RS59024B1 - Anti-phf-tau antitela i njihove upotrebe - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Prikazani pronalazak se odnosi na anti-PHF-tau antitela, i postupke njihovog dobijanja i korišćenja.

Stanje tehnike pronalaska

[0002] Alchajmerova bolest (Alzheimer’s Disease-AD) je degenerativan poremećaj mozga karakterisan kliničkim progresivnim gubitkom memorije, opažanja, rezonovanja, rasuđivanja i emocionalne stabilnosti koji postepeno vodi do duboke metalne dezorijentacije i neizbežno smrti. AD je veoma uobičajeni uzrok progresivnog mentalnog pogoršanja (demencije) kod ljudi u godinama i veruje se da predstavlja četvrti najčešći medicinski uzrok smrtu u Sjedinjenim Američkim Državama. AD je primećen u etničkim grupama širom sveta i predstavlja glavni sadašnji i budući problem javnog zdravlja.

[0003] Mozgovi pojedinaca sa AD pokazuju karakteristične lezije koje se nazivaju senilni (ili amiloidni) plakovi, amiloidna angiopatija (amiloidni depoziti u krvnim sudovima) i neurofibrilarni čvorovi. Veliki broj ovih lezija, naročito amiloidnih plakova i neurofibrilarnih čvorova parnih heliksnih filamenata, se generalno nalaze u nekoliko područja humanog mozga važnih za funkcije pamćenja i opažanja kod pacijenata sa AD.

[0004] Glavna proteinska komponenta neurofibrilarne degeneracije kod AD i nekoliko ostalih neurodegenerativnih bolesti je hiperfosforilovani oblik mikrotubule u vezi sa tau proteinom. Razvijanje terapeutske prevencije ili kliringa tau nakupina su od interesa godinama, ali kandidati za lekove, uključujući jedinjenja protiv nakupina i inhibitore kinaza, su tek ušli u kliničko ispitivanje (Brunden, et al. Nat Rev Drug Discov 8:783-93, 2009).

[0005] WO 93/08302 opisuje monoklonalna antitela koja su usmerena protiv nakupina proteina u vezi sa mikrotubulama. WO 95/17429 opisuje monoklonalna antitela specifična za PHF-tau. WO 96/04309 opisuje monoklonalna antitela specifična za epitop posebne podklase ili oblika fosforilovanog tau. WO 2010/144711 opisuje imunološko ciljanje patoloških tau proteina. Brion et al. (1993) Journal of Neurochemistry 60(4):1372-1382 beleži da neurofilamentna monoklonalna antitela RT97 i 8D8 prepoznaju različito modifikovane epitope u parnom heliksnom filamentu -τ kod Alchajmerove bolesti. Hasegawa et al. (1993) Journal of Neurochemistry 60(6):2068-2077 opisuje karakterizaciju dva različita monoklonalna antitela do parnih heliksnih filamenata. Goedert et al. (1994) Biochemical Journal 301(3):871-877 opisuje mapiranje epitopa monoklonalnih anitela do parnih heliksnih filamenata Alchajmerove bolesti. Condamines et al. (1995) Neuroscience Letters 192(2):81-84 opisuje novi imunotest za mapiranje neurofibrilarne degeneracije kod Alchajmerove bolesti. Hasegawa et al. (1996) FEBS Letters 384:25-30 opisuje karakterizaciju mAb AP422, fosforilaciono zavisno monoklonalno antitelo protiv tau proteina. Hoffmann et al. (1997) Biochemistry 36(26):8114-8124 beleži da jedinstveni specifični epitopi parnih heliksnih filamenta Alchajmerove bolesti uklučuju dvostruku fosforilaciju na specifičnim mestima. Jicha et al. (1997) Journal of Neurochemistry 69(5):2087-2095 opisuje konformaciono i fosforilaciono zavisno prepoznavanje antitela koja prepoznaju parne heliksne filamente Alchajmerove bolesti. Singer et al. (2006) Biochemical and Biophysical Research Communications 346(3):819-828 opisuju susedna fosforilaciona mesta kao PHF-tau specifične markere za Alchajmerovu bolest. Porzig et al. (2007) Biochemical and Biophysical Research Communications 358(2):644-649 opisuju mapiranje mAbs AT8 i Tau5 usmerenih protiv hiperfosforilizovanih regiona humanog tau proteina. Mercken et al. (1992) Acta Neuropathol. 84(3):265-272 beleži da monoklonalna antitela sa selektivnom specifičnošću za Alchajmerov Tau su usmerena protiv epitopa osetljivih na fosfatazu. US 2011/143443 opisuje izolovani monoklonsi vezni protein tau i kit. US 2011/059093 opisuje upotrebu anti-tau ps422 antitela za lečenje bolesti mozga .

[0006] Nedavno, predlinički dokazi su izvedeni na modelu transgenih tau miševa gde aktivna i pasivna imunizacija za tau može imati terapeutski potencijal (Chai, et al. J Biol Chem 286:34457-67, 2011, Boutajangout, et al. J Neurochem 118:658-67, 2011, Boutajangout, et al. J Neurosci 30:16559-66, 2010, Asuni, et al. J Neurosci 27:9115-29, 2007). Transmisija tauopatje i širenje hipoteze je skoro opisano i zasnovano je na Braak-ovim stupnjevma progresije tauopatije na humanom mozgu i širenja tauopatije posle injekcije tau nakupina na predkliničkim tau modelima (Frost, et al. J Biol Chem 284:12845-52, 2009, Clavaguera, et al. Nat Cell Biol 11:909-13, 2009). Prema tome, postoji potreba za lekovima za prevenciju tau nakupina i progresiju tauopatije za lečenje AD i drugih neurodegenerativnih bolesti.

Kratak opis slika nacrta

[0007]

Slika 1 prikazuje kompeticiju obeleženih AT8 sa različitim anti-tau antitelima.

Slika 2 prikazuje kompeticiju obeleženih PT1 sa različitim anti-tau antitelima.

Slika 3 prikazuje kompeticiju obeleženih PT3 sa različitim anti-tau antitelima.

Slika 4 prikazuje kompeticiju obeleženih AT100 sa različitim anti-tau antitelima.

Slika 5 prikazuje kompeticiju obeleženih HT7 sa različitim anti-tau antitelima.

Slika 6 (A) Analiza fosforilovanog tau u homogenatima moždanog stabla (frakcija P1) ženskih transgenih životinja P301L starih 5 meseci tretiranih sa rastvorom soli, mišjim IgG1, PT3 ili AT8 kao što je navedeno na slici, ili iz netretiranih netransgenih životinja (B6). ELISA je obavljen pomoću AT8 (levi panel) ili AT100 (desni panel) kao uhvaćena antitela praćena biotinilovanjem-HT7 i avidin-HRP. ELISA signali su prikazani kao relativna količina homogenata AD mozga (ng/ml) koja obazbeđuje isti ELISA signal kao srednju vrednost uzoraka iz netransgenih životinja (B6). Podaci su prikazani pojedinačno zajedno sa srednjom vrenošću /-S.D. p vrednosti za razlike između životinja tretiranih sa PT3-i IgG1-su naznačene. (B) Western blot homogenata moždanog stabla frakcije PI iz životinja tretiranih sa IgG1 -ili PT3- pomoću AT100. Signal iz homogenata 10 životinja tretiranih sa IgG1 (IgG1-1 to IgG1-10) i 7 životinja tretiranih sa PT3 (PT3-1, PT3-2, PT3-7 do PT3-10 su prikazani. Aktin je korišćen kao kontrola.

Slika 7 Nivoi ukupnog tau u sarkozil rastvornim (pT4 rastvornom), ukupni tau u nerastvornim (pT4 nerastvornom) i fosforolizovanom tau u nerastvornim (AT8 nerastvornom) homogenatima korteksa dobijenih iz transgenih miševa P301L starih 5 meseci tretiranih sa PT3 ili izotipnom kontrolom (IgG) kako je označeno na slici. Nivoi su prikazani kao mera signala iz individulano prikazanih ELISA zajedno sa srednom vrednošću /-SD. Uzorak 1m inj je pozitivna kontrola koja potiče iz mišjeg mozga P301L injektovanog sa tau nakupnom.

Suština pronalaska

[0008] Pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje vezuje PHF-tau koji sadrži VH sa SEQ ID NO: 37 i VL sa SEQ ID NO:38, ili njihovu humanizovanu verziju, gde pomenuta humanizovana verzija ima afinitet naspram PHF-tau sa konstantom disocijacije (KD) manjom od ili jednakom 10<-10>M, kako je određeno sa ProteOn.

[0009] Još jedan aspekt pronalaska su polimukleotidi koji kodiraju antitelo prema pronalasku ili njegov fragment.

[0010] Još jedan aspekt prema pronalasku je vektor koji sadrži polinukleotide prema pronalasku.

[0011] Još jedan aspekt prema pronalasku je ćelija domaćina koja sadrži vektor prema pronalasku.

[0012] Još jedan aspekt prema pronalasku je postupak pripremanja antitela koje vezuje PHF-tau koji obuhvata kultivisanje ćelije domaćina prema pronalasku i regeneraciju antitela proizvedenog od strane ćelije domaćina.

[0013] Pronalazak dalje obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo prema pronalasku i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0014] Pronalazak dalje obezbeđuje antitelo prema pronalasku za upotrebu u lečenju ili prevenciji, ili smanjenju simptoma, neurodegenerativne bolesti koja uključuje patološko nakupljanje tau u mozgu.

Detaljni opis prema pronalasku

[0015] Izraz "antitela" ovde u širem smislu označava i obuhvata imunoglobulin ili molekule antitela uključujući poliklonalna antitela, monoklonalna antitela uključuju mišja, humana, prilagođena humana, humanizovana i himerna monoklonalna antitela i fragmente antitela.

[0016] Generalno, antitela su proteini ili peptidni lanci koji pokazuju specifičnost vezivanja za specifični antigen. Strukture antitela su dobro poznate. Imunoglobulini mogu biti razvrstani u pet glavnih klasa , naime IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, u zavisnosti od aminokiselinske sekvence konstantog domena teškog lanca. IgA i IgG su dalje podklasifikovani kao izotipovi IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. Laki lanci antitela bilo koje vrste kičmenjaka mogu biti razvrstani u jednu od dva jasno različita tipa, naime kapa (κ) i lambda (λ), na osnovu aminokiselinskih sekvenci njihovih konstatnih domena.

[0017] Izraz "fragmenti antitela" označava deo intaktnog tela. Primeri framenata antitela uključuju Fab, Fab’, F(ab’)2i Fv fragmente, CDR, mesto vezivanja antigena, promenjive regione teškog ili lakog lanca, diatela, molekulske jednolančanog antitela i višespecifična antitela obrazovana od bar dva intaktna antitela ili njihovih fragmenata.

[0018] Varjabilni region lakog ili teškog lanca imunoglobulina sastoje se od regiona "okvira" prekinutog sa "mestima vezivanja antigena". Mesta vezivanja antigena su definisana pomoću različitih izraza kao što sledi: (i) regioni određivanja komplementarnosti (Complementarity Determining Regions-CDRs) su zasnovani na varjabilnosti sekvence (Wu and Kabat J Exp Med 132:211-50, 1970). Generalno, mesta vezivanja antigena imaju tri CDRs u svakom promenjivom regionu (HCDR1, HCDR2 i HCDR3 u promenjivom regionu teškog lanca (VH) i LCDR1, LCDR2 i LCDR3 u promenjivom regionu lako lanca (VL)) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991). (ii) Izraz "hipervarjabilni region", "HVR", ili "HV" odnosi se na regione varjabilnog domena antitela koji su hipervarjabilne strukture kao što je definisano kod Chothia and Lesk (Chothia and Lesk J Mol Biol 196:901-17, 1987). Generalno, mesta vezivanja antigena imaju tri hipervarjabilna regiona u svakom VH (HI, H2, H3) i VL (L1, L2, L3). Chothia and Lesk se odnose na strukturno konzervirane HVs kao "kanonske strukture". Sistem numeracije kao i oznaka CDRs i HVs su nedavno revidirane od strane Abhinandan and Martin (Abhinandan and Martin Mol Immunol 45:3832-9, 2008). (iii) Još jedna definicija regiona koji obrazuje mesto koje vezuje antigen je predložena od strane Lefranc (Lefranc, et al. Dev Comp Immunol 27:55-77, 2003) na osnovu upoređivanja domena V iz imuoglobulina i T-ćelijskih receptora. The International ImMunoGeneTics (IMGT) baza podataka (http:_//www_imgt_org) obezbeđuje standardizovanu numeraciju i definiciju ovih regiona. Korespodencija između CDRs, HVs i IMGT delineacija je opisana u Lefranc et al., supra, (iv) Mesto vezivanja antigena može takođe biti ocrtano na osnovu korišćenja ostatka za određivanje specifičnosti (Specificity Determining Residue Usage-SDRU) (Almagro J Mol Recognit 17:132-43, 2004), gde ostaci koji određuju specifičnost (Specificity Determining Residues SDR), se odnose na aminokiselinske ostatke imunogloblina koji su direktno uključeni u kontant antigena.

[0019] "Okvir" ili "sekvenca okvira" su preostale sekvence u okiru varjabilnog regiona antitela drugačije od onih definisanih kao sekvence mesta za vezivanje anitgena. Zbog toga što tačna definicija mesta za vezivanje antigena može biti određena sa različitim delinacijama kao što je ovde opisano, tačan okvir sekvence zavisi od definicije mesta vezivanja antigena.

[0020] Izraz "monoklonalno antitelo" (mAb) koji je ovde korišćen se odnosi na anitelo (ili fragment anitela) dobijen iz populacije suštinski homogenih anitela. Monoklonalna antitela su visoko specifična, tipično se odnose protiv pojedinačnih antigenih determinanti.

[0021] Izraz "epitop" kako je ovde opisan označava deo antigena za koji se antitelo specifično veže. Epitopi se uglavnom sastoje od hemijski aktivne (kao što je polarna, nepolarna ili hidrofobna) površine koja grupiše ostatke kao što su aminokiseline, fosforilovane aminokiseline ili polisaharidne bočne lance i mogu imati specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao što su specifične karakteristike naelektrisanja. Epitop može biti linearan po svojoj prirodi ili može biti diskontinualni epitop, npr., konformacioni epitop, koji je obrazovan sa prostornim odnosom između nesusednih aminokiselina antigena pre nego linearnom serijom aminokiselina. Konformacioni epitop uključuje epitope koji su proizvod savijanja antigena, gde aminokiseline iz različitih delova linearne sekvence antigena dolaze u blizinu u 3-dimenzionalnom prostoru.

[0022] Tau je oblian protein u centralnom i perifernom nervnom sistemu koji ima višestruke dobro poznate izooblike. U centralnom CNS, šest glavnih tau izooblika koji imaju veličinu od 352 do 441 postoje usled alternativnog spjasovanja (Hanger, et al. Trends Mol Med 15:112-9, 2009). Ovi izooblici se razlikuju jedan od drugog regulisanom inkluzijom 0-2 N-terminalnih inserta, i 3 ili 4 tandemski raspoređenja ponovka koji vezuju mikrotubule, i nazivaju se 0N3R (SEQ ID NO:1), 1N3R (SEQ ID NO:2), 2N3R (SEQ ID NO:3), 0N4R (SEQ ID NO:4), 1N4R (SEQ ID NO:5) i 2N4R (SEQ ID NO:6). Izraz "kontrolni tau" kako je ovde korišćen odnosi se na tau izooblik SEQ ID NO:6 koji je lišen fosforilacije i drugih posttranslacionih modifikacija.

[0023] Tau vezuje mikrotubule i reguliše transport tereta kroz ćeliju, postupak koji može biti izmenjen sa tau fosforilacijom. Kod AD i srodnih poremećaja abnormalna fosforilacija tau preovlađuje i misli se da prethodi i/ili aktivira agregaciju tau u fibrile, nazvane parni helikski filamenti (PHF). Glavni sadtojak PHF je hiperfosforilovani tau. Izrazi "parni heliskni filament-tau" ili "PHF-tau" kako je ovde korišćeno odnosi se na dobro poznate tau nakupine u parnim heliksnim filamentima. Dva glavna regiona u PHF strukturi su evidentna u elektronskoj mikroskopiji, dlakasti omotač i jezgro filamenta; dlakasti omotač je osetljiv na proteolizu i lociran je sa spoljne strane filamenta, a jezgro filamenta otporno na proteaze stvara osnovnu strukturu PHFs (Wischik, et al. Proc Natl Acad Sci USA 85:4884-8, 1988).

[0024] "Antitela koja vezuju PHF-tau" kako se ovde koristi se odnosi na antitela koja vezuju PHF-tau kao što je procenjeno na western blot-u. Tipično, vezivanje antitela za PHF-tau može biti procenjeno posle Coomassie bojenja od oko 500 ng PHF-tau posle 1 sata blokiranja u 5% (w/v) nemasnom suvom mleku (NFDM) TBS-T, 0.05% Tween-20. Antitela koja vežu PHF-tau opciono se ne vezuju za kontrolni tau (SEQ ID NO:6) kao što je mereno western blot-om kada je testirao u uslovima opterećenja antigena, gde obe kontrole tau i PHF-tau se detektuju jednako sa tau antitelima koja imaju preference za PHF-tau epitope (npr. antitelo HT7, (ThermoScientific, Rockford, IL) (Mercken, et al. J Neurochem 58:548-53, 1992). Takvi primeri uslova opterećenja antigenom su 500ng PHF-tau i 200 ng kontrolni tau.

[0025] Ovde su korišćeni dobro poznati konvencionalni kodovi aminokiselina sa jednim i tri slova.

Kompozicije materije

[0026] Prikazani pronalazak se odnosi na anti-PHF-tau antitela i upotrebu takvih antitela. Takva anti-PHF-tau antitela mogu imati osobine vezivanja fosforilaovanog epitopa na PHF-tau ili vezivanja za nefosforilovani epitop na PHF-tau. Anti-PHF-tau antitela mogu biti korišćena kao terapeutska sredstva i kao regensi pri istraživanju ili dijagnozi za detektovanje PHF-tau u biološkim uzorcima, na primer u tkivima ili ćelijama.

[0027] Jedno izvođenje opisa je izolovano anitelo koje vezuje PHF-tau koji sadrži mesto vezivanja antigena varjabilnog regiona teškog lanca (VH) SEQ ID NO:35 ili 37, ili mesto vezivanja antigena varjabilnog regiona lakog lanca (VL) SEQ ID NO:36 ili 38. Tabela 1 pokazuje ostatke mesta vezivanja antigena antitela kao primera definisanih prema Kabat ili Chothia kao primera varjabilnih regiona teškog i lakog lanca.

[0028] U još jednom izvođenju opisa, mesto vezivanja antigena VH antitela sadrži regione određivanja komplementarnosti teškog lanca (CDRs) 1 (HCDR1), 2 (HCDR2) i 3 (HCDR3) SEQ ID NOs:7, 8 i 9 ili 13, 14 i 15, respektivno, i mesta vezivanja antigena VL antitela sadrže CDRs lakog lanaca 1 (LCDR1), 2 (LCDR2) i 3 (LCDR3) SEQ ID NOs:10, 11 i 12 ili 16, 17 i 18, respektivno.

[0029] Još jedno izvođenje opisa je izolovano antitelo koje vezuje PHF-tau koji obuhvata mesto vezivanja antigena – varjabilnog regiona teškog lanca (VH) SEQ ID NO:35 ili 37, i mesta vezivanja antigena varjabilnog regiona lakog lanca (VL) SEQ ID NO:36 ili 38.

[0030] U još jednom izvođenju opisa, mesto vezivanja antigena - VH antitela sadrži regione određivanja komplementarnosti teškog lanca (CDRs) 1 (HCDR1), 2 (HCDR2) i 3 (HCDR3) SEQ ID NOs:13, 14 i 15, respektivno, i mesto vezivanja antigena VL antitela sadrže CDRs lakog lananca 1 (LCDR1), 2 (LCDR2) i 3 (LCDR3) SEQ ID NOs:16, 17 i 18, respektivno.

Tabela 1.

[0031] Mada izvođenja prikazana u primerima sadrže parove varjabilnih regiona, jedan oblik teškog i jedan oblik lakog lanca, osoba iz struke će znati da alternativna izvođenja mogu sadržati jedan varjabilni region lakog i teškog lanca . Jedan varjabilni region može biti korišćen za odabir varjabilnih domena u stanju da obrazuju dva domen specifična fragmenta koji vezuju antigen koji su u stanju da, na primer, da vežu PHF-tau. Odabir može biti praćen postupcima odabira za prikaz faga koji koriste na primer hijerarhijski dualni kombinatorijski prilaz opisan u PCT Publ. No. WO92/01047. U ovom prilazu, pojedinačna kolonija koja sadrži ili klon lanca H ili L je korišćena da inficira kompletnu biblioteku klonova koji kodiraju drugi lanac (L ili H), i dobijeni dvolančani domen za vezivanje specifičnog antigena je izabran prema tehnikama prikazivanja faga kako je opisano.

[0032] Još jedno izvođenje prema opisu je izolovano antitelo koje vezuje PHF-tau koji sadrži mesto vezivanja antigena varjabilnog regiona teškog lanca (VH) SEQ ID NO:35 i mesto vezivanja antigena varjabilnog regiona lakog lanca (VL) SEQ ID NO: 36.

[0033] Još jedno izvođenje prema opisu je izolovano antitelo koje veže PHF-tau koje sadrži mesto vezivanja antigena varjabilnog regiona teškog lanca (VH) SEQ ID NO:37 i mesto vezivanja antigena varjabilnog regiona lakog lanca (VL) SEQ ID NO: 38.

[0034] Još jedno izvođenje prema opisu je izolovano antitelo koje vezuje PHF-tau koje sadrži regione određivanja komplementarnosti teškog lanca (CDRs) 1 (HCDR1), 2 (HCDR2) i 3 (HCDR3) SEQ ID NOs:7, 8 i 9, respektivno, i lakog lanca CDRs 1 (LCDR1), 2 (LCDR2) i 3 (LCDR3) SEQ ID NOs:10, 11 i 12, respektivno.

[0035] Još jedno izvođenje opisa je izolovano antitelo koje vezuje PHF-tau koje sadrži regione određivanja komplementarnosti teškog lanca (CDRs) 1 (HCDR1), 2 (HCDR2) i 3 (HCDR3) SEQ ID NOs: 13, 14 i 15, respektivno, i lakog lanca CDRs 1 (LCDR1), 2 (LCDR2) i 3 (LCDR3) SEQ ID NOs:16, 17 i 18, respektivno.

[0036] U bilo kom od prethodnih izvođenja, izolovano antitelo koje vezuje PHF-tau može biti humanizovano.

[0037] Antitela prema prikazanom pronalasku mogu biti dobijena različitim tehnikama, na primer postukom hibridoma (Kohler and Milstein Nature 256:495-7, 1975). Himernim mAbs koja sadrže varjabilne regione lakog i teškog lanca koji potiču od antitela (tipično mišjeg) zajedno sa konstantim regionima lakog i teškog lanca koji potiču od antitela akceptora (tipično druge vrste sisara kao što je čovek) mogu biti pripremljena postupkom opisanim u U.S. Pat. No.4,816,567. CDR-graftovana mAbs koja imaju CDRs koji potiču od nehumanog donora imunoglobulina (tipično mišjeg) i preostali delovi koji potiču iz imunoglobulina molekula koji potiče iz jednog ili više humanih imunoglobulina mogu biti pripremljeni tehnikama poznatim ljudima iz struke kao što su one opisane u U.S. Pat. br. 5,225,539. Potpuno humana mAbs koja nemaju ni jednu nehumanu sekvencu mogu biti pripremljena iz humanog imunoglobulinskog transgenog miša tehnikama na koje se poziva u (Lonberg, et al. Nature 368:856-9, 1994, Fishwild, et al. Nat Biotechnol 14:845-51, 1996, Mendez, et al. Nat Genet 15:146-56, 1997). Humanni mAbs mogu takođe biti pripremljeni i optimizovani iz bibloteka prikaza proteina na površini faga (engl. phage display) (Knappik, et al. J Mol Biol 296:57-86, 2000, Krebs, et al. JImmunol Methods 254:67-84, 2001, Shi, et al. J Mol Biol 397:385-96, 2010).

[0038] Humanizacija antitela se može postići korišćenjem dobro poznatih postupaka, kao što je preuređivanje ostataka koji određuju specifičnost površine (specificity determining residues resurfacing - SDRR) (U.S. Publ. No. 2010/0261620), preuređivanje površine (Padlan et al. Mol. Immunol. 28:489-98, 1991), super humanizacija (Int. Pat. Publ. No. WO04/006955) i optimizaciju sadržaja humanih stringova (U.S. Pat. No. 7,657,380). Humane sekvence okvira korisne za graftovanje/ humanizaciju mogu biti izabrane iz relevantih baza podataka od strane stručnjaka iz ove oblasti . Odabrani okviri mogu biti dalje modifikovani da se sačuva ili unapredi afinitet vezivanja tehnikama kao što su one opisane u Queen et al. (Queen, et al. Proc Natl Acad Sci USA 86:10029-33, 1989) or in U.S. Publ. No.2011/0092372.

[0039] Dobijanje PHF-tau za korišćenje antigena za imunizaciju ili izolovanje antitela iz biblioteke prikaza proteina na površni faga može biti postignuto pomoću bilo koje pogodne tehnike. U postupku kao primer, PHF-tau je izolovan iz mozga pacijenata koji imaju AD pomoću dobro poznatog protokola, kao što su opisani u Greenberg and Davies (Greenberg and Davies Proc Natl Acad Sci USA 87:5827-31, 1990). PHF-tau može biti izolovan iz postmortem korteksa pacijenata sa Ajchajmerom. Izolovani PHF-tau je karakterisan na njegovu čistoću i stupanj hiperfosforilacije sa antitelima poznatim da reaguju sa PHF-tau. U tipičnom PHF-tau preparatu, hiperfosforilovane trake koje se kreću na oko 60, 64, 68 i 72 kDa u western blot-u (Spillantini and Goedert Trends Neurosci 21:428-33, 1998) su detektovane sa AT8 antitelom koje specifično veže hiperfosforilovani PHF-tau ali ne i defosforilovani PHF-tau.

[0040] Antitela prema prikazanom pronalasku mogu imati karakteristiku da ne vežu kontrolni tau SEQ ID NO:6. Takva antitela mogu biti stvorena korišćenjem gore opisanih postupaka i testiranjem antitela na njihov nedostatak vezivanja da bi se kontrolisano tau u western blot-ovima praćen sa Coomassie bojenjem kao što je gore opisano. Kontrolni tau može biti rekombinantono eksprimovan i prečišćen pomoću standarnih postupaka. Primeri antitela koji vezuju PHF-tau ali ne kontrolni tau su antitela PT1 i PT3. Antitela prema pronalasku mogu biti dalje procenjivana na njihovu specifičnost na primer korišćenjem imuno – histohemije na kontrolnim i AD isečcima mozga.

[0041] Antitela mogu imati afinitete naspram PHF-tau sa konstantom disocijacije (KD) manjom od ili jednakom do oko 10<-10>, 10<-11>ili 10<-12>M. Afinitet datog molekula za PHF-tau može biti određen eksperimentalno pomoću bilo kog pogodnog postupka. U takvim postupcima mogu biti korišćeni instrumenti Biacore, ProteOn ili KinExA , ELISA ili kompetitivni testovi vezivanja poznati ljudima iz struke.

[0042] Još jedan aspekt opisa je izolovano antitelo ili fragment koji je kompetitivan za vezivanje PHF-tau sa monoklonalnim antitelom koje sadrži mesto za vezivanje antigena varjabilnog regiona teškog lanca (VH) SEQ ID NO:35 i mesta vezivanja antigena varjabilnog regiona lakog lanca (VL) SEQ ID NO:36, ili mesta vezivanja antigena varjabilnog regiona teškog lanca (VH) SEQ ID NO:37 i mesta vezivanja antigena varjabilnog regona lakog lanca (VL) SEQ ID NO:38.

[0043] Kompeticija između vezivanja za PHF-tau može biti testirana in vitro pomoću dobro poznatih postupaka. Na primer, vezivanje MSD Sulfo-Tag™ NHS-estar-obeleženih antitela za PHF-tau u prisustvu neobeleženog antitela može biti procenjen pomoću imuno testa posle detekcije elekrtohemiluminiscencijom.

[0044] Nekoliko dobro poznatih postupaka pored komepetitivnog vezivanja može biti korišćeno za određivanje epitopa vezivanja antitela prema pronalasku. Na primer, kada strukture obe individualne komponente su poznate, in silico obeležavanje protein-protein može biti izvedeno da se identifikuju kompatibilna mesta interakcije. Izmena vodonik-deuterijum (H/D) može biti izvedena sa kompleksom antigen i antitelo da bi se mapirali regioni na antigenu koji mogu biti vezani sa antitelom. Segment i tačka mutageneze antigena mogu biti korišćeni za lociranje aminokiselina važnih za vezivanje antitela. Zajednička kristalna struktura kompleksa antitela-antigena je korišćena za identifikovanje ostataka koji doprinose epitopu i paratopu.

[0045] Antitela prema pronalasku mogu biti monoklonalna antitela IgG, IgD, IgA ili IgM izotopi. Antitela prema pronalasku mogu biti bispecifična ili multispecifična. Primer bispecifičnog antitela može vezivati dva različita epitopa na PHF-tau ili može vezati PHF-tau i amiloid beta (Aβ). Još jedan primer bispecifičnog antitela može vezati PHF-tau i endogeni transcitozni receptor krvno-moždane barijere kao što je receptor insulina, receptor transferina, receptor faktora rasta -1 sličan insulinu, i lipoproteinski receptor. Primer antitela je tipa IgG1.

[0046] Osobine imunog efektora antitela prema pronalasku mogu biti poboljšane ili utišane pomoću Fc modifikacija tehnikama poznatim osobama iz stuke. Na primer, Fc efektor funkcioniše kao C1q vezivanje, komplemento zavisna citotoksičnost (CDC), antitelo-zavisna ćelijski-posredovana citotoksičnost (ADCC), fagocitoza, nishodna regulacija receptora na površini ćelija (npr., B ćelijski receptor; BCR), itd. Mogu biti obezbeđeni i/ili kontrolisani modifikovanjem ostataka u Fc odgovornim

1

za ove aktivnosti. Farmakokinetične osobine treba takođe ba budu poboljšane mutiranjem ostataka u Fc domenu koji produžava poluživot antitela (Strohl Curr Opin Biotechnol 20:685-91, 2009).

[0047] Dodatno, antitela prema pronalasku mogu biti post-translaciono modifikovana postupcima kao što su glikozilacija, izomerizacija, deglikozilacija ili kovalentne modifikacije koje se ne javljaju u prirodi kao što je adicija polietilen glikolnih ostataka (pegilacija) i lipidacija. Takve modifikacije se mogu javiti in vivo ili in vitro. Na primer, antitela prema pronalasku mogu biti konjugovana za polietilen glikol (PEGilovana) da bi se poboljšao njihovi farmakokinetički profili. Konjugacija može biti izvedena tehnikama poznatim osobama iz struke. Konjugovanje terapeutskih antitela sa PEG je pokazano da poboljšavaju farmakodinamiku dok ne ometa funkciju (Knight, et al. Platelets 15:409-18, 2004, Leong, et al. Cytokine 16:106-19, 2001, Yang, et al. Protein Eng 16:761-70, 2003).

[0048] Još jedno izvođenje pronalaska je izolovani polinukleotid koji kodira antitela prema pronalasku ili njegov komplement, ili fragmente. Primeri izolovanih polinukleotida opisa su polinukleotidi koji kodiraju, polipeptide koji sadrže imunoglobulinski težak lanac CDRs HCDR1, HCDR2 i HCDR3 prikazan u SEQ ID NOs:7, 8 i 9 ili 13, 14 i 15, respektivno, ili polipeptidi koji sadrže imunoglobulinski laki lanac CDRs LCDR1, LCDR2 i LCDR3 prikazan na SEQ ID NOs:10, 11 i 12 ili 16, 17 i 18, respektivno, i polinukleotidi koji imaju sekvencu koja je prikazana na SEQ ID NOs:31-34, koja kodira varjabilni region anititela. Drugi polinukleotidi koji, datom degeneracijom genetskog koda ili preference kodona u ekspresionom sistemu, kodira antitela prema pronalasku su takođe u okviru obima pronalaska. Izolovane nukleinske kiseline prema prikazanom pronalasku mogu biti korišćene dobro poznatim rekombinantnim ili sintetskim tehnikama. DNK koja kodira monoklonalna antitela je lako izolovana i sekvencirana pomoću dorbo poznatih postupaka. Kada je proizvedena hibridoma, takve ćelije mogu služiti kao izvor takve DNK. Alternativno, korišćenjem tehnika prikazivanja kada su kodirajuća sekvenca i translacioni proizvod vezani, kao što su biblioteke prikazivanja proteina na površini faga ili ribozoma, odabar vezivnog sredstva i nukleinske kiseline je olakšan. Posle odabira faga, regioni koji kodiraju antitelo iz faga mogu biti izolovani i korišćeni da se stvore cela antitela, uključujući humana antitela, ili bilo koji dugi željeni fragment koji vezuje antigen, i ekspirmovan u bilo kojem željenom domaćinu, uključujući ćelije sisara, ćelije insekata, ćelije biljaka, kvasca, i bakterija.

[0049] Još jedno izvođenje je vektor koji sadrži bar jedan polinukleotid prema pronalasku. Takvi vektori mogu biti plazmidni vektori, viralni vektori, vektori zasnovani na transpozonu ili bilo koji drugi vektori pogodni za uvođenje polinukleotida prema pronalasku u dati organizam ili genetsku okolinu na bilo koji način.

[0050] Drugo izvođnje je ćelija domaćina koja sadrži bilo koji od polinukleotida prema pronalasku. Takve ćelije domaćina mogu biti eukariotske ćelije, bakterijske ćelije, biljne ćelije ili arhejske ćelije. Primeri eukariotskih ćelija mogu biti sisara, insekata, ptica ili drugih životinjskih organizama. Eukariotske ćelije sisara uključuju imortalizovane ćelijske linije kao što su ćelijske linije hibridoma ili mijeloma kao što su SP2/0 (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, CRL-1581), NS0 (European Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury, Wiltshire, UK, ECACC No. 85110503), FO (ATCC CRL1646) i Ag653 (ATCC CRL-1580) mišje ćelijske linije. Primer ćelijske linije humanog mijeloma je U266 (ATTC CRL-TIB196). Druge korisne ćelijske linije uključuju one koje potiču od Chinese Hamster Ovary (CHO) ćelije koje su CHO-K1SV (Lonza Biologics), CHO-K1 (ATCC CRL-61, Invitrogen) ili DG44.

[0051] Drugo izvođenje pronalaska je postupak dobijanja antitela koje se veže za PHF-tau koje sadrži ćeliju domaćina prema pronalasku i regeneriše antitelo proizvedeno od strane ćelije domaćina. Postupci dobijanja antitela i za njihovo prečišćavanja su dobro poznati u ovoj oblasti.

Postupci lečenja

[0052] Anti-PHF-tau antitela prema pronalasku ili njegovi fragmenti, uključujući Fab, (Fab’)2, scFv fragmente, ili antitela koja sadrže mesta vezivanja antigena antitela prema pronalasku mogu biti korišćena za lečenje, smanjenje ili prevenciju simptoma kod pacijenata koji imaju neurodegenerativnu bolest koja uključuje patološko nakupljanje tau u mozgu, kao što su pacijenti koji pate od AD ili bilo koje tauopatije. Bez želje za ograničavanjem bilo kojom posebnom teorijom, antitela prema pronalasku mogu pokazivati njihov koristan efekat smanjenjem patološkog nakupljanja tau i prema tome količine PHF-tau u mozgu. Antitela prema pronalasku mogu biti korišćena za lečenje životinjskih pacijenata koji pripadaju bilo kojoj klasifikaciji. Primeri takvih životinja uključuju sisare kao što su ljudi, glodare, pse , mačke i životinje sa farme. Na primer, antitela prema pronalasku su korisnau dobijanje leka za lečenje AD, gde je lek pripremljen za davanje u ovde definisanim dozama.

[0053] Drugo izvođenje prema pronalasku je antitelo prema pronalasku za upotrebu u postupku smanjenja nakupljanja tau kod pacijenta kome je to potrebno koji obuhvata davanje terapeutske količine izolovanog antitela prema pronalasku za vreme dovoljno da se smanji nakupljanje tau.

[0054] Još jedno izvođenje je antitelo prema pronalasku za upotrebu u postupku za lečenje ili smanjenje simptoma neurodegenerativne bolesti koja uključuje nakupljanje tau kod pacijenta koji obuhvata davanje pacijentu terapeutski efikasne količine izolovanog anitela prema pronalasku za vreme dovoljno za lečenje ili smanjenje simptoma neurodegenerativne bolesti.

[0055] U bilo kom od gornjih izvođenja, neurodegenerativna bolest koja uključuje nakupljanje tau je tauopatija.

[0056] U bilo kom od izvođenja opisa, izolovano antitelo sadrži antitelo koje vezuje PHF-tau koje obuhvata mesto vezivanja antigena VH SEQ ID NO:35 i mesto vezivanja antigena VL SEQ ID NO:36.

[0057] U bilo kom od gornjih izvođenja, izolovano antitelo sadrži antitelo koje veže PHF-tau koje sadrži mesto vezivanja antigena VH SEQ ID NO:37 i mesto vezivanja antigena VL SEQ ID NO: 38.

[0058] Ovde korišćen izran "tauopatija" obuhvata bilo koju neurodegenerativnu bolest koja uključuje patološko nakupljanje tau u okviru mozga. Pored familijarne i sporadične AD, ostali primeri tauropatija su frontotemporalna demencija sa parkinsonizmom vezanim za hromozome 17 (FTDP-17), progresivna supranuklearna paraliza, kortikobazalna degeneracija, Pikova bolest, progresivna subkortikalna glioza, demencija samo sa čvorovima, difuzni neurofibrilarni čvorovi sa kalcifikatima, argirofilna zrnasta demencija, kompleks amiotrofnog laeralnog sklerozog parkinsonizma - demencije, Daunov sindrom, Gerstmann-Sträussler-Scheinker-ova bolest, Hallervorden-Spatz-ova bolest, miozitis sa inkluzionim telima, Creutzfeld-Jakob-ova bolest, višestruka sistemska atrofija, Niemann-Pick-ova bolest tipa C, prionska proteinska cerebralna amiloidna angiopatija, subakutni sklerozni panencefalitis, miotonična distrofija, ne-gvanamska motorna neuronska bolest sa neurofibrilarnim čvorovima, postencefalitični parkinsonizam, i hronična traumatska encefalopatija, kao što je demecija pugulistika (bolest boksovanja). (Morris, et al. Neuron 70:410-26, 2011).

[0059] Bihejvioralni fenotip u vezi sa tauopatijom koji uključuje kognitivna pogoršanja, ranu promenu ličnosti i disinhibiciju, apatiju, abuliju, mutizam, apraksiju, perseveraciju, stereotipne pokrete/ponašanja, hiperoralnost, disorganizaciju, nesposobnost da se planira ili organizuje sekventionalni zadaci, sebičnost/bezosećajnost, antisocijalne osobine, nedostatak empatije, oklevanje, agramatički govor sa učestalim parafaznim greškama ali relativno očuvano razumevanje, pogoršano razumevanje i deficit izražavanja, polako progresivna nestabilnost u hodu, retropulzije, zamrzavanje, česti padovi, aksijalna rigidnost koja ne reaguje na levodopu, supranuklearna paraliza zurenja, pravougaoni pokreti očiju (engl.square wave jerks), pseudobulbarna paraliza, apraksija uda, distonija, kortikalni senzorni gubitak, i tremor.

[0060] Pacijenti koji podležu tretmanu uključuju asimptomatske pojedince u riziku od AD ili druge tauopatije, kao i pacijente koji trenutno pokazuju simptome. Pacijenti koji podležu tretmanu uključuju pojedince koji imaju poznat genetski rizik AD, kao što je familijarna istorija AD ili prisustvo genetskih faktora rizika u genomu. Primeri faktora rizika su mutacije u prekursoru amiloidnih proteina (APP), naročito u položaju 717 i položajima 670 i 671 (Hardy and Swedish mutations, respectively). Drugi faktori rizika su mutacije u genima prezenilina, PS1 i PS2, i ApoE4, familijarna istorija hiperholesterolemije ili ateroskleroze . Pojedinci koji trenutno pate od AD mogu biti prepoznati od krakteristične demencije prisustvom gore opisanih faktora rizika. Pored toga, brojni dijagnostički testovu su dostupni da se identifikuju pojedinci koji imaju AD. Ovo uljučuje merenje nivoa tau i Aβ42 u cerebrospinalnoj tečnosti. Povećani nivoi tau i smanjeni Aβ42 označavaju prisustvo AD. Pojedinci koji pate od AD mogu takođe biti dijagnozirani prema kriterijumima AD and Related Disorders Association.

Davanje/farmaceutske kompozicije

[0061] Anti-PHF-tau antitela prema pronalasku su pogodna kao oba i terapeutska i profilaktička sredstva za lečenje ili prevenciju neurodegenerativnih poremećaja koji uključuju patološko nakupljanje tau, kao što je AD ili druge tauopatije. Kod asimptomatskih pacijenata, lečenje može početi u bilo kom dobu (npr., oko 10, 15, 20, 25, 30 godine). Uglavnom, međutim, nije neophodno početi lečenje dok pacijent ne dođe do oko 40, 50, 60, ili 70 godina. Lečenje tipično podrazumeva višestruke doze u toku vremenskog perioda. Lečenje može biti praćeno testiranjem antiela ili aktiviranjem odgovara T-ćelija ili B-ćelija na terapeutsko sredstvo u toku vremenskog perioda. Ukoliko ne postoji odgovor, indikovana je veća doza.

[0062] U profilaktičkim primenama, farmaceutske kompozicije ili lekovi su davani pacijentu koji je podložan, ili na drugi način u riziku od, AD u količini dovoljnoj da eliminiše ili smanji rizik, ublaži ozbiljnost ili odloži početak bolesti, uključujući biohemijske, histološke i/ili bihejvioralne simptome bolesti, njegove komplikacije i intermedijarne patološke fenotipove prisutne u toku razvoja bolesti. U terapeutskim primenama, kompozicije ili lekovi su davani pacijentu za koga se sumnja da pati od, ili već pati, od bolesti u količini dovoljnoj da smanji, zaustavi ili odloži bilo koji od simptoma bolesti (biohemijski, histološki i/ili bihejvioralni). Davanje terapeutskog sredstva može smanjiti ili eliminisati srednje kognitivno pogoršanje kod pacijenata kod kojih se nije još razvila karakteristična Alchajmerova patologija. Količina adekvanta da se postigne terapeutsko lečenje ili profilaktičko lečenje je definisana kao terapeutski ili profilaktički efikasna doza. U oba, profilaktičkom i terapeutskom režimu, kompozicije ili lekovi su uglavnom davani u nekoliko doza do postizanja dovoljnog imunog odgovora.

1

[0063] Anti-PHF-tau antitela ili njihovi fragmenti prema pronalasku mogu biti davani u kombinaciji sa drugim sredstvima koja su efikasna u lečenju neurodegenerativnih bolesti. U slučaju AD, antitela prema pronalasku mogu biti davana u kombinaciji sa sredstvima koja smanju ili sprečavaju naslage amiloida -beta (Aβ). Moguće je da su PHF-tau i Aβ patologije sinergijske. Prema tome, kombinovane terapije koje ciljaju klirans obe patologije PHF-tau i Aβ i Aβ-srodnih patologija u isto vreme mogu biti efikasnije od ciljanja svake pojedinačno.

[0064] U slučaju Parkinsonove bolesti i srodnih neurodegenerativnih poremećaja, imuna modulacija da bi se izčistili nagomilani oblici α-sinukleinskog proteina je takođe terapija u nastajanju. Kombinovana terapija koja cilja klirans oba i tau i α-sinukleinskih proteina simultano može biti efikasnija nego ciljanje svakog pojedinačno.

[0065] Kako je ovde korišćeno, "terapeutski efikasna količina" antitela u lečenju ili ublažavanju simptoma tauopatije može biti određena standarnim tehnikama istraživanja. Na primer, doza antitela može biti određena davanjem sredstva u relevantim životinjskim modelima dobro poznatim u ovoj oblasti .

[0066] Pored toga, in vitro testovi mogu opciono biti korišćeni da se pomogne identifikovanje optimalnih doznih opsega. Odabir posebnih efikasnih doza može biti određen (npr., pomoću kliničkih ispitivanja) od strane stručnjaka na osnovu razmatranja nekoliko faktora. Takvi faktori uključuju bolest koja se leči ili sprečava, uključene simptome, telesnu masu pacijenta, pacijentov imuni status i druge faktore poznate osobi iz struke. Tačna doza koja se uključuje u formulacijama će takođe zavisiti od načina davanja i ozbiljnosti bolesti i biće određena na osnovu rasuđivanja profesionalca i okolnosti svakog pacijenta. Efikasne doze mogu biti ekstrapolisane na osnovu kriva doza-odgovor koje potiču od in vitro ili sistema životinjskih modela za testiranje.

[0067] Način davanja za terapeutsku upotrebu antitela prema pronalasku može biti bilo koji pogodan način davanja sredstva domaćinu. Farmaceutske kompozicije ovih antitela su korisne za parenteralno davanja, npr., intradermalno, intramuskularno, intraperitonealno, intravenozno, subkutanozno, intranazalno ili intrakranialno ili oni mogu biti davani u cerebrospinalnu tečnost mozga ili kičme.

[0068] Antitela prema pronalasku mogu biti pripremljena kao farmaceutske kompozicije koje sadrže efikasnu količini antitela kao aktivnog sredstva u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Izraz "nosač" odnosi se na razblaživač, adjuvant, ekscipijent, ili nosač sa kojim se antitelo daje. Takva terapetuska sredstva mogu biti tečnosti, kao što su voda i ulja uključujući petroleum, životinjskog, biljnog ili sintetičkog porekla, kao što su ulje kirkirikija, sojino ulje , mineralno ulje, susamovo ulje i slično. Na primer, može biti korišćen 0.4% rastvor soli i 0.3% glicina. Ovi rastvori su sterilni i generalno bez čestičnog materijala. Oni mogu biti sterilizovani konvencionalno, dobro poznatim tehnikama sterilizacije (npr., filtracijom). Kompozicije mogu sadržati farmaceutski prihvatljive pomoćne supstance kako je potrebno da bi se dobili približno fiziološki uslovi kao što su sredstva za podešavanje pH i puferovanje, stabilizaciju, zgušnjavanju, podmazivanje i sredstva za bojenje itd. Koncentracija antitela prema pronalasku u takvim farmaceutskim formulacijama može široko varirati, tj., od manje od oko 0.5%, uglavnom ili bar oko 1% do toliko kao 15 ili 20% masenih i da će primarno biti selektovana na osnovu željene doze, zapremina tečnosti, viskoznosti itd., prema nariočitom izabranom načinu davanja.

[0069] Lečenje može biti dato po rasporedu jednom dnevno, ili po rasporedu više puta dnevno pri čemu pri čemu primarni način lečenja može biti 1-10 odvojenih doza, praćeno sa drugim datim dozama u naknadnim vremenskim intervalima potrebnim da održi ili pojača odgovor, na primer, 1-4 meseci za drugu dozu, ukoliko je potrebno, naknadnu(e) dozu(e) posle nekoliko meseci. Primeri pogodnih planova lečenja uključuju: (i) 0, 1 mesec i 6 meseci, (ii) 0, 7 dan i 1 mesec, (iii) 0 i 1 mesec, (iv) 0 i 6 meseci ili druge rasporede dovoljen da izazovu željene odgovore koje se očekuje da smanjuju simptome bolesti ili smanjuju ozbiljnost bolesti.

[0070] Prema tome, farmaceutska kompozicija prema pronalasku za intramuskularnu injekciju treba da bude pripremljena da sadrži 1 ml sterilne puferisane vode, i između oko 1 ng do oko 100 mg, oko 50 ng do oko 30 mg ili oko 5 mg do oko 25 mg antitela prema pronalasku. Slično, farmaceutska kompozicija prema pronalasku Za instravensku infuziju treba da je sastavljena da sadrži oko 250 ml sterilnog Ringer-ovog rastvora i oko 1 mg do oko 30 mg ili oko 5 mg do oko 25 mg antitela prema pronalasku. Stvarni postupci za pripremanje kompozicija koje se daju parenteralno su dobro poznati i opisani u više detalja u, na primer, "Remington’s Pharmaceutical Science", 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA.

[0071] Antitela prema pronalasku mogu biti liofilizovana za čuvanje i rekonstruisana u pogodnom nosaču pre upotrebe. Pokazana je da je ova tehnika efikasna sa preparatima antitela i ostalih proteina i mogu biti korišćene dobro poznate tehnike iz stanja tehnike liofilizacije i rekonstrukcije.

Dijagnostički postupci i kitovi

[0072] Antitela prema pronalasku mogu biti korišćena u postupcima dijagnoze AD ili drugih tauopatija kod subjekta. Ovaj postupak obuhvata detektovanje, kod subjekta, prisutva PHF-tau pomoću dijagnostičkog reagensa kao što je antitelo ili njegov fragment prema prikazanom pronalasku.

[0073] PHF-tau može biti detektovan u biološkom uzorku subjekta (npr., krvi, urinu, cerebralnoj spinalnoj tečnosti) dovođenjem u kontakt sa biološkim uzorkom sa dijagnostičkim reagensom sa antitelom, i detektovanje vezivanja dijagnostičkog reagensa sa antitelom za PHF-tau u uzorku od subjekta. Testovi za izvođenje detekcije uključuju dobro poznate postupke kao što su ELISA, imunohistohemija, western blot, ili in vivo snimanje. Primeri dijagnostičkih antitela su antitela PT1 i PT3, i ona su IgG1,κ tipa.

[0074] Dijagnostička antitela ili slični reagensi mogu biti davani intravenskom injekcijom u telo pacijenta, ili direktno u mozak bilo kojim pogodnim načiom davanja sredstva domaćinu kao što je gore opisano. Doza antitela treba da je u okviru istih opsega kao za postupke lečenja. Tipično, antitelo je obeleženo, mada u nekim postupcima, primarno antitelo sa afinitetom za PHF-tau je neobeleženo i sekundarno sredstvo za obeležavanje je korišćeno za vezivanje primarnog antitela. Izbor obeležavanja zavisi od načina detekcije. Na primer, fluorescentna oznaka je pogodna za optičku detekciju. Upotreba paramagnetnih obeleživača je pogodna za tomografsku detekciju bez hiruške intervencije. Radioaktivni obleživači mogu takođe biti detektovani korišćenjem PET ili SPECT.

[0075] Dijagnoza je izvedena upoređavanjem broja, veličine i/ili intenziteta obeleženog PHF-tau, tau nakupna, i/ili neurofibrilarnih čvorova u uzroku subjekta ili kod subjekta, da odgovaraju vrednostima osnovne linije. Vrednosti osnovne linije mogu predstavljati srednje vrednosti nivoa kod populacije

1

pojedinaca bez bolesti. Osnove linije mogu takođe predstavljati ranije nivoe određene kod istog subjekta.

[0076] Gore opisani dijagnostički postupci mogu takođe biti korišćeni za praćenje odgovora subjekta na terapiju detektovanjem prisustva PHF-tau kod subjekta pre, u toku ili posle lečenja. Pad u vrednostima u odnosu na signale osnovne linije su pozitivan odgovor na lečenje. Vrednosti se takođe povećavaju privremeno u biološkim fluidima jer je patološki tau očišćen iz moga.

[0077] Ovde je opisan kit za izvođenje gore opisanih dijagnoza i praćenje postupaka. Tipično, takvi kitovi sadrže dijagnostički reagens kao što su antitela prema opisu, i opciono detektabilni obeleživač. Samo dijagnostičko antitelo može sadržati detektabilni obeleživač (npr., fluorescentni molekul, biotin, itd.) koji je direktno detektabilan ili detektabilan preko sekundarne reakcije (npr., reakcija sa streptavidinom). Alternativno, sekundarni reagens koji sadrži detektabilni obeleživač može biti korišćen, gde sekundarni reagens ima specifičnost vezivanja za primarno antitelo. U dijagnostičkom kitu pogodnom za merenje PHF-tau u biološkom uzorku, može biti snabdeveno antitelo prema kitu prethodno vezano za čvrstu fazu, kao što su bunarčići mikrotitarske posude.

Primer 1

Prečišćavanje parnih heliksnih filamanata - tau (PHF-tau)

[0078] PHF-tau je parcijalno prečišćen modifikovanim postupkom prema Greenberg and Davies (Greenberg and Davies Proc Natl Acad Sci USA 87:5827-31, 1990). Ukratko, postmortem tkivo iz korteksa dobijeno kod histološki potvrđenog pacijenta sa Alchajmerom je parcijalno prečišćeno. Tipično, 5 mg frontalnog korteksa je homogenizovano u 10 vol hladnog pufera H (10 mM Tris, 800 mM NaCl, 1 mM EGTA i 10% saharoza/ pH 7.4) korišćenjem stakla/Teflon Potter tkivnog homogenizera (IKA Works, Inc; Staufen, Germany) na 1000 oum. Homogenizovani materijal je centrifugiran na 27000g u toku 20 min u Sorvall rotoru SS34. Pelete su odbačene i supernatant je podešen na krajnju koncentraciju od 1% (mas/v) N-lauroilsarkozina i 1% (v/v) 2-merkaptoetanola i inkubirana u toku 2 h na 37°C. Zatim je supernatant centrifugiran na 108000g u toku 35 min na 20°C u Beckman 60Ti rotoru. Pelete su pažljivo isprane u PBS i suspendovane u PBS. Supernatant je centrifugiran drugi put kao što je opisano i krajnje pelete su rastvorene, napravljeni alikvoti i zamrznute na -80°C. Kvalitet PHF-tau preparata je procenjivan na 12% SDS-PAGE i western blot-ovan sa anti-tau antitelima AT8 i HT7 (ThermoScientific, Rockford, IL). AT8 detektuje PHF-tau fosforilovan na S202/T205, ali ne vezuje se za nefosforilovani PHF-tau niti za prirodni tip tau. HT7 se vezuje za nefosforilovani epitop na Tau aminokiselinama 159-163 (SEQ ID NO: 6), i prepoznaje oba tau i PHF-tau. Dobar kvalitet PHF-tau preparata je sastavljen od 4 trake koje imaju molekulsku masu od oko 60, 64, 66 i 72 kDa na Western blot-u detektovane sa antitelom koje reaguje sa hiperfosforilovanim PHF-tau kao što je AT8. Dva odvojena PHF-tau preparata sa sličnim kvalitetom i čistoćom su napravljena iz istog uzorka mozga. Preparat 1 je korišćen za imunizaciju.

Primer 2

Generacija monoklonalnih antitela naspram PHF-tau

[0079] Anti-PHF-tau antitela su stvorena pomoću tehnologije standarnog hibridoma kod normalnih Balb/c miševa (Kohler and Milstein Nature 256:495-7, 1975). Dobijeni Obtained hibridomi su zasejani na ploče sa 96-bunarčića i odabirani posle 10 dana u direktnom ELISA na 25 ng/bunarčiću obloženom

1

PHF-tau kao što je dole opisano. Pozitivne ćelije su testirane na unakrnu aktivnost na 10 ng/bunarčiću obloženom sa kontrolnim tau (SEQ ID NO:6) eksprimovanim u E. Coli BL21 ćelijama i prečišćenim toplotnim tretmanom i amonijum sulfatnim taloženjem, i zatim su trenutno subklonirani i pozitivni klonovi su zamrznuti u tečnom azotu. Sve hibridome su gajene u Dulbecco modifikovanom Eagle medijumu obogaćenom sa 10 % fetalnim goveđim serumom (Hyclone, Europe), Hybridoma Fusion Cloning Supplement (2%) (Roche, Brussels, Belgium) 2% HT (Sigma, USA), 1 mM natrijum piruvat, 2 mM L-glutamin i penicilin (100 U/ml) i streptomicin (50 mg/ml).

[0080] Varjabilni regioni antitela su klonirani iz odabranih ćelija hibridoma na pozadini mišjih IgG1/IgG2/ κ i eksprimovani i prečišćeni pomoću rutinskih postupaka.

Direktni ELISA za odabir antitela

[0081] 25 ng/bunarčiću PHF-tau je obloženo u toku noći na 4 °C na NUNC Maxisorp (Life Technologies) mikrotitarske ploče visokog vezivanja sa 96-bunarčića sa ravnim u 50 µl/bunarčiću pufera za oblaganje (10 mM Tris, 10 mM NaCl, i 10 mM NaN3, pH 8.5). Sledećeg dana, ploče su blokirane sa 75 µl/bunarčiću 0.1 % kazeina u PBS u toku 60 min na sobnoj temperaturi. Zatim, 50 µlhibridoma supernatanta je dodato i inkubirano u toku 1 h na37 °C. Posle ispiranja, vezana mopnoklonalna antitela su detektovana sa 50 µl/bunarčiću ovčijeg –anti-mišjeg IgG konjugovanog sa peroksidazom rena u toku 1 hr na 37 °C (Amersham-Pharmacia Biotech). Oba reagensa su razblažena u 0.1 % kazein/PBS. Ploče su isprane i dodato je 50 µl rastvora 0.42 mM 3,5,3’,5’-tetrametilbenzidina, 0.003 % (v/v) H2O2u 100 mM limunske kiseline i 100 mM dinatrijum hidrogen fosfata pH 4.3) kao supstrata. Omogućeno je da se reakcija nastavi u toku maksimalno 15 min na mućkalici za ploče na sobnoj temperaturi, posle čega je razvijanje boje zaustavljeno sa 2 N H2SO4, 50 µl/bunarčiću i ploče su očitane na čitaču za mikrotitarske ploče na 450 nm (Thermomax, Molecular Devices).

Specifičnost monoklonalnih antitela

[0082] Izabrana antitela dobijena iz odabira hibridoma su testirana u toku njihove unakrsne reaktivnosti sa rekombinantno eksprimovanim kontrolnim tau (SEQ ID NO:6).500 ng PHF-tau i 200 ng kontrolnog tau su naneti na a NuPAGE® Novex® Bis-Tris 4-12% gel i blotovani na membrani od nitroceluloza upotrebom iBlot sistema (Invitrogen), prema uputstvu proizvođača. Membrane su blokirane u toku 1 sata sa Tris-puferisanim rastvorom soli Tween-20 (TBS-T; 1M Tris, 150mM NaCl i 0.05% Tween-20, pH 8.5) koji sadrži nemasno mleko u prahu (NFDM) (5% w/v; Biorad) i isprano tri puta u TBS-T. Inkubacijom sa primarnim kontrolnim antitelima (1 µg/ml) HT7, AT8, AT100 (ThermoScientific, Rockford, IL), i BT2 razblaženim u TBS-T koji sadrži NFDM (5% w/v) bili su u toku noći na 4°C. PT1, PT2, PT3, PT4 i PT5 monoklonalna antitela izabrana iz odabira hibridoma su dodata u kulturu supernatanta koji sadrži 10 % FCS. Primarna antitela su detektovana pomoću ovčijeg -antimišjeg Ig konjugovanog sa HRPO (1:20000 u TBS-T, Amersham Biosciences) sa West Dura® poboljšanom hemiluminiscencijom (Pierce, Thermoscientific). Signali su uhvaćeni sa Lumi- sistemom za snimanje (Roche Diagnostic). PT1 i PT3 su reagovali sa PHF-tau i nisu reagovali sa kontrolnim tau u western blot-ovima. PT2 je bio reaktivan sa oba proteina. Profili vezivanja HT7 i AT8 su gore opisani. AT100 se veže za fosforilovani Ser212/Thr214 i vezivanje za PHF-tau ali ne i prirodni tip tau. BT2 prepoznaje nefosforilovani epitop koji sadrži S199/S202, i prema tome prepoznaje prirodni tip tau ali ne i PHF-tau.

1

Kompetitivno vezivanje epitopa

[0083] Monoklonalna antitela PT1, PT2, PT3, PT4, PT5, AT8 (ThermoScientific, Rockford, IL), AT100 (ThermoScientific, Rockford, IL) i HT7 (MN1000) (Thermo Scientific, Rockford, IL) su procenjivana u kompetitivnom vezivanju za PHF-tau ili fosforilovanim tau peptidima. Antitela su obeležena pomoću MSD® SULFO-TAG NHS Ester (Meso Scale Discovery) prema uputstvu proizvođača.

[0084] Za kompeticiju sa obeleženim PT1, PT3, AT100 i HT7, 5 µL (50 µg/mL)/bunarčiću obogaćenog PHF-Tau proteina (prečišćenih kao što je gore opisano) je obloženo na MSD HighBind pločama (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) u toku 2 hr na sobnoj temperaturi (RT). Za kompeticiju sa AT8, 25 µL 0.1 mg/bunarčiću sintetičkog biotinilovanog i pegilovanog pepetida RSGYSSPG(pS)PG(pT)PGSRSR-OH (New England Peptide, LLC., Gardner, MA) (SEQ ID NO:39) koji odgovara ostacima 194-211 kontrolnog tau (SEQ ID NO:6) fosforilovanom na ostacima koji odgovaraju S202/T205 u kontrolnom tau je obložen na ploče koje su napunjene Streptavidinom- (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD). Posle oblaganja, bunarčići su blokirani sa 150 µL 5% MSD sredstva za blokiranje A pufera na RT u toku 2 hr, i isprana tri puta sa 0.1 M HEPES puferom, pH 7.4. 25 µL smeše je pojedinačno obeleženog anti-tau antitela (10 nM ili 50 nM) i serijskih razblaženja različitih neoeleženih kompetitorskih antitela (1 nM do 2 µM) su dodata u svaki bunarčić. Ploče su inkubirane u toku 2 sata na RT uz blago mućkanje i isprane 3 puta kao gore. 150 µL/bunarčiću razblaženog MSD pufera za čitanje T je dodato i ploče su očitavane u SECTOR Imager 6000 (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD).

[0085] Nepreklapajući epitopi anti-Tau mAbs HT7, AT100 i AT8 su gore opisani. Na osnovu objavljenih podataka, ova antitela se ne očekuje da su kompetitivna jedna sa drugim za vezivanje za Tau proteine ili peptide.

[0086] Na osnovu izvedenih kompetitivnih testova, ni jedno od antitela nije kompetitvno jedno sa drugim za vezivanje, ukazujući da se oni svi vežu za različite epitope. U svakom eksperimentu, je samo samoinhibicija primećena. Slike 1-5 pokazuju rezultate testova kompeticije sa obeleženim AT8, PT1, PT3, AT100, i HT7, respektivno.

Primer 3

Anti-PHF tau antitela smanjuju PHF-tau akumulaciju in vivo

[0087] Ženski miševi P301L stari 5 meseci (Taconic, cat#002508) su tretirani jednom nedeljeno sa mišjim IgG1, slanim rastvorom, PT3 (500 mg/mišu) ili AT8 (eksprimovanim iz hibridoma ECACC, sa depozitinim brojem 9110086) u toku 5 meseci. Miševi su anestezirani, perfuzirani sa hladnim PBS i mozgovi su secirani na ledu. Za svakog miša, jedna hemisvera mozga je homogenizirana u 10 zapremina H-pufera, što je praćeno centrifugiranjem na 21,000g u toku 20 min na 4°C. Dobijeni supernatant je centrifugiran na 100,000g u toku 60 min. Posle centrifugiranja, peleta (frakcija PI) je regenerisana i resuspendovana sa puferom za lizu za Western i ELISA analize, kao što je opisano kod Chai et al. J Biol Chem 286:34457-67, 2011. Za uroke korteksa, frakcija PI je dalje tretirana sa 1% (w/v) N-lauroilsarkozinom i ultracentrifugirana da se dalje obogati PHF-tau u peletama. Nađeno je da muški P301L miševi imaju nisku transgenu ekspresiju i nisu uključeni u analize.

[0088] Fosforilovani tau je meren u homogenatima moždanog stabla (frakcija PI) sa sendvič ELISA u kome se koriste antitela AT8 i AT100 kao uhvaćena antitela praćena sa detekcijom biotinillovanih HT7

1

i avidin-HRP (slika 6A i 6B), i sa AT100 u western blot-u (Slika 6C) u suštini kao što je opisano Chai et al. J Biol Chem 286:34457-67, 2011. Ukratko, PI peleta je resuspendovana u puferu za lizu (Cell Signaling). Uzorci PI peleta su inkubirani u AT8 ili AT100 (Thermo Scientific) prethodno obloženim bunarčićima i biotinom obeleženom HT-7 antitelom. Uzorci su zatim isprani 5 puta sa puferom, što je praćeno inkubacijom sa avidin-HRP u toku jednog sata. Posle ovoga,uzorci su inkubirani u jednom koraku sa TMB supstratom (Thermo Scientific) u toku 30 min, praćenim sa 2N H2SO4. Na kraju, reakcija je očitavana na 450 nm i kvantitativno AT8-ili AT100-reaktivni tau u mozgu je određen korišćenjem standardne krive koja potiče iz humanih AD moždanih homogenata, i grafički su prikazani kao relativna količina AD moždanog homogenata (ng/ml) dajući isti ELISA signal kao prosečni uzorci iz netransgenih životinja (B6).

[0089] Statistički značajan pad ili trend naspram značajnostii u fosforilovanom tau je viđen kod P301L transgenih životinja tretiranih sa PT3 kada se porede sa životinjama kojima je davana izotipska kontrola u ELISA testu u kome se koriste ili AT100 (p=0.057) ili AT8 (p=0.0475) da bi se detektovala fosforilacija (ELISA signal: grupa soli (11356228.8); IgG1 grupa (13446245.6); PT3 grupa (660.56134.5); AT8 grupa (12716274)).

[0090] Da bi se potvrdili dobijeni podaci sa, homogenati moždanog stabla (frakcija PI) od IgG1-ili PT3-tretirane životinje su analizirane na western blot-u detektovanjem PHF-tau pomoću AT100 antitela. Filteri su blotovani pomoću antiaktinskog antitela kao kontrole opterećenja (slika 6B). Western blotovi prikazuju ublažene PHF-tau količine detektovane sa AT100 antitelima kada se porede sa životinjama tretiranim sa IgG1.

[0091] Za analize korteksa, obe sarkozil rastvorne (predstavljaju rastvoran tau) i nerastvorne (predstavlja PHF-tau) frakcije korteksa su analizirane sa sendvič ELISA-om pomoću pan-tau antitela (PT4) ili fosfo-tau antitela (AT8) za hvatanje a zatim sa biotin -pan-tau antitelom (hTau10) prećeno sa HRP-avidinom. Životinje tretirane sa PT3 imaju slične nivoe ukupnog tau u poređenju sa životinjama tretiranim sa izotipnom kontrolom IgG1. Kretanje naspram nižih PHF-tau nivoa je evidento kod životinja tretiranih sa PT3 kada se porede sa izotipnom kontrolom u N-lauroilsarkozin nerastvornim frakcijama (ELISA uhvaćen sa PT4: IgG grupama: 8510266261198 i PT3 grupama: 5856396120498; ELISA, uhvaćen sa AT8: IgG grupa: 11258866286240 (N=10) i pT3 grupa: 7465826124970 (N=7)).

Primer 4

Karakterizacija anti-PHF-tau antitela

Određivanje afiniteta

[0092] Interakcije monoklonalnih antitela PT1 i PT3 sa rekombinantim rastvornim tau ili PHF-tau su ispitivane sa ProteOn. Sve interakcije su ispitivane na 25°C pomoću PBS pH 7.4, obogaćenim sa 3 mM EDTA, i 0.005% Tween-20 kao tekućim ili sistemskim puferom. Dva različita formata eksperimenta su korišćena, jedan za interakciju sa rekombinantno eksprimovanim kontrolnim tau i drugi sa interakcijom sa PHF-tau. U ovim eksperimentima HT7 (Pierce, cat #MN1000), mišje anti-tau antitelo je korišćeno kao pozitivna kontrola.

[0093] Da bi se ispitivala interakcija sa rekombinanto ekspirmovanom kontrolnim tau površina biosenzora je pripremljena kuplovanjem sa anti-humanim ili anti-mišjim IgG Fcγ fragmentom specifičnog antitela (Ab) za površinu GLC (ProteOn) senzornog čipa pomoću svakog uputstva

1

proizvođača za hemiju kuplovanja amina (∼5000 jedinica odgovora (RU)). Pufer za kuplovanje je bio 10 mM natrijum acetat, pH 4.5. Anti-PHF-tau antitela su razblažena u tekućem puferu i injektovana da se dobije uhvaćeni 60-130 RUs. Zarobljavanje anti-PFH-Tau mAbs je praćeno injekcijom rekombinanto eksprimovanog kontrolnog (Tau-441, Sigma katalog# T0576-50ug) u rastvoru (0.1 do 75 nM u 5-strukom razblaženju). Asocijacija je praćena u toku 2 minuta (80 µL injektovano pri 40 µL/min). Disocijacija je praćena u toku 10 minuta. Regeneracija površine senzora je dobijena sa 0.85% H3PO4, ili 0.85% H3PO4praćena sa 50 mM NaOH. Podaci su uklapani korišćenjem modela 1:1 vezivanja.

Tabela 2.

[0094] Za ispitivanje interakcije sa PHF-tau površina biosenzora je pripremljena hvatanjemkuplovanjem PHF-tau pomoću HT7 kao sredstva za hvatanje. Dodatno pripremanje PHF-tau kao što je ranije opisano je bilo potrebno za ProteOn da bi se ograničila količina nerastvornog materijala koja ulazi u fluide. PHF-tau kao što je gore opisan je dodatno prirpemljen centrifugiranjem 2-puta na 5000g, 5°C, 10 min gde je supernatant iz drugog centrifugiranja zatim razblažan 1/20 ili 1/40 u tekućem puferu. Da bi se pripremio čip, HT7 je kovalentno imobiliziran za površinu senzornog čipa GLC (ProteOn) pomoću svakoog uputstva proizvođača za hemiju kuplovanja amina (∼3000 jedinica odgovora (RU). Pufer za kuplovanje je bio 10 mM natrijum acetata, pH 4.5. Posle HT7 imobilizacije PHF-tau je injektovan i uhvaćen (∼300 RU) sa HT7. Posle hvatanja, PHF-tau je kovalentno imobiliziran za čip senzora aktivacijom čipa pomoću svakog uputstva proizvođača za hemiju kuplovanja amina. Preostala reaktivna mesta su na kraju blokirana injekcijom etanolamina. Posle dobijanja i stabilizacije PHF-tau-modifikovane površine i referentne površine (koja ne sadrži antien), anti-PHF-tau antitela su razblažena u tekućem puferu i injektovana u rastvor (0.1-75 nM u 5-strukim razblaženjima). Asocijacija je praćena u toku 3 minuta (120 µL injektovana pri 40 µL/min). Disocijacija je praćena u toku 10 ili 15 minuta. Regeneracija površine senzora je dobijana sa 10 mM Gly pH 2. Podaci su uklapani pomoću modela bivalentnog vezivanja kada je očigleni unutrašnji afinitet zabeležen kao odnos koff-1/kon-1.

Na osnovu ProteOn eksperimenata PT1 vezuje PHF-tau sa 322 pM afinitetom i ne pokazuje vezivanje kontrolnog tau pod testiranim uslovima (Tabela 2). PT3 vezuje PHF-tau sa 18 ±2 pM afinitetom i ne pokazuje vezivanje za kontrolni tau u 4 od 5 merenja u testiranim uslovima. Jedan od 5 ProteOn

2

merenja pokazuje slabo vezivanje koje treba da je korišćeno da se proceni afinitet > 75 nM na bazi najviše koncentracije korišćenog kontrolnog tau.

2

2

�

�

2

2

1

�

4

4

Claims (12)

Patenti zahtevi

1. Izolovano antitelo koje vezuje PHF-tau koje sadrži VH SEQ ID NO: 37 i VL SEQ ID NO:38, ili njihovu humanizovanu verziju,

gde pomenuta humanizovana verzija ima afinitet naspram PHF-tau sa konstantom disocijacije (KD) manjom od ili jednakom 10<-10>M, određenom sa ProteOn.

2. Izolovano antitelo prema zahtevu 1, gde je antitelo IgG izotip, opciono gde je antitelo:

(a) IgG1 izotip,

(b) IgG2 izotip,

(c) IgG3 izotip, ili

(d) IgG4 izotip.

3. Izolovano antitelo prema zahtevu 1 ili zahtevu 2, gde je antitelo fragment antitela, kao što je Fab, Fab’, F(ab’)2ili Fv fragment.

4. Izolovano antitelo prema bio kom od zahteva 1-3, gde je antitelo humanizovano.

5. Izolovani polinukleotid koji kodira izolovano antitelo prema bilo kom od zahteva 1-4.

6. Vektor koji sadrži polinukleotid prema zahtevu 5.

7. Ćelija domaćin koja sadrži vektor prema zahtevu 6.

8. Postupak dobijanja antitela koje vezuje PHF-tau koji obuhvata kultivisanje ćelije domaćina prema zahtevu 7 i regeneraciju antitela dobijenog od strane ćelije domaćina.

9. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema bilo kom od zahteva 1-4 i farmaceutski prihvatlji nosač.

10. Izolovano antitelo prema bilo kom od zahteva 1-4 za upotrebu u terapiji.

11. Izolovano antitelo prema bilo kom od zahteva 1-4 za upotrebu u lečenju ili sprečavanju, ili smanjenju simptoma, neurodegenerativne bolesti koja uključuje patološko nagomilavanje tau u mozgu.

12. Izolovano antitelo za upotrebu prema zahtevu 11, gde je neurodegenerativna bolest Alchajmerova bolest.

4