RS59861B1 - Nova imunoterapija protiv nekoliko tumora kao što su karcinom pluća, uključujući nsclc - Google Patents

Description

Opis

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na peptide, nukleinske kiseline i ćelija za korišćene u imunoterapeutskim metodama. Konkretno, predmetni pronalazak se odnosi na imunoterapiju karcinoma. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptidni epitop citotoksi čne T ćelije (CTL) povezane sa tumorom, sam ili u kombinaciji sa drugim peptidima povezanim sa tumorom koji slu že kao aktivni farmaceutski sastojak vakcinskih kompozicija koje stimulišu antitumorske imune odgovore. Predmetna objava se odnosi na 67 peptidnih sekvenci i njihovih varijanti dobijenih iz HLA I klase i HLA II klase molekula ljudskih ćelija tumora koje se mogu koristiti u vakcinskim kompozicijama za izazivanje antitumorskih imunih odgovora.

Pozadina pronalaska

[0002] Karcinom pluća je odgovoran za najveći broj smrtnih slučajeva povezanih sa karcinomom i kod oba pola. Na globalnom nivou karcinom pluća je najčešći karcinom kako u pogledu učestalosti tako i u pogledu smrtnosti. U 2008, zabeleženo je 1,61 milion novih slučajeva, i 1,38 miliona smrtnih slučajeva izazvanih karcinomom pluća. Najviše stope su u Evropi i u Severnoj Americi.

[0003] Od 1987, više žena je umrlo svake godine od karcinoma pluća nego od karcinoma dojke. Stope smrtnosti su nastavile značajno da opadaju kod muškaraca od 1991-2003 za oko 1,9% godišnje. Stope smrtnosti kod žena se približavaju fazi konstantnosti nakon kontinuiranog uvećavanja tokom nekoliko decenija. Ovi trendovi kod stope smrtnosti kod raka pluća odražavaju smanjenje stope pušenja tokom prethodnih 30 godina.

[0004] Procenjuje se da se očekuje 230.000 novih slučajeva karcinoma pluća i 160.000 smrtnih slučajeva usled karcinoma pluća u 2013. godini u Sjedinjenim Državama, prema Nacionalnom institutu za karcinom (NCI).

[0005] Karcinom pluća se klinički klasifikuje kao sitnoćelijski (13%, SCLC) ili nesitnoćelijski (87%, NSCLC) za svrhe lečenja. Prognoze su generalno loše. Od svih osoba sa karcinomom pluća, 15% preživi tokom pet godina nakon postavljanja dijagnoze. Faza bolesti je često uznapredovala u vreme postavljanja dijagnoze. U prezentaciji, 30-40% slučajeva NSCLC su IV faza, a 60% SCLC su IV faza.

[0006] Opcije lečenja se određuju prema vrsti (sitnoćelijski ili nesitnoćelijski) i fazi karcinoma i uključuju hirurgiju, radioterapiju, hemoterapiju, i ciljane biolo ške terapije kao što je bevacizumab (AVASTIN®) i erlotinib (TARCEVA®). Kod lokalizovanih karcinoma, kao tretman se obično bira hirurgija. Skorašnja istraživanja su pokazala da je preživljavanje kod nesitnoćelijskog karcinoma pluća rane faze poboljšano usled hemoterapije nakon hirurgije. Iz razloga što se bolest obično proširila do momenta otkrivanja, radioterapija i hemoterapija se često koriste, ponekada u kombinaciji sa hirurgijom. Hemoterapija sama ili u kombinaciji sa radijacijom je najčešći tretman izbora kod sitnoćelijskog karcinoma pluća; na ovom režimu, veliki broj pacijenata doživi remisiju, koja je dugotrajna u nekim slučajevima.

[0007] Jednogodišnje preživljavanje kod karcinoma pluća se neznatno uvećalo od 37% 1975-1979 do 42% u 2002, najviše usled poboljšanja kod hiruških tehnika i kombinovanih terapija. Ipak, stopa petogodišnjeg preživljavanja kod svih faza spojeno je svega 16%. Stopa preživljavanja je 49% kod slučajeva detektovanih dok je bolest još uvek lokalizovana; ipak, samo 16% karcinoma pluća se dijagnostikuje u ovoj ranoj fazi.

[0008] Uprkos navedenom u prethodnom tekstu, ostaje potreba za novom efikasnom i bezbednom opcijom za karcinome kao što je karcinom pluća, konkretno nesitnoćelijski karcinom pluća (NSCLC), karcinomi želuca i tumori mozga različitih fenotipova koja poboljšava stanje pacijenata nekorišćenjem prekomernih hemoterapijskih ili drugih agenasa koji mogu dovesti do ozbiljnih ne željenih efekata.

[0009] Guang-Hui Wang et al. (Oncology Lett, vol. 5, 21 November 2012, pages 544-548) otkriva značajno visoke ekspresione nivoe matrično-remodelirajućih povezanih 5 (MXRA5) u tkivima sveže kultiviranog kolorektalnog karcinoma (CRC). Ipak, ekspresioni nivoi MXRA5 i mRNK nisu prikazali značajnu razliku između CRC tkiva i njihovih odgovarajućih normalnih tkiva, niti je uočena značajna korelacija između imunoreaktivnog rezultata (IRS) i odgovarajuće relativne kvantitetne (RQ) vrednosti.

[0010] Slično, Buckanovich et al. (J Clin Oncology, vol. 25, no. 7, 1 March 2007, pages 852-861) je otkrio da je MXRA5 bilo prekomerno izražena kod karcinoma jajnika u poređenju sa normalnim jajnicima (putem qRT-PCR) i da je uključeno u angiogenezu tumora.

[0011] US 2011/229504 se odnosi na peptide koji su identifikovani kod gastrointestinalnog i karcinoma želuca. MXRA5 nije spomenuto.

[0012] Predmetni pronalazak koristi peptide koji stimulišu imuni sistem pacijenta i deluju kao antitumorski agensi na neinvazivni način.

Rezime pronalaska

[0013] U prvom aspektu predmetnog pronalaska, predmetni pronalazak se odnosi na peptid koji se sastoji od sekvence amino kiseline prema sekvencionom identifikacionom broju 5 (MXRA5-001), pri čemu pomenuti peptid ima mogućnost da se veže za molekul ljudskog glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) I klase.

[0014] Sledeće tabele prikazuju peptide kao što je opisano, njihov respektivni sekvencioni identifikacioni broj, i prospektivne izvorne proteine za ove peptide. Sekvencioni identifikacioni broj 5 je prema pronalasku. Svi peptidi u tabelama 1a, 1b i 1c se vezuju za HLA A ∗02 alele, peptidi u tabeli 1d se vezuju za HLA-DR alele. Peptidi u tabeli 1c su takođe korisni kod dijagnostikovanja i/ili lečenja karcinoma želuca i ili glioblastoma.

[0015] II klasa peptida u tabeli 1d je takođe korisna kod dijagnostikovanja i/ili tretmana karcinoma želuca i drugih karcinoma koji prekomerno izražavaju ili prezentuju MMP12 ili POSTN.

Tabela 1a: Peptidi kao što je opisano, sekvencioni identifikacioni broj 5 je prema pronalasku

Tabela 1b: Dodatni e tidi kao što e o isano

Tabela 1c: Dodatni e tidi koi su takođe rekomerno izraženi kod lioblastoma i/ili karcinoma želuca

Tabela 1d: Pe tidi MHC II klase kao što e o isano

Tabela 1e: Sledeći e tidi kako e o isano sa dodatnom abundanciom kod druih karcinoma

T l 1f l i i i k k i n n m n ni m k r ih krin m

[0016] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid prema predmetnom pronalasku, pri čemu pomenuti peptid uključuje nepeptidne veze.

[0017] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid prema predmetnom pronalasku, pri čemu je pomenuti peptid deo fuzionog proteina i fuzionisan za N-terminalne aminokiseline HLA-DR invarijantnog lanca (Ii) povezanog sa antigenom ili je fuzionisan za (ili u sekvencu) antitelo, kao što je, na primer, antitelo koje je specifično zbog dendritskih ćelija.

[0018] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na nukelinsku kiselinu, koja kodira peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom.

[0019] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu prema predmetnom pronalasku koja je DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihove kombinacije.

[0020] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ekspresioni vektor koji eksprimira nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom.

[0021] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom, nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom ili ekspresioni vektor u skladu sa predmetnim pronalaskom, za upotrebu u medicini.

[0022] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na antitela u skladu sa predmetnim pronalaskom, i metode njihovog stvaranja.

[0023] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na T-ćelijske receptore (TCR), naročito solubilne TCR (sTCR), u skladu sa predmetnim pronalaskom, i metode njihovog stvaranja.

[0024] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ćeliju domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom ili ekspresioni vektor kao što je ranije opisano.

[0025] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ćeliju domaćina u skladu sa predmetnim pronalaskom koja je ćelija koja predstavlja antigen.

[0026] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ćeliju domaćina u skladu sa predmetnim pronalaskom pri čemu ćelija koja predstavlja antigen je dendritska ćelija.

[0027] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod pravljenja peptida u skladu sa predmetnim pronalaskom, metod obuhvata kultivisanje ćelije domaćina u skladu sa predmetnim pronalaskom, i izolovanje peptida iz ćelije domaćina ili njegovog medijuma kulture.

[0028] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na in vitro metod za proizvodnju aktiviranih citotoksi čnih T limfocita (CTL), metod obuhvata kontaktovanje in vitro CTL sa ljudskim MHC molekulima I klase napunjenih antigenom eksprimiranih na površini pogodne ćelije koja predstavlja antigen tokom perioda vremena koji je dovoljan za aktivaciju pomenutih CTL na antigenski određeni način, pri čemu pomenuti antigen je bilo koji peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom.

[0029] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod u skladu sa predmetnim pronalaskom pri čemu antigen je ubačen u MHC molekule I klase eksprimirane na površini pogodne ćelije koja predstavlja antigen kontaktovanjem dovoljne količine antigena sa ćelijom koja predstavlja antigen.

[0030] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod u skladu sa predmetnim pronalaskom pri čemu ćelija koja predstavlja antigen sadrži ekspresioni vektor koji eksprimira pomenuti peptid koji sadrži sekvencioni identifikacioni broj 5.

[0031] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na aktivirane citotoksične T limfocite (CTL), proizvedene pomoću metoda u skladu sa predmetnim pronalaskom, koji selektivno prepoznaje ćeliju koja aberantno izražava polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa predmetnim pronalaskom.

[0032] Predmetni pronalazak dalje otkriva metod uništavanja ciljanih ćelija kod pacijenta kod kog ciljane ćelije aberantno izražavaju polipeptid koji sadrži bilo koju aminokiselinsku sekvencu u skladu sa predmetnim pronalaskom, metod obuhvata primenu efikasnog broja citotoksi čnih T limfocita (CTL) nad pacijentom u skladu sa predmetnim pronalaskom.

[0033] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu peptida u skladu sa predmetnim pronalaskom, nukleinske kiseline u skladu sa predmetnim pronalaskom, ekspresionog vektora u skladu sa predmetnim pronalaskom, ćelije u skladu sa predmetnim pronalaskom ili aktiviranog citotoksičnog T limfocita u skladu sa predmetnim pronalaskom, za korišćenje u lečenju karcinoma.

[0034] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na korišćenje u skladu sa predmetnim pronalaskom, pri čemu je pomenuti karcinom izabran između nesitnoćelijskog karcinoma pluća (NSCLC), karcinoma pluća, karcinoma želuca i glioblastoma.

[0035] Stimulacija imunog odgovora zavisi od prisustva antigena koji su prepoznati kao strani od strane imunog sistema domaćina. Otkriće postojanja antigena povezanih sa tumorom je povećalo mogućnost korišćenja imunog sistema domaćina za intervenisanje kod rasta tumora. Trenutno se istražuju različiti mehanizmi iskorišćavanja humoralnih i celularnih krakova imunog sistema za imunoterapiju protiv karcinoma.

[0036] Određeni elementi celularnog imunog odgovora su u mogućnosti da konkretno prepoznaju i uništavaju ćelije tumora. Izolacija citotoksičnih T-ćelija (CTL) iz tumorsko-infiltrirajućih ćelijskih populacija ili iz periferalne krvi ukazuje da takve ćelije imaju važnu ulogu kod prirodnih imunih odbrana od karcinoma. CD8-pozitivne T-ćelije konkretno, koje prepoznaju klasu I molekula peptida koji nose glavni kompleks histokompatibilnosti (MHC) od obično 8 do 10 aminokiselinskih ostataka dobijenih od proteina ili defektnih ribozomalnih proizvoda (DRIPS) lociranih u citozolu, imaju va žnu ulogu kod ovog odgovora. MHC molekuli kod ljudi su takođe označeni kao ljudski leukocitni antigeni (HLA).

[0037] Postoje dve klase MHC molekula: MHC klasa I molekula koja se može pronaći kod većine ćelija koje imaju nukleus. MHC molekuli su sastavljeni od alfa teškog lanca i beta-2-mikroglobulina (MHC I klasa receptora) ili alfa i beta lanca (MHC II klasa receptora), respektivno. Njihova trodimenzionalna konformacija ima za rezultat stvaranje vezivnog žleba, koji se koristi za nekovalentne interakcije sa peptidima. MHC klasa I predstavlja peptide koji su rezultat proteolitičkog cepanja pretežno endogenih proteina, DRIP i većih peptida. MHC II klasa molekula se može uglavnom pronaći kod profesionalnih ćelija koje predstavljaju antigen (APC), i primarno predstavlja peptide egzogenih ili transmembranskih proteina koji su uzeti od strane APC tokom trajanja endocitoze, i nakonadno se obra đuju. Kompleksi peptida i molekuli MHC I klase su prepoznati od strane CD8-pozitivnih citotoksičnih T-limfocita koji nose odgovarajući TCR (T-ćelijski receptor), pri čemu su kompleksi peptida i molekula MHC II klase prepoznati od strane CD4-pozitivnih-pomagačkih-T ćelija koje nose odgovarajući TCR. Dobro je poznato da su TCR, peptid i MHC iz tog razloga prisutni u stehiometrijskoj količini od 1:1:1.

[0038] CD4-pozitivne pomagačke T ćelije imaju važnu ulogu u indukovanju i održavanju efikasnog odgovora od strane CD8-pozitivnih citotoksičnih T ćelija. Identifikacija CD4-pozitivnih T-ćelijskih epitopa dobijenih od antigena povezanih sa tumorom (TAA) je od velike va žnosti za razvoj farmaceutskih proizvoda koji izazivaju antitumorske imune odgovore (Kobayashi et al., 2002; Qin et al., 2003; Gnjatic et al., 2003). Na mestu tumora, T pomagačke ćelije, podržavaju CTL prijateljsku citokinu sredinu (Mortara et al., 2006) i privlače efektorske ćelije, na primer, CTL, NK ćelije, makrofage, granulocite (Hwang et al., 2007).

[0039] U odsustvu inflamacije, ekspresija molekula MHC II klase je uglavnom ograničena na ćelije imunog sistema, naročito profesionalne ćelije koje predstavljaju antigen (APC), na primer, monociti, ćelije dobijene od monocita, makrofage, dendritske ćelije. Kod pacijenata sa karcinomom, otkriveno je da ćelije tumora iznenađujuće eksprimiraju molekule MHC II klase (Dengjel et al., 2006).

[0040] Kod životinjskih sisarskih modela je prikazano, na primer, miša, da čak i u odsustvu CTL efektorskih ćelija (tj. CD8-pozitivnih T limfocita), CD4-pozitivne T ćelije su dovoljne za inhibiranje manifestacije tumora kroz inhibiciju angiogeneze sekrecijom interferon-game (IFNy).

[0041] Dodatno, prikazano je da CD4-pozitivne T ćelije koje prepoznaju peptide iz antigena povezanih sa tumorom predstavljenih molekulima HLA II klase mogu neutralisati progresiju tumora indukcijom antitelnih odgovora (Ab).

[0042] Za razliku od peptida povezanih sa tumorom koji se vezuju za molekule HLA I klase, do danas je opisan samo mali broj liganda II klase antigena povezanih sa tumorom (TAA).

[0043] Obzirom da je konstitutivna ekspresija molekula HLA II klase obično ograničena na ćelije imunog sistema, mogućnost izolovanja peptida II klase direktno iz primarnih tumora se ne smatra mogu ćom. Ipak, Dengjel et al. su bili uspešni u identifikovanju broja epitopa MHC II klase direktno iz tumora (WO 2007/028574, EP 1760088 B1; (Dengjel et al., 2006).

[0044] Antigeni koji su prepoznati po tumorskim specifičnim citotoksičnim T limfocitima, to jest, njihovim epitopima, mogu biti molekuli dobijeni iz svih klasa proteina, kao što su enzimi, receptori, transkripcioni faktori itd., koji su izraženi i, u poređenju sa nepromenjenim ćelijama istog porekla, regulisano u ćelijama respektivnog tumora.

[0045] Obzirom da oba tipa odgovora, CD8 i CD4 zavisno, doprinose zajednički i sinergetski antitumorskom dejstvu, identifikacija i karakterizacija antigena povezanih sa tumorom prepoznatih od strane ili CD8+ CTL (ligand:molekul MHC I klase peptidni epitop) ili od strane CD4-pozitivnih T-pomagačkih ćelija (ligand: molekul MHC II klase peptidni epitop) je važna u razvoju vakcina protiv tumora.

[0046] Da bi peptid izazvao (izmamio) celularni imuni odgovor, mora se vezati za MHC molekul. Ovaj proces je zavisan od alele MHC molekula i određenih polimorfizama aminokiselinske sekvence peptida. Vezujući peptidi MHC I klase su obično 8-12 aminokiselinskih ostataka u dužini i obično sadrže dva očuvana ostatka („sidra“) u svojoj sekvenci koja je u interakciji sa odgovaraju ćim vezujućim žlebom MHC molekula. Na ovaj način MHC alela ima „vezujući motiv“ koji utvrđuje koji peptidi se mogu vezati konkretno za vezujući žleb.

[0047] Kod imune reakcije zavisne od MHC I klase, peptidi pored toga što moraju biti sposobni da se vežu za određene molekule MHC I klase eksprimirane od strane tumorskih ćelija, moraju takođe i da budu prepoznati od strane T ćelija koje nose određene T ćelijske receptore (TCR).

[0048] Antigeni koji su prepoznati od strane tumorski specifičnih citotoksičnih T limfocita, to jest, njihovih epitopa, mogu biti molekuli dobijeni od svih klasa proteina, kao što su enzimi, receptori, transkripcioni faktori itd., koji su eksprimirani i, u poređenju sa nepromenjenim ćelijama istog porekla, regulisani u ćelijama respektivnog tumora.

[0049] Trenutna klasifikacija antigena povezanih sa tumorom obuhvata sledeće glavne grupe:

a) Antigeni karcinom-testisa: Prvi ikada identifikovani TAA koji mo že biti prepoznat od strane T ćelija pripada ovoj klasi, koja je originalno nazvana antigeni karcinom-testisa (CT) zbog e kspresije svojih članova kod histološki različitih ljudskih tumora i, među normalnim tkivima, samo u spermatocitima/spermatogoniji testisa i, povremeno, u placenti. Obzirom da ćelije testisa ne eksprimiraju molekule HLA I i II klase, ovi antigeni ne mogu biti prepoznati od strane T ćelija u normalnim tkivima i iz tog razloga mogu biti smatrani kao imunološko tumorsko specifičnim. Dobro poznati primeri CT antigena MAGE članovi familije ili NY-ESO-1.

b) Diferencijacioni antigeni: Ovi TAA se dele između tumora i normalnog tkiva iz kog tumor nastaje; većina je pronađena kod melanoma i normalnim melanocitima. Mnogi od ovih proteina povezanih sa melanocitnim sojem su uključeni u biosintezu melanina i stoga nisu specifični za tumor ali se bez obzira koriste široko kod imunoterapije karcinoma. Primeri uključuju, ali se ne ograničavaju na, tirozinazu i Melan-A/MART-1 kod melanoma ili PSA kod karcinoma prostate.

c) Prekomerno izraženi TAA: Geni koji kodiraju široko eksprimirane TAA su detektovani kod histološko različitih tipova tumora kao i kod mnogih normalnih tkiva, obično sa nižim ekspresionim nivoima. Moguće je da su mnogi od obrađenih epitopa i potenijalno prezentovanih od normalnih tkiva ispod nivoa praga za T ćelijsko prepoznavanje, dok njihova prekomerna ekspresija u tumorskim ćelijama može izazvati antikarcinomski odgovor narušavanjem prethodno utvrđene tolerancije. Prominentni primeri za ovu klasu TAA su Her-2/neu, Survivin, Telomerase ili WT1.

d) Tumorsko specifični antigeni: Ovi jedinstveni TAA su rezultat mutacije normalnih gena (kao što je βkatenin, CDK4,

itd.). Neke od ovih molekularnih promena su povezane sa neoplastičnom transformacijom i/ili progresijom. Tumorski specifični antigeni su generalno u mogućnosti da indukuju snažne imune odgovore bez nošenja rizika od autoimunih reakcija na normalna tkiva. Sa druge strane, ove TAA su u većini slučajeva jedino relevantni za određeni tumor na kom su identifikovani i obično se ne dele između mnogo pojedinačnih tumora.

e) TAA koji su nastali iz abnormalnih post-translacijskih modifikacija: Takvi TAA mogu nastati od proteina koji nisu ni specifični ni prekomerno eksprimirani kod tumora ali ipak postaju povezani sa tumorom post-translacijskim procesima koji su primarno aktivni u tumorima. Primeri za ovu klasu potiču iz izmenjenih obrazaca glikozilacije koji dovode do novih epitopa u tumorima kao za MUC1 ili dešavanja kao što je spajanje proteina tokom degradacije koja može ili ne mora biti tumorsko specifična.

f) Onkoviralni proteini: ovi TAA su viralni proteini koj i mogu imati ključnu ulogu u onkogenom procesu i, iz razloga što su stranog (a ne ljudskog porekla), mogu izazvati odgovor T-ćelije. Primeri takvih proteina su proteini ljudskog papiloma virusa tip 16, E6 i E7, koji su eksprimirani kod cervikalnog karcinoma.

[0050] Da bi proteini bili prepoznati od strane citotoksičnih T-limfocita kao tumorsko-specifični ili povezani antigeni, i da bi se koristili u lečenju, određeni preduslovi moraju biti ispunjeni. Antigen bi trebao da bude eksprimiran uglavnom tumorskim ćelijama a ne, ili u uporedivo malim količinama, od strane normalnih zdravih tkiva ili u drugoj poželjnoj izvedbi, peptid bi trebao biti prekomerno prikazan od strane tumorskih ćelija u poređenju sa normalnim zdravim tkivima. Nadalje je poželjno da respektivni antigen nije samo prisutan u tipu tumora, već takođe i u visokim koncentracijama (tj. kopiran brojevi respektivnog peptida po ćeliji). Tumorsko specifični i tumorsko povezani antigeni su često dobijeni iz proteina koji su direktno umešani u transformaciju normalne ćelije u tumorsku ćeliju usled funkcije, na primer, kod kontrole ćelijskog ciklusa ili supresije apoptoze. Dodatno, nizvodni ciljevi proteina koji su direktno uzročni za transformaciju mogu biti regulisani i stoga mogu biti indirektno povezani sa tumorom. Takvi indirektni antigeni povezani sa tumorom mogu tako đe biti ciljevi vakcinacionog pristupa (Singh-Jasuja et al., 2004). U oba slučaja je od velike važnosti da su epitopi prisutni u aminokiselinskoj sekvenci antigena, jer takav peptid („imunogeni peptid“) ,koji je dobijen iz antigena povezanog sa tumorom, treba da dovede do in vitro ili in vivo T-ćelijskog odgovora.

[0051] U suštini, bilo koji peptid koji je u mogućnosti da veže MHC molekul može funkcionisati kao T-ćelijski epitop. Preduslov za indukciju in vitro ili in vivo T-ćelijskog odgovora je prisustvo T ćelije sa odgovarajućim TCR i odsustvo imunološke tolerancije za ovaj konkretni epitop.

[0052] Stoga, TAA su polazna tačka za razvoj tumorske vakcine. Metodi za identifikovanje i karakterizovanje TAA se zasnivaju na upotrebi CTL koji može biti izolovano od pacijenata ili zdravih subjekata, ili su zasnovani na generisanju diferencijalnih transkripcionih profila ili diferencijalnih obrazaca peptidne ekspresije između tumora i normalnih tkiva.

[0053] Ipak, identifikacija prekomerno eksprimiranih gena kod tumornih tkiva ili ljudskih tumorskih ćelijskih linija, ili selektivno eksprimiranih u takvim tkivima ili ćelijskim linijama, ne pruža preciznu informaciju o upotrebi antigena koji su transkribovani od ovih gena u imunoj terapiji. To je iz razloga što je za takvu aplikaciju pogodna samo pojedinačna subpopulacija epitopa ovih antigena jer T ćelija sa odgovarajućim TCR mora biti prisutna a imunološka tolerancija za ovaj konkretni epitop mora biti odsutna ili minimalna. U veoma poželjnoj izvedbi pronalaska iz tog razloga je važno izabrati samo one prekomerno ili selektivno prezentovane peptide protiv kojih se može pronaći funkcionalna i/ili proliferirajuća T ćelija. Takva funkcionalna T ćelija je definisana kao T ćelija, koja se nakon stimulacije sa određenim antigenom može klonalno proširiti i sposobna je da izvršava efektorske funkcije („efektorska T ćelija“).

[0054] U slučaju TCR i antitela prema pronalasku, imunogenost osnovnih peptida je sekundarna. Za TCR i antitela prema pronalasku, prezentacija je određujući faktor.

[0055] T pomoćne ćelije imaju važnu ulogu u orkestriranju efektorske funkcije CTL u imunitetu protiv tumora. Epitopi T pomoćne ćelije koji pokreću odgovor T pomoćne ćelije tipa TH1podržavaju efektorske funkcije CD8-pozitivno ubice T ćelija, što uključuje citotoksične funkcije usmerene protiv tumorskih ćelija koje prikazuju peptide povezane sa tumorom/MHC komplekse na svojim ćelijskim površinama. Na ovaj način, peptidni epitopi T pomoćne ćelije povezani sa tumorom, sami ili u kombinaciji sa drugim peptidima povezanim sa tumorom, mogu služiti kao aktivni farmaceutski sastojci vakcinskih kompozicija koje stimulišu antitumorske imune odgovore.

5 (MXRA5) povezan sa remodeliranjem matrice

[0056] MXRA5, takođe poznat kao adlikan, kodira adhezioni proteoglikan i pripada grupi gena uključenih u remodeliranje ECM i ćelija-ćelija adheziju (Rodningen et al., 2008). Iako je funkcija MXRA5 kod karcinoma nepoznata, somatske mutacije kod MXRA5 su identifikovane kod tumora dobijene iz mnoštva tkiva, kao što su koža, mozak, pluća i jajnik. RT-PCR je izvršena na adlikanu (MXRA5) je potvrdila microarray otkrića prekomerne ekspresije kod karcinoma debelog creva u poređenju sa normalnim tkivom debelog creva (13 kolorektalnih tumora i 13 normalnih tkiva) (Zou et al., 2002). U skorašnjoj studiji, 5 povezano sa remodeliranjem matrice je bio drugi najčešće mutirani gen kod NSCLC (prvi je TP53) (Xiong et al., 2012).

Detaljni opis pronalaska

[0057] Kao što je ovde korišćeno i izuzev kada je drugačije naznačeno, svi pojmovi su definisani kao što je dato u nastavku teksta.

[0058] Pojam „peptid“ je ovde upotrebljen kako bi se označile serije aminokiselinskih ostataka, povezane jedna za drugu obično peptidnim vezama između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina.

[0059] Nadalje, termin „peptid“ će obuhvatiti soli serija aminokiselinskih ostataka, povezanih jednim sa drugima obično peptidnim vezama između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Soli su poželjno farmaceutski prihvatljive soli.

[0060] Pojam „peptid“ će obuhvatiti „oligopeptid“. Pojam „oligopeptid“ je ovde kori šćen kako bi označio serije aminokiselinskih ostataka, povezane jedna za drugu obično peptidnim vezama između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina.

[0061] Pojam „peptidi predmetnog pronalaska“, će obuhvatiti peptid koji se sastoji od peptida kao što je definisano u prethodnom tekstu u skladu sa sekvencionim identifikacionim brojem 5.

[0062] Pojam „polipeptid“ označava serije aminokiselinskih ostataka, povezane jedna za drugu obično peptidnim vezama između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih amino kiselina. Dužina polipeptida nije kritična za pronalazak sve dok se održavaju ispravni epitopi. U poređenju sa pojmovima peptid ili oligopeptid, pojam polipeptid treba da se odnosi na molekule koji sadr že više od oko 30 aminokiselinskih ostataka.

[0063] Peptidno, oligopeptidno, proteinsko ili polinukleotidno kodiranje za takav molekul je „imunogeno“ (i stoga je „imunogen“unutar predmetnog pronalaska), ukoliko je u mogućnosti da indukuje imuni odgovor. U slučaju predmetnog pronalaska, imunogenost je konkretnije definisana kao sposobnost indukovanja T-ćelijskog odgovora. Stoga, „imunogen“ bi bio molekul koji je sposoban za idukovanje imunog odgovora, i u slučaju predmetnog pronalaska, molekul sposoban za indukovanje T-ćelijskog odgovora. U sledećem aspektu, imunogen može biti peptid, kompleks peptida sa MHC, oligopeptid i/ili protein koji je korišćen kako bi se podigla određena antitela ili TCR protiv njega.

[0064] I klasa T ćelijskog „epitopa“ zahteva kratak peptid koji je povezan za MHC receptor I klase, formirajući ternarni kompleks (alfa lanac MHC I klase, beta-2-mikroglobulin i peptid) koji može biti prepoznat od strane T ćelije koja nosi poklapajući T ćelijski receptor koji se vezuje za MHC/peptidni kompleks sa odgovarajućim afinitetom. Peptidi koji se vezuju za MHC I klasu molekula su obično 8-14 amino kiselina u dužini, a najčešće 9 amino kiselina u dužini.

[0065] Kod ljudi postoji tri različita genetska lokusa koji kodiraju molekule MHC I klase (MHC molekuli ljudi su takođe označeni humani leukocitni antigeni (HLA)): HLA-A, HLA-B i HLA-C. HLA-A∗01, HLA-A∗02 i HLA-B∗07 su primeri različitih alela MHC I klase koje mogu biti eksprimirane od strane ovih lokusa.

Tabela 2: Ekspresione frekvencije F od HLA∗A02 i najfrekventniji HLA-DR serotipi. Frekvencije su dedukovane od haplotipnih frekvencija Gfunutar američke populacije prilagođeno sa Mori et al. (Mori et al., 1997) upotrebljavanjem Hardy-Weinberg formule F=1-(1-Gf)2. Kombinacije A ∗02 sa određenim HLA-DR alelama može biti obogaćeno ili manje frekventno od očekivanog od njihovih pojedinačnih frekvencija usled neravnoteže vezivanja. Za detalje pogledati Chanocket al. (Chanock et al., 2004).

[0066] Stoga, zbog terapijskih i dijagnostičkih svrha peptid koji se vezuje sa odgovarajućim afinitetom za nekoliko različitih receptora HLA II klase je veoma poželjan. Peptid koji se vezuje za nekoliko različitih molekula HLA II klase se naziva promiskuitetno vezivo.

[0067] Kao što je ovde upotrebljeno, referenca ka DNK sekvenci uključuje i jednolančani i dvolančani DNK. Stoga, određena sekvenca, osim ukoliko kontekst ne ukazuje drugačije, se odnosi na jednolančani DNK takve sekvence, dupleks takve sekvence sa svojim komplementnom (dvolančana DNK) i komplement takve sekvence. Pojam „kodirajuća regija“ se odnosi na deo gena koji ili prirodno ili normalno kodira za ekspresioni proizvod tog gena u svom prirodnom genomskom okruženju, tj., region koji kodira in vivo za nativni ekspresioni proizvod gena.

[0068] Kodirajući region može biti od nemutiranog („normalnog“), mutiranog ili izmenjenog gena, ili čak može biti od DNK sekvence, ili gena, u potpunosti sintetizovanog u laboratoriji upotrebom metoda koji su dobro poznati osobama sa naucnim iskustvom DNK sinteze.

[0069] Pojam „nukleotidna sekvenca“ se odnosi na heteropolimer deoksiribonukleotida.

[0070] Nukleotidna sekvenca koja kodira za određeni peptid, oligopeptid ili polipeptid se može prirodno pojaviti ili može biti sintetički konstruisana. Generalno, DNK segmenti koji kodiraju peptide, polipeptide i proteine ovog pronalaska su sastavljeni od cDNK fragmenata i kratkih oligonukleotidnih povezivača, ili od serija oligonukleotida, kako bi se obezbedio sintetički gen koji je sposoban da bude eksprimiran u rekombinantnoj transkripcionoj jedinici koja obuhvata regulatorne elemente dobijene od mikrobnog ili viralnog operona.

[0071] Kao što je upotrebljeno u ovom tekstu, pojam „nukleotidno kodiranje (ili enkodiranje) za peptid“ se odnosi na nukleotidnu sekvencu koja kodira za peptid uključujući veštačke (ručno pravljene) početne i zaustavne kodone kompatibilne za biološki sistem koji će sekvencu eksprimirati.

[0072] Pojam „ekspresioni proizvod“ znači polipeptid ili protein koji je prirodni translacioni proizvod gena i bilo koji kodirajući ekvivalenti sekvence nukleinske kiseline koji su nastali od degeneracije genetskog koda i time kodiranja za istu aminokiselinu(e).

[0073] Pojam „fragment“, kada se odnosi na kodirajuću sekvencu, znači deo DNK koji obuhvata manje od kompletnog kodirajućeg regiona, čija ekspresioni proizvod u suštini zadržava istu biološku funkciju ili aktivnost kao ekspresioni prozivod kompletnog kodirajućeg regiona.

[0074] Pojam „DNK segment“ se odnosi na DNK polimer, u formi odvojenog fragmenta ili kao komponenta veće DNK konstrukcije, koji je dobiijen od DNK izolovanog najmanje jednom u su štinski čistoj formi, tj., bez kontaminirajućih endogenih materijala i u količini ili koncentraciji koja omogućuje identifikaciju, manipulaciju i oporavak segmenta i njegove komponente nukleotidnih sekvenci standardnim biohemijskim metodama, na primer, kori šćenjem klonirajućeg vektora. Takvi segmenti su obezbeđeni u formi otvorenog okvira za čitanje neisprekidanog unutrašnjim netranslantovanim sekvencama, ili intronima, koji su obično prisutni u eukariotskim genima. Sekvence netranslatovane DNK mogu biti prisutne nizvodno od otvorenog okvira za čitanje, gde iste ne ometaju manipulaciju ili ekspresiju kodirajućih regiona.

[0075] Pojam „prajmer“ znači kratka sekvenca nukleinske kiseline koja može biti uparena sa jednim DNK lancem i pruža slobodni 3’-OH kraj na kom DNK polimeraza počinje sintezu deoksiribonukleotidnog lanca.

[0076] Pojam „promoter“ predstavlja region DNK koji je uključen u vezivanje RNK polimeraze za inicijaciju transkripcije.

[0077] Pojam „izolovano“ znači da je materijal uklonjen iz svog originalnog okruženja (na primer, prirodno okruženje ukoliko nastaje prirodnim putem). Na primer, polinukleotid ili polipeptid koji se prirodno pojavljuje, prisutan u živoj životinji nije izolovan, ali je izolovan isti polinukleotid ili polipeptid, odvojen od nekih ili svih koegzistirajućih materijala u prirodnom sistemu. Takvi polinukleotidi bi mogli biti deo vektora i/ili takvi polinukleotidi ili polipeptidi bi mogli biti deo kompozicije, a ipak izolovani tako da takav vektor ili kompozicija nisu deo njihovog prirodnog okruženja.

[0078] Polinukleotidi, i rekombinantni ili imunogeni polipeptidi, opisani u skladu sa predmetnim pronalaskom, mogu takođe biti u „prečišćenoj“ formi. Pojam „prečišćeno“ ne zahteva apsolutnu čistoću; radije je namenjen kao relativna definicija, i mo že obuhvatiti preparate koji su visoko prečišćeni ili preparate koji su samo delimično prečišćeni, jer su ovi pojmovi jasni stručnjacima iz odgovarajuće oblasti. Na primer, pojedinačni klonovi izolovani iz cDNK biblioteke su konvencionalno prečišćeni do elektroforetske homogenosti. Naročito se razmatra prečišćavanje polaznog ili prirodnog materijala za bar jedan red veličine, poželjno dva do tri reda, a još poželjnije četiri ili pet redova veličine. Štaviše, zahtevani polipeptid koji ima čistoću od poželjno 99,999%, ili barem 99,99% ili 99,9%, a čak poželjnije 99% mase ili više je naročito razmatran.

[0079] Nukleinska kiselina i polipeptidni ekspresioni proizvodi opisani u skladu sa predmetnim pronalaskom, kao i ekspresioni vektori koji sadrže takve nukleinske kiseline i/ili takve polipeptide, mogu biti u „obogaćenoj formi“. Kao što je korišćeno u ovom tekstu, pojam „obogaćeno“ znači da je koncentracija materijala je najmanje oko 2, 5, 10, 100 ili 1000 puta veća od svoje prirodne koncentracije (na primer), pogodno 0,01%, mase, poželjno barem oko 0,1% mase. Obogaćeni preparati od oko 0,5%, 1%, 5%, 10% i 20% mase su takođe razmatrani. Sekvence, konstrukti, vektori, klonovi i drugi materijali koji obuhvataju predmetni pronalazak mogu kao prednost biti u oboga ćenoj ili izolovanoj formi.

[0080] Pojam „aktivni fragment“ predstavlja fragment koji generiše imuni odgovor (tj., ima imunogenu aktivnosti) kada se primeni, sam ili opciono sa pogodnim ađuvansom, nad životinjom, kao što je sisar, na primer, zec ili miš, i takođe uključujući čoveka, takav imuni odgovor uzima oblik stimulišućeg T-ćelijskog odgovora kod životinje primaoca, kao što je čovek. Alternativno, „aktivni fragment“ može takođe biti korišćen za indukovanje T-ćelijskog odgovora in vitro.

[0081] Kao što je korišćeno u ovom tekstu, pojmovi „deo“, „segment“ i „fragment“, kada se koriste u vezi sa polipeptidima, odnose se na kontinuiranu sekvencu ostataka, kao što su aminokiselinski ostaci, čija sekvenca formira podskup veće sekvence. Na primer, ukoliko je polipeptid podvrgnut tretmanu sa bilo kojim od uobičajenih endopeptidaza, kao što su tripsin ili himotripsin, dobijeni oligopeptidi iz takvog tretmana bi predstavljali delove, segmente ili fragmente polaznih polipeptida. Kada se koriste u vezi sa polinukleotidima, ovi pojmovi se odnose na proizvode proizvedene tretmanom pomenutih polinukleotida sa bilo kojom endonukleazom.

[0082] U skladu sa predmetnim pronalaskom, pojam „procentna identičnost“ ili „procentno identično“, kada se govori o sekvenci, znači da je sekvenca upoređena sa zahtevanom ili opisanom sekvencom nakon poravnavanja sekvence koja se upoređuje („uporedna sekvenca“) sa opisanom ili zahtevanom sekvencom („referentna sekvenca“). Procentni identitet se zatim utvrđuje prema sledećoj formuli:

pri čemu C je broj razlika između referentne sekvence i uporedne sekvence tokom dužine ravnanja između referentne sekvence i uporedne sekvence, pri čemu

(i) svaka baza ili amino kiselina u referentnoj sekvenci koja nema odgovarajuću poravnatu bazu ili amino kiselinu u uporednoj sekvenci i

(ii) svaka praznina u referentnoj sekvenci i

(iii) svaka poravnana baza ili amino kiselina u referentnoj sekvenci koja se razlikuje od poravnane baze ili amino kiseline u uporednoj sekvenci, konstituiše diferenciju i

(iiii) poravnavanje mora da počne na poziciji 1 poravnanih sekvenci;

i R je broj baza ili amino kiselina u referentnoj sekvenci tokom du žine poravavanja sa uporednom sekvencom sa bilo kojom prazninom napravljenom u referentnoj sekvenci koja se takođe računa kao baza ili amino kiselina.

[0083] Ukoliko postoji poravnavanje između uporedne i referentne sekvence za koje procentna identičnost, kao što je izračunato u prethodnom tekstu, je približno jednka ili veća u odnosu na naznačeni minimum procentne identičnosti, tada uporedna sekvenca ima naznačeni minimum procentne identičnosti u odnosu na referentnu sekvencu čak iako poravnavanja mogu postojati po kojima je gore izračunata procentna identičnost manja od naznačene procentne identičnosti.

[0084] Originalni (nemodifikovani) peptidi, kao što je opisano u ovom tekstu, mogu biti modifikovani supstitucijom jednog ili više ostataka na različitim, moguće selektivnim, mestima unutar peptidnog lanca, osim ukoliko nije drugačije naglašeno.

[0085] Poželjno, te supstitucije su locirane na završetku aminokiselinskog lanca. Takve supstitucije mogu biti konzervativne prirode, na primer, gde je jedna amino kiselina zamenjena amino kiselinom slične strukture i osobina, kao gde je hidrofobna amino kiselina zamenjena sa drugom hidrofobnom amino kiselinom. Čak još konzervativnije bi bila zamena amino kiselina iste ili slične veličine i hemijske strukture, kao gde je leucin zamenjen sa izoleucinom. U istraživanjima sekventnih varijacija u familijama homolognih proteina koji nastaju prirodnim putem, određene aminokiselinske supstitucije su češće tolerisane u odnosu na druge, a ove često prikazuju korelaciju sa sličnostima u veličini, naboju, polaritetu i hidrofobnosti između originalne amino kiseline i njene zamene, i takva je osnova za definisanje „konzervativnih supstitucija“.

[0086] Konzervativne supstitucije su u ovom tekstu definisane kao razmene unutar jedne od slede ćih pet grupa: grupa 1 - mali alifatični, nepolarni ili blago polarni ostaci (Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); grupa 2 -polarni, negativno naelektrisani ostaci i njihove amide (Asp, Asn, Glu, Gln); grupa 3 - polarni, pozitivno naelektrisani ostaci (His, Arg, Lys); grupa 4 - veliki, alifatični, nepolarni ostaci (Met, Leu, Ile, Val, Cys); i grupa 5 - veliki, aromatični ostaci (Phe, Tyr, Trp).

[0087] Manje konzervativne supstitucije mogu uključiti zamenu jedne amino kiseline sa drugom koja ima slične karakteristike ali je nešto drugačijih dimenzija, kao što je zamena alanina sa izoleucinskim ostatkom. Visoko nekonzervativne zamene mogu uključiti supstituisanje kisele aminokiseline za onu koja je polarna, ili čak za onu koja je bazičnog karaktera. Takve „radikalne“ supstitucije ne mogu, ipak, biti odbačene kao neefikasne iz razloga što hemijska dejstva nisu u potpunosti predvidiva i radikalne supstitucije mogu takođe dovesti do serendipitnih efekata koji se inače ne mogu predvideti na osnovu prostih hemijskih principa.

[0088] Naravno, takve supstitucije mogu uključiti druge strukture u odnosu na uobičajene L-amino kiseline. Stoga, D-amino kiseline mogu biti supstituisane za L-amino kiseline koje se uobi čajeno nalaze u antigenim peptidima pronalaska a ipak da budu obuhvaćene otkrićem iz ovog teksta. Dodatno, aminokiseline koje imaju nestandardne R grupe (tj., R grupe osim onih koje se nalaze u 20 uobi čajenih aminokiselina prirodnih proteina) se takođe mogu koristiti za supstitucione svrhe kako bi proizvele imunogene i imunogene polipeptide u skladu sa predmetnim pronalaskom.

[0089] Ako se otkrije da supstitucije na više od jedne pozicije imaju za rezultat peptid sa suštinski ekvivalentnom ili većom antigenskom aktivnošću, kao što je definisano u nastavku teksta, onda će kombinacije tih supstitucija biti testirane kako bi se utvrdilo da li kombinovane supstitucije dovode do aditivnih ili sinergističkih dejstava na antigenost peptida. Najviše 4 pozicije unutar peptida bi simultano bile supstituisane.

[0090] Peptidi kao što je objavljeno se mogu elongirati do 4 aminokiseline, odnosno 1, 2, 3 ili 4 aminokiseline mogu biti dodate na bilo koji završetak ili bilo koju kombinaciju između 4:0 i 0:4.

[0091] Kombinacije elongacija kao što je objavljeno mogu biti prikazane u tabeli 3:

[0092] Aminokiseline za elongaciju mogu biti peptidi originalnih sekvenci proteina ili bilo koja druga aminokiselina. Elongacija se može koristiti za poboljšavanje stabilnosti ili solubilnosti peptida.

[0093] Pojam „T-ćelijski odgovor“ predstavlja specifičnu proliferaciju i aktivaciju efektorskih funkcija inudkovanih peptidom in vitro ili in vivo. Za CTL ograničene na MHC I klasu, efektorske funkcije mogu biti liza peptid-pulsirana, peptid-prekursor pulsirana ili prirodne peptid-prezentuju će ciljane ćelije, sekrecija citokina, poželjno interferon-gama, TNF-alfa ili IL-2 indukovano peptidom, sekrecija efektorskih molekula, poželjno granzima ili perforina indukovanih peptidom, ili degranulacija.

[0094] Preferirano, kada su CTL specifični za peptid sekvencionog identifikacionog broja 1 do sekvencionog identifikacionog broja 92 testirani protiv supstituisanih peptida, peptidna koncentracija pri kojoj supstituisani peptidi postižu polovinu maksimalnog povećanja u lizi u odnosu na pozadinu nije veća od približno 1 mM, poželjno nije veća od približno 1 mM, još poželjnije nije veća od približno 1 nM, a ipak još poželjnije nije veća od približno 100 pM, i najpoželjnije nije veća od približno 10 pM. Takođe je preferirano da supstituisani peptidi budu prepoznati od strane CTL od vi še od jednog individualnog, barem dva, i poželjnije tri individualna.

[0095] Stoga, epitopi kao što je otkriveno mogu biti identični epitopima povezanim sa tumorom koji se prirodno pojavljuju ili tumorno-specifičnim epitopima ili mogu uključiti epitope koji se razlikuju za ne više od 4 ostatka od referentnog peptida, sve dok imaju suštinski identičnu antigenu aktivnost.

[0096] Stimulacija imunog odgovora zavisi od prisustva antigena koji su prepoznati kao strani od strane imunog sistema domaćina. Otkriće postojanja antigena povezanih sa tumorom je sada povećalo mogućnost korišćenja imunog sistema domaćina u intervenisanju kod rasta tumora. Za imunoterapiju protiv karcinoma se trenutno istražuju razni mehanizmi iskorišćavanja i humoralnih i celularnih krakova imunog sistema.

[0097] Specifični elementi celularnog imunog odgovora su u mogućnosti za specifično prepoznavanje i uništavanje ćelija tumora. Izolacija citotoksičnih T-ćelija (CTL) iz ćelijskih populacija koje infiltriraju tumor ili iz periferne krvi sugeriše da takve ćelije imaju važnu ulogu kod prirodnih imunih odgovora protiv karcinoma. CD8-pozitivne T-ćelije konkretno, koje prepoznaju molekule I klase peptida koji nose glavni kompleks histokompatibilnosti (MHC) od obično 8 do 12 ostataka dobijenih iz proteina ili defektnih ribozomalnih proizvoda (DRIPS) lociranih u citosolima, imaju va žnu ulogu u ovom odgovoru. MHC molekuli čoveka su takođe označeni kao ljudski leukocit-antigeni (HLA).

[0098] Molekuli MHC I klase se mogu pronaći kod većine ćelija koje imaju jezgro koje predstavlja peptide koji su rezultat proteolitičkog cepanja uglavnom endogenih, citosoličnih ili nuklearnih proteina, DRIPS i većih peptida. Ipak, peptidi koji su dobijeni iz endozomalnih odeljaka ili egzogenih izvora se takođe često mogu pronaći kod molekula MHC I klase. Ovaj neklasični način prezentacije I klase se u literaturi naziva unakrsna prezentacija.

[0099] Obzirom da oba tipa odgovora, CD8 i CD4 zavisno, doprinose zajednički i sinergistički antitumorskom dejstvu, identifikacija i karakterizacija antigena povezanih sa tumorom prepoznatih od strane ili CTL sa pozitivnim CD8 (molekul MHC I klase) ili CTL sa pozitivnim CD4 (molekul MHC II klase), je važna za razvoj tumorskih vakcina. Iz tog razloga je cilj predmetnog pronalaska da se obezbede kompozicije peptida koje sadže peptide koji se vezuju za MHC komplekse bilo koje klase.

[0100] Imajući u vidu ozbiljna neželjena dejstva i troškove povezane sa lečenjem karcinoma, bolje prognoze i metode dijagnostike su očajnički potrebne. Stoga, postoji potreba da se identifikuju drugi faktori koji predstavljaju biomarkere za karcinom uopšteno, a za karcinom pluća konkretno. Štavise, postoji potreba da se identifikuju faktori koji mogu biti kori šćeni u lečenju karcinoma uopšteno a karcinoma pluća konkretno.

[0101] Predmetni pronalazak obezbeđuje peptid koji je koristan u lečenju karcinoma / tumora, preferirano karcinoma pluća, čak preferiranije nesitnoćelijskog karcinoma pluća (NSCLC) koji prekomerno ili ekskluzivno predstavlja peptid pronalaska. Za ovaj peptid se masenom spektrometrijom prikazalo da je prirodno prisutan preko HLA molekula kod primarnih ljudskih uzoraka karcinoma plu ća (videti primer 1 i sliku 1).

[0102] Izvor gena/proteina (takođe označen kao „protein pune dužine“ ili „osnovni protein“) od kog su peptidi dobijeni se pokazalo da je veoma prekomerno izražen kod nesitnoćelijskog karcinoma pluća, a za sekvencione identifikacione brojeve 66 do 75 karcinom želuca i glioblastom u poređenju sa normalnim tkivima (videti primer 2 i sliku 2 za NSCLC) prikazuje visok stepen tumorske asocijacije izvornih gena. Štaviše, sami peptidi su veoma prekomerno prisutni na tumorskom tkivu ali ne na normalnim tkivima (videti primer 3 i sliku 3).

[0103] Peptidi vezanih HLA mogu biti prepoznati od strane imunog sistema, konkretno T limfocita/T ćelija. T ćelije mogu uništiti ćelije koje predstavljaju prepoznati HLA/peptid kompleks, na primer, ćelije karcinoma pluća predstavljaju dobijene peptide.

[0104] Peptid predmetnog pronalaska se pokazalo da je sposoban za stimulisanje T ćelijskih odgovora i / ili su prekomerno prisutni i zbog toga mogu biti korišćeni za proizvodnju antitela i / ili TCR, konkretno sTCR, prema predmetnom pronalasku (videti primer 4 i sliku 4). Nadalje, peptidi, kada su kompleksirani sa odgovarajućim MHC, se mogu koristiti za proizvodnju antitela i / ili TCR, konkretno sTCR, prema predmetnom pronalasku, takođe. Respektivne metode su dobro poznate stručnjacima, a mogu se takođe pronaći i u odgovarajućoj literaturi. Stoga, peptid predmetnog pronalaska je koristan za generisanje imunog odgovora kod pacijenta, pomoću kog ćelije tumora mogu biti uništene. Imuni odgovor kod pacijenta može biti indukovan direktnom administracijom opisanih peptida ili pogodnih prekursornih supstanci (na primer, elongirani peptidi, proteini ili nukleinske kiseline koje kodiraju ove peptide) nad pacijentom, idealno u kombinaciji sa agensom koji pobolj šava imunogenost (tj., ađuvansom). Može se očekivati da imuni odgovor koji nastaje iz takve terapijske vakcinacije bude visoko određen protiv ćelija tumora iz razloga što ciljani peptidi predmetnog pronalaska nisu prisutni na normalnim tkivima u uporedivom broju, što sprečava rizik od neželjenih autoimunih reakcija protiv normalnih ćelija kod pacijenta.

[0105] Farmaceutske kompozicije sadrže peptide ili u slobodnoj formi ili u formi farmaceutski prihvatljive soli. Kao što je upotrebljivano u ovom tekstu, „farmaceutski prihvatljiva so“ se odnosi na derivat opisanih peptida pri čemu peptid je modifikovan pravljenjem kiselih ili baznih soli agensa. Na primer, kisele soli su pripremljene od slobodne baze (obično gde neutralna forma leka ima neutralnu -NH2grupu) uključujući reakciju sa pogodnom kiselinom. Pogodne kiseline za pripremu kiselih soli uključuju organske kiseline, na primer, sirćetnu kiselinu, propionsku kiselinu, glikolnu kiselinu, piruvinsku kiselinu, oksalnu kiselinu, jabučnu kiselinu, malonsku kiselinu, sukcinsku kiselinu, maleinsku kiselinu, fumarnu kiselinu, vinsku kiselinu, limunsku kiselinu, benzojevu kiselinu, cinaminsku kiselinu, mandelinsku kiselinu, metansulfonsku kiselinu, etansulfonsku kiselinu, p-toluensulfonsku kiselinu, salicilnu kiselinu i slične, kao i neorganske kiseline, na primer, hlorovodoničnu kiselinu, bromovodoničnu kiselinu, sumpornu kiselinu, azotnu kiselinu, fosfornu kiselinu i slične. Suprotno tome, priprema bazičnih soli kiselih funkcionalnih grupa koje mogu biti prisutne na peptidu se vr ši korišćenjem farmaceutski prihvatljive baze kao što je natrijum hidroksid, kalijum hidroksid, amonijum hidroksid, kalcijum hidroksid, trimetilamin ili slični.

[0106] Kod posebno poželjne izvedbe, farmaceutske kompozicije sadrže peptide kao soli sirćetne kiseline (acetate), trifluoro acetate ili hlorovodoničnu kiselinu (hloride).

[0107] Peptid predmetnog pronalaska se može koristiti za generisanje i razvoj određenih antitela protiv MHC/peptidnih kompleksa. Oni se mogu koristiti za terapiju, ciljanje toksina ili radioaktivnih supstanci kod obolelog tkiva. Druga upotreba ovih antitela može biti ciljanje radionuklida kod obolelog tkiva u svrhe snimanja, kao što je PET. Ova upotreba može pomoći za detektovanje malih metastaza ili kako bi se utvrdila dimenzija i precizna lokalizacija obolelih tkiva.

[0108] Stoga je sledeći aspekt pronalaska da obezbedi metod za proizvodnju rekombinantnog antitela koji se konkretno vezuje za glavni kompleks histokompatibilnosti (MHC) I klase kod ljudi koji je kompleksiran sa antigenom ograničenim sa HLA, metod obuhvata: imunizovanje genetski modifikovanog neljudskog sisara koji sadrži ćelije koje eksprimiraju pomenuti glavni kompleks histokompatibilnosti (MHC) I klase kod ljudi sa rastvorljivom formom molekula MHC I klase koji je kompleksiran sa pomenutim antigenom ograničenim sa HLA; izolovanje mRNK molekula iz ćelija koje proizvode antitelo od pomenutog neljudskog sisara; proizvodnja biblioteke fagnog prikaza koja prikazuje proteinske molekule kodirane od strane pomenutih mRNK molekula; i izolovanje najmanje jednog faga iz pomenute biblioteke fagnih prikaza, pomenuti barem jedan fag koji prikazuje pomenuto antitelo koje se konkretno vezuje za pomenuti glavni kompleks histokompatibilnosti (MHC) I klase kod ljudi koji se kompleksira sa pomenutim antigenom ograničenim sa HLA.

[0109] Sledeći aspekt pronalaska je da obezbedi antitelo koje se konkretno vezuje za glavni kompleks histokompatibilnosti (MHC) I klase kod ljudi koji se kompleksira sa antigenom ograničenim sa HLA, pri čemu antitelo je poželjno poliklonalno antitelo, monoklonalno antitelo, bi-specifično antitelo i/ili himerno antitelo.

[0110] Otkriven je metod za proizvodnju pomenutog antitela koje se konkretno vezuje za glavni kompleks histokompatibilnosti (MHC) I klase kod ljudi koji se kompleksira sa antigenom ograničenim sa HLA, metod obuhvata: imunizovanje genetski modifikovanog neljudskog sisara koji sadr ži ćelije koje eksprimiraju pomenuti glavni kompleks histokompatibilnosti (MHC) I klase kod ljudi sa rastvorljivom formom molekula MHC I klase kompleksiranog sa pomenutim antigenom ograničenim sa HLA; izolovanje mRNK molekula iz ćelija koje proizvode antitela pomenutog neljudskog sisara; proizvodnja biblioteke fagnog prikaza koja prikazuje proteinske molekule kodirane sa pomenutim mRNK molekulima; i izolovanje barem jednog faga iz pomenute bibiloteke fagnog prikaza, pomenuti barem jedan fag koji prikazuje pomenuto antitelo konkretno vezivo za pomenuti glavni kompleks histokompatibilnosti (MHC) I klase kod ljudi kompleksiran sa pomenutim antigenom ograničenim sa HLA. Respektivni metodi za proizvodnju takvih antitela i jednolančanih glavnih kompleksa histokompatibilnosti I klase, kao i drugi alati za proizvodnju ovih antitela su otkriveni u WO 03/068201, WO 2004/084798, WO 01/72768, WO 03/070752 i Cohen CJ, Denkberg G, Lev A, Epel M, Reiter Y. Rekombinantna antitela sa MHC-ograničenom, peptidno-određenom, slično T-ćelijskom receptoru specifičnošću: novi alati za istraživanje antigenske prezentacije i TCR-peptid-MHC interakcija. J Mol Recognit. 2003 SepOct;16(5):324-32.; Denkberg G, Lev A, Eisenbach L, Benhar I, Reiter Y. Selektivno ciljanje melanoma i APC korišćenjem rekombinantnog antitela sa specifičnošću sličnoj TCR usmereno prema antigenu diferencijacije melanoma. J Immunol. 2003 Sep 1;171(5):2197-207; i Cohen CJ, Sarig O, Yamano Y, Tomaru U, Jacobson S, Reiter Y. Direktna fenotipska analiza prezentacije antigena MHC I klase kod ljudi: vizualizacija, kvantitacija i in situ detekcija viralnih epitopa kod ljudi korišćenjem peptidnoodređenih, MHC-ograničenih ljudskih rekombinantnih antitela J Immunol. 2003 Apr 15; 170(8):4349-61.

[0111] Poželjno, antitelo se vezuje sa vezujućim afinitetom od ispod 20 nanomolara, pogodno ispod 10 nanomolara, za kompleks, što se smatra „specifičnim“ u kontekstu predmetnog pronalaska.

[0112] Sledeći aspekt pronalaska je da obezbedi metod za proizvodnju rastvorljivog T-ćelijskog receptora koji prepoznaje određeni peptid-MHC kompleks. Takvi rastvorljivi T-ćelijski receptori se mogu generisati od određenih T-ćelijskih klonova, i njihov afinitet se može povećati mutagenezom koja cilja regione koji utvrđuju komplementarnost. Za svrhu selekcije T-ćelijskog receptora, može se upotrebiti fagni prikaz (US 2010/0113300, Liddy N, Bossi G, Adams KJ, Lissina A, Mahon TM, Hassan NJ, et al. Monoclonal TCR-redirected tumor cell killing. Nat Med 2012 Jun;18(6):980-987). Za svrhu stabilizacije T-ćelijskih receptora tokom fagnog prikaza i u slučaju praktičnog korišćenja kao leka, alfa i beta lanac može biti povezan, na primer, nenativnim disulfidnim vezama, drugim kovalentnim vezama (jednolančani T-ćelijski receptor) ili dimerizacijom domena. (videti Boulter JM, Glick M, Todorov PT, Baston E, Sami M, Rizkallah P, et al. Stabilni, rastvorljivi molekuli T-ćelijskog receptora za kristalizaciju i terapeutike. Protein Eng 2003 Sep;16(9):707-711.; Card KF, Price-Schiavi SA, Liu B, Thomson E, Nieves E, Belmont H, et al. Rastvorljiv jednolančani T-ćelijski receptor IL-2 fuzioni protein zadržava MHC-ograničenu peptidnu specifičnost i IL-2 bioaktivnost. Cancer Immunol Immunother 2004 Apr;53(4):345-357; i Willcox BE, Gao GF, Wyer JR, O’Callaghan CA, Boulter JM, Jones EY, et al. Proizvodnja rastvorljivih alfabetnih T-ćelijski receptorskih heterodimera pogodnih za biofizičku analizu vezivanja liganda. Protein Sci 1999 Nov; 8 (11):2418-2423). T-ćelijski receptor može biti povezan za toksine, lekove, citokine (videti US 2013/0115191), domene koji regrutuju efektorske ćelije kao što je anti-CD3 domen, itd., u cilju izvršavanja određenih funkcija na ciljnim ćelijama. Štaviše, moglo bi biti eksprimirano kod T ćelija korišćenih za adoptivni transfer.

[0113] Dalje informacije mogu biti pronađene u WO 2004/033685A1 i WO 2004/074322A1. Kombinacija sTCR je opisana u WO 2012/056407A1. Dalji metodi za proizvodnju su otkriveni u WO 2013/057586A1.

[0114] Kako bi se selektovali prekomerno prisutni peptidi, izračunat je prezentacioni profil koji prikazuje prezentaciju medijanskog uzorka kao i replikatnu varijaciju. Profil suprostavlja uzorke tumorskog entiteta od interesa polaznoj vrednosti uzoraka normalnog tkiva. Svaki od ovih profila mo že nakon toga biti konsolidovan u preko-prezentacioni rezultat izračunavanjem p vrednosti linearnog modela modela mešanih efekata (J. Pinheiro, D. Bates, S. DebRoy, Sarkar D., R Core team. nlme: Linear and Nonlinear Mixed Effects Models. 2008) prilagođavanjem za višestruko testiranje pomoću False Discovery Rate (Y. Benjamini and Y. Hochberg. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological), Vol.57 (No.1):289-300, 1995).

[0115] Zbog identifikacije i relativne kvantitacije HLA liganada masenom spektrometrijom, pre čišćeni su HLA molekuli iz šok-zamrznutih uzoraka tkiva i peptidi povezani sa HLA su izolovani. Izolovani peptidi su razdvojeni i sekvence su identifikovane eksperimentima mrežnom nano-elektrosprej-jonizacijom (nanoESI) tečnom hromatografijom-masenom spektrometrijom (LC-MS). Dobijene peptidne sekvence su verifikovane poređenjem fragmentacionog obrasca prirodnog TUMAP zabeleženog iz NSCLC uzoraka sa fragmentacionim obrascima odgovarajućih sintetičkih referentnih peptida identičnih sekvenci. Obzirom na to da su peptidi direktno identifikovani kao ligandi HLA molekula primarnih tumora, ovi rezultati pružaju neposredni dokaz za prirodno obrađivanje i prezentaciju identifikovanih peptida na primarnom tumorskom tkivu dobijenih od pacijenata sa NSCLC.

[0116] The proprietary discovery pipeline XPRESIDENT® v2.1 (videti, za primer, US 2013-0096016) omogućuje identifikaciju i selekciju relevantnih prekomerno prisutnih peptidnih vakcinskih kandidata baziranih na direktnoj relativnoj kvantitaciji peptidnih nivoa ograni čenih sa HLA na karcinomskim tkivima u poređenju sa nekoliko različitih nekarcinomskih tkiva i organa. To je postignuto razvojem diferencijalne kvantitacije bez oznaka korišćenjem dobijenih LC-MS podataka obrađenih putem proprietary data analysis pipeline, spajanjem algoritama za sekventnu identifikaciju, spektralno grupisanje, brojanje jona, ravnanje vremena retencije, dekonvoluciju stanja napona i normalizaciju.

[0117] Uspostavljeni su prezentacioni nivoi koji uključuju procene grešaka za svaki peptid i uzorak. Identifikovani su peptidi koji su ekskluzivno prisutni na tumorskom tkivu i peptidi koji su prekomerno prisutni kod tumora u odnosu na nekarcinomska tkiva i organe.

[0118] HLA-peptidni kompleksi iz 50 uzoraka šok-zamrznutih NSCLC tumorskih tkiva su prečišćeni i peptidi povezani sa HLA su izolovani i analizirani pomoću LC-MS.

[0119] Svi TUMAP koji su sadržani u predmetnoj aplikaciji su identifikovani ovim pristupom na primarnim uzorcima NSCLC tumora što je potvrdilo njihovo prisustvo na primarnim NSCLC.

[0120] TUMAP koje su identifikovano kod višestrukog NSCLC tumora i normalnih tkiva su kvantifikovano korišćenjem jonskog brojanja LC-MC podataka bez oznake. Metod pretpostavlja da LC-MC signalna područja peptida koreliraju sa svojom abundancijom u uzorku. Svi kvantitativni signali peptida u raznim LC-MS eksperimentima su normalizovani na osnovu centralne tendencije, uprose čeni po uzorku i spojeni u grafikon, koji je nazvan prezentacioni profil. Prezentacioni profil konsolidira razli čite analizacione metode kao što su pretraga proteinske baze podataka, spektralno grupisanje, dekonvolucija stanja napona (pražnjenje) i ravnanje retencionog vremena i normalizacija.

[0121] Predmetni pronalazak se odnosi na peptid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prema sekvencionom identifikacionom broju 5 (MXRA5-001), pri čemu pomenuti peptid ima mogućnost da se veže za molekul glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) I klase kod ljudi.

[0122] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptide u skladu sa pronalaskom, pri čemu peptid uključuje nepeptidne veze.

[0123] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptide prema pronalasku, pri čemu je pomenuti peptid deo fuzionog proteina i fuzionisan za N-terminalne aminokiseline HLA-DR invarijantnog lanca (Ii) povezanog sa antigenom, ili je fuzionisan za (ili na) antitelo, kao što je, na primer, antitelo koje je specifično za dendritske ćelije.

[0124] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu, koja kodira peptid u skladu sa pronalaskom.

[0125] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu u skladu sa pronalaskom koja je DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihove kombinacije.

[0126] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ekspresioni vektor koji eksprimira nukleinsku kiselinu u skladu sa pronalaskom.

[0127] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid u skladu sa pronalaskom, nukleinsku kiselinu u skladu sa pronalaskom ili ekspresioni vektor u skladu sa pronalaskom, za upotrebu u medicini.

[0128] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ćeliju domaćina koja obuhvata nukleinsku kiselinu u skladu sa pronalaskom ili ekspresioni vektor u skladu sa pronalaskom.

[0129] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ćeliju domaćina u skladu sa pronalaskom koja je ćelija koja predstavlja antigen.

[0130] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ćeliju domaćina u skladu sa pronalaskom pri čemu ćelija koja predstavlja antigen je dendritska ćelija.

[0131] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod proizvodnje peptida u skladu sa pronalaskom, metod obuhvata kultivisanje opisane ćelije domaćina i izolovanje peptida iz ćelije domaćina ili njenog medijuma kulture.

[0132] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na in vitro metod za proizvodnju aktiviranih citotoksičnih T limfocita (CTL), metod obuhvata kontaktovanje in vitro CTL sa napunjenim humanim molekulima MHC I klase antigena eksprimiranim na površini pogodne ćelije koja predstavlja antigen tokom vremenskog perioda dovoljnog za aktivaciju pomenutih CTL na antigenski određen način, pri čemu je pomenuti antigen bilo koji peptid u skladu sa pronalaskom.

[0133] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod kao što je opisano, pri čemu pomenuti antigen je postavljen na MHC molekule I klase eksprimirane na površini pogodne ćelije koja predstavlja antigen kontaktovanjem dovoljne količine antigena sa ćelijom koja predstavlja antigen.

[0134] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod u skladu sa pronalaskom, pri čemu ćelija koja predstavlja antigen obuhvata ekspresioni vektor koji eksprimira pomenuti peptid koji sadr ži sekvencioni identifikacioni broj 5.

[0135] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na aktivirane citotoksične T limfocite (CTL), proizvedene postupkom u skladu sa pronalaskom, koji selektivno prepoznaju ćeliju koja aberantno eksprimira polipeptid koji sadrži opisanu aminokiselinsku sekvencu.

[0136] Predmetni pronalazak dalje otkriva metod uništavanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži bilo koju aminokiselinsku sekvencu u skladu sa pronalaskom, metod obuhvata primenu efikasnog broja citotoksičnih T limfocita (CTL) nad pacijentom, u skladu sa pronalaskom.

[0137] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na korišćenje bilo kog peptida u skladu sa pronalaskom, nukleinsku kiselinu u skladu sa pronalaskom, ekspresioni vektor u skladu sa pronalaskom, ćeliju u skladu sa pronalaskom ili aktivirani citotoksični T limfocit u skladu sa pronalaskom, za korišćenje u lečenju karcinoma.

[0138] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu u skladu sa pronalaskom, pri čemu pomenuta upotreba je vakcina.

[0139] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu u skladu sa pronalaskom, pri čemu pomenuti karcinom je izabran između nesitnoćelijskog karcinoma pluća (NSCLC), karcinoma pluća, karcinoma želuca i glioblastoma.

[0140] Pojam “antitelo” ili “antitela” je korišćen u ovom tekstu u širem smislu i uključuje i poliklonalna i monoklonalna antitela. Pored netaknutih ili “punih” molekula imunoglobulina, tako đe su uključeni u pojam “antitela” i fragmenti ili polimeri tih molekula imunoglobulina i humanizovane verzije molekula imunoglobulina, sve dok prikazuju bilo koje od željenih svojstava (na primer, određeno vezivanje polipeptida markera karcinoma pluća, isporuka toksina ćeliji karcinoma pluća koja eksprimira gen marker karcinoma pluća u povišenom nivou, i/ili inhibiranje aktivnosti polipeptida markera karcinoma pluća).

[0141] Antitela pronalaska se mogu kupiti od komercijalnih izvora kada god je to mogu će. Antitela pronalaska mogu takođe biti generisana korišćenjem dobro poznatih metoda. Iskusni stručnjak će razumeti da ili puna dužina polipeptida markera karcinoma pluća ili njihovi fragmenti mogu biti korišćeni za generisanje antitela pronalaska. Polipeptid koji će se koristiti za generisanje antitela pronalaska može biti delimično ili potpuno prečišćen iz prirodnog izvora ili može biti proizveden korišćenjem rekombinantnih DNK tehnika.

[0142] Na primer, cDNK koja kodira ABCA13, MMP12, DST, MXRA5, CDK4, HNRNPH, TANC2, 1RNF213, SMYD3 i SLC34A2, ili bilo koji drugi polipeptid sekvencionih identifikacionih brojeva od 1 do 65 i sekvencionih identifikacionih brojeva od 76 do 84 i polipeptid sekvencionog identifikacionog broja 92, ili njihov fragment, može biti eksprimirana u prokariotskim ćelijama (na primer, bakterija) ili eukariotskim ćelijama (na primer, ćelije kvasca, insekta ili sisara), nakon čega rekombinantni protein može biti prečišćen i korišćen kako bi se generisao monoklonalni ili poliklonalni preparat antitela koji konkretno vezuje polipeptid marker karcinoma pluća korišćen za generisanje antitela kao što je opisano.

[0143] Stručnjak iz oblasti će razumeti da generacija dva ili više različitih setova monoklonalnih ili poliklonalnih antitela maksimizuje verovatnoću dobijanja antitela sa zahtevanom specifičnošću i afinitetom za svoju nameravanu upotrebu (na primer, ELISA, imunohistohemija, in vivo snimanje, imunotoksinska terapija). Antitela su testirana na svoju željenu aktivnost poznatim metodama, u skladu sa svrhom za koju će se antitela koristiti (na primer, ELISA, iunohistohemija, imunoterapija, itd; za dalje navođenje o generaciji i testiranju antitela, videti, na primer, Harlow

and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988, new 2nd edition 2013). Na primer, antitela mogu biti testirana ELISA testovima, Vestern blot, imunohistohemijskim bojanjem karcinoma pluća fiksirano formalinom ili zamrznutih sekcija tkiva. Nakon njihove inicijalne in vitro karakterizacije, antitela namenjena za terapijsku ili in vivo dijagnostičku upotrebu su testirana u skladu sa poznatim metodama kliničkog testiranja.

[0144] Pojam “monoklonalno antitelo”, kao što se upotrebljava u ovom tekstu, se odnosi na antitelo dobijeno iz suštinski homogene populacije antitela, tj.; pojedinačna antitela koja obuhvataju populaciju su identična izuzev mogućih mutacija koje nastaju prirodnim putem koje mogu biti prisutne u malom broju. Monoklonalna antitela iz ovog teksta konkretno uključuju “himerna” antitela kod kojih je deo teškog i/ili lakog lanca identičan sa ili homologan odgovarajućim sekvencama kod antitela dobijenih iz određenih vrsta ili koja pripadaju određenoj klasi ili potklasi antitela, dok je ostatak lan(a)ca identičan sa ili homologan odgovarajućim sekvencama kod antitela dobijenih iz drugih vrsta ili koja pripadaju drugoj klasi ili potklasi antitela, kao i fragmenti takvih antitela, sve dok pokazuju željenu antagonističku aktivnost (Patent Sjedinjenih Država broj 4,816,567).

[0145] Monoklonalna antitela pronalaska mogu biti pripremljena korišćenjem metoda hibridoma. Kod hibridoma metoda, miš ili druga odgovarajuća životinja domaćin se obično imunizira sa imunizirajućim agensom kako bi lučila limfocite koji proizvode ili su sposobni da proizvedu antitela koja će se konkretno vezati za imunizirajući agens. Alternativno, limfociti mogu biti imunizirani in vitro.

[0146] Monoklonalna antitela mogu takođe biti napravljena pomoću rekombinantnih DNK metoda, kao što su one opisane u Patentnu Sjedinjenih Država 4,816,567. DNK koji kodira monoklonalna antitela pronalaska se može lako izolovati i sekvencirati korišćenjem konvencionalnih procedura (na primer, korišćenjem oligonukleotidnih sondi koje su sposobne za vezivanje određeno za gene koji kodiraju teške i lake lance murinskih antitela).

[0147] In vitro metodi su takođe pogodni za pripremu monovalentnih antitela. Digestija antitela kako bi se proizveli njihovi fragmenti, konkretno, Fab fragmenti, može biti izvršena korišćenjem rutinskih tehnika poznatih u nauci. Na primer, digestija se može sprovesti korišćenjem papaina. Primeri digestije papaina su opisani u WO 94/29348 objavljenoj 22. decembra 1994. godine i u Patentu Sjedinjenih Država broj 4,342,566. Papainska digestija antitela obično proizvodi dva identična fragmenta koji vezuju antigen, koji se zovu Fag fragmenti, svaki sa pojedinačnom vezujućom lokacijom antigena, i rezidualnim Fe fragmentom. Tretmanom pepsina se dobija fragment koji ima dve lokacije za spajanje antigena i još uvek je sposoban za unakrsno povezivanje antigena.

[0148] Fragmenti antitela, bilo da su zakačeni za druge sekvence ili ne, mogu takođe uključiti insercije, delecije, supstitucije ili druge izabrane modifikacije odre đenih regiona ili određenih aminokiselinskih ostataka, pod uslovom da aktivnost fragmenta nije značajno izmenjena ili oslabljena u poređenju sa nemodifikovanim antitelom ili fragmentom antitela. Ove modifikacije mogu obezbediti neko dodatno svojstvo, kao što su uklanjanje/dodavanje aminokiselina sposobnih za disulfidno vezivanje, povećanje svoje bio-dugovečnosti, menjanje svojih sekretornih karakteristika, itd. U bilo kom slučaju, fragment antitela mora imati bioaktivno svojstvo, kao što je vezujuća aktivnost, regulacija vezivanja u domenu vezivanja, itd. Funkcionalni ili aktivni regioni antitela mogu biti identifikovani mutagenezom određenog regiona proteina, nakon čega sledi ekspresija i testiranje eksprimiranog polipeptida. Takvi metodi su lako uočljivi iskusnom stručnjaku iz oblasti i mogu uključiti mutagenezu nukleinske kiseline specifične za lokaciju, koja kodira fragment antitela.

[0149] Antitela pronalaska mogu dalje obuhvatati humanizovana antitela ili ljudska antitela. Humanizovane forme neljudskih (na primer, murinskih) antitela su himerni imunoglobulini, njihovi imunoglobulinski lanci ili fragmenti (kao što su Fv, Fab, Fab’ ili druge podsekvence antitela koje vezuju antigen) koji sadrže minimalnu sekvencu dobijenu iz neljudskog imunoglobulina. Humanizovana antitela uključuju ljudske imunoglobuline (antitelo primaoca) kod kojih su ostaci iz regiona koji utvr đuje komplementarnost (CDR) primaoca zamenjeni ostacima iz CDR neljudskih vrsta (antitelo donora) kao što je miš, pacov ili zec koji imaju željenu specifičnost, afinitet i kapacitet. U nekim slučajevima, ostaci Fv okvira (FR) ljudskog imunoglobulina su zamenjeni sa odgovarajućim neljudskim ostacima. Humanizovana antitela mogu takođe obuhvatati ostatke koji nisu nađeni ni u antitelu primaoca ni u uveženom CDR ili okvirnim sekvencama. Generalno, humanizovano antitelo će obuhvatati suštinski sve od barem jednog, a obično dva varijabilna domena, u kojim svi ili suštinski svi CDR regioni odgovaraju onima iz neljudskog imunoglobulina i svi ili suštinski svi iz FR regiona su oni iz imunoglobulinske konsenzusne sekvence kod ljudi. Humanizovano antitelo će optimalno takođe sadržati barem deo kontantnog regiona imunoglobulina (Fc), obično onaj iz ljudskog imunoglobulina.

[0150] Metode za humanizovanje neljudskih antitela su dobro poznate u struci. Generalno, humanizovano antitelo ima jedan ili više aminokiselinskih ostataka uvedenih u njega od izvora koji je neljudski. Ti neljudski aminokiselinski ostaci se često nazivaju “uvoz” ostaci, koji su občino uzeti iz “uvoz” varijabilnog domena. Humanizacija se može suštinski sprovesti supstituisanjem CDRs ili CDR sekvenci glodara za odgovarajuće sekvence ljudskog antitela. Shodno tome, takva “humanizovana” antitela su himerna antitela (Patent Sjedinjenih Dr žava broj 4,816,567), pri čemu je suštinski manje od netaknutog ljudskog varijabilnog domena supstituisano odgovarajućom sekvencom iz neljudskih vrsta. U praksi, humanizovana antitela su obično ljudska antitela kod kojih su neki CDR ostaci i moguće neki FR ostaci supstituisani ostacima sa analognih lokacija antitela glodara.

[0151] Transgene životinje (na primer, miševi) koje su sposobne, nakon imunizacije, da proizvode pun repertoar ljudskih antitela u odsustvu endogene proizvodnje imunoglobulina, se mogu koristiti. Na primer, opisano je da homozigotna delecija gena te škog lanca regiona za pridruživanje antitela kod himernih i germ-linije mutantnih miševa ima za rezultat kompletnu inhibiciju endogene proizvodnje antitela. Transfer ljudskog germ-linija imunoglobulinskog genskog niza kod takvih germ-linija mutantnih miševa će rezultirati proizvodnjom ljudskih antitela nakon antigenskog izazova. Ljudska antitela mogu takođe biti proizvedena u bibliotekama fagnog prikaza.

[0152] Antitela pronalaska se poželjno primenjuju nad subjektom u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Obično, odgovarajuća količina farmaceutski prihvatljive soli je korišćena u formulaciji kako bi formulacija postala izotonična. Primeri farmaceutski prihvatljivog nosača uključuju salin, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. PH vrednost rastvora je poželjno od približno 5 do približno 8, poželjnije od približno 7 do približno 7,5. Dalje, nosači uključuju preparate za produženo oslobađanje kao što su polupropusne matrice čvrstih hidrofobnih polimera koji sadrže antitelo, čije matrice su u formi oblikovanih predmeta, na primer, filmova, lipozoma ili mikročestica. Stručnjacima iz oblasti će biti očigledno da određeni nosači mogu biti poželjniji u zavisnosti od, na primer, načina primene i koncentracije antitela koje se primenjuje.

[0153] Antitela se mogu primeniti nad subjektom, pacijentom ili ćelijom, injekcijom (na primer, intravenozno, intraperitonealno, subkutano, intramuskularno), ili putem drugih metoda kao što je infuzija koja osigurava njihovu isporuku u krvotok u efikasnom obliku. Antitela se takođe mogu primenjivati intratumoralnim ili peritumoralnim putevima, kako bi se postigli lokalni kao i sistemski terapeutski efekti. Poželjna je lokalna ili intravenozna injekcija.

[0154] Efikasne doze i rasporedi za administriranje antitela mogu biti utvrđeni empirijski, i takvo određivanja je u okviru stručne veštine. Oni koji su iskusni u struci će razumeti da doza antitela koja mora biti primenjena će varirati u zavisnosti od, na primer, subjekta koji će primiti antitelo, načina primene, konkretnog tipa antitela koje se koristi i drugih lekova koji se primenjuju. Sama ubi čajena dnevna doza antitela može biti u opsegu od približno 1 mg/kg sve do 100 mg/kg telesne mase ili više dnevno, u zavisnosti od faktora pomenutih u prethodnom tekstu. Nakon administracije antitela za lečenje karcinoma pluća, efikasnost terpeutskog antitela može biti procenjena na različite načine koji su dobro poznati za iskusnog praktikanta. Na primer, dimenzija, broj, i/ili distribucija karcinoma plu ća kod subjekta koji prima tretman može biti praćena korišćenjem standardnih tehnika snimanja tumora. Terapeutski primenjeno antitelo koje sprečava rast tumora, ima za rezultat skupljanje tumora, i/ili sprečava razvoj novih tumora, u poređenju sa tokom bolesti do kog bi došlo u odsustvu administracije antitela, je efikasno antitelo za tretman karcinoma pluća.

[0155] Iz razloga što su dugi tumor markeri ABCA13, MMP12, kao što je opisano, veoma eksprimirani kod ćelija karcinoma pluća i eksprimirani pri ekstremno niskim nivoima kod normalnih ćelija, inhibicija ABCA13 i MMP12 ekspresije ili polipeptidne aktivnosti može biti integrisana u bilo koju terapijsku strategiju za lečenje ili prevenciju NSCLC.

[0156] Kod metoda koji su opisani u prehodnom tekstu, koji uključuju administraciju i unos egzogene DNK u ćelije subjekta (tj., genska transdukcija ili transfekcija), nukleinske kiseline predmetnog pronalaska mogu biti u formi gole DNK ili nukleinske kiseline mogu biti u vektoru za isporuku nukleinskih kiselina u ćelije radi inhibicije proteinske ekspresije markera tumora želuca. Vektor može biti komercijalno dostupan preparat, kao što je adenovirusni vektor (Quantum Biotechnologies, Inc.

(Laval, Quebec, Canada). Isporuka nukleinske kiseline ili vektora u ćelije može biti putem mnoštva mehanizama. U jednom primeru, isporuka može biti posredstvom lipozoma, korišćenjem komercijalno dostupnih lipozomnih preparata kao što su LIPOFECTIN, LIPOFECTAMINE (GIBCO-25 BRL, Inc., Gaithersburg, Md.), SUPERFECT (Qiagen, Inc. Hilden, Germany) i TRANSFECTAM (Promega Biotec, Inc., Madison, Wis.), kao i drugih lipozoma koji su razvijeni u skladu sa standardnim procedurama u nauci. Dodatno, nukleinska kiselina ili vektor ovog pronalaska mogu biti isporučeni in vivo putem elektroporacije, tehnologije koja je dostupna od Genetronics, Inc. (San Diego, Calif.), kao i pomoću mašine SONOPORATION (ImaRx Pharmaceutical Corp., Tucson, Arizona).

[0157] U jednom primeru, isporuka vektora može biti preko virusnog sistema, kao što je retrovirusni vektorni sistem koji može pakovati rekombinantni retrovirusni genom. Rekombinantni retrovirus mo že zatim biti upotrebljen za inficiranje a time i isporuku inficiranim ćelijama antisensne nukleinske kiseline koja inhibira ekspresiju ABCA13, MMP12. Tačan metod uvođenja izmenjene nukleinske kiseline u ćelije sisara nije, naravno, ograničen na korišćenje retrovirusnih vektora. Druge tehnike su široko dostupne za ovu proceduru uključujući korišćenje adenovirusnih vektora, virusnih vektora povezanih sa adeno (AAV), lentivirusnih vektora, pseudotipskih retrovirusnih vektora. Fizi čka transdukcione tehnike se takođe mogu koristiti, kao što je isporuka lipozoma i receptorski posredovani i drugi endocitozni mehanizmi. Ovaj pronalazak se može koristiti u konjunkciji sa bilo kojim od ovih ili drugih uobičajeno korišćenih genskih transfernih metoda.

[0158] Antitela mogu takođe biti korišćena u in vivo dijagnostičkim analizama. Generalno, antitelo je obeleženo sa radionukleotidom (kao što su<111>In,<99>Tc,<14>C,<131>I,<3>H,<32>P ili<35>S) tako da tumor može biti lokalizovan korišćenjem imunoscintigrafije. Antitela za dijagnostičku upotrebu mogu biti označena sa sondama pogodnim za detekciju putem različitih metoda snimanja. Metodi za detekciju sondi uključuju, ali se ne ograničavaju na, fluorescenciju, svetlo, konfokalnu i elektronsku mikroskopiju; snimanje magnetnom rezonancom i spektroskopiju; fluoroskopiju, kompjutersku tomografiju i pozitronsko emisionu tomografiju. Pogodne sonde uključuju, ali se ne ograničavaju na, fluorescein, rodamin, eozin i druge fluorofore, radioizotope, zlato, gadolinijum i druge lantanide, paramagnetno gvožđe, fluorin-18 i druge pozitronsko emitujuće radionuklide. Dodatno, sonde mogu biti bifunkcionalne ili multifunkcionalne i detektabilne od strane vi še od jednog od navedenih metoda. Ova antitela mogu biti direktno ili indirektno označena sa pomenutim sondama. Prikačinjanje ovih sondi za antitela uključuje kovalentno prikačinjanje sonde, inkorporaciju sonde u antitelo i kovalentno prikačinjanje helacionog jedinjenja za vezivanje sonde, između ostalih dobro prepoznato u nauci. Kod imunohistohemije, uzorak obolelog tkiva može biti svež ili zamrznut ili može biti ugrađen u parafin i fiksiran konzervansom kao što je formalin.

[0159] Predmetni pronalazak time obezbeđuje peptid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence u skladu sa sekvencionim identifikacionim brojem 5 (MXRA5-001), pri čemu pomenuti peptid ima mogućnost vezivanja za molekul glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) I klase kod ljudi.

[0160] U predmetnom pronalasku, pojam “homologno” se odnosi na stepen identičnosti (videti procentnu identičnost u prethodnom tekstu) između sekvenci dve aminokiselinske sekvence, tj. peptidnih ili polipeptidnih sekvenci. Ranije pomenuta “homologija” je utvr đena poređenjem dve sekvence poravnate pod optimalnim uslovima u odnosu na sekvence koje se upoređuju. Takva sekvenciona homologija može biti izračunata stvaranjem ravnanja korišćenjem, na primer, ClustalW algoritma. Uobičajeno dostupan softver za analizu sekvence, konkretnije, Vector NTI, GENETYX ili drugi alati za analizu su obezbeđeni od strane javnih baza podataka.

[0161] Stručnjak će moći da proceni, da li će T ćelije indukovane varijantom specifičnog peptida biti u mogućnosti da unakrsno reaguju sa samim peptidom (Fong et al., 2001); (Zaremba et al., 1997; Colombetti et al., 2006; Appay

et al., 2006).

[0162] CTL može naknadno unakrsno reagovati sa ćelijama i uništiti ćelije koje eksprimiraju polipeptid koji sadrži prirodnu aminokiselinsku sekvencu kognatnog peptida kao što je definisano u aspektima pronalaska. Kao što se može dobiti iz naučne literature (Rammensee et al., 1997) i baza podataka (Rammensee et al., 1999), određene pozicije peptida koji vezuju HLA su obično sidreni ostaci koji formiraju jezgrenu sekvencu koja se uklapa u vezivajući motiv HLA receptora, koji je definisan polarnim, elektrofizičkim, hidrofobnim i prostornim svojstvima polipeptidnih lanaca koji konstitui šu vezujući žleb.

Tabela 4: Varijante i motiv peptida u skladu sa sekvencionim identifikacionim brojem: 1, 2, 4, 5 i 7

[0163] Duži peptidi mogu takođe biti pogodni. Takođe je moguće, da je MHC I klasa epitopa, iako obično dužine između 8-11 aminokiselina, generisana peptidnim procesiranjem od du žih peptida ili proteina koji uključuju aktuelni epitop. Poželjno je da su ostaci koji flankuju aktualne epitope ostaci koji suštinski ne utiču na proteolitičko cepanje koje je neophodno kako bi se izložio aktualni epitop tokom procesiranja.

[0164] Vezivanje peptida ili varijante za MHC kompleks može biti testirano metodama koje su poznate u nauci.

[0165] U jednoj izvedbi predmetnog pronalaska, peptid je fuzioni protein koji obuhvata 80 N-terminalnih aminokiselina invarijantnog lanca HLA-DR povezanog sa antigenom (p33, u slede ćem “Ii”) kao što je dobijeno od NCBI, GenBank pristupni broj X00497.

[0166] Nepeptidna veza je, na primer, -CH2-NH, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH-, -COCH2-, - CH(OH)CH2- i -CH2SO-. Patent Sjedinjenih Država 4,897,445 pruža metod za čvrstu faznu sintezu nepeptidnih veza (-CH2-NH) u polipeptidnim lancima što uključuje polipeptide sintetizovane standardnim procedurama i nepeptidnu vezu sintetizovanu reagovanjem amino aldehida i aminokiseline u prisustvu NaCNBH3.

[0167] Poželjna izvedba pronalaska je peptid pri čemu peptid uključuje nepeptidne veze. Generalno, peptidi (barem oni koji sadrže peptidne veze između aminokiselinskih ostataka) mogu biti sintetizovani Fmoc-poliamidnim načinom peptidne sinteze čvrste faze kao što je opisano od strane Lu et al (1981) i tamošnjih referenci. Privremena zaštita N-amino grupe se pruža 9-fluorenilmetiloksikarbonil (Fmoc) grupom. Ponavljajuće cepanje ove bazno-labilne zaštitne grupe je izvršeno korišćenjem 20% piperidina u N, N-dimetilformamidu. Funkcionalnosti bočnog lanca mogu biti zaštićene kao njihovi butil etri (u slučaju serin treonina i tirozina), butil estri (u slučaju glutaminske i asparaginske kiseline), butiloksikarbonil derivat (u slučaju lizina i histidina), tritil derivat (u slučaju cisteina) i 4-metoksi-2,3,6-trimetilbenzensulfonil derivat (u slučaju arginina). Tamo gde su glutamin i asparagin ostaci C-terminala, koristi se 4,4’-dimetoksibenzhidril grupa za zaštitu funkcionalnosti bočnog lanca amida. Podrška čvrste baze se bazira na polidimetil-akrilamid polimeru konstituisanom od tri monomera dimetilakrilamida (backbone-monomer), bisakriloiletilen diamina (unakrsni poveziva č) i akriloilsarkozin metil estra (agens za funkcionalizovanje). Peptid-u-resin rascepivo povezani agens koji je kori šćen je kiselo-labilni derivat 4-hidroksimetil-fenoksiacetatne kiseline. Svi aminokiselinski derivati su dodati kao njihovi prethodno formirani simetrični anhidridni derivati sa izuzetkom asaparagina i glutamina, koji se dodaju korišćenjem reverzne N, N-dicikloheksilkarbodiimid/1hidroksibenzotriazol posredujuće kuplujuće procedure. Sve kuplujuće i deprotekcione reakcije su praćene korišćenjem ninhidrina, trinitrobenzen sulfonske kiseline ili izotinskih test procedura. Nakon zavr šetka sinteze, peptidi se odvajaju od resinske potpore sa istovremenim uklanjanjem zaštitnih grupa bočnog lanca tretmanom sa 95% trifluoroacetatne kiseline koja sadrži 50% skavendžerna mešavine. Skavendžeri koji se uobičajeno koriste uključuju etanditiol, fenol, anizol i vodu, konkretan izbor zavisi od konstituentnih aminokiselina peptida koji se sintetizuje. Takođe je moguća kombinacija metodologija čvrste faze i rastvorne faze za sintezu peptida (videti, na primer (Bruckdorfer et al., 2004) i reference kao što su citirane tamo).

[0168] Trifluoroacetatna kiselina je uklonjena evaporacijom in vacuo, sa naknadnom trituracijom sa dietil etrom dajući sirovi peptid. Bilo koji prisutni skavendžeri su uklonjeni jednostavnim postupkom ekstrakcije koja liofilizacijom vodene faze daje sirovi peptid bez skavend žera. Reagensi za peptidnu sintezu su generalno dostupni od, na primer, Calbiochem-Novabiochem (UK) Ltd, Nottingham NG72QJ, UK.

[0169] Prečišćavanje može biti izvršeno bilo kojom, ili kombinacijom tehnika kao što su rekristalizacija, hromatografija isključivanja veličine, hromatografija jonske razmene, hromatografija hidrofobne interakcije i (obično) reverzno-fazna tečna hromatografija visokih performansi korišćenjem, na primer, acetonitril/voda gradijentna separacija.

[0170] Analiza peptida može biti sprovedena korišćenjem slojne hromatografije, elektroforeze, naročito kapilarne elektroforeze, ekstrakcije čvrste faze (CSPE), reverzno-fazne tečne hromatografije visokih performansi, aminokiselinske analize nakon kisele hidrolize i brzim atomskim bombardovanjem (FAB) masena spektrometrijska analiza, kao i MALDI i ESI-Q-TOF masena spektrometrijska analiza.

[0171] Sledeći aspekt pronalaska obezbeđuje nukleinsku kiselinu (na primer polinukleotid) koja kodira peptid pronalaska. Polinukleotid može biti, na primer, DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihove kombinacije, ili jednolančani i/ili dvolančani, ili nativne ili stabilizovane forme polinukleotida, kao što su, na primer, polinukleotidi sa fosforotioatna backbone i može ili ne mora sadržati introne sve dok kodira za peptid. Naravno, samo peptidi koji sadrže aminokiselinske ostatke koji nastaju prirodnim putem spojeni peptidnim vezama koje nastaju prirodnim putem se mogu kodirati polinukleotidom. Slede ći aspekt pronalaska pruža ekspresioni vektor koji eksprimira polipeptid kao što je objavljeno.

[0172] Mnoštvo metoda je razvijeno kako bi povezali polinukleotide, naročito DNK, sa vektorima na primer pomoću komplementarnih kohezivnih termini. Na primer, komplementarni homopolimerni trakti se mogu dodati DNK segmentu da bi se ubacili u vektorski DNK. Vektor i DNK segment su spojeni vodoničnim vezivanjem između komplementarnih homopolimernih repova kako bi se dobili rekombinantni DNK molekuli.

[0173] Sintetički povezivači koji sadrže jedno ili više restrikcionih mesta obezbeđuju alternativni metod spajanja DNK segmenata sa vektorima. Sintetilčki povezivači koji sadrže mnoštvo restrikcionih endonukleaznih mesta su komercijalno dostupni od niza izvora uključujući International Biotechnologies Inc. New Haven, CN, USA.

[0174] Željeni metod modifikovanja DNK koja kodira polipeptid pronalaska koristi polimeraznu lan čanu reakciju kao što je objavljeno od (Saiki et al., 1988)). Ovaj metod može biti korišćen za uvođenje DNK u odgovarajući vektor, na primer inženjeringom na pogodnim restrikcionim mestima, ili se može koristiti za modifikovanje DNK na druge korisne načine kao što je poznato u nauci. Ukoliko se virusni vektori koriste, poželjni su poks ili adenovirusni vektori.

[0175] DNK (ili u slučaju retrovirusnih vektora, RNK) može zatim biti eksprimirana u pogodnom domaćinu kako bi proizvela polipeptid koji obuhvata peptid pronalaska. Stoga, DNK koja kodira peptid pronalaska može biti korišćena u skladu sa poznatim tehnikama, na odogovarajući način modifikovana obzirom na ovde sadržana učenja, kako bi konstruisala ekspresioni vektor, koji se zatim koristi za transformisanje odgovarajuće ćelije domaćina radi ekspresije i proizvodnje polipeptida pronalaska. Takve tehnike uključuju one koje su opisane u patentima Sjedinjenih Država broj 4,440,859, 4,530,901, 4,582,800, 4,677,063, 4,678,751, 4,704,362, 4,710,463, 4,757,006, 4,766,075 i 4,810,648.

[0176] DNK (ili u slučaju retrovirusnih vektora, RNK) koja kodira polipeptid koji konstitui še jedinjenje pronalaska može biti spojena sa širokim spektrom drugih DNK sekvenci radi uvođenja u odgovarajućeg domaćina. Prateća DNK će zavisiti od prirode domaćina, načina uvođenja DNK u domaćina, i od toga da li je potrebno epizomalno održavanje ili integracija.

[0177] Generalno, DNK je ubačena u ekspresioni vektor, kao što je plazmid, u pravilnoj orijentaciji i ispravnom okviru za čitanje za ekspresiju. Ukoliko je potrebno, DNK može biti povezana sa odgovarajućim transkripcijskim i translacionim regulatornim kontrolnim nukleotidnim sekvencama prepoznatim od strane željenog domaćina, iako su takve kontrole generalno dostupne u ekspresionom vektoru. Vektor se zatim uvodi u domaćina preko uobičajenih tehnika. Generalno, neće svi domaćini biti transformisani vektorom. Stoga, biće neophodno selektovati za transformisane ćelije domaćina.

Jedna selekciona tehnika uključuje inkorporiranje DNK sekvence u ekspresioni vektor, sa bilo kojim neophodnim kontrolnim elementima, koja kodira za selektivno svojstvo u transformisanoj ćeliji, kao što je rezistencija na antibiotike.

[0178] Alternativno, gen za takvo izborno svojstvo može biti drugi vektor, koji je korišćen za zajedničku transformaciju željene ćelije domaćina.

[0179] Ćelije domaćina koje su transformisane rekombinantnom DNK pronalaska su zatim kultivisane tokom odgovarajućeg vremena i pod odgovarajućim uslovima koji su poznati stručnjacima u skladu sa ovde opisanim učenjma, kako bi se omogućila ekspresija polipeptida, koji se zatim može povratiti.

[0180] Mnogi ekspresioni sistemi su poznati, uključujući bakterije (na primer E. coli i Bacillus subtilis), kvasci (na primer Saccharomyces cerevisiae), filamentozne gljivice (na primer Aspergillus spec.), biljne ćelije, životinjske ćelije i ćelije insekata. Poželjno, sistem može biti ćelije sisara kao što su CHO ćelije dostupne od ATCC Cell Biology Collection.

[0181] Tipičan sisarski ćelijski vektorni plazmid za konstitutivnu ekspresiju obuhvata CMV ili SV40 promoter sa pogodnim poli A repom i markerom rezistencije, kao što je neomicin. Jedan primer je pSVL dostupan od Pharmacia, Piscataway, NJ, USA. Primer inducibilnog sisarskog ekspresionog vektora je pMSG, takođe dostupan od Pharmacia. Korisni kvasni plazmidni vektori su pRS403-406 i pRS413-416 i generalno su dostupni od Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA. Plazmidi pRS403, pRS404, pRS405 i pRS406 su plazmidi koji integrišu kvasac (Yips) i inkorporiraju kvasne selektivne markere HIS3, TRP1, LEU2 i URA3. Plazmidi pRS413-416 su kvasni centromerni plazmidi (Ycps). Vektori na bazi CMV promotera (na primer od Sigma-Aldrich) obezbeđuju prolaznu ili stabilnu ekspresiju, citoplazmičnu ekspresiju ili sekreciju, i N-terminalno ili C-terminalno obele žavanje u različitim kombinacijama FLAG, 3xFLAG, c-myc ili MAT. Ovi fuzioni proteini dozvoljavaju detekciju, prečišćavanje i analizu rekombinantnog proteina. Dvostruko označene fuzije pružaju fleksibilnost u detekciji.

[0182] Snažan ljudski regulatorni region promotera citomegalovirusa (CMV) podstiče konstitutivne proteinske ekspresione nivoe do 1 mg/L u COS ćelijama. Kod manje potentnih ćelijskih linija, nivoi proteina su obično ∼0.1 mg/L. Prisustvo SV40 replikacionog porekla će rezultirati sa visokim nivoima DNK replikacije u COS ćelijama koje dopuštaju SV40 replikaciju. CMV vektori, na primer, mogu sadržati pMB1 (derivat pBR322) poreklo za replikaciju u bakterijskim ćelijama, b-laktamazni gen za selekciju ampicilnske rezistencije u bakteriji, hGH poliA i f1 poreklo. Vektori koji sadr že sekvencu preprotripsin vođe (PPT) mogu usmeriti sekreciju FLAG fuzionih proteina u kulturni medijum za pre čišćavanje korišćenjem ANTI-FLAG antitela, resina i ploča. Drugi vektori i ekspresioni sistemi su dobro poznati u nauci za korišćenje sa mnoštvom ćelija domaćina.

[0183] U sledećoj izvedbi dva ili više peptida pronalaska su kodirana i time eksprimirana sukcesivnim redom (slično konstruktima “perle u nizu”). Čineći to, peptidi mogu biti povezani ili fuzionisani zajedno rastezanjem vezivačkih aminokiselina, kao što je na primer LLLLLL, ili mogu biti povezani bez bilo kog dodatnog peptid(a) između sebe.

[0184] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na ćeliju domaćina transformisanu sa polinukleotidnim vektorskim konstruktom predmetnog pronalaska. Ćelija domaćina može biti ili prokariotska ili eukariotska. Bakterijske ćelije mogu biti poželjno prokariotske ćelije domaćina u nekim okolnostima i obično su sojevi E. coli kao, na primer, DH5 sojevi E.coli dostupni od Bethesda Research La boratories Inc., Bethesda, MD, USA i RR1 dostupni od American Type Culture Collection (ATCC) of Rockville, MD, USA (No ATCC 31343). Poželjne eukariotske ćelije domaćina uključuju kvasne, insektne i sisarske ćelije, poželjno ćelije kičmenjaka kao što su one od miša, pacova, majmuna ili ljudskih fibroblastičnih i kolonskih ćelijskih linija. Kvasne ćelije domaćina uključuju YPH499, YPH500 i YPH501, koje su generalno dostupne od Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA. Poželjne ćelije domaćina sisara uključuju ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) dostupne od ATCC kao CCL61, NIH/3T3 embrionske ćelije NIH švajcarskog miša dostupne od ATCC kao CRL 1658, COS-1 ćelije dobijene iz bubrega majmuna dostupne od ATCC kao CRL 1650 i 293 ćelije koje su ljudske embrionske bubrežne ćelije. Poželjne ćelije insekta su Sf9 ćelije koje mogu biti transfektovane sa bakulovirusnim ekspresionim vektorima. Pregled u pogledu izbora pogodnih ćelija domaćina za ekspresiju se može pronaći u, na primer, udžbeniku Paulina Balbás and Argelia Lorence "Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols," prvi deo, drugo izdanje, ISBN 978-1-58829-262-9, i drugoj literaturi koja je poznata stručnim osobama.

[0185] Transformacija odgovarajuće ćelije domaćina sa DNK konstruktom predmetnog pronalaska je ostvarena pomoću dobro poznatih metoda koji obično zavise od tipa vektora koji se koristi. Što se tiče transformacije prokariotskih ćelija domaćina, videti, na primer, Cohen et al (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110 i Sambrook et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. Transformacija kvasnih ćelija je opisana u Sherman et al (1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY. Takođe je korsitan metod iz Beggs (1978) Nature 275,104-109. Što se tiče ćelija kičmenjaka, reagensi korisni za transfektovanje takvih ćelija, na primer kalcijum fosfat i DEAE-dekstranske ili lipozomne formulacije, su dostupne od Stratagene Cloning Systems, or Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, USA. Elektroporacija je takođe korisna za transformisanje i/ili transfektovanje ćelija i dobro je poznata u nauci za transformisanje kvasnih ćelija, bakterijskih ćelija, ćelija insekata i ćelija kičmenjaka.

[0186] Uspešno transformisane ćelije, tj., ćelije koje sadrže DNK konstrukt predmetnog pronalaska, mogu biti identifikovane pomoću dobro poznatih tehnika kao što je PCR. Alternativno, prisustvo proteina u supernatantu može biti detektovano korišćenjem antitela.

[0187] Biće poznato da su određene ćelije domaćina iz pronalaska korisne u pripremi peptida pronalaska, na primer bakterijske, kvasne i ćelije insekta. Međutim, druge ćelije domaćina mogu biti korisne u određenim terapijskim metodima. Na primer, ćelije koje predstavljaju antigen, kao što su dendritske ćelije, mogu biti korisno upotrebljene za eksprimiranje peptida pronalaska tako da mogu biti ubačene u odgovarajuće MHC molekule. Stoga, predmetni pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina koja obuhvata nukleinsku kiselinu ili ekspresioni vektor u skladu sa pronalaskom.

[0188] U poželjnoj izvedbi ćelija domaćina je ćelija koja predstavlja antigen, naročito dendritska ćelija ili ćelija koja predstavlja antigen. APC napunjeno sa rekombinantnim fuzionim proteinom koji sadrži fosfatazu prostatične kiseline (PAP) su trenutno pod ispitivanjem za tretman karcinoma prostate (Sipuleucel-T) (Small et al., 2006; Rini et al., 2006).

[0189] Sledeći aspekt pronalaska obezbeđuje metod proizvodnje peptida, metod koji obuhvata kultivisanje ćelije domaćina i izolovanje peptida iz ćelije domaćina ili njegovog medijuma kulture.

[0190] U sledećoj izvedbi peptida, nukleinska kiselina ili ekspresioni vektor pronalaska su kori šćeni u medicini. Na primer, peptid može biti pripremljen za intravenoznu (i.v.) injekciju, subkutanu (s.c.) injekciju, intradermalnu (i.d.) injekciju, intraperitonealnu (i.p.) injekciju, intramuskularnu (i.m.) injekciju. Poželjne metode peptidne injekcije uključuju s.c., i.d., i.p., i.m. i i.v. Poželjne metode DNK injekcije uključuju i.d., i.m., s.c., i.p. i i.v. Doze od, na primer, između 50 ug i 1,5 mg, poželjno od 125 ug do 500 ug, peptida ili DNK mogu biti date i zavisiće od respektivnog peptida ili DNK. Doze ovog ranga su uspešno korišćene u prethodnim ispitivanjima (Walter et al Nature Medicine 18, 1254-1261 (2012)).

[0191] Sledeći aspekt predmetnog pronalaska uključuje in vitro metod za proizvodnju aktiviranih T-ćelija, metod obuhvata kontaktovanje in vitro T ćelija sa ljudskim MHC molekulima napunjenih antigenom eksprimiranih na površini pogodne ćelije koja predstavlja antigen tokom vremenskog perioda dovoljnog za aktiviranje T ćelije na antigenski određen način, pri čemu antigen je peptid u skladu sa pronalaskom. Poželjno je korišćena odgovarajuća količina antigena sa ćelijom koja predstavlja antigen.

[0192] Poželjno, ćeliji sisara nedostaje ili ima smanjen nivo ili funkciju TAP peptidnog transportera. Pogodne ćelije kojima nedostaje TAP peptidni transporter uključuju T2, RMA-S i drozofil ćelije. TAP je transporter povezan sa procesiranjem antigena.

[0193] Ljudski peptid koji puni deficijentnu ćelijsku liniju T2 je dostupan od American Type Culture Collection, 12301

Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA pod kataloškim brojem CRL 1992; drozofil ćelijska linija Schneider line 2 je dostupna od ATCC pod kataloškim brojem CRL 19863; mišja RMA-S ćelijska linija je opisana u Karre et al 1985.

[0194] Poželjno, ćelija domaćina pre transfekcije suštinski ne eksprimira molekule MHC I klase. Takođe je poželjno da stimulatorska ćelija eksprimira molekul koji je važan za obezbeđivanje ko-stimulatornog signala za T-ćelije kao bilo koji od B7.1, B7.2, ICAM-1 i LFA 3. Sekvence nukleinske kiseline brojnih molekula MHC I klase i ko-stimulatornih molekula su javno dostupne od GenBank i EMBL baza podataka.

[0195] U slučaju epitopa MHC I klase koji se koristi kao antigen, T ćelije su CD8-pozitivni CTL.

[0196] Ukoliko je ćelija koja predstavlja antigen transfektovana da eksprimira takav epitop, ćelija poželjno obuhvata ekspresioni vektor koji eksprimira peptid koji sadrži sekvencioni identifikacioni broj 5.

[0197] Određen broj drugih metoda se može koristiti za generisanje CTL in vitro. Na primer, metodi opisani u Peoples et al (1995) i Kawakami et al (1992) koriste autologne tumorski-infiltrirajuće limfocite u generaciji CTL. Plebanski et al (1995) koristi autologne limfocite periferne krvi (PLB) u pripremi CTL. Jochmus et al (1997) opisuje proizvodnju autologne CTL pulsiranjem dendritskih ćelija sa peptidom ili polipeptidom, ili preko infekcije rekombinantnim virusom. Hill et al (1995) i Jerome et al (1993) koriste B ćelije u proizvodnji autolognog CTL. Dodatno, makrofagi pulsirani sa peptidom ili polipeptidom, ili inficirani sa rekombinantnim virusom, mogu biti kori šćeni u pripremi autolognog CTL. S. Walter et al.

2003 opisuje in vitro primovanje T ćelija korišćenjem veštačkih ćelija koje predstavljaju antigen (aAPC), što je takođe pogodan način za generisanje T ćelija naspram izabranog peptida. U ovom istraživanju, aAPC su generisani kuplovanjem prethodno formiranih MHC:peptid kompleksa na povr šinu polistirenskih čestica (mikroperli) biotin:streptavidin biohemijom. Ovaj sistem dozvoljava ta čnu kontrolu gustine MHC na aAPC, što omogućuje selektivnu elikciju antigenski-specifičnih T ćelijskih odgovora visoke ili niske avidnosti sa visokom efikasnošću iz uzoraka krvi. Izuzev MHC:peptid kompleksa, aAPC bi trebalo da nose druge proteine sa ko-stimulatornom aktivno šću kao anti-CD28 antitela kuplovana za njihovu površinu. Štaviše takvi sistemi bazirani na aAPC često zahtevaju dodavanje odgovarajućih rastvorljivih faktora, na primer, citokina kao interleukin-12.

[0198] Alogene ćelije mogu takođe biti korišćene u pripremi T ćelija a metod je opisan detaljno u WO 97/26328. Na primer, pored drozofil i T2 ćelija, druge ćelije mogu biti korišćene za predstavljanje antigena kao CHO ćelije, ćelije insekta inficirane bakulovirusom, bakterije, kvasac, ciljane ćelije inficirane vakcinijom. Dodatno mogu biti korišćeni biljni virusi (videti, za primer, Porta et al (1994)) što opisuje razvoj cowpea mosaic virusa kao visokoprinosnog sistema za prezentaciju stranih peptida.

[0199] Aktivirane T ćelije koje su usmerene protiv peptida pronalaska su korisne u terapiji. Stoga, sledeći aspekt pronalaska obezbeđuje aktivirane T ćelije koje se mogu dobiti prethodno opisanim postupcima pronalaska.

[0200] Aktivirane T ćelije, koje se proizvode prema gorepomenutom postupku, će selektivno prepoznati ćeliju koja aberantno eksprimira polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sekvencionog identifikacionog broja 5.

[0201] Poželjno, T ćelija prepoznaje ćeliju interakcijom preko svog TCR sa HLA/peptid kompleksom (na primer, vezivanje). T ćelije su korisne u postupku uništavanja ciljanih ćelija kod pacijenta čije ciljane ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu pronalaska pri čemu pacijentu se daje efikasna količična aktiviranih T ćelija. T ćelije koje se primenjuju nad pacijentom mogu biti dobijene od pacijenta i aktivirane kao što je opisano u prethodnom tekstu (tj. one su autologne T ćelije). Alternativno, T ćelije nisu od pacijenta već od drugog pojedinca. Naravno, poželjno je ukoliko je pojedinac zdrav. Pod “zdrav pojedinac” izumitelj podrazumeva da je pojedinac generalno dobrog zdravstvenog stanja, poželjno ima kompetentan imuni sistem i, poželjnije, ne boluje od bilo koje bolesti na koju se može lako testirati i otkriti.

[0202] In vivo, ciljane ćelije za CD8-pozitivne T ćelije u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu biti ćelije tumora (koje nekada eksprimiraju MHC II klase) i/ili stromalne ćelije koje okružuju tumor (tumorske ćelije) (koje nekada takođe eksprimiraju MHC II klase; (Dengjel et al., 2006)).

[0203] T ćelije predmetnog pronalaska se mogu koristiti kao aktivni sastojci terapijske kompozicije. Stoga, pronalazak takođe otkriva metod uništavanja ciljanih ćelija kod pacijenta čije ciljane ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu pronalaska, metod obuhvata primenu efikasnog broja T ćelija nad pacijentom kao što je definisano u prethodnom tekstu.

[0204] Pod “aberantno eksprimirano” autori takođe podrazumevaju da je polipeptid prekomerno eksprimiran u poređenju sa normalnim nivoima ekspresije ili da je gen tih u tkivu iz kog je tumor potekao ali da je u tumoru eksprimiran. Pod “prekomerno eksprimiran” autori podrazumevaju da je polipeptid prisutan u nivou od barem 1,2 puta više u odnosu na normalno tkivo; poželjno barem 2 puta, još poželjnije najmanje 5 ili 10 puta nivoa prisutnog u normalnom tkivu.

[0205] T ćelije mogu biti dobijene pomoću metoda poznatih u nauci, na primer onih opisanih u prethodnom tekstu.

[0206] Protokoli za ovaj takozvani adoptivni transfer T ćelija su dobro poznati u nauci. Recenzije se mogu pronaći u (Gattinoni et al., 2006) i (Morgan et al., 2006).

[0207] Bilo koji molekul pronalaska, tj. peptid, nukleinska kiselina, antitelo, ekspresioni vektor, ćelija, aktiviran CTL, T-ćelijski receptor ili nukleinska kiselina koja ga kodira je korisno u lečenju poremećaja, koje karakterišu ćelije koje izbegavaju imuni odgovor. Stoga bilo koji molekul predmetnog pronalaska može biti korišćen kao medikament ili u proizvodnji medikamenta. Molekul može biti korišćen sam ili u kombinaciji sa drugim molekulima pronalaska ili poznatih molekula.

[0208] Poželjno, medikament predmetnog pronalaska je vakcina. Može biti primenjena direktno nad pacijentom, u pogođeni organ ili sistemski i.d., i.m., s.c., i.p. i i.v ili primenjeno ex vivo nad ćelijama dobijenim od pacijenta ili ljudske ćelijske linije koja je naknadno primenjena nad pacijentom, ili korišćeno in vitro za selektovanje potpopulacije imunih ćelija dobijenih od pacijenta, koje su onda ponovo primenjene nad pacijentom. Ukoliko je nukleinska kiselina primenjena nad ćelijama in vitro, može biti korisno za ćelije da budu transfektovane tako da zajednički eksprimiraju citokine koji stimulišu imunitet, kao što je interleukin-2. Peptid može biti suštinski čist, ili kombinovan sa imunostimulišućim ađuvansom (videti u nastavku) ili korišćen u kombinaciji sa imuno-stimulatornim citokinima, ili administriran sa odgovarajućim sistemom isporuke, na primer lipozomima. Peptid takođe može konjugovan sa pogodnim nosačem kao što je keyhole limpet hemocijanin (KLH) ili manan (videti WO 95/18145 i Longenecker, 1993). Peptid takođe može biti označen, može biti fuzioni protein ili može biti hibridni molekul. Peptidi čija sekvenca je objavljena se očekuje da stimulišu CD4 ili CD8 T ćelije. Ipak, stimulacija CD8 CTL je efikasnija uz prisustvo pomoći koju pružaju CD4 T-pomažuće ćelije. Stoga, za epitope MHC I klase koji stimulišu CD8 CTL fuzioni partner ili sekcije hiridnog molekula pogodno obezbeđuju epitope koji stimulišu CD4-pozitivne T ćelije. Epitopi koji stimulišu CD4 i CD8 su dobro poznati u nauci i uključuju one koji su identifikovani u predmetnom pronalasku.

[0209] U jednom aspektu, vakcina obuhvata barem jedan peptid koji ima aminokiselinsku sekvencu sekvencionog identifikacionog broja 5 i barem jedan dodatni peptid, po željno dva do 50, poželjnije dva do 25, čak još poželjnije dva do 20 i najpoželjnije dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest, četrnaest, petnaest, šesnaest, sedamnaest ili osamnaest peptida. Peptid(i) mogu biti dobijeni iz jednog ili više specifičnih TAA i mogu se vezati za molekule MHC I klase.

[0210] Polinukleotid može biti suštinski čist, ili sadržan u pogodnom vektoru ili sistemu isporuke. Nukleinska kiselina može biti DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihove kombinacije. Metodi dizajniranja i uvođenja takve nukleinske kiseline su dobro poznati u nauci. Pregled je obezbeđen od, na primer, (Pascolo et al., 2005). Polinukleotidne vakcine su jednostavne za pripremu, ali na čin delovanja ovih vektora kod indukovanja imunog odgovora nije u potpunosti shvaćen. Pogodni vektori i sistemi isporuke uključuju virusnu DNK i/ili RNK, kao sistemi bazirani na adenovirusu, vakcinskom virusu, retrovirusima, herpes virusu, virusu povezanom sa adeno ili hibridima koji sadrže elemente od više od jednog virusa. Nevirusni sistemi isporuke uključuju kationske lipide i kationske polimere i dobro su poznati u nauci isporuke DNK. Fizička isporuka, kao što je preko “genskog-pištolja”, može takođe biti korišćena. Peptid ili peptidi kodirani nukleinskom kiselinom mogu biti fuzioni protein, na primer sa epitopom koji stimuliše T ćelije za respektivni suprotni CDR kao što je naznačeno u prethodnom tekstu.

[0211] Medikament pronalaska može takođe uključivati jedan ili više ađuvanasa. Ađuvansi su supstance koje nespecifično pojačavaju ili potenciraju imuni odgovor (na primer, imuni odgovori posredovani od CTL i pomažućih T(TH) ćelija ka antigenu, i stoga bi bili smatrani korisnim u medikamentu predmetnog pronalaska. Pogodni ađuvansi uključuju, ali se ne ograničavaju na, 1018 ISS, soli aluminijuma, AMPLIVAX®, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, flagelin ili TLR5 ligande dobijene iz flagelina, FLT3 ligand, GM-CSF, IC30, IC31, Imikuimod (ALDARA®), rezikuimod, ImuFact IMP321, Interleukine kao IL-2, IL-13, IL-21, Interferon-alfa ili -beta, ili njihovi pegilovani derivati, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, ISCOMs, JuvImmune®, LipoVac, MALP2, MF59, monofosforil lipid A, Montanid IMS 1312, Montanid ISA 206, Montanid ISA 50V, Montanid ISA-51, voda-u-ulju i ulje-u-vodi emulzije, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, OspA, Pep-Tel® vektorski sistem, poli(laktid co-glikolid) [PLG]-bazirane i dekstranske mikročestice, talak-toferin SRL172, Virozomi i druge čestice slične virusima, YF-17D, VEGF trap, R848, beta-glukan, Pam3Cys, Aquila’s QS21 stimulon, koji je dobijen iz saponina, mikobakterijski ekstrakti i mikobakterijski ekstrakti i sintetička mimika bakterijskih ćelijskih zidova, i drugi vlasnički ađuvansi Ribi’s Detox, Quil ili Superfos. Poželjni su ađuvansi kao što su Freund’s ili GMCSF. Nekoliko imunoloških ađuvanasa (na primer, MF59) specifičnih za dendritske ćelije i njihovi pripremu je prethodno opisano (Allison and Krummel, 1995; Allison and Krummel, 1995). Takođe mogu biti korišćeni citokini. Nekoliko citokina je direktno povezano sa uticanjem na migraciju dendritske ćelije u limfoidna tkiva (na primer, TNF-), ubrzavanjem maturacije dendritskih ćelija u efikasne ćelije koje predstavljaju antigen za T-limfocite (na primer, GM-CSF, IL-1 i IL-4) (Patent Sjedinjenih Dr žava broj 5,849,589) i deluju kao immunoađuvansi (na primer, IL-12, IL-15, IL-23, IL-7, IFN-alfa. IFNbeta) (Gabrilovich, 1996).

[0212] Takođe je prijavljeno da CpG imunostimulatorni oligonukleotidi pojačavaju efekte ađuvanasa u vakcinskoj postavci. Bez vezivanja teorijom, CpG oligonukleotidi deluju aktiviranjem uro đenog (neadaptivnog) imunog sistema preko Toll-like receptora (TLR), uglavnom TLR9. CpG koji je izazvao TLR9 aktivaciju pojačava antigenski specifične humoralne i celularne odgovore širokom spektru antigena, uključujući peptide ili proteinske antigene, žive ili uništene viruse, vakcine dendritskih ćelija, autologne celularne vakcine i polisaharidne konjugate i kod profilakti čkih i terapijskih vakcina. Još važnije, pojačava maturaciju i diferencijaciju dendritskih ćelija, što ima za rezultat pojačanu aktivaciju TH1ćelija i snažnu generaciju citotoksičnih T-limfocita (CTL), čak i u odsustvu CD4 T ćelijske pomoći. TH1sklonost indukovana stimulacijom TLR9 se održava čak i u prisustvu vakcinskih ađuvansa kao što je alum ili nepotpuni Freunaov ađuvans (IFA) koji normalno promoviše TH2sklonost. CpG oligonukleotidi prikazuju čak veću ađuvansnu aktivnost kada su formulisani ili zajednički primenjeni sa drugim ađuvansima ili u formulacijama kao što su mikročestice, nanočestice, lipidne emulzije ili slične formulacije, koje su posebno neophodne za indukovanje snažnog odgovora kada je antigen relativno slab. Oni takođe ubrzavaju imuni odgovor i omogućavaju da doze antigena budu redukovane za približno dva reda magnitude, sa uporedivim odgovorima antitela na punu dozu vakcine bez CpG u nekim eksperimentima (Krieg, 2006). Patent Sjedinjenih Država broj 6,406,705 B1 opisuje kombinovanu upotrebu CpG oligonukleotida, ađuvanse nenukleinske kiseline i antigen za indukovanje antigensko specifičnog imunog odgovora. CpG TLR9 antagonist je dSLIM (dvostruki stem loop imunomodulator) od Mologen (Berlin, Germany) koji je preferirana komponenta farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska. Drugi molekuli koji vezuju TLR kao što je RNK koja vezuje TLR 7, TLR 8 i/ili TLR 9 mogu takođe biti korišćeni.

[0213] Drugi primeri za korisne ađuvanse uključuju, ali se ne ograničavaju na hemijski modifikovane CpG (na primer, CpR, Idera), dsRNK analoge kao što su Poli(I:C) i njegove derivate (na primer, AmpliGen®, Hiltonol®, poli-(ICLC), poli(IC-R), poli(I:C12U), neCpG bakterijski DNK ili RNK kao i imunoaktivni mali molekuli i antitela kao što su ciklofosfamid, sunitinib, Bevacizumab®, celebreks, NCX-4016, sildenafil, tadalafil, vardenafil, sorafenib, temozolomid, temsirolimus, XL-999, CP-547632, pazopanib, VEGF Trap, ZD2171, AZD2171, anti-CTLA4, druga antitela koja ciljaju ključne strukture imunog sistema (na primer, anti-CD40, anti-TGFbeta, anti-TNFalfa receptor) i SC58175, koji mo že delovati terapeutski i/ili kao ađuvans. Količine i koncentracije ađuvanasa i aditiva koji su korisni u kontekstu predmetnog pronalaska mogu jednostavno biti utvrđene od strane stručnjaka bez nepotrebnog eksperimentisanja.

[0214] Poželjni ađuvansi su imikuimod, resikuimod, GM-CSF, ciklofosfamid, sunitinib, bevacizumab, interferonalfa, CpG oligonukleotidi i derivati, poli-(I:C) i derivati, RNK, sildenafil i čestične formulacije sa PLG ili virozomima.

[0215] U poželjnoj izvedbi, farmaceutska kompozicija u skladu sa pronalaskom ađuvans je izabran iz grupe koja se sastoji od faktora koji stimulišu koloniju, kao što je stimulišući faktor granulocitne makrofagne kolonije (GM-CSF, sargramostim), ciklofosfamid, imikuimod, resikuimod i interferon-alfa.

[0216] U poželjnoj izvedbi, farmaceutska kompozicija u skladu sa pronalaskom ađuvans je izabran iz grupe koja se sastoji od faktora koji stimulišu koloniju, kao što je stimulišući faktor granulocitne makrofagne kolonije (GM-CSF, sargramostim), ciklofosfamid, imikuimod i resikuimod.

[0217] U poželjnoj izvedbi farmaceutske kompozicije u skladu sa pronalaskom, ađuvans je ciklofosfamid,

imikuimod i resikuimod.

[0218] Čak još preferiraniji ađuvansi su Montanid IMS 1312, Montanid ISA 206, Montanid ISA 50V, Montanid

ISA-51, poli-ICLC (Hiltonol®) i anti-CD40 mAB ili njihove kombinacije.

[0219] Ova kompozicija je korišćena za parenteralnu administraciju, kao što je subkutana, intradermalna, intramuskularna ili oralna administracija. Zbog toga, peptidi i opcino drugi molekuli su rastvoreni ili suspendovani u farmaceutski prihvatljivom, poželjno vodenom nosaču. Dodatno, kompozicija može sadržati ekscipijente, kao što su puferi, agensi za vezivanje, praskajući agensi, razblaživači, arome, lubrikanti, itd. Peptidi takođe mogu biti primenjeni zajedno sa imuno stimulišućim supstancama kao što su citokini. Ekstenzivni spisak ekscipijenata koji mogu biti kori šćeni u takvoj kompoziciji može biti, na primer, preuzet od A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Ed., 2000, American Pharmaceutical Association and pharmaceutical press. Kompozicija mo že biti korišćena za prevenciju, profilaksu i/ili terapiju adenomatoznih ili kanceroznih bolesti. Primerne formulacije se mogu pronaći u, na primer, EP2113253.

[0220] Ipak, zavisno od broja fizičko-hemijskih karakteristika peptida pronalaska potrebno je dalje istraživanje kako bi se obezbedile formulacije za specifične kombinacije peptida, naročito kombinacije sa više od 20 peptida koji su stabilni više od 12 do 18 meseci.

[0221] Predmetni pronalazak obezbeđuje medikament koji je koristan u lečenju karcinoma, naročito nesitnoćelijskog karcinoma pluća (NSCLC), karcinoma pluća, karcinoma želuca i glioblastoma.

[0222] Objavljen je komplet koji obuhvata:

(a) kontejner koji sadrži farmaceutsku kompoziciju kao što je opisano u prethodnom tekstu, u rastvoru ili u liofilizovanoj formi;

(b) opciono drugi kontejner sadrži rastvarač ili rekonstituišući rastvor za liofilizovanu formulaciju; i (c) opciono, instrukcije za (i) korišćenje rastvora ili (ii) rekonstituciju i/ili korišćenje liofilizovane formulacije.

[0223] Komplet može dalje obuhvatati jedan ili više (iii) pufera, (iv) rastvarač, (v) filter, (vi) iglu ili (v) špric. Kontejner je poželjno boca, fiola, špric ili epruveta; i može biti kontejner za višestruku upotrebu. Farmaceutska kompozicija je poželjno liofilizovana.

[0224] Kompleti kao što je otkriveno poželjno obuhvataju liofilizovanu formulaciju predmetnog pronalaska u pogodnom kontejneru i instrukcije za njenu rekonstituciju i/ili upotrebu. Pogodni kontejneri uključuju, na primer, boce, fiole (na primer, dvokomorne fiole), špriceve (kao što su dvokomorni špricevi) i epruvete. Kontejner može biti formiran od raznih materijala kao što je staklo ili plastika. Poželjno komplet i/ili kontejner sadrže instrukcije o ili povezane sa kontejnerom koje ukazuju na uputstva za rekonstituciju i/ili upotrebu. Na primer, oznaka mo že ukazati da se liofilizovana formulacija treba rekonstituisati u peptidne koncentracije kao što je opisano u prethodnom tekstu. Oznaka može dalje ukazivati na to da je formulacija korisna ili namenjena za subkutanu administraciju.

[0225] Kontejner koji drži formulaciju može biti višenamenska fiola, što omogućuje ponovljene administracije (na primer, od 2-6 administracija) rekonstituisane formulacije. Komplet mo že dalje obuhvatati drugi kontejner koji obuhvata pogodni diluent (na primer, rastvor natrijum bikarbonat).

[0226] Nakon mešanja diluenta i liofilizovane formulacije, konačna koncentracija peptida u rekonstituisanoj formulaciji je poželjno najmanje 0, 15 mg/mL/peptid (=75mg) i poželjno ne više od 3 mg/mL/peptid (=1500mg). Komplet može dalje uključivati druge željene materijale sa komercijalnog i korisničkog stanovišta, uključujući druge pufere, diluente, filtere, igle, špriceve i umetke paketa sa instrukcijama za upotrebu.

[0227] Komplet kao što je objavljeno može imati jedan kontejner koji sadrži formulaciju farmaceutskih kompozicija prema predmetnom pronalasku sa ili bez drugih komponenti (na primer, druga jedinjenja ili farmaceutske kompozicije tih drugih jedinjenja) ili mo že imati poseban kontejner za svaku komponentu.

[0228] Poželjno, kompleti kao što je objavljeno uključuju formulaciju pronalaska upakovanu za upotrebu u kombinaciji sa zajedničkom administracijom drugog jedinjenja (kao što su ađuvansi (na primer, GM-CSF), hemoterapeutski agens, prirodni proizvod, hormon ili antagonist, anti-angiogenezni agens ili inhibitor, agens koji indukuje apoptozu ili helator) ili njegove farmaceutske kompozicije. Komponente kompleta mogu biti prethodno kompleksirane ili svaka komponenta mo že biti u odvojenom zasebnom kontejneru pre primene nad pacijentom. Komponente kompleta mogu biti obezbe đene u jednom ili više tečnih rastvora, poželjno, vodenom rastvoru, poželjnije, sterilnom vodenom rastvoru. Komponente kompleta mogu takođe biti obezbeđene kao čvrste supstance, koje mogu biti konvertovane u tečne supstance dodavanjem pogodnih rastvarača, koji su poželjno obezbeđeni u drugom zasebnom kontejneru.

[0229] Kontejner terapeutskog kompleta može biti fiola, epruveta, flašica, boca, špric ili bilo koje drugo sredstvo koje drži čvrsto telo ili tečnost. Obično, kada ima više od jedne komponente, komplet će sadržati drugu fiolu ili drugi kontejner, što omogućuje odvojeno doziranje. Komplet takođe može sadržati drugi kontejner za farmaceutski prihvatljivu tečnost. Poželjno, terapeutski komplet će sadržati aparat (na primer, jednu ili više igala, špriceva, kapi za oči, pipeta, itd.), što omogućuje administraciju agenasa pronalaska koji su komponente predstavljenog kompleta.

[0230] Predmetna formulacija je ona koja je pogodna za administraciju peptida na bilo koji prihvatljivi način kao što je oralno (enteralno), nazalno, oftalno, subkutano, intradermalno, intramuskularno, intravenozno ili transdermalno. Poželjno administracija je s.k., a najpoželjnije i.d. Administracija može biti infuzionom pumpom.

[0231] Obzirom da je peptid pronalaska bio izolovan iz NSCLC, medikament pronalaska je po željno korišćen za lečenje NSCLC.

[0232] Predmetni pronalazak će sada biti opisan u sledećim primerima koji opisuju njegove poželjne izvedbe, ipak, bez ograničavanja na iste.

Kratak opis crteža

[0233]

Slika 1: Primerni maseni spektar iz ABCA13-001 pokazuje svoje prisustvo uzorku primarnog tumora NSCLC898. NanoESI-LCMS je sprovedena na peptidnom bazenu eluiranom iz NSCLC uzorka 898. Maseni hromatogram za m/z 543,8318 - 0,001 Da, z = 2 prikazuje peptidni vrhunac u retencionom vremenu 86,36 min. B) Detektovani vrhunac u masenom hromatogramu u 86,36 min je otkrio signal m/z 543,8318 u MS spektru. C) Maseni spektar koliziono indukovanog raspada iz izabranih prekursora m/z 543,8318 zabeleženo u nanoESILCMS eksperimentu u datom retencionom vremenu je potvrdio prisustvo ABCA13-001 u NSCLC898 uzorku tumora. D) Fragmentacioni obrazac sintetičkog ABCA13-001 referentnog peptida je zabeležen i upoređen sa generisanim prirodnim TUMAP fragmentacionim obrascem prikazanim u C radi sekventne verifikacije.

Slika 2: Ekspresioni profili mRNK izabranih proteina u normalnim tkivima i kod 21 uzorka karcinoma pluća

a) ABCA13 (Probeset ID: 1553605_a_at)

B) MMP12 (Probeset ID: 204580_at)

Slika 3: Prezentacioni profili izabranih peptida HLA I klase. Prezentacioni profil je izra čunat za svaki peptid koji prikazuje sredjnu prezentaciju uzorka kao i replikatne varijacije. Profil suprostavlja uzorke interesnog tumorskog entiteta na osnovnu vrednost uzoraka normalnih tkiva.

a) ABCA13-001

b) DST-001

c) MXRA5-001

Slika 4: Primerni rezultati peptidno-specifične in vitro imunogenosti TUMAP I klase. Određene CD8+ T ćelije su obojene sa HLA multimerima povezanim za dva različita fluorohroma. Tačkasti crteži prikazuju MHC multimer-duplo-pozitivne populacije za stimulišući peptid (levi paneli) i respektivnu negativnu kontrolnu stimulaciju (desni paneli).

Slika 5: Vezujuća svojstva POSTN-002 i MMP12-002 za ispitivane HLA haplotipove: Dijagram prikazuje rezultate vezivanja POSTN-002 i MMP12-002 za 5 od 7 analiziranih HLA-DR haplotipova.

Slika 6: Stabilnost HLA-POSTN-002 i MMP12-002 kompleksa nakon 24 h pri 37°C: Dijagram prikazuje procenat netaknutih HLA-POSTN-002 i HLA-MMP12-002 kompleksa nakon 24 h pri 37°C sa odgovarajućim HLA molekulom.

Slika 7: Primerni vakcinski indukovani CD4 T-ćelijski odgovor na CEA-006 u testu ICS II klase. Nakon in vitro senzitizacije PBMC pacijenta 36-031 su analizirani za CD4 T-ćelijske reakcije na CEA-006 (gornji panel) i mock (donji panel) u vremenskoj tački bazena V8/EOS. Ćelije su stimulisane sa odgovarajućim peptidima i obojene markerima održivosti, anti-CD3, anti-CD8, anti-CD4 i efektorskim markerima (sa desna na levo: CD154, TNF-alfa, IFN-gama, IL-2, IL-10), respektivno. Održive CD4 T ćelije su analizirane na proporciju ćelija pozitivnih na jedan ili više efektorskih molekula.

Slika 8: Imunogenost raznih peptida II klase: Dijagram prikazuje stopu imunog odogovora do 5 različitih peptida II klase detektovanih kod 16 pacijenata za IMA950 peptide i kod 71 pacijenta za IMA910 peptide korišćenjem ICS.

PRIMERI

PRIMER 1:

Identifikacija i kvantitacija peptida povezanih sa tumorom koji su prisutni na ćelijskoj površini

Uzorci tkiva

[0234] Tumorska tkiva pacijenata su obezbeđena od strane Univerziteta Heidelberg, Heidelberg, Nemačka. Pismena informativna saglasnost svih pacijenata je data pre operacije. Tkiva su šokzamrznuta u tečnom azotu neposredno nakon operacije i čuvana do izolacije TUMAP-a na - 80°C.

Izolacija HLA peptida iz uzoraka tkiva

[0235] HLA peptidni bazeni iz šok-smrznutih uzoraka tkiva su dobijeni imunom precipitacijom iz čvrstih tkiva prema blago modifikovanom protokolu (Falk, K., 1991; Seeger, F.H.T., 1999) korišćenjem HLA-A*02-specifičnog antitela BB7.2, HLA-A, -B, -C-specifičnog antitela W6/32, CNBr-aktivirane sefaroze, kiselog tretmana i ultrafiltracije.

Metode

[0236] HLA peptidni bazeni kao dobijeni su razdvojeni prema njihovoj hidrofobnosti reverzno-faznom hromatografijom (Acquity UPLC system, Waters) i eluirajući peptidi su analizirani u LTQ-Orbitrap hibridnom masenom spektrometru (ThermoElectron) opremljenom sa ESI izvorom. Peptidni bazeni su ubačeni direktno u analitičku fuzionu-silika mikro-kapilarnu kolonu (75 mm i.d. x 250 mm) upakovanu sa 1.7 mm C18 reverzno-faznim materijalom (Waters) primenjujući protok od 400 nL po minutu. Naknadno, peptidi su razdvojeni korišćenjem dvofaznog binarnog gradijenta od 180 minuta od 10% do 33% B pri protoku od 300 nL po minutu. Gradijent je sačinjen od rastvarača A (0,1% mravlje kiseline u vodi) i rastvarča B (0,1% mravlje kiseline u acetonitrilu). Zlatom obloženi stakleni kapilar (PicoTip, New Objective) je korišćen za uvođenje u nanoESI izvor. LTQ-Orbitrap maseni spektrometar je kori šćen u režimu zavisnosti od podataka korišćenjem TOP5 strategije. Ukratko, ciklus skeniranja je započet sa kompletnim skeniranjem visoke masene tačnosti u orbitrap (R = 30 000), što je praćeno sa MS/MS skeniranjima takođe u orbitrap (R = 7500) na pet najabundantnijih prekursornih jona sa dinami čkom ekskluzijom prethodno selektovanih jona. Tandem maseni spektri su interpretirani od strane SEQUEST i dodatne ručne kontrole. Identifikovana peptidna sekvenca je osigurana poređenjem generisanog prirodnog peptidnog fragmentacionog obrasca sa fragmentacionim obrascem sinteti čkog referentnog peptida sa identičnom sekvencom. Slika 1 prikazuje primerni spektar dobijen iz tumorskog tkiva za peptid ABCA13-001 povezan sa MHC I klasom i njegov elucioni profil u UPLC sistemu.

[0237] Sprovedena je relativna LC-MS kvantitacija bez oznake jonskim brojanjem tj., ekstrakcijom i analizom LC-MS karakteristika (Mueller et al. 2007a). Postupak pretpostavlja da peptidna LC-MC signalna oblast korelira sa njegovom abundancijom u uzorku. Ekstraktovane karakteristike su dalje obrađene dekonvolucijom stanja napona i poravnavanjem retencionog vremena (Mueller et al. 2007b; Sturm et al. 2008). Konačno, LC-MS karakteristike su unakrsno referisane sa rezultatima sekventne identifikacije kako bi se spojili kvantitativni podaci različitih uzoraka i tkiva u peptidne prezentacione profile. Kvantitativni podaci su normalizovani na dvostepen na čin u skladu sa centralnom tendencijom da se računaju varijacije unutar tehničkih bioloških replikata. Stoga svaki identifikovani peptid može biti povezan sa kvantitativnim podacima koji dozvoljavaju relativnu kvantifikaciju izme đu uzoraka i tkiva. Dodatno, svi kvantitativni podaci dobijeni za peptidne kandidate su ru čno pregledani kako bi se osigurala konzistencija podataka i kako bi se potvrdila tačnost automatizovane analize. Za svaki peptid je izračunat prezentacioni profil koji pokazuje srednju prezentaciju uzorka kao i replikatne varijacije. Profil suprostavlja NSCLC uzorke na osnovnoj liniji normalnih uzoraka tkiva.

[0238] Prezentacioni profili primerno prekomerno prisutnih peptida su prikazani na slici 3.

PRIMER 2

Ekspresiono profilisanje gena koji kodiraju peptide kao što je otkriveno

[0239] Nisu svi peptidi koji su identifikovani kao prisutni na povr šini tumorskih ćelija MHC molekulima pogodni za imunoterapiju, iz razloga što je većina ovih peptida dobijena iz normalnih celularnih proteina eksprimiranih od strane mnogih ćelijskih tipova. Samo nekoliko ovih peptida je povezano sa tumorom i verovatno mogu da indukuju T ćelije sa visokom specifičnošću prepoznavanja za tumor iz kog su dobijene. Kako bi se identifikovali takvi peptidi i minimizirao rizik autoimuniteta indukovanog vakcinacijom autori su se fokusirali na te peptide koji su dobijeni iz proteina koji su prekomerno eksprimirani na tumorskim ćelijama u poređenju sa većinom normalnih tkiva.

[0240] Idealni peptid će biti dobijen iz proteina koji je jedinstven za tumor i nije prisutan u bilo kom drugom tkivu. Kako bi se identifikovali peptidi koji su dobijeni iz gena sa ekspresionim profilom sli čnim idealnom, identifikovani peptidi su dodeljeni proteinima i genima, respektivno, iz kojih su dobijeni i ekspresioni profili ovih gena su generisani.

Izvori i priprema RNK

[0241] Hiruški odstranjeni uzorci tkiva su obezbeđeni od Univerziteta Heidelberg, Heidelberg, Nemačka (videti primer 1) nakon što je pisana saglasnost dobijena od svakog pacijenta. Uzorci tumorsih tkiva su zamrznuti u tečnom azotu neposredno nakon operacije i kasnije homogenizovani sa mortarom i tučkom pod tečnim azotom. Ukupna RNK je pripremljena iz ovih uzoraka korišćenjem TRI reagensa (Ambion, Darmstadt, Germany) a zatim očišćena sa Rneasy (QIAGEN, Hilden, Germany); oba metoda su sprovedena u skladu sa uputstvom proizvođača.

[0242] Ukupna RNK iz zdravih ljudskih tkiva je dobijena komercijalno (Ambion, Huntingdon, UK; Clontech, Heidelberg, Germany; Stratagene, Amsterdam, Netherlands; BioChain, Hay-ward, CA, USA). RNK od nekoliko pojedinaca (između 2 i 123 pojedinca) je pomešana tako da je RNK od svakog pojedinca imala jednaku masu.

[0243] Kvalitet i kvantitet svih RNK uzoraka je procenjen sa Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, Waldbronn, Germany) korišćenjem RNK 6000 Pico LabChip Kit (Agilent).

Eksperimenti mikroniza

[0244] Analiza genske ekspresije svih RNK uzoraka tumora i normalnih tkiva je sprovedena sa Affymetrix Human

Genome (HG) U133A ili HG-U133 Plus 2.0 oligonukleotidnim mikronizovima (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA). Svi koraci su izvršeni u skladu sa Affymetrix uputstvom. Ukratko, dvolančana cDNK je sintetizovana od 5-8 mg ukupne RNK, korišćenjem SuperScript RTII (Invitrogen) i oligo-dT-T7 primera (MWG Biotech, Ebersberg, Germany) kao što je opisano u uputstvu. In vitro transkripcija je izvršena sa BioArray High Yield RNA Transcript Labelling Kit (ENZO Diagnostics, Inc., Farmingdale, NY, USA) za U133A nizove ili sa GeneChip IVT Labelling Kit (Affymetrix) za U133 Plus 2.0 nizove, a nakon toga cRNK fragmentacija, hibridizacija i bojanje sa streptavidin-fikoeritrin i zatim biotinilirano anti-streptavidin antitelo (Molecular Probes, Leiden, Netherlands). Prikazi su skenirani sa Agilent 2500A GeneArray Scanner (U133A) ili the Affymetrix Gene-Chip Scanner 3000 (U133 Plus 2.0), i podaci su analizirani sa GCOS softverom (Affymetrix), korišćenjem podrazumevanih postavki za sve parametre. Radi normalizacije, korišćeno je 100 domaćinskih gena obezbeđenih od Affymetrix. Relativne ekspresione vrednosti su izračunate iz odnosa signalnog loga dobijenih softverom i normalan uzorak bubrega je proizvoljno podešen na 1.0.

[0245] Kao što je objavljeno, primerni ekspresioni profili izvornih gena, koji su veoma prekomerno eksprimirani ili ekskluzivno eksprimirani kod nesitnoćelijskog karcinoma pluća, su prikazani na slici 2.

PRIMER 4

In vitro imunogenost kod prisutnih peptida NSCLC MHC I klase

[0246] Kako bi se dobile informacije koje se tiču imunogenosti TUMAP kao što je otkriveno, sprovodimo istrage korišćenjem in vitro T-ćelijskog primujućeg testa baziranog na ponovljenim simulacijama CD8+ T ćelija sa sa veštačkim ćelijama koje predstavljaju antigen (aAPC) napunjenih sa peptid/MHC kompleksima i anti-CD28 antitelom. Na ovaj način bi mogli pokazati imunogenost za 9 HLA-A∗0201 ograničene TUMAP kao što je otkriveno do sada, demonstrirajući da su ovi peptidi T-ćelijski epitopi protiv kojih postoje CD8+ prekursorne T ćelije kod ljudi (tabela 4).

In vitro primovanje CD8+ T ćelija

[0247] Kako bi se sprovele in vitro stimulacije sa veštačkim ćelijama koje predstavljaju antigen napunjenih sa peptid-MHC kompleks (pMHC) i anti-CD28 antitelom, prvo smo izolovali CD8+ T ćelije iz svežih HLA-A∗02 leukafereznih proizvoda preko pozitivne selekcije korišćenjem CD8 mikroperli (Mil tenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Germany) zdravih donora dobijene od Transfuzione medicine Tuebingen, Nemačka, nakon informisanog pristanka.

[0248] Izolovani CD8+ limfociti ili PBMC su inkubirani do upotrebe u T-ćelijskom medijumu (TCM) koji se sastoji od RPMI-Glutamax (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) dopunjenog sa 10% toplotnog inaktiviranog ljudskog AB seruma (PAN-Biotech, Aidenbach, Germany), 100 U/ml Penicilina / 100 mg/ml Streptomicina (Cambrex, Cologne, Germany), 1 mM natrijum piruvata (CC Pro, Ober-dorla, Germany), 20 mg/ml Gentamicina (Cambrex). 2,5 ng/ml IL-7 (PromoCell, Heidelberg, Germany) i 10 U/ml IL-2 (Novartis Pharma, Nürnberg, Germany) su takođe dodati u TCM u ovom koraku.

[0249] Generacija pMHC/anti-CD28 obloženih perli, T-ćelijske stimulacije i očitavanje su sprovedeni u visoko definisanom in vitro sistemu korišćenjem četiri različita pMHC molekula po stimulacionom uslovu i 8 različitih pMHC molekula po uslovu očitavanja.

[0250] Svi pMHC kompleksi koji su korišćeni za aAPC punjenje i citometrijsko očitavanje su dobijeni iz UV-indukovane MHC ligandne razmene (Rodenko et al., 2006) uz manje modifikacije. Kako bi se utvrdila količina pMHC monomera dobijenog razmenom sprovodimo sedvič ELISA na bazi streptavidina u skladu sa (Rodenko et al., 2006).

[0251] Prečišćen ko-stimulatorni mišji IgG2a anti ljudski CD28 Ab 9.3 (Jung et al., 1987) je hemijski biotiniliran korišćenjem Sulfo-N-hidroksisukcinimidobiotina kao što je preporučeno od proizvođača (Perbio, Bonn, Germany). Korišćene perle su bile polistirenske čestice prečnika 5,6 mm obložene streptavidinom (Bangs Laboratories, Illinois, USA).

[0252] pMHC korišćeno za pozitivne i negativne kontrolne stimulacije su bili A∗0201/MLA-001 (peptid ELAGIGILTV iz modifikovanog Melan-A/MART-1) i A∗0201/DDX5-001 (YLLPAIVHI iz DDX5), respektivno.

[0253] 800.000 perli / 200 ml je obloženo u pločama sa 96 otvora u prisustvu 4 x 12,5 ng različitog biotin-pMHC, isprano i 600 ng biotin anti-CD28 je dodatno naknadno u zapreminu od 200 ml. Stimulacije su pokrenute u pločama sa 96 otvora zajedničkim inkubiranjem 1x10<6>CD8+ T ćelija sa 2x10<5>ispranih obloženih perli u 200 ml TCM dopunjeno sa 5 ng/ml IL-12 (PromoCell) tokom 3-4 days pri 37°C. Polovina medijuma je zatim zamenjena svežim TCM dopunjenim sa 80 U/ml IL-2 i inkubiranje je nastavljeno tokom 3-4 dana pri 37°C. Ovaj stimulacioni krug je izvršen ukupno tri puta. Za pMHC multimerno očitavanje korišćenjem 8 različitih pMHC molekula po uslovu, dvodimenzionalni kombinatorijalni pristup kodiranja je korišćen kao što je opisano u prethodnom tekstu (Andersen et al., 2012) uz manje modifikacije koje uključuju kuplovanje za 5 različitih fluorohroma. Konačno, multimerne analize su izvršene bojanjem ćelija sa Live/dead near IR dye (Invitrogen, Karlsruhe, Germany), CD8-FITC antitelo klonskim SKI (BD, Heidelberg, Germany) i fluorescentnim pMHC multimerima. Za analizu je korišćen BD LSRII SORP citometar opremljen sa odgovarajućim laserima i filterima. Peptidno specifične ćelije su izračunate kao procenat ukupnih CD8+ ćelija. Evaluacija multimernih analiza je izvršena korišćenjem FlowJo softvera (Tree Star, Oregon, USA). In vitro primovanje određenih multimer+ CD8+ limfocita je detektovano poređenjem sa negativnim kontrolnim stimulacijama. Imunogenost za dati antigen je detektovana ukoliko je otkriveno da barem jedan procenjiv in vitro stimulisan otvor od jednog zdravog donora sadrži specifičnu CD8+ T-ćelijsku liniju nakon in vitro stimulacije (tj. ovaj otvor je sadržao najmanje 1% određenog multimera+ između CD8+ T-ćelije i procenat određenog multimera ćelije je bio najmanje 10x medijana negativnih kontrolnih stimulacija.

In vitro imunogenost kod NSCLC peptide

[0254] Kod testiranih peptida HLA I klase, in vitro imunogenost bi mogla biti pokazana generacijom peptidno specifičnih T-ćelijskih linija. Kao što je otkriveno, primerni rezultati protočne citometrije nakon TUMAP-specifičnog multimernog bojanja za dva peptida su prikazani na slici 4 zajedno sa odgovarajućim negativnim kontrolama. Rezultati za 25 peptida kao što je otkriveno su rezimirani u tabeli 5.

Tabela 5: In vitro imunogenost peptida HLA I klase kao što je otkriveno

Primerni rezultati eksperimenata in vitro imunogenosti za peptide koje je sproveo aplikant kao

PRIMER 5

Sinteze peptida

[0255] Svi peptidi su sintetizovani korišćenjem standardne i dobro uspostavljene čvrste faze sinteze peptida upotrebom Fmok-strategije. Nakon prečišćavanja preparativnom RP-HPLC, izvršen je postupak jonske razmene radi inkorporiranja fiziološki kompatibilnih kontra jona (na primer, trifluoro-acetat, acetat, amonijum ili hlorid).

[0256] Identičnost i čistoća svakog pojedinačnog peptida je utvrđena masenom spektrometrijom i analitičkom RP-HPLC. Nakon postupka razmene jona peptidi su dobijeni kao beli do beli časti liofilizati čistoće od 90% do 99,7%.

[0257] Svi TUMAP su poželjno administrirani kao trifluoro-acetatne soli ili acetatne soli, drugi oblici soli su takođe mogući. Za merenja u primeru 4, korišćene su trifluoro-acetatne soli peptida.

PRIMER 6

Razmena UV-ligand

[0258] Kandidatni peptidi za vakcine kao što je otkriveno su dalje testirani na imunogenost in vitro testovima primovanja. Pojedinačni peptid-MHC kompleksi zahtevani za ove testove su proizvedeni razmenom UV-liganda, gde se peptid osetljiv na UV svetlost cepa nakon UV iradijacije i razmenjuje sa interesnim peptidom kao što je analizirano. Samo peptidni kandidati koji mogu efikasno da ve žu i stabilizuju peptidno-receptivne MHC molekule sprečavaju disocijaciju MHC kompleksa. Kako bi se utvrdio prinos reakcije razmene, sprovedena je ELISA bazirana na detekciji lakog lanca ( β2m) stabilizovanih MHC kompleksa. Test je sproveden kao što je generalno opisano u Rodenko et al. (Rodenko B, Toebes M, Hadrup SR, van Esch WJ, Molenaar AM, Schumacher TN, Ovaa H. Generisanje kompleksa peptid-MHC I klase preko ligandne razmene posredovane UV svetlom. Nat Protoc.

2006;1(3):1120-32.).

[0259] Ploče (NUNC) sa 96 otvora MAXISorp su obložene tokom noći sa 2ug/ml streptavidina u PBS na sobnoj temperaturi, isprane 4x i blokirane tokom 30 minuta na 37°C u 2% BSA koje sadrži blokirajući pufer. Refoldovani HLA-A∗0201/MLA-001 monomeri su služili kao standardi, pokrivajući opseg od 8-500ng/ml. Peptid-MHC monomeri iz reakcije UV razmene su razblaženi 100 puta u blokirajućem puferu. Uzorci su inkubirani tokom 1 sata na 37°C, isprani četiri puta, inkubirani sa 2ug/ml HRP konjugovanog anti-β2m tokom 1 sata na 37°C, isprani ponovo i detektovani sa TMB rastvorom koji je zaustavljen sa NH2SO4. Apsorpcija je izmerena pri 450nm.

Tabela 6: Razmena UV-li and

[0260] Kandidatni peptidi koji prikazuju visok prinos razmene (tj. vi ši od 40%, poželjno viši od 50%, poželjnije viši od 70%, najpoželjnije viši od 80%) su generalno poželjni za generaciju i proizvodnju antitela ili njihovih fragmenata, i/ili T ćelijskih receptora ili njihovih fragmenata, jer prikazuju dovoljan aviditet prema MHC molekulima i sprečavaju disocijaciju MHC kompleksa.

PRIMER 7

Vezivanje i imunogenost izabranih peptida MHC II klase

[0261] Proteini HLA II klase su podeljeni u 3 različita izotipa HLA-DR, -DP, DQ koji su kodirani brojnim haplotipovima. Kombinacija različitih α- and β- lanaca povećava diverzitet proteina HLA II klase pronađenih u arbitrarnoj populaciji. Stoga, izabrani TUMAP HLA II klase treba da se ve žu za nekoliko različitih HLA-DR molekula (tj. pokažu promiskuoznu sposobnost vezivanja) kako bi mogli da doprinose efikasnom T-ćelijskom odgovoru kod značajnog procenta pacijenata.

[0262] Promiskuozno vezivanje POSTN-002 i MMP12-002 za različite HLA-DR haplotipove i stabilnost formiranih kompleksa je procenjena u in vitro testu vezivanja od strane spoljnog provajdera usluga kao što sledi.

Materijali i metode

[0263]

Lista e tida

Spisak istraženih HLA-DR haplotipova

[0264] 7 istraženih HLA-DR haplotipova su selektovani prema njihovim frekvencijama kod HLA-A∗02 i HLA-A∗24 pozitivne severnoameričke populacije (tabela 7.1 i 7.2)

[0265] Podaci su dobijeni iz analize 1,35 miliona volontera HLA tipa registrovanih u Nacionalnom programu donora koštane srži (Mori et al., 1997). Analizirana populacija je dalje podeljena u sledeće etničke grupe: Amerikanci bele rase (N=997,193), Afroamerikanci (N=110,057), Azijski Amerikanci (N=81,139), Latinoamerikanci (N=100,128) i Nativni Amerikanci (N=19,203).

Principi testa

[0266] Proimuni REVEAL® MHC-peptid test vezivanja utvrđuje mogućnost svakog peptidnog kandidata da se veže za selektovani haplotip HLA II klase i stabilizuje kompleks HLA-peptid. Time se peptidni kandidati sastavljaju in vitro sa određenim proteinom HLA II klase. Nivo peptida inkorporiranog u HLA molekule je izmeren prisustvom ili odsustvom nativne konformacije sastavljenog HLA-peptid kompleksa u nultoj vremenskoj tački nakon završene refoldujuće procedure (takozvana on-stopa).

[0267] Vezujući kapacitet peptidnog kandidata za određeni HLA molekul se upoređuje sa poznatim veoma snažnim vezujućim svojstvima (pozitivne kontrola) što rezultira odgovarajućim REVEAL® MHC-peptid vezujućim rezultatom. Pozitivni kontrolni peptid je selektovan i obezbeđen od strane ProImmune bazirano na njihovom iskustvu pojedinačno za svaki HLA haplotip.

[0268] Pored afiniteta peptida za određeni HLA molekul, trajna stabilnost formiranog HLA-peptid kompleksa je krucijalna za pojavu imunog odgovora. Shodno tome prisustvo formiranog HLA-peptid kompleksa se meri nakon njegove inkubacije tokom 24 sata na 37°C. Stoga je stabilnost formiranog MHC-peptid kompleksa izračunata kao odnos vezujućih rezultata u 24 sata i vezujućih rezultata koji su dobijeni odmah nakon refoldovanja (shodno tome u nultoj vremenskoj tački) u procentu.

Rezultati

[0269] Analiza POSTN-002 i MMP12-002 u REVEAL® MHC-peptid testu vezivanja je pokazala da se oba peptida vezuju za različite HLA haplotipove. Pokazalo se da POSTN-002 formira kompleks sa 5 a MMP12-002 sa 4 od 7 istraženih HLA haplotipova (slika 5). Ni jedan ni drugi peptid se nisu vezali za HLA-DR3 i HLA-DR6. Detektovani rezultati vezivanja su bili unutar opsega od 0,02 do približno 2,5% u poređenju sa pozivnom kontrolom i očigledno iznad rezultata nevezujućih peptida.

[0270] Analiza stabilnosti formiranih HLA-POSTN-002 i HLA-MMP12-002 kompleksa otkriva da su 3 i 2 od 6 istraženih HLA-peptid kompleksa bili stabilni nakon 24 sata na 37°C, respektivno (slika 6).

[0271] Zaključak o imunogenosti peptida na osnovu njegovog kapaciteta vezivanja za HLA molekul se može napraviti upoređivanjem rezultata vezivanja ovog peptida sa onim koji ima poznatu imunogenost. Shodno tome, pet dobro istraženih peptida sa utvrđenom imunogenošću su izabrani za ovo poređenje. Imunogenost ovih peptida je utvrđena ex vivo u uzorcima krvi vakcinisanih pacijenata korišćenjem intracelularnog bojenja citokina (ICS) CD4 T-ćelija.

[0272] U principu, ICS testovi analiziraju kvalitet određenih T ćelija u smislu efektorskih funkcija. Stoga, periferne mononuklearne ćelije (PBMC) su kultivisane in vitro i potom restimulirane interesnim peptidom, referentnim peptidom i negativnom kontrolom (ovde MOCK). Nakon toga su restimulirane ćelije obojene radi FN-gama, TNF-alfa, IL-2 i IL-10 proizvodnje, kao i ekspresija ko-stimulatornog molekula CD154. Brojanje pogođenih ćelija je izvršeno protočnim citometrom (slika 7).

[0273] Analiza imunogenosti je otkrila 100% imunog odgovora vakcinacijom sa IMA950 peptidima (BIR-002 i MET-005) kod 16 pacijenata i 44% do 86% imunog odgovora vakcinacijom sa IMA910 peptidima (CEA-006, TGFBI-004 i MMP-001) kod 71 pacijenta.

[0274] Da bi se uporedili rezultati vezivanja POSTN-002 i MMP12-002 sa rezultatima vezivanja IMA910 i IMA950 peptida, svi peptidi su postavljeni u tabelu za svaki istraženi HLA-DR haplotip u skladu sa detektovanim rezultatom vezivanja (tabele 8.1 do 8.5).

[0275] Poređenje rezultata vezivanja POSTN-002 i MMP12-002 sa rezultatima vezivanja drugih peptida II klase sa poznatom imunogenošću je pokazalo da su vezujući kapaciteti oba peptida uglavnom locirani u sredini do donje polovine tabela sa izuzetkom HLA-DR2. Vezujući kapaciteti oba peptida za HLA-DR2 su locirani u gornjoj polovini tabele sa MMP12-002 kao glavnim kandidatom. Na osnovu analize mora biti očekivano da oba peptida, POSTN-002 i MMP12-002, takođe indukuju i imuni odgovor.

Claims (15)

Patentni zahtevi

1. Peptid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prema sekvencionom identifikacionom broju 5 (MXRA5-001), pri čemu pomenuti peptid ima sposobnost da se veže za molekul ljudskog glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) klase I.

2. Peptid prema patentnom zahtevu 1, pri čemu pomenuti peptid uključuje nepeptidne veze.

3. Peptid prema bilo kom patentnom zahtevu 1 ili 2, pri čemu pomenuti peptid je deo fuzionog proteina i fuzionisan je za N-terminalne aminokiseline HLA-DR sa antigenom povezanog invarijantnog lanca (Ii), ili je fuzionisan za antitelo.

4. Nukleinska kiselina kodirana za peptid prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 3, koja je DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihova kombinacija, ili ekspresioni vektor koji eksprimira pomenutu nukleinsku kiselinu.

5. Peptid prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 3, nukleinska kiselina ili ekspresioni vektor prema patentnom zahtevu 4 za korišćenje u medicini.

6. Ćelija domaćina, koja obuhvata nukleinsku kiselinu ili ekspresioni vektor prema patentnom zahtevu 4.

7. Ćelija domaćina prema patentnom zahtevu 6, pri čemu pomenuta ćelija domaćina je ćelija koja predstavlja antigen, kao što je, na primer, dendritska ćelija.

8. Izlovan vezujući agens specifično vezan za peptid prema patentnom zahtevu 1, ili za peptid prema patentnom zahtevu 1 sadržan u kompleksu pomenutog peptida sa MHC molekulom.

9. Izolovan vezujući agens prema patentnom zahtevu 8 koji je izabran iz antitela ili njegovog fragmenta, T-ćelijski receptor (TCR), i rastvorljiv TCR (sTCR) ili njegov fragment, pri čemu pomenuti fragment pomenutog antitela, pomenuti TCR ili pomenuti sTCR održava svojstvo specifičnog vezivanja za peptid prema patentnom zahtevu 1.

10. Farmaceutska kompozicija ili njena farmaceutski prihvatljiva so obuhvataju ći peptid prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 3, nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 4, ekspresioni vektor prema patentnom zahtevu 4, ili izolovan vezujući agens prema patentnim zahtevima 8 ili 9, i najmanje jednu drugu komponentu izabranu iz grupe farmaceutski prihvatljivih nosa ča i/ili ekscipijenata.

11. In vitro metod za proizvodnju aktiviranog citotoksičnog T limfocita (CTL) ili T pomagač ćelije (Th ćelija), metod obuhvatajući kontaktovanje in vitro CTL ili Th ćelije sa antigenom napunjenim ljudskim klasa I MHC molekulima eksprimiranim na površini pogodne antigen-prezentujuće ćelije tokom vremenskog perioda dovoljnog za aktiviranje pomenutog CTL na antigenski specifi čan način, pri čemu pomenuti antigen je peptid prema patentnom zahtevu 1.

12. Aktivirani citotoksični T limfocit (CTL) ili T pomagač ćelija (Th ćelija), proizvedeni metodom prema patentnom zahtevu 11, pri čemu pomenuti CTL ili Th ćelija selektivno prepoznaju ćeliju koja predstavlja peptid prema patentnom zahtevu 1.

13. Autologna ili alogena humana citotoksična T ćelija (CTL) ili T pomagač ćelija (Th ćelija), rekombinantno transfektovana sa T-ćelijskim receptorom prema patentnom zahtevu 8 ili 9.

14. Peptid prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 3, nukleinska kiselina ili ekspresioni vektor prema patentnom zahtevu 4, ćelija prema patentnom zahtevu 6 ili 7, aktivirani citotoksični limfocit prema patentnom zahtevu 12 ili antitelo ili TCR ili sTCR prema patentnom zahtevu 8 ili 9 za kori šćenje u tretmanu karcinoma.

15. Peptid prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 3, nukleinska kiselina ili ekspresioni vektor prema patentnom zahtevu 4, ćelija prema patentnom zahtevu 6 ili 7, aktivirani citotoksični T limfocit prema patentnom zahtevu 12 ili antitelo ili TCR ili sTCR prema patentnim zahtevima 8 ili 9 za korišćenje prema patentnom zahtevu 14, pri čemu pomenuti karcinom je izabran između nesitnoćelijskog karcinoma pluća (NSCLC), karcinoma pluća, karcinoma želuca, i glioblastoma.