小瓶的内含物立即转移至准备好的经标记的50mL锥形管中的20mL CM2中。使用不含IL-2的CM2补足至40mL来洗涤细胞，在400×CF下离心5分钟。抽吸出上清液，再悬浮于补充有3000IU/mL IL-2的5mL温热的CM2中。
一式两份移出小等分试样(20μL)，使用自动细胞计数器进行细胞计数。记录计数。在计数时，将具有TIL细胞的50mL锥形管置于37℃、5％ CO2湿式培养箱中，并将盖松开以允许气体交换。测定细胞浓度，将TIL在补充有3000IU/mL IL-2的CM2中稀释至1×106个细胞/mL。
在37℃湿式培养箱中，按需要在24孔组织培养板中的多个孔中以2毫升/孔进行培养，直至微型REP的第0天。将不同TIL株在单独的24孔组织培养板中培养以避免混淆和潜在的交叉污染。
第0天，开始微型REP。针对待测试的饲养细胞批次的数目制备足够的CM2培养基。(例如为了一次性测试4个饲养细胞批次，制备800mL CM2培养基)。将上述制备的CM2的一部分等分，对其补充3000IU/mL IL-2用于细胞培养。(例如为了一次性测试4个饲养细胞批次，制备具有3000IU/mL IL-2的500mL CM2培养基)。
用各TIL株系独立地操作以防止交叉污染，自培养箱取出具有TIL培养物的24孔板，转移至BSC。
使用无菌移液管或100-1000μL移液器和吸头，自含待使用的TIL的各孔取出约1mL培养基，将其置于24孔组织培养板的未使用孔中。
使用新鲜的无菌移液管或100-1000μL移液器和吸头，将剩余培养基与孔中的TIL混合以使细胞再悬浮，接着将细胞悬浮液转移至标记有TIL批次名称的50mL锥形管中，记录体积。
用保留的培养基洗涤孔，将该体积转移至相同的50mL锥形管中。以400×CF旋转细胞以收集细胞沉淀物。抽出培养基上清液，将细胞沉淀物再悬浮于2-5mL含有3000IU/mLIL-2的CM2培养基中，所使用的体积是基于所收集的孔的数目和沉淀物的大小，即，体积应足以确保浓度>1.3×106个细胞/mL。
使用血清移液管，将细胞悬浮液充分混合，记录体积。取出200μL，使用自动化细胞计数器进行细胞计数。在计数时，将具有TIL细胞的50mL锥形管置于5％ CO2、37℃湿式培养箱中，将盖松开以允许气体交换。记录计数。
自培养箱取出含有TIL细胞的50mL锥形管，使其细胞以1.3×106个细胞/mL的浓度再悬浮于补充有3000IU/mL IL-2的温热CM2中。将50mL锥形管放回培养箱中，将盖松开。
对于第二TIL株系重复以上步骤。
在即将TIL接种至T25培养瓶中进行实验之前，如下所示将TIL按1:10稀释成最终浓度为1.3×105个细胞/mL。
制备MACS GMP CD3纯(OKT3)工作溶液。自4℃冰箱中取出OKT3储备液(1mg/mL)，置于BSC中。在微型REP的培养基中使用最终浓度为30ng/mL OKT3。
在用于实验的各T25培养瓶中，每20mL需要600ng OKT3；此相当于每20mL需要60μL的10μg/mL溶液，或者，对于各饲养细胞批次，所测试的全部6个培养瓶需要360μL。
对于所测试的各饲养细胞批次，对于10μg/mL的工作浓度，制备400μL的1mg/mLOKT3的1:100稀释液(例如为了一次性测试4个饲养细胞批次，制备1600μL的1mg/mL OKT3的1:100稀释液：16μL的1mg/mL OKT3+1.584mL具有3000IU/mL IL-2的CM2培养基)。
制备T25培养瓶。在制备饲养细胞之前，标记各培养瓶并用CM2培养基填充培养瓶。将培养瓶置于37℃、5％ CO2湿式培养箱中以保持培养基温热，同时等待添加剩余组分。在制备饲养细胞后，将各组分添加至各培养瓶中的CM2中。
其他信息提供于表36中。
表36：溶液信息
制备饲养细胞。对于此方案，所测试的每个批次需要至少78×106个饲养细胞。由SDBB冷冻的每个1mL小瓶在冷冻时具有100×106个活细胞。假设自液态N2储存解冻后回收率为50％，建议每个批次至少解冻两个1mL小瓶的饲养细胞，由此估计各REP有100×106个活细胞。替代性地，若供应于1.8mL小瓶中，则仅一个小瓶即提供足够的饲养细胞。
在将饲养细胞解冻之前，对于待测试的各饲养细胞批次，将约50mL不含IL-2的CM2预热。自LN2储存器取出指定饲养细胞批次小瓶，置于拉链储存袋中，并置于冰上。将小瓶在封闭的拉链储存袋中通过浸没于37℃水浴中来解冻。自拉链袋取出小瓶，用70％ EtOH喷洒或擦拭，转移至BSC。
使用移液管，将饲养细胞小瓶的内容物立即转移至50mL锥形管中的30mL温热CM2中。用小体积CM2洗涤小瓶以移除小瓶中的任何残余细胞，以400×CF离心5分钟。抽吸出上清液，再悬浮于4mL温热的加3000IU/mL IL-2的CM2中。取出200μL，使用自动细胞计数器进行细胞计数。记录计数。
将细胞以1.3×107个细胞/mL再悬浮于温热的加3000IU/mL IL-2的CM2中。将TIL细胞自1.3×106个细胞/mL稀释至1.3×105个细胞/mL。
设置共培养物。将TIL细胞自1.3×106个细胞/mL稀释至1.3×105个细胞/mL。将4.5mL CM2培养基添加至15mL锥形管中。自培养箱取出TIL细胞，使用10mL血清移液管使其充分再悬浮。自1.3×106个细胞/mLTIL悬浮液取出0.5mL细胞，添加至15mL锥形管中的4.5mL培养基中。将TIL储备液小瓶放回培养箱中。充分混合。对第二TIL株系重复上述操作。
将具有用于单一饲养细胞批次的预热培养基的培养瓶自培养箱转移至BSC。通过用1mL移液器吸头上下移液数次来混合饲养细胞，将1mL(1.3×107个细胞)转移至该饲养细胞批次的各培养瓶中。向各培养瓶中添加60μL OKT3工作储备液(10μg/mL)。将两个对照培养瓶放回培养箱。
将1mL(1.3×105)的各TIL批次转移至相应标记的T25培养瓶中。将培养瓶放回培养箱中，直立孵育。第5天开始进行干预。对测试的所有饲养细胞批次重复此程序。
第5天，更换培养基。制备含有3000IU/mL IL-2的CM2。每个培养瓶需要10mL。利用10mL移液管，将含有3000IU/mL IL-2的10mL温热的CM2转移至各培养瓶中。将培养瓶放回培养箱中，直立孵育至第7天。对测试的所有饲养细胞批次重复操作。
第7天，收集。自培养箱取出培养瓶，转移至BSC，注意不要破坏在培养瓶底部上的细胞层。在不破坏在培养瓶底部上生长的细胞的情况下，自各测试培养瓶取出10mL培养基，自各对照培养瓶取出15mL培养基。
使用10mL血清移液管，将细胞再悬浮于剩余培养基中，充分混合以打散任何细胞团块。通过移液充分混合细胞悬浮液之后，取出200μL用于细胞计数。使用适当标准操作程序结合自动细胞计数器设备对TIL进行计数。记录第7天的计数。对测试的所有饲养细胞批次重复此程序。
评估饲养细胞对照培养瓶的复制机能不全，第0天开始评估含有TIL的培养瓶的扩增倍数。
第7天，继续饲养细胞对照培养瓶至第14天。在完成第7天饲养细胞对照培养瓶的计数之后，将15mL含有3000IU/mL IL-2的新鲜CM2培养基添加至各对照培养瓶中。将对照培养瓶放回培养箱中且以直立位置孵育至第14天。
第14天，饲养细胞对照培养瓶的非增殖期延长。自培养箱中取出培养瓶且转移至BSC，注意不要破坏在培养瓶底部上的细胞层。在不破坏在培养瓶底部上生长的细胞的情况下，自各对照培养瓶取出约17mL培养基。使用5mL血清移液管，将细胞再悬浮于中剩余培养基中且充分混合以打散任何细胞团块。记录各培养瓶的体积。
通过移液充分混合细胞悬浮液之后，取出200μL用于细胞计数。使用适当标准操作程序结合自动细胞计数器设备对TIL进行计数且记录下计数。对测试的所有饲养细胞批次重复此程序。
B.结果和验收准则方案
结果。γ照射的剂量足以使饲养细胞复制机能不全。预期所有批次均符合评估准则，也展示与第0天相比，在REP培养的第7天剩余的活饲养细胞的总数减少。预期所有饲养细胞批次均符合以下评估准则：到REP培养的第7天，TIL的生长扩增100倍。预期饲养细胞对照培养瓶的第14天计数将持续在第7天发现的非增殖趋势。
验收准则。测试的各批次饲养细胞的每个TIL株系复本均满足以下验收准则。验收准则为两倍，如下文表37中所示。
表37：验收准则
评估当在30ng/mL OKT3抗体和3000IU/mL IL-2存在下培养时，照射剂量是否足以使MNC饲养细胞复制机能不全。通过在REP的第7天和第14天以自动细胞计数测定的总活细胞计数(TVC)来评估复制机能不全。
验收准则为“无生长”，指在第7天和第14天，总活细胞数目相对于REP第0天投入培养的初始活细胞数目未增加。
评估饲养细胞支持TIL扩增的能力。根据活细胞自REP第0天培养开始至REP第7天的扩增倍数来测量TIL生长。在第7天，如通过自动细胞计数所评估，TIL培养物达成最小100倍扩增(即，超过在REP第0天投入培养的总活TIL细胞数目的100倍)。
不符合验收准则的MNC饲养细胞批次的附带测试。在MNC饲养细胞批次不满足以上概述的验收准则中的任一项的情况下，将采取以下步骤对该批次进行再测试，以排除造成此情形的简单实验者错误。
若该批次存在两个以上剩余卫星测试小瓶，则再测试该批次。若该批次存在一个或不存在剩余卫星测试小瓶，则根据上文所列的验收准则，该批次不合格。
为进行鉴定，所讨论批次和对照批次必须达成以上验收准则。在符合该准则之后，将准许使用该批次。
实施例4：制备IL-2储备液
本实施例描述了将经纯化的冻干重组人白介素-2溶解在适合用于其他组织培养方案(包括本申请和实施例中所描述的所有方案)的储备液样本中的过程，包括涉及使用rhIL-2的过程。
程序。制备0.2％乙酸溶液(HAc)。将29mL无菌水转移至50mL锥形管中。向50mL锥形管中添加1mL 1N乙酸。通过倒转管2-3次进行充分混合。通过使用Steriflip过滤器过滤对HAc溶液进行灭菌。
在PBS中制备1％ HSA。在150mL无菌过滤器单元中，向96mL PBS中添加4mL的25％HSA储备液。过滤溶液。在4℃下储存。针对制备的每一小瓶rhIL-2，填写表格。
制备rhIL-2储备液(6×106IU/mL最终浓度)。每一批次的rhIL-2不同，所需信息见于制造商的分析证书(Certificate of Analysis，COA)，例如：1)每个小瓶rhIL-2的质量(mg)、2)rhIL-2的比活性(IU/mg)和3)推荐的0.2％ HAc复原体积(mL)。
使用以下公式计算rhIL-2批次所需的1％ HSA的体积：
例如，根据rhIL-2批次10200121(Cellgenix)的COA，1mg小瓶的比活性为25×106IU/mg。建议在2mL的0.2％ HAc中复原rhIL-2。
用酒精拭物擦拭IL-2小瓶的橡胶塞。使用连接至3mL注射器的16G针，将推荐体积的0.2％ HAc注射至小瓶中。请小心不要在拔出针头时移去塞子。将小瓶倒转3次并旋动直至所有粉末均溶解。小心地取下塞子并搁置于酒精拭物上。向小瓶中添加所计算体积的1％HSA。
储存rhIL-2溶液。对于短期储存(<72小时)，将小瓶储存于4℃。对于长期储存(>72小时)，将小瓶等分成较小体积，在冷冻小瓶中于-20℃下储存待用。避免冷冻/解冻循环。在制备日期之后6个月过期。Rh-IL-2标签包括供应商和目录号、批号、过期日期、操作员首字母缩写、浓度和等分体积。
实施例5：冷冻保存过程
本实施例描述了使用7454型CryoMed速率受控冷冻机(Thermo Scientific)，利用实施例14中所描述的简短密闭程序制备的TIL的冷冻保存过程的方法。
所用设备如下：铝制卡盒支架(与CS750冷冻袋相容)、用于750mL袋的冷冻储存盒、低压(22psi)液氮罐、冰箱、热电偶感测器(带式袋)和CryoStore CS750冷冻袋(OriGenScientific)。
冷冻过程在自成核至-20℃之间提供0.5℃速率，在至-80℃终点温度之间提供1℃/分钟的冷却速率。程序参数如下：步骤1：在4℃下等待；步骤2：以1.0℃/min(样本温度)达到-4℃；步骤3：以20.0℃/min(箱室温度)达到-45℃；步骤4：一10.0℃/min(箱室温度)达到-10.0℃；步骤5：以0.5℃/min(箱室温度)达到-20℃；和步骤6：以1.0℃/min(样本温度)达到-80℃。
实施例6：利用成分确定的培养基的肿瘤扩增过程
上文或下文中所公开的过程可用相应的成分确定的培养基(例如CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM，ThermoFisher；包含例如DM1和DM2)替代CM1和CM2培养基来进行。
实施例7：冷冻保存TIL细胞疗法的示例性GEN 2制备
本实施例描述了根据现行组织优良操作规范(current Good Tissue Practices)和现行优良制造规范(current Good Manufacturing Practices)在G-REX培养瓶中进行Iovance Biotherapeutics公司的TIL细胞疗法过程的cGMP制造。本实施例描述了根据现行组织优良操作规范和现行优良制造规范在G-REX培养瓶中进行TIL细胞疗法过程的示例性cGMP制造。
表38：过程扩增示例性计划
表39：培养瓶体积
第0天CM1培养基制备.在BSC中，将试剂添加至RPMI 1640培养基瓶中。添加以下试剂t，每瓶添加：加热灭活人AB血清(100.0mL)；GlutaMaxTM(10.0mL)；硫酸庆大霉素，50mg/mL(1.0mL)；2-巯基乙醇(1.0mL)
自BSC移除不必要的材料。自BSC取出培养基试剂，将硫酸庆大霉素和HBSS保留在BSC以用于配制洗涤培养基制剂。
解冻IL-2等分试样。解冻一份1.1mL IL-2等分试样(6×106IU/mL)(BR71424)，直至所有冰融化。记录IL-2：批号和有效期
将IL-2储备液转移至培养基中。在BSC中，将1.0mL IL-2储备液转移至所制备的CM1第0天培养基瓶中。添加CM1第0天培养基1瓶和IL-2(6×106IU/mL)1.0mL。
将G-REX100MCS传递至BSC中。将G-REX100MCS(W3013130)无菌转移至BSC中。
将所有完全CM1第0天培养基泵吸至G-REX100MCS培养瓶中。组织碎片锥形管或GRex100MCS。
第0天肿瘤洗涤培养基制备。在BSC中，将5.0mL庆大霉素(W3009832或W3012735)添加至1×500mL HBSS培养基(W3013128)瓶中。每瓶添加：HBSS(500.0mL)；硫酸庆大霉素，50mg/mL(5.0mL)。通过1L 0.22微米过滤器单元(W1218810)制备含有庆大霉素的经过滤HBSS。
第0天肿瘤处理。获得肿瘤样品，立即转移至2-8℃的套件中进行处理。等分肿瘤洗涤培养基。使用8”镊子(W3009771)进行肿瘤洗涤1。自样品瓶取出肿瘤且转移至所制备的“洗涤1”培养皿中。此之后为肿瘤洗涤2和肿瘤洗涤3。测量且评估肿瘤。评定是否观测到整个肿瘤面积的>30％为坏死和/或脂肪组织。适用时，进行清除性分割。若肿瘤较大且观测到>30％组织外表坏死/为脂肪，则通过使用解剖刀和/或镊子的组合移除坏死/脂肪组织，同时保留肿瘤内部结构来进行“清除性分割”。分割肿瘤。使用解剖刀和/或镊子的组合，将肿瘤样品切割成均匀的适当大小的碎片(至多6个中间碎片)。转移中间肿瘤碎片。将肿瘤碎片分割成大小约为3×3×3mm的碎块。储存中间碎片以防脱水。重复中间碎片分割。测定所收集的碎块数目。若仅保留所需组织，则自“有利中间碎片”6孔板选择另外的有利肿瘤碎块来填充最多50个块的液滴(drop)。
准备锥形管。将肿瘤碎块转移至50mL锥形管中。准备用于G-REX100MCS的BSC。自培养箱取出G-REX100MCS。将G-REX100MCS培养瓶无菌传递至BSC中。将肿瘤碎片添加至G-REX100MCS培养瓶中。使碎块均匀分布。
按以下参数孵育G-Rex100MCS：孵育G-REX培养瓶：温度LED显示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5％ CO2。计算：孵育时间；下限＝孵育时间+252小时；上限＝孵育时间+276小时。
过程完成后，舍弃所有剩余已升温培养基并解冻IL-2的等分试样。
第11天-培养基制备.监测培养箱。培养箱参数：温度LED显示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5％ CO2。
在培养箱中使3×1000mL RPMI 1640培养基(W3013112)瓶和3×1000mL AIM-V(W3009501)瓶升温≥30分钟。自培养箱取出RPMI 1640培养基。制备RPMI 1640培养基。过滤培养基。将3×1.1mL的IL-2等分试样(6×106IU/mL)(BR71424)解冻。自培养箱取出AIM-V培养基。将IL-2添加至AIM-V中。将10L Labtainer袋和中继泵转移装置无菌转移至BSC中。
准备10L Labtainer培养基袋。准备Baxa泵。准备好10L Labtainer培养基袋。将培养基泵吸至10L Labtainer中。自Labtainer袋取下自动泵吸管。
混合培养基。轻缓地揉按袋子以进行混合。依据取样计划对培养基进行取样。取出20.0mL培养基并置于50mL锥形管中。准备细胞计数稀释管。在BSC中，向四个15mL锥形管中添加4.5mL标记有“用于细胞计数稀释”和批号的AIM-V培养基。将试剂自BSC转移至2-8℃。准备1L转移包。在BSC外部，将1L转移包熔接(依据过程注释5.11)至附接于所准备的“完全CM2第11天培养基”袋的转移装置上。准备饲养细胞转移包。孵育完全CM2第11天培养基。
第11天-TIL收集.预处理表格。培养箱参数：温度LED显示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5％ CO2。自培养箱取出G-REX100MCS。准备好300mL转移包。将转移包熔接至G-REX100MCS。
准备用于TIL收集的培养瓶且起始TIL收集。收集TIL。使用GatheRex，通过血液过滤器将细胞悬浮液转移至300mL转移包中。检查膜上的贴壁细胞。
冲洗培养瓶膜。闭合G-REX100MCS上的夹子。确保所有夹子闭合。热封TIL和“上清液”转移包。计算TIL悬浮液的体积。准备用于取样的上清液转移包。
抽取Bac-T样本。在BSC中，自1L“上清液”转移包中抽吸约20.0mL上清液，并分配至无菌的50mL锥形管中。
依据取样计划接种BacT。使用适当大小的注射器自所准备的标记有BacT的50mL锥形管取出1.0mL样本且接种于厌氧瓶中。
孵育TIL。将TIL转移包置于培养箱中待用。进行细胞计数和计算。测定所进行的细胞计数的活细胞浓度平均值和存活率平均值。存活率÷2。活细胞浓度÷2。测定计数的上限和下限。下限：活细胞浓度平均值×0.9。上限：活细胞浓度平均值×1.1。确认两个计数在可接受界限内。根据进行的所有四次计数测定平均活细胞浓度。
调整TIL悬浮液的体积：计算取出细胞计数样本后TIL悬浮液的经调整体积。总TIL细胞体积(A)。取出的细胞计数样本的体积(4.0mL)(B)经调整的TIL细胞总体积C＝A-B。
计算活TIL细胞总数。平均活细胞浓度*：总体积；总活细胞数：C＝A×B。
流式细胞术的计算：若总活TIL细胞计数≥4.0×107，则计算获得用于流式细胞术样本的1.0×107个细胞的体积。
流式细胞术所需的活细胞总数：1.0×107个细胞。流式细胞术所需的细胞体积：活细胞浓度除以1.0×107个细胞A。
计算等于2.0×108个活细胞的TIL悬浮液的体积。按需要，计算待取出的过量TIL细胞体积，取出过量TIL并按需要将TIL置于培养箱中。计算按需要取出的过量TIL总量。
计算添加至供冷冻的具有靶细胞浓度的过量TIL细胞的CS-10培养基的量为1.0×108个细胞/mL。按需要，对过量TIL离心。观测锥形管并添加CS-10。
填充小瓶。将1.0mL细胞悬浮液等分至适当大小的冷冻小瓶中。将剩余体积等分至适当大小的冷冻小瓶中。若体积≤0.5mL，则将CS10添加至小瓶中，直至体积为0.5mL。
计算获得供冷冻保存的1×107个细胞所需的细胞体积。取出样本以进行冷冻保存。将TIL置于培养箱中。
样本的冷冻保存。观测锥形管，缓慢添加CS-10并记录所添加的CS10的体积0.5mL。
第11天-饲养细胞获得饲养细胞。自LN2冷冻机获得至少两个不同批号的3袋饲养细胞。在准备解冻之前将细胞保存于干冰上。准备水浴或cryotherm低温储存系统。在37.0±2.0℃水浴或cytotherm低温储存系统处解冻饲养细胞约3至5分钟或直至冰刚好消失。自培养箱取出培养基。合并解冻的饲养细胞。将饲养细胞添加至转移包。将饲养细胞自注射器分配至转移包中。对合并的饲养细胞进行混合，标记转移包。
计算转移包中饲养细胞悬浮液的总体积。取出细胞计数样本。对各样本使用单独的3mL注射器，使用无针注射口自饲养细胞悬浮液转移包抽吸4×1.0mL细胞计数样本。将每个样本等分至经标记的冷冻小瓶中。进行细胞计数，测定倍增因子，选定方案并输入倍增因子。测定所进行的细胞计数的活细胞浓度平均值和存活率平均值。测定计数的上限和下限，并确认其在界限内。
调整饲养细胞悬浮液的体积。计算取出细胞计数样本后饲养细胞悬浮液的经调整体积。计算活饲养细胞总数。按需要，获得另外的饲养细胞。按需要，解冻另外的饲养细胞。将第4个饲养细胞袋置于拉链袋中，在37.0±2.0℃水浴或cytotherm低温储存系统中解冻约3至5分钟并合并另外的饲养细胞。测量体积。测量注射器中饲养细胞的体积并记录在下面(B)。计算饲养细胞的新的总体积。将饲养细胞添加至转移包。
按需要，制备稀释液，将4.5mL AIM-V培养基添加至四个15mL锥形管中。准备细胞计数。对各样本使用单独的3mL注射器，使用无针注射口自饲养细胞悬浮液转移包取出4×1.0mL细胞计数样本。进行细胞计数和计算。根据进行的所有四次计数测定平均活细胞浓度。调整饲养细胞悬浮液的体积，计算取出细胞计数样本后饲养细胞悬浮液的经调整体积。饲养细胞总体积减去取出的4.0mL。计算获得5×109个活饲养细胞所需的饲养细胞悬浮液的体积。计算过量饲养细胞体积。计算待取出的过量饲养细胞的体积。取出过量饲养细胞。
使用1.0mL注射器和16G针头，吸取0.15mL OKT3且添加OKT3。热封饲养细胞悬浮液转移包。
第11天G-REX填充和接种设置G-REX500MCS.自培养箱取出“完全CM2第11天培养基”并将培养基泵吸至G-REX500MCS中。将4.5L培养基泵吸至G-REX500MCS中，填充至培养瓶上标示的线处。按需要，热封并孵育培养瓶。将饲养细胞悬浮液转移包熔接至G-REX500MCS。将饲养细胞添加至G-REX500MCS。热封。将TIL悬浮液转移包熔接至培养瓶。将TIL添加至G-REX500MCS。热封。将G-REX500MCS在37.0±2.0℃下孵育，CO2百分比：5.0±1.5％ CO2。
计算孵育范围。进行计算以测定在第16天自培养箱取出G-REX500MCS的适当时间。下限：孵育时间+108小时。上限：孵育时间+132小时。
第11天过量TIL冷冻保存.适用：冷冻过量TIL小瓶。验证在冷冻前已设定CRF。进行冷冻保存。将小瓶自速率受控冷冻机转移至适当储存容器中。完成冷冻后，将小瓶自CRF转移至适当储存容器。将小瓶转移至适当储存容器中。记录在LN2中的储存位置。
第16天培养基制备。预热AIM-V培养基。计算使培养基袋1、2和3的培养基升温的时间。确保所有袋子已升温12与24小时之间的时间。设定用于上清液的10LLabtainer。使用鲁尔接头将流体泵转移装置的较大直径端附接至10L Labtainer袋的一个凹形端口。设定用于上清液的10L Labtainer并进行标记。设定用于上清液的10L Labtainer。确保在自BSC之前取出前闭合所有夹子。注意：在TIL收集期间使用上清液袋，该TIL收集可与培养基制备并行地进行。
解冻IL-2。每袋CTS AIM V培养基解冻5×1.1mL IL-2等分试样(6×106IU/mL)(BR71424)，直至所有冰融化。等分100.0mLGlutaMaxTM。将IL-2添加至GlutaMaxTM中。准备用于配制的CTS AIM V培养基袋。准备用于配制的CTS AIM V培养基袋。多级Baxa泵。准备配制培养基。将GlutaMax+IL-2泵吸至袋子中。监测的参数：温度LED显示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5％ CO2。使完全CM4第16天培养基升温。制备稀释液。
第16天REP分流监测培养箱参数：温度LED显示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5％ CO2。自培养箱取出G-REX500MCS。准备1L转移包，标记为TIL悬浮液并称重为1L。
G-REX500MCS的体积减少。将约4.5L培养物上清液自G-REX500MCS转移至10LLabtainer。
准备用于TIL收集的培养瓶。取出上清液后，闭合通向红色管线的所有夹子。
开始TIL收集。剧烈敲击培养瓶并旋动培养基以使细胞剥离，确保所有细胞剥落。
TIL收集。松开通向TIL悬浮液转移包的所有夹子。使用GatheRex，将细胞悬浮液转移至TIL悬浮液转移包中。注意：确保维持边缘倾斜，直至收集到所有细胞和培养基。检查膜上的贴壁细胞。冲洗培养瓶膜。闭合G-REX500MCS上的夹子。热封含有TIL的转移包。热封含有上清液的10L Labtainer。记录含细胞悬浮液的转移包的重量并计算悬浮液体积。准备用于样本取出的转移包。自细胞上清液取出测试样本。
无菌性和BacT测试取样.自所准备的15mL标记BacT的锥形管取出1.0mL样本。取出细胞计数样本。在BSC中，针对每个样本使用单独的3mL注射器，自“TIL悬浮液”转移包取出4×1.0mL细胞计数样本。
取出支原体样本。使用3mL注射器，自TIL悬浮液转移包取出1.0mL并置于准备的标记有“支原体稀释剂”的15mL锥形管中。
准备用于接种的转移包。将TIL置于培养箱中。自BSC取出细胞悬浮液，置于培养箱中待用。进行细胞计数和计算。首先通过将0.5mL细胞悬浮液添加至所制备的4.5mL AIM-V培养基中来对细胞计数样本进行稀释，得到稀释度为1:10。测定所进行的细胞计数的活细胞浓度平均值和存活率平均值。测定计数的上限和下限。注意：稀释可以根据预期的细胞浓度进行调整。由所进行的全部四次计数测定平均活细胞浓度。调整TIL悬浮液的体积。计算取出细胞计数样本后TIL悬浮液的经调整体积。总TIL细胞体积减去取出的用于测试的5.0mL。
计算活TIL细胞总数。计算待接种的培养瓶的总数目。注意：待接种的G-REX500MCS培养瓶的最大数目为五。若计算的待接种培养瓶的数目超过五，则使用可用的所有体积的细胞悬浮液接种仅五个培养瓶。
计算用于继代培养的培养瓶数目。计算除所准备的袋子以外还需要的培养基袋的数目。按计算需要每两个G-REX-500M培养瓶准备一个10L的“CM4第16天培养基”袋。继续接种第一个GREX-500M培养瓶，同时制备另外的培养基并使其升温。准备测定的所计算数目的另外的培养基袋并使其升温。填充G-REX500MCS。准备泵吸培养基并将4.5L培养基泵吸至G-REX500MCS中。热封。重复填充。孵育培养瓶。计算待添加至新G-REX500MCS培养瓶中的TIL悬浮液的目标体积。若计算的培养瓶数目超过五，则使用所有体积的细胞悬浮液接种仅五个培养瓶。准备用于接种的培养瓶。自培养箱取出G-REX500MCS。准备用于泵吸的G-REX500MCS。除较大过滤器管线外，闭合所有夹子。自培养箱取出TIL。制备用于接种的细胞悬浮液。将“TIL悬浮液”转移包无菌熔接(依据过程注释5.11)至泵入口管线。将TIL悬浮液袋置于称上。
用TIL悬浮液接种培养瓶。将所计算体积的TIL悬浮液泵吸至培养瓶中。热封。填充剩余培养瓶。
监测培养箱。培养箱参数：温度LED显示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5％CO2。孵育培养瓶。
测定在第22天自培养箱取出G-REX500MCS的时间范围。
第22天洗涤缓冲液制备.准备10L Labtainer袋。在BSC中，通过鲁尔接头将4”血浆转移装置附接至10L Labtainer袋。准备10L Labtainer袋。在转移出BSC之前，闭合所有夹子。注意：为每两个待收集的G-REX500MCS培养瓶准备一个10L Labtainer袋。将Plasmalyte泵吸至3000mL袋中，通过翻转泵并操纵袋子的位置而自3000mL Origen袋移除空气。将25％的人白蛋白添加至3000mL袋中。获得最终体积为120.0mL的25％人白蛋白。
制备IL-2稀释剂。使用10mL注射器，在LOVO洗涤缓冲液袋上使用无针注射口取出5.0mL LOVO洗涤缓冲液。将LOVO洗涤缓冲液分配至50mL锥形管中。
等分CRF空白袋LOVO洗涤缓冲液。使用100mL注射器，自无针注入口吸取70.0mLLOVO洗涤缓冲液。
解冻一份1.1mL IL-2(6×106IU/mL)，直至所有冰融化。将50μL IL-2储备液(6×106IU/mL)添加至标记为“IL-2稀释剂”的50mL锥形管中。
冷冻保存准备。将5个冷冻盒置于2-8℃下，以对其进行预调节，以用于最终产物冷冻保存。
制备细胞计数稀释液。在BSC中，向4个单独的15mL锥形管中添加4.5mL已标记批号和“用于细胞计数稀释液”的AIM-V培养基。准备细胞计数。将4个冷冻小瓶标记上小瓶编号(1-4)。将小瓶保存在BSC以供使用。
第22天TIL收集.监测培养箱。培养箱参数：温度LED显示器：37±2.0℃，CO2百分比：5％±1.5％。自培养箱取出G-REX500MCS培养瓶。准备TIL收集袋并进行标记。封闭另外的接头。体积减少：将约4.5L上清液自G-REX500MCS转移至上清液袋。
准备用于TIL收集的培养瓶。开始TIL收集。剧烈敲击培养瓶并旋动培养基以剥离细胞。确保所有细胞剥落。开始TIL收集。松开通向TIL悬浮液收集袋的所有夹子。TIL收集。使用GatheRex，将TIL悬浮液转移至3000mL收集袋中。检查膜上的贴壁细胞。冲洗培养瓶膜。闭合G-Rex500MCS上的夹子，并确保闭合所有夹子。将细胞悬浮液转移至LOVO来源袋中。闭合所有夹子。热封。取出4×1.0mL细胞计数样本。
进行细胞计数。利用NC-200和过程注释5.14进行细胞计数和计算。首先通过将0.5mL细胞悬浮液添加至所制备的4.5mL AIM-V培养基中来对细胞计数样本进行稀释。由此得到1:10稀释度。测定进行细胞计数的细胞的平均存活率、活细胞浓度和总成核细胞浓度。测定计数的上限和下限。测定进行细胞计数的细胞的平均存活率、活细胞浓度和总成核细胞浓度。称量LOVO来源袋。计算活TIL细胞总数。计算成核细胞总数。
制备支原体稀释剂。通过鲁尔样本口自一个上清液袋取出10.0mL并置于15mL锥形管中。
进行“TIL G-REX收集”方案并测定最终产物目标体积。装载一次性套件。取出滤液袋。输入滤液容量。将滤液容器置于实验台上。附接PlasmaLyte。验证已附接PlasmaLyte，观测到PlasmaLyte正在移动。将来源容器附接至导管，验证已附接来源容器。确认PlasmaLyte正在移动。
最终配制和填充。目标体积/袋子计算。计算待配制于空白袋中的CS-10和LOVO洗涤缓冲液的体积。准备CRF空白袋。
计算待添加至最终产物的IL-2的体积。所需最终IL-2浓度(IU/mL)-300IU/mL。IL-2工作储备液：6×104IU/mL。组装连接设备。将4S-4M60无菌熔接至CC2单元接头。将CS750冷冻袋无菌熔接至所制备的线束上。将CS-10袋熔接至4S-4M60的尖端上。在IL-2存在下制备TIL。使用适当大小的注射器，自“IL-2 6×104”等分试样取出测定量的IL-2。标记经配制TIL袋。将经配制TIL袋添加至设备。添加CS10。切换注射器。将约10mL空气吸取至100mL注射器中并更换设备上的60mL注射器。添加CS10。准备CS-750袋。分配细胞。
自最终产物袋移除空气并获得保留物。在填充了最后一个最终产物袋后，即闭合所有夹子。将10mL空气吸取至新的100mL注射器中且更换设备上的注射器。将保留物分配至50mL锥形管中，将管标记为“保留物”和批号。对每个袋子重复空气移除步骤。
准备用于冷冻保存的最终产物，包含目视检查。在冷冻保存之前将冷冻袋保存于降温包上或2-8℃下。
取出细胞计数样本。使用适当大小的移液管，取出2.0mL保留物并置于15mL锥形管中以用于细胞计数。进行细胞计数和计算。注意：仅将一个样本稀释至足够验证稀释度的适当稀释度。将另外的样本稀释至适当稀释因数并继续进行计数。测定所进行的细胞计数的活细胞浓度平均值和存活率平均值。测定计数的上限和下限。注意：可根据预期细胞浓度调整稀释度。测定活细胞浓度平均值和存活率平均值。测定计数的上限和下限。计算IFN-γ。热封最终产物袋。
依据以下示例性取样计划标记并收集样本。
表40：样本计划
无菌性和BacT测试。测试取样。在BSC中，自使用适当大小的注射器收集的保留的细胞悬浮液中取出1.0mL样本，并接种厌氧瓶。对好氧瓶重复以上操作。
最终产物冷冻保存.准备速率受控冷冻机(CRF)。验证已设定CRF。设定CRF探针。将最终产物和样本置于CRF中。测定要达到4℃±1.5℃所需的时间并继续进行CRF运行。完成CRF并储存。完成运行后停止CRF。自CRF取出盒子和小瓶。将盒子和小瓶转移至气相LN2进行储存。记录储存位置。
最终药品的处理和分析包括以下测试：(第22天)通过流式细胞术测定第22天REP的CD3+细胞；(第22天)革兰氏染色法(GMP)；(第22天)通过凝胶凝块LAL分析(GMP)进行细菌内毒素测试；(第16天)BacT无菌性分析(GMP)；(第16天)通过TD-PCR(GMP)检测支原体DNA；可接受的外观特性；(第22天)BacT无菌性分析(GMP)(第22天)；(第22天)IFN-γ分析。也采用如本文所述的其他效力分析来分析TIL产物。
实施例8：GEN 3扩增平台的示例性实施方式
第0天
制备肿瘤洗涤培养基。在开始之前使培养基升温。将5mL庆大霉素(50mg/mL)添加至500mL HBSS瓶中。将5mL肿瘤洗涤培养基添加至15mL锥形瓶中，用于OKT3稀释。准备饲养细胞袋。将饲养细胞无菌转移至饲养细胞袋，在37℃下储存直至使用或冷冻。若在37℃下，则对饲养细胞计数。若冷冻，则解冻接着对饲养细胞计数。
饲养细胞浓度的最佳范围在5×104与5×106个细胞/mL之间。准备四个具有4.5mLAIM-V的锥形管。添加0.5mL细胞级分进行各细胞计数。若总活饲养细胞数≥1×109个细胞，则继续调整饲养细胞浓度。计算自第一个饲养细胞袋取出的饲养细胞体积，以将1×109个细胞添加至第二个饲养细胞袋中。
使用p1000微量移液管，将900μL的肿瘤洗涤培养基转移至OKT3等分试样(100μL)中。使用注射器和无菌技术，吸取0.6mL的OKT3且添加至第二个饲养细胞袋中。将培养基体积调整至2L的总体积。将第二个饲养细胞袋转移至培养箱中。
OKT3制剂详情：OKT3可在小瓶中以100μL等分试样中的原始储备液浓度(1mg/mL)等分且冷冻。每1mL小瓶约10X等分试样。在-80℃下储存。第0天：15μg/培养瓶，即，30ng/mL在500mL-60μL中，最多约1个等分试样。
向标记为过量肿瘤碎块的6孔板的所有孔中添加5mL肿瘤洗涤培养基。保持可用肿瘤洗涤培养基，以进一步用于使肿瘤在分割期间保持水分。将50mL肿瘤洗涤培养基添加至各100mm皮氏培养皿(petri dish)中。
在解剖培养皿盖下用直尺作为参考，将肿瘤分割成27mm3的碎片(3×3×3mm)。分割中间碎片，直至达到60个碎片。根据所产生的最终碎片的数目(每个培养瓶通常60个碎片)对最终碎片的总数目进行计数，准备G-REX-100MCS培养瓶。
在标记为碎片管1至碎片管4的锥形管中保留有利的组织碎片。根据发起的碎片管的数目，计数要接种饲养细胞悬浮液的G-REX-100MCS培养瓶的数目。
自培养箱中取出饲养细胞袋且接种G-REX-100MCS。Label as D0(Day 0).
向G-REX-100MCS中的培养物中添加肿瘤碎片。在无菌条件下，拧开标有肿瘤碎片培养物(D0)1的G-REX-100MCS和标有碎片管的50mL锥形管的盖子。旋转打开的碎片管1，同时轻轻抬起G-REX100MCS的盖子。在旋转的同时，将带有碎片的培养基添加至G-REX100MCS中。记录转移至G-REX100MCS中的碎片的数目。
一旦碎片位于GREX培养瓶的底部，吸取7mL培养基且创建七个1mL等分试样，5mL用于扩增表征，2mL用于无菌样本。将5个等分试样(最终碎片培养上清液)在-20℃下储存进行扩增表征，直至需要。
在一个厌氧BacT/Alert瓶和一个好氧BacT/Alert瓶中各接种1mL最终碎片培养上清液。对取样的各培养瓶重复上述操作。
第7-8天
准备饲养细胞袋。在冷冻时，将饲养细胞袋在37℃水浴中解冻3-5分钟。若冷冻，则对饲养细胞进行计数。饲养细胞浓度的最佳范围在5×104与5×106个细胞/mL之间。制备四个具有4.5mL AIM-V的锥形管。对于每次细胞计数，将0.5mL细胞级分添加至新的冷冻小瓶管中。将样本充分混合且进行细胞计数。
若总活饲养细胞数≥2×109个细胞，则进行下一步骤以调整饲养细胞浓度。计算自第一个饲养细胞袋取出的饲养细胞体积，以将2×109个细胞添加至第二个饲养细胞袋中。
使用p1000微量移液管，将900μL HBSS转移至100μL OKT3等分试样中。通过上下移液3次进行混合。制备两个等分试样。
OKT3制剂详情：可以100μL等分试样形式，以来自小瓶之原始储备液浓度(1mg/mL)将OKT3等分和冷冻。每1mL小瓶约10×等分试样。在-80℃下储存。第7/8天：30μg/培养瓶，即，60ng/mL在500mL-120μl中，最多约2个等分试样。
使用注射器和无菌技术，吸取0.6mL的OKT3且添加至饲养细胞袋中，确保全部添加。将培养基体积调整至2L的总体积。用第二个OKT3等分试样重复上述操作且添加至饲养细胞袋中。将第二个饲养细胞袋转移至培养箱中。
制备具有饲养细胞悬浮液的G-REX100MCS培养瓶。根据第0天产生的G-REX培养瓶的数目记录要处理的G-REX-100MCS培养瓶的数目。自培养箱中取出G-REX培养瓶且自培养箱中取出第二个饲养细胞袋。
在添加饲养细胞悬浮液之前取出上清液。将一个10mL注射器连接至G-REX100培养瓶且吸取5mL培养基。产生五个1mL等分试样：5mL用于扩增表征，将用于扩增表征的5个等分试样(最终碎片培养上清液)在-20℃下储存，直至发起人提出要求。对各G-REX100培养瓶进行标记且重复上述操作。
取决于培养瓶的数目，取得5-20×1mL样本用于表征：
·5mL＝1个培养瓶
·10mL＝2个培养瓶
·15mL＝3个培养瓶
·20mL＝4个培养瓶
继续将饲养细胞接种至G-REX100 MCS中，对各G-REX100 MCS培养瓶重复上述操作。使用无菌转移方法，将500mL的第二个饲养细胞袋按重量(假设1g＝1mL)以重力转移至各G-REX-100MCS培养瓶中且记录量。标记为第7天培养并对各G-REX100培养瓶重复操作。将G-REX-100MCS培养瓶转移至培养箱。
第10-11天
取出第一个G-REX-100MCS培养瓶，无菌条件下，使用10mL注射器取出7mL预处理培养上清液。产生七个1mL等分试样：5mL用于扩增表征，2mL用于无菌样本。
小心地混合培养瓶并使用新的10mL注射器取出10mL上清液，转移至标记为D10/11支原体上清液的15mL管中。
小心地混合培养瓶并使用新的注射器根据待处理的瓶的数量取出以下体积：
·1个培养瓶＝40mL
·2个培养瓶＝20mL/培养瓶
·3个培养瓶＝13.3mL/培养瓶
·4个培养瓶＝10mL/培养瓶
应自所有培养瓶中抽吸总共40mL，合并在标有『第10/11天QC样本』的50mL锥形管中，储存在培养箱中直至需要。进行细胞计数且分配细胞。
将5个等分试样(预处理培养上清液)在≤-20℃下储存进行扩增表征，直至需要。在一个厌氧BacT/Alert瓶和一个好氧BacT/Alert瓶中各接种1mL预处理培养上清液。
继续将细胞悬浮液转移至G-REX-500MCS且针对各G-REX-100MCS重复操作。使用无菌条件，将各G-REX-100MCS的内容物转移至G-REX-500MCS中，监测一次约100mL的流体转移量。当G-REX-100MCS的体积减小至500mL时停止转移。
在转移步骤期间，使用10mL注射器且自G-REX-100MCS吸取10mL细胞悬浮液至注射器中。根据培养中的培养瓶数目，遵循说明书进行操作。若仅有1个培养瓶：使用两个注射器总共取出20mL。若有2个培养瓶：每个培养瓶取出10mL。若有3个培养瓶：每个培养瓶取出7mL。若有4个培养瓶：每个培养瓶取出5mL。将细胞悬浮液转移至一个常见的50mL锥形管中。保持在培养箱中直至细胞计数步骤和QC样本。QC所需的细胞总数为约20e6个细胞：4×0.5mL细胞计数(细胞计数起初未经稀释)。
分析所需的细胞数量如下：
1.最少10×106个细胞用于效力分析，例如本文中所描述的分析，或用于IFN-γ或颗粒酶B分析
2.1×106个细胞用于支原体
3.5×106个细胞用于针对CD3+/CD45+的流式细胞术
将G-REX-500MCS培养瓶转移至培养箱。
制备QC样本。在本实施方式中，分析需要至少15×108个细胞。分析包括：细胞计数和存活率；支原体(1×106个细胞/平均活细胞浓度；)流量(5×106个细胞/平均活细胞浓度；)和IFN-g分析(5×106个细胞-1×106个细胞；IFN-γ分析需要8-10×106个细胞。
计算以10×106个细胞/mL冷冻保存的细胞级分的体积，计算需准备的小瓶的数目
第16-17天
洗涤缓冲液制备(1％ HSA Plasmalyte A)。将HSA和Plasmalyte转移至5L袋中以制备LOVO洗涤缓冲液。使用无菌条件，将总体积为125mL的25％ HSA转移至5L袋中。取出10mL或40mL洗涤缓冲液并转移至『IL-2 6×104IU/mL』管中(若预先制备IL-2，则为10mL，或若新鲜制备IL-2，则为40mL)。
计算添加至Plasmalyte+1％ HSA中的经复原IL-2的体积：经复原的IL-2的体积＝(IL-2的最终浓度×最终体积)/IL-2的比活性(基于标准分析)。IL-2的最终浓度为6×104IU/mL。最终体积为40mL。
取出计算的复原IL-2所需的IL-2的初始体积，转移至『IL-2 6×104IU/mL』管中。将来自预先制备的等分试样的100μL的6×106IU/mL IL-2添加至含有10mL LOVO洗涤缓冲液的标记为『IL-2 6×104IU/mL』的管中。
自G-REX-500MCS培养瓶取出约4500mL上清液。旋转剩余的上清液且将细胞转移至细胞收集池袋中。对所有G-REX-500MCS培养瓶重复操作。
取出60mL上清液且添加至上清液管中以用于质量控制分析，包含支原体检测。在+2-8℃下储存。
细胞收集。对细胞计数，制备四个具有4.5mL AIM-V的15mL锥形管。该管可预先准备。最佳范围＝介于5×104与5×106个细胞/mL之间。(推荐1:10稀释度)。对于1:10稀释度，向预先制备的4500μL AIM V中添加500μL CF。记录稀释因数。
计算LOVO前的TC(总细胞)(存活+死亡)＝
平均总细胞
浓度(LOVO前TC浓度)
(活+死)
X
来源袋的体积
计算LOVO前的TVC(总活细胞)(活)＝
平均总活细胞
浓度(LOVO前TVC)
(活)
X
LOVO来源袋的体积
当总细胞(TC)数目>5×109时，取出5×108个细胞进行冷冻保存，作为MDA保留样本。5×108÷平均TC浓度(步骤14.44)＝要取出的体积。
当总细胞(TC)数目≤5×109时，取出4×106个细胞进行冷冻保存，作为MDA保留样本。4×106÷总TC浓度＝要取出的体积。
当测定总细胞数目时，要取出的细胞数目应允许保留150×109个活细胞。确认LOVO前TVC为5×108或4×106或不适用。计算要取出的细胞体积。
计算袋中剩余的剩余总细胞数。计算LOVO前的TC(总细胞)。[平均总细胞浓度×剩余体积＝剩余的LOVO前TC]
根据剩余的细胞总数目，选择表48中的对应过程。
表41：细胞总数
总细胞： 保留物(mL)
0<细胞总数≤31×109 115
31×109<细胞总数≤71×109 165
71×109<细胞总数≤110×109 215
110×109<细胞总数≤115×109 265
选择对应于所用过程而添加的IL-2的体积。体积计算为：保留物体积×2×300IU/mL＝所需IL-2的IU。所需IL-2的IU/6×104IU/mL＝LOVO后的袋中添加的IL-2的体积。记录添加的所有体积。在冷冻小瓶中获得样本用于进一步分析。
将细胞产物充分混合。密封所有袋以用于进一步处理，适当时包括冷冻保存。
按需要对获得的冷冻小瓶样本进行内毒素、IFN-γ、无菌及其他分析。
实施例9：GEN 2和GEN 3示例性过程
本实施例展示了Gen 2和Gen 3过程。过程Gen 2和Gen 3TIL通常由个体患者通过手术切除肿瘤接着离体扩增得到自体TIL构成。Gen 3过程的起始第一扩增步骤在白介素-2(IL-2)和单克隆抗体OKT3存在下进行细胞培养，该单克隆抗体靶向经辐照的外周血单核细胞(PBMC)的骨架上的T细胞辅助受体CD3。
Gen 2TIL产物的制造由两个阶段组成：1)预快速扩增(预REP)，和2)快速扩增方案(REP)。在预REP期间，将切除的肿瘤切割成≤50个各尺寸为2-3mm的碎片，将该碎片用含血清培养基(含有补充的10％ HuSAB的RPMI 1640培养基)和6,000IU/mL白介素-2(IL-2)培养11天的时间段。在第11天，收集TIL且将其引入大规模二次REP扩增中。REP由以下组成：在5L体积的补充有3000IU/mL rhIL-2的CM2中装载有150μg单克隆抗CD3抗体(OKT3)的含5×109个经辐照的同种异体PBMC饲养细胞的共培养物中活化≤200×106个来自预REP的活细胞，5天。在第16天，将培养物体积减少90％且将细胞级分以≥1×109个活淋巴细胞/培养瓶分至多个G-REX-500培养瓶中，用CM4补足至5L。将TIL再孵育6天。在第22天收集REP，洗涤，配制且冷冻保存，随后在-150℃下运送至临床站点进行输注。
Gen 3TIL产物的制造由三个阶段组成：1)起始第一扩增方案；2)快速第二扩增方案(又称为快速扩增阶段或REP)；和3)继代培养物分流。为了实现起始第一扩增TIL增殖，将所切除的肿瘤切割成≤120个各尺寸为2-3mm的碎片。在起始第一扩增的第0天，在3个100MCS容器中的每一者中，在约100cm2的表面区域上建立约2.5×108个装载有OKT-3的经辐照的同种异体PBMC饲养细胞的饲养细胞层。将肿瘤碎片分布在3个100MCS容器中并培养7天的时间段，各容器含有500mL含血清CM1培养基以及6,000IU/mL白介素-2(IL-2)和15μgOKT-3。在第7天，通过以下来起始REP：将含约5×108个装载有OKT-3的经辐照的同种异体PBMC饲养细胞的另外的饲养细胞层并入三个100MCS容器中的每一个中的肿瘤碎片化培养阶段中并用500mL CM2培养基以及6,000IU/mL IL-2和30μg OKT-3培养。通过活化同一容器中的整个起始第一扩增培养物来增强REP起始，该活化通过使用密闭系统流体将装载OKT3的饲养细胞转移至100MCS容器中来实现。对于Gen 3，TIL规模扩大或分流涉及以下过程步骤：将整个细胞培养物通过密闭系统流体转移而按比例调整至较大容器，转移(自100M培养瓶转移至500M培养瓶)，添加另外的4L CM4培养基。在第16天收集REP细胞，洗涤，配制且冷冻保存，随后在-150℃下运送至临床站点进行输注。
总体而言，Gen 3过程是一个较短、可缩放性更高且易于改良的扩增平台，其将适应稳健制造和过程可比较性。
表42：示例性Gen 2与示例性Gen 3制造过程的比较
在第0天，对于两种过程，将肿瘤洗涤3次且将碎片随机分组且分成两个池；每种过程一个池。对于Gen 2过程，将碎片转移至一个具有含6,000IU/mL rhIL-2的1LCM1培养基的GREX 100MCS培养瓶中。对于Gen 3过程，将碎片转移至一个具有含6,000IU/mL rhIL-2、15μg OKT-3和2.5×108个饲养细胞的500mL CM1培养基的G-REX-100MCS培养瓶中。根据各过程，在不同日进行Rep起始日的TIL的接种。对于Gen 2过程，其中G-REX-100MCS培养瓶的体积减少90％，将收集的细胞悬浮液转移至新的G-REX-500MCS中，在第11天在含有IL-2(3000IU/mL)且外加5×109个饲养细胞和OKT-3(30ng/mL)的CM2培养基中开始REP起始。根据方案，将细胞扩增且在第16天分至多个具有CM4培养基和IL-2(3000IU/mL)的G-REX-500MCS培养瓶中。接着，根据方案，在第22天收集培养物且冷冻保存。对于Gen 3过程，REP起始在第7天发生，其中使用同一个G-REX-100MCS进行REP起始。简言之，向各培养瓶中添加500mL含有IL-2(6000IU/mL)和5×108个饲养细胞和30μg OKT-3的CM2培养基。第9-11天，将培养物的规模扩大。将整个体积的G-REX100M(1L)转移至G-REX-500MCS中，添加4L含有IL-2(3000IU/mL)的CM4。将培养瓶孵育5天。在第16天收集培养物且冷冻保存。
比较中包括三种不同的肿瘤，即两种肺肿瘤(L4054和L4055)和一种黑色素瘤(M1085T)。
对于L4054和L4055，预先制备CM1(培养基1)、CM2(培养基2)和CM4(培养基4)培养基并保持在4℃。在不进行过滤的情况下制备CM1和CM2培养基，以比较在进行和不进行培养基过滤的情况下的细胞生长情况。
对于L4055肿瘤，在REP起始和规模扩大时，将培养基在37℃下保温至多24小时。
结果。对于所实现的总活细胞，Gen 3的结果在Gen 2结果的30％以内。在再刺激之后，Gen 3最终产物显示出更高的IFN-γ产量。如通过存在的总独特CDR3序列所测量，Gen 3最终产物显示出克隆多样性增加。Gen 3最终产物显示出较长的平均端粒长度。
Gen 2和Gen 3过程的预REP和REP扩增遵循上文所描述的过程。对于每个肿瘤，两个池含有相等数目的碎片。由于肿瘤的大小较小，故无法达成每个培养瓶的最大碎片数目。在Gen 2过程的第11天且在Gen 3过程的第7天收集总预REP细胞(TVC)并计数。为比较两个预REP组，将细胞计数除以培养物中所提供的碎片的数目，以计算每个碎片的活细胞的平均值。如以下表43中所指示，与Gen 3过程相比，Gen 2过程中每个碎片始终生长较多的细胞。外推计算第11天Gen 3过程预期的TVC数目，TVC数目是用预REP TVC除以7接着乘以11来计算。
表43：预REP细胞计数
*L4055，未过滤的培养基。
对于Gen 2和Gen 3过程，根据过程条件对TVC进行计数，在该过程的每天产生活细胞百分比。在收集时，收集第22天(Gen 2)和第16天(Gen 3)细胞且测定TVC计数。接着，用TVC除以第0天提供的碎片数目，以计算每个碎片的活细胞平均值。通过用所收集的TVC除以REP起始TVC来计算扩增倍数。如表48中所显示出，比较Gen 2与Gen 3，L4054的扩增倍数类似；在L4055的情况下，Gen 2过程的扩增倍数更高。具体而言，在此情况下，在REP起始日之前使培养基保温24。对于M1085T，在Gen 3中也观测到更高扩增倍数。外推计算第22天Gen 3过程预期的TVC数目，该TVC数目是用REP TVC除以16接着乘以22计算。
表44：TIL最终产物的总活细胞计数和扩增倍数
*L4055，未过滤的培养基。
表45：TIL最终产物的存活率％：在收集后，针对存活率％的放行准则比较最终TILREP产物。Gen 2和Gen 3过程的所有条件皆超过70％存活率准则，在各过程和肿瘤间是相当的。
在收集后，针对存活率百分比的放行准则来比较最终TIL REP产物。Gen 2和Gen 3过程的所有条件皆超过70％存活率准则，在各过程和肿瘤间是相当的。
表45：REP的存活率％(TIL最终产物)
由于每个培养瓶的碎片数目低于最大所需数目，故计算各肿瘤在收集日的估计细胞计数。该估计是基于以下预期：临床肿瘤在第0天足够大以接种2个或3个培养瓶。
表46：将估计细胞计数计算值外推至Gen 3过程的全尺寸2个和3个培养瓶
免疫表型分析-TIL最终产物的表型标记物比较。三种肿瘤L4054、L4055和M1085T在Gen 2和Gen 3过程中均经历TIL扩增。在收集后，对REP TIL最终产物进行流式细胞术分析，以测试纯度、分化和记忆标记物。对于所有条件，TCR a/b+细胞的百分比超过90％。
与自Gen 2过程收集的TIL相比，自Gen 3过程收集的TIL显示更高的CD8和CD28表达量。Gen 2过程显示更高的CD4+百分比。
与自Gen 2过程收集的TIL相比，自Gen 3过程收集的TIL显示更高的中枢记忆隔室表达量。
在来自两种肿瘤L4054和L4055的TIL中分析活化和耗竭标记物，以比较来自Gen 2和Gen 3TIL扩增过程的最终TIL产物。Gen 2与Gen 3过程的活化和耗竭标记物是相当的。
再刺激后的干扰素γ分泌。对于L4054和L4055，在收集日，即Gen 2的第22天和Gen3的第16天，使用经包被的抗CD3板再刺激TIL过夜。使用抗CD3、CD28和CD137珠子对M1085T进行再刺激。在所有条件下再刺激24小时后收集上清液且冷冻上清液。在相同时间，使用相同ELISA板，通过ELISA评定来自两个过程的上清液的IFNγ分析。在所分析的三种肿瘤中观测到来自Gen 3过程的IFNγ产量更高。
培养基中IL-2含量的测量。为了比较Gen 2与Gen 3过程的IL-2消耗，在REP起始、规模扩大和收集日，对肿瘤L4054和L4055收集细胞上清液。通过来自R&D的QuantitateELISA试剂盒测量细胞培养物上清液中的IL-2的量。总体趋势指示，当与Gen 2过程相比较时，Gen 3过程中保持更高的IL-2浓度。此可能归因于Gen 3在REP起始时的IL-2浓度更高(6000IU/mL)以及整个过程中培养基的残留。
代谢底物和代谢物分析。测量代谢底物例如D-葡萄糖和L-谷氨酰胺的含量作为整体培养基消耗的代替物。测量其互逆代谢物，例如乳酸和氨。葡萄糖是培养基中之一种单糖，粒线体利用葡萄糖产生呈ATP形式的能量。当葡萄糖经氧化时，产生乳酸(乳酸是乳酸盐)。在细胞指数生长期间产生大量乳酸盐。更高的乳酸盐含量会对细胞培养过程产生负面影响。
在Gen 2和Gen 3过程的REP起始、规模扩大和收集日收集L4054和L4055的用过的培养基。在Gen 2的第11天、第16天和第22天且在Gen 3的第7天、第11天和第16天收集用过的培养基。在CEDEX生物分析仪上分析上清液中葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、GlutaMaxTM和氨的浓度。
L-谷氨酰胺是细胞培养基制剂中所需的一种不稳定的必需氨基酸。谷氨酰胺含有胺，此酰胺结构基团可向细胞输送和递送氮。当L-谷氨酰胺氧化时，细胞会产生有毒的氨副产物。为了抵消L-谷氨酰胺的降解，Gen 2和Gen 3过程的培养基补充有GlutaMaxTM，其在水溶液中较稳定且不会自发降解。在两个肿瘤株中，Gen 3组在此过程期间显示L-谷氨酰胺和GlutaMaxTM减少，以及整个REP中氨的增加。在Gen 2组中，观测到恒定的L-谷氨酰胺和GlutaMaxTM浓度，以及氨产量的略微增加。Gen 2和Gen 3过程的氨在收集日时是相当的，显示L-谷氨酰胺降解的微小差异。
通过Flow-FISH测量端粒重复序列。使用Flow-FISH技术测量在Gen 2和Gen3过程中L4054和L4055上端粒重复序列的平均长度。使用来自DAKO的用于流式细胞术分析的端粒PNA试剂盒/FITC计算相关端粒长度(RTL)的测定结果。Gen 3显示与Gen 2相当的端粒长度。
CD3分析。为了测定在每个过程中产生的细胞产物的克隆多样性，对所收集的L4054和L4055的TIL最终产物进行取样，通过T细胞受体CDR3部分的测序进行克隆多样性的分析。
表47显示Gen 2与Gen 3之间在L4054的TIL收集细胞产物上共有独特CDR3序列百分比的比较。Gen 3与Gen 2最终产物之间共有199个序列，对应于Gen 2最终产物中前80％的独特CDR3序列中的97.07％与Gen 3最终产物共有。
表47：L4054在Gen 2与Gen 3过程之间共有uCDR3序列的比较
表48显示Gen 2与Gen 3之间在L4055的TIL收集细胞产物上共有的独特CDR3序列百分比的比较。Gen 3与Gen 2最终产物之间共有1833个序列，对应于Gen 2最终产物中前80％的独特CDR3序列中的99.45％与Gen 3最终产物共有。
表48：L4055在Gen 2与Gen 3过程之间的共有的uCDR3序列的比较
CM1和CM2培养基在未过滤情况下预先制备且保持在4℃，直至使用肿瘤L4055以用于Gen 2和Gen 3过程。
对于L4055肿瘤，在REP起始日，使培养基在37℃下保温24小时以用于Gen2和Gen 3过程。
在过程中收集的上清液中未测量到LDH。
用K2 cellometer细胞计数器执行M1085T TIL细胞计数。
在肿瘤M1085T上，样本不可用，例如用于代谢分析的上清液、用于活化和耗竭标记物分析的TIL产物、端粒长度和CD3-TCR vb分析。
结论。本实施例针对功能质量属性以及Gen 2和Gen 3过程的扩增表型表征和培养基消耗来比较3种独立的供体肿瘤组织。
Gen 2和Gen 3预REP和REP扩增比较根据所产生的总活细胞数和总有核细胞群的存活率来评估。Gen 2(22天)与Gen 3(16天)在收集日的TVC细胞剂量之间无可比性。Gen 3细胞剂量低于Gen 2，为在收集时所收集的总活细胞数的约40％。
假定在第11天而非第7天进行预REP收集且在第22天而非第16天进行REP收集，计算Gen 3过程的外推细胞数目。在此两种情况下，与Gen 2过程相比，Gen 3显示比较接近的TVC数目，表明早期活化增进TIL生长。
在Gen 3过程中的另外的培养瓶(2或3个)的外推值的情况下，假定所处理的肿瘤的大小较大，达到如所描述的每个过程所需的最大碎片数目。据观测，与Gen 2过程在第22天时的情形相比，Gen 3过程在第16天收集的TVC可达到类似剂量。此观测结果很重要，指示培养物的早期活化使TIL处理时间缩短。
Gen 2和Gen 3预REP和REP扩增比较是根据所产生的总活细胞数和总有核细胞群的存活率来评估。Gen 2(22天)与Gen 3(16天)在收集日的TVC细胞剂量之间无可比性。Gen3细胞剂量低于Gen 2，为在收集时所收集的总活细胞数的约40％。
就表型表征而言，与Gen 2过程相比，观测到三种肿瘤在Gen 3过程中具有更高的CD8+和CD28+表达量。
与Gen 2过程相比，Gen 3过程显示出略微更高的中枢记忆隔室。
尽管Gen 3过程的时间较短，但Gen 2和Gen 3过程显示相当的活化和耗竭标记物。
在所分析的三种肿瘤中，Gen 3最终产物的IFNγ产量比Gen 2高3倍。此数据表明，与Gen 2过程相比，Gen 3过程产生功能强大且更强效的TIL产物，此可能归因于Gen 3中CD8和CD28的表达量更高。表达型表征表明，与Gen 2过程相比，在三种肿瘤上Gen 3的CD8+、CD28+表达量呈阳性趋势。
Gen 2与Gen 3的TIL最终产物的端粒长度相当。
Gen 2与Gen 3最终产物的葡萄糖和乳酸盐含量相当，表明Gen 3过程的培养基中营养物的含量未受到影响，因为与Gen 2相比，在该过程中的每一天皆未执行体积减小移除且该过程中的整体培养基体积较小。
与Gen 2过程相比，整个Gen 3过程的处理时间减少约两倍，此将显著降低通过Gen3过程扩增的TIL产物的商品成本(COG)。
IL-2消耗表明Gen 2过程中IL-2消耗的总体趋势，在Gen 3过程中，由于未移除旧培养基，故IL-2更高。
通过CDR3 TCRab序列分析测定，Gen 3过程显示更高的克隆多样性。
在预REP第0天添加饲养细胞和OKT-3允许TIL的早期活化且允许使用Gen3过程进行TIL生长。
表49描述Gen 3过程与当前Gen 2过程相比较的各种实施方式和结果。
表49：示例性Gen 3过程特征
实施例10：示例性GEN 3过程(又称为GEN3.1)
本实施例描述了关于“Gen 2与Gen 3过程之间针对TIL扩增的可比较性”的其他研究。Gen 3过程经修改以在该过程早期包括活化步骤，旨在增加最终总活细胞(TVC)输出，同时维持表型和功能概况。如下文所描述，Gen 3实施方式经修改为另一实施方式且本文中在本实施例中称为Gen 3.1。
在一些实施方式中，Gen 3.1TIL制造过程具有四个操作员介入：
1.肿瘤碎片分离和活化：在该过程的第0天，分割肿瘤且产生各自为约3×3mm的最终碎片(总共至多240个碎片)且在1-4个G-REX100MCS培养瓶中培养。各培养瓶含有至多60个碎片、500mL CM1或DM1培养基，补充有6,000IU rhIL-2、15μg OKT3和2.5×108个经辐照的同种异体单核细胞。将培养物在37℃下孵育6-8天。
2.TIL培养物再活化：在第7-8天，在两种情况下，培养物通过缓慢添加补充有6,000IU rhIL-2、30μg OKT3和5×108个经辐照的同种异体单核细胞的CM2或DM1培养基进行补充。注意不要干扰培养瓶底部的现有细胞。将培养物在37℃下孵育3-4天。
3.培养规模扩大：在第10-11天进行。在培养物规模扩大期间，在两种情况下，将G-REX100MCS的全部内含物转移至含有4L补充有3,000IU/mL IL-2的CM4或DM2的G-REX500MCS培养瓶中。将培养瓶在37℃下孵育5-6天直至收集。
4.收集/洗涤/配制：在第16-17天，将培养瓶体积减小且合并起来。将细胞浓缩并用含有1％ HSA的PlasmaLyte A pH 7.4洗涤。将经洗涤的细胞悬浮液与CryoStor10以1:1的比例配制，补充rhIL-2达到最终浓度为300IU/mL。
通过速率受控冷冻将DP冷冻保存且储存在气相液氮中。**完全标准TIL培养基1、2或4(CM1、CM2、CM4)可取代CTSTMOpTmizerTMT细胞无血清扩增培养基，称为成分确定的培养基(DM1或DM2)，如上所述。
过程描述。在第0天，将肿瘤洗涤3次，接着破碎成3×3×3的最终碎片。在将整个肿瘤破碎后，接着将最终碎片同等地随机分组且分成三个池。将一个随机化碎片池引入各组，根据三种实验基质添加相同数目的碎片。
在整个TIL扩增过程中，使用标准培养基进行肿瘤L4063扩增，使用成分确定的培养基(CTS OpTmizer)进行肿瘤L4064扩增。培养基的组分描述于本文中。
CM1完全培养基1：RPMI+谷氨酰胺，补充有2mM GlutaMaxTM、10％人AB血清、庆大霉素(50μg/mL)、2-巯基乙醇(55μM)。最终培养基制剂补充有6000IU/mL IL-2。
CM2完全培养基2：50％ CM1培养基+50％ AIM-V培养基。最终培养基制剂补充有6000IU/mL IL-2。
CM4完全培养基4：补充有GlutaMaxTM(2mM)的AIM-V。最终培养基制剂补充有3000IU/mL IL-2。
CTS OpTmizer CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基补充有CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂(26mL/L)。
DM1：补充有CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂(26mL/L)和CTSTM免疫细胞SR(3％)以及GlutaMaxTM(2mM)的CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基。最终制剂补充有6,000IU/mL IL-2。
DM2：补充有CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂(26mL/L)以及CTSTM免疫细胞SR(3％)和GlutaMaxTM(2mM)的CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基。最终制剂补充有3,000IU/mL IL-2。
所使用的所有类型的培养基，即完全培养基(CM)和成分确定的培养基(DM)，保持在4℃直至使用前一天，在处理日之前，在培养箱中在37℃下预先保温，至多24小时。
在第7天进行两种肿瘤的TIL培养物再活化。L4063在第10天且L4064在第11天进行规模扩大。在第16天收集两种培养物且冷冻保存。
达成的结果。测定Gen 3.0和Gen 3.1过程的细胞计数和存活率百分比。在所有条件下的扩增皆遵循此实施例中所描述的细节。
对于每个肿瘤，将碎片分成三个数目相等的池。由于肿瘤的大小较小，故无法达成每个培养瓶的最大碎片数目。对于三个不同的过程，评定在各条件下的总活细胞数和细胞存活率。细胞计数测定为在第7天用于再活化的TVC、在第10天(L4064)或在第11天(L4063)用于规模扩大的TVC，以及在第16/17天收集的TVC。
第7天和第10/11天的细胞计数视为FIO。通过将第16/17天收集日TVC除以第7天再活化日TVC来计算扩增倍数。为了比较三个组，用收集日的TVC除以在第0天添加于培养物中的碎片的数目，以计算每个碎片的活细胞平均值。
对L4063和L4064进行细胞计数和存活率分析。Gen 3.1—对于两个肿瘤，测试过程每个碎片产生的细胞比Gen 3.0过程要多。
总活细胞计数和扩增倍数；在该过程期间的存活率％。在再活化、规模扩大和收集后，获得在所有条件下的存活率百分比。在第16/17天收集时，针对存活率％的放行准则比较最终TIL。所有条件皆超过70％存活率准则，在各过程和肿瘤间是相当的。
免疫表型分析-TIL最终产物的表型表征。对最终产物进行流式细胞术分析，以测试纯度、分化和记忆标记物。在所有条件下，TCRα/β、CD4+和CD8+细胞的群体百分比是一致的。
进行REP TIL的扩增表型分析。对于两个肿瘤，TIL产物显示与Gen 3.0相比，在Gen3.1条件下具有更高的CD4+细胞百分比，在两种条件下，与Gen 3.1条件相比，在Gen 3.0下具有更高的来自CD8+群体的CD28+细胞百分比。
自Gen 3.0和Gen 3.1过程中收集的TIL显示出相当的表型标记物，如CD4+和CD8+细胞上的CD27和CD56表达，以及CD4+门细胞群上相当的CD28表达。关于TIL最终产物的记忆标记物比较：
对在第16天收集的TIL的冷冻样本染色以进行分析。Gen 3.0与Gen 3.1过程的TIL记忆状态是相当的。关于TIL最终产物的活化和耗竭标记物比较：
针对CD4+和CD8+细胞门的Gen 3.0与Gen 3.1过程的活化和耗竭标记物是相当的。
再刺激后的干扰素γ分泌。对于L4063和L4064，使用经包被的抗CD3板对经收集的TIL再刺激过夜。与Gen 3.0过程相比，在所分析的两个肿瘤中观测到来自Gen3.1过程的更高IFNγ产量。
培养基中IL-2含量的测量。为比较所有条件和过程之间的IL-2消耗量，在第7天再活化起始、第10天(L4064)/第11天(L4063)规模扩大和第16天/第17天收集日收集细胞上清液，并冷冻。随后，将上清液解冻接着分析。通过制造商方案测量细胞培养物上清液中的IL-2的量。
在相同培养基条件下评定的整个过程期间，整个Gen 3和Gen 3.1过程的IL-2消耗是相当的。对所收集的L4063和L4064的用过的培养基进行IL-2浓度(pg/mL)分析。
代谢物分析。对于每种条件，在L4063和L4064第7天再活化起始、第10天(L4064)/第11天(L4063)规模扩大和第16天/第17天收集日自L4063和L4064收集用过的培养基上清液。用CEDEX生物分析仪分析上清液中葡萄糖、乳酸盐、谷氨酰胺、GlutaMaxTM和氨的浓度。
与完全培养基(2g/L)相比，成分确定的培养基中的葡萄糖浓度更高，为4.5g/L。总体而言，在各培养基类型中，Gen 3.0和Gen 3.1过程中葡萄糖的浓度和消耗是相当的。
观测到乳酸盐增加，乳酸盐增加在Gen 3.0与Gen 3.1条件之间和在用于再活化扩增的两个培养基(完全培养基与成分确定的培养基)之间相当。
在一些情况下，标准基础培养基含有2mM L-谷氨酰胺且补充有2mM GlutaMaxTM以补偿L-谷氨酰胺在培养条件下天然降解为L-谷氨酸和氨。
在一些情况下，所使用的成分确定的(无血清)培养基与基础培养基相比不含L-谷氨酰胺，仅补充有最终浓度为2mM的GlutaMaxTM。GlutaMaxTM是含L-丙氨酸和L-谷氨酰胺的二肽，在水溶液中比L-谷氨酰胺更稳定，不会自发降解为谷氨酸和氨。实际上，二肽逐渐解离成单个氨基酸，由此维持较低但足够浓度的L-谷氨酰胺，以保持稳健的细胞生长。
在一些情况下，谷氨酰胺和GlutaMaxTM的浓度在规模扩大日略有降低，但与再活化日相比，在收集日显示出增加至类似或更接近的水平。对于L4064，在整个过程期间，谷氨酰胺和GlutaMaxTM浓度在不同条件之间显示以类似速率略微降低。
氨浓度在含有2mM谷氨酰胺+2mM GlutaMaxTM的标准培养基中生长的样本中要比在含有2mM GlutaMaxTM的成分确定的培养基中生长的样本中高。此外，正如预期的，在培养过程中，氨逐渐增加或积聚。在三种不同测试条件下，不存在氨浓度的差异。
通过Flow-FISH测定端粒重复序列。使用Flow-FISH技术测量在Gen 3和Gen3.1过程中L4063和L4064上端粒重复序列的平均长度。使用来自DAKO的用于流式细胞术分析的端粒PNA试剂盒/FITC计算相关端粒长度(RTL)的测定结果。进行端粒分析。将样本中的端粒长度与对照细胞系(1301白血病)相比较。对照细胞系是具有长稳定端粒的四倍体细胞系，其允许计算相对端粒长度。在两种肿瘤中评定的Gen 3和Gen3.1过程显示出相当的端粒长度。
TCR Vβ谱系分析
为了确定在各过程中产生的细胞产物的克隆多样性，通过对T细胞受体的CDR3部分进行测序来分析TIL最终产物以进行克隆多样性分析。
在三个条件之间比较三个参数：
·独特CDR3(uCDR3)的多样性指数
·共有uCDR3百分比
·对于前80％的uCDR3：
o比较共有uCDR3复本百分比
o比较独特纯克隆型的频率
对照和Gen 3.1测试，TIL收集细胞产物上共有独特CDR3序列的百分比：Gen 3与Gen 3.1测试最终产物之间共有975个序列，相当于Gen 3的前80％的独特CDR3序列中的88％与Gen 3.1共有。
对照和Gen 3.1测试，TIL收集细胞产物上共有独特CDR3序列的百分比：Gen 3与Gen 3.1测试最终产物之间共有2163个序列，相当于Gen 3的前80％的独特CDR3序列中的87％与Gen 3.1共有。
由在不同过程第16天收集时所收集的1×106个细胞鉴别独特CD3序列的数目。基于样本内独特肽CDR的数目，Gen 3.1测试条件显示相较于Gen 3.0略微更高的克隆多样性。
夏侬熵(Shannon entropy)多样性指数是一个可靠且常用的比较度量，因为两种肿瘤的Gen 3.1条件显示出略高于Gen 3过程的多样性，表明Gen 3.1测试条件的TCRVβ谱系比Gen 3.0过程更具多克隆性。
此外，对于肿瘤L4063和L4064，Gen 3.1测试条件的TCR Vβ谱系显示与Gen3.0过程的相应谱系超过87％的重叠。
在再活化日，用于Gen 3.1测试L4064的用过的培养基的IL-2浓度值低于预期值(与Gen 3.1对照和Gen 3.0条件类似)。
该低值可能归因于移液误差，但由于采集的样本极少，故不可能重复该分析。
结论。与Gen 3.0和Gen 3.1对照相比，Gen 3.1测试条件(包含在第0天的饲养细胞和OKT-3)显示在第16天收集时细胞剂量的TVC更高。在Gen 3.1测试条件下最终产物的TVC比Gen 3.0要高约2.5倍。
对于所测试的两个肿瘤样本，在第0天添加OKT-3和饲养细胞的Gen 3.1测试条件在收集时达到培养瓶的最大容量。在该条件下，若在第0天起始最多4个培养瓶，则最终细胞剂量可在80-100×109个TIL之间。
在Gen 3.1测试与Gen 3.0过程之间维持所有质量属性，例如表型表征，包括最终TIL产物的纯度、耗竭、活化和记忆标记物。
在所分析的两个肿瘤中，在第0天添加饲养细胞和OKT-3的Gen 3.1中最终TIL产物的IFN-γ产量比Gen 3.0高3倍，表明Gen 3.1过程产生强效的TIL产物。
在各测试条件下未观测到葡萄糖或乳酸盐含量的差异。在不同培养基条件下，未观测到Gen 3.0与Gen 3.1过程之间谷氨酰胺和氨的差异。培养基中的较低谷氨酰胺含量未限制细胞生长，表明仅在培养基中添加GlutaMaxTM便足以提供细胞增殖所需的营养物。
分别在第11天和第10天进行规模扩大，在该过程的收集日所达到的细胞数目方面未显示显著差异，在两种情况下，在整个过程期间代谢物消耗是相当的。此观测结果表明Gen 3.0优化过程可在处理天数方面具有灵活性，由此促进制造时程的灵活性。
通过CDR3 TCRab序列分析所测量，与Gen 3.0相比，在第0天添加饲养细胞和OKT-3的Gen 3.1过程显示出更高的克隆多样性。
图32描述Gen 3过程(Gen 3优化过程)的实施方式。可使用标准培养基和CTSOptimizer无血清培养基进行Gen 3优化过程TIL扩增。在CTS Optimizer无血清培养基的情况下，建议将培养基中GlutaMaxTM的最终浓度增加至4mM。
实施例11：冷冻保存TIL细胞疗法的示例性制造
本实施例描述了根据现行组织优良操作规范和现行优良制造规范在G-Rex培养瓶中进行Iovance Biotherapeutics公司的TIL细胞疗法过程的cGMP制造。
表50：过程扩增示例性计划
表51：培养瓶容积
培养瓶类型 工作容积/培养瓶(mL)
G-Rex100MCS 1000
G-Rex500MCS 5000
初始过程信息
第0天CM1培养基制备
在BSC中，将试剂添加至RPMI 1640培养基瓶中。添加以下试剂t，每瓶添加：加热灭活人AB血清(100.0mL)；GlutaMax(10.0mL)；硫酸庆大霉素，50mg/mL(1.0mL)；2-巯基乙醇(1.0mL)
自BSC移除不必要的材料。自BSC分发培养基试剂，将硫酸庆大霉素和HBSS保留在BSC中以用于配制的洗涤培养基制备。
解冻IL-2等分试样。解冻一个1.1mL IL-2等分试样(6×106IU/mL)(BR71424)，直至所有冰融化。记录IL-2：批号和有效期
将IL-2储备液转移至培养基中。在BSC中，将1.0mL IL-2储备液转移至所制备的CM1第0天培养基瓶中。添加CM1第0天培养基1瓶和IL-2(6×106IU/mL)1.0mL。
将G-Rex100MCS传递至BSC中。将G-Rex100MCS(W3013130)无菌传递至BSC中。
将所有完全CM1第0天培养基泵吸至G-Rex100MCS培养瓶中。组织碎片锥形管或GRex100MCS。
第0天肿瘤洗涤培养基制备
在BSC中，将5.0mL庆大霉素(W3009832或W3012735)添加至1×500mL HBSS培养基(W3013128)瓶中。每瓶添加：HBSS(500.0mL)；硫酸庆大霉素，50mg/mL(5.0mL)。通过1L 0.22微米过滤器单元(W1218810)制备含有庆大霉素的经过滤HBSS。
第0天肿瘤处理
获得肿瘤。自QAR获得肿瘤样品并立即转移至2-8℃的套件中进行处理。
等分肿瘤洗涤培养基。
肿瘤洗涤1。使用8”镊子(W3009771)，自样品瓶取出肿瘤并转移至所准备的“洗涤1”培养皿中。随后为肿瘤洗涤2和肿瘤洗涤3。
测量肿瘤。评定肿瘤。评定是否观测到整个肿瘤面积的>30％为坏死和/或脂肪组织。若适用：清除性分割。若肿瘤较大且观测到>30％组织外表坏死/为脂肪，则通过使用解剖刀和/或镊子的组合移除坏死/脂肪组织并同时保留肿瘤内部结构来进行“清除性分割”。
分割肿瘤使用解剖刀和/或镊子的组合，将肿瘤样品切割成均匀的适当大小的碎片(至多6个中间碎片)。转移中间肿瘤碎片。将肿瘤碎片分割成大小为3×3×3mm的碎块。储存中间碎片以防脱水。
重复中间碎片分割。测定收集的碎块数目。若仅保留所需组织，则自“有利中间碎片”6孔板选择另外的有利肿瘤碎块来填充最多50个块的液滴。
准备锥形管。将肿瘤碎块转移至50mL锥形管中。准备用于G-REX100MCS的BSC。自培养箱取出G-REX100MCS。将G-Rex100MCS培养瓶无菌传递至BSC中。将肿瘤碎片添加至G-Rex100MCS培养瓶中。使碎块均匀分布。
按以下参数孵育G-Rex100MCS：孵育G-Rex培养瓶：温度LED显示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5％ CO2。计算：孵育时间；下限＝孵育时间+252小时；上限＝孵育时间+276小时。
过程完成后，舍弃所有剩余已升温培养基并解冻IL-2的等分试样。
第11天-培养基制备
监测培养箱。监测培养箱。培养箱参数：温度LED显示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5％ CO2。
在培养箱中使3×1000mL RPMI 1640培养基(W3013112)瓶和3×1000mL AIM-V(W3009501)瓶升温，保持≥30分钟。自培养箱取出RPMI 1640培养基。制备RPMI 1640培养基。过滤培养基。解冻3×1.1mL IL-2等分试样(6×106IU/mL)(BR71424)。自培养箱中取出AIM-V培养基。将IL-2添加至AIM-V中。将10L Labtainer袋和双向精密配液泵(repeaterpump)转移装置无菌转移至BSC中。
准备10L Labtainer培养基袋。准备Baxa泵。准备10L Labtainer培养基袋。将培养基泵吸至10L Labtainer中。自Labtainer袋取下自动泵吸管。
混合培养基。轻缓地揉按袋子以进行混合。依据取样计划对培养基进行取样。取出20.0mL培养基并置于50mL锥形管中。准备细胞计数稀释液管。在BSC中，将4.5mL已标记有“用于细胞计数稀释”和批号的AIM-V培养基添加至四个15mL锥形管中。将试剂自BSC转移至2-8℃。制备1L转移包。在BSC外部，将1L转移包熔接(依据过程注释5.11)至附接于所准备的“完全CM2第11天培养基”袋的转移装置上。准备饲养细胞转移包。孵育完全CM2第11天培养基。
第11天-TIL收集
预处理表格。培养箱参数：温度LED显示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5％CO2。自培养箱取出G-Rex100MCS。准备300mL转移包。将转移包熔接至G-Rex100MCS。
准备用于TIL收集的培养瓶并开始TIL收集。收集TIL。使用GatheRex，透过血液过滤器将细胞悬浮液转移至300mL转移包中。检查膜上的贴壁细胞。
冲洗培养瓶膜。闭合G-Rex100MCS上的夹子。确保所有夹子闭合。热封TIL和“上清液”转移包。计算TIL悬浮液的体积。准备用于取样的上清液转移包。
抽取Bac-T样本。在BSC中，自1L“上清液”转移包中吸取约20.0mL上清液，并分配至无菌的50mL锥形管中。
依据取样计划接种BacT。使用适当大小的注射器自准备的标记有BacT的50mL锥形管取出1.0mL样本并接种于厌氧瓶。
孵育TIL。将TIL转移包置于培养箱中待用。进行细胞计数和计算。测定进行细胞计数的细胞的活细胞浓度平均值和存活率平均值。存活率÷2。活细胞浓度÷2。测定计数的上限和下限。下限：活细胞浓度平均值×0.9。上限：活细胞浓度平均值×1.1。确认两个计数在可接受界限内。根据进行的所有四次计数测定平均活细胞浓度。
调整TIL悬浮液的体积计算取出细胞计数样本后TIL悬浮液的经调整体积。总TIL细胞体积(A)。以取出的细胞计数样本的体积(4.0ml)(B)调整TIL细胞总体积C＝A-B。
计算活TIL细胞总数。平均活细胞浓度*：总体积；活细胞总数：C＝A×B。
流式细胞术的计算：若活TIL细胞总计数为≥4.0×107，则计算获得用于流式细胞术样本的1.0×107个细胞的体积。
流式细胞术所需的活细胞总数：1.0×107个细胞。流式细胞术所需的细胞体积：活细胞浓度除以1.0×107个细胞A。
计算等于2.0×108个活细胞的TIL悬浮液的体积。按需要，计算待取出的过量TIL细胞体积，取出过量TIL并按需要将TIL置于培养箱中。计算按需要取出的过量TIL总量。
将以供冷冻的靶细胞浓度添加至过量TIL细胞的CS-10培养基的计算量为1.0×108个细胞/mL。按需要，对过量TIL离心。观测锥形管并添加CS-10。
填充小瓶。将1.0mL细胞悬浮液等分至适当大小的冷冻小瓶中。按照SOP-00242，将剩余体积等分至适当大小的冷冻小瓶中。若体积≤0.5mL，则将CS10添加至小瓶，直至体积为0.5mL。
样本的TIL冷冻保存
计算获得用于冷冻保存的1×107个细胞所需的细胞体积。取出样本以进行冷冻保存。将TIL置于培养箱中。
样本的冷冻保存。
观测锥形管，缓慢添加CS-10，记录添加0.5mL CS10后的体积。
第11天-饲养细胞
获得饲养细胞。自LN2冷冻机获得至少两个不同批号的3袋饲养细胞。在准备解冻之前将细胞保存于干冰上。准备水浴或Cryotherm。在37.0±2.0℃水浴或cytotherm处解冻饲养细胞约3至5分钟或直至冰刚好消失。自培养箱取出培养基。合并解冻的饲养细胞。将饲养细胞添加至转移包。将饲养细胞自注射器分配至转移包中。对合并的饲养细胞进行混合，标记转移包。
计算转移包中的饲养细胞悬浮液的总体积。
取出细胞计数样本。针对每个样本使用单独的3mL注射器，使用无针注入口自饲养细胞悬浮液转移包抽取4×1.0mL细胞计数样本。将每个样本等分至经标记的冷冻小瓶中。进行细胞计数，测定乘数选定方案，输入乘数。测定进行细胞计数的细胞的活细胞浓度平均值和存活率平均值。测定计数的上限和下限，并确认其在界限内。
调整饲养细胞悬浮液的体积。计算取出细胞计数样本后饲养细胞悬浮液的经调整体积。计算活饲养细胞总数。按需要获得另外的饲养细胞。按需要解冻另外的饲养细胞。将第4个饲养细胞袋置于拉链袋中，在37.0±2.0℃水浴或cytotherm低温储存系统中解冻约3至5分钟并合并另外的饲养细胞。测量体积。测量注射器中饲养细胞的体积并记录在下面(B)。计算饲养细胞的新的总体积。将饲养细胞添加至转移包。
按需要制备稀释液，将4.5mL AIM-V培养基添加至四个15mL锥形管中。准备计算细胞数目。针对每个样本使用单独的3mL注射器，使用非必要注入口自饲养细胞悬浮液转移包取出4×1.0mL细胞计数样本。进行细胞计数和计算。根据进行的所有四次计数测定平均活细胞浓度。调整饲养细胞悬浮液的体积，计算取出细胞计数样本后饲养细胞悬浮液的经调整体积。饲养细胞总体积减去取出的4.0mL。计算获得5×109个活饲养细胞所需的饲养细胞悬浮液的体积。计算过量饲养细胞体积。计算待取出的过量饲养细胞的体积。取出过量饲养细胞。
使用1.0mL注射器和16G针头，吸取0.15mL OKT3并添加OKT3。热封饲养细胞悬浮液转移包。
第11天G-Rex填充和接种
设定G-Rex500MCS。自培养箱取出“完全CM2第11天培养基”并将培养基泵吸至G-Rex500MCS中。将4.5L培养基泵吸至G-Rex500MCS中，填充至培养瓶上标示的线处。按需要热封并孵育培养瓶。将饲养细胞悬浮液转移包熔接至G-Rex500MCS。将饲养细胞添加至G-Rex500MCS。热封。将TIL悬浮液转移包熔接至培养瓶。将TIL添加至G-Rex500MCS。热封。将G-Rex500MCS在37.0±2.0℃下孵育，CO2百分比：5.0±1.5％ CO2。
计算孵育范围。进行计算以测定在第16天自培养箱取出G-Rex500MCS的适当时间。下限：孵育时间+108小时。上限：孵育时间+132小时。
第11天过量TIL冷冻保存
适用：冷冻过量TIL小瓶。验证在冷冻前已设定CRF。进行冷冻保存。将小瓶自速率受控冷冻机转移至适当储存容器中。完成冷冻后，将小瓶自CRF转移至适当储存容器。将小瓶转移至适当储存容器中。记录在LN2中的储存位置。
第16天培养基制备
预热AIM-V培养基。计算使培养基袋1、2和3的培养基升温的时间。确保所有袋子已升温12与24小时之间的时间。设定用于上清液的10L Labtainer。使用鲁尔接头将流体泵转移装置的较大直径端附接至10L Labtainer袋的一个凹形端口。设定用于上清液的10LLabtainer并进行标记。设定用于上清液的10L Labtainer。确保在自BSC之前取出前闭合所有夹子。注意：在TIL收集期间使用上清液袋，该TIL收集可与培养基制备并行地进行。
解冻IL-2。每袋CTS AIM V培养基解冻5×1.1mL IL-2等分试样(6×106IU/mL)(BR71424)，直至所有冰融化。等分100.0mL GlutaMax。将IL-2添加至GlutaMax。准备用于配制的CTS AIM V培养基袋。准备用于配制的CTS AIM V培养基袋。多级Baxa泵。准备配制培养基。将GlutaMax+IL-2泵吸至袋子中。监测的参数：温度LED显示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5％ CO2。使完全CM4第16天培养基升温。制备稀释液。
第16天REP分流
监测培养箱参数：温度LED显示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5％ CO2。自培养箱取出G-Rex500MCS。准备1L转移包，标记为TIL悬浮液并称重为1L。
G-Rex500MCS的体积减少。根据SOP-01777，将约4.5L培养上清液自G-Rex500MCS转移至10L Labtainer。
准备用于TIL收集的培养瓶。取出上清液后，闭合通向红色管线的所有夹子。
开始TIL收集。剧烈敲击培养瓶并旋动培养基以使细胞剥离，以确保所有细胞剥落。
TIL收集。松开通向TIL悬浮液转移包的所有夹子。使用GatheRex，将细胞悬浮液转移至TIL悬浮液转移包中。注意：确保维持边缘倾斜，直至收集到所有细胞和培养基。检查膜上的贴壁细胞。冲洗培养瓶膜。闭合G-Rex500MCS上的夹子。热封含有TIL的转移包。热封含有上清液的10L Labtainer。记录含细胞悬浮液的转移包的重量并计算悬浮液体积。准备用于样本取出的转移包。自细胞上清液取出测试样本。
无菌性和BacT测试取样：自准备的标记有BacT的15mL锥形管取出1.0mL样本。取出细胞计数样本。在BSC中，针对每个样本使用单独的3mL注射器，自“TIL悬浮液”转移包取出4×1.0mL细胞计数样本。
取出支原体样本。使用3mL注射器，自TIL悬浮液转移包取出1.0mL，置于准备的标记有“支原体稀释剂”的15mL锥形管中。
准备用于接种的转移包。将TIL置于培养箱中。自BSC取出细胞悬浮液，置于培养箱中待用。进行细胞计数和计算。首先通过将0.5mL细胞悬浮液添加至准备的4.5mL AIM-V培养基中来对细胞计数样本进行稀释，稀释度为1:10。测定进行细胞计数的细胞的活细胞浓度平均值和存活率平均值。测定计数的上限和下限。注意：可根据预期细胞浓度调整稀释度。根据进行的所有四次计数测定平均活细胞浓度。调整TIL悬浮液的体积。计算取出细胞计数样本后TIL悬浮液的经调整体积。总TIL细胞体积减去取出的用于测试的5.0mL。
计算活TIL细胞总数。计算待接种的培养瓶的总数目。注意：待接种的G-Rex500MCS培养瓶的最大数目为五。若计算的待接种培养瓶的数目超过五，则使用可用的所有体积的细胞悬浮液接种仅五个培养瓶。
计算用于继代培养的培养瓶数目。计算除所准备的袋子以外还需要的培养基袋的数目。按计算需要每两个G-Rex-500M培养瓶准备一个10L“CM4第16天培养基”袋。继续接种第一个GREX-500M培养瓶，同时制备另外的培养基并使其升温。准备测定的所计算数目的另外的培养基袋并使其升温。填充G-Rex500MCS。准备泵吸培养基并将4.5L培养基泵吸至G-Rex500MCS中。热封。重复填充。孵育培养瓶。计算待添加至新G-Rex500MCS培养瓶中的TIL悬浮液的目标体积。若计算的培养瓶数目超过五，则使用所有体积的细胞悬浮液接种仅五个培养瓶。准备用于接种的培养瓶。自培养箱取出G-Rex500MCS。准备用于泵吸的G-Rex500MCS。除较大过滤器管线外，闭合所有夹子。自培养箱取出TIL。制备用于接种的细胞悬浮液。将“TIL悬浮液”转移包无菌熔接(依据过程注释5.11)至泵入口管线。将TIL悬浮液袋置于称上。
用TIL悬浮液接种培养瓶。将所计算体积的TIL悬浮液泵吸至培养瓶中。热封。填充剩余培养瓶。
监测培养箱。培养箱参数：温度LED显示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5％CO2。孵育培养瓶。
测定在第22天自培养箱取出G-Rex500MCS的时间范围。
第22天洗涤缓冲液制备
准备10L Labtainer袋。在BSC中，通过鲁尔接头将4”血浆转移装置附接至10LLabtainer袋。准备10L Labtainer袋。在转移出BSC之前，闭合所有夹子。注意：为每两个待收集的G-Rex500MCS培养瓶准备一个10L Labtainer袋。将Plasmalyte泵吸至3000mL袋中，通过翻转泵和操控袋子的位置来自3000mL Origen袋移除空气。将人白蛋白25％添加至3000mL袋中。获得最终体积为120.0mL的25％人白蛋白。
制备IL-2稀释剂。使用10mL注射器，使用LOVO洗涤缓冲液袋上的无针注入口取出5.0mL LOVO洗涤缓冲液。将LOVO洗涤缓冲液分配至50mL锥形管中。
等分CRF空白袋LOVO洗涤缓冲液。使用100mL注射器，自无针注入口吸取70.0mLLOVO洗涤缓冲液。
解冻IL-2。解冻一份1.1mL IL-2(6×106IU/mL)，直至所有冰融化。IL-2制备。将50μL IL-2储备液(6×106IU/mL)添加至标记有“IL-2稀释液”的50mL锥形管中。
冷冻保存准备。将5个冷冻盒置于2至8℃下，以对其进行预处理，以用于最终产物冷冻保存。
制备细胞计数稀释液。在BSC中，向4个单独的15mL锥形管中添加4.5mL已标记有批号和“用于细胞计数稀释”的AIM-V培养基。准备计算细胞数目。将4个冷冻小瓶标记上小瓶编号(1-4)。将小瓶保存在BSC以供使用。
第22天TIL收集
监测培养箱。培养箱参数：温度LED显示器：37±2.0℃，CO2百分比：5％±1.5％。自培养箱取出G-Rex500MCS培养瓶。准备TIL收集袋并进行标记。封闭另外的接头。体积减少：将约4.5L上清液自G-Rex500MCS转移至上清液袋。
准备用于TIL收集的培养瓶。开始TIL收集。剧烈敲击培养瓶并旋动培养基以剥离细胞。确保所有细胞剥落。开始TIL收集。松开通向TIL悬浮液收集袋的所有夹子。TIL收集。使用GatheRex，将TIL悬浮液转移至3000mL收集袋中。检查膜上的贴壁细胞。冲洗培养瓶膜。闭合G-Rex500MCS上的夹子，并确保闭合所有夹子。将细胞悬浮液转移至LOVO来源袋中。闭合所有夹子。热封。取出4×1.0mL细胞计数样本。
进行细胞计数。利用NC-200和过程注释5.14进行细胞计数和计算。首先通过将0.5mL细胞悬浮液添加至准备的4.5mL AIM-V培养基中来对细胞计数样本进行稀释。由此得到1:10稀释度。测定进行细胞计数的细胞的平均存活率、活细胞浓度和总成核细胞浓度。测定计数的上限和下限。测定进行细胞计数的细胞的平均存活率、活细胞浓度和总成核细胞浓度。称量LOVO来源袋。计算活TIL细胞总数。计算成核细胞总数。
制备支原体稀释剂。通过鲁尔样本口自一个上清液袋取出10.0mL并置于15mL锥形管中。
LOVO
进行“TIL G-Rex收集”方案并测定最终产物目标体积。装载一次性套件。取出滤液袋。输入滤液容量。将滤液容器置于实验台上。附接PlasmaLyte。验证已附接PlasmaLyte，观测到PlasmaLyte正在移动。将来源容器附接至导管，验证已附接来源容器。确认PlasmaLyte正在移动。
最终配制和填充
目标体积/袋子计算。计算待配制于空白袋中的CS-10和LOVO洗涤缓冲液的体积。准备CRF空白袋。
计算待添加至最终产物的IL-2的体积。所需最终IL-2浓度(IU/mL)-300IU/mL。IL-2工作储备液：6×104IU/mL。组装连接设备。将4S-4M60无菌熔接至CC2单元接头。将CS750冷冻袋无菌熔接(依据过程注释5.11)至准备的线束上。将CS-10袋熔接至4S-4M60的尖端上。用IL-2制备TIL。使用适当大小的注射器，自“IL-2 6×104”等分试样取出所测定量的IL-2。标记经配制TIL袋。将经配制TIL袋添加至设备。添加CS10。切换注射器。将约10mL空气吸取至100mL注射器中并替换设备上的60mL注射器。添加CS10。准备CS-750袋。分配细胞。
自最终产物袋移除空气并获得保留物。在填充了最后一个最终产物袋后，即闭合所有夹子。将10mL空气吸取至新的100mL注射器中并替换设备上的注射器。将保留物分配至50mL锥形管中并将管标记为“保留物”和批号。对每个袋子重复空气移除步骤。
准备用于冷冻保存的最终产物，包括目视检查。在冷冻保存之前将冷冻袋保存于降温包上或2至8℃下。
取出细胞计数样本。使用适当大小的移液管，取出2.0mL保留物并置于15mL锥形管中以用于细胞计数。进行细胞计数和计算。注意：仅将一个样本稀释至足够验证稀释度的适当稀释度。将另外的样本稀释至适当稀释因数并继续进行计数。测定进行细胞计数的细胞的活细胞浓度平均值和存活率平均值。测定计数的上限和下限。注意：可根据预期细胞浓度调整稀释度。测定活细胞浓度平均值和存活率平均值。测定计数的上限和下限。计算IFN-γ。热封最终产物袋。
依据以下示例性取样计划标记并收集样本。
表52：取样计划
无菌性和BacT。测试取样。在BSC中，自使用适当大小的注射器收集的保留细胞悬浮液中取出1.0mL样本，并接种厌氧瓶。对好氧瓶重复以上操作。
最终产物冷冻保存
准备速率受控冷冻机。验证已设定CRF。设定CRF探针。将最终产物和样本置于CRF中。测定要达至4℃±1.5℃所需的时间并继续进行CRF运行。完成CRF并储存。完成运行后停止CRF。自CRF取出盒子和小瓶。将盒子和小瓶转移至气相LN2进行储存。记录储存位置。
后处理概述
后处理：最终药品
(第22天)在第22天REP中通过流式细胞术测定CD3+细胞
(第22天)革兰氏染色法(GMP)
(第22天)通过凝胶凝块LAL分析(Gel Clot LAL Assay)进行细菌内毒素测试(GMP)
(第16天)BacT无菌性分析(GMP)
(第16天)通过TD-PCR进行支原体DNA检测(GMP)
可接受的外观属性
(第22天)BacT无菌性分析(GMP)(第22天)
(第22天)IFN-γ分析
提供上述实施例以为一般本领域技术人员提供如何制得并使用本发明的组合物、系统及方法的实施例的完整公开及描述，并不意在限制本发明人定义其发明的范围。对本领域技术人员显而易见的用于进行本发明的上文所描述模式的修改意在落入以下权利要求范围内。本说明书中提及的所有专利及公开指示本领域技术人员的技能水平。
所有标题及章节名称仅用于清晰及参考目的，不应视为以任何方式具限制性。举例而言，本领域技术人员应了解根据本文所述的本发明的精神及范围按需要组合来自不同标题及章节的各种方面的适用性。
本文中引用的所有参考文献以全文引用的方式且出于所有目的并入本文中，其引用程度如同各个别公开或专利或专利申请经特定且个别地指示出于所有目的以全文引用的方式并入本文中一般。
对本领域技术人员将显而易见的是，可在不脱离本申请的精神及范围的情况下对其进行多种修改及改变。本文所述的特定实施方式及实施例仅作为示例提供，本申请仅受随附权利要求的条款以及权利要求所享有的等效物的全部范围的限制。
实施例12：评估抗生素对预REP TIL生长、表型和功能的影响
背景
常规的临床制造方法可能会受到革兰氏阳性细菌物种污染，因为通常而言，大多数的运输和储存培养基仅针对革兰氏阴性细菌和真菌物种。为了加强针对肿瘤运输介质和培养基的抗生素方案，将对具有互补特性的抗生素进行评定。
实验设计
第1阶段：如表53和表54中所示，使用2种不同肿瘤就各种抗生素在运输介质和CM1中的作用进行2轮独立的小规模评定。在预REP之后，终止培养。在HTS中的所有过夜孵育包括2.5μg/mL双性霉素B(或对于“高双性霉素B浓度”条件为10μg/mL)和50μg/mL庆大霉素。
用于11天预REP的CM1的培养条件不包括双性霉素B。
所有测试和对照条件均进行四次重复测试。记录在第11天预REP时的总活细胞和存活率百分比。
表53：第1轮测试的测试条件
表54：第2轮测试的测试条件
第II阶段-关于选择用于肿瘤运输介质和预REP细胞培养的抗生素条件的全面测试
基于第1阶段测试的结果选择抗生素。肿瘤自黑色素瘤、肺、子宫颈肿瘤类型获得并记录详情。将所接受的肿瘤分成2个相等的部分并以与第I阶段测试中过夜孵育类似的方式储存过夜。根据第0天Gen 2批次记录，在全面预REP时相对于硫酸庆大霉素对照测试所选择的抗生素条件。获得TVC、存活率、身分、功能和扩增表型分析数据。
结果
第I阶段
如图43和图44中所示，万古霉素和克林霉素显示出最低细胞毒性且作用不会随试剂浓度的增加而出现增加。添加更高浓度双性霉素B并未出现细胞毒性。尽管通过司徒顿氏(student)“t”检验未观察到统计显著影响，但很明显，利奈唑胺和阿奇霉素对细胞生长具有负面影响，其中随着抗生素浓度增加，观测到细胞毒性增加。所提供的每个误差条均为存活率百分比的四次重复测量值的平均值+/-标准偏差。另外，如图35中所示，当与对照、双性霉素B、克林霉素和万古霉素条件相比较时收集时的存活率。所提供的每个误差条均为存活率百分比的四次重复测量值的平均值+/-标准偏差。
基于在第11天收集时预REP TIL的活细胞计数和存活率百分比，对万古霉素和克林霉素的对照条件进行全面比较测试。两种抗生素均在运输介质和CM1中以100μg/mL浓度测试。
第II阶段
扩增表型
如下表55中所示，对于所测试的任何肿瘤，在对照或万古霉素条件之间观测到的对预REP分化、耗竭活化状态的影响极小。在L4162的对照条件以及L4178的两种条件中，NK细胞浓度更高。如前所述，此可能因为所表征的样本是预REP细胞，该细胞通常具有比在REP结束时的最终药品细胞要高的异质性。
表55：第11天样本的扩增表型
*初始＝CCR7+CD45RA+，CM＝CCR7+CD45RA-，EM＝CCR7-CD45RA-，TEMRA＝CCR7-CD45RA+
如表56中所示，除在庆大霉素+万古霉素条件中IFN-g产生的值更高外，在仅庆大霉素条件与庆大霉素+万古霉素条件之间观察到极小差异，而L4162的身分参数未达到合格准则。各条件之间的值极其类似，表明万古霉素不具有负面影响。
REP后关键属性
表56：D22产物的关键属性
*用aCD3/28/137刺激–未刺激
**可用于表征的细胞太少而无法进行再刺激
***按照LAB-053进行外推。培养是以1:100比例进行且最终TVC乘以100得到所报告的外推TVC。
如表57中所示，对于所测试的任何肿瘤，在对照或万古霉素条件之间观察到对REP后分化、耗竭、活化状态的影响极小。除在L4162肿瘤样本中观察到有3％单核细胞外，非T细胞污染物极少。L4162样本表现不佳，未通过Gen 2方法的合格准则，不过，该两种条件(庆大霉素和庆大霉素+万古霉素)仍以类似方式进行。
基于TVC、存活率、身分、功能和扩增表型分析数据，将100μg/mL万古霉素添加至肿瘤运输介质和CM1预REP培养基中未显示出对预REP细胞产物的不利影响。
第II阶段测试的REP后产物的特征显示出类似的TVC、存活率、身分、功能和扩增表型。
尽管L4162在技术上不满足关于身分的规格，但庆大霉素与庆大霉素+万古霉素条件之间的值是类似的，表明由添加万古霉素引起的影响极小。
表57：D22产物的扩增表型
*初始＝CCR7+CD45RA+，CM＝CCR7+CD45RA-，EM＝CCR7-CD45RA-，TEMRA＝CCR7-CD45RA+
实施例13：评估万古霉素对肿瘤培养基的影响
进行另外的实验以测试万古霉素预防培养基中万古霉素敏感性细菌生长的能力。在该实验中，将以下抗生素添加至在低温保存液(hypothermosol，HTS)中的三种不同细菌浓度的革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌(S.aureus)和粪肠球菌(E.faecalis)中：
a.庆大霉素(50μg/mL)
b.庆大霉素(50μg/mL)+万古霉素(100μg/mL)
c.万古霉素(100μg/mL)
将混合物在2-8℃孵育24小时，接着将1mL各样本添加至20mL具有以上相同抗生素浓度的CM1培养基中。将混合物孵育11天，目视评定细菌生长情况。结果显示于下表56中。
表56：评估抗生素对培养基中细菌生长的影响
如以上所示，万古霉素添加至CM1培养基中抑制金黄色葡萄球菌和粪肠球菌的生长，表明万古霉素是本文提供的方法的培养步骤中抑制革兰氏阳性生物体的适合抗生素。
实施例14：评估万古霉素对肿瘤培养基的影响
进行另外的实验以测试万古霉素预防培养基中万古霉素敏感性细菌生长的能力。在该实验中，将组织碎片接种于具有三种不同负荷的金黄色葡萄球菌和粪肠球菌细菌和以下抗生素的HTS中：
a.庆大霉素(50μg/mL)
b.庆大霉素(50μg/mL)+万古霉素(100μg/mL)
c.万古霉素(100μg/mL)
将所示6种HTS接种物(iHTS)在2-8℃下孵育24小时，用具有与以上相同浓度的抗生素的肿瘤洗涤缓冲液洗涤3次。将肿瘤样本孵育11天，目视评定细菌生长情况。
作为初始对照，若在培养基中存在万古霉素，则经显示，将经接种的HTS直接添加至CM1中可维持无菌性，与表56中所显示的结果类似。本实验的结果示于下表57中。
表57
如以上所示，在添加至CM1稀释的细菌负荷之前进行的肿瘤洗涤步骤足以预防在大多数条件中的生长(6个中的4个，“无”栏)。另外，万古霉素的存在使得在测试的所有细菌负荷下皆未观测到金黄色葡萄球菌和粪肠球菌的生长(“万古霉素”栏)。
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Claims (298)

1.一种用于低温储存肿瘤样本的组合物，其中，所述组合物包含：
a)无血清、无动物组分的冷冻保存培养基；和
b)抗生素组分，其包含：
1)选自以下的抗生素组合：
i.庆大霉素和万古霉素，以及
ii.庆大霉素和克林霉素；或者
2)万古霉素作为抗生素。
2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述抗生素组分包含约50-600μg/mL浓度的万古霉素。
3.如权利要求1所述的组合物，其中，所述抗生素组分包含约100μg/mL浓度的万古霉素。
4.如权利要求1所述的组合物，其中，所述抗生素组分包含约400-600μg/mL浓度的克林霉素。
5.如权利要求1所述的组合物，其中，所述抗生素组分包含约50μg/mL浓度的庆大霉素。
6.如权利要求1所述的组合物，其中，所述抗生素组分包含约50-600μg/mL浓度的万古霉素。
7.如权利要求1所述的组合物，其中，所述抗生素组分包含约100μg/mL浓度的万古霉素。
8.如权利要求1所述的组合物，其中，所述抗生素组分包含抗生素组合，所述抗生素组合包含约50μg/mL的庆大霉素和约400-600μg/mL的克林霉素。
9.如权利要求1所述的组合物，其中，所述抗生素组分包含抗生素组合，所述抗生素组合包含约50μg/mL的庆大霉素和约50-600μg/mL的万古霉素。
10.如权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物还包含抗真菌性抗生素。
11.如权利要求8所述的组合物，其中，所述抗真菌性抗生素为双性霉素B。
12.如权利要求9所述的组合物，其中，所述双性霉素B的浓度为约2.5-10μg/mL。
13.如权利要求1至12中任一项所述的组合物，其中，所述冷冻保存培养基包含：
i.选自钾离子、钠离子、镁离子和钙离子的一种以上电解质；和
ii.在生理条件及低温条件下有效的生物pH缓冲液。
14.如权利要求13所述的组合物，其中，所述钾离子的浓度在约35-45mM范围内，所述钠离子的浓度在约80-120mM范围内，所述镁离子的浓度在约2-10mM范围内，并且所述钙离子的浓度在约0.01-0.1mM范围内。
15.如权利要求13所述的组合物，其中，所述组合物还包含营养有效量的至少一种单糖。
16.如权利要求13所述的组合物，其中，所述组合物还包含不可透过细胞膜且有效抵抗冷暴露期间的细胞膨胀的不透过性阴离子，所述阴离子选自如下：乳糖酸根、葡糖酸根、柠檬酸根和甘油磷酸根。
17.如权利要求13所述的组合物，其中，所述组合物还包含对ATP再生有效的底物，所述底物为选自如下中的至少一个：腺苷、果糖、核糖和腺嘌呤。
18.如权利要求13所述的组合物，其中，所述组合物还包含至少一种调节凋亡诱导的细胞死亡的试剂，所述试剂选自EDTA或维生素E。
19.如权利要求1至12中任一项所述的组合物，其中，所述冷冻保存培养基包含10％DMSO。
20.一种肿瘤样本组合物，其包含：
a)肿瘤样本，所述肿瘤样本包含多个肿瘤细胞和多个肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；和
b)低温储存培养基，其包含：
i.无血清、无动物组分的冷冻保存培养基；和
ii.抗生素组分，其包含：
I)选自以下的抗生素组合：
1.庆大霉素和万古霉素，以及
2.庆大霉素和克林霉素；或者
II)万古霉素作为抗生素。
21.如权利要求20所述的组合物，其中，所述肿瘤样本为实体肿瘤样本。
22.如权利要求21所述的组合物，其中，所述肿瘤样本为如下癌症类型之一：乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、结直肠癌、肺癌、脑癌、肾癌、胃癌、皮肤癌(包括但不限于鳞状细胞癌、基底细胞癌和黑色素瘤)、宫颈癌、头颈癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、肉瘤、膀胱癌和胶质母细胞瘤。
23.如权利要求20所述的组合物，其中，所述肿瘤样本为液体肿瘤样本。
24.如权利要求23所述的组合物，其中，所述液体肿瘤样本为来自血液恶性肿瘤的液体肿瘤样本。
25.如权利要求20所述的组合物，其中，所述肿瘤样本从原发性肿瘤中获得。
26.如权利要求20所述的组合物，其中，所述肿瘤样本从侵袭性肿瘤中获得。
27.如权利要求20所述的组合物，其中，所述肿瘤样本从转移性肿瘤中获得。
28.如权利要求20所述的组合物，其中，所述肿瘤样本从恶性黑色素瘤中获得。
29.如权利要求20所述的组合物，其中，所述多个TIL包含至少90％活细胞。
30.如权利要求20至29中任一项所述的组合物，其中，所述抗生素组分包含约50-600μg/mL浓度的万古霉素。
31.如权利要求20至29中任一项所述的组合物，其中，所述抗生素组分包含约100μg/mL浓度的万古霉素。
32.如权利要求20至29中任一项所述的组合物，其中，所述抗生素组分包含约400-600μg/mL浓度的克林霉素。
33.如权利要求20至29中任一项所述的组合物，其中，所述抗生素组分包含约50μg/mL浓度的庆大霉素。
34.如权利要求20至29中任一项所述的组合物，其中，所述抗生素组分包含约100μg/mL浓度的万古霉素。
35.如权利要求20至29中任一项所述的组合物，其中，所述抗生素组分包含抗生素组合，所述抗生素组合包含约50μg/mL的庆大霉素和约400-600μg/mL的克林霉素。
36.如权利要求20至29中任一项所述的组合物，其中，所述抗生素组分包含抗生素组合，所述抗生素组合包含约50μg/mL的庆大霉素和约50-600μg/mL的万古霉素。
37.如权利要求20至29中任一项所述的组合物，其中，所述抗生素组分包含抗生素组合，所述抗生素组合包含约50μg/mL的庆大霉素和约100μg/mL的万古霉素。
38.如权利要求20至29中任一项所述的组合物，其中，所述组合物还包含抗真菌性抗生素。
39.如权利要求38所述的组合物，其中，所述抗真菌性抗生素为双性霉素B。
40.如权利要求39所述的组合物，其中，所述双性霉素B的浓度为约2.5-10μg/mL。
41.如权利要求20至40中任一项所述的组合物，其中，所述冷冻保存培养基包含：
i.选自钾离子、钠离子、镁离子和钙离子的一种以上电解质；和
ii.在生理条件及低温条件下有效的生物pH缓冲液。
42.如权利要求41所述的组合物，其中，所述钾离子的浓度在约35-45mM范围内，所述钠离子的浓度在80-120mM范围内，所述镁离子的浓度在约2-10mM范围内，并且所述钙离子的浓度在0.01-0.1mM范围内。
43.如权利要求41所述的组合物，其中，所述组合物还包含营养有效量的至少一种单糖。
44.如权利要求41所述的组合物，其中，所述组合物还包含不可透过细胞膜且有效抵抗冷暴露期间的细胞膨胀的不透过性阴离子，所述阴离子选自如下：乳糖酸根、葡糖酸根、柠檬酸根和甘油磷酸根。
45.如权利要求41所述的组合物，其中，所述组合物还包含对ATP再生有效的底物，所述底物为选自如下中的至少一个：腺苷、果糖、核糖和腺嘌呤。
46.如权利要求37所述的组合物，其中，所述组合物还包含至少一种调节凋亡诱导的细胞死亡的试剂，所述试剂选自EDTA或维生素E。
47.如权利要求20至46中任一项所述的组合物，其中，所述冷冻保存培养基包含10％DMSO。
48.一种细胞培养基组合物，其包含：
a.基础培养基，其包含：
i.葡萄糖；
ii.多种盐；
iii.多种氨基酸和维生素；
b.谷氨酰胺或谷氨酰胺衍生物；
c.血清；以及
d.抗生素组分，其包含：
1)选自以下的抗生素组合：
i.庆大霉素和万古霉素；和
ii.庆大霉素和克林霉素；或者
2)万古霉素作为抗生素。
49.一种细胞培养基组合物，其包含：
a.基础培养基，其包含：
i.葡萄糖；
ii.多种盐；
iii.多种氨基酸和维生素；
b.血清白蛋白；
c.胆固醇NF；
d.可选的谷氨酰胺或谷氨酰胺衍生物；以及
e.抗生素组分，其包含：
1)选自以下的抗生素组合：
i.庆大霉素和万古霉素；和
ii.庆大霉素和克林霉素；或者
2)万古霉素作为抗生素。
50.一种细胞培养基组合物，其包含：
a)成分确定的培养基或无血清培养基，其包含：
i.葡萄糖；
ii.多种盐；
iii.多种氨基酸和维生素；
b)可选的转铁蛋白；
c)可选的胰岛素；
d)可选的白蛋白；
e)胆固醇NF；
f)可选的谷氨酰胺或谷氨酰胺衍生物；以及
g)抗生素组分，其包含：
1)选自以下的抗生素组合：
i.庆大霉素和万古霉素；和
ii.庆大霉素和克林霉素；或者
2)万古霉素作为抗生素。
51.如权利要求50所述的细胞培养基，其中，所述细胞培养基包含(可选的重组的)转铁蛋白、(可选的重组的)胰岛素和(可选的重组的)白蛋白。
52.如权利要求50或51所述的细胞培养基，其中，所述成分确定的培养基或无血清培养基包含基础培养基和血清补充剂和/或血清替代物。
53.如权利要求52所述的细胞培养基组合物，其中，所述基础细胞培养基包括：CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基、CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM、CTSTMAIM-V培养基、CTSTMAIM-V SFM、LymphoONETMT细胞扩增无外源物质培养基、杜尔贝科氏改良型伊格尔氏培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔氏基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必须培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基或伊斯科夫氏改良型杜尔贝科氏培养基。
54.如权利要求52或53所述的细胞培养基，其中，所述血清补充剂或血清替代物选自如下：CTSTMOpTmizer T细胞扩增血清补充剂和CTSTM免疫细胞血清替代物。
55.如权利要求50至54中任一项所述的细胞培养基，其中，所述成分确定的培养基或无血清培养基包含一种以上白蛋白或白蛋白替代物。
56.如权利要求50至55中任一项所述的细胞培养基，其中，所述成分确定的培养基或无血清培养基包含一种以上转铁蛋白或转铁蛋白替代物。
57.如权利要求50至56中任一项所述的细胞培养基，其中，所述成分确定的培养基或无血清培养基包含一种以上胰岛素或胰岛素替代物。
58.如权利要求50至57中任一项所述的细胞培养基，其中，所述成分确定的培养基或无血清培养基包含一种以上抗氧化剂。
59.如权利要求50至58中任一项所述的细胞培养基，其中，所述成分确定的培养基或无血清培养基包含一种以上胶原蛋白前体和一种以上微量元素。
60.如权利要求50至59中任一项所述的细胞培养基，其中，所述成分确定的培养基或无血清培养基包含选自如下的一种以上成分：甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、硫胺素、还原型谷胱甘肽、L-抗坏血酸-2-磷酸盐、铁饱和转铁蛋白、胰岛素和含有微量元素部分的化合物，所述微量元素部分为Ag+、Al3+、Ba2+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Ge4+、Se4+、Br、T、Mn2+、P、Si4 +、V5+、Mo6+、Ni2+、Rb+、Sn2+和Zr4+。
61.如权利要求50至60中任一项所述的细胞培养基，其中，所述成分确定的培养基或无血清培养基还包含L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和/或2-巯基乙醇。
62.如权利要求48至61中任一项所述的组合物，其中，所述抗生素组分包含约50-600μg/mL浓度的万古霉素。
63.如权利要求48至61中任一项所述的组合物，其中，所述抗生素组分包含约100μg/mL浓度的万古霉素。
64.如权利要求48至61中任一项所述的组合物，其中，所述抗生素组分包含约400-600μg/mL浓度的克林霉素。
65.如权利要求48至61中任一项所述的组合物，其中，所述抗生素组分包含约50μg/mL浓度的庆大霉素。
66.如权利要求48至61中任一项所述的组合物，其中，所述抗生素组分为约50-600μg/mL浓度的万古霉素。
67.如权利要求48至61中任一项所述的组合物，其中，所述抗生素组分为约100μg/mL浓度的万古霉素。
68.如权利要求48至61中任一项所述的组合物，其中，所述抗生素组分包含抗生素组合，所述抗生素组合包含约50μg/mL的庆大霉素和约400-600μg/mL的克林霉素。
69.如权利要求48至61中任一项所述的组合物，其中，所述抗生素组分包含抗生素组合，所述抗生素组合包含约50μg/mL的庆大霉素和约50-600μg/mL的万古霉素。
70.如权利要求48至61中任一项所述的组合物，其中，所述抗生素组分包含抗生素组合，所述抗生素组合包含约50μg/mL的庆大霉素和约100μg/mL的万古霉素。
71.如权利要求48、49或52至70中任一项所述的细胞培养基，其中，所述基础培养基为RPMI 1640培养基、DMEM培养基或它们的组合。
72.如权利要求48、49或52至70中任一项所述的细胞培养基，其中，所述基础培养基为DMEM培养基。
73.如权利要求48至72中任一项所述的细胞培养基，其中，所述细胞培养基包含谷氨酰胺衍生物，即L-丙氨酸-L-谷氨酰胺(GutaMAX)。
74.如权利要求48至72中任一项所述的细胞培养基，其中，所述细胞培养基包含谷氨酰胺，即L-谷氨酰胺。
75.如权利要求48所述的细胞培养基，其中，所述血清为人类AB血清。
76.如权利要求48至75中任一项所述的细胞培养基，其中，所述细胞培养基还包含IL-2。
77.如权利要求76所述的细胞培养基，其中，所述IL-2是浓度为约3,000-6,000IU/mL的IL-2。
78.如权利要求48至77中任一项所述的细胞培养基，其中，所述细胞培养基还包含抗CD3抗体。
79.如权利要求78所述的细胞培养基，其中，所述抗CD3抗体是浓度为约30ng/mL的OKT-3。
80.如权利要求48至79中任一项所述的细胞培养基，其中，所述细胞培养基还包含抗原呈递饲养细胞。
81.如权利要求78所述的细胞培养基，其中，所述细胞培养基还包含约6,000IU/mL IL-2。
82.如权利要求78所述的细胞培养基，其中，所述细胞培养基还包含约3,000IU/mL IL-2和约30ng/mL OKT-3。
83.如权利要求78所述的细胞培养基，其中，所述细胞培养基还包含约3,000IU/mL IL-2、约30ng/mL OKT-3和抗原呈递饲养细胞。
84.如权利要求78所述的细胞培养基，其中，所述细胞培养基还包含约6,000IU/mL IL-2、约30ng/mL OKT-3和抗原呈递饲养细胞。
85.如权利要求78所述的细胞培养基，其中，所述细胞培养基还包含约3,000IU/mL IL-2。
86.一种肿瘤浸润淋巴细胞组合物，其包含：
a)多个肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；和
b)细胞培养基组合物，其包含：
i.基础培养基，其包含：
1.葡萄糖，
2.多种盐，
3.多种氨基酸和维生素；
ii.谷氨酰胺或谷氨酰胺衍生物；
iii.血清；和
iv.抗生素组分，其包含：
I)选自以下的抗生素组合：
1.庆大霉素和万古霉素；以及
2.庆大霉素和克林霉素；或者
II)万古霉素作为抗生素。
87.一种肿瘤浸润淋巴细胞组合物，其包含：
a)多个肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；和
b)细胞培养基组合物，所述细胞培养基组合物为成分确定的培养基或无血清培养基，所述培养基包含：
i.葡萄糖，
ii.多种盐，
iii.多种氨基酸和维生素；
c)可选的转铁蛋白；
d)可选的胰岛素；
e)可选的白蛋白；
f)胆固醇NF；
g)可选的谷氨酰胺或谷氨酰胺衍生物；以及
h)抗生素组分，其包含：
1)选自以下的抗生素组合：
i.庆大霉素和万古霉素；以及
ii.庆大霉素和克林霉素；或者
2)万古霉素作为抗生素。
88.如权利要求87所述的组合物，其中，所述组合物包含(可选的重组的)转铁蛋白、(可选的重组的)胰岛素和(可选的重组的)白蛋白。
89.如权利要求87或88所述的组合物，其中，所述成分确定的培养基或无血清培养基包含基础培养基和血清补充剂和/或血清替代物。
90.如权利要求89所述的组合物，其中，所述基础细胞培养基包括但不限于：CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基、CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM、CTSTMAIM-V培养基、CTSTMAIM-V SFM、LymphoONETMT细胞扩增无外源物质培养基、杜尔贝科氏改良型伊格尔氏培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔氏基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必须培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基或伊斯科夫氏改良型杜尔贝科氏培养基。
91.如权利要求89或90所述的组合物，其中，所述血清补充剂或血清替代物选自如下：CTSTMOpTmizer T细胞扩增血清补充剂和CTSTM免疫细胞血清替代物。
92.如权利要求87至91中任一项所述的组合物，其中，所述成分确定的培养基或无血清培养基包含一种以上白蛋白或白蛋白替代物。
93.如权利要求87至92中任一项所述的组合物，其中，所述成分确定的培养基或无血清培养基包含一种以上转铁蛋白或转铁蛋白替代物。
94.如权利要求87至93中任一项所述的组合物，其中，所述成分确定的培养基或无血清培养基包含一种以上胰岛素或胰岛素替代物。
95.如权利要求87至94中任一项所述的组合物，其中，所述成分确定的培养基或无血清培养基包含一种以上抗氧化剂。
96.如权利要求87至95中任一项所述的组合物，其中，所述成分确定的培养基或无血清培养基包含一种以上胶原蛋白前体和一种以上微量元素。
97.如权利要求87至96中任一项所述的组合物，其中，所述成分确定的培养基或无血清培养基包含选自如下的一种以上成分：甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、硫胺素、还原型谷胱甘肽、L-抗坏血酸-2-磷酸盐、铁饱和转铁蛋白、胰岛素和含有微量元素部分的化合物，所述微量元素部分为Ag+、Al3+、Ba2+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Ge4+、Se4+、Br、T、Mn2+、P、Si4+、V5 +、Mo6+、Ni2+、Rb+、Sn2+和Zr4+。
98.如权利要求87至97中任一项所述的细胞培养基，其中，所述成分确定的培养基或无血清培养基还包含L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和/或2-巯基乙醇。
99.如权利要求86至98中任一项所述的组合物，其中，所述多个TIL展现出至少90％的活细胞。
100.如权利要求86至99中任一项所述的组合物，其中，所述多个TIL展现出与不含万古霉素和克林霉素的对照肿瘤浸润淋巴细胞组合物相似的记忆性TIL群。
101.如权利要求86至100中任一项所述的组合物，其中，所述多个TIL展现出与不含万古霉素和克林霉素的对照肿瘤浸润淋巴细胞组合物相似的分化CD3+/CD4+、活化CD3+/CD4+和耗竭CD3+/CD4+TIL群。
102.如权利要求86至100中任一项所述的组合物，其中，所述多个TIL展现出与不含万古霉素和克林霉素的对照肿瘤浸润淋巴细胞组合物相似的分化CD3+/CD8+、活化CD3+/CD8+和耗竭CD3+/CD8+TIL群。
103.如权利要求86至102中任一项所述的组合物，其中，所述抗生素组分包含约50-600μg/mL浓度的万古霉素。
104.如权利要求86至102中任一项所述的组合物，其中，所述抗生素组分包含约100μg/mL浓度的万古霉素。
105.如权利要求86至102中任一项所述的组合物，其中，所述抗生素组分包含约400-600μM浓度的克林霉素。
106.如权利要求86至102中任一项所述的组合物，其中，所述抗生素组分包含约50μg/mL浓度的庆大霉素。
107.如权利要求86至102中任一项所述的组合物，其中，所述抗生素组分为约50-600μg/mL浓度的万古霉素。
108.如权利要求86至102中任一项所述的组合物，其中，所述抗生素组分为约100μg/mL浓度的万古霉素。
109.如权利要求86至102中任一项所述的组合物，其中，所述抗生素组分包含抗生素组合，所述抗生素组合包含约50μg/mL的庆大霉素和约400-600μg/mL的克林霉素。
110.如权利要求86至102中任一项所述的组合物，其中，所述抗生素组分包含抗生素组合，所述抗生素组合包含约50μg/mL的庆大霉素和约50-600μg/mL的万古霉素。
111.如权利要求86至102中任一项所述的组合物，其中，所述抗生素组分包含抗生素组合，所述抗生素组合包含约50μg/mL的庆大霉素和约100μg/mL的万古霉素。
112.如权利要求86或89至111中任一项所述的组合物，其中，所述基础培养基为RPMI1640培养基、DMEM培养基或它们的组合。
113.如权利要求86或89至111中任一项所述的组合物，其中，所述基础培养基为DMEM培养基。
114.如权利要求86至113中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含谷氨酰胺衍生物，即L-丙氨酸-L-谷氨酰胺(GutaMAX)。
115.如权利要求86至113中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含谷氨酰胺，即L-谷氨酰胺。
116.如权利要求86所述的组合物，其中，所述血清为人类AB血清。
117.如权利要求86至116中任一项所述的组合物，其中，所述细胞培养基还包含IL-2。
118.如权利要求117所述的组合物，其中，所述IL-2是浓度为约3,000-6,000IU/mL的IL-2。
119.如权利要求117所述的组合物，其中，所述细胞培养基还包含抗CD3抗体。
120.如权利要求119所述的组合物，其中，所述抗CD3抗体是浓度为约30ng/mL的OKT-3。
121.如权利要求86至120中任一项所述的组合物，其中，所述细胞培养基还包含抗原呈递饲养细胞。
122.如权利要求86至121中任一项所述的组合物，其中，所述细胞培养基包含约6,000IU/mL IL-2。
123.如权利要求86至120中任一项所述的组合物，其中，所述细胞培养基还包含约6,000IU/mL IL-2、约30ng/mL OKT和抗原呈递饲养细胞。
124.如权利要求86至123中任一项所述的组合物，其中，所述组合物基本上不含革兰氏阳性细菌。
125.一种用于扩增T细胞的方法，其包括通过如下方式由获自受试者的肿瘤样本来扩增第一T细胞群：在包含抗生素组分的培养基中培养第一T细胞群，实现所述第一T细胞群的生长，其中所述抗生素组分包含：i)抗生素组合，所述抗生素组合选自1)庆大霉素和万古霉素，以及2)庆大霉素和克林霉素；或者ii)万古霉素作为抗生素。
126.如权利要求125所述的方法，其中，所述培养基包含IL-2。
127.如权利要求125所述的方法，其中，所述第一T细胞群培养约7至14天的时间段。
128.一种用于快速扩增T细胞的方法，其包括：使第一T细胞群与包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)、抗原呈递细胞(APC)和抗生素组分的培养基接触，实现所述第一T细胞群的快速生长，由此产生第二T细胞群，其中所述快速扩增进行约7至14天的时间段，并且所述抗生素组分包含：i)抗生素组合，所述抗生素组合选自1)庆大霉素和万古霉素，以及2)庆大霉素和克林霉素；或者ii)万古霉素作为抗生素。
129.如权利要求125至128中任一项所述的方法，其中，所述培养基还包含IL-15和IL-21。
130.如权利要求125至129中任一项所述的方法，其中，所述抗生素组分包含约50-600μg/mL浓度的万古霉素。
131.如权利要求125至129中任一项所述的方法，其中，所述抗生素组分包含约100μg/mL浓度的万古霉素。
132.如权利要求125至129中任一项所述的方法，其中，所述抗生素组分为约100μg/mL浓度的万古霉素。
133.如权利要求125至129中任一项所述的方法，其中，所述抗生素组分包含约400-600μg/mL浓度的克林霉素。
134.如权利要求125至129中任一项所述的方法，其中，所述抗生素组分包含约50μg/mL浓度的庆大霉素。
135.如权利要求125至129中任一项所述的方法，其中，所述抗生素组分包含抗生素组合，所述抗生素组合包含约50μg/mL浓度的庆大霉素和约100μg/mL浓度的万古霉素。
136.如权利要求125至135中任一项所述的方法，其中，所述扩增在基本上不含革兰氏阳性细菌的条件下发生。
137.一种用于将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群的方法，其包括：
a)提供获自受试者切除肿瘤的包含多个肿瘤细胞和TIL的样本；
b)通过将所述样本处理成多个碎片，获得第一TIL群；
c)将所述碎片添加至密闭系统中；
d)通过在第一细胞培养基中培养所述第一TIL群来进行第一次扩增，产生第二TIL群，其中所述第一次扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，所述第一次扩增进行约3-14天以获得第二TIL群，其中自步骤c)至步骤d)的转变在不打开系统的情况下发生，以及所述第一细胞培养基包含IL-2和第一抗生素组分；
e)通过在第二细胞培养基中培养第二TIL群来进行第二次扩增，产生第三TIL群，其中所述第二次扩增进行约7-14天以获得第三TIL群，所述第三TIL群为治疗性TIL群，所述第二次扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，并且自步骤d)至步骤e)的转变在不打开系统的情况下发生，所述第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3、抗原呈递细胞(APC)和可选的第二抗生素组分；
f)收集自步骤e)获得的治疗性TIL群，其中自步骤e)至步骤f)的转变在不打开系统的情况下发生；以及
g)将自步骤f)收集的治疗性TIL群转移至输注袋，其中自步骤f)至步骤g)的转移在不打开系统的情况下发生；
其中所述第一抗生素组分和可选的第二抗生素组分包含：i)抗生素组合，所述抗生素组合选自1)庆大霉素和万古霉素，以及2)庆大霉素和克林霉素；或者ii)万古霉素作为抗生素。
138.如权利要求137所述的方法，其中，在步骤d)之前，所述方法还包括以下步骤：
(i)在包含IL-2和可选的所述第一培养基中的第一抗生素组分的培养基中培养第一TIL群，获得自多个肿瘤碎片释放的TIL，
(ii)将步骤(i)中至少多个自多个肿瘤碎片释放的TIL与多个肿瘤碎片分离，获得多个肿瘤碎片、残留在多个肿瘤碎片中的TIL和自多个肿瘤碎片释放并在所述分离之后保留在其中的任何TIL的混合物，以及
(iii)可选地，消化多个肿瘤碎片、残留在多个肿瘤碎片中的TIL和自多个肿瘤碎片释放并在所述分离之后保留在其中的任何TIL的混合物，产生所述混合物的消化物；并且
在步骤d)中，所述混合物或混合物的消化物在第一细胞培养基中培养，获得所述第二TIL群。
139.如权利要求137所述的方法，其中，在步骤d)中进行的第一次扩增包括：
(i)在第一细胞培养基中培养第一TIL群约3-14天，获得自肿瘤碎片释放的TIL，
(ii)将步骤(i)中至少多个自肿瘤碎片释放的TIL与肿瘤碎片分离，获得第二TIL群，所述第二TIL群为肿瘤碎片、残留在肿瘤碎片中的TIL和自肿瘤碎片释放并在所述分离之后保留在其中的任何TIL的混合物形式，以及
(iii)可选地，消化肿瘤碎片、残留在肿瘤碎片中的TIL和自肿瘤碎片释放并在所述分离之后保留在其中的任何TIL的混合物，产生所述混合物的消化物；并且
在步骤e)中，所述第二次扩增通过在第二培养基中扩增呈混合物或混合物的消化物形式的第二TIL群约7-14天来进行，由此产生第三TIL群。
140.一种用于将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群的方法，其包括：
a)提供第一TIL群，所述第一TIL群由手术切除、穿刺活体组织切片、粗针活体组织切片、小型活体组织切片或用于自受试者获得包含肿瘤和TIL的第一混合物的样本的其他方式获得；
b)在第一细胞培养基中进行第一TIL群的初始第一次扩增，获得第二TIL群，其中，所述第一细胞培养基包含IL-2、可选的OKT-3(抗CD3抗体)、可选的抗原呈递细胞(APC)和第一抗生素组分，所述初始第一次扩增进行约1至7或8天的时间段，所述第二TIL群的数量大于第一TIL群的数量；
c)在第二细胞培养基中进行第二TIL群的快速第二次扩增，获得治疗性TIL群，其中所述第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3、可选的第二抗生素组分和APC；所述快速扩增进行约1至11天的时间段；以及
d)收集治疗性TIL群；
其中，所述第一培养基中的第一抗生素组分和所述第二培养基中的可选的第二抗生素组分包含：i)抗生素组合，所述抗生素组合选自1)庆大霉素和万古霉素，以及2)庆大霉素和克林霉素；或者ii)万古霉素作为抗生素。
141.如权利要求140所述的方法，其中，所述快速第二次扩增进行约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天的时间段。
142.如权利要求140所述的方法，其中，在步骤b)中，所述第一细胞培养基还包含APC，并且步骤c)中的第二培养基中APC的数量大于步骤b)中的第一培养基中APC的数量。
143.如权利要求140所述的方法，其中，在步骤b)之前，所述方法还包括以下步骤：
(i)在包含IL-2和可选的第一抗生素组分的培养基中培养第一TIL群，获得自所述样本释放的TIL，
(ii)将步骤(i)中至少多个自样本释放的TIL与样本分离，获得样本、残留在样本中的TIL和自样本释放并在所述分离之后保留在其中的任何TIL的第二混合物，以及
(iii)可选地，消化所述样本、残留在所述样本中的TIL和自所述样本释放并在所述分离之后保留在其中的任何TIL的第二混合物，产生所述第二混合物的消化物；并且
其中，步骤b)包括在第一细胞培养基中对呈第二混合物或第二混合物的消化物形式的第一TIL群进行初始第一次扩增，获得所述第二TIL群。
144.如权利要求140所述的方法，其中，步骤a)包括通过自受试者的肿瘤中切除样本并将所述样本处理成含有来自所述受试者的肿瘤和TIL的混合物的多个肿瘤碎片，来提供第一TIL群。
145.如权利要求144所述的方法，其中，在步骤b)之前，所述方法还包括如下步骤：
(i)在包含IL-2和可选的所述第一培养基中的第一抗生素组分的培养基中培养第一TIL群，获得自多个肿瘤碎片释放的TIL，
(ii)将步骤(i)中至少多个自样本释放的TIL与肿瘤碎片分离，获得样本、残留在多个肿瘤碎片中的TIL和自多个肿瘤碎片释放并在所述分离之后保留在其中的任何TIL的第二混合物，以及
(iii)可选地，消化多个肿瘤碎片、残留在多个肿瘤碎片中的TIL和自多个肿瘤碎片释放并在所述分离之后保留在其中的任何TIL的第二混合物，产生所述第二混合物的消化物；并且
其中，步骤b)包括在第一细胞培养基中对呈第二混合物或第二混合物的消化物形式的第一TIL群进行初始第一次扩增，获得第二TIL群。
146.一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其包括：
a)通过在包含第一抗生素组分的第一培养基中培养第一TIL群以实现第一TIL群的生长并启动其活化，来进行第一TIL群的初始第一次扩增，所述第一TIL群由手术切除、穿刺活体组织切片、粗针活体组织切片、小型活体组织切片或用于自受试者获得包含肿瘤和TIL的混合物的样本的其他方式获得；
b)在步骤a)中启动的第一TIL群的活化开始衰退之后，通过在可选地包含第二抗生素组分的第二培养基中培养第一TIL群以实现第一TIL群的生长并增强其活化，来进行第一TIL群的快速第二次扩增，获得第二TIL群，其中所述第二TIL群为治疗性TIL群；以及
c)收集治疗性TIL群；
其中所述第一培养基中的第一抗生素组分和所述第二培养基中的可选的第二抗生素组分包含：i)抗生素组合，所述抗生素组合选自1)庆大霉素和万古霉素，以及2)庆大霉素和克林霉素；或者ii)万古霉素作为抗生素。
147.如权利要求146所述的方法，其中在步骤a)中，所述第一培养基还包含IL-2和OKT-3(抗CD3抗体)，以及可选的抗原呈递细胞(APC)，并且在步骤(b)中，第二培养基还包含IL-2、OKT-3及APC。
148.一种用于将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群的方法，其包括：
a)提供第一TIL群，所述第一TIL群由手术切除、穿刺活体组织切片、粗针活体组织切片、小型活体组织切片或用于自受试者获得包含肿瘤和TIL的第一混合物的样本的其他方式获得；
b)在第一细胞培养基中进行第一TIL群的第一次扩增，获得第二TIL群，其中，所述第一细胞培养基包含IL-2和第一抗生素组分，所述第一次扩增进行约3至14天的时间段，所述第二TIL群的数量大于第一TIL群的数量；
c)在第二细胞培养基中进行第二TIL群的第二次扩增，获得治疗性TIL群，其中所述第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3、可选的第二抗生素组分和抗原呈递细胞(APC)；所述第二次扩增进行约7-14天的时间段；以及
d)收集治疗性TIL群；
其中所述第一培养基中的第一抗生素组分和所述第二培养基中的可选的第二抗生素组分包含：i)抗生素组合，所述抗生素组合选自1)庆大霉素和万古霉素，以及2)庆大霉素和克林霉素；或者ii)万古霉素作为抗生素。
149.如权利要求148所述的方法，其中，所述第一次扩增进行约11天的时间段。
150.如权利要求148所述的方法，其中，所述第二次扩增进行约11天的时间段。
151.如权利要求148所述的方法，其中，所述第一次扩增和所述第二次扩增进行约22天的时间段。
152.如权利要求148所述的方法，其中，在步骤b)之前，所述方法还包括如下步骤：
(i)在包含IL-2和可选的所述第一培养基中的第一抗生素组分的培养基中培养第一TIL群，获得自所述样本释放的TIL，
(ii)将步骤(i)中至少多个自样本释放的TIL与所述样本分离，获得样本、残留在样本中的TIL和自样本释放并在所述分离之后保留在其中的任何TIL的第二混合物，以及
(iii)可选地，消化所述样本、残留在所述样本中的TIL和自所述样本释放并在所述分离之后保留在其中的任何TIL的第二混合物，产生所述第二混合物的消化物；并且
其中，步骤b)包括在第一细胞培养基中对呈第二混合物或第二混合物的消化物形式的第一TIL群进行初始第一次扩增，获得第二TIL群。
153.如权利要求148所述的方法，其中，在步骤b)中进行的第一次扩增包括：
(i)在第一细胞培养基中培养第一TIL群约3-14天，获得自所述样本释放的TIL，
(ii)将步骤(i)中至少多个自样本释放的TIL与所述样本分离，获得第二TIL群，所述第二TIL群为所述样本、残留在样本中的TIL和自样本释放并在所述分离之后保留在其中的任何TIL的第二混合物形式，以及
(iii)可选地，消化所述样本、残留在所述样本中的TIL和自所述样本释放并在所述分离之后保留在其中的任何TIL的第二混合物，产生所述第二混合物的消化物；并且
其中，在步骤c)中，所述第二次扩增通过在第二培养基中扩增呈第二混合物或第二混合物的消化物形式的第二TIL群约7-11天来进行，由此产生治疗性TIL群。
154.如权利要求148所述的方法，其中，步骤a)包括通过自受试者的肿瘤中切除样本并将所述样本处理成含有来自所述受试者的肿瘤和TIL的混合物的多个肿瘤碎片，来提供第一TIL群。
155.如权利要求154所述的方法，其中，在步骤b)之前，所述方法还包括如下步骤：
(i)在包含IL-2和可选的第一抗生素组分的培养基中培养第一TIL群，获得自多个肿瘤碎片释放的TIL，
(ii)将步骤(i)中至少多个自样本释放的TIL与多个肿瘤碎片分离，获得样本、残留在多个肿瘤碎片中的TIL和自多个肿瘤碎片释放并在所述分离之后保留在其中的任何TIL的第二混合物，以及
(iii)可选地，消化多个肿瘤碎片、残留在多个肿瘤碎片中的TIL和自多个肿瘤碎片释放并在所述分离之后保留在其中的任何TIL的第二混合物，产生所述第二混合物的消化物；
其中，步骤b)包括在第一细胞培养基中对呈第二混合物或第二混合物的消化物形式的第一TIL群进行第一次扩增，获得第二TIL群。
156.如权利要求154所述的方法，其中，在步骤b)中进行的第一次扩增包括：
(i)在第一细胞培养基中培养第一TIL群约3-14天，获得自肿瘤碎片释放的TIL，
(ii)将步骤(i)中至少多个自肿瘤碎片释放的TIL与肿瘤碎片分离，获得第二TIL群，所述第二TIL群为肿瘤碎片、残留在肿瘤碎片中的TIL和自肿瘤碎片释放并在所述分离之后保留在其中的任何TIL的第二混合物形式，以及
(iii)可选地，消化肿瘤碎片、残留在肿瘤碎片中的TIL和自肿瘤碎片释放并在所述分离之后保留在其中的任何TIL的第二混合物，产生所述第二混合物的消化物；
其中，在步骤c)中，所述第二次扩增通过在第二细胞培养基中扩增呈第二混合物或第二混合物的消化物形式的第二TIL群约7-14天来进行，由此产生治疗性TIL群。
157.如权利要求137至156中任一项所述的方法，其中，所述第一细胞培养基和/或所述第二细胞培养基还包含IL-15和IL-21。
158.如权利要求137至157中任一项所述的方法，其中，所述第一抗生素组分包含约50-600μg/mL浓度的万古霉素。
159.如权利要求137至157中任一项所述的方法，其中，所述第一抗生素组分包含约50-600μg/mL浓度的万古霉素。
160.如权利要求137至157中任一项所述的方法，其中，所述第一抗生素组分包含约100μg/mL浓度的万古霉素。
161.如权利要求137至157中任一项所述的方法，其中，所述第一抗生素组分为约100μg/mL浓度的万古霉素。
162.如权利要求137至157中任一项所述的方法，其中，所述第一抗生素组分包含约400-600μg/mL浓度的克林霉素。
163.如权利要求137至162中任一项所述的方法，其中，所述第一抗生素组分包含约50μg/mL浓度的庆大霉素。
164.如权利要求137至157中任一项所述的方法，其中，所述第一抗生素组分包含抗生素组合，所述抗生素组合包含约50μg/mL浓度的庆大霉素和约100μg/mL浓度的万古霉素。
165.如权利要求137至164中任一项所述的方法，其中，通过在第一细胞培养基中进行第一次扩增获得的TIL群展现出至少90％的活细胞。
166.如权利要求137至165中任一项所述的方法，其中，与通过在不含万古霉素和克林霉素的对照细胞培养基中进行TIL扩增获得的TIL群相比，通过在第一细胞培养基中进行第一次扩增获得的TIL群展现出相似的记忆性TIL群。
167.如权利要求137至166中任一项所述的方法，其中，与通过在不含万古霉素和克林霉素的对照细胞培养基中进行TIL扩增获得的TIL群相比，通过在第一细胞培养基中进行第一次扩增获得的TIL群展现出相似的分化CD3+/CD4+、活化CD3+/CD4+和耗竭CD3+/CD4+TIL群。
168.如权利要求137至167中任一项所述的方法，其中，与通过在不含万古霉素和克林霉素的对照细胞培养基中进行TIL扩增获得的TIL群相比，通过在第一细胞培养基中进行第一次扩增获得的TIL群展现出相似的分化CD3+/CD8+、活化CD3+/CD8+和耗竭CD3+/CD8+TIL群。
169.如权利要求137至168中任一项所述的方法，其中，所述第一细胞培养基包含约6,000IU/mL IL-2。
170.如权利要求137至169中任一项所述的方法，其中，所述第一细胞培养基还包含OKT-3和抗原呈递饲养细胞。
171.如权利要求137至170中任一项所述的细胞培养基，其中，所述第一细胞培养基包含约6,000IU/mL IL-2和30ng/mL OKT-3。
172.如权利要求137至171中任一项所述的细胞培养基，其中，所述第二细胞培养基包含约3,000IU/mL IL-2和30ng/mL OKT-3。
173.如权利要求137至171中任一项所述的方法，其中，所述第二细胞培养基包含6,000IU/mL IL-2和30ng/mL OKT-3。
174.如权利要求137至173中任一项所述的方法，其中，所述第一次扩增和所述第二次扩增在基本上不含革兰氏阳性细菌的条件下发生。
175.如权利要求137至174中任一项所述的方法，其中，所述样本提供于低温储存培养基中，所述低温储存培养基包含：
a)无血清、无动物组分的冷冻保存培养基；和
b)第三抗生素组分，所述抗生素组分包含：
1)选自以下的抗生素组合：
i.庆大霉素、双性霉素B和万古霉素，以及
ii.庆大霉素、双性霉素B和克林霉素；或者
2)万古霉素作为抗生素。
176.如权利要求137至174中任一项所述的方法，其中，所述第一TIL群自受试者的样本获得，所述样本提供于低温储存培养基中，所述低温储存培养基包含：
a)无血清、无动物组分的冷冻保存培养基；和
b)第三抗生素组分，所述抗生素组分包含：
1)选自以下的抗生素组合：
i.庆大霉素、双性霉素B和万古霉素，以及
ii.庆大霉素、双性霉素B和克林霉素；或者
2)万古霉素作为抗生素。
177.如权利要求175或176所述的方法，其中，所述低温储存培养基中的所述第三抗生素组分包含约50-600μg/mL浓度的万古霉素。
178.如权利要求175或176所述的方法，其中，所述低温储存培养基中的所述第三抗生素组分包含约400-600μg/mL浓度的克林霉素。
179.如权利要求175或176所述的方法，其中，所述低温储存培养基中的所述第三抗生素组分包含约50μg/mL浓度的庆大霉素。
180.如权利要求175或176所述的方法，其中，所述低温储存培养基中的所述第三抗生素组分包含约2.5-10μg/mL浓度的双性霉素B。
181.如权利要求175或176所述的方法，其中，所述低温储存培养基中的所述第三抗生素组分包含约50-600μg/mL浓度的万古霉素。
182.如权利要求175或176所述的方法，其中，所述低温储存培养基中的所述第三抗生素组分包含约100μg/mL浓度的万古霉素。
183.如权利要求175或176所述的方法，其中，所述低温储存培养基中的所述第三抗生素组分为约100μg/mL浓度的万古霉素。
184.如权利要求175或176所述的方法，其中，所述低温储存培养基中的所述第三抗生素组分为抗生素组合，所述抗生素组合包含约100μg/mL浓度的万古霉素和约50μg/mL浓度的庆大霉素。
185.如权利要求175或176所述的方法，其中，所述低温储存培养基中的所述第三抗生素组分包含约50μg/mL的庆大霉素、约2.5-10μg/mL双性霉素B和约400-600μM的克林霉素。
186.如权利要求175或176所述的方法，其中，所述低温储存培养基中的抗生素组分包含约50μg/mL的庆大霉素、约2.5-10μg/mL双性霉素B和约50-600μM的万古霉素。
187.通过权利要求137至186中任一项所述的方法制得的治疗性TIL群。
188.一种用于将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群的方法，其包括：
a)通过将自受试者获得的肿瘤样本消化成肿瘤消化物而自受试者切除的肿瘤获得和/或接收第一TIL群；
b)自步骤a)中呈肿瘤消化物形式的第一TIL群中选择PD-l阳性TIL，获得富含PD-l的TIL群；
c)通过在包含IL-2、OKT-3、第一抗生素组分和抗原呈递细胞(APC)的第一细胞培养基中培养所述富含PD-1的TIL群来进行初始第一次扩增，获得第二TIL群，其中，所述初始第一次扩增在包括第一透气表面区域的容器中进行，所述初始第一次扩增进行约1至7或8天的第一时间段以获得第二TIL群，所述第二TIL群的数量大于第一TIL群的数量；
d)通过在包含IL-2、OKT-3、可选的第二抗生素组分和APC的第二细胞培养基中培养第二TIL群来进行快速第二次扩增，获得治疗性TIL群，其中在所述快速第二次扩增中添加的APC的数量是在步骤b)中添加的APC数量的至少两倍，所述快速第二次扩增进行约1至11天的第二时间段以获得治疗性TIL群，所述快速第二次扩增在包括第二透气表面区域的容器中进行；
e)收集自步骤d)获得的治疗性TIL群；以及
f)将自步骤e)收集的TIL群转移至输注袋，
其中，所述第一培养基中的第一抗生素组分和所述第二培养基中的可选的第二抗生素组分包含：i)抗生素组合，所述抗生素组合选自1)庆大霉素和万古霉素，以及2)庆大霉素和克林霉素；或者ii)万古霉素作为抗生素。
189.如权利要求188所述的方法，其中，所述第一抗生素组分包含约50-600μg/mL浓度的万古霉素。
190.如权利要求188所述的方法，其中，所述第一抗生素组分包含约400-600μg/mL浓度的克林霉素。
191.如权利要求188所述的方法，其中，所述第一抗生素组分包含约50μg/mL浓度的庆大霉素。
192.如权利要求188所述的方法，其中，所述第一抗生素组分包含约100μg/mL浓度的万古霉素。
193.如权利要求188所述的方法，其中，所述第一抗生素组分包含约100μg/mL浓度的万古霉素。
194.如权利要求188所述的方法，其中，所述第一抗生素组分为抗生素组合，所述抗生素组合包含约100μg/mL浓度的万古霉素和约50μg/mL浓度的庆大霉素。
195.如权利要求137至194中任一项所述的方法，其中，所述第二TIL群展现出至少90％的活细胞。
196.如权利要求137至195中任一项所述的方法，其中，所述第二TIL群展现出与第一TIL群在不含万古霉素和克林霉素的对照第一细胞培养基中进行扩增获得的第二TIL群相似的记忆性TIL群。
197.如权利要求137至196中任一项所述的方法，其中，所述第二TIL群展现出与第一TIL群在不含万古霉素和克林霉素的对照第一细胞培养基中进行扩增获得的第二TIL群相似的分化CD3+/CD4+、活化CD3+/CD4+和耗竭CD3+/CD4+TIL群。
198.如权利要求137至197中任一项所述的方法，其中，所述第二TIL群展现出与第一TIL群在不含万古霉素和克林霉素的对照第一细胞培养基中进行扩增获得的第二TIL群相似的分化CD3+/CD8+、活化CD3+/CD8+和耗竭CD3+/CD8+TIL群。
199.如权利要求137至198中任一项所述的方法，其中，所述第一细胞培养基包含约6,000IU/mL IL-2。
200.如权利要求137至198中任一项所述的方法，其中，所述第一细胞培养基包含6,000IU/mL IL-2和30ng/mL OKT-3。
201.如权利要求137至200中任一项所述的方法，其中，所述第二细胞培养基包含6,000IU/mL IL-2和30ng/mL OKT-3。
202.如权利要求137至201中任一项所述的方法，其中，步骤a)中的肿瘤样本提供于低温储存培养基中，所述低温储存培养基包含：
a)无血清、无动物组分的冷冻保存培养基；和
b)第三抗生素组分，所述抗生素组分包含：
1)选自以下的抗生素组合：
i.庆大霉素和万古霉素，以及
ii.庆大霉素和克林霉素；或者
2)万古霉素作为抗生素。
203.如权利要求202所述的方法，其中，所述第三抗生素组分包含约50-600μg/mL浓度的万古霉素。
204.如权利要求202所述的方法，其中，所述第三抗生素组分包含约100μg/mL浓度的万古霉素。
205.如权利要求202所述的方法，其中，所述第三抗生素组分包含约400-600μg/mL浓度的克林霉素。
206.如权利要求202所述的方法，其中，所述第三抗生素组分包含约50μg/mL浓度的庆大霉素。
207.如权利要求202所述的方法，其中，所述第三抗生素组分包含约2.5-10μg/mL浓度的双性霉素B。
208.如权利要求202所述的方法，其中，所述第三抗生素组分包含约50-600μg/mL浓度的万古霉素。
209.如权利要求202所述的方法，其中，所述第三抗生素组分包含抗生素组合，所述抗生素组合包含约50μg/mL的庆大霉素、约2.5-10μg/mL的双性霉素B和约400-600μg/mL的克林霉素。
210.如权利要求202所述的方法，其中，所述第三抗生素组分包含抗生素组合，所述抗生素组合包含约50μg/mL的庆大霉素、约2.5-10μg/mL的双性霉素B和约50-600μg/mL的万古霉素。
211.如权利要求202所述的方法，其中，所述第三抗生素组分包含抗生素组合，所述抗生素组合包含约50μg/mL的庆大霉素和约100μg/mL的万古霉素。
212.通过权利要求137至211中任一项所述的方法制得的治疗性TIL群。
213.一种用于扩增来自外周血的外周血淋巴细胞(PBL)的方法，所述方法包括以下步骤：
a)自患者的外周血获得外周血单核细胞(PBMC)的样本；
b)在包含第一细胞培养基的培养物中培养所述PBMC选自如下的时间段：约9天、约10天、约11天、约12天、约13天和约14天，由此实现来自所述PBMC的外周血淋巴细胞(PBL)的扩增，所述第一细胞培养基具有IL-2、抗CD3/抗CD28抗体和第一抗生素组合；以及
c)自步骤(b)中的培养物中收集所述PBL，其中所述第一抗生素组分包含：i)抗生素组合，所述抗生素组合选自1)庆大霉素和万古霉素，以及2)庆大霉素和克林霉素；或者ii)万古霉素作为抗生素。
214.如权利要求213所述的方法，其中，所述患者用依鲁替尼或另一种介白素-2诱导性T细胞激酶(ITK)抑制剂预治疗。
215.如权利要求214所述的方法，其中，所述患者难以用依鲁替尼或另一种ITK抑制剂治疗。
216.如权利要求213所述的方法，其中，所述第一抗生素组分包含约50-600μg/mL浓度的万古霉素。
217.如权利要求213所述的方法，其中，所述第一抗生素组分包含约400-600μg/mL浓度的克林霉素。
218.如权利要求213所述的方法，其中，所述第一抗生素组分包含约50μg/mL浓度的庆大霉素。
219.如权利要求213所述的方法，其中，在步骤(c)中自培养物收集的所述PBL展现出至少90％的活细胞。
220.如权利要求213所述的方法，其中，与在不含万古霉素和克林霉素的对照细胞培养基中由PBMC群扩增获得的PBL群相比，步骤(c)中自培养物收集的PBL展现出相似的分化CD3+/CD4+、活化CD3+/CD4+和耗竭CD3+/CD4+TIL群。
221.如权利要求213所述的方法，其中，与在不含万古霉素和克林霉素的对照细胞培养基中由PBMC群扩增获得的PBL群相比，步骤(c)中自培养物收集的PBL群展现出相似的分化CD3+/CD8+、活化CD3+/CD8+和耗竭CD3+/CD8+TIL群。
222.如权利要求213所述的方法，其中，所述第一细胞培养基包含约3,000IU/mL IL-2。
223.如权利要求213所述的方法，其中，所述抗CD3抗体和所述抗CD28抗体缀合至珠子。
224.如权利要求223所述的方法，其中，所述珠子与所述PBMC以3个珠子：1个PMBC细胞的比率混合于培养物中。
225.如权利要求224所述的方法，其中，步骤b)包括将PBMC和珠子的混合物以约25,000个细胞/cm2至约50,000个细胞/cm2的密度接种于透气表面上，在所述第一细胞培养基中培养约4天，将IL-2添加至所述第一细胞培养基中并培养约5天至约7天，获得扩增的PBL。
226.如权利要求213至225中任一项所述的方法，其中，所述培养在基本上不含革兰氏阳性细菌的条件下进行。
227.如权利要求213至226中任一项所述的方法，其中，步骤a)中的所述PBMC提供于低温储存培养基中，所述低温储存培养基包含：
a)无血清、无动物组分的冷冻保存培养基；和
b)第二抗生素组分，所述抗生素组分包含：
1)选自以下的抗生素组合：
i.庆大霉素和万古霉素，以及
ii.庆大霉素和克林霉素；或者
2)万古霉素作为抗生素。
228.如权利要求227所述的方法，其中，所述低温储存培养基中的所述第二抗生素组分包含约50-600μg/mL浓度的万古霉素。
229.如权利要求227所述的方法，其中，所述低温储存培养基中的所述第二抗生素组分包含约400-600μg/mL浓度的克林霉素。
230.如权利要求227所述的方法，其中，所述低温储存培养基中的所述第二抗生素组分包含约100μg/mL浓度的万古霉素。
231.如权利要求227所述的方法，其中，所述低温储存培养基中的所述第二抗生素组分为约100μg/mL浓度的万古霉素。
232.如权利要求227所述的方法，其中，所述低温储存培养基中的所述第二抗生素组分包含约50-600μg/mL浓度的万古霉素。
233.如权利要求227所述的方法，其中，所述低温储存培养基中的所述第二抗生素组分包含约50μg/mL浓度的庆大霉素。
234.如权利要求227所述的方法，其中，所述低温储存培养基中的所述第二抗生素组分包含约2.5-10μg/mL浓度的双性霉素B。
235.如权利要求227所述的方法，其中，所述低温储存培养基中的所述第二抗生素组分包含抗生素组合，所述抗生素组合包含约100μg/mL的万古霉素和约50μg/mL的庆大霉素。
236.如权利要求227所述的方法，其中，所述低温储存培养基中的所述第二抗生素组分包含抗生素组合，所述抗生素组合包含约50μg/mL的庆大霉素、约2.5-10μg/mL的双性霉素B和约400-600μg/mL的克林霉素。
237.如权利要求227所述的方法，其中，所述低温储存培养基中的所述第二抗生素组分包含抗生素组合，所述抗生素组合包含约50μg/mL的庆大霉素、约2.5-10μg/mL的双性霉素B和约50-600μg/mL的万古霉素。
238.通过权利要求213至237中任一项所述的方法制得的PBL群。
239.如权利要求137至211中任一项所述的方法，其中，在培养第一TIL群之前，将样本在肿瘤洗涤缓冲液中洗涤至少一次，所述洗涤缓冲液包含第四抗生素组分，所述第四抗生素组分包含：
1)抗生素组合，所述抗生素组合选自：
i.庆大霉素和万古霉素，以及
ii.庆大霉素和克林霉素；或者
2)万古霉素作为抗生素。
240.如权利要求239所述的方法，其中，所述洗涤缓冲液中的所述第四抗生素组分包含约50-600μg/mL浓度的万古霉素。
241.如权利要求239所述的方法，其中，所述洗涤缓冲液中的所述第四抗生素组分包含约400-600μg/mL浓度的克林霉素。
242.如权利要求239所述的方法，其中，所述洗涤缓冲液中的所述第四抗生素组分包含约100μg/mL浓度的万古霉素。
243.如权利要求239所述的方法，其中，所述洗涤缓冲液中的所述第四抗生素组分为约100μg/mL浓度的万古霉素。
244.如权利要求239所述的方法，其中，所述洗涤缓冲液中的所述第四抗生素组分包含约50-600μg/mL浓度的万古霉素。
245.如权利要求239所述的方法，其中，所述洗涤缓冲液中的所述第四抗生素组分包含约50μg/mL浓度的庆大霉素。
246.如权利要求239所述的方法，其中，所述洗涤缓冲液中的所述第四抗生素组分包含约2.5-10μg/mL浓度的双性霉素B。
247.如权利要求239所述的方法，其中，所述洗涤缓冲液中的所述第四抗生素组分包含抗生素组合，所述抗生素组合包含约100μg/mL的万古霉素和约50μg/mL的庆大霉素。
248.如权利要求239所述的方法，其中，所述洗涤缓冲液中的所述第四抗生素组分包含抗生素组合，所述抗生素组合包含约50μg/mL的庆大霉素、约2.5-10μg/mL的双性霉素B和约400-600μg/mL的克林霉素。
249.如权利要求239所述的方法，其中，所述洗涤缓冲液中的所述第四抗生素组分包含抗生素组合，所述抗生素组合包含约50μg/mL的庆大霉素、约2.5-10μg/mL的双性霉素B和约50-600μg/mL的万古霉素。
250.如权利要求239至249中任一项所述的方法，其中，将样本在洗涤缓冲液中洗涤至少三次。
251.一种肿瘤样本组合物，其包含：
a)肿瘤样本，所述肿瘤样本包含多个肿瘤细胞和多个肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；和
b)肿瘤洗涤缓冲液，所述洗涤缓冲液包含：
i.一种以上选自钾离子、钠离子、镁离子和钙离子的电解质；
ii.在生理条件下有效的pH缓冲液；和
iii.抗生素组分，所述抗生素组分包含：
a)选自以下的抗生素组合：
1.庆大霉素和万古霉素，以及
2.庆大霉素和克林霉素；或者
b)万古霉素作为抗生素。
252.如权利要求251所述的肿瘤样本组合物，其中，所述肿瘤洗涤缓冲液在维持生理渗透压方面是有效的。
253.如权利要求251或252所述的肿瘤样本组合物，其中，所述pH缓冲液为磷酸盐缓冲液。
254.如权利要求251所述的肿瘤样本组合物，其中，所述肿瘤洗涤缓冲液为汉克氏平衡盐溶液(HBSS)。
255.如权利要求251至254中任一项所述的肿瘤样本组合物，其中，所述肿瘤洗涤缓冲液还包含营养有效量的至少一种单糖。
256.如权利要求255所述的肿瘤样本组合物，其中，所述单糖为葡萄糖。
257.如权利要求251至256中任一项所述的肿瘤样本组合物，其中，所述肿瘤样本为实体肿瘤样本。
258.如权利要求257所述的肿瘤样本组合物，其中，所述肿瘤样本为如下癌症类型之一：乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、结直肠癌、肺癌、脑癌、肾癌、胃癌、皮肤癌(包括但不限于鳞状细胞癌、基底细胞癌和黑色素瘤)、宫颈癌、头颈癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、肉瘤、膀胱癌和胶质母细胞瘤。
259.如权利要求251至256中任一项所述的肿瘤样本组合物，其中，所述肿瘤样本为液体肿瘤样本。
260.如权利要求259所述的肿瘤样本组合物，其中，所述液体肿瘤样本为来自血液恶性肿瘤的液体肿瘤样本。
261.如权利要求251至256中任一项所述的肿瘤样本组合物，其中，所述肿瘤样本从原发性肿瘤中获得。
262.如权利要求251至256中任一项所述的肿瘤样本组合物，其中，所述肿瘤样本从侵袭性肿瘤中获得。
263.如权利要求251至256中任一项所述的肿瘤样本组合物，其中，所述肿瘤样本从转移性肿瘤中获得。
264.如权利要求251至256中任一项所述的肿瘤样本组合物，其中，所述肿瘤样本从恶性黑色素瘤中获得。
265.如权利要求251至264中任一项所述的肿瘤样本组合物，其中，所述抗生素组分包含约50-600μg/mL浓度的万古霉素。
266.如权利要求251至264中任一项所述的肿瘤样本组合物，其中，所述抗生素组分包含约100μg/mL浓度的万古霉素。
267.如权利要求251至264中任一项所述的肿瘤样本组合物，其中，所述抗生素组分包含约400-600μg/mL浓度的克林霉素。
268.如权利要求251至264中任一项所述的肿瘤样本组合物，其中，所述抗生素组分包含约50μg/mL浓度的庆大霉素。
269.如权利要求251至264中任一项所述的肿瘤样本组合物，其中，所述抗生素组分为约100μg/mL浓度的万古霉素。
270.如权利要求251至264中任一项所述的肿瘤样本组合物，其中，所述抗生素组分包含抗生素组合，所述抗生素组合包含约50μg/mL的庆大霉素和约400-600μg/mL的克林霉素。
271.如权利要求251至264中任一项所述的肿瘤样本组合物，其中，所述抗生素组分包含抗生素组合，所述抗生素组合包含约50μg/mL的庆大霉素和约50-600μg/mL的万古霉素。
272.如权利要求251至264中任一项所述的肿瘤样本组合物，其中，所述抗生素组分包含抗生素组合，所述抗生素组合包含约50μg/mL的庆大霉素和约100μg/mL的万古霉素。
273.如权利要求251至272中任一项所述的肿瘤样本组合物，其中，所述组合物还包含抗真菌性抗生素。
274.如权利要求273所述的肿瘤样本组合物，其中，所述抗真菌性抗生素为双性霉素B。
275.如权利要求274所述的肿瘤样本组合物，其中，所述双性霉素B的浓度为约2.5-10μg/mL。
276.一种用于洗涤肿瘤样本的组合物，所述组合物包含：
i.一种以上选自钾离子、钠离子、镁离子和钙离子的电解质；
ii.在生理条件下有效的pH缓冲液；以及
iii.抗生素组分，所述抗生素组分包含：
a)选自以下的抗生素组合：
1.庆大霉素和万古霉素，以及
2.庆大霉素和克林霉素；或者
b)万古霉素作为抗生素。
277.如权利要求276所述的组合物，其中，所述肿瘤洗涤缓冲液在维持生理渗透压方面是有效的。
278.如权利要求276或277所述的组合物，其中，所述pH缓冲液为磷酸盐缓冲液。
279.如权利要求276所述的组合物，其中，所述肿瘤洗涤缓冲液为汉克氏平衡盐溶液(HBSS)。
280.如权利要求276至279中任一项所述的组合物，其中，所述肿瘤洗涤缓冲液还包含营养有效量的至少一种单糖。
281.如权利要求280所述的组合物，其中，所述单糖为葡萄糖。
282.如权利要求276至281中任一项所述的组合物，其中，所述抗生素组分包含约50-600μg/mL浓度的万古霉素。
283.如权利要求276至281中任一项所述的组合物，其中，所述抗生素组分包含约100μg/mL浓度的万古霉素。
284.如权利要求276至281中任一项所述的组合物，其中，所述抗生素组分包含约400-600μg/mL浓度的克林霉素。
285.如权利要求276至281中任一项所述的组合物，其中，所述抗生素组分包含约50μg/mL浓度的庆大霉素。
286.如权利要求276至281中任一项所述的组合物，其中，所述抗生素组分为约100μg/mL浓度的万古霉素。
287.如权利要求276至281中任一项所述的组合物，其中，所述抗生素组分包含抗生素组合，所述抗生素组合包含约50μg/mL的庆大霉素和约400-600μg/mL的克林霉素。
288.如权利要求276至281中任一项所述的组合物，其中，所述抗生素组分包含抗生素组合，所述抗生素组合包含约50μg/mL的庆大霉素和约50-600μg/mL的万古霉素。
289.如权利要求276至281中任一项所述的组合物，其中，所述抗生素组分包含抗生素组合，所述抗生素组合包含约50μg/mL的庆大霉素和约100μg/mL的万古霉素。
290.如权利要求276至289中任一项所述的组合物，其中，所述抗生素组分还包含抗真菌性抗生素。
291.如权利要求290所述的组合物，其中，所述抗真菌性抗生素为双性霉素B。
292.如权利要求291所述的组合物，其中，所述双性霉素B的浓度为约2.5-10μg/mL。
293.如权利要求239至250中任一项所述的方法，其中，所述第一抗生素组分与所述第四抗生素组分相同。
294.如权利要求239至250中任一项所述的方法，其中，所述第一抗生素组分与所述第四抗生素组分不同。
295.如权利要求227至237中任一项所述的方法，其中，所述第一抗生素组分与所述第二抗生素组分相同。
296.如权利要求227至237中任一项所述的方法，其中，所述第一抗生素组分与所述第二抗生素组分不同。
297.如权利要求202至211中任一项所述的方法，其中，所述第一抗生素组分与所述第三抗生素组分相同。
298.如权利要求202至211中任一项所述的方法，其中，所述第一抗生素组分与所述第三抗生素组分不同。
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