RS60387B1 - Rsv-specifična antitela i njihovi funkcionalni delovi - Google Patents

Description

Opis

[0001] Ova prijava koristi U.S. privremenu prijavu serijski br.61/927,819, podnetu 15. januara 2014.

Oblast prijave

[0002] Ova prijava se odnosi na oblast biotehnologije i medicine.

Osnova

[0003] Respiratorni sincicijalni virus (RSV) je virus prehlade koji spada u familiju paramiksovirusa. RSV je zarazan, lako se prenosi i najčešći je uzrok bolesti donjeg respiratornog trakta kod dece mlađe od 2 godine. Do 98% dece koja pohađaju obdanište će biti zaraženo tokom jedne sezone RSV. Kod između 0,5% i 3,2% dece zaražene putem RSV javlja se potreba za hospitalizacijom. Približno 90.000 prijema u bolnicu i 4.500 smrti godišnje prijavljeno je u Sjedinjenim Američkim Državama. Glavni faktori rizika za hospitalizaciju usled RSV su prevremeno rođenje, hronična bolest pluća, urođene srčane mane, ugrožen imunitet i starost manja od 6 nedelja kod inače zdrave dece. Postoji potreba za dodatnim lečenjem RSV pozitivnog bronhiolitisa, pored palijativne nege u vidu adekvatne ishrane i terapije kiseonikom. Antivirusne terapije, poput ribavirina, nisu se pokazale efikasnim kod infekcije putem RSV. Jedno monoklonsko antitelo, palivizumab (naziva se i Synagis®), registrovano je za profilaksu infekcije putem RSV. Palivizumab je genetički konstruisano (humanizovano) monoklonsko antitelo fuzionog proteina RSV. Mada se palivizumab pokazao kao veoma efikasan profilaktik, alternativna antitela i terapije koje pružaju dodatnu zaštitu od RSV bi bile korisne.

[0004] US 2012/070446 otkriva anti-RSV antitela podtipa A sa IC50 od 1,15 ng/ml.

[0005] US 2010/239593 razmatra mišje D25 anti-RSV antitelo koje predstavlja polaznu tačku za predmetna antitela.

[0006] US 2011/008329 i WO 2006/050166 razmatraju dalja anti-RSV antitela.

[0007] Sva ova antitela su modifikovana na ostacima 252, 254 i/ili 256.

[0008] Cilj je da se obezbede sredstva i postupci za borbu protiv infekcije putem RSV i/ili njeno sprečavanje. Dalji cilj je da se obezbede alternativna i/ili poboljšana antitela protiv RSV, ili funkcionalni ekvivalenti takvih antitela, i da se obezbede stabilne ćelije sposobne za proizvodnju antitela ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata protiv RSV.

SAŽETAK

[0009] Predmetni pronalazak je definisan putem referenci na ovde priložene zahteve. U skladu sa opisom, obezbeđeno je sintetičko, rekombinantno ili izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment.

[0010] U jednom otelotvorenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže najmanje sledeće aminokiseline u varijabilnom regionu teškog lanca koje se razlikuju od SEQ ID NO: 7:

[0011] U dodatnom otelotvorenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže najmanje sledeće aminokiseline u varijabilnom regionu teškog lanca koje se razlikuju od SEQ ID NO: 7:

[0012] U dodatnom otelotvorenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže najmanje sledeće aminokiseline u varijabilnom regionu teškog lanca koje se razlikuju od SEQ ID NO: 7:

[0013] U dodatnom otelotvorenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže najmanje sledeće aminokiseline u varijabilnom regionu teškog lanca koje se razlikuju od SEQ ID NO: 7:

[0014] U dodatnom otelotvorenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže najmanje sledeće aminokiseline u varijabilnom regionu teškog lanca koje se razlikuju od SEQ ID NO: 7:

[0015] U daljem otelotvorenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže najmanje sledeće aminokiseline u varijabilnom regionu teškog lanca koje se razlikuju od SEQ ID NO: 7:

[0016] U dodatnom otelotvorenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže najmanje sledeće aminokiseline u varijabilnom regionu teškog lanca koje se razlikuju od SEQ ID NO: 7:

[0017] U daljem otelotvorenju, sekvenca CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sadrži DYIIN (SEQ ID NO: 9), sekvenca CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca sadrži GIIPVLGTVHYGPKFQG (SEQ ID NO: 10), sekvenca CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca sadrži ETALVVSTTYLPHYFDN (SEQ ID NO: 3) ili ETALVVSTTYRPHYFDN (SEQ ID NO: 11).

[0018] Prema pronalasku, sekvenca CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sadrži QASQDIVNYLN (SEQ ID NO: 4), sekvenca CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca sadrži VASNLET (SEQ ID NO: 5), sekvenca CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca sadrži QQYDNLP (SEQ ID NO: 6).

[0019] U jednom otelotvorenju, sintetičko, rekombinantno ili izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sposoban za specifično vezivanje za antigen RSV F sadrži a. sekvencu CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu DYIIN (SEQ ID NO: 9), i

b. sekvencu CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu GIIPVLGTVHYGPKFQG (SEQ ID NO: 10), i

c. sekvencu CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu ETALVVSTTYRPHYFDN (SEQ ID NO: 11), i

d. sekvencu CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu QASQDIVNYLN (SEQ ID NO: 4), i

e. sekvencu CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu VASNLET (SEQ ID NO: 5), i

f. CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu QQYDNLP (SEQ ID NO: 6).

[0020] U drugom otelotvorenju, sintetičko, rekombinantno ili izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sposoban za specifično vezivanje za antigen RSV F sadrži a. sekvencu CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu DYIIN (SEQ ID NO: 9), i

b. sekvencu CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu GIIPVLGTVHYGPKFQG (SEQ ID NO: 10), i

c. sekvencu CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu ETALVVSTTYLPHYFDN (SEQ ID NO: 3), i

d. sekvencu CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu QASQDIVNYLN (SEQ ID NO: 4), i

e. sekvencu CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu VASNLET (SEQ ID NO: 5), i

f. CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu QQYDNLP (SEQ ID NO: 6).

[0021] U daljem otelotvorenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment ima Fc region koji ima Y na poziciji 252Y, T na poziciji 254T i E na poziciji 256, pri čemu numeracija odgovara Kabatovom EU indeksu.

[0022] U još daljem otelotvorenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment je za upotrebu u postupku inhibiranja infekcije putem RSV kod ispitanika, i sastoji se od primene na ispitaniku ovde opisanog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta.

[0023] U skladu sa ovde datim razmatranjem, opisana je sintetička, rekombinantna ili izolovana sekvenca nukleinske kiseline koja kodira ovde opisano antitelo ili njegov antigenvezujući fragment.

[0024] Dodatni ciljevi i prednosti biće delom predstavljeni u opisu koji sledi, a delom će biti očigledni iz opisa, ili se mogu naučiti u praksi. Ciljevi i prednosti će biti ostvareni i pribavljeni putem elemenata i kombinacija posebno istaknutih u priloženim zahtevima.

[0025] Jasno je da i prethodni opšti opis i sledeći detaljan opis služe samo u svrhu primera i pojašnjenja.

[0026] Prateće slike čine deo ove specifikacije, ilustruju jedno otelotvorenje (nekoliko otelotvorenja) i, zajedno sa opisom, služe za objašnjavanje ovde opisanih principa.

KRATAK OPIS SLIKA

[0027]

Slike 1A i B predstavljaju prikaz sekvence teškog lanca D25 i nekoliko varijanti teškog lanca (J, L i LA).

Slika 2 predstavlja prikaz sekvence teškog lanca nekoliko optimizovanih varijanti (1G7, 1F5, 2D10).

Slike 3A i B predstavljaju prikaz sekvence teškog lanca četiri dodatne varijante optimizovane varijante 1G7. Varijante (1G7-GLM, B12-1, E3-5 i E9-2) načinjene su da izmene pI putem inkorporisanja ostataka germinativne linije.

Slike 4A i B prikazuju in vitro aktivnost D25 i nekoliko varijanti u testu mikroneutralizacije. Slike 5A i B prikazuju da D25 i nekoliko varijanti nude zaštitu od izazova podtipa RSV A2 i RSV B.

Slika 6 prikazuje rezultate izazova pamučnog pacova putem RSV A2 kod životinja tretiranih sa 1G7, 1F5, D25 (označeno na slici kao D25wt), ili bez antitela.

Slike 7A i B prikazuju da 1G7 štiti i od RSV A2 i od RSV B9320. Plućni titri RSV su nacrtani kao funkcija serumske koncentracije humanog IgG u vreme sakupljanja.

Slike 8A i B prikazuju neutralizaciju RSV A2 i RSV B9320 različitim antitelima.

Slike 9A i B prikazuju epitop za vezivanje 1G7 kako je definisan mutantima rezistentnim na monoklonsko antitelo.

Slika 10 prikazuje rezultate testa neutralizacije protiv kliničkih izolata RSV.

OPIS SEKVENCI

[0028] Tabela 1 obezbeđuje spisak određenih sekvenci navedenih u predmetnim

otelotvorenjima.

Tabela 1

1 Tabela 1

Tabela 1

OPIS OTELOTVORENJA

I. Antitela ili njihov antigen-vezujući fragment

[0029] Obezbeđena su unapređena RSV-specifična antitela ili njihov antigen-vezujući fragment sa unapređenim svojstvima u poređenju sa drugim antitelima. Antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti uključuju, ali nisu ograničeni na, poliklonska, monoklonska, humana, humanizovana ili himerna antitela, jednolančana antitela, epitop-vezujuće fragmente, npr. Fab, Fab' i F(ab')2, Fd, Fvs, jednolančane Fv (scFv), jednolančana antitela, disulfidno povezane Fv (sdFv), fragmente koji sadrže VL ili VH domen, fragmente proizvedene od strane biblioteke ekspresije Fab. Molekuli scFv su poznati u struci i opisani su, npr., u US patentu 5,892,019. Molekuli imunoglobulina ili antitela obuhvaćeni ovim otkrićem mogu biti bilo kog tipa (npr. IgG, IgE, IgM, IgD, IgA i IgY), klase (npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2) ili potklase molekula imunoglobulina.

[0030] Na primer, pronalazači su uspeli da kreiraju RSV-specifična antitela sa poboljšanim karakteristikama u odnosu na prethodna RSV-specifična antitela, uključujući poboljšanu zaštitu od podtipova RSV A i podtipova RSV B, poboljšanu neutralizaciju i niže vrednosti IC50. Takva antitela imaju posebno visok ili jak afinitet prema RSV, i stoga su naročito pogodna za neutralizaciju i/ili barem delimičnu prevenciju infekcije putem RSV i/ili neželjenih dejstava infekcije putem RSV. Antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti su sinonim za RSV-specifične vezujuće molekule, i uključuju sva antitela pune dužine ili delove antitela koji su sposobni da specifično vezuju RSV.

A. Antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti sa negerminativnim ostacima promenjenim u germinativne ostatke

[0031] U jednom otelotvorenju, najmanje jedan negerminativni ostatak varijabilnog regiona teškog lanca D25 (SEQ ID NO: 7) promenjen je u germinativni ostatak. U drugom otelotvorenju, najmanje 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ili 12 negerminativnih ostataka varijabilnog regiona teškog lanca D25 je vraćeno u germinativni ostatak. U daljem otelotvorenju, najmanje jedan negerminativni ostatak može biti promenjen u germinativni ostatak i najmanje jedna pozicija CDR može biti modifikovana u odnosu na SEQ ID NO: 7.

[0032] U jednom otelotvorenju, varijabilni region teškog lanca je najmanje 99% identičan sa SEQ ID NO: 15.

[0033] U jednom otelotvorenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži sekvencu CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži sekvencu koja se razlikuje za jednu ili dve aminokiseline od ETALVVSTTYLPHYFDN (SEQ ID NO: 3) ili ETALVVSTTYRPHYFDN (SEQ ID NO: 11).

1

[0034] U skladu sa pronalaskom, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže sve identične CDR kao SEQ ID NO: 8 (laki lanac).

[0035] U jednom otelotvorenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži sekvencu CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži DYIIN (SEQ ID NO: 9).

[0036] U jednom otelotvorenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži sekvencu CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži GIIPVLGTVHYGPKFQG (SEQ ID NO: 10).

[0037] U jednom otelotvorenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži sekvencu CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži ETALVVSTTYLPHYFDN (SEQ ID NO: 3) ili ETALVVSTTYRPHYFDN (SEQ ID NO: 11).

[0038] U jednom otelotvorenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži sekvencu CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži DYIIN (SEQ ID NO: 9), sekvencu CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži GIIPVLGTVHYGPKFQG (SEQ ID NO: 10) i sekvencu CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži ETALVVSTTYLPHYFDN (SEQ ID NO: 3) ili ETALVVSTTYRPHYFDN (SEQ ID NO: 11).

[0039] U skladu sa pronalaskom, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži sekvencu CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži QASQDIVNYLN (SEQ ID NO: 4), sekvencu CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži VASNLET (SEQ ID NO: 5) i sekvencu CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži QQYDNLP (SEQ ID NO: 6).

[0040] U skladu sa pronalaskom, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži sekvencu CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži DYIIN (SEQ ID NO: 9), sekvencu CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži GIIPVLGTVHYGPKFQG (SEQ ID NO: 10), sekvencu CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži ETALVVSTTYLPHYFDN (SEQ ID NO: 3) ili ETALVVSTTYRPHYFDN (SEQ ID NO: 11), sekvencu CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži QASQDIVNYLN (SEQ ID NO: 4), sekvencu CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži VASNLET (SEQ ID NO: 5) i sekvencu CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži QQYDNLP (SEQ ID NO: 6).

[0041] U jednom otelotvorenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu koja je u regionima okvira identična sa SEQ ID NO: 15.

[0042] U jednom otelotvorenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži sledeće aminokiseline u varijabilnom regionu teškog lanca koje se razlikuju od SEQ ID NO: 7:

U skladu sa pronalaskom, razlike obezbeđene u tabeli 2 nisu jedine razlike u odnosu na SEQ ID NO: 7. U skladu sa pronalaskom, varijabilni region lakog lanca sadrži SEQ ID NO: 8.

[0043] U skladu sa pronalaskom, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži sledeće aminokiseline u varijabilnom regionu teškog lanca koje se razlikuju od SEQ ID NO: 7:

1

U skladu sa pronalaskom, razlike obezbeđene u tabeli 3 nisu jedine razlike u odnosu na SEQ ID NO: 7. U skladu sa pronalaskom, varijabilni region lakog lanca sadrži SEQ ID NO: 8.

[0044] U skladu sa pronalaskom, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži barem sledeće aminokiseline u varijabilnom regionu teškog lanca koje se razlikuju od SEQ ID NO: 7:

U skladu sa pronalaskom, razlike obezbeđene u tabeli 4 nisu jedine razlike u odnosu na SEQ ID NO: 7. U skladu sa pronalaskom, varijabilni region lakog lanca sadrži SEQ ID NO: 8.

[0045] U skladu sa pronalaskom, antitelo ili antigen-vezujući fragment sadrži sledeće aminokiseline u varijabilnom regionu teškog lanca koje se razlikuju od SEQ ID NO: 7:

1

U skladu sa pronalaskom, razlike obezbeđene u tabeli 5 nisu jedine razlike u odnosu na SEQ ID NO: 7. U skladu sa pronalaskom, varijabilni region lakog lanca sadrži SEQ ID NO: 8.

[0046] U jednom otelotvorenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži sledeće aminokiseline u varijabilnom regionu teškog lanca koje se razlikuju od SEQ ID NO: 7:

1

7. U skladu sa pronalaskom, razlike obezbeđene u tabeli 6 nisu jedine razlike u odnosu na SEQ ID NO: 7. U skladu sa pronalaskom, varijabilni region lakog lanca sadrži SEQ ID NO: 8.

[0047] U skladu sa pronalaskom, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži sekvencu koja je najmanje 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 15. U skladu sa pronalaskom, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži sekvencu koja je najmanje 99% ili 100% identična sekvenci okvira (tj. ne-CDR sekvenca) SEQ ID NO: 15.

[0048] U skladu sa pronalaskom, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži sekvencu koja je identična sa sekvencom DIQMTQSPSSLSAAVGDRVTIT

[0049] U jednom otelotvorenju, primenjena je konzervativna aminokiselinska supstitucija. Konzervativna aminokiselinska supstitucija uključuje supstituciju jedne aminokiseline drugom sa uopšteno sličnim karakteristikama (veličina, hidrofobnost, itd.) tako da ukupno funkcionisanje nije ozbiljno ugroženo.

B. Antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti sa unapređenim CDR

[0050] U skladu sa pronalaskom, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži prve dve ili sve tri promene u tabeli 7.

1

C. Antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti sa poboljšanim poluživotom [0051] U jednom otelotvorenju, mogu se načiniti dodatne izmene ovde opisanih antitela ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata radi poboljšanja njihovog poluživota. U jednom otelotvorenju, mutacije poput mutacija delecije, adicije ili supstitucije mogu se napraviti u antitelima ili njihovim antigen-vezujućim fragmentima radi poboljšanja njihovog poluživota. U jednom otelotvorenju, Fc region može biti mutiran da uključuje jednu, dve, ili sve tri od sledećih supstitucija M252Y, S254T i T256E, pri čemu numeracija odgovara Kabatovom EU indeksu. U jednom otelotvorenju, Fc region može biti mutiran da uključuje sve sledeće supstitucije M252Y, S254T i T256E, pri čemu numeracija odgovara Kabatovom EU indeksu. Dall'Acqua i sar. Properties of Human IgG1s Engineered for Enhanced Binding to the Neonatal Fc Receptor (FcRn), J Biol Chem 281(33):23514-23524 (2006). Otelotvorenje sa sve tri supstitucije je označeno kao varijanta YTE. Drugačije izraženo, u jednom otelotvorenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment ima Fc region koji ima Y na poziciji 252Y, T na poziciji 254T i E na poziciji 256, pri čemu numeracija odgovara Kabatovom EU indeksu.

D. Ostale karakteristike antitela i njihovih antigen-vezujućih fragmenata

[0052] U određenom otelotvorenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment ima IC50 vrednost manju od 10 ng/ml u in vitro testu neutralizacije, pri čemu su HEp-2 ćelije inficirane sa RSV. U drugom otelotvorenju, IC50 je 9 ng/ml, 8 ng/ml, 7 ng/ml, 6 ng/ml, 5 ng/ml, 4 ng/ml, 3 ng/ml ili 2 ng/ml ili manje za RSV podtipa A i/ili RSV podtipa B. U jednom otelotvorenju, IC50 je izmerena u in vitro testu neutralizacije opisanom u primerima, opciono za RSV A2 i/ili RSV B9320.

[0053] . U skladu sa pronalaskom, antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti su efikasni u neutralizaciji RSV sojeva podtipa A i B.

[0054] Kako se ovde koristi, termin antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koristi se u najširem smislu. Može biti veštačko, kao monoklonska antitela (mAb) proizvedena konvencionalnom tehnologijom hibridoma, rekombinantnom tehnologijom i/ili njihov antigen-vezujući fragment. Može uključivati netaknute molekule imunoglobulina, na primer, poliklonsko antitelo, monoklonsko antitelo (mAb), monospecifično antitelo, bispecifično antitelo, polispecifično antitelo, humano antitelo, humanizovano antitelo, životinjsko antitelo (npr. antitelo kamelida), himerna antitela, kao i njihove delove, fragmente, regione, peptide i

1

derivate (dobijene bilo kojom poznatom tehnikom, kao što su, bez ograničavanja, enzimsko cepanje, sinteza peptida ili rekombinantne tehnike), kao što je, na primer, imunoglobulin bez lakih lanaca, Fab, Fab', F (ab')2, Fv, scFv, fragment antitela, dijatelo, Fd, CDR regioni ili bilo koji deo ili peptidna sekvence antitela sposobna za vezivanje antigena ili epitopa. U jednom otelotvorenju, njegov antigen-vezujući fragment je jednolančano antitelo, jednolančani varijabilni fragment (scFv), Fab fragment ili F(ab')2fragment.

[0055] Za antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment se kaže da je „sposobno da vezuje“ molekul ako je sposobno da specifično reaguje sa molekulom kako bi time vezalo molekul za antitelo. Fragmenti ili delovi antitela možda nemaju Fc fragment netaknutog antitela, brže nestaju iz krvotoka, i mogu imati manje nespecifično vezivanje tkiva nego netaknuto antitelo. Primeri antitela se mogu proizvesti od netaknutih antitela korišćenjem postupaka koji su dobro poznati u struci, na primer, proteolitičkim cepanjem sa enzimima kao što je papain (za proizvodnju Fab fragmenata) ili pepsin (za proizvodnju F(ab')2fragmenata). Delovi antitela se mogu napraviti bilo kojim od prethodnih postupaka, ili se mogu napraviti eksprimiranjem dela rekombinantnog molekula. Na primer, CDR region(i) rekombinantnog antitela mogu se izolovati i subklonirati u odgovarajući ekspresioni vektor.

[0056] U jednom otelotvorenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment je humano antitelo ili fragment antitela. Korišćenje humanih antitela za lečenje ljudi može smanjiti mogućnost neželjenih dejstava usled imunološke reakcije kod ljudskog pojedinca na nehumane sekvence. U drugom otelotvorenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment je humanizovan. U drugom otelotvorenju, antitelo ili njegov-antigen-vezujući fragment je himerno antitelo. Na taj način, željena sekvenca, kao što je, na primer, željeno mesto vezivanja, može se uključiti u antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment.

[0057] U jednom otelotvorenju, antitelo može imati IgG, IgA, IgM ili IgE izotip. U jednom otelotvorenju, antitelo je IgG.

II. Nukleinske kiseline koje kodiraju antitela i njihove antigen-vezujuće fragmente [0058] Predmetno razmatranje dalje otkriva sekvencu izolovane, sintetičke ili rekombinantne nukleinske kiseline koja kodira bilo koje od antitela ili njegovih antigen-vezujućih fragmenata prethodno opisanih u odeljku I.A ili I.B. Takva nukleinska kiselina je, na primer, izolovana iz B-ćelije koja je sposobna da proizvodi antitelo ili funkcionalni deo. Takve

2

nukleinske kiseline kodiraju ovde iznete sekvence teškog i lakog lanca. Alternativno, takve nukleinske kiseline kodiraju sekvence teškog i lakog lanca koje sadrže CDR teškog, odnosno lakog lanca, koje su ovde iznete. U nekim razmatranjima, nukleinske kiseline će kodirati antigen-vezujuće fragmente ovde opisanih antitela. Usled degeneracije koda nukleinske kiseline, više nukleinskih kiselina će kodirati istu aminokiselinu, i sve su obuhvaćene ovim tekstom.

III. Postupci upotrebe

A. Postupci upotrebe antitela ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata

[0059] U jednom otelotvorenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment mogu se koristiti u postupku lečenja ili kao lek. Postupak se može koristiti za neutralisanje ili barem delimičnu prevenciju infekcije putem RSV, ili za neutralisanje ili barem delimičnu prevenciju neželjenih dejstava infekcije putem RSV. Postupak se takođe sastoji od primene na pojedincu kome je to potrebno terapeutski efikasne količine antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, kako je ovde opisano. U jednom otelotvorenju, pojedinac kome je to potrebno je ljudski pacijent.

[0060] U jednom otelotvorenju, kako bi se neutralisao RSV, antitelo ili njegov antigenvezujući fragment se mogu davati pojedincu pre nego što dođe do infekcije putem RSV, drugim rečima, kao profilaktički agens. Alternativno, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment se mogu primenjivati kada je pojedinac već inficiran sa RSV. Pomenuto antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment se mogu davati pojedincima sa povećanim rizikom od infekcije putem RSV, kao što su, na primer, prevremeno rođena deca, osobe sa hroničnom bolešću pluća, kongenitalnom bolešću srca i/ili oslabljenim imunitetom, deca mlađa od 6 nedelja. Prevremeno rođena deca uključuju i novorođenčad u prvoj godini života, kao i decu u drugoj godini života i stariju decu kod koje i dalje postoji rizik od infekcije putem RSV. Takođe, starije osobe imaju povećan rizik od infekcije putem RSV, te tako mogu biti ciljane za primenu na osnovu rizika. Antitela ili njihov antigen-vezujući fragment takođe se mogu primeniti kod pojedinaca koji su prethodno imali infekciju putem RSV.

[0061] Za terapeutsku primenu, antitela ili njihov antigen-vezujući fragment se tipično kombinuju sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, adjuvansom, razblaživačem i/ili ekscipijensom. U jednom otelotvorenju, antitela ili njihov antigen-vezujući fragment se kombinuju sa vodom za injekciju. U drugom otelotvorenju, pripremaju se u sterilnom tečnom rastvoru bez konzervanasa sa histidinom, glicinom i hloridom. U drugom otelotvorenju, primeri pogodnih nosača, na primer, sadrže hemocijanin školjke Megathura crenulata (keyhole limpet haemocyanin, KLH), serumski albumin (npr. BSA ili RSA) i ovalbumin. U drugom otelotvorenju, pomenuti pogodni nosač sadrži rastvor, kao što je, na primer, fiziološki rastvor. U drugim otelotvorenjima, antitela ili njihov antigen-vezujući fragment obezbeđena su u liofilizovanom obliku i mešaju se sa vodom za injekciju pre primene.

B. Postupci primene nukleinskih kiselina koje kodiraju antitela i njihove antigenvezujuće fragmente

[0062] U još jednom razmatranju, može da se primeni nukleinska kiselina koja kodira antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment. Nakon primene takve nukleinske kiseline, antitela ili njihov antigen-vezujući fragment se proizvode od strane organizma domaćina. Proizvedena antitela ili njihov antigen-vezujući fragment su sposobni za prevenciju i/ili neutralisanje RSV infekcije i/ili neželjenih dejstava RSV infekcije.

IV. Postupci pravljenja antitela i njihovih antigen-vezujućih fragmenata

[0063] Takođe se razmatra izolovana ćelija koja proizvodi antitelo sposobna za proizvodnju antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta. Ovde opisana antitela ili njihov antigenvezujući fragment mogu se proizvesti iz hibridoma koji luči antitelo, ili iz rekombinantno proizvedene ćelije koja je transformisana ili transficirana genom ili genima koji kodiraju antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment.

[0064] Jedno razmatranje uključuje postupak za proizvodnju antitela ili njegovog antigenvezujućeg fragmenta putem uzgajanja ćelija domaćina u uslovima u kojima je nukleinska kiselina eksprimirana da proizvede antitelo, nakon čega sledi izolovanje antitela. Različite ćelijske linije mogu da se koriste za eksprimiranje antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, uključujući, bez ograničenja, ćelijske linije sisara. U jednom razmatranju, ćelijske linije mogu biti ljudske. U drugom razmatranju, mogu se koristiti ćelijske linije bakterija ili insekata. U jednom razmatranju, ćelijske linije uključuju ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), varijante CHO ćelija (na primer, DG44), 293 ćelije i NSO ćelije. U drugom otelotvorenju, ćelijske linije uključuju VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293F, 293T, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O i T47D, CRL7O3O i HsS78Bst ćelije.

[0065] Rekombinantna ekspresija koristi konstruisanje ekspresionog vektora koji sadrži polinukleotid koji kodira antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment. Kada se dobije polinukleotid, vektor za proizvodnju antitela može biti proizveden pomoću tehnologije rekombinantne DNK koja je dobro poznata u struci. Ekspresioni vektori mogu da uključuju odgovarajuće transkripcione i translacione kontrolne signale. To se može postići korišćenjem tehnika in vitro rekombinantne DNK, sintetičkih tehnika i in vivo genske rekombinacije. U jednom otelotvorenju, vektor koji se može replikovati sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment operabilno povezan sa heterologim promoterom.

[0066] Različiti sistemi ekspresionog vektora domaćina mogu da se koriste za eksprimiranje antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, kao što je opisano u U.S. Pat. br.

5,807,715. Na primer, ćelije sisara, kao što su ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), povezane sa vektorom, kao što je glavni element srednjeg ranog genskog promotera iz humanog citomegalovirusa, predstavljaju efikasan ekspresioni sistem za antitela (Foecking i sar. Gene, 45:101 (1986); i Cockett i sar. Bio/Technology, 8:2 (1990)). Pored toga, može biti odabran soj ćelije domaćina koji moduliše ekspresiju umetnutih sekvenci, ili modifikuje i obrađuje genski proizvod na specifičan željeni način. Takve modifikacije (npr. glikozilacija) i obrada (npr. cepanje) proteinskih proizvoda mogu biti važne za funkciju proteina. Različite ćelije domaćini imaju karakteristike i specifične mehanizme za posttranslacionu obradu i modifikaciju proteina i genskih proizvoda. Odgovarajuće ćelijske linije ili sistemi domaćina mogu se izabrati da se osigura ispravno modifikovanje i obrada proteina iz pronalaska. U tu svrhu, može se koristiti eukariotska ćelija domaćin koja ima ćelijsku aparaturu za odgovarajuću obradu primarnog transkripta, glikozilaciju i fosforilaciju genskog proizvoda.

[0067] U bakterijskim sistemima, broj ekspresionih vektora može se izabrati u zavisnosti od upotrebe nameravane za antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se eksprimiraju. Na primer, kada treba proizvesti veliku količinu takvog antitela ili njegovog antigenvezujućeg fragmenta, za stvaranje farmaceutskih kompozicija koje sadrže antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment mogu biti poželjni vektori koji usmeravaju ekspresiju visokih nivoa proizvoda fuzionog proteina koji se lako prečišćavaju. Takvi vektori uključuju, ali nisu ograničeni na, pUR278 ekspresioni vektor E. coli (Ruther i sar. EMBO, 12:1791 (1983)), u kome kodirajuće sekvence mogu biti pojedinačno ligirane u vektor u okviru sa lac Z kodirajućim regionom tako da se proizvodi fuzioni protein; pIN vektore (Inouye i Inouye,

2

1985, Nucleic Acids Res.13:3101-3109 (1985); Van Heeke i Schuster, 1989, J. Biol. Chem., 24:5503-5509 (1989)); i slično. pGEX vektori se takođe mogu koristiti za ekspresiju stranih polipeptida kao fuzionih proteina sa glutation-S-transferazom (GST). Uopšteno, takvi fuzioni proteini su rastvorljivi i mogu se lako prečistiti iz liziranih ćelija putem adsorpcije i vezivanja za afinitetnu matricu glutation-agaroza, a zatim eluiranjem u prisustvu slobodnog glutationa. pGEX vektori su konstruisani da uvedu trombin i/ili mesta cepanja proteazom faktora Xa u eksprimirani polipeptid, tako da klonirani ciljni genski proizvod može da se otpusti iz GST ostatka.

[0068] U sistemu insekta, virus nuklearne polihedroze Autographa californica (AcNPV) koristi se kao vektor za ekspresiju stranih gena. Virus raste u ćelijama Spodoptera frugiperda. Sekvenca koja kodira protein se može klonirati individualno u neesencijalne regione (na primer, gen polihedrin) virusa i staviti pod kontrolu AcNPV promotera (na primer, polihedrinskog promotera).

[0069] U ćelijama domaćina sisara, mogu da se koriste brojni ekspresioni sistemi na bazi virusa. U slučajevima kada se adenovirus koristi kao ekspresioni vektor, željene kodirajuće sekvence mogu da se ligiraju u transkripcioni/translacioni kontrolni kompleks adenovirusa, npr. kasni promoter i trostruka vodeća sekvenca. Ovaj himerni gen se zatim može umetnuti u genom adenovirusa putem in vitro ili in vivo rekombinacije. Umetanje u neesencijalni region virusnog genoma (npr. region E1 ili E3) daće rekombinantni virus koji je vijabilan i sposoban da eksprimira antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment u inficiranim domaćinima (npr. vidite Logan i Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:355-359 (1984)). Specifični signali za inicijaciju mogu takođe biti potrebni za efikasnu translaciju kodirajućih sekvenci umetnutog antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta. Ovi signali uključuju ATG kodon za inicijaciju i susedne sekvence. Nadalje, kodon za inicijaciju bi generalno trebalo da bude u okviru sa okvirom za čitanje željene kodirajuće sekvence kako bi se obezbedila translacija celog inserta. Ovi egzogeni translacioni kontrolni signali i kodoni za inicijaciju mogu biti različitog porekla, i prirodni i sintetički. Efikasnost ekspresije se može pojačati inkluzijom odgovarajućih elemenata pojačavanja transkripcije, terminatora transkripcije, itd. (vidite, npr. Bittner i sar. Methods in Enzymol., 153:51-544(1987)).

[0070] Stabilna ekspresija se može koristiti za dugoročnu proizvodnju rekombinantnih proteina sa visokim prinosom. Na primer, mogu da se stvore ćelijske linije koje stabilno eksprimiraju molekul proteina. Ćelije domaćini mogu da se transformišu sa prikladno konstruisanim vektorom koji sadrži ekspresione kontrolne elemente (npr. promoter, pojačivač, terminatore transkripcije, mesta poliadenilacije, itd.) i selektabilni marker gen. Nakon uvođenja strane DNK, ćelije mogu da se ostave da rastu 1-2 dana u obogaćenom medijumu, a zatim se prebacuju u selektivni medijum. Selektabilni marker u rekombinantnom plazmidu daje otpornost selekciji i omogućava da ćelije koje su stabilno integrisale plazmid u svoje hromozome rastu i formiraju fokuse koji se zauzvrat mogu klonirati i proširiti u ćelijske linije. Plazmidi koji kodiraju antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment mogu da se koriste za uvođenje gena/kDNK u bilo koju ćelijsku liniju pogodnu za proizvodnju u kulturi.

[0071] Mogu se koristiti brojni selekcioni sistemi, uključujući, bez ograničenja, gene timidin kinaze virusa herpes simpleks (Wigler i sar. Cell, 11:223 (1977)), hipoksantinguanin fosforiboziltransferaze (Szybalska i Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48:202 (1992)) i adenin fosforiboziltransferaze (Lowy i sar. Cell, 22:8-17 (1980)), koji se mogu koristiti u tk-, hgprt-, odnosno aprT-ćelijama. Takođe, otpornost antimetabolita se može koristiti kao osnova za izbor sledećih gena: dhfr, koji daje otpornost na metotreksat (Wigler i sar. Natl. Acad. Sci. USA, 77:357 (1980); O'Hare i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:1527 (1981)); gpt, koji daje otpornost na mikofenolnu kiselinu (Mulligan i Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:2072 (1981)); neo, koji daje otpornost na aminoglikozid G-418 (Wu i Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol.32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); i Morgan i Anderson, Ann. Rev. Biochem.62:191-217 (1993); May, TIB TECH 11(5):155-215 (1993)); i higro, koji daje otpornost na higromicin (Santerre i sar. Gene, 30:147 (1984)). Postupci uobičajeno korišćeni u oblasti tehnologije rekombinantne DNK se mogu rutinski primenjivati za izbor željenog rekombinantnog klona, i takvi postupci su opisani, na primer, u Ausubel i sar. (izd.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); i u poglavljima 12 i 13, Dracopoli i sar. (izd.), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin i sar.1981, J. Mol. Biol., 150:1.

[0072] Kada se antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment proizvedu rekombinantnom ekspresijom, mogu se prečistiti bilo kojim postupkom poznatim u struci za prečišćavanje molekula imunoglobulina, na primer, putem hromatografije (npr. jonoizmenjivačke,

2

afinitetne, posebno afinitetne za specifične antigene protein A ili protein B, i gel hromatografije), centrifugiranja, diferencijalne rastvorljivosti, ili bilo kojom drugom standardnom tehnikom za prečišćavanje proteina. Nadalje, proteini iz predmetnog pronalaska ili njihovi antigen-vezujući fragmenti se mogu spojiti sa sekvencama heterologog polipeptida koje su ovde opisane ili inače poznate u struci kako bi se olakšalo prečišćavanje.

[0073] U nekim razmatranjima, stvorene su ćelije koje proizvode RSV-specifično antitelo koje su stabilne najmanje šest meseci. U drugom razmatranju, ćelija koja proizvodi RSV-specifično antitelo je stabilna najmanje devet nedelja, najmanje tri meseca ili najmanje šest meseci. U drugom razmatranju, alternativni postupci za pravljenje antitela i njihovih antigenvezujućih fragmenata su dobro poznati u struci i opisani barem u US Pat. br.8,562,996.

[0074] Sada će biti načinjen detaljan osvrt na primere predmetnih otelotvorenja, čiji su primeri ilustrovani u pratećim slikama. Kad god je to moguće, isti referentni brojevi će se koristiti u slikama kako bi se ukazalo na iste ili slične delove. Druga otelotvorenja će biti očigledna osobama sa znanjem u struci usled razmatranja ovde prikazane specifikacije i prakse. Otelotvorenja su dalje objašnjena u sledećim primerima. Ovi primeri ne ograničavaju opseg zahteva, već služe isključivo da objasne određena otelotvorenja.

PRIMERI

Primer 1. Priprema i ekspresija monoklonskih antitela

[0075] Fragmenti DNK varijabilnog lakog lanca (VL) i varijabilnog teškog lanca (VH) 1G7 imunoglobulina, pri čemu oba sadrže željene mutacije koje poboljšavaju potentnost antitela, umetnuti su u ekspresioni vektor humanog IgG1 koji sadrži konstantni region kapa lakog lanca i teški konstantni region CH1-šarka-CH2-CH3 IgG1. Da bi eksprimirale 1G7 antitelo, 293 F-ćelije bubrega humanog embriona su tranzijentno transficirane vektorom koji sadrži 1G7 upotrebom reagensa 293Fectin™ (Invitrogen, Carlsbad, CA). Ćelije su uzgajane na 37°C, 120 o/min sa 5% CO2i 80% vlažnosti. Medijum za uzgajanje je napojen drugog dana dodavanjem jednake zapremine medijuma i sakupljen 10 dana nakon transfekcije.

Supernatant je sterilno filtriran kako bi se uklonile ćelije i otpad. IgG je prečišćen korišćenjem kolone proteina A (Hi-trap kolona proteina A, Sigma) i eluirani protein je dijalizovan nasuprot PBS preko noći na 4°C. Koncentracija IgG je određena kvantifikovanjem proteina pomoću uređaja NanoDrop (Thermo Scientific).

2

[0076] Isti pristup je korišćen za proizvodnju drugih antitela.

Primer 2. In vitro test mikroneutralizacije

[0077] Testovi mikroneutralizacije su obavljeni na sledeći način: Ukratko, 2-struka serijska razblaženja MAb su uvedena u mikrotitarske ploče sa 384 bunarčića u medijumu za uzgajanje HEp-2 ćelija u zapremini od 15 µl/bunarčiću. Nakon toga, 15 µl RSV A2 ili RSV B 9320 virusa je razblaženo u medijumu za uzgajanje HEp-2 ćelija do koncentracije u rasponu od 80 do 150 pfu/bunarčiću i dodato je u svaki bunarčić, uključujući kontrolne bunarčiće koji sadrže samo medijum za uzgajanje HEp-2 ćelija, i ploče su inkubirane tokom 1,5 sata na 37°C sa 5% CO2. HEp-2 ćelije su dodate pri 2,5 x 10<5>ćelija/ml u 30 µl u svaki bunarčić, i ploče su inkubirane na 37°C sa 5% CO2. Nakon 3 dana za RSV A2 ili 4 dana za RSV B9320, medijum je uklonjen i 30 µl ledeno hladnog 80% acetona/20% PBS je dodato za fiksiranje ćelija.

[0078] Virusna replikacija je izmerena testom sa imunosorbentom vezanim za enzim (ELISA) korišćenjem anti-RSV F MAb spojenog sa peroksidazom rena koji cilja C mesto RSV F (1331H) (Beeler i van Wyke Coelingh, J Virol.63(7):2941-2950 (1989).1331H MAb je razblaženo 1:6.000 u PBS i 30 µl je dodato u svaki bunarčić. Nakon dva sata inkubacije na 37°C, ploče su tri puta isprane sa PBS-T.30 µl TMB peroksidaze je dodato u svaki bunarčić, i ploče su inkubirane na sobnoj temperaturi u mraku tokom 15 minuta. Reakcija je prekinuta dodavanjem 15 µl 2N H2SO4 u svaki bunarčić. Promet supstrata je meren praćenjem apsorbance na 450 nm korišćenjem čitača mikroploče. Vrednosti IC50 su izračunate koristeći algoritam za nelinearno podešavanje softvera Graphpad Prism, koristeći podešavanje krive sa promenljivim nagibom log (inhibitor) prema odgovoru, i predstavljaju koncentraciju MAb potrebnu za 50% smanjenje apsorbance izmerene na 450 nm.

[0079] Rezultati su obezbeđeni na Slici 4, koja prikazuje da su 1G7, 1F5, 2D10 i D25 inhibirali replikaciju RSV A2 i RSV B9320 u mikroneutralizaciji. Najefikasniji je bio 1G7, nakon toga 1F5, 2D10, a zatim D25.

Primer 3. Model RSV pamučnog pacova

A) Poređenje sposobnosti varijanti D25, J, L, i LA da zaštite od RSV izazova

[0080] Životinje su dozirane sa 0,1 ml antitela intramuskularnom injekcijom pri različitim doznim nivoima prikazanim na slici. Dvadeset četiri sata kasnije, životinje su anestezirane

2

korišćenjem komore izoflurana i inficirane intranazalnom instilacijom 1×10<6>pfu/životinji RSV soja A2. Nakon četiri dana, životinje su žrtvovane gušenjem ugljen dioksidom, pluća su im hirurškim putem uklonjena, bisecirana i zamrznuta u tečnom azotu, ili su odmah obrađena. Uzorci krvi su dobijeni punkcijom srca u vreme žrtvovanja.

[0081] Da bi se procenio efekat primene MAb na replikaciju RSV u plućima pamučnih pacova, virusni titar RSV u homogenatima pluća pamučnog pacova je određen za svaku doznu grupu. U tu svrhu, sakupljena pluća su pojedinačno homogenizovana u 10 delova (masa/zapremina) uravnoteženog Henksovog rastvora soli sa saharoza fosfatom koristeći homogenizator tkiva Fast Prep 24 tokom 20 sekundi sa epruvetama TeenALysing Matrix na sobnoj temperaturi. Dobijene suspenzije su centrifugirane na 930 × g tokom 10 min na 4°C, i supernatanti su sakupljeni i uskladišteni na - 80°C do analize. Uzorci homogenizata pluća su razblaženi 1:10 i 1:100 u medijumu za uzgajanje, i 50 µl uzorka nerazblaženog ili razblaženog homogenizata pluća je dodato u duple bunarčiće HEp-2 ćelija koje su zasejane pri gustini ćelija od 2,5 × 10<5>ćelija/bunarčiću na pločama sa 24 bunarčića, 24 sata pre inokulacije. Nakon 1 sata inkubacije na 37°C sa 5% CO2, inokulum je zamenjen medijumom za uzgajanje koji sadrži 0,8% metil celuloze, i ćelije su inkubirane na 37°C sa 5% CO2.

Nakon pet dana, gornji sloj je uklonjen, i ćelije su fiksirane i imuno-obojene kozjim anti-RSV poliklonskim antitelom, a zatim anti-kozjim HRP antitelom. Ploče su aktivirane reakcijom sa AEC reagensom. Ploče su kvantifikovane pod mikroskopom, koristeći 10x objektiv. Limit detekcije ovog testa je 200 pfu/g tkiva. Uzorci sa virusnim titrom ispod limita detekcije (< 200 pfu/g) su označeni kao 100 pfu/g (polovina donjeg limita detekcije) radi statističke analize. Rezultati su dati na slici 5, pokazujući da su varijante J, L i LA delotvornije od D25 u zaštititi od izazova RSV A, ali su varijante L i LA manje delotvorne zaštititi od izazova RSV B podtipova ( a L je bolja za jedan soj B nego za drugi). Na osnovu ovih podataka, J je izabran kao polazna tačka za dalju optimizaciju.

B) Poređenje sposobnosti varijanti 1G7, 1F5 i D25 da zaštite od RSV izazova

[0082] Model razmatran iznad u delu (A) ovog primera korišćen je za poređenje sposobnosti 1G7, 1F5 i D25 da zaštite od RSV izazova. Životinje su dozirane sa 2 mg/kg, 1 mg/kg, 0,5 mg/kg i 0,25 mg/kg. Rezultati su prikazani na slici 6. Podaci prikazuju da je 1G7 delovao bolje od 1F5 u zaštiti od RSV izazova, mada su oba mogla da smanje titar virusa do granice detekcije. I 1G7 i 1F5 su se pokazali bolje od D25.

2

C) Detaljna procena 1G7 varijante

[0083] Korišćen je isti model pamučnog pacova kao što je opisano u odeljku (A) iznad.

Svaka životinja je dobila 0,1 ml antitela, pri čemu su prisutne različite koncentracije antitela, kako je prikazano na slici 7.1G7 pokazuje odnos doze i odgovora sa plućnim titrom RSV i za RSV A2 i RSV B9320.

D) Poređenje sposobnosti varijanti da neutrališu RSV A2 i RSV B9320

[0084] Korišćen je isti model pamučnog pacova kao što je opisano u odeljku (A) iznad.

[0085] Koncentracije humanog IgG u uzorcima seruma pamučnog pacova na dan sakupljanja pluća određene su pomoću ELISA testa. U ovom testu, humana antitela su uhvaćena kozjim anti-humanim antitelom vezanim za mikrotitarske ploče. Kozje anti-humano IgG (H L) antitelo (0,5 µg/ml u 1× PBS) naneto je na Nunc Maxisorp mikrotitarske ploče sa 384 bunarčića preko noći na 4°C u zapremini od 30 µl. Ploče su isprane, zatim blokirane sa 60 µl rastvora PBS 3% toplotno inaktiviranog kozjeg seruma tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Pufer za blokiranje je uklonjen i uzorci su naneti na sledeći način: Dvostruko serijsko razblaženje standardnog humanog antitela razblaženog u test puferu korišćeno je za standardnu krivu u koncentracionom opsegu od 500 ng/ml do 0,488 ng/ml. Podešene su standardne krive koristeći 4-parametarsko podešavanje krive.

[0086] Rezultati su dati na slici 8 koja pokazuje da ovde opisane varijante imaju niži IC50 nego D25 u neutralisanju RSV A2 i RSV B9320. To takođe pokazuje da nije bilo gubitka aktivnosti na virus A2 ili B9320 sa povećanom aktivnošću primećenom sa E9-2 i B12-1, i samo nominalni gubitak aktivnosti na virus B9320 sa 1G7 GLM i E3-5.

Primer 4. Antitelo kako je definisano mutantima rezistentnim na monoklonsko antitelo [0087] Mutanti virusa RSV A i RSV B su izolovani trostrukim presejavanjem u prisustvu 250 ng/ml 1G7-YTE. 1G7-YTE je 1G7 antitelo sa YTE mutacijom prethodno opisano u odeljku I.C. Nakon poslednjeg presejavanja, određena je sekvenca F proteina RSV. Mutacije odgovaraju regionima koji su prethodno definisani u kokristalnoj strukturi RSV F sa matičnim D25 antitelom. Svi rezistentni mutanti su sadržali izmene u regionu F proteina RSV u F1 regionu između aminokiselina 200-213. Nije se pokazalo da sekundarne mutacije na poziciji 294 poboljšavaju otpornost, i nisu bile otpornije od onih sa jednom mutacijom u

2

regionu 200-213. Sekundarne mutacije u F2 regionu pozadine mutacije N208S dovele su do poboljšane otpornosti. Rezultati su dati na slici 9.

Primer 5. Neutralizacija na kliničke izolate RSV

[0088] Test neutralizacije je izveden prethodnom inkubacijom ekspandovanih virusa kliničkih izolata sa serijom razblaženja natitela pre infekcije HEp2 ćelija. Infekcija ćelija je izmerena kao funkcija ekspresije F proteina na površini ćelija. Vrednosti IC50 su izračunate nelinearnim podešavanjem krivih neutralizacije. Virusna replikacija je izmerena kao u primeru 2 (in vitro test mikroneutralizacije).

[0089] Rezultati su dati na slici 10. IC50 za 1G7 i 1F5 su niže nego za D25 za neutralizaciju A izolata ili B izolata RSV u HEp2 ćelijama.

1

2

4

4

Claims (5)

1. Patentni zahtevi 1. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, pri čemu antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment specifično vezuje respiratorni sincicijalni virus (RSV) i efikasno je u neutralisanju sojeva RSV podtipa A i B i sadrži: varijabilni region teškog lanca koji je najmanje 98% identičan sa SEQ ID NO: 15 i varijabilni region lakog lanca koji je identičan sa SEQ ID NO: 8, Pri čemu CDR1 sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca sadrži DYIIN (SEQ ID NO: 9), CDR2 sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca sadrži GIIPVLGTVHYGPKFQG (SEQ ID NO: 10), i CDR3 sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca sadrži sekvencu koja je identična sa, ili se razlikuje u jednoj ili dve aminokiseline od, ETALVVSTTYLPHYFDN (SEQ ID NO:3) ili ETALVVSTTYRPHYFDN (SEQ ID NO: 11), i pri čemu varijabilni region teškog lanca dalje sadrži sledeće aminokiseline koje se razlikuju od SEQ ID NO: 7:
2. 2. Antitelo ili antigen-vezujući fragment prema zahtevu 1, koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji je najmanje 99% identičan sa SEQ ID NO: 15.
3. 3. Antitelo ili antigen-vezujući fragment prema zahtevu 1, pri čemu antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži humani IgG1 izotip i sadrži Fc region koji sadrži Y na poziciji 252, T na poziciji 254 i E na poziciji 256, pri čemu numeracija odgovara Kabatovom EU indeksu. 4
4. 4. Antigen-vezujući fragment iz zahteva 1, pri čemu, antigen-vezujući fragment je jednolančano antitelo, jednolančani varijabilni fragment (scFv), Fab fragment ili F(ab')2fragment.
5. 5. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od prethodnih zahteva za korišćenje u postupku za prevenciju ili lečenje infekcije putem RSV.