RS61544B1

RS61544B1 - Derivat 2,2-difluoropropionamida metil bardoksolona, njegove farmaceutske supstance i polimorfi za upotrebu za lečenje izvesnih stanja

Info

Publication number: RS61544B1
Application number: RS20210286A
Authority: RS
Inventors: Eric Anderson; Andrea Decker; Xiaofeng Liu
Original assignee: Reata Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2012-04-27
Filing date: 2013-04-24
Publication date: 2021-04-29
Also published as: PT2841445T; PT3444261T; FR24C1015I1; BR112014026640B1; LTPA2024511I1; DK3444261T3; IL235275B; US9701709B2; BR112014026640A2; ES2634315T3; SG11201406868XA; ES2861393T3; FR24C1015I2; NL301276I2; TW201726701A; US20180009839A1; CY2024012I1; US20130324599A1; US8993640B2; KR20150003875A

Description

Opis

OSNOVA PRONALASKA

I. Oblast pronalaska

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na jedinjenje:

N-((4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-cijano-2,2,6a,6b,9,9,12a-heptametil-10,14-diokso-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-oktadekahidropicen-4a-il)-2,2-difluoropropanamid, ovde takođe označeno kao RTA 408, 63415, ili PP415 kao i na njegove polimorfne oblike u terapiji kako je opisano u patentnim zahtevima.

II. Opis srodne tehnike

[0002] Anti-inflamatorna i anti-proliferativna aktivnost triterpenoida koji se nalazi u prirodi, oleanolinske kiseline, poboljšana je hemijskim modifikacijama. Na primer, razvijena su 2-cijano-3,12-diooksooleana-1,9(11)-dien-28-oinska kiselina (CDDO) i srodna jedinjenja. Videti Honda et al., 1997; Honda et al., 1998; Honda et al., 1999; Honda I dr.., 2000a; Honda et al., 2000b; Honda et al., 2002; Suh et al., 1998; Suh et al., 1999; Place et al., 2003; Liby et al., 2005; i SAD Patenti 8,129,429, 7,915,402, 8,124,799, i 7,943,778. Metil estar, bardoksolon metil (CDDOMe), procenjivan je u fazi II i III kliničkih studija za tretman i prevenciju dijabetičke nefropatije i hronične bolesti bubrega. Videti Pergola et al., 2011.

[0003] Takođe je pokazano da su sintetički triterpenoidni analozi oleanolinske kiseline - inhibitori ćelijskih inflamatornih procesa, kao što je indukcija IFN-γ inducibilne azot monoksid sintaze (iNOS) i COX-2 u makrofagama miša. Videti Honda et al, (2000a), Honda et al. (2000b), Honda et al. (2002), i SAD Patenti 8,129,429, 7,915,402, 8,124,799, i 7,943,778. Pokazano je da jedinjenja izvedena iz oleanolinske kiseline utiču na funkciju više ciljnih proteina i tako moduliraju aktivnost nekoliko važnih ćelijskih signalnih puteva povezanih sa oksidativnim stresom, kontrolom ćelijskog ciklusa, i inflamacijom (npr., Dinkova-Kostova et al., 2005; Ahmad et al., 2006; Ahmad et al., 2008; Liby et al., 2007a, i SAD Patenti 8,129,429, 7,915,402, 8,124,799, i 7,943,778).

[0004] Uzimajući u obzir da se profili biološke aktivnosti poznatih terpenoidnih derivata razlikuju, i u odnosu na širok opseg bolesti koje se mogu tretirati ili sprečiti sa jedinjenjima koja poseduju potentne antioksidativne i anti-inflamatorne efekte, i visok stepen neispunjene medicinske potrebe u okviru različitih bolesti, poželjno je sintetisati nova jedinjenja sa različitim profilima biološke aktivnosti za tretman ili prevenciju jedne ili više indikacija.

REZIME PRONALASKA

[0005] Ovaj pronalazak se odnosi na sledeće stavke:

1. Jedinjenje formule:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so,

za upotrebu u lečenju ili prevenciji kancera, pri čemu se jedinjenje primenjuje u kombinaciji sa imunoterapijom.

2. Jedinjenje za upotrebu prema stavci 1, koje je jedinjenje formule:

Polimorfni oblik jedinjenja formule:

za upotrebu u lečenju ili prevenciji kancera, pri čemu se polimorfni oblik primenjuje u kombinaciji sa imunoterapijom; i

pri čemu polimorfni oblik ima obrazac rendgenske difrakcije praha (CuK )) koji sadrži vršnu vrednost halogene grupe na oko 14 ° 2θ, ili

polimorfni oblik je solvat koji ima obrazac rengenske difrakcije praha (CuK ) koji sadrži vrhove na oko 5,6, 7,0, 10,6, 12,7 i 14,6 ° 2θ, ili

polimorfni oblik je solvat koji ima obrazac rendgenske difrakcije praha (CuK ) koji sadrži vrhove na oko 7,0, 7,8, 8,6, 11,9, 13,9 (dvostruki vrh), 14,2 i 16,0 ° 2θ, ili

polimorfni oblik je acetonitril hemisolvat koji ima obrazac rengendske difrakcije praha (CuK ) koji sadrži vrhove na oko 7,5, 11,4, 15,6 i 16,6 ° 2θ, ili

polimorfni oblik je solvat koji ima obrazac rendgenske difrakcije praha(CuK ) koji sadrži vrhove na oko 6,8, 9,3, 9,5, 10,5, 13,6 i 15,6 ° 2θ.

4. Farmaceutska kompozicija za upotrebu u lečenju ili prevenciji kancera, farmaceutska kompozicija koja sadrži:

- aktivni sastojak koji se sastoji od jedinjenja definisanog u stavci 1 ili 2 ili polimorfnog oblika definisanog u stavci 3; i

- farmaceutski prihvatljiv nosač;

- pri čemu se farmaceutska kompozicija daje u kombinaciji sa imunoterapijom.

5. Jedinjenje za upotrebu prema stavkama 1 ili 2 ili polimorfni oblik za upotrebu prema stavci 3 ili farmaceutska kompozicija za upotrebu prema stavci 4, gde je imunoterapija oblik imunoterapije koja cilja kancer, imunoterapija na bazi dendritske ćelije, ili adoptivna T ćelijska imunoterapija.

6. Jedinjenje za upotrebu prema stavkama 1 ili 2 ili polimorfni oblik za upotrebu prema stavci 3 ili farmaceutska kompozicija za upotrebu prema stavci 4, pri čemu je imunoterapija antitelo koje cilja na rak i koje je odabrano od trastuzumaba, alemtuzumaba, bevacizumab, cetuksimab, panitumumab, ibritumomab tiuksetan, tositumomab, brentuksimab vedotin, adotrastuzumab emtanzin i denileukin dititoks.

7. Jedinjenje za upotrebu prema stavci 6 ili polimorfni oblik za upotrebu prema stavcii 6 ili farmaceutska kompozicija za upotrebu prema stavci 6, gde je rak kancer, sarkom, limfom, leukemija, melanom, mezoteliom, višestruki mijelom ili seminom.

8. Jedinjenje za upotrebu prema stavci 6 ili polimorfni oblik za upotrebu prema stavci 6 ili farmaceutska kompozicija za upotrebu prema stavci 6, gde je kancer bešike, krvi, kostiju, mozga, dojke, centralnog nerva sistem, grlić materice, debelo crevo, endometrijum, jednjak, žučna kesa, genitalije, genitourinarni trakt, glava, bubreg, grkljan, jetra, pluća, mišićno tkivo, vrat, oralna ili nazalna sluznica, jajnik, pankreas, prostata, koža, slezina, tanko crevo , debelog creva, želuca, testisa ili štitne žlezde.

9. Jedinjenje formule:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so,

za upotrebu u lečenju ili prevenciji stanja povezanog sa oksidativnim stresom izazvanim mitohondrijskom disfunkcijom.

10. Jedinjenje za upotrebu prema stavci 9, koje je jedinjenje formule:

11. Polimorfni oblik jedinjenja formule:

za upotrebu u lečenju ili sprečavanju stanja povezanog sa oksidativnim stresom izazvanim mitohondrijskom disfunkcijom;

pri čemu polimorfni oblik ima obrazac rengenske difrakcije praha (CuK ) koji sadrži vršnu vrednost halogene grupe na oko 14 ° 2θ , ili

polimorfni oblik je solvat koji ima rendgenski obrazac difrakcije praha (CuK ) koji sadrži vrhove na oko 7,0, 7,8, 8,6, 11,9, 13,9 (dvostruki vrh), 14,2 i 16,0 ° 2θ , ili

polimorfni oblik je acetonitril hemisolvat koji ima obrazac rendgenske difrakcije praha (CuK ) koji sadrži vrhove na oko 7,5, 11,4, 15,6 i 16,6 ° 2θ, ili

polimorfni oblik je solvat koji ima obrazac rendgenske difrakcije praha (CuK ) koji sadrži vrhove na oko 6,8, 9,3, 9,5, 10,5, 13,6 i 15,6 ° 2θ .

12. Farmaceutska kompozicija za upotrebu u lečenju ili prevenciji stanja povezanog sa oksidativnim stresom izazvanim mitohondrijskom disfunkcijom, farmaceutska kompozicija koja sadrži:

- aktivni sastojak koji se sastoji od jedinjenja kako je definisano u stavkam 9 ili 10 ili polimorfnog oblika kako je definisano u stavci 11; i

- farmaceutski prihvatljiv nosač.

13. Jedinjenje formule:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so,

za upotrebu u lečenju ili sprečavanju poremećaja epileptičnog napada.

14. Jedinjenje za upotrebu prema stavci 13, koje je jedinjenje formule:

15. Polimorfni oblik jedinjenja formule:

za upotrebu u lečenju ili prevenciji poremećaja epileptičnog napada;

- gde polimorfni oblik ima dijagram obrazac rendgenske difrakcije praha (CuK ) koji sadrži vrhovnu vrednost halo grupe na oko 14 ° 2θ, ili

- polimorfni oblik je solvat koji ima obrazac rendgenske difrakcije praha (CuK ) koji sadrži vrhove na oko 5,6, 7,0, 10,6, 12,7 i 14,6 ° 2θ, ili

- polimorfni oblik je solvat koji ima obrazac rendgenske difrakcije praha (CuK ) koji sadrži vrhove na oko 7,0, 7,8, 8,6, 11,9, 13,9 (dvostruki vrh), 14,2 i 16,0 ° 2θ, ili

- polimorfni oblik je acetonitril hemisolvat koji ima obrazac rendgenske difrakcije praha (CuK ) koji sadrži vrhove na oko 7,5, 11,4, 15,6 i 16,6 ° 2θ, ili

- polimorfni oblik je solvat koji ima obrazac rendgenske difrakcije praha (CuK ) koji sadrži vrhove na oko 6,8, 9,3, 9,5, 10,5, 13,6 i 15,6 ° 2θ.

16. Farmaceutska kompozicija za upotrebu u lečenju ili prevenciji poremećaja epileptičnog napada, farmaceutska kompozicija koja sadrži:

- aktivni sastojak koji se sastoji od jedinjenja kako je definisano u stavkama 13 ili 14 ili polimorfnog oblika kako je definisano u stavci 15; i

- farmaceutski prihvatljiv nosač.

17. Jedinjenje za upotrebu prema stavci 13 ili 14 ili polimorfni oblik za upotrebu prema stavci 15 ili farmaceutska kompozicija za upotrebu prema stavcii 16, gde je poremećaj epileptičnog napada.

[0006] Sledeći opis odnosi se na ovaj pronalazak kako je definisan u gore navedenim stavkama (i u zahtevima), kao i na referentne realizacije.

[0007] Štaviše, bilo koje reference na postupak lečenja u sledećem opisu treba shvatiti kao odnos na odgovarajuće jedinjenje ili kompoziciju za upotrebu u odgovarajućem tretmanu.

[0008] U nekim aspektima predmetnog pronalaska, obezbeđeno je jedinjenje formule (ovde takođe označeno kao RTA 408, 63415, ili PP415):

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

[0009] U nekim primerima izvođenja, jedinjenje je u obliku farmaceutski prihvatljive soli. U nekim primerima izvođenja, jedinjenje nije u obliku soli.

[0010] U sledećem aspektu obezbeđeni su polimorfni oblici prethodnog jedinjenja. U nekim primerima izvođenja, polimorfni oblik ima obrazac rentgenske difrakcije praha (CuKα) koji sadrži halo pik na oko 14°2θ. U nekim primerima izvođenja, obrazac rentgenske difrakcije praha (CuKα) dodatno sadrži rameni pik na oko 8°2θ. U nekim primerima izvođenja, obrazac rentgenske difrakcije praha (CuKα) je suštinski kao što je prikazano na SL.59. U nekim primerma izvođenja, polimorfni oblik ima Tg od oko 150°C do oko 155°C, uključujući na primer, Tg od oko 153°C ili Tg od oko 150°C. U nekim primerima izvođenja, polimorfni oblik ima krivu diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC) koja sadrži endotermu centriranu od oko 150°C do oko 155°C. U nekim primerima izvođenja, endoterma je centrirana na oko 153°C. U nekim primerima izvođenja, endoterma je centrirana na oko 150°C. U nekim primerima izvođenja, kriva diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC) je suštinski kao što je prikazana na SL.

62.

[0011] U nekim primerima izvođenja, polimorfni oblik je solvat koji ima obrazac rentgenske difrakcije praha (CuKα) koji sadrži pikove na oko 5.6, 7.0, 10.6, 12.7 i 14.6°2θ. U nekim primerima izvođenja, obrazac rentgenske difrakcije praha (CuKα) je značajno kao što je prikazan na SL.75, gornji obrazac.

[0012] U nekim primerima izvođenja, polimorfni oblik je solvat koji ima obrazac rentgenske difrakcije praha (CuKα) koji sadrži pikove na oko 7.0, 7.8, 8.6, 11.9, 13.9 (dvostruki pik), 14.2, i 16.0°2θ. U nekim primerima izvođenja, obrazac rentgenske difrakcije praha (CuKα) je suštinski kao što je prikazano na SL.

75, drugi obrazac odozgo.

[0013] U nekim primerima izvođenja, polimorfni oblik je hemisolvat acetonitrila koji ima obrazac rentgenske difrakcije praha (CuKα) koji sadrži pikove na oko 7.5, 11.4, 15.6 i 16.6°2θ. U nekim primerima izvođenja, obrazac rentgenske difrakcije praha (CuKα) je suštinski kao što je prikazano na SL.

75, drugi obrazac odozdo. U nekim primerima izvođenja, polimorfni oblik ima Tg od oko 196°C. U nekim primerima izvođenja, polimorfni oblik ima krivu diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC) koja sadrži endotermu centriranu na oko 196°C. U nekim primerima izvođenja, kriva diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC) je suštinski kao što je prikazano na SL.116.

[0014] U nekim primerima izvođenja, polimorfni oblik je solvat koji ima obrazac rentgenske difrakcije praha (CuKα) koj sadrži pikove na oko 6.8, 9.3, 9.5, 10.5, 13.6, i 15.6°2θ. U nekim primerima izvođenja, obrazac rentgenske difrakcije praha (CuKα) je suštinski kao što je prikazano na SL.75, donji obrazac.

[0015] U sledećem aspektu obezbeđene su farmaceutske kompozicije koje sadrže aktivni sastojak koji se sastoji od prethodno navedenog jedinjenja ili njegovog polimorfnog oblika (kao što su, npr., bilo koji od polimorfnih oblika opisani ovde prethodno ili u nastavku), i farmaceutski prihvatljivog nosača. U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija je formulisana za primenu: oralno, intraadipozalno, intraarterijalno, intraartikularno, intrakranijalno, intradermalno, intralezionalno, intramuskularno, intranazalno, intraokularno, intraperikardijalno, intraperitonealno, intrapleuralno, intraprostatično, intrarektalno, intratekalno, intratrahealno, intratumoralno, intraumbilikalno, intravaginalno, intravenski, intravezikularno, intravitrealno, lipozomalno, lokalno, mukozalno, parenteralno, rektalno, subkonjunktivalno, subkutano, sublingvalno, topikalno, transbukalno, transdermalno, vaginalno, kao kreme, u lipidnim kompozicijama, preko katetera, preko lavaže, preko konstantne infuzije, preko infuzije, preko inhalacije, preko injekcije, preko lokalnog dopremanja, ili preko lokalizovane perfuzije. U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija ja formulisana za oralnu, intraarterijalnu; intravensku, ili topikalnu primenu. U nekim primerima izvođenja, farmnaceutska kompozicija je formulisana za oralnu primenu.

[0016] U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija je formulisana kao tvrda ili meka kapsula, tableta, sirup, suspenzija, emulzija, rastvor, disperzija čvrste supstance, vafer, ili eliksir. U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija dodatno sadrži agens koji poboljšava rastvorljivost i disperzibilnost. (Na primer, agensi koji poboljšavaju rastvorljivost i diperzibilnost uključuju, ali nisu ograničeni na, PEGs, ciklodekstrane, i derivate celuloze). U nekim primerima izvođenja, jedinjenje ili polimorfni oblik je suspendovan u susamovom ulju.

[0017] U drugim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija je formulisana za topikalnu primenu. U drugim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija je formulisana kao losion, krema, gel, ulje, mast, melem, emulzija, rastvor, ili suspenzija. U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija je formulisana kao losion, kao krema, ili kao gel. U nekim primerima izvođenja, količina aktivnog sastojka je od oko 0.01% do oko 5% po težini, oko 0.01% do oko 3% po težini, ili 0.01%, 0.1%, 1%, ili 3% po težini.

[0018] U sledećem aspektu obezbeđeni su postupci za tretiranje ili prevenciju stanja povezanog sa inflamacijom ili oksidativnim stresom kod pacijenta kome je to potrebno, koji sadrže primenu na pacijenta terapeutski efikasne količine farmaceutske kompozicije kao što je opisano prethodno ili u nastavku. Ovde se takođe nalazi jedinjenje N-((4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-cijano-2,2,6a,6b,9,9,12a-heptametil-10,14-diokso-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14boktadekahidropicen-4a-il)-2,2-difluoropropanamid (ili RTA 408) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, ili polimorfni oblik tog jedinjenja (kao što je, npr., bilo koji od polimorfnih oblika opisanih ovde prethodno ili u nastavku), ili farmaceutsku kompoziciju koja sadrži bilo koji od prethodno pomenutih entiteta i farmaceutski prihvatljiv nosač (uključujući, npr., farmaceutske kompozicije opisane prethodno), za upotrebu u lečenju ili prevenciji stanja povezanog sa inflamacijom ili oksidativnim stresom. Takođe I upotrebu prethodno pomenutog jedinjenja, polimorfnom oblika ili farmaceutske kompozicije za pripremu medikamenta za tretman ili prevenciju stanja povezanog sa inflamacijom ili oksidativnim stresom. U nekim primerima izvođenja, stanje je povezano sa inflamacijom. U drugim primerima izvođenja, stanje je povezano sa oksidativnim stresom. U nekim primerima izvođenja, stanje je kožna bolest ili poremećaj, sepsa, dermatitis, osteoartritis, kancer, inflamacija, autoimuna bolest, inflamatorna bolest creva, komplikacija od lokalizovanog ili potpunog izlaganja tela jonizujućem zračenju, mukozitis, akutna ili hronična insuficijencija organa, bolest jetre, pankreatitis, poremećaj oka, bolest pluća ili dijabetes.

[0019] Obezbeđeno ovde je jedinjenje N-((4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-cijano-2,2,6a,6b,9,9,12a-heptametil-10,14-diokso-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14boktadekahidropicen-4a-il)-2,2-difluoropropanamid (ili RTA 408) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, ili polimorfni oblik tog jedinjenja (kao što je, npr., bilo koji od polimorfnih oblika opisanih ovde prethodno ili u nastavku), ili farmaceutsku kompoziciju koja sadrži bilo koji od prethodno pomenutih entiteta i farmaceutski prihvatljiv nosač (uključujući, npr., farmaceutske kompozicije opisane prethodno), za upotrebu u tretiranju ili sprečavanju stanja izabranog od kožne bolesti ili poremećaja, sepse, dermatitisa, osteoartritisa, kancera, inflamacije, autoimune bolesti, inflamatorne bolesti creva, komplikacije od lokalizovanog ili potpunog izlaganja tela jonizujućem zračenju, mukozitisa, akutne ili hronične insuficijencije organa, bolesti jetre, pankreatitisa, poremećaja oka, bolesti pluća ili dijabetesa. Shodno tome obezbeđena ovde je upotreba prethodno pomenutog jedinjenja, polimorfnog oblika ili farmaceutske kompozicije za pripremu medikamenta za tretiranje ili prevenciju stanja izabranog od kožne bolesti ili poremećaja, sepse, dermatitisa, osteoartritisa, kancera, inflamacije, autoimune bolesti, inflamatorne bolesti creva, komplikacije od lokalizovanog ili potpunog izlaganja tela jonizujućem zračenju, mukozitisa, akutne ili hronične insuficijencije organa, bolesti jetre, pankreatitisa, poremećaja oka, bolesti pluća ili dijabetesa. Obezbeđen ovde je takođe I postupak za tretiranje ili prevenciju stanja izabranog od kožne bolesti ili poremećaja, sepse, dermatitisa, osteoartritisa, kancera, inflamacije, autoimune bolesti, inflamatorne bolesti creva, komplikacije od lokalizovanog ili potpunog izlaganja tela jonizujućem zračenju, mukozitisa, akutne ili hronične insuficijencije organa, bolesti jetre, pankreatitisa, poremećaja oka, bolesti pluća ili dijabetesa kod pacijenta kome je to potrebno, gde postupak sadrži primenu na pacijenta terapeutski efikasne količine prethodno pomenutog jedinjenja, polimorfnog oblika ili farmaceutske kompozicije. U nekim primerima izvođenja, stanje je kožna bolest ili poremećaj kao što je dermatitis, toplotna ili hemijska opekotina, hronična rana, akne, alopecija, drugi poremećaji folikula dlake, bulozna epidermoliza, opekotine od sunca, komplikacije od opekotina od sunca, poremećaji pigmentacije kože, stanje kože povezano sa starošću; post-operativna rana, ožiljak od povrede kože ili opekotine, psorijaza, dermatološka manifestacija autoimune bolesti ili bolest transplanta protiv domaćina, kancer kože, ili poremećaj koji uključuje hiperproliferaciju ćelija kože. U nekim primerima izvođenja, kožna bolest je dermatitis. U nekim primerima izvođenja, dermatitis je alergijski dermatitis, atopijski dermatitis, dermatitis usled izlaganja hemikalijama, ili dermatitis izazvan zračenjem. U drugim primerima izvođenja, kožna bolest ili poremećaj je hronična rana. U nekim primerima izvođenja, hronična rana je dijabetički ulcer, rana usled pritiska, ili venozni ulcer. U drugim primerima izvođenja, kožna bolest ili poremećaj je alopecija. U nekim primerima izvođenja, alopecija je izabrana od ćelavosti ili alopecije izazvane lekovima. U drugim primerima izvođenja, kožna bolest ili poremećaj je poremećaj pigmentacije

1

kože. U nekim primerima izvođenja, poremećaj pigmentacije kože je vitiligo. U drugim primerima izvođenja, kožna bolest ili poremećaj je poremećaj koji uključuje hiperproliferaciju ćelija kože. U nekim primerima izvođenja, poremećaj koji uključuje hiperproliferaciju ćelija kože je hiperkeratoza.

[0020] U drugim primerima izvođenja, stanje je autoimuna bolest, kao što je reumatoidni artritis, lupus, Kronova bolest, ili psorijaza. U drugim primerima izvođenja, stanje je bolest jetre, kao što je masna jetra ili hepatitis.

[0021] U drugim primerima izvođenja, stanje je poremećaj oka, kao što je uveitis, makularna degeneracija, glaukom, dijabetički makularni edem, blefaritis, dijabetička retinopatija, bolest ili poremećaj endotela rožnjače, post-operativna inflamacija, suvoća očiju, alergijski konjuktivitis ili oblik konjuktivitisa. U nekim primerima izvođenja, poremećaj oka je makularna degeneracija. U nekim primerima izvođenja, makularna degeneracija je suvog oblika. U drugim primerima izvođenja, makularna degeneracija je vlažnog oblika. U nekim primerima izvođenja, bolest ili poremećaj endotela rožnjače je Fuchs-ova endotelna kornealna distrofija.

[0022] U drugim primerima izvođenja, stanje je bolest pluća, kao što je zapaljenje pluća, plućna fibroza, COPD, astma, cistična fibroza, ili idiopatska plućna fibroza. U nekim primerima izvođenja, COPD je indukovana dimom iz cigareta.

[0023] U drugim primerima izvođenja, stanje je sepsa. U drugim primerima izvođenja, stanje je mukozitis koji je rezultat terapije zračenjem ili hemoterapije. U nekim primerima izvođenja, mukozitis je prisutan oralno. U drugim primerima izvođenja, stanje je povezano sa izlaganjem zračenju. U nekim primerima izvođenja, izlaganje zračenju dovodi do dermatitisa. U nekim primerima izvođenja, izlaganje zračenju je akutno. U drugim primerima izvođenja, izlaganje zračenju je frakcionisano.

[0024] U drugim primerima izvođenja, stanje je kancer. U nekim primerima izvođenja, kancer je karcinom, sarkom, limfom, leukemija, melanom, mezoteliom, multipli mijelom, ili seminom. U drugim primerima izvođenja, kancer je kancer bešike, krvi, kosti, mozga, dojke, centralnog nervnog sistema, grlića materice, debelog creva, endometrijuma, jednjaka, žučne kese, genitalija, urogenitalnog trakta, glave, bubrega, larinksa, jetre, pluća, mišićnog tkiva, vrata, oralne ili nazalne mukoze, jajnika, pankreasa, prostate, kože, slezine, tankog creva, debelog creva, želudca, testisa, ili tiroidee.

[0025] U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija je primenjena pre ili neposredno nakon što je subjekat tretiran terapijom zračenjem ili hemoterapijom gde hemoterapija ne sadrži RTA 408 ili njegove polimorfne obilke. U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija je primenjena i pre i posle tretiranja subjekta sa terapijom zračenjem, hemoterapijom ili sa oba. U nekim primerima izvođenja, tretman smanjuje sporedni efekat terapije zračenjem ili hemoterapije. U nekim primerima izvođenja, sporedni efekat je mukozitis i dermatitis. U nekim primerima izvođenja, tretman poboljšava efikasnost terapije zračenjem ili hemoterapije. U nekim primerima izvođenja, hemoterapija sadrži primenu na pacijenta terapeutski efikasne količine 5-fluorouracila ili docetaksela.

[0026] Dodatna kombinovana terapija za tretman je takođe predviđena predmetnim opisom. Na primer, u nekim primerima izvođenja, postupci tretiranja kancera kod subjekta, koji sadrže primenu na subjekta farmaceutski efikasne količine jedinjenja predmetnog opisa, postupci mogu dodatno sadržati jedan ili više tretmana izabrana iz grupe koja se sastoji od primene farmaceutski efikasne količine izabranog leka, radioterapije, imunoterapije, genske terapije, i operacije. U nekim primerima izvođenja, postupci mogu dodatno sadržati (1) dovođenje u kontakt ćelije tumora sa jedinjenjem pre dovođenja u kontakt ćelije tumora sa drugim lekom, (2) dovođenje u kontakt ćelije tumora sa drugim lekom pre dovođenja u kontakt ćelije tumora sa jedinjenjem, ili (3) dovođenje u kontakt ćelije tumora sa jedinjenjem i drugim lekom istovremeno. Drugi lek može biti, u određenim primerima izvođenja, antibiotik, anti-inflamatorni, antineoplastični, anti-proliferativni, anti-virusni, imunomodulatorni, ili imunosupresivni. U drugim primerima izvođenja, drugi lek može biti alkilujući agens, modulator androgenog receptora, disruptor citoskeleta, modulator estrogenskog receptora, inhibitor histon-deacetilaze, inhibitor HMG-CoA reduktaze, inhibitor prenil-protein transferaze, modulator retinoidnog receptora, inhibitor topoizomeraze, ili inhibitor tirozin kinaze. U određenim primerima izvođenja, drugi lek je 5-azacitidin, 5-fluorouracil, 9-cis-retinoinska kiselina, aktinomicin D, alitretinoin, sve-trans-retinoinska kiselina, anamicin, aksitinib, belinostat, bevacizumab, beksaroten, bosutinib, busulfan, kapecitabin, karboplatin, karmustin, CD437, cediranib, cetuksimab, hlorambucil, cisplatin, ciklofosfamid, citarabin, dakarbazin, dasatinib, daunorubicin, decitabin, docetaksel, dolastatin-10, doksifluridin, doksorubicin, doksorubicin, epirubicin, erlotinib, etoposid, gefitinib, gemcitabin, gemtuzumab ozogamicin, heksametilmelamin, idarubicin, ifosfamid, imatinib, irinotekan, izotretinoin, iksabepilon, lapatinib, LBH589, lomustin, mehloretamin, melfalan, merkaptopurin, metotreksat, mitomicin, mitoksantron, MS-275, neratinib, nilotinib, nitrozourea, oksaliplatin, paklitaksel, plikamicin, prokarbazin, semaksanib, semustin, natrijum butirat, natrijum fenilacetat, streptozotocin, suberoilanilid hidroksamna kiselina, sunitinib, tamoksifen, teniposid, tiopeta, tioguanin, topotekan, TRAIL, trastuzumab, tretinoin, trihostatin A, valproinska kiselina, valrubicin, vandetanib, vinblastin, vinkristin, vindesin, ili vinorelbin.

[0027] Postupci za tretiranje ili prevenciju bolesti sa inflamatornom komponentom kod subjekta, koje sadrže primenu na subjekta farmaceutski efikasne količine jedinjenja predmetnog opisa su takođe predviđeni. U nekim primerima izvođenja, bolest može biti, na primer, lupus ili reumatoidni artritis. U drugim primerima izvođenja, bolest može biti inflamatorna bolest creva, kao što je Kronova bolest ili ulcerozni kolitis. U drugim primerima izvođenja, bolest sa inflamatornom komponentom može biti kardiovaskularna bolest. U drugim primerima izvođenja, bolest sa inflamatornom komponentom može biti dijabetes, kao što je dijabetes tipa 1 ili tipa 2. U drugim primerima izvođenja, RTA 408, njegovi polimorfi, i farmaceutske kompozicije mogu se takođe koristiti za lečenje komplikacija povezanih sa dijabetesom. Takve komplikacije su dobro poznate stručnjacima i uključuju, ali nisu ograničene na, na primer, gojaznost, hipertenziju, aterosklerozu, koronarnu srčanu bolest, šlog, perifernu vaskularnu bolest, hipertenziju, nefropatiju, neuropatiju, mionekrozu, retinopatiju i metabolički sindrom (sindrom X). U drugim primerima izvođenja, bolest sa inflamatornom komponentom može biti kožna bolest, kao što je psorijaza, akne, ili atopijski dermatitis. Primena RTA 408, njegovih polimorfa, i farmaceutskih kompozicija u postupcima tretiranja takvih kožnih bolesti može biti, ali nije ograničena na, na primer, topikalnu ili oralnu.

[0028] U drugim primerima izvođenja, bolest sa inflamatornom komponentom može biti metabolički sindrom (sindrom X). Pacijent koji ima ovaj sindrom karakteriše se sa tri ili više simptoma izabranih iz sledeće grupe od pet simptoma: (1) abdominalna gojaznost; (2) hipertrigliceridemija; (3) nizak dobar holesterol (HDL); (4) visok krvni pritisak; i (5) povećana glukoza kod gladovanja, koja može biti u opsegu koji je karakterističan za dijabetes tipa 2 ukoliko je pacijent takođe dijabetičar. Svaki od ovih simptoma je definisan u Third Report of the National Cholesterol Education Program Expert Panel on Detection, Evaluation and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults (Adult Treatment Panel III, or ATP III), National Institutes of Health, 2001, NIH Publication No.01-3670. Pacijenti sa metaboličkim sindromom, bilo da su razvili ili nisu razvili jasan dijabetes melitus, imaju povećani rizik za razvijanje makrovaskularnih i mikrovaskularnih komplikacija koje su navedene prethodno koje se javljaju sa dijabetesom tipa 2, kao što je ateroskleroza i koronarna srčana bolest.

[0029] Drugi generalni postupak predmetnog opisa podrazumeva postupak za tretiranje ili prevenciju kardiovaskularne bolesti kod subjekta, koji sadrži primenu na subjekta farmaceutski efikasne količine jedinjenja predmetnog opisa. U nekim primerima izvođenja, kardiovaskularna bolest može biti, ali nije ograničena na, na primer, aterosklerozu, kardiomiopatiju, kongenitalnu srčanu bolest, kongestivnu srčanu insuficijenciju, miokarditis, reumatičnu bolest srca, bolest zalistaka, bolest koronarne arterije, endokarditis, ili infarkt miokarda. Kombinovana terapija je takođe predviđena za postupke lečenja ili prevencije kardiovaskularne bolesti kod subjekta. Na primer, takvi postupci mogu dodatno sadržati primenu farmaceutski efikasne količine jednog ili više kardiovaskularnih lekova. Kardiovaskularni lek može biti, ali nije ograničen na, na primer, lek za snižavanje holesterola, anti-hiperlipidemik, blokator kalcijumovih kanala, anti-hipertenziv, ili inhibitor HMG-CoA reduktaze. U nekim primerima izvođenja, neograničavajući primeri kardiovaskularnih lekova uključuju amlodipin, aspirin, ezetimib, felodipin, lacidipin, lercanidipin, nikardipin, nifedipin, nimodipin, nisoldipin ili nitrendipin. U drugim primerima izvođenja, drugi neograničavajući primeri kardiovaskularnih lekova uključuju atenolol, bucindolol, karvedilol, klonidin, doksazosin, indoramin, labetalol, metildopa, metoprolol, nadolol, oksprenolol, fenoksibenzamin, fentolamin, pindolol, prazosin, propranolol, terazosin, timolol ili tolazolin. U drugim primerima izvođenja, kardiovaskularni lek može biti, na primer, statin, kao što je atorvastatin, cerivastatin, fluvastatin, lovastatin, mevastatin, pitavastatin, pravastatin, rosuvastatin ili simvastatin.

[0030] Postupci za tretiranje ili prevenciju neurodegenerativne bolesti kod subjekta, koji sadrže primenu na subjekta farmaceutski efikasne količine jedinjenja prema predmetnom opisu su takođe predviđeni. U nekim primerima izvođenja, neurodegenerativna bolest može biti izabrana, na primer, iz grupe koja se sastoji od Parkinsonove bolesti, Alchajmerove bolesti, multiple skleroze (MS), Huntington-ove bolesti i amiotrofne lateralne skleroze. U naročitim primerima izvođenja, neurodegenerativna bolest je Alchajmerova bolest. U naročitim primerima izvođenja, neurodegenerativna bolest je MS, kao što je primarna progresivna, relapsno-remisiona sekundarna progresivna ili progresivna relapsna MS. U nekim primerima izvođenja, subjekat može biti, na primer, primat. U nekim primerima izvođenja, subjekat može biti čovek.

1

[0031] U naročitim primerima izvođenja postupaka za lečenje ili prevenciju neurodegenerativne bolesti kod subjekta, koji sadrži primenu na subjekta farmaceutski efikasne količine jedinjenja prema predmetnom opisu, tretman suprimira demijelinizaciju neurona u mozgu ili kičmenoj moždini subjekta. U određenim primerima izvođenja, tretman suprimira inflamatornu demijelinizaciju. U određenim primerima izvođenja, tretman suprimira transekciju aksona neurona u mozgu ili kičmenoj moždini subjekta. U određenim primerima izvođenja, tretman suprimira transekciju neurita u mozgu ili kičmenoj moždini subjekta. U određenim primerima izvođenja, tretman suprimira apoptozu neurona u mozgu ili kičmenoj moždini subjekta. U određenim primerima izvođenja, tretman stimuliše remijelinizaciju aksona neurona u mozgu ili kičmenoj moždini subjekta. U određenim primerima izvođenja, tretman obnavlja gubitak funkcije nakon napada MS. U određenim primerima izvođenja, tretman sprečava novi napad MS. U određenim primerima izvođenja, tretman sprečava onesposobljenost koja je rezultat napada MS.

[0032] Jedan opšti aspekt predmetnog opisa predviđa postupak za tretiranje ili prevenciju poremećaja karakterisanog prekomernom ekspresijom iNOS gena kod subjekta, koji sadrži primenu na subjekta farmaceutski efikasne količine RTA 408, polimorfnih oblika, ili farmaceutske kompozicije predmetnog opisa.

[0033] Sledeći opšti aspekt predmetnog opisa predviđa postupak inhibicije IFN-γ-indukovane proizvodnje azot monoksida u ćelijama subjekta, koji sadrži primenu na pomenutog subjekta farmaceutski efikasne količine RTA 408, polimorfnih oblika, ili farmaceutske kompozicije predmetnog opisa.

[0034] Sledeći opšti postupak predmetnog opisa predviđa postupak za tretiranje ili prevenciju poremećaja karkaterisanog prekomernom ekspresijom COX-2 gena kod subjekta, koji sadrži primenu na subjekta farmaceutski efikasne količine RTA 408, polimorfnih oblika, ili farmaceutske kompozicije prema predmetnom opisu.

[0035] Postupci lečenja renalne/bolesti bubrega (RKD) kod subjekta, koji sadrži primenu na subjekta farmaceutski efikasne količine jedinjenja prema predmetnom pronalasku su takođe predviđeni. Videti Patent 8,129,429. RKD može biti rezultat, na primer, toksičnog incidenta. Toksični incident može biti rezultat, ali nije ograničen na, na primer, rezultat agensa za vizuelizaciju ili leka. Lek može biti hemoterapeutik, na primer. RKD može biti rezultat ishemijske/reperfuzione povrede, u određenim primerima izvođenja. U određenim primerima izvođenja, RKD je rezultat dijabetesa ili hipertenzije. U nekim primerima izvođenja, RKD može biti rezultat autoimune bolesti. RKD može dodatno biti definisana kao hronična RKD ili akutna RKD.

[0036] U određenim postupcima tretiranja renalne/bolesti bubrega (RKD) kod subjekta, koji sadrže primenu na subjekta efikasne količine jedinjenja prema predmetnom opisu, subjekat je podvrgnut ili se podvrgava dijalizi. U određenim primerima izvođenja, subjekat je podvrgnut ili je kandidat da se podvrgne transplantaciji bubrega. Subjekat može biti primat. Primat može biti čovek. Subjekat u ovom ili bilo kom drugom postupku može biti, na primer, krava, konj, pas, mačka, svinja, miš, pacov ili zamorac.

[0037] Takođe je predviđen predmetnim opisom postupak za poboljšanje glomerularne stope filtracije ili klirensa kreatinina kod subjekta, koji sadrži primenu na subjekta farmaceutski efikasne količine RTA 408, polimorfnih oblika, ili farmaceutske kompozicije predmetnog opisa.

[0038] U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija je primenjena u jednoj dnevnoj dozi. U drugim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija je primenjena u više od jedne dnevne doze. U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija je primenjena u farmaceutski efikasnoj količini.

[0039] U nekim primerima izvođenja, doza je od oko 1 mg/kg do oko 2000 mg/kg. U drugim primerima izvođenja, doza je od oko 3 mg/kg do oko 100 mg/kg. U drugim primerima izvođenja, doza je oko 3, 10, 30, ili 100 mg/kg.

[0040] U drugim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija je primenjena topikalno. U nekim primerima izvođenja, topikalna prmena je primenjena na kožu. U drugim primerima izvođenja, topikalna primena je primenjena na oko.

[0041] U drugim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija je primenjena oralno. U drugim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija je primenjena intraokularno.

KRATAK OPIS SLIKA

[0042] Sledeći crteži sačinjavaju deo predmetne specifikacije i uključeni su da bi dodatno demonstrirali određene aspekte predmetnog opisa. Jedna ili više nemačkih reči mogu se naći na crtežima uključujući "Masseänderung" i "temperatur", što znači "promena mase" i "temperatura", respektivno. Pronalazak se može bolje razumeti pozivajući se na jedan od ovih crteža u kombinaciji sa detaljnim opisom specifičnih primera izvođenja predstavljenih ovde.

SL.1 – Efekat RTA 408 na IFNγ-indukovanu proivodnju azot monoksida i vijabilnost ćelija kod RAW264.7 ćelija.

SL. 2a & b – Efekat RTA 408 na aktivaciju antioksidantnog elementa odgovora (ARE): (a) aktivnost NQO1-ARE luciferaze; (b) aktivnost GSTA2-ARE luciferaze.

SL.3a-f – Relativno povećanje savijanja Nrf2 GST ARE posle ćelijskog tretmana sa (a) RTA 402; (b) 63415 (RTA 408); (c) 63170; (d) 63171; (e) 63179; i (f) 63189. Grafik takođe prikazuje vijabilnost ćelija kao što je testirano korišćenjem WST1 reagensa za proliferaciju ćelija i merenjem apsorbance posle 1 časa. Svi lekovi su primenjeni u DMSO i ćelije su uzgajane na 10,000 ćelija/komorici u 384-komornim pločama u DMEM sa niskom vrednošću glukoze sa dodatkom 10% FBS, 1% Penicilina/Streptomicina, i 0.8 mg/mL Geneticina.

SL. 4a-d – Efekat RTA 408 na ekspresiju Nrf2 ciljnog gena u HFL1 fibroblastima pluća. (a) NQO1; (b) HMOX1; (c) GCLM; (d) TXNRD1.

1

SL. 5a-d – Efekat RTA 408 na ekspresiju Nrf2 ciljnog gena u BEAS-2B bronhijalnim epitelijalnim ćelijama. (a) NQO1; (b) HMOX1; (c) GCLM; (d) TXNRD1.

SL. 6a & b – Efekat RTA 408 na nivoe Nrf2 ciljnog proteina. (a) SH-SY5Y ćelije; (b) BV2 ćelije.

SL. 7 - Efekat RTA 408 na enzimsku aktivnost NQO1 u RAW264.7 ćelijama.

SL. 8 - Efekat RTA 408 na ukupne nivoe glutationa u AML-12 ćelijskoj liniji hepatocita.

SL. 9 - Efekat RTA 408 na WST-1 apsorbancu kao marker NADPH.

SL. 10a-d - Efekat RTA 408 na ekspresiju gena uključenih u NADPH sintezu. (a) H6PD; (b) PGD; (c) TKT; (d) ME1.

SL. 11a & b - (a) Efekat RTA 408 na TNF-α-indukovanu aktivaciju reportera NF-κB luciferaze u mišjoj NIH3T3 ćelijskoj liniji sa pokrivenom WST1 i WST1/2 vijabilnošću. (b) TNF-αindukovana aktivacija reportera NF-κB luciferaze u mišjoj NIH3T3 ćelijskoj liniji. Grafik prikazuje relativnu promenu savijanja kao funkciju log promene RTA 408 koncentracije.

SL.12 - Efekat (RTA 408 na TNF-α-indukovanu aktivaciju konstrukta reportera NF-κB luciferaze.

SL. 13a & b - (a) Efekat RTA 408 na TNF-α-indukovanu aktivaciju reportera NF-κB luciferaze u humanoj A549 ćelijskoj liniji sa pokrivenom WST1 i WST1/2 vijabilnošću. (b) TNF-α-indukovana aktivacija reportera NF-κB luciferaze u humanoj A549 ćelijskoj liniji. Grafik prikazuje relativnu promenu savijanja kao funkciju log promene RTA 408 koncentracije.

SL. 14 - Efekat RTA 408 na TNF-α-indukovanu fosforilaciju IκBα.

SL. 15a-d - Efekat RTA 408 na ekspresiju gena transaminaze: (a) ALT1 (GPT1); (b) ALT2 (GPT2); (c) AST1 (GOT1); (d) AST1 (GOT2). Zvezdice označavaju statistički značajnu razliku u odnosu na kontrolnu grupu (*P < 0.05; **P < 0.01).

SL. 16 - Efekat RTA 408 na nivoe piruvata u kultivisanim mišićnim ćelijama (*P < 0.05).

SL. 17 - Efekat 63415 u modelu plućne LPS-posredovane inflamacije (% promene u proinflamatornim citokinima u odnosu na LPS tretman). Jedinjenje 63415 je primenjeno jednom dnevno x3 u Vremenu 0, 24, i 48 č praćeno sa LPS jedan č posle poslednje doze 63415 kod ženki

1

BALB/c miševa. Životinje su žrtvovane 20 č posle primene LPS. BALF je ispitivan u odnosu na ekspresiju proinflamatornih citokina. Jedinjenje 63415 smanjilo je proinflamatorne citokine na način zavisan od doze, sa pikom smanjenja u opsegu od 50%-80% u TNF-α, IL-6, i IL-12.

SL. 18a & b - Efekat RTA 408 na LPS-indukovano zapaljenje pluća kod miševa. (a) inflamatorni citokini; (b) Nrf2 ciljne strukture. RTA 408 je primenjena na ženke BALB/c miševa (n = 10) jednom dnevno x 6 u Vremenu 0, 24, 48, 72, 96, i 120 č praćeno sa LPS u 121 č pri čemu su životinje žrtvovane u 141 č. Ekspresija proteina proinflamatornih citokina je testirana u BALF. Nrf2 biomarkeri su testirani u plućima. Zvezdica označava statistički značajnu razliku od kontrolne grupe sa fiziološkim rastvorom (*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001).

SL. 19a & b – Efekat 63415 na BALF infiltrate kod bleomicin-indukovanog zapaljenja pluća: (a) broj ćelija BAL tečnosti; (b) telesna težina. Jedinjenje 63415 je primenjeno jednom dnevno x 39 na Dane -10 do 28 kod C57BL/6 miševa. Bleomicin je dat na Dan 0. Merene su dnevne težine. BALF broj ćelija je dobijen po žrtvovanju. Primećeno je uočljivo smanjenje inflamatornog infiltrata. Nisu uočena značajna poboljšanja u hroničnom inflamatornom skoru, intersticijalnoj fibrozi, ili broju fibrotičnih fokusa.

SL. 20a & b – Efeakt RTA 408 na bleomicin-indukovanu plućnu fibrozu kod pacova: (a) PMN; (b) Hidroksiprolin. Zvezdica označava statistički značajnu razliku od kontrolne grupe sa bleomicinom (*P < 0.05).

SL. 21 - Efekat RTA 408 na ciljne Nrf2 enzime u plućima od pacova sa bleomicin-indukovanom plućnom fibrozom. Zvezdice označavaju statistički značajnu razliku od kontrolne grupe sa fiziološkim rastvorom (*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001).

SL. 22a-e – Efekat RTA 408 COPD indukovanu dimom cigarete kod miševa. (a) KC; (b) IL-6; (c) TNF-α; (d) IFN-γ; (e) RANTES. RTA 408 (63415) je testiran na nivoima doze od 3 mg/kg (niski), 10 mg/kg (srednji), i 30 mg/kg (visoki). AIM analog (63355) je testiran u istoj studiji za poređenje. Zvezdice označavaju statistički značajnu razliku od kontrolne grupe sa CS.

SL. 23 – Efekat RTA 408 na ciljne Nrf2 enzime u plućima od miševa sa COPD indukovanim dimom cigarete. Zvezdice označavaju statistički značajnu razliku od kontrolne grupe sa fiziološkim rastvorom (*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001). Bodeži predstavljaju statistički značajnu razliku od miševa izloženih dimu cigarete i primenjenom vehikulumu (†P < 0.05).

SL. 24a-d – Efekti 63415 (RTA 408) na telesnu težinu kod BALB/c mišjeg modela sepse. LPS je primenjen na sve životinje na Dan 0. (a) Telesna težina: 63415 (RTA 408); (b) Telesna težina: RTA 405; (c) Sistemski LPS: % Preživljavanja: 63415 (RTA 408); (d) Sistemski LPS: %

1

Preživljavanja: RTA 405. I RTA 405 i 63415 (RTA 408) su primenjeni jednom dnevno x5 na Dane -2 do 2. Jedinjenje 63415 (RTA 408) poboljšalo je preživljavanje. Telesna težina kao funkcija vremena u 63415-tretiranim BALB/c miševima služi kao model za sepsu.

SL. 25 – Efekat 63415 u modelu zračenjem izazvanog oralnog mukozitisa. RTA 405 ili 63415 (RTA 408) je primenjen dan x 20 na Dane -5 do -1 i Dane 1 do 15 na mužjake sirijskih zlatnih hrčaka. Zračenje je bilo na Dan 0. Skorovi za mukozitis su u opsegu od 0 do 5 na osnovu kliničkih manifestacija (0: potpuno zdravi; 1-2: blagi do teški eritem; 3-5: različiti stepeni ulceracije).63415 je poboljšao mukozitis na 30 mg/kg i 100 mg/kg sa do 36% smanjenja ulceracije.

SL. 26 – Efekat 63415 na indukciju Nrf2 ciljnog gena u 14-dnevnoj studiji toksičnosti na miša kod C57BL/6 miševa. iRNK ciljnih Nrf2 gena su procenjivane u jetrama miševa tretiranih PO jednom dnevno x14. Značajna povećanja iRNK ekspresije za višestruke ciljne Nrf2 gene uočena su i bila su u skladu sa izlaganjem tkiva.

SL. 27a & b – Efekat 63415 na indukciju ciljnog Nrf2 gena u jetrama pacova: (a) Ciljni geni; (b) Negativni regulatori. iRNK ciljnih Nrf2 gena su procenjeni u jetrama pacova tretiranim PO jednom dnevno x14.

SL. 28a & b – Efekat 63415 na ciljne Nrf2 gene u tkivima majmuna: (a) Jetra; (b) Pluća. iRNK ciljnih Nrf2 gena su procenjivane kod majmuna tretiranih PO jednom dnevno x14 korišćenjem Panomics QuantiGene® 2.0 Plex tehnologije.

SL. 29a & b – Efekat 63415 na aktivnost ciljnog Nrf2 enzima u jetri miša: (a) NQO1 aktivnost; (b) GST aktivnost. Aktivnost Nrf2 ciljnog enzima procenjivana je u jetrama miševa tretiranih PO jednom dnevno x 14. Aktivnosti NQO1 i GST enzima indukovane su na dozno-zavisni način.

SL. 30a & b – Efekat 63415 na aktivnost ciljnog Nrf2 enzima u jetri pacova: (a) NQO1 aktivnost; (b) GST aktivnost. Aktivnost ciljnog Nrf2 enzima je procenjivana u jetrama pacova tretiranih PO jednom dnevno x 14. Aktivnost NQO1 i GST enzima su indukovane na dozno-zavisni način.

SL. 31a & b – Efekti 63415 na indukciju aktivnosti ciljnog Nrf2 enzima u različitim tkivima makaki majmuna: (a) NQO1 aktivnost; (b) GSR aktivnost.

SL. 32a & b - Koncentracija RTA 408 u mišjoj jetri, plućima i mozgu, i aktivnost NQO1 u mišjoj jetri posle 14 dana dnevne oralne primene. (a) Tkivna distribucija RTA 408 kod miševa posle 14 dana dnevne oralne primene. Podaci predstavljaju srednju vrednost ± SD koncentracije RTA 408 u tkivu sakupljeni 4 č posle krajnje doze studije. Brojevi iznad grešaka prikazuju srednju vrednost.

1

(b) Korelacija RTA 408 sadržaja u jetri miša sa aktivnošću NQO1 enzima. Pojedinačni RTA 408 sadržaj u jetri miša je prikazan na grafikonu nasuprot pojedinačne aktivnosti enzima iz ovog izveštaja.

SL. 33a & b - RTA 408 koncentracija u plazmi, jetri, plućima i mozgu pacova i NQO1 aktivnost u jetri pacova posle 14 dana dnevne oralne primene. (a) Tkivna distribucija RTA 408 kod pacova posle 14 dana dnevne oralne primene. Podaci predstavljaju srednju vrednost ± SD koncentracija RTA 408 u tkivu sakupljeni 4 č posle krajnje doze studije. Brojevi iznad grešaka prikazuju srednju vrednost. *Dve vrednosti su isključene iz izračunavanja srednje vrednosti jer su predstavljali ekstremne vrednosti, definisane kao vrednosti koji dovode do toga da grupa podataka ne prolazi Shapiro-Wilk test normalnosti. (b) Korelacija RTA 408 sadržaja u jetri pacova sa aktivnošću NQO1 enzima. Pojedinačni RTA 408 sadržaj u jetri pacova prikazan je na grafikonu je nasuprot pojedinačne aktivnosti enzima iz ovog izveštaja. Pojedinačni RTA 408 sadržaj jetre pacova prikazan na grafikonu nasuprot pojedinačne aktivnosti enzima iz ovog izveštaja. Tkiva iz 100 mg/kg RTA 408 dozne grupe sakupljena na Dan 6, i uočene toksičnosti u ovoj grupi isključivale su procene aktivnosti NQO1 enzima jetre.

SL. 34a & b – Efekat 63415 tretman na aktivaciju Nrf2 kod PBMC majmuna: (a) PBMC NQO1 nasuprot koncentracije u plazmi; (b) NQO1 pluća nasuprot PBMC NQO1.

SL. 35 – Rezime 63415 14-dnevne studije toksičnosti na majmunima. Sve doze su dobro podnošene bez štetnih kliničkih znakova. Podaci kliničke hemije nisu sugerisali očiglednu toksičnost.

SL. 36 – Efekat vremena doziranja na koncentraciju RTA 408 u plazmi posle topikalne okularne i oralne primene. Koncentracija RTA 408 u plazmi je takođe merena posle 5 dana dnevne topikalne okularne primene RTA 408 i određena da ostaje relativno konzistentna iz merenja izvršenih posle prvog dana.

SL. 37a & b – Korelacija izlaganja RTA 408 u plazmi majmuna sa NQO1 i SRXN1 iRNK ekspresijom u PBMC: (a) NQO1; (b) SRXN1.

SL. 38 – Koncentracija RTA 408 u različitim tkivima ili tečnostima unutar oka u funkciji vremena posle 5 dana topikalnog okularnog doziranja. Koncentracija RTA 408 u plazmi je takođe merena posle topikalne okularne primene.

SL. 39 – Efekat RTA 408 na incidencu dermatitisa stadijuma 3 uzrokovanog izlaganjem akutnom zračenju za različite koncentracije topikano primenjenog RTA 408.

1

SL. 40 - Efekat RTA 408 na incidencu dermatitisa stadijuma 2 uzrokovanog izlaganjem akutnom zračenju tokom tretmana od 30 dana za različite koncentracije topikalno primenjenog RTA 408.

SL. 41 - Efekat RTA 408 na incidencu dermatitisa stadijuma 2 uzrokovanog izlaganjem akutnom zračenju tokom tretmana od 28 dana za različite koncentracije oralno primenjenog RTA 408.

SL. 42a & b - (a) Analiza površine ispod krive kliničke ocene dermatitisa kao funkcija vremena za svaku od različitih kontrolnih grupa uključujući sve životinje korišćene u testu. (b) Analiza površine ispod krive kliničke ocene dermatitisa kao funkcija trajanja te ocene za svaku od različitih kontrolnih grupa uključujući samo životinje koje su završile svih 30 dana u ispitivanju.

SL. 43 – Srednja prva slepa ocena dermatitisa izazvanog akutnim zračenjem kao funkcija vremena za netretirane, netretirane bez izlaganja zračenju, samo nosač i tri oralne količine RTA 408 u 3, 10 i 30 mg/kg. Ocena dermatitisa je zasnovana na skali gde je 0 potpuno zdrav, 1-2 ispoljili su srednji do umereni eritem sa minimalnom do neznatnom deskvamacijom, 3-4 su ispoljili umereni do teški eritem i deskvamaciju i 5 je ispoljio izraženi čir.

SL. 44 - Srednja ocena dermatitisa kao posledice akutnog zračenja kao funkcija vremena za netretirane, netretirane bez izlaganja zračenju, samo nosač, i tri topikalne količine RTA 408 na 3, 10, i 30 mg/kg merena svakog drugog dana od dana 4 do dana 30. Ocena dermatitisa je zasnovana na skali gde je 0 potpuno zdrav, 1-2 ispoljili su srednji do umereni eritem sa minimalnom do neznatnom deskvamacijom, 3-4 su ispoljili umereni do teški eritem i deskvamaciju i 5 je ispoljio izraženi čir.

SL. 45 – Srednja ocena dermatitisa kao posledice akutnog zračenja kao funkcija vremena za netretirane, netretirane bez izlaganja zračenju, samo nosač, i tri topikalne količine RTA 408 na 0.01%, 0.1% i 1% merena svakog drugog dana od dana 4 do dana 30. Ocena dermatitisa je zasnovana na skali gde je 0 potpuno zdrav, 1-2 ispoljili su srednji do umereni eritem sa minimalnom do neznatnom deskvamacijom, 3-4 su ispoljili umereni do teški eritem i deskvamaciju i 5 je ispoljio izraženi čir.

SL. 46 – Kliničke ocene dermatitisa izazvanog frakcionim zračenjem prikazane na grafikonu naspram vremena i promene u oceni dermatitisa za svaku testiranu grupu. Ocena dermatitisa je bazirana na skali u kojoj je 0 potpuno zdrav, 1-2 je ispoljavao srednji do umereni eritem sa mininalnom do neznatnom deskvamacijom, 3-4 je ispoljio srednji do teški eritem i deskvamaciju, i 5 je ispoljio izraženi čir.

2

SL. 47 – Grafikon AUC analize koji pokazuje ocenu dermatitisa (težina 3 dana) za svaku od testiranih grupa tokom celog perioda posmatranja. Ocene dermatitisa su procenjivane svaka dva dana od dana 4 do dana 30 studije.

SL. 48a & b - (a) Grafikon apsorbance na 595 nm za tretiranu ćelijsku liniju kancera prostate LNCaP koja pokazuje relativni citotoksični efekat na ćelije tretirane hemoterapeutskim sredstvom i RTA 408 naspram samo RTA 408. (b) Grafikon apsorbance na 595 nm za tretiranu ćeijsku liniju kancera prostate DU-145 koji pokazuje relativni citotoksični efekat na ćelije tretirane hemoterapeutskim sredstvom i RTA 408 naspram samo RTA 408.

SL. 49 – Crno-bele verzije fotografija u boji skeniranih miševa koje pokazuju aktivnost luciferaze tumora za tri miša: kontrolna životinja bez tretmana, životinja podvrgnuta jonizujućem zračenju (jedna doza, 18 Gy), i životinja kojoj je davano i jonizujuće zračenje (jedna doza, 18 Gy, dan 0) i RTA 408 (17.5 mg/kg i.p., jednom dnevno na dane -3 do -1, zatim pojedinačne doze na dane 1, 3 i 5). Boje naznačene strelicama su indikativne za intenzitet, pri čemu su intenziteti predstavljeni crvenom, žutom, zelenom i plavom po redosledu od najvišeg do najnižeg intenziteta.

SL. 50 – Redukcija koncentracija proteina vodenog humora za različite formulacije RTA 408 (tamni stubovi) u poređenju sa vrednostima iz literature za MaxiDex® (0.1% deksametazon) i maprakorat (svetli stubovi) posle indukcije paracenteze.

SL. 51 – Supresija NO zavisna od doze in vivo sa 63415. CD-1 miševi (n = 6) su dozirani sa DMSO ili AIM pomoću oralne gavaže. LPS (5 mg/kg) je primenjen 24 časa kasnije. Dvadeset i četiri časa posle LPS primene, cela krv je sakupljena za analizu NO. Inhibicija NO je određivana pomoću Griess Reaction iz redukovane, de-proteinizovane plazme.

SL. 52 – Obimna raspodela 63415 (RTA 408) u mišjim tkivima. Miševi su dozirani PO jednom na dan x3 sa 25 mg/kg 63415 (RTA 408) ili 25 mg/kg RTA 405. Krv (plazma i cela krv) i tkiva (mozak, jetra, pluća i bubreg) su sakupljeni 6 časova posle poslednje doze. Izvedena je polukvantitativna analiza sadržaja leka. Značajni nivoi su zabeleženi u CNS-u.

SL. 53 – Indukcija aktivnosti NQO1 u mišjoj jetri, plućima i bubregu sa 63415. Miševi su dozirani PO jednom na dan x3 sa 25 mg/kg. Tkiva su sakupljena 6 časova posle poslednje doze i izvedena je analiza aktivnosti NQO1. Značajna aktivacija NQO1 je zabeležena u više tkiva.

SL. 54 – Rezime 6341514-dnevne studije toksičnosti kod miševa. C57BL/6 miševi su dozirani PO jednom na dan x14. Krajnje tačke su obuhvatale preživljavanje, težinu i kliničku hemijsku analizu. Sve životinje su preživele do dana 14. Nisu se javile značajne promene u težini u poređenju sa grupom koja je primala nosač, i nije bilo dokaza za toksičnost na bilo kojoj dozi na bazi kliničkih hemijskih analiza.

SL. 55 – Tkivna raspodela 63415 iz 14-dnevne studije toksičnosti kod C57BL/6 miševa. Uzorci mozga, pluća i jetre su sakupljeni 4 časa posle krajnje doze i kvatitativno određivani za sadržaj 63415 upotrebom senzitivnog LC/MS/MS postupka. Izlaganja na 10 i 100 mg/kg u plućima prešla su in vitro IC50za NO indukciju za 55- i 1138-puta, respektivno. Izlaganje na 10 i 100 mg/kg u mozgu prevazišlo in vitro IC50za NO indukciju za 29- i 541-puta, respektivno.

SL. 56 – Tkivna raspodela 63415 kod Sprague Dawley pacova. Tkiva su sakupljena četiri časa posle krajnjeg doziranja na dan 14 ili dan 6 (100 mg/kg), ekstrahovana i kvantitativno određena za sadržaj 63415 upotrebom senzitivnog LC/MS/MS postupka. Jedinjenje 63415 se dobro distribuira u ciljnim tkivima. Izlaganja na 10 mg/kg u plućima i mozgu prelazi in vitro IC50za NO inhibiciju za 294- i 240-puta, respektivno.

SL. 57 – Raspodela jedinjenja 63415 u ciljnom tkivu kod makaki majmuna. Tkiva su sakupljena četiri časa posle krajnjeg doziranja na dan 14. Sadržaj jedinjenja 63415 je ekstrahovan i kvantitativno određen upotrebom senzitivnog LC/MS/MS postupka.

SL. 58 - FT-Raman spektar (3400-50 cm<-1>) uzorka PP415-P1, koji odgovara amorfnom obliku (klase 1).

SL. 59 - PXRD (1.5-55.5°2θ) obrazac uzorka PP415-P1, koji odgovara amorfnom obliku (klase 1).

SL. 60 - TG-FTIR termogram (25-350°C) uzorka PP415-P1, koji odgovara amorfnom obliku (klase 1).

SL. 61 -<1>H-NMR spektar u DMSO-d6uzorka PP415-P1, koji odgovara amorfnom obliku (klase 1).

SL. 62 - DSC termogram uzorka PP415-P1, koji odgovara amorfnom obliku (klase 1).

SL. 63 - DVS izoterma uzorka PP415-P1, koja odgovara amorfnom obliku (klase 1).

SL. 64 - FT-Raman spektar uzorka PP415-P1, koji odgovara amorfnom obliku (klase 1), posle DVS merenja (gornji) je nepromenjen u poređenju sa matrijalom pre DVS merenja (donji). Spektri su skalirani i pomereni u y-smeru za svrhu poređenja.

SL. 65 - PXRD obrazac uzorka PP415-P1, koji odgovara amorfnom obliku (klase 1), posle DVS merenja (gornji) je nepromenjen u poređenju sa materijalima pre DVS merenja (donji). Obrasci nisu skalirani, ali su pomereni u y-smeru za svrhu poređenja.

SL. 66 - PXRD obrazac uzorka PP415-P40 (gornji) odgovara obrascu oblika solvata (klasa 2) (donji, uzorak PP415-P19). Obrasci su skalirani i pomereni u y-smeru za svrhu poređenja.

SL. 67 - PXRD obrasci uzoraka za ispitivanje stabilnosti PP415-P2a (gornji), PP415-P3a (drugi od vrha), PP415-P4a (srednji) i PP415-P5a (drugi od dna), koji odgovara amorfnom obliku (klasa 1), posle jedne nedelje ne pokazuje razlike u poređenju sa početnim materijalom na vremenskoj tački t0(donji, uzorak PP415-P1). Obrasci nisu skalirani, ali su pomereni u y-smeru za svrhu poređenja.

SL. 68 - PXRD obrasci uzoraka za ispitivanje stabilnosti PP415-P2b (gornji), PP415-P3b (drugi od vrha), PP415-P4b (srednji), i PP415-P5b (drugi od dna), koji odgovara amorfnom obliku (klase 1), posle dve nedelje ne pokazuju razlike u poređenju sa početnim materijalom na vremenskoj tački t0(donji, uzorak PP415-P1). Obrasci nisu skalirani, ali pomereni u y-smeru za svrhu poređenja.

SL. 69 - PXRD obrasci uzoraka za ispitivanje stabilnosti PP415-P2c (gornji), PP415-P3c (drugi od vrha), PP415-P4c (srednji), i PP415-P5c (drugi od dna), što odgovara amorfnom obliku (klasa 1), posle četiri nedelje ne pokazuju razlike u poređenju sa početnim materijalom na vremenskoj tački t0(donji, uzorak PP415-P1). Obrasci nisu skalirani, ali su pomereni u y-smeru za svrhu poređenja.

SL. 70 - FT-Raman spektri (2400-50 cm<-1>) uzoraka oblika solvata (klase 2) (PP415-P7: gornji; PP415-P8: drugi od vrha; PP415-P9: treći od vrha; PP415-P10: četvrti od vrha; PP415-P11: srednji; PP415-P15: četvrti od dna; PP415-P17: treći od dna; PP415-P21: drugi od dna; PP415-P24: donji). Spektri su skalirani i pomereni u y-smeru za svrhu poređenja.

SL. 71 - FT-Raman spektar (1750-1000 cm<-1>) oblika solvata (klase 2) (PP415-P7: gornji) jasno se razlikuje od spektra amorfnog oblika (klase 1) (PP415-P1: donji). Spektri su skalirani i pomereni u y-smeru za svrhu poređenja.

SL. 72 - FT-Raman spektri (1750-1000 cm<-1>) klase 2 (uzorak PP415-P19: gornji), klase 3 (uzorak PP415-P6: drugi od vrha), klase 4 (uzorak PP415-P13: drugi sa dna) i klase 5 (uzorak PP415-P14: donji) značajno se međusobno razlikuju. Spektri su skalirani i pomereni u y-smeru za svrhu poređenja.

2

SL. 73 - PXRD obrasci (2-32°2θ) uzoraka oblika solvata (klasa 2) (PP415-P7: gornji; PP415-P8: drugi od vrha; PP415-P10: treći od vrha; PP415-P15: četvrti od vrha; PP415-P17: srednji; PP415-P18: četvrti sa dna; PP415-P19: treći sa dna; PP415-P21: drugi sa dna; PP415-P24: donji). Obrasci su skalirani i pomereni u y-smeru za svrhu poređenja.

SL. 74 - PXRD obrasci (11-21°2θ) nekih uzoraka oblika solvata (klasa 2) (PP415-P7: gornji; PP415-P8: drugi od vrha; PP415-P10: srednji; PP415-P21: drugi sa dna; PP415-P24: donji). Obrasci su skalirani i pomereni u y-smeru za svrhe poređenja.

SL. 75 - PXRD obrasci (2-32°2θ) klase 2 (uzorak PP415-P19: gornji), klase 3 (uzorak PP415-P6: drugi sa vrha), klase 4 (uzorak PP415-P13: drugi sa dna) i klase 5 (uzorak PP415-P14: donji) su izrazito različiti. Obrasci su skalirani i pomereni u y-smeru za svrhu poređenja.

SL. 76 - TG-FTIR termogram uzorka PP415-P7, koji odgovara obliku solvata (klase 2).

SL. 77 - TG-FTIR termogram uzorka PP415-P21, koji odgovara obliku solvata (klase 2).

SL. 78 - TG-FTIR termogram uzorka PP415-P24, koji odgovara obliku solvata (klase 2).

SL. 79 - TG-FTIR termogram uzorka PP415-P29, koji odgovara obliku solvata (klase 2).

SL. 80 - TG-FTIR termogram uzorka PP415-P47, koji odgovara obliku solvata (klase 2).

SL. 81 - TG-FTIR termogram uzorka PP415-P48, koji odgovara obliku solvata (klase 2).

SL. 82 - FT-Raman sektri (1800-700 cm<-1>) oblika solvata (klase 2) (donji, uzorak PP415-P7) i osušenog oblika solvata (klase 2) (gornji, uzorak PP415-P30) su slični i pokazuju samo male razlike koje se teško mogu razlikovati unutar grafikona. Spektri su skalirani za svrhu poređenja.

SL. 83 - PXRD obrazac osušenog oblika solvata (klasa 2), uzorak PP415-P30 (gornji) u poređenju sa obrascem oblika solvata (klase 2), uzorak PP415-P7 (donji). Obrasci nisu skalirani, ali su pomereni u y-smeru za svrhu poređenja.

SL. 84 - TG-FTIR termogram osušenog uzorka PP415-P30, koji odgovara obliku solvata (klase 2).

SL. 85 - FT-Raman spektar osušenog uzorka PP415-P18 (svetlo siva) je identičan spektru originalnog uzorka PP415-P15 (tamno siva) slični su i pokazuju samo malo razlike koje se teško mogu razlikovati unutar grafikona. Spektri su skalirani za svrhu poređenja.

SL. 86 - PXRD obrazac osušenog uzorka PP415-P18 (gornji) pokazuje male razlike od obrasca originalnog uzorka PP415-P15 (donji), iako su oba oblici solvata (klase 2). Obrasci su skalirani i pomereni u y-smeru za svrhu poređenja.

SL. 87 - TG-FTIR termogram uzorka PP415-P18, koji odgovara obliku solvata (klase 2).

SL. 88 - FT-Raman spektar uzorka PP415-P17 (gornji) je skoro identičan spektrima osušenih uzoraka PP415-P19 (srednji) i PP415-P32 (donji) i pokazuje samo male razlike koje se teško mogu razlikovati unutar grafikona. Spektri su skalirani i pomereni u y-smeru za svrhu poređenja.

SL. 89 - PXRD obrazac osušenih uzoraka PP415-P19 (srednji) je različit od obrasca originalnog uzorka PP415-P17 (gornji), ali još uvek odgovara obliku klase 2. Obrazac dodatno osušenog uzorka PP415-P32 (donji) pokazuje šire pikove sa nižim odnosom S/N. Materijal je manje kristalan, ali još uvek odgovara obliku klase 2. Obrasci su skalirani i pomereni u y-smeru za svrhu poređenja.

SL. 90 - TG-FTIR termogram uzorka PP415-P19, koji odgovara obliku solvata (klasa 2).

SL. 91 - TG-FTIR termogram uzorka PP415-P32A, koji odgovara obliku solvata (klasa 2).

SL. 92 - FT-Raman spektar uzorka PP415-P21 (gornji) je identičan spektrima osušenih uzoraka PP415-P28 (srednji) i PP415-P34 (donji). Spektri su skalirani i pomereni u y-smeru za svrhu poređenja.

SL. 93 - PXRD obrasci osušenih uzoraka PP415-P28 (srednji) i PP415-P34 (donji) pokazuju šire pikove sa niskim odnosom S/N, što ukazuje na niži kristalinitet uzoraka u poređenju sa obrascem originalnog uzorka PP415-P21 (gornji). Obrasci se donekle razlikuju, ali još uvek odgovaraju obliku klase 2. Oni su skalirani i pomereni u y-smeru za svrhu poređenja.

SL. 94 - TG-FTIR termogram osušenog uzorka PP415-P28, koji odgovara obliku solvata (klasa 2).

SL. 95 - TG-FTIR termogram osušenog uzorka PP415-P34, koji odgovara obliku solvata (klasa 2).

SL. 96 - FT-Raman spektri (2400-50 cm<-1>) uzoraka oblika solvata (klasa 3) (PP415-P6: gornji; PP415-P12: srednji; PP415-P20: donji). Spektri su skalirani i pomereni u y-smeru za svrhu poređenja.

2

SL. 97 - FT-Raman spektri (1750-1000 cm<-1>) uzoraka oblika solvata (klasa 3) (PP415-P6: gornji; PP415-P12: drugi sa vrha; PP415-P20: drugi sa dna) su veoma slični međusobno sa samo malim razlikama, npr., na ∼1690 cm<-1>, ali se jasno razlikuju od klase 1 (PP415-P1: donji). Spektri su skalirani i pomereni u y-smeru za svrhu poređenja.

SL. 98 - PXRD obrasci (2-32°2θ) uzoraka oblika solvata (klasa 3) (PP415-P6: gornji; PP415-P12: srednji; PP415-P20: donji). Obrasci su skalirani i pomereni u y-smeru za svrhu poređenja.

SL. 99 - PXRD obrasci (13.5-18.5°2θ) uzoraka oblika solvata (klasa 3) (PP415-P6: gornji; PP415-P12: srednji; PP415-P20: donji) pokazuju male razlike. Obrasci su skalirani i pomereni u y-smeru za svrhu poređenja.

SL. 100 - TG-FTIR termogram uzorka PP415-P6, koji odgovara obliku solvata (klasa 3).

SL. 101 - TG-FTIR termogram uzorka PP415-P12, koji odgovara obliku solvata (klasa 3).

SL. 102 - TG-FTIR termogram osušenog oblika solvata (klasa 3), uzorak PP415-P25.

SL. 103 - TG-FTIR termogram dodatno osušenog oblika solvata (klasa 3), uzorak PP415-P33.

SL. 104 - FT-Raman spektri (1800-700 cm<-1>) oblika solvata (klasa 3) (gornji, uzorak PP415-P6), osušenog oblika solvata (klasa 3) (srednji, uzorak PP415-P25), i dodatno sušenog oblika solvata (klasa 3) (donji, uzorak PP415-P33) su identični. Spektri su skalirani i pomereni u y-smeru za svrhu poređenja.

SL. 105 - PXRD obrasci (4-24°2θ) oblika solvata (klasa 3) (gornji, uzorak PP415-P6), osšenog oblika solvata (klasa 3) (srednji, uzorak PP415-P25), i dodatno osušenog oblika solvata (klasa 3) (donji, uzorak PP415-P33). Obrasci su skalirani i pomereni u y-smeru za svrhu poređenja.

SL. 106 - TG-FTIR termogram uzorka PP415-P13, koji odgovara obliku acetonitril solvata (klasa 4).

SL. 107 - FT-Raman spektri (1800-700 cm<-1>) oblika acetonitril solvata (klasa 4) (tamno siva, uzorak PP415-P13) i osušenog materijala oblika acetonitril solvata (klasa 4) (svetlo siva, uzorak PP415-P26) su identični i perfektno se prekrivaju. Spektri su skalirani za svrhe poređenja.

2

SL. 108 - PXRD obrazac osušenog oblika acetonitril solvata (klasa 4), uzorak PP415-P26 (donji), u poređenju sa referentnim obrascem oblika acetonitril solvata (klasa 4), uzorak PP415-P13 (gornji). Obraci nisu skalirani, ali su pomereni u y-smeru za svrhe poređenja.

SL. 109 - TG-FTIR termogram osušenog oblika acetonitril solvata (klasa 4), uzorak PP415-P26.

SL. 110 - FT-Raman spektri (1800-700 cm<-1>) oblika acetonitril solvata (klasa 4) (gornji, uzorak PP415-P35), i osušenog oblika acetonitril solvata (klasa 4) (srednji, uzorak PP415-P36 i donji, uzorak PP415-P37) odgovaraju međusobno. Spektri su skalirani i pomereni u y-smeru za svrhu poređenja.

SL. 111 - PXRD obraci (4-24°2θ) oblika acetonitril solvata (klasa 4) (gornji, uzorak PP415-P35) i osušenog oblika acetonitril solvata (klasa 4) (srednji, uzorak PP415-P36 i donji, uzorak PP415-P37) u međusobnoj saglasnosti. Obrasci su skalirani i pomereni u y-smeru za svrhu poređenja.

SL. 112 - TG-FTIR termogram osušenog oblika acetronitril solvata (klasa 4), uzorak PP415-P36.

SL. 113 - TG-FTIR termogram osušenog oblika acetronitril solvata (klasa 4), uzorak PP415-P37.

SL. 114 - DVS izoterma desolvatiranog oblika acetronitril solvata (klasa 4) uzorak PP415-P37).

SL.115 - PXRD obrazac uzorka PP415-P37, oblika acetonitril solvata (klasa 4) posle DVS merenja (donji) je nepromenjen u poređenju sa materijalom pre DVS merenja (gornji). Obrasci nisu skalirani, ali su pomereni u y-smeru za svrhu poređenja.

SL. 116 - DSC termogram oblika desolvatiranog acetonitril solvata (klasa 4) (uzorak PP415-P37).

SL. 117 - DSC termogram ~1:1 smeše amorfnog oblika (klasa 1), uzorak PP415-P1, sa oblikom desolvatiranog acetonitril solvata (klasa 4), uzorak PP415-P36.

SL. 118 - DSC termogram ~1:1 smeše amorfnog oblika (klasa 1), uzorak PP415-P1, sa desolvatiranim oblikom acetonitril solvata (klasa 4), uzorak PP415-P36 (broj eksperimenta: PP415-P39). Skeniranje uz zagrevanje (korak 1) je zaustavljeno za 30 min na 173°C (korak 2) i zatim nastavljeno (korak 3).

SL. 119 - TG-FTIR termogram uzorka PP415-P14, koji odgovara obliku THF solvata (klasa 5).

SL. 120 - FT-Raman spektri (1800-1100 cm<-1>) oblika THF solvata (klasa 5) (isprekidana linija, uzorak PP415-P14), osušeni materijal oblika THF solvata (klasa 5) (isprekidana linija, uzorak

2

PP415-P27), i amorfnog oblika (klasa 1) (puna linija, uzorak PP415-P1). Spektri su skalirani za svrhe poređenja i pokazuju male promene u magnitudi, ali malu odgovarajuću promenu u obliku spektra.

SL. 121 - PXRD obrazac osušenog oblika THF solvata (klasa 5), uzorak PP415-P27 (gornji) u poređenju sa obrascem oblika THF solvata (klasa 5), uzorak PP415-P14 (donji). Obrasci su skalirani i pomereni u y-smeru za svrhe poređenja.

SL. 122 - TG-FTIR termogram uzorka PP415-P27, koji odgovara osušenom THF solvatu (klasa 5).

SL. 123 - PXRD obrazac uzorka PP415-P41 (gornji) odgovara obrascu oblika THF solvata (klasa 5) (srednji, uzorak PP415-P14), a ne obrascu oblika heptanskog solvata, (klasa 2) (donji, uzorak PP415-P19). Obrasci su skalirani i pomereni u y-smeru za svrhe poređenja.

SL. 124 - PXRD obrazac uzorka PP415-P45 (gornji) odgovara obrascu oblika THF solvata (klasa 5) (sredina, uzorak PP415-P14) i ne odgovara obracu oblika heptanskog solvata (klasa 2) (donji, uzorak PP415-P19). Obrasci su skalirani i pomereni u y-smeru za svrhe poređenja.

SL. 125 - PXRD obrazac uzorka PP415-P41 (gornji) odgovara obliku THF solvata (klasa 5). Posle sušenja uzorka PP415-P41 1 dan (drugi od vrha, uzorak: PP415-P44), materijal je uglavnom amorfan. Ostaju neki široki pikovi sa niskim intenzitetom. Posle dodatnog sušenja preko noći (drugi od dna, uzorak PP415-P44a) intenzitet ovih širokih pikova je dodatno smanjen. Amorfni oblik (klasa 1) je prikazan kao referenca (dno, uzorak: PP415-P42). Obraci nisu skalirani, ali su pomereni u y-smeru za svrhe poređenja.

SL. 126 - TG-FTIR termogram uzorka PP415-P44a, koji odgovara amorfnom obliku (klasa 1).

SL. 127 - PXRD obrazac uzorka PP415-P45 (gornji) odgovara obliku THF solvata (klasa 5). Posle sušenja uzorka PP415-P45 1 dan (drugi sa vrha, uzorak PP415-P46), materijal je uglavnom amorfan. Ostaju neki široki pikovi sa niskim intenzitetom. Posle ukupno 4 dana sušenja (drugi sa dna, uzorak PP415-P46a), obrazac ostaje nepromenjen. Amorfni oblik (klasa 1) je prikazan kao referenca (dno, uzorak PP415-P42). Obrasci nisu skalirani, ali su pomereni u y-smeru za svrhu poređenja.

SL. 128 - TG-FTIR termogram uzorka PP415-P46a, koji odgovara amorfnom obliku (klasa 1).

2

SL.129 - PXRD obrazac uzorka PP415-P42 (gornji) odgovara obrascu amorfnog oblika (klasa 1) (dno, uzorak PP415-P1). Obrasci su skalirani i pomereni u y-smeru za svrhu poređenja.

SL. 130 - PXRD obrazac uzorka PP415-P43 (gornji) odgovara obrascu izostrukturnog oblika solvata (klasa 2) (dno, uzorak PP415-P19), a ne obrascu oblika THF solvata (klasa 5) (sredina, uzorak PP415-P14). Obrasci su skalirani i pomereni u y-smeru za svrhu poređenja.

SL.131 - PXRD obrasci uzoraka PP415-P47 (gornji) i PP415-P48 (srednji) odgovaraju esencijalno obrascu oblika izostrukturnih solvata (klasa 2) (dno, uzorak PP415-P19), iako postoje izvesne razlike. Obrasci su skalirani i pomereni u y-smeru za svrhu poređenja.

SL.132 - PXRD obrazac uzorka PP415-P49 (gornji) odgovara obrascu amorfnog oblika (klasa 1) (donji, uzorak PP415-P1). Obrasci su skalirani i pomereni u y-smeru za svrhu poređenja.

OPIS ILUSTRATIVNIH PRIMERA IZVOĐENJA

[0043] Ovde je obezbeđeno u jednom aspektu jedinjenje:

N-((4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-cijano-2,2,6a,6b,9,9,12a-heptametil-10,14-diokso-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-oktadekahidropicen-4a-il)-2,2-difluoropropanamid, koje je ovde takođe označen kao RTA 408, 63415 ili PP415. U drugim neograničavajućim aspektima obezbeđeni ovde su njegovi polimorfni oblici, uključujući njegove solvate. U drugim neograničavajućim aspektima, obezbeđeni su takođe njegove farmaceutski prihvatljive soli. U drugim neograničavajućim aspektima, takođe su obezbeđeni postupci za pripremu, farmaceutske kompozicije i kompleti i artikli za proizvodnju ovih jedinjenja i njihovih polimorfnih oblika.

I. Definicije

[0044] Kada je korišćen u kontekstu hemijske grupe: "vodonik" označava -H; "hidroksi" označava -OH; "okso" označava =O; "karbonil" označava -C(=O)-; "karboksi" označava -C(=O)OH (takođe označen kao -COOH ili -CO2H); "halo" označava nezavisno -F, -Cl, -Br ili -I; "amino" označava -NH2; "hidroksiamino" označava -NHOH; "nitro" označava -NO2; imino označava =NH; "cijano" označava -CN; "izocijanat" označava -N=C=O; "azido" označava -N3; u monovalentnom kontekstu "fosfat" označava -OP(O)(OH)2ili njegov deprotonovani oblik; u dvovalentnom kontekstu "fosfat" označava -OP(O)(OH)O- ili njegov deprotonovani oblik; "merkapto" označava -SH; i "tio" označava =S; "sulfonil" označava -S(O)2-; i "sulfinil" označava -S(O)-. Svaka nedefinisana valenca na atomu strukture prikazane u ovoj prijavi implicitno predstavlja atom vodonika vezan za atom.

[0045] U kontekstu ovog opisa, formule:

2

predstavljaju iste strukture. Kada je tačka nacrtana na ugljeniku, tačka označava da atom ugljenika vezan za taj ugljenik izlazi iz ravni stranice.

[0046] Upotreba reči "a" ili "an," kada su korišćene zajedno sa terminom "sadrži" u patentnim zahtevima i/ili specifikaciji može da označava "jedan," ali je takođe u skladu sa značenjem "jedan ili više," "najmanje jedan," i "jedan ili više od jednog."

[0047] U ovoj prijavi, termin "oko" je korišćen za označavanje da vrednost obuhvata svojstvenu varijaciju greške za uređaj, postupak je korišćen za određivanje vrednosti ili varijacije koja postoji među subjektima studije. Kada je korišćen u kontekstu rentgenske difrakcije praha, termin "oko" je korišćen za označavanje vrednosti od ±0.2°2θ od objavljene vrednosti, poželjno vrednosti od ±0.1°2θ od objavljene vrednosti. Kada je korišćen u kontekstu diferencijalne skenirajuće kalorimetrije ili temperatura staklenog prelaza, termin "oko" je korišćen za označavanje vrednosti od ±10°C u odnosu na maksimum pika, poželjno vrednost od ±2°C u odnosu na maksimum pika. Kada je korišćen u drugim kontekstima, termin "oko" je korišćen za označavanje vrednosti od ±10% od objavljene vrednosti, poželljno vrednost od ±5% od objavljene vrednosti. Treba razumeti da, uvek kada je korišćen termin "oko", takođe je uključena specifična referenca na tačnu numeričku vrednost.

[0048] Termini "sadržati," "imati" i "obuhvatati" su otvoreni vezujući glagoli. Svi oblici ili vremena jednog ili više od ovih glagola, kao što su "sadrži," "koji sadrži," "ima," "koji ima," "obuhvata" i "uključujući," su takođe otvoreni. Na primer, bilo koji postupak koji "sadrži," "ima" ili "obuhvata" jedan ili više koraka nije ograničen na posedovanje samo onog jednog ili više koraka i takođe pokriva druge nenavedene korake.

[0049] Termin "efikasan," kao što je taj termin korišćen u specifikaciji i/ili patentnim zahtevima, označava adekvatan za postizanje željenog, očekivanog ili nameravanog rezultata. "Efikasna količina," "terapeutski efikasna količina" ili "farmaceutski efikasna količina" kada je korišćena u kontekstu lečenja pacijenta ili subjekta sa jedinjenjem označava da je količina jedinjenja koja, kada je primenjena na subjekta ili pacijenta za lečenje bolesti, dovoljna da postigne takvo lečenje za bolest.

[0050] Termin "halo pik" u kontekstu rentgenske difrakcije praha bi označavala široki pik, koji se često proteže >10°2θ u rentgenskom difraktogramu praha, tipično karakaterističan za amorfnu čvrstu supstancu ili sistem.

[0051] Termin "hidrat" kada je korišćen kao modifikator za jedinjenje označava da jedinjenje ima manje od jednog (npr., hemihidrat), jedan (npr., monohidrat), ili više od jednog (npr., dihidrat) molekula vode povezanih sa svakim molekulom jedinjenja, kao što je u čvrstim oblicima jedinjenja.

[0052] Kao što je ovde korišćen, termin "IC50" označava inhibitornu dozu koja je 50% maksimalnog dobijenog odgovora. Ova kvantitativna mera označava koliko je potrebno određenog leka ili druge supstance (inhibitora) da se inhibira dati biološki, biohemijski ili hemijski proces (ili komponenta procesa, tj. enzim, ćelija, ćelijski receptor ili mikroorganizam) za polovinu.

[0053] "Izomer" prvog jedinjenja je posebno jedinjenje u kome svaki molekul sadrži iste gradivne atome kao prvo jedinjenje, ali gde se konfiguracija ovih atoma u tri dimenzije razlikuje.

[0054] Kao što je ovde korišćen, termin "pacijent" ili "subjekat" označava živi sisarski organizam, kao što je čovek, majmun, krava, ovca, koza, pas, mačka, miš, pacov, zamorče ili njihove transgene vrste. U određenim primerima izvođenja, pacijent ili subjekat je ne-humana životinja. U određenim primerima izvođenja, pacijent ili subjekat je primat. U određenim primerima izvođenja, pacijent ili subjekat je čovek. Neograničavajući primeri humanih subjekata su adulti, deca, bebe i fetusi.

[0055] Kao što je generalno ovde korišćen "farmaceutski prihvatljiv" označava ona jedinjenja, materijale, kompozicije, i/ili oblike doze koji su, unutar obima racionalne medicinske procene, pogodni za upotrebu u kontaktu sa tkivima, organima i/ili telesnim tečnostima ljudi i životinja bez prekomerne toksičnosti, iritacije, alergijskog odgovora ili drugih problema ili komplikacija srazmerno razumnom odnosu koristi/rizika.

[0056] "Farmaceutski prihvatljive soli" označava soli jedinjenja za upotrebu prema predmetnom pronalasku koje su farmakološki prihvatljive, kao što su su ovde definisane, i koje poseduju željenu farmakološku aktivnost. Takve soli obuhvataju kisele adicione soli formirane sa neorganskim kiselinama kao što su hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, sumporna kiselina, azotna kiselina, fosforna kiselina i slično; ili sa organskim kiselinama kao što su 1,2-etandisulfonska kiselina, 2-hidroksietansulfonska kiselina, 2-naftalensulfonska kiselina, 3-fenilpropionska kiselina, 4,4’-metilenbis(3-hisroksi-2-en-1-karboksilna kiselina), 4-metilbiciklo[2.2.2]okt-2-en-1-karboksina kiselina, sirćetna kiselina, alifatične mono- i dikarboksilne kiseline, alifatične sumporne kiseline, aromatične sumporne kiseline, benzensulfonska kiselina, benzojeva kiselina, kamforsulfonska kiselina, ugljena kiselina, cimetna kiselina, limunska kiselina, ciklopentanpropionska kiselina, etansulfonska kiselina, fumarna kiselina, glukoheptonska kiselina, glukonska kiselina, glutaminska kiselina, glikolna kiselina, heptanova kiselina, heksanska kiselina, hidroksinaftojeva kiselina, mlečna kiselina, laurilsumporna kiselina, maleinska kiselina, jabučna kiselina, malonska kiselina, bademova kiselina, metansulfonska kiselina, mukonska kiselina, o-(4-hidroksibenzoil)benzojeva kiselina, oksalna kiselina, phlorobenzensulfonska kiselina, fenil-supstituisane alkanske kiseline, propionska kiselina, ptoluensulfonska kiselina, piruvinska kiselina, salicilna kiselina, stearinska kiselina, ćilibarna kiselina, vinska kiselina, tercijarna butilsirćetna kiselina, trimetilsirćetna kiselina i slično. Treba primetiti da određeni anjona koji formira deo bilo koje soli ovog pronalaska nije kritičan, sve dok je so, kao celina, farmakološki prihvatljiva. Dodatni primeri farmaceutski prihvatljivih soli i njihovi postupci pripreme i upotrebe su kao što su predstavljeni u Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, and Use (P. H. Stahl & C. G. Wermuth eds., Verlag Helvetica Chimica Acta, 2002).

1

[0057] "Prevencija" ili "sprečavanje" obuhvata: (1) inhibiciju početka bolesti kod subjekta ili pacijenta koji može biti u riziku od i/ili sa predispozicijom za bolest, ali još uvek ne oseća ili ispoljava bilo koju ili kompletnu patologiju ili simptomatologiju bolesti, i/ili (2) usporava početak patologije ili simptomatologije bolesti kod subjekta ili pacijenta koji može biti u riziku od i/ili sa predispozicijom za bolest, ali još uvek ne oseća ili ispoljava bilo koju ili kompletnu patologiju ili simptomatologiju bolesti.

[0058] "Stereoizomer" ili "optički izomer" je izomer datog jedinjenja u kome su isti atomi vezani za iste druge atome, ali gde se konfiguracija tih atoma u tri dimenzije razlikuje. "Enantiomeri" su stereoizomeri datog jedinjenja koji su međusobni odraz u ogledalu, kao leva i desna šaka. "Diastereomeri" su stereoizomeri datog jedinjenja koji nisu enantiomeri. Hiralni molekuli sadrže hiralni centar, takođe označen kao stereocenter ili stereogeni centar, koji je bilo koja tačka, iako ne neophodno atom, u molekulu koja nosi grupe takve da razmena bilo koje dve grupe dovodi do stereoizomera. U organskim jedinjenjima, hiralni centar je tipično atom ugljenika, fosfora ili sumpora, iako je takođe moguće za druge atome da budu stereocentri u organskim i neorganskim jedinjenjima. Molekul može imati višestruke stereocentre, dajući mnoge stereoizomere. U jedinjenjima čiji je stereoizomerizam posledica tetraedarskih stereogenih centara (npr., tetraedarski ugljenik), ukupan broj hipotetčki mogućih stereoizomera neće preći 2n, gde je n broj tetraedarskih stereocentara. Molekuli sa simetrijom često imaju manje od maksimalnog mogućeg broja stereoizomera.50:50 smeša enantiomera je označena kao racemska smeša. Alternativno, smeša enantiomera može biti enantiomerno obogaćena tako da je jedan enantiomer prisutan u količini većoj od 50%. Tipično, enantiomeri i/ili dijastereomeri mogu biti razdvojeni ili odvojeni upotrebom tehnika poznatih u stanju tehnike. Razmatrano je da za bilo koji stereocentar ili osu hiralnosti za koju stereohemija nije definisana, taj stereocentar ili osa hiralnosti mogu biti prisutni u svom R obliku, S obliku ili kao smeša R i S oblika, uključujući racemske i neracemske smeše. Kao što je ovde korišćen, izraz "značajno bez drugih stereoizomera" označava da kompozicija sadrži ≤15%, poželjnije ≤10%, čak poželjnije ≤5%, ili najpoželjnije ≤1% drugog stereoizomera (drugih stereoizomera).

[0059] "Tretman" ili "lečenje" obuhvata (1) inhibiciju bolesti kod subjekta ili pacijenta koji oseća ili ispoljava patologiju ili simptomatologiju bolesti (npr., zaustavljanje daljeg razvoja patologije i/ili simptomatologije), (2) poboljšanje bolesti kod subjekta ili pacijenta koji oseća ili ispoljava patologiju ili simptomatologiju bolesti (npr., vrši reverziju patologije i/ili simptomatologije), i/ili (3) postiže bilo koje merljivo smanjenje u bolesti kod subjekta ili pacijenta koji oseća ili ispoljava patologiju ili simptomatologiju bolesti.

[0060] Gornje definicije imaju prednost u odnosu na konfliktne definicije u bilo kojoj referenci koja je ovde citirana. Činjenicu da su određeni termini definisani, međutim, ne bi trebalo smatrati indikativnom za to da je bilo koji termin koji je nedefinisan neograničen. Pre se veruje da korišćeni termini opisuju pronalazak tako da stručnjak iz date oblasti može da razume obim i izvođenje predmetnog pronalaska.

II. RTA 408 i sintetički postupci

2

[0061] RTA 408 može biti pripremljen prema postupcima opisanim u delu sa primerima u daljem tekstu. Ovi postupci mogu biti dalje modifikovani i optimizovani upotrebom principa i tehnika organske hemije kao što primenjuje stručnjak iz date oblasti tehnike. Takvi principi i tehnike su opisani, na primer, u March’s Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure (2007).

[0062] Trebalo bi razumeti da određeni anjon koji formira deo bilo koje soli za upotrebu prema pronalasku nije kritičan, sve dok je so, kao celina, farmakološki prihvatljiva. Dodatni primeri farmaceutski prihvatljivih soli i njihovih postupaka za pripremu i upotrebu su predstavljeni u Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, and Use (2002).

[0063] Pored toga, atomi koji grade RTA 408 za primenu prema predmetnom pronalasku su određeni tako da obuhvataju sve izotopske oblike takvih atoma. Izotopi, kao što su ovde korišćeni, obuhvataju one atome koji imaju isti atomski broj, ali različite masene brojeve. Kao opšti primer i bez ograničenja, izotopi vodonika obuhvataju tricijum i deuterijum, i izotopi ugljenika obuhvataju<13>C i<14>C.

[0064] RTA 408 i njegov polimorfni oblik mogu takođe da imaju prednost da mogu biti efikasniji od, biti manje toksični od, imati duže dejstvo od, biti potentniji od, proizvoditi manje sporednih efekata od, lakše se apsorbovati od i/ili imati bolji farmakokinetički profil (npr., veću oralnu biodostupnost i/ili niži klirens) od, i/ili imati druge korisne farmakološke, fizičke ili hemijske prednosti u odnosu na jedinjenja poznata u stanju tehnike za upotrebu u indikacijama koje su ovde navedene.

III. Polimorfni oblici RTA 408

[0065] U nekim primerima izvođenja, predmetni pronalazak daje različite čvrste oblike RTA 408, uključujući njegove solvate. Izvršena je preformulacija i preliminarna studija polimorfizma, i nađeno je da RTA 408 za korišćenje prema patentnom pronalasku, ima visoku tendenciju za formiranje solvata. Kristalni oblici klasa 2, 3, 4 i 5 su u skladu sa solvatima. Za opis klasa, videti Tabelu 1 u daljem tekstu. Pokušaji za sušenje klasa 2 i 3 (dve grupe izostrukturnih solvata) nisu bili uspešni, što je u skladu sa čvrsto vezanim molekulima solvata. U nekim primerima izvođenja, sušenje čvrste supstance klase 4 (acetonitril solvata) dovelo je do izostrukturnog desolvatiranog oblika. U nekim primerima izvođenja, sušenje čvrste supstance klase 5 (THF solvat) rezultovalo je u amorfnom obliku klase 1. Nesolvatirani oblici RTA 408 obuhvataju amorfni oblik (klasa 1) i kristalni desolvatirani solvat klase 4 (izostrukturan sa acetonitril solvatom klase 4). U nekim primerima izvođenja, amorfni oblik ima visoki stakleni prelaz sa Tg ≈ 153°C (ΔCp = 0.72 J/g°C) i samo je malo higroskopan (Δm = 0.4% 50%→85% rel. vlaž.). U nekim primerima izvođenja, amorfni oblik je pogodan za najmanje četiri nedelje pod povišenom temperaturom i uslovima vlažnosti (tj., otvoren na 40°C/~75% rel. vlaž. ili zatvoren na 80°C). U nekim primerima izvođenja, amorfni oblik (klasa 1) je uspešno pripremljen od materijala klase 2 u procesu od dva koraka (transformacija u klasu 5 i kasnije sušenje klase 5 da bi se dobio amorfni oblik), kao i u direktnom postupku od jednog koraka (taloženje iz acetonskog rastvora u hladnom vodenom kupatilu). Kristalni desolvatirani solvat klase 4 (izostrukturan sa solvatom klase 4) je malo higroskopan (dobitak mase od ~0.7 tež.-% od 50% rel. vlaž. do 85% rel. vlaž.) i ima moguću tačku topljenja na 196.1°C (ΔH = 29.31 J/g).

[0066] Uzorak amorfnog oblika 63415, klase 1, je okarakterisan pomoću FT-Raman spektroskopije, PXRD, TG-FTIR, Karl Fischer titracije,<1>H-NMR, DSC i DVS (videti deo sa primerima za dodatne detalje). Nađeno je da uzorak sadrži ~0.9 tež.-% EtOH sa tragovima H2O (prema TG-FTIR). Sadržaj vode od 0.5 tež.-% je određen pomoću Karl Fischer titracije. DSC pokazuje visoku temperaturu staklenog prelaza sa Tg ≈ 153°C (ΔCp = 0.72 J/g°C). Prema DVS, materijal je malo higroskopan (Δm = 0.4% 50%→85% rel. vlaž.). Nije zabeležena kristalizacija u DSC ili DVS eksperimentima.

[0067] Hemijska stabilnost amorfnog oblika je ispitivana u organskim rastvaračima, uključujući aceton, EtOAc, MeOH i MeCN, kao i različite vodene medijume (npr., 1% vodeni rastvor Tween 80, 1% vodeni rastvor SDS, 1% vodeni rastvor CTAB) na koncentraciji od 1 mg/mL u vremenskim tačkama 6 h, 24 h, 2 d i 7 d. Razlaganje ≥1% je zabeleženo samo za rastvore u MeCN posle 7 dana i za suspenzije u 1% vodenom Tween 80 medijumu (u svim vremenskim tačkama na 254 nm i posle 24 h, 2 d i 7 d na 242 nm).

[0068] Pored toga, stabilnost amorfnog oblika je ispitivana preko čuvanja pod povišenom temperaturom i uslovima vlažnosti (otvoren na 25°C/62% rel. vlaž. i 40°C/75% rel. vlaž. i zatvoren na 60°C i 80°C). Posle jedne nedelje, dve nedelje i četiri nedelje, čuvani uzorci su analizirani pomoću PXRD. Nijedan od uzoraka se nije razlikovao od amorfnog početnog materijala.

[0069] Izvedeno je više od 30 eksperimenata kristalizacije i sušenja, uključujući ekvilibraciju suspenzije, sporo hlađenje, isparavanje i taloženje. Dobijena su četiri nova kristalna oblika (klase 2, 3, 4 i 5) pored amorfnog oblika (klasa 1).

[0070] Četiri nova oblika (klase 2, 3, 4 i 5) su okarakterisana pomoću FT-Raman spektroskopije, PXRD i TGFTIR. Svi oblici odgovaraju solvatima (Tabela 1). Eksperimenti sušenja pod vakuumom ili protokom N2su izvedeni sa ciljem da se dobije kristalni, nesolvatirani oblik 63415.

Tabela 1. Rezime dobijenih klasa

4

[0071] Klasa 2: Većina eksperimenata kristalizacije koji su izvedeni rezultovali su u čvrstom materijalu klase 2 (videti deo sa primerima u daljem tekstu). Njeni članovi mogu da odgovaraju izostrukturnim, nestehiometrijskim (<0.5 ekv.) solvatima (heptana, cikloheksana, izopropil etra, 1-butanola, trietilamina i moguće drugih rastvarača, kao što su heksan, drugi etri, itd.) sa čvrsto vezanim molekulima rastvarača. Raman spektri i PXRD obrasci unutar ove klase su veoma slični međusobno, na taj način strukture bi mogle biti esencijalno identične sa samo malim razlikama kao posledica različitih rastvarača koji su ugrađeni.

[0072] Eksperimenti sušenja na uzorcima klase 2 nisu rezultovali u kristalnom, nesolvatiranom obliku. Čak povišene temperature (80°C) i visoki vakuum (<1x10<-3>mbar) nisu mogli potpuno da uklone čvrsto vezane molekule rastvarača; sadržaj rastvarača od >2 tež.-% je uvek ostajao. Kristalinitet ovih delimično osušenih uzoraka je smanjen, ali nije zabeležena transformacija u različitu strukturu niti značajna amorfizacija.

[0073] Klasa 3: Čvrsti materijal klase 3 može biti dobijen iz nekoliko kristalizacija (videti deo sa primerima u daljem tekstu). Uzorci klase 3 su verovatno izostrukturni solvati 2PrOH, EtOH, i verovatno acetona sa čvrsto vezanim molekulima rastvarača. Oni bi mogli da odgovaraju stehiometrijskim hemisolvatima ili ne-stehiometrijskim solvatima sa sadržajem rastvarača od ~0.5 ekv. Kao sa klasom 2, Raman spektri i PXRD obraci unutar ove klase su veoma slični međusobno, što ukazuje na slične strukture koje ugrađuju različite rastvarače.

[0074] Slično klasi 2, eksperimenti sušenja nisu bili uspešni. Veoma čvrsto vezani molekuli rastvarača bi mogli samo delimično da budu uklonjeni (tj., ~5.4 tež.-% do ~4.8 tež. - % posle do 3 d na 1x10<-3>mbar i 80°C). PXRD obrasci su ostali nepromenjeni.

[0075] Klasa 4 može biti dobijena iz 7:3 MeCN/H2O sistema rastvarača (videti deo sa primerima u daljem tekstu). On najverovatnije odgovara kristalnom acetonitril hemisolvatu. Sušenjem (pod vakuumom ili protokom N2na povišenim temperaturama) većina molekula rastvarača bi mogla biti uklonjena bez promene ili uništavanja kristalne strukture (PXRD je ostao nepromenjen). Na taj način, dobijen je kristalni, nesolvatirani oblik (ili pre desolvatirani solvat). On je malo higroskopan (dobitak mase od ~0.7 tež.-% od 50% rel. vlaž. do 85% rel. vlaž.) i ima moguću tačku topljenja na 196.1°C (ΔH = 29.31 J/g).

[0076] Klasa 5 može biti dobijena od ~1:1 THF/H2O sistema rastavrača. Klasa 5 sadrži vezani THF (i možda H2O). Kako se sadržaj dve komponente ne može jednostavno kvantitativno odrediti posebno, tačna priroda ovog kristalnog solvata nije određena.

[0077] Sušenje klase 5 je rezultovalo u značajnoj desolvataciji i transformaciji u smeru amorfnog oblika (klasa 1). U nekim primerima izvođenja, amorfni oblik RTA 408 može biti pripremljen suspendovanjem heptanskog rastvarača klase 2 u 1:1 THF/H2O da bi se formirala čvrsta supstanca klase 5, nakon čega sledi sušenje i amorfizacija.

[0078] Eksperimenti sa ciljem pripreme amorfnog oblika (klasa 1) su izvedeni upotrebom početnog materijala klase 2. Uglavnom amorfni materijal (klasa 1) je pripremljen počevši od materijala klase 2 u procesu od dva koraka preko klase 5 na skali od 100-mg i 3-g (sušenje na 100 mbar, 80°C, nekoliko dana). Nađeno je da je priprema potpuno amorfnog materijala (klasa 1) moguća u postupku od jednog koraka izbegavajući rastvarač THF direktnim taloženjem amorfnog oblika (klase 1) iz rastvora materijala klase 2 u acetonu u hladnom vodenom kupatilu.

IV. Bolesti povezane sa inflamacijom i/ili oksidativnim stresom

[0079] Inflamacija je biološki proces koji obezbeđuje otpornost na infektivne i parazitske organizme i popravku oštećenog tkiva. Inflamacija je uobičajeno okarakterisana lokalizovanom vazodilatacijom, crvenilom, otokom i bolom, regrutacijom leukocita do mesta infekcije ili povrede, proizvodnjom inflamatornih citokina, kao što je TNF-α i IL-1, i proizvodnjom reaktivnih kiseoničnih ili azotnih vrsta, kao što je vodonik peroksid, superoksid, i peroksinitrit. U kasnijim stadijumima inflamacije, remodelovanje tkiva, angiogeneza i formiranje ožiljka (fibroza) mogu da se jave kao deo procesa zarastanja rane. Pod normalnim uslovima, inflamatorni odgovor je regulisan, privremeno, i redukovan je na orkestrirani način pošto je infekcija ili povreda adekvatno rešena. Međutim, akutna inflamacija može da postane prekomerna i opasna po život ako regulatorni mehanizmi oslabe. Alternativno, inflamacija može da postane hronična i da izazove kumulativno ošetećenje tkiva ili sistemske komplikacije. Na bazi najmanje dokaza predstavljenih ovde, RTA 408 može biti korišćen u lečenju ili prevenciji inflamacije ili bolesti povezanih sa inflamacijom.

[0080] Mnoge ozbiljne i uporne humane bolesti uključuju disregulaciju inflamatornih procesa, uključujući bolesti kao što su kancer, ateroskleroza i dijabetes, koji nisu tradicionalno razmotreni kao inflamatorna stanja. U slučaju kancera, inflamatorni procesi su povezani sa procesima koji obuhvataju formiranje tumora, napredovanje, metastazu, i otpornost na terapiju. U nekim prmerima izvođenja, RTA 408 može biti korišćen u lečenju ili prevenciji kancera uključujući karcinom, sarkom, limfom, leukemiju, melanom, mezoteliom, multipli mijelom ili seminom, ili kancer bešike, krvi, kosti, mozga, dojke, centralnog nervnog sistema, grlića materice, debelog creva, endometrijuma, jednjaka, žučne kese, genitalija, urogenitalnog trakta, glave, bubrega, grkljana, jetre, pluća, mišićnog tkiva, vrata, oralne ili nazalne mukoze, jajnika, pankreasa, prostate, kože, slezine, tankog creva, debelog creva, želudca, testisa ili tireoidee. Sada se smatra da je ateroskleroza, dugo smatrana poremećajem metabolizma lipida, primarno inflamatorno stanje, sa aktiviranim makrofagama koji imaju važnu ulogu u formiranju i eventualnoj rupturi aterosklerotičnih plakova. Takođe je pokazano da aktivacija inflamatornih puteva prenosa signala ima ulogu u razvoju insulinske rezistencije, kao i u oštećenju perifernog tkiva povezanog sa dijabetičkom hiperglikemijom. Prekomerna proizvodnja reaktivnih kiseoničnih vrsta i reaktivnih azotnih vrsta, kao što su superoksid, vodonik peroksid, azot oksid i peroksinitrit, je obeležje inflamatornih stanja. Dokaz za disregulisanu proizvodnju peroksinitrita je objavljen kod širokog niza bolesti (Szabo et al., 2007; Schulz et al., 2008; Forstermann, 2006; Pall, 2007).

[0081] Autoimune bolesti kao što su reumatoidni artritis, lupus, psorijaza i multipla skleroza obuhvataju neodgovarajuću i hroničnu aktivaciju inflamatornih procesa u pogođenim tkivima, koja nastaje kao posledica disfunkcije auto- naspram ne-auto prepoznavanja i mehanizama odgovora u imunom sistemu. Kod neurodegenerativnih bolesti kao što su Alchajmerova i Parkinsonova bolest, oštećenje neurona je u korelaciji sa aktivacijom mikroglije i povišenih nivoa pro-inflamatornih proteina, kao što je inducibilna azot oksid sintaza (iNOS). Hronična insuficijencija organa, kao što je insuficijencija bubrega, insuficijencija srca, insuficijencija jetre i hronična opstruktivna bolest pluća, je blisko povezana sa prisustvom hroničnog oksidativnog stresa i inflamacije, dovodeći do razvoja fibroze i eventualnog gubitka funkcije organa. Oksidativni stres u vaskularnim endotelnim ćelijama, koje oblažu velike i male krvne sudove, može da dovede do endotelne disfunkcije i veruje se da je važan faktor koji doprinosi razvoju sistemske kardiovaskularne bolesti, komplikacijama dijabetesa, hroničnoj bolesti bubrega i drugim oblicima insuficijencije organa, i određenom broju drugih bolesti poveznih sa starenjem, uključujući degenerativne bolesti centralnog nervnog sistema i mrežnjače.

[0082] Mnogi drugi poremećaji obuhvataju oksidativni stres i inflamaciju u pogođenim tkivima, uključujući inflamatornu bolest creva; inflamatorne bolesti kože; mukozitis i dermatitis povezan za radijacionom terapijom i hemoterapijom; bolesti oka, kao što su uveitis, glaukom, makularna degeneracija i različiti oblici retinopatije; insuficijencija i odbacivanje transplanta; ishemičnareperfuziona povreda; hronični bol; degenerativna stanja kostiju i zglobova, uključujući osteoartritis i osteoporozu; astmu i cističnu fibrozu; poremećaje sa konvulzijama; i neuropsihijatrijska stanja, uključujući šizofreniju, depresiju, bipolarni poremećaj, post-traumatski stresni poremećaj, poremećaje smanjene pažnje, poremećaja spektra autizma, i poremećaje u ishrani, kao što je anoreksija nervoza. Veruje se da je disregulacija inflamatornih puteva prenosa signala glavni faktor u patologiji bolesti trošenja mišića, uključujuči mišićnu distrofiju i različite oblike kaheksije.

[0083] Različiti opasni po život akutni poremećaji takođe obuhvataju disregulisani inflamatorni prenos signala, uključujući akutnu insuficijenciju organa koja uključuje pankreas, bubrege, jetru ili pluća, infarkt miokarda ili akutni koronarni sindrom, šlog, septički šok, traumu, teške opekotine i anafilaksu.

[0084] Mnoge komplikacije infektivnih bolesti takođe obuhvataju disregulaciju inflamatornih odgovora. Iako inflamatorni odgovor može da ubije patogene, prekomerni inflamatorni odgovor takođe može da bude prilično destruktivan i u nekim slučajevima može biti primarni izvor oštećenja inficiranih tkiva. Pored toga, prekomerni inflamatorni odgovor takođe može da vodi ka sistemskim komplikacijama kao posledica prekomerne proizvodnje inflamatornih citokina, kao što su TNF-α i IL-1. Veruje se da je to faktor u mortalitetu koji je rezultat teškog gripa, teškog akutnog respiratornog sindroma i sepse.

[0085] Aberantna ili prekomerna ekspresija iNOS ili ciklooksigenaze-2 (COX-2) je uključena u patogenezu mnogih procesa bolesti. Na primer, jasno je da je NO potentni mutagen (Tamir and Tannebaum, 1996), i da azot monoksid takođe može da aktivira COX-2 (Salvemini et al., 1994). Pored toga, postoji izrazito povećanje u iNOS u tumorima debelog creva pacova indukovanih karcinogenom, azoksimetanom (Takahashi et al., 1997). Pokazano je da serija sintetičkih analoga triterpenoida oleanolinske kiseline predstavlja snažne inhibitore ćelijskih inflamatornih procesa kao što su indukcija pomoću IFN-γ inducibilne azot monoksid sintaze (iNOS) i COX-2 u mišjim makrofagima. Videti Honda et al. (2000a), Honda et al. (2000b), i Honda et al. (2002).

[0086] U jednom aspektu, RTA 408 koji je ovde opisan je delimično okarakterisan njegovom sposobnošću da inhibira proizvodnju azot oksida u RAW 264.7 ćelijama poreklom od makrofaga indukovanu izlaganjem γ-interferonu. RTA 408 je dalje okarakterisan sposobnošću da indukuje ekspresiju antioksidantnih proteina, kao što je NQO1, i redukuje ekspresiju pro-inflamatornih proteina, kao što je COX-2 i inducibilna azot monoksid sintaza (iNOS). Ove osobine su relevantne za lečenje širokog niza bolesti i poremećaja koji uključuju oksidativni stres i disregulaciju inflamatornih procesa, uključujući kancer, komplikacije lokalizovanog izlaganja ili potpunog izlaganja tela jonizujućem zračenju, mukozitis i dermatitis koji su rezultat radijacione terapije ili hemoterapije, autoimune bolesti, kardiovaskularne bolesti, uključujući aterosklerozu, ishemično-reperfuzionu povredu, akutnu i hroničnu insuficijenciju organa, uključujući insuficijenciju bubrega i insuficijenciju srca, respiratorne bolesti, dijabetes i komplikacije dijabetesa, teške alergije, odbacivanje transplanta, bolest transplanta protiv domaćina, neurodegenerativne bolesti, bolesti oka i mrežnjače, akutni i hronični bol, degenerativne bolesti kostiju, uključujući osteoartritis i osteoporozu, inflamatorne bolesti creva, dermatitis i druge bolesti kože, sepsu, opekotine, poremećaje sa konvuzlijama i neuropsihijatrijske poremećaje.

[0087] U sledećem aspektu, RTA 408 može biti korišćen za lečenje subjekta koji ima stanje kao što su bolesti oka. Na primer, uveitis, makularna degeneracija (kako suvi oblik tako i vlažni oblik), glaukom, dijabetički makularni edem, blefaritis, dijabetička retinopatija, bolesti i poremećaji endotela rožnjače kao što je Fuchs-ova distrofija endotelijuma rožnjače, post-hirurška inflamacija, suvo oko, alergijski konjuktivitis i drugi oblici konjuktivitisa su neograničavajući primeri bolesti oka koje bi se mogle lečiti sa RTA 408.

[0088] U sledećem aspektu, RTA 408 može biti korišćen za lečenje subjekta koji ima stanje kao što su bolesti ili poremećaji kože. Na primer, dermatitis, uključujući alergijski dermatitis, atopijski dermatitis, dermatitis kao posledica hemijskog izlaganja, i dermatitis indukovan zračenjem; termalne ili hemijske opekotine; hronične rane uključujući dijabetičke čireve, rane od pritiska, i venske čireve; akne; alopeciju uključujući ćelavost i alopeciju indukovanu lekom; drugi poremećaji folikula dlake; buloznu epidermoliza; opekotine od sunca i njihove komplikacije; poremećaji pigmentacije kože uključujući vitiligo; stanja kože povezana sa starenjem; post-hirurško zarastanje rana; prevencija ili redukcija ožiljaka od povrede kože, operacija, ili opekotine; psorijaza; dermatološke manifestacije autoimunih bolesti ili bolest transplanta protiv domaćina; prevencija ili lečenje kancera kože; poremećaji koji uključuju hiperproliferaciju ćelija kože kao što je hiperkeratoza su neograničavajući primeri za bolesti kože koje bi mogle da se leče sa RTA 408.

[0089] Bez vezivanja za teoriju, veruje se da je aktivacija antioksidativnog/anti-inflamatornog Keap1/Nrf2/ARE puta uključena u anti-inflamatorne i anti-karcinogene osobine jedinjenja koje je ovde opisano.

[0090] U sledećem aspektu, RTA 408 može biti korišćen za lečenje subjekta koji ima stanje uzrokovano povišenim nivoima oksidativnog stresa u jednom ili više tkiva. Oksidativni stres je rezultat abnormalno visokih ili produženih nivoa reaktivnih kiseoničnih vrsta, kao što su superoksid, vodonik peroksid, azot monoksid i peroksinitrit (formiran pomoću reakcije azot monoksida i superoksida). Oksidativni stres može biti praćen akutnom ili hroničnom inflamacijom. Oksidativni stres može biti izazvan mitohondrijalnom disfunkcijom, aktivacijom imunih ćelija, kao što su makrofage i neutrofili, akutnim izlaganjem spoljašnjem agensu, kao što je jonizujuće zračenje ili citotoksično terapeutsko sredstvo (npr., doksorubicin), traumom ili drugom akutnom povredom tkiva, ishemijom/reperfuzijom, slabom cirkulacijom ili anemijom, lokalizovanom ili sistemskom hipoksijom ili hiperoksijom, povišenim nivoima inflamatornih citokina i drugih proteina povezanih sa inflamacijom, i/ili drugim abnormalnim fiziološkim stanjima, kao što je hiperglikemija ili hipoglikemija.

[0091] U životinjskim modelima mnogih takvih stanja, pokazano je da stimulacija ekspresije inducibilne hem oksigenaze (HO-1), ciljnog gena Nrf2 puta, ima značajan terapeutski efekat uključujući u modelima infarkta miokarda, insuficijencije bubrega, insuficijencije i odbacivanja transplanta, šloga, kardiovaskularne bolesti i autoimune bolesti (npr., Sacerdoti et al., 2005; Abraham & Kappas, 2005; Bach, 2006; Araujo et al., 2003; Liu et al., 2006; Ishikawa et al., 2001; Kruger et al., 2006; Satoh et al., 2006; Zhou et al., 2005; Morse and Choi, 2005; Morse and Choi, 2002). Ovaj enzim se razlaže u gvožđe, ugljen monoksid (CO) i biliverdin (koji je zatim preveden u potentni antioksidativni molekul, bilirubin).

[0092] U sledećem aspektu, RTA 408 može biti korišćen u prevenciji ili lečenju oštećenja tkiva ili insuficijencije organa, akutnog i hroničnog, koje je rezultat oksidativnog stresa pogoršanog inflamacijom. Primeri bolesti koje spadaju u ovu kategoriju obuhvataju srčanu insfucijenciju, insuficijenciju jetre, insuficijenciju i odbacivanje transplanta, insuficijenciju bubrega, pankreatitis, fibrotične bolesti pluća (cističnu fibrozu, COPD, i idiopatsku plućnu fibrozu, pored ostalih), dijabetes (uključujući komplikacije), aterosklerozu, ishemičnu-reperfuzionu povredu, glaukom, šlog, autoimunu bolest, autizam, makularnu degeneraciju i mišićnu distrofiju. Na primer, u slučaju autizma, studije sugerišu da povećani oksidativni stres u centralnom nervnom sistemu može da doprinese razvoju bolesti (Chauhan and Chauhan, 2006).

[0093] Dokazi takođe povezuju oksidativni stres i inflamaciju sa razvojem i patologijom mnogih drugih poremećaja centralnog nervnog sistema, uključujući psihijatrijske poremećaje, kao što su psihoza, velika depresija i bipolarni poremećaj; konvulzivni poremećaji, kao što je epilepsija; bol i senzorni sindromi, kao što su migrena, neuropatski bol ili tinitus; i bihejvioralni sindromi, kao što su poremećaji smanjene pažnje. Videti, npr., Dickerson et al., 2007; Hanson et al., 2005; Kendall-Tackett, 2007; Lencz et al., 2007; Dudhgaonkar et al., 2006; Lee et al., 2007; Morris et al., 2002; Ruster et al., 2005; McIver et al., 2005; Sarchielli et al., 2006; Kawakami et al., 2006; Ross et al., 2003. Na primer, povišeni nivoi inflamatornih citokina, uključujući TNF-α, interferon-γ i IL-6, su povezani sa velikom mentalnom bolešću (Dickerson et al., 2007). Mikroglijalna aktivacija je takođe povezana sa velikom mentalnom bolešću. Prema tome, nishodna regulacija inflamatornih citokina i inhibicija prekomerne aktivacije mikroglije bi mogla biti korisna kod pacijenata sa šizofrenijom, velikom depresijom, bipolarnim poremećajem, poremećajima spektra autizma i drugim neuropsihijatrijskim poremećajima.

[0094] Prema tome, u patologijama koje uključuju samo oksidativni stres ili oksidativni stres pogoršan inflamacijom, tretman može da sadrži primenu na subjekta terapeutski efikasne količine jedinjenja ovog pronalaska, kao što su ona opisana u prethodnom tekstu ili u ovoj specifikaciji. Tretman može biti primenjivan preventivno, unapred od predviđenog stanja oksidativnog stresa (npr., transplantacije organa ili primene radijacione terapije na pacijenta sa kancerom), ili može biti primenjen terapeutski u postavkama koje uključuju ustanovljeni oksidativni stres i inflamaciju. U nekim primerima izvođenja, kada je jedinjenje prema predmetnom pronalasku korišćeno za lečene pacijenta koji prima radijacionu terapiju i/ili hemoterapiju, jedinjenje prema pronalasku može biti primenjeno pre, istovremeno i/ili posle radijacije ili hemoterapije, ili jedinjenje može biti primenjeno u kombinaciji sa drugim terapijama. U nekim primerima izvođenja, jedinjenje prema pronalasku može da spreči i/ili redukuje težinu sporednih efekata povezanih sa radijacionom terapijom ili hemoterapijom (upotrebom različitog sredstva) bez redukcije antikancerskih efekata radijacione terapije ili hemoterapije. Kako takvi sporedni efekti mogu biti ograničavajući za dozu za radijacionu terapiju i/ili hemoterapiju, u nekim primerima izvođenja, jedinjenje prema predmetnom pronalasku može biti korišćeno za omogućavanje višeg i/ili češćeg doziranja radijacione terapije i/ili hemoterapije, na primer, koje rezultira u većoj efikasnosti tretmana. U nekim primerima izvođenja, jedinjenje prema pronalasku kada je primenjeno u kombinaciji sa radijacionom terapijom i/ili hemoterapijom može da pojača efikasnost date doze radijacije i/ili hemoterapije. U nekim primerima izvođenja, jedinjenje prema pronalasku kada je primenjeno u kombinaciji sa radijacionom terapijom i/ili hemoterapijom može da pojača efikasnost date doze zračenja i/ili hemoterapije i da smanji (ili, minimalno, da ne doda) sporedne efekte radijacije i/ili hemoterapije. U nekim primerima izvođenja, i bez vezivanja za teoriju, ova kombinatorna efikasnost može da rezultira iz inhibicije aktivnosti pro-inflamatornog faktora trasnkripcije NF-KB pomoću jedinjenja prema pronalasku. NF-κB je često hronično aktiviran u ćelijama kancera, i takva aktivacija je povezana sa otpornošću na terapiju i stimulaciju napredovanja tumora (npr., Karin, 2006; Aghajan et. al., 2012): Drugi transkripcioni faktori koji stimulišu inflamaciju i kancer, kao što je STAT3 (npr., He and Karin 2011; Grivennikov and Karin, 2010), takođe mogu biti inhibirani jedinjenjem prema pronalasku u nekim primerima izvođenja.

[0095] RTA 408 može biti korišćen za lečenje ili prevenciju inflamatornih stanja, kao što su sepsa, dermatitis, autoimuna bolest i osteoartritis. RTA 408 takođe može biti korišćen za lečenje ili prevenciju inflamatornog bola i/ili neuropatskog bola, na primer, indukcijom Nrf2 i/ili inhibicijom NF-KB.

[0096] RTA 408 takođe može biti korišćen za lečenje ili prevenciju bolesti, kao što je kancer, inflamacija, Alchajmerova bolest, Parkinsonova bolest, multipla skleroza, autizam, amiotrofna lateralna skleroza, Huntington-ova bolest, autoimune bolesti, kao što je reumatoidni artritis, lupus, Kronova bolest i psorijaza, inflamatorna bolest creva, sve druge bolesti za čiju patogenezu se veruje da obuhvata prekomernu proizvodnju azot oksida ili prostaglandina, i patologije koje uključuju samo oksidativni stres ili oksidativni stres pogoršan inflamacijom. RTA 408 može biti korišćen u lečenju ili prevenciji kancera koji obuhvataju karcinom, sarkom, limfom, leukemiju, melanom, mezoteliom, multipli mijelom ili seminom, ili kancer bešike, krvi, kosti, mozga, dojke, centralnog nervnog sistema, grlića materice, debelog creva, endometrijuma, jednjaka, žučne kese, genitalija, urogenitalnog trakta, glave, bubrega, grkljana, jetre, pluća, mišićnog tkiva, vrata, oralne ili nazalne mukoze, jajnika, pankreasa, prostate, kože, slezine, tankog creva, debelog creva, želudca, testisa ili tireoidee.

[0097] Sledeći aspekt inflamacije je proizvodnja inflamatornih prostaglandina, kao što je prostaglandin E. RTA 408 može biti korišćen za stimulaciju vazodilatacije, ekstravazacije plazme, lokalizovanog bola, povišene temperature i drugih simptoma inflamacije. Inducibilni oblik enzima COX-2 je povezan sa

4

njihovom proizvodnjom i visoki nivoi COX-2 su nađeni u upaljenim tkivima. Posledično, inhibicija COX-2 može da olakša mnoge simptome inflamacije i određeni broj važnih anti-inflamatornih lekova (npr., ibuprofen i celekoksib) deluju inhibicijom aktivnosti COX-2. Pokazano je da klasa ciklopentenon prostaglandina (cyPGs) (npr., 15-deoksi prostaglandin J2, takođe poznat kao PGJ2) ima ulogu u stimulaciji usmerenog smanjenja inflamacije (npr., Rajakariar et al., 2007). COX-2 je takođe povezan sa proizvodnjom ciklopentenon prostaglandina. Posledično, inhibicija COX-2 može da ometa potpunu redukciju inflamacije, potencijalno stimulišući opstajanje aktiviranih imunih ćelija u tkivima i dovodeći do hronične, "tinjajuće" inflamacije. Ovaj efekat može biti odgovoran za povećanu incidencu kardiovaskularne bolesti kod pacijenata koji koriste selektivne inhibitore COX-2 tokom dužih vremenskih perioda.

[0098] U jednom aspektu, RTA 408 može biti korišćen za kontrolu proizvodnje pro-inflamatornih citokina unutar ćelije pomoću selektivno aktivirajućih regulatornih cisteinskih ostataka (RCRs) na proteinima koji regulišu aktivnost redoks-osetljivih transkripcionih faktora. Pokazano je da aktivacija RCRs pomoću cyPGs započinje program pro-rezolucije u kome je aktivnost antioksidanta i citoprotektivnog transkripcionog faktora Nrf2 potentno indukovana i aktivnosti pro-oksidanta i proinflamatornih transkripcionih faktora NF-κB i STATs su suprimirane. U nekim primerima izvođenja, RTA 408 može biti korišćen za povećanje proizvodnje antioksidanta i reduktivnih molekula (NQOI, HO-1, SOD1, γ-GCS) i smanjenje oksidativnog stresa i proizvodnje pro-oksidanta i pro-inflamatornih molekula (iNOS, COX-2, TNF-α). U nekim primerima izvođenja, RTA 408 može biti korišćen za izazivanje ćelija koje su domaćin inflamatornog događaja da se vrate na ne-inflamatorno stanje stimulacijom smanjenja inflamacije i ograničenja prekomernog oštećenja tkiva za domaćina.

A. Kancer

[0099] U nekim primerima izvođenja, RTA 408, polimorfni oblici i postupci prema predmetnom opisu mogu biti korišćeni za indukciju apoptoze u tumorskim ćelijama, za indukciju ćelijske diferencijacije, za inhibiciju proliferacije ćelija kancera, za inhibiciju inflamatornog odgovora i/ili za funkcionisanje u hemoprotektivnom kapacitetu. Na primer, dati su novi polimorfni oblike koji imaju jednu ili više od sledećih osobina: (1) sposobnost da indukuju apoptozu i prave razliku između malignih i nemalignih ćelija, (2) aktivnost na sub-mikromolarnim ili nanomolarnim nivoima kao inhibitor proliferacije mnogih malignih ili premalignih ćelija, (3) sposobnost da suprimiraju de novo sintezu azot monoksid sintaze (iNOS) koja indukuje inflamatorni enzim, (4) sposobnost da inhibiraju aktivaciju NF-κB, i (5) sposobnost da indukuju ekspresiju hem oksigenaze-1 (HO-1).

[00100] Nivoi iNOS i COX-2 su povišeni u određenim kancerima i uključeni su u karcinogenezu i pokazano je da inhibitori COX-2 redukuju incidencu primarnih adenoma debelog creva kod ljudi (Rostom et al., 2007; Brown and DuBois, 2005; Crowel et al., 2003). iNOS je eksprimiran u supresornim ćelijama poreklom od mijeloida (MDSCs) (Angulo et al., 2000) i pokazano je da aktivnost COX-2 u ćelijama kancera rezultira u proizvodnji prostaglandina E2 (PGE2), za koji je pokazano da indukuje ekspresiju arginaze u MDSCs (Sinha et al., 2007). Arginaza i iNOS su enzimi koji koriste L-arginin kao supstrat i proizvode L-ornitin i ureu, i L-citrulin i NO, respektivno. Pokazano je da deplecija arginina iz mikrosredine tumora pomoću MDSCs, kombinovana sa proizvodnjom NO i peroksinitrita inhibiraju proliferaciju i indukuju apoptozu T ćelija (Bronte et al., 2003). Pokazano je da inhibicija COX-2 i iNOS redukuje akumulaciju MDSCs, vraća citotoksičnu aktivnost T ćelija povezanih sa tumorom, i odlažu rast tumora (Sinha et al., 2007; Mazzoni et al., 2002; Zhou et al., 2007).

[0101] Inhibicija NF-κB i JAK/STAT puteva prenosa signala je uključena kao strategija za inhibiciju proliferacije epitelijalnih ćelija kancera i indukciju njihove apoptoze. Pokazano je da aktivacija STAT3 i NF-κB rezultira u supresiji apoptoze u ćelijama kancera, i stimulaciji proliferacije, invaziji i metastazi. Pokazano je da su mnogi od ciljnih gena uključeni u ove procese transkripciono regulisani od strane NF-KB i STAT3 (Yu et al., 2007).

[0102] Pored njihovih direktnih uloga u epitelijalnim ćelijama kancera, NF-KB i STAT3 takođe imaju značajne uloge u drugim ćelijama koje se nalaze unutar mikrosredine tumora. Eksperimenti u životinjskim modelima su pokazali da je NF-κB potreban i u ćelijama kancera i u hematopoetskim ćelijama za umnožavanje efekata inflamacije na početak i napredovanje kancera (Greten et al., 2004). Inhibicija NF-κB u ćelijama kancera i mijeloidnim ćelijama smanjuje broj i veličinu, respektivno, rezultujućih tumora. Aktivacija STAT3 u ćelijama kancera rezultuje u proizvodnji nekoliko citokina (IL-6, IL-10) koji suprimiraju sazrevanje dendritskih ćelija povezanih sa tumorom (DC). Pored toga, STAT3 je aktiviran ovim citokinima u samim dendritskim ćelijama. Inhibicija STAT3 u mišjim modelima kancera vraća sazrevanje DC, stimuliše antitumorski imunitet i inhibira rast tumora (Kortylewski et al., 2005). U nekim primerima izvođenja, RTA 408 i njegovi polimorfni oblici se mogu koristiti za lečenje kancera, uključujući, na primer, kancer prostate. U nekim primerima izvođenja, RTA 408 i njegovi polimorfni oblici se mogu koristiti u kombinovanoj terapiji za lečenje kancera uključujući, na primer, kancer prostate. Videti, npr., Primer H u daljem tekstu.

B. Multipla skleroza i druga neurodegenerativna stanja

[0103] U nekim primerima izvođenja, RTA 408, polimerni oblici i postupci priloženi ovde se mogu koristiti za lečenje pacijenata za multiplu sklerozu (MS) ili druga neurodegenerativna stanja kao što su Alchajmerova bolest, Parkinsonova bolest ili amiotrofna lateralna skleroza. Poznato je da je MS inflamatorno stanje centralnog nervnog sistema (Williams et al., 1994; Merrill and Benvenist, 1996; Genain and Nauser, 1997). Na bazi nekoliko ispitivanja, dokazi sugerišu da su inflamatorni, oksidativni i/ili imuni mehanizmi uključeni u patogenezu Alchajmerove bolesti (AD), Parkinsonove bolesti (PD), amiotrofne lateralne skleroze (ALS), i MS (Bagasra et al.; 1995; McGeer and McGeer, 1995; Simonian and Coyle, 1996; Kaltschmidt et al., 1997). Epidemiološki podaci ukazuju na to da hronična upotreba NSAIDs koji blokiraju sintezu prostaglandina iz arahidonata, znatno snižava rizik za razvoj AD (McGeer et al., 1996; Stewart et al., 1997). Na taj način, sredstva koja blokiraju formiranje NO i prostaglandina, mogu biti korišćena u pristupima za prevenciju i lečenje neurodegenerativnih bolesti. Uspešni terapeutski kandidati za lečenje takve bolesti tipično zahtevaju sposobnost da prodiru kroz krvno-moždanu barijeru. Videti, na primer, SAD patentnu objavu 2009/0060873.

C. Neuroinflamacija

[0104] U nekim primerima izvođenja, RTA 408, polimorfni oblici i postupci priloženi ovde mogu biti korišćeni za lečenje pacijenata sa neuroinflamacijom. Neuroinflamacija obuhvata ideju da mikroglijalni i astrocitni odgovori i aktivnosti u centralnom nervnom sistemu imaju fundamentalno karakter sličan inflamaciji, i da su ovi odgovori centralni za patogenezu i napredovanje širokog niza različitih neuroloških poremećaja. Ove ideje su proširene iz Alchajmerove bolesti na druge neurodegenerativne bolesti (Eikelenboom et al., 2002; Ishizawa and Dickson, 2001), na ishemične/toksične bolesti (Gehrmann et al., 1995; Touzani et al., 1999), na biologiju tumora (Graeber et al., 2002) i čak na normalan razvoj mozga. Neuroinflamacija obuhvata široki spektar složenih ćelijskih odgovora koji obuhvataju aktivaciju mikroglije i astrocita i indukciju citokina, hemokina, proteina komplementa, proteina akutne faze, oksidativne povrede i srodnih molekularnih procesa, i ti događaji mogu imati štetne efekte na funkciju neurona, dovodeći do neuronske povrede, dodatne glijalne aktivacije i konačno neurodegeneracije.

D. Bolesti bubrega

[0105] U nekim primerima izvođenja, RTA 408, kao i njegovi polimorfni oblici, mogu biti korišćeni za lečenje pacijenata sa bolestima i poremećajima bubrega, uključujući insuficijenciju bubrega i hroničnu bolest bubrega (CKD), na bazi, na primer, postupaka navedenih u US 8,129,429. Insuficijencija bubrega, koja rezultira u neadekvatnom klirensu metaboličkih otpadnih proizvoda iz krvi i abnormalnim koncentracijama elektrolita u krvi, je značajan medicinski problem u svetu, naročito u razvijenim zemljama. Dijabetes i hipertenzija su među najvažnijim uzrocima hronične insuficijencije bubrega, takođe poznate kao hronična bolest bubrega (CKD), ali je takođe povezana sa drugim stanjima kao što je lupus. Akutna insuficijencija bubrega može da nastane od izlaganja određenim lekovima (npr., acetaminofenu) ili toksičnim hemikalijama, ili od ishemično-reperfuzione povrede povezane sa šokom ili hirurškim procedurama kao što je transplantacija, i može da rezultira u hroničnoj insuficijenciji bubrega. Kod mnogih pacijenata, insuficijencija bubrega napreduje do stadijuma u kome pacijent zahteva redovnu dijalizu ili transplantaciju bubrega da bi nastavio da živi. Obe ove procedure su visoko invazivne i povezane su sa značajnim sporednim efektima i problemima u kvalitetu života. Iako postoje efikasni tretmani za neke komplikacije insuficijencije bubrega, kao što je hiperparatireoidizam i hiperfosfatemija, nije pokazano ni za jedan dostupan tretman da zaustavlja ili vraća nazad napredovanje koje je u osnovi insuficijencije bubrega. Na taj način, sredstva koja mogu da poboljšaju kompromitovanu bubrežnu funkciju bi predstavljala značajan napredak u lečenju insuficijencije bubrega.

[0106] Inflamacija doprinosi značajno patologiji CKD. Tu takođe postoji snažna mehanistička veza između oksidativnog stresa i disfunkcije bubrega. NF-κB put prenosa signala ima važnu ulogu u

4

napredovanju CKD jer NF-κB reguliše transkripciju MCP-1, hemokina koji je odgovoran za regrutovanje monocita/makrofaga rezultujući u inflamatornom odgovoru koji konačno vrši povredu bubrega (Wardle, 2001). Keap1/Nrf2/ARE put kontroliše transkripciju nekoliko gena koji kodiraju antioksidantne enzime, uključujući hem oksigenazu-1 (HO-1). Ablacija Nrf2 gena kod ženki miševa rezultira u razvoju glomerularnog nefritisa sličnog lupusu (Yoh et al., 2001). Pored toga, nekoliko studija je pokazalo da je ekspresija HO-1 indukovana kao odgovor na oštećenje bubrega i inflamaciju i da ovaj enzim i njegovi proizvodi - bilirubin i ugljen monoksid – imaju zaštitnu ulogu u bubregu (Nath et al., 2006).

[0107] Akutna povreda bubrega (AKI) može da se javi posle ishemije-reperfuzije, tretmana sa određenim farmakološkim sredstvima, kao što je cisplatin i rapamicin, i intravenska injekcija radioaktivnogkontrastnog medijuma korišćenog u medicinskoj vizuelizaciji. Kao kod CKD, inflamacija i oksidativni stres doprinose patologiji AKI. Molekularni mehanizmi koji su u osnovi radioaktivnim kontrastomindukovane nefropatije (RCN) nisu dobro shvaćeni; međutim, verovatno je da kombinacija događaja uključujući produženu vazokonstrikciju, oštećenu autoregulaciju bubrega i direktnu toksičnost kontrastnog medijuma svi doprinose insuficijenciji bubrega (Tumlin et al., 2006). Vazokonstrikcija rezultuje u smanjenom protoku krvi u bubregu i izaziva ishemiju-reperfuziju i proizvodnju reaktivnih vrsta kiseonika. HO-1 je snažno indukovan pod ovim uslovima i pokazano je da sprečava ishemičnoreperfuzionu povredu u nekoliko različitih organa, uključujući bubreg (Nath et al., 2006). Specifično, pokazano je da je indukcija HO-1 zaštitna u modelu RCN pacova (Goodman et a/., 2007). Reperfuzija takođe indukuje inflamatorni odgovor, delimično preko aktivacije NF-κB prenosa signala (Nichols, 2004). Ciljno delovanje na NF-κB je predloženo kao terapeutska strategija za sprečavanje oštećenja organa (Zingarelli et al., 2003).

E. Kardiovaskularna bolest

[0108] U nekim primerima izvođenja, RTA 408, polimorfni oblici i postupci priloženi ovde mogu biti korišćeni za lečenje pacijenata sa kardiovaskularnom bolešću. Etiologija CV bolesti je složena, ali većina uzroka su povezani sa neadekvatnim ili potpuno prekinutim snabdevanjem krvlju do kritičnog organa ili tkiva. Često takvo stanje se javlja kao posledica rupture jednog ili više aterosklerotičnih plakova, što dovodi do formiranja tromba koji blokira protok krvi u kritičnom krvnom sudu.

[0109] U nekim slučajevima, aterosleroza može biti tako obimna u kritičnim krvnim sudovima da se razvija stenoza (sužavanje arterija) i protok krvi do kritičnih organa (uključujući srce) je hronično nedovoljan. Takva hronična ishemija može dovesti do oštećenja krajnjeg organa mnogih vrsta, uključujući kardijačnu hipertrofiju povezanu sa kongestivnom srčanom insuficijencijom.

[0110] Ateroskleroza, defekt koji je u osnovi mnogih oblika kardiovaskularne bolesti, javlja se kada fizički defekt ili povreda omotača (endotela) arterije pokrene inflamatorni odgovor koji uključuje proliferaciju ćelija vaskularnog glatkog mišića i infiltraciju leukocita u pogođenu oblast. Konačno, može da se formira komplikovana lezija poznata kao aterosklerotični plak, sastavljena od gore navedenih ćelija kombinovanih sa naslagama lipoproteina koji nose holesterol i drugih materijala (e.g., Hansson et al., 2006). Uprkos značajnim koristima ponuđenim od strane sadašnjih terapeutskih tretmana, mortalitet od kardiovaskularne bolesti ostaje visok i ostaje značajna neispunjena potreba u lečenju kardiovaskularne bolesti.

[0111] Pokazano je da je indukcija HO-1 korisna u nizu različitih modela kardiovaskularne bolesti, i niski nivoi ekspresije HO-1 su u kliničkoj korelaciji sa povišenim rizikom od CV bolesti. RTA 408, polimorfni oblici i postupci priloženi ovde, prema tome, mogu biti korišćeni u lečenju ili prevenciji različitih kardiovaskularnih poremećaja uključujući, ali bez ograničenja na aterosklerozu, hipertenziju, infarkt miokarda, hroničnu insuficijenciju srca, šlog, subarahnoidno krvarenje i restenoze. U nekim primerima izvođenja, RTA 408, polimorfni oblici i postupci priloženi ovde mogu biti korišćeni kao kombinovana terapija sa drugim poznatim kardiovaskularnim terapijama kao što su, ali bez ograničenja na antikoagulanti, trombolitici, streptokinaza, aktivatori tkivnog plazminogena, operacija, bajpas grafting koronarne arterije, balon angioplastika, upotreba stentova, lekovi koji inhibiciju ćelijsku proliferaciju ili lekovi koji snižavaju nivoe holesterola.

F. Dijabetes

[0112] U nekim primerima izvođenja, RTA 408, kao i njegovi polimorfni oblici, mogu biti korišćeni za lečenje pacijenata sa dijabetesom, na bazi, na primer, postupaka opisanih u SAD 8,129,429. Dijabetes je složena bolest okarakterisana nesposobnošću tela da reguliše nivoe glukoze u cirkulaciji. Ovaj nedostatak može biti rezultat nedostatka insulina, peptidnog hormona koji reguliše proizvodnju i apsorpciju glukoze u različitim tkivima. Deficijentni insulin ugrožava sposobnost mišića, masti, i drugih tkiva da apsorbuju glukozu pravilno, dovodeći do hiperglikemije (abnormalno visokih nivoa glukoze u krvi). Najčešće, takva deficijencija insulina je rezultat neadekvatne proizvodnje u ćelijama ostrvaca pankreasa. U većini slučajeva ovo se javlja zbog autoimune destrukcije ovih ćelija, stanja poznatog kao dijabetes tipa 1 ili juvenilni dijabetes, ali takođe može biti posledica fizičke traume ili nekog drugog uzroka.

[0113] Dijabetes može takođe da nastane kada mišićne i ćelije masti postanu manje responsivne na insulin i ne apsorpbuju glukozu pravilno, rezultirajući u hiperglikemiji. Ovaj fenomen je poznat kao insulinska rezistencija, i rezultirajuće stanje je poznato kao dijabetes tipa 2. Dijabetes tipa 2, najčešći tip, je visoko povezan sa gojaznošću i hipertenzijom. Gojaznost je povezana sa inflamatornim stanjem adipoznog tkiva za koje se navodi da ima glavnu ulogu u razvoju insulinske rezistencije (npr., Hotamisligil, 2006; Guilherme et al., 2008).

[0114] Dijabetes je povezan sa oštećenjem mnogih tkiva, većinom zbog toga što je hiperglikemija (i hipoglikemija, koja može da rezultira od prekomernih doza insulina ili doza insulina koje su slabo vremenski raspoređene) značajan izvor oksidativnog stresa. Zbog njihove sposobnosti da štite od oksidativnog stresa, naročito indukcijom ekspresije HO-1, RTA 408, polimorfni oblici i postupci priloženi ovde mogu biti korišćeni u tretmanima za mnoge komplikacije dijabetesa. Kao što je navedeno u prethodnom tekstu (Cai et al., 2005), sumnja se da su hronična inflamacija i oksidativni stres primarni faktori koji doprinose razvoju dijabetesa tipa 2. Pored toga, agonisti PPAPγ kao što su tiazolidindioni

4

sposobni su da redukuju insulinsku rezistenciju i poznato je da su efikasni tretmani za dijabetes tipa 2. U nekim primerima izvođenja, RTA 408, polimorfni oblici i postupci priloženi ovde mogu biti korišćeni kao kombinovane terapije sa agonistima PPARγ kao što su tiazolidindioni.

G. Artritis

[0115] U nekim primerima izvođenja, RTA 408, polimorfni oblici i postupci priloženi ovde mogu biti korišćeni za lečenje pacijenata sa oblikom artritisa. U nekim primerima izvođenja, oblici artritisa koji bi mogli biti lečeni sa RTA 408 i polimorfnim oblicima opisani ovde su reumatoidni artritis (RA), psorijatički artritis (PsA), spondiloartropatije (SpAs) uključujući ankilozni spondilitis (AS), reaktivni artritis (ReA) i enteropatijski artritis (EA), juvenilni reumatoidni artritis (JRA) i rani inflamatorni artritis.

[0116] Za reumatoidni artritis, prvi znaci se tipično javljaju u sloju sinovijalne opne, sa proliferacijom sinovijalnih fibroblasta i njihovim vezivanjem za artikularnu površinu na ivici zglobova (Lipsky, 1998). Zatim, makrofage, T ćelije i druge inflamatorne ćelije su regrutovane u zglob, gde proizvode određeni broj medijatora, uključujući citokine interleukin-1 (IL-1), koji doprinosi hroničnoj sekveli dovodeći do destrukcije kosti i hrskavice, i faktor nekroze tumora (TNF-α), koji ima ulogu u inflamaciji (Dinarello, 1998; Arend and Dayer, 1995; van den Berg, 2001). Koncentracija IL-1 u plazmi je značajno viša kod pacijenata sa RA nego kod zdravih individua i, naročito, nivoi It-1 u plazmi su u korelaciji sa aktivnošću RA bolesti (Eastgate et al., 1988). Pored toga, nivoi sinovijalne tečnosti IL-1 su u korelaciji sa različitim radiografskim i histološkim karakteristikama RA (Kahle et al., 1992; Rooney et al., 1990).

[0117] Drugi oblici artritisa obuhvataju psoriatički artritis (PsA), koji je hronična inflamatorna artropatija okarakterisana vezom artritisa i psorijaze. Studije su otkrile da PsA deli određeni broj genetičkih, patogenih i kliničkih karakteristika sa drugim spondiloartropatijama (SpAs), koja je grupa bolesti koja sadrži ankilozni spondilitis, reaktivni artritis i enteropatijski artritis (Wright, 1979). Postavka da PsA pripada SpA grupi je nedavno dobila dodatnu podršku iz studija imadžinga pokazujući široko rasprostranjeni entezitis kod PsA, ali ne kod RA (McGonagle et al., 1999; McGonagle et a/., 1998). Specifičnije, postulirano je da je entezitis jedan od najranijih događaja koji se javljaju u SpAs, dovodeći do remodelovanja kosti i ankiloze u kičmi, kao i artikularnog sinovitisa kada su upaljene enteze blizu perifernim zglobovima. Povećane količine TNF-α su prijavljene i kod psorijatičke kože (Ettehadi et al., 1994) i sinovijalne tečnosti (Partsch et al., 1997). Nedavna ispitivanja su pokazala pozitivnu korist anti-TNF tretmana kod PsA (Mease et. al., 2000) i ankiloznog spondilitisa (Brandt et al., 2000).

[0118] Juvenilni reumatoidni artritis (JRA), termin za najčešći oblik artritisa kod dece, je primenjen na familiju bolesti okarakterisanih hroničnom inflamacijom i hipertrofijom sinovijalnih membrana. Ovaj termin se preklapa, ali nije potpuni sinonim, sa familijom bolesti označenih kao juvenilni hronični artritis i/ili juvenilni idiopatski artritis u Evropi.

[0119] Poliartikularni JRA je poseban klinički podtip okarakterisan inflamacijom i sinovijalnom proliferacijom u više zglobova (četiri ili više), uključujući male zglobove šaka (Jarvis, 2002). Ovaj podtip JRA može biti težak, zbog toga uključenosti više zglobova i njegovog kapaciteta da napreduje brzo tokom

4

vremena. Iako klinički poseban, poliartikularni JRA nije homogen, i pacijenti variraju u manifestacijama bolesti, starosti početka, prognozi i terapeutskom odgovoru. Ove razlike veoma verovatno reflektuju spektar varijacija u prirodi imunog i inflamatornog napada koji može da se javi kod ove bolesti (Jarvis, 1998).

[0120] Ankilozni spondilitis (AS) je podgrupa bolesti unutar šire klasifikacije bolesti spondiloartropatije. Pacijenti pogođeni različitim podgrupama spondiloartropatije imaju etiologije bolesti koje su često veoma različite, u opsegu od bakterijskih infekcija do nasleđa. Ipak, u svim podgrupama, krajnji rezultat procesa bolesti je aksijalni artritis.

[0121] AS je hronični sistemski inflamatorni reumatski poremećaj aksijalnog skeleta sa ili bez ekstraskeletnih manifestacija. Sakroilijačni zglobovi i kičma su primarno pogođeni, ali takođe mogu biti uključeni zglobovi kuka i ramena, i ređe periferni zglobovi ili određene ekstra-artikularne strukture kao što su oko, vaskulatura, nervni sistem i gastrointestinalni sistem. Etiologija bolesti još uvek nije potpuno shvaćena (Wordsworth, 1995; Calin and Taurog, 1998). Etiologija je snažno povezana sa HLA-B27 alelom glavne histokompatibilne klase I (MHC I) (Calin and Taurog, 1998). AS pogađa individue na vrhuncu života i opasan je zbog njegovog potencijala da izazove hroničan bol i ireverzibilno oštećenje tetiva, ligamenata, zglobova i kostiju (Brewerton et al., 1973a; Brewerton et al., 1973b; Schlosstein et al., 1973).

H. Ulcerozni kolitis

[0122] U nekim primerima izvođenja, RTA 408, polimorfni oblici i postupci priloženi ovde mogu biti korišćeni za lečenje pacijenata sa ulceroznim kolitisom. Ulcerozni kolitis je bolest koja izaziva inflamaciju i rane, označene kao čirevi, u omotaču debelog creva. Inflamacija se obično javlja u rektumu i donjem delu debelog creva, ali može da pogodi celo debelo crevo. Ulcerozni kolitis takođe može biti označen kao kolitis ili proktitis. Inflamacija dovodi do toga da se debelo crevo često prazni, izazivajući dijareju. Čirevi se formiraju na mestima gde je inflamacija ubila ćelije koje oblažu debelo crevo i čirevi krvare i proizvode gnoj.

[0123] Ulcerozni kolitis je inflamatorna bolest creva (IBD), opšti naziv za bolesti koje izazivaju inflamaciju u tankom crevu i debelom crevu. Ulcerozni kolitis može biti teško dijagnostifikovati zbog toga što su njegovi simptomi slični drugim crevnim poremećajima i drugom tipu IBD, Kronovoj bolesti. Kronova bolest se razlikuje od ulceroznog kolitisa zbog toga što izaziva inflamaciju dublje unutar zida creva. Takođe, Kronova bolest se obično javlja u tankom crevu, iako se bolest može takođe javiti u ustima, jednjaku, želudcu, duodenumu, debelom crevu, slepom crevu i anusu.

I. Kronova bolest

[0124] U nekim primerima izvođenja, RTA 408, polimorfni oblici i postupci ovog pronalaska mogu biti korišćeni za lečenje pacijenata sa Kronovom bolešću. Simptomi Kronove bolesti obuhvataju intestinalnu

4

inflamaciju i razvoj intestinalne stenoze i fistula; neuropatiju često prate ovi simptomi. Anti-inflamatorni lekovi, kao što su 5-aminosalicilati (npr., mezalamin) ili kortikosteroidi, se tipično prepisuju, ali nisu uvek efikasni (prikaz u Botoman et al, 1998). Imunosupresija ciklosporinom je nekada korisna za pacijente rezistentne na ili intolerantne na kortikosteroide (Brynskov et al., 1989).

[0125] Kod aktivnih slučajeva Kronove bolesti, povišene koncentracije TNF-α i IL-6 se izlučuju u cirkulaciju krvi, i TNF-α, IL-1, IL-6 i IL-8 se proizvode u višku lokalno od strane mukozalnih ćelija (id.; Funakoshi et al., 1998). Ovi citokini mogu imati dalekosežne efekte na fiziološke sisteme uključujući razvoj kostiju, hematopoezu, i funkciju jetre, tireoidee i neuropsihijatrijsku funkciju. Takođe, neravnoteža IL-1β/IL-1ra odnosa, u korist pro-inflamatornog IL-1β, zabeležena je kod pacijenata sa Kronovom bolešću (Rogler and Andus, 1998; Saiki et al., 1998; Dionne et al., 1998; ali videti Kuboyama, 1998).

[0126] Tretmani koji su predloženi za Kronovu bolest obuhvataju upotrebu različitih antagonista citokina (npr., IL-1ra), inhibitora (npr., inhibitora IL-1β konvertujućeg enzima i antioksidanasa) i anti-citokinskih antitela (Rogler and Andus, 1998; van Hogezand and Verspaget, 1998; Reimund et al., 1998; Lugering et al., 1998; McAlindon et al., 1998). Naročito, monoklonska antitela protiv TNF-α su oprobana sa izvesnim uspehom u lečenju Kronove bolesti (Targan et al., 1997; Stack et al., 1997; van Dullemen et al., 1995). Ova jedinjenja mogu biti korišćena u kombinovanoj terapiji sa RTA 408, polimorfnim oblicima i postupcima predmetog opisa.

J. Sistemski lupus eritematozus

[0127] U nekim primerima izvođenja, RTA 408, polimorfni oblici i postupci prema pronalasku mogu biti korišćeni za lečenje pacijenata sa SLE. Sistemski lupus eitematozus (SLE) je autoimuna reumatska bolest okarakterisana nagomilavanjem autoantitela i imunih kompleksa u tkivima što dovodi do povrede tkiva (Kotzin, 1996). Nasuprot autoimunim bolestima, kao što su MS i dijabetes melitus tipa 1, SLE potencijalno uključuje višestruke sisteme organa direktno i njegove kliničke manifestacije su raznovrsne i varijabilne (prikaz dali Kotzin and O’Dell, 1995). Na primer, neki pacijenti mogu da pokažu primarno osip na koži i bol u zglobovima, da pokažu spontane remisije, i zahtevaju malo leka. Na drugoj strani spektra su pacijenti koji pokazuju tešku i progresivnu obuhvaćenost bubrega koje zahteva terapiju sa visokim dozama steroida i citotoksičnih lekova kao što je ciklofosfamid (Kotzin, 1996).

[0128] Jedno od antitela proizvedeno od strane SLE, IgG anti-dsDNK, ima glavnu ulogu u razvoju lupus glomerulonefritisa (GN) (Hahn and Tsao, 1993; Ohnishi et al., 1994). Glomerulonefritis je ozbiljno stanje kod koga kapilarni zidovi glomerula bubrega koji prečišćavaju krv postaju zadebljani zadebljanjem epitelne strane glomerularnih bazalnih membrana. Bolest je često hronična i progresivna i može dovesti do evetualne insuficijencije bubrega.

K. Sindrom iritabilnog creva

4

[0129] U nekim primerima izvođenja, RTA 408, polimorfni oblici, i postupci ovog pronalaksa mogu biti korišćeni za lečenje pacijenata sa sindromom iritabilnog creva (IBS). IBS je funkcionalni poremećaj okarakterisan abdominalnim bolom i promenjenim navikama creva. Ovaj sindrom može da počne kod mladih odraslih i može biti povezan sa značajnim invaliditetom. Ovaj sindrom nije homogeni poremećaj. Pre su opisani podtipovi IBS na osnovu predominantnog simptoma dijareja, konstipacija ili bol. U odsustvu "alarmantnih" simptoma, kao što su groznica, gubitak u telesnoj težini i gastrointestinalno krvarenje, potrebno je ograničeno dijagnostičko ispitivanje.

[0130] Sve više i više, dokazi o poreklu IBS sugerišu vezu između infektivnog enteritisa i kasnijeg razvoja IBS. Inflamatorni citokini mogu imati ulogu. U ispitivanju pacijenata sa istorijom potvrđenog bakterijskog gastroenteritisa (Neal et al., 1997), 25% je prijavilo perzistetnu promenu navika creva. Perzistentni simptomi mogu biti posledica psihološkog stresa u vreme akutne infekcije (Gwee et al., 1999).

[0131] Noviji podaci sugerišu da bakterijski rast u tankom crevu može takođe da ima ulogu u IBS simptomima. U jednoj studiji (Pimentel et al., 2000), 157 (78%) od 202 IBS pacijenata upućenih za testiranje vodonika u dahu imalo je rezultate testa koji su bili pozitivni za bakterijski rast. Od 47 subjekata koji su imali ponovljeno testiranje, 25 (53%) je prijavilo poboljšanje u simptomima (tj., abdominalnom bolu i dijareji) sa antibiotskim tretmanom.

L. Sjögren-ov sindrom

[0132] U nekim primerima izvođenja, RTA 408, polimorfni oblici i postupci priloženi ovde mogu biti korišćeni za lečenje pacijenata sa Sjögren-ovim sindromom. Primarni Sjögren-ov sindrom (SS) je hronična, sporo napredujuća, sistemska autoimuna bolest, koja pogađa pretežno sredovečne žene (odnos žena prema muškarcima 9:1), iako se može zabeležiti u svim starosnim dobima uključujući detinjstvo (Jonsson et al., 2002). Bolest je okarakterisana infiltracijom limfocita i destrukcijom egzokrinih žlezdi, koje su infiltrirane mononuklearnim ćelijama uključujući CD4+, CD8+ limfocite i B-ćelije (Jonsson et al., 2002). Pored toga, ekstraglandularne (sistemske) manifestacije su zabeležene kod jedne trećine pacijenata (Jonsson et al., 2001).

[0133] Kod drugih sistemskih autoimunih bolesti, kao što je RA, identifikovani su faktori kritični za ektopične germinalne centre (GCs). Pokazano je da reumatoidna sinovijalna tkiva sa GCs proizvode hemokine CXCL13, CCL21 i limfotoksin (LT)-β (detektovan na folikularnom centru i mantle zoni B ćelija). Multivarijantna regresiona analiza ovih analita identifikovala je CXCL13 i LT-β kao jedine citokine koji su prediktivni za GCs u reumatoidnom sinovitisu (Weyand and Goronzy, 2003). Nedavno pokazano je da CXCL13 i CXCR5 u pljuvačnim žlezdama imaju esencijalnu ulogu u inflamatornom procesu regrutacijom B i T ćelija, prema tome doprinoseći limfoidnoj neogenezi i ektopičnom formiranju GC u SS (Salomonsson et al., 2002).

M. Psorijaza

4

[0134] U nekim primerima izvođenja, RTA 408, polimorfni oblici i postupci ovog priloženi ovde mogu biti korišćeni za lečenje pacijenata sa psorijazom. Psorijaza je hronična bolest kože perutanja i inflamacije koja pogađa 2 do 2.6 procenata populacije SAD-a, ili između 5.8 i 7.5 miliona ljudi. Psorijaza se javlja kada se ćelije kože brzo podižu od njihovog porekla ispod površine kože i nagomilavaju se na površini pre nego što su imale šansu da sazreju. Obično ovo kretanje (takođe označeno kao tranzit) traje oko mesec dana, ali kod psorijaze tranzit može da se javi za samo nekoliko dana. U njegovom najtipičnijem obliku, psorijaza rezultira u pečatima debele, crvene (upaljene) kože pokrivene srebrnkastom peruti. Ovi pečati, koji su nekad označeni kao plakovi, obično svrbe ili bole. Plakovi se najčešće javljaju na laktovima, kolenima, drugim delovima nogu, skalpu, donjem delu leđa, licu, dlanovima i tabanima, ali mogu da se jave na koži bilo gde na telu. Bolest takođe može da pogodi nokte na rukama, nokte na nogama, i meka tkiva genitalija i unutar usta.

[0135] Psorijaza je poremećaj kože koji pokreće imuni sistem, naročito uključujući tip belih krvnih zrnaca pod nazivom T ćelije. Normalno, T ćelije pomažu u zaštiti tela protiv infekcije i bolesti. U slučaju psorijaze, T ćelije su stavljene u dejstvo greškom i postaju toliko aktivne da pokreću druge imune odgovore, što dovodi do inflamacije i brzog tranzita ćelija kože.

N. Infektivne bolesti

[0136] U nekim primerima izvođenja, RTA 408, polimorfni oblici, i postupci prema predmetnom opisu mogu biti korisni u lečenju infektivnih bolesti, uključujući virusne i bakterijske infekcije. Kao što je navedeno u prethodnom tekstu, takve infekcije mogu biti povezane sa teškim lokalizovanim ili sistemskim inflamatornim odgovorima. Na primer, grip može da izazove tešku inflamaciju pluća i bakterijska infekcija može da izazove sistemski hiperinflamatorni odgovor, uključujući prekomernu proizvodnju višestrukih inflamatornih citokina, što je oznaka sepse. Pored toga, jedinjenja priloženi ovde mogu biti korisna u direktnoj inhibiciji replikacije virusnih patogena. Prethodne studije su pokazale da srodna jedinjenja kao što je CDDO mogu da inhibiraju replikaciju HIV-a u makrofagama (Vazquez et al., 2005). Druge studije su pokazale da inhibicija NF-κB prenosa signala može da inhibira replikaciju virusa gripa, i da ciklopentenon prostaglandini mogu da inhibiraju replikaciju virusa (e.g., Mazur et al., 2007; Pica et al., 2000).

[0137] Ovde priloženo se odnosi na lečenje ili prevenciju svake od bolesti/poremećaja/stanja navedenih u prethodnom tekstu u delu IV upotrebom jedinjenja RTA 408 ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, ili polimorfnog oblika tog jedinjenja (kao što su, npr., bilo koji od polimorfnih oblika opisanih u prethodnom ili daljem tekstu), ili farmaceutske kompozicije koja sadrži bilo koji od gore navedenih entiteta i farmaceutski prihvatljiv nosač (uključujući, npr., farmaceutske kompozicije opisane u prethodnom tekstu).

V. Farmaceutske formulacije i putevi primene

[0138] RTA 408 može biti primenjivan u različitim postupcima, npr., oralno ili putem injekcije (npr., subkutane, inztravenske, intraperitonealne, itd.). U zavisnosti od puta primene, aktivna jedinjenja mogu biti obložena u materijalu tako da štite jedinjenje od delovanja kiselina i drugih prirodnih stanja koja mogu da inaktiviraju jedinjenje. Ona mogu takođe biti primenjivana kontinuiranom perfuzijom/infuzijom bolesti ili mesta rane.

[0139] Da bi se RTA 408 primenio drugim putem primene osim parenteralnog, može biti neophodno obložiti jedinjenje sa, ili ko-primeniti jedinjenje sa, materijalom za sprečavanje njegove inaktivacije. Na primer, terapeutsko jedinjenje može biti primenjivano na pacijenta u odgovarajućem nosaču, na primer, lipozomima ili razblaživaču. Farmaceutski prihvatljivi razblaživači obuhvataju fiziološki rastvor i vodene puferske rastvore. Lipozomi obuhvataju voda-u-ulju-u-vodi CGF emulzije kao i konvencionalne lipozome (Strejan et al., 1984).

[0140] RTA 408 takođe može biti primenjivan parenteralno, intraperitonealno, intraspinalno ili intracerebralno. Disperzije mogu biti pripremljene u glicerolu, tečnim polietilen glikolima i njihovim smešama i u uljima. Pod uobičajenim uslovima čuvanja i upotrebe, ovi preparati mogu da sadrže konzervans za sprečavanje rasta mikroorganizama.

[0141] Sterilni injektabilni rastvori mogu biti pripremljeni ugradnjom RTA 408 u potrebnu količinu u odgovarajućem rastvaraču sa jednim ili kombinacijom sastojaka nabrojanih u prethodnom tekstu, prema potrebi, nakon čega sledi filterska sterilizacija. Uopšteno, disperzije su pripremljene ugradnjom terapeutskog jedinjenja u sterilni nosač koji sadrži bazni disperzioni medijum i potrebne druge sastojke od onih navedenih u prethodnom tekstu. U slučaju sterilnih prahova za pripremu sterilnih injektabilnih rastvora, poželjni postupci pripreme su vakuumsko sušenje i sušenje zamrzavanjem, koje proizvodi prah aktivnog sastojka (tj., terapeutskog jedinjenja) plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz njegovog prethodno sterilno filtriranog rastvora.

[0142] RTA 408 može postati potpuno amorfan upotrebom postupka direktnog sušenja raspršivanjem. RTA 408 može biti oralno primenjivan, na primer, sa inertnim razblaživačem ili asimilabilnim nosačem. Terapeutsko jedinjenje i drugi sastojci mogu takođe biti uključeni u kapsulu sa tvrdim ili mekanim omotačem, presovani u tablete ili ugrađeni direktno u hranu pacijenta. Za oralnu terapeutsku primenu, terapeutsko jedinjenje može biti ugrađeno, na primer, sa ekscipijensima i korišćeno u obliku tableta, bukalnih tableta, lozengi, kapsula uključujući tvrde ili meke kapsule, eliksire, emulzije, čvrste disperzije, suspenzije, sirupe, vaferi koji se mogu gutati, i slično. Procenat terapeutskog jedinjenja u kompozicijama i preparatima može, naravno, biti variran. Količina terapeutskog jedinjenja u takvim terapeutski korisnim kompozicijama je takva da će biti dobijena pogodna doza.

[0143] Naročito je korisno formulisati parenteralne kompozicije u obliku jedinične doze za lakšu primenu i ujednačenost doze. Jedinični oblik doze kao što je ovde korišćen označava fizički posebne jedinice pogodne kao jedinične doze za pacijente koji se leče, pri čemu svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu terapeutskog jedinjenja izračunata da proizvodi željeni terapeutski efekat u vezi sa potrebnim farmaceutskim nosačem. Specifikacija za jedinične oblike doze za upotrebu prema pronalasku je diktirana

1

i direktno zavisna od (a) jedinstvenih karakteristika terapeutskog jedinjenja i određenog terapeutskog efekta koji se postiže, i (b) ograničenja svojstvenih tehnici pripreme jedinjenja kao što je terapeutsko jedinjenje za lečenje izabranog stanja kod pacijenta.

[0144] RTA 408 takođe može biti primenjivan topikalno na kožu, oko ili mukozu. U nekim primerima izvođenja, jedinjenje može biti pripremljeno u losionu, kremi, gelu, ulju, masti, melemu, rastvoru, suspenziji ili emulziji. Alternativno, ako je poželjna primena na pluća terapeutsko jedinjenje može biti primenjivano inhalacijom u formulaciji suvog praška ili aerosola.

[0145] RTA 408 će tipično biti primenjivano u terapeutski efikasnoj dozi koja je dovoljna za lečenje stanja povezanog sa datim pacijentom. Na primer, efikasnost jedinjenja može biti procenjivana u životinjskom model sistemu koji može biti prediktivan za efikasnost u lečenju bolesti kod ljudi, kao što su model sistemi prikazani u primerima i crtežima.

[0146] Stvarna količina doze RTA 408 ili kompozicije koja sadrži RTA 408 primenjena na pacijenta može biti određena fizičkim i fiziološkim faktorima, kao što su starost, pol, telesna težina, težina stanja, tip bolesti koja se leči, prethodne ili istovremene terapeutske intervencije, idiopatija pacijenta i put primene. Ovi faktori mogu biti određeni od strane iskusnog stručnjaka. Lekar odgovoran za primenu će tipično odrediti koncentraciju aktivnog sastojka (sastojaka) u kompoziciji i odgovarajuću dozu (doze) za pojedinačnog pacijenta. Doza može biti podešena od strane pojedinačnog lekara u slučaju bilo kakvih komplikacija.

[0147] Efikasna količina će tipično da vrira od oko 0.001 mg/kg do oko 1000 mg/kg, od oko 0.01 mg/kg do oko 750 mg/kg, od oko 100 mg/kg do oko 500 mg/kg, od oko 1.0 mg/kg do oko 250 mg/kg, od oko 10.0 mg/kg do oko 150 mg/kg u jednoj ili više primena dnevno, tokom jednog ili nekoliko dana (u zavisnosti od toka načina primene i faktora razmatranih u prethodnom tekstu). Drugi pogodni opsezi doza obuhvataju 1 mg do 10000 mg na dan, 100 mg do 10000 mg na dan, 500 mg do 10000 mg na dan i 500 mg do 1000 mg na dan. U nekim posebnim primerima izvođenja, količina je manja od 10,000 mg na dan sa opsegom od 750 mg do 9000 mg na dan.

[0148] Efikasna količina može biti manja od 1 mg/kg/dan, manja od 500 mg/kg/dan, manja od 250 mg/kg/dan, manja od 100 mg/kg/dan, manja od 50 mg/kg/dan, manja od 25 mg/kg/dan, ili manja od 10 mg/kg/dan. Aternativno može biti u opsegu od 1 mg/kg/dan do 200 mg/kg/dan. U nekim primerima izvođenja, količina bi mogla biti 10, 30, 100 ili 150 mg/kg formulisana kao suspenzija u susamovom ulju kao što je opisano u daljem tekstu u Primeru C1. U nekim primerima izvođenja, količina bi mogla biti 3, 10, 30 ili 100 mg/kg primenjena dnevno preko oralne gavaže kao što je opisano u daljem tekstu u Primerima C2 i C3. U nekim primerima izvođenja, količina bi mogla biti 10, 30 ili 100 mg/kg primenjena oralno kao što je opisano u daljem tekstu u Primeru C6. Na primer, u vezi sa lečenjem dijabetičkih pacijenata, jedinica doze može biti količina koja smanjuje glukozu u krvi za najmanje 40% u poređenju sa netretiranim pacijentom. U sledećem primeru izvođenja, jedinica doze je količina koja smanjuje glukozu u krvi do nivoa koji je 610% od nivoa glukoze u krvi ne-dijabetičkog pacijenta.

[0149] U drugim neograničavajućim primerima, doza može takođe da sadrži od oko 1 µg/kg telesne težine, oko 5 µg/kg telesne težine, oko 10 µg/kg telesne težine, oko 50 µg/kg telesne težine, oko 100

2

µg/kg telesne težine, oko 200 µg/kg telesne težine, oko 350 µg/kg telesne težine, oko 500 µg/kg telesne težine, oko 1 mg/kg telesne težine, oko 5 mg/kg telesne težine, oko 10 mg/kg telesne težine, oko 50 mg/kg telesne težine, oko 100 mg/kg telesne težine, oko 200 mg/kg telesne težine, oko 350 mg/kg telesne težine, oko 500 mg/kg telesne težine, do oko 1000 mg/kg telesne težine ili više po primeni, i bilo koji opseg koji se odavde može izvesti. U neograničavajućim primerima opsega koji se može izvesti od brojeva navedenih ovde, opseg od oko 5 mg/kg telesne težine do oko 100 mg/kg telesne težine, oko 5 µg/kg telesne težine do oko 500 mg/kg telesne težine, itd., može biti primenjen, na bazi brojeva opisanih u prethodnom tekstu.

[0150] U određenim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija prema predmetnom opisu može da sadrži, na primer, najmanje oko 0.01% RTA 408. U drugim primerima izvođenja, RTA 408 može da sadrži između oko 0.01% do oko 75% od težine jedinice, ili između oko 0.01% do oko 5%, na primer, i bilo koji opseg koji se odatle može izvesti. U nekim primerima izvođenja, RTA 408 može biti korišćen u formulaciji kao što je suspenzija u susamovom ulju od 0.01%, 0.1% ili 1% kao što je opisano u daljem tekstu u Primerima F i G. U nekim primerima izvođenja, RTA 408 može biti formulisan za topikalnu primenu na kožu ili oko, upotrebom farmaceutski pogodnog nosača ili suspenzije, emulzije, ili rastvora u koncentracijama u opsegu od oko 0.01% do 10%. U nekim primerima izvođenja koncentracija je u opsegu od oko 0.1% do oko 5%. Optimalna koncentracija može da varira u zavisnosti od ciljnog organa, specifične pripreme i stanja koje se leči.

[0151] Razmatrane su jedna ili višestruke doze sredstva koje sadrži RTA 408. Željeni vremenski intervali za primenu višestrukih doza mogu biti određeni od strane stručnjaka iz date oblasti tehnike upotrebom ne više od rutinskog eksperimentisanja. Na primer, na pacijente se mogu primenjivati dve doze dnevno u približno 12-časovnim intervalima. U nekim primerima izvođenja, sredstvo se primenjuje jednom dnevno. Sredstvo (sredstva) može biti primenjivano po rutinskom režimu. Kao što je ovde korišćen rutinski režim se odnosi na unapred određeni naznačeni vremenski period. Rutinski režim može da obuhvata vremenske periode koji su identični ili koji se razlikuju u dužini, sve dok je režim unapred određen. Na primer, rutinski režim može da obuhvata primenu dva puta na dan, svaki dan, svaka dva dana, svaka tri dana, svaka četiri dana, svakih pet dana, svakih šest dana, na nedeljnoj bazi, na mesečnoj bazi, ili bilo koji broj dana ili nedelja između. Alternativno, unapred određeni rutinski režim može da obuhvata primenu na bazi dva puta dnevno prve nedelje, nakon čega sledi na dnevnoj bazi nekoliko meseci, itd. U drugim primerima izvođenja sredstvo (sredstva) se može uzimati oralno i da vreme njegovog uzimanja jeste ili nije zavisno od unosa hrane. Na taj način, na primer, sredstvo može biti uzimano svakog jutra i/ili svako veče, bez obzira na to kada je pacijent jeo ili će jesti.

VI. Kombinovana terapija

[0152] Pored upotrebe kao monoterapija, RTA 408 i polimorfni oblici opisani ovde mogu takođe naći upotrebu u kombinovanim terapijama. Efikasna kombinovana terapija može biti postignuta sa jednom kompozicijom ili farmakološkom formulacijom koja obuhvata oba sredstva, ili sa dve posebne kompozicije ili formulacije, primenjena istovremeno, pri čemu jedna kompozicija obuhvata RTA 408 ili njegove polimorfne oblike, i druga obuhvata drugo sredstvo (sredstva). Drugi terapeutski modalitet može biti primenjivan pre, istovremeno sa ili posle primene RTA 408 ili njegovih polimorfnih oblika. Terapija upotrebom RTA 408 ili njegovih polimorfnih oblika može da prethodi ili da sledi primenu drugog sredstva (sredstava) pomoću intervala u opsegu od nekoliko minuta do nekoliko nedelja. U primerima izvođenja gde se drugo sredstvo i RTA 408 ili njegovi polimorfni oblici primenjuju posebno, generalno bi se osiguralo da značajan vremenski period nije protekao između vremena svake primene, tako da bi svako sredstvo još uvek bilo sposobno da ispolji povoljno kombinovani efekat. U takvim slučajevima, razmatrano je da bi se tipično primenjivao RTA 408 ili njegovi polimorfni oblici i drugo terapeutsko sredstvo unutar oko 12-24 časova međusobno i, poželjnije, unutar oko 6-12 časova međusobno, sa vremenskim odlaganjem pri čemu je oko 12 časova najpoželjnije. U nekim situacijama, može biti poželjno proširiti vremenski period za lečenje značajno, međutim, gde nekoliko dana (2, 3, 4, 5, 6 ili 7) do nekoliko nedelja (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8) prođe između odgovarajućih primena.

[0153] Takođe je moguće da će više od jedne primene RTA 408 ili njegovih polimorfnih oblika, ili drugog sredstva biti poželjno. S tim u vezi, mogu se koristiti različite kombinacije. Radi ilustracije, tamo gde je RTA 408 ili njegov polimorfni oblik je "A" i drugo sredstvo je "B", sledeće permutacije na bazi 3 i 4 ukupne primene su ilustrativne:

A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B B/A/A A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B B/B/B/A A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/A/B [0154] Druge kombinacije su slično razmatrane. Neograničavajući primeri farmakoloških sredstava koji se mogu koristiti obuhvataju bilo koje farmakološko sredstvo za koje je poznato da se koristi u lečenju kancera. U nekim primerima izvođenja, razmatrane su kombinacije RTA 408 ili njegovih polimorfnih oblika sa imunoterapijom koja ciljno deluje na kancer, genskom terapijom, radioterapijom, hemoterapeutskim sredstvom ili operacijom. Takođe je razmatrana kombinacija RTA 408 ili njegovih polimorfnih oblika sa više od jednog od gore navedenih postupaka uključujući više od jednog tipa specifične terapije. U nekim primerima izvođenja, imunoterapija mogu biti predstavljena drugim antitelima koja ciljno deluju na kancer kao što su, ali bez ograničenja na trastuzumab (Herceptin®), alemtuzumab (Campath®), bevacizumab (Avastin®), cetuksimab (Eribitux®), i panitumumab (Vectibix®) ili konjugovanim antitelima kao što su ibritumomab tiuksetan (Zevalin®), tositumomab (Bexxar®), brentuksimab vedotin (Adcetris®), ado-trastuzumab emtansin (Kadcyla™) ili denileukin dititoks (Ontak®). Pored toga, u nekim primerima izvođenja, RTA 408 ili njegovi polimorfni oblici su predviđeni za upotrebu u kombinovanim terapijama sa imunoterapijama na bazi dendritskih ćelija kao što je Sipuleucel-T (Provenge®) ili imunoterapije sa adoptivnim T-ćelijama.

[0155] Pored toga, razmatrano je da se RTA 408 ili njegovi polimorfni oblici koriste u kombinaciji sa hemoterapeutskim sredstvom kao što su, ali bez ograničenja na, antraciklini, taksani, metotreksat, mitoksantron, estramustin, doksorubicin, etoposid, vinblastin, karboplatin, vinorelbin, 5-fluorouracil, cisplatin, topotekan, ifosfamid, ciklofosfamid, epirubicin, gemcitabin, vinorelbin, irinotekan, etoposid, vinblastin, pemetreksed, melfalan, kapecitabin i oksaliplatin. U nekim primerima izvođenja, RTA 408 ili

4

njegovi polimorfni oblici su korišćeni u kombinaciji sa radijacionom terapijom uključujući, ali bez ograničenja na upotrebu jonizujućeg zračenja. U nekim primerima izvođenja, efekti terapeutskog sredstva protiv kancera su sinergistički pojačani preko primene sa RTA 408 i njegovih polimorfnih oblika. U nekim primerima izvođenja, kombinovane terapije koje su obuhvatale RTA 408 su korišćene za lečenje kancera, uključujući, na primer, kancer prostate. Videti, npr., Primer H u daljem tekstu.

[0156] U nekim primerima izvođenja, postupci mogu dalje da sadrže (1) dovođenje u dodir ćelije tumora sa jedinjenjem pre dovođenja u dodir ćelije tumora sa drugim hemoterapeutskim sredstvom, (2) dovođenje u dodir ćelije tumora sa drugim hemoterapeutskim sredstvom pre dovođenja u dodir ćelije tumora sa jedinjenjem, ili (3) dovođenje u dodir ćelije tumora sa jedinjenjem i drugim hemoterapeutskim sredstvom istovremeno. Drugo hemoterapeutsko sredstvo može, u određenim primerima izvođenja, biti antibiotsko, anti-inflamatorno, anti-neoplastično, anti-proliferativno, anti-virusno, imunomodulatorno ili imunosupresivno. U drugim primerima izvođenja, drugo hemoterapeutsko sredstvo može biti alkilujuće sredstvo, modulator receptora za androgen, disruptor citoskeleta, modulator receptora za estrogen, inhibitor histon-deacetilaze, inhibitor HMG-CoA reduktaze, inhibitor prenil-protein transferaze, modulator receptora za retinoid, inhibitor topoizomeraze ili inhibitor tirozin kinaze. U određenim primerima izvođenja, drugo hemoterapeutsko sredstvo je 5-azacitidin, 5-fluorouracil, 9-cis-retinoinska kiselina, aktinomicin D, alitretinoin, sve-trans-retinoinska kiselina, anamicin, aksitinib, belinostat, bevacizumab, beksaroten, bosutinib, busulfan, kapecitabin, karboplatin, karmustin, CD437, cediranib, cetuksimab, hlorambucil, cisplatin, ciklofosfamid, citarabin, dakarbazin, dasatinib, daunorubicin, decitabin, docetaksel, dolastatin-10, doksifluridin, doksorubicin, doksorubicin, epirubicin, erlotinib, etoposid, gefitinib, gemcitabin, gemtuzumab ozogamicin, heksametilmelamin, idarubicin, ifosfamid, imatinib, irinotekan, izotretinoin, iksabepilon, lapatinib, LBH589, lomustin, mehloretamin, melfalan, merkaptopurin, metotreksat, mitomicin, mitoksantron, MS-275, neratinib, nilotinib, nitrozourea, oksaliplatin, paklitaksel, plikamicin, prokarbazin, semaksanib, semustin, natrijum biturat, natrijum fenilacetat, streptozotocin, suberoilanilid hidroksaminska kiselina, sunitinib, tamoksifen, teniposid, tiopeta, tioguanin, topotekan, TRAIL, trastuzumab, tretinoin, trihostatin A, valproinska kiselina, valrubicin, vandetanib, vinblastin, vinkristin, vindezin ili vinorelbin.

[0157] Pored toga, razmatrane su kombinovane terapije za lečenje kardiovaskularne bolesti upotrebom RTA 408, polimorfnih oblika i farmaceutskih kompozicija prema predmentom opisu. Na primer, takvi postupci mogu dalje da sadrže primenu farmaceutski prihvatljive količine jednog ili više kardiovaskularnih lekova pored RTA 408, polimorfnih oblika i farmaceutskih kompozicija predmetnog opisa. Kardiovaskularni lek može biti, ali bez ograničenja, na primer, lek za snižavanje holesterola, antihiperlipidemijski, blokator kalcijumovih kanala, anti-hipertenziv, ili inhibitor HMG-CoA reduktaze. U nekim primerima izvođenja, neograničavajući primeri kardiovaskularnih lekova obuhvataju amlodipin, aspirin, ezetimib, felodipin, lacidipin, lerkanidipin, nikardipin, nifedipin, nimodipin, nisoldipin ili nitrendipin. U drugim primerima izvođenja, druge neograničavajući primeri kardiovaskularnih lekova obuhvataju atenolol, bucindolol, karvedilol, klonidin, doksazosin, indoramin, labetalol, metildopa, metoprolol, nadolol, oksprenolol, fenoksibenzamin, fentolamin, pindolol, prazosin, propranolol, terazosin, timolol ili tolazolin. U drugim primerima izvođenja, kardiovaskularni lek može biti, na primer, statin, kao što je atorvastatin, cerivastatin, fluvastatin, lovastatin, mevastatin, pitavastatin, pravastatin, rosuvastatin ili simvastatin.

VII. Primeri

[0158] Sledeći primeri su uključeni radi demonstracije poželjnih primera izvođenja prema pronalasku. Stručnjacima iz date oblasti tehnike bi trebalo da je jasno da tehnike opisane u primerima koji slede predstavljaju tehnike za koje je pronalazač otkrio da dobro funkcionišu u izvođenju pronalaska, i na taj način mogu se smatrati da čine poželjne načine za njegovo izvođenje.

A. Sinteza RTA 408 (63415)

[0159]

Reagensi i uslovi: (a) (PhO)2PON3(DPPA), Et3N, toluen, 0°C u trajanju od 5 min, zatim na sobnoj temp., ~94%; (b) benzen, 80°C u trajanju od 2 časa; (c) HCl, CH3CN, na sobnoj temp. u trajanju od 1 čas; (d) CH3CF2CO2H, DCC, DMAP, CH2Cl2, na sobnoj temperaturi preko noći, 73% iz RTA 401 (4 koraka).

[0160] Jedinjenje 1: U rastvor toluena (400 mL), RTA 401 (koji može biti pripremljen prema postupcima navedenim, na primer od strane Honda, et al., 1998; Honda et al., 2000b; Honda et al., 2002; Yates et al., 2007; i SAD patentima 6,326,507 i 6,974,801 (20.0 g, 40.6 mmol) i Et3N (17.0 mL, 122.0 mmol) su dodati u reaktor i hlađeni do 0°C uz mešanje. Difenil fosforil azid (DPPA) (13.2 mL, 61.0 mmol) je dodavan uz mešanje na 0°C tokom 5 min i smeša je kontinuirano mešana na sobnoj temperaturi preko noći (HPLC-MS provera pokazuje da nema preostalog RTA 401). Reakciona smeša je direktno punjena na kolonu silika gela i prečišćena hromatografijom na koloni (silka gel, 0% do 5% EtOAc u CH2Cl2) da bi se dobilo jedinjenje 1 (19.7 g, ∼94%, delimično prevedeno u jedinjenje 2) kao bela pena.

[0161] Jedinjenje 2: Jedinjenje 1 (19.7 g, ∼38.1 mmol) i benzen (250 mL) su dodati u reaktor i zagrevani do 80°C uz mešanje u trajanju od 2 časa (HPLC-MS provera pokazuje da nema preostalog jedinjenja 1).

Reakciona smeša je koncentrovana na sniženom pritisku da bi se dobilo sirovo jedinjenje 2 kao čvrsti ostatak, koji je korišćen za sledeći korak bez prečišćavanja.

[0162] Jedinjenje 3: Sirovo jedinjenje 2 (≤38.1 mmol) i CH3CN (200 mL) su dodati u reaktor i hlađeni do 0°C uz mešanje. HCl (12 N, 90 mL) je dodavan na 0°C tokom 1 min i smeša je kontinuirano mešana na sobnoj temperaturi u trajanju od 1 časa (HPLC-MS provera ne pokazuje preostalo jedinjenje 2). Reakciona smeša je hlađena do 0°C i dodat je 10% NaOH (∼500 mL) uz mešanje. Zatim, dodat je zasićeni NaHCO3(1 L) uz mešanje. Vodena faza je ekstrahovana pomoću EtOAc (2x500 mL). Kombinovana organska faza je isprana sa H2O (200 mL), zasićenim NaCl (200 mL), sušena preko Na2SO4, i koncentrovana da bi se dobilo sirovo jedinjenje 3 (16.62 g) kao svetlo žuta pena, koja je korišćena za sledeći korak bez prečišćavanja.

[0163] RTA 408: Sirovi amin 3 (16.62 g, 35.9 mmol), CH3CF2CO2H (4.7388 g, 43.1 mmol), i CH2Cl2(360 mL) su dodati u reaktor uz mešanje na sobnoj temperaturi. Zatim, dodati su dicikloheksilkarbodiimid (DCC) (11.129 g, 53.9 mmol) i 4-(dimetilamino)-piridin (DMAP) (1.65 g, 13.64 mmol) i smeša je kontinuirano mešana na sobnoj temperaturi preko noći (HPLC-MS provera ne pokazuje da je preostalo jedinjenje 3). Reakciona smeša je filtrirana da bi se uklonili čvrsti sporedni proizvodi i filtrat je direktno punjen na silika gel kolonu i prečišćen hromatografijom na koloni (silika gel, 0% do 20% EtOAc u heksanima) dva puta da bi se dobilo jedinjenje RTA 408 (16.347 g, 73% iz RTA 401 u 4 koraka) kao bela pena:<1>H NMR (400 MHz, CD3Cl) δ 8.04 (s, 1H), 6.00 (s, 1H), 5.94 (s, br, 1H), 3.01 (d, 1H, J = 4.8 Hz), 2.75-2.82 (m, 1H), 1.92-2.18 (m, 4H), 1.69-1.85 (m, 7H), 1.53-1.64 (m, 1H), 1.60 (s, 3H), 1.50 (s, 3H), 1.42 (s, 3H), 1.11-1.38 (m, 3H), 1.27 (s, 3H), 1.18 (s, 3H), 1.06 (s, 3H), 1.04 (s, 3H), 0.92 (s, 3H); m/z 555 (M+1).

B. Farmakodinamika

[0164] Rezime in vitro i in vivo studija da bi se procenili primarni farmakodinamički efekti RTA 408 je dat u daljem tekstu.

1. Efekti RTA 408 na Keap1-Nrf2 i NF-κB in Vitro

[0165] Inhibicija IFNγ-indukovane proizvodnje NO od strane AIMs je Nrf2-zavisna (Dinkova-Kostova, 2005). RAW264.7 mišji makrofagi su postavljeni u 96-komorne ploče u 30,000 ćelija/komorici u tri kopije u RPMI 1640 dopunjenom sa 0.5% FBS i inkubirani na 37°C sa 5% CO2. Sledećeg dana, ćelije su prethodno tretirane sa DMSO (nosač) ili RTA 408 u trajanju od 2 časa, nakon čega sledi tretman sa 20 ng/mL mišjeg IFNγ u trajanju od 24 časa. Nivoi nitrita (NO2-) u medijumu su mereni kao zamena za azot oksid upotrebom Griess Reagent System (cat # G2930, Promega), prema uputstvima proizvođača, s obzirom na to da je nitrit primaran, stabilan proizvod razlaganja NO. Ćelijska vijabilnost je procenjivana upotrebom WST-1 Cell Proliferation Reagent (cat # 11644807001, Roche Applied Science) prema uputstvima proizvođača. IC50vrednosti su određivane na bazi supresije IFNγ-indukovane proizvodnje azot monoksida normalizovane za ćelijsku vijabilnost. Tretman sa RTA 408 rezultirao je u supresiji IFNγindukovane proizvodnje NO na način zavisan od doze, sa srednjom IC50vrednošću od 3.8 ± 1.2 nM. Rezultati iz reprezentativnog eksprimenta su prikazani na SL. 1. Nađeno je da je IC50vrednost za RTA 40845%-65% niža od IC50vrednosti za jedinjenja 63170 (8 ± 3 nM), 63171 (6.9 ± 0.6 nM), 63179 (11 ± 2 nm), i 63189 (7 ± 2 nM).63170, 63171, 63179, i 63189 su jedinjenja formula:

2. Efekat RTA 408 na Nrf2 ciljne gene

[0166] RTA 408 je testiran u dve različite analize reporter luciferaze za procenu aktivacije ARE. Prva testirana reporter luciferaza je bila pod kontrolom jednog ARE poreklom od promotora humanog NQO1 gena, koji omogućava kvantitativnu procenu endogene aktivnosti Nrf2 transkripcionog faktora u kultivisanim sisarskim ćelijama. Ekspresija luciferaze svica iz plazmida NQO1-ARE reporter luciferaze je kontrolisana pomoću vezivanja Nrf2 za specifičnu pojačivačku sekvencu koja odgovara antioksidativnom elementu odgovora (ARE) koji je identifikovan u promotorskom regionu humanog gena za NADPH:hinon oksidoreduktazu 1 (NQO1) (Xie et al., 1995). Plazmid NQO1-ARE-reporter luciferaze je konstruisan inseriranjem humanog NQO1-ARE

CAGTCACAGTGACTCAGCAGAATCTG-3’) u pLuc-MCS vektor upotrebom HindIII/XhoI klonirajućih mesta (GenScript Corp., Piscataway, NJ). HuH-7 ćelijska linija humanog hepatoma, održavana u DMEM (Invitrogen) dopunjena sa 10% FBS i 100 U/mL (svaki) penicilina i streptomicina, prolazno je transficirana upotrebom lipofektamina 2000 (Invitrogen) sa plazmidom NQO1-ARE reporter luciferaze i pRL-TK plazmidom, koji konstitutivno eksprimira Renilla luciferazu i korišćen je kao interna kontrola za normalizaciju nivoa transfekcije. Posle trideset časova transfekcije, ćelije su tretirane sa RTA 408 u trajanju od 18 časova. Akivnost luciferaze svica i Renilla je analizirana pomoću analize Dual-Glo luciferaze (cat # E2920, Promega), i luminiscentni signal je meren na L-Max II luminometru (Molecular Devices). Aktivnost luciferaze svica je normalizovana prema aktivnosti Renilla, i izračunavana je višestruka indukcija u odnosu na kontrolu sa nosačem (DMSO) normalizovane aktivnosti svica. SL. 2a prikazuje indukciju aktivnosti luciferaze zavisnu od doze pomoću RTA 408 u ovoj ćelijskoj liniji. Vrednosti predstavljaju srednju vrednost tri nezavisna eksperimenta. Dvadeset procenata manje RTA 408 (12 nM) od 63189 (14.9 nM) je bilo potrebno za povećanje transkripcije iz NQO1 ARE u HuH-7 ćelijama 2-puta. Slično tome, 2.1-2.4-puta manje RTA 408 od 63170 (25.2 nM) i 63179 (29.1 nM), respektivno, je potrebno za smanjenje transkripcije iz NQO1 ARE u HuH-7 ćelijama za 2-puta.

[0167] Efekat RTA 408 na aktivaciju reporter luciferaze je takođe procenjivan u AREc32 reporter ćelijskoj liniji. Ova ćelijska linija je poreklom od ćelija MCF-7 humanog karcinoma dojke i stabilno je transficirana sa genom reporter luciferaze svica pod transkripcionom kontrolom osam kopija GSTA2 ARE sekvence pacova (Wang, et al., 2006). Posle tretmana sa RTA 408 u trajanju od 18 časova, aktivnost luciferaze svica je merena upotrebom ONE-Glo Luciferase Assay System (Promega, Catalog #E6110) prema uputstvima proizvođača. Odgovor zavisan od doze je zabeležen u AREc32 reporter ćelijskoj liniji (SL.2b). ∼2-struka indukcija aktivnosti luciferaze bila je očigledna posle tretmana sa 15.6 nM RTA 408 u oba, NQO1-ARE i GSTA2-ARE reporter sistemu analize. Posmatranjem rezultata iz studije aktivnosti GSTA2-ARE (AREc32) luciferaze, efekti 63415 (RTA 408) na indukciju GSTA2-ARE mogu direktno biti upoređivani sa onom od RTA 402, 63170, 63171, 63179 i 63189 zajedno sa studijama vijabilnosti WST1 (SL. 3a-f). U poređenju sa vrednostima RTA 402, 63415 je pokazao najbržu indukciju GSTA2-ARE-posredovane transkripcije pet jedinjenja za poređenje sa koncentracijom od 93 nM potrebnom da se dostigne 4-struka indukcija u analizi reporter luciferaze. Sva druga jedinjenja pokazala su sličnu indukciju samo sa mnogo višim koncentracijama, pri čemu je za 63170 potrebna koncentracija od 171 nM, za 63171 je potrebna koncentracija od 133 nM, za 63179 je potrebna koncentracija od 303 nM i za 63189 je potrebna koncentracija od 174 nM da bi se dobila 4-struka indukcija aktivnosti luciferaze. Ove vrednosti odgovaraju 1.86 (63415), 3.40 (63170), 2.65 (63171), 6.05 (63179) i 3.47 (63189) –strukom povećanju u količini aktivnog jedinjenja koja je potrebna u poređenju sa RTA 402 da bi dovelo do iste količine aktivnosti.

[0168] Takođe je pokazano da RTA 408 povećava nivoe transkripta poznatih Nrf2 ciljnih gena u HFL1 humanom fetusnom fibroblastu pluća i BEAS-2B humanim bronhijalnim epitelijalnim ćelijskim linijama. HFL1 ćelije su kultivisane u F-12K medijumu dopunjenom sa 10% fetusnim goveđim serumom i 1% penicilinom-streptomicinom. BEAS-2B ćelije su kultivisane u DMEM/F-12 medijumu dopunjenom sa 10% fetusnim goveđim serumom i 1% penicilinom-streptomicnom. Ćelije su postavljene u 6-komorne posude u gustini od 2.5 x 10<5>ćelija/komori. Sledećeg dana, ćelije su tretirane sa DMSO (nosač) ili RTA 408 (7.8, 15.6, 31.3, 62.5, ili 125 nM) u trajanju od 18 časova. Svaka komorica je primila istu količinu nosača. Posle tretmana, medijum je uklonjen i ćelije su sakupljene upotrebom RLT pufera (Qiagen). Lizati su homogenizovani upotrebom QIAShredder kolona (Qiagen, Catalog #79654) i RNK je izolovana upotrebom RNeasy Mini kompleta (Qiagen, Catalog #74104). Za reverznu tarnskripciju, RNK (1 µg) je spojen sa Oligo(dT)12-18prajmerom i H2O u krajnjoj zapremini od 23.25 µL. Smeša je zagrevana do 70°C u trajanju od 10 min i zatim postavljena na led. Master mešavina koja sadrži 8 µL 5X pufera prve grupe, 2 µL 1 mg/mL BSA, 2 µL 20 mM DTT, 4 µL 5 mM dNTP mešavine, 0.25 µL RNaseOUT™ i 0.5 µL Superscript® II reverzne transkriptaze je dodato u smešu RNK i inkubirano na 42°C u trajanju od 1 časa. Reakcija je inaktivirana zagrevanjem do 70°C u trajanju od 10 min. Reakciona smeša je razblažena 1:3 sa H2O pre upotrebe u qPCR. 2.5 µL razblažene reakcije reverzne transkripcije je spojena sa jednom grupom PCR prajmera (0.36 µM krajnja koncentracija), 2X iQ™ SYBR® Green Supermix (Bio-Rad, Catalog #170-8885) i H2O do krajnje zapremine od 20 µL Sekvence za PCR prajmere su kao što sledi: Glutamat-citein ligaza, modifikatorska podjedinica (GCLM), „forward“ prajmer 5’-GCTGTGGCTACTGCGGTATT-3’ (SEQ ID NO: 1) reverzni prajmer 5’-ATCTGCCTCAATGACACCAT-3’ (SEQ ID NO: 2); Hem oksigenaza-1 (HMOX1) „forward“ prajmer 5’-TCCGATGGGTCCTTACACTC-3’ (SEQ ID NO: 3), reverzni prajmer 5’-TAGGCTCCTTCCTCCTTTCC-3’ (SEQ ID NO: 4); NAD(P)H dehidrogenaza, hinon 1 (NQO1) „forward“ prajmer 5’- AAAACACTGCCCTCTTGTGG-3’ (SEQ ID NO: 5), reverzni prajmer 5’-GTGCCAGTCAGCATCTGGTA-3’ (SEQ ID NO: 6); ribozomalni protein S9 (RPS9) „forward“ prajmer 5’-GATGAGAAGGACCCCACGGCGTCTG-3’ (SEQ ID NO: 7), reverzni prajmer 5’-GAGACAATCCAGCAGCCCAGGAGGG-3’ (SEQ ID NO: 8); tioredoksin reduktaza 1 (TXNRD1) „forward“ prajmer 5’- ATTGCCACTGGTGAAAGACC-3’ (SEQ ID NO: 9), reverzni prajmer 5’-ACCAATTTTGTTGGCCATGT-3’ (SEQ ID NO: 10). Svi prajmeri su su prethodno testirani za specifičnost i efikasnost amplifikacije. cDNK je amplifikovana upotrebom sledećih uslova ciklusa: (95°C u trajanju od 3 min, 44 ciklusa od 95°C u trajanju od 30 sek., 60°C u trajanju od 15 sek., 72°C u trajanju od 15 sek., nakon čega je usledila kriva topljenja od 55°C do 95°C u povećanjima od 0.5°C). Relativna zastupljenost svakog Nrf2 ciljnog gena je određena upotrebom komparativnog CTpostupka (ΔΔCT). PCR reakcije su izvođene u trostrukim komoricama za svaki uzorak. Dva nezavisna eksperimenta su izvedena upotrebom uslova opisanih u prethodnom tekstu. Tretman HFL1 fibroblasta pluća sa RTA 408 u trajanju od 18 časova rezultirao je u povećanoj ekspresiji nekoliko Nrf2 ciljnih gena, uključujući NQO1, HMOX1, GCLM i TXNRD1, kao što je mereno pomoću kvantitativne PCR (SL. 4a-d). Za sve testirane gene, indukcija pomoću RTA 408 je zavisna od doze i očigledna na koncentracijama koje su niske kao 15.6 nM. Tretman BEAS-2B bronhijalnih epitelijalnih ćelija sa RTA 408 u trajanju od 18 časova je rezultirao u sličnom povećanju zavisnom od doze svih procenjivanih Nrf2 ciljnih gena (SL. 5a-d). RTA 408 je takođe povećao ekspresiju Nrf2 ciljnih gena u normalnim humanim mezangijalnim ćelijama (nHMC), mišjoj BV2 mikroglijalnoj ćelijskoj liniji i humanoj SH-SY5Y ćelijskoj liniji neuroblastoma u sličnim koncentracijama.

[0169] Nivoi proteina Nrf2 koji ciljno deluju na NQO1 i HMOX1 su mereni u SH-5Y5Y i BV-2 ćelijama pomoću Western blota posle tretmana sa RTA 408. SH-SY5Y ćelije su postavljene na ploču u 6-komorne ploče u gustini od 4 x 10<5>ćelija po komorici. BV-2 ćelije su postavljene u 6-komorne ploče u gustini od 2.5 x 10<4>ćelija po komorici. Dvadest i četiri (BV-2) ili 48 (SH-SY5Y) časova posle postavljanja na ploču, ćelije su tretirane sa RTA 408 u trajanju od 24 časova. Posle tretmana, ćelije su isprane dva puta sa hladnim PBS i sakupljene u puferu za lizu. Ćelije su ultrazvučno obrađene i ćelijski ostaci su razbistreni centrifugiranjem (10 min @ 18,000 rcf, Beckman Coulter, microfuge 18 centrifuga). Ukupan protein u supernatantu je kvantitativno određen upotrebom Bio-Rad proteinskog reagensa sa SA kao standardom. Iste količine ukupnog ćelijskog proteina su odvojene na SDS-PAGE, i proteini su prebačeni u nitroceluloznu membranu. Membrane su blokirane u trajanju od 1 časa u TBST (1 x TBS sa 0.1% Tween-20) koji sadrži 5% mleko, isprane 3 puta sa TBST, i inkubirane sa primarnim antitelima preko noći na 4°C. NQO1 antitelo je iz Abcam (#AB2346); HMOX1 (HO-1) antitelo je iz Santa Cruz (#sc-10789); aktinsko antitelo je iz Millipore (#MAB 1501). Posle ispiranja sa TBST, sekundarna antitela su dodata u BST 5% mleko za 1 čas na sobnoj temperaturi. Afinitetno prečišćena kozja anti-zečja ili anti-mišja IgG sekundarna antitela su iz Jackson ImmunoResearch (catalog #111-035-144 i #115-035-146, respektivno). Membrane su isprane u TBST, razvijene upotrebom ECL i izložene rentgenskom filmu. Tretman sa RTA 408 takođe je povećao nivoe proteina NQO1 u SH-SY5Y ćelijama na način zavisan od doze (SL. 6a). HMOX1 protein nije detektovan u SH-SY5Y ćelijama netretiranim ili tretiranim sa RTA 408. U BV2 ćelijama, tretman sa RTA 408 povećao je nivoe proteina NQO1 i HMOX1 u koncentracijama do 125 nM (SL. 6b). EC50vrednost za indukciju ekspresije Nrf2 proteina u SK-N-SH ćelijama pomoću RTA 408 (56.4 nM) bila je 45%-65% niža od EC50vrednosti za 63171 (122 nM), 63189 (102 nM) i 63179 (126 nM). Potrebna je ista količina 63170 (54.6 nM).

[0170] EC50je merena upotrebom analize western NQO1 u ćeliji gde su ćelije inkubirane sa jedinjenjem koje se procenjuje tri dana. Posle inkubacije sa jedinjenjem od interesa, ćelije su reagovale sa mišjim NQO1 antitelom i zatim sledećeg dana ćelije su reagovale sa IRDye-800CW-anti-mišjim IgG antitelom. Ciljni signali su vizuelizovani i zatim analizirani.

1

[0171] U skladu sa indukcijom Nrf2 ciljnih gena i odgovarajućim protenskim proizvodima, tretman RAW264.7 ćelija mišjih makrofaga u trajanju od 24 časa povećao je aktivnost NQO1 enzima na način zavisan od doze, sa povećanjima očiglednim na 7.8 nM (SL. 7). Aktivnost NQO1 enzima je merena pomoću modifikovane Prochaska analize (Prochaska and Santamaria, Anal Biochem. 169:328-336, 1988).

[0172] Uzeti zajedno, ovi podaci od višestrukih ćelijskih linija pokazuju da tretman sa RTA 408 povećava transkripcionu aktivnost kontrolisanu pomoću elemenata odgovora antioksidanta, povećava ekspresiju Nrf2 ciljnih gena i povećava aktivnost NQO1, proizvoda Nrf2 ciljnog gena.

3. Efekat RTA 408 na markere ćelijskog redoks kapaciteta

[0173] Glutation i NADPH su kritični faktori potrebni za održavanje ćelijskog redoks kapaciteta. Nekoliko gena su uključeni u sintezu glutationa (npr., GCLC i GLCM) i NADPH [npr., heksoza-6-fosfat dehidrogenaza (H6PD) i jabučni enzim 1 (ME1)] i pokazano je da su regulisani pomoću Nrf2 (Wu, 2011). Efekat RTA 408 tretmana na uklupne nivoe glutationa je procenjivan u mišjoj ćelijskoj liniji hepatocita AML-12 upotrebom GSH-Glo™ Glutathione Assay kompleta (Promega, Catalog #V6912) prema uputstvima proizvođača. Tretman AML-12 ćelija u trajanju od 24 časa sa RTA 408 povećanim ukupnim ćelijskim nivoima glutationa na način zavisan od doze (SL.8). Prikazani podaci su reprezentativni za dva nezavisna eksperimenta. Povećanje od >2-puta u ukupnom glutatuonu je zabeleženo na koncentracijama RTA 408 koje su niske kao 15.6 nM. EC50vrednost upotrebom RAW264.7 mišjeg modela za indukciju nivoa glutationa pomoću RTA 408 (9.9 nM) bila je 22%-57% niža od EC50vrednosti za 63170 (12.1 nM), 63171 (23.2 nM) i 63189 (16 nM).

[0174] Efekat RTA 408 tretmana na nivoe NADPH, kao što je meren pomoću apsorbance redoks-osetljive boje, WST-1 (Roche Applied Science, Catalog #11644807001), je procenjivan u HCT-116 ćelijama. WST-1 apsorbanca je uobičajeno korišćena za procenu ćelijske vijabilnosti merenjem glikolitičke proizvodnje NAD(P)H od strane vijabilnih ćelija. Prema tome, u situacijama gde se proizvodnja NADPH povećava u odsustvu bilo kakvog efekta na ćelijsku vijabilnost, apsorbanca WST-1 se takođe povećava (Berridge et al., 1996). Takođe je pokazano da su nekoliko ključnih gena uključenih u proizvodnju NADPH regulisani pomoću Nrf2 (Thimmulappa et al., 2002; Wu, et al., 2011). RTA 408 tretman u trajanju od 24 časa povećao je apsorbancu WST-1 na način zavisan od doze (SL. 9), što sugeriše da su nivoi NADPH povećani.

[0175] Efekat RTA 408 na ekspresiju gena koji je uključivao puteve sinteze NADPH takođe je procenjivan u ovoj studiji. HCT-116 ćelije su tretirane sa RTA 408 u trajanju od 24 časa, i nivoi iRNK od H6PD, fosfoglukonat dehidrogenaze (PGD), transketolaze (TKT) i ME1 su mereni upotrebom kvantitativnog PCR-a. HCT-116 ćelije su postavljene na ploču u 6-komorne posude u gustini od 3 x 10<5>ćelija/ komorici. Sledećeg dana, ćelije su tretirane sa DMSO (nosač), 10 nM RTA 408, ili 50 nM RTA 408 u trajanju od 24 časa. Svaka komorica je primila istu količinu nosača. Posle tretmana, medijum je uklonjen i ćelije su sakupljene upotrebom RLT pufera (Qiagen). Lizati su homogenizirani upotrebom

2

QIAShredder kolona (Qiagen, Catalog #79654) i RNK je izolovana upotrebom RNeasy Mini kompleta (Qiagen, Catalog #74104). Za reverznu transkripciju, RNK (1 µg) je kombinovana sa Oligo(dT)12-18 prajmerom i H2O u krajnjoj zapremini od 23.25 µL. Smeša je zagrevana do 70°C u trajanju od 10 min i zatim postavljena na led. Master mešavina koja sadrži 8 µL 5X pufera prve grupe, 2 µL 1 mg/mL BSA, 2 µL 20 mM DTT, 4 µL 5 mM dNTP mix, 0.25 µL RNaseOUT™ i 0.5 µL Superscript® II reverzne transkriptaze je dodato u RNK smešu i inkubirano na 42°C u trajanju od 1 časa. Reakcija je inaktivirana zagrevanjem do 70°C u trajanju od 10 min. Reakciona smeša je razblažena 1:3 sa H2O pre upotrebe u qPCR. 2.5 µL razblažene reakcije reverzne transkripcije je spojeno sa jednom grupom PCR prajmera (0.36 µM krajnja koncentracija), 2X iQ™ SYBR® Green Supermix (Bio-Rad, Catalog #170-8885) i H2O do krajnje zapremine od 20 µL. Sekvence za PCR prajmere su kao što sledi: ribozomalni protein S9 (RPS9) „forward“ prajmer 5’-GATGAGAAGGACCCCACGGCGTCTG-3’ (SEQ ID NO: 7), reverzni prajmer 5’-GAGACAATCCAGCAGCCCAGGAGGG-3’ (SEQ ID NO: 8); heksoza-6-fosfat dehidrogenaza (H6PD) „forward“ prajmer 5’-GAGGCCGTGTACACCAAGAT-3’ (SEQ ID NO: 11), reverzni prajmer 5’-AGCAGTGGGGTGAAAATACG-3’ (SEQ ID NO: 12), fosfoglukonat dehidrogenaza (PGD) „forward“ prajmer 5’-AAGGCACTCTACGCTTCCAA-3’ (SEQ ID NO: 13), reverzni prajmer 5’-AGGAGTCCTGGCAGTTTTCA-3’ (SEQ ID NO: 14), transketolaza (TKT) „forward“ prajmer 5’-CATCTCCGAGAGCAACATCA-3’ (SEQ ID NO: 15), reverzni prajmer 5’-TTGTATTGGCGGCTAGTTCC-3’ (SEQ ID NO: 16); jabučni enzim 1 (MF1) „forward“ prajmer 5’-TATATCCTGGCCAAGGCAAC-3’ (SEQ ID NO: 17) reverzni prajmer 5’-GGATAAAGCCGACCCTCTTC-3’ (SEQ ID NO: 18). Svi prajmeri su prethodno testirani za specifičnost i efikasnost amplifikacije. cDNK je amlifikovan upotrebom sledećih uslova ciklusa: (95°C u trajanju od 3 min, 44 ciklusa od 95°C u trajanju od 30 sek, 60°C u trajanju od 15 sek, 72°C u trajanju od 15 sek, nakon čega sledi kriva topljenja od 55°C do 95°C u uvećanjima od 0.5°C). Relativna zastupljenost svakog ciljnog gena je određivana upotrebom komparativnog CT postupka (ΔΔCT). PCR reakcije su izvođene u trostrukim komoricama za svaki uzorak. Dva nezavisna eksperimenta su izvedena upotrebom uslova opisanih u prethodnom tekstu. Tretman sa RTA 408 rezultirao je u povećanju zavisnom od doze u ekspresiji gena uključenih u sintezu NADPH (SL.10a-d).

[0176] Ukratko, tretman sa RTA 408 povećao je ukupne nivoe glutationa u AML-12 hepatocitima i povećao je apsorbancu WST-1, marker proizvodnje NADPH, u HCT-116 ćelijama. Ovo zapažanje je u korelaciji sa povećanjem u ekspresiji nekoliko ključnih gena koji kodiraju enzime uključene u sintezu NADPH.

4. Efekat RTA 408 na TNFα-indukovani NF-κB prenos signala

[0177] NF-κB je transkripcioni faktor koji ima centralnu ulogu u regulaciji mnogih imunih i inflamatornih odgovora. Pokazano je da RTA 402 i drugi AIMs inhibiraju pro-inflamatorni NF-κB prenos signala u različitim ćelijskim linijama (Shishodia, 2006; Ahmad, 2006; Yore, 2006). Upotrebom mišje NIH3T3/NF-κB-luc ćelijske linije (Panomics), ispitivani su efekti RTA 408 i jedinjenja 63171, 63179, 63170 i 63189 na NF-κB-Luc reporter. NIH3T3/NF-κB-luc ćelijska linija održava hromozomalnu integraciju reporter konstrukta luciferaze svica regulisanu sa osam kopija elementa odgovora NF-κB. Efekti ovih jedinjenja mogu biti kvantitativno određivani merenjem vrednosti NF-κB IC50. RTA 408 je pokazao 1.2 µM IC50, koji kada je normalizovan za vijabilnost je pokazao IC50od 1.4 µM. Ostala četiri jedinjenja su pokazala NIH3T3/NF-κB IC50vrednosti od 1.7, 0.2, 1.1 i 1.1 µM, koja kada su normalizovana za vijabilnost pokazala IC50vrednosti od 1.8, 0.6, 1.1 i 1.0 µM, respektivno. RTA 408 i njegovi efekti na NF-κB su prikazani na grafikonu kao funkcija doziranja i relativne višestruke promene kao što su WST1 i WST1/2 prikazani na SL. 11a & b. Efekat RTA 408 na TNFα-indukovani NF-κB prenos signala je procenjivan u HeLa/NF-κB-Luc ćelijama, humanoj ćelijskoj liniji cervikalnog adenokarcinoma koja je stabilno transficirana sa konstruktom reporter luciferaze pod kontrolom višestrukih NF-κB transkripcionih elemenata odgovora. HeLa/NF-κB-Luc ćelije su prethodno tretirane u trajanju od 1 časa sa RTA 408, nakom čega je usledio tretman sa TNF-α (10 ng/mL) u trajanju od dodatnih 5 časova. Posle tretmana, merena je luminescencija, i određivan je efekat prethodnog tretmana sa RTA 408 na aktivnost luciferaze indukovanu sa TNF-α. Prosečni rezultati i standardne devijacije iz tri nezavisna eksperimenta su prikazani na SL.12. RTA 408 je na način zavisan od doze inhibirao aktivaciju NF-κB indukovanu sa TNF-α sa IC50vrednošću od 517 ± 83 nM. Slični rezultati su zabeleženi u drugoj NF-κB reporter ćelijskoj liniji (A549/NF-κB-Luc) gde je RTA 408 inhibirao aktivaciju NF-κB indukovanu sa TNF-α sa IC50vrednošću od 627 nM (opseg 614-649 nM). RTA 408 je bio 1.6-1.8 puta efikasniji u redukciji ekspresije iz NF-κB promotor reporter u HeLa/NF-κB-Luc ćelijama od 63189 (854 nM) i 63170 (953 nM), respektivno. Dodatno eksprimentisanje sa humanim A549 ćelijskim linijama je pokazalo IC50za RTA 408 kao 1.7 µM i vrednost koja je normalizovana za vijabilnost do 1.7 µM. IC50od RTA 408 pokazala je sličnu aktivnost sa 63189, 63179, 63171 i 63170 koi su pokazali IC50vrednosti od 1.1, 1.4, 2.0 i 1.0, respekivno. Kada su te vrednosti bile normalizovane za vijabilnost, analiza je pokazala 1.2, 1.5, 2.1 i 1.1 µM IC50, respektivno. Višestruka promena za NF-κB kao funkcija koncentracije RTA 408 zajedno sa krivama WST1 i WST1/2 su predstavljeni na grafikonu i prikazani na SL.13a & b.

[0178] Efekat RTA 408 na TNF-α-indukovanu fosforilaciju IκBα, ključni korak u aktivaciji NF-κB puta, je takođe procenjivan u HeLa ćelijama. HeLa ćelije su prethodno tretirane sa RTA 408 u trajanju od 6 časova, a zatim tretmanom sa TNF-α (20 ng/mL) u trajanju od 5 min. Ukupni i fosforilovani nivoi IκBα su procenjivani pomoću Western blota. Primarna IκBα antitela su bila iz Santa-Cruz (sc-371), pIκBα antitela su bila iz Cell Signaling (9246), aktinska antitela su bila iz Millipore (MAB 1501). Peroksidazomkonjugovana afinitetno-čista kozja anti-zečja (IgG) i peroksidazom-konjugovana afinitetno-čista kozja anti-mišja IgG sekundarna antitela su kupljena iz Jackson ImmunoResearch. Proteinski blotovi su razvijeni upotrebom ECL, i izloženi rentgenskom filmu. U skladu sa rezultatima iz analize reporter luciferaze, RTA 408 je inhibirao TNF-α-indukovanu fosforilaciju IκBα na način zavisan od doze (SL.

14).

[0179] Takođe je pokazano da RTA 408 inhibira druge pro-inflamatorne puteve prenosa signala, kao što je IL-6-indukovani transduktor signala i transkripcioni aktivator 3 (STAT3) fosoforilacije i receptorni

4

aktivator osteoklastogeneze indukovane sa NF-κB ligandom (RANKL). U HeLa ćelijama, prethodni tretman sa 1 µM RTA 408 u trajanju od 6 časova je inhibirao fosforilaciju STAT3 indukovanu sa IL-6. STAT3 (124H6) i fosfo-STAT3 (Tyr705) monoklonska antitela su bila iz Cell Signaling Technology. Peroksidazom-konjugovana afinitetno-čista kozja anti-zečja IgG i peroksidazom-konjugovana afinitetnočista kozja anti-mišja IgG su bila iz Jackson ImmunoResearch. Osteoklastogeneza je proces diferencijacije od nekoliko koraka koji rezultira iz vezivanja RANKL za njegov receptor, RANK, na ćelijama hematopoetskog porekla. Ovo rezultira u aktivaciji NF-κB i MAPK, koji zauzvrat povećavaju transkripciju ciljnih gena specifičnih za osteoklast, uključujući tartrat-otpornu kiselu fosfatazu (TRAP). Efekat RTA 408 na osteoklastogenezu indukovanu sa RANKL je procenjivan u ćelijskoj liniji mišjih makrofaga RAW264.7. RAW 264.7 ćelije su postavljene na ploču u 24-komornoj ploči u gustini od 5,000 ćelija/komorici. Sledećeg dana, ćelije su tretirane sa RTA 408 u trajanju od 2 časa i zatim tretirane sa 50 ng/mL rekombinantnog mišjeg RANKL (R&D systems). Tretirane ćelije su inkubirane četiri dana da bi se omogućila diferencijacija u osteoklaste. Diferencijacija u osteoklaste je procenjena merenjem aktivnosti TRAP. Ukratko, 90 µL kondicioniranog medijuma ćelijske kulture je uklonjen iz svake test komorice i podeljeno u alikvote u trostruke komorice (30 µL/komorici) 96-komorne ploče.170 µL TRAP Assay pufera (Kamiya Biomedical) je zatim dodato u svaku komoricu i ploča je inkubirana na 37°C u trajanju od 3 časa. Posle inkubacije, apsorbanca na 540 nm je određena upotrebom Spectramax M2 spektrofotometra za očitavanje ploče. RTA 408 je na način zavisan od doze inhibirao TRAP aktivnost indukovanu sa RANKL i formiranje osteoklasta, sa IC50od ∼5-10 nM.

5. Efekat RTA 408 na ekspresiju gena koji kodiraju enzime transaminaze

[0180] Povećanje transaminaza je zabeleženo u 28-dnevnim studijama toksičnosti sa RTA 408 kod pacova i, i u mnogo nižem stepenu, kod majmuna. Slični nalazi su zabeleženi posle oralne primene srodnog AIM (bardoksolon metil) kod ljudi (Pergola, 2011). Jedna hipoteza za ovaj efekat je ta da AIMs direktno ili indirektno povećavaju ekspresiju gena za transaminazu u odsustvu ćelijske toksičnosti. Procena da li tretman sa RTA 408 utiče na nivoe iRNK transaminaze, mišji AML-12 hepatociti su tretirani sa RTA 408 u trajanju od 18 časova, i nivoi iRNK gena koji kodiraju transaminaze su mereni upotrebom kvantitativnog PCR-a. AML-12 ćelije su postavljene na ploču u 6-komornim posudama za kulturu u 3 x 10<5>ćelija po komorici upotrebom 2 mL medijuma po komorici. Sledećeg dana ćelije su tretirane sa DMSO (nosač) ili 250 nM i 500 nM RTA 408 u trajanju od 18 časova na 37°C. Svaka komorica je primila 0.1% DMSO. Izvedena su tri nezavisna ponavljajuća eksperimenta. Posle tretmana, medijum je uklonjen i ćelije su sakupljene upotrebom RLT pufera (Qiagen). Lizati su homogenizovani upotrebom QIAShredder kolona (Qiagen, Catalog #79654) i RNK je izolovana upotrebom RNeasy Mini kompleta (Qiagen, Catalog #74104). Za reverznu transkripciju, RNK (1 µg) je spojen sa Oligo(dT)12-18 prajmerom i H2O u krajnjoj zapremini od 23.25 µL. Smeša je zagrevana do 70°C u trajanju od 10 min i zatim postavljena da led. Master mešavina koja sadrži 8 µL 5X pufera prve grupe, 2 µL 1 mg/mL BSA, 2 µL 20 mM DTT, 4 µL 5 mM dNTP mix, 0.25 µL RNaseOUT™ i 0.5 µL Superscript® II reverzne transkriptaze je dodato u smešu RNK i inkubirano na 42°C u trajanju od 1 časa. Reakcija je inaktivirana zagrevanjem do 70°C u trajanju od 10 min. Reakciona smeša je razblažena 1:3 sa H2O pre upotrebe u qPCR. 2.5 µL razblažene reakcije reverzne transkripcije je spojeno sa jednom grupom PCR prajmera (0.36 µM krajnja koncentracija), 2X iQ™ SYBR® Green Supermix (Bio-Rad, Catalog #170-8885) i H2O do krajnje zapremine od 20 µL. Sekvence za PCR prajmere su kao što sledi: ribozomalni protein L19 (Rpl19) „forward“ prajmer 5’- TCAGGCTACAGAAGAGGCTTGC-3’ (SEQ ID NO: 19), reverzni prajmer 5’- ACAGTCACAGGCTTGCGGATG-3’ (SEQ ID NO: 20); NAD(P)H dehidrogenaza, hinon 1 (Nqo1) „forward“ prajmer 5’-TCGGGCTAGTCCCAGTTAGA-3’ (SEQ ID NO: 21), reverzni prajmer 5’-AAAGAGCTGGAGAGCCAACC-3’ (SEQ ID NO: 22); glutaminska piruvinska transaminaza 1 (Gpt1 ili Alt1) „forward“ prajmer 5’- CACGGAGCAGGTCTTCAACG-3’ (SEQ ID NO: 23), reverzni prajmer 5’-AGAATGGTCATCCGGAAATG-3’ (SEQ ID NO: 24); glutaminska piruvinska transaminaza 2 (Gpt2 ili Alt2) „forward“ prajmer 5’-CGCGGTGCAGGTCAACTACT-3’ (SEQ ID NO: 25), reverzni prajmer 5’-CCTCATCAGCCAGGAGAAAA-3’ (SEQ ID NO: 26); glutamat oksaloacetat transaminaza 1 (Got1 ili Ast1) „forward“ prajmer 5’- GGCTATTCGCTATTTTGTGT-3’ (SEQ ID NO: 27), reverzni prajmer 5’-GACCAGGTGATTCGTACAAT-3’ (SEQ ID NO: 28); Glutamat oksaloacetat transaminaza 2 (Got2 ili Ast2) „forward“ prajmer 5’-AGAGTCCTCTTCAGTCATTG-3’ (SEQ ID NO: 29), reverzni prajmer 5’-ATGATTAGAGCAGATGGTGG-3’ (SEQ ID NO: 30). Svi prajmeri su prethodno testirani za specifičnost i efikasnost amplifikacije. cDNK je amplifikovana upotrebom sledećih uslova ciklusa: (95°C u trajanju od 3 min, 44 ciklusa od 95°C u trajanju od 30 sek., 60°C za 15 sek., 72°C za 15 sek., nakon čega je usledila kriva topljenja od 55°C do 95°C u povećanjima od 0.5°C). Relativna zastupljenost svakog ciljnog gena je određena upotrebom komparativnog CT postupka (ΔΔCT). PCR reakcije su izvođene u trostrukim komoricama za svaki uzorak. Tretman sa RTA 408 povećao je nivoe iRNK alanin transaminaze 1 (Alt1 ili Gpt1) i aspartat transaminaze 1 (Ast1 ili Got1) (SL.15a, c). RTA 408 nije imao efekat na nivoe iRNK alanin transaminaze 2 (Alt2 ili Gpt2) i smanjo je nivoe iRNK aspartat transaminaze 2 (Ast2 ili Got2) (SL. 15b, d). Ovi rezultati pokazuju da RTA 408, u testiranim koncentracijama (250 nM ili 500 nM), utiče na ekspresiju gena za transaminazu in vitro.

6. Efekat RTA 408 na nivoe glikolitičkih intermedijera

[0181] Studije kod dijabetičkih miševa su pokazale da bardoksolon metil povećava mišićno-specifičan insulinom-stimulisani unos glukoze (Saha, 2010). Kod ljudi, prijavljen je veći procenat pacijenata koji primaju bardoksolon metil koji osećaju mišićne grčeve u poređenju sa pacijentima koji primaju placebo (Pergola, 2011). Mišićni spazmi su takođe objavljeni kod dijabetičkih pacijenata posle primene insulina, što sugeriše moguću vezu sa metabolizmom glukoze u mišiću. Efekat RTA 408 na glikolitički metabilizam je procenjivan preko procene nivoa laktata i piruvata u kultivisanim C2C12 mišićnim ćelijama glodara. Da bi se izmerili nivoi laktata, diferencirane C2C12 miotubule su tretirane sa 1 µM ili 2 µM RTA 408 ili insulina u trajanju od 3 časa na 37°C. Pufer je uklonjen i čuvan za merenje ekstracelularnih nivoa laktata. Ćelijski ostaci su peletirani centrifugiranjem (10 min na 14,000 rpm) pre merenja laktata. Da bi se izmerio intracelularni laktat, ćelije su suspendovane u 0.1% Triton X-100 u PBS i lizirane smicanjem sa iglom veličine 25. Ćelijski lizat je centrifuguran (10 min na 14,000 rpm, 4° C) i laktat je meren u supernatantu. Intracelularni i ekstracelularni laktat je meren upotrebom Lactate Assay Kit (BioVision, Catalog # K607-100). Slično tretmanu sa insulinom, tretman diferenciranih C2C12 miotubula sa 1 µM ili 2 µM RTA 408 u trajanju od 3 časa značajno je povećao intracelularne i ekstracelularne nivoe laktata na način zavisan od doze.

[0182] Da bi se izmerili nivoi piruvata, diferencirane C2C12 miotubule su tretirane sa 250 ili 500 nM RTA 408 ili 100 nM insulina u trajanju od 18 časova. Posle tretmana lekom, medijum je uklonjen i ćelije su isprane sa PBS. Ćelije su lizirane u Pyruvate Assay Buffer (Pyruvate Assay Kit, BioVision, Catalog # K609-100). Ćelijski lizati su centrifugirani (10 min na 14,000 rpm, 4°C) i nivoi piruvata su mereni u supernatantu. Tretman C2C12 diferenciranih miotubula sa 250 nM ili 500 nM RTA 408 u trajanju od 18 časova takođe je značajno (P < 0.0001, označeno zvezdicama) povećao intracelularne nivoe piruvata na način zavisan od doze (SL. 16). Zajedno, ovi rezultati pokazuju da RTA 408, u testiranim koncentracijama, može da utiče na mišićne glikolitičke intermedijere in vitro; međutim, nejasno je kako su rezultati iz ovog in vitro sistema u testiranim koncentracijama RTA 408 vezani za potencijalne efekte na metabolizam glukoze u klinički relevantnim nivoima doze kod ljudi.

7. In Vitro procena RTA 408 efluksa pomoću MRP-1

[0183] Jedna od karakteristika kandidata leka je odnos efluksa jedinjenja. Odnos efluksa meri kako lako se jedinjenje transportuje kroz membranu. MRP-1 protein, ili pomoćni protein 1 za otpornost na više lekova, je jedan od familije proteina koji pomažu u olakšavaju transporta organskih anjona i drugih malih molekula kroz ćelijske membrane. Veći efluksni odnos tipično znači da se lek kandidat brzo transportuje izvan membrane i manje je dostupan da modulira intracelularne procese. Slični proteini takođe regulišu transport jedinjenja kroz krvno-moždanu barijeru. Efluksni odnos MRP-1 za RTA 408 (1.3) je eksprimentalno određen kao približno deset puta niži od 63170 (10) i 63171 (11.2) i preko 40-puta niži od 63179 (56.5) i 63189 (57.1). Bez vezivanja za teoriju, RTA 408 možda neće biti dobar supstrat za MRP-1 i/ili kandiat za efluks posredovan preko p-glikoporoteina na krvno-moždanoj barijeri. U nekim primerima izvođenja, RTA 408 može biti korišćen za lečenje poremećaja centralnog nervnog sistema (CNS).

C. Zaštitni efekti RTA 408 u životinjskim modelima bolesti pluća

[0184] RTA 408 je testiran u nekoliko životinjskih modela bolesti pluća za procenu njegove potencijalne efikasnosti u plućima. Za sve studije, RTA 408 je oralno primenjivan jednom dnevno u susamovom ulju u nivoima doze u opsegu od 3 do 150 mg/kg. U većini slučajeva, RTA 408 je primenjen počevši nekoliko dana pre indukcije odgovora na povredu pluća.

1. LPS-indukovana plućna inflamacija kod miševa

[0185] RTA 408 je testiran u dve studije LPS-indukovane inflamacije pluća kod miševa. U prvoj studiji, namenjen za preliminarni pronalazač opsega doza, RTA 408 (30, 100 ili 150 mg/kg) je primenjivan oralno jednom dnevno tri dana, nakon čega sledi LPS primena 1 čas posle krajnje doze. Tečnost bronhoalveolarne lavaže (BALF) je sakupljena 20 časova posle LPS primene (21 čas posle krajnje doze RTA 408) i procenjivana za nivoe pro-inflamatornih markera (tj., IL-6, IL-12p40, TNF-α, i RANTES) upotrebom Luminex™ tehnologije. RTA 408 tretman je rezultirao u značajnoj redukciji u IL-12p40 na svim dozama i u TNF-α u dozama od 100 i 150 mg/kg (SL. 17). U drugoj studiji, RTA 408 (10, 30 ili 100 mg/kg) je primenjivan jednom dnevno šest dana, nakon čega je usledila LPS primena 1 čas posle krajnje doze. U ovoj studiji, značajna smanjenja u telesnoj težini su zabeležena na nivou doze od 100 mg/kg počevši na dan 3. Značajne redukcije u TNF-α su zabeležene u dozi od 10 mg/kg, i značajne redukcije u IL-12p40, TNF-α i RANTES su zabeležene u dozi od 30 mg/kg (SL.18a). Dodatna procena pluća iz miševa u ovoj studiji otkrila je značajno angažovanje relevantnih Nrf2 ciljnih gena, uključujući značajnu indukciju aktivnosti NQO1 enzima (merenjem stope redukcije 2,6-diholorfenol-indofenol) i povećava ukupno GSH (GSH-Glo™, Promega, Madison, WI) u 10 i 30 mg/kg (SL.18b).

2. Bleomicinom-indukovana plućna fibroza

[0186] Efekat RTA 408 je takođe procenjivan u modelima bleomicinom-indukovane plućne fibroze kod miševa i pacova. U prvoj preliminarnoj studiji, RTA 408 (10, 30 ili 100 mg/kg) je primenjivan na miševe jednom dnevno preko oralne gavaže u trajanju od 39 dana, sa izlaganjem bleomicinu (intranazalno) na dan 10. Poslednji dan doziranja, plućno tkivo je sakupljeno i histologija je izvedena da bi se procenio stepen inflamacije i intersticijalne fibroze. U ovom modelu, nisu zabeleženi statistički značajni efekti u testiranim dozama RTA 408 (SL. 19a & b). Dodatna procena je izvedena upotrebom modela plućne fibroze pacova koja je obimno okarakterisana u Lovelace Respiratory Research Institute. U ovoj studiji, pacovi su izlagani bleomicinu ili fiziološkom rastvoru pomoću intratrahealne primene na dan 0. Posle izlaganja, životinje su primale RTA 408 (3, 10 ili 30 mg/kg) jednom dnevno preko oralne gavaže u trajanju od 28 dana. Primena 30-mg/kg doze je zaustavljena na dan 14 kao posledica prekomerne dehidratacije i dijareje kod životinja. Za preostale životinje, tečnost bronhoalveolarne lavaže je sakupljana na dan 28 za procenu pro-inflamatornih infiltrata protočnom citometrijom, i plućno tkivo je analizirano za nivoe hidroksiprolina pomoću LC-MS i histopatologije. Izlaganje bleomicin sulfatu indukovalo je značajno oslabađanje neutrofila i povećanje u rastvorljivom kolagenu u BALF, kao i povećanju u hidroksiprolinu u plućima. Tretman sa 3 i 10 mg/kg RTA 408 značajno je suprimirao infiltraciju polimorfonuklearnih (PMN) ćelija u plućima i takođe je proizveo značajno smanjenje (∼10%-20%) u naslagama hidroksipropila (SL.20a & b).

[0187] Značajno, histopatološka procena je otkrila značajno smanjenje u naslagama kolagena, kao što je procenjeno pomoću trihromskog bojenja, kod pacova tretiranih sa RTA 408. Dok su kontrolne životinje izložene bleomicinu primarno su ispoljile umereno bojenje, životinje tretirane sa 10 mg/kg RTA 408 imale su pretežno minimalno do umereno bojenje (Tabela 2).

Tabela 2: Efekat RTA 408 na naslage kolagena u plućima pacova kao što je procenjeno preko intenziteta trihromskog bojenja

[0188] Dodatna procena pluća od pacova u ovoj studiji je takođe otkrila značajno angažovanje relevantnih Nrf2 ciljnih gena kao što je analizirano pomoću Quantigene Plex 2.0 Multiplex analize (Affymetrix, Santa Clara, CA) (SL. 21). RTA 408 je značajno i zavisno od doze povećao aktivnist enzima NQO1, Txnrd, Gsr i Gst u plućima pacova izloženih bleomicinu, što pokazuje aktivaciju Nrf2 pomoću RTA 408 u ovoj postavci bolesti. Aktivnost NQO1 enzima je procenjivana merenjem stope redukcije DCPIP. Aktivnosti Txnrd, Gst i Gst enzima su merene upotrebom komercijalno dostupnih kompleta iz Cayman Chemical (Ann Arbor, MI).

3. COPD indukovan dimom cigarete kod miševa

[0189] RTA 408 je takođe testiran u mišjem modelu COPD indukovanog dimom cigarete. Miševi su primili RTA 408 (3, 10 ili 30 mg/kg) jednom dnevno preko oralne gavaže tokom dve nedelje i izloženi su dimu cigarete pet dana nedeljno u toku peroda doziranja RTA 408. Na kraju studije, plućno tkivo i BALF su sakupljeni za analizu inflamatornih infiltrata i citokina. U ovom eksperimentu, više-dozna primena RTA 408 u dozama koje su niske kao 3 mg/kg RTA 408 rezultirala je u značajnoj supresiji proinflamatornih citokina, uključujuči KC (funkcionalni mišji homolog humanog IL-8) i TNF-α kao što je mereno upotrebom Luminex™ Technology. Rezime rezultata iz ove studije je predstavljen na SL.22a-e. AIM analog (63355) je testiran u istoj studiji za poređenje.63355 je jedinjenje formule:

[0190] Dodatna procena pluća iz miševa u ovoj studiji takođe je otkrila značajno angažovanje relevantnih Nrf2 ciljnih gena (SL. 23). Aktivnost NQO1 enzima u plućima, merena kao stopa redukcije DCPIP, je značajno smanjena preko izlaganja dimu cigarete; primena RTA 408 je smanjila ovaj gubitak. Aktivnost Txnrd enzima je takođe indukovana sa 30 mg/kg dozom RTA 408. Uopšteno aktivnost Gsr enzima nije promenjena, i aktivnost Gst enzima je smanjena sa tretmanom – od kojih oba verovatno imaju posledicu vremenskog odgovora za ove enzime. Aktivnosti Txnrd, Gst i Gst enzima su merene upotrebom komercijalno dostupnih kompleta iz Cayman Chemical (Ann Arbor, MI).

4. Ovalbuminom-indukovana astma kod miševa

[0191] Potencijalna aktivnost RTA 408 je takođe procenjivana u pilot studiji u mišjem modelu ovalbuminom-indukovane astme. Miševi su senzitizovani sa IP injekcijom ovalbumina i aluminijum hidroksida na dan 0 i dan 14 i intranazalno izloženi ovalbuminu u fiziološkom rastvoru na dane 14, 25, 26 i 27. Miševi su primali RTA 408 (3, 10 ili 30 mg/kg) jednom dnevno preko oralne gavaže na dane 1-13 i 15-27. Posle senzitizacije i izlaganja ovalbuminu, miševi tretirani nosačem imali su značajno povećanje u ukupnom broju leukocita u poređenju sa pozitivnom kontrolom (deksametazonom)-tretiranim miševima. Povećanje u broju T ćelija i B ćelija je takođe zabeleženo kod miševa tretiranih nosačem. Tretman sa RTA 408 na 30 mg/kg značajno je redukovao broj i procenat B ćelija unutar disajnih puteva. RTA 408 (3 i 30 mg/kg) takođe je značajno redukovao broj makrofaga, ali ne i srednji procenat makrofaga, detektovan u disajnim putevima. Ova zapažanja su sugestivna za potencijalnu efikasnost u ovom modelu.

5. Efekti RTA 408 na LPS-indukovanu sepsu kod miševa

[0192] Sepsa je indukovana na dan 0 sa IP injekcijom LPS (21 mg/kg), i preživljavanje je praćeno do dana 4. RTA 408 (10, 30 ili 100 mg/kg) je primenjivan jednom dnevno preko oralne gavaže od dana -2 do dana 2. U grupi koja je primala kontrolu u vidu nosača, 60% životinja je preživelo do dana 4 (više od ∼40% stopa preživljavanja očekivana u ovom modelu). U grupama tretiranim sa RTA 408, 80% životinja u grupi za dozu 10 mg/kg i 90% životinja u grupi za dozu 30 mg/kg je preživelo do dana 4 (SL. 24c & d). Za grupu doze 100 mg/kg, 90% životinja je preživelo do dana 4, sa samo jednim smrtnim slučajem koji se javio na dan 4. Iako su ovi efekti indukovani sa RTA 408 indikativni temeljen efikasnosti u ovom modelu, relativno visoka stopa preživljavanja u kontroloj grupi tretiranoj nosačem onemogućila je statistički-značajnu razliku između kontrolne grupe i grupa tretiranih sa RTA 408. Rezultati dobijeni upotrebom jedinjenja RTA 405 su takođe predstavljeni (SL.24a & b). RTA 405 je jedinjenje formule:

6. Efekti RTA 408 protiv zračenjem-indukovanog oralnog mukozitisa

[0193] Izlaganje akutnom zračenju usmerenom na obraznu kesu hrčaka proizvodi efekte slične onima zabeleženim kod oralnog ulceroznog mukozitisa kod ljudi. Ovi efekti obuhvataju umereni do teški mukozitis okarakterisan teškim eritemom i vazodilatacijom, erozijom površinske mukoze i formiranjem ulcera. Jedna studija je izvedena za procenu efekata RTA 408 u ovom modelu. Na dan 0, svaki hrčak je primao akutnu dozu zračenja od 40 Gy usmerenu na levu obraznu kesu. RTA 408 (10, 30 ili 100 mg/kg) je oralno primenjivan dva puta na dan od dana -5 do dana -1, i dana 1 do dana 15. Počevši od dana 6 i nastavljajući do dana 28 na naizmenične dane, oralni mukozitis je procenjivan upotrebom standardne skale za ocenjivanje od 6 tačaka. Obe doze od 30 i 100 mg/kg RTA 408 uzrokovale su značajnu redukciju u trajanju ulceroznog mukozitisa (SL. 25). Pored toga, takođe je zabeleženo smanjenje u procentu životinja sa ocenama mukozitisa ≥3 zavisno od doze. Međutim, primena RTA 408 u 30 ili 100 mg/kg uzrokovala je značajno smanjenje u dobitku u telesnoj težini zavisno od doze kod hrčaka koji su zračeni. Kao posledica gubitka u telesnoj težini višak od 20%, dva od ukupno osam hrčaka u grupi za dozu od 100 mg/kg su eutanazirani na dan 2.

7. Efekat RTA 408 na indukciju Nrf2 biomarkera in Vivo

[0194] Kao što je opisano u prethodnom tekstu, ključno molekularno ciljno mesto za RTA 408 je Nrf2, centralni transkripcioni regulator antioksidativne ćelijske zaštite. Aktivacija Nrf2 indukuje ushodnu regulaciju baterije citoprotektivnih gena, uključujući NQO1, enzima uključenih u sintezu GSH [tj., katalitičke i modifikatorske jedinice glutamat-cistein ligaze (Gclc i Gclm)], enzima uključenih u detoksifikaciju (tj., glutation S-transferaze [Gsts]), i efluksnih transportera [tj., proteina povezanih sa otpornošću na višestruke lekove (Mrps)]. Indukcija ovih gena rezultira u koordinisamom ćelijskom naporu za zaštitu protiv oksidativnog stresa, istaknutim povećanim antioksidativnim kapacitetom, indukcijom sinteze glutationa i konjugacijom i eksportom potencijalno štetnih molekula iz ćelije. Pored krajnjih tačaka efikasnosti i ekspresije Nrf2 ciljnog gena procenjenog u različitim životinjskim modelima koji su opisani u prethodnom tekstu, sposobnost RTA 408 da indukuje ekspresiju Nrf2 ciljnih gena je takođe procenjivana upotrebom tkiva sakupljenih iz zdravih miševa, pacova i majmuna tretiranih sa RTA 408.

1

[0195] Kao deo ne-GLP 14-dnevnih studija toksičnosti RTA 408 kod miševa, pacova i majmuna, tkiva su sakupljena za svrhe merenja iRNK i nivoa aktivnosti enzima izabranih Nrf2 ciljnih gena. Za miševe i pacove, uzorci jetre su sakupljeni 4 časa posle krajnje doze na dan 14. Za majmune, krv (za izolaciju PBMC), tkivo jetre, pluća i mozga su sakupljeni 24 časa posle krajnje doze na dan 14. Aktivnost doze za NQO1, Gst i glutation reduktaze (Gsr), kao što su opisani u prethodnom tekstu, su mereni u homogenatima tkiva. Nivoi iRNK su određeni upotrebom Quantigene Plex 2.0 tehnologije prema protokolu proizvođača, koji obuhvata analizu na bazi hibridizacije upotrebom xMAP® Luminex® magnetnih kuglica za direktno kvantitativno određivanje iRNK ciljnih mesta. Pored toga, koncentracije RTA 408 su merene u plazmi i tkivima pomoću LC/MS/MS postupaka na TQD masenom spektrometru (Waters, Milford, MA).

[0196] RTA 408 je generalno povećao ekspresiju različitih Nrf2 ciljnih gena na način zavisan od doze u dozama od 10, 30 i 100 mg/kg (SL. 26, SL.27a, SL.28a & b). Transkripciona ushodna regulacija Nrf2 ciljnih gena pomoću RTA 408 takođe je rezultirala u funkcionalnim povećanjima u antioksidativnom odgovoru, kao što je manifestovano preko povećanja zavisnih od doze u aktivnosti NQO1, Gst i Gsr enzima u jetri i plućima glodara, kao i jetri majmuna (SL. 29a & b, SL. 30a & b, SL. 31a & b). Pored toga, kod glodara, izlaganje jetre RTA 408 je u korelaciji sa nivoom aktivnosti enzima of NQO1, prototipski ciljni gen za Nrf2 (SL. 32b, SL. 33b). Kod majmuna, nivo ekspresije iRNK u PBMCs oba NQO1 i sulfiredoksin 1 (SRXN1) je u korelaciji sa izlaganjem plazme RTA 408 (SL.37a & b). Ukupno, RTA 408 je povećao nivoe iRNK i aktivnost Nrf2 ciljnih gena, i takva povećanja su generalno u korelaciji sa izlaganjem tkiva i plazme, što sugeriše da Nrf2 ciljni geni mogu da služe kao izvodljivi biomarkeri za aktivaciju Nrf2 (SL. 34a & b) i mogu biti korisni za procenu farmakološke aktivnosti RTA 408 kod zdravih humanih subjekata.

D. Bezbednosna farmakologija

[0197] GLP-kompatibilan program bezbednosne farmakologije je završen upotrebom RTA 408. Ovo je uključivalo in vitro i in vivo (majmun) studije na kardiovaskularnom sistemu, kao i studije na respiratornom sistemu i centralnom nervnom sistemu na pacovima.

1. Procena efekata RTA 408 na klonirane hERG kanale eksprimirane u HEK293 ćelijama

[0198] Ova studija je izvedena za procenu efekata RTA 408 na brzo aktivirajuću unutrašnju ispravljajuću kalijumovu struju (IKr) izvedenu pomoću hERG (humani gen za kalijumove kanale) kanala stabilno eksprimiranih u humanoj ćelijskoj liniji embrionalnog bubrega (HEK293). Efekti RTA 408 na hERG-srodnu kalijumovu struju su procenjivani upotrebom elektrofizioloških postupaka „patch claim“ cele ćelije. Određeno je da RTA 408 ima IC50vrednost od 12.4 µM u hERG QPatch_Kv11.1 analizi. Ova vrednost je bila 2.5-3 puta viša od vrednosti za 63170 (4.9 µM) i 63189 (3.8 µM), respektivno. RTA 408 IC50 vrednost je bila slična 63171 vrednosti (15.7 µM).

2

2. Kardiovaskularna procena RTA 408 kod makaki majmuna

[0199] Jedna studija je izvedena za procenu potencijalnih kardiovaskularnih efekata RTA 408 kod svesnih slobodno pokretnih makaki majmuna. Ista četiri mužjaka i četiri ženke makaki majmuna su primali nosač (susamovo ulje) i RTA 408 u nivoima doze od 10, 30 i 100 mg/kg prema dizajnu latinskih kvadrata, sa jednom životinjom/polu/tretmanu doziranom svake nedelje, nakon čega sledi period ispiranja od 14 dana između primena, sve dok svaka životinja nije primila sve tretmane. Nosač i RTA 408 su primenjivani na sve životinje preko oralne gavaže u zapremini doze od 5 mL/kg.

[0200] Životinje su instrumentirane telemetrijskim transmiterima za merenje telesne temperature, krvnog pritiska, pulsa i procene elektrokardiograma (ECG). Telesna temperatura, sistolni, dijastolni i srednji arterijski krvni pritisak, puls i parametri ECG (trajanje QRS i RR, PR i QT intervali) su praćeni kontinuirano od najmanje 2 časa pre doze do najmanje 24 časa posle doze. ECG tragovi su štampani na naznačenim vremenskim tačkama iz podataka kardiovaskularnog praćenja i kvantitativno su procenjivani od strane veterinarskog kardiologa sa sertifikatom. Pre prve primene u studiji, netretirane životinje su kontinuirano praćene za kardiovaskularne krajnje tačke tokom najmanje 24 časa, i ovi podaci su korišćeni u izračunavanju ispravnog QT intervala tokom studije.

[0201] Posmatranja za morbiditet, mortalitet, povredu i dostupnost hrane i vode su izvođena najmanje dva puta dnevno za sve životinje. Klinička posmatranja su izvedena pre-doze, približno 4 časa posle doze i posle završetka perioda kardiovaskularnog praćenja. Telesne težine su merene i beležene na dan pre svake primene tretmana.

[0202] RTA 408 u nivoima doze od 10, 30 i 100 mg/kg nije proizveo mortalitet, štetne kliničke znake niti je rezultirao u značajnim promena u telesnoj težini, telesnoj temperaturi, krvnom pritisku ili kvalitativnim ili kvantitativnim (PR, RR, QRS, QT intervali) ECG parametrima (SL. 35; Tabela 45). U grupi za dozu 100 mg/kg, zabeleženo je malo (1.6% u proseku), ali statistički značajno povećanje u ispravljenom QT intervalu; međutim, podaci za pojedinačne životinje nisu pokazali konzistentna povećanja u QTc koji bi ukazivali na efekat povezan sa test artiklom. Posledično, kao posledica male magnitude promene i nedostatka konzistentnog odgovora kod pojedinačnih životinja, ova mala povećanja u QTc nisu smatrana povezanim sa RTA 408 tretmanom. Prema tome, oralna primena RTA 408 nije proizvela efekte na kardiovaskularnu funkciju kod makaki majmuna u dozama do i uključujući 100 mg/kg.

3. Neurobihejvioralna procena RTA 408 kod pacova

[0203] Potencijalna akutna neurobihejvioralna toksičnost RTA 408 je procenjivana kod pacova. Tri grupe za tretman od 10 mužjaka i 10 ženki CD® [Crl:CD® (SD)] pacova su primali RTA 408 u nivoima doze od 3, 10 ili 30 mg/kg. Jedna dodatna grupa od 10 životinja/polu je služila kao kontrola i primila je nosač (susamovo ulje). Nosač ili RTA 408 je primenjen na sve grupe preko oralne gavaže jednom na dan 1 u zapremini doze od 10 mL/kg.

[0204] Posmatranja za morbiditet, mortalitet, povredu dostupnost hrane i vode su izvođeni dva puta na dan za sve životinje. Posmatranja za kliničke znake su izvedena pre doziranja na dan 1 i posle svake procene funkcionalne posmatrajuće baterije (FOB). Procene FOB su izvedene pre-doze (dan -1) i približno 4 i 24 časa posle doze. Telesne težine su merene i beležene pre-doze na dan 1.

[0205] RTA 408 u dozama od 3, 10 i 30 mg/kg nije proizveo mortalitet, štetna klinička zapažanja ili efekte bilo koje od testiranih neurobihejvioralnih mera. Mala smanjenja u dobitku na telesnoj težini su zabeležena približno 24 časa posle doziranja u grupi za 30 mg/kg koja bi potencijalno bila vezana za test artikal. U vezi sa osnovnim neurobihejvioralnim krajnjim tačkama procenjivanim u ovoj studiji, RTA 408 nije proizveo nikakve štetne efekte kod pacova u doazama do i uključujući 30 mg/kg.

4. Plućna procena RTA 408 kod pacova

[0206] Potencijalni efekat RTA 408 na funkciju pluća je procenjivan kod pacova. Tri grupe za tretman od osam mužjaka i osam ženki CD® [Crl:CD® (SD)] pacova su primale RTA 408 u nivoima doze od 3, 10 ili 30 mg/kg. Jedna dodatna grupa od 8 životinja/polu je služila kao kontrola i primala je nosač (susamovo ulje). Nosač ili RTA 408 je primenjen na sve grupe preko oralne gavaže jednom na dan 1 u zapremini doze od 10 mL/kg.

[0207] Posmatranja za mortalitet, morbiditet, povredu i dostupnost hrane i vode su izvedena dva puta na dan za sve životinje. Klinička posmatranja su izvedena pre doziranja, približno 4 časa posle doze, posle završetka 8-časovnog perioda praćenja pluća. Telesne težine su merene i beležene na dan primene RTA 408. Plućna funkcija (stopa respiracije, disajni volumen i minutni volumen) je praćena najmanje 1 čas pre doziranja da bi se ustanovila osnovna vrednost i najmanje 8 časova posle doze.

[0208] RTA 408 u dozama od 3, 10 i 30 mg/kg nije proizveo mortalitet, štetna klinička zapažanja ili efekte na bilo koji od procenjivanih plućnih parametara. Prema tome, u vezi sa osnovnim plućnim krajnjim tačkama procenjivanim u ovoj studiji, RTA 408 nije proizveo nikakve štetne efekte kod pacova u dozama do i uključujući 30 mg/kg.

E. Neklinički prikaz

1. Farmakokinetika

[0209] RTA 408 je ispitivan kako in vitro tako i in vivo da bi se procenila njegova PK i osobine metabolizma. In vitro studije su izvedene za određivanje vezivanja proteina plazme RTA 408 i deljenja krvi/plazme, inhibicije i indukcije citohroma P450 (CYP450), i za identifikaciju metabolita formiranih od strane mikrozoma jetre miševa, pacova, majmuna i ljudi. Podaci koji se odnose na in vivo apsorpciju i raspodelu posle ponovljene primene RTA 408 su dobijeni primarno preko praćenja nivoa leka u plazmi i izbora tkiva iz toksikoloških studija. Osetljivi i selektivni bioanalitički postupci na bazi tečne hromtografije-masene spektrometrije (LC/MS/MS) su korišćeni za merenje koncentracija RTA 408 u

4

plazmi, krvi, i tkivima sa odgovarajućom tačnošću i preciznošću. Merenja su izvedena na TQD i QToF masenim spektrometrima (Waters).

a. Apsorpcija

[0210] Apsorpcija i sistemsko farmakokinetičko ponašanje RTA 408 su ispitivani kod miševa, pacova i majmuna posle jedne i ponavljanih (dnevnih) oralnih primena. Posle oralne primene formulacije suspenzije u dozama od 10 do 100 mg/kg, zabeležene su maksimalne koncentracije u roku od 1 do 2 časa kod miševa, i u roku od 1 do 24 časa kod pacova i majmuna. Sistemsko izlaganje RTA 408 imalo je tendenciju da bude najviše kod pacova, sa nižim nivoima zabeleženim kod miševa i majmuna. Procene vidljivog terminalnog polu-života RTA 408 zabeleženog posle oralne primene su generalno bile u opsegu 6- do 26-časa, iako je vidljiva produžena faza apsorpcije u nekim slučajevima onemogućila izračunavanje definitivne procene polu-života.

[0211] Sistemsko izlaganja RTA 408 je generalno bilo slično kod mužjaka i ženki. Izlaganje RTA 408 posle ponovljene dnevne oralne primene imalo je tendenciju da je malo više puta) od izlaganja zabeleženog posle jedne doze. Primena RTA 408 u opsegu doza od 3 do 100 mg/kg u formulaciji suspenzije generalno je rezultirala u povećanjima u sistemskom izlaganju proporcionalnim sa dozom. Međutim, primena viših doza (100 do 800 mg/kg kod majmuna; 500 do 2000 mg/kg kod pacova) nije rezultirala u sličnim povećanjima u izlaganju, što sugeriše zsičenje apsorpcije u dozama iznad 100 mg/kg. Posle oralne primene neoptimizovane (retko punjena) formulacije kapsule RTA 408 (3 mg/kg) na majmune, sistemsko izlaganje sa normalizovanom dozom imalo je tendenciju da bude nešto niže nego ono zabeleženo sa formulacijom suspenzije.

[0212] Apsorpcija i sistemsko farmakokinetičko ponašanje RTA 408 je ispitivano kod pacova upotrebom jedne i ponavljalih topikalnih primena. Primena RTA 408 u opsegu od 0.01% do 3% pokazala je niže koncentracije u plazmi u odnosu na slično oralno doziranje. Sistemsko izlaganje RTA 408 generalno se povećalo na način zavisan od doze. Topikalna primena je formulisana kao suspenzija u susamovom ulju.

[0213] Upotrebom zečeva, procenjivani su okularna apsorpcija i sistemsko farmakokinetičko ponašanje RTA 408. RTA 408 je primenjivan topikalno na oko jednom na dan tokom pet dana. Okularna primena je pokazala nižu koncentraciju u plazmi RTA 408 u odnosu na to kada je RTA 408 primenjivan oralno (SL.36). Količina RTA 408 u plazmi čak posle pet uzastopnih dana pokazala je samo malu promenu u poređenju sa koncentracijom posle prve doze u odnosu na to kada je RTA 408 primenjivan oralno, gde su koncentracije u plazmi bile skoro 100-puta više (SL.36).

b. Raspodela

[0214] Protein plazme koji vezuje RTA 408 je procenjivan u plazmi miša, pacova, zeca, psa, mini svinje, majmuna i čoveka na koncentracijama RTA 408 od 10-2000 ng/mL upotrebom metodologije ultracentrifugiranja. RTA 408 je obimno vezan za proteine plazme. Vezivanje proteina plazme u nekliničkim vrstama bilo je u opsegu od 93% (miš) do >99% (mini svinja), sa vezivanjem od 95% u toksikološkim vrstama (pacov i majmun) i 97% kod čoveka. Nije bilo dokaza za vezivanje proteina zavisno od koncentracije ni u jednoj od testiranih vrsta. Rezultati iz eksperimenata deljenja krvi-premaplazmi ukazuju na to da RTA 408 ima tendenciju da se distribuira primarno u plazmi koja je frakcija krvi na linearan način, sa odnosima krvi:plazme <1.0 za sve vrste i sve testirane koncentracije.

[0215] Raspodela RTA 408 u tkivima je ispitivana posle oralne primenjen na miševe, pacove i majmune. U 14-dnevnim ne-GLP toksikološkim studijama, izabrana tkiva (jetra, pluća i mozak) su sakupljena u jednoj vremenskoj tački (4 časa iz pacova i miša; 24 časa za majmuna) pošto je krajnja doza studije primenjena i analizirana su za sadržaj RTA 408 upotrebom LC/MS/MS. RTA 408 se lako distribuira u pluća, jetru i mozak. U plućima, koncentracije RTA 408 na 4 časa kod miševa i pacova su slične ili malo više (<2-puta) od koncentracija u plazmi, dok na 24 časa kod majmuna, koncentracije RTA 408 u plućima bile su 6- do 16-puta više od koncentracija plazme. Sličan obrazac je zabeležen za mozak. Nasuprot tome, koncentracije RTA 408 u jetri su bile 5- do 17-puta više nego u plazmi za miševe i pacove na 4 časa, i 2-do 5-puta više nego u plazmi na 24 časa kod majmuna.

[0216] Farmakodinamički efekti RTA 408 u tkivima su procenjivani kod miševa, pacova i majmuna, praćenjem indukcije Nrf2 ciljnih gena u istim tkivima sakupljenim za izlaganje leku iz 14-dnevnih studija toksičnosti. Indukcija Nrf2 ciljnih gena sa RTA 408 rezultirala je u povećanjima u antioksidativnom odgovoru manifestovanom preko povećanja zavisnih od doze u aktivnosti enzima NQO1, glutaton S-transferaze (Gst) i glutation reduktaze (Gsr) u ispitivanim tkivima. Aktivnosti enzima su merene kao što je opisano u prethodnom tekstu. Pored toga, kod glodara, sadržaj RTA 408 u jetri je u korelaciji sa nivoom aktivnosti enzima za NQO1, prototipski ciljni gen za Nrf2. Kod majmuna, nivo ekspresije iRNKu mononuklearnim ćelijama periferne krvi (PBMCs) za oba NQO1 i sulfiredoksin 1 (SRXN1) je bio u korelaciji sa izlaganjem RTA 408 (SL. 37a & b). Ukupno, RTA 408 je indukovao biomarkere Nrf2 kod glodara i majmuna, i takve indukcije generalno su u dobroj korelaciji sa izlaganjem tkiva i plazme RTA 408.

[0217] Kada je RTA 408 primenjivan na zečeve preko okularne topikalne primene, najviše koncentracije jedinjenja su nađene u rožnjači, mrežnjači ili dužici, dok su staklasti humor, vodeni humor i plazma pokazali značajno niže koncentracije RTA 408 (SL.38).

c. Metabolizam

[0218] Metabolizam RTA 408 je ispitivan posle in vitro inkubacije RTA 408 u trajanju od 60 min sa mikrozomima jetre iz miševa, pacova, majmuna i ljudi u prisustvu sistema za regeneraciju nikotinamid adenin dinukleotid fosfata (NADPH) i reakcione smeše uridin difosfat glukuronoziltransferaze (UGT). Obiman metabolizam RTA 408 je zabeležen sa mikrozomima primata, sa <10% ishodnog molekula koji ostaje na kraju 60-min inkubacije u mikrozomima majmuna i čoveka. Nasuprot tome, mera metabolizma je niža u mikrozomima glodara, sa >65% ishodnog molekula koji ostaje na kraju inkubacije. Nedostatak dostupnih autentičnih standarda za različite potencijalne metabolite RTA 408 sprečio je kvantitativnu procenu zabeleženih metabolita. Iz kvalitativne perspektive, sličan obrazac RTA 408 metabolita je zabeležen u vrstama, i obuhvatao je pikove sa masama u skladu sa redukcijom i hidroksilacijom RTA 408 kao i glukuronidacijom RTA 408 ili njegovim redukcionim/hidroksilacionim metabolitima. Nisu zabeleženi jedinstveni humani metaboliti, pri čemu su svi pikovi u inkubacijama humanih mikrozoma takođe zabeleženi u jednoj ili više prekliničkih vrsta. Naročito, na bazi in vitro podataka mikrozoma, svi humani metaboliti su bili prisutni kod pacova ili majmuna, izabranog glodara i ne-glodarske vrste za ispitivanje toksičnosti.

d. Farmakokinetičke interakcije lekova

[0219] Potencijal za RTA 408 da inhibira metabolizam posredovan preko citohroma P450 (CYP450) je procenjivan upotrebom pulovanih mikrozoma humane jetre i standardnih supstrata za specifične CYP450 enzime. RTA 408 je direktno inhibirao CYP2C8 i CYP3A4/5 sa Kivrednostima od približno 0.5 µM za svaki enzim. Nije zabeležena smislena inhibicija za druge testirane enzime (CYP1A2, CYP2B6, CYP2C9, CYP2C19, ili CYP2D6), sa inhibicijom <50% na najvišoj testiranoj koncentraciji (3 µM). Pored toga, bilo je mala ili nije bilo dokaza inhibicije zavisne od metabolizma bilo kog od testiranih enzima. Buduće studije koje ispituju potencijal za CYP3A4/5-posredovane lek-lek interakcije mogu biti odobrene na osnovu ovih podataka, i potencijalno visoke koncentracije koje bi se mogle postići lokalno u gastrointestinalnom (GI) traktu posle oralne primene.

[0220] Potencijal za RTA 408 da indukuje ekspresiju CYP450 enzima je procenjivan upotrebom kultivisanih humanih hepatocita. Pod uslovima gde su prototipski induktori uzrokovali očekivana povećanja u aktivnosti CYP, RTA 408 (do 3 µM nije bio induktor aktivnosti enzima CYP1A2, CYP2B6, ili CYP3A4 u kultivisanim humanim hepatocitama. Aktivnost enzima je merena praćenjem konverzije preko supstrata, fenacetina, bupropiona i testosterona za CYP1A2, CYP2B6 i CYP3A4, respektivno, u izolovanim mikrozomima.

F. Efekti RTA 408 na dermatitis kod akutnog zračenja

[0221] Ispitivani su efekti RTA 408 kao topikalni ili oralni lek za preveciju dermatitia kod akutnog zračenja. Upotrebom mužjaka BALB/c miševa, doza zračenja od 30 Gy primenjena je na dan 0 (Tabela 3). Nosač – susamovo ulje ili RTA 408 je primenjen na pacove na dan -5 do -1 i dane 1 do 30. RTA 408 je primenjen kako oralno u 3, 10 i 30 mg/kg u susamovom ulju i topikalno u procentima kompozicije od 0.01%, 0.1% i 1% u susamovom ulju. Dermatitis je slepo procenjivan svakog drugog dana od dana 4 do dana 30. Na dan 12, zabeležen je tipičan pik dermatitisa i 4 miša su žrtvovana 4 časa posle primene doze. Preostali miševi su žrtvovani na dan 30, 4 časa posle doze. Plazma je sakupljana na dane 12 i 30 kao i uzorci zračene kože za ispitivanje iRNK i histološko ispitivanje.

Tabela 3: Dizajn studije za model dermatitisa kod akutnog zračenja

[0222] U test grupama gde su miševi tretirani sa RTA 408, incidenca dermatitisa izgleda da je malo smanjena u težini kada je RTA 408 davan bilo oralnom ili topikalnom primenom (SL.39-42). Pored toga, krive na grafikonu koje prikazuju prosečnu kliničku ocenu dermatitisa za test grupe kao funkciju vremena prikazuju izvesnu promenu sa primenom RTA 408 bilo u oralnom ili topikalnom obliku od netretiranih test grupa (SL. 43-45) naročito u slučaju gde je RTA 408 davan preko oralne primene. Pored toga, kao što se može videti u Tabelama 4 i 5 u daljem tekstu, procenat miševa koji pate od dermatitisa sa kliničkom ocenom iznad 3 je značajno bio niži za miševe tretirane sa RTA 408 preko oralne primene, dok je procenat miševa koji pate od dermatitisa sa kliničkom ocenom iznad 2 bio malo niži za test grupe koje su primale topikalnu primenu RTA 408.

kojan

etm itrlnika top an

dav je ajim

i kosa iti atm der du gle pre

omičk in 8 kl40 m T vo ho ži nji drusa 2 d na izu en

i ocalim u sji ko pi

gru

test po a

išev

tm na oce

4:Pra

abel

T Tabela 5: Procenat miševa po testirajućoj grupi koja je imala ocenu iznad 3 u njihovom kliničkom pregledu dermatitisa i kojima je davan oralni tretman koji sadrži RTA 408

G. Efekti RTA 408 na dermatitis kod frakcionisanog zračenja

[0223] Upotrebom RTA 408 preko topikalne primene, mereni su efekti RTA 408 ka poboljšanju efekata dermatitisa kod frakcionisanog zračenja. Upotrebom Balb/c miševa, RTA 408 u topikalnom preparatu je primenjen na miševe jednom dnevmo od dana -5 do dana 30 u tri doze u opsegu od 0.01% do 1%. Miševi su zračeni na dane 0-2 i 5-7 sa šest 10-Gy doza na dan. Kliničke ocene dermatitisa za miševe su procenjivane slepo svaka dva dana od dana 4 do kraja studije. Na SL.46, grafikon prikazuje promenu u prosečnoj kliničkoj oceni za svaku grupu kao funkcija vremena. Grafikon prikazuje statistički značajno poboljšanje u ocenama za, miševe tretirane sa 0.1% do 1% topikalnih formulacijama RTA 408. Parametri studije i tretmana mogu se naći u Tabeli 6.

Tabela 6: Uslovi studije za dermatitis indukovan frakcionisanim zračenjem

[0224] Analizom prosečnih kliničkih ocena koje su prikazane na SL. 46, izvedena je analiza površine ispod krive (AUC), koja je dala težinu dermatitisa u odnosu na to koliko dugo je dermatitis trajao. Ova analiza AUC je omogućila direktno poređenje između različitih grupa miševa i efekat tazličitih procenata kompozicije RTA 408 (SL.47 i Tabela 7). Primena topikalnih formulacija RTA 408 smanjila je lezije stadijuma 2 i stadijuma 3 od 60% i 33% kada su miševi izloženi samo nosaču do koncentracije 21% i 6% sa RTA 408 u koncentraciji 1%, respektivno. Druga kompozicija RTA je pokazala izvesnu aktivnost, ali nije bila značajna kao ona prikazana pomoću 1% formulacijom.

Tabela 7: Procenat ocene dermatitisa za svaku grupu tretmana

H. Sinergistički efekti RTA 408 i terapeutskih sredstava protiv kancera na rast tumora

[0225] Studija efekata RTA 408 korišćenog u kombinaciji sa tradicionalnim hemoterapeutskim sredstvima je izvedena radi određivanja efikasnosti potencijalnog tretmana. In vitro studije su izvedene radi određivanja efekata RTA 408 na dve različite ćelijske linije kancera prostate, LNCaP i DU-145. Kao što se može videti sa SL. 48a, tretman ćelijskih linija kancera prostate (LNCaP) in vitro sa 5-

1

fluorouracilom pokazuje statistički značajno povećanje u citotoksičnosti kada je kombinovan sa RTA 408 u dozama u opsegu od 0.125 do 0.5 µM. Upotrebom ćelijske linije prostate DU-145 i docetaksela, RTA 408 je amplifikovao citotoksičnost hemoterapeutskog sredstva na statistički značajan način za doziranje RTA 408 od 0.125 do 0.75 µM kao što je prikazano na SL.48b. Ovaj dokaz podržava koncept da bi RTA 408 mogao da deluje sinergistički sa terapeutskim sredstvima protiv kancera i može da se koristi u nekim primerima izvođenja za obezbeđivanje veće efikasnosti u lečenju pacijenata od kancera.

[0226] Posle uspešnih rezultata in vitro analize, pilot in vivo analiza je izvedena upotrebom LNCaP/C4-2B i DU145 humanog kancera prostate konstruisanog tako da eksprimiraju luciferazu svica (u daljem tekstu označeni kao C4-2B-Luc i DU145-Luc, respektivno). Treba naglasiti da obe ove ćelijske linije rastu na način nezavisan od androgena. Ćelije su kultivisane u RPMI 1640 dopunjenom sa 10% FBS. Ćelije su sakupljene upotrebom TrypLE Express (Invitrogen) i isprane u PBS i brojane. Ćelije su rekonstituisane u PBS da bi se došlo do krajnje koncentracije od 3 x 10<6>ćelija na 30 µL (osim ukoliko nije naznačeno drugačije) i podeljene u alikvote u posebne epruvete. Matrigel sa smanjenim faktorom rasta (BD Bioscience) je otopljen preko noći na 4°C i prebačen u epruvete u alikvote od 30 µL. Rastvori ćelija/Matrigel-a su prebačeni u vivarijum i mešani neposredno pre injekcije u odnosu od 1:1. svaki miš (n = 1 po grupi za ukupno tri životinje) je primio jednu subkutanu injekciju ćelija tumora. Tumori su prethodno ustanovljeni za 4 nedelje. Zatim, jedna životinja je tretirana sa RTA 408 (17.5 mg/kg, i.p.) jednom dnevno u trajanju od 3 dana (dani -3 do -1). Sledećeg dana (dan 0), životinje tretirane sa RTA 408 i jedna druga životinja su tretirani jednom dozom 18 Gy zračenja, lokalizovanog na karlični region gde su tumori implantirani. Miš koji je prethodno tretiran sa RTA 408 primio je tri dodatne doze RTA 408 (17.5 mg/kg, i.p.), jednu svakog drugog dana, tokom sledeće nedelje. Treća životinja nije primila tretman i služila je kao pozitivna kontrola. Napredovanje tumora je praćeno jednom nedeljno preko snimanja u živom stanju. Da bi se detektovale ćelije tumora koje eksprimiraju luciferazu, miševima je IP injektiran D-Luciferin 5 min pre snimanja prema protokolu proizvođača (Caliper LifeScience). Pre snimanja miševi su anestezirani inahalacijom izoflurana i snimani na IVIS Lumina XR sistemu (Caliper LifeScience). Za standardizaciju, minimalno vreme izlaganja neophodno za snimanje kontrolnog tumora je određeno i sve životinje su snimane pod ovim uslovima. Na dan 7, nije bila vidljiva redukcija u veličini tumora kod životinje tretirane zračenjem u poređenju sa kontrolom, dok je životinja koja prima oba RTA 408 i zračenje pokazala manju sliku tumora. Na dan 14 i dan 21, kontrolna životinja je pokazala kontinuirani razvoj tumora i rast, dok je životinja tretirana jonizujućem zračenjem pokazala izvesno poboljšanje, pre svega na dan 21. Sa druge strane, životinja tretirana sa RTA 408 i jonizujućim zračenjem nije pokazala napredovanje od dana 7 do dana 14 i nije imala vidljivi tumor na dan 21. Napredovanje tumora po nedelji se može videti na SL. 49 Oba, in vitro i in vivo podaci pokazuju da izgleda da RTA 408 dopunjava aktivnost različitih terapeutskih sredstava protiv kancera na taj način povećavaju efikasnost sredstva.

I. Efekti RTA 408 na model okularne inflamacije

2

[0227] Studija efekata RTA 408 na okularnu inflamaciju je izvedena upotrebom zečeva New Zealand albino soja. Zečevi su podeljeni u 5 grupa od 12 zečeva kojima su davane tri različite koncentracije RTA 408 (0.01%, 0.1% i 1%), Voltarene© collyre u 0.1% i nosač (susamovo ulje). Svakom zecu su date tri instalacije u roku od 60 min pre indukcije paracenteze i dve instalacije u roku od 30 min posle indukcije paracenteze. Svaka instalacija je bila 50 µL i data je u oba oka. Vodeni humor za 6 životinja po vremenskoj tački je sakupljan 30 min i ponovo 2 časa posle indukcije paracenteze. Količina inflamacije je određivana preko koncentracije proteina u vodenom humoru. Kao što je prikazano na SL. 50, RTA 408 je pokazao smanjenje u proteinu vodenog bhumora slično onome kod najviše koncentracije bilo kog od drugih referentnih jedinjenja (MaxiDex ili maprakorat) u samo 0.01% RTA 408 u formulaciji. Efekti rastuće koncentracije RTA 408 izgleda da su zanemarljivi jer izgleda da sve koncentracije RTA 408 pokazuju relativno slične efekte unutar greške u redukciji koncentracije proteina vodenog humora.

J. Skrining polimorfa

[0228] Studija pre-formulacije i polimorfizma je izvedena za jedinjenje 63415. Kao deo ove studije, preliminarni program polimorfizma je izveden sa ciljem da se identifikuje najpogodniji anhidrovani oblik na sobnoj temperaturi i mogući hidrati sa razumno visokom verovatnoćom. Izvedeno je ukupno 30 eksperimenata kristalizacije, uključujući ekvilibracije faze, eksperimente sušenja i druge tehnike. Sve dobijene čvrste supstance su okarakterisane pomoću FT-Raman spektroskopije. Svi novi oblici su okarakterisani pomoću PXRD i TG-FTIR, i izborno pomoću DSC i DVS.

[0229] Pored toga, amorfni oblik je pripremljen i okarakterisan. Nekoliko eksperimenata koji koriste različite tehnike i pristupe su izvedeni za pripremu amorfnog oblika. Amorfni oblik je okarakterisan pomoću FT-Raman spektroskopije, PXRD, TG-FTIR, DSC, DVS i Karl-Fischer titracije. Stabilnost amorfnog oblika je testirana na uslovima povišene vlažnosti i temperature tokom četiri nedelje.

1. Početni materijal i nomenklatura

[0230] Dve serije 63415 su korišćene kao početni materijal (Tabela 8). 63415 takođe je označen kao PP415 u ovom opisu. Svi uzorci koji su primani ili generisani u toku ovog projekta primili su jednistvenu identifikacionu šifru oblika PP415-Px, gde Px označava broj uzorka/eksperimenta (x = 1, 2, ..., n).

Tabela 8: Početni materijali

2. Jedinjenje 63415, serija # 0414-66-1 (PP415-P1): amorfni oblik

[0231] 63415; serija # 0414-66-1, početni materijal je okarakterisan pomoću FT-Raman spektroskopije, PXRD, TGFTIR, Karl-Fischer titracije,<1>H-NMR, DSC, DVS, i približnih merenja rastvorljivosti. Ovi rezulati su rezimirani u Tabeli 9.

Tabela 9: Karakterizacija 63415 početnog materijala (PP415-P1)

[0232] FT-Raman spektar (SL.58) biće korišćen kao referentni spektar za početni materijal. PXRD (SL.

59) ne pokazuje oštar obrazac pika. Široki halo na ∼10-20°2θ je karakterističan za amorfne materijale.

[0233] TG-FTIR termogram (SL.60) pokazuje postepeni gubitak ∼0.9 tež.-% EtOH (tj., ∼0.1 ekv.) sa tragovima H2O između 25 i 200°C. Razlaganje počinje na T > 290°C.

[0234] Sadržaj vode od 0.5 tež.-% je određen pomoću Karl-Fischer titracije.

[0235]<1>H-NMR spektar (SL. 61) je u skladu sa strukturom i pokazuje ∼0.08 ekv. EtOH, u skladu sa TG-FTIR termogramom.

[0236] DSC termogram (SL.62) prikazuje u prvom skeniranju pri zagrevanju stakleni prelaz amorfnog materijala na Tg= 152.7°C (ΔCp = 0.72 J/g°C). U drugom skeniranju posle gašenja hlađenjem, stakleni prelaz se javlja na Tg= 149.7°C (ΔCp = 0.45 J/g°C).

[0237] DVS izoterma (SL.63) prikazuje da se postepeni gubitak mase 1.0 tež.-% javio posle snižavaja relativne vlažnosti od 50% rel. vlaž. do 0% rel. vlaž.; ravnoteža je dostignuta na 0% rel. vlaž. usled povećanja relativne vlažnosti do 95% rel. vlaž. javio se postepeni dobitak mase od 2.1 tež.-% (u odnosu na masu na 0% rel. vlaž.); ravnoteža je dostignuta na 95% rel. vlaž. Usled snižavanja relativne vlažnosti od 95% rel. vlaž. do 50% rel. vlaž. krajnja masa je bila 0.2 tež.-% ispod početne mase. Povećanje mase od 0.4 tež.-% na 85% rel. vlaž. (u odnosu na početnu masu) klasifikuje uzorak kao slabo higroskopan.

4

[0238] FT-Raman spektar (SL. 64) i PXRD obrazac (SL. 65) uzorka posle DVS merenja su nepromenjeni u poređenju sa spektrom i obrascem uzorka pre merenja.

[0239] Približna rastvorljivost PP415-P1 početnog materijala je merena u dvanaest rastvarača i četiri smeše rastvarača na sobnoj temperaturi ručnim razblaživanjem kombinovanim sa vizuelnim posmatranjem (Tabela 10). Kao posledica eksperimentalne greške koja je svojstvena ovom postupku, vrednosti rastvorljivosti su određene tako da se smatraju grubim procenama i trebalo bi ih koristiti samo za dizajn eksperimenata kristalizacije. Sve smeše rastvarača su navedene kao odnosi prema zapremini (zapr./zapr.).

Tabela 10: Približna rastvorljivost PP415-P1 (amorfnog) početnog materijala

3. Jedinjenje 63415, serija # 2083-69-DC (PP415-P40): klasa 2

[0240] 63415, serija # 2083-69-DC, je heptanski solvat. Ovaj materijal (PP415-P40) je okarakterisan pomoću PXRD i nađeno je da odgovara klasi 2 (SL.66).

[0241] Klasa 2 verovatno odgovara izostrukturnim, ne-stehiometrijskim (<0.5 ekv.) solvatima (od heptana, cikloheksana, izopropil etra, 1-butanola, trietil amina i verovatno drugih rastvarača, kao što je heksan i drugi etri) sa čvrsto vezanim rastvaračem.

[0242] Mali pikovi vidljivi u obrascu PP415-P40 na 7.9°2θ i 13.8°2θ ne odgovaraju pikovima klasa 3, 4 ili 5. njihovo poreklo nije jasno u ovoj tački.

4. Hemijska stabilnost amorfnog oblika

[0243] Hemijska stabilnost amorfnog oblika je ispitivana u različitim rastvaračima tokom sedam dana.

[0244] Rastvori/suspenzije sa koncentracijom od 1 mg/mL su pripremljeni u četiri organska rastvarača (aceton, MeOH, MeCN, EtOAc) i tri vodena surfaktant medijuma (1% vodeni SDS, 1% vodeni Tween 80, 1% vodeni CTAB).

[0245] Četiri posebna rastvora/suspenzije su pripremljeni za svaki rastvarač, ekvilibrisana u trajanju od 6 h, 24 h, 2 d i 7 d i zatim analizirana pomoću HPLC.

[0246] Relativna površina-% dobijena iz HPLC hromatograma je data u Tabeli 11. Jedinjenje izgleda da je do izvesne mere nestabilno u razblaživaču (0.1% mravlja kiselina u MeCN); tokom sekvence (tj., unutar ∼24 časa) površine-% referentnog uzorka (PP415-P1, ispitivan na početku i na kraju sekvence) smanjene od 99.9% do 99.3% na 254 nm i od 99.9% do 99.5% na 242 nm. Kao posledica ovog efekta, uzorci mereni ka kraju sekvence (postavljeni po sledećem redosledu: 7 d, 2 d, 24 h, 6 h), bi mogli biti pogođeni i dobijena površina-% bi mogla biti potcenjena.

Tabela 11: Eksperimenti hemijske stabilnosti sa amorfnim oblikom 63415 (PP415-P1)<a>

[0247] Razlaganje ≥1% je zabeleženo za rastvore u MeCN posle sedam dana i za suspenzije u 1% vodenom Tween 80 medijumu (na svim vremenskim tačkama na 254 nm i posle 24 h, 2 d, i 7 d na 242 nm).

5. Stabilnost prilikom čuvanja amorfnog oblika

[0248] Da bi naučilo više o njegovim fundamentalnim osobinama i fizičkoj stabilnosti, amorfni oblik 63415 je podvrgnut stresnim uslovima prilikom čuvanja na povišenim temperaturama i relativnoj vlažnosti.

[0249] Uzorci amorfnog oblika (PP415-P1 početni materijal) su čuvani otvoreni na 25°C/∼62% rel. vlaž. (preko zasićenog vodenog rastvora NH4NO3) i 40°C/∼75% rel. vlaž. (preko zasićenog vodenog rastvora NaCl) i zatvoreni na 60°C i 80°C (Tabela 12). Na vremenskim tačkama 0 nedelja, 1 nedelja, 2 nedelje i 4 nedelje uzorci su ispitivani pomoću PXRD i upoređivani u odnosu na početni materijal, PP415-P1.

Tabela 12. Eksperimenti stabilnosti prilikom čuvanja sa amorfnim oblikom 63415 (PP415-P1)

[0250] Posle jedne nedelje (vremenska tačka 1 nedelja, SL.67), dve nedelje (vremenska tačka 2 nedelje, SL. 68), i četiri nedelje (vremenska tačka 4 nedelje, SL.69) sva četiri uzorka su još uvek bila amorfna, jer rentgenski difraktogrami praha ne pokazuju razlike u poređenju sa početnim matrijalom u vremenskoj tački 0 nedelja.

6. Eksperimenti kristalizacije i sušenja

a. Eksperimenti kristalizacije

[0251] Eksperimenti fazne ekvilibracije, kristalizacije iz vrelih rastvora, i isparavanja su izvedeni počevši od amorfnog oblika u cilju identifikacije sa razumno visokom verovatnoćom najstabilnijeg anhidrovanog oblika na sobnoj temperaturi i moguće hidrate. Svi dobijeni materijali su okarakterisani pomoću FT-Raman spektroskopije; izabrani uzorci su takođe okarakterisani pomoću PXRD.

[0252] FT-Raman spektri su grupisani u klase prema sličnosti položaja njihovih pikova. Originalni uzorak (PP415-P1, videti Tabelu 8) je klasifikovan zajedno sa proizvodima kristalizacije. Spektri unutar klase, međutim, nisu strogo identični, već slični. Male razlike i promene pika mogu da postoje. Uzimajući u obzir samo FT-Raman spektre, teško je odrediti da li spektri jedne klase pripadaju istom polimorfnom obliku.

[0253] Pikovi u PXRD obrascima su određeni i obrasci su zatim klasifikovani u klastere upotrebom PANalytical X’Pert (Highscore Plus) softvera. Ovi klasteri identifikuju obrasce visoke sličnosti. Međutim, male, ali značajne razlike postoje unutar klastera. Na taj način, obrasci unutar klastera ne moraju neophodno da odgovaraju istim polimorfima, već predstavljaju različite oblike sa veoma sličnim molekularnim strukturama. FT-Raman klase odgovaraju u svim slučajevima PXRD klasterima.

b. Eksperimenti ekvilibracije suspenzije

[0254] Eksperimenti ekvilibracije suspenzije su izvedeni u jednom rastvaraču i jedanaest smeša rastvarača (Tabela 13). Suspenzije od ∼100 mg PP415-P1 u 0.2-2.0 mL izabranih rastvarača su pripremljene i mućkane 4-15 dana na 22-24°C. Čvrste supstance su dobijene i okarakterisane pomoću FT-Raman spektroskopije; većina je takođe okarakterisana pomoću PXRD.

Tabela 13. Eksperimenti ekvilibracije suspenzije počevši od amorfnog oblika (PP415-P1)

c. Kristalizacije iz vrelih rastvora

[0255] Vreli rastvori PP415-P1 su pripremljeni u jednom rastvaraču i četiri smeše rastvarača (Tabela 14). Posle sporog hlađenja do 5°C na stopi od ∼0.2 K/min, taloženje je zabeleženo u tri slučaja (-P20, -P21, -P24). U dva slučaja (-P22, -P23) čvrsta supstanca se nije istaložila, čak posle čuvanja na 4-5°C u trajanju od dva dana. Ovde, rastvarač je isparavan pod protokom N2na sobnoj temperaturi. Čvrste supstance su dobijene i okarakterisane pomoću FT-Raman spektroskopije i za one sa spektrima različitim od amorfnog početnog materijala, FT-Raman klasa 1, takođe pomoću PXRD.

Tabela 14: Eksperimenti sporog hlađenja počevši od amorfnog oblika (PP415-P1)

d. Eksperimenti isparavanja/taloženja

[0256] Bistri rastvori PP415-P1 su pripremljeni u tri smeše rastvarača (Tabela 15). Rastvarači su zatim lagano isparavani na sobnoj temperaturi pod uslovima sredine. Međutim, u dva od tri eksperimenta (-P15 i -P17) bela čvrsta supstanca je istaložena pre početka isparavanja. Dobijene čvrste supstance su ispitivane pomoću FT-Raman spektroskopije i PXRD.

Tabela 15. Eksperimenti sporog isparavanja sa amorfnim oblikom (PP415-P1)

e. Eksperimenti sušenja.

[0257] Najmanje jedan uzorak svake klase je sušen pod vakuumom sa ciljem da se solvati desolvatiraju i da se dobiju ne-solvatirani kristalni oblici 63415 (Tabela 16). Osušeni materijali su okarakterisani dodatno pomoću FT-Raman, PXRD i TG-FTIR.

Tabela 16. Eksperimenti sušenja izvedeni na uzorcima dobijenim iz eksperimenata kristalizacije

7. Karakterizacija novih oblika (klasa)

a. Rezime novih klasa

[0258] Pored amorfnog oblika 63415, četiri nova kristalna oblika su dobijena u ovoj studiji (Tabela 17).

Tabela 17: Rezime dobijenih klasa

[0259] Klasa 2: Većina eksperimenata kristalizacije je rezultirala u čvrstom materijalu klase 2. Ovi uzorci verovatno odgovaraju izostrukturnim, ne-stehiometrijskim (<0.5 ekv.) solvatima (od heptana, cikloheksana, izopropil etra, 1-butanola, trietilamina i moguće heksana i drugih etara, itd.) sa čvrsto vezanim molekulima. Raman spektri i PXRD obrasci unutar ove klase su veoma slični međusobno, na taj način strukture bi mogle biti esencijalno identične sa samo malim razlikama kao posledica različitih rastvarača koji su ugrađeni.

[0260] Eksperimenti sušenja na uzorcima klase 2 nisu rezultovali u kristalnom, ne-solvatiranom obliku. Čak povišene temperature (80°C) i visoki vakuum (<1x10<-3>mbar) ne bi mogli da uklone čvrsto vezane molekule rastvarača potpuno; sadržaj rastvarača od >2 tež.-% uvek ostaje. Kristalinitet ovih uzoraka je smanjen, ali nije zabeležena ni transformacija u različitu strukturu niti značajna amorfizacija.

1

[0261] Klasa 3: Čvrsti materijal klase 3 je dobijen iz nekoliko eksperimenata kristalizacije. Uzorci klase 3 su verovatno izostrukturni solvati 2PrOH, EtOH, i verovatno acetona sa čvrsto vezanim molekulima rastvarača. Oni bi mogli da odgovaraju stehiometrijskim hemisolvatima ili ne-stehiometrijskim solvatima sa sadržajem rastvarača od ∼0.5 ekv. Kao sa klasom 2, Raman spektri i PXRD obrasci unutar ove klase su veoma slični međusobno, što ukazuje na slične strukture koje ugrađuju različite rastvarače.

[0262] Slično klasi 2, eksperimenti sušenja su takođe bili neuspešni. Veoma čvrsto vezani molekuli rastvarača bi mogli samo delimično da budu uklonjeni (∼5.4 tež.-% do ∼4.8 tež.-%, do 3 d na 1x10<-3>mbar i 80°C). PXRD obrazac je ostao nepromenjen.

[0263] Klasa 4: Materijal klase 4 je samo dobijen od 7:3 MeCN/H2O sistema rastvarača. On najverovatnije odgovara kristalnom acetonitril hemisolvatu.

[0264] Sušenjem (pod vakuumom ili protokom N2na povišenim temperaturama) većina rastvarača bi mogla biti uklonjena bez promene ili uništavanja kristalne strukture (PXRD je ostao nepromenjen). Na taj način, dobijen je kristalni, ne-solvatirani oblik (ili pre uništeni desolvatirani solvat). On je slabo higroskopan (dobitak mase od ∼0.7 tež.-% od 50% rel. vlaž. do 85% rel. vlaž.) i ima moguću tačku topljenja na 196.1°C (ΔH = 29.31 J/g).

[0265] Klasa 5: Klasa 5 je takođe dobijena od samo jednog sistema rastvarača (∼1:1 THF/H2O) i sadrži vezani THF (i možda H2O). Kako se sadržaj dve komponente ne može kvantitativno odrediti posebno, tačna priroda ovog kristalnog solvata ne može biti određena.

[0266] Sušenje klase 5 rezultovalo je kompletnoj desolvataciji i transformaciji u amorfni oblik (klasa 1). Jedan mogući postupak za pripremu amorfnog oblika od materijala klase 2 je transformacija klase 2 u klasu 5, nakon čega sledi sušenje i amorfizacija.

b. Klasa 1- amorfni oblik

[0267] Klasa 1, amorfni oblik 63415, je dobijen iz nekoliko eksperimenata kristalizacije (Tabela 18). Većina eksperimenata kristalizacije je rezultirala u kristalnom materijalu klasa 2, 3, 4 ili 5.

[0268] Početni materijal, PP415-P1, je amorfan i pripada klasi 1. Izvedeni su dodatni eksperimenti, isključivo usmereni ka pripremi amorfnog oblika (klasa 1).

Tabela 18. Eksperimenti kristalizacije koji rezultiraju u čvrstom materijalu klase 1

2

c. Klasa 2 – Izostrukturni solvati (npr., heptan)

[0269] Većina eksperimenata kristalizacije rezultirala je u čvrstom materijalu klase 2 (Tabela 19). Pored toga, jedna serija heptanskog rastvarača klase 2, PP415-P40, je korišćena kao početni materijal (videti Tabelu 8).

[0270] FT-Raman spektri klase 2 su jasno slični međusobno (SL.70), ali pokazuju male razlike. Oni se razlikuju značajno od spektra amorfnog početnog materijala, klase 1 (SL.71) i od spektra klasa 3, 4 i 5 (SL.72).

[0271] PXRD obrasci klase 2 (SL.73) potvrđuju kristalinitet materijala. Obrasci uzoraka su veoma slični međusobno, ali pokazuju male razlike (SL.74). Obrasci klase 2 se jasno razlikuju od obrazaca klasa 3,4 i 5 (SL.75).

[0272] TG-FTIR termogram uzorka PP415-P7 (SL.76) pokazuje gubitak ∼7.5 tež.-% EtOAc i hepatana u dva koraka od ∼100°C do 290°C i razlaganja na temperaturama T > 290°C. Pre TG-FTIR eksperimenata, uzorci su kratko sušeni (u trajanju od ∼5 min) pod vakuumom (10-20 mbar) da bi se uklonio višak, nevezani rastvarač. Gubitak oba EtOAc i heptana javio se zajedno u istom temperaturnom opsegu; oba rastvarača izgleda da su čvrsto vezana unutar strukture. Teorijski sadržaj EtOAc (t.k. = 76°C) hemisolvata je 7.4 tež.-%, teorijski sadržaj heptana (t.k. = 98°C) hemisolvata je 8.3 tež.-%. Nažalost, sadržaj dve komponente ne može biti kvantitativno određen posebno.

[0273] TG-FTIR termogram uzorka PP415-P21 (SL.77) pokazuje gubitak ∼5.8 tež.-% cikloheksana, u dva koraka od ∼140°C do ∼250°C i razlaganje na temperaturama T > 250°C. Sa tačkom ključanja cikloheksana na 81°C, rastvarač izgleda čvrsto vezan unutar strukture. Teorijski sadržaj cikloheksana hemisolvata je 7.1 tež.-%. Na taj način, uzorak PP415-P18 moguće odgovara nesterehiometrijskom cikloheksan solvatu (sa <0.5 ekv. sadržaja rastvarača).

[0274] TG-FTIR termogram uzorka PP415-P24 (SL. 78) pokazuje gubitak ∼16.6 tež.-% 1BuOH u koraku od ∼50°C do ∼160°C, dodatni gubitak 1BuOH (6.6 tež.-%) u drugom koraku od 160°C do 230°C i razlaganje na temperaturama T > 230°C. Sa tačkom ključanja od 1BuOH na 117°C, rastvarač najmanje drugog koraka izgleda čvrsto vezan unutar strukture. Teorijski sadržaj 1BuOH hemisolvata je 6.3 tež.-%.

[0275] TG-FTIR termogram uzorka PP415-P29 (SL. 79) pokazuje gubitak ∼5.1 tež.-% EtOAc i TEA od ∼50°C ili do ∼220°C, najveći deo u koraku od 180°C do 210°C. Razlaganje se javlja na temperaturama T > 220°C. Gubitak oba EtOAc i TEA javlja se zajedno u istom temperaturnom opsegu; oba rastvarača izgleda da su čvrsto vezana unutar strukture (sa tačkom ključanja EtOAc na 77°C i tačkom ključanja TEA na 89°C).

[0276] TG-FTIR termogram uzorka PP415-P47 (SL.80) pokazuje tipičan gubitak mase u dva koraka za klasu 2 (ukupnio ∼7.9 tež.-% EtOAc) na temperaturama do 240°C, što ukazuje na veoma čvrsto vezane molekule rastvarača.

[0277] TG-FTIR termogram uzorka PP415-P48 (SL.81) pokazuje gubitak mase ∼3.5 tež.-% etil formata i vode, prvo postepeno i zatim u jasnom koraku između 180°C i 200°C. Može postojati dodatni gubitak etil formata istovremeno sa razlaganjem na T > 240°C.

[0278] Na taj način, uzorci klase 2 bi mogli svi da odgovaraju ne-stehiometrijskim (<0.5 ekv.), izostrukturnim solvatima sa čvrsto vezanim molekulima rastvarača. Kako su Raman, spektri i PXRD obrasci unutar ove klase veoma slični međusobno, strukture bi mogle biti esencijalno identične međusobno sa samo malim promenama u dimenzijama jedinične ćelije ili malim promenama atomskih položaja unutar jedinične ćelije, kao posledica različitih veličina i oblika ugrađenih molekula rastvarača.

Tabela 19: Eksperimenti kristalizacije koji rezultiraju u čvrstom materijalu klase 2

d. Eksperimenti sušenja na uzorcima klase 2

[0279] Nekoliko uzoraka klase 2 su sušeni pod vakuumom (i neki na povišenim temperaturama) i u pokušaju da se desolvatiraju sa ciljem da se dobije anhidrovani oblik 63415. Detalji i karakterizacija osušenih uzoraka su obezbeđeni u daljem tekstu u Tabeli 20.

[0280] Međutim, čak sušenje od tri dana na 80°C i vakuumu <1x10<-3>mbar nije moglo da potpuno ukloni čvrsto vezane molekule rastvarača; sadržaj rastvarača od >2 tež.-% ostao je (videti uzorke -P32 i -P34).

4

PXRD obrasci pokazuju sniženi kristalinitet ovih uzoraka, ali nije zabeležena transformacija u različitu strukturu.

Tabela 20. Eksperimenti sušenja na uzorcima klase 2

[0281] Na taj način, solvati klase 2 izgleda da imaju veoma čvrsto vezane molekule rastvarača. Oni se teško desolvatiraju ili transformišu/amorfizuju.

e. PP415-P7 →→ PP415-P30

[0282] Čvrsti materijal uzorka PP415-P7, klase 2, dobijen iz eksperimenta ekvilibracije suspenzije u 1:2 EtOAc/heptanu je sušen (kao PP415-P30) pod vakuumom nekoliko dana (1-10 mbar, 50-70°C).

[0283] FT-Raman spektar željenog materijala klase 2 (PP415-P30) pokazuje male razlike od originalnog spektra (uzorak PP415-P7, SL.82), ali još uvek odgovara klasi 2.

[0284] PXRD obrazac osušenog materijala klase 2 (PP415-P30) pokazuje malo šire, manje intenzivne pikove (SL.83), ali još uvek odgovara klasi 2.

[0285] TG-FTIR termogram željenog uzorka PP415-P30 (SL.84) pokazuje gubitak ∼2.5 tež.-% heptana (i nešto EtOAc) u dva koraka od ∼50°C do ∼250°C i razlaganje na temperaturama T > 250°C. U poređenju sa TG-FTIR uzorka PP415-P7 (SL. 76), zabeležena su dva koraka gubitka rastvarača, ali ukupna količina rastvarača u uzorku je smanjena od ∼7.5 tež.-% u PP415-P7 do ∼2.5 tež.-% u PP415-P30.

[0286] Na taj način, pokušaj da se desolvatira ovaj solvat na povišenim temperaturama (50-70°C) i vakuumu od 1-10 mbar) uzrokovao je samo delimični gubitak rastvarača.

f. PP415-P15 → → PP415-P18

[0287] Čvrsti materijal uzorka PP415-P 15, klase 2, dobijen iz eksperimenta taloženja u 1:2 DCM/IPE je sušen (kao PP415-P18) pod vakuumom mbar) na sobnoj temperaturi u trajanju od ∼2 h.

[0288] FT-Raman spektar PP415-P18 je identičan spektru uzorka PP415-P15 (SL.85), oba odgovaraju klasi 2.

[0289] PXRD obrazac PP415-P18 pokazuje male razlike sa obrascem PP415-P15 (SL.86). PP415-P18 još uvek odgovara klasi 2.

[0290] TG-FTIR termogram (SL.87) pokazuje gubitak od ∼7.0 tež.-% IPE u dva koraka od ∼140°C do ∼250°C i razlaganje na temperaturama T > 250°C. Sa tačkom ključanja IPE koja je 67°C, rastvarač izgleda da je čvrsto vezan unutar strukture. Teorijski sadržaj IPE hemisolvata je 8.4 tež.-%.

[0291] Nažalost, nije zabeležen TG-FTIR materijala pre koraka sušenja. Međutim, kako rastvarač izgleda tako čvrsto vezan u strukturu i nisu zebeležene (ili su zabeležene samo male) promene u FT-Raman spektrima i PXRD obrascima, pretpostavlja se da sušenje nije imalo značajan efekat na strukturu ili sadržaj rastvarača.

g. PP41 S-P17 → PP415-P19 →PP415-P32

[0292] Čvrsti materijal uzorka PP415-P17, klase 2, dobijen iz eksperimenta taloženja u 1:3 EtOAc/heptana je sušen (kao PP415-P19) pod vakuumom mbar) na sobnoj temperaturi u trajanju od ∼2 h.

[0293] FT-Raman spektar PP415-P19 je identičan spektru uzorka PP415-P 17 (SL. 88); ne mogu se zabeležiti promene, i oba odgovaraju klasi 2.

[0294] PXRD obrazac PP415-P19 se malo razlikuje od obrasca PP415-P17 (SL. 89), ali još uvek odgovara klasi 2.

[0295] TG-FTIR termogram (SL.90) pokazuje gubitak od ∼7.6 tež.-% heptana u dva koraka od ∼140°C do ∼270°C i razlaganje na temperaturama T > 270°C. Sa tačkom ključanja heptana koja je 98°C, rastvarač izgleda čvrsto vezan u strukturi. Teorijski sadržaj heptana hemisolvata je 8.3 tež.-%.

[0296] Dodatni eksperiment sušenja (80°C, <1x1<-3>mbar, 3 dana) je izveden na istom uzorku kao PP415-P32.

[0297] FT-Raman spektar je ostao nepromenjen (SL.88). PXRD obrazac još uvek odgovara klasi 2 (SL.

89), ali uzorak je manje kristalan (jer su pikovi bili širi i imali su niži odnos S/N).

[0298] TG-FTIR termogram (SL. 90) pokazuje gubitak ∼2.2 tež.-% heptana, najveći deo u koraku od 170°C do 200°C i razlaganje na temperaturama T > 250°C.

[0299] Na taj način, sadržaj heptana je bio smanjen samo od 7.6 tež.-% do 2.2 tež.%, potvrđujući čvrsto vezivanje molekula rastvarača.

h. PP415-P21 → PP415-P28 → PP415-P34

[0300] Čvrsti materijal uzorka PP415-P21, klase 2, dobijen iz eksperimenta sporog hlađenja u ∼1:5 EtOH/cikloheksanu je sušen (kao PP415-P28) pod vakuumom nekoliko dana (2-20 mbar, sobna temperatura do 60°C).

[0301] FT-Raman spektar osušenog materijala klase 2 (PP415-P28) pokazuje male razlike u odnosu na spektar klase 2 (uzorak PP415-P21, SL.92), ali još uvek odgovara klasi 2.

[0302] PXRD obrazac osušenog materijala klase 2 (PP415-P28) pokazuje šire, manje intenzivne pikove u poređenju sa obrascem PP415-P21 (SL: 93), što ukazuje na to da je osušeni uzorak manje kristalan. Međutim, obrazac još uvek odgovara klasi 2.

[0303] TG-FTIR termogram osušenog uzorka PP415-P28 (SL. 94) pokazuje gubitak ∼3.0 tež.-% cikloheksana u dva koraka od ∼140°C do ∼250°C i razlaganje na temperaturama T > 250°C. U poređenju sa TG-FTIR uzorka PP415-P21 (SL. 77), dva uzorka gubitka rastvarača su očuvana, ali ukupna količina rastvarača u uzorku je smanjena od ∼5.8 tež.-% u PP415-P21 do ∼3.0 tež.-% u PP415-P28.

[0304] Na taj način, desolvatacija ovog solvata izgleda da je uzrokovala samo delimični gubitak rastvarača, paralelno delimičnom gubitku kristalnosti.

[0305] Dodatno sušenje ovog uzorka (na 80°C, <1 x10<-3>mbar, 3 dana) je izvedeno kao PP415-P34.

[0306] T-Raman spektar je ostao nepromenjen (SL. 92). PXRD obrazac još uvek je odgovarao klasi 2 (SL.93), ali je uzorak bio manje kristalan (jer su pikovi bili širi i imali su niži odnos S/N).

[0307] TG-FTIR termogram (SL.95) pokazuje gubitak ∼2.3 tež.-% cikloheksana, u dva koraka od 25°C do 270°C i razlaganje na temperaturama T>270°C.

[0308] Na taj način, sadržaj cikloheksana je smanjen samo od 3.0 tež.% do 2.3 tež.-% što potvrđuje čvrsto vezivanje molekula rastvarača.

i. Klasa 3- Izostrukturni solvati (npr., etanol)

[0309] Nekoliko eksperimenata kristalizacije rezultovali su u čvrstom materijalu klase 3 i okarakterisani su pomoću FT-Raman spektroskopije, PXRD i TG-FTIR (Tabela 21).

[0310] FT-Raman spektri klase 3 su jasno slični međusobno (SL. 96), ali pokazuju male razlike (SL.

97). Spektri klase 3 značajno se razlikuju od spektra amorfnog početnog materijala, klase 1 (SL.98), i od sprektra klasa 2, 4 i 5 (SL.72).

[0311] PXRD obrasci klase 3 (SL. 99) potvrđuju kristalinitet materijala. Obrasci tri uzorka su slični međusobno, ali pokazuju male, ali značajne razlike (SL. 100). Obrazac klase 3 se jasno razlikuje od obrazaca kristaliniteta klasa 2, 4 i 5 (SL.75).

[0312] TG-FTIR termogram uzorka PP415-P6 (SL.100) pokazuje gubitak ∼5.4 tež.-%2PrOH od 25°C do 250°C, najveći deo u koraku od ∼170°C do 190°C. Razlaganje počinje na temperaturama T > 250°C. Pre TGFTIR eksperimenata, uzorci su kratko sušeni (u trajanju od ∼5 min) pod vakuumom (10-20 mbar) da bi se uklonio višak, nevezani rastvarač. Teorijski sadržaj 2PrOH (t.k. = 82°C) hemisolvata je 5.1 tež.-%.

[0313] TG-FTIR termogram uzorka PP415-P12 (SL. 101) pokazuje gubitak ∼4.9 tež.-% EtOH (sa tragovima vode) od 25°C do 250°C, najveći deo u koraku od ∼160°C do 190°C. Razlaganje počinje na temperaturama T > 250°C. Teorijski sadržaj EtOH (t.k. = 78°C) hemisolvata je 4.0 tež.-%.

[0314] Na taj način, uzorci klase 3 izgleda da su izostrukturni solvati 2PrOH, EtOH, i verovatno acetona sa čvrsto vezanim sadržajem rastvarača. Oni bi mogli da odgovaraju stehiometrijskim hemisolvatima. Međutim, ne može biti isključeno da su ovi oblici nestehiometrijski solvati.

[0315] Kako su Raman spektri i PXRD obrasci unutar ove klase veoma slični međusobno, strukture bi mogle biti esencijalno identične sa samo malim promenama dimenzija jedinične ćelije ili malim promenama atomskih položaja unutar jedinične ćelije kao posledica ugradnje različitih molekula rastvarača.

Tabela 21. Eksperimenti kristalizacije koji rezultuju u čvrstom materijalu klase 3

j. Eksperimenti sušenja na uzorcima klase 3

[0316] Jedan od uzoraka klase 3 (PP415-P6), dobijen iz eksperimenta ekvilibracije suspenzije u 2PrOH, je sušen (kao PP415-P25) pod vakuumom nekoliko dana (2-20 mbar, sobna temperatura do 60°C, Tabela 22).

[0317] TG-FTIR termogram ovog osušenog materijala klase 3, uzorak PP415-P25 (SL.102), pokazuje gubitak ∼5.4 tež.-% 2PrOH od 50°C do 250°C, najveći deo u koraku od 170°C do 190°C, sledeći gubitak ∼1.0 tež.-% 2PrOH od 290°C do 320°C, i razlaganje na temperaturama T > 320°C. U poređenju sa TG-FTIR originalnog uzorka klase 3 PP415-P6 (SL.103), sa sadržajem rastvarača od ∼5.4 tež.-% 2PrOH, izgleda da se sadržaj rastvarač nije značajno smanjio.

[0318] Ovaj materijal je dodatno sušen (kao PP415-P33, Tabela 22) tri dana pod visokim vakuumom i povišenim temperaturama (<1x10<-3>mbar, 80°C) sa ciljem da se solvat desolvatira i da se dobije nesolvatirani, anhidrovani oblik 63415.

[0319] TG-FTIR termogram ovog dodatnog osušenog materijala klase 3, uzorak PP415-P33 (SL.103) pokazuje gubitak od ∼4.2 tež.-% 2PrOH od 50°C do 210°C, najveći deo u koraku od 160°C do 190°C, sledeći gubitak ∼0.5 tež.-% 2PrOH od 210°C do 290°C, i razlaganje na temperaturama T > 290°C.

[0320] U poređenju sa sadržajem rastvarača uzoraka PP415-P6 i PP415-P25, sadržaj rastvarača je smanjen samo od ∼5.4 tež.-% do ∼4.8 tež.-%.

Tabela 22. Ekspermenti sušenja na uzorcima klase 3

[0321] FT-Raman spektri klase 3 (uzorak PP415-P6), osušenog materijala klase 3 (uzorak PP415-P25), i dodatnog osušenog materijala klase 3 (uzorak PP415-P33) su identični i ne pokazuju promene (SL.

104).

[0322] PXRD obrasci klase 3 (uzorak PP415-P6) i dodatnog osušenog materijala klase 3 (uzorak PP415-P33) ne pokazuju nikakve značajne razlike, dok postoji nekoliko malih promena i razlika od obrasca početno osušenog materijala klase 3 (uzorak PP415-P25, SL.105). Svi obrasci odgovaraju klasi 3.

[0323] Kako sušenje nema veliki efekat na sadržaj rastvarača, nije iznenađujuće da FT-Raman spektri i PXRD obrasci osušenih materijala ne pokazuju razlike u poređenju sa neosušenim materijalom.

[0324] Na taj način, klasa 3 je klasa izostrukturnih solvata (2PrOH, EtOH, i verovatno acetona) sa veoma čvrsto vezanim molekulima rastvarača koji bi mogli biti uklonjeni samo delimično (∼5.4 tež.-% do ∼4.8 tež.-%) pomoću uslova sušenja primenjenih ovde (do 3 d na 1 x 10<-3>mbar i 80°C).

k. Klasa 4-Acetonitril solvat

[0325] Klasa 4 je dobijena samo od 7:3 smeše rastvarača MeCN/H2O (Tabela 23). Eksperiment koji je rezultirao u klasi 4 (PP415-P13) je pripremljen kao PP415-P35 za pripremu više materijala za dodatne studije sušenja.

[0326] FT-Raman spektar (SL. 72) i PXRD obrazac (SL.75) klase 4 (uzorak PP415-P13) značajno se razlikuju od spektara i obrazaca klasa 2, 3 i 5.

[0327] TG-FTIR termogram klase 4 (uzorak PP415-P13, SL.106) pokazuje gubitak ∼3.4 tež.-% MeCN (sa tragovima vode) od 25°C do 270°C, najveći deo u koraku od ∼180°C do 210°C. Razlaganje počinje na temperaturama T>270°C. Pre TG-FTIR eksperimenata, uzorci su kratko sušeni (u trajanju od ∼5 min) pod vakuumom (10-20 mbar) da bi se uklonio višak, nevezani rastvarač. Teorijski sadržaj MeCN (t.k. = 81°C) hemisolvata je 3.6 tež.-%.

Tabela 23. Eksperimenti kristalizacije koji rezultiraju u čvrstom materijalu klase 4

l. Eksprimenti sušenja na klasi 4

[0328] Uzorci klase 4 dobijeni iz eksperimenata ekvilibracije suspenzije u ∼7:3 MeCN/H2O su sušeni pod vakuumom nekoliko dana ili pod protokom N2(Tabela 24).

Tabela 24. Eksperimenti sušenja na uzorcima klase 4

[0329] FT-Raman spektar osušenog materijala klase 4 (PP415-P26) je identičan spektru klase 4 (PP415-P13, SL.107).

[0330] PXRD obrazac osušenog materijala klase 4 (PP415-P26) pokazuje samo veoma male razlike od obrasca klase 4, uzorka PP415-P13 (SL. 108). Neki pikovi izgleda da su bolje razvijeni, i intenziteti pikova su pomereni. Nije zabeležena amorfizacija. Obrazac PP415-P26 odgovara klasi 4.

[0331] TG-FTIR termogram osušenog materijala klase 4, uzorka PP415-P26 (SL.109) pokazuje gubitak ∼2.8 tež.-% MeCN od 170°C do 250°C i razlaganje na temperaturama T > 300°C. U poređenju sa TG-FTIR uzorka PP415-P13 (SL.106), sadržaj rastvarača uzorka je smanjen od 3.4 tež.-% do 2.8 tež.-%.

[0332] Na taj način, izgleda da je uzorak delimično desolvatirani solvat. Kako nije ostalo dovoljno materijala za drugi eksperiment sušenja sa kasnijom karakterizacijom, eksperiment PP415-P13 je ponovljen (kao PP415-P35). Još materijala klase 4 je pripremljeno i dva eksperimenta sušenja su izvedeni sa ovim sveže pripremljenim materijalom:

1

• PP415-P36: sušenje pod vakuumom (<1x10<-3>mbar) na 80°C tri dana

• PP415-P37: sušenje pod protokom N2na 80°C tri dana

[0333] FT-Raman spektri ovih osušenih uzoraka klase 4 (PP415-P36 i -P37) odgovaraju spektru klase 4 (tj., PP415-P35, SL.110).

[0334] PXRD obrasci (SL. 111) materijala klase 4 (uzorak PP415-P35) i osušenih uzoraka klase 4 (uzorci PP415-P36 i PP415-P37) su identični. Osušeni uzorci su kristalni.

[0335] TG-FTIR termogrami ovih osušenih uzoraka klase 4 (SL.112 za PP415-P36 i SL.113 za PP415-P37) pokazuju samo mali sadržaj rastvarača (MeCN i/ili H2O) od ∼0.6 tež.-% i ∼0.9 tež.-% za PP415-P36 i PP415-P37, respektivno, u dva koraka od 25°C do 280°C. Sadržaj rastvarača je moguće MeCN i H2O, ali teško ga je odrediti jer su količine male. Razlaganje počinje na temperaturama T > 280°C.

[0336] Na taj način, većina rastvarača ovog solvata bi se mogla ukloniti bez uništavanja kristalne strukture. Dobijen je kristalni, nesolvatirani oblik (ili pre desolvatirani solvat).

m. Dodatna karakterizacija osušene i desolvatirane klase 4

[0337] Sušenje klase 4 (MeCN solvat) rezultovalo je u desolvatiranom solvatu sa sadržajem rastvarača smanjenim do <1 tež.-% (TG-FTIR).

[0338] Nije se javila promena u strukturi posle desolvatacije (FT-Raman i PXRD). Nije zabeležen značajan gubitak kristalnosti.

[0339] Na taj način, dobijen je nesolvatirani, kristalni oblik 63415, jedini koji je poznat do danas.

[0340] Ovaj desolvatirani materijal klase 4 je okarakterisan dodatno pomoću DVS i DSC.

[0341] DVS izoterma (SL. 114) pokazuje da u toku početnog vremena ekvilibracije na 50% rel. vlaž. javio se gubitak mase od ∼0.4 tež.-%. U toku merenja, javio se postepeni, reverzibilni gubitak mase ∼1.3 tež.-% posle snižavanja relativne vlažnosti od 50% rel. vlaž. do 0% rel. vlaž. Dostignuta je ravnoteža. Usled povećanja relativne vlažnosti do 95% rel. vlaž., zabeležen je postepeni dobitak na težini od ∼0.8 tež.-% (u odnosu na ekvilibracionu masu na 50% rel. vlaž.). Dostignuta je ravnoteža. Posle snižavanja relativne vlažnosti do 50% rel. vlaž., krajnja masa je ostala 0.1 tež.-% ispod ekvilibrisane početne mase. Dobitak mase od ∼0.7 tež.-% posle povećanja relativne vlažnosti od 50% rel. vlaž. do 85% rel. vlaž. klasifiovao je uzorak kao slabo higroskopan.

[0342] PXRD obrazac uzorka posle merenja je nepromenjen u poređenju sa obrascem pre merenja (SL.

115).

[0343] DSC termogram uzorka desolvatiranog materijala klase 4 (SL. 116) ne pokazuje no stakleni prelaz koji se može pripisati amorfnom obliku, koji bi se očekivao na ∼150°C, ali umesto toga oštar endotermni pik sa maksimumom na T = 196.1°C (ΔH = 29.31 J/g), koji verovatno odgovara topljenju, i nema razlaganja do 270°C.

[0344] Pored toga, DSC eksperiment je izveden sa ∼1:1 smešom amorfnog materijala, klase 1, sa desolvatiranim materijalom klase 4 radi ispitivanja da li bi amorfni materijal transformisao i

1 1

kristalizovao u desolvatiranu klasu 4, događaj koji se očekuje (ukoliko uopšte) iznad temperature staklenog prelaza amorfnog oblika (Tg≈ 150°C) i ispod tačke topljenja desolvatirane klase 4 (Tm≈ 196°C).

[0345] DSC termogram smeše (SL.117) pokazuje endotermni događaj sa pikom na T = 156.7°C (ΔH = 1.47 J/g) i drugi endotermni događaj sa pikom na 197.0°C (ΔH = 14.1 J/g). Prvi događaj bi se mogao pripisati amorfnom materijalu (stakleni prelaz na Tg≈ 150°C). Drugi događaj bi mogao da odgovara topljenju desolvatirane klase 4 na Tm≈196°C. Toplota fuzije (ΔH = 14.1 J/g) smeše je u dobroj korelaciji sa polovinom toplote fuzije (ΔH = 29.3 J/g) čiste desolvatirane klase 4.

[0346] Ne može se zabeležiti egzotermni događaj u temperaturnom opsegu između staklenog prelaza i topljenja koje odgovara mogućoj kristalizaciji amorfnog materijala. Na taj način, izgleda da se nije javila transformacija amorfnog oblika u desolvatirani oblik klase 4 na ovoj vremenskoj skali.

[0347] U sledećem DSC eksperimentu sa ∼1:1 smešom amorfnog materijala, klase 1, sa desolvatiranim materijalom klase 4, zagrevanje je zaustavljeno na 173°C (između staklenog prelaza i topljenja) da bi se omogućilo vreme za moguću kristalizaciju.

[0348] DSC termogram smeše (SL.118) pokazuje endotermni događaj sa pikom na T = 161.4°C (ΔH= 0.31 J/g) i drugi endotermni događaj da šikom na 201.4°C (ΔH = 11.4 J/g). Kao u prvom eksperimentu, toplota fuzije drugog pika se nije povećala; nisu vidljive indikacije za transformaciju amorfnog oblika u desolvatirani oblik klase 4.

[0349] Zakrivljena osnovna vrdnost (-50°C do 150°C) je najverovatnije artefakt (kao posledica savijenog poklopca držača uzorka).

n. Klasa 5 - THF solvat

[0350] Klasa 5 je dobijena samo od 1:1 THF/H2O smeše rastvarača (Tabela 25).

[0351] FT-Raman spektar (SL.71) i PXRD obrazac (SL.75) klase 5 se značajno razlikuju od spektara i obrazaca klasa 2, 3 i 4.

[0352] TG-FTIR termogram klase 5 (uzorak PP415=P14, SL.119) pokazuje gubitak ∼36.1 tež.-% THF i H2O od 25 do 200°C, najveći deo u koraku od ∼100°C do 130°C. Pre TG-FTIR eksperimenata, uzorci su sušeni kratko (u trajanju od ∼5 min) pod vakuumom (10-20 mbar) da bi se uklonio višak, nevezani rastvarač. Gubitak oba THF i H2O javlja se zajedno u istom temperaturnom opsegu. Razlaganje počinje na temperaturama T > 300°C. Teorijski sadržaj THF (t.k. = 66°C) trisolvata je 28.1 tež.-%. Nažalost, jer sadržaj dve komponente ne može biti posebno kvantitativno određen, tačno stanje solvatacije ne može biti određeno.

[0353] Dati su detalji o eksperimentima i karakterizacijama uzoraka PP415-P41 i PP415-P45.

Tabela 25. Eksperimenti kristalizacije koji rezultuju u čvrstom materijalu klase 5

1 2

o. Eksperimenti sušenja na uzorcima klase 5

[0354] Uzorak klase 5 (PP415-P14), dobijeno iz eksperimenta ekvilibracije suspenzije u ∼1:1 THF/H2O, je sušen (kao PP415-P27) pod vakuumom nekoliko dana (2-20 mbar, sobna temperatura do 60°C, Tabela 26).

Table 26. Eksperimenti sušenja uzoraka klase 5

[0355] FT-Raman spektar osušenog materijala (PP415-P27) se razlikuje od spektra klase 5 (PP415-P14, SL. 120) i, sa njegovim najširim pikovima, liči više spektru klase 1, amorfnog početnog materijala, PP415-P1.

[0356] PXRD obrazac osušenog materijala klase 5 (PP415-P27) pokazuje samo neke široke pikove niskog intenziteta sa niskim odnosom S/N, što ukazuje na slab kristalinitet uzorka (SL. 121). Neki od pikova bi mogli da odgovaraju klasi 5, dok su drugi, tj., na 7.35°20, novi ili pomereni.

[0357] TG-FTIR termogram osušenog materijala klase 5 (SL.122) pokazuje gubitak mase ∼0.3 tež.-% od 25°C do 290°C i razlaganje na temperaturama T > 290°C. Uzorak je anhidrovan.

[0358] Na taj način, sušenjem pod vakuumom, materijal je izgubio svoj sadržaj rastvarača i takođe dosta od njegovog kristaliniteta.

8. Eksperimenti za pripremu amorfnog oblika

[0359] Eksperimenti sa ciljem da se pripremi amorfni oblik, klase 1, izvedeni su upotrebom materijala klase 2 (PP415-P40, Tabela 8) kao početni materijal. Pokušano je nekoliko strategija i postupaka:

• Transformacija klase 2 u klasu 5, nakon čega sledi sušenje klase 5 da bi se dobio amorfan oblik, klase 1.

• Priprema amorfnog oblika, klase 1, direktno do klase 2, ako je moguće upotrebom rastvarača klase 3 1CH.

1

[0360] Uglavnom amorfni materijal je pripremljen počevši od materijala klase 2 u postupku od dva koraka preko klase 5 na skali od 100-mg i skali od 3-g.

[0361] Dodatni eksperimenti su izvedeni sa ciljem da se postupak pojednostavi u postupak od jednog koraka, da bi se izbegao THF rastvarač klase 2 ICH, i da bi se dobio potpuno amorfni materijal. Nađeno je da je najobećavajući postupak taloženje iz rastvora acetona u hladnom vodenom kupatilu. Ovaj direktni postupak daje mnogo bolje rezultate od postupka od dva koraka preko klase 5.

a. Priprema amorfnog oblika preko klase 5

[0362] Eksperimenti kristalizacije upotrebom klase 2, PP415-P40, kao početnog materijala su izvedeni sa ciljem transformacije ovaj heptanski solvat u klasu 5 (verovatno THF solvat), nakon čega je usledilo sušenje klase 5 da bi se dobio amorfan materijal (Tabela 27).

[0363] Veruje se da je klasa 5 dobar intermedijerni korak, jer je lakši za desolvataciju i amorfiziranje od klasa 2 ili 3.

Tabela 27. Rezime eksperimenata usmerenih ka pripremi amorfnog oblika, klase 1, preko materijala klase 5

b. Korak 1: Transformacija klase 2 u klasu 5

[0364] Transformacija heptanskog solvata, klase 2, u THF solvat, klasu 5, je uspešno izvedena suspendovanjem PP415-P40 (heptanski rastvarač) materijala u (1:1) THF/H2O smešu i ekvilibrisanjem suspenzije na sobnoj temperaturi (PP415-P41, 100 mg-skala). Rezultirajući čvrsti materijal odgovara THF solvatu, klasi 5 (SL.123).

[0365] Prvi srazmerno povećani eksperiment od mg-skale do g-skale (330, tj., 3-g skale) je izveden analogno PP415-P41: početni materijal heptanskog solvata klase 2 (PP415-P40) je ekvilibrisan u THF/H2O (1:1) jedan dan i uspešno transformisan u klasu 5, THF solvat (PP415-P45, SL.124).

c. Korak 2: Amorfizacija materijala klase 5 sušenjem

1 4

[0366] Materijal klase 5 (THF solvat) je sušen na povišenoj temperaturi (80°C) pod vakuumom (∼100 mbar) uzimanjem u obzir uslova koji mogu biti korišćeni na API MFG mestu.

[0367] Posle sušenja materijala eksperimenta na skali od 100-mg, PP415-P41, jedan dan na 80°C i 100 mbar on je transformisan u uglavnom amorfni materijal (PP415-P44, SL.125). PXRD obrazac pokazuje samo neke široke pikove sa niskim intenzitetom. Posle dodatnog sušenja (80°C, 100 mbar) preko noći, intenzitet ovih širokih pikova je dodatno smanjen (PP415-P44a). TG-FTIR ovog materijala pokazuje gubitak ∼0.9 tež.-% THF (sa tragovima vode) postepeno od 25°C do 280°C i razlaganje na temperaturama T > 300°C (SL.126).

[0368] Materijal eksperimenta na sklai od 3-g, PP415-P45, je takođe sušen na 80°C i 100 mbar (kao PP415-P46). Transformisan je preko noći u uglavnom amorfni materijal sa samo nekim širokim pikovima sa niskim intenzitetom (SL. 127). Posle ukupno četiri dana sušenja (80°C, 100 mbar), ovi široki pikovi su još uvek prisutni (-P46a, SL.128). TG-FTIR ovog materijala ne pokazuje sadržaj THF, ali pokazuje gubitak ∼0.4 tež.-% vode postepeno od 25°C do 250°C i razlaganje na temperaturama T > 250°C (SL.129).

d. Direktno dobijanje amorfnog oblika

[0369] Priprema amorfnog oblika počevši od materijala klase 2 u postupku od dva koraka preko klase 5 je većinom, ali ne potpuno, uspešna. Na taj način, dodatni eksperimenti su izvedeni sa ciljem da se postupak pojednostavi do postupka od jednog koraka, da bi se izbegla upotreba rastvarača THF klase 2 ICH, i da bi se dobio potpuno amorfni materijal (Tabela 28).

[0370] Amorfni oblik, klase 1, je pripremljen direktno od materijala klase 2 u eksperimentu isparavanja rastvora klase 2 u THF pod protokom N2(PP415-P42, SL.129).

[0371] U pokušaju da se stimuliše nepotpuno osušeni heptan/heksan solvat sa značajnom količinom preostalog rastvarača, izvedeno je isparavanje rastvora klase 2 u 8:2 rastvoru THF/heksana (heksan je korišćen umesto heptana u cilju dobijanja sličnih tačaka ključanja u smeši rastvarača). Međutim, dobijena čvrsta supstanca odgovara klasi 2, klasi izostrukturnih solvata, ne klasi 5 (PP415-P43, SL.

130).

[0372] U cilju izbegavanja rastvarača THF klase 2 ICH, eksperimenti isparavanja su izvedeni u rastvaračima klase 3 ICH.

[0373] Isparavanje rastvora klase 2 u EtOAc pod protokom N2rezultovalo je u kristalnom materijalu sa PXRD obrascem koji odgovara klasi 2 (PP415-P47, SL. 130). TG-FTIR (SL. 80) pokazuje tipičan gubitak mase od dva koraka klase 2 (ukupno ∼7.9 tež.-% EtOAc) na temperaturama do 240°C, što ukazuje na veoma čvrsto vezane molekule rastvarača.

[0374] Isparavanje u etil formatu takođe je dalo kristalni materijal klase 2, a ne amorfni oblik (PP415-P48, SL. 131). TG-FTIR (SL. 78) pokazuje gubitak mase ∼3.5 tež.-% etil formata, prvo postepeno i zatim u jasnom koraku između 180°C i 200°C. Može postojati dodatni gubitak etil formata istovremeno sa razlaganjem na T> 240°C.

1

[0375] Međutim, materijal klase 2 je uspešno transformisan u amorfni oblik, klase 1, dodavanjem rastvora acetona u hladno (5°C) vodeno kupatilo (PP415-P49, SL.132).

[0376] Ovaj direktan postupak za pripremu amorfnog oblika daje bolje rezultate i to je put koji više obećava nego postupak od dva koraka.

Tabela 28. Rezime eksperimenata usmerenih ka dobijanju amorfnog oblika direktno od početnog materijala klase 2

9. Instrumentalni - tipični uslovi merenja

[0377] FT-Raman spektroskopija: Bruker RFS100 sa OPUS 6.5 softverom; Nd:YAG 1064-nm ekscitacija, Ge detektor, 3500-100 cm<-1>opseg; tipični uslovi merenja: 100-300 mW nominalna snaga lasera, 64-128 skeniranja, 2 cm<-1>rezolucija.

[0378] PXRD: Stoe Stadi P; Mythen1K Detector; Cu-Kα zračenje; standardni uslovi merenja: transmisija; 40 kV i 40 mA snaga cevi; zakrivljen Ge monohromator; 0.02°2θ veličina koraka, 12 s ili 60 s vreme koraka, 1.5-50.5°2θ ili 1.0-55°2θ opseg skeniranja; režim detektora: skeniranje koraka; 1°2θ ili 6°2θ korak detektora; standardna priprema uzorka: 10 do 20 mg uzorka je postavljeno između dve acetatne folije; držač uzorka: Stoe transmisioni držač uzorka; uzorak je rotiran u toku merenja.

[0379] TG-FTIR: Netzsch Termo-mikro-ravnoteža TG 209 sa Bruker FT-IR spektrometrom vektor 22; aluminijumski lonci sa mikro-otvorom), atmosfera N2, 10 K/min stopa zagrevanja, 25-250°C ili 25-350°C opseg.

[0380] DSC: Perkin Elmer DSC 7; zlatni lonci (zatvoren ili sa mikro-otvorom), uzorak napunjen u sredini N2, 10 K/min stopa zagrevanja, -50 do 250°C ili 350°C opseg, u vreme gašenja hlađenjem (na -200 K/min) do -50°C između skeniranja.

[0381] DVS: Projekt Messtechnik Sorptions Prüfsystem SPS 11 - 100n ili sistemi za merenje površine DVS-1. Uzorak je postavljen na držač od aluminijuma ili platine na vrhu mikro-ravnoteže i ostavljen da se ekvilibriše u trajanju od 2 časa na 50% relativne vlažnosti pre početka unapred definisanog programa vlažnosti:

(1) 50 → 0% rel. vlaž. (5%/h); 5 h na 0% rel. vlaž.

(2) 0 → 95% rel. vlaž. (5%/h); 5 h na 95% rel. vlaž.

(3) 95 → 50% rel. vlaž. (5%/h); 2 h na 50% rel. vlaž.

1

[0382] Higroskopnost je klasifikovana na bazi dobitka mase na 85% rel. vlaž. u odnosu na početnu masu kao što sledi: ima tendenciju da se pretvori u tečnost (dovoljno vode apsorbovane da se formira tečnost), veoma higroskopan (povećanje mase od ≥15%), higroskopan (povećanje mase <15%, ali ≥2%), slabo higroskopan (ovećanje mase <2%, ali ≥0.2%), ili ne higroskopan (povećanje mase <0.2%).

[0383] Rastvarači: Za sve eksperimente, korišćeni su Fluka, Merck ili ABCR rastvarači analitičkog kvaliteta.

[0384] Približno određivanje rastvorljivosti: Približne rastvorljivosti su određene postepenim razblaživanjem suspenzije od oko 10 mg supstance u 0.05 mL rastvarača. Ako supstanca nije rastvorena dodavanjem ukupno >10 mL rastvarača, rastvorljivost je naznačena kao <1 mg/mL. Kao posledica eksperimentalne greške svojstvene ovom postupku, vrednosti rastvorljivosti su određene tako da se smatraju grubim procenama i trebalo bi ih koristiti samo za dizajn eksperimenata kristalizacije.

[0385] Određivanje hemijske stabilnosti: Pripremljena su četiri uzorka od 1.0 mg PP415-P1 materijala u 1.0 mL odgovarajućeg rastvarača. Dobijene suspenzije/rastvori su ekvilibrisani u Eppendorf Thenomixer Comfort mućkalici sa kontrolisanom temperaturom u trajanju od 7 d, 2 d, 24 h i 6 časova na 25°C na stopi mućkanja od 500 rpm. Ako je neophodno, čvrsta faza je odvojena filterskim centrifugiranjem (0.5-µm PVDF membrana). Filtrati su razblaženi u razblaživaču (0.1% mravlja kiselina u MeCN) do koncentracija ≤0.2 mg/mL (nepoznata i verovatno niža za suspenzije) i ispitivani upotrebom HPLC postupka datog u Tabeli 29. Kao referenca, PP415-P1 materijal je razblažen u razblaživaču do koncentracije od 0.25 mg/mL i dodat na početku i na kraju HPLC sekvence.

Rezultati HPLC

[0386]

Tabela 29. Postupak HPLC korišćen za određivanja hemijske stabilnosti

1

10. Skraćenice

Postupci:

[0387]

AUC analiza površine ispod krive

DSC diferencijalna skenirajuća kalorimetrija

DVS dinamička sorpcija pare

FT Raman Fourier-transformacija Raman spektroskopija

<1>H-NMR protonska nuklearna magnetna rezonantna spektroskopija

HPLC tečna hromatografija visokog učinka

PXRD rentgenska difrakcija praha

TG-FTIR termogravimetrija spojena sa Fourier-ovom transformacijom infracrvenom spektroskopijom

Hemikalije:

[0388]

1BuOH 1-butanol

CTAB cetil trimetilamonijum bromid

DCM dihlorometan

DEE dietil etar

DMF N,N-dimetilformamid

EtOAc etil acetat

EtOH etanol

IPE izopropil etar

MeCN acetonitril

MEK metil etil keton

MeOH metanol

PEG propilen glikol

PTFE politetrafluoroetilen, Teflon

2PrOH 2-propanol, izopropanol

SDS natrijum dodecil sulfat

TBME terc-butil metil etar

1

TEA trietilamin

THF tetrahidrofuran

Tween 80 polioksietilen (80) sorbitan monooleat ili polosirbat 80

Geni, proteini i biološki parametri:

[0389]

AIM antioksidantni modulator inflamacije Akr1cl 1 član familije 1 aldo-keto reduktaze

ALP alkalna fosfataza

ALT alanin transaminaza

ARE antioksidantni element odgovora

AST aspartat transaminaza

AUC površina ispod krive

BAL bronhoalveolarna lavaža

BALF tečnost bronhoalveolarne lavaže

Bil bilirubin

BUN azot uree u krvi

COPD hronična opstruktivna bolest pluća

COX-2 ciklooksigenaza-2

Cr kreatin

CYP450 citohrom P450

Eh-1 epoksid hidrolaza 1

G6PD glukoza-6 fosfat dehidrogenaza

Gclc glutamat-cistein ligaza, katalitička podjedinica Gclm glutamat-cistein ligaza, modifikujuća podjedinica Ggt1 gama-glutamiltransferaza

Glrx glutaredoksin-1

Glu glukoza

GOT glutaminska-oksalosirćetna transaminaza GPT1 glutaminska-piruvat transaminaza

Gpx3 glutation peroksidaza 3

GSH glutation

GSR glutation reduktaza

GSs glutation sintetaza

GST glutation S-transferaza

GSTa1 glutation S-transferaza alfa 1

GSTp1 glutation S-transferaza pi 1

Gy Grej

1

H6PD heksoza-6-fosfat dehidrogenaza

hERG humani gen vezan sa kalijumovim kanalom

HMOX1 hem oksigenaza (deciklizacija) 1

HO-1 hem oksigenaza

IFNγ interferon-gama

IL interleukin

iNOS inducibilna azot oksid sintaza

IκBα inhibitor alfa jedarnog faktora pojačivača gena kapa lakog polipeptida u B-ćelijama

KC protein srodan mišjem IL-8

Keap 1 Kelch-sličan protein-1 vezan za ECH

LPS lipopolisaharid

ME1 jabučni enzim 1

MPCE mikrojedarni polihromatski eritrociti

Mrp protein srodan sa metG

Mrps proteini vezani za otpornost na više lekova

NADPH nikotinamid adenin dinukleotid fosfat, redukovan

NFκB jedarni faktor pojačivača kapa-lakog-lanca aktiviranih B ćelija

NO azot oksid

NQO1 NAD(P)H hinon oksidoreduktaza 1

Nrf2 faktor 2 eritroidnog jedarnog faktora

p- IκBα fosforilisani IκBα

PBMC mononuklearne ćelije periferne krvi

PCE polihromatski eritrociti

PGD fosfoglukonat dehidrogenaza

PMN polimorfonuklearni

RANTES protein, koji eksprimira i izlučuje regulisane i normalne T ćelije

SOD1 superoksid dismutaza 1

SRXN1 sulfiredoksin-1

TG ukupni gliceridi

TKT transketolaza

TNFα faktor alfa nekroze tumora

Txn tioredoksin

TXNRD1 tioredoksin reduktaza 1

xCT član 11, familije 7 nosača supstance koja se rastvara

Razno:

[0390]

11

API aktivni farmaceutski sastojak

aq. vodeni

t.k. tačka ključanja

cryst. kristalni

decomp. razlaganje

d dan(i)

ekv. ekvivalent

ekvil. ekvilibracija

evap. isparavanje

h čas(ovi)

mat. materijal

min minut(i)

t.t. tačka topljenja

MS molekularne rešetke

part. delimično

precip. taloženje

rel. vlaž. relativna vlažnost

rpm obrtaja u minuti

sobna temperatura sobna temperatura (∼25°C)

S/N signal-prema-šumu (odnos)

solv. rastvarač

susp. suspenzija

T temperatura

Tg temperatura staklenog prelaza

theo. teorijski

viz. pos. Vizuelno posmatranje

w nedelja(e)

tež.-% težinski procenat

K. Dodatne tabele

[0391]

Tabela 30: Lista uzoraka i izvedenih eksperimenata

11

12

Tabela 31. Parametri sa SL.51

Tabela 32.63415: Primarni In Vivo ADMET –Ključne primarne ADMET analize i krajnje tačke

Tabela 33. Parametri sa SL.54

12

Tabela 34.63415 je negativan za genotoksičnost u In Vivo studiji mikrojedra

12

5 .3 SL a sriet

ra

. Pa 35 la

abeT

Tabela 36. In vitro aktivnost 63415 i 63355

Tabela 37. Parametri sa SL.52

Tabela 38. Parametri sa SL.53

REFERENCE

[0392] Sledeće reference mogu da daju primere proceduralnih i drugih detalja dopunskih u odnosu na one navedene ovde.

U.S. Patent 6,326,507

U.S. Patent 6,974,801

U.S. Patent 7,915,402

U.S. Patent 7,943,778

U.S. Patent 8,124,799

U.S. Patent 8,129,429

U.S. patentna objava 2009/0060873

Abraham and Kappas, Free Radical Biol. Med., 39:1-25, 2005.

Aghajan et al., J Gastroenterol Hepatol., Suppl 2:10-14, 2012.

Ahmad et. al., Cancer Res., 68:2920-2926, 2008.

Ahmad et. al., J. Biol. Chem., 281:35764-9, 2006.

1

Angulo et al., Eur. J. Immunol., 30:1263-1271, 2000.

Araujo et. al., J. Immunol., 171(3):1572-1580, 2003.

Arend and Dayer, Arthritis Rheum., 38:151-160, 1995.

Bach, Hum. Immunol., 67(6):430-432, 2006.

Bagasra et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:12041-12045, 1995.

Blake et. al. Am JRespir Cell Mol Biol, 42:524-36, 2010.

Berridge et al., Biochemica, 4: 14-19, 1996.

Botoman et al., Am. Fam. Physician, 57(1):57-68, 1998.

Brandt et al., Arthritis Rheum., 43:1346-1352, 2000.

Brewerton et al., Lancet., 1:904-907, 1973a.

Brewerton et al., Lancet., 1:956-957, 1973b.

Bronte et al., Trends Immunol., 24:302-306, 2003.

Brown and DuBois J. Clin. Oncol., 23:2840-2855, 2005.

Brynskov et al., N. Engl. J. Med., 321(13):845-850,1989.

Cantin et. al., J Clin Invest, 79:1665-73, 1987.

Cai et al., Nat. Med., 11(2):183-190, 2005.

Calin and Taurog, In: The Spondylarthritides, Calin et. al. (Eds.), Oxford, UK. Oxford University Press, 179, 1998.

Car et. al., Am J Respir Crit Care Med, 149:655-9, 1994.

Cemuda-Morollon et. al., J Biol Chem, 276:35530-6, 2001.

Chan and Kan, Proc Natl Acad Sci. USA, 96:12731-6,1999.

Chauhan and Chauhan, Pathophysiology, 13(3): 171-181.2006.

Chen and Kunsch, Curr Pharm Des, 10:879-91, 2004.

Cho et. al., Am J Respir Cell Mol Biol, 26:175-82, 2002.

Crowell et al., Mol. Cancer Ther., 2:815-823, 2003.

Cuzzocrea et. al., Mol Pharmacol, 61:997-1007, 2002.

Dickerson et. al., Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, March 6, 2007.

Dinarello, Int. Rev. Immunol., 16:457-499, 1998.

Dinkova-Kostova et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102(12):4584-4589, 2005.

Dionne et al., Clin. Exp. Imunol., 112(3):435-442, 1998.

Douglas et. al., Am J Respir Crit Care Med, 158:220-5, 1998.

Dudhgaonkar et. al., Eur. J. Pain, 10(7):573-9, 2006.

Eastgate et al., Lancet, 2(8613):706-9, 1988.

Eikelenboom et al., Glia, 40(2):232-239,2002.

Ettehadi et al., Clin. Exp. Immunol., 96(1):146-151, 1994.

Fischer et. al.,. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis, 6:413-21, 2011.

Forstermann, Biol. Chem., 387:1521, 2006.

Funakoshi et al., Digestion, 59(1):73-78, 1998.

Gebel et. al., Toxicol Sci, 115:238-52, 2010.

1 1

Gehrmann et al., Glia, 15(2):141-151, 1995.

Genain and Nauser, J. Mol. Med., 75:187-197, 1997.

Goodman et al., Kidney Int., 72(8):945-953, 2007.

Graeber et al., Glia, 40(2):252-259, 2002.

Greten et al., Cell, 118:285-296, 2004.

Grivennikov and Karin, Cytokine Growth Factor Rev., 21(1):11-19, 2010.

Guilherme et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 9(5):367-77, 2008.

Gwee et al., Gut., 44(3):400-406., 1999.

Hallgren et. al., Am Rev Respir Dis, 139:373-7, 1989.

Hahn and Tsao, In: Dubois’ Lupus Erythematosus, 4th Ed, Wallace and Hahn (Eds.), Lea and Febiger, Philadelphia,

195-201, 1993.

Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, and Use, Stahl and Wermuth Eds.), Verlag Helvetica Chimica Acta,

2002.

Hanson et. al., BMC Medical Genetics, 6(7), 2005.

Hansson et al., Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis., 1:297-329, 2006.

Hayden and Ghosh, Cell, 132:344-62, 2008.

He and Karin, Cell Res., 21(1):159-168, 2011.

Honda et. al. Bioorg. Med. Chem. Lett., 12:1027-1030, 2002.

Honda et. al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 16(24):6306-6309, 2006.

Honda et. al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 7:1623-1628, 1997.

Honda et. al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 8(19):2711-2714, 1998.

Honda et. al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 9(24):3429-3434,1999.

Honda et. al., J. Med. Chem., 43:4233-4246, 2000 a.

Honda et. al., J. Med. Chem., 43:1866-1877, 2000 b.

Hotamisligil, Nature, 444(7121):860-7, 2006.

Iizuka et. al., Genes Cells, 10:1113-25, 2005.

Ikezaki et. al., Food Chem Toxicol, 34:327-35, 1996.

Ishii et. al., J Immunol, 175:6968-75, 2005.

Ishikawa et. al., Circulation, 104(15):1831-1836, 2001.

Ishizawa and Dickson, J. Neuropathol. Exp. Neurol., 60(6):647-657, 2001.

Jarvis, Curr. Opin. Rheumatol., 10(5):459-467, 1998.

Jarvis, Pediatr. Ann., 31(7):437-446, 2002.

Jonsson et al., Oral Dis., 8(3):130-140, 2002.

Jonsson et al., Trends Immunol., 22(12):653-654, 2001.

Kahle et al., Ann. Rheum. Dis., 51:731-734, 1992.

Kaltschmidt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:2642-2647, 1997.

Karin, Nature, 441(7092):431-436, 2006.

1 2

Kawakami et. al., Brain Dev., 28(4):243-246, 2006.

Kawamoto et. al., J Biol Chem, 275:11291-9, 2000.

Kendall-Tackett, Trauma Violence Abuse, 8(2):117-126,2007.

Kensler et. al., Annu Rev Pharmacol Toxicol, 47:89-116, 2007.

Kikuchi et. al., Respir Res, 11:31, 2010.

Kim et. al., Mutat Res, 690:12-23, 2010.

King et. al., Am J Respir Crit Care Med, 184:92-99, 2011.

Kinnula et. al., Am J Respir Crit Care Med, 172:417-22, 2005.

Klingsberg et. al., Respirology, 15:19-31, 2010.

Kortylewski et al., Nat. Med., 11:1314-1321, 2005.

Kotzin and O’Dell, In: Samler’s Immunologic Diseases, 5th Ed., Frank et al. (Eds.), Little Brown & Co., Boston,

667-697,1995.

Kotzin, Cell, 85:303-306,1996.

Kruger et. al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 319(3):1144-1152, 2006.

Kuboyama, Kurume Med. J., 45(1):33-37, 1998.

Lee et. al., Mol Cell, 36:131-40, 2009.

Lee et. al., Glia., 55(7):712-22, 2007.

Lencz et. al., Mol. Psychiatry, 12(6):572-80, 2007.

Levonen et. al., Biochem J, 378:373-82, 2004.

Li and Kong, Mol Carcinog, 48:91-104, 2009.

Liby et. al., Cancer Res., 65(11):4789-4798, 2005.

Liby et. al., Mol. Cancer Ther., 6(7):2113-9, 2007 b.

Liby et. al., Nat. Rev. Cancer, 7(5):357-356, 2007 a.

Lipsky, In: Harrison’s principles of internal medicine, Fauci et al.(Eds.), 14th Ed., NY, McGraw-Hill, 1880-1888, 1998.

Liu et. al., FASEB J., 20(2):207-216, 2006.

Lu et. al., J. Clin. Invest., 121(10):4015-29, 2011.

Lugering et al., Ital. J. Gastroenterol. Hepatol., 30(3):338-344, 1998.

Malhotra et. al., Am J Respir Crit Care Med, 178:592-604, 2008.

March’s Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms; and structure, 2007.

Mazur et al., Cell Microbiol., 9(7):1683-94, 2007.

Mazzoni et al., J. Immunol., 168:689-695, 2002.

McAlindon et al., Gut, 42(2):214-219, 1998.

McGeer and McGeer, Brain Res. Brain Res. Rev., 21:195-218, 1995.

McGeer et al., Neurology, 19:331-338, 1996.

McGonagle et al., Arthritis Rheum., 41:694-700, 1998.

McGonagle et al., Curr. Opin. Rheumatol., 11:244-250,1999.

McIver et. al., Pain, 120(1-2):161-9, 2005.

1

Mease et al., Lancet, 356:385-390, 2000.

Merrill and Benvenist, Trends Neurosci., 19:331-338, 1996.

Mochizuki et. al., Am J Respir Crit Care Med, 171:1260-6, 2005.

Morbidity & Mortality: 2009 Chart Book on Cardiovascular, Lung, and Blood Diseases. National Heart, Lung, and

Blood Institute, 2009.

Morris et. al., J. Mol. Med., 80(2):96-104, 2002.

Morse and Choi, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 172(6):660-670, 2005.

Morse and Choi, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 27(1):8-16, 2002.

Nath et al., Neurology, 66(1):149-150, 2006.

Neal et al., BMJ., 314(7083):779-782, 1997.

Nichols, Drug News Perspect., 17(2):99-104, 2004.

Ohnishi et al., Int. Immunol., 6:817-830, 1994.

Ogushi et. al., J Med Invest, 44:53-8, 1997.

Pall, Med. Hypoth., 69:821-825, 2007.

Parambil et. al., Chest, 128:3310-5, 2005.

Partsch et al., Br. J. Rheumatol., 24:518-523,1997.

Pergola et. al., N Engl J Med, 365:327-336, 2011.

Pica et al., Antimicrob Agents Chemother., 44(1):200-4, 2000.

Pimentel et al., Am. J. Gastroenterol., 95(12):3503-3506, 2000.

Place et. al., Clin. CancerRes., 9(7):2798-806, 2003.

Prochaska and Santamaria, Anal Biochem., 169:328-336, 1988.

Rajakariar et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104(52):20979-84, 2007.

Rangasamy et. al., J Clin Invest, 114:1248-59, 2004.

Rangasamy et. al., J Exp Med, 202:47-59, 2005.

Reimund et al, Eur. J. Clin. Invest., 28(2):145-150, 1998.

Renauld, J Clin Pathol, 54:577-89, 2001.

Rogler and Andus, World J. Surg., 22(4):382-389, 1998.

Rooney et al., Rheumatol. Int., 10:217-219, 1990.

Ross et. al, Am. J. Clin. Pathol., 120(Suppl):S53-71, 2003.

Ross et. al., Expert Rev. Mol. Diagn., 3(5):573-585, 2003.

Rossi et. al., Nature, 403:103-8,2000.

Rostom et al., Ann. Intern. Med., 146, 376-389,2007.

Ruster et. al., Scand. J. Rheumatol., 34(6):460-3,2005.

Sacerdoti et. al., Curr Neurovasc Res., 2(2):103-111, 2005.

Saha et. al., J Biol Chem, 285:40581-92, 2010.

Saiki et al., Scand. J. Gastroenterol., 33(6):616-622, 1998.

Salomonsson et al., Scand. J. Immunol., 55(4):336-342, 2002.

Salvemini et. al., J. Clin. Invest., 93(5):1940-1947, 1994.

1 4

Sarchielli et. al., Cephalalgia, 26(9):1071-1079 , 2006.

Satoh et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103(3):768-773, 2006.

Schlosstein et al., NE J. Medicine, 288:704-706, 1973.

Schulz et. al., Antioxid. Redox. Sig., 10:115, 2008.

Selman et. al., Ann Intern Med, 134:136-51, 2001.

Sheppard, J Clin Invest, 107:1501-2, 2001.

Shishodia et. al., Clin Cancer Res, 12:1828-38, 2006.

Simonian and Coyle, Annu. Rev Pharmacol. Toxicol., 36:83-106, 1996.

Singh et. al., Free Rad Biol Med, 46:376-386, 2009.

Sinha et al., Cancer Res., 67:4507-4513, 2007.

Sporn et. al., J Nat Prod, 74:537-45, 2011.

Sriram et. al., Pulm Pharmacol Ther, 22:221-36, 2009.

Stack et. al., Lancet, 349(9051):521-524, 1997.

Standiford et. al., Chest, 103:121S, 1993.

Standiford et. al., J Immunol, 151:2852-63, 1993.

Stewart et al., Neurology, 48:626-632, 1997.

Straus et. al., Proc Natl Acad Sci USA, 97:4844-9, 2000.

Strejan et. al., J. Neuroimmunol., 7:27, 1984.

Strieter, Am J Respir Crit Care Med, 165:1206-7, 2002.

Suh et. al., Cancer Res., 58:717-723, 1998.

Suh et. al., Cancer Res., 59(2):336-341, 1999.

Sussan et al., Proc Natl Acad Sci USA, 106:250-5, 2009.

Szabo et. al., Nature Rev. Drug Disc., 6:662-680, 2007.

Takafiashi et. al., Cancer Res., 57:1233-1237, 1997.

Tamir and Tannebaum, Biochim. Biophys. Acta, 1288:F31-F36, 1996.

Taniguchi et. al., Eur Respir J, 35:821-9, 2010.

Targan et al., N. Engl. J. Med., 337(15):1029-1035, 1997.

Thimmulappa et al., Cancer Research, 62: 5196-5203, 2002.

Third Report of the National Cholesterol Education Program Expert Panel on Detection, Evaluation and Treatment

of High Blood Cholesterol in Adults (Adult Treatment Panel III, or ATP III), National Institutes of Health, 2001, NIH

Publication No.01-3670.

Touzani et al., J. Neuroimmunol., 100(1-2):203-215, 1999.

Tumlin et al., Am. J. Cardiol., 98(6A): 14K-20K, 2006.

van den Berg, Semin. Arthritis Rheum., 30(5S-2):7-16, 2001.

van Dullemen et al., Gastroenterol., 109(1):129-135, 1995.

van Hogezand and Verspaget, Drugs, 56(3):299-305, 1998.

Vazquez et al., J. Virol., 79(7):4479-91, 2005.

1

Wakabayashi, et. al., Antioxid Redox Signal, 13:1649-63, 2010.

Wang et al., Cancer Res., 66:10983-10994, 2006.

Wardle, Nephrol. Dial. Transplant., 16(9): 1764-8,2001.

Weyand and Goronzy, Ann. NY Acad. Sci., 987:140-149,2003.

Williams et al., Clin. Neurosci., 2(3-4):229-245, 1994.

Wordsworth, In: Genes and Arthritis, Brit. Medical Bulletin, 51:249-266, 1995. Wright, Clin. Orthop. Related Res., 143:8-14, 1979.

Wu et. al., Toxicol Sci, 123:590-600, 2011.

Xie et. al., J. Biol. Chem., 270(12):6894-6900, 1995.

Yates et al., Mol. Cancer Ther, 6(1):154-162, 2007.

Yore et. al., Mol Cancer Ther, 5:3232-9, 2006.

Yoh et al., Kidney Int., 60(4):1343-1353, 2001.

Yu et al., Nat. Rev. Immunol., 7:41-51, 2007.

Zhou et al., Am. J. Pathol., 166(1):27-37, 2005.

Zhou et al., Cancer Sci., 98:882-889, 2007.

Zingarelli et al., J. Immunol, 171(12):6827-6837, 2003.

1

14

Claims

Patentni zahtevi 1. Jedinjenje iz formule:
ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu za lečenje ili sprečavanje kancera, pri čemu to jedinjenje treba isporučiti pacijentu u kombinaciji sa imunoterapijom. 2.Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, koje je jedinjenje iz formule:
3. Polimorfni oblik jedinjenja koje ima formulu:

za upotrebu za lečenje ili sprečavanje kancera, pri čemu taj polimorfni oblik treba isporučiti u kombinaciji sa imunoterapijom; i pri čemu polimorfni oblik ima obrazac rendgenske difrakcije praha (CuKα) sa vršnom vrednošću halogene grupe na oko 14 °2θ, ili polimorfni oblik je solvat koji ima obrazac rendgenske difrakcije praha (CuKα) koji obuhvata vršne vrednosti na oko 5,6, 7,0, 10,6, 12,7, i 14,6 °2 θ , ili polimorfni oblik je solvat koji ima obrazac rendgenske difrakcije praha (CuKα) koji obuhvata vršne vrednosti na oko 7,0, 7,8, 8,6, 11,9, 13,9 (dupla vršna vrednost), 14,2, i 16,0 °2 θ , ili polimorfni oblik je acetonitril hemisolvat koji ima obrazac rendgenske difrakcije praha (CuK ) koji obuhvata vršne vrednosti na oko 7,5, 11,4, 15,6, i 16,6 °2 θ , ili polimorfni oblik je solvat koji ima obrazac rendgenske difrakcije praha (CuKα) koji obuhvata vršne vrednosti na oko 6,8, 9,3, 9,5, 10,5, 13,6, i 15,6 °2 θ .
4. Farmaceutska supstanca za upotrebu za lečenje ili sprečavanje kancera, ta farmaceutska supstanca obuhvata: aktivni sastojak sa jedinjenjem kao što je definisano u patentnom zahtevu 1 ili 2 ili polimorfni oblik kao što je definisano u patentnom zahtevu 3; i farmaceutski prihvatljiv nosač; pri čemu tu farmaceutsku supstancu treba isporučiti pacijentu u kombinaciji sa imunoterapijom.
5. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili 2 ili polimorfni oblik za upotrebu prema patentnom zahtevu 3 ili farmaceutska supstanca za upotrebu prema patentnom zahtevu 4, pri čemu je ta imunoterapija oblik imunoterapije koja cilja kancer, imunoterapija na bazi dendritske ćelije, ili adoptivna T ćelijska imunoterapija.
6. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili 2 ili polimorfni oblik za upotrebu prema patentnom zahtevu 3 ili farmaceutska supstanca za upotrebu prema patentnom zahtevu 4, pri čemu je imunoterapija antitelo koje cilja kancer koje je izabrano iz trastuzumaba, alemtuzumaba, bevacizumaba, cetuksimaba, panitumumaba, ibritumomab tiuksetana, tositumomaba, brentuksimab vedotina, ado-trastuzumab emtanzina, i denileukin dititoksa.
7. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 6 ili polimorfni oblik za upotrebu prema patentnom zahtevu 6 ili farmaceutska supstanca za upotrebu prema patentnom zahtevu 6, pri čemu je kancer karcinom, sarkom, limfom, leukemija, melanom, mezoteliom, multipli mijelom, ili seminom.
8. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 7 ili polimorfni oblik za upotrebu prema patentnom zahtevu 7 ili farmaceutska supstanca za upotrebu prema patentnom zahtevu 7, pri čemu je taj kancer melanom.
9. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 6 ili polimorfni oblik za upotrebu prema patentnom zahtevu 6 ili farmaceutska supstanca za upotrebu prema patentnom zahtevu 6, pri čemu se radi o kanceru bešike, krvi, kosti, mozga, dojke, centralnog nervnog sistema, grlića materice, debelog creva, endometrijuma, ezofagusa, žučne kese, genitalija, genitourinarnog trakta, glave, bubrega, ždrela, jetre, pluća, mišićnog tkiva, vrata, oralne ili nazalne sluzokože, 14 jajnika, pankreasa, prostate, kože, slezine, tankog creva, velikog creva, želuca, testisa, ili tireoidne žlezde.
10. Jedinjenje iz formule:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu za lečenje ili sprečavanje stanja povezanih sa oksidativnim stresom prouzrokovanim mitohondrijalnom disfunkcijom.
11. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, koje je jedinjenje iz formule:
12. Polimorfni oblik jedinjenja koje ima formulu:

za upotrebu za lečenje ili sprečavanje stanja povezanih sa oksidativnim stresom prouzrokovanim mitohondrijalnom disfunkcijom; pri čemu taj polimorfni oblik ima obrazac rendgenske difrakcije praha (CuKα) sa vršnom vrednošću halogene grupe na oko 14 °2θ, ili polimorfni oblik je solvat koji ima obrazac rendgenske difreakcije praha (CuKα) sa vršnom vrednošću na oko 5,6, 7,0, 10,6, 12,7, i 14,6 °2θ, ili polimorfni oblik je solvat koji ima obrazac rendgenske difrakcije praha (CuKα) sa 14 vršnom vrednošću na oko 7,0, 7,8, 8,6, 11,9, 13,9 (dupla vršna vrednost), 14,2, i 16,0 °2 θ, ili polimorfni oblik je acetonitril hemisolvat koji ima obrazac rendgenske difrakcije praha (CuKα) sa vršnom vrednošću na oko 7,5, 11,4, 15,6, i 16,6 °2 θ, ili polimorfni oblik je solvat koji ima obrazac rendgenske difrakcije praha (CuKα) sa vršnom vrednošću na oko 6,8, 9,3, 9,5, 10,5, 13,6, i 15,6 °2 θ.
13. Farmaceutska supstanca za upotrebu za lečenje ili sprečavanje stanja povezanih sa oksidativnim stresom prouzrokovanim mitohondrijalnom disfunkcijom. ta farmaceutska supstanca obuhvata: aktivni sastojak koji se sastoji od jedinjenja kao što je definisano u patentnom zahtevu 10 ili 11 ili polimorfnog oblika kao što je definisano u patentnom zahtevu 12; i farmaceutski prihvatljiv nosač.
14. Jedinjenje iz formule:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu za lečenje ili sprečavanje poremećaja epileptičnog napada.
15. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 14, koje je jedinjenje iz formule:
16. Polimorfni oblik jedinjenja koje ima formulu:

za upotrebu za lečenje ili sprečavanje poremećaja epileptičnog napada; pri čemu polimorfni oblik ima obrazac rendgenske difrakcije praha (CuKα) sa vršnom vrednošću halogene grupe na oko 14 °2 θ ili polimorfni oblik je solvat koji ima obrazac rendgenske difreakcije praha (CuKα) sa vršnom vrednošću na oko 5,6, 7,0, 10,6, 12,7, i 14,6 °2 θ, ili polimorfni oblik je solvat koji ima obrazac rendgenske difrakcije praha (CuKα) sa vršnom vrednošću na oko 7,0, 7,8, 8,6, 11,9, 13,9 (dupla vršna vrednost), 14,2, i 16,0 °2 θ, ili polimorfni oblik je acetonitril hemisolvat koji ima obrazac rendgenske difrakcije praha (CuKα) sa vršnom vrednošću na oko 7,5, 11,4, 15,6, i 16,6 °2 θ, ili polimorfni oblik je solvat koji ima obrazac rendgenske difrakcije praha (CuKα) sa vršnom vrednošću na oko 6,8, 9,3, 9,5, 10,5, 13,6, i 15,6 °2 θ.
17. Farmaceutska supstanca za upotrebu za lečenje ili sprečavanje poremećaja epileptičnog napada, farmaceutska supstanca obuhvata: aktivni sastojak koji se sastoji od jedinjenja kao što je definisano u patentnom zahtevu 14 ili 15 ili polimorfnog oblika kao što je definisano u patentnom zahtevu 16; i farmaceutski prihvatljiv nosač.
18. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 14 i 15 ili polimorfni oblik za upotrebu prema patentnom zahtevu 16 ili farmaceutska supstanca za upotrebu prema patentnom zahtevu 17, pri čemu je taj poremećaj epileptičnog napada epilepsija. 1