RS59625B1 - Anti-il-17a antitela i njihova upotreba u lečenju autoimunskih i inflamatornih poremećaja - Google Patents

Description

Opis

POVEZANE PRIJAVE

[0001] Predmetno otkriće ima prioritet u odnosu na US 61/762406, podnet 8. februara 2013.

OBLAST PRONALASKA

[0002] Predmetno otkriće se odnosi na terapeutska antitela i njihove antigen-vezujuće delove koji se specifično vezuju za IL-17A i heterodimerni IL-17AF, ali se ne vezuju specifično za homodimerni IL-17F. Otkriće se specifičnije odnosi na specifična antitela i njihove antigenvezujuće delove koji inhibiraju dejstvo IL-17A i sposobni su za inhibiranje aktivnosti indukovane putem IL-17A, kao i na kompozicije i postupke korišćenja pomenutih antitela i njihovih antigen-vezujućih delova, npr. u lečenju patoloških poremećaja koji se mogu lečiti inhibiranjem signalizacije IL-17A, na primer autoimunskih i inflamatornih poremećaja kao što su reumatoidni artritis, psorijaza, sistemski eritemski lupus (SLE), lupus nefritis, multipla skleroza ili hronična opstruktivna bolest pluća, astma ili cistična fibroza.

POZADINA PRONALASKA

[0003] Interleukin-17A (IL-17A koji se takođe ponekad naziva IL-17) je centralni limfokin koji proizvodi nedavno definisani podskup inflamatornih T ćelija, Th17 ćelije. U nekim životinjskim modelima, te ćelije su ključne za različite autoimunske i inflamatorne procese. Povišeni nivoi IL-17A su povezani sa uveitisom (Ambadi-Obi, i sar. 2007, Nature Med; 13:711-718), reumatoidnim artritisom (RA), psorijazom, upalom disajnih puteva, hroničnom opstruktivnom bolešću pluća (HOBP), inflamatornom bolešću creva (Kronova bolest i ulcerativni kolitis), odbacivanjem alografta, kancerom, intraperitonealnim apscesima i adhezijama i multiplom sklerozom (Weaver, i sar. 2007, Annu Rev Immunol; 25:821-852; Witowski i sar.2004, Cell Mol Life Sci; 61:567-579). Th17 ćelije mogu ubrzano da iniciraju inflamatorni odgovor kojim dominiraju neutrofili (Miossec, i sar.2009, NEJM; 361:888-98).

[0004] IL-17A je prvobitno identifikovan kao transkript iz hibridoma T ćelije glodara. On je osnovni član grupe citokina koja se naziva familija IL-17. Poznat kao CTLA8 kod glodara, IL-17A pokazuje veliku homologost sa viralnim IL-17A koji kodira otvoreni ram za čitanje T limfotropnog radinovirusa herpesvirus saimiri (Rouvier E, i sar.1993, J. Immunol. 150: 5445-56).

[0005] IL-17A je citokin koji deluje kao snažan posrednik u reakcijama odloženog tipa putem povećavanja proizvodnje hemokina u različitim tkivima radi regrutovanja monocita i neutrofila na mesto inflamacije, slično interferonu gama. Familija IL-17 obavlja ulogu proinflamatornih citokina koji odgovaraju na invaziju na imunski sistem od strane ekstracelularnih patogena, i indukuje uništavanje ćelijske matrice patogena. IL-17A deluje sinergijski sa faktorom nekroze tumora i interleukinom-1 (Miossec P, i sar.2009, N. Engl. J. Med.361:888-98).

[0006] Da bi se ostvarilo njegovo dejstvo, IL-17A se vezuje za površinski ćelijski receptor tipa I koji se naziva IL-17R, i koji ima najmanje dve varijante, IL-17RA i IL-17RC (Pappu R, i sar.

2012, Trends Immunol.; 33:343-9). IL-17RA vezuje IL-17A, IL-17AF i IL-17F i eksprimiran je u brojnim tkivima: vaskularnim endotelnim ćelijama, perifernim T ćelijama, potomstvu B ćelija, fibroblastima, plućima, mijelomonocitnim ćelijama i stromalnim ćelijama koštane srži (Kolls JK, Lindén A 2004, Immunity 21:467-76; Kawaguchi M, i sar. 2004, J. Allergy Clin. Immunol. 114:1265-73; Moseley TA, i sar.2003, Cytokine Growth Factor Rev.14:155-74).

[0007] Pored IL-17A, u članove familije IL-17 spadaju IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E (takođe se naziva IL-25) i IL-17F. Svi članovi familije IL-17 imaju sličnu proteinsku strukturu, sa četiri veoma očuvana cisteinska ostatka kritična za njihov 3-dimenzionalni oblik. Filogenetska analiza otkriva da među članovima familije IL-17, izooblici IL-17F 1 i 2 (ML-1) imaju najveću homologost sa IL-17A (dele 55, odnosno 40% identičnosti aminokiselina sa IL-17A), nakon čega slede IL-17B (29%), IL-17D (25%), IL-17C (23%), i IL-17E koji je najmanje srodan sa IL-17A (17%). Svi ovi citokini su dobro očuvani kod sisara, pri čemu je čak 62-88% aminokiselina očuvano između humanih i mišjih homologa (Kolls JK, Lindén A 2004, Immunity 21:467-76).

[0008] IL-17A je protein od 155 aminokiselina koji je homodimerski izlučeni glikoprotein povezan disulfidom, molekulske mase 35 kDa (Kolls JK, Lindén A 2004, Immunity 21:467-76). Struktura IL-17A se sastoji od signalnog peptida praćenog aminokiselinskim regionom karakterističnim za familiju IL-17. N-povezano mesto glikozilacije na proteinu je prvobitno identifikovano nakon što su prečišćavanjem proteina otkrivene dve trake u standardnoj SDS-PAGE analizi, jedna na 15 kDa i druga na 20 kDa. Poređenjem različitih članova familije IL-17 otkrivena su četiri očuvana cisteina koji formiraju dve disulfidne veze (Yao Z, i sar.1995, J. Immunol. 155:5483-6). IL-17 je jedinstven po tome što nema sličnosti sa drugim poznatim interleukinima. Nadalje, IL-17 nema sličnosti sa bilo kojim drugim poznatim proteinima ili strukturnim domenima (Kolls JK, Lindén A 2004, Immunity 21:467-76). Generalno, drugi članovi familije IL-17 poput IL-17F formiraju homodimere (poput IL-17A).

[0009] Takođe je poznato da IL-17A u određenim uslovima gradi heterodimer sa IL-17F. Heterodimerni IL-17AF takođe proizvode Th17 ćelije nakon stimulisanja od strane IL-23.

[0010] Smatra se da IL-17AF šalje signale kroz receptore IL-17RA i IL-17RC poput IL-17A i IL-17F. Biološke funkcije IL-17AF su slične funkcijama IL-17A i IL-17F. Stimulisanje ciljnih ćelija od strane IL-17AF indukuje proizvodnju različitih hemokina, pored neutrofilije disajnih puteva u odgovarajućim okolnostima. IL-17AF se u ovim aktivnostima smatra manje potentnim od homodimernog IL-17A, ali potentnijim od homodimernog IL-17F. Na primer, ako potentnost IL-17A iznosi 1, onda je relativna potentnost IL-17AF oko 1/10 potentnosti IL-17A, a relativna potentnost IL-17F je oko 1/100 potentnosti IL-17A. I humani i mišji IL-17AF pokazuju aktivnost na mišjim ćelijama. IL-17AF se sastoji od ukupno 271 aminokiseline i ima molekulsku masu od oko 30,7 kDa (podaci iz opisa proizvoda humanog IL-17AF heterodimera proizvođača Shenandoah Biotechnology).

[0011] Objavljene su brojne relevantne kristalne strukture. One uključuju kristalne strukture za homodimerni IL-17F (Hymowitz i sar.2001, EMBO J, 19:5332-5341).

[0012] Kristalna struktura IL-17F u kompleksu sa receptorom IL-17RA je takođe objavljena (Ely i sar.2009 Nature Immunology 10:1245-1251). Pored toga, objavljena je najmanje jedna kristalna struktura IL-17A u kompleksu sa Fab fragmentom antitela (Gerhardt i sar. 2009 Journal of Molecular Biology, 5:905-921).

[0013] Nekoliko inflamatornih i autoimunskih bolesti, uključujući psorijazu, povezane su sa pogoršanim odgovorima Th1 i/ili Th17. Mnoge od njih se trenutno leče ili opštim imunosupresivima ili biološkim lekovima sa veoma selektivnim dejstvom, kao što su anti-TNF-α antitela koja nisu efikasna za sve pacijente. Otkriveno je da oni povećavaju rizik od infekcija i da postaju neefikasni nakon produženog lečenja. Zato postoji neispunjena medicinska potreba za lečenjem sa poboljšanim bezbednosnim profilom i istovremenim kapacitetom indukovanja dugotrajne remisije ili izlečenja bolesti.

[0014] Brojne imunske regulatorne funkcije su prijavljene za familiju IL-17 citokina, pretpostavlja se usled toga što indukuju brojne molekule sa imunskom signalizacijom. Najznačajnija uloga IL-17A je njegovo učešće u indukovanju i posredovanju u proinflamatornim odgovorima. IL-17A je takođe povezan sa alergijskim odgovorima. IL-17 indukuje proizvodnju mnogih drugih citokina (kao što je IL-6, G-CSF, GM-CSF, IL-1β, TGF-β, TNF-α), hemokina (uključujući IL-8, GRO-α i MCP-1) i prostaglandina (npr. PGE2) od strane mnogih tipova ćelija (fibroblasti, endotelne ćelije, epitelne ćelije, keratinociti i makrofagi). Otpuštanje citokina uzrokuje mnoge funkcije, kao što je remodelovanje disajnih puteva, karakteristika odgovora IL-17A. Povećana ekspresija hemokina privlači druge ćelije, uključujući neutrofile, ali ne i eozinofile. Funkcija IL-17 je takođe ključna za podskup CD4+ T ćelija koje se nazivaju T pomoćne 17 (Th17) ćelije. Kao posledica ovih funkcija, familija IL-17 je povezana sa mnogim imunskim/autoimunskim bolestima, uključujući reumatoidni artritis, astmu, lupus, odbacivanje alografta i anti-tumorski imunitet (Aggarwal S, Gurney AL 2002, J. Leukoc. Biol. 71:1-8). Dodatno, pronađene su veze sa drugim stanjima kao što je osteoartritis, sepsa, septički ili endotoksični šok, alergijska reakcija, gubitak koštane mase, psorijaza, ishemija, sistemska skleroza, fibroza i moždani udar.

[0015] Generisana su i predložena brojna antitela za IL-17A za korišćenje u lečenju bolesti i poremećaja posredovanih putem IL-17A, uključujući antitela navedena u WO2011053763 (Centocor) i WO2012093254 (UCB Pharma). Pored toga, US20070218065 (Zymogenetics) opisuje antitela koja se vezuju za oba heterodimera IL-17A i F, kao i za homodimerni IL-17F. Anti-IL-17 antitela koja imaju reaktivnost među različitim vrstama su takođe opisana u struci, uključujući i WO2007149032 (AstraZeneca), koji opisuje anti-humano IL-17A antitelo koje vezuje IL-17A čoveka, majmuna cinomolgus (cino) i psa, ali ne i mišji IL-17A. Slično tome, WO2007070750 (Eli Lilly) opisuje anti-humano IL-17 antitelo (mAb126), koje vezuje IL-17 čoveka i cinomolgusa, ali ne i IL-17 pacova ili miša. Antitela kao alat za IL-17A su takođe dostupna, uključujući mišje antitelo eBio64DEC17 koje prepoznaje i mišji i humani IL-17A, kao i nekoliko drugih vrsta.

[0016] Tako, postoji potreba za specifičnim antitelima koja antagonizuju efekte IL-17A, imaju reaktivnost kod različitih vrsta i sposobna su da inhibiraju aktivnost indukovanu putem IL-17A, a naročito za kompozicijama i metodama korišćenja pomenutih antitela za lečenje patoloških poremećaja koji se mogu lečiti inhibiranjem signalizacije IL-17A.

SAŽETAK PRONALASKA

[0017] Stoga, u jednom aspektu, otkriće obezbeđuje izolovano terapeutsko humano antitelo ili njegov antigen-vezujući deo koji sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) prema ID BR. SEKV: 12 i varijabilni region lakog lanca (VL) prema ID BR. SEKV: 43, i pri čemu se pomenuto antitelo ili molekul specifično vezuju za homodimerni IL-17A ili heterodimerni IL-17AF, ali se ne vezuju specifično za homodimerni IL-17F.

[0018] U jednom otelotvorenju, IL-17A, IL-17AF ili IL-17F su odabrani od jednog ili više, kao što je dva ili tri ili više, od majmuna cinomolgus, majmuna rezus makaki, majmuna marmozet, pacova, miša ili čoveka. U jednom specifičnom otelotvorenju, IL-17A, IL-17AF ili IL-17F je od čoveka. U jednom specifičnom otelotvorenju, IL-17A, IL-17AF ili IL-17F je od čoveka i miša. U jednom specifičnom otelotvorenju, IL-17A, IL-17AF ili IL-17F je od majmuna cinomolgus, majmuna rezus makaki, majmuna marmozet, pacova, miša i čoveka.

[0019] U jednom specifičnom otelotvorenju, izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući deo sadrži CDR-e teškog lanca, u sekvenci, ID BR. SEKV: 7, ID BR. SEKV: 8 i ID BR. SEKV: 3 i CDR-e lakog lanca, u sekvenci, ID BR. SEKV: 42, ID BR. SEKV: 23 i ID BR. SEKV: 11.

[0020] U jednom specifičnom otelotvorenju, izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući deo sadrži teški lanac imunoglobulina prema ID BR. SEKV: 14, i laki lanac imunoglobulina prema ID BR. SEKV: 44.

[0021] U jednom aspektu otkrića, obezbeđeno je izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući deo, koji se vezuje za isti epitop kao izolovano antitelo ili molekul prema specifičnim otelotvorenjima otkrića.

[0022] U jednom otelotvorenju, izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući deo vezuju se za epitop IL-17A, kao što je humani IL-17A epitop, koji sadrži Arg78, Glu80 i Trp90.

[0023] IL-17A epitop može dalje da sadrži Tyr85 ili Arg124.

[0024] U jednom otelotvorenju, epitop IL-17A, kao što je humani IL-17A epitop, dalje sadrži jedan ili više od Pro82, Ser87 ili Val88.

[0025] U jednom aspektu otkrića, obezbeđeno je izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući deo, koji sadrži površinu za prepoznavanje antigena koja ima karakteristike za prepoznavanje epitopa ekvivalentne sa antitelom ili molekulom prema specifičnim otelotvorenjima.

[0026] U jednom aspektu otkrića, obezbeđeno je izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući deo, koji je unakrsno blokiran za vezivanje za IL-17A, kao što je humani IL-17A, ili IL-17AF, kao što je humani IL-17AF, od strane najmanje jednog antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela prema specifičnim otelotvorenjima.

[0027] U jednom otelotvorenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući deo se ne vezuju specifično za a) bilo koji pojedinačni ili više humanih IL-17F homodimera, IL-17B homodimera, IL-17C homodimera, IL-17D homodimera, IL-17E homodimera, i/ili b) bilo koji pojedinačni ili više IL-17F homodimera majmuna cinomolgus, IL-17F homodimera miša, i/ili c) bilo koji pojedinačni ili više drugih humanih citokina izabranih iz grupe koja se sastoji od IL-1, IL-3, IL-4, IL-6, IL-8, gIFN, TNF alfa, EGF, GMCSF, TGF beta 2, i/ili d) bilo koji pojedinačni ili više drugih mišjih citokina, izabranih iz grupe koja se sastoji od IL-1b, IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL18, IL23, IFN ili TNF.

[0028] U jednom otelotvorenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući deo se vezuju za IL-17A, kao što je humani IL-17A, tako da antitelo ili njegov antigen-vezujući deo inhibiraju ili blokiraju vezivanje između IL-17A i njegovog receptora, i smanjuju ili neutrališu aktivnost IL-17A.

[0029] U jednom otelotvorenju, afinitet vezivanja antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela za humani IL-17A je 100 nM ili manje, 10 nM ili manje, 1 nM ili manje, 100 pM ili manje, ili 10 pM ili manje, kako je izmereno pomoću Biacore<TM>. U specifičnom otelotvorenju, afinitet vezivanja antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela za humani IL-17A je ispod 200 pM, ili ispod 100 pM, kako je izmereno pomoću Biacore<TM>.

[0030] U jednom otelotvorenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući deo sposobni su za inhibiranje sekrecije IL-6, ili sekrecije GRO-alfa prilikom in vitro testiranja, poželjno korišćenjem uzgajanih hondrocita ili fibroblasta.

[0031] U jednom otelotvorenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući deo sposobni su za inhibiranje oticanja kolena kod antigenom indukovanog artritisa u in vivo eksperimentalnom modelu, kao što je AIA model pacova.

[0032] U jednom otelotvorenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući deo konjugovani su do daljeg aktivnog ostatka.

[0033] Antitelo ili njegov antigen-vezujući deo mogu biti monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući deo, poželjno himerno, humanizovano ili humano antitelo ili njegov deo.

[0034] U jednom aspektu otkrića, obezbeđena je farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo ili njegov antigen-vezujući deo prema otelotvorenjima otkrića, u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa, razblaživača ili nosača.

[0035] U jednom otelotvorenju, farmaceutska kompozicija sadrži jedan ili više dodatnih aktivnih sastojaka.

[0036] U jednom specifičnom otelotvorenju, pomenuta farmaceutska kompozicija je liofilizat. U drugom specifičnom otelotvorenju, farmaceutska kompozicija je tečna formulacija koja sadrži terapeutski prihvatljivu količinu antitela ili molekula iz otkrića, poželjno pripremljenu kao fabrički napunjeni špric.

[0037] Otkriće se dalje odnosi na korišćenje pomenutog antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela iz otkrića, na primer XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 ili XAB5 antitela, za upotrebu kao lek, poželjnije, u lečenju patološkog poremećaja koji je posredovan putem IL-17A ili koji se može lečiti inhibicijom signalizacije IL-17A, ili sekrecije IL-6 ili GRO-alfa.

[0038] U jednom specifičnom otelotvorenju, antitela ili njihov antigen-vezujući deo iz otkrića mogu se koristiti u lečenju autoimunskih i inflamatornih poremećaja, kao što je artritis, reumatoidni artritis, psorijaza, hronična opstruktivna bolest pluća, sistemski eritemski lupus (SLE), lupus nefritis, astma, multipla skleroza ili cistična fibroza.

[0039] U jednom aspektu otkrića, obezbeđeno je korišćenje pomenutog antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela, na primer XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 ili XAB5 antitela, u proizvodnji leka za upotrebu u lečenju patološkog poremećaja koji je posredovan putem IL-17A ili koji se može lečiti inhibicijom sekrecije IL-6 ili GRO-alfa.

[0040] U jednom specifičnom otelotvorenju, patološki poremećaj posredovan putem IL-17A ili koji se može lečiti inhibiranjem sekrecije IL-6 ili GRO-alfa je inflamatorni poremećaj ili stanje, kao što je artritis, reumatoidni artritis, psorijaza, hronična opstruktivna bolest pluća, sistemski eritemski lupus (SLE), lupus nefritis, astma, multipla skleroza ili cistična fibroza.

[0041] U jednom aspektu otkrića, obezbeđena je metoda lečenja patološkog poremećaja koji je posredovan putem IL-17A, ili koji se može lečiti inhibiranjem sekrecije IL-6 ili GRO-alfa, pri čemu pomenuta metoda obuhvata primenu efikasne količine izolovanog antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela prema otkriću, na primer XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 ili XAB5 antitela, tako da je stanje ublaženo.

[0042] U jednom otelotvorenju, stanje je inflamatorni poremećaj ili stanje, kao što je artritis, reumatoidni artritis, psorijaza, hronična opstruktivna bolest pluća, sistemski eritemski lupus (SLE), lupus nefritis, astma, multipla skleroza ili cistična fibroza.

[0043] Otkriće se takođe odnosi na sredstva za proizvodnju antitela ili njihovih antigenvezujućih delova iz otkrića. Takva sredstva uključuju izolovane molekule nukleinske kiseline koji kodiraju najmanje teški i/ili laki varijabilni region(varijabilne regione) antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela iz otkrića ili klonirajuće ekspresione vektore koji sadrže takve nukleinske kiseline, posebno za rekombinantnu proizvodnju antitela ili njegovog antigenvezujućeg dela prema otkriću, na primer XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 ili XAB5, u ćeliji domaćinu. U specifičnom otelotvorenju, takav klonirajući ili ekspresioni vektor sadrži najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline izabranu iz grupe koja se sastoji od ID BR. SEKV: 18, 31, 51, 19, 28, 32, 38, 40, 46, 48, 52, 56 i 58. U drugom otelotvorenju, on sadrži najmanje jednu od sledećih kodirajućih sekvenci varijabilnog teškog i lakog lanca izabranu iz grupe koja se sastoji od ID BR. SEKV: 16, 29, 49, 17, 27, 30, 37, 39, 45, 47, 50, 55 i 57, operativno povezanu sa odgovarajućim sekvencama promotera, koje su dobro poznate stručnjaku za ovu oblast.

[0044] U jednom otelotvorenju, molekul nukleinske kiseline je informaciona RNK (iRNK),

[0045] Otkriće se dalje odnosi na ćeliju domaćina koja sadrži jedan ili više klonirajućih ili ekspresionih vektora, kako je gore opisano, i na postupak za proizvodnju antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela iz otkrića, na primer XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 ili XAB5, pri čemu pomenuti postupak obuhvata uzgajanje ćelije domaćina, prečišćavanje i regenerisanje pomenutog antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela.

Definicije

[0046] Kako bi se predmetno otkriće lakše razumelo, prvo su definisani određeni termini. Dodatne definicije su postavljene kroz detaljan opis.

[0047] Termin "imunski odgovor" odnosi se na dejstvo, na primer, limfocita, ćelija koje prezentuju antigen, fagocita, granulocita i rastvorljivih makromolekula proizvedenih od strane gorenavedenih ćelija ili jetre (uključujući antitela, citokine i komplement) koje dovodi do selektivnog oštećenja, uništenja, ili eliminisanja iz ljudskog tela invazivnih patogena, ćelija ili tkiva inficiranih patogenima, kanceroznih ćelija, ili, u slučaju autoimunske ili patološke inflamacije, normalnih ljudskih ćelija ili tkiva.

1

[0048] "Put transdukcije signala" ili "signalna aktivnost" odnosi se na biohemijski uzročni odnos koji generalno inicira interakcija protein-protein poput vezivanja faktora rasta za receptor, koji dovodi do transmisije signala iz jednog dela ćelije u drugi deo ćelije. Generalno, transmisija uključuje specifičnu fosforilaciju jednog ili više ostataka tirozina, serina ili treonina na jednom ili više proteina u seriji reakcija koje uzrokuju transdukciju signala. Pretposlednji proces tipično uključuje nuklearne događaje, što dovodi do promene ekspresije gena.

[0049] "Antitelo" koje se javlja u prirodi je glikoprotein koji sadrži najmanje dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama. Svaki teški lanac se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca (ovde skraćeno kao VH) i konstantnog regiona teškog lanca. Konstantni region teškog lanca se sastoji od tri domena CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca (ovde skraćeno kao VL) i konstantnog regiona lakog lanca. Konstantni region lakog lanca se sastoji od jednog domena, CL. VHi VLregioni se mogu dalje podeliti na regione hipervarijabilnosti, nazvane regioni koji određuju komplementarnost (CDR), isprekidane sa regionima koji su više očuvani, nazvanim regioni okvira (FR). Svaki VHi VLje sastavljen od tri CDR-a i četiri FR-a, poređanih od amino terminusa do karboksi terminusa sledećim redosledom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Varijabilni regioni teškog i lakog lanca sadrže vezujući domen koji interaguje sa antigenom. Konstantni regioni antitela mogu posredovati u vezivanju imunoglobulina za tkiva domaćine ili faktore, uključujući različite ćelije imunskog sistema (npr. efektorske ćelije) i prvu komponentu (C1q) klasičnog sistema komplemenata.

[0050] Termini "region koji određuje komplementarnost" i "CDR", kako se ovde koriste, označavaju sekvence aminokiselina u varijabilnim regionima antitela koji dodeljuju antigensku specifičnost i afinitet vezivanja. Generalno, postoje tri CDR-a u svakom varijabilnom regionu teškog lanca (HCDR1, HCDR2, HCDR3) i tri CDR-a u svakom varijabilnom regionu lakog lanca (LCDR1, LCDR2, LCDR3).

[0051] Precizne granice sekvence aminokiselina datog CDR mogu se utvrditi korišćenjem bilo koje dobro poznate šeme, uključujući one koje opisuju Kabat i sar. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD ("Kabatova" šema numeracije), Al-Lazikani i sar., (1997) JMB 273,927-948 ("Čotijina" šema numeracije). Na primer, za klasične formate, po Kabatu, aminokiselinski ostaci CDR u varijabilnom domenu teškog lanca (VH) su numerisani 31-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2) i 95-102 (HCDR3), a aminokiselinski ostaci CDR u varijabilnom domenu lakog lanca (VL) su numerisani 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) i 89-97 (LCDR3). Po Čotijinoj numeraciji, aminokiselinski ostaci CDR u VH su numerisani 26-32 (HCDR1'), 52-56 (HCDR2') i 95-102 (HCDR3'), a aminokiselinski ostaci u VL su numerisani 26-32 (LCDR1'), 50-52 (LCDR2') i 91-96 (LCDR3'). Kombinovanjem Kabatove i Čotijine definicije CDR, CDR-i se sastoje od aminokiselinskih ostataka 26-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2) i 95-102 (HCDR3) u humanom VH i aminokiselinskih ostataka 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) i 89-97 (LCDR3) u humanom VL.

[0052] Termin "antigen-vezujući deo" antitela (ili jednostavno "antigen deo"), kako se ovde koristi, odnosi se na kompletnu dužinu ili jedan ili više fragmenata antitela, kao što je protein, koji zadržava sposobnost da se specifično vezuje za antigen (npr. deo IL-17A). Pokazalo se da antigen-vezujuću funkciju antitela mogu da obavljaju fragmenti antitela kompletne dužine. Primeri vezujućih fragmenata obuhvaćeni terminom "antigen-vezujući deo" antitela uključuju Fab fragment, jednovalentni fragment koji se sastoji od VL, VH, CLi CH1 domena; F(ab)2fragment, dvovalentni fragment koji se sastoji od dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom na regionu šarke; Fd fragment koji se sastoji od VHi CH1 domena; Fv fragment koji se sastoji od VLi VHdomena jedne grane antitela; dAb fragment (Ward i sar. 1989, Nature 341:544-546), koji se sastoji od VHdomena; i izolovani region koji određuje komplementarnost (CDR), ili bilo koje fuzione proteine koji sadrže takve antigen-vezujuće delove.

[0053] Prema tome, termin "antigen-vezujući deo" može takođe da se odnosi na delove koji odgovaraju antitelu iz otkrića koji mogu biti sadržani u alternativnim okvirima ili konstrukcijama kao što su kamelidna antitela ili molekuli "ne-antitela", kao što je opisano u nastavku.

[0054] Nadalje, iako su dva domena Fv fragmenta, VLi VH, kodirani odvojenim genima, oni mogu biti spojeni, korišćenjem rekombinantnih metoda, sintetičkim linkerom koji im omogućava da budu formirani kao jednolančani protein u kome se VLi VHregioni uparuju i grade jednovalentne molekule (poznate kao jednolančani Fv (scFv); vidi, npr. Bird i sar.1988, Science 242:423-426; i Huston i sar. 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883). Takva jednolančana antitela takođe treba da budu obuhvaćena u okviru termina "antigen-vezujući deo" antitela. Ti fragmenti antitela su pribavljeni putem uobičajenih tehnika poznatih stručnjacima za ovu oblast, i fragmenti su podvrgnuti skriningu za korisnost na isti način kao i netaknuta antitela.

[0055] "Izolovano antitelo", kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo koje suštinski slobodno od drugih antitela koja imaju različite antigenske specifičnosti (npr. izolovano antitelo koje se specifično vezuje za IL-17A, kao što je humani IL-17A, suštinski je slobodno od antitela koja se specifično vezuju za druge antigene osim IL-17A). Izolovano antitelo koje se specifično vezuje za IL-17A može, međutim, imati unakrsnu reaktivnost sa drugim antigenima, kao što su molekuli IL-17A drugih vrsta, ili IL-17A heterodimeri, poput IL-17AF. Štaviše, izolovano antitelo može biti u velikoj meri slobodno od drugih ćelijskih materijala i/ili hemikalija.

[0056] Termini "monoklonsko antitelo" ili "kompozicija monoklonskih antitela" kako se ovde koristi označava pripremu molekula antitela iz jedne molekulske kompozicije. Kompozicija monoklonskog antitela ispoljava pojedinačnu specifičnost vezivanja i afinitet prema konkretnom epitopu.

[0057] Termin IL-17A odnosi se na humani IL-17A kako je definisan u ID BR. SEKV: 76 ili ID BR. SEKV: 78, osim ako nije drugačije opisano. Termin IL-17F odnosi se na humani IL-17F kako je definisan u ID BR. SEKV: 77, osim ako nije drugačije opisano. IL-17AF je heterodimer IL-17A podjedinice i IL-17F podjedinice, što će biti jasno stručnjaku za ovu oblast. Rekombinantni proteini, označeni prefiksom "r", različitih vrsta korišćeni su u testovima opisanim u nastavku. Na primer, rekombinantni humani IL-17A je imenovan rhuIL-17. Stručnjak za ovu oblast zna kako da eksprimira takve proteine pomoću polaznih materijala i standardnih protokola poznatih u struci. Međutim, kako bi se pomoglo stručnjaku, osim ako nije drugačije naglašeno, mogu se koristiti sledeće sekvence aminokiselina : IL-17A cinomolgus majmuna (cyno), ID BR. SEKV: 79; cynoIL-17F, ID BR. SEKV: 80; IL-17A rezus majmuna (rezus), ID BR. SEKV: 81; IL-17A marmozet majmuna (marmozet), ID BR. SEKV: 82; mišji (m) IL-17A, ID BR. SEKV: 83; mIL-17F, ID BR. SEKV: 84; pacovski IL-17A, ID BR. SEKV: 85; humani IL-17 receptor A (huIL-17RA), ID BR. SEKV: 86. Kao što je poznato stručnjaku, gorepomenute sekvence se mogu razlikovati u maloj meri, tj. usled porekla iz grupa različitih populacija. U primerima, antitela kao alat se takođe koriste npr. u svrhe skrininga. Takva antitela su standardna antitela i stručnjak ih može lako pribaviti.

1

[0058] Termin "epitop" označava determinantu proteina sposobnu za specifično vezivanje za antitelo. Epitopi se uobičajeno sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupacija molekula, kao što su aminokiseline ili bočni lanci šećera, i obično imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Konformacioni i nekonformacioni epitopi se razlikuju po tome da se vezivanje za prve ali ne i za druge gubi u prisustvu denaturišućih rastvarača.

[0059] Termin "izotip" označava klasu antitela (npr. IgM, IgE, IgG kao što je IgG1 ili IgG4) koju obezbeđuju geni konstantnog regiona teškog lanca. Izotip takođe uključuje modifikovane verzije jedne od tih klasa, gde su modifikacije načinjene da bi se izmenila Fc funkcija, na primer, da bi se pojačale ili smanjile efektorske funkcije ili vezivanje za Fc receptore.

[0060] Termin "humano antitelo", kako se ovde koristi, treba da obuhvata antitela koja imaju varijabilne regione u kojima su i regioni okvira i CDR-i dobijeni od sekvenci humanog porekla. Nadalje, ukoliko antitelo sadrži konstantni region, konstantni region je takođe dobijen od takvih humanih sekvenci, npr. sekvenci humane germinativne linije, ili mutantne verzije sekvenci humane germinativne linije ili antitelo koje sadrži konsenzusne sekvence okvira dobijene iz analize humanih sekvenci okvira, kako je opisano u Knappik, i sar. 2000, J Mol Biol 296:57-86).

[0061] "Humanizovano" antitelo je antitelo koje zadržava reaktivnost ne-humanog antitela pri čemu je manje imunogeno kod ljudi. To se može postići, na primer, zadržavanjem ne-humanih CDR regiona i zamenom preostalih delova antitela njihovim humanim parnjacima (tj. konstantnog regiona kao i delova okvira varijabilnog regiona). Vidi, npr. Morrison i sar. 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855; Morrison i Oi, 1988, Adv. Immunol., 44:65-92; Verhoeyen i sar.1988, Science, 239:1534-1536; Padlan 1991, Molec. Immun., 28:489-498; i Padlan 1994, Molec. Immun., 31:169-217. Drugi primeri tehnologije humanog inženjerstva uključuju, ali nisu ograničeni na tehnologiju Xoma prikazanu u US 5,766,886.

[0062] Humana antitela iz otkrića mogu da uključe ostatke aminokiselina koji nisu kodirani humanim sekvencama (npr. mutacije uvedene nasumičnom mutagenezom ili mutagenezom specifičnom za mesto in vitro ili somatskom mutacijom in vivo). Međutim, termin "humano antitelo", kako se ovde koristi, ne treba da uključi antitela u kojima su CDR sekvence dobijene od germinativne linije drugih vrsta sisara, kao što je miš, graftovane na humane sekvence okvira.

[0063] Termin "humano monoklonsko antitelo" se odnosi na antitela koja pokazuju jedinstvenu specifičnost vezivanja koja imaju varijabilne regione u kojima su i regioni okvira i CDR dobijeni od humanih sekvenci.

[0064] Termin "rekombinantno humano antitelo", kako se ovde koristi, obuhvata sva humana antitela koja se pripremaju, eksprimiraju, nastaju ili izoluju rekombinantnim metodama, kao što su antitela izolovana iz životinje (npr. miša) koja je transgena ili transhromozomalna za humane imunoglobulinske gene ili iz njih pripremljen hibridom, antitela izolovana iz ćelije domaćina transformisane da eksprimira humano antitelo, npr. transfektoma, antitela izolovana iz rekombinanta, kombinatorne biblioteke humanih antitela i antitela koja se pripremaju, eksprimiraju, nastaju ili izoluju bilo kojim drugim putem koji uključuje splajsovanje celog ili dela sekvence humanog imunoglobulinskog gena u druge sekvence DNK. Takva rekombinantna humana antitela imaju varijabilne regione u kojima su regioni okvira i CDR dobijeni od imunoglobulinske sekvence humane germinativne linije. U određenim otelotvorenjima, međutim, takva rekombinantna humana antitela mogu se podvrgnuti in vitro mutagenezi (ili, kada se koristi životinja transgena za humane IgG sekvence, in vivo somatskoj mutagenezi) pa su tako sekvence aminokiselina VHi VLregiona rekombinantnih antitela sekvence koje, iako su dobijene od sekvenci VHi VLhumane germinativne linije i srodne sa njima, ne mogu prirodno postojati u repertoaru germinativne linije humanog antitela in vivo.

[0065] Kako se ovde koristi, termin "izotip" označava klasu antitela (npr. IgM, IgE, IgG kao što je IgG1 ili IgG4) koju obezbeđuju geni konstantnog regiona teškog lanca.

[0066] Fraze "antitelo koje prepoznaje antigen" i "antitelo specifično za antigen" ovde se koriste kao sinonimi termina "antitelo koje se specifično vezuje za antigen".

[0067] Kako se ovde koristi, antitelo ili njegov antigen-vezujući deo koji se "specifično vezuje za IL-17A polipeptid" treba da se odnosi na antitelo ili njegove antigen-vezujuće delove koji se vezuju za humani IL-17A polipeptid sa KDod 100 nM ili manje, 10 nM ili manje, 1 nM ili manje, 100 pM ili manje, ili 10 pM ili manje. Antitelo koje "unakrsno reaguje sa antigenom

1

koji nije IL-17A" treba da označava antitelo koje vezuje taj antigen sa KDod 10 nM ili manje, 1 nM ili manje, ili 100 pM ili manje. Antitelo koje "ne reaguje unakrsno sa konkretnim antigenom" treba da označava antitelo koje se vezuje za taj antigen sa KDod 100 nM ili više, ili KDod 1 µM ili više, ili KDod 10 µM ili više. U određenim otelotvorenjima, takva antitela koja ne reaguju unakrsno sa antigenom pokazuju vezivanje u odnosu na te proteine koje se suštinski ne može detektovati standardnim testovima vezivanja.

[0068] Termin "Kassoc" ili "Ka", kako se ovde koristi, treba da se odnosi na brzinu asocijacije konkretne interakcije antitelo-antigen, dok termin "Kdis" ili "Kd", kako se ovde koristi, treba da se odnosi na brzinu disocijacije konkretne interakcije antitelo-antigen.

[0069] Termin "KD", kako se ovde koristi, treba da označava konstantu disocijacije, koja se dobija iz odnosa Kdi Ka(tj. Kd/Ka) i izražava se kao molarna koncentracija (M). KDvrednosti za antitela se mogu odrediti pomoću metoda dobro poznatih u struci. Jedna metoda za određivanje KDantitela je korišćenje površinske plazmonske rezonance, ili korišćenje biosenzorskog sistema kao što je Biacore<TM>sistem, koji je dobro poznat stručnjaku za ovu oblast i funkcioniše npr. kako je opisano u Primerima.

[0070] Inhibiranje vezivanja IL-17 za njegov receptor se može pogodno testirati različitim testovima, uključujući testove koji su nadalje opisani u ovom tekstu. Pod terminom "u istoj meri" podrazumeva se da referenca i ekvivalentni molekuli ispoljavaju, statistički, suštinski identičnu inhibitorsku aktivnost IL-17 u jednom od testova koji je ovde naveden (vidi Primere). Na primer, IL-17 vezujući molekuli iz otkrića tipično imaju polovinu maksimalne inhibitorske koncentracije (IC50), za inhibiciju humanog IL-17 proizvodnje IL-6 indukovane sa IL-17 u humanim dermalnim fibroblastima, koja je u okviru od /-10<5>, tj. ispod 10 nM, poželjnije 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 ili 2 nM od, poželjno suštinski ista kao, IC50odgovarajućeg referentnog molekula prilikom testiranja npr. kako je opisano u Primerima. Alternativno, test koji se koristi može biti test kompetitivne inhibicije vezivanja IL-17 putem rastvorljivih IL-17 receptora i IL-17 vezujućih molekula iz otkrića.

[0071] Kako se ovde koristi, termin "afinitet" se odnosi na jačinu interakcije između antitela i antigena na jednom antigenskom mestu. U okviru svakog antigenskog mesta, varijabilni region "kraka" antitela interaguje putem slabih nekovalentnih sila sa antigenom na brojnim mestima,

1

što je više interakcija, jači je afinitet. Kako se ovde koristi, termin "veliki afinitet" za IgG antitelo ili njegov fragment (npr. Fab fragment) odnosi se na antitelo koje ima KDod 10<-8>M ili manje, 10<-9>M ili manje, ili 10<-10>M, ili 10<-11>M ili manje, ili 10<-12>M ili manje, ili 10<-13>M ili manje za ciljni antigen. Međutim, veliki afinitet vezivanja može zatim da varira za druge izotipove antitela. Na primer, veliki afinitet vezivanja za IgM izotip označava antitelo koje ima KDod 10<-7>M ili manje, ili 10<-8>M ili manje.

[0072] Kako se ovde koristi, termin "aviditet" se odnosi na informativnu meru ukupne stabilnosti ili jačine kompleksa antitelo-antigen. Njega kontrolišu tri bitna faktora: afinitet epitopa antitela, valentnost i antigena i antitela, i strukturno uređenje interagujućih delova. Na kraju, ovi faktori definišu specifičnost antitela, to jest, verovatnoću da se konkretno antitelo vezuje za određeni epitop antigena.

[0073] Kako se ovde koristi, antitelo ili njegov antigen vezujući deo koji inhibira vezivanje IL-17A za IL-17R treba da označava antitelo ili njegov antigen-vezujući deo koji inhibira vezivanje IL-17A za IL-17R uz IC50od 10 nM ili manje, poželjno uz IC50od 1 nM ili manje, još poželjnije uz IC50od 100 pM, ili manje, kako je izmereno in vitro testom kompetitivnog vezivanja. Takav test je detaljnije opisan u primerima u nastavku.

[0074] Kako se ovde koristi, termin "IL-17A antagonist" ili "IL-17A blokirajući molekul" treba da označava antitelo ili njegov antigen-vezujući deo koji inhibira IL-17A indukovanu signalnu aktivnost putem IL-17R i tako smanjuje ili neutrališe aktivnost IL-17A. To se može videti u testu humane ćelije kao što je test proizvodnje IL-6 ili GRO-alfa zavisan od IL-17A u humanim ćelijama. Takav test je detaljnije opisan u Primerima u nastavku. U nekim otelotvorenjima, antitela ili njihovi antigen-vezujući delovi iz otkrića inhibiraju proizvodnju IL-6 ili GRO-alfa zavisnu od IL-17A kako je mereno u in vitro testu humane ćelije sa IC50od 10 nM ili manje, 1 nM ili manje, ili 100 pM ili manje. Takav test je detaljnije opisan u Primerima u nastavku. U nekim otelotvorenjima, antitela ili njihovi antigen-vezujući delovi iz otkrića inhibiraju antigenom indukovani artritis u in vivo testovima na miševima i pacovima. Takvi testovi su detaljnije opisani u Primerima u nastavku.

1

[0075] Kako se ovde koristi, termin "ADCC" ili "ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela" označava aktivnost koja iscrpljuje ćelije. ADCC aktivnost se može izmeriti putem standardnog ADCC testa, koji je dobro poznat stručnjaku za ovu oblast.

[0076] Kako se ovde koristi, termin "selektivnost" antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela iz otkrića označava antitelo ili njegov antigen-vezujući deo koji se vezuje za određeni ciljni polipeptid, ali ne za blisko srodne polipeptide. Fraze "antitelo koje prepoznaje antigen" i "antitelo specifično za antigen" ovde se koriste kao sinonimi termina "antitelo koje se specifično vezuje za antigen".

[0077] Termin "nukleinska kiselina" ili "polinukleotid" označava dezoksiribonukleinske kiseline (DNK) i ribonukleinske kiseline (RNK) i njihove polimere u jednolančanom ili dvolančanom obliku. Ukoliko nije specifično ograničen, termin obuhvata nukleinske kiseline koje sadrže poznate analoge prirodnih nukleotida koji imaju slična svojstva vezivanja kao referentna nukleinska kiselina, i metabolišu se na način sličan nukleotidima koji se javljaju u prirodi. (Vidi, U.S. Pat. br.8,278,036 za Kariko i sar. koji prikazuje molekule iRNK u kojima je uridin zamenjen pseudouridinom, metode za njihovu sintezu i metode za isporuku terapeutskih proteina in vivo.) Metode pakovanja iRNK se mogu koristiti, na primer, one prikazane u U.S. Pat. br.8,278,036 za Kariko i sar; i patentnoj prijavi WO2013/090186A1, za Moderna. Ako nije drugačije naznačeno, konkretna sekvenca nukleinske kiseline takođe implicitno obuhvata njene konzervativno modifikovane varijante (npr. supstitucije degenerativnog kodona), alele, ortologe, SNP i komplementarne sekvence, kao i eksplicitno naznačene sekvence. Specifično, supstitucije degenerativnih kodona se mogu postići generisanjem sekvenci u kojima je treći položaj jednog ili više odabranih (ili svih) kodona supstituisan ostacima mešovitih baza i/ili dezoksiinozina (Batzer i sar. Nucleic Acid Res.

19:5081 (1991); Ohtsuka i sar. J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); i Rossolini i sar. Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).

[0078] Kako se ovde koristi, termin "ispitanik" uključuje bilo kog čoveka ili nehumanu životinju. Termin "nehumana životinja" obuhvata sve kičmenjake, npr. sisare i ne-sisare, kao što su neljudski primati, ovce, psi, mačke, konji, krave, kokoške, vodozemci, reptili, itd. Kako se ovde koriste, termini "cyno" ili "cinomolgus" se odnose na cinomolgus majmuna (Macaca fascicularis). Kako se ovde koriste, termini "rezus" ili "rezus makaki" označavaju rezus makaki

1

majmuna (Macaca mulatta). Kako se ovde koristi, termin "marmozet" se odnosi na marmozet majmuna.

[0079] Kako se ovde koristi, termin "lečiti" ili "lečenje" bilo koje bolesti ili poremećaja (tj. reumatoidnog artritisa) odnosi se u jednom otelotvorenju na ublažavanje bolesti ili poremećaja (tj. usporavanje ili zaustavljanje ili smanjivanje napredovanja bolesti ili najmanje jednog njenog kliničkog simptoma). U drugom otelotvorenju, "lečiti" ili "lečenje" se odnosi na olakšavanje ili ublažavanje najmanje jednog fizičkog parametra, uključujući one koje pacijent možda ne primećuje. U još jednom otelotvorenju, "lečiti" ili "lečenje" se odnosi na modulisanje bolesti ili poremećaja, bilo fizički (npr. stabilizacija uočljivog simptoma), fiziološki (npr. stabilizacija fizičkog parametra), ili oba istovremeno. Postupci za procenu lečenja i/ili prevencije bolesti su generalno poznati u struci, osim ukoliko su ovde specifično opisani.

[0080] Kako se ovde koristi, "biranje" ili "izabran" u odnosu na pacijenta znači da je konkretan pacijent specifično izabran iz veće grupe pacijenata usled toga što konkretni pacijent ispunjava unapred određeni kriterijum. Slično tome, "selektivno lečiti pacijenta" se odnosi na pružanje lečenja pacijentu koji je specifično izabran iz veće grupe pacijenata usled toga što konkretni pacijent ispunjava unapred određeni kriterijum. Slično tome, "selektivna primena" se odnosi na davanje leka pacijentu koji je specifično izabran iz veće grupe pacijenata usled toga što konkretni pacijent ispunjava unapred određeni kriterijum.

[0081] Kako se ovde koristi, termin "optimizovana" znači da je sekvenca nukleotida izmenjena tako da kodira sekvencu aminokiselina pomoću kodona koji su poželjni u proizvođačkoj ćeliji ili organizmu, generalno eukariotskoj ćeliji, na primer, ćelije Pichia, ćelije Trichoderma, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) ili humane ćelije. Optimizovana sekvenca nukleotida je konstruisana da zadrži u potpunosti ili u najvećoj mogućoj meri sekvencu aminokiseline koja je prvobitno kodirana polaznom sekvencom nukleotida, koja je poznata i kao "matična" sekvenca. Ovde date optimizovane sekvence su konstruisane tako da imaju kodone koji su poželjni u CHO ćelijama sisara, međutim, optimizovana ekspresija tih sekvenci u drugim eukariotskim ćelijama je takođe ovde predviđena. Sekvence aminokiselina kodirane optimizovanim sekvencama nukleotida takođe se nazivaju optimizovanim.

1

[0082] Kako se ovde koristi, procenat identičnosti između dve sekvence je funkcija broja identičnih položaja zajedničkih za sekvence (tj. % identičnosti = br. identičnih položaja/ukupan br. položaja x 100), uzimajući u obzir broj praznina i dužinu svake praznine, koje se moraju uvesti zarad optimalnog poravnanja dve sekvence. Poređenje sekvenci i utvrđivanje procenta identičnosti između dve sekvence se može ostvariti pomoću matematičkog algoritma, kako je opisano u nastavku.

[0083] Procenat identičnosti između dve sekvence aminokiselina može se utvrditi pomoću algoritma koji su dali E. Meyers i W. Miller 1988, Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, koji je uključen u program ALIGN (verzija 2.0), korišćenjem PAM120 tabele težine ostataka, kaznene dužine praznine od 12 i kaznene praznine od 4. Alternativno, procenat identičnosti između dve sekvence aminokiselina može se utvrditi korišćenjem algoritma koji su dali Needleman i Wunsch 1970, J. Mol, Biol.48:444-453 koji je uključen u program GAP u softverskom paketu GCG (dostupan na http://www.gcg.com), korišćenjem Blossom 62 matrice ili PAM250 matrice, i težine praznine od 16, 14, 12, 10, 8, 6, ili 4 i težine dužine od 1, 2, 3, 4, 5, ili 6.

[0084] Procenat identičnosti između dve sekvence nukleotida aminokiselina može se takođe utvrditi, na primer, korišćenjem algoritama kao što je program BLASTN za sekvence nukleinskih kiselina koji kao zadate vrednosti koristi dužinu reči (W) od 11, očekivanje (E) od 10, M=5, N=4 i poređenje oba lanca.

[0085] Termini "unakrsno blokira", "unakrsno blokiran", "unakrsno blokiranje" ovde se koriste kao sinonimi i označavaju sposobnost antitela ili drugog vezujućeg agensa da ometa vezivanje drugih antitela ili vezujućih agenasa za IL-17A na standardnom testu kompetitivnog vezivanja.

[0086] Sposobnost ili mera u kojoj antitelo ili drugi vezujući agens, kao što je antigen-vezujući deo antitela, može da ometa vezivanje drugog antitela ili vezujućeg molekula za IL-17A, i prema tome da li se može reći da unakrsno blokira u skladu sa otkrićem, može se utvrditi korišćenjem standardnog testa kompetitivnog vezivanja. Jedan pogodan test uključuje korišćenje tehnologije Biacore<TM>(npr. korišćenjem instrumenta Biacore<TM>3000 (Biacore<TM>, Uppsala, Švedska)), koji može da meri opseg interakcija korišćenjem tehnologije površinske plazmonske rezonance. Drugi test za merenje unakrsnog blokiranja koristi pristup zasnovan na ELISA testu. Više detalja o ovim metodama je dato u Primerima.

2

[0087] Na primer, antitela koja su ovde data kao primeri (tj. XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 i XAB5) i njihovi antigen-vezujući delovi će se svi međusobno "unakrsno blokirati". Sva ova antitela ciljaju isti epitop na IL-17A. Očekivalo bi se da se druga unakrsno blokirajuća antitela vezuju za isti, ili srodni, epitop.

[0088] Prema pronalasku, unakrsno blokirajuće antitelo ili drugi vezujući agens, kao što je antigen-vezujući deo antitela, prema pronalasku se vezuje za IL-17A u opisanom testu unakrsnog blokiranja Biacore<TM>tako da je zabeleženo vezivanje kombinacije (smeše) antitela ili vezujućih agenasa između 80% i 0,1% (npr.80% do 4%) maksimalnog teorijskog vezivanja, specifično između 75% i 0,1% (npr. 75% do 4%) maksimalnog teorijskog vezivanja, i specifičnije između 70% i 0,1% (npr.70% do 4%), i specifičnije između 65% i 0,1% (npr.65% do 4%) maksimalnog teorijskog vezivanja (kako je gore definisano) dva antitela ili vezujućih agenasa u kombinaciji

[0089] Antitelo se definiše kao unakrsno blokirajuće u ELISA testu kako je opisano u Primerima, ako faza rastvora anti-IL-17A antitela može da izazove smanjenje između 60% i 100%, specifično između 70% i 100%, i specifičnije između 80% i 100% detekcionog signala IL-17A (tj. količine IL-17A vezanog obloženim antitelom) u poređenju sa detekcionim signalom IL-17A dobijenim u odsustvu faze rastvora anti-IL-17A antitela (tj. bunarčići sa pozitivnom kontrolom).

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0090] Predmetno otkriće se delimično zasniva na otkriću molekula antitela koji se specifično vezuju za homodimerni IL-17A i heterodimerni IL-17AF, ali se ne vezuju specifično za homodimerni IL-17F. Otkriće se odnosi i na antitela kompletnog IgG formata i na njihove antigen-vezujuće delove, koji će biti dalje opisani u nastavku.

[0091] U skladu sa tim, predmetno otkriće obezbeđuje antitela kao i njihove antigen-vezujuće delove sa sposobnostima vezivanja koje su iznenađujuće slične za nekoliko vrsta, poput odabranih od jednog ili više od cinomolgusa, rezus makakija, marmozeta, pacova, miša ili čoveka, kao i farmaceutske kompozicije, postupke za proizvodnju i postupke korišćenja takvih antitela ili kompozicija.

Rekombinantna antitela

[0092] Antitela iz otkrića uključuju humano rekombinantno antitelo XAB1 i derivate antitela XAB2, XAB3, XAB4 i XAB5, koji su dobijeni, izolovani i strukturno okarakterisani svojim aminokiselinskim sekvencama teškog i lakog lanca kompletne dužine, kako je opisano u Tabeli 1 u nastavku.

Tabela 1. Aminokiselinske sekvence teškog i lakog lanca kompletne dužine XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 i XAB5.

[0093] Odgovarajući varijabilni regioni, aminokiselinske sekvence VHi VLtakvih izolovanih antitela XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 i XAB5 iz otkrića su prikazani u Tabeli 2 u nastavku.

Tabela 2. Aminokiselinske sekvence varijabilnog teškog i lakog lanca XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 i XAB5.

[0094] Druga antitela iz otkrića uključuju ona koja imaju aminokiseline koje su mutirane izbacivanjem, ubacivanjem ili supstitucijom aminokiselina, pa ipak imaju najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sa gore opisanim antitelima, posebno u CDR regionima prikazanim u gore opisanim sekvencama. U nekim otelotvorenjima, antitelo iz otkrića je mutantna varijanta bilo kog od XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 i XAB5, pri čemu pomenuta mutantna varijanta antitela uključuje mutantne aminokiselinske sekvence, pri čemu je ne više od 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselina mutirano izbacivanjem, ubacivanjem ili supstitucijom aminokiselina u CDR regionima u poređenju sa CDR regionima prikazanim u gore opisanim sekvencama.

[0095] Kodirajuće sekvence lakih i teških lanaca kompletne dužine XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 i XAB5 su prikazane u Tabeli 3 u nastavku.

Tabela 3. DNK kodirajuće sekvence teškog i lakog lanca kompletne dužine.

2

[0096] Kodirajuće sekvence nukleotida varijabilnih lakih i teških lanaca XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 i XAB5 su prikazane u Tabeli 4 u nastavku.

Tabela 4. DNK kodirajuće sekvence varijabilnog teškog i lakog lanca aminokiselinske sekvence.

[0097] Druge nukleinske kiseline koje kodiraju antitela iz otkrića uključuju nukleinske kiseline koje su mutirane izbacivanjem, ubacivanjem ili supstitucijom nukleotida, a ipak imaju najmanje 60, 70, 80, 90, 95 ili 100 procenata identičnosti sa CDR-om odgovarajućih kodirajućih regiona prikazanih u sekvencama koje su prethodno opisane u Tabeli 5 ili u Tabeli 6 u nastavku.

[0098] U nekim otelotvorenjima, to uključuje varijante nukleinskih kiselina gde je ne više od 1, 2, 3, 4 ili 5 nukleotida zamenjeno izbacivanjem, ubacivanjem ili supstitucijom nukleotida u CDR kodirajućim regionima sa CDR kodirajućim regionima prikazanim u sekvencama koje su prethodno opisane iznad ili u Tabeli 5 ili u Tabeli 6 u nastavku.

[0099] Za antitela koja se vezuju za isti epitop, VH, VL, laki lanac kompletne dužine i sekvence teškog lanca kompletne dužine (sekvence nukleotida i sekvence aminokiselina) mogu se "mešati i uparivati" radi stvaranja drugih anti-IL-17A vezujućih molekula iz otkrića. Vezivanje IL-17A takvih "mešanih i uparenih" antitela može se testirati pomoću prethodno opisanih testova vezivanja ili drugih uobičajenih testova vezivanja (npr. ELISA). Kada se ti lanci pomešaju i upare, VHsekvencu konkretnog VH/VLpara treba zameniti strukturno sličnom VHsekvencom. Slično tome, sekvencu teškog lanca kompletne dužine iz konkretnog para teškog lanca kompletne dužine / lakog lanca kompletne dužine treba zameniti strukturno sličnom sekvencom teškog lanca kompletne dužine. Slično tome, VLsekvencu konkretnog VH/VLpara treba zameniti strukturno sličnom VLsekvencom. Slično tome, sekvencu lakog lanca kompletne dužine iz konkretnog para teškog lanca kompletne dužine / lakog lanca kompletne dužine treba zameniti strukturno sličnom sekvencom lakog lanca kompletne dužine. Shodno tome, u jednom aspektu, otkriće obezbeđuje izolovano rekombinantno antitelo ili njegov antigen-vezujući deo sa: varijabilnim regionom teškog lanca koji sadrži sekvencu aminokiseline odabranu iz grupe koja se sastoji od ID BR. SEKV: 12 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu aminokiseline odabranu iz grupe koja se sastoji od ID BR. SEKV: 13, 25, 35, 43 i 53, pri čemu su pomenuti regioni teškog i lakog lanca izabrani tako da se antitelo specifično vezuje za IL-17A.

[0100] Primeri aminokiselinskih sekvenci VHCDR1 (takođe se nazivaju HCDR1 ili HCDR1', u zavisnosti od definicije CDR koja se koristi), VHCDR2 (takođe se nazivaju HCDR2 ili HCDR2', u zavisnosti od definicije CDR koja se koristi), VHCDR3 (takođe se nazivaju HCDR1 ili HCDR1', u zavisnosti od definicije CDR koja se koristi), VLCDR1 (takođe se nazivaju LCDR1 ili LCDR1', u zavisnosti od definicije CDR koja se koristi), VLCDR2 (takođe se nazivaju LCDR2 ili LCDR2', u zavisnosti od definicije CDR koja se koristi), VLCDR3

2

(takođe se nazivaju HCDR3 ili HCDR3', u zavisnosti od definicije CDR koja se koristi) nekih antitela i njihovih antigen-vezujućih delova prema otkriću su prikazani Tabeli 5 i Tabeli 6.

[0101] U tabeli 5, CDR regioni nekih antitela iz otkrića su opisani putem Kabatovog sistema (Kabat, E. A., i sar.1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, peto izdanje, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publikacije br. 91-3242, vidi takođe Zhao i Lu 2009, Molecular Immunology 47:694-700)

[0102] Radi lakšeg čitanja, kada su CDR regioni opisani prema Kabatovoj definiciji, nadalje se nazivaju HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, odnosno LCDR3.

Tabela 5. CDR regioni XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 i XAB5 prema Kabatovoj definiciji.

2

[0103] Konsenzusne sekvence ID BR. SEKV: 73, ID BR. SEKV: 74 i ID BR. SEKV: 75 sadrže brojne varijabilne aminokiseline, označene sa X. Na osnovu poravnanja sekvenci za sekvence XAB2 do XAB5, četiri varijabilne aminokiseline ID BR. SEKV: 73 mogu se pogodno izabrati u skladu sa sledećim: Prva varijabilna aminokiselina (X1) može se izabrati iz grupe koja se sastoji od Gly (G) i Val (V), druga varijabilna aminokiselina (X2) može se izabrati iz grupe koja se sastoji od Tyr (Y), Asn (N) i Ile (I), treća varijabilna aminokiselina (X3) može se odabrati iz grupe koja se sastoji od Trp (W) i Ser (S), a četvrta varijabilna aminokiselina (X4) može se izabrati iz grupe koja se sastoji od Glu (E) i Ala (A). ID BR. SEKV: 9 ima identičnost sekvence od 91% u odnosu na ID BR. SEKV: 22 i identičnost sekvence od 73% u odnosu na ID BR. SEKV: 34 i ID BR. SEKV: 42. ID BR. SEKV: 22 ima identičnost sekvence od 64% u odnosu na ID BR. SEKV: 34 i ID BR. SEKV: 42. ID BR. SEKV: 34 ima identičnost sekvence od 91% u odnosu na ID BR. SEKV: 42.

[0104] Slično tome, jedna varijabilna aminokiselina u ID BR. SEKV: 74 može se pogodno izabrati u skladu sa sledećim: X1 se može izabrati iz grupe koja se sastoji od Asn (N) i Gln (Q). ID BR. SEKV: 10 ima identičnost sekvence od 86% u odnosu na ID BR. SEKV: 23.

[0105] Jedna varijabilna aminokiselina u ID BR. SEKV: 75 može se pogodno izabrati u skladu sa sledećim: X1 se može izabrati iz grupe koja se sastoji od Asn (N) i Asp (D). ID BR. SEKV: 11 ima identičnost sekvence od 89% u odnosu na ID BR. SEKV: 24.

[0106] U tabeli 6, CDR regioni nekih antitela iz otkrića su opisani pomoću Čotijinog sistema, Al-Lazikani i sar.1997, J. Mol. Biol. 273:927-948. Radi lakšeg čitanja, kada su CDR regioni opisani prema Čotijinoj definiciji, nadalje se nazivaju HCDR1', HCDR2', HCDR3', LCDR1', LCDR2', odnosno LCDR3'.

Tabela 6. CDR regioni XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 i XAB5 prema Čotijinoj definiciji.

2

[0107] Konsenzusne sekvence ID BR. SEKV: 71 i ID BR. SEKV: 72 sadrže brojne varijabilne aminokiseline, označene sa X. Na osnovu poravnanja sekvenci za sekvence XAB2 do XAB5, četiri varijabilne aminokiseline ID BR. SEKV: 71 mogu se pogodno izabrati u skladu sa sledećim: prva varijabilna aminokiselina (X1) može se izabrati iz grupe koja se sastoji od Gly (G) i Val (V), druga varijabilna aminokiselina (X2) može se izabrati iz grupe koja se sastoji od Tyr (Y), Asn (N) i Ile (I), treća varijabilna aminokiselina (X3) može se odabrati iz grupe koja se sastoji od Trp (W) i Ser (S), a četvrta varijabilna aminokiselina (X4) može se izabrati iz grupe koja se sastoji od Glu (E) i Ala (A). ID BR. SEKV: 4 ima identičnost sekvence od 86% u odnosu na ID BR. SEKV: 20 i identičnost sekvence od 57% u odnosu na ID BR. SEKV: 33 i ID BR. SEKV: 41. ID BR. SEKV: 20 ima identičnost sekvence od 43% u odnosu na ID BR. SEKV: 33 i ID BR. SEKV: 41. ID BR. SEKV: 33 ima identičnost sekvence od 86% u odnosu na ID BR. SEKV: 41.

2

[0108] Slično tome, jedna varijabilna aminokiselina u ID BR. SEKV: 72 može se pogodno izabrati u skladu sa sledećim: X1 se može izabrati iz grupe koja se sastoji od Asn (N) i Asp (D). ID BR. SEKV: 6 ima identičnost sekvence od 86% u odnosu na ID BR. SEKV: 21.

[0109] S obzirom na to da svako od ovih antitela može da se vezuje za IL-17A i da antigenvezujuću specifičnost obezbeđuju prvenstveno regioni CDR1, 2 i 3, sekvence VHCDR1, 2 i 3 i sekvence VLCDR1, 2 i 3 mogu se "mešati i uparivati" (tj. CDR-i različitih antitela se mogu mešati i uparivati, svako antitelo koje sadrži VHCDR1, 2 i 3 i VLCDR1, 2 i 3 stvara druge anti-IL-17A vezujuće molekule iz otkrića). Vezivanje IL-17A takvih "mešanih i uparenih" antitela može se testirati pomoću testova vezivanja opisanih u prethodnom tekstu i u Primerima, ili pomoću drugih uobičajenih testova vezivanja (npr. ELISA). Kada se sekvence CDR VHmešaju i uparuju, CDR1, CDR2 i/ili CDR3 sekvence konkretne sekvence VHtreba da se zamene strukturno sličnim sekvencama CDR. Slično tome, kada se sekvence CDR VLmešaju i uparuju, CDR1, CDR2 i/ili CDR3 sekvence konkretne sekvence VLtreba da se zamene strukturno sličnim sekvencama CDR. Uobičajeno veštim stručnjacima će biti očigledno da nove sekvence VHi VLmogu da se stvore supstituisanjem jedne ili više sekvenci CDR regiona VHi/ili VLsa strukturno sličnim sekvencama iz sekvenci CDR prikazanih ovde za monoklonska antitela predmetnog otkrića.

[0110] U jednom otelotvorenju, izolovano rekombinantno antitelo ili njegov antigen-vezujući deo ima: CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca prema ID BR. SEKV: 7; CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca prema ID BR. SEKV: 8; CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca prema ID BR. SEKV: 3; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od ID BR. SEKV: 9, 22, 34, 42 i 73, i poželjno izabranu od ID BR. SEKV: 42; CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od ID BR. SEKV: 10, 23 i 74, i poželjno izabranu od ID BR. SEKV: 23; i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od ID BR. SEKV: 11, 24 i 75, i poželjno izabranu od ID BR. SEKV: 11; pri čemu su pomenuti CDR regioni izabrani tako da se antitelo ili protein iz otkrića specifično vezuju za IL-17A.

[0111] U drugom otelotvorenju, izolovano rekombinantno antitelo ili njegov antigen-vezujući deo ima: HCDR1' varijabilnog regiona teškog lanca prema ID BR. SEKV: 1; HCDR2' varijabilnog regiona teškog lanca prema ID BR. SEKV: 2; HCDR3' varijabilnog regiona teškog

2

lanca prema ID BR. SEKV: 3; LCDR1' varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od ID BR. SEKV: 4, 20, 33, 41, i 71, i poželjno izabranu od ID BR. SEKV: 41; LCDR2' varijabilnog regiona lakog lanca prema ID BR. SEKV: 5; i LCDR3' varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od ID BR. SEKV: 6, 21 i 72, i poželjno izabranu od ID BR. SEKV: 6; pri čemu su pomenuti CDR regioni izabrani tako da se antitelo ili protein iz otkrića specifično vezuju za IL-17A.

[0112] U određenim otelotvorenjima, antitelo ili njegov antigen-vezujući deo sadrži ID BR. SEKV: 7, ID BR. SEKV: 8 i ID BR. SEKV: 3; ili ID BR. SEKV: 12; ili antitelo sadrži ID BR. SEKV: 14.

[0113] Kako se ovde koristi, humano antitelo sadrži varijabilne regione teškog ili lakog lanca ili teške ili lake lance kompletne dužine koji su "proizvod" ili "dobijeni od" konkretne sekvence germinativne linije ako su varijabilni regioni ili lanci kompletne dužine antitela pribavljeni iz sistema koji koristi gene imunoglobulina humane germinativne linije. Takvi sistemi obuhvataju imunizaciju transgenih miševa koji nose gene humanog imunoglobulina gde je željeni antigen ili biblioteka za skrining gena humanog imunoglobulina prikazana na fagu sa željenim antigenom. Humano antitelo koje je "proizvod" ili "dobijeno od" sekvence imunoglobulina humane germinativne linije može se identifikovati kao takvo poređenjem aminokiselinske sekvence humanog antitela sa aminokiselinskim sekvencama imunoglobulina humanih germinativnih linija i biranjem sekvence imunoglobulina humane germinativne linije koja je po sekvenci najbliža (tj. najveći % identičnosti) sekvenci humanog antitela. Humano antitelo koje je "proizvod" ili "dobijeno od" konkretne sekvence imunoglobulina humane germinativne linije može da sadrži razlike u aminokiselinama u poređenju sa sekvencom germinativne linije, usled, na primer, somatskih mutacija koje se javljaju u prirodi ili namernog uvođenja mutacija usmerenih na mesto. Međutim, izabrano humano antitelo je tipično najmanje 90% identično po aminokiselinskoj sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom koju kodira gen imunoglobulina humane germinativne linije i sadrži ostatke aminokiselina koji identifikuju humano antitelo kao humano u poređenju sa sekvencama aminokiselina imunoglobulina germinativne linije drugih vrsta (npr. mišje sekvence germinativne linije). U određenim slučajevima, humano antitelo može biti najmanje 60%, 70%, 80%, 90%, ili najmanje 95%, ili čak najmanje 96%, 97%, 98%, ili 99% identično po aminokiselinskoj sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom koju kodira gen imunoglobulina germinativne linije. Tipično, humano antitelo dobijeno od konkretne sekvence humane germinativne linije neće pokazivati više od 10 razlika u aminokiselinama od aminokiselinske sekvence koju kodira gen imunoglobulina humane germinativne linije. U određenim slučajevima, humano antitelo će pokazivati ne više od 5, ili čak ne više od 4, 3, 2 ili 1 razlike u aminokiselinama od aminokiselinske sekvence koju kodira gen imunoglobulina germinativne linije.

[0114] U predmetnom otkriću, identifikovan je epitop na IL-17A koji je posebno poželjan kao cilj za vezivanje potencijalno terapeutskih antitela. Taj epitop je vezan sa XAB1 i varijantama antitela XAB2, XAB3, XAB4 i XAB5 koje su razvijene modifikovanjem sekvence XAB1. Taj epitop se nalazi u sekvenci IL-17A, između ostataka Arg 78 i Trp 90.

[0115] Može se smatrati da epitop sadrži sledeće najpoželjnije aminokiselinske ostatke iz IL-17A: Arg 78, Glu 80, Trp 90. Pored toga, poželjni su i sledeći aminokiselinski ostaci: Tyr 85, Arg 124. Drugi značajni aminokiselinski ostaci su Pro 82, Ser 87, Val 88. Dalji aminokiselinski ostaci koji daju doprinos su Val 45*, Leu 49, Asp 81, Glu 83, Pro 86, Pro 130, Phe 133, Lys 137*, pri čemu aminokiseline obeležene sa (*) označavaju ostatak priložen od strane druge podjedinice IL-17A homodimera IL-17A.

[0116] Pokazalo se da antitela koja ciljaju ovaj epitop na IL-17A blokiraju vezivanje IL-17A za njegov receptor kako bi se inhibirali efekti posredovani putem IL-17A in vitro i smanjila ozbiljnost antigenom indukovanog artritisa eksperimentalnog in vivo modela. Pored toga, neočekivano se pokazalo da antitela koja se vezuju za taj epitop inhibiraju in vitro efekte posredovane putem IL-17AF heterodimera, a takođe zadržavaju iznenađujuće visok afinitet prema IL-17A i IL-17AF dobijenim od miša i drugih varijacija vrsta ciljnog molekula.

[0117] Tako, ovaj epitop je posebno poželjan pošto je takođe neočekivano očuvan u pristupačnom formatu u strukturi IL-17AF heterodimera. Shodno tome, poželjna antitela iz otkrića će se takođe vezivati za IL-17AF heterodimere. Bez želje da se ograničimo teorijom, predviđa se da je struktura IL-17AF heterodimera dovoljno slična sa IL-17A, ili da ga interakcija sa antitelima iz otkrića čini dovoljno sličnim sa IL-17A, tako da i dalje može doći do vezivanja.

1

[0118] To je neočekivano, jer strukturne analize zasnovane na dostupnim strukturama za IL-17A, IL-17F i interakcijama između ovih molekula i antitela ili receptora koje su dobijene pomoću rendgenske kristalografije (objavljena u struci i sprovedena od strane pronalazača) u kombinaciji sa in silico predviđanjima, sugerišu da neće neophodno doći do vezivanja za IL-17AF, ili unakrsne reaktivnosti antitela iz otkrića sa njim. Specifičnije, predviđeno je da će N-terminalni region IL-17F monomerske podjedinice heterodimera sterno ometati vezivanje antitela iz otkrića sa IL-17AF heterodimerom. Očekivalo se da neće biti značajne unakrsne reaktivnosti antitela sa IL-17AF.

[0119] Međutim, uprkos ovim predviđanjima, utvrdili smo da dolazi do unakrsnog vezivanja prikazanih antitela za IL-17AF. Ovo zapravo može biti pogodno iz brojnih razloga. Kao što je gore razmotreno, IL-17AF je takođe umešan kao proinflamatorni citokin, i može biti uključen u mnoga ista patološka stanja ili neželjene biološke događaje, kao što je opisano ili se sumnja za IL-17A. Antitela iz otkrića stoga mogu biti posebno terapeutski vredna, jer mogu da ciljaju ili ometaju i IL-17A i IL-17AF.

[0120] Štaviše, predmetni pronalazači su demonstrirali da ovo vezivanje između antitela iz otkrića i IL-17AF takođe korelira sa inhibicijom biološke aktivnosti IL-17AF, kako je uočeno u in vitro testovima. Shodno tome, antitela iz otkrića nisu efikasna samo u ciljanju i suprotstavljanju/neutralisanju aktivnosti IL-17A, već i aktivnosti IL-17AF.

[0121] Dalje neočekivane posledice rada koji su obavili predmetni pronalazači su sledeće. Afinitetno sazrevanje izvornog "matičnog" antitela XAB1 je takođe dovelo do skupa antitela koja zadržavaju veliki afinitet, ili poboljšani afinitet prema IL-17A varijantama dobijenim od drugih vrsta, kao što su cinomolgus, rezus makaki, marmozet, pacov ili miš.

[0122] To je neočekivano, jer se prilikom težnje za poboljšanjem afiniteta antitela iz otkrića prema humanom IL-17A nije očekivalo da dođe i do poboljšanja afiniteta dobijenih antitela prema varijantama različitih vrsta IL-17A. Zapravo, uobičajeno bi se moglo očekivati suprotno. Napori da se unapredi afinitet antitela prema varijanti specifične vrste (tj. čoveka) ciljnog antigena bi uobičajeno očekivano smanjili afinitet varijante drugih vrsta prema tom antigenu. Koncept varijanti po vrstama (ili homologa/paraloga) prepoznaje zajedničko poreklo za date vrste, ali prihvata da dolazi do divergencije tokom evolucione istorije. Shodno tome, čak i kada

2

postoji dobar stepen očuvanja sekvenci između varijanti konkretnog molekula koje su identifikovane u različitim vrstama, ne može se pretpostaviti da će poboljšani afinitet prema varijanti jedne vrste dovesti do poboljšanja afiniteta prema varijanti druge vrste. Zapravo, divergencija između sekvenci različitih vrsta generalno dovodi do očekivanja da će poboljšanje afiniteta prema jednoj varijanti verovatnije dovesti do smanjenja (ili čak ukidanja) afiniteta vezivanja za varijantu druge vrste. Identičnost sekvence između mišjeg i humanog IL-17A je samo 62% (Moseley i sar.2003, Cytokine & Growth Factor Reviews 14:155-174).

[0123] Međutim, u predmetnom slučaju to nije uočeno, i varijante antitela koje su pronalazači generisali su zadržale visok afinitet prema varijantama IL-17A drugih vrsta. To je korisno, jer tokom rada neophodnog za razvoj molekula antitela kandidata kao korisnog terapeutskog molekula može biti potrebno sprovođenje raznovrsnih testova na drugim vrstama ili na ćelijama, molekulima ili sistemima koji sadrže komponente druge vrste, ili su dobijeni od nje (kao što je cinomolgus, rezus makaki, marmozet, pacov ili miš). To čini antitela iz otkrića posebno pogodnim za dalji razvoj.

[0124] Shodno tome, antitela i njihovi antigen-vezujući delovi, kako je prikazano ovde, mogu deliti niz poželjnih svojstava, uključujući veliki afinitet prema IL-17A, unakrsnu reaktivnost sa IL-17A drugih vrsta kao što je miš, pacov, cinomolgus i marmozet, izostanak unakrsne reaktivnosti za druge IL-17 izotipove poput IL-17F, izostanak unakrsne reaktivnosti za druge citokine (kao što su humani ili mišji citokini), unakrsnu reaktivnost sa heterodimernim IL-17AF, sposobnost blokiranja vezivanja IL-17A za njegov receptor poput IL-17RA, sposobnost inhibiranja ili neutralisanja bioloških efekata indukovanih putem IL-17A, kao što je stimulacija sekrecije IL-6 ili GRO-alfa, i/ili sposobnost inhibiranja in vivo efekata posredovanih putem IL-17A (i/ili IL-17AF) kao što je oticanje primećeno kod modela antigenom indukovanog artritisa.

[0125] Takođe se pokazalo da antitela i njihovi antigen-vezujući delovi, kako je prikazano ovde, obezbeđuju sporu eliminaciju kompleksa antitelo-IL17A, spor obrt liganda i dugotrajno hvatanje IL17A. Dalje pogodne osobine ovih antitela i proteina su obezbeđene u detaljnim otelotvorenjima.

Homologa antitela

[0126] U još jednom otelotvorenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući deo, kako je ovde prikazano, ima aminokiselinske sekvence teškog i lakog lanca kompletne dužine, sekvence nukleotida teškog i lakog lanca kompletne dužine, sekvence nukleotida varijabilnog regiona teškog i lakog lanca, ili aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca, ili svih 6 CDR regiona aminokiselinskih sekvenci ili sekvenci koje kodiraju nukleotide antitela XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 i XAB5 opisanih u prethodnom tekstu, posebno u Tabeli 1, i pri čemu antitela ili proteini iz otkrića zadržavaju željena funkcionalna svojstva izvornih XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 i XAB5 antitela.

[0127] Željena funkcionalna svojstva izvornih XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 i XAB5 antitela se mogu izabrati iz grupe koja se sastoji od:

(i) afiniteta vezivanja za IL-17A (specifično vezivanje za IL-17A), na primer, sa KDod 1 nM ili manje, 100 pM ili manje, ili 10 pM ili manje, kako je izmereno u testu Biacore<TM>, npr. kao što je opisano u Primerima;

(ii) kompetitivne inhibicije vezivanja IL-17R za IL-17A, na primer, sa IC50od 10 nM ili manje, ili 1 nM ili manje, ili 100 pM ili manje, kako je izmereno u in vitro testu kompetitivnog vezivanja, npr. kao što je opisano u Primerima;

(iii) inhibicije aktivnosti zavisne od IL-17A, na primer proizvodnje IL-6 ili GRO-alfa, na primer, sa IC50od10 nM ili manje, ili 1 nM ili manje, ili 100 pM ili manje, kako je izmereno u ćelijskom testu kao što je opisano u Primerima;

(iv) inhibicije uočenih efekata, na primer oticanja kolena, kako je izmereno u in vivo testu antigenom indukovanog artritisa kao što je opisano u Primerima;

(v) unakrsne reaktivnosti sa IL-17A polipeptidom cinomolgusa, rezus makakija, pacova ili miša;

(vi) unakrsne reaktivnosti sa humanim ili mišjim IL-17AF polipeptidom;

4

(vii) afiniteta vezivanja za IL-17AF (specifično vezivanje za IL-17AF), na primer, sa KDod 1 nM ili manje, 100 pM ili manje, ili 10 pM ili manje, kako je izmereno u testu Biacore<TM>, npr. kao što je opisano u Primerima;

(viii) inhibicije vezivanja IL-17AF, na primer, sa IC50od 200 nM ili manje, ili 150 nM ili manje, ili 100 nM ili manje, kako je izmereno u in vitro testu kompetitivnog vezivanja kao što je opisano u Primerima;

(ix) pogodnih svojstava za razvoj leka, konkretno, da je stabilan i ne stvara agregate u formulaciji pri visokoj koncentraciji, tj. iznad 50 mg/ml.

[0128] Na primer, otkriće se odnosi na homologa antitela XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 i XAB5 (ili njihov antigen-vezujući deo) koja sadrže sekvence varijabilnog teškog lanca (VH) i sekvence varijabilnog lakog lanca (VL), pri čemu CDR sekvence, tj.6 CDR regiona, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3 ili HCDR1', HCDR2', HCDR3', LCDR1', LCDR2', LCDR3', dele najmanje 60, 70, 90, 95 ili 100 procenata identičnosti sekvence sa odgovarajućim CDR sekvencama najmanje jednog antitela XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 i XAB5, pri čemu se pomenuto homologo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, kao što je njegov antigen-vezujući deo, specifično vezuje za IL-17A, i antitelo ili protein ispoljava najmanje jedno od sledećih funkcionalnih svojstava: inhibira vezivanje IL-17A za njegove receptore, inhibira proizvodnju IL-6 ili GRO-alfa zavisnu od IL-17A u ćelijskim testovima, ili inhibicija efekata uočenih u in vivo testu artritisa indukovanog antigenom. U povezanom specifičnom otelotvorenju, homologo antitelo ili protein se vezuju za IL-17A sa KDod 1 nM ili manje i inhibiraju vezivanje IL-17A za njegove receptore kako je izmereno u in vitro testu kompetitivnog vezivanja sa IC50od 1 nM ili manje. CDR-i XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 i XAB5 su prethodno definisani u Tabeli 5 i Tabeli 6.

[0129] Otkriće se dalje odnosi na homologa antitela XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 i XAB5 (ili njihove antigen vezujuće fragmente, kao što su njihovi antigen-vezujući delovi) koja sadrže varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca koji su najmanje 80%, 90%, ili najmanje 95% ili 100% identični sa odgovarajućim varijabilnim regionima teškog i lakog lanca bilo kog od antitela XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 ili XAB5; homologo antitelo ili protein se specifično vezuje za IL-17A i ispoljava najmanje jedno od sledećih funkcionalnih svojstava: inhibira vezivanje IL-17A za njegove receptore, inhibira proizvodnju IL-6 ili GRO-alfa zavisnu od IL-17A u ćelijskim testovima, ili inhibicija efekata uočenih u in vivo testu artritisa indukovanog antigenom. U povezanom specifičnom otelotvorenju, homologo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, kao što je njegov antigen-vezujući deo, vezuje se za IL-17A sa KDod 1 nM ili manje i inhibira vezivanje IL-17A za njegove receptore, kako je izmereno u in vitro testu kompetitivnog vezivanja sa IC50od 1 nM ili manje. Aminokiselinske sekvence VHi VLXAB1, XAB2, XAB3, XAB4 i XAB5 su prethodno definisane u Tabeli 2.

[0130] U drugom primeru, otkriće se odnosi na homologa antitela XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 i XAB5 (ili njihove antigen-vezujuće fragmente, kao što su njihovi antigen-vezujući delovi) koja sadrže teški lanac kompletne dužine i laki lanac kompletne dužine, pri čemu: varijabilni teški lanac je kodiran sekvencom nukleotida koja je najmanje 80%, najmanje 90%, ili najmanje 95% ili 100% identična sa odgovarajućom sekvencom kodirajućeg nukleotida varijabilnih teških i lakih lanaca XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 i XAB5, homologo antitelo ili njegovi antigen-vezujući fragmenti, kao što je njegov antigen-vezujući deo, specifično se vezuju za IL-17A i ispoljavaju najmanje jedno od sledećih funkcionalnih svojstava: inhibiraju vezivanje IL-17A za njegove receptore, inhibiraju proizvodnju IL-6 ili GRO-alfa zavisnu od IL-17A u ćelijskim testovima, ili inhibicija efekata uočenih u in vivo testu artritisa indukovanog antigenom. U povezanom specifičnom otelotvorenju, homologo antitelo ili njegov antigenvezujući fragment, kao što je njegov antigen-vezujući deo, vezuje se za IL-17A sa KDod 1 nM ili manje, i inhibira vezivanje za IL-17A u in vitro testu kompetitivnog vezivanja sa IC50od 1 nM ili manje. Sekvence kodirajućeg nukleotida varijabilnih regiona XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 i XAB5 mogu se dobiti iz Tabele 3 koja prikazuje sekvence kodirajućeg nukleotida kompletne dužine XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 i XAB5, dok Tabela 2 prikazuje aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 i XAB5.

[0131] U različitim otelotvorenjima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, kao što je antigen-vezujući deo antitela, mogu da ispolje jednu ili više, dve ili više, tri ili više, ili četiri ili više željenih funkcionalnih svojstava koja su gore razmatrana. Antitelo ili protein iz otkrića može biti, na primer, humano antitelo, humanizovano antitelo ili himerno antitelo. U jednom otelotvorenju, antitelo ili protein je potpuno humano tiho antitelo, kao što je potpuno humano tiho IgG1 antitelo.

[0132] Utišane efektorske funkcije mogu se dobiti mutacijom u Fc konstantnom delu antitela i opisane su u Art: Strohl 2009 (LALA i N297A); Baudino 2008, D265A (Baudino i sar.2008, J. Immunol. 181:6664-69, Strohl, CO 2009, Biotechnology 20:685-91). Primeri tihih IgG1 antitela sadrže takozvani LALA mutant koji sadrži mutaciju L234A i L235A u aminokiselinskoj sekvenci Fc IgG1. Drugi primer za tiho IgG1 antitelo sadrži mutaciju D265A. Mutacija D265A se takođe poželjno može kombinovati sa mutacijom P329A (DAPA). Drugo tiho IgG1 antitelo sadrži mutaciju N297A, što dovodi do aglikozilovanih ili neglikozilovanih antitela.

[0133] Antitela sa mutantnim aminokiselinskim sekvencama se mogu dobiti mutagenezom (npr. mutageneza usmerena na mesto ili PCR-posredovana mutageneza) kodirajućih molekula nukleinske kiseline, a zatim testiranjem kodiranog izmenjenog antitela za zadržanu funkciju (tj. funkcije koje su prethodno iznete) pomoću ovde opisanih funkcionalnih testova.

Antitela sa konzervativnim modifikacijama

[0134] U određenim otelotvorenjima, antitelo (ili njegov antigen-vezujući deo) iz otkrića ima varijabilni region teškog lanca koji sadrži HCDR1, HCDR2 i HCDR3 sekvence (ili HCDR1', HCDR2' i HCDR3') i varijabilni region lakog lanca koji sadrži LCDR1, LCDR2 i LCDR3 sekvence (ili LCDR1', LCDR2' i LCDR3'), pri čemu jedna ili više ovih CDR sekvenci ima naznačene aminokiselinske sekvence zasnovane na antitelima XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 ili XAB5 koja su ovde opisana ili njihovim konzervativnim modifikacijama, i pri čemu antitelo ili protein zadržavaju željena funkcionalna svojstva anti-IL-17A antitela iz otkrića.

[0135] Kako se ovde koristi, termin "konzervativne modifikacije sekvenci" treba da označi supstitucije aminokiselina kod kojih je ostatak aminokiseline zamenjen ostatkom aminokiseline koji ima sličan bočni lanac. Familije aminokiselinskih ostataka koji imaju slične bočne lance su definisane u struci. Te familije uključuju aminokiseline sa baznim bočnim lancima (npr. lizin, arginin, histidin), kiselim bočnim lancima (npr. asparaginska kiselina, glutaminska kiselina), nenaelektrisanim polarnim bočnim lancima (npr. glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein, triptofan), nepolarnim bočnim lancima (npr. alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin), beta-razgranatim bočnim lancima (npr. treonin, valin, izoleucin) i aromatičnim bočnim lancima (npr. tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin). Tako, jedan ili više aminokiselinskih ostataka u CDR regionima antitela iz otkrića može biti zamenjeno drugim aminokiselinskim ostacima iz iste familije bočnog lanca, a izmenjeno antitelo može biti testirano na zadržanu funkciju pomoću ovde opisanih funkcionalnih testova.

[0136] Modifikacije se mogu uvesti u antitelo kako je ovde otkriveno uobičajenim tehnikama poznatim u struci, kao što je mutageneza usmerena na mesto ili PCR-posredovana mutageneza.

Konstruisana i modifikovana antitela

[0137] Druga antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti mogu se pripremiti pomoću antitela koje ima jednu ili više prethodno prikazanih sekvenci VHi/ili VLXAB1, XAB2, XAB3, XAB4 ili XAB5 kao polaznog materijala za projektovanje modifikovanog antitela, gde modifikovano antitelo može imati izmenjena svojstva u odnosu na početno antitelo. Antitelo se može konstruisati modifikacijom jednog ili više ostataka u jednom ili oba varijabilna regiona (tj. VHi/ili VL), na primer u jednom ili više CDR regiona i/ili u jednom ili više regiona okvira. Dodatno ili alternativno, antitelo se može konstruisati modifikacijom ostataka u konstantnom regionu (konstantnim regionima), na primer radi izmene efektorske funkcije (efektorskih funkcija) antitela.

[0138] Jedan tip projektovanja varijabilnog regiona koji se može obaviti je CDR graftovanje. Antitela interaguju sa ciljnim antigenima pretežno putem aminokiselinskih ostataka koji se nalaze u šest regiona koji određuju komplementarnost (CDR) teškog i lakog lanca. Usled toga, sekvence aminokiselina u CDR su raznovrsnije između pojedinačnih antitela nego sekvence izvan CDR-a. Pošto su CDR sekvence odgovorne za većinu antigen-antigen interakcija, moguće je eksprimirati rekombinantna antitela koja podražavaju svojstva specifičnih antitela koja se javljaju u prirodi putem konstruisanja ekspresionih vektora koji obuhvataju CDR sekvence specifičnih prirodnih antitela graftovane na sekvence okvira različitog antitela sa različitim svojstvima (vidi, npr. Riechmann, L. i sar.1998, Nature 332:323-327; Jones, P. i sar.

1986, Nature 321:522-525; Queen, C. i sar. 1989, Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033; U.S. Patent br.5,225,539, Winter, i U.S. Patente br.5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 i 6,180,370, Queen i sar.)

[0139] Shodno tome, drugo otelotvorenje pronalaska se odnosi na izolovano rekombinantno CDR-graftovano anti-IL-17A antitelo koje sadrži 6 CDR regiona bilo kog od XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 ili XAB5 kako je definisano u Tabeli 5 ili Tabeli 6, a ipak sadrži različite sekvence okvira od izvornih antitela.

[0140] Takve sekvence okvira se mogu pribaviti iz javnih baza podataka DNK ili objavljenih referenci koje uključuju sekvence gena antitela germinativne linije. Na primer, sekvence DNK germinativne linije za gene varijabilnih regiona humanih teških i lakih lanaca se mogu pronaći u "VBase" bazi podataka sekvenci humane germinativne linije (dostupno na internetu na www.mrc- cpe.cam.ac.uk/vbase), kao i u Kabat, E. A., i sar. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, peto izdanje, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publikacija br..91-3242; Tomlinson, I. M., i sar.1992, J. Mol. Biol.227:776-798; i Cox, J. P. L. i sar.1994, Eur. J Immunol. 24:827-836.

[0141] Primeri sekvenci okvira su one koje su strukturno slične sekvencama okvira koje su korišćene u bilo kom od XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 ili XAB5. Sekvence CDR1, 2 i 3 VHi sekvence CDR1, 2 i 3 VLse mogu graftovati na regione okvira koji imaju sekvencu identičnu onoj koja se može naći u genu imunoglobulina germinativne linije iz kojeg se dobijaju sekvence okvira, ili se sekvence CDR mogu graftovati na regione okvira koji sadrže jednu ili više mutacija u poređenju sa sekvencama germinativne linije. Na primer, otkriveno je da je u određenim slučajevima korisno mutirati ostatke u regionima okvira radi održavanja ili unapređenja sposobnosti antitela da vezuje antigen (vidi, npr. U.S. Patente br. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 i 6,180,370, Queen i sar.).

[0142] Drugi tip mutacije varijabilnog regiona je mutacija ostataka aminokiselina u CDR1, CDR2 i/ili CDR3 regionima VHi/ili VLkako bi se time poboljšalo jedno ili više svojstava vezivanja (npr. afinitet) željenog antitela, što je poznato kao "afinitetno sazrevanje". Mutageneza usmerena na mesto ili PCR-posredovana mutageneza se može izvršiti radi uvođenja mutacije (mutacija), i efekat na vezivanje antitela, ili druga željena funkcionalna svojstva, mogu se proceniti u in vitro ili in vivo testovima kao što je ovde opisano i dato u Primerima. Stoga, u jednom otelotvorenju, otkriće se odnosi na afinitetno sazrela antitela dobijena od jednog od XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 ili XAB5 antitela. Mogu se uvesti konzervativne modifikacije (kao što je prethodno razmatrano). Mutacije mogu biti supstitucije, ubacivanja ili izbacivanja aminokiselina. Štaviše, tipično nije izmenjeno više od jednog, dva, tri, četiri ili pet ostataka u CDR regionu. Na primer, antitelo iz otkrića je afinitetno sazrelo antitelo koje sadrži 6 CDR-a jednog od XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 ili XAB5 i pri čemu nije izmenjeno više od jednog, dva, tri, četiri ili pet ostataka u CDR regionu.

[0143] Shodno tome, u drugom otelotvorenju, otkriće obezbeđuje izolovana konstruisana anti-IL-17A antitela koja sadrže varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca koji su identični sa odgovarajućim varijabilnim regionima teškog i lakog lanca najmanje jednog od XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 ili XAB5 antitela, osim što aminokiselinske sekvence teškog i/ili lakog lanca pomenutog konstruisanog antitela imaju jednu, dve, tri, četiri ili pet supstitucija, izbacivanja ili ubacivanja aminokiselina u poređenju sa originalnom sekvencom.

Graftovanje antigen-vezujućih domena u alternativne okvire ili konstrukcije

[0144] Širok dijapazon okvira ili konstrukcija antitela/imunoglobulina može da se koristi sve dok dobijeni polipeptid uključuje najmanje jedan vezujući region XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 ili XAB5 koji se specifično vezuje za IL-17A. Takvi okviri ili konstrukcije uključuju 5 glavnih idiotipova humanih imunoglobulina ili njegove fragmente (kao što su oni prikazani u drugim delovima ovog teksta), i uključuju imunoglobuline drugih životinjskih vrsta, poželjno je sa humanizovanim aspektima. Antitela sa jednim teškim lancem poput onih koja su identifikovana kod kamelida su od posebnog interesa u tom pogledu. Stručnjaci za ovu oblast nastavljaju da razvijaju i otkrivaju nove okvire, konstrukcije i fragmente.

[0145] U jednom aspektu, otkriće se odnosi na generisanje antitela koja nisu zasnovana na imunoglobulinu ili njihovih antigen-vezujućih delova pomoću neimunoglobulinskih konstrukcija na koje se CDR-i iz otkrića mogu graftovati. Poznati ili budući neimunoglobulinski okviri i konstrukcije mogu se koristiti, sve dok sadrže region za vezivanje specifičan za ciljni protein sa ID BR. SEKV: 76. Takva jedinjenja se ovde nazivaju "polipeptidi koji sadrže vezujući region specifičan za cilj". Primeri neimunoglobulinskih okvira su dalje opisani u odeljcima u nastavku (kamelidna antitela i konstrukcija bez antitela).

4

Kamelidna antitela

[0146] Proteini antitela dobijeni od članova familije kamila i jednogrbih kamila (Camelus bactrianus i Camelus dromedarius) uključujući vrste iz novog sveta, kao što su lame (Lama paccos, Lama glama i Lama vicugna), okarakterisani su uzimajući u obzir veličinu, strukturnu složenost i antigenost za humane ispitanike. Određenim antitelima iz ove familije sisara u prirodnom obliku nedostaju laki lanci, te su tako strukturno različita od tipičnih četvorolančanih kvaternernih struktura koje imaju dva teška i dva laka lanca, za antitela drugih životinja. Vidi PCT Publikaciju br. WO 94/04678.

[0147] Region antitela kamelida koji je mali pojedinačni varijabilni domen identifikovan kao VHHmože se dobiti genetskim inženjerstvom dajući mali protein koji ima veliki afinitet prema cilju, što dovodi do proteina izvedenog iz antitela male molekulske mase poznatog kao "kamelidno nanotelo". Vidi U.S. Patent br. 5,759,808 izdat 2. juna, 1998; vidi takođe Stijlemans, B. i sar.2004, J Biol Chem 279: 1256-1261; Dumoulin, M. i sar.2003, Nature 424: 783-788; Pleschberger, M. i sar. 2003, Bioconjugate Chem 14: 440-448; Cortez-Retamozo, V. i sar. 2002, Int J Cancer 89: 456-62; i Lauwereys, M. i sar. 1998, EMBO J 17: 3512-3520. Konstruisane biblioteke kamelidnih antitela i fragmenata antitela su komercijalno dostupne, na primer, od kompanije Ablynx, Ghent, Belgija. Kao i kod drugih antitela nehumanog porekla, aminokiselinska sekvenca kamelidnog antitela se može izmeniti rekombinantnim putem da bi se dobila sekvenca koja više podseća na humanu sekvencu, tj. nanotelo može biti "humanizovano". Tako, prirodno niska antigenost kamelidnih antitela za ljude može dalje da se smanji.

[0148] Kamelidno nanotelo ima molekulsku masu oko jedne desetine molekulske mase humanog IgG, i protein ima fizički prečnik od svega nekoliko nanometara. Jedna posledica male veličine je sposobnost kamelidnih nanotela da se vezuju za antigenska mesta koja su funkcionalno nevidljiva većim proteinima antitela, tj. kamelidna nanotela su korisna kao reagensi koji detektuju antigene koji su inače skriveni kada se koriste klasične imunološke tehnike, i kao mogući terapeutski agensi. Još jedna posledica male veličine je da kamelidno nanotelo može da inhibira kao rezultat vezivanja za specifično mesto na žljebu ili uskoj pukotini ciljnog proteina, i tako može da posluži u svojstvu koje više podseća na funkciju klasičnog leka male molekulske mase nego na funkciju klasičnog antitela.

[0149] Mala molekulska masa i kompaktna veličina dovode do toga da su kamelidna nanotela izuzetno termostabilna, stabilna na ekstremnim pH vrednostima i stabilna na proteolitičku digestiju, i slabo antigena. Druga posledica je da kamelidna nanotela sa lakoćom prelaze iz sistema krvotoka u tkiva, pa čak prelaze krvno-moždanu barijeru i mogu da leče poremećaje koji utiču na nervno tkivo. Nanotela mogu dalje olakšati transport leka kroz krvno-moždanu barijeru. Vidi U.S. Patentnu publikaciju br. 20040161738 objavljenu 19. avgusta 2004. Ove osobine u kombinaciji sa malom antigenošću za ljude nagoveštavaju veliki terapeutski potencijal. Nadalje, ovi molekuli mogu biti u potpunosti eksprimirani u prokaritskim ćelijama kao što je E. coli i eksprimiraju se kao fuzioni proteini u bakteriofagu i funkcionalni su.

[0150] Konstruisana nanotela se mogu dalje prilagođavati pomoću genetskog inženjerstva kako bi imala poluživot u primaocu od 45 minuta do dve nedelje. U specifičnom otelotvorenju, kamelidno antitelo ili nanotelo se dobija graftovanjem CDR sekvenci teškog ili lakog lanca jednog od humanih antitela iz otkrića, XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 ili XAB5, u nanotelo ili sekvence okvira antitela sa jednim domenom, kao što je na primer opisano u PCT publikaciji br. WO 94/04678.

Konstrukcija bez antitela

[0151] Poznati neimunoglobulinski okviri ili konstrukcije uključuju, bez ograničenja, adnektine (fibronektin) (Compound Therapeutics, Inc., Waltham, MA), ankirin (Molecular Partners AG, Zurich, Švajcarska), antitela domena (Domantis, Ltd (Cambridge, MA) i Ablynx nv (Zwijnaarde, Belgija)), lipokalin (Anticalin) (Pieris Proteolab AG, Freising, Nemačka), male modularne imunske lekove (Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA), maksitela (Avidia, Inc. (Mountain View, CA)), protein A (Affibody AG, Švedska) i afilin (gama-kristalin ili ubikvitin) (Scil Proteins GmbH, Halle, Nemačka), mimetike epitopa proteina (Polyphor Ltd, Allschwil, Švajcarska).

(a) Fibronektinska konstrukcija

[0152] Fibronektinske konstrukcije se poželjno zasnivaju na domenu fibronektina tipa III (npr. deseti modul fibronektina tipa III (domen 10 Fn3)). Domen fibronektina tipa III ima 7 ili 8 beta lanaca koji su raspodeljeni između dve beta ravni, koje su upakovane jedna naspram druge kako bi formirale jezgro proteina, i dalje sadrže petlje (analogno CDR-ima) koje povezuju beta lance i izložene su rastvaraču. Postoje najmanje tri takve petlje na svakoj ivici sendviča beta ravni, pri čemu je ivica granica proteina pod normalnim uglom na smer beta lanaca (US Patent br. 6,818,418).

[0153] Ove konstrukcije bazirane na fibronektinu nisu imunoglobulin, mada je ukupan sklop blisko povezan sa sklopom najmanjeg funkcionalnog fragmenta antitela, varijabilnim regionom teškog lanca, koji sadrži celokupnu jedinicu za prepoznavanje antigena u IgG kamile ili lame. Zbog te strukture, neimunoglobulinsko antitelo podražava antigen-vezujuća svojstva koja su po prirodi i afinitetu slična kao kod antitela. Te konstrukcije se mogu koristiti u strategiji randomizacije i mešanja petlji in vitro koja je slična postupku afinitetnog sazrevanja antitela in vivo. Ovi molekuli zasnovani na fibronektinu mogu da se koriste kao konstrukcije tamo gde se regioni petlje molekula mogu zameniti CDR-ima XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 ili XAB5 standardnim tehnikama kloniranja.

(b) Ankirin - Molecular Partners

[0154] Ova tehnologija se zasniva na korišćenju proteina sa ponavljajućim modulima izvedenih iz ankirina kao konstrukcija za nošenje varijabilnih regiona koji mogu da se koriste za vezivanje za različite ciljeve. Ponavljajući modul ankirina je polipeptid od 33 aminokiseline koji sadrži dva anti-paralelna α-heliksa i β-zaokret. Vezivanje varijabilnih regiona je pretežno optimizovano upotrebom displeja ribozoma.

(c) Maksitela/Avimeri - Avidia

[0155] Avimeri se dobijaju iz prirodnog proteina koji sadrži A-domen kao što je LRP-1. Ti domeni se koriste u prirodi za protein-protein interakcije, i kod ljudi je preko 250 proteina strukturno zasnovano na A-domenima. Avimeri se sastoje od brojnih monomera "A-domena" (2-10) povezanih pomoću aminokiselinskih linkera. Mogu se kreirati avimeri koji mogu da se vežu za ciljani antigen korišćenjem metodologije opisane, na primer, u US Patentnim publikacijama br.20040175756, 20050053973, 20050048512 i 20060008844.

4

(d) Protein A - Affibody

[0156] Affibody® afinitetni ligandi su mali jednostavni proteini koji se sastoje od snopa od tri heliksa na bazi konstrukcije jednog ili više IgG-vezujućih domena proteina A. Protein A je površinski protein iz bakterije Staphylococcus aureus. Domen konstrukcije se sastoji od 58 aminokiselina, od kojih je 13 randomizovano da generiše Affibody® biblioteke sa velikim brojem varijanti liganada (vidi npr. US Patent br. 5,831,012). Molekuli Affibody® imitiraju antitela; oni imaju molekulsku masu od 6 kDa, u poređenju sa molekulskom masom antitela, koja je 150 kDa. Uprkos njihovoj maloj veličini, mesto vezivanja molekula Affibody® je slično kao za antitela.

(e) Anticalins - Pieris

[0157] Anticalins® su proizvodi koje je razvila kompanija Pieris ProteoLab AG. Dobijeni su od lipokalina, rasprostranjene grupe malih i robusnih proteina koji su obično uključeni u fiziološki transport ili skladištenje hemijski osetljivih ili nerastvornih supstanci. Nekoliko prirodnih lipokalina se javlja u tkivu ili telesnim tečnostima čoveka.

[0158] Arhitektura proteina podseća na imunoglobuline, sa hipervarijabilnim petljama povrh čvrstog okvira. Međutim, za razliku od antitela ili njihovih rekombinantnih fragmenata, lipokalini su sastavljeni od pojedinačnog lanca polipeptida sa 160 do 180 aminokiselinskih ostataka, te su neznatno veći od pojedinačnog imunoglobulinskog domena.

[0159] Set od četiri petlje, koji čini džep za vezivanje, ispoljava izraženu strukturnu plastičnost i toleriše širok raspon bočnih lanaca. Mesto vezivanja se tako može preoblikovati u vlasničkom postupku kako bi prepoznavalo propisane ciljane molekule ili različite oblike sa velikim afinitetom i specifičnošću.

[0160] Jedan protein iz familije lipokalina, bilin-vezujući protein (BBP) dobijen od velikog kupusara, korišćen je za razvoj antikalina putem mutageneze seta od četiri petlje. Jedan primer patentne prijave koja opisuje "antikaline" je PCT Publikacija WO 199916873.

(f) Affilin - Scil Proteins

[0161] Affilin™ molekuli su mali neimunoglobulinski proteini koji su projektovani za specifične afinitete prema proteinima i malim molekulima. Novi Affilin™ molekuli se mogu veoma brzo izabrati iz dve biblioteke, od kojih se svaka zasniva na različitim proteinima konstrukcije koji su izvedeni od ljudi.

[0162] Affilin™ molekuli ne pokazuju bilo kakvu strukturnu homologost sa imunoglobulinskim proteinima. Scil Proteins koristi dve Affilin™ konstrukcije, od koji je jedna gama kristalin, humani strukturni protein očnog sočiva, a druga je "ubikvitinska" superfamilija proteina. Obe humane konstrukcije su veoma male, pokazuju veliku temperaturnu stabilnost i skoro da su otporne na pH promene i denaturišuće agense. Velika stabilnost je pre svega posledica proširene strukture beta ravni proteina. Primeri proteina izvedenih gama kristalinom su opisani u WO200104144, a primeri proteina "sličnih ubikvitinu" su opisani u WO2004106368.

(g) Mimetici epitopa proteina (Protein Epitope Mimetics - PEM)

[0163] PEM su ciklični molekuli srednje veličine slični peptidu (MM 1-2 kDa) koji imitiraju beta ukosnice sekundarne strukture proteina, najznačajniju sekundarnu strukturu koja učestvuje u protein-protein interakcijama.

Okvir ili Fc inženjerstvo

[0164] Konstruisana antitela i njihovi antigen-vezujući delovi iz otkrića uključuju ona u kojima su načinjene modifikacije regiona okvira u VHi/ili VL, npr. da bi se poboljšala svojstva antitela. Takve modifikacije okvira su tipično načinjene da bi se smanjila imunogenost antitela. Na primer, jedan pristup je "povratno mutiranje" jednog ili više ostataka okvira u odgovarajuću sekvencu germinativne linije. Specifičnije, antitelo koje je prošlo somatsku mutaciju može sadržati ostatke okvira koji se razlikuju od sekvence germinativne linije od koje je antitelo dobijeno. Takvi ostaci mogu da se identifikuju poređenjem sekvenci okvira antitela sa sekvencama germinativne linije od kojih je antitelo dobijeno. Da bi se sekvence regiona okvira vratile u svoju konfiguraciju germinativne linije, somatske mutacije mogu biti "povratno

4

mutirane" u sekvencu germinativne linije, na primer, putem mutageneze usmerene na mesto ili PCR-posredovane mutageneze. Takva "povratno mutirana" antitela takođe treba da budu obuhvaćena otkrićem.

[0165] Drugi tip modifikacija okvira uključuje mutaciju jednog ili više ostataka u regionu okvira, ili čak u jednom ili više CDR regiona, kako bi se uklonili epitopi T ćelija, čime se smanjuje potencijalna imunogenost antitela. Ovaj pristup se takođe naziva "deimunizacija", i detaljnije je opisan u U.S. Patentnoj publikaciji br.20030153043 čiji su autori Carr i sar.

[0166] Pored modifikacija načinjenih u regionima okvira ili CDR, ili kao njihova alternativa, antitela iz otkrića se mogu konstruisati da uključe modifikacije u Fc regionu, tipično da bi se izmenilo jedno ili više funkcionalnih svojstava antitela, kao što je poluživot u serumu, fiksacija komplementa, vezivanje Fc receptora i/ili ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela. Nadalje, antitelo iz otkrića može biti hemijski modifikovano (npr. jedan ili više hemijskih funkcionalnih ostataka se može vezati za antitelo) ili modifikovano da se izmeni njegova glikozilacija, ponovo radi izmene jednog ili više funkcionalnih svojstava antitela. Svako od ovih otelotvorenja je detaljnije opisano u nastavku.

[0167] Kako se ovde koristi, termin "Fc region" se koristi da definiše region C-terminusa teškog lanca imunoglobulina, uključujući Fc region nativne sekvence i varijante Fc regiona. Fc region teškog lanca humanog IgG se uopšteno definiše tako da sadrži aminokiselinske ostatke od položaja C226 ili od P230 do karboksilnog terminusa IgG antitela. Numerisanje ostataka u Fc regionu je prema Kabatovom EU indeksu. Lizin C-terminusa (ostatak K447) Fc regiona može da se ukloni, na primer, tokom proizvodnje ili prečišćavanja antitela. Shodno tome, kompozicija antitela iz otkrića može da sadrži populacije antitela u kojima su svi K447 ostaci uklonjeni, populacije antitela u kojima nije uklonjen nijedan K447 ostatak, i populacije antitela koje imaju mešavinu antitela sa K447 ostatkom ili bez njega.

[0168] U jednom otelotvorenju, region šarke CH1 je modifikovan tako da je broj cisteinskih ostataka u regionu šarke izmenjen, npr. povećan ili smanjen. Ovaj pristup je detaljnije opisan u U.S. Patentu br. 5,677,425 čiji su autori Bodmer i sar. Broj cisteinskih ostataka u regionu šarke CH1 je izmenjen, na primer, radi olakšavanja sklapanja lakih i teških lanaca ili radi povećanja ili smanjenja stabilnosti antitela.

4

[0169] U drugom otelotvorenju, Fc region šarke antitela je mutiran da smanji biološki poluživot antitela. Specifičnije, uvedena je jedna ili više mutacija aminokiselina u CH2-CH3 region interfejsa domena fragmenta Fc šarke tako da antitelo ima umanjeno vezivanje stafilokoknog proteina A (SpA) u odnosu na SpA vezivanje nativnog domena Fc šarke. Ovaj pristup je detaljnije opisan u U.S. Patentu br.6,165,745 čiji su autori Ward i sar.

[0170] U drugom otelotvorenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući deo su modifikovani da se produži njegov biološki poluživot. Mogući su raznovrsni pristupi. Na primer, može se uvesti jedna ili više od sledećih mutacija: T252L, T254S, T256F, kao što je opisano u U.S. Patentu br. 6,277,375, Ward. Alternativno, da bi se produžio biološki poluživot, antitelo se može izmeniti u CH1 ili CL regionu kako bi sadržalo epitop za vezivanje receptora spasa (eng. salvage receptor) uzet iz dve petlje CH2 domena Fc regiona IgG, kao što opisuju U.S. patenti br. 5,869,046 i 6,121,022 autora Presta i sar.

[0171] U još jednom otelotvorenju, Fc region je izmenjen zamenom najmanje jednog ostatka aminokiseline različitim ostatkom aminokiseline da bi se izmenile efektorske funkcije antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela. Na primer, jedna ili više aminokiselina se može zameniti različitim aminokiselinskim ostacima tako da antitelo ima izmenjen afinitet prema efektorskom ligandu ali zadržava antigen-vezujuću sposobnost matičnog antitela. Efektorski ligand prema kome je afinitet izmenjen može biti, na primer, Fc receptor ili C1 komponenta komplementa. Ovaj pristup je detaljnije opisan u U.S. Patentima br.5,624,821 i 5,648,260 čiji su autori Winter i sar.

[0172] U drugom otelotvorenju, jedna ili više aminokiselina odabranih od aminokiselinskih ostataka se može zameniti različitim aminokiselinskim ostatkom tako da antitelo ima izmenjeno vezivanje C1q i/ili smanjenu ili ukinutu citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC). Ovaj pristup je detaljnije opisan u U.S. Patentu br.6,194,551 čiji su autori Idusogie i sar.

[0173] U drugom otelotvorenju, jedan ili više aminokiselinskih ostataka je izmenjen kako bi se time izmenila sposobnost antitela da fiksira komplement. Ovaj pristup je detaljnije opisan u PCT Publikaciji WO 94/29351 čiji su autori Bodmer i sar.

4

[0174] U još jednom otelotvorenju, Fc region je modifikovan da poveća sposobnost antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela da posreduje u ćelijskoj citotoksičnosti zavisnoj od antitela (ADCC) i/ili da poveća afinitet antitela prema Fcγ receptoru putem modifikovanja jedne ili više aminokiselina. Ovaj pristup je dalje opisan u PCT Publikaciji WO 00/42072 čiji je autor Presta. Štaviše, mesta vezivanja na humanom IgG1 za FcγRI, FcγRII, FcγRIII i FcRn su mapirana, i opisane su varijante sa poboljšanim vezivanjem (vidi Shields, R.L. i sar.2001, J. Biol. Chem 276:6591-6604).

[0175] U određenim otelotvorenjima, koristi se Fc domen IgG1 izotipa. U nekim specifičnim otelotvorenjima, koristi se mutantna varijanta Fc fragmenta IgG1, npr. tihi Fc IgG1 koji umanjuje ili eliminiše sposobnost fuzionog polipeptida da posreduje u ćelijskoj citotoksičnosti zavisnoj od antitela (ADCC) i/ili da se vezuje za Fcγ receptor. Primer tihog mutanta izotipa IgG1 je IgG1 u kome je leucin zamenjen alaninom na položajima aminokiselina 234 i 235 kao što opisuju Hezareh i sar.2001, J. Virol 75:12161-8. Drugi primer tihog mutanta izotipa IgG1 je IgG1 sa mutacijom D265A (aspartat je supstituisan alaninom na položaju 265). U određenim otelotvorenjima, Fc domen je tihi Fc mutant koji sprečava glikozilaciju na položaju 297 Fc domena. Na primer, Fc domen sadrži supstituciju aminokiseline asparagina na položaju 297. Jedan primer takve supstitucije aminokiseline je zamena N297 glicinom ili alaninom.

[0176] U još jednom otelotvorenju, glikozilacija antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela je modifikovana. Na primer, može se napraviti aglikozilovano antitelo (tj. antitelo nema glikozilaciju). Glikozilacija može biti izmenjena da bi se, na primer, povećao afinitet antitela prema antigenu. Takve modifikacije ugljenih hidrata se mogu postići, na primer, izmenom jednog ili više mesta glikozilacije u sekvenci antitela. Na primer, može se načiniti jedna ili više aminokiselinskih supstitucija koje dovode do eliminacije jednog ili više mesta glikozilacije varijabilnog regiona okvira, čime se eliminiše glikozilacija na tom mestu. Takva aglikozilacija može povećati afinitet antitela prema antigenu. Takav pristup je detaljnije opisan u U.S. Patentima br.5,714,350 i 6,350,861 čiji su autori Co i sar.

[0177] Dodatno ili alternativno, mogu se napraviti antitelo ili njegov antigen-vezujući deo koji imaju izmenjen tip glikozilacije, kao što je hipofukozilovano antitelo koje ima smanjenu količinu fukozil ostataka ili antitelo koje ima povećanje bisektujućih struktura GlcNac. Pokazalo se da takvi izmenjeni šabloni glikozilacije povećavaju ADCC sposobnost antitela. Takve modifikacije ugljenih hidrata se mogu postići, na primer, eksprimiranjem antitela u ćeliji

4

domaćinu sa izmenjenom mašinom za glikozilaciju. Ćelije sa izmenjenom mašinom za glikozilaciju su opisane u struci, i mogu se koristiti kao ćelije domaćini za eksprimiranje rekombinantnih antitela iz otkrića, čime se proizvodi antitelo sa izmenjenom glikozilacijom. Na primer, EP 1 176 195 čiji su autori Hang i sar. opisuje ćelijsku liniju sa funkcionalno ometanim FUT8 genom, koji kodira fukozil transferazu, tako da antitela eksprimirana u takvoj ćelijskoj liniji ispoljavaju hipofukozilaciju. Stoga, u jednom otelotvorenju, antitela iz otkrića se proizvode rekombinantnim eksprimiranjem u ćelijskoj liniji koja ispoljava šablon hipofukozilacije, ćelijskoj liniji sisara sa nedostatkom ekspresije FUT8 gena koji kodira fukozil transferazu. PCT Publikacija WO 03/035835 čiji je autor Presta opisuje varijantu ćelijske linije CHO, Lecl3 ćelije, koja ima smanjenu sposobnost vezivanja fukoze za Asn(297)-povezane ugljene hidrate, što takođe dovodi do hipofukozilacije antitela eksprimiranih u ćeliji domaćinu (vidi takođe Shields, R.L. i sar. 2002, J. Biol. Chem.277:26733-26740). PCT Publikacija WO 99/54342 čiji su autori Umana i sar. opisuje ćelijske linije konstruisane da eksprimiraju glikozil transferaze koje modifikuju glikoprotein (npr. beta(1,4)-N acetilglukozaminil transferaza III (GnTIII)) tako da antitela eksprimirana u konstruisanim ćelijskim linijama pokazuju porast bisektujućih GlcNac struktura, što dovodi do povećane ADCC aktivnosti antitela (vidi takođe Umana i sar.1999, Nat. Biotech.17:176-180). Alternativno, antitela i njihovi antigen-vezujući delovi iz otkrića se mogu proizvesti u kvascu ili filamentoznim gljivama konstruisanim za šablon glikozilacije sličan onom kod sisara, i sposobnim za proizvodnju antitela bez fukoze kao šablona glikozilacije (vidi, na primer, EP 1297 172).

[0178] Druga modifikacija antitela ili njihovih antigen-vezujućih delova kao što je ovde prikazano, koja se razmatra u okviru otkrića, je pegilovanje. Ti molekuli mogu biti pegilovani da bi se, na primer, produžio njihov biološki poluživot (npr. u serumu). Na primer, da bi se antitelo pegilovalo, antitelo, ili njegov fragment, tipično se dovodi u reakciju sa polietilen glikolom (PEG), kao što je reaktivni estar ili aldehidni derivat PEG, u uslovima u kojima se jedna ili više PEG grupa vezuje za antitelo ili fragment antitela. Pegilovanje se može izvršiti reakcijom acilovanja ili reakcijom alkilovanja sa reaktivnim PEG molekulom (ili analognim reaktivnim polimerom rastvornim u vodi). Kako se ovde koristi, termin "polietilen glikol" treba da obuhvati svaki od oblika PEG koji je korišćen za derivatizaciju drugih proteina, kao što je mono (C1-C10) alkoksi- ili ariloksi polietilen glikol ili polietilen glikol maleimid. U određenim otelotvorenjima, antitelo koje će biti pegilovano je aglikozilovano antitelo. Postupci pegilovanja proteina su poznati u struci, i mogu se primeniti na antitela iz otkrića. Vidi, na primer, EP 0154 316 čiji su autori Nishimura i sar. i EP 0401 384 čiji su autori Ishikawa i sar.

4

[0179] Druga modifikacija antitela i njihovih antigen-vezujućih delova koja se razmatra u okviru otkrića je konjugat ili fuzija proteina barem iz antigen-vezujućeg regiona antitela iz otkrića sa proteinom seruma, kao što je humani albumin iz seruma ili njegov fragment, radi produženja poluživota dobijenog molekula. Takav pristup, na primer, opisuju Ballance i sar. EP 0322 094.

[0180] Druga mogućnost je fuzija barem antigen-vezujućeg regiona antitela iz otkrića sa proteinima sposobnim da se vežu za proteine seruma, kao što je humani albumin iz seruma, radi produženja poluživota dobijenog molekula. Takav pristup, na primer, opisuju Nygren i sar. EP 0486 525.

Postupci konstruisanja izmenjenih antitela

[0181] Kao što je gore razmotreno, anti-IL-17A antitela sa VHi VLsekvencama ili sekvencama teškog ili lakog lanca kompletne dužine koje su prikazana ovde mogu da se koriste za kreiranje novih anti-IL-17A antitela putem modifikovanja sekvenci teškog lanca i/ili lakog lanca kompletne dužine, VHi/ili VLsekvenci, ili na njih vezanih konstantnih regiona. Tako, u drugom aspektu otkrića, strukturne karakteristike anti-IL-17A antitela iz otkrića se koriste za kreiranje strukturno povezanih anti-IL-17A antitela ili njihovih antigen-vezujućih delova koji zadržavaju najmanje jednu funkcionalnu karakteristiku ovde prikazanih antitela, kao što je vezivanje za humani IL-17A, i takođe inhibiraju jednu ili više funkcionalnih karakteristika IL-17A (npr. inhibiranje vezivanja IL-17A ili IL-17AF za njegove receptore, inhibiranje proizvodnje IL-6, GRO-alfa koja je indukovana pomoću IL-17A ili IL-17AF, itd.) inhibitorske aktivnosti u in vivo testovima.

[0182] Druga antitela koja zadržavaju suštinski ista svojstva vezivanja za IL-17A uključuju himerna antitela ili CDR graftovana antitela bilo kog od XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 ili XAB5 koja zadržavaju iste VH i VL regione, ili CDR regione, bilo kog od XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 ili XAB5 i različite konstantne regione ili regione okvira (na primer, različiti Fc region izabran od drugog izotipa, na primer IgG4 ili IgG2).

[0183] Na primer, jedan ili više CDR regiona bilo kog od XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 ili XAB5, ili njihove mutacije, mogu se rekombinantno kombinovati sa poznatim regionima okvira i/ili drugim CDR-ima radi kreiranja dodatnih rekombinantno konstruisanih anti-IL-17A antitela iz otkrića, kao što je prethodno razmotreno. Drugi tipovi modifikacija uključuju one opisane u prethodnom odeljku. Početni materijal za postupak konstruisanja je jedna ili više VHi/ili VLsekvenci XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 ili XAB5 koje su obezbeđene u prethodnim tabelama, ili jedan ili više njihovih CDR regiona. Da bi se kreiralo konstruisano antitelo, nije neophodno zapravo pripremiti (tj. eksprimirati kao protein) antitelo koje ima jednu ili više VHi/ili VLsekvenci XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 ili XAB5 ili jedan ili više njihovih CDR regiona. Prevashodno, informacije koje se nalaze u sekvencama se koriste kao polazni materijal za kreiranje "druge generacije" sekvenci dobijenih od originalnih sekvenci, a zatim se sekvence "druge generacije" pripremaju i eksprimiraju kao protein.

[0184] Sekvence druge generacije se dobijaju, na primer, izmenom sekvence koja kodira DNK najmanje jednog aminokiselinskog ostatka u sekvenci varijabilnog regiona teškog lanca antitela i/ili sekvenci varijabilnog regiona lakog lanca antitela bilo kog od XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 ili XAB5, kako bi se stvorila najmanje jedna izmenjena sekvenca antitela, i eksprimiranjem izmenjene sekvence antitela kao proteina.

[0185] Shodno tome, u drugom otelotvorenju, otkriće pruža metodu za pripremu anti-IL-17A antitela optimizovanog za eksprimiranje u ćeliji sisara koje se sastoji od: sekvence teškog lanca kompletne dužine antitela, sekvence lakog lanca kompletne dužine antitela bilo kog od XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 or XAB5; izmene najmanje jednog kodona u sekvenci za kodiranje nukleotida, pri čemu pomenuti kodon kodira aminokiselinski ostatak u sekvenci teškog lanca kompletne dužine antitela i/ili u sekvenci lakog lanca kompletne dužine antitela, tako da nastaje najmanje jedna izmenjena sekvenca antitela, i eksprimiranja izmenjene sekvence antitela kao proteina.

[0186] Izmenjena sekvenca antitela takođe može da se pripremi skriningom biblioteka antitela koje imaju jedinstvene sekvence teškog i lakog CDR3 bilo kog od XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 ili XAB5, ili minimalne esencijalne determinante vezivanja, kao što je opisano u US Patentnoj publikaciji br. 20050255552, i alternativne sekvence za CDR1 i CDR2 sekvence. Skrining takođe može da se obavi u skladu sa bilo kojom tehnologijom za skrining koja je prikladna za skrining antitela iz biblioteka antitela, kao što je tehnologija displeja faga.

1

[0187] Standardne tehnike molekulske biologije mogu da se koriste za pripremu i ekspresiju izmenjene sekvence antitela. Antitelo koje je kodirano izmenjenim sekvencama antitela je ono koje zadržava jedno, neka ili sva željena funkcionalna svojstva ovde opisanih anti-IL-17A antitela, pri čemu ta funkcionalna svojstva uključuju, ali nisu ograničena na, specifično vezivanje za humani IL-17A; i/ili inhibiranje vezivanja IL-17A za njegove receptore; i/ili inhibiranje proizvodnje indukovane putem IL-17A, na primer, IL-6 ili GRO-alfa itd.

[0188] Izmenjeno antitelo može da ispolji jedno, dva ili više ili tri ili više funkcionalnih svojstava koja su prethodno razmotrena.

[0189] U određenim otelotvorenjima metoda konstruisanja antitela iz otkrića, mutacije mogu da se uvedu nasumično ili selektivno u celoj sekvenci za kodiranje anti-IL-17A antitela ili u njenom delu, i dobijena modifikovana anti-IL-17A antitela mogu da se podvrgnu skriningu na aktivnost vezivanja i/ili druga funkcionalna svojstva kao što je ovde opisano. Mutacioni postupci su opisani u struci. Na primer, PCT Publikacija WO 02/092780, čiji je autor Short, opisuje postupke za stvaranje i proveru mutacija antitela pomoću saturacione mutageneze, sintetičkog ligacionog sklapanja, ili njihove kombinacije. Alternativno, PCT Publikacija WO 03/074679, čiji su autori Lazar i sar., opisuje postupke korišćenja metoda računarskog skrininga za optimizaciju fizičkohemijskih svojstava antitela.

Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju antitela iz otkrića

[0190] Drugi aspekt otkrića se odnosi na molekule nukleinske kiseline koji kodiraju antitela ili proteine iz otkrića. Primeri sekvenci nukleotida varijabilnog lakog lanca su one koje kodiraju aminokiselinske sekvence varijabilnog lakog lanca bilo kog od XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 i XAB5, pri čemu su potonje sekvence dobijene iz Tabele 3 (koja prikazuje cele sekvence za kodiranje nukleotida teških i lakih lanaca XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 ili XAB5) i Tabele 2 (koja prikazuje aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 ili XAB5).

[0191] Otkriće se takođe odnosi na molekule nukleinske kiseline koji se dobijaju iz potonjih sekvenci koje su optimizovane za ekspresiju proteina u ćelijama sisara, na primer, CHO ćelijskoj liniji.

2

[0192] Nukleinske kiseline mogu biti prisutne u celim ćelijama, u ćelijskom lizatu, ili mogu biti nukleinske kiseline u delimično prečišćenom ili suštinski čistom obliku. Nukleinska kiselina je "izolovana" ili "načinjena suštinski čistom" kada je prečišćena od drugih ćelijskih komponenti ili drugih kontaminanata, npr. drugih ćelijskih nukleinskih kiselina ili proteina, pomoću standardnih tehnika, uključujući alkalni/SDS tretman, razdvajanje traka pomoću CsCl, hromatografiju na koloni, elektroforezu na agaroznom gelu i druge dobro poznate u struci. Vidi, F. Ausubel, i sar. izd.1987, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York. Nukleinska kiselina iz otkrića može da bude, na primer, DNK ili RNK, i može ali ne mora da sadrži intronske sekvence. U jednom otelotvorenju, nukleinska kiselina je molekul kDNK. Ta nukleinska kiselina može da bude prisutna u vektoru kao što je vektor displeja faga ili rekombinantni plazmidni vektor.

[0193] Nukleinske kiseline iz otkrića mogu da se dobiju korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije. Kada se dobiju DNK fragmenti koji kodiraju, na primer, VHi VLsegmente, tim fragmentima DNK može dalje da se manipuliše pomoću standardnih tehnika rekombinacije DNK, na primer, kako bi se geni varijabilnog regiona konvertovali u gene lanca antitela kompletne dužine, gene fragmenta Fab ili u scFv gen. U tom manipulisanju, VL- ili VH-kodirajući fragment DNK se operativno povezuje sa drugim molekulom DNK, ili sa fragmentom koji kodira drugi protein, kao što je konstantni region antitela ili fleksibilni linker. Termin "operativno povezan", kako se koristi u ovom kontekstu, treba da znači da su dva fragmenta DNK spojena na funkcionalan način, na primer, tako da sekvence aminokiselina koje su kodirane sa dva fragmenta DNK ostanu u okviru, ili tako da se protein eksprimira pod kontrolom željenog promotera.

[0194] Izolovana DNK koja kodira VHregion može da se konvertuje u gen teškog lanca kompletne dužine putem operativnog povezivanja VH-kodirajuće DNK sa drugim molekulom DNK koji kodira konstantne regione teškog lanca (CH1, CH2 i CH3). Sekvence gena konstantnog regiona humanog teškog lanca su poznate u struci (vidi npr. Kabat, E. A., i sar.

1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, peto izdanje, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242) i fragmenti DNK koji obuhvataju te regione mogu da se dobiju standardnom PCR amplifikacijom. Konstantni region teškog lanca može da bude konstantni region IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ili IgD. U nekim otelotvorenjima, konstantni region teškog lanca se bira među izotipovima IgG1. Za gen teškog lanca Fab fragmenta, VH-kodirajuća DNK može operativno da se poveže sa drugim molekulom DNK koji kodira samo konstantni region teškog lanca CH1.

[0195] Izolovana DNK koja kodira VLregion može da se konvertuje u gen lakog lanca kompletne dužine (kao i u gen lakog lanca Fab) pomoću operativnog povezivanja VL-kodirajuće DNK sa drugim molekulom DNK koji kodira konstantni region lakog lanca, CL. Sekvence gena konstantnog regiona humanog lakog lanca su poznate u struci (vidi npr. Kabat, E. A., i sar.1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, peto izdanje, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) i fragmenti DNK koji obuhvataju te regione mogu da se dobiju standardnom PCR amplifikacijom. Konstantni region lakog lanca može biti kapa ili lambda konstantni region.

[0196] Da bi se stvorio scFv gen, VH- i VL-kodirajući fragmenti DNK su operativno povezani sa drugim fragmentom koji kodira fleksibilni linker, npr. kodira sekvencu aminokiselina (Gly4 -Ser)3, tako da VHi VLsekvence mogu da se eksprimiraju kao susedni jednolančani protein, pri čemu su VLi VHregioni spojeni fleksibilnim linkerom (vidi npr. Bird i sar.1988, Science 242:423-426; Huston i sar.1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty i sar.

1990, Nature 348:552-554).

Izolovanje rekombinantnih antitela iz otkrića

[0197] Raznovrsne metode za skrining antitela i njihovih antigen-vezujućih delova su opisane u struci. Takve metode mogu da se podele na in vivo sisteme, kao što su transgeni miševi sposobni da proizvedu potpuno humana antitela nakon antigenske imunizacije, i in vitro sisteme, koji se sastoje od generisanja kodirajućih biblioteka DNK antitela, ekspesije biblioteke DNK u odgovarajućem sistemu za proizvodnju antitela, odabira klona koji eksprimira antitelokandidat koje se vezuje za cilj uz kriterijum selekcije afiniteta i regenerisanje odgovarajuće kodirajuće sekvence odabranog klona. Ove in vitro tehnologije su poznate kao tehnologije displeja, i obuhvataju bez ograničenja, displej faga, displej RNK ili DNK, displej ribozoma, displej ćelije kvasca ili ćelije sisara. Dobro su opisane u struci (za pregled tehnologija pogledajte npr.: Nelson i sar.2010, Nature Reviews Drug discovery, "Development trends for human monoclonal antibody therapeutics" (Advance Online Publication) i Hoogenboom i sar.

2001, Method in Molecular Biology 178:1-37, O'Brien i sar. izd., Human Press, Totowa, N.J.).

4

U jednom specifičnom otelotvorenju, humana rekombinantna antitela iz otkrića se izoluju korišćenjem postupaka displeja faga za biblioteke za skrining biblioteka humanih rekombinantnih antitela, kao što su HuCAL® biblioteke.

[0198] Repertoari VHi VLgena ili povezanih CDR regiona mogu odvojeno da se kloniraju putem reakcije lančane polimerizacije (polymerase chain reaction - PCR) ili da se sintetišu putem DNK sintetizatora i nasumično rekombinuju u biblioteke faga, koje zatim mogu da se pretraže za antigen-vezujuće klonove. Takvi postupci displeja faga za izolovanje humanih antitela su utvrđeni u struci i opisani u primerima u nastavku. Vidi na primer: U.S. Patente br.

5,223,409, 5,403,484 i 5,571,698, Ladner i sar.; U.S. Patente br.5,427,908 i 5,580,717, Dower i sar.; U.S. Patente br.5,969,108 i 6,172,197, McCafferty i sar.; i U.S. Patente br.5,885,793, 6,521,404, 6,544,731, 6,555,313, 6,582,915 i 6,593,081, Griffiths i sar.

[0199] U određenom otelotvorenju, humana antitela usmerena protiv IL-17A mogu da se identifikuju korišćenjem transgenih ili transhromozomskih miševa koji nose delove ljudskog imunskog sistema, a ne mišjeg sistema. Ti transgeni i transhomozomski miševi uključuju miševe koji se ovde nazivaju HuMAb miševi, odnosno KM miševi, a kolektivno se ovde nazivaju "humanim Ig miševima".

[0200] HuMAb mouse<®>(Medarex, Inc.) sadrži minilokuse gena humanog imunoglobulina koji kodiraju nepreuređene imunoglobulinske sekvence humanog teškog (µ i γ) i κ lakog lanca, zajedno sa ciljanim mutacijama koje inaktiviraju endogene lokuse µ i κ lanca (vidi npr. Lonberg, i sar. 1994, Nature 368:856-859). Shodno tome, miševi ispoljavaju smanjenu ekspresiju mišjeg IgM ili κ, i kao odgovor na imunizaciju, uvedeni transgeni humanog teškog i lakog lanca su podvrgnuti zameni klase i somatskoj mutaciji radi generisanja monoklonskog humanog IgGκ velikog afiniteta (Lonberg, N. i sar. 1994, gore; pregled Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. i Huszar, D.1995, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93, i Harding, F. i Lonberg, N. 1995, Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546). Priprema i korišćenje HuMAb miševa, i genomske modifikacije koje nose takvi miševi, dalje su opisani u Taylor, L. i sar.1992, Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. i sar.

1993, International Immunology 5:647-656; Tuaillon i sar. 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724; Choi i sar.1993, Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. i sar.1993, EMBO J.12: 821-830; Tuaillon i sar.1994, J. Immunol.152:2912-2920; Taylor, L. i sar.1994, International Immunology 579-591; i Fishwild, D. i sar.1996, Nature Biotechnology 14: 845-851. Vidi dalje, U.S. Patente br.5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299 i 5,770,429; svi Lonberg i Kay; U.S. Patent br.5,545,807, Surani i sar.; PCT Publikacije br. WO 92103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97113852, WO 98/24884 i WO 99/45962, Lonberg i Kay; i PCT Publikaciju br. WO 01/14424, Korman i sar.

[0201] U drugom otelotvorenju, humana antitela iz otkrića mogu da se uzgajaju pomoću miša koji nosi sekvence humanog imunoglobulina na transgenima i transhromozomima, kao što je miš koji nosi transgen humanog teškog lanca i transhromozom humanog lakog lanca. Takvi miševi, koji se ovde nazivaju "KM miševi", opisani su detaljno u PCT Publikaciji WO 02/43478, Ishida i sar.

[0202] Dalje, alternativni transgeni životinjski sistemi koji eksprimiraju gene humanog imunoglobulina su dostupni u struci, i mogu da se koriste za uzgajanje anti-IL-17A antitela iz otkrića. Na primer, može da se koristi alternativni transgeni sistem kompanije Abgenix, Inc. koji se naziva Xenomouse. Takvi miševi su opisani, npr. u U.S. Patentima br. 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6,150,584 i 6,162,963, Kucherlapati i sar. Kao što će stručnjak za ovu oblast razumeti, može da se koristi nekoliko drugih mišjih modela, kao što je Trianni<TM>miš kompanije Trianni, Inc, VelocImmune<TM>miš kompanije Regeneron Pharmaceuticals, Inc, ili Kymouse<TM>miš kompanije Kymab Limited.

[0203] Štaviše, alternativni transhromozomski životinjski sistemi koji eksprimiraju gene humanog imunoglobulina su dostupni u struci, i mogu da se koriste za uzgajanje anti-IL-17A antitela iz otkrića. Na primer, mogu da se koriste miševi koji istovremeno nose transhromozome humanog teškog lanca i transhromozome humanog lakog lanca, koji se nazivaju "TC miševi". Takve miševe opisuju Tomizuka i sar.2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727.

[0204] Humana monoklonska antitela iz otkrića takođe mogu da se pripreme korišćenjem SCID miševa u kojima su rekonstituisane humane imunske ćelije tako da može da se generiše odgovor humanog antitela nakon imunizacije. Takvi miševi su opisani, na primer, u U.S. Patentima br.5,476,996 i 5,698,767, Wilson i sar.

Generisanje monoklonskih antitela iz otkrića iz mišjeg sistema

[0205] Monoklonska antitela (mAb) mogu da se proizvedu raznovrsnim tehnikama, uključujući konvencionalnu metodologiju monoklonskih antitela, npr. standardnu tehniku hibridizacije somatske ćelije koju su dali Kohler i Milstein 1975, Nature 256:495. Mogu se koristiti brojne tehnike za proizvodnju monoklonskog antitela, npr. viralna ili onkogena transformacija B limfocita.

[0206] Životinjski sistem za pripremu hibridoma je mišji sistem. Proizvodnja hibridoma u mišu je dobro uspostavljena procedura. Imunizacioni protokoli i tehnike za izolovanje imunizovanih splenocita za fuziju su poznati u struci. Takođe su poznati i fuzioni partneri (npr. ćelije mišjeg mijeloma) i fuzione procedure.

[0207] Himerna ili humanizovana antitela iz predmetnog otkrića mogu da se pripreme na osnovu sekvence mišjeg monoklonskog antitela pripremljenog kao što je prethodno opisano. DNK koja kodira imunoglobuline teškog i lakog lanca može da se dobije od željenog mišjeg hibridoma i da se konstruiše da sadrži nemišje (npr. humane) sekvence imunoglobulina korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije. Na primer, da bi se stvorilo himerno antitelo, mišji varijabilni regioni mogu da se povežu sa humanim konstantnim regionima korišćenjem metoda poznatih u struci (vidi npr. U.S. Patent br.4,816,567, Cabilly i sar.). Da bi se stvorilo humanizovano antitelo, mišji CDR regioni mogu da se ubace u humani okvir korišćenjem metoda poznatih u struci. Vidi npr. U.S. Patent br. 5,225,539, Winter, i U.S. Patente br.5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 i 6,180,370, Queen i sar.

Generisanje hibridoma koji proizvode humana monoklonska antitela

[0208] Da bi se generisali hibridomi koji proizvode humana monoklonska antitela iz otkrića, splenociti i/ili ćelije limfnih čvorova iz imunizovanih miševa mogu da se izoluju i fuzionišu sa odgovarajućom imortalizovanom ćelijskom linijom, kao što je ćelijska linija mišjeg mijeloma. Dobijeni hibridomi mogu da budu pretraženi za proizvodnju antigen-specifičnih ili epitopspecifičnih antitela. Na primer, jednoćelijske suspenzije limfocita slezine iz imunizovanih miševa mogu da se fuzionišu sa šestinom broja P3X63-Ag8.653 nesekretujućih ćelija mišjeg mijeloma (ATCC, CRL 1580) sa 50% PEG. Ćelije su zasejane sa oko 2 x 145 na mikrotitarskim pločama sa ravnim dnom, nakon čega sledi dvonedeljna inkubacija u selektivnom medijumu koji sadrži 20% fetusnog seruma klona, 18% "653" kondicioniranog medijuma, 5% origena (IGEN), 4 mM L-glutamina, 1 mM natrijum piruvata, 5 mM HEPES, 0:055 mM 2-merkaptoetanola, 50 jedinica/ml penicilina, 50 mg/ml streptomicina, 50 mg/ml gentamicina i 1X HAT (Sigma; HAT se dodaje 24 sata nakon fuzije). Nakon približno dve nedelje, ćelije mogu da se uzgajaju u medijumu u kojem je HAT zamenjen sa HT. Pojedinačni bunarčići mogu da budu ispitani pomoću ELISA testa za humana monoklonska IgM i IgG antitela. Jednom kada dođe do obimnog rasta hibridoma, medijum može da se posmatra obično nakon 10-14 dana. Hibridomi koji luče antitelo mogu biti ponovo zasejani, ponovo ispitani, i ako su i dalje pozitivni na humani IgG, monoklonska antitela mogu biti subklonirana jednom ili dvaput ograničavanjem razblaživanja. Stabilni subklonovi zatim mogu da se uzgajaju in vitro radi generisanja malih količina antitela u medijumu za uzgajanje tkiva radi karakterizacije.

[0209] Da bi se prečistila humana monoklonska antitela, odabrani hibridomi mogu da se uzgajaju u dvolitarskoj flaši sa mešanjem radi prečišćavanja monoklonskih antitela. Supernatant može da se filtrira i koncentruje pre afinitetne hromatografije sa protein A sefarozom (Pharmacia, Piscataway, N.J.). Eluirani IgG se može proveriti pomoću gel elektroforeze i tečne hromatografije visokih performansi, kako bi se obezbedila čistoća. Rastvor pufera se može zameniti PBS-om, i koncentracija se može odrediti putem OD280, koristeći koeficijent ekstinkcije od 1,43. Može se uzeti alikvot antitela, i može se čuvati na -80° C.

Generisanje transfektoma koji proizvode humana monoklonska antitela

[0210] Antitela iz otkrića mogu da se proizvode u transfektomu ćelije domaćina korišćenjem, na primer, kombinacije tehnika rekombinantne DNK i metoda transfekcije gena na način dobro poznat u struci (npr. Morrison, S.1985, Science 229:1202).

[0211] Na primer, da bi se eksprimirala antitela, ili njihovi fragmenti antitela, može se dobiti DNK koja kodira lake i teške lance delimične ili kompletne dužine pomoću standardnih tehnika molekularne biologije ili biohemije (npr. hemijska sinteza DNK, PCR amplifikacija ili kloniranje kDNK korišćenjem hibridoma koji eksprimira željeno antitelo) i DNK može da se ubaci u ekspresione vektore tako da su geni operativno povezani sa transkripcionim i translacionim kontrolnim sekvencama. U tom kontekstu, termin "operativno povezan" treba da znači da je gen antitela ligiran u vektor tako da transkripcione i translacione kontrolne sekvence u vektoru obavljaju svoju predviđenu funkciju regulisanja transkripcije i translacije gena antitela. Ekspresioni vektor i ekspresione kontrolne sekvence su izabrane tako da budu kompatibilne sa ekspresionom ćelijom domaćinom koja se koristi. Gen lakog lanca antitela i gen teškog lanca antitela mogu da se ubace u zaseban vektor ili, što je češće, oba gena se ubacuju u isti ekspresioni vektor. Geni antitela se ubacuju u ekspresioni vektor pomoću standardnih metoda (npr. ligacijom komplementarnih mesta restrikcije na fragmentu gena antitela i vektoru, ili ligacijom tupog kraja kada nema mesta restrikcije). Varijabilni regioni lakog i teškog lanca antitela koja su ovde opisana mogu da se koriste za stvaranje gena antitela kompletne dužine bilo kog izotipa antitela putem njihovog umetanja u ekspresione vektore koji već kodiraju konstantne regione teškog i lakog lanca željenog izotipa, tako da je VHsegment operativno povezan sa CHsegmentom(segmentima) u vektoru, i VLsegment je operativno povezan sa CLsegmentom u vektoru. Dodatno ili alternativno, rekombinantni ekspresioni vektor može da kodira signalni peptid, koji se naziva i vodeća sekvenca, koji olakšava lučenje lanca antitela iz ćelije domaćina. Gen lanca antitela može da se klonira u vektor tako da signalni peptid bude povezan u okviru sa amino terminusom gena lanca antitela. Signalni peptid može biti signalni peptid imunoglobulina ili heterologi signalni peptid (tj. signalni peptid neimunoglobulinskog proteina). Primeri takvih signalnih peptida mogu se naći u Tabeli 7, a primeri sekvenci polinukleotida koje kodiraju signalne peptide mogu se naći u Tabeli 8.

Tabela 7. Signalni peptidi za teške i lake peptidne lance.

Tabela 8. Sekvence polinukleotida koje kodiraju signalne peptide.

[0212] Pored gena lanca antitela, rekombinantni ekspresioni vektori iz otkrića nose i regulatorne sekvence koje kontrolišu ekspresiju gena lanca antitela u ćeliji domaćinu. Termin "regulatorna sekvenca" treba da uključi promotere, pojačivače i druge ekspresione kontrolne elemente (npr. signale poliadenilacije) koji kontrolišu transkripciju ili translaciju gena lanca antitela. Takve regulatorne sekvence je, na primer, opisao Goeddel 1990, Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA). Stručnjacima za ovu oblast će biti jasno da dizajn ekspresionog vektora, uključujući i odabir regulatornih sekvenci, može da zavisi od faktora kao što je izbor ćelije domaćina koja će se transformisati, željeni nivo eksprimiranja proteina, itd. Regulatorne sekvence za ekspresiju ćelije domaćina sisara uključuju virusne elemente koji regulišu visoke nivoe ekspresije proteina u ćelijama sisara, kao što su promoteri i/ili pojačivači dobijeni od citomegalovirusa (CMV), Simijan virusa 40 (SV40), adenovirusa (npr. adenovirusni glavni kasni promoter (AdMLP)) i poliom. Alternativno, mogu da se koriste nevirusne regulatorne sekvence, kao što je promoter ubikvitina ili promoter P-globina. Dalje, regulatorni elementi sastavljeni od sekvenci iz različitih izvora, kao što je SRa promoterski sistem, koji sadrže sekvence ranog promotera SV40 i dugo terminalno ponavljanje ljudskog T ćelijskog leukemijskog virusa tip 1 (Takebe, Y. i sar.1988, Mol. Cell. Biol.8:466-472).

[0213] Pored gena lanca antitela i regulatornih sekvenci, rekombinantni ekspresioni vektori iz otkrića mogu da nose i dodatne sekvence, kao što su sekvence koje regulišu replikaciju vektora u ćelijama domaćina (npr. poreklo replikacije) i selektabilni marker geni. Selektabilni marker gen olakšava izbor ćelije domaćina u koju će se uvesti vektor (vidi, npr. U.S. Patente br.

4,399,216, 4,634,665 i 5,179,017, čiji su autori Axel i sar.). Na primer, selektabilni marker gen tipično dodeljuje otpornost na lekove, kao što je G418, higromicin ili metotreksat, ćeliji domaćinu u koju se vektor uvodi. Selektabilni marker geni uključuju gen dihidrofolat reduktaze (DHFR) (za upotrebu u dhfr ćelijama domaćinima sa selekcijom/amplifikacijom metotreksata) i neo gen (za selekciju G418).

[0214] Za ekspresiju lakih i teških lanaca su primenjene standardne tehnike radi transfekcije ćelije domaćina sa ekspresionim vektorima koji kodiraju teške i lake lance.

[0215] Različiti oblici termina "transfekcija" treba da obuhvate širok raspon tehnika koje se uobičajeno koriste za uvođenje egzogene DNK u prokariotsku ili eukariotsku ćeliju domaćina, npr. elektroporaciju, taloženje kalcijum fosfata, transfekciju DEAE dekstranom i slično. Teorijski je moguće eksprimirati antitela iz otkrića bilo u prokariotskim ili u eukariotskim ćelijama domaćinima. Ekspresija antitela u eukariotskim ćelijama, na primer u ćelijama domaćina sisara, kvasca ili filamentozne gljive, razmatra se jer je za takve eukariotske ćelije, a naročito za ćelije sisara, verovatnije nego za prokariotske ćelije da će sastaviti i lučiti ispravno složeno i imunološki aktivno antitelo.

[0216] U jednom specifičnom otelotvorenju, klonirajući ili ekspresioni vektor prema otkriću sadrži najmanje jednu od kodirajućih sekvenci iz Tabele 3, operativno povezanu sa pogodnim sekvencama promotera. U drugom specifičnom otelotvorenju, klonirajući ili ekspresioni vektor prema otkriću sadrži najmanje jednu kodirajuću sekvencu iz Tabele 4, operativno povezanu sa pogodnim sekvencama promotera.

[0217] Ćelije domaćina sisara za ekspresiju rekombinantnih antitela iz otkrića uključuju ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO ćelije) (uključujući dhfr-CHO ćelije, opisane u Urlaub i Chasin 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220 korišćene sa DH FR selektabilnim markerom, npr. kao što je opisano u R.J. Kaufman i P.A. Sharp 1982, Mol. Biol. 159:601-621), CHOK1 dhfr+ ćelijske linije, NSO ćelije mijeloma, COS ćelije i SP2 ćelije. Posebno, za upotrebu sa NSO ćelijama mijeloma, drugi ekspresioni sistem je ekspresioni sistem GS gena prikazan u PCT Publikacijama WO 87/04462, WO 89/01036 i EP 0338 841. U jednom otelotvorenju,

1

ćelije domaćina sisara za ekspresiju rekombinantnih antitela iz otkrića uključuju ćelijske linije sisara sa nedostatkom ekspresije FUT8 gena, na primer kako je opisano u US Patentu br.

6,946,292.

[0218] Kada se rekombinantni ekspresioni vektori koji kodiraju gene antitela uvedu u ćelije domaćina sisara, antitela se proizvode uzgajanjem ćelija domaćina u vremenskom periodu koji je dovoljan da omogući ekspresiju antitela u ćelijama domaćina ili lučenje antitela u medijum za uzgajanje u kome se ćelije domaćini uzgajaju. Antitela mogu da se regenerišu iz medijuma za uzgajanje korišćenjem standardnih postupaka prečišćavanja proteina (vidi na primer Abhinav i sar.2007, Journal of Chromatography 848:28-37).

[0219] U jednom specifičnom otelotvorenju, ćelija domaćin iz otkrića je ćelija domaćin transficirana ekspresionim vektorom koji ima kodirajuće sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od ID BR. SEKV: 18, 31, 51, 19, 28, 32, 38, 40, 46, 48, 52, 56 i 58, pogodne za ekspresiju XAB1, XAB2, XAB3, XAB4, odnosno XAB5, operativno povezane sa pogodnim sekvencama promotera.

[0220] Potonje ćelije domaćini zatim mogu da se uzgajaju dalje u pogodnim uslovima radi ekspresije i proizvodnje antitela iz otkrića izabranog iz grupe koja se sastoji od XAB1, XAB2, XAB3, XAB4, odnosno XAB5.

Imunokonjugati

[0221] U drugom aspektu, predmetno otkriće prikazuje anti-IL-17A antitelo iz otkrića, ili njegov fragment, konjugovano sa aktivnim ili terapeutskim ostatkom, kao što je citotoksin, lek (npr. imunosupresiv) ili radiotoksin. Takvi konjugati se ovde nazivaju "imunokonjugatima". To može biti naročito poželjno ako se IL-17A eksprimira na površini Th17 ćelija (Brucklacher-Waldert i sar.2009, J Immunol. 183:5494-501).

[0222] Imunokonjugati koji uključuju jedan ili više citotoksina se nazivaju "imunotoksini". Citotoksin ili citotoksični agens uključuju bilo koji agens koji je štetan za ćelije (npr. ubija ih). Primeri uključuju takson, citohalazin B, gramicidin D, etidijum bromid, emetin, mitomicin, etopozid, tenopozid, vinkristin, vinblastin, t. kolhicin, doksorubicin, daunorubicin, dihidroksi

2

antracin dion, mitoksantron, mitramicin, aktinomicin D, 1 -dehidrotestosteron, glukokortikoide, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol i puromicin i njihove analoge ili homologe. Terapeutski agensi takođe uključuju, na primer, antimetabolite (npr. metotreksat, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, citarabin, 5-fluorouracil dekarbazin), ablacione agense (npr. mehloretamin, tiotepa hlorambucil, mejfalan, karmustin (BSNU) i lomustin (CCNU), ciklofosfamid, busulfan, dibromomanitol, streptozotocin, mitomicin C i cis-dihlordiamin platinu (II) (DDP) cisplatin, antracikline (npr. daunorubicin (nekada daunomicin) i doksorubicin), antibiotike (npr. daktinomicin (nekada aktinomicin), bleomicin, mitramicin i antramicin (AMC)) i anti-mitotske agense (npr. vinkristin i vinblastin).

[0223] Drugi primeri terapeutskih citotoksina koji mogu biti konjugovani sa antitelom iz otkrića uključuju duokarmicine, caliheamicine, majtanzine i auristatine i njihove derivate. Jedan primer konjugata kaliheamicinskog antitela je komercijalno dostupan (Mylotarg<TM>; Wyeth-Ayerst).

[0224] Citoksini mogu da se konjuguju sa antitelima iz otkrića pomoću tehnologije linkera dostupne u struci. Primeri za vrste linkera koji su korišćeni za konjugovanje citotoksina za antitelo uključuju, ali nisu ograničeni na, linkere koji sadrže hidrazone, tioetre, estre, disulfide i peptid. Može se odabrati linker koji je, na primer, podložan cepanju na niskom pH u lizozomskom odeljku ili podložan cepanju proteazama, kao što su proteaze koje se poželjno eksprimiraju u tumorskom tkivu, kao što su katepsini (npr. katepsin B, C, D).

[0225] Za dalje razmatranje tipova citotoksina, linkera i metoda konjugacije terapeutskih agenasa sa antitelima, takođe pogledajte Saito, G. i sar.2003, Adv. Drug Deliv. Rev.55:199-215; Trail, P.A. i sar. 2003, Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. 2003, Cancer Cell 3:207-212; Allen, T.M.2002, Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. i Kreitman, R. J.2002, Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. i Springer, C.J. 2001, Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264.

[0226] Antitela iz predmetnog otkrića takođe mogu da se konjuguju sa radioaktivnim izotopom radi generisanja citotoksičnih radiofarmaceutika, koji se takođe nazivaju i radioimunokonjugati. Primeri radioaktivnih izotopa koji mogu da se konjuguju sa antitelima za dijagnostičku ili terapeutsku upotrebu uključuju, ali nisu ograničeni na, jod<131>, indijum<111>, itrijum<90>, i lutecijum<177>. Metoda za pripremu radioimunokonjugata je utvrđena u struci. Primeri radioimunokonjugata su komercijalno dostupni, uključujući Zevalin<TM>(DEC Pharmaceuticals) i Bexxar<TM>(Corixa Pharmaceuticals), i slične metode mogu da se koriste za pripremu radioimunokonjugata pomoću antitela iz otkrića.

[0227] Konjugati antitela iz otkrića mogu da se koriste za modifikovanje datog biološkog odgovora, a funkcionalni ostatak leka ne treba da se tumači sa ograničenjem na klasične terapeutske agense. Na primer, funkcionalni ostatak leka može biti protein ili polipeptid koji ima željenu biološku aktivnost. Takvi proteini mogu da uključuju, na primer, enzimski aktivni toksin ili njegov aktivni fragment, kao što je abrin, ricin A, pseudomonas egzotoksin, ili toksin difterije, protein kao što je faktor nekroze tumora ili interferon-γ, modifikatore biološkog odgovora kao što su, na primer, limfokini, interleukin-1 ("IL1"), interleukin-2 ("IL2"), interleukin-6 ("IL6"), faktor stimulacije kolonije granulocita makrofaga ("GM-CSF"), faktor stimulacije kolonije granulocita ("G-CSF") ili drugi faktori rasta.

[0228] Tehnike za konjugovanje takvih terapeutskih ostataka za antitela su dobro poznate, pogledajte, npr. Amon i sar.1985, "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", u Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld i sar. (izd.), str.

243-56; Hellstrom i sar. 1987, "Antibodies For Drug Delivery", u Controlled Drug Delivery (2. izd.), Robinson i sar. (izd.), str. 623-53; Thorpe 1985, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", u Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera i sar. (izd.), str.475-506; Thorpe i sar.1982, Immunol. Rev., 62:119-58.

Bispecifični molekuli

[0229] U drugom aspektu, predmetno otkriće prikazuje bispecifične ili multispecifične molekule koji sadrže anti-IL-17A/AF antitelo ili njegov antigen-vezujući deo iz otkrića. Antitelo ili njegov antigen-vezujući deo iz otkrića mogu da se derivatizuju ili povežu sa drugim funkcionalnim molekulom, npr. drugim peptidom ili proteinom (npr. drugo antitelo ili ligand za receptor) radi generisanja bispecifičnog molekula koji se vezuje za najmanje dva različita mesta vezivanja ili ciljana molekula. Antitelo ili protein iz otkrića mogu zapravo biti derivatizovani ili povezani sa više od jednog drugog funkcionalnog molekula radi generisanja

4

multispecifičnih molekula koji se vezuju za više od dva mesta vezivanja i/ili ciljana molekula. Takvi multispecifični molekuli takođe treba da budu obuhvaćeni terminom "bispecifični molekul" kao što se ovde koristi. Da bi se stvorio bispecifični molekul iz otkrića, antitelo ili protein iz otkrića mogu da se funkcionalno povežu (npr. putem hemijskog kuplovanja, genetske fuzije, nekovalentne asocijacije ili na drugi način) sa jednim ili više drugih vezujućih molekula, kao što je drugo antitelo, fragment antitela, peptid ili vezujući mimetik, tako da se dobije bispecifični molekul.

[0230] Shodno tome, predmetno otkriće uključuje bispecifične molekule koji sadrže najmanje jednu prvu specifičnost vezivanja za IL-17A, na primer, jedan antigen-vezujući deo bilo kog od XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 ili XAB5 i drugu specifičnost vezivanja za drugi ciljani epitop. Na primer, drugi ciljani epitop je drugi epitop IL-17A različit od prvog ciljanog epitopa. Drugi primer je bispecifični molekul koji sadrži najmanje jednu prvu specifičnost vezivanja za IL-17A, na primer, jedan antigen-vezujući deo bilo kog od XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 ili XAB5 i drugu specifičnost vezivanja za epitop u IL-17A ili u drugom ciljanom antigenu.

[0231] Dodatno, za otkriće u kojem je bispecifični molekul multispecifičan, molekul može dalje da uključi treću specifičnost vezivanja, uz prvi i drugi ciljani epitop.

[0232] U jednom otelotvorenju, bispecifični molekuli iz otkrića sadrže kao specifičnost vezivanja najmanje jedno antitelo ili njegov fragment antitela, uključujući, npr. Fab, Fab', F(ab')2, Fv ili jednolančani Fv. Antitelo takođe može da bude dimer lakog lanca ili teškog lanca, ili njegov minimalni fragment kao što je Fv ili jednolančani konstrukt kao što opisuju Ladner i sar. U.S. Patent br.4,946,778.

[0233] Druga antitela koja mogu da se koriste u bispecifičnim molekulima iz otkrića su mišja, himerna i humanizovana monoklonska antitela.

[0234] Bispecifični molekuli iz predmetnog otkrića mogu da se pripreme pomoću konjugovanja specifičnosti vezivanja konstituenata, korišćenjem metoda poznatih u struci. Na primer, svaka specifičnost vezivanja bispecifičnog molekula može da se generiše zasebno, i da se zatim konjuguju jedna sa drugom. Kada su specifičnosti vezivanja proteini ili peptidi, za kovalentnu konjugaciju mogu da se koriste raznovrsni agensi za kuplovanje ili unakrsno vezivanje. Primeri agenasa za unakrsno vezivanje uključuju protein A, karbodiimid, N-sukcinimidil-S-acetil-tioacetat (SATA), 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzojevu kiselinu) (DTNB), ofenilendimaleimid (oPDM), N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)propionat (SPDP) i sulfosukcinimidil 4-(N-maleimidometil) cikloheksan-I-karboksilat (sulfo-SMCC) (vidi npr. Karpovsky i sar.1984, J. Exp. Med.160:1686; Liu, MA i sar.1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Druge metode uključuju one koje opisuje Paulus 1985, Behring Ins. Mitt. No.

78,118-132; Brennan i sar.1985, Science 229:81-83), i Glennie i sar. 1987, J. Immunol.139: 2367-2375). Agensi za konjugovanje su SATA i sulfo-SMCC, i oba su dostupna od kompanije Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).

[0235] Kada su specifičnosti vezivanja antitela, ona se mogu konjugovati putem sulfhidrilnog vezivanja regiona šarke C-terminusa dva teška lanca. U konkretnom otelotvorenju, region šarke je modifikovan da sadrži neparan broj sulfhidril ostataka, na primer, pre konjugovanja.

[0236] Alternativno, obe specifičnosti vezivanja mogu da se kodiraju u istom vektoru i eksprimiraju i sastave u istoj ćeliji domaćinu. Ova metoda je posebno korisna kada je bispecifični molekul fuzioni protein mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2ili ligand x Fab. Bispecifični molekul iz otkrića može biti jednolančani molekul koji sadrži jedno jednolančano antitelo i determinantu vezivanja, ili jednolančani bispecifični molekul koji sadrži dve determinante vezivanja. Bispecifični molekuli mogu da sadrže najmanje dva jednolančana molekula. Metode za pripremu bispecifičnih molekula su opisane na primer u U.S. Patentu broj 5,260,203; U.S. Patentu broj 5,455,030; U.S. Patentu broj 4,881,175; U.S. Patentu broj 5,132,405; U.S. Patentu broj 5,091,513; U.S. Patentu broj 5,476,786; U.S. Patentu broj 5,013,653; U.S. Patentu broj 5,258,498; i U.S. Patentu broj 5,482,858.

[0237] Vezivanje bispecifičnih molekula za njihove specifične ciljeve može da se potvrdi, na primer, testom enzimski povezanog imunosorbenta (ELISA), radioimunotestom (REA), FACS analizom, biološkim testom (npr. inhibicija rasta) ili vestern blot testom. Svaki od ovih testova generalno detektuje prisustvo kompleksa protein-antitelo koji je od posebnog interesa putem korišćenja označenog reagensa (npr. antitela) specifičnog za željeni kompleks.

Multivalentna antitela

[0238] U drugom aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje multivalentna antitela koja sadrže najmanje dva identična ili ista antigen-vezujuća dela antitela iz otkrića koji se vezuju za IL-17A, na primer, izabrana od antigen-vezujućih delova bilo kog od XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 ili XAB5. U jednom otelotvorenju, multivalentna antitela obezbeđuju najmanje dva, tri ili četiri antigen-vezujuća dela antitela. Antigen-vezujući delovi mogu da se povežu putem proteinske fuzije ili kovalentnog ili nekovalentnog povezivanja. Alternativno, metode povezivanja su opisane za bispecifične molekule. Četvorovalentna jedinjenja mogu da se dobiju na primer unakrsnim povezivanjem antitela iz otkrića sa antitelom koje se vezuje za konstantne regione antitela iz otkrića, na primer Fc ili region šarke.

Farmaceutske kompozicije

[0239] U drugom aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje kompoziciju, npr. farmaceutsku kompoziciju, koja sadrži jednu ili više kombinacija antitela ili njihovih antigen-vezujućih delova iz predmetnog otkrića, na primer, jedno antitelo izabrano iz grupe koja se sastoji od XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 i XAB5, formulisano zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. Takve kompozicije mogu da uključuju jedno antitelo ili kombinaciju (npr. dva ili više različitih) antitela ili imunokonjugata ili bispecifičnih molekula iz otkrića. Na primer, farmaceutska kompozicija iz otkrića može da sadrži kombinaciju antitela ili proteina koji se vezuju za različite epitope na ciljanom antigenu ili koji imaju komplementarne aktivnosti.

[0240] Farmaceutske kompozicije iz otkrića takođe mogu da se primenjuju u kombinovanoj terapiji, tj. u kombinaciji sa drugim agensima. Na primer, kombinovana terapija može da uključuje anti-IL-17A antitelo ili protein iz predmetnog otkrića, na primer jedno antitelo izabrano iz grupe koja sadrži XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 i XAB5, u kombinaciji sa najmanje jednim drugim antiinflamatornim ili drugim hemoterapeutskim agensom, na primer, imunosupresivom. Primeri terapeutskih agenasa koji mogu da se koriste u kombinovanoj terapiji su detaljnije opisani u nastavku u odeljku o primenama antitela ili proteina iz otkrića.

[0241] Kako se ovde koristi, "farmaceutski prihvatljiv nosač" uključuje bilo koji i sve rastvarače, disperzione medijume, obloge, antibakterijske i antifungalne agense, izotonične agense i agense za odlaganje adsorpcije i slično, koji su fiziološki kompatibilni. Nosač treba da bude pogodan za intravensku, intramuskularnu, subkutanu, parenteralnu, spinalnu ili epidermalnu primenu (npr. putem injekcije ili infuzije). U jednom otelotvorenju, nosače treba da bude pogodan za subkutanu primenu. U zavisnosti od načina primene, aktivno jedinjenje, tj. antitelo, imunokonjugat ili bispecifični molekul, može biti obloženo materijalom radi zaštite jedinjenja od dejstva kiselina i drugih prirodnih uslova koji mogu da dovedu do inaktivacije jedinjenja.

[0242] Farmaceutske kompozicije iz otkrića mogu da uključe jednu ili više farmaceutski prihvatljivih soli. "Farmaceutski prihvatljiva so" se odnosi na so koja zadržava željenu biološku aktivnost matičnog jedinjenja i ne pruža nijedan neželjeni toksikološki efekat (vidi npr. Berge, S.M., i sar.1977, J. Pharm. Sci.66:1-19). Primeri takvih soli obuhvataju kisele adicione soli i bazne adicione soli. Kisele adicione soli uključuju one dobijene iz netoksičnih neorganskih kiselina, kao što je hlorovodonična, azotna, fosforna, sumporna, bromovodonična, jodovodonična, fosforna i slično, kao i iz netoksičnih organskih kiselina, kao što su alifatične mono- i dikarboksilne kiseline, fenil-supstituisane alkanske kiseline, hidroksi alkanske kiseline, aromatične kiseline, alifatične i aromatične sulfonske kiseline, i slično. Bazne adicione soli uključuju one dobijene iz zemnoalkalnih metala, kao što je natrijum, kalijum, magnezijum, kalcijum i slično, kao i iz netoksičnih organskih amina, kao što jeN,N'-dibenziletilendiamin, N-metilglukamin, hlorprokain, holin, dietanolamin, etilendiamin, prokain i slično.

[0243] Farmaceutske kompozicije iz otkrića takođe mogu da uključe farmaceutski prihvatljiv antioksidans. Primeri za farmaceutski prihvatljive antioksidanse uključuju: antioksidanse rastvorljive u vodi, poput askorbinske kiseline, cistein hidrohlorida, natrijum bisulfata, natrijum metabisulfita, natrijum sulfita i slično; antioksidanse rastvorljive u ulju, poput askorbil palmitata, butilovanog hidroksianizola (BHA), butilovanog hidroksitoluena (BHT), lecitina, propil galata, alfa-tokoferola, i slično; i helirajuće agense metala, poput limunske kiseline, etilendiamin tetrasirćetne kiseline (EDTA), sorbitola, vinske kiseline, fosforne kiseline, i slično.

[0244] Primeri pogodnih vodenih i nevodenih nosača koji mogu da se koriste u farmaceutskim kompozicijama iz otkrića uključuju vodu, etanol, poliole (kao što je glicerol, propilen glikol, polietilen glikol i slično) i njihove pogodne smeše, biljna ulja, kao što je maslinovo ulje, i injektabilne organske estre, kao što je etil oleat. Odgovarajuća fluidnost se može održati, na primer, upotrebom materijala za oblaganje, poput lecitina, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije, i upotrebom surfaktanata.

[0245] Ove kompozicije takođe mogu da sadrže adjuvanse poput konzervanasa, kvašljivaca, emulgatora i raspršivača. Sprečavanje prisustva mikroorganizama može da se obezbedi procedurama sterilizacije i inkluzijom različitih antibakterijskih i antifungalnih agenasa, na primer, parabena, hlorbutanola, fenol sorbinske kiseline i slično. Takođe, može biti poželjno da se u kompozicije uključe izotonični agensi, poput šećera, natrijum hlorida, i slično. Dodatno, produžena apsorpcija injektabilnog farmaceutskog oblika može se postići uključivanjem agenasa koji odlažu apsorpciju, poput aluminijum monostearata i želatina.

[0246] Farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije ili sterilne praškove za ekstratemporalnu pripremu sterilnih injektabilnih rastvora ili disperzije. Upotreba takvih medijuma i agenasa za farmaceutski aktivne supstance je poznata u struci. Osim u meri u kojoj je bilo koji konvencionalni medijum ili agens inkompatibilan sa aktivnim jedinjenjem, njegova upotreba u farmaceutskim kompozicijama iz otkrića je razmotrena. Dodatna aktivna jedinjenja mogu takođe biti obuhvaćena kompozicijama.

[0247] Terapeutske kompozicije tipično moraju biti sterilne i stabilne u uslovima proizvodnje i skladištenja. Kompozicija može biti formulisana kao rastvor, mikroemulzija, lipozom ili druga uređena struktura pogodna za visoku koncentraciju leka. Nosač može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol i tečni polietilen glikol, i slično), i njihove pogodne smeše. Odgovarajuća fluidnost se može održati, na primer, upotrebom obloga, poput lecitina, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. U mnogim slučajevima, u kompoziciju se mogu uključiti izotonični agensi, na primer, šećeri, polialkoholi poput manitola, sorbitola, ili natrijum hlorid. Produžena apsorpcija injektabilne farmaceutske kompozicije može se postići uključivanjem u kompoziciju agenasa koji odlažu apsorpciju, na primer, soli monostearata i želatina.

[0248] Pregled razvoja stabilnih proteinskih formulacija (npr. antitela) može se naći u Cleland i sar.1993, Crit. Reviews. Ther. Drug Carrier Systems 10(4):307-377 i Wei Wang 1999, Int. J.

Pharmaceutcs 185:129-88. Dodatna diskusija o formulacijama za antitela može se naći, npr. u Daugherty i Mrsny 2006, Advanced Drug Delivery Reviews 58: 686-706; US Pat. br.

6,171,586, 4,618,486, US Publikacija br.20060286103, PCT Publikacija WO 06/044908, WO 07/095337, WO 04/016286, Colandene i sar. 2007, J. Pharm. Sci 96: 1598-1608; Schulman 2001, Am. J. Respir. Crit. Care Med.164:S6-S11 i drugim poznatim referencama.

[0249] Rastvori ili suspenzije koje se koriste za intradermalnu ili subkutanu primenu uobičajeno uključuju jednu ili više sledećih komponenti: sterilni razblaživač kao što je voda za injekciju, slani vodeni rastvor, fiksirana ulja, polietilen glikole, glicerin, propilen glikol ili druge sintetičke rastvarače, antibakterijske agense kao što su benzil alkohol ili metil parabeni, antioksidanse kao što je askorbinska kiselina ili natrijum bisulfit, helirajuće agense kao što je etilendiamin tetrasirćetna kiselina, pufere kao što su acetati, citrati ili fosfati, i agense za podešavanje tonusa kao što je natrijum hlorid ili dekstroza. pH može da se podesi kiselinama ili bazama, kao što su hlorovodonična kiselina ili natrijum hidroksid. Takvi preparati mogu biti priložene u ampulama, špricevima za jednokratnu upotrebu ili plastičnim ili staklenim bočicama sa više doza.

[0250] Sterilni injektabilni rastvori mogu da se pripreme inkorporisanjem aktivnog jedinjenja u zahtevanoj količini u odgovarajućem rastvaraču sa jednim sastojkom ili kombinacijom sastojaka nabrojanih gore, po potrebi, a zatim sterilizacijom putem mikrofiltracije. Generalno, disperzije se pripremaju inkorporisanjem antitela ili proteina iz otkrića u sterilni vehikulum koji sadrži bazni disperzioni medijum i druge potrebne sastojke od onih prethodno nabrojanih. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih injektabilnih rastvora, metode pripreme su sušenje u vakuumu i liofilizacija (sušenje zamrzavanjem) koje daju prašak aktivnog jedinjenja i bilo kojih željenih sastojaka iz njegovog prethodno sterilno filtriranog rastvora.

[0251] U jednom specifičnom otelotvorenju, XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 ili XAB5 antitela su primenjena kao tečna formulacija u bočici. Količina leka po bočici je bila 150 mg. Tečnost je sadržala 150 mg/ml antitela, 4,8 mM L-histidina, 15,2 mM L-Histidin-HCl 220 mM saharoze i 0,04% polisorbata 20, sa pH 6,0 ± 0,5. Prekomerno punjenje od 20% je dodato da bi se omogućilo kompletno uklanjanje planirane doze.

[0252] Količina aktivnog sastojka koji može da se kombinuje sa materijalom nosača radi proizvodnje pojedinačnog doznog oblika će varirati u zavisnosti od ispitanika koji se leči i konkretnog načina primene. Količina aktivnog sastojka koji može da se kombinuje sa materijalom nosača radi proizvodnje pojedinačnog doznog oblika će uobičajeno biti ona količina kompozicije koja proizvodi terapeutski efekat. Generalno, od sto procenata, ova količina će biti u rasponu od oko 0,01 procenat do oko 99 procenata aktivnog sastojka, od oko 0,1 procenat do oko 70 procenata ili od oko 1 procenat do oko 30 procenata aktivnog sastojka u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

[0253] Dozni režimi su prilagođeni da obezbede optimalan željeni odgovor (npr. terapeutski odgovor). Na primer, može biti primenjen pojedinačni bolus, nekoliko podeljenih doza može biti primenjeno u određenom vremenskom periodu ili doza može biti proporcionalno smanjena ili povećana kao što je naznačeno potrebama terapeutske situacije. Posebno je pogodno formulisati parenteralne kompozicije u pojedinačnom doznom obliku radi lakše primene i uniformnosti doze. Pojedinačni dozni oblik, kako se ovde koristi, odnosi se na fizički odvojene jedinice prilagođene kao jedinične doze za subjekta koji se leči; svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnog jedinjenja izračunatu da proizvede željeno terapeutsko dejstvo zajedno sa potrebnim farmaceutskim nosačem. Specifičnost za pojedinačne dozne oblike iz otkrića je određena i direktno zavisi od jedinstvenih karakteristika aktivnog jedinjenja i konkretnih terapeutskih efekata koje treba postići i ograničenja svojstvenih za struku za spravljanje takvog aktivnog jedinjenja za lečenje osetljivosti kod pojedinaca.

[0254] Za primenu antitela ili proteina, doza je u rasponu od oko 0,0001 do 150 mg/kg, poput 5, 15 i 50 mg/kg subkutane primene, i češće 0,01 do 5 mg/kg, telesne težine domaćina. Na primer, doze mogu da budu 0,3 mg/kg telesne težine, 1 mg/kg telesne težine, 3 mg/kg telesne težine, 5 mg/kg telesne težine ili 10 mg/kg telesne težine ili u opsegu od 1-10 mg/kg. Primer režima lečenja podrazumeva primenu jednom nedeljno, jednom na svake dve nedelje, jednom na svake tri nedelje, jednom na svake četiri nedelje, jednom mesečno, jednom na svaka 3 meseca ili jednom na svakih tri do 6 meseci. Dozni režimi za anti-IL17A antitelo ili protein iz otkrića obuhvataju 1 mg/kg telesne težine, 3 mg/kg telesne težine, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg ili 30 mg/kg putem intravenske primene, pri čemu se antitelo daje korišćenjem jednog od sledećih rasporeda doziranja: svake četiri nedelje za šest doza, zatim svaka tri meseca; svake tri nedelje; 3 mg/kg telesne težine jednom nakon čega sledi 1 mg/kg telesne težine na svake tri nedelje.

1

[0255] U nekim metodama, dva ili više antitela sa različitim specifičnostima vezivanja se primenjuju simultano, u tom slučaju doza svakog antitela koje se primenjuje ulazi u naznačene opsege. Antitela ili proteini iz otkrića se obično daju nekoliko puta. Intervali između pojedinačnih doza mogu, na primer, biti nedeljni, mesečni, tromesečni ili godišnji. Intervali takođe mogu biti neredovni, kako je naznačeno merenjem nivoa antitela za ciljani antigen u krvi pacijenta. U nekim metodama, doza se prilagođava da bi se dosegla koncentracija antitela u plazmi od oko 1-1000 µg/ml, a u nekim metodama oko 25-300 µg/ml.

[0256] Alternativno, antitelo ili protein mogu da se primenjuju kao formulacija sa produženim oslobađanjem, u kom slučaju je potrebna manje česta primena. Doza i učestalost variraju u zavisnosti od poluživota antitela u pacijentu. Uopšteno, humana antitela pokazuju najduži poluživot, nakon čega slede humanizovana antitela, himerna antitela i nehumana antitela. Doza i učestalost primene mogu da variraju u zavisnosti od toga da li je lečenje profilaktičko ili terapeutsko. Kod profilaktičkih primena, relativno mala doza se primenjuje u relativno retkim intervalima tokom dužeg vremenskog perioda. Neki pacijenti nastave sa primanjem lečenja do kraja života. Kod terapeutskih primena, relativno velika doza u relativno kratkim intervalima je ponekad potrebna dok se progresija bolesti ne umanji ili završi ili dok pacijent ne ispolji parcijalno ili kompletno poboljšanje simptoma bolesti. Nakon toga, pacijentu može biti davan profilaktički režim.

[0257] Stvarni dozni nivoi aktivnih sastojaka u farmaceutskim kompozicijama predmetnog otkrića mogu da variraju kako bi se dobila količina aktivnog sastojka koja je efikasna za postizanje željenog terapeutskog odgovora za konkretnog pacijenta, kompoziciju i način primene, a da pri tome nije toksična za pacijenta. Izabrani dozni nivo će zavisiti od brojnih farmakokinetičkih faktora, uključujući aktivnost konkretnih kompozicija predmetnog otkrića koje se koriste ili njihovog estra, soli ili amida, način primene, vreme primene, brzinu izlučivanja konkretnog jedinjenja koje se koristi, trajanje lečenja, druge lekove, jedinjenja i/ili materijale koji se koriste u kombinaciji sa konkretnim upotrebljenim kompozicijama, starost, pol, težinu, stanje, opšte zdravlje i prethodnu medicinsku istoriju pacijenta koji se leči, i slične faktore dobro poznate u medicinskoj struci.

[0258] "Terapeutski efikasna doza" anti-IL-17A antitela ili proteina iz otkrića može da dovede do smanjenja težine simptoma bolesti, veće učestalosti i dužeg trajanja perioda bez simptoma bolesti, ili prevencije oštećenja ili invaliditeta usled bolesti.

2

[0259] Kompozicija iz predmetnog otkrića može da se primenjuje pomoću jednog ili više načina primene korišćenjem jedne ili više raznovrsnih metoda poznatih u struci. Kao što će stručnjaci razumeti, način i/ili metoda primene će varirati u zavisnosti od željenih rezultata. Načini primene antitela iz otkrića uključuju intravenski, intramuskularni, intradermalni, intraperitonealni, subkutani, spinalni ili druge parenteralne načine primene, na primer injekcijom ili infuzijom. Izraz "parenteralna primena", kako se ovde koristi, podrazumeva načine primene koji nisu enteralna i topikalna primena, obično putem injekcije, i uključuje, bez ograničenja, intravensku, intramuskularnu, intraarterijalnu, intratekalnu, intrakapsularnu, intraorbitalnu, intrakardijalnu, intradermalnu, intraperitonealnu, transtrahealnu, subkutanu, subkutikularnu, intraartikularnu, subkapsularnu, subarahnoidnu, intraspinalnu, epiduralnu i intrastemalnu injekciju i infuziju.

[0260] Alternativno, antitelo ili protein iz otkrića mogu da se primene na neparenteralni način, kao što je topikalni, epidermalni ili mukozni način primene, na primer, intranazalno, oralno, vaginalno, rektalno, sublingvalno ili topikalno.

[0261] Antitela ili proteini iz otkrića mogu da se pripreme sa nosačima koji će štititi antitela od ubrzanog otpuštanja, kao što je formulacija sa kontrolisanim otpuštanjem, uključujući implantate, transdermalne flastere i mikrokapsulirane sisteme za isporuku. Mogu da se koriste biorazgradivi, biokompatibilni polimeri, poput etilen vinil acetata, polianhidrida, poliglikolne kiseline, kolagena, poliortoestara i polimlečne kiseline. Mnoge metode za pripremu takvih formulacija su patentirane ili uopšteno poznate stručnjacima. Vidi, npr. Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, izd., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

[0262] Terapeutske kompozicije mogu da se primenjuju sa medicinskim uređajima poznatim u struci. Na primer, u jednom otelotvorenju, terapeutska kompozicija iz otkrića može da se primeni hipodermičkim uređajem za injekciju bez igle, kao što su uređaji prikazani u U.S. Patentima br.5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824 ili 4,596,556. Primeri dobro poznatih implantata i modula koji su korisni u tekućem otkriću uključuju: US Patent br. 4,487,603, koji prikazuje implantabilnu mikroinfuzionu pumpu za izdavanje leka kontrolisanom brzinom; US Patent br.4,486,194, koji prikazuje terapeutski uređaj za primenu leka kroz kožu; US Patent br. 4,447,233, koji prikazuje infuzionu pumpu za lek, za isporuku leka sa preciznom brzinom infuzije; US Patent br. 4,447,224, koji prikazuje implantabilni infuzioni aparat sa varijabilnim protokom za neprekidnu isporuku leka; US Patent br.

4,439,196, koji prikazuje osmotski sistem za isporuku leka koji ima pregrade sa više odeljaka; i US Patent br. 4,475,196, koji prikazuje osmotski sistem za isporuku leka. Mnoštvo drugih takvih implanata, sistema isporuke i modula je poznato stručnjacima.

[0263] U određenim otelotvorenjima, antitela ili proteini iz otkrića mogu da se formulišu kako bi se osigurala pravilna distribucija in vivo. Na primer, krvno-moždana barijera (KMB) isključuje mnoga veoma hidrofilna jedinjenja. Kako bi se osiguralo da terapeutska jedinjenja iz otkrića pređu KMB (ako je to poželjno), ona mogu da se formulišu, na primer, u lipozomima. Za metode proizvodnje lipozoma, pogledajte, npr. U.S. Patente 4,522,811, 5,374,548 i 5,399,331. Lipozomi mogu da sadrže jedan ili više funkcionalnih ostataka koji se selektivno transportuju u specifične ćelije ili organe, tako poboljšavajući ciljnu isporuku leka (vidi, npr. V.V. Ranade 1989, J. Cline Pharmacol. 29:685). Primeri ostataka za ciljanje uključuju folat ili biotin (vidi, npr. U.S. Patent 5,416,016 za Low i sar.), manozide (Umezawa i sar. 1988, Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038), antitela (P.G. Bloeman i sar.1995, FEBS Lett.

357:140; M. Owais i sar.1995, Antimicrob. Agents Chemother.39:180), surfaktantski receptor proteina A (Briscoe i sar.1995, Am. J. Physiol.1233:134); p120 (Schreier i sar.1994, J. Biol. Chem. 269:9090), pogledajte takođe Keinanen i Laukkanen 1994, FEBS Lett.346:123; Killion i Fidler 1994, Immunomethods 4:273.

Primene i metode iz otkrića

[0264] Antitela ili proteini iz predmetnog otkrića imaju in vitro i in vivo dijagnostičke i terapeutske primene. Na primer, ovi molekuli se mogu davati ćelijama u kulturi, npr. in vitro ili in vivo, ili ispitaniku, npr. in vivo, radi lečenja, prevencije ili dijagnostikovanja širokog dijapazona bolesti.

[0265] Metode su posebno pogodne za lečenje, prevenciju i dijagnostikovanje poremećaja povezanih sa IL-17A i/ili autoimunih i inflamatornih poremećaja, npr. reumatoidnog artritisa ili psorijaze.

[0266] Specifično, otkriće obezbeđuje metodu lečenja poremećaja povezanih sa IL-17A i/ili autoimunih i inflamatornih poremećaja. U određenim otelotvorenjima, metoda sadrži korak

4

primene izolovanog antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela, prema otkriću, ispitaniku kome je to potrebno.

[0267] Otkriće takođe obezbeđuje metode za smanjenje ili supresiju IL-17A ili IL-17AF indukovanog signalnog odgovora u ciljanim ćelijama ili tkivima putem dovođenja ćelije u kontakt sa kompozicijom koja sadrži terapeutski efikasnu dozu antitela iz otkrića.

[0268] Otkriće takođe pruža metode za smanjenje nivoa IL6, CXCL1, IL-8, GM-CSF i/ili CCL2 u ćeliji, koja sadrži korak dovođenja ćelije u kontakt sa antitelom ili antigen-vezujućim fragmentom, kao što je njegov antigen-vezujući deo, u skladu sa otkrićem.

[0269] U predmetnom opisu, fraza "bolest posredovana sa IL-17A/AF" ili "poremećaj povezan sa IL-17A/AF" obuhvata sve bolesti i zdravstvena stanja u kojima IL-17A ili IL-17AF igra ulogu, bilo direktno ili indirektno, u bolesti ili zdravstvenom stanju, uključujući izazivanje, razvoj, progresiju, otpornost ili patologiju bolesti ili stanja. Shodno tome, ovi termini uključuju stanja koja su povezana sa, ili okarakterisana nenormalnim nivoima IL-17A/AF i/ili bolesti ili stanja koja mogu da se leče smanjenjem ili supresijom IL-17A/AF indukovane aktivnosti u ciljanim ćelijama ili tkivima, npr. proizvodnje IL-6 ili GRO-alfa. To uključuje inflamatorna stanja i autoimune bolesti, kao što je artritis, reumatoidni artritis ili psorijaza. Oni dalje uključuju alergije i alergijska stanja, hipersenzitivne reakcije, hroničnu opstruktivnu bolest pluća, cističnu fibrozu i odbacivanje transplantata organa ili tkiva.

[0270] Na primer, antitela ili proteini iz otkrića mogu da se koriste za lečenje primaoca transplantata srca, pluća, kombinovanog transplantata srca-pluća, transplantata jetre, bubrega, pankreasa, kože ili rožnjače, uključujući odbacivanje alografta ili odbacivanje ksenografta, i za prevenciju bolesti kalem protiv domaćina, kao što je nakon transplantacije koštane srži, i arterioskleroza povezana sa transplantacijom organa.

[0271] Antitela ili proteini iz otkrića, iako nisu na to ograničena, korisni su za lečenje, prevenciju ili poboljšanje autoimune bolesti i inflamatornih stanja, posebno inflamatornih stanja sa etiologijom koja uključuje autoimunsku komponentu kao što je artritis (na primer, reumatoidni artritis, artritis chronica progrediente i artritis deformans) i reumatske bolesti, uključujući inflamatorna stanja i reumatske bolesti, uključujući gubitak koštane mase, inflamatorni bol, spondiloartropatije, uključujući ankilozirajući spondilitis, Rajterov sindrom, reaktivni artritis, psorijazni artritis, juvenilni idiopatski artritis i enteropatski artritis, entezitis, hipersenzitivnost (uključujući disajnu hipersenzitivnost i dermalnu hipersenzitivnost) i alergije. Specifične autoimunske bolesti za koje antitela iz otkrića mogu da se koriste uključuju autoimunske hematološke poremećaje (uključujući npr. hemolitičku anemiju, aplastičnu anemiju, čistu anemiju crvenih krvnih zrnaca i idiopatsku trombocitopeniju), sistemski eritemski lupus (SLE), lupus nefritis, inflamatorne bolesti mišića (dermatomiozitis), periodontitis, polihondritis, sklerodermiju, Vegenerovu granulomatozu, dermatomiozitis, hronični aktivni hepatitis, miasteniju gravis, psorijazu, Stiven-Džonsonov sindrom, idiopatsku celijakiju, autoimunske inflamatorne bolesti creva (uključujući npr. ulcerozni kolitis, Kronovu bolest i sindrom iritabilnih creva), endokrinu oftalmopatiju, Grejvsovu bolest, sarkoidozu, multiplu sklerozu, sistemsku sklerozu, fibrotične bolesti, primarnu bilijarnu cirozu, juvenilni dijabetes (dijabetes melitus tip I), uveitis, suvo oko i vernalno zapaljenje vežnjače oka, intersticijalnu fibrozu pluća, periprostetičku osteolizu, glomerulonefritis (sa nefrotskim sindromom ili bez njega, npr. uključujući idiopatski nefrotski sindrom ili nefropatiju minimalnih promena), multipli mijelom i druge tipove tumora, inflamatorne bolesti kože i rožnjače, miozitis, labavljenje koštanih implantata, metaboličke poremećaje, (kao što je gojaznost, ateroskleroza i druge kardiovaskularne bolesti uključujući dilatativnu kardiomiopatiju, miokarditis, dijabetes melitus tip II i dislipidemiju) i autoimune tiroidne bolesti (uključujući Hašimotov tireoiditis), primarni vaskulitis malih i srednjih krvnih sudova, vaskulitis velikih krvnih sudova, uključujući arteritis džinovskih ćelija, hidradenitis suppurativa, optički neuromijelitis, Šegrenov sindrom, Behčetovu bolest, atopijski i kontaktni dermatitis, bronhiolitis, inflamatorne bolesti mišića, autoimunske periferne neuropatije, imunološke bolesti bubrega, jetre i tiroidne žlezde, inflamaciju i aterotrombozu, sindrome autoinflamatorne groznice, imunohematološke poremećaje i bulozne bolesti kože i membrana sluzokože. Anatomski, uveitis može biti prednji, intermedijarni, stražnji ili panuveitis. Može biti hroničan ili akutan. Etiologija uveitisa može biti autoimunska ili neinfektivna, infektivna, povezana sa sistemskim oboljenjem ili sindrom bele tačke.

[0272] Antitela ili proteini iz otkrića takođe mogu biti od koristi u lečenju, prevenciji ili poboljšanju astme, bronhitisa, bronhiolitisa, idiopatskih intersticijalnih pneumonija, pneumokonioza, plućnog emfizema i drugih opstruktivnih ili inflamatornih bolesti disajnih puteva.

[0273] Antitela ili proteini iz otkrića takođe mogu biti od koristi u lečenju bolesti koštanog metabolizma, uključujući osteoartritis, osteoporozu i druge inflamatorne artritise i gubitak koštane mase uopšte, uključujući starosni gubitak koštane mase, i posebno periodontalnu bolest.

[0274] Pored toga, antitela ili proteini iz otkrića mogu takođe biti od koristi u lečenju hroničnih kandidijaza i drugih hroničnih gljivičnih bolesti, dok se kod komplikacija usled parazitskih infekcija i komplikacija usled pušenja smatraju obećavajućim pravcima lečenja, kao i kod virusne infekcije i komplikacija usled virusnih infekcija.

[0275] Inhibiranje IL-17 i njegovih receptora je među novim načinima delovanja (modes of action - MOA) za lečenje hroničnih inflamatornih bolesti koji najviše obećavaju, pri čemu je psorijaza najnaprednija indikacija od nekolicine bolesti koje se trenutno proučavaju za razvoj leka za modulaciju IL-17 (Miossec P i Kolls JK. 2012, Nat Rev Drug Discov.10:763-76). Nekoliko studija je nedvosmisleno pokazalo da je blokiranje IL-17A kod pacijenata sa umerenom do teškom psorijazom plaka bezbedno u kratkom roku i indukuje izuzetna poboljšanja (npr. Hueber W, Patel DD, Dryja T, i sar.2010, Sci Transl Med. ;2:52ra72). Ova otkrića su prevazišla očekivanja i potvrdila hipotezu da je IL-17A ključni molekul za signalizaciju u patogenezi psorijaze (Garber K.2012,Nat Biotechnology 30:475-477).

[0276] Nadalje, u nekoliko životinjskih modela koji uključuju model najčešće multiple skleroze (MS) eksperimentalnog autoimunog encefalomijelitisa, IL-17 je ključan za inflamatorne procese (Bettelli E, i sar. 2008, Nature; 453:1051-57, Wang HH, i sar. 2011, J Clin Neurosci; 18(10):1313-7, Matsushita T, i sar.2013, PLoS One; 8(4):e64835). Efekti IL-17 su prvenstveno proinflamatorni i u sinergiji sa drugim citokinima. Efekti IL-17 kao što je indukovanje proizvodnje hemokina od strane ćelija epitela, stimulisanje interleukina (IL)-1b, faktora nekroze tumora-alfa (TNFa) i matrične metaloproteinaze (MMP)-9 u makrofagima, i indukovanje lučenja IL 6, IL-8 i prostaglandina E2, dobro se uklapaju sa mnogim aspektima patologije MS. Takođe postoje podaci koji zastupaju ključnu ulogu IL-17 u neuroinflamaciji, uključujući transgene modele prekomerne ekspresije u miševima (Haak S i sar. 2009, JCI; 119:61-69).

[0277] Astma je heterogena inflamatorna bolest disajnih puteva koja se klinički manifestuje simptomima opstrukcije disajnih puteva koji variraju po ozbiljnosti ili spontano ili kao odgovor na lečenje. Iako se smatra da su izazivači astme T pomoćne ćelije tip 2 (Th2) i njihovi proizvodi, skorašnji podaci ukazuju na to da je genski potpis Th2-visoki prisutan u disajnim putevima samo kod ∼50% ispitanika sa astmom (Woodruff PG i sar.2009, Am J Respir Crit Care Med 180:388-95). Neutrofilna inflamacija je dominantna kod akutne teške astme; neke osobe sa astmom imaju izraženu neutrofiliju sputuma i loš klinički odgovor na inhalirane steroide; neutrofilija sputuma je izražena kod astmatičara koji uzimaju velike doze inhaliranih i/ili oralnih steroida (Wenzel 2012, Nature Med 18:716-25).

[0278] Povišeni nivoi IL-17A koji su u korelaciji sa težinom astme su prijavljeni u krvotoku i disajnim putevima pojedinaca sa astmom u poređenju sa zdravim kontrolnim populacijama. Pretkliničke studije na mišjim modelima alergijske upale pluća nagoveštavaju potrebu za IL-17A i njegovim receptorom (IL-17RA) kod neutrofilne inflamacije disajnih puteva i hiperresponsivnosti disajnih puteva otporne na steroide. Dakle, svojstva IL-17A in vitro, njegovo prisustvo u povećanim količinama kod astme i pretklinički modeli bolesti podržavaju ulogu IL-17A u neutrofilnim i Th2-niskim oblicima bolesti koji imaju slabu responsivnost na steroide (Cosmi L i sar.2009, Am J Respir Crit Care Med 180:388-95).

[0279] Tako, sledeći spisak uslova sadrži posebno poželjne ciljeve za lečenje antitelima ili njihovim antigen-vezujućim delovima prema otkriću: Multipla skleroza, psorijaza, astma, sistemski eritemski lupus (SLE) i lupus nefritis.

[0280] Antitela ili proteini iz otkrića mogu da se primenjuju kao jedini aktivni sastojak ili u kombinaciji, npr. kao adjuvans za druge lekove ili u kombinaciji sa njima, npr. imunosupresivnim ili imunomodulišućim agensima ili drugim antiinflamatornim agensima ili drugim citotoksičnim ili antikancerogenim agensima, npr. za lečenje ili prevenciju prethodno pomenutih bolesti. Na primer, antitela iz otkrića mogu da se koriste u kombinaciji sa DMARD lekovima, npr. solima zlata, sulfasalazinom, antimalaricima, metotreksatom, D-penicilaminom, azatioprinom, mikofenolnom kiselinom, takrolimusom, sirolimusom, minociklinom, leflunomidom, glukokortikoidima; inhibitorom kalcineurina, npr. ciklosporinom A ili FK 506; modulatorom recirkulacije limfocita, npr. analozima FTY720 i FTY720; mTOR inhibitorom, npr. rapamicinom, 40-O-(2-hidroksietil)-rapamicinom, CCI779, ABT578, AP23573 ili TAFA-93; askomicinom koji ima imunosupresivna svojstva, npr. ABT281, ASM981, itd.; kortikosteroidima; ciklofosfamidom; azatioprinom; leflunomidom; mizoribinom; mikofenolat mofetilom; 15-dezoksispergualinom ili njegovim imunosupresivnim homologom, analogom ili derivatom; imunosupresivnim monoklonskim antitelima, npr. monoklonskim antitelima za receptore leukocita, npr. MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD25, CD28, CD40. CD45, CD58, CD80, CD86 ili njihovim ligandima; drugim imunomodulatorskim jedinjenjima, npr. rekombinantnim vezujućim molekulom koji ima barem deo ekstracelularnog domena CTLA4 ili njegovog mutanta, npr. barem ekstracelularni deo CTLA4 ili njegov mutant spojen sa ne-CTLA4 sekvencom proteina, npr. CTLA4Ig (na prim. označeno ATCC 68629) ili njegov mutant, npr. LEA29Y; inhibitorima adhezionih molekula, npr. LFA-1 antagonistima, ICAM-1 ili -3 antagonistima, VCAM-4 antagonistima ili VLA-4 antagonistima; ili hemoterapeutskim agensom, npr. paklitakselom, gemcitabinom, cisplatinom, doksorubicinom ili 5-fluorouracilom; anti TNF agensima, npr. monoklonskim antitelima za TNF, npr. infliksimabom, adalimumabom, CDP870, ili receptorskim konstruktima za TNF-RI ili TNF-RII, npr. etanercept, PEG-TNF-RI; blokatorima proinflamatornih citokina, IL1 blokatorima, npr. anakinra ili IL1 trap, kanakinumab, IL13 blokatori, IL4 blokatori, IL6 blokatori, drugi IL17 blokatori (kao što je secukinumab, brodalumab, iksekizumab); blokatorima hemokina, npr. inhibitorima ili aktivatorima proteaza, npr. metaloproteazama, anti-IL15 antitelima, anti-IL6 antitelima, anti-IL4 antitelima, anti-IL13 antitelima, anti-CD20 antitelima, NSAIL, kao što je aspirin ili antiinfektivni agens (spisak nije ograničen na pomenute agense).

[0281] U skladu sa gorepomenutim, predmetno otkriće u daljem aspektu obezbeđuje:

Metodu kao što je gore definisana koja sadrži zajedničku primenu, npr. istovremenu ili sekvencijalnu, terapeutski efikasne količine anti-IL-17A antitela ili njegovog antigenvezujućeg dela kao što je ovde prikazano, i najmanje jednu drugu lekovitu supstancu, pri čemu je pomenuta druga lekovita supstanca imunosupresivni / imunomodulatorski, antiinflamatorni ili antiinfektivni lek, npr. kao što je gore naznačeno.

[0282] Ili terapeutsku kombinaciju, npr. komplet, koji sadrži terapeutski efikasnu količinu a) antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela kao što je ovde prikazano, i b) najmanje jednu drugu supstancu izabranu od imunosupresivnog / imunomodulatorskog, antiinflamatornog ili antiinfektivnog leka, npr. kao što je gore naznačeno. Komplet može da sadrži uputstvo za njegovu primenu.

[0283] Kada se antitela ili njihovi antigen-vezujući delovi kao što su ovde prikazani primenjuju u kombinaciji sa drugom imunosupresivnom / imunomodulatorskom, antiinflamatornom hemoterapeutskom ili antiinfektivnom terapijom, doze kombinacije jedinjenja koja se zajedno primenjuju će naravno varirati u zavisnosti od tipa lekova koji se zajedno primenjuju, npr. od toga da li je u pitanju DMARD, anti-TNF, IL1 blokator ili drugo, od specifičnog leka koji se koristi, od stanja koje se leči, i tako dalje.

[0284] U jednom otelotvorenju, antitela ili njihovi antigen-vezujući delovi mogu da se koriste za detektovanje nivoa IL-17A ili nivoa ćelija koje sadrže IL-17A. To se može postići, na primer, dovođenjem uzorka (kao što je in vitro uzorak) i kontrolnog uzorka u kontakt sa anti-IL-17A antitelom (ili proteinom) u uslovima koji omogućavaju formiranje kompleksa između antitela i IL-17A. Bilo koji kompleksi koji se formiraju između antitela (ili proteina) i IL-17A se detektuju i porede u uzorku i kontroli. Na primer, standardni postupci detekcije, dobro poznati u struci, kao što su ELISA i test protočne citometrije, mogu da se obave korišćenjem kompozicija iz otkrića.

[0285] Shodno tome, u jednom aspektu, otkriće dalje pruža postupke za detektovanje prisustva IL-17A (npr. humanog IL-17A antigena) u uzorku, ili merenje količine IL-17A, koji sadrže dovođenje uzorka i kontrolnog uzorka u kontakt sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim delom, koji se specifično vezuje za IL-17A u uslovima koji omogućavaju formiranje kompleksa između antitela ili njegovog dela i IL-17A. Formiranje kompleksa se zatim detektuje, pri čemu razlika u formiranju kompleksa između uzorka i kontrolnog uzorka ukazuje na prisustvo IL-17A u uzorku.

[0286] Takođe, u opsegu otkrića su i kompleti koji sadrže kompozicije (npr. antitela, proteine, humana antitela i bispecifične molekule) iz otkrića i uputstvo za upotrebu. Komplet dalje može da sadrži najmanje jedan dodatni reagens, ili jedno ili više dodatnih antitela ili proteina iz otkrića (npr. antitelo koje ima komplementarnu aktivnost koje se vezuje za epitop na ciljanom antigenu različitom od prvog antitela). Kompleti obično uključuju etiketu koja označava nameravanu upotrebu sadržaja kompleta. Termin etiketa obuhvata svaki pisani ili snimljeni materijal dostavljen na kompletu ili sa njim, ili koji može na drugi način ići uz komplet. Komplet može dalje da sadrži alate za dijagnostikovanje da li pacijent spada u grupu koja će odgovoriti na lečenje anti-IL-17A antitelom, kako je gore definisano.

[0287] Otkriće koje je u potpunosti opisano sada će biti dalje ilustrovano sledećim primerima i patentnim zahtevima, koji su ilustrativni i ne treba ih shvatiti kao dalje ograničavajuće.

KRATAK OPIS SLIKA

[0288]

Slika 1 obezbeđuje trodimenzionalnu strukturu XAB1 Fab. Slika 1A je prostorni prikaz. Slika 1B je pojednostavljena struktura.

Slika 2 pruža trodimenzionalnu strukturu XAB1 Fv kompleksa sa humanim IL-17A. Slika 2A prikazuje dva XAB1 Fv fragmenta u prostornom prikazu, a Slika 2B prikazuje pojednostavljenu strukturu dva XAB1 Fv fragmenta.

Slika 3 prikazuje grafikone rezultata ELISA testa u skladu sa primerom. Numeracija na grafikonu odgovara oznakama kandidata na sledeći način: 1 je MB440; 2 je MB464; 3 je MB468; 4 je MB444; 5 je MB435; 6 je MB463; 7 je XAB1. Slika 3A je grafikon koji prikazuje normalizovan signal u odnosu na koncentraciju Fab (M). Slika 3B je grafikon koji prikazuje normalizovan preostali signal u odnosu na vreme inkubacije ispiranja (sati). Sl.3C je grafikon koji prikazuje normalizovan signal u odnosu na koncentraciju Fab konkurenta (M).

Slika 4 pruža trodimenzionalnu strukturu XAB2 Fv kompleksa sa humanim IL-17A. Slika 4A prikazuje dva XAB2 Fv fragmenta u prostornom prikazu, a Slika 4B prikazuje pojednostavljenu strukturu dva XAB2 Fv fragmenta.

Slika 5 pruža trodimenzionalnu strukturu XAB2 Fv kompleksa sa humanim IL-17A, kao uvećani prikaz.

Slika 6 pruža trodimenzionalnu strukturu XAB5 Fv kompleksa sa humanim IL-17A. Slika 6A prikazuje dva XAB5 Fv fragmenta u prostornom prikazu, a Slika 6B prikazuje pojednostavljenu strukturu dva XAB5 Fv fragmenta.

1

Slika 7 pruža trodimenzionalnu strukturu XAB5 Fv kompleksa sa humanim IL-17A, kao uvećani prikaz L-CDR1 antitela.

Slika 8 pruža trodimenzionalnu strukturu XAB4 Fv kompleksa sa humanim IL-17A. Slika 8A prikazuje dva XAB4 Fv fragmenta u prostornom prikazu, a Slika 8B prikazuje pojednostavljenu strukturu dva XAB4 Fv fragmenta.

Slika 9 pruža trodimenzionalnu strukturu XAB4 Fv kompleksa sa humanim IL-17A, kao uvećani prikaz L-CDR1 antitela.

Slika 10 pruža trodimenzionalnu strukturu XAB4 Fv kompleksa sa humanim IL-17A, kao uvećani prikaz L-CDR2 antitela.

Slika 11 je grafikon koji prikazuje terapeutski rezultat za XAB4 u modelu eksperimentalnog autoimunog encefalomijelitisa (EAE).

Slika 12 je grafikon koji pokazuje terapeutsku promenu težine (%) životinja u EAE modelu.

Slika 13 je grafikon koji pokazuje kumulativne terapeutske rezultate u EAE modelu.

Slike 14 i 15 su grafikoni koji prikazuju poređenje terapeutskog rezultata pre i posle lečenja u EAE modelu.

Slika 16 je grafikon koji pokazuje profilaktički rezultat za XAB4 u EAE modelu.

Slika 17 je grafikon koji pokazuje profilaktičku promenu težine (%) životinja u EAE modelu.

Slika 18 je grafikon koji pokazuje kumulativne profilaktičke rezultate u EAE modelu.

Slika 19 je grafikon koji pokazuje maksimalne profilaktičke rezultate u EAE modelu.

Slika 20 je grafikon koji pokazuje početak EAE u EAE modelu.

2

Slika 21 je grafikon koji prikazuje antagonistički efekat XAB4 na otpuštanje IL-6 u modelu humanog astrocita.

Slika 22 je grafikon koji prikazuje antagonistički efekat XAB4 na otpuštanje CXCL1 u modelu humanog astrocita.

Slika 23 je grafikon koji prikazuje antagonistički efekat XAB4 na otpuštanje IL-8 u modelu humanog astrocita.

Slika 24 je grafikon koji prikazuje antagonistički efekat XAB4 na otpuštanje GM-CSF u modelu humanog astrocita.

Slika 25 je grafikon koji prikazuje antagonistički efekat XAB4 na otpuštanje CCL2 u modelu humanog astrocita.

Primeri

[0289] XAB1 je humano IgG1/κ monoklonsko antitelo. Generisano je korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije. Ukratko, korišćen je sistem Medarex. Miševi su imunizovani rekombinantnim humanim IL-17A. Miševi su eutanazirani inhalacijom CO2, i ćelije slezine su prikupljene i fuzionisane sa ćelijskom linijom mijeloma pomoću PEG 4000. Fuzionisane ćelije su zasejane u bunarčiće sa dovodnim slojem peritonealnih ćelija. Supernatanti su uzeti iz uzgajanih ćelija i testirani na IL-17A reaktivna mAb pomoću ELISA testa. Klonovi pozitivni na proizvodnju IL-17A mAb su izabrani i skinuti sa ploča.

[0290] Hibridom odgovoran za lučenje XAB1 je identifikovan za dalju karakterizaciju na osnovu početnih obećavajućih svojstava vezivanja antitela/antigena, kao što je afinitet vezivanja za IL-17A, sposobnost blokiranja vezivanja IL-17A za njegov receptor i sposobnost blokiranja IL-17A posredovanih bioloških efekata u in vitro testovima.

[0291] Aminokiselinska sekvenca XAB1 je ID BR. SEKV: 14 (teški lanac) i ID BR. SEKV: 15 (laki lanac). XAB1 je izabrano za naknadno afinitetno sazrevanje.

[0292] Kao prvi korak ka strukturno vođenom afinitetnom sazrevanju, kristalna struktura XAB1 Fab u slobodnom stanju kao i odgovarajući Fv kompleks sa humanim IL-17A su određeni kako je opisano u nastavku. Analiza trodimenzionalne strukture XAB1 Fv kompleksa sa humanim IL-17A omogućila je da se proces racionalnog afinitetnog sazrevanja sprovede zajedno sa nasumičnijim procesom, i kao njegova alternativa. Više detalja je dato u nastavku.

[0293] Pored toga, rendgenska kristalografija je korišćena da se okarakterišu neke od afinitetno sazrelih varijanti antitela koja su generisana. Analiza kristalnih podataka od afinitetno sazrelih varijanti omogućila je bolje razumevanje ponašanja pri vezivanju varijanti antitela, i otkrivena su neka neočekivana svojstva, kao što će biti opisano u nastavku.

Primer 1. Kristalna struktura XAB1 Fab u slobodnom stanju

(i) Materijal i metode

[0294] Standardni protokoli molekularne biologije su korišćeni za dobijanje Fab fragmenta XAB1 antitela. Ukratko, Fab je kloniran i eksprimiran u E. coli W3110 sa C-terminalnom heksahistidinskom oznakom na teškom lancu. Rekombinantni protein je prečišćen hromatografijom sa Ni-helatom, a zatim gel filtracijom na koloni SPX-75 u 10 mM TRIS pH 7,4, 25 mM NaCl. Fab XAB1 je zatim koncentrovan ultrafiltracijom do 10,4 mg/ml i kristalisan.

[0295] Praćeni su standardni protokoli kristalizacije. Ukratko, kristali su uzgajani na 19°C u SD2 pločama sa 96 bunarčića, korišćenjem metode difuzije pare u sedećim kapima. Osnovni rastvor proteina je pomešan 1:1 sa puferom za kristalizaciju koji sadrži 40% PEG 300, 0,1 M natrijum fosfat-citrat pH 4,2. Ukupna veličina kapi je bila 0,4 µl. Pre prikupljanja rendgenskih podataka, jedan kristal je postavljen na najlonsku kriopetlju, i direktno je brzo ohlađen u tečnom azotu. Prikupljanje i obrada rendgenskih podataka obavljeni su pomoću standardnih protokola. Ukratko, rendgenski podaci do rezolucije od 2,1 Å prikupljeni su na uređaju Swiss Light Source, linija zraka X10SA, sa CCD detektorom MAR225 i rendgenskim zračenjem od 1,0000 Å. Ukupno je snimljeno 180 slika, svaka sa oscilacijom od 1,0° na rastojanju od kristala do detektora koje je iznosilo 190 mm, i obrađene su pomoću softverskog paketa HKL2000. Kristal je spadao u prostornu grupu C2 sa parametrima ćelije a=51,63 Å, b=132,09 Å, c=77,25

4

Å, α = 90,00°, β = 9888°, γ = 90,00° i jednim XAB1 Fab molekulom u asimetričnoj jedinici. Rezolucija R-sym do 2,1 Å bila je 10,4% i kompletnost podataka 99,0%.

[0296] Struktura je određena molekulskom zamenom pomoću programa PHASER. Modeli pretrage za domene VH/VLi CH1/CLgenerisani su od PDB unosa 1HEZ. Iterativna izgradnja i poboljšavanje modela su izvršeni pomoću programa Coot (Crystallographic Object-Oriented Toolkit, komplet alata orijentisan na kristalografski objekat) i CNX (Crystallography & NMR eXplorer) verzija 2002, sve dok više nisu mogla da se naprave značajna poboljšanja modela. Konačne vrednosti R i R-free bile su 0,188, odnosno 0,231. Konačni usavršeni model je imao devijaciju korena srednje kvadratne greške (RMSD) od idealne dužine veza i uglova veza 0,004 Å, odnosno 0,9°.

(ii) Rezultati

[0297] Rezultati rendgenskog poboljšavanja Fab XAB1 su dati u

Tabeli 9 i trodimenzionalnoj strukturi prikazanoj na Slici 1.

Tabela 9. Rendgensko poboljšavanje Fab XAB1 pomoću programa CNX.

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 POBOLJŠAVANJE.

NAPOMENA 3 PROGRAM : CNX 2002

NAPOMENA 3 AUTORI : Brunger, Adams, Clore, Delano,

NAPOMENA 3 Gros, Grosse-Kunstleve, Jiang,

NAPOMENA 3 Kuszewski, Nilges, Pannu, Read,

NAPOMENA 3 Rice, Simonson, Warren

NAPOMENA 3 i

NAPOMENA 3 Accelrys Inc.,

NAPOMENA 3 Yip, Dzakula).

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 PODACI KORIŠĆENI ZA POBOLJŠAVANJE.

NAPOMENA 3 OPSEG REZOLUCIJE VISOKI (ANGSTREMA): 2,10 NAPOMENA 3 OPSEG REZOLUCIJE NISKI (ANGSTREMA): 33,33 NAPOMENA 3 PRESEK PODATAKA (SIGMA(F)) : 0,0

NAPOMENA 3 PRESEK PODATAKA VISOKI (ABS(F)) : 19645630,62 NAPOMENA 3 PRESEK PODATAKA NISKI (ABS(F)) : 0,000000 NAPOMENA 3 KOMPLETNOST (RAD TEST) (%) : 98,2

NAPOMENA 3 BROJ REFLEKSIJA : 29298

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 POSTAVLJENO PREMA PODACIMA KORIŠĆENIM ZA POBOLJŠAVANJE.

NAPOMENA 3 POSTUPAK UNAKRSNE VALIDACIJE : U CELINI NAPOMENA 3 IZBOR KOMPLETA TESTOVA ZA FREE R VREDNOST : NASUMIČNO NAPOMENA 3 R VREDNOST (RADNI KOMPLET) : 0,188

NAPOMENA 3 FREE R VREDNOST : 0,231

NAPOMENA 3 VELIČINA KOMPLETA TESTOVA ZA FREE R VREDNOST (%): 4,9

NAPOMENA 3 BROJ KOMPLETA TESTOVA ZA FREE R VREDNOST : 1436 NAPOMENA 3 PROCENJENA GREŠKA FREE R VREDNOSTI : 0,006 NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 UKLAPANJE U BIN SA NAJVEĆOM REZOLUCIJOM.

NAPOMENA 3 UKUPAN BROJ UPOTREBLJENIH BINOVA : 6 NAPOMENA 3 OPSEG REZOLUCIJE BINA VISOKI (A) : 2,10 NAPOMENA 3 OPSEG REZOLUCIJE BINA NISKI (A) : 2,23

NAPOMENA 3 KOMPLETNOST BINA (RAD TEST) (%) : 94,7

NAPOMENA 3 REFLEKSIJE U BINU (RADNI KOMPLET) : 4478 NAPOMENA 3 R VREDNOST BINA (RADNI KOMPLET) : 0,201 NAPOMENA 3 FREE R VREDNOST BINA : 0,241

NAPOMENA 3 VELIČINA KOMPLETA TESTOVA ZA FREE R VREDNOST BINA (%): 4,5

NAPOMENA 3 BROJ KOMPLETA TESTOVA ZA FREE R VREDNOST BINA : 213

NAPOMENA 3 PROCENJENA GREŠKA FREE R VREDNOSTI BINA : 0,016 NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 BROJ ATOMA KORIŠĆENIH U POBOLJŠAVANJU KOJI NISU VODONIK.

NAPOMENA 3 ATOMI PROTEINA : 3311

NAPOMENA 3 ATOMI NUKLEINSKIH KISELINA : 0

NAPOMENA 3 HETEROGENI ATOMI : 5

NAPOMENA 3 ATOMI RASTVARAČA : 313

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 B VREDNOSTI.

NAPOMENA 3 IZ VILSONOVOG DIJAGRAMA (A**2) : 21,1 NAPOMENA 3 SREDNJA B VREDNOST (UKUPNO, A**2) : 27,4 NAPOMENA 3 UKUPNA ANIZOTROPSKA B VREDNOST.

NAPOMENA 3 B11 (A**2) : -6,02

NAPOMENA 3 B22 (A**2) : 3,30

NAPOMENA 3 B33 (A**2) : 2,73

NAPOMENA 3 B12 (A**2) : 0,00

NAPOMENA 3 B13 (A**2) : 3,82

NAPOMENA 3 B23 (A**2) : 0,00

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 MODELOVANJE SA VOLUMINOZNIM RASTVARAČEM.

NAPOMENA 3 UPOTREBLJENA METODA : RAVNI MODEL

NAPOMENA 3 KSOL : 0,399279

NAPOMENA 3 BSOL : 54,4727 (A**2)

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 PROCENJENA GREŠKA KOORDINATA.

NAPOMENA 3 ESD IZ LUCATIJEVOG DIJAGRAMA (A) : 0,21 NAPOMENA 3 ESD IZ SIGMAA (A) : 0,12

NAPOMENA 3 PRESEK NISKE REZOLUCIJE (A) : 5,00

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 PROCENJENA GREŠKA KOORDINATA UNAKRSNOM VALIDACIJOM.

NAPOMENA 3 ESD IZ LUCATIJEVOG DIJAGRAMA C-V (A) : 0,29 NAPOMENA 3 ESD IZ SIGMAA C-V (A) : 0,14

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 ODSTUPANJA RMS OD IDEALNIH VREDNOSTI. NAPOMENA 3 DUŽINE VEZA (A) : 0,004

NAPOMENA 3 UGLOVI VEZA (STEPENI) : 0,9

NAPOMENA 3 DIHEDRALNI UGLOVI (STEPENI) : 21,4 NAPOMENA 3 NEODGOVARAJUĆI UGLOVI (STEPENI) : 0,58 NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 IZOTROPSKI TOPLOTNI MODEL : OGRANIČEN

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 OGRANIČENJA IZOTROPSKOG TOPLOTNOG FAKTORA. RMS SIGMA NAPOMENA 3 VEZA GLAVNOG NIZA (A**2) : 1,41 ; 1,50 NAPOMENA 3 UGAO GLAVNOG NIZA (A**2) : 2,21 ; 2,00 NAPOMENA 3 VEZA BOČNOG NIZA (A**2) : 2,31 ; 2,00 NAPOMENA 3 UGAO BOČNOG NIZA (A**2) : 3,44 ; 2,50 NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 NCS MODEL : NEMA

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 OGRANIČENJA NCS. RMS SIGMA/TEŽINA NAPOMENA 3 GRUPA 1 POZICIONA (A) : NULA ; NULA NAPOMENA 3 GRUPA 1 B-FAKTOR (A**2) : NULA ; NULA NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 DATOTEKA SA PARAMETRIMA 1 : protein_rep.param NAPOMENA 3 DATOTEKA SA PARAMETRIMA 2 : water_rep.param NAPOMENA 3 DATOTEKA SA TOPOLOGIJOM 1 : protein_no_cter.top NAPOMENA 3 DATOTEKA SA TOPOLOGIJOM 2 : water.top

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 OSTALE NAPOMENE O POBOLJŠAVANJU: NULA

SSBOND 1 CYS L 23 CYS L 88

SSBOND 2 CYS L 134 CYS L 194

SSBOND 3 CYS H 22 CYS H 96

SSBOND 4 CYS H 143 CYS H 199

CRYST1 51,627 132,089 77,247 90,00 98,88 90,00 C 12 1 8

ORIGX1 1,000000 0,000000 0,000000 0,00000

ORIGX2 0,000000 1,000000 0,000000 0,00000

ORIGX3 0,000000 0,000000 1,000000 0,00000

SCALE1 0,019370 0,000000 0,003027 0,00000

SCALE2 0,000000 0,007571 0,000000 0,00000

SCALE3 0,000000 0,000000 0,013103 0,00000

[0298] Slika 1 pruža trodimenzionalnu strukturu Fab XAB1 kako je dobijena u Primeru 1. Slika 1A je prostorni prikaz. Slika 1B je pojednostavljena struktura. Teški i laki lanac Fab XAB1 se prikazuju tamnom, odnosno svetlosivom bojom.

Primer 2. Kristalna struktura XAB1 Fv kompleksa sa humanim IL-17A: analiza paratopa za strukturno vođeno afinitetno sazrevanje

(i) Materijal i metode

[0299] Standardni protokoli molekularne biologije su korišćeni za dobijanje Fv fragmenta XAB1 antitela. Ukratko, Fv je kloniran i eksprimiran u E. coli W3110 sa C-terminalnom heksahistidinskom oznakom na teškom lancu i C-terminalnom Strep-oznakom na lakom lancu. Rekombinantni protein je prečišćen hromatografijom sa Ni-helatom.

[0300] Kompleks XAB1 Fv fragmenta sa humanim IL-17A je zatim pripremljen pomoću standardne metodologije. Ukratko, humani IL-17A (1,1 mg) je pomešan sa viškom Fv (2,7 mg) i kompleks je propušten kroz S100 gel hromatografiju, u 10 mM TRIS pH 7,4, 25 mM NaCl. Proteinski kompleks je zatim koncentrovan ultrafiltracijom do 21,2 mg/ml i kristalisan.

[0301] Praćeni su standardni protokoli kristalizacije. Ukratko, kristali su uzgajani na 19°C u SD2 pločama sa 96 bunarčića, korišćenjem metode difuzije pare u sedećim kapima. Osnovni rastvor proteina je pomešan 1:1 sa puferom za kristalizaciju koji sadrži 10% PEG 20.000, 0,1 M Bicin pH 9,0, 2,0% (V/V) dioksana. Ukupna veličina kapi je bila 0,4 µl. Pre rendgenskog prikupljanja podataka, jedan kristal je nakratko prebačen u 1:1 smešu pufera za kristalizaciju koji sadrži 20% PEG 20.000, 30% glicerola, a zatim je brzo ohlađen u tečnom azotu.

[0302] Prikupljanje i obrada rendgenskih podataka obavljeni su pomoću standardnih protokola. Ukratko, rendgenski podaci do rezolucije od 3,0 Å prikupljeni su na uređaju Swiss Light Source, linija zraka X10SA, sa CCD detektorom MAR225 i rendgenskim zračenjem od 1,0000 Å. Ukupno je snimljeno 110 slika svaka sa oscilacijom od 1,0° na rastojanju od kristala do detektora koje je iznosilo 300mm, i obrađene su pomoću softverskog paketa HKL2000. Kristal je spadao u prostornu grupu P21212 sa parametrima ćelije a=184,31 Å, b=55,81 Å, c=70,99 Å, α = β = γ = 90°. Rezolucija R-sym do 3,0 Å bila je 11,2% i kompletnost podataka 99,9%.

[0303] Struktura je određena molekulskom zamenom pomoću programa PHASER. Model pretrage za XAB1 Fv je generisan iz prethodno utvrđene kristalne strukture XAB1 Fab (vidi Primer 1). Model pretrage za IL-17A je generisan iz objavljene kristalne strukture humanog IL-17F (PDB unos 1jpy). Iterativna izgradnja i poboljšavanje modela su izvršeni pomoću Coot (Crystallographic Object-Oriented Toolkit, komplet alata orijentisan na kristalografski objekat) i CNX (Crystallography & NMR eXplorer) verzija 2002, sve dok više nisu mogla da se naprave značajna poboljšanja modela. Konačne vrednosti R i R-free bile su 0,215, odnosno 0,269. Konačni usavršeni model je imao devijaciju korena srednje kvadratne greške (RMSD) od idealne dužine veza i uglova veza 0,007 Å, odnosno 1,0°.

(ii) Rezultati

[0304] Izračunavanja molekulske zamene su otkrila dimerni kompleks koji sadrži jedan IL-17A homodimer sa dva vezana XAB1 Fv fragmenta. Rezultati rendgenskog poboljšavanja kompleksa XAB1 Fv sa humanim IL-17A su dati u Tabeli 10, a trodimenzionalna struktura ovog kompleksa je prikazana na Slici 2. Svaki XAB1 Fv ostvaruje kontakt sa obe podjedinice IL-17A, ali velika većina intermolekulskog kontakta (oko 96% pokrivene površine) se pripisuje samo jednoj podjedinici IL-17A.

Tabela 10. Rendgensko poboljšavanje kompleksa XAB1 Fv sa IL-17A dobijeno pomoću programa CNX.

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 POBOLJŠAVANJE.

NAPOMENA 3 PROGRAM : CNX 2002

NAPOMENA 3 AUTORI : Brunger, Adams, Clore, Delano,

NAPOMENA 3 Gros, Grosse-Kunstleve, Jiang,

NAPOMENA 3 Kuszewski, Nilges, Pannu, Read,

NAPOMENA 3 Rice, Simonson, Warren

NAPOMENA 3 i

NAPOMENA 3 Accelrys Inc.,

NAPOMENA 3 (Badger, Berard, Kumar, Szalma,

NAPOMENA 3 Yip, Dzakula).

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 PODACI KORIŠĆENI ZA POBOLJŠAVANJE.

NAPOMENA 3 OPSEG REZOLUCIJE VISOKI (ANGSTREMA): 3,01 NAPOMENA 3 OPSEG REZOLUCIJE NISKI (ANGSTREMA): 47,74 NAPOMENA 3 PRESEK PODATAKA (SIGMA(F)) : 0,0

NAPOMENA 3 PRESEK PODATAKA VISOKI (ABS(F)) : 15276175,80 NAPOMENA 3 PRESEK PODATAKA NISKI (ABS(F)) : 0,000000 NAPOMENA 3 KOMPLETNOST (RAD TEST) (%) : 99,5

NAPOMENA 3 BROJ REFLEKSIJA : 15190

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 POSTAVLJENO PREMA PODACIMA KORIŠĆENIM ZA POBOLJŠAVANJE.

NAPOMENA 3 POSTUPAK UNAKRSNE VALIDACIJE : U CELINI NAPOMENA 3 IZBOR KOMPLETA TESTOVA ZA FREE R VREDNOST : NASUMIČNO NAPOMENA 3 R VREDNOST (RADNI KOMPLET) : 0,215

NAPOMENA 3 FREE R VREDNOST : 0,269

NAPOMENA 3 VELIČINA KOMPLETA TESTOVA ZA FREE R VREDNOST (%): 4,9

NAPOMENA 3 BROJ KOMPLETA TESTOVA ZA FREE R VREDNOST : 748 NAPOMENA 3 PROCENJENA GREŠKA FREE R VREDNOSTI : 0,010 NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 UKLAPANJE U BIN SA NAJVEĆOM REZOLUCIJOM.

NAPOMENA 3 UKUPAN BROJ UPOTREBLJENIH BINOVA : 6 NAPOMENA 3 OPSEG REZOLUCIJE BINA VISOKI (A) : 3,00 NAPOMENA 3 OPSEG REZOLUCIJE BINA NISKI (A) : 3,19

NAPOMENA 3 KOMPLETNOST BINA (RAD TEST) (%) : 94,6

1

NAPOMENA 3 REFLEKSIJE U BINU (RADNI KOMPLET) : 2234 NAPOMENA 3 R VREDNOST BINA (RADNI KOMPLET) : 0,301 NAPOMENA 3 FREE R VREDNOST BINA : 0,350

NAPOMENA 3 VELIČINA KOMPLETA TESTOVA ZA FREE R VREDNOST BINA (%): 5,3

NAPOMENA 3 BROJ KOMPLETA TESTOVA ZA FREE R VREDNOST BINA : 124

NAPOMENA 3 PROCENJENA GREŠKA FREE R VREDNOSTI BINA : 0,031 NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 BROJ ATOMA KORIŠĆENIH U POBOLJŠAVANJU KOJI NISU VODONIK.

NAPOMENA 3 ATOMI PROTEINA : 5007

NAPOMENA 3 ATOMI NUKLEINSKIH KISELINA : 0

NAPOMENA 3 HETEROGENI ATOMI : 0

NAPOMENA 3 ATOMI RASTVARAČA : 33

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 B VREDNOSTI.

NAPOMENA 3 IZ VILSONOVOG DIJAGRAMA (A**2) : 54,9 NAPOMENA 3 SREDNJA B VREDNOST (UKUPNO, A**2) : 44,8 NAPOMENA 3 UKUPNA ANIZOTROPSKA B VREDNOST.

NAPOMENA 3 B11 (A**2) : 5,66

NAPOMENA 3 B22 (A**2) : 0,97

NAPOMENA 3 B33 (A**2) : -6,63

NAPOMENA 3 B12 (A**2) : 0,00

NAPOMENA 3 B13 (A**2) : 0,00

NAPOMENA 3 B23 (A**2) : 0,00

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 MODELOVANJE SA VOLUMINOZNIM RASTVARAČEM.

NAPOMENA 3 UPOTREBLJENA METODA : RAVNI MODEL

NAPOMENA 3 KSOL : 0,313124

NAPOMENA 3 BSOL : 20,608 (A**2)

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 PROCENJENA GREŠKA KOORDINATA.

2

NAPOMENA 3 ESD IZ LUCATIJEVOG DIJAGRAMA (A) : 0,33 NAPOMENA 3 ESD IZ SIGMAA (A) : 0,39

NAPOMENA 3 PRESEK NISKE REZOLUCIJE (A) : 5,00

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 PROCENJENA GREŠKA KOORDINATA UNAKRSNOM VALIDACIJOM.

NAPOMENA 3 ESD IZ LUCATIJEVOG DIJAGRAMA C-V (A) : 0,44 NAPOMENA 3 ESD IZ SIGMAA C-V (A) : 0,51

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 ODSTUPANJA RMS OD IDEALNIH VREDNOSTI.

NAPOMENA 3 DUŽINE VEZA (A) : 0,007

NAPOMENA 3 UGLOVI VEZA (STEPENI) : 1,0

NAPOMENA 3 DIHEDRALNI UGLOVI (STEPENI) : 22,1 NAPOMENA 3 NEODGOVARAJUĆI UGLOVI (STEPENI) : 0,78 NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 IZOTROPSKI TOPLOTNI MODEL : OGRANIČEN

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 OGRANIČENJA IZOTROPSKOG TOPLOTNOG FAKTORA. RMS SIGMA NAPOMENA 3 VEZA GLAVNOG NIZA (A**2) : 1,46 ; 1,50 NAPOMENA 3 UGAO GLAVNOG NIZA (A**2) : 2,62 ; 2,00 NAPOMENA 3 VEZA BOČNOG NIZA (A**2) : 1,63 ; 2,00 NAPOMENA 3 UGAO BOČNOG NIZA (A**2) : 2,62 ; 2,50 NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 NCS MODEL : NEMA

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 OGRANIČENJA NCS. RMS SIGMA/TEŽINA NAPOMENA 3 GRUPA 1 POZICIONA (A) : NULA ; NULA NAPOMENA 3 GRUPA 1 B-FAKTOR (A**2) : NULA ; NULA NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 DATOTEKA SA PARAMETRIMA 1 : protein_rep.param NAPOMENA 3 DATOTEKA SA PARAMETRIMA 2 : water_rep.param NAPOMENA 3 DATOTEKA SA TOPOLOGIJOM 1 : protein_no_cter.top NAPOMENA 3 DATOTEKA SA TOPOLOGIJOM 2 : water.top

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 OSTALE NAPOMENE O POBOLJŠAVANJU: NULA

SSBOND 1 CYS L 23 CYS L 88

SSBOND 2 CYS H 22 CYS H 96

SSBOND 3 CYS A 23 CYS A 88

SSBOND 4 CYS B 22 CYS B 96

SSBOND 5 CYS C 94 CYS C 144

SSBOND 6 CYS C 99 CYS C 146

SSBOND 7 CYS D 94 CYS D 144

SSBOND 8 CYS D 99 CYS D 146

CRYST1 184,306 55,813 70,991 90,00 90,00 90,00 P 2121 2 24

ORIGX1 1,000000 0,000000 0,000000 0,00000

ORIGX2 0,000000 1,000000 0,000000 0,00000

ORIGX3 0,000000 0,000000 1,000000 0,00000

SCALE1 0,005426 0,000000 0,000000 0,00000

SCALE2 0,000000 0,017917 0,000000 0,00000

SCALE3 0,000000 0,000000 0,014086 0,00000

[0305] Slika 2 pruža trodimenzionalnu strukturu XAB1 Fv kompleksa sa humanim IL-17A, kao što je dobijeno u Primeru 2. Slika 2A prikazuje dva XAB1 Fv fragmenta u prostornom prikazu. IL-17A homodimer je prikazan kao pojednostavljena struktura. Slika 2B prikazuje dva XAB1 Fv fragmenta kao pojednostavljenu strukturu. IL-17A homodimer je prikazan u prostornom prikazu. Teški i laki lanac XAB1 Fv su prikazani tamnom, odnosno svetlosivom bojom. Jedan lanac IL-17A homodimera je prikazan svetlosivom bojom, drugi je prikazan tamnosivom.

[0306] Obavljena je detaljna analiza kompleksa. Sprovedena je pažljiva vizuelna inspekcija kristalne strukture pomoću programa Coot i Pymol, i deo površine proteina koja je pokrivena u međuprostoru antitelo-antigen je izračunat programom AREAIMOL iz programskog paketa CCP4. Intermolekulski kontakti su definisani korišćenjem graničnog rastojanja od 3,9Å između atoma antitela i antigena. Pregled vezivanja može da se rezimira na sledeći način. Vezivanje XAB1 je simetrično. Svaki Fv fragment se vezuje za ekvivalentni epitop IL17A homodimera.

4

[0307] Vezivanje svakog Fv fragmenta u proseku je pokrilo 1732Å<2>kombinovane površine, i uključivalo je 30 ostataka antitela i 25 IL-17A aminokiselinskih ostataka. Doprinos lakog lanca XAB1 (oko 560Å<2>) pokrivenoj površini bio je veći nego doprinos teškog lanca (oko 275Å<2>). Pored toga, CDRH2 nije ostvario direktan kontakt sa IL-17A i izgleda da je previše udaljen od antigena proteina da bi mogao da pruži mogućnosti afinitetnog sazrevanja. Izgleda da je doprinos CDRH1 ograničen samo na jedan bočni lanac aminokiseline (Tyr32); ovaj CDR je takođe bio previše udaljen od IL-17A da bi mogao da pruži mogućnosti afinitetnog sazrevanja kroz aminokiselinske supstitucije. CDRH3 XAB1 je ostvario više bliskih kontakata sa IL-17A. Međutim, pažljiva inspekcija strukture u ovom regionu nije otkrila nikakvu mogućnost daljeg unapređenja ovih kontakata tačkastim mutacijama; stoga, CDRH3 je ocenjen kao neprikladan za ciljani region za unapređenje afiniteta. Suprotno tome, proučavanje CDR-a lakog lanca je pokazalo brojne mogućnosti za afinitetno sazrevanje. Od tri CDR-a lakog lanca, smatralo se da CDRL1 najviše obećava, i na osnovu te pretpostavke, pronalazači su predložili randomizaciju položaja 30 do 32 lakog lanca u pokušaju osnaživanja kontakata sa IL-17A ostacima Arg124, Phe133 i Tyr85.

Afinitetno sazrevanje prema racionalnom dizajnu

[0308] Na osnovu prethodnih rezultata, utvrđeno je da je međupovršina XAB1 sa homodimernim IL-17A srazmerno mala, i karakterišu je dominantni doprinos lakog lanca, izostanak učešća CDRH2 i uglavnom indirektan doprinos CDRH1 (tj. putem stabilizacije CDRH3). Shodno tome, nije se činilo da teški lanac XAB1 pruža obećavajuće mogućnosti za afinitetno sazrevanje.

[0309] Nasuprot tome, laki lanac XAB1 je nudio neke mogućnosti na ostacima aminokiselina 30 do 32, uz opciono ubacivanje do 4 aminokiselinska ostatka (CDRL1), aminokiselina 51 do 53 i 56 (CDRL2) i aminokiselinskih ostataka 92 i 93, uz opciono ubacivanje do 4 aminokiselinska ostatka.

[0310] Dostupnost objavljene kristalne strukture za homodimerni humani IL-17F i struktura homodimernog IL-17F u kompleksu sa humanim receptorom IL-17RA omogućava da se predviđanja prave na osnovu uočenih struktura kristalisanog IL-17A i IL-17A u kompleksu sa XAB1 (i njegovim varijantama).

[0311] Ispitane su strukturne sličnosti predviđene između IL-17F i IL-17A (na osnovu identičnosti sekvenci i homologije). IL-17F i IL-17A su imali strukturnu sličnost. Pronalazači su pretpostavili da bi se IL-17A vezao za N-terminalni domen svog receptora na isti način koji je pokazan za objavljeni kompleks IL-17F/IL-17RA (Ely LK i sar. 2009, Nat Immunol.

10:1245-51).

[0312] Na osnovu uočene strukture i poređenja poznatih sekvenci za humani IL-17A i IL-17F, zajedno sa sekvencom IL-17A dobijenom od drugih vrsta, pronalazači su načinili još neka dodatna predviđanja:

[0313] Očekivalo se da će XAB1 (i varijante antitela dobijene tako što su imale poboljšan afinitet prema epitopu ciljanom od strane XAB1) biti visokospecifičan za humani IL-17A. Pretpostavljeno je da će takva antitela zadržati deo unakrsne reaktivnosti sa IL-17A drugih vrsta (na osnovu velikog stepena očuvane identičnosti sekvenci i homologije između vrsta). Međutim, na osnovu dostupnih podataka o sekvencama i strukturnih predviđanja bilo je nejasno u kojoj meri se može očekivati unakrsna reaktivnost sa varijantama IL-17A različitih vrsta. Uzevši u obzir nedostatak strukturne sličnosti sa drugim interleukinima, očekivalo se da će unakrsna reaktivnost sa takvim molekulima (ljudi ili drugih vrsta) biti malo verovatna.

[0314] Pored toga, razlike između sekvenci IL-17A i IL-17F (posebno u N-terminalnom regionu) dovele su do pretpostavki da se anti-IL-17A antitela iz otkrića neće vezivati za IL-17F. Na primer, preklapanje dve kristalne strukture je ukazalo na to da će sterne smetnje sprečiti vezivanje između tih antitela i IL-17F. Nadalje, ekstrapolacija strukture IL-17AF heterodimera je takođe nagovestila da bi takvo uplitanje, posebno u N-terminalnom regionu, ometalo vezivanje antitela za IL-17AF heterodimere i tako dovelo do izostanka vezivanja za IL-17AF, tj. izostanka unakrsne reaktivnosti ovih antitela za IL-17AF heterodimere.

Primer 3. Generisanje afinitetno sazrelih varijanti antitela

[0315] Stvarno afinitetno sazrevanje prvobitnog XAB1 antitela je fokusirano na laki lanac, iz prethodno razmotrenih razloga. Posao je obavljen u tri koraka: (i) generisanje biblioteke, (ii) skrining biblioteke i (iii) karakterizacija kandidata.

[0316] Posao konstruisanja proteina (tj. afinitetno sazrevanje) je obavljen u formatu Fab fragmenta radi lakšeg rukovanja. Kandidati su nakon konstruisanja formatirani nazad do punog IgG.

(i) Generisanje biblioteke

[0317] DNK sekvenca koja kodira varijabilni domen lakog lanca je mutirana da bi se stvorila biblioteka varijanti gena. Dva različita pristupa (A i B) su korišćena za generisanje biblioteke, što je dalo dve različite biblioteke.

1) Metoda A - nasumična mutacija pomoću PCR sklone greškama:

[0318] DNK region koji kodira varijabilni domen lakog lanca XAB1 je nasumično mutiran pomoću PCR sklone greškama. Detaljnije, taj region je amplifikovan korišćenjem polimeraze mutazim II, koja uvodi mutacije sa velikom učestalošću (više podataka potražite u vodiču priloženom uz komplet za nasumičnu mutagenezu GeneMorph II, proizvođača Stratagene br.

200550). Međutim, može da se koristi bilo koja tehnika ili strategija za nasumične mutacije.

[0319] Objedinjene varijante PCR fragmenata su zatim klonirane isecanjem i umetanjem u ekspresioni vektor XAB1. Suštinski, matična nemutirana sekvenca je isečena iz ekspresionog vektora i zamenjena nasumično mutagenizovanom sekvencom koja je umetnuta na njeno mesto. Da bi se to postiglo, korišćene su standardne tehnike molekularne biologije.

[0320] Na taj način je dobijena biblioteka varijanti ekspresionih vektora koja sadrži raznovrsne nasumično mutagenizovane sekvence varijabilnih domena.

2) Metoda B - mutacija prema racionalnom dizajnu:

[0321] Po ovom pristupu, stvaranje biblioteke je vođeno strukturnom analizom izvedenom da prethodi afinitetnom sazrevanju. Specifični ostaci aminokiselina (konkretno, u CDR1 lakog lanca XAB1) su ciljani na bazi informacija o epitopu i paratopu dobijenim iz gore opisane kristalne strukture.

[0322] Tri aminokiselinska ostatka, izabrana na osnovu informacija o kristalnoj strukturi, potpuno su randomizovana. Za konstrukciju su korišćeni standardni pristupi molekularne biologije.

[0323] Prvo je fragment varijabilnog regiona koji kodira odgovarajući CDR i prvi deo okvira lakog lanca amplifikovan putem PCR, koristeći degenerisane oligonukleotide.

[0324] U stvari, oligonukleotidi koji kodiraju CDR su sintetisani tako da obezbede različite baze na definisanom položaju ili položajima. Dizajn oligonukleotida je omogućio randomizaciju specifično ciljanih položaja aminokiselina u CDR putem degenerisanih kodona NNK (gde N označava sve 4 baze, A, T, C i G, a K označava G i T), i omogućio je da svih 20 aminokiselina bude na tim položajima.

[0325] Nakon ovog prvog koraka, drugi fragment koji preklapa prvi i kodira preostali deo lakog lanca, takođe je amplifikovan pomoću PCR. Oba fragmenta su onda sastavljena pomoću PCR za "sklapanje", dajući kompletni varijabilni laki lanac, i klonirani nazad u ekspresioni vektor putem "isecanja i umetanja". Pri tome je matična sekvenca zamenjena nizom racionalno mutiranih sekvenci, pri čemu je na specifičnim položajima aminokiselina bilo zastupljeno svih 20 prirodnih aminokiselina.

(ii) Skrining biblioteke

[0326] Kada su napravljene biblioteke koje sadrže sekvence koje kodiraju varijante XAB1, bilo je potrebno pretražiti ih kako bi se izabrale one sa boljim karakteristikama od matične sekvence XAB1, na primer, veći afinitet prema IL-17A.

[0327] Korišćene su dve tehnike skrininga. Prvo, visokoprotočni skrining je izvršen putem "skrininga filtracije kolonija" (CFS). Ovaj test je omogućio prikladan skrining velikog broja klonova. On je omogućio redukciju na pozitivne rezultate pre ELISA skrininga, što je posebno korisno za nasumični pristup "metode A", jer je veličina biblioteke bila mnogo veća (>10<5>) u poređenju sa veličinom biblioteke u "metodi B" (samo 8000). ELISA skrining je pogodan za 10<4>klonova ili manje, i daje rezultate koji su više kvantitativni.

1) Skrining filtracije kolonija (CFS):

[0328] Protokol za CFS je bio na bazi rada Skerra i sar. 1991, Anal Biochem 196:151-155. Načinjena su neka prilagođavanja.

[0329] Kolonije E. coli koje eksprimiraju varijante Fab biblioteka gajene su na filteru na vrhu Petri kutije koja je sadržala LB agar i glukozu. Istovremeno, na PVDF membranu je nanet ciljni protein (IL-17A). Premazana membrana je stavljena na ploču agara. Filter sa kolonijama E. coli koje eksprimiraju fragmente Fab je stavljen povrh membrane. Fab fragmenti eksprimirani ćelijama difundovali su iz kolonija i vezivali ciljni IL-17A. Fab fragment tako uhvaćen na PVDF membrani zatim je detektovan korišćenjem sekundarnog antitela konjugovanog sa alkalnom fosfatazom za vestern bojenje. Uslovi za izbor samo varijanti sa poboljšanim osobinama vezivanja prethodno su utvrđeni koristeći XAB1 kao referencu.

[0330] Konkretnije, posle transformacije ćelija E. coli bibliotekom, ćelije su raspoređene po membranskom filteru Durapore<TM>(0,22 µm GV, Millipore®, kat. br. GVWP09050) postavljenom na Petri kutiju sa LB agarom 1% glukoze željenim antibiotikom. Ploče su inkubirane preko noći na 30°C

[0331] PVDF membrana (Immobilon-P, Millipore®, kat. br. IPVH08100) prethodno je nakvašena u metanolu, isprana u PBS-u i premazana rastvorom huIL-17A u koncentraciji od 1 µg/ml u PBS-u. Membrana je inkubirana preko noći na sobnoj temperaturi. Nakon premazivanja, membrana je isprana 2 puta u fiziološkom rastvoru sa Tris puferom (TBS) 0,05% Tween (TBST) i blokirana dva sata na sobnoj temperaturi u TBST sa 5% mleka. Onda je membrana isprana četiri puta u TBST-u i potopljena u 2xYT medijum sa 1mM IPTG. Ova membrana, nazvana hvatajuća membrana, postavljena je na ploču LB agara sa 1 mM IPTG željenim antibiotikom, i pokrivena je membranom Durapore sa kolonijama na vrhu. Dobijeni sendvič je inkubiran četiri sata na 30°C.

[0332] Posle ove inkubacije, hvatajuća membrana je 4 puta isprana pomoću TBST i blokirana u TBST sa 5% mleka tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Onda je membrana jednom isprana pomoću TBST i inkubirana sa sekundarnim antitelom (anti-hu_kappa laki lanac antitela, konjugovanog sa alkalnom fosfatazom (AP), Sigma kat. br. A3813, razblaženo 1:5000 u TBST sa 2% mleka), 1 sat na sobnoj temperaturi. Posle toga, membrana je 4 puta isprana u TBST-u, jednom u TBS-u, i inkubirana u rastvoru supstrata (SigmaFast BCIP/NBT tableta, 1 tableta u 10 ml H2O). Kada je signal dostigao očekivani intenzitet, membrana je isprana vodom i ostavljena da se osuši.

[0333] Nakon razvijanja signala na hvatajućoj membrani, odabrane su kolonije koje daju jači signal od matičnog XAB1, i podvrgnute su drugom ELISA skriningu opisanom u nastavku.

2) ELISA skrining:

[0334] Nakon CFS, ELISA je korišćena za skrining kandidata odabranih pomoću CFS. Ukratko, kod relativno malog broja varijanti identifikovanih putem PCR mutageneze sklone greškama (tj. biblioteke A), ELISA je izvedena ručno na formatu sa 96 bunarčića. Nasuprot tome, kod biblioteka konstruisanih racionalnim dizajnom (metoda B), treba izvršiti skrining većeg broja poboljšanih klonova na nivou ELISA kako bi se napravila razlika između njihovih različitih afiniteta vezivanja za IL-17A, i kako bi se prepoznali klonovi sa najvećim afinitetom. U tu svrhu je korišćen ELISA robot na ploči formata sa 384 bunarčića. Međutim, protokol za ELISA je bio isti u oba slučaja, jedina razlika je u zapremini reagensa.

a) Ćelijske kulture:

[0335] Klonovi su prvo uzgajani preko noći na 30°C, 900 o/min, u 2xYT medijumu 1% glukoze željeni antibiotik. Ploče koje su sadržale te kulture nazvane su glavnim pločama. Sledećeg dana, alikvoti kultura sa glavnih ploča preneti su u ekspresione ploče koje su sadržale 2xYT medijum 0,1% glukoze željeni antibiotik. Te ploče su inkubirane na 30°C, 900 o/min oko 3 sata. Zatim je dodat rastvor izopropil β-D-1-tiogalaktopiranozida (IPTG) u finalnoj koncentraciji od 0,5 mM. Ploče su inkubirane preko noći na 30°C, 990 o/min.

[0336] Sledećeg dana, u kulture je dodat pufer za lizu (2x) boratni rastvor u puferovanom fiziološkom rastvoru (BBS) (Teknova kat. br. B0205) 2,5 mg/ml lizozima 10 u/ml benzonaze). Ploče su inkubirane 1 sat na sobnoj temperaturi, zatim je radi blokiranja dodat TBST sa 12,5% mleka. Nakon 30 min inkubacije, lizati ćelija su razblaženi 1:10 u TBST-u sa 2% mleka, i preneti na ELISA ploče.

1

b) ELISA:

[0337] ELISA ploče (Nunc Maxisorp) su premazane rastvorom huIL-17A u koncentraciji od 1 µg/ml tokom 1 sata. Ploče su isprane jednom pomoću TBST, i blokirane 1 sat pomoću TBST sa 5% mleka. Nakon blokiranja, ploče su 3 puta isprane pomoću TBST i zatim su razblaženi ćelijski lizati naneti na ploče i inkubirani 1 sat. Posle toga, ploče su 3 puta isprane pomoću TBST i inkubirane 1 sat sa sekundarnim antitelom konjugovanim sa AP.

[0338] Ploče su na kraju 3 puta isprane pomoću TBST i zatim inkubirane sa rastvorom supstrata (AttoPhos komplet supstrata, Roche kat. br. 11681 982 001). Ceo postupak je obavljen na sobnoj temperaturi.

[0339] Pored "klasične" ELISA opisane iznad, takođe je primenjena modifikovana ELISA radi boljeg pravljenja razlike između klonova sa veoma velikim afinitetom (u pikomolskom opsegu) prema ciljnom proteinu. ELISA sa "povratnom reakcijom" i "kompetitivna" ELISA su razvijene za tu namenu, kao što je u nastavku detaljno objašnjeno.

c) ELISA sa "povratnom reakcijom":

[0340] Za ovaj test, modifikacija u poređenju sa "klasičnim" protokolom za ELISA odnosila se na korak ispiranja posle koraka vezivanja (inkubacija ćelijskog lizata na ELISA pločama). U "klasičnom" protokolu, ploča je 3 puta isprana pomoću TBST. Rastvor za ispiranje je raspoređen i odmah usisan, bez vremena inkubacije. Za ELISA sa "povratnom reakcijom", ploča je isprana 6 puta tokom najmanje 3 sata. Ovo dugo ispiranje je povećalo rigoroznost testa, i omogućilo je identifikaciju klonova sa malom brzinom povratne reakcije.

d) "Kompetitivna" ELISA:

[0341] Ovaj modifikovani protokol za ELISA test uključuje dodatni korak nakon koraka vezivanja. Posle inkubacije lizata ćelija, ploče su 3 puta isprane pomoću TBST, i zatim je rastvor matičnog XAB1 (200 nM u TBST-u sa 2% mleka) inkubiran preko noći na sobnoj temperaturi. Ova duga inkubacija sa viškom matičnog Fab omogućila je, kao u slučaju ELISA sa "povratnom reakcijom", identifikaciju klonova sa malom brzinom povratne reakcije, što je

1 1

dovelo do boljeg razlikovanja klonova sa afinitetom u pikomolarnom opsegu. Ostatak protokola je bio sličan protokolu "klasične" ELISA. Sekundarno antitelo koje je upotrebljeno u ovom slučaju bilo je anti-Flag označeno antitelo konjugovano sa AP, jer su varijante Fab iz biblioteke imale oznaku Flag na C kraju teškog lanca, ali ne i Fab matičnog XAB1 korišćenog za takmičenje.

(iii) Karakterizacija kandidata

[0342] Pogoci identifikovani tokom skrininga proizvedeni su u većem obimu radi dalje fizičkohemijske karakterizacije, kao i da se potvrdi vezivanje sa velikim afinitetom za IL-17A, i/ili druge povoljne osobine u dodatnim testovima. Oni su detaljnije opisani u nastavku.

(iv) Rezultati: Skrining i inicijalna karakterizacija kandidata nakon afinitetnog sazrevanja XAB1

1) Pristup nasumične mutageneze (metoda A):

[0343] Nađeno je da stopa mutacije nakon kreiranja biblioteke PCR mutagenezom sklonom greškama dostiže maksimalno 2 do 3 mutacije po genu. Oko 3x10<4>klonova je pretraženo putem skrininga filtracije kolonija, i identifikovana su 94 poboljšana klona koji su prosleđeni na ispitivanje vezivanja, ELISA sa "povratnom reakcijom" i "kompetitivnu" ELISA. Podaci ELISA testa u kombinaciji sa rezultatima sekvenciranja doveli su do identifikacije 6 kandidata, ističući 3 moguća žarišta za poboljšanje, Gly na položaju 28 u Val (G28V) u LCDR1; Gly na položaju 66 u Val (G66V) ili Ser (G66S) u okviru 3; Asn92 u Asp (N92D) u LCDR3 (podaci nisu prikazani, ali je pozicioniranje identično kao kod XAB2, VL, tj. ID BR. SEKV: 25).

[0344] Primećen je zaustavni kodon u jednom od klonova, ali nije bio relevantan, jer je korišćeni soj E. coli bio narandžasti supresorski soj koji omogućava očitavanje. Na osnovu dobijenih podataka, izgleda da mutacije G28V i G66V izazivaju najbolja poboljšavanja. Varijanta XAB1, koja je sadržala dve pomenute tačkaste mutacije, kreirana je standardnim tehnikama molekularne biologije. Sledeća varijanta je klonirana tako da pored toga ima supstituciju N92D, kako bi se ispitalo da li bi uklanjanje potencijalnog posttranslacionog mesta deamidacije (N92, S93) bilo korisno. Urađeno je detaljnije profilisanje ove dve varijante,

1 2

konkretno varijante sa trostrukom mutacijom koja se pominje kao XAB_A2 što je konačno dovelo do XAB2. U XAB2, aminokiseline broj 1 do 23 prema Kabatovoj definiciji čine okvir 1, aminokiseline broj 24 do 34 (Kabat) čine LCDR1, aminokiseline broj 35 do 49 (Kabat) čine okvir 2, aminokiseline 50 do 56 (Kabat) čine LCDR2, aminokiseline 57 do 88 (Kabat) čine okvir 3, aminokiseline 89 do 97 (Kabat) čine LCDR3, i aminokiseline 98 do 107 (Kabat) čine okvir 4. Takođe se primenjuje ista podela drugih VL sekvenci prema otelotvorenjima pronalaska.

[0345] Tako, supstitucija G66V pomenuta iznad nalazi se u regionu okvira, koji se zove spoljašnja petlja. Ovaj region okvira u nekim slučajevima može da doprinese vezivanju. Na bazi dostupnih strukturnih informacija, naknadno je predloženo da bi ova mutacija zaista mogla da interaguje sa regionom IL-17A koji se ne može razdvojiti od kristalne strukture, ali može biti u blizini spoljašnje petlje.

2) Pristup racionalne mutageneze (metoda B):

[0346] Napravljen je snimak distribucije aminokiselina na randomizovanim položajima putem sekvenciranja 32 nasumično izabrana člana. Nije bilo značajne pristrasnosti, mada se sa ovako malim brojem sekvenci ne može uraditi statistika. Oko 4x10<4>klonova je pretraženo, što je bio preveliki broj uzoraka za teoretsku veličinu biblioteke koja iznosi 8000. Identifikovan je veliki broj pogodaka, i 2630 klonova je prosleđeno na ELISA skrining. Nakon vezivanja, ELISA sa "povratnom reakcijom" i "kompetitivne" ELISA, sekvencirano je 60 klonova sa najvećim poboljšanjima. Kod tih 60 klonova nađene su 22 jedinstvene sekvence, i rezultat je predstavljen u Tabeli 11.

Tabela 11. ELISA svih izabranih 22 jedinstvena kandidata. Vrednosti su normalizovane na matični Fab XAB1. Prikaz pokazuje koliko često je neka sekvenca nađena u ovih 60 pogodaka. Razlika u aminokiselinskim sekvencama je data u tri poslednje kolone. XAB1

1

ima aminokiseline I S A na tim položajima. ELISA signali određeni iz sirovog ekstrakta Fab ekspresije kulture iz E. coli.

[0347] Od 22 jedinstvena klona, 6 je odabrano za obim od 0,5 l standardne ekspresije E. coli i prečišćavanje u dva koraka putem IMAC (afinitetna hromatografija na imobilisanom metalu)

1 4

(Ni-NTA) i SEC (gel filtracija velike rezolucije). Prečišćeni Fab su zatim korišćeni da potvrde poboljšanje vezivanja putem ELISA.

[0348] Rezultati ELISA testa izabranih i prečišćenih kandidata Fab u poređenju sa XAB1 prikazani su na Slici 3, gde brojevi dijagrama odgovaraju kandidatu na sledeći način: 1 je MB440; 2 je MB464; 3 je MB468; 4 je MB444; 5 je MB435; 6 je MB463; 7 je XAB1.

[0349] Slika 3A je grafikon koji prikazuje normalizovan signal u odnosu na Fab koncentraciju (M). Može se videti da su svi izabrani klonovi doveli do većeg signala nego XAB1. Slika 3B je grafikon koji prikazuje normalizovan preostali signal u odnosu na vreme inkubacije ispiranja (sati). Svi izabrani klonovi su doveli do većeg signala nego XAB1. Slika 3C je grafikon koji prikazuje normalizovan signal u odnosu na koncentraciju Fab konkurenta (M). Još jednom, može se videti da su svi izabrani klonovi doveli do većeg signala nego XAB1.

Primer 4. Targetiranje potencijalnog posttranslacionog mesta deamidacije.

[0350] Pronalazači su pretpostavili da aminokiselinski motiv asparagin praćen glicinom (NG) ili, u manjoj meri i kada je praćen serinom (NS), može biti podložan posttranslacionoj deamidaciji. Takvi motivi su prisutni u L-CDR2 (položaj 56/57) i L-CDR3 (92/93) XAB1 antitela. Četiri varijante IgG su generisane kako bi se testiralo da li NG mesto može da se ukloni a da to ne utiče na svojstva vezivanja i aktivnosti. Ove četiri varijante tačkaste mutacije su klonirane standardnim procedurama molekularne biologije i proizvedene standardnom tranzijentnom transfekcijom HEK ćelija na skali od 100 ml i prečišćene na koloni sa proteinom A.

[0351] Prečišćene varijante IgG su analizirane u in vitro testu neutralizacije (npr. kao što je opisano u primerima 12 i 13) radi poređenja njihove aktivnosti sa IgG matičnog XAB1. Rezultati su pokazali da su od ove četiri varijante, tri imale smanjenu aktivnost. Ali kandidatsko XAB_B12 (mutacija N56Q) zadržalo je aktivnost u poređenju sa matičnim XAB1.

1

Tabela 12. Pregled modifikacija sekvenci za XAB1 i odgovarajući efekat na in vitro neutralizaciju.

[0352] Nakon što je najprikladnija supstitucija ovako identifikovana, ona je uvedena u pogotke koji su najviše obećavali, identifikovane tokom procesa afinitetnog sazrevanja, što je dalo XAB2 (XAB_A2 N56Q), XAB3 (MB468 N56Q), XAB4 (MB435 N56Q). Oni su proizvedeni standardnom tranzijentnom transfekcijom HEK ćelija i prečišćeni na koloni sa proteinom A zajedno sa XAB5 (MB435), koji je i dalje imao NG mesto.

[0353] NG motiv je uklonjen (N56Q) kod XAB2, XAB3, XAB4, ali je i dalje prisutan u XAB5. NS motiv u L-CDR3 je uklonjen (N92D) u XAB2, kako je otkriveno tokom pristupa nasumičnog afinitetnog sazrevanja. Stoga, optimalan komplet varijanti je bio dostupan za testiranje podložnosti deamidaciji potencijalnih mesta.

[0354] Četiri prečišćena kandidata su razblažena u puferu pH 8 i inkubirana na 40°C kako bi se izazvala reakcija deamidacije. Uzeti su alikvoti u nekoliko vremenskih tačaka kako bi se utvrdio stepen deamidacije putem katjonske izmenjivačke hromatografije (CEX), u skladu sa

1

principima koji su dobro poznati stručnjaku, i utvrđena je in vitro aktivnost neutralizacije pomoću testa zasnovanog na ćelijama (npr. kao što je opisano u primerima 12 i 13).

[0355] Rezultati CEX su pokazali porast procenta kiselih varijanti tokom vremena, kao što je očekivano za svaki IgG, verovatno zahvaljujući posttranslacionim mestima za modifikaciju u okviru antitela, ali stepen porasta je bio veći za XAB5 nego za ostale kandidate, tj.72% prema 46% nakon jedne nedelje i 94% prema 83% nakon 4 nedelje. Konačno, rezultati in vitro testa aktivnosti neutralizacije su bili u korelaciji sa rezultatima CEX, pokazujući da je XAB5 izgubio aktivnost nakon 4 nedelje inkubiranja tokom stanja prinudne deamidacije. Metodologija gel hromatografije povezane sa višeugaonim rasipanjem svetla (SEC-MALS), koja je dobro poznata stručnjaku, korišćena je za praćenje nivoa agregacije u uzorcima.

[0356] Podaci su sažeti u Tabeli 13.

1

[0357] Ovi podaci ukazuju na uspešno uklanjanje potencijalnog posttranslacionog mesta za deamidaciju koje je moglo da utiče na aktivnost antitela. To je povoljno, jer je zato verovatnije da će XAB2, XAB3 i XAB4 postići homogeniji proizvod nego XAB1, jer ne može doći do posttranslacione deamidacije koja bi uticala na aktivnost antitela tokom proizvodnje ili skladištenja.

Primer 5. Rendgenska analiza varijanti antitela dobijenih afinitetnim sazrevanjem: XAB2

[0358] Ukratko, XAB2 Fv je kloniran i eksprimiran u E. coli TGf1 sa C-terminalnom heksahistidinskom oznakom na teškom lancu i C-terminalnom Strep-oznakom na lakom lancu, u skladu sa principima koji su dobro poznati stručnjaku. Rekombinantni protein je prečišćen hromatografijom sa Ni-helatom i gel hromatografijom (SPX-75).

[0359] Kompleks XAB2 Fv fragmenta sa humanim IL-17A je zatim pripremljen pomoću standardne metodologije. Ukratko, humani IL-17A (1,5 mg) je pomešan sa viškom XAB2 Fv (3,7 mg) i kompleks je propušten kroz kolonu S100 za gel hromatografiju, u 10 mM TRIS pH 7,4, 25 mM NaCl. Proteinski kompleks je zatim koncentrovan ultrafiltracijom do 26,3 mg/ml i kristalisan.

[0360] Praćeni su standardni protokoli kristalizacije. Ukratko, kristali su uzgajani na 19°C u SD2 pločama sa 96 bunarčića, korišćenjem metode difuzije pare u sedećim kapima. Osnovni rastvor proteina je pomešan 1:1 sa puferom za kristalizaciju koji sadrži 0,2 M kalcijum acetat, 20% PEG 3,350. Ukupna veličina kapi je bila 0,4 µl. Pre rendgenskog prikupljanja, jedan kristal je nakratko prebačen u 1:1 smešu pufera za kristalizaciju koji sadrži 30% PEG 3350, 30% glicerola, a zatim je brzo ohlađen u tečnom azotu.

[0361] Prikupljanje i obrada rendgenskih podataka obavljeni su pomoću standardnih protokola. Ukratko, rendgenski podaci do rezolucije od 2,0 Å prikupljeni su na uređaju Swiss Light Source, linija zraka X06DA, sa CCD detektorom MAR225 i rendgenskim zračenjem od 1,0000 Å. Ukupno je snimljeno 360 slika, svaka sa oscilacijom od 0,5° na rastojanju od kristala do detektora koje je iznosilo 190 mm, i obrađene su pomoću softverskog paketa XDS. Kristal je spadao u prostornu grupu P21212 sa parametrima ćelije a=184,72 Å, b=55,56 Å, c=71,11 Å, α = β = γ = 90°. Rezolucija R-sym do 2,0 Å bila je 5,2% i kompletnost podataka 100,0%.

1

[0362] Pošto je kristal XAB2 Fv kompleksa veoma izomorfan sa kristalom XAB1 Fv kompleksa (Primer 2), struktura potonjeg je korišćena kao ulazni model za inicijalno pokretanje kristalografskog poboljšavanja sa programom CNX. Iterativna korekcija i poboljšavanje modela su izvršeni pomoću Coot (Crystallographic Object-Oriented Toolkit, komplet alata orijentisan na kristalografski objekat) i CNX (Crystallography & NMR eXplorer) verzija 2002, sve dok više nisu mogla da se naprave značajna poboljšanja kristalografskog modela. Konačne vrednosti R i R-free bile su 0,214, odnosno 0,259. Konačni usavršeni model je imao devijaciju korena srednje kvadratne greške (RMSD) od idealne dužine veza i uglova veza 0,005 Å, odnosno 0,9°.

Rezultati

[0363] Rezultati rendgenskog poboljšavanja kompleksa XAB2 Fv sa humanim IL-17A su dati u Tabeli 14, a trodimenzionalna struktura ovog kompleksa je prikazana na Slici 4. Analiza rendgenske kristalografije potvrdila je da je XAB2 varijanta antitela zadržala ciljnu specifičnost i vezivala se sa visokim afinitetom za suštinski isti epitop kao i matično XAB1 antitelo. Međutim, u strukturi kompleksa XAB1, petlja lakog lanca koja sadrži Gly66 usvaja konformaciju koja više nije moguća kada se taj ostatak mutira u valin. Kao posledica, u XAB2 kompleksu, mutacija Gly66 u valin (G66V) prisiljava petlju da usvoji novu konformaciju, a bočni lanac valina ostvaruje hidrofobni kontakt sa Ile51 iz IL-17A (Slika 5). Još dva IL-17A ostatka, Pro42 i Arg43, postaju vidljiva (određena) u ovoj kristalnoj strukturi. Ti antigenski ostaci ostvaruju dodatne vezujuće interakcije sa XAB2 antitelom, konkretno hidrofobni kontakt sa Val28 (Slika 5).

Tabela 14. Rendgensko poboljšavanje kompleksa XAB2 Fv sa IL-17A dobijeno pomoću programa CNX.

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 POBOLJŠAVANJE.

NAPOMENA 3 PROGRAM : CNX 2002

NAPOMENA 3 AUTORI : Brunger, Adams, Clore, Delano,

NAPOMENA 3 Gros, Grosse-Kunstleve, Jiang,

NAPOMENA 3 Kuszewski, Nilges, Pannu, Read,

1

NAPOMENA 3 Rice, Simonson, Warren

NAPOMENA 3 i

NAPOMENA 3 Accelrys Inc.,

NAPOMENA 3 (Badger, Berard, Kumar, Szalma,

NAPOMENA 3 Yip, Dzakula).

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 PODACI KORIŠĆENI ZA POBOLJŠAVANJE.

NAPOMENA 3 OPSEG REZOLUCIJE VISOKI (ANGSTREMA): 2,00 NAPOMENA 3 OPSEG REZOLUCIJE NISKI (ANGSTREMA): 71,11 NAPOMENA 3 PRESEK PODATAKA (SIGMA(F)) : 0,0

NAPOMENA 3 PRESEK PODATAKA VISOKI (ABS(F)) : 2329350,20 NAPOMENA 3 PRESEK PODATAKA NISKI (ABS(F)) : 0,000000 NAPOMENA 3 KOMPLETNOST (RAD TEST) (%) : 99,8

NAPOMENA 3 BROJ REFLEKSIJA : 50409

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 POSTAVLJENO PREMA PODACIMA KORIŠĆENIM ZA POBOLJŠAVANJE.

NAPOMENA 3 POSTUPAK UNAKRSNE VALIDACIJE : U CELINI NAPOMENA 3 IZBOR KOMPLETA TESTOVA ZA FREE R VREDNOST : NASUMIČNO NAPOMENA 3 R VREDNOST (RADNI KOMPLET) : 0,214

NAPOMENA 3 FREE R VREDNOST : 0,259

NAPOMENA 3 VELIČINA KOMPLETA TESTOVA ZA FREE R VREDNOST (%): 5,0

NAPOMENA 3 BROJ KOMPLETA TESTOVA ZA FREE R VREDNOST : 2521 NAPOMENA 3 PROCENJENA GREŠKA FREE R VREDNOSTI : 0,005 NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 UKLAPANJE U BIN SA NAJVEĆOM REZOLUCIJOM.

NAPOMENA 3 UKUPAN BROJ UPOTREBLJENIH BINOVA : 6 NAPOMENA 3 OPSEG REZOLUCIJE BINA VISOKI (A) : 2,00 NAPOMENA 3 OPSEG REZOLUCIJE BINA NISKI (A) : 2,13

NAPOMENA 3 KOMPLETNOST BINA (RAD TEST) (%) :100,0 NAPOMENA 3 REFLEKSIJE U BINU (RADNI KOMPLET) : 7858

11

NAPOMENA 3 R VREDNOST BINA (RADNI KOMPLET) : 0,262 NAPOMENA 3 FREE R VREDNOST BINA : 0,304

NAPOMENA 3 VELIČINA KOMPLETA TESTOVA ZA FREE R VREDNOST BINA (%): 5,0

NAPOMENA 3 BROJ KOMPLETA TESTOVA ZA FREE R VREDNOST BINA : 414

NAPOMENA 3 PROCENJENA GREŠKA FREE R VREDNOSTI BINA : 0,015 NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 BROJ ATOMA KORIŠĆENIH U POBOLJŠAVANJU KOJI NISU VODONIK.

NAPOMENA 3 ATOMI PROTEINA : 5055

NAPOMENA 3 ATOMI NUKLEINSKIH KISELINA : 0

NAPOMENA 3 HETEROGENI ATOMI : 0

NAPOMENA 3 ATOMI RASTVARAČA : 376

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 B VREDNOSTI.

NAPOMENA 3 IZ VILSONOVOG DIJAGRAMA (A**2) : 27,8 NAPOMENA 3 SREDNJA B VREDNOST (UKUPNO, A**2) : 37,3 NAPOMENA 3 UKUPNA ANIZOTROPSKA B VREDNOST.

NAPOMENA 3 B11 (A**2) : -0,85

NAPOMENA 3 B22 (A**2) : 3,93

NAPOMENA 3 B33 (A**2) : -3,08

NAPOMENA 3 B12 (A**2) : 0,00

NAPOMENA 3 B13 (A**2) : 0,00

NAPOMENA 3 B23 (A**2) : 0,00

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 MODELOVANJE SA VOLUMINOZNIM RASTVARAČEM.

NAPOMENA 3 UPOTREBLJENA METODA : RAVNI MODEL

NAPOMENA 3 KSOL : 0,338594

NAPOMENA 3 BSOL : 46,0594 (A**2)

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 PROCENJENA GREŠKA KOORDINATA.

NAPOMENA 3 ESD IZ LUCATIJEVOG DIJAGRAMA (A) : 0,25 NAPOMENA 3 ESD IZ SIGMAA (A) : 0,19

NAPOMENA 3 PRESEK NISKE REZOLUCIJE (A) : 5,00

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 PROCENJENA GREŠKA KOORDINATA UNAKRSNOM VALIDACIJOM.

NAPOMENA 3 ESD IZ LUCATIJEVOG DIJAGRAMA C-V (A) : 0,31 NAPOMENA 3 ESD IZ SIGMAA C-V (A) : 0,22

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 ODSTUPANJA RMS OD IDEALNIH VREDNOSTI.

NAPOMENA 3 DUŽINE VEZA (A) : 0,005

NAPOMENA 3 UGLOVI VEZA (STEPENI) : 0,9

NAPOMENA 3 DIHEDRALNI UGLOVI (STEPENI) : 21,0 NAPOMENA 3 NEODGOVARAJUĆI UGLOVI (STEPENI) : 0,70 NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 IZOTROPSKI TOPLOTNI MODEL : OGRANIČEN

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 OGRANIČENJA IZOTROPSKOG TOPLOTNOG FAKTORA. RMS SIGMA NAPOMENA 3 VEZA GLAVNOG NIZA (A**2) : 1,49 ; 1,50 NAPOMENA 3 UGAO GLAVNOG NIZA (A**2) : 2,44 ; 2,00 NAPOMENA 3 VEZA BOČNOG NIZA (A**2) : 1,95 ; 2,00 NAPOMENA 3 UGAO BOČNOG NIZA (A**2) : 2,93 ; 2,50 NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 NCS MODEL : NEMA

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 OGRANIČENJA NCS. RMS SIGMA/TEŽINA NAPOMENA 3 GRUPA 1 POZICIONA (A) : NULA ; NULA NAPOMENA 3 GRUPA 1 B-FAKTOR (A**2) : NULA ; NULA NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 DATOTEKA SA PARAMETRIMA 1 : protein_rep.param NAPOMENA 3 DATOTEKA SA PARAMETRIMA 2 : water_rep.param NAPOMENA 3 DATOTEKA SA PARAMETRIMA 3 : ion.param

NAPOMENA 3 DATOTEKA SA TOPOLOGIJOM 1 : protein.top

NAPOMENA 3 DATOTEKA SA TOPOLOGIJOM 2 : water.top

NAPOMENA 3 DATOTEKA SA TOPOLOGIJOM 4 : ion.top

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 OSTALE NAPOMENE O POBOLJŠAVANJU: NULA

SSBOND 1 CYS L 23 CYS L 88

SSBOND 2 CYS H 22 CYS H 96

SSBOND 3 CYS A 23 CYS A 88

SSBOND 4 CYS B 22 CYS B 96

SSBOND 5 CYS C 94 CYS C 144

SSBOND 6 CYS C 99 CYS C 146

SSBOND 7 CYS D 94 CYS D 144

SSBOND 8 CYS D 99 CYS D 146

CRYST1 184,719 55,558 71,109 90,00 90,00 90,00 P 2121 2 24

ORIGX1 1,000000 0,000000 0,000000 0,00000

ORIGX2 0,000000 1,000000 0,000000 0,00000

ORIGX3 0,000000 0,000000 1,000000 0,00000

SCALE1 0,005414 0,000000 0,000000 0,00000

SCALE2 0,000000 0,017999 0,000000 0,00000

SCALE3 0,000000 0,000000 0,014063 0,00000

[0364] Slika 4 pruža trodimenzionalnu strukturu XAB2 Fv kompleksa sa humanim IL-17A. Slika 4A prikazuje dva XAB2 Fv fragmenta u prostornom prikazu, a IL-17A homodimer je prikazan kao pojednostavljena struktura. Slika 4B prikazuje dva XAB2 Fv fragmenta kao pojednostavljenu strukturu, a IL-17A homodimer je prikazan u prostornom prikazu. Teški i laki lanac XAB2 Fv su prikazani tamnom, odnosno svetlosivom bojom. Jedan lanac IL-17A homodimera je prikazan svetlosivom bojom, drugi je prikazan tamnosivom.

[0365] Slika 5 prikazuje trodimenzionalnu strukturu kompleksa XAB2 Fv sa humanim IL-17A kao uvećani prikaz L-CDR1 i regiona spoljašnje petlje antitela, koji nose mutacije glicina u valin (G28V, odnosno G66V). G66V mutacija dovodi do promene u konformaciji spoljašnje petlje, kao i do dodatnih kontakata antitelo-antigen sa IL-17A ostacima Pro42, Arg43 i Ile51. XAB2 Fv je prikazan na svetlosivom crtežu, a humani IL-17A homodimer je prikazan tamnijim nijansama sive. Ile51 ne pripada istoj IL-17A podjedinici kao Pro42 i Arg43.

11

Primer 6. Rendgenska analiza varijanti antitela dobijenih afinitetnim sazrevanjem: XAB5

[0366] XAB5 Fv je kloniran i eksprimiran u E. coli TGf1 sa C-terminalnom heksahistidinskom oznakom na teškom lancu i C-terminalnom Strep-oznakom na lakom lancu. Rekombinantni protein je prečišćen hromatografijom sa Ni-helatom, a zatim gel filtracijom na koloni SPX-75 u PBS puferu. LC-MS analiza je pokazala očekivanu masu teškog lanca (13703,4 Da), i prisustvo dva oblika lakog lanca: kompletne dužine (115aa; 12627,3 Da; oko 27%) i sa skraćenom Strep-oznakom (A1 do Q112; 12222,8 Da; oko 73%).

[0367] Kompleks XAB5 Fv fragmenta sa humanim IL-17A je zatim pripremljen pomoću standardne metodologije. Ukratko, humani IL-17A (1,4 mg) mešan je sa viškom XAB5 Fv (3,4 mg) i kompleks je propušten kroz kolonu S100 za gel hromatografiju, u 10 mM TRIS pH 7,4, 25 mM NaCl. Proteinski kompleks je zatim koncentrovan ultrafiltracijom do 16,5 mg/ml i kristalisan.

[0368] Praćeni su standardni protokoli kristalizacije. Ukratko, kristali su uzgajani na 19°C u SD2 pločama sa 96 bunarčića, korišćenjem metode difuzije pare u sedećim kapima. Osnovni rastvor proteina je pomešan 1:1 sa puferom za kristalizaciju koji sadrži 15% PEG 5000 MME, 0,1 M MES pH 6,5, 0,2 M amonijum sulfat. Ukupna veličina kapi je bila 0,4 µl. Pre rendgenskog prikupljanja, jedan kristal je nakratko prebačen u 1:1 smešu pufera za kristalizaciju koji sadrži 20% PEG 5000, 40% glicerola, a zatim je brzo ohlađen u tečnom azotu.

[0369] Prikupljanje i obrada rendgenskih podataka obavljeni su pomoću standardnih protokola. Ukratko, rendgenski podaci do rezolucije od 3,1 Å prikupljeni su na uređaju Swiss Light Source, linija zraka X10SA, sa detektorom Pilatus i rendgenskim zračenjem od 1,00000 Å. Ukupno je snimljeno 720 slika svaka sa oscilacijom od 0,25° na rastojanju od kristala do detektora koje je iznosilo 520 mm, i obrađene su pomoću softverskog paketa XDS. Kristal je spadao u prostornu grupu C2221sa parametrima ćelije a=55,37 Å, b=84,08 Å, c=156,35 Å, α = β = γ = 90°. Rezolucija R-sym do 3,1 Å bila je 8,9% i kompletnost podataka 99,7%.

[0370] Struktura je određena molekulskom zamenom pomoću programa Phaser, korišćenjem modela za pretragu dobijenih iz prethodno utvrđenog kompleksa XAB2 Fv. Iterativna korekcija i poboljšavanje modela su izvršeni pomoću Coot (Crystallographic Object-Oriented Toolkit, komplet alata orijentisan na kristalografski objekat) i CNX (Crystallography & NMR eXplorer) verzija 2002, sve dok više nisu mogla da se naprave značajna poboljšanja kristalografskog modela. Konačne vrednosti R i R-free bile su 0,222, odnosno 0,305. Konačni usavršeni model je imao devijaciju korena srednje kvadratne greške (RMSD) od idealne dužine veza i uglova veza 0,008 Å, odnosno 1,2°.

Rezultati

[0371] Rezultati rendgenskog poboljšavanja kompleksa XAB5 Fv sa humanim IL-17A su dati u Tabeli 15, a trodimenzionalna struktura ovog kompleksa je prikazana na Slici 6. U toj kristalnoj strukturi XAB5 Fv kompleks ima preciznu kristalografsku dvostruku simetriju: asimetrična jedinica kristala sadrži samo polovinu celog dimernog kompleksa. XAB5 Fv ostvaruje kontakt sa obe podjedinice IL-17A, ali velika većina intermolekulskog kontakta je sa samo jednom podjedinicom (oko 90% površine IL-17 pokrivene sa XAB5 Fv se pripisuje samo jednoj IL-17A podjedinici). Analiza rendgenske kristalografije potvrdila je da je XAB5 varijanta antitela zadržala ciljnu specifičnost i vezivala se sa visokim afinitetom za suštinski isti epitop kao i matično XAB1 antitelo. Međutim, u strukturi XAB5 kompleksa, CDRL1 lakog lanca ima tri tačkaste mutacije koje obezbeđuju pojačano vezivanje za humani IL-17A. Trp 31 iz lakog lanca XAB5 učestvuje u snažnim hidrofobnim/aromatičnim interakcijama sa Tyr 85 iz IL-17A i, u manjoj meri, sa Phe 133 iz IL-17A. Asn 30 iz lakog lanca XAB5 daje vodoničnu vezu karbonilu glavnog lanca Pro 130 iz IL-17A i u Van der Valsovom kontaktu je sa Leu 49 (ista podjedinica IL-17A) i Val 45 (druga podjedinica IL-17A). Glu 32 iz lakog lanca XAB5 stabilizuje CDRL1 petlju putem intramolekulskih H-vezanih interakcija. Nadalje, Glu 32 pravi povoljne elektrostatičke interakcije sa Arg 124 iz IL-17A, ali ne učestvuje u interakciji sonog mosta "licem u lice" (Slika 7).

Tabela 15. Rendgensko poboljšavanje kompleksa XAB5 Fv sa IL-17A dobijeno pomoću programa CNX.

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 POBOLJŠAVANJE.

NAPOMENA 3 PROGRAM : CNX 2002

11

NAPOMENA 3 AUTORI : Brunger, Adams, Clore, Delano,

NAPOMENA 3 Gros, Grosse-Kunstleve, Jiang,

NAPOMENA 3 Kuszewski, Nilges, Pannu, Read,

NAPOMENA 3 Rice, Simonson, Warren

NAPOMENA 3 i

NAPOMENA 3 Accelrys Inc.,

NAPOMENA 3 (Badger, Berard, Kumar, Szalma,

NAPOMENA 3 Yip, Dzakula).

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 PODACI KORIŠĆENI ZA POBOLJŠAVANJE.

NAPOMENA 3 OPSEG REZOLUCIJE VISOKI (ANGSTREMA): 3,11 NAPOMENA 3 OPSEG REZOLUCIJE NISKI (ANGSTREMA): 46,25 NAPOMENA 3 PRESEK PODATAKA (SIGMA(F)) : 0,0

NAPOMENA 3 PRESEK PODATAKA VISOKI (ABS(F)) : 3778977,84 NAPOMENA 3 PRESEK PODATAKA NISKI (ABS(F)) : 0,000000 NAPOMENA 3 KOMPLETNOST (RAD TEST) (%) : 99,0

NAPOMENA 3 BROJ REFLEKSIJA : 6801

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 POSTAVLJENO PREMA PODACIMA KORIŠĆENIM ZA POBOLJŠAVANJE.

NAPOMENA 3 POSTUPAK UNAKRSNE VALIDACIJE : U CELINI NAPOMENA 3 IZBOR KOMPLETA TESTOVA ZA FREE R VREDNOST : NASUMIČNO NAPOMENA 3 R VREDNOST (RADNI KOMPLET) : 0,222

NAPOMENA 3 FREE R VREDNOST : 0,305

NAPOMENA 3 VELIČINA KOMPLETA TESTOVA ZA FREE R VREDNOST (%): 5,0

NAPOMENA 3 BROJ KOMPLETA TESTOVA ZA FREE R VREDNOST : 340 NAPOMENA 3 PROCENJENA GREŠKA FREE R VREDNOSTI : 0,017 NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 UKLAPANJE U BIN SA NAJVEĆOM REZOLUCIJOM.

NAPOMENA 3 UKUPAN BROJ UPOTREBLJENIH BINOVA : 6 NAPOMENA 3 OPSEG REZOLUCIJE BINA VISOKI (A) : 3,10

11

NAPOMENA 3 OPSEG REZOLUCIJE BINA NISKI (A) : 3,29

NAPOMENA 3 KOMPLETNOST BINA (RAD TEST) (%) : 89,9

NAPOMENA 3 REFLEKSIJE U BINU (RADNI KOMPLET) : 961 NAPOMENA 3 R VREDNOST BINA (RADNI KOMPLET) : 0,293 NAPOMENA 3 FREE R VREDNOST BINA : 0,403

NAPOMENA 3 VELIČINA KOMPLETA TESTOVA ZA FREE R VREDNOST BINA (%): 4,9

NAPOMENA 3 BROJ KOMPLETA TESTOVA ZA FREE R VREDNOST BINA : 50

NAPOMENA 3 PROCENJENA GREŠKA FREE R VREDNOSTI BINA : 0,057 NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 BROJ ATOMA KORIŠĆENIH U POBOLJŠAVANJU KOJI NISU VODONIK.

NAPOMENA 3 ATOMI PROTEINA : 2492

NAPOMENA 3 ATOMI NUKLEINSKIH KISELINA : 0

NAPOMENA 3 HETEROGENI ATOMI : 5

NAPOMENA 3 ATOMI RASTVARAČA : 4

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 B VREDNOSTI.

NAPOMENA 3 IZ VILSONOVOG DIJAGRAMA (A**2) : 85,2 NAPOMENA 3 SREDNJA B VREDNOST (UKUPNO, A**2) : 71,0 NAPOMENA 3 UKUPNA ANIZOTROPSKA B VREDNOST.

NAPOMENA 3 B11 (A**2) : 23,21

NAPOMENA 3 B22 (A**2) : 7,23

NAPOMENA 3 B33 (A**2) :-30,44

NAPOMENA 3 B12 (A**2) : 0,00

NAPOMENA 3 B13 (A**2) : 0,00

NAPOMENA 3 B23 (A**2) : 0,00

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 MODELOVANJE SA VOLUMINOZNIM RASTVARAČEM.

NAPOMENA 3 UPOTREBLJENA METODA : RAVNI MODEL

NAPOMENA 3 KSOL : 0,389339

NAPOMENA 3 BSOL : 59,5295 (A**2)

11

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 PROCENJENA GREŠKA KOORDINATA.

NAPOMENA 3 ESD IZ LUCATIJEVOG DIJAGRAMA (A) : 0,35 NAPOMENA 3 ESD IZ SIGMAA (A) : 0,42

NAPOMENA 3 PRESEK NISKE REZOLUCIJE (A) : 5,00

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 PROCENJENA GREŠKA KOORDINATA UNAKRSNOM VALIDACIJOM.

NAPOMENA 3 ESD IZ LUCATIJEVOG DIJAGRAMA C-V (A) : 0,51 NAPOMENA 3 ESD IZ SIGMAA C-V (A) : 0,45

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 ODSTUPANJA RMS OD IDEALNIH VREDNOSTI.

NAPOMENA 3 DUŽINE VEZA (A) : 0,008

NAPOMENA 3 UGLOVI VEZA (STEPENI) : 1,2

NAPOMENA 3 DIHEDRALNI UGLOVI (STEPENI) : 23,1 NAPOMENA 3 NEODGOVARAJUĆI UGLOVI (STEPENI) : 0,73 NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 IZOTROPSKI TOPLOTNI MODEL : OGRANIČEN

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 OGRANIČENJA IZOTROPSKOG TOPLOTNOG FAKTORA. RMS SIGMA NAPOMENA 3 VEZA GLAVNOG NIZA (A**2) : 1,40 ; 1,50 NAPOMENA 3 UGAO GLAVNOG NIZA (A**2) : 2,49 ; 2,00 NAPOMENA 3 VEZA BOČNOG NIZA (A**2) : 1,82 ; 2,00 NAPOMENA 3 UGAO BOČNOG NIZA (A**2) : 2,93 ; 2,50 NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 NCS MODEL : NEMA

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 OGRANIČENJA NCS. RMS SIGMA/TEŽINA NAPOMENA 3 GRUPA 1 POZICIONA (A) : NULA ; NULA NAPOMENA 3 GRUPA 1 B-FAKTOR (A**2) : NULA ; NULA NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 DATOTEKA SA PARAMETRIMA 1 : protein_rep.param

11

NAPOMENA 3 DATOTEKA SA PARAMETRIMA 2 : water_rep.param

NAPOMENA 3 DATOTEKA SA PARAMETRIMA 3 : ion.param

NAPOMENA 3 DATOTEKA SA TOPOLOGIJOM 1 : protein_no_cter.top

NAPOMENA 3 DATOTEKA SA TOPOLOGIJOM 2 : water.top

NAPOMENA 3 DATOTEKA SA TOPOLOGIJOM 4 : ion.top

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 OSTALE NAPOMENE O POBOLJŠAVANJU: NULA

SSBOND 1 CYS S 23 CYS S 88

SSBOND 2 CYS S 22 CYS S 96

SSBOND 3 CYS S 94 CYS S 144

SSBOND 4 CYS S 99 CYS S 146

CRYST1 55,372 84,082 156,350 90,00 90,00 90,00 C 22 21 24

ORIGX1 1,000000 0,000000 0,000000 0,00000

ORIGX2 0,000000 1,000000 0,000000 0,00000

ORIGX3 0,000000 0,000000 1,000000 0,00000

SCALE1 0,018060 0,000000 0,000000 0,00000

SCALE2 0,000000 0,011893 0,000000 0,00000

SCALE3 0,000000 0,000000 0,006396 0,00000

[0372] Slika 6 pruža trodimenzionalnu strukturu XAB5 Fv kompleksa sa humanim IL-17A. Kompletni homodimerni kompleks sa preciznom kristalografskom dvostrukom simetrijom je ovde prikazan. Slika 6A prikazuje dva XAB5 Fv fragmenta u prostornom prikazu, a IL-17A homodimer je prikazan kao pojednostavljena struktura. Slika 6B prikazuje dva XAB5 Fv fragmenta pojednostavljenu strukturu, a IL-17A homodimer je prikazan u prostornom prikazu. Teški i laki lanac XAB5 Fv su prikazani tamnom, odnosno svetlosivom bojom. Jedan lanac IL-17A homodimera je prikazan svetlosivom bojom, drugi je prikazan tamnosivom.

[0373] Slika 7 pruža trodimenzionalnu strukturu XAB5 Fv kompleksa sa humanim IL-17A. Uvećani prikaz L-CDR1 antitela koji nosi tri mutacije otkrivene pomoću strukturno vođenog pristupa pristrasne biblioteke: Asn 30, Trp 31 i Glu 32. Ovi bočni lanci XAB5 doprinose novim interakcijama vezivanja sa antigenskim humanim IL-17A, konkretno sa IL-17A ostacima Tyr85, Phe133, Arg124, Pro 130, Leu 49 (svi iz iste podjedinice IL-17A) i Val 45 (iz druge podjedinice IL-17A).

11

Primer 7. Rendgenska analiza varijanti antitela dobijenih afinitetnim sazrevanjem: XAB4

[0374] XAB4 Fv je kloniran i eksprimiran u E. coli TG1 ćelijama sa C-terminalnom heksahistidinskom oznakom na teškom lancu i C-terminalnom Strep-oznakom na lakom lancu. Rekombinantni protein je prečišćen hromatografijom sa Ni-helatom.

[0375] Kompleks XAB4 Fv fragmenta sa humanim IL-17A je zatim pripremljen pomoću standardne metodologije. Ukratko, humani IL-17A (0,5 mg) je pomešan sa viškom XAB4 Fv (1,2 mg) i kompleks je propušten kroz kolonu SPX-75 za gel hromatografiju, u 10 mM TRIS pH 7,4, 25 mM NaCl. Proteinski kompleks je zatim koncentrovan ultrafiltracijom do 6,9 mg/ml i kristalisan.

[0376] Praćeni su standardni protokoli kristalizacije. Ukratko, kristali su uzgajani na 19°C u VDX pločama sa 24 bunarčića, korišćenjem metode difuzije pare u sedećim kapima. Osnovni rastvor proteina je pomešan 2:1 sa puferom za kristalizaciju koji sadrži 15% PEG 5000 MME, 0,1 M MES pH 6,5, 0,2 M amonijum sulfat. Ukupna veličina kapi je bila 3,0 µl. Pre rendgenskog prikupljanja, jedan kristal je nakratko prebačen u 1:1 smešu pufera za kristalizaciju koji sadrži 25% PEG 5000, 20% glicerola, a zatim je brzo ohlađen u tečnom azotu.

[0377] Prikupljanje i obrada rendgenskih podataka obavljeni su pomoću standardnih protokola. Ukratko, rendgenski podaci do rezolucije od 3,15 Å prikupljeni su na uređaju Swiss Light Source, linija zraka X10SA, sa detektorom Pilatus i rendgenskim zračenjem od 0,99984 Å. Ukupno je snimljeno 720 slika svaka sa oscilacijom od 0,25° na rastojanju od kristala do detektora koje je iznosilo 500 mm, i obrađene su pomoću softverskog paketa XDS. Kristal je spadao u prostornu grupu C2221sa parametrima ćelije a=55,76 Å, b=87,11 Å, c=156,31 Å, α = β = γ = 90°. Rezolucija R-sym do 3,15 Å bila je 5,5% i kompletnost podataka 99,9%.

[0378] Pošto je kristal kompleksa XAB4 Fv skoro izomorfan sa kristalom kompleksa XAB5 Fv (Primer 6), struktura potonjeg je korišćena kao ulazni model za utvrđivanje strukture putem molekulske zamene sa programom Phaser. Iterativna korekcija i poboljšavanje modela su izvršeni pomoću Coot (Crystallographic Object-Oriented Toolkit, komplet alata orijentisan na kristalografski objekat) i Autobuster verzija 1.11.2 (Buster verzija 2.11.2), sve dok više nisu

12

mogla da se naprave značajna poboljšanja kristalografskog modela. Konačne vrednosti R i R-free bile su 0,197, odnosno 0,253. Konačni usavršeni model je imao devijaciju korena srednje kvadratne greške (RMSD) od idealne dužine veza i uglova veza 0,009 Å, odnosno 1,0°.

(i) Rezultati

[0379] Rezultati rendgenskog poboljšavanja kompleksa XAB4 Fv sa humanim IL-17A su dati u Tabeli 16, a trodimenzionalna struktura ovog kompleksa je prikazana na Slici 8. U toj kristalnoj strukturi , kao i kod kompleksa XAB5 Fv (Primer 6), kompleks XAB4 Fv ima preciznu kristalografsku dvostruku simetriju: asimetrična jedinica kristala sadrži samo jednu polovinu celog dimernog kompleksa. XAB4 Fv ostvaruje kontakt sa obe podjedinice IL-17A, ali velika većina intermolekulskih kontakata je samo sa jednom podjedinicom (93% površine IL-17 pokrivene sa XAB4 Fv se pripisuje samo jednoj podjedinici). Analiza rendgenske kristalografije potvrdila je da je XAB4 varijanta antitela zadržala ciljnu specifičnost i vezivala se sa visokim afinitetom za suštinski isti epitop kao i matično XAB1 antitelo. Međutim, u strukturi XAB4 kompleksa, kao i u strukturi XAB5 kompleksa, CDRL1 lakog lanca ima tri tačkastke mutacije koje obezbeđuju pojačano vezivanje za humani IL-17A. Kao što je već opisano za kompleks XAB5 (Primer 6), Trp 31 iz lakog lanca XAB4 učestvuje u snažnim hidrofobnim/aromatičnim interakcijama sa Tyr 85 iz IL-17A i, u manjoj meri, sa Phe 133 iz IL-17A. Asn 30 iz lakog lanca XAB4 daje vodoničnu vezu karbonilu glavnog lanca Pro 130 iz IL-17A i u Van der Valsovom kontaktu je sa Leu 49 (ista podjedinica IL-17A) i Val 45 (druga podjedinica IL-17A). Glu 32 iz lakog lanca XAB4 stabilizuje CDRL1 petlju putem intramolekulskih H-vezanih interakcija. Nadalje, Glu 32 pravi povoljne elektrostatičke interakcije sa Arg 124 iz IL-17A, ali ne učestvuje u interakciji sonog mosta "licem u lice" (Slika 9). XAB4 se takođe razlikuje od XAB1 na položaju 56 lakog lanca, usled mutacije Asn u Gln projektovane da ukloni potencijalno mesto deamidacije. Rendgenska analiza pokazuje da Gln 56 iz XAB4 ostvaruje kontakte sa ostacima antigena proteina Leu 76 i Trp 90 i umanjuje dostupnost Tyr 67 i Ser 64 rastvaračima (Slika 10).

Tabela 16. Rendgensko poboljšavanje kompleksa XAB4 Fv sa IL-17A dobijeno pomoću programa Autobuster.

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 POBOLJŠAVANJE.

NAPOMENA 3 PROGRAM : BUSTER 2.11.2

NAPOMENA 3 AUTORI : BRICOGNE, BLANC, BRANDL, FLENSBURG, KELLER, NAPOMENA 3 : PACIOREK, ROVERSI, SHARFF, SMART, VONRHEIN, WOMACK;

NAPOMENA 3 : MATTHEWS, TEN EYCK, TRONRUD

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 PODACI KORIŠĆENI ZA POBOLJŠAVANJE.

NAPOMENA 3 OPSEG REZOLUCIJE VISOKI (ANGSTREMA): 3,15 NAPOMENA 3 OPSEG REZOLUCIJE NISKI (ANGSTREMA): 78,15 NAPOMENA 3 PRESEK PODATAKA (SIGMA(F)) : 0,0

NAPOMENA 3 KOMPLETNOST ZA OPSEG (%) : 99,85

NAPOMENA 3 BROJ REFLEKSIJA : 6881

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 POSTAVLJENO PREMA PODACIMA KORIŠĆENIM ZA POBOLJŠAVANJE.

NAPOMENA 3 POSTUPAK UNAKRSNE VALIDACIJE : U CELINI NAPOMENA 3 IZBOR KOMPLETA TESTOVA ZA FREE R VREDNOST : NASUMIČNO NAPOMENA 3 R VREDNOST (RADNI KOMPLET KOMPLET TESTOVA) : 0,1998

NAPOMENA 3 R VREDNOST (RADNI KOMPLET) : 0,1972 NAPOMENA 3 FREE R VREDNOST : 0,2531

NAPOMENA 3 VELIČINA KOMPLETA TESTOVA ZA FREE R VREDNOST (%): 5,01

NAPOMENA 3 BROJ KOMPLETA TESTOVA ZA FREE R VREDNOST : 345 NAPOMENA 3 PROCENJENA GREŠKA FREE R VREDNOSTI : NULA NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 UKLAPANJE U BIN SA NAJVEĆOM REZOLUCIJOM.

NAPOMENA 3 UKUPAN BROJ UPOTREBLJENIH BINOVA : 5 NAPOMENA 3 OPSEG REZOLUCIJE BINA VISOKI (ANGSTREMA) : 3,15 NAPOMENA 3 OPSEG REZOLUCIJE BINA NISKI (ANGSTREMA) : 3,52 NAPOMENA 3 KOMPLETNOST BINA (RAD TEST) (%) : 99,85 NAPOMENA 3 REFLEKSIJE U BINU (RADNI KOMPLET KOMPLET TESTOVA) : 1916

NAPOMENA 3 R VREDNOST BINA (RADNI KOMPLET KOMPLET TESTOVA) : 0,2376

NAPOMENA 3 REFLEKSIJE U BINU (RADNI KOMPLET) : 1820 NAPOMENA 3 R VREDNOST BINA (RADNI KOMPLET) : 0,2326 NAPOMENA 3 FREE R VREDNOST BINA : 0,3295

NAPOMENA 3 VELIČINA KOMPLETA TESTOVA ZA FREE R VREDNOST BINA (%): 5,01

NAPOMENA 3 BROJ KOMPLETA TESTOVA ZA FREE R VREDNOST BINA : 96

NAPOMENA 3 PROCENJENA GREŠKA FREE R VREDNOSTI BINA : NULA NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 BROJ ATOMA KORIŠĆENIH U POBOLJŠAVANJU KOJI NISU VODONIK.

NAPOMENA 3 ATOMI PROTEINA : 2499

NAPOMENA 3 ATOMI NUKLEINSKIH KISELINA : 0

NAPOMENA 3 HETEROGENI ATOMI : 5

NAPOMENA 3 ATOMI RASTVARAČA : 0

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 B VREDNOSTI.

NAPOMENA 3 IZ VILSONOVOG DIJAGRAMA (A**2) : 102,42 NAPOMENA 3 SREDNJA B VREDNOST (UKUPNO, A**2) : 124,95 NAPOMENA 3 UKUPNA ANIZOTROPSKA B VREDNOST.

NAPOMENA 3 B11 (A**2) : -11,5511

NAPOMENA 3 B22 (A**2) : -28,0012

NAPOMENA 3 B33 (A**2) : 39,5523

NAPOMENA 3 B12 (A**2) : 0,0000

NAPOMENA 3 B13 (A**2) : 0,0000

NAPOMENA 3 B23 (A**2) : 0,0000

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 PROCENJENA GREŠKA KOORDINATA.

NAPOMENA 3 ESD IZ LUCATIJEVOG DIJAGRAMA (A) : 0,787

12

NAPOMENA 3 DPI (BLOW EQ-9) ZASNOVAN NA VREDNOSTI FREE R (A) : 0,474

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 REFERENCE: BLOW, D. (2002) ACTA CRYST D58, 792-797 NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 KOEFICIJENTI KORELACIJE.

NAPOMENA 3 KOEFICIJENT KORELACIJE FO-FC : 0,9113

NAPOMENA 3 KOEFICIJENT KORELACIJE FO-FC FREE : 0,8848 NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 RENDGENSKA TEŽINA : 20,89

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 GEOMETRIJSKA FUNKCIJA.

NAPOMENA 3 BIBLIOTEKE OGRANIČENJA.

NAPOMENA 3 BROJ UPOTREBLJENIH BIBLIOTEKA : 8

NAPOMENA 3 BIBLIOTEKA 1 : protgeo_eh99.dat (V1.8) 20110121 STANDARDNA NAPOMENA 3 REČNIK AMINOKISELINA. VEZE I UGLOVI IZ

NAPOMENA 3 ENGH I HUBER EH99. DRUGE VREDNOSTI ZASNOVANE NA NAPOMENA 3 PRETHODNOG TNT ILI UZETE IZ CCP4. UKLJUČUJE NAPOMENA 3 ATOMI VODONIKA.

NAPOMENA 3 BIBLIOTEKA 2 : exoticaa.dat (V1.8) 20100430 KOLEKCIJA NAPOMENA 3 NESTANDARDNIM AMINOKISELINAMA, UGLAVNOM EH91 BEZ

NAPOMENA 3 INFORMACIJA O IDEALNOM RASTOJANJU NAPOMENA 3 BIBLIOTEKA 3 : nuclgeo.dat (V1.14) 20091104

NAPOMENA 3 BIBLIOTEKA 4 : bcorrel.dat (V1.15) 20080423

NAPOMENA 3 BIBLIOTEKA 5 : contact.dat (V1.20.2.1) 20110510 NAPOMENA 3 BIBLIOTEKA 6 : idealdist_contact.dat (V1.7) 20110119 NAPOMENA 3 KONTAKT NA IDEALNOM RASTOJANJU TERMINOLOŠKI PODACI KAKO SU UPOTREBLJENI U NAPOMENA 3 PROLSQ. VREDNOSTI KOJE SE OVDE KORISTE SU ZASNOVANE NA REFMAC NAPOMENA 3 5.5 IMPLEMENTACIJI.

NAPOMENA 3 BIBLIOTEKA 7 :ograničenja za SO$ (SULFATNI JON) iz cif NAPOMENA 3 rečnika SO4.cif korišćenjem refmacdict2tnt revizije NAPOMENA 3 1.23.2.7; buster uobičajena jedinjenja v 1.0 (05. maj NAPOMENA 3 2011.)

NAPOMENA 3 BIBLIOTEKA 8 : assume.dat (V1.10) 20110113

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 BROJ DEFINISANIH TERMINA GEOMETRIJSKIH FUNKCIJA : 15 NAPOMENA 3 TERMIN BROJ TEŽINA FUNKCIJA.

NAPOMENA 3 DUŽINE VEZA : 2566 ; 2,00 ; HARMONIČNI NAPOMENA 3 UGLOVI VEZA : 3486 ; 2,00 ; HARMONIČNI NAPOMENA 3 TORZIONI UGLOVI : 860 ; 2,00 ; SINUSOIDNE NAPOMENA 3 TRIGONALNE RAVNI UGLJENIKA : 61 ; 2,00 ; HARMONIČNI NAPOMENA 3 GENERALNE RAVNI : 369 ; 5,00 ; HARMONIČNI NAPOMENA 3 IZOTROPSKI TOPLOTNI FAKTORI : 2566 ; 20,00 ; HARMONIČNI NAPOMENA 3 LOŠI NEVEZANI KONTAKTI : NULA ; NULA ; NULA NAPOMENA 3 NEODGOVARAJUĆE TORZIJE : NULA ; NULA ; NULA NAPOMENA 3 PSEUDOROTACIONI UGLOVI : NULA ; NULA ; NULA NAPOMENA 3 HIRALNE NEODGOVARAJUĆE TORZIJE : 323 ; 5.00 ; POLUHARMONIČNI NAPOMENA 3 ZBIR ZAUZETOSTI : NULA ; NULA ; NULA NAPOMENA 3 KORISNA RASTOJANJA : NULA ; NULA ; NULA NAPOMENA 3 KORISNI UGLOVI : NULA ; NULA ; NULA NAPOMENA 3 KORISNA TORZIJA : NULA ; NULA ; NULA NAPOMENA 3 KONTAKT NA IDEAL. RAST.TERM. : 2984 ; 4.00 ; POLUHARMONIČNI NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 ODSTUPANJA RMS OD IDEALNIH VREDNOSTI.

NAPOMENA 3 DUŽINE VEZA (A) : 0,009

NAPOMENA 3 UGLOVI VEZA (STEPENI) : 1,00

NAPOMENA 3 TORZIONI UGLOVI OMEGA PEPTIDA (STEPENI) : 4,39 NAPOMENA 3 DRUGI TORZIONI UGLOVI (STEPENI) : 18,96 NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 SLIČNOST.

12

NAPOMENA 3 NCS.

NAPOMENA 3 ZASTUPLJENOST NCS : NEMA

NAPOMENA 3 CILJNA OGRANIČENJA.

NAPOMENA 3 CILJNA ZASTUPLJENOST : LSSR

NAPOMENA 3 CILJNA STRUKTURA : xab5_il17a_complex_final_buster.pdb NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 DETALJI ZA TLS.

NAPOMENA 3 BROJ TLS GRUPA : 3

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 TLS GRUPA : 1

NAPOMENA 3 KOMPLET : { H|* }

NAPOMENA 3 POREKLO ZA GRUPU (A): 10,9676 -8,7396 -10,1379 NAPOMENA 3 T TENZOR

NAPOMENA 3 T11: -0,1266 T22: 0,0257

NAPOMENA 3 T33: -0,2829 T12: -0,3040

NAPOMENA 3 T13: -0,0312 T23: 0,1050

NAPOMENA 3 L TENZOR

NAPOMENA 3 L11: 7,4496 L22: 4,4770

NAPOMENA 3 L33: 4,2880 L12: 1,1123

NAPOMENA 3 L13: -1,8044 L23: 3,0307

NAPOMENA 3 S TENZOR

NAPOMENA 3 S11: 0,2013 S12: 0,3070 S13: -0,5774

NAPOMENA 3 S21: 0,4752 S22: -0,5377 S23: 0,7096

NAPOMENA 3 S31: 1,0885 S32: -1,0885 S33: 0,3364

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 TLS GRUPA : 2

NAPOMENA 3 KOMPLET : { I|* }

NAPOMENA 3 POREKLO ZA GRUPU (A): 22,7365 0,7101 -35,1243 NAPOMENA 3 T TENZOR

NAPOMENA 3 T11: -0,1883 T22: 0,1529

NAPOMENA 3 T33: -0,3560 T12: 0,0318

NAPOMENA 3 T13: -0,1985 T23: 0,0144

NAPOMENA 3 L TENZOR

12

NAPOMENA 3 L11: 2,7494 L22: 9,3427

NAPOMENA 3 L33: 3,8648 L12: 0,8073

NAPOMENA 3 L13: -0,6650 L23: -2,0544

NAPOMENA 3 S TENZOR

NAPOMENA 3 S11: 0,0485 S12: 0,3188 S13: 0,0579

NAPOMENA 3 S21: 0,0595 S22: 0,1433 S23: 0,7000

NAPOMENA 3 S31: 0,0050 S32: -0,6066 S33: -0,1917

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 TLS GRUPA : 3

NAPOMENA 3 KOMPLET : { L|* }

NAPOMENA 3 POREKLO ZA GRUPU (A): 33,2517 -11,1794 -14,2151 NAPOMENA 3 T TENZOR

NAPOMENA 3 T11: 0,0667 T22: -0,1645

NAPOMENA 3 T33: -0,2360 T12: 0,1870

NAPOMENA 3 T13: -0,2270 T23: -0,1209

NAPOMENA 3 L TENZOR

NAPOMENA 3 L11: 3,3694 L22: 3,7848

NAPOMENA 3 L33: 8,8916 L12: -0,6497

NAPOMENA 3 L13: -2,6132 L23: 0,8234

NAPOMENA 3 S TENZOR

NAPOMENA 3 S11: -0,0839 S12: -0,2629 S13: -0,1560

NAPOMENA 3 S21: 0,3804 S22: 0,7574 S23: -0,5378

NAPOMENA 3 S31: 1,0885 S32: 1,0885 S33: -0,6736

NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 NAPOMENE O POBOLJŠAVANJU.

NAPOMENA 3 BROJ NAPOMENA O POBOLJŠAVANJU : 1

NAPOMENA 3 NAPOMENA 1 : KONTAKT NA IDEAL. RAST. TERM. KONTAKT PODEŠAVANJE. SVI ATOMI

NAPOMENA 3 IMAJU CCP4 TIP ATOMA IZ BIBLIOTEKE NAPOMENA 3

NAPOMENA 3 OSTALE NAPOMENE O POBOLJŠAVANJU: NULA NAPOMENA 3

SSBOND 1 CYS H 22 CYS H 96 1555 1555 2,03

12

SSBOND 2 CYS I 94 CYS I 144 1555 1555 2.05

SSBOND 3 CYS I 99 CYS I 146 1555 1555 2,04

SSBOND 4 CYS L 23 CYS L 88 1555 1555 2,07

CISPEP 1 TYR I 85 PRO I 86 0 3,67

CISPEP 2 GLU I 125 PRO I 126 0 -9,25

CISPEP 3 PRO I 126 PRO I 127 0 5,92

CISPEP 4 SER L 7 PRO L 8 0 -6,50

CISPEP 5 TYR L 94 PRO L 95 0 -6,52

CRYST1 55,760 87,109 156,306 90,00 90,00 90,00 C 22 21

[0380] Slika 8 pruža trodimenzionalnu strukturu kompleksa XAB4 Fv sa humanim IL-17A. Slika 8A prikazuje dva XAB4 Fv fragmenta u prostornom prikazu, a IL-17A homodimer je prikazan kao pojednostavljena struktura. Slika 8B prikazuje dva XAB4 Fv fragmenta kao pojednostavljenu strukturu, a IL-17A homodimer je prikazan u prostornom prikazu. Teški i laki lanac XAB4 Fv su prikazani tamnom, odnosno svetlosivom bojom. Jedan lanac IL-17A homodimera je prikazan svetlosivom bojom, drugi je prikazan tamnosivom.

[0381] Slika 9 prikazuje trodimenzionalnu strukturu kompleksa XAB4 Fv sa humanim IL-17A kao uvećani prikaz L-CDR1 antitela koji nosi tri mutacije otkrivene pomoću strukturno vođenog pristupa pristrasne biblioteke: Asn 30, Trp 31 i Glu 32. Ovi bočni lanci XAB4 doprinose novim interakcijama vezivanja sa antigenskim humanim IL-17A, konkretno sa IL-17A ostacima Tyr85, Phe133, Arg124, Pro 130, Leu 49 (svi iz iste podjedinice IL-17A) i Val 45 (iz druge podjedinice IL-17A).

[0382] Slika 10 pruža trodimenzionalnu strukturu XAB4 Fv kompleksa sa humanim IL-17A, kao uvećani prikaz L-CDR2 antitela koji prikazuje mutaciju Asn 56 u Gln. Bočni lanac XAB4 daje vezujuće kontakte sa IL-17A ostacima Trp 90 i Leu 76 i umanjuje dostupnost Tyr 67 i Ser 64 rastvaračima (sve iz iste podjedinice IL-17A).

[0383] Da rezimiramo, analiza rendgenske kristalografije potvrdila je da su varijante antitela izabrane za dalju analizu zadržale svoju ciljnu specifičnost i vezivale se sa visokim afinitetom za suštinski isti epitop kao i matično XAB1 antitelo. Čvršće povezivanje između svake od varijanti antitela i IL-17A je uočeno, kao rezultat dodatnih ili unapređenih vezujućih kontakata (vidi Tabelu 17 u nastavku).

12

[0384] Dalja karakterizacija varijanti antitela je sprovedena kao što je opisano u nastavku.

Tabela 17. Rendgenske analize IL-17A epitopa vezanog sa XAB1, XAB2, XAB4 i XAB5: zbirna i zasnovana na strukturi, kvalitativna klasifikacija ostataka epitopa. (*): ostatak koji je doprinos druge podjedinice IL-17A.

Primer 8. Merenja afiniteta i unakrsna reaktivnost izmerena pomoću Biacore<TM>

[0385] Određivanje kinetičkih parametara vezivanja je postignuto merenjem površinske plazmonske rezonance korišćenjem Biacore<TM>optičkog senzora T200 ili T100 (http://www.biacore.com). Ova tehnologija omogućava utvrđivanje bez oznaka mikroskopske

12

konstante brzine za vezivanje (ka) i disocijaciju (kd) liganda za receptor. Zato je posebno pogodna za karakterizaciju interakcija antitelo-antigen.

[0386] Indirektno vezivanje antitela za površinu Biacore<TM>čipa je ostvareno putem antihumanog Ig antitela (GE Healthcare Bio-Sciences AB; kat.br. BR-1008-39) 25 µg/ml u puferu za imobilizaciju (10 mM natrijum acetat pH 5,0) ili putem proteina A (RepliGen: rPA-50) 20 µg/ml u puferu za imobilizaciju (10 mM natrijum acetat pH 5,0 ili pH 4,0).

[0387] Antitelo je razblaženo u blanko puferu do finalne koncentracije od 1,00 ili 1,25 µg/ml.

[0388] Merenja afiniteta za utvrđivanje konstanti disocijacije XAB4 ili XAB1 su obavljena za rekombinantni huIL-17A (ID BR. SEKV: 78, npr. dvostruko rastuće koncentracije od 0,14 do 8,8 nM), rekombinantni huIL-17A/F heterodimer (npr. dvostruko rastuće koncentracije od 0,13 do 8 nM), rekombinantni huIL-17F (ID BR. SEKV: 77, npr. dvostruko rastuće koncentracije od 7,8 do 500 nM) IL-17A cinomolgusa (ID BR. SEKV: 79, npr. dvostruko rastuće koncentracije od 0,63 do 40 nM) IL-17A rezusa (ID BR. SEKV: 82, npr. dvostruko rastuće koncentracije od 1,6 do 100 nM) IL-17A marmozeta (ID BR. SEKV: 82, npr. dvostruko rastuće koncentracije od 0,63 do 40 nM) rekombinantni mIL-17A (ID BR. SEKV: 83, npr. dvostruko rastuće koncentracije od 0,78 do 50 nM), rekombinantni mIL-17A/F heterodimer (R&D Systems® kat. br.5390-IL; npr. dvostruko rastuće koncentracije od 1,25 do 40 nM) pacovski IL-17A (ID BR. SEKV: 85, npr. dvostruko rastuće koncentracije od 0,78 do 50 nM), korišćenjem metode indirektnog kuplovanja/vezivanja (vidi gore) i površina je regenerisana 10 mM glicinom pH 1,75 ili pomoću MgCl2(3 M). Jedna površina čipa je premazana i ponovo korišćena bez značajnog gubitka vezujućeg kapaciteta. Odabrano je da koncentracije liganda počnu ispod KDi da se završe na koncentraciji većoj od desetostrukog KD.

[0389] Slični ali ne i identični uslovi su korišćeni za merenje afiniteta XAB2 i XAB3.

[0390] Kinetički tragovi su procenjeni sa Biacore<TM>T200 kontrolnim softverom verzija 1.0. Ceo komplet ovih tragova sa rastućim koncentracijama se uzima zajedno i naziva se ciklus. Dva uzorka sa nultom koncentracijom (blanko uzorci) su uključena u svaku seriju koncentracija analita kako bi se omogućilo dvostruko poređenje tokom procene podataka

1

Rezultati

[0391] Vezivanje anti-IL-17 antitela XAB4, XAB1, XAB2 i XAB3 za IL-17A čoveka, cinomolgus majmuna, rezus majmuna, miša i pacova, za humani i mišji IL-17A/F heterodimer i za humani IL-17F je utvrđeno pomoću površinske plazmonske rezonance korišćenjem tehnologije Biacore<TM>.

[0392] Izračunate su kinetičke konstante brzine asocijacije (ka) i disocijacije (kd), kao i ravnotežna konstanta disocijacije (KD).

[0393] Podaci o afinitetu XAB4 su prikazani u Tabeli 18, podaci o afinitetu XAB1 su prikazani u Tabeli 19, podaci o afinitetu XAB2 su prikazani u Tabeli 20, i podaci o afinitetu XAB3 su prikazani u Tabeli 21. Afinitetno sazrevanje XAB1, XAB2 i XAB3 je povećalo afinitet prema IL-17A čoveka, majmuna cinomolgusa, miša i pacova.

Tabela 18. Afinitet i kinetičke konstante brzine vezivanja XAB4.

n.d. = ne može se odrediti, opseg primenjene konc. antigena previše mali i nespecifično vezivanje antigena za referentnu protočnu ćeliju primećeno pri najvećim koncentracijama antigena (500-50 pM).

1 1

*brzina disocijacije izvan granica može da se meri instrumentom(kd< 1 x 10<-5>1/s)

Tabela 19. Afinitet i kinetičke konstante brzine vezivanja XAB1.

n.d. = ne može se odrediti, opseg primenjene konc. antigena previše mali i nespecifično vezivanje antigena za referentnu protočnu ćeliju primećeno pri tri najveće koncentracije antigena (500-50 pM).

Tabela 20. Afinitet i kinetičke konstante brzine vezivanja XAB2.

Tabela 21. Afinitet i kinetičke konstante brzine vezivanja XAB3.

1 2

n.d. = ne može se odrediti

[0394] Afinitet i kinetičke konstante brzine XAB2, XAB3 i XAB5 mogu se porediti sa onima koje su uočene za XAB4.

Primer 9. Vezivanje u ELISA testu za IL-17A i druge članove familije

[0395] Izvršena je titracija željenih antitela na različitim antigenima. Ukratko, bunarčići ELISA mikrotitarskih ploča (Nunc imuno ploče MaxiSorp: Invitrogen, kat. br. 4-39454A) premazani su sa 1 µg/ml rekombinantnog huIL-17A (ID BR. SEKV: 76; 1,8 mg/ml), rekombinantnim huIL-17A/F (0,59 mg/ml), rekombinantnim huIL-17F (ID BR. SEKV: 77; 1,8 mg/ml)), rekombinantnim huIL-17B (R&D Systems® kat. br.1248IB/CF), rekombinantnim huIL-17C (R&D Systems® kat. br. 1234IL/CF), rekombinantnim huIL-17D (R&D Systems® kat. br.

1504IL/CF), rekombinantnim huIL-17E (R&D Systems® kat. br. 1258-IL/CF), rekombinantnim cinoIL-17A (ID BR. SEKV: 79; 0,21 mg/ml), rekombinantnim cinoIL-17F (ID BR. SEKV: 80; 1,525 mg/ml), rekombinantnim mIL-17A (ID BR. SEKV: 83; 2,8 mg/ml), rekombinantnim mIL-17A/F (R&D Systems® kat. br.5390-IL), rekombinantnim mIL-17F (ID BR. SEKV: 84; 0,2 mg/ml) i rekombinantnim pacovIL-17A (ID BR. SEKV: 85; 3,8 mg/ml) (100 µl/bunarčiću) u fosfatnom rastvoru u puferovanom fiziološkom rastvoru (PBS) bez Ca i Mg (10x; Invitrogen kat. br. 14200-083) 0,02% NaN3(Sigma kat. br. S-8032) i inkubirani preko noći na 4°C.

[0396] Sledećeg dana, mikrotitarske ploče su blokirane sa 300 µl PBS/2% BSA (frakcija V; Roche kat. br.10 735 094 001)/0,02% NaN3tokom 1 h na 37°C. Ploče su zatim isprane 4 puta sa PBS/0,05% Tween 20 (Sigma kat. br. P7949) /0,02% NaN3. XAB4 ili XAB1 se dodaju u koncentraciji 1 µg/ml u triplikatu u bunarčiće (100 µl/bunarčiću) tokom 3 h na sobnoj temperaturi.

[0397] Da bi se verifikovalo premazivanje antigena na pločama, korišćena su kontrolna antitela, konkretno mišje mAb anti-huIL-17F, (Novartis, 5 µg/ml) kozje anti-hu-IL-17B (R&D Systems® kat. br. AF1248; 10 µg/ml), mišje mAb anti-huIL-17C (R&D Systems® kat. br.

1

MAB1234; 10 µg/ml), kozje anti-huIL-17D (R&D Systems® kat. br. AF1504; 10 µg/ml), mišje mAb anti hu-IL-17E (R&D Systems® kat. br. MAB1258; 10 µg/ml), mišje anti-mIL-17A ili anti-mIL-17A/F (Novartis; 1 µg/ml) i pacovsko anti-mIL-17F (R&D Systems® kat. br. MAB2057; 1 µg/ml;) (100 µl/bunarčiću u PBS-u, 0,02% NaN3tokom 3h na RT).

[0398] Ploče su zatim isprane 4 puta sa PBS/0,05% Tween 20/0,02% NaN3. Zatim je kozje anti-humano IgG antitelo konjugovano sa alkalnom fosfatazom (Sigma kat. br. A9544) dodato u bunarčiće koji su dobili ispitivano antitelo pri razblaživanju od 1/20.000 (100 µl/bunarčiću) tokom 2 h 30 min na RT. U bunarčiće koji su dobili mišje mAb, dodato je kozje anti-mišje IgG antitelo konjugovano sa alkalnom fosfatazom (Sigma kat. br. A7434) pri razblaženju od 1/10.000 (100 µl/bunarčiću) tokom 2 h 30 min na RT. Dodato je mišje anti-kozje IgG antitelo konjugovano sa alkalnom fosfatazom (Sigma kat. br. A8062) u kozja antitela pri razblaženju od 1/50.000 (100 µl/bunarčiću) tokom 2 h 30 min na RT. Ploče su zatim isprane 4 puta, i 100 µl supstrata (tablete p-nitrofenil fosfata; Sigma; 5 mg kat. br. N9389; 20 mg kat. br. N2765) rastvorenog u dietanolaminskom puferu pH 9,8, da bi se dobila konačna koncentracija od 1 mg/ml, dodato je u svaki bunarčić.

[0399] Ploče su očitane nakon 30 min u čitaču za mikroploče Spectra Max M5 (Molecular Devices) korišćenjem filtera od 405 i 490 nm. Vrednosti su srednje vrednosti ± SEM trostrukih vrednosti.

Rezultati

[0400] Ove studije pokazuju da su XAB4 i XAB1 sposobni za vezivanje humanog i mišjeg IL-17A i humanog i mišjeg IL-17A/F. Pored toga, pokazano je da XAB4 može da vezuje IL-17A cinomolgusa i pacova. Vezivanje za IL-17F čoveka, cinomolgusa i miša nije detektovano u ovim eksperimentalnim uslovima, kao ni vezivanje za druge članove humane familije (IL-17B, IL-17C, IL-17D i IL-17E).

1 4

Tabela 22. Unakrsna reaktivnost XAB4 i XAB1 sa članovima IL-17 familije čoveka, majmuna cinomolgusa, miša i pacova, putem ELISA.

Primer 10. Unakrsna reaktivnost sa drugim humanim, mišjim i pacovskim interleukinima putem ELISA

[0401] U drugom setu eksperimenata je procenjena unakrsna reaktivnost antitela iz otkrića za odabrane humane, mišje ili pacovske citokine.

1

[0402] Trostruki broj bunarčića ELISA mikrotitarskih ploča (Nunc imuno ploče MaxiSorp: Invitrogen kat. br. 4-39454A) premazan je sa 100 µl/bunarčiću sledećih citokina: rekombinantni huIL1β (Novartis), rekombinantni huIL-3 (R&D Systems® kat. br.203-IL/CF), rekombinantni huIL-4 (R&D Systems® kat. br. 204-IL/CF), rekombinantni huIL-6 (R&D Systems® kat. br.206-IL-1010/CF), rekombinantni huIL-8 (R&D Systems® kat. br.208-IL-010/CF), rekombinantni huIL-12 (R&D Systems® kat. br. 219-IL-005/CF), rekombinantni huIL-13 (Novartis), rekombinantni huIL-17A (ID BR. SEKV: 76), rekombinantni huIL-17A/F, rekombinantni huIL-17F (ID BR. SEKV: 77), rekombinantni huIL-18 (MBL kat. br. B003-5), rekombinantni huIL-20 (Novartis), rekombinantni huIL-23 (R&D Systems® kat. br.1290-IL-010/CF), rekombinantni huIFNγ (Roche), rekombinantni huTNFα (Novartis), rekombinantni huEGF (Sigma kat. br.E9644.), rekombinantni huTGFβ2 (Novartis), rekombinantni mIL-1β (R&D Systems® kat. br.401-ML), rekombinantni mIL-2 (R&D Systems® 402-ML-020/CF), rekombinantni mIL-6 (R&D Systems® kat. br. 406-ML-010/CF), rekombinantni mIL-12 (R&D Systems® kat. br. 419-ML-010/CF), rekombinantni mIL-17A (ID BR. SEKV: 83), rekombinantni mIL-17A/F (R&D Systems® kat. br.5390-IL), rekombinantni mIL-17F (R&D Systems® kat. br.2057-IL/CF), rekombinantni mIL-18 (MBL kat. br.B004-5), rekombinantni mIL-23 (R&D Systems® kat. br.1887-ML), rekombinantni mIFN-γ (R&D Systems® Kat. br.

485-MT), rekombinantni mTNFα (R&D Systems® Kat. br.410-MT), rekombinantni pacovski IL-4 (R&D Systems® kat. br.504-RL/CF), rekombinantni pacovski IL-6 (R&D Systems® kat. br. 506-RL-010), rekombinantni pacovIL-12 (R&D Systems® kat. br. 1760-RL/CF), rekombinantni pacovIL-17A (ID BR. SEKV: 85), rekombinantni pacovIL-23 (R&D Systems® kat. br.3136-RL-010/CF), rekombinantni pacovTNFα (R&D Systems® kat. br.510-RT/CF), sa 1 µg/ml sa izuzetkom rekombinantnog mIL-6, rekombinantnog mIL-12 i rekombinantnog mTNFα koji su premazani sa 0,5 µg/ml u fosfatnom rastvoru u puferovanom fiziološkom rastvoru (PBS) bez Ca i Mg (10x; Invitrogen kat. br.14200-083) 0,02% NaN3(Sigma kat. br. S-8032) i inkubirani preko noći na 4°C.

[0403] Sledećeg dana, mikrotitarske ploče su blokirane sa 300 µl PBS/2% BSA (frakcija V; Roche kat. br.10 735 094 001)/0,02% NaN3tokom 1 h na 37°C. Ploče su zatim isprane 4 puta sa PBS/0,05% Tween 20 (Sigma kat. br. P7949) /0,02% NaN3.

[0404] Antitela iz otkrića su dodata pri 10 µg/ml (100 µl/bunarčiću) tokom 3 h na sobnoj temperaturi. Da bi se verifikovalo premazivanje antigena na pločama, korišćeno je 100 µl/bunarčiću sledećih kontrolnih antitela: mišje anti-huIL1β (R&D Systems® kat. br.

1

MAB601), mišje anti-huIL-3 (R&D Systems® kat. br. MAB603), mišje anti-huIL4 (R&D Systems® kat. br. MAB604), mišje anti-huIL-6 (R&D Systems® kat. br. MAB206), mišje antihu-IL8 (R&D Systems® kat. br. MAB208), mišje anti-huIL-12 (R&D Systems® kat. br. MAB219), mišje anti-huIL-13 (Novartis), mišje anti-huIL-17A (Novartis), mišje anti-huIL-17F (Novartis), mišje anti-huIL-18 (MBL kat. br. D043-3), mišje anti-huIL-20 (Abcam kat. br. ab57227), kozje anti-huIL-23 (R&D Systems® kat. br. AF1716), mišje anti-huIFN-γ (R&D Systems® kat. br. MAB285), mišje anti-huTNF-α (R&D Systems® kat. br. MAB610), mišje anti-hu-EGF (R&D Systems® kat. br. MAB236), humano anti-huTGFβ2 (Novartis), pacovsko anti-mIL-1β (R&D Systems® kat. br. MAB401), pacovsko anti-mIL-2 (R&D Systems® Kat. br. MAB402), pacovsko anti-mIL-6 (R&D Systems® kat. br. MAB406), pacovsko anti-mIL-12 (R&D Systems® kat. br. MAB419), mišje anti-m/pacovIL-17A (Novartis), pacovsko antimIL-17F (R&D Systems® kat. br. MAB2057), pacovsko anti-mIL-18 (MBL kat. br. D047-3), pacovsko anti-mIFN-γ (R&D Systems® kat. br. MAB485), kozje anti-mTNFα (R&D Systems® kat. br. AF-410-NA), mišje anti-pacovsko IL-4 (R&D Systems® kat. br. MAB504), kozje anti-pacovsko IL-6 (R&D Systems® kat. br. AF506), kozje anti-pacovsko IL-12 (R&D Systems® kat. br. AF1760), mišje anti-pacovsko IL-23 (R&D Systems® kat. br. MAB3510), mišje anti-pacovsko TNFα (R&D Systems® kat. br. MAB510). Ona su dodata sa 1 ili 5 µg/ml, u PBS-u, 0,02% NaN3tokom 3 h na RT.

[0405] Ploče su zatim isprane 4 puta sa PBS/0,05% Tween 20/0,02% NaN3. Zatim je kozje anti-humano IgG antitelo konjugovano sa alkalnom fosfatazom (Sigma kat. br. A9544) dodato u bunarčiće sa humanim antitelima pri razblaženju od 1/20.000 (100 µl/bunarčiću). Kozje antimišje IgG antitelo konjugovano sa alkalnom fosfatazom (Sigma kat. br. A1047) dodato je u bunarčiće sa mišjim antitelima pri razblaženju od 1/10.000 (100 µl/bunarčiću). Zečje anti-kozje IgG antitelo konjugovano sa alkalnom fosfatazom (Sigma kat. br. A7650) dodato je u bunarčiće sa kozjim antitelima pri razblaženju od 1/1000 (100 µl/bunarčiću), a zečje anti-pacovsko IgG antitelo konjugovano sa alkalnom fosfatazom (Sigma kat. br. A6066) dodato je u bunarčiće sa pacovskim antitelima pri razblaženju od 1/20.000 (100 µl/bunarčiću). Sekundarna antitela su inkubirana 2 h 30 min na RT. Ploče su zatim isprane 4 puta, i 100 µl supstrata (tablete pnitrofenil fosfata; Sigma; 5 mg kat. br. N9389 ili 20 mg kat. br. N2765) rastvorenog u dietanolaminskom puferu pH 9,8, da bi se dobila konačna koncentracija od 1 mg/ml, dodato je u svaki bunarčić.

1

[0406] Ploče su očitane nakon 30 min na RT ili na 4oC preko noći u čitaču za mikroploče Spectra Max M5 (Molecular Devices) korišćenjem filtera od 405 i 490 nm. Vrednosti su srednje vrednosti ± SEM trostrukih vrednosti.

Rezultati

[0407] Dobijeni podaci pokazuju da su i XAB4 i XAB1 veoma selektivni za IL-17A humanog, mišjeg ili pacovskog porekla i za IL-17A/F humanog ili mišjeg porekla. Pored toga, u testiranim uslovima, reaktivnost XAB1 na 10 µg/ml za humani IL-17F (nije uočena na 1 µg/ml, vidi prethodno) nije uočena sa XAB4. Reaktivnost za druge testirane citokine nije otkrivena.

Tabela 23. Unakrsna reaktivnost XAB4 i XAB1 sa humanim citokinima putem ELISA.

1

Napomena: negativne vrednosti su posledica toga što se blanko (vrednost optičke gustine bunarčića bez specifičnih antitela) oduzima.

Tabela 24. Unakrsna reaktivnost XAB4 i XAB1 sa mišjim citokinima putem ELISA.

Napomena: negativne vrednosti su posledica toga što se blanko (vrednost optičke gustine bunarčića bez specifičnih antitela) oduzima.

1

Tabela 25. Unakrsna reaktivnost XAB4 i XAB1 sa pacovskim citokinima putem ELISA.

Napomena: negativne vrednosti su posledica toga što se blanko (vrednost optičke gustine bunarčića bez specifičnih antitela) oduzima.

Primer 11. In vitro test inhibiranja kompetitivnog vezivanja IL-17A - IL-17RA i IL-17A/F-IL-17RA

[0408] Humani IL-17RA se uzima iz osnovnog rastvora (BTP22599: 1,68 mg/ml = 46,2 µM). ELISA mikrotitarske ploče su premazane sa humanim IL-17RA (100 µl/bunarčiću, 1 µg/ml, ∼27,5 nM) u PBS/ 0,02% NaN3i inkubirane preko noći na sobnoj temperaturi. Sledećeg dana, ploče su blokirane sa 300 µl PBS/2% BSA/0,02% NaN3tokom 1 h na 37°C. Ploče su zatim isprane 4 puta sa PBS/0,05% Tween20/0,02% NaN3.

[0409] Nakon ove preparacije, titracija varijanti antitela (50 µl, koncentracije od 12 nM do 0,12 nM za IL-17A i 1200 nM do 40 nM za IL-17A/F, u 3-strukim koracima) bila je prethodno inkubirana sa humanim IL-17A biotinom (50 µl na 0,94 nM) ili IL-17A/F (50 µl na 31 nM) tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi.

14

[0410] 100 µl smeše je dodato u bunarčić tokom 3 sata i 30 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja sa PBS/0,05% Tween20/0,02% NaN3četiri puta, alkalnom fosfatazom konjugovan streptavidin je dodat pri konačnom razblaženju od 1/10.000 (100 µl/ bunarčiću). Nakon 45 minuta na sobnoj temperaturi ploče su ponovo isprane četiri puta sa PBS/0,05% Tween20/0,02% NaN3i dodat je supstrat p-nitrofenilfosfat u dietanolaminskom puferu pH 9,8 (1 mg/ml) (100 µl/bunarčiću).

[0411] Ploče su očitane nakon 30 minuta u čitaču za mikroploče Spectra Max M5, filteri od 405 i 490 nm (triplikati). Izračunavanje procenta inhibicije i IC50za različite varijante antitela je obavljeno korišćenjem logističkog modela sa četiri parametra (Excel Xlfit; FIT model 205).

Rezultati

[0412] Podaci pokazuju da su i XAB4 i XAB1 sposobni da blokiraju vezivanje huIL-17A i huIL-17A/F sa huIL-17RA. Veći afinitet XAB4 prema IL-17A i IL-17A/F se odražava u većem kapacitetu za inhibiciju. IC50vrednosti su objavljene u tabeli. Veće koncentracije potrebne za blokiranje IL-17A/F-IL-17RA interakcije su u najvećoj meri objašnjene činjenicom da su oko 30 puta veće koncentracije IL-17A/F korišćene u testu. Antitelo se vezuje za A podjedinicu A/F i stoga ne može da spreči vezivanje F podjedinice za IL-17RA. Međutim, vezivanje F za IL-17RA je prilično slabo, u opsegu od 300nM.

Tabela 26. XAB4 i XAB1 inhibiraju vezivanje huIL-17A i huIL-17A/F za huIL-17RA.

Primer 12. In vitro neutralizacija aktivnosti humanog IL-17A i IL-17A/F pomoću varijanti antitela iz otkrića

(i) Test na C20A4Cl6 ćelijama (ćelijska linija humanog hondrocita)

[0413] C20A4Cl6 ili C-20/A4, klon 6, (Goldring MB, i sar.1994, J Clin Invest; 94:2307-16) ćelije su uzgajane u RPMI (Gibco kat. br. 61870-010) dopunjenim 10% fetalnim telećim serumom ultraniskog IgG (Gibco kat. br. 16250-078; serija 1074403), β-merkaptoetanolom (5x10<-5>M konačno) i normocinom (0,1 mg/ml; InvivoGen kat. br. ant-nr-2).

[0414] Ćelije su odvojene od plastike korišćenjem rastvora Accutase (PAA kat. br. L11-007). Ćelije su raspoređene na mikrotitarske ploče sa 96 bunarčića sa gustinom od 5x10<3>u bunarčiću od 100µl u RPMI 1640 (Gibco kat. br. 61870-010) bez fetalnog telećeg seruma, βmerkaptoetanola (5x10<-5>M konačno) i normocina (0,1 mg/ml).

[0415] C20A4Cl6 su ostavljene da se zalepe za ploče preko noći. Sledećeg jutra, različite koncentracije rekombinantnog huIL-17A (ID BR. SEKV: 76; Mm 32.000), rekombinantnog huIL-17A/F (Mm 32.800), rekombinantnog huIL-17F (ID BR. SEKV: 77; Mm 30.000), ili kontrolnog medijuma u prisustvu humanog TNFα (Novartis; Mm 17.500) su dodate u zapremini od 50 µl u trostruke bunarčiće u prisustvu 50 µl različitih koncentracija ispitivanog antitela (XAB4; XAB1), kontrolnog antitela (Simulect® 1,1% rastvor, serija C0011; 831179) ili kontrolnog medijuma, kako bi se dostigla finalna zapremina od 200 µl/bunarčiću i finalna koncentracija od 0,5% fetalnog telećeg seruma.

[0416] HuIL-17A (30 pM), huIL-17A/F (300 pM) i huIL-17F (10 nM) su dodati zajedno sa huTNFα (6 pM). XAB4 (Mm 150.000) je dodat u koncentraciji u rasponu od 1 do 0,003 nM radi neutralizacije huIL-17A, u koncentraciji u rasponu od 10 do 0,03 nM radi neutralizacije huIL-17A/F i u koncentraciji u rasponu od 3 µM do 30 nM za huIL-17F. XAB1 (Mm 150.000) je dodat u koncentraciji u rasponu od 3 do 0,01 nM radi neutralizacije huIL-17A, u koncentraciji u rasponu od 10 do 0,03 nM radi neutralizacije huIL-17A/F i u koncentraciji u rasponu od 3 µM do 30 nM za huIL-17F. Simulect® je dodat u koncentraciji u rasponu od 3 µM do 100 nM. Supernatanti kulture su sakupljeni nakon inkubacije od 24 h i proizvodnja huIL-6 je izmerena pomoću ELISA testa.

(ii) Test na BJ ćelijama (humani fibroblasti)

[0417] BJ ćelije (fibroblasti humane kože od ATCC kat. br. CRL 2522) su uzgajane u RPMI (Gibco kat. br. 61870-010) dopunjenim sa 10% fetalnog telećeg seruma sa ultraniskim IgG (Gibco kat. br. 16250-078; serija 1074403), β-merkaptoetanolom (5x10<-5>M konačno) i normocinom (0,1 mg/ml; InvivoGen kat. br. ant-nr-2). Ćelije su odvojene sa plastike korišćenjem rastvora Accutase (PAA kat. br. L11-007).

[0418] Ćelije su raspoređene na mikrotitarske ploče sa 96 bunarčića sa gustinom od 5x10<3>u bunarčiću od 100 µl u RPMI 1640 fetalnog telećeg seruma, β-merkaptoetanola (5x10<-5>M konačno) i normocina (0,1 mg/ml). BJ ćelije su ostavljene da se zalepe za ploče preko noći. Sledećeg jutra, različite koncentracije rhuIL-17A (ID BR. SEKV: 76; Mm 32.000), rhuIL-17A/F (Mm 32.800) i rhuIL-17F (ID BR. SEKV: 77; Mm 30.000), ili kontrolnog medijuma u prisustvu humanog TNFα (Novartis; Mm 17.500) su dodate u zapremini od 50 µl u trostruke bunarčiće u prisustvu 50 µl različitih koncentracija ispitivanog antitela (XAB4; XAB1), kontrolnog antitela (Simulect® 1,1% rastvor, serija br. C0011; 831179) ili kontrolnog medijuma kako bi se dostigla finalna zapremina od 200 µl/bunarčiću i finalna koncentracija od 2,5% fetalnog telećeg seruma.

[0419] HuIL-17A (30 pM), huIL-17A/F (300 pM) i huIL-17F (10 nM) su dodati zajedno sa huTNFα (6 pM). XAB4 (Mm 150.000) je dodat u koncentraciji u rasponu od 1 do 0,003 nM radi neutralizacije huIL-17A, u koncentraciji u rasponu od 10 do 0,03 nM radi neutralizacije huIL-17A/F i u koncentraciji u rasponu od 3 µM do 30 nM za huIL-17F. XAB1 (Mm 150.000) je dodat u koncentraciji u rasponu od 3 do 0,01 nM radi neutralizacije huIL-17A, u koncentraciji u rasponu od 10 do 0,03 nM radi neutralizacije huIL-17A/F i u koncentraciji u rasponu od 3 µM do 30 nM za huIL-17F. Simulect® je dodat u koncentraciji u rasponu od 3 µM do 100 nM. Supernatanti kulture su sakupljeni nakon inkubacije od 24 h i proizvodnja huIL-6 i huGROα je izmerena pomoću ELISA testa.

14

(iii) Testovi detekcije

1) ELISA za detekciju proizvodnje humanog IL-6

[0420] ELISA mikrotitarske ploče su premazane anti-humanim IL-6 mišjim Mab (R&D Systems® kat. br. MAB206; 100 µl/bunarčiću sa 1 µg/ml) u PBS-u 0,02% NaN3i inkubirane preko noći na 4°C. Sledećeg dana, mikrotitarske ploče su blokirane sa 300µl PBS/2% BSA/0,02% NaN3tokom 3h na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane 4 puta sa PBS/0,05% Tween 20/0,02% NaN3. Dodati su supernatanti kulture C20A4Cl6 (konačno razblaženje 1:5 za kulture stimulisane sa huIL-17A plus huTNFα, ili 1:2 za kulture stimulisane sa huTNFα plus huIL-17A/F ili IL-17F; 100µl/bunarčiću) ili BJ ćelije (konačno razblaženje 1:10 za kulture stimulisane sa huIL-17A plus huTNFα, ili 1:5 za kulture stimulisane sa huTNFα plus huIL-17A/F ili IL-17F; 100 µl/bunarčiću).

[0421] Kako bi se utvrdila kriva titracije, rhuIL-6 (Novartis; 100µl/bunarčiću) je titrisan od 500 pg/ml do 7.8 pg/ml u koracima razblaživanja 1:2. Nakon inkubiranja preko noći na sobnoj temperaturi, ploče su isprane 4 puta sa PBS/0,05% Tween 20/0,02% NaN3. Dodato je kozje anti-humano IL-6 antitelo konjugovano sa biotinom (R&D Systems® kat. br. BAF206; 30 ng/ml; 100 µl/bunarčiću). Uzorci su ostavljeni da reaguju tokom 4 h na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja (4 puta), streptavidin konjugovan sa alkalnom fosfatazom (Jackson Immunoresearch kat. br. 016-050-084) je dodat pri konačnom razblaženju od 1/10.000 (100 µl/bunarčiću).

[0422] Nakon 40 minuta na sobnoj temperaturi, ploče su ponovo isprane 4 puta. Tablete supstrata p-nitrofenil fosfata (Sigma; 5 mg, kat. br. N9389; 20 mg, kat. br. N2765) su rastvorene u dietanolaminskom puferu pH 9,8 da bi se dobila finalna koncentracija od 1 mg/ml. 100 µl je dodato u svaki bunarčić, i optička gustina je očitana nakon 1 h u čitaču za mikroploče Spectra Max M5 (Molecular Devices) korišćenjem filtera od 405 i 490 nm.

2) ELISA za detekciju proizvodnje humanog GROα

[0423] ELISA mikrotitarske ploče su premazane anti-humanim GROα mišjim Mab (R&D Systems® kat. br. MAB275; 100 µl/bunarčiću sa 1,5 µg/ml) u PBS/0,02%NaN3i inkubirane preko noći na 4°C. Sledećeg dana, mikrotitarske ploče su blokirane sa 300 µl PBS/2% BSA/0,02% NaN3tokom 3 h na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane 4 puta sa PBS/0,05% Tween20/0,02% NaN3. Dodati su supernatanti kulture BJ ćelija (konačno razblaženje 1:2, 100µl/bunarčiću).

[0424] Kako bi se utvrdila kriva titracije, humani GROα (R&D Systems® kat. br.275-GR/CF; 100 µl/bunarčiću) je titrisan od 2 ng/ml do 0,03 ng/ml u koracima razblaživanja 1:2.) Nakon inkubiranja preko noći na sobnoj temperaturi, ploče su isprane 4 puta sa PBS/0,05% Tween 20/0,02% NaN3.

[0425] Dodato je kozje anti-humano GROα antitelo konjugovano sa biotinom (R&D Systems® kat. br. BAF275; 100 ng/ml; 100 µl/bunarčiću). Uzorci su ostavljeni da reaguju tokom 4 h na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja (4 puta), streptavidin konjugovan sa alkalnom fosfatazom (Jackson Immunoresearch kat. br. 016-050-084) je dodat pri konačnom razblaženju od 1/10.000 (100 µl/bunarčiću). Nakon 40 minuta na sobnoj temperaturi, ploče su ponovo isprane 4 puta. Tablete supstrata p-nitrofenil fosfata (Sigma; 5 mg, kat. br. N9389; 20 mg, kat. br. N2765) su rastvorene u dietanolaminskom puferu pH 9,8 da bi se dobila finalna koncentracija od 1 mg/ml. 100 µl je dodato u svaki bunarčić, i optička gustina je očitana nakon 1 h u čitaču za mikroploče Spectra Max M5 (Molecular Devices) korišćenjem filtera od 405 i 490 nm.

3) Izračunavanje

[0426] Podaci su objavljeni kao srednje vrednosti /- SEM. Konstruisanje krive sa četiri parametra je korišćeno za ELISA izračunavanje. IC50vrednosti za inhibiciju lučenja IL-6 i GRO-α od strane antitela su izračunate korišćenjem Xlfit (FIT model 205).

(iv) Rezultati

1) Test na C20A4Cl6 ćelijama (ćelijska linija humanog hondrocita)

[0427] I XAB4 i XAB1 imaju sposobnost neutralizacije indukovanja lučenja huIL-6 od strane C20A4Cl6 ćelija stimulisanih sa rhuIL-17A i rhuIL-17A/F u prisustvu rhuTNFα. Kontrolno

14

antitelo (Simulect®) pri 100 nM nije imalo dejstvo. Vrednosti IC50(srednje vrednosti ± SEM) za XAB4 i XAB1 su prikazane u

Tabela 27. Inhibicija na huIL-17F nije primećena čak ni pri koncentracijama Ab od 3 µM.

Tabela 27. Inhibitorsko dejstvo XAB4 i XAB1 na lučenje huIL-6 od strane C20A4Cl6 ćelija.

<a>Osnovna proizvodnja hu IL-6 bez stimulisanja (0,13 ± 0,003) se oduzima

<b>Osnovna proizvodnja huIL-6 u kulturama samo sa TNF (0,20 ± 0,003) se oduzima

[0428] Iz ovih eksperimenata je jasno da matično XAB1 antitelo deli neutrališuću aktivnost sa svojim derivatima. Takođe je uočeno da varijanta XAB4 ima veću neutrališuću aktivnost od XAB1.

[0429] U dodatnom eksperimentu, analognom eksperimentu koji je prethodno opisan, sva antitela XAB1-XAB5 su upoređena, kao što se može videti u Tabeli 28. Ovde se može videti da su profili inhibicije za XAB2, XAB3 i XAB5 uporedivi sa onima koji su uočeni za XAB4 i XAB1, posebno za XAB4.

14

Tabela 28. Tabela inhibitorskog dejstva XAB antitela na lučenje huIL-6 od strane C20A4Cl6 ćelija.

<a>Osnovna proizvodnja HuIL-6 bez stimulusa (0,04 ± 1,13 ng/ml) se oduzima.

2) Test na BJ ćelijama (humani fibroblasti)

[0430] I XAB4 i XAB1 imaju sposobnost neutralizacije indukovanja lučenja huIL-6 i huGROα od strane BJ ćelija stimulisanih sa rhuIL-17A i rhuIL-17A/F u prisustvu huTNFα. Kontrolno antitelo (Simulect®) pri 100 nM nije imalo dejstvo. IC50vrednosti za inhibiciju IL-6 i hu GROα su date u

[0431] Tabeli 29 i Tabeli 30. Inhibicija na huIL-17F nije primećena čak ni pri koncentracijama Ab od 3 µM. Iz ovih eksperimenata je jasno da matično XAB1 antitelo deli neutrališuću aktivnost sa svojim derivatima.

[0432] Takođe je uočeno da varijanta XAB4 ima veću neutrališuću aktivnost od XAB1.

Tabela 29. Inhibitorsko dejstvo XAB4 i XAB1 na lučenje huIL-6 od strane BJ ćelija.

14

<a>Osnovna proizvodnja hu IL-6 bez stimulusa (0,32 ± 0,002 ng/ml) se oduzima.

<b>Osnovna proizvodnja huIL-6 u kulturama stimulisanim samo sa TNF (0,45 ± 0,02 ng/ml) se

oduzima.

Tabela 30. Inhibitorsko dejstvo XAB4 i XAB1 na lučenje hu-GRO-alfa od strane BJ

ćelija.

<a>Osnovna proizvodnja hu GROα bez stimulusa (0,03 ± 0,01 ng/ml) se oduzima.

<b>Osnovna proizvodnja hu GROα u kulturama samo sa TNF (0,15 ± 0,008 ng/ml) se oduzima.

14

[0433] U dodatnim eksperimentima, analognim eksperimentima koji su prethodno opisani, sva antitela XAB1-XAB5 se porede, kao što se može videti u Tabeli 31 i Tabeli 32. Ovde se može videti da su profili inhibicije za XAB2, XAB3 i XAB5 uporedivi sa onima koji su uočeni za XAB4 i XAB1, posebno za XAB4.

Tabela 31. Inhibitorsko dejstvo XAB antitela na lučenje huIL-6 od strane BJ ćelija.

<a>Osnovna proizvodnja HuIL-6 bez stimulusa (0,15 ± 4,06 ng/ml) se oduzima

Tabela 32. Inhibitorsko dejstvo XAB antitela na lučenje huGROα od strane BJ ćelija.

<a>Osnovna proizvodnja HuGROα bez stimulusa (0,03 ± 0,02 ng/ml) se oduzima

Primer 13. In vitro neutralizacija aktivnosti mišjeg IL-17A i IL-17A/F pomoću varijanti antitela iz otkrića

[0434] CMT-93 ćelije (ATCC CCL-223) su uzgajane u RPMI (Gibco kat. br. 61870-010) dopunjenim sa 10% fetalnog telećeg seruma sa ultraniskim IgG (Gibco kat. br.16250-078; lot

14

1074403), β-merkaptoetanolom (5x10<-5>M konačno) i normocinom (0,1 mg/ml; InvivoGen kat. br. ant-nr-2).

[0435] Ćelije su odvojene sa plastike korišćenjem rastvora Accutase (PAA kat. br. L11-007) i raspoređene na mikrotitarske ploče sa 96 bunarčića sa gustinom od 5x10<3>u bunarčiću od 100 µl u RPMI 1640 bez fetalnog telećeg seruma, β-merkaptoetanola i normocina.

[0436] Ćelije su ostavljene da se zalepe za ploče preko noći. Sledećeg jutra, rmIL-17A (ID BR. SEKV: 83, Mm 31.000) sa 1 nM, rmIL-17A/F (R&D Systems® kat. br.5390-IL; Mm 30.400) sa 3 nM, rmIL-17F (ID BR. SEKV: 84; Mm 30.000) sa 30 nM, pacovIL-17A (ID BR. SEKV: 85; Mm 31.000) sa 1 nM ili kontrolni medijum se dodaju u zapremini od 50 µl u trostruke bunarčiće u prisustvu 50 µl različitih koncentracija ispitivanih antitela (XAB4 ili XAB1), kontrolnih antitela (Simulect® 1,1% rastvor, C0011; 831179) ili kontrolnog medijuma kako bi se dostigla finalna zapremina od 200 µl/bunarčiću i finalna koncentracija od 1% fetalnog telećeg seruma.

[0437] Supernatanti kulture su sakupljeni nakon inkubacije od 24 h i proizvodnja KC je izmerena pomoću ELISA.

(i) ELISA za detekciju proizvodnje mišjeg KC

[0438] ELISA mikrotitarske ploče su premazane pacovskim anti-mišjim KC Mab (R&D Systems® kat. br. MAB453; 100 µl/bunarčiću sa 1 µg/ml) u PBS/0,02%NaN3i inkubirane preko noći na 4°C. Sledećeg dana, mikrotitarske ploče su blokirane sa 300 µl PBS/2% BSA/0,02% NaN3tokom 3 h na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane 4 puta sa PBS/0,05% Tween20/0,02% NaN3. Dodati su supernatanti kulture CMT-93 ćelija (konačno razblaženje 1:5, 100 µl/bunarčiću).

[0439] Kako bi se utvrdila kriva titracije, mišji KC (R&D Systems® kat. br. 453-KC; 100 µl/bunarčiću) je titrisan od 1 ng/ml do 0,016 ng/ml u koracima razblaživanja 1:2. Nakon inkubiranja preko noći na sobnoj temperaturi, ploče su isprane 4 puta sa PBS/0,05% Tween 20/0,02% NaN3. Dodato je kozje anti-mišje KC antitelo konjugovano sa biotinom (R&D Systems® kat. br. BAF453; 100 µl/bunarčići) sa 0,1 µg/ml. Uzorci su ostavljeni da reaguju

1

tokom 4 h na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja (4 puta), streptavidin konjugovan sa alkalnom fosfatazom (Jackson Immunoresearch kat. br.016-050-084) je dodat pri konačnom razblaženju od 1/10.000 (100 µl/bunarčiću). Nakon 40 minuta na sobnoj temperaturi, ploče su ponovo isprane 4 puta. Tablete supstrata p-nitrofenil fosfata (Sigma; 5 mg, kat. br. N9389; 20 mg, kat. br. N2765) su rastvorene u dietanolaminskom puferu pH 9,8 da bi se dobila finalna koncentracija od 1 mg/ml. 100 µl supernatanata kulture je dodato u svaki bunarčić i optička gustina je očitana nakon 1 h u čitaču za mikroploče Spectra Max M5 (Molecular Devices) korišćenjem filtera od 405 i 490 nm.

(ii) Izračunavanje

[0440] Podaci su objavljeni kao srednje vrednosti /- SEM. Konstruisanje krive sa četiri parametra je korišćeno za ELISA izračunavanje. Vrednosti IC50za inhibiciju lučenja KC od strane antitela su izračunate korišćenjem Xlfit<TM>(FIT model 205).

(iii) Rezultati

[0441] I XAB4 i XAB1 imaju sposobnost neutralizacije indukovanja lučenja KC od strane CMT-93 ćelija stimulisanih mišjim ili pacovskim IL-17A i mišjim IL-17A/F. Kontrolno antitelo (Simulect®) nije imalo dejstvo. Vrednosti IC50(srednje vrednosti ± SEM) za XAB4 i XAB1 su prikazane u Tabeli 33. Inhibicija na huIL-17F nije primećena čak ni pri koncentracijama Ab od 10 µM.

Tabela 33. Inhibitorsko dejstvo XAB4 i XAB1 na lučenje mišjeg KC od strane CMT-93 ćelija.

1 1

<a>Osnovna proizvodnja KC bez stimulusa (0,07 ± 0,001 ng/ml) se oduzima.

[0442] Iz ovih eksperimenata je jasno da matično XAB1 antitelo, kao i njegovi derivati, ima neutrališuću aktivnost. Takođe je uočeno da varijanta XAB4 ima veću neutrališuću aktivnost od XAB1.

[0443] U dodatnom eksperimentu, analognom eksperimentu koji je prethodno opisan, sva antitela XAB1-XAB5 se porede, kao što se može videti u Tabeli 34. Ovde se može videti da su profili inhibicije za XAB2, XAB3 i XAB5 uporedivi sa onima koji su uočeni za XAB4 i XAB1, posebno za XAB4.

Tabela 34 Inhibitorsko dejstvo XAB antitela na lučenje KC od strane CMT-93 ćelija.

<a>Osnovna proizvodnja KC bez stimulusa (0,19 ± 5,81 ng/ml) se oduzima.

Primer 14. Test antigenom indukovanog artritisa na pacovu (pacovski AIA)

[0444] Ženke Luisovih pacova (120-150 g) su intradermalno senzitizovane na leđima na dva mesta na metilovani albumin iz goveđeg seruma (mBSA) homogenizovan 1:1 sa kompletnim Frojndovim adjuvansom -21. i -14. dana (0,1 ml sa 5mg/ml mBSA). Pacovi su 0. dana anestezirani koristeći smešu 5% izofluran/vazduh, i održavani pomoću izoflurana na 3,5% preko maske za lice za intraartikularne injekcije. Desno koleno je primilo 50 µl 10 mg/ml mBSA u 5% rastvoru glukoze (koleno sa injektovanim antigenom), dok je levo koleno primilo samo 50 µl 5% rastvora glukoze (koleno sa injektovanim vehikulumom). Zatim je izmeren prečnik levog i desnog kolena pomoću pomičnog merila, odmah nakon intraartikularne injekcije i ponovo 2, 4. i 7. dana.

1 2

[0445] Lečenje je primenjivano jednom subkutanom injekcijom -3. dana. Antitelo iz otkrića je injektovano sa 0,15, 1,5, 15 i 116 mg/kg. Otok desnog kolena je izračunat kao udeo otoka levog kolena, i odnos otoka R/L (desno/levo) kolena je predstavljen u odnosu na vreme, dajući dijagrame površine ispod krive (AUC) za kontrolnu i lečenu grupu. Procenat inhibicije pojedinačnih životinja u svakoj grupi AUC lečenja izračunat je u odnosu na AUC kontrolne grupe (0% inhibicije) pomoću Excel tabele.

Rezultati

[0446] Rezultati su prikazani u Tabeli 35. Inhibicija oticanja desnog kolena povezano sa dozom je prikazana za XAB4 pomoću izračunatog ED50od 1,68 mg/kg s.c.

Tabela 35. Efekat lečenja pomoću XAB4 sa jednom dozom na otok kolena od 0. do 7. dana kod antigenski indukovanog artritisa Luisovih pacova.

Tačke sa podacima predstavljaju srednju vrednost ± SEM za n=5 životinja. * p<0,05 i ** p<0,01 ANOVA a zatim Danetov test u odnosu na kontrolnu krivu.

[0447] Slično tome, dozno povezana inhibicija oticanja kolena je pokazana za XAB4 na modelu koji koristi Vistar pacove (podaci nisu prikazani), i na modelu koji koristi model mišjeg artritisa indukovanog antigenom (podaci nisu prikazani).

Primer 15. Mehanistički model angionegeneze

[0448] Kada se komore koje sadrže humani IL-17A (između 150 i 200 ng) subkutano ubace u miša, izazivaju novi rast krvnih sudova oko implantat. Obim angiogeneze je u korelaciji sa količinom novonastalog tkiva u ovoj oblasti. Profilaktičko lečenje sa XAB4 sa 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1 i 3 mg/kg je inhibiralo angiogenezu indukovanu humanim IL-17. Svih 5 većih doza je

1

dovelo do potentne i značajne inhibicije težine komore tkiva. Četiri veće doze nisu pokazale zavisnost od doze, međutim, doza od 0,03 mg/kg je bila manje efikasna od doza od 0,1 mg/kg i više.

[0449] Ova studija pokazuje da potentno angiogeno dejstvo IL-17A može biti neutralisano sa anti-IL-17A antitelom i pruža eksperimentalni dokaz in vivo efikasnosti XAB4 za humani IL-17A.

Primer 16. Eksperimentalni model autoimunog encefalomijelitisa (EAE)

[0450] Eksperimentalni model autoimunog encefalomijelitisa (EAE) je poznati životinjski model za multiplu sklerozu (pregled vidite npr. u Constantinescu i sar., Br J Pharmacol 2011). Pokazalo se da inhibicija IL-17 smanjuje ozbiljnost EAE kod C57Bl/6 miševa (Haak S i sar.

2009, JCI; 119:61-69).

[0451] Ženke C57Bl/6 miševa (starosti 9 nedelja, Harlan, Nemačka) imunizovane su smešom 50/50 rekombinantnog pacovskog peptida mijelin oligodendrocit glikoproteina (MOG1-125) (generisan interno) i kompletnog Frojndovog adjuvansa (CFA, generisan dodatkom 8 mg/ml soja Mycobacterium tuberculosis H37RA (Difco) u nekompletni Frojndov adjuvans (IFA, Sigma). Imunizacija je izvršena subkutanom injekcijom sa 200 µg/životinji MOG1-125u bazu repa 0. dana. Pored toga, injektovano je 200 ng/životinji pertusis toksina (PT) intraperitonealno 0. i 2. dana.

[0452] Ispitan je efekat terapeutskog tretmana i efekat profilaktičkog tretmana XAB4.

Terapeutski tretman

[0453] Za terapeutski tretman je korišćeno 16 miševa (8 za XAB4 i 8 za kontrolu). Tretman je započet kada su životinje imale klinički rezultat od najmanje 2,5 (ozbiljna slabost zadnjih udova) tokom 3 dana. Posle toga, 15 mg/kg XAB4 ili antitela za kontrolu izotipa je injektovano subkutano svake nedelje u jednoj dozi.

1 4

[0454] Rezultati su prikazani na Slikama 11 do 15 (d.p.i. su dani posle imunizacije). Na svim slikama, XAB4 je predstavljen kružićima a kontrola izotipa kvadratićima. Terapeutski rezultat (srednja vrednost+SEM) prikazan je na Slici 11. Jasno se vidi da su životinje tretirane pomoću XAB4 imale niži srednji klinički rezultat nego kontrola izotipa. Slika 12 prikazuje promenu težine (%) za dve grupe miševa, a Slika 13 prikazuje kumulativne terapeutske rezultate. Slike 14 i 15 su poređenja terapeutskog rezultata pre i posle lečenja. Jasno se vidi na svim dijagramima da XAB4 ima terapeutski efekat u poređenju sa kontrolom izotipa. Tako, terapeutski tretman pomoću XAB4 značajno smanjuje ozbiljnost EAE.

Profilaktički tretman

[0455] Za profilaktički tretman je korišćeno 19 miševa (10 za XAB4 i 9 za kontrolu). Svaka životinja je jedan dan pre imunizacije tretirana sa 15 mg/kg XAB4 ili kontrole izotipa, putem jedne subkutane injekcije. Posle toga, 15 mg/kg XAB4 ili antitela za kontrolu izotipa je injektovano subkutano svake nedelje u jednoj dozi.

[0456] Rezultati su prikazani na Slikama 16 do 20 (d.p.i. su dani posle imunizacije). Na slikama 16 do 19, XAB4 je predstavljen kružićima a kontrola izotipa je predstavljena otvorenim kvadratićima. Profilaktički rezultat (srednja vrednost+SEM) prikazan je na Slici 16. Jasno se vidi da su životinje tretirane pomoću XAB4 imale niži srednji klinički rezultat. Slika 17 prikazuje promenu težine (%) za dve grupe miševa, a Slika 18 prikazuje kumulativne profilaktičke rezultate. Maksimalni profilaktički rezultat se vidi na Slici 19. Jasno se vidi na svim dijagramima da XAB4 ima efekta u poređenju sa kontrolom izotipa. Nadalje, na Slici 20, gde je XAB4 predstavljen punom linijom a kontrola izotipa je predstavljena tačkastom linijom, vidi se da je početak EAE kasniji kod grupe miševa tretirane pomoću XAB4, u poređenju sa grupom miševa tretiranom kontrolom izotipa.

[0457] Tako, prikazano je da profilaktički tretman pomoću XAB4 značajno odlaže početak EAE i smanjuje maksimalnu ozbiljnost EAE.

1

Primer 17. Smanjenje IL17A indukovanih nivoa IL6, CXCL1, IL-8, GM-CSF i CCL2 u humanim astrocitima

[0458] Dejstvo XAB4 na nivoe IL-6, CXCL1, IL-8, GM-CSF, i CCL2 u astrocitima izolovanim iz cerebralnog korteksa ljudskog mozga je ispitano. Astrociti otpuštaju niz faktora rasta, citokina i hemokina koji im omogućavaju da regulišu ćelijsku komunikaciju, migraciju i preživljavanje nervnih, glijalnih i imunskih ćelija. Direktna komunikacija krajnjih astrocitnih stopala sa endotelnim ćelijama takođe omogućava astrocitima da kontrolišu funkciju krvnomoždane barijere. Štaviše, astrociti oslobađaju i preuzimaju neurotransmitere, kao što je glutamat, na sinaptičkoj pukotini što im omogućava da regulišu sinaptičku transmisiju i ekscitoksičnost. Značajno je da astrociti formiraju patologiju ožiljka nakon povrede CNS, i tako imaju prividno suprotne uloge u normalnoj fiziologiji i patofiziologiji. Kod bolesti, smatra se da astrociti imaju ulogu u nizu psihijatrijskih, neuroloških i neurodegenerativnih poremećaja, gde će njihova uloga u neuroinflamaciji verovatno biti značajna.

[0459] Podaci su pokazali da kostimulacija sa IL-17A i TNFα pojačava otpuštanje IL-6, CXCL1, IL-8, GM-CSF i CCL2, i da XAB4 inhibira nivoe IL-6, CXCL1, IL-8, GM-CSF i CCL2 u humanim astrocitima. Ovi podaci ukazuju na dominantnu ulogu IL-17A u otpuštanju citokina iz astrocita i podržavaju njihovo korišćenje kao meta za lek kod neuroinflamatornih bolesti. Od značaja je da je prethodno tretiranje humanih astrocita sa XAB4 inhibiralo nivoe IL-6, CXCL1, IL-8, GM-CSF i CCL2 indukovane sa IL-17A i indukovane sa IL-17A/TNFα, ali je bez uticaja na one indukovane sa TNFα. Uzeti zajedno, ovi podaci ukazuju na to da selektivna inhibicija IL-17A signalizacije sa XAB4 umanjuje nivo proinflamatornih citokina u humanim astrocitima. Kod bolesti, smatra se da astrociti imaju ulogu u nizu psihijatrijskih, neuroloških i neurodegenerativnih poremećaja, gde će njihova uloga u neuroinflamaciji verovatno biti značajna. Novi lekovi koji izmenjuju rad astrocita su stoga potencijalno vredni, kada se regulisanje rada astrocita može pokazati terapeutski korisnim. Posledično, pošto se pokazalo sa XAB4 ima dejstvo na IL-6, CXCL1, IL-8, GM-CSF i CCL2 proizvodnju astrocita, može se zaključiti da XAB4 može biti korisno terapeutsko sredstvo, recimo za lečenje multiple skleroze (MS).

1

Materijali i metode

[0460] Svi citokini su kupljeni od kompanije R&D Systems. Basiliximab (Novartis, Basel, Švajcarska) je korišćen kao izotop za kontrolu. Primarna antitela koja su korišćena su: anti-IL17RA Alexa Fluor 647 (BG/hIL17AR, Biolegend), anti-IL17RC Alexa Fluor 488 (309822, R&D Systems, UK), anti-p65 (Santa Cruz, SAD), mišje IgG Alexa Fluor 647 (MOPC-21, Biolegend, UK), mišje IgG Alexa Fluor 488 (133303, R&D System, UK), mišje IgG Biotin (G155-178, BD Biosciences, Švajcarska) i pacovsko IgG PE (A95-1, BD Biosciences, Švajcarska). Sekundarna antitela i boje koje su korišćene su: biotinilovani kozji anti-zečji IgG (BA1000, Vector, UK), Alexa Fluor 488 i Alexa Fluor 633 konjugovano sa streptavidinom (S11223 i S2137, Life Technology, SAD), kozje anti-mišje Alexa Fluor 488 i Alexa Fluor 633 (A1101 i A21050, Life Technology, SAD), streptavidin BV421 (405226, Biolegend, UK), Hoechst 34580 (H21486, Life Technology, SAD).

Humani astrociti dobijeni iz cerebralnog korteksa su kupljeni od ScienCell Research Laboratory (SAD) (kataloški broj 1800). Ćelije su uzgajane u skladu sa uputstvom dobavljača. Ukratko, ćelije su uzgajane u medijumima humanih astrocita (ScienCell kataloški broj 1801) dopunjenim sa 1% suplementa za rast astrocita (ScienCell kataloški broj 1852), 5% fetalnog telećeg seruma (ScienCell kataloški broj 0010) i 1% penicilina/streptomicina (ScienCell kataloški broj 0503). Ćelije su održavane u flašama za uzgajanje T75 sa 5% CO2i 37°C i zamenom medijuma na svaka tri dana do 80% spajanja. Za sve tretmane, 70.000 ćelija je naneto na ploče sa 24 bunarčića, uzgajane su 3 dana, izgladnjivane bez seruma 2-4 sata, posle čega su astrociti tretirani 2 sata pomoću XAB4, a zatim su tretirani 18-20 h rekombinantnim humanim citokinima, kako je navedeno na legendi slika. Ćelijski peleti su korišćeni za kvantifikaciju nivoa iRNK citokina putem qPCR, i supernatanti su korišćeni za kvantifikaciju nivoa proteina citokina putem HTRF (Cisbio, France, korišćen za IL-6, IL-8 i CXCL1) ili AlphaLISA (PerkinElmer, USA, korišćen za CCL2 i GM-CSF).

[0461] Merenje iRNK citokina je izvršeno putem lančane reakcije polimeraze u realnom vremenu (RT-PCR). Ukratko, astrociti su lizirani tokom 5 min na sobnoj temperaturi laganim mućkanjem u 350 µl pufera za lizu (RLT pufer sa 1% β-merkaptoetanola) i ukupna RNK je ekstrahovana pomoću kompleta RNeasy Microkit (74004, Qiagen, Švajcarska). kDNK je sintetisana pomoću reversne transkriptaze SuperScript III (18080-400, Life Technology, Švajcarska). Nivo ekspresije svakog gena je procenjen putem q-PCR na mašini za PCR u

1

stvarnom vremenu Viia7 (Life Technology, Švajcarska). Sonde Taqman su nabavljene od Life Technology, Švajcarska. Svaki uzorak je analiziran u triplikatu i normalizovan na hipoksantinguanin fosforiboziltransferazu (HPRT). Nivoi humanih IL6, IL8, CXCL1 proteina (ng/ml) u supernatantu humanih astrocita (10 µl) procenjeni su putem HTRF (IL6: 62IL6PEC; IL8: 62IL8PEC; CXCL1: 6FGROPEG, Cisbio, Francuska) i nivo humanog CCL2 proteina (ng/ml) u supernatantu humanih astrocita (5 µl) procenjen je putem AlphaLISA humanog CCL2/MCP1 (AL244C, PerkinElmer, SAD). Sva merenja su izvršena prema uputstvu proizvođača.

[0462] Ćelijske suspenzije humanih astrocita su dobijene od adherentnih kultura pomoću PBS-5mM EDTA. Za ekstracelularno bojenje, ćelije su inkubirane sa celim IgG miša tokom 10 min na 4° C u PBS-u sa 2% BSA, i zatim obojene antitelima tokom 30 min na 4° C u PBS-u sa 2% BSA. Za intracelularno bojenje, ćelije su permeabilisane rastvorom Cytofix/Cytoperm (554714, BD Biosciences, Švajcarska) tokom 20 min na 4°C pre inkubacije sa antitelima tokom 30 min na 4°C. Nakon filtracije kroz sito od 70 µm, ćelije su razvijene na BDFortessa (BD Biosciences, Švajcarska) i podaci su analizirani pomoću softvera FlowJo (Tree Star Inc., SAD).

[0463] Nakon tretiranja jedinjenjem, ćelije su isprane u PBS-u (Sigma Aldrich, Nemačka) i fiksirane u ledenom 100% metanolu tokom 10 min. Ćelije su ispirane 3 x 5 min u sterilnom PBS-u, zatim permeabilizovane inkubacijom sa 0,2% rastvorom Triton-X-100 (Sigma Aldrich, Nemačka) u PBS-u tokom 5 min na sobnoj temperaturi. Nereaktivna mesta su blokirana preko noći na 4°C puferom za blokiranje koji se sastoji od 10% normalnog kozjeg seruma (Life Technology, SAD) i 2% albumina goveđeg seruma (Sigma Aldrich, Nemačka) u PBS-u. Ćelije su zatim inkubirane u primarnom antitelu preko noći na 4°C. Primarno antitelo je uklonjeno, i ćelije su ispirane 3 x 5 min u PBS-u, posle čega je primenjeno sekundarno fluorescentno antitelo tokom 2 h na sobnoj temperaturi. Pokrovne ljuspice su zatim ispirane 5 x 5 min u PBS-u i obojene kontrabojom Hoescht 34580 za nukleinske kiseline. Pokrovne ljuspice su na kraju postavljena na mikroskopske pločice u medijumu za postavljanje VectashieldR (Vector, UK), i krajevi pokrovne ljuspice su zaptiveni lakom za nokte. Ćelije su snimljene pomoću konfokalnog laserskog skenirajućeg mikroskopa Zeiss LSM 510 META koristeći invertni mikroskop Axiovert 200M (Zeiss Ltd, Nemačka).

1

Rezultati

[0464] Antagonizam stimulacije TNF-α ili IL-17A, ili kostimulacije IL-17A/TNF-α putem XAB4 je prikazan na Slikama 21 A do 25 A. Antagonizam kostimulacije IL-1β ili IL-17A/ IL-1β putem XAB4 je prikazan na Slikama 21 B do 25 B.

[0465] Slika 21 prikazuje antagonističko dejstvo na otpuštanje IL-6, Slika 22 prikazuje antagonističko dejstvo na otpuštanje CXCL1, Slika 23 prikazuje antagonističko dejstvo na IL-8, Slika 24 prikazuje antagonističko dejstvo na GM-CSF i Slika 25 prikazuje antagonističko dejstvo na CCL2.

[0466] Primarni humani astrociti su tretirani sa rastućim koncentracijama XAB4 (0,01 nM, 0,1 nM, 1 nM i 10 nM), sa ili bez IL-17A (50 ng/ml), TNF-α (10 ng/ml), IL-1β, IL-17A/TNF-α i IL-1β/TNF-α. Sve korišćene koncentracije su naznačene na slikama. Prikazani podaci predstavljaju dva eksperimenta za 0,01 nM XAB4 i tri eksperimenta za 0,1 nM, 1 nM i 10 nM XAB4. Prikazane vrednosti su srednje vrednosti ± SEM.

[0467] Kao što se može videti na Slici 21A, XAB4 (sve koncentracije) ima antagonističko dejstvo, u poređenju i sa kontrolom i sa izotipom, na otpuštanje IL-6 iz astrocita stimulisanih sa IL-17A, ili IL-17A/TNF-α. Koncentracija IL-6 (ng/ml) je predstavljena y-osom, a koncentracija XAB4 je predstavljena na x-osi (0, tj. kontrola, 0,01 nM, 0,1 nM 1 nM i 10 nM) za svaki skup podataka i 10 nM za izotip. Skup podataka sa leve strane odnosi se na nestimulisane ćelije, sledeći skup podataka se odnosi na ćelije stimulisane sa TNF-α (10 ng/ml), sledeći skup podataka se odnosi na ćelije stimulisane sa IL-17A (50 ng/ml), a poslednji skup podataka se odnosi na ćelije kostimulisane sa TNF-α (10 ng/ml) i IL-17A (50 ng/ml). Poslednji skup podataka ima od 10 puta veću razmeru y-ose. Kao što se vidi na Slici 21B, XAB4 (sve koncentracije) nema antagonističko dejstvo na ćelije stimulisane sa IL-1β (0,1 ng/ml) ili kostimulisane sa IL-1β (0,1 ng/ml) i IL-17A (50 ng/ml), u poređenju sa izotipom.

[0468] Kao što se može videti na Slici 22A, XAB4 (sve koncentracije) ima antagonističko dejstvo, u poređenju i sa kontrolom i sa izotipom, na otpuštanje CXCL1 iz astrocita stimulisanih sa IL-17A, ili IL-17A/TNF-α. Koncentracija CXCL1 (ng/ml) je predstavljena yosom, a koncentracija XAB4 je predstavljena na x-osi (0, tj. kontrola, 0,01 nM, 0,1 nM 1 nM i

1

10 nM) za svaki skup podataka i 10 nM za izotip. Skup podataka sa leve strane odnosi se na nestimulisane ćelije, sledeći skup podataka se odnosi na ćelije stimulisane sa TNF-α (10 ng/ml), sledeći skup podataka se odnosi na ćelije stimulisane sa IL-17A (50 ng/ml), a poslednji skup podataka se odnosi na ćelije kostimulisane sa TNF-α (10 ng/ml) i IL-17A (50 ng/ml). Poslednji skup podataka ima od 10 puta veću razmeru y-ose. Kao što se vidi na Slici 22B, XAB4 (sve koncentracije) nema antagonističko dejstvo na ćelije stimulisane sa IL-1β (0,1 ng/ml) ili kostimulisane sa IL-1β (0,1 ng/ml) i IL-17A (50 ng/ml), u poređenju sa izotipom.

[0469] Kao što se može videti na Slici 23A, XAB4 (sve koncentracije) ima antagonističko dejstvo, u poređenju sa kontrolom, na otpuštanje IL-8 iz astrocita stimulisanih sa IL-17A, ili IL-17A/TNF-α. U poređenju sa izotipom, XAB4 (0,1 nM, 1 nM i 10 nM) ima antagonističko dejstvo na otpuštanje IL-8. Koncentracija IL-8 (ng/ml) je predstavljena y-osom, a koncentracija XAB4 je predstavljena na x-osi (0, tj. kontrola, 0,01 nM, 0,1 nM 1 nM i 10 nM) za svaki skup podataka i 10 nM za izotip. Skup podataka sa leve strane odnosi se na nestimulisane ćelije, sledeći skup podataka se odnosi na ćelije stimulisane sa TNF-α (10 ng/ml), sledeći skup podataka se odnosi na ćelije stimulisane sa IL-17A (50 ng/ml), a poslednji skup podataka se odnosi na ćelije kostimulisane sa TNF-α (10 ng/ml) i IL-17A (50 ng/ml). Poslednji skup podataka ima oko 5 puta veću razmeru y-ose. Kao što se vidi na Slici 23B, XAB4 (sve koncentracije) nema antagonističko dejstvo na ćelije stimulisane sa IL-1β (0,1 ng/ml) ili kostimulisane sa IL-1β (0,1 ng/ml) i IL-17A (50 ng/ml), u poređenju sa izotipom.

[0470] Kao što se može videti na Slici 24A, XAB4 (sve koncentracije) ima antagonističko dejstvo, u poređenju i sa kontrolom i sa izotipom, na otpuštanje GM-CSF iz astrocita stimulisanih sa IL-17A/TNF-α. XAB4 (0,1 nM, 1 nM i 10 nM) ima antagonističko dejstvo na otpuštanje GM-CSF iz astrocita stimulisanih sa IL-17A, u poređenju sa izotipom i kontrolom. Koncentracija GM-CSF (ng/ml) je predstavljena y-osom, a koncentracija XAB4 je predstavljena na x-osi (0, tj. kontrola, 0,01 nM, 0,1 nM 1 nM i 10 nM) za svaki skup podataka i 10 nM za izotip. Skup podataka sa leve strane odnosi se na nestimulisane ćelije, sledeći skup podataka se odnosi na ćelije stimulisane sa TNF-α (10 ng/ml), sledeći skup podataka se odnosi na ćelije stimulisane sa IL-17A (50 ng/ml), a poslednji skup podataka se odnosi na ćelije kostimulisane sa TNF-α (10 ng/ml) i IL-17A (50 ng/ml). Kao što se vidi na Slici 24B, XAB4 (sve koncentracije) nema ili ima malo antagonističko dejstvo na ćelije stimulisane sa IL-1β (0,1 ng/ml) ili kostimulisane sa IL-1β (0,1 ng/ml) i IL-17A (50 ng/ml), u poređenju sa izotipom.

1

[0471] Kao što se može videti na Slici 25A, XAB4 (sve koncentracije) ima antagonističko dejstvo, u poređenju i sa kontrolom i sa izotipom, na otpuštanje CCL2 iz astrocita stimulisanih sa IL-17A. XAB4 (0,1 nM, 1 nM i 10 nM) ima antagonističko dejstvo na otpuštanje CCL2 iz astrocita stimulisanih sa IL-17A/TNF-α, u poređenju sa izotipom i kontrolom. Koncentracija CCL2 (ng/ml) je predstavljena y-osom, a koncentracija XAB4 je predstavljena na x-osi (0, tj. kontrola, 0,01 nM, 0,1 nM 1 nM i 10 nM) za svaki skup podataka i 10 nM za izotip. Skup podataka sa leve strane odnosi se na nestimulisane ćelije, sledeći skup podataka se odnosi na ćelije stimulisane sa TNF-α (10 ng/ml), sledeći skup podataka se odnosi na ćelije stimulisane sa IL-17A (50 ng/ml), a poslednji skup podataka se odnosi na ćelije kostimulisane sa TNF-α (10 ng/ml) i IL-17A (50 ng/ml). Kao što se vidi na Slici 25B, XAB4 (sve koncentracije) nema antagonističko dejstvo na ćelije stimulisane sa IL-1β (0,1 ng/ml) ili kostimulisane sa IL-1β (0,1 ng/ml) i IL-17A (50 ng/ml), u poređenju sa izotipom.

[0472] Uzeti zajedno, ovi podaci ukazuju na to da selektivno inhibiranje IL-17A signalizacije sa XAB4 umanjuje nivo proinflamatornih citokina u humanim astrocitima. Kod bolesti, smatra se da astrociti imaju ulogu u nizu psihijatrijskih, neuroloških i neurodegenerativnih poremećaja, gde će njihova uloga u neuroinflamaciji verovatno biti značajna. Pošto se pokazalo da XAB4 ima dejstvo na IL-6, CXCL1, IL-8, GM-CSF i CCL2 proizvodnju astrocita, XAB4 može biti korisno terapeutsko sredstvo, recimo za lečenje multiple skleroze (MS).

Informacije o sekvencama

[0473] Podaci o sekvencama koji se odnose na XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 i XAB5 su navedeni u nastavku radi lakšeg pregleda.

[0474] Tabela 1 opisuje sekvence aminokiselina (ID BR. SEKV.) teških i lakih lanaca kompletne dužine primera XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 i XAB5.

[0475] XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 ili XAB5 antitela mogu da se proizvedu pomoću uobičajenih procesa rekombinantne proizvodnje i prečišćavanja antitela. Na primer, kodirajuće sekvence kao što su opisane u Tabeli 3 ili Tabeli 4 se kloniraju u proizvodni vektor radi rekombinantne ekspresije u proizvodnoj ćelijskoj liniji sisara.

1 1

[0476] Tabela 2 rezimira aminokiselinske sekvence varijabilnih teških (VH) i lakih lanaca (VL) XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 ili XAB5, koje mogu da se koriste za generisanje himernih antitela iz XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 ili XAB5.

[0477] Tabela 5 rezimira korisne CDR sekvence XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 i XAB5 (i sekvence konsenzusa) za generisanje alternativnih CDR graftovanih antitela, pri čemu su CDR regioni iz XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 i XAB5 definisani prema Kabatovoj definiciji.

[0478] Tabela 6 rezimira korisne CDR sekvence XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 i XAB5 (i sekvence konsenzusa) za generisanje alternativnih CDR graftovanih antitela, pri čemu su CDR regioni iz XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 i XAB5 definisani prema Čotijinoj definiciji.

[0479] Sve sekvence navedene u ovoj specifikaciji (ID BR. SEKV.) mogu se naći u Tabeli 36.

SPISAK SEKVENCI

[0480] Korisne sekvence aminokiselina i nukleotida za primenu pronalaska mogu se naći u Tabeli 36.

Tabela 36. Spisak sekvenci

1 2

1

14

1

1

1

1

1

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

1

11

12

Claims (17)

PATENTNI ZAHTEVI Podnosi se sledeći zahtev:

1. Izolovano terapeutsko humano antitelo ili njegov antigen-vezujući deo koji sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) prema ID BR. SEKV: 12 i varijabilni region lakog lanca (VL) prema ID BR. SEKV: 43,

i pri čemu se pomenuto antitelo ili njegov antigen-vezujući deo specifično vezuju za homodimerni IL-17A ili heterodimerni IL-17AF, ali se ne vezuju specifično za homodimerni IL-17F.

2. Izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući deo prema zahtevu 1, pri čemu su IL-17A, IL-17AF ili IL-17F izabrani od jednog ili više od majmuna cinomolgusa, majmuna rezus makaki, majmuna marmozet, pacova, miša ili čoveka.

3. Izolovano antitelo prema zahtevu 1 ili 2 koje sadrži aminokiselinsku sekvencu teškog lanca prema ID BR. SEKV: 14 i aminokiselinsku sekvencu lakog lanca prema ID BR. SEKV: 44.

4. Izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući deo prema bilo kom od prethodnih zahteva, sposobno za inhibiranje lučenja IL-6 ili lučenja GRO-alfa prilikom in vitro testiranja, poželjno korišćenjem uzgajanih hondrocita ili fibroblasta.

5. Izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući deo prema bilo kom od prethodnih zahteva, sposobno za inhibiranje oticanja kolena kod antigenom indukovanog artritisa u in vivo eksperimentalnom modelu.

6. Izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući deo prema bilo kom od prethodnih zahteva, konjugovano sa daljim funkcionalnim ostatkom.

7. Izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući deo prema bilo kom od prethodnih zahteva, koje je monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući deo.

8. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo ili njegov antigen-vezujući deo prema bilo kom od prethodnih zahteva, u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa, razblaživača ili nosača.

9. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 8, koja dalje sadrži jedan ili više dodatnih aktivnih sastojaka.

10. Izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući deo prema bilo kom od zahteva 1 do 7 za upotrebu kao lek.

11. Izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući deo prema bilo kom od zahteva 1 do 7 za upotrebu u lečenju inflamatornog poremećaja ili stanja.

12. Izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući deo za upotrebu prema zahtevu 11, pri čemu je poremećaj ili stanje artritis, reumatoidni artritis, psorijaza, hronična opstruktivna bolest pluća, sistemski eritemski lupus (SLE), lupus nefritis, astma, multipla skleroza ili cistična fibroza.

13. Izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira bilo koje od antitela ili njihovih antigen-vezujućih delova kao što je definisano u bilo kom od zahteva 1 do 7.

14. Klonirajući ili ekspresioni vektor koji sadrži jednu ili više sekvenci nukleinske kiseline prema zahtevu 13, pri čemu je vektor pogodan za rekombinantnu proizvodnju izolovanog antitela ili njegovih antigen-vezujućih delova kao što je definisano bilo kojim od zahteva 1 do 7.

15. Ćelija domaćin koja sadrži jedan ili više klonirajućih ili ekspresionih vektora prema zahtevu 14.

16. Izolovani molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 13, pri čemu je molekul nukleinske kiseline informaciona RNK (iRNK).

1 4

17. Postupak za proizvodnju izolovanog antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela prema bilo kom od zahteva 1 do 7, koji sadrži uzgajanje ćelije domaćina prema zahtevu 15, prečišćavanje i regenerisanje pomenutog antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela.

1