CN106701693A - 表达血清ⅰ型马立克氏病病毒gb基因的重组火鸡疱疹病毒的构建及其应用 - Google Patents
表达血清ⅰ型马立克氏病病毒gb基因的重组火鸡疱疹病毒的构建及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106701693A CN106701693A CN201710046543.0A CN201710046543A CN106701693A CN 106701693 A CN106701693 A CN 106701693A CN 201710046543 A CN201710046543 A CN 201710046543A CN 106701693 A CN106701693 A CN 106701693A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- virus
- recombinant
- rhvt
- genes
- serum
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241001502481 Meleagrid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 title claims abstract description 72
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 title claims abstract description 58
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 54
- 241000701047 Gallid alphaherpesvirus 2 Species 0.000 title abstract description 17
- 238000010276 construction Methods 0.000 title abstract description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 101
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 55
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 54
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims abstract description 28
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 17
- 208000006758 Marek Disease Diseases 0.000 claims abstract description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 12
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 206010044302 Tracheitis Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 201000009837 laryngotracheitis Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 101150034814 F gene Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 101150093578 VP2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 61
- 108010031571 Marek's disease virus glycoprotein B Proteins 0.000 claims description 33
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 28
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 28
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 claims description 27
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 26
- 239000002574 poison Substances 0.000 claims description 26
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims description 16
- 241001260012 Bursa Species 0.000 claims description 13
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 13
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 claims description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 10
- 241000701063 Gallid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 claims description 9
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 9
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 9
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 9
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 claims description 5
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 claims description 5
- 241000175212 Herpesvirales Species 0.000 claims description 4
- 241000230452 Cyclothone braueri Species 0.000 claims description 2
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 claims description 2
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 claims description 2
- 229940047431 recombinate Drugs 0.000 claims description 2
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 claims 2
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 claims 2
- 206010037844 rash Diseases 0.000 claims 2
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 abstract description 17
- 241000271566 Aves Species 0.000 abstract description 8
- 229940023832 live vector-vaccine Drugs 0.000 abstract description 7
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 abstract description 4
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 abstract description 4
- 101710194807 Protective antigen Proteins 0.000 abstract description 4
- 210000001669 bursa of fabricius Anatomy 0.000 abstract description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 208000027954 Poultry disease Diseases 0.000 abstract 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 54
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 34
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 24
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 15
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 15
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 12
- 101500001532 Avian infectious bursal disease virus Capsid protein VP2 Proteins 0.000 description 11
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 11
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 11
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 11
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 11
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 11
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 11
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000013461 design Methods 0.000 description 8
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 8
- 241000702626 Infectious bursal disease virus Species 0.000 description 7
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 5
- 101100298998 Caenorhabditis elegans pbs-3 gene Proteins 0.000 description 4
- 208000002352 blister Diseases 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 3
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 206010011732 Cyst Diseases 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 2
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 2
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 2
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 230000002633 protecting effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000701802 Aviadenovirus Species 0.000 description 1
- 208000020406 Creutzfeldt Jacob disease Diseases 0.000 description 1
- 208000003407 Creutzfeldt-Jakob Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000010859 Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 description 1
- 241000700662 Fowlpox virus Species 0.000 description 1
- 241000726306 Irus Species 0.000 description 1
- 208000030289 Lymphoproliferative disease Diseases 0.000 description 1
- 208000010359 Newcastle Disease Diseases 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 101150099105 alien gene Proteins 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000003837 chick embryo Anatomy 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 1
- 210000004709 eyebrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000000720 eyelash Anatomy 0.000 description 1
- 210000003746 feather Anatomy 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 210000000554 iris Anatomy 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000004126 nerve fiber Anatomy 0.000 description 1
- 210000000633 nuclear envelope Anatomy 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000007096 poisonous effect Effects 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16311—Mardivirus, e.g. Gallid herpesvirus 2, Marek-like viruses, turkey HV
- C12N2710/16321—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16311—Mardivirus, e.g. Gallid herpesvirus 2, Marek-like viruses, turkey HV
- C12N2710/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16311—Mardivirus, e.g. Gallid herpesvirus 2, Marek-like viruses, turkey HV
- C12N2710/16334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
- C12N2720/00011—Details
- C12N2720/00022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
- C12N2760/18122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒的构建及其应用。本发明构建的一种重组嵌合火鸡疱疹病毒rHVT‑GB株，是将血清Ⅰ型MDV GB(glycoprotein B，MDV1‑GB)基因的表达盒重组到HVT中获得的重组病毒，该重组病毒可作为生产毒种用于制备马立克氏病疫苗，相比HVT起到更好的免疫保护作用大大增强了对MD的免疫保护能力；该rHVT‑GB重组毒株可用作载体，构建能够表达其它禽类病原保护性抗原基因(如新城疫病毒F基因、传染性喉气管炎的GB基因和传染性法氏囊的VP2基因)的病毒用于制备活载体疫苗预防其它相应的禽类疫病。
Description
技术领域
本发明涉及一种表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒的构建及其应用。动物生物制品学领域，
背景技术
鸡马立克氏病(Marek’s disease,MD)，是由鸡马立克氏病病毒(Marek’s diseasevirus,MDV)引起的一种鸡马立克氏病(Marek`s Disease，MD)是由鸡疱疹病毒引起鸡的一种最常见的淋巴细胞增生性疾病，以外周神经、虹膜、皮肤、肌肉和各内脏器官的淋巴样细胞浸润、增生和肿瘤形成为特征。
本病早在1907年由匈牙利的兽医病理学家马立克首先发现，并在1961年命名为马立克氏病。现在世界各主要养鸡国家和地区均有流行，在我国也是经济意义上最重要的禽病之一，对我国养鸡生产造成严重威胁和巨大的经济损失。
马立克氏病病毒(Marek’s disease virus,MDV)属于细胞结合性疱疹病毒B群。病毒有两种存在形式，即裸体粒子(核衣壳)和有囊膜的完整病毒粒子。前者病毒核衣壳呈六角形，直径为85～100nm，有严格的细胞结合性，离开细胞致病性即显著下降和丧失，在外界环境中生存活力很低，主要见于肾小管、法氏囊、神经组织和肿瘤组织中。大多数裸体病毒粒子存在于细胞核中，偶见于细胞浆或细胞外液中。后者主要存在于细胞核膜附近或者核空泡中，直径130～170nm，主要见于羽毛囊角化层中，多数是有囊膜的完整病毒粒子，非细胞结合性，可脱离细胞而存在，对外界环境抵抗力强，在本病的传播方面起重要作用。
1975年Bulow和Biggs采用间接免疫荧光试验、琼脂凝胶免疫沉淀反应及病毒中和试验，把MDV和相关病毒(HVT)分为三种血清型，随后这种分类方法由Lee所建立的MDV型特异性单克隆抗体所证实。
根据MDV的三种血清型，目前商品化MDV疫苗分为致弱的Ⅰ型CVI988/Rispens株、无致病性的Ⅱ型SB1株和Ⅲ型火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of turkey，HVT)FC126株。致弱的Ⅰ型CVI988/Rispens株对MD保护效果好，但其作为严格的细胞结合型病毒，必须液氮保存运输，极大的增加了疫苗成本。HVT可以冻干保存，节约了疫苗成本，但其对MD的保护力较弱，因此提高HVT的免疫效力十分必要。Ross将血清Ⅰ型MDV的GB基因插入到HVT基因组的TK基因，但构建的重组病毒在体内的增殖能力变弱。(Ross LJ,Binns MM,Tyers P,Pastorek J,Zelnik V,Scott S:Construction and properties of a turkey herpesvirusrecombinant expressing the Marek's disease virus homologue of glycoprotein Bof herpes simplex virus.The Journal of general virology 1993,74(Pt3):371-377.)，而疫苗毒的增殖能力又和保护力紧密相关(Gimeno IM,Witter RL,Hunt HD,ReddySM,Reed WM:Biocharacteristics shared by highly protective vaccines againstMarek's disease.Avian Pathol2004,33(1):59-68.)。因此，构建正常增殖且具有更高保护力的HVT非常有必要。
疫苗是防制畜禽疾病的重要手段之一，目前大多重要的家禽传染病都可用相应的疫苗作有效的预防。为了进一步降低生产成本，提高产品质量，禽用新型疫苗的研究迫在眉睫。随着分子生物学技术的日臻完善，以改造病毒核酸结构为手段的疫苗，如基因缺失株疫苗、插入突变株、病毒活载体疫苗等得到了极大的发展，其中病毒活载体疫苗以生产使用方便，价格低廉，且安全性、稳定性及免疫力较强等方面优势，成为研究的热点。相对于其它病毒载体(如禽痘病毒、禽腺病毒、新城疫病毒等)，鸡马立克氏病病毒(Marek’s diseasevirus,MDV)作为最有潜力的疫苗载体，其突出的优点体现在：MDV是严格的细胞结合型病毒，构建的载体疫苗不受母源抗体的干扰，克服了众多活病毒载体疫苗的缺陷；MDV分子大小为180kb左右，能够容纳较大片段基因的插入，而不影响重组病毒的稳定性；MDV疫苗适合早期免疫，对多数病毒特别是免疫抑制性病毒疫苗的研发带来了曙光。基于HVT构建病毒活载体疫苗不仅具有上述优点，还可以实现一苗两防、一苗多防，具有广阔的市场前景。
发明内容
本发明的目的是为提供了一种嵌合火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of turkey,HVT)rHVT-GB，其实际上是在血清Ⅲ型马立克氏病病毒(Marek’s disease virus,MDV)HVT的基础上，将血清Ⅰ型MDV GB(glycoprotein B，MDV1-GB)基因的表达盒重组到HVT中，获得了一种全新的重组火鸡疱疹病毒rHVT-GB；本发明同时还为利用rHVT-GB为载体，构建能够表达其它禽类病原保护性抗原基因(如新城疫病毒F基因、传染性喉气管炎的GB基因和传染性法氏囊的VP2基因)的病毒活载体疫苗，该疫苗不仅可以预防MD，同时还能够预防其它禽类疫病。
本发明的技术方案
1.一种表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒，其特征在于该表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒被命名为一种重组火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of turkey)rHVT-GB株，该毒株已于2017年01月11日送北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为：CGMCC No.13400。
2.本发明所述的一种表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒的构建，其特征在于：将血清Ⅰ型MDV的GB基因表达盒重组到HVT基因组中，重组位点为HVT(GenBank:AF291866.1)基因组的位于HVT087-HVT088基因之间的US2区域，该表达盒的基因序列如Seq ID No:1所示。
3.本发明所述的一种表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其特征在于该重组毒株在鸡体中诱导抗马立克氏病的保护性免疫中的应用。
4.本发明所述的一种表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其特征在于该重组毒株作为生产毒株在动物疫苗株的应用。
5.本发明所述的一种表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其特征在于将该重组病毒作为病毒载体构建新的重组疫苗病毒中的应用。
6.本发明所述特征在的一种表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其于将新城疫病毒的F基因表达盒重组到rHVT-GB基因组中，重组位点为HVT(GenBank:AF291866.1)基因组的HVT065和HVT066之间，其中F基因表达盒的启动子序列如Seq ID No:2所示；F基因序列如Seq ID No:3所示；PolyA序列如Seq ID No:6所示，构建获得的重组病毒被命名为重组火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of turkey)rHVT-GB-NDVF株，该毒株已于2017年01月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为：CGMCC No.13399。
7.本发明所述特征在的一种表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其于重组火鸡疱疹病毒rHVT-GB-NDVF株在鸡中诱导抗马立克氏病和鸡新城疫的保护性免疫中的应用、并作为生产毒株在相应动物疫苗中的应用。
8.本发明所述特征在的一种表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其于重组火鸡疱疹病毒rHVT-GB-NDVF株作为病毒载体构建新的重组疫苗病毒的应用。
9.本发明所述特征在的一种表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其特征在于将鸡传染性喉气管炎病毒的GB基因表达盒重组到rHVT-GB基因组中，重组位点为HVT(GenBank:AF291866.1)基因组的HVT065和HVT066之间，ILTV-GB基因表达盒的启动子序列如Seq ID No:2所示，GB基因序列如Seq ID No:4所示，PolyA序列如SeqID No:6所示；获得被命名为重组火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of turkey)rHVT-GB-ILTVGB株，该毒株已于2017年01月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为：CGMCCNo.13398。
10.本发明所述一种表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其特征在于其中的重组火鸡疱疹病毒rHVT-GB-ILTVGB株在鸡中诱导抗马立克氏病和鸡传染性喉气管炎的保护性免疫中的应用、并作为生产毒株在相应动物疫苗中的应用。
11.本发明所述一种表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其特征在于其中的重组火鸡疱疹病毒rHVT-GB-ILTVGB株作为病毒载体构建新的重组疫苗病毒的应用。
12.本发明所述一种表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其特征在于将鸡传染性法氏囊病毒的VP2基因表达盒重组到rHVT-GB基因组中，重组位点为HVT(GenBank:AF291866.1)基因组的HVT065和HVT066之间,VP2基因表达盒的启动子序列如Seq ID No:2所示，VP2基因序列如Seq ID No:5所示，PolyA序列如Seq ID No:6所示；获得被命名为重组火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of turkey)rHVT-GB-IBDVVP2株，该毒株已于2017年01月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为：CGMCC No.13397。
13.本发明所述的一种表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其特征在于其中重组火鸡疱疹病毒rHVT-GB-IBDVVP2株在鸡中诱导抗鸡马立克氏病和传染性法氏囊病的保护性免疫中的应用、并作为生产毒株在相应动物疫苗中的应用。
14.本发明所述的一种表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其特征在于其中重组火鸡疱疹病毒rHVT-GB-IBDVVP2株作为病毒载体构建新的重组疫苗病毒的应用。
本发明具体实施方式
1.毒株的构建：
(1)本发明提供了一种重组火鸡疱疹病毒(rHVT-GB)，其实际上是将血清Ⅰ型MDV的GB基因(MDV1-GB)重组到火鸡疱疹病毒基因组中，获得了一种全新的重组嵌合火鸡疱疹病毒rHVT-GB，该病毒通过将由启动子控制下的MDV1-GB基因(MDV1-GB基因表达盒)插入到HVT基因组中，rHVT-GB可以对鸡MD起到比HVT更好的免疫保护作用。
该重组病毒的DNA序列模式图如附图1所示，具体如下：在本发明中，发明人将含有MDV1-GB基因表达盒插入HVT基因组中，插入的区域为HVT基因组中病毒生长非必需的区域US区域(在HVT基因组HVT087-HVT088基因之间)。为了达到上述的目的，发明人首先构建了用来同源重组的重组质粒，该重组质粒含有US2基因两侧的同源序列，以HVT基因组为模板进行扩增，扩增后的左右臂序列通过酶切位点克隆入PUC18中，克隆后的含有左右臂的重组质粒命名为PHVT-DS。然后由血清Ⅰ型MDV弱毒CVI988株基因组(GenBank:DQ530348.1)为模板扩增获得了含MDV1-GB基因表达盒，扩增后的MDV1-GB表达盒通过PACI酶切位点克隆入PHVT-DS中，克隆鉴定成功的质粒即为用来将MDV1-GB重组进HVT US2区域的重组质粒，该质粒命名为PHVT-DS-MDV1-GB。利用重组质粒(PHVT-DS-MDV1-GB)与HVT基因组共转染CEF，待出现蚀斑后，将细胞传一代，留一半液氮冻存，另一半超声破碎后利用有限稀释法稀释病毒传至96孔细胞培养板中(做好稀释梯度，使每孔平均仅含有1个蚀斑或少于1个蚀斑)，待蚀斑出现后，挑选仅含有1个蚀斑的孔进行传代，1个孔传平行的2个孔。待蚀斑出现后，其中1个孔利用间接免疫荧光(利用抗MDV-GB的单抗进行筛选)检测重组病毒，如果为阳性，对应的另1个孔的病毒则含有重组病毒，经过多轮纯化后，进行毒种保存鉴定，该病毒被命名为一种重组火鸡疱疹病毒rHVT-GB株，并于2017年01月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为：CGMCC No.13400。
(2)同时，本发明利用rHVT-GB为载体平台，分别表达了新城疫病毒(NDV)的F基因、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的GB基因和鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)的VP2基因。上述重组病毒的DNA序列模式图如附图2、图3和图4所示。具体方案如下：在本发明中，发明人将含有NDV F基因、ILTV-GB基因和IBDV-VP2基因表达盒分别插入rHVT-GB基因组中，插入的区域为HVT(GenBank:AF291866.1)基因组的HVT065和HVT066之间。为了达到上述的目的，发明人首先构建了用来同源重组的重组质粒，NDV F基因由人工合成，为了考虑效力性，合成的F基因型属于NDV基因Ⅶd亚型，同时，考虑到安全性，将其F基因裂解位点的氨基酸序列人为改造为GRQGRL，符合弱毒株的特征；ILTV-GB基因参考了疫苗株(GenBank:JN580317.1)GB序列；IBDV-VP2基因参考NCBI序列(GenBank:HG974565.1)，上述F基因、GB基因和VP2基因均由商业公司合成。启动子参考了疱疹病毒(Murid herpesvirus 1strain Smith)的启动子序列，终止序列为真核表达载体中常用的PolyA终止序列。具体构建方法如下：按常规方法提取HVT病毒基因组DNA，根据Genebank中发表的HVT-FC126株(GenBank:AF291866.1)的全基因序列，扩增左同源臂扩增左同源臂连接至PMD19-Tsimple载体，构建成质粒PMD19-L。设计引物扩增启动子，将启动子克隆入PMD19-L中，构建成质粒PMD19-L-PRO。然后设计引物扩增VP2基因，将VP2基因克隆入PMD19-L-PRO中，构建成质粒PMD19-L-PRO-VP2。设计引物扩增PolyA(以pCMVbeta质粒为模板,GenBank:U02451)，将PolyA克隆入PMD19-L-PRO-VP2中，构建成质粒PMD19-L-PRO-VP2-PolyA；最后设计引物扩增右同源臂，克隆入质粒PMD19-L-PRO-VP2-PolyA，构建成最终的重组质粒PMD19-L-PRO-VP2-PolyA-R，该质粒用来将IBDV-VP2重组到rHVT-GB基因组中的HVT065和HVT066之间。在构建PMD19-L-PRO-VP2-PolyA-R的过程中，VP2基因两端设计了Not I酶切位点，利用此酶切位点可以将NDV-F和ILTV-GB基因克隆入PMD19-L-PRO-VP2-PolyA-R，分别构建重组质粒PMD19-L-PRO-F-PolyA-R和PMD19-L-PRO-GB-PolyA-R。参考rHVT-GB的构建方法，分别将PMD19-L-PRO-VP2-PolyA-R、PMD19-L-PRO-F-PolyA-R和PMD19-L-PRO-GB-PolyA-R重组质粒与rHVT-GB基因组共转染CEF，借助间接免疫荧光技术利用有限稀释法克隆重组病毒，利用该方法分别获得重组火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of turkey)rHVT-GB-NDVF株、重组火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of turkey)rHVT-GB-ILTVGB株和重组火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of turkey)rHVT-GB-IBDVVP2株，该三株病毒已于2017年01月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号分别为为：CGMCCNo.13399，CGMCC No.13398和CGMCC No.13397。
2.重组病毒的验证
将rHVT-GB、rHVT-GB-NDVF、rHVT-GB-ILTVGB、rHVT-GB-IBDVVP2和HVT接种于12孔细胞培养板上。培养出现明显蚀斑后，分别用抗MDV1-GB、NDV-F、ILTV-GB和IBDV-VP2的单抗或血清进行间接免疫荧光鉴定，结果表明，rHVT-GB中的MDV1-GB基因、rHVT-GB-NDVF中的MDV1-GB和NDV-F基因、rHVT-GB-ILTVGB中的MDV1-GB和ILTV-GB以及rHVT-GB-IBDVVP2中的MDV1-GB和IBDV-VP2都获得了良好的正确表达。
3.疫苗制备
发明人将上述重组病毒制备成疫苗，以方便进行免疫操作，进一步的，发明人将重组病毒应用于鸡的免疫保护实验中。
rHVT-GB对鸡预防MD的免疫保护效力评价1日龄SPF鸡免疫rHVT-GB后，免疫后7日分别接种1000PFU病毒量的鸡马立克氏病病毒(Marek’s disease virus,MDV)Md5超强毒株(ATCC，VR-987)，rHVT-GB免疫组疫苗保护指数为75，明显优于HVT免疫组(保护指数为55)。
rHVT-GB-NDVF对鸡预防ND免疫保护效力评价1日龄SPF鸡免疫rHVT-GB-NDVF，免疫后21日各肌肉注射新城疫病毒强毒北京株0.5ml(含105EID50，中国兽医药品监察所，CVCCAV1611)，观察14d，rHVT-GB-NDVF对ND的保护率达到90％。
rHVT-GB-ILTVGB对ILT免疫保护效力评价1日龄SPF鸡免疫rHVT-GB-ILTVGB，免疫后21日，鸡各气管内注射鸡传染性喉气管炎强毒北京株0.2ml(含104EID50，CVCC AV中国兽医药品监察所)，攻毒后观察10d，rHVT-GB-ILTVGB对ILT保护率达到100％。
rHVT-GB-IBDVVP2对鸡预防IBD免疫保护效力评价1日龄SPF鸡免疫rHVT-GB-IBDVVP2，21日龄每只点眼攻击IBDV BC6/85株(中国兽医药品监察所，CVCC AV7)10个MID，72小时后剖检法氏囊，观察法氏囊病变。rHVT-GB-IBDVVP2免疫组保护17只。HVT-GB免疫组和攻毒对照组法氏囊均发生病变(法氏囊出现浆膜呈胶冻样或有不同程度的出血)，rHVT-GB-IBDVVP2可以对IBD形成良好的保护。
综上所述，本发明提供了一种重组火鸡疱疹病毒(rHVT-GB)，其实际上是将血清Ⅰ型MDV GB基因的表达盒重组到HVT中，获得了一种全新的重组火鸡疱疹病毒rHVT-GB，该病毒同时也是一种良好的马立克氏病疫苗，作为疫苗，相比HVT，rHVT-GB可以对MD起到更好的免疫保护作用。
本发明同时利用rHVT-GB为载体，构建能够表达其它禽类病原保护性抗原基因(新城疫病毒F基因、传染性喉气管炎的GB基因和传染性法氏囊的VP2基因)的病毒活载体疫苗，获得3个重组火鸡疱疹病毒rHVT-GB-NDVF株、rHVT-GB-ILTVGB株和rHVT-GB-IBDVVP2株。将上述3个重组病毒制备疫苗，不仅可以预防MD，同时各自还能够有效预防其它禽类疫病。
附图说明
图1为rHVT-GB基因组示意图；MDV1-GB表达盒插入HVT基因组中的US2区域，插入位点为基因HVT087和HVT088之间。
图2为MDV1-GB表达盒在HVT基因组中整合位点示意图；删除线加黑序列上游部分为基因HVT087，删除线加黑序列下游部分为基因HVT088(US2)，删除线部分为MDV1-GB取代的HVT序列。
图3为NDV-F/ILTV-GB/IBDV-VP2表达盒整合位点示意图；加黑序列上游部分为HVT065,加黑序列下游部分为HVT066，删除线部分为NDV-F/ILTV-GB/IBDV-VP2表达盒取代的HVT序列。
图4为rHVT-GB-NDVF基因组示意图；NDV-F表达盒插入HVT基因组中，插入位点为基因HVT065和HVT066之间。
图5为rHVT-GB-ILTVGB基因组示意图；ILTV-GB表达盒插入HVT基因组中，插入位点为基因HVT065和HVT066之间。
图6为rHVT-GB-IBDVVP2基因组示意图；IBDV-VP2表达盒插入HVT基因组中，插入位点为基因HVT065和HVT066之间。
本发明涉及生物材料资源信息
本发明构建的重组火鸡疱疹病毒rHVT-GB株、rHVT-GB-NDVF株、rHVT-GB-ILTVGB株和rHVT-GB-IBDVVP2株等四株病毒已于2017年01月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号分别为为：CGMCC No.13400，CGMCC No.13399、CGMCC No13398.和CGMCC No.13397；鸡马立克氏病病毒(Marek’s disease virus)Md5株(ATCC，VR-987)购自美国菌种保藏中心(American type culture collection,ATCC)；鸡新城疫病毒(Newcastle v diseaseirus)强毒北京株(CVCC AV1611)、鸡传染性喉气管炎病毒Infectious北京株(CVCC AV22)和鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus)BC6/85株(CVCC AV7)请见中国兽医药品监察所、中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著，中国兽医菌种目录(第二版)，中国农业科学技术出版社，2002年，p142、137和135。
本发明的积极意义
本发明涉及表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒的构建及其应用，本发明提供了一种嵌合火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of turkey,HVT)rHVT-GB，其实际上是在血清Ⅲ型马立克氏病病毒(Marek’s disease virus,MDV)HVT的基础上，将血清Ⅰ型MDV GB(glycoprotein B，MDV1-GB)基因的表达盒重组到HVT中，获得了一种全新的重组火鸡疱疹病毒rHVT-GB，该病毒同时也是一种良好的马立克氏病疫苗，通过将由启动子控制下的MDV1-GB基因插入到HVT基因组中，作为疫苗，相比HVT,rHVT-GB可以对鸡马立克氏病(Marek’s disease,MD)起到更好的免疫保护作用。
相对于血清Ⅰ型MD疫苗，HVT可以冻干保存，大大节约了运输储藏成本。HVT除了能够预防MD外，其还是优良的病毒载体，但HVT本身作为MD疫苗，对MD的保护能力较弱，本发明构建的嵌合病毒rHVT-GB，大大增强了对MD的免疫保护能力。本发明同时利用rHVT-GB为载体，构建能够表达其它禽类病原保护性抗原基因(如新城疫病毒F基因、传染性喉气管炎的GB基因和传染性法氏囊的VP2基因)的病毒活载体疫苗，该疫苗不仅可以预防MD，同时还能够预防其它禽类疫病。
实施例
以下实施例为进一步说明本发明，不对本发明请求保护的技术方案构成限制。
实施例1
——嵌合病毒rHVT-GB的构建
1.重组质粒PHVT-DS的构建
首先构建用来同源重组的重组质粒，该重组质粒含有US2基因两侧的同源序列，引物(序列7、序列8、序列9和序列10)；
以HVT基因组为模板进行扩增，扩增后的左右臂序列通过酶切位点克隆入PUC18中，克隆后的含有左右臂的重组质粒命名为PHVT-DS。
2.PHVT-DS-MDV1-GB的构建
由血清Ⅰ型MDV弱毒CVI988株基因组(GenBank:DQ530348.1)为模板扩增获得了含MDV1-GB基因表达盒，具体如下：
设计引物(序列11和序列12)扩增MDV血清Ⅰ型GB基因表达盒(MDV1-GB表达盒)：
以CVI988基因组为模板，进行扩增，扩增后的MDV1-GB表达盒通过PACI酶切位点克隆入PHVT-DS中，克隆鉴定成功的质粒即为用来将MDV1-GB重组进HVT US2区域的重组质粒，该质粒命名为PHVT-DS-MDV1-GB。
HVT-US2left sense：5-GATgaattcA CATCGGGCCA CGTTCCGCC-3 29(序列7)；
HVT-US2left antisense：5-ATAGTCGACt taattaaGAT GAGCTGACGT GTGGAAT-3 37(序列8)。
HVT-US2right sense：5-ATCgtcgacA CTAATATGGG CACACCCAC-3 29(序列9)；
HVT-US2right antisense：5-ATCaagcttT GGCCCATCTA GGTGATTAT-3 29(序列10)。
MDV1-GB-F:cggTTAATTA Agacctccct tggccatgat gaatgg 36(序列11)；
MDV1-GB-R:ccgTTAATTA Aagaaggaaa gcatcgagca atcac 36(两端加入了PACI酶切位点，序列12)。
3.重组病毒的构建
利用重组质粒(PHVT-DS-MDV1-GB)与HVT基因组共转染CEF，待出现蚀斑后，将细胞传一代，留一半液氮冻存，另一半超声破碎后利用有限稀释法稀释病毒传至96孔细胞培养板中(做好稀释梯度，使每孔平均仅含有1个蚀斑或少于1个蚀斑)，待蚀斑出现后，挑选仅含有1个蚀斑的孔进行传代，1个孔传平行的2个孔。待蚀斑出现后，其中1个孔利用间接免疫荧光(利用抗MDV-GB的单抗进行筛选)检测重组病毒，如果为阳性，对应的另1个孔的病毒则含有重组病毒，经过多轮纯化后，进行毒种保存鉴定，该病毒株被命名为重组火鸡疱疹病毒rHVT-GB株(CGMCC No.13400)。
实施例2
——重组火鸡疱疹病毒rHVT-GB-NDVF、rHVT-GB-ILTVGB和rHVT-GB-IBDVVP2的构建
利用rHVT-GB为载体平台，分别表达了新城疫病毒(NDV)的F基因、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的GB基因和鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)的VP2基因。具体构建方法如下：
1.重组火鸡疱疹病毒rHVT-GB-NDVF、rHVT-GB-ILTVGB和rHVT-GB-IBDVVP2株的构建
按常规方法提取HVT病毒基因组DNA，根据Genebank中发表的HVT-FC126株(GenBank:AF291866.1)的全基因序列，扩增左同源臂，扩增左同源臂连接至PMD19-Tsimple载体，构建成质粒PMD19-L。设计引物(序列15和序列16)扩增启动子，将启动子克隆入PMD19-L中，构建成质粒PMD19-L-PRO。然后设计引物(序列17和序列18)扩增VP2基因，将VP2基因克隆入PMD19-L-PRO中，构建成质粒PMD19-L-PRO-VP2。设计引物(序列19和序列20)扩增PolyA，将PolyA克隆入PMD19-L-PRO-VP2中，构建成质粒PMD19-L-PRO-VP2-PolyA；最后设计引物HVT-R-F(序列21)和HVT-R-R(序列22)扩增右同源臂，克隆入质粒PMD19-L-PRO-VP2-PolyA，构建成最终的重组质粒PMD19-L-PRO-VP2-PolyA-R，该质粒用来将IBDV-VP2重组到rHVT-GB基因组中的HVT065和HVT066之间。在构建PMD19-L-PRO-VP2-PolyA-R的过程中，VP2基因两端设计了Not I酶切位点，利用此酶切位点可以将NDV-F和ILTV-GB克隆入PMD19-L-PRO-VP2-PolyA-R，分别构建重组质粒PMD19-L-PRO-F-PolyA-R和PMD19-L-PRO-GB-PolyA-R。参考rHVT-GB的构建方法，分别将PMD19-L-PRO-VP2-PolyA-R、PMD19-L-PRO-F-PolyA-R和PMD19-L-PRO-GB-PolyA-R重组质粒与rHVT-GB基因组共转染CEF，借助间接免疫荧光技术利用有限稀释法克隆重组病毒，利用该方法分别获得重组火鸡疱疹病毒rHVT-GB-NDVF(CGMCCNo.13399)、rHVT-GB-ILTVGB(CGMCC No.13398)和rHVT-GB-IBDVVP2(CGMCC No.13397)。
HVT-L-F:5-GTTCCTTGAA ATGCCGACAA CTCTAAAAAC GGTATTCG-3 38(序列13)；
HVT-L-R:5-GCTAGCGCGG CCGCGAATTC GTTTAATGTT AGTTTATT-3 38(下游引物5’端含有Nhe I/NotI/EcoRI酶切位点，序列14)；
PRO-F:-GGGGAATTCA CTAGTGGATC CCCCAACTCC GCCCGTTTTA TGACTAGA-3 48(EcoRI，序列15)；
PRO-R:5-AAATTGCGGC CGCCTGCAGC GAGGAGCTCT GCGTTCTACG GTGGT-3 45(Not I，序列16)
Vp2-F:5-aatGCGGCCG CTCTAGAACT CGTCGATCGC AGCGATGACA AACCTGCAAG-3 50(Not I，序列17)；
Vp2-R:5-GGCGCTAGCA AGCTTACCTC CTTATAGCCC GGATTATGTC TTTGAAGCCA-3 50(HindIII/Nhe I，序列18),
polyA-F:5-AATAAGCTTG ATCTAGAGCG GCCGCGG-3 27(HindIII，序列19)；
polyA-R:5-AATGCTAGCG TCGACTCTAG AGGATCCG-3 28(Sal I/Nhe I，序列20)，
HVT-R-F:5-GGCGGTCGAC AATTATTTTA TTTAAT-3 26(序列21)；
HVT-R-R:5-GGCGCTAGCC TAGTGTTTCA ATTAT-3 25(序列22)
实施例3
——重组病毒的验证
1.rHVT-GB重组病毒
将50PFU病毒量的rHVT-GB和HVT接种于12孔细胞培养板上。培养出现明显蚀斑后，将生长液倒掉，用冷的丙酮:乙醇(3:2)固定液固定10min，PBS洗1次，rHVT-GB和HVT接种孔中分别加入0.5mL(1:100稀释)MDV1-GB单抗，放置于37℃恒温培养箱中反应1h，用PBS清洗3次，每孔加上0.5mL FITC标记抗鼠IgG荧光抗体，放置于37℃恒温生化培养箱中反应1h，用PBS洗3次，在倒置荧光显微镜下观察，细胞蚀斑出现了特异性绿色荧光，而对照组HVT感染CEF细胞后无荧光，结果表明MDV1-GB基因能够良好的正确表达。
2.rHVT-GB-NDVF重组病毒
将50PFU病毒量的rHVT-GB-NDVF和HVT接种于12孔细胞培养板上。培养出现明显蚀斑后，将生长液倒掉，用冷的丙酮:乙醇(3:2)固定液固定10min，PBS洗1次，rHVT-GB-NDVF和HVT接种孔中加入0.5mL(1:100稀释)MDV1-GB单抗，另外rHVT-GB-NDVF和HVT接种孔中加入0.5mL抗NDV-F小鼠血清。放置于37℃恒温培养箱中反应1h，用PBS清洗3次，每孔加上0.5mLFITC标记抗鼠IgG荧光抗体，放置于37℃恒温生化培养箱中反应1h，用PBS洗3次，在倒置荧光显微镜下观察，rHVT-GB-NDVF接种孔中细胞蚀斑，加入MDV1-GB单抗或抗NDV-F小鼠血清后均出现了特异性绿色荧光，而对照组HVT感染CEF细胞后无荧光，表明MDV1-GB基因和NDV-F基因均能够良好的正确表达。
3.重组病毒rHVT-GB-ILTVGB
将50PFU病毒量的rHVT-GB-ILTVGB和HVT接种于12孔细胞培养板上。培养出现明显蚀斑后，将生长液倒掉，用冷的丙酮:乙醇(3:2)固定液固定10min，PBS洗1次，rHVT-GB-ILTVGB和HVT接种孔中加入0.5mL(1:100稀释)MDV1-GB单抗，另外rHVT-GB-ILTVGB和HVT接种孔中加入0.5mL抗ILTV-GB小鼠血清。放置于37℃恒温培养箱中反应1h，用PBS清洗3次，每孔加上0.5mL FITC标记抗鼠IgG荧光抗体，放置于37℃恒温生化培养箱中反应1h，用PBS洗3次，在倒置荧光显微镜下观察，rHVT-GB-ILTVGB接种孔中细胞蚀斑，加入MDV1-GB单抗或抗ILTV-GB小鼠血清后均出现了特异性绿色荧光，而对照组HVT感染CEF细胞后无荧光，表明MDV1-GB基因和ILTV-GB基因均能够良好的正确表达。
4.rHVT-GB-IBDVVP2重组病毒
将50PFU病毒量的rHVT-GB-IBDVVP2和HVT接种于12孔细胞培养板上。培养出现明显蚀斑后，将生长液倒掉，用冷的丙酮:乙醇(3:2)固定液固定10min，PBS洗1次，rHVT-GB-IBDVVP2和HVT接种孔中加入0.5mL(1:100稀释)MDV1-GB单抗，另外rHVT-GB-IBDVVP2和HVT接种孔中加入0.5mL抗IBDV-VP2小鼠血清。放置于37℃恒温培养箱中反应1h，用PBS清洗3次，每孔加上0.5mL FITC标记抗鼠IgG荧光抗体，放置于37℃恒温生化培养箱中反应1h，用PBS洗3次，在倒置荧光显微镜下观察，rHVT-GB-IBDVVP2接种孔中细胞蚀斑，加入MDV1-GB单抗或抗IBDV-VP2小鼠血清后均出现了特异性绿色荧光，而对照组HVT感染CEF细胞后无荧光，表明MDV1-GB基因和IBDV-VP2基因均能够良好的正确表达。
实施例4
——重组病毒制备疫苗
将重组病毒接种鸡胚成纤维细胞，制备种子病毒；用转瓶进行扩大培养，接种密度为每1cm2面积接种1000PFU的重组病毒，接种后约50小时，有70％以上单层细胞出现典型的细胞病变(CPE)时，倒去培养液，加入适量胰酶消化液，在室温下消化10min左右，细胞单层出现疏松拉网接近脱离瓶壁现象时，立即加入与消化液等量的含10％牛血清的营养液，停止消化。轻轻摇动转瓶，使细胞全部脱离瓶壁，离心收集的细胞用超声波裂解后加入适量SPGA稳定剂，摇匀后分装冻干。
实施例5
——rHVT-GB疫苗对鸡预防MD的免疫保护效力评价
80只1日龄SPF鸡，随机分成4组，第1组接种rHVT-GB，免疫剂量为4000PFU/只，第2组接种HVT,免疫剂量为4000PFU/只。第3组为攻毒对照组(非免疫攻毒)，第4组为空白对照组(非免疫非攻毒组)。7日龄时，1、2、3组鸡只经腹腔分别接种1000PFU病毒量的鸡马立克氏病超强毒Md5株，四组鸡在70日龄时全部剖杀，统计结果。以免疫鸡攻毒保护指数(PI)作为评价疫苗免疫效力的指标。攻毒前死亡的鸡只判定为非特异性死亡，不计入试验鸡数。对攻毒后死亡及试验结束存活的鸡只计数并逐一剖检，详细记录各试验组MD病变阳性鸡只数，对MD病变可疑鸡只采取病料进行病理学检查。MD阳性鸡是指由MD导致死亡鸡、具有眼观MD肿瘤病变鸡只以及眼观MD肿瘤病变可疑而组织病理学检验为MD病理变化的鸡只。
试验疫苗的免疫效力用保护指数(PI)表示，
其中：
统计结果见表1，攻毒对照组出现100％的MD特异性病变。HVT免疫组出现45％的MD特异性病变，包括前期的MD特异性死亡，疫苗保护指数为55；rHVT-GB免疫组疫苗保护指数为75，明显优于HVT免疫组。
表1rHVT-GB对SPF鸡的免疫保护效果
实施例6
——rHVT-GB-NDVF疫苗对鸡预防ND免疫保护效力评价
80只1日龄SPF鸡，随机分成4组,第1组接种rHVT-GB-NDVF，免疫剂量为4000PFU/只，第2组接种rHVT-GB，免疫剂量为4000PFU/只，第3组为攻毒对照组(非免疫攻毒组)，第三组为空白对照(非免疫非攻毒)组。免疫后21日，1、2、3组鸡各肌肉注射新城疫北京株强毒0.5ml(含105EID50)，观察14d，rHVT-GB-NDVF保护率达到90％。
表2rHVT-GB-NDVF对SPF鸡的免疫保护效果
| 组别 | 试验动物数 | 攻毒用毒株 | ND发病或死亡 | 保护率(％) |
| rHVT-GB-NDVF疫苗免疫组 | 20 | NDV(北京株) | 2 | 90 |
| rHVT-GB疫苗免疫组 | 20 | NDV(北京株) | 20 | 0 |
| 攻毒对照组- | 20 | NDV(北京株) | 20 | 0 |
| 空白对照组- | 20 | - | 0 | - |
实施例7
——rHVT-GB-ILTVGB疫苗对ILT免疫保护效力评价
80只1日龄SPF鸡，随机分成4组,第1组接种rHVT-GB-ILTVGB疫苗，免疫剂量为4000PFU/只，第2组接种rHVT-GB疫苗，免疫剂量为4000PFU/只，第3组为攻毒对照组(攻毒对照组)，第三组为空白对照(非免疫非攻毒)组。免疫后21日，1、2、3组鸡各气管内注射鸡传染性喉气管炎强毒株0.2ml(含104EID50)，观察10d，rHVT-GB-ILTVGB保护率达到100％。
表3rHVT-GB-ILTVGB对SPF鸡的免疫保护效果
| 组别 | 试验动物数 | 攻毒用毒株 | ILT发病数 | 保护率(％) |
| rHVT-GB-ILTVGB疫苗免疫组 | 20 | ILTV(北京株) | 0 | 100 |
| rHVT-GB疫苗免疫组 | 20 | ILTV(北京株) | 20 | 0 |
| -攻毒对照组 | 20 | ILTV(北京株) | 20 | 0 |
| 空白对照组- | 20 | - | 0 | - |
实施例8
——rHVT-GB-IBDVVP2疫苗对鸡预防IBD免疫保护效力评价
80只1日龄SPF鸡，随机分成4组,第1组接种rHVT-GB-IBDVVP2，免疫剂量为4000PFU/只，第2组接种rHVT-GB，免疫剂量为4000PFU/只，第3组为攻毒对照组(非免疫攻毒组)，第三组为空白对照(非免疫非攻毒)组。21日龄每只点眼攻击BC6/85株10个MID，72小时后剖检法氏囊，观察法氏囊病变。rHVT-GB-IBDVVP2免疫组保护17只。第2组(rHVT-GB免疫组)和第3组(攻毒对照组)法氏囊均发生病变(法氏囊出现浆膜呈胶冻样或有不同程度的出血)。
表4rHVT-GB-IBDVVP2对SPF鸡的免疫保护效果
| 组别 | 试验动物数 | 攻毒用毒株 | IBD病变数 | 保护率(％) |
| rHVT-GB-IBDVVP2疫苗免疫组 | 20 | IBDV BC6/85株 | 3 | 85 |
| rHVT-GB疫苗免疫组 | 20 | IBDV BC6/85株 | 20 | 0 |
| -攻毒对照组 | 20 | IBDV BC6/85株 | 20 | 0 |
| -空白对照组 | 20 | - | 0 | - |
序列表
<110> 北京邦卓生物科技有限公司
<120> 表达血清Ⅰ型MDV GB基因的HVT构建及其作为病毒活载体表达外源基因的应用
<130>
<160> 22
<170> Patentin version 3.5
<210> 1
<211> 3870
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 对人工序列的描述：构建rHVT-GB所用MDV1-GB表达盒序列
<400> 1
gacctccctt ggccatgatg aatggttgga gatggtaaaa tcggcatcaa gtgatgtagc 060
tcgtagacgt aaaatgtatg cagagcgttt aacaaagaag tccctagcga gtctggataa 120
atgtattacc gaacaaagac atgaactaga aaaaatgttg cgtgtgaatg tatatggcga 180
agtattgata gactcttata cggcattatt caatgggttc cgttccagga aaagattatt 240
ggaagcggtt aaaaattgct gtgcaaacat cattgataat cgtaatagtg acgatgcatt 300
tgatgctcat cggttcatgc aaacatcatt actgaaacac agaatagatc ctgctatgct 360
tccaagtctc actcacaaat tttttcaact tgtgaatgga ccgatgttta gtcacgatag 420
acatcggttc gcccagccgt cgaatacagc attatatttt agtgttgaaa atgtagggct 480
gcttcctcac ttaaaggagg aaatggctcg attcatgttt catagcagta gaaaaacaga 540
ttggaccgtc agtaagttta gagggtttta tgactttagc actatagata atgtaactgc 600
ggcccatcgc atggcttgga aatatatcaa agaactgatt tttgcaacag ctttattttc 660
ttctgtattt aaatgtggcg aattgcacat ctgtcgtgcc gacagtttgc agatcaacag 720
caatggagac tatgtatgga aaaatggaat atatataaca tatgaaaccg aatatccact 780
tataatgatt ctggggtcag aatcaagcac ttcagaaacg caaaatatga ctgcaattat 840
tgatacagat gttttttcgt tgctttattc tattttgcag tatatggccc ccgttacggc 900
agatcaggtg cgagtagaac agattaccaa cagccacgcc cccatctgac ccgtccaata 960
ttcttgtgtc cctgcatttt atctcacaca atttatgaac agcatcatta agatcatctc 1020
actatgcact attttaggcg gaattgcatt tttttcctta tagttattct atatggtacg 1080
aactcatctc cgagtaccca aaatgtgaca tcaagagaag ttgtttcgag cgtccagttg 1140
tctgaggaag agtctacgtt ttatctttgt cccccaccag tgggttcaac cgtgatccgt 1200
ctagaaccgc cgcgaaaatg tcccgaacct agaaaagcca ccgagtgggg tgaaggaatc 1260
gcgatattat ttaaagagaa tatcagtcca tataaattta aagtgacgct ttattataaa 1320
aatatcattc agacgacgac atggacgggg acgacatata gacagatcac taatcgatat 1380
acagatagga cgcccgtttc cattgaagag atcacggatc taatcgacgg caaaggaaga 1440
tgctcatcta aagcaagata ccttagaaac aatgtatatg ttgaagcgtt tgacagggat 1500
gcgggagaaa aacaagtact tctaaaacca tcaaaattca acacgcccga atctagggca 1560
tggcacacga ctaatgagac gtataccgtg tggggatcac catggatata tcgaacggga 1620
acctccgtca attgtatagt agaggaaatg gatgcccgct ctgtgtttcc gtattcatat 1680
tttgcaatgg ccaatggcga catcgcgaac atatctccat tttatggtct atccccacca 1740
gaggctgccg cagaacccat gggatatccc caggataatt tcaaacaact agatagctat 1800
ttttcaatgg atttggacaa gcgtcgaaaa gcaagccttc cagtcaagcg taactttctc 1860
atcacatcac acttcacagt tgggtgggac tgggctccaa aaactactcg tgtatgttca 1920
atgactaagt ggaaagaggt gactgaaatg ttgcgtgcaa cagttaatgg gagatacaga 1980
tttatggccc gtgaactttc ggcaacgttt atcagtaata cgactgagtt tgatccaaat 2040
cgcatcatat taggacaatg tattaaacgc gaggcagaag cagcaatcga gcagatattt 2100
aggacaaaat ataatgacag tcacgtcaag gttggacatg tacaatattt cttggctctc 2160
gggggattta ttgtagcata tcagcctgtt ctatccaaat ccctggctca tatgtacctc 2220
agagaattga tgagagacaa caggaccgat gagatgctcg acctggtaaa caataagcat 2280
gcaatttata agaaaaatgc tacctcattg tcacgattgc ggcgagatat tcgaaatgca 2340
ccaaatagaa aaataacatt agacgacacc acagctatta aatcgacatc gtctgttcaa 2400
ttcgccatgc tccaatttct ttatgatcat atacaaaccc atattaatga tatgtttagt 2460
aggattgcca cagcttggtg cgaattgcag aatagagaac ttgttttatg gcacgaaggg 2520
ataaagatta atcctagcgc tacagcgagt gcaacattag gaaggagagt ggctgcaaag 2580
atgttggggg atgtcgctgc tgtatcgagc tgcactgcta tagatgcgga atccgtcact 2640
ttgcaaaatt ctatgcgagt tatcacatcc actaatacat gttatagccg accattggtt 2700
ctattttcat atggagaaaa ccaaggaaac atacagggac aactcggtga aaacaacgag 2760
ttgcttccaa cgctagaggc tgtagagcca tgctcggcta atcatcgtag atattttctg 2820
tttggatccg gttatgcttt atttgaaaac tataattttg ttaagatggt agacgctgcc 2880
gatatacaga ttgctagcac atttgtcgag cttaatctaa ccctgctaga agatcgggaa 2940
attttgcctt tatccgttta cacaaaagaa gagttgcgtg atgttggtgt attggattat 3000
gcagaagtag ctcgccgcaa tcaactacat gaacttaaat tttatgacat aaacaaagta 3060
atagaagtgg atacaaatta cgcgtttatg aacggtttgg ccgaattgtt taacggtatg 3120
ggtcaggtag ggcaagctat aggcaaagtt gtagtagggg ctgccggtgc aatcgtatct 3180
accatatctg gtgtctctgc tttcatgtca aatccctttg gggctttggc aatcggttta 3240
atcattatag caggactcgt ggctgcattt ttagcatatc gttatgtaaa caagcttaaa 3300
agcaatccaa tgaaagccct ttatcctatg acaacagaag tgcttaaggc acaggcaacg 3360
cgtgagttgc atggcgagga atcagatgat ttggaacgaa catctattga tgaaagaaaa 3420
ttagaagaag ctagagaaat gataaaatat atggcgttag tctccgcgga agaacgccac 3480
gagaaaaaac tgcggagaaa gaggcgaggc actaccgccg ttctatcgga ccacctggca 3540
aaaatgagga ttaaaaatag taaccctaaa tatgataagt tacctactac atattcagac 3600
tcagaagatg atgctgtgta agtgggcact attatatttg aactgaataa aacgcataga 3660
gcatgatatg gtttactcat ttattgcgag atataaagca tattcaatac gatatattgc 3720
gaacgtgatg ctaaaaacat agctccctgt attattgatg cgccatcatt tgattaataa 3780
atacatcgac gccggcatca ctggtgcggt gtataccagc tacggcgcta gcattcatgg 3840
tatcccgtga ttgctcgatg ctttccttct 3870
<210> 2
<211> 1391
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 对人工序列的描述：构建重组火鸡疱疹病毒rHVT-GB-NDVF、rHVT-GB-ILTVGB和rHVT-GB-IBDVVP2所用启动子序列
<400> 2
aactccgccc gttttatgac tagaaccaat agtttttaat gccaaatgca ctgaaatccc 060
ctaatttgca aagccaaacg ccccctatgt gagtaatacg gggacttttt acccaatttc 120
ccaagcggaa agccccctaa tacactcata tggcatatga atcagcacgg tcatgcactc 180
taatggcggc ccatagggac tttccacata gggggcgttc accatttccc agcatagggg 240
tggtgactca atggccttta cccaagtaca ttgggtcaat gggaggtaag ccaatgggtt 300
tttcccatta ctggcaagca cactgagtca aatgggactt tccactgggt tttgcccaag 360
tacattgggt caatgggagg tgagccaatg ggaaaaaccc attgctgcca agtacactga 420
ctcaataggg actttccaat gggtttttcc attgttggca agcatataag gtcaatgtgg 480
gtgagtcaat agggactttc cattgtattc tgcccagtac ataaggtcaa tagggggtga 540
atcaacagga aagtcccatt ggagccaagt acactgcgtc aatagggact ttccattggg 600
ttttgcccag tacataaggt caatagggga tgagtcaatg ggaaaaaccc attggagcca 660
agtacactga ctcaataggg actttccatt gggttttgcc cagtacataa ggtcaatagg 720
gggtgagtca acaggaaagt cccattggag ccaagtacat tgagtcaata gggactttcc 780
aatgggtttt gcccagtaca taaggtcaat gggaggtaag ccaatgggtt tttcccatta 840
ctggcacgta tactgagtca ttagggactt tccaatgggt tttgcccagt acataaggtc 900
aataggggtg aatcaacagg aaagtcccat tggagccaag tacactgagt caatagggac 960
tttccattgg gttttgccca gtacaaaagg tcaatagggg gtgagtcaat gggtttttcc 1020
cattattggc acgtacataa ggtcaatagg ggtgagtcat tgggtttttc cagccaattt 1080
aattaaaacg ccatgtactt tcccaccatt gacgtcaatg ggctattgaa actaatgcaa 1140
cgtgaccttt aaacggtact ttcccatagc tgattaatgg gaaagtaccg ttctcgagcc 1200
aatacacgtc aatgggaagt gaaagggcag ccaaaacgta acaccgcccc ggttttcccc 1260
tggaaattcc atattggcac gcattctatt ggctgagctg cgttctacgt gggtataaga 1320
ggcgcgacca gcgtcggtac cgtcgcagtc ttcggtctga ccaccgtaga acgcagagct 1380
cctcgctgca g 1391
<210> 3
<211> 1662
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 对人工序列的描述：NDV-F基因序列
<400> 3
atgggctcca aaccttctac caggatccca gcacctctga tgctggtcac ccggattatg 060
ctgatattag gctgtattcg ttcgacaagc tctcttgacg gcaggcctct tgcagctgca 120
ggaattgtag taacaggaga taaggcagtc aatgtataca cctcgtctca gacagggtca 180
atcatagtca agttgctccc gaatatgccc agggataagg aggcgtgtgc gaaagcccca 240
ttagaggcat ataacagaac actgactact ttgctcactc ctcttggcga ctccatccgc 300
aagattcaag ggtctgtgtc cacgtctgga ggagggagac aggggcgcct tataggtgct 360
gttattggca gtgtagctct tggggttgca acagcggcac agataacagc agctgcggcc 420
ctaatacaag ccaacaagaa tgctgccaac atccttcggc ttaaggagag cattgctgca 480
accaatgaag ctgtgcatga agtcaccgac ggattatcac aactatcagt ggcagttggg 540
gagatgcagc agtttgtcaa tgaccagttt aataatacgg cgcgagaatt ggactgtata 600
aaaatcacac aacaggttgg tgtagaactc aacctatacc taactgaatt gactacagta 660
ttcgggccac agatcacctc tcctgcatta actcagctga ccatccaggc actttataat 720
ttagctggtg gcaatatgga ttacttatta actaagttag gtatagggaa caatcaactc 780
agctcattaa ttggtagcgg cctgatcact ggttacccta tactgtatga ctcacagact 840
caactcttgg gcatacaagt gaatttgccc tcagtcggga acttaaataa tatgcgtgcc 900
acctatttgg agaccttatc tgtgagtaca accaaaggat atgcctcagc acttgtcccg 960
aaagtagtga cacaagtcgg ttctgtgata gaagagcttg acacctcaca ctgtatagag 1020
tccgatctgg atttatattg tactagaata gtgacattcc ccatgtcccc aggtatttat 1080
tcctgtttga gcggcaacac atcagcttgc atgtattcaa agactgaagg cgcactcact 1140
acgccgtata tggcccttaa aggctcagtt attgccaatt gtaagataac aacatgtaga 1200
tgtacagacc ctcctggtat catatcgcaa aattatggag aagctgtatc cctgatagat 1260
agacattcgt gcaatgtctt atcattagac gggataactc tgaggctcag cggagaattt 1320
gatgcaactt atcaaaagaa catctcaata ctagattctc aagtcatcgt gacaggcaat 1380
cttgatatat caaccgaact tggaaacgtc aacaattcaa tcagcaatgc cttggataag 1440
ttggcagaaa gcaacagtaa gatagaaaaa gtcaatgtca gattaaccag cacatctgct 1500
ctcattacct atattgttct aactgtcatt tctctatttt tcggtgcact taatctgggt 1560
ttagcgtgtt acctgatgta caaacagaag gcacaacaaa agaccttgct atggcttggg 1620
aataatgccc ttgatcagat gagagccact acaagagcat ga 1662
<210> 2
<211> 2652
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 对人工序列的描述：ILTV-GB基因序列
<400> 4
atgcaatcct acatcgccgt gaacattgac atggctagct tgaaaatgct gatctgcgtg 060
tgcgtggcaa tcctgatccc atctacccta tctcaagatt cacacggaat tgctggaata 120
atagaccctc gtgatacagc cagcatggat gttggaaaaa tctctttctc cgaagccatt 180
gggtcggggg caccgaaaga accccagatt agaaacagaa tttttgcgtg ctcatctcca 240
actggcgcca gtgttgcgag gcttgcccag ccacgacatt gtcaccgaca tgccgattcg 300
actaacatga ctgaaggaat tgccgtagtc ttcaagcaaa acattgcccc gtacgtcttt 360
aatgtgactc tatactataa acatataacc acagttacta cgtgggcatt attctcaaga 420
ccccaaataa caaatgagta cgtgaccagg gttccaatag actatcatga aattgtcagg 480
attgatcgat cgggagaatg ctcatccaaa gcaacgtatc ataaaaattt catgtttttt 540
gaagcttacg acaatgatga agcagaaaaa aaattgcccc tggttccatc actgttaaga 600
tcaactgtct ccaaggcgtt tcatacaact aactttacta agcgacatca aaccctggga 660
taccgaacgt ctacatcggt cgactgtgtt gtggaatatc tacaggctag atctgtatac 720
ccgtatgatt actttggaat ggcgacaggt gatacagtag aaatttctcc tttttatacc 780
aaaaacacga ccggaccaag gcgtcacagt gtctacagag actatagatt tctcgaaatc 840
gcaaattatc aagtcaggga tttggaaacc ggacaaataa gaccccctaa aaaaagaaac 900
tttctaacag atgaacaatt cactataggc tgggatgcaa tggaagaaaa ggaatctgta 960
tgtactctca gtaaatggat tgaagtcccg gaagcagttc gtgtttcgta caaaaacagt 1020
taccactttt cacttaaaga tatgactatg acgttctcgt ccggaaaaca accttttaac 1080
atcagcaggc ttcatttggc tgaatgcgtt cctaccatag cctcggaggc catagatggc 1140
atctttgcca gaaagtatag ttcgactcat gtccgttctg gggacatcga atactatctc 1200
ggtagtggcg gatttctgat cgcatttcag aaactcatga gccatggctt ggctgaaatg 1260
tacctagaag aggcacaaag acaaaatcat ctcccgagag ggagagagcg tcgccaagcc 1320
gcaggtcgcc gcacggcgtc gctgcagtct ggacctcagg gtgatagaat tactacccac 1380
agttctgcaa catttgccat gttacaattt gcatacgaca aaatccaagc ccatgttaac 1420
gagcttatcg gaaatttgtt ggaagcgtgg tgtgagcttc agaaccgcca actgattgta 1500
tggcatgaga tgaagaaact aaacccgaac tcactgatga catctttgtt cggacaacct 1560
gtaagcgcca ggctattggg agacatcgta gcggtatcaa aatgtataga aattccaatc 1620
gaaaatatta ggatgcagga ttccatgcgc atgccagggg acccaaccat gtgctatacc 1680
agaccagtac ttattttcag gtattcgtcc tcccctgagt cacagttttc tgcgaactca 1740
acagaaaacc acaatcttga catattaggc caactcggag aacataatga aattttacaa 1800
gggcggaatt tgatagaacc atgcatgatc aatcacagac ggtactttct gttgggagaa 1860
aactaccttc tttacgaaga ctatacattt gttagacaag taaatgcttc cgagatcgaa 1920
gaagtgagca tattcatcaa cttgaacgcc actatactag aagatttgga ctttgtgccc 1980
gtcgaagtat acactcgcga ggaactcaga gatactggga ctttaaacta tgatgatgtg 2040
gtcagatatc aaaatattta taacaaaagg ttcagagaca ttgacactgt aatacgtgga 2100
gataggggag atgcaatctt tagagcaata gcagattttt ttggcaacac tcttggagaa 2160
gtaggaaagg cattgggaac tgtagtgatg acagccgcgg cagcagtaat ttctacagta 2220
tctggcatcg cctcatttct ttctaacccg ttcgccgcac tcggaattgg gatagcggtg 2280
gtggtgagca ttattttagg actgctggcg ttcaaatatg taatgaacct gaaatcaaac 2340
ccagttcagg ttctgttccc aggcgcagtt cccccggccg gaactcctcc acgaccctct 2400
agacgttact acaaggatga ggaggaggtt gaggaggata gtgatgagga cgacaggata 2460
cttgccacca gagttctgaa aggccttgag cttctacaca aggatgaaca gaaagctcga 2520
agacagaaag cgcggttttc tgcttttgct aaaaatatga gaaacctatt tcgcagaaaa 2580
ccccgaacca aggaagatga ctaccccctg ctcgaatacc cttcgtgggc agaagaaagc 2640
gaagacgaat aa 2652
<210> 5
<211> 1359
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 对人工序列的描述：IBDV-VP2基因序列
<400> 5
Atgacaaacc tgcaagatca aacccaacag attgttccgt tcatacggag ccttctgatg 060
Ccaacaaccg gaccggcgtc cattccggac gacaccctgg agaagcacac tctcaggtca 120
Gagacctcga cctacaattt gactgtgggg gacacagggt cagggctaat tgtctttttc 180
Cctggattcc ctggctcaat tgtgggtgct cactacacac tgcagagcaa tgggaactac 240
Aagttcgatc agatgctcct gactgcccag aacctaccgg ccagctacaa ctactgcaga 300
Ctagtgagtc ggagtctcac agtgaggtca agcacactcc ctggtggcgt ttatgcacta 360
Aacggcacca taaacgccgt gaccttccaa ggaagcctga gtgaactgac agatgttagc 420
tacaatgggt tgatgtctgc aacagccaac atcaacgaca aaattgggaa tgtcctggta 480
ggggaagggg tcactgtcct cagcctaccc acatcatatg atcttgggta tgtgaggctt 540
ggtgacccca ttcccgctat agggcttgac ccaaaaatgg tagctacatg cgacagcagt 600
gacaggccca gagtctacac cataactgca gccgatgatt accaattctc atcacagtac 660
caaccaggtg gggtaacaat cacactgttc tcagccaaca ttgatgctat cacaagcctc 720
agcattgggg gagagctcgt gtttcaaaca agcgtccaag gccttgtact gggcgccacc 780
atctacctta taggctttga tgggactgcg gtaatcacca gagctgtagc cgcagataat 840
gggctgacgg ccggcaccga caatcttatg ccattcaatc ttgtcattcc aaccaatgag 900
ataacccagc caatcacatc catcaaactg gagatagtga cctccaaaag tggtggtcag 960
gcaggggatc agatgtcatg gtcggcaagt gggagcctag cagtgacgat ccatggtggc 1020
aactatccag gggccctccg tcccgtcaca ctagtagcct acgaaagagt ggcaacagga 1080
tccgtcgtta cggtcgctgg ggtgagtaac ttcgagctga ttccaaatcc tgaactagca 1140
aagaacctgg ttacagaata cggccgattt gacccaggag ccatgaacta cacaaaattg 1200
atactgagtg agagggaccg tcttggcatc aagaccgtct ggccaacaag ggagtacact 1260
gattttcgtg agtacttcat ggaggtggcc gacctcaact ctcccctgaa gattgcagga 1320
gcatttggct tcaaagacat aatccgggct ataaggagg 1359
<210> 6
<211> 232
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 对人工序列的描述：PolyA序列
<400> 6
tctagagcgg ccgcggggat ccagacatga taagatacat tgatgagttt ggacaaacca 060
Caactagaat gcagtgaaaa aaatgctcta tttgtgaaat ttgtgatgct attgctttat 120
ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag ttaacaacaa caattgcatt catcttatgt 180
ttcaggttca gggggaggtg tgggaggttt tttcggatcc tctagagtcg ac 232
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 对人工序列的描述：扩增后US2基因左右臂序列的引物HVT-US2 leftsense
<400> 7
GATgaattcA CATCGGGCCA CGTTCCGCC-3 29
<210> 8
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 对人工序列的描述：扩增后US2基因左右臂序列的引物 HVT-US2 leftantisense
<400> 8
ATAGTCGACt taattaaGAT GAGCTGACGT GTGGAAT-3 37
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 对人工序列的描述：扩增后US2基因左右臂序列的引物HVT-US2 rightsense
<400> 9
ATCgtcgacA CTAATATGGG CACACCCAC-3 29；
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 对人工序列的描述：扩增后US2基因左右臂序列的引物HVT-US2 rightantisense
<400> 10
ATCaagcttT GGCCCATCTA GGTGATTAT-3 29
<210> 11
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 对人工序列的描述：MDV1-GB基因上游引物MDV1-GB-F
<400> 11
cggTTAATTA Agacctccct tggccatgat gaatgg 36
<210> 12
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 对人工序列的描述：MDV1-GB基因的下游引物MDV1-GB-R
<400> 12
ccgTTAATTA Aagaaggaaa gcatcgagca atcac（两端加入了PACI酶切位点） 36
<210> 13
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 对人工序列的描述：扩增左同源臂上游引物HVT-L-F
<400> 13
gttccttgaa atgccgacaa ctctaaaaac ggtattcg 38
<210> 14
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 对人工序列的描述：扩增左同源臂下游引物HVT-L-R
<400> 14
GCTAGCGCGG CCGCGAATTC gtttaatgtt agtttatt (下游引物5’端含有Nhe I/NotI/EcoRI酶切位点) 38
<210> 15
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 对人工序列的描述：扩增启动子的上游引物PRO-F
<400> 15
GGGGAATTCA CTAGTGGATC CCCCAACTCC GCCCGTTTTA TGACTAGA (EcoRI) 48
<210> 16
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 对人工序列的描述： 扩增启动子的下游引物PRO-R
<400> 16
AAATTGCGGC CGCCTGCAGC GAGGAGCTCT GCGTTCTACG GTGGT(Not I) 45
<210> 17
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 对人工序列的描述：扩增Vp2基因的上游引物Vp2-F
<400> 17
aatGCGGCCG CTCTAGAACT CGTCGATCGC AGCGATGACA AACCTGCAAG (Not I) 50
<210> 18
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 对人工序列的描述：扩增VP2基因的下游引物Vp2-R
<400> 18
GGCGCTAGCA AGCTTACCTC CTTATAGCCC GGATTATGTC TTTGAAGCCA (HindIII/NheI) 50
<210> 19
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 对人工序列的描述：扩增polyA的上游引物polyA-F
<400> 19
AATAAGCTTG ATCTAGAGCG GCCGCGG (HindIII) 27
<210> 20
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 对人工序列的描述：扩增polyA的下游引物polyA-R
<400> 20
AATGCTAGCG TCGACTCTAG AGGATCCG (Sal I/Nhe I) 28
<210> 21
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 对人工序列的描述：扩增右同源臂的上游引物HVT-R-F
<400> 21
GGCGGTCGAC aattatttta tttaat 26
<210> 22
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 对人工序列的描述：扩增右同源臂的下游引物HVT-R-R
<400> 22
GGCGCTAGCc tagtgtttca attat 25
4
Claims (14)
1.一种表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒，其特征在于该表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒被命名为火鸡疱疹病毒(Herpesvirusof turkey)rHVT-GB株重组病毒，该毒株已于2017年01月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为：CGMCC No.13400。
2.如权利要求1所述的一种表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒的构建，其特征在于：将血清Ⅰ型MDV的GB基因表达盒重组到HVT基因组中，重组位点为HVT(GenBank:AF291866.1)基因组的位于HVT087-HVT088基因之间的US2区域，该表达盒的基因序列如Seq ID No:1所示。
3.如权利要求1所述的一种表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其特征在于该重组毒株在鸡体中诱导抗马立克氏病的保护性免疫中的应用。
4.如权利要求1和3所述的一种表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其特征在于该重组毒株作为生产毒株在动物疫苗株的应用。
5.如权利要求1和3所述的一种表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其特征在于将该重组病毒作为病毒载体构建新的重组疫苗病毒中的应用。
6.如权利要求1和5所述特征在的一种表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其于将新城疫病毒的F基因表达盒重组到rHVT-GB基因组中，重组位点为HVT(GenBank:AF291866.1)基因组的HVT065和HVT066之间，其中F基因表达盒的启动子序列如Seq ID No:2所示；F基因序列如Seq ID No:3所示；PolyA序列如Seq ID No:6所示，构建获得的重组病毒被命名为火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of turkey)rHVT-GB-NDVF株重组病毒，该毒株已于2017年01月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为：CGMCCNo.13399。
7.如权利要求6所述特征在的一种表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其于重组火鸡疱疹病毒rHVT-GB-NDVF株在鸡中诱导抗马立克氏病和鸡新城疫的保护性免疫中的应用、并作为生产毒株在相应动物疫苗中的应用。
8.如权利要求7所述特征在的一种表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其于重组火鸡疱疹病毒rHVT-GB-NDVF株作为病毒载体构建新的重组疫苗病毒的应用。
9.如权利要求1和5所述特征在的一种表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其特征在于将鸡传染性喉气管炎病毒的GB基因表达盒重组到rHVT-GB基因组中，重组位点为HVT(GenBank:AF291866.1)基因组的HVT065和HVT066之间，ILTV-GB基因表达盒的启动子序列如Seq ID No:2所示，GB基因序列如Seq ID No:4所示，PolyA序列如Seq ID No:6所示；获得被命名为火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of turkey)rHVT-GB-ILTVGB株重组病毒，该毒株已于2017年01月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为：CGMCCNo.13398。
10.如权利要求9所述一种表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其特征在于其中的重组火鸡疱疹病毒rHVT-GB-ILTVGB株在鸡中诱导抗马立克氏病和鸡传染性喉气管炎的保护性免疫中的应用、并作为生产毒株在相应动物疫苗中的应用。
11.如权利要求9所述一种表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其特征在于其中的重组火鸡疱疹病毒rHVT-GB-ILTVGB株作为病毒载体构建新的重组疫苗病毒的应用。
12.如权利要求1和5所述一种表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其特征在于将鸡传染性法氏囊病毒的VP2基因表达盒重组到rHVT-GB基因组中，重组位点为HVT(GenBank:AF291866.1)基因组的HVT065和HVT066之间,VP2基因表达盒的启动子序列如Seq ID No:2所示，VP2基因序列如Seq ID No:5所示，PolyA序列如Seq ID No:6所示；获得被命名为火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of turkey)rHVT-GB-IBDVVP2株重组，该毒株已于2017年01月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为：CGMCC No.13397。
13.如权利要求12所述的一种表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其特征在于其中重组火鸡疱疹病毒rHVT-GB-IBDVVP2株在鸡中诱导抗鸡马立克氏病和传染性法氏囊病的保护性免疫中的应用、并作为生产毒株在相应动物疫苗中的应用。
14.如权利要求12所述的一种表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其特征在于其中重组火鸡疱疹病毒rHVT-GB-IBDVVP2株作为病毒载体构建新的重组疫苗病毒的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710046543.0A CN106701693A (zh) | 2017-01-19 | 2017-01-19 | 表达血清ⅰ型马立克氏病病毒gb基因的重组火鸡疱疹病毒的构建及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710046543.0A CN106701693A (zh) | 2017-01-19 | 2017-01-19 | 表达血清ⅰ型马立克氏病病毒gb基因的重组火鸡疱疹病毒的构建及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106701693A true CN106701693A (zh) | 2017-05-24 |
Family
ID=58909361
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710046543.0A Pending CN106701693A (zh) | 2017-01-19 | 2017-01-19 | 表达血清ⅰ型马立克氏病病毒gb基因的重组火鸡疱疹病毒的构建及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106701693A (zh) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107099513A (zh) * | 2017-06-22 | 2017-08-29 | 北京邦卓生物科技有限公司 | 一种共表达ndv hn和ibdv vp2基因的hvt的构建及其应用 |
| WO2018112051A1 (en) * | 2016-12-14 | 2018-06-21 | Merial, Inc. | Recombinant hvt vectors expressing multiple antigens of avian pathogens, and vaccines comprising them |
| WO2020127964A1 (en) * | 2018-12-21 | 2020-06-25 | Ceva Sante Animale | Recombinant avian herpes viruses containing multiple foreign genes |
| RU2812979C2 (ru) * | 2018-12-21 | 2024-02-06 | Сева Санте Анималь | Рекомбинантные вирусы птичьего герпеса, содержащие несколько чужеродных генов |
| CN118272324A (zh) * | 2024-02-26 | 2024-07-02 | 中国农业大学 | 表达禽腺病毒血清4型纤突蛋白的重组火鸡疱疹病毒、用途和疫苗 |
| CN119639689A (zh) * | 2024-03-12 | 2025-03-18 | 中国农业大学 | 共表达禽流感H9基因和禽腺病毒4型Fiber-2基因的重组火鸡疱疹病毒、用途 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1192783A (zh) * | 1995-07-07 | 1998-09-09 | 日本是恩株式会社 | 马立克氏病病毒基因及其在抗马立克氏病的保护性疫苗中的应用 |
| CN105920598A (zh) * | 2011-11-30 | 2016-09-07 | 梅里亚有限公司 | 表达禽类病原体的抗原的重组hvt载体及其用途 |
-
2017
- 2017-01-19 CN CN201710046543.0A patent/CN106701693A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1192783A (zh) * | 1995-07-07 | 1998-09-09 | 日本是恩株式会社 | 马立克氏病病毒基因及其在抗马立克氏病的保护性疫苗中的应用 |
| CN105920598A (zh) * | 2011-11-30 | 2016-09-07 | 梅里亚有限公司 | 表达禽类病原体的抗原的重组hvt载体及其用途 |
Non-Patent Citations (10)
Cited By (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP4085928A1 (en) * | 2016-12-14 | 2022-11-09 | Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. | Recombinant hvt vectors expressing multiple antigens of avian pathogens, and vaccines comprising them |
| EP4112072A1 (en) * | 2016-12-14 | 2023-01-04 | Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. | Recombinant hvt vectors expressing multiple antigens of avian pathogens, and vaccines comprising them |
| US12385068B2 (en) | 2016-12-14 | 2025-08-12 | Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. | Recombinant HVT vectors expressing multiple antigens of avian pathogens and uses thereof |
| WO2018112051A1 (en) * | 2016-12-14 | 2018-06-21 | Merial, Inc. | Recombinant hvt vectors expressing multiple antigens of avian pathogens, and vaccines comprising them |
| US10822620B2 (en) | 2016-12-14 | 2020-11-03 | Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. | Recombinant HVT vectors expressing multiple antigens of avian pathogens and uses thereof |
| CN107099513B (zh) * | 2017-06-22 | 2020-07-14 | 北京邦卓生物科技有限公司 | 一种共表达ndv hn和ibdv vp2基因的hvt的构建及其应用 |
| CN107099513A (zh) * | 2017-06-22 | 2017-08-29 | 北京邦卓生物科技有限公司 | 一种共表达ndv hn和ibdv vp2基因的hvt的构建及其应用 |
| CN113226363A (zh) * | 2018-12-21 | 2021-08-06 | 法国诗华大药厂 | 含有多个外来基因的重组禽疱疹病毒 |
| US20220040287A1 (en) * | 2018-12-21 | 2022-02-10 | Ceva Sante Animale | Recombinant avian herpes viruses containing multiple foreign genes |
| JP2022515172A (ja) * | 2018-12-21 | 2022-02-17 | セヴァ サンテ アニマレ | 複数の外来遺伝子を含む組換えトリヘルペスウイルス |
| RU2812979C2 (ru) * | 2018-12-21 | 2024-02-06 | Сева Санте Анималь | Рекомбинантные вирусы птичьего герпеса, содержащие несколько чужеродных генов |
| CN113226363B (zh) * | 2018-12-21 | 2024-08-23 | 法国诗华大药厂 | 含有多个外来基因的重组禽疱疹病毒 |
| JP7590329B2 (ja) | 2018-12-21 | 2024-11-26 | セヴァ サンテ アニマレ | 複数の外来遺伝子を含む組換えトリヘルペスウイルス |
| WO2020127964A1 (en) * | 2018-12-21 | 2020-06-25 | Ceva Sante Animale | Recombinant avian herpes viruses containing multiple foreign genes |
| CN118272324A (zh) * | 2024-02-26 | 2024-07-02 | 中国农业大学 | 表达禽腺病毒血清4型纤突蛋白的重组火鸡疱疹病毒、用途和疫苗 |
| CN119639689A (zh) * | 2024-03-12 | 2025-03-18 | 中国农业大学 | 共表达禽流感H9基因和禽腺病毒4型Fiber-2基因的重组火鸡疱疹病毒、用途 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106701693A (zh) | 表达血清ⅰ型马立克氏病病毒gb基因的重组火鸡疱疹病毒的构建及其应用 | |
| CN107099513B (zh) | 一种共表达ndv hn和ibdv vp2基因的hvt的构建及其应用 | |
| CN102363769A (zh) | 鸡马立克氏病毒Meq基因缺失疫苗株，其构建方法及应用 | |
| CN117551699B (zh) | 一种重组火鸡疱疹病毒rHVT-HA-VP2的构建方法 | |
| CN102220287B (zh) | 鸡传染性支气管炎冷适应致弱疫苗株及其应用 | |
| CN101514334A (zh) | 鸡传染性支气管炎病毒弱毒疫苗株及其应用 | |
| WO2021103421A1 (zh) | 基因vii型新城疫病毒弱毒株及其应用 | |
| CN102628053A (zh) | 重组鸡马立克氏病病毒sc9-1株和sc9-2株的构建和应用 | |
| CN103740759B (zh) | 表达h5n1亚型禽流感病毒ha基因的重组火鸡疱疹病毒 | |
| CN110343671A (zh) | 一种表达vp2基因的重组ⅰ型马立克氏病病毒疫苗毒株 | |
| CN102634489B (zh) | 一种重组火鸡疱疹病毒及其应用 | |
| CN103382460B (zh) | 一株马立克氏病病毒疫苗株及其分离鉴定和应用 | |
| CN102559610A (zh) | 表达禽流感病毒血凝素（HA）基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株（rDEVus78Ha）及其构建方法和应用 | |
| CN111593027A (zh) | 一种草鱼呼肠孤病毒ⅱ型弱毒株及其应用 | |
| CN106754761A (zh) | 一种重组马立克氏病病毒meq和vIL‑8双基因缺失株的构建及其应用 | |
| CN103224913A (zh) | 一种鸭瘟活疫苗及其制备方法 | |
| CN102399756A (zh) | 鸡马立克氏病病毒miRNA缺失疫苗株及其应用 | |
| CN114395536B (zh) | 一种禽腺病毒4、8和11型三价疫苗及其制备方法和应用 | |
| CN107296956A (zh) | 一种基因重组活载体疫苗 | |
| CN103589693A (zh) | 一种表达ibdv vp2和法氏囊素三肽嵌合蛋白重组火鸡疱疹病毒 | |
| CN100516198C (zh) | 一种利用基因重组技术获得粗糙型布氏杆菌及其疫苗的生产方法 | |
| CN108342367B (zh) | 一种重组马立克病毒毒株sca13株及其应用 | |
| CN103160474A (zh) | 肠道病毒71型病毒株、疫苗、动物模型建立方法 | |
| CN101974472A (zh) | 迟钝爱德华氏菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株、相关制剂及其应用 | |
| CN110499296A (zh) | 一种耐热的血清8b型禽腺病毒基因工程疫苗候选株及其构建方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20170524 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |