[go: up one dir, main page]

RS60631B1 - Antitela protiv cd73 i njihova upotreba - Google Patents

Antitela protiv cd73 i njihova upotreba

Info

Publication number
RS60631B1
RS60631B1 RS20200915A RSP20200915A RS60631B1 RS 60631 B1 RS60631 B1 RS 60631B1 RS 20200915 A RS20200915 A RS 20200915A RS P20200915 A RSP20200915 A RS P20200915A RS 60631 B1 RS60631 B1 RS 60631B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
antibody
amino acid
antibodies
human
Prior art date
Application number
RS20200915A
Other languages
English (en)
Inventor
Nils Lonberg
Alan J Korman
Bryan C Barnhart
Aaron P Yamniuk
Mohan Srinivasan
Karla A Henning
Ming Lei
Emanuela Sega
Angela Goodenough
Maria N Jure-Kunkel
Guodong Chen
John Sack
Richard Huang
Martin J Corbett
Joseph E Myers
Liang Schweizer
Sandra V Hatcher
Haichun Huang
Pingping Zhang
Original Assignee
Bristol Myers Squibb Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bristol Myers Squibb Co filed Critical Bristol Myers Squibb Co
Publication of RS60631B1 publication Critical patent/RS60631B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6871—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting an enzyme
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/303—Liver or Pancreas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3038—Kidney, bladder
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046—Stomach, Intestines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3053—Skin, nerves, brain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3061—Blood cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G01N33/5759—
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/72—Increased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/916—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. phosphatases (3.1.3), phospholipases C or phospholipases D (3.1.4)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)

Description

Opis
OBLAST TEHNIKE NA KOJU SE PRONALAZAK ODNOSI
[0001] Klaster diferencijacije 73 (CD73), takođe poznat kao ekto-5'-nukleotidza (ekto-5'NT, EC 3.1.3.5), je glikozil-fosfatidilinozitol (GPI)-povezan enzim ćelijske površine, nalazi se u većini tkiva, ali se posebno eksprimuje u endotelijalnim ćelijama i podskupovima hematopoetskih ćelija (Resta et al., Immunol Rev 1998;161:95-109 i Colgan et al., Prinergic Signal 2006;2:351-60). Poznato je da CD73 katalizuje defosfolrilaciju vanćelijskih nukleozid monofosfata u nukleozide, kao što je adenozin. Adenozin je široko proučavan signalni molekul koji posreduje svoje biološke efekte preko nekoliko receptora, uključujući A1, A2A, A2B, i A3. Pokazano je da adenozin reguliše proliferaciju i migraciju mnogih kancera i da ima imunosupresivni efekat kroz regulaciju anti-tumorskih T ćelija (Zhang et al., Kancer Res 2010;70:6407-11).
Prijavljeno je da je CD73 eksprimiran na mnogim različitim kancerima, uključujući kancere debelog creva, pluća, pankreasa, jajnika, bešike, leukemiju, gliom, glioblastom, melanom, tiroidne žlezde, jednjaka, prostate i dojke (Jin et al., Kancer Res 2010;70:2245-55 i Stagg et al., PNAS 2010;107:1547-52). Štaviše, ekspresija CD73 kod kancera povezana je sa povećanom proliferacijom, migracijom, neovaskularizacijom, invazivnošću, metastazama i kraćim preživljavanjem pacijenata. Aktivnost CD73 takođe je predložena kao prognostički marker u papilarnim karcinomima tiroidee. Dok se pokazalo da CD73 reguliše interakcije ćelija-ćelija i ćelija-matriks na ćelijama tumora, ekspresija i aktivnost CD73 su takođe povezani sa smanjenjem T-ćelijskih odgovora i umešani su u rezistenciju na lekove (Spychala et al., Pharmacol Ther 3000;87:161-73). Tako CD73 može regulisati progresiju kancera i direktno i indirektno, što naglašava njegov potencijal kao nove terapijske mete. Opisano je monoklonsko antitelo protiv humanog CD73 koje inhibira stvaranja metastaza kod humanog kancera dojke indukovanjem grupisanja i internalizacije CD73 eksprimiranog na površini ćelija kancera (Terp et al., J Immunol 2013;191(8):4165-4173). Opisano je još jedno humano antitelo protiv humanog CD73 dobijeno iz scFv biblioteke fagnog displeja koje veže i internalizuje u ćelijama kancera dojke, da inhibira CD73 enzimsku aktivnost, i da inhibira rast tumora u ksenograf modelu (Rust et al., Mol Kancer, Biomed Central 2013;12(1):11).
[0002] S obzirom na stalnu potrebu za poboljšanim strategijama za ciljanje bolesti kao što je kancer, veoma su poželjne metode regulacije progresije tumora putem više mehanizama, kao i metode za regulisanje aktivnosti CD73 i povezani terapijski agensi.
REZIME
[0003] Ovde su data izolovana antitela, kao što su monoklonska antitela (njihovi delovi koji vezuju antigen), posebno humana monoklonska antitela, koja specifično vezuju CD73 i imaju poželjna funkcionalna svojstva. Ova svojstva uključuju visok afinitet vezivanja za humani CD73, vezivanja za CD73 majmuna (npr., CD73 cinomolgusa), i sposobnost inhibicije CD73 enzimske aktivnosti. Antitela opisana ovde mogu se koristiti za inhibiranje rasta tumora, smanjenje proizodnje adenozina, podsticanje imunog odgovora i detekciju proteina CD73 u uzorku.
[0004] Antitela predmetnog pronalaska protiv CD73 su definisana u patentnim zahtevima 1-11.
[0005] Predmetni pronalazak se odnosi na izolovana antitela koja se vezuju za humani Klaster diferencijacije 73 (CD73) i sadrže CDR1, CDR2, i CDR3 sekvence teškog lanca koje sadrže SEQ ID NOs (sekvence sa ID brojevima): 5, 6, i 7, redom, i CDR1, CDR2, i CDR3 sekvence lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 13, 14, i 15, redom, pri čemu antitelo (eng. Antibody -Ab) sadrži konstantni region teškog lanca koji sadrži IgG2 zglob i IgG2 CH1 domen.
[0006] U određenim tehničkim rešenjima, antitela protiv CD73 predmetnog pronalaska se vezuju u regionima FTKVQQIRRAEPNVLLLDA (SEQ ID NO (sekvenca sa ID brojem): 96) i/ili LYLPYKVLPVGDEVVG (SEQ ID NO: 97) humanog CD73, npr., gde epitop obuhvata ili se preklapa sa FTKVQQIRRAEPNVLLLDA (SEQ ID NO: 96) i/ili LYLPYKVLPVGDEVVG (SEQ ID NO: 97) humanog CD73.
[0007] U određenim tehničkim rešenjima, antitela protiv CD73 predmetnog pronalaska se vezuju za epitop na humanom CD73 (SEQ ID NO: 1) koji uključuje sve ili deo aminokiselinskih ostataka FTKVQQIRRAEPNVLLLDA (SEQ ID NO: 96) i/ili LYLPYKVLPVGDEVVG (SEQ ID NO: 97). U određenim tehničkim rešenjima, epitop vezan antitelima protiv CD73 predmetnog pronalaska je određen, npr., HDX-MS-om i/ili kristalografijom.
[0008] U određenim tehničkim rešenjima, antitela protiv CD73 predmetnog pronalaska sadrže tri varijabilna CDR-ova teškog lanca i tri varijabilna CDR-ova lakog lanca koji su u parovima varijabilnog teškog lanca i varijabilnog lakog lanca antitela protiv CD73 predstavljeni pomoću SEQ ID NOs: 4 i 12; ili SEQ ID NOs: 135 i 12.
[0009] U određenim tehničkim rešenjima, antitela protiv CD73 predmetne objave sadrže varijabilne regione teškog i lakog lanca koji imaju sekvence aminokiselina koje su najmanje 80% identične, npr., najmanje 85% identične, najmanje 90% identične, najmanje 95% identične, najmanje 96% identične, najmanje 97% identične, najmanje 98% identične, ili najmanje 99% identične ili više aminokiselinskim sekvencama varijabilnog regiona teškog lanca antitela protiv CD73 opisanih ovde, npr., koji sadrže aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NOs: 4, 135, 171 i varijabilni region lakog lanca antitela protiv CD73 opisanih ovde, npr., sadrže aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 12.
[0010] U određenim tehničkim rešenjima, antitela protiv CD73 predmetne objave sadrže sekvence varijabilnog regiona teškog lanca i lakog lanca koje su najmanje 80% identične, npr., najmanje 85% identične, najmanje 90% identične, najmanje 95% identične, najmanje 96% identične, najmanje 97% identične, najmanje 98% identične, ili najmanje 99% identične ili više (npr., 100%), aminokiselinskim sekvencama: SEQ ID NOs: 135 i 12; SEQ ID NOs: 4 i 12; ili SEQ ID NOs: 171 i 12.
[0011] U određenim tehničkim rešenjima, antitela protiv CD73 predmetnog pronalaska sadrže varijabilne regione teškog i lakog lanca izabrane iz grupe koja se sastoji od: SEQ ID NOs: 135 i 12; SEQ ID NOs: 4 i 12; ili SEQ ID NOs: 171 i 12.
[0012] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo predmetnog pronalaska sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima sekvencu aminokiselina navedenu u SEQ ID NO: 135 i varijabilni region lakog lanca koji ima sekvencu aminokiselina navedenu u SEQ ID NO: 12.
[0013] U određenim tehničkim rešenjima, antitela protiv CD73 predmetne objave imaju sekvence teškog lanaca i lakog lanaca pune dužine najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 99% ili 100% identične sekvencama aminkiselina bilo kog antitela protiv CD73 opisanog ovde, npr., SEQ ID NOs: 100 i 102; SEQ ID NOs: 133 ili 189 (bez C-terminalnog lizina) i 102; SEQ ID NOs: 189 i 102; ili bilo kojim od SEQ ID NOs: 188 i 102.
[0014] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo predmetnog pronalaska sadrži region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 133 ili 189 i region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 102.
[0015] U određenim tehničkim rešenjima, antitela protiv CD73 predmetne objave su IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4 antitela, ili njihove varijante. U određenim tehničkim rešenjima, antitela protiv CD73 predmetne objave vezuju isti epitop na CD73 kao antitela koja imaju prethodne sekvence varijabilnih regiona teškog i lakog lanca (npr., antitela CD73.4-2, i/ili 11F11-2).
[0016] U određenim tehničkim rešenjima, antitela protiv CD73 predmetne objave sadrže modifikovan konstantni region teškog lanca koji uključuje, npr., humani CH1 domen, humani zglobni domen, humani CH2 domen, i humani CH3 domen redom od N- ka C- kraju, pri čemu su najmanje 2 domena različitog izotipa (npr., IgG1, IgG2, IgG3, i IgG4 izotipovi). Na primer, u određenim tehničkim rešenjima, modifikovan konstantni region sadrži humani IgG2 zglob i bar jedan od CH2 i CH3 domena nije IgG2 izotipa. U određenim tehničkim rešenjima, CH1 je humani IgG2 CH1 domen, npr., ima aminokiselinsku sekvencu ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SS GLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV (SEQ ID NO: 124). Modifikovan konstantni region može da obuhvati humani IgG2 zglobni domen, npr., humani IgG2 zglobni domen koji smanjuje heterogenost u vezivanju cisteina, npr., humani IgG2 zglobni domen koji ima supstituisanu amino kiselinu na C219, npr., C219S, u odnosu na zglobni domen divljeg tipa humanog IgG2 (SEQ NO 136), npr., humani IgG2 zglobni domen koji ima aminokiselinsku sekvencu ERKSCVECPPCPAPPVAG (SEQ ID NO: 123). Modifikovan konstantni region može da obuhvati humani IgG1 CH2 domen koji smanuje ili eliminiše efektorske funkcije, npr., humani IgG1 CH2 domen koji ima aminokiselinske supstitucije A330S i P331S, u odnosu na CH2 domen divljeg tipa humanog IgG1 (SEQ ID NO: 137), npr., humani IgG1 CH2 domen sadrži aminokiselinsku sekvencu
Modifikovani konstantni region može obuhvatiti CH3 domen divljeg tipa humanog IgG1, npr., koji ima aminokiselinsku sekvencu
[0017] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo protiv CD73 predmetnog pronalaska sadrži modifikovan region teškog lanca koji sadrži IgG2 zglob i IgG2 CH1 domen, pod uslovom da antitelo nije IgG2 antitelo, npr., antitelo ne sadrži konstantni region teškog lanca IgG2 divljeg tipa.
[0018] U određenim tehničkim rešenjima, antitela protiv CD73 predmetnog pronalaska sadrže bilo koje od konstantnih regiona koji sadrže aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NOs: 130, 164, 165, 168 i 169, 268, 273, , 315, 329, i 332-338.
[0019] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo protiv CD73 predmetnog pronalaska sadrži VH i VL domene od 11F11 ili CD73.4, i konstantni region teškog lanca koji sadrži IgG2 zglob i IgG2 CH1 domen. Konstantni region teškog lanca može biti IgG2CS-IgG1.1f (SEQ ID NO: 169) ili IgG2CS-IgGlf (SEQ ID NO: 165), pri čemu se "CS" odnosi na "C219S."
[0020] U određenim tehničkim rešenjima, antitela protiv CD73 predmetnog pronalaska pokazuju bar jednu od sledećih osobina:
(a) inhibicija CD73 enzimke aktivnosti;
(b) vezivanje na CD73 cinomolgusa;
(c) antitelom posredovana CD73 internalizacija u ćelijama, npr., ćelijama tumora; i (d) vezivanje na konformacioni epitop koji sadrži amino kiseline 65-83 i 157-172 humanog CD73.
[0021] U određenim tehničkim rešenjima, antitela protiv CD73 predmetnog pronalaska se vezuju za humani CD73 (monomerni i/ili dimerni CD73) sa KDod oko 10 nM do 0.1 nM ili manje od izmerenog, npr., BIACORE® SPR analizom, i internalizuje se u tumorske ćelije sa T1/2ne većim od 10 min mereno, npr., pulsnim praćenjem (eng. pulse chase) i kao što je opisano u Primerima.
[0022] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo protiv CD73 predmetnog pronalaska je humano antitelo i pokazuje jednu ili više sledećih osobina:
(a) vezuje se za humani CD73 sa KDod 10 nM ili manjom kako je određeno površinskom plazmonskom rezonancijom (Surface Plasmon Resonance (SPR));
(b) inhibira CD73 enzimsku aktivnost;
(c)internalizuje CD73 pomoću antitelom posredovane CD73 internalizacije u ćelije, npr., tumorske ćelije; i
(d) vezuje se za humani CD73 sa EC50od 0.1 do 10 nM ili manje kako je izmereno FACS-om.
[0023] Ovde su dati bispecifični molekuli koji sadrže antitela protiv CD73 predmetnog pronalaska povezana sa molekulom koji ima drugu specifičnost vezivanja, kao i imunokonjugati koji sadrže antitela protiv CD73 predmetnog pronalaska vezana za agens.
[0024] Takođe su obezbeđeni molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju sekvencu varijabilnog regiona teškog i/ili lakog lanca antitela protiv CD73 predmetnog pronalaska, kao i vektori ekspresije koji sadrže molekule nukleinske kiseline, i ćelije transformisane vektorima ekspresije.
[0025] Takođe su obezbeđene kompozicije i kitovi koji sadrže antitela protiv CD73 predmetnog pronalaska. Shodno tome, još jedan aspekt predmetnog pronalaska odnosi se na kompozicije koje sadrže antitelo predmetnog pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač. U jednom tehničkom rešenju, kompozicija dalje sadrži jedan ili više dodatnih terapijskih agenasa. U jednom tehničkom rešenju, dodatni terapijski agens je antitelo antagonist na protein 1 programirane ćelijske smrti (PD-1), antitelo antagonist na ligand 1 programirane smrti (PD-L1), antitelo antagonist na protein 4 povezan sa citotoksičnim T-limfocitima (CTLA-4), ili antitelo antagonist na gen 3 aktivacije limfocita (LAG3).
[0026] Ovde je data metoda pripreme antitela protiv CD73 predmetnog pronalaska, koja obuhvata eksprimranje antitela protiv CD73, ovde stavljenog na uvid javnosti, u ćeliji i izolovanje antitela iz ćelije.
[0027] Takođe su obezbeđene metode upotrebe antitela protiv CD73, ovde stavljene na uvid javnosti, npr., metode smanjenja nivoa adenozina, npr., u ili uz tumor, npr., tumorsku ćeliju, koja eksprimira CD73, metode stimulisanja antigen-specifičnog T ćelijskog odgovora, metode stimulisanja imunog odgovora kod subjekta, metode inhibicije rasta ćelija tumora kod subjekta, metode lečenja kancera, npr., imunoterapijom. U određenim tehničkim rešenjima, kancer je kancer bešike, kancer dojke, rak materice/grlića materice, kancer jajnika, kancer prostate, kancer testisa, kancer jednjaka, gastrointestinalni kancer, kancer pankreasa, kolorektalni kancer, kancer debelog creva, kancer bubrega, kancer glave i vrata, kancer pluća, kancer stomaka, kancer ćelija zametka, kancer kostiju, kancer jetre, kancer tiroidne žlezde, kancer kože, neoplazma centralnog nervnog sistema, limfom, leukemija, mijelom, sarkom, ili kancer povezan sa virusom. Kancer može biti metastatski kancer, uporni kancer, ili rekurentni kancer.
[0028] U određenim tehničkim rešenjima, ovde opisane metode dalje sadrže administriranje jednog ili više dodatnih terapeutika, npr., terapeutika koji stimuliše imuni sistem, npr., PD-1 antagonist, CTLA-4 antagonist, LAG-3 antagonist, GITR antagonist, i/ili antitelo protiv CD39, antitelo protiv A2AR, ili hemijski inhibitor A2AR.
[0029] Ostale karakteristike i prednosti trenutne predmetne objave biće vidljive iz sledećeg detaljnog opisa i primera, koje ne treba tumačiti kao ograničavajuće.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0030]
Slika 1A pokazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 237) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 135) varijabilnog regiona teškog lanca CD73.4-1 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 5), CDR2 (SEQ ID NO: 6) i CDR3 (SEQ ID NO: 7) regioni su razgraničeni i naznačena su izvođenja germinativnih V, D i J. Slika 1B pokazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 140) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 8) varijabilnog regiona lakog lanca (VK1) humanog monoklonskog antitela CD73.4-1. CDR1 (SEQ ID NO: 9), CDR2 (SEQ ID NO: 10) i CDR3 (SEQ ID NO: 11) regioni su razgraničeni i naznačena su izvođenja germinativnih V, D i J. Slika 2A pokazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 237) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 135) varijabilnog regiona teškog lanca CD73.4-2 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 5), CDR2 (SEQ ID NO: 6) i CDR3 (SEQ ID NO: 7) regioni su razgraničeni i naznačena su izvođenja germinativnih V, D i J. Slika 2B pokazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 141) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 12) varijabilnog regiona lakog lanca CD73.4-2 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 13), CDR2 (SEQ ID NO: 14) i CDR3 (SEQ ID NO: 15) regioni su razgraničeni i naznačena su izvođenja germinativnih V, D i J.
Slika 3A pokazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 139) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 4) varijabilnog regiona teškog lanca 11F11-1 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 5), CDR2 (SEQ ID NO: 6) i CDR3 (SEQ ID NO: 7) regioni su razgraničeni i naznačena su izvođenja germinativnih V, D i J. Slika 3B pokazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 140) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 8) varijabilnog regiona lakog lanca 11F11-1 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 9), CDR2 (SEQ ID NO: 10) i CDR3 (SEQ ID NO: 11) regioni su razgraničeni i naznačena su izvođenja germinativnih V, D i J.
Slika 4A pokazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 139) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 4) varijabilnog regiona teškog lanca 11F11-2 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 5), CDR2 (SEQ ID NO: 6) i CDR3 (SEQ ID NO: 7) regioni su razgraničeni i naznačena su izvođenja germinativnih V, D i J. Slika 4B pokazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 141) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 12) varijabilnog regiona lakog lanca 11F11-2 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 13), CDR2 (SEQ ID NO: 14) i CDR3 (SEQ ID NO: 15) regioni su razgraničeni i naznačena su izvođenja germinativnih V, D i J.
Slika 5A pokazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 142) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 16) varijabilnog regiona teškog lanca 4C3-1 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 17), CDR2 (SEQ ID NO: 18) i CDR3 (SEQ ID NO: 19) regioni su razgraničeni i naznačena su izvođenja germinativnih V, D i J.
Slika 5B pokazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 143) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 20) varijabilnog regiona lakog lanca 4C3-1 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 21), CDR2 (SEQ ID NO: 22) i CDR3 (SEQ ID NO: 23) regioni su razgraničeni i naznačena su izvođenja germinativnih V, D i J.
Slika 6A pokazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 142) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 16) varijabilnog regiona teškog lanca 4C3-2 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 17), CDR2 (SEQ ID NO: 18) i CDR3 (SEQ ID NO: 19) regioni su razgraničeni i naznačena su izvođenja germinativnih V, D i J.
Slika 6B pokazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 144) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 24) varijabilnog regiona lakog lanca 4C3-2 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 25), CDR2 (SEQ ID NO: 26) i CDR3 (SEQ ID NO: 27) regioni su razgraničeni i naznačena su izvođenja germinativnih V, D i J.
Slika 7A pokazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 142) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 16) varijabilnog regiona teškog lanca 4C3-3 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 17), CDR2 (SEQ ID NO: 18) i CDR3 (SEQ ID NO: 19) regioni su razgraničeni i naznačena su izvođenja germinativnih V, D i J.
Slika 7B pokazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 145) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 28) varijabilnog regiona lakog lanca 4C3-3 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 29), CDR2 (SEQ ID NO: 30) i CDR3 (SEQ ID NO: 31) regioni su razgraničeni i naznačena su izvođenja germinativnih V, D i J.
Slika 8A pokazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 146) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 32) varijabilnog regiona teškog lanca 4D4-1 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 33), CDR2 (SEQ ID NO: 34) i CDR3 (SEQ ID NO: 35) regioni su razgraničeni i naznačena su izvođenja germinativnih V, D i J.
Slika 8B pokazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 147) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 36) varijabilnog regiona lakog lanca 4D4-1 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 37), CDR2 (SEQ ID NO: 38) i CDR3 (SEQ ID NO: 39) regioni su razgraničeni i naznačena su izvođenja germinativnih V, D i J.
Slika 9A pokazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 148) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 40) varijabilnog regiona teškog lanca 10D2-1 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 41), CDR2 (SEQ ID NO: 42) i CDR3 (SEQ ID NO: 43) regioni su razgraničeni i naznačena su izvođenja germinativnih V, D i J.
Slika 9B pokazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 149) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 44) varijabilnog regiona lakog lanca 10D2-1 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 45), CDR2 (SEQ ID NO: 46) i CDR3 (SEQ ID NO: 47) regioni su razgraničeni i naznačena su izvođenja germinativnih V, D i J.
Slika 10A pokazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 148) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 40) varijabilnog regiona teškog lanca 10D2-2 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 41), CDR2 (SEQ ID NO: 42) i CDR3 (SEQ ID NO: 43) regioni su razgraničeni i naznačena su izvođenja germinativnih V, D i J.
Slika 10B pokazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 150) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 48) varijabilnog regiona lakog lanca 10D2-2 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 49), CDR2 (SEQ ID NO: 50) i CDR3 (SEQ ID NO: 51) regioni su razgraničeni i naznačena su izvođenja germinativnih V, D i J.
Slika 11A pokazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 151) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 52) varijabilnog regiona teškog lanca 11A6-1 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 53), CDR2 (SEQ ID NO: 54) i CDR3 (SEQ ID NO: 55) regioni su razgraničeni i naznačena su izvođenja germinativnih V, D i J.
Slika 11B pokazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 152) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 56) varijabilnog regiona lakog lanca 11A6-1 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 57), CDR2 (SEQ ID NO: 58) i CDR3 (SEQ ID NO: 59) regioni su razgraničeni i naznačena su izvođenja germinativnih V, D i J.
Slika 12A pokazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 153) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 60) varijabilnog regiona teškog lanca 24H2-1 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 61), CDR2 (SEQ ID NO: 62) i CDR3 (SEQ ID NO: 63) regioni su razgraničeni i naznačena su izvođenja germinativnih V, D i J.
Slika 12B pokazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 154) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 64) varijabilnog regiona lakog lanca 24H2-1 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 65), CDR2 (SEQ ID NO: 66) i CDR3 (SEQ ID NO: 67) regioni su razgraničeni i naznačena su izvođenja germinativnih V, D i J.
1
Slika 13A pokazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 155) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 68) varijabilnog regiona teškog lanca 5F8-1 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 69), CDR2 (SEQ ID NO: 70) i CDR3 (SEQ ID NO: 71) regioni su razgraničeni i naznačena su izvođenja germinativnih V, D i J.
Slika 13B pokazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 156) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 72) varijabilnog regiona lakog lanca 5F8-1 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 73), CDR2 (SEQ ID NO: 74) i CDR3 (SEQ ID NO: 75) regioni su razgraničeni i naznačena su izvođenja germinativnih V, D i J.
Slika 14A pokazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 155) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 68) varijabilnog regiona teškog lanca 5F8-2 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 69), CDR2 (SEQ ID NO: 70) i CDR3 (SEQ ID NO: 71) regioni su razgraničeni i naznačena su izvođenja germinativnih V, D i J.
Slika 14B pokazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 157) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 76) varijabilnog regiona lakog lanca 5F8-2 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 77), CDR2 (SEQ ID NO: 78) i CDR3 (SEQ ID NO: 79) regioni su razgraničeni i naznačena su izvođenja germinativnih V, D i J.
Slika 15A pokazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 155) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 68) varijabilnog regiona teškog lanca 5F8-3 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 69), CDR2 (SEQ ID NO: 70) i CDR3 (SEQ ID NO: 71) regioni su razgraničeni i naznačena su izvođenja germinativnih V, D i J.
Slika 15B pokazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 242) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 238) varijabilnog regiona lakog lanca 5F8-3 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 239), CDR2 (SEQ ID NO: 240) i CDR3 (SEQ ID NO: 241) regioni su razgraničeni i naznačena su izvođenja germinativnih V, D i J.
Slika 16A pokazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 158) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 80) varijabilnog regiona teškog lanca 6E11-1 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 81), CDR2 (SEQ ID NO: 82) i CDR3 (SEQ ID NO: 83) regioni su razgraničeni i naznačena su izvođenja germinativnih V, D i J.
Slika 16B pokazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 159) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 84) varijabilnog regiona lakog lanca 6E11-1 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 85), CDR2 (SEQ ID NO: 86) i CDR3 (SEQ ID NO: 87) regioni su razgraničeni i naznačena su izvođenja germinativnih V, D i J.
Slika 17A pokazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 160) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 88) varijabilnog regiona teškog lanca 7A11-1 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 89), CDR2 (SEQ ID NO: 90) i CDR3 (SEQ ID NO: 91) regioni su razgraničeni i naznačena su izvođenja germinativnih V, D i J.
Slika 17B pokazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 161) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 92) varijabilnog regiona lakog lanca 7A11-1 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 93), CDR2 (SEQ ID NO: 94) i CDR3 (SEQ ID NO: 95) regioni su razgraničeni i naznačena su izvođenja germinativnih V, D i J.
Slika 18 pokazuje aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 189) teškog lanca anti-CD73 antitela CD73.4-IgG2CS-IgG1.1f, i njegov varijabilni region, CDR-ove 1, 2 i 3, CH1, Zglob, CH2 i CH3 domene.
Slika 19 pokazuje podatke SPR senzogram podatke za vezivanje 600, 200, 66.7, 22.2, 7.4, i 2.5 nM humanog-CD73-his (debele linije) ili cyno-CD73-his (tanke linije) na CD73.4- IgG2-C219S-IgG1.1f zarobljen na imobilizovanoj površini proteina A na 25°C.
Slike 20A1 i 20A2 pokazuju vezivanje antitela 11F11, CD73.4 i CD73.10 sa naznačenim konstantnim regionima teškog lanca na humane CD73 pozitivne Calu6 ćelije (ćelijska linija humanog plućnog adenokarcinoma).
Slike 20B1 i 20B2 pokazuju vezivanje antitela 11F11, CD73.4 i CD73.10 sa naznačenim konstantnim regionima teškog lanca na humane CD73 negativne DMS114 ćelije (ćelijska linija sitnoćelijskog karcinoma pluća).
Slike 20C1 i 20C2 pokazuju vezivanje antitela 11F11, CD73.4 i CD73.10 sa naznačenim konstantnim regionima teškog lanca na cyno CD73 pozitivne CHO ćelije.
Slike 20D1 i 20D2 pokazuju vezivanje antitela 11F11, CD73.4 i CD73.10 sa naznačenim konstantnim regionima teškog lanca na cyno CD73 negativne CHO-K1 ćelije.
Slika 20E pokazuje vezivanje naznačenih antitela za T ćelije od donora D 1 i D2. Slika 20F pokazuje vezivanje naznačenih antitela za T ćelije od donora D1 i D2.
Slike 21A1 i 21A2 pokazuju inhibiciju enzimske aktivnosti za zrca vezanog humanog CD73 pomoću anti-CD73 antitela 11F11, CD73.4 i CD73.10 sa naznačenim konstantnim regionom teškog lanca. Sva antitela inhibiraju enzimsku aktivnost humanog CD73.
Slike 21B1 i 21B2 pokazuju inhibiciju enzimske aktivnosti za zrnca vezanog cyno CD73 pomoću anti-CD73 antitela 11F11, CD73.4 i CD73.10 sa naznačenim konstantnim regionima teškog lanca. Sva antitela inhibiraju enzimsku aktivnost cyno CD73.
Slike 22A1 i 22A2 pokazuju enzimsku inhibiciju CD73 u humanim CD73 pozitivnim Calu6 ćelijama od strane 11F11, CD73.4 i CD73.10 antitela sa naznačenim konstantnim regionima teškog lanca. Sva antitela su inhibirala enzimsku aktivnost CD73 u ovim ćelijama.
Slike 22B1 i 22B2 pokazuju enzimsku inhibiciju CD73 u humanim CD73 negativnim DMS-114 ćelijama od strane 11F11, CD73.4 i CD73.10 antitela sa naznačenim konstantnim regionima teškog lanca.
Slika 22C pokazuje EC50 i Ymax vrednosti inhibicije endogene CD73 aktivnosti fragmentima 11F11 i 11F11 F(ab')2, kako je određeno u cAMP testu koristeći Calu-6 i HEK/A2R ćelije. Slika 22C takođe prikazuje EC50 i Ymax vrednosti fragmenata 11F11 i 11F11 F(ab')2u eseju Calu-6 internalizacije. Na slici je pokazano da je 11F11 Fab fragment neaktivan u ova dva testa.
Slika 22D prikazuje vremenski tok proizvodnje adenozina iz ćelija Calu6 tretiranih 11F11 ili 4C3 antitelom, mereno LC/MS/MS-om, što ukazuje na to da se CD73 enzimska inhibicija antitelom 11F11 dešava brže nego kod 4C3 antitela.
Slika 23A prikazuje kinetike antitelom posredovane internalizacije CD73 pomoću sledećih antitela: 11F11, 4C3, 6D11, CD73.3-IgGl.lf sa 4C3Vkl lakim lancem ("3-VhhHC-IgG1.1f/4C3Vk1"), CD73.4-IgG2CS sa 11F11 Vk2 lakim lanacem ("4-Vh-hHC-IgG2-C219S/11F11-Vk2"), CD73.10-IgG2CS ("CD73.10-Vh-hHC-IgG2-C219S"), CD73.10-IgG2CS-IgG1.1f ("CD73.10-Vh-hHC-IgG2-C219S-IgG1.1f"), i CD73.10-IgG1.1f ("CD73.10-Vh-hHC-IgG1.1f") antitela u H2228 ćelijama.11F11 (koje je IgG2
1
izotipa), CD73.4-IgG2CS, CD73.10-IgG2CS i CD73.10-IgG2CS-IgG1.1f antitela se internalizuju brže i u većem stepenu od ostalih ispitivanih, koja su IgG1 izotipa.
Slika 23B pokazuje kinetike internalizacije CD73 posredovane antitelom, istim antitelima kao što su ona prikazana na Slici 23A u HCC15 ćelijama (ćelijska linija nesitnoćelijskog karcinoma pluća), pokazujući slične rezultate onim dobijenim u H2228 ćelijama (ćelijska linija nesitnoćelijskog karcinoma pluća).
Slika 23C pokazuje kinetike internalizacije CD73 posredovane antitelom, istim antitelima kao što su ona prikazana na Slikama 23A i 23B, kao i CD73.11-IgG2CS ("11-Vh-hVC-IgG2-C219S"), u Calu6 ćelijama, pokazujući slične rezultate onim dobijenim u H2228 i HCC15 ćelijama.
Slika 23D pokazuje kinetike internalizacije CD73 posredovane antitelom, istim antitelima kao što su ona prikazana na Slici 23C u NCI-2030 ćelijama (ćelijska linija nesitno ćelijskog karcinoma pluća), pokazujući slične rezultate onim dobijenim u H2228, HCC15, i Calu6 ćelijama.
Slika 23E pokazuje kinetike internalizacije CD73 posredovane antitelom, naznačenim antitelima u Calu6 ćelijama, mereno protočnom citometrijom.
Slika 23F pokazuje kinetike internalizacije CD73 posredovane antitelom, naznačenim antitelima u NCI-H292 ćelijama (ćelijska linija mukoepidermoidnog pulmonarnog karcinoma), mereno protočnom citometrijom, ali gde antitela nisu isprana nakon prve inkubacije ćelija sa antitelima.
Slika 23G pokazuje procenat internalizovanog CD73 u Calu6 ćelijama tretiranim naznačenim antitelima, pokazujući internalizaciju CD73 posredovanu antitelom, naznačenim antitelima u Calu6 ćelijama tokom vremena.
Slika 23H pokazuje procenat internalizovanog CD73 u NCI-H292 ćelijama tretiranim sa naznačenim antitelima tokom vremena, pokazujući internalizaciju CD73 posredovanu antitelom, naznačenim antitelima u NCI-H292 ćelijama tokom vremena. Slika 23I pokazuje procenat internalizovanog CD73 u SNU-C1 ćelijama (ćelijska linija karcinoma debelog creva) tretiranim sa naznačenim antitelima tokom vremena, pokazujući internalizaciju CD73 posredovanu antitelom, naznačenim antitelima u SNU-C1 ćelijama tokom vremena.
Slika 23J pokazuje procenat internalizovanog CD73 u NCI-H1437 ćelijama (ćelijska linija nesitno ćelijskog karcinoma pluća) tretiranim sa naznačenim antitelima tokom vremena, pokazujući internalizaciju CD73 posredovanu antitelom, naznačenim antitelima u NCI-H1437 ćelijama tokom vremena.
Slika 23K pokazuje procenat internaizovanog CD73 u Calu6 ćelijama tretiranim sa navedenim antitelima tokom vremena, pokazujući internalizaciju CD73 posredovanu antitelom, naznačenim antitelima uu Calu6 ćelijama tokom vremena.
Slika 23L pokazuje procenat internalizovanog CD73 u NCI-H292 ćelijama tretiranim sa navedenim antitelima tokom vremena, pokazujući internalizaciju CD73 posredovanu antitelom, naznačenim antitelima u Calu6 ćelijama tokom vremena.
Slika 23M pokazuje nivo CD73 na površini Calu6 ćelija tretiranim sa 5 µg/ml naznačenih antitela tokom 0, 5, 15 ili 30 minuta.
Slika 24A pokazuje odsečke tumora ksenografta kod životinja, sakupljene 4 dana nakon tretiranja životinja sa kontrolnim antitelom i obojene za CD73 enzimsku aktivnost. Odsečci pokazuju gustu smeđu boju, ukazujući na CD73 enzimsku aktivnost.
Slika 24B pokazuje odsečke tumora ksenografta kod životinja, sakupljene 1 dan nakon tretiranja životinja sa 11F11 antitelom i obojene za CD73 enzimsku aktivnost. Odsečci pokazuju značajno manje smeđe boje u odnosu na kontrolne odsečke tumora prikazane na Slici 24A, ukazujući na in vivo inhibiciju CD73 enzimske aktivnosti od strane CD73.10-IgG2CS-IgG1.1f već 1. dana nakon početka tretiranja.
Slika 24C pokazuje odsečke tumora ksenografta kod životinja, sakupljene 2 dana nakon tretiranja životinja sa CD73.10-IgG2CS-IgG1.1f i obojene za CD73 enzimsku aktivnost. Odsečci pokazuju značajno manje smeđe boje u odnosu na kontrolne odsečke tumora prikazane na Slici 24A i u odnosu na odsečke tumora nakon 1 dana tretiranja životinja sa CD73.10-IgG2CS-IgG1.1f, ukazujući na in vivo inhibiciju CD73 enzimske aktivnosti od strane CD73.10-IgG2CS-IgG1.1f najmanje 2 dana nakon početka tretiranja.
Slika 24D pokazuje odsečke tumora ksenografta kod životinja, sakupljene 3 dana nakon tretiranja životinja sa CD73.10-IgG2CS-IgG1.1f i obojene za CD73 enzimsku aktivnost. Odsečci pokazuju značajno manje smeđe boje u odnosu na kontrolne sekcije tumora prikazane na Slici 24A, ukazujući na in vivo inhibiciju CD73 enzimske aktivnosti od strane CD73.10-IgG2CS-IgG1.1f najmanje 3 dana nakon početka lečenja. Slika 24E pokazuje odsečke tumora ksenografta kod životinja, sakupljene 7 dana nakon tretiranja životinja sa CD73.10-IgG2CS-IgG1.1f i obojene za CD73 enzimsku aktivnost. Odsečci pokazuju značajno manje smeđe boje u odnosu na kontrolne sekcije tumora prikazane na Slici 24A, ukazujući na in vivo inhibiciju CD73 enzimske aktivnosti od strane CD73.10-IgG2CS-IgG1.1f najmanje 7 dana nakon početka lečenja.
1
Slika 24F pokazuje vremenski tok enzimske aktivnosti humanog CD73 u SNUC1 tumorima kod ksenograft miševa tretiranih sa kontrolnim (ne CD73) antitelom ili sa 1 mg/kg, 3 mg/kg ili 10 mg/kg CD73.4-IgG2CS-IgG1.1f, pokazujući da antitelo protiv CD73 efikasno smanjuje CD73 enzimsku aktivnost u tumorima ksenograft miševa. Slika 25A pokazuje nivoe enzimske aktivnosti CD73 miša u kontrolnim odsečcima tumora iz Balb/c miševa koji nose singeneične 4T1 tumore i kontrolni mIgG.
Slika 25B pokazuje odsečke tumora (4T1 dani 1-7) Balb/c miševa koji nose singeneične 4T1 tumore potkožno tretirane sa anti-mišijim CD73 antitelom TY23, pokazujući da TY23 in vivo inhibira CD73 enzimsku inhibiciju.
Slika 26A pokazuje nivo unakrsnog blokiranja 4C3 od strane anti-CD73antitela 4C3, 7A11, 6E11, 5F8, 4C3, 11F11 i 11A6 kako je određeno protočnom citometrijom. Slika 26B pokazuje nivo unakrsnog blokiranja 11F11 od strane anti-CD73antitela 4C3, 7A11, 6E11, 5F8, 4C3, 11F11 i 11A6 kako je određeno protočnom citometrijom. Slika 27A pokazuje aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 283) humanog CD73 i regiona interakcije sa CD73.4-IgG2CS-IgG1.1f, što je predstavljeno u tamno sivoj boji. Što je jača interakcija, tamnije je sivo.
Slika 27B pokazuje model interakcije između dimernog humanog CD73 proteina i CD73.4-IgG2CS-IgG1.1f.
Slika 28A pokazuje kristalografski model interakcije između humanog CD73 i 11F11Fab' fragmenta.
Slika 28B pokazuje model kompozitne strukture dva humana CD73 kompleksa sa 11F11.
Slika 28C pokazuje model interakcije između humanog CD73 i 11F11 antitela.
Slika 28D pokazuje model interakcije između 11F11 i humanog CD73.
Slika 29A pokazuje SEC-MALS podatke za humani CD73 i komplekse antitela. "CD73.4-hibrid" odnosi se na CD73.4-IgG2CS-IgG1.1f.
Slika 29B pokazuje DLS podatke za humani CD73 i komplekse antitela.
Slika 30A pokazuje podatke SEC hromatograma za komplekse hCD73-his sa CD73.4 antitelom koje sadrži različite konstantne regione, pokazujući efekat IgG2 zgloba i CH1 domena na veličinu kompleksa antitelo/antigen.
Slika 30B pokazuje DLS podatke za komplekse hCD73-his sa CD73.4 antitelom koje sadrži različite konstantne regione, pokazujući efekat IgG2 zgloba i CH1 domena na veličinu kompleksa antitelo/antigen.
1
Slika 30C pokazuje MALS podatke za komplekse hCD73-his sa CD73.4 antitelom koje sadrži različite konstantne regione, pokazujući efekat IgG2 zgloba i CH1 domena na veličinu kompleksa antitelo/antigen.
Slika 30D pokazuje shematski model hCD73-his/mAb kompleksa izvedenih iz MALS-određenih masa na Slici 30C.
Slika 30E pokazuje da CH1 region utiče na komplekse višeg reda. Histogrami pokazuju % površine ispod pikova 1 i 2, prikazanih na grafikonu, za svaki konstrukt.
Slika 31 pokazuje procenat internalizacije CD73 posredovane antitelom u toku 1, 4 ili 21 sata nakon dodavanja svakog od prikazanih antitela. Stubići za svako antitelo su prikazani redosledom od 21 sat (sa leve strane), 4 sata (sredina) i 1 sat (desno).
Slika 32A pokazuje prekrivanje podataka sa SEC hromatograma za 1:1 molarne komplekse hCD73-his sa 16 različitih CD73.4 antitela koja sadrže različite sekvence konstantnih regiona.
Slika 32B pokazuje proširenje podataka hromatograma od 11 - 19.5 min sa Slike 32A, sa 4 različite naznačene vrste elucije.
Slika 32C pokazuje procenat područja signala UV hromatograma za pik 2 na Slici 32B, grafički prikazan za 16 različitih antitelo/CD73-his kompleksa. Podaci su sortirani sa leva na desno u skladu sa povećanjem površine pika.
Slika 33 pokazuje antitelo vezano za njegov anti-his Fab uhvaćen njegovim FcγR-his proteinima. Odgovori vezivanja su prikazani kao procenat od teorijskog Rmax pretpostavljajući 1:1 mAb:FcγR stehiometriju vezivanja. Stubići za svako antitelo prikazani su redosledom koji je prikazan obojenim legendama na dnu slajda.
Slika 34 pokazuje antitelo vezano za njegov anti-his Fab uhvaćen njegovim FcgR-his proteinima. Odgovori vezivanja su prikazani kao procenat od teorijskog Rmax pretpostavljajući 1:1 mAb:FcγR stehiometriju vezivanja. Stubići za svako antitelo prikazani su redosledom koji je prikazan obojenim legendama na dnu slajda.
Slika 35 pokazuje poravnanje VH i VL sekvenci različitih antitela protiv CD73. VH i VL CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence su podebljane.
DETALJAN OPIS
[0031] Ovde su opisana izolovana antitela, posebno monoklonska antitela, npr., humana monoklonska antitela, koja se specifično vezuju za CD73 i na taj način smanjuju aktivnost CD73 ("antagonist antitela protiv CD73"). U određenim tehničkim rešenjima, antitela koja su
1
ovde opisana su izvedena iz određenih germinativnih sekvenci teškog i lakog lanca i/ili sadrže posebne strukturne karakteristike kao što su CDR regioni koji sadrže određene aminokiselinske sekvence. Ovde su data izolovana antitela, metode za pravljenje takvih antitela, imunokonjugata i bispecifičnih molekula koji sadrže takva antitela, i farmaceutske kompozicije formulisane da sadrže antitela. Ovde su takođe date metode upotrebe antitela za smanjenje rasta tumora, samostalno ili u kombinaciji sa drugim terapijskim agensima (npr., antitelima) i/ili lečenju kancera. Prema tome, ovde opisana antitela protiv CD73 mogu se koristiti u lečenju u širokom rasponu terapijskih primena, uključujući, na primer, inhibiciju rasta tumora, inhibiciju metastaza, i pojačavanje imunog odgovora protiv tumora.
Definicije
[0032] Da bi se ovaj opis mogao lakše razumeti, prvo se definišu određeni pojmovi. Dodatne definicije su date u detaljnom opisu.
[0033] Izraz "Klaster diferencijacije 73" ili "CD73" kako se ovde koristi odnosi se na enzim (nukleotidaza) koji može da pretvori vanćelijske nukleozid 5' monofosfate u nukleozide, naime adenozin monofosfat (AMP) u adenozin. CD73 se obično nalazi kao dimer usidren na ćelijskoj membrani preko glikozilfosfatidilinozitol (GPI) veze, ima aktivnost ekto-enzima i igra ulogu u transdukciji signala. Primarna funkcija CD73 je njegovo pretvaranje vanćelijskih nukleotida (npr., 5'- AMP) u adenozin, visoko imunosupresivni molekul. Dakle, ekto-5'-nukleotidaza katalizuje defosfolrilaciju purinskih i pirimidinskih ribo- i deoksiribonukleozid monofosfata u odgovarajući nukleozid. Iako CD73 ima široku supstratnu specifičnost, preferira purinske ribonukleozide.
[0034] CD73 se takođe označava kao ekto-5'nukleaza (ekto-5'NT, EC 3.1.3.5). Izraz "CD73" uključuje bilo koje varijante ili izoforme CD73 koje su prirodno eksprimirane od starne ćelija. Prema tome, antitela koja su ovde opisana mogu uzajamno reagovati sa CD73 nekih vrsta osim humanih (npr., cinomolgus CD73). Alternativno, antitela mogu biti specifična za humani CD73 i ne pokazuju nikakvu unakrsnu reaktivnost sa drugim vrstama. CD73 ili bilo koje njegove varijante i izoforme, mogu biti ili izolovane iz ćelija ili tkiva koji ih prirodno eksprimiraju ili se rekombinantno proizvode koristeći dobro poznate tehnike u oblasti i/ili one opisane ovde.
[0035] Identifikovane su dve izoforme humanog CD73, obe dele iste N-terminalne i C-terminalne delove. Izoforma 1 (Pristupni Br. NP_002517.1; SEQ ID NO: 1) predstavlja najduži protein, koji se sastoji od 574 amino kiselina i 9 egzona. Izoforma 2 (Pristupni Br. NP_001191742.1; SEQ ID NO: 2) kodira kraći protein, koji se sastoji od 524 aminokiselina, a
1
nedostaju joj aminokiseline 404-453. Izoformi 2 nedostaje alternativni egzonski okvir koji rezultira transkriptom sa samo 8 egzona, ali sa istim N- i C-terminalnim sekvencama.
[0036] Sekvenca proteina cinomolgus (cyno) CD73 obezbeđena je kao SEQ ID NO: 3. Izrazi cinomolgus i cyno odnose se na vrstu Macaca fascicularis i koriste se zamenljivo u celoj specifikaciji.
[0037] Izraz "antitelo" kako se ovde koristi može da obuhvata cela antitela i bilo koje fragmente koji se vezuju za antigen (tj., "antigen-vezujuće delove") ili njihove jednostruke lance. "Antitelo" se odnosi, u jednom tehničkom rešenju, na glikoprotein koji sadrži najmanje dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama, ili njegov deo koji veže antigen. Svaki teški lanac se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca (skraćeno ovde kao VH) i konstantnog regiona teškog lanca. U određenim IgG, IgD i IgA antitelima koja se prirodno javljaju, konstantni region teškog lanca se sastoji od tri domena, CH1, CH2 i CH3. U određenim antitelima koja se javljaju u prirodi, svaki laki lanac se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca (skraćeno ovde kao VL) i konstantnog regiona lakog lanca. Konstantni region lakog lanca sastoji se od jednog domena, CL. VHi VLregioni mogu se dalje podeliti na regione hipervarijabilnosti, nazivaju se regioni koji određuju komplementarnost (CDR), isprekidani sa regionima koji su sačuvaniji, a nazivaju se okvirni regioni (FR). Svaki VHi VLse sastoji od tri CDR-a i četiri FR-a, raspoređenih od amino-kraja do karboksi-kraja u sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Varijabilni regioni teških i lakih lanaca sadrže domen vezivanja koji intereaguje sa antigenom. Konstantni regioni antitela mogu posredovati vezivanje imunoglobulina za tkiva domaćina ili faktore, uključujući razne ćelije imunog sistema (npr., efektorske ćelije) i prvu komponentu (Clq) klasičnog sistema komplementa.
[0038] Teški lanac antitela može ili ne mora da sadrži terminalni lizin (K), ili terminalni glicin i lizin (GK). Prema tome, bilo koja od sekvenci teškog lanca i sekvenci konstantnog regiona teškog lanca obezbeđenih ovde mogu završiti sa GK ili G, ili sa nedostatkom K ili GK, bez obzira na to šta poslednja amino kiselina iz sekvence obezbeđuje. To je zato što se terminalni lizin a ponekad glicin i lizin cepaju tokom ekspresije antitela.
[0039] Antitela se obično specifično vezuju za njihov srodni antigen sa visokim afinitetom, što se odražava konstantom disocijacije (KD) od 10<-7>do 10<-11>M ili manje. Smatra se da bilo koja KDveća od oko 10<-6>M ukazuje na nespecifično vezivanje. Kako se ovde koristi, antitelo koje se "vezuje specifično" za antigen odnosi se na antitelo koje se vezuje za antigen i na suštinski identične antigene visokog afiniteta, što znači da imaju KDod 10<-7>M ili manju, poželjno 10<-8>M ili manju, još poželjnije 5 x 10<-9>M ili manju, i najpoželjnije između 10<-8>M i 10<-10>M ili
1
manju, ali se ne vezuje sa visokim afinitetom za nesrodne antigene. Antigen je "suštinski identičan" datom antigenu ako pokazuje visok stepen identičnosti sekvence datom antigenu, na primer, ako pokazuje najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97%, ili najmanje 99% ili veću identičnost sekvence, sekvenci datog antigena. Kao primer, antitelo koje se specifično vezuje za humani CD73 takođe može uzajamno reagovati sa CD73 iz određenih vrsta primata (npr., cinomolgus majmuna), ali ne može uzajamno reagovati sa CD73 drugih vrsta, ili sa antigenom koji nije CD73.
[0040] Imunoglobulin može biti od bilo kojeg od opšte poznatih izotipova, uključujući ali nije ograničeno na IgA, sekretorni IgA, IgG i IgM. IgG izotip je podeljen na podklase kod određenih vrsta: IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4 kod ljudi, i IgG1, IgG2a, IgG2b i IgG3 kod miševa. U određenim tehničkim rešenjima, ovde opisana antitela protiv CD73 su od humanog IgG1 ili IgG2 podtipa. Imunoglobulini, npr., human IgG1, postoji u nekoliko alotipova, koji se međusobno razlikuju u najviše nekoliko aminokiselina. "Antitelo" može da uključuje, na primer, antitela koja se javljaju i koja se ne javljaju u prirodi; monoklonska i poliklonska antitela; himerna i humanizovana antitela; humana i antitela koja nisu ljudska; potpuno sintetička antitela; i jednolančana antitela.
[0041] Izraz "deo koji veže antigen" od antitela, kako se ovde koristi, odnosi se na jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost da se specifično vezuju za antigen (npr., humani CD73). Pokazano je da antigen-vezivajuću funkciju od strane antitela mogu obavljati fragmenti antitela pune dužine. Primeri vezujućih fragmenata obuhvaćeni su izrazom "deo koji veže antigen" antitela, npr., antitelo protiv CD73 opisano ovde, uključuje (i) Fab fragment, monovalentni fragment koji se sastoji od VL, VH, CL i CH1 domena; (ii) F(ab')2fragment, bivalenti fragment koji sadrži dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom u zglobnom regionu; (iii) Fd fragment koji se sastoji od VHi CH1 domena; (iv) Fv fragment koji se sastoji od VLi VHdomena jednog kraka antitela, (v) dAt fragment (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), koji se sastoji od VHdomena; i (vi) izolovani region koji određuje komplementarnost (CDR) ili (vii) kombinacija dva ili više izolovanih CDR-a koji se po izboru mogu povezati sintetičkim veznikom (linkerom). Osim toga, iako su dva domena Fv fragmenta, VLi VH, kodirana odvojenim genima, oni se mogu spojiti, upotrebom rekombinantnih metoda, sintetičkim linkerom koji im omogućava da budu napravljeni kao jedinstveni proteinski lanac u kome su VLi VHregioni parovi koji formiraju monovalentne molekule poznate kao jednolančani Fv (scFv); videti npr., Bird et al. (1988) Science 242:423-426; i Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Ovakva jednolančana antitela su takođe predviđena da budu obuhvaćena izrazom "deo koji veže antigen" od antitela. Ovi i drugi
2
potencijalni konstrukti opisani su u Chan & Carter (2010) Nat. Rev. Immunol. 10:301. Ovi fragmenti antitela su dobijeni korišćenjem konvencionalnih tehnika poznatih prosečnom poznavaocu oblasti, i fragmenti su pretraženi na korisnost na isti način kao i intaktna antitela. Delovi koji vezuju antigen mogu se dobiti rekombinantnim DNK tehnikama, ili enzimskim ili hemijskim cepanjem intaktnih imunoglobulina.
[0042] "Bispecifično" ili "bifunkcionalno antitelo" je veštačko hibridno antitelo koje ima dva različita para teškog/lakog lanca, čime nastaju dva mesta vezivanja antigena sa specifičnošću za različite antigene. Bispecifična antitela se mogu dobiti različitim postupcima uključujući fuziju hibridoma ili povezivanje Fab' fragmenata. Videti, npr., Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992).
[0043] Izraz "monoklonsko antitelo," kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo koje pokazuje jedinstvenu specifičnost vezivanja i afinitet za određeni epitop ili kompoziciju antitela u kojoj sva antitela pokazuju jedinstvenu specifičnost vezivanja i afinitet za određeni epitop. Obično će takva monoklonska antitela biti izvedena iz jedne ćelije ili nukleinske kiseline koja kodira antitelo, i razmnožavaće se bez namernog uvođenja bilo kakvih promena u sekvenci. Prema tome, izraz "humano monoklonsko antitelo" odnosi se na monoklonsko antitelo koje ima varijabilne i konstantne regione po izboru izvedeno iz humanih germinativnih sekvenci imunoglobulina. U jednom tehničkom rešenju, humana monoklonska antitela se dobijaju hibridomom, na primer, dobijenim fuzijom B ćelije dobijene od transgene ili transhromozomske ne-humane životinje (npr., transgeni miš koji ima genom koji sadrži humani transgeni teški lanac i l transgeni laki lanac), do besmrtne ćelije.
[0044] Izraz "rekombinantno humano antitelo," kako se ovde koristi, uključuje sva humana antitela koja se dobijaju, eksprimiraju, stvaraju ili izoluju rekombinantnim sredstvima, kao što su (a) antitela izolovana od životinje (npr., miša) koja su transgenska ili transhromozomska za humane imunoglobulinske gene ili hibridom koji je od njih dobijen, (b) antitela izolovana iz ćelije domaćina transformisanih da eksprimiraju antitelo, npr., iz transfektoma, (c) antitela izolovana iz rekombinantne, kombinatorne biblioteke humanih antitela, i (d) antitela dobijena, eksprimirana, stvorena ili izolovana na bilo koji leki način koji uključuje spajanje sekvenci gena humanog imunoglobulina sa drugim DNK sekvencama. Takva rekombinantna humana antitela sadrže varijabilne i konstantne regione koji koriste određene humane germinativne sekvence imunoglobulina i kodirani su germinativnim genima, ali uključuju naknadna preuređenja i mutacije koje nastaju, na primer, tokom suzrevanja antitela. Kao što je poznato u oblasti (videti, npr., Lonberg (2005) Nature Biotech. 23(9): 1117-1125), varijabilni region sadrži antigen vezujući domen, koji je kodiran od strane različitih gena koji se preuređuju da bi formirali antitelo specifično za strani antigen. Pored preuređenja, varijabilni region može dalje da se modifikuje višestrukim pojedinačnim promenama aminokiselina (koje se nazivaju somatska mutacija ili hipermutacija) da bi se povećao afinitet antitela prema stranom antigenu. Konstantni region će se promeniti u daljem odgovoru na antigen (tj., izotipska promena). Zbog toga, preuređene i somatski mutirane sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju imunoglobulinske polipeptide lakog lanca i teškog lanca u odgovoru na antigen možda neće biti identične originalnim germinativnim sekvencama, već će biti suštinski identične ili slične (tj., imaće najmanje 80% identičnosti).
[0045] "Humano" antitelo (HuMAb) odnosi se na antitelo koje ima varijabilne regione u kojima su i okvirni i CDR regioni izvedeni iz humanih germinativnih sekvenci imunoglobulina. Nadalje, ako antitelo sadrži konstantni region, konstantni region je takođe izveden iz humanih germinativnih sekvenci imunoglobulina. Ovde opisana antitela mogu obuhvatiti aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani humanim germinativnim imunoglobulinskim sekvencama (npr., mutacije uvedene slučajnim ili za mesto specifičnim mutagenezama in vitro ili somatskom mutacijom in vivo). Međutim, izraz "humano antitelo", kako se ovde koristi, ne podrazumeva uključivanje antitela u kojima su CDR sekvence izvedene iz germinativne sekvence druge vrste sisara, kao što je miš, ugrađene u humane okvirne sekvence. Izrazi "humana" antitela i "potpuno humana" antitela koriste se sinonimno.
[0046] "Humanizovano" antitelo odnosi se na antitelo u kome su neke, većina ili sve aminokiseline izvan CDR domena ne-humanog antitela zamenjene odgovarajućim aminokiselinama izvedenih iz humanih imunoglobulina. U jednom tehničkom rešenju humanizovanog oblika antitela, neke, većina ili sve aminokiseline izvan CDR domena su zamenjene aminokiselinama iz humanih imunoglobulina, dok su neke, većina ili sve aminokiseline unutar jednog ili više CDR regiona nepromenjene. Male adicije, delecije, insercije, supstitucije ili modifikacije aminokiselina su dozvoljene sve dok ne ukinu sposobnost antitela da se veže za određeni antigen. "Humanizovano" antitelo zadržava antigensku specifičnost sličnu onoj u originalnom antitelu.
[0047] "Himerno antitelo" odnosi se na antitelo u kome su varijabilni regioni izvedeni iz jedne vrste a konstantni regioni su izvedeni iz druge vrste, kao što je antitelo u kome su varijabilni regioni izvedeni iz mišjeg antitela i konstantni regioni su izvedeni iz humanog antitela.
[0048] "Modifikovan konstantni region teškog lanca" odnosi se na konstantni region teškog lanca koji sadrži konstantne domene CH1, zglob, CH2, i CH3, pri čemu su jedan ili više konstantnih domena iz različitog izotipa (npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4). U određenim tehničkim rešenjima, modifikovani konstantni region uključuje humani IgG2 CH1 domen i humani IgG2 zglob spojen na humani IgG1 CH2 domen i humani IgG1 CH3 domen. U određenim tehničkim rešenjima, tako modifikovani konstantni regioni takođe uključuju aminokiselinske modifikacije unutar jednog ili više domena u odnosu na aminokiselinsku svekvencu divljih vrsta.
[0049] Kad se ovde pominje antitelo kao "CD73.3" ili "CD73.4" bez navođenja identiteta konstantnog regiona, osim ako je drukčije naznačeno, odnosi se na antitela koja imaju varijabilne regione od CD73.3 ili CD73.4, redom, sa bilo kojim konstantnim regionom opisanim ovde.
[0050] Kako se ovde koristi, "izotip" se odnosi na klasu antitela (npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD, i IgE antitelo) koja je kodirana genima konstantnog regiona teškog lanca.
[0051] "Alotip" se odnosi na prirodno prisutne varijante unutar određene grupe izotipa, pri čemu se varijante razlikuju u nekoliko amino kiselina (videti, npr., Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1). Ovde opisana antitela mogu biti bilo kakvog alotipa.
[0052] Ako ovde nije drugačije navedeno, svi brojevi amino kiseline su u skladu sa EU indeksom sistema Kabat (Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Peto izdanje, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publikacija Br..
91-3242).
[0053] Fraze "antitelo koje prepoznaje antigen" i "antitelo specifično za antigen" ovde su korišćene naizmenično sa frazom "antitelo koje se specifično vezuje za antigen."
[0054] "Izolovano antitelo", kako se ovde koristi, je predviđeno da se odnosi na antitelo koje je u suštini bez drugih antitela koja imaju različite antigenske specifičnosti (npr., izolovano antitelo koje specifično vezuje CD73 je u suštini bez antitela koja specifično vezuju antigene koji nisu CD73). Izolovano antitelo koje se specifično vezuje za epitop od CD73 može, međutim, imati unakrsnu reaktivnost na ostale CD73 proteine različitih vrsta.
[0055] Kako se ovde koristi, antitelo koje "inhibira CD73" odnosi se na antitelo koje inhibira biološku i/ili enzimsku funkciju CD73. Ove funkcije uključuju, na primer, sposobnost antitela da inhibira CD73 enzimsku aktivnost, npr., CD73-regulisanu proizvodnju adenozina ili smanjenje proizvodnje cAMP.
[0056] Kako se ovde koristi, antitelo koje se "internalizuje" odnosi se na antitelo koje prelazi ćelijsku membranu nakon vezivanja na antigen sa ćelijske površine. Internalizacija uključuje antitelom posredovanu receptorsku, npr., CD73, internalizaciju. U nekim tehničkim rešenjima, antitelo se "internalizuje" u ćelije koje eksprimiraju CD73 stopom od T1/2jednako oko 10 min ili manje.
2
[0057] "Efektorska funkcija" se odnosi na interakciju Fc regiona antitela sa Fc receptorom ili ligandom, ili na biohemijski događaj koji iz toga proizilazi. Primeri "efektorskih funkcija" uključuju Clq vezivanje, citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC), vezivanje Fc receptora, efektorske funkcije posredovane FcγR kao što su ADCC i antitelo zavisna ćelijskiposredovana fagocitoza (ADCP), i nishodna regulacija receptora ćelijske površine (npr., B ćelijski receptor; BCR). Takve efektorske funkcije obično zahtevaju da se Fc region kombinuje sa vezujućim domenom (npr., varijabilnim domenom antitela).
[0058] "Fc receptor" ili "FcR" je receptor koji se vezuje za Fc region imunoglobulina. FcR-i koji se vezuju za IgG antitelo sadrže receptore familije FcγR, uključujući alelne varijante i alternativno spojene oblike ovih receptora. Familija FcγR se sastoji od tri aktivirajuća (FcγRI, FcγRIII, i FcγRIV kod miševa; FcγRIA, FcγRIIA, i FcγRIIIA kod ljudi) i jednog inhibitornog (FcγRIIB) receptora. Različita svojstva humanih FcγR-a sumirana su u Tabeli 1. Većina urođenih tipova efektorskih tipova ćelija zajedno eksprimira jedan ili više aktivirajućih FcγR i inhibitorni FcγRIIB, dok prirodne ćelije ubice (NK) selektivno eksprimiraju jedan aktivirajući Fc receptor (FcγRIII kod miševa i FcγRIIIA kod ljudi) ali ne i inhibitorni FcγRIIB kod miševa i ljudi. Humani IgG1 se vezuje za većinu humanih Fc receptora i i smatra se ekvivalentnim mišjem IgG2a u odnosu na vrste aktivirajućih Fc receptora na koje se on vezuje.
Tabela 1. Svojstva humanih FcγR-a
[0059] "Zglob", "zglobni domen" ili "zglobni region" ili "zglobni region antitela" odnosi se na domen konstantnog regiona teškog lanca koji pridružuje CH1 domen CH2 domenu i uključuje gornji, srednji, i donji deo zgloba (Roux et al. J. Immunol. 1998 161:4083). Zglob pruža različite nivoe fleksibilnosti između vezujućih i efektorskih regiona antitela i takođe pruža mesta za intermolekularno disulfidno vezivanje između dva konstantna regiona teškog lanca. Kako se ovde koristi, zglob počinje na Glu216 i završava se na Gly237 za sve IgG izotipove (Roux et al., 1998 J Immunol 161:4083). Sekvence zglobova divljeg tipa IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4 prikazane su u Tabelama 2 i 31.
Tabela 2.
Aminokiseline zglobnog regiona
2
Aminokiseline zglobnog regiona
* C-terminalne aminokiselinske sekvence CH1 domena.
[0060] Izraz "zglob" uključuje zglobove divljeg tipa (kao što su oni izneti u Tabelama 2 i 31), kao i njihove varijante (npr., zglobovi koji se prirodno ne pojavljuju ili modifikovani zglobovi). Na primer, izraz "IgG2 zglob" uključuje zglob divljeg tipa IgG2, kao što je prikazano u Tabeli 2, i varijante koje imaju 1, 2, 3, 4, 5, 1-3, 1-5, 3-5 i/ili najviše 5, 4, 3, 2, ili 1 mutaciju, npr., supstitucije, delecije ili adicije. Primeri IgG2 varijanti zgloba uključuju IgG2 zglobove u kojima su 1, 2, 3 ili sva 4 cisteina (C219, C220, C226 i C229) promenjena u drugu aminokiselinu. U specifičnom tehničkom rešenju, IgG2 sadrži C219S supstituciju. IgG2 zglob može takođe da sadrži supstituciju na C220 ili supstitucije i na C219 i na C220. IgG2 zglob može da sadrži supstituciju, koja će sama, ili zajedno sa jednom ili više supstitucija u drugim regionima teškog ili lakog lanca prouzrokovati da antitelo poprimi oblik A ili B (videti, npr., Allen et al. (2009)
2
Biochemistry 48:3755). U određenim aspektima ovde opisanim, zglob je hibridni zglob koji sadrži sekvence iz najmanje dva izotipa. Nar primer, zglob može da sadrži gornji, srednji ili donji zglob iz jednog izotipa i ostatak zgloba iz jednog ili više drugih izotipova. Na primer, zglob može biti IgG2/IgG1 zglob, i može da sadrži, npr., gornje i srednje zglobove od IgG2 i donji zglob od IgG1. Zglob može imati efektorsku funkciju ili biti lišen efektorske funkcije. Na primer, donji zglob divljeg tipa IgG1 pruža efektorsku funkciju.
[0061] Izraz "CH1 domen" odnosi se na konstantni region teškog lanca koji povezuje varijabilni domen sa zglobom u konstantnom domenu teškog lanca. Kako se ovde koristi, CH1 domen počinje od A118 i završava se na V215. Izraz "CH1 domen" uključuje divlji tip CH1 domena (kao što imaju SEQ ID NO: 98 za IgG1 i SEQ ID NO: 124 za IgG2), kao i njihove varijante (npr., CH1 domeni koji se ne javljaju prirodno ili modifikovani CH1 domeni). Na primer, izraz "CH1 domen" uključuje divlji tip CH1 domena i njihove varijante koje imaju 1, 2, 3, 4, 5, 1-3, 1-5, 3-5 i/ili najviše 5, 4, 3, 2, ili 1 mutaciju, npr., supstitucije, delecije ili adicije. Primeri CH1 domena uključuju CH1 domene sa mutacijama koje modifikuju biološku aktivnost antitela, kao što su ADCC, CDC ili poluživot. Ovde su date modifikacije CH1 domena koje utiču na biološku aktivnost antitela. CH1 domen može da sadrži supstituciju C131S, čija supstitucija može izazvati IgG2 antitelo ili antitelo koje sadrži najmanje deo IgG2 antitela, kao što je zglob i/ili zglob i CH1, da usvoji oblik B, za razliku od A oblika antitela.
[0062] Izraz "CH2 domen" odnosi se na konstantni region teškog lanca koji povezuje zglob i CH3 domen u konstantnom domenu teškog lanca. Kako se ovde koristi, CH2 domen počinje na P238 i završava se na K340. Izraz "CH2 domen" uključuje divlji tip CH2 domena (kao što ima SEQ ID NO: 137 za IgG1; Tabela 35), kao i njihove varijante (npr., CH2 domeni koji se ne javljaju prirodno ili modifikovani CH2 domeni). Na primer, izraz "CH2 domen" uključuje divlji tip CH2 domena i njihove varijante koje imaju 1, 2, 3, 4, 5, 1-3, 1-5, 3-5 i/ili najviše 5, 4, 3, 2, ili 1 mutaciju, npr., supstitucije, delecije ili adicije. Primeri CH2 domena uključuju CH2 domene sa mutacijama koje modifikuju biološku aktivnost antitela, kao što su ADCC, CDC ili poluživot. U određenim tehničkim rešenjima, CH2 domen sadrži supstitucije A330S/P331S koje smanjuju efektorsku funkciju. Ovde su date druge modifikacije CH2 domena koje utiču na biološku aktivnost antitela.
[0063] Izraz "CH3 domen" odnosi se na konstantni region teškog lanca koji je C-terminalni do CH2 domena u konstantnom domenu teškog lanca. Kako se ovde koristi, CH3 domen počinje na G341 i završava se na K447. Izraz "CH3 domen" uključuje divlji tip CH3 domena (kao što ima SEQ ID NO: 138 za IgG1; Tabela 35), kao i njihove varijante (npr., CH3 domeni koji se ne javljaju prirodno ili modifikovani CH3 domeni). Na primer, izraz "CH3 domen" uključuje
2
divlji tip CH3 domena i njihove varijante koje imaju 1, 2, 3, 4, 5, 1-3, 1-5, 3-5 i/ili najviše 5, 4, 3, 2, ili 1 mutaciju, npr., supstitucije, delecije ili adicije. Izuzetan primer CH3 domena uključuje CH3 domene sa mutacijama koje modifikuju biološku aktivnost antitela, kao što je ADCC, CDC ili poluživot. Ove su date modifikacije CH3 domena koje utiču na biološku aktivnost antitela.
[0064] "CL domen" se odnosi na konstantni domen lakog lanca. Izraz "CL domen" uključuje divlji tip CL domena i njihove varijante, npr., varijante koje sadrže C214S.
[0065] "Fc region sa nativnom sekvencom" ili "Fc sa nativnom sekvencom" sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je identična sekvenci aminokiselina Fc regiona koja se nalazi u prirodi. Humani Fc regioni sa nativnom sekvencom uključuju Fc region humanog IgG1 sa nativnom sekvencom; Fc region humanog IgG2 sa nativnom sekvencom; Fc region humanog IgG3 sa nativnom sekvencom; i Fc region humanog IgG4 sa nativnom sekvencom kao i njihove prirodne varijante. Fc sa nativnom sekvencom uključuje različite alotipove Fc-a (videti, npr., Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1).
[0066] Izraz "epitop" ili "antigena determinanta" odnosi se na mesto na antigenu (npr., CD73) na koje se imunoglobulin ili antitelo specifično vezuje. Epitopi unutar proteinskih antigena mogu da se formiraju i iz susednih aminokiselina (obično linearni epitop) ili nesusednih aminokiselina koje su smeštene jedna naspram druge tercijarnim savijanjem proteina (obično konformacioni epitop). Epitopi nastali od susednih aminokiselina se obično, ali ne uvek, zadržavaju izloženi rastvaračima za denaturaciju, dok se epitopi formirani tercijarnim savijanjem obično gube prilikom tretiranja sa denaturacionim rastvaračima. Epitop obično uključuje najmanje 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 aminokiselina u jedinstvenoj prostornoj konformaciji. Metode za određivanje koji su epitopi vezani određenim antitelom (tj., mapiranje epitopa) su dobro poznate prosečnom poznavaocu oblasti i uključuju, na primer, imunobloting i imunoprecipitacione eseje, pri čemu se peptidi koji se preklapaju ili su susedni (npr., iz CD73) testiraju na reaktivnost sa datim antitelom (npr., antitelo protiv CD73). Metode za određivanje prostorne konformacije epitopa uključuju tehnike u oblasti i one opisane ovde, na primer, kristalografiju x-zracima, 2-dimenzionalnu nuklearnu magnetnu rezonancu i HDX-MS (videti, npr., Epitop Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, tom 66, G. E. Morris, Ed. (1996)).
[0067] Izraz "mapiranje epitopa" odnosi se na postupak identifikacije molekularnih determinanti na antigenu koji učestvuje u antitelo-antigen prepoznavanju.
[0068] Izraz "vezuje se za isti epitop" u odnosu na dva ili više antitela znači da se antitela vezuju za isti segment aminokiselinskih ostataka, kako je određeno datom metodom. Tehnike za
2
utvrđivanje da li se antitela vezuju za "isti epitop na CD73" sa ovde opisanim antitelima uključuju, na primer, metode mapiranja epitopa, kao što su, analize x-zracima kristala antigen: antitelo kompleksa, koji obezbeđuju atomsku rezoluciju epitopa, i masena spektometrija za razmenu vodonik/deuterijum (HDX-MS). Ostale metode koje prate vezivanje antitela na fragmente antigena (npr. proteolitičke fragmente) ili na mutirane varijacije antigena gde se gubitak vezivanje usled modifikacije aminokiselinskog ostatka unutar antigenske sekvence često smatra indikacijom komponente epitopa (npr. alanin skenirajuća mutageneza -Cunningham & Bunari (1985) Science 244:1081). Pored toga, takođe se mogu koristiti računarske kombinatoričke metode za mapiranje epitopa. Ove metode se oslanjaju na sposobnost antitela od interesa da afinitetno izoluju specifično kratke peptide iz kombinatornih biblioteka fagnog displeja peptida.
[0069] Antitela koja se "nadmeću sa drugim antitelom za vezivanje za cilj" se odnose na antitela koja inibiraju (delimično ili potpuno) vezivanje drugog antitela za cilj. Da li se dva antitela međusobno nadmeću za ciljno vezivanje, tj., da li i u kojoj meri jedno antitelo inhibira vezivanje drugog antitela za metu, može se utvrditi korišćenjem poznatih eksperimenata kompeticije, npr,. kao što su oni opisani u Primerima. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo se takmiči sa, i inhibira vezivanje drugog antitela za cilj za najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 100%. Nivo inhibicije ili kompeticije može biti različit u zavisnosti od toga koje je antitelo "blokirajuće antitelo" (tj., hladno antitelo koje se prvo inkubira sa ciljem). Testovi kompeticije mogu se izvesti kako je opisano, na primer, u Ed Harlow i David Lane, Cold Spring Harb Protoc ; 2006; doi:10.1101/pdb.prot4277 ili u poglavlju 11 "Using Antibodies" od Ed Harlow i David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA 1999. Antitela koja se takmiče vežu se na isti epitop, epitop koji se preklapa ili susedne epitope (npr., što je dokazano sternim ometanjem).
[0070] Ostali testovi kompetitivnog vezivanja uključuju: direktnu ili indirektnu radioimunoanalizu sa čvrstom fazom (RIA), direktni ili indirektni enzimski imunoesej sa čvrstom fazom (EIA), kompetitivni esej u sendviču (videti Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983)); direktni biotin-avidin EIA sa čvrstom fazom (videti Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986)); esej sa direktno obeleženom čvrstom fazom, sendvič esej sa direktno obeleženom čvrstom fazom (videti Harlow and Lane, Antbodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); RIA sa čvrstom fazom sa direktnom oznakom koji koristi 1-125 oznaku (videti Morel et al., Mol. Immunol.25(1):7 (1988)); direktni biotin-avidin sa čvrstom fazom EIA (Cheung et al., Virology 176:546 (1990)); i direktno obeležen RIA. (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol.32:77 (1990)).
2
[0071] Kako se ovde koristi, izrazi "specifično vezivanje," "selektivno vezivanje," "selektivno se veže," i "specifično se veže," odnose se na vezivanje antitela za epitop na unapred određeni antigen ali ne i na druge antigene. Tipično, antitelo (i) se vezuje sa ravnotežnom konstantom disocijacije (KD) približno manjom od 10<-7>M, poput približno manje od 10<-8>M, 10<-9>M ili 10<-10>M ili čak nižom ako je određena, npr., tehnologijom površinske plazmonske rezonance (SPR) u BIACORE® 2000 instrumentu površinske plazmonske rezonance koristeći unapred određeni antigen, npr., rekombinantni humani CD73, kao analit i antitelo kao ligand, ili Scatchard-ovu analizu vezivanja antitela za antigen pozitivne ćelije, i (ii) vezuje se na unapred određeni antigen sa afinitetom koji je najmanje dva puta veći od njegovog afiniteta vezivanja za nespecifični antigen (npr., BSA, kazein) osim prethodno određenog antigena ili usko srodnog antigena. Prema tome, ako nije drugačije naznačeno, antitelo koje se "specifično veže za humani CD73" odnosi se na antitelo koje se vezuje za rastvorljivi ili ćelijski vezan humani CD73 sa KDod 10<-7>M ili manjom, poput približno manje od 10<-8>M, 10<-9>M ili 10<-10>M ili još nižom. Antitelo koje "unakrsno reaguje sa CD73 cinomolgusa" odnosi se na antitelo koje se vezuje za CD73 cinomolgusa sa KDod 10<-7>M ili manjom, kao što je manjom od 10<-8>M, 10<-9>M ili 10<-10>M ili još nižom. U određenim tehničkim rešenjima, antitela koja ne reaguju unakrsno sa CD73 iz vrsta koje nisu humane pokazuju pretežno nedetektibilno vezivanje protiv ovih proteina u standardnim testovima vezivanja.
[0072] Izraz "kassoc" ili "ka", kako se ovde koristi, odnosi se na konstantu brzine asocijacije određene interakcije antitelo-antigen, dok se "kdis" ili "kd," kako se ovde koristi, odnosi na konstantu brzine disocijacije određene interakcije antitelo-antigen. Izraz "KD", kako se ovde koristi, odnosi se na ravnotežnu konstantu disocijacije, koja se dobija iz odnosa kdprema ka(tj,. kd/ka) i izražava se kao molarna koncentracija (M). Vrednosti KDvrednosti za antitela mogu da se odrede metodama dobro utvrđenim u oblasti. Poželjni metod za određivanje KDantitela je upotreba površinske plazmonske rezonancije, poželjno korišćenjem biosenzorskog sistema kao što je Biacore® sistem površinske plazmonske rezonancije ili protočnom citometrijom i Scatchard-ovom analizom.
[0073] Izraz "EC50" u kontekstu in vitro ili in vivo testa koji koristi antitelo ili njegov fragment koji se veže za antigen, odnosi se na koncentraciju antitela ili njegovog dela koji veže antigen koji indukuje odgovor koji je 50% maksimalnog odgovora, tj., na pola puta između maksimalnog odgovora i bazne linije.
[0074] "Brzina internalizacije" antitela ili receptora, npr., CD73, posredovana antitelom, npr., antitelom protiv CD73, može biti predstavljena, npr., T1/2internalizacije, npr., kao što je prikazano u Primerima. Brzina internalizacije antitela protiv CD73 može biti poboljšana ili povećana za najmanje 10%, 30%, 50%, 75%, 2 puta, 3 puta, 5 puta ili više, što rezultira smanjenjem T1/2od najmanje 10%, 30%, 50%, 75%, 2 puta, 3 puta, 5 puta ili više menjajući konstantni region teškog lanca antitela u modifikovan konstantni region teškog lanca, npr., onog koji sadrži IgG2 zglob i IgG2 CH1 domen. Na primer, umesto da ima T1/2od 10 minuta, modifikovan konstantni region teškog lanca može povećati brzinu internalizacije i na taj način smanjiti T1/2na 5 minuta (tj., dvostruko povećanje brzine internalizacije ili dvostruko smanjenje T1/2). "T1/2" se definiše kao vreme za koje se postiže polovina maksimalne internalizacije, mereno od trenutka dodavanja antitela ćelijama. Maksimalni nivo internalizacije može biti nivo internaizacije na platou grafika koji predstavlja grafički prikazanu internalizaciju naspram koncentracija antitela. Modifikovan konstantni region teškog lanca može povećati maksimalni nivo internalizacije antitela za najmanje 10%, 30%, 50%, 75%, 2 puta, 3 puta, 5 puta ili više. Drugi način upoređivanja efikasnosti internalizacije različitih antitela, kao što je antitelo sa, i isto antitelo bez, modifikovanog konstantnog regiona teškog lanca, je poređenjem njihovog nivoa internalizacije pri datoj koncentraciji antitela (npr., 100 nM) ili pri datom vremenu (npr., 2 minuta, 5 minuta, 10 minuta ili 30 minuta). Upoređivanjem nivoa internalizacije takođe se može obaviti upoređivanjem nivoa EC50internalizacije. Nivo internalizacije jednog antitela može se definisati u odnosu na nivo datog (referentnog) antitela, npr., antitelo ovde opisano, npr., 11F11 ili CD73.4-IgG2CS-IgG1 ili CD73.4-IgG2CS-IgG1.1f, i, može se naznačiti kao procenat vrednosti dobijene sa datim (referentnim) antitelom. Obim internalizacije može biti povećan za najmanje 10%, 30%, 50%, 75%, 2 puta, 3 puta, 5 puta ili više, poređenjem bilo kojom od ovih metoda.
[0075] Izraz "prirodno se pojavljuje" kako se ovde koristi i kada se primenjuje na objekt odnosi se na činjenicu da se objekat može naći u prirodi. Na primer, polipeptidna ili polinukleotidna sekvenca prisutna u organizmu (uključujući viruse) koja se može izolovati iz izvora u prirodi i koju čovek nije namerno modifikovao u laboratoriji, prirodno se javlja.
[0076] "Polipeptid" se odnosi na lanac koji sadrži najmanje dva uzastopno povezana ostatka aminokiseline, bez gornje granice dužine lanca. Jedan ili više ostataka aminokiseline u proteinu mogu da sadrže modifikaciju kao što je, ali ne ograničavajući se na, glikozilacija, fosforilacija ili disulfidna veza. "Protein" može da sadrži jedan ili više polipeptida.
[0077] Izraz "molekul nukleinske kiseline," kako se ovde koristi, podrazumeva da uključuje molekule DNK i molekule RNK. Molekul nukleinske kiseline može biti jednolančan ili dvolančan, i može biti cDNK.
[0078] Takođe su obezbeđene "konzervativne modifikacije sekvence" sekvenci navedenih u SEQ ID NOs opisanim ovde, tj., modifikacije nukleotidne i aminokiselinske sekvence koje ne
1
ukidaju vezivanje antitela kodiranih nukleotidnom sekvencom ili koje sadrže aminokiselinsku sekvencu, na antigenu. Takve konzervativne modifikacije sekvence uključuju konzervativne supstitucije nukleotida i aminokiseline, kao i, nukleotidne i aminokiselinske adicije i delecije. Na primer, modifikacije se mogu uvesti u ovde opisane SEQ ID NOs standardnim tehnikama poznatim u oblasti, kao što su mutageneza usmerena na mesto i PCR-om posredovana mutageneza. Konzervativne modifikacije sekvence uključuju konzervativne supstitucije amino kiseline, u kojima je aminokiselinski ostatak zamenjen ostatkom aminokiseline sa sličnim bočnim lancem. Familije aminokiselinskih ostataka sa sličnim bočnim lancima su definisane u oblasti. Ove familije uključuju amino kiseline sa osnovnim bočnim lancima (npr., lizin, arginin, histidin), kiselim bočnim lanacima (npr., asparaginska kiselina, glutaminska kiselina), nenaelektrisanim polarnim bočnim lanacima (npr., glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein, triptofan), nepolarnim bočnim lanacima (npr., alanin, valin, leucine, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin), beta-razgranatim bočnim lancima (npr., treonin, valin, izoleucin) i aromatičnim bočnim lanacima (npr., tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin). Tako je predviđeni neesencijalni aminokiselinski ostatak u antitelu protiv CD73 poželjno zamenjen sa drugim aminokiselinskim ostatkom iz iste familije bočnog lanca. Metode identifikacije konzervativnih supstitucija nukleotida i aminokiselina koje ne eliminišu vezivanje antigena dobro su poznate u oblasti (videti, npr., Brummell et al., Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); i Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997)).
[0079] Alternativno, u drugom tehničkom rešenju, mutacije se mogu uvesti nasumično duž celog ili delom kodirajuće sekvence antitela protiv CD73, kao što je mutageneza zasićenosti, i rezultirajuća modifikovana antitela protiv CD73 mogu biti pregledana na poboljšanu aktivnost vezivanja.
[0080] Za nukleinske kiseline, izraz "značajna homologija" označava da su dve nukleinske kiseline, ili njihove određene sekvence, kada su optimalno poravnate i upoređene, identične, sa odgovarajućim nukleotidnim insercijama ili delecijama, u najmanje oko 80% nukleotida, obično najmanje oko 90% do 95%, i poželjnije najmanje oko 98% do 99.5% nukleotida. Alternativno, postoji značajna homologija kada će segmenti hibridizovati u uslovima selektivne hibridizacije do komplementa lanca.
[0081] Za polipeptide, izraz "značajna homologija" označava da su dva polipeptida, ili njihove određene sekvence, kada su optimalno usklađene i upoređene, identične, sa odgovarajućim insercijama ili delecijama aminokiseline, u najmanje oko 80% aminokiselina, obično najmanje oko 90% do 95%, a poželjnije najmanje oko 98% do 99.5% aminokiselina.
2
[0082] Procentualni identitet između dve sekvence je funkcija broja identičnih pozicija koje sekvence dele kada su sekvence optimalno poređane (tj., % homologije = # identičnih pozicija/ukupno # pozicija x 100), a optimalno poravnanje određeno je uzimajući u obzir broj praznina i dužinu svake praznine, koju je potrebno uvesti za optimalno poravnanje dve sekvence. Poređenje sekvenci i određivanje procenta identiteta između dve sekvence može se izvršiti korišćenjem matematičkog algoritma, kao što je opisano u neograničavajućim primerima u daljem tekstu.
[0083] Procentualni identitet između dve sekvence nukleotida, može se utvrditi pomoću GAP programa u GCG softverskom paketu (dostupno na http://www.gcg.com), koristeći NWSgapDNK.CMP matriks i masu praznine od 40, 50, 60, 70, ili 80 i dužinsku masu od 1, 2, 3, 4, 5, ili 6. Procentualni identitet između dve nukleotidne ili aminokiselinske sekvence može se takođe odrediti pomoću algoritma E. Meyers i W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)) koji je ugrađen u ALIGN program (verzija 2.0), upotrebom tabele sa masenim ostatkom PAM120, kaznene dužine praznine od 12 i kaznene praznine od 4. Pored toga, procenat identiteta između dve aminokiselinske sekvence može se utvrditi pomoću algoritma Needleman i Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) koji je ugrađen u GAP program u GCG softveru paketa (dostupno na http://www.gcg.com), koristeći matricu Blossum 62 ili matricu PAM250, i masu praznine od 16, 14, 12, 10, 8, 6, ili 4 i dužinsku masu od 1, 2, 3, 4, 5, ili 6.
[0084] Ovde opisane sekvence nukleinskih kiselina i proteina mogu se dalje koristiti kao "upitna sekvenca" za obavljanje pretraživanja javnih baza podataka da bi se, na primer, identifikovale srodne sekvence. Takva pretraživanja se mogu obaviti korišćenjem NBLAST i XBLAST programa (verzija 2.0) od Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Pretraživanje BLAST nukleotida može se obaviti pomoću NBLAST programa, ocena = 100, dužina reči = 12 da bi se dobile nukleotidne sekvence homologne nukleotidnim sekvencama molekula opisanim ovde. Pretraživanje BLAST proteina može se obaviti sa XBLAST programom, ocena = 50, dužina reči = 3 da se dobiju sekvence homologne molekulima proteina dobijenim ovde. Da bi se postigla poravnanja praznina za poređenje, Gapped BLAST se može koristiti kao što je opisano u Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402. Kada se koriste BLAST i Gapped BLAST programi, mogu se upotrebiti zadani parametri odgovarajućih programa (npr., XBLAST i NBLAST). Videti www.ncbi.nlm.nih.gov.
[0085] Nukleinske kiseline mogu biti prisutne u celim ćelijama, u ćelijskom lizatu, ili u delimično prečišćenom ili suštinski čistom obliku. Nukleinska kiselina je "izolovana" ili "učinjena suštinski čistom" kada je prečišćena od drugih ćelijskih komponenti ili drugih kontaminanata, npr., od drugih ćelijskih nukleinskih kiselina (npr., ostalih delova hromozoma) ili proteina, standardnim tehnikama, uključujući alkalno/SDS tretiranje, CsCl obavijanje, hromatografiju na koloni, elektroforezu na agaroznom gelu i druge dobro poznate u oblasti. Videti, F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, Njujork (1987).
[0086] Nukleinske kiseline, npr., cDNK, mogu biti mutirane, u skladu sa standardnim tehnikama da se obezbede genske sekvence. Za kodirajuće sekvence, ove mutacije mogu uticati na sekvencu amino kiseline po želji. Konkretno, razmatraju se DNK sekvence koje su uglavnom homologne sa ili su izvedene iz nativnih V, D, J, konstanti, prekidača i drugih takvih sekvenci opisanih ovde.
[0087] Izraz "vektor," kako se ovde koristi, odnosi se na molekul nukleinske kiseline koji može da transportuje drugu nukleinsku kiselinu sa kojom je povezan. Jedan tip vektora je "plazmid," koji se odnosi na kružnu dvolančanu petlju DNK u koju se mogu vezati dodatni DNK segmenti. Drugi tip vektora je virusni vektor, pri čemu se dodatni DNK segmenti mogu vezati u virusni genom. Određeni vektori su sposobni za autonomnu replikaciju u ćeliji domaćina u koju su uvedeni (npr., bakterijski vektori koji imaju bakterijsko poreklo replikacije i epizomalni vektori sisara). Ostali vektori (npr., ne-epizomalni vektori sisara) mogu se integrisati u genom ćelije domaćina nakon uvođenja u ćeliju domaćina i na taj način se replikuju zajedno sa genomom domaćina. Štaviše, određeni vektori su u stanju da usmeravaju ekspresiju gena za koje su oni operativno povezani. Takvi se vektori ovde navode kao "rekombinantni vektori ekspresije" (ili jednostavno, "vektori ekspresije") Generalno, vektori ekspresije koji se koriste u rekombinantnim DNK tehnikama često su u obliku plazmida. U ovoj specifikaciji, "plazmid" i "vektor" mogu se koristiti naizmenično jer je plazmid najčešće korišćeni oblik vektora. Međutim, takođe su obuhvaćeni i drugi oblici ekspresionih vektora, poput virusnih vektora (npr., retrovirusi sa oštećenjem replikacije, adenovirusi i virusi povezani sa adeno virusima), koji služe ekvivalentnim funkcijama.
[0088] Izraz "rekombinantna ćelija domaćina" (ili jednostavno "ćelija domaćina"), kako se ovde koristi, se odnosi na ćeliju koja sadrži nukleinsku kiselinu koja nije prirodno prisutna u ćeliji, i možda na ćeliju u kojoj je uveden rekombinantni vektor ekspresije. Treba shvatiti da su takvi pojmovi namenjeni da se ne odnose samo na određenu pedmetnu ćeliju već i na potomstvo takve ćelije. Budući da se u sledećim generaijama mogu dogoditi određene modifikacije ili zbog mutacija ili uticaja okoline, takvo potomstvo ne može, u stvari, biti identično roditeljskoj ćeliji, ali je još uvek uključeno u opseg obima "ćelija domaćina" kako se ovde koristi.
4
[0089] Kako se ovde koristi, izraz "antigen" se odnosi na bilo koju prirodnu ili sintetsku imunogenu supstancu, kao što je protein, peptid, ili hapten. Antigen može biti CD73 ili njegov fragment.
[0090] "Imuni odgovor" se odnosi na biološki odgovor kičmenjaka protiv stranih uzročnika, čiji odgovor štiti organizam od ovih uzročnika i bolesti koje oni izazivaju. Imuni odgovor je posredovan dejstvom ćelije imunog sistema (na primer, T limfocita, B limfocita, ćelije prirodne ubice (NK), makrofaga, eozinofila, mastocita, dendritske ćelije ili neutrofila) i rastvorljivih makromolekula koje proizvodi bilo koja od ovih ćelija ili jetra (uključujući antitela, citokine, i komplement) koji rezultira u selektivnom ciljanju, vezivanju za, oštećenjem, uništavanjem, i/ili eliminacijom iz tela kičmenjaka invazivnih patogena, ćelija ili tkiva zaraženih patogenima, kanceroznih ili drugih nenormalnih ćelija, ili, u slučajevima autoimunosti ili patoloških upala, normalnih humanih ćelija ili tkiva. Imuni odgovor ili reakcija uključuje, npr., aktivaciju ili inhibiciju T ćelije, npr., efektorsku T ćeliju ili Th ćeliju, kao što je CD4+ ili CD8+ T ćelija, ili inhibiciju Treg ćelije.
[0091] "Imunomodulator" ili "imunoregulator" se odnosi na agens, npr., komponentu signalnog puta, koje može biti uključen u modulaciju, regulisanje, ili modifikaciju imunog odgovora. "Modulacija," "regulisanje," ili "modifikacija" imunog odgovora odnosi se na bilo kakve promene u ćeliji imunog sistema ili na aktivnost takve ćelije (npr., efektorska T ćelija). Takva modulacija uključuje stimulaciju ili supresiju imunog sistema koja se može manifestovati povećanjem ili smanjenjem broja različitih tipova ćelija, povećanjem ili smanjenjem aktivnosti ovih ćelija, ili bilo kojim drugim promenama koje se mogu dogoditi unutar imunog sistema. Identifikovani su i inhibitorni i stimulišući imunomodulatori, od kojih neki mogu da pojačaju funkciju u mikro okruženju tumora. Imunomodulator se može nalaziti na površini T ćelije. "Imunomodulatorni cilj" ili "imunoregulatorni cilj" je imunomodulator koji je ciljan za vezivanje, i čija je aktivnost izmenjena vezivanjem, supstance, agensa, grupe, jedinjenja ili molekula. Imunomodulatorni ciljevi uključuju, na primer, receptore na površini ćelije ("imunomodulatorni receptori") i ligande receptora ("imunomodulatorni ligandi").
[0092] Povećana sposobnost stimulacije imunog odgovora, ili imunog sistema, može biti rezultat pojačane agonističke aktivnosti kostimulatornih receptora T ćelija i/ili pojačane antagonističke aktivnosti inhibitornih receptora. Povećana sposobnost stimulisanja imunog odgovora ili imunog sistema može se odraziti višestrukim povećanjem EC50 ili maksimalnog nivoa aktivnosti u eseju koji meri imuni odgovor, npr., esej koji meri promene u oslobađanju citokina ili hemokina, citolitičku aktivnost (određuje se direktno na ciljnim ćelijama ili indirektno preko detekcije CD107a ili granzima) i ploriferaciju. Sposobnost stimulisanja imunog odgovora ili aktivnosti imunog sistema može se povećati za najmanje 10%, 30%, 50%, 75%, 2 puta, 3 puta, 5 puta ili više.
[0093] "Imunoterapija" se odnosi na lečenje subjekta koji je pogođen sa, ili je u riziku da se zarazi ili koji trpi recidiv bolesti metodom koja obuhvata indukciju, pojačavanje, suzbijanje ili na drugi način modifikovanje imunog odgovora.
[0094] "Imunostimulirajuća terapija" ili "imunostimulatorna terapija" odnosi se na terapiju koja rezultira povećanjem (indukovanjem ili pojačavanjem) imunog odgovora kod subjekta za, npr., lečenje kancera.
[0095] "Potenciranje endogenog imunog odgovora" znači povećanje efikasnosti ili potencijala postojećeg imunog odgovora kod subjekta. Ovo povećanje efikasnosti i potencijala može se postići, na primer, prevladavanjem mehanizama koji suzbijaju endogeni imuni odgovor domaćina ili stimuliranjem mehanizama koji pojačavaju imuni odgovor endogenog domaćina.
[0096] "T efektor" ("Teff") ćelije se odnosi na T ćelije (npr., CD4+ i CD8+ T ćelije) sa citolitičkim aktivnostima kao i T pomoćne (Th) ćelije, koje luče citokine i aktiviraju i usmeravaju druge imune ćelije, ali ne uključuju regulatorne T ćelije (Treg ćelije).
[0097] Kako se ovde koristi, izraz "povezan" odnosi se na udruživanje dva ili više molekula. Veza može biti kovalentna ili nekovalentna. Veza takođe može biti genetska (tj., rekombinantno spojeno). Ovakva povezivanja mogu se ostvariti korišćenjem širokog asortimana poznatih tehnika, kao što su hemijska konjugacija i rekombinantna proizvodnja proteina.
[0098] Kako se ovde koristi, "administriranje" odnosi se na fizičko unošenje kompozicije koja sadrži terapijski agens subjektu, koristeći bilo koji od različitih postupaka i sistema za isporuku koji su poznati prosečnim poznavaocima oblasti. Poželjni putevi administriranja antitela koja su ovde opisana uključuju intravenozno, intraperitonealno, intramuskularno, subkutano, spinalno ili druge parenteralne puteve davanja, na primer injekcijom ili infuzijom. Izraz "parenteralna primena" kako se ovde koristi označava načine davanja koji nisu enteralno i topikalno davanje, obično injekcijom, i uključuje, bez ograničenja, intravenoznu, intraperitonealnu, intramuskularnu, intraarterijalnu, intratekalnu, intralimfatsku, intralezionalnu, intrakapsularnu, intraorbitalnu, intrakardijalnu, intradermalnu, transtrahealnu, subkutanu, subkutikularnu, intraartikularnu, subkapsularnu, subarahnoidnu, intraspinalnu, epiduralnu i intrasternalnu injekciju i infuziju, kao i in vivo elektroporaciju. Alternativno, antitelo opisano ovde može se administrirati preko neparenteralnog puta, kao što je topikalni, epidermalni ili mukozni put davanja, na primer, intranazalno, oralno, vaginalno, rektalno, sublingvalno ili topikalno. Administriranje se takođe može obaviti, na primer, jednom, više puta, i/ili tokom jednog ili više produženih perioda.
[0099] Kako se ovde koristi, izraz "odgovor posredovan T ćelijom" odnosi na odgovor posredovan od T ćelije, uključujući efektorske T ćelije (npr., CD8<+>ćelije) i pomoćne T ćelije (npr., CD4+ ćelije). Odgovori posredovani T ćelijom uključuju, na primer, T ćelijsku citotoksičnost i ploriferaciju.
[0100] Kako se ovde koristi, izraz "odgovor citotoksičnih T limfocita (CTL)" odnosi se na imuni odgovor indukovan od strane citotoksičnih T ćelija. CTL odgovori su posredovani najpre od strane CD8<+>T ćelija.
[0101] Kako se ovde koristi, izrazi "inhibira" ili "blokira" (npr., odnosi se na inhibiciju/blokiranje CD73 vezivanja ili aktivnosti) koriste se naizmenično i obuhvataju i delimičnu i potpunu inhibiciju/blokiranje.
[0102] Kako se ovde koristi, "kancer" se odnosi na široku grupu bolesti koje karakteriše nekontrolisani rast nenormalnih ćelija u telu. Neregulisana ćelijska podela može rezultirati stvaranjem malignih tumora ili ćelija koje napadaju susedna tkiva i mogu metastazirati u udaljene delove tela preko limfnog sistemema ili krvotoka.
[0103] Izrazi "lečiti," "lečenje" i "tretman," kako se ovde koristi, odnose se na bilo koju vrstu intervencije ili procesa koji se vrši na subjektu, ili mu se administrira aktivni agens sa ciljem preokreta, ublažavanja, olakšavanja, inhibicije, ili usporavanje ili sprečavanje napredovanja, razvoja, ozbiljnosti ili ponavljanja simptoma, komplikacije, stanja ili biohemijskih pokazatelja povezanih sa nekom bolešću. Profilaksa se odnosi na administriranje subjektu koji nije bolestan, kako bi se sprečilo da se bolest pojavi ili umanji njene efekte ako se desi.
[0104] "Hematološka malignost" uključuje limfom, leukemiju, mijelom ili limfoidnu malignost, kao i kancer slezine i limfnih čvorova. Primeri limfoma uključuju i B ćelijske limfome i T ćelijske limfome. B-ćelijski limfomi uključuju i Hočkinov limfom i većinu ne Hočkinovih limfoma. Neograničavajući primeri B ćelijskih limfoma uključuju difuzni limfom velikih B-ćelija, folikularni limfom, limfom limfnog tkiva povezan sa sluznicom, sitnoćelijski limfocitni limfom (preklapa se hroničnom limfocitnom leukemijom), limfom ćelija plašta (MCL – mantle cell lymphoma), Burkitov limfom, medijastinalni limfom velikih B ćelija, Waldenstrom-ova makroglobulinemija, B ćelijski limfom marginalne zone nodusa, limfom marginalne zone slezine, intravaskularni limfom velikih B-ćelija, primarni izlivni limfom, limfomatoidni granulomatozis. Neograničavajući primeri T ćelijskih limfoma uključuju ekstranodalni T ćelijski limfom, kožni T ćelijski limfom, anaplastični krupnoćelijski limfom, i angioimunoblastični T ćelijski limfom. Hematološke malignosti takođe uključuju leukemiju, kao što je, ali ne ograničavajući se na, sekundarna leukemija, hronična limfocitna leukemija, akutna mijeloična leukemija, hronična mijeloična leukemija, i akutna limfoblastična leukemija. Hematološke malignosti dalje uključuju mijelome, kao što su, ali ne ograničavajući se na, multipli mijelom i tinjajući multipli mijelom. Ostali hematološki i/ili B ćelijski- ili T-ćelijski povezani kanceri obuhvaćeni su izrazom hematološka malignost.
[0105] Izraz "efikasna doza" ili "efikasno doziranje" je definisano kao količina dovoljna da se postigne ili bar delimično postigne željeni efekat. "Terapijski efikasna količina" ili "terapijski efikasno doziranje" leka ili terapijskog agensa je bilo koja količina leka koja, kada se koristi sama ili u kombinaciji sa drugim terapijskim agensom, pospešuje regresiju bolesti o čemu govori smanjenje težine simptoma bolesti, povećanje učestalosti i trajanja perioda bez simptoma bolesti, ili sprečavanje oštećenja ili invaliditeta zbog patnje usled bolesti. "Profilaktički efikasna količina" ili "profilaktički efikasno doziranje" leka je količina leka koja se kada se daje sama, ili u kombinaciji sa drugim terapijskim agensom subjektu koji je u riziku da razvije bolest ili pretrpi recidiv bolesti, inhibira razvoj ili ponavljanje bolesti. Sposobnost terapijskog ili profilaktičkog agensa da podstakne regresiju bolesti ili inhibira razvoj ili ponovnu pojavu bolesti u humanim subjektima tokom kliničkih ispitivanja, u model sistemima životinja koji predviđaju efikasnost kod ljudi, ili testiranjem aktivnosti agenasa u in vitro esejima, može se proceniti korišćenjem različitih postupaka poznatih stručnjaku u oblasti.
[0106] Kao primer, anti-kancer agens je lek koji usporava napredovanje kancera ili podstiče regresiju kancera kod subjekta. U poželjnim tehničkim rešenjima, terapijski efikasna količina leka pospešuje regresiju kancera do tačke eliminacije kancera. "Promovisanje regresije kancera" znači da davanje efikasne količine leka, samostalno ili u kombinaciji sa antineoplastičnim agensom, rezultira smanjenjem rasta ili veličine tumora, nekrozom tumora, smanjenjem ozbiljnosti bar jednog simptoma bolesti, porast u učestalosti i trajanju perioda bez simptoma bolesti, prevencija oštećenja ili invaliditeta zbog nevolje bolesti, ili na drugi način ublažavanje simptoma bolesti kod pacijenta. Farmakološka efikasnost odnosi se na sposobnost leka da promoviše regresiju kancera kod pacijenta. Fiziološka sigurnost se odnosi na prihvatljivo nizak nivo toksičnosti, ili drugih štetnih fizioloških efekta na nivou ćelije, organa i/ili organizma (štetnih efekta) koji su posledica primene leka.
[0107] Kao primer za lečenje tumora, terapijski efikasna količina ili doziranje leka poželjno inhibira rast ćelija ili rast tumora za najmanje oko 20%, poželjnije za najmanje oko 40%, još poželjnije za najmanje oko 60%, i još poželjnije za najmanje oko 80% u odnosu na nelečene subjekte. U najpoželjnijim tehničkim rešenjima, terapijski efikasna količina ili doza leka u potpunosti inhibira rast ćelije ili rast tumora, tj., poželjno inhibira rast ćelije ili rast tumora za 100%. Sposobnost jedinjenja da inhibira rast tumora može se proceniti korišćenjem opisanih testova u daljem tekstu. Alternativno, ovo svojstvo kompozicije može se proceniti ispitivanjem sposobnosti jedinjenja da inhibira rast ćelija, a takva inhibicija može da se meri in vitro testovima poznatim stručnjacima u oblasti. U drugim poželjnim tehničkim rešenjima koja su ovde opisana, može se posmatrati regresija tumora i može da traje tokom najmanje oko 20 dana, poželjnije najmanje oko 40 dana, ili još poželjnije najmanje oko 60 dana.
[0108] Izrazi "pacijent" i "subjekt" odnose se na svakog čoveka ili životinju koja nije čovek koji prima ili profilaktički ili terapijski tretman. Na primer, ovde opisane metode i kompozicije mogu se koristiti za lečenje subjekta koji ima kancer. Izraz "životinja koja nije čovek" uključuje sve kičmenjake, npr., sisare i ne-sisare, kao što su ne-humanih primati, ovcu, psa, kravu, kokoške, vodozemce, gmizavce, itd..
[0109] Različiti aspekti opisani ovde su detaljnije opisani u narednim pododeljcima.
I. Anti-CD73 antitela
[0110] Ovde su opisana antitela, npr., potpuno humana antitela, za koja su karakteristična određena funkcionalna svojstva ili osobine. Na primer, antitela specifično vezuju humani CD73. Pored toga, antitela mogu unakrsno reagovati sa CD73 jednog ili više ne-humanih primata, kao što je CD73 cinomolgusa.
[0111] Pored specifičnog vezivanja za rastvorljivi i/ili membranski vezan humani CD73, antitela opisana ovde pokazuju jedno ili više sledećih funkcionalnih svojstava:
(a) inhibicija CD73 enzimske aktivnosti, što rezultira smanjenjem proizvedenog adenozina; (b) vezivanje za cyno CD73;
(c) antitelom posredovana CD73 internalizacija u ćelije, npr., ćelije tumora; i
(d) vezivanje na konformacioni epitop koji sadrži amino kiseline 65-83 i 157-172 humanog CD73.
[0112] Poželjno, antitela protiv CD73 se vezuju za humani CD73 (monomerni ili dimerni; izoforma 1 ili 2) sa visokim afinitetom, na primer, sa KDod 10<-7>M ili manjom, 10<-8>M ili manjom, 10<-9>M ili manjom, 10<-10>M ili manjom, 10<-11>M ili manjom, 10<-12>M ili manjom, 10<-12>M do 10<-7>M, 10<-11>M do 10<-7>M, 10<-10>M do 10<-7>M, 10<-9>M do 10<-7>M, ili 10<-10>M do 10<-8>M. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo protiv CD73 se vezuje za rastvorljivi humani CD73, npr, kako je utvrđeno BIACORE® SPR analizom, sa KDod 10<-7>M ili manjom, 10<-8>M ili manjom, 10<-9>M (1 nM) ili manjom, 10<-10>M ili manjom, 10<-12>M do 10<-7>M, 10<-11>M do 10<-7>M, 10<-10>M do 10<-7>M, 10<-9>M do 10<-7>M, 10<-8>M do 10<-7>M ili 10<-10>M do 10<-8>M. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo protiv CD73 se vezuje za vezani (npr., vezan za ćelijsku membranu, npr., Calu6 ćelija) humani CD73, npr., kako je ovde utvrđeno i kao što je dalje opisano ovde, sa EC50 manjom od 1 nM. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo protiv CD73 se vezuje za vezani humani CD73, npr., za ćelijsku membranu vezani humani CD73, npr., kako je utvrđeno protočnom citometrijom i Scatchard-ovim nacrtom, sa KDod 10<-7>M ili manjom, 10<-8>M ili manjom, 10<-9>M (1 nM) ili manjom, 10<-10>M ili manjom, 10<-12>M do 10<-7>M, 10<-11>M do 10<-8>M, 10<-10>M do 10<-8>M, 10<-9>M do 10<-8>M, 10<-11>M do 10<-9>M, 10<-10>M do 10<-8>M, ili 10<-10>M do 10<-9>M. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo protiv CD73 vezuje se za rastvorljivi humani CD73 sa KDod 10<-7>M ili manjom, 10<-8>M ili manjom, 10<-9>M (1 nM) ili manjom, 10<-10>M ili manjom, 10<-12>M do 10<-7>M, 10<-11>M do 10<-7>M, 10<-10>M do 10<-7>M, 10<-9>M do 10<-7>M, 10<-10>M do 10<-8>M, ili 10<-8>M do 10<-7>M, i vezani humani CD73, npr., humani CD73 vezan za ćelijsku membranu, sa KDili EC50od 10<-7>M ili manjom, 10<-8>M ili manjom, 10<-9>M (1 nM) ili manjom, 10<-10>M ili manjom, 10<-12>M do 10<-7>M, 10<-11>M do 10<-8>M, 10<-10>M do 10<-8>M, 10<-9>M do 10<-8>M, 10<-11>M do 10<-9>M, ili 10<-10>M do 10<-9>M.
[0113] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo protiv CD73 se vezuje za cyno CD73 sa visokim afinitetom, npr., vezuje se za CHO ćeliju koja eksprimira cyno CD73 sa EC50 od 0.1 nM do 10 nM, kao što je EC50 manja od 1nM, kako je određeno, npr,. kako je dalje opisano ovde.
[0114] U određenim tehničkim rešenjima, antitela protiv CD73 opisana ovde takođe se vezuju za CD73 cinomolgusa, npr., vezuje se za membranski vezan CD73 cinomolgusa, npr, za CHO ćeliju koja eksprimira cyno CD73 sa EC50od 100 nM ili manjom, 10 nM ili manjom, 1 nM ili manjom, 100 nM do 0.01 nM, 100 nM do 0.1 nM, 100 nM do 1 nM, ili 10 nM do 0.1 nM, kako je izmereno, npr., u Primerima.
[0115] U određenim tehničkim rešenjima, antitela protiv CD73 su najmanje 90%, 95%, 98%, ili 99% monomerna, kako je određeno, npr., SEC-om. Antitela protiv CD73 takođe mogu imati biofizičke karakteristike koje su slične ili u okviru opsega ovde opisanih antitela.
[0116] U određenim tehničkim rešenjima, antitela protiv CD73 inhibiraju enzimsku aktivnost humanog i/ili cyno CD73, npr., kako je određeno u testovima za perlice vezanog CD73, ili kako je određeno u ćelijama, npr., Calu6, SKMEL24 ili H292 ćelijama, ili kako je određeno u in vivo testu, npr., ksenograft modelu tumora, npr., kako je dalje opisano u Primerima. Antitela protiv CD73 mogu da imaju inhibitorne aktivnosti koje su barem slične, ili u okviru antitela koja su ovde opisna. Na primer, antitela protiv CD73 mogu inhibirati humanog CD73 (npr., CD73 vezanog za čvrstu supstancu) enzimsku aktivnost (proizvodnju adenozina) sa EC50manjom od 10 nM ili manjom od 5 nM ili u opsegu od 1 do 10 nM ili 5 do 10 nM. Antitela
4
protiv CD73 mogu inhibirati aktivnost humanog CD73 na ćelijama, npr., Calu6 ćelijama sa EC50manjom od 10 nM ili manjom od 1 nM ili u opsegu od 0.1 do 10 nM, 0.1 do 1 nM ili 0.1 do 0.5 nM.
[0117] U određenim tehničkim rešenjima, antitela protiv CD73 bivaju internalizovana (i posreduju kod CD73 internalizacije) od strane ćelije za koju se vezuju kao što je određeno, npr., testom internalizacije sa visokim sadržajem ili FACS-om ili protočnom citometrijom, kako je dalje opisano u Primerima. Antitela protiv CD73 mogu da imaju karakteristike internalizacije (EC50, T1/2i Ymax), i vreme do platoa koji su bar slični ili u opsegu antitela opisanih u Primerima. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo protiv CD73 ima T1/2internalizacije manje od 1 sata, kao što je manje od 30 minuta, manje od 15 minuta, manje od 12 minuta, manje od 10 minuta, manje od 7 minuta ili čak manje od 5 minuta u jednoj ili više ćelijskih linija, npr., onih navedenih u Primerima, kako je određeno, npr., u testu internalizacije sa visokim sadržajem (opisano u Primeru 6A). U određenim tehničkim rešenjima, antitelo protiv CD73 dostiže maksimalnu antitelom posredovanu internalizaciju antitela protiv CD73 u roku od 10 sati ili manje, 6 sati ili manje, 5 sati ili manje, 4 sata ili manje, 3 sata ili manje, 2 sata ili manje, 1 sat ili manje, npr., u rasponu od 10 minuta do 10 sati, 10 minuta do 6 sati, 1 sat do 10 sati ili 1 sat do 6 sati, kako je određeno, npr., korišćenjem testa internalizacije sa visokim sadržajem, kao što je opisano, npr., u Primeru 6A, ili korišćenjem protočne citometrije, kao što je opisano, npr., u Primeru 6B. Maksimalni nivo anti- CD73 antitelom posredovane internalizacije CD73 može biti najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90% ili više, u zavisnosti od ćelijskog tipa. Na primer, EC50anti-CD73 antitelom posredovane internalizacije CD73 u Calu6 ćelijama, mereno testom internalizacije visokog sadržaja opisano u Primerima, može biti manja od 10 nM, npr., od 0.1 do 10 nM ili 1 do 10 nM ili 1 do 5 nM i Ymax od najmanje 90% ili najmanje 95%.
[0118] Antitela protiv CD73, npr., antitela koja imaju IgG2 zglob, IgG2 CH1 domen, ili IgG2 zglob i IgG2 CH1 domen, mogu posredovati sledeće karakteristike internalizacije CD73 merene testom internalizacije visokog sadržaja, npr., kao što je opisano u Primeru 6A:
• EC50od 10 nM ili manje, 5 nM ili manje, 1nM ili manje, ili 0.1 do 10 nM ili 0.1 do 1 nM; Ymax (maksimalni procenat internalizacija) od najmanje 90%, 95% ili 98% u Calu6 ćelijama i T1/2manje od 30 minuta ili manje od 10 minuta u Calu6 ćelijama;
• T1/2 manje od 30 minuta ili manje od 10 minuta u humanim ćelijama, npr., Calu6 ćelijama, HCC44 ćelijama, H2030 ćelijama, H2228 ćelijama, HCC15 ćelijama, SKLU1 ćelijama, SKMES1 ćelijama ili SW900 ćelijama.
[0119] Antitela protiv CD73, npr., antitela koja imaju IgG2 zglob, IgG2 CH1 domen, ili IgG2 zglob i IgG2 CH1 domen, mogu posredovati sledeće karakteristike CD73 internalizacije merene protočnom citometrijom, npr., kao što je opisano u Primeru 6B:
• T1/2od 1 sata ili manje i Ymax od najmanje 70% u Calu6 ćelijama;
• T1/2od 30 minuta ili manje i Ymax od najmanje 70% u NCI-H292 ćelijama;
• T1/2od 2 sata ili manje i Ymax od najmanje 30% u SNUC1 ćelijama; i/ili
• T1/2od 30 minuta ili manje i Ymax od najmanje 60% u NCI-H1437 ćelijama.
[0120] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo protiv CD73 je bin1 antitelo, tj., ono se takmiči za vezivanje za humanim CD73 sa 11F11, ali ne sa 4C3.
[0121] U određenim tehničkim rešenjima, antitela protiv CD73 se vezuju za epitop, npr., konformacioni epitop u N-terminalnom delu humanog CD73, npr., epitop smešten u amino kiselinama 65-83 humanog CD73 (SEQ ID NO:96), kako je utvrđeno, npr., HDX-MS-om, kako je dalje opisano u Primerima. U određenim tehničkim rešenjima, antitela protiv CD73 se vezuju za amino kiseline 157-172 humanog CD73 (SEQ ID NO: 97), ili za epitop smešten u amino kiselinama 157-172, humanog CD73 (SEQ ID NO: 97), kako je utvrđeno, npr., HDX-MS-om. Alternativno, antitela protiv CD73 se vezuju za epitop, npr., diskontinuirani epitop u N-terminalnom delu humanog CD73, kako je utvrđeno, npr., HDX-MS-om.
[0122] U određenim tehničkim rešenjima, antitela protiv CD73 se vezuju za amino kiseline 65 do 83 i amino kiseline 157-172 humanog CD73, ili za epitop u amino kiselinama 65 do 83 i amino kiselina 157-172, izoforme 1 ili 2 humanog CD73, tj., aminokiselinske sekvence FTKVQQIRRAEPNVLLLDA (SEQ ID NO: 96) i LYLPYKVLPVGDEVVG (SEQ ID NO: 97), kako je utvrđeno, npr., HDX-MS-om. U određenim tehničkim rešenjima, antitela protiv CD73 se vezuju za sve ili deo amino kiselina 65 do 83 i amino kiseline 157-172 humanog CD73, kako je utvrđeno, npr., HDX-MS-om. U određenim tehničkim rešenjima, antitela protiv CD73 se vezuju i za glikozilovani i neglikozilovani humani CD73. U određenim tehničkim rešenjima, antitela protiv CD73 se vezuju samo za glikozilovani CD73 i ne za neglikozilovani CD73.
[0123] Antitela protiv CD73 mogu se nadmetati za vezivanje na CD73 sa (ili inhibiraju vezivanje od) antitelima protiv CD73 koja sadrži CDR-ove ili varijabilne regione ovde opisane, npr., one od CD73.4-1, CD73.4-2, CD73.3, 11F11-1, 11F11-2, 4C3-1, 4C3-2, 4C3-3, 4D4, 10D2-1, 10D2-2, 11A6, 24H2, 5F8-1, 5F8-2, 6E11 i/ili 7A11. U određenim tehničkim rešenjima, antitela protiv CD73 inhibiraju vezivanje CD73.4-1, CD73.4-2, CD73.3, 11F11, 4C3, 4D4, 10D2, 11A6, 24H2, 5F8, 6E11 i/ili 7A11 na humani CD73 za najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 100%. U određenim tehničkim rešenjima, CD73.4-1, CD73.4-2, CD73.3, 11F11-1, 11F11-2, 4C3-1, 4C3-2, 4C3-3, 4D4, 10D2-1, 10D2-2, 11A6, 24H2, 5F8-1, 5F8-2, 6E11 i/ili 7A11 inhibiraju vezivanje antitela protiv CD73 na humani CD73 za najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 100%. U određenim tehničkim rešenjima, antitela protiv CD73 inhibiraju vezivanje CD73.4-1, CD73.4-2, CD73.3, 11F11-1, 11F11-2, 4C3-1, 4C3-2, 4C3-3, 4D4, 10D2-1, 10D2-2, 11A6, 24H2, 5F8-1, 5F8-2, 6E11 i/ili 7A11 na humani CD73 za najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 100% i CD73.4-1, CD73.4-2, CD73.3, 11F11-1, 11F11-2, 4C3-1, 4C3-2, 4C3-3, 4D4, 10D2-1, 10D2-2, 11A6, 24H2, 5F8-1, 5F8-2, 6E11 i/ili 7A11 inhibiraju vezivanje antitela protiv CD73 na humani CD73 za najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 100% (npr., takmiče se u oba smera). Kompetitivni eksperimenti se mogu izvesti, npr., kako je ovde dalje opisano, npr., u Primerima.
[0124] U određenim tehničkim rešenjima, antitela protiv CD73 inhibiraju CD73 enzimsku aktivnost i/ili su internalizovani u ćelijama ne zahtevajući multivalentno umrežavanje, kako je određeno, npr., nedostatkom potrebe za FcR vezivanjem.
[0125] U određenim tehničkim rešenjima, antitela protiv CD73 imaju 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ili 11 karakteristika navedenih u Tabeli 3.
[0126] Tabela 3: Potencijalna svojstva anti-CD73 antitela
(1) vezivanje na humani CD73, npr., izoformu 1 i 2 za perlice vezanog humanog monomernog i dimernog humanog CD73, npr., sa KDod 10 nM ili manje (npr., 0.01 nM do 10 nM), npr., mereno BIACORE® SPR analizom;
(2) vezivanje za membranski vezan humani CD73, npr., sa EC50od 1 nM ili manje (npr.0.01 nM do 1 nM);
(3) vezivanje za CD73 cinomolgusa, npr., vezivanje za membranski vezan CD73 cinomolgusa, npr., sa EC50od 10 nM ili manje (npr., 0.01 nM do 10 nM);
(4) inhibicija enzimske aktivnosti humanog CD73, npr., sa EC50 od 10 nM ili manje; (5) inhibicija enzimske aktivnosti cyno CD73, npr., sa EC50 od 10 nM ili manje;
(6) inhibicija endogene (ćelijske) enzimske aktivnost humanog CD73 u Calu6 ćelijama sa EC50 od 10 nM ili manje;
(7) inhibicija enzimske aktivnosti humanog CD73 in vivo;
(8) internalizacija, npr., antitelom posredovana (ili zavisna) internalizacija CD73, u ćelijama, npr., sa T1/2manjim od 1 sat, 30 minuta ili 10 minuta i/ili Ymax od najmanje 70%, 80% ili 90%;
4
(9) vezivanje na konformacioni epitop na humanom CD73, npr., diskontinuirani epitop unutar aminokiselinske sekvence (SEQ ID NO: 1) koji uključuje sve ili deo aminokiselinskih ostataka FTKVQQIRRAEPNVLLLDA (SEQ ID NO: 96) i/ili LYLPYKVLPVGDEVVG (SEQ ID NO: 97);
(10) kompeticija u bilo kom smeru ili u oba smera za vezivanje na humani CD73 sa CD73.4-1, CD73.4-2, CD73.3, 11F11-1, 11F11-2, 4C3-1, 4C3-2, 4C3-3, 4D4, 10D2-1, 10D2-2, 11A6, 24H2, 5F8-1, 5F8-2, 6E11 i/ili 7A11; i
(11) interakcija sa humanim CD73 po sličnom obrascu kao CD73.4, što je određeno rendgenskom kristalografijom.
[0127] Aktivnost antitela koje pokazuje jedno ili više ovih funkcionalnih svojstava (npr., biohemijska, imunohemijska, ćelijska, fiziološka ili druge biološke aktivnosti, ili slično) onako kako je određeno u skladu sa metodologijama poznatim u oblasti i ovde opisanim, razumeće se da se odnose na statistički značajnu razliku u određenoj aktivnosti u odnosu na onu koja se vidi u odsustvu antitela (npr., ili kada je prisutno kontrolno antitelo nebitne specifičnosti). U određenim tehničkim rešenjima, antitelo protiv CD73 ovde stavljeno na uvid javnosti smanjuje izmereni parametar (npr., volumen tumora, metastaze tumora, nivoe adenozina, nivoe cAMP-a) za najmanje 10% izmerenog parametra, poželjnije za najmanje 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ili 90%, i u određenim poželjnim tehničkim rešenjima, za više od 92%, 94%, 95%, 97%, 98% ili 99%. Suprotno tome, antitelo protiv CD73 ovde stavljeno na uvid javnosti povećava izmereni parametar za najmanje 10%, kao što je za najmanje 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% (tj.2 puta), 3 puta, 5 puta, ili 10 puta.
[0128] Standardni testovi za procenu sposobnosti vezivanja antitela za CD73 raznih vrsta su poznati u oblasti, uključujući na primer, ELISA-e, Western blotove, i RIA-e. Pogodni testovi su detaljno opisani u Primerima. Kinetika vezivanja (npr., afinitet vezivanja) antitela se takođe može proceniti standardnim testovima poznatim u oblasti, kao što je BIACORE® SPR analiza. Testovi za procenu uticaja antitela na funkcionalna svojstva CD73 (npr., proizvodnja adenozina, rast i metastaza tumora, inhibicija T ćelija) detaljnije su opisani daljem tekstu i u Primerima.
[0129] U određenim tehničkim rešenjima, antitela protiv CD73 nisu nativna antitela ili nisu antitela koja se prirodno javljaju. Na primer, antitela protiv CD73 imaju post-translacione modifikacije koje se razlikuju od onih antitela koja se prirodno javljaju, po tome što imaju više, manje ili različit tip post-translacione modifikacije.
[0130] U određenim tehničkim rešenjima, antitela protiv CD73 stimulišu Teff (T efektorsku) funkciju i/ili smanjuju Treg funkciju, npr., uklanjanjem CD73 sa površine T ćelija i/ili inhibiranjem njegove enzimske aktivnosti.
[0131] U određenim tehničkim rešenjima, antitela protiv CD3 sadrže najmanje IgG2 zglob, i po potrebi takođe IgG2 CH1 domen ili fragment ili derivat zgloba i/ili CH1 domena i antitelo A oblika (videti, npr., Allen et al. (2009) Biochemistry 48:3755). U određenim tehničkim rešenjima, antitela protiv CD3 sadrže najmanje IgG2 zglob, i po izboru takođe IgG2 CH1 domen ili fragment ili derivat zgloba i/ili CH1 domena i antitelo usvaja formu B (videti, npr., Allen et al. (2009) Biochemistry 48:3755). U određenim tehničkim rešenjima, kompozicija sadrži smešu anti-CD73 antitela sa oblikom A i anti-CD73 antitela sa oblikom B.
[0132] Ovde su data anti-humana CD73 antitela koja (i) sadrže varijabilni region koji se vezuje za region na humanom CD73 koji je sličan onom vezanom za 11F11, ali se ne vezuje za region sličan onom vezanom za 4C3 (tj., je bin1 antitelo); (ii) vezuju se za monomerni i dimerni humani CD73 sa Kd od 10 nM ili manje; (iii) inhibiraju enzimsku aktivnost (konverzija AMP-a u adenozin) humanog CD73, npr., na ćelijama, npr., Calu6 ćelijama, sa EC50manjom od 10 nM; i (iv) posreduju antitelo zavisnu CD73 internalizaciju u ćelijama, npr., sa T1/2 od 1 sat ili manje (ili 30 minuta ili manje, ili 10 minuta ili manje), Ymax od 50% ili više (ili 60% ili više, 70% ili više, 80% ili više ili 90% ili više) u humanim ćelijama, npr., Calu6 ćelijama, H2228 ćelijama, HCC15 ćelijama H2030 ćelijama, SNUC1 ćelijama. U određenim tehničkim rešenjima, antitela sadrže IgG2 zglob ili IgG2 zglob i IgG2 CH1 domen. Ovde su data antitela protiv humanog CD73 koja (i) sadrže varijabilni region koji se vezuje za region na humanom CD73 koji je sličan onom vezanom za 11F11, ali se ne vezuje za region sličan onom vezanom za 4C3 (tj., je bin1 antitelo); (ii) vezuju se za monomerni i dimerni humani CD73 sa Kd od 10 nM ili manje, kako je određeno SPR-om (Biacore); (iii) inhibiraju enzimsku aktivnost (konverzija AMP-a u adenozin) humanog CD73, npr., na ćelijama, npr., Calu6 ćelijama, sa EC50manjom od 10 nM; i (iv) posreduju antitelo zavisnu CD73 internalizaciju u ćelijama, npr., sa T1/2 od 30 minuta ili manje, Ymax od 80% ili više u humanim Calu6, H2228, HCC15 ili H2030 ćelijama, kako je određeno korišćenjem testa internalizacije visokog sadržaja opisanom u Primeru 6A.
[0133] U poželjnim tehničkim rešenjima, ovde opisano antitelo protiv CD73 nije značajno toksično. Na primer, antitelo protiv CD73 nije značajno toksično za organ čoveka, npr., jedan ili više od navedenih, jetre, bubrega, mozga, pluća, i srca, kako je određeno, npr., kliničkim ispitivanjima. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo protiv CD73 ne izaziva značajno neželjeni imuni odgovor, npr., autoimunost ili upalu.
4
II. Tipična anti-CD73 antitela
[0134] Predmetni pronalazak se odnosi na izolovana antitela protiv CD73 koja sadrže CDR1, CDR2, i CDR3 sekvence teškog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 5, 6, i 7, redom, i CDR1, CDR2, i CDR3 sekvence lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 13, 14, i 15, redom, i koje sadrže konstantni region teškog lanca koji sadrži IgG2 zglob i IgG2 CH1 domen. Pored antitela protiv CD73 predmetnog pronalaska, predmetna objava takođe pruža i druge primere antitela protiv CD73.
Varijabini regioni antitela protiv CD73
[0135] Specifična antitela ovde opisana su antitela, npr., monoklonska antitela, koja imaju CDR i/ili sekvence varijabilnog regiona antitela 11F11-1, 11F11-2, 4C3-1, 4C3-2, 4C3-3, 4D4, 10D2-1, 10D2-2, 11A6, 24H2, 5F8-1, 5F8-2, 6E11, 7A11, CD73.3-1, -2 ili -3, CD73.4-1 i -2, CD73.4-2, CD73.5-1 i -2, CD73.6-1 i -2, CD73.7-1 i -2, CD73.8-1 i -2, CD73.9-1 i -2, CD73.10-1 i -2 i CD73.11, kao i antitela koja imaju najmanje 80% identičnosti (npr., najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 99% identičnosti) sa njihovim varijabilnim regionom ili CDR sekvencama. Antitela predmetnog pronalaska su antitela, npr., monoklonska antitela, koja imaju CDR i/ili sekvence varijabilnog regiona antitela 11F11-2, CD73.4-2 i CD73.5-2. Tabela 4 navodi SEQ ID NOs CDR-ova VH i VL regiona svakog antitela, kao i one od VH i VL regiona. Kao što je dalje opisano u Primerima, određeni teški lanaci mogu postojati sa više od jednog lakog lanca, i SEQ ID NOs alternativnih lakih lanaca takođe su navedeni u Tabeli ispod.
Tabela 4:
4
4
[0136] Ovde su data izolovana antitela, ili njihovi delovi koji vezuju antigen, koji sadrže varijabilne regione teškog i lakog lanca, pri čemu varijabilni region teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 4, 16, 32, 40, 52, 60, 68, 80, 88, 135, i 170-177.
[0137] Takođe su obezbeđena izolovana antitela, ili njihovi delovi koji vezuju antigen, koji sadrže varijabilne regione teškog i lakog lanca, pri čemu varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 8, 12, 20, 24, 28, 36, 44, 48, 56, 64, 72, 76, 84, 92 i 238. Ovde su data izolovana antitela, ili njihov deo koji veže antigen, koja sadrže:
(a) sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 135 i 8, redom;
(b) sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 135 i 12, redom;
(c) sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 4 i 8, redom;
(d) sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 4 i 12, redom;
(e) sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 16 i 20, redom;
(f) sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 16 i 24, redom;
(g) sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 16 i 28, redom;
(h) sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 32 i 36, redom;
(i) sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 40 i 44, redom;
(j) sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 40 i 48, redom;
4
(k) sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 52 i 56, redom;
(1) sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 60 i 64, redom;
(m) sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 68 i 72, redom;
(n) sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 68 i 76, redom;
(o) sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 68 i 238, redom;
(p) sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 80 i 84, redom;
(q) sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 88 i 92, redom;
(r) sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 170 i 20, redom;
(s) sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 170 i 24, redom;
(t) sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 170 i 28, redom;
(u) sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 171 i 8, redom;
(v) sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 171 i 12, redom;
(w) sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 172 i 8, redom;
(x) sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 172 i 12, redom;
(y) sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 173 i 8, redom;
(z) sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 173 i 12, redom;
(a2) sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 174 i 8, redom;
4
(b2) sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 174 i 12, redom;
(c2) sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 175 i 8, redom;
(d2) sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 175 i 12, redom;
(e2) sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 176 i 8, redom;
(f2) sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 176 i 12, redom; ili
(g2) sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 177 i 36, redom.
[0138] U jednom tehničkom rešenju predmetnog pronalaska, izolovana antitela sadrže (a) sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 135 i 12, redom;
(b) sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 4 i 12, redom; ili
(c) sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 171 i 12, redom.
[0139] Ovde opisana antitela protiv CD73 mogu da sadrže CDRl regione, CDR2 regione i CDR3 regione teškog i lakog lanca antitela protiv CD73 ovde opisanih, npr., CD73.4-1, CD73.4-2, CD73.3, 11F11-1, 11F11-2, 11F11, 4C3-1, 4C3-2, 4C3-3, 4D4, 10D2-1, 10D2-2, 11A6,24H2, 5F8-1, 5F8-2, 5F8-3, 6E11 i 7A11, ili njihove kombinacije. Antitela protiv CD73 predmetnog pronalaska sadrže CDR1 regione, CDR2 regione i CDR3 regione teškog i lakog lanca od antitela protiv CD73 CD73.4-2 ili 11F11-2.
[0140] S obzirom na to da se svako od ovih antitela veže za CD73 i da je specifičnost vezivanja antigena obezbeđena prevashodno od regiona CDR1, 2 i 3, sekvence VHCDR1, 2 i 3 i sekvence VLCDR1, 2 i 3 mogu se "pomešati i uskladiti" (tj., CDR-ovi iz različitih antitela mogu se mešati i podudarati, mada svako antitelo mora da sadrži VHCDR1, 2 i 3 i VLCDR1, 2 i 3) da bi se stvorili drugi molekuli koji se vežu za anti-CD73 opisan ovde. CD73 vezivanje takvih "pomešanih i usklađenih" antitela može se testirati korišćenjem tetova vezivanja koji su opisani gore u Primerima (npr., ELISA testovi). Poželjno, kada se VHCDR sekvence mešaju i podudaraju, CDR1, CDR2 i/ili CDR3 sekvenca iz određene VHsekvence je zamenjena sa strukturno sličnom CDR sekvencom (sekvencama). Slično tome, kada se VLCDR sekvence mešaju i podudaraju, CDR1, CDR2 i/ili CDR3 sekvenca iz određene VLsekvence je poželjno zamenjena strukturno sličnom CDR sekvencom (sekvencama). Biće odmah očigledno prosečnom poznavaocu oblasti da se nove VHi VLsekvence mogu stvoriti supstitucijom jedne ili više sekvenci VHi/ili VLCDR regiona sa strukturno sličnim sekvencama iz CDR sekvenci stavljenim ovde na uvid javnosti za monoklonska antitela CD73.4-1, CD73.4-2, 11F11-1, 11F11-2, 4C3-1, 4C3-2, 4C3-3, 4D4, 10D2-1, 10D2-2, 11A6, 24H2, 5F8-1, 5F8-2, 6E11 i/ili 7A11. "Mešovita i podudarna" antitela koja imaju afinitet vezivanja, bioaktivnost i/ili druga svojstva ekvivalentna ili bolja od specifičnih antitela ovde stavljenih na uvid javnosti mogu biti izabrana za upotrebu u ovde opisanim postupcima.
[0141] Ovde su data izolovana antitela, ili njihov deo koji veže antigen, koja sadrže:
(a) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 5, 17, 33, 41, 53, 61, 69, 81, i 89;
(b) CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 6, 18, 34, 42, 54, 62, 70, 82, i 90;
(c) CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 7, 19, 35, 43, 55, 63, 71, 83, i 91;
(d) CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 9, 13, 21, 25, 29, 37, 45, 49, 57, 65, 73, 77, 85, i 93;
(e) CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 10, 14, 22, 26, 30, 38, 46, 50, 58, 66, 74, 78, 86, i 94; i
(f) CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 11, 15, 23, 27, 31, 39, 47, 51, 59, 67, 75, 79, 87, i 95;
pri čemu se antitelo specifično vezuje za humani CD73.
[0142] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo sadrži varijabilne regione teškog i lakog lanca, pri čemu CDR1, CDR2, i CDR3 regioni varijabilnog regiona teškog lanca sadrže SEQ ID NOs: 5-7; 17-19; 33-35; 41-43; 53-55; 61-63; 69-71; 81-83; ili 89-91;
pri čemu se antitelo specifično vezuje za humani CD73. Antitela predmetnog pronalaska sadrže varijabilne regione teškog i lakog lanca, pri čemu CDR1, CDR2, i CDR3 regioni varijabilnog regiona teškog lanca sadrže SEQ ID NOs: 5-7.
1
[0143] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo sadrži varijabilni region teškog i lakog lanca, pri čemu CDR1, CDR2, i CDR3 regioni varijabilnog regiona lakog lanca sadrže:
(a) SEQ ID NOs: 9-11; 13-15; 21-23; 25-27; 29-31; 37-39; 45-47; 49-51; 57-59; 65-67; 73-75; 77-79; 85-87; ili 93-95;
pri čemu se antitelo specifično vezuje za humani CD73. Antitela predmetnog pronalaska sadrže varijabilne regione teškog i lakog lanca, pri čemu CDR1, CDR2, i CDR3 regioni varijabilnog regiona lakog lanca sadrže SEQ ID NOs: 13-15.
[0144] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo sadrži varijabilne regione teškog i lakog lanca, pri čemu:
(a) CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca sadrže SEQ ID NOs: 5-7, redom, i CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca sadrži SEQ ID NOs: 9-11, redom;
(b) CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca sadrže SEQ ID NOs: 5-7, redom, i CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca sadrže SEQ ID NOs: 13-15, redom;
(c) CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca sadrže SEQ ID NOs: 17-19, redom, i CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca sadrže SEQ ID NOs: 21-23, redom;
(d) CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca sadrže SEQ ID NOs: 17-19, redom, i CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca sadrže SEQ ID NOs: 25-27, redom;
(e) CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca sadrže SEQ ID NOs: 17-19, redom, i CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca sadrže SEQ ID NOs: 29-31, redom;
(f) CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca sadrže SEQ ID NOs: 33-35, redom, i CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca sadrže SEQ ID NOs: 37-39, redom;
(g) CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca sadrže SEQ ID NOs: 41-43, redom, i CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca sadrže SEQ ID NOs: 45-47, redom;
2
(h) CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca sadrže SEQ ID NOs: 41-43, redom, i CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca sadrže SEQ ID NOs: 49-51, redom;
(i) CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca sadrže SEQ ID NOs: 53-55, redom, i CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca sadrže SEQ ID NOs: 57-59, redom;
(j) CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca sadrže SEQ ID NOs: 61-63, redom, i CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca sadrže SEQ ID NOs: 65-67, redom;
(k) CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca sadrže SEQ ID NOs: 69-71, redom, i CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca sadrže SEQ ID NOs: 73-75, redom;
(l) CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca sadrže SEQ ID NOs: 69-71, redom, i CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca sadrže SEQ ID NOs: 77-79, redom;
(m) CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca sadrže SEQ ID NOs: 81-83, redom, i CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca sadrže SEQ ID NOs: 85-87, redom; ili
(n) CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca sadrže SEQ ID NOs: 89-91, redom, i CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca sadrže SEQ ID NOs: 93-95, redom;
pri čemu se antitelo specifično vezuje za humani CD73, i po izboru ima jednu ili više karakteristika navedenih u Tabeli 3, npr., sposobnost da inhibira defosfolrilaciju AMP-a i da posreduje CD73 receptor zavisnu internalizaciju.
[0145] U određenim tehničkim rešenjima predmetnog pronalaska, antitelo sadrži varijabilne regione teškog i lakog lanca, pri čemu CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca sadrže SEQ ID NOs: 5-7, redom, i CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca sadrže SEQ ID NOs: 13-15, redom;
pri čemu se antitelo specifično vezuje za human CD73, i po izboru ima jednu ili više karakteristika navedenih u Tabeli 3, npr., sposobnost da inhibira defosfolrilaciju AMP-a i da posreduje CD73 receptor zavisnu internalizaciju.
[0146] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo sadrži varijabilne regione teškog i lakog lanca, pri čemu:
(a) CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca se sastoje od SEQ ID NOs: 5-7, redom, i CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca se sastoje od SEQ ID NOs: 9-11, redom;
(b) CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca se sastoje od SEQ ID NOs: 5-7, redom, i CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca se sastoje od SEQ ID NOs: 13-15, redom;
(c) CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca se sastoje od SEQ ID NOs: 17-19, redom, i CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca se sastoje od SEQ ID NOs: 21-23, redom;
(d) CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca se sastoje od SEQ ID NOs: 17-19, redom, i CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca se sastoje od SEQ ID NOs: 25-27, redom;
(e) CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca se sastoje od SEQ ID NOs: 17-19, redom, i CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca se sastoje od SEQ ID NOs: 29-31, redom;
(f) CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca se sastoje od SEQ ID NOs: 33-35, redom, i CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca se sastoje od SEQ ID NOs: 37-39, redom;
(g) CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca se sastoje od SEQ ID NOs: 41-43, redom, i CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca se sastoje od SEQ ID NOs: 45-47, redom;
(h) CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca se sastoje od SEQ ID NOs: 41-43, redom, i CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca se sastoje od SEQ ID NOs: 49-51, redom;
(i) CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca se sastoje od SEQ ID NOs: 53-55, redom, i CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca se sastoje od SEQ ID NOs: 57-59, redom;
(j) CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca se sastoje od SEQ ID NOs: 61-63, redom, i CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca se sastoje od SEQ ID NOs: 65-67, redom;
(k) CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca se sastoje od SEQ ID NOs: 69-71, redom, i CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca se sastoje od SEQ ID NOs: 73-75, redom;
4
(l) CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca se sastoje od SEQ ID NOs: 69-71, redom, i CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca se sastoje od SEQ ID NOs: 77-79, redom;
(m) CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca se sastoje od SEQ ID NOs: 81-83, redom, i CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca se sastoje od SEQ ID NOs: 85-87, redom; ili
(n) CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca se sastoje od SEQ ID NOs: 89-91, redom, i CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca se sastoje od SEQ ID NOs: 93-95, redom;
pri čemu se antitelo specifično vezuje za humani CD73, i po izboru ima jednu ili više karakteristika navedenih u Tabeli 3, npr., sposobnost da inhibira defosfolrilaciju AMP-a i da posreduje receptor CD73 zavisnu internalizaciju.
[0147] U određenim tehničkim rešenjima predmetnog pronalaska, antitelo sadrži varijabilne regione teškog i lakog lanca, pri čemu se CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca sastoje od SEQ ID NOs: 5-7, redom, i CDR1, CDR2, i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca sadrže SEQ ID NOs: 13-15, redom;
pri čemu se antitelo specifično vezuje za humani CD73, i po izboru ima jednu ili više karakteristika navedenih u Tabeli 3, npr., sposobnost da inhibira defosfolrilaciju AMP-a i da posreduje receptor CD73 zavisnu internalizaciju.
Konstantni domeni teškog lanca antitela protiv CD73
[0148] Konstantni region teškog lanca antitela protiv CD73 opisanih ovde može biti bilo kog izotipa, npr., IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4, ili njihove kombinacije i/ili njihove modifikacije. Antitelo protiv CD73 može da ima efektorsku funkciju ili može da ima smanjenu ili da bude bez efektorske funkcije. U određenim tehničkim rešenjima, antitela protiv CD73 opisana ovde sadrže modifikovan konstantni region teškog lanca koji pruža pojačana svojstva antitelu. Kao što je opisano u Primerima, antitela protiv CD73 koja imaju IgG2 zglob i po izboru IgG2 CH1 domen, kao što su ona koja imaju varijabilne regione od 11F11 antitela, su bolje i brže internalizovana u odnosu na antitela koja imaju isti varijabilni region ali ne-IgG2 zglob ili CH1, npr., u odnosu na antitela koja imaju IgG1 zglob ili IgG1 zglob i IgG1 CH1. Na primer antitelo koje sadrži varijabilne regione od 11F11 antitela i sadrži IgG2 zglob i po izboru IgG2 CH1 i IgG1 CH2 i IgG1 CH3 domene, i bez obzira da li je sa efektorskom funkcijom ili je bez nje, efikasnije se internalizuje u ćelije vezivanjem za CD73 na ćelijskoj membrani u odnosu na isto antitelo, ali sa IgG1 zglobom ili IgG1 zglobom i IgG1 CH1 domenom. Kao što je dalje prikazano, CD73 antitelo koje ima IgG2 zglob i ostatak antitela IgG1 izotipa internalizuje se efikasnije od istog antitela gde je zglob IgG1 izotipa. Antitelo koje ima, pored IgG2 zgloba i IgG2 CH1 domen internalizuje se još efikasnije od istog antitela u kojem je CH1 domen IgG1 CH1 domen. Kao što je dalje prikazano, antitela protiv CD73 sa IgG2 zglobom i po izboru IgG2 CH1 takođe formiraju veće antitelo/antigen komplekse od antitela koja imaju IgG1 zglob ili IgG1 zglob i IgG1 CH1. Čini se da povećana internalizacija korelira sa povećanom veličinom antitelo/antigen kompleksa. Kao što je dalje opisano u Primerima, izgleda da pojačana internalizacija nije povezana sa višim ili nižim afinitetom antitela. Prema tome, ovde su data antitela protiv CD73 koja imaju modifikovan konstantni region teškog lanca koja posreduju antitelom posredovanu CD73 internalizaciju, i gde se antitelo sa modifikovanim konstantnim regionom teškog lanca vezuje za CD73 sa sličnim afinitetom kao i isto antitelo, ali sa drugačijim konstantnim regionom teškog lanca.
[0149] U određenim tehničkim rešenjima, CD73 antitelo sadrži modifikovani konstantni region teškog lanca koji sadrži zglob IgG2 izotipa ("IgG2 zglob") i CH1, CH2 i CH3 domen. U određenim tehničkim rešenjima, modifikovani konstantni region teškog lanca sadrži IgG2 zglob i CH1, CH2 i CH3 domen, pri čemu najmanje jedan od CH1, CH2 i CH3 domena nije IgG2 izotipa. Antitela predmetnog pronalaska sadrže IgG2 zglob i IgG2 CH1 domen. U određenim tehničkim rešenjima, modifikovani konstantni region teškog lanca sadrži zglob IgG2 izotipa, CH1 IgG2 izotipa, pri čemu bar jedan od CH2 i CH3 domena nije IgG2 izotipa. IgG2 zglob može biti zglob divljeg tipa IgG2, npr., zglob humanog IgG2 divljeg tipa (npr., sa SEQ ID NO: 136) ili njegova varijanta, pod pretpostavkom da IgG2 zglob zadrži sposobnost da antitelu donese pojačanu aktivnost (npr., povećana internalizacija od strane ćelije; pojačana inhibicija enzimske aktivnosti; povećana aktivnost antagonista ili blokiranja; sposobnost formiranja velikih antitelo/antigen unakrsno-povezananih kompleksa; povećana sposobnost da stimuliše ili pojača imuni odgovor; i/ili povećani anti-proliferativni ili antitumorski efekat) u odnosu na isto antitelo koje ne sadrži IgG2 zglob i po izboru ne sadrži IgG2 CH1 domen. U određenim tehničkim rešenjima, varijanta IgG2 zgloba zadržava sličnu rigidnost ili krutost kao i IgG2 zglob divljeg tipa. Rigidnost zgloba ili antitela može se utvrditi, npr., kompjuterskim modelovanjem, elektronskom mikroskopijom, spektroskopijom kao što je nuklearna magnetna rezonanca (NMR), rendgenskom kristalografijom (B-faktori), ili analitičkom ultracentrifugacijom brzine sedimentacije (AUC) za merenje ili upoređivanje radijusa okretanja antitela koja sadrže zglob. Zglob ili antitelo mogu imati sličnu ili veću rigidnost u odnosu na drugi zglob, ako antitelo koje sadrži zglob ima vrednost dobijenu jednim od testova opisanih u predhodnoj rečenici koja se razlikuje od vrednosti istog antitela sa drugačijim zglobom, npr., IgG1 zglob, u manje od 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, ili 100%. Stručnjak u oblasti bi mogao da utvrdi iz testova da li zglob ili antitelo imaju bar sličnu rigidnost kao kod drugog zgloba ili antitela, redom, interpretacijom rezultata ovih testova. Primer varijante humanog IgG2 zgloba je IgG2 zglob koji sadrži supstituciju jednog ili više od četiri cisteinska ostatka (tj., C219, C220, C226 i C229) sa drugom amino kiselinom. Cistein može biti zamenjen serinom. Primer IgG2 zgloba je humani IgG2 zglob koji sadrži C219X mutaciju ili C220X mutaciju, pri čemu je X bilo koja amino kiselina osim serina. U određenim tehničkim rešenjima, IgG2 zglob ne sadrži obe, i C219X i C220X supstituciju. U određenim tehničkim rešenjima, IgG2 zglob sadrži C219S ili C220S, ali ne oba i C219S i C220S. Ostale varijante IgG2 zgloba koje se mogu koristiti uključuju humane IgG2 zglobove koji sadrže C220, C226 i/ili C229 supstituciju, npr., C220S, C226S ili C229S mutaciju (koja se može kombinovati sa C219S mutacijom). IgG2 zglob može takođe biti IgG2 zglob u kome je deo zgloba onaj drugog izotipa (tj., to je himerni ili hibridni zglob), pod uslovom da je rigidnost himernog zgloba barem slična onoj od IgG2 zgloba divljeg tipa. Na primer, IgG2 zglob može biti IgG2 zglob u kome je donji zglob (kao što je definisano u Tabeli 2) IgG1 izotipa, i on, npr., je donji zglob IgG1 divljeg tipa.
[0150] "Hibridni" ili "himerni" zglob se naziva specifičnim izotipom ako je više od polovine uzastopnih amino kiseline zgloba iz tog izotipa. Na primer, zglob koji ima gornji i srednji zglob od IgG2 i donji zglob od IgG1 smatra se IgG2 hibridnim zglobom.
[0151] U određenim tehničkim rešenjima, CD73 antitelo sadrži modifikovan konstantni region teškog lanca koji sadrži IgG2 zglob koji sadrži jedan od sledećih zglobova:
ERKCCVECPPCPAPPVAG (SEQ ID NO: 348);
ERKSCVECPPCPAPPVAG (SEQ ID NO: 349);
ERKCSVECPPCPAPPVAG (SEQ ID NO: 350);
ERKXCVECPPCPAPPVAG (SEQ ID NO: 351);
ERKCXVECPPCPAPPVAG (SEQ ID NO: 352);
ERKCCVECPPCPAPPVAGX (SEQ ID NO: 353);
ERKSCVECPPCPAPPVAGX (SEQ ID NO: 354);
ERKCSVECPPCPAPPVAGX (SEQ ID NO: 355);
ERKXCVECPPCPAPPVAGX (SEQ ID NO: 356);
ERKCXVECPPCPAPPVAGX (SEQ ID NO: 357);
ERKCCVECPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 358);
ERKSCVECPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 359);
ERKCCSVECPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 360);
ERKXCVECPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 361);
ERKCXVECPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 362);
ERKCCVECPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 363);
ERKSCVECPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 364);
ERKCCSVECPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 365);
ERKXCVECPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 366);
ERKCXVECPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 367);
ERKCCVECPPCPAP (SEQ ID NO: 368);
ERKSCVECPPCPAP (SEQ ID NO: 369);
ERKCSVECPPCPAP (SEQ ID NO: 370);
ERKXCVECPPCPAP (SEQ ID NO: 371); ili
ERKCXVECPPCPAP (SEQ ID NO: 372),
gde je X bilo koja amino kiselina, osim cisteina,
ili bilo koja od gore navedenih sekvenci, u kojima je 1-5, 1-3, 1-2 ili 1 amino kiselina umetnuta između aminokiselinskih ostataka CVE i CPP. U određenim tehničkim rešenjima, THT ili GGG su umetnuti.
[0152] U određenim tehničkim rešenjima, zglob sadrži SEQ ID NO: 348, 349, 350, 351, ili 352, pri čemu su 1, 2, 3 ili sve 4 amino kiseline P233,V234, A235 i G237 (što odgovara C-terminalnim 4 amino kiselinama "PVAG" (SEQ ID NO: 373) deletirane ili supstituisane sa drugom amino kiselinom, npr., amino kiselinama C-kraja IgG1 zgloba (ELLG (SEQ ID NO: 374) ili ELLGG (SEQ ID NO: 375). U određenim tehničkim rešenjima, zglob sadrži SEQ ID NO: 348, 349, 350, 351, ili 352, pri čemu su V234, A235 i G237 deletirani ili supstituisani sa drugom amino kiselinom. U određenim tehničkim rešenjima, zglob sadrži SEQ ID NO: 348, 349, 350, 351, ili 352, pri čemu su A235 i G237 deletirani ili supstituisani sa drugom amino kiselinom. U određenim tehničkim rešenjima, zglob sadrži SEQ ID NO: 348, 349, 350, 351, ili 352, pri čemu su G237 deletirani ili supstituisani sa drugom amino kiselinom. U određenim tehničkim rešenjima, zglob sadrži SEQ ID NO: 348, 349, 350, 351, ili 352, pri čemu su V234 i A235 deletirani ili supstituisani sa drugom amino kiselinom. Supstitucija PVAG (SEQ ID NO: 373) u IgG2 sa odgovarajućim aminokiselinama IgG1 zgloba, tj., (ELLG (SEQ ID NO: 374) ili ELLGG (SEQ ID NO: 375)) radi dobijanja hibridnog zgloba, npr., prikazano gore, pruža zglob koji ima prednost IgG2 zgloba i efektorsku funkciju IgG1 zglobova.
[0153] U određenim tehničkim rešenjima, modifikovani konstantni region teškog lanca sadrži zglob koji se sastoji od ili se sastoji u osnovi od jedne od sekvenci prikazanih gore, npr., bilo koje od SEQ ID NOs: 348-372, i npr., ne sadrži dodatne aminokiselinske ostatake zgloba.
[0154] U određenim tehničkim rešenjima, 1 ili 1-2 ili 1-3 aminokiseline su ubačene između zgloba i CH2 domena, npr., može se dodati dodatni glicin.
[0155] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo protiv CD73 sadrži modifikovani konstantni region teškog lanca koji sadrži IgG1 (koji nije obuhvaćen antitelima ovog pronalaska) ili konstantni region IgG2, pri čemu zglob sadrži deleciju 1-10 aminokiselina. Kao što je opisano u primerima, IgG1 antitelo kome nedostaju aminokiselinski ostaci SCDKTHT (S219, C220, D221, K222, T223, H224 i T225; SEQ ID NO: 376) dodeljena antitelo posredovana CD73 internalizacija efikasnija je od istog antitela koji ima konstantni region IgG1 divljeg tipa. Slično tome, u kontekstu IgG2 antitela, IgG2 antitelo kojem nedostaju aminokiselinski ostaci CCVE (C219, C220, V222, i E224; SEQ ID NO: 377) dodeljena antitelo posredovana CD73 internalizacija efikasnija je od istog antitela koje ima konstantni region IgG1 divljeg tipa. Prema tome, ovde su dati modifikovani konstantni region teškog lanca u kojem zglob sadrži deleciju 1, 2, 3, 4, 5, 6, ili 7 aminokiselinskih ostataka, odabranih od ostataka S219, C220, D221, K222, T223, H224 i T225 za IgG1 antitelo, i ostatake C219, C220, V222, i E224 za IgG2 antitelo.
[0156] U određenim tehničkim rešenjima, modifikovani konstantni region teškog lanca sadrži CH1 domen koji je divlji tip CH1 domena od IgG1 (nisu obuhvaćeni antitelima predmetnog pronalaska) ili IgG2 izotipa ("IgG1 CH1 domen" ili "IgG2 CH1 domen," redom). CH1 domeni izotipa IgG3 i IgG4 ("IgG3 CH1 domen i "IgG4 CH1 domen," redom) se takođe mogu koristiti (nisu obuhvaćeni antitelima predmetnog pronalaska). CH1 domen može takođe biti varijanta CH1 domena divljeg tipa, npr., varijanta divljeg tipa IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 CH1 domena. Primeri varijanti CH1 domena uključuju A114C, T173C i/ili C131, npr., C131S.
[0157] CH1 domen, npr., IgG2 CH1 domen, može da sadrži supstituciju C131S, pri čemu supstituciju prenosi na IgG2 antitelo ili antitelo koje ima IgG2 CH1 i zglob B forme (ili konformacije).
[0158] Modifikovani konstantni region teškog lanca prema predmetnom pronalasku sadrži CH1 domen koji je IgG2 izotipa. U određenim tehničkim rešenjima, domen CH1 je CH1 domen divljeg tipa IgG2, npr., koji ima aminokiselinsku sekvencu:
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SS GLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV (SEQ ID NO: 378). U određenim tehničkim rešenjima, CH1 domen je varijanta od SEQ ID NO: 378 i sadrži 1-10, 1-5, 1-2 ili 1 aminokiselinsku supstituciju ili deleciju u odnosu na SEQ ID NO: 378. Kao što je dalje opisano u Primerima, ovde je pokazano da IgG2 CH1 domen ili njegove varijante daju pojačana ili izmenjena svojstva internalizacije antitelima protiv CD73 u odnosu na IgG1 antitela i čak više pojačanu ili ojačanu internalizaciju kada antitela takođe sadrže IgG2 zglob. U određenim tehničkim rešenjima, IgG2 CH1 varijante ne sadrže supstitucije ili delecije aminokiselina kod jednog ili više sledećih aminokiselinskih ostataka: C131, R133, E137 i S138, a ostaci amino kiselina su prikazani kao podebljani i podvučeni u SEQ ID NO: 378 prikazano gore. Na primer, modifikovani konstantni region teškog lanca može da sadrži IgG2 CH1 domen u kome nijedan od R133, E137 i S138 nije supstituisan sa drugom aminokiselinom ili deletiran ili u kojem nijedan od C131, R133, E137 ili S138 nije supstituisan sa drugom aminokiselinom ili deletiran. U određenim tehničkim rešenjima, C131 je supstituisan sa drugom aminokiselinom, npr., C131S, pri čemu supstitucija pokreće antitelo da postigne konformaciju B. Ovde je pokazano da će antitela i konformacije A i konformacije B koja imaju modifikovane konstantne regione teškog lanca imati poboljšane aktivnosti u odnosu na isto antitelo sa IgG1 konstantnim regionom.
[0159] U određenim tehničkim rešenjima, N192 i/ili F193 (prikazani kao kurzivi i podvučeni ostaci u SEQ ID NO: 378 prikazani gore) su supstituisani sa drugom amino kiselinom, npr., sa odgovarajućim aminokiselinama u IgG1, tj., N192S i/ili F193L.
[0160] U određenim tehničkim rešenjima, jedan ili više aminokiselinskih ostataka od IgG2 CH1 domena su supstituisani sa odgovarajućim aminokiselinskim ostacima u IgG4. Na primer, N192 može biti N192S; F193 može biti F193L; C131 može biti C131K; i/ili T214 može biti T214R.
[0161] Antitelo može da sadrži modifikovani konstantni region teškog lanca koji sadrži IgG2 CH1 domen ili njegovu varijantu i IgG2 zglob ili njegovu varijantu. Zglob i CH1 domen mogu biti kombinacija bilo kog IgG2 zgloba i IgG2 CH1 domena opisanih ovde. U određenim tehničkim rešenjima, IgG2 CH1 i zglob obuhvataju sledeću aminokiselinsku sekvencu ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SS GLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAG ( SEQ ID NO: 379), ili aminokiselinsku sekvencu koja se od nje razlikuje u najviše 1-10 aminokiselina. Varijante aminokiselina su kao što je gore opisano za zglob i CH1 domene.
[0162] U određenim tehničkim rešenjima, antitela sadrže najmanje IgG2 zglob, i po izboru takođe IgG2 CH1 domen ili fragment ili derivat zgloba i/ili CH1 domena i antitelo usvaja formu (konformacije) A (videti, npr., Allen et al. (2009) Biochemistry 48:3755). U određenim tehničkim rešenjima, antitela protiv CD73 sadrže najmanje IgG2 zglob, i po izboru takođe IgG2 CH1 domen ili fragment ili derivat zgloba i/ili CH1 domena i antitelo usvaja formu B (videti, npr., Allen et al. (2009) Biochemistry 48:3755).
[0163] U određenim tehničkim rešenjima, modifikovani konstantni region teškog lanca sadrži CH2 domen koji je divlji tip CH2 domena od IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 izotipa ("IgG1 CH2 domen," "IgG2 CH2 domen," "IgG3 CH2 domen," ili "IgG4 CH2 domen," redom). CH2 domen takođe može da bude varijanta divljeg tipa CH2 domena, npr., varijanta divljeg tipa IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 CH2 domena. Primeri varijanti CH2 domena uključuju varijante koje modeliraju biološku aktivnost Fc regiona antitela, kao što je ADCC ili CDC ili moduliraju poluživot antitela ili njegovu stabilnost. U jednom tehničkom rešenju, CH2 domen je humani IgG1 CH2 domen sa A330S i P331S mutacijom, pri čemu CH2 domen ima smanjenu efektorsku funkciju u odnosu na isti CH2 domen bez mutacija. CH2 domen može imati poboljšanu efektorsku funkciju. CH2 domeni mogu da sadrže jednu ili više sledećih mutacija: SE (S267E), SELF (S267E/L328F), SDIE (S239D/I332E), SEFF i GASDALIE (G236A/S239D/A330L/I332E) i/ili jednu ili više mutacija kod sledećih aminokiselina: E233, G237, P238, H268, P271, L328 i A330. Ostale mutacije ovde su dalje navedene na drugom mestu.
[0164] U određenim tehničkim rešenjima, modifikovani konstantni region teškog lanca sadrži CH3 domen koji je divlji tip CH3 domena od IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 izotipa ("IgG1 CH3 domen," "IgG2 CH3 domen," "IgG3 CH3 domen," ili "IgG4 CH3 domen," redom. CH3 domen može takođe da bude varijanta divljeg tipa CH3 domena, npr., varijanta divljeg tipa IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 CH3 domena. Primeri varijanti CH3 domena uključuju varijante koje moduliraju biološku aktivnost Fc regiona antitela, poput ADCC ili CDC ili moduliraju polu-život antitela ili njegovu stabilnost.
[0165] Modifikovani konstantni region teškog lanca prema predmetnom pronalasku sadrži zglob od IgG2 izotipa i CH1 region od IgG2 izotipa. IgG2 zglob i CH1 mogu biti IgG2 zglob divljeg tipa i CH1 ili njihove varijante, pod uslovom da imaju željenu biološku aktivnost. U određenim tehničkim rešenjima, modifikovani konstantni region teškog lanca sadrži IgG2 zglob koji sadrži C219S mutaciju, i IgG2 CH1, koji može biti divljeg tipa ili sadrži najviše 1-10, 1-5, 1-3, 1-2 ili 1 supstituciju amino kiselina, deleciju ili adiciju. Modifikovani konstantni region teškog lanca može dalje da sadrži divlji tip ili mutirane CH2 i CH3 domene. Na primer, CD73 antitelo može da sadrži konstantni domen teškog lanca koji sadrži IgG2 CH1 domen, IgG2 zglob, koji može da sadrži C219S, i IgG1 CH2 iCH3 domen, pri čemu CH2 i CH3 domen može biti bez efektora, što uključuje mutacije A330S i P331S.
[0166] Obično, varijante CH1, zgloba, CH2 ili CH3 domena mogu da sadrže 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više mutacija, i/ili najviše 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ili 1 mutaciju, ili 1-10 ili 1-5 mutacija, ili sadrže aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identična onoj odgovarajućeg domena divljeg tipa (CH1, zglob, CH2, ili CH3 domen, redom), pod uslovom da konstantni region teškog lanca koji sadrži specifičnu varijantu zadržava neophodnu biološku aktivnost.
1
[0167] Tabela 5 prikazuje primere konstantnih regiona humanog teškog lanca koji sadrže humani CH1, zglob, CH2 i/ili CH3 domene, pri čemu je svaki domen ili divlji tip domena ili njegova varijanta koja pruža željenu biološku aktivnost konstantnom regionu teškog lanca. Antitela predmetnog pronalaska sadrže IgG2 zglob i IgG2 CH1 domen. Neispunjena ćelija u Tabeli 5 ukazuje da je domen prisutan ili ne, i ako je prisutan može biti bilo kojeg izotipa, npr., IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4. Na primer, antitelo sadrži konstantni region 1 teškog lanca u Tabeli 5 je antitelo koje sadrži konstantni region teškog lanca koji sadrži najmanje IgG2 zglob, i koji može takođe da sadrži CH1, CH2 i/ili CH3 domen, i ako postoji, čiji je CH1, CH2 i/ili CH3 domen IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 izotipa. Kao još jedan primer za razumevanje Tabele 5, antitelo koje sadrži konstantni region 8 teškog lanca je antitelo koje sadrži konstantni region teškog lanca koji sadrži IgG1 CH1 domen, i IgG2 zglob, IgG1 CH2 domen, i koji može ali ne mora takođe da sadrži CH3 domen, koji je prisutan, može biti IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 izotipa.
Tabela 5:
2
[0168] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo koje sadrži konstantni region teškog lanca prikazano u Tabeli 5 ima pojačanu biološku aktivnost u odnosu na isto antitelo koje sadrži konstantni region teškog lanca koje ne sadrži taj specifični konstantni region teškog lanca ili u odnosu na isto antitelo koje sadrži IgG1 konstantni region.
[0169] U određenim tehničkim rešenjima, postupak za poboljšanje biološke aktivnosti CD73 antitela koje ne sadrži IgG2 zglob i/ili ne sadrži IgG2 CH1 domen obuhvata obezbeđivanje antitela protiv CD73 koje ne sadrži IgG2 zglob i/ili ne sadrži IgG2 CH1 domen, i zamenjuje CH1 domen bez IgG2 zgloba i bez IgG2 sa IgG2 zglobom i IgG2 CH1 domenom, redom. Postupak za poboljšanje biološke aktivnosti CD73 antitela koje ne sadrži modifikovani konstantni region teškog lanca, može obuhvatiti dobijanje antitela protiv CD73 koje ne sadrži modifikovani konstantni region teškog lanca, i zamenu njegovog konstantnog regiona teškog lanca sa modifikovanim konstantnim regionom teškog lanca.
[0170] Tipični modifikovani konstantni regioni teškog lanca koji mogu biti povezani sa anti-CD73 varijabilnim regionima, npr., oni opisani ovde, su dati u Tabeli 6, koja pokazuje identitet svakog od domena. Antitela predmetnog pronalaska sadrže IgG2 zglob i IgG2 CH1 domen.
Tabela 6:
4
[0171] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo koje sadrži modifikovani konstantni region teškog lanca koji sadrži IgG2 zglob koji sadrži SEQ ID NO: 123, 136, 178, 179, ili 348-372 ili njihovu varijantu, kao što je IgG2 zglob koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se (i) razlikuje od SEQ ID NO: 123, 136, 178, 179, ili 348-372 u 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija; (ii) razlikuje od SEQ ID NO: 123, 136, 178, 179, ili 348-372 u najviše 5, 4, 3, 2, ili 1 aminokiselinskoj supstituciji, adiciji ili deleciji; (iii) razlikuje od SEQ ID NO: 123, 136, 178, 179, ili 348-372 u 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 ili 3-5 aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija i/ili (iv) sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa SEQ ID NO: 123, 136, 178, 179, ili 348-372, pri čemu u bilo kom od (i)-(iv), aminokiselinska supstitucija može biti konzervativna aminokiselinska supstitucija ili nekonzervativna aminokiselinska supstitucija; i gde modifikovani konstantni region teškog lanca ima pojačanu biološku aktivnost u odnosu na drugi konstantni region teškog lanca, npr., konstantni region teškog lanca koji ne sadrži IgG2 zglob ili u odnosu na isti modifikovani konstantni region teškog lanca koji ne sadrži IgG2 zglob. Na primer, zglob može biti divljeg tipa, ili sadrži C219S, C220S ili C219S i C220S supstitucije.
[0172] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo koje sadrži modifikovani konstantni region teškog lanca koji sadrži IgG1 CH1 domen koji sadrži SEQ ID NO: 98 (nije obuhvaćeno antitelima predmetnog pronalaska) ili IgG2 CH1 domen koji sadrži SEQ ID NO: 124, ili varijantu od SEQ ID NO: 98 ili 124, čija varijanta se (i) razlikuje od SEQ ID NO: 98 ili 124 u 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija; (ii) razlikuje od SEQ ID NO: 98 ili 124 u najviše 5, 4, 3, 2, ili 1 aminokiselinskoj supstituciji, adiciji ili deleciji; (iii) razlikuje od SEQ ID NO: 98 ili 124 u 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 ili 3-5 aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija i/ili (iv) sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa SEQ ID NO: 98 ili 124, pri čemu u bilo kojem od (i)-(iv), supstitucija aminokiselina može biti konzervativna supstitucija aminokiselina ili nekonzervativna supstitucija aminokiselina; i gde modifikovani konstantni region teškog lanca ima pojačanu biološku aktivnost u odnosu na drugi konstantni region teškog lanca, npr., konstantni region teškog lanca koji ne sadrži IgG2 zglob ili ne sadrži IgG2 zglob i CH1 domen ili u odnosu na isti modifikovani konstantni region teškog lanca koji ne sadrži IgG2 zglob ili ne sadrži IgG2 zglob i CH1 domen. IgG2 CH1 domen može da sadrži C131S ili druge mutacije koje uzrokuju da IgG2 zglob i antitelo koje sadrži CH1 usvoje A ili B formu.
[0173] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo opisano ovde sadrži modifikovani konstantni region teškog lanca koji sadrži IgG1 CH2 domen koji sadrži SEQ ID NO: 137 ili 125, ili varijantu od SEQ ID NO: 137 ili 125, čija varijanta se (i) razlikuje od SEQ ID NO: 137 ili 125 u 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija; (ii) razlikuje od SEQ ID NO: 137 ili 125 u najviše 5, 4, 3, 2, ili 1 aminokiselinskoj supstituciji, adiciji ili deleciji; (iii) razlikuje od SEQ ID NO: 137 ili 125 u 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 ili 3-5 aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija i/ili (iv) sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa SEQ ID NO: 137 ili 125, pri čemu u bilo kojoj od (i)-(iv), supstitucija aminokiselina može biti konzervativna supstitucija aminokiselina ili nekonzervativna supstitucija aminokiselina; i gde modifikovani konstantni region teškog lanca ima pojačanu biološku aktivnost u odnosu na drugi konstantni region teškog lanca, npr., konstantni region teškog lanca koji ne sadrži IgG2 zglob ili u odnosu na isti modifikovani konstantni region teškog lanca koji ne sadrži IgG2 zglob.
[0174] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo opisano ovde sadrži modifikovani konstantni region teškog lanca koji sadrži IgG1 CH3 domen koji sadrži SEQ ID NO: 138, ili varijantu SEQ ID NO: 138, čija varijanta se (i) razlikuje od SEQ ID NO: 138 u 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija; (ii) razlikuje od SEQ ID NO: 138 u najviše 5, 4, 3, 2, ili 1 aminokiselinskoj supstituciji, adiciji ili deleciji; (iii) razlikuje od SEQ ID NO: 138 u 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 ilii 3-5 aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija i/ili (iv) sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa SEQ ID NO: 138, pri čemu u bilo kojem od (i)-(iv), supstitucija aminokiselina može biti konzervativna supstitucija aminokiselina ili nekonzervativna supstitucija aminokiselina; i gde modifikovani konstantni region teškog lanca ima pojačanu biološku aktivnost u odnosu na drugi konstantni region teškog lanca, npr., konstantni region teškog lanca koji ne sadrži IgG2 zglob li u odnosu na isti modifikovani konstantni region teškog lanca koji ne sadrži IgG2 zglob.
[0175] Modifikovani konstantni regioni teškog lanca mogu takođe da sadrže kombinaciju CH1, zgloba, CH2 i CH3 domena opisanih gore.
[0176] U određenim tehničkim rešenjima, CD73 antitelo sadrži modifikovani konstantni region teškog lanca koji sadrži bilo koju od SEQ ID NOs: 162-169, 180-183, 267-282, ili 300-347, ili varijantu bilo koje od SEQ ID NOs: 162-169, 180-183, 267-282, i 300-347, čija varijanta se (i) razlikuje od SEQ ID NOs: 162-169, 180-183, 267-282, i 300-347 u 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija; (ii) razlikuje od SEQ ID NOs: 162-169, 180-183, 267-282, i 300-347 u najviše 10, 9, 8, 7, 6,5, 4, 3, 2, ili 1 aminokiselinskoj supstituciji, adiciji ili deleciji; (iii) razlikuje od SEQ ID NOs: 162-169, 180-183, 267-282, i 300-347 u 1-5, 1-3, 1-2, 2-5, 3-5, 1-10, ili 5-10 aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija i/ili (iv) sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična bilo kojoj od SEQ ID NOs: 162-169, 180-183, 267-282, i 300-347, pri čemu u bilo kojoj od (i)-(iv), supstitucija aminokiselina može biti konzervativna supstitucija aminokiselina ili nekonzervativna supstitucija aminokiselina; i gde modifikovani konstantni region teškog lanca ima pojačanu biološku aktivnost u odnosu na drugi konstantni region teškog lanca, npr., konstantni region teškog lanca koji ne sadrži IgG2 zglob ili ne sadrži IgG2 CH1 domen ili u odnosu na isti modifikovani konstantni region teškog lanca koji ne sadrži IgG2 zglob i/ili ne sadrži IgG2 CH1 domen.
[0177] Modifikovani konstantni regioni teškog lanca mogu imati (i) sličnu, smanjenu ili povećanu efektorsku funkciju (npr., vezivanje za FcγR, npr., FcγRIIB) u odnosu na konstantni region teškog lanca divljeg tipa i ili (ii) slični, smanjeni ili povećani poluživot (ili vezivanje za FcRn receptor) u odnosu na konstantni region teškog lanca divljeg tipa.
[0178] VH domen anti-CD73 antitela opisanog ovde može biti povezan za konstantni region teškog lanca koji je opisan ovde. Na primer, Slika 18 pokazuje aminokiselinsku sekvencu antitela CD73.4 koja je povezana sa konstantnim regionom teškog lanca IgG2CS-IgG1.1f (SEQ ID NO:133 ili 169). Takođe ovde su obuhvaćena i antitela koja sadrže teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se razlikuje od one od CD73.4-IgG2CS-IgGl.lf (SEQ ID NO:133 ili 189) u najviše 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2 ili 1 aminokiselini (supstitucijom, adicijom ili delecijom) i/ili koje su najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identične aminokiselinskoj sekvenci teškog lanca od CD73.4-IgG2CS-IgG1.1f (SEQ ID NO:133 ili 189). Na primer, ovde su obuhvaćena antitela koja sadrže teški lanac od CD73.4-IgG2CS-IgG1.1f (SEQ ID NO: 133 ili 189), i gde su C-terminalni K ili GK ili PGK izbrisani ili su prisutni. Ostale varijante od CD73.4-IgG2CS-IgG1.1f (SEQ ID NO:133 ili 189) uključuju one koje imaju teški lanac različitog alotipa, i gde, npr., amino kiseline 356 i 358 su D i L, redom. Varijante uključuju one koje imaju dodatni cistein mutiran u IgG2 zglobu, npr., C220 (ili imaju C220S umesto C219S), i one koje nemaju mutacije A330S i/ili P331S. Varijante od CD73.4-IgG2CS-IgG1.1f (SEQ ID NO:133 ili 189) poželjno imaju najmanje slična biohemijska svojstva i/ili biološke aktivitnosti, npr., efikasnost internalizacije, inhibiciju CD73 enzimske aktivnosti, afinitet za humani CD73, i vezivanje za isti ili slični epitop, u odnosu na CD73.4-IgG2CS-IgG1.1f (SEQ ID NO: 133 ili 189).
[0179] U određenim tehničkim rešenjima, antitela protiv CD73, ili njihovi delovi koji vezuju antigen, sadrže bilo koji od ovde opisanih konstantnih regiona, npr., konstantne regione koji sadrže sekvence amino kiselina navedene u SEQ ID NOs: 126, 127, 129, 130, 162-169, 180-183, 267-282, i 300-347.
[0180] Laki lanac antitela protiv CD73 opisan ovde može da sadrži konstantni region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 131, ili varijantu od SEQ ID NO: 131, čija varijanta se (i) razlikuje od SEQ ID NO: 131 u 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija; (ii) razlikuje od SEQ ID NO: 131 u najviše 10, 9, 8, 7, 6,5, 4, 3, 2, ili 1 amino kiselinskoj supstituciji, adiciji ili deleciji; (iii) razlikuje od SEQ ID NO: 131 u 1-5, 1-3, 1-2, 25, 3-5, 1-10, ili 5-10 aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija i/ili (iv) sadrži sekvencu aminokiselina koja je najmanje oko 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa SEQ ID NO: 131, pri čemu u bilo kojoj od (i)-(iv), aminokiselinska supstitucija može biti konzervativna supstitucija aminokiselina ili nekonzervativna supstitucija aminokiselina. Primer CL mutacije uključuje C124S.
[0181] Teški i laki lanci koji sadrže aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75% ili 70% identična bilo kojem od teških ili lakih lanaca navedenih u Tabeli 35, kako je ovde detaljno opisano (ili njihovi variajabilni regioni), mogu se koristiti za formiranje antitela protiv humanog CD73 koja imaju željene karakteristike, npr., ona koja su ovde detaljnije opisana. Tipične varijanta su ona koje sadrže alotipsku varijaciju, npr., u konstantnom domenu. Teški i laki lanci koji sadrže aminokiselinsku sekvencu koja se razlikuje u najviše 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2 ili 1 aminokiselini (supstitucijom, adicijom ili delecijom) od bilo kog od teških ili lakih lanaca navedenih u Tabeli 35, kako je ovde detaljno opisano (ili njihovi variajabilni regioni), mogu se koristiti za formiranje antitela protiv humanog CD73 koja imaju željene karakteristike, npr., ona koja su ovde detaljnije opisana.
[0182] U različitim tehničkim rešenjima, antitela koja su gore opisana pokazuju jedno ili više, dva ili više, tri ili više, četiri ili više, pet ili više, šest ili više, sedam ili više, osam ili više, devet ili više, deset, ili sva funkcionalna svojstva navedena u Tabeli 3.
[0183] Takva antitela uključuju, na primer, humana antitela, humanizovana antitela, ili himerna antitela.
[0184] U jednom tehničkom rešenju, ovde opisana antitela protiv CD73 vezuju se i za glikozilovani (npr., N-vezana ili O-vezana glikozilacija) i neglikozilovani humani CD73. Određena antitela protiv CD73 mogu da se vezuju za glikozilovani, ali ne i za neglikozilovani CD73 ili za neglikozilovani ali ne i glikozilovani CD73.
[0185] U jednom tehničkom rešenju, ovde opisana antitela protiv CD73 vezuju se za konformacioni epitop.
[0186] U jednom tehničkom rešenju, ovde opisana antitela protiv CD73 vezuju se za aminokiselinske ostatke u sledećem regionu humanog CD73:
FTKVQQIRRAEPNVLLLDA (SEQ ID NO: 96) i
odgovara aminokiselinskim ostacima 65-83 humanog CD73 (SEQ ID NO: 1 ili 2), kako je određeno, npr., HDX-MS-om.
[0187] U jednom tehničkom rešenju, ovde opisana antitela protiv CD73 vezuju se za sve ili za deo sledećih aminokiselinskih ostataka u humanom CD73: FTKVQQIRRAEPNVLLLDA (SEQ ID NO: 96), što odgovara aminokiselinskim ostacima 65-83 humanog CD73 (SEQ ID NO: 1 ili 2), kako je određeno, npr., HDX-MS-om.
[0188] U jednom tehničkom rešenju, ovde opisano antitelo protiv CD73 vezuje se za aminokiselinske ostatke u sledećem regionu humanog CD73:
LYLPYKVLPVGDEVVG (SEQ ID NO: 97),
što odgovara aminokiselinskim ostacima 157-172 humanog CD73 (SEQ ID NO: 1 ili 2), kako je određeno, npr., HDX-MS-om.
[0189] U jednom tehničkom rešenju, ovde opisano antitelo protiv CD73 vezuje se za sve ili deo sledećih aminokiselinskih ostataka unutar humanog CD73: LYLPYKVLPVGDEVVG (SEQ ID NO: 97), što odgovara ostacima amino kiselina 157-172 humanog CD73 (SEQ ID NO: 1 ili 2), kako je određeno, npr., HDX-MS-om.
[0190] U jednom tehničkom rešenju, ovde opisano antitelo protiv CD73 vezuje se za nekontinuirane aminokiselinske ostatke unutar sledećih regiona humanog CD73 (SEQ ID NO: 1 ili 2):
FTKVQQIRRAEPNVLLLDA (SEQ ID NO: 96) i LYLPYKVLPVGDEVVG (SEQ ID NO: 97).
[0191] U jednom tehničkom rešenju, ovde opisano antitelo protiv CD73 vezuje se za sve ili za deo nekontinuiranih ostataka amino kiselina unutar sledećih regiona humanog CD73 (SEQ ID NO: 1 ili 2): FTKVQQIRRAEPNVLLLDA (SEQ ID NO: 96) i LYLPYKVLPVGDEVVG (SEQ ID NO: 97), koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima 65-83 i 157-172 humanog CD73 (SEQ ID NO: 1 ili 2), kako je određeno, npr., HDX-MS-om.
[0192] U određenim tehničkim rešenjima, antitela protiv CD73 imaju interakcije sa humanim CD73 koje odgovaraju onim prikazanim u Tabeli 30, kako je određeno rendgenskom kristalografijom. Antitelo može da deli najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ili 99% interakcija sa humanim CD73 koje su prikazane u Tabeli 30.
III. Antitela koja imaju posebne germinativne sekvence
[0193] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo protiv CD73 sadrži varijabilni region teškog lanca iz određenog germinativnog gena teškog lanca imunoglobulina i/ili varijabilnog regiona lakog lanca iz određenog germinativnog gena lakog lanca imunoglobulina.
[0194] Kao što je ovde pokazano, pripremljena su humana antitela specifična za CD73 koja sadrže varijabilni region teškog lanca koji je produkt ili je izveden iz humanog germinativnog VH 3-33 gena, VH 3-10 gena, VH 3-15 gena, VH 3-16, JH6b gena, VH 6-19 gena, VH 4-34 gena, i/ili JH3b gena. Prema tome, ovde su data izolovana monoklonska antitela specifična za humani CD73, ili njihovi delovi koji vezuju antigen, koja sadrže varijabilni region teškog lanca koji je produkt ili je izveden iz humanog VH germinativnog gena izabranog od grupe koja se sastoji od: VH 3-33, VH 3-10, VH 3-15, VH 3-16, VH 6-19, ili VH 4-34.
[0195] Pripremljena su humana antitela specifična za CD73 koja sadrže varijabilni region lakog lanca koji je produkt ili je izveden iz humanog germinativnog VK L6 gena, VK L18 gena, VK L15 gena, VK L20 gena, VK A27 gena, JK5 gena, JK4 gena, JK2 gena, i JK1 gena. Prema tome, ovde su data izolovana monoklonska antitela specifična za humani CD73, ili njihovi delovi koji vezuju antigen, koji sadrže varijabilni region lakog lanca koji je produkt ili je izveden iz humanog VK germinativnog gena izabranog od grupe koja se sastoji od: VK L6, VK L18, VK L15, VK L20, i VK A27.
[0196] Prioritetna ovde opisana antitela su ona koja sadrže varijabilni region teškog lanca koji je produkt ili je izveden iz jednog od gore navadenih humanih germinativnih VH gena i takođe sadrže varijabilni region lakog lanca koji je produkt ili je izveden iz jednog od gore navedenih humanih germinativnih VK gena.
[0197] Kako se ovde koristi, humano antitelo sadrži varijabilni region teškog ili lakog lanca koji su "proizvod od" ili su "izvedeni iz" određene germinativne sekvence ako su varijabilni regioni antitela dobijeni iz sistema koji koristi humane germinativne imunoglobulinske gene. Takvi sistemi uključuju imunizaciju transgenog miša koji nosi gene humanog imunoglobulina sa antigenom od interesa ili skrining biblioteke gena humanog imunoglobulina pokazanog na fagnom displeju sa antigenom od interesa. Humano antitelo koje je "proizvod od" ili je "izvedeno iz" humane germinativne sekvence imunoglobulina može se identifikovati kao takvo poređenjem aminokiselinske sekvence humanog antitela sa aminokiselinskim sekvencama humanih germinativnih imunoglobulina i izborom humane germinativne imunoglobulinske sekvence koja je najbliža u sekvenci (tj., najveći % identiteta) sekvenci humanog antitela. Humano antitelo koje je "proizvod od" ili je "izvedeno iz" određene germinativnog sekvence humanog imunoglobulina može da sadrži razlike u aminokiselinama u poređenju sa germinativnom sekvencom, usled, na primer, somatskih mutacija koje se javljaju u prirodi ili namernog uvođenja mutacija koje su usmerene na mesto. Međutim, izabrano humano antitelo obično je najmanje 90% identično u sekvenci aminokiseline sekvenci amino kiseline kodirane humanim germinativnim genom imunoglobulina i sadrži ostatke amino kiselina koji identifikuju humano antitelo kao ljudsko u poređenju sa aminokiselinskom sekvencom germinativnog imunoglobulina drugih vrsta (npr., mišje germinativne sekvence). U određenim slučajevima, humano antitelo može biti najmanje 95%, ili čak najmanje 96%, 97%, 98%, ili
1
99% identično u aminokiselinskoj sekvenci, sekvenci amino kiseline kodirane germinativnim genom imunoglobulina. Tipično, humano antitelo izvedeno iz određene humane germinativne sekvence će pokazati ne više od 10 razlika u aminokiselinama od sekvence aminokiselina kodirane humanim germinativnim imunoglobulinskim genom. U određenim slučajevima, humano antitelo može pokazati ne više od 5, ili čak ne više od 4, 3, 2, ili 1 razlike između amino kiselina od sekvence aminokiseline kodirane germinativnim imunoglobulinskim genom.
IV. Homologa antitela
[0198] Ovde su obuhvaćena antitela koja imaju varijabilne regione teškog i lakog lanca koji sadrže aminokiselinske sekvence koje su homologe sekvencama aminokiselina željenih antitela ovde opisanih (antitela i aminokiselinske sekvence obuhvaćeni predmetnim pronalaskom su definisani u patentnim zahtevima), i gde antitela zadržavaju željena funkcionalna svojsta antitela protiv CD73 opisanih ovde.
[0199] Na primer, izolovano antitelo protiv CD73, ili njegov deo koji veže antigen, može da sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca, pri čemu:
(a) varijabilni region teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci izabranoj od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 4, 16, 32, 40, 52, 60, 68, 80, 88, 135, i 170-177, ili sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, ili 1-50 aminokiselinskih promena (tj., aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija) u odnosu na aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 4, 16, 32, 40, 52, 60, 68, 80, 88, 135, i 170-177, redom;
(b) varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci izabranoj od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 8, 12, 20, 24, 28, 36, 44, 48, 56, 64, 72, 76, 84, 92, i 138, ili sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, ili 1-50 aminokiselinskih promena (tj., aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija) u odnosu na aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 8, 12, 20, 24, 28, 36, 44, 48, 56, 64, 72, 76, 84, 92, i 238, redom;
(c) antitelo se specifično vezuje za CD73, i
(d) antitelo pokazuje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ili sva funkcionalna svojstva navedena u Tabeli 3.
2
[0200] U određenim tehničkim rešenjima, antitela protiv CD73 sadrže varijabilne regione teškog i lakog lanca sa procentnim identitetima i/ili aminokiselinskim promenama i funkcijama razmatranim gore (tj., (a)-(d)), gde CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 7, 19, 35, 43, 55, 63, 71, 83, i 91, i po izboru CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 5, 17, 33, 41, 53, 61, 69, 81, i 89, i po izboru CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 6, 18, 34, 42, 54, 62, 70, 82, i 90.
[0201] U određenim tehničkim rešenjima, antitela protiv CD73 sadrže varijabilne regione teškog i lakog lanca sa procentnim identitetima i/ili aminokiselinskim promenama i funkcijama razmatranim gore (tj., (a)-(d)), gde CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 11, 15, 23, 27, 31, 39, 47, 51, 59, 67, 75, 79, 87, 95, i 241, i po izboru CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 9, 13, 21, 25, 29, 37, 45, 49, 57, 65, 73, 77, 85, 93, i 239, i po izboru CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 10, 14, 22, 26, 30, 38, 46, 50, 58, 66, 74, 78, 86, 94, i 240.
[0202] U određenim tehničkim rešenjima, antitela protiv CD73 sadrže varijabilne regione teškog i lakog lanca sa procentnim identitetima i/ili aminokiselinskim promenama i funkcijama razmatranim gore (tj., (a)-(d)), gde CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 7, 19, 35, 43, 55, 63, 71, 83, i 91, i po izboru CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 5, 17, 33, 41, 53, 61, 69, 81, i 89, i po izboru CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 6, 18, 34, 42, 54, 62, 70, 82, i 90, i gde CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 11, 15, 23, 27, 31, 39, 47, 51, 59, 67, 75, 79, 87, 95, i 241, i po izboru CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 9, 13, 21, 25, 29, 37, 45, 49, 57, 65, 73, 77, 85, 93, i 239, i po izboru CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 10, 14, 22, 26, 30, 38, 46, 50, 58, 66, 74, 78, 86, 94, i 240.
[0203] U različitim tehničkim rešenjima, antitelo može biti, na primer, humano antitelo, humanizovano antitelo ili himerno antitelo.
[0204] Izolovano antitelo protiv CD73, ili njegov deo koji veže antigen, može da sadrži teški lanac i laki lanac, pri čemu:
(a) teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci izabranoj od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 100, 103, 107, 109, 112, 114, 116, 119, 121, 133, 184-210 ili sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, ili 1-50 aminokiselinskih promena (tj., aminokiselinske supstitucije, adicije ili delecije) u odnosu na aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 100, 103, 107, 109, 112, 114, 116, 119, 121, 133, i 184-210, redom;
(b) laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci izabranoj od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 101, 102, 104, 105, 106, 108, 110, 111, 113, 115, 117, 118, 120 i 122 ili sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, ili 1-50 aminokiselinskih promena (tj., tj., aminokiselinske supstitucije, adicije ili delecije) u odnosu na aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 101, 102, 104, 105, 106, 108, 110, 111, 113, 115, 117, 118, 120 i 122, redom;
(c) antitelo se specifično veže za CD73, i
(d) antitelo pokazuje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ili sva funkcionalna svojstva navedena u Tabeli 3.
[0205] U određenim tehničkim rešenjima, antitela protiv CD73 sadrže teške i lake lance sa procentnim identitetom i/ili aminokiselinskim promenama i funkcijama razmatranim gore (tj., (a)-(d)), pri čemu CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 7, 19, 35, 43, 55, 63, 71, 83, i 91, i po izboru CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 5, 17, 33, 41, 53, 61, 69, 81, i 89, i po izboru CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 6, 18, 34, 42, 54, 62, 70, 82, i 90.
[0206] U određenim tehničkim rešenjima, antitela protiv CD73 sadrže teške i lake lanace sa procentnim identitetom i/ili aminokiselinskim promenama i funkcijama razmatranim gore (tj., (a)-(d)), pri čemu CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 11, 15, 23, 27, 31, 39, 47, 51, 59, 67, 75, 79, 87, 95, i 241, i po izboru CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 9, 13, 21, 25, 29, 37, 45, 49, 57, 65, 73, 77, 85, 93, i 239, i po izboru CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca sadrži
4
aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 10, 14, 22, 26, 30, 38, 46, 50, 58, 66, 74, 78, 86, 94, i 240.
[0207] U određenim tehničkim rešenjima, antitela protiv CD73 sadrže teške i lake lance sa procentnim identitetom i/ili aminokiselinskim promenama i funkcijama razmatranim gore (tj., (a)-(d)), pri čemu CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 7, 19, 35, 43, 55, 63, 71, 83, i 91, i po izboru CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 5, 17, 33, 41, 53, 61, 69, 81, i 89, i po izboru CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 6, 18, 34, 42, 54, 62, 70, 82, i 90, i gde CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 11, 15, 23, 27, 31, 39, 47, 51, 59, 67, 75, 79, 87, 95, i 241, i po izboru CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 9, 13, 21, 25, 29, 37, 45, 49, 57, 65, 73, 77, 85, 93, i 239, i po izboru CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 10, 14, 22, 26, 30, 38, 46, 50, 58, 66, 74, 78, 86, 94, i 240.
[0208] Takođe su obezbeđena antitela protiv CD73 koja sadrže VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VLCDR1, VLCDR2, i/ili VLCDR3 koji se razlikuju od odgovarajućih CDR-ova od CD73.4-1, CD73.4-2, CD73.3, 11F11-1, 11F11-2, 4C3-1, 4C3-2, 4C3-3, 4D4, 10D2-1, 10D2-2, 11A6, 24H2, 5F8-1, 5F8-2, 6E11 i/ili 7A11, u 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4, ili 1-5 aminokiselinskih promena (tj., aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija). U određenim tehničkim rešenjima, antitelo protiv CD73 sadrži 1-5 aminokiselinskih promena u svakom od 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 CDR-ova u odnosu na odgovarajuće sekvence u CD73.4-1, CD73.4-2, CD73.3, 11F11-1, 11F11-2, 11F11, 4C3-1, 4C3-2, 4C3-3, 4D4, 10D2-1, 10D2-2, 11A6, 24H2, 5F8-1, 5F8-2, 6E11 i/ili 7A11. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo protiv CD73 sadrži ukupno 1-5 promena aminokiselina duž svih CDR-ova u odnosu na CDR-ove u CD73.4-1, CD73.4-2, CD73.3, 11F11-1, 11F11-2, 4C3-1, 4C3-2, 4C3-3, 4D4, 10D2-1, 10D2-2, 11A6, 24H2, 5F8-1, 5F8-2, 6E11 i/ili 7A11.
[0209] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo protiv CD73 sadrži VH i VL CDR-ove koji se sastoje od onih od CD73.4-1 ili CD73.4-2, pri čemu su jedna ili više aminokiselina u jednom ili više CDR-ova one od jednog od ostalih antitela protiv CD73 ovde stavljenih na uvid javnosti.
[0210] Mutacije (npr., supstitucije, adicije, delecije) koje se mogu napraviti u sekvencama varijabilnog regiona antitela protiv CD73 mogu se odrediti na osnovu sledećeg: (i) mutacije koje su uvedene u antitela, kao što je opisano u Primerima; i (ii) poređenje aminokiselinskih ostataka na svakoj poziciji u varijabilnim domenima ovde opisanih antitela protiv CD73 (videti Tabelu 35 i Sliku 35): različita amino kiselina na određenom položaju u antitelu protiv CD73 može ukazivati da se aminokiselinski ostatak u ovom položaju može promeniti u drugi aminokiselinski ostatak bez znatnog uticaja na aktivnosti antitela; dok ako se isti aminokiselinski ostatak nađe na istom položaju u nekoliko ili svim antitelima protiv CD73, to može ukazivati na to da ta određena aminokiselina treba da se sačuva i ne menja u drugi ostatak. Primeri tehničkih rešenja su dati ispod.
[0211] U određenim tehničkim rešenjima, okvirne supstitucije mogu da se uvedu na poziciji 25 (...RLSCATSGFTF... u 11F11) varijabilnog regiona teškog lanca (npr., konzervativna supstitucija, npr., u S ili A) antitela protiv CD73 opisanih ovde. Na primer, ako je amino kiselina na ovom položaju T, može se uvesti supstitucija u A ili S; ako je aminokiselina na ovom položaju A, može se uvesti supstitucija u S ili T; i ako je aminokiselina na ovom položaju S, može se uvesti supstitucija u T ili A. Antitela 24H2, 4D4, 10D2, 6E11, 7A11, 11A6, i 4C3 imaju A na ovom mestu, 11F11 ima T na ovoj poziciji, i 73.5, 73.7, i 73.9 imaju S na ovom položaju.
[0212] Slično tome, u određenim tehničkim rešenjima, okvirne supstitucije mogu da se uvedu na poziciji aminokiseline 94 (...AEDTAVYYCAR... u 11F11) varijabilnog regiona teškog lanca (npr., V u L ili L u V). Na primer, antitela 11F11, 73.3-73.10, 24H2, 4D4, 5F8, i 10D2 imaju V na ovom mestu, i 6E11, 7A11, 11A6, i 4C3 imaju L na ovom položaju.
[0213] U određenim tehničkim rešenjima, aminokiselinske supstitucije mogu se izvršiti u CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca anti-CD73 antitela ovde stavljenih na uvid javnosti. Na primer, aminokiselina na poziciji 52 (...WVAVILYDGSN... u 11F11) može biti supstituisana sa W, ili ako je aminokiselina na ovom položaju W, tada aminokiselina može biti supstituisana sa L (antitela 11F11 i 73.4-73.7 imaju L na ovom položaju, i antitela 73.8-73.10, 24H2, i 4D4 imaju W na ovom položaju).
[0214] Slično tome, u određenim tehničkim rešenjima, aminokiselina na poziciji 54 (... VILYDGSNKYY... u 11F11) može biti supstituisana sa S ili E, ili ako je aminokiselina na ovom položaju S, tada aminokiselina može biti supstituisana sa E. Antitela 11F11, 73.4, 73.5, 24H2, 10D2, i 5F8 imaju G na ovom položaju, antitela 73.6-73.9, 6E11, 7A11, 4C3, i 73.3 imaju S na ovom položaju, i antitela 73.10 i 4D4 imaju E na ovom položaju.
[0215] Ostale dopuštene supstitucije u varijabilnom regionu mogu se odrediti na osnovu poravnanja sekvenci varijabilnih regiona teškog i lakog lanca na Slici 35 koristeći slične razloge kako je gore opisano.
[0216] Antitela koja imaju sekvence sa homologijom sa onima od CD73.3, CD73.4, CD73.5, CD73.6 , CD73.7, CD73.8, CD73.9, CD73.10, CD73.11, 11F11, 4C3, 4D4, 10D2, 11A6, 24H2, 5F8, 6E11 i/ili 7A11, npr., VHi VLregioni od SEQ ID NOs: 4, 16, 32, 40, 52, 60, 68, 80, 88, 135, 170-177, i SEQ ID NOs: 8, 12, 20, 24, 28, 36, 44, 48, 56, 64, 72, 76, 84, 92, redom, ili teški i laki lanci od SEQ ID NOs: 100, 103, 107, 109, 112, 114, 116, 119, 121, 133, i 184-210, i SEQ ID NOs: 101, 102, 104, 105, 106, 108, 110, 111, 113, 115, 117, 118, 120 i 122, redom, ili CDR-ovi se mogu dobiti mutagenezom (npr., usmerenom na mesto ili PCR-om posredovanom mutagenezom) molekula nukleinske kiseline, npr., SEQ ID NOs: 139, 142, 146, 148, 151, 153, 155, 158, 160, 237 i/ili SEQ ID NOs: 140, 141, 143, 144, 145, 147, 149, 150, 152, 154, 156, 157, 159, 161 ili SEQ ID NOs: 134, 243, 246, 250, 252, 255, 257, 259, 262, 264, i/ili SEQ ID NOs: 244, 245, 247, 248, 249, 251, 253, 254, 256, 258, 260, 261, 263, 265, 266 nakon čega sledi testiranje kodiranog izmenjenog antitela za zadržavanje funkcije korišćenjem ovde opisanih funkcionalnih testova.
V. Antitela sa konzervativnim modifikacijama
[0217] Antitela protiv CD73 mogu da sadrže varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence, pri čemu jedna ili više od ovih CDR sekvenci sadrži određene aminokiselinske sekvence na osnovu preferiranih antitela opisanih ovde npr., od CD73.4-1, CD73.4-2, CD73.3, 11F11-1, 11F11-2, 4C3-1, 4C3-2, 4C3-3, 4D4, 10D2-1, 10D2-2, 11A6, 24H2, 5F8-1, 5F8-2, 6E11 i/ili 7A11, ili njihovih konzervativnih modifikacija, i gde antitela zadržavaju željena funkcionalna svojstva antitela protiv CD73 opisanih ovde. Antitela protiv CD73 predmetnog pronalaska sadrže CDR1, CDR2, i CDR3 sekvence teškog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 5, 6, i 7, redom, i CDR1, CDR2, i CDR3 sekvence lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 13, 14, i 15, redom.
[0218] Prema tome, izolovano antitelo protiv CD73, ili njegov deo koji veže antigen, može da sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR1, CDR2, i CDR3 sekvence i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR1, CDR2, i CDR3 sekvence, pri čemu:
(a) CDR3 sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 7, 19, 35, 43, 55, 63, 71, 83, i 91, i njihovih konzervativnih modifikacija, npr., 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 ili 1-5 konzervativnih aminokiselinskih supstitucija;
(b) CDR3 sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od aminokiselinske sekvence sa SEQ ID NOs: 11, 15, 23, 27, 31, 39, 47, 51, 59, 67, 75, 79, 87, i 95, i njihovih konzervativnih modifikacijae, npr., 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 ili 1-5 konzervativnih aminokiselinskih supstitucija;
(c) antitelo se specifično veže za CD73, i
(d) antitelo pokazuje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ili sva funkcionalna svojstva navedena u Tabeli 3.
[0219] U poželjnom tehničkom rešenju, CDR2 sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NOs: 6, 18, 34, 42, 54, 62, 70, 82, i 90, i njihovih konzervativnih modifikacija, npr., 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 ili 1-5 konzervativnih supstitucija amino kiselina; i CDR2 sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 10, 14, 22, 26, 30, 38, 46, 50, 58, 66, 74, 78, 86, i 94, i njihovih konzervativnih modifikacija, npr., 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 ili 1-5 konzervativnih supstitucija aminokiselina. U drugom poželjnom tehničkom rešenju, CDR1 sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 5, 17, 33, 41, 53, 61, 69, 81, i 89, i njihovih konzervativnih modifikacija, npr., 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 ili 1-5 konzervativnih supstitucija aminokiselina; i CDR1 sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od amino kiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 9, 13, 21, 25, 29, 37, 45, 49, 57, 65, 73, 77, 85, i 93, i njihovih konzervativnih modifikacija, npr., 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 ili 1-5 konzervativnih supstitucija aminokiselina.
[0220] U različitim tehničkim rešenjima, antitela mogu biti, na primer, humana antitela, humanizovana antitela ili himerna antitela.
[0221] Konzervativne supstitucije aminokiselina mogu se vršiti u delovima antitela drugačijim od, ili dodatno sa, CDR-ovima Na primer, konzervativne modifikacije aminokiselina mogu se obaviti u okvirnom regionu ili u konstantnom regionu, npr., Fc regionu. Bilo koja od supstitucija opisanih ovde može biti konzervativna supstitucija. Varijabilni region ili teškog ili lakog lanca može da sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, ili 1-50 konzervativnih supstitucija aminokiselina u odnosu na sekvence antitela protiv CD73 koje su ovde date. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo protiv CD73 sadrži kombinaciju konzervativnih i nekonzervativnih aminokiselinskih modifikacija.
VI. Antitela koja vezuju isti epitop na CD73 ili se takmiče za vezivanje sa CD73 sa antitelima opisanim ovde
[0222] Takođe su obezbeđena antitela koja se takmiče za vezivanje za CD73 sa određenim ovde opisanim antitelima protiv CD73 (npr., antitela CD73.4, CD73.3, 11F11, 4C3, 4D4, 10D2, 11A6, 24H2, 5F8, 6E11 i 7A11). Takva kompetitivna antitela se mogu identifikovati na osnovu njihove sposobnosti da kompetitivno inhibiraju vezivanje za CD73 jednog ili više monoklonskih antitela 11F11-1, 11F11-2, 4C3-1, 4C3-2, 4C3-3, 4D4, 10D2-1, 10D2-2, 11A6, 24H2, 5F8-1, 5F8-2, 6E117A11 i/ili CD73.3 ili CD73.4 (sa bilo kojim konstantnim regionima i lakim lanacima opisanim ovde za ova antitela) u standardnim testovima vezivanja CD73. Na primer, mogu se koristiti standardni ELISA testovi ili kompetitivni ELISA testovi u kojima se rekombinantni humani CD73 protein imobiliše na ploču, dodaju se različite koncentracije neobeleženog prvog antitela, ploča se ispere, doda se obeleženo drugo antitelo, ispere, i meri se količina vezanog obeleživača. Ako rastuća koncentracija neobeleženog (prvog) antitela (koje se takođe naziva "blokirajuće antitelo") inhibira vezivanje obeleženog (drugog) antitela, kaže se da prvo antitelo inhibira vezivanje drugog antitela za cilj (metu) na ploči, ili se kaže da se takmiči sa vezivanjem drugog antitela. Dodatno ili alternativno, BIACORE® SPR analiza može da se koristi za procenu sposobnosti antitela da se takmiče. Sposobnost antitela iz testa da inhibira vezivanje antitela protiv CD73 opisanog ovde za CD73 pokazuje da antitelo iz testa može da se takmiči sa antitelom za vezivanje na CD73.
[0223] Ovde su takođe data antitela protiv CD73 koja inhibiraju vezivanje antitela protiv CD73 opisanih ovde za CD73 na ćelijama, npr., tumorskim ćelijama, za najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% i/ili čije vezivanje za CD73 na ćelijama, npr., tumorskim ćelijama, je inhibirano za najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% , npr., mereno ELISA-om ili FACS-om, poput korišćenja testa opisanog u prethodnom paragrafu.
[0224] Antitela koja se takmiče za vezivanje sa antitelima protiv CD73 opisanim ovde mogu biti identifikovana korišćenjem poznatih metoda u oblasti. Na primer, miševi se mogu imunizovati sa humanim CD73 kao što je opisano ovde, dobijaju se hibridomi, i dobijena monoklonska antitela se pretražuju na sposobnost da se nadmeću sa antitelom opisanim ovde za vezivanje na CD73. Miševi se takođe mogu imunizovati manjim fragmentom CD73 koji sadrži epitop na koji se antitelo veže. Epitop ili region koji sadrži epitop može se identifikovati, npr., skriningom za vezivanje za niz preklapajućih peptida koji obuhvataju CD73. Alternativno, postupak Jespers et al., Biotechnology 12:899, 1994 može se koristiti za usmeravanje izbora antitela koje ima isti epitop i samim tim slična svojstva antitelu protiv CD73 opisanom ovde. Pomoću fagnog displeja, prvo se teški lanac antitela protiv CD73 uparuje sa repertoarom (poželjno humanim) lakih lanaca da se izabere antitelo koje se vezuje za CD73, i zatim se novi laki lanac uparuje sa repertoarom (poželjno humanim) teških lanaca da se izabere (poželjno humano) antitelo koje vezuje CD73 koje ima isti epitop ili region epitopa kao antitelo protiv CD73 opisano ovde. Alternativno ovde opisane varijante antitela mogu se dobiti mutagenezom cDNK koja kodira teške i lake lanace antitela.
[0225] Tehnike za određivanje antitela koja se vezuju za "isti epitop na CD73" sa antitelima opisanim ovde uključuju, na primer, metode mapiranja epitopa, kao što su rendgenske analize kristala antigen:antitelo kompleksa, koji obezbeđuju atomsku rezoluciju epitopa. Druge metode prate vezivanje antitela na fragmente antigena ili mutirane varijacije antigena pri čemu se gubitk vezivanja usled modifikacije aminokiselinskog ostatka unutar antigenske sekvence često smatra indikacijom komponente epitopa. Pored toga, takođe se mogu koristiti kompjuterske kombinatoričke metode za mapiranje epitopa. Metode se takođe mogu osloniti na sposobnost antitela od interesa da afinitetno izoluje specifične kratke peptide (bilo u nativnom trodimenzionalnom obliku bilo u denaturisanom obliku) iz kombinatornih biblioteka fagnog displeja peptida. Zatim se peptidi smatraju vodičima za definiciju epitopa koji odgovara antitelu korišćenom za skrining biblioteke peptida. Za mapiranje epitopa, takođe su razvijeni računarski algoritmi koji su pokazali da preslikavaju konformacione diskontinuirane epitope.
[0226] Alanin skenirajuća mutageneza, kako je opisano u Cunningham and Bunari (1989) Science 244: 1081-1085, ili neki drugi oblik tačkaste mutageneze ostataka amino kiselina u CD73 takođe se može koristiti za određivanje funkcionalnog epitopa za antitelo protiv CD73. Studije mutageneza, međutim, mogu takođe otkriti aminokiselinske ostatke koji su ključni za ukupnu trodimenzionalnu strukturu CD73 ali koji nisu direktno uključeni u antitelo-antigen kontakte, pa stoga mogu biti potrebne druge metode da se potvrdi funkcionalni epitop određen ovom metodom.
[0227] Epitop ili region epitopa ("region epitopa" je region koji sadrži epitop ili se preklapa sa epitopom) vezan specifičnim antitelom može se takođe odrediti procenom vezivanja antitela na peptide koji sadrže fragmente CD73, npr., nedenaturisani ili denaturisani fragmenti. Serije preklapajućih peptida koje obuhvataju sekvencu CD73 (npr., humani CD73) mogu se sintetizovati i pregledati na vezivanje, npr. u direktnom ELISA, kompetitivnom ELISA (gde se peptid procenjuje na njegovu sposobnost da spreči vezivanje antitela za CD73 vezan za bunarić mikrotitar ploče), ili na čipu. Takve metode analize peptida možda neće biti u stanju da otkriju neke diskontinuirane funkcionalne epitope, tj. funkcionalne epitope koji uključuju aminokiselinske ostatke koji nisu susedni duž primarne sekvence polipeptidnog lanca CD73.
[0228] Epitop se takođe može identifikovati pomoću otiska proteina zasnovanog na MS-u, kao što je masena spektrometrija izmene vodonik/deuterijum (Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry - HDX-MS) i Brze Fotohemijske Oksidacije Proteina (Fast Photochemical Oxidation of Proteins - FPOP). HDX-MS se može izvesti, npr., kako je dalje opisano u Primerima i u Wei et al. (2014) Drug Discovery Today 19:95. FPOP se može izvesti kao što je opisano, npr., u Hambley and Gross (2005) J. American Soc. Mass Spectrometry 16:2057.
[0229] Epitop vezan antitelom protiv CD73 takođe se može odrediti strukturnim metodama, kao što je određivanje kristalne strukture X-zracima (npr., WO2005/044853), molekulskim modelovanjem i nuklearnom magnetnom rezonantnom (NMR) spektroskopijom, uključujući NMR određivanje stopa H-D razmene labilnih amidnih vodonika u CD73 kada je slobodan i kada je vezan u kompleksu sa antitelom od interesa (Zinn-Justin et al. (1992) Biochemistry 31, 11335-11347; Zinn-Justin et al. (1993) Biochemistry 32, 6884-6891).
[0230] U odnosu na kristalografiju X-zracima, kristalizacija se može izvršiti korišćenjem bilo koje od ponatih metoda u oblasti (npr. Giege et al. (1994) Acta Crystallogr. D50:339-350; McPherson (1990) Eur. J. Biochem. 189:1-23), uključujući mikro šaržu (npr. Chayen (1997) Struktura 5:1269-1274), difuziju pare u visećoj kapi (npr. McPherson (1976) J. Biol. Chem. 251:6300-6303), sejanjem i dijalizom. Poželjno je koristiti preparat proteina koji ima koncentraciju od najmanje oko 1 mg/mL i poželjno oko 10 mg/mL do oko 20 mg/mL. Kristalizacija se može najbolje postići u taložnom rastvoru koji sadrži polietilen glikol 1000-20,000 (PEG; prosečna molekulska masa u opsegu od oko 1000 do oko 20,000 Da), poželjno oko 5000 do oko 7000 Da, poželjnije oko 6000 Da, sa koncentracijama u opsegu od oko 10% do oko 30% (m/v). Takođe može biti poželjno uključiti agens za stabilizaciju proteina, npr. glicerol u koncentraciji koja se kreće od oko 0.5% do oko 20%. Pogodna so, kao što je natrijum hlorid, litijum hlorid ili natrijum citrat takođe može biti poželjna u precipitacionom rastvoru, poželjno u koncentraciji u opsegu od oko 1 mM do oko 1000 mM. Talog je poželjno puferiran na pH od oko 3.0 do oko 5.0, poželjno oko 4.0. Specifični puferi korisni u precipitacionom rastvoru mogu varirati i dobro su poznati u oblasti (Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Third ed., (1994) Springer-Verlag, Njujork). Primeri korisnih pufera uključuju, ali nisu ograničeni na, HEPES, Tris, MES i acetat. Kristali mogu da rastu u širokom rasponu temperatura, uključujući 2° C, 4° C, 8° C i 26° C.
[0231] Antitelo: antigen kristali mogu se proučavati korišćenjem dobro poznatih tehnika difrakcije rendgenskih zraka i mogu se porediti korišćenjem računarskog softvera kao što je X-
1
PLOR (Yale University, 1992, distribuiran od strane Molecular Simulations, Inc.; videti npr. Blundell & Johnson (1985) Meth. Enzymol. 114 & 115, H. W. Wyckoff et al., eds., Academic Press; američka patentna prijava sa objavom br. 2004/0014194), i BUSTER (Bricogne (1993) Acta Cryst. D49:37-60; Bricogne (1997) Meth. Enzymol. 276A:361-423, Carter & Sweet, eds.; Roversi et al. (2000) Acta Cryst. D56:1313-1323).
[0232] Antitela protiv CD73 mogu da se vežu za isti epitop kao i bilo koja antitela protiv CD73 koja imaju ovde opisane aminokiselinske sekvence, što je određeno tehnikom mapiranja epitopa, kao što je tehnika opisana ovde. Antitela protiv CD73 takođe mogu imati slične interakcije sa humanim CD73, npr., mogu imati najmanje oko 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ili više interakcija prikazanih u Tabeli 30, kako je određeno rendgenskom (X-ray) kristalografijom.
VII. Inženjerizovana i modifikovana antitela
VH i VL regioni
[0233] Takođe su obezbeđena inženjerizovana i modifikovana antitela koja se mogu pripremiti korišćenjem antitela koje ima jednu ili više VHi/ili VLsekvenci ovde stavljenih na uvid javnosti kao početni materijal da bi se konstruisalo modifikovano antitelo, takvo modifikovano antitelo može imati izmenjena svojstva u odnosu na početno antitelo. Antitelo se može konstruisati modifikovanjem jednog ili više ostataka unutar jednog ili oba varijabilna regiona (tj., VHi/ili VL), na primer unutar jednog ili više CDR regiona i/ili unutar jednog ili više okvirnih regiona. Dodatno ili alternativno, antitelo se može konstruisati modifikovanjem ostataka unutar jednog ili više konstantnih regiona, na primer da se izmeni jedna ili više efektorska funkcija antitela.
[0234] Jedan tip inženjeringa varijabilnog regiona koji se može izvesti je CDR presađivanje. Antitela intereaguju sa ciljanim antigenima pretežno preko aminokiselinskih ostataka koji su locirani u šest komplementarnih determisnisanih regiona teškog i lakog lanca (CDR-ovi). Iz tog razloga, aminoiselinske sekvence unutar CDR-ova su različitije između pojedinačnih antitela od sekvenci izvan CDR-ova. Pošto su CDR sekvence odgovorne za većinu antitelo-antigen interakcija, moguće je eksprimirati rekombinantna antitela koja oponašaju svojstva specifičnih referentnih antitela konstrukcijom vektora ekspresije koji uključuju CDR sekvence iz specifičnog referentnog antitela presađenog na okvirne sekvence od drugog antitela sa različitim svojstvima (videti, npr., Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A.
2
86:10029-10033; američki patent sa br. 5,225,539 od Winter, i američki patenti sa brojevima 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 i 6,180,370 od Queen et al.)
[0235] Prema tome, drugo tehničko rešenje opisano ovde odnosi se na izolovano monoklonsko antitelo, ili njegov deo koji veže antigen, a sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR1, CDR2, i CDR3 sekvence koje sadrže aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 5, 17, 33, 41, 53, 61, 69, 81, i 89, SEQ ID NOs: 6, 18, 34, 42, 54, 62, 70, 82, i 90, i SEQ ID NOs: 7, 19, 35, 43, 55, 63, 71, 83, i 91, redom, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR1, CDR2, i CDR3 sekvence koje sadrže aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 9, 13, 21, 25, 29, 37, 45, 49, 57, 65, 73, 77, 85, i 93, SEQ ID NOs: 10, 14, 22, 26, 30, 38, 46, 50, 58, 66, 74, 78, 86, i 94, i SEQ ID NOs:11, 15, 23, 27, 31, 39, 47, 51, 59, 67, 75, 79, 87, i 95, redom. Prema tome, takva antitela sadrže VHi VLCDR sekvence monoklonskih antitela CD73.4-1, CD73.4-2, 11F11-1, 11F11-2, 4C3-1, 4C3-2, 4C3-3, 4D4, 10D2-1, 10D2-2, 11A6, 24H2, 5F8-1, 5F8-2, 6E11 i 7A11, još mogu da sadrže različite okvirne sekvence ovih antitela.
[0236] Takve okvirne sekvence mogu da se dobiju iz javnih DNK baza podataka ili objavljenih referenci koje uključuju sekvence germinativnog gena antitela. Na primer, germinativne DNK sekvence za humane gene varijabilnog regiona teškog i lakog lanca mogu se naći u bazi podataka "VBase" humane germinativne sekvence (dostupno na Internetu na www.mrccpe.cam.ac.uk/vbase), kao i u Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, peto izdanje, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publikacija br. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol.227:776-798; i Cox, J. P. L. et al. (1994) "A Directory of Human Germline VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836.
[0237] Poželjne okvirne sekvence za upotrebu u ovde opisanim antitelima su one koje su strukturno slične okvirnim sekvencama korišćenim od antitela opisanih ovde. VHCDR1, 2 i 3 sekvence, i VLCDR1, 2 i 3 sekvence, mogu se presaditi na okvirne regione koji imaju identične sekvence kao oni koji se nalaze u germinativnom imunoglobulinskom genu iz koga potiče okvirna sekvenca, ili CDR sekvence mogu biti presađene na okvirne regione koji sadrže do 20, poželjno konzervativnih, aminokiselinskih supstitucija u poređenju sa germinativnim sekvencama. Na primer, otkriveno je da je u određenim slučajevima korisno mutirati ostatke unutar okvirnih regiona da bi se održala ili povećala sposobnost vezivanja antigena za antitelo (videti npr., američki patenti sa brojevima 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 i 6,180,370 od Queen et al).
[0238] Ovde opisana konstruisana antitela uključuju ona u kojima su napravljene modifikacije okvirnih ostataka unutar VHi/ili VL, npr. da poboljšaju svojstva antitela. Obično su takve modifikacije okvira napravljene da smanje imunogenost antitela. Na primer, jedan pristup je "povratnomutirati" jedan ili više okvirnih ostataka u odgovarajuću germinativnu sekvencu. Preciznije, antitelo koje je pretrpelo somatsku mutaciju može sadržati okvirne ostatake koji se razlikuju od germinativne sekvence iz koje je antitelo izvedeno. Takvi ostaci se mogu identifikovati upoređivanjem okvirnih sekvenci antitela sa germinativnom sekvencom iz koje je antitelo izvedeno. Da bi se vratile okvirne sekvence regiona njihovoj germinativnoj konfiguraciji, somatske mutacije mogu biti "povratnomutirane" u germinativnu sekvencu putem, na primer, mutageneze usmerene na mesto ili mutagenezom posredovanim PCR-om. Takva "povratnomutirana" antitela su takođe predviđena da budu obuhvaćena. Drugi tip okvirnih modifikacija uključuje mutiranje jednog ili više ostataka unutar okvirnog regiona, ili čak unutar jednog ili više CDR regiona, kako bi se uklonili epitopi T ćelija i tako smanjila potencijalna imunogenost antitela. Ovaj pristup se takođe naziva "deimunizacija" i detaljnije je opisan u američkom patentu sa objavom br.20030153043 od Carr et al.
[0239] Drugi tip modifikacija varijabilnog regiona je da se mutiraju ostaci aminokiselina unutar CDR regiona radi poboljšanja jednog ili više svojstava vezivanja (npr., afinitet) antitela od interesa. Mutageneza koja je usmerena na mesto ili mutageneza posredovana PCR-om može se izvesti kako bi se uvela mutacija(mutacije) i efekat na vezivanje antitela, ili drugo funkcionalno svojstvo od interesa, može se proceniti in vitro ili in vivo testovima kako je ovde opisano i navedeno u Primerima. Poželjno su uvedene konzervativne modifikacije (kao što je gore diskutovano). Mutacije mogu biti adicije aminokiseline, delecije, ili poželjno supstitucije. Štaviše, obično se ne menja više od jednog, dva, tri, četiri ili pet ostataka unutar CDR regiona.
[0240] Prema tome, takođe su obezbeđena izolovana monoklonska antitela protiv CD73, ili njihovi delovi koji se vezuju za antigen, koja sadrže varijabilni region teškog lanca koji sadrži: (a) VHCDR1 region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 5, 17, 33, 41, 53, 61, 69, 81, i 89, ili aminokiselinsku sekvencu koja ima jednu, dve, tri, četiri ili pet aminokiselinskih supstitucija, delecija ili adicija u poređenju sa SEQ ID NOs: 5, 17, 33, 41, 53, 61, 69, 81, i 89; (b) VHCDR2 region sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 6, 18, 34, 42, 54, 62, 70, 82, i 90, ili aminokiselinsku sekvencu koja ima jednu, dve, tri, četiri ili pet aminokiselinskih supstitucija, delecija ili adicija u poređenju sa SEQ ID NOs: 6, 18, 34, 42, 54, 62, 70, 82, i 90; (c) VHCDR3 region sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs:7, 19, 35, 43, 55, 63, 71, 83, i 91, ili aminokiselinsku sekvencu koja ima jednu, dve, tri, četiri ili
4
pet aminokiselinskih supstitucija, delecija ili adicija u poređenju sa SEQ ID NOs: 7, 19, 35, 43, 55, 63, 71, 83, i 91; (d) VLCDR1 region sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 9, 13, 21, 25, 29, 37, 45, 49, 57, 65, 73, 77, 85, ili 93, ili aminokiselinsku sekvencu koja ima jedan, dva, tri, četiri ili pet aminokiselinskih supstitucija, delecija ili adicija u poređenju sa SEQ ID NOs: 9, 13, 21, 25, 29, 37, 45, 49, 57, 65, 73, 77, 85, ili 93; (e) VLCDR2 region sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 10, 14, 22, 26, 30, 38, 46, 50, 58, 66, 74, 78, 86, i 94, ili aminokiselinska sekvenca ima jednu, dve, tri, četiri ili pet aminokiselinskih supstitucija, delecija ili adicija u poređenju sa SEQ ID NOs: 10, 14, 22, 26, 30, 38, 46, 50, 58, 66, 74, 78, 86, i 94; i (f) VLCDR3 region sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 11, 15, 23, 27, 31, 39, 47, 51, 59, 67, 75, 79, 87, i 95, ili aminokiselinsku sekvencu koja ima jednu, dve, tri, četiri ili pet aminokiselinskih supstitucija, delecija ili adicija u poređenju sa SEQ ID NOs: 11, 15, 23, 27, 31, 39, 47, 51, 59, 67, 75, 79, 87, i 95.
[0241] Ostaci metionina u CDR-ovima antitela mogu da se oksiduju, što rezultira potencijalnom hemijskom razgradnjom i posledičnim smanjenjem potencijala antitela. Shodno tome, takođe su obezbeđena antitela protiv CD73 koja imaju jedan ili više metioninskih ostataka u teškom i/ili lakom lancu CDR-ova zamenjenih aminokiselinskim ostacima koji ne podležu oksidativnoj degradaciji.
[0242] Slično tome, mesta deamidacije mogu se ukloniti iz antitela protiv CD73, naročito u CDR-ovima.
[0243] Potencijalna mesta glikozilacije unutar antigen vezujućeg domena se poželjno eliminišu da bi se sprečila glikozilacija koja može ometati vezivanje antigena. Videti, npr., američki patent sa br.5,714,350.
Ciljano vezivanje antigena
[0244] U različitim tehničkim rešenjima, antitelo ove predmetne objave je modifikovano tako da selektivno blokira vezivanje antigena u tkivima i sredinama gde bi vezivanje antigena bilo štetno, ali omogućava vezivanje antigena tamo gde bi bilo korisno. U jednom tehničkom rešenju, blokirajuća peptidna "maska" je generisana da se specifično veže za antigen vezujuću površinu antitela i interferira sa vezivanjem antigena, pri čemu je maska je povezana za svaki od vezujućih kraka antitela pomoću linkera koji je moguće odcepiti peptidazom. Videti, npr., američki patent sa br. 8,518,404 od CytomX. Takvi konstrukti su korisni za lečenja kancera u kojima je nivo proteaze uveliko povećan u mikro-okruženju tumora u poređenju sa ne-tumorskim tkivima. Selektivno cepanje linkera koji je moguće odcepiti u mikro-okruženju tumora omogućava disocijaciju maskirajućeg/blokirajućeg peptida, omogućavajući antigen vezivanje selektivno u tumoru, a ne u perifernim tkivima u kojima vezivanje antigena može izazvati neželjene sporedne efekte.
[0245] Alternativno, u srodnom tehničkom rešenju, razvijeno je bivalentno vezujuće jedinjenje ("maskirajući ligand") koje sadrži dva domena vezivanja antigena koji se vežu na obe antigen vezujuće površine (bivalentnog) antitela i ometaju vezivanje antigena, u kojem su maske dva domena vezivanja međusobno povezane (ali ne i antitelo) sa linkerom koji se može odcepiti, na primer odcepiti peptidazom. Videti, npr., Int'1 patentnu prijavu sa objavom sa br. WO 2010/077643 od Tegopharm Corp. Maskirajući ligandi mogu sadržati, ili biti izvedeni iz, antigena za koje je antitelo namenjeno da se veže, ili mogu biti nezavisno generisani. Takvi maskirajući ligandi su korisni za lečenje kancera kod kojih su nivoi proteaze uveliko povećani u mikro-okruženju tumora u poređenju sa ne-tumorskim tkivima. Selektivno cepanje linkera koji može da se odcepi u mikro-okruženju tumora omogućava disocijaciju dva domena vezivanja jednog od drugog, smanjujući avidnost za antigen vezujuće površine antitela. Rezultirajuća disocijacija maskirjućeg liganda od antitela omogućava antigen vezujuću selektivnost u tumoru, a ne u perifernim tkivima u kojima vezivanje antigena može izazvati neželjene sporedne efekte.
Fcs i modifikovani Fcs
[0246] Pored aktivnosti terapijskog antitela koja proizilazi iz vezivanja antigen vezujućeg domena za antigen (npr. blokiranje srodnog liganda ili proteina receptora u slučaju antitela antagonista, ili indukovana signalizacija u slučaju antitela agonista), Fc deo antitela komunicira sa imunim sistemom uglavnom kompleksnim putem da izazove brojne biološke efekte. Funkcije efektora, kao što je Fc region imunoglobulina odgovorne su za mnoge važne funkcije antitela, kao što je antigen-zavisna ćelijska citotoksičnost (ADCC), citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC), i antitelo-zavisna ćelijski-posredovana fagocitoza (ADCP), rezultiraju ubijanjem ciljanih ćelija, mada različitim mehanizmima.
[0247] Antitela protiv CD73 mogu da sadrže variajabilne domene antitela opisanih ovde sa konstantnim domenima koji sadrže različite Fc regione, izabrane na osnovu bioloških aktivitnosti (ako postoje) antitela za predviđenu upotrebu. Salfeld (2007) Nat. Biotechnol.
25:1369. Humani IgG-i, na primer, mogu se klasifikovati u četiri podklase, IgG1, IgG2, IgG3, i IgG4, i svaka od njih sadržis Fc region sa jedinstvenim profilom za vezivanje na jedan ili više Fcγ receptora (aktivirajući receptori FcγRI (CD64), FcγRIIA, FcγRIIC (CD32); FcγRIIIA i FcγRIIIB (CD16) i inhibirajući receptor FcγRIIB), i za prvu komponentu komplementa (C1q). Humani IgG1 i IgG3 se vezuju za sve Fcγ receptore; IgG2 se vezuje za FcγRIIAH131, i sa nižim afinitetom za FcγRIIAR131FcγRIIIAv158; IgG4 se vezuje za FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIC, i FcγRIIIAV158; a inhibitorni receptor FcγRIIB ima niži afinitet za IgG1, IgG2 i IgG3 od svih ostalih Fcγ receptora. Bruhns et al. (2009) Krv 113:3716. Studije su pokazale da se FcγRI ne vezuje za IgG2, a FcγRIIIB se ne vezuje za IgG2 ili IgG4. Id. Uopšte, u pogledu ADCC aktivnosti, humani IgG1 ≧IgG3 >>IgG4 ≧IgG2. Kao posledica, na primer, konstantni domen IgG1, a ne IgG2 ili IgG4, može biti izabran za upotrebu u leku gde je poželjan ADCC; IgG3 se može izabrati ako se aktiviraju NK ćelije koje eksprimiraju FcγRIIIA, monociti makrofaga; i IgG4 se može izabrati ako će antitelo da se koristi da desenzibiluje pacijente sa alergijom. IgG4 se takođe može izabrati ako je poželjno da antitelo nema sve efektorske funkcije.
[0248] Prema tome, ovde opisani varijabilni regioni anti-CD73 mogu biti povezani (npr., kovalentno povezani ili spojeni) sa Fc, npr., IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 Fc, koji mogu biti bilo kog alotipa ili izoalotipa, npr., za IgG1: G1m, G1m1(a), G1m2(x), G1m3(f), G1m17(z); za IgG2: G2m, G2m23(n); za IgG3: G3m, G3m21(g1), G3m28(g5), G3m11(b0), G3m5(b1), G3m13(b3), G3m14(b4), G3m10(b5), G3m15(s), G3m16(t), G3m6(c3), G3m24(c5), G3m26(u), G3m27(v); . Videti, npr., Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1). Na izbor alotipa mogu uticati potencijalni problemi imunogenosti, npr. minimizovanje stvaranja antitela protiv lekova.
[0249] Varijabilni regioni opisani ovde mogu biti povezani sa Fc koji sadrži jednu ili više modifikacija, tipično za promenu jednog ili više funkcionalnih svojstava antitela, kao što je poluživot u serumu, fiksacija komplementa, vezivanje Fc receptora, i/ili ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela. Dalje, antitelo opisano ovde može biti hemijski modifikovano (npr., jedan ili više hemijskih delova mogu biti vezani za antitelo) ili može biti modifikovano tako da promeni svoju glikozilaciju, da promeni jedno ili više funkcionalnih svojstava antitela. Svako od ovih tehničkih rešenja je detaljnije opisano u daljem tekstu. Numerisanje ostataka u Fc regionu je ono iz EU indeksa od Kabat-a. Ovde stavljene na uvid javnosti varijante sekvenci date su sa pozivom na broj ostatka praćeno aminokiselinom koja je supstituisana umesto aminokiseline koja se nalazi u prirodi, po izboru prethodi ostatak koji se prirodno nalazi na toj poziciji. Ako na određenoj poziciji može biti prisutno više aminokiselina, npr. ako se sekvence razlikuju između prirodnih izotipa, ili ako se na poziciji mogu supstituisati višestruke mutacije, one su razdvojene kosim crtama (npr. "X/Y/Z").
[0250] Na primer, neko može da izvrši modifikacije u Fc regionu kako bi se generisala Fc varijanta sa (a) povećanom ili smanjenom ćelijskom citotoksiksičnošću zavisnom od antitela (ADCC), (b) povećanom ili smanjenom komplementom posredovanom citotoksičnošću (CDC), (c) povećanim ili smanjenim afinitetom za C1q i/ili (d) povećanim ili smanjenim afinitetom za Fc receptor u odnosu na matični Fc. Takve varijante Fc regiona obično će sadržati najmanje jednu aminokiselinsku modifikaciju u Fc regionu. Smatra se da je kombinacija modifikacija aminokiselina posebno poželjna. Na primer, varijanta Fc regiona može da uključuje dve, tri, četiri, pet, itd. supstitucija u njima, npr. specifične pozicije Fc regiona koje su ovde identifikovane. Primeri varijanti Fc sekvence su ovde stavljeni na uvid javnosti, i takođe su dati u američkim patentima sa br.
5,624,821; 6,277,375; 6,737,056; 6,194,551; 7,317,091; 8,101,720; PCT Patentne Publikacije WO 00/42072; WO 01/58957; WO 04/016750; WO 04/029207; WO 04/035752; WO 04/074455; WO 04/099249; WO 04/063351; WO 05/070963; WO 05/040217, WO 05/092925 i WO 06/020114.
Smanjenje Efektorske Funkcije
[0251] ADCC aktivnost može biti smanjena modifikovanjem Fc regiona. U određenim tehničkim rešenjima, mesta koja utiču na vezivanje za Fc receptore mogu biti uklonjena, poželjno mesta koja nisu mesta vezivanja receptora za spas. U drugim tehničkim rešenjima, Fc region može biti modifikovan da ukloni ADCC mesto. ADCC mesta su poznata u oblasti; videti, na primer, Sarmay et al. (1992) Molec. Immunol.29 (5): 633-9 u pogledu ADCC mesta u IgG1-u. U jednom tehničkom rešenju, G236R i varijanta L328R humanog IgG1 efikasno eliminišu FcγR vezivanje. Horton et al. (2011) J. Immunol. 186:4223 i Chu et al. (2008) Mol. Immunol.
45:3926. U drugim tehničkim rešenjima, Fc koji ima smanjeno vezivanje za FcγRs sadrži aminokiselinske supstitucije L234A, L235E i G237A. Gross et al. (2001) Immunity 15:289. Dalje, FcγR-nevezujuća antitela mogu se pripremiti pretvaranjem FcγR-vezujućeg domena od IgG1 (na pozicijama 233, 234, 235, 236, 327, 330, i 331) u sekvencu IgG2 ili IgG4. US 2013/0317203.
[0252] CDC aktivnost se takođe može smanjiti modifikovanjem Fc regiona. Mutacije na IgG1 pozicijama D270, K322, P329 i P331, konkretno mutacije alanina D270A, K322A, P329A i P331A, značajno smanjuju sposobnost odgovarajućeg antitela da veže C1q i aktivira komplement. Idusogie et al. (2000) J. Immunol. 164:4178; WO 99/51642. Pokazano je da modifikacija položaja 331 od IgG1 (npr. P331S) smanjuje vezivanje komplementa. Tao et al.
(1993) J. Exp. Med.178:661 i Canfield & Morrison (1991) J. Exp. Med.173:1483. U drugom primeru, jedan ili više aminokiselinskih ostataka unutar aminokiselinskih položaja 231 do 239 su izmenjeni da bi se na taj način smanjila sposobnost antitela da fiksira komplement. WO 94/29351.
[0253] U nekim tehničkim rešenjima, Fc sa smanjenom fiksacijom komplementa ima aminokiselinske supstitucije A330S i P331S. Gross et al. (2001) Immunity 15:289.
[0254] Za upotrebe u kojima efektorska funkcija treba da bude u potpunosti izbegnuta, npr. kada je samo vezivanje antigena dovoljno da generiše željenu terapijsku korist, a efektorska funkcija vodi samo do (ili povećava rizik od) neželjenih nuspojava, mogu se koristiti IgG4 antitela, ili se mogu osmisliti antitela ili fragmenti kojima nedostaje Fc region ili njegov značajan deo, ili Fc može biti mutiran da potpuno eliminiše glikozilaciju (npr. N297A). Alternativno, stvoren je hibridni konstrukt humanog IgG2 (CH1 domen i region zgloba) i humani IgG4 (CH2 i CH3 domeni) je generisan bez efektorske funkcije, nedostaje mu sposobnost da veže FcγRs (poput IgG2) i ne može da aktivira komplement (poput IgG4). Rother et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25:1256. Videti takođe Mueller et al. (1997) Mol. Immunol.
34:441; Labrijn et al. (2008) Curr. Op. Immunol. 20:479 (diskutuje Fc modifikacije za opšte smanjenje funkcije efektora).
[0255] U drugim tehničkim rešenjima, Fc region je promenjen zamenom najmanje jednog aminokiselinskog ostatka sa različitim aminokiselinskim ostatkom da bi se smanjila celokupna efektorska funkcija(funkcije) antitela. Na primer, jedna ili više aminokiselina izabrana od ostataka aminokiselina 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 i 322 može da se zameni sa drugim aminokiselinskim ostatkom tako da antitelo ima smanjeni afinitet za efektor ligand, ali zadržava sposobnost vezivanja antigena roditeljskog antitela. Efektor ligand kome je izmenjen afinitet može biti, na primer, Fc receptor (ostaci 234, 235, 236, 237, 297) ili C1 komponenta komplementa (ostaci 297, 318, 320, 322). Američki patent sa br.5,624,821 i 5,648,260, oba od Winter et al.
[0256] WO 88/007089 predložila je modifikacije u IgG Fc regionu da bi se smanjilo vezivanje za FcyRI da smanji ADCC (234A; 235E; 236A; G237A) ili blokira vezivanje za C1q komponentu komplementa da bi eliminisao CDC (E318A ili V/K320A i K322A/Q). Videti takođe Duncan & Winter (1988) Nature 332:563; Chappel et al. (1991) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 88:9036; i Sondermann et al. (2000) Nature 406:267 (diskutuje o efektima ovih mutacija na FcγRIII vezivanje).
[0257] Fc modifikacije koje smanjuju funkciju efektora takođe uključuju supstitucije, insercije, i delecije na pozicijama 234, 235, 236, 237, 267, 269, 325, i 328, kao što je 234G, 235G, 236R, 237K, 267R, 269R, 325L, i 328R. Fc varijanta može da sadrži 236R/328R. Ostale modifikacije za smanjenje FcγR i interakcija komplementa uključuju supstitucije 297A, 234A, 235A, 237A, 318A, 228P, 236E, 268Q, 309L, 330S, 331 S, 220S, 226S, 229S, 238S, 233P, i 234V. Ove i druge modifikacije su pregledane u Strohl (2009) Current Opinion in Biotechnology 20:685-691. Funkcije efektora (i ADCC i aktivacija komplementa) mogu se smanjiti, uz zadržavanje neonatalnog FcR vezivanja (zadržavanje poluživota), mutiranjem IgG ostataka na jednom ili više položaja 233 - 236 i 327 - 331, kao što je E233P, L234V, L235A, po izboru G236Δ, A327G, A330S i P331S u IgG1; E233P, F234V, L235A, po izboru G236Δ u IgG4; i A330S i P331S u IgG2. Videti Armour et al. (1999) Eur. J. Immunol. 29:2613; WO 99/58572. Druge mutacije koje smanjuju funkciju efektora uključuju L234A i L235A u IgG1 (Alegre et al. (1994) Transplantation 57:1537); V234A i G237A u IgG2 (Cole et al. (1997) J. Immunol.
159:3613; videti takođe američki patent sa br.5,834,597); i S228P i L235E za IgG4 (Reddy et al. (2000) J. Immunol.164:1925). Sledeća kombinacija mutacija za smanjenje funkcije efektora u humanom IgG1 uključuje L234F, L235E i P331S. Oganesyan et al. (2008) Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 64:700. Videti generalno Labrijn et gal. (2008) Curr. Op. Immunol.
20:479. Dodatne mutacije nađene da smanjuju funkciju efektora u kontekstu Fc (IgG1) fuzionog proteina (abatacept) su C226S, C229S i P238S (EU brojanje ostatka). Davis et al. (2007) J. Immunol.34:2204.
[0258] Ostale Fc varijante sa smanjenim ADCC i/ili CDC su stavljene na uvid javnosti kod Glaesner et al. (2010) Diabetes Metab. Res. Rev.26:287 (F234A i L235A da smanje ADCC i ADCP u IgG4); Hutchins et al. (1995) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 92:11980 (F234A, G237A i E318A u IgG4); An et al. (2009) MAbs 1:572 i američka patentna prijava sa objavom 2007/0148167 (H268Q, V309L, A330S i P331S u IgG2); McEarchern et al. (2007) Krv 109:1185 (C226S, C229S, E233P, L234V, L235A u IgG1); Vafa et al. (2014) Metode 65:114 (V234V, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S, P331S u IgG2).
[0259] U određenim tehničkim rešenjima, bira se Fc koji u suštini nema funkciju efektora, tj., ima smanjeno vezivanje zaFcγRs i smanjenu fiksaciju komplementa. Tipični Fc, npr., IgG1 Fc, koji je bez efekta sadrži sledećih pet mutacija: L234A, L235E, G237A, A330S i P331S. Gross et al. (2001) Immunity 15:289. Tipični teški lanci koji sadrže ove mutacije navedeni su u Popisu Sekvence, kako je detaljno prikazano u Tabeli 35. Ovih pet supstitucija može biti kombinovano sa N297A da se takođe eliminiše glikozilacija.
Poboljšanje Funkcije Efektora
[0260] Alternativno, ADCC aktivnost može se povećati modifikovanjem Fc regiona. S obzirom na aktivnost ADCC, humani IgG1 ≧IgG3>> IgG4 ≧IgG2, tako i IgG1 konstantni domen, a ne IgG2 ili IgG4, može da se izabere za upotrebu u leku gde je ADCC poželjna. Alternativno, Fc region može biti modifikovan tako da poveća ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC) i/ili da poveća afinitet za Fcγ receptor modifikovanjem jedne ili više amino kiseline na sledećim pozicijama: 234, 235, 236, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 313, 315, 320, 322, 324, 325, 326, 327, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 433, 434, 435, 436, 437, 438 ili 439. Videti WO 2012/142515; videti takođe WO 00/42072. Tipične supstitucije uključuju 236A, 239D, 239E, 268D, 267E, 268E, 268F, 324T, 332D, i 332E. Tipične varijante uključuju 239D/332E, 236A/332E, 236A/239D/332E, 268F/324T, 267E/268F, 267E/324T, i 267E/268F/324T. Na primer, pokazano je da humani IgG1Fc-i koji sadrže G236A varijantu, koja se po izboru može kombinovati sa I332E, povećava odnos afiniteta vezivanja FcγIIA/FcγIIB približno 15-puta. Richards et al. (2008) Mol. Cancer Therap. 7:2517; Moore et al. (2010) mAbs 2:181. Druge modifikacije za poboljšanje interakcija FcγR i komplementa uključuju ali nisu ograničene na supstitucije 298A, 333A, 334A, 326A, 247I, 339D, 339Q, 280H, 290S, 298D, 298V, 243L, 292P, 300L, 396L, 3051, i 396L. Ove i druge modifikacije razmotrene su u (2009) Current Opinion in Biotechnology 20:685-691. Specifično, i ADCC i CDC mogu biti poboljšani promenama na poziciji E333 od IgG1, npr. E333A. Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591. Upotreba mutacija P247I i A339D/Q za poboljšanje funkcije efektora u IgG1 stavljena je na uvid javnosti u WO 2006/020114, i D280H, K290S ± S298D/V je stavljen na uvid javnosti u WO 2004/074455. Pokazano je da su varijante K326A/W i E333A/S povećavale funkciju efektora u humanom IgG1, a E333S u IgG2. Idusogie et al. (2001) J. Immunol.
166:2571.
[0261] Specifično, mesta vezivanja na humanom IgG1 za FcγR1, FcγRII, FcγRIII i FcRn su mapirana, a opisane su varijante sa poboljšanim vezivanjem. Shields et al. (2001) J. Biol. Chem.
276:6591-6604. Pokazano je da specifične mutacije na pozicijama 256, 290, 298, 333, 334 i 339 poboljšavanju vezivanje za FcγRIII, uključujući kombinaciju mutanata T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A i S298A/E333A/K334A (imaju pojačano FcγRIIIa vezivanje i ADCC aktivnost). Identifikovane su druge IgG1 varijante sa snažno pojačanim vezivanjem za FcγRIIIa, uključujući varijante sa S239D/I332E i S239D/I332E/A330L mutacijama koje su pokazale najveći porast afiniteta za FcγRIIIa, smanjenje vezivanja FcyRIIb, i snažnu
1
citotoksičnu aktivnost kod cinomolgus majmuna. Lazar et al.(2006) Proc. Nat'l Acad Sci. (USA) 103:4005; Awan et al. (2010) Krv 115:1204; Desjarlais & Lazar (2011) Exp. Cell Res.
317:1278. Uvođenje trostrukih mutacija u antitela kao što je alemtuzumab (CD52-specifično), trastuzumab (HER2/nespecifično), rituksimab (CD20-specifično), i cetuksimab (EGFR-specifično) je prevedeno u znatno pojačanu ADCC aktivnost in vitro, i S239D/I332E varijanta pokazala je pojačan kapacitet za potrošnju B ćelija kod majmuna. Lazar et al. (2006) Proc. Nat'l Acad Sci. (USA) 103:4005. Pored toga, identifikovani su IgG1 mutanti koji sadrže L235V, F243L, R292P, Y300L, V305I i P396L mutacije, koji su pokazali pojačano vezivanje za FcγRIIIa i istovremeno pojačanu ADCC aktivnost kod transgenih miševa koji eksprimiraju humani FcyRIIIa u modelima B ćelijskih maligniteta i kancera dojke. Stavenhagen et al. (2007) Kancer Res. 67:8882; američki patent sa br.8,652,466; Nordstrom et al. (2011) Breast Cancer Res. 13:R123.
[0262] Različiti IgG izotipovi takođe pokazuju različitu CDC aktivnost (IgG3>IgG1>>IgG2≈IgG4). Dangl et al. (1988) EMBO J. 7:1989. Za upotrebe u kojima je poželjan pojačani CDC, moguće je takođe uvesti mutacije koje povećavaju vezivanje za C1q. Sposobnost regrutovanja komplementa (CDC) može se poboljšati mutacijama na K326 i/ili E333 u IgG2, kao što su K326W (koji smanjuje ADCC aktivnost) i E333S, kako bi se povećalo vezivanje za C1q, prvu komponentu kaskade komplementa. Idusogie et al. (2001) J. Immunol.
166:2571. Uvođenje S267E / H268F/S324T (samostalno ili u bilo kojoj kombinaciji) u humani IgG1 pojačava C1q vezivanje. Moore et al. (2010) mAbs 2:181. Fc region IgG1/IgG3 hibridnog izotipa antitela "113F" od Natsume et al. (2008) Cancer Res.68:3863 (slika 1 u njemu) takođe daje poboljšani CDC. Videti takođe Michaelsen et al. (2009) Scand. J. Immunol.
70:553 i Redpath et al. (1998) Immunology 93:595.
[0263] Dodatne mutacije koje mogu povećati ili smanjiti efektorsku funkciju su stavljene na uvid javnosti u Dall'Acqua et al. (2006) J. Immunol.177:1129. Videti takođe Carter (2006) Nat. Rev. Immunol. 6:343; Presta (2008) Curr. Op. Immunol. 20:460.
[0264] Fc varijante koje povećavaju afinitet za inhibitorni receptor FcyRIIb takođe se mogu koristiti, npr. da se poveća izazivanje apoptoze ili aktivnosti ađuvansa. Li & Ravitd.h (2011) Science 333:1030; Li & Ravitd.h (2012) Proc. Nat'l Acad. Sci (USA) 109:10966; Američka patentna prijava sa objavom br. 2014/0010812. Takve varijante mogu da obezbede antitelo sa imunomodulatornim aktivnostima povezanim sa FcyRllb<+>ćelijama, uključujući na primer B ćelije i monocite. U jednom tehničkom rešenju, Fc varijante obezbeđuju selektivno pojačani afinitet prema FcyRllb u odnosu na jedan ili više aktivirajućih receptora. Modifikacije za promenu vezivanja za FcyRllb uključuju jednu ili više modifikacija na poziciji izabranoj od
2
grupe koja se sastoji od 234, 235, 236, 237, 239, 266, 267, 268, 325, 326, 327, 328, i 332, prema EU indeksu. Tipične supstitucije za poboljšanje FcyRllb afiniteta uključuju ali nisu ograničene na 234D, 234E, 234F, 234W, 235D, 235F, 235R, 235Y, 236D, 236N, 237D, 237N, 239D, 239E, 266M, 267D, 267E, 268D, 268E, 327D, 327E, 328F, 328W, 328Y, i 332E, Tipične supstitucije uključuju 235Y, 236D, 239D, 266M, 267E, 268D, 268E, 328F, 328W, i 328Y, Ostale Fc varijante za poboljšanje vezivanja za FcyRllb uključuju 235Y/267E, 236D/267E, 239D/268D, 239D/267E, 267E/268D, 267E/268E, i 267E/328F. Specifično su, S267E, G236D, S239D, L328F i I332E varijante, uključujući S267E L328F dvostruku varijantu, humanog IgG1, od posebne vrednosti u specifičnom povećanju afiniteta za inhibitorni FcyRllb receptor. Chu et al. (2008) Mol. Immunol. 45:3926; Objava američke patentne prijave 2006/024298; WO 2012/087928. Pojačana specifičnost za FcγRIIb (za razliku od FcγRIIa<R131>) može se dobiti dodavanjem supstitucije P238D. Mimoto et al. (2013) Protein. Eng. Des. & Selection 26:589; WO 2012/115241.
[0265] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo je modifikovano tako da poveća svoj biološki poluživot. Mogući su različiti pristupi. Na primer, ovo se može postići povećanjem afiniteta vezivanja Fc regiona za FcRn. U jednom tehničkom rešenju, antitelo se menja unutar CH1 ili CL regiona tako da sadrži epitop koji veže receptor spašavanja uzet iz dve petlje CH2 domena od Fc regiona IgG-a, kao što je opisano u američkim patentima sa brojevima 5,869,046 i 6,121,022 od Presta et al. Drugi primeri Fc varijanti koji povećavaju vezivanje za FcRn i/ili poboljšavaju farmakokinetičke osobine uključuju supstitucije na pozicijama 259, 308, i 434, uključujući na primer 259I, 308F, 428L, 428M, 434S, 434H, 434F, 434Y, i 434M. Druge varijante koje povećavaju Fc vezivanje za FcRn uključuju: 250E, 250Q, 428L, 428F, 250Q/428L (Hinton et al., 2004, J. Biol. Chem.279(8): 6213-6216, Hinton et al.2006 Journal of Immunology 176:346-356), 256A, 272A, 305A, 307A, 31 1A, 312A, 378Q, 380A, 382A, 434A (Shields et al, Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(9):6591-6604), 252F, 252Y, 252W, 254T, 256Q, 256E, 256D, 433R, 434F, 434Y, 252Y/254T/256E, 433K/434F/436H (Dall Acqua et al. Journal of Immunology, 2002, 169:5171-5180, Dall'Acqua et al., 2006, Journal of Biological Chemistry 281:23514-23524), Videti američki patent sa br, 8,367,805,
[0266] Modifikacija određenih konzerviranih ostataka u IgG Fc (I253/H310/Q311/H433/N434), kao što je N434A varijanta (Yeung et al. (2009) J. Immunol.
182:7663), predložena je kao način da se poveća afinitet FcRn, povećavajući time poluživot antitela u cirkulaciji. WO 98/023289. Pokazano je da kombinacija Fc varijante koja sadrži M428L i N434S povećava FcRn vezivanje i povećava poluživot u serumu do pet puta. Zalevsky et al. (2010) Nat. Biotechnol. 28:157. Kombinacija Fc varijante koja sadrži T307A, E380A i modifikacije N434A takođe produžava poluživot IgG1 antitela. Petkova et al. (2006) Int. Immunol. 18:1759. Pored toga, pokazano je i da kombinacije Fc varijanti koje sadrže M252Y/M428L, M428L/N434H, M428L/N434F, M428L/N434Y, M428L/N434A, M428L/N434M, i M428L/N434S varijante produžavaju poluživot. WO 2009/086320.
[0267] Dalje, kombinacija Fc varijante koja sadrži M252Y, S254T i T256E, povećava poluživot-gotovo 4-puta. Dall'Acqua et al. (2006) J. Biol. Chem. 281:23514. Srodna modifikacija IgG1 koja obezbeđuje povećani afinitet FcRn ali smanjenu pH zavisnost (M252Y / S254T / T256E / H433K / N434F) korišćena je za stvaranje IgG1 konstrukta ("MST-HN Abdeg") koji se koristi kao konkurent za sprečavanje vezivanja drugih antitela za FcRn, što rezultira povećanim uklanjanjem tog drugog antitela, bilo endogenog IgG (npr. u autoimunom okruženju) ili drugog egzogenog (terapijskog) mAb. Vaccaro et al. (2005) Nat. Biotechnol.
23:1283; WO 2006/130834.
[0268] Ostale modifikacije za povećavanje FcRn vezivanja su opisane u Yeung et al. (2010) J. Immunol. 182:7663-7671; 6,277,375; 6,821,505; WO 97/34631; WO 2002/060919,
[0269] U određenim tehničkim rešenjima, hibridni IgG izotipi se mogu koristiti za povećanje FcRn vezivanja, i potencijalno povećanje poluživota. Na primer, hibridna varijanta IgG1/IgG3 može se konstruisati supstitucijom IgG1 položaja u CH2 i/ili CH3 regionu sa aminokiselinama iz IgG3 na položajima gde se dva izotipa razlikuju. Tako se može konstruisati hibridna varijanta IgG antitela koja sadrži jednu ili više supstitucija, npr., 274Q, 276K, 300F, 339T, 356E, 358M, 384S, 392N, 397M, 422I, 435R, i 436F. U drugim tehničkim rešenjima koja su opisana ovde, hibridna varijanta IgG1/IgG2 može biti konstruisana supstitucijom položaja IgG2 u regionu CH2 i/ili CH3 sa aminokiselinama iz IgG1 na pozicijama gde se dva izotipa razlikuju. Tako se može konstruisati hibridna varijanta IgG antitela koja sadrži jednu ili više supstitucija, npr., jednu ili više od sledećih aminokiselinskih supstitucija: 233E, 234L, 235L, -236G (odnosi se na inserciju glicina na poziciji 236), i 327A. Videti američki patent sa br.8,629,113. Stvoren je hibrid IgG1/IgG2/IgG4 sekvenci koji navodno povećava poluživot u serumu i poboljšava ekspresiju. američki patent sa br.7,867,491 (sekvenca broj 18 u njemu).
[0270] Poluživot antitela predmetnog pronalaska u serumu se takođe može povećati pegilacijom. Antitelo može biti pegilirano da, na primer, poveća biološki (npr., serumski) poluživot antitela. Da bi se antitelo pegiliralo, antitelo ili njegov fragment, obično reaguje sa polietilen glikol (PEG) reagesom, kao što je reaktivni estar ili aldehidni derivat PEG-a, pod uslovima u kojima se jedna ili više PEG groupa veže na antitelo ili fragment antitela. Poželjno, pegiliranje se izvodi reakcijom acilacije ili reakcijom alkilacije reaktivnim PEG molekulom (ili polimer reaktivnim analogom rastvornim u vodi). Kako se ovde koristi, izraz "polietilen
4
glikol" treba da obuhvati bilo koji od oblika PEG-a koji su korišćeni za derivatizaciju drugih proteina, kao što je mono (C1-C10) alkoksi-ili ariloksi-polietilen glikol ili polietilen glikolmaleimid. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo koje se pegilira je aglikozilovano antitelo. Metode za pegiliranje proteina poznate su u oblasti i mogu se primeniti na ovde opisana antitela. Videti na primer, EP 0154316 od Nishimura et al. i EP 0401384 od Ishikawa et al.
[0271] Alternativno, pod nekim okolnostima može biti poželjno da se smanji poluživot antitela predmetnog pronalaska, a ne da se poveća. Modifikscije kao što je I253A (Hornick et al. (2000) J. Nucl. Med. 41:355) i H435A/R I253A ili H310A (Kim et al. (2000) Eur. J. Immunol.
29:2819) u Fc humanog IgG1-a mogu smanjiti FcRn vezivanje, što smanjuje poluživot (povećava uklanjanje) za upotrebu u situacijama u kojima je poželjno brzo uklanjanje, kao što je medicinsko snimanje. Videti takođe Kenanova et al. (2005) Kancer Res. 65:622. Druga sredstva za poboljšanje uklanjanja uključuju formatiranje antigen vezujućih domena predmetnog pronalaska kao fragmenta antitela kojima nedostaje sposobnost da vežu FcRn, kao što su Fab fragmenti. Takve modifikacije mogu smanjiti poluživot antitela u cirkulaciji sa nekoliko nedelja na nekoliko sati. Selektivna PEGilacija fragmenata antitela može se zatim koristiti za fino podešavanje (povećanje) poluživota fragmenata antitela ako je potrebno. Chapman et al. (1999) Nat. Biotechnol.17:780. Za povećanje poluživota, fragmenti antitela mogu takođe da se spoje sa albuminom humanog seruma, npr. u fuzionisanju konstrukta proteina. Yeh et al. (1992) Proc. Nat'l Acad. Sci. 89:1904. Alternativno, bispecifično antitelo može biti konstruisano sa prvim antigen vezujućim domenom predmetnog pronalaska i drugim antigen vezujućim domenom koji se vezuje za humani serum albumin (HSA). Videti međunarodnu patentnu prijavu sa objavom WO 2009/127691 i patentne reference koje su tamo navedene. Alternativno, specijalizovane polipeptidne sekvence se mogu dodati fragmentima antitela da se poveća poluživot, npr. "XTEN" polipeptidne sekvence. Schellenberger et al. (2009) Nat. Biotechnol.27:1186; međunarodna patentna prijava sa objavom WO 2010/091122. Additional Fc Variants
[0272] Kada se koristi konstantni domen IgG4, obično je poželjno uključiti supstituciju S228P, koja oponaša sekvencu zgloba u IgG1 i na taj način stabilizuje molekule IgG4, npr. smanjuje razmenu Fab-kraka između terapijskog antitela i endogenog IgG4 kod pacijenta koji se leči. Labrijn et al. (2009) Nat. Biotechnol.27:767; Reddy et al. (2000) J. Immunol.164:1925.
[0273] Potencijalno mesto cepanja proteazom u zglobu IgG1 konstrukata može da se eliminiše modifikacijama D221G i K222S, povećavajući stabilnost antitela. WO 2014/043344.
[0274] Afiniteti i svojstva vezivanja Fc varijante za njene ligande (Fc receptori mogu se odrediti različitim in vitro metodama ispitivanja (biohemijskim ili imunološkim ispitivanjima) poznatim u oblasti uključujući ali bez ograniženja, ravnotežne metode (npr., enzim-povezan imunoabsorbentni test (ELISA), ili radioimunoanalizu (RIA)), ili kinetiku (npr., BIACORE® SPR analiza), i druge metode kao što su ispitivanja indirektnog vezivanja, testovi kompetitivne inhibicije, fluorescentni rezonantni prenos energije (FRET), gel elektroforeza i hromatografija (npr., gel filtracija). Ove i druge metode mogu da koriste obeliživač na jednoj ili više komponenti koje se ispituju i/ili upotrebljavaju različitim metodama detekcije uključujući ali neograničavajući se na hromogene, fluorescentne, luminescentne ili izotopske obeleživače. Detaljan opis afiniteta vezivanja i kinetike može se naći u Paul, W. E., ed., Fundamental Immunology, 4. Izdanje., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999), koji se fokusira na interakcije antitelo-imunogen.
[0275] U još nekim tehničkim rešenjima, glikozilacija antitela je modifikovana da poveća ili smanji funkciju efektora. Na primer, aglikozilovano antitelo može da se napravi tako da mu nedostaje kompletna funkcija efektora mutiranjem konzerviranog ostatka asparagina na poziciji 297 (npr. N297A), čime se ukida komplement i vezivanje FcyRI. Bolt et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:403. Videti takođe Tao & Morrison (1989) J. Immunol. 143:2595 (koristeći N297Q u IgG1 da eliminiše glikozilaciju na poziciji 297).
[0276] Iako aglikozilovana antitela uglavnom nemaju funkciju efektora, mogu da se uvedu mutacije da bi se ta funkcija obnovila. Aglikozilovana antitela, npr. ona koja su rezultat N297A/C/D/ili H mutacija ili proizvedena u sistemima (npr. E. coli) koji ne glikoziluju proteine, mogu se dalje mutirati da se obnovi FcyR vezivanje, npr. S298G i/ili T299A/G/ili H (WO 2009/079242), ili E382V i M428I (Jung et al. (2010) Proc. Nat'l Acad. Sci (USA) 107:604).
[0277] Pored toga, antitelo sa pojačanim ADCC može da se napravi menjanjem glikozilacije. Na primer, pokazalo se da uklanjanje fukoze iz teškog lanca Asn297-povezanih oligosaharida pojačava ADCC, zasnovano na poboljšanom vezivanju za FcyRIIIa. Shields et al. (2002) JBC 277:26733; Niwa et al. (2005) J. Immunol. Metode 306: 151; Cardarelli et al. (2009) Clin. Cancer Res.15:3376 (MDX-1401); Cardarelli et al. (2010) Cancer Immunol. Immunotherap.
59:257 (MDX-1342). Ovakva antitela sa niskim nivoom fukoze mogu se proizvesti, npr., u ćelijama jajnika nokautiranog kineskog hrčka (CHO) kojima nedostaje fukoziltransferaza (FUT8) (Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol. Bioeng.87:614), ili u drugim ćelijama koje generišu afukozilirana antitela. Videti, npr., Zhang et al. (2011) mAb 3:289 i Li et al. (2006) Nat. Biotechnol. 24:210 (oba opisuju proizvodnju antitela u glikokonstruisanom Pichia pastoris.); Mossner et al. (2010) Krv 115:4393; Shields et al. (2002) J. Biol. Chem.
277:26733; Shinkawa et al. (2003) J. Biol. Chem. 278:3466; EP 1176195B1. ADCC se takođe može poboljšati kao što je opisano u PCT Publikaciji WO 03/035835, koja stavlja na uvid javnosti upotrebu varijante CHO ćelijske linije, Lec13, sa smanjenom sposobnošću vezivanja fukoze za Asn(297)-povezane ugljene hidrate, što takođe rezultira hipofukozilacijom antitela eksprimiranih u toj ćeliji domaćina (videti takođe Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem.
277:26733-26740). Alternativno, analozi fukoze se mogu dodati medijumu kulture tokom proizvodnje antitela da inhibiraju ugradnju fukoze u ugljenihidrat na antitelu. WO 2009/135181.
[0278] Povećanje struktura račvanja GlcNac u oligosaharidima vezanim za antitelo takođe poboljšava ADCC. PCT Publikacija WO 99/54342 od Umana et al. opisuje ćelijske linije konstruisane da eksprimiraju glikoprotein-modifikujuću glikozil transferazu (npr., beta(1,4)-N-acetilglukozaminiltransferaza III (GnTIII)) tako da antitela eksprimirana u konstruisanim ćelijskim linijama pokazuju povećano račvanje GlcNac struktura što rezultira povećanom ADCC aktivnošću antitela (videti takođe Umana et al. (1999) Nat. Biotech.17:176-180).
[0279] Razvijene su dodatne varijante glikozilacije koje su bez ostataka galaktoze, sijalne kiseline, fukoze i ksiloze (tkozvane GNGN glikoforme), koje pokazuju pojačane ADCC i ADCP ali smanjeni CDC, kao i druge koje su bez sijalne kiseline, fukoze i ksiloze (takozvane G1/G2 glikoforme), koje pokazuju pojačane ADCC, ADCP i CDC. Američka patentna prijava sa objavom sa brojem 2013/0149300. Antitela koja imaju ove obrasce glikozilacije su po izboru proizvedena u genetički modifikovanim N. benthamiana biljkama u kojima su izbačeni endogeni geni ksilozil ili fukozil transferaze.
[0280] Glikoinženjering se takođe može koristiti za modifikovanje anti-inflamatornih svojstava IgG konstrukta promenom sadržaja α2,6 sijalila u lancima ugljenih hidrata vezanih na Asn297 iz Fc regiona, pri čemu povećan udeo α2,6 sijaliliranih oblika rezultira pojačanim antiinflamatornim efektima. Videti Nimmerjahn et al. (2008) Ann. Rev. Immunol. 26:513. Suprotno tome, smanjenje udela antitela koja imaju α2,6 sijalilirane ugljene hidrate može biti korisno u slučajevima kada se ne žele anti-inflamatorna svojstva. Postupci modifikacije α2,6 sijaliliranih sadržaja antitela, na primer selektivnim prečišćavanjem α2,6 sijaliliranih oblika ili enzimskom modifikacijom, dati su u američkoj patentnoj prijavi sa objavom br.2008/0206246. U drugim tehničkim rešenjima, aminokiselinska sekvenca Fc regiona može biti modifikovana tako da imitira efekat α2,6 sijalilacije, na primer uključivanjem modifikacije F241A. WO 2013/095966.
VIII. Fizička svojstva antitela
[0281] Ovde opisana antitela mogu da sadrže jedno ili više mesta glikozilacije u varijabilnom regionu bilo lakog ili teškog lanca. Takva mesta glikozilacije mogu da rezultiraju povećanom imunogenošću antitela ili promenom pK antitela usled izmenjenog antigen vezivanja (Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala i Morrison (2004) J. Immunol 172:5489-94; Wallick et al (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37:697-706). Poznato je da se glikozilacija dešava po motivima koji sadrže N-X-S/T sekvencu. U nekim slučajevima, poželjno je da bude antitelo protiv CD73 koje ne sadrži varijabilni region glikozilacije. Ovo se može postići ili izborom antitela koja ne sadrže motiv glikozilacije u varijabilnom regionu ili mutiranjem ostataka unutar regiona glikozilacije.
[0282] U određenim tehničkim rešenjima, antitela koja su ovde opisana ne sadrže mesta izomerizma asparagina. Deamidacija asparagina može da se dogodi na N-G ili D-G sekvencama i može da rezultira stvaranjem ostatka izoaspartične kiseline koji može uvesti deformaciju (eng. kink) u polipeptidni lanac i može smanjiti njegovu stabilnost (efekat izoasparaginske kiseline). Na primer, ako je aminokiselinska sekvenca Asp-Gly prisutna u CDR sekvencama teškog i/ili lakog lanca antitela, sekvenca je supstituisana sa aminokiselinskom sekvencom koja ne podleže izomerizaciji. U jednom tehničkom rešenju opisanom ovde, antitelo sadrži CDR2 sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 6, ali gde je Asp ili Gly u Asp-Gly sekvenci (VILYDGSNKYYPDSVKG; SEQ ID NO: 6) zamenjen sa aminokiselinskom sekvencom koja ne podleže izomerizaciji, na primer, Asp-Ser ili Ser-Gly sekvenca.
[0283] Svako antitelo će imati karakterističnu izoelektričnu tačku (pI), koja uglavnom pada u opsegu pH između 6 i 9.5. pI za IgG1 antitelo obično pada unutar pH opsega od 7-9.5 i pI za IgG4 antitelo obično pada unutar pH opsega od 6-8. Postoji spekulacija da antitela sa pI izvan normalnog opsega mogu imati neke nerazvijenosti i nestabilnosti pod in vivo uslovima. Stoga je poželjno da postoji antitelo protiv CD73 koje sadrži pI vrednost koja pada u normalni opseg. To se može postići ili odabirom antitela sa pI u normalnom opsegu ili mutiranjem naelektrisanih površinskih ostataka.
[0284] Svako antitelo će imati karakterističnu temperaturu topljenja, sa višom temperaturom topljenja koja ukazuje na veću ukupnu stabilnost in vivo (Krishnamurthy R and Manning M C (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71). Uopšteno, poželjno je da TM1(temperatura početnog odvijanja) bude veća od 60° C, poželjno veća od 65° C, još poželjnije veća od 70° C. Tačka topljenja antitela može da se meri korišćenjem diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (Chen et al (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al (1999) Immunol Lett 68:47-52) ili cirkularnim dihroizmom (Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9). U poželjnom tehničkom rešenju, odabrana su antitela koja se ne razgrađuju brzo. Degradacija antitela može da se meri korišćenjem kapilarne elektroforeze (CE) id MALDI-MS-om (Alexander A J and Hughes D E (1995) Anal Chem 67:3626-32).
[0285] U drugom poželjnom tehničkom rešenju, izabrana su antitela koja imaju minimalne agregacione efekte, što može dovesti do pokretanja neželjenog imunog odgovora i/ili izmenjenih ili nepovoljnih farmakokinetičkih svojstava. Uopšteno su prihvatljiva antitela sa agregacijom od 25% ili manje, poželjno 20% ili manje, još poželjnije 15% ili manje, čak poželjnije 10% ili manje i još poželjnije 5% ili manje. Agregacija može da se meri pomoću nekoliko tehnika, uključujući ekskluzionu kolonu na osnovu veličine (SEC), tečnu hromatografiju visokih performansi (HPLC), i rasipanje svetlosti.
IX. Metode inženjerisanih antitela
[0286] Kao što je gore diskutovano, antitela protiv CD73 ovde stavljena na uvid javnosti imaju VHi VLsekvence mogu se koristiti za stvaranje novih antitela protiv CD73 modifikovanjem VH i/ili VL sekvenci, ili konstantnog(konstantnih) regiona povezanog sa njima. Prema tome, u drugom aspektu opisanom ovde, strukturne karakteristike antitela protiv CD73 opisanog ovde, npr. CD73.4, 11F11, 4C3, 4D4, 10D2, 11A6, 24H2, 5F8, 6E11 i/ili 7A11, koriste se za stvaranje strukturno povezanih antitela protiv CD73 koja zadržavaju bar jedno funkcionalno svojstvo antitela opisanih ovde, kao što je vezivanje na humani CD73 i CD73cinomolgusa. Na primer, jedan ili više CDR regiona od 11F11, 4C3, 4D4, 10D2, 11A6, 24H2, 5F8, 6E11 i/ili 7A11, ili njihovih mutacija, mogu se kombinovati rekombinantno sa poznatim okvirnim regionima i/ili drugim CDR-ovima da bi se stvorila dodatna, rekombinanto-kombinovana, antitela protiv CD73 opisana ovde, kao što je gore diskutovano. Ostale vrste modifikacija uključuju one opisane u prethodnom odeljku. Polazni materijal za inženjerski postupak je jedna ili više ovde datih VHi/ili VLsekvenci, ili jedan ili više njihovih CDR regiona. Da bi se stvorilo konstruisano antitelo, nije neophodno da se zapravo pripremi (tj., eksprimira kao protein) antitelo koje ima jednu ili više VHi/ili VLsekvenci koje su ovde obezbeđene, ili jedan ili više njihovih CDR regiona. Umesto toga, informacija sadržana u sekvenci(sekvencama) se koristi kao polazni materijal za kreiranje sekvence(sekvenci) "druge generacije" izvedene iz originalne sekvence(i) i zatim se sekvenca(e) " druge generacije" priprema i eksprimuje kao protein.
[0287] Prema tome, ovde su date metode za pripremanje antitela protiv CD73 koje sadrže:
(a) obezbeđivanje: (i) sekvence varijabilnog regiona teškog lanca antitela koja sadrži CDR1 sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 5, 17, 33, 41, 53, 61, 69, 81, i 89, CDR2 sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 6, 18, 34, 42, 54, 62, 70, 82, i 90, i/ili CDR3 sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 7, 19, 35, 43, 55, 63, 71, 83, i 91; i (ii) sekvence varijabilnog regiona lakog lanca antitela koja sadrži CDR1 sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 9, 13, 21, 25, 29, 37, 45, 49, 57, 65, 73, 77, 85, i 93, CDR2 sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 10, 14, 22, 26, 30, 38, 46, 50, 58, 66, 74, 78, 86, i 94, i/ili CDR3 sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 11, 15, 23, 27, 31, 39, 47, 51, 59, 67, 75, 79, 87, i 95;
(b) izmenu najmanje jednog aminokiselinskog ostatka unutar sekvence varijabilnog regiona teškog lanca antitela i/ili sekvence varijabilnog regiona lakog lanca antitela da bi se stvorilo bar jedna izmenjena sekvenca antitela; i
(c) ekspresiju izmenjene sekvence antitela kao proteina.
[0288] Standardne tehnike molekularne biologije mogu se koristiti za pripremu i ekspresiju izmenjene sekvence antitela.
[0289] Poželjno, antitelo kodirano izmenjenom sekvencom(sekvencama) antitela je ono koje zadržava jedno, neka ili sva funkcionalna svojstva antitela protiv CD73 opisanih ovde, koja uključuju ona koja su navedena u Tabeli 3.
[0290] Izmenjeno antitelo može da pokazuje jedno ili više, dva ili više, tri ili više, četiri ili više, pet ili više, šest ili više, sedam ili više, osam ili više, devet ili više, deset, ili sva funkcionalna svojstva koristeći ovde opisane funkcionalne testove. Funkcionalna svojstva izmenjenih antitela mogu se proceniti korišćenjem standardnih testova dostupnih u oblasti i/ili opisanih ovde, kao što su oni navedeni u Primerima (npr., ELISA-testovi, FACS).
[0291] U određenim tehničkim rešenjima metoda konstruisanja antitela opisanih ovde, mutacije se mogu uvesti nasumično ili selektivno duž cele ili u delu kodirajuće sekvence antitela protiv CD73 a rezultirajuća modifikovana antitela protiv CD73 mogu biti proverena na aktivnost vezivanja i/ili druga funkcionalna svojstava kao što je ovde opisano. Mutacione metode su opisane u oblasti. Na primer, PCT Publikacija WO 02/092780 od Short-a opisuje metode za kreiranje i skrining mutacija antitela korišćenjem saturacione mutageneze, skupa sintetičkih ligacija, ili kombinacija istih. Alternativno, PCT Publikacija WO 03/074679 od Lazar et al. opisuje metode upotrebe računarskih metoda skrininga za optimizaciju fizikohemijskih osobina antitela.
X. Molekuli nkleinskih kiselina
1
[0292] Sledeći aspekt opisan ovde odnosi se na molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju ovde opisana antitela. Nukleinske kiseline mogu biti prisutne u celim ćelijama, u ćelijskom lizatu, ili u delimično prečišćenom ili suštinski čistom obliku. Nukleinska kiselina je "izolovana" ili "učinjena suštinski čistom" kada se pročisti od drugih ćelijskih komponenti ili drugih kontaminanta, npr., od drugih ćelijskih nukleinskih kiselina (npr., druge hromozomske DNK, npr., hromozomske DNK koja je povezana sa izolovanom DNK u prirodi) ili proteina, standardnim tehnikama, uključujući alkalni/SDS tretman, CsCl vezivanje, hromatografiju na koloni, restrikcione enzime, elektroforezu na agaroznom gelu i druge dobro poznate u oblasti. Videti, F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing i Wiley Interscience, Njujork. Nukleinska kiselina opisana ovde može biti, na primer, DNK ili RNK i može ili ne mora da sadrži intronske sekvence. U određenim tehničkim rešenjima, nukleinska kiselina je molekul cDNK.
[0293] Nukleinska kiseline opisana ovde može biti dobijena korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije. Za antitela koja su eksprimirana hibridomima (npr., hibridomi pripremljeni od transgenih miševa koji nose humane imunoglobulinske gene kao što je opisano u daljem tekstu), cDNK-e koje kodiraju lake i teške lance antitela napravljene od hibridoma mogu se dobiti tehnikama standardnom PCR amplifikacijom ili kloniranjem cDNK. Za antitela dobijena iz biblioteke gena imunoglobulina (npr., korišćenjem tehnike fagnog displeja), nukleinska kiselina koja kodira antitelo može da se dobije iz biblioteke.
[0294] Poželjni molekuli nukleinskih kiselina opisani ovde su oni koji kodiraju VH i VL sekvence ovde opisanih antitela protiv CD73, npr.,CD73.411F11-1, 11F11-2, 4C3-1, 4C3-2, 4C3-3, 4D4, 10D2-1, 10D2-2, 11A6, 24H2, 5F8-1, 5F8-2, 6E11, 7A11, CD73.3 i/ili CD73.4 monoklonskih antitela. DNK sekvence koje kodiraju VH sekvence od CD73.4 (CD73.4-1 i CD73.4-2) 11F11 (11F11-1 i 11F11-2), 4C3 (4C3-1, 4C3-2 i 4C3-3), 4D4, 10D2 (10D2-1 i 10D2-2), 11A6, 24H2, 5F8 (5F8-1 i 5F8-2), 6E11, 7A11, CD73.3 i CD73.4 su navedene u SEQ ID NOs: 4, 16, 32, 40, 52, 60, 68, 80, 88, 135, i 170, redom. DNK sekvence koje kodiraju VL sekvence od 11F11-1, 11F11-2, 4C3-1, 4C3-2, 4C3-3, 4D4, 10D2-1, 10D2-2, 11A6, 24H2, 5F8-1, 5F8-2, 6E117A11, CD73.3 i/ili CD73.4 su navedene u SEQ ID NOs: 8, 12, 20, 24, 28, 36, 44, 48, 56, 64, 72, 76, 84, i 92, redom.
[0295] Jednom kada se dobiju fragmenti DNK koji kodiraju VH i VL segmente, tim DNK fragmentima može se dalje manipulisati standardnim rekombinantnim DNK tehnikama, na primer da promene gene varijabilnog regiona u gen lanca antitela pune dužine, u gene Fab fragmenta ili u scFv gen. U ovim manipulacijama, DNK fragment koji kodira VL- ili VH operativno je povezan sa drugim fragmentom DNK koji kodira drugi protein, kao što je
1 1
konstantni region antitela ili fleksibilni linker. Izraz "operativno povezan", kako se koristi u ovom kontekstu, zamišljeno je da znači da su dva fragmenta DNK spojena tako da aminokiselinske sekvence kodirane sa dva fragmenta DNK ostaju unutar okvira.
[0296] Izolovana DNK koja kodira VH može se pretvoriti u gen pune dužine teškog lanca operativnim povezivanjem DNK koji kodira VH sa drugim molekulom DNK koji kodira konstantni region teškog lanca (zglob, CH1, CH2 i/ili CH3). Sekvence gena humanog konstantnog regiona teškog lanca su poznate u oblasti (videti npr., Kabat, E. A., el al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Peto Izdanje, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publikacija Br..91-3242) i fragmenti DNK koji obuhvataju ove regione mogu se dobiti standardnom PCR amplifikacijom. Konstantni region teškog lanca može biti IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ili IgD konstantni region, na primer, IgG1 region. Za gen teškog lanca fragmenta Fab, DNK koja kodira VH može se operativno povezati sa drugim molekulom DNK koji kodira samo CH1 konstantni region teškog lanca.
[0297] Izolovana DNK koja kodira VL region može se pretvoriti u gen pune dužine lakog lanca (kao i gen lakog lanca Fab) operativnim povezivanjem DNK koji kodira VL sa drugim molekulom DNK koji kodira konstantni region lakog lanca, CL. Sekvence gena humanog konstantnog regiona lakog lanca su poznate u oblasti (videti npr., Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Peto Izdanje, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publikacija Br..91-3242) i fragmenti DNK koji obuhvataju ove regione mogu se dobiti standardnom PCR amplifikacijom. Konstantni region lakog lanca može biti kapa ili lambda konstantni region.
[0298] Da bi se stvorio gen scFv, DNK fragmenti koji kodiraju VH- i VL su operativno povezani sa drugim fragmentom koji kodira fleksibilnie linker, npr., kodira aminokiselinsku sekvencu (Gly4- Ser)3, tako da se VH i VL sekvence mogu eksprimovati kao neprekinuti jednolančani protein, sa VL i VH regionima spojenih fleksibilnim linkerom (videti npr., Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554).
[0299] Ovde su takođe dati molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju VH i VL sekvence ili teške i lake lance pune dužine koji su homologni onim od ovde opisanih antitela, npr., 11F11-1, 11F11-2, 4C3-1, 4C3-2, 4C3-3, 4D4, 10D2-1, 10D2-2, 11A6, 24H2, 5F8-1, 5F8-2, 6E11 7A11, CD73.3 i/ili CD73.4 monoklonska antitela. Primeri molekula nukleinske kiseline kodiraju VH i VL sekvence koje su najmanje 70% identične, na primer, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 99% identične, molekulima nukleinske kiseline koji kodiraju VH i VL sekvence ili teške i lake lance pune
1 2
dužine od 11F11-1, 11F11-2, 4C3-1, 4C3-2, 4C3-3, 4D4, 10D2-1, 10D2-2, 11A6, 24H2, 5F8-1, 5F8-2, 6E117A11, CD73.3 i/ili CD73.4 monoklonska antitela, npr., sekvence navedene u Tabeli 35. Na primer, ovde su data antitela protiv CD73 koja sadrže VH lanac i VL lanac koji su kodirani nukleotidnim sekvencama koje su najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identiče sa SEQ ID NO: 139 i SEQ ID NO: 140 ili 141; SEQ ID NO: 237 i SEQ ID NO: 140 ili 141; SEQ ID NO: 142 i SEQ ID NO: 143, 144 ili 145; SEQ ID NO: 146 i SEQ ID NO: 147; SEQ ID NO: 148 i SEQ ID NO:149 ili 150; SEQ ID NO: 151 i SEQ ID NO: 152; SEQ ID NO: 153 i SEQ ID NO: 154; SEQ ID NO: 155 i SEQ ID NO: 156 ili 157 ili 242; SEQ ID NO: 158 i SEQ ID NO: 159; SEQ ID NO: 160 i SEQ ID NO: 161. Takođe su obezbeđena antitela protiv CD73 koja sadrže teški lanac i laki lanac koji su kodirani nukleotidnim sekvencama koje su najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identične sa SEQ ID NOs: 134, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 243, 266 (teški lanac) i SEQ ID NO: 244 ili 245 (laki lanac); SEQ ID NO: 211, 212, 213 ili 246 i SEQ ID NO: 247, 248 ili 249; SEQ ID NO: 235, 236 ili 250 i 251; SEQ ID NO: 252 i SEQ ID NO: 253 ili 254; SEQ ID NO: 255 i SEQ ID NO: 256; SEQ ID NO: 257 i SEQ ID NO: 258; SEQ ID NO: 259 i SEQ ID NO: 260 ili 261; SEQ ID NO: 262 i SEQ ID NO: 263; SEQ ID NO: 264 i SEQ ID NO: 265. Ovde su takođe dati molekuli nukleinske kiseline sa tihim mutacijama (tj., osnovne promene koje ne menjaju rezultirajuću aminokiselinsku sekvencu nakon translacije molekula nukleinske kiseline), npr., za optimizaciju kodona.
XI. Generacija antitela
[0300] Različita antitela predmetnog pronalaska mogu se proizvesti korišćenjem raznih poznatih tehnika, kao što je standardna tehnika hibridizacije somatske ćelije koju su opisali Kohler i Milstein, Nature 256: 495 (1975). Iako su poželjni postupci hibridizacije somatske ćelije, u principu mogu da se koriste i druge tehnike za proizvodnju monoklonskih antitela takođe, npr., virusna ili onkogena transformacija B limfocita, tehnika fagnog displeja korišćenjem biblioteka gena humanih antitela.
[0301] Poželjni sistem životinja za pripremu hibridoma je mišji sistem. Proizvodnja hibridoma u mišu je veoma dobro uspostavljen postupak. Protokoli imunizacije i tehnika za izolaciju imunizovanih splenocita za fuziju su poznati u oblasti. Fuzijski partneri (npr., ćelije mišjeg mijeloma) i postupci fuzije su takođe poznati.
1
[0302] Himerna ili humanizovana antitela koja su opisana ovde mogu se pripremiti na osnovu sekvence mišjeg monoklonskog antitela pripremljenog kao što je gore opisano. DNK koja kodira teški i laki lanac imunoglobulina može da se dobije od mišjih hibridoma koji su od interesa i konstruisani tako da sadrže ne-mišje (npr.,. humane) imunoglobulinske sekvence korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije. Na primer, da bi se stvorilo himerno antitelo, mišji varijabilni regioni mogu biti povezani sa humanim konstantnim regionom korišćenjem postupaka poznatih u oblasti (videti npr., američki patent br.4,816,567 od Cabilly et al.). Da bi se stvorilo humanizovano antitelo, mišji CDR regioni mogu biti ubačeni u humani okvir korišćenjem postupaka poznatih u oblasti (videti npr., američki patent br. 5,225,539 od Winter, i američke patente sa brojevima 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 i 6,180,370 od Queen et al.).
[0303] U jednom tehničkom rešenju, ovde opisana antitela su humana monoklonska antitela. Takva humana monoklonska antitela usmerena protiv CD73 mogu da se generišu korišćenjem transgenih ili transhromozomskih miševa koji nose delove humanog imunog sistema radije nego mišji sistem. Ovi transgeni i transhromozomski miševi uključuju miševe koji se ovde odnose na HuMAb miševe i KM miševe, redom, i ovde se zajedno odnose na "miševe sa humanim Ig."
[0304] HuMAb miš® (Medarex, Inc.) sadrži humane minilokus gene imunoglobulina koji kodiraju neuređene sekvence humanog teškog (µ i γ) i κ lakog lanca imunoglobulina, zajedno sa ciljanim mutacijama koje inaktiviraju endogene lokuse µ i κ lanca (videti npr., Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859). Prema tome, miševi pokazuju smanjenu ekspresiju mišjeg IgM ili κ, a kao odgovor na immunizaciju, uvedeni transgeni humanog teškog i lakog lanca podležu prebacivanju klase i somatskoj mutaciji da bi se stvorio humani monoklonski IgGκ visokog afiniteta (Lonberg, N. et al. (1994), supra; pregledan u Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. i Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, i Harding, F. i Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546). Priprema i upotreba HuMab miševa, i genomske modifikacije koje nose takvi miševi, dalje je opisano u Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J.
12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; i Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851. videti dalje, američke patente sa brojevima 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,8
1 4
74,299; i 5,770,429; svi od Lonberg i Kay; američki patent sa br. 5,545,807 od Surani et al.; PCT objava sa brojevima WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 i WO 99/45962, sve od Lonberg i Kay; i PCT objava br. WO 01/14424 od Korman et al.
[0305] U određenim tehničkim rešenjima, antitela koja su ovde opisana stvaraju se pomoću miša koji nosi humane imunoglobulinske sekvence na transgenima i transhromozomima, kao što je miš koji nosi transgen humanog teškog lanca i transhromozom humanog lakog lanca. Takvi miševi, ovde se odnose na "KM miševe", i detaljno su opisani u PCT objavi WO 02/43478 od Ishida et al.
[0306] Još dalje, alternativni transgeni životinjski sistemi koji eksprimiraju humane imunoglobulinske gene dostupni su u oblasti i mogu se koristiti za stvaranje antitela protiv CD73 opisanih ovde. Na primer, može se koristiti alternativni transgeni sistem koji se odnosi na Ksenomiša (Abgenix, Inc.); takvi miševi su opisani u, na primer, američkim patentima sa brojevima 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6, 150,584 i 6,162,963 od Kucherlapati et al.
[0307] Pored toga, alternativni transhromozomski životinjski sistemi koji eksprimiraju humane imunoglobulinske gene su dostupni u oblasti i mogu se koristiti za podizanje antitela protiv CD73 opisanih ovde. Na primer, mogu se koristiti miševi koji nose i transhromozom humanog teškog lanca i transhromozom humanog lakog lanca, koji su označeni kao "TC miševi"; takvi miševi su opisani u Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727. Dalje, krave koje nose transhromozome humanog teškog i lakog lanca opisane su u oblasti (Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894) i mogu se koristiti za podizanje antitela protiv CD73 opisanih ovde.
[0308] Dodatni mišji sistemi opisani u oblasti za podizanje humanih antitela, npr., human antitela protiv CD73, uključuju (u) VelocImmune® miša (Regeneron Pharmaceuticals, Inc.), u kome su zamenjeni endogeni varijabilni regioni teškog i lakog lanca miša, putem homologe rekombinacije, sa humanim varijabilnim regionima teškog i lakog lanca, operativno povezanim sa endogenim konstantnim regionima miša, tako da se himerna antitela (humani V/mišji C) podižu u miševima, a zatim se naknadno pretvaraju u potpuno humana antitela koristeći standardne rekombinantne DNK tehnike; i (ii) MeMo® miš (Merus Biopharmaceuticals, Inc.), u kome miš sadrži neuređene humane promenljive regione teškog lanca ali i jedan preuređeni humani region lakog lanca. Takvi miševi, i njihova upotreba za podizanje antitela, opisani su u, na primer, WO 2009/15777, US 2010/0069614, WO 2011/072204, WO 2011/097603, WO 2011/163311, WO 2011/163314, WO 2012/148873, US 2012/0070861 i US 2012/0073004.
1
[0309] Ovde opisana humana monoklonska antitela mogu se takođe pripremiti korišćenjem metoda fagnog prikaza za skrining biblioteka humanih imunoglobulinskih gena. Takve metode fagnog displeja za izolovanje humanog antitela su uspostavljene u oblasti. Videti na primer: američke patente sa brojevima 5,223,409; 5,403,484; i 5,571,698 od Ladner et al.; američke patente sa brojevima 5,427,908 i 5,580,717 od Dower et al.; američke patente sa brojevima 5,969,108 i 6,172,197 od McCafferty et al.; i američke patente sa brojevima 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 i 6,593,081 od Griffiths et al.
[0310] Ovde opisana humana monoklonska antitela mogu se takođe pripremiti korišćenjem SCID miševa u kojima su rekonstruisane humane imune ćelije tako da nakon imunizacije može da se stvori odgovor humanog antitela. Takvi miševi su opisani u, na primer, američke patente sa brojevima 5,476,996 i 5,698,767 od Wilson et al.
Imunizacije
[0311] Da bi se generisala potpuno humana antitela na CD73, transgeni ili transhromozomski miševi koji sadrže humane imunoglobulinske gene (npr., HCol2, HCo7 ili KM miševi) mogu se imunizovati prečišćenim ili obogaćenim preparatom antigena za CD73 i/ili ćelijama koje eksprimiraju CD73, kao što je opisano za druge antigene, na primer, kod Lonberg et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 i WO 98/24884. Alternativno, miševi se mogu imunizovati sa DNK koja kodira humani CD73. Poželjno, miševi će u prvoj infuziji biti uzrasta 6-16 nedelja. Na primer, prečišćeni ili obogaćeni preparat (5-50 µg) rekombinantnog CD73 antigena može se koristiti za imunizaciju HuMAb miševa intraperitonealno. U slučaju da imunizacije pomoću prečišćenog ili obogaćenog preparata CD73 antigena ne rezultiraju antitelima, miševi se takođe mogu imunizovati sa ćelijama koje eksprimiraju CD73, npr., ćelijskom linijom koja promoviše imune odgovore. Primeri ćelijskih linija uključuju stabilne CHO i Raji ćelijske linije koje prekomerno eksprimiraju CD73.
[0312] Kumulativno iskustvo sa različitim antigenima pokazalo je da transgeni miševi HuMAb najbolje reaguju kada su u početku imunizovani intraperitonealno (IP) ili subkutano (SC) sa antigenom u Ribijevom ađuvansu, praćeno IP/SC imunizacijama svake druge nedelje (do ukupno 10) sa antigenom u Ribijevom ađuvansu. Imuni odgovor se može pratiti tokom protokola imunizacije sa uzorcima plazme dobijenim retroorbitalnim krvarenjem. Plazma se može proveriti ELISA testom i FACS-om (kao što je opisano ispod), a miševi sa dovoljnim titrima humanog imunoglobulina protiv CD73 mogu da se koriste za fuzije. Miševi se
1
intravenski mogu pojačati sa antigenom 3 dana pre žrtvovanja i ukloni im se slezina i limfni čvorovi. Očekuje se da će biti potrebno obaviti 2-3 fuzije za svaku imunizaciju. Između 6 i 24 miševa su obično imunizovana za svaki antigen. Obično se koriste sojevi HCo7, HCo12, i KM. Pored toga, i HCo7 i HCo12 transgeni se mogu uzgajati zajedno u jednom mišu koji ima dva različita humana transgena (HCo7/HCo12) teškog lanca.
Stvaranje hibridoma koji proizvode monoklonska antitela na CD73
[0313] Da bi se generisali hibridomi koji proizvode humana monoklonska antitela opisana ovde, splenociti i/ili ćelije limfnog čvora od imunizovanih miševa mogu se izolovati i spojiti u odgovarajuću imortalizovanu ćelijsku liniju, kao što je ćelijska linija mišjeg mijeloma. Dobijeni hibridomi mogu se proveriti na proizvodnju antitela specifičnih za antigen. Na primer, jednoćelijske suspenzije limfocita slezine iz imunizovanih miševa mogu se spojiti sa Sp2/0 nesekretornim ćelijama mišjeg mijeloma (ATCC, CRL 1581) sa 50% PEG. Ćelije su postavljene pri približno 2 x 10<5>u mikrotitar ploči sa ravnim dnom, nakon čega je usledila dvonedeljna inkubacija u selektivnom medijumu koji sadrži 10% fetalnog klon seruma, 18% "653" kondicioniranog medijuma, 5% origena (IGEN), 4 mM L-glutamina, 1 mM natrijum piruvata, 5mM HEPES-a, 0.055 mM 2-merkaptoetanola, 50 jedinica/ml penicilina, 50 mg/ml streptomicina, 50 mg/ml gentamicina i IX HAT (Sigma). Nakon otprilike dve nedelje, ćelije mogu da se uzgajaju u medijumu u kome je HAT zamenjen sa HT. Pojedinačni bunari mogu zatim da se provere ELISA-om na humana monoklonska IgM i IgG antitela. Jednom kada se pojavi opsežni rast hibridoma, srednja vrednost može da se opazi obično nakon 10-14 dana. Hibridomi koje izlučuje antitelo mogu da se zamene, ponovo pregledaju, i ako su i dalje pozitivni na humani IgG, monoklonska antitela mogu biti subklonirana najmanje dva puta ograničavanjem razblaženja. Stabilni subkloni mogu zatim da se uzgajaju in vitro da bi se generisale male količine antitela u medijumu kulture tkiva za karakterizaciju.
[0314] Za prečišćavanje humanih monoklonskih antitela, izabrani hibridomi mogu da se uzgajaju u dvolitarskim spiner-bocama (bocama za centrifugu) za prečišćavanje monoklonskog antitela. Supernatanti mogu da se filtriraju i koncentruju pre afinitetne hromatografije sa protein A-sefarozom (Pharmacia, Piscataway, N.J.). Eluirani IgG može da se proveri gel elektroforezom i tečnom hromatografijom visokih performansi da bi se osigurala čistoća. Puferni rastvor može da se zameni PBS-om, i koncentracija može da se odredi sa OD280 korišćenjem 1.43 koeficijenta ekstinkcije. Monoklonska antitela mogu da se alikvotiraju i čuvaju na -80° C.
1
XII. Proizvodnja antitela
Stvaranje transfektoma koji proizvode monoklonska antitela na CD73
[0315] Antitela ovog predmetnog pronalaska mogu da se proizvedu u transfektomu ćelije domaćina korišćenjem, na primer, kombinacije tehnika rekombinantne DNK i metoda genske transfekcije kao što je dobro poznato u oblasti (Morrison, S. (1985) Science 229:1202).
[0316] Na primer, za eksprimiranje antitela, ili njihovih fragmenata antitela, DNK koje kodiraju delove ili punu dužinu lakih i teških lanaca, mogu da se dobiju standardnim tehnikama molekularne biologije (npr., PCR amplifikacijom ili kloniranjem cDNK korišćenjem hibridoma koje eksprimira antitelo od interesa) i DNK mogu da se umetnu u vektore ekspresije tako da su geni operativno povezani sa transkripcijskim i translacijskim kontrolnim sekvencama. U tom kontekstu, izraz "operativno povezan" treba da znači da je gen antitela vezan u vektor tako da transkripcione i translacione kontrolne sekvence unutar vektora služe svojoj predviđenoj funkciji regulisanja transkripcije i translacije gena antitela. Vektor ekspresije i kontrolne sekvence ekspresije su izabrani da budu kompatibilni sa korišćenom ćelijom domaćina ekspresije. Gen lakog lanca antitela i gen teškog lanca antitela mogu biti ubačeni u odvojeni vektor ili su oba gena ubačena u isti ekspresijski vektor. Geni antitela se ubacuju u vektor(e) ekspresije standardnim metodama (npr., ligacijom komplementarnih restrikcionih mesta na genskom fragmentu antitela i vektoru, ili ligacijom tupih krajeva ako nisu prisutna mesta restrikcije). Varijabilni regioni lakog i teškog lanca antitela opisanih ovde mogu se koristiti za stvaranje pune dužine gena antitela bilo kojeg izotipa antitela umetanjem njih u ekspresione vektore koji već kodiraju konstantne regione teškog i lakog lanca željenog izotipa tako da je VHsegment operativno povezan sa CHsegmentom(tima) unutar vektora i VLsegment je operativno povezan sa CLsegmentom unutar vektora. Dodatno ili alternativno, rekombinantni ekspresijski vektor može da kodira signalni peptid koji olakšava sekreciju lanca antitela iz ćelije domaćina. Geni lanca antitela mogu biti klonirani u vektoru tako da je signalni peptid u okviru povezan sa amino krajem lakog lanca antitela. Signalni peptid može biti imunoglobulinski signalni peptid ili heterologni signalni peptid (tj., signalni peptid iz proteina koji nije imunoglobulin).
[0317] Pored gena lanca antitela, rekombinantni vektori ekspresije mogu da nose regulatorne sekvence koje kontrolišu ekspresiju gena lanca antitela u ćeliji domaćina. Izraz "regulatorna sekvenca" obuhvata promotore, pojačivače i druge elemente za kontrolu ekspresije (npr., signali poliadenilacije) koji kontrolišu transkripciju ili translaciju gena lanca antitela. Takve
1
regulatorne sekvence su opisane, na primer, u Goeddel (Gene Ekspresija Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). Stručnjaci u oblasti će razumeti da dizajn vektora ekspresije, uključujući izbor regulatornnih sekvenci, može da zavisi od takvih faktora kao što je izbor ćelije domaćina koja će se transformisati, željenog nivoa ekspresije proteina itd.. Poželjne regulatorne sekvence za ekspresiju ćelija domaćina-sisara uključuju virusne elemente koji usmeravaju visoke nivoe ekspresije proteina u ćelijama sisara, kao što su promotori i/ili pojačivači izvedeni iz citomegalovirusa (CMV), Simian Virusa 40 (SV40), adenovirusa, (npr., glavnog kasnog promotora adenovirusa (AdMLP) i polioma). Alternativno, mogu se koristiti regulatorne sekvence koje nisu virusne, kao što je ubikvitin promotor ili βglobin promotor. Još dalje, regulatorni elementi sastavljeni od sekvenci iz različitih izvora, kao što je sistem SRα promotora, koji sadrži sekvence ranog SV40 promotora i dugo terminalno ponavljanje virusa leukemije humane T ćelije, tipa 1 (Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Ćelija. Biol.
8:466-472).
[0318] Pored gena lanca antitela i regulatornih sekvenci, rekombinantni vektori ekspresije mogu da nose dodatne sekvence, kao što su sekvence koje regulišu replikaciju vektora u ćelijama domaćina (npr., poreklo replikacije) i selektivne marker gene. Selektivni marker geni olakšavaju selekciju ćelija domaćina u koje je vektor uveden (videti, npr., američke patente sa brojevima 4,399,216, 4,634,665 i 5,179,017, sve od Axel et al.). Na primer, obično selektivni marker geni daju otpornost na lekove, kao što je G418, higromicin ili metotreksat, na ćeliji domaćina u koju je vektor uveden. Poželjni selektivni marker geni uključuju gen dihidrofolat reduktaze (DHFR) (za upotrebu u dhfr- ćelijama domaćina sa metotreksat selekcijom/pojačavanjem) i neo gen (za selekciju G418).
[0319] Za ekspresiju lakih i teških lanaca, ekspresijski vektor(i) koji kodira teške i lake lance se standardnim tehnikama transfektuje u ćeliju domaćina. Različiti oblici izraza "transfekcija" treba da obuhvate širok spektar tehnika koje se obično koriste za unošenje egzogene DNK u prokariotsku ili eukariotsku ćeliju domaćina, npr., elektroporacijom, taloženjem kalcijum fosfatom, DEAE-dekstran transfekcijom i slično. Iako je teorijski moguće eksprimirati antitela ovde opisana ili u prokariotskim ili eukariotskim ćelijama domaćina, ekspresija antitela u eukariotskim ćelijama, najpoželjnije ćelijama domaćina sisara, je najpoželjnija jer su takve eukariotske ćelije, a naročito ćelije sisara, češće od prokariotskih ćelija sposobne da sakupe i izdvoje pravilno savijeno i imunološki aktivno antitelo. Prijavljeno je da je prokariotska ekspresija gena antitela neefikasna za proizvodnju visokih prinosa aktivnog antitela (Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13). Antitela ovog predmetnog pronalaska
1
se takođe mogu proizvesti u glikokonstruisanim sojevima kvasca Pichia pastoris. Li et al. (2006) Nat. Biotechnol.24:210.
[0320] Poželjne ćelije domaćina sisara za ekspresiju rekombinantnih antitela ovde opisanih uključuju jajnik kineskog hrčka (CHO ćelije) (uključujući dhfr- CHO ćelije, opisane u Urlaub i Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, koristi se sa DHFR selektivnim markerom, npr., kao što je opisano u R. J. Kaufman i P. A. Sharp (1982) Mol. Biol.159:601-621), NSO ćelijama mijeloma, COS ćelijama i SP2 ćelijama. Naročito, za upotrebu sa NSO ćelijama mijeloma, drugi poželjni sistem ekspresije je sistem ekspresije GS gena stavljen na uvid javnosti u WO 87/04462, WO 89/01036 i EP 338,841. Kada se rekombinantni vektori ekspresije koji kodiraju gene antitela uvode u ćelije domaćina sisara, antitela se proizvode kultivacijom ćelija domaćina kroz vremenski period dovoljan da omogući ekspresiju antitela u ćelijama domaćina ili, poželjnije, sekrecijom antitela u medijum za kulturu u kojem rastu ćelije domaćina. Antitela se mogu obnoviti iz kulture medijuma korišćenjem standardnih metoda prečišćavanja proteina.
[0321] N- i C-krajevi polipeptidnih lanaca antitela ovog predmetnog pronalaska mogu se razlikovati od očekivane sekvence zbog često posmatranih post-translacionih modifikacija. Na primer, ostaci lizina na C-kraju često nedostaju iz teških lanaca antitela. Dick et al. (2008) Biotechnol. Bioeng. 100:1132. Ostaci glutamina na N-kraju, i u manjoj meri ostaci glutamata, često se pretvaraju u ostatke piroglutamata i na lakim i na teškim lanacima terapijskih antitela. Dick et al. (2007) Biotechnol. Bioeng.97:544; Liu et al. (2011) JBC 28611211; Liu et al. (2011) J. Biol. Chem.286:11211.
XIII. Eseji
[0322] Ovde opisana antitela mogu se testirati na vezivanje za CD73, na primer, standardnom ELISA. Ukratko, mikrotitarske ploče su obložene sa prečišćenim CD73 sa 1-2 µg/ml u PBS-u, a zatim blokirane sa 5% goveđim serum albuminom u PBS-u. Razblaženja antitela (npr., razblaženja plazme od miševa imunizovanih sa CD73) se dodaju u svaki bunar i inkubiraju tokom 1-2 sata na 37°C. Ploče se isperu sa PBS/Tween i zatim se inkubiraju sa sekundarnim reagensom (npr., za humana antitela, kozji-anti-humani IgG Fc-specifični poliklonski reagens) konjugovani za ren peroksidazom (HRP) tokom 1 sata na 37°C. Nakon ispiranja, ploče su razvijene sa ABTS supstratom (Moss Inc, produkt: ABTS-1000) i analizirane spektrofotometrom na OD 415-495. Serumi iz imunizovanih miševa su zatim dalje provereni
11
protočnom citometrijom na vezivanje za ćelijsku liniju koja eksprimira humani CD73, ali ne i na kontrolnu ćelijsku liniju koja ne eksprimira CD73. Ukratko, vezivanje antitela protiv CD73 se procenjuje inkubiranjem CHO ćelija koje eksprimiraju CD73 sa antitelom protiv CD73 pri razblaženju 1:20. Ćelije su isprane i vezivanje se detektuje sa PE-obeleženim anti-humanim IgG Ab. Protočna citometrijska analiza se izvodi korišćenjem FACS-a protočne citometrije (Bekton Dickinson, San Jose, CA). Poželjno je da se za fuzije koriste miševi koji razvijaju najviše titra.
[0323] ELISA test kao što je opisano gore može se koristiti za proveru antitela i, prema tome, hibridoma koji proizvode antitela koja pokazuju pozitivnu reaktivnost sa imunogenom CD73. Hibridomi koji proizvode antitela koja se vezuju, poželjno sa visokim afinitetom, na CD73 mogu se zatim subklonirati i dalje okarakterisati. Po jedan klon iz svakog hibridoma, koji zadržava reaktivnost roditeljskih ćelija (ELISA), može biti izabran za pravljenje ćelijske banke, i za prečišćavanje antitela.
[0324] Da bi se prečistila antitela protiv CD73, izabrani hibridomi mogu da rastu u dvolitarskim spiner bocama (za centrifugu) za prečišćavanje monoklonskog antitela. Supernatanti se mogu filtrirati i koncentrovati pre afinitetne hromatografije sa protein A-sefarozom (Pharmacia, Piscataway, NJ). Eluirani IgG može da se proveri gel elektroforezom i tečnom hromatografijom visokih performansi da bi se osigurala čistoća. Puferski rastvor može da se zameni PBS-om, i koncentracija može da se odredi OD280korišćenjem 1.43 koeficijenta ekstinkcije. Monoklonska antitela mogu biti alikvotirana i čuvana na -80 °C.
[0325] Da bi se utvrdilo da li se izabrana monoklonska antitela protiv CD73 vežu za jedinstvene epitope, svako antitelo se može biotinilirati koristeći komercijalno dostupne reagense (Pierce, Rockford, IL). Vezivanje biotiniliranog mAb može se otkriti sa streptavidin obeleženom sondom. Kompetitivne studije upotrebom neobeleženih monoklonskih antitela i biotinilirana monoklonska antitela mogu se izvesti pomoću CD73 premazanih ELISA ploča kao što je opisano gore.
[0326] Da bi se odredio izotip prečišćenih antitela, izotip ELISA-e mogu se izvesti pomoću reagenasa specifičnih za antitela određenog izotipa. Na primer, da bi se odredio izotip humanog monoklonskog antitela, bunari mikrotitarskih ploča mogu biti obloženi sa 1 µg/ml antihumanog imunoglobulina preko noći na 4° C. Nakon blokiranja sa 1% BSA, ploče reaguju sa 1µg /ml ili manje od testiranih monoklonskih antitela ili prečišćenih kontrola izotipa, na sobnoj temperaturi tokom jednog do dva sata. Bunari mogu zatim da reaguju ili sa humanim IgG1 ili sa humanim IgM-specifičnim probama konjugovanim alkalnom fosfatazom. Ploče su razvijene i analizirane kako je opisano gore.
[0327] Za testiranje vezivanja monoklonskih antitela na žive ćelije koje eksprimiraju CD73, može se koristiti protočna citometrija, kao što je opisano u Primerima. Ukratko, ćelijske linije koje eksprimiraju membranski-vezan CD73 (uzgajan u standardnim uslovima rasta) pomešaju se sa različitim koncentracijama monoklonskog antitela u PBS-u koji sadrži 0.1% BSA na 4°C tokom 1 sata. Nakon ispiranja, ćelije reaguju sa sa Fluorescein-obeleženim anti- IgG antitelom pod istim uslovima kao i bojenje primarnog antitela. Uzorci se mogu analizirati FACScan instrumentom korišćenjem svojstava svetlosnog i bočnog raspršivanja za prelazak na pojedine ćelije i određeno je vezivanje obeleženih antitela. Alternativni test pomoću fluorescentne mikroskopije može da se koristi (dodatno ili umesto) testa protočne citometrije. Ćelije mogu da se oboje tačno kako je gore opisano i pregledaju fluorescentnom mikroskopijom. Ova metoda omogućava vizuelizaciju pojedinih ćelija, ali može da ima smanjenu osetljivost u zavisnosti od gustine antigena.
[0328] Antitela protiv CD73 mogu se dalje testirati na reaktivnost sa CD73 antigenom Western blotting-om. Ukratko, ćelijski ekstrakti iz ćelija koje eksprimiraju CD73 mogu se pripremiti i podvrgnuti natrijum dodecil sulfat poliakrilamidni gel elektroforezi. Nakon elektroforeze, razdvojeni antigeni će biti preneti na nitrocelulozne membrane, blokirani sa 20% mišjeg seruma, i ispitivani sa monoklonskim antitelima koje treba testirati. Vezivanje IgG može da se otkrije upotrebom anti-IgG alkalne fosfataze i razvije sa BCIP/NBT supstratnim tabletama (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO).
[0329] Metode za analizu afiniteta vezivanja, unakrsna-reaktivnost, i kinetike vezivanja različitih antitela protiv CD73 uključuju standardne testove poznate u oblasti, na primer, BIACORE® analizu površinske plazmonske rezonancije (SPR) korišćenjem BIACORE® 2000 SPR instrumenta (Biacore AB, Uppsala, Švedska).
XIV. Imunokonjugati i derivati antitela
[0330] Ovde opisana antitela mogu se koristiti u dijagnostičke svrhe, uključujući testiranje uzorka i in vivo snimanje, i u tu svrhu antitelo (ili njegov fragment vezivanja) može biti konjugovano sa odgovarajućim detektujućim agensom, da bi se stvorio imunokonjugat. Za dijagnostičke svrhe, odgovarajući agensi su detektujući obeleživači koji uključuju radioizotope, za snimanje celog tela, i radioizotope, enzime, fluorescentne obeleživače i druge pogodne oznake antitela za ispitivanje uzorka.
[0331] Obeleživači koji se mogu otkriti mogu biti bilo koji od različitih vrsta koje se trenutno koriste u oblasti in vitro dijagnostike, uključujući obeležene čestice, uključujući metalne solove kao što je kolidno zlato, izotope kao što je I<125>ili Tc<99>predstavljene na primer sa peptidnim helatorskim agensom N2S2, N3S ili N4tipa, hromofore koje uključuju fluorescentne markere, biotin, luminescentne markere, fosforescentne markere i slično, kao i oznake enzima koji pretvaraju dati supstrat u detektabilni marker, i polinukleotidne oznake koje su otkrivene nakon amplifikacije kao što je lančana reakcija polimerazom. Biotinilirano antitelo bi se tada otkrilo vezivanjem avidina ili streptavidina. Pogodne oznake enzima uključuju peroksidazu rena, alkalnu fosfatazu i slično. Na primer, oznaka može biti enzim alkalna fosfataza, detektovana merenjem prisustva ili formiranja hemiluminescencije posle konverzije 1,2 dioksetanskih substrata kao što su adamantil metoksi fosforiloksi fenil dioksetan (AMPPD), dinatrijum 3-(4-(metoksispiro{1,2-dioksetan-3,2'-(5'-hloro)triciklo{3.3.1.1 3,7}dekan}-4-il) fenil fosfat (CSPD), kao i CDP i CDP-star® ili drugi luminescentni supstrati dobro poznati stručnjacima u oblasti, na primer helati pogodnih lantanida kao što je Terbijum(III) i Europijum(III). Detektibilna sredstva određuju se izabranim obeleživačem. Prisustvo obeleživača ili njegovih reakcionih proizvoda može da se uoči golim okom, u slučaju kada je obeleživač čestica koja se nakuplja na odgovarajućim nivoima, ili korišćenjem instrumenata kao što su spektrofotometar, luminometar, fluorimetar, i slično, sve u skladu sa standardnom praksom.
[0332] Poželjno, metode konjugacije rezultiraju vezama koje su suštinski (ili blizu) neimunogene, npr., peptidne- (tj.amidne-), sulfidne-, (sterično ometene), disulfidne-, hidrazonske-, i etarske veze. Ove veze su gotovo neimunogene i pokazuju razumnu stabilnost u serumu (videti npr. Senter, P. D., Curr. Opin. Chem. Biol. 13 (2009) 235-244; WO 2009/059278; WO 95/17886).
[0333] U zavisnosti od biohemijske prirode grupe i antitela, mogu da se koriste različite strategije konjugacije. U slučaju da je deo prirodnog ili rekombinantnog polipeptida između 50 do 500 amino kiselina, u udžbenicima su opisane standardne procedure koje opisuju hemiju za sintezu proteinskih konjugata, koju stručnjak u oblasti može lako da prati (videti npr. Hackenberger, C. P. R., i Schwarzer, D., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 47 (2008) 10030-10074). U jednom tehničkom rešenju se koristi reakcija maleinimido grupe sa cisteinskim ostatkom unutar antitela ili grupe. Ovo je posebno pogodna hemija spajanja u slučaju npr. Fab ili Fab'-fragmenta antitela koje se koristi. Alternativno u jednom tehničkom rešenju izvršeno je spajanje na C-terminalnom kraju antitela ili grupe. C-terminalna modifikacija proteina, npr. Fab-fragmenta može se izvesti kako je opisano (Sunbul, M. and Yin, J., Org. Biomol. Chem.7 (2009) 3361-3371).
[0334] Generalno, mesto specifična reakcija i kovalentno spajanje temelji se na pretvaranju prirodne aminokiseline u aminokiselinu sa reaktivnošću koja je ortogonalna reaktivnosti ostalih
11
prisutnih funkcionalnih grupa. Na primer, specifični cistein u okviru konteksta retke sekvence može se enzimski pretvoriti u aldehid (videti Frese, M. A., i Dierks, T., ChemBioChem. 10 (2009) 425-427). Takođe je moguće dobiti željenu modifikaciju aminokiseline korišćenjem specifične enzimske reaktivnosti određenih enzima sa prirodnom aminokiselinom u datom kontekstu sekvence (videti, npr., Taki, M. et al., Prot. Eng. Des. Sel. 17 (2004) 119-126; Gautier, A. et al. Chem. Biol.15 (2008) 128-136. Proteazom katalizovano formiranje C--N veza opisano je u od Bordusa, F., Highlights in Bioorganic Chemistry (2004) 389-403.
[0335] Reakcija specifična za mesto i kovalentno spajanje takođe se može postići selektivnom reakcijom terminalnih aminokiselina sa odgovarajućim modifikujućim reagensima. Reaktivnost N-terminalnog cisteina sa benzonitrilima (videti Ren, H. et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48 (2009) 9658-9662) može da se koristi za postizanje kovalentnog spajanja specifičnog za mesto. Prirodna hemijska ligacija se takođe može osloniti na C-terminalne cisteinske ostatke (Taylor, E. Vogel; Imperiali, B, Nucleic Acids and Molecular Biology (2009), 22 (Protein Engineering), 65-96). EP 1 074 563 opisuje metod konjugacije koji se zasniva na bržoj reakciji cisteina unutar negativno naelektrisanih aminokiselina od cisteina koji se nalazi u delu pozitivno naelektrisanih aminokiselina.
[0336] Grupa takođe može da bude sintetički peptid ili mimički peptid. U slučaju da je polipeptid hemijski sntetisan, aminokiseline sa ortogonalnom hemijskom reaktivnošću mogu biti ugrađene tokom takve sinteze (videti npr. de Graaf, A. J. et al., Bioconjug. Chem.20 (2009) 1281-1295). Pošto je u pitanju velika raznolikost ortogonalnih funkcionalnih grupa i one se mogu uvesti u sintetički peptid, konjugacija takvog peptida za linker je standardna hemija.
[0337] Da bi se dobio konjugat mono-obeleženog polipeptida sa stehiometrijom 1:1 može hromatografijom da se odvoji od drugih sporednih produkata konjugacije. Ovaj postupak može da se olakša upotrebom bojom obeleženog člana para vezivanja i naelektrisanog linkera. Korišćenjem ove vrste obeleženog i visoko negativno naelektrisanog člana para vezivanja, monokonjugovani polipeptidi se lako odvajaju od neobeleženih polipeptida i polipeptida koji nose više od jednog linkera, jer se za razdvajanje mogu koristiti razlike u naboju i molekulskoj težini. Fluorescentna boja može da bude korisna za prečišćavanje kompleksa od nevezanih komponenti, poput obeleženog jednovalentnog vezivnog sredstva.
[0338] U jednom tehničkom rešenju grupa vezana za antitelo protiv CD73 je izabrana od grupe koja se sastoji od vezujućeg dela, obeležavajućeg dela, i biološki aktivnog dela.
[0339] Antitela opisana ovde mogu takođe biti konjugovana sa terapijskim agensom da bi se formirao imunokonjugat kao što je konjugat antitelo-lek (ADC). Pogodni terapijski agensi uključuju antimetabolite, alkilirajuće agense, vezivna sredstva za mali žleb DNK, interkalatore DNK, umreživače DNK, inhibitore histon deacetilaze, inhibitore nuklearnog izvoza, inhibitore proteazoma, inhibitore topoizomeraze I ili II, inhibitore proteina toplotnog udara, inhibitore tirozin kinaze, antibiotike, i anti-mitotičke agense. U ADC, antitelo i terapijski agens poželjno su konjugovani preko linkera koji se može odcepiti kao što je peptidil, disulfid, ili hidrazonski linker. Poželjnije, linker je peptidil linker kao što su Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Pro-Val-Gly-Val-Val (SEQ ID BR: 219), Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Cit-Cit, Val-Lys, Lys, Cit, Ser, ili Glu. ADC-ovi se mogu pripremiti kao što je opisano u američkim patentima sa brojevima 7,087,600; 6,989,452; i 7,129,261; PCT objavi WO 02/096910; WO 07/038658; WO 07/051081; WO 07/059404; WO 08/083312; i WO 08/103693; američkim patentnim objavama 20060024317; 20060004081; i 20060247295. Druge upotrebe za antitela protiv CD73, npr., kao monoterapija, ovde su date na drugom mestu, npr., u odeljku koji se odnosi na kombinovane tretmane.
[0340] Tačnije, u ADC-u, antitelo se konjuguje sa lekom, pri čemu antitelo deluje kao ciljni agens za usmeravanje ADC-a u ciljnu ćeliju koja eksprimira njegov antigen, kao što je ćelija kancera. Poželjno, antigen je antigen povezan sa tumorom, tj., onaj koji je jedinstveno eksprimiran ili prekomerno eksprimiran od ćelija kancera. Nekada, lek se oslobađa, bilo unutar ciljne ćelije bilo u njenoj blizini, da deluje kao terapijski agens. Za pregled mehanizama delovanja i upotrebe ADC-ova u terapija kancera, videti Schrama et al., Nature Rev. Drug Disc.
2006, 5, 147.
[0341] Za lečenje kancera, lek je poželjno citotoksični lek koji izaziva smrt ciljane ćelije kancera. Citotoksični lekovi koji se mogu koristiti u ADC-ima uključuju sledeće vrste jedinjenja i njihove analoge i derivate:
(a) enedieni kao što je kaliheamicin (videti, npr., Lee et al., J. Am. Chem. Soc.1987, 109, 3464 i 3466) i uncialamicin (videti, npr., Davies et al., WO 2007/038868 A2 (2007) i Chowdari et al., US 8,709,431 B2 (2012));
(b) tubulizini (videti, npr., Domling et al., US 7,778,814 B2 (2010); Cheng et al., US 8,394,922 B2 (2013); i Cong et al., US 2014/0227295 A1;
(c) CC-1065 i duokarmicin (videti, npr., Boger, US 6,5458,530 B1 (2003); Sufi et al., US 8,461,117 B2 (2013); i Zhang et al., US 2012/0301490 A1 (2012));
(d) epotiloni (videti, npr., Vite et al., US 2007/0275904 A1 (2007) i US RE42930 E (2011));
(e) auristatini (videti, npr., Senter et al., US 6,844,869 B2 (2005) i Doronina et al., US 7,498,298 B2 (2009));
11
(f) pirolobezodiazepin (PBD) dimeri (videti, npr., Howard et al., US 2013/0059800 A1(2013); US 2013/0028919 A1 (2013); i WO 2013/041606 A1 (2013)); i
(g) maitansinoidi kao što su DM1 i DM4 (videti, npr., Chari et al., US 5,208,020 (1993) i Amphlett et al., US 7,374,762 B2 (2008)).
XV. Bispecifični molekuli
[0342] Ovde opisana antitela mogu se koristiti za formiranje bispecifičnih molekula. Antitelo protiv CD73, ili njegovi delovi koji vezuju antigen, mogu se derivatizovati ili povezati sa drugim funkcionalnim molekulom, npr., drugim peptidom ili proteinom (npr., drugim antitelom ili ligandom za receptor) da bi se stvorio bispecifični molekul koji se veže za bar dva različita mesta vezivanja ili ciljna molekula. Antitelo opisano ovde u stvari može biti derivatizovano ili povezano sa više od jednog funkcionalnog molekula da bi se stvorili multispecifični molekuli koji se vezuju za više od dva različita mesta vezivanja i/ili ciljna molekula; takvi multispecifični molekuli takođe su obuhvaćeni terminom "bispecifični molekul" kako se ovde koristi. Da bi se stvorio ovde opisani bispecifični molekul, antitelo opisano ovde može biti funkcionalno povezano (npr., hemijskim spajanjem, genetskom fuzijom, nekovalentnom asocijacijom ili na neki drugi način) sa jednim ili više drugih vezujućih molekula, kao što su drugo antitelo, fragment antitela, peptid ili mimetičko vezivanje, tako da nastaje bispecifični molekul.
[0343] Prema tome, ovde su dati bispecifični molekuli koji sadrže najmanje jednu prvu specifičnost vezivanja za CD73 i drugu specifičnost vezivanja za drugi ciljani epitop. U ovde opisanom tehničkom rešenju u kome je bispecifični molekul multispecifičan, molekul može dalje da uključi i treću specifičnost vezivanja.
[0344] U jednom tehničkom rešenju, ovde opisani bispecifični molekuli sadrže kao specifičnost vezivanja najmanje jedno antitelo, ili njegov fragment antitela, uključujući, npr., Fab, Fab', F(ab')2, Fv, ili pojedinačni lanac Fv. Antitelo takođe može da bude dimer lakog lanca ili teškog lanca, ili bilo koji njegov minimalni fragment kao što je Fv ili jednolančani konstrukt kao što je opisano u Ladner et al. američkom patentu br.4,946,778.
[0345] Vezivanje bispecifičnih molekula na njihove specifične mete može da se potvrdi korišćenjem priznatih metoda u oblasti, kao što je enzim-povezan imunosorbentni test (ELISA), radioimunotest (RIA), FACS analiza, biotest (npr., inhibicija rasta), ili Western Blot test. Svaki od ovih testova generalno detektuje prisustvo kompleksa protein-antitelo od posebnog interesa, korišćenjem obeleženih reagenasa (npr., antitelo) specifičnih za kompleks od interesa.
11
XVI. Kompozicije
[0346] Dalje su obezbeđene kompozicije, npr., farmaceutske kompozicije, koje sadrže jedno ili kombinaciju antitela protiv CD73, ili njihovog dela (delova) koji veže antigen, opisane ovde, formulisane zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. Takve kompozicije mogu da uključe jedno ili kombinaciju (npr., dva ili više različitih) antitela, ili imunokonjugate ili bispecifične molekule opisane ovde. Na primer, farmaceutska kompozicija opisana ovde može da sadrži kombinaciju antitela (ili imunokonjugata ili bispecifika) koja se vezuju za različite epitope na ciljnom antigenu ili koja imaju komplementarne aktivnosti. Kompozicije predmetnog pronalaska sadrže antitelo predmetnog pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0347] U određenim tehničkim rešenjima, kompozicija sadrži antitelo protiv CD73 u koncentraciji od najmanje 1 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 50 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml, 1-300 mg/ml, ili 100-300 mg/ml.
[0348] Ovde opisane farmaceutske kompozicije takođe mogu biti administrirane u kombinovanoj terapiji, tj., u kombinaciji sa drugim agensima. Na primer, kombinovana terapija može da sadrži antitelo protiv CD73 opisano ovde kombinovano sa najmanje jednim drugim agensom protiv kancera i/ili za stimuliranje T-ćelija (npr., aktiviranje). Primeri terapijskih agenasa koji mogu da se koriste u kombinovanoj terapiji su detaljnije opisani dole u odeljku o upotrebi ovde opisanih antitela.
[0349] U nekim tehničkim rešenjima, terapijske kompozicije ovde stavljene na uvid javnosti mogu da uključuju druga jedinjenja, lekove, i/ili agense koji se koriste za lečenje kancera. Takva jedinjenja, lekovi, i/ili agensi mogu da uključuju, na primer, lekove za hemoterapiju, lekove sa malim molekulom ili antitela koja stimulišu imuni odgovor na dati kancer. U nekim slučajevima, terapijske kompozicije mogu da sadrže, na primer, jedan ili više agenasa navedenih u odeljku o kombinovanim terapijama.
[0350] Kako se ovde koristi, "farmaceutski prihvatljiv nosač" uključuje bilo koji i sve rastvarače, disperzijske podloge, obloge, antibakterijske i antifungalne agense, izotonične i agense za odlaganje apsorpcije i slično, koji su fiziološki kompatibilni. Poželjno, nosač je pogodan za intravenozno, intramuskularno, subkutano, parenteralno, spinalno ili epidermalno administriranje (npr., injekcijom ili infuzijom). U zavisnosti od puta primene (administracije), aktivno jedinjenje, tj., antitelo, imunokonjugat, ili bispecifični molekul, može biti obloženo materijalom koji bi zaštitio jedinjenje od delovanja kiselina i drugih prirodnih uslova koji mogu inaktivirati jedinjenje.
11
[0351] Ovde opisana farmaceutska jedinjenja mogu da sadrže jednu ili više farmaceutski prihvatljivih soli. "Farmaceutski prihvatljiva so" odnosi se na so koja zadržava željenu biološku aktivnost matičnog jedinjenja i ne daje nikakve neželjene toksikološke efekte (videti npr., Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19). Primeri takvih soli uključuju kisele adicione soli i bazne adicione soli. Kisele adicione soli uključuje one koje su izvedene iz netoksičnih neorganskih kiselina, kao što je hlorovodonična, azotna, fosforna, sumporna, bromovodonična, jodovodonična, fosforasta i slično, kao i iz netoksičnih organskih kiselina kao što su alifatične mono- i dikarboksilen kiseline, fenil supstituisane alkanoične kiseline, hidroksi alkanoične kiseline, aromatične kiseline, alifatične i aromatične sulfonske kiseline i slično. Bazne adicione soli uključuju one koje su izvedene iz zemnoalkalnih metala, kao što je natrijum, kalijum, magnezijum, kalcijum i slično, kao i iz netoksičnih organskih amina, kao što su N,N'- dibenziletilendiamin, N-metilglukamin, hloroprokain, holin, dietanolamin, etilendiamin, prokain i slično.
[0352] Farmaceutska kompozicija opisana ovde takođe može da sadrži farmaceutski prihvatljiv anti-oksidans. Primeri farmaceutski prihvatljivih antioksidanasa uključuju: (1) antioksidanse rastvorljive u vodi, kao što je askorbinska kiselina, cistein hidrohlorid, natrijum bisulfat, natrijum metabisulfit, natrijum sulfit i slično; (2) antioksidanse rastvorljive u ulju, kao što je askorbil palmitat, butilirani hidroksianizol (BHA), butilirani hidroksitoluen (BHT), lecitin, propil galat, alfa-tokoferol, i slično; i (3) agense za heliranje metala, kao što su limunska kiselina, etilendiamin tetrasirćetna kiselina (EDTA), sorbitol, vinska kiselina, fosforna kiselina, i slično.
[0353] Primeri pogodnih vodenih i nevodenih nosača koji se mogu koristiti u farmaceutskim kompozicijama opisanim ovde uključuju vodu, etanol, poliole (kao što je glicerol, propilen glikol, polietilen glikol, i slično), i njihove odgovarajuće smeše, biljna ulja, kao što je maslinovo ulje, i injektabilni organski estri, kao što je etil oleat. Pravilna fluidnost može se održati, na primer, upotrebom materijala za oblaganje, kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzija, i upotrebom površinski aktivnih materija.
[0354] Ove kompozicije mogu takođe da sadrže ađuvanse kao što su konzervansi, agensi vlaženja, emulgatori i agensi raspršivanja. Prevencija prisustva mikroorganizama može se obezbediti i postupcima sterilizacije, supra, i uključivanjem različitih antibakterijskih i antifungalnih agenasa, na primer, parabena, hlorobutanola, fenol sorbinske kiseline, i slično. Takođe može biti poželjno uključiti izotonične agense, poput šećera, natrijum hlorida, i slično u kompozicijama. Pored toga, produžena apsorpcija farmaceutskog oblika za ubrizgavanje
11
može se postići uključivanjem agenasa koji odlažu apsorpciju kao što su alumininijum monostearat i želatin.
[0355] Farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za istovremenu pripremu sterilnih injekcionih rastvora ili disperzije. Upotreba takvih medijuma i agenasa za farmaceutski aktivne supstance je poznata u oblasti. Osim u meri ako je bilo koji uobičajeni medijum ili agens nespojiv sa aktivnim jedinjenjem, razmatra se njihova upotreba u ovde opisanim farmaceutskim kompozicijama. Dopunska aktivna jedinjenja se takođe mogu ugraditi u kompozicije.
[0356] Terapijske kompozicije obično moraju da budu sterilne i stabilne u uslovima proizvodnje i skladištenja. Kompozicija može da se formuliše kao rastvor, mikroemulzija, lipozom, ili druga naručena pogodna za visoku koncentraciju leka. Nosač može da bude rastvarač ili disperzijski medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol, i tečni polietilen glikol, i slično) i njihove odgovarajuće smeše. Odgovarajuća fluidnost može da se održi, na primer, upotrebom obloga kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom površinski aktivnih materija. U mnogim slučajevima, poželjno je da se u sastav uključe izotonični agensi, na primer, šećeri, polialkoholi kao što su manitol, sorbitol, ili natrijum hlorid. Produžena apsorpcija injekcionih kompozicija može se postići uključivanjem u sastav agenasa koji odlažu apsorpciju, na primer, monostearatnih soli i želatina.
[0357] Sterilni rastvori za ubrizgavanje mogu da se pripreme tako da se aktivno jedinjenje u potrebnoj količini ugradi u odgovarajući rastvarač sa jednim ili kombinacijom prethodno nabrojanih sastojaka, a po potrebi praćeno je i sterilizacionom mikrofiltracijom. Generalno, disperzije se pripremaju inkorporiranjem aktivnog jedinjenja u sterilni nosač koji sadrži osnovni disperzni medijum i potrebni su ostali sastojci od onih nabrojanih gore. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih injekcionih rastvora, poželjni postupci pripreme su sušenje u vakumu i sušenje zamrzavanjem (liofilizacija) koji daju prašak aktivnog sastojka plus bilo koji njihov dodatni željeni sastojak iz prethodno sterilisanog-filtratnog rastvora.
[0358] Količina aktivnog sastojka koja može da se kombinuje sa materijalom nosača za dobijanje jednog doznog oblika variraće u zavisnosti od subjekta koji se leči i određenog načina administracije. Količina aktivnog sastojka koja se može kombinovati sa materijalom nosača za dobijanje jednog doznog oblika će uglavnom biti ona količina kompozicije koja daje terapijski efekat. Generalno, od sto procenata, ta količina će se kretati u opsegu od oko 0.01 procenta do oko devedesetdevet procenata aktivnog sastojka, poželjno od oko 0.1 procenta do oko 70
11
procenata, najpoželjnije od oko 1 procenta do oko 30 procenata aktivnog sastojka u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.
[0359] Režimi doziranja se prilagođavaju tako da daju optimalni željeni odgovor (npr., terapijski odgovor). Na primer, može da se administrira jedan bolus, više podeljenih doza može biti administrirano tokom vremena ili doza može biti proporcionalno smanjena ili povećana kao što je naznačeno potrebama terapijske situacije. Naročito je pogodno formulisanje parenteralnih kompozicija u doznom jediničnom obliku za lakše administriranje i ujednačenost doziranja. Oblik dozirane jedinice kako se ovde koristi odnosi se na fizički odvojene jedinice pogodne kao unitarne doze za subjekte koji se leče; svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnog jedinjenja izračunatu da proizvede željeni terapijski efekat u vezi sa traženim farmaceutskim nosačem. Specifikacija za ovde opisane oblike dozirane jedinice diktirana je i direktno zavisna od (a) jedinstvenih karakteristika aktivnog jedinjenja i određenog terapijskog efekta koji treba da se postigne, i (b) ograničenja koja su svojstvena oblasti spajanja takvih aktivnih jedinjenje za lečenje osetljivosti kod pojedinaca.
[0360] Za administraciju antitela, dozni opseg je od oko 0.0001 do 100 mg/kg, i češće 0.01 do 5 mg/kg telesne mase domaćina. Na primer doze mogu biti 0.3 mg/kg telesne mase, 1 mg/kg telesne mase, 3 mg/kg telesne mase, 5 mg/kg telesne mase ili 10 mg/kg telesne mase ili unutar opsega od 1-10 mg/kg. Tipičan režim lečenja podrazumeva administraciju jednom nedeljno, jednom svake dve nedelje, jednom u tri nedelje, jednom u četiri nedelje, jednom mesečno, jednom u 3 meseca ili jednom u tri do 6 meseci.
[0361] U nekim postupcima, dva ili više monoklonskih antitela sa različitim specifičnostima vezivanja administrirana su istovremeno, u tom slučaju doza svakog administriranog antitela pada u navedenom rasponu. Antitelo se obično administrira u više navrata. Intervali između pojedinih doza mogu biti, na primer, nedeljno, mesečno, svaka tri meseca ili godišnje. Intervali takođe mogu biti neredovni što se pokazuje merenjem nivoa antitela u krvi na ciljani antigen kod pacijenta. U nekim postupcima, doziranje se prilagođava tako da se postigne koncentracija antitela u plazmi od oko 1-1000 µg/ml a kod nekih metoda oko 25-300 µg/ml.
[0362] Antitelo može da se administrira kao formulacija sa produženim oslobađanjem, u tom slučaju je potrebna ređa administracija. Doziranje i učestalost variraju u zavisnosti od poluživota antitela kod pacijenta. Generalno, humana antitela pokazuju najduži poluživot, a zatim humanizovana antitela, himerna antitela, i antitela koja nisu humana. Doziranje i učestalost administracije može varirati u zavisnosti od toga da li je lečenje profilaktičko ili terapijsko. U profilaktičkim aplikacijama, relativno mala doza se administrira u relativno retkim vremenskim intervalima tokom dugog vremenskog perioda. Neki pacijenti nastavljaju
12
da se leče do kraja života. U terapijskim aplikacijama, ponekad je potrebna relativno velika doza u relativno kratkim intervalima dok se progresija bolesti ne smanji ili prekine, a poželjno dok pacijent ne pokaže delimičnu ili potpunu amelioraciju simptoma bolesti. Nakon toga, pacijentu se može administrirati profilaktički režim.
[0363] Stvarni nivoi doziranja aktivnih sastojaka u ovde opisanim farmaceutskim kompozicijama mogu varirati tako da se dobije količina aktivnnog sastojka koja je efikasna da se postigne željeni terapijski odgovor za određenog pacijenta, sastav i način administracije, a da pri tom nije toksičan za pacijenta. Odabrani nivo doziranja će zavisiti od različitih farmakokinetičkih faktora uključujući aktivnost određenih kompozicija koje su ovde opisane, ili njihovog estra, soli ili amida, načina administracije, vremena administracije, brzine izlučivanja određenog jedinjenja koje se koristi, trajanja lečenja, drugih lekova, jedinjenja i/ili materijala koji se koriste u kombinaciji sa određenim upotrebljivim kompozicijama, starost, pol, težina, stanje, opšte zdravstveno stanje i prethodna medicinska istorija pacijenta koji se leči, i slični faktori dobro poznati u medicinskoj struci.
[0364] "Terapijski efikasna doza" antitela protiv CD73 koje je ovde opisano poželjno dovodi do smanjenja težine simptoma bolesti, povećanja učestalosti i trajanja perioda bez simptoma bolesti, ili sprečavanja oštećenja ili onesposobljavanja zbog bolovanja od bolesti. U kontekstu kancera, terapijski efikasna doza poželjno sprečava dalje pogoršanje fizičkih simptoma povezanih sa kancerom. Simptomi kancera su dobro poznati u oblasti i uključuju, na primer, neobične karakteristike mladeža, promenu izgleda mladeža, uključujući asimetriju, obrub, boju i/ili prečnik, novo pigmentisano područje kože, nenormalni mladež, tamno područje ispod nokta, kvržice dojke, promene bradavice, ciste dojki, bol u grudima, smrt, gubitak težine, slabost, prekomerni umor, otežano jelo, gubitak apetita, hronični kašalj, pogoršavajuća zadihanost, kašalj praćen krvlju, krv u urinu, krv u stolici, mučnina, povraćanje, metastaze jetre, metastaze pluća, koštane metastaze, nadutost trbuha, natečenost, tečnost u peritonealnoj šupljini, vaginalno krvarenje, zatvor, distenzija trbuha, perforacija debelog creva, akutni peritonitis (infekcija, groznica, bol), bol, povraćanje krvi, obilno znojenje, groznica, visok krvni pritisak, anemija, dijareja, žutica, vrtoglavica, drhtavica, mišićni grč, metastaze debelog creva, plućne metastaze, metastaze bešike, metastaze jetre, metastaze kostiju, metastaze bubrega, i metastaze pankreasa, otežano gutanje, i slično.
[0365] Trapijski efikasna doza može da spreči ili odloži pojavu kancera, kao što je moguće da se pokaže kada su prisutni rani ili preliminarni znaci bolesti. Laboratorijski testovi korišćeni u diajagnostici kancera uključuju hemiju (uključujući merenje nivoa CD73), hematologiju, serologiju i radiologiju. Prema tome, bilo koji klinički ili biohemijski test koji prati bilo šta od prethodnog može se upotrebiti za utvrđivanje da li je određeni tretman terapijski efikasna doza za lečenje kancera. Osoba sa prosečnim poznavanjem oblasti mogla bi da odredi takve količine na osnovu takvih faktora kao što su veličina subjekta, težina simptoma subjekta, i odabrana posebna kompozicija ili način administracije.
[0366] Kompozicija ovde opisana može se administrirati preko jednog ili više načina administracije koristeći jedan ili više različitih postupaka poznatih u oblasti. Kao što će znati poznavalac u struci, put i/ili način administracije će se razlikovati u zavisnosti od željenih rezultata. Poželjni putevi administracije antitela ovde opisanih uključuju intravenoznu, intramuskularnu, intradermalnu, intraperitonealnu, subkutanu, spinalnu ili drugu parenteralnu rutu administracije, na primer injekcijom ili infuzijom. Izraz "parenteralna administracija" kako se ovde koristi znači načine administracije koji nisu enteralna i topikalna administracija, obično injekcijom, i uključuje, bez ograničenja, intravensku, intramuskularnu, intraarterijalnu, intratekalnu, intrakapsularnu, intraorbitalnu, intrakardijalnu, intradermalnu, intraperitonealnu, transtrahealnu, potkožnu, subkutikularnu, intraartikularnu, subkapsularnu, subarahnoidnu, intraspinalu, epiduralnu i intrasternalnu injekciju i infuziju.
[0367] Alternativno, antitelo opisano ovde može se administrirati neparenteralnim putem, kao što je topikalni, epidermalni ili mukozni put administracije, na primer, intranazalno, oralno, vaginalno, rektalno, sublingvalno ili lokalno.
[0368] Aktivna jedinjenja mogu se pripremiti sa nosačima koji će zaštititi jedinjenje od brzog otpuštanja, kao što je formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implantate, transdermalne flastere, i mikrokapsulirane sisteme za isporuku. Mogu se koristiti biorazgradivi, biokompatibilni polimeri, kao što je etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri i polilaktična kiselina. Mnogi postupci za pripremu takvih formulacija su patentirani ili opšte poznati onima koji poznaju oblast. Videti, npr., Sustained i Controlled Release Drug Delivery Sistems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Njujork, 1978.
[0369] Terapijske kompozicije mogu se administrirati medicinskim uređajima znanim u oblasti. Na primer, u poželjnom tehničkom rešenju, terapijska kompozicija opisana ovde može biti administrirana hipodermičnim injekcionim uređajem bez igle, kao što su uređaji stavljeni na uvid javnosti u američkim patentima sa brojevima 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; ili 4,596,556. Primeri dobro poznatih implantata i modula za upotrebu sa antitelima protiv CD73 opisanim ovde uključuju: američki patent br.4,487,603, koji stavlja na uvid javnosti implantabilnu pumpu za mikro-infuziju za izdavanje lekova kontrolisanom brzinom; američki patent br.4,486,194, koji stavlja na uvid javnosti terapijski uređaj za administriranje lekova kroz kožu; američki patent br. 4,447,233, koji stavlja na uvid javnosti pumpu za infuziju za isporuku leka sa preciznom brzinom infuzije; američki patent br.4,447,224, koji stavlja na uvid javnosti aparat za infuziju sa varijabilnim tokom za kontinuiranu isporuku leka; američki patent br.4,439,196, koji stavlja na uvid javnosti sistem za davanje osmotskog leka koji ima odeljke sa više komora; i američki patent br. 4,475,196, koji stavlja na uvid javnosti sistem za davanje osmotskog leka. Mnogi drugi takvi implantati, sistemi za isporuku i moduli poznati su stručnjacima u oblasti.
[0370] U određenim tehničkim rešenjima, antitela protiv CD73 opisana ovde mogu biti formulisana da obezbede pravilnu distribuciju in vivo. Na primer, krvno-moždana barijera (BBB) isključuje mnoštvo visoko hidrofilnih jedinjenja. Da bi se odiguralo da ovde opisana terapijska jedinjenja prelaze BBB (po želji), mogu se formulisati, na primer, u lipozomima. Za metode proizvodnje lipozoma, videti, npr., američke patente 4,522,811; 5,374,548; i 5,399,331. Lipozomi mogu da sadrže jednu ili više grupa koje se selektivno transportuju u specifične ćelije ili organe, na taj način poboljšavaju ciljanu isporuku leka (videti, npr., V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Primeri ciljnih grupa uključuju folat ili biotin (videti, npr., američki patent 5,416,016 od Low et al.); manozid (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); antitela (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett.
357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agenss Chemother. 39:180); receptor surfaktant proteina A (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); st120 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); videti takođe K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett.
346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273.
XVII. Primene i metode
[0371] Antitela, kompozicije antitela i metode opisani ovde imaju brojne in vitro i in vivo primene, npr., inhibiranje rasta tumora, inhibiranje metastaza tumora, pojačavanje imunog odgovora, npr., smanjenjem signala adenozina, ili detekcijom CD73. U poželjnom tehničkom rešenju, antitela koja su ovde opisana su humana antitela. Na primer, antitela protiv CD73 opisana ovde mogu se administrirati ćelijama u kulturi, in vitro ili ex vivo, ili humanim subjektima, npr., in vivo, da inhibiraju proliferaciju tumorskih ćelija. Prema tome, ovde su date metode modifikacije rasta tumora kod subjekta koji obuhvataju administriranje antitela subjektu, ili njegovog dela koji veže antigen, opisanih ovde tako da se rast tumora kod subjekta smanjuje.
[0372] U određenom tehničkom rešenju, metode su posebno pogodne za lečenje kancera in vivo. Da bi se postigla antigen-specifična inhibicija rasta tumora, antitela protiv CD73 opisana
12
ovde mogu se administrirati zajedno sa antigenom od interesa ili antigen već može biti prisutan kod subjekta koji se leči (npr., subjekat koji nosi tumor). Kada se antitela na CD73 administriraju zajedno sa drugim agensom, ta dva se mogu administrirati odvojeno ili istovremeno.
[0373] Takođe su obuhvaćene metode za otkrivanje prisustva humanog antigena CD73 u uzorku, ili za merenje količine humanog antigena CD73, koje obuhvataju kontaktiranje uzorka, i kontrolnog uzorka, sa humanim monoklonskim antitelom, ili njegovim delom koji veže antigen, koji specifično vezuje humani CD73, pod uslovima koji omogućavaju stvaranje kompleksa između antitela ili njegovog dela i humanog CD73. Tada se detektuje formiranje kompleksa, pri čemu razlika u formiranju kompleksa između uzorka u poređenju sa kontrolnim uzorkom ukazuje na prisustvo humanog antigena CD73 u uzorku. Štaviše, ovde opisana antitela protiv CD73 mogu se koristiti za prečišćavanje humanog CD73 pomoću imunoafinitetnog prečišćavanja.
[0374] Dalje su obuhvaćene metode stimulisanja imunog odgovora (npr., antigen-specifičnog T ćelijskog odgovora) kod subjekta koje obuhvataju administriranje antitela protiv CD73 ovde opisanog subjektu tako da je imuni odgovor (npr., antigen-specifični T ćelijski odgovor) kod subjekta stimulisan. U poželjnom tehničkom rešenju, subjekat je subjekat koji nosi tumor i imuni odgovor protiv tumora je stimulisan. Tumor može biti čvrst tumor ili tečan tumor, npr., hematološka malignost. U određenim tehničkim rešenjima, tumor je imunogeni tumor. U određenim tehničkim rešenjima, tumor je neimunogeni.
[0375] Ove i druge metode opisane ovde diskutovane su detaljnije u daljem tekstu.
Kancer
[0376] Inhibicija CD73 anti-CD73 antitelima može smanjiti rast tumora i metastazu kod pacijenta. Inhibicija CD73 anti-CD73 antitelima takođe može poboljšati imuni odgovor na kancerogene ćelije kod pacijenta. Ovde su date metode za lečenje subjekta koji imaju kancer, koje obuhvataju administriranje subjektu antitela protiv CD73 opisanog ovde, tako da se subjekt leči, npr., tako da je rast kanceroznih tumora inhibiran ili smanjen i/ili da tumori regresiraju. Antitelo protiv CD73 može da se koristi samo za inhibiranje rasta kanceroznih tumora. Alternativno, antitelo protiv CD73 može da se koristi u konjugaciji sa drugim agensom, npr., drugim imunogenim agensima, standardnim lečenjem kancera, ili drugim antitelima, kao što je opisano ispod.
[0377] Prema tome, ovde su date metode za lečenje kancera, npr., inhibiranjem rasta tumorskih ćelija, kod subjekta, koji obuhvataju administriranje subjektu terapijski efikasne količine antitela protiv CD73 opisanog ovde, ili njegovog dela koji vezuje antigen. Antitelo može biti humano antitelo protiv CD73 (kao što je bilo koje od ovde opisanih humanih antitela protiv humanog CD73). Dodatno ili alternativno, antitelo može biti himerno ili humanizovano antitelo protiv CD73, npr., himerno ili humanizovano antitelo protiv CD73 sadrži antitelo protiv CD73 opisano ovde, ili njegov deo koji vezuje antigen.
[0378] Kanceri čiji rast može biti inhibiran korišćenjem antitela predmetnog pronalaska uključuju kancere koji obično reaguju na imunoterapiju. Neograničavajući primeri kancera za lečenje uključuju karcinom pločastih želija, sitnoćelijski kancer pluća, nesitnoćelijski kancer pluća, pločasti nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), ne NSCLC, gliom, gastrointestinalni kancer, renalni kancer (npr. karcinom jasne ćelije), kancer jajnika, kancer jetre, kolorektalni kancer, endometrialni kancer, kancer bubrega (npr., karcinom bubrežnih ćelija (RCC)), kancer prostate (npr. hormon refraktorni adenokarcinom prostate), kancer tiroidne žlezde, neuroblastom, kancer pankreasa, glioblastom (multiformni glioblastom), kancer grlića materice, kancer bešike kancer stomaka, hepatom, kancer dojke, karcinom debelog creva, i kancer glave i vrata (ili karcinom), kancer želudca, tumor germskih ćelija, pedijatrijski sarkom, sinonazalni prirodni ubica, melanom (npr., metastatski maligni melanom, kao što je kožni ili intraokularni maligni melanom), kancer kostiju, kancer kože, kancer materice, kancer analnog regiona, kancer testisa, karcinom jajovoda, karcinom endometrijuma, karcinom slepog creva, karcinom vagine, karcinom vulve, kancer jednjaka, kancer tankog creva, kancer endokrinog sistema, kancer paratiroine žlezde, kancer nadbubrežne žlezde, sarkom mekog tkiva, kancer uretre, kancer penisa, čvrsti tumori u detinjstvu, kancer uretera, karcinom bubrežne karlice, neoplazma centralnog nervnog sistema (CNS), primarni limfom CNS-a, angiogeneza tumora, tumor kičmene osovine, gliom matičnih ćelija mozga, adenom hipofize, Kapošijev sarkom, epidermoidni kancer, kancer skvamoznih ćelija, T-ćelijski limfom, kancer izazvan okruženjem uključujući one indukovane azbestom, kanceri povezani sa virusom (npr., tumori u vezi sa humanim papiloma virusom (HPV)), i hematološke malignosti izvedene iz bilo koje od dve glavne linije krvnih ćelija, tj., mijeloidne ćelijske linije (koja proizvodi granulocite, eritrocite, trombocite, makrofage i mastocite) ili limfoidne ćelijske linije (koja proizvodi B, T, NK i plazma ćelije), kao što su sve vrste luekemija, limfomi, i mijelomi, npr., akutni, hronični, limfocitne i/ili mijelogene leukemije, kao što je akutna leukemija (ALL), akutna mijelogena leukemija (AML), hronična limfocitna leukemija (CLL), i hronična mijelogena leukemija (CML), nediferencirana AML (M0), mijeloblastična leukemija (M1), mijeloblastična leukemija
12
(M2; sa sazrevanjem ćelija), promijelocitna leukemija (M3 ili M3 varijanta [M3V]), miejlomonocitna leukemija (M4 ili M4 varijanta sa eozinofilijom [M4E]), monocitna leukemija (M5), eritroleukemija (M6), megakarioblastična leukemija (M7), izolovani granulocitnic sarkom, i hloroma; limfomi, kao što je Hodčkin-ov limfom (HL), non-Hodčkinov limfom (NHL), B-ćelijski limfomi, T-ćelijski limfomi, limfoplazmacitoidni limfom, monocitoidni B-ćelijski limfom, limfno tkivo povezano sa mukozom (MALT) limfom, anaplastični (npr., Ki 1+) limfom velikih ćelija, limfom/leukemija odraslih T-ćelija, mantle ćelijski limfom, angio imunoblastični T-ćelijski limfom, angiocentrični limfom, intestinalni T-ćelijski limfom, primarni medijastinalni B-ćelijski limfom, prekursor T-limfoblastični limfom, T-limfoblastični; i limfom/leukemija (T-Lbly/TALL), periferni T- ćelijski limfom, limfoblastični limfom, post-transplantacijski limfoproliferativni poremećaj, istinski histiocitni limfom, primarni limfom centralnog nervnog sistema, primarni efuzioni limfom, limfoblastični limfom (LBL), hematopoetski tumori limfoidne loze, akutna limfoblastična leukemija, difuzni limfom velikih B-ćelija, Burkit-ov limfom, folikularni limfom, difuzni histiocitni limfom (DHL), imunoblastični limfom velikih ćelija, prekursor B-limfoblastični limfom, kožni T-ćelijski limfom (CTLC) (koji se takođe naziva fungoidi mukoze ili Sezarijev sindrom), i limfoplazmacitoidni limfom (LPL) sa Waldenstromovom makroglobulinemijom; mijelomi, kao što je IgG mijelom, mijelom lakog lanca, nesekretorni mijelom, tinjajući mijelom (takođe se naziva indolenti mijelom), solitarni plazmocitom, i višestruki mijelomi, hronična limfocitna leukemija (CLL), limfom dlakavih ćelija; hematopoetski tumori mijeloidne loze, tumori mezenhimskog porekla, uključujući fibrosarkom i rabdomiosarkom; seminom, teratokarcinom, tumori centralnih i perifernih nerava, uključujući astrocitom, skvanom; tumori mezenhimskog porekla, uključujući fibrosarkom, rabdomiosarkom, i osteosarkom; i drugi tumori, uključujući melanom, kseroderma pigmentosum, keratoakantom, seminom, folikularni kancer tiroidne žlezde i teratokarcinom, hematopoetski tumori limfoidne loze, na primer T-ćelijski i B-ćelijski tumori, uključujući ali ne ograničavajući se na T-ćelijske poremećaje kao što je T-prolimfocitna leukemija (T-PLL), uključujući sitnoćelijsku i cerebriformnu ćelijsku vrstu; velika granularna limfocitna leukemija (LGL) poželjno T-ćelijskog tipa ; a/d T-NHL hepatosplenični limfom; periferni/post-timusni T ćelijski limfom (pleomorfni i imunoblastični podtipovi); angiocentrični (nazalni) T-ćelijski limfom; kancer glave i vrata, renalni kancer, rektalni kancer, kancer tiroine žlezde; akutni mieloidni limfom, kao i bilo koja kombinacija navedenih kancera. Ovde opisane metode mogu se takođe koristiti za lečenje metastatskih kancera, refraktornih kancera (npr., refraktorni kancer na prethodnu imunoterapiju, npr., sa blokirajućim CTLA-4 ili PD-1 ili PD-L1 antitelom), i povratni kanceri.
12
[0379] Metode se mogu koristiti za lečenje tumora ili kancera koji su pozitivni na CD73, ili koji esprimiraju visoke nivoe CD73. Metoda može da obuhvati prvo određivanje nivoa CD73 na tumorima ili ćelijama tumora, i lečenje sa antitelom protiv CD73, npr., opisanim ovde, ako tumori ili ćelije eksprimiraju CD73, npr., visoke nivoe CD73.
[0380] Antitelo protiv CD73 može da se administrira kao monoterapija, ili kao jedina imunostimulirajuća terapija. Antitela na CD73, npr., ovde opisana antitela protiv CD73, takođe mogu da se kombinuju sa imunogenskim agensom, kao što su ćelije kancera, prečišćeni antigeni tumora (uključujući rekombinantne proteine, peptide i molekule ugljenih hidrata), ćelije, i ćelije koje su zaražene genima kodiranja imuno stimulišućih citokina (He et al (2004) J. Immunol.
173:4919-28). Nelimitirajući primeri vakcina tumora koje se mogu koristiti uključuju peptide antigena melanoma, kao što su peptidi od gp100, MAGE antigeni, Trp-2, MART1 i/ili tirozinaza, ili tumorske ćelije transficirane da eksprimiraju citokin GM-CSF (razmatrano dalje ispod).
[0381] Kod ljudi se pokazalo da su neki tumori imunogeni kao što su melanomi. Snižavanjem praga aktivacije T ćelija pomoću inhibicije CD73, odgovori tumora kod domaćina mogu se aktivirati, omogućavajući lečenje neimunogenih tumora ili onih koji imaju ograničenu imunogenost.
[0382] Antitelo protiv CD73, npr., antitelo protiv CD73 opisano ovde, može se kombinovati sa protokolom vakcinacije. Mnoge eksperimentalne strategije za vakcinaciju protiv tumora su osmišljene (videti Rosenberg, S., 2000, Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62; Logothetis, C., 2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302; Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book Spring: 414-428; Foon, K. 2000, ASCO Educational Book Spring: 730-738; videti takođe Restifo, N. and Sznol, M., Cancer Vaccines, poglavlje 61, str.
3023-3043 in DeVita et al. (eds.), 1997, Cancer: Principles and Practice of Oncology, peto izdanje). U jednoj od ovih strategija, vakcina se priprema korišćenjem autologne ili alogene ćelije tumora. Pokazalo se da su ove ćelijske vakcine najefikasnije kada su ćelije tumora transducirane da eksprimiraju GM-CSF. Pokazano je da je GM-CSF moćan aktivator izlaganja antigena za vakcinaciju protiv tumora (Dranoff et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A.90: 3539-43).
[0383] Istraživanje ekspresije gena i obrasci ekspresije gena velikog obima kod različitih tumora doveli su do definicije takozvanih tumor specifičnih antigena (Rosenberg, S A (1999) Immunity 10: 281-7). U mnogim slučajevima, ovi antigeni specifični za tumor su antigeni za diferencijaciju eksprimirani u tumorima i u ćeliji iz koje je tumor nastao, na primer melanocitni antigeni gp100, MAGE antigeni i Trp-2. Ono što je još važnije, može se pokazati da su mnogi
12
od ovih antigena mete T ćelija specifičnih za tumor koji se nalazi u domaćinu. Inhibicija CD73 može se koristiti zajedno sa kolekcijom rekombinantnih proteina i/ili peptida eksprimovanih u tumoru da bi se stvorio imuni odgovor na ove proteine. Na ove proteine imuni sistem normalno gleda kao na antigene i zbog toga je tolerantan prema njima. Tumorski antigen može da uključi proteinsku telomerazu, koja je potrebna za sintezu telomera hromozoma i koja je eksprimovana u više od 85% humanih kancera i samo u ograničenom broju somatskih tkiva (Kim et al. (1994) Science 266: 2011-2013). Tumorski antigen takođe može biti "neo-antigeni" eksprimirani u ćelijama kancera zbog somatskih mutacija koje menjaju sekvencu proteina ili stvaraju fuzione proteine između dve nepovezane sekvence (tj., bcr-abl u Filadelfijskom hromozomu), ili idiotip iz B ćelije tumora.
[0384] Ostale vakcine protiv tumora mogu da sadrže proteine virusa umešanih u humane kancere kao što su Humani Papiloma Virusi (HPV), Virusi Hepatitisa (HBV i HCV) i Kapošijev Sarkom povezan sa Herpes Virusom (KHSV). Drugi oblik antigena specifičnog za tumor koji se može koristiti zajedno sa inhibicijom CD73 su prečišćeni proteini toplotnog udara (HSP) izolovani iz samog tumorskog tkiva. Ovi proteini toplotnog udara sadrže fragmente proteina iz ćelija tumora i ovi HSP-i su visoko efikasni u isporuci antigen prezentujućim ćelijama za stvaranje imunosti tumora (Suot & Srivastava (1995) Science 269:1585-1588; Tamura et al. (1997) Science 278:117-120).
[0385] Dendritske ćelije (DC) su snažne antigen prezentujuće ćelije koje se mogu koristiti za praćenje antigen-specifičnih odgovora. DC se mogu proizvesti ex vivo i opteretiti sa različitim proteinskim i peptidnim antigenima kao i ekstraktima tumorskih ćelija (Nestle et al. (1998) Nature Medicine 4: 328-332). DC se takođe mogu transdukovati genetskim sredstvima da eksprimiraju i ove antigene tumora. DC su takođe spojene direktno sa tumorskim ćelijama u svrhu imunizacije (Kugler et al. (2000) Nature Medicine 6:332-336). Kao metoda vakcinacije, DC imunizacija može efikasno biti kombinovana sa inhibicijom CD73 da aktivira snažnije antitumorske odgovore.
[0386] Inhibicija CD73 može takođe biti kombinovana sa standardnim tretmanima kancera (npr., hirurgijom, zračenjem, ili hemoterapijom). Inhibicija CD73 može biti efikasno kombinovana sa hemoterapijskim režimima. U tim slučajevima, može biti moguće smanjiti dozu administriranog hemoterapijskog reagensa (Mokyr et al. (1998) Kancer Research 58: 5301-5304). Primer takve kombinacije je antitelo protiv CD73 u kombinaciji sa dekarbazinom za lečenje melanoma. Sledeći primer takve kombinacije je antitelo protiv CD73 u kombinaciji sa interleukinom-2 (IL-2) za lečenje melanoma. Naučno utemeljene kombinovane upotrebe inhibicije CD73 i hemoterapija je da ćelijska smrt, koja je posledica citotoksičnog dejstva
12
većine hemoterapijskih jedinjenja, treba da rezultira povećanim nivoom tumorskog antigena na putu prezentacije antigena. Ostale kombinovane terapije koje mogu rezultirati sinergijom sa inhibicijom CD73 zbog ćelijske smrti su radijacija, hirurgija, i nedostatak hormona. Svaki od ovih protokola stvara izvor antigena tumora kod domaćina. Inhibitori angiogeneze mogu takođe biti kombinovani sa inhibicijom CD73. Inhibicija angiogeneze dovodi do smrti tumorskih ćelija što može uvesti antigen tumora u puteve prezentacije antigena domaćina.
[0387] Još jedan primer takve kombinacije je antitelo protiv CD73 u kombinaciji sa anti-CD39, anti-A2AR ili hemijskim inhibitorom, ili antiA2BR antitelom ili hemijskim inhibitorom. Naučno utemeljenje iza kombinovane upotrebe inhibicije CD73 i inhibicije CD39, A2AR, ili A2BR je da su ti proteini takođe povezani sa biološkom funkcijom i signalizacijom CD73. Konkretno, CD39 katalizuje konverziju ATP-a ili ADP-a u AMP, pružajući tako supstrat (AMP) za CD73 enzimsku aktivnost (tj. konverziju AMP-a u adenozin). Dalje, adenozin je ligand za četiri poznata receptora, uključujući AIR, A2AR, A2BR, i A3. Pokazano je da A2AR i A2BR regulišu ploriferaciju, rast, migraciju, i metastazu tumorskih ćelija, kao i aktivaciju T-ćelija u okruženju tumora putem cAMP signalizacije.
[0388] Ovde opisana antitela protiv CD73 mogu se takođe koristiti u kombinaciji sa bispecifičnim antitelima koja ciljaju efektore koje eksprimiraju Fcα ili Fcγ receptori na ćelijama tumora (videti, npr., američke patente sa brojevima 5,922,845 i 5,837,243). Bispecifična antitela se mogu koristiti za ciljanje dva odvojena antigena. Na primer anti-Fc receptor/anti tumorski antigen (npr., Her-2/neu) bispecifična antitela korišćena su za ciljanje makrofaga na mestima tumora. Ovo ciljanje može efikasnije aktivirati tumor specifične odgovore. Alternativno, antigen se može isporučiti direktno DC-a upotrebom bispecifičnih antitela koja se vezuju za tumorski antigen i specifične ćelijske površinske markere dendritskih ćelija.
[0389] Tumori izbegavaju imunološki nadzor domaćina pomoću velikog broja raznolikih mehanizama. Mnogi od ovih mehanizama se mogu prevazići inaktivacijom proteina koji su eksprimirani od strane tumora i koji su imunosupresivni. Oni uključuju, između ostalih, TGF-β (Kehrl et al. (1986) J. Exp. Med. 163: 1037-1050), IL-10 (Howard & O'Garra (1992) Immunology Today 13: 198-200), id Fas ligand (Hahne et al. (1996) Science 274: 1363-1365). Antitela na svaki od ovih entiteta mogu se koristiti u kombinaciji sa antitelima protiv CD73 za suzbijanje dejstva imunosupresivnog agensa i favorizovanje imunoloških odgovora tumora od strane domaćina.
[0390] Ostala antitela koja aktiviraju imunološku reakciju domaćina mogu se koristiti u kombinaciji sa antitelima protiv CD73. Ona uključuju molekule na površini dendritskih ćelija koji aktiviraju DC funkciju i prezentaciju antigena. Antitela protiv CD40 mogu efikasno da
12
zemene aktivnost T ćelije pomagača (Ridge et al. (1998) Nature 393: 474-478) i mogu se koristiti u sprezi sa antitelima protiv CD73. Aktiviranje antitela na kostimulatorne molekule T ćelija, kao što su OX-40 (Weinberg et al. (2000) Immunol 164: 2160-2169), 4-1BB (Melero et al. (1997) Nature Medicine 3: 682-685 (1997), i ICOS (Hutloff et al. (1999) Nature 397: 262-266) takođe mogu obezbediti povećane nivoe aktivacije T ćelija. Inhibitori za PD1, PD-L1 ili CTLA-4 (npr., američki patent br. 5,811,097), takođe se mogu koristiti u sprezi sa antitelom protiv CD73.
[0391] Ostale metode opisane ovde se koriste za lečenje pacijenata koji su bili izloženi određenim toksinima ili patogenima. Prema tome, drugi aspekt opisan ovde pruža metodu lečenja infektivne bolesti kod subjekta koja obuhvata administriranje subjektu antitela protiv CD73, ili njegovog dela koji veže antigen, tako da je subjekt lečen od infektivne bolesti. Dodatno ili alternativno, antitelo može biti himerno ili humanizovano antitelo.
[0392] U svim gore navedenim metodama, inhibicija CD73 može biti kombinovana sa drugim oblicima imunoterapije kao što je lečenje citokinom (npr., interferonima, GM-CSF, G-CSF, IL-2), ili terapijom bispecifičnim antitelom, što omogućava poboljšanu prezentaciju tumorskih antigena (videti, npr., Holliger (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak (1994) Struktura 2:1121-1123).
Kombinovane terapije
[0393] Pored gore navedenih kombinovanih terapija, antitela protiv CD73 opisana ovde mogu takođe da se koriste u kombinovanoj terapiji, npr., za lečenje kancera, kao što je opisano ispod.
[0394] Ovde su dalje date metode kombinovane terapije u kojima je antitelo protiv CD73 koadministrirano sa jednim ili više dodatnih agenasa, npr., antitela, koji su efikasni u stimulaciji imunih odgovora i na taj način dodatno pojačavaju, stimulišu ili regulišu imune odgovore kod subjekta.
[0395] Generalno, antitelo protiv CD73 koje je ovde opisano može da se kombinuje sa (i) agonistom kostimulatornog receptora i/ili (ii) antagonistom inhibitornog signala na T ćelijama, oba od njih imaju za rezultat pojačavanje antigen-specifičnih T ćelijskih odgovora (regulatori imune kontrolne tačke). Većina od kostimulisanih i koinhibitornih molekula su članovi imunoglobulinske super familije (IgSF), i antitela protiv CD73 opisana ovde mogu biti administrirana sa agensom koji cilja na člana IgSF familije da poveća imuni odgovor. Jedna važna familija liganada vezanih za membranu koji se vezuju za kostimulatorne ili koinhibitorne receptore je B7 familija, koja uključuje B7-1, B7-2, B7-H1 (PD-L1), B7-DC (PD-L2), B7-H2
1
(ICOS-L), B7-H3, B7-H4, B7-H5 (VISTA), i B7-H6. Druga familija liganada vezanih za membranu koji se vezuju za kostimulatorne ili koinhibitorne receptore je TNF familija molekula koji se vezuju za srodne članove familije TNF receptora, koja uključuje CD40 i CD40L, OX-40, OX-40L, CD70, CD27L, CD30, CD30L, 4-1BBL, CD137, GITR, TRAIL/Apo2-L, TRAILR1/DR4, TRAILR2/DR5, TRAILR3, TRAILR4, OPG, RANK, RANKL, TWEAKR/Fn14, TWEAK, BAFFR, EDAR, XEDAR, TACI, APRIL, BCMA, LTβR, LIGHT, DcR3, HVEM, VEGI/TL1A, TRAMP/DR3, EDAR, EDA1, XEDAR, EDA2, TNFR1, Limfotoksin α/TNFβ, TNFR2, TNFα, LTβR, Limfotoksin α 1β2, FAS, FASL, RELT, DR6, TROY, NGFR (videti, npr., Tansey (2009) Drug Discovery Today 00:1). Aktivacija T ćelija je takođe regulisana rastvorljivim citokinima. Tako se antitela protiv CD73 mogu koristiti u kombinaciji sa (i) antagonistima (ili inhibitorima ili blokirajućim agensima) proteina IgSF familije ili B7 familije ili TNF familije koji inhibiraju T ćelijsku aktivaciju ili antagonistima citokina koji inhibiraju T ćelijsku aktivaciju (npr., IL-6, IL-10, TGF-β, VEGF; "imunosupresivni citokini") i/ili (ii) agonistima stimulativnih receptora IgSF familije, B7 familije ili TNF familije ili citokina koji stimulišu T ćelijsku aktivaciju, za stimulisanje imunog odgovora, npr., za lečenje proliferativnih bolesti, kao što je kancer.
[0396] Na primer, T ćelijski odgovori mogu da se stimulišu kombinacijom ovde opisanih antitela protiv CD73, npr., CD73.4-IgG2CS-IgG1.1f, i jednog ili više sledećih agenasa:
(1) Antagonist (inhibitor ili blokirajući agens) proteina koji inhibira T ćelijsku aktivaciju (npr., inhibitori imunih kontrolnih tačaka), kao što je CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, i LAG-3, kako je opisano gore, i bilo koji od sledećih proteina: TIM-3, Galektin 9, CEACAM-1, BTLA, CD69, Galektin-1, TIGIT, CD113, GPR56, VISTA, 2B4, CD48, GARP, CD73, PD1H, LAIR1, TIM-1 ,TIM-4, CD39.
(2) Agonist proteina koji stimuliše T ćelijsku aktivaciju, kao što je B7-1, B7-2, CD28, 4-1BB (CD137), 4-1BBL, GITR, GITRL, ICOS, ICOS-L, OX40, OX40L, CD70, CD27, CD40, DR3 i CD28H.
[0397] Izuzetni primeri agenasa koji moduliraju jedan od gore navedenih proteina i mogu da se kombinuju sa antagonistima antitela protiv CD73, npr., onim opisanim ovde, za lečenje kancera, uključuju: Yervoy™ (ipilimumab) ili Tremelimumab (na CTLA-4), galiksimab (na B7.1), BMS-936558 (na PD-1), CT-011 (na PD-1), MK-3475 (na PD-1), AMP224 (na B7DC), BMS-936559 (na B7-H1), MPDL3280A (na B7-H1), MEDI-570 (na ICOS), AMG557 (na B7H2), MGA271 (na B7H3), IMP321 (na LAG-3), BMS-663513 (na CD137), PF-05082566 (na CD137), CDX-1127 (na CD27), anti-OX40 (Providence Health Services), huMAbOX40L
1 1
(na OX40L), Atacicept (na TACI), CP-870893 (na CD40), Lucatumumab (na CD40), Dacetuzumab (na CD40), Muromonab-CD3 (na CD3), Ipilumumab (na CTLA-4).
[0398] Ostali molekuli koji se mogu kombinovati sa antagonističkim anti-CD73 antitelima za lečenje kancera uključuju antagoniste inhibitornih receptora na NK ćelijama ili agoniste aktivirajućih receptora na NK ćelijama. Na primer, antagonistička antitela protiv CD73 mogu da se kombinuju sa antagonistima KIR-a (npr., lirilumab).
[0399] Aktivacija T ćelija je takođe regulisana rastvorljivim citokinima, i antitela protiv CD73 mogu biti administrirana subjektu, npr., koji imaju kancer, sa antagonistima citokina koji inhibiraju T ćelijsku aktivaciju ili agonistima citokina koji stimulišu T ćelijsku aktivaciju.
[0400] U određenim tehničkim rešenjima, antitela protiv CD73 mogu da se koriste u kombinaciji sa (i) antagonistima (ili inhibitori ili blokirajući agensi) proteina IgSF familije ili B7 familije ili TNF familije koji inhibiraju T ćelijsku aktivaciju ili antagonistima citokina koji inhibiraju T ćelijsku aktivaciju (npr., IL-6, IL-10, TGF-β, VEGF; "imunosupresivni citokini") i/ili (ii) agonistima stimulatornih receptora IgSF familije, B7 familije ili TNF familije ili citokina koji stimulišu T ćelijsku aktivaciju, za stimulaciju imunog odgovora, npr., za lečenje proliferativnihh bolesti, kao što je kancer.
[0401] Još drugi agenasi za kombinovane terapije uključuju agense koji inhibiraju ili iscrpljuju makrofage ili monocite, uključujući ali ne ograničavajući se na antagoniste CSF-1R kao što je CSF-1R antagonist antitela uključujući RG7155 (WO11/70024, WO11/107553, WO11/131407, WO13/87699, WO13/119716, WO13/132044 ) ili FPA-008 (WO11/140249; WO13169264; WO14/036357).
[0402] Antitela protiv CD73 takođe se mogu administrirati sa agensima koji inhibiraju TGF-β signalizaciju.
[0403] Dodatni agensi koji mogu biti kombinovani sa antitelom protiv CD73 uključuju agense koji povećavaju prezentaciju antigena tumora, npr., vakcine dendritskih ćelija, GM-CSF sekretujuće ćelijske vakcine, CpG oligonukleotidi, i imikvimod, ili terapije koje povećavaju imunogenost ćelija tumora (npr., antraciklini).
[0404] Ipak druge terapije koje se mogu kombinovati sa antitelom protiv CD73 uključuju terapije koje iscrpljuju ili blokiraju Treg ćelije, npr., agens koji specifično vezuje CD25.
[0405] Druga terapija koja se može kombinovati sa antitelom protiv CD73 je terapija koja inhibira metabolički enzim kao što je indolamin dioksigenaza (IDO), dioksigenaza, arginaza, ili sintetaza azot oksida.
[0406] Druga klasa agenasa koja se može koristiti sa antitelom protiv CD73 uključuje agense koji inhibiraju stvaranje adenozina ili inhibiraju A2A receptor adenozina.
1 2
[0407] Ostale terapije koje se mogu kombinovati sa antitelom protiv CD73 za lečenje kancera uključuju terapije koje ukidaju/sprečavaju anergiju ili iscrpljivanje T ćelija i terapije koje pokreću urođenu imunu aktivaciju i/ili inflamaciju na mestu tumora.
[0408] Antitelo protiv CD73 može biti kombinovano sa više od jednog imuno-onkološkog agensa, i može biti, npr., kombinovano sa kombinatornim pristupom koji cilja više elemenata imunog puta, kao što je jedan ili više od sledećih: terapija koja poboljšava prezentaciju tumorskog antigena (npr., vakcine dendritskih ćelija, ćelijske vakcine koje izlučuju GM-CSF, CpG oligonukleotidi, imikvimod); terapija koja inhibira negativnu imuno regulaciju npr., inhibiranjem CTLA-4 i/ili PD1/PD-L1/PD-L2 puta i/ili iscrpljivanjem ili blokiranjem Treg ćelija ili drugih imuno supresivnih ćelija; terapija koja stimuliše pozitivnu imuno regulaciju, npr., sa agonistima koji stimulišu CD-137, OX-40, i/ili GITR put i/ili stimulišu efektorsku funkciju T ćelija; terapija koja sistemski povećava učestalost antitumorskih T ćelija; terapija koja iscrpljuje ili inhibira Treg ćelije, kao što su Treg ćelije u tumoru, npr., korišćenjem antagonista CD25 (npr., daklizumab) ili ex vivo iscrpljivanjem za perlice vezanog anti-CD25; terapija koja utiče na funkciju supresorskih mijeloidnih ćelija u tumoru; terapija koja povećava imunogenost ćelija tumora (npr., antraciklini); adoptivni T ćelijski ili NK ćelijski transfer uključujući genetski modifikovane ćelije, npr., ćelije modifikovane himernim receptorima antigena (CAR-T terapija); terapija koja inhibira metabolički enzim kao što je indolamin dioksigenaza (IDO), dioksigenaza, arginaza, ili sintetaza azot oksida; terapija koja ukida/sprečava anergiju ili iscrpljenost; terapija koja pokreće urođenu imunološku aktivaciju i/ili inflamaciju na mestu tumora; administriranje imuno stimulativnih citokina; ili blokiranje imunorepresivnih citokina.
[0409] Generalno, antitela protiv CD73 opisana ovde mogu da se koriste zajedno sa jednim ili više agonističkih agenasa koji vezuju pozitivne kostimulatorne receptore, blokirajućim agensima koji oslabljuju signalizaciju putem inhibitornih receptora, antagonistima, i jednim ili više agenasa koji sistemski povećavaju učestalost anti-tumorskih T ćelija, agensima koji prevazilaze posebne imuno supresivne puteve unutar mikrookruženja tumora (npr., blokiraju inhibicijsko angažovanje receptora (npr., PD-L1/PD-1 interakcije), troše ili inhibiraju Treg ćelije (npr., korišćenjem monoklonskog antitela protiv CD25 (npr., daklizumab) ili ex vivo trošenje za perlice vezanog anti-CD25), inhibiraju metaboličke enzime kao što je IDO, ili ukidaju/sprečavaju anergiju ili iscrpljenost T ćelija) i agensima koji pokreću urođenu imunološku aktivaciju i/ili inflamaciju na mestu tumora. Povećana internalizacija inhibicijskih receptora može prevesti na niži nivo potencijal inhibitora (pod pretpostavkom da ne nastaje signalizacija).
1
[0410] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo protiv CD73 je administrirano subjektu zajedno sa BRAF inhibitorom ako je subjekt pozitivan na mutaciju BRAF V600.
[0411] Ovde su date metode za stimulisanje imunog odgovora kod subjekta koje obuhvataju administriranje subjektu antagonističkog anti-CD73 molekula, npr., antitela, i jednog ili više dodatnih imunostimulirajućih antitela, kao što je antagonist protiv PD-1, npr., antagonističko antitelo, antagonist protiv PD-Ll, npr., antagonističko antitelo, antagonistički anti-CTLA-4 antagonist, npr., antagonističko antitelo i/ili antagonist protiv LAG3, npr., antagonističko antitelo, tako da se stimuliše imuni odgovor u subjektu, na primer da inhibira rast tumora ili da stimuliše antivirusni odgovor. U jednom tehničkom rešenju, subjektu se administrira antagonističko antitelo protiv CD73 i antagonističko antitelo protiv PD-1. U jednom tehničkom rešenju, subjektu se administrira antagonističko antitelo protiv CD73 i antagonističko antitelo protiv PD-Ll. U jednom tehničkom rešenju, subjektu se administrira antagonističko antitelo protiv CD73 i antagonističko antitelo protiv CTLA-4. U jednom tehničkom rešenju, antitelo protiv CD73 je humano antitelo, kao što je antitelo opisano ovde. Alternativno, antitelo protiv CD73 može biti, na primer, himerno ili humanizovano antitelo (npr., pripremljeno od mišjeg mAb protiv CD73), kao što je dalje opisano ovde. U jednom tehničkom rešenju, najmanje jedno dodatno imunostimulirajuće antitelo (npr., antagonist anti-PD-1, antagonist anti-PD-Ll, antagonist anti-CTLA-4 i/ili antagonist anti-LAG3 antitelo) je humano antitelo. Alternativno, najmanje jedno dodatno imunostimulirajuće antitelo može biti, na primer, himerno ili humanizovano antitelo (npr., pripremljeno od mišjeg anti-PD-1, anti-PD-Ll, anti-CTLA-4 i/ili anti-LAG3 antitelo).
[0412] Ovde su date metode za lečenje hiperproliferativne bolesti (npr., kancera), koje obuhvataju administriranje subjektu antagonističkog antitela protiv CD73 i antagonističkog antitela PD-1. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo protiv CD73 je administrirano u subterapijskoj dozi, antitelo protiv PD-1 je administrirano u subterapijskoj dozi, ili se oba antitela administriraju u subterapijskoj dozi. Ovde su takođe date metode za promenu neželjenog događaja povezanog sa lečenjem hiperproliferativne bolesti sa imunostimulirajućim agensom, koje obuhvataju administriranje subjektu antitela protiv CD73 i subterapijske doze antitela protiv PD-1. U određenim tehničkim rešenjima, subjekat je čovek. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo protiv PD-1 je monoklonsko antitelo sa humanom sekvencom i antitelo protiv CD73 je monoklonsko antitelo sa humanom sekvencom, kao što je antitelo koje sadrži CDR-ove ili varijabilne regione od 11F11, 4C3, 4D4, 10D2, 11A6, 24H2, 5F8, 6E11, 7A11, CD73.3, CD73.4, CD73.5, CD73.6, CD73.7, CD73.8, CD73.9, CD73.10 ili CD73.11 opisanih ovde ili drugo antagonist antitelo protiv CD73 opisano ovde.
1 4
[0413] Pogodni PD-1 antagonisti za upotrebu u ovde opisanim postupcima, uključuju, bez ograničenja, ligande, antitela (npr., monoklonska antitela i bispecifična antitela), i multivalentne agense. U jednom tehničkom rešenju, PD-1 antagonist je fuzioni protein, npr., Fc fuzioni protein, kao što je AMP-244. U jednom tehničkom rešenju, PD-1 antagonist je anti-PD-1 ili anti-PD-Ll antitelo.
[0414] Poseban primer antitela protiv PD-1 je nivolumab (BMS-936558) ili antitelo koje sadrži CDR-ove ili varijabilne regione jednog od antitela 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 7D3, 5F4 i 4A11 opisano u WO 2006/121168. U određenim tehničkim rešenjima, anti-PDl antitelo je MK-3475 (Lambrolizumab) opisano u WO2012/145493; AMP-514 opisano u WO 2012/145493; i CT-011 (Pidilizumab; prethodno CT-AcTibody ili BAT; videti, npr., Rosenblatt et al. (2011) J. Imunotherapy 34:409). Sledeća poznata PD-1 antitela i drugi PD-1 inhibitori uključuju one opisane u WO 2009/014708, WO 03/099196, WO 2009/114335, WO 2011/066389, WO 2011/161699, WO 2012/145493, američki patenti sa brojevima 7,635,757 i 8,217,149, i američka patentna objava br. 2009/0317368. Bilo koje od antitela protiv PD-1 stavljenih na uvid javnosti u WO2013/173223 takođe se može koristiti. Antitelo protiv PD-1 koje se nadmeće za vezivanje sa, i/ili se veže za isti epitop na PD-1, kao i jedno od ovih antitela takođe se može koristiti u kombinovanim tretmanima.
[0415] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo protiv PD-1 se vezuje za humani PD-1 sa KDod 5×10<-8>M ili manjom, veže se za humani PD-1 sa KDod 1×10<-8>M ili manjom, veže se za humani PD-1 sa KDod 5×10<-9>M ili manjom, ili veže za humani PD-1 sa KDod između 1×10<-8>M i 1×10<-10>M ili manjom.
[0416] Ovde su date metode za lečenje hiperproliferativne bolesti (npr., kancera), koje obuhvataju administriranje subjektu antagonist antitela protiv CD73 i antagonist antitela PD-L1. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo protiv CD73 je administrirano u subterapijskoj dozi, antitelo protiv PD-Ll je administrirano u subterapijskoj dozi, ili se oba administriraju u subterapijskoj dozi. Ovde su date metode za promenu neželjenog događaja povezanog sa lečenjem hiperproliferativne bolesti sa imunostimulirajućim agensom, koje obuhvataju administriranje subjektu antitela protiv CD73 i subterapijske doze antitela protiv PD-Ll. U određenim tehničkim rešenjima, subjekat je čovek. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo protiv PD-Ll je monoklonsko antitelo humane sekvence i antitelo protiv CD73 je monoklonsko antitelo humane sekvence, kao što je antitelo koje sadrži CDR-ove ili varijabilne regione od 11F11, 4C3, 4D4, 10D2, 11A6, 24H2, 5F8, 6E11, 7A11, CD73.3, CD73.4, CD73.5, CD73.6, CD73.7, CD73.8, CD73.9, CD73.10 ili CD73.11 opisane ovde, ili drugo antagonističko antitelo protiv CD73 opisano ovde.
1
[0417] U jednom tehničkom rešenju, antitelo protiv PD-Ll je BMS-936559 (pominje se kao 12A4 u WO 2007/005874 i američkom patentu br.7,943,743), ili antitelo koje sadrži CDR-ove ili varijabilne regione od 3G10, 12A4, 10A5, 5F8, 10H10, 1B12, 7H1, 11E6, 12B7 i 13G4, koji su opisani u PCT Publikaciji WO 07/005874 i američkom patentu br.7,943,743. U određenom tehničkom rešenju antitelo protiv PD-Ll je MEDI4736 (takođe poznato kao Anti-B7-H1) ili MPDL3280A (takođe poznato kao RG7446). Bilo koje antitelo protiv PD-Ll stavljeno na uvid javnosti u WO2013/173223, WO2011/066389, WO2012/145493, američkim patentima sa brojevima 7,635,757 i 8,217,149 i američkoj publikaciji br. 2009/145493 takođe se može koristiti. Antitela protiv PD-Ll koja se nadmeću sa i/ili se vezuju za isti epitop kao i bilo koje od ovih antitela takođe se mogu koristiti u kombinovanim tretmanima.
[0418] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo protiv PD-Ll se vezuje za humani PD-L1 sa KDod 5×l0<-8>M ili manjom, veže se za humani PD-L1 sa KDof 1×10<-8>M ili manjom, veže se za humani PD-L1 sa KDod 5×10<-9>M ili manjom ili se veže za humani PD-L1 sa KDod između 1×10<-8>M i 1×10<-10>M ili manjom.
[0419] Ovde su date metode za lečenje hiperproliferativne bolesti (npr., kancera), koje obuhvataju administriranje subjektu antitela protiv CD73 opisanog ovde i CTLA-4 antagonističkog antitela. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo protiv CD73 je administrirano u subterapijskoj dozi, antitelo protiv CTLA-4 je administrirano u subterapijskoj dozi, ili se oba administriraju u subterapijskoj dozi. Ovde su date metode za promenu neželjenog događaja povezanog sa lečenjem hiperproliferativne bolesti sa imunostimulirajućim agensom, koje obuhvataju administriranje subjektu antitela protiv CD73 i subterapijske doze antitela protiv CTLA-4. U određenim tehničkim rešenjima, subjekat je čovek. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo protiv CTLA-4 je antitelo izabrano od grupe: Yervoy™ (ipilimumab ili antitelo 10D1, opisano u PCT publikaciji WO 01/14424), tremelimumab (ranije ticilimumab, CP-675,206), monoklonsko ili antitelo protiv CTLA-4 opisano u bilo kojoj od sledećih publikacija: WO 98/42752; WO 00/37504; američkom patentu br.6,207,156; Hurwitz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(17):10067-10071; Camacho et al. (2004) J. Clin. Oncology 22(145): Apstrakt No.2505 (antitelo CP-675206); i Mokyr et al. (1998) Kancer Res.
58:5301-5304. Bilo koje antitelo protiv CTLA-4 stavljeno na uvid javnosti u WO2013/173223 takođe se može koristiti.
[0420] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo protiv CTLA-4 se vezuje za humani CTLA-4 sa KDod 5×10<-8>M ili manjom, veže se za humani CTLA-4 sa KDod 1×10<-8>M ili manjom, veže se za humani CTLA-4 sa KDod 5×10<-9>M ili manjom, ili se veže za humani CTLA-4 sa KDod između 1×10<-8>M i 1×10<-10>M ili manjom.
1
[0421] Ovde su date metode za lečenje hiperproliferativne bolesti (npr., kancera), koje sadrže administriranje subjektu antitela protiv CD73 i antitela protiv LAG-3. U daljim tehničkim rešenjima, antitelo protiv CD73 je administrirano u subterapijskoj dozi, antitelo protiv LAG-3 je administrirano u subterapijskoj dozi, ili se oba administriraju u subterapijskoj dozi. Ovde su date metode za promenu neželjenog događaja povezanog sa lečenjem hiperproliferativne bolesti sa imunostimulirajućim agensom, koje obuhvataju administriranje subjektu antitela protiv CD73 i subterapijske doze antitela protiv LAG-3. U određenim tehničkim rešenjima, subjekat je čovek. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo protiv PD-Ll je monoklonsko antitelo humane sekvence i antitelo protiv CD73 je monoklonsko antitelo humane sekvence, kao što je antitelo koje sadrži CDR-ove ili variajabilne regione od 11F11, 4C3, 4D4, 10D2, 11A6, 24H2, 5F8, 6E11, 7A11, CD73.3, CD73.4, CD73.5, CD73.6, CD73.7, CD73.8, CD73.9, CD73.10 ili CD73.11 ili drugo antagonist antitelo protiv CD73 opisano ovde. Primeri antitela protiv LAG3 uključuju antitela koja sadrže CDR-ove ili varijabilne regione antitela 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 ili 17E5, koji su opisani u američkoj patentnoj objavi br. US2011/0150892 i WO2014/008218. U jednom tehničkom rešenju, antitelo protiv LAG-3 je BMS-986016. Druga u oblasti prepoznata antitela protiv LAG-3 koja se mogu koristiti uključuju IMP731 opisan u US 2011/007023. IMP-321 se takođe može koristiti. Antitela protiv LAG-3 koja se nadmeću sa i/ili vezuju za isti epitop kao i bilo koje od ovih antitela takođe mogu da se koriste u kombinovanim tretmanima.
[0422] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo protiv LAG-3 se vezuje za humani LAG-3 sa KDod 5×10<-8>M ili manjom, veže se za humani LAG-3 sa KDod 1×10<-8>M ili manjom, veže se za humani LAG-3 sa KDof 5×10<-9>M ili manjom, ili se veže za humani LAG-3 sa KDod između 1×10<-8>M i 1×10<-10>M ili manjom.
[0423] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo protiv CD73 je administrirano zajedno sa agonističkim antitelom protiv GITR, npr., antitelom koje ima CDR sekvence od 6C8, npr., humanizovano antitelo koje ima CDR-ove od 6C8, kao što je opisano, npr., u WO2006/105021; antitelom koje sadrži CDR-ove od antitela protivGITR opisanim u WO2011/028683; antitelom koje sadrži CDR-ove od antitela protiv GITR opisanim u JP2008278814; ili antitelom koje sadrži CDR-ove od antitela protiv GITR opisanim u WO2015187835 .
[0424] Administriranje antitela protiv CD73 opisanih ovde i antagonista, npr., antagonističkih antitela, na jedan ili više drugih ciljnih antigena kao što su LAG-3 i/ili CTLA-4 i/ili PD-1 i/ili PD-L1 može poboljšati imuni odgovor na ćelijama kancera kod pacijenta. Kanceri čiji rast može biti inhibiran korišćenjem antitela iz predmetne objave uključuju kancere koji obično reaguju na imunoterapiju. Reprezentativni primeri kancera za lečenje sa kombinovanom terapijom
1
predmetne objave uključuje one kancere posebno navedene gore u diskusiji o monoterapiji antitelima protiv CD73.
[0425] U određenim tehničkim rešenjima, kombinacija terapijskih antitela koja su ovde razmatrana može da se administrira istovremeno kao pojedinačna kompozicija u farmaceutski prihvatljivom nosaču, istovremeno kao odvojene kompozicije sa svakim antitelom u farmaceutski prihvatljivom nosaču. U drugom tehničkom rešenju, kombinacija terapijskih antitela može biti administrirana uzastopno. Na primer, antitelo protiv CTLA-4 i antitelo protiv CD73 mogu se administrirati uzastopno, tako da se antitelo protiv CTLA-4 administrira prvo a antitelo protiv CD73 drugo, ili antitelo protiv CD73 se administrira prvo i antitelo protiv CTLA-4 drugo. Dodatno ili alternativno, antitelo protiv PD-1 i antitelo protiv CD73 mogu se administrirati uzastopno, kao što je antitelo protiv PD-1 koje se administrira prvo i antitelo protiv CD73 drugo, ili antitelo protiv CD73 koje se administrira prvo i antitelo protiv PD-1 drugo. Dodatno ili alternativno, antitelo protiv PD-L1 i antitelo protiv CD73 mogu se administrirati uzastopno, tako da se antitelo protiv PD-Ll administrira prvo a antitelo protiv CD73 drugo, ili antitelo protiv CD73 se administrira prvo i antitelo protiv PD-1 drugo. Dodatno ili alternativno, antitelo protiv LAG-3 i antitelo protiv CD73 mogu se administrirati uzastopno, tako da se antitelo protiv LAG-3 administrira prvo a antitelo protiv CD73 drugo, ili antitelo protiv CD73 se administrira prvo i antitelo protiv LAG-3 drugo.
[0426] Nadalje, ako se više od jedne doze kombinovane terapije administrira uzastopno, redosled uzastopnog administriranja može se preokrenuti ili zadržati u istom redosledu u svakoj vremenskoj tački administriranja, uzastopno administriranje može biti kombinovano sa istovremenim administriranjem, ili bilo kojom kombinacijom istih. Na primer, prvo administriranje kombinacije antitela protiv CTLA-4 i antitela protiv CD73 može biti istovremena, drugo administriranje može biti uzastopno sa antitelom protiv CTLA-4 kao prvim i antitelom protiv CD73 kao drugim, i treće administriranje može biti uzastopno sa antitelom protiv CD73 kao prvim i antitelom protiv CTLA-4 kao drugim, itd.. Dodatno ili alternativno, prvo administriranje kombinovanog antitela protiv PD-1 i antitela protiv CD73 može biti istovremeno, drugo administriranje može biti uzastopno sa antitelom protiv PD-1 kao prvim i antitelom protiv CD73 kao drugim, i treće administriranje može biti uzastopno sa antitelom protiv CD73 kao prvim i antitelom protiv PD-1 kao drugim, itd.. Dodatno ili alternativno, prvo administriranje kombinovanog antitelo protiv PD-L1 i antitela protiv CD73 može biti istovremeno, drugo administriranje može biti uzastopno sa antitelom protiv PD-Ll kao prvim i antitelom protiv CD73 kao drugim, i treće administriranje može biti uzastopno sa antitelom protiv CD73 kao prvim i antitelom protivPD-Ll kao drugim, itd.. Dodatno ili alternativno, prvo
1
administriranje kombinovanog antitela protiv LAG-3 i antitela protiv CD73 može biti istovremeno, drugo administriranje može biti uzastopno sa antitelom protiv LAG-3 kao prvim i antitelom protiv CD73 kao drugim, i treće administriranje može biti uzastopno sa antitelom protiv CD73 kao prvim i antitelom protiv LAG-3 kao drugim, itd. Druga reprezentativna shema doziranja može da uključi prvo administriranje koje je uzastopno sa anti-CD73 prvim i anti-CTLA-4 drugim antitelom (i/ili anti-PD-1 antitelo i/ili anti-PD-Ll antitelo i/ili anti-LAG-3 antitelo), a sledeće administriranje može biti istovremeno.
[0427] U jednom tehničkom rešenju, subjekat koji je bolestan i čija bolest može imati korist od stimulacije imunog sistema, npr., kancer ili infektivna bolest, leči se administriranjem subjektu imuno-onkološkog agensa i antitela protiv CD73, pri čemu je imuno-onkološki agens CD137 (4-1BB) agonist, kao što je agonističko antitelo CD137. Pogodna CD137 antitela uključuju, na primer, urelumab ili PF-05082566 (WO12/32433).
[0428] U jednom tehničkom rešenju, subjekt koji je bolestan i čija bolest može imati korist od stimulacije imunog sistema, npr., kancer ili infektivna bolest, leči se administriranjem subjektu imunoonkološkog agensa i antitela protiv CD73, pri čemu je imunoonkološki agens OX40 agonist, kao što je agonističko OX40 antitelo. Pogodna OX40 antitela uključuju, na primer, MEDI-6383, MEDI-6469 ili MOXR0916 (RG7888; WO06/029879).
[0429] U jednom tehničkom rešenju, subjekt koji je bolestan i čija bolest može imati koristi od stimulacije imunog sistema, npr., kancer ili infektivna bolest, leči se administriranjem subjektu imunoonkološkog agensa i antitela protiv CD73, pri čemu je imunoonkološki agens CD40 agonist, kao što je agonističko CD40 antitelo. U određenim tehničkim rešenjima, imunoonkološki agens je CD40 antagonist, kao što je antagonističko CD40 antitelo. Pogodna CD40 antitela uključuju, na primer, lukatumumab (HCD122), dacetuzumab (SGN-40), CP-870,893 ili Chi Lob 7/4.
[0430] U jednom tehničkom rešenju, subjekt koji je bolestan i čija bolest može imati koristi od stimulacije imunog sistema, npr., kancer ili infektivna bolest, leči se administriranjem subjektu imunoonkološkog agensa i antitela protiv CD73, pri čemu je imunoonkološki agens CD27 agonist, kao što je agonističko CD27 antitelo. Pogodna CD27 antitela uključuju, na primer, varlilumab (CDX-1127).
[0431] U jednom tehničkom rešenju, subjekt koji je bolestan i čija bolest može imati koristi od stimulacije imunog sistema, npr., kancer ili infektivna bolest, leči se administriranjem subjektu imunoonkološkog agensa i antitela protiv CD73, pri čemu je imunoonkološki agens MGA271 (do B7H3) (WO11/109400).
1
[0432] U jednom tehničkom rešenju, subjekt koji je bolestan i čija bolest može imati koristi od stimulacije imunog sistema, npr., kancer ili infektivna bolest, leči se administriranjem subjektu imunoonkološkog agensa i antitela protiv CD73, pri čemu je imunoonkološki agens KIR antagonist, kao što je lirilumab.
[0433] U jednom tehničkom rešenju, subjekt koji je bolestan i čija bolest može imati koristi od stimulacije imunog sistema, npr., kancer ili infektivna bolest, leči se administriranjem subjektu imunoonkološkog agensa i antitela protiv CD73, pri čemu je imunoonkološki agens IDO antagonist. Pogodni IDO antagonisti uključuju, na primer, INCB-024360 (WO2006/122150, WO07/75598, WO08/36653, WO08/36642), indoksimod, NLG-919 (WO09/73620, WO09/1156652, WO11/56652, WO12/142237) ili F001287.
[0434] U jednom tehničkom rešenju, subjekt koji je bolestan i čija bolest može imati koristi od stimulacije imunog sistema, npr., kancer ili infektivna bolest, leči se administriranjem subjektu imunoonkološkog agensa i antitela protiv CD73, pri čemu je imunoonkološki agens agonist Toll-sličnog receptora, npr., TLR2/4 agonist (npr., Bacillus Calmette-Guerin); TLR7 agonist (npr., Hiltonol ili Imikvimod); TLR7/8 agonist (npr., Rezikvimod); ili TLR9 agonist (npr., CpG7909).
[0435] U jednom tehničkom rešenju, subjekt koji je bolestan i njegova bolest može imati koristi od stimulacije imunog sistema, npr., kancer ili infektivna bolest, leči se administriranjem subjektu imunoonkološkog agensa i antitela protiv CD73, pri čemu je imunoonkološki agens TGF-β inhibitor, npr., GC1008, LY2157299, TEW7197, ili IMC-TR1.
[0436] U jednom aspektu, antitelo protiv CD73 je uzastopno administrirano pre administriranja drugog agensa, npr., imunoonkološkog agensa. U jednom aspektu, antitelo protiv CD73 se administrira istovremeno sa drugim agensom, npr., imunoonkološkim agensom. U još jednom aspekt, antitelo protiv CD73 se uzastopno administrira nakon administriranja drugog agensa. Administriranje dva agensa može početi u vremenima koja su odvojena, npr., 30 minuta, 60 minuta, 90 minuta, 120 minuta, 3 sata, 6 sati, 12 sati, 24 sata, 36 sati, 48 sati, 3 dana, 5 dana, 7 dana, ili jednu ili više nedelja, ili administriranje drugog agensa može početi, npr., 30 minuta, 60 minuta, 90 minuta, 120 minuta, 3 sata, 6 sati, 12 sati, 24 sata, 36 sati, 48 sati, 3 dana, 5 dana, 7 dana, ili jednu ili više nedelje nakon što je prvi agens administriran.
[0437] U određenim aspektima, antitelo protiv CD73 i drugi agens, npr., imunoonkološki agens, su administrirani istovremeno pacijentu, npr., infuziraju se istovremeno, npr., tokom perioda od 30 ili 60 minuta. Antitelo protiv CD73 može biti koformulisano sa drugim agensom, npr., imunoonkološkim agensom.
14
[0438] Po izboru, anti-CD73 kao jedini imunoterapijski agens, ili kombinacija antitela protiv CD73 i jednog ili više dodatnih imunoterapijskih antitela (npr., anti-CTLA-4 i/ili anti-PD-1 i/ili anti-PD-L1 i/ili anti-LAG-3 blokada) može se dalje kombinovati sa imunogenskim agensom, kao što su kancerozne ćelije, prečišćeni tumorski antigensi (uključujući rekombinantne proteine, peptide, i molekule ugljenih hidrata), ćelije, i ćelije koje su transficirane genima koji kodiraju imuno stimulišuće citokine (He et al. (2004) J. Immunol. 173:4919-28). Neograničavajući primeri tumorskih vakcina koji se mogu koristiti uključuju peptide antigena melanoma, kao što su peptidi od gp100, MAGE antigeni, Trp-2, MART1 i/ili tirozinaza, ili tumorske ćelije transficirane da eksprimiraju citokin GM-CSF (dalje raspravljano ispod). Kombinovana CD73 inhibicija i jedno ili više dodatnih antitela (npr., CTLA-4 i/ili PD-1 i/ili PD-L1 i/ili LAG-3 blokada) takođe se mogu kombinovati sa standardnim lečenjem kancera. Na primer, kombinovana CD73 inhibicija i jedno ili više dodatnih antitela (npr., CTLA-4 i/ili PD-1 i/ili PD-L1 i/ili LAG-3 blokada) mogu se efikasno kombinovati sa hemoterapijskim režimima. U tim je slučajevima moguće smanjiti dozu drugog hemoterapijskog reagensa koji se administrira sa kombinacijom predmetne objave (Mokyr et al. (1998) Cancer Research 58: 5301-5304). Primer takve kombinacije je kombinacija antitela protiv CD73 antagonista sa ili bez dodatnog antitela, kao što su antitela protiv CTLA-4 i/ili antitela protiv PD-1 i/ili antitela protiv PD-L1 i/ili antitela protiv LAG-3) dalje u kombinaciji sa dekarbazinom za lečenje melanoma. Drugi primer je kombinacija sa ili bez antitela protiv CD73 i antitela protiv CTLA-4 i/ili antitela protiv PD-1 i/ili antitela protiv PD-L1 i/ili antitela protiv LAG-3 dalje u kombinaciji sa interleukinom-2 (IL-2) za lečenje melanoma. Naučno utemeljenje iza kombinovane upotrebe inhibicije CD73 i blokade CTLA-4 i/ili PD-1 i/ili PD-L1 i/ili LAG-3 sa hemoterapijom je to da bi ćelijska smrt, koja je posledica citotoksičnog delovanja većine hemoterapijskih jedinjenja, trebalo da rezultira povećanim nivoom tumorskog antigena na putu prezentacije antigena. Ostale kombinacione terapije koje mogu rezultirati sinergijom sa kombinovanom CD73 inhibicijom sa ili bez i CTLA-4 i/ili PD-1 i/ili PD-L1 i/ili LAG-3 blokade usled ćelijske smrti uključuju zračenje, hirurgiju, ili lišavanje hormona. Svaki od ovih protokola stvara izvor antigena tumora kod domaćina. Inhibitori angiogeneze se takođe mogu kombinovati sa kombinovanom inhibicijom CD73 i blokadom CTLA-4 i/ili PD-1 i/ili PD-L1 i/ili LAG-3. Inhibicija angiogeneze dovodi do smrti tumorskih ćelija, što može biti izvor tumorskog antigena koji se ubacuje u puteve prezentacije antigena domaćina.
[0439] Antagonističko antitelo protiv CD73 kao jedini imunoterapijski agens, ili kombinacija antagonističkog CD73 i blokirajućih antitela CTLA-4 i/ili PD-1 i/ili PD-L1 i/ili LAG-3 takođe mogu da se koriste u kombinaciji sa bispecifičnim antitelima koja ciljaju efektorske ćelije koje eksprimiraju Fcα ili Fcγ receptor tumorskim ćelijama (videti, npr., američke patente sa brojevima 5,922,845 i 5,837,243). Bispecifična antitela se mogu koristiti za ciljanje dva odvojena antigena. T ćelijski krak ovih odgovora bi se povećao korišćenjem kombinovane inhibicije CD73 i blokade CTLA-4 i/ili PD-1 i/ili PD-L1 i/ili LAG-3.
[0440] U drugom primeru, antagonističko antitelo protiv CD73 kao jedini imunoterapijski agens, ili kombinacija antitela protiv CD73 i dodatnog imunostimulirajućeg agensa, npr., antitelo protiv CTLA-4 i/ili antitelo protiv PD-1 i/ili antitelo protiv PD-L1 i/ili LAG-3 agens, npr., antitelo, može se koristiti u konjugaciji sa anti-neoplastičnim antitelom, kao što je Rituxan® (rituksimab), Herceptin® (trastuzumab), Bexxar® (tositumomab), Zevalin® (ibritumomab), Campath® (alemtuzumab), Lymphocide® (eprtuzumab), Avastin® (bevacizumab), i Tarceva® (erlotinib), i slično. Kao primer i ne želeći da se veže teorijom, lečenje sa antitelom protiv kancera ili antitelom protiv kancera konjugovanim sa toksinom može dovesti do smrti ćelije kancera (npr., ćelije tumora) što bi moglo da potencira imuni odgovor posredovan imunostimulirajućim agensom, npr., CD73, CTLA-4, PD-1, PD-L1 ili LAG-3 agensom, npr., antitelom. U tipičnom tehničkom rešenju, lečenje hiperproliferativne bolesti (npr., tumora kancera) može da uključi agens protiv kancera, npr., antitelo, u kombinaciji sa anti-CD73 i po izboru dodatnim imunostimulirajućim agensom, npr., anti-CTLA-4 i/ili anti-PD-1 i/ili anti-PD-L1 i/ili anti-LAG-3 agensom, npr., antitelom, istovremeno ili uzastopno ili bilo koja njihova kombinacija, što može potencirati anti-tumorske imune odgovore od strane domaćina.
[0441] Tumori izbegavaju imunološki nadzor domaćina pomoću velikog broja mehanizama. Mnogi od ovih mehanizama se mogu prevazići inaktivacijom proteina, koji su eksprimirani tumorima i koji su imunosupresivni. Oni uključuju, između ostalog, TGF-β (Kehrl et al. (1986) J. Exp. Med.163: 1037-1050), IL-10 (Howard & O'Garra (1992) Immunology Today 13: 198-200), i Fas ligand (Hahne et al. (1996) Science 274: 1363-1365). Antitela na svaki od ovih entiteta mogu se dalje kombinovati sa antitelom protiv CD73 sa ili bez dodatnog imunostimulirajućeg agensa, npr., anti-CTLA-4 i/ili anti-PD-1 i/ili anti-PD-L1 i/ili anti-LAG-3 agens, kao što je antitelo, za suzbijanje dejstva imunosupresivnih agenasa i favorizovanje anti-tumorskih imunih odgovora od strane domaćina.
[0442] Drugi agensi, npr., antitela, koja se mogu koristiti za akiviranje imunološke reakcije domaćina mogu se dalje koristiti u kombinaciji sa antitelom protiv CD73 sa ili bez dodtanog imunostimulirajućeg agensa, kao što je anti-CTLA-4 i/ili anti-PD-1 i/ili anti-PD-L1 i/ili anti-LAG-3 antitelo. Ovi uključuju molekule na površini dendritskih ćelija koje aktiviraju DC funkciju i prezentaciju antigena. Antitela protiv CD40 (Ridge et al., supra) mogu se koristiti zajedno sa antitelom protiv CD73 i po izboru dodatnim imunostimulirajućim agensom, npr., anti-CTLA-4 i/ili anti-PD-1 i/ili anti-PD-L1 i/ili anti-LAG-3 agensom, npr., antitelom. Druga aktivirajuća antitela na kostimulatorne molekule T ćelija Weinberg et al., supra, Melero et al. supra, Hutloff et al., supra, takođe mogu da obezbede povećanje nivoa T ćelijske aktivacije.
[0443] Kao što je rečeno gore, transplantacija koštane srži trenutno se koristi za lečenje različitih tumora hematopoetskog porekla. Imunoterapija protiv CD73, sama ili u kombinaciji sa CTLA-4 i/ili PD-1 i/ili PD-L1 i/ili LAG-3 blokadom, može se koristitito za povećanje efikasnosti donor nakalemljenih tumor specifičnih T ćelija.
[0444] Nekoliko eksperimentalnih protokola lečenja uključuje ex vivo aktivaciju i ekspanziju antigen specifičnih T ćelija i adoptivni transfer tih ćelija u primaoce da bi se antigen-specifične T ćelije protiv tumora (Greenberg & Riddell, supra). Ove metode se takođe mogu koristiti za aktiviranje T ćelijskih odgovora na infektivne agense kao što je CMV. Ex vivo aktivacija u prisustvu anti-CD73 sa ili bez dodatne imunostimulirajuće terapije, npr., anti-CTLA-4 i/ili anti-PD-1 i/ili anti-PD-L1 i/ili anti-LAG-3 antitela može se očekivati da poveća učestalost i aktivnost adoptivno prebačenih T ćelija.
[0445] Ovde su date metode za promenu neželjenog događaja povezanog sa lečenjem hiperproliferativne bolesti (npr., kancera) sa imunostimulirajućim agensom, koje obuhvataju administriranje antitela protiv CD73 sa ili bez i subterapijske doze anti-CTLA-4 i/ili anti-PD-1 i/ili anti-PD-L1 i/ili anti-LAG-3 agensa, npr., antitela, subjektu. Na primer, ovde opisani postupci obezbeđuju metodu za smanjenje učestalosti kolitisa ili dijareje izazvane imunostimulirajućim terapijskim antitelom administriranjem pacijentu steroida koji se ne apsorbuje. Kako se ovde koristi, "steroid koji se ne apsorbuje" je glukokortikoid koji pokazuje opsežan metabolizam prvog prolaza, tako da je nakon metabolizma u jetri, bioraspoloživost steroida mala, tj., manja od oko 20%. U jednom tehničkom rešenju opisanom ovde, steroid koji se ne apsorbuje je budesonid. Budesonid je lokalno delujući glukokortikosteroid, koji se metaboliše obilno, primarno u jetri, nakon oralnog administriranja. ENTOCORT EC® (Astra-Zeneca) je pH- i vremenski zavisna oralna formulacija budesonida, razvijena da optimizuje isporuku leka u ileumu i celom debelom crevu. ENTOCORT EC® je odobren u U.S. za lečenje blage do umerene Kronove bolesti koja uključuje ileum i/ili ulazno debelo crevo. Uobičajena oralna doza ENTOCORT EC® za lečenje Kronove bolesti je 6 do 9 mg/dan. ENTOCORT EC® se oslobađa u crevima pre nego što se apsorbuje i zadrži u crevnoj sluznici. Jednom kada prođe kroz ciljno tkivo crevne sluznice, ENTOCORT EC® se opsežno metabolizuje citohrom P450 sistemom u jetri do metabolita sa zanemarljivom glukokortikoidnom aktivnošću. Zbog toga je bioraspoloživost mala (oko 10%). Niska bioraspoloživost budesonida rezultira poboljšanim
14
terapijskim odnosom u poređenju sa drugim glukokortikoidima sa manje opsežnim metabolizmom prvog prolaza. Budesonid rezultira sa manje štetnih efekata, uključujući manju supresiju hipotalamus-hipofize, nego kortikosteroidi koji deluju sistemski. Međutim, hronično administriranje ENTOCORT EC® može da rezultira u sistemskim efektima glukokortikoida kao što su hiperkorticizam i adrenalna supresija. Videti PDR 58. izdanje 2004; 608-610.
[0446] U još daljim tehničkim rešenjima, inhibicija CD73 sa ili bez CTLA-4 i/ili PD-1 i/ili PD-L1 i/ili LAG-3 blokade (tj., imunostimulirajuća terapijska antitela protiv CD73 i po izboru anti-CTLA-4 i/ili anti-PD-1 i/ili anti-PD-L1 i/ili anti-LAG-3 antitela) zajedno sa steroidom koji se ne apsorbuje može dalje da se kombinuje sa salicilatom. Salicilati uključuju 5-ASA agense kao što su, na primer: sulfasalazin (AZULFIDINE®, Pharmacia & UpJohn); olsalazin (DIPENTUM®, Pharmacia & UpJohn); balsalazid (COLAZAL®, Salix Pharmaceuticals, Inc.); i mesalamin (ASACOL®, Procter & Gamble Pharmaceuticals; PENTASA®, Shire US; CANASA®, Axcan Scandipharm, Inc.; ROWASA®, Solvay).
[0447] U skladu sa ovde opisanim metodama, salicilat administriran u kombinaciji sa anti-CD73 sa ili bez anti-CTLA-4 i/ili anti-PD-1 i/ili anti-PD-L1 i/ili anti-LAG-3 antitela i storoidom koji ne može da se apsorbuje može da obuhvati svako preklapanje ili uzastopnu administraciju salicilata i storoida koji ne može da se apsorbuje u cilju smanjena učestalosti kolitisa izazvanih imunostimulirajućim antitelima. Tako, na primer, metode za smanjenje slučaja kolitisa izazavanog imunostimulirajućim antitelima opisanim ovde obuhvataju administriranje salicilata i storoida koji ne može da se apsorbuje istovremeno ili uzastopno (npr., salicilat se administrira 6 sati nakon storoida koji ne može da se apsorbuje), ili bilo koju njihovu kombinaciju. Dalje, salicilat i storoid koji ne može da se apsorbuje mogu se administrirati istim putem (npr., oba se administriraju oralno) ili različitim putevima (npr., salicilat se administrira oralno a storoid koji ne može da se apsorbuje se administrira rektalno), koji mogu da se razlikuju od puta(puteva) korišćenih za administriranje antitela protiv CD73 i protiv CTLA-4 i/ili protiv PD-1 i/ili protiv PD-L1 i/ili protiv LAG-3.
[0448] Antitela protiv CD73 i kombinovane terapije sa antitelom, opisane ovde mogu se takođe koristiti u kombinaciji sa drugim dobro poznatim terapijama koje su izabrane zbog svoje posebne korisnosti u odnosu na indikaciju koja se leči (npr., kancer). Kombinacije ovde opisanih antitela protiv CD73 mogu se koristiti uzastopno sa poznatim farmaceutski prihvatljivim agensom(ima).
[0449] Na primer, antitela protiv CD73 i kombinovane terapije antitelom opisane ovde mogu se koristiti u kombinaciji (npr., istovremeno ili odvojeno) sa dodatnim tretmanom, kao što su zračenje, hemoterapija (npr., korišćenjem kamptotecina (CPT-11), 5-fluorouracila (5-FU), cisplatina, doksorubicina, irinotekana, paklitaksela, gemcitabina, cisplatina, paklitaksela, karboplatin-paklitaksela (Taksol), doksorubicina, 5-fu-a, ili kamptotecina apo21/TRAIL (6X kombo)), jedan ili više inhibitora proteazoma (npr., bortezomib ili MG132), jedan ili više Bcl-2 inhibitora (npr., BH3I-2' (bcl-x1 inhibitor), indolamin dioksigenaza-1 (IDO1) inhibitor (npr., INCB24360), AT-101 (R-(-)-gosipol derivat), ABT-263 (mali molekul), GX-15-070 (obatoklaks), ili MCL-1 (antagonisti proteina-1 diferencijacije ćelija mijeloidne leukemije)), iAP (inhibitor apoptoze proteina) antagonisti (npr., smac7, smac4, mimetički smac mali molekul, sintetički smac peptidi (videti Fulda et al., Nat Med 2002;8:808-15), ISIS23722 (LY2181308), ili AEG-35156 (GEM-640)), HDAC (histon deacetilaza) inhibitori, antitela protiv CD20 (npr., rituksimab), inhibitori angiogeneze (npr., bevacizumab), anti-angiogeni agenasi koji ciljaju VEGF i VEGFR (npr., Avastin), sintetički triterpenoidi (videti Hyer et al., Cancer Research 2005;65:4799-808), c-FLIP (ćelijski FLICE-inhibitorni protein) modulatori (npr., prirodni i sintetički ligandi od PPARγ (peroksizom proliferator-aktivirani receptor γ), 5809354 ili 5569100), inhibitori kinaze (npr., Sorafenib), Trastuzumab, Cetuksimab, Temsirolimus, mTOR inhibitori kao što je rapamicin i temsirolimus, Bortezomib, JAK2 inhibitori, HSP90 inhibitori, PI3K-AKT inhibitori, Lenalildomid, GSK3β inhibitori, IAP inhibitori i/ili genotoksični lekovi.
[0450] Ovde opisana antitela protiv CD73 i kombinovane terapije antitelom mogu se dalje koristiti u kombinaciji sa jednim ili više anti-proliferativnih citotokičnih agenasa. Klase jedinjenja koja se mogu koristiti kao anti-proliferativni citotokični agensi uključuju, ali nisu ograničeni na, sledeće: Alkilirajući agensi (uključujući, bez ograničenja, azotne iperite, etilenimin derivate, alkil sulfonate, nitrozouree i triazene): Uracil iperit, Hlormetin, Ciklofosfamid (CYTOXAN™) fosfamid, Melfalan, Hlorambucil, Pipobroman, Trietilenmelamin, Trietilentiofosforamin, Busulfan, Karmustin, Lomustin, Streptozocin, Dakarbazin i Temozolomid.
[0451] Antimetaboliti (uključujući, bez ograničenja, antagoniste folne kiseline, analoge pirimidina, analoge purina i inhibitore adenozin deaminaze): Metotreksat, 5-Fluorouracil, Floksuridin, Citarabin, 6-Merkaptopurin, 6-Tioguanin, Fludarabin fosfat, Pentostatin, i Gemcitabin.
[0452] Pogodni anti-proliferativni agensi za kombinovanje sa antagonističkim anti-CD73 antitelima, bez ograničenja, taksani, paklitaksel (paklitaksel je komercijalno dostupan kao TAXOL™), docetaksel, diskodermolid (DDM), diktiostatin (DCT), Peloruzid A, epotiloni, epotilon A, epotilon B, epotilon C, epotilon D, epotilon E, epotilon F, furanoepotilon D, dezoksiepotilon B1, [17]-dehidrodezoksiepotilon B, [18]dehidrodezoksiepotiloni B, C12,13-
14
ciklopropil-epotilon A, C6-C8 premošćen epotilon A, trans-9,10-dehidroepotilon D, cis-9,10-dehidroepotilon D, 16-desmetilepotilon B, epotilon B10, diskoderomolid, patupilon (EPO-906), KOS-862, KOS-1584, ZK-EPO, ABJ-789, XAA296A (Diskodermolid), TZT-1027 (soblidotin), ILX-651 (tasidotin hidrohlorid), Halihondrin B, Eribulin mesilat (E-7389), Hemiasterlin (HTI-286), E-7974, Cirptoficini, LY-355703, Maitansinoid imunokonjugati (DM-1), MKC-1, ABT-751, T1-38067, T-900607, SB-715992 (ispinesib), SB-743921, MK-0731, STA-5312, eleuterobin, 17beta-acetoksi-2-etoksi-6-okso-B-homo-estra-1,3,5(10)-trien-3-ol, ciklostreptin, izolaulimalid, laulimalid, 4-epi-7-dehidroksi-14,16-didemetil-(+)-diskodermolidi, i kriptotilon 1, pored ostalih agenasa za stabilizaciju mikrotubulina poznatih u oblasti.
[0453] U slučajevima kada je poželjno da se neskladno proliferativne ćelije povuku u mirovanje zajedno sa ili pre tretmana sa antitelima protiv CD73 opisanim ovde, hormoni i steroidi (uključujući sintetičke analoge), kao što je 17a-Etinilestradiol, Dietilstilbestrol, Testosteron, Prednizon, Fluoksimesteron, Dromostanolon propionat, Testolakton, Megestrolacetat, Metilprednizolon, Metil-testosteron, Prednizolon, Triamcinolon, Hlorotrianizen, Hidroksiprogesteron, Aminoglutetimid, Estramustin, Medroksiprogesteronacetat, Leuprolid, Flutamid, Toremifen, ZOLADEX™, mogu takođe da se administriraju pacijentu. Kada se koriste ovde opisani postupci ili kompozicije, drugi agensi koji se koriste u modulaciji rasta ili metastaza tumora u kliničkom okruženju, kao što su antimimetici, takođe se mogu administrirati po želji.
[0454] Metode za sigurno i efikasno administriranje hemoterapijskih agenasa poznate su stručnjacima u oblasti. Pored toga, njihovo administriranje je opisano u standardnoj literaturi. Na primer, administracija mnogih hemoterapijskhi agensa je opisana u Physicians' Desk Reference (PDR), npr., 1996 izdanje (Medical Economics Company, Montvale, N.J. 07645-1742, USA).
[0455] Hemoterapijski agens(i) i/ili terapija zračenjem mogu biti administrirani u skladu sa terapijskim protokolima koji su dobro poznati. Stručnjacima u oblasti će biti očigledno da administracija hemoterapijskog agensa(agenasa) i/ili terapije zračenjem mogu varirati u zavisnosti od bolesti koja se leči i poznatih efekata hemoterapijskog agensa(egenasa) i/ili terapije zračenjem na tu bolest. Takođe, u skladu sa znanjem kvalifikovanog kliničara, terapijski protokoli (npr., dozne količine i vremena administriranja) mogu se menjati s obzirom na posmatrane efekte administriranih terapijskih sredstava na pacijenta, i s obzirom na posmatrane reakcije bolesti na administrirane terapijske agense.
[0456] Ova predmetna objava je dalje ilustrovana sledećim primerima
14
PRIMERI
Primer 1: Stvaranje humanog antitela protiv CD73
[0457] Humana monoklonska antitela protiv humanog CD73 su generisana u Hco7, Hco27, Hco20, Hco12, Hco17, i Hc2 sojevima od HuMAb® transgenih miševa ("HuMAb" je zaštitni znak kompannije Medarex, Inc., Princeton, Nju Džerzi) i KM miševa (KM Miš® soj koji sadrži SC20 transhromozome kao što je opisano u PCT objavi WO 02/43478). HC2/KCo27 HuMAb miševi i KM miševi su generisani kako je opisano u američkim patentima sa brojevima 5,770,429 i 5,545,806.
[0458] Miševi, uključujući različite genotipove transgenih miševa (kao što su, KM, Hco7, Hco27, Hco20, Hco12, Hco17 i Hc2), su imunizovani sa različitim imunizacijskim strategijama (različit antigen, različita doza, trajanje, putevi administriranja (stopalo (fp), intraperitonealni (ip) i subkutani (sc) i ađuvans (CFA/IFA, Ribi i antitelo), itd.). Izvršene su i proverene fuzije miševa, i identifikovana su antitela iz tih fuzija. Dalja karakterizacija je dovela do izolacije antitela od posebnog interesa, uključujući antitela označena kao 11F11-1, 11F11-2, 4C3-1, 4C3-2, 4C3-3, 4D4-1, 10D2-1, 10D2-2, 11A6-1, 24H2-1, 5F8-1, 5F8-2, 6E11-1, i 7A11-1. Tabela 7 (ispod) obezbeđuje IgG izotip i alotip teških lanaca, kao i tip lakog lanca, za svako antitelo. Antitela koja se razlikuju samo u lakom lancu predstavljena su drugom cifrom posle crtice. Na primer, 11F11-1 ima isti teški lanac kao 11F11-2, ali 11F11-1 ima laki lanac VK1, dok 11F11-2 ima laki lanac VK2. Ako nije drugačije naznačeno, rekombinantna antitela zasnovana na VH regionima antitela u tabeli su napravljena sa pretežno lakim lancem.
Tabela 7:
Klon Izotip Preovlađujući laki lanac Ostali eksprimirani laki lanci
14
[0459] Aminokiselinske i nukleotidne sekvence od sekvence pune dužine teških i lakih lanaca, VH i VL domeni i CDR-ovi svakog antitela dati su u Listi sekvenci i u Tabeli 35. Takođe su date aminokiselinske sekvence VH i VL na Slikama 1A do 17B, a poravnanje aminokiselinskih sekvenci VH i VL različitih antitela je dato na Slici 35 (CDR sekvence su podebljane).
Primer 2: Aminokiselinske supstitucije u varijailnim regionima i izotipske varijacije
[0460] Okvirni region od VH regiona antitela 11F11 je mutiran uvođenjem jedne od više mutacija na sledećim aminokiselinskim ostacima (prikazane su aminokiseline okruženja i mutirana amino kiselina je podvučena): T25 (okvirna mutacija; ... RLSCATSGFTF...), L52 (CDR2 mutacija; ...WVAVILYDGSN...), G54 (CDR2 mutacija; ...VILYDGSNKYY...) i V94 (okvirna mutacija; ...AEDTAVYYCAR...). Nazivi konstrukata i supstitucije u svakom od njih su navedeni u Tabeli 8:
Tabela 8.
14
[0461] Takođe je modifikovan konstantni region antitela 11F11 i 4D4, njegovim prebacivanjem na konstantni region IgG2 (CH1, zglob, CH2 i CH3) sa C219S supstitucijom ("IgG2CS"; SEQ ID NO:267), i konstantnim regionom IgG1 bez efektora, sa supstitucijama L234A, L235E, G237A, A330S i P331S ("IgG1.1f"; SEQ ID NO:268) ili hibridnim konstantnim regionom IgG1/IgG2 bez efektora koji sadrži CH1 i zglob od IgG2 (sa C219S) i CH2 i CH3 od IgG1 (sa A330S/P331S) ("IgG2CS-IgG1.1f" ili "IgG2C219S-IgG1.1f"; SEQ ID NO:169). Napravljeni konstrukti navedeni su u Tabeli 9.
Tabela 9.
14
[0462] Aminokiselinska sekvenca od CD73.4-IgG2CS IgG1.1f je prikazana na Slici 18 (SEQ ID NO: 189).
[0463] Antitela CD73.3-CD73.11 su napravljena na sledeći način. Laki lanac VK2 (SEQ ID NO: 102) je korišćen za antitela koja potiču iz 11F11 (CD73.4, CD73.6, CD73.8 i CD73.10). Teški i laki lanci su eksprimirani u HEK293-6E ćelijama i kultura medijuma je sakupljana 5 dana nakon transfekcije.
[0464] Vezivanje konstrukata za humane FcγR je mereno SPR-om. Podaci vezivanje hCD64 i hCD32a-H131 za molekule IgG1.1 i IgG2 bili su u skladu sa očekivanim vrednostima za različite Fc. IgG1.1f je najviše inertan Fc. IgG2 i IgG2-C219S pokazali su tipično vezivanje FcR za IgG2. Kao što se očekivalo, podatak za IgG2-C219S-G1.1f sugeriše značajno slabije vezivanje od IgG1 ili IgG2 divljeg tipa, ali povećano vezivanje u poređenju sa IgG1.1f. IgG2-C219S-G1.1f imao je slabo hCD32a-H131 vezivanje (KDod 2.3µM) a afinitet vezivanja za sve ostale FcγR bio je manji od 5µM. Afinitet vezivanja IgG2-C219S-G1.1f za cyno FcγR-e je bio veći od 5µM. SPR analiza vezivanja IgG2-C219S-G1.1f za humani FcRn pokazala je vezivanje zavisno od pH (snažno na pH6, i slabo vezivanje sa brzom disocijacijom na pH 7.4).
[0465] Nađeno je da rekombinantni preparati često nemaju C-terminalni Lys teškog lanca. Na primer, 97% teških lanaca antitela CD73.4.IgG2-C219S-G1.1f nije imalo C-terminalni lizin. Određeni preparati imali su piro-Q na N-terminalu Q (glutamin) teškog lanca. Na primer, 94% N-terminalnog glutamina teškog lanca od antitela CD73.4.IgG2-C219S-G1.1f bio je piro-Q.
Primer 3: Karakteristike vezivanja antitela protiv CD73
A. Površinska plazmonska rezonancija (SPR – Surface Plasmon Resonance)
[0466] Kinetike i afinitet vezivanja CD73 su proučavani površinskom plazmonskom rezpnancijom (SPR) korišćenjem Biacore T100 instrumenta (GE Healthcare) na 25°C.
[0467] Jedan eksperimentalni format testirao je vezivanje N-terminalnog domena od hCD73 (sastoji se od ostataka 26 - 336 humanog CD73; označen N-hCD73) za antitela koja su zarobljena na imobilizovanim površinama proteina A. Za ove eksperimente, protein A (Pierce) je imobilizovan do gustine od 3000 - 4000 RU u protočnim ćelijama 1-4 od CM5 senzorskog čipa (GE Healthcare) korišćenjem standardne etil(dimetilaminopropil) karbodiimid (EDC) / N-hidroksisukcinimid (NHS) hemije, sa etanolaminskim blokiranjem, u radnom puferu od 0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% v/v tween 20. Kinetički eksperimenti su izvedeni prvim hvatanjem antitela (5-10ug/ml) na površinama proteina A korišćenjem 30 s
1
kontaknog vremena pri 10ul/min, sa vezivanjem 600, 200, 66.7, 22.2, 7.4, i 2.5 nM N-hCD73-his, koristeći vreme asocijacije od 180 s i vreme disocijacije od 360 s pri protoku od 30 ul/min. Radni pufer za kinetičke eksperimente bio je 10 mM natrijum fosfat, 130 mM natrijum hlorid, 0.05% tween 20, pH 7.1. Površine su regenerisane nakon svakog ciklusa korišćenjem dva 30 s impulsa od 10 mM glicina pH 1.5 pri brzini protoka od 30 µl/min. Podaci senzograma bili su dvostruko upoređeni i zatim su podešeni na 1:1 Langmuir model pomoću Biacore T100 softvera za procenu v2.0.4, da bi se odredila konstanta brzine asocijacije (ka), konstanta brzine disocijacije (kd), i ravnotežna konstanta disocijacije (KD).
[0468] Rezultati su prikazani u Tabeli 10. U tabeli se nalaze podaci iz različitih eksperimenata. Za antitela za koja su prikazana dva ili više skupa brojeva, svaki skup odgovara podacima dobijenim u zasebnom eksperimentu.
1 1
Kinetike vezivanja CD73 mAb za N-hCD73-his (hCD73(26-336)His) na 25C°
1 2
[0469] KDu tabeli je monovalenta KD, tj., KDvezivanja antitela na N-terminalni deo humanog CD73, koji je monovalentan.
[0470] Mutacija G54S se tolerše i čini se da malo povećava afinitet, istovremeno uklanjajući predviđeno mesto DG izomerizacije. Čini se da mutacija L52W uzrokuje smanjenje afiniteta za približno 10 puta.4D4 varijante imaju jedinstvene CDR3 sekvence i različite kinetike (sporije udruživanje u poređenju sa 11F11 molekulima).
[0471] Prosečna KDiz 10 eksperimenata za CD73.4- IgG2-C219S-IgG1.1f je 1.1 ± 0.4 nM. Mutacija T25A u odnosu na 11F11 ne utiče na afinitet.
[0472] Rezultati pokazuju da se sva antitela protiv CD73 vezuju za humani CD73 sa dobrim afinitetom i imaju sporu stopu disocijacije.
[0473] Rezultati ispitivanja vezivanja pokazuju da je aktivnost vezivanja održavana nakon uvođenja mutacija u 11F11, 4C3 ili 4D4, ili izotipske promene, iako su neka antitela imala smanjeni afinitet u odnosu na originalno antitelo (tj., 11F11, 4C3 ili 4D4). Konkretno, CD73.10 (T25A,L52W,G54E) ima brži stepen disocijacije u odnosu na CD73.4 (T25A) ili CD73.11 (4D4). Poređenje svih IgG2 molekula pokazuje da 11F11 i CD73.4 (11F11-T25A) imaju najveći monovalentni afinitet CD73 (KD = 1.1 nM ± 0.4 nM). CD73.10 (11F11-T25A, L52W, G54E) ima ∼10-puta niži CD73 afinitet od 11F11 ili CD73.4. Ovo sugeriše da ili L52W ili G54E ili obe mutacije smanjuju afinitet CD73 kada su u kombinaciji sa ostalim sekvencama 11F11. 4D4 i CD73.11 imaju afinitet uporediv sa CD73.10 (KD ∼5nM), ali različite kinetike. Veruje se da epitop 4C3 obuhvata regione N- i C-domena CD73, zbog toga je za izolovani N-domen izmerena slaba KD (KD = 100-200 nM).
[0474] Takođe je ispitivano vezivanje CD73.4-IgG2-C219S-IgG1.1f za cyno CD73. Specifičnost CD73.4-IgG2-C219S-IgG1.1f za vezivanje CD73 cinomolgus majmuna upoređena je sa vezivanjem za humani CD73 površinskom plazmonskom rezonancijom (SPR) korišćenjem Biacore T100 instrumenta (GE Healthcare) na 25°C. Vanćelijski domen pune dužine bilo humanog CD73 (sastoji se od ostataka 27 - 547 humanog CD73 povezanog sa His oznakom, nazvanim hCD73-his) ili CD73 cinomolgusa (sastoji se od ostataka 27 - 547 CD73 cinomolgusa povezanog sa His oznakom, nazvanim cy-CD73-his) su testirani na vezivanje za antitela koja su zarobljena na površinama imobilizovanog proteina A. Za ove eksperimente, protein A (Pierce) je imobilizovan do gustine od 3000 - 4000 RU u protočnim ćelijama 1-4 senzorskog čipa CM5 (GE Healthcare) korišćenjem standardne etil(dimetilaminopropil) karbodiimid (EDC) / N-hidroksisukcinimid (NHS) hemije, sa etanolaminskim blokiranjem, u radnom puferu od 0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% v/v tween 20. Eksperimenti su izvedeni prvo hvatanjem antitela (5-10ug/ml) na površinama proteina A
1
koristeći vreme kontakta od 30 s pri 10ul/min, sa vezivanjem 600, 200, 66.7, 22.2, 7.4, i 2.5 nM hCD73-his ili cyno-CD73-his, koristeći vreme asocijacije od 180 s i vreme disocijacije 360 s pri protoku od 30 ul/min. Radni pufer za ove eksperimente bio je 10 mM natrijum fosfat, 130 mM natrijum hlorid, 0.05% tween 20, pH 7.1. Površine su regenerisane nakon svakog ciklusa korišćenjem dva 30 s impulsa od 10 mM glicina pH 1.5 pri brzini protoka od 30 µl/min.
[0475] Rezultati, koji su prikazani na Slici 19, pokazuju da se CD73.4-IgG2-C219S-IgG1.1f veže sa sličnim afinitetom i kinetikama za cyno i humani CD73. CD73.4-IgG2-C219S-IgG1.1f se vezuje za dimer humanog i cyno CD73 pune dužine sa KD manjom od 1nM. Nije primećena značajna unakrsna reaktivnost CD73.4-IgG2-C219S-IgG1.1f na mišjem i pacovskom CD73.
[0476] Kinetike i afinitet izolovanog fragmenta Fab iz antitela 11F11 su takođe ocenjeni sa SPR. U ovim eksperimentima, Fab domen iz mišjeg antitela protiv 6xHis je imobilizovan na senzorskom čipu CM5 korišćenjem EDC/NHS do gustine od -3000 RU. hCD73-his pune dužine je zarobljen u 10 RU gustine na Fc2 (1ug/ml hCD73-his), 40 RU gustine na Fc3 (5ug/ml hCD73-his) i 160 RU gustine na Fc4 (20ug/ml hCD73-his), koristeći vreme kontakta od 30 s pri 10 ul/min. Zatim je fragment 11F11 Fab (prečišćen od pepsinom-odcepljenog L-cisteinredukovanog 11F11 antitela) testiran za vezivanje pri 400, 135, 44.4, 14.8, 4,9, 1.7, 0.55 nM, korišćenjem vremena asocijacije 180 s, vremena disocijacije 600 s pri 30 ul/min, u radnom puferu od 10 mM natrijum fosfata, 130 mM natrijum hlorida, 0.05% tween 20, pH 7.1. Površine su regenerisane nakon svakog ciklusa korišćenjem dva 15 s impulsa od 10 mM glicina pH 2.0 pri protoku od 30 µl/min. Podaci senzograma su dvostruko upoređeni i zatim su postavljeni na 1:1 Langmuirov model korišćenjem Biacore T100 programa za procenu v2.0.4, da bi se odredila konstanta brzine asocijacije (ka), konstanta brzine disocijacije (kd), ravnotežna konstanta disocijacije (KD). Rezultati su prikazani u Tabeli 11 ispod.
Tabela 11.
1 4
[0477] Dakle, rezultati pokazuju da 11F11 Fab fragment ima visoki afinitet za hCD73 (KD∼0.74nM).
B. Vezivanje CD73 antitela na CD73 potitivne ćelije
[0478] Titracione krive vezivanja su dobijene sa antitelima CD73 na Calu6 (CD73 endogeni ekspresori; ćelijska linija humanog pulmonarnog adenokarcinoma), DMS114 (negativna CD73; ćelijska linija humanog sitnoćelijskog kancera pluća), CHO-cyno CD73 (transfeciran cyno CD73) i CHO-K1 (negativni cyno CD73), ćelijama koristeći Alexa Fluor® 647 Kozji Anti-Humani IgG (H+L) kao sekundarno antitelo, Invitrogen kat. br. A-21445, koristeći sledeću metodu: stavljeno je 100000 ćelija na ploču u 100uL PBS+2% FBS-a po bunaru i blokirano tokom 20min. Korišćenjem ploče sa 96 dubokih bunara sa dnom u obliku slova U, zapremine antitela i PBS+2% FBS su kombinovane kako je diktirano u Tabeli 12 ispod.
Tabela 12.
[0479] Serijsko razblaženje u 8 tačaka izvršeno je razblaživanjem šestine zapremine (90uL) u 450µL PBS+2% FBS-a. Ćelijska ploča je spinovana 5 minuta na 1500 opm. Dodato je 100uL razblaženog antitela po bunaru ploče. 100uL PBS+2% FBS-a je dodato u sve ostale bunare. Ploče su obojene na ledu tokom 45min, spinovane su pri 1500 opm tokom 5min i isprane dva
1
puta sa 200uL PBS-a 2% FBS-a po bunaru. Bunari koji su primili nekonjugovano antitelo, plus jedan neobojeni bunar po ćelijskoj liniji, su resuspendovanovani u 100uL APC antihumanog sekundarnog antitela (20ug/mL). 100uL PBS-a 2% FBS-a je dodato u sve ostale bunare, i obojeno na ledu tokom 45min. Ploče su spinovane pri 1500 opm tokom 5min i isprane sa 200uL PBS-a 2% FBS-a po bunaru. Ploče su ponovo isprane, resuspendovane sa 200uL 2% FBS-a u PBS-u po bunaru i uzorci su obrađeni.
[0480] Rezultati, koji su prikazani na Slikama 20A1, 20A2, 20B1, 20B2, 20C1, 20C2, 20D1, 20D2, i Tabeli 13, pokazuju da se sva antitela CD73 vežu na ćelije koje prirodno eksprimiraju CD73 (Calu6 ćelije) i CHO ćelije koje su transficirane da eksprimiraju cyno CD73, ali da se antitela ne vezuju za ćelije koje ne eksprimiraju CD73 (DMS114 i CHO-K1). EC50 vezivanja dobijene za svako antitelo su prikazane u Tabeli 13.
Tabela 13.
[0481] EC50 vezivanja CD73.4-IgG2-IgG1.1f za humane tumorske ćelijske linije je bila 0.5nM (opseg od 0.3 do 0.67nM). EC50 vezivanja CD73.4-IgG2-IgG1.1f za cyno CD73 transfektovane CHO ćelije je bila 0.3nM (opseg 0.1 do 0.5nM).
[0482] Određeno je takođe vezivanje antitela CD73.4 za humane B i T ćelije. Human krv od dva donora, D316 i D329, dobijena je od Immunsciences, BMS. Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su izolovane sa gradijentnim medijumom za razdvajanje ćelija Limfolit-H. PBMC su inkubirani sa serijski razblaženim FITC-obeleženim CD73.4-IgG2, CD73.4-IgG2-IgG1.1f, ili CD73.4-IgG1.1f antitelima, i T ćelije i B ćelije su identifikovane sa fluorohrom-obeleženim
1
antitelima za CD3 i CD20. Ćelije oba donora su sakupljene za neobojene i FMO (Fluorescencija minus jedan) kontrolne uzorke. Rezultati, koji su prikazani na Slikama 20E i F i Tabeli 14, pokazuju da se antitela vezuju specifično za humane B i T ćelije.
Tabela 14: IC50 vezivanja CD73 antitela za B i T ćelije
Primer 4: Biofizičke karakteristike antitela protiv CD73
A. Ekskluziona hromatografija po veličini spojena sa linijskim detektorom raspršivanja svetlosti iz više uglova (SEC-MALS)
[0483] Oligomerno stanje od CD73 mAb je ispitivano ekskluzionom hromatografijom po veličini u vezi sa linijskim detektorom raspršivanja svetlosti iz više uglova (eng. Multi-Angle Light Scattering Detector SEC-MALS). Izokratska odvajanja izvedena su na Shodex PROTEIN KW-803 koloni koja je povezana sa Prominence Shimadzu UFLC u puferu koji sadrži 200 mM K2HPO4, 150 mM NaCl, pH 6.8, sadrži 0.02% Na azida (0.1 µm filtrirano) sa brzinom od 0.5 mL/min. Uzorci su ubrizgani u kolonu korišćenjem SIL-20AC Prominence Shimadzu autouzorkivača, i podaci su dobijeni iz tri „online“ detektora povezanih u nizu: Prominence SPD-20AD diodni niz UV/vis spektrofotometar praćen Wyatt miniDAWN™ TREOS detektorom raspršivanja svetlosti iz više uglova zatim Wyatt Optilab T-rEX detektor inteksa refrakcije. Podaci (kao što je pokazano u Tabeli 15 ispod) su prikupljeni i analizirani korišćenjem Astra (Wyatt) i Labsolutions (Shimadzu) softvera. Rezultati su prikazani u Tabeli 15.
B. Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija (DSC)
1
[0484] Termička stabilnost od CD73 mAb određena je korišćenjem MicroCal Kapilara DSC instrumenta (GE Healthcare). Antitela su analizirana u koncentracijama od 0.5 - 0.75 mg/ml u PBS-u pH 7.1. Da bi se stabilizovala osnovna linija DSC instrumenta i dobila konzistentna termička istorija, pre analize uzorka snimljeno je više skenova samog pufera, kako u uzorku tako i u referentnoj ćeliji. Skeniranje uzorka sadrži mAb u ćeliji uzorka i PBS pH 7.1 u referentnoj ćeliji. Sva skeniranja su izvršena od 10-110°C brzinom skeniranja od 60°/h koristeći 5 minutni period termostatiranja pre ciklusa i nije bilo termostatiranja posle ciklusa. Podaci (kao što je prikazano u Tabeli 15 ispod) su analizirani korišćenjem MicroCal Origin Cap DSC softvera za analizu. Odgovarajuća pufer-pufer skeniranja slepe probe (eng. blank) oduzeta su od podataka za uzorak-pufer, i vrednosti temperature središnje tačke prelaza (Tm) su određene prilagođavanjem podataka modelu koji nije 2-stanje. Rezultati su prikazani u Tabeli 15. Tm1, Tm2 i Tm3 su Tm za različite domene u antitelima.
Tabela 15. SEC-MALS i DSC
1
[0485] Rezultati pokazuju da su sva antitela uglavnom monomerna i stabilna.
Primer 5: Inhibicija enzimske aktivnosti antitelima protiv CD73
A. Inhibicija enzimske aktivnosti za perlice vezanog CD73
[0486] Da bi se procenila inhibicija enzimske aktivnosti za perlice vezanog CD73 antitelima protiv CD73, korišćeni su sledeći materijali i metode:
Materijali
[0487] TM pufer: 25mM Tris, 5mM MgCl2u vodi
0.5mM Natrijum fosfatni pufer, pH8.0
Pufer za ispiranje (10mL 0.5mM Natrijum fosfat, pH8.0; 10mL 5M NaCl; 34mL voda; 10uL Tween-20)
Dinatrijumova so adenozin 5'-monofosfata, Sigma Cat#01930-%G, 300mM u TM puferu Hidrat dinatrijumove soli adenozin 5'-trifosfata, Sigma Cat#A6419-1G, 100mM u TM puferu rhCD73, 0.781mg/mL
1
cyno CD73, Sino Biological Inc kat.br.90192-C08H
Magnetne his-obeležene perlice, Invitrogen kat.br.10103D
CellTiter-Glo® Luminiscentni esej ćelijske vijabilnosti, Promega kat.br.G7572 mAbO, nepovezano antitelo koje ne vezuje CD73
Metode
[0488] Serijsko razblaženje antitela protiv CD73 u 6 tačaka navedeno u Tabeli 16 (maksimalne koncentracije 10ug/mL) izvršeno je kombinovanjem zapremina kako je potvrđeno u Tabeli 16, ili razblaživanjem 3-puta (prenošenje 225uL u 450uL TM pufera). Sva antitela sa IgG2 zglobom sadržala su C219S mutaciju.
Tabela 16.
[0489] Magnetne perlice (2ul perlica po uzorku) su isprane u 1mL natrijum-fosfatnog pufera u epruveti za mikrocetrifugu. Perlice su skinute magnetom i resuspendovane u 400uL TM pufera. Za svaku vrstu CD73: U posebnoj epruveti, CD73 (75ng po uzorku) je kombinovan sa TM da bi se zapremina povećala do 400uL. Treća epruveta je pripremljena za prazne perlice (bez CD73). Suspenzija perlica je kombinovana sa rastvorom rhCD73 i mešana na šejkeru tokom
1
5min na sobnoj temperaturi. Perlice su skinute magnetom i perlice su isprane u 1mL pufera za ispiranje. Perlice su skinute magnetom i resuspendovane u TM puferu (40uL po uzorku). Perlice su prenete u PCR ploče sa 96-bunara (40uL po bunaru).200uL po bunaru serijski razblaženog CD73 HuMab je dodato u ploče i dobro je mešano. Ploče su inkubirane tokom 30 min na sobnoj temperaturi. Pripremljeno je 700uL svakog od 400uM ATP-a (8X) i 1.2mM AMP-a (8X). Bilo je kombinovano 650uL od svakog da bi se napravio 4X AMP/ATP miks štoka. Perlice su skinute i isprane dva puta sa 200uL TM pufera po bunaru. Perlice su ponovo skinute i resuspendovane u 30uL TM pufera.30uL perlica je prebačeno u crne ploče sa 96 bunara.10 uL od 4x rastvora štoka AMP/ATP (finalna koncentracija 150uM AMP/50uM ATP) je dodato i mešano. Dodati su kontrolni bunari (finalna koncentracija 150uM AMP i/ili 50uM ATP) u zapremini od 40uL. Ploče su inkubirane tokom 15 min na 37°C.
[0490] Rezultati su prikazani na Slikama 21A1, 21A2, 21B1, i 21B2, i Tabeli 17.
Tabela 17:
1 1
[0491] Rezultati enzimske inhibicije cyno CD73 su predstavljeni u Tabeli 18.
Tabela 18:
[0492] Rezultati pokazuju da antitela zavisno od doze inhibiraju enzimsku aktivnost humanog CD73. CD73.4.IgG2-C219S-IgG1.1f ima EC50 od 2.97 (opseg 2.9 do 3.1nM) u testu enzimske inhibicije rekombinantnog humanog CD73. CD73.4.IgG2-C219S-IgG1.1f ima EC50 od 3.7 (opseg 1.6 do 12.6 nM) u testu enzimske inhibicije rekombinantnog cyno CD73. Stoga, sva testirana antitela na CD73 inhibiraju enzimsku aktivnost za perlice vezanog humanog i cyno CD73.
B. Inhibicija CD73 enzimske aktivnosti u Calu6 ćelijama
[0493] Ovaj primer opisuje procenu Calu6 (CD73 pozitivnih) i DMS-114 (CD73 negativnih) ćelija za CD73 defosfolrilaciju AMP-a nakon tretmana antitelima protiv CD73.
Materijali:
[0494] CD73 antitela; vidi tabelu ispod
MabO kontrolno antitelo, 5.38 mg/mL
TM pufer: 25mM Tris, 5mM MgCl2u vodi
1 2
Dinatrijumova so adenozin 5'-monofosfata, Sigma kat.br.01930-%G, 300mM u TM puferu Hidrat dinatrijumove soli adenozin 5'-trifosfata, Sigma kat.br.A6419-1G, 100mM u TM puferu rhCD73, 0.781mg/mL
CellTiter-Glo® Luminiscentni esej ćelijske vijabilnosti, Promega kat.br.G7572
Metode:
[0495] Antitela su bila serijski razblažena kombinovanjem zapremina prečišćenih antitela i PBS-a kako je diktirano u Tabeli 19 ispod u ploči, sa dnom u obliku slova U, sa 96-bunara. Izvršeno je serijsko razblaženje u 6-tačaka sa antitelima (maksimalne koncentracije 25ug/mL, 300uL) i razblaženje u 5 tačaka, i prenošenje 60uL u 240uL PBS-a. Sva antitela sa IgG2 zglobom sadrže C219S mutaciju.
Tabela 19.
[0496] Ćelije su sakupljene sa Versene-om i izbrojane. Ploče su zasejane, spinovane na 1500opm tokom 5min, i resuspendovane u 100uL serijski razblaženog antitela. Svi ostali bunari su resuspendovani u 100uL PBS-a. Inkubacija je bila na 37°C tokom 20min. Pripremljeno je 15mL 180uM štoka AMP-a u TM puferu.
1
[0497] Ploče su spinovane na 1500opm tokom 5min i isprane jednom sa 200uL PBS/bunar. Ploče su spinovane ponovo i resuspendovane u 100uL AMP-a. Svi ostali bunari su resuspendovani u 100uL TM pufera. Ćelije su inkubirane sa AMP-om tokom 60min na 37°C. Pripremljeno je 7.5mL 60uM štoka ATP-a u TM puferu. Ploče su spinovane na 1500opm tokom 5 min i 50uL supernatanta je prebačeno u crne ploče sa 96 bunara. Dodato je 50uL ATP-a. rhCD73 je dodat u određene bunare sa 75ng po bunaru kao pozitivna kontrola. Bunari koji nisu primili rhCD73 napunjeni su do 100uL sa TM puferom. Finalna koncentracija je bila 90uM AMP-a: 30uM ATP-a. Inkubacija je bila na 37°C tokom 15 min. Za CellTiterGlo Test (koji detektuje ATP), dodato je 100uL po bunaru i ploče su očitane.
[0498] Rezultati, koji su prikazani na Slikama 22A1, 22A2, 22B1, 22B2, i Tabeli 20, pokazuju da antitela protiv CD73 inhibiraju defosforilaciju AMP-a (ili smanjuju preradu AMP-a) u humanim CD73 pozitivnim Calu6 ćelijama, ali nemaju efekat u CD73 negativnim DMS114 ćelijama. EC50 za blokadu endogenog ćelijskog CD73 u humanoj tumorskoj ćelijskoj liniji Calu6 od CD73.4-IgG2S-IgG1.1f antitela je 0.39nM (opseg 0.31 do 0.48nM). Ovi eksperimenti su ponovljeni u ćelijama NCI-H292 (ćelijska linija mukoepidermoidnog karcinoma) i SK-MEL-24 (ćelijska linija humanog melanoma) i rezultati su bili slični (Tabela 20).
Tabela 20:
1 4
C. Inhibicija enzimske aktivnosti CD73 u cAMP eseju dualne ćelijske linije cAMP eseju homogene vremenski razložene fluorescencije (HTRF)
[0499] Antitela CD73 su serijski razblažena sa PBS puferom koji sadrži 0.2% BSA, i nanošena su na ploče 5 µl/bunar u proksi ploču sa belim dnom sa 384 bunara (PerkinElmer, Waltham,
1
MA). Calu-6 ćelije su sakupljene i resuspendovane u PBS-u koji sadrži 0.2% BSA, a zatim je na ploču naneto 5 µl ćelija (300 ćelije/bunar). Ćelije su inkubirane sa antitelima tokom 10 minuta na 37°C 5% CO2i 95% vlažnosti, nakon čega je sledilo dodavanje 5 µl/bunar 80mM AMP-a. Ćelije su dalje inkubirane sa AMP-om tokom 30 minuta na 37°C. Za to vreme, HEK293/A2AR ćelije su sakupljene i razblažene do 0.4 miliona/ml u PBS-u koji sadrži 0.2% BSA. One su dodate u esej ploču pri 5 µl/bunar i nastavljena je inkubacija na 37°C tokom 1 sata. HRTF eseji su izvedeni korišćenjem homogene vremenski razložene fluorescencije (HTRF) HiRange cAMP detekcijskog kita (Cisbio, Bedford, MA) dodavanjem 10 µl/bunar cAMP-konjugovanog d2 i 10 µl/bunar europijum kriptata konjugovanog sa anti-cAMP antitelom u puferu za liziranje prema upustvima proizvođača. Ploče su inkubirane na sobnoj temperaturi tokom 60 minuta i očitani su fluorescentno rezonantni energetski transfer (Fluorescence Resonance Energy Transfer - FRET) signali (665 i 615 nM) korišćenjem čitača ploča EnVision (PerkinElmer, Waltham, MA). FRET signal je izračunat kao odnos signala od 665 nm (akceptor) i 615 nm (donor) kanala i množenjem sa 10,000. Izmereni su IC50i Ymax. Ymax je određen poređenjem sa dozom od 100nM od 11F11 kao internim maksimumom. Sva izračunavanja su određena kao procenat inhibicije u poređenju sa ovom kontrolom, koja je postavljena na 100%.
[0500] Rezultati, koji su prikazani u Tabeli 21, pokazuju da su mAb protiv CD73 pokazala različite efikasnosti i potencijale u ovom cAMP testu korišćenjem sistema ko-kulture ćelijske linije. Sva Ab pokazuju neko smanjenje u proizvodnji adenozina, i obim inhibicije bio je sličan za većinu proverenih Ab. Najveća inhibicija primećena je kod 11F11, 11A6, 4C3 i 5F8.
Tabela 21:
[0501] Enzimski testovi i inhibicije takođe su sprovedeni sa 11F11 Fab i F(ab')2. Rezultati, koji
1
su prikazani na Slici 22C, pokazali su da se enzimska inhibicija dogodila sa F(ab')2fragmentom, ali ne i sa Fab fragmentom. Dakle, Fc region nije potreban za enzimsku inhibiciju 11F11, ali je potrebna bivalentnost.
[0502] Enzimska inhibicija u Calu6 ćelijama je takođe određena za CD73.4 antitela koja sadrže različite konstantne regione teškog lanca, koji su prikazani u Tabeli 26, koristeći cAMP test opisan gore. Rezultati, u pogledu EC50 i nivoa inhibicije u odnosu na pozidinu ("S:B") dati su u poslednje dve kolone Tabele 28. Rezultati pokazuju da sva CD73.4 antitela inhibiraju enzimsku aktivnost humanog CD73 u Calu6 ćelijama.
D. Vremenski tok inhibicije enzimske aktivnosti CD73
[0503] Inhibicija enzimske aktivnosti takođe je procenjena u vremenskom toku ocenjivanjem stvaranja adenozinina pomoću LC/MS/MS. Calu6 ćelije su inkubirane sa 11F11 ili 4C3 tokom 30 minuta, 2 sata ili 4 sata, nakon čega sledi dodavanje 50µM AMP-a i procena proizvodnje adenozina pomoću LC/MS/MS korišćenjem standardnih metoda.
Uslovi Masene Spektrometrije (Xevo TQ-S):
[0504] Instrument: Xevo TQ-S (sa Waters 2777C)
1
[0505] Rezultati, koji su prikazani na Slici 22D, pokazuju da vreme inkubacije pravi razliku u vremenskoj tački od 30 min i da se inhibicija sa 11F11 dešava brže od one sa 4C3. Iako su oba antitela postigla jednaku inhibiciju na kasnijim vremenskim tačkama, antitelo 11F11 brže inhibira CD73 enzimsku aktivnost u ćelijama.
Primer 6: Internalizacija CD73 posredovana antitelom
[0506] Internalizacija CD73 posredovana antitelom protiv CD73 merena je u dva različita testa.
A. Test internalizacije visokog sadržaja (test vremena fiksiranog na 2 sata)
[0507] Antitela protiv CD73 korišćena su za testiranje CD73 internalizacije, zavisne od antitela protiv CD73, u Calu6 ćelijama procenom ćelijske ekspresije nakon 2 sata inkubacije antitela. Ćelije (2,000 ćelije/bunar) u 20 µl kompletnog medijuma (Gibco RPMI Media 1640 sa 10% toplog inaktiviranog fetalnog goveđeg seruma) su nanešene na ploču 384 BD Falcon plate i gajene su preko noći na 37°C 5% CO2i 95% vlažnosti. Antitela protiv CD73 su serijski razblažena sa PBS puferom koji sadrži 0.2% BSA, i naneta su pri 5 µl/bunar na ćelijsku ploču. Ćelije su inkubirane sa antitelima tokom 2 sata na 37°C 5% CO2i 95% vlažnosti, nakon čega su jednom isprane sa PBS puferom. Formaldehid (finalno 4% u PBS-u) je zatim nanet na ćelijsku ploču sa 20ul/bunar, i ploča je inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 10 minuta, nakon čega je sva tečnost aspirirana i ćelije su isprane jednom sa 30µl PBS-a. Antitelo za detekciju (2.5 µg/bunar od anti-CD73 Ab CD73.10.IgG2C219S) je dodato sa 15 µg/bunar u fiksiranu ćelijsku ploču. Ćelije su inkubirane na 4°C preko noći. Sledećeg dana, ploča je isprana dva puta sa PBS puferom, nakon čega je dodato sekundarno antitelo koje sadrži Alexa-488 kozje anti humano i DAPI, obojeno tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Nakon 3 ispiranja u PBS puferu, ploča je slikana na Arraysean Vti (Cellomics, Pittsburgh, PA), i izmereni su IC50i Ymax. Ymax je određen poređenjem sa dozom od 100 nM od 11F11 kao internim maksimumom. Svi proračuni su određeni kao procenat internalizacije u poređenju sa ovom kontrolom, koja je postavljena na 100%.
[0508] Rezultati su prikazani u Tabeli 22.
Tabela 22:
1
[0509] Dakle, rezultati pokazuju da je EC50 od CD73 internalizacije posredovane sa CD73.4.IgG2-C219S-IgG1.1f u ćelijskoj liniji Calu6 koja eksprimira humani CD73 bila 1.2 nM, i da je maksimalni nivo internalizacije u ćelijskoj liniji bio 97.5%.
[0510] Testovi internalizacije su takođe sprovedeni sa 11F11 Fab i F(ab')2. Rezultati, koji su prikazani na Slici 22C, pokazuju da se internalizacija dogodila sa F(ab')2fragmentom, ali ne i sa Fab fragmentom. Stoga, Fc region nije potreban za internalizaciju 11F11.
[0511] Sprovedene su kinetičke studije internalizacije za procenu brzine internalizacije. Ćelije (2,000 ćelija/bunar) u 20 µl kompletnog medijuma (Gibco RPMI Media 1640 sa 10% toplog inaktiviranog fetalnog goveđeg seruma) su nanete na ploču 384 BD Falcon plate i gajene su preko noći na 37°C 5% CO2i 95% vlažnosti. CD73 antitela su razblažena u PBS puferu koji
1
sadrži 0.2% BSA do 10µg/ml i dodate su sa 5 µl/bunar u ćelijske ploče. Ćelije su inkubirane sa antitelima tokom vremenskog kursa 0-2 sata na 37°C, nakon čega su jednom isprane sa PBS puferom. Ćelije su potom fiksirane sa formaldehidom (konačnih 4% u PBS-u) na sobnoj temperaturi tokom 10 minuta, i zatim isprane jednom sa 30ul PBS-a. Antitelo za detekciju (2.5 µg/bunar anti-CD73 Abs CD73.10.IgG2C219S) je razblaženo sa PBS puferom koji sadrži 0,2% BSA, i dodato 15 µl/bunar u fiksirane ćelijske ploče. Ploča je inkubirana na 4°C preko noći. Sledećeg dana, nakon 3 ispiranja u PBS puferu, dodato je sekundarno antitelo Alexa488-kozje anti humano sa DAPI. Ćelije su obojene tokom 60 minuta na sobnoj temperaturi, nakon 3 ispiranja, dobijene su slike korišćenjem Arrayscan Vti (Cellomics, Pittsburgh, PA). Rezultati su prikazani na Slikama 23A - 23D i Tabelama 23 i 24. Vrednosti u Tabeli 24 proizilaze iz podataka prikazanih na Slikama 23A-D.
Tabela 23:
1
11
��
[0512] Rezultati pokazuju da bin 1 antitela (11F11 i njihovi derivati CD73.4 i CD73.10) pokazuju dobru EC50internalizacije i maksimalne vrednosti (97.5%), mada su neka antitela bila više internalizovana od drugih.11F11 je bio najaktivniji i internalizovan je u roku od nekoliko minuta, postigavši plato za 30 minuta, dok je 6E11 (takođe bin 1 antitelo, IgG1) internalizovan sporije, dostižući plato za oko 1 sat (Slike 23A-D). Bin 2 antitela (5F8 i 4C3) nisu bila značajno internalizovana. Pored toga, prisustvo IgG2 zgloba i CH1 domena povećalo je brzinu i stepen internalizacije. Ovaj trend je primećen u nekoliko ćelijskih linija (Slike 23A-D i Tabela 24).
B. Internalizacija merena protočnom citometrijom
[0513] Internalizacija CD73 posredovana antitelom protiv CD73 je takođe testirana protočnom citometrijom. Navedene ćelije su inkubirane sa 10 µg/mL naznačenog antitela tokom 30 minuta na ledu, isprane nekoliko puta, i prebačene na 37 °C tokom naznačenog vremena. Ćelije su sakupljene u isto vreme posle naznačenog vremena inkubacije. Ćelije su ponovo obojene primarnim antitelom (isto antitelo korišćeno za početnu inkubaciju) a zatim anti-humanim sekundarnim antitelom. Ćelije su zatim testirane na ekspresiju CD73 protočnom citometrijom.
[0514] Rezultati, koji su prikazani na Slici 23E i Tabeli 25, u skladu su sa onim dobijenim u gore opisanim testovima internalizacije, i ukazuju da su sva antitela sa IgG2 zglobom i CH1 indukovala brzu i kompletnu internalizaciju. Nivoi CD73 su ostali niski i nakon 22 sata nakon ispiranja, što ukazuje da je internalizacija trajna.
[0515] Slični rezultati, prikazani na Slici 23F i Tabeli 25, dobijeni su u ćelijskoj liniji NCI-H292, u kojoj je antitelo zadržano u kulturi tokom vremena inkubacije (bez ispiranja). Opet, ovi podaci ukazuju na brzu i značajnu internalizaciju i održavanje negativne regulacije endogenog CD73.
[0516] Testovi internalizacije su takođe sprovedeni sa humanim SNU-C1 (ćelijska linija kancera debelog creva) i NCI-H1437 (ćelijska linija nesitnoćelijskog kancera pluća) ćelijama. Rezultati, koji su prikazani na Slikama 23I i J i Tabeli 25, takođe ukazuju na brzu internalizaciju sa maksimalnim nivoom postignutim u roku od 5 sati i maksimalnim nivoom internalizacije od oko 50% za CD73.4.IgG2-C219S-IgG1.1f u SNU-C1 i 60% za NCI-H1437 ćelije. Slike 23G i H pokazuju slične kinetike internalizacije CD73.4.IgG2-C219S-IgG1.1f u Calu6 i NCI-H292 ćelije. Za grafike, koji pokazuju % internalizovanog CD73, ovaj broj je dobijen na sledeći način:
1
gde je za svako antitelo, MFIt=xje MFI u datoj vremenskoj tački i MFIt=0je maksimalna fluorescencija na t=0, i MFI<pozadina>je MFI samo sekundarnog Ab.
Tabela 25: EC50antitelom posredovane CD73 internalizacije u nekoliko ćelijskih linija
[0517] Dodatni testovi internalizacije sprovedeni su u ćelijama Calu6 i H292 kako bi se dodatno razlikovala uloga izotipa u internalizaciji. Testovi internalizacije su izvedeni kao što je gore opisano (protokol bez koraka ispiranja antitela), a antitela različitih hibridnih izotipa prikazanih u Tabeli 26 održavana su u kulturi na 10µg/mL tokom vremena inkubacije. Za eksperimente protočne citometrije, postupak iz Primera 6B prilagođen je analizi visokog protoka na pločama sa 96 bunara (za razliku od ploča sa 48 bunara) i sa 50,000 ćelija po bunaru.
1 4
Tabela 26: Konstantni regioni testirani sa varijabilnim regionima CD73.4:
1
[0518] Vezivanje FcγR se pokazalo onakvim kako se očekivalo za svaki konstrukt, tj., FcyR vezivanje je podstaknuto donjim zglobom/CH2 regionom.
[0519] Rezultati su prikazani na Slikama 23K, L, M i u Tabeli 27 i 28. Podaci prikazani u Tabeli 27 generisani su korišćenjem istog protokola opisanog u Primeru 6B. Podaci prikazani u Tabeli 28 generisani su korišćenjem istog protokola opisanog u Primeru 6A.
Tabela 27: Ymax i T1/2antitelom posredovane CD73 internalizacije u Calu6 i NCI-292 ćelijama
1
[0520] Slike 23K, L i M i Tabele 27 i 28 pokazuju da su antitela koja imaju zglob i CH1 domen od IgG2 izotipa najefikasnija u pokretanju internalizacije CD73, dok antitela koja imaju IgG1 zglob i CH1 domen odgovaraju donjim krivama na slici, tj., nižem stepenu internalizacije. Pored toga, antitela sa samo zglobom od IgG2 imaju pojačanu internalizaciju u poređenju sa zglobom humanog IgG1. Pored toga, antitela koja imaju zglob i CH1 domen od IgG2 izotipa imaju superiorne karakteristike internalizacije u odnosu na antitela sa IgG1 izotipom.
1
[0521] Prema tome, antitelo mAb-CD73.4-IgG2CS-IgG1.1f protiv CD73 indukuje brzu internalizaciju u zavisnosti od testirane ćelijske linije. T1/2 za internalizaciju je variralo od minuta do manje od jednog sata. Većina testiranih ćelijskih linija imale su T1/2 ispod 10 minuta. Skoro kompletna internalizacija je indukovana za neke ćelijske linije i sve testirane su imale najmanje 50% smanjene površinske ekspresije CD73 koje obično dostižu maksimalne nivoe za 5 sati, što je mnogo kraće u nekim slučajevima.
[0522] Podaci SEC-MALS i DLS pokazuju da se formiraju veći kompleksi između hCD73-his i mAb koji sadrže IgG2 zglob i CH1 region (IgG2-C219S ili IgG2-C219S-IgG1.1f), u poređenju sa onima koji sadrže IgG1 zglob i CH1 region (IgG1.1f).
Primer: 7: Enzimska inhibicija CD73 kod tumora u modelima životinja sa ksenograftom
[0523] Miševi koji nose subkutane humane Calu6 tumore testirani su sa CD73.10-IgG1.1, CD73.10-IgG2CS, ili CD73.10-IgG2CS-IgG1.1 posle 7 dana rasta. Antitela su dozirana pri 10 mg/kg IP. Tumori su prikupljeni na 1, 2, 3 i 7 dan nakon administriranja antitela, ugrađeni u OCT i brzo zaleđeni u ohlađenom izopentanu. Ugrađeni tumori u OCT su isečeni u odsečke od 5-6 µm i ostavljeni su da se suše preko noći na sobnoj temperaturi (st). Odsečci tumora su fiksirani tokom 2.5 min sa 1:1 smešom hladnog 10% fosfat-puferovanog formalina i acetona a zatim preinkubirani tokom 1 sata na st u 50 mM Tris-maleatnog pufera, pH 7.4 koji sadrži 2 mM CaCl2 i 0.25 M saharoze. Posle 1 sata pufer za preinkubaciju je uklonjen i zamenjen sa istim puferom obogaćenim sa 5 mM MnCl2, 2 mM Pb(NO3)2, 2.5 % Dekstrana T200, 2.5 mM levamizola, i 1 mM AMP-a. Enzimska reakcija je izvedena tokom 1 h na 37 °C. Nakon ispiranja sa DI vodom, odesčci su inkubirani tačno 1 min sa 1% (NH4)2S a zatim brzo isprani sa DI vodom. Odsečci su suprotno obojeni sa hematoksilinom, dehidrirani i pripremljeni sa sredstvom za ugradnju na bazi ksilena. Braon boja ukazuje na prisustvo aktivnog CD73, dok nedostatak druge braon boje ukazuje da je enzimska aktivnost CD73 inhibirana antitelom.
[0524] Rezultati pokazuju da CD73.10-IgG1.1, CD73.10-IgG2CS, i CD73.10-IgG2CS-IgG1.1 inhibiraju enzimsku aktivnost CD73 in vivo. Reprezentativni obojeni odsečci tumora iz miševa koji su tretirani sa CD73.10-IgG2CS-IgG1.1 antitelom su prikazani na Slikama 24A-E. Obojeni odsečci tumora iz miševa koji su tretirani sa druga dva antitela bili su slični. Stepen inhibicije CD73 povezan je sa serumskim nivoima antitela. Stoga je malo viši nivo aktivnosti CD73 primećen u primeru na dan 3 povezan sa nižim nivoom antitela u serumu u primeru na dan 7.
[0525] Sličan eksperiment kao gore opisan izveden je na miševima koji nose potkožne humane SNUC1 ksenograft tumore izvedene iz adenokarcinoma debelog creva i tretirane sa anti-CD73
1
antitelom CD73.4IgG2CS-IgG1.1f. Miševi sa SNUC1 tumorima su tretirani sa CD73.4IgG2CS-IgG1.1f sa 1, 3 i 10 mg/kg IP nultog dana. Tumori su sakupljani na 24h, 48h, 72h, 96h i 168h nakon doziranja. Test enzimske inhibicije CD73 izveden je kao što je opisano gore. Kvantifikacija braon boje je izvedena pomoću softvera Image Pro Premier (Media Cybernetics).
[0526] Rezultati, koji su prikazani na grafiku na Slici 24F, pokazuju da je aktivnost CD73 značajno smanjena kod životinja doziranih sa antitelom protiv CD73 u poređenju sa miševima tretiranim kontrolnim antitelom, što ukazuje na snažnu CD73 enzimsku inhibiciju antitelom u sve tri koncentracije. Prema tome, anti- CD73 antitelo CD73.4CS-IgG1.1f efikasno inhibira enzimsku aktivnost CD73 in vivo. Kinetike CD73 inhibicije antitelima protiv CD73 takođe su određene u 4T1 singeneičnom modelu tumora. TY/23 (pacovsko antitelo protiv mišjeg CD73) ili pacovska IgG kontrola (10mg/kg) ubrizgano je 7 dana posle injekcije tumorskih ćelija 4T1. Tumor, slezina, puna krv i serum prikupljeni su 1, 2, 3, 6 i 7 dana nakon tretmana Ab-om. Inhibicija aktivnosti CD73 merena je kao što je gore opisano u odeljcima od naznačenog dana. Reprezentativni odsečci tumora su prikazani na Slikama 25A i B. Podaci pokazuju da TY/23 in vivo inhibira aktivnost CD73.
Primer 8: Epitopsko svrstavanje (eng. epitope binning) i unakrsna blokada na bazi protočne citometrije
[0527] Studije epitopskog svrstavanja su izvedene pomoću Biolayer Interferometry (BLI) korišćenjem Octet RED instrumenta (Pall Fortebio) na 25°C. Za ove studije, 20-30 ug/ml hCD73-his je zarobljeno na anti-penta-his senzorima koristeći fazu učitavanja 90-180s. Konkurencija antitela je procenjena tako što je dozvoljeno datom antitelu (mAb1) da se veže za hCD73-his površine tokom 180s, nakon čega je usledilo neposreno izlaganje rastvoru drugog antitela (mAb2) tokom 180s. Signal vezivanja za mAb2 nakon prethodnog vezivanja mAb1 je upoređen sa signalom od mAb2 u odsustvu konkurencije, da bi se odredilo da li se mAb1 i mAb2 takmiče za vezivanje za hCD73-his površine. Ove eksperimenti su izvedeni za brojne mAb parove u oba poretka (mAb1 zatim mAb2 i mAb2 zatim mAb1) da bi se uspostavili profili kompeticije i epitopske grupe (eng. bins) (kao što je sažeto u Tabeli 29 ispod).
[0528] Kao što je prikazano u Tabeli 29, analiza epitopskog svrstavanja pokazala je 2 epitopske grupe.
1
Tabela 29.
[0529] Antitela su takođe podvrgnuta unakrsnoj blokadi na bazi protočne citometrije. Eksperiment je izveden na sledeći način koristeći jedan set fluorescentno obeleženog antitela i drugi set neobeleženog antitela: 100000 NCI-H292 ćelija je posejano po bunaru. Ploča je spinovana i ćelije su resuspendovane u 100uL 2% FBS-a u PBS-u po bunaru. Ćelije su bile blokirane na ledu tokom 20min. Neobeleženo antitelo, kako je navedeno, u 2% FBS-u u PBS-u je dodato u svaki bunar. Ploča je spinovana i ćelije su resuspendovane u 100uL po bunaru razblaženog, obeleženog antitela (10ug/mL), tj., bilo 4C3 ili 11F11, konjugovano na FITC. 6 bunara sa ćelijama je inkubirano bez antitela, i resuspendovano u 100uL 2% FBS-a u PBS-u samo (za kontrole). Ćelije su zatim inkubirane na ledu tokom 30min. Ćelije su isprane dva puta sa 2% FBS-om u PBS-u i uzorci su resuspendovani u 140uL 2%FBS-a u PBS-u, i analizirani na FacsCalibur protočnom citometru (Bekton Dickinson).
[0530] Rezultati unakrsnog blokiranja bazirani na protočnoj citometriji, koji su prikazani na Slikama 26A i B, potvrđuju gore navedene SPR podatke epitopskog svrstavanja. Na primer, 7A11 se takmiči sa 11F11, ali sa 4C3 ne.
Primer 9: Mapiranje epitopa pomoću HDX
[0531] Ovaj Primer opisuje upotrebu HDX-MS za identifikaciju epitopa na humanom CD73 na koji CD73.4-IgG2CS-IgG1.1f.
[0532] Metoda masene spektrometrije za izmenu vodonik/deuterijum (HDX-MS) vrši ispitivanje konformacije proteina i konformacione dinamike u rastvoru nadgledanjem brzine i obima izmene deuterijuma atoma vodonika amida proteinske kičme (osim prolina). Nivo
1
izmene HDX zavisi od pristupačnosti rastvarača proteina i vodončnih veza, a povećanje mase proteina pod HDX može se tačno izmeriti MS-om. Kada se ova tehnika upari sa enzimskom digestjom, mogu se razrešiti strukturne karakteristike na nivou peptida, omogućavajući razlikovanje površinski izloženih peptida od onih savijenih unutra. U eksperimentima mapiranja epitopa, deuterijumsko obeležavanje i sledeći eksperimenti kvenčovanja se izvode paralelno za antigen i kompleks antigen/mAb, posle čega sledi onlajn digestija pepsina, odvajanje peptida i MS analiza.
[0533] Pre mapiranja epitopa od CD73.4-IgG2-CS-IgG1.1f u CD73 pomoću HDX-MS, izvedeni su nedeuterisani eksperimenti da bi se napravila lista uobičajenih peptičnih peptida za rekombinantni humani ECD dimerni CD73 pune dužine (12 µM) i proteinski kompleks rekombinantnog humanog CD73 i CD73 mAb (1:1 molarni odnos, 12 µM za CD73 mAb), postižući pokrivenost sekvence od 88% za ECD CD73 pune dužine. U eksperimentu HDX-MS, 5 µL od CD73 (SEQ ID NO: 99) ili CD73 sa CD73.4-IgG2-CS-IgG1.1f mAb je razblaženo u 55 µL D2O pufera (10 mM fosfatni pufer, D2O, pD 7.0) da bi se pokrenule reakcije obeležavanja na sobnoj temperaturi. Upotrebljeni CD73 protein je bio glikozilovani dimer hCD73 pune dužine koji ima SEQ ID NO: 99, takođe pokazano ispod). Reakcije su izvedene u različitim vremenskim periodima: 20 sek, 1 min, 10 min i 240 min. Na kraju svakog perioda reakcije obeležavanja, reakcija je ugašena dodavanjem pufera za gašenje (100 mM fosfatni pufer sa 4M GdnCl i 0.4M TCEP, pH 2.5, 1:1, v/v) i 50 µL ugašenog uzorka je ubrizgano u Waters HDX-MS sistem za analizu. Nivoi unošenja deuterijuma sa uobičajenim peptičkim peptidima su praćeni u odsustvu /prisustvu CD73 mAb.
[0534] Upotrebljeni protein CD73 imao je aminokiselinsku sekvencu koja ima SEQ ID NO: 99.
[0535] Merenja HDX-MS na CD73 mAb u CD73 pokazuju da CD73.4-IgG2-CS-IgG1.1f mAb prepoznaje diskontinuirani epitop koji se sastoji od dva peptidna regiona u N-terminalnom regionu CD73:
Peptidni region 1 (65-83): FTKVQQIRRAEPNVLLLDA (SEQ ID NO: 96)
Peptidni region 2 (157-172): LYLPYKVLPVGDEVVG (SEQ ID NO: 97)
[0536] Trodimenzionalni prikaz interakcija (Slika 27B) pokazuje da su ova dva regiona geometrijski bliska. Detaljna mapa prikazana je na Slici 27A.
Primer 10: Kristalna struktura 11F11 koji se vezuje za CD73
[0537] Ovaj Primer opisuje kristalnu strukturu Fab' od 11F11 vezanog za CD73(26-336)His.
1 1
[0538] CD73(26-336)His je prečišćen iz prolazno transficiranih HEK-293 E ćelija korišćenjem standardnih protokola, i korišćen je kao takav, ili je deglikozilovan pomoću PNGaza F tretmana i koncentrovan do 1.2mg/ml. Antitelo 11F11 Fab' je pripremljeno pepsinskom digestijom 11F11 korišćenjem standardnih protokola, i koncentrovano do 1.1 mg/ml.
[0539] Kompleks je formiran inkubiranjem jednakih zapremina deglikozilovanog hCD73(26-336)His i 11F11 Fab' preko noći na 4°C, prečišćen korišćenjem GE Superdex 20026/60 kolone, i koncentrovan do 9.5mg/ml korišćenjem 10k MWCO spin koncentratora.
[0540] Kristali su rasli u sedećim kapljicama, eksperimentima sa difuzijom pare i kapljica je bila 0.25 uL protein pomešan sa 0.25 uL rezervoar rastvora. Postavljeno je preko 7100 eksperimenata kristalizacije. Početni kristalni vodiči su bili mali oko 10 µm. Optimizovani kristali su bili veličine 200 - 300 µm. Optimizacija kristalizacije uključivala je skrining: aditiva, deterdženata, taloga, pH, temperature, i tipa pufera. Uslovi koji su omogućili stvaranje kristala bili su sledeći: rezervoar rastvor se sastojao od 34% polipropilen glikola P400, 0.1 M Na/K PO4pH 6.5, i 15 µM CYMAL-7; postavka eksperimenata kristalizacije na sobnu temperaturu i zatim postavljanje na 4°C da se inkubira; i inkubacija na 4°C tokom 7 dana. Formiranje kristala je primećeno samo kod glikozilovanog proteina CD73.
[0541] Kristali su sakupljeni direktno iz kristalizacione kapi i smešteni su direktno u tečni N2. Pregledano je preko 100 kristala radi difrakcije interno (eng. in-house).
[0542] Podaci su prikupljeni pomoću malog snopa, vrlo malog prigušenja, i spiralnog prikupljanja podataka na SER-CAT snopu 22ID sa Rayonix MX-33HS detektorom CCD visoke brzine. Skupovi podataka prikupljeni su na 4.1 Å, 3.8 Å, 3.5 Å, i na kraju na 3.05 Å. Podaci, obrađeni i skalirani pomoću rutinske HKL2000 (Otwinowski Z., Minor W., Methods in Enzymology 276, 307-326 (1997)), bili su 96% potpuni do rezolucije 3.04 Å.
[0543] BLAST (Altschul et al. (1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol.
215:403-410) pretraživač je korišćen za pronalaženje najbližeg modela za CD73 N-terminalni domen i Fc i Fv domene u RCSB Protein Data Bank koja se koriste u pretraživanju molekularne zamene: model CD73 je bio od PDB unosa 4H1S (Heuts et al. Chembiochem. 5. novembar 2012;13(16):2384-91).
[0544] Oni su korišćeni kao početni u pretraživanju molekularne zamene PHASER (McCoy et al. J. Appl. Cryst. (2007). 40, 658-674). Pretragom CD73 pronađeno je 5 molekula u asimetričnoj jedinici. Ako je CD73 fiksiran, pretragom modela pretraživanja teškog lanca pronađeno je 2 molekula u asimetričnoj jedinici. Održavajući CD73-ove i teške lanace fiksirane, treća PHASER pretraga sa lakim lanacem je takođe pronašla 2 molekula u asimetričnoj jedinici. Sastavljen model od pet kompletnih kompleksa napravljen je od parcijalnih rešenja
1 2
preklapanjem pet CD73-ova i podudaranjem teških i lakih lanaca. Ovo je korišćeno kao početni model za doradu BUSTER-a (Bricogne et al. (2011) BUSTER verzija 2.11.6. Cambridge, Ujedinjeno kraljevstvo: Global Phasing Ltd).
[0545] Model je ponovo postavljen i aminokiseline su izmenjene tako da odražavaju sekvence 11F11. Model je bio podvrgnut opsežnoj manuelnoj izradi i usavršavanju modela. Ukupno pet ciklusa usavršavanja BUSTER-a izvedeno je da se kompletira usavršavanje. Finalni R-faktor je 20.59% (bez R = 24.58%) za 27,484 atoma proteina i 24 molekula rastvarača.
[0546] Prikazi kristalnih struktura kompleksa navedeni su na Slikama 28A-D.
[0547] Kristalna struktura pokazuje da su sve interakcije osim jedne iz ostataka u CDR regionima, i da je većina interakcija iz VH domena sa dve dodatne interakcije iz VL domena (Slika 28A). Interaktivni ostaci humanog CD73 i 11F11 Fab' prikazani su u Tabeli 30.
Tabela 30.
1
14
[0548] Model zasnovan na kompozitnoj strukturi dva kompleksa CD73(NDT)/11F11 nanesenih na dimer CD73 (PDB Unos 4H1S) sugeriše da se 11F11 vezuje za površinu na CD73 udaljenu od kontakta dimera, što sugeriše da Fab ne bi ometao formiranje dimera.
1
[0549] Poređenje HDX-MS mapiranja i rezultata rendgenskih zraka na kompleksu CD73/11F11 pokazuje da su oni u osnovnom aranžmanu pokazali sličnan epitop na CD73 (65-83 i 157-172). Međutim, rendgenska struktura pokazuje dodatne interakcije (manje od 6Å) u području Met-105 do Asp-111 (uključujući H-veze za Arg-109 i Tyr-110), Lys-135 do Pro-139, i Asp-317 do Ile-320 (uključujući H-veze za Ser-319).
Primer 11: Uticaj različitih zglob/Fcs na veličinu antitelo/CD73 kompleksa
[0550] Kao što je prikazano u gornjim Primerima, antitela protiv CD73 sa IgG2 zglobom i CH1 su bolji inhibitori enzimske aktivnosti CD73 na ćelijama i bolje se internalizuju od istih antitela sa IgG1 zglobom. Na osnovu ovog zapažanja, i činjenice da je IgG2 zglob čvršći od IgG1 zgloba, pretpostavljeno je da se formiraju veći kompleksi između antigena i antitela koji imaju IgG2 zglob u odnosu na antitela koja imaju IgG1 zglob. Sledeći eksperiment je sproveden zbog analiziranja ove hipoteze.
[0551] Struktura i oligomerno stanje kompleksa CD73/antitelo u rastvoru ispitivani su SEC-MALS i DLS. Za ove studije, antitela koja sadrže bilo IgG1 ili IgG2 konstantni region, mešana su u različitim molarnim odnosima sa rekombinatnim proteinima koji sadrže bilo vanćelijski domen humanog CD73 pune dužine koji sadrži C-terminalni polihistidinski obeleživač (ostaci amino kiselina 26 - 546 od humanog CD73, nazvan "hCD73-his") ili fragment koji odgovara N-terminalnom domenu humanog CD73 (ostaci amino kiselina 26 - 336, nazvan "N-hCD73-his").
[0552] Oligomerno stanje CD73/antitelo kompleksa je ispitano ekskluzionom hromatografijom po veličini čestica zajedno sa linijskim detektorom raspršivanja svetlosti iz više uglova (SEC-MALS). Izokratska odvajanja su izvedena na koloni Shodex PROTEIN KW-803 povezanom sa Prominence Shimadzu UFLC u puferu koji sadrži 200 mM K2HPO4, 150 mM NaCl, pH 6.8, koji sadrži 0.02% Na azida (filtriran 0.1 µm) sa brzinom od 0.5 mL/min. Uzorci su ubrizgani u kolonu korišćenjem SIL-20AC Prominence Shimadzu automatskog uzorkivača, i podaci su dobijeni od tri „onlajn“ detektora spojena u nizu: Prominence SPD-20AD diodni niz UV/vis spektrofotometar praćen Wyatt miniDAWN™ TREOS detektorom rasipanja svetlosti iz više uglova zatim Wyatt Optilab T-rEX detektor indeksa refrakcije. Podaci su prikupljeni i analizirani pomoću Astra (Wyatt) i Labsolutions (Shimadzu) softvera.
[0553] Studije dinamičkog raspršivanja svetlosti (DLS) izvedene su na Wyatt DynaPro čitaču ploča sa 384 bunara na 25°C. Eksperimentalni parameteri su 20 akvizicija od 5 s svaka po merenju, a merenja su zabeležena četvorostruko, sa prijavljenim prosečnim i standardnim
1
odstupanjem. Funkcije autokorelacije intenziteta bile su podešene korišćenjem algoritma "Regularization" u softveru Dynamics (Wyatt Technologies).
[0554] Rezime SEC-MALS i DLS dat je na Slikama 29A i B. Analiza samog antitela, pokazuje vremena zadržavanja (oko 16 - 17 min), mase (140 - 150 kDa), i hidrodinamičke prečnike (5.0 - 5.4 nm) za svako antitelo koje je tipično za monomerno monoklonsko antitelo. Podaci za hCD73-his protein su u skladu sa proteinom koji usvaja očekivanu dimernu strukturu u rastvoru; posebno, masa određena iz SEC-MALS podataka (120 kDa) je u skladu sa onom koja se očekuje za CD73-his dimer (117 kDa) i nije u skladu sa onim što bi se očekivalo za hCD73-his monomer (58.5 kDa). Podatak za N-hCD73 je u skladu sa rekombinantnim N-domenskim proteinom koji je monomeran u rastvoru (merena masa SEC-MALS = 38 kDa, u poređenju sa očekivanom monomernom masom = 35.0 kDa), što se očekuje jer se region vanćelijskog domena pune dužine CD73 koji je odgovoran za dimerizaciju proteina nalazi unutar C-terminalnog domena bez doprinosa ostataka N-domena.
[0555] Otkriveno je da ekvimolarne smeše datog antitela sa N-hCD73-his eluiraju kao jedna vrsta u SEC sa kraćim vremenom zadržavanja od antitela ili samog N-hCD73-his, kao i veće hidrodinamičke prečnike (Rh – hydrodynamic radii) pomoću DLS, što je u skaldu sa formiranjem kompleksa. Podaci MALS pokazuju mase za ove komplekse od približno 210 kDa. To je u skladu sa jednim molekulom N-hCD73-his vezanim za svaki od dva Fab domena datog antitela da bi se formirao kompleks 1:2 antitelo:N-hCD73-his.
[0556] SEC-MALS podaci za smeše antitela protiv CD73 sa hCD73-his dimerom pokazuje da se smeša eluira ranije i od hCD73-his i od samog antitela, sugerišući da se formiraju kompleksi. Poređenje podataka za mAb koja sadrže isti varijabilni region ali različite konstantne domene, pokazuje da su vremena elucije za komplekse hCD73-his sa mAb koji sadrže IgG2 konstantne domene (IgG2-C219S, IgG2-C219S-IgG1.1f) ranija od onih za komplekse hCD73-his sa mAb koji sadrže IgG1.1f konstantni domen. Pored toga, mase određene MALS-om za komplekse hCD73-his sa mAb koji sadrže IgG2 konstantni domen su veće od onih za komplekse hCD73-his sa mAb koji sadrže IgG1 konstantni domen. DLS podaci dalje pokazuje da su hidrodinamički prečnik kompleksa hCD73-his sa mAb koji sadrži IgG2 konstantni domen veći od onih kompleksa hCD73-his sa mAb koji sadrži IgG1 konstantni domen. Na primer, podaci SEC-MALS i DLS za CD73.4 sa tri različita konstantna regiona (IgG2-C219S, IgG2-C219S-IgG1.1f, ili IgG1.1f) prikazani su na Slici 30. Ovde se vidi da kompleks hCD73-his sa CD73.4 koji sadrži IgG2 konstantni ima kraća vremena zadržavanja (Slika 30A), veće hidrodinamičke prečnike (Slika 30B) i veće mase određene MALS-om (Slika 30C), u poređenju sa kompleksima hCD73-his sa CD73.4-IgG1.1f. Na osnovu MALS masa, shematski model
1
strukture i stehiometrije kompleksa između hCD73-his i antitela je prikazan na Slici 30D, gde kompleksi koji sadrže CD73.4-IgG1.1f pretežno formiraju manje 2:2 (pik 1 = -550 kDa) ili 4:4 mAb/CD73 dimerne komplekse (pik 2 = -1300 kDa), dok CD73.4-IgG2-C219S ili CD73.4-IgG2-C219S-IgG1.1f formiraju mnogo veće komplekse (>3000 kDa) sa hCD73-his, za koje se ne mogu pouzdano modelovati precizna struktura i stehiometrija.
[0557] CD73.4 antitela koja imaju konstantne regione teškog lanca navedene u Tabeli 26 takođe su testirana na veličinu formiranja kompleksa. Kao što je prikazano na Slici 30D, rezultati pokazuju da su kompleksi višeg reda formirani sa antitelima koja imaju IgG2 CH1 domen u odnosu na ona koji imaju IgG1 CH1 domen.
[0558] Kolektivno SEC-MALS i DLS podaci pokazuju da se formiraju veći kompleksi između hCD73-his i mAb koja sadrže IgG2 zglob i CH1 region (IgG2-C219S ili IgG2-C219S-IgG1.1f), u poređenju sa onima koja sadrže IgG1 zglob i CH1 region (IgG1.1f). Pored toga, antitela koja imaju IgG2 CH1 domen formiraju veće komplekse od onih koji imaju IgG1 CH1 domen.
Primer 12: Značaj nekih aminokiselinskih ostataka u IgG2 CH1 i zglobu u poboljšanju CD73 internalizacije posredovane antitelom
[0559] Antitela protiv CD73 (CD73.4) sa konstantnim regionima teškog lanca prikazana u Tabeli 31 su pripremljena i testirana kao što je opisano gore u testovima antitelom posredovane CD73 internalizacije.
Tabela 31: Konstantni regioni teškog lanca koji su pripojeni anti-CD73 varijabilnim regionima
1
1 O is Konstrukti SE ID NO
Rezultati, koji su prikazani na Slici 31, pružaju sledeće informacije u kontekstu CD73 internalizacije:
Čini se da CH2 domen nema uticaj kako je prikazano
∘ a) Primećena je vrlo mala razlika u sposobnosti internalizacije između antitela koja sadrže modifikovani konstantni region teškog lanca formata "AY" (ima
1
IgG2 zglob ERKCCVECPPCPAPPVAG (SEQ ID NO: 8) u odnosu na one sa formatom "KH" (ERKCCVECPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 22) (Skup 5, 6 i 7);
∘ b) CH2 zamene su uporedive sa G1 ili G2 divljeg tipa (Skupovi 5 i 6); i ∘ c) ostatak 237 nema uticaja na internalizaciju: ni na dodavanje "G" ostatka u IgG2 zglob ni na deleciju C terminalnog "G" u internalizaciji pod uticajem IgG1 zgloba (Skup 9).
Ovo sugeriše da CH2 domen ne utiče na internalizaciju (tj., CH2 domen može biti iz IgG1 ili IgG2);
• Zamena CH1 regiona navedenih u Skupu 3 (KRGEGSSNLF; KRGEGS; SNLF;
ITNDRTPR i SNLFPR) u IgG1 sa onima iz IgG2 obezbeđuje malu korist, tj., internalizacija ostaje slična onoj u IgG1; vidi Skup 3);
• Zamena CH1 regiona navedenih u Skupu 4 (RKEGSGNSFL; RKEGSG; NSFL;
TIDNTRRP i NSFLRP) u IgG2 sa onima iz IgG1 ima promenljiv uticaj: promena NSFL nema uticaja, dok su ostala 2 regiona (RKEGSG & RP) uključena (videti Skup 4). Na osnovu rezultata Skupova 3 i 4, čini se da postoji interakcija između CH1 regiona i zgloba, pri čemu su RKEGSG i RP regioni važniji od NSFL regiona;
• Region zgloba utiče na internalizaciju, tj., zglob od IgG2 obezbeđuje bolju internalizaciju u odnosu na zglob od IgG1 (videti Skupove 7 i 8). Pored toga, IgG1 sa delecijom (G1-delta-zglob) poboljšava internalizaciju nad IgG1. IgG2 sa delecijom (G2-delta-zglob) obezbeđuje sličan nivo internalizacije u odnosu na onaj od IgG2 zgloba. Ovo sugeriše da zglobni region utiče na internalizaciju, čiji je efekat pojačan pomoću IgG2 CH1 (G2-G1-G2-G2-AY je uporediv sa G1-G2-G1-G1-AY);
• IgG2.4 (C220S) ima sličnu ili smanjenu internalizaciju u poređenju sa IgG2.3 (C219S).
IgG2.3/4 (C219S/C220S) ima znatno smanjenu internalizaciju u poređenju sa IgG2.3 ili samim IgG2.4 (videti Skup 10). Ovo sugeriše da je internalizacija antitela sa IgG2 zglobom i C219S približno ista kao ona od IgG2 zgloba sa C220S, od kojih su obe mnogo bolje nego ona kod IgG2 zgloba i sa C219S i sa C220S;
• IgG2.5 (C131S mutacija) ima smanjenu internalizaciju u poređenju sa konstruktima sa C131 (videti Skupove 1, 6 i 7).
[0560] Dakle, ovi rezulti pokazuju da su i CH1 domen i zglob relevantni u antitelo posredovanoj CD73 internalizaciji, i da je antitelo koje ima IgG2 sekvence iz ovih domena internalizovano sa boljom efikasnošću u odnosu na antitelo koje ima ove regione iz IgG1.
1 1
Primer 13: Antitela koja imaju IgG2 zglob i/ili CH1 domen formiraju komplekse velike molekulske mase
[0561] CD73.4 antitela koja imaju konstantne regione teškog lanca navedene u Tabeli 26 su takođe testirana na formiranje kompleksa velike molekulske mase pomoću SEC-MALS i DLS eksperimenata, kao što je opisano u Primeru 11.
[0562] Tri od 16 antitela u ovoj studiji prethodno su testirana: CD73.4-IgG1.1f, CD73.4-IgG2-C219S (takođe se nazivaju CD73.4-IgG2.3), i CD73.4-IgG2-C219S-IgG1.1f (takođe se nazivaju CD73.4-IgG2.3G1.1f-KH). SEC-MALS i DLS podaci samih antitela pokazali su vremena zadržavanja, mase, i hidrodinamičke prečnike za svako antitelo koji su tipični za monomerno monoklonsko antitelo. Ekvimolarni kompleksi svakog antitela (5.5 uM) sa hCD73-his (5.5uM) pokazali su sporija vremena zadržavanja za sve komplekse u poređenju sa antitelom ili samim hCD73-his što ukazuje na stvaranje kompleksa. Preklapanje podataka sa SEC hromatograma za svaki od 16 kompleksa prikazano je na Slici 32A. Podaci hromatograma mogu se podeliti u 4 odvojena pika, koji su prikazani na Slici 32B. Pik 1 sadrži najveće vrste, sa MALS-određenim masama koje sugerišu komplekse sa masenim ekvivalentom većim od 4:4 hCD73-his:mAb kompleksa. Pik 2 sadrži vrste sa MALS-određenim masama koje sugerišu komplekse od oko 2:2 hCD73-his:mAb kompleksa. Pik 3 je neznatna vrste sa niskim signalom i MALS-određenim masama koje sugerišu oko 1:1 hCD73-his:mAb kompleksa. Pik 4 odgovara eluciji samih mAb sa MALS-određenim masama u skladu sa slobodnim antitelom. Da bi se odredile relativne količine svake vrste, 4 pika od svakog hromatograma su integrisana kao pik 1 (<12.9 min), pik 2 (12.9 - 15.1 min), pik 3 (15.1 - 16.7 min), pik 4 (16.7 - 19.3 min). Integracija je takođe uključivala dodatni integrisani opseg nazvan pik 5 (>19.3 min) da bi se objasnile sve vrste niske molekulske težine, za koje je nađeno da su zanemarljive (<3.5% za sve komplekse). Procenat svake vrste iz ove integracije sabran je u Tabeli 32. Svi kompleksi su sadržali sličan mali procenat pika 3 (oko 6-9%), ali promenljive količine drugih pikova. Najvažnije je da su svi kompleksi između hCD73-his i antitela koja sadrže CH1 domen iz hIgG1 imali značajno veći procenat manjih kompleksa (pik 2), dok su oni koji sadrže CH1 domen iz hIgG2 imali veći procenat većih kompleksa (pik 1) (Tabela 32 i Slika 32C). Ovo sugeriše važnu ulogu ne samo regiona zgloba već takođe i CH1 domena u formiranju kompleksa višeg reda.
1 2
Tabela 32: Vremena zadržavanja CD73.4 antitela sa modifikovanim konstantnim regionima teškog lanca
1
Primer 14: Vezivanje Fc receptora za antitela sa konstruisanim konstantnim domenima
[0563] Ovaj Primer pokazuje da se antitela koja imaju modifikovane konstantne regione teškog lanca koji sadrže CH1 i zglob od IgG2 vezuju za FcyR-e kada oni sadrže CH2 i CH3 domene od IgG1.
[0564] Pored antigen vezivanja od strane varijabilnih domena, antitela mogu angažovati Fcgama receptore (FcgRs) kroz interakciju sa konstantnim domenima. Ove interakcije posreduju efektorske funkcije kao što je antitelo-zavisna ćelijska citotoksičnost (ADCC) i antitelo-zavisna ćelijska fagocitoza (ADCP). Aktivnost efektorske funkcije je visoka za IgG1 izotip, ali vrlo niska ili je nema za IgG2 i IgG4 zbog ovih izotipa koji imaju niži afinitet za FcgR-e. Pored toga, efektorska funkcija IgG1 može se modifikovati preko mutacije aminokiselinskih ostataka unutar konstantnih regiona da bi se promenili FcgR afinitet i selektivnost.
[0565] Vezivanje antitela za Fc gama receptore (FcyR ili FcgR) proučavano je korišćenjem biosenzorskih tehnologija uključujući Biacore površinsku plazmonsku rezonanciju (SPR) i Fortebio Biolayer Interferometriju (BLI). SPR studije su izvedene na Biacore T100 instrumentu (GE Healthcare) na 25°C. Fab fragment iz mišjeg antitela protiv 6xHis je imobilizovan na čip senzoru CM5 korišćenjem EDC/NHS do gustine od -3000 RU. Različiti his-obeleženi FcgR-i (7 ug/ml) su uhvaćeni preko his-obeleženih C-terminusa korišćenjem vremena kontakta od 30 s na 10 ul/min, a vezivanje 1.0 µM antitela je procenjeno u radnom puferu od 10 mM NaPO4,
1 4
130 mM NaCl, 0.05% p20 (PBS-T) pH 7.1. FcgR-i korišćeni za ove eksperimente uključuju CD64 (FcgRI), CD32aH131 (FcgRIIa-H131), CD32a-R131 (FcgRIIa-R131), CD32b (FcgRIIb), CD16a-V158 (FcgRIIIa-V158), CD16b-NA1 (FcgRIIIb-NA1), i CD16B-NA2 (FcgRIIIb-NA2). BLI eksperimenti su izvedeni na Fortebio Octet RED instrumentu (Pall, Fortebio) na 25°C u 10 mM Na3PO4, 130 mM NaCl, 0.05% p20 (PBS-T) pH 7.1. Antitela su uhvaćena iz nerazblaženih ekspresijskih supernatanata na senzorima obloženim proteinom A, praćeno vezivanjem 1 µM hCD32a-H131, hCD32a-R131, hCD32b, hCD16a-V158, ili 0.1 µM hCD64 analita.
[0566] Prvo, napravljena su antitela koja sadrže modifikovane IgG1 Fc domene uključujući supstitucije S267E (SE) i S267E/L328F (SELF), kao i različite kombinacije mutacija P238D, P271G, H268D, A330R, G237D, E233D, označene kao V4, V7, V8, V9 i V12. Vezivanje ovih antitela je proučeno pomoću Biacore SPR u poređenju sa IgG1f, IgG2.3 (IgG2-C219S) i IgG4.1 (IgG4-S228P) antitelima, kao i antitelom IgG1.1f koje je konstruisano da smanji vezivanje za sve FcgR. Rezultati, koji su prikazani na Slici 33, pokazuju očekivana svojstva vezivanja FcgR za IgG1f, IgG2.3 i IgG4.1 i mutirana IgG1 antitela, uključujući povećana CD32a-H131, CD32a-R131 i CD32b vezivanja za SE i SELF, kao i povećanu selektivnost V4, V7, V8, V9 i V12 mutanata za CD32b preko CD32a-H131 i CD32a-R131, Slika 33.
[0567] Sledeći skup konstrukata korišćen je za konstruisanje funkcije efektora u inače efektorsko funkcijski negativnom IgG2 izotipu. Za ovu studiju, gore opisane mutacije uvedene su u kontekstu IgG2.3 konstantnog regiona, ili IgG2.3/IgG1f hibrida nazvanog IgG2.3G1-AY (Tabela 33). Antitela su eksprimirana u malom obliku kao supernatanti, i testirana na vezivanje za FcgR-e korišćenjem Fortebio Octet BioLayer Interferometrijske biosenzor tehnologije. Pošto su antitela prisutna u maloj koncentraciji u supernatantima, eksperiment je izveden hvatanjem antitela iz supernatanata korišćenjem senzora obeleženih proteinom A, a potom vezivanjem FcgR analita u rastvoru. Prečišćeni i kontrolni supernatant IgG1f uključujući antitela IgG1, SE, P238D, V4 i V12 divljeg tipa su takođe uključeni za poređenje, i svako od ovih kontrolnih antitela pokazalo je očekivana svojstva vezivanja FcgR (Slika 34). IgG2.3 antitelo je takođe pokazalo očekivani profil vezivanja, sa vidljivim vezivanjem samo za CD32a-H131. Međutim, sve mutacije za uvođenje S267E, L328F, P238D, P271G, H268D, A330R, G237D, ili E233D mutacije u IgG2.3 nisu uspele da rekapituliraju FcgR afinitet odgovarajućih konstruisanih IgG1 mAb (Slika 34). Suprotno tome, IgG2.3G1-AY konstrukt bio je u stanju da u potpunosti sačuva FcgR vezujuća svojstva IgG1 divljeg tipa, zadržavajući CH1 i zglobne regione IgG2.3. Pored toga, svi mutanti IgG2.3G1-AY koji sadrže S267E, L328F, P238D, P271G, H268D, A330R, G237D, i E233D pokazali su svojstva vezivanja FcgR uporediva sa
1
mAb-ima verzije IgG1 koja sadrže iste mutacije (Slika 34). Ovo pokazuje uspešnu konstrukciju antitela sa CH1 i zglobnim regionima od IgG2 u kombinaciji sa efektorskom funkcijom divljeg tipa ili mutantnog IgG1.
Tabela 33: Konstruisani IgG2 konstrukti
1
[0568] Ova inženjerska strategija je dalje istražena proizvodnjom drugih antitela formatiranih sa IgG2.3G1-AY, IgG2.3G1-AY-S267E (IgG2.3G1-AY-V27), kao i varijante oblika IgG2-B (IgG2.5G1-AY i IgG2.5G1-AY-V27), i druga hibridna antitela koja sadrže različie kombinacije IgG1 i IgG2 konstantnih domena, i testiranjem vezivanja ovih antitela na anti-his Fab zarobljen his-obeleženim FcgR-ima korišćenjem Biacore SPR tehnologije. U skladu sa podacima Octet supernatanta, podaci SPR pokazali su da IgG2.3G1-AY i IgG2.3G1-AY-V27 antitela imaju uporediva FcgR svojstva vezivanja za IgG1f i IgG1f-S267E, redom, uprkos tome što sadrže CH1 i zglobne regione od A-forme IgG2 antitela (IgG2.3) (Tabela 34). Slični podaci su takođe dobijeni korišćenjem IgG2.5G1-AY i IgG2.5G1-AY-V27 antitela, pokazujući uspešan inženjering B-forme IgG2 antitela (sadrži C131S mutaciju nazvanu IgG2.5) koja imaju IgG1f ili modifikovani IgG1f slične efektorske funkcije. Podaci za nekoliko drugih antitela sa IgG2.3G1-AY, IgG2.3G1-AY-V27, IgG2.5G1-AY, ili IgG2.5G1-AY-V27 sa konstantnim regionima ali različitim varijabilnim regionima pokazali su da je ova inženjerska strategija široko primenljiva na ostalim antitelima nezavisno od varijabilnih domena (Tabela 34). Ostali konstrukti koji pokazuju IgG1f-slična svojstva vezivanja FcgR uključuju IgG1-G2.3G1-AY, i IgG1deltaTHT, dok nekoliko konstrukata modifikovanog konstantnog regiona nije uspelo da zadrži svojstva vezivanja slična IgG1f FcgR, uključujući IgG2.3G1-KH, IgG2.5G1-KH, IgG2.3plusTHT, IgG2.5plusTHT i IgG2.3plusGGG konstrukte (Tabela 34).
Tabela 34: %Rmax vrednosti za 1 µM antitelo koje vezuje anti-his Fab zarobljen FcgR-his proteine
1
1
1
2
Uzeti zajedno ovi podaci pokazuju da sekvenca u IgG1 neposredno C-terminalna konzerviranom CPPCPAP (SEQ ID NO: 380) motivu u zglobnom regionu daje efektorsku funkciju posredvanu sa FcgR, dok se CH1 i gornji delovi zgloba antitela mogu zameniti sa IgG2 ili modifikovanim IgG2 sekvencama, da se potencijalno kombinuju efektorske funkcije IgG1 i modifikovanog IgG1 sa superiornim svojstvima internalizacije ili signalizacije antitela koja sadrže IgG2 CH1 i/ili zglobne regione.
Ekvivalenti
[0569] Oni koji su stručnjaci u oblasti će prepoznati ili će moći da utvrde, koristeći samo rutinske eksperimente, mnoge ekvivalente specifičnih tehničkih rešenja opisanih ovde.
2 1
SAŽETAK LISTE SEKVENCI
[0570]
Tabela 35.
22
2
24
2
2
2
2
2
21
SEQ Opis Sekvenca
21
SEQ Opis Sekvenca
21
21
21 SEQ Opis Sekvenca
21
SEQ Opis Sekvenca
21
SEQ Opis Sekvenca
22
SEQ Opis Sekvenca
22
22
22
22
22
22 SEQ Opis Sekvenca
2
SEQ Opis Sekvenca
21 SEQ Opis Sekvenca
22
2 SEQ Opis Sekvenca
24 SEQ Opis Sekvenca
2
SEQ Opis Sekvenca
2
SEQ Opis Sekvenca
2
2
2 SEQ Opis Sekvenca
24
SEQ Opis Sekvenca
24
SEQ Opis Sekvenca
24
SEQ Opis Sekvenca
24
SEQ Opis Sekvenca
24
SEQ Opis Sekvenca
24
SEQ Opis Sekvenca
24
SEQ Opis Sekvenca
2
SEQ Opis Sekvenca
21 SEQ Opis Sekvenca
22 SEQ Opis Sekvenca
2
SEQ Opis Sekvenca
24 SEQ Opis Sekvenca
2
SEQ Opis Sekvenca
2
2
2 SEQ Opis Sekvenca
2
SEQ Opis Sekvenca
2
SEQ Opis Sekvenca
21 SEQ Opis Sekvenca
22 SEQ Opis Sekvenca
2
SEQ Opis Sekvenca
24 SEQ Opis Sekvenca
2
SEQ Opis Sekvenca
2
SEQ Opis Sekvenca
2
SEQ Opis Sekvenca
2
SEQ Opis Sekvenca
2
SEQ Opis Sekvenca
2
SEQ Opis Sekvenca
21 SEQ Opis Sekvenca
22 SEQ Opis Sekvenca
2
SEQ Opis Sekvenca
24 SEQ Opis Sekvenca
2
2
2
2
2 SEQ Opis Sekvenca
2
21
22
2
24
2
2
2 SEQ Opis Sekvenca
2
2
2
21 SEQ Opis Sekvenca
22 SEQ Opis Sekvenca
2
SEQ Opis Sekvenca
24
2
2
380 Deo zgloba CPPCPAP
Lista sekvenci obezbeđuje sekvence zrelih varijabilnih regiona i teških i lakih lanaca (tj. sekvence ne uključuju signalne peptide).
2

Claims (14)

Patentni zahtevi
1. Izolovano antitelo koje se vezuje za humani klaster diferencijacije 73 (CD73) i sadrži CDR1, CDR2, i CDR3 sekvence teškog lanca koje sadrže SEK ID BROJEVA (SEQ ID NOs): 5, 6, i 7, redom, i CDR1, CDR2, i CDR3 sekvence lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 13, 14, i 15, redom, gde antitelo sadrži konstantni region teškog lanca koji sadrži IgG2 zglob i IgG2 CH1 domen.
2. Izolovano antitelo iz patentnog zahteva 1, gde domen zgloba sadrži aminokiselisku supstituciju C219S, u skladu sa EU indeksom Kabat sistema, u odnosu na domen zgloba humanog IgG2 divljeg tipa (SEK ID BR - SEQ ID NO: 136).
3. Izolovano antitelo iz patentnog zahteva 1 ili 2, gde konstantni region teškog lanca sadrži:
(a) CH1 domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEQ ID NO: 124; i
(b) zglobni domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEQ ID NO: 123.
4. Izolovano antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 3, gde antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je data u SEQ ID NO: 135 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je data u SEQ ID NO: 12.
5. Izolovano antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 3, gde antitelo sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je data u SEQ ID NO: 133 ili 189 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je data u SEQ ID NO: 102.
6. Izolovano antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 3, gde teški i laki lanci su i teški i laki lanci pune dužine, redom.
7. Izolovano antitelo iz patentnog zahteva 6, koje je IgG antitelo.
8. Izolovano antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 3, gde antitelo sadrži težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je data u SEQ ID NO: 133 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je data u SEQ ID NO: 102.
2
9. Izolovano antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 3, gde antitelo sadrži težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je data u SEQ ID NO: 189 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je data u SEQ ID NO: 102.
10. Izolovano antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1-9 koje je humano antitelo i ispoljava jedno ili više od sledećih svojstava:
(a) vezuje se za humani CD73 sa KDod 10 nM ili manjom kao što je određeno pomoću površinske plazmonske rezonance (Surface Plasmon Resonance - SPR);
(b) inhibira CD73 enzimsku aktivnost;
(c) internalizuje CD73 pomoću antitelom posredovane CD73 internalizacije u ćelije, npr., ćelije tumora; i
(d) vezuje se za humani CD73 sa EC50od 0.1 do 10 nM ili manjom kako je mereno pomoću FACS.
11. Izolovano antitelo iz patentnog zahteva 7, gde konstantni region teškog lanca dalje sadrži humani lgG1 CH2 domen koji sadrži aminokiselinske supstitucije A330S i P331S, u skladu sa EU indeksom Kabat sistema, u odnosu na CH2 domen humanog IgG1 divljeg tipa (SEQ ID NO: 137).
12. Kompozicija koja sadrži antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1-11, i farmaceutski prihvatljiv nosač.
13. Kompozicija iz patentnog zahteva 12, koja dalje sadrži jedan ili više dodatnih terapijskih agenasa.
14. Kompozicija iz patentnog zahteva 13, gde dodatni terapijski agens je antitelo antagonist na protein 1 programirane ćelijske smrti (PD-1), antitelo antagonist na ligand 1 programirane smrti (PD-L1) , antitelo antagonist na protein 4 povezan sa citotoksičnim T-limfocitima (CTLA-4), ili antitelo antagonist na gen 3 aktivacije limfocita (LAG-3).
RS20200915A 2014-11-21 2015-11-19 Antitela protiv cd73 i njihova upotreba RS60631B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462083056P 2014-11-21 2014-11-21
PCT/US2015/061639 WO2016081748A2 (en) 2014-11-21 2015-11-19 Antibodies against cd73 and uses thereof
EP15816276.8A EP3221363B1 (en) 2014-11-21 2015-11-19 Antibodies against cd73 and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60631B1 true RS60631B1 (sr) 2020-09-30

Family

ID=55022668

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200915A RS60631B1 (sr) 2014-11-21 2015-11-19 Antitela protiv cd73 i njihova upotreba

Country Status (36)

Country Link
US (6) US10100129B2 (sr)
EP (2) EP3725808B1 (sr)
JP (2) JP6805142B2 (sr)
KR (2) KR102569813B1 (sr)
CN (2) CN113773388B (sr)
AR (1) AR102698A1 (sr)
AU (2) AU2015349878A1 (sr)
BR (1) BR112017010110A2 (sr)
CA (1) CA2968357A1 (sr)
CL (2) CL2017001296A1 (sr)
CO (1) CO2017005845A2 (sr)
CY (1) CY1123355T1 (sr)
DK (1) DK3221363T3 (sr)
EA (2) EA202090956A3 (sr)
ES (2) ES2986091T3 (sr)
HR (1) HRP20201176T1 (sr)
HU (1) HUE050596T2 (sr)
IL (2) IL252353B (sr)
LT (1) LT3221363T (sr)
MA (1) MA40309A1 (sr)
ME (1) ME03806B (sr)
MX (1) MX383868B (sr)
MY (1) MY189836A (sr)
NZ (1) NZ731633A (sr)
PE (1) PE20170782A1 (sr)
PH (1) PH12017500918A1 (sr)
PL (1) PL3221363T3 (sr)
PT (1) PT3221363T (sr)
RS (1) RS60631B1 (sr)
SG (2) SG10201913004UA (sr)
SI (1) SI3221363T1 (sr)
SM (1) SMT202000413T1 (sr)
TN (1) TN2017000203A1 (sr)
TW (2) TWI758928B (sr)
UY (1) UY36404A (sr)
WO (1) WO2016081748A2 (sr)

Families Citing this family (158)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6018361B2 (ja) 2008-01-31 2016-11-02 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 制御性ｔ細胞活性を抑制するための、ヒトｃｄ３９に対する抗体およびその使用
US10053513B2 (en) * 2009-11-30 2018-08-21 Janssen Biotech, Inc. Antibody Fc mutants with ablated effector functions
KR101791430B1 (ko) 2009-11-30 2017-10-30 얀센 바이오테크 인코포레이티드 이펙터 기능이 제거된 항체 Ｆｃ 돌연변이체
US9738724B2 (en) 2012-06-08 2017-08-22 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies comprising site-specific non-natural amino acid residues, methods of their preparation and methods of their use
DK2863955T3 (en) 2012-06-26 2017-01-23 Sutro Biopharma Inc MODIFIED FC PROTEINS, INCLUDING LOCATION-SPECIFIC NON-NATURAL AMINO ACID RESIDUES, CONJUGATES THEREOF, METHODS OF PRODUCING ITS AND PROCEDURES FOR USE THEREOF
ES2658039T3 (es) 2013-07-10 2018-03-08 Sutro Biopharma, Inc. Anticuerpos que comprenden múltiples residuos de aminoácidos no naturales sitio-específicos, métodos para su preparación y métodos de uso
LT3218406T (lt) 2014-11-10 2021-06-25 Medimmune Limited Surišančios molekulės, specifiškos cd73 ir jų panaudojimas
DK3221346T3 (da) 2014-11-21 2020-10-12 Bristol Myers Squibb Co Antistoffer omfattende modificerede konstante områder af tungkæden
DK3221363T3 (da) 2014-11-21 2020-08-10 Bristol Myers Squibb Co Antistoffer mod cd73 og anvendelser deraf
IL254039B2 (en) 2015-02-19 2023-12-01 Compugen Ltd Anti-pvrig antibodies and methods of use
US11130817B2 (en) 2015-10-12 2021-09-28 Innate Pharma CD73 blocking agents
BR112018015238A2 (pt) * 2016-01-27 2018-12-18 Sutro Biopharma Inc conjugado de anticorpo, anticorpo, kit, composição farmacêutica, e, métodos para tratar ou prevenir uma doença ou condição e para diagnosticar uma doença ou condição
IL295230A (en) * 2016-03-04 2022-10-01 Bristol Myers Squibb Co Combination therapy with anti-cd73 antibodies
JP2019528082A (ja) * 2016-06-08 2019-10-10 シャンハイ ジャオ トン ユニバーシティ スクール オブ メディシン アゴニスト抗体の活性を増強する抗体重鎖定常領域配列
SG11201810509PA (en) 2016-06-20 2018-12-28 Kymab Ltd Anti-pd-l1 antibodies
AU2017292934B9 (en) 2016-07-07 2024-08-29 Bolt Biotherapeutics, Inc. Antibody adjuvant conjugates
EP3481869A4 (en) * 2016-07-11 2020-02-26 Corvus Pharmaceuticals, Inc. ANTI-CD73 ANTIBODIES
WO2018024162A1 (en) * 2016-08-03 2018-02-08 Sunshine Lake Pharma Co., Ltd. Glp-1 fusion protein comprising mutated immunoglobulin fc portion
IL264999B2 (en) * 2016-08-23 2025-03-01 Univ Johns Hopkins Antibody-activated nanoparticles for reprogrammed T-cell responses.
WO2018049083A1 (en) * 2016-09-07 2018-03-15 The Regents Of The University Of California Antibodies to oxidation-specific epitopes
TW201825519A (zh) * 2016-10-18 2018-07-16 美商美國禮來大藥廠 TGFβ受體II抗體
MA46952A (fr) 2016-12-01 2019-10-09 Regeneron Pharma Anticorps anti-pd-l1 radiomarqués pour imagerie immuno-pet
WO2018112108A1 (en) 2016-12-13 2018-06-21 Bolt Biotherapeutics, Inc. Antibody adjuvant conjugates
CN110072891A (zh) * 2016-12-13 2019-07-30 安斯泰来制药株式会社 抗人cd73抗体
SI3383916T1 (sl) * 2017-01-24 2022-06-30 I-Mab Biopharma Us Limited Protitelesa proti-CD73 in njihove uporabe
BR112019018685A8 (pt) 2017-03-16 2023-03-21 Innate Pharma Anticorpos, composição farmacêutica, kit, usos de um anticorpo e método in vitro de identificação ou seleção de um anticorpo
CN113201071A (zh) * 2017-03-28 2021-08-03 礼进生物医药科技（上海）有限公司 用于增强肿瘤微环境中免疫应答的治疗剂和方法
US20210107989A1 (en) * 2017-04-04 2021-04-15 Corvus Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating cd73hi tumors
US20210284750A1 (en) 2017-04-14 2021-09-16 Bolt Biotherapeutics, Inc. Immunoconjugate Synthesis Method
US12226479B2 (en) 2017-05-11 2025-02-18 The General Hospital Corporation Methods and compositions of use of CD8+ tumor infiltrating lymphocyte subtypes and gene signatures thereof
EP3630830A1 (en) 2017-05-23 2020-04-08 Helmholtz Zentrum München - Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Novel cd73 antibody, preparation and uses thereof
JP7257335B2 (ja) 2017-05-25 2023-04-13 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー アンタゴニスト性ｃｄ４０モノクローナル抗体およびその使用
US11312783B2 (en) * 2017-06-22 2022-04-26 Novartis Ag Antibody molecules to CD73 and uses thereof
EP3642240A1 (en) 2017-06-22 2020-04-29 Novartis AG Antibody molecules to cd73 and uses thereof
WO2019027935A1 (en) 2017-07-31 2019-02-07 Tizona Therapeutics ANTI-CD39 ANTIBODIES, COMPOSITIONS COMPRISING ANTI-CD39 ANTIBODIES AND METHODS OF USING ANTI-CD39 ANTIBODIES
SG11202002192QA (en) 2017-10-06 2020-04-29 Innate Pharma Restoration of t cell activity via the cd39/cd73 axis
WO2019087094A1 (en) 2017-11-03 2019-05-09 Novartis Ag Anti-cd40 antibodies for use in treatment of sjögren's syndrome
KR20200096253A (ko) 2017-11-30 2020-08-11 노파르티스 아게 Bcma-표적화 키메라 항원 수용체, 및 이의 용도
MX2020008949A (es) 2018-02-27 2021-01-08 Incyte Corp Imidazopirimidinas y triazolopirimidinas como inhibidores de a2a / a2b.
WO2019170131A1 (zh) * 2018-03-07 2019-09-12 复旦大学 靶向cd73的抗体及抗体-药物偶联物、其制备方法和用途
CN110240654A (zh) * 2018-03-07 2019-09-17 复旦大学 结合cd73的抗体-药物偶联物
AR114275A1 (es) 2018-03-09 2020-08-12 Agenus Inc Anticuerpos anti-cd73 y métodos de uso de los mismos
CA3090008A1 (en) * 2018-03-09 2019-09-12 Phanes Therapeutics, Inc. Anti-cd73 antibodies and uses thereof
US10745485B2 (en) * 2018-03-13 2020-08-18 Tusk Therapeutics Ltd. Anti-CD25 antibody agents
AR117566A1 (es) * 2018-04-02 2021-08-18 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos anti-trem-1 y sus usos
JP7680208B2 (ja) * 2018-04-04 2025-05-20 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 抗ｃｄ２７抗体およびその使用
JP2021521182A (ja) * 2018-04-12 2021-08-26 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｃｄ７３アンタゴニストとｐｄ−１／ｐｄ−ｌ１軸アンタゴニストの組み合わせ治療
CN112153988A (zh) 2018-05-17 2020-12-29 博尔特生物治疗药物有限公司 免疫缀合物
JP7391046B2 (ja) 2018-05-18 2023-12-04 インサイト・コーポレイション Ａ２ａ／ａ２ｂ阻害剤としての縮合ピリミジン誘導体
EP3569618A1 (en) 2018-05-19 2019-11-20 Boehringer Ingelheim International GmbH Antagonizing cd73 antibody
TWI869346B (zh) 2018-05-30 2025-01-11 瑞士商諾華公司 Ｅｎｔｐｄ２抗體、組合療法、及使用該等抗體和組合療法之方法
WO2019232244A2 (en) * 2018-05-31 2019-12-05 Novartis Ag Antibody molecules to cd73 and uses thereof
US11492409B2 (en) 2018-06-01 2022-11-08 Novartis Ag Binding molecules against BCMA and uses thereof
EA202092518A1 (ru) 2018-06-18 2021-08-23 Иннейт Фарма Композиции и способы лечения рака
IL279829B2 (en) 2018-07-05 2025-05-01 Incyte Holdings Corp Fused pyrazine derivatives as A2A/A2B inhibitors
WO2020020307A1 (en) * 2018-07-25 2020-01-30 I-Mab Biopharma Co., Ltd. Anti-cd73 anti-pd-l1 bispecific antibodies
US12497464B1 (en) 2018-08-03 2025-12-16 Berkeley Therapeutics, Inc. Antibody, antibody fragments or peptide for treating cancer and methods of formation and administration
CN112739385A (zh) 2018-08-29 2021-04-30 博尔特生物治疗药物有限公司 靶向egfr的免疫缀合物
WO2020069382A1 (en) * 2018-09-28 2020-04-02 Lyvgen Biopharma Co., Ltd. Anti-cd137 binding molecules having engineered fc domains and therapeutic uses thereof
CA3118775A1 (en) * 2018-11-12 2020-05-22 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Anti-cd73 antibody, antigen-binding fragment thereof and application thereof
AR117091A1 (es) 2018-11-19 2021-07-07 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos monoclonales antagonistas contra cd40 y sus usos
CN111434688A (zh) * 2019-01-11 2020-07-21 上海开拓者生物医药有限公司 Cd73抗体及其制备方法和应用
CN111499747B (zh) * 2019-01-11 2022-03-18 康诺亚生物医药科技（成都）有限公司 一种抗cd73单克隆抗体及其应用
JOP20210164A1 (ar) 2019-01-11 2023-01-30 Omeros Corp طرق وتركيبات علاج السرطان
WO2020154548A2 (en) * 2019-01-23 2020-07-30 New York University Antibodies specific to delta 1 chain of t cell receptor
CN109734813B (zh) * 2019-01-28 2022-06-17 广东昭泰体内生物医药科技有限公司 一种嵌合抗原受体及其应用
TWI829857B (zh) 2019-01-29 2024-01-21 美商英塞特公司 作為a2a / a2b抑制劑之吡唑并吡啶及三唑并吡啶
WO2020190731A1 (en) 2019-03-15 2020-09-24 Bolt Biotherapeutics, Inc. Immunoconjugates targeting her2
AU2020241686A1 (en) 2019-03-15 2021-11-04 Bolt Biotherapeutics, Inc. Immunoconjugates targeting HER2
US20220152215A1 (en) 2019-03-15 2022-05-19 Bolt Biotherapeutics, Inc. Immunoconjugates Targeting CEA
WO2020190734A1 (en) 2019-03-15 2020-09-24 Bolt Biotherapeutics, Inc. Immunoconjugates targeting pd-l1
SG11202111106WA (en) * 2019-04-23 2021-11-29 Innate Pharma Cd73 blocking antibodies
JP7623706B2 (ja) * 2019-06-06 2025-01-29 ジャコバイオ ファーマスーティカルズ カンパニー リミテッド Ｃｄ７３に特異的な結合分子と結合分子の使用
US20200390899A1 (en) 2019-06-13 2020-12-17 Bolt Biotherapeutics, Inc. Aminobenzazepine compounds, immunoconjugates, and uses thereof
CN112111008B (zh) * 2019-06-19 2024-04-30 海正生物制药有限公司 抗cd73抗体及其应用
CN112300279A (zh) * 2019-07-26 2021-02-02 上海复宏汉霖生物技术股份有限公司 针对抗cd73抗体和变体的方法和组合物
EP4010005A4 (en) * 2019-08-09 2022-11-23 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. HOG-TCN1 MONOCLONAL ANTIBODIES AND METHODS FOR THEIR PRODUCTION AND USE
TWI793439B (zh) * 2019-08-21 2023-02-21 大陸商和鉑醫藥（上海）有限責任公司 抗ｃｄ７３抗體及其應用
US12312410B2 (en) * 2019-08-27 2025-05-27 Elpiscience (Suzhou) Biopharma, Ltd Anti-CD39 antibodies
CN114630684A (zh) 2019-09-03 2022-06-14 博尔特生物治疗药物有限公司 氨基喹啉化合物、免疫缀合物及其用途
US20220347312A1 (en) 2019-09-04 2022-11-03 Bolt Biotherapeutics, Inc. Immunoconjugate Synthesis Method
CN112442132A (zh) * 2019-09-05 2021-03-05 复旦大学 靶向肿瘤的重组双功能融合蛋白及其应用
AU2020342778A1 (en) * 2019-09-06 2022-03-31 Les Laboratoires Servier Anti-CD73 antibodies
CN114502590A (zh) 2019-09-18 2022-05-13 诺华股份有限公司 Entpd2抗体、组合疗法、以及使用这些抗体和组合疗法的方法
EP4038053A1 (en) 2019-09-30 2022-08-10 Bolt Biotherapeutics, Inc. Amide-linked, aminobenzazepine immunoconjugates, and uses thereof
AU2020371628A1 (en) * 2019-10-21 2022-05-19 Purdue Research Foundation Engineered natural killer cells and methods for using the same in immunotherapy and autophagy inhibition techniques
TWI857167B (zh) 2019-10-25 2024-10-01 美商博特生物治療公司 噻吩并氮呯免疫結合物及其用途
EP3822288A1 (en) * 2019-11-18 2021-05-19 Deutsches Krebsforschungszentrum, Stiftung des öffentlichen Rechts Antibodies targeting, and other modulators of, the cd276 antigen, and uses thereof
PE20221409A1 (es) 2020-01-03 2022-09-20 Incyte Corp Anticuerpos anti-cd73 y usos de estos
CA3166536A1 (en) 2020-01-03 2021-07-08 Incyte Corporation Cd73 inhibitor and a2a/a2b adenosine receptor inhibitor combination therapy
WO2021150702A1 (en) 2020-01-21 2021-07-29 Bolt Biotherapeutics, Inc. Anti-pd-l1 antibodies
CN115151308A (zh) 2020-01-21 2022-10-04 博尔特生物治疗药物有限公司 抗pd-l1抗体
WO2021173832A1 (en) 2020-02-25 2021-09-02 Bolt Biotherapeutics, Inc. Cancer treatment methods
BR112022020256A2 (pt) * 2020-04-09 2023-01-03 Aprilbio Co Ltd “anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ácido nucleico, vetor de expressão, célula, composição, uso da composição e uso do anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo
EP4141030A4 (en) * 2020-04-22 2024-09-04 Akeso Biopharma, Inc. ANTI-CD73 ANTIBODY AND ITS USE
JP7763780B2 (ja) * 2020-04-22 2025-11-04 中山康方生物医▲藥▼有限公司 抗ｃｄ７３／抗ｐｄ－１二重特異性抗体及びその使用
CR20220582A (es) 2020-05-01 2023-01-09 Bolt Biotherapeutics Inc Anticuerpos anti-dectina-2
CA3176626A1 (en) 2020-05-08 2021-11-11 David Dornan Elastase-substrate, peptide linker immunoconjugates, and uses thereof
KR20230009448A (ko) * 2020-05-12 2023-01-17 바이오세우스 인크. 항-cd73 항체 및 이의 용도
WO2021247188A1 (en) 2020-06-05 2021-12-09 Bristol-Myers Squibb Company Cd73 antagonist potency assay and methods of use thereof
JP2023532234A (ja) * 2020-06-22 2023-07-27 イノベント バイオロジクス（スーチョウ）カンパニー，リミティド 抗ｃｄ７３抗体とその用途
US20230321250A1 (en) * 2020-07-08 2023-10-12 Octagon Therapeutics, Inc. Cancer cell modulators
WO2022036101A1 (en) 2020-08-13 2022-02-17 Bolt Biotherapeutics, Inc. Pyrazoloazepine immunoconjugates, and uses thereof
CA3191745A1 (en) * 2020-08-17 2022-02-24 Akeso Biopharma, Inc. Anti-cd73 antibody and use thereof
CN111944850B (zh) * 2020-08-28 2023-03-31 澳门大学 表达抗cd22嵌合抗原受体和pd-l1阻断蛋白的细胞的制备方法、表达载体及应用
CN112251463B (zh) * 2020-09-30 2023-06-06 广东药康生物科技有限公司 一种cd73人源化小鼠模型的构建方法
CA3196299A1 (en) * 2020-10-23 2022-04-28 Baiyong Li Anti-cd73 antibody and use thereof
EP4240491A1 (en) 2020-11-06 2023-09-13 Novartis AG Cd19 binding molecules and uses thereof
CN117126281A (zh) * 2020-11-09 2023-11-28 江苏中新医药有限公司 抗cd73单克隆抗体及其在制备肿瘤药物中的应用
EP4251650A4 (en) * 2020-11-27 2024-10-23 Elpiscience (Suzhou) Biopharma, Ltd. Novel conjugate molecules targeting cd39 and tgfbeta
TWI900705B (zh) * 2020-12-11 2025-10-11 大陸商上海華奧泰生物藥業股份有限公司 Ｃｄ７３的抗原結合蛋白及其應用
CN116723866A (zh) 2020-12-11 2023-09-08 博尔特生物治疗药物有限公司 抗pd-l1免疫缀合物和其用途
US20220195066A1 (en) 2020-12-11 2022-06-23 Bolt Biotherapeutics, Inc. Anti-cea immunoconjugates, and uses thereof
JP2023552791A (ja) 2020-12-11 2023-12-19 ボルト バイオセラピューティクス、インコーポレーテッド 抗ｈｅｒ２免疫複合体、及びその使用
JP2024501453A (ja) 2020-12-11 2024-01-12 ボルト バイオセラピューティクス、インコーポレーテッド 抗ｃｅａイムノコンジュゲート、及びそれらの使用
JP2023552792A (ja) 2020-12-11 2023-12-19 ボルト バイオセラピューティクス、インコーポレーテッド 抗ｈｅｒ２免疫複合体、及びその使用
WO2022133169A1 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Century Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptor systems with adaptable receptor specificity
JP2024502005A (ja) 2020-12-29 2024-01-17 インサイト・コーポレイション Ａ２ａ／ａ２ｂ阻害剤、ｐｄ－１／ｐｄ－ｌ１阻害剤、及び抗ｃｄ７３抗体を含む併用療法
US20240067747A1 (en) * 2021-01-13 2024-02-29 Shanghai Huaota Biopharmaceutical Co., Ltd. Cd73-binding protein and use thereof
MX2023009100A (es) 2021-02-03 2023-09-25 Mozart Therapeutics Inc Agentes aglutinantes y métodos para usar los mismos.
WO2022178416A1 (en) * 2021-02-22 2022-08-25 Northwestern University Anti-cd73 monoclonal antibodies
WO2022179039A1 (zh) * 2021-02-24 2022-09-01 苏州近岸蛋白质科技股份有限公司 抗人cd73抗体及其应用
JP2024511088A (ja) 2021-03-26 2024-03-12 ボルト バイオセラピューティクス、インコーポレーテッド ２－アミノ－４－カルボキサミド－ベンゾアゼピン免疫複合体、及びその使用
CA3212907A1 (en) 2021-03-26 2022-09-29 Gary Brandt 2-amino-4-carboxamide-benzazepine immunoconjugates, and uses thereof
US20240301082A1 (en) * 2021-05-05 2024-09-12 Corvus Pharmaceuticals, Inc. Anti-cd73 compounds to treat oncovirus-positive cancers
DE102022116343A1 (de) 2021-07-01 2023-01-05 Edwards Lifesciences Corporation Herzklappenreparaturvorrichtungen und Zuführvorrichtungen dafür
WO2023076876A1 (en) 2021-10-26 2023-05-04 Mozart Therapeutics, Inc. Modulation of immune responses to viral vectors
CA3234604A1 (en) 2021-10-29 2023-05-04 Shelley Erin ACKERMAN Tlr agonist immunoconjugates with cysteine-mutant antibodies, and uses thereof
EP4471062A4 (en) * 2022-01-25 2025-07-16 Cspc Megalith Biopharmaceutical Co Ltd ANTI-CD73 ANTIBODY AND ITS USE
US12187806B2 (en) 2022-03-04 2025-01-07 Development Center For Biotechnology Anti-CD73 antibodies and use thereof
EP4494658A1 (en) * 2022-03-14 2025-01-22 Shanghai Huaota Biopharmaceutical Co., Ltd. Antibody-drug conjugate and use thereof
KR20250004779A (ko) 2022-04-13 2025-01-08 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 Trop-2 발현 암을 치료하기 위한 병용 요법
CN116903744B (zh) * 2022-08-12 2024-03-08 南京蓬勃生物科技有限公司 抗cd73抗体或其抗原片段及其应用
EP4572772A1 (en) 2022-08-17 2025-06-25 Capstan Therapeutics, Inc. Conditioning for in vivo immune cell engineering
CN120390652A (zh) 2022-12-01 2025-07-29 免疫医疗有限公司 用于治疗癌症的包含抗pd-l1抗体和抗cd73抗体的组合疗法
WO2024130003A1 (en) 2022-12-15 2024-06-20 Bolt Biotherapeutics, Inc. Cancer combination treatment method
WO2024137619A1 (en) 2022-12-20 2024-06-27 Bolt Biotherapeutics, Inc. Anti-claudin, bis-benzimid azole sting agonist immunoconjugates, and uses thereof
WO2024173384A1 (en) 2023-02-14 2024-08-22 Bolt Biotherapeutics, Inc. Aza-benzazepine immunoconjugates, and uses thereof
WO2024186626A1 (en) 2023-03-03 2024-09-12 Bolt Biotherapeutics, Inc. Aza-bicyclic sting agonist immunoconjugates, and uses thereof
AU2024240129A1 (en) 2023-03-17 2025-10-09 Oxitope Pharma B.V. Anti-phosphocholine antibodies and methods of use thereof
CN120981564A (zh) 2023-03-17 2025-11-18 圭尔医疗有限公司 调节性t细胞疗法
WO2024216089A1 (en) 2023-04-13 2024-10-17 Bolt Biotherapeutics, Inc. Anti-dectin-2 antibody combination therapy
CN121263210A (zh) 2023-04-17 2026-01-02 沛科生物公司 抗体和抗体-药物偶联物以及使用方法和合成工艺及中间体
CN118812710A (zh) * 2023-04-17 2024-10-22 上海鑫湾生物科技有限公司 特异性结合cd73的抗体及其制备方法和应用
US12311033B2 (en) 2023-05-31 2025-05-27 Capstan Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations and compositions
CN116813786B (zh) * 2023-08-03 2024-11-26 贝达药业股份有限公司 抗cd73抗体及其应用
WO2025076127A1 (en) 2023-10-05 2025-04-10 Capstan Therapeutics, Inc. Constrained ionizable cationic lipids and lipid nanoparticles
WO2025076113A1 (en) 2023-10-05 2025-04-10 Capstan Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipids with conserved spacing and lipid nanoparticles
WO2025135233A1 (ko) * 2023-12-21 2025-06-26 ㈜지아이이노베이션 Cd73에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도
WO2025134068A1 (en) 2023-12-22 2025-06-26 Ac Immune Sa Antibody drug conjugates targeting proteinopathies, and uses thereof
WO2025137640A1 (en) 2023-12-22 2025-06-26 Gilead Sciences, Inc. Azaspiro wrn inhibitors
WO2025162964A1 (en) 2024-01-30 2025-08-07 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for the treatment of endometriosis
WO2025179294A2 (en) 2024-02-22 2025-08-28 Capstan Therapeutics, Inc. Immune engineering amplification
WO2025217452A1 (en) 2024-04-11 2025-10-16 Capstan Therapeutics, Inc. Constrained ionizable cationic lipids and lipid nanoparticles
WO2025217454A2 (en) 2024-04-11 2025-10-16 Capstan Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipids and lipid nanoparticles
WO2025233264A1 (en) 2024-05-07 2025-11-13 Innate Pharma Use of cd73 blocking agents in combination with anti-cd20 x cd3 t cell engagers
WO2026006689A2 (en) 2024-06-28 2026-01-02 Firefly Bio, Inc. Bcl-xl degrader antibody conjugates and uses thereof
WO2026006688A2 (en) 2024-06-28 2026-01-02 Firefly Bio, Inc. Degrader antibody conjugates and uses thereof

Family Cites Families (292)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
GB8720833D0 (en) 1987-09-04 1987-10-14 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5476996A (en) 1988-06-14 1995-12-19 Lidak Pharmaceuticals Human immune system in non-human animal
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
CA2006596C (en) 1988-12-22 2000-09-05 Rika Ishikawa Chemically-modified g-csf
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
DK0463151T3 (da) 1990-01-12 1996-07-01 Cell Genesys Inc Frembringelse af xenogene antistoffer
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
JP2938569B2 (ja) 1990-08-29 1999-08-23 ジェンファーム インターナショナル，インコーポレイティド 異種免疫グロブリンを作る方法及びトランスジェニックマウス
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
WO1993012227A1 (en) 1991-12-17 1993-06-24 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
CA2061703C (en) 1992-02-20 2002-07-02 Rudolf E. Falk Formulations containing hyaluronic acid
CA2061566C (en) 1992-02-20 2002-07-09 Rudolf E. Falk Treatment of disease employing hyaluronic acid and nsaids
DE69233782D1 (de) 1991-12-02 2010-05-20 Medical Res Council Herstellung von Autoantikörpern auf Phagenoberflächen ausgehend von Antikörpersegmentbibliotheken
CA2130762C (en) 1994-08-24 1999-07-06 Eva Anne Turley Treatment of disease and conditions associated with macrophage infiltration
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
CA2161351C (en) 1993-04-26 2010-12-21 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
CA2163345A1 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Susan Adrienne Morgan Antibodies
EP0702553A1 (en) 1993-12-27 1996-03-27 BAXTER INTERNATIONAL INC. (a Delaware corporation) Water soluble non-immunogenic polyamide cross-linking agents
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6410690B1 (en) 1995-06-07 2002-06-25 Medarex, Inc. Therapeutic compounds comprised of anti-Fc receptor antibodies
US5811097A (en) 1995-07-25 1998-09-22 The Regents Of The University Of California Blockade of T lymphocyte down-regulation associated with CTLA-4 signaling
NZ321172A (en) 1995-10-03 2000-02-28 Scripps Research Inst CBI analogs of CC-1065 and the duocarmycins
CA2249195A1 (en) 1996-03-18 1997-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
US5834597A (en) 1996-05-20 1998-11-10 Protein Design Labs, Inc. Mutated nonactivating IgG2 domains and anti CD3 antibodies incorporating the same
US5922845A (en) 1996-07-11 1999-07-13 Medarex, Inc. Therapeutic multispecific compounds comprised of anti-Fcα receptor antibodies
US7247302B1 (en) 1996-08-02 2007-07-24 Bristol-Myers Squibb Company Method for inhibiting immunoglobulin-induced toxicity resulting from the use of immunoglobulins in therapy and in vivo diagnosis
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
WO1998042752A1 (en) 1997-03-21 1998-10-01 Brigham And Women's Hospital Inc. Immunotherapeutic ctla-4 binding peptides
ATE319745T1 (de) 1997-05-21 2006-03-15 Biovation Ltd Verfahren zur herstellung von nicht-immunogenen proteinen
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
ATE375365T1 (de) 1998-04-02 2007-10-15 Genentech Inc Antikörper varianten und fragmente davon
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
EP1746107B1 (en) 1998-04-02 2014-12-17 Genentech, Inc. Antibody variants and fragments thereof
PT1071700E (pt) 1998-04-20 2010-04-23 Glycart Biotechnology Ag Modificação por glicosilação de anticorpos para melhorar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
CA2356215C (en) 1998-12-23 2015-11-24 Pfizer Inc. Human monoclonal antibodies to ctla-4
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP1141024B1 (en) 1999-01-15 2018-08-08 Genentech, Inc. POLYPEPTIDE COMPRISING A VARIANT HUMAN IgG1 Fc REGION
ES2601882T5 (es) 1999-04-09 2021-06-07 Kyowa Kirin Co Ltd Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional
US20040031072A1 (en) 1999-05-06 2004-02-12 La Rosa Thomas J. Soy nucleic acid molecules and other molecules associated with transcription plants and uses thereof for plant improvement
CA2904259C (en) 1999-05-07 2016-11-15 Genentech, Inc. Use of rituximab to treat vasculitis
US20040146516A1 (en) 1999-06-17 2004-07-29 Utah Ventures Ii L.P. Lumen-exposed molecules and methods for targeted delivery
JP4118462B2 (ja) 1999-07-19 2008-07-16 株式会社リコー 携帯電子機器
EP1074563A1 (en) 1999-08-02 2001-02-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Chimeric polypeptides enhancing dimer formation through electrostatic interactions and disulfide bond, method for production and uses thereof
WO2001014556A1 (en) 1999-08-23 2001-03-01 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Novel b7-4 molecules and uses therefor
ATE354655T1 (de) 1999-08-24 2007-03-15 Medarex Inc Humane antikörper gegen ctla-4 und deren verwendungen
AU7721500A (en) 1999-09-29 2001-04-30 Human Genome Sciences, Inc. Colon and colon cancer associated polynucleotides and polypeptides
CA3016482A1 (en) 1999-11-30 2001-06-07 Mayo Foundation For Medical Education And Research B7-h1, a novel immunoregulatory molecule
US6610286B2 (en) 1999-12-23 2003-08-26 Zymogenetics, Inc. Method for treating inflammation using soluble receptors to interleukin-20
DE60040240D1 (de) 1999-12-23 2008-10-23 Zymogenetics Inc Löslicher interleukin-20 rezeptor
EP1743648B1 (en) 1999-12-23 2010-03-03 ZymoGenetics, Inc. Method for treating inflammation
US20070042392A1 (en) 2000-02-03 2007-02-22 Nuvelo, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
DE60122286T2 (de) 2000-02-11 2007-08-02 Merck Patent Gmbh Steigerung der zirkulierenden halbwertzeit von auf antikörpern basierenden fusionsproteinen
EP1283722A1 (en) 2000-03-31 2003-02-19 Idec Pharmaceuticals Corporation Combined use of anti-cytokine antibodies or antagonists and anti-cd20 for the treatment of b cell lymphoma
HUP0002003A3 (en) 2000-05-24 2003-01-28 Pronuk Biotechnologia Kft Process and reagent-kit for determining of 5'-nucleotidase activity
NO311144B1 (no) 2000-05-25 2001-10-15 Pedersen Viggo Wahl Spylemekanisme for vannklosett
WO2002004613A2 (en) 2000-07-07 2002-01-17 University Of North Carolina At Chapel Hill Isolated polynucleotides encoding human 5'-nucleotide cn-ia and cn-ib, isolated proteins encoded by the same, and methods utilizing the same
EP1301538B1 (en) 2000-07-11 2015-12-09 Research Corporation Technologies, Inc Artificial antibody polypeptides
EP1916303B1 (en) 2000-11-30 2013-02-27 Medarex, Inc. Nucleic acids encoding rearranged human immunoglobulin sequences from transgenic transchromosomal mice
EP1355919B1 (en) 2000-12-12 2010-11-24 MedImmune, LLC Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
BR0207854A (pt) 2001-03-07 2004-08-24 Merck Patent Gmbh Tecnologia de expressão para proteìnas contendo uma porção de anticorpo de isotipo hìbrido
EP1421203A4 (en) 2001-05-17 2005-06-01 Diversa Corp NEW ANTIGEN-BINDING MOLECULES FOR THERAPEUTIC, DIAGNOSTIC, PROPHYLACTIC, ENZYMATIC, INDUSTRIAL AND AGRICULTURAL APPLICATIONS AND METHOD FOR THE PRODUCTION AND SCREENING THEREOF
US7129261B2 (en) 2001-05-31 2006-10-31 Medarex, Inc. Cytotoxic agents
HUP0600342A3 (en) 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
US6545530B1 (en) 2001-12-05 2003-04-08 Linear Technology Corporation Circuit and method for reducing quiescent current in a voltage reference circuit
US20040002587A1 (en) 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
AU2003217912A1 (en) 2002-03-01 2003-09-16 Xencor Antibody optimization
US8188231B2 (en) 2002-09-27 2012-05-29 Xencor, Inc. Optimized FC variants
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US20040014194A1 (en) 2002-03-27 2004-01-22 Schering Corporation Beta-secretase crystals and methods for preparing and using the same
IL149820A0 (en) 2002-05-23 2002-11-10 Curetech Ltd Humanized immunomodulatory monoclonal antibodies for the treatment of neoplastic disease or immunodeficiency
ES2381617T5 (es) 2002-08-14 2016-02-24 Macrogenics, Inc. Anticuerpos específicos frente a FcgammaRIIB y sus procedimientos de uso
WO2004029207A2 (en) 2002-09-27 2004-04-08 Xencor Inc. Optimized fc variants and methods for their generation
ATE480562T1 (de) 2002-10-15 2010-09-15 Facet Biotech Corp Veränderung von fcrn-bindungsaffinitäten oder von serumhalbwertszeiten von antikörpern mittels mutagenese
AU2004204494B2 (en) 2003-01-09 2011-09-29 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
WO2004079013A1 (en) * 2003-03-03 2004-09-16 Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Ecto-5’-nucleotidase (cd73) used in the diagnosis and the treatment of pancreatic cancer
US9051373B2 (en) 2003-05-02 2015-06-09 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
EP2281577B1 (en) 2003-05-14 2016-11-16 ImmunoGen, Inc. Drug conjugate composition
US20100069614A1 (en) 2008-06-27 2010-03-18 Merus B.V. Antibody producing non-human mammals
CN1829533A (zh) 2003-05-30 2006-09-06 阿莱克申药物公司 包含改造恒定区的抗体和融合蛋白
CA2527878A1 (en) 2003-05-30 2005-01-27 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Antibodies and fusion proteins that include engineered constant regions
WO2005044853A2 (en) 2003-11-01 2005-05-19 Genentech, Inc. Anti-vegf antibodies
US7473531B1 (en) 2003-08-08 2009-01-06 Colora Corporation Pancreatic cancer targets and uses thereof
WO2005019258A2 (en) 2003-08-11 2005-03-03 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
US20150071948A1 (en) 2003-09-26 2015-03-12 Gregory Alan Lazar Novel immunoglobulin variants
US8399618B2 (en) 2004-10-21 2013-03-19 Xencor, Inc. Immunoglobulin insertions, deletions, and substitutions
US20060134105A1 (en) 2004-10-21 2006-06-22 Xencor, Inc. IgG immunoglobulin variants with optimized effector function
US8101720B2 (en) 2004-10-21 2012-01-24 Xencor, Inc. Immunoglobulin insertions, deletions and substitutions
US8883147B2 (en) 2004-10-21 2014-11-11 Xencor, Inc. Immunoglobulins insertions, deletions, and substitutions
GB0324368D0 (en) 2003-10-17 2003-11-19 Univ Cambridge Tech Polypeptides including modified constant regions
PT2489364E (pt) 2003-11-06 2015-04-16 Seattle Genetics Inc Compostos de monometilvalina conjugados com anticorpos
BRPI0506771A (pt) 2004-01-12 2007-05-22 Applied Molecular Evolution anticorpo, e, composição farmacêutica
US7329353B2 (en) 2004-01-23 2008-02-12 Amgen Inc. LC/MS method of analyzing high molecular weight proteins
EP1737890A2 (en) 2004-03-24 2007-01-03 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the fc region
US7778814B2 (en) 2004-03-30 2010-08-17 Siemens Aktiengesellschaft Method and device for simulating an automation system
CA2564076C (en) 2004-05-19 2014-02-18 Medarex, Inc. Chemical linkers and conjugates thereof
US7691962B2 (en) 2004-05-19 2010-04-06 Medarex, Inc. Chemical linkers and conjugates thereof
AU2005290250A1 (en) 2004-07-30 2006-04-06 Rinat Neuroscience Corp. Antibodies directed against amyloid-beta peptide and methods using same
JP5055603B2 (ja) 2004-08-04 2012-10-24 メントリック・バイオテック・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー 変異Ｆｃ領域
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
WO2006047350A2 (en) 2004-10-21 2006-05-04 Xencor, Inc. IgG IMMUNOGLOBULIN VARIANTS WITH OPTIMIZED EFFECTOR FUNCTION
AU2005299716B2 (en) 2004-10-22 2012-09-06 Amgen Inc. Methods for refolding of recombinant antibodies
US8367805B2 (en) 2004-11-12 2013-02-05 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
EA010654B1 (ru) 2004-11-23 2008-10-30 Пи Ай Пи Ко., Лтд. Вмонтированная в стену распределительная коробка водоснабжения
JP4986633B2 (ja) 2005-01-12 2012-07-25 協和発酵キリン株式会社 安定化されたヒトＩｇＧ２およびＩｇＧ３抗体
US7700099B2 (en) 2005-02-14 2010-04-20 Merck & Co., Inc. Non-immunostimulatory antibody and compositions containing the same
CA2602777C (en) 2005-03-25 2018-12-11 Tolerrx, Inc. Gitr binding molecules and uses therefor
US7714016B2 (en) 2005-04-08 2010-05-11 Medarex, Inc. Cytotoxic compounds and conjugates with cleavable substrates
PL2161336T5 (pl) 2005-05-09 2017-10-31 Ono Pharmaceutical Co Ludzkie przeciwciała monoklonalne przeciwko białku Programmed Death 1 (PD-1) oraz sposoby leczenia raka z zastosowaniem samych przeciwciał anty-PD-1 lub w połączeniu z innymi środkami immunoterapeutycznymi
BR122020016659B8 (pt) 2005-05-10 2021-07-27 Incyte Holdings Corp moduladores de 2,3-dioxigenase de indolamina e métodos de modulação de atividade de inibição e de imunossupressão
US8163881B2 (en) 2005-05-31 2012-04-24 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Immunoglobulin molecules with improved characteristics
CN104356236B (zh) 2005-07-01 2020-07-03 E.R.施贵宝&圣斯有限责任公司 抗程序性死亡配体1(pd-l1)的人单克隆抗体
EA016577B1 (ru) 2005-09-26 2012-06-29 Медарекс, Инк. Конъюгаты антитело-лекарство и их применение
WO2007038868A2 (en) 2005-10-03 2007-04-12 The University Of British Columbia Novel enediyne compound and uses thereof
SI1940789T1 (sl) 2005-10-26 2012-03-30 Medarex Inc Postopki in spojine za pripravo cc analogov
US20080206246A1 (en) 2006-04-05 2008-08-28 Ravetch Jeffrey V Polypeptides with enhanced anti-inflammatory and decreased cytotoxic properties and relating methods
WO2007059404A2 (en) 2005-11-10 2007-05-24 Medarex, Inc. Duocarmycin derivatives as novel cytotoxic compounds and conjugates
TWI382974B (zh) 2005-12-20 2013-01-21 英塞特公司 作為吲哚胺２，３-二氧化酶調節劑之ｎ-羥基甲脒基雜環化物
PE20080316A1 (es) 2006-05-25 2008-04-10 Bristol Myers Squibb Co Compuestos de aziridinil-epotilona
AR062448A1 (es) 2006-05-25 2008-11-12 Endocyte Inc Conjugados de analogos de aziridinil-epotilona y composiciones farmaceuticas que comprenden los mismos
DE102006027624A1 (de) 2006-06-13 2007-12-20 Elexxion Gmbh Handstück für insbesondere medizinische Laseranwendungen
US8221751B2 (en) 2006-06-21 2012-07-17 Oncotherapy Science, Inc. Tumor-targeting monoclonal antibodies to FZD10 and uses thereof
US20150030534A1 (en) 2013-07-26 2015-01-29 Rutgers, The State University Of New Jersey Antibody cocktails for breast cancer radioimmunotherapy
EP2078732B1 (en) * 2006-07-10 2015-09-16 Fujita Health University Method of identifying a candidate diagnostic or therapeutic antibody using flow cytometry
CA2663057C (en) 2006-09-19 2015-12-08 Incyte Corporation N-hydroxyamidinoheterocycles as modulators of indoleamine 2,3-dioxygenase
CL2007002650A1 (es) 2006-09-19 2008-02-08 Incyte Corp Compuestos derivados de heterociclo n-hidroxiamino; composicion farmaceutica, util para tratar cancer, infecciones virales y desordenes neurodegenerativos entre otras.
PT2099823E (pt) 2006-12-01 2014-12-22 Seattle Genetics Inc Agentes de ligação ao alvo variantes e suas utilizações
WO2008140603A2 (en) 2006-12-08 2008-11-20 Macrogenics, Inc. METHODS FOR THE TREATMENT OF DISEASE USING IMMUNOGLOBULINS HAVING FC REGIONS WITH ALTERED AFFINITIES FOR FCγR ACTIVATING AND FCγR INHIBITING
CL2007003622A1 (es) 2006-12-13 2009-08-07 Medarex Inc Anticuerpo monoclonal humano anti-cd19; composicion que lo comprende; y metodo de inhibicion del crecimiento de celulas tumorales.
TWI412367B (zh) 2006-12-28 2013-10-21 Medarex Llc 化學鏈接劑與可裂解基質以及其之綴合物
WO2008103693A2 (en) 2007-02-21 2008-08-28 Medarex, Inc. Chemical linkers with single amino acids and conjugates thereof
JP2008278814A (ja) 2007-05-11 2008-11-20 Igaku Seibutsugaku Kenkyusho:Kk アゴニスティック抗ヒトｇｉｔｒ抗体による免疫制御の解除とその応用
DK2662449T3 (en) 2007-05-30 2017-05-15 Postech Academy-Industry- Found immunoglobulin fusion proteins
EP2526967A1 (en) 2007-07-17 2012-11-28 Merck Patent GmbH Engineered anti-alpha v-integrin hybrid antibodies
US20090028857A1 (en) 2007-07-23 2009-01-29 Cell Genesys, Inc. Pd-1 antibodies in combination with a cytokine-secreting cell and methods of use thereof
DE102007036200A1 (de) 2007-08-02 2009-02-05 Knorr-Bremse Systeme für Nutzfahrzeuge GmbH Induktiver Weg- oder Drehwinkelsensor mit zwischen zwei Spulen angeordnetem Abschirmblech
CA3128656A1 (en) 2007-08-22 2009-02-26 The Regents Of The University Of California Activatable binding polypeptides and methods of identification and use thereof
EP2197911A2 (en) 2007-09-14 2010-06-23 Amgen Inc. Homogeneous antibody populations
ES2566957T3 (es) 2007-09-26 2016-04-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Región constante de anticuerpo modificado
PE20140132A1 (es) 2007-09-26 2014-02-14 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo anti-receptor de il-6
CN101809162B (zh) * 2007-09-28 2013-06-05 中外制药株式会社 血浆中动力学被改善的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体
PL2195017T3 (pl) 2007-10-01 2015-03-31 Bristol Myers Squibb Co Ludzkie antyciała, które wiążą mezotelinę i ich zastosowania
WO2009053368A1 (en) 2007-10-22 2009-04-30 Merck Serono S.A. Single ifn-beta fused to a mutated igg fc fragment
US8975081B2 (en) 2007-10-24 2015-03-10 Faron Pharmaceuticals Oy Biomarker for monitoring development of diseases and assessing the efficacy of therapies
FI20070795A0 (fi) 2007-10-24 2007-10-24 Faron Pharmaceuticals Oy Uusi biomarkkeri sairauksien kehittämisen tarkkailuun ja terapioiden tehon arviointiin
US20090181037A1 (en) 2007-11-02 2009-07-16 George Heavner Semi-Synthetic GLP-1 Peptide-FC Fusion Constructs, Methods and Uses
CA2932121A1 (en) 2007-11-30 2009-06-11 Newlink Genetics Corporation Ido inhibitors
MX2010005966A (es) 2007-11-30 2010-06-15 Bristol Myers Squibb Co Conjugados de anticuerpo monoclonal-molecula asociada dirigidos a la proteina tirosina-cinasa 7 (ptk7).
AU2008334063A1 (en) 2007-11-30 2009-06-11 Bristol-Myers Squibb Company Anti-B7H4 monoclonal antibody-drug conjugate and methods of use
KR20160074019A (ko) 2007-12-05 2016-06-27 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항ｎｒ１０ 항체 및 그의 이용
EP2808345A3 (en) 2007-12-05 2015-03-11 Massachusetts Institute of Technology Aglycosylated immunoglobulin mutants
PL2235059T3 (pl) 2007-12-26 2015-08-31 Xencor Inc Warianty FC o zmodyfikowanym wiązaniu do FCRN
EP2234620B1 (fr) 2008-01-03 2016-03-09 Université d'Aix-Marseille Tritherapie utilisable lors du traitement d'un patient infecte par le vih
WO2009100309A2 (en) 2008-02-08 2009-08-13 Medimmune, Llc Anti-ifnar1 antibodies with reduced fc ligand affinity
US8168757B2 (en) 2008-03-12 2012-05-01 Merck Sharp & Dohme Corp. PD-1 binding proteins
EP2268668A1 (en) 2008-04-17 2011-01-05 Ablynx N.V. Peptides capable of binding to serum proteins and compounds, constructs and polypeptides comprising the same
EP2282773B2 (en) 2008-05-02 2025-03-05 Seagen Inc. Methods and compositions for making antibodies and antibody derivatives with reduced core fucosylation
AR072999A1 (es) 2008-08-11 2010-10-06 Medarex Inc Anticuerpos humanos que se unen al gen 3 de activacion linfocitaria (lag-3) y los usos de estos
WO2010077643A1 (en) 2008-12-08 2010-07-08 Tegopharm Corporation Masking ligands for reversible inhibition of multivalent compounds
EP4331604B9 (en) 2008-12-09 2025-07-23 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-pd-l1 antibodies and their use to enhance t-cell function
EA020843B1 (ru) 2009-02-03 2015-02-27 Амуникс Оперейтинг Инк. Удлиненные рекомбинантные полипептиды и содержащие их композиции
EP2409991B1 (en) 2009-03-19 2017-05-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
TWI682995B (zh) 2009-03-19 2020-01-21 日商中外製藥股份有限公司 抗體恆定區域改變體
US20110007023A1 (en) 2009-07-09 2011-01-13 Sony Ericsson Mobile Communications Ab Display device, touch screen device comprising the display device, mobile device and method for sensing a force on a display device
US8394922B2 (en) 2009-08-03 2013-03-12 Medarex, Inc. Antiproliferative compounds, conjugates thereof, methods therefor, and uses thereof
CA2772613C (en) 2009-09-03 2020-03-10 Schering Corporation Anti-gitr antibodies
JP5837821B2 (ja) 2009-09-24 2015-12-24 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
WO2011056652A1 (en) 2009-10-28 2011-05-12 Newlink Genetics Imidazole derivatives as ido inhibitors
JO3437B1 (ar) 2009-10-30 2019-10-20 Esai R & D Man Co Ltd أجسام مضادة محسنة مضادة للفراكتالكين البشري واستخداماتها
CA2778714C (en) 2009-11-24 2018-02-27 Medimmune Limited Targeted binding agents against b7-h1
KR101791430B1 (ko) 2009-11-30 2017-10-30 얀센 바이오테크 인코포레이티드 이펙터 기능이 제거된 항체 Ｆｃ 돌연변이체
JP5909449B2 (ja) 2009-12-10 2016-04-26 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 重鎖抗体を作製するマウス
HUE044179T2 (hu) 2009-12-10 2019-10-28 Hoffmann La Roche Elsõsorban humán CSF1R extracelluláris domén 4-et megkötõ antitestek és ezek alkalmazása
US20120021409A1 (en) 2010-02-08 2012-01-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Common Light Chain Mouse
PL2505654T5 (pl) 2010-02-08 2020-11-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mysz ze wspólnym łańcuchem lekkim
JP5705242B2 (ja) 2010-02-19 2015-04-22 ゼンコア インコーポレイテッド 新規ｃｔｌａ４−ｉｇ免疫アドヘシン
WO2011108714A1 (ja) 2010-03-04 2011-09-09 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
SG10201604336VA (en) 2010-03-04 2016-07-28 Macrogenics Inc Antibodies Reactive With B7-H3, Immunologically Active Fragments Thereof And Uses Thereof
EP2542588A1 (en) 2010-03-05 2013-01-09 F. Hoffmann-La Roche AG Antibodies against human csf-1r and uses thereof
US9169323B2 (en) 2010-03-05 2015-10-27 Hoffmann-La Roche Inc. Antibodies against human CSF-1R
WO2011120135A1 (en) 2010-03-29 2011-10-06 Zymeworks, Inc. Antibodies with enhanced or suppressed effector function
MX392483B (es) 2010-04-13 2025-03-24 Bristol Myers Squibb Co Proteínas de dominio de armazón basadas en fibronectina que se unen a la proteína convertasa subtilisina kexina tipo q (pcsk9).
NZ602933A (en) 2010-04-15 2014-09-26 Seattle Genetics Inc Pyrrolobenzodiazepines used to treat proliferative diseases
JP5870400B2 (ja) 2010-04-15 2016-03-01 シアトル ジェネティクス，インコーポレーテッド 標的化ピロロベンゾジアゼピンコンジュゲート
WO2012007783A1 (en) 2010-07-13 2012-01-19 Institut Gustave Roussy Kits and methods for detecting the ability to induce an immunogenic cancer cell death in a subject
EP2561088A1 (en) 2010-04-22 2013-02-27 Institut Gustave Roussy Compounds and uses thereof to induce an immunogenic cancer cell death in a subject
WO2011131246A1 (en) 2010-04-22 2011-10-27 Institut Gustave Roussy Compounds and uses thereof to induce an immunogenic cancer cell death in a subject
US8865653B2 (en) 2010-04-22 2014-10-21 Institut Gustave Roussy Method of treatment for immunogenic treatment resistant cancer
WO2011131472A1 (en) 2010-04-22 2011-10-27 Institut Gustave Roussy Compounds and uses thereof to induce an immunogenic cancer cell death in a subject
TW201138808A (en) 2010-05-03 2011-11-16 Bristol Myers Squibb Co Serum albumin binding molecules
NZ603193A (en) 2010-05-04 2014-07-25 Five Prime Therapeutics Inc Antibodies that bind csf1r
WO2011163314A1 (en) 2010-06-22 2011-12-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Hybrid light chain mice
US8907053B2 (en) 2010-06-25 2014-12-09 Aurigene Discovery Technologies Limited Immunosuppression modulating compounds
US20130123345A1 (en) 2010-07-23 2013-05-16 The Ohio State University Method of treating a viral infection dysfunction by disrupting an adenosine receptor pathway
AU2011283694B2 (en) 2010-07-29 2017-04-13 Xencor, Inc. Antibodies with modified isoelectric points
SG187225A1 (en) 2010-07-30 2013-02-28 Novartis Ag Fibronectin cradle molecules and libraries thereof
WO2012031320A1 (en) 2010-09-06 2012-03-15 Peter Maccallum Cancer Institute Cancer diagnostic
MY177065A (en) 2010-09-09 2020-09-03 Pfizer 4-1bb binding molecules
HUE039375T2 (hu) 2010-10-29 2018-12-28 Perseus Proteomics Inc Magas internalizálási kapacitású anti-CDH3 antitest
EP2656073A4 (en) 2010-12-20 2014-12-17 Univ Rockefeller Modulating agonistic tnfr antibodies
US9540433B2 (en) * 2011-02-01 2017-01-10 Genmab A/S Human antibodies and antibody-drug conjugates against CD74
CA2827923C (en) 2011-02-25 2021-11-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fc.gamma.riib-specific fc antibody
DK2697257T3 (en) 2011-04-13 2017-01-30 Bristol Myers Squibb Co FC FUSION PROTEINS INCLUDING UNKNOWN LINKERS OR EVENTS
NO2694640T3 (sr) 2011-04-15 2018-03-17
PT2699264T (pt) 2011-04-20 2018-05-23 Medimmune Llc Anticorpos e outras moléculas que ligam b7-h1 e pd-1
US8852599B2 (en) 2011-05-26 2014-10-07 Bristol-Myers Squibb Company Immunoconjugates, compositions for making them, and methods of making and use
WO2013041606A1 (en) 2011-09-20 2013-03-28 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepines as unsymmetrical dimeric pbd compounds for inclusion in targeted conjugates
US20130149300A1 (en) 2011-09-27 2013-06-13 Icon Genetics Gmbh MONOCLONAL ANTIBODIES WITH ALTERED AFFINITIES FOR HUMAN FCyRI, FCyRIIIa, AND C1q PROTEINS
ES2402038B1 (es) 2011-10-14 2013-11-25 Josep Ramon Viola Terès Base para palé y palé provisto de esta
WO2013086448A2 (en) 2011-12-07 2013-06-13 Amgen Inc IgG2 DISULFIDE ISOFORM SEPARATION
BR112014012624A2 (pt) 2011-12-15 2018-10-09 F Hoffmann-La Roche Ag anticorpos, composição farmacêutica, ácido nucleico, vetores de expressão, célula hospedeira, método para a produção de um anticorpo recombinante e uso do anticorpo
SG11201403311SA (en) 2011-12-19 2014-07-30 Univ Rockefeller Non-sialylated anti-inflammatory polypeptides
AU2013211824B2 (en) 2012-01-27 2017-06-01 Gliknik Inc. Fusion proteins comprising IgG2 hinge domains
CA2861122A1 (en) 2012-02-06 2013-08-15 Genentech, Inc. Compositions and methods for using csf1r inhibitors
DK2814829T3 (en) 2012-02-13 2017-03-20 Bristol Myers Squibb Co RELATIONSHIPS, CONJUGATES THEREOF AND USES AND RELATED PROCEDURES
AR090263A1 (es) 2012-03-08 2014-10-29 Hoffmann La Roche Terapia combinada de anticuerpos contra el csf-1r humano y las utilizaciones de la misma
HK1208233A1 (en) 2012-05-11 2016-02-26 戊瑞治疗有限公司 Methods of treating conditions with antibodies that bind colony stimulating factor 1 receptor (csf1r)
SG10201700698WA (en) 2012-05-15 2017-02-27 Bristol Myers Squibb Co Cancer immunotherapy by disrupting pd-1/pd-l1 signaling
AU2013281328B2 (en) 2012-06-27 2017-11-23 Meiragtx Uk Ii Limited Combination for treating an inflammatory disorder
UY34887A (es) 2012-07-02 2013-12-31 Bristol Myers Squibb Company Una Corporacion Del Estado De Delaware Optimización de anticuerpos que se fijan al gen de activación de linfocitos 3 (lag-3) y sus usos
HK1212214A1 (en) 2012-08-31 2016-06-10 戊瑞治疗有限公司 Methods of treating conditions with antibodies that bind colony stimulating factor 1 receptor (csf1r)
MX366666B (es) 2012-09-13 2019-07-19 Bristol Myers Squibb Co Proteínas del dominio de soporte basadas en fibronectina que se fijan a miostatina.
SI2956173T1 (sl) 2013-02-14 2017-06-30 Bristol-Myers Squibb Company Spojine tubulizina, postopki pridobivanja in uporaba
WO2014153424A1 (en) 2013-03-19 2014-09-25 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Reducing diabetes in patients receiving hmg-coa reductase inhibitors (statins)
KR102049991B1 (ko) 2013-03-28 2019-12-02 삼성전자주식회사 항 c-Met/항 Her2 이중 특이 항체
CN103278634B (zh) * 2013-05-16 2015-01-07 中国科学院近代物理研究所 Cd73作为肾透明细胞癌干细胞表面标志物的应用
PT3702373T (pt) 2013-09-13 2022-09-27 Beigene Switzerland Gmbh Anticorpos anti-pd1 e a sua utilização como agentes terapêuticos e de diagnóstico
PT3508502T (pt) 2013-09-20 2023-06-22 Bristol Myers Squibb Co Combinação de anticorpos anti-lag-3 e anticorpos anti-pd-1 para tratar tumores
AU2014374055B2 (en) 2013-12-30 2018-11-08 Epimab Biotherapeutics Inc. Fabs-in-tandem immunoglobulin and uses thereof
WO2015145360A1 (en) 2014-03-24 2015-10-01 Glennie Martin J Modified antibodies containing modified igg2 domains which elicit agonist or antagonistic properties and use thereof
WO2015164573A1 (en) 2014-04-25 2015-10-29 Vitae Pharmaceuticals, Inc. Purine derivatives as cd73 inhibitors for the treatment of cancer
PT3151921T (pt) 2014-06-06 2019-11-21 Bristol Myers Squibb Co Anticorpos contra recetor do fator de necrose tumoral induzido por glicocorticoide e utilizações dos mesmos
DK3204417T3 (da) 2014-10-10 2020-10-12 Innate Pharma Cd73-blokering
LT3218406T (lt) 2014-11-10 2021-06-25 Medimmune Limited Surišančios molekulės, specifiškos cd73 ir jų panaudojimas
WO2016075176A1 (en) 2014-11-11 2016-05-19 Medimmune Limited Therapeutic combinations comprising anti-cd73 antibodies and a2a receptor inhibitor and uses thereof
DK3221363T3 (da) * 2014-11-21 2020-08-10 Bristol Myers Squibb Co Antistoffer mod cd73 og anvendelser deraf
DK3221346T3 (da) 2014-11-21 2020-10-12 Bristol Myers Squibb Co Antistoffer omfattende modificerede konstante områder af tungkæden
CN108738324B (zh) 2015-11-19 2022-06-21 百时美施贵宝公司 抗糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(gitr)抗体及其用途
IL295230A (en) 2016-03-04 2022-10-01 Bristol Myers Squibb Co Combination therapy with anti-cd73 antibodies
JP7257335B2 (ja) 2017-05-25 2023-04-13 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー アンタゴニスト性ｃｄ４０モノクローナル抗体およびその使用
KR20200012907A (ko) 2017-05-25 2020-02-05 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 변형된 IgG1 Fc 도메인 및 그와의 항-CD40 도메인 항체 융합체
CN110719915A (zh) 2017-05-25 2020-01-21 百时美施贵宝公司 包含经修饰的重链恒定区的抗体
JP2021521182A (ja) 2018-04-12 2021-08-26 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｃｄ７３アンタゴニストとｐｄ−１／ｐｄ−ｌ１軸アンタゴニストの組み合わせ治療
CN113348177A (zh) 2018-11-28 2021-09-03 百时美施贵宝公司 包含经修饰的重链恒定区的抗体

Also Published As

Publication number Publication date
HUE050596T2 (hu) 2020-12-28
IL252353B (en) 2021-06-30
KR20170080699A (ko) 2017-07-10
TWI711630B (zh) 2020-12-01
UY36404A (es) 2016-06-01
US10100129B2 (en) 2018-10-16
EA201790986A1 (ru) 2017-10-31
PT3221363T (pt) 2020-07-23
LT3221363T (lt) 2020-08-10
SG11201703192SA (en) 2017-05-30
HRP20201176T1 (hr) 2020-11-13
JP6805142B2 (ja) 2020-12-23
KR20230125855A (ko) 2023-08-29
IL252353A0 (en) 2017-07-31
US9605080B2 (en) 2017-03-28
SG10201913004UA (en) 2020-03-30
US20190055320A1 (en) 2019-02-21
TW202124451A (zh) 2021-07-01
US20190062456A1 (en) 2019-02-28
KR102569813B1 (ko) 2023-08-24
EP3221363B1 (en) 2020-05-06
JP7235712B2 (ja) 2023-03-08
ME03806B (me) 2021-04-20
CL2017001296A1 (es) 2018-02-16
MX2017006624A (es) 2017-08-21
ES2986091T3 (es) 2024-11-08
TN2017000203A1 (en) 2018-10-19
US10167343B2 (en) 2019-01-01
EA202090956A2 (ru) 2020-09-30
WO2016081748A3 (en) 2016-09-15
EA202090956A3 (ru) 2020-12-30
SI3221363T1 (sl) 2020-09-30
TWI758928B (zh) 2022-03-21
IL283965A (en) 2021-07-29
US20230051701A1 (en) 2023-02-16
CN107001474B (zh) 2021-10-01
US20180127513A1 (en) 2018-05-10
HK1244817A1 (en) 2018-08-17
CA2968357A1 (en) 2016-05-26
JP2017537620A (ja) 2017-12-21
EP3725808B1 (en) 2024-07-17
EA035766B1 (ru) 2020-08-07
US20160145350A1 (en) 2016-05-26
NZ731633A (en) 2022-01-28
PE20170782A1 (es) 2017-07-04
CN113773388A (zh) 2021-12-10
CL2018001414A1 (es) 2018-08-24
PL3221363T3 (pl) 2021-01-11
MA40309A1 (fr) 2018-01-31
BR112017010110A2 (pt) 2018-01-30
CN107001474A (zh) 2017-08-01
CO2017005845A2 (es) 2017-09-11
SMT202000413T1 (it) 2020-09-10
MX383868B (es) 2025-03-14
TW201625693A (zh) 2016-07-16
EP3725808A1 (en) 2020-10-21
PH12017500918A1 (en) 2017-11-20
MY189836A (en) 2022-03-11
AU2015349878A1 (en) 2017-05-25
ES2807182T3 (es) 2021-02-22
CY1123355T1 (el) 2021-12-31
DK3221363T3 (da) 2020-08-10
JP2021061837A (ja) 2021-04-22
US20170253665A1 (en) 2017-09-07
AR102698A1 (es) 2017-03-15
WO2016081748A2 (en) 2016-05-26
US11352440B2 (en) 2022-06-07
AU2021215286A1 (en) 2021-09-09
EP3221363A2 (en) 2017-09-27
CN113773388B (zh) 2025-03-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7235712B2 (ja) Ｃｄ７３に対する抗体およびその使用
JP7387776B2 (ja) Ｔｉｍ３に対する抗体およびその使用
JP7320555B2 (ja) グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体（ｇｉｔｒ）に対する抗体およびその使用
US12060421B2 (en) Antibodies to TIGIT
CN108738324B (zh) 抗糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(gitr)抗体及其用途
JP2022104961A (ja) 抗ｃｄ７３抗体を用いた併用療法
CN111886255A (zh) 抗tim3抗体及其用途
HK40036870A (en) Antibodies against cd73 and uses thereof
HK1244817B (en) Antibodies against cd73 and uses thereof