ITUB20154769A1 - Anticorpo monoclonale anti-BARF1 - Google Patents

Description

Titolo: "Anticorpo monoclonale anti-BARFl"

DESCRIZIONE

La presente invenzione trova applicazione nel campo della medicina e, in particolare , per il trattamento e la diagnosi dei tumori.

Il virus di Epstein-Barr (EBV) è un γherpesvirus associato a tumori umani , come il carcinoma nasofaringeo (NPC), il linfoma di Hodgkin (HL), il linfoma di Burkitt , alcuni linfomi delle cellule T, e delle cellule NK, ed il carcinoma gastrico (GC) .

Il virus usualmente infetta in modo asintomatico circa il 95% della popolazione . Occasionalmente , il virus può riattivarsi ed essere presente in forma infettante nella saliva . Oltre ai geni latenti, la cui espressione differenziale caratterizza le varie forme di latenza riscontrate nei tumori, due RNA noncodif icanti e non poiiadenilati , cioè EBER1 e EBER2, sono espressi in tutte le forme di latenza virale.

Studi recenti hanno dimostrato che BARF1 è una proteina espressa durante il ciclo di latenza in NPC EBV-associati e nel carcinoma gastrico.

BARF1 condivide un'omologia limitata con il recettore del fattore umano 1 stimolante le colonie (1'oncogene FMS) e mostra attività oncogena guando è espresso nei fibrobiasti dei roditori e nelle cellule epiteliali primarie delle scimmie.

Il gene BARF1 è localizzato a livello nucleotidico tra le posizioni 165,449-166,189 del genoma EBV del ceppo B95.8, e codifica per una proteina di 221 amminoacidi. Il gene codifica per una proteina transmembrana espressa sulla superficie delle cellule infettate da EBV.

Sono già stati descritti gli effetti immortalizzanti di BARF1 su cellule primarie epiteliali di primati (Wei et al 1997) e la trasformazione maligna in fibrobiasti di roditori (Wei e Ooka 1989).

E interessante notare che il dominio extracellulare di BARF1 può essere scisso e rilasciato dalle cellule, e può agire come un fattore di crescita in vivo; esso può inibire la secrezione di «-interferone da cellule mononucleate ed ha attività mitogenica in vivo.

Gli effetti biologici delle forme intracellulari e delle forme secrete della proteina devono essere ancora completamente chiariti e 1'identificazione del recettore per la forma secreta di BARF1 sembra essere di grande importanza per la comprensione delle funzioni di BARF1 in vivo.

Dato il rilevante ruolo patogenetico di BARF1 nello sviluppo di neoplasie EBV-associate e considerato che tale proteina può costituire un valido bersaglio terapeutico per tali tumori, lo sviluppo di un anticorpo monoclonale (mAb) specifico per BARF1 può rappresentare una strategia di notevole rilevanza terapeutica per un più efficace controllo di tali neoplasie.

RIASSUNTO DELL'INVENZIONE

Nella presente invenzione si descrive 1'ottenimento e 1'isolamento di un anticorpo monoclonale (mAb) specifico per BARF1, nonché la sua caratterizzazione in vitro e la descrizione degli effetti terapeutici indotti in vivo in modelli animali.

Il mAb ha dimostrato di essere efficace nei saggi di attivazione del Complemento (Compìement-Dependent Cytotoxicity , CDC) e di induzione di attività citotossica cellulo-mediata anticorpodipendente (Antibody-Dependent Ce11-mediated Cytotoxicity, ADCC) in vitro, prerequisiti fondamentali per 1'espletamento dell'attività terapeutica in vivo.

Inoltre, 1'analisi di biodistribuzione in vivo condotta utilizzando 1'anticorpo anti-BARFl coniugato con un fluorocromo ha dimostrato una selettiva localizzazione dell'anticorpo a livello della massa tumorale esprimente EBV.

Il mAb è stato utilizzato per esperimenti in vivo di immunoterapia passiva tramite iniezione in topi SCID, precedentemente trapiantati con diversi tipi di cellule EBV-positive o negative, ed ha dimostrato di essere in grado di rallentare la crescita tumorale selettivamente delle cellule tumorali EBV-positive, BARF1 esprimenti.

Infine, utilizzando 1'imaging in vivo di cellule tumorali trasdotte con luciferasi, è stato possibile monitorare in vivo 1'attività del mAb nel tempo e confermare 1'effetto terapeutico del trattamento in topi portatori di tumori.

Nel complesso, questi dati indicano che BARF1 è un nuovo antigene EBV-specifico, e che l'uso di anticorpi monoclonali anti-BARFl può essere un potente strumento per la rilevazione ed il trattamento dei tumori legati al virus.

OGGETTO DELL'INVENZIONE

In un primo oggetto, la presente invenzione mette a disposizione le seguenze delle regioni determinanti la complementarietà (CDR) dei domini variabili della catena pesante e della catena leggera dell'anticorpo monoclonale anti-BARFl, nonché degli interi domini variabili della catena pesante e leggera.

In particolare, le sequenze CDR1, CDR2 e CDR3 delle catene pesanti corrispondono rispettivamente alle sequenze SEQ. ID. n. 3, 4 e 5, mentre le CDR1, CDR2 e CDR3 delle catene leggere corrispondono rispettivamente alla sequenza SEQ. ID. n. 6, alla seguenza AGCACATCC e alla seguenza SEQ. ID. 7.

Per guanto concerne il dominio variabile della catena pesante, guesto è codificato dalla seguenza corrispondente alla SEQ. ID. n. 1, mentre guello della catena leggera corrisponde alla SEQ. ID. n. 2.

Ciascuna sequenza rappresenta un ulteriore oggetto dell'invenzione.

Secondo 1'invenzione, 1'anticorpo può essere un'immunoglobulina intera o un frammento immunoglobulinico comprendenti almeno un dominio variabile di catena pesante ed un dominio variabile di catena leggera.

Detto frammento è preferibilmente un frammento Fab, un frammento F(ab')2, un frammento Fv a catena singola (single chain Fragment variable, scFv) o i suoi derivati (diabody, triabody ecc.).

In un aspetto particolare, tale frammento Fv a catena singola è legato a domini di trasduzione del segnale 1infoidi, nel formato di un Chimeric Antigen Receptor (CAR).

Ancora più in particolare, detti domini comprendono: CD28, CD3ζ, GDI37, OX-40.

1/anticorpo dell'invenzione o un suo frammento può essere sia murino sia umanizzato.

L'anticorpo è inoltre descritto per uso medico e, in particolare, viene gui descritto nell'ambito della terapia e della diagnosi dei tumori correlati al virus di Epstein-Barr o comungue esprimenti epitopi omologi a guello di BARF1 riconosciuto da detto anticorpo.

In particolare, nel trattamento e nella diagnosi di tumori umani, come il carcinoma nasofaringeo (NPC), il linfoma di Hodgkin (HL), il linfoma di Burkitt, linfomi non-Hodgkin EBV+, neoplasie delle cellule T e delle cellule NK, ed il carcinoma gastrico (GC).

L'anticorpo è inoltre descritto per 1'impiego nella produzione di Chimeric Antigen Receptor e per la trasduzione di cellule 1infoidi per immunoterapia adottiva.

In un ulteriore oggetto dell'invenzione è messo a disposizione un peptide virale antigenico (qui a seguito indicato con 08/08) avente una seguenza corrispondente alla SEQ. ID n. 10 ed un ottamero avente una seguenza corrispondente alla SEQ. ID n. 11 o SEQ. ID n. 12, che preferibilmente è guello avente SEQ. ID n. 11.

Tali pepdidi e tale ottamero, insieme ai loro omologi cellulari quali epitopi immunogenici, sono qui descritti per l'uso medico, in particolare nei protocolli di immunizzazione e vaccinazione attiva.

A tale scopo, è qui descritta una preparazione farmaceutica comprendente 1'anticorpo o uno o più dei peptidi della presente invenzione, insieme ad uno o più eccipienti farmaceuticamente accettabili.

BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE

Figura 1: a) Sequenza amminoacidica della proteina BARF1- corrispondente alla Seq. ID n. 13. b) Dot Blot. I peptidi utilizzati per le immunizzazioni e qli ottameri derivati dal peptide 08/08 sono stati legati su membrana PVDF e marcati con anticorpo anti-BARF1. La positività è presente solo in corrispondenza del peptide 08/08 e 08/08-1, che raffigura così 1 'epitopo minimo dell'antigene selezionato, c) Percentuali di fluorescenza e MFI di tre linee cellulari BARF1-positive (GRANTA-519, C-666, BL-41 B95.8) e di due negative (RAJI e BL-41), come risultato dall'analisi in citometria a flusso. d) Citometria a flusso. Cellule MKN-45 sono state trasdotte con il plasmide codificante BARF1 e marcate con anti-BARFl mAb. La linea di cellule trasdotta ha mostrato un alto segnale di positività.

Figura 2: a) CDC (citotossicità complementodipendente). Percentuale di lisi specifica di linee cellulari EBV-positive (GRANTA-519, C-666 e BL-41 B95.8) e negative (BL-41) dopo l'esposizione a diverse concentrazioni di anti-BARFl mAb seguito dal complemento. Tutte le linee cellulari EBV-positive, anche se in misura diversa, sono state U sate, mentre la linea cellulare EBV-negativa non è stata U sata.

Per ogni condizione sperimentale il controllo isotipico è stato utilizzato come controllo negativo. b) ADCC (citotossicità cellulo-mediata anticorpodipendente). Lisi specifica di linee cellulari EBV-positive (GRANTA-519 e C-666) ed EBV-negative (BL-41) dopo 1 'esposizione a mAb anti-BARFl seguito da cellule effettrici umane (PBMC). Tutte le linee cellulari EBV-positive, anche se in misura diversa, sono state U sate, mentre la linea cellulare EBV-negativa non è stata U sata. Per ogni condizione sperimentale il controllo isotipico e la presenza di cellule effettrici in assenza di immunoglobuline (solo PBMC) sono state usate come controlli negativi.

Figura 3: Biodistribuzione. Analisi statistica della fluorescenza ottenuta da masse tumorali MKN-45 e MKN-45 BARF1-trasdotte a differenti giorni dopo iniezione i.v. di mAb anti-BARFl coniugato ad Alexa680. L 'analisi ANOVA mostra una differenza statisticamente significativa tra i due gruppi (p <0.001).

Figura 4: a: Cinetica di crescita dei tumori indotti dall'inoculo di cellule C-666 (5xl0<6>) s.c. in topi SCID. Cinque topi non sono stati trattati, mentre 9 topi hanno ricevuto un totale di 1 mg di anticorpo anti-BARFl . 1/ analisi statistica condotta (Wilcoxon test) ha rivelato che la riduzione della crescita tumorale ottenuta grazie alla somministrazione di anti-BARFl mAb è statisticamente significativa ai giorni 24, 26, e 28 (p=0.0028, p=0 .002 e p=0.0026, rispettivamente) . b: Analisi di bioluminescenza di topi iniettati per via sottocutanea al giorno 0 con 5xl0<6>cellule C-666-LUX. Le immagini si riferiscono al giorno 14 e 49 del gruppo di controllo (etri, non trattato) e del gruppo trattato (anti-BARFl mAb). I valori sono espressi come radianza (p/sec/cm<2>/sr) . c: Analisi statistica della radianza da topi iniettati s.c. al giorno 0 con 5xl0<6>cellule C-666-LUX. Il gruppo di controllo non è stato trattato, mentre il gruppo trattato ha ricevuto mAb anti-BARFl (1 mg). Al giorno 49, la luminosità media del gruppo trattato è inferiore rispetto al controllo (p <0.001).

Figura 5: a. Cinetica di crescita dei tumori indotti dall'inoculo di cellule GRANTA-5 19 (5x10<6>) per via sottocutanea in topi SCID. Nove topi non sono stati trattati , mentre 13 topi hanno ricevuto un totale di 1 mg di anticorpo anti-BARFl . L'analisi statistica (Wilcoxon test ) ha rivelato che la riduzione della crescita tumorale ottenuta mediante somministrazione di anti-BARFl mAb è statisticamente significativa al giorno 21 (pCO.OOl). b: Analisi di sopravvivenza di topi SCID inoculati per via endovenosa con cellule GRANTA-519. Il test di Kaplan-Meier ha rivelato un miglioramento statisticamente significativo della sopravvivenza del gruppo trattato (p=0.0Q2). c: Analisi di bioluminescenza di topi iniettati per via endovenosa al giorno 0 con 3xl0<6>cellule GRANTA-519-LUX. Le immagini si riferiscono al giorno 14 e 21 del gruppo di controllo (non trattato) e del gruppo trattato (anti-BARFl mAb). È possibile notare la presenza di segnali nella zona 1infonodale. I valori sono dati come radianza (p/sec/cm<2>/sr). d: Analisi statistica di radianza da topi iniettati i.v. al giorno 0 con 3x10<6>cellule GRANTA-5 19-LUX. Al giorno 21, la radianza media del gruppo trattato è risultata significativamente inferiore rispetto al gruppo di controllo (p<0.05).

Figura 6: seguenza VH dell'ibridoma 3D4 con indicazione delle sequenze del CDR1, CDR2 e CDR3.

Figura 7: sequenza VK dell'ibridoma 3D4 con indicazione delle sequenze del CDR1, CDR2 e CDR3.

Figura 8 : sequenza della proteina BARF1 .

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE

Sono state individuate le seguenti sequenze :

VH ibridoma 3D4

Seq. ID n. 1:

CAC C AT GGGCAGGC T T AC AT CC T C AT T CCTGCTGCTGATTGT C CC T GCATATGT C CT T TC C C AGGT TAC T CT GAAAGAGT C T GGC C CT GGGAT AT T GCAGC CC T C CC AGAC C C TC A GT C T GAC T TGT T CT T T CT C T GGGT TT T C AC T GAGC AC T T CT GGTAT GGGT GTGAGCT G GAT TCGTCAGC C TT C AGGAAAGGGTC T GGAGT GGC TGGC AC AC AT T T AC T GGGAT GAT GAC AAGC GCT AT AAC C CAT C CC T GAAGAGC C GGC T CAC AAT C T CC AAGGAT AC C T CC A GAAAC C AGGT AT T C C T C AAGAT CACCAGTGT GGAC AC T GC AGAT AC T GC CACATACTA CT GT GC T C GAAGAGAT GGGACAC GGGGGTTT GAC TAC T GGGGC CAAGGC AC CAC T CT C AC AGTC T C CT C AGC C AAAAC AAC AGC C C CAT C GGT CT AT CC AC TGGC CC C T GT GT GT G GAGATAC AAC T GGC T C CT C GGT GACT C T AGGATGC CT GGTC AAG

m CUI

CAC CAT GGGCAGGC T T AC AT CC T C AT T C CT GC TGC TGAT FRI TGT C CCT GCATATGT C CT T T CC C AGGT TAC TCTGAAAGA GT C T GGC C CT GGGAT ATT GCAGC C CT C C CAGACC C TC AG TCTGACTTGTTCTTTCTCT GGGT TT T CAC T GAGC ACT T C TGGTAT GGGT CORI Seq . ID n.3 GT GAGC T GGAT TCGTCAGC C TT C AGGAAAGGGTC T GGAG FR2

TGGC TGGC AC AC AT T T AC T GGGAT GAT GAC AAG CDR2 Seq . ID n . 4 CGCTATAACCCATCCCTGAAGAGCCGGCTCACAATCTCC FR3

AAGGAT AC CT C CAGAAAC C AGGT ATT C C TC AAGAT CAC C AGT GT GGAC AC T GC AGAT AC T GC C AC AT AC T AC T GT GC T C GAAGAGAT GGGACAC GGGGGTTT GAC TAC CDR3 Seq . ID n . 5 TGGGGC CAAGGC AC C ACT C T CAC AGT C T C FR4

CT C AGC C AAAAC AAC AGC C C CAT C GGT C TAT C CAC TGGC CHI CC C T GT GT GT GGAGAT AC AACT GGCT C C TC GGTGACT C T AGGATGC CTGGT CAAG

VK ibridoma 3D4

Seq. ID n. 2:

VK ibridoma 3D4

CACCATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATA ATGTCCAGAGGACAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCTAG GGGAAC GGGT C ACC AT GAC C TGC ACT GC CAC C TC AAGT GTAAGTT C C AGT T AC T T GC A CTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACTCTGGATTTATAGCACATCCAAC CTGGCTT CTGGAGT C C CAGC TC GC TT C AGT GGCAGTGGGTCT GGGACCTC T TAC T CT C TCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCACCAGTATCA TC GT TC C C CAC C GT GGAC GT TC GGTGGAGGC ACC AAGC T GGAAAT C AAAC GGGC T GAT GCTGCACCAACTGTATCCATCTCCCCCCATCCAGTGTA

in cui :

CACCATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCT FRI AAT C AGT GCC T C AGT C AT AATGT C CAGAGGAC AAATT GT TCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCTAGG GGAACGGGTC AC CAT GAC C T GC AC TGC C AC C TCAAGTGTAAGTTCCAGTTAC CDRl Seq. ID n . 6 TT GC AC T GGT AC CAGC AGAAGC C AGGAT CC T C CC C CAAA FR2 CTCTGGATTTAT AGCACATCC CDR2

AAC C TGGC TT C T GGAGTC C C AGC TCGC T TC AGTGGCAGT FR3

GGGT CT GGGAC C TC T T AC T C TC T C AC AATC AGCAGCAT G GAGGCT GAAGAT GC T GCC AC TT AT TAC T GC CACCAGTATCATCGTTCCCCACCGTGGACG CDR3 Seq. ID n . 7 TT C GGT GGAGGC AC C AAGC T GGAAAT CAAA FR4 CGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTCCCCCCAT CL CCAGTGTA

Materiali e metodi

Linee cellulari

Sono state utilizzate le seguenti linee cellulari umane : GRANTA-5 1 9 (linfoma mantellare a cellule B, EBV+ , BARF1+ ) , C-666 (NPC, EBV+ , BARF1+ ) , BL-41 (linfoma di Burkitt, EBV-) , BL-41 B95.8 (la stessa linea di cellule infettate con EBV) , Raj i (linea cellulare simil-linf oblastica B , EBV+ , ma BARF1-) , e MKN-45 (carcinoma gastrico, EBV-) .

B95 . 8 è una linea cellulare di scimmia utilizzata per la generazione di vi rioni EBV. Tutte le linee di cellule, ad eccezione di MKN-45, sono state coltivate in terreno RPMI 1640 (Euroclone), supplementato con 10% di siero fetale bovino inattivato al calore (FBS, Gibco), 10 mM Hepes, 1 mM Na piruvato, 2 mM Ultraglut amine (tutto da Lonza BioWhittaker ), e 1% Antibiotico/ antimicotico (Gibco) , di seguito denominato terreno RPMI completo.

MKN-45 è stata coltivata in DMEM supplementato con gli stessi additivi , indicato come terreno DMEM completo .

La linea cellulare NS0 è una linea di mieiorna di topo utilizzata per la generazione di ibridomi . Cellule NS0 sono coltivate in DMEM supplementato con 10% di FBS inattivato al calore, 10 mM Hepes, 5xl0<-3>mM β-mercaptoetanolo, 2 mM Ultraglut amine , 1% Antibiotico/ antimicotico .

Produzione di anticorpi

La sequenza di BARF1 è stata analizzata utilizzando strumenti bioinformatici .

Sono stati identificati tre epitopi principali : 05/0 CVGKNDKEEAHGVYVS GYLSQ Seq. ID n. 8 0608 CRMKLGETEVTKEHLS Seq. ID n. 9 08/0827-43 ERVTLTSYWRRVSL Seq. ID n.10 I peptidi sono stati coniugati a KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) utilizzando il Kit Imject Maleimide Activated mcKLH (Thermo Sd entific) e utilizzati per la vaccinazione dei topi.

L'ibridoma anti-BARFl è stato derivato dalla fusione di cellule di mieiorna NS0 murino con le cellule della milza di un topo BALB/c che era stato immunizzato una volta per via sottocutanea con 100 pg di ognuno dei peptidi KLH- coniugati in Complete Freund Adjuvant (CFA) e poi due volte con 100 pg di ognuno dei peptidi KLH-coniugati in Incomplete Freund Adjuvant (IFA).

Quando necessario, vaccinazioni supplementari sono state eseguite in IFA.

Le cellule spleniche di topo immunizzato sono state raccolte e fuse con cellule di mieiorna NS0 utilizzando polietilenglicole (PEG) secondo procedure standard.

Dopo la fusione, le cellule sono state seminate in piastre da 96 pozzetti e gli ibridomi sono stati selezionati in un mezzo contenente ipoxantinaaminopterina-timidina (HAT).

Linee di ibridoma in grado di crescere nel mezzo di selezione sono state sottoposte a screening per la reattività anti-BARFl mediante saggio immunoenzimatico (ELISA) e citometria a flusso.

Il test ELISA è stato effettuato come segue: piastre a 96 pozzetti sono state incubate ON a 4°C con 100 microlitri/pozzetto del peptide specifico (10 μg/ml); dopo il blocco con 1% BSA per 2 ore a 37°C, sono state incubate per 1 ora a 37°C con 100 μΐ del surnatante dell'ibridoma e, dopo ripetuti lavaggi, per 1 ora con anticorpo di capra HRP-coniugato antitopo (Ge Healthcare).

Dopo lo sviluppo del segnale usando OPD (Sigma-Aldrich), la reazione è stata bloccata con 50 μΐ di acido cloridrico 3 N e 1'assorbanza è stata letta a 450 nm con un lettore di piastre Victor X3 Multilabel (Perkin Elmer). Per la citometria a flusso, cellule GRANTA-519 sono state marcate con il surnatante dei cloni, poi è stato aggiunto un anticorpo secondario FITC anti-topo (Dako) e le cellule sono state analizzate utilizzando FACSCalibur (BD).

Solo i cloni che hanno dato un segnale positivo valutato mediante citometria a flusso sono stati utilizzati per gli esperimenti successivi.

Il riconoscimento anticorpaie è stato valutato mediante Dot Slot.

Brevemente, sono stati sintetizzati peptidi 8-mer con sovrapposizione di 4-amminoacidi, derivata dal peptide originale 08/0827-43: infatti, il mAb usato per tutti gli esperimenti deriva da un topo immunizzato con guesto peptide.

I peptidi 8-mer e gli originali Ο8/Ο827-43, O5/O8201-221e O6/O8103-120sono stati trasferiti su una membrana PVDF (circa 10 pg/spot, Miilipore).

Dopo aver bloccato con PBS/10% Tween/3% BSA, le piastre sono state incubate con anticorpi mAb anti-BARF1, in seguito con una Ig di capra anti-topo coniugata a HRP, e infine il segnale è stato rilevato utilizzando il substrato EGL Plus Western Blotting Substrate (Pierce).

La chemioluminescenza è stata valutata utilizzando lo strumento XRS ChemiDoc e il software QuantityOne (vers. 4.6) (entrambi da BioRad).

Saggi in vitro

Marcature

Linee cellulari EBV-negative (RAJI, BL-41) e positive (GRANTA-519, C-666 e BL-41 B95.8) sono state marcate con circa 1 pg di anti-BARFl mAb per 15 minuti su ghiaccio e poi con un IgG FITC secondario anti-topo.

Per identificare specificamente BARF1, è stata generata una linea cellulare BARF1 trasdotta.

II plasmide BARF1 è stato gentilmente fornito dal laboratorio del Dottor Dolcetti e utilizzato per trastettare cellule Phoenix come già descritto.

Particelle BARF1 -retrovirali (BARF1-RV) sono state conservate a -80°C.

Una linea cellulare EBV-negativa, MKN-4 5, è stata piastrata (4xl0<6>) con 2 mi BARF1-RV in una piastra da 6 pozzetti in presenza di polibrene (8 pg/ml) .

Dopo centrifugazione (45 min a 1800 rpm) , le cellule sono state incubate a 32°C per 2 ore, e il terreno è stato sostituito con 2 mi di terreno fresco contenente BARF1-RV e polibrene .

Dopo una ulteriore centrifugazione , le cellule MKN-4 5 sono state incubate a 32°C per 4 ore, poi il terreno è stato sostituito con terreno DMEM completo fresco e lasciate una notte a 37°C.

Il giorno seguente , terreno DMEM completo è stato sostituito con 4 mi di BARF1-RV con polibrene e centrifugato; dopo incubazione a 32°C per 5 ore, il mezzo contenente le particelle virali è stato sostituito con DMEM completo e incubato a 37°C.

La selezione con G418 (250 pg/ml, Sigma-Aldrich) è iniziata il giorno successivo .

Dopo una settimana in coltura in presenza di G418, cellule BARFl-trasdotte e cellule di tipo wildtype sono state analizzate per la presenza di BARF1 mRNA mediante RT-PCR.

Le cellule sono state anche analizzate mediante citometria a flusso utilizzando un anticorpo anti-BARF1.

Citotossicità complemento-dipendente (CDC)

Cellule bersaglio (6xl0<5>cellule GRANTA-519, C-666, e Raji) sono state caricate con 100 pCi Na2<51>Cr04(Perkin-Elmer) per 1 ora e 30 minuti a 37°C.

Le cellule sono state poi seminate a 2x10<3>cellule/pozzetto in triplicato e marcate con circa 1 pg anti-BARFl mAb.

Poi, le cellule sono state risospese in 200 microlitri di RPMI contenente 25% di siero umano (non-inattivato al calore, mantenendo in tal modo tutte le proteine del complemento ancora attive; Lonza), per 1 ora a 37°C.

I controlli negativi (o rilascio spontaneo) non erano marcati con il mAb, mentre per il controllo positivo (rilascio massimo) sono stati aggiunti 100 μΐ di Triton 5% (Sigma-Aldrich).

Al termine dell 'incubazione, 100 μΐ di surnatante sono stati valutati per la radioattività utilizzando un contatore γ-ray (Cobra Gamma Counting System, Packard Instrument Company).

L'indice di citotossicità è stato valutato come segue :

C.I. = 100 X %test - %spont

100% - %spont

dove :

%test è la percentuale di citotossicità ottenuta con mAb più complemento,

%spont è la percentuale di citotossicità del solo complemento .

Citolisi cellulo-mediata anticorpo-dipendente (ADCC) ADCC è stata effettuata utilizzando il protocollo calceina-AM (Invitrogen) .

In breve, lxl 0<6>cellule bersaglio sono state risospese in 1 mi di soluzione salina bilanciata di Hank addizionata con 5% FBS (HBSS-FBS, 5,4 mM KC1, 0,3 mM Na2HP04, 0,4 mM K3⁄4P04, 0,2 mM NaHC03, 0,5 mM MgCl2, 0,4 mM MgS04, 137 mM NaCl, il tutto da Sigma-Aldrich) e marcato con 7,5 μΐ di calceina-AM 1 mg/ml per 30 minuti a 37°C.

Le cellule sono state poi marcate con mAb anti-BARF1 ad una concentrazione di 20 pg/ml, 10 pg/ml e 5 pg/ml ; controlli negativi sono stati effettuati solo con HBSS-FBS.

Come controllo positivo, le cellule bersaglio sono state U sate con Triton 5%.

Le cellule sono state seminate, e sono state aggiunte cellule effettrici : PBMC appena scongelati da donatori sani sono stati seminati a diversi rapporti effettore :bersaglio (300:1, 150:1 e 75:1) per 4 ore a 37°C, poi 100 μΐ di surnatante sono stati raccolti e seminati su una piastra opaca a 96 pozzetti (Nunc) .

Dopo 15 minuti a RT, la piastra è stata letta a 485 nm utilizzando lo strumento Victor X3 Multilabel Reader Piate .

La percentuale di lisi (% Lys) è stata calcolata come segue:

% lisi = 100 X test - spont

max - spont

dove :

test è il valore sperimentale,

spont è il valore di cellule bersaglio non trattate, e

max è il valore di controllo positivo.

Saggi in vivo

Biodistribuzione

Per studiare la biodistribuzione degli anti corpi, 1'anti-BARFl monoclonale è stato coniugato con Alexa 680, utilizzando il kit SAIVI Rapid Antibody Labeling Kit (Invitrogen) e seguendo le indicazioni del produttore.

Ai topi SCID sono stati iniettate per via sottocutanea su un fianco una linea cellulare EBV-negativa (come MKN-45) e sull'altro una linea cellulare EBV-positiva (come BARF1-MKN-45, C-666 o SNU-719).

Non appena entrambi i tumori sono diventati palpabili, 100 pg di anticorpo Alexa-680 anti-BARFl sono stati iniettati nella vena caudale dell'animale anestetizzato ed il segnale di fluorescenza è stato analizzato ogni 24 ore utilizzando il dispositivo eXplore Optix (Ge Healthcare).

L'intensità di fluorescenza rilevata sulle masse tumorali è stata confrontata e la tendenza analizzata con il test statistico ANOVA per misurazioni ripetute.

Terapia

I topi sono stati tenuti in gabbie di plastica, a temperatura costante e con una dieta equilibrata in uno stabulario SPF (Specific Pathogen Free).

Le procedure che coinvolgono gli animali e la loro cura sono state condotte secondo le linee guida istituzionali in conformità con le leggi nazionali (D.Lgs. N° 116/92) e CEASA (Università di Padova, Comitato Etico per la sperimentazione sugli animali). Tutti gli esperimenti di crescita in vivo del tumore sono stati condotti secondo le linee guida del Comitato di Coordinamento di Ricerca sul Cancro del Regno Unito (UKCCCR) (Cancer Metastasis 1989, "UKCCCR guide1ines for thè welfare of animals in experimental neoplasia").

Topi SCID e RAG<_/_>Y-chain<_/~>di età da sei a otto settimane sono stati iniettati s.c. con 5xl0<6>cellule GRANTA-519 o C-666.

I topi sono stati poi divisi in gruppi non trattati e trattati, ricevendo rispettivamente 1 mi di PBS o 1 mg anti-BARFl monoclonale (5 iniezioni i.p. di 0,2 mi ciascuno, uno ogni due giorni).

La massa tumorale è stata valutata ogni due giorni misurando il diametro massimo e minimo, ed è stata calcolata applicando la formula:

Tmass = d<2>X D

2

dove d è il diametro minimo e D il diametro massimo.

Al fine di valutare meglio la cinetica di crescita dei tumori, è stato utilizzato un approccio di imaging in vivo basato sulla luciferasi.

A tal fine, le linee di cellule tumorali sono state trasdotte con 1'enzima luciferasi. Brevemente , particelle lentivirali codificanti la luciferasi (LV-LUX) sono state prodotte in cellule 293T per cot rasfezione transitoria del vettore (pHR'tripCMV-luc2-IRES-tNGFR-S IN) , il plasmide envelope (HCMV-G) e di packaging (p8.74), seguendo un protocollo già pubblicato .

Il virus è stato raccolto 48 e 72 ore dopo la trasfez ione, e concentrato mediante ultracentrifugazione .

5xl0<5>cellule GRANTA-519 e C-666 sono state raccolte e risospese in 1 mi di mezzo RPMI completo con LV-LUX concentrato (da 3 a 5 volte).

Le cellule sono state incubate ON a 37 °C in presenza del virus , poi il surnatante contenente i virioni è stato scartato ed è stato aggiunto mezzo fresco .

Settantadue ore dopo 1'infezione , 2x10<5>cellule sono state raccolte , risospese in 50 microlitri di PBS e piastrati in una piastra opaca a 96 pozzetti (Nunc).

Poi, 50 μΐ di D-Luciferin (0,3 mg/mi, Caliper ) sono stati aggiunti alle cellule per 5 minuti, e la piastra è stata analizzata utilizzando IVIS Lumina II .

Cellule GRANTA-519 e C-666 luciferasi-trasdotte sono state iniettate s.c. in topi SCID (5x10V 200 μΐ RPMI/topo) al giorno 0.

Al giorno 7 , i topi iniettati sono stati suddivisi casualmente in due gruppi , uno dei quali trattato con 0,3 mg/topo di anti-BARFl mAb settimanalmente .

Gli animali anestetizzati i.p. (1-3% isoflurano, Meri al Italia SpA) sono stati iniettati con 150 mg/kg di D-Luciferin in PBS. Otto minuti dopo 1'iniezione di luci ferina, i topi sono stati analizzati per 1 'emissione di fotoni usando IVIS Lumina II.

La stessa analisi è stata effettuata settimanalmente e la luminosità media di fotoni (espressa come p/sec/cm<2>/sr) è stata valutata .

In un esperimento diverso, topi SCID sono stati iniettati i.v. con 3xl0<6>cellule GRANTA-519 e C-666 luciferasi-t ras dotte.

Poi, parte dei topi è stata trattata con 0,3 mg/topo di anti-BARFl mAb a partire dal giorno 7 e poi settimanalmente .

Tutti i topi sono stati analizzati settimanalmente utilizzando IVIS Lumina II.

Alla fine di ogni acquisizione, è stata ottenuta un 'immagine fotografica .

Le immagini di bioluminescenza a pseudocolori sono mostrate sovrapposte a immagini dei topi in scala di grigi, con il segnale più intenso rilevato della luciferasi mostrato in rosso e il segnale più debole indicato in blu.

Analisi statistiche

Sia per la crescita del tumore sia per 1'analisi di bioluminescenza, le analisi statistiche sono state condotte utilizzando il software MedCalc , versione 9.4 .2.0, applicando di volta in volta i test più appropriati .

I diagrammi di sopravvivenza e 1'analisi dei dati di sopravvivenza (utilizzando test di Kaplan-Meier ) sono stati effettuati con lo stesso software statistico.

Risultati

Produzione di anticorpi

Topi convenzionali BALB/c sono stati immunizzati in base ad un programma di routine con peptidi (05/08, 06/08 e 08/08; Fig. la) coniugati a KLH, ed i sieri sono stati raccolti e analizzati mediante test ELISA.

Tutti i peptidi hanno dato valori di assorbanza elevati anche ad altissima diluizione dopo 1'immunizzazione , dimostrando così 1'immunogenicità di peptidi KLH-coniugati .

D 'altra parte, poiché BARF1 viene espresso sulla superficie delle cellule infettate , abbiamo marcato la linea cellulare GRANTA-5 19, una linea cellulare umana di linfoma mantellare a cellule B esprimente EBV e BARF1 mRNA, con sieri dei topi e 1'analisi è stata condotta tramite citometria a flusso.

Dopo una prima serie di 3 vaccinazioni , le cellule GRANTA-5 19 sono risultate negative, il che ha richiesto vaccinazioni supplementari dei topi prima che un opportuno segnale venisse rilevato .

E interessante notare che i titoli di immunoglobuline , come valutato dal test ELISA, sono rimasti guasi allo stesso livello, il che indica che gli anticorpi sono già presenti a titolo elevato nei topi dopo un normale programma di immunizzazione, ma solo dopo vaccinazioni ripetute alcune Ig sono in grado di riconoscere epitopi naturalmente conformati e fisiologicamente presentati sulla superficie delle cellule .

Dopo la generazione di ibridomi e la selezione eseguita mediante ELISA e citometria a flusso, solo un clone (3D4, derivato da un topo immunizzato con peptide 08/08) è stato scelto per la successiva analisi.

La isotipizzazione ha rivelato che appartiene alle immunoglobuline IgG2a.

Come prima prova di riconoscimento di BARF1, 1'anticorpo è stato testato mediante saggio Dot Blot: i peptidi utilizzati per 1'immunizzazione, ed i peptidi 8-mer, derivati dal peptide 08/08 e sovrapposti per 4 aminoacidi, sono stati ancorati ad una membrana PVDF per individuare e confermare 1'epitopo riconosciuto dall'anticorpo anti-BARFl.

L'analisi Dot blot ha rivelato che il mAb non riconosce peptidi non collegati (05/08 e 06/08), mentre il peptide 08/08 è marcato positivamente.

Inoltre, dal peptide 08/08 sono stati creati due peptidi supplementari, che vanno da AA 1 a 8 (08/08-1) e 4-12 (08/08-2):

08/08-1 RVTLTSYW Seq. ID n. 11

08/08-2 TSYWRRVS Seq. ID n. 12

Solo il peptide 08/08-1 è stato riconosciuto dall' anticorpo anti-BARFl, indicando così che 1'epitopo riconosciuto risiede nella sua sequenza (Fig. lb).

L'analisi BLAST del peptide rivela che la sequenza è specifica per la proteina BARF1 e per il fattore stimolante le colonie umano 1 (hCSF-1), che è già stato descritto condividere alta omologia con la proteina BARF1 .

Saggi in vitro

Colorazione mediante immunofluorescenza

L'anticorpo anti-BARFl stato usato per marcare linee cellulari tumorali appartenenti a diversi istotipi e con o senza la presenza di EBV.

Anche se con diverse capacità di colorazione, il clone 3D4 ha mantenuto la capacità di colorare le cellule BARF1 -positive, mentre le cellule BARF1-negative sono rimaste negative (Fig. le).

Le differenze di colorazione delle cellule positive possono essere attribuite con buona probabilità all 'espressione differenziale di BARF1 : infatti , sono disponibili poche informazioni sull' espressione di BARF1 sulla superficie cellulare, in modo che possiamo aspettarci un' espressione proteica differenziale su linee cellulari differenti o sulla stessa linea cellulare ma a diversi stadi di coltura (in mezzo fresco piuttosto che in uno acidificato) .

Inoltre , è stata descritta la scissione del dominio extracellulare di BARF1, anche se la percentuale di scissione è ancora da chiarire.

Al fine di definire più precisamente la specificità dell' anticorpo per il suo bersaglio, abbiamo generato un modello cellulare che esprime BARF1 : la marcatura della linea cellulare BARF1-tras dotta MKN-4 5 con anti-BARF1 mAb ha rivelato un'alta positività, rispetto alla forma wild type (Fig. ld) , dimostrando così la specificità dell 'anticorpo generato .

CDC e ADCC

La lisi complemento-mediata (CDC) è stata valutata in un saggio standard di rilascio di cromo. Anche in guesta prova, abbiamo utilizzato sia linee cellulari EBV-positive che negative come cellule bersaglio .

La Figura 2a mostra un esperimento rappresentativo, nelle migliori condizioni sperimentali (rapporto E:T 300:1).

Linee cellulari EBV-positive (GRANTA-519, C-666 e BL-41 B95.8) sono state U sate guando esposte al complemento, mentre la lisi della linea cellulare BL41 (linea cellulare EBV-negativa) era quasi paragonabile al segnale di fondo.

Come è stato descritto per 1'analisi citof luorimetrica, abbiamo sperimentato diverse percentuali di lisi per le diverse linee di cellule, che, di nuovo, possono essere ascrivibili all 'espressione differenziale di BARF1 sulla superficie cellulare (Fig. 2a).

E stato eseguito un saggio di citotossicità cellulo-mediata dipendente da anti corpi (ADCC) utilizzando Calcein AM.

Anche per questo test sono state usate cellule EBV-positive (GRANTA-519, C-666) e negative (BL-41), mentre come cellule effettrici sono stati utilizzati PBMC da Buffy Coat (Fig. 2b).

La Figura 2b è rappresentativa dei diversi esperimenti effettuati .

La più alta lisi cellulare BARF1 -positiva è stata ottenuta con 20 pg/ml di clone 3D4 ad un rapporto effettori :target di 300:1.

E' stata valutata nei PBMC la popolazione NK (CD16 e CD56 positiva): la percentuale di cellule NK è stato quantificata tra il 12 % e il 15% della popolazione totale .

Saggi in vivo

Biodistribuzione

Per 1'analisi di biodistribuzione è stato analizzato il segnale di fluorescenza dell'anticorpo anti-BARFl coniugato a Alexa-680 in topi portatori di masse tumorali EBV-positive e negative.

I topi sono stati iniettati in un fianco con cellule MKN-45 e dall'altro con cellule MKN-45 trasdotte con BARF1.

L'analisi è stata eseguita giornalmente per una settimana ed i valori di intensità di fluorescenza riportati per le due masse tumorali.

L'analisi statistica ha rivelato che 1'anticorpo si accumula specificamente nella massa tumorale positiva per BARF1 (Fig. 3, p <0,01).

Terapia

Le linee cellulari tumorali sono state iniettate in topi SCID per valutare la capacità terapeutica di anti corpi anti-BARFl in un modello di topo.

Cellule C-666 sono state iniettate per via sottocutanea in topi SCID e parte di essi sono stati trattati con mAb anti-BARFl.

L'analisi statistica della cinetica di crescita tumorale di topi trattati rispetto al controllo ha rivelato che 1 'iniezione di mAb anti-BARFl ha rallentato e ridotto la crescita tumorale (p=0.0028, p=0 .002 e p=0 .0026 ai giorni 24, 26, e 28, rispettivamente; Fig. 4a).

Dopo 30 giorni, 1'effetto terapeutico del trattamento decade, e la massa tumorale C-666 inizia a crescere rapidamente anche nel gruppo trattato.

Al contrario, in topi iniettati per via sottocutanea con cellule RAJI, il trattamento non ha dato alcuna riduzione della massa tumorale , come previsto dai risultati in vitro.

Cellule C-666 sono state anche iniettate per via sottocutanea in topi RAG Y-chain (che mancano di cellule B, T e NK funzionali) , ma non è stata osservata alcuna differenza tra il controllo ed il gruppo trattato (p=0,77 ; dati non mostrati ), indicando così che la modalità d 'azione principale del mAb selezionato è probabilmente ADCC.

Per 1 'analisi della stessa linea cellulare iniettata tramite la vena caudale, è stato impiegato un modello di bioluminescenza: infatti, cellule C-666 sono state trasdotte con 1 'enzima luciferasi ed iniettate per via endovenosa in topi.

Il modello tumorale di topo è stato analizzato settimanalmente con 1'apparecchiatura IVIS Lumina II, e il numero di fotoni all'interno di un'area di interesse è il parametro utilizzato per 1'analisi statistica.

Come indicato in precedenza per la cinetica di crescita s.c. del tumore, la progressione del tumore C-666 è stata rallentata dal trattamento con anticorpi anti-BARFl (Fig. 4b).

L'analisi statistica è stata effettuata sulla radianza media (Fig. 4c), rivelando una progressione migliore per il gruppo trattato (n = 12) rispetto al controllo (n = 12) (p<0.001 al giorno 49), dimostrando così un'attività terapeutica anti-BARFl mAb.

Infine, abbiamo analizzato la sopravvivenza dei topi trattati e di controllo, che ha delineato un miglioramento significativo nel gruppo trattato vs. il gruppo di controllo (dati non mostrati).

Gli stessi esperimenti sono stati effettuati utilizzando la linea cellulare GRANTA-519.

Nel gruppo di controllo la crescita del tumore è veloce e aggressiva, mentre nei topi trattati con mAb è ridotta significativamente (p<0,05 al giorno 21; Fig. 5a).

Come già descritto, la stessa prova quando effettuate in topi RAG<_/_>Y-chain<_/_>non ha rivelato una differenza significativa nella crescita tumorale, sottolineando così 1 'importanza di ADCC come meccanismo di citotossicità mediata dall' anticorpo anti-BARFl (p=0,14; dati non mostrati).

Inoltre , cellule GRANTA-519 sono state trasdotte con il gene della lucif erasi , iniettate i.v . e analizzate con bioluminescenza .

Anche in questo contesto, 1 'analisi statistica della sopravvivenza ha mostrato un andamento migliore dei topi trattati rispetto al controllo (p=0.002; Fig. 5b).

Lo studio ha rivelato che anche in questa condizione il trattamento con mAb anti-BARFl ha rallentato la diffusione del tumore rispetto al gruppo di controllo (p<0,05 al giorno 21; Fig. 5c e 5d) .

Claims (4)

1. RIVENDICAZIONI 1. Anticorpo monoclonale diretto contro il recettore BARF1 o epitopi cellulari omologhi comprendente almeno un dominio variabile di catena pesante e un dominio variabile di catena leggera, il dominio variabile della catena pesante VH comprendente le sequenze CDR1, CDR2, CDR3 codificate rispettivamente dalla SEQ.ID. n.3, SEQ.ID. n.4 e SEQ.ID. n.5, il dominio variabile della catena leggera comprendente le sequenze CDR1, CDR2, CDR3 della catena leggera VK codificate rispettivamente dalla sequenza della SEQ.ID. n. 6, dalla sequenza: AGCACATCC e dalla sequenza della SEQ.ID. n. 7.
2. 2. Anticorpo monoclonale diretto contro il recettore BARF1 o epitopi cellulari omologhi secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il dominio variabile della catena pesante è codificato dalla sequenza corrispondente alla SEQ. ID. n. 1 e il dominio variabile della catena leggera è codificato dalla sequenza corrispondente alla SEQ. ID. n. 2. 3. Anticorpo monoclonale diretto contro il recettore BARF1 o epitopi cellulari omologhi secondo la rivendicazione 1 o 2, caratterizzato dal fatto di essere scelto nel gruppo che comprende immunoglobuline intere e frammenti immunoglobulinici comprendenti almeno un dominio variabile di catena pesante ed un dominio variabile di catena leggera. 4. Anticorpo monoclonale diretto contro il recettore BARF1 o epitopi cellulari omologhi secondo la rivendicazione precedente, caratterizzato dal fatto di essere scelto nel gruppo che comprende frammenti Fab, frammenti F(ab')2, frammenti Fv a catena singola (SCFv). 5. Anticorpo monoclonale diretto contro il recettore BARF1 o epitopi cellulari omologhi secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui un frammento Fv a catena singola (scFv) è legato a domini di trasduzione del segnale linfoidi. 6. Anticorpo monoclonale diretto contro il recettore BARF1 o epitopi cellulari omologhi secondo la rivendicazione precedente, in cui detti domini di trasduzione del segnale linfoidi comprendono; CD28, CD3C, CD137, OX-40. 7. Anticorpo monoclonale diretto contro il recettore BARF1 o epitopi cellulari omologhi secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto di essere murino o umanizzato . 8. Una sequenza nucleotidica scelta nel gruppo che consiste della SEQ. ID, n. 1 codificante la porzione variabile della catena pesante di un anticorpo anti-BARF1, SEQ. ID. n. 2 codificante la porzione variabile della catena leggera di un anticorpo anti-BARF1, SEQ. ID. n.
3. 3, SEQ. ID. n.
4. 4, SEQ. ID. n. 5 codificanti rispettivamente le sequenze CDR1, CDR2 e CDR3 di detta catena pesante, SEQ. ID. n. 6, la sequenza: AGCACATCC, e SEQ. ID. n. 7, codificanti rispettivamente le sequenze CDR1, CDR2 e CDR3 di detta catena leggera. 9. Anticorpo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti da 1 a 7 per il trattamento, la cura o la diagnosi di patologie correlate al virus Epstein-Barr (EBV) o comunque esprimenti epitopi omologhi a quello di BARF1 riconosciuto da detto anticorpo. 10. Anticorpo secondo la rivendicazione precedente in cui dette patologie sono scelte nel gruppo che comprende: il carcinoma nasofaringeo (NPC) , il linfoma di Hodgkin (HL), il linfoma di Burkitt, alcuni linfomi non-Hodgkin EBV+ a cellule T e a cellule NK, ed il carcinoma gastrico (GC). 11. Metodo per la preparazione di Chimeric Antigen Receptor comprendente 1'impiego dell'anticorpo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti da 1 a 7. 12. L'anticorpo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti da 1 a 7 per uso medico. 13. L'anticorpo secondo la rivendicazione precedente per l'uso medico nella trasduzione di cellule linfoidi per immunoterapia adottiva. 14. Il peptide virale antigenico 08/08 avente la sequenza corrispondente alla SEQ. ID n. 10 e gli omologhi cellulari quali epitopi immunogenici. 15. Il peptide virale antigenico 08/08-1 avente la sequenza corrispondente alla SEQ. ID n. 11 e gli omologhi cellulari quali epitopi immunogenici. 16. Il peptide virale antigenico 08/08-1 secondo la rivendicazione precedente per l'uso medico. 17. Il peptide virale antigenico 08/08-1 secondo la rivendicazione precedente per 1' uso medico nell'immunizzazione e nella vaccinazione. 18. Una preparazione farmaceutica comprendente una quantità efficace dell'anticorpo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7 o di uno dei peptidi di ciascuna delle rivendicazioni 14 o 15, ed eccipienti farmaceuticamente accettabili.