RS60514B1

RS60514B1 - Postupci i sastavi za tretman beta talasemije

Info

Publication number: RS60514B1
Application number: RS20200781A
Authority: RS
Inventors: Pei-Qi Liu; Andreas Reik; Lei Zhang
Original assignee: Sangamo Therapeutics Inc
Priority date: 2014-02-03
Filing date: 2015-02-02
Publication date: 2020-08-31
Also published as: WO2015117081A2; WO2015117081A3; HUE051232T2; EP3102673A2; DK3102673T3; HRP20201038T1; PT3102673T; US10072066B2; PL3102673T3; ES2796087T3; US20150218253A1; SI3102673T1; LT3102673T; EP3102673B1; EP3102673A4

Description

Opis

Oblast

[0001] Predmetno obelodanjenje spada u oblast genomskog inženjeringa matičnih ćelija hematopoeze, posebno se odnosi na tretman hemoglobinopatije, poput beta talasemije.

STANJE TEHNIKE

[0002] Genska terapija ima ogroman potencijal za novu eru u ljudskoj medicini. Ove metodologije će omogućiti tretman za stanja za koja standardna medicinska praksa do danas nije imala odgovor. Jedna oblast koja posebno obećava je sposobnost genetičkog inženjeringa ćelije da prouzrokuje da ta ćelija eksprimira proizvod koji se prethodno nije proizvodio u toj ćeliji, na primer, zahvaljujući mutaciji koja inaktivira kognitivni gen u svom genomu. Primeri upotrebe ove tehnologije uključuju ciljanu korekciju mutacije koja uzrokuje bolest, umetanje gena koji kodira novi terapeutski protein, umetanje kodirajuće sekvence koja kodira protein koji nedostaje u ćeliji ili kod pojedinca, umetanje divljeg tipa gena u ćeliji koji sadrži mutiranu sekvencu gena i umetanje sekvence koja kodira strukturnu nukleinsku kiselinu kao što su mikroRNK ili siRNK.

[0003] Transgeni se mogu dostaviti u ćeliju na različite načine, tako da se transgen integriše u sopstveni genom i održava tamo. Poslednjih godina razvijena je strategija za integraciju transgena koja koristi razdvajanje sa nukleazama specifičnim za lokaciju, za ciljano umetanje u odabrani genski lokus (pogledati npr. suvlasnički SAD patent 7,888,121). Nukleaze specifične za ciljane gene mogu se iskoristiti tako da se transgeni konstrukt umeće bilo procesom vođenim homologijom usmerenom popravkom (HDR) ili krajnjim hvatanjem tokom procesa nehomolognog spajanja krajeva (NHEJ). Ciljani lokusi uključuju lokuse „sigurne luke“, na primer CCR5 gen, CXCR4 gen, PPP1R12C (takođe poznat kao AAVS1) gen, albumin gen ili Rosa gen. Pogledati npr. SAD patent br.7,888,121; 7,972,854;

7,914,796; 7,951,925; 8,110,379; 8,409,861; 8,586,526; SAD publikacije patenata 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20060063231; 20080159996; 201000218264; 20120017290; 20110265198; 20130137104; 20130122591; 20130177983 i 20130177960). Nukleazom posredovana integracija nudi mogućnost poboljšanog eksprimiranja transgena, povećane sigurnosti i trajanja eksprimiranja, u poređenju sa klasičnim pristupima integracije koji se oslanjaju na slučajnu integraciju transgena, jer omogućava tačno pozicioniranje transgena za minimalan rizik od utišavanja gena ili aktiviranja onkogena u blizini. Nukleaze uključuju cinkov prst nukleaze (ZFN), aktivator transkripcije poput efektorskih nukleaza (TALEN), mega ili homing endonukleaze, sisteme nukleaza kao što su CRISPR/Cas koji koriste RNK vodič za određivanje specifičnosti, i fuzije između nukleaza kao što su mega-TAL.

[0004] Ciljana integracija posredovana nukleazom takođe se može koristiti za ciljanu korekciju gena endogenog lokusa. Korekcija gena može se dogoditi nakon razdvajanja nukleaza kao što je gore navedeno umetanjem transgena od interesa u mutirani endogeni lokus. Alternativno, mutirani gen može da se koriguje integrisanjem dela divljeg tipa ili konstruisane sekvence kako bi zamenio (ispravio) mutirani deo lokusa gena. za korigovanje gena, kao i za ciljanu integraciju bilo koje egzogene sekvence, koriste se nukleaze specifične za sekvencu (npr. ZFN, TALEN, CRISPR/Cas, meganukleaze ili megaTAL) za uvođenje DSB u endogeni gen od interesa i donora, koji obično sadrži krake homologije u endogeni (mutirani) gen, integrisan je tako da donor izmeni endogeni (mutirani) gen. Ovaj pristup se može koristiti za ispravljanje mutacija unutar endogene genske sekvence i/ili za umetanje konstruisanih sekvenci za željenu svrhu.

[0005] Crvena krvna zrnca (RBC), ili eritrociti, su glavna ćelijska komponenta krvi. U stvari, RBC čine jednu četvrtinu ćelija kod čoveka. Zreli RBC nemaju nukleus i mnoge druge organele kod ljudi i prepuni su hemoglobina, metaloproteina koji se nalazi u RBC koji funkcioniše tako da prenosi kiseonik do tkiva, ali takođe i izvodi ugljen dioksid iz tkiva nazad u pluća radi uklanjanja. Protein čini otprilike 97% suve težine RBC i povećava sposobnost prenošenja kiseonika u krvi za oko sedamdeset puta. Hemoglobin je heterotetramer koji se sastoji od dva α-slična lanca globina i dva β-slična lanca globina i 4 heme grupe. Kod odraslih se α2β2 tetramer naziva hemoglobin A (HbA) ili hemoglobin odraslih. Tipično, alfa i beta lanci globina sintetišu se u približnom odnosu 1:1 i čini se da je ovaj odnos kritičan u pogledu stabilizacije hemoglobina i RBC. U stvari, u nekim slučajevima kada je jedna vrsta globin gena neadekvatno eksprimirana (pogledati u nastavku), smanjuje se eksprimiranje (npr. upotrebom specifične siRNK) druge vrste globina, čime se ovaj odnos vraća na 1:1, što ublažava neke aspekte mutantnog ćelijskog fenotipa (pogledati Voon i dr (2008) Haematologica 93(8): 1288). U fetusu u razvoju stvara se drugačiji oblik hemoglobina, fetalni hemoglobin (HbF) koji ima veći afinitet vezivanja za kiseonik od hemoglobina A, tako da kiseonik može da se prenese u bebin sistem kroz majčin krvotok. Fetalni hemoglobin takođe sadrži dva α lanca globina, ali umesto odraslih β lanaca globina, on ima dva fetalna γ lanca globina (tj., fetalni hemoglobin je α2γ2). Nakon otprilike 30 nedelja gestacije, sinteza γ globina u fetusu počinje da opada, dok proizvodnja β globina raste. Do približno 10 meseci starosti nakon rođenja, hemoglobin novorođenčeta je gotovo čitav α2β2, mada neki HbF ostaju i nakon odrastanja (otprilike 1-3% ukupnog hemoglobina). Regulacija prelaska sa proizvodnje γ na β je prilično složena i pre svega uključuje regulaciju na dole eksprimiranja γ globina sa istovremenom regulacijom na gore eksprimiranja β globina.

[0006] Genetska oštećenja u sekvencama koje kodiraju lance hemoglobina mogu biti odgovorna za brojne bolesti poznate kao hemoglobinopatije, uključujući anemiju i talasemije srpastih ćelija. Kod većine bolesnika sa hemoglobinopatijama, geni koji kodiraju γ globin ostaju netaknuti, ali je eksprimiranje γ globina relativno malo zbog normalne represije gena koja se dešava oko rođenja, kako je gore opisano.

[0007] Talasemije su takođe bolesti koje se odnose na hemoglobin i obično uključuju smanjenu proizvodnju lanaca globina. To se može dogoditi mutacijama u regulatornim regionima gena ili mutacijom u kodiranoj sekvenci globina što rezultuje smanjenom proizvodnjom. Alfa talasemije su povezane sa ljudima zapadnoafričkog i južnoazijskog porekla, i mogu pružiti malarijski otpor. Beta talasemija povezana je sa ljudima mediteranskog porekla, obično iz Grčke i primorskih regione Turske i Italije. Tretman talasemije obično uključuje transfuziju krvi i terapiju helacijom gvožđa. Transplantacije koštane srži se takođe koriste za tretman ljudi sa teškim talasemijama, ako se može identifikovati odgovarajući donor, ali ovaj postupak može predstavljati značajne rizike. Beta talasemije su uglavnom podeljene u tri grupe: i) Talasemijska osobina ili manja talasemija, gde su pacijenti nosioci alela bolesti talasemije, ili imaju vrlo blage simptome koji mogu rezultovati blagom anemijom. ii) pacijenti sa srednjom talasemijom, gde je nedostatak beta globina dovoljno veliki da izazove umereno tešku anemiju i značajne zdravstvene probleme, uključujući deformacije kostiju i povećanje slezine. Međutim, postoji širok raspon kliničke ozbiljnosti ovog stanja, i granica između srednje talasemije i najtežeg oblika, velike talasemije, može biti zbunjujuća. Čini se da je presudan faktor količina transfuzije krvi koja je potrebna pacijentu. iii) Velika talasemija ili Cooley-jeva anemija. Ovo je najteži oblik beta talasemije kod koje potpuni nedostatak beta globina izaziva anemiju opasnu po život koja zahteva redovne transfuzije krvi i opsežnu stalnu medicinsku negu. Ove opsežne, doživotne transfuzije krvi vode do preopterećenja gvožđem koje se mora tretirati helacionom terapijom kako bi se sprečila rana smrt od zatajenja organa.

[0008] Za beta talasemije, krajem 1980-ih, procenjeno je da približno 54 mutacije beta globin gena obuhvataju sve poznate bolesne gene beta globina; broj je od tada narastao na preko 200. Mutacije su podeljene na mutacije koje rezultuju nefunkcionalnim proteinima beta globina, uključujući besmislene mutacije i mutacije promene okvira; mutacije obrade RNK, uključujući promene u spojnicama splajsovanja i promene konsenzus sekvenci splajsovanja, kao i promene unutarnjih introničnih i egzoničnih sekvenci što rezultuje nestalnim splajsovanjem; transkripcioni mutanti; mutanti za razdvajanje polyA i RNK; mutanti mesta kapica; i nestabilni mRNK mutanti. Ove mutacije rezultuju ili potpunim gubitkom beta globinske mRNK u ćeliji (što se takođe naziva „β-0“) ili smanjenim nivoa eksprimiranja i akumulacije mRNK (što se naziva „β “). (pogledati, npr., Kazazian i Boehm (1988) Blood vol 71 No 4: 1107). Pacijenti sa blažim β oblicima beta talasemije mogu imati relativno normalan životni vek, ali oni sa teškim oblicima β-0 mogu umreti pre tridesete godine života ako se ne tretiraju, a ako se ne održava nivo gvožđa takođe može imati slično skraćen životni vek ukoliko im se primenjuju česte transfuzije. Treba napomenuti da su neke specifične mutacije češće od drugih; posebno, u nekim delovima Evrope i Bliskog Istoka, mutacija poznata pod nazivom „IVS1-1“ (koja označava „intervenišući sekvenca 1, mutacija broj 1“) čini oko 20% svih glavnih mutacija b-talasemije. U ovoj mutaciji, „GT“ dinukleotid na početku introna 1 ljudskog beta globin gena se menja u „AT“, čime se prekida ključni signal (poznat kao „motiv splajsovanja donora“) neophodan za tačno i efikasno uklanjanje introna 1 iz pre-mRNK beta globina. Kao rezultat toga, primećeno je značajno smanjenje proteina beta globina tokom eritropoeze, što rezultuje velikom b-talasemijom koja je zavisna od transfuzija.

[0009] Stoga, ostaje potreba za dodatnim postupcima i sastavima koje se mogu koristiti za uređivanje genoma, za ispravljanje aberantnog gena ili za promenu eksprimiranja drugih, na primer za tretman beta talasemija.

SAŽETAK

[0010] Pronalazak pruža genetski modifikovanu CD34+ matičnu ćeliju hematopoeze koja sadrži: par cinkov prst nukleaza, gde par obuhvata: (i) prvu cinkov prst nukleazu koja se vezuje za ciljano mesto kao što je prikazano u SEQ ID NO:5, gde prva ZFN sadrži naredne heliks regione prepoznavanja: F1:LRHHLTR (SEQ ID NO:11); F2: QSGTRKT (SEQ ID NO:12); F3: RSDNLST (SEQ ID NO:13); F4: DSANRIK (SEQ ID NO:14); F5: LRHHLTR (SEQ ID NO:11); i F6: QSGNLHV (SEQ ID NO:15); i (ii) druga cinkov prst nukleaza koja se vezuje za ciljano mesto kao što je prikazano u SEQ ID NO:4, gde druga ZFN sadrži naredne heliks regione prepoznavanja: F1:AMQTLRV (SEQ ID NO:16); F2: DRSHLAR (SEQ ID NO:7); F3: RSDNLSE (SEQ ID NO:8); F4: ASKTRKN (SEQ ID NO:9); i F5: TSSDRKK (SEQ ID NO:17) ili VYEGLKK (SEQ ID NO:18); i donorsku sekvencu koja sadrži sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID NO:19 ili SEQ ID NO:21, gde je donorska sekvenca umetnuta u endogeni aberantni ljudski beta-hemoglobin (Hbb) gen nakon ciljanog razdvajanja para cinkov prst nukleaza, ispravljajući na taj način sekvencu Hbb gena, i gde aberantni Hbb gen sadrži intervenišuća sekvenca 1, mutacija broj 1 (IVS1-1) mutaciju.

Pronalazak takođe pruža genetski modifikovanu ćeliju poreklom od ćelije predmetnog pronalaska, gde ćelija sadrži: par cinkov prst nukleaza, gde par obuhvata: (i) prvu cinkov prst nukleazu koja se vezuje za ciljano mesto kao što je prikazano u SEQ ID NO:5, prva ZFN sadrži naredne heliks regione prepoznavanja: F1:LRHHLTR (SEQ ID NO:11); F2:

QSGTRKT (SEQ ID NO:12); F3: RSDNLST (SEQ ID NO:13); F4: DSANRIK (SEQ ID NO:14); F5: LRHHLTR (SEQ ID NO:11); i F6: QSGNLHV (SEQ ID NO:15); i (ii) druga cinkov prst nukleaza koja se vezuje za ciljano mesto kao što je prikazano u SEQ ID NO:4, gde druga ZFN sadrži naredne heliks regione prepoznavanja: F1:AMQTLRV (SEQ ID NO:16); F2: DRSHLAR (SEQ ID NO:7); F3: RSDNLSE (SEQ ID NO:8); F4: ASKTRKN (SEQ ID NO:9); i F5: TSSDRKK (SEQ ID NO:17) ili VYEGLKK (SEQ ID NO:18); i donorsku sekvencu koja sadrži sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID NO:19 ili SEQ ID NO:21,

Pronalazak dalje pruža genetski modifikovanu diferenciranu ćeliju poreklom od ćelije predmetnog pronalaska, poput crvena krvna zrnca (RBC), gde ćelija sadrži: par cinkov prst nukleaza, gde par obuhvata: (i) prva cinkov prst nukleaza koja se vezuje na ciljano mesto kao što je prikazano u SEQ ID NO:5, gde prva ZFN sadrži naredne heliks regione prepoznavanja: F1:LRHHLTR (SEQ ID NO:11); F2: QSGTRKT (SEQ ID NO:12); F3: RSDNLST (SEQ ID NO:13); F4: DSANRIK (SEQ ID NO:14); F5: LRHHLTR (SEQ ID NO:11); i F6:

QSGNLHV (SEQ ID NO:15); i (ii) druga cinkov prst nukleaza koja se vezuje za ciljano mesto kao što je prikazano u SEQ ID NO:4, gde druga ZFN sadrži naredne heliks regione prepoznavanja: F1:AMQTLRV (SEQ ID NO:16); F2: DRSHLAR (SEQ ID NO:7); F3:

RSDNLSE (SEQ ID NO:8); F4: ASKTRKN (SEQ ID NO:9); i F5: TSSDRKK (SEQ ID NO:17) ili VYEGLKK (SEQ ID NO:18); i donorsku sekvencu koja sadrži sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID NO:19 ili SEQ ID NO:21,

Pronalazak pruža farmaceutski sastav koji sadrži genetski modifikovanu ćeliju predmetnog pronalaska.

Pronalazak takođe pruža genetski modifikovanu ćeliju predmetnog pronalaska za upotrebu u tretmanu beta talasemije.

Pronalazak dalje pruža sastav koji sadrži par cinkov prst nukleaza ili polinukleotid koji kodira par cinkov prst nukleaza, gde par obuhvata: (i) prvu cinkov prst nukleazu koja se vezuje za ciljano mesto kao što je prikazano u SEQ ID NO:5, prva ZFN sadrži naredne heliks regione prepoznavanja: F1:LRHHLTR (SEQ ID NO:11); F2: QSGTRKT (SEQ ID NO:12); F3:

RSDNLST (SEQ ID NO:13); F4: DSANRIK (SEQ ID NO:14); F5: LRHHLTR (SEQ ID NO:11); i F6: QSGNLHV (SEQ ID NO:15); i (ii) druga cinkov prst nukleaza koja se vezuje za ciljano mesto kao što je prikazano u SEQ ID NO:4, gde druga ZFN sadrži naredne heliks regione prepoznavanja: F1:AMQTLRV (SEQ ID NO:16); F2: DRSHLAR (SEQ ID NO:7); F3: RSDNLSE (SEQ ID NO:8); F4: ASKTRKN (SEQ ID NO:9) i F5: TSSDRKK (SEQ ID NO:17) ili VYEGLKK (SEQ ID NO:18). Pronalazak pruža in vitro postupak izmene Hbb eksprimiranja u ćeliji, gde postupak uključuje: uvođenje u ćeliju jednog ili više polinukleotida prema pronalasku, pod uslovima tako da se jedan ili više proteina eksprimiraju i eksprimiranje Hbb gena je povećano.

Pronalazak takođe pruža farmaceutski sastav predmetnog pronalaska za upotrebu u postupku tretmana pacijenta sa β talasemijom, gde postupak obuhvata primenu pacijentu farmaceutskog sastava u količini dovoljnoj za povećanje eksprimiranja Hbb gena kod pacijenta.

[0011] Ovde su obelodanjeni postupci i sastavi za promenu eksprimiranja i/ili za korigovanje jednog ili više gena koji kodiraju proteine koji su uključeni u genetsku bolest (npr., proizvodeći proteine kojima nedostaju, imaju manjak ili su aberanti sa bolesti i/ili proteine koji regulišu ove proteine), kao što su hemoglobinopatije (npr., beta talasemije). Promena takvih gena može rezultovati tretmanom ovih genetskih bolesti (npr., beta talasemije).

Konkretno, uređivanje genoma koristi se za ispravljanje aberantnog gena, umetanje gena divljeg tipa ili promenu eksprimiranja endogenog gena. Pomoću neograničavajućeg primera, mutirani gen koji kodira β globin može se ispraviti u ćeliji kako bi se stvorio β globin protein divljeg tipa u ćeliji za tretman hemoglobinopatije prouzrokovane neispravnim genom β globina. Jedan pristup dalje uključuje upotrebu modifikacije matične ćelije (npr., matična ćelija hematopoeze ili RBC prekursor), gde se matična ćelija zatim može koristiti da se ugradi u pacijenta, za tretman hemoglobinopatije.

[0012] U jednom aspektu, ovde opisani protein je protein ili sistem nukleaze (npr., ZFN, TALEN, mega ili homing endonukleaza, mega-TAL ili CRISPR/Cas sistem) koji se vezuje za ciljano mesto u regionu od interesa (npr., β globin gen) u genomu, gde nukleaza sadrži jedan ili više sintetičkih domena. ZFP može biti cinkov prst nukleaza (ZFN) koja razdvaja ciljani genomski region od interesa, gde ZFN sadrži jedan ili više sintetičkih cinkov prst domen vezujućih domena i domen razdvajanja nukleaze ili polu-domen razdvajanja. Nukleaza može biti TALE nukleaza (TALEN) koja razdvaja ciljani genomski region od interesa, gde TALEN sadrži jedan ili više sintetičkih TALE DNK vezujućih domena i domen razdvajanja nukleaze ili polu-domen razdvajanja. Nukleaza može biti CRISPR/Cas sistem u kom se CRISPR/Cas specifičnost određuje pomoću sintetičke jednolančano vođene mRNK. Domeni razdvajanja i polu-domeni razdvajanja mogu se dobiti, na primer, iz različitih restrikcionih endonukleaza i/ili homing endonukleaza. U jednom aspektu, polu-domen razdvajanja je izveden iz Tipa IIS restrikcione endonukleaze (npr., Fok I). DNK vezujući domen (npr. cinkov prst ili TALE DNK vezujući domen) može prepoznati ciljano mesto u beta globin genu. Domen cinkovog prsta može da sadrži 5 ili 6 cinkov prst domena i prepoznaje ciljano mesto u globin genu.

[0013] U drugom aspektu, ovde je opisan CRISPR/Cas sistem koji se vezuje za ciljano mesto u regionu od interesa (npr., visoko eksprimirani gen, gen povezan sa bolešću ili gen sigurne luke) u genomu, gde CRISPR/Cas sistem sadrži CRIPSR/Cas nukleazu i sintetičku crRNK/tracrRNK (ili jednolančano vođena RNK). CRISPR/Cas sistem može prepoznati ciljano mesto u visoko eksprimiranom genu, genu povezanom sa bolešću ili sigurna luka genu. U određenim aspektima, sistem CRISPR/Cas prepoznaje cilj u beta globin genu.

[0014] ZFN, TALEN i/ili CRISPR/Cas sistem, kako su ovde opisani, mogu da se vezuju i/ili razdvajaju region od interesa u kodirajućem ili nekodirajućem regionu unutar ili pored gena, kao što je, na primer, liderska sekvenca, prateća sekvenca ili intron, ili unutar netranskribovanog regiona, bilo uzvodno ili nizvodno od kodirajućeg regiona. ZFN, TALEN i/ili CRISPR/Cas sistem mogu se vezati za i/ili razdvojiti globin gen. ZFN, TALEN i/ili CRISPR/Cas sistem mogu se vezati i/ili razdvojiti gen sigurne luke, na primer CCR5 gen, CXCR4 gen, PPP1R12C (takođe poznat kao AAVS1) gen, albumin gen, HPRT gen ili a Rosa gen. Pogledati npr. SAD patent br.7,888,121; 7,972,854; 7,914,796; 7,951,925; 8,110,379; 8,409,861; 8,586,526; SAD publikacije patenata 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20060063231; 20080159996; 201000218264; 20120017290; 20110265198; 20130137104; 20130122591; 20130177983 i 20130177960. Pored toga, za pomoć u izboru može se koristiti i HPRT lokus (pogledati) SAD publikacija patenata br.20130122591). U drugom aspektu, ovde su opisani sastavi koji sadrže jednu ili više cinkov prst nukleaza i/ili TALE nukleaza ili CRISPR/Cas sistem kako je ovde opisano. ZFN, TALEN i/ili CRISPR/Cas sistem mogu se vezati za i razdvojiti β ili globin gen. U drugom aspektu, ovde su opisani sastavi koji sadrže jednu ili više cinkov prst nukleaza, TALE nukleaza ili Cas nukleaza, kako je ovde opisano.

[0015] U narednom aspektu, ovde opisani je polinukleotid koji kodira jedan ili više ZFN, TALEN i/ili CRISPR/Cas sistem, kako su ovde opisani. Polinukleotid može biti, na primer, mRNK. U nekim aspektima, mRNK može biti hemijski modifikovana (Pogledati npr.

Kormann i dr, (2011) Nature Biotechnology 29(2):154-157). U drugim aspektima, mRNK može da sadrži ARCA poklopac (pogledati SAD patente 7,074,596 i 8,153,773). U daljim otelotvorenjima, mRNK može da sadrži mešavinu nemodifikovanih i modifikovanih nukleotida (pogledati SAD patentnu publikaciju 20120195936).

[0016] U narednom aspektu, ovde je opisan ZFN, TALEN i/ili CRISPR/Cas sistem vektor eksprimiranja koji sadrži polinukleotid, koji kodira jedan ili više ZFN, TALEN i/ili CRISPR/Cas sistem, kako su ovde opisani, operativno povezan sa promoterom. U jednom otelotvorenju, vektor eksprimiranja je virusni vektor.

[0017] U jednom aspektu, ovde je opisan ZFN, TALEN i/ili CRISPR/Cas sistem protein koji se koristi za razdvajanje ciljane DNK.

[0018] U drugom aspektu, ovde je opisana genetski modifikovana ćelija ili ćelijska linija, na primer, u poređenju sa sekvencom divljeg tipa ćelije ili ćelijske linije. U određenim aspektima, ćelija sadrži genetski modifikovane RBC prekursore (matične ćelije hematopoeze poznate kao „HSC“). Ćelija ili ćelijske linije mogu biti heterozigotne ili homozigotne za modifikaciju. Modifikacije mogu da sadrže umetanje, brisanje i/ili njihove kombinacije. HSC se mogu modifikovati pomoću sintetičke nukleaze i nukleinske kiseline donora tako da je divlji tip gena (npr., globin gen) umetnut i eksprimira se i/ili se endogeni aberantni gen koriguje. Modifikacija (npr., umetanje) može biti na ili blizu mesta vezivanja i/ili razdvajanja nukleaza, na primer, unutar 1-300 (ili bilo koja vrednost između) baznih parova uzvodno ili nizvodno od mesta razdvajanja, poželjnije unutar 1-100 baznih parova (ili bilo koja vrednost između) sa bilo koje strane mesta vezivanja i/ili razdvajanja, još poželjnije unutar 1 do 50 baznih parova (ili bilo koja vrednost između) od bilo koje strane mesta vezivanja i/ili razdvajanja. U nekim slučajevima, genska sekvenca divljeg tipa za umetanje kodira divlji tip β globina. U drugim slučajevima, endogeni aberantni gen je gen β globina, na primer jedna ili više genskih modifikacija koje ispravljaju bar jednu mutaciju u endogenom aberantom ljudskom beta hemoglobin (Hbb) genu. U nekim aspektima, modifikacija beta globin gena omogućava pravilno spajanje transkribovanih RNK. U nekim slučajevima, region za korigovanje sadrži IVS 1-1, 1-5, 1-6, 1-110 mutacije. Region beta globina koji je korigovan sadrži IVS 1-1 mutaciju. Region za korigovanje može da sadrži IVS 2-1, 2-745 ili 2-654 mutacije. Delimično ili potpuno diferencirane ćelije koje potiču od modifikovanih matičnih ćelija kako je ovde opisano, i takođe su opisane (npr., RBC ili RBC prekursor ćelije). Takođe su opisani sastavi kao što su farmaceutski sastavi koji sadrže genetski modifikovane ćelije.

[0019] U drugom aspektu, ovde je opisan postupak za korekciju ili umetanje sekvence u endogeni gen (npr., beta globin gen) u ćeliji (npr., matična ćelija), gde taj postupak obuhvata razdvajanje endogenog gena korišćenjem jedne ili više nukleaza i korigovanje ili umetanje sekvence na mesto razdvajanja. U određenim aspektima, genomska sekvenca u bilo kom ciljanom genu se zamenjuje, na primer korišćenjem ZFN ili TALEN para, ili CRIPSR/Cas sistema (ili vektora koji kodira ZFN, TALEN i/ili CRIPSR/Cas sistem) kako je ovde opisano i „donorske“ sekvence (u nekim slučajevima poznata i kao „transgen“) koja se umeće u gen nakon ciljanog razdvajanja sa ZFN, TALEN i/ili CRIPSR/Cas sistemom. Donorska sekvenca može biti prisutna u ZFN ili TALEN vektoru, prisutna u zasebnom vektoru (npr., Ad, AAV ili LV vektor) ili, alternativno, može se uvesti u ćeliju koristeći drugačiji mehanizam za isporuku nukleinske kiseline. Takvo umetanje donorske nukleotidne sekvence u ciljani lokus (npr., globin gen, drugi gen sigurne luke, itd.) rezultuje eksprimiranjem transgena pod kontrolom elementa genetske kontrole ciljanog lokusa (npr. globina). Transgen može kodirati nekodirajuću RNK (npr., shRNK).

[0020] U drugim aspektima, genetski modifikovani RBC prekursori (matične ćelije

1

hematopoeze poznate kao „HSC“) primenjuju se u transplantaciji koštane srži, i RBC se razlikuju i sazrevaju in vivo. U nekim otelotvorenjima, HSC su izolovani posle G-CSF-indukovane mobilizacije, a u drugim, ćelije su izolovane iz ljudske koštane srži ili pupčanih vrpci. U nekim otelotvorenjima, modifikovani HSC se primenjuju kod pacijenta nakon blagog mijeloablativnog predkondicioniranja. U drugim aspektima, HSC se primenjuju nakon pune mijeloablacije, tako da nakon ugradnje 100% ćelija hematopoeze potiče iz modifikovanih HSC. U još jednom aspektu, ovde su opisane ćelijske linije i/ili transgeni životinjski modeli (sistemi). Transgena ćelija i/ili životinja može uključivati transgen koji kodira ljudski gen. U nekim slučajevima, transgena životinja sadrži knock-out na endogenom lokusu koji odgovara egzogenom transgenu (npr., mišji globin gen je izbačen i ljudski globin gen je ubačen u miša), omogućavajući razvoj in vivo sistema u kom se ljudski protein može izolovano izučavati. Takvi transgeni modeli mogu se koristiti u svrhu skrininga za identifikaciju malih molekula ili velikih biomolekula ili drugih entiteta koji mogu da interaguju sa ili modifikuju ljudski protein od interesa. U nekim aspektima obelodanjenja, transgen je integrisan u odabrani lokus (npr., globin ili sigurna luka) u matičnoj ćeliji (npr., embrionalna matična ćelija, indukovana pluripotentna matična ćelija, matična ćelija hematopoeze itd.) ili životinjski embrion dobijen bilo kojim od ovde opisanih postupaka, i zatim je embrion implantiran tako da se rodi živa životinja. Životinja se zatim uzgaja do polne zrelosti i dozvoljava joj se da proizvede potomstvo gde bar neki potomci sadrže uređene sekvence endogenih gena ili integrisani transgen.

[0021] U još jednom daljem aspektu, ovde je opisan postupak za integrisanje nukleinske kiseline koja se nalazi u endogenom lokusu ili korekciju endogenog gena na željenom lokusu (npr., globin gen) hromozoma, na primer u hromozomu embriona. U određenim aspektima obelodanjenja, postupak uključuje: (a) injekcija embriona sa (i) najmanje jednim DNK vektorom, gde DNK vektor sadrži uzvodnu sekvencu i nizvodnu sekvencu koja okružuje sekvencu nukleinskih kiselina koje treba integrisati, i (ii) najmanje jedan RNK molekul koji kodira cink prst, TALE ili Cas9 nukleazu. U slučaju upotrebe Cas9 proteina, takođe se uvodi jednolančano vođena (sg)RNK. Nukleaza ili sistem nukleaza prepoznaje ciljano mesto u ciljanom lokusu (npr., globin ili lokus sigurne luke), i zatim se (b) embrion uzgaja kako bi se omogućilo eksprimiranje cinkov prst ili TALE nukleaze i/ili CRISPR/Cas sistema, gde se prekid dvostrukog lanca, uveden u cilj pomoću cinkov prst nukleaze, TALEN ili CRISPR/Cas sistema, zatim popravlja homolognom rekombinacijom sa DNK vektorom, tako da integriše sekvencu nukleinskih kiselina u hromozom.

[0022] U bilo kom od ovde opisanih postupaka, polinukleotid koji kodira cinkov prst nukleazu, TALEN i/ili CRIPSR/Cas sistem može sadržati DNK, RNK ili njihove kombinacije. Polinukleotid može da sadrži plazmid. Polinukleotid koji kodira nukleazu može sadržati mRNK.

[0023] Takođe je obelodanjen komplet koji sadrži ZFP, TALEN i/ili CRIPSR/Cas sistem. Komplet može da sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju ZFP, TALEN ili CRISPR/Cas sistem, (npr. RNK molekule ili gene koji kodiraju ZFP, TALEN ili Cas9 sadržane u pogodnom vektoru eksprimiranja), i ako je potrebno, sintetičke sg RNK, ili alikvote proteina nukleaze, donorske molekule, odgovarajuće ćelije domaćina, uputstva za izvođenje postupaka pronalaska i slično.

[0024] Prema tome, obelodanjenje uključuje, ali nije ograničeno na, genetski modifikovanu ćeliju koja sadrži genomsku modifikaciju. U jednom aspektu, genomska modifikacija ispravlja bar jednu mutaciju aberantnog ljudskog beta hemoglobin (Hbb) gena. U narednom aspektu, genomska modifikacija je izabrana iz grupe koja se sastoji od umetanja, brisanja i njihovih kombinacija. U povezanom aspektu, genetski modifikovana ćelija je napravljena nukleazom koja uključuje jednu od više ovde objavljenih nukleaza (npr., ZFN (npr, kao što je obelodanjeno u poslednja dva reda Tabele 1), TALEN, itd.), gde ta nukleaza može da se unese u obliku nukleinske kiseline i/ili proteina. U određenim aspektima, mutacija je intervenišuća sekvenca 1, mutacioni broj 1 (IVS1-1) mutacija, IVS1-5 mutacija, IVS1-6 mutacija, IVS1-110 mutacija, IVS2-1 mutacija, IVS2-745 mutacija ili IVS2-654 mutacija. Genomska modifikacija može korigovati mutaciju tačke. U gore opisano genetički modifikovanoj ćeliji, genomska modifikacija može biti unutar jedne ili više sekvenci prikazanih u SEQ ID NO:3, na primer, genomska modifikacija unutar SEQ ID NO:3 remeti motiv donora splajsovanja. GT dinukleotid na početku introna 1 ljudskog beta globin gena može da se promeni u AT.

Genomska modifikacija može korigovati mutaciju koja menja mesto donora splajsovanja za mRNK obradu aberantnog Hbb gena koji dovodi do beta talasemije. Genomska modifikacija može biti na ili blizu bilo koje od sekvenci prikazanih kao SEQ ID NO:4 ili 5. Genomska modifikacija može sadržati umetanje donorske sekvence koja sadrži novo mesto razdvajanja restrikcionog enzima u odnosu na endogeni Hbb gen. U određenim aspektima, donorska sekvenca je dužine između 2 kb do 200 kb, na primer, donorska sekvenca odabrana od bilo kog od SEQ ID NO:20 i 22, i novo mesto razdvajanja restrikcionog enzima je Xba I mesto.

Donorska sekvenca može sadržati transgene bilo koje dužine.

[0025] Bilo koja od genetski modifikovanih ćelija kako je ovde opisano može biti, na primer, matična ćelija, poput matičnih ćelija hematopoeze (npr., CD34+). Dalje, ovde je opisana genetski modifikovana diferencirana ćelija, poreklom od bilo koje od genetski modifikovane matične ćelije, kako je ovde opisano, uključujući, na primer, crveno krvno zrnce (RBC).

[0026] Takođe je obelodanjen farmaceutski sastav koji sadrži jednu od više genetski modifikovanih ćelija kako je ovde opisano.

[0027] Pored toga, cinkov prst protein koji sadrži 4, 5 ili 6 cinkov prst domena koji sadrže heliks region prepoznavanja, gde svaki cinkov prst domen sadrži heliks regione prepoznavanja po redosledu prikazanom u poslednja dva reda Tabele 1. U određenim aspektima, obelodanjen je fuzioni protein koji sadrži cinkov prst protein i divlji tip ili sintetički polu-domen razdvajanja. Takođe su opisani polinukleotidi koji kodiraju bilo koji od ZFP i/ili fuzionih proteina koji su ovde opisani. Ovde su opisane izolovane ćelije (npr. takođe su obelodanjena crvena krvna zrnca (RBC) ili prekursorske ćelije (npr. CD4+ matične ćelije hematopoeze) koje sadrže jedan ili više ovde opisanih ZFP, fuzionih proteina i/ili polinukleotida. Takođe su opisani kompleti koji sadrže polinukleotid, protein i/ili ćeliju, kako je ovde opisano.

[0028] Takođe je opisan postupak za promenu Hbb eksprimiranja u ćeliji, gde postupak uključuje: uvođenje u ćeliju jednog ili više polinukleotida kako je ovde opisano, pod uslovima da su jedan ili više proteina eksprimirani i eksprimiranje Hbb gena je izmenjeno. (npr., povećano). Postupci mogu dalje da obuhvataju integrisanje donorske sekvence u genom ćelije, na primer korišćenjem virusnog vektora, kao oligonukleotida i/ili na plazmidu.

Donorska sekvenca može da sadrži transgen, i eksprimiranje transgena može biti pod kontrolom endogenog ili egzogenog promotera. Donor može sadržati oligonukleotid koji koriguje mutaciju koja menja mesto donora splajsovanja za mRNK obradu Hbb gena. Ćelija može biti prekursorska ćelija crvenih krvnih zrnaca (RBC) i/ili matična ćelija hematopoeze. U određenim aspektima, postupci obuhvataju proizvodnju genetski modifikovane ćelije koja sadrži genomsku modifikaciju unutar endogenog Hbb gena, gde taj postupak obuhvata korake: a) dovođenja u dodir ćelije ss polinukleotidom koji kodira fuzioni protein koji sadrži cinkov prst nukleazu koja sadrži 4,5 ili 6 cinkov prst domena, gde svaki cinkov prst domen

1

sadrži heliks region prepoznavanja i dalje gde su heliks regioni prepoznavanja u redosledu prikazanom u jednom od poslednja dva reda Tabele 1; b) podvrgavanja ćelije uslovima pogodnim za eksprimiranje fuzionog proteina iz polinukleotida; i c) modifikovanje endogenog Hbb gena sa eksprimiranim fuzionim proteinom koji je dovoljan za proizvodnju genetski modifikovane ćelije. U bilo kom od ovde opisanih postupaka, postupci mogu dalje sadržati stimulaciju ćelija sa najmanje jednim citokinom. Polinukleotid se može isporučiti unutar ćelije, na primer, korišćenjem najmanje jednog nevirusnog sistema za isporuku, virusnog sistema za isporuku i/ili nosača za isporuku. Postupci mogu uključivati podvrgavanje ćelija električnom polju.

[0029] Takođe je opisan postupak tretmana pacijenta sa β talasemijom, gde postupak uključuje primenu pacijentu farmaceutskog sastava kako je ovde opisano (npr., farmaceutski sastav opisuje jedan ili više proteina, polinukleotida i/ili ćelija kako je ovde opisano) u količini dovoljnoj da poveća eksprimiranje Hbb gena kod pacijenta.

[0030] Ovi i drugi aspekti će biti očigledni stručnjaku u svetlu obelodanjenja u celini.

KRATAK OPIS SLIKA

[0031]

Slika 1 je ilustracija strukture ljudskog beta globin gena, prilagođena od Kazazian i Boehm (1998) ibid. Na vrhu je ilustracija beta globin gena gde osenčena regiona označavaju eksone, dok čista regiona označavaju introne kao i 5' i 3' nekodirajuće regione. Takođe je prikazano nekoliko poznatih vrsta mutacija beta globina povezanih sa talasemijama, gde otvoreni balonski marker označava mutacije koje utiču na splajsovanje, zatvoreni baloni ukazuju na transkripcione mutacije, otvoreni kvadrati ukazuju na mutaciju mesta kapice, strelica na dole ukazuje na mutacije razdvajanja RNK, ispunjene strelice na gore označavaju mutaciju pomeranja okvira, otvorene strelice na gore označavaju nonsens mutacije, blok sa zvezdicom označava mutacije koje povećavaju nestabilnost mRNK, i otvoreni pravougaonici označavaju primećene mutacije brisanja. Donji panel na Slici 1 (SEQ ID NO:1) prikazuje lokaciju IVS 1-1 mutacije i sekvencu divljeg tipa koja odgovara ovoj sekvenci. Takođe su prikazane lokacije vezivanja za dva ZFN koja se razdvajaju na ili blizu IVS 1-1 mutacije, i tačka mutacije odgovorna za IVS 1-1 mutaciju je označena otvorenom zagradom.

Slike 2A i 2B prikazuju aktivnost ZFN para 43545/43544. Slika 2A je gel koji pokazuje aktivnost razdvajanja ZFN para u ljudskim CD34+ ćelijama koristeći Cel I Surveyor test, dok je Slika 2B grafikon koji prikazuje razdvajanje bilo divljeg tipa („wt“), ili IVS1.1 mutant sekvence izmerenog Dual-Luciferase Single Strand Annealing testom (pogledati SAD patent 8586526). Eksperimenti prikazani na Slici 2B su duplikati. Kontrolni eksperimenti su vršeni sa ćelijama transdukovanim sa GFP reporter plazmidom („GFP“) ili lažno transficiranim ćelijama („negativno“). Podaci ukazuju na to da su oba alela razdvojena od strane ZFN para.

Slike 3A i 3B prikazuju šeme uvođenja IVS 1-1 mutacije u beta globin gen divljeg tipa. Slika 3A prikazuje korake modifikacije gena gde je sekvenca divljeg tipa u endogenom beta globin genu zamenjena IVS 1-1 mutacijom. Donor je jednolančani oligonukleotid koji sadrži IVS 1-1 mutaciju (koja označava mutaciju A tačke) kao i XbaI restrikciono mesto („ss oligonukleotid“) i ZFN mesto razdvajanja. Razdvojeni endogeni gen (koji označava divlji tip G) prikazan je ispod nukleotida donora, i „genski korigovani“ endogeni gen, koji sada sadrži i IVS 1-1 mutaciju i Bal restrikciono mesto, prikazan je na dnu. Slika 3B (SEQ ID NO:2) je krupan prikaz ss oligonukleotida koji pokazuje sekvencu oko ZFN mesta razdvajanja kao i uvedene nukleotide u zagradama.

Slika 4 prikazuje rezultate uvođenja IVS 1-1 mutacije opisane na Slici 3 u beta globin gen divljeg tipa u normalnim CD34+ ćelijama. Prikazan je gel koji označava rezultate razdvajanja uvedenog XbaI restrikcionog enzima (RFLP). Enzimsko razdvajanje ukazuje da su CD34+ ćelije „korigovane“ bilo sa ss oligonukleotidnim donorom koji sadrži divlji tip („wt“) ili IVS 1-1 beta globin sekvencom i XbaI mestom restrikcije. Takođe su ispod gela prikazani rezultati su rezultata sekvenciranja visoke propusnosti PCR proizvoda koji sadrže ovaj region u tretiranim ćelijama. Naznačena je količina ciljane integracije donora u uzorcima koji primaju donora („% TI“) i količina ZFN aktivnosti („% indeksa“) u uzorcima.

Slika 5 prikazuje genomsku sekvencu (SEQ ID NO:3) oko IVS 1-1 mutacije (adaptirano od Lapoumeroulie i dr, (1987) Nucleic Acids Research, 15(20): 8195). Na slici su navedena kriptična mesta splajsovanja koja se koriste kada je normalno mesto splajsovanja poremećeno G->A IVS1-1 mutacijom.

Slike 6A i 6B prikazuju rezultate nakon korekcije gena u CD34+ ćelijama dobijenim od pacijenta. CD34+ ćelije dobijene od pacijenata beta talasemije („p13“ prikazane na Slici 6B) , zajedno sa CD34+ ćelijama divljeg tipa („wt“ prikazane na Slici 6A) tretirane su oligonukleotidom kako bi se korigovala IVS 1-1 mutacija kod divljeg tipa. Ćelije su tretirane bilo samo sa ZFN parovima, sa ZFN plus genom koji koriguje oligo donora („WT oligo“) ili sa samo oligo donorom i GFP. U većini slučajeva, oligo donor je takođe sadržao jedinstveno XbaI restrikciono mesto („XbaI“). Gelovi prikazuju XbaI razdvajanje genomske DNK

1

izolovane iz tretiranih ćelija i demonstriraju umetanje donorskih oligonukleotida. Oznake traka su naredne: Traka 1 prikazuje rezultate koristeći ZFN 43545/43544; Traka 2 prikazuje rezultate koristeći ZFN 43545/45946; Traka 3 prikazuje rezultate koristeći ZFN 43545/45952; Traka 4 prikazuje rezultate koristeći ZFN 43545/43544 i WT oligo XbaI; Traka 5 prikazuje rezultate koristeći ZFN 43545/45946 i WT oligo XbaI; Traka 6 prikazuje rezultate koristeći ZFN 43545/45952 i WT oligo XbaI; Traka 7 prikazuje rezultate koristeći GFP i WT oligo XbaI; Traka 8 prikazuje rezultate koristeći ZFN 43545/43544 i WT Oligo (samo p13); i Traka 9 prikazuje rezultate netransficiranih ćelija.

DETALJAN OPIS

[0032] Ovde su obelodanjeni postupci i sastavi za proučavanje i tretman genetske bolesti poput hemoglobinopatije. Opisano je genomsko uređivanje ciljane ćelije, tako da dolazi do povoljne promene u proizvodnji jednog ili više globin gena, što za posledicu ima tretman hemoglobinopatija, kao što je talasemija, kod pacijenta koji ima potrebu za tim. Povoljne promene u proizvodnji globina uključuju, ali nisu ograničene na, korekciju aberantne sekvence β globin gena. Pored toga, isporuka izmenjenih matičnih ćelija hematopoeze u transplantaciji izmenjenoj kako bi se eksprimirao željeni proteinski proizvod može biti slično korisna u tretmanu hemoglobinopatija, kao što je talasemija. Takođe su opisane ćelijske linije i životinje sa izmenjenom proizvodnjom globina.

[0033] Stoga se ovde opisani postupci i sastavi mogu koristiti za promenu proizvodnje jednog ili više globin gena (npr. β) u ćeliji (npr., eritroidna ćelija prekursor). Ove izmene i postupci i sastavi mogu se koristiti za uređivanje endogenog gena ili umetanje gena na željenu lokaciju u genomu ćelije (npr., u HSC). Ćelije prethodnika mogu se izvesti od pacijenata koji imaju potrebu za tim, modifikovati ex vivo, i zatim vratiti pacijentu bilo u transplantu koštane srži.

Uopšteno

[0034] Praksa postupaka, kao i priprema i upotreba ovde objavljenih sastava, osim ako nije drugačije naznačeno, koriste konvencionalne tehnike molekularne biologije, biohemije, strukture i analize hromatina, računarske hemije, kultivisanja ćelija, rekombinantne DNK i srodnih poljima koja su u okviru veština stručnjaka. Ove tehnike su u celosti objašnjene u literaturi. Pogledati, na primer, Sambrook i dr.MOLECULAR CLONING: A

1

LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 and Third edition, 2001; Ausubel i dr., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 and periodic updates; the series METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol.304, „Chromatin“ (P.M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; and METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol.119, „Chromatin Protocols“ (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999.

Definicije

[0035] Izrazi „nukleinska kiselina“, „polinukleotid“ i „oligonukleotid“ se upotrebljavaju naizmenično i odnose se na deoksiribonukleotidni ili ribonukleotidni polimer, u linearnoj ili kružnoj konformaciji, i u jednolančanom ili dvolančanom obliku. Za potrebe predmetnog obelodanjenja, ovi izrazi ne treba da se tumače kao ograničavajući u smislu dužine polimera. Izrazi mogu da obuhvate poznate analoge prirodnih nukleotida, kao i nukleotide koji su modifikovani u baznim, šećernim i/ili fosfatnim delovima (npr., fosforotioatne kičme).

Generalno, analog određenog nukleotida ima istu specifičnost spajanja baza; tj., analog A će se bazno spojiti sa T.

[0036] Izrazi „polipeptid“, „peptid“ i „protein“ koriste se naizmenično za označavanje polimera aminokiselinskih ostataka. Izraz se takođe odnosi na polimere aminokiselina u kojima su jedna ili više aminokiselina hemijski analozi ili modifikovani derivati odgovarajućih prirodnih aminokiselina.

[0037] „Vezivanje“ se odnosi na sekvencilno nekovalentnu interakciju između makromolekula (npr., između proteina i nukleinske kiseline). Ne moraju sve komponente interakcije vezivanja biti specifične za sekvencu (npr., dodiri sa fosfatnim ostacima u DNK kičmi), sve dok je interakcija u celini specifična za sekvencu. Takve interakcije generalno karakteriše konstanta disocijacije (Kd) od 10<-6>M<-1>ili niže. „Afinitet“ se odnosi na snagu vezivanja: povećani afinitet vezivanja je povezan sa nižim Kd.

[0038] „Vezujući protein“ je protein koji je sposoban da se nekovalentno vezuje za drugi molekul. Vezujući protein se može vezati za, na primer, DNK molekul (DNK-vezujući

1

protein), RNK molekul (RNK-vezujući protein) i/ili molekul proteina (protein-vezujući protein). U slučaju protein-vezujućeg proteinan, može da se vezuje za sebe (da formira homodimere, homotrimre, itd.) i/ili se može vezati za jedan ili više molekula različitih proteina. Vezujući protein može imati više vrsta vezujuće aktivnosti. Na primer, cinkov prst proteini imaju aktivnost vezivanja DNK, vezivanja RNK i vezivanje proteina.

[0039] „Cinkov prst DNK-vezujući protein“ (ili vezujući domen) je protein ili domen, u okviru većeg proteina, koji vezuje DNK na specifičan način kroz jednu ili više cinkov prst nukleaza, koji su regioni aminokiselinske sekvence u vezujućem domenu čija se struktura stabilizuje koordinacijom cink jona. Izraz cinkov prst DNK-vezujući protein često se skraćuje kao cinkov prst protein ili ZFP.

[0040] „TALE DNK vezujući domen“ ili „TALE“ je polipeptid koji sadrži jedan ili više TALE domena/jedinica ponavljanja. Ponovljeni domeni su uključeni u vezivanje TALE za njegovu srodnu ciljanu DNK sekvencu. Jedna „jedinica ponavljanja“ (koja se takođe naziva „ponavljanje“) obično je dužine 33-35 aminokiselina i pokazuje barem određenu homolognost sekvenci sa drugim TALE sekvencama ponavljanja unutar TALE proteina koji se javlja prirodno. Pogledati npr. SAD publikacija patenata br.20110301073.

[0041] Cink prst i TALE vezujući domeni mogu se „konstruisati“ tako da se vezuju na unapred određenu nukleotidnu sekvencu, na primer, inženjeringom (menjajući jednu ili više aminokiselina) u heliks regionu prepoznavanja prirodnog cinkov prst ili TALE proteina.

Stoga, sintetički DNK vezujući proteini (cinkov prst ili TALE) su proteini koji se ne javljaju prirodno. Neograničavajući primeri postupaka za inženjering proteina koji vezuju DNK su dizajn i selekcija. Sintetički DNK vezujući protein je protein koji se ne javlja u prirodi, čiji dizajn/sastav uglavnom potiče iz racionalnih kriterijuma. Racionalni kriterijumi za dizajn uključuju primenu pravila supstitucije i računarskih algoritama za obradu podataka u bazi podataka u koje se čuvaju informacije o postojećim ZFP i/ili TALE dizajnima i podacima o vezivanja. Pogledati, na primer, US patente 6,140,081; 6,453,242; i 6,534,261; takođe pogledati WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 i WO 03/016496 i SAD publikaciju br.20110301073.

[0042] „Izabran“ cinkov prst protein ili TALE je protein koji se ne javlja u prirodi, čija proizvodnja je prevashodno rezultat empirijskog procesa, kao što je prikaz faga, zamka za

1

interakciju ili hibridna selekcija. Pogledati npr., SAD patent br.8,586,526; 5,789,538;

5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; i 6,200,759;.

[0043] „TtAgo“ je prokariotski Argonaut protein za koji se misli da je uključen u utišavanje gena. TtAgo je dobijen iz Thermus thermophilus bakterija. Pogledati, npr., Swarts i dr, ibid, G. Sheng i dr., (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, 652). „TtAgo sistem“ su sve potrebne komponente, uključujući, na primer, DNK vodič za razdvajanje pomoću TtAgo enzima.

[0044] „Rekombinacija“ se odnosi na proces razmene genetskih informacija između dva polinukleotida. Za potrebe predmetnog obelodanjenja, „homologna rekombinacija“ (HR) odnosi se na specijalizovani oblik takve razmene koji se dešava, na primer, tokom popravke prekida dvostrukog lanca u ćelijama pomoću mehanizama za popravljanje usmerenih na homologiju. Ovaj proces zahteva homologiju nukleotidne sekvence, koristi molekul „donora“ kako bi popravio „ciljani“ molekul po obrascu. (tj. onaj koji je doživeo prekid dvostrukog lanca), i poznat je i kao „ne-unakrsna konverzija gena“ ili „konverzija gena kratkog trakta“, jer dovodi do prenosa genetskih informacija od donora do cilja. Bez želje da se veže bilo kojom određenom teorijom, takav prenos može uključivati korekciju neusklađenosti heterodupleks DNK koja se formira između pokvarenog cilja i donora i/ili „vezivanje zavisno od sinteze“, u kom se donor koristi za ponovnu sintezu genetske informacije koje će postati deo cilja i/ili srodnih procesa. Ovakav specijalizovani HR često rezultuje promenom sekvence ciljanog molekula, tako da se deo ili cela sekvenca donora polinukleotida ugradi u ciljani polinukleotid.

[0045] U postupcima obelodanjenja, jedna ili više ciljanih nukleaza, kako je ovde opisano, stvaraju prekid dvostrukog lanca u ciljanoj sekvenci (npr., ćelijski hromatin) na unapred određenom mestu, i „donorski“ polinukleotid, koji ima homologiju nukleotidnoj sekvenci u regione prekida, može se uvesti u ćeliju. Pokazalo se da prisustvo prekida dvostrukog lanca olakšava integraciju donorske sekvence. Donorska sekvenca može biti fizički integrisana ili, alternativno, donorski polinukleotid se koristi kao obrazac za popravku prekida homolognom rekombinacijom, što rezultuje unošenjem celog ili dela nukleotidne sekvence, kakva je kod donora, u ćelijski hromatin. Stoga se prva sekvenca u ćelijskom hromatinu može izmeniti i, u određenim slučajevima, može se pretvoriti u sekvencu prisutnu u donorskom polinukleotidu. Prema tome, upotreba termina „zamena“ ili „zameniti“ može se razumeti da predstavlja

1

zamenu jedne nukleotidne sekvence drugom, (tj., zamena sekvence u informacionom smislu), ali ne zahteva nužno fizičku ili hemijsku zamenu jednog polinukleotida drugim.

[0046] U bilo kom od ovde opisanih postupaka, dodatni parovi cinkov prst ili TALEN proteina mogu se koristiti za dodatno dvolančano razdvajanje dodatnih ciljanih mesta unutar ćelije. Pored toga, CRISPR/Cas sistem se može slično koristiti da indukuje dodatne prekide dvostrukog lanca.

[0047] U određenim postupcima za ciljanu rekombinaciju i/ili zamenu i/ili izmenu sekvence u regionu od interesa u ćelijskom hromatinu, hromozomska sekvenca se menja homolognom rekombinacijom sa egzogenom „donorskom“ nukleotidnom sekvencom. Takva homologna rekombinacija se stimuliše prisustvom prekida dvostrukog lanca u ćelijskom hromatinu, ako su prisutne sekvence homologne regionu prekida.

[0048] U bilo kom od ovde opisanih postupaka, egzogena nukleotidna sekvenca („donorska sekvenca“ ili „transgen“) može da sadrži sekvence koje su homologne, ali nisu identične genomskim sekvencama u regionu od interesa, čime se stimuliše homologna rekombinacija za umetanje a ne-identične sekvence u region od interesa. Prema tome, delovi donorske sekvence koji su homologni sekvenci u regionu od interesa mogu da pokazuju između oko 80 do 99% (ili bilo koji ceo broj između njih) identičnosti sekvence genomskoj sekvenci koja se zamenjuje. Homologija između donorske sekvence i genoma može biti veća od 99%, na primer ako se samo 1 nukleotid razlikuje između donorske sekvence i genoma od preko 100 susednih baznih parova. U određenim slučajevima, nehomologni deo donorske sekvence može sadržati sekvence koje nisu prisutne u regionu od interesa, tako da se nove sekvence uvode u region od interesa. U tim slučajevima, nehomologna sekvenca je obično povezana sekvencama od 50-1000 baznih parova (ili bilo koje celobrojne vrednosti između njih) ili bilo kojim brojem baznih parova većim od 1000, koji su homologni ili identični sekvencama u regionu od interesa. U drugim slučajevima, donorska sekvenca je nehomologna prvoj sekvenci i umetnuta je u genom pomoću nehomolognih mehanizama rekombinacije.

[0049] Bilo koji od ovde opisanih postupaka može se koristiti za delimičnu ili potpunu inaktivaciju jedne ili više ciljanih sekvenci u ćeliji ciljanom integracijom donorske sekvence koja narušava eksprimiranje gena od interesa. Takođe su obelodanjene ćelijske linije sa delimično ili potpuno inaktiviranim genima.

2

[0050] Pored toga, ovde opisani postupci ciljane integracije mogu se takođe koristiti za integrisanje jedne ili više egzogenih sekvenci. Egzogena sekvenca nukleinskih kiselina može da sadrži, na primer, jedan ili više gena ili cDNK molekula, ili bilo koju vrstu kodirajuće ili nekodirajuće sekvence, kao i jedan ili više kontrolnih elemenata (npr., promoteri). Pored toga, sekvenca egzogenih nukleinskih kiselina može da proizvede jedan ili više RNK molekula (npr., RNK male ukosnice (shRNK), inhibitorne RNK (RNKis), mikroRNK (miRNK), itd.).

[0051] „Razdvajanje“ se odnosi na prekid kovalentne kičme DNK molekula. Razdvajanje se može započeti raznim postupcima, uključujući, ali ne ograničavajući se na, enzimsku ili hemijsku hidrolizu fosfodiesterske veze. Moguće su i jednolančano razdvajanje i dvolančano razdvajanje, i dvolančano razdvajanje se može dogoditi kao rezultat dva različita jednolančana razdvajanja. Razdvajanje DNK može rezultovati stvaranjem tupih krajeva ili stepenastih krajeva. Fuzioni polipeptidi se koriste za ciljano dvolančano razdvajanje DNK.

[0052] „Polu-domen razdvajanja“ je polipeptidna sekvenca koja u kombinaciji sa drugim polipeptidom (identičnim ili različitim) formira kompleks koji ima aktivnost razdvajanja (poželjno aktivnost dvolančanog razdvajanja). Izrazi „prvi i drugi polu-domeni razdvajanja;“ „+ i - polu-domeni razdvajanja“ i „desni i levi polu-domeni razdvajanja“ se koriste naizmenično kako bi označili parove polu-domena razdvajanja koji dimerizuju.

[0053] „Sintetički polu-domen razdvajanja“ je polu-domen razdvajanja koji je modifikovana tako da formira obligatorne heterodimere sa drugim polu-domenom razdvajanja (npr., još jedan sintetički polu-domen razdvajanja). Takođe pogledati, SAD patent br.7,888,121;

7,914,796; 8,034,598 i 8,823,618.

[0054] Izraz „sekvenca“ odnosi se na nukleotidnu sekvencu bilo koje dužine, koja može biti DNK ili RNK; može biti linearna, kružni ili razgranati, i može biti ili jednolančana ili dvolančana. Izraz „donorska sekvenca“ odnosi se na nukleotidnu sekvencu koja je umetnuta u genom. Donorska sekvenca može biti bilo koje dužine, na primer dužine između 2 i 10.000 nukleotida (ili bilo koji ceo broj između ili iznad njih), poželjno između oko 100 i 1.000 nukleotida (ili bilo koji ceo broj između njih), poželjnije između oko 200 i 500 nukleotida dužine.

[0055] „Gen povezan sa bolešću“ je onaj koji je na neki način neispravan kod monogene bolesti. Neograničavajući primeri monogenih bolesti uključuju tešku kombinovanu imunodeficijenciju, cističnu fibrozu, bolesti lizozomskog skladištenja (npr. Gaucher-ova, Hurler-ova, Hunter-ova, Fabri-jeva, Neimann-Pick-ova, Tay-Sach-ova, itd.), anemiju srpastih ćelija i talasemiju.

[0056] „Hromatin“ je nukleoproteinska struktura koja sadrži ćelijski genom. Ćelijski hromatin sadrži nukleinsku kiselinu, pre svega DNK, i protein, uključujući histone i nehistonske hromozomske proteine. Većina eukariotskog ćelijskog hromatina postoji u obliku nukleozoma, gde nukleozomsko jezgro sadrži otprilike 150 baznih parova DNK povezanih sa oktamerom koji sadrži po dva od svakog histona H2A, H2B, H3 i H4; i veznik DNK (promenljive dužine u zavisnosti od organizma) se proteže između jezgara nukleozoma.

Molekul histona HI generalno je povezan sa veznik DNK. Za potrebe predmetnog obelodanjenja, izraz „hromatin“ treba da obuhvati sve vrste ćelijskog nukleoproteina, i prokariotske i eukariotske. Ćelijski hromatin uključuje i hromozomski i epizomalni hromatin.

[0057] „Hromozom“ je hromatinski kompleks koji sadrži ceo ili deo genoma ćelije. Genom ćelije se često karakteriše svojim kariotipom, što je zbirka svih hromozoma koji čine genom ćelije. Genom ćelije može da sadrži jedan ili više hromozoma.

[0058] „Epizom“ je nukleinska kiselina koja se replicira, nukleoproteinski kompleks ili druga struktura koja sadrži nukleinsku kiselinu koja nije deo hromozomskog kariotipa ćelije.

Primeri epizoma uključuju plazmide i određene virusne genome.

[0059] „Ciljano mesto“ ili „ciljana sekvenca“ je sekvenca nukleinskih kiselina koja definiše deo nukleinske kiseline na koji će se vezujući molekul vezati pod uslovom da postoje dovoljni uslovi za vezivanje.

[0060] „Egzogeni“ molekul je molekul koji nije normalno prisutan u ćeliji, ali se može uvesti u ćeliju jednim ili više genetskih, biohemijskih ili drugih postupaka. „Normalno prisustvo u ćeliji“ se određuje u odnosu na određenog razvojnog stadijuma ćelije i uslova okruženja. Tako, na primer, molekul koji je prisutan samo tokom embrionalnog razvoja mišića je egzogeni molekul u odnosu na mišićnu ćeliju odrasle osobe. Slično tome, molekul izazvan toplotnim šokom je egzogeni molekul u odnosu na ćeliju koja nije pod tim toplotnim šokom.

Egzogeni molekul može da sadrži, na primer, funkcionalnu verziju neispravnog endogenog molekula ili neispravnu verziju normalno-funkcionišućeg endogenog molekula.

[0061] Egzogeni molekul može biti, između ostalog, mali molekul, kao što je generisan kombinatornim hemijskim procesom, ili makromolekul poput proteina, nukleinske kiseline, ugljenih hidrata, lipida, glikoproteina, lipoproteina, polisaharida, bilo kog modifikovanog derivata gore navedenih molekula, ili bilo koji kompleks koji sadrži jedan ili više gore navedenih molekula. Nukleinske kiseline uključuju DNK i RNK, mogu biti jedno- ili dvolančane; mogu biti linearne, razgranate ili kružni; i mogu biti bilo koje dužine. Nukleinske kiseline uključuju one koje su sposobne da formiraju duplekse, kao i nukleinske kiseline koje formiraju triplekse. Pogledati, na primer, SAD patent br.5,176,996 i 5,422,251. Proteini uključuju, ali nisu ograničeni na, proteine koji vezuju DNK, faktore transkripcije, faktore remodeliranja hromatina, metilirane proteine koji vezuju DNK, polimeraze, metilaze, demetilaze, acetilaze, deacetilaze, kinaze, fosfataze, integraze, rekombinaze, ligaze, topoizomeraze, giraze i helikaze.

[0062] Egzogeni molekul može biti ista vrsta molekula kao i endogeni molekul, npr., egzogeni protein ili nukleinska kiselina. Na primer, egzogena nukleinska kiselina može da sadrži infektivni virusni genom, plazmid ili epizom koji je unesen u ćeliju, ili hromozom koji obično nije prisutan u ćeliji. Postupci za unošenje egzogenih molekula u ćelije poznati su stručnjacima i uključuju, ali nisu ograničeni na, prenos posredovan lipidima (tj., lipozomi, uključujući neutralne i katjonske lipide), elektroporaciju, direktno ubrizgavanje, ćelijsku fuziju, bombardovanje česticama, ko-taloženje kalcijum-fosfatom, prenošenje posredovanjem DEAE-dekstranom i prenos posredovan virusnim vektorom. Egzogeni molekul takođe može biti ista vrsta molekula kao i endogeni molekul, ali potiče od različite vrste u odnosu na onu od koje ćelija potiče. Na primer, ljudska nukleinska kiselina može biti uvedena u ćelijsku liniju koja je prvobitno izvedena od miša ili hrčka.

[0063] Suprotno tome, „endogeni“ molekul je onaj koji je normalno prisutan u određenoj ćeliji u određenoj fazi razvoja pod određenim uslovima okruženja. Na primer, endogena nukleinska kiselina može da sadrži hromozom, genom mitohondrije, hloroplast ili drugu organelu, ili epizomsku nukleinsku kiselinu koja se javlja u prirodi. Dodatni endogeni molekuli mogu da sadrže proteine, na primer, faktore transkripcije i enzime.

2

[0064] „Fuzioni“ molekul je molekul u kom su dva ili više podjedinična molekula povezana, po mogućnosti kovalentno. Podjedinični molekuli mogu biti isti hemijski tip molekula, ili mogu biti različiti hemijski tipovi molekula. Primeri prvog tipa fuzionog molekula uključuju, ali nisu ograničeni na, fuzione proteine (na primer, fuzija između ZFP ili TALE DNK-vezujućeg domena i jednog ili više aktivacionog domena) i fuzione nukleinske kiseline (na primer, nukleinska kiselina koja kodira opisani fuzioni protein supra). Primeri drugog tipa fuzionog molekula uključuju, ali nisu ograničeni na, fuziju između nukleinske kiseline koja stvara tripleks i polipeptida, i fuziju između veznika sa manjim žlebom i nukleinske kiseline.

[0065] Eksprimiranje fuzionog proteina u ćeliji može biti rezultat isporuke fuzionog proteina u ćeliju ili isporuke polinukleotida koji kodira fuzioni protein u ćeliju, gde je polinukleotid transkribovan i transkript je preveden, kako bi se stvorio fuzioni protein. Trans-splajsovanje, razdvajanje polipeptida i ligacija polipeptida takođe mogu biti uključeni u eksprimiranje proteina u ćeliji. Postupci za isporuku polinukleotida i polipeptida ćelijama su predstavljeni drugde u ovom obelodanjenju.

[0066] „Gen“, za potrebe predmetnog obelodanjenja, uključuje DNK region koji kodira genski proizvod (pogledati infra), kao i sve DNK regione koji regulišu proizvodnju genskog proizvoda, bez obzira da li su takve regulatorne sekvence povezane sa kodirajućim i/ili transkribovanim sekvencama. Shodno tome, gen uključuje, ali nije nužno ograničen na, promoterske sekvence, terminatore, translacione regulatorne sekvence kao što su mesta vezivanja za ribozome i unutrašnja mesta ulaska u ribozome, pojačivače, prigušivače, izolatore, granične elemente, poreklo replikacije, mesta za vezivanje matriksa i kontrolne regione lokusa. „Aberantni“ gen je gen koji se razlikuje u nukleotidnoj sekvenci od gena divljeg tipa, uključujući gen koji uključuje jednu ili više mutacija (npr. tačkaste mutacije, umetanja i/ili brisanja) u poređenju sa sekvencom divljeg tipa. Hbb divljeg tipa je obelodanjen, na primer, pod GenBank pristupnim br. NG_000007 (takođe pogledati, Efstratiadis i dr. (1980) Cell 21(3):653-668). Proizvod kodiran aberantnim genom može pokazati istu ili različitu funkciju (npr., povećanu funkciju, smanjenu funkciju, bez funkcije) u poređenju sa proizvodom gena divljeg tipa. Primerni aberantni Hbb geni su obelodanjeni ovde i kod Kazazian i Boehm (1988) Blood vol 71 No 4: 1107.

[0067] „Gensko eksprimiranje“ odnosi se na konverziju informacija, sadržanih u genu, u genski proizvod. Genski proizvod može biti direktan transkripcioni proizvod gena (npr., mRNK, tRNK, rRNK, antisens RNK, ribozom, strukturalna RNK ili bilo koji drugi tip RNK) ili protein proizveden translacijom mRNK. Genski proizvodi takođe uključuju RNK koje su modifikovane procesima kao što su ograničavanje, poliadenilacija, metilacija i uređivanje i proteini modifikovani, na primer, metilacijom, acetilacijom, fosforilacijom, ubikvitacijom, ADP-ribozilacijom, miristilacijom i glikozilacijom.

[0068] „Modulacija“ eksprimiranja gena odnosi se na promenu aktivnosti gena. Modulacija eksprimiranja može uključivati, ali nije ograničena na, aktivaciju gena i represiju gena.

Uređivanje genoma (npr., razdvajanje, promena, inaktivacija, slučajna mutacija) mogu se koristiti za modulaciju eksprimiranja. Inaktivacija gena odnosi se na svako smanjivanje eksprimiranja gena u poređenju sa ćelijom koja ne uključuje ZFP ili TALEN, kako je ovde opisano. Dakle, inaktivacija gena može biti delimična ili potpuna.

[0069] „Region od interesa“ je bilo koji region ćelijskog hromatina, kao što je, na primer, gen ili nekodirajuća sekvenca unutar ili blizu gena, za koji je poželjno da vezuje egzogeni molekul. Vezivanje može biti u svrhu ciljanog razdvajanja DNK i/ili ciljane rekombinacije. Region interesa može biti prisutan u hromozomu, epizomu, organelarnom genomu (npr., mitohondrija, hloroplast) ili infikasnom virusnom genomu, npr. Region od interesa može biti unutar regiona kodiranja gena, unutar transkribovanih nekodirajućih regiona, kao što su, na primer, liderske sekvence, prateće sekvence ili introni, ili unutar ne-transkribovanih regiona, bilo uzvodno ili nizvodno od kodirajućeg regiona. Region od interesa može biti mali kao jednog para nukleotida ili dužine do 2.000 nukleotidnih parova, ili bilo koja celobrojna vrednost nukleotidnih parova.

[0070] „Eukariotske“ ćelije uključuju, ali nisu ograničene na, gljivične ćelije (poput kvasca), biljne ćelije, životinjske ćelije, ćelije sisara i ljudske ćelije (npr., T-ćelije).

[0071] „Crvena krvna zrnca“ (RBC), ili eritrociti, su terminalno diferencirane ćelije koje potiču iz matičnih ćelija hematopoeze. Njima nedostaju nukleaze i većina ćelijskih organela. RBC sadrže hemoglobin koji prenosi kiseonik iz pluća u periferna tkiva. U stvari, 33% pojedinačnog RBC je hemoglobin. Takođe nose CO2, proizveden od strane ćelija tokom metabolizma, iz tkiva i nazad u pluća radi oslobađanja tokom izdisaja. RBC se proizvode u koštanoj srži kao odgovor na hipoksiju krvi koja je posredovana oslobađanjem eritropoetina (EPO) putem bubrega. EPO izaziva porast broja proeritroblasta i skraćuje vreme potrebno za

2

potpuno sazrevanje RBC. Nakon otprilike 120 dana, pošto RBC ne sadrži jedro ili bilo koje druge regenerativne sposobnosti, ćelije se uklanjaju iz cirkulacije bilo fagocitnim aktivnostima makrofaga u jetri, slezini i limfnim čvorovima (∼90%) ili hemolizom u plazmi (∼10%). Nakon zahvatanja makrofaga, hemijske komponente RBC se razgrađuju unutar vakuola makrofaga usled dejstva lizozomalnih enzima.

[0072] „Sekretorna tkiva“ su ona tkiva životinje koja izlučuju proizvode iz pojedine ćelije u neki lumen određenog tipa koji se obično izvode iz epitela. Primeri sekretornih tkiva koja su lokalizovana u gastrointestinalnom traktu uključuju ćelije creva, pankreasa i žučne kese.

Ostala sekretorna tkiva uključuju jetru, tkiva povezana sa očima i sluzokožama poput pljuvačnih žlezda, mlečnih žlezda, prostate, hipofize i ostalih članova endokrinog sistema. Pored toga, sekretorna tkiva uključuju pojedinačne ćelije tkivnog tipa koje su sposobne za sekreciju.

[0073] Izrazi „operativna veza“ i „operativno vezani“ (ili „operativno povezani“) se upotrebljavaju naizmenično u odnosu na sastav dve ili više komponenti (kao što su elementi sekvence), u kojima su komponente raspoređene tako da obe komponente normalno funkcionišu i dozvoljavaju mogućnost da bar jedna od komponenti može da posreduje funkciju koja se vrši na barem jednoj od drugih komponenti. Kao ilustracija, transkripciona regulatorna sekvenca, poput promotera, operativno je povezana sa kodirajućom sekvencom ako transkripciona regulatorna sekvenca kontroliše nivo transkripcije kodirajuće sekvence kao odgovor na prisustvo ili odsustvo jednog ili više transkripcionih regulatornih faktora.

Transkripciona regulatorna sekvenca je uglavnom operativno povezana kao cis sa kodirajućom sekvencom, ali ne mora biti direktno pored nje. Na primer, pojačivač je transkripciona regulatorna sekvenca koja je operativno povezana sa kodirajućom sekvencom, iako one nisu susedne.

[0074] Uzimajući u obzir fuzione polipeptide, izraz „operativno povezan“ može se odnositi na činjenicu da svaka komponenta obavlja istu funkciju u povezivanju sa drugom komponentom, kao što bi bio slučaj da nije tako povezana. Na primer, u smislu fuzionog polipeptida u kom je ZFP, TALE ili Cas DNK-vezujući domen fuzionisan za aktivacioni domen, ZFP, TALE ili Cas DNK-vezujući domen i aktivacioni domen su u operativnoj vezi ako, u fuzionom polipeptidu, ZFP, TALE ili Cas DNK vezujući domen može da vezuje svoje ciljano mesto i/ili njegovo vezujuće mesto, dok aktivacioni domen može da reguliše eksprimiranje gena. Kada

2

je fuzioni polipeptid, u kom se ZFP ili TALE DNK-vezujući domen fuzioniše za domen razdvajanja, ZFP ili TALE DNK-vezujući domen i domen razdvajanja su u operativnoj vezi ako, u fuzionom polipeptidu, ZFP ili TALE DNK-vezujući domen može da vezuje svoje ciljano mesto i/ili svoje vezujuće mesto, dok domen razdvajanja može da razdvaja DNK u blizini ciljanog mesta.

[0075] „Funkcionalni fragment“ proteina, polipeptida ili nukleinske kiseline je protein, polipeptid ili nukleinska kiselina čija sekvenca nije identična proteinu, polipeptidu ili nukleinskoj kiselini pune dužine, ali zadržava istu funkciju kao protein pune dužine, polipeptid ili nukleinska kiselina. Funkcionalni fragment može da ima veći, manji ili isti broj ostataka kao odgovarajući prirodni molekul i/ili može da sadrži jednu ili više aminokiselinskih ili nukleotidnih supstitucija. Postupci za određivanje funkcije nukleinske kiseline (npr., kodirajuća funkcija, sposobnost hibridizacije do druge nukleinske kiseline) dobro su poznati u struci. Slično tome, postupci za određivanje funkcije proteina su dobro poznati. Na primer, funkcija vezivanja DNK polipeptida može se odrediti, na primer, ispitivanjem vezivanja filtera, promenom elektroforetske mobilnosti ili imunoprecipitacijom. DNK razdvajanje može se analizirati elektroforezom gela. Pogledati Ausubel i dr., supra. Sposobnost proteina da komunicira sa drugim proteinima može se odrediti, na primer, koimunoprecipitacijom, dvo-hibridnim testovima ili komplementacijom, i genetskom i biohemijskim. Pogledati, na primer, Fields i dr. (1989) Nature 340:245-246; SAD patent br.

5,585,245 i PCT WO 98/44350.

[0076] „Vektor“ je sposoban da prenosi gensku sekvencu u ciljane ćelije. Tipično, „vektorski konstrukt“, „vektor eksprimiranja“ i „vektor prenosa gena“ označavaju bilo koji konstrukt nukleinske kiseline koji je sposoban da usmerava eksprimiranje gena od interesa, i koji može da prenosi genske sekvence ciljanim ćelijama. Dakle, izraz uključuje kloniranje i eksprimiranje, kao i integrisanje vektora.

[0077] „Reporterski gen“ ili „reporterska sekvenca“ odnosi se na bilo koju sekvencu koja proizvodi proteinski proizvod koji se lako meri, poželjno iako ne nužno rutinskim ispitivanjem. Pogodni reporterski geni uključuju, ali nisu ograničeni na, sekvence koje kodiraju proteine koji posreduju rezistenciju na antibiotike (npr., rezistencija na ampicilin, rezistencija na neomicin, rezistencija na G418, rezistencija na puromicin), sekvence koje kodiraju obojene ili fluorescentne ili luminescentne proteine (npr., zeleni fluorescentni

2

protein, pojačani zeleni fluorescentni protein, crveni fluorescentni protein, luciferaza) i proteine koji posreduju u pojačanom ćelijskom rastu i/ili amplifikaciji gena (npr., dihidrofolat reduktaza). Oznake epitopa uključuju, na primer, jednu ili više kopija FLAG-a, His, myc, Tap, HA ili bilo koje aminokiselinska sekvenca koje se može detektovati. „Oznake eksprimiranja“ uključuju sekvence koje kodiraju reportere koji mogu biti operativno povezani sa željenom genskom sekvencom u cilju praćenja eksprimiranja gena od interesa.

[0078] Izrazi „pacijent“ i „bolesnik“ koriste se naizmenično i odnose se na sisare kao što su ljudski pacijenti i primati koji nisu čovek, kao i eksperimentalne životinje poput zečeva, pasa, mačaka, pacova, miševa i drugih životinja. Shodno tome, izraz „pacijent“ ili „bolesnik“, kako se ovde koristi, označava bilo kog pacijenta sisar ili pacijenta kom mogu da se primenjuju izmenjena RBC (ili matične ćelije) predmetnog pronalaska. Pacijenti predmetnog pronalaska uključuju one koji su bili izloženi jednom ili više hemijskih toksina, uključujući, na primer, nervni toksin.

Nukleaze

[0079] Ovde su opisani sastavi, naročito nukleaze, koje su korisne za ciljanje gena za upotrebu sa hemoglobinopatijama. Nukleaza može biti prirodna, ili ona koja se ne javlja u prirodi (tj., proizvedena u DNK-vezujućem domenu i/ili domenu razdvajanja). Bilo koji DNK-vezujući domen može se koristiti u ovde opisanim nukleazama. Na primer, DNK-vezujući domen prirodne nukleaze može se izmeniti tako da se vezuje na izabrano ciljano mesto (npr., meganukleaza koja je sintetički da se vezuje na mesto drugačije od srodnog mesta vezivanja). U drugim aspektima, nukleaza obuhvata heterologene vezujuće domene i domene razdvajanja DNK (npr., cinkov prst nukleaze; TAL-efektor nukleaze; DNK-vezujuće domene meganukleaze sa heterolognim domenim razdvajanja), ili generičke nukleaze vođene posebnim RNK vodičem (npr. CRPISR/Cas).

A. DNK-vezujući domeni

[0080] U određenim aspektima, nukleaza je meganukleaza (homing endonukleaza).

Meganukleaze koje se prirodno javljaju prepoznaju 15-40 mesta razdvajanja baznog para i obično su grupisane u četiri porodice: LAGLIDADG porodica, GIY-YIG porodica, His-Cyst box porodica i HNH porodica. Primeri homing endonukleaza uključujuI-SceI, I-CeuI, PI-

2

PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII i I-TevIII. Njihove sekvence prepoznavanja su poznate. Pogledati takođe SAD patent br.

5,420,032; SAD patent br.6,833,252; Belfort i dr. (1997) Nucleic Acids Res.25:3379-3388; Dujon i dr. (1989) Gene 82:115-118; Perler i dr. (1994) Nucleic Acids Res.22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet.12:224-228; Gimble i dr. (1996) J. Mol. Biol.263:163-180; Argast i dr. (1998) J. Mol. Biol.280:345-353 i New England Biolabs katalog.

[0081] U određenim aspektima, nukleaza sadrži sintetičku (ne-prirodnu) homing endonukleazu (meganukleazu). Poznate su sekvence prepoznavanja homing endonukleaza i meganukleaza kao što su I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII and I-TevIII. Pogledati takođe SAD patent br.

5,420,032; SAD patent br.6,833,252; Belfort i dr.(1997) Nucleic Acids Res.25:3379-3388; Dujon i dr. (1989) Gene 82:115-118; Perler i dr.(1994) Nucleic Acids Res.22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet.12:224-228; Gimble i dr. (1996) J. Mol. Biol.263:163-180; Argast i dr. (1998) J. Mol. Biol.280:345-353 i New England Biolabs katalog. Pored toga, DNK-vezujuća specifičnost endonukleaza i meganukleaza može se konstruisati da vezuje neprirodna ciljana mesta. Pogledati, na primer, Chevalier i dr. (2002) Molec. Cell10:895-905; Epinat i dr. (2003) Nucleic Acids Res.31:2952-2962; Ashworth i dr. (2006) Nature 441:656-659; Paques i dr. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66; SAD publikacija patenata br.

20070117128. DNK-vezujući domeni matičnih endonukleaza i meganukleaza mogu se izmeniti u kontekstu nukleaze kao celine (tj. tako da nukleaza obuhvata srodni domen razdvajanja) ili se može spojiti u heterologni domen razdvajanja.

[0082] U drugim aspektima, DNK-vezujući domen sadrži prirodno nastali ili sintetički (ne javlja se u prirodi) TAL efektorski DNK-vezujući domenu. Pogledati npr. SAD publikacija patenata br.20110301073. Za biljne patogene bakterije roda Xanthomonas se zna da uzrokuju mnoge bolesti u važnim usevima. Patogenost Xanthomonas zavisi od sistema očuvanja sekrecije tipa III (T3S) koji u biljnu ćeliju ubrizgava više od 25 različitih efektorskih proteina. Među tim ubrizganim proteinima su efektori slični transkripcionom aktivatoru (TALE) koji oponašaju aktivatore biljnih transkripcija i manipulišu biljnim transkriptom (pogledati Kay i dr (2007) Science 318:648-651). Ovi proteini sadrže DNK-vezujući domen i transkripcioni aktivacioni domen. Jedan od najbolje opisanih TALE je AvrBs3 iz Xanthomonas campestgris pv. Vesicatoria (pogledati Bonas i dr (1989) Mol Gen Genet 218: 127-136 i WO2010079430). TALE sadrže centralizovani domen tandemskih ponavljanja, i svako ponavljanje sadrži

2

otprilike 34 aminokiseline koje su ključne za specifičnost DNK vezivanja ovih proteina.

Pored toga, oni sadrže lokalizacione sekvence jedra i kiseli transkripcioni aktivacioni domen (za pregled pogledati Schornack S, i dr (2006) J Plant Physiol 163(3): 256-272). Pored toga, u fitopatogenim bakterijama Ralstonia solanacearum pronađena su dva gena, označena brg11 i hpx17 koji su homologni AvrBs3 porodici Xanthomonas u R. solanacearum biovar 1 soju GMI1000, i u biovar 4 soju RS1000 (Pogledati Heuer i dr (2007) Appl and Envir Micro 73(13): 4379-4384). Ovi geni su 98,9% identični po nukleotidnoj sekvenci, ali se razlikuju brisanjem 1.575 baznih parova u domenu ponavljanja od hpx17. Međutim, oba genska proizvoda imaju manje od 40% identičnosti sekvenci sa proteinima AvrBs3 porodice od Xanthomonas.

[0083] Prema tome, u nekim aspektima, DNK-vezujući domenu koji se vezuje za ciljano mesto u ciljanom lokusu (npr., globin ili sigurna luka) je sintetički domen iz TAL efektora sličan onima dobijenim iz biljnih patogena Xanthomonas (pogledati Boch i dr, (2009) Science 326: 1509-1512 and Moscou and Bogdanove, (2009) Science326: 1501) i Ralstonia (pogldati Heuer i dr (2007) Applied and Environmental Microbiology 73(13): 4379-4384); SAD patent br. 8,420,782 i 8,440,431 i SAD publikacija patenata br.20110301073.

[0084] U određenim aspektima, DNK-vezujući domen sadrži cinkov prst protein (npr., cinkov prst protein koji se vezuje za ciljano mesto u globin ili sigurna luka genu). Poželjno, cinkov prst protein nije prirodan jer je konstruisan da se vezuje na ciljano mesto po izboru. Pogledati, na primer, pogledati, na primer, Beerli i dr. (2002) Nature Biotechnol.20:135-141; Pabo i dr. (2001) Ann. Rev. Biochem.70:313-340; Isalan i dr. (2001) Nature Biotechnol.19:656-660; Segal i dr. (2001) Curr. Opin. Biotechnol.12:632-637; Choo i dr. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol.10:411-416; SAD patent br.6,453,242; 6,534,261; 6,599,692; 6,503,717; 6,689,558; 7,030,215; 6,794,136; 7,067,317; 7,262,054; 7,070,934; 7,361,635; 7,253,273; i SAD patentnu publikaciju br.2005/0064474; 2007/0218528; 2005/0267061.

[0085] Konstruisano vezivanje cinkovog prsta ili TALE domena mogu imati novu specifičnost vezivanja, u poređenju sa cinkov prst proteinima koji se javljaju u prirodi.

Postupci inženjering uključuju, ali nisu ograničeni na, racionalni dizajn i razne vrste odabira. Racionalni dizajn uključuje, na primer, upotrebu baza podataka koje sadrže triplet (ili kvadriplet) nukleotidne sekvence i pojedinačne cinkov prst aminokiselinske sekvence, u kojima je svaka triplet ili kvadriplet nukleotidna sekvenca povezan sa jednom ili više aminokiselinskih sekvenci cinkovog prsta koje vezuju određenu triplet ili kvadriplet sekvencu. Pogledati, na primer, suvlasničke SAD patente 6,453,242 i 6,534,261.

[0086] Primeri postupci odabira, uključujući prikaz faga i dvo-hibridne sisteme, obelodanjeni su u SAD patentima 5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,410,248; 6,140,466;

6,200,759; i 6,242,568; kao i WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 i GB 2,338,237. Pored toga, poboljšanje specifičnosti vezivanja za cinkov prst vezujuće domene opisano je, na primer, u suvlasničkom WO 02/077227.

[0087] Pored toga, kao što je obelodanjeno ovde i u drugim referencama, DNK domeni (npr. multi-cinkov prst proteini ili TALE domeni) mogu se povezati koristeći bilo koje odgovarajuće vezničke sekvence, uključujući, na primer, veznike dužine od 5 ili više aminokiselina. Takođe pogledati, SAD patent br.6,479,626; 6,903,185; i 7,153,949 za primerne vezničke sekvence dužine 6 ili više aminokiselina. Ovde opisani DNK-vezujući proteini mogu da sadrže bilo koju kombinaciju pogodnih veznika od pojedinačnih cinkov prst nukleaza proteina. Pored toga, poboljšanje specifičnosti vezivanja za cinkov prst vezujuće domene je opisano, na primer, u suvlasničkom WO 02/077227.

[0088] Izbor ciljanih lokacija; DNK-vezujući domeni i postupci za dizajniranje i izgradnju fuzionih proteina (i polinukleotidi koji ih kodiraju) poznati su stručnjacima i detaljno su opisani u SAD patent br.8,586,526; 7,888,121; 6,140,081; 5,789,538; 6,453,242; 6,534,261; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,200,759.

[0089] Pored toga, kao što je obelodanjeno ovde i u drugim referencama, DNK-vezujući domeni (npr. multi-cinkov prst proteini) mogu biti povezani korišćenjem bilo koje odgovarajuće vezničke sekvence, uključujući, na primer, veznike dužine 5 ili više aminokiselina. Takođe pogledati, SAD patent br.6,479,626; 6,903,185; i 7,153,949 za primerne vezničke sekvence dužine 6 ili više aminokiselina. Ovde opisani proteini mogu da uključuju bilo koju kombinaciju pogodnih veznika između pojedinih cinkov prst proteina.

[0090] U određenim aspektima, nukleaza sadrži CRISPR/Cas sistem. CRISPR (klasterisana pravilno razmaknuta kratka palindromska ponavljanja) lokus, koji kodira RNK komponente sistema, i cas (CRISPR-povezan) lokus, koji kodira proteine (Jansen i dr., 2002. Mol.

Microbiol. 43: 1565-1575; Makarova i dr., 2002. Nucleic Acids Res.30: 482-496; Makarova i

1

dr., 2006. Biol. Direct 1: 7; Haft i dr., 2005. PLoS Comput. Biol.1: e60) čine genske sekvence CRISPR/Cas nuclease sistema. CRISPR lokusi u mikrobnim domaćinima sadrže kombinaciju CRISPR-povezanih gena (Cas) kao i nekodirajuće RNK elemente koji mogu programirati specifičnost CRISPR-posredovanog razdvajanja nukleinske kiseline.

[0091] CRISPR tipa II jedan je od najbolje opisanih sistema i vrši ciljano prekidanje DNK dvostrukog lanca u četiri uzastopna koraka. Prvo, dve nekodirajuće RNK, pre-crRNK niz i tracrRNK, transkribovane su iz CRISPR lokusa. Drugo, tracrRNK se hibridizuje na ponovljene regione pre-crRNK i posreduje u obradi pre-crRNK u zrele crRNK koje sadrže pojedinačne razmaknute sekvence. Treće, zrela crRNK:tracrRNK kompleks usmerava Cas9 do ciljane DNK preko Watson-Crick baznog uparivanja između razmaknice na crRNK i proto razmaknice na ciljanoj DNK pored motiva susednog proto-razmaknici (PAM), što je dodatni zahtev za prepoznavanje cilja. Konačno, Cas9 posreduje razdvajanje ciljane DNK kako bi se stvorio prekid dvostrukog lanca unutar proto razmaknice. Aktivnost CRISPR/Cas sistema sastoji se od tri koraka: (i) umetanje strane DNK sekvence u CRISPR niz kako bi se sprečili budući napadi, u procesu koji se zove „adaptacija“, (ii) eksprimiranje relevantnih proteina, kao i eksprimiranje i obrada niza, praćena (iii) RNK-posredovanim interferencijama sa stranom nukleinskom kiselinom. Tako je u bakterijskoj ćeliji nekoliko takozvanih 'Cas' proteina uključeno u prirodnu funkciju CRISPR/Cas sistema i imaju ulogu u funkcijama kao što su umetanje strane DNK itd.

[0092] U određenim aspektima, Cas protein može biti „funkcionalni derivat“ prirodnog Cas proteina. „Funkcionalni derivat“ prirodne sekvence polipeptida je jedinjenje koje ima kvalitativno biološko svojstvo zajedničko sa prirodnim sekvencom polipeptida. „Funkcionalni derivati“ uključuju, ali nisu ograničeni na, fragmente prirodne sekvence i derivate prirodne sekvence polipeptida i njihove fragmente, pod uslovom da imaju zajedničko biološko delovanje sa odgovarajućom prirodnom sekvencom polipeptida. Ovde razmatrana biološka aktivnost je sposobnost funkcionalnog derivata da hidrolizuje DNK supstrat na fragmente. Izraz „derivat“ obuhvata varijante aminokiselinskih sekvenci polipeptida, kao i njihove kovalentne modifikacije i fuzije. Pogodni derivati Cas polipeptida ili njegovog fragment uključuju, ali nisu ograničeni na mutante, fuzije, kovalentne modifikacije Cas proteina ili njegovog fragmenta. Cas protein, koji uključuje Cas protein ili njegov fragment, kao i derivate Cas proteina ili njegovog fragmenta, može se dobiti iz ćelije ili sintetisati hemijski, ili kombinacijom ove dve procedure. Ćelija može biti ćelija koja prirodno proizvodi Cas protein

2

ili ćelija koja prirodno proizvodi Cas protein i genetski je konstruisana da proizvodi endogeni protein protein na višem nivou eksprimiranja, ili da proizvodi Cas protein iz egzogeno unete nukleinske kiseline, što je nukleinska kiselina kodira Cas, koji je isti ili različit od endogenog Cas. U nekim slučajevima, ćelija prirodno ne proizvodi Cas protein i genetski je konstruisana da proizvodi Cas protein.

[0093] Primerni sistemi CRISPR/Cas nukleaza koji ciljaju sigurnu luku i druge gene obelodanjeni su, na primer, u SAD prijavi br.14/278,903.

[0094] U nekim aspektima, DNK vezujući domen deo je TtAgo sistema (pogledati Swarts i dr, ibid; Sheng i dr, ibid). Kod eukariota, utišavanje gena posreduje Argonaut (Ago) porodica proteina. U ovoj paradigmi Ago je vezan za male (19-31 nt) RNK. Ovaj kompleks za utišavanje proteina i RNK prepoznaje ciljane RNK putem Watson-Crick baznog uparivanja između male RNK i cilja, i endonukleolitički razdvaja ciljanu RNK (Vogel (2014) Science 344:972-973). Suprotno tome, prokariotski Ago proteini se vezuju za male jednolančane fragmente DNK i verovatno deluju na detektovanje i uklanjanje strane (često virusne) DNK (Yuan i dr., (2005) Mol. Cell 19, 405; Olovnikov, i dr. (2013) Mol. Cell 51, 594; Swarts i dr., ibid). Primeri prokariotskih Ago proteina uključuju one iz Aquifex aeolicus, Rhodobacter sphaeroides, i Thermus thermophilus.

[0095] Jedan od najbolje opisanih prokariotskih Ago proteina je onaj iz T. thermophilus (TtAgo; Swarts i dr. ibid). TtAgo se povezuje sa jednolančanim fragmentima od 15 nt ili 13-25 nt sa 5' fosfatnim grupama. Ova „DNK vodič“ koju vezuje TtAgo vezuje za usmeravanje protein-DNK kompleksa za vezanje Watson-Crick komplementarne DNK sekvence u treći deo DNK molekula. Jednom kada informacije o sekvenci u tom DNK vodiču omoguće identifikaciju ciljane DNK, TtAgo-DNK vodič kompleks razdvaja ciljanu DNK. Takav mehanizam je podržan i strukturom TtAgo-DNK vodič kompleksa dok je vezan za svoju ciljanu DNK (G. Sheng i dr., ibid). Ago od Rhodobacter sphaeroides (RsAgo) ima slična svojstva (Olivnikov i dr. ibid).

[0096] Egzogeni DNK vodič proizvoljne DNK sekvence mogu se postaviti na TtAgo protein (Swarts i dr. ibid.). Budući da je specifičnost TtAgo razdvajanja usmerena od strane DNK vodiča, TtAgo-DNK kompleks formiran sa egzogenim, specifikovan DNK vodič će stoga usmeriti TtAgo ciljano DNK razdvajanje na komplementarnu specifikovanu ciljanu DNK. Na ovaj način može se stvoriti ciljani prekid dvostrukog lanca u DNK. Upotreba TtAgo-DNK vodič sistema (ili ortolognih Ago-DNK vodič sistema iz drugih organizama) omogućava ciljano razdvajanje genomske DNK unutar ćelija. Takvo razdvajanje može biti jednolančano ili dvolančano. Za razdvajanje genomske DNK sisara, bilo bi poželjnije koristiti verziju TtAgo kodona optimizovanog za eksprimiranje u ćelijama sisara. Dalje, možda bi bilo bolje tretirati ćelije TtAgo-DNK kompleksom formiranim in vitro gde se TtAgo protein spaja sa peptidom koji prodire kroz ćeliju. Dalje, možda bi bilo korisnije koristiti verziju TtAgo proteina koji je izmenjen mutagenezom kako bi se poboljšala aktivnost na 37 stepeni Celzijusa. Ago-RNK-posredovano razdvajanje DNK moglo bi se koristiti za uticaj na mnoštvo ishoda, uključujući odbacivanje gena, ciljano dodavanje gena, korekciju gena, ciljano brisanje gena korišćenjem tehnika standardnih u struci za eksploataciju prekida DNK.

[0097] Prema tome, nukleaza može da sadrži bilo koji DNK-vezujući domen koji se specifično vezuje za ciljano mesto u bilo kom genu.

B. Razdvajanje domena

[0098] Svaki pogodan domen razdvajanja se može operativno povezati sa bilo kojim DNK-vezujućim domenom (npr., ZFP, TALE, RNK vodič itd.) kako bi se formirala nukleaza ili sistem nukleaza. Na primer, ZFP, TALE, meganukleaza, RNK i drugi DNK-vezujući domeni fuzionisani su u za domene nukleaze kako bi se stvorile nukleaze - funkcionalni entitet koji je u stanju da prepozna željeni cilj nukleinske kiseline kroz sintetički DNK-vezujući domen i izazove da se DNK preseče na ili u blizini mesta vezivanja putem aktivnosti nukleaze.

Sintetičke nukleaze, uključujući cinkov prst nukleaze („ZFN“), TALEN, CRISPR/Cas sisteme nukleaze i homing endonukleaze, i sve koje su konstruisane specifično da se vezuju za ciljana DNK mesta, imaju mogućnost regulisanja eksprimiranja gena endogenih gena, i korisne su u genomskom inženjeringu i genskoj terapiji, uključujući inaktiviranje HIV receptora kao što su CCR5 i CXCR4. Pogledati, npr., SAD patente br.8,586,526; 6,534,261; 6,599,692;

6,503,717; 6,689,558; 7,067,317; 7,262,054; 7,888,121; 7,972,854; 7,914,796; 7,951,925; 8,110,379; 8,409,861; SAD publikacije patenata 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060063231; 20080159996; 201000218264; 20120017290; 20110265198; 20130137104; 20130122591; 20130177983 i 20130177960 i SAD prijavu br.14/278,903, čija su obelodanjenja

4

[0099] Kao što je gore navedeno, domen razdvajanja može biti heterologan DNK-vezujućem domenu, na primer cinkov prst DNK-vezujući domen i domen razdvajanja iz nukleaze ili TALEN DNK-vezujućeg domena i domen razdvajanja, ili meganukleaza DNK-vezujući domen i domen razdvajanja od druge nukleaze. Heterologni domeni razdvajanja mogu se dobiti iz bilo koje endonukleaze ili egzonukleaze. Primeri endonukleaza iz kojih se može dobiti domen razdvajanja uključuju, ali nisu ograničeni na, restrikcione endonukleaze i homing endonukleaze. Pogledati, na primer, 2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, MA; and Belfort i dr. (1997) Nucleic Acids Res.25:3379-3388. Poznati su dodatni enzimi koji razdvajaju DNK (npr., S1 Nukleaza; nukleaza zlatnog mungo pasulja; pankreasna DNaza I; mikrokokna nukleaza; endonukleaza kvasca HO; pogledati takođe Linn i dr. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993). Jedan ili više ovih enzima (ili njihovi funkcionalni fragmenti) mogu se koristiti kao izvor domena razdvajanja i polu-domena razdvajanja.

[0100] Slično tome, polu-domen razdvajanja se može izvesti iz bilo koje nukleaze ili njenog dela, kao što je izneto gore, za šta je potrebna dimerizacija za aktivnost razdvajanja.

Generalno, dva fuziona proteina su potrebna za razdvajanje ako fuzioni proteini sadrže poludomene razdvajanja. Alternativno, može se koristiti pojedinačni protein koji sadrži dva poludomena razdvajanja. Dva polu-domena razdvajanja mogu se izvesti iz iste endonukleaze (ili njenih funkcionalnih fragmenata), ili svaki polu-domen razdvajanja može biti izveden iz različite endonukleaze (ili njenih funkcionalnih fragmenata). Pored toga, ciljana mesta za dva fuziona proteina su poželjno postavljena, jedan u odnosu na drugi, tako da vezanje dva fuziona proteina na njihova ciljana mesta postavlja polu-domene razdvajanja u prostornu orijentaciju jedan prema drugom, što omogućava polu-domenima razdvajanja da formiraju funkcionalni domen razdvajanja, npr., dimerizacijom. Prema tome, u određenim slučajevima, bliže ivice ciljanih mesta su razdvojene sa 5-8 nukleotida ili 15-18 nukleotida. Međutim, bilo koji ceo broj nukleotida ili nukleotidnih parova može se naći između dva ciljana mesta (npr., od 2 do 50 nukleotidnih parova ili više). Uglavnom, mesto razdvajanja leži između ciljanih mesta.

[0101] Restrikcione endonukleaze (restrikcioni enzimi) prisutne su u mnogim vrstama i sposobne su za sekvencno-specifično vezivanje za DNK (na mestu prepoznavanja) i razdvajanje DNK na ili u blizini mesta vezivanja. Određeni restrikcioni enzimi (npr., Tip IIS) razdvajaju DNK na mestima koja su uklonjena sa mesta prepoznavanja i imaju razdvojive vezujuće domene i domene razdvajanja. Na primer, Fok I enzima Tip IIS katalizuje dvolančano razdvajanje DNK, na 9 nukleotida od svog mesta prepoznavanja na jednom lancu i 13 nukleotida od svog mesta prepoznavanja na drugom. Pogledati, na primer, SAD patente 5,356,802; 5,436,150 i 5,487,994; kao i Li i dr. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA89:4275-4279; Li i dr. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:2764-2768; Kim i dr. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA91:883-887; Kim i dr. (1994b) J. Biol. Chem.269:31,978-31,982. Prema tome, u jednom otelotvorenju, fuzioni proteini sadrže domen razdvajanja (ili polu-domen razdvajanja) iz najmanje jednog restriktivnog enzima tipa IIS i jednog ili više cinkov prst vezujućih domena, koji mogu ali ne moraju biti sintetički.

[0102] Fok I je primeran restrikcioni enzim Tipa IIS, čiji je domen razdvajanja razdvojiv od vezujućeg domena. Ovaj konkretni enzim je aktivan kao dimer. Bitinaite i dr. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10,570-10,575. Prema tome, za potrebe predmetnog obelodanjenja, deo Fok I enzima koji se koristi u obelodanjenim fuzionim proteinima smatra se poludomenom razdvajanja. Stoga, za ciljano dvolančano razdvajanje i/ili ciljanu zamenu ćelijskih sekvenci korišćenjem cinkov prsta-Fok I fuzija, dva fuziona proteina, od kojih svaki sadrži Fok I polu-domen razdvajanja, mogu se koristiti za rekonstituciju katalitički aktivnog domena razdvajanja. Alternativno, takođe se može koristiti jedan molekul polipeptida koji sadrži DNK-vezujući domen i dva Fok I polu-domena razdvajanja.

[0103] Domen razdvajanja ili polu-domen razdvajanja mogu biti bilo koji deo proteina koji zadržava aktivnost razdvajanja ili zadržava sposobnost multimerizacije (npr., dimerizacije) kako bi se formirao funkcionalni domen razdvajanja.

[0104] Primeri restrikcionih enzima tipa IIS opisani su u međunarodnoj publikaciji WO 07/014275. Dodatni restrikcioni enzimi takođe sadrže razdvojive vezujuće domene i domene razdvajanja, i oni su razmatrani u predmetnom obelodanjenju. Pogledati, na primer, Roberts i dr. (2003) Nucleic Acids Res.31:418-420.

[0105] U nekim otelotvorenjima, domen razdvajanja sadrži jedan ili više sintetičkih poludomena razdvajanja (koji se takođe nazivaju mutanti domena dimerizacije) koji minimizuju ili sprečavaju homodimerizaciju, kao što je opisano, na primer, u SAD patentima br.7,888,121; 7,914,796; 8,034,598 i 8,823,618. Ostaci aminokiselina na položajima 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537 i 538 od Fok I su svi ciljevi za uticaj na dimerizaciju Fok I polu-domena razdvajanja.

[0106] Primerni sintetički polu-domeni razdvajanja od Fok I koji formiraju obligatorne heterodimere uključuje par u kom prvi polu-domen razdvajanja uključuje mutacije na aminokiselinskim ostacima na položajima 490 i 538 od Fok I, dok drugi polu-domen razdvajanja obuhvata mutacije na aminokiselinskim ostacima 486 i 499.

[0107] Stoga, u jednom otelotvorenju mutacija na 490 zamenjuje Glu (E) sa Lys (K); mutacija na 538 zamenjuje Iso (I) sa Lys (K); mutacija na 486 zamenjuje je Gln (Q) sa Glu (E); i mutacija na položaju 499 zamenjuje Iso (I) sa Lys (K). Specifično, ovde opisani sintetički polu-domeni razdvajanja su pripremljeni mutiranjem položaja 490 (E→K) i 538 (I→K) u jednom polu-domenu razdvajanja kako bi se proizveo sintetički polu-domen razdvajanja označen sa „E490K:I538K“ i mutiranjem položaja 486 (Q→E) i 499 (I→L) u drugom poludomenu razdvajanja, kako bi se proizveo sintetički polu-domen razdvajanja označen kao „Q486E:I499L“. Ovde opisani sintetički polu-domeni razdvajanja su obligatorni heterodimerni mutanti kod kojih je aberantno razdvajanje minimizovano ili ukinuto. Pogledati npr. SAD patent br.7,914,796.

[0108] U nekim otelotvorenjima, sintetički polu-domen razdvajanja sadrži mutacije na položajima 486, 499 i 496 (numerisane u odnosu na FokI divljeg tipa), na primer mutacije koje zamenjuju divlji tip Gln (Q) ostatka na položaju 486 sa Glu (E) ostatkom, divlji tip Iso (I) ostatka na položaju 499 sa Leu (L) ostatkom i divlji tip Asn (N) ostatka na položaju 496 sa Asp (D) ili Glu (E) ostatkom (takođe se nazivaju „ELD“ i „ELE“ domeni, respektivno). U drugim otelotvorenjima, sintetički polu-domen razdvajanja sadrži mutacije na položajima 490, 538 i 537 (numerisane u odnosu na FokI divljeg tipa), na primer mutacije koje zamenjuju divlji tip Glu (E) ostatka na položaju 490 sa Lys (K) ostatkom, divlji tip Iso (I) ostatka na položaju 538 sa Lys (K) ostatkom, i divlji tip His (H) ostatka na položaju 537 sa Lys (K) ostatkom ili Arg (R) ostatkom (takođe se nazivaju „KKK“ i „KKR“ domeni, respektivno). U drugim otelotvorenjima, sintetički polu-domen razdvajanja sadrži mutacije na položajima 490 i 537 (numerisane u odnosu na FokI divljeg tipa), na primer mutacije koje zamenjuju divlji tip Glu (E) ostatka na položaju 490 sa Lys (K) ostatkom i divlji tip His (H) ostatka na položaju 537 sa Lys (K) ostatkom ili Arg (R) ostatkom (takođe se nazivaju i „KIK“ i „KIR“ domeni, respektivno). (Pogledati US Patent br.8,623,618). Ovde opisani sintetički polu-domeni razdvajanja mogu se pripremiti bilo kojim pogodnim postupkom, na primer, mutagenezom usmerenom na mesto divljeg tipa polu-domena razdvajanja (Fok I) kao što je opisano u SAD patentima br. SAD patentima br.7,888,121; 7,914,796; 8,034,598 i 8,823,618.

[0109] Alternativno, nukleaze se mogu sastaviti in vivo na ciljanom mestu nukleinske kiseline pomoću takozvane tehnologije„razdvojnih enzim“ (pogledati npr. SAD publikacija patenata br. 20090068164). Komponente takvih razdvojnih enzima mogu se eksprimirati ili na odvojenim konstruktima eksprimiranja, ili se mogu povezati u jednom otvorenom okviru za čitanje, gde su pojedinačne komponente razdvojene, na primer, samo-razdvajajućim 2A peptidom ili IRES sekvencama. Komponente mogu biti pojedinačni cinkov prst vezujući domeni ili domeni vezujućeg domena meganukleaze nukleinske kiseline.

[0110] Nukleazama se može ispitati aktivnost pre upotrebe, na primer u hromozomnom sistemu zasnovanom na kvascu, kao što je opisano u WO 2009/042163 i 20090068164.

Konstrukti eksprimiranja nukleaze mogu se lako dizajnirati koristeći postupci poznate u struci. Pogledati, npr., Publikacije američkih patenata 20030232410; 20050208489;

20050026157; 20050064474; 20060188987; 20060063231; i Međunarodna publikacija WO 07/014275. Eksprimiranje nukleaze može biti pod kontrolom konstitutivnog promotera ili inducibilnog promotera, na primer promotera galaktokinaze koji se aktivira (de-potiskuje) u prisustvu rafinoze i/ili galaktoze i potiskuje u prisustvu glukoze.

Ciljana mesta

[0111] Kao što je detaljno opisano iznad, DNK-vezujući domeni mogu se konstruisati tako da se vezuju za bilo koju izabranu sekvencu u lokusu, na primer globin gen ili sigurna luka gen. Sintetički DNK-vezujući domen može imati novu specifičnost vezivanja, u poređenju sa DNK-vezujućim domenom u prirodi. Postupci inženjering uključuju, ali nisu ograničeni na, racionalni dizajn i razne vrste odabira. Racionalni dizajn uključuje, na primer, upotrebu baza podataka koje sadrže triplet (ili kvadriplet) nukleotidne sekvence i pojedinačne (npr. cinkov prst) aminokiselinske sekvence, u kojima je svaka triplet ili kvadriplet nukleotidna sekvenca povezan sa jednom ili više aminokiselinskih sekvenci DNK vezujućeg domena koje vezuju određenu triplet ili kvadriplet sekvencu. Pogledati, na primer, suvlasničke SAD patente 6,453,242 i 6,534,261. Racionalni dizajn TAL-efektora domena se takođe može izvesti. Pogledati npr. SAD publikacija patenata br.20110301073.

[0112] Primeri postupaka odabira primenjivi na DNK-vezujuće domene, uključujući prikaz faga i dvo-hibridne sisteme, obelodanjeni su u US patentima 5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,410,248; 6,140,466; 6,200,759; i 6,242,568; kao i WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 i GB 2,338,237.

[0113] Izbor ciljanih mesta; nukleaze i postupci za dizajniranje i konstrukciju fuzionih proteina (i polinukleotidi koji ih kodiraju) poznati su stručnjacima i detaljno su opisani u SAD patentnim prijavama br.20050064474 i 20060188987.

[0114] Pored toga, kao što je obelodanjeno ovde i u drugim referencama, DNK-vezujući domeni (npr., višestruki cinkov prst proteini) mogu se povezati koristeći bilo koje odgovarajuće vezničke sekvence, uključujući, na primer, veznike od 5 ili više aminokiselina. Pogledati npr. SAD patente br.6,479,626; 6,903,185; i 7,153,949 za primerne vezničke sekvence dužine 6 ili više aminokiselina. Ovde opisani proteini mogu da uključuju bilo koju kombinaciju pogodnih veznika od pojedinih DNK-vezujućih domena proteina. Takođe pogledati, SAD publikacija patenata br.20110287512.

Donori

[0115] Kao što je gore napomenuto, umetanje egzogene sekvence (koja se takođe naziva „donorska sekvenca“ ili „donor“ ili „transgen“), na primer za korigovanje mutantnog gena ili za pojačano eksprimiranje gena divljeg tipa. Biće očigledno da donorska sekvenca obično nije identična sekvenci genoma gde je smeštena. Donorska sekvenca može da sadrži nehomolognu sekvencu okruženu sa dva regioni homologije kako bi se omogućio efikasan HDR na lokaciji od interesa. Pored toga, donorske sekvence mogu da sadrže vektorski molekul koji sadrži sekvence koje nisu homologne regionu od interesa za ćelijski hromatin. Donorski molekul može da sadrži nekoliko diskontinuiranih regiona homologije za ćelijski hromatin. Na primer, za ciljano umetanje sekvenci koje inače nisu prisutne u regionu od interesa, navedene sekvence mogu biti prisutne u donorskom molekulu nukleinske kiseline i povezane sa homolognim regionima za sekvencu u regionu od interesa.

[0116] Ovde su opisani postupci ciljanog umetanja bilo kog polinukleotida za umetanje u odabrano mesto. Polinukleotidi za umetanje mogu se takođe nazvati „egzogenim“ polinukleotidima, „donorskim“ polinukleotidima ili molekulima ili „transgenima“. Donorski polinukleotid može biti DNK ili RNK, jednolančani i/ili dvolančani i može se uvesti u ćeliju u linearnom ili kružnom obliku. Pogledati npr. SAD patentne publikaciju br.20100047805, 20110281361, 20110207221 i SAD prijavu br.13/889,162. Donorske sekvence mogu biti sadržane u DNK MC, koji se može uvesti u ćeliju u kružnom ili linearnom obliku. Ako se uvede u linearnom obliku, krajevi donorske sekvence se mogu zaštititi (npr. od egzonukleolitičke razgradnje) postupcima poznatim stručnjacima. Na primer, jedan ili više didezoksinukleotidnih ostataka se dodaju na 3' kraj linearnog molekula i/ili se samokomplementarni oligonukleotidi ligiraju na jedan ili oba kraja. Pogledati, na primer, Chang i dr. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4959-4963; Nehls i dr. (1996) Science 272:886-889. Dodatni postupci za zaštitu egzogenih polinukleotida od razgradnje uključuju, ali nisu ograničeni na, dodavanje terminalne amino grupe (grupe) i upotrebu modifikovanih internukleotidnih veza kao što su, na primer, fosforotioati, fosforamidati i ostaci O-metil riboze ili deoksiriboze. Ako se uvede u dvolančani oblik, donor može obuhvatati jedno ili više ciljanih mesta nukleaze, na primer, ciljana mesta nukleaze koja okružuju transgene radi integrisanja u genom ćelije. Pogledati npr. SAD publikaciju patenata br.20130326645.

[0117] Polinukleotid se može uvesti u ćeliju kao deo vektorskog molekula koji ima dodatne sekvence, kao što su, na primer, poreklo replikacije, promoteri i geni koji kodiraju rezistenciju na antibiotike. Pored toga, donorski polinukleotidi mogu se uvesti kao gola nukleinska kiselina, kao nukleinska kiselina kompleksirana sa agensom kao što su lipozom ili poloksamer, ili se mogu isporučiti virusima (npr., adenovirus, AAV, herpesvirus, retrovirus, lentivirus i lentivirus sa defektnom integrazom (IDLV). Pogodni nevirusni vektori uključuju nanotaksične vektore, uključujući vektore komercijalno dostupne od InCellArt (Francuska).

[0118] Dvolančani donor može uključivati sekvence (npr. kodirajuće sekvence, koje se takođe nazivaju transgeni) dužine veće od 1 kb, na primer između 2 i 200 kb, između 2 i 10 kb (ili bilo koja vrednost između). Dvolančani donor takođe uključuje najmanje jedno ciljano mesta nukleaze, npr. donor može da sadrži najmanje 1 ciljano mesto, na primer, za upotrebu sa CRISPR/Cas, ili 2 ciljana mesta, na primer za ZFN ili TALEN par. Tipično, ciljana mesta nukleaze su izvan transgenih sekvenci, na primer, 5' i/ili 3' transgenih sekvenci, radi razdvajanja transgena. Mesto razdvajanja nukleaza može biti za bilo koju nukleazu. Ciljano mesta nukleaze koje se nalazi u dvolančanom donoru može biti za iste nukleaze koje se koriste za razdvajanje endogenog cilja u kom je razdvojeni donor integrisan postupcima nezavisnim od homologije.

[0119] Donor je obično ubačen tako da njegovo eksprimiranje pokreće endogeni promoter na

4

mestu integracije, tačnije promoter koji pokreće eksprimiranje endogenog gena u koji je donor ubačen (npr., globin, AAVS1 itd.). Međutim, biće očigledno da donor može sadržati promoter i/ili pojačivač, na primer konstitutivni promoter ili inducibilni ili tkivno-specifični promoter.

[0120] Molekularni donor može biti ubačen u endogeni gen tako da se eksprimiraju svi, neki ili nijedan od endogenih gena. Na primer, transgen kakav je ovde opisan može biti ubačen u globin lokus tako da se neke ili nijedna endogena sekvenca globina ne eksprimiraju, na primer kao fuzija sa transgenom. U drugim aspektima, transgen (npr., sa ili bez globin kodirajućih sekvenci) integrisan je u bilo koji endogeni lokus, na primer sigurna luka lokus. Pogledati, npr., US publikacije patenata 20080299580; 20080159996 i 201000218264.

[0121] Kada su dodatne (npr., sekvence globina, endogene ili deo transgena) eksprimirane sa transgenom, dodatne sekvence (npr., globina) mogu biti sekvence pune dužine (divlji tip ili mutant) ili delimične sekvence. Poželjno, dodatne sekvence su funkcionalne.

Neograničavajući primeri funkcije ovih dodatnih sekvenci punih dužina ili delimičnih dodatnih sekvenci, na primer sekvenci koje kodiraju globin, uključuju povećanje poluživota u serumu polpeptida eksprimiranog od strane transgenom (npr., terapeutskog gen) i/ili koji deluje kao nosilac.

[0122] Dalje, iako nisu potrebne za eksprimiranje, egzogene sekvence mogu takođe obuhvatati transkripcione ili translacione regulatorne sekvence, na primer, promotere, pojačivače, izolatore, unutrašnja mesta ulaska ribozoma, sekvence koje kodiraju 2A peptide i/ili signale poliadenilacije.

[0123] Ovde opisani transgeni nošeni na donorskim sekvencama mogu biti izolovani iz plazmida, ćelija ili drugih izvora korišćenjem standardnih tehnika poznatih u struci, kao što je PCR. Donori za upotrebu mogu da sadrže različite tipove topologije, uključujući kružnu superzamotanu, kružnu opuštenu, linearnu i slično. Alternativno, oni se mogu hemijski sintetisati korišćenjem standardnih tehnika sinteze oligonukleotida. Pored toga, donori mogu biti metilirani ili im nedostaje metilacija. Donori mogu biti u obliku veštačkih hromozoma bakterije ili kvasca (BAC ili IAC).

[0124] Ovde opisani dvolančani donorski polinukleotidi mogu da sadrže jednu ili više neprirodnih baza i/ili kičmi. Naročito, umetanje donorskog molekula sa metiliranim citozinima može se izvesti korišćenjem ovde opisanih postupaka kako bi se postiglo stanje transkripcione mirnoće u regionu od interesa.

[0125] Egzogeni polinukleotid (donor) može da sadrži bilo koju sekvencu od interesa (egzogena sekvenca). Primeri egzogenih sekvenci uključuju, ali nisu ograničeni na bilo koju sekvencu za kodiranje polipeptida (npr., cDNK), promoterske sekvence, pojačivačke sekvence, epitopske oznake, marker gene, mesta prepoznavanja razdvajanja enzima i različite vrste konstrukata eksprimiranja. Marker geni uključuju, ali nisu ograničeni na, sekvence koje kodiraju proteine koji posreduju rezistenciju na antibiotike (npr., rezistencija na ampicilin, rezistencija na neomicin, G418 rezistencija, rezistencija na puromicin), sekvence koje kodiraju obojene ili fluorescentne ili luminescentne proteine (npr., zeleni fluorescentni protein, pojačani zeleni fluorescentni protein, crveni fluorescentni protein, luciferaza) i proteine koji posreduju kod pojačanog ćelijskog rasta i/ili amplifikacije gena (npr., dihidrofolat reduktaza). Oznake epitopa uključuju, na primer, jednu ili više FLAG kopija, His, myc, Tap, HA ili bilo koje aminokiselinska sekvenca koje se može detektovati.

[0126] U poželjnim aspektima, egzogena sekvenca (transgen) sadrži polinukleotid koji kodira bilo koji polipeptid čija eksprimiranje u ćeliji je poželjno, uključujući, ali ne ograničavajući se na antitela, antigene, enzime, receptore (na površini ćelije ili u jedru), hormone, limfokine, citokine, reporterske polipeptide, faktore rasta i funkcionalne fragmenti bilo čega od gore navedenog. Kodirajuće sekvence mogu biti, na primer, cDNK.

[0127] U određenim aspektima, egzogene sekvence mogu da sadrže marker gen (opisan iznad), što omogućava odabir ćelija koje su podvrgnute ciljanoj integraciji, i povezanu sekvencu koja kodira dodatnu funkcionalnost. Neograničavajući primeri marker gena uključuju GFP, marker izbora lekova i slično.

[0128] Dodatne genske sekvence koje se mogu umetnuti mogu obuhvatati, na primer, divlje tipove gena koji će zameniti mutirane sekvence. Na primer, genska sekvenca beta globina divljeg tipa može biti umetnuta u genom matične ćelije u kojoj je mutirana endogena kopija gena. Kopija divljeg tipa može se umetnuti u endogeni lokus, ili može alternativno da bude ciljana na sigurna luka lokuse.

[0129] konstrukt takvih kaseta eksprimiranja, u skladu sa saznanjima ove specifikacije, koristi metodologije dobro poznate u oblasti molekularne biologije (pogledati, na primer, Ausubel ili Maniatis). Pre upotrebe kasete eksprimiranja za generisanje transgenih životinja, odzivnost kasete eksprimiranja na induktor stresa povezan sa odabranim kontrolnim elementima može se testirati uvođenjem kasete eksprimiranja u odgovarajuću ćelijsku liniju (npr., primarne ćelije, transformisane ćelije ili imortalizovane ćelijske linije).

[0130] Pored toga, iako nisu potrebne za eksprimiranje, egzogene sekvence mogu takođe biti transkripcione ili translacione regulatorne sekvence, na primer, promoteri, pojačivači, izolatori, unutrašnja mesta ulaska ribozoma, sekvence koje kodiraju 2A peptide i/ili signali poliadenilaciji. Dalje, kontrolni elementi gena od interesa mogu se operativno povezati sa reporterskim genima kako bi se stvorili himerni geni (npr., reporterske kasete eksprimiranja).

[0131] Može se postići i ciljano umetanje nekodirajuće sekvence nukleinskih kiselina.

Sekvence koje kodiraju antisens RNK, RNKi, shRNK i mikro RNK (miRNK) se takođe mogu koristiti za ciljano umetanje.

[0132] Nukleinska kiselina donora može sadržati nekodirajuće sekvence koje su specifična ciljana mesta za dodatne dizajne nukleaze. Nakon toga, dodatne nukleaze se mogu eksprimirati u ćelijama tako da se originalni donorski molekul razdvaja i modifikuje umetanjem drugog donorskog molekula od interesa. Na taj način mogu se generisati ponovne integracije molekula donora, što omogućava slaganje osobina na određenom lokusu od interesa ili na sigurna luka lokusu.

Isporuka

[0133] Nukleaze, polinukleotidi koji kodiraju ove nukleaze, donorski polinukleotidi i sastavi koji sadrže ovde opisane proteine i/ili polinukleotide mogu se isporučiti in vivo ili ex vivo na bilo koji pogodan način.

[0134] Postupci za isporuku nukleaza kakvi su opisani ovde, opisani su, na primer, u SAD patentima br.6,453,242; 6,503,717; 6,534,261; 6,599,692; 6,607,882; 6,689,558; 6,824,978; 6,933,113; 6,979,539; 7,013,219; i 7,163,824.

[0135] Nukleaze i/ili donorski konstrukti, kako je ovde opisano, takođe se mogu isporučiti pomoću vektora koji sadrže sekvence koje kodiraju jedan ili više cinkov prst ili TALEN

4

proteina. Može se koristiti bilo koji vektorski sistem uključujući, ali bez ograničenja na, plazmidne vektore, retrovirusne vektore, lentivirusne vektore, adenovirusne vektore, poksvirusne vektore; herpesvirusni vektori i adeno-pridružene virusne vektori itd. Takođe pogledati, SAD patente br.6,534,261; 6,607,882; 6,824,978; 6,933,113; 6,979,539;

7,013,219; i 7,163,824. Dalje, biće očigledno da bilo koji od ovih vektora može sadržati jednu ili više sekvenci potrebnih za tretman. Prema tome, kada se jedna ili više nukleaza i donorski konstrukt unesu u ćeliju, nukleaze i/ili donorski polinukleotid mogu se preneti na istom vektoru ili na različitim vektorima. Kada se koristi više vektora, svaki vektor može sadržati sekvencu koja kodira jednu ili više nukleaza i/ili donorskih konstrukata.

[0136] Konvencionalni virusni i nevirusni postupci prenosa gena mogu se koristiti za uvođenje nukleinskih kiselina koje kodiraju nukleaze i donorske konstrukte u ćelijama (npr., sisarskim ćelijama) i ciljanim tkivima. Nevirusni sistemi za isporuku vektora uključuju DNK plazmide, golu nukleinsku kiselinu i nukleinsku kiselinu kompleksiranu sa nosačem za isporuku, poput lipozoma ili poloksamera. Sistemi za isporuku virusnih vektora uključuju DNK i RNK viruse, koji nakon isporuke u ćeliju imaju ili epizomske ili integrisane genome. Za pregled postupaka genske terapije pogledati Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada i dr., u Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler i Böhm (eds.) (1995); and Yu i dr., Gene Therapy 1:13-26 (1994).

[0137] Postupci nevirusne isporuke nukleinskih kiselina uključuju elektroporaciju, lipofekciju, mikroinjekciju, biolistiku, virozome, lipozome, imunolipozome, polikaciju ili lipid:nukleinska kiselina konjugate, golu DNK, veštačke virione i agensom-poboljšan unos DNK. Sonoporacija koristeći npr., Sonitron 2000 sistem (Rich-Mar) takođe se može koristiti za isporuku nukleinskih kiselina.

[0138] Dodatni primerni sistemi za isporuku nukleinskih kiselina uključuju one pružene od strane Amaxa Biosystems (Keln, Nemačka), Maxcyte, Inc. (Rokvil, Merilend), BTX Molecular Delivery Systems (Holiston, MA) i Copernicus Therapeutics Inc., (pogledati na primer US6008336). Lipofekcija je opisana u npr., SAD patentima br.5,049,386; 4,946,787; i 4,897,355) i lipofekcijski reagensi se komercijalno prodaju (npr., Transfectam™ i Lipofectin™). Katjonski i neutralni lipidi koji su pogodni za efikasnu lipofekciju prepoznavanja receptora polinukleotida uključuju one od Felgner, WO 91/17424, WO 91/16024.

[0139] Dobijanje lipidnih kompleksa: nukleinske kiseline, uključujući ciljane lipozome kao što su imunolipidni kompleksi, dobro su poznate stručnjacima u oblasti (pogledati npr.

Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese i dr., Cancer Gene Ther.2:291-297 (1995); Behr i dr., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy i dr., Bioconjugate Chem.5:647-654 (1994); Gao i dr., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad i dr., Cancer Res.52:4817-4820 (1992); SAD patente br.4,186,183, 4,217,344, 4,235,871, 4,261,975, 4,485,054, 4,501,728, 4,774,085, 4,837,028, i 4,946,787).

[0140] Dodatni načini isporuke uključuju upotrebu pakovanja nukleinskih kiselina koje će se isporučiti u EnGeneIC nosačima za isporuku (EDV). Ovi EDV se posebno isporučuju ciljanim tkivima koristeći bispecifična antitela gde jedan krak antitela ima specifičnost za ciljano tkivo, dok drugo ima specifičnost za EDV. Antitelo dovodi EDV na površinu ciljane ćelije, i zatim se EDV putem endocitoze unosi u ćeliju. Jednom kada uđe u ćeliju, sadržaj se oslobađa (pogledati MacDiarmid i dr (2009) Nature Biotechnology 27(7):643).

[0141] Upotreba RNK ili DNK sistema baziranih na virusu za isporuku nukleinskih kiselina koje kodiraju sintetičke ZFP koristi visoko evoluirane procese za usmeravanje virusa na specifične ćelije u telu i transport virusa do jedra. Virusni vektori se mogu primenjivati direktno pacijentima (in vivo) ili se mogu koristiti za tretman ćelija in vitro, i zatim se modifikovane ćelije primenjuju pacijentima (ex vivo). Konvencionalni virusni sistemi za isporuku ZFP uključuju, ali nisu ograničeni na, retrovirusne, lentivirusne, adenovirusnne, adeno-povezane, vakcinijine i herpes simpleks virusne vektora za prenos gena. Integracija u genom domaćina moguća je pomoću retrovirusnih, lentivirusnih i adeno-povezanih postupaka prenosa gena virusa, što često rezultuje dugoročnim eksprimiranjem umetnutog transgena. Pored toga, primećena je visoka efikasnost transdukcije u mnogim različitim ćelijskim tipovima i ciljanim tkivima.

[0142] Tropizam retrovirusa može se izmeniti uključivanjem stranih proteina omotača, što proširuje potencijalnu ciljanu populaciju ciljanih ćelija. Lentivirusni vektori su retrovirusni

4

vektori koji su u stanju da transdukuju ili inficiraju ćelije koje ne dele i obično proizvode visoke titre virusa. Odabir retrovirusnog sistema za prenos gena zavisi od ciljanog tkiva.

Retrovirusni vektori se sastoje od cis-delujućih dugih terminalnih ponavljanja sa kapacitetom pakovanja za do 6-10 kb stranih sekvence. Minimum cis-delujućih LTR je dovoljno za replikaciju i pakovanje vektora, koji se zatim koriste za integrisanje terapeutskog gena u ciljanoj ćeliji kako bi se pružilo trajno eksprimiranje transgena. Široko korišteni retrovirusni vektori uključuju one koji se zasnivaju na mišjem virusu leukemije (MuLV), majmunskom virusu leukemije (GaLV), simijanskom virusu imunodeficijencije (SIV), humanom virusu imunodeficijencije (HIV) i njihovim kombinacijama (pogledati npr. Buchscher i dr., J. Virol.

66:2731-2739 (1992); Johann i dr., J. Virol.66:1635-1640 (1992); Sommerfelt i dr., Virol. 176:58-59 (1990); Wilson i dr., J. Virol.63:2374-2378 (1989); Miller i dr., J. Virol.65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700).

[0143] U primenama u kojima je poželjno prolazno eksprimiranje mogu se koristiti adenovirusni sistemi. Vektori zasnovani na adenovirusu su sposobni da postignu veoma visoku transdukcionu efikasnost u mnogim tipovima ćelija, i ne zahtevaju deljenje ćelija. Sa takvim vektorima dobijeni su visoki titar i visoki nivo eksprimiranja. Ovaj vektor se može proizvesti u velikim količinama u relativno jednostavnom sistemu. Adeno-povezani virusni („AAV“) vektori se takođe koriste za transdukovanje ćelija ciljanim nukleinskim kiselinama, npr., u in vitro proizvodnja nukleinskih kiselina i peptida, i za in vivo i ex vivo procedure genske terapije (pogledati npr. West i dr., Virology 160:38-47 (1987); U.S. Patent No.

4,797,368; WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994). konstrukt rekombinantnih AAV vektora opisana je u velikom broju publikacija, uključujući SAD patent br.5,173,414; Tratschin i dr., Mol. Cell. Biol.5:3251-3260 (1985); Tratschin, i dr., Mol. Cell. Biol.4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); i Samulski i dr., J. Virol.63:03822-3828 (1989).

[0144] Najmanje šest pristupa virusnim vektorima trenutno je dostupno za prenos gena u kliničkim ispitivanjima, koji koriste pristupe koji uključuju komplementaciju defikasnih vektora genima ubačenih u pomoćne ćelijske linije kako bi se generisao transducioni agens.

[0145] pLASN i MFG-S su primeri retrovirusnih vektora koji su korišćeni u kliničkim ispitivanjima (Dunbar i dr., Blood 85:3048-305 (1995); Kohn i dr., Nat. Med.1:1017-102 (1995); Malech i dr., PNAS 94:2212133-12138 (1997)). PA317/pLASN je bio prvi

4

terapeutski vektor korišćen u ispitivanju genske terapije. (Blaese i dr., Science 270:475-480 (1995)). Primećena je efikasnost transdukcije od 50% ili više kod vektora sa MFG-S pakovanjem. (Ellem i dr., Immunol Immunother. 44(1):10-20 (1997); Dranoff i dr., Hum. Gene Ther.1:111-2 (1997).

[0146] Rekombinantni adeno-povezani virusni vektori (rAAV) su obećavajući alternativni sistemi za isporuku gena zasnovani na defikasnom i nepatogenom parvovirusu, adenopovezanom virusu tipa 2. Svi vektori izvedeni su iz plazmida koji zadržava samo invertovana terminačna ponavljanja AAV 145 baznog para koja okružuju kasetu za eksprimiranje transgena. Efikasan prenos gena i stabilna isporuka transgena zahvaljujući integraciji u genome transdukovane ćelije ključne su karakteristike ovog vektorskog sistema. (Wagner i dr., Lancet 351:91171702-3 (1998), Kearns i dr., Gene Ther.9:748-55 (1996)). Ostali AAV serotipi, uključujući AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9 i AAVrh10, i sve njihove varijante, takođe se mogu koristiti u skladu sa ovim pronalaskom.

[0147] Rekombinantni adenovirusni vektori (Ad) sa nedostatkom replikacije mogu se proizvesti sa visokim titrom i lako inficirati više različitih tipova ćelija. Većina adenovirusnih vektora konstruisana je tako da transgen zamenjuje Ad E1a, E1b i/ili E3 gene; potom se u ljudskim 293 ćelijama propagira replikacioni defektni vektor, koji pruža izbrisanu funkciju gena u trans. Ad vektori mogu transdukovati više vrsta tkiva in vivo, uključujući diferencirane ćelije koje se ne dele, poput onih koje se nalaze u jetri, bubrezima i mišićima. Konvencionalni Ad vektori imaju veliku nosivost. Primer upotrebe Ad vektora u kliničkom ispitivanju uključivao je polinukleotidnu terapiju za antitumorsku imunizaciju intramuskularnom injekcijom (Sterman i dr., Hum. Gene Ther.7:1083-9 (1998)). Dodatni primeri upotrebe adenovirusnih vektora za prenos gena u kliničkim ispitivanjima uključuju Rosenecker i dr., Infection 24:15-10 (1996); Sterman i dr., Hum. Gene Ther.9:7 1083-1089 (1998); Welsh i dr., Hum. Gene Ther.2:205-18 (1995); Alvarez i dr., Hum. Gene Ther. 5:597-613 (1997); Topf i dr., Gene Ther.5:507-513 (1998); Sterman i dr., Hum. Gene Ther.7:1083-1089 (1998).

[0148] Ćelije za pakovanje koriste se za formiranje virusnih čestica koje su sposobne da inficiraju ćeliju domaćina. Takve ćelije uključuju 293 ćelije, koje pakuju adenovirus i ψ2 ćelije ili PA317 ćelije, koje pakuju retrovirus. Virusni vektori koji se koriste u genskoj terapiji se obično generišu proizvodnom ćelijskom linijom koja pakuje vektor nukleinske kiseline u

4

virusnu česticu. Vektori obično sadrže minimalne virusne sekvence potrebne za pakovanje i naknadnu integraciju u domaćina (ako je primenljivo), gde se druge virusne sekvence zamenjuju kasetom eksprimiranja koja kodira protein koji treba da se eksprimira. Nedostajuće virusne funkcije su pružene u trans pomoću ćelijske linije za pakovanje. Na primer, AAV vektori koji se koriste u genskoj terapiji obično poseduju samo sekvence obrnutog terminalnog ponavljanja (ITR) iz AAV genoma, koje su potrebni za pakovanje i integraciju u genom domaćina. Virusna DNK je upakovana u ćelijsku liniju, koja sadrži pomoćni plazmid koji kodira ostale AAV gene, odnosno rep i kapa, ali joj nedostaju ITR sekvence. Ćelijska linija je takođe zaražena adenovirusom kao pomagačem. Virus pomagač promoviše replikaciju AAV vektora i eksprimiranje AAV gena iz plazmida pomagača. Plazmid pomagač nije supakovan u značajnim količinama zbog nedostatka ITR sekvence. Kontaminacija adenovirusom može se smanjiti, npr., termičkom obradom na koju je adenovirus osetljiviji od AAV.

[0149] U mnogim primenama za gensku terapiju poželjno je da se vektor genske terapije isporučuje sa visokim stepenom specifičnosti za određeni tip tkiva. Prema tome, virusni vektor se može modifikovati tako da ima specifičnost za određeni tip ćelije eksprimiranjem liganda kao fuzionog proteina sa virusnim omotačem na spoljnoj površini virusa. Ligand je izabran da ima afinitet za receptor za koji se zna da postoji na ćelijskom tipu od interesa. Na primer, Han i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9747-9751 (1995) su saopštili da se Moloney virus mišje leukemije može modifikovati tako da eksprimira ljudski heregulin fuzionisan za gp70, i rekombinantni virus inficira određene ćelije raka dojke kod ljudi koje eksprimiraju receptor ljudskog epidermalnog faktora rasta. Ovaj princip se može proširiti i na druge virusciljana ćelija parove, u kojima ciljana ćelija eksprimira receptor, i virus eksprimira fuzioni protein koji sadrži ligand za receptor ćelijske površine. Na primer, filamentozni fag može biti konstruisan da prikazuje fragmente antitela (npr., FAB ili Fv) koji imaju specifični afinitet vezivanja za praktično bilo koji izabrani ćelijski receptor. Iako se gore navedeni opis odnosi prvenstveno na virusne vektore, isti principi se mogu primeniti i na nevirusne vektore. Takvi vektori mogu da se konstruišu tako da sadrže određene sekvence unosa koje pogoduju unosu specifičnih ciljanih ćelija.

[0150] Vektori genske terapije se mogu isporučiti in vivo primenom pojedinačnom pacijentu, obično sistemskom administracijom (npr., intravenska, intraperitonealna, intramuskularna, subdermalna ili intrakranijalna infuzija) ili lokalnom primenom, kao što je opisano u daljem

4

tekstu. Alternativno, vektori se mogu isporučiti ćelijama ex vivo, kao što su ćelije ekstrahovane iz pojedinačnog pacijenta (npr., limfociti, aspirati koštane srži, biopsija tkiva) ili univerzalne donorske matične ćelije hematopoeze, nakon čega sledi reimplantacija ćelija kod pacijenta, obično nakon odabira za ćelije u koje je ugrađen vektor.

[0151] Vektori (npr., retrovirusi, adenovirusi, lipozomi itd.) koji sadrže nukleaze i/ili donorske konstrukte takođe se mogu primeniti direktno u organizam za transdukciju ćelija in vivo. Alternativno, može se primeniti gola DNK. Primena je bilo kojim načinom koji se obično koristi za uvođenje molekula u krajnji dodir sa ćelijama krvi ili tkiva, uključujući, ali ne ograničavajući se na, injekciju, infuziju, lokalnu primenu i elektroporaciju. Pogodni postupci primene takvih nukleinskih kiselina su dostupni i dobro su poznati stručnjacima, i, iako se za primenu određenog sastava može koristiti više od jednog puta, određeni put često može pružiti neposredniju i efikasniju reakciju od druga ruta.

[0152] Vektori pogodni za unošenje polinukleotida koji su ovde opisani uključuju neintetegrišuće lentivirusne vektore (IDLV). Pogledati, na primer, Ory i dr. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA93:11382-11388; Dull i dr. (1998) J. Virol.72:8463-8471; Zuffery i dr.

(1998) J. Virol.72:9873-9880; Follenzi i dr. (2000) Nature Genetics 25:217-222; SAD patentnu publikaciju No 20090117617.

[0153] Farmaceutski prihvatljivi nosači su delom određeni specifičnim sastavom koji se primenjuje, kao i posebnim postupkom koji se koristi za primenu smeše. Shodno tome, postoji širok izbor pogodnih formulacija farmaceutskih sastava, kao što je opisano u daljem tekstu (pogledati, npr., Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989).

[0154] Očigledno je da sekvence kodiranja nukleaza i donorski konstrukti mogu isporučiti pomoću istih ili različitih sistema. Na primer, donorski polinukleotid može da nosi plazmid, dok AAV vektor može da nosi jednu ili više nukleaza. Pored toga, različiti vektori se mogu primenjivati istim ili različitim putevima (intramuskularna injekcija, injekcija u repnu venu, druga intravenska injekcija, intraperitonealna primena i/ili intramuskularna injekcija. Vektori se mogu isporučiti istovremeno ili bilo kojim redosledom.

[0155] Dakle, predmetno obelodanjenje uključuje in vivo ili ex vivo tretman bolesti i stanja koja su podložna umetanju transgena koji kodiraju terapeutski protein, na primer tretman

4

hemoglobinopatija putem nukleazom-posredovane integracije gena koji kodira globin protein. Sastavi se primenjuju ljudskom pacijentu u količini efikasnoj za postizanje željene koncentracije terapeutskog polipeptida u serumu ili ciljanom organu ili ćeliji. Primena može biti bilo kojim načinom na koji se polinukleotidi dostavljaju željenim ciljanim ćelijama. Na primer, razmatraju se i in vivo i ex vivo postupci. Intravenska injekcija u portalnu venu je poželjni način primene. Ostali in vivo načini primene uključuju, na primer, direktnu injekciju u režnjeve jetre ili bilijarni kanal, i intravenska injekcija distalno na jetru, uključujući preko jetrene arterije, direktna injekcija u parenhim jetre, injekcija kroz jetrenu arteriju i/ili retrogradna injekcija kroz bilijarno stablo. Ex vivo načini primene uključuju transdukciju in vitro resetovanih hepatocita ili drugih ćelija jetre, praćeno infuzije transdukovanih, reseciranih hepatocita nazad u portalnu vaskulaturu, parenhim jetre ili bilijarno stablo ljudskog pacijenta, pogledati npr., Grossman i dr., (1994) Nature Genetics, 6:335-341.

[0156] Efikasna količina nukleaza i donora koja će se primeniti variraće od pacijenta do pacijenta, i u skladu sa terapeutskim polipeptidom od interesa. Shodno tome, efikasne količine najbolje određuje lekar koji primenjuje sastave, i odgovarajuće doze može lako da odredi stručnjak. Nakon što se omogući dovoljno vremena za integraciju i eksprimiranje (na primer, 4-15 dana, na primer), analizom nivoa seruma ili drugih tkiva terapeutskog polipeptida i upoređivanjem sa početnim nivoom pre primene, utvrdiće se da li je količina koja se daje preniska, unutar pravog raspona ili previsoka. Pogodni režimi za početnu i narednu primenu su takođe promenljivi, ali ih karakteriše inicijalna primena, i zatim naknadne primene ako je potrebno. Naknadne primene mogu se primenjivati u različitim intervalima, u rasponu od dnevno do godišnje, do svakih nekoliko godina. Stručnjak će razumeti da se mogu preporučiti odgovarajuće imunosupresivne tehnike za izbegavanje inhibicije ili blokade transdukcije imunosupresijom vektora isporuke, pogledati npr., Vilquin i dr., (1995) Human Gene Ther.

6:1391-1401.

[0157] Formulacije za ex vivo i in vivo primene uključuju suspenzije u tečnim ili emulgovanim tečnostima. Aktivni sastojci se često mešaju sa pomoćnim sastojcima koji su farmaceutski prihvatljivi i kompatibilni sa aktivnim sastojkom. Pogodni pomoćni sastojci uključuju, na primer, vodu, fiziološki rastvor, dekstrozu, glicerol, etanol ili slično, i njihove kombinacije. Pored toga, sastav može da sadrži manje količine pomoćnih supstanci, kao što su ovlaživači ili emulgatori, pH puferišući agensi, stabilizatori ili drugi reagensi koji povećavaju efikasnost farmaceutskog sastava.

Ćelije

[0158] Ovde su takođe opisane ćelije i/ili ćelijske linije kod kojih je endogena sekvenca ljudskog beta-hemoglobina (Hbb) modifikovana. Modifikacija može biti, na primer, u poređenju sa sekvencom divljeg tipa, koja može biti ćelija pacijenta sa talasemijom. Ćelija ili ćelijske linije mogu biti heterozigotne ili homozigotne za modifikaciju. Modifikacije mogu da sadrže umetanje, brisanje i/ili njihove kombinacije.

[0159] Hbb gen može biti modifikovan nukleazom (npr., ZFN, TALEN, CRISPR/Cas sistem, Ttago sistem, itd.), na primer nukleaza kako je ovde opisano. U određenim aspektima, genomska modifikacija je za intervenišuća sekvenca 1, mutacija broj 1 (IVS1-1 ili IVS.1), IVS1-5, IVS1-6, IVS1-110, IVS2-1, IVS2-745 ili IVS2-654 mutacije, na primer modifikacija koja ispravlja mutiranu IVS.1 sekvencu kao što se primećuje kod pacijenata sa talasemijom, kao što je beta talasemija. Genomska modifikacija može biti unutar jedne ili više sekvenci prikazanih u SEQ ID NO:3, na primer koja remeti motiv donora splajsovanja (npr., modifikacija dinukleotida „GT“ na početku introna 1 ljudskog beta globin gena je modifikovana u „AT“). Genomska modifikacija može da popravi mutaciju koja menja mesto donora splajsovanja za mRNK obradu Hbb gena, i dovodi do beta talasemije.

[0160] Modifikacija je poželjno na ili blizu mesta vezivanja ili/ili razdvajanja nukleaza, na primer, unutar 1-300 (ili bilo koje druge vrednosti između) baznih parova uzvodno ili nizvodno od mesta razdvajanja, i više poželjno unutar 1-100 baznih parova (ili bilo koja vrednost između) od bilo koje strane mesta vezivanja i/ili razdvajanja, još poželjnije unutar 1 do 50 baznih parova (ili bilo koja vrednost između) od bilo koje strane vezivanja i/ili mesta razdvajanja. U određenim aspektima, modifikacija je na ili blizu bilo koje ciljane sekvence prikazane u SEQ ID NO:3, 4 ili 5.

[0161] Bilo koja ćelija ili ćelijska linija može biti modifikovana, na primer matična ćelija, na primer embrionalna matična ćelija, indukovana pluripotentna matična ćelija, matična ćelija hematopoeze, matična ćelija neurona i mezenhimalna matična ćelija. Ostali neograničavajući primeri ćelija kako je ovde opisano uključuju T-ćelije (npr., CD4+, CD3+, CD8+ itd.); dendritičke ćelije; B-ćelije. Takođe je obelodanjen potomak matične ćelije, uključujući delimično ili potpuno diferenciranu ćeliju (npr., RBC ili RBC prekursorska ćelija).

1

Neograničavajući primeri drugih ćelijskih linija, uključujući modifikovanu BCL11A sekvencu, uključuju COS, CHO (npr., CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11, CHO-DUKX, CHOK1SV), VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa, HEK293 (npr., HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T) i perC6 ćelije, kao i ćelije insekata kao što su Spodopterafugiperda (Sf), ili gljiva ćelije kao što su Saccharomyces, Pichia i Schizosaccharomyces.

[0162] Ovde opisane ćelije su korisne u tretmanu i/ili sprečavanju poremećaja, na primer, od strane ex vivo terapije. Ćelije modifikovane nukleazom mogu se proširiti i zatim ponovo uvesti u pacijenta korišćenjem standardnih tehnika. Pogledati, npr., Tebas i dr (2014) New Eng J Med 370(10):901. U slučaju matičnih ćelija, nakon infuzije u pacijenta, takođe dolazi do in vivo diferencijacije ovih prekursora na ćelije koje eksprimiraju funkcionalni transgen. Takođe su opisani farmaceutski sastavi koji sadrže ćelije kako je ovde opisano. Pored toga, ćelije mogu biti krio-konzervirane pre primene pacijentu.

[0163] Bilo koja od ovde modifikovanih ćelija ili ćelijskih linija može pokazati pojačano eksprimiranje divljeg tipa ili je umetnuta. Takođe su obelodanjeni sastavi kao što su farmaceutski sastavi koje sadrže genetski modifikovane ćelije, kako je ovde opisano.

Primene

[0164] Ovde opisani postupci i sastavi namenjeni su modifikaciji eksprimiranja proteina ili korekciji aberantne genske sekvence u genetskoj bolesti, poput talasemije. Stoga, postupci i sastavi omogućavaju tretman i/ili prevenciju takvih genetskih bolesti. Uređivanje genoma, na primer od matičnih ćelija, koristi se za ispravljanje aberantnog gena, umetanje gena divljeg tipa ili promenu eksprimiranja endogenog gena. Kao neograničavajući primer, gen divljeg tipa, npr. koji kodira bar jedan globin (npr. β globin), može da se umetne u ćeliju kako bi pružio globin proteine koji su deficitarni i/ili nedostaju, i na taj način tretirao genetsku bolest, npr., hemoglobinopatiju. Alternativno ili dodatno, genomsko uređivanje sa ili bez primene odgovarajućeg donora, može da popravi neispravni endogeni gen, npr., ispravljanje tačke mutacije u β-hemoglobinu, za obnavljanje eksprimiranja gena i/ili tretman genetske bolesti, npr. beta talasemije.

[0165] Naredni primeri se odnose na primerna otelotvorenja predmetnog obelodanjenja u kojima nukleaza obuhvata cinkov prst nukleazu (ZFN). Razumeće se da je to samo za potrebe davanja primera, i da se mogu koristiti i druge nukleaze, na primer TALEN, homing

2

endonukleaze (meganukleaze) sa sintetičkim DNK-vezujućim domenima i/ili fuzija prirodno nastalih ili sintetičkih homing endonukleaza (meganukleaza) i DNK-vezujućih domena i heterolognih domena razdvajanja, (npr. Mega-TAL) i/ili CRISPR/Cas sistema koji obuhvata sintetički pojedinačan RNK vodič.

PRIMERI

Primer 1: Dizajn, konstrukt i opšta karakterizacija cinkov prst protein nukleaza (ZFN)

[0166] Cinkov prst proteini su sintetički i ugrađeni u plazmide, AAV ili adenovirusne vektore suštinski kako je opisano kod Urnov i dr. (2005) Nature 435(7042):646-651, Perez i dr (2008) Nature Biotechnology 26(7):808-816, i kako je opisano u SAD patentu br.6,534,261. Za ZFN i TALEN specifične za ljudski beta globin lokus, pogledati, takođe, u suvlasničkom SAD patentu br.7,888,121.

Primer 2: Aktivnost ZFN specifičnih za beta globin

[0167] ZFN parovi koji ciljaju ljudski beta globin lokus na ili blizu IVS1-1 mutacije napravljeni su kako je opisano iznad. Takođe pogledati, SAD publikacija patenata br.

20140093913. Aminokiselinske sekvence heliks regiona prepoznavanja svakog prsta navedenih ZFN prikazane su u Tabeli 1 u nastavku zajedno sa celim ciljanim mestima (DNK ciljana mesta označena velikim slovima; nedodirnuti nukleotidi navedeni malim slovima). Lokacija ciljanog mesta je takođe prikazana na Slici 1. Svi ZFP su testirani za specifičnost vezivanja za svoju ciljanu sekvencu.

Tabela 1: Cinkov prst nukleaze

[0168] Cel-I test (Surveior™, Transgenomics) kao što je opisano kod Perez i dr. (2008) Nat. Biotechnol. 26: 808-816 i Guschin i dr. (2010) Methods Mol Biol.649:247-56), korišćen je za detektovanje ZFN-izazvanih modifikacija ciljanog gena u K562 ili HSC. U ovom testu, PCR-amplifikacija ciljanog mesta praćena je kvantifikacijom umetanja i/ili brisanja („indels“) korišćenjem enzima za detektovanje neusklađenosti Cel-I (Yang i dr. (2000) Biochemistry 39: 3533-3541) koji je pružio procenu donje granice DSB frekvencije. Tri dana nakon transfekcije vektora eksprimiranja ZFN pri standardnim uslovima (37°C) ili korišćenjem hipotermičkog šoka (30°C, pogledati suvlasničku SAD publikaciju patenata SAD publikaciju patenata br. 20110041195), genomska DNK je izolovana iz K562 ćelija pomoću DNeasy kompleta (Qiagen).

[0169] Rezultati (Slika 2A) iz Cel-I testa pokazali su da ZFN mogu da indukuju razdvajanje na svojim ciljanim mestima. Pored toga, ZFN su testirani za aktivnost korišćenjem Dual-Luciferase Single Strand Annealing testa (DLSSA). Ovaj sistem je korišćen za kvantifikaciju aktivnosti ZFN u prolazno transficiranim ćelijama, i zasnovan je na Dual-Luciferase Reporter® sistemu testiranja od Promega. Sistem sekvencilno meri dva pojedinačna reporterenzima, Firefly i Renilla luciferaze, u jednoj epruveti (komorica). Oba reportera, Firefly i Renilla luciferaza, ponovo su konstruisani, i uslovi ispitivanja su optimizovani. Firefly luciferaza reporter konstrukt sadrži dve nepotpune kopije Firefly kodirajućih regiona koji su

4

razdvojene DNK vezujućim mestima za ZFN. U ovom istraživanju, 5' kopija je izvedena iz približno dve trećine N-terminalnog dela Firefly gena, i 3' kopija je izvedena iz približno dve trećine C-terminalnog dela Firefly gena. Dve nepotpune kopije sadrže približno 600-bp krake homologije. Razdvojeni Firefly fragmenti nemaju aktivnost luciferaze. Prekid dvostrukog lanca DNK uzrokovan ZFN parom stimuliše rekombinaciju između bočnih ponavljanja jednolančanim spajanjem puta, i zatim obnavlja funkciju Firefly luciferaze. Ko-transficirani Renilla luciferaza plazmid pruža unutrašnju kontrolu. Luminescentna aktivnost svakog izveštača čita se na luminometru. Normalizacijom aktivnosti eksperimentalnog reportera (Firefly) na aktivnost unutrašnje kontrole (Renilla) minimizuje se eksperimentalna varijabilnost prouzrokovana razlikama u vijabilnosti ćelija i/ili efikasnosti transfekcije.

Normalizovana vrednost koristi se za određivanje aktivnosti datog ZFN ili TALEN para.

[0170] Rezultati (Slika 2B) pokazuju da je par 43545/43544 sposoban da razdvaja i sekvencu beta globina divljeg tipa i mutiranu IVS 1-1 sekvencu.

Primer 3: Uređivanje IVS 1-1 beta globin lokusa

[0171] ZFN 43545/43544 par specifičan za ljudski beta globin gen (HBB) korišćen je za unošenje DNK donora u lokus beta globina na sledeći način. oligo donora dizajniran je za hvatanje u razdvojenom HBB genu nakon ZFN tretmana. Oligo je sadržao XbaI restrikciono mesto, tako da je nakon umetanja oligoa, novo restrikciono mesto uvedeno u intron Hbb gena (IVS1) odmah nakon ZFN mesta prepoznavanja, koje bi se kasnije moglo vizuelizovati restriktivnom digestijom PCR proizvoda koji sadrži ZFN region vezivanja (pogledati Sliku 3).

[0172] Različiti oligo su isporučeni u CD34+ ćelije kao jednolančani molekuli i prikazani su u nastavku:

Hbb oligo WT:

Hbb oligo WT XbaI:

[0173] Za CD34+ transdukciju korišćen je BTX ECM830 uređaj sa 2 mm kivetom. mRNK iz ćelija je pripremljena koristeći mMessageMachine T7 Ultra Kit (#AM1345, Ambion).

Ljudske CD34+ ćelije su uzgajane u x-vivo10 medijumu (Lonza) sa 1xCC110 (tehnologija matičnih ćelija) na pločama tretiranim kulturom bez tkiva. Ćelije su prebrojane i sakupljene centrifugiranjem pri 1200 obrtaja tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi. Ćelije su isprane 1-2x sa PBS sobne temperature. Za svaku transfekciju korišćeno je 200.000 ćelija, koje su resuspendovane u 100 µL BTexpress rastvoru. Po transfekciji je dodato 2-4 µg mRNK i smeša je preneta u kivetu. Odmah po prenosu, smeša je elektroporisana na 250 V tokom 5 milisekundi. Prethodno zagrejani medijum je dodan u kivetu, i medijumi plus ćelije prebačeni su na 48-komorične ploče tretirane sa kulturom koja nije tkiv, i zatim je inkubirano na 37°C. Uređivanje gena mereno je DNK sekvenciranjem visoke propusnosti PCR amplikona HBB gena. Analizirana je procentualna modifikacija gena nehomolognim spajanjem („NHEJ“, uzrokovana zacelivanjem prekida dvostrukog lanca DNK nakon razdvajanja izazvanog sa ZFN) ili ciljane integracije oligoa nakon razdvajanja ZFN („korekcija gena“).

[0174] Kao što je prikazano na Slici 4, donorski β globin oligo je ubačen u pravilan lokus, što je verifikovano prisustvom novog mesta restrikcije prisutnog na donorskoj DNK. Pored toga, izvršena je analiza sekvenci kako bi se verifikovao procenat alela koji sadrže ciljanu integraciju i/ili indekse (umetanja i/ili brisanja) uvedenih od strane NHEJ, koji je sklon greškama, nakon razdvajanja ZFN. Genomska DNK je ekstrahovana (korišćenjem Qiagen QIAamp® DNK mikro-kompleta) i analizirana na ZFN aktivnost na sledeći način. Ukratko, region koje obuhvata mesto razdvajanja je amplifikovan PCR standardnim postupcima, i nakon amplifikacije, PCR proizvod je sekvencioniran pomoću MiSeq visokoprotočne analize promene sekvenciranja u skladu sa uputstvima proizvođača (Illumina®).

[0175] Kako bi se odredio procenat izmenjenih alela, genomski region od interesa je PCR amplifikovan korišćenjem prajmera koji dodaju standardneIllumina® sekvence. Izvršena je druga grupa od 13 rundi PCR kako bi se dodala sekvenca barkodova i adapter mosta sekvenca na oba kraja. Sekvenciranje je izvršeno na Illumina® MiSeq prema protokolima proizvođača za sekvenciranje amplikona. MiSeq generiše čitanje uparenih delova, koji se spajaju i adaptiraju pomoću standardnog softvera za poravnanje. Čitanja su potom demultipleksirana po uzorku putem parova barkoda sekvenci pomoću prilagođenih skripti. Amplikon sekvence su zatim globalno usklađene sa referentnom sekvencom primenom Needleman-Wunsch algoritma (Needleman, Saul B.; and Wunsch, Christian D. (1970). Jour Mol Bio 48 (3): 443-53). Praznine ili umetanja u poravnanje računaju se kao% NHEJ događaja, i upoređuju se sa neobrađenom sekvencom kontrolnog uzorka kako bi se odredila pozadinska stopa specifična za sekvencu.

[0176] Za proračun ciljane integracije, amplikon sekvence su globalno usklađene sa referentnom sekvencom pomoću biopitonske implementacije Needleman-Wunsch algoritma (Needleman, Saul B.; and Wunsch, Christian D., ibid). Promene sekvenci generisane eksperimentalnim tretmanima su tražene, prebrojane i upoređene sa brojevima u kontrolnim uzorcima. Poznati polimorfizmi sa jednom karakteristikom (SNP) mogu se maskirati tokom ovog postupka i isključiti iz daljih brojanja (npr., 1-bp brisanja SFP u blizini ciljanog mesta ZFN). Procenat nehomolognog spajanja krajeva (NHEJ%) (koji se takođe naziva indels) izračunato je određivanjem procenta sekvenci koje sadrže umetanja i/ili brisanja. Uzorci tretirani samo sa GFP vektorom korišćeni su za procenu PCR i greške sekvenciranja na osnovu pozadinske frekvencije umetanja i brisanja. Primećene su frekvencije manje od 1%.

[0177] Rezultati pokazuju da je u prisustvu donora oligoa i ZFN para otprilike 12-14% ćelija pokazalo integraciju. Pored toga, analiza prisutnosti indelsa pokazala je da kada su ZFN prisutni, indeksi su detektovani u 42-70% alela. Pogledati, takođe, Sliku 4.

[0178] Za diferenciranje transgenih ćelija CD34+ na zrele RBC, korišćeni su postupci poznati u struci. Grupe ZFN-modifikovanih CD34+ ćelija su indukovane da se diferenciraju kako je opisano kod Giarratana i dr. (2011)Blood118(19):5071-9.

[0179] Na dan 14 diferencijacije eritrocita, izolovana je ukupna RNK, i slajsovanje beta globin gena je analizirano standardnim RT-PCR i analizom sekvence, kao što je opisano iznad. Rezultati (pogledati Tabelu 2) pokazuju da razdvajanje sa samim ZFN može da uvede indekse koji ometaju pravilno splajsovanje, i taj efekat se takođe primećuje u prisustvu IVS 11 oligo donora, gde se pojavljuje procenat splajsovanja javlja preko novih kriptičnih mesta splajsovanja (pogledati Sliku 5). Međutim, kada se koristi WT oligo donor, splajsovanje se delimično vraća na nivoe koji se vide kada se ne koristi ZFN. Pored toga, čini se da prisustvo uvedenog XbaI mesta u oligo donoru ne utiče na splajsovanje.

Tabela 2: Splajsovanje proizvoda u tretiranim eritrocitima

Primer 4: Oligo-zasnovana korekcija gena od IVS1-1 mutaciji u CD34+ ćelijama talasemije.

[0180] CD34+ ćelije dobijene od talasemije potom su tretirane da koriguju IVS 1-1 mutaciju. Ovaj pacijent, „p13“, je β<0>β<0>pacijent sa IVS1-1 mutacijom na jednom alelu i nonsens mutacijom (TGG->TAG) na drugom alelu kod kodona 15. CD34+ ćelije su izolovane i tretirane nukleoidima i oligo donorima kao što je opisano u Primeru 3. Pored toga, visokoprotočna analiza sekvenciranja he izvršena kako bi se ispitala modifikacija prouzrokovana nukleazama i oligoima. Genomska DNK je izolovana iz uzoraka i pokazala je da postoji velika brzina razdvajanja restrikcionim enzimom XbaI usled ciljane integracije oligo donora (pogledati Sliku 6).

[0181] Analiza redosleda prikazana je u Tabeli 3. Prvi skup podataka je za WT CD34 ćelije gde oba alela beta globina imaju sekvencu divljeg tipa, dok je druga grupa podataka za ćelije p13 pacijenta beta talasemije.

Tabela 3: Rezultati posle korekcije gena u CD34+ ćelijama

[0182] Podaci pokazuju aktivnost nukleaza na IVS1-1 mestu u obe ćelijske populacije, mereno indel aktivnošću u uzorcima sa samim ZFN. U prisustvu donora koji sadrže XbaI mesto, primetan je broj RFLP detekcije, što ukazuje na integraciju oligoa donora. U p13 ćelijama primena WT oligo donora koji uključuje XbaI mesto uzrokuje pojavu XbaI RFLP na oba alela. Takođe postoji porast WT sekvence „G“ na IVS1-1 mestu na IVS1-1 alelu (na primer, sa 43545/43544 ZFN parom, detetovana je vrednost 34,6% WT sekvence u poređenju sa 10,7% u netransficiranim ćelijama.

[0183] CD34+ ćelije dobijene od pacijenta koje su ZFN- modifikovane su indukovane kako bi se diferencirale u kolonije koristeći Stemcell Technologies' Methocult metilcelulozni medijum, u skladu sa uputstvima proizvođača. Diferencijacija je analizirana ispitivanjem tipova kolonija koje potiču od Methocult-izazvane diferencijacije: jedinice koje formiraju koloniju, eritroid („CFU-E“); jedinice koje formiraju udare, eritroidi („BFU-E“); jedinice koje formiraju kolonije, granulociti/makrofagi („CFU-GM“) i jedinice koje formiraju kolonije; granulocit/eritrocit/monocit/makrofag („CFU-GEMM“). BFU-E kolonije su odabrane i analizirane za genotipizaciju i beta globin splajsovanje korišćenjem MiSeq analize.20% svih klonova ima IVS1.1 mutaciju korigovanu na divlji tip „G“, i beta globina splajsovanje vraćeno je u normalu. Podaci su takođe potvrdili da dodavanje XbaI restrikcionog mesta u IVS1 intronu nema štetan uticaj na beta globin splajsovanje.

[0184] Uzeti zajedno, ovi podaci pokazuju uspešnu gensku korekciju mutacije (IVS1-1 mutacija) u beta globin genu u CD34+ ćelijama dobijenim od pacijenta sa beta talasemijom.

Claims

Patentni zahtevi

1. Genetički modifikovana CD34+ matična ćelija hematopoeze koja sadrži:

par cinkov prst nukleaza, gde par obuhvata:

(i) prvu cinkov prst nukleazu koja se vezuje za ciljano mesto kao što je prikazano u SEQ ID NO:5, gde prva ZFN sadrži naredne heliks regione prepoznavanja:

F1: LRHHLTR (SEQ ID NO:11);

F2: QSGTRKT (SEQ ID NO:12);

F3: RSDNLST (SEQ ID NO:13);

F4: DSANRIK (SEQ ID NO:14);

F5: LRHHLTR (SEQ ID NO:11); i

F6: QSGNLHV (SEQ ID NO:15); i

(ii) drugu cinkov prst nukleazu koja se vezuje za ciljano mesto kao što je prikazano u SEQ ID NO:4, gde druga ZFN sadrži naredne heliks regione prepoznavanja:

F1: AMQTLRV (SEQ ID NO:16);

F2: DRSHLAR (SEQ ID NO:7);

F3: RSDNLSE (SEQ ID NO:8);

F4: ASKTRKN (SEQ ID NO:9); i

F5: TSSDRKK (SEQ ID NO:17) ili VYEGLKK (SEQ ID NO:18);

i donorsku sekvencu koja sadrži sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID NO:19 ili SEQ ID NO:21,

gde se donorska sekvenca umeće u endogeni aberantni ljudski beta-hemoglobin (Hbb) gen nakon ciljanog razdvajanja para cinkov prst nukleaza, korigujući na taj način sekvencu Hbb gena, i gde aberantni Hbb gen sadrži intervenišuća sekvenca 1, mutacija broj 1 (IVS1-1) mutaciju.

2. Genetički modifikovana ćelija prema patentnom zahtevu 1, gde donorska sekvenca ispravlja mutaciju tačke.

3. Genetički modifikovana ćelija prema patentnom zahtevu 2, gde aberantni Hbb gen sadrži genomsku modifikaciju unutar jedne ili više sekvenci prikazanih u SEQ ID NO:3.

4. Genetički modifikovana ćelija prema patentnom zahtevu 3, gde genomska modifikacija unutar SEQ ID NO:3 ometa motiv donora splajsovanja, kao što je promena GT dinukleotida na početku introna 1 ljudskog beta globin gena u AT dinukleotid.

5. Genetički modifikovana ćelija prema patentnom zahtevu 2, gde, da se koriguje mutacija koja menja mesto donora splajsovanja za mRNK obradu aberantnog Hbb gena, što dovodi do beta talasemije.

6. Genetički modifikovana ćelija prema patentnom zahtevu 2, gde aberantni Hbb gen sadrži genomsku modifikaciju na ili blizu bilo koje od sekvenci prikazanih kao SEQ ID NO:4 ili 5.

7. Genetički modifikovana ćelija prema patentnom zahtevu 6, gde donorska sekvenca sadrži novo mesto razdvajanja restrikcionog enzima u odnosu na endogeni Hbb gen.

8. Genetički modifikovana ćelija izvedena iz ćelije prema bilo kom patentnom zahtevu 1 do 7, gde ćelija sadrži:

par cinkov prst nukleaza, gde par obuhvata:

F1: LRHHLTR (SEQ ID NO:11);

F2: QSGTRKT (SEQ ID NO:12);

F3: RSDNLST (SEQ ID NO:13);

F4: DSANRIK (SEQ ID NO:14);

F5: LRHHLTR (SEQ ID NO:11); i

F6: QSGNLHV (SEQ ID NO:15); i

F1: AMQTLRV (SEQ ID NO:16);

F2: DRSHLAR (SEQ ID NO:7);

F3: RSDNLSE (SEQ ID NO:8);

F4: ASKTRKN (SEQ ID NO:9); i

F5: TSSDRKK (SEQ ID NO:17) ili VYEGLKK (SEQ ID NO:18);

i donorsku sekvencu koja sadrži sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID NO:19 ili SEQ ID NO:21.

9. Genetski modifikovana diferencirana ćelija izvedena iz ćelije prema bilo kom patentnom zahtevu 1-7, kao što je crveno krvno zrnce (RBC), gde ćelija sadrži:

par cinkov prst nukleaza, gde par obuhvata:

F1: LRHHLTR (SEQ ID NO:11);

F2: QSGTRKT (SEQ ID NO:12);

F3: RSDNLST (SEQ ID NO:13);

F4: DSANRIK (SEQ ID NO:14);

F5: LRHHLTR (SEQ ID NO:11); i

F6: QSGNLHV (SEQ ID NO:15); i

F1: AMQTLRV (SEQ ID NO:16);

F2: DRSHLAR (SEQ ID NO:7);

F3: RSDNLSE (SEQ ID NO:8);

F4: ASKTRKN (SEQ ID NO:9); i

F5: TSSDRKK (SEQ ID NO:17) ili VYEGLKK (SEQ ID NO:18);

10. Farmaceutski sastav koji sadrži genetički modifikovanu ćeliju prema bilo kom patentnom zahtevu 1 do 4.

11. Genetički modifikovana ćelija prema bilo kom patentnom zahtevu 1 do 9, za upotrebu u tretmanu beta talasemije.

12. Sastav koji sadrži par cinkov prst nukleaza, ili polinukleotid koji kodira par cinkov prst nukleaza, gde par obuhvata:

F1: LRHHLTR (SEQ ID NO:11);

F2: QSGTRKT (SEQ ID NO:12);

F3: RSDNLST (SEQ ID NO:13);

F4: DSANRIK (SEQ ID NO:14);

F5: LRHHLTR (SEQ ID NO:11); i

F6: QSGNLHV (SEQ ID NO:15); i

F1: AMQTLRV (SEQ ID NO:16);

F2: DRSHLAR (SEQ ID NO:7);

F3: RSDNLSE (SEQ ID NO:8);

F4: ASKTRKN (SEQ ID NO:9); i

F5: TSSDRKK (SEQ ID NO:17) ili VYEGLKK (SEQ ID NO:18).

13. In vitro postupak za promenu Hbb eksprimiranja u ćeliji, gde postupak sadrži: uvođenje u ćeliju jednog ili više polinukleotida prema patentnom zahtevu 12, pod uslovima tako da se jedan ili više proteina eksprimiraju, i da se povećava eksprimiranje Hbb gena.

14. Farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 10, za primenu u postupku tretmana pacijenta sa β talasemijom, gde postupak obuhvata primenu farmaceutskog sastava pacijentu u količini dovoljnoj da se poveća eksprimiranje Hbb gena kod pacijenta.