RS58802B1

RS58802B1 - Modifikovani fenilalanin-amonijak-liazni polipeptidi

Info

Publication number: RS58802B1
Application number: RS20190709A
Authority: RS
Inventors: Gjalt W Huisman; Nicholas J Agard; Benjamin Mijts; Jonathan Vroom; Xiyun Zhang
Original assignee: Codexis Inc
Priority date: 2013-04-18
Filing date: 2014-04-17
Publication date: 2019-07-31
Also published as: LT2986722T; AU2014253900A1; US20200231959A1; PH12015502412A1; SG11201508598YA; CY1121891T1; US20200040325A1; US20190055536A1; AU2019272057A1; MY193198A; US20190241882A1; DK3521423T3; US11130947B2; EP2986722B1; US10160963B2; JP2020185016A; EP2986722A2; WO2014172541A2; JP7129715B2; MX2015014662A

Description

OBLAST PRONALASKA

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na modifikovane fenilalanin amonijak-liaza (FAL) polipeptide i njihove kompozicije, kaoi na polinukleotide koji kodiraju modifikovane fenilalanin amonijakliaza (FAL) polipeptide. U nekim ostvarenjima, modifikovani fenilalanin amonijak-liaza (FAL) polipeptide su optimizovani da obezbede pojačanu kataliičku aktivnost, kao i redukovanu osetljivost na proteolizu i povećanu toleranciju na kisele nivoe pH. U nekim ostvarenjima, modifikovani fenilalanin amonijak-liaza (FAL) polipeptidi su deimunizovani. Pronalazak se takođe odnosi na upotrebu kompozicija koje sadrže modifikovane FAL polipeptide za terapeutske i industrijske namene.

POZADINA PRONALASKA

[0002] Fenilalanin amonijak-liaza (FAL) zajedno sa histidina amonijak-liazom (HAL) i tirozin amonijak-lijazom (TAL) su članovi familije aromatičnih amino kiselinksih lijaza (EC 4.3.1.23-1.25 and 4.3.1.3). Još specifičnije enzimi koji poseduju FAL aktivnost (EC 4.3.1.23-1.25 i prethodno klasifikovani kao EC4.3.1.5) katalizuju neoksidativnu deaminaciju L-fenilalanina u (E)-cinaminsku kiselinu. FAL je ne-sisarski enzim koji je široko rasprostranjen među biljkama i takoše je identifikovan u gljivama i u ograničenom broju bakterija. FAL enzimi mogu da se koriste kao terapeutski protein za tretiranje metaboličkih poremećaja, fenilketonurije (FKU). FKU je autozomalni metabolički genetiki poremećaj u kome enzim jetre fenilalanin hidroksilaza (FAH) ili jedan ili više enzima koji su uključeni u sintezu ili recikliranje kofaktoratetrahidrobiopterina, su nefunksionalni usled mutacije u jednom ili više odgovarajućih gena. Nedostatak funkcionalnosti rezultira u visokim nivoima fenialanina u krvotoku. Fenilalanin se konvertuje u fenilpiruvat (fenilketon) i druge derivate. Kod ljudi, ako se FKU ne tretira u ranoj fazi, visoki nivoi fenilalanina i nekih produkata degradacije mogu prouzrokovati značajne medicinske problem uključujući intelektualna oštećenja, mikrocefaliju ili napade. Mnogobrojne studije su se fokusirale na upotrebu FAL u tretmanima FKU putem supstitucije enzima (Ambrus et al., Science 201:837-839 [1978]; Bourget et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 10:57-59 [1984]; i Sarkissian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:2339-2344 [1999]).

[0003] Jedna metoda detoksifikacije fenilalanina u krovotoku je upotreba injektabilnog rekombinantnog FAL ili FAL varijanti koje su modifikovani pegilacijom (PEG-FAL). Pegilacija se pokazala da poboljšava piluživot enzima i redukuje odgovor domaćina na antigen (Videti na pr. WO 2008/153776, WO 2011/097335, i US Pat. No.7,531,341). FAL varijante koje su korisne u PEG-FAL kompozicijama su opisane kao varijante divljeg tipa Nostoc punctiforme (NpFAL); Anabaena variabilis (AvFAL) i Rhodosporidium toruloides (RtFAL). Posebno, varijante divljeg tipa AvFAL su opisane naznačeno time da su cisteinski ostaci na pozicijama 64, 318, 503 i 565 zamenjeni sa serinom (Videti e.g., US Pat Nos: 7,790,433; 7,560,263; i 7,537,923).

[0004] Alternativni put administarcije FAL kao načina redukcije koncentracije L-fenilalanina u plazmi kod FKU pacijenata je neizvazivna fromulacija kao što je oralna formulacija (Sarkissian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:2339-2344 [1999]). Ključna prednost oralne administracije FAL-a je smanjena izlošenost enzima imunom sistemu a samim tim minimalizuje se imuni odgovor koji se beleši kod injektabilnog PEG-FAL. Međutim, glavno ograničenje za oralnu formulaciju FAL je gubitak enzimske aktivnosti u želucu i lumenu creva. Kako bi FAL bio efektivan i funkcionalan on mora biti otporan na degradaciju usled niske pH i proteaza kao što su tripsin, himotripsin, karboksipeptidaze i pepsin koji normalno degraduju proteinsku hranu do oligopeptida i amino kiselina. U nekim prethodnim studijama (Sarkissian, supra) u cilju postizanja značajnog efekta za oralnu administraciju FAL, velike količine enzima su bile neophodne, delimično zbog enzimske degradacije od strane proteaza a delimično zbog relativno niske aktivnosti na pH 7.0. Različiti načini supresije FAL degardacije nakon digestije su izučavani (Kim et al., Molec. Therap., 10:220 - 224 [2004]; and Shah et al., Int. J. Pharmaceut., 356:61-68 [2008]).

[0005] Jedan pristup za povećanje efektivnosti FAL u nepovoljnim uslovima digestivnog trakta je da se obezbede modifikovani FAL polipeptidi koji su tolerantni na inherentne nepovoljne uslove. Kang i autori su koristili mutagenezu usmerenu na mesto (site directed mutagenesis) mesta za sečenje himotipsina i pegilaciju površinskog lizina AvFAL kako bi redukovali proteolitičku inaktivaciju (Videti, Kang et al., Mol. Gen. Metabol., 99:4-9 [2010]). U ovim studijama deset mesta za sečenje su specifično mutirana i svi osim dva od ovih dobijenih mutanata (F18A I R94G) su izbubila preko 50% originalne enzimske aktivnosti. Nijedan od mutanata nije pokzaivao povećanu aktivnost a F18A mutant je pokazao malo povećanje u rezistenciji na tripsin (Kang et al., supra). Dalje studije sa FAL, iako efektivne, generalno nisu rezultirale u produženom životu enzima. Zato, oralna administracija prethodno opisanih FAL mutanata i njihovih derivate ne rezultira u efektivnim tretmanima FKU.

[0006] Uprkos ostvarenom progresu sa različitim formulacijama FAL ostaje potreba za FAL polipeptidima koji imaju poboljšane osobine za oralnu administraciju. Ove poboljšane osobine uključuju bez ograničenja duži polu-život, povećanu katalitičku aktivnost, poboljšanu stabilost u uslovima digestivnog trakta i redukovanu agregaciju.

[0007] Kao dodatak terapeutskim primenana FAL enziimi se mogu koristiti u industrijskoj sintezi L-fenilalanina i drugih substituisanih L-fenilalaninskih derivata. Ovi derivati mogu biti korišćeni kao farmaceutski prekursori (Gloge et al., Chem., 6: 3386-3390 [2000]; Bartsch et al., Prot. Eng. Des. Sel., 23:929-933 [2010]; and Turner, Curr. Opin. Chem. Biol., 234-240 [2011])

[0008] FAL enzimi se takođe mogu upotrebljavati u poljoprivredi. FAL igra značajnu ulogu u biosintezi fenilpropanoida (kao što su flavonoidi i lignin) u biljkama, gljivama i bakterijama i može da ima ulogu enzima povezanog sa odbranom (Bate et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7608-7612 [1994]). Modulacija FAL aktivnosti upotrebom rekombinantnih polipeptida koji imaju FAL aktivnost moće da dovede do nastanka efikasnih herbicida.

[0009] FAL polipeptidi iz cijanobakterija Anabaena Variabilis and Nostoc punctiforme su uspešno kinetičku i strukturno opisani (Moffitt M C et al., Amer. Chem. Soc., Biochemistry, 2007, 46 (4), pp 1004-1012).

[0010] Više vrsta PEGiolvanih rekombinantnih fenilalanin amonijak liaza je evaluirano za tertiranje fenilketonurija od strane Sarkissian et al. (Sarkissian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105:20894-20899 [2008]).

[0011] Kompozicije prokariotskih fenilalanin amonijak-liaza i metoda njihovog korišćenja su opisani u patentu US 2008/0008695 A1.

[0012] US 5,753,487 opisuje metodu za hemijsku modifikaciju fenilalanin amonijak-liaza enzima kako bi bili stabilisani u odnosu na proteolitičku degradaciju.

KRATAK PREGLED PRONALASKA

[0013] Ovaj pronalazak se odnosi na modifikovane fenilalanin amonijak-liaza (FAL) polipeptide i njihove kompozicije, kaoi na polinukleotide koji kodiraju modifikovane fenilalanin amonijakliaza (FAL) polipeptide. U nekim aspektima modifikovani polipeptidi su optimizovani da obezbede pojačanu katalitičku aktivnost, kao i redukovanu senzitivnost na proteolizu i povećanu toleranciju prema kiselim pH nivoima. U nekim aspektima modifikovani FAL polipeptidi su deimunizovani. Ovaj pronalazak se takođe odnosi na upotrebu kompozicija koje obuhvataju modifikovane FAL polipeptide za terapeutske i industrisjke potrebe. U nekim aspektima, ovaj pronalazak se odnosi na modifikovane fenilalanin amonijak-liaza (FAL) polipeptide i njihove biološki aktivne fragmente i analoge koji imaju poboljšane osobine kao što su povećana tolerancija na kiselu pH i/ili redukovanu senzitivnost na proteolizu.

[0014] Ovaj pronalazak se odnosi na modifikovane fenilalanin amonijak-liaza (FAL) polipeptide i njihove biološki aktivne fragmente i analoge koji imaju poboljšane osobine kada se uporede sa divljim tipom FAL enzima ili referentnim FAL polipeptidom pod suštinski istim uslovima. Ovaj pronalazak se dalje odnosi na metode upotrebe modifikovanih FAL polipeptida i njihovih biološki aktivnih fragmenata i analoga u terapeutskim i/ili industrijskim kompozicijama i metodama upotrebe ovakvih kompozicija za terapeutske i/ili industrijske procese.

[0015] Ovaj pronalazak obezbeđuje modifikovanu fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost koja obuhvata: a) aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 85% identična sa referentnom sekvencom SEQ ID NO:4 ili njenim funkcionalnim fragmentom; i b) polipeptidnu sekvencu koja obuhvata najmanje jednu razliku u aminokiselinskom ostatku kada se uporedi sa SEQ ID NO:4 ili njenim funkcionalnim fragmentom na jednom ili više aminokiseonskih pozicija; i c) koji poseduje poboljšane osobine odabrane od i) pojačana katalitička aktivnost, ii) redukovana senzitivnost na proteolizu, iii) povećana tolerancija na kiselu pH iv) redukovana imunogenost ili kombinacija bilo koje od i), ii), iii) ili iv), kada se uporedi sa referentnom sekvencom SEQ ID NO:4, naznačeno time da postoji najmanje jedna razlika u aminokiselinskom ostatku na poziciji 307, i naznačeno time da su aminokiselinske pozicije pobrojane kao i u referentnom SEQ ID NO:4.

[0016] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje polinukleotidnu sekvencu koja kodira najmanje jedan modifikovan polipeptid iz pronalaska, opcionalno naznačeno time da:

(i) je pomenuta sekvenca operativno povezana sa kontrolnom sekvencom; i/ili (ii) je pomenuti polinukleotid kodon-optimizovan.

[0017] Ovaj pronalazak takođe obuhvata ekspresiju koja obuhvata najmanje jedne polinukleotidne sekvence iz pronalaska, i najmanje jedne kontrolne sekvence, opcionalno naznačeno time da je pomenuta kontrolna sekvenca promotor, na primer, naznačeno time da je pomenuti promotor heterologni promotor.

[0018] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje domaćinsku ćeliju koja je transformisana sa najmnaje jednom polinukleptidnom sekvencom iz pronalaska, i/ili vektorom iz pronalaska, opcionalno naznačeno time da je domaćinska ćelija E.coli.

[0019] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje metodu za proizvodnju modifikovanog FAL polipeptida u domaćinskoj ćeliji koja obuhvata gajenje domaćinske ćelije koja sadrži najmanje jedan polinukleotid koji kodira najmanje jedan modifikovani polipeptid koji ima fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost iz pronalaska, i/ili najmanje jednu polinukleotidnu sekvencu pronalaska, i/ili najmanje jedan vektor iz pronalaska, u povoljnim uslovima gajenja, tako da se najmanje jedan modifikovani FAL polipeptid proizvodi, opcionalno naznačeno time da pomenuta metoda dalje obuhvata dobijanje najmanje jednog modifikovanog polipeptida koji ima fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost iz kulture i/ili domaćinskih ćelija, na primer naznačeno time da pomenuta metoda obuhvata korak prečišćavanja pomenutog najmanje jednog modifikovanog polipeptida koji ima fenilalanin fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost produkovanu.

[0020] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje kompoziciju koja obuhvata najmanje jedan modifikovani polipeptid koji ima fenilalanin fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost iz pronalaska, opcionalno naznačeno time da je pomenuta kompozicija:

(i) farmaceutska kompozicija, opcionalno naznačeno time da pomenuta farmaceutska kompozicija dalje obuhvata najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv ekcipijent i/ili nosač, i/ili (ii) je pogodna za tretman fenilketonurije.

[0021] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje polipeptid na osnovu pronalaska ili kompoziciju na osnovu pronalaska za upotrebu u terapiji.

[0022] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju iz pronalaska za upotrebu u tretmanu i/ili prevenciji simptoma fenilketonurije u subjektu.

[0023] U prvom apsektu, postoje otkriveni modifikovani fenilalanin amonijak-liaza (FAL) polipeptidinaznačeno time da modifikovani FAL polipeptidi imaju poboljšane osobine odabrane iz grupe sledećih i) pojačana katalitička aktivnost, ii) redukovana osetljivost na proteolizu, iii) povećana tolerancija na kiselu pH, iv) redukovana agregacija, ili bilo koja kokmbinacija i), ii), iii) ili iv), kada se uporedi sa referentnom sekvencom kad se meri pod suštinski istim uslovima. U nekim specifičnim aspektima, modifikovani FAL pollipeptidi imaju dve poboljšane osobine. U drugim specifičnim aspektima, poboljšana osobina je redukovana senzitivnost na proteolizu, a u još nekom drugim specifičnim aspektima poboljana osobina je pojačana tolerancija na kiselu pH.

[0024] U drugom aspektu ovog pronalaska, modifikovani FAL polipeptidi ukjlučuju proteine koji imaju najmanje 85% identičnih amino kiselinskih sekvenci sa SEQ ID NO:4 ili njegovim funkcionalnim fragmentom i raziku u amino kiselinskom ostatku na poziciji koja odgovara pozicijama X39; X91; X158; X180; X195; X243; X245; X256; X257; X270; X290; X307; X308; X326; X349; X364; X394; X399; X400; X404; X407; X443; X453; X459; X460; X463; X474; X522; X524; i X528, kada se optimalno poravnaju sa polipeptidom od SEQ ID NO:4.

[0025] U nekim specifčnim aspektima prvog i drugog aspekta ovog otkrivaja, modifikovani FAL polipeptidi obuhvataju najmanje razliku u amino kiselinskom ostatku na jednom mestu ili na više pozicija aminokiselinskog ostatka koje odgovaraju A39; A91; Y158; S180; K195; T243; 1245; A256; L257; N270; N290; H307; E308; 1326; L349; L364; A394; S399; N400; P404; L407; F443; N453; Y459; T460; T463; N474; K522; T524; i P528, kada se optimalno poravnaju sa polipeptidom od SEQ ID NO:4. U nekim specifičnim aspektima modifikovani FAL polipeptidi obuhvataju najmanje 2 najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7, najmanje 8, najmanje 9, najmanje 10, najmanje 15 i najmanje 20 razlika u aminokiselinksim ostacima u odnosu na raferentni polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4.

[0026] U nekim specifčnim aspektima prvog i drugog aspekta ovog otkrivaja, modifikovani FAL polipeptidi obuhvataju najmanje 90%, (najmanje 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%) aminokiselinske identičnosti sa SEQ ID NO:4. U još daljim specifičnim aspektima, modifikovani FAL polipeptidi obuhvataju najmanje 90%, (najmanje 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%) aminokiselinske identičnosti sa SEQ ID NO:4., i obuhvataju jednu ili više od sledećih supstitucija A39V; A91V; Y158H; S180A; K195E; T243I/L; I245L; A256G; L257W/A; N270K; N290G; H307G/Q/M; E308Q; I326F; L349M; L364Q; A394V; S399N; N400K; P404A; L407V; F443H; N453G; Y459F; T460G; T463N; N474Q; K522Y/F/N; T524S; and P528L.

[0027] U drugim specifčnim aspektima modifikovani FAL polipeptidi su dobijeni zi divljeg soja Anabaena variabilis FAL (kao što je ATCC29413; NCBI proteinska referentna sekvenca YP_324488.1; SEQ ID NO:4).

0028] U trećem aspektu modifikovani FAL polipeptidi koji imaju fenilalanin amonijak-liaznu

(FAL) aktivnost koji su ovde otkriveni obuhvataju aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 99% identičnu sekvencu sa SEQ ID NO:10 ili njenim funkcionalnim fragmentom.

[0029] U četvrtom aspektu modifikovani FAL polipeptidi koji imaju fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost koji su ovde otkriveni obuhvataju aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnu sekvencu sa SEQ ID NO:10 ili njegovim funkcionalnim fragmentom i dalje imaju razliku u aminokiselinskom ostatku u poređenju sa SEQ ID NO:10, na jednoj, dve, tri, četiri, pet ili šest dodatnih amoino kiselinskih pozicija.

[0030] U petom aspektu otkrivenia polinukleotidna sekvenca koja kodira bilo koji od modifikovanih FAL polipeptida kao što je ovde opisano.

[0031] U šestom aspektu postoji otkrivena farmaceutska kompozicija ili industrijska kompozicija koja obuhvata jedan od modifikovanih FAL polipeptida kao što jeovde opisano.

[0032] U nekim ostvarenjima postoje otkriveni modifikovani polipeptidi koji imaju fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost koji obuhvataju a) aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 85% identičnu seknvencu sa referentnom sekvencom SEQ ID NO:4 ili njenim funkcionalnim fragmentom; b) razliku u aminokiselinskom ostatkukada se uporedi sa SEQ ID NO:4 ili njenim funkcionalnim fragmentomna jednoj ili više aminokiselinskih pozicija; c) koja pokazuje poboljšane osobine odabrane od bilo koje od i), ii), iii) ili iv) kada se uporedi sareferentnom sekvencom. U nekim ostvarenjima, jedna ili više aminokiselinskih pozicija su odabrane od X39; X54; X59; X73; X91; X158; X112, X134, X180; X195; X240; X243; X245; X256; X257; X270; X290; X304, X305; X307; X308; X326; X349; X353; X364; X394; X399; X400; X404; X407; X443; X453; X459; X460; X463; X474; X509; X521; X522; X524; X528; X546; X564; i/ili njihovih kombinacija kada se optimalno poravnaju sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:4. U nekim dodatnim apektima, poboljšana osobina odabrana je od redukovane senzitivnosti na proteolizu i/ili povećane tolerancije na kiselu pH. U još dodatnim aspektima referentna sekvenca je divlji tip FAL dobijen iz Anabaena variabilis. U nekim daljim aspektima aminokiselinski ostatak referentne sekvence of SEQ ID NO:4 odgovara A39; T54; G59, S73; A91; Y158; S180; K195; A112; R134; Q240; T243; 1245; A256; L257; N270; N290; Y304; R305; H307; E308; 1326; L349; D353; L364; A394; S399; N400; P404; L407; F443; N453; Y459; T460; T463; N474; E509; Q521; K522; T524; P528; S546; i/ili P564. U nekim ostvarenjima razlika u aminokiselinskom ostatku kada se uporedi sa SEQ ID NO:4 je odabrana od jedne ili više supstitucija koje slede: A39V; T54K; G59R; S73K; A112C; R134Q; A91V; Y158H; S180A; K195E; Q240R/W; T243I/L; I245L; A256G; L257W/A; N270K; N290G; Y304H; R305M; H307G/Q/M; E308Q; I326F; L349M; D353A/N; L364Q; A394V; S399N; N400K; P404A; L407V; F443H; N453G; Y459F; T460G; T463N; N474Q; E509L; Q521K/S; K522Y/F/N; T524S;P528L; S546R; i P564 G/L/M; kada se optimalno poravnaju sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 4. U nekim daljim aspektima, modifikovani polipeptid ima najmanje oko 90%, ima najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99%, ili oko 100% sekvencne identičnosti sa referentnom sekvencom SEQ ID NO:4. U nekim daljim aspektima modifikovani polipeptid ima najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% sekvencne identičnosti sa referentnom sekvencom SEQ ID NO:4. U nekim daljim aspektima modifikovani polipeptid ima najmanje oko 90% sekvencne identičnosti sa referentnom sekvencom SEQ ID NO:4. U nekim dodatnim aspektima, modifikovani polipeptid ima najmanje oko 95% sekvencne identičnosti sa referentnom sekvencom SEQ ID NO:4. U nekim dodatnim aspektima, modifikovani polipeptid ima najmanje oko 90% sekvencne identičnosti sa referentnom sekvencom SEQ ID NO:4; i razliku u aminokiselinskom ostatku na poziciji H307. U nekim dodatnim aspektima, modifikovani polipeptid ima najmanje 90% sekvencne identičnosti sa referentnom sekvencom SEQ ID NO:4; U nekim daljim aspektima modifikovani polipeptid ima najmanje 95% sekvencne identičnosti sa referentnom sekvencom SEQ ID NO:4. U nekim dodatnim aspektima, modifikovani polipeptid ima najmanje oko 90% sekvencne identičnosti sa referentnom sekvencom SEQ ID NO:4; i razliku u aminokiselinskom ostatku na poziciji H307. U nekim dodatnim aspektima razlika u aminokiselinskom ostatku je H307G/Q/M. U nekim daljim aspektima, razlika u aminokiselinskom ostatku je odabrana iz kombinacije jedne ili više od A39; A91; Q240; A256; N290; Y304; R305; H307; D353 A394; S399; P404; L407; Q521; K522; and T524.

[0033] Postoje takođe otkriveni modifikovani polipeptidi koji imaju fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost koja obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99%, ili najmanje oko 100% identična u sekvenci sa SEQ ID NO:6, 8, 10, 12, i/ili 14, ili njihovim funkcionalnim fragmentima. U nekim ostvarenjima, modifikovani polipeptidi koji imaju fenilalanin amonijakliaznu (FAL) aktivnost obuhvataju aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 95% identičnu sekvencu sa SEQ ID NO:6, 8, 10, 12, i/ili 14, ili njihovim funkcionalnim fragmentima.

[0034] U nekim daljim ostvarenjima, modifikovani polipeptidi koji imaju fenilalanin amonijakliaznu (FAL) aktivnost obuhvataju aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 99% identičnu sekvencu sa SEQ ID NO:6, 8, 10, 12, i/ili 14, ili njihovim funkcionalnim fragmentima.

[0035] Postoje takođe otkriveni modifikovani polipeptidi koji imaju fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost koji obuhvataju aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identičnu sekvencu sa SEQ ID NO:6, 8, 10, 12, i/ili 14, ili njihovim funkcionalnim fragmentima. U nekim ostvarenjima, modifikovani polipeptidi koji imaju fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost obuhvataju aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 95% identičnu sekvencu sa SEQ ID NO:6, 8, 10, 12, i/ili 14, ili njihovim funkcionalnim fragmentima. U nekim daljim ostvarenjima, modifikovani polipeptidi koji imaju fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost obuhvataju aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 99% identičnu sekvencu sa SEQ ID NO:6, 8, 10, 12, i/ili 14, ili njihovim funkcionalnim fragmentima. U nekim daljim ostvarenjima, modifikovani polipeptidi koji imaju fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost obuhvataju aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnu sekvencu sa SEQ ID NO:6, 8, 10, 12, i/ili 14, ili njihovim funkcionalnim fragmentima. U nekim daljim ostvarenjima, modifikovani polipeptidi koji imaju fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost obuhvataju aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 99% identičnu sekvencu sa SEQ ID NO:6, 8, 10, 12, i/ili 14, ili njihovim funkcionalnim fragmentima.

[0036] Postoje takođe otkriveni modifikovani polipeptidi koji imaju fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost koji obuhvataju aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99%, ili najmanje oko 100% identičnu sekvencu SEQ ID NO:4, ili njenim funkcionalnim fragmentima, naznačeno time da je modifikovani polipeptidi deimunizovan. Postoje takođe otkriveni modifikovani polipeptidi koji imaju fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost koji obuhvataju aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identičnu sekvencu sa SEQ ID NO:4, ili njenim funkcionalnim fragmentima, naznačeno time da je modifikovani polipeptidi deimunizovan. U nekim ostvarenjima, modifikovani polipeptidi koji imaju fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost obuhvataju aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnu sekvencu sa SEQ ID NO:4, ili njenim funkcionalnim fragmentima, naznačeno time da je modifikovani polipeptidi deimunizovan. U nekim dodatnim ostvarenjima, modifikovani polipeptid koji ima fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost je varijanta FAL iz bilo koje od tabela 9-1 do 9-7. U nekim ostvarenjima, deimunizovani modifikovani polipeptid koji ima fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnu sekvencu sa SEQ ID NO:6, 8, 10, 12, i/ili 14.

[0037] Postoje takođe otkrivene polipeptidne sekvence koje kodiraju modifikovane polipeptid koji imaju FAL aktivnost koji su ovde otkriveni. U nekim ostvarenjima, polinukleotidna sekvenca je operativno vezana za konstrolnu sekvencu, Postoje dalje otkriveni vektori koji sadrže najmanje jednu polinukleotidnu sekvencu koja kodira najmanje jedan modifikovni polipeptid koji ima FAL aktivnost. Postoje takođe otkrivene domaćinske ćelije koje si transformisane sa najmanje jednom polinukleotidnom sekvencom koja kodira modifikovani polipeptid koji ima FAL aktivnost, kao što je ovde otkriveno.

[0038] Dalje su otkrivene metode za proizvodnju modifikovanog FAL polipeptida u domaćinskoj ćeliji, koje obuhvataju gajenje dimaćinske ćelije koja sadrži najmanje jedan polinukleotid koji kodira najmanje jedan modifikovani FAL polipeptid u odgovarajućim uslovima gajenja. Dalje su otkrivene metode za proizvodnju modifikovanog FAL polipeptida u domaćinskoj ćeliji, koje obuhvataju gajenje dimaćinske ćelije koja sadrži polinukleotid koji kodira modifikovani FAL polipeptid u odgovarajućim uslovima gajenja. U nekim ostvarenjima, metode dalje obuhvataju dobijanje modifikovanog FAL polipeptida iz kulture i/ili domaćinskih ćelija.

[0039] Takođe otkrivene su kompozicije koje obuhvataju najmanje jedan modifikovani polipeptid koji ima FAL aktivnost kao što je ovde opisano. U nekim ostvarenjima, kompozicija je farmaceutska kompozicija koja dalje obuhvata farmaceutski prihvatljivi nosač. Postoje dalje otkrivene upotrebe kompozicija.

[0040] Postoje takođe otkriveni modifikovani polipeptidi koji imaju fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost i koji sadrže a) aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 85%, najmanje oko 86%, najmanje oko 87%, najmanje oko 88%, najmanje oko 89%, najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99%, ili više identičnosti u sekvenci sa referentnom sekvencom koja ima fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost, ili njenim funkcionalnim fragmentom; b) polipeptidnu sekvencu koja obuhvata najmanje jednu razliku u aminokiselinskom ostatku kada se uporedi sa referentnom sekvencom koja ima fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost, ili njenim funkcionalnim fragmentom na jednom ili više aminokiselinksih pozicija; koja pokazuje poboljšano svojstvo odabrano od i) pojačane katalitičke aktivnost, ii) redukovane osetljivosti na proteolizu, iii) povećane tolerancije na kiselu pH, iv) redukovane agregacije, v) redukovane imunogenosti ili bilo koje kokmbinacije od bilo kojih od i), ii), iii), iv) ili v) kada se uporedi sa referentnom sekvencom kad se poredi sa referentnom sekvencom koja ima fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost. U nekim ostvarenjima referentna sekvenca je prokariotska FAL, dok je u nekim drugim ostvarenjima referentna sekvenca eukariotska FAL. U nekim ostvarenjima, referentna sekvenca je bakterijska FAL (na primer Anabaena variabilis FAL), dok je u nekim drugim ostvarenjima humana ili druga FAL. U nekim daljim ostvarenjima, referentna sekvenca je sekvenca divljeg soja (na pr. divlji soj Anabaena variabilis FAL) dok je u nekim alternativnim ostvarenjima referentna sekvenca varijanta enzima (na pr. modifikovani polipeptid koji ima FAL aktivnost).

[0041] U nekim ostvarenjima, modifikovani polipeptidi koji imaju fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost koja je ovde otkrivena obuhvataju a) aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 85%, najmanje oko 86%, najmanje oko 87%, najmanje oko 88%, najmanje oko 89%, najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99%, ili više identičnosti u sekvenci sa referentnom sekvencom SEQ ID NO:4 ili njenim funkcionalnim fragmentom; b) polipeptdinu sekvencu koja obuhvata najmanje jednu razliku u aminokiselinskom ostatku kada se uporedi sa SEQ ID NO:4, ili njenim funkcionalnim fragmentom na jednom ili više aminokiselinskih pozicija; i c) koja pokazuje poboljšano svojstvo koje je odabrano od i) pojačane katalitičke aktivnost, ii) redukovane osetljivosti na proteolizu, iii) povećane tolerancije na kiselu pH, iv) redukovane agregacije, v) redukovane imunogenosti ili bilo koje kokmbinacije od bilo kojih od i), ii), iii), iv) ili v) kada se uporedi sa referentnom sekvencom SEQ ID NO:4.

[0042] U nekim dodatim ostvarenjima, modifikovani polipeptidi koji imaju fenilalanin amonijakliaznu (FAL) aktivnost obuhvata: a) aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 85%, najmanje 86%, najmanje 87%, najmanje 88%, najmanje 89%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili više identičnosti u sekvenci sa referentnom sekvencom SEQ ID NO:4 ili njenim funkcionalnim fragmentom; b) polipeptdinu sekvencu koja obuhvata najmanje jednu razliku u aminokiselinskom ostatku kada se uporedi sa SEQ ID NO:4, ili njenim funkcionalnim fragmentom na jednom ili više aminokiselinskih pozicija; i c) koja pokazuje poboljšano svojstvo koje je odabrano od i) pojačane katalitičke aktivnost, ii) redukovane osetljivosti na proteolizu, iii) povećane tolerancije na kiselu pH, iv) redukovane agregacije, v) redukovane imunogenosti ili bilo koje kokmbinacije od bilo kojih od i), ii), iii), iv) ili v) kada se uporedi sa referentnom sekvencom SEQ ID NO:4.

[0043] U nekim ostvarenjima, modifikovani polipeptidi koji imaju fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost obuhvataju najamnje jednu zamenu (supstituciju) na jednoj ili više aminokiseinskih pozicija: 20, 24, 27, 39, 43, 45, 47, 54, 58, 59, 62, 70, 73, 80, 82, 91, 94, 98, 104, 105, 110, 112, 115, 117, 118, 119, 121, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 149, 150, 151, 153, 154, 156, 157, 158, 159, 172, 174, 175, 176, 177, 178, 180, 187, 191, 195, 199, 205, 206, 210, 212, 213, 214, 232, 240, 243, 245, 247, 248, 250, 256, 257, 266, 270, 275, 278, 279, 285, 286, 289, 290, 292, 304, 305, 307, 308, 309, 319, 321, 326, 331, 332, 334, 349, 353, 355, 364, 365, 369, 370, 371, 372, 374, 375, 377, 378, 379, 381, 382, 383, 384, 385, 387, 389, 394, 396, 399, 400, 403, 404, 407, 417, 418, 425, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 443, 446, 447, 453, 456, 459, 460, 461, 463, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 482, 483, 503, 507, 509, 521, 522, 524, 525, 528, 538, 546, 547, 551, 558, 560, 564, 565, i/ili bilo kojoj njihovoj kombinaciji naznačeno time da su aminokiselinske pozicije označena istim brojem kao i kodreferentne sekvence SEQ ID NO:4. U nekim ostvarenjima, aminokiselonski ostatak referentne sekvence, SEQ ID NO:4 odgovara A39, T54, G59, S73, A91, Y158, S180, K195, A112, R134, Q240, T243, 1245, A256, L257, N270, N290, Y304, R305, H307, E308, 1326, L349, D353, L364, A394, S399, N400, P404, L407, F443, N453, Y459, T460, T463, N474, E509, Q521, K522, T524, P528, S546, i/ili P564. U nekim dodatnim ostvarenjima, razlike u aminokiselinksim ostacima kada se uporede sa SEQ ID NO:4 su odabrane od jedne ili više subsitutcija koje slede: A39V, T54K, G59R, S73K, A112C, R134Q, A91V, Y158H, S180A, K195E, Q240R/W, T243I/L, I245L, A256G, L257W/A, N270K, N290G, Y304H, R305M, H307G/Q/M, E308Q, I326F, L349M, D353A/N, L364Q, A394V, S399N, N400K, P404A, L407V, F443H, N453G, Y459F, T460G, T463N, N474Q, E509L, Q521K/S, K522Y/F/N, T524S,P528L, S546R, i P564 G/L/M, kada se optimalno poravnaju sa polipeptidom SEQ ID NO:4. U nekim daljim ostvarenjima, modifikovani polipeptid ima najmanje 90% identičnu sekvencu sa SEQ ID NO:4 i razliku u aminokiselinskom ostatku na poziciji H307. U nekim ostvarenjima, razlika u aminokiselinskom ostatku je H307G/Q/M. U nekim još daljim ostvarenjima, razlika u aminokiselinskom ostatku je odabrana od kombinacije jedne ili više od: A39, A91, Q240, A256, N290, Y304, R305, H307, D353, A394, S399, P404, L407, Q521, K522, i T524. U nekim dodoatnim stvarenjima poboljšano svojstvo modifikovanog polipeptida koji ima fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost je odabrana od redukovane osetljivosti na proteolizu i+ili povećane otpornosti na kiselu pH.

[0044] Postoje takođe otkriveni modifikovani polipeptidi koji imaju fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost koji obuhvataju: aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje koja ima najmanje oko 85%, najmanje oko 86%, najmanje oko 87%, najmanje oko 88%, najmanje oko 89%, najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99%, ili više identičnosti u sekvenci sa referentnom sekvencom SEQ ID NO:10 ili njenim funkcionalnim fragmentom; b) polipeptidnu sekvencu koja sadrži najmanje jednu razliku u

1

aminokiselinskom ostatku kada se uporedi sa SEQ ID NO:10 ili njenim funkcionalnim fragmentom na jednoj ili više aminokiselinskih pozicija; i c) koja pokazuje poboljšano svojstvo koje je odabrano od i) pojačane katalitičke aktivnost, ii) redukovane osetljivosti na proteolizu, iii) povećane tolerancije na kiselu pH, iv) redukovane agregacije, v) redukovane imunogenosti ili bilo koje kokmbinacije od bilo kojih od i), ii), iii), iv) ili v) kada se uporedi sa referentnom sekvencom SEQ ID NO:10.

[0045] U nekim ostvarenjima, postoje takođe otkriveni modifikovani polipeptidi koji imaju fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost koji obuhvataju a) aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje koja ima najmanje 85%, najmanje 86%, najmanje 87%, najmanje 88%, najmanje 89%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili više identičnosti u sekvenci sa referentnom sekvencom SEQ ID NO:10 ili njenim funkcionalnim fragmentom; b) polipeptidnu sekvencu koja sadrži najmanje jednu razliku u aminokiselinskom ostatku kada se uporedi sa SEQ ID NO:10 ili njenim funkcionalnim fragmentom na jednoj ili više aminokiselinskih pozicija; c) koja pokazuje poboljšano svojstvo koje je odabrano od i) pojačane katalitičke aktivnost, ii) redukovane osetljivosti na proteolizu, iii) povećane tolerancije na kiselu pH, iv) redukovane agregacije, v) redukovane imunogenosti ili bilo koje kokmbinacije od bilo kojih od i), ii), iii), iv) ili v) kada se uporedi sa referentnom sekvencom SEQ ID NO:10.

[0046] U nekim ostvarenjima, postoje takođe otkriveni modifikovani polipeptidi koji imaju fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost i obuhvataju: a) aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 85% identična u odnosu na referentnu sekvencu SEQ ID NO:10 ili njeni funkcionalni fragment; b) polipeptidnu sekvencu koja obuhvata najmanje jednu razliku u aminokiselinskom ostatku kada s uporedi sa SEQ ID NO:10 ili njenim funkcionalnim fragmentom na jednoj ili više aminokiselinskih pozicija; i c) ) koja pokazuje poboljšano svojstvo koje je odabrano od i) pojačane katalitičke aktivnost, ii) redukovane osetljivosti na proteolizu, iii) povećane tolerancije na kiselu pH, iv) redukovane agregacije, v) redukovane imunogenosti ili bilo koje kokmbinacije od bilo kojih od i), ii), iii), iv) ili v) kada se uporedi sa referentnom sekvencom SEQ ID NO:10.

[0047] U nekim ostvarenjima, postoje takođe otkriveni modifikovani polipeptidi koji imaju fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost i obuhvataju aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 85% identična u odnosu na referentnu sekvencu SEQ ID NO:10 i najmanje jednu razliku u aminokiselinskom ostatku kada se uporedi sa SEQ ID NO:10 i koja pokazuje najmanje jednuo poboljšano svojstvo odabrano od redukovane osetljivosti na proteolizu, povećane tolerancije na kiselu pH, redukovanu agregaciju i/ili redukovanu imunogenost kada se uporedi sa SEQ ID NO:10.

[0048] U nekim ostvarenjima, postoje takođe otkriveni modifikovani polipeptidi koji imaju fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost naznačeno time da je rezlika u aminokiselinskom ostatku kada se uporedi sa SEQ ID NO: 10, odabrana od jedne ili više od sledećih zamena (supstitucija) ili setova supstitucija: I27E/V39A;

27E/V39A/R43L/V105C/A153R/L214E/P266H/L278D/C503Q;I27E/V39A/R43L/L214E/A547D ;

I27E/V39A/V105C/A112C/R134Q/L214E/L278D/C503Q/A547D/C565N;

I27E/V39A/V105C/A112C/R134Q/A153R/Q205T/L214E/P266H/L278D/C503Q/A551D;

I27E/V39A/V105C/A112C/Q205T/P210C/P266H/C503Q/A547D;

I27E/V39A/V105C/A112C/Q205T/P266H/I285E/C503Q/A551D;

I27E/V39A/V105C/A112C/L214E/I285E/C503Q/A547D;

I27E/V39A/V105C/S131N/R134Q/Q205T/L214E/C503Q/A547D/C565N;

I27E/V39A/V105C/R134Q/A153R/P210C/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D;

I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/P210C/L278D/C503Q/A547D;

I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/L214E;

I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/L214E/A551D/C565N;

I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N;

I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C;

I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E;

I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E/I285E/A547D;

I27E/V39AN105C/RI34Q/P210C/L214E/C503Q/A551D/C565N;

I27E/V39A/V105C/R134Q/L214E/L278D/A547D/A551D;

I27E/V39A/V105C/R134Q/L214E/I285E/C503Q/A547D/A551D;

I27E/V39A/V105C/R134Q/P266H/C503Q;

I27E/V39A/105C/R134Q/P266H/C503Q/A547D/A551D;

I27E/V39A/V105C/R134Q/L278D/C503Q/C565N;

I27E/V39A/V105C/R134Q/L278D/I285E/C503Q; I27E/V39A/V105C/R134Q/L278D/A551D; I27E/V39A/V105C/R134Q/I285E/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/R134Q/C503Q/A551D; I27E/V39A/V105C/A153R/Q205T/L278D/C503Q/A547D/A551D;

I27E/V39A/V105C/A153R/L214E;

I27E/V39A/V105C/A153R/I285E; I27E/V39A/V105C/A153R/C503Q/A547D/C565N;

I27E/V39A/V105C/A153R/A551D/C565N;

I27E/V39A/V105C/Q205T/P210C/L214E/L278D/A547D;

I27E/V39A/V105C/Q205T/P210C/L278D/C503Q;

I27E/V39A/V105C/Q205T/P210C/L278D/A547D;

I27E/39A/105C/Q205T/L214E/L278D/C503Q/A547D;

I27E/V39A/V105C/Q205T/L278D/C503Q/A547D;

I27E/V39A/V105C/P210C/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N;

I27E/V39A/V105C/P210C/L214E/P266H/L278D;

I27E/V39A/V105C/L214E/P266H/C503Q/A547D/C565N;

I27E/V39A/V105C/L214E/L278D/L309P/C503Q/A547D/A551D;

I27E/V39A/V105C/L278D/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/V105C/I285E/A547D;

I27E/V39A/V105C/C503Q/A551D; I27E/V39A/V105C/C503Q/A547D/A551D/C565N;

I27E/V39A/A112C/R134Q/Q205T/P210C/L214E/A551D/C565N;

I27E/V39A/A112C/R134Q/L214E/P266H/A551D;

I27E/V39A/A112C/R134Q/L214E/C503Q/A547D; I27E/V39A/A112C/R134Q/P266H/I285E; I27E/V39A/A112C/Q205T/L214E/P266H/C503Q/A551D/C565N;

I27E/V39A/A112C/Q205T/L278D/I285E;

I27E/V39A/A112C/L214E; I27E/V39A/A112C/L214E/L278D/C503Q/A547D/A551D;

I27E/V39A/A112C/I285E;

I27E/V39A/A112C/A547D;

I27E/V39A/R134Q;

I27E/V39A/R134Q/A153R/Q205T/L214E/P266H/C503Q;

I27E/V39A/R134Q/A153R/P210C/L214E/L278D/I285E/A547D/C565N;

I27E/V39A/R134Q/A153R/L214E/P266H/L278D/C503Q/A547D/C565N;

I27E/V39A/R134Q/A153G/L214E/P266H/I285E/C503Q/A551D/C565N;

I27E/V39A/R134Q/A153R/L214E/C503Q/A547D; I27E/V39A/R134Q/A153R/L278D;

I27E/V39A/R134Q/A153R/L278D/A547D/A551D; I27E/V39A/R134Q/A153R/A547D;

I27E/V39A/R134Q/Q205T/L214E/P266H/I285E/C503Q/A551D/C565N;

I27E/V39A/R134Q/Q205T/P266H/C503Q/A551D/C565N;

I27E/V39A/R134Q/P210C/L214E/C503Q; I27E/V39A/R134Q/P210C/C503Q/A551D;

I27E/V39A/R134Q/L214E/P266H/A551D;

I27E/V39A/R134Q/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D;

I27E/V39A/R134Q/L278D/C503Q/A547D;

I27E/V39A/R134Q/C503Q/A547D;

I27E/V39A/R134Q/A547D/C565N;

I27E/V39A/Q205T/L214E/C503Q/C565N;

I27E/V39A/Q205T/P266H/I285E/A547D/A551D/C565N; I27E/V39A/Q205T/P266H/A551D; I27E/V39A/Q205T/L278D/C503Q/A551D/C565N; I27E/V39A/Q205T/L278D/C503Q/C565N; I27E/V39A/Q205T/C503Q/A547D/C565N;

I27E/V39A/P210C/T212S;

I27E/V39A/P210C/L214E/L278D/C503Q/A551D;

I27E/V39A/P210C/L214E/I285E/C503Q/A551D;

I27E/V39A/P210C/P266H/I285E/C503Q/A547D; I27E/V39A/P210C/P266H/C503Q/A551D; I27E/V39A/L214E; I27E/V39A/L214E/P266H/L278D/C503Q/A547D/A551D/C565N;

I27E/V39A/L214E/L278D/C503Q; I27E/V39A/L214E/L278D/C503Q/A547D/C565N;

I27E/V39A/L214E/C503Q/A551D;

I27E/V39A/P266H;

I27E/V39A/P266H/L278D;

I27E/V39A/L278D;

I27E/V39A/L278D/A547D;

I27E/V39A/L278D/I285E/C503Q/A547D;

I27E/V39A/L278D/C503Q/C565N;

I27E/V39A/C503Q; I27E/G45D/Q205T/P266H/C565N;

I27E/V105C;

I27E/V105C/R134Q/A153R/P210C/L214E/C503Q/A547D;

I27E/V105C/R134Q/A153R/I285E/A547D;

I27E/V105C/R134Q/A153R/C503Q;

I27E/V105C/R134Q/Q205T/P210C/C503Q;

I27E/V105C/R134Q/Q205T/L214E/P266H/L278D/C503Q/C565N;

I27E/V105C/Q205T/P266H/C503Q;

I27E/V105C/R134Q/P210C/L214E/P266H/L278D/A551D/C565N;

I27E/V105C/R134Q/P210C/L214E/C503Q/A551D/C565N;

I27E/V105C/R134Q/P210C/P266H/L278D/I285E/C503Q/A551D/C565N;

I27E/V105C/R134Q/L214E/L278D/C503Q/A547D;

I27E/V105C/R134Q/L214E/L278D/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V105C/Q205T;

I27E/V105C/Q205T/L214E/P266H; I27E/V105C/Q205T/L214E/P266H/A551D/C565N;

I27E/V105C/Q205T/L214E/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N;

I27E/V105C/Q205T/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V105C/L214E;

I27E/V105C/L214E/P266H/C503Q; I27E/V105C/L214E/I285E/A551D/C565N;

I27E/V105C/L214E/A547D/A551D/C565N; 127EN105C/L214E/A551D/C565N;

I27E/V105C/P266H; I27E/V105C/P266H/I285E/C503Q/A547D/C565N;

I27E/V105C/L278D/A547D; I27E/V105C/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N;

I27E/V105C/C503Q/A547D/C565N; I27E/V105C/C503Q/A547D/A551D/C565N;

I27E/A112C/R134Q/A153R/L214E/P266H/C503Q;

I27E/A112C/R134Q/L278D/I285E/C503Q/A551D/C565N;

I27E/A112C/R134Q/Q205T/L278D/C503Q; I27E/A112C/R134Q/Q205T/I285E/C503Q;

I27E/A112C/Q205T/P266H/L278D/I285E/C503Q; I27E/A112C/P210C/L214E/C503Q/A547D; I27E/R134Q; I27E/R134Q/A153R/I285E/C503Q/A547D;

1

I27E/R134Q/Q205T/I285E/C503Q/A551D; I27E/R134Q/Q205T/P266H/L278D/A547D;

I27E/R134Q/P210C; I27E/R134Q/L214E/C503Q; I27E/R134Q/L214E/C503Q/A547D;

I27E/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D; I27E/R134Q/L214E/C503Q/C565N;

I27E/R134Q/L278D/I285E/A551D/C565N; I27E/R134Q/I285E/C503Q;

I27E/A153R/L214E/L278D/I285E/A551D/C565N;

I27E/A153R/L214E/L278D/A551D 27E/Q205T;

I27E/Q205T/L214E/L278D/I285E/C503Q/C565N; I27E/Q205T/L214E/C503Q/A547D/C565N; I27E/Q205T/P266H/L278D/I285E/A551D/C565N; I27E/Q205T/L278D/A551D; I27E/P210C; I27E/P210C/L214E/C503Q/A547D; I27E/P210C/L278D/C503Q; I27E/P210C/C503Q;

I27E/P210C/C503Q/C565N; I27E/P210C/A551D; I27E/L214E;

I27E/L214E/P266H/L278D/I285E/A551D; I27E/L214E/L278D; I27E/L214E/L278D/C503Q; I27E/L214E/C503Q; I27E/L214E/C503Q/A547D; I27E/L214E/C503Q/A547D/C565N;

I27E/L214E/A551D; I27E/P266H/L278D/C503Q; I27E/P266H/A547D/A551D;

I27E/L278D/C503Q/A551D; I27E/L278D/C503Q/A551D/C565N; I27E/A547D/C565N;

V39A/G45S/L278D/C503Q/A551D; V39A/V105C/R134Q/A153R/Q205T/A551D;

V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E/A551D;

V39A/V105C/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D;

V39A/V105C/A153R/P266H/A547D/A551D; V39A/V105C/Q205T/C503Q;

V39A/V105C/Q205T/A551D; V39A/V105C/P210C/A547D;

V39A/V105C/L214E/P266H/A547D/C565N;

V39A/V105C/L214E/I285E/C503Q/A551D/C565N;

V39A/A112C/R134Q/Q205T/L214E/L278D;

V39A/A112C/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D;

V39A/A112C/A153R/Q205T/L278D/C503Q/A547D; V39A/R134Q;

V39A/R134Q/Q205T/L214E/C503Q/C565N; V39A/R134Q/P210C/L214E/A547D/C565N; V39A/A153R/C503Q/A547D; V39A/Q205T/L278D/A547D/A551D;

V39A/P210C/L214E/L278D/I285E/C503Q/A551D; V39A/P266H;

V39A/P275R/L278D/C503Q/A551D; V39A/C503Q; V39A/C503Q/A551D/C565N; V105C; V105C/A112C/R134Q/Q205T/L214E/Y492H/C503Q/A547D;

V105C/R134Q/A153R/Q205T/L214E/C503Q; V105C/R134Q/Q205T/L214E/A547D;

V105C/R134Q/Q205T/P266H/L278D;

V105C/R134Q/L214E/P266H/I285E/C503Q/A551D/C565N;

V105C/R134Q/L214E/L278D/C565N; V105C/R134Q/L214E/C503Q/A547D;

V105C/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D; V105C/R134Q/C503Q;

V105C/R134Q/C503Q/A547D; V105C/R134Q/C503Q/A547D/C565N;

V105C/A153R/Q205T/L214E/P266H/C503Q/A547D;

V105C/A153R/Q205T/P266H/I285E/A547D/C565N;

V105C/Q205T/P210C/L214E/C503Q/A547D; V105C/Q205T/L214E/L278D;

V105C/Q205T/L214E/C503Q/A547D/A551D/C565N;

V105C/Q205T/C503Q/A551D; V105C/L214E/P266H/L278D/A547D;

V105C/L214E/L278D/C503Q/A547D/A551D; V105C/L214E/I285E;

V105C/L214E/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N; V105C/L214E/I285E/A547D/C565N; V105C/L278D/C503Q/A551D; V105C/I285E; V105C/I285E/A547D; V105C/C503Q;

V105C/A547D/A551D;

A112C/R134Q/A153R/L214E/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N;

A112C/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D/C565N; A112C/L214E/L278D;

A112C/L278D/C503Q/A547D; R134Q/Q205T/L214E/I285E/C503Q/A551D/C565N;

R134Q/Q205T/C503Q; R134Q/P210C/L214E/L278D/C503Q/A547D/C565N;

R134Q/P210C/L214E/C503Q/A547D/A551D; R134Q/L214E; R134Q/L214E/L278D/C503Q; R134Q/L214E/L278D/C503Q/A551D; R134Q/L214E/I285E/C503Q; R134Q/C503Q;

R134Q/C503Q/A547D/A551D; A153R; Q205T/L214E/I285E/C503Q/A551D;

Q205T/L214E/I285E/C503Q/C565N; Q205T/L214E/C503Q/A547D/C565N;

Q205T/L278D/I285E/A547D/A551D; P210C/L214E; P210C/L214E/P266H; L214E/P266H;

L214E/P266H/C503Q/A547D/A551D/C565N; L214E/C503Q/A547D; L214E/A547D;

P266H/L278D/C503Q; P266H/C565N; L278D/A547D; C503Q; C503Q/A547D;

C503Q/A547D/A551D/C565N; C503Q/A547D/C565N; C503Q/A551D;

C503Q/A551D/C565N; A547D; and/or C565N.

0049] U nekim dodatnim ostvarenjima, postoje takođe otkriveni modifikovani polipeptidi koji imaju fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost naznačeno time da je rezlika u aminokiselinskom ostatku kada se uporedi sa SEQ ID NO: 10, odabrana od jedne ili više od sledećih zamena (supstitucija) ili setova supstitucija V80I/R134C/P564Q; V121C; A123G; A124G; M125L; L126I/T; L126M/R134L; L127A; A129G/L; N130Q; N130C/M370I R134W; M133R; R134I; R134N/G307C; G135C/S; i/ili G135A/A394E.

[0050] U nekim dodatnim ostvarenjima, postoje takođe otkriveni modifikovani polipeptidi koji imaju fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost naznačeno time da je rezlika u aminokiselinskom ostatku kada se uporedi sa SEQ ID NO: 10, odabrana od jedne ili više od sledećih zamena (supstitucija) ili setova supstitucija: G20S/I144L; R43S; L47M/I144L; L47M/R146E; L47M/M147G/A383E; L47M/P157C; Q58H/L143V; Q58K/P157D/G369C; A62S/M147V; S82I/G135C/P157F/W279L; R94C/I149E; T110I/I139R; L118M/L141H; A119E/T156H/A289D; I139M/V; R140D/G/M; R140N/A199E; R140E/A334S/A551D; L141K/Q/P/T; E142H/P/V; E142D/G371D; L143F/M; I144L/N/V; K145N/Q/R; K145G/P157T; R146H/L; R146W/D191Y; M147A; I149L/R; F150K/L/M; L151M; A153C/G; A153S/H250N; G154R; G154Y/L174M/Q321K/S456I/G483C; T156K/G483C; P157D/F/H/Y; Y158E; V159C/H/L/M; M247I; L319M; i/ili Q389K.

[0051] U još nekim dodoatnim ostvarenjima, postoje takođe otkriveni modifikovani polipeptidi koji imaju fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost naznačeno time da je rezlika u aminokiselinskom ostatku kada se uporedi sa SEQ ID NO: 10, odabrana od jedne ili više od sledećih zamena (supstitucija) ili setova supstitucija P117T/Y176Q; V172I/C/L; L174M; S175G; Y176E/I/M/R/V; I177M/V; T178L/A477S; i/ili S180C/T.

[0052] U nekim dodatnim ostvarenjima, postoje takođe otkriveni modifikovani polipeptidi koji imaju fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost naznačeno time da je rezlika u aminokiselinskom ostatku kada se uporedi sa SEQ ID NO: 10, odabrana od jedne ili više od sledećih zamena (supstitucija) ili setova supstitucija: R43S/H374K; R43S/H374R; A112S/M370A/A507E; M147I/H374S; S187R/L381V; D191Y/H385N; A232S; Q240K/H374R; A256S/L381N; P275Q/M370S; P275T/H374R; Q332K/Y377M; A334S/H374V; L349M; Q355K/H374S; M370G/I/S; G371H/N/Q/S; M372A/V; H374A/D/G/L/N/R/S/T; H374Q/P396Q; H374R/G417C; L375I; L375M; Y377C/I/N; Y378C/D/E/I/L/N/S; Y378F/P404Q; I379C/H/L/M/N; L381G/V; L381M/Q560K; L382C/H/I/M/S; A383S/V; K384R; H385C/G/N; H385M/P403H; H385S/P403H; D387S; L418M; G425V; A447S; S461G; and/or S525L.

[0053] U još nekim dodatnim ostvarenjima, postoje takođe otkriveni modifikovani polipeptidi koji imaju fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost naznačeno time da je rezlika u aminokiselinskom ostatku kada se uporedi sa SEQ ID NO: 10, odabrana od jedne ili više od sledećih zamena (supstitucija) ili setova supstitucija: A24S/F434M; A62S/T433N; S98I;

1

L213M/S438L; Q240K/T433Y; S286R/Y435T; A289S/L431E; S331I; L431C/E/G/P/S/V; L432C/V; T433A/I/L/N/P/Q/R/S/V/W; F434C; Y435L; Y435Q/H446N; G436M; G436D/T; N437E/G/Q; N437T/L538M; S438C/F/M/R/T; I439C/F/L/V; i/ili A477S.

[0054] U nekim dodoatnim ostvarenjima, postoje takođe otkriveni modifikovani polipeptidi koji imaju fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost naznačeno time da je rezlika u aminokiselinskom ostatku kada se uporedi sa SEQ ID NO: 10, odabrana od jedne ili više od sledećih zamena (supstitucija) ili setova supstitucija: A24E; Q58R/Y475H; A70S/N474E; L104M/V476L; A119E/G365A; L206M; P275Q; G276V; Q292H/A479G; Q355H/I478C; P404T/A477V; I471F/G/K/M/N/R/V/W; F472G; Q473H/K/M/R/S; Q473H/A507S; N474A/H/R/W; N474D/R490H; Y475C/F/L/Q; V476C/I/L; I478N/S; A479G/S; F482C/L; G483C/H/S; G483A/S524I; G483R/G537C; i/ili A558S.

[0055] U nekim dodoatnim ostvarenjima, postoje takođe otkriveni modifikovani polipeptidi koji imaju fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost naznačeno time da je rezlika u aminokiselinskom ostatku kada se uporedi sa SEQ ID NO: 10, odabrana od jedne ili više od sledećih zamena (supstitucija) ili setova supstitucija V39A/K115E/M133R/C565N;

V39A/M133R/F472G/C503Q/C565N; V39A/M133R/F472G/C565N; V39A/M133R/C503Q;

V39A/M133R/C503Q/C565N; V39A/M147A/Y378E/C503Q/C565N;

V39A/M147A/Y378E/C565N; V39A/M147A/L381G/F472G/C503Q/C565N;

V3A/M147A/L381G/C503Q/C565N; V39A/M147A/F472G/C503Q/C565N;

V39A/M147A/F472G/C565N; V39A/M147A/C565N;

V39A/G248C/L381G/F472G/C503Q/C565N; V39A/Y378E/C503Q/C565N;

V39A/Y378E/C565N; V39A/L381G; V39A/F472G/C503Q/C565N; V39A/C503Q/C565N;

M133R/L381G/C565N; M133R/C503Q; Y378D/C503Q; Y378E/F472G/C503Q/C565N;

L381G/F472GC503Q/C565N; i/ili F472G/C503Q/C565N.

[0056] U još nekim dodatnim ostvarenjima, postoje takođe otkriveni modifikovani polipeptidi koji imaju fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost naznačeno time da je rezlika u aminokiselinskom ostatku kada se uporedi sa SEQ ID NO: 10, odabrana od jedne ili više od sledećih zamena (supstitucija) ili setova supstitucija: I27E/V39A;

27E/V39A/R43L/V105C/A153R/L214E/P266H/L278D/C503Q;

I27E/V39A/R43L/L214E/A547D;

I27E/V39A/V105C/A112C/R134Q/L214E/L278D/C503Q/A547D/C565N;

I27E/V39A/V105C/A112C/R134Q/A153R/Q205T/L214E/P266H/L278D/C503Q/A551D;

I27E/V39A/V105C/A112C/Q205T/P210C/P266H/C503Q/A547D;

I27E/V39A/V105C/A112C/Q205T/P266H/I285E/C503Q/A551D;

I27E/V39A/V105C/A112C/L214E/I285E/C503Q/A547D;

I27E/V39A/V105C/S131N/R134Q/Q205T/L214E/C503Q/A547D/C565N;

I27E/V39A/V105C/R134Q/A153R/P210C/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D;

I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/P210C/L278D/C503Q/A547D;

I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/L214E;

I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/L214E/A551D/C565N;

I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N;

I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C; I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E;

I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E/I285E/A547D;

I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E/C503Q/A551D/C565N;

I27E/V39A/V105C/R134Q/L214E/L278D/A547D/A551D;

I27E/V39A/V105C/R134Q/L214E/I285E/C503Q/A547D/A551D;

1

I27E/V39A/V105C/R134Q/P266H/C503Q;

I27E/V39A/V105C/R134Q/P266H/C503Q/A547D/A551D;

I27E/V39A/V105C/R134Q/L278D/C503Q/C565N;

I27E/V39A/V105C/A153R/L214E; I27E/V39A/V105C/A153R/I285E;

I27E/V39A/V105C/A153R/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/V105C/A153R/A551D/C565N; I27E/V39A/V105C/Q205T/P210C/L214E/L278D/A547D;

I27E/V39A/V105C/Q205T/P210C/L278D/C503Q;

I27E/V39A/V105C/Q205T/P210C/L278D/A547D;

I27E/V39A/V105C/Q205T/L214E/L278D/C503Q/A547D;

I27E/V39A/V105C/Q205T/L278D/C503Q/A547D;

I27E/V39A/V105C/P210C/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N;

I27E/V39A/V105C/P210C/L214E/P266H/L278D;

I27E/V39A/V105C/L214E/P266H/C503Q/A547D/C565N;

I27E/V39A/V105C/L214E/L278D/L309P/C503Q/A547D/A551D;

I27E/V39A/V105C/L278D/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/V105C/I285E/A547D;

I27E/V39A/V105C/C503Q/A551D; I27E/V39A/V105C/C503Q/A547D/A551D/C565N;

I27E/V39A/A112C/R134Q/Q205T/P210C/L214E/A551D/C565N;

I27E/V39A/A112C/R134Q/L214E/P266H/A551D;

I27E/V39A/A112C/Q205T/L278D/I285E; I27E/V39A/A112C/L214E;

I27E/V39A/A112C/L214E/L278D/C503Q/A547D/A551D;I27E/V39A/A112C/I285;

I27E/V39A/A112C/A547D; I27E/V39A/R134Q;

I27E/V39A/R134Q/A153R/Q205T/L214E/P266H/C503Q;

I27E/V39A/R134Q/A153R/P210C/L214E/L278D/I285E/A547D/C565N;

I27E/V39A/R134Q/A153R/L214E/P266H/L278D/C503Q/A547D/C565N;

I27E/V39A/R134Q/A153G/L214E/P266H/I285E/C503Q/A551D/C565N;

I27E/V39A/R134Q/A153R/L214E/C503Q/A547D; I27E/V39A/R134Q/A153R/L278D;

I27E/V39A/R134Q/A153R/L278D/A547D/A551D; I27E/V39A/R134Q/A153R/A547D;

I27E/V39A/R134Q/Q205T/L214E/P266H/I285E/C503Q/A551D/C565N;

I27E/V39A/R134Q/Q205T/P266H/C503Q/A551D/C565N;

I27E/V39A/R134Q/P210C/L214E/C503Q; I27E/V39A/R134Q/P210C/C503Q/A551D;

I27E/V39A/R134Q/L214E/P266H/A551D;

I27E/V39A/R134Q/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D;

I27E/V39A/R134Q/L278D/C503Q/A547D; I27E/V39A/R134Q/C503Q/A547D;

I27E/V39A/R134Q/A547D/C565N; I27E/V39A/Q205T/L214E/C503Q/C565N;

I27E/V39A/Q205T/P266H/I285E/A547D/A551D/C565N; I27E/V39A/Q205T/P266H/A551D; I27E/V39A/Q205T/L278D/C503Q/A551D/C565N; I27E/V39A/Q205T/L278D/C503Q/C565N; I27E/V39A/Q205T/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/P210C/T212S;

I27E/V39A/P210C/L214E/L278D/C503Q/A551D;

I27E/V39A/P210C/L214E/I285E/C503Q/A551D;

I27E/V39A/L214E/L278D/C503Q; I27E/V39A/L214E/L278D/C503Q/A547D/C565N;

I27E/V39A/L214E/C503Q/A551D; I27E/V39A/P266H; I27E/V39A/P266H/L278D;

I27E/V39A/L278D; I27E/V39A/L278D/A547D; I27E/V39A/L278D/I285E/C503Q/A547D;

1

I27E/V39A/L278D/C503Q/C565N; I27E/V39A/C503Q; I27E/G45D/Q205T/P266H/C565N; I27E/V105C; I27E/V105C/R134Q/A153R/P210C/L214E/C503Q/A547D;

I27E/V105C/R134Q/A153R/I285E/A547D; I27E/V105C/R134Q/A153R/C503Q;

I27E/V105C/R134Q/Q205T/P210C/C503Q;

I27E/V105C/R134Q/Q205T/L214E/P266H/L278D/C503Q/C565N;

I27E/V105C/Q205T/P266H/C503Q;

I27E/V105C/R134Q/P210C/L214E/P266H/L278D/A551D/C565N;

I27E/V105C/R134Q/P210C/L214E/C503Q/A551D/C565N;

I27E/V105C/R134Q/P210C/P266H/L278D/I285E/C503Q/A551D/C565N;

I27E/V105C/R134Q/L214E/L278D/C503Q/A547D;

I27E/V105C/R134Q/L214E/L278D/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V105C/Q205T;

I27E/V105C/Q205T/L214E/P266H; I27E/V105C/Q205T/L214E/P266H/A551D/C565N;

I27E/V105C/Q205T/L214E/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N;

I27E/V105C/Q205T/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V105C/L214E;

I27E/V105C/L214E/P266H/C503Q; I27E/V105C/L214E/I285E/A551D/C565N;

I27E/V105C/L214E/A547D/A551D/C565N; I27E/V105C/L214E/A551D/C565N;

I27E/V105C/P266H; I27E/V105C/P266H/I285E/C503Q/A547D/C565N;

I27E/V105C/L278D/A547D; I27E/V105C/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N;

I27E/V105C/C503Q/A547D/C565N; I27E/V105C/C503Q/A547D/A551D/C565N;

I27E/A112C/R134Q/A153R/L214E/P266H/C503Q;

I27E/A112C/R134Q/L278D/I285E/C503Q/A551D/C565N;

I27E/A112C/R134Q/Q205T/L278D/C503Q; I27E/A112C/R134Q/Q205T/I285E/C503Q;

I27E/R134Q/Q205T/I285E/C503Q/A551D; I27E/R134Q/Q205T/P266H/L278D/A547D;

I27E/R134Q/P210C; I27E/R134Q/L214E/C503Q; I27E/R134Q/L214E/C503Q/A547D;

I27E/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D; I27E/R134Q/L214E/C503Q/C565N;

I27E/R134Q/L278D/I285E/A551D/C565N; I27E/R134Q/I285E/C503Q;

I27E/A153R/L214E/L278D/I285E/A551D/C565N; I27E/A153R/L214E/L278D/A551D;

I27E/Q205T; I27E/Q205T/L214E/L278D/I285E/C503Q/C565N;

I27E/Q205T/L214E/C503Q/A547D/C565N; I27E/Q205T/P266H/L278D/I285E/A551D/C565N; I27E/Q205T/L278D/A551D; I27E/P210C; I27E/P210C/L214E/C503Q/A547D;

I27E/P210C/L278D/C503Q; I27E/P210C/C503Q; I27E/P210C/C503Q/C565N;

I27E/P210C/A551D; I27E/L214E; I27E/L214E/P266H/L278D/I285E/A551D;

I27E/L214E/L278D; I27E/L214E/L278D/C503Q; I27E/L214E/C503Q;

I27E/L214E/C503Q/A547D; I27E/L214E/C503Q/A547D/C565N;

I27E/L214E/A551D;I27E/P266H/L278D/C503Q;

I27E/P266H/A547D/A551D; I27E/L278D/C503Q/A551D; I27E/L278D/C503Q/A551D/C565N; I27E/A547D/C565N; V39A/G45S/L278D/C503Q/A551D;

V39A/V105C/R134Q/A153R/Q205T/A551D; V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E/A551D; V39A/V105C/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D; V39A/V105C/A153 R/P266H/A547D/A551D; V39A/V105C/Q205T/C503Q; V39A/V105C/Q205T/A551D;

V39A/V105C/P210C/A547D; V39A/V105C/L214E/P266H/A547D/C565N;

V39A/V105C/L214E/1285E/C503Q/A551D/C565N;

V39A/A112C/R134Q/Q205T/L214E/L278D;

V39A/A112C/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D;

V39A/A112C/A153R/Q205T/L278D/C503Q/A547D; V39A/R134Q;

1

V39A/P210C/L214E/L278D/I285E/C503Q/A551D; V39A/P266H;

V105C/R134Q/A153R/Q205T/L214E/C503Q; V105C/R134Q/Q205T/L214E/A547D;

V105C/R134Q/Q205T/P266H/L278D;

V105C/R134Q/L214E/P266H/I285E/C503Q/A551D/C565N;

V105C/R134Q/L214F/L278D/C565N; V105C/R134Q/L214E/C503Q/A547D;

V105C/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D; V105C/R134Q/C503Q;

V105C/R134Q/C503Q/A547D; V105C/R134Q/C503Q/A547D/C565N;

V105C/A153R/Q205T/L214E/P266H/C503Q/A547D;

V105C/A153R/Q205T/P266H/I285E/A547D/C565N;

V105C/Q205T/P210C/L214E/C503Q/A547D; V105C/Q205T/L214E/L278D;

V105C/Q205T/L214E/C503Q/A547D/A551D/C565N; V105C/Q205T/C503Q/A551D;

V105C/L214E/P266H/L278D/A547D; V105C/L214E/L278D/C503Q/A547D/A551D;

V105C/L214E/I285E; V105C/L214E/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N;

V105C/L214E/I285E/A547D/C565N; V105C/L278D/C503Q/A551D; V105C/I285E;

V105C/I285E/A547D; V105C/C503Q; V105C/A547D/A551D;

A112C/R134Q/A153R/L214E/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N;

A112C/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D/C565N; A112C/L214E/L278D;

A112C/L278D/C503Q/A547D; R134Q/Q205T/L214E/I285E/C503Q/A551D/C565N;

R134Q/Q205T/C503Q; R134Q/P210C/L214E/L278D/C503Q/A547D/C565N;

R134Q/C503Q/A547D/A551D; A153R; Q205T/L214E/I285E/C503Q/A551D;

Q205T/L214E/I285E/C503Q/C565N; Q205T/L214E/C503Q/A547D/C565N;

Q205T/L278D/I285E/A547D/A551D; P210C/L214E; P210C/L214E/P266H; L214E/P266H; L214E/P266H/C503Q/A547D/A551D/C565N; L214E/C503Q/A547D; L214E/A547D;

P266H/L278D/C503Q; P266H/C565N; L278D/A547D; C503Q; C503Q/A547D;

C503Q/A547D/A551D/C565N; C503Q/A547D/C565N; C503Q/A551D;

C503Q/A551D/C565N; A547D; C565N; V80I/R134C/P564Q; V121C; A123G; A124G;

M125L; L126I/T; L126M/R134L; L127A; A129G/L; N130Q; N130C/M370I R134W; M133R; R134I; R134N/G307C; G135C/S; G135A/A394E; G20S/I144L; R43S; L47M/I144L;

L47M/R146E; L47M/M147G/A383E; L47M/P157C; Q58H/L143V; Q58K/P157D/G369C; A62S/M147V; S82I/G135C/P157F/W279L; R94C/I149E; T110I/I139R; L118M/L141H;

A119E/T156H/A289D; I139M/V; R140D/G/M; R140N/A199E; R140E/A334S/A551D;

L141K/Q/P/T; E142H/P/V; E142D/G371D; L143F/M; I144L/N/V; K145N/Q/R; K145G/P157T; R146H/L; R146W/D191Y; M147A; I149L/R; F150K/L/M; L151M; A153C/G; A153S/H250N; G154R; G154Y/L174M/Q321K/S456I/G483C; T156K/G483C; P157D/F/H/Y; Y158E;

V159C/H/L/M; M247I; L319M; Q389K; P117T/Y176Q; V172I/C/L; L174M; S175G;

Y176E/I/M/R/V; I177M/V; T178L/A477S; S180C/T; R43S/H374K; R43S/H374R;

A112S/M370A/A507E; M147I/H374S; S187R/L381V; D191Y/H385N; A232S; Q240K/H374R; A256S/L381N; P275Q/M370S; P275T/H374R; Q332K/Y377M; A334S/H374V; L349M;

Q355K/H374S; M370G/I/S; G371H/N/Q/S; M372A/V; H374A/D/G/L/N/R/S/T; H374Q/P396Q; H374R/G417C; L375I; L375M; Y377C/I/N; Y378C/D/E/I/L/N/S; Y378F/P404Q;

I379C/H/L/M/N; L381G/V; L381M/Q560K; L382C/H/I/M/S; A383S/V; K384R; H385C/G/N; H385M/P403H; H385S/P403H; D387S; L418M; G425V; A447S; S461G; S525L;

A24S/F434M; A62S/T433N; S98I; L213M/S438L; Q240K/T433Y; S286R/Y435T;

A289S/L431E; S331I; L431C/E/G/P/S/V; L432C/V; T433A/I/L/N/P/Q/R/S/V/W; F434C;

Y435L; Y435Q/H446N; G436M; G436D/T; N437E/G/Q; N437T/L538M; S438C/F/M/R/T;

1

[0057] Postoje takođe otkriveni modifikovani polipeptidi koji imaju fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost koji obuhvataju a) aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje koja ima najmanje oko 86%, najmanje oko 87%, najmanje oko 88%, najmanje oko 89%, najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99%, ili više identičnosti u sekvenci sa referentnom sekvencom SEQ ID NO:26 ili njenim funkcionalnim fragmentom; b) polipeptidnu sekvencu koja sadrži najmanje jednu razliku u aminokiselinskom ostatku kada se uporedi sa SEQ ID NO:26 ili njenim funkcionalnim fragmentom na jednoj ili više aminokiselinskih pozicija; c) koja pokazuje poboljšano svojstvo koje je odabrano od i) pojačane katalitičke aktivnost, ii) redukovane osetljivosti na proteolizu, iii) povećane tolerancije na kiselu pH, iv) redukovane agregacije, v) redukovane imunogenosti ili bilo koje kokmbinacije od bilo kojih od i), ii), iii), iv) ili v) kada se uporedi sa referentnom sekvencom SEQ ID NO:26.

[0058] U nekim ostvarenjima, postoje takođe otkriveni modifikovani polipeptidi koji imaju fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost koji obuhvataju: a) aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 85%, najmanje 86%, najmanje 87%, najmanje 88%, najmanje 89%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili više identična u sekvenci sa referentnom sekvencom SEQ ID NO:26 ili njenim funkcionalnim fragmentom; b) polipeptidnu sekvencu koja sadrži najmanje jednu razliku u aminokiselinskom ostatku kada se uporedi sa SEQ ID NO:26 ili njenim funkcionalnim fragmentom na jednoj ili više aminokiselinskih pozicija; c) koja pokazuje poboljšano svojstvo koje je odabrano od i) pojačane katalitičke aktivnost, ii) redukovane osetljivosti na proteolizu, iii) povećane tolerancije na kiselu pH, iv) redukovane agregacije, v) redukovane imunogenosti ili bilo koje kokmbinacije od bilo kojih od i), ii), iii), iv) ili v) kada se uporedi sa referentnom sekvencom SEQ ID NO:26.

[0059] U nekim dodoatnim ostvarenjima, postoje takođe otkriveni modifikovani polipeptidi koji imaju fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost koji obuhvataju: a) aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 85% li više identična u sekvenci sa referentnom sekvencom SEQ ID NO:26 ili njenim funkcionalnim fragmentom; b) polipeptidnu sekvencu koja sadrži najmanje jednu razliku u aminokiselinskom ostatku kada se uporedi sa SEQ ID NO:26 ili njenim funkcionalnim fragmentom na jednoj ili više aminokiselinskih pozicija; and c) koja pokazuje poboljšano svojstvo koje je odabrano od i) pojačane katalitičke aktivnost, ii) redukovane osetljivosti na proteolizu, iii) povećane tolerancije na kiselu pH, iv) redukovane agregacije, v) redukovane

2

imunogenosti ili bilo koje kokmbinacije od bilo kojih od i), ii), iii), iv) ili v) kada se uporedi sa referentnom sekvencom SEQ ID NO:26. U nekim ostvarenjima, modifikovani polipeptidi koji imaju fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost iz ovog otkrića obuhvataju aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 85% li više identična u sekvenci sa referentnom sekvencom SEQ ID NO:26, i koja sadrži najmanje jednu razliku u aminokiselinskom ostatku kada se uporedi sa SEQ ID NO:26, koja pokazuje makar jedno poboljšano svojstvo koje je odabrano pojačane katalitičke aktivnost, redukovane osetljivosti na proteolizu, povećane tolerancije na kiselu pH, redukovane agregacije i/ili redukovane imunogenosti kada se uporedi sa SEQ ID NO:26.U nekim ostvarenjima modifikovanih polipeptida rezlika u aminokiselinskom ostatku kada se uporedi sa SEQ ID NO: 10, je odabrana od jedne ili više od sledećih zamena (supstitucija) ili setova supstitucija: I27E/V39A; A24E/G381L; L127V; A129I1V; S131C/T; H132L/S; R134C/F/H/K; R134H/Y378E/G381L; R134H/Y378E/G381L/V388T; R134H/V388T; A136K; A289S; M372L; H374G/M/Q; G381A/C/F/I/L/M/N/Q/S/T; A383C/M; V388C/T; L431M; i/ili L563M

[0060] U nekim ostvarenjima, postoje takođe otkriveni modifikovani polipeptid koji ima fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost iz otkrića ima najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, ili najmanje oko 99% identičnu sekvencu u odnosu na referentnu sekvencu SEQ ID NO:4. U nekim ostvarenjima, modifikovani polipeptid koji ima fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost iz otkrića ima najmanje oko 90% identičnu sekvencu u odnosu na referentnu sekvencu SEQ ID NO:4, dok u nekim daljim ostvarenjima, modifikovani polipeptid ima najmanje 95% identičnu sekvencu u odnosu na referentnu sekvencu SEQ ID NO:4. U nekim ostvarenjima, modifikovani polipeptid koji ima fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost iz otkrića ima najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identičnu sekvencu u odnosu na referentnu sekvencu SEQ ID NO:4. U nekim ostvarenjima, modifikovani polipeptid koji ima fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost iz otkrića ima najmanje 90% identičnu sekvencu u odnosu na referentnu sekvencu SEQ ID NO:4, dok u nekim daljim ostvarenjima, modifikovani polipeptid ima najmanje 95% identičnu sekvencu u odnosu na referentnu sekvencu SEQ ID NO:4. U nekim daljim ostvarenjima modifikovani polipeptid obuhvata funkcionalne fragmente polipeptida (na pr. bilo koju od varijanti koje su ovde obezbeđene u tabelama) koji imaju fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost iz otkrića.

[0061] U nekim ostvarenjima, postoje takođe otkriveni modifikovani polipeptid koji ima fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost iz otkrića ima najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, ili najmanje oko 99% identičnu sekvencu u odnosu na SEQ ID NO:6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, i/ili 26. U nekim ostvarenjima, modifikovani polipeptid koji ima fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost iz otkrića ima najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identičnu sekvencu u odnosu na SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, i/ili 26. U nekim ostvarenjima, modifikovani polipeptid koji ima fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost ima najmanje oko 90% identičnu sekvencu sa SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, i/ili 26. U nekim ostvarenjima, modifikovani polipeptid koji ima fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost obuhvata amino kiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 99% identičnu sekvencu sa SEQ ID NO:6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, i/ili 26, ili njihovim funkcionalnim fragmentom. U nekim daljim ostvarenjima, modifikovani polipeptidi obuhvataju funkcionalne fragmente polipeptida (e.g., funkcionlne fragmente SEQ ID NO:6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, i/ili 26, kao i bilo koju od varijanti koje su ovde obezbeđene u tabelama, koje ovde imaju fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost iz otkrića.

[0062] Postoje takođe otkkriveni modifikovani polipeptid koji ima fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost, naznačeno time da su modofokovani polipeptidi varijante FAL-ova obezbeđeni u bilo kojoj od tabela 2-1 do 2-5 i/ili tabela 9-1 do 9-7.

[0063] U nekim ostvarenjima, modifikovani polipeptid koji ima fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost je enzim iz Anabaena variabilis. U nekim dodatnim ostvarenjima, modifikovani polipeptidi koji ima fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost su termostabilni. U nekim ostvarenjima, modifikovani polipeptidi koji ima fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost su rezistentni na proteolizu. U nekim dodatim ostvarenjima, modifikovani polipeptidi koji ima fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost su rezistentni na proteolizu od strane makar jednog enzima digestivnog trakta. U nekim daljim ostvarenjima, modifikovani polipeptidi koji ima fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost su rezistentni na himotripsin, tripsin karboksipeptidaze i/ili elastaze. U nekim daljim ostvarenjima, modifikovani polipeptidi koji ima fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost je stabilan u kiseloj sredini.

[0064] Postoje otkriveni modifikovani polipeptidi koji imaju fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost koji us deimunizovani. U nekim ostvarenjima deimunizovani modifikovani polipeptidi obuhvataju aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99%, ili više, identičnu sekvencu sa SEQ ID NO:6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, i/ili 26. U nekim ostvarenjima deimunizovani modifikovani polipeptidi obuhvataju aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili više, identičnu sekvencu sa SEQ ID NO:6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, i/ili 26. U nekim ostvarenjima deimunizovani modifikovani polipeptidi obuhvataju aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnu sekvencu sa SEQ ID NO:6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, i/ili 26. U nekim ostvarenjima deimunizovani modifikovani polipeptidi obuhvataju aminokiselinsku sekvencu koja ima 95% identičnu sekvencu sa SEQ ID NO:6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, i/ili 26.

[0065] U još nekim daljim ostvarenjima, postoje otkriveni prečišćeni modifikovani polipeptidi koji imaju fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost.

[0066] Postoje takođe otkrivene polinukleotidne sekcence koje kodiraju najmanje jedan modifikovani polipeptid koji ima fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost kao što je ovde prikazano. U nekim ostvarenjima, polinukleotidna sekvenca je operativno vezana za kontrolnu sekvencu. U nekim dodatnim ostvarenjima, polinukleotidna sekvenca je kodon-otpimizovana.

[0067] Takođe su otkriveni ekspresioni vektori koji obuhvataju najmanje jednu polinukleotidnu sekvencu koja kodira najmanje jedan modifikovani polipeptid koji ima fenilalanin amonijakliaznu (FAL) aktivnost kao što je ovde prikazano. U nekim ostvarenjima ekspresioni vektor dalje obuhvata najmanje jednu kontrolnu sekvencu. U nekim ostvarenjima kontrolna sekvenca je promotor. U nekim dodatnim ostvarenjima promotor je heterologni promotor.

[0068] Takođe su otkrivene domaćinske ćelije transformisane sa najmanje jednom polinukleotidnom sekvencom koja kodira najmanje jedan modifikovani polipeptid koji ima fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost, i/ili najmanje jedan ekspresioni vektor koji obuhvata najmanje jednu polinukleotidnu sekvencu koja kodira najmanje jedan modifikovani polipeptid koji ima fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost i najmanje jednu kontrolnu sekvencu. U nekim ostvarenjima, domaćinske ćelije sadrže najmanje jedan modifikovani polipeptid koji ima fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost koji je kodon-optimizovan. U nekim ostvarenjima ćelija je E. coli.

[0069] Takođe su otkrivene metode za proizvodnju najmanje jednog modifikovanog FAL polipeptida u domaćinskoj ćeliji koje obuhvataju kultivaciju u domaćinskoj ćeliji koja sadrži najmanje jedan polinukleotid koji kodira najmanje jedan modifikovani polipeptid koji ima fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost i/ili najmanje jedan ekspresioni vektor koji obuhvata najmanje jednu polinukleotidnu sekvencu koja kodira najmanje jedan modifikovani polipeptid koji ima fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost i najmanje jednu kontrolnu sekvencu u odgovarajužim uslovima za gajenje, tako da se proizvodi modifikovani FAL polipeptid. U nekim ostvarenjima, metode dalje obuhvataju korak dobijanja najmanje najmanje jednog modifikovanog polipeptida koji ima fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost iz kulture i/ili domaćinskih ćelija. U nekim daljim ostvarenjima, metode dalje obuhvataju korak prečišćavanja najmanje jednog modifikovaog polipeptida koji ima fenilalanin amonijak-liazu (FAL).

[0070] Takođe su otkrivene kompozicije koje obuhavtaju najmanje jedan modifikovan FAL polipeptid koji ima fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost kao što je ovde otkriveno. U nekim ostvarenjima, kompozicija je farmaceutska kompozicija. U nekim sledećim ostvarenjima, kompozicija je dijetetski i/ili hutricioni dodatak (suplement). U nekim daljim ostvarenjima farmaceutske kompozicije dalje obuhvataju najmanje jedanfarmaceutski prihvatljiv ekscipijent i/ili nosač. U nekim dodatnim ostvarenjima, kompozicija je pogodna za tertman fenilketonurije. U nekim daljim ostvarenjima, farmaceutska kompozicija je pogodna za oralnu primenu (administraciju) kod ljudi. U nekim ostvarenjima kompozicija je u formi pilule, tablete, kapsule, gelkapsule, tečnosti ili emulzije. U još nekim daljim ostvarenjima, pilula, tableta, kapsula ili gelkapsula dalje obuhvataju enteričnu oblogu. U nekim dodatnim ostvarenjima farmaceutska kompozicija je pogodna za parenteralno injektiranje kod ljudi. U nekim ostvarenjima farmaceutska kompozicija se koadministrira sa najmanje jednim dodatnim farmaceutski efektnim jedinjenjem. U nekim daljim ostvarenjima, farmaceutska kompozicija obuhvata najmanje jedno terapeutski efektivno jednjenje. U nekim dodatnim ostvarenjima farmaceutska kompozicija je prisutna u dijetetskom i/ili nutricionom suplementu.

[0071] Postoje takođe otkrivene metode za tretiranje i/ili prevenciju simptoma fenilketonurije u subjektu, koje obuhvataju obezbeđivanje subjekta sa fenilketonurijom, i koje obezbeđuju subjektu najmanje jednu kompoziciju koja je ovde otkrivena. U nekim ostvarenjima kompozicija obuhvata dijetetski/nutricioni suplement. U nekim ostvarenjima metode, simptomi fenilketonurije su ublaženi. U nekim oddatnim ostvarenjima, tretirani subjekat može da jede u konzumira ishranu koja je manje restriktivna što se tiče sadržaja metionina, fenilalanina i/ili tirozina u odnosu na ishrane koje su obavezne za subjekte koji pokazuju simptome fenilalanina. U nekim ostvarenjima, tretirani subjekt (to jest subjekt kome je obezbeđen najmanje jedna kompozicija koja sadrži najmanje jedan modifikovani polipeptid koji ima fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost kao što je ovde otkriveno) može da konzumira ishranu koja je manje restriktivna što se tiče sadržaja metionina, fenilalanina i/ili tirozina u odnosu na ishrane koje su obavezne za subjekte kojima nije obezbeđen najmanje jedna

2

kompozicija koja je ovde opisana. U nekim ostvarenjima, kompozicija koja ja obezbeđena subjektima obuhvata farmaceutsku kompoziciju, dok kod nekih alternativnih ostvarenja, kompozicija obuhvata dijetetski i/ili nutricioni suplement. Takođe su otkriveni tretirani subjekti, naznačeno time da je subjektu administrirana najmanje jedna kompozicija i/ili farmaceutska kompozicija koja obuhvata najmanje jedan modifikovani polipeptid koji ima fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost kao što je ovde otkriveno. U nekim ostvarenjima subjekat je životinja odabrana iz grupe primate, glodara i dvozupci (paglodari). U nekim dodatnim ostvarenjima subjekat je miš. U nekim daljim ostvarenjima, subjekat je čovek. U još nekim daljim ostvarenjima subjekat je infant ili dete, dok je u nekim alternativnim ostvarenjima subjekat je humani adult ili maldi adult.

[0072] Takođe su otkrivene upotrebe kompozicija koje obuhvataju najmanje jedan modifikovani polipeptid koji ima fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost kao što je ovde otkriveno.

KRATAK OPIS SLIKA [0073]

Slika 1 prikazuje poravnanje proteinske sekvence divljeg tipa FAL: Anabaena variabilis FAL (NCBI YP_324488.1 (SEQ ID NO:4)); Nostoc punctiforme fenilalanina/histidin amonijak liaza "NpPHAL" (NCBI YP_001865631.1 (SEQ ID NO:30); Rivularia sp. histidin amonijak-liaza "RspHAL" (NCBI YP_007056096.1 (SEQ ID NO:31); Oscil- latoria sp. histidin amonijak-liaza "Osp HAL" (NCBI YP_07108482.1(SEQ ID NO:32); and Gloeocapsa sp. histidin amonijakliaza "GspHAL" (NCBI YP_007127054.1) (SEQ ID NO:33).

Slika 2 prikazuje redukovanu senzitivnost na proteolizu (izražena kao tolerance na himotripsin i tripsin) kada se uporedi sa divljim tipom AvFAL testiranim na pH 7.0 za Varijantu broj 22 (SEQ ID NO:8), Varijantu broj 30 (SEQ ID NO:6) i Varijantu broj 36 (SEQ ID NO:10) kao što je dalje opisano u primeru 4.

Slika 2B obezbeđuje grafikon koji prikazuje povećanu toleranciju na kiselu pH kada se uporedi sa divljim tipom AvFAL testiranim na pH 4.0 do 5.2, za Varijantu broj 22, 30 i 36 kao što je dalje opisano u promeru 4.

Slika 3 obezbeđuje rezultate KMza divlji tip FAL i Varijantu broj 36.

Slika 4 obezbeđuje podatke koji se odnose na amino kiselinsku specifičnost kod FAL divljeg tipa i Varijantu broj 36.

Slika 5 obezbeđuje rezultate koji pokazuju relativnu stabilnost FAL divljeg tipa i Varijantu broj 36 koji su izloženi humanomhimotripsinu i tripsinu.

Slika 6 obezbeđuje rezultate relativne stabilnosti FAL divljeg tipa i Varijante broj 36, 42, i 43 izložene ekstraktu pankreasa svinje.

OPIS PRONALASKA

[0074] Ovaj pronalazak se odnosi na modifikovane FAL polipeptide, mutante, njihove biološki aktivne fragmente i analoge, i farmaceutske i industrijske kompozicije koje obuhvataju iste. .

[0075] Ovaj pronalazak se odnosi na modifikovane fenilalanin amonijak-liazne (FAL) polipeptide i njihove kompozicije, kao in a polinukleotide koji kodiraju modifikovane fenilalanin amonijak-liazne (FAL) polipeptide. U nekim ostvarenjima, modifikovani FAL polipeptide su optimizovani da obezbede pojačanu katalitičku aktivnost, kao i redukovanu senzitivnost na proteolizu i povećanu toleranciju na kisele pH nivoe. U nekim ostvarenjima, modifikovani FAL polipeptidi su deimunizovani. Pronalazak se odnosi in a upotrebe kompozicija koje obuhvataju modifikovane FAL polipeptide za terapeutske i industrijske potrebe.

Skraćenice i Definicije:

[0076] Ukoliko nije drugačije definisano, svi ovde korišćeni tehnički i naučni pojmovi generalno imaju isto značenje kao što ga uobičajeno podrazumeva stručnjak iz oblasti na koje se ovaj izum odnosi. Uopšteno, ovde korišćena nomenklatura i laboratorijski postupci ćelijskih kultura, molekularne genetike, mikrobiologije, organske hemije, analitičke hemije i hemije nukleinskih kiselina opisani u tekstu dobro su poznati i uobičajeno korišćeni u struci. Takve tehnike su dobro poznate i opisane u brojnim tekstovima i referencama dobro poznatim stručnjacima. Standardne tehnike ili njihove modifikacije korišćene su za hemijske sinteze i hemijske analize.

[0077] Iako bilo koje prikladne metode i materijali slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani nalaze primenu u praksi ovog pronalaska, neke metode i materijali su opisani ovde. Podrazumeva se da ovaj pronalazak nije ograničen na određenu opisanu metodologiju, protokole i reagense, jer oni mogu varirati, zavisno o kontekstu u kojem ih koriste stručnjaci. U skladu s tim, termini definisani neposredno ispod su u potpunosti opisani referencom na primenu kao celinu.

[0078] Takođe, kako se ovde koristi, jednina "a", "an" i "the" uključuje reference za množinu, osim ukoliko kontekst jasno ne pokazuje drugačije.

[0079] Numerički rasponi uključuju brojeve koji određuju raspon. Tako, svaki numerički raspon ovde prikazan treba da obuhvati svaki uži numerički raspon koji se nalazi unutar takvog šireg numeričkog raspona, kao da su svi uži numerički rasponi ovde eksplicitno napisani. Takođe je predviđeno da svako maksimalno (ili minimalno) numeričko ograničenje koje je ovde prikazano uključuje svako niže (ili više) numeričko ograničenje, kao da su takva niža (ili viša) numerička ograničenja izričito napisana u ovom dokumentu.

[0080] Izraz "oko" znači prihvatljivu grešku za određenu vrednost. U nekim slučajevima "oko" znači unutar 0,05%, 0,5%, 1,0%, ili 2,0%, od datog raspona vrednosti. U nekim slučajevima, "oko" znači unutar 1, 2, 3 ili 4 standardne devijacije date vrednosti.

[0081] Nadalje, zaglavlja koja su ovde navedena nisu ograničenja različitih aspekata ili ostvarenja pronalaska koji se mogu odnositi na aplikaciju kao celinu. U skladu s tim, termini definisani neposredno ispod u potpunosti su definisani referencom na aplikaciju kao cjelinu. Bez obzira na to, kako bi se olakšalo razumevanje pronalaska, dole su definisani brojni pojmovi.

[0082] Ako nije drugačije naznačeno, nukleinske kiseline se ispisuju s leva na desno u orijentaciji 5' ka 3'; aminokiselinske sekvence su zapisane s leva na desno od amino ka karboksi orijentaciji.

[0083] Kako se ovde koristi, pojam "sadrži" i njegove srodne oznake koriste se u njihovom inkluzivnom smislu (tj., ekvivalentan je pojmu "uključujući" i njegovim odgovarajućim srodnicima).

[0084] "EC" broj se odnosi na nomenklaturu enzima Odbora za nomenklaturu Međunarodne unije za biohemiju i molekularnu biologiju (NC-IUBMB). IUBMB biohemijska

2

klasifikacija je numerički sistem klasifikacije enzima koji se temelji na hemijskim reakcijama koje katalizuju.

[0085]"ATCC" se odnosi na američku kolekciju kultura ćelija čija “bio”zbirka uključuje gene i sojeve.

[0086] "NCBI" se odnosi na Nacionalni centar za biološke informacije i baze podataka o sekvencama koje su u njemu sadržane.

[0087] Kako se ovde koristi, pojam "polipeptid fenilalanin amonijak-lijaza (FAL) polipeptid" odnosi se na klasu enzima unutar familije aromatičnih aminokiselina (EC 4.3.1.23, EC 4.3.1.24 i EC4.3.1.25) koja takođe uključuje histidin amonijak-lijazu i tirozin amonijaklijazu. FAL polipeptidi se takođe ponekad nazivaju i fenilalanin/tirozin amonijak-lijaza jer neki FAL enzimi mogu koristiti tirozin kao i fenilalanin kao supstrat. Međutim, AvFAL i varijante koje su ovde opisane i za koje se traži zaštita ne koriste tirozin kao supstrat. FAL polipeptidi katalizuju konverziju L-fenilalanina u trans-cinaminsku kiselinu i amonijak. FAL aktivnost odnosi se na enzimsku aktivnost FAL polipeptida. U nekim poželjnim ostvarenjima, FAL enzim takođe sadrži kofaktor 3,5-dihidro-5-metiliden-4H-imidazol-4-on (MIO). Ovaj kofaktor je možda potreban za katalitičku aktivnost i nastaje ciklizacijom i dehidracijom konzerviranog segmenta tripeptida aktivnog mjesta Ala167-Ser168-Gly169.

[0088] "Protein," "polipeptid" i "peptid" ovde se koriste naizmenično za označavanje polimera od najmanje dve aminokiseline koje su kovalentno vezane amidnom vezom, bez obzira na dužinu ili post-translacionu modifikaciju (npr. glikozilaciju ili fosforilaciju).

[0089] "Aminokiseline" se ovde navedene ili pomoću njihovih opštepoznatih troslovnih simbola ili sa jednoslovnim simbolima koje preporučuje IUPAC-IUB Biohemijska komisija za nomenklaturu. Nukleotidi se takođe mogu navesti njihovim opšte prihvaćenim jednoslovnim kodovima.

[0090] Termin "modifikovan", "rekombinantni", "neprirodan" i "varijanta", se koristi u odnosu na ćeliju, polinukleotid ili polipeptid odnosi se na materijal ili materijal koji odgovara prirodnom ili nativnom obliku, materijal koji je modifikovan na način koji inače ne bi postojao u prirodi ili je identičan s njim, ali je proizveden ili izveden iz sintetičkih materijala i/ili manipulacijom pomoću rekombinantnih tehnika.

[0091] Kako se ovde koristi, "divlji tip" i "prirodni" odnosi se na oblik koji se nalazi u prirodi. Na primer, polipeptidna ili polinukleotidna sekvenca divljeg tipa je sekvenca prisutna u organizmu koji se može izolovati iz izvora u prirodi i koji nije namerno modifikovan ljudskom manipulacijom.

[0092] "Deimunizovani", kako je ovde navedeno, odnosi se na manipulaciju proteinom da se kreira varijanta koja nije tako imunogena kao divlji tip ili referentni protein. U nekim ostvarenjima, deimunizacija je potpuna, tada varijantni protein ne stimuliše imuni odgovor kod pacijenata kojima je administriran/dat. Ovaj odgovor se može meriti različitim metodama uključujući, ali bez ograničenja, prisustvo ili obilje neutralizacije (tj. antitela protiv leka), prisustvo anafilaktičkog odgovora, ili prevalenciju ili intenzitet otpuštanja citokina nakon davanja proteina. U nekim ostvarenjima, varijantni protein je manje imunogen nego divlji tip ili referentni protein. U nekim ostvarenjima, deimunizacija

2

uključuje modifikacije proteina (npr. epitopa) koje prepoznaju T-ćelijski receptori. U nekim ostvarenjima epitopi T-ćelija su uklanjeni iz divljeg tipa ili referentnog proteina kako bi se proizveo deimunizovani varijantni protein. U nekim ostvarenjima, deimunizirani protein pokazuje niže nivoe odgovora u biohemijskim i ćelijsko-biološkim prediktorima humanih imunoloških odgovora, uključujući T-ćelijske aktivacione eseje dendritičnih ćelija, ili testove vezanja peptida humanog leukocitnog antigena (HLA).

[0093] "Kodirajuća sekvenca" se odnosi na onaj deo nukleinske kiseline (npr., gen) koji kodira aminokiselinsku sekvencu proteina.

[0094] Pojam "procenat (%) identičnosti sekvence" ovde se koristi da se odnosi na poređenja između polinukleotida i polipeptida i određuje se upoređivanjem dve optimalno usklađene sekvence u prozoru za poređenje, pri čemu deo polinukleotidne ili polipeptidne sekvence u prozoru za poredjenje može sadržati adicije ili delecije (tj. praznine) u poređenju sa referentnom sekvencom koja služi za optimalno poređenje dve sekvence. Procenat se može izračunati određivanjem broja položaja na kojima se pojavljuje identična baza nukleinske kiseline ili aminokiselina u obe sekvence kako bi se dobio broj uparenih pozicija, deljenjem broja podudarnih pozicija s ukupnim brojem pozicija u prozoru poređenja i množenjem rezultata sa 100 da bi se dobio procenat identičnosti sekvence. Alternativno, procenat se može izračunati određivanjem broja pozicija na kojima se pojavljuje ili identična baza nukleinske kiseline ili aminokiselinski ostatak u obe sekvence ili se nukleinsko kiselinska baza ili aminokiselinski ostatak poravnava sa razmakom kako bi se dobio broj podudarnih položaja deljenjem broja podudarnih pozicija s ukupnim brojem pozicija u prozoru za poređenje i množenjem rezultata sa 100 da bi se dobio procenat identičnosti sekvence. Oni koji poznaju ovu oblast znaju da postoje mnogi poznati algoritmi dostupni za poređenje dve sekvence. Optimalno poređenje sekvenci može se sprovesti, na primer, algoritmom lokalne homologije Smitha i Watermana (Smith i Waterman, Adv. App. Math., 2: 482 [1981]), algoritmom homologog poređenja Needlemana i Wunscha (Needleman i Wunsch, J. Mol. Biol., 48: 443 [1970]), postupkom pretrage za sličnost Pearsona i Lipmana (Pearson i Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 [1988]) kompjuteriziovanim pretragama tih algoritama (npr. GAP, BESTFIT, FASTA i TFASTA u softverskom paketu GCG Wisconsin), ili vizuelnim pregledom, kao što je poznato u struci. Primeri algoritama koji su prikladni za određivanje procenta identičnosti sekvence i sličnosti sekvenci uključuju, ali nisu ograničeni na BLAST i BLAST 2.0 algoritme (vidi npr. Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 [1990]. i Altschul i sur., Nucleic Acids Res., 3389-3402 [1977]). Softver za obavljanje BLAST analiza javno je dostupan na web stranici Nacionalnog centra za biotehnološke informacije. Ovaj algoritam uključuje prvo identifikaciju parova sekvenci visokog skora/poklapanja (HSP-ova) identifikaciju kratkih reči dužine "W" u nizu upita, koje se ili podudaraju ili zadovoljavaju neke pozitivne vrednosti praga "T", kada je usklađen sa rečju iste dužine u nizu baze podataka. T je označen kao prag za ocenu susedne reči (vidi Altschul et al, supra). Ovi početni pogodci susednih reči deluju kao seme za pokretanje pretraživanja kako bi pronašli duže HSP-ove koji ih sadrže. Pogođene reči se zatim proširuju u oba smera za svaku sekvencu, sve dok se ukupni rezultat poravnanja može povećati. Kumulativni rezultati se izračunavaju koristeći, za nukleotidne sekvence, parametre "M" (nagradni rezultat za par podudarnih ostataka; uvek>0) i "N" (kazna za neusklađene ostatke; uvek<0). Za aminokiselinske sekvence se koristi matrica bodovanja za izračunavanje kumulativnog rezultata. Produženje pogođene reči u svakom smeru se zaustavlja kada: kumulativni rezultat poravnanja opadne za količinu "X" od maksimalne postignute

2

vrednosti; kumulativna ocena ide na nulu ili niže, zbog nakupljanja jednog ili više ostataka tokom poravnanja sa negativnim rezultatom; ili je postignut kraj bilo koje sekvence. Parametri algoritma BLAST W, T i X određuju osjetljivost i brzinu poravnanja. BLASTN program (za nukleotidne sekvence) koristi kao zadatu vrednost dužinu reči (W) od 11, očekivanje (E) od 10, M = 5, N = -4, i poreeđenje oba lanca. Za aminokiselinske sekvence, BLASTP program koristi kao zadatu vrednost dužinu reči (W) od 3, očekivanje (E) od 10, i matricu za ocenjivanje BLOSUM62 (vidi npr. Henikoff i Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89). : 10915 [1989]). Primerno određivanje poravnavanja sekvenci i identičnost sekvence može koristiti BESTFIT ili GAP programe u GCG Wisconsin Software paketu (Accelrys, Madison WI), koristeći zadate parametre.

[0095] "Referentna sekvenca" se odnosi na definisanu sekvencu koja se koristi kao osnova za poređenje sekvenci. Referentna sekvenca može biti podskup veće sekvence, na primer, segment gena pune dužine ili polipeptidne sekvence. Generalno, referentna sekvenca je najmanje 20 nukleotidnih ili aminokiselinskih ostataka u dužini, najmanje 25 ostataka u dužini, najmanje 50 ostataka u dužini, najmanje 100 ostataka u dužini ili pune dužine nukleinske kiseline ili polipeptida. S obzirom da dva polinukleotida ili polipeptida mogu svaki (1) sadržati sekvencu (tj. deo kompletne sekvence) koja je slična između dve sekvence, i (2) može dalje sadržati sekvencu koja je divergentna između dve sekvence, poređenja sekvenci između dva (ili više) polinukleotida ili polipeptida tipično se izvode poređenjem sekvenci dva polinukleotida ili polipeptida preko "prozora za poređenje" kako bi se identifikovali i uporedili lokalni regioni sličnosti sekvenci. U nekim ostvarenjima, "referentna sekvenca" se može temeljiti na primarnoj aminokiselinskoj sekvenci, gdje je referentna sekvenca ona sekvenca koja može imati jednu ili više promena u primarnoj sekvenci. Na primer, izraz "referentna sekvenca bazirana na SEQ ID NO: 4 ima valin na ostatku koji odgovara X39" odnosi se na referentnu sekvencu u kojoj je odgovarajući ostatak u položaju X39 u SEQ ID NO: 4 (npr., alanin) , promenjen u valin.

[0096] "Prozor za poređenje" odnosi se na konceptualni segment od najmanje oko 20 susednih/graničnih nukleotidnih pozicija ili aminokiselinskih ostataka u kojima se redosled može uporediti sa referentnom sekvencom od najmanje 20 susednih nukleotida ili aminokiselina i gdje deo sekvence u prozoru za poređenje može sadržati adicije ili delecije (tj. praznine) od 20 posto ili manje u poređenju sa referentnom sekvencom (koja ne uključuje adicije ili delecije) za optimalno poređenje dve sekvence. Prozor za poređenje može biti duži od 20 susjednih ostataka i uključuje, po izboru, 30, 40, 50, 100 ili duže prozore.

[0097] "Odgovara", "upućuje na" i "u odnosu na" kada se koristi u kontekstu numeracije date aminokiseline ili polinukleotidne sekvence odnosi se na numerisanje/nabrajanje ostataka navedene referentne sekvence kada se data aminokiselina ili polinukleotidna sekvenca upoređuje sa referentnom sekvencom. Drugim rečima, broj ostatka ili položaj ostatka datog polimera je označen u odnosu na referentnu sekvencu, a ne na stvarni numerički položaj ostatka unutar date aminokiselinske ili polinukleotidne sekvence. Na primer, određena aminokiselinska sekvenca, kao što je ona kod modifikovanog FAL-a, može se porediti sa referentnom sekvencom uvođenjem praznina za optimizaciju podudaranja ostataka između dve sekvence. U tim slučajevima, iako su prisutne praznine, numerisanje ostatka u datoj aminokiselinskoj ili polinukleotidnoj sekvenci napravljeno je u odnosu na referentnu sekvencu sa kojom je poravnato.

2

[0098] "Aminokiselinska razlika" i "razlika u ostacima" odnosi se na razliku u aminokiselinskom ostatku na položaju u polipeptidnoj sekvenci u odnosu na aminokiselinski ostatak na odgovarajućem položaju u referentnoj sekvenci. Položaji aminokiselinskih razlika uopšteno su ovde označeni kao "Xn", gde se n odnosi na odgovarajući položaj u referentnoj sekvenci na kojoj se temelji razlika u ostacima. Na primer, "razlika u ostacima na položaju X91 u poređenju sa SEQ ID NO: 4" odnosi se na razliku aminokiselinskog ostatka na polipeptidnom položaju koji odgovara položaju 91 u SEQ ID NO: 4. Prema tome, ako referentni polipeptid SEQ ID NO: 4 ima alanin na poziciji 91, tada se "razlika u ostacima na položaju X91 u poređenju sa SEQ ID NO: 4" odnosi na aminokiselinsku supstituciju bilo kog ostatka osim alanina na položaju polipeptida koji odgovara položaju 91 u SEQ ID NO: 4. U većini slučajeva ovde, specifična razlika aminokiselinskih ostataka na položaju naznačena je kao "XnY" gdje "Xn" specificira odgovarajući ostatak i položaj referentnog polipeptida (kao što je gore opisano), a "Y" je jednoslovni identifikator aminokiseline pronađene u modifikovanom polipeptidu (tj. različit ostatak od onog u referentnom polipeptidu). U nekim slučajevima (npr. u tabelama u primerima), takođe su opisane specifične aminokiselinske razlike koje su označene konvencionalnom oznakom "AnB", gdje je A identifikator pojedinačnog slova ostatka u referentnoj sekvenci, "n" je broj položaja ostatka u referentnoj sekvenci, a B je pojedinačni identifikator supstitucije ostatka u sekvenci modifikovanog polipeptida. U nekim slučajevima, polipeptid iz ovog izuma može uključivati jednu ili više razlika aminokiselinskih ostataka u odnosu na referentnu sekvencu, što je naznačeno popisom specificiranih položaja gdje su razlike u ostacima prisutne u odnosu na referentnu sekvencu. U nekim ostvarenjima, gdje se više od jedne aminokiseline može koristiti u specifičnoj poziciji ostatka polipeptida, različiti aminokiselinski ostaci koji se mogu upotrebiti su odvojeni sa "/" (npr., X307G/X307Q ili X307G/Q). Ovo otkriće uključuje modifikovane polipeptidne sekvence koje sadrže jednu ili više aminokiselinskih razlika koje uključuju bilo/ili obe konzervativnu i nekonzervativne aminokiselinsku zamenu.

[0099] Pojmovi "set aminokiselinske supstitucije/zamene" i "supstitucioni set" odnose se na grupu aminokiselinskih supstitucija unutar polipeptidne sekvence. U nekim ostvarenjima supstitucioni setovi obuhvaćaju 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ili više aminokiselinskih supstitucija. U nekim ostvarenjima, supstitucioni skup odnosi se na grupu aminokiselinskih supstitucija koje su prisutne u bilo kojoj od varijanti AvFAL polipeptida koje su navedene u bilo kojoj tabeli u primerima. Na primjer, supstitucioni skup prisutan u varijanti 36 je A39V/A91V/N290G/H307G/ L407V/T524S, gde su aminokiselinski položaji relativni prema SEQ ID NO: 4.

[0100] "Konzervativna aminokiselinska supstitucija" odnosi se na supstituciju ostatka sa različitim ostatkom koji ima sličan bočni lanac, te zato tipično uključuje supstituciju aminokiseline u polipeptidu sa aminokiselinama unutar iste ili slične definisane klase aminokiselina. Kao primer, a ne kao ograničenje, aminokiselina s alifatičnim bočnim lancem može biti supstituisana sa drugom alifatičnom aminokiselinom (npr., alanin, valin, leucin i izoleucin); aminokiselina sa hidroksilnim bočnim lancem je supstituisana s drugom aminokiselinom sa hidroksilnim bočnim lancem (npr. serinom i treoninom); aminokiseline koje imaju aromatične bočne lance supstituisane su s drugom aminokiselinom koja ima aromatični bočni lanac (npr. fenilalanin, tirozin, triptofan i histidin); aminokiselina sa baznim bočnim lancem je supstituisana s drugom aminokiselinom sa baznim bočnim lancem (npr. lizin i arginin); aminokiselina sa kiselim bočnim lancem je supstituisana s drugom aminokiselinom sa kiselim bočnim lancem (npr. asparaginska kiselina ili glutaminska kiselina); i hidrofobna ili

2

hidrofilna aminokiselina supstituisana je sa drugom hidrofobnom ili hidrofilnom aminokiselinom.

[0101] "Nekonzervativna supstitucija" se odnosi na supstituciju aminokiseline u polipeptidu sa aminokiselinom sa značajno različitim osobinama bočnog lanca. Nekonzervativne supstitucije mogu koristiti aminokiseline između, a ne unutar, definisanih grupa i uticati na: (a) strukturu peptidne osnove/kičme u području supstitucije (npr., prolin za glicin); (b) naelektrisanje ili hidrofobnost; i / ili (c) strukturu bočnog lanca. Kao primer, a ne kao ograničenje, primeri nekonzervativnih supstitucija uključuju kiselu aminokiselinu supstituisanu sa baznom ili alifatičnom aminokiselinom; aromatična aminokiselina supstituisana sa malom aminokiselinom; i hidrofilne aminokiseline supstituisane sa hidrofobnom aminokiselinom.

[0102] "Delecija" se odnosi na modifikaciju polipeptida uklanjanjem jedne ili više aminokiselina iz referentnog polipeptida. Delecije mogu obuhvatiti uklanjanje 1 ili više aminokiselina, 2 ili više aminokiselina, 5 ili više aminokiselina, 10 ili više aminokiselina, 15 ili više aminokiselina, ili 20 ili više aminokiselina, do 10% od ukupnog broja aminokiselina, ili do 20% od ukupnog broja aminokiselina koje čine referentni enzim uz zadržavanje enzimske aktivnosti i/ili zadržavanje poboljšanih svojstava modifikovanog enzima transaminaze. Delecije se mogu usmeriti na unutrašnje delove i/ili terminalne delove polipeptida. U različitim ostvarenjima, delecija može da sadrži kontinualni segment ili može biti diskontinuirana.

[0103] "Insercija" se odnosi na modifikaciju polipeptida dodavanjem jedne ili više aminokiselina iz referentnog polipeptida. Insercije mogu biti u unutrašnjim delovima polipeptida, ili na karboksi ili amino kraju. Insercije, kako se ovde koriste, obuhvataju fuzione proteine kao što je već poznato. Insercija može biti susedni segment aminokiselina ili odvojen jednom ili više aminokiselina u prirodnom polipeptidu.

[0104] Termini "funkcionalni fragment" i "biološki aktivni fragment" se ovde koriste naizmenično, i odnose se na polipeptid koji ima amino-terminalnu i/ili karboksi-terminalnu deleciju (e) i/ili unutrašnju deleciju, ali gde je preostala aminokiselinska sekvenca identična odgovarajućim pozicijama u sekvenci sa kojom se upoređuje (npr. modifikovani FAL u punoj dužini iz ove invencije) i koja zadržava skoro svu aktivnost polipeptida cele dužine.

[0105] "Izolovani polipeptid" se odnosi na polipeptid koji je suštinski odvojen od drugih kontaminanata koji ga prirodno prate (npr. proteini, lipidi i polinukleotidi). Termin obuhvata polipeptide koji su uklonjeni ili prečišćeni iz svog prirodnog okruženja ili ekspresionog sistema (npr. ćelija domaćina ili in vitro sinteza). Rekombinantni FAL polipeptidi mogu biti prisutni u ćeliji, prisutni u ćelijskom mediju, ili pripremljeni u različitim oblicima, kao što su lizati ili izolovani preparati. Kao takvi, u nekim ostvarenjima, ovde opisani rekombinantni FAL polipeptidi su izolovani polipeptidi.

[0106] "Suštinski čist polipeptid" se odnosi na sadržaj u kome je polipeptidna vrsta dominantna prisutna vrsta (tj. na molarnoj ili težinskoj osnovi ona je prisutnija od bilo koja druge pojedinačne makromolekulska vrste u sastavu), i generalno je značajno prečišćeni sadržaj kada predmetna vrsta sadrži najmanje oko 50 procenata makromolekulskih vrsta prisutnih po mol-u ili % težine. Generalno, potpuno čist FAL sadržaj će sadržati oko 60% ili više, oko 70% ili više, oko 80% ili više, oko 90% ili više, oko 95% ili više, i oko 98% ili više svih makromolekulskih vrsta po mol-u ili % težine prisutne u sadržaju. U nekim ostvarenjima, predmetna vrsta je prečišćena do esencijalne homogenosti (tj. vrste kontaminanata se ne mogu detektovati u sadržajui konvencionalnim metodama detekcije) gde se sastav sastoji u suštini od jedne makromolekulske vrste. Vrste rastvarača, mali molekuli (<500 Daltona) i vrste elementarnih jona ne smatraju se makromolekulskim vrstama. U nekim ostvarenjima, izolovani rekombinantni FAL polipeptidi su uglavnom čiste polipeptidne kompozicije.

[0107] "Poboljšano enzimsko svojstvo" odnosi se na modifikovani FAL polipeptid koji pokazuje poboljšanje bilo kog enzimskog svojstva u poređenju sa referentnim FAL polipeptidom, kao što je divlji tip FAL polipeptida (npr. AvFAL divlji tip koji ima SEQ ID NO: 4) ili drugi modifikovani FAL polipeptid. Poboljšane osobine uključuju, ali nisu ograničene na, osobine kao što su povećana ekspresija proteina, povećana termoaktivnost, povećana termostabilnost, povećana aktivnost pH, povećana stabilnost, povećana enzimska aktivnost, povećana specifičnost supstrata i/ili afinitet, povećana specifična aktivnost, povećana otpornost na supstrat i/ili inhibicija krajnjeg proizvoda, povećana hemijska stabilnost, poboljšana hemoselektivnost, poboljšana stabilnost rastvarača, povećana tolerancija na kiseli pH, povećana tolerancija na proteolitičku aktivnost (tj. smanjena osetljivost na proteolizu), smanjena agregacija, povećana rastvorljivost, smanjena imunogenost i izmenjen temperaturni profil.

[0108] "Povećana enzimska aktivnost" i "povećana katalitička aktivnost" odnose se na poboljšano svojstvo modifikovanih FAL polipeptida, koji mogu biti predstavljeni povećanjem specifične aktivnosti (npr. proizvodom/vremenom/težinom proteina) i/ili povećanjem procenta konverzije supstrata u proizvod (npr. procenat konverzije početne količine supstrata u proizvod u određenom vremenskom periodu koristećenjem određene količine FAL) u poređenju sa referentnim FAL enzimom (npr. divlji tip AvFAL i/ili drugi modifikovani AvFAL proizvod). Primeri metoda za određivanje enzimske aktivnosti su dati u primerima. Bilo koje svojstvo koje se odnosi na enzimsku aktivnost može biti obuhvaćeno, uključujući klasična enzimska svojstva Km, Vmakili kcat, promene koje mogu dovesti do povećane enzimske aktivnosti. Poboljšanja enzimske aktivnosti mogu biti od oko 1.1 puta enzimske aktivnosti odgovarajućeg enzima divljeg tipa, do 2 puta, 5 puta, 10 puta, 20 puta, 25 puta, 50 puta, 75 puta, 100 puta, 150 puta, 200 puta ili više enzimske aktivnosti od prirodnog FAL ili drugog modifikovanog FAL-a iz koga su izvedeni FAL polipeptidi.

[0109] U nekim ostvarenjima, modifikovani FAL polipeptidi imaju kcatod najmanje 0.1/sek, najmanje 0.2/sek, najmanje 0.3/ sek, najmanje 0.5/ sek, najmanje 1.0/sek i u nekim poželjnim realizacijama većim od 1.0/sek. U nekim realizacijama, Kmje u opsegu od oko 1 mm do oko 5 mM; u opsegu od oko 5 mm do oko 2 mM; u opsegu od oko 10 mm do oko 2 mM; ili u opsegu od oko 10 mm do oko 1 mM. U nekim specifičnim realizacijama, modifikovani FAL enzim pokazuje poboljšanu enzimsku aktivnost u opsegu od 1.5 do 10 puta, 1.5 do 25 puta, 1.5 do 50 puta, 1.5 do 100 puta ili više, od referentnog FAL enzima. FAL aktivnost može da se meri bilo kojim standardnim esejem poznatim u tehnici (npr., praćenjem promena spektrofotometrijskih svojstava reaktanata ili proizvoda). U nekim ostvarenjima, količina proizvedenih proizvoda se meri uz pomoć separacije tečne hromatografije visokoih performansi (HPLC) kombinovane sa UV apsorpcijom ili fluorescentnom detekcijom direktno ili posle derivatizacije o-ftaldialdehida (OPA). U nekim ostvarenjima, poređenja aktivnosti enzima su urađena upotrebom definisanog preparata

1

enzima, definisanog eseja pod postavljenim uslovima, i jednog ili više definisanih supstrata, kao što je ovde u nastavku detaljnije opisano. Generalno, kada se porede lizati, određuje se broj ćelija i količina testiranog proteina, kao i upotreba identičnih espresionih sistema i identičnih ćelija domaćina kako bi se minimizovale varijacije u količini enzima proizvedenog u ćelijama domaćina i prisutnih u lizatima.

[0110] Izraz "poboljšana tolerancija na kiseli pH" znači da rekombinantni FAL prema pronalasku pokazuje povećanu stabilnost (tj. višu zadržanu aktivnost na oko pH 7.0, nakon izlaganja kiselom pH tokom određenog vremenskog perioda [1 sat, do 24 sata]) u poređenju sa referentnim FAL-om.

[0111] "Fiziološki pH", kako se ovde koristi, označava opseg pH koji se obično nalazi u tankom crevu subjekta (npr., čoveku). Normalno je da je gradijent pH od piloričnog otvora do debelog creva, u opsegu od oko 6.0 do 7.5.

[0112] Termin "kiseli pH" koji se koristi u odnosu na poboljšanu stabilnost u kiselim uslovima pH ili povećanu toleranciju na kiseli pH znači pH opseg od oko 1.5 do 6.8.

[0113] Termini "proteolitička aktivnost" i "proteoliza" korišćeni ovde naizmenično odnose se na razgradnju proteina na manje polipeptide ili aminokiseline. Razgradnja proteina je generalno rezultat hidrolize peptidne veze proteaznim (proteinaznim) enzimima. Enzimi proteaze uključuju, ali nisu ograničeni na pepsin, tripsin, himotripsin, elastazu; karboksipeptidazu A i B, i peptidaze (npr. amino peptidaza, dipeptidaza i enteropeptidaza).

[0114] Izrazi "redukovanje osetljivosti na proteolizu" i "redukovanje proteolitičke osetljivosti" ovde su korišćeni naizmenično, što znači da će inžinjerisani FAL polipeptid prema pronalasku imati veću enzimsku aktivnost u poređenju sa referentnim FAL-om u standardnom testu (npr., kao što je opisano u primerima) nakon tretmana sa jednom ili više proteaza.

[0115] "Agregacija" označava grupisanje ili taloženje FAL polipeptida. Agregacija može dovesti do inaktivacije enzima. Izraz "redukovana agregacija" označava da će modifikovani FAL polipeptid biti manje sklon agregaciji, u poređenju sa referentnim FAL-om. Postupci za procenu agregacije su poznati u tehnici, uključujući ali ne ograničavajući se na upotrebu fluorescentne mikroskopije sa odgovarajućim bojama (npr. tioflavin T ili “Nile Red”), dinamičko rasipanje svetlosti, protočna citometrija sa odgovarajućim bojama (npr. “Bodipi”), filtracija i analiza pomoću SDS-PAGE, i/ili “Vestern blotting”, fluorescentna korelaciona spektroskopija i elektronska mikroskopija. Postoje komercijalno dostupni kitovi za procenu agregacije (npr., kit za ispitivanje agregacije proteina ProteoStat® [Enzo]).

[0116] "Konverzija" se odnosi na enzimatsku konverziju (ili biotransformaciju) supstrat(a) u odgovarajućim proizvod(ima). "Procenat konverzije" odgovara procentu supstrata koji se konvertuje u proizvod u određenom vremenskom periodu pod određenim uslovima. Prema tome, "enzimska aktivnost" ili "aktivnost" FAL polipeptida može se izraziti kao "procenat konverzije" supstrata u proizvod u određenom vremenskom periodu.

[0117]"Hibridizacija" se odnosi na uslove hibridizacije, kao što su uslovi pranja, u hibridizaciji nukleinskih kiselina. Generalno, hibridizacione reakcije se izvode pod manje strogim uslovima, praćene ispiranjem u različitim, ali strožim uslovima. Izraz "umereno stroga hibridizacija" odnosi se na uslove koji dozvoljavaju ciljnoj DNK da veže komplementarnu nukleinsku kiselinu koja ima oko 60% identčnosti, poželjno oko 75% identičnosti, oko 85% identitčnisti sa ciljnom

2

DNK, pa do većih od oko 90% identčnosti sa ciljnim polinukleotidom. Primeri umereno strogih uslova su uslovi ekvivalentni hibridizaciji u 50% formamidu, 53 Denhartovom rastvoru, 53SSPE, 0.2% SDS-u na 42°C, nakon čega sledi ispiranje u 0.23SSPE, 0.2% SDS-u, na 42°C. "Hibridizacija u strogim uslovima" se generalno odnosi na uslove koji su oko 10°C ili manje od termičke temperature topljenja Tm, kao što je određeno pod uslovima rastvora za definisanu sekvencu polinukleotida. U nekim realizacijama, strogi uslov se odnosi na uslove koji dozvoljavaju hibridizaciju samo onih sekvenci nukleinskih kiselina koje formiraju stabilne hibride u 0.018M NaCl na 65°C (tj. ako hibrid nije stabilan u 0.018M NaCl na 65°C, neće biti stabilan u strogim uslovima, kao što je ovde razmatrano). Visoko strogi uslovi mogu biti obezbeđeni, na primer, hibridizacijom u uslovima koji su ekvivalentni 50% formamidu, 53 Denhartovom rastvoru, 53SSPE, 0.2% SDS-u na 42°C, nakon čega sledi ispiranje u 0.13SSPE i 0.1% SDS-u na 65°C. Drugi visoko strogi uslov je hibridizacija u uslovima koji su ekvivalentni hibridizaciji u 5x SSC-u koji sadrži 0.1% (v:v) SDS-a na 65°C i ispiranje u 0.1x SSC-u koji sadrži 0.1% SDS-a na 65°C. Drugi visoko strogi uslovi hibridizacije, kao i umereno strogi uslovi, opisani su u gore navedenim referencama.

[0118] "Optimizovani kodon" odnosi se na promene u kodonima polinukleotida koji kodiraju protein do onih koji se prvenstveno koriste u određenom organizmu, tako da je kodirani protein efikasnije izražen u tom organizmu. Iako je genetski kod izrođen, pošto je većina aminokiselina predstavljena sa nekoliko kodona, nazvanim "sinonimi" ili "sinonimni" kodoni, dobro je poznato da korišćenje kodona od strane određenih organizama nije slučajno već pristrasno prema određenim kodonskim tripletima. Ova pristrasnost korišćenja kodona može biti veća u odnosu na dati gen, gene uobičajene funkcije ili poreklom od predaka, visoko eksprimirane proteine u odnosu na proteine sa niskim brojem kopija i kodirajućih regiona agregatne regione koji kodiraju protein genoma organizma. U nekim ostvarenjima, polinukleotidi koji kodiraju FAL enzime su kodon optimizovani za optimalnu proizvodnju iz organizma domaćina odabranog za ekspresiju.

[0119] "Kontrolna sekvenca" se ovde odnosi na sve jedinjenja, koje su neophodne ili pogodne za ekspresiju polinukleotida i/ili polipeptida iz ovog pronalaska. Svaka kontrolna sekvenca može biti nativna ili strana sekvenca nukleinske kiseline koja kodira polipeptid. Takve kontrolne sekvence uključuju, ali nisu ograničene na, lidere, poliadenilacione sekvence, propeptidne sekvence, promotorske sekvence, signalne peptidne sekvence, inicijacijske sekvence i transkripcione terminatore. Minimalno, kontrolne sekvence uključuju promotor i transkripcione i translacione stop signale. U nekim ostvarenjima, kontrolne sekvence su snabdevene linkerima/veznicima u svrhu uvođenja specifičnih restrikcionih mesta koje olakšavaju ligaciju kontrolnih sekvenci sa kodirajućim regionom sekvence nukleinske kiseline koja kodira polipeptid.

[0120] "Operativno vezan" je ovde definisan kao konfiguracija u kojoj je kontrolna sekvenca adekvatno postavljena (tj. u funkcionalnom odnosu) na poziciji u odnosu na polinukleotid od interesa, tako da kontrolna sekvenca usmerava ili reguliše ekspresiju polinukleotida koji kodira polipeptid od interesa.

[0121] "Promotorska sekvenca" se odnosi na sekvencu nukleinske kiseline koja je od strane ćelije domaćina prepoznata za ekspresiju polinukleotida od interesa, kao što je kodirajuća sekvenca. Promotorska sekvenca sadrži kontrolne transkripcione sekvence koje posreduju u ekspresiji polinukleotida od interesa. Promotor može biti bilo koja sekvenca nukleinske kiseline koja pokazuje transkripcionu aktivnost u odabranoj ćeliji domaćina uključujući mutirane, skraćene i hibridne promotore, i može se dobiti iz gena koji kodiraju ekstracelularne ili intracelularne polipeptide, bilo homologe ili heterologe prema ćeliji domaćinu.

[0122] "Pogodni reakcioni uslovi" se odnose na one uslove u reakcionom rastvoru za konverziju enzima (npr., opsezi nanošenja enzima, nanošenje supstrata, temperatura, pH, puferi, korastvarači, itd.) pod kojima je FAL polipeptid iz ovog pronalaska sposoban za konvertovanje supstrata u željeni proizvodni spoj. Primeri "pogodnih reakcionih uslova" su ovde opisani (videti, primeri).

[0123] "Nanošenje", kao što je "nanošenje jedinjenja" ili "nanošenje enzima" odnosi se na koncentraciju ili količinu jedinjenja u reakcionoj smeši na početku reakcije. "Supstrat" u kontekstu procesa reakcije enzimatske konverzije odnosi se na jedinjenje ili molekul na koji deluje FAL polipeptid. "Proizvod" u kontekstu postupka enzimske konverzije odnosi se na jedinjenje ili molekul koji je rezultat delovanja polipeptida FAL na supstratu.

[0124] Kako je ovde korišćen, termin "kultivacija" se odnosi na rast populacije mikrobijalnih ćelija pod adekvatnim uslovima, koristeći bilo koji adekvatan medijum (npr., tečnost, gel ili čvrsta supstanca).

[0125] Rekombinantni polipeptidi (npr. FAL enzimske varijante) mogu biti proizvedeni korišćenjem bilo kog adekvatnog postupka poznatog u struci. Na primer, postoji širok spektar različitih tehnika mutageneze, dobro poznatih stručnjacima u ovoj oblasti. Pored toga, kompleti mutageneze su takođe dostupni od mnogih komercijalnih dobavljača za molekularnu biologiju. Dostupni su postupci za pravljenje specifičnih supstituci kod definisanih aminokiselina (usmeren na mesto), specifičnih ili nasumičnih mutacija u lokalizovanom regionu gena (region-specifično), ili nasumične mutageneze celog gena (npr., zasićena mutageneza). Brojni adekvatni postupci su poznati onima koji su u stanju tehnike da generišu enzimske varijante, uključujući ali ne ograničavajući se na mesto specifičnu mutagenezu jednolančane DNK ili dvolančane DNK koristeći PCR, kasetnu mutagenezu, sintezu gena, PCR koji je sklon/pravi greške, mešanje, i mutagenezu hemijskog zasićenja, ili bilo koji drugi pogodan postupak poznat u struci. Neograničavajući primeri metoda korišćenih za DNK i proteinsko inženjerstvo su dati u sledećim patentima: US Pat.6,117,679; US Pat.6,420,175; US Pat.6,376,246; US Pat.

6,586,182; US Pat. 7,747,391; US Pat. 7,747,393; US Pat. 7,783,428; i US Pat.

8,383,346. Nakon što se varijante proizvedu, mogu se pretražiti za bilo koje željeno svojstvo (npr. visoka ili povećana aktivnost, ili niska ili smanjena aktivnost, povećana termička aktivnost, povećana termička stabilnost, i / ili kiselinska pH stabilnost, itd.). U nekim ostvarenjima, "rekombinantni FAL polipeptidi" (koji se takođe ovde nazivaju "modifikovani FAL polipeptidi," "varijante FAL enzima" i "FAL varijante") nalaze upotrebu.

[0126] Kako se ovde koristi, "vektor" je DNK konstrukt za uvođenje DNK sekvence u ćeliju. U nekim realizacijama, vektor je ekspresioni vektor koji je operativno povezan sa poželjnom kontrolnom sekvencom koja je sposobna za ekspresiju, u pogodnom domaćinu, polipeptida kodiranog u DNK sekvenci. U nekim ostvarenjima, "ekspresioni vektor" ima promotorsku sekvencu operativno vezanu za DNK sekvencu (npr., transgen) da pokrene ekspresiju u ćeliji domaćinu, a u nekim realizacijama takođe sadrži sekvencu terminacije transkripcije.

4

[0127] Kako se ovde koristi, izraz "ekspresija" obuhvata bilo koji korak uključen u proizvodnju polipeptida uključujući, ali ne ograničavajući se na, transkripciju, post-transkripcionu modifikaciju, translaciju i post-translaciionu modifikaciju. U nekim ostvarenjima, termin takođe obuhvata sekreciju polipeptida iz ćelije.

[0128] Kako se ovde koristi, izraz "proizvodi" se odnosi na proizvodnju proteina i/ili drugih jedinjenja uz pomoć ćelija. Namera je da termin obuhvata bilo koji korak uključen u proizvodnju polipeptida uključujući, ali ne ograničavajući se na, transkripciju, post-transkripcijsku modifikaciju, translaciju i post-translacijsku modifikaciju. U nekim ostvarenjima, termin takođe obuhvata sekreciju polipeptida iz ćelije.

[0129] Kako se ovde koristi, aminokiselinska ili nukleotidna sekvenca (npr., promotorska sekvenca, signalni peptid, terminatorska sekvenca, itd.) je "heterologa" u odnosu na drugu sekvencu sa kojom je operativno povezana ako dve sekvence nisu povezane u prirodi.

[0130] Kako se ovde koriste, termini "ćelija domaćin" i "soj domaćin" se odnose na pogodne domaćine za ekspresione vektore koji sadrže ovde opisanu DNK (npr., polinukleotidne sekvence koje kodiraju najmanje jednu AvFAL varijantu). U nekim ostvarenjima, ćelije domaćini su prokariotske ili eukariotske ćelije koje su transformisane ili transfektovane vektorima konstruisanim korišćenjem rekombinantnih DNK tehnika kao što je poznato u tehnici.

[0131] Izraz "analog" označava polipeptid koji ima više od 70% identičnosti sekvence ali manje od 100% identičnosti sekvence (npr., više od 75%, 78%, 80%, 83%, 85%, 88%, 90%, 91% 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti sekvence) sa referentnim polipeptidom. U nekim ostvarenjima, analozi uključuju aminokiselinske ostatke koji se ne pojavljuju u prirodi, uključujući, ali ne ograničavajući se na, homoarginin, ornitin i norvalin, kao i aminokiseline koje se javljaju u prirodi. U nekim ostvarenjima, analozi takođe uključuju jedan ili više D-aminokiselinskih ostataka i nepeptidne veze između dva ili više aminokiselinskih ostataka.

[0132] Termin "terapeutski" odnosi se na jedinjenje koje se daje subjektu koji pokazuje znake ili simptome patologije, a koje ima korisne ili poželjne medicinske efekte.

[0133] Termin "farmaceutska kompozicija/sastav" se odnosi na kompoziciju pogodnu za farmaceutsku upotrebu kod sisara (npr., čovek) koja sadrži farmaceutski efikasnu količinu projektovanog FAL polipeptida obuhvaćenog ovim pronalaskom i prihvatljiv nosač.

[0134] Izraz "efektivna količina" označava količinu dovoljnu da proizvede željeni rezultat. Stručnjak iz oblasti može odrediti koja je efektivna količina korišćenjem rutinskog eksperimentisanja.

[0135] Izrazi "izolovani" i "prečišćeni" korišćeni su da se odnose na molekul (npr., izolovana nukleinska kiselina, polipeptid, itd.) ili drugu komponentu koja je uklonjena iz najmanje bar jedne druge komponente sa kojom je prirodno povezana. Termin "prečišćeni" ne zahteva apsolutnu čistoću, već je namenjen kao relativna definicija.

[0136] Termin "subjekat" obuhvata sisare kao što su ljudi, nehumani primati, stoka, kućne ljubimci i laboratorijske životinje (npr. glodari i lagamorfi). Namera je da taj termin obuhvata i ženke i mužjake.

[0137] Kako se ovde koristi, termin "pacijent" označava bilo koji subjekat koji se procenjuje, leči ili doživljava bolest.

[0138] Termin "novorođenče" se odnosi na dete u periodu od prvog meseca nakon rođenja do približno jedne (1) godine starosti. Kako se ovde koristi, termin "novorođenče" se odnosi na dete u periodu od rođenja do 28. dana života. Termin "prevremeno rođeno dete" se odnosi na novorođenče rođeno posle navršene dvadesete nedelje trudnoće, ali pre punog termina, obično od 500 do 2499 grama po rođenju. "Dete sa veoma niskom porođajnom težinom" je novorođenče težine manje od 1500 g na rođenju.

[0139] Kako se ovde koristi, izraz "dete" se odnosi na osobu koja nije dostigla punoletstvo za pristanak na lečenje ili istraživačke procedure. U nekim ostvarenjima, termin se odnosi na osobu između vremena rođenja i adolescencije.

[0140] Kako se ovde koristi, izraz "odrasla osoba/adult" se odnosi na osobu koja je dostigla punoletstvo za relevantnu nadležnost (npr.18 godina u Sjedinjenim Državama). U nekim ostvarenjima, termin se odnosi na bilo koji potpuno porasli, zreli organizam. U nekim ostvarenjima, izraz "mlada odrasla osoba" se odnosi na lice mlađe od 18 godina, koje je dostiglo polnu zrelost.

[0141] Kako se ovde koristi, "kompozicija" i "formulacija" obuhvataju proizvode koji sadrže najmanje jedan modifikovan FAL iz ovog pronalaska, namenjen za bilo koju pogodnu upotrebu (npr. farmaceutske kompozicije, dijetetske/nutritivne dodatke, hranu, itd.).

[0142] Izrazi "administracija" i "administriranje" kompozicije znače davanje kompozicije predmetnog pronalaska subjektu (npr., osobi koja pati od efekata PKU).

[0143] Izraz "nosač" kada se koristi u odnosu na farmaceutsku kompoziciju označava bilo koji standardni farmaceutski nosač, pufere i ekscipijente, kao što su stabilizatori, konzervansi i adjuvansi.

[0144] Izraz "farmaceutski prihvatljiv" označava materijal koji se može dati subjektu bez izazivanja neželjenih bioloških efekata ili interakcije na štetan način sa bilo kojom komponentom u kojoj se nalazi i koja ima željenu biološku aktivnost.

[0145] Kako se ovde koristi, termin "ekscipijent" se odnosi na bilo koji farmaceutski prihvatljivi aditiv, nosač, razblaživač, adjuvant ili drugi sastojak, osim aktivnog farmaceutskog sastojka (API; npr., projektovani FAL polipeptidi ovog pronalaska). Ekscipijenti su tipično uključeni u formulaciju i/ili za administraciju.

[0146] Termin "terapeutski efektivna količina" kada se koristi u odnosu na simptome bolesti/stanja odnosi se na količinu i/ili koncentraciju jedinjenja (npr., modifikovani FAL polipeptidi) koji ublažava, slabi ili eliminiše jedan ili više simptoma bolesti/stanja ili sprečava ili odlaže početak simptoma (npr. PKU). U nekim ostvarenjima, termin se koristi u odnosu na količinu kompozicije koja izaziva biološki (npr. medicinski) odgovor od strane tk iva, sistema ili životinjskog subjekta koji se traži od istraživača, lekara, veterinara ili drugog kliničara.

[0147] Termin "terapeutski efikasna količina" kada se koristi u odnosu na bolest stanje odnosi se na količinu i/ili koncentraciju kompozicije koja ublažava, slabi ili eliminiše bolest/stanje.

[0148] Namera je da termini "lečenje", "tretiranje" i "tretman" obuhvataju preventivno (npr. profilaktičko), kao i FALijativni lečenje.

Modifikovani FAL polipeptidi:

[0149] Roditeljski FAL polipeptidi od kojih su dobijeni modifikovani FAL polieptidi iz ovog otkrića uključuju bakterijske sojeve kao što su Anabaena (e.g., A. variabilis), Nostoc (e.g., N. punctiforme), Rhodosporidium (e.g., R. toruloides), Streptomyces (e.g., S. maritimus or S. verticillatus), Oscillatoria sp., Gloeocapsa sp., i Rivularia sp. FAL enzimi iz ovih sojeva su identifikovani i dobro poznati.

Homologe enzimske sekvence iz from Anabaena (A. variabilis) ATCC 29413 i NCBI YP_324488.1; Nostoc (N. punctiforme) ATCC 29133 i NCBI YP_00186563.1; Oscillatoria sp. PCC 6506 and NCBI ZP_07108482.1 i Gloeocapsa sp. PCC7428 and NCBI YP_007127054.1 obezbeđene sun a slici 1. Nostoc punctiforme fenilalanin/histidin amonijak liaza "NpFHAL" (NCBI YP_001865631.1 (SEQ ID NO:30); Rivularia sp. histidin amonijak-liaza "RspHAL" (NCBI YP_007056096.1 (SEQ ID NO:31); Oscillatoria sp. histidin amonijak-liaza "Osp HAL" (NCBI YP_07108482.1 (SEQ ID NO:32); i Gloeocapsa sp. histidin amonijak-liaza "GspHAL" (NCBI YP_007127054.1) (SEQ ID NO:33) imaju više od 70% homologije sa AvFAL (SEQ ID NO:4).

[0150] Dalje, kada se određena FAL varijanta (na pr. modifikovani FAL polipeptid) veže za referencu vezanu za modifikaciju određenog aminokiselinskog ostataka u sekvenci divljeg tipa FAL ili referentnog FAL, treba razumeti da su varijante drugog modifikovanog FAL na ekvivalentnoj poziciji (što je determinisano na osnovu opcionalnog poravnanja aminokiselinske sekvence između odgovarajućih aminokiselinskih sekvenci) takođe ovde obuhvaćene. U nekim ostvarenjima, modifikovani FAL polipeptid je dobijen od bilo kog polipeptida iz gore navedenih bakterijskih sojeva (na pr., Nostoc [N. punctiforme], Rhodosporidium [R. toruloides], Streptomyces [S. maritimus or S. verticillatus], Oscillatoria sp. Gloeocapsa sp i Rivularia sp.). U nekim ododatnim ostvarenjima, modifikovan FAL polipeptid iz pronalaska obuhvata konzervirano aktivno mesto Ala167-Ser168-Gly169 i ima najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identičnu sekvencu sa SEQ ID NO:4. U nekim ostvarenjima modifikovani FAL polipeptidi obuhavatju ne samo FAL aktivnost već i aktivnost na tirozinske i/ili histidinske supstrate.

[0151] U nekim ostvarenjima, modifikovani FAL polipeptidi su proizvedeni gajenjem mikroorganizma koji sadrža najmanje jednu polinukleotidnu sekvencu koja kodira najmanje jedan modifikovan FAL polipeptid u uslovima koji su sprovodivi za proizvodnju modifikovanog FAL polipeptida. U nekim ostvarenjima, modifikovani FAL polipeptid je naknadno dobijen iz medijuma za gajenje i/ili ćelija.

[0152] Otkriveni su primeri modifikovanih FAL polipeptida koji imaju FAL aktivnost. Promeri obezbeđuju tebale koje prikazuju strukturne informacije o sekvenci gde se koreliraju specifične osobine aminokiselinskih sekvenci sa funkcionalnim aktivnostima modifikovanih FAL polipeptida. Ova strukturno-funkcionalna korelacija je obezbeđena u formi razlika specifičnih aminokiselinskih ostataka u odnosu na referentni modifikovani polipeptid SEQ ID NO:4, kao i propratnih eksperimentalno određenih podataka za primere modifikovnih FAL polipeptida.

[0153] U nekim ostvarenjima, modifikovani polipeptidi iz pronlaska koji imaju FAL aktivnost obuhvataju a) aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 85%, identična sa referentnom sekvencom SEQ ID NO:4 b) razliku u aminokiselinskom ostatku kada se uporedi sa SEQ ID NO:4 na jednoj ili više aminokiselinskih pozicija; i c) koja pokazuje poboljšano svojstvo koje je odabrano od i) pojačane katalitičke aktivnost, ii) redukovane osetljivosti na proteolizu, iii) povećane tolerancije na kiselu pH, iv) redukovane agregacije ili bilo koje kokmbinacije od bilo kojih od i), ii), iii) iili iv) kada se uporedi sa referentnom sekvencom.

[0154] U nekim ostvarenjima, modifikovani polipeptidi koji pokazuju najmanje jedno poboljšano svojstvo imaju najmanje 85%, najmanje 88%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili više identičnu aminokiselinsku sekvencu sa SEQ ID NO:4, i razliku u aminokiselinskom ostatku kada se uporedi sa SEQ ID NO:4, na jednoj ili više aminokiselinskih pozicija (kao na 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 20 ili više aminokiselinskih poziciija u poređenju sa SEQ ID NO:4 ili sekvencom koja ima najmanje 85%, najmanje 88%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili više identičnu aminokiselinsku sekvencu sa SEQ ID NO:4). U nekim ostvarenjima, razlike u reziduima kada se porede sa SEQ ID NO:4, na jednoj ili više pozicija uključuju najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više konzerviranih aminokiselinski supstitucija. U nekim ostvarenjima, modifikovani FAL polipeptid je polipeptid naveden u tabeli koja je obezbeđena u PRIMERIMA.

[0155] U nekim ostvarenjima, modifikovani polipeptidi koji pokazuju najmanje jedno poboljšano svojstvo imaju najmanje 85%, najmanje 88%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili više identičnu aminokiselinsku sekvencu sa SEQ ID NO:4 i razliku u aminokiselinskom ostatku kada se uporedi sa SEQ ID NO:4 na jednoj ili više aminokiselinskih pozicija izabranih od X39; X54; X59; X73; X91; X158; X112, X134, X180; X195; X240; X243; X245; X256; X257; X270; X290; X304, X305; X307; X308; X326; X349; X353; X364; X394; X399; X400; X404; X407; X443; X453; X459; X460; X463; X474; X509; X521; X522; X524; X528; X546; X564; ili bilo koje njihove kombinacije, kada se optimalno poravna sa aminokiselinskom skevencom SEQ ID NO:4. U nekim ostvarenjima aminokiselinska razlika je na1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, ili 20 ili više aminokiselinksih pozicija.

[0156] U nekim ostvarenjima, modifikovani polipeptidi koji pokazuju najmanje jedno poboljšano svojstvo imaju najmanje 85% (najmanje 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) identičnu aminokiselinsku sekvencu sa SEQ ID NO:4 i imaju razliku u aminokiselinskom ostatku na poziciji H307 i opcionalno razliku u aminokiselinskom ostatku na pozicijama, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više. U nekim ostvarenjima razlika u aminokiselinskom ostatku na poziciji 307 je H307/G/Q/M.

[0157] U nekim ostvarenjima, modifikovani polipeptidi koji pokazuju najmanje jedno poboljšano svojstvo imaju najmanje 85% (najmanje88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) identičnu aminokiselinsku sekvencu sa SEQ ID NO:4 i imaju najmanje jednu razliku u aminokiselinskom ostatku odbranu od kombinacije jedne ili više A39; T54; G59, S73; A91; Y158; S180; K195; A112; R134; Q240; T243; 1245; A256; L257; N270; N290; Y304; R305; H307; E308; 1326; L349; D353; L364; A394; S399; N400; P404; L407; F443; N453; Y459; T460; T463; N474; E509; Q521; K522; T524; P528; S546; i/ili P564. U nekim ostvarenjima postoje razlike u aminokiselinskim ostacima na 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više aminokiselinskih pozicija.

[0158] U nekim ostvarenjima, modifikovani polipeptidi koji pokazuju najmanje jedno poboljšano svojstvo imaju najmanje 85% (najmanje 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) identičnu aminokiselinsku sekvencu sa SEQ ID NO:4 i imaju razliku u aminokiselinskom ostatku odbranu od kombinacije jedne ili više od A39V; T54K; G59R; S73K; A112C; R134Q; A91V; Y158H; S180A; K195E; Q240R/W; T243I/L; I245L; A256G; L257W/A; N270K; N290G; Y304H; R305M; H307G/Q/M; E308Q; I326F; L349M; D353A/N; L364Q; A394V; S399N; N400K; P404A; L407V; F443H; N453G; Y459F; T460G; T463N; N474Q; E509L; Q521K/S; K522Y/F/N; T524S;P528L; S546R; i P564 G/L/M, kada se optimalno poravnaju sa SEQ ID NO:4.

[0159] U nekim ostvarenjima, razlika u aminokiselinskom ostatku je odabrana od kombinacije jedne ili više od A39V; A91V; A256G; N290G; A394V; S399N; P404A; L407V; K522Y/F/N; i/ili T524S, kada se optimalno poravnaju sa SEQ ID NO:4

[0160] U nekim ostvarenjima otkriveni su funkcionalni fragmenti modifikovanih FAL peptida. U nekim ostvarenjima, funkcionalni fragmenti obuhvataju najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, ili najmanje oko 99% aktivnosti modifikovanog FAL polipeptida od koga su dobijeni (na pr. parentalni tj roditeljski modifikovani FAL). U nekim ostvarenjima, funkcionalni fragmenti obuhvataju najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, ili najmanje oko 99% roditeljske sekvence modifikovanog FAL. U nekim ostvarenjima funkcionalni fragment će biti skraćen za manje od 5, manje od 10, manje od 15, manje od 10, manje od 25, manje od 30, manje od 35, manje od 40, manje od 45, i manje od 50 aminokiselina

[0161] U nekim ostvarenjima otkriveni su funkcionalni fragmenti modifikovanih FAL peptida. U nekim ostvarenjima, funkcionalni fragmenti obuhvataju najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% aktivnosti modifikovanog FAL polipeptida od koga su dobijeni (na pr. parentalni tj roditeljski modifikovani FAL). U nekim ostvarenjima, funkcionalni fragmenti obuhvataju najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% roditeljske sekvence modifikovanog FAL. U nekim ostvarenjima funkcionalni fragment će biti skraćen za manje od 5, manje od 10, manje od 15, manje od 10, manje od 25, manje od 30, manje od 35, manje od 40, manje od 45, manje od 50, manje od 55, manje od 60, manje od 65, ili manje od 70 aminokiselina

[0162] U nekim ostvarenjima modifikovni FAL polipetidi koji pokazuju najmanje jedno poboljšano svojstvo imaju najmanje 85%, najmanje 88%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili više više identičnu aminokiselinsku sekvencu sa SEQ ID NO:6 i razliku u aminokiselinskom ostatku kada se uporedi sa SEQ ID NO:6 na jednoj ili više aminokiselinksih pozicija (kao na 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 ili više aminokiselinksih pozicija) u poređenju sa SEQ ID NO:6, ili sekvencu koja ima najmanje 85%, najmanje 88%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili više identičnu aminokiselinsku sekvencu sa SEQ ID NO:6. U nekim ostvarenjima, modfikovani FAL obuhvata najmanje 90% identičnu sekvencu sa SEQ ID NO:6 i ima razliku u aminokiselinskom ostatku u poređenju sa SEQ ID NO:6 na najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više aminokiselinskih pozicija. U nekim ostvarenjima, modifikovani FAL polipeptid se sastoji od sekvence SEQ ID NO:6.

[0163] U nekim ostvarenjima modifikovni FAL polipetidi koji pokazuju najmanje jedno poboljšano svojstvo imaju najmanje 85%, najmanje 88%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili više identičnu aminokiselinsku sekvencu sa SEQ ID NO: 10, ili njenim funkcionalnim fragmentom i razliku u aminokiselinskom ostatku kada se uporedi sa SEQ ID NO: 10, na jednoj ili više aminokiselinksih pozicija (kao na 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 ili više aminokiselinksih pozicija) kada se uporedi sa SEQ ID NO: 10, ili sekvencu koja ima najmanje 85%, najmanje 88%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili više identičnu aminokiselinsku sekvencu sa SEQ ID NO: 10. U nekim ostvarenjima, modfikovani FAL obuhvata najmanje 95% identičnu sekvencu sa SEQ ID NO: 10, i ima razliku u aminokiselinskom ostatku u poređenju sa SEQ ID NO:10, na najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više aminokiselinskih pozicija. U nekim ostvarenjima, modifikovani FAL polipeptid se sastoji od sekvence SEQ ID NO:10.

[0164] U nekim ostvarenjima modifikovni FAL polipetidi koji pokazuju najmanje jedno poboljšano svojstvo imaju najmanje 85%, najmanje 88%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili više identičnu aminokiselinsku sekvencu sa SEQ ID NO12: ili njenim funkcionalnim fragmentom i razliku u aminokiselinskom ostatku kada se uporedi sa SEQ ID NO:12 na jednoj ili više aminokiselinksih pozicija (kao na 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 ili više aminokiselinksih pozicija) kada se uporedi sa SEQ ID NO: 12, ili sekvencu koja ima najmanje 85%, najmanje 88%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili više identičnu aminokiselinsku sekvencu sa SEQ ID NO: 12. U nekim ostvarenjima, modfikovani FAL obuhvata najmanje 95% identičnu sekvencu sa SEQ ID NO: 12, i ima razliku u aminokiselinskom ostatku u poređenju sa SEQ ID NO:12, na najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više aminokiselinskih pozicija. U nekim ostvarenjima, modifikovani FAL polipeptid se sastoji od sekvence SEQ ID NO: 12.

[0165] U nekim ostvarenjima modifikovni FAL polipetidi koji pokazuju najmanje jedno poboljšano svojstvo imaju najmanje 85%, najmanje 88%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili više identičnu aminokiselinsku sekvencu sa SEQ ID NO: 14 ili njenim funkcionalnim fragmentom i razliku u aminokiselinskom ostatku kada se uporedi sa SEQ ID NO:14 na jednoj ili više aminokiselinksih pozicija (kao na 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 ili više aminokiselinksih pozicija) kada se uporedi sa SEQ ID NO: 14, ili sekvencu koja ima najmanje 85%, najmanje 88%, najmanje 90 %, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95 %, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili više identičnu aminokiselinsku sekvencu sa SEQ ID NO:14. U nekim ostvarenjima, modfikovani FAL obuhvata najmanje 95% identičnu sekvencu sa SEQ ID NO:

4

14, i ima razliku u aminokiselinskom ostatku u poređenju sa SEQ ID NO:14, na najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više aminokiselinskih pozicija. U nekim ostvarenjima, modifikovani FAL polipeptid se sastoji od sekvence SEQ ID NO: 14.

[0166] U nekim ostvarenjima modifikovni FAL polipetidi koji pokazuju najmanje jedno poboljšano svojstvo imaju najmanje 85%, najmanje 88%, najmanje 90%, najmanje91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili više identičnu aminokiselinsku sekvencu sa SEQ ID NO:16 ili njenim funkcionalnim fragmentom i razliku u aminokiselinskom ostatku kada se uporedi sa SEQ ID NO:16 na jednoj ili više aminokiselinksih pozicija (kao na 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 ili više aminokiselinksih pozicija) kada se uporedi sa SEQ ID NO:16, ili sekvencu koja ima najmanje 85%, najmanje 88%, najmanje 90 %, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95 %, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili više identičnu aminokiselinsku sekvencu sa SEQ ID NO:16. U nekim ostvarenjima, modfikovani FAL obuhvata najmanje 95% identičnu sekvencu sa SEQ ID NO:16, i ima razliku u aminokiselinskom ostatku u poređenju sa SEQ ID NO:16, na najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više aminokiselinskih pozicija. U nekim ostvarenjima, modifikovani FAL polipeptid se sastoji od sekvence SEQ ID NO: 16.

[0167] U nekim ostvarenjima modifikovni FAL polipetidi koji pokazuju najmanje jedno poboljšano svojstvo imaju najmanje 85%, najmanje 88%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili više identičnu aminokiselinsku sekvencu sa SEQ ID NO:18 ili njenim funkcionalnim fragmentom i razliku u aminokiselinskom ostatku kada se uporedi sa SEQ ID NO:18 na jednoj ili više aminokiselinksih pozicija (kao na 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 ili više aminokiselinksih pozicija) kada se uporedi sa SEQ ID NO:18, ili sekvencu koja ima najmanje 85%, najmanje 88%, najmanje 90 %, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95 %, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili više identičnu aminokiselinsku sekvencu sa SEQ ID NO:18. U nekim ostvarenjima, modfikovani FAL obuhvata najmanje 95% identičnu sekvencu sa SEQ ID NO:18, i ima razliku u aminokiselinskom ostatku u poređenju sa SEQ ID NO:18, na najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više aminokiselinskih pozicija. U nekim ostvarenjima, modifikovani FAL polipeptid se sastoji od sekvence SEQ ID NO:18.

[0168] U nekim ostvarenjima modifikovni FAL polipetidi koji pokazuju najmanje jedno poboljšano svojstvo imaju najmanje 85%, najmanje 88%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili više identičnu aminokiselinsku sekvencu sa SEQ ID NO:16 ili njenim funkcionalnim fragmentom i razliku u aminokiselinskom ostatku kada se uporedi sa SEQ ID NO:14 na jednoj ili više aminokiselinksih pozicija (kao na 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 ili više aminokiselinksih pozicija) kada se uporedi sa SEQ ID NO:20, ili sekvencu koja ima najmanje 85%, najmanje 88%, najmanje90 %, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95 %, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili više identičnu aminokiselinsku sekvencu sa SEQ ID NO:20. U nekim ostvarenjima, modfikovani FAL obuhvata najmanje 95% identičnu sekvencu sa SEQ ID NO:20, i ima razliku u aminokiselinskom ostatku u poređenju sa SEQ ID NO:20, na najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više aminokiselinskih pozicija. U nekim ostvarenjima, modifikovani FAL polipeptid se sastoji od sekvence SEQ ID NO: 20.

[0169] U nekim ostvarenjima modifikovni FAL polipetidi koji pokazuju najmanje jedno poboljšano svojstvo imaju najmanje 85%, najmanje 88%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili više identičnu aminokiselinsku sekvencu sa SEQ ID NO:16 ili njenim funkcionalnim fragmentom i razliku u aminokiselinskom ostatku kada se uporedi sa SEQ ID NO:22 na jednoj ili više aminokiselinksih pozicija (kao na 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 ili više aminokiselinksih pozicija) kada se uporedi sa SEQ ID NO:22, ili sekvencu koja ima najmanje 85%, najmanje 88%, najmanje 90 %, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95 %, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili više identičnu aminokiselinsku sekvencu sa SEQ ID NO:22. U nekim ostvarenjima, modfikovani FAL obuhvata najmanje 95% identičnu sekvencu sa SEQ ID NO:22, i ima razliku u aminokiselinskom ostatku u poređenju sa SEQ ID NO:22, na najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više aminokiselinskih pozicija. U nekim ostvarenjima, modifikovani FAL polipeptid se sastoji od sekvence SEQ ID NO: 22.

[0170] U nekim ostvarenjima modifikovni FAL polipetidi koji pokazuju najmanje jedno poboljšano svojstvo imaju najmanje 85%, najmanje 88%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili više identičnu aminokiselinsku sekvencu sa SEQ ID NO:16 ili njenim funkcionalnim fragmentom i razliku u aminokiselinskom ostatku kada se uporedi sa SEQ ID NO:24 na jednoj ili više aminokiselinksih pozicija (kao na 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 ili više aminokiselinksih pozicija) kada se uporedi sa SEQ ID NO:24, ili sekvencu koja ima najmanje 85%, najmanje 88%, najmanje 90 %, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95 %, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili više identičnu aminokiselinsku sekvencu sa SEQ ID NO:24. U nekim ostvarenjima, modfikovani FAL obuhvata najmanje 95% identičnu sekvencu sa SEQ ID NO:24, i ima razliku u aminokiselinskom ostatku u poređenju sa SEQ ID NO:24, na najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više aminokiselinskih pozicija. U nekim ostvarenjima, modifikovani FAL polipeptid se sastoji od sekvence SEQ ID NO: 24.

Varijante sa redukovanom senzitivnošću na proteolizu:

[0171] U nekim ostvarenjima modifikovni FAL polipetidi iz otkrića pokazuju redukovanu senzitivnost na proteolizu i obuhvataju: a) aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 85% ili više identičnu aminokiselinsku sekvencu sa referentnom sekvencom SEQ ID NO:4; i b) razliku u aminokiselinskom ostatku kada se uporedi sa SEQ ID NO:4 na jednoj ili više aminokiselinksih pozicija.

[0172] U nekim ostvarenjima modifikovni FAL polipetidi koji pokazuju redukovanu senzitivnost na proteolizu imaju najmanje 85%, najmanje 88%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili više identičnu aminokiselinsku sekvencu sa SEQ ID NO:4 i razliku u aminokiselinskom ostatku kada se uporedi sa SEQ ID NO:4 na jednoj ili više aminokiselinksih pozicija (kao na 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 20 ili više aminokiselinksih pozicija u odnosu na SEQ ID NO:4 ili sekvencu koja najmanje 85%, najmanje 88%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili više identičnu aminokiselinsku sekvencu sa SEQ ID NO:4).

[0173] U nekim ostvarenjima modifikovni FAL polipetidi koji pokazuju redukovanu senzitivnost na proteolizu imaju najmanje 85%, najmanje 88%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili više identičnu aminokiselinsku sekvencu sa SEQ ID NO:4 i razliku u aminokiselinskom ostatku kada se uporedi sa SEQ ID NO:4, na jednoj ili više aminokiselinksih pozicija odabranih od X39; X54; X59; X73; X91; X158; X112, X134, X180; X195; X240; X243; X245; X256; X257; X270; X290; X304, X305; X307; X308; X326; X349; X353; X364; X394; X399; X400; X404; X407; X443; X453; X459; X460; X463; X474; X509; X521; X522; X524; X528; X546; X564; ili bilo koje njihove kombinacije kada se optimalno poravnaju sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 4. U nekim ostvarenjima razlika u aminokiselinskom ostatku je na 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, ili 20 ili više aminokiselinski pozicija.

[0174] U nekim ostvarenjima modifikovni FAL polipetidi koji pokazuju redukovanu senzitivnost na proteolizu imaju najmanje 85%, najmanje 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili više identičnu aminokiselinsku sekvencu sa SEQ ID NO:4 i obuhvata razliku u aminokiselinskom ostatku na poziciji X307; X326; X460; X307; i/ili X528 i opcionalno razliku u aminokiselinskom ostatku na 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više aminokiselinksih pozicija. U nekim ostvarenjima razlika u aminokiselinskom ostatku je odabrana od Y304H/W; R305L/M; H307G/M/Q; I326F; Q240W; T460G; P528L; i bilo koje od kombincija subtitucija kada se poravnaju sa SEQ ID NO:4.

[0175] U nekim ostvarenjima modifikovni FAL polipetidi koji pokazuju redukovanu senzitivnost na proteolizu imaju najmanje 85%, najmanje 88%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili više identičnu aminokiselinsku sekvencu sa bilo kojom od SEQ ID NOS: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, i/ili 24, ili nihovim funkcionalnim fragmentom i razliku u aminokiselinskom ostatku kada se uporedi sa SEQ ID NOS: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, i/ili 24, na jednoj ili više aminokiselinksih pozicija (kao na 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 ili više aminokiselinksih pozicija) kada se uporedi sa SEQ ID NOS:10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, i/ili 24, ili sekvencu koja ima najmanje 85%, najmanje 88%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili više identičnu aminokiselinsku sekvencu sa SEQ ID NOS: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, i/ili 24. U nekim ostvarenjima, modifikovni FAL obuhvata najmanje 95% identičnu sekvencu sa SEQ ID NOS:10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, i/ili 24, i obuhvata razliku u aminokiselinskom ostatku u odnosu na SEQ ID NOS: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, i/ili 24, na najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više aminokiselinksih pozicija. U nekim ostvarenjima, FAL obuhvataili se sastoji osekvence od SEQ ID NO:10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, i/ili 24.

[0176] U nekim ostvarenjima proteolitička senzitivnost modifikovanih FAL polipeptid je redukovana najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje30%, najmanje40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, or najmanje 95%, u odnosu na divlji tip FAL (na pr., AvFAL koji ima SEQ ID NO:4) ili kada se uporedi sa referentnim FAL polipeptidom pod suštinski istim uslovima. Proteolitička aktivnost se može meriti upotrebom bilo koje pogodne metode u nauci, uključujući ali bez ograničenja na one opisane u primerima.

[0177] U nekim ostvarenjima, modifikovni FAL polipetidi koji pokazuju redukovanu senzitivnost na proteolizu imaju redukovanu senzitivnost na kompozicije koje sadrže jednu ili više proteaza,

4

uključujući ali bez ograničenja na tripsin, himotirpsin, karboksipeptidazu A i B, peptidaze (na pr., amino peptidaze, dipeptidaze i neteropeptidaze) kada se obe referentna FAL i modifikovana FAL koje imaju redukovanu senzitivnost uporede i izlože suštinski istoj količini i vrsti proteaze u suštinski istim uslovima.

[0178] U nekim ostvarenjima modifikovni FAL polipetidi koji pokazuju redukovanu senzitivnost na proteolizu imaju nivoe enzimske aktivnosti oko

1.0 puta, 2-f puta, 5- puta, 10- puta, 20-puta, 25- puta, 50- puta, 75- puta, 100- puta, 150- puta, 200- puta ili više enzimske aktivnosti u odnosu na referentni FAL (na pr., AvFAL). U nekim ostvarenjima modifikovni FAL polipetidi imaju veću enzimsku aktivnost kada se uporede sa referentnim FAL, kada se aktivnost meri na u opsegu pH 4.5 do 7.5; kada se aktivnost meri na u opsegu pH 4.5 do 6.5; kada se aktivnost meri na u opsegu pH f 5.0 do 7.5; kada se aktivnost meri na u opsegu pH 5.0 do 6.5; kada se aktivnost meri na u opsegu pH 5.5 do 7.5; i/ili takođe kada se aktivnost meri na u opsegu pH 5.5 do 6.5. U nekim drugim ostvarenjima, modifikovani FAL polipeptidi imaju vrednosti Kmu opsegu od 1 μM do 5mM.

Varijante sa povećanom tolerancijom na kiselu pH:

[0179] U nekim ostvarenjima modifikovni FAL polipetidi iz otkrića koji imaju FAL aktivnost, su tolerantne na nivoe kisele pH i sadrže a) aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 85% identičnu sekvencu sa referentnom sekvencom SEQ ID NO:4, ili njenim fragmentom; b) razliku u aminokiselinskom ostatku kada se uporedi sa SEQ ID NO:4, najednoj ili više aminokiselinksih pozicija.

[0180] U nekim ostvarenjima modifikovni FAL polipetidi koji pokazuju povećanu toleranciju na kiselu pH kada se uporede sa AvFAL i/ili sa drugim referentnim polipeptidom imaju najmanje 85%, najmanje 88%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili više identičnu aminokiselinsku sekvencu sa SEQ ID NO: 4, i razliku u aminokiselinskom ostatku kada se uporedi sa SEQ ID NO:4, 1, na jednoj ili više aminokiselinskih pozicija (kao na 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15,20 ili više aminokiselinksih pozicijakada se uporedi sa SEQ ID NO:4 ili sekvencu koja ima najmanje 85%, najmanje 88%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili više identičnu aminokiselinsku sekvencu sa SEQ ID NO:4.

[0181] U nekim ostvarenjima modifikovni FAL polipetidi koji pokazuju povećanu toleranciju na kiselu pH kada se uporede sa AvFAL i/ili sa drugim referentnim polipeptidom imaju najmanje 85%, najmanje 88%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili više identičnu aminokiselinsku sekvencu sa SEQ ID NO: 4 i razliku u aminokiselinskom ostatku kada se uporedi sa SEQ ID NO:4, na jednoj ili više aminokiselinksih pozicija koje su odabrane od X39; X54; X59; X73; X91; X158; X112, X134, X180; X195; X240; X243; X245; X256; X257; X270; X290; X304, X305; X307; X308; X326; X349; X353; X364; X394; X399; X400; X404; X407; X443; X453; X459; X460; X463; X474; X509; X521; X522; X524; X528; X546; X564; ili bilo koje njihove kombinacije kada se optimalno poravnaju sa sekvencom SEQ ID NO:4. U nekim ostvarenjima razlika u amonokiselinskom ostatku na je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, ili 20 ili više aminokiselinskih pozicija.

[0182] U nekim ostvarenjima modifikovni FAL polipetidi koji pokazuju povećanu toleranciju na kiselu pH kada se uporede sa AvFAL i/ili sa drugim referentnim polipeptidom imaju najmanje 85%, najmanje 88%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili više identičnu aminokiselinsku sekvencu sa SEQ ID NO: 4 i razliku u aminokiselinskom ostatku kada se uporedi sa SEQ ID NO:4, na jednoj ili više aminokiselinksih pozicija koje su odabrane od X39; X54; X59; X73; X91; X158; X112, X134, X180; X195; X240; X243; X245; X256; X257; X270; X290; X304, X305; X307; X308; X326; X349; X353; X364; X394; X399; X400; X404; X407; X443; X453; X459; X460; X463; X474; X509; X521; X522; X524; X528; X546; X564; ili bilo koje njihove kombinacije; i opcionalno razlika u amonokiselinskom ostatku na je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, ili 20 ili više aminokiselinskih pozicija.U nekim ostvarenjima razlika u amonokiselinskom ostatku je A39; T54; G59, S73; A91; Y158; S180; K195; A112; R134; Q240; T243; 1245; A256; L257; N270; N290; Y304; R305; H307; E308; 1326; L349; D353; L364; A394; S399; N400; P404; L407; F443; N453; Y459; T460; T463; N474; E509; Q521; K522; T524; P528; S546; i/ili P564, kada se poravna sa SEQ ID NO:4. U nekim ostvarenjima, modifikovni FAL polipetidi koji pokazuju povećanu toleranciju na kiselu pH imaju najmanje 85%, najmanje 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identičnu sekvencu sa SEQ ID NO:4, i sadrži razliku u amonokiselinskom ostatku na jednoj ili više pozicija A39V; T54K; G59R; S73K; A112C; R134Q; A91V; Y158H; S180A; K195E; Q240R/W; T243I/L; I245L; A256G; L257W/A; N270K; N290G; Y304H; R305M; H307G/Q/M; E308Q; I326F; L349M; D353A/N; L364Q; A394V; S399N; N400K; P404A; L407V; F443H; N453G; Y459F; T460G; T463N; N474Q; E509L; Q521K/S; K522Y/F/N; T524S;P528L; S546R; i/ili P564 G/L/M; kada se poravna sa SEQ ID NO:4

[0183] U nekim ostvarenjima kada su uslovi drugih eseja u suštini isti, modifikovani FAL polipetidi koji pokazuju povećanu toleranciju na kiselu pH kada kada se uporede sa referentnim FAL polipeptidima imaju povećanu toleranciju na kiselu pH u opsegu između 1.5 to 6.5; između 1.5 i 5.0; između 2.0 to 5.5; između 3.0 and 6.8; između 3.0 i 5.5; između 4.0 i 6.5; između 4.0 i 4.5; između 4.5 i između 5.0; između 4.5 i 5.5, između 4.5 i 6.0; između 4.5 i 6.5; između 5.0 i 6.5; između 5.0 i 6.0; između 5.0 i 5.5; između 5.5 i 6.0; između 6.0 i 6.5; i/ili između 6.5 i 7.0. U nekim ostvarenjima, povećana tolerancija na kiselu pH se pokazuje na pH od oko 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0 i/ili 6.5.

[0184] U nekim ostvarenjima modifikovani FAL polipetidi koji pokazuju povećanu toleranciju na kiselu pH takođe pokazuju vežu FAL aktivnost kada se uporede sa referentnim FAL kada se meri standardnim esejom. Bilo koji pogodan esej može da se primeni u otkriću, uključujući ali bez ograničenja one koji su ovde opisani.

[0185] Dalje je predviđeno je da bilo koji od modifikovanih polipeptida koji su dati kao primer (na pr. Varijanta Br. 1 - Varijanta Br. 1010) može da se koristi kao početna aminokiselinska sekvenca za sintetisanje modifikovanih FAL polipeptida, na primer putem ponavljajućih ciklusa evolucije tako što se dodaju nove promenjene kombinacije različitih aminokiselina od polipeptida i drugih pozicija ostataka koje su ovde prikazane. U nekim ostvarenjima, dodatna poboljšanja su generisana uključivanjem aminokiselinskih razlika na pozicijama ostataka koje su zadržane kao nepromenjene kroz prethodne ture evolucije. Nije namera da otkrivanje bude limitirano na bilo koju metodu za proizvodnju modifikovanih FAL polipeptida, i bilo koja određena metoda može da se koristi, uključujući ali bez ograničenja i metode koje su ovde otkrivene.

Polinukleotidi koji kodiraju modifikovane polipeptide. Ekspresioni vektori i domaćinske

4

ćelije:

[0186] Otkriveni su polinukleotidi koji kodiraju modifikovane FAL polipeptide koji su ovde opisani. U nekim ostvarenjima polinukleotidi su operativno vezani za jednu ili više heterolognih regulatornih sekvenci koje kontrolišu gensku ekspresiju kako bi se napravio rekombinantni polinukleotid koji je u stanju da eksprimira polipeptid. U nekim ostvarenjima ekspresioni konstrukti koji sadrže najmanje jedan heterologni polinukleotid koji kodira modifiovani(e) polipeptid(e) je ubačen u odgovarajuću domaćinsku ćeliju kako bi se eksprimirao odgovarajući FAL polipeptid(i).

[0187] Ono što će biti očigledno stručnjaku iz oblasti, jeste da dostupnost proteinske sekvence i znajnja o kodonima koji odgovaraju različitim aminokiselinama obezbeđuju opis svih polinukleotida koji su sposobni da kodiraju polipeptide koji su ovde tema. Degeneracija genetskog koda, gde su iste aminokiseline kodirane od strane alternativnih ili sinonmnih kododna, omogućava da se proizvodi ekstremno veliki broj nukleinskih kiselina, i to sve koje kodiraju modifikovani FAL polipeptid. Zato su otkrivene metode i kompozicije za proizvodnju svake pojedinačne i svake moguće varijacije FAL polinukleotida koja može da se napravi i koja kodira FAL polipeptid koji su ovde opisani putem selekcije kombinacija koja se bazira na odabiru mogućih kodona, i sve te varijante treba uzeti u obzir da su specifično otkrivene za bilo koji od polipeptida koji su ovde opisani, uključujući aminokiselinske sekvence koje su predstavljene u Primerima (na pr, videti u različitim tabelama).

[0188] U nekim ostvarenjima, kodoni su preferencijalno optimizovani za upotrebu u odabranoj domaćinskoj ćeliji za potrebe proizvodnje proteina. NA primer, poženji preferencijalni kodoni koji se koriste u bakteriji su tipično korišćeni za ekspresiju u bakterijama. Kao posledica toga, kodon optimizovani polinukleotidi koji kodiraju modifikovane FAL polipeptid sadrže preferenciljalne kodone na oko 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ili više od 90% kodonskih pozicija u okviru kompletnog kodirajućeg regiona.

[0189] U nekim ostvarenjima, FAL polinukleotid kodira modifikovan polipeptid koji ima FAL aktivnost sa osobinama koje su ovde opisane, naznačeno time da polipeptid obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična sa referentnom sekvencom odabranom od SEQ ID NOS:3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, i/ili 23, ili aminokiselinsku sekvencu bilo koje varijante (na pr., onih koje su obezbeđene u primerima), i jednu ili više razlika u ostatacima kada se uporedi sa referentnim polinukleotidom od SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 i/ili 23, ili aminokiselinsku sekvencu bilo koje od varijanti koje su otkrivene u primerima (na primer na 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više pozicija aminokiselinskih ostataka). U nekim ostarenjima referentna sekvenca je odabrana od SEQ ID NOS: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, i/ili 23.

[0190] U nekim ostvarenjima, FAL polinukleotid kodira modifikovan polipeptid koji ima FAL aktivnost sa osobinama koje su ovde opisane, naznačeno time da polipeptid obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili više identična sa referentnom sekvencom SEQ ID NO:4 i jednu ili više razlika u ostatacima kada se uporedi sa SEQ ID NO:4 na pozicijama ostatka X39; X54; X59; X73; X91; X158; X112, X134, X180; X195; X240; X243; X245; X256; X257; X270; X290; X304, X305; X307; X308; X326; X349; X353; X364; X394; X399; X400; X404; X407; X443; X453; X459; X460; X463; X474; X509; X521; X522; X524; X528; X546; i/ili

4

X564; kada se optimalno poravna sa SEQ ID NO:4.

[0191] U nekim ostvarenjima, polinukleotid kodira modifikovan FAL polipeptid obuhvata polinukleotidnu sekvencu odabranu od polinukleotidne skevence odabrane od SEQ ID NOS: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, i/ili 23. U nekim ostvarenjima, polinukleotid kodira modifikovan FAL polipeptid ima najmnaje 80%, 85%, 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identične nukleotidne ostatke sa SEQ ID NOS:2, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, i/ili 23.

[0192] U nekim ostvarenjima polinukleotidi su sposobni da hibridizuju u jako ograničenim uslovima sa referentnom polinukleotidnom sekvencom koja je odabrana od SEQ ID NOS:2, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, i/ili 23, ili njihovim komplememtom, ili polinukleotidnom sekvencom kojakodira bilo koju varijantu FAL polipeptida koji su ovde otkriveni. U nekim ostvarenjima, polinukloetid koji je sposoban da hibridizuje pod strogo ograničenim uslovima kodira FAL polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja ima jednu ili više rzidualnih razlika kada se uporedi sa SEQ ID NO:4, na pozicijama ostataka odabranih od X39; X54; X59; X73; X91; X158; X112, X134, X180; X195; X240; X243; X245; X256; X257; X270; X290; X304, X305; X307; X308; X326; X349; X353; X364; X394; X399; X400; X404; X407; X443; X453; X459; X460; X463; X474; X509; X521; X522; X524; X528; X546; i/ili X564.

[0193] U nekim ostvarenjima izolovani polinukleotid koji kodira bilo koji od modifikovanih FAL polipeptida koji su ovde je izmanipulisan na različite načine kako bi se olakšala ekspresija FAL polipeptida. U nekim ostvarenjima polinukoeotidi koji kodiraju FAL polipeptide obuhvataju skepresione vektore gde je prisutna jedna ili više kontrolnih sekvenci kako bi se regulisala ekspresija FAL polinukleotida i/ili polipeptida. Manipulacija izolovanog polipeptida pre njegove insercije (ubacivanja) u vektor može biti poželjna ili neopodna u zavisnosti od ekspresionog vektora koji se koristi. Tehnike za modifikaciju polinukleotida i nukleinskih kiselina koje koriste metode rekombinanatne DNK su dobro poznate u nauci. U nekim ostvarenjima kontrolne sekvence uključuju između ostalih, promotore, lider sekvence, poliadenilovane sekvence, propeptid sekvence, signalne peptidne sekvence i transkripcione terminatore. U nekim ostvarenjima pogodni promotori su odabrani na osnovu odabira domaćinske ćelije. Za bakterijske domaćinske ćelije, pogodni promotori za usmeravanje transkripcije nukleinsko kiselinskih konstrukata iz ovog otkrića uključuju ali bez ograničenja na promotore koji se dobijaju iz E. coli lac operona, Streptomyces coelicolor gena za agarazu (dagA), Bacillus subtilis gena za levano saharozu (sacB), Bacillus licheniformis gena za alfa-amilazu (amyL), Bacillus stearothermophilus gena za maltogenu amilazu (amyM), Bacillus amyloliquefaciens gena za alfa-amilazu (amyQ), Bacillus licheniformis gena za penicinilazu (penP), Bacillus subtilis xylA i xylB gena, i prokariotskog gena za beta-laktamazu (Videti na pr. Villa-Kamaroff et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 75: 3727-3731 [1978]), kao i tac promotor (Videti na pr. DeBoer et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 80: 21-25 [1983]). Primeri promotora za domaćinske ćelije iz filamentoznih gljiva kuključuju, ali nisu limitirani na promotore koji su dobijeni iz gena za Aspergillus oryzae TAKA amilazu, Rhizomucor miehei aspartičnu proteinazu, Aspergillus niger neutranu alfa-amilazu, Aspergillus niger alfa-amilazu stabilnu na kiselinu, Aspergillus niger ili Aspergillus awamori glukoamilazu (glaA), Rhizomucor miehei lipasu, Aspergillus oryzae alkalnu proteazu, Aspergillus oryzae triozo fosfat izomerazu, Aspergillus nidulans acetamidase, i Fusarium oxysporum tripsin-sličnu proteazu (Videti na pr., WO 96/00787), kao i NA2-tpi promotor (hibrid promotora iz gena za Aspergillus niger neutralnu alfa-amilazu i Aspergillus oryzae triozo fosfat izomerazu), i njihove mutirane, skraćene, i hinridne promotore. Primeri promotora iz ćelija kvasaca mogu biti iz gena za Saccharomyces cerevisiae enolazu (ENO-1), Saccharomyces cerevisiae galaktokinazu (GAL1), Saccharomyces cerevisiae

4

alkoholnu dehidrogenazu/gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazu (ADH2/GAP), i Saccharomyces cerevisiae 3-pfosfoglicerat kinazu. Drugi korisni promotori za domaćinske ćelije iz kvasca su poznate u nauci (Videti na pr. Romanos et al., Yeast 8:423-488 [1992]).

[0194] U nekim ostvarenjima kontrolna sekvenca je takođe pogodna terminatorska skevenca transkripcije (to jest sekvenca propoznata od tsrane domaćinske ćelije kako bi se zaustavila transkripcija). U nekim ostvarenjima terminator sekvenca je operativno vezana za 3’ terminus sekvence nukleinske kiseline koja kodira FAL polipeptid. Bilo koji pogodan terminator koji je funkcionalan u domaćinskoj ćeliji koja je odabrana može se koristiti za ovaj pronalazak. Primeri transkripcionih terminatora za domaćinske ćelije poreklom iz filamentoznih gljiva mogu se dobiti iz gena za Aspergillus oryzae TAKA amilazu, Aspergillus niger glukoamilazu, Aspergillus nidulans antranilat sintazu, Aspergillus niger alfa-glukozidazu, i Fusarium oxysporum tripsinsličnu proteazu. Primeri terminatora iz dmaćinskih ćelija poreklom iz kvasca mogu se dobiti iz gena za Saccharomyces cerevisiae enolazu, Saccharomyces cerevisiae cytohrom C (CYC1), i Saccharomyces cerevisiae gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazu. Drugi korisni terminatori za domaćinske ćelije vasca poznate su u nauci (videti na pr. Romanos et al., supra).

[0195] U nekim ostvarenjima, kontrolna sekvenca je takođe pogodna lider sekvenca (na primer, netranslirajući region iRNK koji je važan za translaciju od strane domaćinske sekvence). U nekim ostvarenjima lider sekvenca je operativno vezana za 5’ terminus sekvence nukleinske kiseline koja kodira FAL polipeptid. Bilo koja pogodna lider sekvenca koja je funkcionalna u domaćisnskoj ćeliji od izbora može se koristiti u ovom otkriću. Primeri lidera za domaćisnke ćelije poreklom iz filamentoznih gljiva su dobijene iz gena za Aspergillus oryzae TAKA amilazu, i Aspergillus nidulans triozo fosfat izomerazu. Pogodni lideri za domaćinske ćelije iz kvasca su dobijene iz gena za Saccharomyces cerevisiae enolazu (ENO-1), Saccharomyces cerevisiae 3-fosfoglicerat kinazu, Saccharomyces cerevisiae alfa-faktor, i Saccharomyces cerevisiae alkoholnu dehidrogenazu/gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazu (ADH2/GAP).

[0196] U nekim ostvarenjima kontrolna sekvenca je takođe poliadenilovana sekvenca (na pr. skevenca operativno vezana za 3’ terminus nukleokiselinske sekvence i koja kada se transkriptuje biva prepoznata od strane domaćinske ćelije kao signal da se dodapoliadenozinski ostatak na transkribovanu iRNK). Bilo koja pogodna poliadenalizovana sekvenca koja je funkcionalna u domaćisnkoj ćeliji od izbora se može koristiti u ovom otkriću. Primeri poliadenalizovanih skevenci za domaćinske ćelije poreklom iz filamentozne gljive uključuju ali bez ograničenja na gene za Aspergillus oryzae TAKA amylazu, Aspergillus niger glukoamilazu, Aspergillus nidulans antranilat sintazu, Fusarium oxysporum tripsin-sličnu proteazu, i Aspergillus niger alfa-glukozidazu. Poznate su korisne poliadenalizovan seekvence za domaćinske ćelije kvasca (videti na pr., Guo and Sherman, Mol. Cell. Bio., 15:5983-5990 [1995])

[0197] U nekim ostvarenjima kontrolna sekvenca je takođe signalna sekvenca

(na pr. kodirajući region koji kodira aminkiselinsku skevencu povezanu sa amino terminusom polipeptida i usmerava kodirajući polipeptid ka sekretornom putu domaćina). U nekim ostvarenjima 5’ kraj kodirajuće skevence nukleinsko kiselinske sekvence inherentno sadrži kodirajući region za signalni peptid koji je prirodno vezan za translacioni okvir čitanja sa segmentom kodirajućeg regiona koji kodira sekretovani polipeptid. Alternativno, u nekim ostvarenjima 5’ kraj kodirajuće skevence sadrži kodirajući region za signalni peptid koji je stran

4

kodiraujćoj sekvenci. Bilo koji odgovarajući kodirajući region signalnog peptide koji usmerava eksprimirani polipeptid u sekretorni put u domaćinskoj ćeliji od izbora se može primeniti u ekspresiji modifikovanog(ih) peptide. Efektivni kodirajući regioni za signalni peptid za bakterijske domaćinske ćelije su kodirajući regioni za signalni peptid uklučuju, ali nisu limitirani na njih one koji su dobijeni iz gena za Bacillus NClB 11837 maltogensku amilazu, Bacillus stearothermophilus alfa-amolazu, Bacillus licheniformis subtilizin, Bacillus licheniformis betalaktamazu, Ba- cillus stearothermophilus neutralnu proteazu (nprT, nprS, nprM), i Bacillus subtilis prsA. Dalji signalni peptide su poznati u nauci (videt na pr., Simonen and FALva, Microbiol. Rev., 57:109-137 [1993]). U nekim ostvarenjiima, efektivni kodirajući regioni za signalni peptid za domaćisnke ćelije poreklom iz filamentoznih gljiva uključuju ali nisu limitirani na kodirajuće regione za signalni peptid dobijene iz gena za Aspergillus oryzae TAKA amilazu, Aspergillus niger neutralnu amilazu, Aspergillus niger glukoamilazu, Rhizomucor miehei aspartičnu proteinazu, Humicola insolens celulazu, i Humicola lanuginosa lipazu. Korisni signalni peptide za kvaščeve domaćinske ćelije uključuju ali bez ograničenja one iz gena za Saccharomyces cerevisiae alpha-factor and Saccharomyces cerevisiae invertazu.

[0198] U nekim ostvarenjiima kontrolna sekvenca je takođe propeptid kodirajući region koji kodira aminokiselinsku sekvencu koja je pozicionirana na amino terminus polipeptida. Rezultantni polipeptid se označava kao"proenzim," "propolipeptid," ili "zimogen." Propolipeptid se može konvertovati u zrezli aktivni polipeptid putem kataliptičkog ili autokatalitičkog sečenja polipeptida iz propolipeptida. Propeptid kodirajući region se može dobiti iz bilo kog odgovarajućeg izvora uključujući, ali bez ograničenja na gene za Bacillus subtilis alkaline proteazu (aprE), Bacillus subtilis neutralnu proteazu (nprT), Saccharomyces cerevisiae alfafaktor, Rhizomucor miehei aspartic proteinazu, i Myceli- ophthora thermophila laktazu (Videti na pr., WO 95/33836). Kada su oba i peptid i popeptid regiona prisutni n aminoterminusus polipeptida, propeptidni region je pozicioniran do amino terminusa polipeptida i signalni peptidni region je pozicioniran do amino terminusa propeptidnog regiona.

[0199] U nekim ostvarenjiima koriste se takođe i regulatorne sekvence. Ove sekvence olakšavaju regulaciju ekspresije polipeptida u odnosu na rast domaćinske ćelije. Primeri regulatornih sistema su oni koji dovode do ekspresije gena u smislu paljenja i gašenja gena kao odgovor na hemijske ili fizičke stimulus uključujući iprisustvo regulatornog jedinjenja. U prokariotskim domaćinskim ćelijama pogodne regulatorne sekvence uključuju ali nisu ograničeni na na lac, tac, i trp operatorske sisteme. U domaćinskim ćelijama kvasca pogodni regulatorni sistemi uključuju ali nisu ograničeni na ADH2 sistem ili GAL1 sistem. Kod filamentoznih gljiva pogodne regulatorne sekvence uključuju ali nisu ograničene na TAKA promotor alfa-amilaze, Aspergillus niger promotor glukoamilaze, i Aspergillus oryzae promotor promotor glukoamilaze.

[0200] U drugom aspektu otkriće se odnosi na rekombinacioni ekspresioni vektor koji obuhvata polinukleotid koji kodira modifikovani FAL polipeptid i jedan ili više regulatornih regiona kao što su promotor i terminator, oridžin replikacije, itd. U zavisnosti od tipa domaćina u koji su ubačeni. U nekim ostvarenjima, različite nukleinske kiseline i kontrolne sekvence koje su ovde opisane su spojene zanedno da produkuju rekombinantne ekspresione vektore koji uključuju jedno ili više pogodnih restrikcionih mesta kako bi se omogućila insercija (ubacivanje) ili delecija (izbacivanje) nukleinsko kiselinske sekvence koja kodira FAL polipeptid na tim mestima. Alternativno, u nekim ostvarenjima, nukleinsko kiselinska sekvenca iz otkrića se ekprimira putem insercije nukleinsko kiselinske sekvence ili nukleinsko kiselinskog konstrukta koji obuhvata sekvencu u odgovarajućem vektoru za ekspresiju. U nekim ostvarenjima koji se

4

odnose na korišćenje ekspresionog vektora, kodirajuća sekvenca je locirana u vektoru tako da je kodirana sekvenca operativno vezana za odgovarajuću kontrolnu skenvencu za ekpresiju.

[0201] Rekombinanatni ekspresioni vektor može biti bilo koji pogodni vektor (na primer plazmid ili virus) koji može da se podvrgne na zgodan način procedurama rekombinantne DNK tehnologije i može da rezultira u ekpresiji FAL polinukleotidne sekvence. Izbor vektora tipično zavisi od kompatibilnosti vektora sa domaćinskom ćelijom u koju se vektor ubacuje. Vektori mogu biti linearni ili zatvoreni cirkularni plazmidi.

[0202] U nekim ostvarenjima ekspresioni vektor je autonomni replikativni vektor (na primer vektor koji postoji kao ekstrahromozomalni entite gde je replikacija nezavisna od hromozomalne replikacije, kao što je plazmid, ekstrahromozomalni element, minihromozom, ili veštački hromozom). Vektor može da poseduje bilo koji deo koji obezbeđuje smo-replikaciju. U nekim alternativnim ostvarenjima, vektor je onaj koji se, nakon intrdukcije u domaćinsku ćeliju, integriše u genom i replikuje zajedno sa hromozomom (hromozomima) u koji je integrisan. Dalje, u nekim ostvarenjima koristi se pojedinačni vektor ili plazmid, ili dva ili više vektora ili plazmida koji zajedno sadrže ukupnu DNK koja treba da se introdukuje u genome domaćinske ćelije.

[0203] U nekim ostvarenjima ekspresioni vektor sadrži jedan ili više selekcionih markera, koji omogućavaju selekciju taransformisanih ćelija. "Selekcioni marker" je gen koji obezbeđuje za rezistenciju na biocid ili virus, rezistenciju na teške metale, prototrofnost na auksotrofe i slično. Primeri bakterijskih skelektabilnih markera uključuju ali nisu limitirani na dal gene iz Bacillus subtilis ili Bacillus licheniformis, ili markere koji obezbbešuju rezistenciju na antibiotike kao što su ampicillin, kanamycin, hloramfenikol ili tetraciklin. Pogodni marker za domaćisnke ćelije kvasca uključuju ali nisu limitirani na ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, i URA3. Selektabilni marker za upotrebu u domaćisnkim ćelijama poreklom iz filamentoznih gljiva uključuju ali nisu limitirani na amdS (acetamidaza; e.g., fiz A. nidulans ili A. orzyae), argB (ornitin karbamoiltransferaze), bar (fosfinotricin acetiltransferaza; na pr., iz S. hygroscopicus), hph (higromicin fosfotransferaza), niaD (nitrat reduktaza), pyrG (orotidin-5’-fosfat dekarboksilaza; na pr., iz A. nidulans ili A. orzyae), sC (sulfat adeniltransferaza, i trpC (antranilat sintaza), kao i njihove ekvivalente. U drugom apektu, otkrivene su domaćisnke ćelije koje obuhvataju najmanje jedan polinukeotid koji kodira najmanje jedan modifikova FAL polipeptid iz otkrića, polinukleotid(e) koji su operativno vezani za jedan ili više kontrolnih sekvenci za ekspresiju modifikovanog(ih) FAL enzima u domaćinskoj ćeliji. Domaćinska ćelija pogodna za ekspresiju polipeptida kodiranih od strane ekspresionih vektora iz pronalaska su dobro poznati u nauci i uključuju ali bez limitiranjana, bakterijske ćelije kao što su E. coli, Vibrio fluvialis, Streptomyces i Salmonella typhimurium ćelije; ćelije gljiva, kao ćelije kvasca (na pr., Saccharomyces cerevisiae ili Pichia pastoris (ATCC Accession No.201178)); insektske ćelije kao Drosophila S2 i Spodoptera Sf9 ćelije; životinjske ćelije kao CHO, COS, BHK, 293, i Bowes ćelije melanoma; i biljne ćelije. Primeri domaćisnkih ćelija takođe uključuju različite Escherichia coli sojeve (na pr., W3110 (ΔfhuA) i BL21).

[0204] U skladu sa tim, otkrivene su metode za proizvodnju modifikovanih FAL polipeptida, gde metode obuhvataju gajenje domaćinske ćelije koja je sposobna da eksprimira polinukleotid koji kodira modifikovani FAL polipeptid u uslovima koji su povoljni za ekspresiju polipeptida. U nekim ostvarenjima metode dalje obuhvataju korake izolacije i/ili prečišćavanja polipeptida, kao što je ovde opisano.

[0205] Odgovarajući medijumi za gajenja i uslovi rasta za domaćisnke ćelije su dobro poznati u nauci. Predviđa se da će bilo koja pogodna metoda za ubacivanje (introdukciju) polinukleotida za ekpresiju FAL polipeptida u ćelije naći svoju upotrebu u ovom pronalsaku.

Pogodne tehnike uključuju ali nisu ograničene samo na elektroporaciju, biolistic bombardovanje česticama, transfekcija posredovana lipozomima, transfekcija pomoću kalcijum hlorida i fuzija protoplasta.

[0206] Modifikovani FAL polipeptidi sa osobinama koje su ovde otkrivene mogu se dobiti tako što je polinukleotidna sekvenca koja kodira prirodni ili modifikovani FAL polipeptid podvrgne bilo kojoj pogodnoj mutagenezi i/ili metodama usmerene evolucije koje su poznate u nauci, i/ili opisane ovde. Primer tehnike usmerene evolucije je mutageneza i/ii DNK mešanje (shuffling) (Videti na pr., Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751 [1994]; WO 95/22625; WO 97/0078; WO 97/35966; WO 98/27230; WO 00/42651; WO 01/75767 and U.S. Pat.

6,537,746). Druge procedure usmerene evolucije kojese mogu koristiti uključuju, između ostalog, staggered extension process (StEP), in vitro rekombinaciju (Videti na pr,., Zhao et al., Nat. Biotechnol., 16:258-261 [1998]), mutagenetski PCR (Videti na pr., Caldwell et al., PCR Methods Appl., 3:S136-S140 [1994]), i kasetnu mutagenezu (Videti na pr., Black et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:3525-3529 [1996]).

[0207] Metode mutageneze i usmerene evolucije mogu se odmah primeniti na FAL kodirajuće polinukleotide da bi se dobile varijante biblioteka koje se mogu eksprimirati, pregledavati i analizirati. Bilo koja pogodna metoda mutageneze i usmerene evolucije ima primenu u ovom otkriću i poznate su u ovoj oblasti.

(Videti na pr. US Patent Br. 5,605,793, 5,830,721, 6,132,970, 6,420,175, 6,277,638, 6,365,408, 6,602,986, 7,288,375, 6,287,861, 6,297,053, 6,576,467, 6,444,468, 5,811238, 6,117,679, 6,165,793, 6,180,406, 6,291,242, 6,995,017, 6,395,547, 6,506,602, 6,519,065, 6,506,603, 6,413,774, 6,573,098, 6,323,030, 6,344,356, 6,372,497, 7,868,138, 5,834,252, 5,928,905, 6,489,146, 6,096,548, 6,387,702, 6,391,552, 6,358,742, 6,482,647, 6,335,160, 6,653,072, 6,355,484, 6,03,344, 6,319,713, 6,613,514, 6,455,253, 6,579,678, 6,586,182, 6,406,855, 6,946,296, 7,534,564, 7,776,598, 5,837,458, 6,391,640, 6,309,883, 7,105,297, 7,795,030, 6,326,204, 6,251,674, 6,716,631, 6,528,311, 6,287,862, 6,335,198, 6,352,859, 6,379,964, 7,148,054, 7,629,170, 7,620,500, 6,365,377, 6,358,740, 6,406,910, 6,413,745, 6,436,675, 6,961,664, 7,430,477, 7,873,499, 7,702,464, 7,783,428, 7,747,391, 7,747,393, 7,751,986, 6,376,246, 6,426,224, 6,423,542, 6,479,652, 6,319,714, 6,521,453, 6,368,861, 7,421,347, 7,058,515, 7,024,312, 7,620,502, 7,853,410, 7,957,912, 7,904,249, i sve srodne ne-SAD parnjake; Ling et al., Anal. Biochem, 254(2):157-78 [1997]; Dale et al., Meth. Mol. Biol., 57:369-74 [1996]; Smith, Ann. Rev. Genet., 19:423-462 [1985]; Botstein et al., Science, 229:1193-1201 [1985]; Carter, Biochem. J., 237:1-7 [1986]; Kramer et al., Cell, 38:879-887 [1984]; Wells et al., Gene, 34:315-323 [1985]; Minshull et al., Curr. Op. Chem. Biol., 3:284-290 [1999]; Christians et al., Nat. Biotechnol., 17:259-264 [1999]; Crameri et al., Nature, 391:288-291 [1998]; Crameri, et al., Nat. Biotechnol., 15:436-438 [1997]; Zhang et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 94:4504-4509 [1997]; Crameri et al., Nat. Biotechnol., 14:315-319 [1996]; Stemmer, Nature, 370:389-391 [1994]; Stem- mer, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91:10747-10751 [1994]; WO 95/22625; WO 97/0078; WO 97/35966; WO 98/27230; WO 00/42651; WO 01/75767; WO 2009/152336, i U.S. Pat. No.6,537,746.

[0208] U nekim ostvarenjima enzimski klonovi dobijeni nakon mutagenize se pregledavaju tako što se enzimske preparacijame izlažu definisanoj temperaturi (ili drugim uslovima eseja) i meri se količina enzimske aktivnosti koja je ostala nakon tretmana toplotom ili drugim uslovima pogodnog eseja. Klonovi koji sadrže polinukleotid koji kodira FAL polipeptid se zatim izoluju iz gena, sekvenciraju radi identifikacije promena u nnukleotidnoj sekvenci (ako ih ima), i koriste se za ekspresiju enzima u odmaćinskoj ćeliji. Merenje enszimske aktivnosti iz

1

ekspresionih bibliotekamože se izvesti pomoću bilo koje prigodne metode poznate u nauci (na primer standardne biohemijske tehnike, kao što je HPLC analiza).

[0209] Za modifikovane polipeptide poznate skevence mogu se pripremiti polinukleotidi koji kodiraju enzim putem standardnih metoda čevrste-faze, na osnovu poznatih sintetičkih metoda. U nekim ostvarenjima, fragmenti do oko 100 baza mogu de individualno sintetisati, zatim spojiti (na pr., putem metoda enzimske ili hemijske ligacije ili metoda posredovanih sa polimerazom) kako bi se formirala željena kontinualna sekvenca. Na primer, polinukleotidi i oliginukleotidi koji su ovde otkriveni mogu se pripremiti putem hemijske sinteze kuz upotrebu klasične metode u kojoj se koristi fosforamidit (videti na pr., Beaucage et al., Tet. Lett., 22:1859-69 [1981]; and Matthes et al., EMBO J., 3:801-05 [1984]), kao što se tipično i radi u slučaju automatizovanih sinettičkih metoda. Na osnovu fosforamidit metode, oligonukleotidi se sintetišu (na primer u aparatu za automatsko sintetisanje DNK, prečišćavaju se, komplementarno se spajaju, ligiraju se i kloniraju u odgovarajuće vektore).

[0210] U skladu sa tim, u nekim ostvarenjima metoda za pripremu modifikovanog FAL polipeptida može obuhvatiti: (a) sintetisanje polinukleotida koji kodira polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku skevencu koja je odabrana od aminokiselinskih skevenci bilo koje varijante koja je ovde opisan i (b) ekspresiju FAL polipeptida koji je kodiran od strane polinukleotida. U nekim ostvarenjima metode, aminokiselinske sekvenca kodirana od strane polinukleotida može opcionalno imati jednu ili nekoliko (na pr. do 3, 4, 5, ili do 10) delecija, insercija i/ili supstitucija aminokiselinskih ostataka. U nekim ostvarenjima aminokiselinska sekvenca ima opcionalno 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 1-15, 1-20, 1-21, 1-22, 1-23, 1-24, 1-25, 1-30, 1-35, 1-40, 1-45, ili 1-50 delecija, insercija i/ili supstitucija aminokiselinskih ostataka. U nekim ostvarenjima aminokiselinska sekvenca ima opcionalno 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 30, 35, 40, 45, ili 50 delecija, insercija i/ili supstitucija aminokiselinskih ostataka. U nekim ostvarenjima aminokiselinska sekvenca ima opcionalno 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 21, 22, 23, 24, ili 25 delecija, insercija i/ili supstitucija aminokiselinskih ostataka. U nekim ostvarenjima supstitucije su konzervativne ili ne-konzervativne supstitucije.

[0211] Eksprimirani modifikovani FAL polipeptid može da se evalira za bilo koju željenu poboljčanu osobinu ili kombinaciju osobina (na primer aktivnost, selektivnost, stabilnost, tolarancija na kiselinu, osetljivost na proteazu, itd.) korišćenjem bilo kog pogodnog eseja koji je poznat u nauci, uključujuži ali bez ograničenja na eseje i uslove koji su ovde opisani.

[0212] U nekim ostvarenjima bilo koji od modifikovanih FAL polipeptida koji su ekprimirani u domaćinskoj ćeliji dobija se iz ćelija i/ili medijuma za gajenja pomoću bilo koje jedne ili više tehnika poznatih u nauci za prečišćevanje proteina, uključujući između ostalog tretman lizozomom, sonifikaciju, filtraciju, isoljavanje (salting-out), ultracentrifugiranje i hromatografiju.

0213] Tehnike hormatografije za izolaciju FAL polipeptida uključuju, između ostalih,

reverzno faznu hromatografiju, tečnu hromatografiju visoke preformanse, jonsko izmenjivačku hromatografiju, hromatografiju hidrofobnih interakcija, hromatografiju selekcije na osnovu veličine (size-exclusion), elektroforezu u gelu, i afinitativnu hromatografiju. Uslovi za prečišžavanje odgovarajućeg enzima zavise delimično od faktora kao što je net šarža, hidrofobnost, hidrofilnost, molekulska težina, molekulski oblik, itd. i biće očigledni onima koji se bave naukom. U nekim ostvarenjima afinitativne tehnike se mogu koristiti za izolaciju poboljšanih FAL enzima. Za afinitativno hormatografsko prečišćavanje, bilo koje antitelo koje

2

se specifično vezuje za FAL polipeptid od interesa može naći primenu. Za proizvodnju antitela, različite životinje domaćini uključujući ali bez ograničenja na njih, zečeve, miševe, pacove, itd imunizuju se injektiranjem FAL polipeptida, ili njegovog fragmenta. U nekim ostvarenjima FAAL polipeptid ili njegov fragment je vezan za pogodan nosač kao BSA u smislu da us bočne funkcionalne grupe lanca ili linkeri vezani za bočnu funkcionalnu grupu lanca.

[0214] U nekim ostvarenjima modifikovani FAL polipeptid se proizvodi u domaćisnkoj ćeliji metodom koja obuhvata gajenje domaćisnke ćelije ( na pr, soj E. coli) koj sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira modifikovani FAL polipeptid koao što je ovde opisano u uslovima koji omogućavaju proizvodnju modifikovanog FAL polipeptida i dobijanje modifikovanog FAL polipeptida iz ćelija i/ili medijuma za gajenja. U nekim ostvarenjima domaćisnka ćelija proizvodi više od jednog modifikovanog FAL polipeptida.

[0215] U nekim ostvarenjima otkrivena je metoda za proizvodnju modifikovanog FAL polipeptida koji obuhvata gajenje rekombinantne bakterijske ćelije koja sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira modifikovani FAL polipeptid koji ima najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnu skevencu sa referentnom sekvencom SEQ ID NO:4, i jednu ili više razlika u aminokiselinskom ostatku kada se uporedi sa SEQ ID NO:4 odabranom od X39; X91; X158; X180; X195; X243; X245; X256; X257; X270; X290; X307; X308; X326; X349; X364; X394; X399; X400; X404; X407; X443; X453; X459; X460; X463; X474; X522; X524; i X528, ili njihovom kombinacijom kada se optimalno poravna sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:4 pod povoljnim uslovima koji omogućavaju proizvodnju modifikovanog FAL polipeptida i opcionalno dobijanje modifikovanog FAL polipeptida iz kulture i/ili gajenih bakterijskih ćelija. U nekim ostvarenjima domaćinska ćelija proizvodi više od jednog modifikovanog FAL polipetida.

0216] U nekim ostvarenjima, modifikovani FAL polipeptidi su dobijeni iz rekombinantnih

domaćisnkih ćelija i/ili medijuma za gajenja, dalje su prečiđćeni bilo kojom pogodnom metodom (metodama) koji su poznati u nauci. U nekim dodatnim ostvarenjima, prečišćeni TAL polipeptidi su kombinovani sa drugim sastojcima i jedinjnejima kako bi se obezbedile kompozicije i formulacije koje obuhvataju modifikovane FAL polipeptide kao prigodne za različite primene i upotrebe (na pr. farmaceutske kompozicije).

Kompozicije:

[0217] Otkriveni su modifikovani FAL polipeptidi pogodni za upotrebu u mnogobrojnim kompozicijama. Kompozicije nalaze upotrebu u mnogim oblastima uključujući ali bez ograničenja proizvodnju farmaceutikala, dodataka ishrani kao i nutricionih suplemenata, hrane, stočne hrane, i finih hemikalija. Na primer u nekim ostvarenjima otkriveni su hrana i/ili stočna hrana koja obuhvata najmanje jednu modifikovanu FAL varijantu i/ili najmanje jednu polinukleotidnu sekvencu koja kodira najmanje jednu FAL varijantu. U nekim ostvarenjima otkrivena su pica koja obuhvataju najmanje jednu modifikovanu FAL varijantu.

[0218] U nekim ostvarenjima modifikovana FAL varijanta u hrani, stočnoj hrani i/ili dodatacima ishrani kao i nutricionim suplemenatima je glikozilovana. Dalje, modifikovane FAL varijante nalaze upotrebu u bilo kom pogodnom matriksu za dostavu enzima koji može da se konzumira u ishrani. U nekim ostvarenjima modifikovane FAL varijante su prisutne u matriksu za dostavu enzima koji može da se konzumira u ishrani koji je namenjen za brzu disperziju FAL varijante u digestivni trakt u životinje nakon unošenja varijante.

[0219] Postoje takođe otkriveni mofidfikovni FAL polipeptidi koji su pogodni za upotrebu u proizvodnji finih hemikalija i drugih industrijski važnih jedinjenja (videti na pr., US Pat. Appln. Nos.2013/0340119, 2013/0005012, and 2005/0260724, i WO 2012/122333).

[0220] Opisani su konstruisani FAL polipeptidi koji su pogodni za upotrebu u farmaceutskim i drugim kompozicijama, kao što su dijetetski/nutritivni dodaci.

[0221] U zavisnosti od načina primene, ove kompozicije koje sadrže terapeutski efikasnu količinu projektovanog FAL-a, a u skladu sa pronalaskom, su u čvrstom, polučvrstom ili tečnom obliku. U nekim ostvarenjima, kompozicije obuhvataju druge farmaceutski prihvatljive komponente kao što su razblaživači, puferi, ekscipijenti, soli, emulgatori, konzervansi, stabilizatori, punioci i drugi sastojci. Detalji o tehnikama formulisanja i primene dobro su poznati u struci i opisani u literature.

[0222] U nekim ostvarenjima, modifikovani FAL polipeptidi su formulisani za upotrebu u oralnim farmaceutskim kompozicijama. Bilo koji pogodan format za upotrebu u dostavi modifikovanih FAL polipeptida nalazi se upotrebom u opisu, uključujući ali ne ograničavajući se na pilule, tablete, gel tablete, kapsule, pastile, dražeje, prahove, meke gelove, sol-gelove, gelove, emulzije, implantate, flasteri, sprejevi, masti, linimenti, kreme, paste, želee, boje, aerosoli, gume za žvakanje, demulcenti, štapići, suspenzije (uključujući, ali ne ograničavajući se na, uljane suspenzije, emulzije ulja u vodi, itd.), kaše, sirupi, formulacije koje se kontrolisano oslobađaju, supozitorije, itd. U nekim ostvarenjima, modifikovani FAL polipeptidi su obezbeđeni u formatu pogodnom za injekciranje (tj. u injektabilnoj formulaciji). U nekim ostvarenjima, modifikovani FAL polipeptidi su obezbeđeni u biokompatibilnim matricama kao što su sol-gelovi, uključujući sol-gel na bazi silicijum-dioksida (npr. oksisilan). U nekim ostvarenjima, modifikovani FAL polipeptidi su inkapsulirani. U nekim alternativnim realizacijama, modifikovani FAL polipeptidi su inkapsulirani u nanostrukture (npr., nanocevi, nanotubule, nanokapsule ili mikrokapsule, mikrosfere, liposomi, itd.). Zaista, nije namera da se otkriće ograniči na bilo koju određenu formulaciju isporuke i/ili način isporuke. Namera je da se modifikovani FAL polipeptidi administriraju bilo kojim pogodnim sredstvima poznatim u struci, uključujući, ali ne ograničavajući se na, parenteralno, oralno, lokalno, transdermalno, intranazalno, intraokularno, intratekalno, preko implantata, itd.

[0223] U nekim ostvarenjima, modifikovani FAL polipeptidi su hemijski modifikovani glikozilacijom, pegilacijom (tj. modifikovanom sa polietilen glikolom [PEG] ili aktiviranim PEG-om, itd.) Ili drugim jedinjenjima (vidi npr., Ikeda, Amino Acids 29: 283-287 [2005] US patent br.

7,531,341, 7,534,595, 7,560,263 i 7,53,653, US Pat. Appl. Publ. Nos. 2013/0039898, 2012/0177722, itd.). Zaista, nije namera da se otkriće ograniči na bilo koji poseban način isporuke i/ili mehanizam.

[0224] U nekim dodatnim ostvarenjima, modifikovani FAL polipeptidi su obezbeđeni u formulacijama koje sadrže matriks-stabilizovane enzimske kristale. U nekim ostvarenjima, formulacija sadrži umreženi kristalni modifikovani FAL enzim i polimer sa reaktivnom grupom koja se vezuje za kristale enzima. Takođe su opisani modifikovani FAL polipeptidi u polimerima.

[0225] U nekim ostvarenjima, kompozicije koje sadrže modifikovane FAL polipeptide iz opisa uključuju jedno ili više uobičajeno upotrebljenih jedinjenja, uključujući, ali bez ograničenja na

4

šećere (npr. laktozu, saharozu, manitol i/ili sorbitol), skrob (npr. kukuruz, pšenicu, pirinač, krompir ili drugi biljni skrob), celulozu (npr. metil celuloza, hidroksipropilmetil celuloza, natrijum karboksimetilceluloza), gume (npr. arapski, tragakant, guar, itd.), i/ili proteine (npr. želatin, kolagen, itd.). Dodatne komponente u oralnim formulacijama mogu uključivati sredstva za bojenje i zaslađivanje (npr. glukozu, saharozu i manitol) i lubricant sredstva (npr. magnezijum stearat), kao i enteričke obloge (npr. metakrilatni polimeri, hidroksil propil metil celuloza ftalat, i/ili bilo koje druge prikladne enteričke obloge poznate u tehnici). U nekim ostvarenjima uključena su sredstva za dezintegraciju ili solubilizaciju (npr., umreženi polivinil pirolidon, agar, alginska kiselina ili njene soli, kao što je natrijum alginat). U nekim ostvarenjima, modifikovani FAL polipeptid se kombinuje sa različitim dodatnim komponentama, uključujući, ali bez ograničenja, konzervanse, sredstva za suspendovanje, agense za zgušnjavanje, sredstva za vlaženje, alkohole, masne kiseline i/ili emulgatore, naročito u tečnim formulacijama.

[0226] U nekim ostvarenjima, modifikovani FAL polipeptid se kombinuje sa različitim dodatnim komponentama, uključujući, ali bez ograničenja, konzervanse, sredstva za suspendovanje, sredstva za zgušnjavanje, sredstva za vlaženje, alkohole, masne kiseline i/ili emulgatore, naročito u tečnim formulacijama. U nekim ostvarenjima, modifikovani FAL polipeptidi se administriraju subjektima u kombinaciji sa drugim jedinjenjima koji se koriste u tretmanu FKU, uključujući ali ne ograničavajući se na KUVAN® tetrahidrobiopterin (BioMarin Pharmaceutical, Inc., Novato, CA), antacide (npr. omeprazol, esomeprazol i druge prazole), kao i bilo koja druga pogodna jedinjenja.

[0227] U nekim ostvarenjima, opisani su modifikovani FAL polipeptidi pogodni za upotrebu u smanjenju koncentracije fenilalanina u tečnostima kao što su krv, cerebrospinalna tečnost, itd. Doza modifikovanog(ih) FAL polipeptida koja se daje životinji zavisi od stanja bolesti, opšteg stanja životinje i drugih faktora koji su poznati stručnjacima. U nekim ostvarenjima, kompozicije su namenjene za pojedinačno ili višestruko davanje životinji. U nekim ostvarenjima, razmatra se da je koncentracija modifikovanog FAL polipeptida u kompoziciji(ama) koja se daje životinji (npr. čoveku sa FKU) dovoljna da efikasno leči, ublažava i/ili sprečava bolest (npr. FKU, stanja, bolesti i/ili simptomi povezani sa PKU). U nekim ostvarenjima, modifikovani FAL polipeptidi se daju u kombinaciji sa drugim farmaceutskim i/ili dijetetskim kompozicijama.

Industrijske kompozicije

[0228] Smatra se da će modifikovani FAL polipeptidi iz pronalaska naći upotrebu u industrijskim kompozicijama. U nekim ostvarenjima, modifikovani FAL polipeptidi su formulisani za upotrebu u prehrambenoj i/ili prehrambenoj industriji. U nekim ostvarenjima, modifikovani FAL polipeptidi su formulisani u granuliranim ili peletiranim proizvodima koji su pomešani sa komponentama stočne hrane kao što su dodatni enzimi (na primer, celulaze, lakaze i amilaze). U nekim alternativnim ostvarenjima, modifikovani FAL polipeptidi se koriste u tečnim kompozicijama hrane za životinje (npr., vodene suspenzije ili suspenzije na bazi ulja). Prema tome, u nekim ostvarejnima, modifikovani FAL varijante opisa su dovoljno termotolerantne i termostabilne da izdrže tretman koji se koristi za proizvodnju peleta i druge obrađene hrane za životinje/ hrane za ljude.

[0229] Modifikovane FAL varijante ovog pronalaska takođe se koriste u proizvodnji derivata fenilalanina i/ili fenilalanina.

[0230] Prethodni i drugi aspekti pronalaska mogu se bolje razumeti u vezi sa sledećim neograničavajućim primerima. Primeri su dati samo u ilustrativne svrhe i nisu namenjeni da ograniče obim ovog pronalaska na bilo koji način.

EXPERIMENTALNI DEO

[0231] Primeri koji slede, ukluučujući i eksperimente i dobijene rezultata, su obezbeđeni samo radi ilustracije i ne treba ih smatrati kao ograničavajuće za ovo otkriće.

[0232] U eksperimentlnom otkriću koje sledi, primenjuju se sledeće skraćenice: ppm (delovi po milionu); M (molarno); mM (millimolarno), uM i mM (micromolarno); nM (nanomolarno); mol (molovi); gm and g (gram); mg (milligrami); ug i μg (mikrogrami); L i 1 (litar); ml and mL (millilitar); cm (centimetri); mm (millimetri); um and μm (mikrometri); sec. (sekunde); min(s) (minut(e)); h(s) i hr(s) (sat(i)); U (jedinice); MW (molekulska težina); rpm (rotacija u monuti); psi i PSI (funta po kvadratnom inču); °C (stepen Celzijusa); RT i rt (sobna temperatura); CDS (kodirajuća sekvenca); DNA (dezoksiribonukleinska kiselina); RNA (ribonukleinska kiselina); E. coli W3110 (soj E. coli koji se uobičajeno koristi u laboratoriji, dostupan od strane Coli Genetic Stock Center [CGSC], New Haven, CT); HTP (visoki protok); HPLC (tečna hromatografija visokog pritiska); CFSE (karboksifluorescein sukcinimidil estar); IPTG (izopropil ®-D-1-tiogalaktopiranozid); PES (polietarsulfon); PHE i phe (fenilalanin); BSA (goveđi serum albumin); PBMC (periferne mononuklearne ćelije krvi); PKU (fenilketonurija); MHC (glavni kompleks histokompatibilnosti); HLA (humani leukocitni antigen); HLA-DR (MHC klase II receptor napovršini ćelija kodiran od strane HLA kompleksa na hromozomu #6); FIOPC (opseg (fold) poboljšanja u odnosu na pozitivnu kontrolu); LB (Luria bujon); Athens Research (Athens Research Technology, Atina, GA); ProSpec (ProSpec Tany Technogene, East Brunswick, NJ); Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO); Ram Scientific (Ram Scientific, Inc., Yonkers, NY); FALl Corp. (FALl, Corp., Pt. Washington, NY); Millipore (Millipore, Corp., Billerica MA); Difco (Difco Laboratories, BD Diagnostic Systems, Detroit, MI); Molecular Devices (Molecular Devices, LLC, Sunnyvale, CA); Kuhner (Adolf Kuhner, AG, Basel, Switzerland); Cambridge Isotope Laboratories, (Cambridge Isotope Laboratories, Inc., Tewksbury, MA); Applied Biosystems (Applied Biosystems, part of Life Technologies, Corp., Grand Island, NY), Agilent (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA); Thermo Scientific (part of Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA); Corning (Corn- ing, Inc., FALo Alto, CA); Constant Systems (Constant Systems Ltd., Daventry, United Kingdom); Megazyme (Megazyme International, Wicklow, Ireland); Enzo (Enzo Life Sciences, Inc., Farmingdale, NY); GE Healthcare (GE Healthcare Bio- Sciences, Piscataway, NJ); Harlan (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN); AB Sciex (AB Sciex, Framingham, MA); and Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

[0233] Sledeći polinukleotidne i polipeptidne sekvence imaju upotrebu u ovom otkriću. U nekim slučajevima (videti dalje u tekstu) polinukleotidnu sekvencu prati kodirani polipeptid.

Polinukleotidna sekvenca pET16b-AvFAL ekspresionog vektora (SEQ ID NO:1):

Polinukleotidna sekvenca AvFAL ORF (SEQ ID NO:2):

Polinukleotidna sekvenca WT AvFAL (SEQ ID NO:3):

Polinukleotidna sekvenca AvFAL Varijanta br.30 (SEQ ID NO:5):

1

Polipeptidna sekvenca AvFAL Varijanta br.30 (SEQ ID NO:6):

Polinukleotidna sekvenca AvFAL Varijanta br.22 (SEQ ID NO:7):

2

Polipeptidna sekvenca AvFAL Varijanta br.22 (SEQ ID NO:8):

Polinukleotidna sekvenca AvFAL Varijanta br.36 (SEQ ID NO:9):

Polipeptidna sekvenca AvFAL Varijanta br.36 (SEQ ID NO:10):

Polinukleotidna sekvenca AvFAL Varijanta br.42 (SEQ ID NO:11):

4

Polipeptidna sekvenca AvFAL Varijanta br.42 (SEQ ID NO:12):

Polinukleotidna sekvenca AvFAL Varijanta br.43 (SEQ ID NO:13):

Polipeptidna sekvenca AvFAL Varijanta br.43 (SEQ ID NO:14):

Polinukleotidna sekvenca AvFAL Varijanta br.1002 (SEQ ID NO:15):

Polipeptidna sekvenca AvFAL Varijanta br.1002 (SEQ ID NO:16):

Polinukleotidna sekvenca AvFAL Varijanta br.1008 (SEQ ID NO:17):

Polipeptidna sekvenca AvFAL Varijanta br 1008 (SEQ ID NO:18):

Polinukleotidna sekvenca AvFAL Varijanta br.1009 (SEQ ID NO:19):

Polipeptidna sekvenca AvFAL Varijanta br 1009 (SEQ ID NO:20):

Polinukleotidna sekvenca AvFAL Varijanta br.1010 (SEQ ID NO:21):

Polipeptidna sekvenca AvFAL Varijanta br 1010 (SEQ ID NO:22):

Polinukleotidna sekvenca AvFAL Varijanta br 1084 (SEQ ID NO:23):

Polipeptidna sekvenca AvFAL Varijanta br.1084 (SEQ ID NO:24):

Polinukleotidna sekvenca AvFAL Varijanta br.967 (SEQ ID NO:25):

1

Polipeptidna sekvenca varijanta br. 967 (SEQ ID NO:26):

2

Ekspresioni vektor pCK100900i:

�

PRIMER 1

Dobijanje FAL gena i konstrukcija ekspresionih vektora

[0234] Dobijena je plazmidna DNA Anabaena variabilis fenilalanin amonijak-lijaze (AvFAL) i sintetski gen, koji kodira AvFAL, je kodon optimizovan za ekspresiju u E. coli i kloniran u ekspresijski vektor E. coli pET16b da se dobije pET16b-AvFAL (SEQ ID NO.: 1). AvFAL otvoreni okvir čitanja (SEQ ID NO.: 2) umnožen je pomoću PCR-a korišćenjem oligonukleotida: FAL-pCK-F i FAL-pCK-R i subkloniran u ekspresijski vektor pCK100900i (SEQ ID NO.: 27).

[0235] Ovaj plazmidni konstrukt je transformisan u E. coli soj koji je izveden iz W3110. Tehnike usmerene evolucije, generalno poznate stručnjacima, korišćene su za formiranje biblioteka genskih varijanti iz ovog plazmidnog konstrukta (vidi na pr. US patent br. 8,383,346 i WO2010/144103).

PRIMER 2

Rast i eseji visokog protoka (HTP)

Visok protok (HTP) rasta FAL i FAL varijanti

[0236] Transformisane E. coli ćelije su odabrane stavljanjem na LB agar ploče koje sadrže 1% glukoze i 30 µg/ml hloramfenikola. Nakon inkubacije preko noći na 37°C, kolonije su zasejavane u NUNC ™ (Thermo-Scientific) bunare, plitke ploče ravnog dna koje se sastoje od 96 bunara, punjene sa 180 µl/bunar LB-a uz dodatak 1% glukoze i 30 µg/ml hloramfenikola. Kulture su ostavljene da rastu preko noći 18-20 sati u mućkalici (200 rpm, 30°C i 85% relativne vlažnosti; Kuhner). Uzorci izrasli preko noći (20 µL) preneti su u Costar duboke ploče sa 96 bunara napunjene sa 380 µl Terrific bujonom obogaćenim sa 30 µg/ml hloramfenikola. Ploče su inkubirane 135 minuta u mućkalici (250 rpm, 30°C, i 85% relativne vlažnosti; Kuhner). Ćelije su zatim indukovane sa 40 µL 10 mM IPTG u sterilnoj vodi i inkubirane preko noći 20-24 sata u mućkalici (250 rpm, 30°C i 85% relativne vlažnosti; Kuhner). Dve ponovljene kulture su kombinovane, ćelije su istaložene (4000 rpm x 20 min), supernatanti odbačeni i ćelije zamrznute na -80°C do analize.

Liza HTP taloga (peleta)

[0237] Prvo, 500 µL pufera za lizu (20 mM Tris pH 7,5, 1 mM MgS04, 1 mg/ml lizozima i 0,5 mg/ml polimiksin B sulfata) dodato je u pelete ćelija. Smeša je mešana 1.5 h na sobnoj temperaturi i oborena/peletirana (4000 rpm x 5 min) pre upotrebe prečišćenih lizata u različitim, ovde opisanim HTP testovima. Analiza ovih lizata pomoću SDS-PAGE otkrila je prisustvo prekomerno eksprimiranog proteina očigledne MT od 60 kDa, u skladu s očekivanom MT za FAL.

Analiza prečišćenih lizata

[0238] Aktivnost FAL varijante je određena merenjem formiranja cinaminske kiseline kako je određeno promenom apsorbancije na 290 nm tokom vremena. Za ovaj test, bilo 100 µL 200 mM Tris/50 mM fenilalanina, pH 7.5, ili 200mM natrijum fosfata/50mM fenilalanina pH 70, 80 µL vode, i 20 µL prečišćenog lizata dodato je u poli-akrilne ploča sa 96 bunara (Costar # 3635, Corning). Reakcije su kratko promešane i aktivnost je određena praćenjem apsorbance na 290 nm tokom vremena (svakih 12-20 sek tokom 5-20 min) korišćenjem SpectraMax® Plus384 ili SpectraMax® 190 (Molecular Devices) apsorpcionog čitača mikroploče.

HTP-analiza prečišćenih lizata tretiranih proteazom

[0239] FAL varijante su indukovane himotripsinom i tripsinom da bi se simulisalo okruženje donjeg creva. Prvo, 30 µL mešavine proteaze (0.01 - 100 mg/ml himotripsina (C4129 Sigma Aldrich), 0.01 - 100 mg/ml tripsina (T7409 Sigma Aldrich), 1 mM CaCl2i 1 mM HCl), 0 - 30 µL 20 mM natrijum-tauroholata u 500 mM natrijum fosfatu pH 7.0 i 90-120 µL prečišćenog lizata dodato je u bunare 96-bunarskih ploča s okruglim dnom (Costar # 3798, Corning).

Ploče su zatvorene i inkubirane na 37°C, 400 rpm (obrtaja u minuti), 1" za 1 h pre analize. Za ispitivanje, bilo 100 µL 200 mM Tris/50 mM fenilalanina pH 7.5 ili 200 mM natrijum fosfata/50 mM fenilalanina pH 7.0 i 100 mL lizata tretiranog proteazom dodato je u bunare poliakrilne 96-bunarske ploče (Costar # 3635, Corning). Reakcije su kratko mešane i aktivnost je određivanana praćenjem apsorbance na 290 nm tokom vremena (svakih 12-20 sek tokom 5-20 min) pomoću SpectraMax® Plus384 ili SpectraMax® 190 (Molecular Devices) apsorbance čitača mikroploče. Rezultati su dati u narednim tabelama.

HTP-analiza prečišćenih lizata tretiranih kiselinom

[0240] U ovom testu, FAL varijante su izazvane kiselim uslovima, da bi se simulirali uslovi u želucu. Prvo, 20 µL 1M natrijum citrata (pH 3.7-4.5) i 30 µL vode ili 50 µL 400 mM natrijum citrata pH 3.7-4.8, i 50 uL prečošćenog lizata dodato je u bunare 96-bunarskih ploča s okruglim dnom (Costar # 3798, Corning). Ploča je zatvorena i inkubirana na 37°C, 400 rpm, 1" za 1 sat pre analize. Za ispitivanje, 100 µL bilo 200 mM Tris-a, 50 mM fenilalanina pH 7.5 i 80 µL 1M Tris pH 7.5 ili 200 mM natrijum fosfat/50 mM fenilalanina pH 7.0 i 80 µl 1.0 M natrijum fosfata pH 7.0 i 20 µl lizata tretiranog kiselinom je dodato u bunare poliakrilne ploče sa 96 bunara (Costar # 3635, Corning). Reakcije su kratko mešane, a aktivnost je određena praćenjem apsorbancije na 290 nm tokom vremena (svakih 12-20 sek tokom 5-20 min) korišćenjem SpectraMax® Plus384 ili SpectraMax® 190 (Molecular Devices) apsorbancije čitača mikroploče. Rezultati su navedeni u narednim tabelama.

HTP-analiza prečišćenih lizata tretiranih pepsinom

[0241] U dodatnim esejima, FAL varijante su izazvane kiselim uslovima i pepsinom, za dalje testiranje varijanti, pod uslovima koji oponašaju želučano okruženje. Prvo, 50 µL 0.01-100 mg/ml pepsina u 400 mM natrijum citrata pH 1.5-4, i 50 µl prečišćenog lizata su dodati se u bunare 96-bunarskih ploča s okruglim dnom (Costar # 3798, Corning). Ploča je zatvorena i inkubirana na 37°C, 400 rpm, 1" bacanje za 1-12h pre analize. Za ispitivanje, bilo 100 µL 200 mM Tris/50 mM fenilalanina pH 7.5 i 80 µL 1M Tris pH 7.5 ili 200 mM natrijum fosfata/50 mM fenilalanina pH 7.0 i 20 µL lizata tretiranog kiselinom dodaju se u bunare poliakrilne ploče sa 96 bunara (Costar # 3635, Corning). Reakcije su kratko mešane, a aktivnost je određena praćenjem apsorbancije na 290 nm tokom vremena (svakih 12-20 sek tokom 5-20 min) korišćenjem SpectraMax® Plus384 ili SpectraMax® 190 (Molecular Devices) apsorbancije čitača mikroploče.

�

PRIMER 3

Eseji za određivanje agregacije proteina kod FAL varijanti

[0242] Sklonost FAL varijanti za agregiranje određena je pomoću ProteoStat® Protein Aggregation Assay kit-a (Enzo), prema uputstvima proizvođača. Ukratko, prečišćeni FAL na 0-100 mM je pomešan sa ProteoStat® reagensom za detekciju (1: 2000) i analiziran preko protočne citometrije. Uzorci su procenjuju na fluorescenciju, u skladu sa ProteoStat® standardima za agregiranje, kao što je poznato (vidi npr. Bershtein i sur., Mol.Cll, 133-144 [2013])

PRIMER 4

Liofilizovani lizati iz kultura mešanih u flaskovima (pljosnate boce) (SF)

[0243] Odabrane HTP culture, rasle kako je gore opisano, stavljene su na LB ploče sa 1% glukoze i 30 µg/ml hloramfenikola i gajene preko noći na 37°C. Jedna kolonija iz svake kulture je preneta u 50 ml LB-a sa 1% glukoze i 30 µg/ml hloramfenikola. Kulture su gajane 18 h na 30°C, 250 rpm i subkultivisane u razblaženju od otprilike 1:10 u 250 ml Terrific bujona sa 30 µg/ml hloramfenikola, do konačnog OD600 od 0.2. Kulture su inkubirane 135 minuta na 30°C, 250 rpm, do OD600 od 0.6 i indukovane sa 1 mM IPTG.

Indukovane kulture su inkubirane 20 h na 30°C, 250 rpm. Nakon ovog perioda inkubacije, kulture su centrifugirane 4000 rpm x 10 min. Supernatant je odliven, a peleti su resuspendirani u 30 ml 50 mM natrijum fosfata pH 7.5. Ćelije su istaložene (4000 rpm x 10 min), resuspendirane u 12 ml 50 mM natrijum fosfata pH 7.5, i lizirane korišćenjem One Shot Cell Disruption sistema (Constant Systems) na 17,000 psi. Lizat je oboren (10,000 rpm x 30 min) i supernatant zamrznut i liofilizovan kako bi se dobio prah koji sadrži enzim.

Prečišćavanje FAL-a iz kultura mešanih u flaskovima

[0244] FAL Varijanta br.42 gajena je u kulturama u flaskovima do zasićenja, kao što je gore opisano. Zasićene kulture su peletirane centrifugiranjem (4000 rpm x 20 min) i peleti ćelija čuvani na -80° C do prečišćavanja. Ćelijski peleti su odmrznuti na sobnoj temperaturi i resuspendirani u 25 mM Tris-u, pH 8 sa 130 mM NaCl u 5 mL pufera/g ćelija. Suspenzija uzorka je lizirana korišćenjem mikrofluidizatora s setovanim pritiskom od 110 psi. Dobiveni lizat je pročišćen centrifugiranjem na 10,000 rpm tokom 1 sata, nakon čega sledi filtriranje kroz 0.2 mm PES filter (Millipore).

[0245] Nakon filtracije, dobiveni lizat je zagrejan na 70-85°C 1.5-2 sata u prisustvu ili odsustvu 10 mM Phe. Lizat je sklonjen sa grejanja i prečišćen centrifugiranjem na 10,000 rpm na 4°C tokom 1 sata. Supernatant koji je sadržao rastvorljivi FAL je zatim filtriran kroz 0.2 mm PES filtar pre punjenja hromatografske kolone.

[0246] Toplotom obrađeni, filtrirani lizat, koji sadrži 80-100 mg ukupnih proteina, razređen je dvostruko pomoću 25 mM Tris-a, pH 8 sa 1.2 M amonijum sulfatom. Uzorak je stavljen na kolonu HiPrep 16/10 Fenil FF (hi sub) (GE Healthcare) koja je prethodno ekvilibrisana sa 25 mM Tris-om, pH 8 sa 0.6 M amonijum sulfatom. Nakon punjenja uzorka, kolona je isprana istim puferom sa tri volumena kolone, praćeno linearnim gradijentom od 0.6 M - 0 M amonijum sulfata u 25 mM Tris-u, pH 8 za volumen jedne kolone. Čvrsto vezan FAL je eluiran sa kolone korišćenjem izokratskog eluiranja sa 25 mM Tris-om, pH 8 za tri volumena kolone. Frakcije koje sadrže aktivni i čisti FAL su spojene.

[0247]Prečišćeni FAL iz fenilne kolone je pufer-izmenjen u 0.5 M Tris-u, pH 8.5 i koncentrisan. Koncentrovani FAL je analiziran pomoću SDS-PAGE i nađeno je da je prisutan u traci na <60 kDa. Prečišćeni FAL uzorci su filtrirani pomoću PES filtra 0.45 mm i sačuvani na -80°C do upotrebe.

PRIMER 5

Karakterizacija prečišćenih FAL i FAL varijanti

[0248] U ovom primeru, opisani su eseji urađeni za karakterizaciju divljeg tipa i FAL varijanti.

Tolerancija na kiselu pH:

4

[0249] Liofilizovani prahovi koji sadrže FAL varijante su rastvoreni kao 2 g/L u 20 mM natrijum fosfatu pH 7.0. Zatim je 50 µL enzimskih rastvora pomešano sa 50 µL 400 mM limunske kiseline (pH 4.0-5.2) ili 100 mM natrijum fosfata i reakcije inkubirane na 37°C, 1 sat na 400 rpm (1 " odlivanje, bacanje). Nakon toga je 20 µl rastvora kratko pomešano sa 80 µL 1M natrijum fosfata pH 7.0 i 100 µL 200 mM Tris/ 50mM fenilalanina pH 7.5. Enzimatska aktivnost u kiselim uslovima je određena praćenjem apsorbance na 290 nm tokom vremena (svakih 12-20 s tokom 5-20 min) pomoću SpectraMax® Plus384 ili SpectraMax® 190 (Molecular Devices) apsorbpcionog čitača mikroploče. Rezultati su prikazani na Slici 2. Kao što je prikazano na Slici 2, varijante br. 30 i 36 su zadržale veću aktivnost nakon što su inkubirane na pH približno 4 do 4.8, u poređenju sa FAL divljim tipom.

Determinacija KM:

[0250] Da bi se procenilo da li su mutacije u FAL varijantama izmenile afinitet FAL varijanti za feniletanolin, određena je Mihaelisova konstanta za enzim divljeg tipa i Varijantu 36. Prvo, 100 µL 15 µg/ml FAL-a u 100 mM Tris pH 8.0 i 100 µl 0-32 mM fenilalanina u 100 mM Tris-a, pH 8.0, su dodati u bunare poliakrilne 96-bunarske ploče (Costar # 3625, Corning). Reakcija je kratko mešana i inicijalne mere/vrednosti određene praćenjem apsorbance na 290 nm tokom vremena (svakih 12-20 sek tokom 5-20 min) upotrebom SpectraMax® Plus384 ili SpectraMax® 190 (Molecular Devices) apsorbcionog čitača mikroploče. KMza svaku testiranu FAL varijantu je određena uklapanjem podataka u Lineweaver-Burkeov dijagram, kao što je poznato u struci. Rezultati su prikazani na Slici 3. Kao što je prikazano, KMje bila 74 mM za enzim divljeg tipa i 60 mM za Variantu 36.

Specifičnost aminokiselina:

[0251] Pored fenilalanina neke fenilalaninske amonijak-lijaze pokazuju aktivnost protiv tirozina i/ili histidina. Da bi se utvrdilo jesu li mutacije prisutne u FAL varijantama promenile specifičnost FAL varijanti za fenilalanin, procenjene su aktivnosti divljeg tipa enzima i Varijante 36 na te tri aminokiseline. Prvo, 100 µL 5 g/L liofilizovanog praška koji sadrži FAL u 10 mM natrijum fosfatu pH 7.0 i 100 mL 50 mM fenilalanina ili histidina ili 2.5 mM tirozina u 200 mM natrijum fosfatu pH 7.5 dodati su u bunare poliakrilne 96-bunarske ploče (Costar # 3635, Corning). Rastvori su kratko pomešani i početne vrednosti određene praćenjem apsorbance na 290 nm tokom vremena (svakih 12-20 sek tokom 5-20 min) korišćenjem SpectraMax® Plus384 ili SpectraMax® 190 (Molecular Devices) apsorbcionog čitača mikroploče. Rezultati su prikazani na Slici 4. Kao što je naznačeno, nije uočena aktivnost koja se može detektirati ni za WT (divlji tip) enzim ni za Varijantu br.36 bilo sa histidinom ili tirozinom, što ukazuje da su ti enzimi specifični za fenilalanin.

Rezistencija na svinjske i goveđe proteaze:

[0252] Uzorci FAL varijanti, pripremljeni kako je opisano u Primeru 4, otopljeni su kao 2 g/L u 100 mM natrijum fosfatu pH 7.0. Svinjski tripsin i goveđi himotripsin (100 mg svaki) otopljeni su u 2 ml 100 mM natrijum fosfata pH 7.0 i serijski razblaženi dvostruko jedanaest puta u 100 mM natrijum fosfatu. Nakon toga je 80 µL rasvora enzima FAL varijante pomiješano sa 20 µL rastvora tripsina i himotripsina. Reakcione smeše su inkubirane na 37°C 1 h na 400 rpm (1" odlivanje, bacanje). Zatim je 20 µL reakcione smeše pomešano sa 80 µL vode i 100 µL 100 mM natrijum fosfata, 50 mM fenilalanina, pH 7.0. Svaki rastvor je kratko promešan i aktivnost je određena praćenjem apsorbance na 290 nm tokom vremena (svakih 12-20s tokom 5-20 min) uporabom SpectraMax® Plus384 ili SpectraMax® 190 (Molecular Devices) apsorbcionog čitača mikroploča. Rezultati su prikazani na Slici 2. Kao što je naznačeno na ovoj slici sve testirane varijante pokazale su poboljšanu rezistenciju/otpornost na proteazu, u poređenju sa FAL-om divljeg tipa, pri čemu je Varijanta br.36 bila najstabilnija prema proteolizi.

Rezistencija na humane proteaze:

[0253] Kao što je gore opisano, neke evoluirane/razvijene FAL varijante ispitivane su na svinjski tripsin i goveđi himotripsin kako bi se procenila njihova rezistencija na proteolizu pomoću enzima prisutnih u gastrointestinalnom traktu. Neke od razvijenih FAL varijanti su takođe testirane korišćenjem humanih enzima, kako bi se potvrdilo da su otporne na humane homologe svinjskih ili goveđih enzima. U ovim testovima, liofilizovani prahovi WT FAL i Varijante br.36 (2.4 g/L u 100 mM natrijum fosfata, pH 7.0) su inkubirani sa humanim himotripsinom (Athens Research) 0-80 BTEE jedinica/ml ili humanim tripsinom (ProSpec) (0-10,000 BAEE jedinica/ml) na 37°C tokom 2 h. Zatim je 100 µL smeše dodato u bunare poliakrilne 96-bunarske ploče (Costar # 3635, Corning), praćeno dodavanjem 100 µL 50 mM fenilalanina, 200 mM natrijum fosfata pH 7.0. Rastvor je kratko promešan i početne vrednosti određene praćenjem apsorbance na 290 nm tokom vremena (svakih 12-20s tokom 5-20 min) pomoću SpectraMax® Plus384 ili SpectraMax® 190 (Molecular Devices) apsorpcionog čitača mikroploče. Rezultati su prikazani na Slici 5. Kao što je prikazano na Slici 5, Varijanta br.36 bila je stabilnija od divljeg tipa FAL enzima.

Rezistencija na sirovi ekstrakt pankreasa:

[0254] Razvijene FAL varijante su takođe testirane kako bi se utvrdila njihova rezistencija na enzime pankreasa. Liofilizovani WT FAL prah, liofilizovani prahovi Varijante br. 36, Varijante br. 42 i Varijante br. 43 (pripremljeni kao što je opisano u primeru 4; 12 g/L u 50 mM kalijum fosfatu pH 6.8) pomešani su 1:1 sa svinjskim pankreatinom (4x Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), i inkubirani na 37°C uz mućkanje (400 rpm, 1 "bacanje) u trajanju do 23 h. U naznačenim vremenskim tačkama, 10 µL alikvota reakcije dodato je u 190 µL 50 mM fenilalanina, 190 mM natrijum fosfata pH 7.0, u bunare poliakrilne 96-bunarske ploče (Costar # 3635, Corning). Reakcija je kratko promešana i početne vrednosti određene praćenjem apsorbance na 290 nm tokom vremena (svakih 12-20 sek tokom 5-20 min) upotrebom SpectraMax® Plus384 ili SpectraMax® 190 (Molecular Devices) apsorpcionog čitača mikroploče. Rezultati su prikazani na Slici 6. Kao što je prikazano na Slici 6, Varijanta br.36, Varijanta br.42 i Varijanta br.43, sve su pokazale signifikantnu stabilnost pod ovim uslovima ispitivanja, u poređenju sa divljim tipom FAL enzima.

Uticaj crevnih deterdženata:

[0255] Razvijene FAL varijante su takođe testirane na njihovu osjetljivost na proteolizu u prisustvu ili odsustvu intestinalnih žučnih kiselina i masnih kiselina, kako bi se procenilo da li te kiseline utiču na njihovu stabilnost. Liofilizovani prahovi koji sadrže Varijantu br.36 (pripremljenu kao što je opisano u primeru 4) rastvoreni su kao 50 µg/ml u 0-16 mM natrijum tauroholatu, 100 mM natrijum fosfatu, pH 7.0. Svinjski tripsin i goveđi himotripsin (80 mg svaki) rastvoreni su u 2 ml 100 mM natrijum fosfata pH 7.0 i serijski razblaženi dvostruko jedanaest puta u 100 mM natrijum fosfatu. Za esej, 50 µL FAL rastvora pomiješno je sa 50 µL rastvora proteaze. Smeše su inkubirane na 37°C tokom 1 sata na 400 rpm (1" bacanje). Zatim je 50 µL smeše pomešano sa 150 µL 200 mM natrijum fosfata, 50 mM fenilalanina pH 7.0. Svaka reakcija je kratko promešana i aktivnost određena praćenjem apsorbance na 290 nm tokom vremena (svakih 12-20s tokom 5-20 min) korišćenjem SpectraMax® Plus384 ili SpectraMax® 190 (Molecular Devices) apsorbpcionog čitača mikroploče. Rezultati su prikazani na Slici 7. Kao što je prikazano na ovoj slici, dodatni natrijum tauroholat povećava osetljivost Varijante br.36 na proteolizu.

PRIMER 6

Intestinalna Stabilnost FAL varijante

[0256] Da bi se procenila stabilnost i aktivnost FAL varijanti tokom njihovog prolaska kroz creva životinja, miševi su bili gavažirani (kljukani/hranjeni) sa prečišćenim enzimskim varijantama. Zdravi C57B1/6 miševi, stari 10-12 nedelja i težine 20-26 g, čuvani su u metaboličkom kavezu i držani na postu 15h. Voda je obezbeđivana ad libitum. Nakon prekonoćnog posta, životinje su gavažirane pomoću igle kalibra 21 mešavinom 0.3 mL 0.5 M Tris-HCl pH 8.5 i 8 mg/ml u 0.5 M Tris-HCl pH 8.5, WT FAL (pripemljen kako je opisano u Primeru 4) ili 8 mg/ml u 0.5 M Tris-HCl pH 8.5 Varianta br. 42 (pripremljen kao što je opisano u Primeru 4). U 0.5, 2 ili 6 h nakon hranjenja, životinje su dekapitovane, plazma je sakupljena pomoću epruveta, sa zelenim vrhom, za prikupljanje kapilarne krvi (Ram Scientific), kao i sadržaj želuca, duodenuma (~ 1-8 cm od želuca), jejunuma (~ 10-18 cm od želuca), ileuma (~ 8 cm iznad cekuma) i debelog crijeva (~ 5 cm ispod cekuma). Težina ovih sadržaja je zabeležena i sadržaj sačuvan na -80°C do analiziranja.

[0257] Sadržaj želuca ili creva je razblažen 4x sa 100 mM natrijum fosfatom pH 7.0, kratko promešan i centrifugiran na 14,000 rpm x 2 min. Supernatanti su prebačeni u 350 µL, 0.45 mM, AcroPrep ™ Advanced filtarsku ploču s 96 bunara (FALl Corp) i čestice su uklonjene vakuumskom filtracijom. Prečišćeni filtrat je procenjen na enzimsku aktivnost kako je opisano u prethodnim primerima kao i na prisutnost intaktnog FAL proteina pomoću SDS-PAGE. Rezultati su pokazali da je enzimska aktivnost u duodenumu i jejunumu bila veća za razvijene FAL varijante, u poređenju sa divljim tipom FAL enzima i negativnom kontrolom.

PRIMER 7

Nivoi fenilalanin plazme

[0258] Uzorci plazme sakupljeni od miševa opisanih u Primeru 6 su procenjeni kako bi se odredila količina fenilalanina prisutnog u krvotoku testiranih miševa. Mišja plazma (50 µL) je kombinovana sa 250 µL acetontrila koji je sadržao 0.6 mM dl-fenilalanina (Prsten D5) (tj. izotopski obeležena verzija fenilalanina koja sadrži deuterijum, a ne vodonik vezan sa ugljenicima iz aromatičnog prstena; Cambridge Isotope Laboratories). Uzorci su mešani na sobnoj temperaturi 5 min, centrifugirani na 3200 x g tokom 10 minuta na 4°C i supernatanti prebačeni na ploču za analizu uzorka. Za analizu, 10 µL svakog uzorka je injektirano u a3200 QTRAP® LC / MS / MS sistem (AB Sciex) preko DISCOVERY® C18 kolone (150 x 2.1 mM, 5mm kuglice) (Supelco, sada Sigma-Aldrich), eluirano sa 0.1% mravlje kiseline u vodi (A) i acetonitrilu (B). Uzorci su eluirani preko 5 min gradijenta (t = 0, 97% A; 3 min, 50% A; 3.5 min, 5% A; 4 min, 97% A; 5 min, 95% A) gledajući prelaz 166 do120 za endogeni fenilalanin i 171 do 125 za izotopno obeleženi standard. Rezultati su pokazali da su nivoi fenilalanina u plazmi niži u 30-minutnoj vremenskoj točki u uzorcima miševa kojima je data razvijena FAL varijanta (tj. Varijanta br.42), u poređenju sa divljim tipom FAL enzima i negativnom kontrolom.

PRIMER 8

Terapeutska funkcija FAL varijante

[0259] Da bi se procenilo da li FAL varijante redukuju serumske nivoe Phe in vivo, korišćen je mišji model PKU. U tim eksperimentima, FAL proteini su gavažirani u odabrane životinje. Prvo, konstantni bazični nivo Phe utvrđen je kod miševa uklanjanjem Phe iz njihove ishrane na tri dana, nakon čega je usledila injekcija poznate količine rastvora koji sadrži Phe. Homozigotni PAH enu-2 miševi stari 3 do 6 meseci sa pozadinskim C57B1/6 (Vidi McDonald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1965-1967 [1990]) prebačeni su na ishranu bez fenilalanina (TD.97152, Harlan) sa 0.03 g/L Phe obezbeđenog u vodi za piće tokom 72 h. Pre započinjanja tretmana u vremenu = 0 h, miševi su injektirani sa Phe 0.15 mg/g telesne težine (od 10 g/L rastvora Phe u vodi). Pedeset i pet minuta nakon injektiranja, oko 20 µL krvi je sakupljeno punkcijom iz repne vene i naneto na filter papir. Nakon toga, u vriemenu 1 h, 3 h, i 5 h nakon injektiranja, miševi su gavažirani sa 0.3 ml 50-100 g/L WT AvFAL, WT AvFAL plus aprotinin, BSA, ili sa Varijantom br.42. 6 h-, 7 h- i 9 h nakon injektiranja, dodatni krvni uzorci (mrlje) su sakupljeni na filter papiru. Krvne mrlje su sušene i čuvane na -20°C pre LC-MS/MS analize za utvrđivanje nivoa Phe i Tyr korišćenjem poznatih postupaka (vidi, Chase et al., Clin. Chem, 39: 66-71 [1993] ]).

[0260] Rezultati su prikazani na Slici 8. Kao što je prikazano na ovoj slici, gavaža sa neaktivnim proteinom (BSA), dovela je do povećanja nivoa serumskog Phe. Nasuprot tome, tretman proteolitički osetljivim WT AvFAL rezultirao je konstantnim nivoima Phe, dok je isti protein, u kombinaciji s aprotininom, inhibitorom proteaze, doveo do značajnog pada nivoa Phe. Rezultati takođe pokazuju da je primena modifikovanog FAL-a Varijanta br. 42 rezultirala u snižavanju nivoa serumskog Phe u odsustvu inhibitora proteaze.

PRIMER 9

Deimunizacija FAL-a

[0261] U ovom primeru, opisani su eksperimenti sprovedeni da bi se identifikovale različitosti koje bi uklonile T-ćelijske epitope iz FAL-a.

Identifikacija različitosti deimunizacije:

[0262] Za identifikaciju aminokiselina koje, kada su mutirane, mogu ukloniti T-ćelijske epitope, korišćene su računske metode kako bi se identifikovale FAL sekvence za koje se predviđa da će izazivati T-ćelijski odgovor. Paralelno su sprovedena i eksperimentalna pretraživanja dozvoljenih, ne-štetnih mutacija, posebno za aminokiseline koje održavaju aktivnost proteina u neosporavanom eseju (npr., U esejima opisanim u Primeru 2). Zatim su analizirane aktivne varijante za efekat mutacija na predviđenu imunogenost.

Kompjuterska identifikacija mogućih T-ćelijskih epitopa u varijanti AvFAL:

[0263] Pretpostavljeni T-ćelijski epitopi u AvFAL Varijanti br.36 identifikovni su pomoću Immune Epitope Database (IEDB; baza podataka imunološkog epitopa i analize resursa) alata, kao što je poznato u tehnici i alata za statističku analizu (vidi npr. Iedb.org i Vita et al., Nucl. Acids Res., 38 (izdanje baze podataka): D854-62 [2010]. Epub 2009 Nov 11]). AvFAL varijanta je analizirana u sve moguće 15-merne okvire za analizu, pri čemu svaki okvir preklapa posljednji sa 14 aminokiselina. 15-merni okviri ocenjeni su za imunogeni potencijal ocenjivanjem njihovih 9-mernih centralnih regiona za predviđeno vezanje za osam zajedničkih HLA-DR alela klase II (DRB1*0101, DRB1*0301, DRB1*0401, DRB1*0701, DRB1*0401, DRB1*0701, DRB1*0801, DRB1*1101, DRB1*1301 i DRB1*1501) koji zajedno pokrivaju gotovo 95% ljudske populacije (Vidi npr., Southwood et al., J. Immunol., 160: 3363-3373 [1998]), preporučuje se na internet stranici IEDB-a. Potencijalni klasteri za T-ćelijskih epitopa koji su sadržani u varijanti AvFAL (tj. Sub-regioni sadržani u varijanti AvFAL koji imaju neobično veliki potencijal za imunogenost) identifikovani su uz pomoć alata za statističku analizu, kao što je poznato. Identifikovani klasteri T-ćelijskih epitopa za su poređeni sa IEDB bazom podataka poznatih epitopa i GenBank proteinske bazom podataka. Ovim poređenjima je identifikovano 10 (deset) pretpostavljenih T-ćelijskih epitopa u varijanti AvFAL Varijanta br.36. Ovi epitopi se pominju kao TCE-I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX i X, niže u tekstu.

Dizajn deimunizovanih biblioteka:

[0264] Prvo, razvijena je kombinatorna biblioteka koja sadrži sve neutralne i korisne mutacije identifikovane iz serije usmerenih evolucija koje se korišćene za kreiranje varijanti AvFAL-a, u 10 pretpostavljenih T-ćelijskih epitop regiona, identifikovanih kao što je gore opisano. Analizirani su efekti tih mutacija na predviđeno vezanje na osam uobičajenih HLA-DR alela klase II. Pretpostavljene su višestruke mutacije koje će ukloniti ili smanjiti TCE-I, II, VI, VII. Ove mutacije su kombinovane u kombinatornu biblioteku. Biblioteke su zatim dizajnirane pomoću zasićene mutageneze kako bi se mutirala svaka pojedina aminokiseline unutar preostalih šest T-ćelijskih epitopa (tj. TCE-III, IV, V, VIII, IX i X). Konačno je napravljena kombinatorna biblioteka koja je sadržala korisnu raznovrsnost identifikovanu iz višestrukih serija/krugova evolucije koji su ciljali TCE-I, III, IV, VIII i X, zajedno sa C503 i C565, dve aminokiseline su označene da utiču na agregaciono stanje FAL varijanti. Najbolji pogodci iz ove biblioteke podvrgnuti su daljoj saturacionoj mutagenezi koja je pogađala TCE-III i VIII i dodatnom ciljanom mutagenezom na nekoliko položaja.

Konstrukcija i pregled deimunizovanih biblioteka:

[0265] Kombinatorijske i saturacione mutagenetske biblioteke, dizajnirane kako je gore opisano, konstruisane su već poznatim metodama i i testirane na aktivnost u nespornom eseju kako je opisano u Primeru 2. Aktivne varijante su identifikovane i sekvencirane. Njihove aktivnosti i mutacije u odnosu na AvFAL Variantu Br.36 i brojne AvFAL Variante date su u Tablelama 9-1 do 9-7, ispod.

Identifikacija deimunizujuće raznovrsnosti:

[0266] Aktivne varijante analizirane su na nivo njihove imunogenosti pomoću procene njihovog vezanja za osam uobičajenih HLA-DR alela klase II opisanih gore. Ukupni rezultat imunogenosti i broj imunogenih tačaka prikazani su u Tabelama 9-1 do 9-7. Ukupni rezultat imunogenosti odražava celokupnu predviđenu imunogenost varijante (tj. viša ocena ukazuje na viši nivo predviđene imunogenosti). Imunogeni "broj pogodaka/tačaka" označava broj 15-mernih analiziranih okvira s neuobičajeno visokim potencijalom za imunogenost (tj. veći broj pogodaka/tačaka ukazuje na veći potencijal za imunogenost). Mutacije s nižim ukupno predviđenim rezultatom imunogenosti i / ili brojem imunogenih ta čaka manjim od referentne varijante smatrale su se kao "deimunizirajuće mutacije". Deimunizirajuće mutacije koje su identifikovane kao najbolje rekombinirane su da formiraju brojne varijante koje su aktivne i predviđene su da budu značajno manje imunogene od početne referentne varijante AvFAL. U Tabelama koje slede, prikazani su rezultati FIOP-a iz nepromenjene analize; za ukupni rezultat imunogenosti (TIS) i broj imunogenih tačaka (IHC), rezultati su naznačeni za celi FAL protein (Tabele 9-1, 9-8 i 9-9) ili za naznačeni epitop (Tabele 9-2 do 9-7).

�

11

��

�

��

�

In vitro testiranje deimunizovanih FAL varijanti:

[0267] Deimunizovane FAL varijante su testirane u dendritskom T-ćelijskom eseju da bi se empirijski testirala njihova sposobnost da izazovu T-ćelijski odgovor. Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su izolovane iz humanog donora korišćenjem standardne tehnike. Ove ćelije se koriste kao izvor monocita koji se kultivišu u definisanim medijima da bi se generisale nezrele dendritske ćelije. Ove nezrele dendritične ćelije (DC) su punjene deimunizovanim FAL varijantama i zatim su indukovane u zreliji fenotip daljnjim kultivisanjem u definisanim medijumima da bi se obezbedili antigeni vezani DC. PBMC donori sa CD8+ osiromašenim T-ćelijama,

1

dobijeni iz istih uzoraka donora kao DC obeleženi sa CFSE, zatim kultivisani sa antigen-vezanim DC-ima tokom 7 dana, nakon čega su testirani oktuplikati. Svaka DC-T-ćelijska kultura uključuje skup netretiranih kontrola (tj. negativne kontrole). Test takođe uključuje referentne kontrole antigena (tj. pozitivne kontrole), koje sadrže dva potentna cela protein antigena. Testovi koji koriste ćelije izolovane iz 50 humanih donora sa raznim alelima klase II kompleksa velike histokompatibilnosti pružaju statistički relevantnu procenu kapaciteta FAL varijanti da izazove T-ćelijski odgovor.

1

11

12

��

12

��

12

1

11

��

1

14

1

�

1

��

14

��

14

�

11

12

1

��

�

1

�

1

11

��

�

��

1

�

1

11

��

1

14

�

1

�

1

11

��

1

��

�

Claims

Patentni zahtevi 1. Modifikovani polipeptid koji ima fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost koji obuhvata: a) aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 85% identična sa referentnom sekvencom SEQ ID NO:4 ili njenim funkcionalnim fragmentom; i b) najmanje jednu razliku u aminokiselinskom ostatku kada se uporedi sa SEQ ID NO:4 ili njegovim funkcionalnim fragmentom na jednoj ili više aminokiselinskih pozicija; i c) koji pokazuje poboljšane osobine odabrane od sledećih i) pojačane katalitičke aktivnosti, ii) redukovane osetljivosti na proteolizu, iii) povećane tolerancije na kiselu pH, ili bilo koje kombinacije i), ii), ili iii), kada se uporedi sa referentnom sekvencom SEQ ID NO:4, gde najmanje jedna aminokiselinska razlika je na poziciji 307, i gde su aminokiselinske pozicije numerisane kao referentna sekvenca SEQ ID NO:4.
2. Modifikovani polipeptid iz patentnog zahteva 1, gde: (i) je razlika u aminokiselinskom ostatku kada se uporedi sa SEQ ID NO:4 sledeća substitucija H307G/Q/M kada se optimalno poravna sa polipeptidom SEQ ID NO:4; (ii) je razlika u aminokiselinskom ostatku H307, i jednoj ili više od A39, A91, Q240, A256, N290, Y304, R305, D353, A394, S399, P404, L407, Q521, K522, i T524;

(iii) modifikovani polipeptid ima najmanje oko 90% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO:4; i da je razlika u aminokiselinskom ostatku na poziciji H307, opciono gde je razlika u aminokiselinskom ostatku H307G/Q/M; i/ili (iv) da je poboljšana osobina odabrana od redukovane osetljivosti na proteolizu i/ili povećane tolerancije na kiselu pH.
3. Modifikovani polipeptid iz bilo kog od patentnih zahteva 1 i 2, što je modifikovani polipeptid najmanje oko 95% identičan po sekvenci sa referentnom sekvencom SEQ ID NO:4.
4. Modifikovani polipeptid iz bilo kog od prethodnih patentnih zahteva, što je pomenuti modifikovani polipeptid: (i) termostabilan; (ii) rezistentan na proteolizu, opciono što je pomenuti modifikovani polipeptid rezistentan na proteolizu od strane makar jednog enzima digestivnog trakta, na primer na himotripsin, tripsin, karboksipeptidazu, i/ili elastazu; (iii) stabilan na dejstvo kiseline; i/ili (iv) je prečišćen.
5. Polinukleotidna sekvenca koja kodira makar jedan modifikovan polipeptid iz bio kog prethodnog patentnog zahteva, opciono gde: (i) je pomenuta sekvenca operativno vezana za kontrolnu sekvencu; i/ili (ii) pomenuti polinukleotid je kodon-optimizovan.
6. Ekspresioni vektor koji obuhvata najmanje jednu polinukleotidnu sekvencu iz patentnog zahteva 5, i najmanje jednu kontrolnu sekvencu, opciono što je pomenuta kontrolna sekvenca promotor, na primer što je pomenuti promotor heterologni promotor.
7. Domaćinska ćelija transformisana sa najmanje jednom polinukleotidnom sekvencom iz patentnog zahteva 5, i/ili vektor iz patentnog zahteva 6, opciono što je pomenuta domaćinska ćelija E. coli.
8. Postupak za proizvodnju modifikovanog FAL polipeptida u domaćinskoj ćeliji koja obuhvata gajenje domaćinske ćelije koja sadrži najmanje jedan polinukleotid koji kodira najmanje jedan modifikovani polipeptid koji ima fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 4, i/ili najmanje jednu polinukleotidnu sekvencu iz patentnog zahteva 5, i/ili najmanje jedan vektor iz patentnog zahteva 6, u povoljnim uslovima gajenja, tako da se proizvodi najmanje jedan modifikovani FAL polipeptid, opciono gde pomenuti postupak dalje obuhvata dobijanje najmanje jednog modifikovanog polipeptida koji ima fenilalanin amonijakliaznu (FAL) aktivnost iz kulture i/ili domaćinskih ćelija, na primer gde pomenuti postupak obuhvata korak prečišćavanja pomenutog najmanje jednog modifikovanog dobijenog polipeptida koji ima fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost.
9. Kompozicija koja obuhvata najmanje jedan modifikovani polipeptid koji ima fenilalanin amonijak-liaznu (FAL) aktivnost iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 4, opciono što je pomenuta kompozicija: (i) farmaceutska kompozicija, opciono gde pomenuta farmaceutska kompozicija dalje obuhvata najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv ekcipijent i/ili nosač, i/ili (ii) je pogodna za tretman fenilketonurije.
10. Farmaceutska kompozicija iz patentnog zahteva 9, što je pomenuta kompozicija: (i) pogodna za oralnu administraciju kod ljudi; (ii) da je u obliku pilule, tablete, kapsule, gel kapsule, tečna, ili emulzija, opciono što pomenuta pilula, tableta, ili gel kapsula koja dalje ima enteričnu oblogu; i/ili (iii) se zajedno administrira sa najmanje jednim dodatnim terapeutski efektivnim jedinjenjem, opciono gde pomenuta kompozicija sadrži najmanje jedno dodatno terapeutski efektivno jedinjenje.
11. Farmaceutska kompozicija iz bilo kog od patentnih zahteva 9 i/ili 10 (iii), gde je pomenuta kompozicija pogodna za parenteralno injektiranje kod ljudi.
12. Modifikovani polipeptid na osnovu bilo kog od patentnih zahteva 1-4 ili kompozicija na osnovu bilo kog od patentnih zahteva 9-11 za upotrebu u terapiji.
13. Farmaceutska kompozicija iz bilo kog od patentnih zahteva 9-11 za upotrebu u tretmanu i/ili sprečavanju simptoma fenilketonurije kod subjekta, opciono što: (i) su pomenuti simptomi fenilketonurije ublaženi; (ii) da je pomenuti subjekat u stanju da konzumira ishranu koja je manje ograničena u svom sadžaju metionina, fenilalanina i/ili tirozina u odnosu na ishranu koja se zahteva za subjekte kojima nije obezbeđena makar najmanje jedna farmaceutska kompozicija koja obuhvata najmanje jedan modifikovani polipeptid koji ima fenilalaninsku amonijak-liaznu (FAL) aktivnost kao što je prikazano u patentnim zahtevima 1-5; (iii) pomenuti subjekt je odojče ili dete; ili (iv) pomenuti subjekt je odrasla osoba ili mlada osoba. 1