[go: up one dir, main page]

EA034034B1 - Сконструированные полипептиды фенилаланин-аммиак-лиазы - Google Patents

Сконструированные полипептиды фенилаланин-аммиак-лиазы Download PDF

Info

Publication number
EA034034B1
EA034034B1 EA201591995A EA201591995A EA034034B1 EA 034034 B1 EA034034 B1 EA 034034B1 EA 201591995 A EA201591995 A EA 201591995A EA 201591995 A EA201591995 A EA 201591995A EA 034034 B1 EA034034 B1 EA 034034B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
pal
polypeptide
seq
sequence
amino acid
Prior art date
Application number
EA201591995A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201591995A1 (ru
Inventor
Гьялт В. Хейсман
Николас Дж. Агард
Бенджамин Мейтс
Джонатан Врум
Сиюнь Чжан
Original Assignee
Кодексис, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Кодексис, Инк. filed Critical Кодексис, Инк.
Publication of EA201591995A1 publication Critical patent/EA201591995A1/ru
Publication of EA034034B1 publication Critical patent/EA034034B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y403/00—Carbon-nitrogen lyases (4.3)
    • C12Y403/01—Ammonia-lyases (4.3.1)
    • C12Y403/01005—Phenylalanine ammonia-lyase (4.3.1.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y403/00—Carbon-nitrogen lyases (4.3)
    • C12Y403/01—Ammonia-lyases (4.3.1)
    • C12Y403/01024—Phenylalanine ammonia-lyase (4.3.1.24)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)

Abstract

Изобретение относится к сконструированным полипептидам фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL) и их композициям, а также полинуклеотидам, кодирующим сконструированные полипептиды фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL).

Description

Перекрестная ссылка на родственные заявки
По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной патентной заявки США с серийным номером 61/813586, зарегистрированной 18 апреля 2013 г., и предварительной патентной заявки
США с серийным номером 61/897932, зарегистрированной 31 октября 2013 г., которые обе полностью включены посредством ссылки для всех целей.
Ссылка на приложение списка последовательностей, списка таблиц или компьютерных программ, предоставленное как текстовый файл ASCII
Список последовательностей, записанный в файле СХ7-131WO2_ST25.TXT, созданном 15 апреля 2014 г., 127412 бит, машинного формата IBM-PC, операционной системы MS-Windows, таким образом, полностью включен посредством ссылки.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к сконструированным полипептидам фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL) и их композициям, а также полинуклеотидам, кодирующим сконструированные полипептиды фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL). В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL оптимизируют для обеспечения повышенной каталитической активности, а также сниженной чувствительности к протеолизу и повышенной устойчивости к кислым уровням pH. B некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL являются деиммунизированными. Изобретение также относится к использованию композиций, содержащих сконструированные полипептиды PAL, в терапевтических и промышленных целях.
Уровень техники, предшествующий изобретению
Фенилаланин-аммиак-лиаза PAL наряду с гистидин-аммиак-лиазой (HAL) и тирозин-аммиаклиазой (TAL) являются представителями семейства лиаз ароматических аминокислот (EC 4.3.1.23-1.25 и 4.3.1.3). Более конкретно ферменты, обладающие активностью PAL (EC 4.3.1.23-1.25 и ранее классифицированные как EC 4.3.1.5), катализируют неокислительное дезаминирование L-фенилаланина в (E)коричную кислоту. PAL представляет собой не принадлежащий млекопитающим фермент, который широко распространен у растений, а также его идентифицировали в грибах и в ограниченном числе бактерий. Ферменты PAL можно использовать в качестве терапевтического белка для лечения нарушения обмена веществ, фенилкетонурии (PKU). PKU представляет собой аутосомальное метаболическое генетическое нарушение, при котором фермент печени фенилаланингидроксилаза (РАН) или один или более ферментов, участвующих в синтезе или кругообороте кофактора тетрагидробиоптерина, является нефункциональным вследствие мутации в одном из соответствующих генов. Такой недостаток функциональности приводит к высоким уровням фенилаланина в кровотоке. Фенилаланин преобразуется в фенилпируват (фенилкетон) и другие производные. У людей, если не проводят лечение PKU на ранней стадии, высокие уровни фенилаланина и некоторых его продуктов распада могут вызывать серьезные медицинские проблемы, включая умственную отсталость, микроцефалию и судороги. Многие исследования были посвящены использованию PAL для лечения PKU путем замены ферментов (Ambrus et al., Science, 201:837-839 [1978]; Bourget et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 10:57-59 [1984] и Sarkissian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:2339-2344 [1999]).
Один из способов нейтрализации фенилаланина в кровяном русле заключается в использовании инъецируемой рекомбинантной PAL и вариантов PAL, модифицированных пегилированием (PEG-PAL). Было продемонстрировано, что пегилирование улучшает время полужизни ферментов и снижает антигенный ответ у индивидуума (см., например, WO 2008/153776, WO 2011/097335 и патент США № 7531341). Варианты PAL, пригодные в композициях PEG-PAL были описаны как варианты Nostoc punctiforme (NpPAL); Anabaena variabilis (AvPAL) и Rhodosporidium toruloides (RtPAL) дикого типа. B частности, были описаны варианты AvPAL дикого типа, в которых остатки цистеина в положениях 64, 318, 503 и 565 заменяли серином (см., например, патенты США № 7790433, 7560263 и 7537923).
Альтернативный путь введения PAL в качестве средства снижения концентрации L-фенилаланина в плазме у индивидуумов с PKU, заключается в неинвазивном составе, такой как пероральный состав (Sarkissian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:2339-2344 [1999]). Главным преимуществом пероральной доставки PAL является снижение воздействия фермента на иммунную систему, таким образом, сведение к минимуму иммунного ответа, который наблюдают при инъецируемом PEG-PAL. Однако основным ограничением для перорального состава PAL является потеря ферментативной активности в желудке и просвете кишечника. Для того чтобы являться эффективной и функциональной, PAL должна являться устойчивой к расщеплению под действием кислых pH и протеаз, таких как трипсин, химотрипсин, карбоксипептидазы и пепсин, которые обычно расщепляют белковую пищу до олигопептидов и аминокислот. B некоторых предшествующих исследованиях (Sarkissian, выше) для получения достоверного эффекта при пероральном введении PAL требовалось большое количество фермента частично вследствие ферментативного расщепления протеазами и частично вследствие относительно низкой специфической активности при pH 7,0. Исследовали различные средства для подавления расщепления PAL при пищеварении (Kim et al., Molec. Therap., 10:220-224 [2004] и Shah et al., Int. J. Pharmaceut., 356:61-68 [2008]).
Один из подходов повышения эффективности PAL в жестких условиях желудочно-кишечного тракта заключается в предоставлении сконструированных полипептидов PAL, которые являются устойчивы- 1 034034 ми к естественным тяжелым условиям. Kang et al. использовали сайт-направленный мутагенез участка расщепления химотрипсина и пегилирование поверхностных лизинов AvPAL для снижения протеолитической инактивации (см., Kang et al., Mol. Gen. Metabol., 99:4-9 [2010]). B этих исследованиях десять участков расщепления подвергали конкретным мутациям и все, кроме двух таких получаемых мутантов (F18A и R94G) теряли более 50% исходной ферментативной активности. Ни один из этих мутантов не обладал повышенной активностью, а для мутанта F18A демонстрировали незначительное увеличение устойчивости к трипсину (Kang et al., выше). Дополнительные исследования PAL, несмотря на то, что являлись эффективными, как правило, не приводили к более устойчивому ферменту. Таким образом, пероральное введение ранее описанных мутантов PAL и их производных не приводит к эффективному лечению PKU.
Несмотря на успехи, достигнутые с различными составами PAL, все еще сохраняется потребность в полипептидах PAL, обладающих улучшенными свойствами для перорального введения. Эти улучшенные свойства включают без ограничения большее время полужизни, повышенную каталитическую активность, улучшенную стабильность в условиях пищеварительного тракта и сниженную агрегацию.
В дополнение к терапевтическим применениям ферменты PAL также можно использовать в промышленном синтезе L-фенилаланина и других замещенных производных L-фенилаланина. B дальнейшем такие производные можно использовать в качестве фармацевтических предшественников (Gloge et al., Chem., 6: 3386-3390 [2000], Bartsch et al., Prot. Eng. Des. Sel., 23:929-933 [2010] и Turner, Curr. Opin. Chem. Biol., 234-240 [2011]).
Ферменты PAL также можно использовать в сельскохозяйственных применениях. PAL играет значительную роль в биосинтезе фенилпропаноидов (таких как флавоноиды и лигнин) в растениях, грибах и бактериях и может действовать в качестве связанного с защитной системой фермента (Bate et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:7608-7612 [1994]). Модуляция активности PAL путем использования рекомбинантных полипептидов, обладающих активностью PAL, могут потенциально приводить к эффективным гербицидам.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к сконструированным полипептидам фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL) и их композициям, а также к полинуклеотидам, кодирующим сконструированные полипептиды фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL). B некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL оптимизируют для обеспечения повышенной каталитической активности, а также сниженной чувствительности к протеолизу и повышенной устойчивости к кислым уровням pH. B некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL являются деиммунизированными. Изобретение также относится к использованию композиций, содержащих сконструированные полипептиды PAL, в терапевтических и промышленных целях. B некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к сконструированным полипептидам фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL) и их биологически активным фрагментам и аналогам, обладающим улучшенными свойствами, таким как повышенная устойчивость к кислому pH и/или сниженная чувствительность к протеолизу.
Настоящее изобретение относится к сконструированным полипептидам PAL и их биологически активным фрагментам и аналогам, обладающим улучшенными свойствами по сравнению с ферментом PAL дикого типа или эталонным полипептидом PAL, по существу, в одних и тех же условиях. Изобретение дополнительно относится к способам использования сконструированных полипептидов PAL и их биологически активных фрагментов и аналогов в терапевтических и/или промышленных композициях и способам использования таких композиций для терапевтических и/или промышленных целей.
В первом аспекте изобретение относится к сконструированным полипептидам фенилаланинаммиак-лиазы (PAL), где сконструированный полипептид PAL обладает улучшенным свойством, выбранным из группы из i) повышенной каталитической активности, ii) сниженной чувствительности к протеолизу, iii) повышенной устойчивости к кислому pH, iv) сниженной агрегации или комбинации любого из i), ii), iii) или iv) по сравнению с эталонной последовательностью при измерении, по существу, в одних и тех же условиях. B некоторых конкретных вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL обладают двумя улучшенными свойствами. B других конкретных вариантах осуществления улучшенное свойство представляет собой сниженную чувствительность к протеолизу и в еще одних других вариантах осуществления улучшенное свойство представляет собой повышенная устойчивость к кислому pH.
Во втором аспекте сконструированные полипептиды PAL включают белки, обладающие по меньшей мере 85% идентичностью аминокислотных последовательностей с SEQ ID NO: 4 или ее функциональным фрагментом и различием аминокислотных остатков в положении, соответствующем положениям Х39, Х91, Х158, Х180, Х195, Х243, Х245, Х256, Х257, Х270, Х290, Х307, Х308, Х326, Х349, Х364, Х394, Х399, Х400, Х404, Х407, Х443, Х453, Х459, Х460, Х463, Х474, Х522, Х524 и Х528 при оптимальном выравнивании с полипептидом SEQ ID NO: 4.
В некоторых конкретных вариантах осуществления первого и второго аспектов сконструированные полипептиды PAL облают по меньшей мере одним различием аминокислотных остатков одного или более положений аминокислотных остатков, соответствующих А39, А91, Y158, S180, K195, Т243, I245,
- 2 034034
A256, L257, N270, N290, Н307, Е308, 1326, L349, L364, А394, S399, N400, Р404, L407, F443, N453, Y459, Т460, Т463, N474, K522, Т524 и Р528 при оптимальном выравнивании с полипептидом SEQ ID NO: 4. B некоторых конкретных вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL обладают по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15 и по меньшей мере 20 различиями аминокислотных остатков в сравнении с эталонным полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.
В других конкретных вариантах осуществления первого и второго аспектов сконструированные полипептиды PAL обладают по меньшей мере 90% (по меньшей мере 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 и 99%) идентичностью аминокислотных последовательностей с SEQ ID NO: 4. B еще одних дополнительных конкретных вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL обладают по меньшей мере 90% (по меньшей мере 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 и 99%) идентичностью аминокислотных последовательностей с SEQ ID NO: 4 и содержат одну или более следующих замен: A39V, A91V, Y158H, S180A, K195E, T243I/L, I245L, A256G, L257W/A, N270K, N290G, H307G/Q/M, E308Q, I326F, L349M, L364Q, A394V, S399N, N400K, Р404А L407V, F443H, N453G, Y459F, T460G, T463N, N474Q, K522Y/F/N, T524S иP528L.
В других конкретных вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL получают из PAL дикого типа Anabaena variabilis (таких как АТСС29413; эталонная последовательность белка NCBI YP_324488.1, SEQ ID NO: 4).
В третьем аспекте сконструированные полипептиды, обладающие активностью фенилаланинаммиак-лиазы (PAL), предусматриваемые изобретением, содержат аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 10 или ее функциональным фрагментом.
В четвертом аспекте сконструированные полипептиды, обладающие активностью фенилаланинаммиак-лиазы (PAL), предусматриваемые изобретением, содержат аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 10, или ее функциональным фрагментом и дополнительно обладающую различием аминокислотных остатков по сравнению с SEQ ID NO: 10 в одном, двух, трех, четырех, пяти, шести или более положений аминокислот.
В пятом аспекте изобретение относится к полинуклеотидной последовательности, кодирующей любой из сконструированных полипептидов PAL, как описано в настоящем описании.
В шестом аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции или промышленной композиции, содержащей любой из сконструированных полипептидов PAL, как описано в настоящем описании.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к сконструированным полипептидам, обладающим активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), a) содержащим аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью последовательности с эталонной последовательностью SEQ ID NO: 4 или ее функциональным фрагментом; b) обладающих различием аминокислотных остатков по сравнению с SEQ ID NO: 4 или ее функциональным фрагментом в одном или более положений аминокислот, и c) которые обладают улучшенным свойством, выбранным из i) повышенной каталитической активности, ii) сниженной чувствительности к протеолизу, iii) повышенной устойчивости к кислому pH, iv) сниженной агрегации или комбинаций любого из i), ii), iii) или iv), по сравнению с эталонной последовательностью. В некоторых вариантах осуществления одно или более положений аминокислот выбраны из Х39, Х54, Х59, Х73, Х91, Х158, Х112, Х134, Х180, Х195, Х240, Х243, Х245, Х256, Х257, Х270, Х290, Х304, Х305, Х307, Х308, Х326, Х349, Х353, Х364, Х394, Х399, Х400, Х404, Х407, Х443, Х453, Х459, Х460, Х463, Х474, Х509, Х521, Х522, Х524, Х528, Х546, Х564 и/или их сочетаний при оптимальном выравнивании с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4. B некоторых дополнительных вариантах осуществления улучшенное свойство выбрано из сниженной чувствительности к протеолизу и/или повышенной устойчивости к кислому pH. B дополнительных вариантах осуществления эталонная последовательность представляет собой PAL дикого типа, получаемый из Anabaena variabilis. B некоторых дополнительных вариантах осуществления аминокислотный остаток эталонной последовательности SEQ ID NO: 4 соответствует А39, Т54, G59, S73, А91, Y158, S180, K195, А112, R134, Q240, Т243, 1245, А256, L257, N270, N290, Y304, R305, Н307, Е308, 1326, L349, D353, L364, А394, S399, N400, Р404, L407, F443, N453, Y459, Т460, Т463, N474, Е509, Q521, K522, Т524, Р528, S546 и/или Р564. B некоторых вариантах осуществления различие аминокислотного остатка по сравнению с SEQ ID NO: 4 выбрано из одной или более следующих замен: A39V, Т541<. G59R, S73K, А112С, R134Q, A91V, Y158H, S180A, K195E, Q240R/W, T243I/L, I245L, A256G, L257W/A, N270K, N290G, Y304H, R305M, H307G/Q/M, E308Q, I326F, L349M, D353A/N, L364Q, A394V, S399N, N400K, Р404A, L407V, F443H, N453G, Y459F, T460G, T463N, N474Q, E509L, Q521K/S, K522Y/F/N, T524S, P528L, S546R и P564G/L/M при оптимальном выравнивании с полипептидом SEQ ID NO: 4. B некоторых дополнительных вариантах осуществления сконструированный полипептид обладает по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизи
- 3 034034 тельно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или приблизительно 100% идентичностью последовательности с эталонной последовательностью SEQ ID NO: 4. B некоторых дополнительных вариантах осуществления сконструированный полипептид обладает по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с эталонной последовательностью SEQ ID NO: 4. B некоторых дополнительных вариантах осуществления сконструированный полипептид обладает по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью последовательности с эталонной последовательностью SEQ ID NO:4. B некоторых дополнительных вариантах осуществления сконструированный полипептид обладает по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности с эталонной последовательностью SEQ ID NO: 4. B некоторых дополнительных вариантах осуществления сконструированный полипептид обладает по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 4 и различием аминокислотного остатка в положении Н307. B некоторых дополнительных вариантах осуществления сконструированный полипептид обладает по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с эталонной последовательностью SEQ ID NO: 4. B некоторых дополнительных вариантах осуществления сконструированный полипептид обладает по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с эталонной последовательностью SEQ ID NO: 4. B некоторых дополнительных вариантах осуществления сконструированный полипептид обладает по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 4 и различием аминокислотных остатков в положении Н307. B некоторых дополнительных вариантах осуществления различие аминокислотного остатка представляет собой H307G/Q/M. B некоторых дополнительных вариантах осуществления различие аминокислотного остатка выбрано из комбинации одного или более A39, А91, Q240, А256, N290, Y304, R305, Н307, D353 А394, S399, Р404, L407, Q521, K522 и Т524.
Настоящее изобретение также относится к сконструированным полипептидам, обладающим активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), содержащим аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или по меньшей мере приблизительно 100% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 и/или 14 или ее функциональным фрагментом. B некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды, обладающие активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), содержат аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 и/или 14 или ее функциональным фрагментом.
В некоторых дополнительных вариантах осуществления сконструированные полипептиды, обладающие активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), содержат аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 и/или 14 или ее функциональным фрагментом.
Настоящее изобретение также относится к сконструированным полипептидам, обладающим активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), содержащим аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 и/или 14 или ее функциональным фрагментом. B некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды, обладающие активностью фенилаланин-аммиаклиазы (PAL), содержат аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 и/или 14 или ее функциональным фрагментом.
В некоторых дополнительных вариантах осуществления сконструированные полипептиды, обладающие активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), содержат аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 и/или 14 или ее функциональным фрагментом. B некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды, обладающие активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), содержат аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 и/или 14 или ее функциональным фрагментом. B некоторых дополнительных вариантах осуществления сконструированные полипептиды, обладающие активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), содержат аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 и/или 14 или ее функциональным фрагментом.
Настоящее изобретение также относится к сконструированным полипептидам, обладающим активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), содержащим аминокислотную последовательность, обла
- 4 034034 дающую по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или по меньшей мере приблизительно 100% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 4 или ее функциональным фрагментом, где сконструированный полипептид является деиммунизированным. Настоящее изобретение также относится к сконструированным полипептидам, обладающим активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), содержащим аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:4 или ее функциональным фрагментом, где сконструированный полипептид является деиммунизированным. B некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды, обладающие активностью фенилаланинаммиак-лиазы (PAL), содержат аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 4 или ее функциональным фрагментом, где сконструированный полипептид является деиммунизированным. B некоторых дополнительных вариантах осуществления сконструированный полипептид, обладающий активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), представляет собой вариант PAL, приведенный в любой из табл. с 9-1 по 9-7. B некоторых вариантах осуществления деиммунизированный сконструированный полипептид, обладающий активностью фенилаланин-аммиак-лиаза (PAL), содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 и/или 14.
Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидным последовательностям, кодирующим сконструированные полипептиды, обладающие активностью PAL, представленной в настоящем описании.
B некоторых вариантах осуществления полинуклеотидная последовательность является функционально связанной с контролирующей последовательностью. Настоящее изобретение дополнительно относится к векторам, содержащим по меньшей мере одну полинуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере неконструируемый полипептид, обладающий активностью PAL. Настоящее изобретение также относится к клеткам-хозяевам, трансформируемым по меньшей мере одной полинуклеотидной последовательностью, кодирующей сконструированный полипептид, обладающий активностью PAL, как предоставлено в настоящем описании.
Настоящее изобретение дополнительно относится к способам продукции сконструированного полипептида PAL в клетке-хозяине, включающим культивирование клетки-хозяина, содержащей по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере один сконструированный полипептид PAL, в подходящих условиях культивирования. Настоящее изобретение дополнительно относится к способам продукции сконструированного полипептида PAL в клетке-хозяине, включающим культивирование клетки-хозяина, содержащей полинуклеотид, кодирующий сконструированный полипептид PAL в подходящих условиях культивирования. B некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают выделения сконструированного полипептида PAL из культуры и/или клеток-хозяев.
Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим по меньшей мере один сконструированный полипептид, обладающий активностью PAL, как предоставлено в настоящем описании.
B некоторых вариантах осуществления композиция представляет собой фармацевтическую композицию, дополнительно содержащую фармацевтически приемлемый носитель. Настоящее изобретение дополнительно относится к видам использования таких композиций.
Настоящее изобретение также относится к сконструированным полипептидам, обладающим активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), содержащим: a) аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 86%, по меньшей мере приблизительно 87%, по меньшей мере приблизительно 88%, по меньшей мере приблизительно 89%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или большей идентичностью последовательности с эталонной последовательностью, обладающей активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), или ее функциональным фрагментом; b) полипептидную последовательность, обладающую по меньшей мере одним различием аминокислотного остатка по сравнению с эталонной последовательностью, обладающей активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), или ее функциональным фрагментом в одном или более положений аминокислот, и c) которые обладают улучшенным свойством, выбранным из i) повышенной каталитической активности, ii) сниженной чувствительности к протеолизу, iii) повышенной устойчивости к кислому pH, iv) сниженной агрегации, v) сниженной иммуногенности или сочетания любых из i), ii), iii), iv) или v) по сравнению с эталонной последовательностью, обладающей активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL). B некоторых вариантах осуществления эталонная последовательность представляет собой прокариотическую PAL, при этом в
- 5 034034 некоторых других вариантах осуществления эталонная последовательность представляет собой эукариотическую PAL. B некоторых вариантах осуществления эталонная последовательность представляет собой бактериальную PAL (например, PAL Anabaena variabilis), при этом в некоторых других вариантах осуществления он представляет собой PAL человека или другую PAL. B некоторых дополнительных вариантах осуществления эталонная последовательность представляет собой последовательность дикого типа (например, PAL дикого типа A. variabilis), при этом в некоторых альтернативных вариантах осуществления эталонная последовательность представляет собой вариант фермента (например, сконструированный полипептид, обладающий активностью PAL).
В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды, обладающие активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), по настоящему изобретению содержат: a) аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 86%, по меньшей мере приблизительно 87%, по меньшей мере приблизительно 88%, по меньшей мере приблизительно 89%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или большей идентичностью последовательности с эталонной последовательностью SEQ ID NO: 4 или ее функциональным фрагментом; b) полипептидную последовательность, обладающую по меньшей мере одним различием аминокислотного остатка по сравнению с SEQ ID NO: 4 или ее функциональным фрагментом в одном или более положений аминокислот, и c) которые обладают улучшенным свойством, выбранным из i) повышенной каталитической активности, ii) сниженной чувствительности к протеолизу, iii) повышенной устойчивости к кислому pH, iv) сниженной агрегации, v) сниженной иммуногенности или сочетания любых из i), ii), iii), iv) или v) по сравнению с эталонной последовательностью SEQ ID NO:4.
B некоторых дополнительных вариантах осуществления сконструированные полипептиды, обладающие активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), содержат: a) аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или большей идентичностью последовательности с эталонной последовательностью SEQ ID NO: 4, или ее функциональный фрагмент; b) полипептидную последовательность, обладающую по меньшей мере одним различием аминокислотного остатка по сравнению с SEQ ID NO: 4 или ее функциональным фрагментом в одном или более положений аминокислот; и c) которые обладают улучшенным свойством, выбранным из i) повышенной каталитической активности, ii) сниженной чувствительности к протеолизу, iii) повышенной устойчивости к кислому pH, iv) сниженной агрегации, v) сниженной иммуногенности или сочетания любых из i), ii), iii), iv) или v), по сравнению с эталонной последовательностью SEQ ID NO: 4.
В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды, обладающие активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), содержат по меньшей мере одну замену(ы) в одном или более из следующих положений аминокислот: 20, 24, 27, 39, 43, 45, 47, 54, 58, 59, 62, 70, 73, 80, 82, 91, 94, 98, 104, 105, 110, 112, 115, 117, 118, 119, 121, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 139,
140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 149, 150, 151, 153, 154, 156, 157, 158, 159, 172, 174, 175, 176,177,
178, 180, 187, 191, 195, 199, 205, 206, 210, 212, 213, 214, 232, 240, 243, 245, 247, 248, 250, 256, 257,266,
270, 275, 278, 279, 285, 286, 289, 290, 292, 304, 305, 307, 308, 309, 319, 321, 326, 331, 332, 334, 349,353,
355, 364, 365, 369, 370, 371, 372, 374, 375, 377, 378, 379, 381, 382, 383, 384, 385, 387, 389, 394, 396,399,
400, 403, 404, 407, 417, 418, 425, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 443, 446, 447, 453, 456,459,
460, 461, 463, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 482, 483, 503, 507, 509, 521, 522, 524, 525,528,
538, 546, 547, 551, 558, 560, 564, 565 и/или любых их сочетаниях, где положения аминокислот нумеруют со ссылкой на SEQ ID NO: 4.
B некоторых вариантах осуществления аминокислотный остаток эталонной последовательности SEQ ID NO: 4 соответствует А39, Т54, G59, S73, А91, Y158, S180, K195, А112, R134, Q240, Т243, I245, А256, L257, N270, N290, Y304, R305, Н307, E308, I326, L349, D353, L364, А394, S399, N400, P404, L407, F443, N453, Y459, Т460, Т463, N474, Е509, Q521, K522, Т524, Р528, S546 и/или P564. B некоторых дополнительных вариантах осуществления различие аминокислотного остатка по сравнению с SEQ ID NO: 4 выбрано из одной или более следующих замен: A39V, Т541<. G59R, S73K, A112C, R134Q, A91V, Y158H, S180A, K195E, Q240R/W, T243I/L, I245L, A256G, L257W/A, N270K, N290G, Y304H, R305M, H307G/Q/M, E308Q, I326F, L349M, D353A/N, L364Q, A394V, S399N, N400K, P404A, L407V, F443H, N453G, Y459F, T460G, T463N, N474Q, E509L, Q521K/S, K522Y/F/N, T524S, P528L, S546R и P564G/L/M, при оптимальном выравнивании с полипептидом SEQ ID NO: 4. B некоторых дополнительных вариантах осуществления сконструированный полипептид обладает по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 4 и различием аминокислотного остатка в положении H307. B некоторых вариантах осуществления различие аминокислотного остатка представляет собой
- 6 034034
H307G/Q/M. B некоторых предпочтительных вариантах осуществления различие аминокислотного остатка выбрано из комбинации одного или более A39, А91, Q240, А256, N290, Y304, R305, Н307, D353,
А394, S399, Р404, L407, Q521, K522 и Т524.
В некоторых дополнительных вариантах осуществления улучшенное свойство сконструированных полипептидов, обладающих активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), выбрано из сниженной чувствительности к протеолизу и/или повышенной устойчивости к кислому pH.
Настоящее изобретение также относится к сконструированным полипептидам, обладающим активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), содержащим: a) аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 86%, по меньшей мере приблизительно 87%, по меньшей мере приблизительно 88%, по меньшей мере приблизительно 89%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или большей идентичностью последовательности с эталонной последовательностью SEQ ID NO: 10 или ее функциональным фрагментом; b) полипептидную последовательность, обладающую по меньшей мере одним различием аминокислотного остатка по сравнению с SEQ ID NO: 10 или ее функциональным фрагментом в одном или более положений аминокислот, и c) которые обладают улучшенным свойством, выбранным из i) повышенной каталитической активности, ii) сниженной чувствительности к протеолизу, iii) повышенной устойчивости к кислому pH, iv) сниженной агрегации, v) сниженной иммуногенности или сочетания любых из i), ii), iii), iv) или v), по сравнению с эталонной последовательностью SEQ ID NO: 10.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение также относится к сконструированным полипептидам, обладающим активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), содержащим: a) аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или большей идентичностью последовательности с эталонной последовательностью SEQ ID NO: 10 или ее функциональным фрагментом; b) полипептидную последовательность, обладающую по меньшей мере одним различием аминокислотного остатка по сравнению с SEQ ID NO: 10 или ее функциональным фрагментом в одном или более положений аминокислот, и c) которые обладают улучшенным свойством, выбранным из i) повышенной каталитической активности, ii) сниженной чувствительности к протеолизу, iii) повышенной устойчивости к кислому pH, iv) сниженной агрегации, v) сниженной иммуногенности или сочетания любых из i), ii), iii), iv) или v), по сравнению с эталонной последовательностью SEQ ID NO: 10.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение также относится к сконструированным полипептидам, обладающим активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), содержащим: a) аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью последовательности с эталонной последовательностью SEQ ID NO: 10 или ее функциональным фрагментом; b) полипептидную последовательность, обладающую по меньшей мере одним различием аминокислотного остатка по сравнению с SEQ ID NO: 10 или ее функциональным фрагментом в одном или более положений аминокислот; и c) которые обладают улучшенным свойством, выбранным из i) повышенной каталитической активности, ii) сниженной чувствительности к протеолизу, iii) повышенной устойчивости к кислому pH, iv) сниженной агрегации, v) сниженной иммуногенности или сочетания любых из i), ii), iii), iv) или v), по сравнению с эталонной последовательностью SEQ ID NO: 10.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение также относится к сконструированным полипептидам, обладающим активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), содержащим аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью последовательности с эталонной последовательностью SEQ ID NO: 10 и по меньшей мере одним различием аминокислотного остатка по сравнению с SEQ ID NO: 10, и которая обладает по меньшей мере одним улучшенным свойством, выбранным из повышенной каталитической активности, сниженной чувствительности к протеолизу, повышенной устойчивости к кислому pH, сниженной агрегации и/или сниженной иммуногенности по сравнению с SEQ ID NO: 10.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение также относится к сконструированным полипептидам, обладающим активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), где различие аминокислотного остатка по сравнению с SEQ ID NO: 10 выбрано из одной или более следующих ниже замен или серии замен:
- 7 034034
I27E/V39A; 127E/V39A/R43L/V105С/А153R/L214Е/Р266H/L278D/C503Q
I27E/V39A/R43L/L214E/A547D;
127E/V39A/V105С/А112C/R134Q/L214E/L278D/C503Q/A547D/C565N;
127E/V39A/V105С/А112C/R134Q/A153R/Q205T/L214Е/Р266H/L278D/C503Q/ A551D; I27E/V39A/V105С/А112C/Q205Т/Р210С/Р266H/C503Q/A547D
127E/V39A/V105C/A112C/Q205T/P266Н/1285E/C503Q/A551D;
127E/V39A/V105C/A112C/L214Е/1285E/C503Q/A547D; I27E/V39A/V105C/S131N/R134Q/Q205T/L214E/C503Q/A547D/C565N;
127E/V39A/V105C/R134Q/A153R/P210C/L278D/1285E/C503Q/A547D/A551D; 127E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/P210C/L278D/C503Q/A547D;
I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/L214E; I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/L214E/A551D/C565N;
127E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/L278D/1285E/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C; I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E
127E/V39A/V105C/R134Q/P210C/L214Е/1285E/A547D;
I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E/C503Q/A551D/C565N;
127E/V39A/V105C/R134Q/L214E/L278D/A547D/A551D;
127E/V39A/V105C/R134Q/L214Е/1285E/C503Q/A547D/A551D;
127E/V39A/V105C/R134Q/P266H/C503Q;
127E/V39A/V105C/R134Q/P266H/C503Q/A547D/A551D;
127E/V39A/V105C/R134Q/L278D/C503Q/C565N;
127E/V39A/V105C/R134Q/L278D/1285E/C503Q;
127E/V39A/V105C/R134Q/L278D/A551D;
I27E/V39A/V105C/R134Q/I285E/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/R134Q/C503Q/A551D;
- 8 034034
I27E/V39A/V105C/A153R/Q205T/L278D/C503Q/A547D/A551D;
I27E/V39A/V105C/A153R/L214E; I27E/V39A/V105C/A153R/I285E
I27E/V39A/V105C/A153R/C503Q/A547D/C565N;
I27E/V39A/V105C/A153R/A551D/C565N;
I27E/V39A/V105C/Q205T/P210C/L214E/L278D/A547D;
127E/V39A/V105C/Q205Т/Р210C/L278D/C503Q;
127E/V39A/V105C/Q205Т/Р210C/L278D/A547D;
I27E/V39A/V105C/Q205T/L214E/L278D/C503Q/A547D;
127E/V39A/V105C/Q205T/L278D/C503Q/A547D;
I27E/V39A/V105C/P210C/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N;
127E/V39A/V105С/Р210C/L214Е/Р266H/L278D;
I27E/V39A/V105C/L214E/P266H/C503Q/A547D/C565N;
I27E/V39A/V105C/L214E/L278D/L309P/C503Q/A547D/A551D;
127E/V39A/V105C/L278D/C503Q/A547D/C565N;
I27E/V39A/V105C/I285E/A547D; I27E/V39A/V105C/C503Q/A551D
I27E/V39A/V105C/C503Q/A547D/A551D/C565N;
I27E/V39A/A112C/R134Q/Q205T/P210C/L214E/A551D/C565N;
127E/V39А/А112C/R134Q/L214Е/Р266H/A551D;
127E/V39А/А112C/R134Q/L214Е/С503Q/A547D;
127E/V39А/А112C/R134Q/P266Н/1285Е;
I27E/V39A/A112C/Q205T/L214E/P266H/C503Q/A551D/C565N;
127E/V39А/А112C/Q205T/L278D/1285Е; I27E/V39A/A112C/L214E
127E/V39А/А112C/L214E/L278D/C503Q/A547D/A551D;
I27E/V39A/A112C/I285E; I27E/V39A/A112C/A547D; I27E/V39A/R134Q
127E/V39A/R134Q/A153R/Q205T/L214Е/Р266H/C503Q;
127E/V39A/R134Q/A153R/P210C/L214E/L278D/1285Е/А547D/C565N;
I27E/V39A/R134Q/A153R/L214E/P266H/L278D/C503Q/A547D/C565N;
127E/V39A/R134Q/A153G/L214Е/Р266Н/1285E/C503Q/A551D/C565N;
I27E/V39A/R134Q/A153R/L214E/C503Q/A547D;
127E/V39A/R134Q/A153R/L278D;
127E/V39A/R134Q/A153R/L278D/A547D/A551D;
I27E/V39A/R134Q/A153R/A547D;
127E/V39A/R134Q/Q205T/L214Е/Р266Н/1285E/C503Q/A551D/C565N;
I27E/V39A/R134Q/Q205T/P266H/C503Q/A551D/C565N;
127E/V39A/R134Q/P210C/L214Е/С503Q;
I27E/V39A/R134Q/P210C/C503Q/A551D;
- 9 034034
127E/V39A/R134Q/L214Е/Р266H/A551D;
127E/V39A/R134Q/L278D/1285E/C503Q/A547D/A551D;
I27E/V39A/R134Q/L278D/C503Q/A547D; I27E/V39A/R134Q/C503Q/A547D;
I27E/V39A/R134Q/A547D/C565N; I27E/V39A/Q205T/L214E/C503Q/C565N;
127E/V39A/Q205Т/Р266Н/1285Е/А547D/A551D/C565N;
127E/V39A/Q205Т/Р266H/A551D;
127E/V39A/Q205T/L278D/C503Q/A551D/C565N;
127E/V39A/Q205T/L278D/C503Q/C565N;
I27E/V39A/Q205T/C503Q/A547D/C565N; 127E/V39А/Р210С/Т212S;
127E/V39А/Р210C/L214E/L278D/C503Q/A551D;
I27E/V39A/P210C/L214E/I285E/C503Q/A551D;
127E/V39А/Р210С/Р266Н/1285E/C503Q/A547D;
127E/V39А/Р210С/Р266H/C503Q/A551D; I27E/V39A/L214E;
127E/V39A/L214Е/Р266H/L278D/C503Q/A547D/A551D/C565N;
127E/V39A/L214E/L278D/C503Q;
127E/V39A/L214E/L278D/C503Q/A547D/C565N;
I27E/V39A/L214E/C503Q/A551D; I27E/V39A/P266Н;
I27E/V39A/P266H/L278D; I27E/V39A/L278D; I27E/V39A/L278D/A547D;
127E/V39A/L278D/1285E/C503Q/A547D; I27E/V39A/L278D/C503Q/C565N; I27E/V39A/C503Q; I27E/G45D/Q205Т/Р266H/C565N; I27E/V105C;
I27E/V105C/R134Q/A153R/P210C/L214E/C503Q/A547D;
127E/V105C/R134Q/A153R/1285Е/А547D;
I27E/V105C/R134Q/A153R/C503Q;
I27E/V105C/R134Q/Q205T/P210C/C503Q;
127E/V105C/R134Q/Q205T/L214Е/Р266H/L278D/C503Q/C565N;
127E/V105C/Q205Т/Р266H/C503Q;
I27E/V105C/R134Q/P210C/L214E/P266H/L278D/A551D/C565N;
I27E/V105C/R134Q/P210C/L214E/C503Q/A551D/C565N;
127E/V105C/R134Q/P210С/Р266H/L278D/1285E/C503Q/A551D/C565N;
127E/V105C/R134Q/L214E/L278D/C503Q/A547D;
127E/V105C/R134Q/L214E/L278D/C503Q/A547D/A551D/C565N;
I27E/V105C/Q205T; I27E/V105C/Q205T/L214E/P266H;
127E/V105C/Q205T/L214Е/Р266H/A551D/C565N;
127E/V105C/Q205T/L214E/L278D/1285E/C503Q/A547D/A551D/C565N;
I27E/V105C/Q205T/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V105C/L214E;
127E/V105C/L214Е/Р266H/C503Q;
- 10 034034
127E/V105C/L214Е/1285E/A551D/C565N; I27E/V105C/L214E/A547D/A551D/C565N;
I27E/V105C/L214E/A551D/C565N; I27E/V105C/P266H;
127E/V105С/Р266Н/1285E/C503Q/A547D/C565N;
127E/V105C/L278D/A547D;
127E/V105С/1285E/C503Q/A547D/A551D/C565N;
I27E/V105C/C503Q/A547D/C565N;
I27E/V105C/C503Q/A547D/A551D/C565N;
127Е/А112C/R134Q/A153R/L214Е/Р266H/C503Q;
127Е/А112C/R134Q/L278D/1285E/C503Q/A551D/C565N;
127Е/А112C/R134Q/Q205T/L278D/C503Q;
127Е/А112C/R134Q/Q205Т/1285E/C503Q;
127Е/А112C/Q205Т/Р266H/L278D/1285E/C503Q;
I27E/A112C/P210C/L214E/C503Q/A547D; I27E/R134Q;
127E/R134Q/A153R/1285E/C503Q/A547D;
I27E/R134Q/Q205T/I285E/C503Q/A551D;
127E/R134Q/Q205Т/Р266H/L278D/A547D; I27E/R134Q/P210C;
I27E/R134Q/L214E/C503Q; I27E/R134Q/L214E/C503Q/A547D;
I27E/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D;
I27E/R134Q/L214E/C503Q/C565N;
127E/R134Q/L278D/1285E/A551D/C565N; I27E/R134Q/I285E/C503Q;
127Е/А153R/L214E/L278D/1285E/A551D/C565N;
127Е/А153R/L214E/L278D/A551D; I27E/Q205T;
127E/Q205T/L214E/L278D/1285E/C503Q/C565N; I27E/Q205T/L214E/C503Q/A547D/C565N;
127E/Q205Т/Р266H/L278D/1285E/A551D/C565N;
I27E/Q205T/L278D/A551D; I27E/P210C;
I27E/P210C/L214E/C503Q/A547D; I27E/P210C/L278D/C503Q;
I27E/P210C/C503Q; I27E/P210C/C503Q/C565N; I27E/P210C/A551D;
I27E/L214E; I27E/L214E/P266H/L278D/I285E/A551D;
127E/L214E/L278D; I27E/L214E/L278D/C503Q; I27E/L214E/C503Q;
I27E/L214E/C503Q/A547D; I27E/L214E/C503Q/A547D/C565N;
I27E/L214E/A551D; I27E/P266H/L278D/C503Q;
I27E/P266H/A547D/A551D; I27E/L278D/C503Q/A551D;
I27E/L278D/C503Q/A551D/C565N; I27E/A547D/C565N;
V39A/G45S/L278D/C503Q/A551D; V39A/V105C/R134Q/A153R/Q205T/A551D;
- 11 034034
V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E/A551D;
V39A/V105C/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D;
V39A/V105С/А153R/P266Н/А547D/A551D; V39A/V105C/Q205T/C503Q;
V39A/V105C/Q205T/A551D; V39A/V105C/P210C/A547D;
V39A/V105C/L214E/P266H/A547D/C565N;
V39A/V105C/L214Е/1285E/C503Q/A551D/C565N;
V39A/A112C/R134Q/Q205T/L214E/L278D;
V39A/A112C/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D;
V39A/A112C/A153R/Q205T/L278D/C503Q/A547D; V39A/R134Q;
V39A/R134Q/Q205T/L214E/C503Q/C565N;
V39A/R134Q/P210C/L214E/A547D/C565N; V39A/A153R/C503Q/A547D;
V3 9A/Q205T/L278D/A547D/A551D;
V39A/P210C/L214E/L278D/1285E/C503Q/A551D; V39A/P266H;
V39A/P275R/L278D/C503Q/A551D; V39A/C503Q;
V39A/C503Q/A551D/C565N; V105C;
VI05C/A112C/R134Q/Q205T/L214Е/Y492H/C503Q/A547D;
V105C/R134Q/A153R/Q205T/L214E/C503Q;
V105C/R134Q/Q205T/L214E/A547D; V105C/R134Q/Q205T/P266H/L278D;
V105C/R134Q/L214E/P266H/I285E/C503Q/A551D/C565N;
VI05C/R134Q/L214E/L278D/C565N; V105C/R134Q/L214E/C503Q/A547D;
V105C/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D; V105C/R134Q/C503Q;
V105C/R134Q/C503Q/A547D; V105C/R134Q/C503Q/A547D/C565N;
VI05C/A153R/Q205T/L214E/P266H/C503Q/A547D;
VI05C/A153R/Q205T/P266Н/1285E/A547D/C565N;
V105C/Q205T/P210C/L214E/C503Q/A547D; V105C/Q205T/L214E/L278D;
V105C/Q205T/L214E/C503Q/A547D/A551D/C565N;
V105C/Q205T/C503Q/A551D; V105C/L214E/P266H/L278D/A547D;
VI05C/L214E/L278D/C503Q/A547D/A551D; VI05C/L214Е/1285E;
VI05C/L214Е/1285E/C503Q/A547D/A551D/C565N;
VI05C/L214Е/1285E/A547D/C565N; VI05C/L278D/C503Q/A551D;
V105C/I285E; V105C/I285E/A547D; V105C/C503Q; VI05C/A547D/A551D;
Al12C/R134Q/A153R/L214E/L278D/1285E/C503Q/A547D/A551D/C565N;
A112C/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D/C565N; Al 12C/L214E/L278D;
Al12C/L278D/C503Q/A547D;
R134Q/Q205T/L214Е/1285E/C503Q/A551D/C565N; R134Q/Q205T/C503Q;
R134Q/P210C/L214E/L278D/C503Q/A547D/C565N;
R134Q/P210C/L214E/C503Q/A547D/A551D; R134Q/L214E;
R134Q/L214E/L278D/C503Q; R134Q/L214E/L278D/C503Q/A551D;
R134Q/L214Е/1285E/C503Q; R134Q/C503Q; R134Q/C503Q/A547D/A551D;
A153R; Q205T/L214Е/1285E/C503Q/A551D;
Q205T/L214Е/1285E/C503Q/C565N; Q205T/L214E/C503Q/A547D/C565N;
Q205T/L278D/1285E/A547D/A551D; P210C/L214E; P210C/L214E/P266H;
L214E/P266H; L214E/P266H/C503Q/A547D/A551D/C565N;
L214E/C503Q/A547D; L214E/A547D; P266H/L278D/C503Q; P266H/C565N;
L278D/A547D; C503Q; C503Q/A547D; C503Q/A547D/A551D/C565N;
C503Q/A547D/C565N; C503Q/A551D; C503Q/A551D/C565N; A547D и/или
C565N.
В некоторых дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение также относится к сконструированным полипептидам, обладающим активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), где различие аминокислотного остатка по сравнению с SEQ ID NO: 10 выбрано из одной или более следую- 12 034034 щих ниже замен или серии замен:
V80I/R134C/P564Q; V121C; A123G; A124G; M125L;
L126I/T; L126M/R134L; L127A; A129G/L; N130Q; N130C/M370I R134W;
M133R; R134I; R134N/G307C; G135C/S и/или G135A/A394E.
В некоторых дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение также относится к сконструированным полипептидам, обладающим активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), где различие аминокислотного остатка по сравнению с SEQ ID NO: 10 выбрано из одной или более следующих ниже замен или серии замен:
G20S/I144L; R43S; L47M/I144L; L47M/R146E;
L47М/М147G/A38ЗЕ; L47M/P157C; Q58H/L143V; Q58K/P157D/G369C;
IA62S/M147V; S82I/G135O/P157F/W279L; R94C/I149E; T110I/I139R;
L118M/L141H; A119E/T156H/A289D; I139M/V; R140D/G/M; R140N/A199Е; R140E/A334S/A551D; L141K/Q/P/T; E142H/P/V; E142D/G371D; L143F/M; I144L/N/V; K145N/Q/R; K145G/P157T; R146H/L; R146W/D191Y; М147А; I149L/R; F150K/L/M; L151M; A153C/G; A153S/H250N; G154R;
G154Y/L174M/Q321K/S456I/G483C; T156K/G483C; P157D/F/H/Y; Y158E;
V159C/H/L/M; M247I; L319M и/или Q389K.
В еще одних некоторых дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение также относится к сконструированным полипептидам, обладающим активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), где различие аминокислотного остатка по сравнению с SEQ ID NO: 10 выбрано из одной или более следующих ниже замен или серии замен:
P117T/Y176Q; V172I/C/L;
L174M; S175G; Y176Е/I/М/R/V; I177M/V; T178L/A477S и/или S180C/T.
В некоторых дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение также относится к сконструированным полипептидам, обладающим активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), где различие аминокислотного остатка по сравнению с SEQ ID NO: 10 выбрано из одной или более следующих ниже замен или серии замен:
R43S/H374K; R43S/H374R; A112S/M370A/A507E;
M147I/H374S; S187R/L381V; D191Y/H385N; A232S; Q240K/H374R;
IA256S/L381N; P275Q/M370S; P275T/H374R; Q332K/Y377M; A334S/H374V;
L349M; Q355K/H374S; M370G/I/S; G371H/N/Q/S; M372A/V;
H374A/D/G/L/N/R/S/T; H374Q/P396Q; H374R/G417C; L375I; L375M;
Y377C/I/N; Y378C/D/E/I/L/N/S; Y378F/P404Q; I379C/H/L/M/N;
L381G/V; L381M/Q560K; L382C/H/I/M/S; A383S/V; K384R; H385C/G/N;
Н385М/Р403Н; H385S/P403H; D387S; L418M; G425V; A447S; S461G и/или S525L.
В некоторых дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение также относится к сконструированным полипептидам, обладающим активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), где различие аминокислотного остатка по сравнению с SEQ ID NO: 10 выбрано из одной или более следующих ниже замен или серии замен:
A24S/F434M; A62S/T433N; S98I; L213M/S438L;
Q240K/T433Y; S286R/Y435T; A289S/L431E; S331I; L431C/E/G/P/S/V;
L432C/V; T433A/I/L/N/P/Q/R/S/V/W; F434C; Y435L; Y435Q/H446N;
G436M; G436D/T; N437E/G/Q; N437T/L538M; S438C/F/M/R/T;
I439C/F/L/V и/или A477S.
В некоторых дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение также относится к сконструированным полипептидам, обладающим активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), где различие аминокислотного остатка по сравнению с SEQ ID NO: 10 выбрано из одной или более следующих ниже замен или серии замен:
А24Е; Q58R/Y475H; A70S/N474E; L104M/V476L;
A119E/G365A; L206M; P275Q; G276V; Q292H/A479G; Q355H/I478C;
P404T/A477V; I471F/G/K/M/N/R/V/W; F472G; Q473H/K/M/R/S;
Q473H/A507S; N474A/H/R/W; N474D/R490H; Y475C/F/L/Q; V476C/I/L;
I478N/S; A479G/S; F482C/L; G483C/H/S; G483A/S524I; G483R/G537C и/или A558S.
- 13 034034
В некоторых дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение также относится к сконструированным полипептидам, обладающим активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), где различие аминокислотного остатка по сравнению с SEQ ID NO: 10 выбрано из одной или более следующих ниже замен или серии замен:
V39A/K115E/M133R/C565N;
V39A/M133R/F472G/C503Q/C565N; V39A/M133R/F472G/C565N;
V39A/M133R/C503Q; V39A/M133R/C503Q/C565N;
V39A/M147A/Y378E/C503Q/C565N; V39A/M147A/Y378E/C565N;
V39A/M147A/L381G/F472G/C503Q/C565N;
V39A/M147A/L381G/C503Q/C565N; V39A/M147A/F472G/C503Q/C565N;
V39А/М147А/F472G/C565N; V39A/M147A/C565N;
V39A/G248C/L381G/F472G/C503Q/C565N; V39A/Y378E/C503Q/C565N;
V39A/Y378E/C565N; V39A/L381G; V39A/F472G/C503Q/C565N;
V39A/C503Q/C565N; M133R/L381G/C565N; M133R/C503Q; Y378D/C503Q;
Y378Е/F472G/C503Q/C565N; L381G/F472GC503Q/C565N и/или
F472G/C503Q/C565N.
В еще одних других некоторых дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение также относится к сконструированным полипептидам, обладающим активностью фенилаланин-аммиаклиазы (PAL), где различие аминокислотного остатка по сравнению с SEQ ID NO: 10 выбрано из одной или более следующих ниже замен или серии замен:
I27E/V39A;
I27E/V39A/R43L/V105C/A153R/L214E/P266H/L278D/C503Q;
I27E/V39A/R43L/L214E/A547D;
127E/V39A/V105С/А112C/R134Q/L214E/L278D/C503Q/A547D/C565N;
I27E/V39A/V105С/А112C/R134Q/A153R/Q205T/L214Е/Р266H/L278D/C503Q/
A551D; I27E/V39A/V105C/A112C/Q205T/P210C/P266H/C503Q/A547D;
127E/V39A/V105С/А112C/Q205Т/Р266Н/1285E/C503Q/A551D;
I27E/V39A/V105C/A112C/L214E/I285E/C503Q/A547D;
I27E/V39A/V105C/S131N/R134Q/Q205T/L214E/C503Q/A547D/C565N;
127E/V39A/V105C/R134Q/A153R/P210C/L278D/I285Е/С503Q/A547D/A551D;
127E/V39A/V105C/R134Q/Q205Т/Р210C/L278D/C503Q/A547D;
- 14 034034
I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/L214E;
I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/L214E/A551D/C565N;
127E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/L278D/1285E/C503Q/A547D/A551D/C565N;
I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C; I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E
127E/V39A/V105C/R134Q/P210C/L214Е/1285Е/А547D;
I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E/C503Q/A551D/C565N;
127E/V39A/V105C/R134Q/L214E/L278D/A547D/A551D;
127E/V39A/V105C/R134Q/L214Е/1285E/C503Q/A547D/A551D;
I27E/V39A/V105C/R134Q/P266H/C503Q;
127E/V39A/V105C/R134Q/P266H/C503Q/A547D/A551D;
127E/V39A/V105C/R134Q/L278D/C503Q/C565N;
127E/V39A/V105C/R134Q/L278D/1285E/C503Q;
I27E/V39A/V105C/R134Q/L278D/A551D;
127E/V39A/V105C/R134Q/1285Е/А547D/A551D;
I27E/V39A/V105C/R134Q/C503Q/A551D;
127E/V39A/V105С/А153R/Q205T/L278D/C503Q/A547D/A551D;
I27E/V39A/V105C/A153R/L214E; I27E/V39A/V105C/A153R/I285E
I27E/V39A/V105C/A153R/C503Q/A547D/C565N;
I27E/V39A/V105C/A153R/A551D/C565N;
127E/V39A/V105C/Q205Т/Р210C/L214E/L278D/A547D;
127E/V39A/V105C/Q205Т/Р210C/L278D/C503Q;
127E/V39A/V105C/Q205Т/Р210C/L278D/A547D;
127E/V39A/V105C/Q205T/L214E/L278D/C503Q/A547D;
127E/V39A/V105C/Q205T/L278D/C503Q/A547D;
I27E/V39A/V105C/P210C/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N;
127E/V39A/V105С/Р210C/L214Е/Р266H/L278D;
127E/V39A/V105C/L214Е/Р266H/C503Q/A547D/C565N;
127E/V39A/V105C/L214E/L278D/L309P/C503Q/A547D/A551D;
127E/V39A/V105C/L278D/C503Q/A547D/C565N;
127E/V39A/V105С/1285Е/А547D; I27E/V39A/V105C/C503Q/A551D
I27E/V39A/V105C/C503Q/A547D/A551D/C565N;
I27E/V39A/A112C/R134Q/Q205T/P210C/L214E/A551D/C565N;
127E/V39А/А112C/R134Q/L214Е/Р266H/A551D;
I27E/V39A/A112C/R134Q/L214E/C503Q/A547D;
I27E/V39A/A112C/R134Q/P266H/I285E;
127E/V39А/А112C/Q205T/L214Е/Р266H/C503Q/A551D/C565N;
- 15 034034
127E/V39А/А112C/Q205T/L278D/1285Е; I27E/V39A/A112C/L214E
127E/V39А/А112C/L214E/L278D/C503Q/A547D/A551D;
I27E/V39A/A112C/I285E; I27E/V39A/A112C/A547D; I27E/V39A/R134Q
127E/V39A/R134Q/A153R/Q205T/L214Е/Р266H/C503Q;
127E/V39A/R134Q/A153R/P210C/L214E/L278D/1285Е/А547D/C565N;
127E/V39A/R134Q/A153R/L214Е/Р266H/L278D/C503Q/A547D/C565N;
127E/V39A/R134Q/A153G/L214Е/Р266Н/1285E/C503Q/ A551D/ C565N.
I27E/V39A/R134Q/A153R/L214E/C503Q/A547D;
I27E/V39A/R134Q/A153R/L278D;
I27E/V39A/R134Q/A153R/L278D/A547D/A551D;
I27E/V39A/R134Q/A153R/A547D;
127E/V39A/R134Q/Q205T/L214Е/Р266Н/1285E/C503Q/A551D/C565N;
127E/V39A/R134Q/Q205Т/Р266H/C503Q/A551D/C565N;
I27E/V39A/R134Q/P210C/L214E/C503Q;
I27E/V39A/R134Q/P210C/C503Q/A551D;
127E/V39A/R134Q/L214Е/Р266H/A551D;
127E/V39A/R134Q/L278D/1285E/C503Q/A547D/A551D;
I27E/V39A/R134Q/L278D/C503Q/A547D; I27E/V39A/R134Q/C503Q/A547D
I27E/V39A/R134Q/A547D/C565N; I27E/V39A/Q205T/L214E/C503Q/C565N
127E/V39A/Q205Т/Р266Н/1285Е/А547D/A551D/C565N;
127E/V39A/Q205Т/Р266H/A551D;
127E/V39A/Q205T/L278D/C503Q/A551D/C565N;
127E/V39A/Q205T/L278D/C503Q/C565N;
I27E/V39A/Q205T/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/P210C/T212S
127E/V39А/Р210C/L214E/L278D/C503Q/A551D;
I27E/V39A/P210C/L214E/I285E/C503Q/A551D;
127E/V39А/Р210С/Р266Н/1285E/C503Q/A547D;
127E/V39А/Р210С/Р266H/C503Q/A55ID; I27E/V39A/L214E
127E/V39A/L214Е/Р266H/L278D/C503Q/A547D/A551D/C565N;
127E/V39A/L214E/L278D/C503Q;
127E/V39A/L214E/L278D/C503Q/A547D/C565N;
I27E/V39A/L214E/C503Q/A551D; I27E/V39A/P266Н
I27E/V39A/P266H/L278D; I27E/V39A/L278D; I27E/V39A/L278D/A547D
127E/V39A/L278D/1285E/C503Q/A547D; I27E/V39A/L278D/C503Q/C565N I27E/V39A/C503Q; I27E/G45D/Q205Т/Р266H/C565N; I27E/V105C
I27E/V105C/R134Q/A153R/P210C/L214E/C503Q/A547D;
- 16 034034
127E/V105C/R134Q/A153R/1285Е/А547D;
I27E/V105C/R134Q/A153R/C503Q;
127E/V105C/R134Q/Q205Т/Р210C/C503Q;
127E/V105C/R134Q/Q205T/L214Е/Р266H/L278D/C503Q/C565N;
I27E/V105C/Q205T/P266H/C503Q;
127E/V105C/R134Q/P210C/L214Е/Р266H/L278D/A551D/C565N;
127E/V105C/R134Q/P210C/L214E/C503Q/A551D/C565N;
127E/V105C/R134Q/P210С/Р266H/L278D/1285E/C503Q/A551D/C565N;
127E/V105C/R134Q/L214E/L278D/C503Q/A547D;
127E/V105C/R134Q/L214E/L278D/C503Q/A547D/A551D/C565N;
I27E/V105C/Q205T; 127E/V105C/Q205T/L214Е/Р266Н
127E/V105C/Q205T/L214Е/Р266H/A551D/C565N;
127E/V105C/Q205T/L214E/L278D/1285E/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V105C/Q205T/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V105C/L214E
I27E/V105C/L214E/P266H/C503Q;
127E/V105C/L214Е/1285E/A551D/C565N;
I27E/V105C/L214E/A547D/A551D/C565N;
I27E/V105C/L214E/A551D/C565N; 127E/V105С/Р266Н
127E/V105С/Р266Н/1285E/C503Q/A547D/C565N;
127E/V105C/L278D/A547D;
127E/V105С/1285Е/С503Q/A547D/A551D/C565N;
I27E/V105C/C503Q/A547D/C565N;
I27E/V105C/C503Q/A547D/A551D/C565N;
127Е/А112C/R134Q/A153R/L214Е/Р266H/C503Q;
127Е/А112C/R134Q/L278D/1285E/C503Q/A551D/C565N;
127Е/А112C/R134Q/Q205T/L278D/C503Q;
127Е/А112C/R134Q/Q205Т/1285E/C503Q;
127Е/А112C/Q205Т/Р266H/L278D/1285E/C503Q;
127Е/А112С/Р210C/L214E/C503Q/A547D; I2 7E/R134Q
I27E/R134Q/A153R/I285E/C503Q/A547D;
127E/R134Q/Q205Т/1285E/C503Q/A551D;
127E/R134Q/Q205Т/Р266H/L278D/A547D; I27E/R134Q/P210C
I27E/R134Q/L214E/C503Q; I27E/R134Q/L214E/C503Q/A547D
I27E/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D;
I27E/R134Q/L214E/C503Q/C565N;
I27E/R134Q/L278D/I285E/A551D/C565N; I27E/R134Q/I285E/C503Q
- 17 034034
127Е/А153R/L214E/L278D/1285E/A551D/C565N;
127Е/А153R/L214E/L278D/A551D; I27E/Q205T;
127E/Q205T/L214E/L278D/1285E/C503Q/C565N;
I27E/Q205T/L214E/C503Q/A547D/C565N;
127E/Q205Т/Р266H/L278D/1285E/A551D/C565N;
127E/Q205T/L278D/A551D; I27E/P210C;
I27E/P210C/L214E/C503Q/A547D; I27E/P210C/L278D/C503Q;
I27E/P210C/C503Q; I27E/P210C/C503Q/C565N; I27E/P210C/A551D;
I27E/L214E; 127E/L214Е/Р266H/L278D/1285E/A551D;
127E/L214E/L278D; I27E/L214E/L278D/C503Q; I27E/L214E/C503Q;
I27E/L214E/C503Q/A547D; I27E/L214E/C503Q/A547D/C565N;
I27E/L214E/A551D; I27E/P266H/L278D/C503Q;
I27E/P266H/A547D/A551D; I27E/L278D/C503Q/A551D;
I27E/L278D/C503Q/A551D/C565N; I27E/A547D/C565N;
V39A/G45S/L278D/C503Q/A551D; V39A/V105C/R134Q/A153R/Q205T/A551D;
V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E/A551D;
V39A/V105C/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D;
V39A/V105С/А153R/P266Н/А547D/A551D; V39A/V105C/Q205T/C503Q;
V39A/V105C/Q205T/A551D; V39A/V105C/P210C/A547D;
V39A/V105C/L214E/P266H/A547D/C565N;
V39A/V105C/L214Е/1285E/C503Q/A551D/C565N;
V39A/A112C/R134Q/Q205T/L214E/L278D;
V39A/A112C/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D;
V39A/A112C/A153R/Q205T/L278D/C503Q/A547D; V39A/R134Q;
V39A/R134Q/Q205T/L214E/C503Q/C565N;
V39A/R134Q/P210C/L214E/A547D/C565N; V39A/A153R/C503Q/A547D;
V39A/Q205T/L278D/A547D/A551D;
V39A/P210C/L214E/L278D/1285E/C503Q/A551D; V39A/P266H;
V39A/P275R/L278D/C503Q/A551D; V39A/C503Q;
V39A/C503Q/A551D/C565N; V105C;
V105C/A112C/R134Q/Q205T/L214E/Y492H/C503Q/A547D;
V105C/R134Q/A153R/Q205T/L214E/C503Q;
V105C/R134Q/Q205T/L214E/A547D; VI05C/R134Q/Q205T/P266H/L278D;
VI05C/R134Q/L214E/P266Н/1285E/C503Q/A551D/C565N;
V105C/R134Q/L214E/L278D/C565N; V105C/R134Q/L214E/C503Q/A547D;
V105C/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D; V105C/R134Q/C503Q;
- 18 034034
V105C/R134Q/C503Q/A547D; V105C/R134Q/C503Q/A547D/C565N
Vl05С/А153R/Q205T/L214Е/Р266H/C503Q/A547D;
Vl05C/A153R/Q205T/P266Н/1285E/A547D/C565N;
V105C/Q205T/P210C/L214E/C503Q/A547D; V105C/Q205T/L214E/L278D
V105C/Q205T/L214E/C503Q/A547D/A551D/C565N;
V105C/Q205T/C503Q/A551D; Vl05C/L214Е/P266H/L278D/A547D
Vl05C/L214E/L278D/C503Q/A547D/A551D; V105C/L214E/I285E
Vl05C/L214Е/1285E/C503Q/A547D/A551D/C565N;
Vl05C/L214Е/1285E/A547D/C565N; V105C/L278D/C503Q/A551D
V105C/I285E; V105C/I285E/A547D; V105C/C503Q; V105C/A547D/A551D Al12C/R134Q/A153R/L214E/L278D/1285E/C503Q/A547D/A551D/C565N; A112C/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D/C565N; A112C/L214E/L278D
Al12C/L278D/C503Q/A547D;
R134Q/Q205T/L214Е/1285E/C503Q/A551D/C565N; R134Q/Q205T/C503Q
R134Q/P210C/L214E/L278D/C503Q/A547D/C565N;
R134Q/P210C/L214E/C503Q/A547D/A551D; R134Q/L214E
R134Q/L214E/L278D/C503Q; R134Q/L214E/L278D/C503Q/A551D
R134Q/L214Е/1285E/C503Q; R134Q/C503Q; R134Q/C503Q/A547D/A551D
A153R; Q205T/L214E/I285E/C503Q/A551D
Q205T/L214Е/1285E/C503Q/C565N; Q205T/L214E/C503Q/A547D/C565N.
Q205T/L278D/1285E/A547D/A551D; P210C/L214E; P210C/L214E/P266H
L214E/P266H; L214E/P266H/C503Q/A547D/A551D/C565N.
L214E/C503Q/A547D; L214E/A547D; P266H/L278D/C503Q; P266H/C565N.
L278D/A547D; C503Q; C503Q/A547D; C503Q/A547D/A551D/C565N.
C503Q/A547D/C565N; C503Q/A551D; C503Q/A551D/C565N; A547D; C565N. V80I/R134C/P564Q; V121C; A123G; A124G; M125L; L126I/T
L126M/R134L; L127A; A129G/L; N130Q; N130C/M370I R134W; M133R. R134I; R134N/G307C; G135C/S; G135A/A394E; G20S/I144L; R43S
L47M/I144L; L47M/R146E; L47M/M147G/A383E; L47M/P157C
Q58H/L143V; Q58K/P157D/G369C; A62S/M147V
S82I/G135C/P157F/W279L; R94C/I149E; T110I/I139R; L118M/L141H
A119E/T156H/A289D; I139M/V; R140D/G/M; R140N/A199E
R140E/A334S/A551D; L141K/Q/P/T; E142H/P/V; E142D/G371D; L143F/M. I144L/N/V; K145N/Q/R; K145G/P157T; R146H/L; R146W/D191Y; M147A. I149L/R; F150K/L/M; L151M; A153C/G; A153S/H250N; G154R.
G154Y/Ll74M/Q321K/S4561/G483C; T156K/G483C; P157D/F/H/Y; Y158E
- 19 034034
V159C/H/L/M; M247I; L319M; Q389K; P117T/Y176Q; V172I/C/L; L174M;
S175G; Y176E/I/M/R/V; I177M/V; T178L/A477S; S180C/T; R43S/H374K;
R43S/H374R; Al 12S/M370А/А507Е; M147I/H374S; S187R/L381V;
D191Y/H385N; A232S; Q240K/H374R; A256S/L381N; P275Q/M370S;
P275T/H374R; Q332K/Y377M; A334S/H374V; L349M; Q355K/H374S;
M370G/I/S; G371H/N/Q/S; M372A/V; H374A/D/G/L/N/R/S/T;
H374Q/P396Q; H374R/G417C; L375I; L375M; Y377C/I/N;
Y378C/D/E/I/L/N/S; Y378F/P404Q; I379C/H/L/M/N; L381G/V;
L381M/Q560K; L382С/Н/I/М/S; A383S/V; K384R; H385C/G/N;
H385M/P403H; H385S/P403H; D387S; L418M; G425V; A447S; S461G;
S525L; A24S/F434M; A62S/T433N; S98I; L213M/S438L; Q240K/T433Y; S286R/Y435T; A289S/L431E; S331I; L431C/E/G/P/S/V; L432C/V;
T433A/I/L/N/P/Q/R/S/V/W; F434C; Y435L; Y435Q/H446N; G436M;
G436D/T; N437E/G/Q; N437T/L538M; S438C/F/M/R/T; I439C/F/L/V;
A477S; A24E; Q58R/Y475H; A70S/N474E; L104M/V476L; A119E/G365A; L206M; P275Q; G276V; Q292H/A479G; Q355H/I478C; P404T/A477V;
I471F/G/K/M/N/R/V/W; F472G; Q473H/K/M/R/S; Q473H/A507S;
N474A/H/R/W; N474D/R490H; Y475C/F/L/Q; V476C/I/L; I478N/S;
A479G/S; F482C/L; G483C/H/S; G483A/S524I; G483R/G537C; A558S;
V39A/K115E/M133R/C565N; V39A/M133R/F472G/C503Q/C565N;
V39A/M133R/F472G/C565N; V39A/M133R/C503Q;
V39A/M133R/C503Q/C565N; V39A/M147A/Y378E/C503Q/C565N;
V39A/M147A/Y378E/C565N; V39A/M147A/L381G/F472G/C503Q/C565N;
V39A/M147A/L381G/C503Q/C565N; V39A/M147A/F472G/C503Q/C565N;
V39A/M147А/F472G/C565N; V39A/M147A/C565N;
V39A/G248C/L381G/F472G/C503Q/C565N; V39A/Y378E/C503Q/C565N;
V39A/Y378E/C565N; V39A/L381G; V39A/F472G/C503Q/C565N;
V39A/C503Q/C565N; M133R/L381G/C565N; M133R/C503Q; Y378D/C503Q;
Y378E/F472G/C503Q/C565N; L381G/F472GC503Q/C565N и/или
F472G/C503Q/C565N.
Настоящее изобретение также относится к сконструированным полипептидам, обладающим активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), содержащим: a) аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 86%, по меньшей мере приблизительно 87%, по меньшей мере приблизительно 88%, по меньшей мере приблизительно 89%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или большей идентичностью последовательности с эталонной последовательностью SEQ ID NO: 26 или ее функциональным фрагментом; b) полипептидную последовательность, обладающую по меньшей мере одним различием аминокислотного остатка по сравнению с SEQ ID NO: 26 или ее функциональным фрагментом в одном или более положений аминокислот, и c) которые обладают улучшенным свойством, выбранным из i) повышенной каталитической активности, ii) сниженной чувствительности к протеолизу, iii) повышенной устойчивости к кислому pH, iv) сниженной агрегации, v) сниженной иммуногенности или сочетания любых из i), ii), iii), iv) или v), по сравнению с эталонной последовательностью SEQ ID NO: 26.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение также относится к сконструированным полипептидам, обладающим активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), содержащим: a) аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или большей идентичностью последовательности с эталонной последовательностью SEQ ID NO: 26 или ее функциональным фрагментом; b) полипептидную последовательность, содержащую по меньшей мере одним различием аминокислотного остатка по сравнению с SEQ ID NO: 26 или ее функциональный фрагмент в
- 20 034034 одном или более положений аминокислот, и с) которые обладают улучшенным свойством, выбранным из
i) повышенной каталитической активности, ii) сниженной чувствительности к протеолизу, iii) повышенной устойчивости к кислому pH, iv) сниженной агрегации, v) сниженной иммуногенности или сочетания любых из i), ii), iii), iv) или v), по сравнению с эталонной последовательностью SEQ ID NO: 26.
В некоторых дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к сконструированным полипептидам, обладающим активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), содержащим: a) аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью последовательности с эталонной последовательностью SEQ ID NO: 26 или ее функциональным фрагментом; b) полипептидную последовательность, обладающую по меньшей мере одним различием аминокислотного остатка по сравнению с SEQ ID NO: 26 или ее функциональным фрагментом в одном или более положений аминокислот, и с) которые обладают улучшенным свойством, выбранным из i) повышенной каталитической активности, ii) сниженной чувствительности к протеолизу, iii) повышенной устойчивости к кислому pH, iv) сниженной агрегации, v) сниженной иммуногенности или сочетания любых из i), ii) , iii), iv) или v), по сравнению с эталонной последовательностью SEQ ID NO: 26. B некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды, обладающие активностью фенилаланин-аммиаклиазы (PAL) по настоящему изобретению, содержат аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью последовательности с эталонной последовательностью SEQ ID NO: 26 и по меньшей мере одним различием аминокислотного остатка по сравнению с SEQ ID NO: 126, и которая обладает по меньшей мере одним улучшенным свойством, выбранным из повышенной каталитической активности, сниженной чувствительности к протеолизу, повышенной устойчивости к кислому pH, сниженной агрегации и/или сниженной иммуногенности, по сравнению с SEQ ID NO: 26. B некоторых вариантах осуществления сконструированных полипептидов различие аминокислотного остатка по сравнению с SEQ ID NO: 26 выбрано из одной или более следующих ниже замен или серии замен:
A24E/G381L, L127V, A129I/V, S131C/T, H132L/S, R134C/F/H/K, R134H/Y378E/G381L, R134H/Y378E/G381L/V388T, R134H/V388T, А136Н, A289S, M372L, H374G/M/Q,
G381A/C/F/I/L/M/N/Q/S/T, А383С/М, V388C/T, L431M и/или L563M.
В некоторых вариантах осуществления сконструированный полипептид, обладающий активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL) по настоящему изобретению, обладает по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью последовательности с эталонной последовательностью SEQ ID NO: 4. B некоторых вариантах осуществления сконструированный полипептид, обладающий активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL) по настоящему изобретению, обладает по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью последовательности с эталонной последовательностью SEQ ID NO: 4, при этом в некоторых дополнительных вариантах осуществления сконструированный полипептид обладает по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности с эталонной последовательностью SEQ ID NO: 4. B некоторых вариантах осуществления сконструированный полипептид, обладающий активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), по настоящему изобретению обладает по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с эталонной последовательностью SEQ ID NO: 4. B некоторых вариантах осуществления сконструированный полипептид, обладающий активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL) по настоящему изобретению, обладает по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с эталонной последовательностью SEQ ID NO: 4, при этом в некоторых дополнительных вариантах осуществления сконструированный полипептид обладает по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с эталонной последовательностью SEQ ID NO: 4. B некоторых дополнительных вариантах осуществления сконструированные полипептиды содержат функциональные фрагменты полипептидов (например, любого из вариантов, предоставленных в таблицах в настоящем описании), обладающих активностью фенилаланин-аммиаклиазы (PAL) по настоящему изобретению.
В некоторых вариантах осуществления сконструированный полипептид, обладающий активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL) по настоящему изобретению, обладает по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 и/или 26. B некоторых вариантах осуществления сконструированный полипептид, обладающий активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL) по настоящему изобретению, обладает по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 6, 8,
- 21 034034
10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 и/или 26. В некоторых вариантах осуществления сконструированный полипептид, обладающий активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 и/или 26. B некоторых вариантах осуществления сконструированный полипептид, обладающий активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 и/или 26 или ее функциональным фрагментом. B некоторых дополнительных вариантах осуществления сконструированные полипептиды содержат функциональные фрагменты полипептидов (например, функциональные фрагменты SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 и/или 26, а также любой из вариантов, предоставленных в таблицах в настоящем описании), обладающих активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL) по настоящему изобретению.
Настоящее изобретение также относится к сконструированным полипептидам, обладающим активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), где сконструированные полипептиды представляют собой варианты PAL, приведенные в любой из табл. 2-1 - 2-5 и/или табл. с 9-1 по 9-7.
В некоторых вариантах осуществления сконструированный полипептид, обладающий активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), представляет собой фермент Anabaena variabilis. B некоторых дополнительных вариантах осуществления сконструированные полипептиды, обладающие активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), являются термостабильными. В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды, обладающие активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), являются устойчивыми к протеолизу. B некоторых дополнительных вариантах осуществления сконструированные полипептиды, обладающие активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), являются устойчивыми к протеолизу по меньшей мере одним ферментом желудочно-кишечного тракта. B некоторых дополнительных вариантах осуществления сконструированные полипептиды, обладающие активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), являются устойчивыми к протеолизу химотрипсином, трипсином, карбоксипептидазами и/или эластазами. B некоторых дополнительных вариантах осуществления сконструированный полипептид, обладающий активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), является кислотостойким.
Настоящее изобретение также относится к сконструированным полипептидам, обладающим активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), которые являются деиммунизированными. B некоторых вариантах осуществления деиммунизированные сконструированные полипептиды содержат аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или большей идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 и/или 26. B некоторых дополнительных вариантах осуществления деиммунизированные сконструированные полипептиды содержат аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или большей идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 и/или 26. В некоторых вариантах осуществления деиммунизированные сконструированные полипептиды содержат аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 и/или 26. B некоторых вариантах осуществления деиммунизированные сконструированные полипептиды содержат аминокислотную последовательность, обладающую 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 и/или 26.
В еще одних других некоторых дополнительных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к очищенным сконструированным полипептидам, обладающим активностью фенилаланинаммиак-лиазы (PAL).
Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидным последовательностям, кодирующим по меньшей мере один сконструированный полипептид, обладающий активностью фенилаланин-аммиаклиазы (PAL), как указано в настоящем описании. B некоторых вариантах осуществления полинуклеотидная последовательность является функционально связанной с контролирующей последовательностью. B некоторых дополнительных вариантах осуществления полинуклеотидная последовательность является кодон-оптимизированной.
Настоящее изобретение также относится к экспрессирующим векторам, содержащим по меньшей мере одну полинуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере один сконструированный полипептид, обладающий активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), как предоставлено в настоящем описании. B некоторых вариантах осуществления экспрессирующий вектор дополнительно содержит по меньшей мере одну контролирующую последовательность. B некоторых вариантах осуществления контролирующая последовательность представляет собой промотор. B некоторых дополни- 22 034034 тельных вариантах осуществления промотор представляет собой гетерологичный промотор.
Настоящее изобретение также относится к клеткам-хозяевам, трансформированным по меньшей мере одной полинуклеотидной последовательностью, кодирующей по меньшей мере один из сконструированных полипептидов, обладающих активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), и/или по меньшей мере одним экспрессирующим вектором, содержащим по меньшей мере одну полинуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере один сконструированный полипептид, обладающий активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), и по меньшей мере одну контролирующую последовательность. B некоторых вариантах осуществления клетки-хозяева содержат по меньшей мере один сконструированный полипептид, обладающий активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), который является кодон-оптимизированным. B некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
Настоящее изобретение также относится к способам продукции по меньшей мере одного сконструированного полипептида PAL в клетке-хозяине, включающим культивирование клетки-хозяина, содержащей по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере один сконструированный полипептид, обладающий активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), и/или по меньшей мере один экспрессирующий вектор, содержащий по меньшей мере одну полинуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере один сконструированный полипептид, обладающий активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), и по меньшей мере одну контролирующую последовательность, в подходящих условиях культивирования, таких, что продуцируется сконструированный полипептид PAL. B некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают этап выделения по меньшей мере одного сконструированного полипептида, содержащего фенилаланин-аммиак-лиазу (PAL), из культуры и/или клеток-хозяев. B некоторых дополнительных вариантах осуществления способы дополнительно включают этап очистки по меньшей мере одного сконструированного полипептида, содержащего фенилаланин-аммиак-лиазу (PAL).
Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим по меньшей мере один сконструированный полипептид, обладающий активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), как предоставлено в настоящем описании. B некоторых вариантах осуществления композиция представляет собой фармацевтическую композицию. B некоторых вариантах осуществления композиция представляет собой пищевую и/или питательную добавку. B некоторых дополнительных вариантах осуществления фармацевтические композиции дополнительно содержат по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент и/или носитель. B некоторых дополнительных вариантах осуществления композиция является подходящей для лечения фенилкетонурии. B некоторых дополнительных вариантах осуществления фармацевтическая композиция является подходящей для перорального введения человеку. B некоторых вариантах осуществления композиция находится в форме пилюли, таблетки, капсулы, желатиновой капсулы, жидкости или эмульсии. B еще одних некоторых дополнительных вариантах осуществления пилюля, таблетка, капсула или желатиновая капсула дополнительно содержит растворяющееся в кишечнике покрытие. B некоторых дополнительных вариантах осуществления фармацевтическая композиция является подходящей для парентеральной инъекции человеку. B некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композицию вводят совместно по меньшей мере с одним дополнительным терапевтически эффективным соединением. B некоторых дополнительных вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере одно дополнительное терапевтически эффективное соединение. B некоторых дополнительных вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержится в пищевой и/или питательной добавке.
Настоящее изобретение также относится к способам лечения и/или профилактики симптомов фенилкетонурии у индивидуума, включающим предоставление индивидуума, страдающего фенилкетонурией и предоставление по меньшей мере одной композиции, предоставленной в настоящем описании, индивидууму. B некоторых вариантах осуществления композиция содержит фармацевтическую композицию, при этом в некоторых альтернативных вариантах осуществления композиция содержит пищевую/питательную добавку. B некоторых вариантах осуществления способов улучшают симптомы фенилкетонурии. B некоторых дополнительных вариантах осуществления получающий лечение индивидуум способен употреблять пищу, которая является в меньшей степени ограниченной по содержанию метионина, фенилаланина и/или тирозина в ней, чем виды пищи, необходимые индивидуумам, проявляющим симптомы фенилкетонурии. B некоторых вариантах осуществления получающий лечение индивидуум (т.е. индивидуум, которому предоставляли по меньшей мере одну композицию, содержащую по меньшей мере один сконструированный полипептид, обладающий активностью фенилаланин-аммиаклиазы (PAL), как предоставлено в настоящем описании) способен употреблять пищу, которая является в меньшей степени ограниченной по содержанию метионина, фенилаланина и/или тирозина в ней, чем виды пищи, необходимые индивидуумам, которым не предоставляли по меньшей мере одну композицию, как предоставлено в настоящем описании. B некоторых вариантах осуществления композиция, предоставляемая индивидуумам, содержит фармацевтическую композицию, при этом в некоторых альтернативных вариантах осуществления композиция содержит пищевую/питательную добавку. Настоящее изобретение также относится к получающим лечение индивидуумам, где индивидуумам вводили по мень- 23 034034 шей мере одну композицию и/или фармацевтическую композицию, содержащую по меньшей мере один сконструированный полипептид, обладающий активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), как предоставлено в настоящем описании. B некоторых вариантах осуществления индивидуум представляет собой животное, выбранное из приматов, грызунов и зайцеобразных. B некоторых дополнительных вариантах осуществления индивидуум представляет собой мышь. B некоторых дополнительных вариантах осуществления индивидуум представляет собой человека. B еще одних других некоторых дополнительных вариантах осуществления индивидуум представляет собой грудного ребенка или ребенка, при этом в некоторых альтернативных вариантах осуществления индивидуум представляет собой взрослого человека или молодого человека.
Настоящее изобретение также относится к видам использования композиций, содержащих по меньшей мере один сконструированный полипептид, обладающий активностью фенилаланин-аммиаклиазы (PAL), предоставленный в настоящем описании.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 предоставлено выравнивание последовательностей белка PAL дикого типа: PAL Anabaena variabilis (NCBI YP_324488.1 (SEQ ID NO: 4)); фенилаланин/гистидин-аммиак-лиазы Nostoc punctiforme NpPHAL (NCBI YP_001865631.1 (SEQ ID NO: 30); гистидин-аммиак-лиазы Rivularia sp. RspHAL (NCBI YP_007056096.1 (SEQ ID NO: 31); гистидин-аммиак-лиазы Oscillatoria sp. OspHAL (NCBI YP_07108482.1 (SEQ ID NO: 32) и гистидин-аммиак-лиазы Gloeocapsa sp. GspHAL (NCBI YP_007127054.1) (SEQ ID NO: 33).
На фиг. 2А предоставлена сниженная чувствительность к протеолизу (выражаемая в устойчивости к химотрипсину и трипсину) по сравнению с AvPAL дикого типа, тестируемой при pH 7,0 из варианта № 22 (SEQ ID NO: 8), варианта № 30 (SEQ ID NO: 6) и варианта № 36 (SEQ ID NO: 10), как дополнительно описано в примере 4.
На фиг. 2В приведен график, демонстрирующий повышенную устойчивость к кислому pH по сравнению с AvPAL дикого типа, тестируемой при pH от 4,0 до 5,2 для вариантов 22, 30 и 36, как дополнительно описано в примере 4.
На фиг. 3 предоставлены результаты KM для PAL дикого типа и варианта № 36.
На фиг. 4 предоставлены данные, демонстрирующие аминокислотную специфичность PAL дикого типа и варианта № 36.
На фиг. 5 предоставлены результаты, демонстрирующие относительную стабильность PAL дикого типа и варианта № 36, подвергающихся действию химотрипсина и трипсина человека.
На фиг. 6 предоставлены результаты, демонстрирующие относительную стабильность PAL дикого типа и вариантов № 36, 42 и 43, подвергающихся действию экстракта поджелудочной железы свиньи.
На фиг. 7 представлен график, демонстрирующий результаты, полученные в примере 5.
На фиг. 8 представлен график, демонстрирующий результаты, полученные в примере 8.
Описание изобретения
Настоящее изобретение относится к сконструированным полипептидам PAL, их мутантам, биологически активным фрагментам и аналогам и содержащим их фармацевтическим и промышленным композициям.
Изобретение относится к сконструированным полипептидам фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL) и их композициям, а также полинуклеотидам, кодирующим сконструированные полипептиды фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL). В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL оптимизируют так, чтобы обеспечивать повышенную каталитическую активность, а также сниженную чувствительность к протеолизу и повышенную устойчивость к кислым уровням pH. B некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL являются деиммунизированными. Изобретение также относится к использованию композиций, содержащих сконструированные полипептиды PAL, в терапевтических и промышленных целях.
Сокращенные обозначения и определения.
Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, как правило, имеют такое же значение, как общепринято понимает специалист в данной области, к которой принадлежит настоящее изобретение. Как правило, номенклатура, используемая в настоящем описании, и описанные ниже лабораторные способы культивирования клеток, молекулярной генетики, микробиологии, органической химии, аналитической химии и химии нуклеиновых кислот представляют собой такие, которые являются хорошо известными и общепринято применяемыми в данной области. Такие техники хорошо известны и описаны во многих учебниках и справочных изданиях, хорошо известных специалистам в данной области. Для химических синтезов и химических анализов используют стандартные способы или их модификации. Все патенты, патентные заявки, статьи и публикации, указанные в настоящем описании как выше, так и ниже, таким образом, явно включены в настоящее описание посредством ссылки.
Несмотря на то, что любые подходящие способы и вещества, аналогичные или эквивалентные таким, которые описывают в настоящем описании, находят применение в практическом осуществлении настоящего изобретения, некоторые способы и вещества описываются в настоящем описании. Следует
- 24 034034 понимать, что это изобретение не ограничено конкретной методологией, описываемыми протоколами и реагентами, т.к. они могут изменяться в зависимости от контекста, в котором их используют специалисты в данной области. Таким образом, определяемые непосредственно ниже термины более полно описаны посредством ссылки на заявку в целом. Все патенты, патентные заявки, статьи и публикации, указываемые в настоящем описании как выше, так и ниже, таким образом, явно включены в настоящее описание посредством ссылки.
Кроме того, как используют в настоящем описании, формы единственного числа включают обозначаемые объекты во множественном числе, если из контекста явно не следует иное.
Числовые диапазоны являются включительными для чисел, определяющих диапазон. Таким образом, каждый числовой диапазон, описываемый в настоящем описании, предназначен включать каждый более узкий числовой диапазон, который входит в такой более широкий числовой диапазон, таким образом, как если бы такие более узкие числовые диапазоны являлись все явным образом включенными в настоящее описание. Также предполагают, что каждое максимальное (или минимальное) числовое ограничение, описываемое в настоящем описании, включает каждое более низкое (или более высокое) числовое ограничение, таким образом, как если бы более низкие (или более высокие) числовые ограничения были бы явно описаны в настоящем описании.
Термин приблизительно означает приемлемую ошибку для конкретной величины. B некоторых случаях приблизительно означает в пределах 0,05, 0,5, 1,0 или 2,0% от данного диапазона величины. B некоторых случаях приблизительно означает в пределах 1, 2, 3 или 4 стандартных отклонения данной величины.
Кроме того, заголовки, предоставленные в настоящем описании, не являются ограничениями различных аспектов или вариантов осуществления изобретения, которые можно делать посредством ссылки на заявку в целом. Таким образом, термины, определяемые непосредственно ниже, более полно определены посредством ссылки на заявку в целом. Тем не менее, для облегчения понимания изобретения ниже определяют ряд терминов.
Если не указано иначе, нуклеиновые кислоты записывают слева направо в ориентации 5'-3'; аминокислотные последовательности записывают слева направо в ориентации амино-карбокси соответственно.
Как используют в настоящем описании, термин содержащий и его родственные формы используют в их широком смысле (т.е. эквивалентном термину включающий и его соответствующим родственным формам).
Число EC относится к номенклатуре ферментов комитета по номенклатуре Международного союза биохимии и молекулярной биологии (NC-IUBMB). Биохимическая классификация IUBMB представляет собой систему нумерической классификации ферментов на основе химических реакций, которые они катализирует.
АТСС относится к Американской коллекции типовых культур, хранилище биологических материалов которой содержит гены и штаммы.
NCBI относится к Национальному центру биологической информации и базам данных последовательностей, предоставляемых им.
Как используют в настоящем описании, термин полипептид фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL) относится к классу ферментов в семействе лиаз ароматических аминокислот (EC 4.3.1.23, EC 4.3.1.24 и EC4.3.1.25), которое также включает гистидин-аммиак-лиазу и тирозин-аммиак-лиазу. Полипептиды PAL также в некоторых случаях обозначают как фенилаланин/тирозин-аммиак-лиазу, т.к. некоторые ферменты PAL могут использовать тирозин, а также фенилаланин в качестве субстрата. Однако AvPAL и варианты, описываемые и заявляемые в настоящем описании, не используют тирозин в качестве субстрата. Полипептиды PAL катализируют преобразование L-фенилаланина в транс-коричную кислоту и аммиак. Активность PAL относится к ферментативной активности полипептидов PAL. B некоторых предпочтительных вариантах осуществления фермент PAL также содержит кофактор 3,5-дигидро-5-метилиден4Н-имидазол-4-он (MIO). Этот кофактор может являться необходимым для каталитической активности и образуется в результате кристаллизации и дегидратации консервативного трипептидного сегмента Ala167-Ser168-Gly169 активного центра.
Белок, полипептид и пептид используют взаимозаменяемо в настоящем описании для обозначения полимера по меньшей мере из двух аминокислот, ковалентно связанных амидной связью, независимо от длины или посттрансляционной модификации (например, гликозилирования или фосфорилирования).
Аминокислоты обозначают в настоящем описании посредством общеизвестных их трехбуквенных символов или посредством однобуквенных символов, рекомендуемых Комиссией по биохимической номенклатуре IUPAC-IUB. Аналогично нуклеотиды можно обозначать посредством их общепринятых однобуквенных кодов.
Термин конструируемый, рекомбинантный, неприродный и вариант при использовании со ссылкой на клетку, полинуклеотид или полипептид относится к веществу или веществу, соответствующему природной или нативной форме вещества, которое модифицировали таким образом, что в ином случае оно не могло бы существовать в природе или является идентичным такой форме, но получаемым
- 25 034034 или выделяемым из синтетических веществ и/или путем обработки рекомбинантными способами.
Как используют в настоящем описании, дикого типа и природная относятся к форме, встречающейся в природе. Например, полипептид или полинуклеотидная последовательность дикого типа представляет собой последовательность, присутствующую в организме, которую можно выделять из источника в природе, и которая не подвергалась целенаправленным модификациям в результате обработки человеком.
Как используют в настоящем описании, деиммунизированный относится к обработке белка с целью получения варианта, который не является таким же иммуногенным, как белок дикого типа или эталонный белок. B некоторых вариантах осуществления деиммунизированный заключается в том, что вариант белка не стимулирует иммунный ответ у пациентов, которым вводят вариант белка. Такой ответ можно измерять различными способами, включая, но не ограничиваясь ими, наличие или относительное содержание нейтрализующих (т.е. антител против лекарственного средства), наличие анафилактического ответа или преобладания или интенсивности высвобождения цитокинов после введения белка. B некоторых вариантах осуществления вариант белка является менее иммуногенным, чем белок дикого типа или эталонный белок. B некоторых вариантах осуществления деиммунизация включает модификации белков (например, эпитопов), которые распознаются Т-клеточными рецепторами. B некоторых вариантах осуществления для получения деиммунизированного варианта белка из белка дикого типа или эталонного белка удаляют Т-клеточные эпитопы. B некоторых вариантах осуществления для деиммунизированного белка демонстрируют более низкие уровни ответа биохимических и клеточно-биологических показателей иммунных ответов человека, включая анализы активации дендритных клеток - Т-клеток или анализы связывания пептидов лейкоцитарного антигена человека (HLA).
Кодирующая последовательность относится к части нуклеиновой кислоты (например, гену), кодирующей аминокислотную последовательность белка.
Термин процент (%) идентичности последовательности применяют в настоящем описании для обозначения сравнений полинуклеотидов и полипептидов и определяют путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей на протяжении всего окна сравнениям, где участок полинуклеотидной или полипептидной последовательности в окне сравнения может содержать добавления или делеции (например, пропуски) по сравнению с эталонной последовательностью для оптимального выравнивания двух последовательностей. Процент можно рассчитывать путем определения числа положений, в которых встречаются идентичное основание нуклеиновой кислоты или аминокислотный остаток в обеих последовательностях, с получением числа совпадающих положений, деления числа совпадающих положений на общее число положений в окне сравнения и умножением результата на 100 с получением процента идентичности последовательности. Альтернативно, процент можно рассчитывать путем определения числа положений, в которых встречается идентичное основание нуклеиновой кислоты или аминокислотного остатка в обеих последовательностях, или в которых основание нуклеиновой кислоты или аминокислотного остатка выравнивают с пропуском с получением числа совпадающих положений, делением числа совпадающих положений на общее число положений в окне сравнения и умножением результата на 100 с получением процента идентичности последовательности.
Специалистам в данной области понятно, что существует много установленных алгоритмов, доступных для выравнивания двух последовательностей. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно проводить, например, посредством алгоритма локальной гомологии СмитаВатермана (Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 [1981]), посредством алгоритма гомологичного выравнивания Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 [1970]), путем поиска сходства способом Пирсона и Липмана (Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444 [1988]), посредством компьютеризированных реализаций этих алгоритмов (например, GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете программ GCG Wisconsine) или визуально, как известно в данной области. Примеры алгоритмов, которые являются подходящими для определения процента идентичности последовательности и сходства последовательности включают, но не ограничиваются ими, алгоритмы BLAST и BLAST 2.0 (см., например, Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 [1990], и Altschul et al., Nucleic Acids Res., 3389-3402 [1977]). Программное обеспечение для проведения анализов BLAST является общедоступным на веб-сайт Национального центра биотехнологической информации (the National Center for Biotechnology Information). Этот алгоритм включает сначала идентификации пар последовательностей с высокими оценками (HSP) путем идентификации коротких слов длиной W в запрашиваемой последовательности, которая совпадает или удовлетворяет некоторой положительной пороговой оценки Т при выравнивании со словом той же длины в последовательности из базы данных. T относится к порогу оценки соседних слов (см. Altschul et al., выше). Такие исходные совпадения соседних слов выступают в качестве затравки для инициации поиска для выявления более длинных HSP, содержащих их. Затем совпадения слов расширяют в обоих направлениях вдоль каждой последовательности до тех пор, пока можно увеличивать совокупную оценку выравнивания. Совокупные оценки для нуклеотидных последовательностей вычисляют с использованием параметров М (награда за пару совпадающих остатков; всегда >0) и N (штраф за несовпадающие остатки; всегда <0). Для аминокислотных последовательностей для вычисления совокупной оценки используют оценочную матрицу. Расширение совпадений слов в каждом направ- 26 034034 лении останавливают, если совокупная оценка выравнивания снижается на значение X от ее максимального достигнутого значения; совокупная оценка снижается до нуля или ниже вследствие накопления одного или более выравниваний остатков с отрицательной оценкой, или достигают конца любой из последовательностей. Параметры W, T и X алгоритма BLAST определяют чувствительность и скорость выравнивания. В программе BLASTN (для нуклеотидных последовательностей) используют в качестве значений по умолчанию длину слова (W) 11, ожидание (Е) 10, М = 5, N = -4 и сравнение обеих цепей. B программе BLASTP для аминокислотных последовательностей используют в качестве значений по умолчанию длину слова (W) 3, ожидание (Е) 10 и оценочную матрицу BLOSUM62 (см., например, Henikoff и Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915 [1989]). Для иллюстративного определения выравнивания последовательностей и % идентичности последовательности можно применять программы BESTFIT или GAP в пакете программ GCG Wisconsin (Accelrys, Madison WI) с использованием предоставляемых параметров по умолчанию.
Эталонная последовательность относится к определенной последовательности, используемой в качестве основы для сравнения последовательностей. Эталонная последовательность может представлять собой подгруппу более крупной последовательности, например сегмент полноразмерного гена или полипептидной последовательности. Как правило, длина эталонной последовательности составляет по меньшей мере 20 нуклеотидов или аминокислотных остатков, по меньшей мере 25 остатков, по меньшей мере 50 остатков, по меньшей мере 100 остатков или представляет собой полную длину нуклеиновой кислоты или полипептида. Вследствие того что каждый из двух полинуклеотидов или полипептидов может (1) содержать последовательность (например, участок полной последовательности), который является одинаковым для двух последовательностей, и (2) может дополнительно содержать последовательность, которая является различной для двух последовательностей, сравнения последовательностей между двумя (или более) полинуклеотидами или полипептидами, как правило, проводят путем сравнения последовательностей двух полинуклеотидов или полипептидов на протяжении всего окна сравнения для идентификации и сравнения локальных областей сходства последовательностей. В некоторых вариантах осуществления эталонная последовательность может быть основана на первичной аминокислотной последовательности, где эталонная последовательность представляет собой последовательность, которая может содержать одно или более изменений в первичной последовательности. Например, фраза эталонная последовательность, основанная на SEQ ID NO: 4, содержащая валин в остатке, соответствующем Х39 относится к эталонной последовательности, в которой соответствующий остаток в положении Х39 в SEQ ID NO: 4 (например, аланин) заменяли на валин.
Окно сравнения относится к концептуальному сегменту по меньшей мере приблизительно 20 смежных положений нуклеотидов или аминокислотных остатков, где последовательность можно сравнивать с эталонной последовательностью по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов или аминокислот, и где участок последовательности в окне сравнения может содержать добавления или делеции (например, пропуски) 20% или менее по сравнению с эталонной последовательностью (которая не содержит добавления или делеции) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Окно сравнения может составлять более 20 смежных остатков и включает, необязательно, 30, 40, 50, 100 или более длинных окон.
Соответствующий, относится к и относительно при использовании в отношении нумерации данной аминокислоты или полинуклеотидной последовательности относится к нумерации остатков конкретной эталонной последовательности, когда данную аминокислотную или полинуклеотидную последовательность сравнивают с эталонной последовательностью. Другими словами, число остатков или положение остатка данного полимера обозначают относительно эталонной последовательности, а не по фактическому нумерационному положению остатка в данной аминокислотной или полинуклеотидной последовательности. Например, данную аминокислотную последовательность, такую как последовательность сконструированной PAL, можно выравнивать с эталонной последовательностью путем введения пропусков для оптимизации совпадений остатков между двумя последовательностями. B этих случаях, несмотря на то, что присутствуют пропуски, нумерацию остатка в данной аминокислотной или полинуклеотидной последовательности проводят относительно эталонной последовательности, с которой ее выравнивали.
Различие аминокислоты и различие остатка относятся к различию аминокислотного остатка в положении полипептидной последовательности относительно аминокислотного остатка в соответствующем положении в эталонной последовательности. Положения различий аминокислот в настоящем описании, как правило, обозначают как Xn, где n относится к соответствующему положению в эталонной последовательности, на котором основано различие остатка. Например, различие остатка в положении Х91 по сравнению с SEQ ID NO: 4 относится к различию аминокислотного остатка в положении полипептида, соответствующем положению 91 SEQ ID NO: 4. Таким образом, если эталонный полипептид SEQ ID NO: 4 содержит аланин в положении 91, то различие остатка в положении Х91 по сравнению с SEQ ID NO: 4 относится к замене аминокислоты любого остатка аминокислотой, отличной от аланина, в положении полипептида, соответствующем положению 91 SEQ ID NO: 4. B большинстве случаев в настоящем описании конкретное различие аминокислотного остатка в положении обозначают как
- 27 034034
XnY, где Xn обозначает соответствующий остаток и положение эталонного полипептида (как описано выше), и Y представляет собой однобуквенный идентификатор аминокислоты, встречающейся в сконструированном полипептиде (например, другой остаток, чем в эталонном полипептиде). B некоторых случаях (например, в таблицах в примерах) настоящее изобретение также относится к конкретным различиям аминокислот, обозначаемым общепринятым условным обозначением AnB, где A представляет собой однобуквенный идентификатор остатка в эталонной последовательности, n представляет собой номер положения остатка в эталонной последовательности, и B представляет собой однобуквенный идентификатор замены остатка в последовательности сконструированного полипептида. B некоторых случаях полипептид по настоящему изобретению может содержать одно или более различий аминокислотного остатка относительно эталонной последовательности, которое указано в списке конкретных положений, в которых присутствуют различия остатка относительно эталонной последовательности. В некоторых вариантах осуществления, где более одной аминокислоты можно использовать в конкретном положении остатка полипептида, различные аминокислотные остатки, которые можно использовать, разделяют / (например, X307G/X307Q или X307G/Q). Настоящее изобретение включает сконструированные полипептидные последовательности, содержащие одно или более различия аминокислот, которые включают любые/или как консервативные, так и неконсервативные аминокислотные замены.
Термины серия замен аминокислот и серия замен относится к группе замен аминокислот в полипептидной последовательности. B некоторых вариантах осуществления серии замен содержат 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или более замен аминокислот. B некоторых вариантах осуществления серия замен относится к серии замен аминокислот, которая содержится в любом из вариантов полипептидов AvPAL, перечисленных в любой из таблиц в примерах. Например, серия замен, содержащаяся в варианте 36, представляет собой A39V/A91V/N290G/H307G/L407V/T524S, где положения аминокислот указаны относительно SEQ ID NO: 4.
Консервативная аминокислотная замена относится к замене остатка другим остатком, содержащим аналогичную боковую цепь, и, таким образом, как правило, включает замену аминокислоты в полипептиде аминокислотами в том же или аналогичном определенном классе аминокислот. B качестве примера, а не ограничения аминокислоту с алифатической боковой цепью можно заменять другой алифатической аминокислотой (например, аланином, валином, лейцином и изолейцином); аминокислоту с гидроксильной боковой цепью заменяют другой аминокислотой с гидроксильной боковой цепью (например, серином и треонином); аминокислоту, содержащую ароматические боковые цепи, заменяют другой аминокислотой, содержащей ароматическую боковую цепь (например, фенилаланин, тирозин, триптофан и гистидин); аминокислоту с основной боковой цепью заменяют другой аминокислотой с основной боковой цепью (например, лизином и аргинином); аминокислоту с кислой боковой цепью заменяют другой аминокислотой с кислой боковой цепью (например, аспарагиновой кислотой или глутаминовой кислотой) и гидрофобную или гидрофильную аминокислоту заменяют другой гидрофобной или гидрофильной аминокислотой соответственно.
Неконсервативная замена относится к замене аминокислоты в полипептиде аминокислотой со свойствами боковой цепи, значительно отличающимися. B неконсервативных заменах могут быть использованы аминокислоты между различных групп, а не внутри одной группы, и они влияют на (a) структуру пептидного остова в области замены (например, пролина на глицин); (b) заряд или гидрофобность и/или (c) объем боковой цепи. B качестве примера, а не ограничения иллюстративные неконсервативные замены включают кислую аминокислоту, заменяемую основной или алифатической аминокислотой; ароматическую аминокислоту, заменяемую небольшой аминокислотой, и гидрофильную аминокислоту, заменяемую гидрофобной аминокислотой.
Делеция относится к модификации полипептида путем удаления одной или более аминокислот из эталонного полипептида. Делеции могут включать удаление 1 или более аминокислот, 2 или более аминокислот, 5 или более аминокислот, 10 или более аминокислот, 15 или более аминокислот или 20 или более аминокислот, до 10% от общего числа аминокислот или до 20% от общего числа аминокислот, составляющих эталонный фермент при сохранении ферментативной активности и/или сохранении улучшенных свойств сконструированного фермента трансаминазы. Делеции могу быть направлены на внутренние участки и/или концевые участки полипептида. B различных вариантах осуществления делеция может включать непрерывный сегмент или может являться дискретной.
Вставка относится к модификации полипептида путем добавления одной или более аминокислот к эталонному полипептиду. Вставку могут делать во внутренние участки полипептида или к карбоксиили аминоконцам. Как используют в настоящем описании, вставки включают слитые белки, как известно в данной области. Вставка может представлять собой смежный сегмент аминокислот или являться разделенной одной или более аминокислотами в природном полипептиде.
Термины функциональный фрагмент и биологически активный фрагмент в настоящем описании используют взаимозаменяемо для обозначения полипептида, который имеет аминоконцевую и/или карбоксиконцевую делецию(и) и/или внутренние делеции, но где остальная часть аминокислотной последовательности является идентичной соответствующим положениям в последовательности, с которой ее сравнивают (например, полноразмерной сконструированной PAL по настоящему изобретению), и ко- 28 034034 торая сохраняет, по существу, полную активность полноразмерного полипептида.
Выделенный полипептид относится к полипептиду, который, по существу, отделяют от других загрязняющих веществ, которые содержатся с ним в природе (например, белок, липиды и полинуклеотиды). Термин включает полипептиды, которые удаляли или выделяли из их природного окружения, или экспрессирующую систему (например, клетку-хозяин или синтез in vitro). Рекомбинантные полипептиды PAL могут содержаться в клетке, содержаться в клеточной среде, или их можно получать в различных формах, таких как лизаты или выделенные препараты. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления рекомбинантные полипептиды PAL, предоставленные в настоящем описании, представляют собой выделенные полипептиды.
По существу, чистый полипептид относится к композиции, в которой тип полипептида представляет собой преобладающий содержащийся вид (например, в пересчете на моль или массу он является более многочисленным, чем другие отдельные виды макромолекул в композиции) и, как правило, представляет собой в значительной степени очищенную композицию, когда целевой вид включает по меньшей мере приблизительно 50% содержащихся видов макромолекул в пересчете на моль или мас.%. Как правило, по существу, чистая композиция PAL содержит приблизительно 60% или более, приблизительно 70% или более, приблизительно 80% или более, приблизительно 90% или более, приблизительно 95% или более и приблизительно 98% или более всех типов макромолекул в пересчете на моль или мас.%, содержащихся в композиции. B некоторых вариантах осуществления целевой вид очищают, по существу, до однородного состояния (например, в композиции невозможно детектировать загрязняющие молекулы общепринятыми способами детекции), где композиция состоит, по существу, из одного вида макромолекул. Молекулы растворителя, низкомолекулярные соединения (<500 Да) и виды ионов элементов не читают видами макромолекул. B некоторых вариантах осуществления выделенные рекомбинантные полипептиды PAL представляют собой, по существу, чистые полипептидные композиции.
Улучшенное ферментативное свойство относится к сконструированному полипептиду PAL, который характеризуется улучшением любого ферментативного свойства по сравнению с эталонным полипептидом PAL, такой как полипептид PAL дикого типа (например, AvPAL дикого типа, содержащий SEQ ID NO: 4) или другой сконструированный полипептид PAL. Улучшенные свойства включают, но не ограничиваются ими, такие свойства, как повышенная экспрессия белка, повышенная термоактивность, повышенная термостабильность, повышенная активность pH, повышенная стабильность, повышенная ферментативная активность, повышенная субстратная специфичность и/или аффинность, повышенная специфическая активность, повышенная устойчивость к ингибированию субстратом и/или конечным продуктом, повышенная химическая стабильность, улучшенная хемоселективность, улучшенная стабильность в отношении растворителя, повышенная устойчивость к кислому pH, повышенная устойчивость к протеолитическому действию (т.е. сниженной чувствительности к протеолизу), сниженная агрегация, повышенная растворимость, сниженная иммуногенность и измененный температурный профиль.
Повышенная ферментативная активность и повышенная каталитическая активность относится к улучшенному свойству сконструированных полипептидов PAL, которое может быть представлено увеличением специфической активности (например, продуцируемого продукта/времени/массы белка) и/или увеличением процента преобразования субстрата в продукт (например, процент преобразования исходного количества субстрата в продукт за предопределенный момент времени с использованием предопределенного количества PAL) по сравнению с эталонным ферментом PAL (например, AvPAL дикого типа и/или другой сконструированной AvPAL). Иллюстративные способы определения ферментативной активности приведены в примерах. На любое свойство, относящееся к ферментативной активности, можно оказывать влияние, включая классические ферментативные свойства Km, Vmax или kcat, изменения которых могут приводить к повышенной ферментативной активности. Улучшения ферментативной активности могут составлять приблизительно от 1,1 раза ферментативной активности соответствующего фермента дикого типа до менее 2 раз, 5 раз, 10 раз, 20 раз, 25 раз, 50 раз, 75 раз, 100 раз, 150 раз, 200 раз или более ферментативной активности по сравнению с природной PAL или другой сконструированной PAL, из которых получали полипептиды PAL.
В некоторых вариантах осуществления kcat сконструированных полипептидов PAL составляет по меньшей мере 0,1/с, по меньшей мере 0,2/с, по меньшей мере 0,3/с, по меньшей мере 0,5/с, по меньшей мере 1,0/с и в некоторых предпочтительных вариантах осуществления более 1,0/с. B некоторых вариантах осуществления Km находится в диапазоне приблизительно от 1 мкМ приблизительно до 5 мМ; в диапазоне приблизительно от 5 мМ приблизительно до 2 мМ; в диапазоне приблизительно от 10 мкМ приблизительно до 2 мМ или в диапазоне приблизительно от 10 мкМ приблизительно до 1 мМ. B некоторых конкретных вариантах осуществления сконструированный фермент PAL обладает улучшенной ферментативной активностью в диапазоне от 1,5 до 10 раз, от 1,5 до 25 раз, от 1,5 до 50 раз, от 1,5 до 100 раз или более раз большей, чем, ферментативная активность эталонного фермента PAL. Активность PAL можно измерять любым стандартным анализом, известным в данной области (например, мониторингом изменений спектрофотометрических свойств взаимодействующих веществ или продуктов). B некоторых вариантах осуществления измеряют количество продуцируемых продуктов посредством разделением высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ), объединенной с детекцией оптической плотно
- 29 034034 стью в УФ-области или флуоресцентной детекцией непосредственно или после дериватизации ортофталевым альдегидом (ОРА). B некоторых вариантах осуществления сравнения ферментативных активностей проводят с использованием определенного препарата фермента, определенного анализа при установленном условии и одного или более определенных субстратов, как дополнительно подробно описано в настоящем описании. Как правило, когда сравнивают лизаты, определяют количества клеток и количества оцениваемого белка, а также используют идентичные экспрессирующие системы и идентичные клетки-хозяева для минимизации изменений количеств фермента, продуцируемого клетками-хозяевами и содержащегося в лизатах.
Термин улучшенная устойчивость к кислому pH означает, что рекомбинантная PAL по изобретению обладает повышенной стабильностью (т.е. более высокой остаточной активностью приблизительно при pH 7,0 после воздействия кислым pH в течение предопределенного периода времени [1 ч, до 24 ч]) по сравнению с эталонной PAL.
Как используют в настоящем описании, физиологический pH означает диапазон pH, как правило, встречающийся в тонком кишечнике у индивидуума (например, человека). Как правило, существует градиент pH от пилорического клапана до толстой кишки в диапазоне приблизительно от 6,0 до 7,5.
Термин кислый pH, используемый со ссылкой на улучшенную стабильность в отношении условий кислого pH или повышенной устойчивости к кислому pH, означает диапазон pH приблизительно от 1,5 до 6,8.
Термины протеолитическая активность и протеолиз, используемые в настоящем описании взаимозаменяемо, относятся к расщеплению белков на полипептиды меньшего размера или аминокислоты. Расщепление белков, как правило, является результатом гидролиза пептидной связи ферментами протеазы (протеиназой). Ферменты протеазы включают, но не ограничиваются ими, пепсин, трипсин, химотрипсин, эластаза; карбоксипептидазу A и B и пептидазы (например, аминопептидазу, дипептидазу и энтеропептидазу).
Фразы снижение чувствительности к протеолизу и снижение протеолитической чувствительности используют в настоящем описании взаимозаменяемо, они означают, что сконструированный полипептид PAL по изобретению обладает более высокой ферментативной активностью по сравнению с эталонной PAL в стандартном анализе (например, как описано в примерах) после обработки одной или нескольким протеазами.
Агрегация означает слипание или осаждение полипептида PAL. Агрегация может приводить к инактивации фермента. Термин сниженная агрегация означает, что сконструированный полипептид PAL является в меньшей степени склонным к агрегации по сравнению с эталонной PAL. Способы оценки агрегации известны в данной области, включая, но не ограничиваясь ими, использование флуоресцентной микроскопии с подходящими красителями (например, тиофлавин T или нильский красный), динамики светорассеяния, проточной цитометрии с подходящими красителями (например, Bodipy), фильтрования и анализа посредством SDS-PAGE и/или Вестерн-блоттинга, флуоресцентной корреляционной спектроскопии и электронной микроскопии. Существуют коммерчески доступные наборы для оценки агрегации (например, набор для анализа агрегации белка ProteoStat® [Enzo]).
Преобразование относится к ферментативной конверсии (или биотрансформации) субстрата(ов) до соответствующего продукта(ов). Процент преобразования относится к проценту субстрата, который подвергается преобразованию до продукта в течение периода времени при конкретных условиях. Таким образом, ферментативную активность или активность полипептида PAL можно выражать в виде процента преобразования субстрата до продукта в течение определенного периода времени.
Условие жесткости гибридизации относится к условиям гибридизации, таким как условия промывания при гибридизации нуклеиновых кислот. Как правило, реакции гибридизации проводят в условиях пониженной жесткости после промываний различной, но более высокой жесткости. Термин гибридизация в умеренно жестких условиях относится к условиям, которые обеспечивают возможность ДНКмишени связываться с комплементарной нуклеиновой кислотой, которая обладает приблизительно 60% идентичностью, предпочтительно приблизительно 75% идентичностью, приблизительно 85% идентичностью с ДНК-мишенью, с большей чем приблизительно 90% идентичность с полинуклеотидом-мишенью. Иллюстративные умеренно жесткие условия представляют собой условия, эквивалентные гибридизации в 50% формамиде, 5х растворе Денхардта, 5xSSPE, 0,2% SDS при 42°C с последующим промыванием в 0,2xSSPE, 0,2% SDS при 42°C. Гибридизация в условиях высокой жесткости в основном относится к условиям, которые составляют приблизительно 10°C или менее от температуры теплового плавления Tm, как определяют в условиях раствора для определенной полинуклеотидной последовательности. B некоторых вариантах осуществления условия высокой жесткости относится к условиям, которые обеспечивают гибридизацию только этих последовательностей нуклеиновой кислоты, которые образуют стабильные гибриды в 0,018М NaCl при 65°C (например, если гибрид не является стабильным в 0,018М NaCl при 65°C, он не будет являться стабильным в условиях с высокой жесткостью, как предусмотрено в настоящем описании). Условия с высокой жесткостью можно обеспечивать, например, гибридизацией в условиях, эквивалентных 50% формамида, 5х раствору Денхардта, 5xSSPE, 0,2% SDS при 42°C с после- 30 034034 дующим промыванием в 0,1xSSPE и 0,1% SDS при 65°C. Другое условие высокой жесткости представляет собой гибридизацию в условиях, эквивалентных гибридизации в 5xSSC, содержащем 0,1% (мас.:об.)
SDS при 65°C, и промыванию в 0,1xSSC, содержащем 0,1% SDS при 65°C. Другие условия гибридизации с высокой жесткостью, а также умеренно жесткие условия описаны в ссылках, цитируемых выше.
Кодон-оптимизированный относится к изменениям кодонов полинуклеотида, кодирующего белок, до кодонов, предпочтительно используемых в конкретном организме таким образом, что кодируемый белок более эффективно экспрессируется в этом организме. Хотя генетический код является вырожденным, что заключается в том, что многие аминокислоты представлены несколькими кодонами, называемыми синонимами или синонимичными кодонами, хорошо известно, что частота использования кодона конкретными организмами является не случайной и смещенной в сторону конкретных триплетов кодонов. Это смещение частоты использования кодона может являться более высоким по отношению к данному гену, генам общей функции или происхождения предков, экспрессируемым на высоком уровне белкам в сравнении с низкокопийными белками и совокупных кодирующих белок области генома организма. B некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды, кодирующие ферменты PAL, являются кодон-оптимизированными для оптимальной продукции в организме-хозяине, выбранной для экспрессии.
Контролирующая последовательность в настоящем описании предназначена включать все компоненты, которые являются необходимыми или предпочтительными для экспрессии полинуклеотида и/или полипептида по настоящему изобретению. Каждая контролирующая последовательность может являться нативной или чужеродной по отношению к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид. Такие контролирующие последовательности включают, но не ограничиваются ими, лидерные последовательности, последовательности полиаденилирования, пропептидные последовательности, промоторные последовательности, сигнальные пептидные последовательности, инициирующие последовательности и терминаторы транскрипции. Как минимум, контролирующие последовательности включают промотор и стоп-сигналы транскрипции и трансляции. B некоторых вариантах осуществления контролирующие последовательности предоставляют с линкерами с целью введения конкретных участков рестрикции, облегчающих лигирование контролирующих последовательностей с кодирующей областью последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид.
Функционально связанный определяют в настоящем описании как конфигурацию, в которой контролирующая последовательность соответствующим образом располагается (например, в функциональной зависимости) в положении относительно представляющего интерес полинуклеотида таким образом, что контролирующая последовательность направляет или регулирует экспрессию полинуклеотида, кодирующего представляющий интерес полипептид.
Промоторная последовательность относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которую распознает клетка-хозяин для экспрессии представляющего интерес полинуклеотида, такого как кодирующего последовательность. Промоторная последовательность содержит последовательности регуляции транскрипции, которые опосредуют экспрессии представляющего интерес полинуклеотида. Промотор может представлять собой любую последовательность нуклеиновой кислоты, которая обладает транскрипционной активностью в выбранной клетке-хозяине, включая мутантные, усеченные и гибридные промоторы, и ее можно получать из генов, кодирующих внеклеточные или внутриклеточные полипептиды, гомологичные или гетерологичные по отношению к клетке-хозяину.
Подходящие условия реакции относятся к таким условиям в реакционном растворе ферментативной конверсии (например, диапазонам нагрузки фермента, нагрузки субстрата, температур, pH, к буферам, вспомогательным растворители и т.д.), при которых полипептид PAL по настоящему изобретению способен преобразовывать субстрат до желаемого соединения-продукта. Иллюстративные подходящие условия реакции предоставлены в настоящем описании (см., раздел Примеры).
Нагрузка, такая как в нагрузке соединением или нагрузке ферментом, относится к концентрации или количеству компонента в реакционной смеси в начале реакции. Субстрат в отношении способа реакции ферментативной конверсии относится к соединению или молекуле, на которое действует полипептид PAL. Продукт в отношении способа ферментативной конверсии относится к соединению или молекуле, получаемой в результате действия полипептида PAL на субстрат.
Как используют в настоящем описании, термин культивирование относится к выращиванию популяции клеток микроорганизмов в подходящих условиях с использованием любой подходящей среды (например, жидкости, геля или твердого вещества).
Рекомбинантные полипептиды (например, варианты фермента PAL) можно получать любыми подходящими способами, известными в данной области. Например, существует широкий спектр различных техник мутагенеза, хорошо известных специалистам в данной области. Кроме того, наборы для мутагенеза также являются доступными от многих коммерческих поставщиков в области молекулярной биологии. Доступными являются способы проведения конкретных замен в определенных аминокислотах (сайт-направленных), конкретных или случайных мутаций в локализованной области гена (областьспецифических) или случайный мутагенез на всем протяжении гена (например, насыщающий мутагенез).
- 31 034034
Многие подходящие способы получения вариантов фермента известны специалистам в данной области, включая, но не ограничиваясь ими, сайт-специфический мутагенез одноцепочечной ДНК или двухцепочечной ДНК с использованием ПЦР, кассетный мутагенез, синтез генов, ПЦР со сниженной точностью, перестановка и химический насыщающий мутагенез или любой другой известный в данной области подходящий способ. Неограничивающие примеры способов, используемых для конструирования ДНК и белка, предоставлены в следующих патентах США №№: 6117679; 6420175; 6376246; 6586182; 7747391; 7747393; 7783428 и 8383346. После получения вариантов можно проводить их скрининг на любое желаемое свойство (например, высокую или повышенную активность или низкую или пониженную активность, повышенную термическую активность, повышенную термостабильность и/или стабильность к кислому pH и т.д.). B некоторых вариантах осуществления находят применения рекомбинантные полипептиды PAL (также обозначаемые в настоящем описании как сконструированные полипептиды PAL, варианты ферментов PAL и варианты PAL).
Как используют в настоящем описании, вектор представляет собой конструкцию ДНК для введения последовательности ДНК в клетку. B некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой экспрессирующий вектор, который является функционально связанным с подходящей контролирующей последовательностью, способной обеспечивать экспрессию у подходящего хозяина полипептида, кодируемого в последовательности ДНК. B некоторых вариантах осуществления экспрессирующий вектор содержит промоторную последовательность, функционально связанную с последовательностью ДНК (например, трансген) для направления экспрессии в клетке-хозяине, а в некоторых вариантах осуществления также содержит последовательность терминации транскрипции.
Как используют в настоящем описании, термин экспрессия включает любой этап, включающий продукцию полипептида, включая, но не ограничиваясь ими, транскрипцию, посттранскрипционную модификацию, трансляцию и посттрансляционную модификацию. В некоторых вариантах осуществления термин также включает секрецию полипептида клеткой.
Как используют в настоящем описании, термин способы относится к продукции белков и/или других соединений клетками. Следует понимать, что термин включает любой этап, вовлеченный в продукцию полипептидов, включая, но не ограничиваясь ими, транскрипцию, посттранскрипционную модификацию, трансляцию и посттрансляционную модификацию. B некоторых вариантах осуществления термин также включает секрецию полипептида клеткой.
Как используют в настоящем описании, аминокислота или нуклеотидная последовательность (например, промоторная последовательность, сигнальный пептид, терминирующая последовательность и т.д.) является гетерологичной другой последовательности, с которой она является функционально связанной, если две последовательности не являются связанными в природе.
Как используют в настоящем описании, термины клетка-хозяин и штамм-хозяин относятся к подходящим хозяевам для экспрессирующих векторов, содержащих ДНК, предоставленную в настоящем описании (например, полинуклеотидные последовательности, кодирующие по меньшей мере один вариант AvPAL). B некоторых вариантах осуществления клетки-хозяева представляют собой прокариотические или эукариотические клетки, которые трансформировали или трансфицировали векторами, сконструированными с использованием технологий рекомбинантной ДНК, как известно в данной области.
Термин аналог означает полипептид, обладающий более 70% идентичностью последовательности, но менее чем 100% идентичностью последовательности (например, более 75, 78, 80, 83, 85, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% идентичностью последовательности) с эталонным полипептидом. B некоторых вариантах осуществления аналоги включают неприродные аминокислотные остатки, включая, но не ограничиваясь ими, гомоаргинин, орнитин и норвалин, а также природные аминокислоты. B некоторых вариантах осуществления аналоги также включают один или более D-аминокислотных остатка и непептидные связи между двумя или более аминокислотными остатками.
Термин терапевтический относится к соединению, вводимому индивидууму, который проявляет признаки или симптомы патологии, обладающему благоприятными или желаемыми медицинскими эффектами.
Термин фармацевтическая композиция относится к композиции, подходящей для фармацевтического использования у являющегося млекопитающим индивидуума (например, человека), содержащей фармацевтически эффективное количество сконструированного полипептида PAL, предусматриваемое изобретением, и приемлемый носитель.
Термин эффективное количество означает количество, достаточное для оказания желаемого результата. Специалист в данной области может определять эффективное количество с использованием общепринятого экспериментирования.
Термины выделенный и очищенный используют для обозначения молекулы (например, выделенной нуклеиновой кислоты, полипептида и т.д.) или другого компонента, который удаляют по меньшей мере из одного другого компонента, с которым он является связанным в природе. Термин очищенный не требует абсолютной чистоты, наоборот он предназначен для относительного определения.
Термин индивидуум включает млекопитающих, таких как люди, не являющиеся человеком приматы, домашний скот, животные-компаньоны и лабораторные животные (например, грызуны и зайцеоб- 32 034034 разные). Следует понимать, что термин включает как особей женского пола, так и мужского пола.
Как используют в настоящем описании, термин пациент означает любого индивидуума, у которого проводят оценку, лечение заболевания, или который страдает заболеванием.
Термин грудной ребенок относится к ребенку в возрасте от первого месяца после рождения приблизительно до одного года. Как используют в настоящем описании, термин новорожденный относится к ребенку в период от рождения до 28 суток жизни. Термин недоношенный ребенок относится к грудному ребенку, рожденному после двадцатой недели беременности, еще до полного срока, как правило, массой от ~500 до ~2499 г при рождении. Грудной ребенок с очень низкой массой тела при рождении представляет собой грудного ребенка с массой тела менее 1500 г при рождении.
Как используют в настоящем описании, термин ребенок относится к индивидууму, который не достиг совершеннолетия для согласия на лечение или исследовательские процедуры. B некоторых вариантах осуществления термин относится к индивидууму в возрасте от рождения до пубертатного периода.
Как используют в настоящем описании, термин совершеннолетний человек относится к индивидууму, который достиг совершеннолетия для соответствующей юрисдикции (например, возраста 18 лет в Соединенных Штатах Америки). B некоторых вариантах осуществления термин относится к любому выросшему зрелому организму. B некоторых вариантах осуществления термин молодой совершеннолетний человек относится к индивидууму в возрасте менее 18 лет, но который достиг половой зрелости.
Как используют в настоящем описании, композиция и состав содержат продукты, содержащие по меньшей мере одну сконструированную PAL по настоящему изобретению, предназначенную для любого подходящего использования (например, фармацевтические композиции, пищевые/питательные добавки, корма и т.д.).
Термины введение и введение композиции означает предоставление композиции по настоящему изобретению индивидууму (например, индивидууму, страдающему последствиями PKU).
Термин носитель при использовании в отношении фармацевтической композиции означает любой стандартный фармацевтический носитель, буферы и эксципиенты, такие как стабилизаторы, консерванты и адъюванты.
Термин фармацевтически приемлемый означает вещество, которое можно вводить индивидууму, не вызывая какого-либо нежелательного биологического действия или вредного взаимодействия с любым из компонентов, в котором оно содержится, и которое обладает желаемой биологической активностью.
Как используют в настоящем описании, термин эксципиент относится к любой фармацевтически приемлемой добавке, носителю, разбавителю, адъюванту или другому ингредиенту, отличному от активного фармацевтического ингредиента (API, например, сконструированных полипептидов PAL по настоящему изобретению). Эксципиенты, как правило, вводят для целей формулирования и/или введения.
Термин терапевтически эффективное количество при использовании по отношению к симптомам заболевания/состояния относится к количеству и/или концентрации соединения (например, сконструированным полипептидам PAL), которая улучшает, замедляет или устраняет один или более симптомов заболевания/состояния или предотвращает или отсрочивает начало симптома(ов) (например, PKU). B некоторых вариантах осуществления термин используют по отношению к количеству композиции, которое вызывает биологический (например, медицинский) ответ ткани, системы или являющегося животным индивидуума, который выявляет исследователь, врач, ветеринар или другой практикующий врач.
Термин терапевтически эффективное количество при использовании по отношению к заболеванию/состоянию относится к количеству и/или концентрации композиции, которая улучшает, ослабляет или устраняет заболевание/состояние.
Следует понимать, что термины лечащий, лечить и лечение включают превентивное (например, профилактическое), а также паллиативное лечение.
Сконструированные полипептиды PAL.
Исходные полипептиды PAL, из которых выделяют сконструированные полипептиды PAL по изобретению, включают бактериальные штаммы, такие как Anabaena (например, А. variabilis), Nostoc (например, N. punctiforme), Rhodosporidium (например, R. toruloides), Streptomyces (например, S. maritimus или S. verticillatus), Oscillatoria sp., Gloeocapsa sp. и Rivularia sp. Ферменты PAL из этих штаммов идентифицированы и хорошо известны. Гомологичные последовательности фермента из Anabaena (A. variabilis) АТСС 29413 и NCBI YP_324488.1; Nostoc (N. punctiforme) АТСС 29133 и NCBI YP_00186563.1; Oscillatoria sp. PCC 6506 и NCBI ZP_ 07108482.1 и Gloeocapsa sp. PCC7428 и NCBI_YP 007127054.1 приведены на фиг. 1. Фенилаланин/гистидин-аммиак-лиаза Nostoc punctiforme NpPHAL (NCBI YP_001865631.1 (SEQ ID NO: 30); гистидин-аммиак-лиаза Rivularia sp. RspHAL (NCBI YP_007056096.1 (SEQ ID NO: 31); гистидин-аммиак-лиаза Oscillatoria sp. Osp HAL (NCBI YP_07108482.1 (SEQ ID NO: 32) и гистидин-аммиак-лиаза Gloeocapsa sp. GspHAL (NCBI YP_007127054.1) (SEQ ID NO: 33) обладают более чем 70% гомологией с AvPAL (SEQ ID NO: 4).
Кроме того, когда конкретный вариант PAL (т.е. сконструированный полипептид PAL) указывают посредством ссылки на модификацию конкретных аминокислотных остатков в последовательности PAL дикого типа или эталонной PAL, следует понимать, что в настоящее описание включены варианты дру- 33 034034 гой PAL, модифицированной в эквивалентном положении(ях) (как определяют на основании оптимального выравнивания аминокислотных последовательностей между соответствующими аминокислотными последовательностями). B некоторых вариантах осуществления сконструированный полипептид PAL получают из любого из перечисленных полипептидов из указанных выше бактериальных штаммов (т.е. Nostoc [N. punctiforme], Rhodosporidium [R. toruloides], Streptomyces [S. maritimus или S. verticillatus], Oscillatoria sp., Gloeocapsa sp и Rivularia sp.). B некоторых дополнительных вариантах осуществления сконструированный полипептид PAL по настоящему изобретению содержит консервативный активный центр Ala167-Ser168-Gly169 и обладает по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL обладают не только активностью PAL, а также активностью в отношении субстратов тирозина и/или гистидина.
В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL получают культивированием микроорганизма, содержащего по меньшей мере одну полинуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере один сконструированный полипептид PAL в условиях, которые являются благоприятными для продукции сконструированного полипептида PAL. B некоторых вариантах осуществления сконструированный полипептид PAL в дальнейшем выделяют из получаемой среды для культивирования и/или клеток.
Настоящее изобретение относится к иллюстративным сконструированным полипептидам PAL, обладающим активностью PAL. B примерах приведены таблицы, в которых представлена информация о структуре последовательностей, корреляции конкретных признаков аминокислотной последовательности с функциональной активностью сконструированных полипептидов PAL. Эта информация о структурнофункциональной корреляции приведена в форме конкретных различий аминокислотных остатков относительно эталонного сконструированного полипептида SEQ ID NO: 4, а также связанных данных экспериментально определяемой активности для иллюстративных сконструированных полипептидов PAL.
В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL по настоящему изобретению, обладающие активностью PAL, содержат:
a) аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью последовательности с эталонной последовательностью SEQ ID NO: 4;
b) различие аминокислотного остатка по сравнению с SEQ ID NO: 4 в одном или более положений аминокислот, и
c) которые обладают улучшенным свойством, выбранным из i) повышенной каталитической активности, ii) сниженной протеолитической чувствительности, iii) повышенной устойчивости к кислому pH, iv) сниженной агрегации или сочетания любых из i), ii), iii) или iv), по сравнению с эталонной последовательностью.
В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL, обладающие по меньшей мере одним улучшенным свойством, обладают по меньшей мере 85%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или большей идентичностью аминокислотных последовательностей с SEQ ID NO: 4, и различием аминокислотного остатка по сравнению с SEQ ID NO: 4 в одном или более положений аминокислот (таких как 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 20 или более положения аминокислот по сравнению с SEQ ID NO: 4 или последовательность, обладающей по меньшей мере 85%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или большей идентичностью аминокислотных последовательностей с SEQ ID NO: 4). B некоторых вариантах осуществления различие остатка по сравнению с SEQ ID NO: 4 в одном или более положений включают по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более консервативных аминокислотных замены. B некоторых вариантах осуществления сконструированный полипептид PAL представляет собой полипептид, указанный в таблицах, приведенных в примерах.
В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL, обладающие по меньшей мере одним улучшенным свойством, обладают по меньшей мере 85%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или большей идентичностью аминокислотных последовательностей с SEQ ID NO: 4 и различием аминокислотного остатка по сравнению с SEQ ID NO: 4 в одном или более положений аминокислот, выбранных из Х39, Х54, Х59, Х73, Х91, Х158, Х112, Х134, Х180, Х195, Х240, Х243, Х245, Х256, Х257, Х270, Х290, Х304, Х305, Х307, Х308, Х326, Х349, Х353, Х364, Х394, Х399, Х400, Х404, Х407, Х443, Х453, Х459, Х460, Х463, Х474, Х509, Х521, Х522, Х524, Х528, Х546, Х564 или любой их комбинации, при оптимальном выравнивании с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4. B некоторых вариантах осуществления различие аминокислот существует в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 или
- 34 034034 или более положений аминокислот.
В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL, обладающие по меньшей мере одним улучшенным свойством, обладают по меньшей мере 85% (по меньшей мере 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%) идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 4 и обладают различием аминокислотного остатка в положении Н307 и необязательно различием аминокислотного остатка в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более положений аминокислот. B некоторых вариантах осуществления различие аминокислотного остатка в положении 307 представляет собой H307/G/Q/M.
В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL, обладающие по меньшей мере одним улучшенным свойством, обладают по меньшей мере 85% (по меньшей мере 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%) идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 4 и обладают по меньшей мере одним различием аминокислотного остатка, выбранного из комбинации одного или более А39, Т54, G59, S73, А91, Y158, S180, K195, А112, R134, Q240, Т243, I245, А256, L257, N270, N290, Y304, R305, Н307, Е308, I326, L349, D353, L364, А394, S399, N400, Р404, L407, F443, N453, Y459, Т460, Т463, N474, Е509, Q521, K522, Т524, Р528, S546 и/или Р564. B некоторых дополнительных вариантах осуществления существуют различия аминокислотного остатка в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более положений аминокислот.
В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL, обладающие улучшенным свойством, обладают по меньшей мере 85% (по меньшей мере 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%) идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 4 и обладают различием аминокислотного остатка, выбранного из комбинации одного или более A39V, Т541<. G59R, S73K, А112С, R134Q, A91V, Y158H, S180A, K195E, Q240R/W, T243I/L, I245L, A256G, L257W/A, N270K, N290G, Y304H, R305M, H307G/Q/M, E308Q, I326F, L349M, D353A/N, L364Q, A394V, S399N, N400K, P404A, L407V, F443H, N453G, Y459F, T460G, T463N, N474Q, E509L, Q521K/S, K522Y/F/N, T524S,P528L, S546R и P564G/L/M, при оптимальном выравнивании с SEQ ID NO: 4.
B некоторых вариантах осуществления различие аминокислотного остатка выбрано из комбинации одного или более A39V, A91V, A256G, N290G, A394V, S399N, P404A, L407V, K522Y/F/N и/или T524S, при оптимальном выравнивании с SEQ ID NO: 4.
B некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к функциональным фрагментам сконструированных полипептидов PAL. B некоторых вариантах осуществления функциональные фрагменты содержат по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% активностью сконструированного полипептида PAL, из которого их получают (т.е. исходного сконструированной PAL). B некоторых вариантах осуществления функциональные фрагменты обладают по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% исходной последовательности сконструированной PAL. B некоторых вариантах осуществления проводят усечение функционального фрагмента менее чем на 5, менее чем на 10, менее чем на 15, менее чем на 10, менее чем на 25, менее чем на 30, менее чем на 35, менее чем на 40, менее чем на 45 и менее чем на 50 аминокислот.
B некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к функциональным фрагментам сконструированных полипептидов PAL. B некоторых вариантах осуществления функциональные фрагменты обладают по меньшей мере приблизительно 95, 96, 97, 98 или 99% активностью сконструированного полипептида PAL, из которого их получают (т.е. исходного сконструированной PAL). B некоторых вариантах осуществления функциональные фрагменты содержат по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% исходной последовательности сконструированной PAL. B некоторых вариантах осуществления проводят усечение функционального фрагмента менее чем на 5, менее чем на 10, менее чем на 15, менее чем на 10, менее чем на 25, менее чем на 30, менее чем на 35, менее чем на 40, менее чем на 45, менее чем на 50, менее чем на 55, менее чем на 60, менее чем на 65 или менее чем на 70 аминокислот.
В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL, обладающие по меньшей мере одним улучшенным свойством, обладают по меньшей мере 85%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или большей идентичностью аминокислотных последовательностей с SEQ ID NO: 6 и различием аминокислотного остатка по сравнению с SEQ ID NO: 6 в одном или более положений аминокислот (таких как 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 или более положений аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO: 6 или последовательностью, обладающей по меньшей мере 85%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или большей идентичностью аминокислотных последовательностей с
- 35 034034
SEQ ID NO: 6. B некоторых вариантах осуществления сконструированные PAL обладают по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 6 и обладают различием аминокислот по сравнению с SEQ ID NO: 6 по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более положений аминокислот.
B некоторых вариантах осуществления сконструированный полипептид PAL состоит из последовательности SEQ ID NO: 6.
В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL, обладающие по меньшей мере одним улучшенным свойством, обладают по меньшей мере 85%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или большей идентичностью аминокислотных последовательностей с SEQ ID NO: 10 или ее функциональным фрагментом и различием аминокислотного остатка по сравнению с SEQ ID NO: 10 в одном или более положений аминокислот (таких как в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 или более положений аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO: 10 или последовательностью, обладающей по меньшей мере 85%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или большей идентичностью аминокислотных последовательностей с SEQ ID NO: 10. B некоторых вариантах осуществления сконструированные PAL обладают по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 10 и обладают различием аминокислот по сравнению с SEQ ID NO: 10 по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более положений аминокислот. В некоторых вариантах осуществления сконструированный полипептид PAL состоит из последовательности SEQ ID NO: 10.
В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL, обладающие по меньшей мере одним улучшенным свойством, обладают по меньшей мере 85%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или большей идентичностью аминокислотных последовательностей с SEQ ID NO: 12 или ее функциональным фрагментом и различием аминокислотного остатка по сравнению с SEQ ID NO: 12 в одном или более положений аминокислот (таких как в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 или более положений аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO: 12 или последовательностью, обладающей по меньшей мере 85%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или большей идентичностью аминокислотных последовательностей с SEQ ID NO: 12. B некоторых вариантах осуществления сконструированные PAL обладают по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 12 и обладают различием аминокислот по сравнению с SEQ ID NO: 12 по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более положений аминокислот. В некоторых вариантах осуществления сконструированный полипептид PAL состоит из последовательности SEQ ID NO: 12.
В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL, обладающие по меньшей мере одним улучшенным свойством, обладают по меньшей мере 85%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или большей идентичностью аминокислотных последовательностей с SEQ ID NO: 14 или ее функциональным фрагментом и различием аминокислотного остатка по сравнению с SEQ ID NO: 14 в одном или более положений аминокислот (таких как в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 или более положений аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO: 14 или последовательностью, обладающей по меньшей мере 85%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или большей идентичностью аминокислотных последовательностей с SEQ ID NO: 14. B некоторых вариантах осуществления сконструированные PAL обладают по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 14 и обладают различием аминокислот по сравнению с SEQ ID NO: 14 по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более положений аминокислот. В некоторых вариантах осуществления сконструированный полипептид PAL состоит из последовательности SEQ ID NO: 14.
В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL, обладающие по меньшей мере одним улучшенным свойством, обладают по меньшей мере 85%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или большей идентичностью аминокислотных последовательностей с SEQ ID NO: 16 или ее функциональным фрагментом и различием аминокислотного остатка по сравнению с SEQ ID NO: 16 в одном или более положений аминокислот (таких как в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 или более положений аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO: 16 или последовательностью, обладающей по меньшей мере 85%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по
- 36 034034 меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или большей идентичностью аминокислотных последовательностей с SEQ ID NO: 16. B некоторых вариантах осуществления сконструированные PAL обладают по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 16 и обладают различием аминокислот по сравнению с SEQ ID NO: 16 по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более положений аминокислот. В некоторых вариантах осуществления сконструированный полипептид PAL состоит из последовательности SEQ ID NO: 16.
В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL, обладающие по меньшей мере одним улучшенным свойством, обладают по меньшей мере 85%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или большей идентичностью аминокислотных последовательностей с SEQ ID NO: 18 или ее функциональным фрагментом и различием аминокислотного остатка по сравнению с SEQ ID NO: 18 в одном или более положений аминокислот (таких как в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 или более положений аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO: 18 или последовательностью, обладающей по меньшей мере 85%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или большей идентичностью аминокислотных последовательностей с SEQ ID NO: 18. B некоторых вариантах осуществления сконструированные PAL обладают по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 18 и обладают различием аминокислот по сравнению с SEQ ID NO: 18 по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более положений аминокислот. В некоторых вариантах осуществления сконструированный полипептид PAL состоит из последовательности SEQ ID NO: 18.
В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL, обладающие по меньшей мере одним улучшенным свойством, обладают по меньшей мере 85%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или большей идентичностью аминокислотных последовательностей с SEQ ID NO: 20 или ее функциональным фрагментом и различием аминокислотного остатка по сравнению с SEQ ID NO: 20 в одном или более положений аминокислот (таких как в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 или более положений аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO: 20 или последовательностью, обладающей по меньшей мере 85%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или большей идентичностью аминокислотных последовательностей с SEQ ID NO: 20. B некоторых вариантах осуществления сконструированные PAL обладают по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 20 и обладают различием аминокислот по сравнению с SEQ ID NO: 20 по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более положений аминокислот. В некоторых вариантах осуществления сконструированный полипептид PAL состоит из последовательности SEQ ID NO: 20.
В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL, обладающие по меньшей мере одним улучшенным свойством, обладают по меньшей мере 85%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или большей идентичностью аминокислотных последовательностей с SEQ ID NO: 22 или ее функциональным фрагментом и различием аминокислотного остатка по сравнению с SEQ ID NO: 22 в одном или более положений аминокислот (таких как в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 или более положений аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO: 22 или последовательностью, обладающей по меньшей мере 85%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или большей идентичностью аминокислотных последовательностей с SEQ ID NO: 22. B некоторых вариантах осуществления сконструированные PAL обладают по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 22 и обладают различием аминокислот по сравнению с SEQ ID NO: 22 по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более положений аминокислот. В некоторых вариантах осуществления сконструированный полипептид PAL состоит из последовательности SEQ ID NO: 22.
В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL, обладающие по меньшей мере одним улучшенным свойством, обладают по меньшей мере 85%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или большей идентичностью аминокислотных последовательностей с SEQ ID NO: 24 или ее функциональным фрагментом и различием аминокислотного остатка по сравнению с SEQ ID NO: 24 в одном или более положений аминокислот (таких как в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15
- 37 034034 или более положений аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO: 24 или последовательностью, обладающей по меньшей мере 85%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или большей идентичностью аминокислотных последовательностей с SEQ ID NO: 24. B некоторых вариантах осуществления сконструированные PAL обладают по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 24 и обладают различием аминокислот по сравнению с SEQ ID NO: 24 по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более положений аминокислот. В некоторых вариантах осуществления сконструированный полипептид PAL состоит из последовательности SEQ ID NO: 24.
Варианты со сниженной чувствительностью к протеолизу.
В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL по настоящему изобретению обладают активностью PAL, обладают сниженной чувствительностью к протеолизу и a) содержат аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью последовательности с эталонной последовательностью SEQ ID NO: 4; b) обладают различием аминокислотного остатка по сравнению с SEQ ID NO: 4 в одном или более положений аминокислот.
В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL, которые обладают сниженной чувствительностью к протеолизу, обладают по меньшей мере 85%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или большей идентичностью аминокислотных последовательностей с SEQ ID NO: 4 и различием аминокислотного остатка по сравнению с SEQ ID NO: 4 в одном или более положений аминокислот (таких как в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 20 или более положений аминокислот по сравнению с SEQ ID NO: 4 или последовательностью, обладающей по меньшей мере 85%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или большей идентичностью аминокислотных последовательностей с SEQ ID NO: 4).
В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL, которые обладают сниженной чувствительностью к протеолизу обладают по меньшей мере 85%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или большей идентичностью аминокислотных последовательностей с SEQ ID NO: 4 и различием аминокислотного остатка по сравнению с SEQ ID NO: 4 в одном или более положений аминокислот выбраны из Х39, Х54, Х59, Х73, Х91, Х158, Х112, Х134, Х180, Х195, Х240, Х243, Х245, Х256, Х257, Х270, Х290, Х304, Х305, Х307, Х308, Х326, Х349, Х353, Х364, Х394, Х399, Х400, Х404, Х407, Х443, Х453, Х459, Х460, Х463, Х474, Х509, Х521, Х522, Х524, Х528, Х546, Х564 или любого их сочетания, при оптимальном выравнивании с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4. B некоторых вариантах осуществления различие аминокислот существует в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 или 20 или более положений аминокислот.
В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL, которые обладают сниженной чувствительностью к протеолизу, обладают по меньшей мере 85%, по меньшей мере 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 4 и обладают различием аминокислотного остатка в положении Х307, Х326, Х460, Х307 и/или Х528 и необязательно различием аминокислотного остатка в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более положений аминокислот. B некоторых вариантах осуществления различие аминокислотного остатка выбрано из Y304H/W, R305L/М, H307G/M/Q, I326F, Q240W, T460G, P528L и любого сочетания этих замен при выравнивании с SEQ ID NO: 4.
В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL, которые обладают сниженной чувствительностью к протеолизу, обладают по меньшей мере 85%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или большей идентичностью аминокислотных последовательностей с любой из SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 и/или 24 или ее функциональным фрагментом и различием аминокислотного остатка по сравнению с SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 и/или 24 в одном или более положений аминокислот (таких как в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 или более положений аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 и/или 24, или последовательностью, обладающей по меньшей мере 85%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или большей идентичностью аминокислотных последовательностей с SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 и/или 24. B некоторых вариантах осуществления сконструированная PAL обладает по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 и/или 24 и обладает различием аминокислот по
- 38 034034 сравнению с SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 и/или 24 по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более положений аминокислот. B некоторых вариантах осуществления PAL содержит или состоит из последовательности из SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 И/или 24.
B некоторых вариантах осуществления протеолитическая чувствительность сконструированных полипептидов PAL является сниженной по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% от протеолитической чувствительности PAL дикого типа (например, AvPAL, содержащей SEQ ID NO: 4) или по сравнению с эталонным полипептидом PAL, по существу, в одних и тех же условиях. Протеолитическую активность можно измерять любыми подходящими известными в данной области способами, включая, но не ограничиваясь ими, способы, описанные в примерах.
В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL, обладающие сниженной чувствительностью к протеолизу, обладают сниженной чувствительностью к композиции, содержащей одну или более протеаз, включая, но не ограничиваясь ими, пепсин, трипсин, химотрипсин, карбоксипептидазу A и В, пептидазы (например, аминопептидазу, дипептидазу и энтеропептидазу), когда эталонную PAL и сконструированную PAL, обладающую сниженной чувствительностью сравнивают и подвергают действию, по существу, одному и тому же количеству и типу протеазы, по существу, в одних и тех же условиях.
В некоторых вариантах осуществления сконструированный полипептид PAL, обладающий сниженной чувствительностью к протеолизу, обладает уровнями ферментативной активности, которые являются приблизительно в 1,0, 2, 5, 10, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200 раз или более больше ферментативной активности эталонной PAL (например, AvPAL). B некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды обладают большей ферментативной активностью по сравнению с эталонной PAL, когда активность измеряют при диапазоне pH от 4,5 до 7,5; когда активность измеряют при диапазоне pH от 4,5 до 6,5; когда активность измеряют при диапазоне pH от 5,0 до 7,5; когда активность измеряют при диапазоне pH от 5,0 до 6,5; когда активность измеряют при диапазоне pH от 5,5 до 7,5 и/или также когда активность измеряют при диапазоне pH от 5,5 до 6,5. B некоторых других вариантах осуществления значения Km сконструированных полипептидов PAL находятся в диапазоне от 1 мкМ до 5 мМ.
Варианты с повышенной устойчивостью к кислому pH.
В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL по изобретению обладают активностью PAL, являются устойчивыми к кислым уровням pH и a) содержат аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью последовательности с эталонной последовательностью SEQ ID NO: 4 или ее фрагментом; и b) обладают различием аминокислотного остатка по сравнению с SEQ ID NO: 4 в одном или более положений аминокислот.
В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL, которые обладают повышенной устойчивостью к кислому pH по сравнению с AvPAL дикого типа и/или другого эталонного полипептида, обладают по меньшей мере 85%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или большей идентичностью аминокислотных последовательностей с SEQ ID NO: 4 и различием аминокислотного остатка по сравнению с SEQ ID NO: 4 в одном или более положений аминокислот (таких как в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 20 или более положений аминокислот по сравнению с SEQ ID NO: 4 или последовательностью, обладающей по меньшей мере 85%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или большей идентичностью аминокислотных последовательностей с SEQ ID NO: 4.
В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL, которые обладают повышенной устойчивостью к кислому pH по сравнению с AvPAL дикого типа и/или другим эталонным полипептидом, обладают по меньшей мере 85%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или большей идентичностью аминокислотных последовательностей с SEQ ID NO: 4 и различием аминокислотного остатка по сравнению с SEQ ID NO: 4 в одном или более положений аминокислот выбраны из Х39, Х54, Х59, Х73, Х91, Х158, Х112, Х134, Х180, Х195, Х240, Х243, Х245, Х256, Х257, Х270, Х290, Х304, Х305, Х307, Х308, Х326, Х349, Х353, Х364, Х394, Х399, Х400, Х404, Х407, Х443, Х453, Х459, Х460, Х463, Х474, Х509, Х521, Х522, Х524, Х528, Х546, Х564 или любого их сочетания при оптимальном выравнивании с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4. B некоторых вариантах осуществления различие аминокислот существует в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 или 20 или более положений аминокислот.
В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL, которые обладают повышенной устойчивостью к кислому pH по сравнению с AvPAL дикого типа и/или другого эталонного
- 39 034034 полипептида, обладают по меньшей мере 85%, по меньшей мере 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 4 и обладают различием аминокислотного остатка в положении Х39, Х54, Х59, Х73, Х91, Х158, Х112, Х134, Х180, Х195, Х240, Х243, Х245, Х256, Х257, Х270, Х290, Х304, Х305, Х307, Х308, Х326, Х349, Х353, Х364, Х394, Х399, Х400, Х404, Х407, Х443, Х453, Х459, Х460, Х463, Х474, Х509, Х521, Х522, Х524, Х528, Х546, Х564 или любого их сочетания и необязательно различием аминокислотного остатка в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более положений аминокислот. B некоторых вариантах осуществления различие аминокислотного остатка существует в А39, Т54, G59, S73, А91, Y158, S180, K195, А112, R134, Q240, Т243, I245, А256, L257, N270, N290, Y304, R305, Н307, Е308, I326, L349, D353, L364, А394, S399, N400, Р404, L407, F443, N453, Y459, Т460, Т463, N474, E509, Q521, K522, Т524, Р528, S546 и/или Р564 при выравнивании с SEQ ID NO: 4. B некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL, которые обладают повышенной устойчивостью к кислому pH, обладают по меньшей мере 85%, по меньшей мере 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 4 и обладают различием аминокислотного остатка в одном или более положений A39V, Т541<. G59R, S73K, А112О, R134Q, A91V, Y158H, S180A, K195E, Q240R/W, T243I/L, I245L, A256G, L257W/A, N270K, N290G, Y304H, R305M, H307G/Q/M, E308Q, I326F, L349M, D353A/N, L364Q, A394V, S399N, N400K, Р404Л L407V, F443H, N453G, Y459F, T460G, T463N, N474Q, E509L, Q521K/S, K522Y/F/N, T524S,P528L, S546R и/или P564G/L/M при выравнивании с SEQ ID NO: 4.
B некоторых вариантах осуществления, когда все условия другого анализа являются, по существу, одинаковыми, сконструированные полипептиды PAL, обладающие повышенной устойчивостью к кислому pH по сравнению с эталонным полипептидом PAL, обладают повышенной устойчивостью к pH в диапазоне от 1,5 до 6,5; от 1,5 до 5,0; от 2,0 до 5,5; от 3,0 до 6,8; от 3,0 до 5,5; от 4,0 до 6,5; от 4,0 и 4,5; от 4,5 до 5,0; от 4,5 до 5,5, от 4,5 до 6,0; от 4,5 до 6,5; от 5,0 до 6,5; от 5,0 до 6,0; от 5,0 до 5,5; от 5,5 до 6,0; от 6,0 до 6,5 и/или от 6,5 до 7,0. B некоторых вариантах осуществления повышенная устойчивость к кислому pH проявляется при pH от приблизительно 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0 и/или 6,5.
В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL, которые обладают повышенной устойчивостью к кислому pH, также обладают большей активностью PAL по сравнению с эталонной PAL при измерении стандартным анализом. Любой подходящий анализ находит применение в настоящем изобретении, включая, но не ограничиваясь ими, анализа, предоставленные в настоящем описании.
Дополнительно предусмотрено, что любой из иллюстративных сконструированных полипептидов (т.е. вариант № 1 - вариант № 1010) находит применение в качестве начальной аминокислотной последовательности для синтеза других сконструированных полипептидов PAL, например, последующими циклами эволюции путем добавления новых комбинаций отличных различий аминокислот от других полипептидов и других положений остатка, описываемых в настоящем описании. B некоторых вариантах осуществления получают дополнительные улучшения путем введения различий аминокислот в положениях остатков, которые поддерживают как незаряженные на всем протяжении ранних циклов эволюции. Следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено каким-либо конкретным способом получения сконструированных полипептидов PAL, т.к. любой подходящий способ находит применение, включая, но не ограничиваясь ими, способы, предоставленные в настоящем описании.
Полинуклеотиды, кодирующие сконструированные полипептиды, экспрессирующие векторы и клетки-хозяева.
Настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, кодирующим сконструированные полипептиды PAL, описываемые в настоящем описании. B некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды функционально связывают с одной или более гетерологичных регуляторных последовательностей, которые регулируют экспрессию гена, для получения рекомбинантного полинуклеотида, способного экспрессировать полипептид. B некоторых вариантах осуществления экспрессирующие конструкции, содержащие по меньшей мере один гетерологичный полинуклеотид, кодирующий сконструированный полипептид(ы) PAL, вводят в подходящие клетки-хозяева для экспрессии соответствующего полипептид(ов) PAL.
Как будет понятно специалисту в данной области, доступность последовательности белка и знание кодонов, соответствующих различным аминокислотам, обеспечивают описание всех полинуклеотидов, способных кодировать целевые полипептиды. Вырожденность генетического кода, когда одни и те же аминокислоты кодируются альтернативными или синонимичными кодонами, обеспечивает возможность получения очень большого числа нуклеиновых кислот, которые все кодируют сконструированный полипептид PAL. Таким образом, настоящее изобретение относится к способам и композициям для получения каждого и всех возможных изменений полинуклеотидов PAL, которые можно получать, которые кодируют полипептиды PAL, описываемые в настоящем описании, отбором комбинаций на основании выбора возможных кодонов, и считают, что все такие изменения конкретно описаны для любого полипептида, описываемого в настоящем описании, включая аминокислотные последовательности, приведенные в примерах (например, в различных таблицах).
B некоторых вариантах осуществления кодоны предпочтительно оптимизируют для использования
- 40 034034 выбранной клеткой-хозяином для продукции белка. Например, предпочтительные кодоны, используемые в бактериях, как правило, используют для экспрессии в бактериях. Таким образом, кодоноптимизированные полинуклеотиды, кодирующие сконструированные полипептиды PAL, содержат предпочтительные кодоны приблизительно в 40, 50, 60, 70, 80, 90 или более 90% положений кодонов полноразмерной кодирующей области.
B некоторых вариантах осуществления полинуклеотид PAL кодирует сконструированный полипептид, обладающий активностью PAL, со свойствами, описываемыми в настоящем описании, где полипептид содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичностью с эталонной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 и/или 23, или аминокислотную последовательность любого варианта (например, вариантов, предоставленных в примерах) и обладает одним или более различий остатков по сравнению с эталонным полинуклеотидом SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 и/или 23 или аминокислотной последовательностью любого варианта, как описано в примерах (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более положений аминокислотного остатка). B некоторых вариантах осуществления эталонная последовательность выбрана из SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 и/или 23.
B некоторых вариантах осуществления полинуклеотид PAL кодирует сконструированный полипептид, обладающий активностью PAL, со свойствами, описываемыми в настоящем описании, где полипептид содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичностью последовательности с эталонной последовательностью SEQ ID NO: 4 и одним или более различий остатков по сравнению с SEQ ID NO: 4 в положениях остатков из Х39, Х54, Х59, Х73, Х91, Х158, Х112, Х134, Х180, Х195, Х240, Х243, Х245, Х256, Х257, Х270, Х290, Х304, Х305, Х307, Х308, Х326, Х349, Х353, Х364, Х394, Х399, Х400, Х404, Х407, Х443, Х453, Х459, Х460, Х463, Х474, Х509, Х521, Х522, Х524, Х528, Х546 и/или Х564 при оптимальном выравнивании с полипептидом SEQ ID NO: 4.
B некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, кодирующий сконструированные полипептиды PAL, содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из полинуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 и/или 23. B некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, кодирующий сконструированный полипептид PAL, обладает по меньшей мере 80, 85, 90, 93, 95, 96, 97, 98, 99% идентичностью нуклеотидных остатков с SEQ ID NO: 2, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 и/или 23.
B некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды способны гибридизироваться в условиях с высокой жесткостью с эталонной полинуклеотидной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 2, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 и/или 23, или ее комплемента или полинуклеотидной последовательностью, кодирующей любой из вариантов полипептидов PAL, предоставленных в настоящем описании. B некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, способный гибридизироваться в условиях с высокой жесткостью, кодирует полипептид PAL, содержащий аминокислотную последовательность, которая обладает одним или более различием остатков по сравнению с SEQ ID NO: 4 в положениях остатков, выбранных из Х39, Х54, Х59, Х73, Х91, Х158, Х112, Х134, Х180, Х195, Х240, Х243, Х245, Х256, Х257, Х270, Х290, Х304, Х305, Х307, Х308, Х326, Х349, Х353, Х364, Х394, Х399, Х400, Х404, Х407, Х443, Х453, Х459, Х460, Х463, Х474, Х509, Х521, Х522, Х524, Х528, Х546 и/или Х564.
B некоторых вариантах осуществления выделенный полинуклеотид, кодирующий любой из сконструированных полипептидов PAL в настоящем описании, обрабатывают различными способами для облегчения экспрессии полипептида PAL. B некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды, кодирующие полипептиды PAL, содержат экспрессирующие векторы, где содержится одна или более контролирующих последовательностей для регуляции экспрессии полинуклеотидов PAL и/или полипептидов. Обработка выделенного полинуклеотида перед его встраиванием в вектор может являться желательной или необходимой в зависимости от используемого экспрессирующего вектора. Техники модификации полинуклеотидов и последовательностей нуклеиновых кислот способами рекомбинантных ДНК хорошо известны в данной области. B некоторых вариантах осуществления контролирующие последовательности содержат наряду с другими промоторы, лидерные последовательности, последовательности полиаденилирования, пропептидные последовательности, сигнальные пептидные последовательности и терминаторы транскрипции. B некоторых вариантах осуществления подходящие промоторы выбраны в зависимости от выбора клеток-хозяев. Для бактериальных клеток-хозяев подходящие промоторы для направления транскрипции конструкций нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению включают, но не ограничиваются ими, промоторы, получаемые из lac-оперона Е. coli, гена агаразы Streptomyces coelicolor (dagA), гена левансахаразы Bacillus subtilis (sacB), гена α-амилазы Bacillus licheniformis (amyL), гена мальтогенной амилазы Bacillus stearothermophilus (amyM), гена α-амилазы Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), гена пенициллиназы Bacillus licheniformis (penP), генов xylA и xylB Bacillus subtilis и прокариотического гена β-лактамазы (см., например, Villa-Kamaroff et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 75:3727-3731 [1978]), а также промотора tac (см., например, DeBoer et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 80: 21-25 [1983]).
- 41 034034
Иллюстративные промоторы для клеток-хозяев нитевидных грибов, включают, но не ограничиваются ими, промоторы, получаемые из генов TAKA-амилазы Aspergillus oryzae, аспарагиновой протеиназы Rhizomucor miehei, нейтральной α-амилазы Aspergillus niger, кислотостойкой α-амилазы Aspergillus niger, глюкоамилазы Aspergillus niger или Aspergillus awamori (glaA), липазы Rhizomucor miehei, щелочной протеазы Aspergillus oryzae, триозофосфатизомеразы Aspergillus oryzae, ацетамидазы Aspergillus nidulans и трипсиноподобной протеазы Fusarium oxysporum (см., например, WO 96/00787), a также промотора NA2-tpi (гибрида промоторов из генов нейтральной α-амилазы Aspergillus niger и триозофосфатизомеразы Aspergillus oryzae) и их мутантные, усеченные и гибридные промоторы. Иллюстративные промоторы дрожжевой клетки можно получать из генов енолазы Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), галактокиназы Saccharomyces cerevisiae (GAL1), алкогольдегидрогеназы/глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы Saccharomyces cerevisiae (ADH2) и 3-фосфоглицераткиназы Saccharomyces cerevisiae. Другие пригодные промоторы для дрожжевых клеток-хозяев известны в данной области (см., например, Romanos et al., Yeast, 8:423-488 [1992]).
B некоторых вариантах осуществления контролирующая последовательность также представляет собой подходящую последовательность терминатора транскрипции (т.е. последовательность, распознаваемую клеткой-хозяином для терминации транскрипции). B некоторых вариантах осуществления терминирующая последовательность является функционально связанной с 3'-концом последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид PAL. Любой подходящий терминатор, который является функциональным в выбираемой клетке-хозяине, находит применение в настоящем изобретении. Иллюстративные терминаторы транскрипции для клеток-хозяев нитевидных грибов можно получать из генов TAKA-амилазы Aspergillus oryzae, глюкоамилазы Aspergillus niger, антранилатсинтазы Aspergillus nidulans, α-глюкозидазы Aspergillus niger и трипсиноподобной протеазы Fusarium oxysporum. Иллюстративные терминаторы для дрожжевых клеток-хозяев можно получать из генов енолазы Saccharomyces cerevisiae, цитохрома С Saccharomyces cerevisiae (CYC1) и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы Saccharomyces cerevisiae. Другие пригодные терминаторы для дрожжевых клеток-хозяев являются известными в данной области (см., например, Romanos et al., выше).
B некоторых вариантах осуществления контролирующая последовательность также является подходящей лидерной последовательностью (т.е. нетранслируемой областью мРНК, которая является важной для трансляции клеткой-хозяином). B некоторых вариантах осуществления лидерная последовательность является функционально связанной с 5'-концом последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид PAL. Любая подходящая лидерная последовательность, которая является функциональной в выбираемой клетке-хозяине, находит применение в настоящем изобретении. Иллюстративные лидерные последовательности для клеток-хозяев нитевидных грибов получают из генов TAKA-амилазы Aspergillus oryzae и триозофосфатизомеразы Aspergillus nidulans. Подходящие лидерные последовательности для дрожжевых клеток-хозяев получают из генов енолазы Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), 3фосфоглицераткиназы Saccharomyces cerevisiae, α-фактора Saccharomyces cerevisiae и алкогольдегидрогеназы/глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP).
B некоторых вариантах осуществления контролирующая последовательность также является последовательностью полиаденилирования (т.е. последовательностью функционально связанной с 3'концом последовательности нуклеиновой кислоты, и которая при транскрипции распознается клеткойхозяином как сигнал добавления остатков полиаденозина к транскрибируемой мРНК). Любая подходящая последовательность полиаденилирования, которая является функциональной в выбираемой клеткехозяине, находит применение в настоящем изобретении. Иллюстративные последовательности полиаденилирования для клеток-хозяев нитевидных грибов включают, но не ограничиваются ими, гены TAKAамилазы Aspergillus oryzae, глюкоамилазы Aspergillus niger, антранилатсинтазы Aspergillus nidulans, трипсиноподобной протеазы Fusarium oxysporum и α-глюкозидазы Aspergillus niger. Последовательности полиаденилирования, пригодные для дрожжевых клеток-хозяев, являются известными (см., например, Guo and Sherman, Mol. Cell. Bio., 15:5983-5990 [1995]).
B некоторых вариантах осуществления контролирующая последовательность также является сигнальным пептидом (т.е. кодирующей областью, которая кодирует аминокислотную последовательность, связанную с аминоконцом полипептида, и направляет кодируемый полипептид в секреторном пути клетки). B некоторых вариантах осуществления 5'-конец кодирующей последовательности нуклеиновой кислоты естественным образом содержит кодирующую область сигнального пептида, естественно связанного в рамке считывания трансляции с сегментом кодирующей области, кодирующей секретируемый полипептид. Альтернативно, в некоторых вариантах осуществления 5'-конец кодирующей последовательности содержит кодирующую область сигнального пептида, которая является чужеродной кодирующей последовательности. Любой подходящий сигнальный пептид, кодирующий область, которая направляет экспрессируемый полипептид в секреторном пути выбираемой клетки-хозяина, находит применение для экспрессии сконструированного полипептида(ов). Эффективные кодирующие области сигнального пептида для бактериальных клеток-хозяев представляют собой кодирующие области сигнальных пептидов, включают, но не ограничиваются ими, кодирующие области сигнальных пептидов, полу
- 42 034034 чаемые из генов мальтогенной амилазы Bacillus NClB 11837, α-амилазы Bacillus stearothermophilus, субтилизина Bacillus licheniformis, β-лактамазы Bacillus licheniformis, нейтральных протеаз Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM) и prsA Bacillus subtilis. Дополнительные сигнальные пептиды являются известными в данной области (см., например, Simonen and Palva, Microbiol. Rev., 57:109-137 [1993]). B некоторых вариантах осуществления эффективные кодирующие области сигнальных пептидов для клеток-хозяев нитевидных грибов включают, но не ограничиваются ими, кодирующие области сигнальных пептидов, получаемые из генов TAKA-амилазы Aspergillus oryzae, нейтральной амилазы Aspergillus niger, глюкоамилазы Aspergillus niger, аспарагиновой протеиназы Rhizomucor miehei, целлюлазы Humicola insolens и липазы Humicola lanuginosa. Пригодные сигнальные пептиды для дрожжевых клетокхозяев включают, но не ограничиваются ими, сигнальные пептиды из генов α-фактора Saccharomyces cerevisiae и инвертазы Saccharomyces cerevisiae.
B некоторых вариантах осуществления контролирующая последовательность также является кодирующей областью пропептида, которая кодирует аминокислотную последовательность, расположенную на аминоконце полипептида. Получаемый полипептид обозначают как профермент, прополипептид или зимоген. Прополипептид можно преобразовывать до зрелого активного полипептида путем каталитического или аутокаталитического отщепления пропетида от прополипептида. Кодирующую область для пропептида можно получать из любого подходящего источника, включая, но не ограничиваясь ими, гены щелочной протеазы Bacillus subtilis (aprE), нейтральной протеазы Bacillus subtilis (nprT), α-фактора Saccharomyces cerevisiae, аспарагиновой протеиназы Rhizomucor miehei и лактазы Myceliophthora thermophila (см., например, WO 95/33836). B случае, когда содержатся области сигнального пептида и пропептида в аминоконце полипептида, область пропептида располагается после аминоконца полипептида, и область сигнального пептида располагается после аминоконца области пропептида.
B некоторых вариантах осуществления также используют регуляторные последовательности. Эти последовательности облегчают регуляцию экспрессии полипептида относительно роста клетки-хозяина. Примеры регуляторных систем представляют собой системы, приводят к тому, что экспрессия гена активируется или подавляется в ответ на химический или физический стимул, включая наличие регуляторного соединения. B прокариотических клетках-хозяевах, подходящие регуляторные последовательности включают, но не ограничиваются ими, системы-операторы lac, tac и trp. B дрожжевых клетках-хозяевах подходящие регуляторные системы включают, но не ограничиваются ими, систему ADH2 или систему GAL1. В нитевидных грибах подходящие регуляторные последовательности включают, но не ограничиваются ими, промотор TAKA- α-амилазы, промотор глюкоамилазы Aspergillus niger и промотор глюкоамилазы Aspergillus oryzae.
B другом аспекте настоящее изобретение относится к рекомбинантному экспрессирующему вектору, содержащему полинуклеотид, кодирующий сконструированный полипептид PAL, и одну или более регулирующих экспрессию областей, таких как промотор и терминатор, точка начала репликации и т.д., в зависимости от типа хозяев, в которые их вводят. B некоторых вариантах осуществления различные последовательности нуклеиновых кислот и контролирующие последовательности, описываемые в настоящем описании, связывают друг с другом с получением рекомбинантных экспрессирующих векторов, которые содержат один или более подходящих участков рестрикции для обеспечения вставки или замены последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид PAL, в таких участках. Альтернативно, в некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению экспрессируется встраиваемой последовательностью нуклеиновой кислоты или конструкцией нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность в подходящем векторе для экспрессии. B некоторых вариантах осуществления, включающих создание экспрессирующего вектора, кодирующая последовательность располагается в векторе таким образом, чтобы кодирующая последовательность являлась функционально связанной с подходящими контролирующими последовательностями для экспрессии.
Рекомбинантный экспрессирующий вектор может представлять собой любой подходящий вектор (например, плазмиду или вирус), который можно подходящим способом подвергать способам рекомбинантной ДНК, и который приводит к экспрессии полинуклеотидной последовательности PAL. Выбор вектора, как правило, зависит от совместимости вектора с клеткой-хозяином, в которую вектор необходимо вводить. Векторы могут представлять собой линейные плазмиды или замкнутые кольцевые плазмиды.
B некоторых вариантах осуществления экспрессирующий вектор представляет собой автономно реплицирующийся вектор (т.е. вектор, который существует как внехромосомная структурная единица, репликация которой не зависит от хромосомной репликации, такой как плазмида, внехромосомный элемент, мини-хромосома или искусственная хромосома). Вектор может содержать любое средство для обеспечения саморепликации. B некоторых альтернативных вариантах осуществления вектор представляет собой вектор, который при введении в клетку-хозяин интегрируется в геном и реплицируется совместно с хромосомой(ами), в которую он был интегрирован. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления используют один вектор или плазмиду или два или более векторов или плазмид, которые со- 43 034034 вместно содержат общую ДНК, которую необходимо вводить в геном клетки-хозяин и/или транспозон.
B некоторых вариантах осуществления экспрессирующий вектор содержит один или более селектируемых маркеров, которые обеспечивают простой отбор трансформированных клеток.
Селектируемый маркер представляет собой ген, продукт которого обеспечивает устойчивость к биоцидам или вирусам, устойчивость к тяжелым металлам, прототрофность ауксотрофам и т.п. Примеры бактериальных селектируемых маркеров включают, но не ограничиваются ими, гены dal из Bacillus subtilis или Bacillus licheniformis или маркеры, которые придают устойчивость к антибиотикам, такую как устойчивость к ампициллину, канамицину, хлорамфениколу или тетрациклину. Подходящие маркеры для дрожжевых клеток-хозяев включают, но не ограничиваются ими, ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 и URA3. Селектируемые маркеры для применения в клетках-хозяевах нитевидных грибов включают, но не ограничиваются ими, amdS (ацетамидазу, например, из А. nidulans или A. orzyae), argB (орнитинкарбамоилтрансферазы), bar (фосфинотрицинацетилтрансферазу, например, из S. hygroscopicus), hph (гигромицинфосфотрансферазу), niaD (нитратредуктазу), pyrG (оротидин-5'-фосфатдекарбоксилазу, например, из A. nidulans или A. orzyae), sC (сульфатаденилтрансферазу) и trpC (антранилатсинтазу), а также их эквиваленты. B другом аспекте настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере один сконструированный полипептид PAL по настоящему изобретению, где полинуклеотид(ы) является функционально связанным с одной или более контролирующими последовательностями для экспрессии сконструированного фермента(ов) PAL в клетке-хозяине. Клетки-хозяева, пригодные для использования для экспрессии полипептидов, кодируемых экспрессирующими векторами по настоящему изобретению, хорошо известны в данной области и включают, но не ограничиваются ими, бактериальные клетки, такие как клетки Е. coli, Vibrio fluvialis, Streptomyces и Salmonella typhimurium; клетки грибов, такие как дрожжевые клетки (например, Saccharomyces cerevisiae или Pichia pastoris (№ доступа АТСС 201178)); клетки насекомых, такие как клетки Drosophila S2 и Spodoptera Sf9; животные клетки, такие как клетки CHO, COS, BHK, 293 и клетки меланомы Боуэса, и растительные клетки. Иллюстративные клетки-хозяева также включают различные штаммы Escherichia coli (например, W3110 (AfhuA) и BL21).
Таким образом, в другом аспекте настоящее изобретение относится к способам получения сконструированных полипептидов PAL, где способы включают культивирование клетки-хозяина, способного экспрессировать полинуклеотид, кодирующий сконструированный полипептид PAL в условиях, подходящих для экспрессии полипептида. B некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают этапы выделения и/или очистки полипептидов PAL, как описано в настоящем описании.
Подходящие среды для культивирования и условия роста для клеток-хозяев хорошо известны в данной области. Предусматривают, что в настоящем изобретении находит применение любой подходящий способ введения полинуклеотидов для экспрессии полипептидов PAL в клетках. Подходящие техники включают, но не ограничиваются ими, электропорацию, бомбардировку биолистическими частицами, опосредованную липосомами трансфекцию, трансфекцию хлоридом кальция и слияние протопластов.
Сконструированные полипептиды PAL со свойствами, описываемыми в настоящем описании, можно получать подверганием полинуклеотида, кодирующего природный или сконструированный полипептид PAL любому подходящему мутагенезу и/или направленной эволюции известными в данной области способами, и/или как описано в настоящем описании. Иллюстративная техника направленной эволюции представляет собой мутагенез и/или перестановку ДНК (см., например, Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:10747-10751 [1994]; WO 95/22625, WO 97/0078, WO 97/35966, WO 98/27230, WO 00/42651, WO 01/75767 и патент США 6537746). Другие способы направленной эволюции, которые можно использовать, наряду с другими включают способ ступенчатой достройки (StEP), рекомбинацию in vitro (см., например, Zhao et al., Nat. Biotechnol., 16:258-261 [1998]), мутагенную ПЦР (см., например, Caldwell et al., PCR Methods Appl., 3:S136-S140 [1994]) и кассетный мутагенез (см., например, Black et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3525-3529 [1996]).
Способы мутагенеза и направленной эволюции можно легко применять к кодирующим PAL полинуклеотидам для получения библиотек вариантов, которые можно экспрессировать, проводить скрининг и анализировать. Любые подходящие способы мутагенеза и направленной эволюции находят применение в настоящем изобретении и хорошо известны в данной области (см., например, патенты США №№ 5605793, 5830721, 6132970, 6420175, 6277638, 6365408, 6602986, 7288375, 6287861, 6297053, 6576467,
6444468, 5,811238, 6117679, 6165793, 6180406, 6291242, 6995017, 6395547, 6506602, 6519065, 6506603,
6413774, 6573098, 6323030, 6344356, 6372497, 7868138, 5834252, 5928905, 6489146, 6096548, 6387702,
6391552, 6358742, 6482647, 6335160, 6653072, 6355484, 6,03,344, 6319713, 6613514, 6455253, 6579678,
6586182, 6406855, 6946296, 7534564, 7776598, 5837458, 6391640, 6309883, 7105297, 7795030, 6326204,
6251674, 6716631, 6528311, 6287862, 6335198, 6352859, 6379964, 7148054, 7629170, 7620500, 6365377,
6358740, 6406910, 6413745, 6436675, 6961664, 7430477, 7873499, 7702464, 7783428, 7747391, 7747393,
7751986, 6376246, 6426224, 6423542, 6479652, 6319714, 6521453, 6368861, 7421347, 7058515, 7024312,
7620502, 7853410, 7957912, 7904249 и все родственные не принадлежащие США эквивалентные документы; Ling et al., Anal. Biochem., 254 (2):157-78 [1997]; Dale et al., Meth. Mol. Biol., 57:369-74 [1996];
- 44 034034
Smith, Ann. Rev. Genet., 19:423-462 [1985]; Botstein et al., Science, 229:1193-1201 [1985]; Carter, Biochem. J., 237:1-7 [1986]; Kramer et al., Cell, 38:879-887 [1984]; Wells et al., Gene, 34:315-323 [1985]; Minshull et al., Curr. Op. Chem. Biol., 3:284-290 [1999]; Christians et al., Nat. Biotechnol., 17:259-264 [1999]; Crameri et al., Nature, 391:288-291 [1998]; Crameri, et al., Nat. Biotechnol., 15:436-438 [1997]; Zhang et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 94:4504-4509 [1997]; Crameri et al., Nat. Biotechnol., 14:315-319 [1996]; Sterner, Nature, 370:389-391 [1994]; Stemmer, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91:10747-10751 [1994], WO 95/22625, WO 97/0078, WO 97/35966, WO 98/27230, WO 00/42651, WO 01/75767, WO 2009/152336 и патент США № 6537746, которые все включены в настоящее описание посредством ссылки).
B некоторых вариантах осуществления проводят скрининг клонов фермента, получаемых после обработки с применением мутагенеза, подвергая препараты фермента определенной температуре (или другим условиям анализа) и измеряя величину ферментативной активности, оставшейся после термических обработок или других подходящих условий анализа. Затем клоны, содержащие полинуклеотид, кодирующий полипептид PAL, выделяют из гена, секвенируют для идентификации изменений нуклеотидной последовательности (в случае их наличия) и используют для экспрессии фермента в клетке-хозяине. Измерение ферментативной активности в экспрессионных библиотеках можно проводить любым подходящим известным в данной области способом (например, стандартными биохимическими способами, такими как анализ ВЭЖХ).
Для сконструированных полипептидов с известной последовательностью можно получать полинуклеотиды, кодирующие фермент, стандартными твердофазными способами в соответствии с известными способами синтеза. В некоторых вариантах осуществления можно индивидуально синтезировать фрагменты приблизительно до 100 оснований, затем соединять их (например, способами ферментативного или химического лизирования или опосредованными полимеразой способами) с получением любой желаемой непрерывной последовательности. Например, полинуклеотиды и олигонуклеотиды, описываемые в настоящем описании, можно получать химическим синтезом классическим фосфорамидитным способом (см., например, Beaucage et al., Tet. Lett., 22:1859-69 [1981] и Matthes et al., EMBO J., 3:801-05 [1984]), как это реализуют, как правило, в автоматизированных способах синтеза. B соответствии с фосфорамидитным способом синтезируют олигонуклеотиды (например, в автоматическом синтезаторе ДНК, очищают, выравнивают, лигируют и клонируют в подходящие векторы).
Таким образом, в некоторых вариантах осуществления способ получения сконструированного полипептида PAL может включать: (a) синтез полинуклеотида, кодирующего полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотной последовательности любого варианта, как описано в настоящем описании, и (b) экспрессию полипептида PAL, кодируемого полинуклеотидом. B некоторых вариантах осуществления способа аминокислотная последовательность, кодируемая полинуклеотидом, может необязательно содержать одну или более (например, до 3, 4, 5 или до 10) делеций, вставок и/или замен аминокислотных остатков. B некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность необязательно содержит 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 1-15, 1-20, 121, 1-22, 1-23, 1-24, 1-25, 1-30, 1-35, 1-40, 1-45 или 1-50 делеций, вставок и/или замен аминокислотных остатков. B некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность необязательно содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 30, 35, 40, 45 или 50 делеций, вставок и/или замен аминокислотных остатков. B некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность необязательно содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 делеций, вставок и/или замен аминокислотных остатков. B некоторых вариантах осуществления замены представляют собой консервативные или неконсервативные замены.
Экспрессируемый сконструированный полипептид PAL можно оценивать на любое желаемое улучшенное свойство или сочетание свойств (например, активность, избирательность, стабильность, устойчивость к кислоте, чувствительность к протеазе и т.д.) любым подходящим анализом, известным в данной области, включая, но не ограничиваясь ими, анализы и условия, описываемые в настоящем описании.
B некоторых вариантах осуществления любой из сконструированных полипептидов PAL, экспрессируемых в клетке-хозяине, выделяют из клеток и/или среды для культивирования любым одним или более хорошо известным способом очистки белка, включая наряду с другими обработку лизоцимом, обработку ультразвуком, фильтрование, высаливание, ультрацентрифугирование и хроматографию.
Хроматографические способы выделения полипептидов PAL включают наряду с другими хроматографию с обращенной фазой, высокоэффективную жидкостную хроматографию, ионообменную хроматографию, хроматографию с гидрофобным взаимодействием, эксклюзионную хроматографию, электрофорез в геле и аффинную хроматографию. Условия очистки конкретного фермента частично зависят от таких факторов, как суммарный заряд, гидрофобность, гидрофильность, молекулярная масса, форма молекулы и т.д., и они будут понятны специалистам в данной области. B некоторых вариантах осуществления для выделения улучшенных ферментов PAL можно использовать аффинные способы. Для очистки аффинной хроматографией можно использовать любое антитело, которое специфически связывается с представляющим интерес полипептидом PAL. Для получения антител различных животных-хозяев, включая, но, не ограничиваясь ими, кроликов, мышей, крыс и т.д., иммунизируют посредством инъекции
- 45 034034 полипептида PAL или его фрагмента. B некоторых вариантах осуществления полипептид PAL или фрагмент присоединяют к подходящему носитель, такому как BSA, посредством функциональной группы боковой цепи или линкеров, присоединяемых к функциональной группе боковой цепи.
В некоторых вариантах осуществления сконструированный полипептид PAL продуцируют в клетке-хозяине способом, включающим культивирование клетки-хозяина (например, штамма Е. coli), содержащей полинуклеотидную последовательность, кодирующую сконструированный полипептид PAL, как описано в настоящем описании, в условиях, благоприятных для спродукции сконструированного полипептида PAL, и выделение сконструированного полипептида PAL из клеток и/или среды для культивирования. B некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин продуцирует более одного сконструированного полипептида PAL.
B некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу получения сконструированного полипептида PAL, включающему культивирование рекомбинантной бактериальной клетки, содержащей полинуклеотидную последовательность, кодирующую сконструированный полипептид PAL, обладающий по меньшей мере 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью последовательности с эталонными последовательностями SEQ ID NO: 4, и один или более различиями аминокислотного остатка по сравнению с SEQ ID NO: 4, выбранными из Х39, Х91, Х158, Х180, Х195, Х243, Х245, Х256, Х257, Х270, Х290, Х307, Х308, Х326, Х349, Х364, Х394, Х399, Х400, Х404, Х407, Х443, Х453, Х459, Х460, Х463, Х474, Х522, Х524 и Х528 или их сочетаний, при оптимальном выравнивании с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4, в подходящих условиях культивирования для обеспечения продукции сконструированного полипептида PAL и необязательно выделение сконструированного полипептида PAL из культуры и/или культивируемых бактериальных клеток. B некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин продуцирует более одного сконструированного полипептида PAL.
B некоторых вариантах осуществления после того, как сконструированные полипептиды PAL выделяют из рекомбинантных клеток-хозяев и/или среды для культивирования, их дополнительно очищают любым подходящим способом(ами), известными в данной области. B некоторых дополнительных вариантах осуществления очищенные полипептиды PAL объединяют с другими ингредиентами и соединениями с получением композиций и составов, содержащих сконструированный полипептид PAL, в зависимости от конкретного случая для различных применений и использований (например, фармацевтические композиции).
Композиции.
Настоящее изобретение относится к сконструированным полипептидам PAL, пригодным для использования во многих композициях. Эти композиции находят применение во многих областях, включая, но не ограничиваясь ими, фармацевтические средства, пищевые/питательные добавки, пищевой продукт, корм и получение химических веществ тонкого органического синтеза. Например, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к пищевым продуктам и/или кормам, содержащим по меньшей мере один вариант сконструированной PAL и/или по меньшей мере одной полинуклеотидной последовательности, кодирующей по меньшей мере один вариант PAL. B некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к напитками, содержащим по меньшей мере один сконструированный вариант PAL.
B некоторых вариантах осуществления вариант сконструированной PAL в пищевом продукте, корме и/или питательной/пищевой добавке является гликозилированным. Кроме того, варианты сконструированных PAL находят применение в любой подходящей пищевой матрице для доставки фермента. B некоторых вариантах осуществления варианты сконструированных PAL содержатся в пищевой матрице для доставки фермента, сконструированной для быстрого всасывания варианта PAL в желудочнокишечном тракте животного после проглатывания варианта.
Настоящее изобретение также относится к сконструированным полипептидам PAL, пригодным для использования для получения химических веществ тонкого органического синтеза и других промышленно ценных соединений (см., например, патентные заявки США №№ 2013/0340119, 2013/0005012 и 2005/0260724 и WO 2012/122333).
Фармацевтические и другие композиции.
Настоящее изобретение относится к сконструированным полипептидам PAL, пригодным для использования в фармацевтических и других композициях, таких как пищевые/питательные добавки.
B зависимости от способа введения эти композиции, содержащие терапевтически эффективное количество сконструированной PAL по изобретению, находятся в твердой, полутвердой или жидкой форме. B некоторых вариантах осуществления композиции содержат другие фармацевтически приемлемые компоненты, такие как разбавители, буферы, эксципиенты, соли, эмульгаторы, консерванты, стабилизаторы, наполнители и другие ингредиенты. Подробное описание способов формулирования и введения хорошо известны в данной области и описаны в литературе.
В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL формулируют для применения в пероральных фармацевтических композициях. Любой подходящий формат для применения для доставки сконструированных полипептидов PAL находит применение в настоящем изобретении, включая, но не ограничиваясь ими, пилюли, таблетки, гелевые таблетки, капсулы, таблетки-леденцы,
- 46 034034 драже, порошки, мягкие гели, золь-гели, гели, эмульсии, имплантаты, пластыри, спреи, мази, линименты, кремы, пасты, виды желе, краски, аэрозоли, жевательные резинки, мягчительные средства, карандаши, суспензии (включая, но не ограничиваясь ими, суспензии на основе масла, эмульсии масло в воде и т.д.), взвеси, сиропы, составы с контролируемым высвобождением, суппозитории и т.д. B некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL предоставляют в формате, подходящем для инъекции (т.е. в инъецируемом составе). B некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL предоставляют в биологически совместимых матриксах, таких как мягкие гели, включая золь-гели на основе диоксида кремния (например, оксисилан). B некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL инкапсулируют. В некоторых альтернативных вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL инкапсулируют в наноструктуры (например, нанотрубки, нанотубулы, нанокапсулы или микрокапсулы, микросферы, липосомы и т.д.). Следует понимать, что фактически настоящее изобретение не ограничено каким-либо конкретным составом для доставки и/или средствами доставки. Следует понимать, что сконструированные полипептиды PAL можно вводить любыми подходящими средствами, известными в данной области, включая, но не ограничиваясь ими, парентеральные, пероральные, местные, чрескожные, интраназальные, внутриглазные, интратекальные, посредством имплантатов и т.д.
В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL химически модифицируют гликозилированием, пегилированием (т.е. модифицируют с использованием полиэтиленгликоля [PEG] или активированного PEG и т.д.) или другими соединениями (например, с Ikeda, Amino Acids 29:283-287 [2005]; патенты США № 7531341, 7534595, 7560263 и 753653; публикации патентных заявок США № 2013/0039898, 2012/0177722 и т.д.). Следует понимать, что фактически настоящее изобретение не ограничено каким-либо конкретным способом и/или механизмом доставки.
B некоторых дополнительных вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL предоставляют в составах, содержащих стабилизированные матрицей кристаллы ферменты. B некоторых вариантах осуществления состав содержит поперечно-сшитый кристаллический сконструированный фермент PAL и полимер с реакционноспособной группой, которая присоединяется к кристаллам фермента. Настоящее изобретение также относится к сконструированным полипептидам PAL в полимерах.
B некоторых вариантах осуществления композиции, содержащие сконструированные полипептиды PAL по настоящему изобретению, содержат один или более широко используемых соединенийносителей, включая, но не ограничиваясь ими, сахара (например, лактозу, сахарозу, маннит и/или сорбит), крахмалы (например, кукурузный, пшеничный, рисовый, картофельный или крахмал из других растений), целлюлозу (например, метилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу натрия), камеди (например, акации, трагакант, гуар и т.д.) и/или белки (например, желатин, коллаген и т.д.). Дополнительные компоненты в пероральных составах могут включать красители и или подсластители (например, глюкозу, сахарозу и маннит) и смазки (например, стеарат магния), а также растворяющиеся в кишечнике покрытия (например, метакрилатные полимеры, фталат гидроксилпропилметилцеллюлозы и/или любое другое подходящее растворяющееся в кишечнике покрытие, известное в данной области). Некоторые варианты осуществления содержат диспергирующие средства или солюбилизаторы (например, поперечно-сшитый поливинилпирролидон, агар, альгиновую кислоту или ее соли, такие как альгинат натрия). B некоторых вариантах осуществления сконструированный полипептид PAL объединяют с различными дополнительными компонентами, включая, но не ограничиваясь ими, консерванты, суспендирующие средства, загустители, средства для смачивания, спирты, жирные кислоты и/или эмульгаторы, в частности в жидких составах.
В некоторых вариантах осуществления сконструированный полипептид PAL следует объединять с различными дополнительными компонентами, включая, но не ограничиваясь ими, консерванты, суспендирующие средства, загустители, средства для смачивания, спирты, жирные кислоты и/или эмульгаторы, в частности в жидких составах. B некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL вводят индивидуумам в комбинации с другими соединениями, используемыми для лечения PKU, включая, но не ограничиваясь ими, тетрагидробиоптерин KUVAN® (BioMarin Pharmaceutical, Inc., Novato, CA), антациды (например, омепразол, эзомепразол и другие празолы), а также любые другие подходящие соединения.
B некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к сконструированным полипептидам PAL, пригодным для использования для снижения концентрации фенилаланина в жидкостях, таких как кровь, цереброспинальная жидкость и т.д. Доза сконструированного полипептида(ов) PAL, вводимых животному, зависит от состояния или заболевания, общего состояния животного и других факторов, известных специалистам в данной области. B некоторых вариантах осуществления композиции предназначены для однократного или многократного введения животному. B некоторых вариантах осуществления предусмотрено, что концентрация сконструированного полипептида(ов) PAL в композиции(ях), вводимых животному (например, человеку с PKU), является достаточной для эффективного лечения, улучшения состояния и/или профилактики заболевания (например, PKU и/или связанных с PKU состояний, заболеваний и/или симптомов). B некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL вводят в комбинации с другими фармацевтическими и/или пищевыми композициями.
- 47 034034
Промышленные композиции.
Предусматривают, что сконструированные полипептиды PAL по настоящему изобретению находят применение в промышленных композициях. В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL формулируют для применения в пищевой и/или кормовой промышленностях. B некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL формулируют в гранулированных или пеллетированных продуктах, которые смешивают с компонентами корма для животных, таких как дополнительные ферменты (например, целлюлазы, лакказы и амилазы). B некоторых альтернативных вариантах осуществления сконструированные полипептиды PAL используют в жидких композициях корма для животных (например, взвесях на водной или масляной основе). Таким образом, в некоторых вариантах осуществления варианты сконструированных PAL по настоящему изобретению являются достаточно термоустойчивыми и термостабильными для того, чтобы подвергаться обработке, используемой для получения пиллет и других обработанных кормов/пищевых продуктов.
Варианты сконструированных PAL по настоящему изобретению также находят применение при получении фенилаланина и/или производных фенилаланина.
Указанные выше и другие аспекты изобретения можно лучше понять в связи со следующими ниже неограничивающими примерами. Примеры предоставлены исключительно с иллюстративными целями и не предназначены ограничивать каким-либо образом объем настоящего изобретения.
Экспериментальная часть
Следующие ниже примеры, включая эксперименты и получаемые результаты, предоставлены исключительно с иллюстративными целями, и не следует их интерпретировать как ограничивающие настоящее изобретение.
B описании экспериментальной части ниже применяют следующие ниже сокращенные обозначения: м.д. - миллионные доли; М - малярный; мМ - миллимолярный, мкМ и цМ - микромолярный; нМ наномолярный; моль - моль; г - грамм; мг - миллиграммы; мкг и μτ - микрограммы; л - литр; мл - миллилитр; см - сантиметры; мм - миллиметры; мкм и μм - микрометры; с - секунды; мин - минута(ы); ч час(ы); Ед. - единицы; Mw - молекулярная масса; об/мин - оборотов в минуту; фунт/дюйм2 - фунтов на квадратный дюйм; °C - градусы Цельсия; КТ - комнатная температура; CDS - кодирующая последовательность; ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота; РНК - рибонуклеиновая кислота) Е. coli W3110 широкоиспользуемый лабораторный штамм Е. coli, доступный от Coli Genetic Stock Center [CGSC], New Haven, CT; HTP - высокопроизводительный; ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография; CFSE - сложный эфир карбоксифлуоресцеинсукцинимидила; IPTG - изопропил-в-Э-1-тиогалактопиранозид; PES - полиэфирсульфон; РНЕ и phe - фенилаланин; BSA - бычий сывороточный альбумин; РВМС - мононуклеарные клетки периферической крови; PKU - фенилкетонурия; МНС - главный комплекс гистосовместимости; HLA - лейкоцитарный антиген человека; HLA-DR - рецептор клеточной поверхности МНС II класса, кодируемый комплексом HLA на хромосоме № 6; FIOPC - величина улучшений по отношению к положительному контролю; LB - бульон Лурия; Athens Research - Athens Research Technology, Athens, GA; ProSpec - ProSpec Tany Technogene, East Brunswick, NJ; Sigma-Aldrich - SigmaAldrich, St. Louis, MO; Ram Scientific - Ram Scientific, Inc., Yonkers, NY; Pall Corp. - Pall, Corp., Pt. Washington, NY; Millipore - Millipore, Corp., Billerica MA; Difco - Difco Laboratories, BD Diagnostic Systems, Detroit, MI; Molecular Devices - Molecular Devices, LLC, Sunnyvale, CA; Kuhner - Adolf Kuhner, AG, Basel, Switzerland; Cambridge Isotope Laboratories - Cambridge Isotope Laboratories, Inc., Tewksbury, MA; Applied Biosystems - Applied Biosystems, часть Life Technologies, Corp., Grand Island, NY, Agilent - Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA; Thermo Scientific - часть Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA; Corning Corning, Inc., Palo Alto, CA; Constant Systems - Constant Systems Ltd., Daventry, United Kingdom; Megazyme - Megazyme International, Wicklow, Ireland; Enzo - Enzo Life Sciences, Inc., Farmingdale, NY; GE Healthcare - GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, NJ; Harlan - Harlan Laboratories, Indianapolis, IN; AB Sciex - AB Sciex, Framingham, MA и Bio-Rad - Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA.
B настоящем изобретении находят применение следующие ниже полинуклеотидные и полипептидные последовательности. B некоторых случаях (как продемонстрировано ниже) за полинуклеотидной последовательностью следует кодируемый полипептид.
Полинуклеотидная последовательность экспрессирующего вектора pET16b-AvPAL (SEQ ID NO:)
- 48 034034
TCTCATGTTT GACAG CTTATCATC GATAAGС T T TAATGCGGTAGT T TATCACAGT TAAA TT GCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGAAATCTAACAATGCGCTCATCGTCATCCTCGGCA CCGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGC GGGATATCCGGATATAGTTCCTCCTTTCAGCAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGC CCCAAGGGGTTATGCTAGTTATTGCTCAGCGGTGGCAGCAGCCAACTCAGCTTCCTTTCG GGCTTTGTTAGCAGCCGGATCCTTAATGCAGACACGGCAGAATGTCCTGAACGGCCTGA ACAATAACACCACCGGCTGCAATATCTGCACTAATACGTGCAATATGTTCATCCAGACCC TGTTCATTATCATTC СAAATATACGGACGAT С T GAGGTCGGTTTCT GACСAACAACATGA CGAACTGCGCTATACAGACGTTCGGTTGCCGGTGACAGACAGGCACGTGCATCATAATG ACCGGTTTTTTTGTAGGTACGCAGATCAACTGCCTGAACACCAAACATCAGGGCAATGGC AACATAATTCTGAAAAATATCAACGCTACGACGTGCCAGGGTTGCGCTGGTATAACCCTG GCTGTTAATATTCTGGTTAAACTGTTCGGCATGGGTCGGAAAACGATCTGCAATACTATT ACCATAAAAGGTCAGCAGCGGCATAATGCTATTACCGCAAATCTGCAGACCTTTCAGAC C CATAT TAACT T TACGT T CACGAT TACСCAGCAGAC T CGGAGGCAGACCAT T GС TAAATT CCGGTGATGCCAGCAGTGCAATCTGAACATCCAGATGTTTTGCCAGCAGACCGATATAAT AG C G CAGAT GAT C CATAC C CATAC CAACATACT GACСCAGAAAATTACCAC CAT GATAG CTTGCCTGATTATCAACATCAATCAGCGGGTTATCGGTAACGCTGTTAATCTCAATTTCG ATTTGTTTGGCAATCTGGCTAATACCATCAACAATCGGACCCAGATACTGCGGCAGACAA C GCAGGС TATAACGAT СС T GGAT CAGT T CAT GAT CACGATAATCAT GT T TACCAT СCAGT TCATCACGAACCAGCTGGCTATTGGCCAGCAGGCTAATCATCTGATCTGCTGCCCACAGC TGACCCGGATGCGGTTTGCTGTTATGGATAAACGGATGAAAGCTCTGATTTGTACCATTC AGTGCCTGAATATCCAGTGCATGAACACCCATTGCAATTGCGGTCAGAATCTGGGTATCA
- 49 034034
TAAACACAATTTGCTGCAATACCGGTCATAACGCTGGTGCCATTCATCATTGCCAGACCT TCTTTCGGCAGCAGGGTCAGCGGACTCAGATTCAGCTGACGCAGTGCGGTCGGTGCGTCC ATTTCTTTGCCATTAAAATCAACTTTAAAGCTCGGGTCCAGGCCAATCAGGCTACCGGTA ATATAGCTCAGCGGAACCAGATCACCGCTGGCACCAATGCTACCAAATTCATAAACATA CGGGGTAACACCGGCATTCAGAAAGATTTCCATGCGTTTAATCAGTTCCAGACGAATACC GCTTGCACCACGCATGTGGCTATTTGCACGCAGCAGCATTGCTGCACGAACATCTGCCAG CGGCAGTTTATTACCTGCACCGGTTTTCAGAAACCAAACCAGATTGGTCTGCAGTTCGCT TGCCTGTTCACGGCTAATTGCAACATTTGCCATACCACCAAAACCGCTGGTAACACCATA AATCGGTTCACCGCTTTCAACTGCATTATTGATATAATCACAGCTGGCCTGAATACCCTG CAGAATATCGGTATTATTGGTCAGGCTAACCAGGGTGCCATTACGGGCAACACGTGCAA CATCATTGATGGTCAGTTTCTGATTACCAATAATCACATTTGCGCTGCTATTGCCGGTAAA GCTAAACTGCTGGCTGCTGGTTTTGCTCTGTGCCTGGCTCAGGGTTTTCATATGACGACCT TCGATATGGCCGCTGCTGTGATGATGATGATGATGATGATGATGATGGCCCATGGTATAT СTССTTСTTAAAGTTAAACAAAATTATTTСTAGAGGGGAATTGTTATСCGСTСACAATTСC CCTATAGTGAGTCGTATTAATTTCGCGGGATCGAGATCTCGATCCTCTACGCCGGACGCA TCGTGGCCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCA CCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTA TGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCC TTGCGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGT CGCATAAGGGAGAGCGTCGAGATCCCGGACACCATCGAATGGCGCAAAACCTTTCGCGG TATGGCATGATAGCGCCCGGAAGAGAGTCAATTCAGGGTGGTGAATGTGAAACCAGTAA CGTTATACGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGGTGA ACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGGGAAAAAGTGGAAGCGGCGATGGCGGA GCTGAATTACATTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGA TTGGCGTTGCCACCTCCAGTCTGGCCCTGCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTA AATCTCGCGCCGATCAACTGGGTGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGC GTCGAAGCCTGTAAAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGGGCTGAT CATTAACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCTGCACTAATGT TCCGGCGTTATTTCTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCAT GAAGACGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCATCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAATCGC GCTGTTAGCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCTGGCTGGCATAA ATATCTCACTCGCAATCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTGGAGTGCCA TGTCCGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGCTGAATGAGGGCATCGTTCCCACTGCGATGC TGGTTGCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGTCCGGGCTG CGCGTTGGTGCGGATATCTCGGTAGTGGGATACGACGATACCGAAGACAGCTCATGTTAT ATCCCGCCGTTAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGAC
- 50 034034
CGCTTGCTGCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCA CTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTT GGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAG CGCAACGCAATTAATGTAAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCGGGATCTCGACCGATGCCC TTGAGAGCCTTCAACCCAGTCAGCTCCTTCCGGTGGGCGCGGGGCATGACTATCGTCGCC GCACTTATGACTGTCTTCTTTATCATGCAACTCGTAGGACAGGTGCCGGCAGCGCTCTGG GTCATTTTCGGCGAGGACCGCTTTCGCTGGAGCGCGACGATGATCGGCCTGTCGCTTGCG GTATTCGGAATCTTGCACGCCCTCGCTCAAGCCTTCGTCACTGGTCCCGCCACCAAACGT TTCGGCGAGAAGCAGGCCATTATCGCCGGCATGGCGGCCGACGCGCTGGGCTACGTCTT GCTGGCGTTCGCGACGCGAGGCTGGATGGCCTTCCCCATTATGATTCTTCTCGCTTCCGG CGGCATCGGGATGCCCGCGTTGCAGGCCATGCTGTCCAGGCAGGTAGATGACGACCATC AGGGACAGCTTCAAGGATCGCTCGCGGCTCTTACCAGCCTAACTTCGATCACTGGACCGC TGATCGTCACGGCGATTTATGCCGCCTCGGCGAGCACATGGAACGGGTTGGCATGGATTG TAGGCGCCGCCCTATACCTTGTCTGCCTCCCCGCGTTGCGTCGCGGTGCATGGAGCCGGG CCACCTCGACCTGAATGGAAGCCGGCGGCACCTCGCTAACGGATTCACCACTCCAAGAA TTGGAGCCAATCAATTCTTGCGGAGAACTGTGAATGCGCAAACCAACCCTTGGCAGAAC ATATCCATCGCGTCCGCCATCTCCAGCAGCCGCACGCGGCGCATCTCGGGCAGCGTTGGG TCCTGGCCACGGGTGCGCATGATCGTGCTCCTGTCGTTGAGGACCCGGCTAGGCTGGCGG GGTTGCCTTACTGGTTAGCAGAATGAATCACCGATACGCGAGCGAACGTGAAGCGACTG CTGCTGCAAAACGTCTGCGACCTGAGCAACAACATGAATGGTCTTCGGTTTCCGTGTTTC GTAAAGTCTGGAAACGCGGAAGTCAGCGCCCTGCACCATTATGTTCCGGATCTGCATCGC AGGATGCTGCTGGCTACCCTGTGGAACACCTACATCTGTATTAACGAAGCGCTGGCATTG ACCCTGAGTGATTTTTCTCTGGTCCCGCCGCATCCATACCGCCAGTTGTTTACCCTCACAA CGTTCCAGTAACCGGGCATGTTCATCATCAGTAACCCGTATCGTGAGCATCCTCTCTCGTT TCATCGGTATCATTACCCCCAT GAACAGAAATССССС T TAGACGGAGGCAT CAGT GACCA AACAGGAAAAAACCGCCCTTAACATGGCCCGCTTTATCAGAAGCCAGACATTAACGCTT CTGGAGAAACTCAACGAGCTGGACGCGGATGAACAGGCAGACATCTGTGAATCGCTTCA CGACCACGCTGATGAGCTTTACCGCAGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAA CCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGA GCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATG ACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAG ATTGTACTGAGAGTGCACCATATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGA AAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTC GGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCA GGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTA AAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAA
- 51 034034
ATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTT
CCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGT
CCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAG
TTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGA
CCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATC
GCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTA
CAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCT
GCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAAC
AAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAA
AAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAA
AC T C AC G T T AAG G GAT T T T G G T C AT GAGAT T AT C AAAAAG GAT C T T С AC С T AGAT С С T T T
T AAAT T AAAAAT GAAG T T T T AAAT CAAT С T AAAG TAT AT AT GAG T AAAC T T G G T С T GACA
GTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCAT
AGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCC
CAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAA
ACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATC
CAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGC
AACGTTGTTGCCATTGCTGCAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCAT
TCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAG
CGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCAC
TCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTC
TGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTG
CTCTTGCCCGGCGTCAACACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCT
CATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATC
CAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGC
GTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGA
CAC G GAAAT G T T GAATAC TCATACTCTTCCTTTTT CAATATTAT T GAAGCAT T TAT GAGGG
T TAT T GT С T CAT GAGC GGAT ACAT AT T T GAAT GTAT T T AGAAAAAT AAAC AAAT AG GGG T
TСCGCGCACATTTСССCGAAAAGTGССACСTGAGGTСTAAGAAACCATTATTATCATGAG
ATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAAGAAT(SEQ ID N0:1)
Полинуклеотидная последовательность ORF AvPAL (SEQ ID NO: 2)
ATGAAAACCCTGAGCCAGGCACAGAGCAAAACCAGCAGCCAGCAGTTTAGCTTTACCGG
CAATAGCAGCGCAAATGTGATTATTGGTAATCAGAAACTGACCATCAATGATGTTGCAC
GTGTTGCCCGTAATGGCACCCTGGTTAGCCTGACCAATAATACCGATATTCTGCAGGGTA
TTCAGGCCAGCTGTGATTATATCAATAATGCAGTTGAAAGCGGTGAACCGATTTATGGTG
TTACCAGCGGTTTTGGTGGTATGGCAAATGTTGCAATTAGCCGTGAACAGGCAAGCGAA
- 52 034034
CTGCAGACCAATCTGGTTTGGTTTCTGAAAACCGGTGCAGGTAATAAACTGCCGCTGGCA
GATGTTCGTGCAGCAATGCTGCTGCGTGCAAATAGCCACATGCGTGGTGCAAGCGGTATT
CGTCTGGAACTGATTAAACGCATGGAAATCTTTCTGAATGCCGGTGTTACCCCGTATGTT
TATGAATTTGGTAGCATTGGTGCCAGCGGTGATCTGGTTCCGCTGAGCTATATTACCGGT
AGCCTGATTGGCCTGGACCCGAGCTTTAAAGTTGATTTTAATGGCAAAGAAATGGACGC
ACCGACCGCACTGCGTCAGCTGAATCTGAGTCCGCTGACCCTGCTGCCGAAAGAAGGTCT
GGCAATGATGAATGGCACCAGCGTTATGACCGGTATTGCAGCAAATTGTGTTTATGATAC
CCAGATTCTGACCGCAATTGCAATGGGTGTTCATGCACTGGATATTCAGGCACTGAATGG
TACAAATCAGAGCTTTCATCCGTTTATCCATAACAGCAAACCGCATCCGGGTCAGCTGTG
GGCAGCAGATCAGATGATTAGCCTGCTGGCCAATAGCCAGCTGGTTCGTGATGAACTGG
ATGGTAAACATGATTATCGTGATCATGAACTGATCCAGGATCGTTATAGCCTGCGTTGTC
TGCCGCAGTATCTGGGTCCGATTGTTGATGGTATTAGCCAGATTGCCAAACAAATCGAAA
T T GAGAT TAACAG C G T TAC C GATAAC CCGCTGATTGATGTTGATAAT CAG G CAAG С TAT C
ATGGTGGTAATTTTCTGGGTCAGTATGTTGGTATGGGTATGGATCATCTGCGCTATTATAT
CGGTCTGCTGGCAAAACATCTGGATGTTCAGATTGCACTGCTGGCATCACCGGAATTTAG
CAATGGTCTGCCTCCGAGTCTGCTGGGTAATCGTGAACGTAAAGTTAATATGGGTCTGAA
AGGTCTGCAGATTTGCGGTAATAGCATTATGCCGCTGCTGACCTTTTATGGTAATAGTAT
T G CAGAT CGTTTTCC GAC С CAT G С C GAACAG T T TAAC CAGAATAT TAACAG С CAG G G T TA
TACCAGCGCAACCCTGGCACGTCGTAGCGTTGATATTTTTCAGAATTATGTTGCCATTGC
CCTGATGTTTGGTGTTCAGGCAGTTGATCTGCGTACCTACAAAAAAACCGGTCATTATGA
TGCACGTGCCTGTCTGTCACCGGCAACCGAACGTCTGTATAGCGCAGTTCGTCATGTTGT
TGGTCAGAAACCGACCTCAGATCGTCCGTATATTTGGAATGATAATGAACAGGGTCTGG
ATGAACATATTGCACGTATTAGTGCAGATATTGCAGCCGGTGGTGTTATTGTTCAGGCCG
TTCAGGACATTCTGCCGTGTCTGCAT (SEQ ID N0:2)
Полинуклеотидная последовательность AvPAL WT (SEQ ID NO: 3)
ATGAAAACCCTGAGCCAGGCACAGAGCAAAACCAGCAGCCAGCAGTTTAGCTTTACCGG
CAATAGCAGCGCAAATGTGATTATTGGTAATCAGAAACTGACCATCAATGATGTTGCAC
GTGTTGCCCGTAATGGCACCCTGGTTAGCCTGACCAATAATACCGATATTCTGCAGGGTA
TTCAGGCCAGCTGTGATTATATCAATAATGCAGTTGAAAGCGGTGAACCGATTTATGGTG
TTACCAGCGGTTTTGGTGGTATGGCAAATGTTGCAATTAGCCGTGAACAGGCAAGCGAA
CTGCAGACCAATCTGGTTTGGTTTCTGAAAACCGGTGCAGGTAATAAACTGCCGCTGGCA
GATGTTCGTGCAGCAATGCTGCTGCGTGCAAATAGCCACATGCGTGGTGCAAGCGGTATT
CGTCTGGAACTGATTAAACGCATGGAAATCTTTCTGAATGCCGGTGTTACCCCGTATGTT
TATGAATTTGGTAGCATTGGTGCCAGCGGTGATCTGGTTCCGCTGAGCTATATTACCGGT
AGCCTGATTGGCCTGGACCCGAGCTTTAAAGTTGATTTTAATGGCAAAGAAATGGACGC
ACCGACCGCACTGCGTCAGCTGAATCTGAGTCCGCTGACCCTGCTGCCGAAAGAAGGTCT
- 53 034034
GGCAATGATGAATGGCACCAGCGTTATGACCGGTATTGCAGCAAATTGTGTTTATGATAC
CCAGATTCTGACCGCAATTGCAATGGGTGTTCATGCACTGGATATTCAGGCACTGAATGG
TACAAATCAGAGCTTTCATCCGTTTATCCATAACAGCAAACCGCATCCGGGTCAGCTGTG
GGCAGCAGATCAGATGATTAGCCTGCTGGCCAATAGCCAGCTGGTTCGTGATGAACTGG
ATGGTAAACATGATTATCGTGATCATGAACTGATCCAGGATCGTTATAGCCTGCGTTGTC
TGCCGCAGTATCTGGGTCCGATTGTTGATGGTATTAGCCAGATTGCCAAACAAATCGAAA
T T GAGAT TAACAGC G T TAC C GATAACСCGС T GAT T GAT GT T GATAATGAGGCAAGС TAT C
ATGGTGGTAATTTTCTGGGTCAGTATGTTGGTATGGGTATGGATCATCTGCGCTATTATAT
CGGTCTGCTGGCAAAACATCTGGATGTTCAGATTGCACTGCTGGCATCACCGGAATTTAG
CAATGGTCTGCCTCCGAGTCTGCTGGGTAATCGTGAACGTAAAGTTAATATGGGTCTGAA
AGGTCTGCAGATTTGCGGTAATAGCATTATGCCGCTGCTGACCTTTTATGGTAATAGTAT
T G GAGAT CGTTTTCC GAG C CAT G С C GAACAGT T TAACCAGAATATTAACAGСCAGGGT TA
TACCAGCGCAACCCTGGCACGTCGTAGCGTTGATATTTTTCAGAATTATGTTGCCATTGC
CCTGATGTTTGGTGTTCAGGCAGTTGATCTGCGTACCTACAAAAAAACCGGTCATTATGA
TGCACGTGCCTGTCTGTCACCGGCAACCGAACGTCTGTATAGCGCAGTTCGTCATGTTGT
TGGTCAGAAACCGACCTCAGATCGTCCGTATATTTGGAATGATAATGAACAGGGTCTGG
ATGAACATATTGCACGTATTAGTGCAGATATTGCAGCCGGTGGTGTTATTGTTCAGGCCG
TTCAGGACATTCTGCCGTGTCTGCAT (SEQ ID N0:3)
Полипептидная последовательность AvPAL WT (SEQ ID NO: 4)
MKTLSQAQSKTSSQQFSFTGNSSANVIIGNQKLTINDVARVARNGTLVSLTNNTDILQG
IQAS
CDYINNAVESGEPIYGVTSGFGGMANVAISREQASELQTNLVWFLKTGAGNKLPLADVRAA
MLLRANSHMRGASGIRLELIKRMEIFLNAGVTPYVYEFGSIGASGDLVPLSYITGSLIGLDPSF
KVDFNGKEMDAPTALRQLNLSPLTLLPKEGLAMMNGTSVMTGIAANCVYDTQILTAIAMGV
HALDIQALNGTNQSFHPFIHNSKPHPGQLWAADQMISLLANSQLVRDELDGKHDYRDHELIQ
DRYSLRCLPQYLGPIVDGISQIAKQIEIEINSVTDNPLIDVDNQASYHGGNFLGQYVGMGMDH LRYYIGLLAKHLDVQIALLASPEFSNGLPPSLLGNRERKVNMGLKGLQICGNSIMPLLTFYGN
SIADRFPTHAEQFNQNINSQGYTSATLARRSVDIFQNYVAIALMFGVQAVDLRTYKKTGHYD ARACLSPATERLYSAVRHWGQKPTSDRPYIWNDNEQGLDEHIARISADIAAGGVIVQAVQDIL PCLH (SEQ ID N0:4)
Полинуклеотидная последовательность варианта AvPAL № 30 (SEQ ID NO: 5)
ATGAAAACCCTGAGTCAGGCACAGAGCAAAACCAGCAGCCAGCAGTTTAGCTTTACCGG
CAATAGCAGC GСAAAT G T GAT TAT T GG TAATCAGAAACT GACCAT CAAT GATGTTGTACG
TGTTGCCCGTAATGGCACCCTGGTTAGCCTGACCAATAATACCGATATTCTGCAGGGTAT
TCAGGCCAGCTGTGATTATATCAATAATGCAGTTGAAAGCGGTGAACCGATTTATGGTGT
- 54 034034
TACCAGCGGTTTTGGTGGTATGGCAAATGTTGTAATTAGCCGTGAACAGGCAAGCGAACT
GCAGACCAATCTGGTTTGGTTTCTGAAAACCGGTGCAGGTAATAAACTGCCGCTGGCAG
ATGTTCGTGCAGCAATGCTGCTGCGTGCAAATAGCCACATGCGTGGTGCAAGCGGTATTC
GTCTGGAACTGATTAAACGCATGGAAATCTTTCTGAATGCCGGTGTTACCCCGTATGTTT
ATGAATTTGGTAGCATTGGTGCCAGCGGTGATCTGGTTCCGCTGAGCTATATTACCGGTA
GCCTGATTGGCCTGGACCCGAGCTTTAAAGTTGATTTTAATGGCAAAGAAATGGACGCAC CGACCGCACTGCGTCAGCTGAATCTGAGTCCGCTGACCCTGCTGCCGAAAGAAGGTCTG
GCAATGATGAATGGCACCAGCGTTATGACCGGTATTGCAGCAAATTGTGTTTATGATACC
CAGATTCTGACCGCAATTGCAATGGGTGTTCATGCACTGGATATTCAGGGACTGAATGGT ACAAATCAGAGCTTTCATCCGTTTATCCATAACAGCAAACCGCATCCGGGTCAGCTGTGG GCAGCAGATCAGATGATTAGCCTGCTGGCCGGTAGCCAGCTGGTTCGTGATGAACTGGA
TGGTAAACATGATTATCGTGATCATGAACTGATCCAGGATCGTTATAGCCTGCGTTGTCT
GCCGCAGTATCTGGGTCCGATTGTTGATGGTATTAGCCAGATTGCCAAACAAATCGAAAT
TGAGATTAACAGCGTTACCGATAACCCGCTGATTGATGTTGATAATCAGGCAAGCTATCA TGGTGGTAATTTTCTGGGTCAGTATGTTGGTATGGGTATGGATCATCTGCGCTATTATATC
GGTCTGCTGGCAAAACATCTGGATGTTCAGATTGCACTGCTGGTATCACCGGAATTTAAC AATGGTCTGCCTGCGAGTCTGGTGGGTAATCGTGAACGTAAAGTTAATATGGGTCTGAAA
GGTCTGCAGATTTGCGGTAATAGCATTATGCCGCTGCTGACCTTTTATGGTAATAGTATT
GCAGATCGTTTTCCGACCCATGCCGAACAGTTTAACCAGAATATTAACAGCCAGGGTTAT
ACCAGCGCAACCCTGGCACGTCGTAGCGTTGATATTTTTCAGAATTATGTTGCCATTGCC
CTGATGTTTGGTGTTCAGGCAGTTGATCTGCGTACCTACAAAAAAACCGGTCATTATGAT
GCACGTGCCTGTCTGTCACCGGCAACCGAACGTCTGTATAGCGCAGTTCGTCATGTTGTT
GGTCAGTATCCGAGCTCAGATCGTCCGTATATTTGGAATGATAATGAACAGGGTCTGGAT GAACATATTGCACGTATTAGTGCAGATATTGCAGCCGGTGGTGTTATTGTTCAGGCCGTT CAGGACATTCTGCCGTGTCTGCAT (SEQ ID N0:5)
Полипептидная последовательность варианта AvPAL № 30 (SEQ ID NO: 6)
MKTLSQAQSKTSSQQFSFTGNSSANVIIGNQKLTINDWRVARNGTLVSLTNNTDILQG
IQAS
CDYINNAVESGEPIYGVTSGFGGMANVVISREQASELQTNLVWFLKTGAGNKLPLADVRAA MLLRANSHMRGASGIRLELIKRMEIFLNAGVTPYVYEFGSIGASGDLVPLSYITGSLIGLDPSF KVDFNGKEMDAPTALRQLNLSPLTLLPKEGLAMMNGTSVMTGIAANCVYDTQILTAIAMGV HALDIQGLNGTNQSFHPFIHNSKPHPGQLWAADQMISLLAGSQLVRDELDGKHDYRDHELIQ DRYSLRCLPQYLGPIVDGISQIAKQIEIEINSVTDNPLIDVDNQASYHGGNFLGQYVGMGMDH LRYYIGLLAKHLDVQIALLVS PE FNNGLPAS LVGNRERKVNMGLKGLQICGNSIMPLLT FYG NSlADRFPTHAEQFNQNINSQGYTSATLARRSVDIFQNYVAIALMFGVQAVDLRTYKKTGHY DARACLSPATERLYSAVRHWGQYPSSDRPYIWNDNEQGLDEHIARISADIAAGGVIVQAVQDI LPCLH (SEQ ID NO:6)
Полинуклеотидная последовательность варианта AvPAL № 22 (SEQ ID NO: 7)
- 55 034034
ATGAAAACCCTGAGCCAGGCACAGAGCAAAACCAGCAGCCAGCAGTTTAGCTTTACCGG
CAATAGCAGCGCAAATGTGATTATTGGTAATCAGAAACTGACCATCAATGATGTTGCAC
GTGTTGCCCGTAATGGCACCCTGGTTAGCCTGACCAATAATACCGATATTCTGCAGGGTA
TTCAGGCCAGCTGTGATTATATCAATAATGCAGTTGAAAGCGGTGAACCGATTTATGGTG
TTACCAGCGGTTTTGGTGGTATGGCAAATGTTGCAATTAGCCGTGAACAGGCAAGCGAA
CTGCAGACCAATCTGGTTTGGTTTCTGAAAACCGGTGCAGGTAATAAACTGCCGCTGGCA
GATGTTCGTGCAGCAATGCTGCTGCGTGCAAATAGCCACATGCGTGGTGCAAGCGGTATT
CGTCTGGAACTGATTAAACGCATGGAAATCTTTCTGAATGCCGGTGTTACCCCGTATGTT
TATGAATTTGGTAGCATTGGTGCCAGCGGTGATCTGGTTCCGCTGAGCTATATTACCGGT
AGCCTGATTGGCCTGGACCCGAGCTTTAAAGTTGATTTTAATGGCAAAGAAATGGACGC
ACCGACCGCACTGCGTCAGCTGAATCTGAGTCCGCTGACCCTGCTGCCGAAAGAAGGTCT
GGCAATGATGAATGGCACCAGCGTTATGACCGGTATTGCAGCAAATTGTGTTTATGATAC
CCAGATTCTGACCGCAATTGCAATGGGTGTTCATGCACTGGATATTCAGGCACTGAATGG
TACAAATCAGAGCTTTCATCCGTTTATCCATAACAGCAAACCGCATCCGGGTCAGCTGTG
GGCAGCAGATCAGATGATTAGCCTGCTGGCCAATAGCCAGCTGGTTCGTGATGAACTGG
ATGGTAAACATGATTATCGTGATGGTGAACTGATCCAGGATCGTTATAGCCTGCGTTGTC
TGCCGCAGTATCTGGGTCCGATTGTTGATGGTATTAGCCAGATTGCCAAACAAATCGAAA
TTGAGATTAACAGCGTTACCGATAACCCGCTGATTGATGTTGATAATCAGGCAAGCTATC
ATGGTGGTAATTTTCTGGGTCAGTATGTTGGTATGGGTATGGATCATCTGCGCTATTATAT
CGGTCTGCTGGCAAAACATCTGGATGTTCAGATTGCACTGCTGGCATCACCGGAATTTAG
CAATGGTCTGCCTCCGAGTCTGCTGGGTAATCGTGAACGTAAAGTTAATATGGGTCTGAA
AGGTCTGCAGATTTGCGGTAATAGCATTATGCCGCTGCTGACCTTTTATGGTAATAGTAT
T G CAGAT CGTTTTCC GAC C CAT G С C GAACAGT T TAACCAGAATATTAACAGСCAGGGT TA
TACCAGCGCAACCCTGGCACGTCGTAGCGTTGATATTTTTCAGAATTATGTTGCCATTGC
CCTGATGTTTGGTGTTCAGGCAGTTGATCTGCGTACCTACAAAAAAACCGGTCATTATGA
TGCACGTGCCTGTCTGTCACCGGCAACCGAACGTCTGTATAGCGCAGTTCGTCATGTTGT
TGGTCAGAAACCGACCTCAGATCGTCCGTATATTTGGAATGATAATGAACAGGGTCTGG
ATGAACATATTGCACGTATTAGTGCAGATATTGCAGCCGGTGGTGTTATTGTTCAGGCCG
TTCAGGACATTCTGCCGTGTCTGCAT (SEQ ID N0:7)
Полипептидная последовательность варианта AvPAL № 22 (SEQ ID NO: 8)
MKTLSQAQSKTSSQQFSFTGNSSANVIIGNQKLTINDVARVARNGTLVSLTNNTDILQGIQAS
CDYINNAVESGEPIYGVTSGFGGMANVAISREQASELQTNLVWFLKTGAGNKLPLADVRAA
MLLRANSHMRGASGIRLELIKRMEIFLNAGVTPYVYEFGSIGASGDLVPLSYITGSLIGLDPSF
KVDFNGKEMDAPTALRQLNLSPLTLLPKEGLAMMNGTSVMTGIAANCVYDTQILTAIAMGV
HALDIQALNGTNQSFHPFIHNSKPHPGQLWAADQMISLLANSQLVRDELDGKHDYRDGELIQ
DRYSLRCLPQYLGPIVDGISQIAKQIEIEINSVTDNPLIDVDNQASYHGGNFLGQYVGMGMDH
LRYYIGLLAKHLDVQIALLASPEFSNGLPPSLLGNRERKVNMGLKGLQICGNSIMPLLTFYGN
SIADRFPTHAEQFNQNINSQGYTSATLARRSVDIFQNYVAIALMFGVQAVDLRTYKKTGHYD
ARACLSPATERLYSAVRHWGQKPTSDRPYIWNDNEQGLDEHIARISADIAAGGVIVQAVQDIL
PCLH (SEQ ID N0:8)
Полинуклеотидная последовательность варианта AvPAL № 36 (SEQ ID NO: 9)
- 56 034034
ATGAAAACCCTGAGTCAGGCACAGAGCAAAACCAGCAGCCAGCAGTTTAGCTTTACCGG
CAATAGCAG C G CAAATGT GAT TAT T GGTAAT CAGAAAC T GAGCAT CAAT GAT GT T GTAGG
TGTTGCCCGTAATGGCACCCTGGTTAGCCTGACCAATAATACCGATATTCTGCAGGGTAT
TCAGGCCAGCTGTGATTATATCAATAATGCAGTTGAAAGCGGTGAACCGATTTATGGTGT
TACCAGCGGTTTTGGTGGTATGGCAAATGTTGTAATTAGCCGTGAACAGGCAAGCGAACT
GCAGACCAATCTGGTTTGGTTTCTGAAAACCGGTGCAGGTAATAAACTGCCGCTGGCAG
ATGTTCGTGCAGCAATGCTGCTGCGTGCAAATAGCCACATGCGTGGTGCAAGCGGTATTC
GTCTGGAACTGATTAAACGCATGGAAATCTTTCTGAATGCCGGTGTTACCCCGTATGTTT
ATGAATTTGGTAGCATTGGTGCCAGCGGTGATCTGGTTCCGCTGAGCTATATTACCGGTA
GCCTGATTGGCCTGGACCCGAGCTTTAAAGTTGATTTTAATGGCAAAGAAATGGACGCAC
CGACCGCACTGCGTCAGCTGAATCTGAGTCCGCTGACCCTGCTGCCGAAAGAAGGTCTG
GCAATGATGAATGGCACCAGCGTTATGACCGGTATTGCAGCAAATTGTGTTTATGATACC
CAGATTCTGACCGCAATTGCAATGGGTGTTCATGCACTGGATATTCAGGCACTGAATGGT
ACAAATCAGAGCTTTCATCCGTTTATCCATAACAGCAAACCGCATCCGGGTCAGCTGTGG
GCAGCAGATCAGATGATTAGCCTGCTGGCCGGTAGCCAGCTGGTTCGTGATGAACTGGA
TGGTAAACATGATTATCGTGATGGTGAACTGATCCAGGATCGTTATAGCCTGCGTTGTCT
GCCGCAGTATCTGGGTCCGATTGTTGATGGTATTAGCCAGATTGCCAAACAAATCGAAAT
T GAGAT TAACAGC G T TAC C GATAACС CGС T GAT T GAT GT T GATAATCAGGCAAGС TAT CA
TGGTGGTAATTTTCTGGGTCAGTATGTTGGTATGGGTATGGATCATCTGCGCTATTATATC
GGTCTGCTGGCAAAACATCTGGATGTTCAGATTGCACTGCTGGCATCACCGGAATTTAGC
AATGGTCTGCCTCCGAGTCTGGTGGGTAATCGTGAACGTAAAGTTAATATGGGTCTGAAA
GGTCTGCAGATTTGCGGTAATAGCATTATGCCGCTGCTGACCTTTTATGGTAATAGTATT
G GAGAT CGTTTTCC GAG C CAT G С C GAACAG T T TAAC CAGAATAT TAACAG C GAG G G T TAT
ACCAGCGCAACCCTGGCACGTCGTAGCGTTGATATTTTTCAGAATTATGTTGCCATTGCC
CTGATGTTTGGTGTTCAGGCAGTTGATCTGCGTACCTACAAAAAAACCGGTCATTATGAT
GCACGTGCCTGTCTGTCACCGGCAACCGAACGTCTGTATAGCGCAGTTCGTCATGTTGTT
G G T CAGAAAC C GAG С T CAGAT CGTCCGTATATTTG GAAT GATAATGAACAG GG T С T GGA
TGAACATATTGCACGTATTAGTGCAGATATTGCAGCCGGTGGTGTTATTGTTCAGGCCGT
TCAGGACATTCTGCCGTGTCTGCAT (SEQ ID N0:9)
Полипептидная последовательность варианта AvPAL № 36 (SEQ ID NO: 10)
MKTLSQAQSKTSSQQFSFTGNSSANVIIGNQKLTINDWRVARNGTLVSLTNNTDILQGIQAS
CDYINNAVESGEPIYGVTSGFGGMANWISREQASELQTNLVWFLKTGAGNKLPLADVRAA
MLLRANSHMRGASGIRLELIKRMEIFLNAGVTPYVYEFGSIGASGDLVPLSYITGSLIGLDPSF
KVDFNGKEMDAPTALRQLNLSPLTLLPKEGLAMMNGTSVMTGIAANCVYDTQILTAIAMGV
HALDIQALNGTNQSFHPFIHNSKPHPGQLWAADQMISLLAGSQLVRDELDGKHDYRDGELIQ
DRYSLRCLPQYLGPIVDGISQIAKQIEIEINSVTDNPLIDVDNQASYHGGNFLGQYVGMGMDH
LRYYIGLLAKHLDVQIALLASPEFSNGLPPSLVGNRERKVNMGLKGLQICGNSIMPLLTFYGN
SlADRFPTHAEQFNQNINSQGYTSATLARRSVDIFQNYVAIALMFGVQAVDLRTYKKTGHYD
ARACLSPATERLYSAVRHWGQKPSSDRPYIWNDNEQGLDEHIARISADIAAGGVIVQAVQDI
LPCLH (SEQ ID N0:10)
Полинуклеотидная последовательность варианта AvPAL № 42 (SEQ ID NO: 11)
- 57 034034
ATGAAAACCCTGAGTCAGGCACAGAGCAAAACCAGCAGCCAGCAGTTTAGCTTTACCGGC
AATAG GAG C G СAAAT GTGATTATTGGTAAT CAGAAAC T GAG CAT СAAT GATGTTGTACGT GTTGCCCGTAATGGCACCCTGGTTAGCCTGACCAATAATAAAGATATTCTGCAGCGTATTCAGG CCAGCTGTGATTATATCAATAATGCAGTTGAAAAAGGTGAACCGATTTATGGTGTTACCAGCGG TTTTGGTGGTATGGCAAATGTTGTAATTAGCCGTGAACAGGCAAGCGAACTGCAGACCAATCTG GTTTGGTTTCTGAAAACCGGTGCAGGTAATAAACTGCCGCTGGCAGATGTTCGTGCAGCAATGC TGCTGCGTGCAAATAGCCACATGCGTGGTGCAAGCGGTATTCGTCTGGAACTGATTAAACGCAT GGAAATCTTTCTGAATGCCGGTGTTACCCCGTATGTTTATGAATTTGGTAGCATTGGTGCCAGC GGTGATCTGGTTCCGCTGAGCTATATTACCGGTAGCCTGATTGGCCTGGACCCGAGCTTTAAAG TTGATTTTAATGGCAAAGAAATGGACGCACCGACCGCACTGCGTCAGCTGAATCTGAGTCCGCT GACCCTGCTGCCGAAAGAAGGTCTGGCAATGATGAATGGCACCAGCGTTATGACCGGTATTGCA GCAAATTGTGTTTATGATACCCAGATTCTGACCGCAATTGCAATGGGTGTTCATGCACTGGATA TTCAGGCACTGAATGGTACAAATCAGAGCTTTCATCCGTTTATCCATAACAGCAAACCGCATCC GGGTCAGCTGTGGGCAGCAGATCAGATGATTAGCCTGCTGGCCGGTAGCCAGCTGGTTCGTGAT GAACTGGATGGTAAACATGATTATATGGATGGTGAACTGATCCAGGATCGTTATAGCCTGCGTT GTCTGCCGCAGTATCTGGGTCCGATTGTTGATGGTATTAGCCAGATTGCCAAACAAATCGAAAT TGAGATTAACAGCGTTACCGATAACCCGCTGATTGATGTTGATAATCAGGCAAGCTATCATGGT GGTAATTTTCTGGGTCAGTATGTTGGTATGGGTATGGATCATCTGCGCTATTATATCGGTCTGC TGGCAAAACATCTGGATGTTCAGATTGCACTGCTGGCATCACCGGAATTTAGCAATGGTCTGCC TCCGAGTCTGGTGGGTAATCGTGAACGTAAAGTTAATATGGGTCTGAAAGGTCTGCAGATTTGC GGTAATAGCATTATGCCGCTGCTGACCTTTTATGGTAATAGTATTGCAGATCGTTTTCCGACCC ATGCCGAACAGTTTAACCAGAATATTAACAGCCAGGGTTATACCAGCGCAACCCTGGCACGTCG TAGCGTTGATATTTTTCAGAATTATGTTGCCATTGCCCTGATGTTTGGTGTTCAGGCAGTTGAT CTGCGTACCTACAAAAAAACCGGTCATTATGATGCACGTGCCCAGCTGTCACCGGCAACCGAAC GTCTGTATAGCGCAGTTCGTCATGTTGTTGGTAAAAAACCGAGCTCAGATCGTCCGTATATTTG GAATGATAATGAACAGGGTCTGGATGAACATATTGCACGTATTAGTGCAGATATTGCAGCCGGT GGTGTTATTGTTCA GGCCGTTCAGGACATTCTGCCGCCGCTGCAT (SEQ ID N0:11)
Полипептидная последовательность варианта AvPAL № 42 (SEQ ID NO: 12)
MKTLSQAQSKTSSQQFSFTGNSSANVIIGNQKLTINDWRVARNGTLVSLTNNKDILQRIQASC DYINNAVEKGEPIYGVTSGFGGMANWISREQASELQTNLVWFLKTGAGNKLPLADVRAAMLLR ANSHMRGASGIRLELIKRMEIFLNAGVTPYVYEFGSIGASGDLVPLSYITGSLIGLDPSFKVDF NGKEMDAPTALRQLNLSPLTLLPKEGLAMMNGTSVMTGIAANCVYDTQILTAIAMGVHALDIQA LNGTNQSFHPFIHNSKPHPGQLWAADQMISLLAGSQLVRDELDGKHDYMDGELIQDRYSLRCLP QYLGPIVDGISQIAKQIEIEINSVTDNPLIDVDNQASYHGGNFLGQYVGMGMDHLRYYIGLLAK HLDVQIALLASPEFSNGLPPSLVGNRERKVNMGLKGLQICGNSIMPLLTFYGNSIADRFPTHAE QFNQNINSQGYTSATLARRSVDIFQNYVAIALMFGVQAVDLRTYKKTGHYDARAQLSPATERLY SAVRHWGKKP SSDRPYIWNDNEQGLDEHIARISADIAAGGVIVQAVQDILPPLH (SEQ ID N0:12)
Полинуклеотидная последовательность варианта AvPAL № 43 (SEQ ID NO: 13)
- 58 034034
ATGAAAACCCTGAGTCAGGCACAGAGCAAAACCAGCAGCCAGCAGTTTAGCTTTACCGGCAATA
GCAGCGCAAATGTGATTATTGGTAATCAGAAACTGAGCATCAATGATGTTGTACGTGTTGСC
CGTAATGGCACCCTGGTTAGCCTGACCAATAATAAAGATATTCTGCAGCGTATTCAGGCCAGCT
GTGATTATATCAATAATGCAGTTGAAAGCGGTGAACCGATTTATGGTGTTACCAGCGGTTTTGG
TGGTATGGCAAATGTTGTAATTAGCCGTGAACAGGCAAGCGAACTGCAGACCAATCTGGTTTGG
TTTCTGAAAACCGGTGCAGGTAATAAACTGCCGCTGGCAGATGTTCGTGCAGCAATGCTGCTGC
GTGCAAATAGCCACATGCGTGGTGCAAGCGGTATTCGTCTGGAACTGATTAAACGCATGGAAAT
CTTTCTGAATGCCGGTGTTACCCCGTATGTTTATGAATTTGGTAGCATTGGTGCCAGCGGTGAT
CTGGTTCCGCTGAGCTATATTACCGGTAGCCTGATTGGCCTGGACCCGAGCTTTAAAGTTGATT
TTAATGGCAAAGAAATGGACGCACCGACCGCACTGCGTCAGCTGAATCTGAGTCCGCTGACCCT
GCTGCCGAAAGAAGGTCTGGCAATGATGAATGGCACCAGCGTTATGACCGGTATTGCAGCAAAT
TGTGTTTATGATACCCAGATTCTGACCGCAATTGCAATGGGTGTTCATGCACTGGATATTCAGG
СAC T GAAT G G TACAAAT CAGAGC TTTCATCCGTTTATC CATAACAG СAAAC CGCATCCGGGTCA
GCTGTGGGCAGCAGATCAGATGATTAGCCTGCTGGCCGGTAGCCAGCTGGTTCGTGATGAACTG
GATGGTAAACATGATTATATGGATGGTGAACTGATCCAGGATCGTTATAGCCTGCGTTGTCTGC
CGCAGTATCTGGGTCCGATTGTTGATGGTATTAGCCAGATTGCCAAACAAATCGAAATTGAGAT
TAACAGCGTTACCGATAACCCGCTGATTGATGTTGATAATCAGGCAAGCTATCATGGTGGTAAT
TTTCTGGGTCAGTATGTTGGTATGGGTATGGATCATCTGCGCTATTATATCGGTCTGCTGGCAA
AACATCTGGATGTTCAGATTGCACTGCTGGCATCACCGGAATTTAGCAATGGTCTGCCTCCGAG
TCTGGTGGGTAATCGTGAACGTAAAGTTAATATGGGTCTGAAAGGTCTGCAGATTTGCGGTAAT
AGCATTATGCCGCTGCTGACCTTTTATGGTAATAGTATTGCAGATCGTTTTCCGACCCATGCCG
AACAGTTTAACCAGAATATTAACAGCCAGGGTTATACCAGCGCAACCCTGGCACGTCGTAGCGT
TGATATTTTTCAGAATTATGTTGCCATTGCCCTGATGTTTGGTGTTCAGGCAGTTGATCTGCGT
ACCTACAAAAAAACCGGTCATTATGATGCACGTGCCCAGCTGTCACCGGCAACCGAACGTCTGT
ATAGCGCAGTTCGTCATGTTGTTGGTAAAAAACCGAGCTCAGATCGTCCGTATATTTGGAATGA TAATGAACAGGGTCTGGATGAACATATTGCACGTATTAGTGCAGATATTGCAGCCGGTGGTGTT ATTGTTCAGGCCGTTCAGGACATTCTGCCGAACCTGCAT (SEQ ID N0:13)
Полипептидная последовательность варианта AvPAL № 43 (SEQ ID NO: 14)
MKTLSQAQSKTSSQQFSFTGNSSANVIIGNQKLTINDWRVARNGTLVSLTNNKDILQRIQASC
DYINNAVESGEPIYGVTSGFGGMANWISREQASELQTNLVWFLKTGAGNKLPLADVRAAMLLR
ANSHMRGASGIRLELIKRMEIFLNAGVTPYVYEFGSIGASGDLVPLSYITGSLIGLDPSFKVDF
NGKEMDAPTALRQLNLSPLTLLPKEGLAMMNGTSVMTGIAANCVYDTQILTAIAMGVHALDIQA
LNGTNQSFHPFIHNSKPHPGQLWAADQMISLLAGSQLVRDELDGKHDYMDGELIQDRYSLRCLP
QYLGPIVDGISQIAKQIEIEINSVTDNPLIDVDNQASYHGGNFLGQYVGMGMDHLRYYIGLLAK
HLDVQIALLASPEFSNGLPPSLVGNRERKVNMGLKGLQICGNSIMPLLTFYGNSIADRFPTHAE
QFNQNINSQGYTSATLARRSVDIFQNYVAIALMFGVQAVDLRTYKKTGHYDARAQLSPATERLY SAVRHWGKKPSSDRPYIWNDNEQG LDEHIARISADIAAGGVIVQAVQDILPNLH (SEQ ID N0:14)
Полинуклеотидная последовательность варианта AvPAL № 1002 (SEQ ID NO: 15)
ATGAAAACCCTGAGTCAGGCACAGAGCAAAACCAGCAGCCAGCAGTTTAGCTTTACCGGCAATA
GCAGCGCAAATGTGATTATTGGTAATCAGAAACTGACCATCAATGATGTTGCGCGTGTTGCC
CGTAATGGCACCCTGGTTAGCCTGACCAATAATACCGATATTCTGCAGGGTATTCAGGCCAGCT
GTGATTATATCAATAATGCAGTTGAAAGCGGTGAACCGATTTATGGTGTTACCAGCGGTTTTGG
TGGTATGGCAAATGTTGTAATTAGCCGTGAACAGGCAAGCGAACTGCAGACCAATCTGGTTTGG
TTTCTGAAAACCGGTGCAGGTAATAAACTGCCGCTGGCAGATGTTCGTGCAGCAATGCTGCTGC
GTGCAAATAGCCACATGCATGGTGCAAGCGGTATTCGTCTGGAACTGATTAAACGCGCGGAAAT
CTTTCTGAATGCCGGTGTTACCCCGTATGTTTATGAATTTGGTAGCATTGGTGCCAGCGGTGAT
- 59 034034
CTGGTTCCGCTGAGCTATATTACCGGTAGCCTGATTGGCCTGGACCCGAGCTTTAAAGTTGATT
TTAATGGCAAAGAAATGGACGCACCGACCGCACTGCGTCAGCTGAATCTGAGTCCGCTGACCCT
GCTGCCGAAAGAAGGTCTGGCAATGATGAATGGCACCAGCGTTATGACCGGTATTGCAGCAAAT
TGTGTTTATGATACCCAGATTCTGACCGCAATTGCAATGGGTGTTCATGCACTGGATATTCAGG
CACTGAATGGTACAAATCAGAGCTTTCATCCGTTTATCCATAACAGCAAACCGCATCCGGGTCA
GCTGTGGGCAGCAGATCAGATGATTAGCCTGCTGGCCGGTAGCCAGCTGGTTCGTGATGAACTG
GATGGTAAACATGATTATCGTGATGGTGAACTGATCCAGGATCGTTATAGCCTGCGTTGTCTGC
CGCAGTATCTGGGTCCGATTGTTGATGGTATTAGCCAGATTGCCAAACAAATCGAAATTGAGAT
TAACAGCGTTACCGATAACCCGCTGATTGATGTTGATAATCAGGCAAGCTATCATGGTGGTAAT
TTTCTGGGTCAGTATGTTGGTATGGGTATGGATCATCTGCGCTATTATATCGGTGGCCTGGCAA
AACATCTGGATGTTCAGATTGCACTGCTGGCATCACCGGAATTTAGCAATGGTCTGCCTCCGAG
TCTGGTGGGTAATCGTGAACGTAAAGTTAATATGGGTCTGAAAGGTCTGCAGATTTGCGGTAAT
AGCATTATGCCGCTGCTGACCTTTTATGGTAATAGTATTGCAGATCGTTTTCCGACCCATGCCG
AACAGTTTAACCAGAATATTAACAGCCAGGGTTATACCAGCGCAACCCTGGCACGTCGTAGCGT
TGATATTGGCCAGAATTATGTTGCCATTGCCCTGATGTTTGGTGTTCAGGCAGTTGATCTGCGT
ACCTACAAAAAAACCGGTCATTATGATGCACGTGCCCAGCTGTCACCGGCAACCGAACGTCTGT
ATAGCGCAGTTCGTCATGTTGTTGGTCAGAAACCGAGCTCAGATCGTCCGTATATTTGGAATGA
TAATGAACAGGGTCTGGATGAACATATTGCACGTATTAGTGCAGATATTGCAGCCGGTGGTGTT
ATTGTTCAGGCCGTTCAGGACA TTCTGCCGAACCTGCAT (SEQ ID N0:15)
Полипептидная последовательность варианта AvPAL № 1002 (SEQ ID NO: 16)
MKTLSQAQSKTSSQQFSFTGNSSANVIIGNQKLTINDVARVARNGTLVSLTNNTDILQGIQAS
CDYINNAVESGEPIYGVTSGFGGMANWISREQASELQTNLVWFLKTGAGNKLPLADVRAA
MLLRANSHMHGASGIRLELIKRAEIFLNAGVTPYVYEFGSIGASGDLVPLSYITGSLIGLDPSF
KVDFNGKEMDAPTALRQLNLSPLTLLPKEGLAMMNGTSVMTGIAANCVYDTQILTAIAMGV
HALDIQALNGTNQSFHPFIHNSKPHPGQLWAADQMISLLAGSQLVRDELDGKHDYRDGELIQ
DRYSLRCLPQYLGPIVDGISQIAKQIEIEINSVTDNPLIDVDNQASYHGGNFLGQYVGMGMDH
LRYYIGGLAKHLDVQIALLASPEFSNGLPPSLVGNRERKVNMGLKGLQICGNSIMPLLTFYGN
SIADRFPTHAEQFNQNINSQGYTSATLARRSVDIGQNYVAIALMFGVQAVDLRTYKKTGHYD
ARAQLSPATERLYSAVRHWGQKPSSDRPYIWNDNEQGLDE
HIARISADIAAGGVIVQAVQDILPNLH (SEQ ID N0:16)
Полинуклеотидная последовательность варианта AvPAL № 1008 (SEQ ID NO: 17)
ATGAAAACCCTGAGTCAGGCACAGAGCAAAACCAGCAGCCAGCAGTTTAGCTTTACCGGCAATA
GCAGCGCAAATGTGATTATTGGTAATCAGAAACTGACCATCAATGATGTTGCGCGTGTTGCCCG
TAATGGCACCCTGGTTAGCCTGACCAATAATACCGATATTCTGCAGGGTATTCAGGCCAGCTGT
- 60 034034
GATTATATCAATAATGCAGTTGAAAGCGGTGAACCGATTTATGGTGTTACCAGCGGTTTTGGTG
GTATGGCAAATGTTGTAATTAGCCGTGAACAGGCAAGCGAACTGCAGACCAATCTGGTTTGGTT
TCTGAAAACCGGTGCAGGTAATAAACTGCCGCTGGCAGATGTTCGTGCAGCAATGCTGCTGCGT
GCAAATAGCCACATGCATGGTGCAAGCGGTATTCGTCTGGAACTGATTAAACGCGCGGAAATCT
TTCTGAATGCCGGTGTTACCCCGTATGTTTATGAATTTGGTAGCATTGGTGCCAGCGGTGATCT
GGTTCCGCTGAGCTATATTACCGGTAGCCTGATTGGCCTGGACCCGAGCTTTAAAGTTGATTTT
AATGGCAAAGAAATGGACGCACCGACCGCACTGCGTCAGCTGAATCTGAGTCCGCTGACCCTGC
TGCCGAAAGAAGGTCTGGCAATGATGAATGGCACCAGCGTTATGACCGGTATTGCAGCAAATTG
TGTTTATGATACCCAGATTCTGACCGCAATTGCAATGGGTGTTCATGCACTGGATATTCAGGCA
CTGAATGGTACAAATCAGAGCTTTCATCCGTTTATCCATAACAGCAAACCGCATCCGGGTCAGC
TGTGGGCAGCAGATCAGATGATTAGCCTGCTGGCCGGTAGCCAGCTGGTTCGTGATGAACTGGA
TGGTAAACATGATTATCGTGATGGTGAACTGATCCAGGATCGTTATAGCCTGCGTTGTCTGCCG
CAGTATCTGGGTCCGATTGTTGATGGTATTAGCCAGATTGCCAAACAAATCGAAATTGAGATTA
ACAGCGTTACCGATAACCCGCTGATTGATGTTGATAATCAGGCAAGCTATCATGGTGGTAATTT
TCTGGGTCAGTATGTTGGTATGGGTATGGATCATCTGCGCTATTATATCGGTGGCCTGGCAAAA
CATCTGGATACCCAGATTGCACTGCTGGCATCACCGGAATTTAGCAATGGTCTGCCTCCGAGTC
TGGTGGGTAATCGTGAACGTAAAGTTAATATGGGTCTGAAAGGTCTGCAGATTTGCGGTAATAG
CATTATGCCGCTGCTGACCTTTTATGGTAATAGTATTGCAGATCGTTTTCCGACCCATGCCGAA
CAGTTTAACCAGAATATTAACAGCCAGGGTTATACCAGCGCAACCCTGGCACGTCGTAGCGTTG
ATATTGGCCAGAATTATGTTGCCATTGCCCTGATGTTTGGTGTTCAGGCAGTTGATCTGCGTAC
CTACAAAAAAACCGGTCATTATGATGCACGTGCCCAGCTGTCACCGGCAACCGAACGTCTGTAT
AGCGCAGTTCGTCATGTTGTTGGTCAGAAACCGAGCTCAGATCGTCCGTATATTTGGAATGATA
ATGAACAGGGTCTGGATGAACATATTGCACGTATTAGTGCAGATATTGCAGCCGGTGGTGTTAT
TGTTCAGGCCGTTCAGGACA TTCTGCCGAACCTGCAT (SEQ ID N0:17)
Полипептидная последовательность варианта AvPAL № 1008 (SEQ ID NO: 18)
MKTLSQAQSKTSSQQFSFTGNSSANVIIGNQKLTINDVARVARNGTLVSLTNNTDILQGI
QASCDYINNAVESGEPIYGVTSGFGGMANWISREQASELQTNLVWFLKTGAGNKLPLADVR
AAMLLRANSHMHGASGIRLELIKRAEIFLNAGVTPYVYEFGSIGASGDLVPLSYITGSLIGLDP
SFKVDFNGKEMDAPTALRQLNLSPLTLLPKEGLAMMNGTSVMTGIAANCVYDTQILTAIAM
GVHALDIQALNGTNQSFHPFIHNSKPHPGQLWAADQMISLLAGSQLVRDELDGKHDYRDGE
LIQDRYSLRCLPQYLGPIVDGISQIAKQIEIEINSVTDNPLIDVDNQASYHGGNFLGQYVGMGM
DHLRYYIGGLAKHLDTQIALLASPEFSNGLPPSLVGNRERKVNMGLKGLQICGNSIMPLLTFY
GNSIADRFPTHAEQFNQNINSQGYTSATLARRSVDIGQNYVAIALMFGVQAVDLRTYKKTGH
YDARAQLSPATERLYSAVRHWGQKPSSDRPYIWNDNEQGLDEHIARISADIAAGGVIVQAVQD
ILPNLH (SEQ ID N0:18)
Полинуклеотидная последовательность варианта AvPAL № 1009 (SEQ ID NO: 19)
- 61 034034
ATGAAAACCCTGAGTCAGGCACAGAGCAAAACCAGCAGCCAGCAGTTTAGCTTTACCGGCAATA
GCAGCGCAAATGTGATTATTGGTAATCAGAAACTGACCATCAATGATGTTGCGCGTGTTGCCCG
TAATGGCACCCTGGTTAGCCTGACCAATAATACCGATATTCTGCAGGGTATTCAGGCCAGCTGT
GATTATATCAATAATGCAGTTGAAAGCGGTGAACCGATTTATGGTGTTACCAGCGGTTTTGGTG
GTATGGCAAATGTTGTAATTAGCCGTGAACAGGCAAGCGAACTGCAGACCAATCTGGTTTGGTT
TCTGAAAACCGGTGCAGGTAATAAACTGCCGCTGGCAGATGTTCGTGCAGCAATGCTGCTGCGT
GCAAATAGCCACATGCATGGTGCAAGCGGTATTCGTCTGGAACTGATTAAACGCGCGGAAATCT
TTCTGAATGCCGGTGTTACCCCGTATGTTTATGAATTTGGTAGCATTGGTGCCAGCGGTGATCT
GGTTCCGCTGAGCTATATTACCGGTAGCCTGATTGGCCTGGACCCGAGCTTTAAAGTTGATTTT
AATGGCAAAGAAATGGACGCACCGACCGCACTGCGTCAGCTGAATCTGAGTCCGCTGACCCTGC
TGCCGAAAGAAGGTCTGGCAATGATGAATGGCACCAGCGTTATGACCGGTATTGCAGCAAATTG
TGTTTATGATACCCAGATTCTGACCGCAATTGCAATGGGTGTTCATGCACTGGATATTCAGGCA
CTGAATGGTACAAATCAGAGCTTTCATCCGTTTATCCATAACAGCAAACCGCATCCGGGTCAGC
TGTGGGCAGCAGATCAGATGATTAGCCTGCTGGCCGGTAGCCAGCTGGTTCGTGATGAACTGGA
TGGTAAACATGATTATCGTGATGGTGAACTGATCCAGGATCGTTATAGCCTGCGTTGTCTGCCG
CAG TATCTGGGTCCGATTGTTGATGGTATTAGC CAGAT TGC СAAACAAAT C GAAATT GAGAT TA
ACAGCGTTACCGATAACCCGCTGATTGATGTTGATAATCAGGCAAGCTATCATGGTGGTAATTT
TCTGGGTCAGTATGTTGGTATGGGTATGGATCATCTGCGCTATGAAATCGGTCTGCTGGCAAAA
CATCTGGATGTTCAGATTGCACTGCTGGCATCACCGGAATTTAGCAATGGTCTGCCTCCGAGTC
TGGTGGGTAATCGTGAACGTAAAGTTAATATGGGTCTGAAAGGTCTGCAGATTTGCGGTAATAG
CATTATGCCGCTGCTGACCTTTTATGGTAATAGTATTGCAGATCGTTTTCCGACCCATGCCGAA
CAGTTTAACCAGAATATTAACAGCCAGGGTTATACCAGCGCAACCCTGGCACGTCGTAGCGTTG
ATATTGGCCAGAATTATGTTGCCATTGCCCTGATGTTTGGTGTTCAGGCAGTTGATCTGCGTAC
CTACAAAAAAACCGGTCATTATGATGCACGTGCCCAGCTGTCACCGGCAACCGAACGTCTGTAT
AGCGCAGTTCGTCATGTTGTTGGTCAGAAACCGAGCTCAGATCGTCCGTATATTTGGAATGATA
ATGAACAGGGTCTGGATGAACATATTGCACGTATTAGTGCAGATATTGCAGCCGGTGGTGTTAT
TGTTCAGGCCGTTCAGGACA TTCTGCCGAACCTGCAT (SEQ ID N0:19)
Полипептидная последовательность варианта AvPAL № 1009 (SEQ ID NO: 20)
MKTLSQAQSKTSSQQFSFTGNSSANVIIGNQKLTINDVARVARNGTLVSLTNNTDILQGI
QASCDYINNAVESGEPIYGVTSGFGGMANWISREQASELQTNLVWFLKTGAGNKLPLADVR
AAMLLRANSHMHGASGIRLELIKRAEIFLNAGVTPYVYEFGSIGASGDLVPLSYITGSLIGLDP
SFKVDFNGKEMDAPTALRQLNLSPLTLLPKEGLAMMNGTSVMTGIAANCVYDTQILTAIAM
GVHALDIQALNGTNQSFHPFIHNSKPHPGQLWAADQMISLLAGSQLVRDELDGKHDYRDGE
LIQDRYSLRCLPQYLGPIVDGISQIAKQIEIEINSVTDNPLIDVDNQASYHGGNFLGQYVGMGM
DHLRYEIGLLAKHLDVQIALLASPEFSNGLPPSLVGNRERKVNMGLKGLQICGNSIMPLLTFY
GNSIADRFPTHAEQFNQNINSQGYTSATLARRSVDIGQNYVAIALMFGVQAVDLRTYKKTGH YDARAQLSPATERLYSAVRHWGQKPSSDRPYIWNDNEQGLDEHIARISADIAAGGVIVQAV QDILPNLH (SEQ ID N0:20)
Полинуклеотидная последовательность варианта AvPAL № 1010 (SEQ ID NO: 21)
- 62 034034
ATGAAAACCCTGAGTCAGGCACAGAGCAAAACCAGCAGCCAGCAGTTTAGCTTTACCGGCAATA
GCAGCGCAAATGTGATTATTGGTAATCAGAAACTGACCATCAATGATGTTGCGCGTGTTGCCCG
TAATGGCACCCTGGTTAGCCTGACCAATAATACCGATATTCTGCAGGGTATTCAGGCCAGCTGT
GATTATATCAATAATGCAGTTGAAAGCGGTGAACCGATTTATGGTGTTACCAGCGGTTTTGGTG
GTATGGCAAATGTTGTAATTAGCCGTGAACAGGCAAGCGAACTGCAGACCAATCTGGTTTGGTT
TCTGAAAACCGGTGCAGGTAATAAACTGCCGCTGGCAGATGTTCGTGCAGCAATGCTGCTGCGT
GCAAATAGCCACATGCATGGTGCAAGCGGTATTCGTCTGGAACTGATTAAACGCGCGGAAATCT
TTCTGAATGCCGGTGTTACCCCGTATGTTTATGAATTTGGTAGCATTGGTGCCAGCGGTGATCT
GGTTCCGCTGAGCTATATTACCGGTAGCCTGATTGGCCTGGACCCGAGCTTTAAAGTTGATTTT
AATGGCAAAGAAATGGACGCACCGACCGCACTGCGTCAGCTGAATCTGAGTCCGCTGACCCTGC
TGCCGAAAGAAGGTCTGGCAATGATGAATGGCACCAGCGTTATGACCGGTATTGCAGCAAATTG
TGTTTATGATACCCAGATTCTGACCGCAATTGCAATGGGTGTTCATGCACTGGATATTCAGGCA
CTGAATGGTACAAATCAGAGCTTTCATCCGTTTATCCATAACAGCAAACCGCATCCGGGTCAGC
TGTGGGCAGCAGATCAGATGATTAGCCTGCTGGCCGGTAGCCAGCTGGTTCGTGATGAACTGGA
TGGTAAACATGATTATCGTGATGGTGAACTGATCCAGGATCGTTATAGCCTGCGTTGTCTGCCG
CAGTATCTGGGTCCGATTGTTGATGGTATTAGCCAGATTGCCAAACAAATCGAAATTGAGATTA
ACAGCGTTACCGATAACCCGCTGATTGATGTTGATAATCAGGCAAGCTATCATGGTGGTAATTT
TCTGGGTCAGTATGTTGGTATGGGTATGGATCATCTGCGCTATGAAATCGGTCTGCTGGCAAAA
CATCTGGATACCCAGATTGCACTGCTGGCATCACCGGAATTTAGCAATGGTCTGCCTCCGAGTC
TGGTGGGTAATCGTGAACGTAAAGTTAATATGGGTCTGAAAGGTCTGCAGATTTGCGGTAATAG
CATTATGCCGCTGCTGACCTTTTATGGTAATAGTATTGCAGATCGTTTTCCGACCCATGCCGAA
CAGTTTAACCAGAATATTAACAGCCAGGGTTATACCAGCGCAACCCTGGCACGTCGTAGCGTTG
ATATTGGCCAGAATTATGTTGCCATTGCCCTGATGTTTGGTGTTCAGGCAGTTGATCTGCGTAC
CTACAAAAAAACCGGTCATTATGATGCACGTGCCCAGCTGTCACCGGCAACCGAACGTCTGTAT
AGCGCAGTTCGTCATGTTGTTGGTCAGAAACCGAGCTCAGATCGTCCGTATATTTGGAATGATA
ATGAACAGGGTCTGGATGAACATATTGCACGTATTAGTGCAGATATTGCAGCCGGTGGTGTTAT
TGTTCAGGCCGTTCAGGACA TTCTGCCGAACCTGCAT (SEQ ID NO: 21)
Полипептидная последовательность варианта AvPAL № 1010 (SEQ ID NO: 22)
MKTLSQAQSKTSSQQFSFTGNSSANVIIGNQKLTINDVARVARNGTLVSLTNNTDILQGI
QAS C DYINNAVE SGEPIYGVTSG FGGMANWIS RE QAS E LQTNLVW FLKT GAGNKL PLADVR
AAMLLRANSHMHGASGIRLELIKRAEIFLNAGVTPYVYEFGSIGASGDLVPLSYITGSLIGLDP
SFKVDFNGKEMDAPTALRQLNLSPLTLLPKEGLAMMNGTSVMTGIAANCVYDTQILTAIAM
GVHALDIQALNGTNQSFHPFIHNSKPHPGQLWAADQMISLLAGSQLVRDELDGKHDYRDGE
LIQDRYSLRCLPQYLGPIVDGISQIAKQIEIEINSVTDNPLIDVDNQASYHGGNFLGQYVGMGM
DHLRYEIGLLAKHLDTQIALLASPEFSNGLPPSLVGNRERKVNMGLKGLQICGNSIMPLLTFY
GNSlADRFPTHAEQFNQNINSQGYTSATLARRSVDIGQNYVAIALMFGVQAVDLRTYKKTGH
YDARAQLSPATERLYSAVRHWGQKPSSDRPYIWNDNEQGLDE
HIARISADIAAGGVIVQAVQDILPNLH (SEQ ID N0:22)
Полинуклеотидная последовательность варианта AvPAL № 1084 (SEQ ID NO: 23)
- 63 034034
ATGAAAACCCTGAGTCAGGCACAGAGCAAAACCAGCAGCCAGCAGTTTAGCCATACCGGCAAT
AGCAGCGCAAATGTGATTATTGGTAATCAGAAACTGACCATCAATGATGTTGTACGTGTTGCCC
GTAATGGCACCGCGGTTAGCCTGACCAATAATAAAGATATTCTGCAGCGTATTCAGGCCAGCTG
TGATTATATCAATAATGCAGTTGAAAAAGGTGAACCGATTTATGGTGTTACCAGCGGTTTTGGT
GGTATGGCAAATGTTGTAATTAGCCGTGAACAGGCAAGCGAACTGCAGACCAATCTGGTTTGGT
TTCTGAAAACCGGTGCAGGTAATAAACTGCCGCTGGCAGATGTTCGTGCAGCAATGCTGCTGCG
TGCAAATAGCCACATGCGTGGTGCAAGCGGTATTCGTCTGGAACTGATTAAACGCATGGAAATC
TTTCTGAATGCCGGTGTTACCCCGTATGTTTATGAATTTGGTAGCATTGGTGCCAGCGGTGATC
TGGTTCCGCTGAGCTATATTACCGGTAGCCTGATTGGCCTGGACCCGAGCTTTAAAGTTGATTT
TAATGGCAAAGAAATGGACGCACCGACCGCACTGCGTCAGCTGAATCTGAGTCCGCTGACCCTG
CAGCCGAAAGAAGGTCTGGCAATGATGAATGGCACCAGCGTTATGACCGGTATTGCAGCAAATT
GTGTTTATGATACCCAGATTCTGACCGCAATTGCAATGGGTGTTCATGCACTGGATATTCAGGC
ACTGAATGGTACAAATCAGAGCTTTCATCCGTTTATCCATAACAGCAAACCGCATCCGGGTCAG
CTGTGGGCAGCAGATCAGATGATTAGCCTGCTGGCCGGTAGCCAGCTGGTTCGTGATGAACTGG
ATGGTAAACATGATTATATGGATGGTGAACTGATCCAGGATCGTTATAGCCTGCGTTGTCTGCC
GCAGTATCTGGGTCCGATTGTTGATGGTATTAGCCAGATTGCCAAACAAATCGAAATTGAGATT
AACAGCGTTACCGATAACCCGCTGATTGATGTTGATAATCAGGCAAGCTATCATGGTGGTAATT
TTCTGGGTCAGTATGTTGGTATGGGTATGGATCATCTGCGCTATTATATCGGTCTGCTGGCAAA
ACATCTGGATGTTCAGATTGCACTGCTGGCATCACCGGAATTTAGCAATGGTCTGCCTCCGAGT
CTGGTGGGTAATCGTGAACGTAAAGTTAATATGGGTCTGAAAGGTCTGCAGATTTGCGGTAATA
GCATTATGCCGCTGCTGACCTTTTATGGTAATAGTATTGCAGATCGTTTTCCGACCCATGCCGA
ACAGTTTAACCAGAATATTAACAGCCAGGGTTATACCAGCGCAACCCTGGCACGTCGTAGCGTT
GATATTTTTCAGAATTATGTTGCCATTGCCCTGATGTTTGGTGTTCAGGCAGTTGATCTGCGTA
CCTACAAAAAAACCGGTCATTATGATGCACGTGCCCAGCTGTCACCGGCAACCGAACGTCTGTA
TAGCGCAGTTCGTCATGTTGTTGGTAAAAAACCGAGCTCAGATCGTCCGTATATTTGGAATGAT AATGAACAGGGTCTGGATGAACATATTGCACGTATTAGTGCAGATATTGCAGCCGGTGGTGTTA TTGTTCAGGCCGTTCAGG ACATTCTGCCGCCGCTGCAT
Полипептидная последовательность варианта AvPAL № 1084 (SEQ ID NO: 24)
MKTLSQAQSKTSSQQFSHTGNSSANVIIGNQKLTINDWRVARNGTAVSLTNNKDILQRI
QASCDYINNAVEKGEPIYGVTSGFGGMANWISREQASELQTNLVWFLKTGAGNKLPLADV
RAAMLLRANSHMRGASGIRLELIKRMEIFLNAGVTPYVYEFGSIGASGDLVPLSYITGSLIGLD
PSFKVDFNGKEMDAPTALRQLNLSPLTLQPKEGLAMMNGTSVMTGIAANCVYDTQILTAIA
MGVHALDIQALNGTNQSFHPFIHNSKPHPGQLWAADQMISLLAGSQLVRDELDGKHDYMD
GELIQDRYSLRCLPQYLGPIVDGISQIAKQIEIEINSVTDNPLIDVDNQASYHGGNFLGQYVGM
GMDHLRYYIGLLAKHLDVQIALLASPEFSNGLPPSLVGNRERKVNMGLKGLQICGNSIMPLL
TFYGNSIADRFPTHAEQFNQNINSQGYTSATLARRSVDIFQNYVAIALMFGVQAVDLRTYKK
TGHYDARAQLSPATERLYSAVRHWGKKPSSDRPYIWNDNEQGLDE
HIARISADIAAGGVIVQAVQDILPPLH (SEQ ID N0:24)
Полинуклеотидная последовательность варианта AvPAL № 967 (SEQ ID NO: 25)
- 64 034034
ATGAAAACCCTGAGTCAGGCACAGAGCAAAACCAGCAGCCAGCAGTTTAGCTTTACCGG
CAATAGCAGCGCAAATGTGATTATTGGTAATCAGAAACTGACCATCAATGATGTTGCGC
GTGTTGCCCGTAATGGCACCCTGGTTAGCCTGACCAATAATACCGATATTCTGCAGGGTA
TTCAGGCCAGCTGTGATTATATCAATAATGCAGTTGAAAGCGGTGAACCGATTTATGGTG
TTACCAGCGGTTTTGGTGGTATGGCAAATGTTGTAATTAGCCGTGAACAGGCAAGCGAAC
TGCAGACCAATCTGGTTTGGTTTCTGAAAACCGGTGCAGGTAATAAACTGCCGCTGGCAG
ATGTTCGTGCAGCAATGCTGCTGCGTGCAAATAGCCACATGCGTGGTGCAAGCGGTATTC
GTCTGGAACTGATTAAACGCGCGGAAATCTTTCTGAATGCCGGTGTTACCCCGTATGTTT
ATGAATTTGGTAGCATTGGTGCCAGCGGTGATCTGGTTCCGCTGAGCTATATTACCGGTA
GCCTGATTGGCCTGGACCCGAGCTTTAAAGTTGATTTTAATGGCAAAGAAATGGACGCAC
CGACCGCACTGCGTCAGCTGAATCTGAGTCCGCTGACCCTGCTGCCGAAAGAAGGTCTG
GCAATGATGAATGGCACCAGCGTTATGACCGGTATTGCAGCAAATTGTGTTTATGATACC
CAGATTCTGACCGCAATTGCAATGGGTGTTCATGCACTGGATATTCAGGCACTGAATGGT
ACAAATCAGAGCTTTCATCCGTTTATCCATAACAGCAAACCGCATCCGGGTCAGCTGTGG
GCAGCAGATCAGATGATTAGCCTGCTGGCCGGTAGCCAGCTGGTTCGTGATGAACTGGA
TGGTAAACATGATTATCGTGATGGTGAACTGATCCAGGATCGTTATAGCCTGCGTTGTCT
GCCGCAGTATCTGGGTCCGATTGTTGATGGTATTAGCCAGATTGCCAAACAAATCGAAAT
TGAGATTAACAGCGTTACCGATAACCCGCTGATTGATGTTGATAATCAGGCAAGCTATCA
TGGTGGTAATTTTCTGGGTCAGTATGTTGGTATGGGTATGGATCATCTGCGCTATTATATC
GGTGGCCTGGCAAAACATCTGGATGTTCAGATTGCACTGCTGGCATCACCGGAATTTAGC
AATGGTCTGCCTCCGAGTCTGGTGGGTAATCGTGAACGTAAAGTTAATATGGGTCTGAAA
GGTCTGCAGATTTGCGGTAATAGCATTATGCCGCTGCTGACCTTTTATGGTAATAGTATT
G CAGAT CGTTTTCC GAC С CAT GC C GAACAG T T TAAC CAGAATAT TAACAG С CAG G G T TAT
ACCAGCGCAACCCTGGCACGTCGTAGCGTTGATATTGGCCAGAATTATGTTGCCATTGCC
CTGATGTTTGGTGTTCAGGCAGTTGATCTGCGTACCTACAAAAAAACCGGTCATTATGAT
GCACGTGCCCAGCTGTCACCGGCAACCGAACGTCTGTATAGCGCAGTTCGTCATGTTGTT
GGTCAGAAACCGAGCTCAGATCGTCCGTATATTTGGAATGATAATGAACAGGGTCTGGA TGAACATATTGCACGTATTAGTGCAGATATTGCAGCCGGTGGTGTTATTGTTCAGGCCGT TCAGGACATTCTGCCGAACCTGCAT (SEQ ID N0:25)
Полипептидная последовательность варианта № 967 (SEQ ID NO: 26)
MKTLSQAQSKTSSQQFSFTGNSSANVIIGNQKLTINDVARVARNGTLVSLTNNTDILQGIQAS
CDYINNAVESGEPIYGVTSGFGGMANWISREQASELQTNLVWFLKTGAGNKLPLADVRAA MLLRANSHMRGASGIRLELIKRAEIFLNAGVTPYVYEFGSIGASGDLVPLSYITGSLIGLDPSF
К VDFNGKEMDAPTALRQLNLSPLTLLPKEGLAMMNGTSVMTGIAANCVYDTQILTAIAMGVH
ALDIQALNGTNQSFHPFIHNSKPHPGQLWAADQMISLLAGSQLVRDELDGKHDYRDGELIQD RYSLRCLPQYLGPIVDGISQIAKQIEIEINSVTDNPLIDVDNQASYHGGNFLGQYVGMGMDHL RYYIGGLAKHLDVQIALLAS PE FSNGLPPS LVGNRERKVNMGLKGLQICGNSIMPLLT FYGNS IADRFPTHAEQFNQNINSQGYTSATLARRSVDIGQNYVAIALMFGVQAVDLRTYKKTGHYDA RAQLSPATERLYSAVRHWGQKPSSDRPYIWNDNEQGLDE
HIARISADIAAGGVIVQAVQDILPNLH (SEQ ID N0:26)
Экспрессирующий вектор pCK100900i
- 65 034034
TGGCCACCATCACCATCACCATTAGGGAAGAGCAGATGGGCAAGCTTGACCTGTGAAGT GAAAAATGGCGCACATTGTGCGAGATTTTTTTTTGAATTСTACGTAAAAAGCAGСCGATA CATCGGCTGCTTTTTTTTTGNNNGAGGTTCCAACTTGTGGTATAATGAAATAAGATCACT CCGGAGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAGGAACTAAAATGGA GAAAAAAAT СAC T G GATATAC CAC CGTTGATATATCC CAAT G G CAT C G TAAAGAACAT T T T GAG G CAT T T CAG T CAG T T GC T CAAT G TAC С TATAAC CAGAC C G T T CAG CTGGATATTAC GGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAAAAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTATTCACAT TCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGAGTTCCGTATGGCAATGAAAGACGGTGAGCT GGTGATATGGGATAGTGTTCACCCTTGTTACACCGTTTTCCATGAGCAAACTGAAACGTT TTCATCGCTCTGGAGTGAATACCACGACGATTTCCGGCAGTTTCTACACATATATTCGCA AGATGTGGCGTGTTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAAGGGTTTATTGAGAATAT GTTTTTCGTCTCAGCCAATCCCTGGGTGAGTTTCACCAGTTTTGATTTAAACGTGGCCAAT ATGGACAACTTCTTCGCCCCCGTTTTCACCATGGGCAAATATTATACGCAAGGCGACAAG
- 66 034034
GTGCTGATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATCATGCCGTCTGTGATGGCTTCCATGTCGGC AGAATGCTTAATGAATTACAACAGTACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCGTAACTGCA GGAGCTCAAACAGCAGCCTGTATTCAGGCTGCTTTTTTCGTTTTGGTCTGCGCGTAATCTC TTGCTCTGAAAACGAAAAAACCGCCTTGCAGGGCGGTTTTTCGAAGGTTCTCTGAGCTAC CAACTCTTTGAACCGAGGTAACTGGCTTGGAGGAGCGCAGTCACCAAAACTTGTCCTTTC AGTTTAGССTTAACCGGCGCATGACTTCAAGACTAACTССTСTAAATСAATTACCAGTGG CTGCTGCCAGTGGTGCTTTTGCATGTCTTTCCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGG ATAAGGCGCAGCGGTCGGACTGAACGGGGGGTTCGTGCATACAGTCCAGCTTGGAGCGA ACTGCCTACCCGGAACTGAGTGTCAGGCGTGGAATGAGACAAACGCGGCCATAACAGCG GAATGACACCGGTAAACCGAAAGGCAGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCCGCCAGG GGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCACTGATTTGAGCGTCA GATTTCGTGATGCTTGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGGCTTTGCCGCGGCCCT CTCACTTCCCTGTTAAGTATCTTCCTGGCATCTTCCAGGAAATCTCCGCCCCGTTCGTAAG CCATTTCCGCTCGCCGCAGTCGAACGACCGAGCGTAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCG GAATATATCCTGTATCACATATTCTGCTGACGCACCGGTGCAGCCTTTTTTCTCCTGCCAC ATGAAGCACTTCACTGACACCCTCATCAGTGAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTA GGCCTATGGCCTTTTTTTTTTNTGNNAAACCTTTCGCGGTATGGNATNANAGCGCCCGGA AGAGAG T CAAT TAAGAG G G T G G T GAAT G T GAAAC CAG TAAC GTTATACGATGTCG CAGA GTATGCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGGTGAACCAGGCCAGCCACGTTTC TGCGAAAACGCGGGAAAAAGTGGAAGCGGCGATGGCGGAGCTGAATTACATTCCCAACC GCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGCCACCTCCAGTC TGGCCCTGCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGATCAACTGG GTGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGAAGCCTGTAAAGCGGCG GTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGGGCTGATCATTAACTATCCGCTGGATGAC CAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCTGCACTAATGTTCCGGCGTTATTTCTTGATGTCT CTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATGAAGACGGTACGCGACTGGGCG TGGAGCATCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAATCGCGCTGTTAGCGGGCCCATTAAGTT CTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCTGGCTGGCATAAATATCTCACTCGCAATCAAATTC AGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTGGAGTGCCATGTCCGGTTTTCAACAAACCATG CAAATGCTGAATGAGGGCATCGTTCCCACTGCGATGCTGGTTGCCAACGATCAGATGGC GCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGTCCGGGCTGCGCGTTGGTGCGGACATCTCGGT AGTGGGATACGACGATACCGAAGACAGCTCATGTTATATCCCGCCGTTAACCACCATCA AACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAACTCTCTCAGG GCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACC CTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTG GCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGGTACCCGATAAAAGCGGCTT
- 67 034034
CCTGACAGGAGGCCGTTTTGTTTCTCGAGTTAATTAAGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAA
TGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATG
T T G T G T G GAAT T G T GAG C G GATAACAAT T T GAGACAG GAAACAG СТАТ GAG CAT GAT TAG
GGATTCACTGGCCGTCGTTTTACAATCTAGAGGCCAGCCTGGCCATAAGGAGATATACAT
ATGGGCCATCATCATCATCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCATATCGAAGGTCGT
CAT AT GAAAAC OCT GAG С C AG GC AC AGAG С AAAAC GAG GAG С C AG GAG TTTAGCTTTAC
C G G CAATAG GAG C G СAAAT GTGATTATTGGTAAT CAGAAAC T GAG CAT GAAT GAT G T T G
CACGTGTTGCCCGTAATGGCACCCTGGTTAGCCTGACCAATAATACCGATATTCTGCAGG
GTAT T CAGGCCAGC T GT GAT TATAT GAATAAT GCAGT TGAAAGC GG TGAAC C GAT T TAT G
GTGTTACCAGCGGTTTTGGTGGTATGGCAAATGTTGCAATTAGCCGTGAACAGGCAAGCG
AACTGCAGACCAATCTGGTTTGGTTTCTGAAAACCGGTGCAGGTAATAAACTGCCGCTGG
CAGATGTTCGTGCAGCAATGCTGCTGCGTGCAAATAGCCACATGCGTGGTGCAAGCGGT
ATTCGTCTGGAACTGATTAAACGCATGGAAATCTTTCTGAATGCCGGTGTTACCCCGTAT
GTTTATGAATTTGGTAGCATTGGTGCCAGCGGTGATCTGGTTCCGCTGAGCTATATTACC
GGTAGCCTGATTGGCCTGGACCCGAGCTTTAAAGTTGATTTTAATGGCAAAGAAATGGAC
GCACCGACCGCACTGCGTCAGCTGAATCTGAGTCCGCTGACCCTGCTGCCGAAAGAAGG
TCTGGCAATGATGAATGGCACCAGCGTTATGACCGGTATTGCAGCAAATTGTGTTTATGA
TAC С CAGAT T С T GAC C G CAAT T G CAAT GGGTGTTCATG GAG TGGATATTCAGGCACT GAA
TGGTAGAAATCAGAGСTTTCATСCGTTTATCCATAACAGGAAACCGCATСCGGGTGAGСT
GTGGGCAGCAGATCAGATGATTAGCCTGCTGGCCAATAGCCAGCTGGTTCGTGATGAAC
TGGATGGTAAACATGATTATCGTGATCATGAACTGATCCAGGATCGTTATAGCCTGCGTT
GTCTGCCGCAGTATCTGGGTCCGATTGTTGATGGTATTAGCCAGATTGCCAAACAAATCG
AAATTGAGATTAACAGCGTTACCGATAACCCGCTGATTGATGTTGATAATCAGGCAAGCT
ATCATGGTGGTAATTTTCTGGGTCAGTATGTTGGTATGGGTATGGATCATCTGCGCTATTA
TATCGGTCTGCTGGCAAAACATCTGGATGTTCAGATTGCACTGCTGGCATCACCGGAATT
TAGCAATGGTCTGCCTCCGAGTCTGCTGGGTAATCGTGAACGTAAAGTTAATATGGGTCT
GAAAGGTCTGCAGATTTGCGGTAATAGCATTATGCCGCTGCTGACCTTTTATGGTAATAG
TATTGCAGATCGTTTTCCGACCCATGCCGAACAGTTTAACCAGAATATTAACAGCCAGGG
TTATACCAGCGCAACCCTGGCACGTCGTAGCGTTGATATTTTTCAGAATTATGTTGCCATT
GCCCTGATGTTTGGTGTTCAGGCAGTTGATCTGCGTACCTACAAAAAAACCGGTCATTAT
GATGCACGTGCCTGTCTGTCACCGGCAACCGAACGTCTGTATAGCGCAGTTCGTCATGTT
GTTGGTCAGAAACCGACCTCAGATCGTCCGTATATTTGGAATGATAATGAACAGGGTCTG
GATGAACATATTGCACGTATTAGTGCAGATATTGCAGCCGGTGGTGTTATTGTTCAGGCC
GTTCAGGACATTCTGCCGTGTCTGCATTAAGGCCAAAC (SEQ ID N0:27)
Пример 1. Получение гена PAL и конструкция экспрессирующих векторов.
Плазмидную ДНК фенилаланин-аммиак-лиазы Anabaena variabilis (AvPAL) получали и синтетический ген, кодирующий AvPAL, подвергали оптимизации кодона для экспрессии в Е. coli и клонировали в экспрессирующий вектор pET16b Е. coli с получением pET16b-AvPAL (SEQ ID NO: 1). Открытую рамку считывания AvPAL (SEQ ID NO: 2) амплифицировали посредством ПЦР с использованием олигонуклеотидов PAL-pCK-F и PAL-pCK-R и субклонировали в экспрессирующий вектор pCK100900i (SEQ ID NO: 27). _____________________________________________________________________________________________
Праймер Последовательность 5’-3’ SEQ ID NO:
PAL-pCK-F CTAGAGGCCAGCCTGGCCATAAGGAGATATACATATG AAAACCCTGAGCCAGGCAC SEQ ID NO: 2 8
PAL-pCK-R GATGGTGATGGTGGCCAGTTTGGCCTTAATGCAGACA CGGCAGAATG SEQ ID NO: 2 9
Эту плазмидную конструкцию трансформировали в штамм Е. coli, получаемый из W3110. Для по- 68 034034 лучения библиотек вариантов гена на основании этой плазмидной конструкции использовали способы направленной эволюции, как правило, известные специалистам в данной области (см., например, патент
США № 8383346 и WO 2010/144103).
Пример 2. Высокоэффективный рост и высокопроизводительные (НТР) анализы.
Высокоэффективный рост PAL и высокопроизводительные (НТР) варианты PAL.
Отбирали трансформированные клетки Е. coli путем высевания на планшеты с агаром LB, содержащим 1% глюкозы и 30 мкг/мл хлорамфеникола. После инкубации в течение ночи при 37°C колонии помещали в лунки 96-луночных плоскодонных планшетов NUNC™ (Thermo-Scientific), наполненных 180 мкл/лунку LB, дополненным 1% глюкозой и 30 мкг/мл хлорамфениколом. Культуры оставляли расти в течение ночи в течение 18-20 ч во встряхивателе (200 об/мин, 30°C и при относительной влажности 85%; Kuhner).
Выросшие в течение ночи образцы (20 мкл) переносили в 96-луночные планшеты с глубокими лунками Costar, наполненными 380 мкл бульона Terrific, дополненного 30 мкг/мл хлорамфеникола. Планшеты инкубировали в течение 135 мин в шейкере (250 об/мин, 30°C и относительной влажности 85%; Kuhner). Затем клетки индуцировали 40 мкл 10 мМ IPTG в стерильной воде и инкубировали в течение ночи в течение 20-24 ч во встряхивателе (250 об/мин, 30°C и относительной влажности 85%; Kuhner). Объединяли культуры двух повторений, клетки осаждали (4000 об/мин х 20 мин), удаляли супернатанты и замораживали клетки при -80°C до анализа.
Лизирование НТР осадков.
Сначала к осадкам клеток добавляли 500 мкл лизирующего буфера (20 мМ Tris pH 7,5, 1 мМ MgSO4, 1 мг/мл лизоцима и 0,5 мг/мл сульфата полимиксина B). Смесь перемешивали в течение 1,5 ч при комнатной температуре и осаждали центрифугированием (4000 об/мин х 5 мин) перед тем, как использовать осветленные лизаты в различных НТР анализах, описываемых в настоящем описании. Анализ таких лизатов посредством SDS-PAGE выявлял наличие сверхэкспрессированного белка кажущейся Mw ~60 кДа, соответствующей ожидаемой Mw PAL.
Анализ осветленных лизатов.
Активность вариантов PAL определяли путем измерения образования коричной кислоты, как определяют по изменению оптической плотности при 290 нм в течение определенного периода времени. Для этого анализа в лунки полиакрилатного 96-луночного планшета (Costar № 3635, Corning) добавляли 100 мкл 200 мМ Tris/50 мМ фенилаланина, pH 7,5 или 200 мМ фосфата натрия/50 мМ фенилаланина pH 7,0, 80 мкл воды и 20 мкл осветленного лизата. Реакционные смеси быстро перемешивали и определяли активность путем наблюдения оптической плотности при 290 нм в течение определенного периода времени (каждые 12-20 с в течение 5-20 мин) с использованием микропланшетного спектрофотометра для определения оптической плотности SpectraMax® Plus384 или SpectraMax® 190 (Molecular Devices).
НТР анализ осветленных лизатов, предварительно обрабатываемых протеазой.
Варианты PAL обрабатывали химотрипсином и трипсином для имитации среды нижнего отдела кишечника. Сначала в лунки 96-луночного круглодонного планшета (Costar № 3798, Corning) добавляли 30 мкл смеси протеазы (0,01-100 мг/мл химотрипсина (С4129 Sigma Aldrich), 0,01-100 мг/мл трипсина (Т7409 Sigma Aldrich), 1 мМ CaCl2 и 1 мМ HCl), 0-30 мкл 20 мМ таурохолата натрия в 500 мМ фосфате натрия pH 7,0 и 90-120 мкл осветленного лизата. Планшеты герметично закрывали и инкубировали в течение 1 ч при 37°C, 400 об/мин, амплитуда качания 1 до анализа. Для анализа в лунки полиакрилатного 96-луночного планшета (Costar № 3635, Corning) добавляли 100 мкл 200 мМ Tris/50 мМ фенилаланина pH 7,5 или 200 мМ фосфата натрия/50 мМ фенилаланин pH 7,0 и 100 мкл обработанного протеазой лизата. Реакционные смеси быстро перемешивали и определяли активность путем наблюдения оптической плотности при 290 нм в течение определенного периода времени (каждые 12-20 с в течение 5-20 мин) с использованием микропланшетного спектрофотометра для определения оптической плотности SpectraMax® Plus384 или SpectraMax® 190 (Molecular Devices). Результаты приведены в следующих ниже таблицах.
НТР анализ осветленных лизатов, предварительно обработанных кислотой.
B этом анализе варианты PAL подвергали кислым условиям для имитации среды желудка. Сначала в лунки 96-луночного круглодонного планшета (Costar № 3798, Corning) добавляли 20 мкл 1М цитрата натрия (pH 3,7-4,5) и 30 мкл воды или 50 мкл 400 мМ цитрата натрия pH 3,7-4,8 и 50 мкл осветленного лизата. Планшет герметично закрывали и инкубировали в течение 1 ч при 37°C, 400 об/мин, амплитуда качания 1 до анализа. Для анализа в лунки полиакрилатного 96-луночного планшета (Costar № 3635, Corning) добавляли 100 мкл 200 мМ Tris, 50 мМ фенилаланина pH 7,5 и 80 мкл 1М Tris pH 7,5 или 200 мМ фосфата натрия/50 мМ фенилаланина pH 7,0 и 80 мкл 1,0М фосфата натрия pH 7,0 и 20 мкл обработанного кислотой лизата. Реакционные смеси быстро перемешивали и определяли активность путем наблюдения оптической плотности при 290 нм в течение определенного периода времени (каждые 12-20 с в течение 5-20 мин) с использованием микропланшетного спектрофотометра для определения оптической плотности SpectraMax® Plus384 или SpectraMax® 190 (Molecular Devices). Результаты приведены в следующих ниже таблицах.
- 69 034034
НТР анализ осветленных лизатов, предварительно обработанных пепсином.
B дополнительных анализах варианты PAL подвергали кислым условиям и пепсину для дополнительного тестирования вариантов в условиях, которые имитируют желудочную среду. Сначала в лунки 96-луночного круглодонного планшета (Costar № 3798, Corning) добавляют 50 мкл 0,01-100 мг/мл пепсина в 400 мМ цитрата натрия pH 1,5-4 и 50 мкл осветленного лизата. Планшет герметично закрывают и инкубируют в течение 1-12 ч при 37°C, 400 об/мин, амплитуда качания 1 до анализа. Для анализа в лунки полиакрилатного 96-луночного планшета (Costar № 3635, Corning) добавляют 100 мкл 200 мМ Tris/50 мМ фенилаланина pH 7,5 и 80 мкл 1М Tris pH 7,5 или 200 мМ фосфата натрия/50 мМ фенилаланина pH 7,0 и 20 мкл обработанного кислотой лизата. Реакционные смеси быстро перемешивают и определяют активность путем наблюдения оптической плотности при 290 нм в течение определенного периода времени (каждые 12-20 с в течение 5-20 мин) с использованием микропланшетного спектрофотометра для определения оптической плотности SpectraMax® Plus384 или SpectraMax® 190 (Molecular Devices).
Таблица 2-1
Относительная активность вариантов PAL в случае баз обработки (U-C), _______обработки п
Вариант
ротеазой (P-C) и обработки кислотой (A-C)
Различия аминокислот относительно SEQ ID
N0:4
A39V/A91V/Y158H/S180A/N290G/A394V/
S399N/N474Q/K522Y/T524S
A39V/A91V/Y158H/A256G/A394V/P404A/
N474Q
АЗ 9V/A9IV/S18 ОА/АЗ 9 4V/K52 2 Е/Т 52 4 S
A39V/A91V/Y158H/T243I/A256G/S399N/
P404A/L407V/N474C
Е308С
N400K
L364Q
A256G/N290G/P404A/L407V/N4740/K522F
Y158H/S18ОА/АЗ94V/T463N/N4740/T524Ξ
Различия аминокислот относительно SEC
ID N0:4
A39V/A91V/Y158H/S180A/K195E/A256G/
S399N/L407V/Y459F/T463N/K522N/T524S
A39V/A91V/Y158H/S180A/K195E/A256G/
N290G/S399N/Y459F/T463N
A39V/A91V/Y158H/S180A/K195E/T243I/
A394V
A39V/A91V/Y158H/K195E/T243I/A256G/
A394V/S399N/N474O/K522Y/T524S
АЗ9V/A91V/Y158H/S180А/К195Е/1245L/
S399N/L407V/Y459F/T463N/N474Q/T524S
НЗО /М
A39V/A91V/Y158H/S180A/T243L/A394V/
S399N/T463N/K522F
A91V/N474Q
S180A/K195E
A91V/Y158H/T243I/A256G/N290G/S399N/
L407V/Y459F/T463N/N474O/K522N/T524S
A39V/Y158H/S180A/S399N
A91V/N270K
H307G
- 70 034034
23 + + + + + N453G
24 + + + + + + H307Q
25 + + + + + L257W
26 + + + + + + A91V/Y158H/I245L/A256G/S399N/Y459F/ T463N/K522Y/T524S
27 + + + + + F443H
28 + + + + + + A91V/Y158H/S180A
29 + + + + + A91Y/Y158H/K195E/S399N
30 + + + + + + + A39V/A91V/A256G/N290G/A394V/S399N/ P404A/L407V/K522Y/T524S
31 + + + + + L257A
32 + + + + + + Y158H/K195E/T243L/A256G/A394V/S399N/ L407V/N474Q/ K522F/T524S
33 + + + + L349M
34 + + + + + + + I326F
35 + + + + + + + + + T460G/P528L
1. Относительную активность рассчитывали как активность варианта/активность SEQ ID NO: 4 (кодируемого SEQ ID NO: 3).
2. Вариант № 22 содержит полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 7 и полипептидную последовательность SEQ ID NO: 8, и вариант № 30 содержит полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5 и полипептидную последовательность SEQ ID NO: 6.
3. + = 0,1-1,0 относительной активности AvPAL дикого типа;
++ = > на 1,0-2,0 относительной активности AvPAL дикого типа;
+++ = > на 2,0 относительной активности AvPAL дикого типа.
Таблица 2-2 Относительная активность вариантов PAL в случае баз обработки (U-C),
Вариант № обработки протеазой (P-C) и обработки кислотой (A-C)
и-с Р-С А-С Различия аминокислот - относительно AvPAL дикого типа (SEQ ID N0:4)
36 ++ ++ + + + A39V/A91V/N290G/H307G/L407V/T524S
37 ++ +++ + + A39V/A91V/N290G/H307G/L407V
38 + ++ + A39V/A91V/A256G/N290G/H307G/S399N/ P404A/L407V/K522Y/T524S
39 ++ + + + A39V/A91V/A256G/N290G/S399N/P404A/ L407V/K522Y
40 + ++ + A39V/A256G/N290G/H307G/P404A/L407V
41 + ++ + A39V/A91V/A256G/N290G/H307G/P404A/ L407V/T524S
1. Относительную активность рассчитывали как активность варианта/активность варианта № 30.
2. Вариант № 36 содержит полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 9 и полипептидную последовательность SEQ ID NO: 10.
3. + = > на 1,0-3,0 относительной активности варианта 30;
++ = > на 3,0-10 относительной активности варианта 30;
+++ = > на 10-35 относительной активности варианта 30.
- 71 034034
Таблица 2-3
Относительная активность вариантов PAL в случае баз обработки (U-C), обработки протеазой (P-C) и обработки кислотой (A-C)
Вариант № и-с А-С Р-С Мутации (относительно варианта №36)
42 + + + T54K/G59R/S73K/R305M/C503Q/Q521K/C565P
43 + + + + + + T54K/G59R/R305M/C503Q/Q521K/C565N
44 + + + + + + + G59R/C503Q
45 + + + + + + + K32P/G59R/S73K/Q240W/C503Q/C565N
46 + + + K32P/G59R/S73K/Q240W/C565P
47 + + + + + + K32P/T54K/S73K/R305M/C503Q/Q521K/C565N
48 + + + + + + + + Y304H/D353A
49 + + + + + +++ S73K/D353A
50 + + + + A112C/S546R
51 + + + + + S73K/Q240W/Y304H
52 + + + + R134Q/Q240W/Y304H/D353A/E509L
1. Относительную активность рассчитывали как активность варианта/активность варианта № 36.
2. Вариант № 42 содержит полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 11 и полипептидную последовательность SEQ ID NO: 12. Варианта № 43 содержит полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 13 и полипептидную последовательность SEQ ID NO: 14.
3. + = > на 0,5-1,5 относительной активности варианта 36;
++ = > на 1,5-3 относительной активности варианта 36; +++ = > на 3-10 относительной активности варианта 36.
Таблица 2-4
Относительная активность вариантов PAL в случае баз обработки (U-C), обработки протеазой (P-C) и обработки кислотой (A-C)
Вариант № и-с Р-С А-С Мутации (относительно варианта №30)
53 + + + D303R
54 + + + + Е308А
55 + + + E308D
56 + + ++ + G2 5 6A
57 + ++ + Н307А
58 + +++ + H307D
59 + ++ + Н307Е
60 + ++ + H307F
61 + +++ + H307G
62 + + + H307I
63 + + + Н307 л
64 + + +++ + + Н307М
65 + ++ + H307N
66 + + ++ + + H307R
67 + + + H307Y
68 + +++ + R305 л
69 + +++ + R3 05M
70 + +++ + R305Q
71 + + ++ + V91A/G256A
72 + ++ + Y304H
73 + + + Y304W
74 + + + С503К
75 + + + C503Q
76 + + + С565А
77 + + + C565G
- 72 034034
78 + + + C565I
79 + + + С565К
80 + + + С565 л
81 + + + + C565N
82 + + + С565Р
83 + + + С565Т
1. Относительную активность рассчитывали как активность варианта/активность варианта № 30 (варианты 53-73) или SEQ ID NO: 4 (кодируемые SEQ ID NO: 3) (варианты 74-83).
2. + = > на 0,5-1,5 относительной активности варианта 30;
++ = > на 1,5-3 относительной активности варианта 30;
+++ = > на 3-10 относительной активности варианта 30.
Таблица 2-5
Относительная активность вариантов PAL в случае баз обработки (U-C), обработки протеазой (P-C) и обработки кислотой (A-C)
Мутации относительно варианта 42
R59G/R1340/0240R/K521O/P564L
R59G/P564M
R59G/O240W/E509L/K521О/Р564М
R59G/R134Q/Q240R/K521Q/P565N
Y304H/D353A/E509L
R59G/R134O/Y304H/D353N/K521O
R59G/R1340/0240R/K521S
R134Q/Y304H/D353A/K521S/P565N
R59G/R134Q/Q240R/Y304H/D353A/K521Q/P564M
Q240W/D353A/E509L/K521O
R1340/0240W/E509L/K521S
R134Q/Q240R/D353A/K521Q/P564G
R134Q/K521C
Ко21С
R134O/D353A/K521S/P564M
R59G/R1340/0240W/D353A
R59G/K521S
R59G/D353A
Q240R/D353A/K521S
R59G/D353A/E509L/P564L
R59G/D353A/K521C
R59G/R134Q/D353A/E509L/K521Q
Q240R/Y304H/E509L
R59G/Q240R/D353A/E509L
R59G/R134Q/E509L
R59G/Q240R/D353A/P564M/P565N
R134Q/D353A/K521S
R134Q/Q240W/Y304H/D353A/P564L
O240R/E509L/P565N
Вариант
- 73 034034
Относительная активность вариантов PAL в случае баз обработки (U-C), обработки протеазой (P-C) и обработки кислотой (A-C)
1043
Q240R/K521S/P564M/P565N
Вариант №
Р-С
Мутации относительно варианта 42
1044
R134Q/D353A/P564L
1045
R59G/R134Q
1046
R59G/Q240R
1047
Y304H/E509L
1048
R134Q/Q240R/D353A/E509L/K521Q/P564L
1049
Q240W/E509L/P564L/P565N
Таблица 2-5
1050
R59G/E509L/P564L
1051
R134Q/D353A/E509L/P564L
1052
R59G/D353A/P565N
1053
Q240R/E509L
1054
Q240R
1055
D353A/K521Q
1056
Q240W/D353A/E509L
1057
Fl8H/L47A/L214Q/E540D
1058
Fl8H/L47A/L214Q/E308К/F450Y/S546R
1059
F18H/L47A/F450Y/P528L/S546R
1060
L214Q/E308Q/T460G
1061
F18H/F450Y/E540D
1062
P528L/S546R
1063
F18H/L214Q/F450Y
1064
E308Q/F450Y/R467G
1065
F18H/E540D
1066
L47A/L214Q/S546R
1067
F18H/L214Q/E308Q
1068
L47A/L214Q/E308Q
1069
Fl8H/L47E/L214Q/R467G/E540D/S546R
1070
L47A/F450Y
1071
L47A/L214Q
1072
Fl8H/L47A/L214Q/S546R
1073
F18H/L214Q
1074
L214Q/F450Y/P528L
1075
Fl8H/L214Q/E308Q/F450Y/R467G
Таблица 2-5
Относительная активность вариантов PAL в случае баз обработки (U-C), обработки . протеазой (P-C) и обработки кислотой (A-C)
Вариант № и-с Р-С А-С Мутации относительно варианта 42
1076 + + + L47A/L214Q/E540D
1077 + + + L214Q/E540D
1078 + + + F18H/L47A/E308Q/S546R
1079 + + + F18H
1080 + + + F18H/L47A/F450Y/S546R
- 74 034034
1081 + + + F18H/L47A/L214Q/F450Y
1082 + + + F18H/L47A
1083 + + + L47A
1084 + + + F18H/L47A/L214Q
1085 + + + L214Q/S546R
1086 + + + Fl 8H/L214Q/R467G/S546R
1087 + + + F18H/L47A/L214Q/E308Q
1088 + + + Fl8H/L214Q/T460G
1089 + + + F18H/L47A/F450Y
1090 + + + F18H/L214Q/E540D
1. Относительную активность рассчитывали как активность варианта/активность варианта № 42.
2. - < на 0,5 относительной активности варианта № 42;
+ = > на 0,5-1,5 относительной активности варианта № 42;
++ = > на 1,5-3 относительной активности варианта № 42.
Пример 3. Анализы определения агрегации белка вариантов PAL.
Способность вариантов PAL образовывать агрегаты определяют с использованием набора для анализа агрегации белков ProteoStat® (Enzo) по инструкциям производителя. B кратком изложении 0-100 мкМ очищенной PAL смешивают с реагентом для детекции ProteoStat® (1:2000) и анализируют проточной цитометрией. Образцы оценивают на флуоресценцию в сравнении со стандартами агрегации ProteoStat®, как известно в данной области (см., например, Bershtein et al., Mol. Cell, 133-144 [2013]).
Пример 4. Лиофилизированные лизаты из культур во встряхиваемых колбах (SF).
Отобранные НТР культуры, выращиваемые, как описано выше, высевали на планшеты с LB-агаром с 1% глюкозой и 30 мкг/мл хлорамфениколом и выращивали в течение ночи при 37°C. Одну колонию из каждой культуры переносили в 50 мл LB с 1% глюкозой и 30 мкг/мл хлорамфеникола. Культуры выращивали в течение 18 ч при 30°C, 250 об/мин и субкультивировали при разведении приблизительно 1:10 в 250 мл бульона Terrific с 30 мкг/мл хлорамфеникола до конечной OD600 0,2. Культуры инкубировали в течение 135 мин при 30°C, 250 об/мин до OD600 0,6 и индуцировали 1 мМ IPTG. Индуцируемые культуры инкубировали в течение 20 ч при 30°C, 250 об/мин. После этого периода инкубации культуры центрифугировали 4000 об/мин х10 мин. Удаляли супернатант и ресуспендировали осадки в 30 мл 50 мМ фосфата натрия pH 7,5. Клетки осаждали (4000 об/мин х10 мин), ресуспендировали в 12 мл 50 мМ фосфата натрия pH 7,5 и лизировали с использованием системы One Shot Cell Disruption (Constant Systems) при 17000 фунтов/кв.дюйм. Лизаты осаждали (10000 об/мин х 30 мин) и супернатант замораживали и лиофилизировали с получением содержащего фермент порошка.
Выделение PAL из культур во встряхиваемой колбе.
Вариант PAL № 42 выращивали в культурах во встряхиваемой колбе до насыщения, как описано выше. Насыщенные культуры осаждали центрифугированием (4000 об/мин х 20 мин) и хранили клеточные осадки при -80°C до очистки. Клеточные осадки размораживали при комнатной температуре и ресуспендировали в 25 мМ Tris, pH 8 с 130 мМ NaCl при 5 мл буфера/г клеток. Образец взвесь лизировали с использованием микрофлюидизатора при заданной уровне давлении 110 фунтов/кв.дюйм. Получаемый лизат осветляли центрифугированием при 10000 об/мин в течение 1 ч с последующим фильтрованием через 0,2 мкм фильтр PES (Millipore).
После фильтрования получаемый лизат нагревали при 70-85°C в течение 1,5-2 ч в присутствии или отсутствие 10 мМ Phe. Лизат удаляли из условий нагрева и осветляли центрифугированием при 10000 об/мин при 4°C в течение 1 ч. Затем перед внесением в хроматографическую колонку супернатант, содержащий растворимую PAL, фильтровали через 0,2 мкм фильтр PES.
Термически обработанный фильтрованный лизат, содержащий 80-100 мг общего белка, разбавляли в два раза с использованием 25 мМ Tris, pH 8 с 1,2М сульфата аммония. Образец нагружали в колонку HiPrep 16/10 Phenyl FF (hi sub) (GE Healthcare), предварительно уравновешиваемую 25 мМ Tris, pH 8 с 0,6M сульфатом аммония. После нагрузки образца колонку промывали тремя объемами колонки того же буфера с последующим одним объемом колонки с линейным градиентом 0,6-0М сульфата аммония в 25 мМ Tris, pH 8. Прочно связанный PAL элюировали из колонки с использованием изократического элюирования 25 мМ Tris, pH 8 тремя объемами колонки. Объединяли фракции, содержащие активную и чистую PAL.
Выделяемую PAL из фенильной колонки подвергали замене буфера на 0,5М Tris, pH 8,5 и концентрировали. Концентрированную PAL анализировали посредством SDS-PAGE и выявляли, что она содержится в полосе ~60 кДа. Очищенные образцы PAL фильтровали с использованием 0,45 мкм фильтра PES и хранили при -80°C до момента использования.
Пример 5. Характеризация очищенной PAL и вариантов PAL.
- 75 034034
B этом примере описаны анализы, проводимые для характеризации PAL дикого типа и вариантов
PAL.
Устойчивость к кислому pH.
Лиофилизированные порошки, содержащие варианты PAL, растворяли при 2 г/л в 20 мМ фосфате натрия pH 7,0. Затем 50 мкл растворов фермента смешивали с 50 мкл 400 мМ лимонной кислота (pH 4,05,2) или 100 мМ фосфата натрия и инкубировали реакционные смеси при 37°C в течение 1 ч при 400 об/мин (амплитуда качания 1). Затем 20 мкл раствора быстро перемешивали с 80 мкл 1М фосфата натрия pH 7,0 и 100 мкл 200 мМ Tris/50 мМ фенилаланина pH 7,5. Ферментативную активность в кислых условиях определяли путем наблюдения оптической плотности при 290 нм в течение определенного периода времени (каждые 12-20 с в течение 5-20 мин) с использованием микропланшетного спектрофотометра для определения оптической плотности SpectraMax® Plus384 или SpectraMax® 190 (Molecular Devices). Результаты представлены на фиг. 2. Как указано на фиг. 2, варианты № 30 и 36 сохраняли больше активности после того, как их инкубировали при pH приблизительно от 4 до 4,8 по сравнению с PAL дикого типа.
Определение KM.
Для оценки, изменяли ли мутации в вариантах PAL аффинность вариантов PAL к фенилаланину, определяли константу Михаэлиса для фермента дикого типа и варианта 36. Сначала в лунки полиакрилатного 96-луночного планшета (Costar № 3625, Corning) добавляли 100 мкл 15 мкг/мл PAL в 100 мМ Tris pH 8,0 и 100 мкл 0-32 мМ фенилаланина в 100 мМ Tris, pH 8,0. Реакционную смесь быстро перемешивали и определяли начальные скорости путем наблюдения оптической плотности при 290 нм в течение определенного периода времени (каждые 12-20 с в течение 5-20 мин) с использованием микропланшетного спектрофотометра для определения оптической плотности SpectraMax® Plus384 или SpectraMax® 190 (Molecular Devices). KM для каждого тестируемого варианта PAL определяли аппроксимацией данных к графику Лайнуивер-Берка, как известно в данной области. Результаты представлены на фиг. 3. Как продемонстрировано, KM составляла 74 мкМ для фермента дикого типа и 60 мкМ для варианта 36.
Специфичность к аминокислотам.
Некоторые фенилаланин-аммиак-лиазы обладают активностью против тирозина и/или гистидина в дополнение к фенилаланину. Для оценки, изменяли ли мутации, присутствующие в вариантах PAL, специфичность вариантов PAL к фенилаланину, оценивали активности фермента дикого типа и варианта 36 в отношении этих трех аминокислот. Сначала в лунки полиакрилатного 96-луночного планшета (Costar № 3635, Corning) добавляли 100 мкл 5 г/л содержащего PAL лиофилизированного порошка в 10 мМ фосфате натрия pH 7,0 и 100 мкл 50 мМ фенилаланина или гистидина, или 2,5 мМ тирозина в 200 мМ фосфате натрия pH 7,5. Растворы быстро перемешивали и определяли начальные скорости путем наблюдения оптической плотности при 290 нм в течение определенного периода времени (каждые 12-20 с в течение 5-20 мин) с использованием микропланшетного спектрофотометра для определения оптической плотности SpectraMax® Plus384 или SpectraMax® 190 (Molecular Devices). Результаты представлены на фиг. 4. Как указано, не наблюдали детектируемой активности для фермента WT или варианта № 36 с гистидином или тирозином, что указывает на то, что эти ферменты являются специфичными к фенилаланину.
Устойчивость к протеазам свиньи и крупного рогатого скота.
Образцы вариантов PAL, получаемых, как описано в примере 4, растворяли при 2 г/л в 100 мМ фосфата натрия pH 7,0. Свиной трипсин и химотрипсин крупного рогатого скота (100 мг каждый) растворяли в 2 мл 100 мМ фосфата натрия pH 7,0 и проводили 2-кратные серийные разведения одиннадцать раз в 100 мМ фосфате натрия. Затем 80 мкл растворов вариантов фермента PAL смешивали с 20 мкл раствора трипсина и химотрипсина. Реакционные смеси инкубировали при 37°C в течение 1 ч при 400 об/мин (амплитуда качания 1). Затем 20 мкл реакционной смеси смешивали с 80 мкл воды и 100 мкл 100 мМ фосфата натрия, 50 мМ фенилаланина pH 7,0. Каждый раствор быстро перемешивали и определяли активность путем наблюдения оптической плотности при 290 нм в течение определенного периода времени (каждые 12-20 с в течение 5-20 мин) с использованием микропланшетного спектрофотометра для определения оптической плотности SpectraMax® Plus384 или SpectraMax® 190 (Molecular Devices). Результаты представлены на фиг. 2. Как указано на этой фигуре, все тестируемые варианты обладали улучшенной устойчивостью к протеазе по сравнению с PAL дикого типа, где вариант № 36 является наиболее устойчивым к протеолизу.
Устойчивость к протеазам человека.
Как описано выше, некоторые выделенные варианты PAL подвергали скринингу против свиного трипсина и химотрипсина крупного рогатого скота для оценки их устойчивости к протеолизу ферментами, содержащимися в желудочно-кишечном тракте. Некоторые из выделенных вариантов PAL также тестировали с использованием ферментов человека для подтверждения, что они являются устойчивыми к гомологам человека ферментов свиньи или крупного рогатого скота. B этих анализах лиофилизированные порошки PAL WT и варианта № 36 (2,4 г/л в 100 мМ фосфате натрия, pH 7,0) инкубировали с химотрипсином человека (Athens Research) 0-80 ВТЕЕ ед./мл или трипсином человека (ProSpec) (0-10000
- 76 034034
ВАЕЕ ед./мл) при 37°C в течение 2 ч. Затем в лунки полиакрилатного 96-луночного планшета (Costar № 3635, Corning) добавляли 100 мкл смеси с последующим добавлением 100 мкл 50 мМ фенилаланина, 200 мМ фосфата натрия pH 7,0. Раствор быстро перемешивали и определяли начальные скорости путем наблюдения оптической плотности при 290 нм в течение определенного периода времени (каждые 12-20 с в течение 5-20 мин) с использованием микропланшетного спектрофотометра для определения оптической плотности SpectraMax® Plus384 или SpectraMax® 190 (Molecular Devices). Результаты представлены на фиг. 5. Как продемонстрировано на фиг. 5, вариант № 36 являлся более стабильным, чем фермент PAL дикого типа.
Устойчивость к неочищенному экстракту поджелудочной железы.
Выделенные варианты PAL также тестировали для определения их устойчивости к ферментам поджелудочной железы. Лиофилизированные порошки PAL WT, лиофилизированные порошки варианта № 36, варианта № 42 и варианта № 43 (получаемые, как описано в примере 4; 12 г/л в 50 мМ фосфате калия pH 6,8) смешивали 1:1 с панкреатином свиньи (4x Sigma-Aldrich, St. Louis, МО) и инкубировали при 37°C при встряхивании (400 об/мин, амплитуда качания 1) до 23 ч. B указанные моменты времени в лунки полиакрилатного 96-луночного планшета (Costar № 3635, Corning) добавляли 10 мкл аликвоту реакционных смесей к 190 мкл 50 мМ фенилаланина, 190 мМ фосфата натрия pH 7,0. Реакционную смесь быстро перемешивали и определяли начальные скорости путем наблюдения оптической плотности при 290 нм в течение определенного периода времени (каждые 12-20 с в течение 5-20 мин) с использованием микропланшетного спектрофотометра для определения оптической плотности SpectraMax® Plus384 или SpectraMax® 190 (Molecular Devices). Результаты представлены на фиг. 6. Как продемонстрировано на фиг. 6, для всех из варианта № 36, варианта № 42 и варианта № 43 демонстрировали существенную стабильность в этих условиях анализа по сравнению с ферментом PAL дикого типа.
Влияние детергентов кишечника.
Выделенные варианты PAL также тестировали на их чувствительность к протеолизу в присутствии или отсутствие желчных кислот и жирных кислот кишечника для оценки, влияют ли эти кислоты на их стабильность. Лиофилизированные порошки, содержащие вариант № 36 (получаемый, как описано в примере 4) растворяли при 50 мкг/мл в 0-16 мМ таурохолате натрия, 100 мМ фосфате натрия, pH 7,0. Свиной трипсин и химотрипсин крупного рогатого скота (80 мг каждого) растворяли в 2 мл 100 мМ фосфата натрия pH 7,0 и проводили 2-кратные серийные разведения одиннадцать раз в 100 мМ фосфате натрия. Для анализа 50 мкл растворов PAL смешивали с 50 мкл раствора протеазы. Смеси инкубировали при 37°C в течение 1 ч при 400 об/мин (амплитуда качания 1). Затем 50 мкл смесей смешивали со 150 мкл 200 мМ фосфата натрия, 50 мМ фенилаланина pH 7,0. Каждую реакционную смесь быстро перемешивали и определяли активность путем наблюдения оптической плотности при 290 нм в течение определенного периода времени (каждые 12-20 с в течение 5-20 мин) с использованием микропланшетного спектрофотометра для определения оптической плотности SpectraMax® Plus384 или SpectraMax® 190 (Molecular Devices). Результаты представлены на фиг. 7. Как представлено на этой фигуре, дополнительный таурохолат натрия повышает чувствительность варианта № 36 к протеолизу.
Пример 6. Стабильность в кишечнике варианта PAL.
Для оценки стабильности и активности вариантов PAL, как они проходят через кишку животного, мышей подвергали принудительному кормлению очищенными вариантами фермента. Здоровых мышей С57В1/6 в возрасте 10-12 недель и массой 20-26 г содержали в метаболической клетке и содержали без корма в течение 15 ч. Воду предоставляли ad libitum. После отсутствия корма в течение ночи животных подвергали принудительному кормлению с использованием иглы для принудительного кормления 21 калибра смесью 0,3 мл 0,5М Tris-HCl pH 8,5 и 8 мг/мл в 0,5М Tris-HCl pH 8,5, PAL WT (получаемой, как описано в примере 4) или 8 мг/мл в 0,5М Tris-HCl pH 8,5 варианта № 42 (получаемого, как описано в примере 4). Через 0,5, 2 или 6 ч после принудительного кормления животных декапитировали, собирали плазму с использованием пробирок для сбора крови с зеленой крышкой (Ram Scientific) и собирали содержимое желудка, двенадцатиперстной кишки (~1-8 см от желудка), тощей кишки (~10-18 см от желудка), подвздошной кишки (~8 см выше слепой кишки) и толстой кишки (~5 см ниже слепой кишки). Регистрировали массу этого содержимого и хранили содержимое при -80°C до анализа.
Содержимое желудка или кишечника разбавляли 4x100 мМ фосфатом натрия pH 7,0, быстро перемешивали и центрифугировали при 14000 об/мин х2 мин. Супернатанты переносили в 350 мкл, 0,45 мкМ 96-луночный планшет для фильтрования AcroPrep™ Advanced (Pall Corp) и удаляли твердые частицы вакуумным фильтрованием. Осветленные фильтраты оценивали на ферментативную активность, как описано в предшествующих примерах и на наличие интактного белка PAL посредством SDS-PAGE. Результаты свидетельствуют о том, что ферментативная активность в двенадцатиперстной кишке и тощей кишке, по-видимому, являлась более высокой для выделенных вариантов PAL по сравнению с ферментом PAL дикого типа и отрицательным контролем.
Пример 7. Уровни фенилаланина в плазме.
Оценивали образцы плазмы, собираемые у мышей, описанные в примере 6, для определения количества фенилаланина, содержащегося в кровотоке тестируемых мышей. Плазму мышей (50 мкл) объеди
- 77 034034 няли с 250 мкл ацетонитрила, содержащего 0,6 мМ dl-фенилаланина (кольцо D5) (т.е. изотопно-меченный вариант фенилаланина, содержащий дейтерий вместо водорода, связанного с атомами углерода ароматического кольца; Cambridge Isotope Laboratories). Образцы перемешивали при комнатной температуре в течение 5 мин, центрифугировали при 3200xg в течение 10 мин при 4°C и переносили супернатанты в планшет для анализа образцов. Для анализа 10 мкл каждого образца впрыскивали в систему 3200 QTRAP® LC/MS/MS (AB Sciex) через колонку DISCOVERY® C18 (150x2,1 мМ, гранулы 5 мкм) (Supelco, в настоящее время Sigma-Aldrich), элюируя 0,1% муравьиной кислотой в воде (A) и ацетонитриле (B). Образцы элюировали в градиенте 5 мин (t=0, 97% A; 3 мин, 50% A; 3,5 мин, 5% A; 4 мин, 97% A; 5 мин, 95% А), наблюдая за переходом от 166 до 120 для эндогенного фенилаланина и от 171 до 125 для изотопно-меченного стандарта. Результаты свидетельствовали о том, что уровни фенилаланина в плазме являлись ниже в момент времени 30 мин в образцах от мышей, которым давали выделенный вариант PAL (т.е. вариант № 42) по сравнению с ферментом PAL дикого типа и отрицательного контроля.
Пример 8. Терапевтическая функция варианта PAL.
Для оценки, снижают ли варианты PAL уровни Phe в сыворотке in vivo, использовали модель PKU на мышах. B этих экспериментах пораженных животных подвергали принудительному кормлению белками PAL. Сначала устанавливали соответствующий исходный уровень Phe у мышей путем удаления Phe из их рациона в течение трех суток с последующей инъекцией известного количества содержащего Phe раствора. Гомозиготных мышей РАН enu-2 с фенотипом С57В1/6 в возрасте от трех до шести месяцев (см. McDonald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:1965-1967 [1990]) переводили на не содержащий фенилаланин рацион (TD. 97152, Harlan) с 0,03 г/л Phe, предоставляемого в их питьевой воде в течение 72 ч. Для начала обработки в момент времени = 0 ч мышам инъецировали 0,15 мг/г массы тела Phe (из 10 г/л раствора Phe в воде). Через 55 мин после инъекции собирали приблизительно 20 мкл крови посредством венепункции хвоста и наносили мазки на фильтровальную бумагу. Затем в моменты времени через 1, 3 и 5 ч после инъекции мышей подвергали принудительному кормлению 0,3 мл 50-100 г/л AvPAL WT, AvPAL WT плюс апротинин, BSA или варианта № 42. Через 6, 7 и 9 ч после инъекции наносили дополнительные мазки крови на фильтровальную бумагу. Мазки крови сушили и хранили при -20°C до анализа LC-MS/MS на уровни Phe и Tyr известными в данной области способами (см., Chase et al., Clin. Chem., 39:66-71 [1993]).
Результаты представлены на фиг. 8. Как указано на этой фигуре, принудительное кормление неактивным белком (BSA) приводило к повышению уровней Phe в сыворотке. B противоположность этому обработка протеолитически чувствительным AvPAL WT приводили к постоянным уровням Phe, при этом тот же белок, объединенный с ингибитором протеазы апротинин, приводил к значительному снижению уровней Phe. Результаты также демонстрируют, что введение сконструированного варианта PAL № 42 приводило к сниженным уровням Phe в сыворотке при отсутствии ингибиторов протеаз.
Пример 9. Деиммунизация PAL.
B этом примере описаны эксперименты, проводимые для идентификации разнообразия, которое приводит к удалению Т-клеточных эпитопов из PAL.
Идентификация разнообразия деиммунизации.
Для идентификации аминокислот, которые в случае мутации могут приводит к удалению Тклеточных эпитопов, использовали компьютерные способы для идентификации последовательностей PAL, для которых теоретически рассчитано, что они вызывают Т-клеточный ответ. Параллельно также проводили экспериментальные исследования допустимых, невредных мутаций, в частности для аминокислот, которые поддерживают активность белка в анализе без подвергания каким-либо воздействиям (например, в анализах, описанных в примере 2). Затем анализировали активные варианты на эффект мутаций на теоретически рассчитанную иммуногенность.
Компьютерная идентификация вероятных Т-клеточных эпитопов в варианте AvPAL.
Вероятные Т-клеточные эпитопы в варианте AvPAL № 36 идентифицировали с использованием средств базы данных иммунологических эпитопов (IEDB; веб-сайт Immune Epitope Database and Analysis Resource), как известно в данной области, и запатентованных средств статистического анализа (см., например, iedb.org и Vita et al., Nucl. Acids Res., 38 (Database issue) D854-62 [2010]. Epub 2009 Nov 11]). Вариант AvPAL детально анализировали во всех возможных 15-мерных рамках анализа, где каждая рамка перекрывает последнюю на 14 аминокислот. 15-мерные рамки анализа оценивали на иммуногенный потенциал посредством оценки 9-мерных областей ядра для теоретически рассчитанного связывания с восемью общими аллелями HLA-DR II класа (DRB1*0101, DRB1*0301, DRB1*0401, DRB1*0701, DRB1*0801, DRB1*1101, DRB1*1301 и DRB1*1501), которые в совокупности приходятся почти на 95% популяции людей (см., например, Southwood et al., J. Immunol., 160:3363-3373 [1998]), способами, рекомендованными на веб-сайте IEDB. Идентифицировали потенциальные кластеры Т-клеточных эпитопов, содержащиеся в варианте AvPAL (т.е. подобласти, содержащиеся в варианте AvPAL, который обладает чрезмерно высоким потенциалом иммуногенности) с использованием средств статистического анализа, как известно в данной области. Проводили скрининг идентифицированных кластеров Т-клеточных эпитопов с использованием базы данных IEDB известных эпитопов и базы данных по структуре белка Gen- 78 034034
Bank. Этими скринингами идентифицировали 10 вероятных Т-клеточных эпитопов в варианте AvPAL №
36. Эти эпитопы ниже обозначают как TCE-I, II, III, VI, V, VI, VII, VIII, IX и X.
Конструирование деиммунизированных библиотек.
Сначала разрабатывали комбинаторную библиотеку, содержащую все нейтральные и полезные мутации, идентифицированные во время циклов направленной эволюции, используемой для создания вариантов AvPAL, в 10 возможных областях Т-клеточных эпитопов, идентифицированных, как описано выше. Анализировали эффекты этих мутаций на теоретически рассчитанное связывание с восемью общими аллелямии HLA-DR II класса. Было теоретически рассчитано, что многие мутации удаляют или снижают TCE-I, II, VI, VII. Эти мутации объединяли в комбинаторной библиотеке. Затем конструировали библиотеки с использованием насыщающего мутагенеза для мутации каждой отдельной аминокислоты в оставшихся шести Т-клеточных эпитопах (т.е. TCE-III, IV, V, VIII, IX и X). B заключение получали комбинаторную библиотеку, содержащую благоприятное разнообразие, идентифицированное на основании многих циклов эволюции, которая направленно воздействуют на TCE-I, III, IV, VIII и X наряду с С503 и С565, двумя аминокислотами, описанными как влияющие на состояние агрегации вариантов PAL. Лучшие совпадения из такой библиотеки подвергали дополнительному насыщающему мутагенезу, направленному на TCE-III и VIII, и дополнительному направленному мутагенезу в нескольких положениях.
Конструкция и скрининг деиммунизированных библиотек.
Конструировали комбинаторные библиотеки и библиотеки насыщающего мутагенеза, конструируемые, как описано выше, известными в данной области способами и тестировали на активность в анализе без подвергания каким-либо воздействиям, как описано в примере 2. Идентифицировали и секвенировали активные варианты. Их виды активности и мутации в отношении варианта AvPAL № 36 и многих вариантов AvPAL приведены в таблю с 9-1 по 9-7 ниже.
Идентификация разнообразия деиммунизации.
Активные варианты анализировали на их уровни иммуногенности путем оценки их связывания с восемью общими аллелями HLA-DR II класса, описанными выше. Общая оценка иммуногенности и количество иммуногенных совпадений приведены в табл. с 9-1 по 9-7. Общая оценка иммуногенности отражает суммарную теоретически рассчитанную иммуногенность варианта (т.е. более высокая оценка указывает на более высокий уровень теоретически рассчитанной иммуногенности). Количество иммуногенный совпадений указывает на число 15-серных рамок анализа с чрезмерно высоким потенциалом иммуногенности (т.е. большее количество совпадений указывает на более высокий потенциал иммуногенности). Считали, что мутации с более низкой общей теоретически рассчитанной оценкой иммуногенности и/или количеством иммуногенных совпадений менее чем в эталонном варианте являлись деиммунизирующими мутациями.
Деиммунизирующие мутации, которые идентифицировали как самые лучшие, рекомбинировали с получением ряда вариантов, которые являлись активными, и для которых было теоретически рассчитано, что они являются в значительной степени менее иммуногенными, чем начальный эталонный вариант AvPAL. B следующих ниже таблицах приведены результаты FIOP из анализа без подвергания какимлибо воздействиям; для общей оценки иммуногенности (TIS) и количества иммуногенных совпадений (IHC) результаты указаны для полного белка PAL (табл. 9-1, 9-8 и 9-9) или для указанного эпитопа (табл. с 9-2 по 9-7).
Таблица 9-1 FIOP, общая иммуногенность (TIS) и количество иммуногенных совпадений (IHC) для вариантов, направленных на TCE-I, II, VI и VII (- = FIOP<0,7; + = FIOP _ 0,7<FIOP<1,4; ++ = FIOP>1,4)
Вариант № Активные мутации (по сравнению с вариантом №36) FIOP TIS IHC
Вариант 36 + 680 52
100 I27E/L214E + 634 51
101 VI05C/R134Q/Q205Т/Р266H/L278D + 645 48
102 I27E/L214E/C503Q/A547D + 629 51
103 V105C/Q205T/P210C/L214E/C503Q/A547D + 619 49
104 127Е/А112C/R134Q/Q205Т/1285E/C503Q + 622 45
105 V39A/P266H + 665 45
106 I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C + 607 41
107 127E/V39A/V105С/Р210C/L214Е/Р266H/L278D + 590 42
108 V39A/V105C/L214Е/Р266Н/А547D/C565N + 613 42
109 I27E/V39A/A112C/L214E + 616 42
- 79 034034
Вариант № Активные мутации (по сравнению с вариантом №36) FIOP TIS IHC
110 127E/V39A/R134Q/A153G/L214Е/Р266Н/12 85E/C503Q/A551D/C565N + 572 37
111 127E/R134Q/L278D/1285E/A551D/C565N + 626 48
112 127E/V39A/V105С/А112C/Q205Т/Р266Н/12 85E/C503Q/A551D + 594 39
113 127E/V105C/L214Е/Р266H/C503Q + 614 49
114 I27E/V39A/R134Q + 637 44
115 C503Q/A547D + 675 52
116 V105C/C503Q + 660 50
117 127E/R134Q/Q205Т/Р266H/L278D/A547D + 641 50
118 127E/V105C/R134Q/P210С/Р266H/L278D/I 285E/C503Q/A551D/C565N + 596 45
119 127E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/L278D/12 85E/C503Q/A547D/A551D/C565N + 585 38
120 V105C/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D + 619 48
121 127E/V39A/V105C/L214E/L278D/L309Р/С5 03Q/A547D/A551D + 587 42
122 Vl05C/L278D/C503Q/A551D + 655 50
123 127E/V105C/R134Q/P210C/L214Е/Р266H/L 278D/A551D/C565N + + 591 48
124 I27E/R134Q/L214E/C503Q/A547D + + 620 50
125 R134Q/P210C/L214E/L278D/C503Q/A547D/ C565N + 630 50
126 I27E/V39A/V105C/Q205T/P210C/L214E/L2 78D/A547D + 585 42
127 V39A/Q205T/L278D/A547D/A551D + 654 44
128 Vl05C/R134Q/L214Е/Р266Н/1285E/C503Q/ A551D/C565N + 598 45
129 I27E/V105C/L214E/A547D/A551D/C565N + 609 49
130 127E/V39A/V105C/Q205T/L278D/C503Q/A5 47D + 615 42
131 127E/V39A/V105C/R134Q/L214Е/1285Е/С5 03Q/A547D/A551D + 564 38
132 C503Q/A547D/A551D/C565N + 675 52
133 V105C/R134Q/L214E/C503Q/A547D + 619 48
134 I27E/V105C/Q205T/C503Q/A547D/A551D/C 565N + 630 49
135 I27E/V39A + 646 45
136 127E/V39A/V105C/L214Е/Р266H/C503Q/A5 47D/C565N + 594 42
137 A112C/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D/ C565N + 636 48
138 127Е/А112C/R134Q/A153R/L214Е/Р266Н/С 503Q + 619 47
139 C503Q/A551D + 675 52
140 127E/V39A/V105C/R134Q/L278D/C503Q/C5 65N + 617 42
141 R134Q/Q205T/L214E/I285E/C503Q/A551D/ C565N + 613 47
142 Vl05C/L214Е/1285Е/А547D/C565N + 607 46
143 I27E/V39A/R43L/L214E/A547D + 625 45
144 127E/V39А/Р210C/L214Е/1285E/C503Q/A5 51D + 584 41
145 I27E/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D + 620 50
146 V39A/V105С/А153R/P266Н/А547D/A551D + 637 42
147 V39A/C503Q + 665 45
- 80 034034
Вариант № Активные мутации (по сравнению с вариантом №36) FIOP TIS IHC
148 127E/V39A/V105С/Р21 ОС/1285E/C503Q/ A547D/A551D/C565N + 590 39
149 RI34Q/L214E/L278D/C503Q/A551D + 639 50
150 I27E/V39A/R134Q/C503Q/A547D + 632 44
151 A153R + 677 51
152 I27E/V39A/V105C/A112C/R134Q/L214E/ L278D/C503Q/A547D/C565N + 585 41
153 C503Q/A547D/C565N + 675 52
154 127E/V39A/L214Е/Р266H/L278D/C503Q/ A547D/A551D/C565N + 614 44
155 L278D/A547D + 675 52
156 V39A/G45S/L278D/C503Q/A551D + 667 45
157 V39A/A153R/C503Q/A547D + 657 44
158 R134Q/P210C/L214E/C503Q/A547D/A551D + 630 50
159 I27E/A547D/C565N + 656 52
160 V39A/R134Q/P210C/L214E/A547D/C565N + 615 43
161 127E/V39А/Р210С/Р266Н/1285E/C503Q/ A547D + 610 41
162 I27E/V39A/R134Q/L278D/C503Q/A547D + 632 44
163 I27E/V105C/R134Q/Q205T/P210C/C503Q + 622 48
164 127E/V105C/R134Q/L214E/L278D/C503Q/ A547D + 600 48
165 I27E/V105C/C503Q/A547D/C565N + 636 50
166 I27E/L214E/C503Q + 634 51
167 VI05C/L214E/L278D/C503Q/A547D/A551D + 628 49
168 127E/V105C/Q205T/L214Е/Р266Н + 609 49
169 V39A/A112C/R134Q/L214E/C503Q/A547D/ A551D + 621 41
170 I27E/R134Q/L214E/C503Q/C565N + 625 50
171 I27E/V39A/R134Q/A153R/Q205T/L214E/ P266H/C503Q + 602 42
172 I27E/V39A/L214E/C503Q/A551D + 614 44
173 V39A/V105C/Q205T/A551D + 634 42
174 I27E/V39A/Q205T/C503Q/A547D/C565N + 635 44
175 A547D + 675 52
176 I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E/ C503Q/A551D/C565N + 576 41
177 V39A/P275R/L278D/C503Q/A551D + 667 45
178 127E/V39A/V105C/Q205Т/Р210C/L278D/ A547D + 611 42
179 VI05С/А153R/Q205T/L214Е/Р266H/C503Q/ A547D + 620 48
180 V105C/A112C/R134Q/Q205T/L214E/Y492H/ C503Q/A547D + 614 48
181 127Е/Р210C/L278D/C503Q + 651 51
182 I27E/P210C/C503Q + 651 51
183 I27E/V39A/R134Q/A153R/L214E/C503Q/ A547D + 602 42
184 127Е/Р266Н/А547D/A551D + 656 52
185 VI05C/L214Е/1285E/C503Q/A547D/A551D/ C565N + 607 46
186 127E/V105С/Р266Н/1285E/C503Q/A547D/ C565N + 615 47
187 Q205T/L278D/1285Е/А547D/A551D + 648 48
- 81 034034
Вариант № Активные мутации (по сравнению с вариантом №36) FIOP TIS IHC
188 V39A/V105C/Q205T/C503Q + 639 42
189 127E/V39A/Q205Т/Р266Н/1285Е/А547D/ A551D/C565N + 614 41
190 V105C/L214E/I285E + 612 46
191 V105C/R134Q/C503Q/A547D/C565N + 646 49
192 I27E/V39A/V105C/R134Q/C503Q/A551D + 612 42
193 127E/R134Q/Q205Т/1285E/C503Q/A551D + 620 47
194 127E/V39А/А112C/Q205T/L278D/1285Е + 616 39
195 127E/V39А/А112C/Q205T/L214Е/Р266Н/ C503Q/A551D/C565N + 606 42
196 I27E/V39A/L278D/A547D + 641 45
197 127E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/L214Е/ A551D/C565N + 580 41
198 I27E/G45D/Q205T/P266H/C565N + 656 51
199 I27E/V39A/A112C/L214E/L278D/C503Q/ A547D/A551D + 611 42
200 I27E/Q205T + 655 51
201 127Е/А112C/R134Q/Q205T/L278D/C503Q + 643 48
202 C565N + 680 52
203 127E/V39A/V105C/R134Q/Q205Т/Р21 ОС/ L278D/C503Q/A547D + 602 41
204 VI05C/L214Е/Р266H/L278D/A547D + 628 49
205 V105C/R134Q/A153R/Q205T/L214E/C503Q + 616 47
206 V105C/R134Q/C503Q + 651 49
207 I27E/V39A/Q205T/L278D/C503Q/C565N + 640 44
208 127E/V39A/V105C/S131N/R134Q/Q205Т/ L214E/C503Q/A547D/C565N + 579 41
209 Q205T/L214E/I285E/C503Q/A551D + 622 48
210 127E/L214E/L278D/C503Q + 634 51
211 VI05C/R134Q/L214E/L278D/C565N + 624 48
212 I27E/V39A/L214E + 619 44
213 L214E/C503Q/A547D + 648 51
214 L214E/P266H + 653 51
215 I27E/V39A/C503Q + 646 45
216 P210C/L214E + 644 51
217 V105C + 660 50
218 Al12C/R134Q/A153R/L214E/L278D/1285Е/ C503Q/A547D/A551D/C565N + 612 44
219 127E/Q205T/L278D/A551D + 650 51
220 I27E/L214E/A551D + 629 51
221 R134Q/L214Е/1285Е/С503Q + + 623 47
222 I27E/V39A/V105C/C503Q/A551D + 621 43
223 Al 12C/L278D/C503Q/A547D + 672 50
224 127E/R134Q/A153R/1285E/C503Q/A547D + + 623 47
225 127E/V39A/V105C/A153R/1285Е + 602 39
226 I27E/V39A/R134Q/L278D/I285E/C503Q/ A547D/A551D + + 611 41
Вариант № Активные мутации (по сравнению с вариантом №36) FIOP TIS IHC
227 R134Q/C503Q + 671 51
228 V39A/C503Q/A551D/C565N + 660 45
229 I27E/V39A/P266H + 646 45
230 V105C/I285E + 639 47
231 I27E/V39A/V105C/A153R/L214E + 596 41
232 A112C/L214E/L278D + 650 49
233 I27E/R134Q/P210C + 642 50
234 I27E/A153R/L214E/L278D/A551D + 626 50
- 82 034034
235 VI05С/1285Е/А547D + 634 47
236 127E/Q205T/L214E/L278D/1285Е/ C503Q/C565N + 608 48
237 I27E/V39A/P210C/T212S + 636 44
238 I27E/P266H/L278D/C503Q + 661 52
239 127E/V105C/Q205T/L214Е/Р266H/A551D/ C565N + 604 49
240 I27E/A112C/P210C/L214E/C503Q/A547D + 617 49
241 I27E/V39A/R134Q/P210C/C503Q/A551D + 622 43
242 127E/V39A/V105С/1285Е/А547D + 600 40
243 127E/V39A/Q205T/L278D/C503Q/A551D/ C565N + 635 44
244 127E/R134Q/1285E/C503Q + 631 48
245 127E/V39А/Р210C/L214E/L278D/C503Q/ A551D + 605 44
246 V39А/А112C/R134Q/Q205T/L214E/L278D + 621 41
247 127E/V39A/L214E/L278D/C503Q + 619 44
248 I27E/V105C/L214E + 614 49
249 127E/V39A/V105C/R134Q/P266H/C503Q/ A547D/A551D + 612 42
250 127E/V39А/Р210С/Р266H/C503Q/A551D + 631 44
251 I27E/V39A/V105C/A153R/C503Q/A547D/ C565N + 618 42
252 V39A/V105C/R134Q/L214E/C503Q/A547D/ A551D + 604 41
253 I27E/L214E/L278D + 634 51
254 I27E/V39A/V105C/R134Q/A153R/P210C/ L278D/1285E/C503Q/A547D/A551D + 578 37
255 V105C/R134Q/Q205T/L214E/A547D + 614 48
256 I27E/V105C/R134Q/A153R/C503Q + 629 48
257 V105C/R134Q/C503Q/A547D + 646 49
258 127E/V39A/L278D/1285E/C503Q/A547D + 620 42
259 I27E/V39A/R134Q/A153R/L278D + 634 43
260 I27E/V39A/A112C/R134Q/L214E/C503Q/ A547D + 602 41
261 I27E/V39A/R134Q/A153R/L278D/A547D/ A551D + 629 43
262 I27E/V39A/L278D/C503Q/C565N + 646 45
263 Q205T/L214E/C503Q/A547D/C565N + 643 51
264 R134Q/L214E + 644 50
265 I27E/V39A/P266H/L278D + 646 45
266 R134Q/Q205T/C503Q + 665 50
Вариант № Активные мутации (по сравнению с вариантом №36) FIOP TIS IHC
267 V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E/A551D + 595 41
268 VI05С/А153R/Q205Т/Р266Н/1285Е/А547D/ C565N + 625 45
269 I27E/V39A/R134Q/L214E/P266H/A551D + 605 43
270 L214Е/Р266H/C503Q/A547D/A551D/C565N + 648 51
271 V39A/V105C/P210C/A547D + 630 42
272 I27E/V105C + 641 50
273 127E/V39A/R134Q/Q205T/L214Е/Р266Н/ I285E/C503Q/A551D/C565N + 579 40
274 I27E/V39A/R134Q/Q205T/P266H/C503Q/ A551D/C565N + 626 43
275 I27E/V105C/R134Q/P210C/L214E/C503Q/ A551D/C565N + 591 48
276 I27E/L214E/C503Q/A547D/C565N + 629 51
277 I27E/V39A/R134Q/A153R/P210C/L214E/ L278D/I285E/A547D/C565N + 572 39
278 127E/V39А/А112С/1285Е + 622 40
- 83 034034
279 127Е/А112C/R134Q/L278D/1285E/C503Q/ A551D/C565N + 623 46
280 127E/L214Е/Р266H/L278D/1285E/A551D + 608 48
281 I27E/V39A/V105C/A153R/A551D/C565N + 618 42
282 V39A/V105C/R134Q/A153R/Q205T/A551D + 622 40
283 I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/L214E + 585 41
284 I27E/V105C/Q205T + 635 49
285 127E/Q205Т/Р266H/L278D/1285E/A551D/ C565N + 629 48
286 I27E/R134Q/L214E/C503Q + 625 50
287 V105C/Q205T/L214E/C503Q/A547D/A551D/ C565N + 623 49
288 V39A/V105C/L214Е/1285E/C503Q/A551D/ C565N + 592 39
289 127E/V39A/V105C/L278D/C503Q/A547D/ C565N + 621 43
290 127E/V39A/V105C/R134Q/1285E/A547D/ A551D + 591 39
291 127E/V39A/A112C/R134Q/L214E/P266Н/ A551D + 602 41
292 I27E/L278D/C503Q/A551D + 656 52
293 I27E/V39A/R134Q/A153R/A547D + 629 43
294 P266H/C565N + 680 52
295 I27E/V105C/I285E/C503Q/A547D/A551D/ C565N + 615 47
296 I27E/V39A/L278D + 646 45
297 P210C/L214E/P266H + 644 51
298 I27E/V39A/R134Q/P210C/L214E/C503Q + 601 43
299 I27E/V39A/R43L/V105C/A153R/L214E/ P266H/L278D/C503Q + 607 42
300 127E/V105C/Q205T/L214E/L278D/1285Е/ C503Q/A547D/A551D/C565N + 583 46
301 I27E/V39A/V105C/C503Q/A547D/A551D/ C565N + 621 43
302 127E/V105C/L214Е/1285E/A551D/C565N + 588 46
303 I27E/P210C/A551D + 646 51
304 127E/V39A/V105C/Q205T/L214E/L278D/ C503Q/A547D + 589 42
- 84 034034
Вариант № Активные мутации (по сравнению с вариантом №36) FIOP TIS IHC
305 127E/V105C/L278D/A547D + 636 50
306 C503Q + 680 52
307 127E/V39A/V105C/R134Q/L214E/L278D/ A547D/A551D + 585 41
308 I27E/R134Q + 652 51
309 V39A/R134Q + 656 44
310 I27E/V39A/V105C/A112C/Q205T/P210C/ P266H/C503Q/A547D + 611 42
311 V39А/А112С/А153R/Q205T/L278D/ C503Q/A547D + 648 41
312 127E/V105С/Р266Н + 641 50
313 127E/V39A/V105C/R134Q/P210C/L214Е + 581 41
314 127E/V39A/V105C/R134Q/L278D/A551D + 612 42
315 I27E/V39A/V105C/A112C/R134Q/A153R/ Q205T/L214Е/Р266H/L278D/C503Q/A551D + 577 40
316 127E/V105C/R134Q/A153R/1285Е/А547D + 603 45
317 I27E/V39A/A112C/A547D + 638 43
318 I27E/V39A/R134Q/A153R/L214E/ P266H/L278D/C503Q/A547D/C565N + 602 42
319 127E/V105C/Q205Т/Р266H/C503Q + 635 49
320 127E/V39A/V105C/R134Q/L278D/ I285E/C503Q + 596 39
321 C503Q/A551D/C565N + 675 52
322 I27E/V39A/A112C/R134Q/Q205T/ P210C/L214E/A551D/C565N + 593 41
323 R134Q/C503Q/A547D/A551D + 666 51
324 127Е/А112C/Q205Т/Р266H/L278D/ I285E/C503Q + 631 46
325 P266H/L278D/C503Q + 680 52
326 I27E/V39A/Q205T/P266H/A551D + 635 44
327 Q205T/L214Е/1285E/C503Q/C565N + 627 48
328 I27E/V105C/R134Q/Q205T/L214E/ P266H/L278D/C503Q/C565N + 600 48
329 I27E/V39A/V105C/R134Q/P266H/ C503Q + 617 42
330 I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C/ L214E/I285E/A547D + 555 38
331 I27E/V39A/V105C/Q205T/P210C/ L278D/C503Q + 616 42
332 I27E/V39A/R134Q/A547D/C565N + 632 44
333 V105C/A547D/A551D + 655 50
334 I27E/V105C/R134Q/A153R/P210C/ L214E/C503Q/A547D + 588 47
335 127Е/Р210C/L214Е/С503Q/A547D + + 620 51
336 I27E/V105C/C503Q/A547D/A551D/ C565N + 636 50
337 127E/V105C/R134Q/L214E/L278D/ C503Q/A547D/A551D/C565N + 600 48
338 I27E/V39A/V105C/A153R/Q205T/ L278D/C503Q/A547D/A551D + 612 41
339 I27E/V39A/V105C/A112C/L214E/ I285E/C503Q/A547D + 573 39
340 L214E/A547D + 648 51
341 VI05C/Q205T/L214E/L278D + 628 49
342 I27E/V39A/Q205T/L214E/C503Q/ C565N + 614 44
343 I27E/P210C + 651 51
- 85 034034
Вариант № Активные мутации (по сравнению с вариантом №36) FIOP TIS IHC
344 V105C/Q205T/C503Q/A551D + 649 49
345 I27E/V39A/A112C/R134Q/P266H/I285E + 613 39
346 V39A/P210C/L214E/L278D/I285E/C503Q/ A551D + 603 41
347 I27E/Q205T/L214E/C503Q/A547D/C565N + 624 51
348 127E/V39A/L214E/L278D/C503Q/A547D/ C565N + 614 44
349 I27E/P210C/C503Q/C565N + 651 51
350 127E/L278D/C503Q/A551D/C565N + 656 52
351 R134Q/L214E/L278D/C503Q + 644 50
352 127Е/А153R/L214E/L278D/1285E/A551D/ C565N + 605 47
353 I27E/V105C/L214E/A551D/C565N + 609 49
354 V39A/R134Q/Q205T/L214E/C503Q/C565N + 624 43
Таблица 9-2
FIOP, общая иммуногенность (TIS) и количество иммуногенных совпадений (IHC) для вариантов, направленных на TCE-III (- = FIOP<0,7; + = FIOP 0,7<FIOP<1,4; ++ = FIOP>1,4)
Вариант № Активные мутации (по сравнению с вариантом №36) FIOPC TIS IHC
Вариант 36 + 71 7
400 401 402 403 404 405 V80I/R134C/P564Q V121C R134L A124G R134W L126M + + + + + + 60 44 78 58 63 56 5 6 7 7 5 5
406 N130C/M370I + 62 6
407 N130Q + 65 7
408 A123G + 67 8
409 A129G + 64 9
410 G135A/A394E + 76 7
411 A129L + 82 9
412 M133R + 52 3
413 G135S + 78 9
414 L126T + 62 8
415 L127A + 46 6
416 R134I + 82 7
417 R134N/G307C + 60 5
418 L126I + + 80 12
419 G135C + 67 6
420 M125L + 72 8
- 86 034034
Таблица 9-3
FIOP, общая иммуногенность (TIS) и количество иммуногенных совпадений (IHC) для вариантов, направленных на TCE-IV (- = FIOP<0,7; = FIOP 0,7<FIOP<1,4; ++ = FIOP> 1,4)
Вариант № Активные мутации (по сравнению с вариантом №36) FIOPC TIS IHC
Вариант 36 + 74 11
500 Р157Н + 69 8
501 R14 0M + 72 11
502 P157F + 80 12
503 А153С + 56 7
504 E142V + 84 14
505 K145G/P157T + 62 8
506 R140D + 63 8
507 E142D/G371D + 79 13
508 М147А + 48 1
509 T156K/G483C + 83 12
510 P157D + 64 8
511 A62S/M147V + 62 8
512 R146L + 81 14
513 Y158E + 72 11
514 G154Y/L174M/Q321K/S4561/G48ЗС + 75 10
515 S821/G135С/Р157F/W279L + 77 11
516 I144N + 61 7
517 T110I/I139R + 65 8
518 L47M/I144L + 67 8
519 L47M/M147G/A383E + 48 4
520 G20S/I144L + 67 8
521 R146W/D191Y + 62 5
522 P157Y + 73 9
523 L47M/P157C + 68 8
524 Е142Р + 68 9
525 F150K + 59 6
526 L141T + 55 7
527 V159H + 67 8
528 I144L + 67 8
529 A119E/T156H/A289D + 78 11
530 Q58K/P157D/G369C + 64 8
531 L47M/R146E + 58 6
532 Е142Н + 79 13
533 R140N/A199E + 67 8
534 I144V + 72 13
535 I149L + 69 9
536 R146H + 77 12
537 I139M + 74 11
538 A153S/H250N + 73 10
539 L319M + 74 11
540 R140E/A334S/A551D + 63 8
541 F150L + 79 12
542 L143M + 72 11
543 A153G + 62 8
- 87 034034
Вариант № Активные мутации (по сравнению с вариантом №36) FIOPC TIS IHC
544 I139V + 74 11
545 Q58H/L143V + 72 11
546 G154R + 81 13
547 K145Q + 72 11
548 L143F + 74 11
549 R140G + 67 8
550 V159C + 72 11
551 Q389K + 74 11
552 L141P + 58 5
553 M247I + 74 11
554 F150M + 77 12
555 L141Q + 59 7
556 L151M + 68 9
557 V159 л + 74 11
558 R94C/I149E + 53 6
559 V159M + 74 11
560 L118M/L141H + 58 7
561 K145N + 71 11
562 I149R + 72 11
563 K145R + 84 15
564 L141K + 59 7
565 R43S + 74 11
Таблица 9-4
FIOP, общая иммуногенность (TIS) и количество иммуногенных совпадений (IHC) для вариантов, направленных на TCE-V (- = FIOP<0,7; + = FIOP 0,7<FIOP<1 4; ++ = FIOP>1,4)
Вариант № Активные мутации (по сравнению с вариантом №36) FIOPC TIS IHC
Вариант 36 + 36 2
600 Y176R + 51 4
601 S180C + 27 0
602 S180T + 27 0
603 V172L + 30 1
604 I177V + 24 0
605 V172I + 29 1
606 I177M + 30 1
607 Y176I + 54 4
608 Y17 6M + 33 2
609 Y176V + 41 3
610 L174M + 21 0
611 P117T/Y176Q + 37 2
Вариант № Активные мутации (по сравнению с вариантом №36) FIOPC TIS IHC
612 S175G + 26 0
613 T178L/A477S + 43 5
614 V172C + 26 0
615 Y176E + 20 0
- 88 034034
Таблица 9-5
FIOP, общая иммуногенность (TIS) и количество иммуногенных совпадений (IHC) для вариантов, направленных на TCE-VIII (- = FIOP<0,7; = FIOP 0,7<FIOP<1,4; ++ = FIOP> 1,4)
Вариант № Активные мутации (по сравнению с вариантом №36) FIOPC TIS IHC
Variant 36 + 83 10
700 A232S + 83 10
701 Al12S/M370А/А507Е + 71 10
702 Q240K/H374R + 83 10
703 S461G + 83 10
704 H374D + 83 10
705 М372А + 74 10
706 L349M + 83 10
707 Y378S + 74 7
708 G371H + 91 11
709 Y377N + 82 10
710 I379N + 80 8
711 D191Y/H385N + 81 10
712 I379L + 83 10
713 R43S/H374R + 83 10
714 Q355K/H374S + 83 10
715 P275T/H374R + 83 10
716 H374Q/P396Q + 99 14
717 H385N + 81 10
718 Y378 л + 78 9
719 I379C + 70 7
720 M370G + 64 10
721 M372V + 76 10
722 K384R + 87 10
723 A3 8 3V + 88 13
724 M147I/H374S + 83 10
725 Y378F/P404Q + 85 10
726 H374S + 83 10
727 Y378E + 55 2
728 H374R/G417C + 83 10
729 L418M + 83 10
730 S525L + 83 10
731 Y378D + 60 4
- 89 034034
Вариант № Активные мутации (по сравнению с вариантом № 36) FIOPC TIS IHC
732 A383S + 88 10
733 D387S + 96 11
734 L382H + 78 10
735 L382C + 76 8
736 G371Q + 84 10
737 H374L + 85 11
738 Y378C + 58 5
739 Н374А + 83 10
740 L375M + 77 10
741 Н385С + 74 8
742 A334S/H374V + 85 11
743 H374R + 83 10
744 Н385М/Р403Н + 83 11
745 Y378I + 83 10
746 Y377I + 86 10
747 H385G + 74 7
748 H385S/P403H + 79 9
749 H374N + 83 10
750 S187R/L381V + 78 7
751 L382S + 77 9
752 Y377C + 75 7
753 L381V + 78 7
754 G371S + 88 10
755 A256S/L381N + 70 6
756 I379M + 80 10
757 R43S/H374K + 83 10
758 I379H + 76 7
759 M370S + 64 10
760 P275Q/M370S + 64 10
761 G425V + 83 10
762 A447S + 83 10
763 L382M + 80 10
764 G371N + 84 10
765 L381M/Q560K + 79 10
767 L382I + 77 8
768 H374G + 83 10
769 M370I + 76 10
770 Q332K/Y377M + 86 10
771 Y378N + 64 5
772 L375I + 83 10
773 Н374Т + 83 10
774 L381G + 60 4
- 90 034034
Таблица 9-6
FIOP, общая иммуногенность (TIS) и количество иммуногенных совпадений (IHC) для вариантов, направленных на TCE-IX (- = FIOP<0,7; + = FIOP 0,7<FIOP<1,4; ++ = FIOP> 1,4)
Вариант № Активные мутации (по вариантом № сравнению с 6) FIOP С TIS IHC
Вариант 36 + 45 4
800 I439V + 49 4
801 I439C + 39 1
802 S438F + 50 4
803 T433S + 44 0
804 Т433А + 35 0
805 Y435Q/H446N + 43 2
806 L431V + 28 0
807 N437Q + 40 0
808 L213M/S438L + 46 4
809 L432C + 39 2
810 L432V + 47 4
811 T433L + 50 4
812 L431P + 18 0
813 I439F + 47 4
814 S286R/Y435T + 53 4
815 S98I + 45 4
816 S438R + 48 4
817 S331I + 45 4
818 S438M + 44 4
819 Q240K/T433Y + 41 0
820 T433I + 46 3
821 T433N + 38 0
822 L431S + 27 0
823 N437G + 38 0
824 L431E + 26 0
825 L431C + 25 0
826 G436T + 45 0
827 G436D + 42 1
828 T433V + 59 7
829 N437T/L538M + 52 4
830 A289S/L431E + 26 0
831 T433Q + 37 0
832 I439L + 46 4
833 F434C + 34 0
834 Т433Р + 35 0
835 A24S/F434M + 69 8
836 L431G + 18 0
837 S438C + 45 1
838 T433W + 33 0
839 Y435L + 57 5
840 A62S/T433N + 38 0
841 N437E + 46 3
842 A477S + 45 4
843 G4 3 6M + 87 11
844 T433R + 70 10
845 S438T + 46 4
- 91 034034
Таблица 9-7
FIOP, общая иммуногенность (TIS) и количество иммуногенных совпадений (IHC) для вариантов, направленных на ТСЕ-Х (- = FIOP<0,7; + = FIOP 0,7<FIOP<1,4; ++ = FIOP>1,4)
Вариант
N474D/R490H
Р2 /50
G483H
0473H/A507S
N474H
Q4 /ЗМ
L104M/V476L
A119E/G365A
0292H/A479G
А4 7 98
A558S
0473S
0473R
A70S/N474E
Q58R/Y475H
0473Н
P404T/A477V
F482C
Q355H/I478C
L2 0 6M
N474A
- 92 034034
Таблица 9-8
FIOP, общая иммуногенность (TIS) и количество иммуногенных совпадений (IHC) для вариантов, направленных на TCE-I, III, VI, VIII и X (- = FIOP<0,7; + = FIOP 0,7<FIOP<1,4; ++ = FIOP>1,4)
L381G/F472GC503Q/C565N
956
967
Активные мутации (по сравнению с
Вариант № вариантом №36)
Вариант
F472G/C503Q/C565N
M133R/C503Q
M133R/L381G/C565N
V39A/C503Q/C565N
V39A/F472G/C503Q/C565N
V39A/G248C/L381G/F472G/C503Q/C565N
V39A/K115E/M133R/C565N
V39A/L381G
V39A/M133R/C503Q
V39A/M133R/C503Q/C565N
V39A/M133R/F472G/C503Q/C565N
V39A/M133R/F472G/C565N
V39А/М147А/С565N
V39A/M147A/F472G/C503Q/C565N
V39A/M147A/F472G/C565N
V39A/M147A/L381G/C503Q/C565N
V39A/M147A/L381G/F472G/C503Q/C565N
V39A/M147A/Y378E/C503Q/C565N
V39A/M147A/Y378E/C565N
V39A/Y378E/C503Q/C565N
V39A/Y378E/C565N
Y378D/C503Q
Y378E/F472G/C503Q/C565N
Таблица 9-9 FIOP, общая иммуногенность (TIS) и количество иммуногенных совпадений (IHC) для вариантов, направленных на TCE-III и VIII (- = FIOP<0,7; + = FIOP 0,7<FIOP<1,4; . ++ = FIOP>1,4)
Вариант № Активные мутации (по сравнению с вариантом №967) FIOP TIS IHC
Вариант 967 +
974 A129I - 598 26
975 A12 9V - 595 24
976 А13 6К + + 595 22
977 A24E/G381L + 604 28
978 A2 8 9S + 590 23
979 А383С + 577 18
980 А3 8 3М + + 602 28
981 G381A + + 598 24
982 G381C - 580 22
983 G381F + 601 25
984 G381I + + 610 27
985 G381L + + 610 28
986 G381M + 606 28
987 G381N + 597 24
- 93 034034
Тестирование in vitro деиммунизированных вариантов PAL.
Деиммунизированные варианты PAL тестируют в анализе дендритных Т-клеток для эмпирического тестирования их способности вызывать Т-клеточный ответ. Стандартными способами выделяют мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) от донора, являющегося человеком. Эти клетки используют в качестве источника моноцитов, которые культивируют в средах определенного состава для получения незрелых дендритных клеток. Эти незрелые дендритные клетки (DC) нагружают деиммунизированными вариантами PAL, а затем индуцируют в более зрелый фенотип дополнительным культивированием в средах определенного состава с получением праймированных антигеном DC. РВМС от донора с истощенными CD8+ Т-клетками, получаемые из образцов того же донора, что и DC, метят CFSE, затем культивируют с праймированными антигеном DC в течение 7 суток, после чего тестируют в восьми повторениях. Каждая культура клеток DC-T включает набор необрабатываемых контролей (т.е. отрицательных контролей). Анализ также включает контроли эталонным антигеном (т.е. положительные контроли), содержащие два эффективных полных белковых антигена. Анализы, в которых используют клетки, выделяемые у 50 являющихся людьми доноров с различными аллелями главного комплекса гистосовместимости II класса, обеспечивают статистически значимую оценку способности вариантов PAL вызывать Т-клеточный ответ.
Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на конкретные варианты осуществления, можно проводить различные изменения и можно заменять эквиваленты для адаптации к конкретной ситуации, веществу, композиции, способа, этапа или этапов способа, таким образом получая преимущество по изобретению, не выходя за рамки объема того, что описано в заявке изобретения.
Для всех целей в Соединенных Штатах Америки каждая и любая публикация и патентный документ, цитируемый в этом описании, включен в настоящее описание посредством ссылки, как если бы конкретно и отдельно указывали, что каждая такая публикация или документ включен в настоящее описание посредством ссылки. Цитирование публикаций и патентных документов не предназначено служить в качестве показателя того, что любой такой документ принадлежит к известному уровню техники, и не представляет собой допущение его содержания или даты.

Claims (40)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Сконструированный полипептид, обладающий активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), который
    a) содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO: 4 и имеет замену в положении H307G/Q/M по сравнению с SEQ ID NO: 4; и
    - 94 034034 дополнительно содержит по меньшей мере одну или более из следующих аминокислотных замен A39V, T54K, G59R, S73K, А112С, R134Q, A91V, Y158H, S180A, K195E, Q240R/W, T243E/L, I245L, A256G, L257W/A, N270K, N290G, Y304H, R305M, E308Q, I326F, L349M, D353A/N, L364Q, A394V, S399N, N400K, P404A, L407V, F443H, N453G, Y459F, T460G, T463N, N474Q, E509L, Q521K/S, K522Y/F/N, T524S, P528L, S546R и P564G/L/M при оптимальном выравнивании с полипептидной последовательностью SEQ ID NO: 4;
    b) обладает улучшенным свойством каталитической активности, сниженной чувствительностью к протеолизу, повышенной устойчивостью к кислому pH, сниженной агрегацией, сниженной иммуногенностью или их сочетанием по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 4.
  2. 2. Полипептид по п.1, где улучшенное свойство выбрано из сниженной чувствительности к протеолизу и/или повышенной устойчивости к кислому pH.
  3. 3. Полипептид по п.1, где последовательность представляет собой PAL дикого типа, получаемую из Anabaena variabilis.
  4. 4. Полипептид по п.1, который по меньшей мере приблизительно на 95% идентичен последовательности SEQ ID NO: 4.
  5. 5. Полипептид, обладающий активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), по любому из пп.1-4, представляющий собой фермент Anabaena variabilis.
  6. 6. Полипептид, обладающий активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что является термостабильным.
  7. 7. Полипептид, обладающий активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что является устойчивым к протеолизу.
  8. 8. Полипептид, обладающий активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), по п.7, отличающийся тем, что является устойчивым к протеолизу по меньшей мере одним ферментом желудочно-кишечного тракта.
  9. 9. Полипептид, обладающий активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), по п.8, отличающийся тем, что является устойчивым к протеолизу химотрипсином, трипсином, карбоксипептидазами и/или эластазами.
  10. 10. Полипептид, обладающий активностью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), по любому из пп.19, отличающийся тем, что является кислотоустойчивым.
  11. 11. Полипептид по любому из пп.1-10, отличающийся тем, что является деиммунизированным.
  12. 12. Полипептид по п.11, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO: 8.
  13. 13. Полипептид по любому из пп.1-12, который является очищенным.
  14. 14. Полинуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид по любому из пп.1-13.
  15. 15. Полинуклеотидная последовательность по п.14, которая находится под контролем промотора.
  16. 16. Полинуклеотидная последовательность по п.14 и/или 15, которая является кодоноптимизированной.
  17. 17. Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотидную последовательность по любому из пп.14-16, которая находится под контролем промотора.
  18. 18. Вектор экспрессии по п.17, в котором указанная контролирующая последовательность представляет собой промотор.
  19. 19. Вектор экспрессии по п.18, в котором указанный промотор представляет собой гетерологичный промотор.
  20. 20. Клетка-хозяин, трансформированная полинуклеотидной последовательностью по любому из пп.14-16 и/или вектором по любому из пп.17-19.
  21. 21. Клетка-хозяин по п.20, которая является E.coli.
  22. 22. Способ получения полипептида PAL в клетке-хозяине, включающий культивирование клеткихозяина по п.20 в условиях культивирования, обеспечивающих экспрессию указанного полипептида.
  23. 23. Способ по п.22, дополнительно включающий выделение полипептида, содержащего фенилаланин-аммиак-лиазу (PAL), из культуры и/или клеток-хозяев.
  24. 24. Способ по п.23, дополнительно включающий этап очистки указанного полипептида.
  25. 25. Композиция для лечения и/или профилактики фенилкетонурии у пациента, содержащая полипептид по любому из пп.1-13.
  26. 26. Композиция по п.25, которая является фармацевтической композицией.
  27. 27. Композиция по п.26, дополнительно содержащая по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент и/или носитель.
  28. 28. Композиция по любому из пп.25-27, которая подходит для лечения фенилкетонурии.
  29. 29. Композиция по любому из пп.26-28, которая подходит для перорального введения человеку.
  30. 30. Композиция по любому из пп.26-29, которая находится в форме пилюли, таблетки, капсулы, желатиновой капсулы, жидкости или эмульсии.
  31. 31. Композиция по п.30, где указанная пилюля, таблетка, капсула или желатиновая капсула дополнительно содержит растворяющееся в кишечнике покрытие.
    - 95 034034
  32. 32. Композиция по любому из пп.26-28, которая подходит для парентеральной инъекции человеку.
  33. 33. Композиция по любому из пп.26-32, которая содержит по меньшей мере одно дополнительное терапевтически эффективное соединение.
  34. 34. Композиция по п.33, которая содержит по меньшей мере одно дополнительное терапевтически эффективное соединение.
  35. 35. Способ лечения и/или профилактики фенилкетонурии у индивидуума, включающий введение композиции по любому из пп.26-34.
  36. 36. Способ по п.35, при котором течение фенилкетонурии облегчается.
  37. 37. Способ по п.35 и/или 36, где индивидуум употребляет в пищу рацион, который ограничен по содержанию метионина, фенилаланина и/или тирозина по сравнению с контролем.
  38. 38. Способ по любому из пп.35-37, где индивидуум представляет собой ребенка.
  39. 39. Способ по любому из пп.35-38, где индивидуум представляет собой взрослого или молодого человека.
  40. 40. Применение композиции по любому из пп.25-34 для лечения и/или профилактики фенилкетонурии у индивидуума.
EA201591995A 2013-04-18 2014-04-17 Сконструированные полипептиды фенилаланин-аммиак-лиазы EA034034B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361813586P 2013-04-18 2013-04-18
US201361897932P 2013-10-31 2013-10-31
PCT/US2014/034500 WO2014172541A2 (en) 2013-04-18 2014-04-17 Engineered phenylalanine ammonia lyase polypeptides

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201591995A1 EA201591995A1 (ru) 2016-04-29
EA034034B1 true EA034034B1 (ru) 2019-12-20

Family

ID=51729192

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201591995A EA034034B1 (ru) 2013-04-18 2014-04-17 Сконструированные полипептиды фенилаланин-аммиак-лиазы

Country Status (27)

Country Link
US (17) US9611468B2 (ru)
EP (3) EP2986722B1 (ru)
JP (5) JP6637410B2 (ru)
KR (1) KR102218930B1 (ru)
CN (2) CN109486803B (ru)
AU (2) AU2014253900C1 (ru)
CA (1) CA2909719C (ru)
CY (1) CY1121891T1 (ru)
DK (2) DK2986722T3 (ru)
EA (1) EA034034B1 (ru)
ES (2) ES2890955T3 (ru)
HR (1) HRP20190928T1 (ru)
HU (2) HUE043549T2 (ru)
IL (1) IL242067B (ru)
LT (1) LT2986722T (ru)
MX (1) MX366196B (ru)
MY (1) MY193198A (ru)
NZ (1) NZ713396A (ru)
PE (1) PE20151775A1 (ru)
PH (1) PH12015502412A1 (ru)
PL (1) PL2986722T3 (ru)
PT (1) PT2986722T (ru)
RS (1) RS58802B1 (ru)
SG (1) SG11201508598YA (ru)
SI (1) SI2986722T1 (ru)
SM (1) SMT201900315T1 (ru)
WO (1) WO2014172541A2 (ru)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL2986722T3 (pl) 2013-04-18 2019-10-31 Codexis Inc Skonstruowane polipeptydy amoniakoliazy fenyloalaniny
US9605252B2 (en) 2014-04-16 2017-03-28 Codexis, Inc. Engineered tyrosine ammonia lyase
EP3294760B1 (en) 2015-05-13 2021-03-24 Synlogic Operating Company, Inc. Bacteria engineered to reduce hyperphenylalaninemia
CN106636048A (zh) * 2016-12-14 2017-05-10 江南大学 一株酶活提高的苯丙氨酸脱氨酶突变体
CN106755160B (zh) * 2017-01-17 2019-08-02 湖州颐辉生物科技有限公司 一种组氨酸解氨酶及其用途
MX2019009615A (es) * 2017-02-13 2019-10-14 Codexis Inc Polipeptidos dise?ados de fenilalanina amonio liasa.
CN110914288B (zh) * 2017-05-27 2023-05-05 宁波酶赛生物工程有限公司 工程化醛缩酶多肽及其应用
EP3642221A1 (en) 2017-06-21 2020-04-29 Synlogic Operating Company, Inc. Bacteria for the treatment of disorders
CA3102968A1 (en) * 2018-06-12 2019-12-19 Codexis, Inc. Engineered tyrosine ammonia lyase
US11198861B2 (en) 2018-07-12 2021-12-14 Codexis, Inc. Engineered phenylalanine ammonia lyase polypeptides
CN113316635A (zh) * 2018-10-29 2021-08-27 科德克希思公司 工程化dna聚合酶变体
AU2019397401A1 (en) * 2018-12-14 2021-06-17 Codexis, Inc. Engineered tyrosine ammonia lyase
US20230183712A1 (en) * 2020-02-19 2023-06-15 Trustees Of Tufts College Methods for engineering amino acid ammonia lyase enzymes and enzymes thereby obtained
CN115298308A (zh) * 2020-03-20 2022-11-04 同生运营公司 经工程化以减轻高苯丙氨酸血症的微生物
EP4271806A1 (en) * 2020-12-31 2023-11-08 Synlogic Operating Company, Inc. Microorganisms engineered to reduce hyperphenylalaninemia
WO2022246126A1 (en) * 2021-05-21 2022-11-24 Codexis, Inc. Engineered methionine gamma lyase variants
CN114015636B (zh) * 2021-12-08 2023-09-29 天地壹号饮料股份有限公司 重组醋酸菌及其制备方法和应用
CN114457151B (zh) * 2022-01-27 2024-06-11 宁夏医科大学总医院 一种用于检测苯丙氨酸羟化酶基因突变的检测试剂盒及其检测方法
CN117417925A (zh) * 2022-07-18 2024-01-19 浙江泽科塔生物医药有限公司 Pal变体、包含该pal变体的药物组合物以及用于制备该pal变体的方法
CN115518691B (zh) * 2022-10-14 2023-11-21 天津大学 一种具有类漆酶活性的人工酶及制备方法和应用
CN115873837A (zh) * 2022-11-18 2023-03-31 安徽盈科生物科技有限公司 高表达的新型的苯丙氨酸解氨酶
CN116478975B (zh) * 2023-06-16 2023-09-01 苏州优信合生技术有限公司 高活性苯丙氨酸解氨酶突变体及其表达菌株
TW202519654A (zh) * 2023-09-19 2025-05-16 日商積水化學工業股份有限公司 解氨酶及其用途

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5753487A (en) * 1993-06-25 1998-05-19 Novo Nordisk A/S Stabilised phenylalanine ammonia lyase
WO2003018759A2 (en) * 2001-08-24 2003-03-06 Pcbu Services, Inc. Phenylalanine ammonia lyase polypeptide and polynucleotide sequences and methods of obtaining and using same
US20080008695A1 (en) * 2006-06-12 2008-01-10 Vellard Michel C Compositions of prokaryotic phenylalanine ammonia-lyase and methods of using compositions thereof
US7560263B2 (en) * 2007-08-17 2009-07-14 Biomarin Pharmaceutical Inc. Compositions of prokaryotic phenylalanine ammonia-lyase and methods of treating cancer using compositions thereof
US20130039898A1 (en) * 2010-02-04 2013-02-14 Biomarin Pharmaceutical Inc. Compositions of prokaryotic phenylalanine ammonia-lyase variants and methods of using compositions thereof

Family Cites Families (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US603344A (en) 1898-05-03 Trough for well-curbs
US753653A (en) 1903-09-14 1904-03-01 American Car & Foundry Co Hopper-bottom car.
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US6406855B1 (en) 1994-02-17 2002-06-18 Maxygen, Inc. Methods and compositions for polypeptide engineering
US6117679A (en) 1994-02-17 2000-09-12 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US6165793A (en) 1996-03-25 2000-12-26 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US20060257890A1 (en) 1996-05-20 2006-11-16 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US5928905A (en) 1995-04-18 1999-07-27 Glaxo Group Limited End-complementary polymerase reaction
US6309883B1 (en) 1994-02-17 2001-10-30 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US5834252A (en) 1995-04-18 1998-11-10 Glaxo Group Limited End-complementary polymerase reaction
US6395547B1 (en) 1994-02-17 2002-05-28 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US6995017B1 (en) 1994-02-17 2006-02-07 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US6335160B1 (en) 1995-02-17 2002-01-01 Maxygen, Inc. Methods and compositions for polypeptide engineering
AU694954B2 (en) 1994-06-03 1998-08-06 Novo Nordisk A/S Purified myceliophthora laccases and nucleic acids encoding same
ATE294871T1 (de) 1994-06-30 2005-05-15 Novozymes Biotech Inc Nicht-toxisches, nicht-toxigenes, nicht- pathogenes fusarium expressionssystem und darin zu verwendende promotoren und terminatoren
FI104465B (fi) 1995-06-14 2000-02-15 Valio Oy Proteiinihydrolysaatteja allergioiden hoitamiseksi tai estämiseksi, niiden valmistus ja käyttö
US6096548A (en) 1996-03-25 2000-08-01 Maxygen, Inc. Method for directing evolution of a virus
US6506602B1 (en) 1996-03-25 2003-01-14 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US7148054B2 (en) 1997-01-17 2006-12-12 Maxygen, Inc. Evolution of whole cells and organisms by recursive sequence recombination
US6326204B1 (en) 1997-01-17 2001-12-04 Maxygen, Inc. Evolution of whole cells and organisms by recursive sequence recombination
CA2276064C (en) 1997-01-17 2013-12-17 Maxygen, Inc. Evolution of whole cells and organisms by recursive sequence recombination
EP2270234B1 (en) 1997-12-08 2013-03-06 California Institute of Technology Method for creating polynucleotide and polypeptide sequences
US6365408B1 (en) 1998-06-19 2002-04-02 Maxygen, Inc. Methods of evolving a polynucleotides by mutagenesis and recombination
JP4221100B2 (ja) 1999-01-13 2009-02-12 エルピーダメモリ株式会社 半導体装置
US6376246B1 (en) 1999-02-05 2002-04-23 Maxygen, Inc. Oligonucleotide mediated nucleic acid recombination
US6436675B1 (en) 1999-09-28 2002-08-20 Maxygen, Inc. Use of codon-varied oligonucleotide synthesis for synthetic shuffling
US6917882B2 (en) 1999-01-19 2005-07-12 Maxygen, Inc. Methods for making character strings, polynucleotides and polypeptides having desired characteristics
US6368861B1 (en) 1999-01-19 2002-04-09 Maxygen, Inc. Oligonucleotide mediated nucleic acid recombination
AU3210100A (en) 1999-01-19 2000-08-01 Maxygen, Inc. Methods for making character strings, polynucleotides and polypeptides having desired characteristics
US7024312B1 (en) 1999-01-19 2006-04-04 Maxygen, Inc. Methods for making character strings, polynucleotides and polypeptides having desired characteristics
US7702464B1 (en) 2001-08-21 2010-04-20 Maxygen, Inc. Method and apparatus for codon determining
US6961664B2 (en) 1999-01-19 2005-11-01 Maxygen Methods of populating data structures for use in evolutionary simulations
AU3719500A (en) 1999-03-05 2000-09-21 Maxygen, Inc. Recombination of insertion modified nucleic acids
US7430477B2 (en) 1999-10-12 2008-09-30 Maxygen, Inc. Methods of populating data structures for use in evolutionary simulations
US6519065B1 (en) 1999-11-05 2003-02-11 Jds Fitel Inc. Chromatic dispersion compensation device
WO2001075767A2 (en) 2000-03-30 2001-10-11 Maxygen, Inc. In silico cross-over site selection
US20050084907A1 (en) 2002-03-01 2005-04-21 Maxygen, Inc. Methods, systems, and software for identifying functional biomolecules
US7747391B2 (en) 2002-03-01 2010-06-29 Maxygen, Inc. Methods, systems, and software for identifying functional biomolecules
HUE028524T2 (en) 2002-03-01 2016-12-28 Codexis Mayflower Holdings Llc Procedures, systems and software for identifying functional biomolecules
EP1488335A4 (en) 2002-03-09 2006-11-15 Maxygen Inc OPTIMIZING CROSSOVER POINTS FOR THE ADJUSTED EVOLUTION
US8003356B2 (en) 2004-04-20 2011-08-23 E. I. Du Pont De Nemours And Company Methods for the preparation of para-hydroxycinnamic acid and cinnamic acid at alkaline pH
JP2008513027A (ja) * 2004-09-17 2008-05-01 バイオマリン ファーマシューティカル インコーポレイテッド フェニルアラニンアンモニアーリアーゼの改変体および化学的に修飾された改変体
US20090038023A1 (en) 2005-03-10 2009-02-05 Verenium Corporation Lyase Enzymes, Nucleic Acids Encoding Them and Methods For Making and Using Them
US7531341B1 (en) 2006-06-12 2009-05-12 Biomarin Pharmaceutical Inc. Compositions of prokaryotic phenylalanine ammonia-lyase and methods of using compositions thereof
US20090011400A1 (en) * 2006-12-01 2009-01-08 The Salk Institute for Biological Studies and The Regents of the University of California Substrate switched ammonia lyases and mutases
CA2726850C (en) 2008-06-13 2015-06-02 Codexis, Inc. Method of synthesizing polynucleotide variants
US20090312196A1 (en) 2008-06-13 2009-12-17 Codexis, Inc. Method of synthesizing polynucleotide variants
US8383346B2 (en) 2008-06-13 2013-02-26 Codexis, Inc. Combined automated parallel synthesis of polynucleotide variants
CN103282500A (zh) 2010-11-05 2013-09-04 巴斯夫植物科学有限公司 用于增加植物中产量和精细化学品生产的方法
WO2012122333A1 (en) 2011-03-08 2012-09-13 Arizona Board Of Regents, A Body Corporate Of The State Of Arizona, Acting For And On Behalf Of Arizona State University Microbial conversion of glucose to styrene and its derivatives
WO2012178126A1 (en) 2011-06-23 2012-12-27 Phytogene, Inc. Enzymatic system for monomer synthesis
PL2986722T3 (pl) 2013-04-18 2019-10-31 Codexis Inc Skonstruowane polipeptydy amoniakoliazy fenyloalaniny

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5753487A (en) * 1993-06-25 1998-05-19 Novo Nordisk A/S Stabilised phenylalanine ammonia lyase
WO2003018759A2 (en) * 2001-08-24 2003-03-06 Pcbu Services, Inc. Phenylalanine ammonia lyase polypeptide and polynucleotide sequences and methods of obtaining and using same
US20080008695A1 (en) * 2006-06-12 2008-01-10 Vellard Michel C Compositions of prokaryotic phenylalanine ammonia-lyase and methods of using compositions thereof
US7560263B2 (en) * 2007-08-17 2009-07-14 Biomarin Pharmaceutical Inc. Compositions of prokaryotic phenylalanine ammonia-lyase and methods of treating cancer using compositions thereof
US20130039898A1 (en) * 2010-02-04 2013-02-14 Biomarin Pharmaceutical Inc. Compositions of prokaryotic phenylalanine ammonia-lyase variants and methods of using compositions thereof

Also Published As

Publication number Publication date
SMT201900315T1 (it) 2019-07-11
PH12015502412B1 (en) 2016-02-22
US10941391B2 (en) 2021-03-09
PE20151775A1 (es) 2015-12-02
SG11201508598YA (en) 2015-11-27
US10975367B2 (en) 2021-04-13
CN105324483A (zh) 2016-02-10
WO2014172541A2 (en) 2014-10-23
CN105324483B (zh) 2018-11-30
DK2986722T3 (da) 2019-05-13
RS58802B1 (sr) 2019-07-31
SI2986722T1 (sl) 2019-07-31
US10160963B2 (en) 2018-12-25
US20200032233A1 (en) 2020-01-30
US11401515B2 (en) 2022-08-02
PT2986722T (pt) 2019-06-21
AU2019272057A1 (en) 2019-12-19
US10358639B2 (en) 2019-07-23
MX2015014662A (es) 2016-03-03
EP2986722A4 (en) 2017-02-22
US10870843B2 (en) 2020-12-22
CY1121891T1 (el) 2020-10-14
US20190040377A1 (en) 2019-02-07
MY193198A (en) 2022-09-26
US11136571B2 (en) 2021-10-05
US9611468B2 (en) 2017-04-04
NZ713396A (en) 2020-06-26
KR20150143816A (ko) 2015-12-23
JP2020185017A (ja) 2020-11-19
US20200032236A1 (en) 2020-01-30
US20210222146A1 (en) 2021-07-22
US10717974B2 (en) 2020-07-21
JP6637410B2 (ja) 2020-01-29
US11913045B2 (en) 2024-02-27
HUE055899T2 (hu) 2022-01-28
BR112015026160A2 (pt) 2017-10-10
AU2014253900A1 (en) 2015-11-12
HRP20190928T1 (hr) 2019-07-26
HUE043549T2 (hu) 2019-08-28
AU2014253900C1 (en) 2020-04-02
WO2014172541A3 (en) 2015-02-19
CN109486803A (zh) 2019-03-19
EP3971288A1 (en) 2022-03-23
EP3521423A1 (en) 2019-08-07
US20200399627A1 (en) 2020-12-24
CA2909719C (en) 2022-09-27
US20180016568A1 (en) 2018-01-18
US20190055535A1 (en) 2019-02-21
PH12015502412A1 (en) 2016-02-22
US20190241882A1 (en) 2019-08-08
US10494623B2 (en) 2019-12-03
LT2986722T (lt) 2019-09-10
US20200199566A1 (en) 2020-06-25
JP7129715B2 (ja) 2022-09-02
KR102218930B1 (ko) 2021-02-23
JP2016516428A (ja) 2016-06-09
US20200040325A1 (en) 2020-02-06
EP2986722B1 (en) 2019-04-03
IL242067B (en) 2018-03-29
EP3521423B1 (en) 2021-07-21
US20140314843A1 (en) 2014-10-23
US20180037880A1 (en) 2018-02-08
US10144924B2 (en) 2018-12-04
JP2018166524A (ja) 2018-11-01
EP2986722A2 (en) 2016-02-24
US20200231959A1 (en) 2020-07-23
MX366196B (es) 2019-07-01
ES2729048T3 (es) 2019-10-30
US10640759B2 (en) 2020-05-05
US11130947B2 (en) 2021-09-28
PL2986722T3 (pl) 2019-10-31
DK3521423T3 (da) 2021-09-06
US10294468B2 (en) 2019-05-21
JP2020185016A (ja) 2020-11-19
CA2909719A1 (en) 2014-10-23
ES2890955T3 (es) 2022-01-25
JP2022183356A (ja) 2022-12-08
US10487319B2 (en) 2019-11-26
US20190055536A1 (en) 2019-02-21
AU2019272057B2 (en) 2021-05-27
CN109486803B (zh) 2022-10-25
US20200032234A1 (en) 2020-01-30
US20170191050A1 (en) 2017-07-06
US20200032235A1 (en) 2020-01-30
AU2014253900B2 (en) 2019-09-19
EA201591995A1 (ru) 2016-04-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7129715B2 (ja) 操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチド
KR102573324B1 (ko) 조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제 폴리펩티드
BR112015026160B1 (pt) Polipeptídeo engenheirado com atividade de fenilalanina amônia-liase,sequência de polinucleotídeo, vetor de expressão, célula hospedeira transformada, método para produzir um polipeptídeo de pal engenheirado em uma célula hospedeira, composição, e, uso de uma composição

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM