[go: up one dir, main page]

RS59892B1 - Rekombinantni hvt vektori koji eksprimiraju antigene patogena ptica i njihove upotrebe - Google Patents

Rekombinantni hvt vektori koji eksprimiraju antigene patogena ptica i njihove upotrebe

Info

Publication number
RS59892B1
RS59892B1 RS20200111A RSP20200111A RS59892B1 RS 59892 B1 RS59892 B1 RS 59892B1 RS 20200111 A RS20200111 A RS 20200111A RS P20200111 A RSP20200111 A RS P20200111A RS 59892 B1 RS59892 B1 RS 59892B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
ndv
hvt
recombinant
virus
vsb1
Prior art date
Application number
RS20200111A
Other languages
English (en)
Inventor
Michel Bublot
Teshome Mebatsion
Joyce Pritchard
Perry Linz
Original Assignee
Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=47358292&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS59892(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc filed Critical Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc
Publication of RS59892B1 publication Critical patent/RS59892B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/869—Herpesviral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/15—Reoviridae, e.g. calf diarrhea virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A61K39/17—Newcastle disease virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/245—Herpetoviridae, e.g. herpes simplex virus
    • A61K39/255—Marek's disease virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/295—Polyvalent viral antigens; Mixtures of viral and bacterial antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/01—DNA viruses
    • C07K14/03—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/115—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • C07K14/125—Newcastle disease virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/14—Reoviridae, e.g. rotavirus, bluetongue virus, Colorado tick fever virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16071—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16311—Mardivirus, e.g. Gallid herpesvirus 2, Marek-like viruses, turkey HV
    • C12N2710/16341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/16343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/00034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/10011—Birnaviridae
    • C12N2720/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
    • C12N2760/18134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Opis
UNAKRSNE REFERENCE SA SRODNIM PATENTNIM PRIJAVAMA
[0001] Ova patentna prijava koristi pravo prvenstva U.S. privremene patentne prijave 61/564,877 podnete 30. novembra 2011. i U.S. privremene patentne prijave 61/694,957 podnete 30. avgusta 2012.
OBLAST PRONALASKA
[0002] Pronalazak se odnosi na rekombinantne virusne vektore za insertovanje i ekspresiju stranih gena, koji se koriste kao neškodljivi imunizacioni prenosnici za postizanje zaštite od različitih patogena. Odnosi se i na multivalentnu kompoziciju ili vakcinu koja uključuje jedan ili više rekombinantnih virusnih vektora za zaštitu od različitih patogena. U ovom tekstu opisani su metodi spravljanja i upotrebe rekombinantnih virusnih vektora.
OSNOV PRONALASKA
[0003] Vakcinisanje živine u širokoj je upotrebi za zaštitu živinskih zajednica od pustošećih oboljenja koja uključuju Newcastle bolest (Newcastle disease, ND), infektivnu bolest burze (infectious bursal disease, IBD), Marekovu bolest (Marek’s disease, MD), infektivni bronhitis (infectious bronchitis, IB), infektivni laringotraheitis (infectious laryngotracheitis, ILT) i ptičju influencu (avian influenza, AI). ND izazvana je ptičjim paramiksovirusom I (avian paramyxovirus 1, APMV-1) označenim i kao ND virus (NDV) koji pripada familiji Paramyxoviridae. MD izazvana je Gallid herpesvirusom 2 (familija Herpesviridae) označenim i kao MD virus serotip 1 (MDV1). IB izazvan je IB virusom (IBV) koji pripada familiji Coronaviridae, ILT izazvan je Gallid herpesvirusom 1 (familija Herpesviridae) označenim i kao ILT virus (ILTV), i AI izazvana je AI virusom (AIV) koji pripada familiji Orthomyxoviridae.
[0004] Brojni rekombinantni ptičji virusni vektori predloženi za vakcinisanje ptica protiv ovih ptičjih patogena. Korišćeni virusni vektori uključuju avipoks viruse, posebno virus ptičjih boginja (EP-A-0,517,292), Marekov virus, na primer serotipove 2 i 3 (HVT) (WO-A-87/04463), ili alternativno ITLV, NDV i ptičji adenovirus. Kada su neki od ovih rekombinantnih ptičjih virusnih vektora bili korišćeni za vakcinaciju, ostvareni su različiti nivoi zaštite.
[0005] Nekoliko rekombinantnih HVT (herpesvirus of turkey, herpesvirus ćuraka, označeni i kao Meleagrid herpesvirus 1 ili MDV serotip 3) vektora koji eksprimiraju antigene iz različitih patogena (US patent br. 5,980,906, 5,853,733, 6,183,753, 5,187,087) uključujući IBDV, NDV, ILTV i AIV, bilo je razvijeno i licencirano. Od posebnog interesa je HVT vektor koji eksprimira IBDV VP2 zaštitni gen, koji je pokazao jasne prednosti u odnosu na klasične IBD vakcine (Bublot et al J.Comp. Path.2007, Vol.137, S81-S84; US 5,980,906). Drugi HVT vektori od interesa su oni koji eksprimiraju NDV (Morgan et al 1992, Avian dis.
36, 858-70; US 6,866,852; US5,650,153) ili ILTV (Johnson et al, 2010 Avian Dis 54, 1251-1259; US6,299,882; US5,853,733) zaštitni gen/gene. Jedan od praktičnih problema u vezi sa korišćenjem ovih nekoliko rekombinantnih vakcina na bazi HVT je njihova interferencija. Kada se pomešaju dva HVT rekombinanta koja eksprimiraju različite antigene, indukuje se niža zaštita protiv bar jedne od bolesti (Rudolf Heine 2011; Issues of the Poultry Recombinant Viral Vector Vaccines which May Cause an Effect on the Economic Benefits of those Vaccines; rad predstavljen na XVII World Veterinary Poultry Association (WVPA) Congress, Cancún, Mexico, 14-18. avgusta 2011; Slacum G, Hein R. and Lynch P., 2009, The compatibility of HVT recombinants with other Marek’s disease vaccines, 58th Western Poultry Disease Conference, Sacramento, CA, USA, 23-25. mart, p 84).
[0006] Kombinacija HVT i SB-1, vakcinskog soja Gallid herpesvirusa 3 (MDV serotip 2 ili MDV-2), pokazala je sinergistički efekat u zaštiti od MD (Witter and Lee, 1984, Avian Pathology 13, 75-92). Da bi se rešio problem interferencije, od interesa je izvršiti procenu HVT virusa kao vakcinskog vektora za eksprimiranje jednog ili više zaštitnih antigena protiv različitih patogena ptica.
[0007] Genom SB-1 kloniran je i okarakterisan u bakterijskom veštačkom hromozomu (bacterial artificial chromosome, BAC) (Petherbridge, et al., J. Virol. Methods 158, 11-17, 2009; Singh et al., Research in Veterinary Science 89, 140-145, 2010). MDV2 SB-1 sekvenca nedavno je dobijena i analizirana (Spatz and Schat, Virus Gene 42, 331-338, 2011). Deleciju glikoproteina E SB-1 virusa opisali su Petherbridge, et al. (J. Virol. Methods 158, 11-17, 2009). Međutim, nisu saopštena istraživanja u kojima se koristi SB-1 kao virusni vektor koji eksprimira strane zaštitne gene.
[0008] Imajući u vidu potencijalni efekat životinjskih patogena, na primer NDV i IBDV, na veterinarsko javno zdravlje i ekonomiju, potrebni su efikasni metodi sprečavanja infekcija i zaštite životinja. Postoji potreba za rešenjem kombinovanih efikasnih vektorskih vakcina i pogodnog metoda spravljanja vakcine, čime bi mogao da se olakša problem interferencije zapažene između dve vektorske vakcine na bazi HVT.
KRATAK OPIS PRONALASKA
[0009] U prvom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje kompoziciju ili vakcinu koja uključuje:
prvi rekombinantni HVT (herpesvirus ćuraka) vektor koji uključuje heterologni polinukleotid koji kodira i eksprimira F antigen virusa Newcastle bolesti (Newcastle disease virus F, NDV-F), operabilno vezan za SV40 promotor i SV40 poliA signal, i gde su, pored toga, polinukleotid koji kodira NDV-F polipeptid, operabilno vezani SV40 promotor i SV40 poliA signal insertovani u lokus "intergensko mesto 1" (intergenic site 1, IG1) HVT genoma, i gde, pored toga, polinukleotid koji kodira i eksprimira NDV-F ima sekvencu kako je navedeno u SEQ ID NO: 1; i
drugi rekombinantni HVT vektor koji uključuje heterologni polinukleotid koji kodira i eksprimira VP2 antigen virusa infektivne bolesti burze (infectious bursal disease virus, IBDV), pri čemu je drugi rekombinantni HVT vektor vHVT13.
[0010] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje kompoziciju ili vakcinu predmetnog pronalaska za upotrebu u metodu vakcinisanja životinje, pomenuti metod uključuje najmanje jednu primenu kompozicije ili vakcine.
[0011] U trećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje kompoziciju ili vakcinu predmetnog pronalaska za upotrebu u metodu indukovanja zaštitnog odgovora kod životinje, protiv virusa Newcastle bolesti (NDV), virusa infektivne bolesti burze (tj., IBDV ili virusa Gumboro bolesti) i virusa Marekove bolesti (MDV), pomenuti metod uključuje najmanje jednu primenu kompozicije ili vakcine.
[0012] U ovom tekstu opisani su iznenađujući rezultati da su polivalentne kompozicije ili vakcine koje sadrže jednostruki ili dvostruki HVT vektor, bile efikasne u zaštiti životinja od različitih patogena ptica, bez interferencije. Iznenađujući rezultati zapaženi su i kada su različite kombinacije promotora, kodon-optimizovanog gena, poliA repova i insercionih mesta davale različite nivoe efikasnosti i stabilnosti ekspresije jednog ili više heterolognih gena in vivo.
[0013] U ovom tekstu opisan je rekombinantni HVT vektor koji uključuje jedan ili više heterolognih polinukleotida koji kodiraju i eksprimiraju najmanje jedan antigen ptičjeg patogena.
[0014] U ovom tekstu opisana je kompozicija ili vakcina koja sadrži jedan ili više rekombinantnih HVT vektora koji uključuju jedan ili više heterolognih polinukleotida koji kodiraju i eksprimiraju najmanje jedan antigen patogena ptica.
[0015] U ovom tekstu opisana je polivalentna kompozicija ili vakcina koja sadrži jedan ili više rekombinantnih HVT vektora koji uključuju heterologne polinukleotide koji kodiraju i eksprimiraju najmanje jedan antigen patogena ptica i jedan ili više rekombinantnih SB1 vektora koji uključuju heterologne polinukleotide koji kodiraju i eksprimiraju najmanje jedan antigen patogena ptica.
[0016] U ovom tekstu opisan je metod vakcinisanja životinje, ili indukovanja imunogenog ili zaštitnog odgovora kod životinje, koji uključuje najmanje jednu primenu kompozicije ili vektora predmetnog pronalaska.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0017] Detaljan opis koji sledi, predstavljen primerima, i čiji cilj nije da pronalazak ograniči na specifične opisane primere izvođenja, može se razumeti udružen sa pratećim slikama koje su uključene u ovaj tekst kao reference, gde:
Slika 1 predstavlja tabelu koja prikazuje SEQ ID NO pripisan svakoj DNK i proteinskoj sekvenci.
Slika 2 prikazuje strukturu genoma HVT i njegova inserciona mesta.
Slika 3 prikazuje mapu plazmida pHM103.
Slika 4 prikazuje rezultate PCR analize vHVT114.
Slika 5 prikazuje rezultate dvostrukog testa imunofluorescencije.
Slika 6 prikazuje rezultate analize metodom Southern blot vHVT114.
Slika 7 prikazuje rezultate imunoprecipitacije i analize metodom Western blot za vHVT114.
Slika 8 prikazuje analizu metodom Western blot imunoprecipitiranog uzorka iz ćelija inficiranih vHVT306.
Slika 9 prikazuje analizu metodom Western blot imunoprecipitiranog uzorka iz ćelija inficiranih vSB1-009.
Slika 10 prikazuje rezultat studije vHVT304 i vHVT114 protiv infekcije izazvane NDV ZJ1 i CA02.
Slika 11 prikazuje rezultat oslobađanja virusa posle infekcije NDV CA02 i ZJ1.
Slika 12 prikazuje rezultat oslobađanja virusa posle infekcije NDV Chimalhuacan.
Slika 13 prikazuje poravnavanje sekvenci i procenat identičnosti.
Slika 14 prikazuje sekvence DNK i proteina.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0018] Napominje se da u ovoj objavi i posebno u zahtevima, izrazi kao "uključuje", "uključen", "koji uključuje" i slično mogu imati značenje koje im je pripisano prema Zakonu za patente Sjedinjenih Američkih Država npr., mogu značiti "obuhvata", "obuhvaćen", "koji obuhvata", i slično; i da izrazi kao "koji se sastoji suštinski od" i "sastoji se suštinski od" imaju značenje koje im je pripisano prema Zakonu za patente Sjedinjenih Američkih Država npr., oni dopuštaju elemente koji nisu eksplicitno navedeni, ali isključuju elemente koji se nalaze u stanju tehnike ili koji utiču na bazične ili nove karakteristike pronalaska.
[0019] Ukoliko nije drugačije navedeno, tehnički izrazi se koriste u skladu sa uobičajenom upotrebom. Definicije opštih pojmova u molekularnoj biologiji mogu se naći u Benjamin Lewin, Genes V. izdavač Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, izdavač Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); i Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, izdavač VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).
[0020] Izrazi navedeni u jednini odnose se i na množinu ukoliko kontekstom nije jasno naznačeno drugačije. Slično tome, reč "ili" treba da uključuje "i" ukoliko kontekstom nije jasno naznačeno drugačije. Reč "ili" označava bilo kojeg člana određenog spiska, a uključuje i svaku kombinaciju članova tog spiska.
[0021] Izraz "životinja" koristi se u ovom tekstu da obuhvati sve sisare, ptice i ribe. Životinja, kako se koristi u ovom tekstu, može se birati iz grupe koja se sastoji od kopitara (npr., konj), pasa (npr., psi, vukovi, lisice, kojoti, šakali), mačaka (npr., lavovi, tigrovi, domaće mačke, divlje mačke, druge velike mačke, i druge mačke uključujući geparda i risa), goveda (npr., govedo), svinje (npr., svinja), ovce (npr., ovce, koze lame, bizoni), ptica (npr., kokoška, patka, guska, ćurka, prepelica, fazan, papagaj, zeba, jastreb, vrana, noj, emu i kazuar), primata (npr., prosimijan, tarzijer, majmun, gibon, čovekoliki majmun), ljudi, i riba. Izraz "životinja" uključuje i pojedinačne životinje na svim stupnjevima razvića, uključujući embrionalne i fetalne stupnjeve.
[0022] Izrazi "polipeptid" i "protein" koriste se u ovom tekstu naizmenično za označavanje polimera uzastopnih aminokiselinskih rezidua.
[0023] Izraz "nukleinska kiselina", "nukleotid", i "polinukleotid" koriste se naizmenično i označavaju RNK, DNK, cDNK, ili cRNK i njihove derivate, na primer one koji sadrže modifikovanu osovinu. Podrazumeva se da su u ovom tekstu opisani polinukleotidi koji sadrže sekvence komplementarne onima koje su opisane u ovom tekstu. "Polinukleotid" opisan u ovom tekstu uključuje i "forward" lanac (5’ ka 3’) i "reverse" komplementarni lanac (3’ ka 5’). Polinukleotidi prema pronalasku mogu se pripremiti na različite načine (npr. hemijskom sintezom, genskim kloniranjem, itd.) i mogu zadobiti različite forme (npr. linearni ili granati, jednolančani ili dvolančani, ili njihov hibrid, prajmeri, probe itd.).
[0024] Izrazi "genomska DNK" ili "genom" koriste se naizmenično i označavaju naslednu genetičku informaciju organizma-domaćina. Genomska DNK uključuje DNK nukleusa (označenu i kao hromozomska DNK) ali i DNK plastida (npr., hloroplasta) i drugih ćelijskih organela (npr., mitohondrija). Genomska DNK ili genom, razmatran u predmetnom pronalasku, odnosi se i na RNK virusa. RNK može biti pozitivni lanac ili negativni lanac RNK. Izraz "genomska DNK", razmatran u predmetnom pronalasku, uključuje genomsku DNK koja sadrži sekvence komplementarne opisanima u ovom tekstu. Izraz "genomska DNK" odnosi se i na informacionu RNK (messenger, mRNK), komplementarnu DNK (complementary, cDNK), i komplementarnu RNK (cRNK).
[0025] Izraz "gen" koristi se u širokom smislu za označavanje bilo kojeg segmenta polinukleotida udruženog sa biološkom funkcijom. Prema tome, geni ili polinukleotidi uključuju introne i egzone kao u genomskoj sekvenci, ili samo kodirajuće sekvence kao u cDNK, na primer, otvoreni ram čitanja (open reading frame, ORF), počevši od "start" kodona (metioninski kodon) i završavajući se terminacionim signalom ("stop" kodon). Geni i polinukleotidi mogu uključivati i regione koji regulišu njihovu ekspresiju, na primer inicijaciju transkripcije, terminaciju translacije i transkripcije. Prema tome, uključeni su i promotori i regioni za vezivanje ribozoma (ovi regulatorni elementi obično leže približno između 60 i 250 nukleotida ushodno od "start" kodona kodirajuće sekvence ili gena; Doree S M et al.; Pandher K et al.; Chung J Y et al.), terminatori transkripcije (terminator se obično nalazi unutar oko 50 nukleotida nishodno od "stop" kodona kodirajuće sekvence ili gena; Ward C K et al.). Gen ili polinukleotid označava i fragment nukleinske kiseline koji eksprimira mRNK ili funkcionalnu RNK, ili kodira specifični protein, i koji sadrži regulatorne sekvence.
[0026] Izraz "heterologna DNK", kako se koristi u ovom tekstu, označava DNK poreklom iz različitog organizma, na primer različitog tipa ćelije ili različite vrste u odnosu na primaoca. Izraz takođe označava DNK ili njen fragment na genomu DNK domaćina, pri čemu je heterologna DNK insertovana u region genoma koji se razlikuje od originalne lokacije.
[0027] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "antigen" ili "imunogen" označava supstancu koja indukuje specifičan imunski odgovor u životinji-domaćinu. Antigen može uključivati organizam u celini, ubijen, atenuisan ili živ; podjedinicu ili deo organizma; rekombinantni vektor koji sadrži insert sa imunogenskim odlikama; deo ili fragment DNK koji može da indukuje imunski odgovor posle prezentacije životinji-domaćinu; polipeptid, epitop, hapten, ili bilo koju njihovu kombinaciju. Alternativno, imunogen ili antigen može uključivati toksin ili antitoksin.
[0028] Izraz "imunogeni protein ili peptid", kako se koristi u ovom tekstu. uključuje polipeptide koji su imunski aktivni u smislu da su, kada se jednom primene kod domaćina, sposobni da pobude imunski odgovor humoralnog i/ili ćelijskog tipa uperen protiv proteina. Poželjno, proteinski fragment je takav da ima suštinski istu imunsku aktivnost kao ceo protein. Prema tome, proteinski fragment opisan u ovom tekstu uključuje ili se sastoji od najmanje jednog epitopa ili antigenske determinante. "Imunogeni" protein ili polipeptid, kako se koristi u ovom tekstu, uključuje sekvencu proteina pune dužine, njene analoge, ili imunogene fragmente istog. Pod "imunogenim fragmentom" misli se na fragment proteina koji uključuje jedan ili više epitopa i tako podstiče gore opisani imunski odgovor. Takvi fragmenti mogu se identifikovati korišćenjem neke od brojnih tehnika mapiranja epitopa, dobro poznatih u struci. Na primer, linearni epitopi mogu se determinisati npr., tako što će se na čvrstim podlogama istovremeno sintetisati veliki broj peptida koji odgovaraju delovima proteinskog molekula, i zatim reagovanjem peptida sa antitelima dok su peptidi još prikačeni za podloge. Slično tome, konformacioni epitopi se lako identifikuju određivanjem prostorne konformacije amino-kiselina na primer, rendgenskom kristalografijom i dvodimenzionalnom nuklearnom magnetnom rezonancom.
[0029] Izraz "imunogeni protein ili peptid" razmatra još i delecije, adicije i supstitucije u sekvenci, dok god polipeptid funkcioniše u pokretanju imunskog odgovora, kako je definisano u ovom tekstu. Izraz "konzervativna varijacija" označava zamenu aminokiselinske rezidue drugom biološki sličnom reziduom, ili zamenu nukleotida u sekvenci nukleinske kiseline tako da se kodirana aminokiselinska rezidua ostaje nepromenjena ili biva predstavljena drugom, biološki sličnom reziduom. U tom smislu, posebno poželjne supstitucije obično će biti po prirodi konzervativne, tj., one supstitucije koje se dešavaju unutar familije amino-kiselina. Na primer, amino-kiseline se uopšteno svrstavaju u četiri familije: (1) kisele - aspartat i glutamat; (2) bazne - lizin, arginin, histidin; (3) nepolarne -alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan; i (4) nenaelektrisane polarne - glicin, asparagin, glutamin, cistein, serin, treonin, tirozin. Fenilalanin, triptofan, i tirozin se ponekad svrstavaju u aromatične amino-kiseline. Primeri konzervativnih varijacija uključuju korišćenje jedne hidrofobne rezidue, na primer, izoleucina, valina, leucina ili metionina umesto druge hidrofobne rezidue, ili korišćenje jedne polarne rezidue umesto druge polarne rezidue, na primer, supstituciju lizina argininom, asparaginske kiseline glutaminskom kiselinom, ili asparagina glutaminom ili slično; ili sličnu konzervativnu zamenu aminokiseline strukturno srodnom amino-kiselinom koja neće bitno uticati na biološku aktivnost. Proteini koji imaju suštinski istu aminokiselinsku sekvencu kao referentni molekul, ali poseduju manje aminokiselinske supstitucije koje ne utiču bitno na imunogenost proteina su, prema tome, obuhvaćeni definicijom referentnog polipeptida. Svi polipeptidi proizvedeni ovim modifikacijama obuhvaćeni su ovim tekstom. Izraz "konzervativna varijacija" uključuje i upotrebu supstituisane amino-kiseline umesto nesupstituisane matične amino-kiseline, uz uslov da su antitela na supstituisani polipeptid imunoreaktivna i na nesupstituisani polipeptid.
[0030] Izraz "epitop" označava mesto na antigenu ili hapten na koji specifične B ćelije i/ili T ćelije odgovaraju. Izraz se takođe koristi naizmenično sa "antigenska determinanta" ili "mesto antigenske determinante". Antitela koja prepoznaju isti epitop mogu se identifikovati jednostavnim imunotestom koji pokazuje sposobnost jednog antitela da blokira vezivanje drugog antitela za ciljni antigen.
[0031] "Imunski odgovor" na kompoziciju ili vakcinu je razvijanje, u domaćinu, imunskog odgovora posredovanog ćelijama i/ili antitelima na kompoziciju ili vakcinu od interesa. Obično, "imunski odgovor" uključuje, ali se ne ograničava na jedan ili više od sledećih efekata: proizvodnja antitela, B ćelija, pomažućih T ćelija i/ili citotoksičnih T ćelija specifično usmerenih ka antigenu ili antigenima sadržanim u kompoziciji ili vakcini od interesa. Poželjno, domaćin će ispoljiti terapijski ili zaštitini imunski odgovor tako da će otpornost na novu infekciju biti pojačana i/ili će klinička jačina bolesti biti smanjena. Takva zaštita biće pokazana smanjenjem ili izostankom simptoma koji se normalno ispoljavaju kod inficiranog domaćina, kraćim vremenom oporavka i/ili sniženim titrom virusa kod inficiranog domaćina.
[0032] Izrazi "rekombinantni" i "genetički modifikovani" koriste se naizmenično i označavaju svaku modifikaciju, promenu ili inženjerisanje polinukleotida ili proteina u odnosu na njihov nativni oblik ili strukturu, ili svaku modifikaciju, promenu ili inženjerisanje polinukleotida ili proteina u odnosu na njihovu nativnu sredinu ili okruženje. Modifikacija, promena ili inženjerisanje polinukleotida ili proteina mogu uključivati, bez ograničavanja, deleciju jednog ili više nukleotida ili amino-kiselina, deleciju čitavog gena, kodon-optimizaciju gena, konzervativnu supstituciju amino-kiselina, inserciju jednog ili više heterolognih polinukleotida.
[0033] Izraz "dvostruki HVT konstrukt" ili "dvostruki HVT vektor" označava HVT virusni vektor koji uključuje dva heterologna polinukleotida.
[0034] Izrazi "polivalentna vakcina ili kompozicija", "kombinaciona ili 'kombo' vakcina ili kompozicija" i "multivalentna vakcina ili kompozicija" koriste se naizmenično da označe kompoziciju ili vakcinu koja sadrži više od jedne kompozicije ili vakcine. Polivalentna vakcina ili kompozicija može sadržati dve. tri. četiri ili više kompozicija ili vakcina. Polivalentna vakcina ili kompozicija može uključivati rekombinantne virusne vektore, aktivne ili atenuisane ili ubijene viruse divljeg tipa, ili mešavinu rekombinantnih virusnih vektora i divljeg tipa virusa u aktivnom ili atenuisanom obliku ili ubijene.
[0035] Jedan primer izvođenja opisan u ovom tekstu obezbeđuje rekombinantni HVT virusni vektor koji uključuje jedan ili više heterolognih polinukleotida koji kodiraju i eksprimiraju najmanje jedan antigen ili polipeptid patogena ptica. HVT sojevi upotrebljeni u rekombinantnom virusnom vektoru mogu biti bilo koji HVT sojevi, uključujući, ali ne ograničavajući se na HVT soj FC126 (Igarashi T. et al., J. Gen. Virol.70, 1789-1804, 1989).
[0036] Sledeći primer izvođenja opisan u ovom tekstu obezbeđuje rekombinantni SB-1 virusni vektor koji uključuje jedan ili više heterolognih polinukleotida koji kodiraju i eksprimiraju najmanje jedan antigen ili polipeptid patogena ptica. SB-1 sojevi mogu biti bilo koji SB-1 sojevi, uključujući, ali ne ograničavajući se na komercijalnu vakcinu protiv Marekove bolesti (SB-1 vakcina) (Merial Select Inc., Gainesville, GA 30503, USA), SB-1 soj koji ima genomsku sekvencu definisanu GenBank pristupnim brojem HQ840738.1.
[0037] Geni koji kodiraju antigen ili polipeptid opisan u ovom tekstu mogu biti oni koji kodiraju fuzioni protein virusa Newcastle bolesti (Newcastle disease virus fusion protein, NDV-F), hemaglutinin neuraminidazu virusa Newcastle bolesti (Newcastle disease virus hemagglutinin neuraminidase, NDV-HN), glikoporotein C virusa Marekove bolesti (Marek’s disease virus glycoprotein C, gC), glikoporotein B virusa Marekove bolesti (Marek’s disease virus glycoprotein B, gB), glikoporotein E virusa Marekove bolesti (Marek’s disease virus glycoprotein E, gE), glikoporotein I virusa Marekove bolesti (Marek’s disease virus glycoprotein I, gI), glikoporotein H virusa Marekove bolesti (Marek’s disease virus glycoprotein H, gH) ili glikoporotein L virusa Marekove bolesti (Marek’s disease virus glycoprotein L, gL), VP2 virusa infektivne bolesti burze (infectious bursal disease virus, IBDV), IBDV VPX, IBDV VP3, IBDV VP4, glikoprotein B ILTV, glycoprotein I ILTV, UL32 ILTV, glikoprotein D ILTV, glikoprotein E ILTV, glikoprotein C ILTV, hemaglutinin
1
influence (influenza hemaglutinin, HA), neuraminidazu influence (influenza neuraminidase, NA), zaštitine gene izvedene iz Mycoplasma gallisepticum (MG), ili Mycoplasma synoviae (MS), ili njihove kombinacije. Antigen ili polipeptid može biti bilo koji antigen iz živinskog patogena odabranog iz grupe koja se sastoji od virusa ptičjeg encefalomijelitisa, ptičjeg reovirusa, ptičjeg paramiksovirusa, ptičjeg metapneumovirusa, ptičjeg virusa influence, ptičjeg adenovirusa, virusa ptičjih boginja, ptičjeg koronavirusa, ptičjeg rotavirusa, virusa kokošje anemije, ptičjeg astrovirusa, ptičjeg parvovirusa, kokcidioze (Eimeria sp.), Campylobacter sp., Salmonella sp., Pasteurella sp., Avibacterium sp., Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Clostridium sp., i E. coli.
[0038] Pored toga, u ovom tekstu opisani su homolozi gore pomenutih antigena ili polinukleotida. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "homolozi" uključuje ortologe, analoge i paraloge. Izraz "analozi" označava dva polinukleotida ili polipeptida koji imaju istu ili sličnu funkciju, ali su se razvili razdvojeno u nesrodnim organizmima. Izraz "ortologi" označava dva polinukleotida ili polipeptida iz različitih vrsta, ali koji su se razvili iz zajedničkog predačkog gena, specijacijom. Normalno, ortolozi kodiraju polipeptide koji imaju iste ili slične funkcije. Izraz "paralozi" označava dva polinukleotida ili polipeptida koji su nastali duplikacijom unutar genoma. Paralozi obično imaju različite funkcije, ali ove funkcije mogu biti povezane. Analozi, ortolozi, i paralozi divljeg tipa polipeptida mogu se razlikovati od divljeg tipa polipeptida po posttranslacionim modifikacijama, razlikama u sekvenci amino-kiselina ili oba. Tačnije, homolozi opisani u ovom tekstu obično će ispoljiti bar 80-85%, 85-90%, 90-95%, ili 95%, 96%, 97%, 98%, 99% sekvencione identičnosti sa celim ili delom polinukleotidnih ili polipeptidnih sekvenci gore opisanih antigena, i ispoljiće sličnu funkciju.
[0039] U jednom primeru izvođenja opisanom u ovom tekstu, obezbeđen je rekombinantni HVT ili SB-1 virusni vektor koji uključuje jedan ili više heterolognih polinukleotida koji kodiraju i eksprimiraju NDV-F antigen ili polipeptid. U jednom aspektu primera izvođenja, NDV-F antigen ili polipeptid ima najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% sekvencione identičnosti sa polipeptidom koji ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO:2, 4, 6, 33, 35, ili 37, ili konzervativnom varijantom, alelskom varijantom, homolognim ili imunogenim fragmentom koji uključuje najmanje osam ili najmanje deset uzastopnih amino-kiselina jednog od ovih polipetida, ili kombinacijom ovih polipeptida. U drugom aspektu primera izvođenja, heterologni polinukleotid kodira NDV-F antigen ili polipeptid koji ima najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% sekvencione identičnosti sa polipeptidom koji ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO:2, 4, 6, 33, 35, ili 37. U još jednom primeru izvođenja, heterologni polinukleotid ima najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% sekvencione identičnosti sa polinukleotidom koji ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO:1, 3, 5, 32, 34, ili 36.
[0040] Varijante uključuju alelske varijante. Izraz "alelska varijanta" označava polinukleotid ili polipeptid koji sadrži polimorfizam koji dovodi do promena u sekvencama amino-kiselina proteina i koji postoji unutar prirodne populacije (npr., vrsta ili varijetet virusa). Tipičan rezultat takvih prirodnih alelskih varijacija može biti 1-5% varijanse polinukleotida ili polipeptida. Alelske varijante mogu da se identifikuju sekvenciranjem sekvence nukleinske kiseline od interesa kod većeg broja različitih vrsta, što se lako može izvesti korišćenjem hibridizacionih proba za identifikovanje genetičkog lokusa istog gena kod ovih vrsta. Svaka i sve takve varijacije nukleinske kiseline i rezultujući polimorfizmi amino-kiselina ili varijacije koji su rezultat prirodne alelske varijacije i koje ne menjaju funkcionalnu aktivnost gena od interesa, opisani su u ovom tekstu.
[0041] Izraz "identičnost", u vezi sa sekvencom, može označavati, na primer, broj pozicija sa identičnim nukleotidima ili amino-kiselinama podeljen brojem nukleotida ili amino-kiselina u kraćoj od dve sekvence, pri čemu poravnavanje dveju sekvenci može da se odredi u skladu sa Wilburovim i Lipmanovim algoritmom (Wilbur and Lipman). Sekvenciona identičnost ili sekvenciona sličnost dveju aminokiselinskih sekvenci, ili sekvenciona identičnost između dve nukleotidne sekvence može da se odredi korišćenjem Vector NTI softverskog paketa (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA). Kada se za RNK sekvence kaže da su slične, ili da imaju određeni stepen sekvencione identičnosti ili homologije sa DNK sekvencama, timidin (T) u DNK sekvenci smatra se jednakim uracilu (U) u RNK sekvenci. Prema tome, RNK sekvence mogu da se izvedu iz DNK sekvenci, pri čemu se timidin (T) DNK sekvenci smatra jednakim uracilu (U) u RNK sekvenci.
[0042] Polinukleotidi objave uključuju sekvence koje su degenerisane kao rezultat genetičkog koda, npr., upotrebe kodona optimizovanog za specifičnog domaćina. Kako se koristi u ovom tekstu, "optimizovani" označava polinukleotid koji je genetički inženjerisan tako da poveća svoju ekspresiju u datoj vrsti. Da bi se obezbedili optimizovani polinukleotidi koji kodiraju NDV-F polipeptide, DNK sekvenca gena za NDV-F protein može da se modifikuje tako da 1) uključuje kodone koji su poželjni za gene sa visokom ekspresijom za određenu vrstu; 2) ima A+T ili G+C sadžaj u kompoziciji nukleotidnih baza kakav se uglavnom nalazi u pomenutoj vrsti; 3) formira inicijacionu sekvencu pomenute vrste; ili 4) eliminiše sekvence koje izazivaju destabilizaciju, neodgovarajuću poliadenilaciju, degradaciju i terminaciju RNK, ili koje formiraju sekundarnu strukturu ukosnice ili RNA splajsujuća mesta. Povišena ekspresija NDV F proteina u pomenutoj vrsti može se postići korišćenjem distribucione frekvencije upotrebe kodona u eukariotima ili prokariotima, ili u određenoj vrsti. Izraz "frekvencija upotrebe poželjnog kodona" označava preferenciju koju pokazuje specifična ćelija-domaćin u vezi sa upotrebom nukleotidnih kodona za određivanje date amino-kiseline. Postoji 20 prirodnih amino-kiselina, od kojih većinu određuje više od jednog kodona. Prema tome, sve degenerisane nukleotidne sekvence uključene su u objavu pod uslovom da aminokiselinska sekvenca NDV-F polipeptida kodirana nukleotidnom sekvencom ostaje funkcionalno nepromenjena.
[0043] Uspešna ekspresija heterolognih polinukleotida rekombinantnim/modifikovanim infektivnim virusom zahteva dva uslova. Prvo, heterologni polinukleotidi moraju biti insertovani ili introdukovani u region genoma virusa tako da modifikovani virus ostane vijabilan. Drugi uslov za ekspresiju insertovanih heterolognih polinukleotida je prisustvo regulatornih sekvenci koje omogućavaju ekspresiju gena u virusnom okruženju (na primer: promotor, enhenser, donorsko i akceptorsko splajsujuće mesto i intron, Kozakova konsenzusna sekvenca inicijacije translacije, poliadenilacioni signali, netranslatujući sekvencioni elementi).
[0044] Mesto insercije može biti bilo koji neesencijalni region HVT genoma, uključujući, ali ne ograničavajući se na region između ATG ORF UL55 i spoja UL sa susednim regionom ponovka (US5,980,906), IG1 lokus, IG2 lokus, IG3 lokus, UL43 lokus, US10 lokus, SORF3/US2 lokus (vidi SL.2)
[0045] Uopšteno, pogodno je upotrebiti snažan promotor funkcionalan u eukariotskim ćelijama. Promotori uključuju, ali se ne ograničavaju na neposredni rani citomegalovirusni (cytomegalovirus, CMV) promotor, CMV promotor zamorca, promotor SV40, promotore Pseudorabies virusa kao što je promotor glikoproteina X, Herpes simplex virusa-1 kao što je alfa 4 promotor, promotore virusa Marekove bolesti (uključujući MDV-1, MDV-2 i HVT) kao što su oni koji pokreću ekspresiju glikoproteina gC, gB, gE, ili gI, promotore virusa infektivnog laringotraheitisa kao što su oni za gene glikoproteina gB, gE, gI, gD, ili druge promotore herpesvirusa.
[0046] Jedan primer izvođenja pronalaska obezbeđuje rekombinantni HVT vektor koji uključuje heterologne polinukleotide koji kodiraju i eksprimiraju NDV-F antigen ili polipeptid. U jednom aspektu primera izvođenja, polinukleotid koji kodira NDV-F polipeptid operabilno je vezan za SV40 promotor koji ima sekvencu kako je navedeno u SEQ ID NO:9 i dakle, ekspresija NDV-F antigena ili polipeptida regulisana je SV40 promotorom. U sledećem aspektu primera izvođenja, ekspresija NDV-F antigena ili polipeptida regulisana je SV40 poliA signalom koji ima sekvencu kako je navedeno u SEQ ID NO:11. U aspektu opisanom u
1
ovom tekstu, polinukleotid koji kodira NDV-F polipeptid operabilno je povezan sa MDV gB promotorom koji ima sekvencu kako je navedeno u SEQ ID NO:38 i dakle, ekspresija NDV-F antigena ili polipeptida regulisana je MDV gB promotorom.
[0047] Sledeći primer izvođenja opisan u ovom tekstu obezbeđuje rekombinantni dvostruki HVT vektor koji uključuje prvi heterologni polinukleotid koji kodira i eksprimira NDV-F antigen ili polipeptid i drugi polinukleotid koji kodira i eksprimira IBDV VP2 antigen ili polipeptid. U jednom aspektu primera izvođenja, NDV-F antigen ili polipeptid ima najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% sekvencione identičnosti sa polipeptidom koji ima sekvencu kako je navedeno u SEQ ID NO:2, 4, 6, 33, 35, ili 37. U sledećem aspektu primera izvođenja, IBDV VP2 antigen ili polipeptid ima najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% sekvencione identičnosti sa polipeptidom koji ima sekvencu kako je navedeno u SEQ ID NO:8 ili 42. U sledećem aspektu, polinukleotid koji kodira NDV-F polipeptid operabilno je povezan sa SV40 promotorom koji ima sekvencu kako je navedeno u SEQ ID NO:9 i ekspresija NDV-F antigena ili polipeptida regulisana je SV40 promotorom. U još jednom aspektu, ekspresija NDV-F antigena ili polipeptida regulisana je SV40 poliA signalom koji ima sekvencu kako je navedeno u SEQ ID NO:11, ili sintetskim poli A signalom koji ima sekvencu kako je navedeno u SEQ ID NO:12. U sledećem aspektu, ekspresija IBDV VP2 antigena ili polipeptida regulisana je CMV-IE promotorom koji ima sekvencu kako je navedeno u SEQ ID NO:10 i SV40 poliA signalom koji ima sekvencu kako je navedeno u SEQ ID NO:11.
[0048] Još jedan primer izvođenja opisan u ovom tekstu obezbeđuje rekombinantni dvostruki HVT vektor koji uključuje dva polinukleotida koja kodiraju i eksprimiraju IBDV VP2 antigene ili polipeptide. U jednom aspektu primera izvođenja, IBDV VP2 antigen ili polipeptid ima najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% sekvencione identičnosti sa polipeptidom koji ima sekvencu kako je navedeno u SEQ ID NO:8 ili 42. U jednom aspektu, polinukleotid koji kodira prvi IBDV VP2 antigen ili polipeptid operabilno je povezan sa CMV-IE promotorom koji ima sekvencu kako je navedeno u SEQ ID NO:10, i polinukleotid koji kodira drugi IBDV VP2 antigen ili polipeptid operabilno je povezan sa CMV promotorom zamorca, koji ima sekvencu kako je navedeno u SEQ ID NO:43. U sledećem aspektu, ekspresija prvog IBDV VP2 antigena ili polipeptida regulisana je CMV-IE promotorom koji ima sekvencu kako je navedeno u SEQ ID NO:10 i SV40 poliA signalom koji ima sekvencu kako je navedeno u SEQ ID NO:11, i ekspresija drugog IBDV VP2 antigena ili polipeptida regulisana je CMV promotorom zamorca, koji ima sekvencu kako je navedeno u SEQ ID NO:43 i sintetskim poliA signalom koji ima sekvencu kako je navedeno u SEQ ID NO:12. U još jednom aspektu primera izvođenja, polinukleotidi koji kodiraju IBDV VP2 antigen ili polipeptid mogu biti insertovani u jedan ili više lokusnih regiona koji se biraju iz grupe koja se sastoji od IG1, IG2, US10, SORF3-US2 i gD, genoma HVT. U jednom primeru izvođenja, u ovom tekstu je opisana farmaceutska kompozicija ili vakcina koja uključuje jedan ili više rekombinantnih HVT ili SB-1 virusnih vektora predmetnog pronalaska i farmaceutski ili veterinarski prihvatljivi nosač, ekscipijent, prenosnik ili adjuvans.
[0049] U sledećem primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje kompoziciju ili vakcinu koja uključuje HVT virusni vektor koji sadrži polinukleotid koji kodira NDV-F antigen, SV40 promotor i, opciono, farmaceutski ili veterinarski prihvatljivi nosač, ekscipijent, prenosnik ili adjuvans. U sledećem primeru izvođenja opisanom u ovom tekstu, obezbeđena je farmaceutska kompozicija ili vakcina koja uključuje prvi HVT vektor koji sadrži polinukleotid koji kodira NDV-F antigen, drugi HVT vektor koji uključuje polinukleotid koji kodira IBDV VP2 antigen i, opciono, farmaceutski ili veterinarski prihvatljivi nosač, ekscipijent, prenosnik ili adjuvans. U sledećem primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje kompoziciju ili vakcinu koja uključuje HVT virusni vektor koji uključuje polinukleotid koji kodira NDV-F antigen, SB-1 vektor koji uključuje polinukleotid koji kodira NDV-F antigen, opciono farmaceutski ili veterinarski prihvatljivi nosač, ekscipijent, prenosnik ili adjuvans. Farmaceutska kompozicija ili vakcina opisana u ovom tekstu može uključivati prvi HVT vektor koji uključuje polinukleotid koji kodira NDV-F antigen, drugi HVT vektor koji uključuje polinukleotid koji kodira IBDV VP2 antigen, SB-1 vektor koji uključuje polinukleotid koji kodira NDV-F antigen, opciono farmaceutski ili veterinarski prihvatljivi nosač, ekscipijent, prenosnik ili adjuvans.
[0050] U još jednom primeru izvođenja opisanom u ovom tekstu, obezbeđena je kompozicija ili vakcina koja uključuje dvostruki HVT virusni vektor koji uključuje: i) prvi heterologni polinukleotid koji kodira i eksprimira NDV-F antigen ili polipeptid; ii) drugi polinukleotid koji kodira i eksprimira IBDV VP2 antigen ili polipeptid; i iii) opciono farmaceutski ili veterinarski prihvatljivi nosač, ekscipijent, prenosnik ili adjuvans. U sledećem primeru izvođenja opisanom u ovom tekstu, obezbeđena je kompozicija ili vakcina koja uključuje dvostruki HVT virusni vektor koji sadrži dva polinukleotida koji kodiraju i eksprimiraju IBDV VP2 antigene ili polipeptide, i opciono farmaceutski ili veterinarski prihvatljivi nosač, ekscipijent, prenosnik ili adjuvans. U još jednom primeru izvođenja, kompozicija koja uključuje dvostruki HVT virusni vektor uključuje još i HVT vektor koji sadrži polinukleotid koji kodira IBDV VP2 antigen, ili SB-1 vektor koji sadrži polinukleotid koji kodira NDV-F
1
antigen, ili njihovu kombinaciju. Farmaceutski ili veterinarski prihvatljivi nosači ili adjuvans ili prenosnici ili ekscipijenti dobro su poznati stručnjaku u oblasti. Na primer, farmaceutski ili veterinarski prihvatljivi nosač ili adjuvans ili prenosnik ili ekscipijent može biti razblaživač vakcine za Marekovu bolest, koji se upotrebljava za vakcine protiv MD. Drugi farmaceutski ili veterinarski prihvatljivi nosači ili adjuvansi ili prenosnici ili ekscipijenti koji se mogu koristiti u metodima ovog pronalaska, uključuju, ali se ne ograničavaju na 0.9% rastvor NaCl (npr., slani rastvor) ili fosfatni pufer, poli-(L-glutamat) ili polivinilpirolidon. Farmaceutski ili veterinarski prihvatljivi nosači ili prenosnici ili ekscipijenti mogu biti predstavljeni bilo kojim jedinjenjem ili kombinacijom jedinjenja koja olakšavaju primenu vektora (ili proteina koji se eksprimira na osnovu vektora pronalaska in vitro), ili koja olakšavaju transfekciju ili infekciju i/ili poboljšavaju prezervaciju vektora (ili proteina). Doze i dozne zapremine u ovom tekstu se razmatraju u opštem opisu, a može ih odrediti i stručnjak u oblasti, na osnovu ove objave, zajedno sa onim što je poznato u struci, bez izvođenja nepotrebnih eksperimenata.
[0051] Opciono, kao farmaceutski ili veterinarski prihvatljivi nosači ili adjuvansi ili prenosnici ili ekscipijenti mogu se dodati druga jedinjenja, uključujući, bez ograničavanja alum; CpG oligonukleotide (ODN), posebno ODN 2006, 2007, 2059, ili 2135 (Pontarollo R.A. et al., Vet. Immunol. Immunopath, 2002, 84: 43-59; Wernette C.M. et al., Vet. Immunol. Immunopath, 2002, 84: 223-236; Mutwiri G. et al., Vet. Immunol. Immunopath, 2003, 91: 89-103); poliA-poliU, dimetildioktadecilamonijum bromid (dimethyldioctadecylammonium bromide, DDA) ("Vaccine Design The Subunit and Adjuvant Approach", editori Michael F. Powell and Mark J. Newman, Pharmaceutical Biotechnology, 6: p.03, p.157); N,N-dioktadecil-N’,N’-bis(2-hidroksietil) propandiamin (kao A VRIDINE®) (Ibid, p. 148); karbomer, hitozan (vidi US patent serijski br.5,980.912 na primer).
[0052] Farmaceutske kompozicije i vakcine prema pronalasku mogu uključivati ili sastojati se suštinski od jednog ili više adjuvanasa. Pogodni adjuvansi za upotrebu u izvođenju predmetnog pronalaska su (1) polimeri akrilne ili metakrilne kiseline, maleinski anhidrid i polimeri alkenil derivata, (2) imunostimulirajuće sekvence (immunostimulating sequences, ISS), kao što su oligodeoksiribonukleotidne sekvence sa jednom ili više nemetilisanih CpG jedinica (Klinman et al., 1996; WO98/16247), (3) emulzija ulja u vodi, kao SPT emulzija opisana na str. 147 u "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach", objavili M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, i emulzija MF59 opisana na str. 183 istog rada, (4) katjonski lipidi koji sadrže kvaternarnu amonijum so, npr., DDA (5) ctokini, (6) aluminijum hidroksid ili aluminijum fosfat, (7) saponin ili (8) drugi adjuvansi o kojima se govori u bilo
1
kojem od dokumenata citiranih u sadašnjoj patentnoj prijavi, ili (9) sve njihove kombinacije ili mešavine.
[0053] Sledeći aspekt opisan u ovom tekstu je metod indukovanja imunskog odgovora životinje na jedan ili više antigena ili zaštitnog odgovora životinje na jedan ili više patogena ptica, metod uključuje inokulisanje životinje, najmanje jedanput, vakcinom ili farmaceutskom kompozicijom predmetnog pronačaska. Još jedan aspekt opisan u ovom tekstu je metod indukovanja imunskog odgovora kod životinje na jedan ili više antigena ili zaštitnog odgovora životinje na jedan ili više patogena ptica, po režimu primene "prime-boost" (indukovanje-pojačavanje), koji se sastoji od najmanje jedne primarne primene i najmanje jedne pojačavajuće primene, korišćenjem najmanje jednog zajedničkog polipeptida, antigena, epitopa ili imunogena. Imunska kompozicija ili vakcina upotrebljena prilikom primarne primene može biti ista, ili može biti različita po prirodi od one koja je upotrebljena kao pojačivač.
[0054] Patogeni ptica mogu biti virus Newcastle bolesti (NDV), virus infektivne bolesti burze (tj., IBDV ili virus Gumboro bolesti), virus Marekove bolesti (MDV), virus infektivnog laringotraheitisa (ILTV), virus ptičjeg encefalomijelitisa, ptičji reovirus, ptičji paramiksovirus, ptičji metapneumovirus, ptičji virus influence, ptičji adenovirus, virus ptičjih boginja, ptičji koronavirus, ptičji rotavirus, ptičji parvovirus, ptičji astrovirus i virus kokošje anemije, uzročnik kokcidioze (Eimeria sp.), Campylobacter sp., Salmonella sp., Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Pasteurella sp., Avibacterium sp., E. coli ili Clostridium sp.
[0055] Obično, jedno davanje vakcine vrši se kod pileta starog jedan dan, supkutanim ili intramuskularnim putem, ili in ovo u vreme kada je embrion star 17-19 dana. Drugo davanje može se obaviti u toku prvih 10 dana života. U vreme prve primene, životinje su poželjno predstavljene najmanje 17 dana starim embrionom ili su životinje stare jedan dan.
[0056] Kod pileta starog jedan dan, mogu se upotrebiti različiti putevi primene, na primer, supkutani ili imtramuskularni, intradermalni, transdermalni. In ovo vakcinacija može se izvršiti ubrizgavanjem u amnionsku kesicu i/ili u embrion. Za vakcinisanje se mogu upotrebiti komercijalno dostupni uređaji za in ovo i SC primenu.
[0057] Pronalazak i aspekti opisani u ovom tekstu biće dodatno opisani pomoću neograničavajućih primera koji slede.
PRIMERI
1
[0058] Konstruisanje DNK inserata, plazmida i rekombinantnih virusnih vektora obavljena je korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije, koje su opisali J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989).
Primer 1 Konstruisanje rekombinantnog vHVT114 koji eksprimira NDV-F
Pripremanje donorskog plazmida pHM103+Fopt
[0059] Plazmid pHM103 (Merial Limited) koji sadrži ručice intergenskog regiona I HVT FC126 (vidi SL.2), SV40 promotor i SV40 poli A, razloži se korišćenjem NotI, defosforiliše, i fragment od 5.6 kb se ekstrahuje na gelu. Fragment od 1.7 kb, bočno ograničen sa NotI, hemijski sintetisanog kodon-optimizovanog NDV-F gena sa genotipom VIId (SEQ ID NO:1, kodira SEQ ID NO:2) takođe se razloži korišćenjem NotI i fragment od 1.7 kb se ekstrahuje na gelu. Fragmenti od 5.6 i 1.7 kb se spoje da se napravi pHM103+Fopt (SL.3).
Dobijanje rekombinantnog HVT virusnog vektora
[0060] In vitro rekombinacija (in vitro recombination, IVR) izvodi se koelektroporacijom sekundarnih fibroblasta embriona pileta (secondary chicken embryo fibroblast cells, 2° CEF ćelije), uz korišćenje pHM103+Fopt kao donorskog plazmida i virusne DNK izolovane iz HVT soja FC126. Koelektroporacija se izvodi korišćenjem 1x10<7>2° CEF u 300 μl Opti-MEM, koje se podvrgavaju elektrošoku na 150 volti sa kapacitetom od 950, u 2-milimetarskoj kiveti za elektroporaciju. Transfektovane ćelije se zaseju na ploče sa 96 bunarčića i inkubiraju 5 dana. Ćelije gajene na ploči sa 96 bunarčića se zatim dupliciraju na dve ploče sa 96 bunarčića. Jedan set ploče sa 96 bunarčića koristi se za IFA uz upotrebu pilećeg poliklonskog seruma na NDV-F, da bi se identifikovali pozitivni bunarčići koji sadrže rekombinante, a drugi set ploče sa 96 bunarčića koristi se za izolovanje inficiranih ćelija iz pozitivnih bunarčića.
[0061] Prečišćavanje rekombinantnih virusa obavlja se najpre dupliranjem ploče sa 96 bunarčića i IFA odabirom bunarčića koji sadrže najviše IFA-pozitivnih plaka, uz najmanje IFA-negativnih plaka. Bunarčići koji zadovoljavaju ove kriterijume se zatim sakupe i dovedu do zapremine od 1 ml u DMEM+2% FBS. Iz 1 ml-skog stoka, uzme se 5-20 μl i pomeša sa 1x107 CEF u 10 ml DMEM+2% FBS i alikvotira na novu ploču sa 96 bunarčića da se dobije jedna HVT plaka po bunarčiću. Supernatanti iz bunarčića sa pojedinačnim plakama testiraju se na odsustvo roditeljskog virusa, korišćenjem PCR. Posle pet ciklusa prečišćavanja plaka,
1
izoluje se rekombinantni virus označen kao vHVT114 i njegova čistoća se testira korišćenjem IFA i PCR da bi se potvrdila ekspresija NDV-F i odsustvo roditeljskog virusa.
PCR analiza rekombinantnog vHVT114
[0062] DNK se ekstrahuje iz vHVT114 pomoću mešavine fenol/hloroform, izvrši se precipitacija etanolom i resuspendovanje u 20 mM HEPES. PCR prajmeri (prikazani u Tabeli 1) dizajnirani su tako da specifično identifikuju prisustvo kodon-optimizovanog NDV-F, SV40 promotora, kao i čistoću rekombinantnog virusa u odnosu na prisustvo FC126 CL2 roditeljskog virusa. PCR se izvodi na 200 ng templata DNK, zajedno sa naznačenim parovima prajmera prikazanim u Tabeli 1. Uslovi PCR ciklusa su sledeći: 94 °C tokom 2 min; 30 ciklusa na 94 °C tokom 30 s, 55 °C tokom 30 s, 68 °C tokom 3 min; 68 °C tokom 5 min. Očekivani PCR proizvodi prikazani su u Tabeli 2. Rezultati PCR prikazani su na Slici 4. Kako se može videti na Slici 4, veličina PCR proizvoda posle gel-elektroforeze u dobroj je saglasnosti sa očekivanim veličinama i obrascima traka.
Tabela 1
Tabela 2
Analiza ekspresije rekombinantnog vHVT114
1
[0063] Imunofluorescentna analiza izvršena je korišćenjem vHVT114 koji je prošao više od deset pasaža posle eksperimentalne prematične kulture (pre-master seed, pre-MSV). Pre-MSV i pre-MSV+12 materijali razblaže se medijumom u odnosu 1:100. Pedeset mikrolitara razblaženog virusa doda se u 10 ml DMEM+2% FBS sa 1x10<7>CEF i alikvotira na ploči sa 96 bunarčića (100 μl/bunarčiću). Ploče se inkubiraju 3 dana na 37°C+5%CO2dok virusne plake ne postanu vidljive. Ploče se zatim tri minuta fiksiraju 95% ledenohladnim acetonom i isperu u tri promene PBS. Pileći antiserum protiv virusa Newcastle bolesti (partija br. C0139, Charles Rivers Laboratory) u razblaženju 1:1000 doda se zajedno sa monoklonskim antitelom L-78 (Merial Limited) u razblaženju 1:3000 i ploče se inkubiraju 1 sat na 37°C. Posle 1 sata inkubacije, ploče se isperu u tri promene PBS i doda se antipileće antitelo sa FITC (kat. br. F8888, Sigma) zajedno sa magarećim antimišjim antitelom (IgG) sa Alexa Fluor 568 (kat. br. A 10037, Molecular Probe) u razblaženju 1:500. Ploče se ponovo inkubiraju 1 sat na 37°C. Posle 1 sata inkubacije ćelije se isperu u tri promene PBS. Doda se mala količina PBS da bi se sprečilo sušenje monosloja i autofluorescencija. Ćelije se zatim vizuelizuju fluorescentnim mikroskopom korišćenjem kombinacije filtera za tetrametilrodamin izotiocijanat (tetramethylrhodamine isothiocyanate, TRITC) i fluorescein izotiocijanat (fluorescein isothiocyanate, FITC).
[0064] vHVT114 virusne plake vizuelizuju se TRITC i FITC filterom za dvostruko bojenje. FITC test pokazuje NDV-F ekspresiju, a TRITC test pokazuje HVT ekspresiju. Zbog toga što su bunarčići ploče sa 96 bunarčića mali, svaki bunarčić je registrovan tako što su plake prvo brojane uz TRITC filter, a zatim je vršeno ponovno brojanje uz FITC filter. Preko 500 plaka brojano je za pre-MSV i pre-MSV+12 pasažu. Na obe ploče sve plake su bile pozitivne i za FITC i za TRITC (SL.5).
Analiza rekombinantnog vHVT114 metodom Southern blot
[0065] Ukupna genomska DNK ekstrahuje se iz HVT FC126 i vHVT114 prema standardnom protokolu ekstrakcije genomske DNK. Za svako razlaganje restrikcionim enzimom, 3 μg genomske DNK (1 ng za donorski plazmid) koristi se za ukupnu zapreminu reakcije od 20 μl za svaki uzorak. Genomska DNK HVT FC126 (negativna kontrola), pHM103+Fopt donorski plazmid, i vHVT114 se, svaki, razlažu preko noći na 37°C, restrikcionim endonukleazama BamHI, PstI, SphI, i NcoI. Restrikcioni fragmenti HVT FC126 (negativna kontrola), pHM103+Fopt donorskog plazmida, i vHVT114 genomska DNK razdvoje se na 1% agaroznom gelu i prenesu na pozitivno naelektrisanu najlonsku membranu. Prema uputstvima proizvođača kita North2South Chemiluminescent Hybridization and Detection Kit (Thermo
2
Scientific), membrana je pre-hibridizovana tokom 1 h, a zatim hibridizovana biotinizovanom NDV-F probom preko noći na 55°C. Posle hibridizacije preko noći, izvedeno je nekoliko ispiranja pod stringentnim uslovima, posle čega je membrana stavljena u blokirajući pufer, uz dodavanje streptavidin-HRP. Posle ispiranja membrane od nevezanog streptavidin-HRP, doda se supstratni rastvor luminala i peroksida. Membrana se zatim izloži X-zracima na filmu i film se razvije. Mesta gde je biotinizovana proba bila vezana za DNK bila su hemiluminiscentna i pojavila su se na filmu posle izlaganja X-zracima. Tabela 3 pokazuje očekivane Southern blot-trake uz korišćenje NDV-F probe. Rezultati dobijeni metodom Southern blota pokazali su očekivane obrasce razlaganja (SL.6).
Tabela 3
Sekvenciona analiza insertovanog regiona u rekombinantnom vHVT114
[0066] Analiza regiona genomske DNK vHVT114 izvršena je PCR amplifikacijom. Ukupno 10 prajmera korišćeno je za amplifikovanje čitave kasete, kao i iza bočnih BamHI-I ručica upotrebljenih u donorskom plazmidu. PCR proizvod od 4.727 kb prečišćen je na gelu i ceo fragment je sekvenciiran korišćenjem prajmera za sekvenciranje. Rezultat sekvenciranja potvrđuje da vHVT114 sadrži ispravne sekvence SV40 promotora, kodon-optimizovanog NDV-F i SV40 poliA, koje tačno odgovaraju sekvenci opisanoj za donorski plazmid pHM103+Fopt u SEQ ID NO:18.
Analiza rekombinantnog vHVT114 metodom Western blot
[0067] Približno 2x10<6>fibroblastnih ćelija pileta inficira se vHVT114 Pre-MSV pri ∼0.1 MOI (multiplicity of infection, multiplicitet infekcije). Posle dva dana inkubacije na 37°C, inficirane i neinficirane ćelije se sakupe strugačem ćelija posle uklanjanja medijuma i ispiranja korišćenjem PBS. Ćelije se sakupe u 1 ml PBS i centrifugiraju. Ćelijski peleti se liziraju uz pomoć Pierce Classic IP kita (kat. br. 26146, Thermo Scientific). Za formiranje imunskog kompleksa korišćeno je 100 μl anti-NDV-F monoklonskog antitela 001C3 (Merial Limited). Uzorak antitelo/lizat doda se agarozi sa proteinom A/G (Protein A/G Plus Agarose) za zadržavanje imunskog kompleksa. Imunski kompleks se tri puta ispere da bi se uklonio nevezani materijal i zatim se eluira zapreminom od 50 μl pufera za eluiranje uzorka pod neredukujućim uslovima. Posle 5 minuta ključanja, 10 μl uzoraka nanese se na 10% akrilamidni gel (Invitrogen). PAGE se vrši u MOPS puferu (Invitrogen) na 200 volti tokom 1 sata. Zatim se gel prenese na PVDF membranu.
[0068] Protein Detector Western Blot Kit TMB System (KPL, kat. br. 54-11-50) upotrebljen je za blotovanje PVDF membrane, uz korišćenje reagenasa i praćenje uputstava proizvođača. Posle blokiranja membrane u trajanju od 1 sata, na sobnoj temperaturi, membrana se ispere u tri promene 1X pufera za ispiranje, po pet minuta, a zatim potopi u blokirajući pufer koji sadrži pileći serum protiv NDV virusa (partija br. C0139, Charles River Laboratories) u razblaženju 1:1000. Pošto se ispere u tri promene pufera za ispiranje, membrana se inkubira sa kozjim antipilećim IgG (KPL, kat. br. 14-24-06) obeleženim peroksidazom, u razblaženju 1:2000, 1 sat na sobnoj temperaturi. Membrana se zatim ispere u tri promene 1X pufera za ispiranje, po pet minuta. Na membranu se doda 5 ml TMB peroksidaznog supstrata i blago ljulja oko 1 minuta. Razvijanje reakcije zaustavlja se stavljanjem membrane u vodu.
[0069] Tokom imunoprecipitacije i Western blota u uzorku vHVT114 detektovan je protein od približno 55 kD, što odgovara očekivanoj veličini F1 komponente NDV-F proteina (SL.7).
Primer 2 Konstruisanje rekombinantnih vHVT110, vHVT111, vHVT112, vHVT113 i vHVT116 koji eksprimiraju NDV-F
[0070] Stvaranje i karakterizacija HVT rekombinanata vHVT 110, vHVT111, vHVT112, vHVT113, i vHVT116 vrši se suštinski isto kao što je opisano u Primeru 1 za vHVT114.
Tabela 4 prikazuje osobine svojstvene svakom konstruktu oko ekspresionih kaseta, uključujući odgovarajuće sekvence.
Tabela 4 Karakteristike ekspresionih kaseta pojedinačnih HVT rekombinanata
vHVT110
[0071] Plazmid pCD046 (vlasništvo kompanije Merial) koji sadrži ručice intergenskog regiona I HVT FC126, mišji CMV promotor i SV40 poli A, razlaže se korišćenjem NotI, defosforiliše i fragment od 6.6 kb se ekstrahuje na gelu. Fragment od 1.7 kb bočno ograničen sa NotI, hemijski sintetisanog NDV-F gena koji sadrži divlji tip F sekvence (SEQ ID NO:3, kodira SEQ ID NO:4) takođe se razlaže pomoću NotI i fragment od 1.7 kb se ekstrahuje na gelu. Fragmenti od 6.6 i 1.7 kb se povežu da bi se napravio donorski plazmid pCD046+NDV-F wt (wild type, divlji tip) (SEQ ID NO:21 za vHVT110) upotrebljen u transfekciji za stvaranje rekombinantnog vHVT110. Sekvenciranjem insertovanog regiona potvrđeno je da vHVT110 sadrži ispravne sekvence mCMV promotora, divljeg tipa NDV-F gena i SV40 poliA. Sekvenca takođe tačno odgovara sekvenci opisanoj za donorski plazmid pCD046+NDV-F wt u SEQ ID NO:21.
vHVT111
[0072] Plazmid pHM103 (vlasništvo kompanije Merial) koji sadrži ručice intergenskog regiona I HVT FC126, SV40 promotor i SV40 poliA razloži se pomoću NotI, defosforiliše i fragment od 5.6 kb se ekstrahuje na gelu. Fragment od 1.7 kb bočno ograničen sa NotI, hemijski sintetisanog NDV-F gena koji sadrži divlji tip F sekvence (SEQ ID NO:3, kodira SEQ ID NO:4) takođe se razlaže pomoću NotI i fragment od 1.7 kb se ekstrahuje na gelu. Fragmenti od 5.6 i 1.7 kb se povežu da se napravi donorski plazmid (SEQ ID NO:22 za
2
vHVT1110) upotrebljen u transfekciji za stvaranje rekombinantnog vHVT111. Sekvenciranjem insertovanog regiona potvrđeno je da vHVT111 sadrži ispravne sekvence SV40 promotora, divljeg tipa NDV-F gena i SV40 poliA kako je pokazano u sekvenci donorskog plazmida pHM103+NDV-F wt (SEQ ID NO:22).
vHVT112
[0073] Iz plazmida pUC57 NDV-F YZCQ (sintetiše ga kompanija GeneScript) iseče se, pomoću NotI, fragment koji obuhvata sintetski divlji tip gena NDV-F YZCQ (SEQ ID NO:34 kodira SEQ ID NO:35) i insertuje na isto mesto plazmida pCD046 koji sadrži mCMV promotor i SV40 poliA rep. Povezani materijal se transformiše korišćenjem Top10 Oneshot kita (kat. br. C404002, Invitrogen). Bakterijske kolonije se gaje u LBamp bujonu, plazmid se ekstrahuje korišćenjem Qiagens MiniSpin Prep kita, i pretražuje u pogledu orijentacije inserta. Ispravni donorski plazmid označen je kao pCD046+NDVF VII YZCQ. Uzgajaju se kulture u velikim razmerama i plazmidi se ekstrahuju pomoću Qiagens Maxi Prep kita. Prolazna ekspresija plazmida iz Maxi Prep proverava se korišćenjem Fugene Transfection Reagent u fibroblastima embriona pileta (CEF) i pilećeg anti-NDV poliklonskog antiseruma.
[0074] Plazmid pCD046+NDV-F VII YZCQ (SEQ ID NO:29) koristi se u transfekciji za stvaranje rekombinantnog vHVT112. Sekvenciranjem insertovanog regiona potvrđuje se da vHVT112 sadrži ispravne sekvence mCMV promotora, divljeg tipa NDV-F YZCQ gena i SV40 poliA. Sekvenca takođe tačno odgovara sekvenci opisanoj za donorski plazmid pCD046+NDV-F VII YZCQ u SEQ ID NO:29.
vHVT113
[0075] Iz plazmida pUC57 NDV Texas F (sintetiše ga kompanija GeneScript) iseče se, pomoću NotI, fragment koji obuhvata sintetski gen NDV Texas F (SEQ ID NO:36 kodira SEQ ID NO:37) i insertuje na isto mesto pCD046 plazmida koji sadrži mCMV promotor i SV40 poliA rep. Povezani materijal se transformiše korišćenjem Top10 Oneshot kita (kat. br. C404002, Invitrogen). Bakterijske kolonije se gaje u LBamp bujonu, plazmid se ekstrahuje korišćenjem Qiagens MiniSpin Prep kita, i pretražuje u pogledu orijentacije inserta. Ispravni donorski plazmid označen je kao pCD046+Texas NDVF. Uzgajaju se kulture u velikim razmerama i plazmidi se ekstrahuju pomoću Qiagens Maxi Prep kita. Prolazna ekspresija plazmida iz Maxi Prep proverava se korišćenjem Fugene Transfection Reagent u fibroblastima embriona pileta (CEF) i pilećeg anti-NDV poliklonskog antiseruma.
[0076] Plazmid pCD046+Texas NDV-F (SEQ ID NO:30) koristi se u transfekciji za stvaranje rekombinantnog vHVT113. Sekvenciranjem insertovanog regiona potvrđuje se da vHVT113 sadrži ispravne sekvence mCMV promotora, divljeg tipa gena NDV-F Texas F i SV40 poliA. Sekvenca takođe tačno odgovara sekvenci opisanoj za donorski plazmid pCD046+Texas NDV-F u SEQ ID NO:30.
vHVT039
[0077] Iz DNK ekstrahovane iz MDV1 RB1B soja, pomoću metoda PCR amplifikuje se promotor MDV gB (SEQ ID NO:38), uz korišćenje prajmera HM101 (5’-CCG-GAA-TTC-CGA-TGT-TTA-GTC-ACG-ATA-GAC-3’) (SEQ ID NO:44) i HM102 (5’-ATAAGA-GCG-GCC-GCA-GTG-AGA-TGA-TCT-TAA-TGA-TG-3’) (SEQ ID NO:45). Prvi sadrži EcoRI mesto i drugi sadrži NotI mesto za povezivanje EcoRI/NotI-razloženog PCR proizvoda od 630 bp u EcoRI/NotI razloženi pCD046 plazmid. Proizvod povezivanja se koristi za transformisanje DH5α-kompetentnih ćelija. Kolonije se sakupe i pregledaju u pogledu prisustva insertovanog PCR fragmenta, restrikcionom analizom korišćenjem EcoRI i NotI. Dobijeni plazmid označen je kao pHM102.
[0078] Velogeni NDV Texas soj (genotip IV) gaji se na 11 dana starim oplođenim SPF jajima i poluprečišćava. Ukupna RNK se ekstrahuje i izvrši se RT PCR korišćenjem dva prajmera F-ATG (5’ TAT-AGC-GGC-CGCAAG-ATG-GGC-TCC-AGA-TCT-TCT-ACC-AG 3’) (SEQ ID NO:46) i F-STOP (5’ CGA-GGC-GGC-CGC-TCA-TATTTT-TGT-AGT-GGC-TCT-C 3’) (SEQ ID NO:47). Oni omogućavaju potpunu amplifikaciju NDV F gena uz dodatak NotI mestaushodno od ATG i nishodno od STOP kodona. PCR fragment od 1.7 kb razložen je pomoću NotI i povezan u NotI-razloženi pHM102. Dobijenii plazmid označen je kao pHM119 i koristi se kao donorski plazmid u rekombinaciji in vitro, kotransfekcijom CEF ćelija roditeljskom HVT DNK da bi se dobio vHVT039, kako je gore opisano. Sekvenciranjem insertovanog regiona potvrđeno je da vHVT039 sadrži ispravne sekvence MDV gB promotora, divljeg tipa nemodifikovanog NDV-F gena iz Texas soja (SEQ ID NO:32 kodira SEQ ID NO:33) i SV40 poliA, kako je pokazano u delimičnoj sekvenci donorskog plazmida pHM119 (SEQ ID NO:31).
vHVT116
[0079] Plazmid pHM103 (vlasništvo kompanije Merial) koji sadrži ručice intergenskog regiona I HVT FC126, SV40 promotor i SV40 poliA, razlaže se korišćenjem NotI, defosforiliše i fragment od 5.6 kb se ekstrahuje na gelu. Fragment od 1.7 kb bočno ograničen
2
sa NotI, hemijski sintetisanog, kodon-optimizovanog gena NDV-F CA02 genotipa V (SEQ ID NO:5, kodira SEQ ID NO:6) takođe se razloži korišćenjem NotI i fragment od 1.7 kb se ekstrahuje na gelu. Fragmenti od 5.6 i 1.7 kb povežu se da bi se dobio pHM103 NDV-F CA02 (SEQ ID NO:23 za vHVT116) upotrebljen u transfekciji za stvaranje rekombinantnog vHVT116. Sekvenciranjem insertovanog regiona potvrđuje se da vHVT116 sadrži ispravne sekvence SV40 promotora, kodon-optimizovanog gena NDV-F CA02 i SV40 poliA, kako je pokazano u sekvenci donorskog plazmida pHM103+NDV-F wt (SEQ ID NO:23).
Diskusija
[0080] Različite kasete pod kontrolom mCMV ili ne-CMV promotora insertovane su na različite lokuse HVT genoma (Tabela 4). Uprkos ponovljenim pokušajima, stvaranje konstrukta sa kombinacijom mCMV i kodon-optimizovane F sekvence nije bilo uspešno posle pasaže 2. Međutim, kada je divlji tip sekvence bio pod kontrolom mCMV, dobijen je stabilan konstrukt vHVT110. Pored toga, rekombinantni vHVT111 sa divljim tipom F sekvence pod kontrolom SV40 promotora takođe je bio stabilan tokom više od 10 in vitro pasaža. Neočekivano, kodon-optimizovana F sekvenca pod kontrolom SV40 promotora bila je, slično tome, stabilna tokom više od 10 in vitro pasaža (npr. vHVT114 i vHVT116). Ovi rezultati ukazuju na delikatnu ravnotežu između snage promotora i prirode gena koji on kontroliše (kodon-optimizovani ili neoptimizovani) u dobijanju genetički stabilnog HVT konstrukta.
Primer 3 Konstruisanje vHVT306, dvostrukog HVT vektora koji eksprimira NDV-F i IBDV VP2
[0081] Konstruisan je donorski plazmid pHVT US2 SV-Fopt-synPA koji sadrži SV40 promotor, sintetski kodon-optimizovani gen NDV F VII, sintetski poliA rep bočno ograničen sekvencama SORF3 i US2 ručicama iz HVT FC126.
Dobijanje rekombinantnog virusa
[0082] Standardni postupak homologne rekombinacije bio je praćen koelektroporacijom sekundarnih CEF ćelija korišćenjem donorskog plazmida pHVT US2 SV-Fopt-synPA i virusne DNK izolovane iz vHVT13 (HVT vektor koji eksprimira IBDV VP2 gen, Merial Limited). Suštinski, postupak opisan u primeru 1 za vHVT114 korišćen je za dobijanje plaka, prečišćavanje i karakterizaciju rekombinanata imunofluorescencijom.
2
[0083] Posle pet ciklusa prečišćavanja plaka, izolovan je čisti rekombinantni virus (vHVT306) i čistoća vHVT306 testirana je i potvrđena pomoću IFA i PCR.
PCR analiza
[0084] Virusna DNK se ekstrahuje iz stoka vHVT306 na stupnju prematične kulture (pre-MSV) korišćenjem QIA DNeasy Blood & Tissue kita (Qiagen cat#69506). PCR prajmeri se dizajniraju tako da identifikuju prisustvo optimizovanog NDV F, divljeg tipa NDV F, SV40 promotora, mCMV promotora, bočnih ručica US2 HVT virusa i SB-1 virusa.
[0085] PCR amplifikacija uz korišćenje različitih prajmera potvrdila je da vHVT306 ima očekivane obrasce amplifikacije i očekivane amplikone.
Analiza ekspresije
[0086] Test indirektne imunofluorescencije (indirect immunofluorescent assay, IFA) izvodi se na vHVT306 na stupnju pre-MSV, iz stoka. CEF u koje je inokulisan vHVT306 fiksiraju se tri minuta ledenohladnim 95% acetonom na sobnoj temperaturi i suše na vazduhu 10 min. Posle ispiranja u tri promene PBS, dodaju se dva primarna antitela, pileći serum protiv virusa Newcastle bolesti (Charles Rivers Laboratories kat. br. 10100641, partija br. C0117A) u razblaženju 1:500 i L78 monoklonsko antitelo protiv HVT (Merial Select, Gainesville, GA) u razblaženju 1:3000 i inkubiraju 45 min na 37°C. Posle ispiranja u tri promene PBS, dodaju se dva sekundarna antitela, kozji anti-pileći IgG--fluorescein (KPL kat. br. 02-24-06, partija br.
110020) u razblaženju 1:500 i magareći antimišji IgG-Alexa Fluor 568 (Molecular Probe br.
10037, partija br. 989784) u razblaženju 1:300. Ploče se inkubiraju na 37°C u trajanju od 45 min i zatim ispiraju u tri promene PBS. Da bi se identifikovale IFA pozitivne plake, ćelije su posmatrane fluorescentnim mikroskopom korišćenjem filtera za fluorescein izotiocijanat (FITC) i tetrametilrodamin izotiocijanat (TRITC), na invertnom mikroskopu Nikon Eclipse Ti.
[0087] Slično tome, ekspresija IBDV VP2 proteina (SEQ ID NO:8 kodiran SEQ ID NO:7) vHVT306 ispitivana je upotrebom IFA uz korišćenje pilećeg anti-IBDV seruma (Charles River Laboratories kat. br. 10100610 partija br. G0117) (razblaženje 1:500) i anti-NDV F monoklonskog antitela 001C3 (Asceitic fluid, serija 10/09/044, 02/11/2010) (razblaženje 1:300) kao primarnih antitela; što je praćeno kozjim antipilećim IgG-fluorescein (KPL kat. br.
02-24-06, partija br. 110020) (razblaženje 1:500) i magarećim antimišjim IgG-Alexa Fluor 568 (Molecular Probe br. A10037, partija br. 989784) (razblaženje 1:300) kao sekundarnim antitelima.
2
[0088] Rezultati IFA ukazuju da vHVT306 eksprimira NDV F gene u CEF inficiranim virusima.
[0089] Korišćenjem FITC-filtera i TRITC-filtera, pod mikroskopom je izbrojano preko 400 vHVT306 plaka. Ukupna ekspresija NDV F gena i IBDV VP2 poklapa se sa HVT plakama (Tabela 5).
Tabela 5 Dvostruka IFA vHVT306
Analiza metodom Southern blot
[0090] Ukupna genomska DNK ekstrahovana je iz CEF inficiranih vHVT306 na stupnju pre-MSV. Analiza metodom Southern blot izvedena je prema standardnom protokolu.
[0091] Ukupno 3 probe upotrebljene su za potvrdu kasete NDV F (SV40 promotor, NDV F kodon-optimizovani gen, sintetski poliA rep) između SORF3 i US2 u vHVT306 kao i retencije kasete IBDV VP2 (mCMV promotor, IBDV VP2 gen, SV40 poli A rep).
[0092] Rezultati analize metodom Southern blot pokazali su obrazac razlaganja očekivan na osnovu vektorskog mapiranja pomoću Vector NTI (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA). Kaseta NDV F (SV40 promotor, NDV F kodon-optimizovani gen, sintetski poliA rep) locirana je između SORF3 i US2, i IBDV VP2 kaseta (mCMV promotor, IBDV VP2 gen, SV40 poli A rep) je intaktna kao kod roditeljskog virusa (vHVT13).
Genomska analiza
[0093] Genomska DNK stoka vHVT306 na stupnju pre-MSV sekvenciirana je da bi se proverila sekvenca regiona rekombinacione ručice kao i insertovane genske kasete.
[0094] Dizajnirani su prajmeri za amplifikovanje cele insertovane genske kasete uključujući rekombinacionu ručicu upotrebljenu u donorskom plazmidu. Analiza genomske DNK vHVT306 izvedena je PCR-amplifikacijom, što je praćeno određivanjem nukleotidne sekvence.
2
[0095] Potvrđeno je da je vHVT306 (donorski plazmid pHVT US2 SV- Fopt-synPA) koji sadrži rekombinantne ručice, SV40 promotor i NDV F kodon-optimizovani gen ispravan, kako je pokazano u SEQ ID NO:20.
Analiza metodom Western blot
[0096] CEF monosloj inficiran je sa vHVT306 pre-MSV pri MOI ∼0.1. Posle 4 dana inkubacije, CEF su peletirane i isprane korišćenjem PBS, što je praćeno lizom pomoću IP pufera za lizu/ispiranje (IP Lysis/Wash buffer), Pierce Classic IP kit (Thermo Scientific kat. br. 26146) prema protokolu proizvođača. Lizat se prethodno izbistri i inkubira sa 100 μl anti-NDV F monoklonskog antitela 001C3 da se napravi imunski kompleks. Imunski kompleks se imobiliše na agarozi sa proteinom A/G i posle uklanjanja nevezanog imunskog kompleksa u nekoliko koraka ispiranja, 50 μl pufera za uzorak koristi se za eluiranje pod neredukujućim uslovima. Neinficirane CEF uključene su kao kontrole.
[0097] Po 20 μl eluiranih uzoraka razdvaja se elektroforezom na gelovima sa 10% Bis-Tris. Posle elektroforeze, razdvojeni proteini se prenesu na PVDF membranu. TMB Western Blot kit za detekciju proteina (KPL kat. br. 54-11-50) koristi se za detektovanje NDV antigena na PVDF membrani uz korišćenje pilećeg anti-NDV seruma (Charles River Laboratories Laboratories kat. br. 10100641, partija br.C0117A), i kozjeg antipilećeg IgG-peroksidaza konjugata (KPL kat. br.14-24-06), prema protokolima proizvođača.
[0098] Ekspresija NDV F proteina iz vHVT306 bila je potvrđena imunodetekcijom u dva koraka. Prvo se NDV F proteini eksprimirani u vHVT306-inficiranim CEF imunoprecipitiraju uz korišćenje anti-NDV F monoklonskog antitela 001C3. Zatim se izvrši Western blot analiza korišćenjem anti-NDV poliklonskog seruma (Charles River Laboratories kat. br. 10100641, partija br. C0117A) da bi se detektovao NDV F protein u imobilisanim uzorcima (kompleks NDV F protein-monoklonsko antitelo) (SL.8). U lizatima vHVT306 pre-MSV, pomoću anti-NDV seruma detektovan je protein od 55 kDa, koji odgovara očekivanoj veličini NDV F1 fuzionog proteina (SL.8).
Primer 4 Konstruisanje dvostrukih HVT vektora vHVT301, vHVT302, vHVT303, vHVT304 i vHVT307 koji eksprimiraju NDV-F i IBDV VP2, i dvostrukog HVT vektora vHVT202 koji eksprimira IBDV VP2 varijante
Primer 4.1 Konstruisanje vHVT301, vHVT302, vHVT303, vHVT304 i vHVT307
2
[0099] Dobijanje i karakterizacija dvostrukih HVT rekombinanata vHVT301, vHVT302, vHVT303, vHVT304, i vHVT307 obavljaju se suštinski na isti način kao što je opisano za vHVT306 u Primeru 3. Tabela 6.1 pokazuje osobine svojstvene svakom konstruktu oko ekspresionih kaseta, uključujući odgovarajuće sekvence.
Tabela 6.1 Karakteristike ekspresionih kaseta dvostrukih HVT rekombinanata
vHVT301
[0100] Plazmid pHVT IG2 Sbfl (vlasništvo kompanije Merial) koji sadrži ručice intergenskog regiona 2 iz vHVT13 razloži se korišćenjem SmaI, defosforiliše i fragment od 4.3 kb se ekstrahuje na gelu. Donorski plazmid pHM103+NDVF wt koji sadrži SV40 promotor, NDV-F genotipa VIId divljeg tipa, SV40 poli A rep razloži se pomoću EcoRI i SailI, tretira Klenowim fragmentom, i fragment od 2.3 kb se ekstrahuje na gelu. Dva fragmenta se povežu da bi se napravio donorski plazmid pHVT IG2 SV Fwt Sbfl (SEQ ID NO: 24) koji se koristi u transfekciji za dobijanje rekombinantnog vHVT301.
vHVT302
[0101] Veštački sintetisani plazmid pHVT US10 cds koji sadrži sekvence US10 ručice iz vHVT13 razloži se korišćenjem NotI, defosforiliše, i fragment od 4.7 kb se ekstrahuje na gelu. Fragment od 1.7 kb bočno ograničen sa NotI, hemijski sintetisanog, kodon-optimizovanog, NDV-F genotipa VIId razložen je pomoću NotI i ekstrahovan na gelu. Dva fragmenta se povežu da bi se napravio donorski plazmid pHVT US 10 cds F opt koji se koristi u transfekciji za dobijanje rekombinantnog vHVT302. Transkripcija insertovanog F gena trebalo bi da se pokrene nativnim US 10 promotorom i zaustavia nativnim US 10 poliA signalom. Za eksprimiranje ovog inserta ne dodaju se egzogeni promotor ili poliA. Sekvenciranjem insertovanog regiona potvrđuje se da vHVT302 sadrži ispravnu sekvencu kodon-optimizovanog gena NDV-F VIId, kako je pokazano u sekvenci donorskog plazmida pHVT US10 cds F opt (SEQ ID NO: 25).
vHVT303
[0102] Veštački sintetisani plazmid pHVT US10 cds koji sadrži sekvence US10 ručice iz vHVT13, razloži se korišćenjem NotI, defosforiliše, i fragment od 4.7 kb se ekstrahuje na gelu. Fragment od 1.7 kb bočno ograničen sa NotI, hemijski sintetisanog, kodonoptimizovanog, NDV-F genotipa V razložen je pomoću NotI i ekstrahovan na gelu. Dva fragmenta se povežu da bi se napravio donorski plazmid pHVT US 10 cds F CA02 opt koji se koristi u transfekciji za dobijanje rekombinantnog vHVT303. Kao i za vHVT302, transkripcija insertovanog F gena trebalo bi da se pokrene nativnim US 10 promotorom i zaustavi nativnim US 10 poliA signalom. Za eksprimiranje ovog inserta ne dodaju se egzogeni promotor ili poliA. Sekvenciranjem insertovanog regiona potvrđuje se da vHVT303 sadrži ispravnu sekvencu kodon-optimizovanog NDV-F genotipa V, kako je pokazano u sekvenci donorskog plazmida pHVT US10 cds F CA02 (SEQ ID NO: 26).
vHVT304
[0103] Donorski plazmid pHVT IG2 Sbfl koji sadrži ručice intergenskog regiona 2 iz vHVT13 razlaže se korišćenjem SbfI, defosforiliše i fragment od 4.3 kb se ekstrahuje na gelu. Veštački sintetisani plazmid koji sadrži SV40 promotor kodon-optimizovani NDV-F genotip VIId sintetski poliA rep bočno ograničen sa SbfI, razlaže se pomoću SbfI i fragment od 2.3 kb se ekstrahuje na gelu. Dva fragmenta se povežu da bi se napravio donorski plazmid pHVT IG2 SV Fopt syn tail koji se koristi u transfekciji za dobijanje rekombinantnog vHVT304. Sekvenciranjem insertovanog regiona potvrđuje se da vHVT304 sadrži ispravne sekvence SV40 promotora, kodon-optimizovanog NDV-F gena VIId, i sintetskog poliA repa, kako je prikazano u sekvenci donorskog plazmida pHVT IG2 SV Fopt syn tail (SEQ ID NO:27).
vHVT307
[0104] Donorski plazmid pHVT US2-SORF3 koji sadrži US2 i SORF3 ručice iz vHVT13 razlaže se pomoću SbfI, defosforiliše i fragment od 5.1 kb se ekstrahuje na gelu. Plazmid SB-1 UL55 SV CaF syn tail Sbfl koji sadrži SV40 promotor kodon-optimizovani NDV-F genotipa V sintetski poliA rep bočno ograničen sa SbfI razlaže se pomoću SbfI i fragment od 2.3 kb se ekstrahuje na gelu. Dva fragmenta se povežu da se dobije donorski plazmid
1
pHVT US2 SV-FCA02 opt-synPA koji se koristi u transfekciji za dobijanje rekombinantnog vHVT307. Sekvenciranjem insertovanog regiona potvrđuje se da vHVT307 sadrži ispravne sekvence SV40 promotora, kodon-optimizovanog gena NDV-F VIId, i sintetskog poli A repa, kako je pokazano u sekvenci donorskog plazmida pHVT US2 SV-FCA02 opt-synPA (SEQ ID NO: 28).
Diskusija
[0105] Jedan od glavnih ciljeva ovog rada bio je razvijanje multivalentnog vektora na osnovu ptičjeg herpesvirusa, uključivanjem nekoliko zaštitnih gena od interesa u osovinu ptičjeg herpesvirusa (npr. HVT). Preduslov za ovaj pristup je definisanje ekspresionih kaseta koje sadrže odgovarajuće kombinacije promotor-gen-poliA i procena njihove genetičke stabilnosti i sposobnosti zaštite od određene bolesti.
[0106] Sa ciljem stvaranja efikasne MD-IBD-ND trovalentne vektorske vakcine, kodonoptimizovane ili neoptimizovane genske sekvence virusa Newcastle bolesti (NDV)-F klonirane su u vHVT13 osovinu (HVT-IBD, licencirana vakcina za istovremenu zaštitu pilića od MD i IBD) pod kontrolom humanog CMV (mišji CMV se već koristi u vHVT13). Svi vHVT-IBD-F konstrukti pod kontrolom humanog CMV promotora izgubili su ekspresiju F-proteina u roku od šest pasaža, bilo da je NDV-F sekvenca kodon-optimizovana ili ne i bez obzira na mesto insercije. Gubitak ekspresije F proteina bio je brži (u roku od dve pasaže) kada se hCMV kombinovao sa kodon-optimizovanim F proteinom, u odnosu na kombinovanje hCMV sa divljim tipom F-sekvence (gubitak ekspresije F proteina u roku od 6 pasaža). Posmatrano zajedno, podaci pokazuju da humani CMV nije idealan promotor za stvaranje stabilnih HVT rekombinanata koji eksprimiraju NDV-F protein. Izvan očekivanja, ovaj primer pokazuje da su SV40 promotor i HVT endogeni promotor (US10 promotor) stvorili stabilne HVT rekombinante koji eksprimiraju NDV-F protein.
Primer 4.2 Konstruisanje vHVT202
Konstruisanje donorskog plazmida HVT SORF3-US2 gpVar-Ewtsyn
[0107] Fragment koji obuhvata sintetsku varijantu E gena VP2 IBDV divljeg tipa (SEQ ID NO:41 kodira SEQ ID NO:42) iseče se iz plazmida pUC57 varijanta E wt (sintetiše ga kompanija GeneScript) korišćenjem NotI i insertuje na isto mesto SORF3 i US2, plazmida koji sadrži gpCMV promotor i sintetski poliA rep. Povezani materijal se transformiše korišćenjem Top10 Oneshot kita (kat. br. C404002, Invitrogen). Bakterijske kolonije se gaje u
2
LBamp bujonu, plazmid se ekstrahuje korišćenjem Qiagens MiniSpin Prep kita, i pretražuje u pogledu orijentacije inserta korišćenjem SacI+HindIII razlaganja. Ispravan donorski plazmid označen je kao pHVT SORF3-US2 gpVar-Ewt Syn. Tabela 6.2 prikazuje osobine svojstvene konstruktu oko ekspresionih kaseta, uključujući odgovarajuće sekvence. Uzgajaju se kulture u velikim razmerama i ekstrakcija plazmida se vrši korišćenjem Qiagens Maxi Prep kita. Prolazna ekspresija plazmida iz Maxi Prep proverava se korišćenjem Fugene transfekcionog reagensa u fibroblastima embriona pileta (CEF) i pilećeg anti-IBDV poliklonskog antiseruma.
Tabela 6.2 Karakteristike ekspresionih kaseta dvostrukih HVT rekombinanata
Dobijanje rekombinanata
[0108] Standardni postupak homologne rekombinacije praćen je koelektroporacijom sekundarnih CEF ćelija uz korišćenje pHVTSORF3-US2 gpVar-Ewt Syn donorskog plazmida i virusne DNK izolovane iz vHVT306 i razložene pomoću SbfI. vHVT306, koji eksprimira klasični VP2 iz IBDV i NDV-F, odabran je kao roditeljski, da bi se pojednostavio postupak odabira, kako je opisano u nastavku. Varijantni E VP2 donorski plazmid dizajniran je da bi se zamenio F gen i rekombinanti su prvo odabrani po odsustvu ekspresije F gena, a zatim pomoću PCR po prisustvu varijante E VP2. Koelektroporacija je izvodena korišćenjem 1x10<7>2° CEF u 300 μl Opti-MEM koje se podvrgavaju elektrošoku od 150 volti sa kapacitetom 950, u 2 mm-skoj kiveti za elektroporaciju. Transfektovane ćelije se zaseju na ploče sa 96 bunarčića i inkubiraju 5-7 dana. Ćelije gajene na ploči sa 96 bunarčića se zatim dupliciraju na dve ploče sa 96 bunarčića i inkubiraju još 5 dana. Jedan set ploča sa 96 bunarčića koristi se za IFA uz upotrebu pilećeg poliklonskog seruma protiv NDV-F da bi se identifikovali pozitivni bunarčići koji sadrže roditeljske vHVT306 i drugi set ploča sa 96 bunarčića koristi se za izolovanje inficiranih ćelija iz IFA negativnih bunarčića.
[0109] Prečišćavanje rekombinantnog virusa izvodi se prvo dupliranjem ploče sa 96 bunarčića i IFA odabirom bunarčića koji sadrže najviše IFA negativnih (protiv NDV-F) plaka, uz najmanje IFA pozitivnih plaka. Bunarčići koji zadovoljavaju ove kriterijume se zatim dovode do zapremine od 1 ml u DMEM+2% FBS. Iz 1 ml stoka uzme se 5-20 μl (zavisno od broja vidljivih plaka) i meša sa 1x10<7>CEF u 10 ml DMEM+2% FBS i alikvotira na novu ploču sa 96 bunarčića sa namerom da se dobije jedna HVT plaka po bunarčiću. Posle 4 dana inkubacije, ploče sa 96 bunarčića se dupliraju i bunarčići koji sadrže plake testiraju se na prisustvo rekombinantnog HVT i odsustvo roditeljskog virusa, pomoću IFA i PCR. Bunarčići za koje, prema upoređivanju PCR traka, izgleda da sadrže više rekombinantnog virusa i manje roditeljskog virusa ponovo se sakupe i dovedu do 1 ml i alikvotiraju na novim pločama sa 96 bunarčića (isto kao ranije). Posle pet ciklusa prečišćavanja ćelija inficiranih virusom, izoluje se rekombinantni HVT koji nosi dva VP2 IBDV proteina i čistoća rekombinantnog virusa testira se pomoću PCR da bi se potvrdilo odsustvo roditeljskog virusa.
[0110] Sekvenciranjem insertovanog regiona potvrđuje se da vHVT202 sadrži ispravne sekvence CMV promotora zamorca, varijantu E VP2 gena IBDV divljeg tipa, i sintetski poli A rep, kako je prikazano u sekvenci donorskog plazmida HVT SORF3-US2 gpVar-Ewtsyn (SEQ ID NO:39).
Analiza rekombinanta metodom PCR
[0111] Iz stoka virusa DNK je ekstrahovana pomoću mešavine fenol/hloroform, precipitirana etanolom, i resuspendovana u 20 mM HEPES. PCR prajmeri su dizajnirani tako da specifično identifikuju varijantu E wt gena, promotor, poliA, kao i čistoću rekombinantnog virusa u pogledu prisustva roditeljskog HVT virusa. PCR se izvodi korišćenjem 200 μg DNK templata, zajedno sa odgovarajućim parovima prajmera navedenim u Tabeli 1. Uslovi PCR ciklusa su sledeći (ako nije drugačije napomenuto): 94°C - 2 min; 30 ciklusa na 94°C - 30 s, 55°C - 30 s, 68°C - 3 min; 68°C - 5 min.
[0112] Čistoća rekombinantnog virusa proverava se metodom PCR uz korišćenje parova prajmera specifičnih za bočne ručice HVT, gpCMV promotor, varijantu E gena i sintetski rep (syn tail). Analiza je obuhvatila i prajmere specifične za SB1, MDV serotip 2 (SB1US1.FP SB1Sorf4.RP). Rezultati PCR pokazuju da rekombinantni virus vHVT202 nosi željenu ekspresionu kasetu i da stok virusa ne sadrži detektabilne količine roditeljskog HVT virusa.
Imunofluorescentno bojenje rekombinantnog vHVT202 virusa koji eksprimira dva proteina VP2 iz IBDV
[0113] Za imunofluorescentno ispitivanje, P3 materijal se razblaži u odnosu 1:100 u medijumu. Približno 50 μl razblaženog virusa doda se u 10 ml DMEM+2% FBS sa 1x10<7>CEF i zatim alikvotira na ploču sa 96 bunarčićas (100 μl/bunarčiću). Ploče se inkubiraju 4 dana na 37°C+5% CO2dok virusne plake ne postanu vidljive. Ploče se fiksiraju 95% ledenohladnim acetonom tri munuta i isperu u tri promene PBS. Jedan bunarčić koristi se za
4
pileći antiserum protiv virusa Newcastle bolesti (partija br. C0139, Charles Rivers Laboratory) koji se doda u razblaženju 1:1000 i ploče se inkubiraju 1 sat na 37°C. Drugi bunarčić se upotrebi za pileći antiserum protiv IBDV (partija br. G0117). Posle jednog sata inkubacije, ploče se isperu u tri promene PBS i doda se antipileće antitelo sa FITC (kat. br. F8888, Sigma) u razblaženju 1:500. Ploče se ponovo inkubiraju 1 sat na 37°C. Posle jednog sata inkubacije, ćelije se isperu u tri promene PBS i vizuelizuju fluorescentnim mikroskopom uz korišćenje filtera za fluorescein izotiocijanat (FITC).
[0114] Rezultati imunofluorescentnog bojenja pokazuju da vHVT202 ispoljava veoma snažnu ekspresiju VP2 proteina kada se koriste poliklonski serumi protiv klasičnog i protiv varijante E VP2 proteina.
Zaključak
[0115] Na osnovu analize metodom PCR i imunofluorescencijom, vHVT202 predstavlja rekombinantni HVT u koji je varijanta E gena VP2 IBDV pod kontrolom gpCMV promotora, uspešno insertovana u rekombinantnu HVT osnovu koja već eksprimira klasični gen VP2 IBDV. Prema tome, vHVT202 nosi gene i varijante E VP2 i klasični VP2 IBDV i ne sadrži detektabilnu količinu roditeljskog virusa vHVT306.
Primer 5 Konstruisanje rekombinantnih vSB1-009, vSB1-004, vSB1-006, vSB1-007, vSB1-008, i vSB1-010 koji eksprimiraju NDV-F
Primer 5.1 Konstruisanje vSB1-009, vSB1-004, vSB1-006, vSB1-007, i vSB1-008
[0116] Cilj ove studije bio je konstruisanje rekombinantnog virusnog vektora vSB1-009 iz virusa SB-1, u koji je insertovana ekspresiona kaseta koja sadrži SV40 promotor i fuzioni protein virusa Newcastle bolesti (NDV-F) umesto kodirajuće sekvence UL44 (gC) SB-1.
[0117] Konstruisan je donorski plazmid pSB144 cds SV FCAopt koji sadrži UL44 bočne ručice SB1 virusa, SV40 promotor i NDV F kodon-optimizovanu gensku sekvencu (SEQ ID NO:5, kodira SEQ ID NO:6).
Dobijanje rekombinantnog virusa
[0118] Standardni postupak homologne rekombinacije praćen je koelektroporacijom sekundarnih CEF ćelija uz korišćenje donorskog plazmida pSB144 cds SV FCAopt i virusne DNK izolovane iz CEF inficiranih SB-1 virusom. Suštinski, postupak opisan u primeru 1 za vHVT114 korišćen je za dobijanje plaka, prečišćavanje i karakterizaciju rekombinanata imunofluorescencijom
[0119] Posle pet ciklusa prečišćavanja plaka, izolovan je čisti rekombinantni virus (vSB1-009) i čistoća vSB 1-009 ispitana je korišćenjem IFA i PCR da bi se potvrdila tačnost insercije kao i odsustvo ostataka roditeljskog virusa.
Analiza metodom PCR
[0120] Virusna DNK se ekstrahuje iz stoka vSB 1-009 na stupnju prematične kulture virusa, (pre-MSV) uz pomoć QIA DNeasy Blood & Tissue kita (Qiagen kat. br. 69506). PCR prajmeri su dizajnirani tako da identifikuju prisustvo optimizovanog NDV F, NDV F divljeg tipa, SV40 promotora, mCMV promotora, bočne ručice UL44 SB-1 virusa i HVT virusa. PCR amplifikacije se izvode korišćenjem približno 200 ng DNK templata, zajedno sa parovima prajmera.
[0121] PCR amplifikacija sa različitim prajmerima potvrdila je da vSB1-009 ima očekivane obrasce amplifikacije i očekivane amplikone.
Analiza ekspresije
[0122] Test indirektne imunofluorescencije (IFA) izvodi se na vSB 1-009 na stupnju pre-MSV da bi se ispitala ekspresija gena NDV F i antigena virusa SB-1. CEF u koje je inokulisan vSB 1-009 fiksiraju se tri minuta ledenohladnim 95% acetonom na sobnoj temperaturi i suše na vazduhu 10 min. Ploče se isperu pomoću PBS, zatim se dodaju dva primarna antitela, pileći serum protiv virusa Newcastle bolesti (Charles Rivers Laboratories kat. br. 10100641, partija br. C0117A) u razblaženju 1:500 i Y5.9 monoklonsko antitelo na SB-1 virus (Merial Select, Gainesville, GA) u razblaženju 1:3000 i ploče se inkubiraju 45 min na 37°C. Posle ispiranja u tri promene PBS, dodaju se dva sekundarna antitela, kozji antipileći IgG-fluorescein (KPL kat. br. 02-24-06, partija br. 110020) u razblaženju 1:500 i magareći antimišji IgG-Alexa Fluor 568 (Molecular Probe br. A10037, partija br. 989784) u razblaženju 1:250. Ploče se inkubiraju na 37°C 45 min, što je praćeno ispiranjem u tri promene PBS. Bunarčići se pretražuju na prisustvo IFA pozitivnih plaka korišćenjem fluorescentnog mikroskopa i filtera za fluorescein izotiocijanat (FITC) i tetrametilrodamin izotiocijnat (TRITC), na invertnom mikroskopu Nikon Eclipse Ti. Slično tome, reaktivnost vSB 1-009 sa NDV F Mab ispituje se dvojnim IFA korišćenjem anti-MDV seruma (Charles River Laboratories, kat. br. 10100628, partija br. D0111) (razblaženje 1/300) i anti-NDV F monoklonskog antitela (razblaženje 1/300) kao primarnih antitela. Kozji antipileći IgGfluorescein (KPL kat. br. 02-24-06, partija br. 110020) (razblaženje 1:500) i magareći antimišji IgG-Alexa Fluor 568 (Molecular Probe br. A10037, partija br. 989784) (razblaženje 1:250) koriste se kao sekundarna antitela. Bunarčići se posmatraju da bi se identifikovale IFA pozitivne plake pomoću fluorescentnog mikroskopa uz korišćenje filtera za FITC i TRITC, na invertnom mikroskopu Nikon Eclipse Ti.
[0123] Rezultati IFA pokazuju da vSB 1-009 eksprimira NDV F protein u CEF inficiranim virusom. Preko 500 vSB 1-009 plaka izbrojano je za ekspresiju NDV F proteina i SB-1-virus specifičnog proteina, metodom dvojne IFA. Ekspresija NDV F proteina potpuno se poklapa sa ekspresijom antigena virusa SB-1 u svakoj virusnoj plaki (Tabela 7).
Tabela 7 Dvojna IFA za vSB1-009
[0124] Reaktivnost NDV F Mab bila je potvrđena metodom dvojne IFA. Više od 200 vSB 1-009 plaka bilo je ispitano na reaktivnost Mab na NDV F kao i na reaktivnost sa anti-MDV serumom. Reaktivnost sa Mab na NDV F potpuno se poklapala sa reaktivnošću sa anti-MDV serumom, u svakoj virusnoj plaki (Tabela 8).
Tabela 8 Reaktivnost vSB1-009 sa anti-NDV F Mab
Analiza metodom Southern blot
[0125] Ukupna genomska DNK ekstrahovana je iz CEF inficiranih vSB 1-009 na stupnju pre-MSV. Genomske DNK vSB1-009, SB-1 virusa (negativna kontrola), pSB1 44 cds SV FCA opt donorskog plazmida razlože se na 37°C pomoću EcoRI, Ncol, i KpnI restrikcionih endonukleaza, zasebno. Restrikcioni fragmenti se razdvoje elektroforezom na 0.8 % agaroznom gelu i prenesu na pozitivno naelektrisanu najlonsku membranu. Posle prebacivanja, membrana se tretira korišćenjem 0.4 M NaOH i zatim neutrališe 2XSSC-HCl puferom. Posle toga, membrana se osuši na vazduhu i podvrgne umrežavanju pomoću UV.
[0126] Sledeći uputstva proizvođača North2South Chemiluminescent Hybridization and Detection kita (Thermo Scientific kat. br. 89880), membrana se prehibridizuje 1 h, a zatim hibridizuje probom na 55°C, preko noći. Za hibridizaciju, koriste se dve probe; 1) Sbflfragment pSB1 44 cds SV FCA opt kao proba za kasetu NDV F, 2) SmaI-EcoRI fragment pUC57 SB1 44 ručice (GenScript) kao proba za rekombinacionu ručicu. Posle hibridizacije preko noći, obavi se nekoliko ispiranja pod stringentnim uslovima, zatim se membrana stavi u blokirajući pufer uz dodavanje streptavidin-HRP. Posle spiranja nevezanog streptavidin-HRP sa membrane, doda se supstratni rastvor luminala i peroksida. Membrana se zatim izloži X-zracima na filmu i film se razvije.
[0127] Rezultati analize metodom Southern blot bili su očekivani na osnovu vektorskog mapiranja pomoću Vector NTI. NDV F kaseta (SV40 promotor, kodon-optimizovani gen NDV-F CA02) zamenila je UL44 kodirajuće sekvence SB-1 virusa.
Genomska analiza
[0128] Genomska DNK vSB1-009 na stupnju pre-MSV analizira se određivanjem nukleotidne sekvence regiona rekombinacione ručice kao i insertovane genske kasete. Prajmeri su dizajnirani i upotrebljeni za amplifikaciju čitave kasete gena NDV-F uključujući rekombinacione ručice.
[0129] Za sekvencu vSB1-009 (donorski plazmid pSB1 44 cds SV FCAopt), koja sadrži rekombinantne ručice, SV40 promotor i NDV F kodon-optimizovani gen, potvrđeno je da je ispravna, kako je pokazano u SEQ ID NO:19.
Analiza metodom Western blot
[0130] CEF monosloj se inficira sa vSB1-009 pre-MSV pri MOI ∼ 0.1. Posle 5 dana inkubacije, CEF se peletiraju i isperu pomoću PBS, što je praćeno lizom pomoću IP pufera za lizu/ispiranje, Pierce Classic IP Kit (Thermo Scientific kat. br. 26146) prema protokolu proizvođača. Lizat se prethodno izbistri i inkubira sa 100 μl anti-NDV F monoklonskog antitela da se napravi imunski kompleks. Imunski kompleks se imobiliše na agarozi sa proteinom A/G i posle uklanjanja nevezanog imunskog kompleksa u nekoliko koraka ispiranja, 50 μl pufera za uzorak koristi se za eluiranje pod neredukujućim uslovima. Neinficirane CEF uključene su kao kontrole. Po 20 μl eluiranih uzoraka razdvaja se elektroforezom na gelovima sa 10% Bis-Tris. Posle elektroforeze, razdvojeni proteini se prenesu na PVDF membranu. TMB Western Blot kit za detekciju proteina (KPL kat. br. 54-11-50) koristi se za detektovanje NDV antigena na PVDF membrani uz korišćenje pilećeg anti-NDV seruma (Charles River Laboratories Laboratories kat. br. 10100641, partija br. C0117A), i kozjeg antipilećeg IgG-peroksidaza konjugata (KPL kat. br. 14-24-06) prema protokolima proizvođača.
[0131] Ekspresija NDV F proteina iz vSB1-009 bila je potvrđena imunodetekcijom u dva koraka. Prvo se NDV F proteini eksprimirani u vSB 1-009-inficiranim CEF imobilišu imunoprecipitacijom uz korišćenje anti-NDV F monoklonskog antitela 001C3. Zatim, se izvrši Western blot analiza korišćenjem anti-NDV poliklonskog seruma (Charles River Laboratories kat. br. 10100641, partija br. C01 17A) da bi se detektovao NDV F protein u imobilisanim uzorcima (kompleks NDV F protein-monoklonsko antitelo) (SL. 9). U lizatima vSB1-007 pre-MSV, pomoću anti-NDV seruma, detektovan je protein od približno 55 kDa, koji odgovara očekivanoj veličini NDV F1 fuzionog proteina (SL.9).
[0132] Dobijanje i karakterizacija HVT rekombinanata vSB 1-004, vSB1-006, vSB 1-007 i vSB 1-008 obavljeni su suštinski na isti način kao za vSB1-009, što je opisano u ovom primeru. Tabela 9.1 prikazuje osobine svojstvene svakom konstruktu oko ekspresionih kaseta, uključujući odgovarajuće sekvence. Dobijanje i karakterizacija rekombinantnih vektora iz SB1 virusa opisani su i u US patentnoj prijavi pod serijskim brojem USSN 13/689,572, podnetoj 29. novembra 2012 (Merial limited).
Tabela 9.1 Karakteristike ekspresionih kaseta SB1 rekombinanata
Primer 5.2 Konstruisanje dvostrukog konstrukta vSB1-010
Konstruisanje donorskog plazmida SB1US2 gpVIIdwtsyn
[0133] Korišćenjem plazmida HVT SOrf3-US2 gpVar-Ewt Syn, gpCMV, varijanta E, Syn rep se uklone razlaganjem pomoću SbfI. Ovaj fragment se veže u donorski plazmid SB1 US2. Varijanta E gena se iseče pomoću NotI i zameni divljim tipom NDV-F VIId. Sintetski gen NDV-F VIId divljeg tipa (SEQ ID NO:3 kodira SEQ ID NO:4) iseče se iz pUC57 NDV-F VIId wt plazmida (sintetiš ga kompanija GeneScript) razlaganjem pomoću NotI. Povezani materijal se transformiše korišćenjem Top10 Oneshot kita (kat. br. C404002, Invitrogen). Bakterijske kolonije se gaje u LBamp bujonu, plazmid se ekstrahuje korišćenjem Qiagens MiniSpin Prep kita, i pretražuju u pogledu orijentacije inserta korišćenjem NcoI+SalI razlaganja. Ispravni donorski plazmid označen je kao pSB1 US2 gpVIIdwt Syn. Tabela 9.2 prikazuje osobine svojstvene konstruktu oko ekspresionih kaseta, uključujući odgovarajuće sekvence. Kulture se gaje u velikim razmerama i ekstrakcija plazmida se vrši korišćenjem Qiagens Maxi Prep kit. Prolazna ekspresija plazmida iz Maxi Prep proverava se korišćenjem Fugene transfekcionog reagensa u fibroblastnim ćelijama embriona pileta (CEF) i pilećeg poliklonskog seruma protiv NDV-F.
Dobijanje rekombinanta
[0134] Standardni postupak homologne rekombinacije praćen je koelektroporacijom sekundarnih CEF ćelija uz korišćenje donorskog plazmida pSB1 US2 gpVIIdWt Syn i virusne DNK izolovane iz vSB 1-009 (vSB1-009 je rekombinantni virus koji eksprimira F gen iz NDV CA02). Suštinski, postupak isti kao onaj koji je opisan u primeru 1 za vHVT114 korišćen je za dobijanje plaka, prečišćavanje i karakterizaciju rekombinanata imunofluorescencijom.
[0135] Posle pet ciklusa prečišćavanja plaka, izoluje se čisti rekombinantni virus (vSB1-010) i čistoća vSB1-010 se ispituje pomoću IFA i PCR da bi se potvrdila odgovarajuća insercija kao i odsustvo ostataka roditeljskog virusa.
Tabela 9.2 Karakteristike ekspresione kasete vSB1-010
[0136] Sekvenciranjem insertovanog regiona potvrđeno je da vSB1-010 sadrži ispravne sekvence CMV promotora zamorca i gena NDV-F VIId wt, kako je pokazano u sekvenci donorskog plazmida SB1US2 gpVIIdwtsyn (SEQ ID NO:40).
Analiza rekombinanta metodom PCR
[0137] DNK se ekstrahuje iz stoka virusa pomoću mešavine fenola/hloroforma, precipitira etanolom i resuspenduje u 20 mM HEPES. PCR prajmeri su dizajnirani tako da specifično
4
identifikuju gen NDV-F VIId wt, promotor, poliA, kao i čistoću rekombinantnog virusa u pogledu prisustva roditeljskog virusa SB1. PCR se izvodi korišćenjem 200 μg DNK templata zajedno sa specifikovanim parovima prajmera navedenim u Tabeli 1. Uslovi PCR ciklusa su sledeći (ukoliko nije drugačije navedeno): 94°C - 2 min; 30 ciklusa na 94°C - 30 s, 55°C - 30 s, 68°C - 3 min; 68°C - 5 min.
[0138] Čistoća rekombinantnog virusa proverava se metodom PCR, uz korišćenje parova prajmera specifičnih za bočne ručice SB1, gpCMV promotor, gen NDV-F VIId wt i sintetski rep. Prajmeri, specifični za HVT, MDV serotip 3 (MB080 MB081) takođe su uključeni u analizu. Rezultati PCR pokazuju da rekombinantni virus vSB1-010 nosi željenu ekspresionu kasetu i da stok virusa ne sadrži detektabilne količine roditeljskog SB1-009 virusa.
Imunofluorescentno bojenje rekombinantnog vSB1-010 virusa koji eksprimira dva NDV-F proteina
[0139] Za imunofluorescentno testiranje, materijal P3 se razblaži medijumom u odnosu 1:100. Približno 50 μl razblaženog virusa doda se u 10 ml DMEM+2% FBS sa 1x10<7>CEF i zatim alikvotira na ploču sa 96 bunarčića (100 μl/bunarčiću). Ploče se inkubiraju 5 dana 37°C+5%CO2dok virusne plake ne postanu vidljive. Ploče se zatim tri minuta fiksiraju 95% ledenohladnim acetonom i isperu u tri promene PBS. Doda se pileći antiserum protiv virusa Newcastle bolesti (partija br. C0139, Charles Rivers Laboratory) u razblaženju 1:1000 i ploče se inkubiraju na 37°C 1 sat. Posle 1 sata inkubacije ploče se isperu u tri promene PBS i doda se FITC antipileće antitelo (kat. br. F8888, Sigma) u razblaženju 1:500. Ploče se ponovo inkubiraju na 37°C 1 sat. Posle 1 sata inkubacije ćelije se isperu u tri promene PBS i vizuelizuju fluorescentnim mikroskopom uz korišćenje filtera za fluorescein izotiocijanat (FITC).
[0140] Rezultati imunofluorescentnog bojenja ukazuju na to da vSB1-010 ispoljava veoma jaku ekspresiju NDV-F proteina kada se koristi poliklonski serum protiv proteina NDV-F CA02 i protiv proteina NDV-F VIId.
Zaključak
[0141] Na osnovu testiranja metodom PCR i analize imunofluorescencijom, vSB1-010 predstavlja rekombinantni SB-1 u kojem je gen NDV-F VIId pod kontrolom gpCMV promotora uspešno insertovan u vSB1-009, koji već eksprimira gen NDV F CA02. Posledično vSB1-010 nosi gene NDV-F i genotipa VIId i CA02 F i ne sadrži detektabilne roditeljske vSB 1-009.
Primer 6 Efikasnost vHVT110, vHVT111, vHVT114 i vSB1-004 koji eksprimiraju NDV F gen protiv infekcija sojevima NDV Chimalhuacan i Malaysian (MAL04-01) kod SPF pilića starih 14 dana
[0142] Cilj ove studije bio je proceniti efikasnost tri rekombinantna konstrukta iz HVT (vHVT110, vHVT111 i vHVT114) i jednog rekombinantnog konstrukta iz SB1 (vSB1-004) koji eksprimiraju gen NDV F, protiv infekcije virusom Newcastle bolesti (Chimalhuacan i Malaysian virusni sojevi) izazvane kod SPF pilića starih 14 dana.
[0143] Karakteristike ovih 5 kandidata za vakcinu prikazane su u Tabeli 10 u nastavku.
Tabela 10 Karakteristike vektora upotrebljenih u studiji efikasnosti
[0144] Na D0, 100 SPF pilića starih jedan dan nasumično je raspoređeno u 10 grupa od po 10 ptica. Na D0, pticama je supkutano injektirano u vrat po 0.2 mL rekombinantnih vakcina koje sadrže zadatu dozu od 2000 pfu, kako je opisano u Tabeli 11 u nastavku. Treba napomenuti da je titar vSB1-004 (31600 pfu) dat pticama iz grupe 6 bio znatno viši od predviđenog. Na D14 ptice su intramuskularno inficirane velogenim sojem ND Malaysia (genotip VIId) (podgrupe "a") ili virulentnim sojem ND Chimalhuacan (genotip V) (podgrupe "b").
Tabela 11 Studija efikasnosti sa vHVT110, vHVT111, vHVT114 i vSB1-004
[0145] Svaka grupa praćena je pre i posle infekcije. Klinički znaci posle infekcije bili su procenjivani svakodnevno na sledeći način: zdravi / sa specifičnim simptomima (razbarušeno perje, stanje slabosti, tortikolis, tremor) / smrt. Na D14, uzorci seruma uzimani su iz svake grupe za serološku analizu (test inhibicije hemaglutinacije (haemagglutination inhibition, HI) virusom Newcastle bolesti).
[0146] Kao što je i očekivano, nevakcinisane životinje (G1a i G1b) nisu ispoljile antitela na NDV na D14. U svakoj vakcinisanoj grupi (podgrupe "a" i "b" G2 do G5) zapažena serokonverzija sa niskim titrom (prosečni HI titar <0.6 log10) potvrdila je unos vakcine. Broj pozitivnih u odnosu na ukupan broj testiranih ptica zavisio je od grupe i bio je najviši (90%) u vHVT114 vakcinisanim pticama (vidi gornju Tabelu).
[0147] Procenti zaštite od mortaliteta i morbiditeta saopšteni su u gornjoj Tabeli. Puna podložnost zapažena je u kontrolnim grupama G1a i G1b čime je potvrđena velika snaga obe infekcije. Najniži nivoi zaštite zapaženi su u grupama vakcinisanim korišćenjem vHVT111 ili vSB 1-004. Najviša stopa zaštite od morbiditeta i mortaliteta dobijena je u grupama vakcinisanim korišćenjem vHVT110 ili vHVT114, bez obzira na soj upotrebljen za izazivanje infekcije (homologni soj tj. Malaysian genotip VIId ili heterologni soj tj. Chimalhuacan genotip V). Primećena je korelacija između % ptica pozitivnih u HI testu pre veštačke infekcije i % zaštite.
[0148] Razlika u zaštiti dobijenoj sa vHVT110 i vHVT111 jasno ilustruje značaj promotora, pri čemu je mCMV IE promotor potentniji od SV40 promotora za transkripciju F gena divljeg tipa (wt) genotipa VIId. Razlika u zaštiti dobijenoj sa vHVT111 i vHVT114 ilustruje značaj nukleotidne sekvence F gena, pri čemu je optimizovana sekvenca potentnija od sekvence divljeg tipa (ili nativne).
[0149] U zaključku, rezultati ove studije pokazali su značaj promotora i nukleotidne sekvence F gena u zaštiti od ND, indukovanoj vektorskim vakcinama iz virusa Marekove bolesti. Za postizanje najbolje efikasnosti, potrebna je optimalna kombinacija ovih faktora, kao u vHVT114.
4
Primer 7 Efikasnost vHVT114, vHVT116, vHVT301, vHVT302 i vHVT303 koji eksprimiraju NDV F gen, protiv infekcije sojem NDV Texas GB kod SPF pilića starih 14 dana
[0150] Cilj ove studije bio je proceniti efikasnost 2 jednostruka rekombinantna konstrukta iz HVT (vHVT114 i vHVT116) koji eksprimiraju gen NDV F i 3 dvostruka rekombinantna konstrukta iz HVT (vHVT-301, vHVT302 i vHVT303) koji eksprimiraju gene NDV F i IBDV VP2, protiv infekcije virusom Newcastle bolesti (Texas GB soj, genotip II), izazvane kod SPF pilića starih 14 dana.
[0151] Karakteristike ova 4 kandidata za vakcinu opisane su u Tabeli 12 u nastavku.
Tabela 12 Karakteristike vektora upotrebljenih u studiji efikasnosti
[0152] Na D0, 120 SPF pilića starih jedan dan nasumično je raspoređeno u 6 grupa od po 20 ptica. Pticama je na D0 supkutano injektirano u vrat po 0.2 mL rekombinantnih vakcina koje sadrže zadatu dozu od 1000 pfu, kako je opisano u Tabeli 13 u nastavku. Na D14, ptice su intramuskularno inficirane korišćenjem 4.5 log10 velogenog soja ND Texas GB (genotip II).
Tabela 13 Rezultati studije efikasnosti
[0153] Svaka grupa praćena je pre i posle izazivanja infekcije. Posle izazivanja infekcije, zapaženi su klinički znaci NDV i mortalitet.
[0154] Procenti kliničke zaštite saopšteni su u gornjoj Tabeli. Puna podložnost zapažena je u nevakcinisanoj inficiranoj kontrolnoj grupi G1, čime je potvrđena velika snaga obe infekcije. Delimična zaštita zapažena je kod 5 kandidata za vakcinu, najbolje osobine dobijene su sa vHVT114 i vHVT116. Među dvostrukim HVT rekombinantima, vHVT302 je davala najbolju zaštitu. Ponašala se bolje od vHVT303, što ukazuje da optimizovani gen F NDV genotipa VIId daje bolju unakrsnu zaštitu protiv infekcije genotipom II nego optimizovani gen F NDV genotipa V. Slična tendencija zapažena je sa jednostrukim HVT, vHVT114 (VIId gen) se ponašao malo bolje od vHVT116 (V gen), ali razlika je bila manje izražena. Ovi rezultati ukazuju na to da gen F NDV oba genotipa VIId i V insertovana u HVT vektor obezbeđuju unakrsnu zaštitu protiv infekcije heterolognim NDV genotipa II; pri tome, gen VIId potencijalno može pružiti bolju unakrsnu zaštitu. vHVT302 indukuje bolju zaštitu od ND nego vHVT301, što potvrđuje značaj promotora, poli-A i lokusa insercije. U zaključku, rezultati ove studije pokazuju da se vrlo dobra rana zaštita od ND indukuje testiranim vektorskim vakcinama za Marekovu bolest, posebno testiranom jednostrukom HVT-ND.
Primer 8 Efikasnost vHVT114, vHVT116, vSB1-007, vSB1-008 (samog ili sa vHVT13) i vHVT 304, protiv infekcija izazvanih korišćenjem NDV ZJ1 (genotip VIId) i California/02 (genotip V) kod SPF pilića starih 21 dan
[0155] Cilj ove studije bio je proceniti efikasnost 2 jednostruka rekombinantna konstrukta iz HVT (vHVT114 i vHVT116), 2 rekombinantna konstrukta iz SB1 (vSB1-007 i vSB1-008) koji eksprimiraju gen F NDV i dvostrukog rekombinanta iz HVT (vHVT304) protiv infekcije virusom Newcastle bolesti soj NDV ZJ1 (genotip VIId) i California/02 (genotip V), izazvane kod SPF pilića starih 21 dan.
[0156] Karakteristike ovih 5 kandidata za vakcinu opisane su u Tabeli 14 u nastavku ovog teksta.
Tabela 14 Karakteristike vektora upotrebljenih u studiji efikasnosti
4
[0157] Na D0, 158 SPF pilića starih jedan dan nasumično je raspoređeno u 6 grupa od po 24 ptice (vakcinisane) i 1 grupu od 12 ptica (nevakcinisane kontrole). Pticama je na D0 supkutano injektirano u vrat po 0.2 mL rekombinantnih vakcina koje sadrže zadatu dozu od 1000 pfu, kako je opisano u Tabeli 15 u nastavku. Ptice su zatim razdvojene u dve podgrupe, svaka podgrupa je na D21 intramuskularno inficirana velogenim sojem NDV ZJ1 (genotip VIId) ili California/02 (genotip V) u dozi od 5 log10 EID50.
Tabela 15 Rezultati studije efikasnosti
[0158] Svaka grupa praćena je pre i posle izazivanja infekcije. Tehnički problemi sa izolatorima smanjili su broj ptica u grupi 2 (vHVT114: od 24 na 14) i u grupi 3 (vHVT116: od 24 na 20). Posle infekcije NDV zapaženi su klinički znaci. Serum je uzet iz uzoraka krvi ptica iz grupa 2 i 7 pre izazivanja infekcije (D21) za NDV serologiju HI testom, uz korišćenje svakog od infektivnih sojeva kao antigena.
[0159] Prosečni serološki titri HI u G2 i G7 pre infekcije prikazani su na Slici 10. Titri HI bili su viši sa ZJ1 antigenom u obe grupe. Titri HI indukovani korišćenjem vHVT114 bili su viši od onih koji su indukovani korišćenjem vHVT304.
4
[0160] Procenti zaštite od mortaliteta i morbiditeta saopšteni su u gornjoj tabeli. Puna podložnost zapažena je kod nevakcinisane veštački inficirane kontrolne grupe G1, čime je potvrđena velika snaga obe infekcije. Sve vakcine indukovale su visoke nivoe (≥75%) zaštite protiv obe infekcije. Puna klinička zaštita protiv obe infekcije indukivana je korišćenjem vHVT114 i vSB1-008. Prateći sličnu tendenciju kao titri HI, zaštita od ND indukovana korišćenjem vHVT304 bila je malo niža od one koja je indukovana korišćenjem vHVT114.
[0161] Oslobađanje virusa procenjivano je posle izazivanja infekcije, metodom RT-PCR u realnom vremenu, u brisevima usta i kloake uzetim 2 i 4 dana posle infekcije. Procenat pozitivnih (Ct<40) ptica prikazan je za obe infekcije na SL. 11A i 11B. Zapaziti da je svih 6 ptica bilo mrtvo 4. dana posle infekcije u kontrolnoj grupi inficiranoj izolatom CA/02, a samo jedna ptica (od 6) je bila živa 4, dana posle infekcije u kontrolnoj grupi inficiranoj korišćenjem ZJ1. Oslobađanje virusa detektovano je kod svih kontrolnih ptica. Smanjenje procenta ptica pozitivnih na oslobađanje virusa zapaženo je kod svih vakcinisanih grupa.
[0162] U zaključku, rezultati ove studije pokazali su da testirane vektorske vakcine protiv Marekove bolesti pružaju vrlo dobru zaštitu od ND na uzrastu od 3 nedelje.
Primer 9 Efikasnost vHVT114, vSB1-007, vSB1-009, vHVT306 i vHVT307 kao vakcina protiv infekcija izazvanih sojem NDV Texas GB kod SPF pilića starih 28 dana
[0163] Cilj ove studije bio je proceniti efikasnost kombinacija različitih vektorskih vakcina iz virusa Marekove bolesti, koje eksprimiraju gen F NDV i/ili VP2 IBDV protiv infekcije virusom Newcastle bolesti (Texas GB soj, genotip II) izazvane kod SPF pilića starih 28 dana.
[0164] Karakteristike 5 rekombinantnih kandidata za vakcinu testiranih u ovoj studiji opisane su u Tabeli 16 u nastavku.
Tabela 16 Karakteristike vektora upotrebljenih u studiji efikasnosti
4
[0165] U nekim grupama, vakcine protiv virusa Marekove bolesti serotip 1 (soj CVI988 (ili Rispens); Gallid herpesvirus 2) i serotip 2 (soj SB-1; gallid herpesvirus 3) takođe su korišćene u kombinaciji sa rekombinantnim virusima.
[0166] Na D0, 135 SPF pilića starih jedan dan, nasumično je raspoređeno u 9 grupa od po 15 ptica. Na D0, pticama je supkutano injektirano u vrat po 0.2 mL vakcine koja sadrži zadatu dozu od 2000 pfu za rekombinantne vakcine (vSB1-007, vSB1-009, vHVT13, vHVT306, vHVT307, vHVT114), i 1000 pfu za roditeljske sojeve vakcine protiv Marekove bolesti (SB-1 i CVI988). Dizajn 9 grupa prikazan je u Tabeli 17 u nastavku ovog teksta. Na D28, ptice su intramuskularno inficirane velogenim sojem ND Texas GB (genotip II) u dozi od 4.0 log10 EID50.
Tabela 17 Rezultati studije efikasnosti
[0167] Svaka grupa praćena je pre i posle izazivanja infekcije. Posle izazivanja infekcije registrovani su klinički znaci NDV.
[0168] Procenti zaštite od mortaliteta i morbiditeta predstavljeni su u gornjoj tabeli. Puna podložnost zapažena je kod nevakcinisane inficirane kontrolne grupe G1, čime je potvrđena velika snaga obe infekcije. Odlični nivoi zaštite zapaženi su kod svih vakcinisanih grupa. Ptice iz G3, G6, G7 i G9 bile su zaštićene u potpunosti. Ova studija pokazuje da kandidati vSB1-ND mogu da se primenjuju uporedno sa vHVT13 i CVI988 i da i dalje obezbeđuju veoma dobru zaštitu od ND. Slično tome, dvostruki HVT-IBD+ND kompatibilni su sa SB-1, a vHVT-ND (vHVT114) kompatibilan je sa vHVT13 i SB-1.
4
[0169] U zaključku, rezultati ove studije pokazuju odsustvo interferencije u zaštiti od ND izazvanoj testiranim roditeljskim i vektorskim vakcinama iz virusa Marekove bolesti.
Primer 10 Efikasnost vHVT114, vHVT307, vSB1-007 i vSB1-009 u kombinaciji sa vHVT13 protiv infekcija sojem NDV Chimalhuacan (genotip V) kod SFP pilića na D28
[0170] Cilj ove studije bio je proceniti efikasnost jednog rekombinantnog konstrukta iz HVT (vHVT114) i dva rekombinantna konstrukta iz SB1 (vSB1-007 i vSB 1-009) koji eksprimiraju gen F NDV u kombinaciji sa vHVT-IBD (vHVT13), kao i dvostrukog HVT vHVT307 koji eksprimira i F NDV i VP2 IBDV, protiv infekcije virusom ND (Chimalhuacan, genotip V) izazvane kod SPF pilića starih 28 dana.
[0171] Karakteristike ova 4 kandidata za vakcinu opisane su u Tabeli 18 u nastavku.
Tabela 18 Karakteristike vektora upotrebljenih u studiji efikasnosti
[0172] Na D0, 45 SPF pilića starih jedan dan, nasumično je raspoređeno u 4 grupe od po 10 ptica i jednu grupu od 5 ptica. Na D0, pticama je supkutano injektirano u vrat po 0.2 mL rekombinantne vakcine koja sadrži zadatu dozu od 2000 pfu, kako je opisano u Tabeli 19 u nastavku ovog teksta. Na D28, ptice su intramuskularno inficirane velogenim sojem NDV Chimalhuacan (genotip V) u dozi od 5.0 log10 EID50.
Tabela 19 Rezultati studije efikasnosti
4
[0173] Svaka grupa praćena je pre i posle izazivanja infekcije. Klinički znaci NDV registrovani su posle izazivanja infekcije. Orofaringealni brisevi uzimani su u vakcinisanim grupama 5. i 7. dana posle izazivanja infekcije da bi se procenilo opterećenje virusom pomoću RT-PCR u realnom vremenu.
[0174] Procenti zaštite od mortaliteta i morbiditeta predstavljeni su u gornjoj tabeli. Puna podložnost zapažena je kod nevakcinisane inficirane kontrolne grupe G1, čime je potvrđena velika snaga infekcije. Kod sve 4 vakcinisane grupe zapažena je veoma dobra zaštita, a puna klinička zaštita ostvarena je korišćenjem vHVT114+vHVT13.
[0175] Procenat pozitivnih ptica i prosečan titar oslobađanja virusnih čestica (izražen kao log10 EID50 ekvivalent po mL) prikazani su na SL. 12A i 12B. Iznenađujuće, oslobađanje virusnih čestica nije detektovano u G2, što ukazuje na potpunu (i protiv kliničkih znakova i protiv oslobađanja virusa) zaštitu od ND indukovanu korišćenjem vHVT114 čak i kada se primenjuje uporedno sa vHVT13, u uslovima testiranja. Nivoi oslobađanja virusa detektovani u drugim vakcinisanim grupama bili su niski, pri čemu je samo blago povišen nivo detektovan u G3 (vHVT307), samo 5. dana posle infekcije (post-infection, pi).
[0176] U zaključku, ovaj primer dodatno ilustruje odličnu zaštitu od ND ostvarenu dvostrukim rekombinantom HVT-IBD+ND ili kombinacijom rekombinantnih virusa SB1-ND ili HVT-ND i HVT-IBD (vHVT13). Nasuprot opštem verovanju u oblasti da druga HVT vakcina (konvencionalna HVT vakcina ili rekombinantna HVT vakcina) interferira sa imunitetom na strane gene insertovane u prvu rekombinantnu HVT vakcinu, predmetni pronalazak je pokazao iznenađujući rezultat da vHVT114 u kombinaciji sa vHVT13 pruža odličnu zaštitu od NDV, dok efekat interferencije nije zapažen.
Primer 11 Efikasnost vHVT306, vSB1-008 u kombinaciji sa vHVT13 primenjenih SC ili in ovo protiv infekcije sojem NDV Chimalhuacan (genotip V) kod SPF pilića na D28
[0177] ] Cilj ove studije bio je proceniti efikasnost vHVT306, dvostrukog HVT koji eksprimira i gen NDV F i gen IBDV VP2, i vSB1-008 rekombinanta SB1 koji eksprimira gen NDV F u kombinaciji sa vHVT-IBD (vHVT13), kada se primene in ovo ili supkutano, protiv infekcije virusom Newcastle bolesti (Chimalhuacan, genotip V) izazvane kod SPF pilića starih 28 dana.
[0178] Karakteristike ova dva kandidata za vakcinu protiv ND saopštene su u Tabeli 14 (vSB1-008) i u Tabeli 16 (vHVT306).
[0179] Dizajn grupa prikazan je u Tabeli 20. Šezdeset SPF oplođenih jaja (posle približno 18 dana i 18 sati inkubacije; D-3) korišećno je za in ovo primenu (20 po grupi za G1, G2 i G3).
Pedeset mikrolitara vakcine koja sadrži 2000 PFU primenjeno je in ovo korišćenjem IntelliLab System uređaja, AviTech LLC (Salisbury, MD, USA). Posle primene in ovo praćeni su sposobnost izleganja i preživljavanje. Na D0, 20 SPF pilića starih jedan dan nasumično je raspoređeno u 2 grupe od po 10 ptica (G4 i G5). Na D0, pticama je injektirano supkutano (SC) u vrat po 0.2 mL rekombinantne vakcine koja sadrži zadatu dozu od 2000 pfu, kako je opisano u Tabeli 20 u nastavku ovog teksta. Deset ptica po grupi intramuskularno je inficirano na D28 velogenim sojem NDV Chimalhuacan (genotip V) u dozi od 5.0 log10 EID50.
Tabela 20 Dizajn studije i rezultati efikasnosti protiv ND
[0180] Svaka grupa praćena je pre i posle izazivanja infekcije. Klinički znaci NDV registrovani su posle izazivanja infekcije. Orofaringealni brisevi uzimani su iz vakcinisanih grupa 5. i 7. dana posle izazivanja infekcije da bi se procenilo opterećenje virusom pomoću RT-PCR u realnom vremenu.
[0181] Ptice iz grupa G1 i G2 pokazale su punu sposobnost izleganja i vijabilnost do D28 (dan infekcije). Sposobnost izleganja u G3 bila je 85%, a u toj grupi je još jedna ptica uginula posle izleganja. Niža sposobost izleganja u toj grupi može se objasniti problemima u vezi sa inkubatorom za jaja. Na D1 i D28, telesne težine mužjaka i ženki iz G1, G2 i G3 bile su slične.
[0182] Procenti zaštite od mortaliteta i morbiditeta predstavljeni su u Tabeli 20. Puna podložnost infekciji zapažena je kod nevakcinisane inficirane kontrolne grupe G1, čime je potvrđena velika snaga infekcije. Vrlo dobra zaštita zapažena je kod sve 4 vakcinisane grupe, a puna klinička zaštita ostvarena je korišćenjem vHVT306, bez obzira na put primene.
[0183] Procenat pozitivnih ptica i prosečni titar oslobađanja virusa (izražen kao log10 EID50 ekvivalent po mL) prikazani su u Tabeli 21. Odsustvo oslobađanja virusa ili vrlo nisko oslobađanje virusa zabeleženi su u G2 i G4 vakcinisanim korišćenjem vHVT306. Nivoi
1
oslobađanja virusa u grupama vakcinisanim korišćenjem vSB1-008+vHVT13 bili su viši, naročito 5. dana posle infekcije (pi).
Tabela 21 Rezultati zaštite od oslobađanja virusa (procenat ptica sa detektabilnim oslobađanjem i prosečno opterećenje virusom, u log10) posle procene na D5 i D7 posle izazivanja NDV infekcije
[0184] U zaključku, ovaj primer pokazuje da dvojni rekombinant HVT - vHVT306 pruža odličnu zaštitu od ND, bilo da je primenjen in ovo ili SC. Svojstva vSB1-008+vHVT13 bile su malo lošije, naročito posle primene in ovo, ali to se bar delimično može objasniti problemima sa inkubatorom za jaja. Zaista, prilikom in ovo testiranja neškodljivosti drugog rekombinanta SB1-ND (vSB1-009) pri 1000 ili 4000 PFU, zajedno sa 6000 PFU vHVT13 nije pokazana nikakva razlika u sposobnosti izleganja i ranom preživljavanju u odnosu na grupu koja je primala samo 6000 PFU vHVT13.
Primer 12 Efikasnost vHVT304, vHVT306, vSB1-007 i vSB1-008 u kombinaciji sa vHVT13 protiv infekcije sojem NDV Chimalhuacan (genotip V) kod komercijalnih brojler pilića na D42
[0185] Cilj ove studije bio je proceniti efikasnost dva dvostruka HVT (vHVT304 i vHVT306) koji eksprimiraju i gen F NDV i gen VP2IBDV, kao i dva rekombinanta SB1 (vSB1-007 i vSB 1-008) koji eksprimiraju gen F NDV u kombinaciji sa vHVT-IBD (vHVT13), protiv infekcije virusom Newcastle bolesti (Chimalhuacan, genotip V), izazvane kod komercijalnih brojler pilića starih 42 dana.
[0186] Karakteristike ova 4 kandidata za vakcinu protiv ND predstavljene su u Tabelama 14 i 16. Dizajn grupa prikazan je u Tabeli 22. Na D0, 55 komercijalnih brojler pilića starih jedan dan nasumično je raspoređeno u 5 grupa od po 11 ptica. Na D0, pticama je supkutano (SC)
2
injektirano u vrat, po 0.2 mL rekombinantne vakcine koja sadrži zadatu dozu od 2000 pfu, kako je opisano u Tabeli 22 u nastavku ovog teksta. Na D42, deset ptica po grupi intramuskularno je inficirano velogenim sojem NDV Chimalhuacan (genotip V) u dozi od 5.0 log10 EID50.
Tabela 22 Dizajn studije i rezultati efikasnosti protiv ND
[0187] Svaka grupa praćena je pre i posle izazivanja infekcije. Klinički znaci NDV registrovani su u toku 14 dana posle izazivanja infekcije. U vakcinisanim grupama, 5. i 7. dana posle izazivanja infekcije uzimani su orofaringealni brisevi da bi se procenilo opterećenje virusom metodom RT-PCR u realnom vremenu.
[0188] Procenti zaštite od mortaliteta i morbiditeta predstavljeni su u Tabeli 22. Puna podložnost zapažena je kod nevakcinisane inficirane kontrolne grupe G1, čime je potvrđena velika snaga infekcije. Vrlo dobra zaštita zapažena je kod sve 4 vakcinisane grupe, a puna klinička zaštita ostvarena je korišćenjem vHVT306 i vSB1-007+vHVT13.
[0189] ] Procenat pozitivnih ptica i prosečni titar oslobađanja virusa (izražen kao log10 EID50 ekvivalent po mL) prikazani su u Tabeli 23. Najbolje smanjenje oslobađanja virusa dobijeno je korišćenjem vHVT306 i vSB1-007+vHVT13, koji su bili i najbolji kandidati za kliničku zaštitu.
Tabela 23 Rezultati zaštite od oslobađanja virusa (procenat ptica sa detektabilnim oslobađanjem i prosečno opterećenje virusom, u log10) procenjeni na D5 i D7 posle infekcije izazivane NDV (pi)
[0190] Nađeno je da je vHVT306 pružio bolju zaštitu od ND nego vHVT304. Ova dva dvostruka HVT sadrže istu NDV F ekspresionu kasetu, ali je ona insertovana na dva različita lokusa, a kaseta VP2 IBDV insertovana je na istom mestu. Ovaj primer, prema tome, ilustruje značaj lokusa insercije u dizajnu HVT rekombinanata. vSB1-007+vHVT13 bio je bolji od vSB1-008+vHVT13. Struktura genoma vSB1-007 razlikuje se od strukture vSB1-008 u različitim aspektima: lokus insercije, promotor, poliadenilacioni signal i poreklo F gena. Kombinacija ovih stranih sekvenci i lokusa insercije u vSB 1-007 najverovatnije je bila odgovorna za najbolju zaštitu od ND.
[0191] U zaključku, ovaj primer ilustruje značaj lokusa insercije i drugih regulatornih sekvenci u NDV ekspresionoj kaseti, u zaštiti od ND indukovanoj vektorima iz HVT i MDV serotip 2.
Primer 13 Efikasnost rekombinantnih vakcina HVT-ND+IBD (vHVT304 i vHVT306) ili SB1-ND (vSB1-008) u kombinaciji sa vHVT13, protiv infekcije klasičnim IBDV izolatom kod SPF pilića na D14
[0192] Cilj ove studije bio je proceniti ranu efikasnost dvostrukih rekombinanata HVT -vHVT304 i vHVT306, kao i vHVT13, kada se primenjuju uporedno sa rekombinantnim konstruktom SB1-ND (vSB1-008), protiv infekcije virulentnim virusom bolesti burze (vIBDV) (Faragher 52/70 soj), izazvane kod SPF pilića starih 14 dana.
[0193] Karakteristike dvostrukih rekombinanata HVT i SB1 upotrebljenih u ovoj studiji prikazani su u Tabelama 14 i 16.
[0194] Na D0, 95 SPF pilića starih jedan dan nasumično je raspoređeno u 9 grupa od po 10 ptica i 1 grupu od 5 ptica (nevakcinisana neinficirana kontrolna grupa). Na D0, pticama je supkutano (SC) injektirano u vrat, po 0.2 mL rekombinantne vakcine koja sadrži zadatu dozu od 300 ili 1000 pfu, kako je opisano u Tabeli 24 u nastavku ovog teksta. Na D14, sakupljeni su uzorci krvi od 5 ptica po grupi za serološko testiranje korišćenjem Kit ProFLOK® plus IBD (Synbiotics Corp). Na D14, ptice (10 ptica po grupi osim za grupu 7 gde je 1 ptica uginula pre infekcije) su inficirane ukapavanjem kapi za oči (0.05 mL po ptici) u dozi od 2.5 log10 EID50.
4
Tabela 24 Dizajn studije i rezultati efikasnosti protiv IBD
[0195] Svaka grupa praćena je pre i posle izazivanja infekcije. Klinički znaci IBDV registrovani su tokom 11 dana od izazivanja infekcije (od D15 do D25). Na kraju perioda posmatranja posle izazivanja infekcije (D33), sve preživele ptice bile su eutanazirane i izvršena je nekropsija. Utvrđene su telesna težina i težina burze. Svaka Fabricijusova burza (bursa of Fabricius, BF) je izmerena i zatim zasebno stavljena u posudu sa 4% formaldehidom za histološka ispitivanja. Histološke lezije burze ocenjivane su prema skali prikazanoj u Tabeli 25.
Tabela 25 Skala ocenjivanja histoloških lezija Fabricijusove burze*
[0196] Smatralo se da su ptice obolele ako su umrle i/ili ako su pokazale jasne znake bolesti i/ili jake lezije Fabricijusove burze (tj., histološki skor ≥3).
[0197] Prosečni ELISA IBD+ titar antitela izražen kao log10 pre izazivanja infekcije prikazan je u Tabeli 24. U svim vakcinisanim grupama detektovani su značajni titri koji su bili značajno viši nego u kontrolnoj grupi G1. Serološki titar nije zavisio od doze.
[0198] Kod svih ptica iz kontrolne grupe G1 zapaženi su jaki klinički znaci posle izazivanja infekcije. Sedam od 10 ptica iz te grupe je uginulo u toku jedanaestodnevnog perioda opservacije, što ukazuje na visoku snagu infekcije. Posle izazivanja infekcije nijedna od vakcinisanih ptica nije pokazala jake kliničke znake osim 1 ptice u G4, koja je uginula. Procenti zaštite od jakih lezija burze prikazani su u gornjoj tabeli. Značajna zaštita od IBD zapažena je u svim grupama, pri čemu je najbolja zaštita zapažena u G2 i G3 (samo vHVT13). Uporedna primena vSB1-008+vHVT13 i dvostrukog vHVT304 i vHVT306 konstrukta indukovala je slične nivoe zaštite od IBD. Pri ispitivanim dozama, zaštita nije zavisila od doze. Prosečne vrednosti odnosa težina burze/telesna težina takođe su prikazane u Tabeli 24. U svim vakcinisanim grupama odnosi su bili viši nego u kontrolnoj grupi u kojoj je izazvana infekcija.
[0199] U zaključku, ovi podaci ukazuju da kombinacije vektora SB1-ND kako sa jednostrukim HVT-IBD tako i sa dvostrukim HVT koji eksprimiraju i NDV-F i IBDV-VP2 indukuju antitela i ranu zaštitu u modelu snažne infekcije virusom IBD.
Primer 14 Efikasnost jednostrukih rekombinantnih vakcina HVT-ND (vHVT114) ili SB1-ND (vSB1-007 i vSB1-009) u kombinaciji sa vHVT13 protiv infekcije veoma virulentnim izolatom IBDV kod komercijalnih brojler pilića na D23
[0200] Cilj ove studije bio je proceniti efikasnost vHVT13, kada se primenjuje uporedno sa rekombinantnim konstruktima HVT-ND (vHVT114) ili SB1-ND (vSB1-007 i vSB 1-009), protiv infekcije veoma virulentnim virusom infektivne bolesti burze (very virulent infectious bursal disease virus, vvIBDV) (91-168/980702) izazvane kod komercijalnih brojler pilića starih 23 dana.
[0201] Karakteristike ova 4 kandidata za vakcinu opisane su u Tabelama 14 i 16. Na D0, 90 brojler pilića starih jedan dan nasumično je raspoređeno u 7 grupa od po 12 ptica i 1 grupu od 6 ptica (nevakcinisana neinficirana kontrolna grupa). Na D0, pticama je supkutano injektirano u vrat, po 0.2 mL rekombinantne vakcine koja sadrži zadatu dozu od 3000 pfu, kako je opisano u Tabeli 26. Na D14, od 5 ptica po grupi sakupljeni su uzorci krvi za serološko testiranje korišćenjem Kit ProFLOK® plus IBD (Synbiotics Corp). Na D0, serum dodatnih 10 brojler pilića starih jedan dan testiran je istim kitom da bi se procenio nivo majčinskog antitela na IBDV. Na D23, ptice (10 ptica po grupi) su inficirane ukapavanjem kapi za oči (0.05 mL po ptici) izolata vvIBDV 91-168 u dozi od 4.3 log10 EID50.
[0202] Svaka grupa praćena je pre i posle izazivanja infekcije. Klinički znaci IBDV registrovani su tokom 11 dana posle izazivanja infekcije (od D23 do D33). Na kraju perioda posmatranja posle izazivanja infekcije (D33), sve preživele ptice bile su eutanazirane i nekropsirane. Utvrđene su telesna težina i težina burze. Svaka Fabricijusova burza (BF) je izmerena i zatim zasebno stavljena u posudu sa 4% formaldehidom za histološka ispitivanja. Histološke lezije burze ocenjivane su prema skali prikazanoj u Tabeli 25.
[0203] Smatralo se da su ptice obolele ako su umrle i/ili ako su pokazale jasne znake bolesti i/ili jake lezije Fabricijusove burze (tj., histološki skor ≥3).
Tabela 26 Dizajn studije i serološki rezultati
[0204] Prosečni ELISA IBD+ titar na D0 bio je 4.36±0.01 log10 što ukazuje na veoma visok nivo IBD majčinskog antitela pri izleganju. Na D23, prosečni ELISA IBD+ titar i dalje je bio visok (3.9) u kontrolnoj G1. Prosečni ELISA titri u vakcinisanim grupama nisu bili značajno različiti od onih u kontrolnoj grupi.
[0205] Posle izazivanja infekcije, ni u jednoj grupi nisu zabeleženi ni morbiditet ni mortalitet. Procenti zaštite od snažnih lezija burze prikazani su u Tabeli 26, gore. Rezultat je pokazao da uporedna primena vHVT114, vSB 1-007 ili vSB1-009 nije interferirala sa vHVT13-indukovanom zaštitom od IBD, što ukazuje na odsustvo interferencije. Slično tome, prosečni odnosi težina burze/telesna težina kod vakcinisanih grupa bili su bliski i jasno viši od onog u kontrolnoj grupi, što je ukazalo na zaštitu od IBD i odsustvo razlika između režima vakcinisanja.
[0206] U zaključku, podaci su ukazali na kompatibilnost između vHVT114, vSB1-007 ili vSB 1-009 i vHVT13 u zsštiti od IBD. Izostanak interferencije između dva vektora iz HVT u zaštiti od IBD bio je opet neočekivan i potvrdio je rezultate dobijene za zaštitu od ND (vidi primer 10),
Primer 15 Efikasnost dvostrukih rekombinantnih vakcina HVT-ND+IBD (vHVT304 i vHVT306) sa ili bez SB-1 i SB1-ND (vSB1-007 i vSB1-008) u kombinaciji sa vHVT13, protiv infekcije izolatom varijante E IBDV, kod SPF pilića na D28
[0207] Cilj ove studije bio je proceniti efikasnost dve dvostruke vakcine sa vektorima iz HVT (HVT-ND+IBD: vHVT304 i vHVT306) ili dve vSB-1-NDV u kombinaciji sa (vSB1-007+vHVT13, vSB1-008+vHVT13) pri supkutanoj (SC) primeni, kod SPF pilića starih jedan dan, inficiranih varijantom E IBDV (VAR-E) 28 dana posle vakcinisanja.
[0208] Na D0, 105 SPF pilića starih jedan dan nasumično je raspoređeno u 7 grupa od po 15 ptica, uključujući grupu inficiranih kontrola (G6) i neinficiranih kontrola (G7). Na D0, pticama iz grupa G1 do G5 je supkutano injektirano u vrat, po 0.2 mL rekombinantnih i/ili SB-1 vakcina od kojih svaka sadrži zadatu dozu od 2000 pfu. Dizajn studije prikazan je u Tabeli 27 u nastavku ovog teksta. Na D28, sve ptice iz grupa G1 do G6 inficirane su ukapavanjem kapi za oči (0.03 mL po ptici) izolata varijante E IBDV (University of Delaware, USA) u dozi od 3 log10 EID50. Svaka grupa je praćena pre i posle izazivanja infekcije. Jedanaest dana posle izazivanja infekcije, ptice su merene i nekropsirane. Burze su izolovane i izmerena im je težina. Izračunavani su odnosi težina burze/telesna težina (odnos težina burze/telesna težina X 100).
Tabela 27 Dizajn studije i rezultati IBD efikasnosti
[0209] Prosečni odnosi težina burze/telesna težina prikazani su u Tabeli 27. U poređenju sa neinficiranim pticama, inficirane kontrolne ptice imale su jaku atrofiju burze. Vakcine vSB1-007 i vSB 1-008 nisu interferirale sa zaštitom indukovanom vHVT13 (G4 i G5). Odnosi težina burze/telesna težina ptica vakcinisanih dvostrukim HVT (HVT-ND+IBD) bili su malo niži nego kod neinficirane kontrolne grupe, ali jasno viši nego kod inficirane kontrolne grupe. Pored toga, vakcina protiv Marekove bolesti iz SB-1 serotip 2 nije interferirala sa zaštitom od IBD indukovanom vHVT304.
[0210] U zaključku, ovi podaci pokazuju da obe kombinacije vektora SB1-ND sa jednostrukim HVT-IBD ili dvostrukim HVT koji eksprimiraju i NDV-F i IBDV-VP2 pružaju zaštitu od IBD u modelu infekcije varijantom E IBDV.
Primer 16 Odsustvo interferencije vHVT114, vSB1-009 i/ili SB-1 u zaštiti od varijante E IBD indukovanoj vHVT13 kod SPF pilića
[0211] Cilj ove studije bio je proceniti efikasnost vHVT13 kada se primeni SC ili in ovo istovremeno sa vHVT114, vSB 1-009 i/ili SB-1 kod SPF pilića u modelu infekcije varijantom E IBDV (VAR-E) na D28.
[0212] 75 SPF pilića starih jedan dan i 75 embriona SPF starih 18 do 19 dana nasumično se rasporede u 5 grupa (G1 do G5, odnosno G6 do G10) uključujući grupu inficiranih kontrola (G4 odnosno G9) i neinficiranih kontrola (G5, odnosno G10). Na D0, pticama iz grupa G1 do G3 supkutano je injektirano u vrat po 0.2 mL vakcina od kojih je svaka sadržala zadatu dozu od 3000 pfu, osim za SB-1 za koju je zadata doza iznosila 1000 PFU. Ptice iz G6 do G8 primile su iste doze vakcine, ali u zapremini od 0.05 mL, in ovo, 2-3 dana pre izleganja. Dizajn studije prikazan je u Tabeli 28 u nastavku ovog teksta. Dvadeset osmog dana starosti, sve ptice iz grupa G1 do G4 i G6 do G9 inficirane su ukapavanjem kapi za oči (0.03 mL po ptici) izolata varijanta E IBDV, University of Delaware (USA), u dozi od 3 log10 EID50. Svaka grupa praćena je pre i posle izazivanja infekcije. Jedanaest dana posle izazivanja infekcije, ptice su izmerene i nekropsirane. Burze su izolovane i izmerena im je težina. Izračunavani su odnosi težina burze/telesna težina (odnos težina burze/telesna težina X 100).
Tabela 28 Dizajn studije i rezultati efikasnosti protiv IBD
[0213] Prosečni odnosi težina burze/telesna težina prikazani su u Tabeli 28. Inficirane kontrolne ptice (G4 i G9) imale su jaku atrofiju burze u poređenju sa neinficiranim pticama. Odnosi težina burze/telesna težina vakcinisanih grupa (G1 do G3 i G6 do G8) bili su slični onima u neinficiranim kontrolnim grupama (G5 i G10) i znatno iznad onih u inficiranim kontrolnim grupama (G4 i G9). Odsustvo interferencije vHVT114 u zaštiti od IBD, indukovanoj vHVT13 SC ili in ovo, bilo je iznenađujuće i potvrdilo je podatke dobijene u primerima 10 i 14.
[0214] U zaključku, ovi podaci jasno pokazuju kompatibilnost vHVT114+vSB1-009 ili SB-1 i vSB 1-009 sa vHVT13 kada se primenjuju SC ili in ovo, u modelu infekcije varijantom E IBDV.
Primer 17 Efikasnost vektora vHVT114 i vHVT13 i SB1 ili vSB1-009 protiv infekcije veoma virulentnim plus (+) virusom Marekove bolesti
[0215] Cilj ove studije bio je proceniti efikasnost protiv Marekove bolesti, različitih kombinacija vakcina uključujući vHVT114, vHVT13, SB-1 i/ili vSB1-009 kada se daju SC SPF pilićima starim jedan dan, koji su 4 dana kasnije inficirani veoma virulentnim plus virusom Marekove bolesti (vv+MDV), izolat T-King.
[0216] Na D0, 100 SPF pilića starih jedan dan nasumično je raspoređeno u 5 grupa od po 20 ptica. Na D0, pticama iz grupa 1 do 3 supkutano je injektirano u vrat po 0.2 mL vakcine koja sadrži zadatu dozu od 2000 pfu za svaku vakcinu osim za SB-1 za koju je zadata doza iznosila 1000 pfu. Ptice iz grupa 4 i 5 bile su nevakcinisane i korišćene su kao lažne kontrole, inficirane (grupa 4) ili neinficirane (grupa 5). Dizajn studije prikazan je u Tabeli 29. Na D4, sve ptice iz grupa 1 do 4 bile su intraperitonealno inficirane sa 0.2 mL vv+MDV, izolat T-King.
Tabela 29 Dizajn studije i rezultati zaštite od MD
[0217] Svaka grupa praćena je na dnevnoj bazi u pogledu bilo kakvih neželjenih reakcija pre i posle izazivanja infekcije. Na dan 49, sve žive ptice su žrtvovane i nekropsirane da bi se ispitale krupne lezije udružene sa Marekovom bolešću. Pilići su klasifikovani kao pozitivni za infekciju Marekovom bolešću ako su bili zapaženi nervni simptomi kao što su paraliza, lokomotorni simptomi svojstveni bolesti, i jaka iscrpljenost ili depresija, ako je primećena smrtnost koja se direktno pripisuje Marekovoj bolesti, ili ako se prilikom nekropsije zapaze
1
makroskopske lezije. Lezije mogu uključivati, ali se ne ograničavaju na sledeće: lezije jetre, srca, slezine, gonada, bubrega i mišića.
[0218] Rezultati zaštite prikazani su u Tabeli 29, gore. Sve vakcinisane grupe (G1 do G3) ponašale su se jednako, indukujući delimičnu (65%) zaštitu od MD, što je i očekivano za ovaj model ranog izazivanja veoma jake infekcije. Ovi rezultati ukazuju na to da kandidati za vektorske vakcine zadržavaju svoju sposobnost zaštite od Marekove bolesti.
Primer 18 Efikasnost rekombinantnih vektora HVT i SB1 protiv Marekove bolesti
[0219] Efikasnost protiv Marekove bolesti pokazana je i za rekombinantne vektore iz HVT i za rekombinantne vektore iz SB-1, pojedinačne ili u kombinaciji. Za izazivanje infekcije korišćeni su sojevi virulentnog virusa Marekove bolesti (vMD) tipa GA22, veoma virulentnog virusa Marekovem bolesti (vvMD) tipa RB1B i/ili veoma virulentnog plus virusa Marekove bolesti (vv+MD) tipa T. King. Pilići stari jedan dan inokulisani su supkutano, ili su oplođenja jaja stara 18-19 dana inokulisana dozom od 0.2 ml odnosno dozom od 0.05 ml, testiranih virusa. Na pet dana starosti vakcinisani pilići i naivne kontrole inficirani su relevantnim virusom Marekove bolesti (v, vv, ili vv+ MDV). Inficirane ptice posmatrane su do sedam nedelja starosti. Sve ptice su žrtvovane i nekropsirane da bi se posmatrale makroskopski vidljive lezije udružene sa Marekovom bolešću, kako je opisano u Primeru 17.
Primer 19 Interferencija HVT sa vHVT13-indukovanim antitelima na IBDV kod komercijalnih pilića
[0220] Cilj ove studije bio je odrediti da li uporedna primena HVT i vHVT13 utiče na vHVT13-indukovani odgovor antitela na IBDV kod komercijalnih pilića.
[0221] Osamdeset braon pilića starih jedan dan korišćeno je u tri izolacione jedinice. Na uzrastu od jednog dana, od njih petnaest uzorkovana je krv da bi se ispitalo prisustvo antitela na virus IBD poreklom iz majke (maternally derived antibodies, MDA). Preostale ptice su podeljene u tri grupe, kako je pokazano u Tabeli 30. Ptice iz grupe 2 i 3 vakcinisane su SC u zadnji deo vrata komercijalnim dozama vHVT13 (VAXXITEK HVT+IBD; Merial SAS, Lyon, France) i/ili sa ćelijama udruženim HVT - BioHVT (Merial S.p.A., Noventa, Italy). Uzorkovanje krvi izvedeno je na uzrastu od 25, 35 i 45 dana. ELISA kit upotrebljen za procenu serološkog odgovora IBDV bio je PROFLOK PLUS IBD (IBD+) Ab ELISA kit, Synbiotics (Synbiotics Corp., Kansas City, MO, USA).
Tabela 30 Dizajn studije i rezultati serološke analize
2
[0222] Prosečni ELISA titri prikazani su u Tabeli 30. Titri u nevakcinisanoj grupi G1 smanjili su se od D1 do D45, što je odgovaralo padu majčinskih IBDV antitela. Kako je očekivano, ELISA titri u vHVT13 grupi G2, ostaju visoki do D45, što ukazuje da se majčinska antitela postepeno zamenjuju vHVT13-indukovanim antitelima. Dodavanje HVT u vHVT13 ima jasan negativan uticaj jer su titri antitela zapaženi u G3 bili slični onima u G1. Ovi rezultati su u suprotnosti sa rezultatima dobijenim sa vHVT114+vHVT13 jer vHVT114 nije smanjio vHVT13-indukovane IBD+ ELISA titre (vidi primer 14, Tabelu 26). Oni potvrđuju neočekivanu osobinu vHVT114 da ne interferira sa imunogenošću vHVT13.
[0223] U zaključku, nasuprot onome što je zapaženo sa vHVT114, dodavanje HVT u vHVT13 ima jasan negativan uticaj na vHVT13-indukovani humoralni imunitet na IBDV.
Primer 20 Interferencija komercijalne vakcine HVT-ND sa vHVT13-indukovanom zaštitom od IBD
[0224] Cilj ove studije bio je odrediti da li uporedna primena komercijalnih vektorskih HVT-ND vakcine sa vHVT13 utiče na vHVT13-indukovanu zaštitu od IBD, kod SPF pilića.
[0225] Sedamdeset pet SPF pilića (3 grupe (G2, G3 i G4) od po 25) vakcinisano je na uzrastu od jednog dana, SC, komercijalnom dozom vHVT13 (VAXXITEK HVT+IBD), sa ili bez komercijalne doze licencirane HVTvektorske vakcine protiv ND (vHVT-NDl i vHVT-ND2) kako je pokazano u Tabeli 31. Petnaest ptica držano je kao nevakcinisane kontrole (G1). Tri nedelje posle vakcinacije, ptice (20 pilića u G2, G3 i G4 i 10 pilića u G1) bile su inficirane sojem Ph/B1 virusa IBD (izolovan na Filipinima) u dozi od najmanje 2.0 log10 EID50 u 0.05 ml, primenjenoj preko oka. Svi pilići su posmatrani 5 dana da bi se pratila pojava kliničkih znakova ili smrti od uzroka koji se mogu pripisati infekciji virusom IBD, i posle okončanja perioda posmatranja podvrgnuti su eutanaziji na humani način da bi se izvršila nekropsija i ispitale IBD lezije, posebno lezije Fabricijusove burze. Smatralo se da su ptice zaštićene ako njihove burze nisu imale lezije tipične za IBD: atrofija burze, periburzalni edem i/ili hemoragija u tkivima burze.
Tabela 31 Dizajn studije i podaci o zaštiti od IBD
[0226] Rezultati su prikazani u Tabeli 31. Svih 10 inficiranih kontrolnih ptica pokazalo je kliničke znake i od njih 10, 8 ih je uginulo 4 ili 5 dana posle infekcije, što ukazuje na to da je infekcija izazvana IBDV bila veoma snažna. Sve su imale jake lezije burze, uključujući jaku atrofiju i hemoragična polja. Sam vHVT13 indukuje potpunu zaštitu, dok obe kombinacije sa vHVTND indukuju delimičnu kliničku zaštitu i zaštitu burze.
[0227] U zaključku, ovi rezultati jasno pokazuju da 2 komercjalne HVT-vektorske vakcine protiv ND interferiraju sa vHVT13-indukovanom zaštitom od IBD.
Primer 21 Efikasnost vSB1-004, vSB1-006, vSB1-007, vSB1-008, SB1-vektorskih ND vakcina pojedinačno, ili zajedno sa vHVT13 HVT-vektorskom IBD vakcinom, i vHVT302 i vHVT304 vakcinama protiv veštačkih infekcija sojem NDV Texas GB kod SPF pilića starih 14 i/ili 28 dana
[0228] Cilj ispitivanja bio je procena efikasnosti kombinacija različitih vektorskih vakcina protiv Marekove bolesti koje eksprimiraju gen NDV F i/ili IBDV VP2 protiv veštačke infekcije virusom Njukastl bolesti (soj Texas GB, genotip II) sprovedene kod SPF pilića starosti 14 i/ili 28 dana.
[0229] Karakteristike 6 NDV rekombinantnih vakcina kandidati koji su ispitivani u ovoj studiji opisani su u tabeli 32 ispod.
Tabela 32 Karakteristike 6 NDV rekombinantnih vakcinalnih kandidata ispitivanih u ovoj studiji
4
[0230] Na dan D0, 225 jednodnevnih SPF pilića je nasumično raspoređeno u 9 grupa od po 15 ptica (G1a do G9a veštački inficiranih na dan D14) i 6 grupa od po 15 ptica (G1b, G3b, G4b, G5b, G8b, G9b veštački inficiranih na dan D28). Ptice su primile subkutanu injekciju u vrat na dan D0 od 0.2 mL koja sadrži ciljnu dozu od 2000 pfu za rekombinantne vakcine. Plan studije prikazan je u tabeli 33 ispod. Ptice su veštački inficirane intramuskularnim putem na dan D14 ili D28 sa 4.3 odnosno 4.2 log10 EID50 (0.1 mL) velogenog soja ND Texas GB (genotip II).
Tabela 33 Rezultati efikasnosti protiv ND
[0231] Svaka grupa je posmatrana pre i posle veštačke infekcije. Klinički znaci NDV posle veštačke infekcije su zabeleženi. Jedna ptica je uginula u grupama G6 i G7 pre veštačke infekcije, čime je broj ptica smanjen sa 15 na 14 u ovim grupama.
[0232] Procenti kliničke zaštite (uključujući zaštitu od mortaliteta i morbiditeta) prikazani su u tabeli 33 gore. Potpuna osetljivost je zapažena u nevakcinisanim veštački inficiranim kontrolnim grupama G1a i G1b čime je potvrđeno da je veštačka infekcija veoma teška. Delimične zaštite u opsegu od 13.3 do 46.6% su zapažene posle veštačke infekcije na dan D14, pri čemu su najviši nivoi zaštite indukovani sa vSB1-008, vSB1-007 i vHVT304. Nivoi zaštite posle veštačke infekcije ND na dan D28 bili su mnogo viši za sve vakcinisane grupe i bili su ponovo neznatno viši od onih u grupama vakcinisanim sa vSB1-008, vSB1-007 ili vHVT304. Ovi rezultati su ukazali na to da nivoi zaštite od ND zavise od datuma veštačke infekcije i od konstrukta. Konstrukti vSB 1-008 i vSB1-007 imali su neznatno bolji učinak od vSB 1-004 i vSB 1-006, i vHVT304 je imao neznatno bolji učinak od vHVT302, što ukazuje na to da različite karakteristike konstrukata imaju ulogu u učinku vektorskih vakcina na bazi MDV.
[0233] U zaključku, rezultati ove studije pokazuju da nivoi zaštite od ND indukovane vektorima Marekove bolesti koji eksprimira gen NDV F mogu da zavise od različitih parametara uključujući vektor, lokus insercije, F gen, promotor, poli-adenilaciono mesto i uslove veštačke infekcije.
Primer 22 Efikasnost dvostrukog HVT-ND+IBD vHVT304 i vHVT306 vakcina protiv veštačkih infekcija sojem NDV Texas GB kod SPF pilića starih 14 i/ili 28 dana
[0234] Cilj ispitivanja bio je procena efikasnosti HVT-vektorskih vakcina koje eksprimiraju gene NDV F i IBDV VP2 protiv veštačke infekcije virusom Njukastl bolesti (soj Texas GB, genotip II) sprovedene kod SPF pilića starih14 i/ili 28 dana.
[0235] Karakteristike 2 rekombinantna vakcinalna kandidata koji su ispitivani u ovoj studiji opisane su u tabeli 34 ispod.
Tabela 34 Karakteristike rekombinantnih vakcinalnih kandidata upotrebljenih u ovoj studiji
[0236] Na dan D0, 90 jednodnevnih SPF pilića je nasumično raspoređeno u 3 grupe od po 15 ptica (G1a do G3a veštački inficiranih na dan D14) i 3 grupe od po 15 ptica (G1b do G3b veštački inficiranih na dan D28). Ptice su primile subkutanu injekciju u vrat na dan D0 od 0.2 mL, koja sadrži ciljnu dozu od 2000 pfu za rekombinantne vakcine. Plan studije prikazan je u tabeli 35 ispod. Ptice su veštački inficirane intramuskularnim putem na dan D14 ili D28 ciljnom dozom od 4.0 log10 EID50 (0.1 mL) velogenog soja ND Texas GB (genotip II).
Tabela 35 Rezultati efikasnosti protiv ND
[0237] Svaka grupa je posmatrana pre i posle veštačke infekcije. Klinički znaci NDV posle veštačke infekcije su zabeleženi. Jedna ptica je uginula u grupi G2b pre veštačke infekcije čime je broj ptica smanjen sa 15 na 14 u ovoj grupi.
[0238] Procenti kliničke zaštite (uključujući zaštitu od mortaliteta i morbiditeta) prikazani su u tabeli 35 iznad. potpuna osetljivost je zapažena u nevakcinisanim veštački inficiranim kontrolnim grupama G1a i G1b čime je potvrđeno da je veštačka infekcija veoma teška. Nivoi zaštite posle veštačke infekcije na dan D14 bili su mnogo niži od onih dobijenih posle veštačke infekcije na dan D28. Ovi vakcinalni kandidati imali su istu ekspresionu kasetu NDV F insertovanu u 2 različita lokusa genoma vHVT13. Imali su podjednak učinak u smislu zaštite od ND u ispitivanim uslovima, što ukazuje na to da su oba inserciona lokusa (IG2 i SORF3-US2) podjednako pogodna za inserciju kasete NDV F.
[0239] U zaključku, rezultati ove studije pokazali su da nivoi zaštite od ND indukovane vektorima Marekove bolesti koji eksprimiraju gen NDV F zavise od različitih parametara uključujući vektor, lokus insercije, F gen, promotor, poli-adenilaciono mesto i uslove veštačke infekcije.
Primer 23 Rana efikasnost protiv ND indukovana dvostrukim HVT-ND+IBD (vHVT302, vHVT303 i vHVT304) ili SB1-vektorima (vSB1-006 i vSB1-007) kod jednodnevnih SPF pilića protiv veštačke infekcije NDV velogenim genotipom V
[0240] Cilj ispitivanja je bio procena efikasnosti tri dvostruka HVT-ND+IBD (vHVT302, vHVT303 i vHVT304) i dva SB1-ND vektora (vSB1-006 i vSB1-007) kod jednodnevnih SPF pilića protiv veštačke infekcije NDV velogenim genotipom V (Chimalhuacan) sprovedene na dan D14.
[0241] Karakteristike 5 rekombinantnih vakcinalnih kandidata ispitivanih u ovoj studiji opisane su u tabeli 36 ispod.
Tabela 36 Karakteristike rekombinantnih vakcinalnih kandidata upotrebljenih u ovoj studiji
[0242] Nasumično je obrazovano šest grupa (1 i 2) od po deset jednodnevnih belih pilića Leghorn bez specifičnih patogena (SPF). Ptice iz grupa 2 do 6 su vakcinisane subkutanim putem (potiljak) ciljnom dozom od 2000 PFU kao što je prikazano u tabeli 37 ispod. Pilići iz grupe 1 nisu vakcinisani i zadržani su kao kontrolne ptice. Sa 2 nedelje starosti, sve ptice su veštački inficirane velogenim sojem NDV genotip V Mexican Chimalhuacan (Mex V). Veštačka infekcija je izvedena intramuskularnim (IM) putem upotrebom 10<5>doza koje inficiraju 50% jaja (EID50) razblaženih u 0.2 ml fiziološke sterilne vode. Sve ptice su posmatrane do 14 dana posle veštačke infekcije. Posle veštačke infekcije, zdravstveni status svake ptice je ocenjivan dnevno kao što sledi: zdrava / sa specifičnim simptomima (raščupano perje, ispruženost, iskrivljenost vrata, tremor) / mrtva. Svaka ptica koja je pokazala specifične simptome tokom više od 2 dana ili je zapaženo da je bolesna na dan D28 uzeta je u obračun morbiditeta.
Tabela 37 Rezultati rane zaštite od ND indukovane različitim MDV vektorskim kandidatima koji eksprimiraju gen NDV F kod jednodnevnih SPF pilića
[0243] Rezultati zaštite su rezimirani u tabeli 37. Sve kontrolne ptice su uginule posle veštačke infekcije ND. Različiti nivoi zaštite od ND indukovani različitim ispitivanim vakcinama nalaze se u opsegu od 10% do 80% i od 0% i 60% u smislu zaštite od mortaliteta i morbiditeta, respektivno. Kandidat vHVT304 je indukovao bolju zaštitu od kandidata vHVT303 i vHVT302; ovo može da bude posledica egzogenog promotora SV40 smeštenog ispred gena NDV F. Učinak vSB1-007 bio je neznatno bolji od vSB 1-006. Osim toga, učinak dobijen sa vHVT304 bio je uporediv sa onim dobijenim sa vSB1-007 što ukazuje na to da različiti vektori Marekove bolesti mogu da dostignu isti nivo zaštite od ND.
[0244] U zaključku, ova studija pokazuje da oba dvostruka HVT-ND+IBD i SB1-ND vektorske vakcine mogu da dostignu značajne nivoe zaštite od ND u veoma ozbiljnom ranom modelu veštačke infekcije NDV.
Primer 24 Efikasnost protiv ND indukovana dvostrukim HVT-ND+IBD vHVT306 primenjenim in ovo ili SC putem kod jednodnevnih SPF pilića pri veštačkoj infekciji NDV velogenim genotipom V sprovedenoj na dan D28
[0245] Cilj ispitivanja je bio da se proceni efikasnost jednog dvostrukog HVT-ND+IBD (vHVT306) primenjenog in ovo ili SC putem kod SPF pilića protiv veštačke infekcije NDV velogenim genotipom V (Chimalhuacan) sprovedene u uzrastu od 28 dana.
[0246] Karakteristike rekombinantnog vakcinalnog kandidata vHVT306 ispitanog u ovoj studiji opisane su u tabeli 38 ispod. Pojedinačna HVT-IBD vektorska vakcina vHVT13 korišćena je kao kontrola.
Tabela 38 Karakteristike rekombinantnog vakcinalnog kandidata upotrebljenog u ovoj studiji
[0247] Na dan 3, 40 SPF embrionisanih jaja starosti oko 18 dana i 18 časova inkubacije nasumično je raspoređeno u 2 grupe od po 20 jaja svaka. Na dan D0, dodata je jedna grupa 12 dana starih SPF pilića. Definicija grupa je data u tabeli 39 ispod. Vakcinacija je izvedena na dan D-3 (in ovo putem) ili na dan D0 (SC putem, u zadnji deo vrata) i ciljna doza vHVT306 i vHVT13 bila je 2000PFU/ptici. Za in ovo put primene, praćen je procenat izleganja, vijabilnost (do D28) i rast ptica (između izleganja i D28).
[0248] Na dan D28, 10 ptica po grupi je veštački inficirano virulentnim ND sojem Chimalhuacan. Veštačka infekcija je izvedena intramuskularnim (IM) putem upotrebom 10<5>doza koje inficiraju 50% jaja (EID50) razblaženih u 0.2 ml fiziološke sterilne vode. Ptice su posmatrane do 14 dana posle veštačke infekcije. Zabeleženi su specifični klinički znaci i mortalitet. Svaka ptica koja je pokazala specifične simptome tokom više od 2 dana ili primećeno da je bolesna na dan D42 uzeta je u obračun za izračunavanje morbiditeta. Pet i sedam dana posle veštačke infekcije (tj. na dan D33 i D35), uzet je orofaringealni bris od svake preživele ptice. Svi brisevi su analizirani metodom qRT-PCR specifičnom za NDV.
Tabela 39 Rezultati zaštita od ND indukovane vektorskim kandidatom vHVT306 MDV koji eksprimira gene NDV F i IBDV VP2 primenjenim SC ili in ovo putem kod SPF pilića
[0249] Potpuno izleganje je zabeleženo posle in ovo vakcinacije u grupama 1 i 2 i sve ptice koje su se izlegle su preživele do dana D28. Nije detektovana razlika u telesnim težinama između dve grupe na dane D0 i D28 što potvrđuje izvrsnu bezbednost vHVT306 kada se primeni in ovo. Rezultati zaštite su rezimirani u tabeli 39. Sve kontrolne ptice vakcinisane sa vHVT13 uginule su do 4 dana posle veštačke infekcije ND. Potpuna klinička zaštita od ND bila je indukovana sa vHVT306 primenjenim na oba načina primene. Osim toga, izlučivanje virusa nije detektovano posle in ovo primene, dok je samo nekoliko ptica izlučivalo detektabilnu količinu virusa veštačke infekcije posle SC primene.
1
[0250] U zaključku, ova studija je pokazala da dvostruki HVT-ND+IBD vHVT306 indukuje odličan nivo zaštite od ND putem SC ili in ovo primene u modelu veoma ozbiljne heterologe veštačke infekcije NDV.
Primer 25 Efikasnost rekombinantnih vakcina na bazi dvostrukog HVT-ND+IBD (vHVT302, vHVT303 i vHVT304), protiv veštačke infekcije izazvane klasičnim izolatom IBDV na dan D15 kod SPF pilića
[0251] Cilj ispitivanja bio je procena rane efikasnosti protiv IBD dvostrukih HVT rekombinanata rekombinantnih konstrukata vHVT302, vHVT303 i vHVT304 pri veštačkoj infekciji virusom virulentne infektivne burzalne bolesti (vIBDV) (soj Faragher 52/70) sprovedenoj kod SPF pilića starosti15 dana.
[0252] Karakteristike 3 dvostruka HVT-ND+IBD rekombinantna vakcinalna kandidata koji su ispitivani u ovoj studiji opisane su u tabeli 40 ispod.
Tabela 40 Karakteristike ekspresionih kaseta dvostrukih HVT rekombinanata
[0253] Na dan D0, 40 jednodnevnih SPF pilića je nasumično raspoređeno u 4 grupe od po 10 ptica uključujući jednu kontrolnu grupu (G1) koja je vakcinisana vektorom vSB 1-004, a SB-1 koji eksprimira gen NDV F. Pet drugih SPF ptica je zadržano nevakcinisano i one nisu veštački inficirane za procenu težina burza/telo. Ptice su primile subkutanu injekciju u vrat na dan D0 od 0.2 mL rekombinantnih vakcina koje sadrže ciljnu dozu od 2000 pfu kao što je opisano u tabeli 41 ispod. Na dan D15, sakupljeni su uzorci krvi svih ptica po grupi (10 ptica po grupi osim za grupe 1 i 3 u kojima je 1 ptica uginula pre uzimanja uzorka krvi) za serološka ispitivanja pomoću kompleta Kit ProFLOK® plus IBD (Synbiotics Corp). Na dan
2
D15, ptice iz sve 4 grupe su veštački inficirane kapanjem u oko (0.05 mL po ptici) sa 2.5 log10 EID50.
Tabela 41 Plan studije i rezultati efikasnosti protiv IBD
[0254] Svaka grupa je posmatrana pre i posle veštačke infekcije. Klinički znaci IBDV su beleženi tokom 11 dana posle veštačke infekcije (od D15 do D25). Na kraju perioda posmatranja posle veštačke infekcije (D25), sve preživele ptice su eutanizirane i urađena je nekropsija. Težine tela i burze su zabeležene. Svaka Fabricijusova burza (BF) je izmerena, a zatim pojedinačno skladištena u 4% formaldehidu za histologiju. Histološka oštećenja burze su ocenjivana prema skali predstavljenoj u tabeli 42.
[0255] Ptica je smatrana pogođenom ako je uginula i/ili je pokazala očigledan znak bolesti i/ili ozbiljna oštećenja Fabricijusove burze (tj., histološku ocenu ≥3).
[0256] Srednji ELISA IBD+ titar antitela izražen u log 10 pre veštačke infekcije prikazan je u tabeli 41. Značajni titrovi koji su detektovani kod svih vakcinisanih grupa, bili su značajno viši od onih u kontrolnoj grupi G1. Serološki titar bio je neznatno viši u G3 (vHVT303).
[0257] Ozbiljni klinički znaci su zapaženi posle veštačke infekcije kod svih 9 ptica kontrolne grupe G1, što je vodilo uginuću 1 ptice. Samo jedna vakcinisana ptica u G2 (vHVT302) pokazala je kliničke znake posle veštačke infekcije. Procenti zaštite od ozbiljnih oštećenja burze prikazani su u tabeli 41 iznad. Značajna zaštita od IBD je zapažena u svim vakcinisanim grupama, pri čemu je potpuna zaštita primećena u G3 (vHVT303). Srednji težinski odnosi burza/telo su takođe prikazani u tabeli 41. Odnosi u svim vakcinisanim grupama bili su viši od onih u veštački inficiranoj kontrolnoj grupi G1 i nisu bili značajno drugačiji od nevakcinisane i kontrolne grupe koja nije veštački inficirana.
4
[0258] U zaključku, ovi podaci pokazuju da su tri dvostruka konstrukta HVT-IBD+ND ispitivana u ovoj studiji indukovala IBD antitela i ranu zaštitu od IBD u modelu ozbiljne veštačke infekcije IBDV.
Primer 26 Efikasnost pet različitih HVT-ND vakcinalnih kandidata protiv veštačkih infekcija velogenim NDV izolatom ZJ1 (genotip VIId) kod SPF pilića starih 14 dana
[0259] Cilj ispitivanja bio je procena efikasnosti 5 pojedinačnih HVT rekombinantnih konstrukata (vHVT39, vHVT110, vHVT111, vHVT112 i vHVT113) koji eksprimiraju gen NDV F protiv veštačke infekcije virusom Njukastl bolesti velogenim NDV izolatom ZJ1 (genotip VIId) sprovedene kod SPF pilića starosti 14 dana.
[0260] Karakteristike ovih 5 vakcinalnih kandidata opisane su u tabeli 43 ispod.
Tabela 43 Karakteristike rekombinantnih virusa HVT-ND upotrebljenih u studiji veštačke infekcije
[0261] Na dan D0, 72 jednodnevnih SPF pilića je nasumično raspoređeno u 5 grupa od po 12 ptica (vakcinisane) i 1 grupu od 12 ptica (nevakcinisane kontrole). Ptice su primile subkutanu injekciju u vrat na dan D0 od 0.2 mL rekombinantnih vakcina koje sadrže ciljnu dozu od 6000 pfu kao što je opisano u tabeli 44 ispod. Ptice su veštački inficirane intramuskularnim putem na dan D14 sa 5 log 10 EID50 velogenog NDV soja ZJ1/2000 (genotip VIId).
Tabela 44 Rezultati efikasnosti protiv ND
[0262] Svaka grupa je posmatrana pre i posle veštačke infekcije. Klinički znaci NDV i mortalitet su zabeleženi posle veštačke infekcije. Orofaringealni brisevi su uzeti na 2 i 4 dana posle infekcije (dpi) za procenu virusnog opterećenja metodom RT-PCR u realnom vremenu upotrebom postupka opisanog kod Wise et al. (2004; Development of a Real-Time Reverse-Transcription PCR for Detection of Newcastle Disease Virus RNA in Clinical Samples. J Clin Microbiol 42, 329-338).
[0263] Procenti zaštite od mortaliteta i morbiditeta prikazani su u tabeli 44 gore. Potpuna osetljivost je zapažena kod nevakcinisane veštački inficirane kontrolne grupe G1 čime je potvrđeno da je veštačka infekcija veoma teška. Vakcine su indukovale različite nivoe zaštite od mortaliteta (25-100%) ili od morbiditeta (8%-83%). Najbolji nivo zaštite indukovan je sa vHVT110, dok je najniži indukovan sa vHVT039, pri čemu su ostali kandidati dali intermedijarne rezultate. Rezultati orofaringealnog izlučivanja na 2 i 4 dpi su takođe prikazani u tabeli 44 gore i su u skladu sa onima za kliničku zaštitu. Ovi vakcinalni kandidati razlikuju se po svojoj promotorskoj sekvenci i sekvenci F gena. Ovi rezultati pokazuju da su oba ova parametra značajna za konstruisanje optimalnog vakcinalnog kandidata HVT-ND.
[0264] U zaključku, rezultati ove studije pokazuju značaj sekvence promotora i F gena u efikasnosti protiv ND indukovanoj HVT-vektorskim vakcinalnim kandidatima za ND.
Primer 27 Procena efikasnosti protiv Njukastl bolesti indukovane dvostrukim SB1 konstruktima koji eksprimiraju IBDV VP2 i NDV F
[0265] Cilj ispitivanja je procena efikasnosti dvostrukih SB1 konstrukata koji eksprimiraju IBDV VP2 i NDV F protiv veštačke infekcije virusom Njukastl bolesti.
[0266] Na dan D0, jednodnevni SPF pilići su nasumično raspoređeni u nekoliko grupa od po 10-20 ptica, uključujući vakcinisane i nevakcinisane grupe. Ptice iz vakcinisanih grupa su primile subkutanu injekciju u vrat na dan D0 od 0.2 mL koja sadrži ciljnu dozu od 1000 do 5000 pfu rekombinantnih vakcina. Alternativno, ista doza u 0.05 mL može da se primeni in ovo 2 ili 3 dana pre izleganja. Ptice (najmanje jedna vakcinisana i jedna nevakcinisana grupa) su veštački inficirane intramuskularnim putem u različito vreme posle vakcinacije: na primer, D14, D28 ili D42 sa oko 4.0 log10 EID50 (0.1 mL) velogenog soja NDV kao što je soj Texas GB (genotip II), ZJ1 (genotip VIId), Chimalhuacan (genotip V).
[0267] Svaka grupa je praćena klinički pre i posle veštačke infekcije. Klinički znaci NDV (morbiditet) i mortalitet su zabeleženi posle veštačke infekcije. Izračunati su procenti kliničke zaštite u svim grupama. Najmanje 90% nevakcinisanih veštački inficiranih SPF ptica treba da ugine ili da bude ozbiljno bolesno posle veštačke infekcije da bi se potvrdila ozbiljnost veštačke infekcije. Orofaringealni i brisevi kloake mogu da se uzorkuju u različita vremena posle veštačke infekcije kao što je 3, 5, 7 i 9 dana posle veštačke infekcije i virusno opterećenje može da se proceni metodom RT-PCR u realnom vremenu. Najbolji kandidati će biti oni koji su indukovali najviši nivo kliničke zaštite i najniži nivo virusnog opterećenja u brisevima. Slična studija može da se sprovede kod brojlera koji imaju majčinska NDV antitela; međutim, ova majčinska antitela mogu potencijalno da zaštite nevakcinisane ptice ako se veštačka infekcija sprovede rano. Dvostruki SB1 konstrukt može takođe da se ispita u kombinaciji sa drugim vakcinama protiv Marekove bolesti ili vektorskim vakcinama.
Primer 28 Procena efikasnosti protiv infektivne burzalne bolesti indukovane dvostrukim SB1 konstruktima koji eksprimiraju IBDV VP2 i NDV F
[0268] Cilj ispitivanja je procena efikasnosti protiv IBD dvostrukog SB1 koji eksprimira i IBDV VP2 i NDV F.
[0269] Jednodnevni SPF pilići su nasumično raspoređeni u nekoliko grupa od po 10 do 20 ptica uključujući vakcinisane i nevakcinisane kontrole. Nevakcinisane kontrole će biti razdvojene na 2 podgrupe uključujući veštački inficirane i ptice koje nisu veštački inficirane. Ptice iz vakcinisanih grupa su primile subkutanu injekciju u vrat na dan D0 od 0.2 mL vakcina od kojih svaka sadrži ciljnu dozu od 1000 do 5000 pfu. Alternativno, ista doza u 0.05 mL može da se primeni in ovo 2 ili 3 dana pre izleganja. U različita vremena posle vakcinacije, kao što je 14, 21, 28 ili 42 dana posle vakcinacije, sve ptice iz vakcinisanih grupa i veštački inficirane kontrole su veštački inficirane kapanjem u oko (0.03 mL koji sadrži 2 do 4 log 10 EID50 po ptici) virulentnog IBDV (kao što je soj Faragher ili SAD standardni soj), veoma virulentnim IBDV kao što je izolat 91-168 ili varijantom izolata IBDV kao što je izolat SAD Delaver varijanta E. Svaka grupa je klinički praćena pre i posle veštačke infekcije. Pticama može da se uradi nekropsija 4 ili 5 dana posle veštačke infekcije za procenu krupnih oštećenja burze. Nekropsija može da bude urađen i 10 do 11 dana posle veštačke infekcije. Mogu da budu procenjena velika i/ili histološka oštećenja. Osim toga, ptice i burza se mere i težinski odnosi burza/telo (odnos težina burze/težina tela X 100) se izračunavaju u poređenju sa onima kod nevakcinisane grupe koja nije veštački inficirana. Kontrolne SPF veštački inficirane ptice moraju da pokažu kliničke znake i/ili da imaju značajne velika i/ili histološka oštećenja, i/ili da imaju težinski odnos burza/telo značajno niži nego kod vakcinisanih kontrolnih ptica koje nisu veštački inficirane da bi se potvrdila težina veštačke infekcije. Efikasnost vakcine se procenjuje poređenjem ovih parametara sa nevakcinisanim/veštački inficiranim i nevakcinisanim/veštački neinficiranim grupama. Takva studija može da se sprovede na brojlerima koji imaju majčinska IBDV antitela; međutim ova majčinska antitela mogu potencijalno da zaštite nevakcinisane ptice ako se veštačka infekcija sprovede rano. Dvostruki SB1 konstrukt može takođe da se ispita u kombinaciji sa drugim vakcinama protiv Marekove bolesti ili vektorskim vakcinama.
Primer 29 Procena efikasnosti protiv Marekove bolesti indukovane dvostrukim SB1 konstruktima koji eksprimiraju IBDV VP2 i NDV F
[0270] Cilj ispitivanja je procena efikasnosti protiv Marekove bolesti indukovane vektorima SB1 koji eksprimiraju i IBDV VP2 i NDVF.
[0271] Jednodnevni SPF pilići su nasumično raspoređeni u nekoliko grupa od po 20 do 50 ptica uključujući vakcinisane i nevakcinisane kontrole. Nevakcinisane kontrole mogu da budu razdvojene na 2 podgrupe uključujući veštački inficirane i ptice koje nisu veštački inficirane. Ptice iz vakcinisanih grupa su primile subkutanu injekciju u vrat na dan D0 od 0.2 mL vakcina od kojih svaka sadrži ciljnu dozu od 1000 do 5000 pfu. Alternativno, ista doza u 0.05 mL može da se primeni in ovo 2 ili 3 dana pre izleganja. U različita vremena posle vakcinacije, kao što je 3 do 10 dana posle vakcinacije, sve ptice iz vakcinisanih grupa i veštački inficirane kontrole su veštački inficirane intraperitonealnim putem sa 0.2 mL soja virusa Marekove bolesti (MDV). Soj MDV može da bude različitih pato-tipova kao što je virulentni MDV (vMDV) uključujući izolat JM ili GA22, veoma virulentni MDV (vvMDV) kao što je izolat RB-1B ili Md5, veoma virulentni plus (vv+MDV) kao što je izolat T-King ili 648A. Inokulum soja za veštačku infekciju MDV se priprema inficiranjem pilića, sakupljanjem i zamrzavanjem njihovih krvnih ćelija u tečnom azotu u prisustvu kriokonzervansa kao što je DMSO. Doza koja inficira 50% pilića (CID50) se uspostavlja za svaku seriju virusa za veštačku infekciju pre sprovođenja studija vakcinacije/veštačke infekcije. Svaka grupa se klinički posmatra pre i posle veštačke infekcije. Na pticama se izvodi nekropsija posle najmanje 7 nedelja posle vakcinacije i prisustvo velikih oštećenja Marekove bolesti se proverava kod svake ptice. Oštećenja mogu da uključuju, ali nisu ograničena na sledeće: oštećenja jetre, srca, slezine, gonada, bubrega, nerava i mišića. Ovakva studija može da se sprovede kod brojlera koji imaju majčinska MDV antitela. Dvostruki SB1 konstrukt može da se ispita i u kombinaciji sa drugim vakcinama protiv Marekove bolesti (na primer HVT i ili CVI988 Rispens sojevi) ili vektorskim vakcinama za MD. Veštačka infekcija MD može takođe da se izvede kontaktom između vakcinisanih ptica i nevakcinisanih SPF pilića inficiranih sa MDV.
1
2
4
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
11
11
11
11
11
11
11
12
12
12
12
12
12
12
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
14
14
14
14
14
14
14
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
21
21
21
21
21
21
21
22

Claims (5)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Kompozicija ili vakcina, naznačena time, što sadrži
prvi rekombinantni HVT (herpesvirus ćuraka) vektor koji uključuje heterologni polinukleotid koji kodira i eksprimira F antigen virusa Newcastle bolesti (NDV-F), operabilno vezan za SV40 promotor i SV40 poliA signal, i gde su, pored toga, polinukleotid koji kodira NDV-F polipeptid, operabilno vezani SV40 promotor i SV40 poliA signal insertovani u lokus "intergensko mesto 1" (IG1) HVT genoma, i gde, pored toga, polinukleotid koji kodira i eksprimira NDV-F ima sekvencu kako je navedeno u SEQ ID NO: 1; i drugi rekombinantni HVT vektor koji uključuje heterologni polinukleotid koji kodira i eksprimira VP2 antigen virusa infektivne bolesti burze (IBDV), pri čemu je drugi rekombinantni HVT vektor vHVT13.
2. Kompozicija ili vakcina iz patentnog zahteva 1, naznačena time, što kompozicija uključuje još i jedan ili više rekombinantnih vektora SB1, pri čemu se vektor SB1 bira iz grupe koju čine vSB1-009 koji uključuje promotor SV40 i kodon-optimizovani polinukleotid koji kodira NDV-F antigen iz genotipa CA02 insertovane u UL44 lokus genoma SB1; vSB1-010 koji uključuje CMV promotor zamorca i polinukleotid koji kodira NDV-F antigen iz genotipa VIId insertovane u SORF4-US2 lokus genoma SB1; vSB1-004 koji uključuje mCMV IE promotor i polinukleotid koji kodira NDV-F antigen iz genotipa VIId insertovane u US 10 lokus genoma SB1; vSB1-006 koji uključuje SV40 promotor i kodon-optimizovani polinukleotid koji kodira NDV-F antigen iz genotipa VIId insertovane u UL55/LORF5 lokus genoma SB1; vSB1-007 koji uključuje SV40 promotor i kodon-optimizovani polinukleotid koji kodira NDV-F antigen iz genotipa VIId insertovane u UL44 lokus genoma SB1, i vSB1-008 koji uključuje SV40 promotor i kodon-optimizovani polinukleotid koji kodira NDV-F antigen iz genotipa CA02 insertovane u UL55/LORF5 lokus genoma SB1.
3. Kompozicija ili vakcina iz patentnog zahteva 1 ili 2 za upotrebu u metodu vakcinisanja životinje, pri čemu pomenuti metod uključuje najmanje jednu primenu kompozicije ili vakcine.
4. Kompozicija ili vakcina iz patentnog zahteva 1 ili 2 za upotrebu u metodu indukovanja zaštitnog odgovora kod životinje protiv virusa Newcastle bolesti (NDV), virusa
22
infektivne bolesti burze (tj., IBDV ili virusa Gumboro bolesti) i virusa Marekove bolesti (MDV), pri čemu pomenuti metod uključuje najmanje jednu primenu kompozicije ili vakcine.
5. Kompozicija ili vakcina za upotrebu prema patentnom zahtevu 3 ili 4, naznačena time, što je životinja ptica.
RS20200111A 2011-11-30 2012-11-29 Rekombinantni hvt vektori koji eksprimiraju antigene patogena ptica i njihove upotrebe RS59892B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161564877P 2011-11-30 2011-11-30
US201261694957P 2012-08-30 2012-08-30
PCT/US2012/067135 WO2013082327A1 (en) 2011-11-30 2012-11-29 Recombinant hvt vectors expressing antigens of avian pathogens and uses thereof
EP12801680.5A EP2785373B1 (en) 2011-11-30 2012-11-29 Recombinant hvt vectors expressing antigens of avian pathogens and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS59892B1 true RS59892B1 (sr) 2020-03-31

Family

ID=47358292

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200111A RS59892B1 (sr) 2011-11-30 2012-11-29 Rekombinantni hvt vektori koji eksprimiraju antigene patogena ptica i njihove upotrebe
RS20190443A RS58610B1 (sr) 2011-11-30 2012-11-29 Rekombinantni vektori gallid herpesvirusa 3 (mdv serotip 2) koji eksprimiraju antigene ptičjih pathogena i njihove upotrebe
RS20200113A RS59893B1 (sr) 2011-11-30 2012-11-29 Rekombinantni hvt vektori koji eksprimiraju antigene patogena ptica i njihove upotrebe

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20190443A RS58610B1 (sr) 2011-11-30 2012-11-29 Rekombinantni vektori gallid herpesvirusa 3 (mdv serotip 2) koji eksprimiraju antigene ptičjih pathogena i njihove upotrebe
RS20200113A RS59893B1 (sr) 2011-11-30 2012-11-29 Rekombinantni hvt vektori koji eksprimiraju antigene patogena ptica i njihove upotrebe

Country Status (29)

Country Link
EP (7) EP3251691B1 (sr)
JP (1) JP6149301B2 (sr)
KR (1) KR102013135B1 (sr)
CN (3) CN105920598A (sr)
AR (2) AR090401A1 (sr)
BR (1) BR112014013276B1 (sr)
CA (1) CA2857025C (sr)
CO (1) CO7061033A2 (sr)
CY (3) CY1121528T1 (sr)
DK (3) DK2785374T3 (sr)
ES (3) ES2785045T3 (sr)
HK (1) HK1248566A1 (sr)
HR (3) HRP20192241T1 (sr)
HU (3) HUE042471T2 (sr)
IN (1) IN2014CN04833A (sr)
LT (3) LT3251691T (sr)
ME (1) ME03433B (sr)
MX (2) MX365984B (sr)
PE (1) PE20141482A1 (sr)
PH (2) PH12014501174A1 (sr)
PL (3) PL2785373T3 (sr)
PT (3) PT2785373T (sr)
RS (3) RS59892B1 (sr)
RU (1) RU2620936C2 (sr)
SI (3) SI2785374T1 (sr)
SM (3) SMT201900188T1 (sr)
UA (1) UA118651C2 (sr)
WO (2) WO2013082327A1 (sr)
ZA (1) ZA201403804B (sr)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6134324B2 (ja) 2011-10-21 2017-05-24 インターベット インターナショナル ベー． フェー． 感染性喉頭気管炎ウイルスおよびニューカッスル病ウイルス抗原をコードする組換え非病原性マレック病ウイルス構築物
CN105920598A (zh) 2011-11-30 2016-09-07 梅里亚有限公司 表达禽类病原体的抗原的重组hvt载体及其用途
EP2644702A1 (en) 2012-03-30 2013-10-02 Ceva Sante Animale Multivalent recombinant avian herpes virus and vaccine for immunizing avian species
AR097029A1 (es) * 2013-07-26 2016-02-17 Intervet Int Bv Aceleración de la respuesta inmune inducida por virus vectorial en aves, composición, uso, método para la vacunación y método para acelerar la respuesta inmune
EP2845904A1 (en) * 2013-09-06 2015-03-11 Ceva Sante Animale Recombinant Marek's disease viruses and uses thereof
AR103245A1 (es) * 2014-12-24 2017-04-26 Intervet Int Bv Vacuna vectorial basada en hvt (herpes virus de los pavos) frente a nd (enfermedad de newcastle) - ibd (enfermedad de gumboro) mejorada
HK1257191A1 (zh) * 2015-08-10 2019-10-18 The Texas A&M University System 重组火鸡疱疹病毒疫苗及其用途
BR112018076021A2 (pt) 2016-06-17 2019-04-02 Intervet International B.V. constructos de vírus não patogênicos recombinantes da doença de marek que codificam os antígenos do vírus da laringotraqueíte infecciosa e do vírus da doença infecciosa bursal
JOP20190088A1 (ar) * 2016-10-21 2019-04-21 Us Agriculture نواقل مؤتلفة للتعبير عن مولدات مضاد فيروس انفلونزا الطيور و استخداماتها
HUE060926T2 (hu) 2016-12-14 2023-04-28 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc Madárpatogének több antigénjét expresszáló, rekombináns HVT-vektorok és azokat tartalmazó vakcinák
CN106929483B (zh) * 2017-01-19 2020-09-25 北京邦卓生物科技有限公司 表达鸡新城疫病毒f基因的重组火鸡疱疹病毒的构建及其应用
CN106701693A (zh) * 2017-01-19 2017-05-24 北京邦卓生物科技有限公司 表达血清ⅰ型马立克氏病病毒gb基因的重组火鸡疱疹病毒的构建及其应用
EP3391903B1 (en) * 2017-04-21 2022-02-23 The Pirbright Institute Recombinant gallid herpesvirus 3 vaccines encoding heterologous avian pathogen antigens
CN107099513B (zh) * 2017-06-22 2020-07-14 北京邦卓生物科技有限公司 一种共表达ndv hn和ibdv vp2基因的hvt的构建及其应用
CN107254450A (zh) * 2017-07-20 2017-10-17 扬州大学 克服鸡新城疫母源抗体影响的嵌合新城疫病毒疫苗载体候选株及构建方法
CN107603958A (zh) * 2017-09-29 2018-01-19 天津农学院 融合表达TM‑1基因和gD基因重组腺病毒的构建方法及重组腺病毒和应用
MX2020003591A (es) * 2017-10-12 2020-07-22 Intervet Int Bv Constructos del virus recombinante no patogenico de la enfermedad de marek que codifica multiples antigenos heterologos.
MX2020006343A (es) 2017-12-20 2020-09-03 Intervet Int Bv Diluyente mejorado para vacuna de herpesvirus alfa asociado con celulas.
CN108543067A (zh) * 2017-12-25 2018-09-18 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 共表达h5亚型禽流感ha蛋白和传染性法氏囊vp2蛋白的重组火鸡疱疹病毒疫苗株
WO2019147869A2 (en) * 2018-01-24 2019-08-01 Virogin Biotech Canada Ltd Recombinant viral vaccines
CN109468315B (zh) * 2018-12-07 2021-09-07 袁隆平农业高科技股份有限公司 水稻耐淹基因Sub1共显性分子标记及应用
KR20210108971A (ko) * 2018-12-21 2021-09-03 세바 상뜨 아니말르 다수의 외래 유전자를 함유하는 재조합 조류 헤르페스 바이러스
JP2022547975A (ja) 2019-09-11 2022-11-16 ゾエティス・サービシーズ・エルエルシー 鳥病原体の抗原を発現する組換えシチメンチョウヘルペスウイルスベクターおよびそれらの使用
CN110872578B (zh) * 2019-11-29 2022-09-16 扬州优邦生物药品有限公司 一株变异株传染性法氏囊病毒、亚单位疫苗及其制备方法和应用
US20230031097A1 (en) * 2019-12-20 2023-02-02 Intervet Inc. Multivalent hvt vector vaccine
US11299517B2 (en) * 2020-04-15 2022-04-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Recombinant vaccine against Marek's disease and Newcastle disease
EP4168043A1 (en) 2020-06-17 2023-04-26 Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH Recombinant hvt vectors expressing influenza hemagglutinin and immunogenic compositions, and production and uses thereof
CN112206317B (zh) * 2020-10-12 2023-09-22 浙江省淡水水产研究所 一种草鱼出血病二价核酸菌蜕疫苗的制备方法
US20230372474A1 (en) 2020-10-15 2023-11-23 Ceva Sante Animale Recombinant hvt and uses thereof
CN114317827B (zh) * 2022-01-07 2023-03-24 河南省农业科学院 一种鉴别不同血清型马立克病病毒感染与免疫的多重pcr引物、方法及应用
CN115927213A (zh) * 2022-09-30 2023-04-07 扬州大学 表达鸡新城疫病毒f基因的重组火鸡疱疹病毒及其构建方法和应用
CN116139264A (zh) * 2022-12-28 2023-05-23 中国农业科学院上海兽医研究所 重组火鸡疱疹病毒活载体疫苗及其应用
KR102758680B1 (ko) * 2023-07-10 2025-02-04 (주)바이오드 전염성 f낭병 및/또는 조류 인플루엔자 항원을 발현하는 키메라 바이러스 및 이를 포함하는 백신 조성물
KR102758682B1 (ko) * 2024-01-02 2025-02-04 (주)바이오드 전염성 f낭병 항원을 발현하는 키메라 바이러스 및 이를 포함하는 백신 조성물
US12473572B1 (en) 2024-06-28 2025-11-18 Farmacológicos Veterinarios S.A.C. Gallid alphaherpesvirus 3 (MDV-2), a viral vector against different avian pathogens: a new vaccination strategy in the poultry industry

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4603112A (en) 1981-12-24 1986-07-29 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus
US5174993A (en) 1981-12-24 1992-12-29 Health Research Inc. Recombinant avipox virus and immunological use thereof
US4722848A (en) 1982-12-08 1988-02-02 Health Research, Incorporated Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus
US4769330A (en) 1981-12-24 1988-09-06 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus and methods for making and using the same
EP0138854B1 (en) 1983-03-08 1992-11-04 Chiron Mimotopes Pty. Ltd. Antigenically active amino acid sequences
EP0256092B1 (en) 1986-01-27 1998-04-08 Syntro Corporation Attenuated herpesviruses, herpesviruses which include foreign dna encoding an amino acid sequence and vaccine containing same
JP2779447B2 (ja) 1988-03-20 1998-07-23 財団法人阪大微生物病研究会 弱毒マレック病ウイルス・ベクターを用いる組換え遺伝子作成法、及び該ウイルスの組換え体
ES2070997T3 (es) 1989-12-04 1995-06-16 Akzo Nobel Nv Virus de herpes recombinante de pavos y vacunas vector vivas derivadas de los mismos.
EP0575491B1 (en) 1991-03-07 2003-08-13 Virogenetics Corporation Genetically engineered vaccine strain
BE1004877A3 (fr) 1991-05-27 1993-02-16 Solvay Virus de l'avipox recombinant, culture de cellules infectees par ce virus et vaccins pour la volaille derives de ce virus.
US5853733A (en) 1993-02-26 1998-12-29 Syntro Corporation Recombinant herpesvirus of turkeys and uses thereof
US6183753B1 (en) 1994-08-09 2001-02-06 Schering-Plough Veterinary Corp. Recombinant chimeric virus and uses thereof
FR2719056B1 (fr) 1994-04-20 1996-09-06 Rhone Merieux Herpesvirus transformés pour exprimer gD in vitro.
PT776361E (pt) * 1994-08-09 2007-04-30 Schering Plough Ltd Herpesvírus recombinantes de perus e suas utilizações
RU2059414C1 (ru) * 1994-12-09 1996-05-10 Государственная Курская биофабрика - Фирма "БИОК" Поливалентная вакцина для профилактики болезни марека и способ ее изготовления
FR2728795B1 (fr) * 1994-12-30 1997-03-21 Rhone Merieux Vaccin vivant recombinant aviaire, utilisant comme vecteur un virus herpes aviaire
JPH104956A (ja) * 1996-06-21 1998-01-13 Univ Michigan State マレク病ワクチン製造のための維持可能な細胞株の改良
FR2751225B1 (fr) * 1996-07-19 1998-11-27 Rhone Merieux Formule de vaccin polynucleotidique aviaire
US6610661B1 (en) 1996-10-11 2003-08-26 The Regents Of The University Of California Immunostimulatory polynucleotide/immunomodulatory molecule conjugates
US5980912A (en) 1997-03-25 1999-11-09 Zonagen, Inc. Chitosan induced immunopotentiation
US6632664B1 (en) * 1997-10-03 2003-10-14 Nippon Zeon Co., Ltd. Avian infectious herpesvirus recombinants and recombinant vaccines prepared with the use of the same
EP0974660A1 (en) 1998-06-19 2000-01-26 Stichting Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid (ID-DLO) Newcastle disease virus infectious clones, vaccines and diagnostic assays
US6299882B1 (en) 1999-04-09 2001-10-09 Schering Corporation UL54.5 of Marek's disease virus (MDV)
KR100354972B1 (ko) 2000-04-11 2002-10-05 대한민국 닭전염성기관지염 바이러스 ｓ1 단백질을 발현하는유전자재조합 마렉바이러스 및 그의 제조방법
US6764684B2 (en) * 2001-09-28 2004-07-20 Zeon Corporation Avian herpesvirus-based recombinant infectious bursal disease vaccine
US6866852B2 (en) 2002-01-31 2005-03-15 Zeon Corporation Recombinant herpesvirus of turkeys and use thereof
KR100801180B1 (ko) * 2006-09-26 2008-02-05 주식회사 고려비엔피 약독화된 재조합 뉴캐슬병 바이러스 및 이를 함유하는뉴캐슬병 백신
PL2419132T3 (pl) * 2009-04-15 2015-03-31 Ceva Sante Animale Wektory z rekombinowanego herpeswirusa ptaków i szczepionki do immunizacji wodnych gatunków ptactwa
CN105920598A (zh) 2011-11-30 2016-09-07 梅里亚有限公司 表达禽类病原体的抗原的重组hvt载体及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
MX365984B (es) 2019-06-21
EP3572092A1 (en) 2019-11-27
RU2014126375A (ru) 2016-01-27
KR102013135B1 (ko) 2019-08-22
EP2785373A1 (en) 2014-10-08
PH12014501174B1 (en) 2014-09-08
LT3251691T (lt) 2020-02-10
CY1124618T1 (el) 2022-03-24
ES2719409T5 (es) 2022-12-07
PL2785373T3 (pl) 2020-06-01
CN105920598A (zh) 2016-09-07
WO2013082317A8 (en) 2014-07-10
RU2620936C2 (ru) 2017-05-30
BR112014013276B1 (pt) 2021-07-27
PL2785374T3 (pl) 2019-07-31
CN104159604B (zh) 2016-08-24
HUE042471T2 (hu) 2019-07-29
BR112014013276A2 (pt) 2018-05-15
EP3251691A1 (en) 2017-12-06
PL3251691T3 (pl) 2020-06-01
HK1248566A1 (en) 2018-10-19
SI2785373T1 (sl) 2020-02-28
AR089039A1 (es) 2014-07-23
IN2014CN04833A (sr) 2015-09-18
CN104159604A (zh) 2014-11-19
HRP20190525T8 (hr) 2023-01-20
ES2775218T3 (es) 2020-07-24
HRP20190525T1 (hr) 2019-05-03
UA118651C2 (uk) 2019-02-25
SI3251691T1 (sl) 2020-02-28
ZA201403804B (en) 2015-04-29
MX361893B (es) 2018-12-18
MX2014006361A (es) 2015-03-05
PT2785374T (pt) 2019-05-09
PL2785374T5 (pl) 2023-01-09
EP3251691B1 (en) 2019-11-20
HK1197175A1 (en) 2015-01-09
ES2719409T3 (es) 2019-07-10
DK2785374T3 (en) 2019-04-08
RS58610B1 (sr) 2019-05-31
HK1200018A1 (en) 2015-07-31
LT2785373T (lt) 2020-02-10
WO2013082317A2 (en) 2013-06-06
AR090401A1 (es) 2014-11-12
EP4112073A1 (en) 2023-01-04
WO2013082327A1 (en) 2013-06-06
ES2785045T3 (es) 2020-10-05
EP3578199A1 (en) 2019-12-11
EP2785374B2 (en) 2022-08-17
PE20141482A1 (es) 2014-11-08
HUE047724T2 (hu) 2020-05-28
CA2857025A1 (en) 2013-06-06
JP2015500806A (ja) 2015-01-08
WO2013082327A8 (en) 2014-07-03
PT2785373T (pt) 2020-01-27
SMT201900690T1 (it) 2020-01-14
EP2785373B1 (en) 2019-11-20
HK1247832A1 (en) 2018-10-05
HUE047909T2 (hu) 2020-05-28
CY1122872T1 (el) 2021-05-05
DK2785373T3 (da) 2020-02-03
HRP20190525T4 (hr) 2023-01-20
CA2857025C (en) 2021-08-03
EP2785374A2 (en) 2014-10-08
DK3251691T3 (da) 2020-02-10
SMT201900188T1 (it) 2019-05-10
PH12015502790B1 (en) 2019-03-13
RS59893B1 (sr) 2020-03-31
SMT201900671T1 (it) 2020-01-14
WO2013082317A3 (en) 2013-08-15
PH12015502790A1 (en) 2017-07-10
LT2785374T (lt) 2019-04-25
PT3251691T (pt) 2020-01-28
JP6149301B2 (ja) 2017-06-21
CO7061033A2 (es) 2014-09-19
KR20140097515A (ko) 2014-08-06
MX2014006360A (es) 2015-03-05
ME03433B (me) 2020-01-20
CN104159605B (zh) 2019-04-19
CY1121528T1 (el) 2020-05-29
SI2785374T1 (sl) 2019-04-30
HRP20192241T1 (hr) 2020-03-06
PH12014501174A1 (en) 2014-09-08
HRP20192215T1 (hr) 2020-02-21
EP2785374B1 (en) 2019-01-09
EP3263130A1 (en) 2018-01-03
CN104159605A (zh) 2014-11-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2785373B1 (en) Recombinant hvt vectors expressing antigens of avian pathogens and uses thereof
US9114108B2 (en) Recombinant HVT vectors expressing antigens of avian pathogens and uses thereof
US9770502B2 (en) Recombinant gallid herpesvirus 3 (MDV serotype 2) vectors expressing antigens of avian pathogens and uses thereof
HK40077732A (en) Recombinant hvt vectors expressing antigens of avian pathogens and uses thereof
HK1247832B (en) Recombinant hvt vectors expressing antigens of avian pathogens and uses thereof
HK40021345A (en) Recombinant gallid herpesvirus 3 (mdv serotype 2) vectors expressing antigens of avian pathogens and uses thereof
HK1197175B (en) Recombinant hvt vectors expressing antigens of avian pathogens and uses thereof
HK40017399A (en) Recombinant hvt vectors expressing antigens of avian pathogens and uses thereof
HK1200018B (en) Recombinant gallid herpesvirus 3 (mdv serotype 2) vectors expressing antigens of avian pathogens and uses thereof