CN111218473A - 一种拯救腮腺炎病毒的系统和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种制备腮腺炎病毒的系统及方法，它是通过构建带有T7启动子的腮腺炎病毒全长质粒，以及辅助质粒，通过反向遗传学的方法制备腮腺炎病毒。所述辅助质粒有4种：NP质粒、P质粒、L质粒和T7RNAP质粒。其中T7RNAP质粒是带有CMV启动子和编码T7聚合酶的DNA的序列。本发明可以有效制备具有较高免疫原性的腮腺炎病毒，具有良好的应用前景。

Description

一种拯救腮腺炎病毒的系统和方法

技术领域

本发明涉及病毒反向遗传学领域，特别涉及一种拯救腮腺炎病毒的系统和方法。

背景技术

腮腺炎病毒(Mumps virus，MuV)属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)，腮腺炎病毒属。基因组为不分节段的单股负链核糖核酸(RNA)，长度为15384bp。流行性腮腺炎(腮腺炎)是由腮腺炎病毒引起的急性传染病，该病毒可广泛累及各脏器，其临床表现主要在腮腺、性腺和中枢神经系统，如无菌性脑膜炎、脑炎、睾丸炎、卵巢炎、胰腺炎等^[1]。

腮腺炎疫苗接种已有近50年历史，国内外在用或使用过的腮腺炎减毒活疫苗株包括：中国S₇₉株、美国Jeryl Lynn株、日本Urabe Am9株、前苏联Leningrad-Zagreb株、瑞士Rubini株以及比利时RIT4385株^[2]。美国Jeryl Lynn疫苗株接种范围最广，由两种亚株组成即主要成分JL1亚株和次要成分JL2亚株，比例为5∶1^[34]。我国大规模使用的腮腺炎疫苗S₇₉株是从Jeryl Lynn株减毒活疫苗中传代获得的，第3代工作种子批也含有两个亚株JL1和JL2，比例为2∶5^[5]。GSK公司基于Jeryl Lynn株通过有限稀释法分离获得均一纯化的JL1亚株用来开发疫苗，该疫苗株命名为RIT4385。有研究表明：默克公司Jeryl-Lynn株和GSK公司RIT4385株疫苗接种儿童抗体阳性率都达到了90％以上，免疫原性优于S₇₉株^[6-7]。Sueli L^[8]等对默克公司ProQuad^TM疫苗中腮腺炎病毒的主要组成成分JL1株和GSK公司的RIT4385株进行全基因组测序对比发现两者序列完全相同。

通过有限稀释法纯化JL1亚株需连续稀释至单克隆，并对稀释单克隆进行测序等工作，需要耗费大量的人力及时间。

发明内容

为了获得成分明确的腮腺炎病毒减毒株，以保证其疫苗产品的稳定性，本发明提供了一种拯救腮腺炎病毒的系统和方法。

首先，本发明提供了一种腮腺炎病毒拯救系统，它包括：全长质粒、NP质粒、P质粒、L质粒和T7RNAP质粒；

所述全长质粒是带有T7启动子序列、以及腮腺炎病毒基因组或反基因组的DNA序列的质粒；

所述NP质粒是带有能编码腮腺炎病毒核衣壳蛋白的DNA的质粒；

所述P质粒是带有能编码腮腺炎病毒磷蛋白的DNA的质粒；

所述L质粒是带有能编码腮腺炎病毒聚合酶蛋白的DNA的质粒；

所述T7RNAP质粒是带有能编码T7RNA聚合酶的DNA的质粒；

所述NP、P、L和T7RNAP质粒还分别带有CMV启动子序列。

进一步地，所述全长质粒中，腮腺炎病毒基因组序列3’端带有丁型肝炎病毒核酶序列(HdvRZ)；腮腺炎病毒反基因组序列5’端带有丁型肝炎病毒核酶序列的反向互补序列，所述丁型肝炎病毒核酶序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述腮腺炎病毒为8₇₉株、Jeryl Lynn株、Urabe Am9株、Leningrad-Zagreb株、Rubini株以及RIT4385株中的一种。

更进一步地，所述腮腺炎病毒为Jeryl Lynn株的JL1亚株。

本发明还提供了一种腮腺炎病毒拯救的方法，该方法包括：

(1)在培养基内的宿主细胞中使用权利要求1～5所述全长质粒、NP质粒、P质粒、L质粒和T7RNAP质粒进行转染或转化；所述转染或转化在足够使所述拯救组合物共表达、并装配成感染性病毒的条件下进行；

(2)培养细胞；

(3)收集病毒。

进一步地，所述全长质粒、NP质粒、P质粒、L质粒和T7RNAP质粒的质量比是：12∶8∶4∶8∶4。

进一步地，所述宿主细胞为CEF、BHK、293T、BSR、CHO、MRC-5、WI-38、HEK 293、EB66和Vero细胞中的一种，优选宿主细胞为Vero细胞。

进一步地，所述宿主细胞为P150代内的Vero细胞。

进一步地，每5×10⁵个宿主细胞需要12μg的全长质粒。

本发明的方法可以有效地从质粒和细胞中拯救出单一的腮腺炎病毒JL1株，测序结果显示：拯救病毒JL1^R扩增片段序列与疫苗株JL1的理论序列一致。

本发明的方法还能获得高滴度的腮腺炎病毒，其传代培养滴度从拯救后的P2代开始就能达到6lgCCID₅₀/mL以上。

本发明的方法得到的腮腺炎病毒还具有很好的免疫原性，其免疫原性与疫苗株S₇₉的免疫原性接近。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

附图说明

图1为载体pT7-IRES His-C DNA的改造示意图。

图2为JL1全长分段构建示意图。

图3A为pT7-MCS3-MUV_JL1(HdvRz)质粒酶切分析图：1：Supecoiled Marker；2：质粒pT7-MCS3-MUV_JL1(HdvRz)；3：NheI-NotI双酶切产物；4：XhoI-SacII双酶切产物；5：HindIII酶切产物；6：DNA Marker DL15000。

图3B为pCDIBP-MuV_JL1-NP、pCDIBP-MuV_JL1-P质粒酶切分析图：1：SupecoiledMarker；2：质粒pCDIBP-MuV_JL1-NP；3：质粒pCDIBP-MuV_JL1-P；4：

pCDIBP-MuV_JL1-NP的NheI-；NotI双酶切产物；5：pCDIBP-MuV_JL1-P的NheI-NotI双酶切产物；6：DNA Marker DL15000。

图3C为pCDIBP-MuV_JL1-L质粒酶切分析图：1：Supecoiled Marker；2：质粒pCDIBP-MuV_JL1-L；3：NheI-NotI双酶切产物。

图4是拯救病毒JL1^R感染Vero细胞图。

图5RT-PCR扩增病毒JL1^R的L基因前段：1：DL5000DNA Marker；2，3，4：腮腺炎病毒JL1^R的PCR产物；5，6：Vero细胞PCR产物(阴性对照)；7：全长质粒pT7-MCS3-MUV_JL1(HdvRz)的PCR产物(阳性对照)。

图6腮腺炎病毒JL1^R的传代滴度图：Passage，传代次数。

以下通过具体实施方式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

具体实施方式

实施例1腮腺炎病毒拯救系统构建

1材料与方法

1.1细胞及质粒

P139代Vero细胞，腮腺炎疫苗株S₇₉，质粒pT7-IRES His-CDNA(Takara公司)，质粒pCDIBP-T7RNAP。(带CMV启动子序列和T7RNA聚合酶DNA序列，见附录1，SEQ ID NO.2)

1.2主要试剂

高纯度病毒RNA提取试剂盒购自Roche公司；

高保真DNA聚合酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶等购自NEB公司；随机引物、SuperscriptIII反转录酶购自Invitrogen公司；胶回收试剂盒购自Promega公司；质粒提取试剂盒购自Omega公司；琼脂糖、DNAmarker购自Takara公司；MEM、FBS培养液购自Gibco公司；其他试剂均为国产试剂。

1.3全长质粒及辅助质粒构建

1.3.1载体pT7-IRES His-C DNA改造

以pT7-IRES His-C DNA载体为模板，pT7-MCS3-NotI、pT7-MCS3-NheI(序列见表1)为引物PCR扩增获得载体骨架，胶回收PCR片段。由金唯智公司合成限制性内切酶多克隆位点NheI-AscI-ClaI-HindIII-BsrGI-XhoI-SacII-XmaI-NotI核苷酸序列MCS3，MCS3通过NheI和NotI酶切位点与载体PCR扩增产物连接，改造后的载体命名为pT7-MCS3。载体pT7-IRES His-C DNA的改造示意图见图1。

1.3.2全长质粒克隆构建

参照腮腺炎毒株JL1的基因组序列(Genbank：FJ211586)，将JL1全长cDNA序列15384bp分成F1-F7序列共7个片段，由金唯智公司分段合成，其中F7段5’端连接有丁型肝炎病毒核酶序列(HdvRZ)，JL1全长分段构建示意图见图2。HDvRz序列如附录1中的SEQ IDNO.1所示。将基因F1-F7分别克隆至载体pT7-MCS3上，得到pT7-MCS3-F1-pT7-MCS3-F7共7个重组质粒。7个重组质粒依据酶切位点按顺序拼接腮腺炎毒株全长cDNA，构建流程如下：将pT7-MCS3-F2质粒中F2片段通过酶切位点ClaI-HindIII克隆至pT7-MCS3-F3质粒，得到质粒pT7-MCS3-F23。将pT7-MCS3-F23质粒中F23片段通过酶切位点ClaI-BsrGI克隆至pT7-MCS3-F1质粒，得到质粒pT7-MCS3-F123。将pT7-MCS3-F123质粒中F123片段通过酶切位点AscI-BsrGI克隆至pT7-MCS3-F4，得到质粒pT7-MCS3-F1234。将pT7-MCS3-F6质粒中F6片段通过酶切位点SacII-XmaI克隆至pT7-MCS3-F7(HdvRz)质粒，得到质粒pT7-MCS3-F67(HdvRz)。将pT7-MCS3-F67(HdvRz)质粒中F67(HdvRz)片段通过酶切位点SacII-NotI克隆至pT7-MCS3-F5质粒，得到质粒pT7-MCS3-F567(HdvRz)。将pT7-MCS3-F1234质粒中F1234片段通过酶切位点AscI-XhoI克隆至pT7-MCS3-F567(HdvRz)质粒，构建质粒pT7-MCS3-MUVJL1(HdvRz)，对最终构建的pT7-MCS3-MUVJL1(HdvRz)进行酶切验证。

1.3.3辅助质粒构建

以pT7-MCS3-F1质粒为模板，pCDIBP-MuVNP-NheI、pCDIBP-MuVNP-NotI为引物扩增NP基因，经NheI-NotI酶切位点克隆至pCDIBP载体，得到辅助质粒pCDIBP-MuV_JL1-NP。L基因分2段进行构建：片段L1及片段F567。首先以pT7-MCS3-F4质粒为模板，pCDIBP-MuV_L1-NheI、pCDIBP-MuV_L1-XhoI为引物扩增L1基因片段，经NheI-XhoI酶切位点克隆至pCDIBP载体，得到质粒pCDIBP-MuV_JL1-L₁。而后pT7-MCS3-F567中F567片段经XhoI-NotI双酶切后克隆到质粒pCDIBP-MuV_JL1-L₁，得到辅助质粒pCDIBP-MuV_JL1-L。腮腺炎病毒V/P基因完整转录后mRNA编码V蛋白，插入2个非模板的G残基编码P蛋白^[9]。将MuV的P基因序列信息金唯智公司合成，将合成基因通过NheI-NotI酶切位点克隆至载体pCDIBP，得到辅助质粒pCDIBP-MuV_JL1-P。辅助质粒构建用PCR引物序列信息见表1。

表1 PCR引物序列信息

注：粗体：保护碱基；下划线：限制性酶切位点。

1.4重组病毒拯救

将5×10⁵个P141代Vero细胞用电转缓冲液充分混匀悬浮，加入12μg pT7-MCS3-MUV_JL1(HdvRz)、8μg pCDIBP-MuV_JL1-NP、4μg pCDIBP-MuV_JL1-P、8μg pCDIBP-MuV_JL1-L及4μgpCDIBP-T7RNAP混匀。混合物转入直径为2mm的BioRad电转杯，指数波、140V、950μF电击1次。电转染后将细胞移入T25瓶，补加5ml 10％NBS/MEM，5％CO₂37℃培养24h后换液，继续培养到细胞病变约80～90％后将转染细胞及上清混合物反复冻融3次，收获拯救病毒JL1^R。拯救病毒接种单层P141代Vero细胞，37℃培养3-4d后收获P2代JL1^R病毒。RT-PCR及基因片段测序鉴定P2代JL1^R病毒。

1.5病毒滴度测定

采用终点稀释法检测病毒滴度，用Reed-Muench法计算细胞半数感染剂量(CCID₅₀)。拯救病毒JL1^R在150代内的Vero细胞上传代培养，取P1-P10代病毒，于-20℃冻融一次收集病毒液。病毒液用含2％NBS的MEM进行10倍系列稀释，每稀释度病毒液100μL/孔接种至96孔板培养的Vero细胞中，每个稀释度接种8个孔，置37℃，5％CO₂条件下培养7天判定结果。

2.结果

2.1全长质粒及辅助质粒酶切鉴定

DNAman软件对构建质粒进行酶切位点分析后，分别用限制性内切酶NheI-NotI、XhoI-SacII及HindIII酶切pT7-MCS3-MUV_JL1(HdvRz)，用NheI-NotI酶切辅助质粒pCDIBP-MuV_JL1-NP、pCDIBP-MuV_JL1-P、及pCDIBP-MuV_JL1-L，所得目的基因片段条带数目及大小均与预期大小一致，质粒构建结果正确，见图3。

2.2病毒拯救

全长质粒pT7-MCS3-MUV_JL1(HdvRz)与相应的辅助质粒共同电转染Vero细胞后，拯救到腮腺炎病毒JL1^R。病毒JL1^R感染Vero细胞3d后，细胞间膜融合形成由数个大小不同的“空泡”组成的大噬斑样病变，如图4。

2.3 RT-PCR与基因测序

按Roche高纯度病毒RNA提取试剂盒说明书提取P2代病毒JL1^R的基因组RNA，利用随机引物将RNA逆转录为cDNA，并以此cDNA为模板，用引物pCDIBP-MuV_JL1-NheI及pCDIBP-MuV_JL1-XhoI扩增L前段基因片段，鉴定病毒。1％琼脂糖电泳显示：实验组及全长质粒阳性对照组的PCR产物片段大小约460bp，与理论片段大小一致，细胞阴性对照组无目的片段，见图5。用JL1-6-S，JL1-6-R，JL1-7-S，JL1-7-R两对引物(引物序列信息见表1)扩增病毒JL1^R基因组SH及HN片段，测序结果显示：拯救病毒JL1^R扩增片段序列与疫苗株JL1的理论序列一致。

2.4病毒传代培养及滴度测定

腮腺炎病毒JL1^R在Vero细胞上传代培养到P10代，采用终点稀释法检测病毒JL1^RP1-P10代的感染性滴度，用Reed-Muench法计算细胞半数感染剂量(CCID₅₀)。除拯救获得的P1代JL1^R滴度略低，为4.57lgCCID₅₀/mL外，其他P2-P10病毒滴度均在6lgCCID₅₀/mL以上(图6)，P7-P10代病毒滴度基本稳定。

为了验证本发明拯救出的病毒的免疫原性，将实施例1中拯救得到的病毒用于以下实验例。

实验例免疫原性测定

1.方法

1.1小鼠免疫

将30只BALB/c小鼠随机分为3组：拯救病毒JL1^R组、疫苗株S₇₉组和空白对照组，每组10只。JL1^R组和S₇₉组小鼠经腹腔注射，病毒浓度为10⁶CCID₅₀/mL，每只小鼠注射0.5mL，免疫2次，间隔21d。末次免疫14d后经心脏穿刺采血，分离血清，56℃灭活30min，测定血清中和抗体效价。对照组免疫MEM培养基。

1.2血清交叉保护中和效价测定

采用微量细胞病变(CPE)抑制法测定中和抗体效价。将病毒滴度已知的JL1^R及S₇₉稀释到2×10³CCID₅₀/mL，待测血清按1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320系列稀释，50μL/孔加至96孔板内，每个稀释度设8个复孔；待测血清分别与等体积JL1^R和S₇₉病毒混合，37℃，5％CO₂孵箱中和1h。每孔加入100μL细胞浓度为10⁵个/mL的Vero细胞，37℃，5％CO₂培养7d后，观察CPE。将能抑制50％CPE的最高稀释度判定为抗体的中和效价，以稀释倍数的倒数表示，计算待测血清中和抗体效价。

2.结果

JL1^R免疫血清组针对病毒JL1^R的中和抗体滴度为144.54，针对疫苗株S₇₉的中和抗体滴度为99.77；S₇₉免疫血清针对病毒JL1^R的中和抗体滴度为181.97，针对疫苗株S₇₉的中和抗体滴度为169.82；拯救病毒JL1^R能够在小鼠中诱导抗腮腺炎疫苗株S₇₉和拯救病毒JL1^R的中和抗体，而且拯救病毒JL1^R与疫苗株S₇₉的免疫原性接近，二者诱发抗腮腺炎病毒抗体滴度接近(见表2)。

表2病毒JL1^R，疫苗株S₇₉诱导的中和抗体滴度

综上，本发明可以成功拯救出腮腺炎病毒，且该拯救病毒具有较高的滴度和良好的免疫原性。本发明具有良好的应用前景。

附录1相关序列

HDvRz(SEQ ID NO.1)：

pCDIBP-T7RNAP(SEQ ID NO.2)：

附录2参考文献列表

[1]Rubin S，Eckhaus M，Rennick L J，et al.Molecular biology，pathogenesisand pathology of mumps virus[J].J Pathol，2015，235(2)：242-252.

[2]Hviid A，Rubin S，Muhlemann K.Mumps[J].Lancet，2008，371(9616)：932-944.

[3]Afzal MA，Pickford AR，Forsey T，et al.Heterogeneous mumps vaccine[J].Lancet，1992，340(8825)：980-981.

[4]Afzal MA，Pickford AR，Forsey T，et al.The Jeryl Lynn vaccine strainof mumps virus is a mixture of two distinct isolates[J].J Gen Virol，1993，74(Pt5)：917-920.

[5]张靖，梁宇，陈实，等.流行性腮腺炎疫苗株S79全基因序列测定与分析[J].中国微生物学和免疫学杂志，2010，30(12)：1105-1109.

[6]刘淑勤，黄跃红，陈秀芬.不同毒株制备的腮腺炎疫苗的免疫效果分析[J].华南预防医学，2005，31(3)：39-42.

[7]徐海明，唐巧英.腮腺炎病毒疫苗株与野毒株的部分核苷酸序列分析[J].中华微生物学和免疫学杂志，1999，19(3)：215-218.

[8]Tillieux S L，Halsey W S，Sathe G M，et al.Comparative analysis ofthe complete nucleotide sequences of measles，mumps，and rubellastrain genomescontained in Priorix-Tetra and ProQuad live attenuated combined vaccines[J].Vaccine，2009，27(16)：2265-2273.

SEQUENCE LISTING

<110> 成都生物制品研究所有限责任公司

<120> 一种拯救腮腺炎病毒的系统和方法

<130> GY014-18P1708

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 295

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> HDvRz

<400> 1

accctaatcc tgccctaggt ggttaggcat tatttgcaat atattaaaga aaactttgaa 60

aatacgaagt ttctattccc agctttgtct ggtggccggc atggtcccag cctcctcgct 120

ggcgccggct gggcaacatt ccgaggggac cgtcccctcg gtaatggcga atgggacgcg 180

gccgatccgg ctgctaacaa agcccgaaag gaagctgagt tggctgctgc caccgctgag 240

caataactag cataacccct tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt tttgc 295

<210> 2

<211> 7381

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> pCDIBP-T7RNAP

<400> 2

actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc 60

cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 120

ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 180

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ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 300

tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 360

accatggtcg aggtgagccc cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca 420

cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg 480

gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg ggcggggcgg ggcgaggcgg 540

agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt tatggcgagg 600

cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc gggcggggag tcgctgcgac 660

gctgccttcg ccccgtgccc cgctccgccg ccgcctcgcg ccgcccgccc cggctctgac 720

tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg ggctgtaatt 780

agcgcttggt ttaatgacgg cttgtttctt ttctgtggct gcgtgaaagc cttgaggggc 840

tccgggaggg ccctttgtgc ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg 900

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cggggctttg tgcgctccgc agtgtgcgcg aggggagcgc ggccgggggc ggtgccccgc 1020

ggtgcggggg gggctgcgag gggaacaaag gctgcgtgcg gggtgtgtgc gtgggggggt 1080

gagcaggggg tgtgggcgcg tcggtcgggc tgcaaccccc cctgcacccc cctccccgag 1140

ttgctgagca cggcccggct tcgggtgcgg ggctccgtac ggggcgtggc gcggggctcg 1200

ccgtgccggg cggggggtgg cggcaggtgg gggtgccggg cggggcgggg ccgcctcggg 1260

ccggggaggg ctcgggggag gggcgcggcg gcccccggag cgccggcggc tgtcgaggcg 1320

cggcgagccg cagccattgc cttttatggt aatcgtgcga gagggcgcag ggacttcctt 1380

tgtcccaaat ctgtgcggag ccgaaatctg ggaggcgccg ccgcaccccc tctagcgggc 1440

gcggggcgaa gcggtgcggc gccggcagga aggaaatggg cggggagggc cttcgtgcgt 1500

cgccgcgccg ccgtcccctt ctccctctcc agcctcgggg ctgtccgcgg ggggacggct 1560

gccttcgggg gggacggggc agggcggggt tcggcttctg gcgtgtgacc ggcggctcta 1620

gagcctctgc taaccatgtt catgccttct tctttttcct acagctcctg ggcaacgtgc 1680

tggttattgt gctgtctcat cattttggca aagaattcgc caccatgaac accatcaata 1740

ttgccaagaa cgacttttct gatatcgagc tggccgctat tccattcaat acactggctg 1800

accactacgg agagcggctg gcccgcgaac agctggctct ggagcatgaa agctatgaga 1860

tgggagaagc ccgattcagg aagatgtttg agaggcagct gaaagctggg gaagtggcag 1920

acaacgcagc cgctaagcca ctgattacca cactgctgcc caaaatgatc gccagaatta 1980

atgattggtt cgaggaagtg aaggcaaaac gaggaaagag gcctaccgcc ttccagtttc 2040

tgcaggagat caagccagaa gctgtggcat acatcaccat caagactacc ctggcatgcc 2100

tgacaagcgc cgacaacaca actgtgcagg cagtcgcttc cgcaatcgga cgagctattg 2160

aggacgaagc acgctttggg agaatccggg atctggaggc caagcacttc aagaaaaacg 2220

tggaggaaca gctgaacaag agggtggggc atgtctataa gaaggccttc atgcaggtgg 2280

tcgaggccga catgctgtca aagggactgc tgggaggaga ggcctggagc tcctggcaca 2340

aagaagatag catccatgtg ggagtccgct gcatcgagat gctgattgaa tctactggga 2400

tggtgagtct gcaccgacag aacgccggcg tggtcggaca ggactctgag acaatcgaac 2460

tggctcccga gtatgccgaa gctattgcaa ctagagccgg agctctggca gggatcagtc 2520

caatgttcca gccctgcgtg gtccccccta agccttggac tggcatcacc gggggcggat 2580

actgggctaa tggaaggaga ccactggcac tggtgcgaac acactctaag aaagccctga 2640

tgagatacga ggatgtctat atgcccgaag tgtataaggc catcaacatt gctcagaata 2700

cagcatggaa aattaacaag aaagtgctgg ccgtcgctaa tgtgatcact aagtggaaac 2760

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acatcgatat gaaccctgaa gctctgaccg catggaagcg cgcagccgct gcagtgtaca 2880

gaaaggataa agcccggaag tcccggcgca tttctctgga gttcatgctg gaacaggcca 2940

acaagtttgc taatcacaaa gcaatctggt tcccctacaa catggactgg cgcggacgag 3000

tctatgccgt gagcatgttc aaccctcagg ggaatgatat gacaaagggc ctgctgactc 3060

tggctaaggg gaaaccaatt gggaaggagg gctactattg gctgaaaatc cacggggcca 3120

attgcgctgg cgtcgacaag gtgccattcc ccgagaggat caagttcatc gaggaaaacc 3180

atgaaaatat tatggcatgt gccaagtctc ccctggagaa cacatggtgg gccgaacagg 3240

atagtccttt ctgctttctg gccttctgtt ttgagtacgc tggagtgcag caccatgggc 3300

tgagttataa ttgctccctg ccactggcct ttgacggctc ttgtagtgga atccagcact 3360

tctccgcaat gctgagggat gaggtcggag gaagagcagt gaacctgctg ccatctgaga 3420

cagtgcagga catctacggc attgtcgcca agaaagtgaa tgagatcctg caggctgacg 3480

caattaacgg gactgataat gaggtggtca ccgtcacaga tgaaaacact ggcgagatca 3540

gcgaaaaggt gaaactggga accaaggccc tggctggaca gtggctggca tacggagtca 3600

cccgctcagt gacaaagcga agcgtgatga ccctggctta tggcagcaaa gagttcggct 3660

tcaggcagca ggtgctggaa gacaccatcc agccagccat tgattccgga aaggggctga 3720

tgtttacaca gcccaaccag gccgctggct acatggccaa gctgatctgg gagtcagtga 3780

gcgtcacagt ggtcgcagcc gtggaagcta tgaattggct gaagtccgct gcaaaactgc 3840

tggccgctga ggtgaaggac aagaaaactg gcgaaattct gaggaaaaga tgcgccgtcc 3900

actgggtgac ccctgatgga ttcccagtgt ggcaggagta taagaaaccc atccagacca 3960

gactgaacct gatgttcctg ggccagtttc ggctgcagcc tacaatcaac actaataagg 4020

acagtgagat tgatgctcat aaacaggaat cagggattgc acctaatttt gtgcacagcc 4080

aggacggctc ccatctgcgg aagactgtgg tctgggctca cgagaaatac ggcatcgaat 4140

ccttcgcact gattcatgac tcttttggaa ccatcccagc cgatgcagcc aacctgttca 4200

aggctgtccg cgagactatg gtggacacct acgaaagttg tgatgtgctg gccgacttct 4260

atgatcagtt tgctgaccag ctgcacgagt cacagctgga taagatgccc gcactgcctg 4320

ccaaaggcaa cctgaatctg agagacatcc tggagtccga tttcgcattt gcctgactcg 4380

aggatctttt tccctctgcc aaaaattatg gggacatcat gaagcccctt gagcatctga 4440

cttctggcta ataaaggaaa tttattttca ttgcaatagt gtgttggaat tttttgtgtc 4500

tctcactcgg aaggacatat gggagggcaa atcatttaaa acatcagaat gagtatttgg 4560

tttagagttt ggcaacatat gcccatatgc tggctgccat gaacaaaggt tggctataaa 4620

gaggtcatca gtatatgaaa cagccccctg ctgtccattc cttattccat agaaaagcct 4680

tgacttgagg ttagattttt tttatatttt gttttgtgtt atttttttct ttaacatccc 4740

taaaattttc cttacatgtt ttactagcca gatttttcct cctctcctga ctactcccag 4800

tcatagctgt ccctcttctc ttatggagat ccctcgacct gcagcccaag cttggcgtaa 4860

tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata 4920

cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta 4980

attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gcggatccgc 5040

atctcaatta gtcagcaacc atagtcccgc ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc 5100

cgcccagttc cgcccattct ccgccccatg gctgactaat tttttttatt tatgcagagg 5160

ccgaggccgc ctcggcctct gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc 5220

taggcttttg caaaaagcta acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa 5280

tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc 5340

caaactcatc aatgtatctt atcatgtctg gatccgctgc attaatgaat cggccaacgc 5400

gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg 5460

cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta 5520

tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc 5580

aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag 5640

catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac 5700

caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc 5760

ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt 5820

aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc 5880

gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga 5940

cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta 6000

ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta 6060

tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga 6120

tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg 6180

cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag 6240

tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc 6300

tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact 6360

tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt 6420

cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta 6480

ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta 6540

tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc 6600

gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat 6660

agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt 6720

atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg 6780

tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca 6840

gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta 6900

agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg 6960

cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact 7020

ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg 7080

ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt 7140

actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga 7200

ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc 7260

atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa 7320

caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgggtcgac attgattatt 7380

g 7381

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> pT7-MCS3-NotI

<400> 3

atccgcggcc gctaattcac 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> pT7-MCS3-NheI

<400> 4

tagctagcgg cgtaatcatg 20

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> pCDIBP-MuVNP-NheI

<400> 5

ctagctagca tgtcatctgt gctcaaggca tttg 34

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> pCDIBP-MuVNP-NotI

<400> 6

ttgcggccgc ttactcatcc cagtctccca cttgc 35

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> pCDIBP-MuVL1-NheI

<400> 7

ctagctagca tggcgggcct aaatgagata ct 32

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> pCDIBP-MuVL1-XhoI

<400> 8

ctcgagatct ggtaaacaag ttagg 25

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> JL1-6-S

<400> 9

accctgccgt cgcactat 18

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> JL1-6-R

<400> 10

cacgctgatc taactcttgt tg 22

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> JL1-7-S

<400> 11

taggagttaa attagcaaga g 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> JL1-7-R

<400> 12

gcatagagtg gacctagtat c 21

Claims (10)

1.一种腮腺炎病毒的拯救系统，其特征在于，它包括：全长质粒、NP质粒、P质粒、L质粒和T7RNAP质粒；

所述全长质粒是带有T7启动子序列、以及腮腺炎病毒基因组或反基因组的DNA序列的质粒；

所述NP质粒是带有能编码腮腺炎病毒核衣壳蛋白的DNA的质粒；

所述P质粒是带有能编码腮腺炎病毒磷蛋白的DNA的质粒；

所述L质粒是带有能编码腮腺炎病毒聚合酶蛋白的DNA的质粒；

所述T7RNAP质粒是带有能编码T7RNA聚合酶的DNA的质粒；

所述NP、P、L和T7RNAP质粒还分别带有CMV启动子序列。

2.如权利要求1所述的病毒拯救系统，其特征在于，所述全长质粒中，腮腺炎病毒基因组序列3’端带有丁型肝炎病毒核酶序列(HdvRZ)；腮腺炎病毒反基因组序列5’端带有丁型肝炎病毒核酶序列的反向互补序列，所述丁型肝炎病毒核酶序列如SEQ ID NO.1所示。

3.如权利要求2所述的病毒拯救系统，其特征在于，所述腮腺炎病毒为S₇₉株、JerylLynn株、Urabe Am9株、Leningrad-Zagreb株、Rubini株以及RIT4385株中的一种。

4.如权利要求3所述的病毒拯救系统，其特征在于，所述腮腺炎病毒为Jeryl Lynn株的JL1亚株。

5.一种腮腺炎病毒拯救的方法，其特征在于，该方法包括：

(1)在培养基内的宿主细胞中使用权利要求1～4所述全长质粒、NP质粒、P质粒、L质粒和T7RNAP质粒进行转染或转化；所述转染或转化在足够使所述拯救组合物共表达、并装配成感染性病毒的条件下进行；

(2)培养细胞；

(3)收集病毒。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述全长质粒、NP质粒、P质粒、L质粒和T7RNAP质粒的质量比是：12:8:4:8:4。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为CEF、BHK、293T、BSR、CHO、MRC-5、WI-38、HEK 293、EB66和Vero细胞中的一种。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为Vero细胞。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为P150代内的Vero细胞。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，每5×10⁵个宿主细胞需要12μg的全长质粒。

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