RS59774B1

RS59774B1 - Vakcina zasnovana na rekombinantnom jeryl lynn 2 virusu zauški

Info

Publication number: RS59774B1
Application number: RS20200031A
Authority: RS
Inventors: Reinhard Glueck; Viviana Giannino; Gaurav Gupta
Original assignee: Cadila Healthcare Ltd
Priority date: 2015-03-27
Filing date: 2016-03-28
Publication date: 2020-02-28
Also published as: HRP20200018T1; PL3274447T3; AR104271A1; JP2018510642A; EP3274447B1; LT3274447T; HUE047571T2; BR112017020643A2; KR20170131659A; ES2764677T3; AU2016242460A1; JP2020074792A; IL254698A0; SG11201707904XA; SI3274447T1; KR101970428B1; DK3274447T3; CN107667175A; CA2980847C; WO2016157208A9

Description

Opis

OBLAST OVOG PRONALASKA

[0001] Ovaj pronalazak obezbeđuje novu vakcinu protiv zauški sastavljenu od visoko imunogenog rMuV<JL2>(zasnovanog na rekombinantnom virusu zauški Jeryl Lynn2). Ovaj pronalazak na odgovarajući način obezbeđuje izolovani genom koji obuhvata virus zauški ovog pronalaska, zajedno sa vektorima, ćelijama domaćinima i kompozicije koje obuhvataju taj virus. Vakcina prema ovom pronalasku je bezbedna, isplativa, visoko efikasna i stabilna i konzistentna u pogledu produktivnosti.

POZADINA OVOG PRONALASKA

[0002] Zauške su akutna virusna bolest koju karakteriše temperatura i oticanje parotidn(e)ih žlezd(e)a koja obično pogađa malu decu i može da dovede do komplikacija kao što su orhitis, ooforitis, pankreatitis, i meningo-encefalitis. Međutim, otprilike polovina inficiranih pojedinaca razvije klasičnu bolest. Virus zauški (MuV) je član familije paramyxoviridae family, podfamilije Paramyxovirinae i genus Rubulavirus, koji napada samo ljude [Hviid et al., 2008]. MuV ima jednolančani, negativni smisaoni RNK genom koji se sastoji od 15,384 nukleotida. Genom kodira dva površinska glikoproteina; fuzija (F) i haemaglutinin-neuraminidaza (HN), četiri jezgrana proteina; nukleoprotein (NP), fosfo (P), matrica (M) i veliki protein (L), i mali hidrofobni protein (SH) povezan sa membranom.

[0003] Istorijski gledano, zauške se smatraju bolešću dečijeg doba ali tokom poslednje dve decenije, javljala se i kod starije dece i odraslih u zemljama gde je imunizacija protiv zauški u rutinskoj upotrebi. Uprkos visokoj stopi vakcinisanosti, ponovno javljanje zauški je prijavljeno u određenom broju zemalja kao što su SAD, Ujedinjeno Kraljevstvo, Kanada, Republika Moldavija i Holandija [Bernard et al., 2008; Brockhoff et al., 2010; CDC, 2010; Whelan et al., 2010; Yung et al., 2010]. U Indiji su dostupni oskudni podaci vezano za epidemiologiju zauški, njihovu učestalost i prevalenciju antitela. Nekoliko epidemija zauški je prijavljeno u zemljama Kerala i Maharaštra [Geeta and Kumar, 2004; John, 2004; Ghatage and Kakade, 2007]. Vakcina protiv zauški se daje deci zajedno sa vakcinama protiv malih boginja i rubeole u uzrastu od 12 meseci starosti ili posle. Dva soja živog atenuisanog virusa zauški se koriste u vakcinama u Ujedinjenom Kraljevstvu, naime, soj Urabe, dobijen iz Japanskog izolata divljeg tipa pasažom u jajovodu i soj Jeryl Lynn, dobijen pasažom kulture tkiva Američkog izolata divljeg tipa. Vakcine mimo onih zasnovanih na živim atenuisanim sojevima virusa nisu dostupne za zauške.

[0004] Vakcina Jeryl Lynn (JL) virusa zauški (MuV) sadrži dva različita komponentna soja, MuVJL5 i MuVJL2 koji se značajno razlikuju u svojim nukleotidnim sekvencama (Amexis et al., 2002).

[0005] Za MuVJL vakcinu je prijavljeno da je dobijena iz jednog kliničkog izolata (Afzal et al., 1993), koji je pretvoren u živu atenuisanu vakcinu pasažom virusa u nehumane ćelije domaćine. Prijavljene su kompletne nukleotidne sekvence MuVJL5 i MuVJL2 (Clarke et al., 2000; Amexis et al., 2002) i pokazuju 414 nukleotidnih izmena, koje dovode do 87 aminokiselinskih izmena, između MuVJL5 i MuVJL2. Ovaj nivo varijacije je na istom nivou kao razlike između genotipova MuV. Postoje biološke razlike između MuVJL5 i MuVJL2. Na primer, MuVJL2 raste bolje u embrionisanim jajima od MuVJL5, (Amexis et al., 2002). I MuVJL5 i MuVJL2 nisu neurovirusni prilikom ispitivanja neurovirusnosti kod pacova (Rubin et al., 1999, 2000, 2003).

[0006] Poznato je da rast MuV zavisi i od soja i od ćelije domaćina [Afzal et al, 1990]. Takođe je prijavljeno da jako svojstvo MuV sojeva da stupaju u interakciju specifično sa kulturom Vero ćelija dovodi do veoma različitih oblika citopatogenog efekta (CPE). Tokom virusne infekcije ćelije, replikativni ciklus virusa je praćen nekim brojem biohemijskih i morfoloških promena unutar ćelije koje obično kulminiraju smrću ćelije. Ove morfološke promene su označene kao citopatogeni efekat virusa (CPE). CPE može da ima nekoliko oblika, npr. formiranje sincicijuma, zaokruživanje ćelije, dezorijentacija, oticanje ili skupljanje, odvajanje od površine, liza ukupnih ćelija, itd. Oblik CPE zavisi i od virusa i od ćelija u kojima raste. [Vaccine 28 (2010) 1887-1892]

[0007] U Amexis et al.2002 je pomenuto, da podaci iz MAPREC-a (molekulski postupak za određivanje odnosa podsojeva Jeryl Lynn u raznim Jeryl Lynn preparatima) potvrđuju rezultate iz eksperimenata kloniranja, da se prvom pasažom Merck MVL na Vero ćelije procenat JL2 smanjuje sa 20 na 2% i da se ni jedan ne može detektovati u narednim pasažama, dok je pasaža soja Jeryl Lynn u embrionisanim jajima pilića (ECE) dovela do brze akumulacije JL2 (tokom 90%) i gubitka JL1, što ukazuje da JL2 ima jaku prednost izbora u ECE.

[0008] Autor je dalje zaključio da brz nestanak JL2 tokom pasaže virusa u Vero i CEF ćelije, kako je detektovano kloniranjem i MAPREC-om, ukazuje da se JL2 slabo replikuje u kulturama Vero i CEF ćelija ili da može biti potrebno prisustvo JL1 u funkciji pomoćnika.

[0009] Iz prethodnog opisa, može se zaključiti da je razvoj modela oslobađanja JL2 soja pristupom Vero ili CEF ćelijama kao ćelijama domaćinima težak za dalji razvoj vakcine. Nekoliko faktora kao što su citopatogeni efekat, ćelija domaćin, soj virusa, kombinacija soja virusa i ćelija domaćina imaju uticaja u slučaju razvoja imunogene kompozicije protiv Jeryl Lynn virusa zauški.

[0010] U ovom pronalasku, pronalazači su razvili JL2 soj zasnovan na imunogenoj kompoziciji koji dalje može da se formuliše zajedno sa odgovarajućim stabilizatorom u svrhu vakcinisanja. Takva imunogena kompozicija prema ovom pronalasku je ona koja ima višu imunogenost, koja ne sadrži strane proteine i druge agense i koja je konačno dobar kandidat za razvoj vakcine protiv zauški. Pored toga, takva vakcina je stabilnija od konvencionalne vakcine verovatno zbog veće genetske homogenosti soja.

[0011] Iznenađujuće, pronalazači ovog pronalaska mogu da razviju pomenutu stabilnu imunogenu kompoziciju upotrebom Vero ćelija kao ćelija domaćina. Iako je poznato da Vero ćelija nije dobar kandidat za razvoj JL2 soja, pronalazači ovog pronalaska su iznenađujuće razvili novu imunogenu kompoziciju protiv virusa zauški upotrebom ćelija sisara kao što su Vero ćelije ili MRC-5 ćelije ili HEK 293T ćelije.

KRATAK SADRŽAJ OVOG PRONALASKA

[0012] Ovaj pronalazak obezbeđuje stabilan Jeryl Lynn 2 (u nastavku JL2) soj koji se može koristiti da se proizvede vakcina protiv zauški.

[0013] U prvom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje izolovani genom pune dužine atenuisanog JL2 soja virusa zauški koji obuhvata polinukleotidnu sekvencu koja ima SEQ ID NO.8.

[0014] U drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje vektor koji obuhvata polinukleotidnu sekvencu prvog aspekta (genom pune dužine izolovanog JL2 soja kao što je opisano).

[0015] U trećem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina koja obuhvata vektor drugog aspekta. Pri tome, ćelije domaćini mogu biti odgovarajuće ćelije sisara koje su stabilne i konzistentne u pogledu kvaliteta i produktivnosti. Takve ćelije sisara mogu biti Vero ćelija, MRC-5 ćelija, HEK 293T ćelija, na primer.

[0016] U četvrtom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje vakcinu protiv virusa zauški, koja obuhvata genom pune dužine atenuisanog JL2 soja virusa zauški prema prvom aspektu.

[0017] U petom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje imunogenu kompozicija koja sadrži genom pune dužine atenuisanog JL2 soja virusa zauški prema prvom aspektu.

[0018] U šestom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje kompoziciju za oslobađanje rekombinantnog virusa zauški JL2 soja, gde kompozicija za oslobađanje obuhvata transkripcioni vektor koji obuhvata polinukleotidnu sekvencu prema prvom aspektu; ekspresioni vektor koji obuhvata izolovan gen(e) koji kodira transdelujući protein(e), pri čemu je transdelujući protein izabran iz grupe koju čine NP protein, P protein, L protein i njihove kombinacije; i RNK polimerazu za odgovarajuću transkripciju polinukleotidne sekvence prema prvom aspektu.

[0019] Prema tome, ovaj pronalazak obezbeđuje novu imunogenu kompozicije koja je zaštita protiv virusa zauški. Imunogena kompozicija prema ovom pronalasku sadrži genetski homogene viruse zauški derivirane iz Jeryl Lynn soja.

[0020] Ovaj pronalazak obezbeđuje stabilnu vakcinu koja obuhvata pomenutu imunogenu kompoziciju koja je zaštita protiv virusa zauški.

[0021] Takva vakcina može se kombinovati sa komponentama vakcina protiv boginja, rubeole i/ili varičela da bi se napravila kombinovana vakcina.

[0022] Ovaj pronalazak obezbeđuje stabilnu imunogenu kompoziciju deriviranu iz Jeryl Lynn 2 soja, koji može da zaštiti protiv virusa zauški. Takva imunogena kompozicija je derivirana korišćenjem metodologije reverzne genetike.

[0023] Takva imunogena kompozicija je napravljena korišćenjem raznih ćelije sisara kao domaćina za razvoj stabilne vakcine protiv virusa zauški.

[0024] Dalje, ovaj opis obezbeđuje metode za razvoj pomenute visoko imunogene i stabilne kompozicije.

DETALJAN OPIS NACRTA

[0025]

Fig.1 prikazuje hemijski sintetizovane fragmente genoma virusa zauški Jeryl Lynn soja rastvorenih na agaroznom gelu. Pri tome ima šest fragmenata koji prekrivaju pune dužine genoma atenuisanog JL2 soja virusa zauški. Pri tome, kombinacija 1+2, 3+4 i 5+6 fragmenata su prikazane. Ona prikazuje da su fragmenti odgovarajuće dobijeni posle restrikcione digestije.

Fig.2 prikazuje restrikcionu mapu pMuV<JL2>.

Fig.3 prikazuje formiranje sincicijuma u Vero ćelijama posle P0 pasaže.

Fig.4 prikazuje a) MRC5 ćelije bez infekcije (kontrola) b) MRC5 ćelije inficirane sa rMuV<JL2>FL.

Fig.5 prikazuje Vero ćelije fiksirane TCA bojenjem pod UV svetlom obojenim kristalno ljubičasto pri tome A i B gde rMuV<JL2>prikazuje sincicijume.

KRATAK SADRŽAJ SEKVENCI

[0026]

Sekvenca 1 je nukleotidna sekvenca prvog fragmenta dobijenog restrikcionom digestijom upotrebom restrikcionih mesta NotI i RsrII. Fragment 1 dobijen iz digestije ima položaj 1-3576 nukleotidnog položaja genoma DNK pune dužine. (SEQ ID NO.1)

Sekvenca 2 je nukleotidna sekvenca prvog fragmenta dobijenog restrikcionom digestijom upotrebom restrikcionih mestai RsrII i AvrII. Fragment 2 dobijen iz te digestije ima položaj 3576 -6258 nukleotidnog položaja genoma DNK pune dužine. (SEQ ID NO.2)

Sekvenca 3 je nukleotidna sekvenca prvog fragmenta dobijenog restrikcionom digestijom upotrebom restrikcionih mesta AvrII i XhoI. Fragment 3 dobijen iz te digestije ima položaj 6258 -8438 nukleotidnog položaja genoma DNK pune dužine. (SEQ ID NO.3)

Sekvenca 4 je nukleotidna sekvenca prvog fragmenta dobijenog restrikcionom digestijom upotrebom restrikcionih mesta XhoI i KpnI. Fragment 4 dobijen iz te digestije ima položaj 8438 -10498 nukleotidnog položaja genoma DNK pune dužine. (SEQ ID NO.4)

Sekvenca 5 je nukleotidna sekvenca prvog fragmenta dobijenog restrikcionom digestijom upotrebom restrikcionih mestai KpnI i XmaI. Fragment 5 dobijen iz te digestije ima položaj 10498 -13950 nukleotidnog položaja genoma DNK pune dužine. (SEQ ID NO.5)

Sekvenca 6 je nukleotidna sekvenca prvog fragmenta dobijenog restrikcionom digestijom upotrebom restrikcionih mestai XmaI i NarI. Fragment 6 dobijen iz te digestije ima položaj 13950 -15440 nukleotidnog položaja genoma DNK pune dužine. (SEQ ID NO.6)

Sekvenca 7 je potpuna nukleotidna sekvenca vektora pMuV<JL2>. (SEQ ID NO.7)

Sekvenca 8 je potpuna nukleotidna sekvenca oslobođenog rekombinantnog virusa zauški rMuV<JL2>FL. (SEQ ID NO.8)

Sekvenca 9 je nukleotidna sekvenca koja kodira nukleoprotein (NP) virusa zauški. (SEQ ID NO.9) Sekvenca 10 je nukleotidna sekvenca koja kodira fosfoprotein (P) virusa zauški. (SEQ ID NO.10) Sekvenca 11 je nukleotidna sekvenca koja kodira veliki (L) protein virusa zauški. (SEQ ID NO.11) Sekvenca 12 je aminokiselinska sekvenca nukleoproteina (NP) virusa zauški. (SEQ ID NO.12) Sekvenca 13 je aminokiselinska sekvenca fosfoproteina (P) virusa zauški. (SEQ ID NO.13) Sekvenca 14 je aminokiselinska sekvenca velikog proteina (L) virusa zauški. (SEQ ID NO.14) Sekvenca 15 je nukleotidna sekvenca pSC6-T7 koja kodira T7 RNK polimerazu. (SEQ ID NO.15)

DETALJAN OPIS OVOG PRONALASKA

[0027] U jednom od načina ostvarivanja, ovaj pronalazak obezbeđuje imunogenu kompoziciju zasnovanu na stabilnom JL2 soju, koja se može koristiti da se proizvede vakcina protiv zauški. Izolovani JL2 soj je genetski homogen i visoko imunogen. Opisani izolovani JL2 soj pri tome je bezbedan i delotvoran u pogledu proizvodnje antitela protiv virusa zauški.

[0028] U daljem načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak obezbeđuje genom pune dužine JL2 soja razvijen iz reverzno transkriptovanog m-RNK JL2 soja. JL2 genom pune dužine bio je hemijski sintetizovan u šest različitih fragmenata koji pokrivaju ukupnu dužinu genoma (15,384 bp) virusa zauški. Takvi hemijski sintetizovani fragmenti genoma mogu biti pojačani upotrebom odgovarajućih vektora plazmida (intermedijarni vektori). Genom pune dužine može sintetizovati u manje od ili više od šest fragmenata ovde ilustrovanih, a pri tome upotrebom postupka restrikcione digestije.

[0029] Ovaj opis obezbeđuje postupak kloniranja hemijski sintetizovanih fragmenata JL2 genoma u odgovarajućem vektoru. Transdelujući virusni proteini NP (nukleoprotein), P (fosfoprotein) i L (veliki protein) koji kodira gene virusa zauški, a gen kodirajuće T7 RNK polimeraza se kloniraju u pomoćne plazmide.

[0030] Transdelujući virusni proteini mogu biti definisani kao virusni proteini suštinski neophodni za virusnu enkapsidaciju, transkripciju i translaciju.

[0031] U poželjnom načinu ostvarivanja, transdelujući virusni proteini obuhvataju nukleotidne sekvence kao što je izneto u SEQ ID NO.9 to 11.

[0032] U poželjnijem načinu ostvarivanja, transdelujući virusni proteini obuhvataju aminokiselinske sekvence kao što je izneto u SEQ ID NO.12 to 14.

[0033] U daljem načinu ostvarivanja, T7 RNK polimeraza sadrži vektor koji obuhvata nikleotidnu sekvencu kao što je izneto u SEQ ID NO.15.

[0034] U jednom drugom načinu ostvarivanja prema ovom pronalasku vektori mogu biti izabrani iz grupe koju čine pBluescript, pBluescript II, pBluescript II SK (+), pUC19, pCA, pSC6 i drugi slični. Ovi vektori su komercijalno dostupni i poznati stručnjaku.

[0035] U jednom načinu ostvarivanja, opisan je vektor koji sadrži genom pune dužine izolovanog JL2 soja. Ovaj opis obezbeđuje postupak za konstruisanje plazmida koji obuhvata genom pune dužine JL2 (pMuV<JL2>) faznim kloniranjem hemijski sintetizovanih fragmenata JL2 genoma upotrebom pBluescript II SK (+) kao konačnog transkripcionog vektora.

[0036] Taj transkripcioni vektor obuhvata operativno povezanu transkripcionu jedinicu koja obuhvata skup genetskog elementa ili elemenata koji ima regulacionu ulogu u ekspresiji, na primer, neki promoter, neki strukturni gen ili kodirajuću sekvencu koja je transkriptovana u RNK zauški, i odgovarajuću transkripciju za inicijaciju i završne sekvence. Svi postupci kloniranja prema ovom pronalasku su suštinski opisali Sambrook i Russel (2001). Ovaj opis obezbeđuje postupak za oslobađanje JL2 soja u kom se JL2 soj kultiviše u odgovarajućoj ćelij(ama)i domaćin(a)u. Pri tom, ćelije domaćini mogu biti odgovarajuće ćelije sisara ili one koje nisu od sisara a koje su stabilne i konzistentne u pogledu kvaliteta i produktivnosti. Već je poznato da je pasaža Jeryl Lynn soja u embrionisanim jajima pilića (ECE) dovela do brze akumulacije JL2 (preko 90%) i gubitka JL1, što ukazuje da JL2 ima jaku prednost izbora kod ECE. Ali, ECE ćelije su prvenstveno ćelije koje nisu konzistentne i koje ne mogu da se reprodukuju. Stoga, postaje teško da se održavaju željeni titri JL2 soja upotrebom takvih primarnih ćelija.

[0037] Ovaj pronalazak obezbeđuje proizvodnju imunogene kompozicije isključivo upotrebom ćelija sisara. Takva ćelija sisara može biti izabrana iz grupe koju čine Vero ćelija, MRC-5 ćelija, HEK 293T ćelija i druge slične sekundarne ili tercijarne ćelijske linije i ćelije koje nisu od sisara kao što su E.coli i druge slične mogu da se koriste. Imunogena kompozicija koja je stabilna i dovoljno imunogena na proizvodnom nivou nije dostupna u tehnici. Stoga, imunogena kompozicija koja koristi takvog pomenutog domaćina koji može da se koristi za pripremu vakcine protiv virusa zauški nije dostupna na tržištu. Očekuje se da ovaj pronalazak zadovolji trenutnu potražnju.

[0038] U poželjnom načinu ostvarivanja, ovaj opis obezbeđuje transfekciju odgovarajućih ćelija domaćina sisara upotrebom plazmida koji sadrži JL2 genom zauški pune dužine (pMuV<JL2>) i pomoćnih plazmida koji sadrže gene koji kodiraju transdelujuće virusne proteine NP, P, L i plazmid koji sadrži T7 gen polimeraze. Transfektovane ćelije se inkubiraju kako bi se obezbedilo stvaranje sincicijuma.

[0039] U poželjnijem načinu ostvarivanja, korišćeni su pomoćni plazmidi koji kodiraju Nukleoprotein (NP) označen sa p_N<JL2>, fosfor protein (P) označen sa p_P<JL2>, veliki protein (L) označen sa p_L<JL2>i plazmid koji kodira T7 polimerazu označen sa pSC6-T7 (SEQ ID NO.15).

[0040] Plazmidi koji eksprimiraju transdelujuće virusne proteine i T7 polimerazu koji su korišćeni za zajedničko transfektovanje ćelija domaćina zajedno sa pMuV<JL2>mogu biti definisani kao pomoćni plazmidi. Oni su ključni za virusnu enkapsidaciju, transkripciju i translaciju.

[0041] Sincicijumi mogu biti definisani kao uvećane ćelije sa više formiranih jezgara koje nastaju iz fuzije inficiranih ćelija sa susednim ćelijama posredovanih ekspresijom virusnih proteina.

[0042] Ovi sincicijumi su korišćeni za inficiranje različitih ćelija domaćina sisara za virusno kultivisanje (pasaža P0). Virusni potomci su oslobođeni posle P0 pasaže (rMuV<JL2>FL). Pasaža može biti definisana kao potkultivisanje oslobođenog virusa na ćelijama domaćina. Nakon prve pasaže, sveže ćelije sisara su inficirane pasažom P0 za naredne pasaže (PI i P2). Posle konačne pasaže, oslobođeni virusi su čuvani kao virusne zalihe (matični soj).

[0043] U drugom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak obezbeđuje kompoziciju za oslobađanje koja obuhvata sledeće elemente:

a. transkripcioni vektor koji obuhvata genom pune dužine JL2 soja.

b. ekspresioni vektor obuhvata izolovan gen(e) koji kodira transdelujući protein(e) pri čemu je transdelujući protein izabran iz grupe koju čine NP protein, P protein, L protein i njihova kombinacije.

c. RNK polimeraza za odgovarajuću transkripciju genoma pune dužine JL2 soja.

[0044] Pri tome, prema ovom pronalasku, RNK polimeraza je poželjno T7 RNK polimeraza.

[0045] U jednom drugom načinu ostvarivanja, oslobođene viruse karakteriše metode sekvencioniranje poznate u tehnici, poželjnije metoda sekvencioniranja dugih kloniranih delova.

[0046] U jednom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak obezbeđuje novu, stabilnu i visoko imunogenu kompoziciju koja obuhvata izolovan JL2 soj koji se može koristiti za razvoj vakcine protiv virusa zauški.

[0047] Takva imunogena kompozicija obuhvata genetski homogeni JL2 soj. Stabilna imunogena kompozicija prema ovom pronalasku je bez MuVJL5 komponentnog soja koji je deo konvencionalne vakcine protiv virusa zauški. Prema tome, ovaj pronalazak obezbeđuje stabilnu čistu i visoko imunogenu kompoziciju koja može da zaštiti od antigena virusa zauški koji je konvencionalno zaštićen upotrebom kombinacije JL2 i JL5 sojeva.

[0048] U poželjnom načinu ostvarivanja, ćelija domaćin je izabrana iz grupe koju čine Vero ćelije i MRC-5 ćelije.

[0049] Kako je prethodno navedeno, poznato je da konvencionalni JL2 soj dobro uspeva prevashodno u ćelijama dobijenim iz embriona pilića. Mane upotrebe ćelija embrionisanih jaja leže u riziku od zaostalih proteina dobijenih iz jajeta i drugih nepoznatih spoljnih agenasa uključujući i druge viruse. Takvi zaostali proteini dobijeni iz jajeta mogu da budu uzrok izazivanja neželjenih alergijskih reakcija kod vakcinisanih pojedinaca. Štaviše, prisustvo nepoznatih drugih virusa može da izazove dodatni rizik za vakcinu.

Pronalazači ovog pronalaska su razvili stabilan, homogen i čist izolovan JL2 soj i kompoziciju koja ga obuhvata upotrebom Vero ćelija i MRC-5 ćelija koje se mogu koristiti za razvoj stabilne vakcine protiv virusa zauški.

[0050] U daljem načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak obezbeđuje stabilnu vakcinu koja obuhvata genetski homogen i toplotno stabilan JL2 soj.

[0051] U daljem načinu ostvarivanja, ova vakcina obezbeđuje kombinovanu vakcinu koja sadrži male boginje, rubeolu, varičelu i druge sojeve živih virusa za vakcine zajedno sa Jeryl Lynn vakcinom ovog pronalaska.

[0052] Ovaj opis obezbeđuje postupak za razvoj pomenute imunogene kompozicije upotrebom konvencionalne metodologije reverzne genetike. Uključuje postupak kloniranja za razvoj genoma pune dužine JL2 soja virusa zauški. Takav genom pune dužine JL2 soja je reverzno transkriptovan iz originalne m-RNK izolovanog Jeryl Lynn soja. Stabilno formiranje sincicijuma se dešava kao rezultat citopatogenog efekta iz reverzno transkriptovanog JL2 soja ovog pronalaska. Takav sincicijum dobijen od izolovanog JL2 soja ovog pronalaska je genetski homogen i visoko imunogen. Takav soj imunogene vakcine može da se uzgaja u proizvodnji ćelijske kulture upotrebom različitih ćelijskih linija sisara. Pronalazači su zaključili da su supstrati ćelija kao što su Vero ćelije, MRC-5 ćelije ili HEK 293T ćelije, u poređenju sa CEF primarnim ćelijama koje su korišćene u klasičnoj Jeryl Lynn vakcini, bolji u kultivisanju ćelija u višestrukim pasažima sa nižim troškom proizvodnje.

[0053] Imunogena kompozicija dobijena upotrebom pomenutih ćelijskih linija sisara je konzistentna u pogledu kvaliteta i osetljivosti da se proizvedu željeni titri JL2 soja dok, ne može da se reprodukuje u slučaju CEF primarnih ćelija.

[0054] Štaviše, imunogena kompozicija prema ovom pronalasku pomaže u izbegavanju rizika od kontaminacije novih sporednih agenasa iz ćelijskih supstrata korišćenjem odgovarajuće stabilne sekundarne ćelijske linije što nije slučaj sa primarnim ćelijama. To znači da je imunogena kompozicija kako je ovde opisana komercijalno vijabilna.

[0055] Postupak za razvoj pomenute imunogene kompozicije prema ovom opisu koji obuhvata strategiju kloniranja koja uključuje upotrebu odgovarajućeg vektora radi transfektovanja odgovarajuće ćelije domaćina.

[0056] Ovaj opis obezbeđuje postupak za proizvodnju rekombinantnog virusa zauški koji obuhvata sledeće faze:

a. Hemijska sinteza fragmenata sekvence genoma atenuisanog JL2 virusa zauški;

b. Kloniranje svakog dobijenog fragmenta gena u intermedijarni vektor radi njegove amplifikacije; c. Konstrukcija klona genoma DNK pune dužine atenuisanog JL2 soja virusa zauški radi dobijanja pMuVJL2 vektora kroz ligaciju svakog fragmenta gena u jedan vektor;

d. Zajednička transfekcija ćelije domaćina sa pMuVJL2 i ekspresioni vektor koji obuhvata izolovan gen koji kodira transdelujući protein pri čemu je taj transdelujući protein izabran iz grupe koju čine NP protein, P protein i L protein do negativnog lanca oslobađanja virusa zauški;

e. Opciono, prolaz oslobođenog virusa zauški u ćeliju domaćina radi svoje ekspanzije.

[0057] U daljem načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata imunogenu kompoziciju sa odgovarajućim farmaceutski prihvatljivim nosačem ili ekscipijensom.

[0058] U jednom od načina ostvarivanja, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata imunogenu kompoziciju sa odgovarajućim puferom, stabilizatorom, tenzionim agensom, površinski aktivnim sredstvom i krijoprotektantom.

[0059] U jednom od načina ostvarivanja, pufer može biti izabran iz grupe koju čine fosfatni-pufer, histidin-pufer, citratni-pufer, sukcinatni-pufer, acetatni-pufer, argininski pufer, fosfatom puferisan slani rastvor, trometaminski pufer i drugi slični, poželjno fosfatni pufer.

U jednom od načina ostvarivanja, stabilizatori mogu biti izabrani iz grupe koju čine aminokiselina(e), šećer(i), poliol(i) i njihova kombinacija.

[0060] U jednom od načina ostvarivanja, aminokiseline mogu biti izabrane iz grupe koju čine arginin, glicin, lizin, histidin, glutaminska kiselina, aspartična kiselina, izoleucin, leucin, alanin, fenilalanin, tirozin, triptofan, metionin, serin, prolin, cistein / cistin i njihove odgovarajuće kombinacije.

[0061] U ovom pronalasku, šećeri mogu biti izabrani iz grupe koju čine glukoza, fruktoza, galaktoza, manoza, sorboza, riboza, deoksiriboza, saharoza, trehaloza, laktoza, maltoza, rafinoza i njihove odgovarajuće mešavine, poželjno trehaloza ili sorbitol ili manitol.

[0062] Dalje, poliol može biti izabran iz grupe koju čine manitol, sorbitol, dekstran, glicerol, arabitol, propilen glikol, polietilen glikol i njihove odgovarajuće kombinacije, poželjno sorbitol.

[0063] U jednom od načina ostvarivanja, odgovarajući tenzioni agensi mogu biti izabrani iz grupe koju čine šećer(i), so(li) i njihova kombinacija za pomenutu farmaceutsku kompoziciju.

[0064] U jednom od načina ostvarivanja, odgovarajuće soli mogu biti izabrane iz grupe koju čine tenzioni agens kao što je NaCl ili KCl. ili drugi slični.

[0065] U ovom pronalasku, površinski aktivno sredstvo može biti izabrano iz grupe koju čine polioksietilensorbitan estri masnih kiselina (Tween), polioksietilen alkil etri, alkilfenilpolioksietilen etri, polioksietilen-polioksipropilen kopolimer i natrijum dodecil sulfat (SDS) i njihova kombinacija.

[0066] Dalje, krijoprotaktant može biti izabran iz grupe koju čine šećeri i drugi slični.

1

[0067] U daljem načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak obezbeđuje imunogenu kompoziciju koja sadrži rekombinantni JL2 (rMuVJL2FL) sa odgovarajućim adjuvansom.

[0068] Adjuvans može biti definisan kao supstanca koja se dodaje vakcini da bi se povećao telesni imuni odgovor na vakcinu.

[0069] Adjuvansi prema ovom pronalasku mogu biti izabrani iz grupe koju čine soli aluminijuma, Mono Fosforil Lipid (MPL) analozi kao što su GLA (glukopiranozil lipid adjuvans), monatid, izazivači citokina, i adjuvansi na bazi skvalena, lipofilni adjuvansi i drugi slični.

[0070] U poželjnom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak obezbeđuje vakcine koje sadrže imunogenu kompoziciju ovog pronalaska protiv Jeryl Lynn. Ove vakcine mogu da se primenjuju konvencionalnim putevima i dozama.

Analitičke metode korišćene u ovom pronalasku

[0071]

1. RT-PCR: Reverzna transkripcija lančane reakcija polimeraze (RT-PCR) je postupak korišćen za sintezu i amplifikaciju komplementarne DNK reverznim transkriptovanjem RNK. RT-PCR koristi enzim reverznu transkriptazu i prajmer radi kaljenja i produžavanja željene RNK sekvence. Ukoliko je RNK prisutna, reverzna transkriptaza i prajmer će se kaliti do RNK sekvence i transkriptovati komplementarni lanac DNK (cDNK). Ovaj lanac se zatim replikuje sa prajmerima i Taq polimerazom, i sledi se standardni PCR protokol. Ovaj protokol kopira DNK jednog lanca milion puta za kratko vreme radi proizvodnje značajne količine DNK. PCR proizvodi (cDNK lanci) su zatim razdvojeni pomoću elektroforeze u agaroznom gelu.

2. Elektroforeza na agaroznom gelu: Elektroforeza na agaroznom gelu je postupak elektroforeze na gelu korišćen u biohemiji, molekularnoj biologiji, genetici, i kliničkoj hemiji za razdvajanje izmešane populacije DNK ili proteina u matrici agaroze.

3. Metoda sekvencioniranja dugih kloniranih delova: Sekvencioniranje dugih kloniranih delova je postupak sekvencioniranja fragmenata velike DNK. Fragmenti koji su predugački se sekvencioniraju u očitavanje jedne sekvence upotrebom postupka terminacije lanca, pri čemu ovaj postupak funkcioniše tako što se dugačka sekvenca deli na nekoliko uzastopnih kraćih sekvenci. Pojam " sekvencioniranja dugih kloniranih delova " je korišćen tako gde je glavni cilj sekvencioniranje genoma.

4. Analiza više sekvenci: Analiza više sekvenci je postupak korišćen za analizu biološke sekvence kako bi se odredio region sličnosti i razlike između sekvenci koje su poravnane za analizu.

PRIMERI

[0072] Sledeći neograničavajući primeri opisuju oslobađanje JL2 iz genomske i strukturne zajedničke transfekcije plazmida do odgovarajuće ćelije sisara. Dalje, izolacija čistog i genetski homogenog JL2 soja korišćenjem ograničavajućeg postupka razblaženja je opisana u nastavku.

Primer 1: Konstrukcija klona genoma DNK pune dužine atenuisanog JL2 soja virusa zauški

Generisanje cDNK pune dužine JL2 virusa zauški

[0073] Šest fragmenata sekvence genoma je hemijski sintetizovano (GeneArt-Thermo Fisher Scientific) da bi se pokrila ukupna dužina genoma (15,384 bp) virusa zauški. Nakon toga, svaki fragment genoma i vektor su isečeni specifičnom restrikcionom endonukleazom (New England Bio Labs) i klonirani u intermedijarne vektore. Svaki fragment je verifikovan rastvaranjem na agaroznom gelu kako je prikazano na Fig.1. Fragmenti dobijeni posle restrikcione digestije su opisani u nastavku:

Fragment 1: poz.1 - 3576 NotI-RsrII (SEQ ID NO.1);

Fragment 2: poz.3576 - 6258 RsrII-AvrII (SEQ ID NO.2);

Fragment 3: poz.6258 - 8438 AvrII-XhoI (SEQ ID NO.3);

Fragment 4: poz.8438 - 10498 XhoI-KpnI (SEQ ID NO.4);

Fragment 5: poz.10498 - 13950 KpnI-XmaI (SEQ ID NO.5);

Fragment 6: poz.13950 - 15440 XmaI-NarI (SEQ ID NO.6)

[0074] Restrikciona mesta pomenuta u ovom primeru su dobro poznata stručnjaku. Stručnjak može da koristi alternativna restrikciona mesta po svom zahtevu.

Kloniranje dobijenih fragmenata u transkripcioni vektor i ligacija fragmenata

[0075] Hemijski sintetizovani i obrađeni fragmenti restrikcione endonukleaze inkorporisani su u plazmid postupnim postupcima kloniranja, upotrebom modifikovanog pBluescript II SK (+) u ulozi konačnog vektora. Progresivna ligacija fragmenata jedan za drugi putem kohezivnih krajeva dovela je do definitivnog pMuV<JL2>plazmida. Mapa vektora pMuV<JL2>plazmida je prikazana na Fig.2. Plazmid pMuV<JL2>ima nukleotidnu sekvencu kao što je izneto u SEQ ID NO.7. Pomoćni plazmidi koji sadrže gene za strukturne proteine virusa zauški i plazmid koji sadrži T7 RNK gen polimeraze su generisani kloniranjem u odgovarajući vektor. Pri tome, pSC6 vektor je korišćen za kloniranje gena koji kodiraju transdelujuće proteine i T7 RNK polimerazu. Kloniranje kao što je opisano u ovoj prijavi je sprovedeno kao što je opisano kod Sambrook i Russel (2001).

Primer 2: Oslobađanje atenuisanog Jeryl-Lynn 2 virusa zauški

[0076] Komercijalno dostupne HEK 293T ćelije su transfektovane pMuV<JL2>zajedno sa pomoćnim plazmidima p_N<JL2>, p_P<JL2>, p_L<JL2>i pSC6-T7. HEK 293T ćelije su zasejane u bunarčić od 35mm da bi se postiglo ∼ 50-70% konfluencije prilikom transfektovanja. Konfluencija je pojam koji se uobičajeno koristi kao procena broja adherentnih ćelija u posudi ili sudu za kulturu, pozivajući se na proporciju površine koju pokriva jedan sloj ćelija.4 sata pre transfekcije, medijum se zameni sa 3 ml DMEM koji sadrži 10% FCS. Svi rekombinantni plazmidi su pripremljeni prema QIAGEN kompletu za pripremu plazmida.

Komplet za zajedničko taloženje DNK Ca<2+>fosfatom je iz Invitrogen-a.

[0077] Ćelije su zajedno transfektovane sa plazmidima u sledećoj konačnoj koncentraciji:

[0078] Pomenuti plazmidi razblaženi u H2O su dodati u Eppendorf epruvetu koja sadrži 2M CaCl2, pri čemu se ta kompozicija dodaje u drugu Eppendorf epruvetu koja sadrži HEPES pufer u uslovima mućkanja, i inkubirana je 30 minuta na sobnoj temperaturi (RT). Zajednički talozi su u kapima dodati u kulturu i sprovedena je transfekcija na 37°C i 5% CO2 za oko 18 sati. Nakon toga, medijum za transfekciju je zamenjen sa 3.0 ml DMEM bez FCS. Prolazna ekspresija T7 polimeraze dopušta delotvornu proteinsku ekspresiju T7-promovisnih gena, konačno je dovela do negativnog lanca oslobanja virusa zauški. Transfektovane ćelije su praćene oko 15 dana do formiranja sincicijuma.

Formiranje sincicijuma iz jednog plaka je prikazano na Fig.3. Jedinstveni sincicijumi su pokupljeni kako bi se zarazile Vero ćelije odobrene od strane WHO radi uspostavljanja pasaže 0 (P0) virusa.

[0079] Oslobođeni rekombinantni atenuisani virus je imenovan kao rMuV<JL2>FL. Nukleotidna sekvenca rMuV<JL2>FL je kao što je izneto u SEQ ID NO.8.

Analitičko sekvencioniranje oslobođenog virusa zauški

[0080] Posle oko 15 dana nakon transfekcije, čim su se pojavili prvi sincicijumi, jedan klon je aspiriran pod mikroskopom i nakon toga je korišćen za karakterizaciju. Karakterizacija je sprovedena sekvencioniranjem oslobođenog rMuV<JL2>FL genoma virusa. Virusna RNK iz rMuV<JL2>FL inficirana Vero ćelijama je pripremljena prema uputstvima kompleta Qiagen RNeasy Mini. Počevši od 2.0 µl ekstrahovane virusne RNK, reverzna transkripcija i amplifikacija su izvedene jedna za drugom, prema

1

uputstvima kompleta Qiagen OneStep RT-PCR.

[0081] 34 para prajmera, koja pokrivaju sekvencu genoma pune dužine (15,384 bp) su dizajnirana kako bi se amplifikovali PCR fragmenti koji se preklapaju. Prečišćeni PCR-ovi su sekvencionirani prema metodi sekvencioniranja dugih kloniranih delova.

[0082] Sekvence očitavanja vrednosti su sklopljene tako da pokrivaju ceo rMuV<JL2>FL virusni genom.6 tačkastih mutacija je detektovano u L genu oslobođenog rMuV<JL2>FL u odnosu na sekvencu originalnog plazmida pMuV<JL2>, i potvrđeno analizom više sekvenci.

Tabela-1: Tačkaste mutacije i promena aminokiseline u L genu oslobođenog rMuV<JL2>FL

Primer 3: Ekspanzija oslobođenog JL2 virusa zauški

[0083] P0 pasaža oslobođenog rMuV<JL2>FL virusa je kultivisana u Vero ćelijama odobrenim od strane WHO. Vero ćelije, koje se održavaju kao jednostruki slojevi u DMEM sa dodatkom 5% FBS i kada konfluencija dostigne 70-80%, Vero ćelije su inficirane P0 pasažom oslobođenog rMuV<JL2>FL virusa upotrebom 0.5-1.0 mL oslobođenog virusa u 5.0 mL ukupne zapremine OPTIMEM. Ćelije su inkubirane 1 sat na 37°C i 5% CO2. Posle inkubacije, inokulum je zamenjen DMEM 5% FBS. Inficirane ćelije su razdvojene posle 2 dana, i primećeno je 90-100% formiranje sincicijuma posle 5-dpi. Frakcije bez ćelija (CF) i frakcije povezane sa ćelijama (CA)su sakupljene da bi se dobile zalihe virusa na laboratorijskom nivou, dostižući titre između 1 x 10<4>pfu/mL u sakupljenim frakcijama koje ne sadrže ćelije (CF) i 1 x 10<6>pfu/mL u sakupljenim frakcijama koje su povezane sa ćelijama (CA).

Primer 4: Pripremanje banke matičnih ćelija oslobođenog JL2 virusa zauški i proizvodnja žetve jednog virusa

[0084] Oslobođen virus zauški iz P0 pasaža je dalje prošao do pasaža 2 (P2) u Vero ćelijama kako bi se dobilo dovoljno matičnog semena.

[0085] Titri dobijeni posle svake pasaže u Vero ćelije su dati u nastavku:

P0 pasaž: titri između 1 x 10<3>pfu/mL (CF, frakcija bez ćelija) - 1 x 10<4>pfu/mL (CA, frakcija povezana sa ćelijom).

P1 pasaž: titri između 1 x 10<4>pfu/mL (CF, frakcija bez ćelija) - 5 x 10<4>pfu/mL (CA, frakcija povezana sa ćelijom).

P2 pasaž: titri između 1 x 10<4>pfu/mL (CF, frakcija bez ćelija) - 1 x 10<6>pfu/mL (CA, frakcija povezana sa ćelijom).

[0086] Takvo matično seme je čuvano na temperaturi između -150°C do -196°C. Ovo matično seme će se koristi za proizvodnju radnog semena za pripremanje komercijalne vakcine za humanu upotrebu. Radno seme dobijeno iz matičnog semena je korišćeno za proizvodnju žetve jednog virusa u Vero ćelijama. Radno seme dobijeno iz matičnog semena se može koristiti za proizvodnju žetve jednog virusa u MRC5 ćelijama. Proizvodnja žetve jednog virusa u MRC5 ćelijama je takođe ilustrovana ovde u nastavku.

Proizvodnja žetve jednog virusa u MRC5 ćelijama

Kultivisanje ćelija

[0087] Medijumi su uklonjeni a ćelije su oprane sa MEM EBS medijumima i dodat je TrypLE rastvor (zamena tripsina) na 1ml/ T75 cm2 i 10ml/RB 850 cm2 i inkubiran na 35±2°C. Ćelije su ponovo suspendovane nakon odvajanja u svežem medijumu i posejane u nove posude za kulturu i rotirajuće boce. U potpunosti konfluentan T75 sud je podeljen u odnosu od 1:4 do 1:16 u T 75, T 175 i RB 850 rotirajućim bocama redom u naknadne pasaže u zavisnosti od veličine šarže. Ćelije su podeljene jednom nedeljno i nakon postizanja dovoljne konfluencije. Nakon toga, ćelije su korišćene za inokulaciju virusa.

Proizvodnja žetve jednog virusa

[0088] Žetva jednog virusa - Zauške se proizvode inficiranjem MRC-5 ćelija semenom radnog virusa i inkubiranjem na 33 ± 2°C, 60-120 minuta za adsorpciju virusa. Posle adsorpcije, svaka inficirana rotirajuća boca je popunjena sa 250-300mL Creek-ovog minimalnog medijuma (CMM) i inkubirana na 33±2°C pri 0.5 rpm, 40 do 70 sati u rotirajućem aparatu. Posle završetka inkubacije, sve rotirajuće boce su analizirane zbog bistrine i odvajanja jednostrukog sloja. Jednostruki sloj je ispran jednostavnim MEM

1

medijumima i popunjen sa 1000-200 mL ravnih MEM medijuma. Boce su ponovo inkubirane na 33 ± 2 °C pri 0.5 rpm, 5 do 13 dana u rotirajućem aparatu. Na kraju inkubacije sve rotirajuće boce su posmatrane zbog bistrine i prisustva citopatogenih efekata a žetva je sakupljena iz rotirajućih boca u jednoj ambalaži. Albumin humanog seruma je korišćen kao sredstvo za stabilizovanje za sakupljenu žetvu virusa. Isti je zatim distribuiran u pojedinačne prethodno sterilisane PETG boce kao jedna žetva. Tako dobijena masa je razbistrena i razblažena do neophodne koncentracije za proizvodnju vakcine protiv zauški. MRC5 ćelije bez infekcije (kontrola) i MRC5 ćelije inficirane sa rMuV<JL2>FL su prikazane kao (a) i (b) redom na Fig.4.

[0089] Proizvedena vakcina protiv zauški (JL) je ispitana radi potentnosti i pronađeno je da je u opsegu od 10<4.12>/ml do 10<4.57>/ml CCID50(infektivna doza ćelijske kulture koja inficira 50% kultivisanih ćelija) ispitanih postupkom ćelijske kulture.

Primer 5: Identifikacija i kvantifikacija soja JL2 zauški ispitivanjem plaka i in situ imunofluorescencija

Titracija virusa ispitivanjem plaka

[0090] Serijska desetostruka razblaženja priprema virusa su urađena upotrebom OPTIMEM do konačne zapremine od 0.5 ml. Svako razblaženje je dodato na Vero ćelijske kulture od 35 mm. Posle 1 h adsorpcije virusa, inokulum je uklonjen a inficirane ćelije su pokrivene sa 2.0 ml DMEM koji sadrži 5% FCS i 1% agaroze sa niskom tačkom topljenja (LMP agaroza). Posle 5 dana inkubacije na 37°C i 5% CO2, kulture su fiksirane sa 1ml 10% TCA za 1 h, zatim UV unakrsno povezane za 30 min. Posle uklanjanja pokrivača agaroze, jednostruki slojevi ćelije su obojeni kristalno ljubičasto rastvoreni u 4% etanolu, oprani vodom a plakovi su prebrojani pod obrnutim mikroskopom. Mikroskopska slika je prikazana na Fig.5.

In situ imunofluorescencija

[0091] Razna desetostruka razblaženja matičnog semena su pripremljena iz virusa matičnog semena u MEM (minimalni esencijalni medijum) medijumu koji sadrži 2% FBS (fetalni goveđi serum). Nakon toga, suspenzija Vero ćelije je pripremljena u koncentracionom opsegu između 0.15-0.20 miliona/mL. Ova suspenzija ćelije je nalivena u ploču sa 96 bunarčića iznad razblaženja virusa i drži se na 37 °C sa 5% CO2. Ploča je inkubirana pod istim uslovima tokom deset dana. Posle deset dana, ćelijski supernatant iz ploče je odbačen i opran PBS-om (fosfatom puferisan slani rastvor). Ćelije u ploči su fiksirane acetonmetanol puferom za fiksaciju. Anti-zauške IgG antitela konjugovana sa FITC (fluorescein izotiocijanat) je dodat u radno razblaženje od 1:50. Titar virusa je određen brojanjem obojenih ćelija pod fluorescentnim

1

mikroskopom upotrebom Spearman Karber formule.

[0092] Spearman-Kärber formula:

x0 = (log10 najnižeg razblaženja sa svim pozitivnim bunarčićima) d = log10 faze razblaženja, jedan u ovom slučaju ni = broj replika, šest u ovom slučaju ri = broj pozitivnih bunarčića

Primer 6: Formulisanje imunogene kompozicije

[0093] Potrebna količina vakcine protiv zaušaka jedne žetve je izračunata da bi se dobio ciljani titar od 1000 CCID50. Slično potrebna količina sirovog materijala (stabilizatora) je izračunata kako bi se formulisala vakcina željene veličine šarže prema kompoziciji gotovog proizvoda. Stabilizator 176 (kombinovana kompozicija žalatinastog sorbitola & drugih aminokiselina) & M199 (razblaživač) prema izračunatoj količini su prebačeni u sterilini kontejner i tome je dodata i pomešana izračunata količina vakcine protiv zaušaka jedne žetve.

[0094] Konačna formulacija je kao što je opisano u nastavku:

[0095] Konačna formulacija se punila u 0.5ml/fiole koje su polušlifovane i liofilizirane standardnim ciklusom gde je brzo zamrzavanje do -60° C, primarno sušenje sprovedeno na -40°C a sekundarno sušenje na 37 °C . Pronađen je okrugli intaktni kolač koji se rekonstituiše za manje od 1 minuta a ispitivanje vlage dolazi pod 1.6% - 2 %.

[0096] Proizvedena vakcina protiv zauški (JL) je ispitana radi potentnosti i pronađeno je da je u opsegu od 10<3>/doza do 10<3 57>/ml CCID50ispitano postupkom ćelijske kulture.

[0097] Imunogena kompozicija ovog pronalaska je ispitana radi određivanja imunogenosti oslobođenog virusa zauški standarnom metodom imunološkog ispitivanja. Primeri takve metode imunološkog ispitivanja su ELISA (imunoenzimska proba) i druge standardne metode korišćene za određivanje neutrališućeg antitela virusa zauški. Takvo ispitivanje može da se koristi kako bi se odredila imunogenost oslobođenog virusa kod primata ili onih koji to nisu. Takva ispitivanja mogu biti korisna kako bi se odredila optimalna doza i dozni režim za pomenutu vakcinu. Zaključeno je da je imunogena kompozicija ovog pronalaska koja ima oslobođeni virus zauški odgovarajuća za dalje pripremanje vakcine. Postupak

1

za proizvodnju oslobođenog virusa zauški prema ovom pronalasku ne uključuje upotrebu bilo kog elementa iz nekog drugog virusnog ili nevirusnog patogenog entiteta. Prema tome, oslobođeni virus zauški je stabilan i homogen i samim tim ne sadrži druge patogene čestice osim virusa zauški. Stoga oslobođeni virus zauški prema ovom pronalasku je odgovarajući kandidat za razvoj vakcine.

1

�

2

�

2

�

4

�

1

�

4

�

Claims

Patentni zahtevi

1. Izolovani genom pune dužine atenuisanog JL2 soja virusa zauški koji obuhvata polinukleotidnu sekvencu koja ima SEQ ID NO.8.

2. Vektor koji obuhvata polinukleotidnu sekvencu prema zahtevu 1, i, opciono, pri čemu je taj vektor izabran iz grupe koju čine pUC19, pBluescript, pBluescript II, pBluescript II SK (+), pCA ili pSC6.

3. Ćelija domaćin koja obuhvata vektor prema zahtevu 2, i, opciono, pri čemu je ta ćelija domaćin izabrana iz grupe koju čine ćelija sisara ili ćelija ne-sisara.

4. Ćelija domaćin prema zahtevu 3, pri čemu je ćelija sisara izabrana iz grupe koju čine HEK 293T ćelija, Vero ćelija ili MRC-5 ćelija, a ćelija ne-sisara je izabran iz grupe koju čine ćelija bakterije ili ćelija kasca.

5. Vakcina protiv virusa zauški koja obuhvata genom pune dužine atenuisanog JL2 soja virusa zauški prema zahtevu 1.

6. Imunogena kompozicija koja sadrži genom pune dužine atenuisanog JL2 soja virusa zauški prema zahtevu 1, sa odgovarajućim farmaceutskim ekscipijensima, i opciono, pri čemu su ti farmaceutski ekscipijensi izabrani iz grupe koju čine pufer(i), stabilizator(i), tenzioni agens(i), površinski aktivni adjuvans(i), krijoprotektant(i) ili njihove kombinacije.

7. Imunogena kompozicija prema zahtevu 6, pri čemu

(a) pufer je izabran iz grupe koju čine fosfatni-pufer histidin-pufer, citratni-pufer, sukcinatni-pufer, acetatni-pufer, argininski pufer, fosfatnom puferisan slani rastvor, trometaminski pufer i njihove mešavine;

(b) stabilizator je izabran iz grupe koju čine amino kiselina(e), šećer(i), poliol(i), ili njihove kombinacije;

(c) tenzioni agens je izabran iz grupe koju čine šećer(i), so(li) ili njihove kombinacije;

(d) površinski aktivno sredstvo je izabrano iz grupe koju čine polioksietilensorbitan estri masnih kiselina (Tween), polioksietilen alkil etri, alkilfenilpolioksietilen etri, polioksietilen-polioksipropilen kopolimer i natrijum dodecil sulfat (SDS) ili njihove kombinacije;

(e) adjuvans je izabran iz grupe koju čine soli aluminijuma, mono fosforil lipid analozi kao što su glukopiranozil lipid adjuvans, monatid, izazivači citokina, adjuvansi na bazi skvalena, lipofilni adjuvansi ili njihove kombinacije; i

(f) krijoprotektant je šećer(i).

8. Imunogena kompozicija prema zahtevu 7 koja obuhvata stabilizatore izabrane iz grupe koju čine amino kiselina(e), šećer(i), poliol(i), ili njihove kombinacije, pufer(i) ili so(li).

9. Imunogena kompozicija prema zahtevu 8, pri čemu

- pufer je izabran iz grupe koju čine fosfatni-pufer histidin-pufer, citratni-pufer, sukcinatni-pufer, acetatni-pufer, argininski pufer, fosfatom puferisan slani rastvor, trometaminski pufer i njihove mešavine;

- amino kiselina je izabrana iz grupe koju čine arginin, glicin, lizin, histidin, glutaminska kiselina, aspartična kiselina, izoleucin, leucin, alanin, fenilalanin, tirozin, triptofan, metionin, serin, prolin, cistein/cistin i njihove odgovarajuće kombinacije;

- šećer je izabran iz grupe koju čine glukoza, fruktoza, galaktoza, manoza, sorboza, riboza, deoksiriboza, saharoza, trehaloza, laktoza, maltoza, rafinoza i njihove odgovarajuće mešavine, poželjno trehaloza ili rafinoza;

- poliol je izabran iz grupe koju čine manitol, sorbitol, dekstran, glicerol, arabitol, propilen glikol, polietilen glikol i njihove odgovarajuće kombinacije;

- so je izabrana iz grupe koju čine NaCl ili KCl.

10. Kompozicija za oslobađanje koja obuhvata sledeće elemente:

a. transkripcioni vektor koji obuhvata polinukleotidnu sekvencu prema zahtevu 1;

b. ekspresioni vektor koji obuhvata izolovan gen(e) koji kodira(ju) transdelujući protein(e), pri čemu je transdelujući protein izabran iz grupe koju čine NP protein, P protein, L protein i njihove kombinacije;

c. RNK polimerazu za odgovarajuću transkripciju polinukleotidne sekvence prema zahtevu 1.

11. Kompozicija prema zahtevu 10, pri čemu gen(i) koji kodira(ju) transdelujući protein je izabran iz grupe koju čine SEQ ID NO.9 do 11.

12. Kompozicija prema zahtevu 10 ili 11, pri čemu su aminokiselinske sekvence transdelujućih proteina izabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO.12 do 14.