RS57910B1 - Bispecifična igg antitela kao aktivatori t ćelije - Google Patents

Description

Opis

OBLAST TEHNIKE

[0001] Pronalazak se odnosi na polje inženjeringa antitela. Posebno se odnosi na polje terapijskih (humanih) antitela za lečenje bolesti koje uključuju aberantne ćelije. Posebno se odnosi na bispecifična antitela za lečenje tumora.

OSNOVA PRONALASKA

[0002] U laboratorijama, bispecifična antitela su se široko primenjivala za retargeting imunih efektorskih ćelija na tumorske ćelije. U ovom slučaju jedno mesto vezivanja je usmereno protiv tumor povezanih antigena (TAA) i drugog antigena protiv triger molekula na efektorskim ćelijama, kao na primer CD3 na T ćelijama (Kontermann, MABS 2012 (4) 182-197; Chames and Baty, MABS 2009 (1) 539-547; Moore et al. Blood 2011 (117) 4542-4551). Prva bispecifična antitela koja ciljno deluju na CD3 i antigen povezan sa ćelijom tumora bile su od glodara i proizvedene su korišćenjem hibridnih hibridoma (Liu et al. 1985 PNAS 82: 8648, Staerz et al. 1986 PNAS 83:1453, Lanzavecchia et al. 1987, Eur.J.Imm. 17:105). U ovim hibridnim hibridomima rearanžman Ig teških i lakih lanaca rezultovao je u proizvodnji bispecifičnih funkcionalnih molekula antitela unutar mnogo većeg pula monospecifičnih i nefunkcionalnih bispecifičnih antitela koja su rezultat pogrešnog sparivanja teškog i lakog lanca. Zbog njihove dvostruke specifičnosti, ova funkcionalna bispecifična antitela bila su sposobna da premoste mišje i humane citotoksične T limfocite (CTL) da ciljno deluju na ćelije i iniciraju citotoksičnu funkciju koja rezultuje u lizi tumorskih ćelija koje prikazuju relevantni antiogen. Međutim, CD3xTAA bispecifičnim IgG posredovana indukcija lize ćelija tumora sa poliklonskim mirujućim humanim T ćelijama nije se mogla postići osim ukoliko nije obezbeđena ko-stimulacija sa dodatim egzogenim IL-2 ili anti-CD28 mAb. Primer za ovo je hibridni IgG2b pacova/IgG1 miša CD3xCD19 bispecifični molekul koji je bio sposoban da indukuje lizu CD19 pozitivne ćelijske linije tumora REH B-ALL od strane mirujućih humanih T limfocita samo nakon ko-primene IL-2 (Haagen et al. 1995 Blood 85:3208). Zeidler et al. pokazali su korišćenjem sličnog IgG2b pacova/IgG2a miša CD3xEpcam molekula da je bispecifičnim IgG-indukovana liza Epcam-pozitivnih tumorskih ćelija mogla biti postignuta u mešovitim ćelijskim kulturama koje sadrže i mononuklearne ćelije iz periferne krvi (PBMC) i tumorskih ćelija bez dodavanja egzogenog IL2 (Zeidler et al. 1999 J. Immunol. 163:1246). Autori su tvrdili da’treća’ ruka antitela, Fc region, izaziva ovaj efekat preko intereakcije sa Fcγ receptor-pozitivnim pomoćnim ćelijama prisutnim unutar PBMC frakcije. Naročito, snažni aktivacioni potencijal je u korelaciji sa hibridnom potklasom kombinovanog IgG2a miša/IgG2b pacova koja, za razliku od drugih objavljenih kombinacija (npr., IgG2a miša/IgG1 miša ili IgG2b pacova/IgG1 miša), ne samo vezuje, već takođe aktivira Fcγ receptor-pozitivne pomoćne ćelije. Ovo takozvano triomAb CD3xEpcam bispecifično antitelo, takođe poznato kao katumaksomab, klinički je razvijeno i registrovano je u Evropi za palijativni tretman abdominalnih tumora epitelnog porekla. Dok je ovo bispecifično antitelo jasno pokazalo kliničku efikasnost, njegovo glodarsko poreklo indukuje anti-produkt imune odgovore nakon ponovljenih doziranja i stoga sprečava široko rasprostranjenu primenu ovog formata.

[0003] Alternativni CD3xTAA formati su istraživani da bi se rešili i problemi u proizvodnji i problemi sa imunogenošću povezani sa hibridnim glodarskim triomAb formatom. Takvi formati su često molekuli slični imunoglobulinu koji odudaraju od humanih IgG molekula pune dužine, i uključuju molekule kao što su Dual-Affinity Re-Targeting (DART™) molekule koji su razvijeni od strane Macrogenics worldwide web na macrogenics.com/Platforms-DART.html, Bispecific T cell Engager (BiTE®) molekuli koji su razvijeni od strane Micromet, sada Amgen (Sheridan C, Nat Biotechnol. 2012 (30):300-1), Dual Variable Domain-immunoglobulin (DVD-Ig™) molekuli koji su razvijeni od strane Abbott, i TandAb® RECRUIT molekuli koji su razvijeni od strane Affimed world wide web na affimed.com/tandab-recruit. Pokazano je za jedan od ovih formata da je za uspešno retargetovanje limfocita periferne krvi da liziraju CD19-pozitivne ćelije tumora korišćenjem CD3xCD19 diatela bila neophodna pre-aktivacija T limfocita periferne krvi, sada korišćenjem anti-CD3 antitela plus humani IL-2 (Kipriyanov et al.1998 Int.J.Can.77:763). Drugi formati, kao što je bivalentni jednolančani Fv CD3xTAA BiTE® format (Loffler et al. 2000 Blood 95:2098) ne zahtevaju pre-aktivaciju mirujućih T ćelija i sposoban je da indukuje lizu antigen pozitivnih tumorskih ćelija in vitro na ekstremno efikasan način (Dreier et al.2002 Int.J.Canc.

100:690). Dodatne studije korišćenjem BiTE®s targetinga različitih TAAs otkrile su da je potentna efikasnost BiTE® formata u korelaciji sa veličinom antigena i naročito sa rastojanjem epitopa na TAA do membrane ćelije tumora (Bluemel et al. 2010 Cancer Immunol. Immunother. 59:1197). Efikasno formiranje citolitičkih sinapsi T ćelije je pokazano za BiTE® molekule za koje je objašnjeno da formiraju strukturnu osnovu za njihovu potenciju (Offner et al. Molecular Immunology 2006 (43) 763-771) za koje se takođe veruje da je povezano sa malom veličinom BiTE® formata. Ukoliko je veličina bitna, to bi sugerisalo da bi veći molekuli kao što je intaktni IgG bili preveliki da formiraju efikasne citolitičke sinapse. CD3xCD19 BiTE®, blinatumomab, je pokazao izvanrednu kliničku efikasnost kod pacijenata sa refraktornim ne-Hodgkin limfomom i akutnom limfatičnom leukemijom (Bargou et al. 2008 Science 321:974). Iako CD3xCD19 BiTE® pokazuje veoma efikasnu lizu ćelija tumora pri niskim nivoima in vitro, primena ovog bispecifičnog formata na pacijente je povezana sa značajnim problemima. Usled njihove male veličine, BiTE®s se brzo izbacuju iz cirkulacije i doziranje pacijenata na taj način zahteva kontinuiranu infuziju. Kako dozni režim ima ukupno trajanje od više od 2 meseca, ovaj tretman ima značajan uticaj na kvalitet života pacijenata.

[0004] Stoga ostaje potreba za efikasnim bispecifičnim IgG molekulima pune dužine koji angažuju T ćelije za iskorenjivanje aberantnih ćelija koji kombinuju dugačak polu-život u cirkulaciji nakon intravenske primene bez potrebe za stalnom infuzijom bez toga da su imunogeni i sa samo ograničemim sporednim efektima.

KRATAK OPIS SLIKA

[0005]

SL. 1: CLEC12A i srodne sekvence.

SL. 2: T-ćelijska aktivacija sa različitim antitelima: monoklonsko bivalentno CD3 IgG, bispecifično CD3XCLEC12 IgG, bispecifično CD3xizotip kontrolno IgG, monoklonsko bivalentno CLEC12A IgG, monoglonsko bivalentno izotip kontrola IgG.

SL. 3: Specifična liza HL60 ćelija sa CD3XCLEC12A bispecifičnim IgG i kontrolnim antitelima.

SL. 4: Specifična liza HL60 ćelija sa CD3XCLEC12A bispecifičnim IgG i kontrolnim antitelima. (E:T odnosi).

SL. 5: Specifična liza HL60 ćelija sa nekoliko CD3XCLEC12A bispecifičnih IgG molekula koji se sastoje od različitih CLEC12A ruku & fiksirane CD3 ruke, i kontrolnih antitela.

SL. 6: Specifična liza HL60 ćelija sa CD3XCLEC12A bispecifičnim IgG u kombinaciji sa Fc utišavanjem (DM= dvostruki mutant; TM= trostruki mutant; WT= divlji tip, bez Fc utišavanja).

SL. 7: Fc utišavanje ne utiče na FcRn vezivanje.

SL. 8: CD3xCLEC12A bsAb target specifična indukcija T ćelijske proliferacije.

SL. 9: CD8+ T ćelijski kompartman AML pacijenata u poređenju sa zdravim donorima.

SL. 10: Specifična CD3xCLEC12A DM-Fc indukovana T ćelijska aktivacija i liza HL60 tumor ćelija sa T ćelijama AML pacijenta.

SL. 11: Specifična liza AML blasta sa autologim T ćelijama AML pacijenta.

SL. 12: Specifična liza monocita sa T ćelijama pacijenta.

SL. 13: Fc utišavanje značajno eliminiše oslobađanje citokina iz ćelija koje ne učestvuju. SL. 14A: FACS bojenje anti-CD3 antitela na HPB-ALL ćelije

SL. 14B: IgG vezani za ploču, T ćelije obeležene sa CFSE, očitavanje na dan 5 sa FACS FIG 15:HL60 analiza citotksičnosti

FIG 16: FACS bojenje anti-CLEC12A antitela na HL60 ćelijama

SL. 17: HL60 analiza citotoksičnosti

FIG 18: FACS analiza

FIG 19: HL60 analiza citotoksičnosti

FIG 20: VH sekvence CD3-specifičnih i CLEC12A-specifičnih Fab ruku. VL sekvenca 012 zajedničkog lakog lanca. CDR sekvence su u boldu i podvučene.

REZIME PRONALASKA

[0006] Predmetni pronalazak se odnosi na potpuno humano IgG bispecifično antitelo pune dužine za tretman AML. Jedna ruka antitela vezuje se za epitop na imunim efektorskim ćelijama, CD3, dok druga ruka ciljno deluje na CLEC12A, specifčni površinski target mijeloidne ćelije koji je eksprimiran u 90-95% de novo i relapsnih AML pacijenata. CLEC12A je eksprimiran na AML leukemijskim matičnim ćelijama, ali ne na normalnim hematopoetskim ćelijama. Za razliku od CD33, CLEC12A nije eksprimiran na eritroidnim prekursorima ili megakariocitama, tako da CD3xCLEC12A bispecifično IgG1 antitelo prema predmetnom pronalasku ne bi trebalo da indukuje depleciju trombocita ili crvenih krvnih ćelija. Eksperimenti sa kolonijama ćelija kostne srži pokazali su da deplecija CLEC12A+ ćelija u normalnoj kostnoj srži ne utiče na mijeloidne linije koje daju trombocite i crvene krvne ćelije. CD3xCLEC12A bispecifično IgG anttielo prema predmetnom pronalasku u poželjnom primeru izvođenja sadrži modifikovani Fc region tako da smanji nespecifičnu imunu aktivaciju koja je rezultat angažovanja T ćelija i FcγR eksprimirajućih ćeilja unutar PBMC. Na osnovu podataka opisanih za triomAb bispecifično antitelo u prethodnoj tehnici postojala je velika sumnja da bi CD3xTAA bispecifični IgG potpuno humanog IgG1 formata bio sposoban da indukuje litičku anti-tumorsku aktivnost kod mirujućih limfocita periferne krvi bez potrebe za pre-aktivacijom T ćelija. Dodatno, dostupni podaci za BiTE® format sugerisali su da bi IgG molekul pune dužine bio preveliki da stvori efikasne citolitičke sinapse između ćelija tumora i efektornih ćelija. Iznenađujuće, pokazali smo da je potpuno humani CD3xCLEC12A bispecifični IgG1 pune dužine bio sposoban da indukuje veoma efikasnu T ćelijski posredovanu lizu CLEC12A-pozitivnih HL60 AML ćelija tumora in vitro. Ustvari, efikasna liza je posredovana mirujućim T limfocitima prečišćenim iz PBMC bez potrebe za prethodnom aktivacijom T ćelija. Dodatno, pokazali smo da ova litička aktivnost nije neophodno zavisna od interakcija sa FcγR prisutnim na HL60 ćelijama jer na ovu litičku aktivnost nije uticalo prosustvo viška humanog IgG kada je analiza izvedena u medijumu koji sadrži humani serum. Ovo je prvi put da humano IgG1 bispecifično antitelo pune dužine koje angažuje T ćelije ispoljava efikasnu lizu ćelije tumora bez potrebe za pre-aktivacijom T ćelije ili potrebe za aktivnim FcγR interakcijama. Efikasna liza je postignuta uprkos relativno velike veličine IgG1 u poređenju sa BiTE® molekulima. Izvanredno, kada su uvedene mutacije CH2/donjeg zgloba u CD3xCLEC12A bispecifični IgG1 molekul da bi se dodatno smanjile interakcije Fc receptora, ovo je još uvek rezultovalo u efikasnoj lizi ćelija tumora od strane imunih efektorskih ćelija. Bispecifično humano IgG1 antitelo koje angažuje T ćelije ima prednosti u odnosu na trenutni IgG koji koristi hibridnu potklasu kombinovanog IgG2a miša/ IgG2b pacova, jer će humani IgG1 biti manje imunogen i stoga može biti primenjen za ponovljenu terapiju. Dodatno, bispecifično humano IgG1 antitelo pune dužine koje angažuje T ćelije ima prednosti u odnosu na imunoglobulin/slične molekule kao što su DART™, TandAb® ili BiTE® jer se humani IgG1 pune dužine ne izbacuje brzo iz cirkulacije i doziranje pacijenata stoga ne zahteva kontinuiranu infuziju, što je korisnije za pacijente.

PRIMERI IZVOĐENJA

[0007] Pronalazak obezbeđuje bispecifično IgG antitelo prema patentnim zahtevima, naznačeno time da bispecifično IgG antitelo sadrži jednu ruku koja specifično prepoznaje CLEC12A i drugu ruku koja specifično prepoznaje antigen na imunoj efektorskoj ćeliji, CD3, koji je sposoban da regrutuje takve ćelije protiv aberantne ćelije koja eksprimira CLEC12A.

[0008] Kao što je ovde korišćeno, termin "specifično prepoznaje CLEC12A" označava da pomenuta ruka ima sposobnost da specifično prepoznaje CLEC12A, u situaciji kada je CLEC12A prisutan u blizini pomenutog antitela. Slično tome, termin "specifično prepoznaje antigen na imunim efektornim ćelijama" znači da pomenuta ruka ima sposobnost da specifično prepoznaje pomenuti antigen kada je pomenuti antigen prisutan u blizini pomenutog antitela. Takvo prepoznavanje antigena od strane antitela je tipično posredovano preko regiona antitela koji određuju komplementarnost i specifične trodimenzionalne strukture i antigena i ruke antitela koji omogućavaju da se ove dve strukture međusobno precizno vežu (interakcija slična ključu i bravi), suprotno nasumičnom, nespecifičnom lepljenju antitela. Kako antitelo specifično prepoznaje epitop antigena, i kako takav antigen može biti prisutan takođe u drugim jedinjenjima, antitela prema predmetnom pronalasku koja "specifično prepoznaju CLEC12A", i "specifično prepoznaju antigen na imunim efrektornim ćeijama" mogu takođe prepoznati druga jedinjenja, ukoliko takva druga jedinjenja sadrže istu vrstu epitopa. Stoga, termini "specifično prepoznaju CLEC12A", "specifično prepoznaje antigen na imunim efektornim ćelijama" i "specifično prepoznaje CD3" ne isključuju vezivanje antitela za druga jedinjenja koja sadrže isti (vrstu) epitop. Umesto toga, dozvoljena je unakrsna reaktivnost. Antitelo prema predmetnom pronalasku je tipično sposobno da vezuje CLEC12A i antigen na imunim efektorskim ćelijama, CD3, sa afinitetom vezivanja od najmanje 1x10<-5>M, kao što je detaljnije dato u nastavku.

[0009] Termin "antitelo" kao što je ovde korišćeno označava proteinski molekul koji pripada klasi imunoglobulinskih proteina, koji sadrži jedan ili više domena koji vezuju epitop na antigenu, gde su takvi domeni izvedeni iz ili dele homologiju sekvence sa varijabilnim regionom antitela. Antitela za terapeutsku upotrebu su poželjno što bliskija prirodnim antitelima subjekta koji se tretira (na primer humana antitela za humane subjekte). Vezivanje antitela može se izraziti u odnosu na specifičnost i afinitet. Specifičnost određuje koji antigen ili njegov epitop je specifično vezan od strane vezujućeg domena. Afinitet je mera za snagu vezivanja za određeni antigen ili epitop. Specifično vezivanje, ili "specifično prepoznaje" je definisano kao vezivanje sa afinitetom (KD) od najmanje 1x10<-5>M, poželjnije 1x10<-7>M, poželjnije većom od 1x10<-9>M. Tipično, antitela za terapeutske primene imaju afinitete od do 1x10<-10>M ili još veće. Antitela prema predmetnom pronalsku su tipično bispecifična antitela pune dužine humane IgG potklase. Poželjno, antitela prema predmetnom pronalasku su iz humane IgG1 potklase.

[0010] Termin ’IgG pune dužine’ prema pronalasku je definisan tako da sadrži suštinski kompletan IgG, koji međutim ne mora obavezno imati sve funkcije intaktnog IgG. Za otklanjanje sumnje, IgG pune dužine sadrži dva teška i dva laka lanca. Svaki lanac sadrži konstantne (C) i varijabilne (V) regione, koji se mogu razložiti u domene označene CH1, CH2, CH3, VH, i CL, VL. IgG antitelo se vezuje za antigen preko domena varijabilnog regiona koji se nalaze u Fab delu, i nakon vezivanja mogu interagovati sa molekulima i ćelijama imunog sistema preko konstantnih regiona, uglavnom Fc dela. Termini ’domen varijabilnog regiona’, ’varijabilni region’, ’varijabilni domen’, ’VH/VL par, ’VH/VL’, ’Fab deo, ’Fab ruka, ’Fab’ ili ’ruka’ su ovde korišćeni naizmenično. Antitela pune dužine prema pronalasku obuhvataju IgG molekuli naznačeno time da mogu biti prisutne mutacije koje obezbeđuju željene karakteristike. Takve mutacije ne smeju biti delecije značajnih delova bilo kog od regiona. Međutim, IgG molekuli gde su deletirani jedan ili više aminokiselinskih ostataka, bez suštinske izmene karakteristika vezivanja rezultujućeg IgG molekula, su obuhvaćene unutar termina "IgG pune dužine". Na primer, takvi IgG molekuli mogu imati jednu ili više delecija od između 1 i 10 aminokiselinskih ostataka, poželjno u ne-CDR regionima, naznačeno time da deletirane aminokiseline nisu esencijalne za specifičnost vezivanja IgG.

[0011] IgG antitela pune dužine su poželjna zbog njihovog povoljnog polu-života i potrebe da ostanu što bliže potpuno autologim (humanim) molekulima iz razloga imunogenosti. Prema pronalasku, korišćena su bispecifična IgG antitela. U poželjnom primeru izvođenja, korišćena su bispecifična IgG1 antitela pune dužine. IgG1 je favorizovan na osnovu njegovog dugog polu-života u cirkulaciji čoveka. Da bi se sprečila bilo kakva imunogenost kod ljudi poželjno je da bispecifično IgG antitelo prema pronalasku je humani IgG1. Termin ’bispecifično’ (bs) označava da se jedna ruka antitela vezuje za prvi antigen dok se druga ruka vezuje za drugi antigen, naznačeno time da pomenuti prvi i drugi antigeni nisu identični. Prema predmetnom pronalasku, pomenuti prvi i drugi antigeni su ustvari dva različita molekula koji se nalaze na dva različita tipa ćelija. Termin ’jedna ruka [antitela]’ poželjno označava jedan Fab deo pune dužine IgG antitela. Bispecifična antitela koja posreduju u citotoksičnosti regrutovanjem i aktiviranjem endogenih imunih ćelija su klasa koja se javlja kao sledeća generacija antitelo terapeutika. Ovo se može postići kombinovanjem specifičnosti vezivanja antigena za ciljne ćelije (tj., tumorske ćelije) i efektorne ćelije (tj., T ćelije, NK ćelije, i makrofage) u jednom molekulu (Cui et al. JBC 2012 (287) 28206-28214; Kontermann, MABS 2012 (4) 182-197; Chames and Baty, MABS 2009 (1) 539-547; Moore et al. Blood 2011 (117) 4542-4551; Loffler et al. 2000 Blood 95:2098; Zeidler et al. 1999 J. Immunol. 163:1246). Prema pronalasku, bispecifična antitela su obezbeđena naznačeno time da jedna ruka vezuje CLEC12A antigen na aberantnim (tumorskim) ćelijama dok druga ruka vezuje antigen na imunim efektornim ćelijama.

[0012] Termin ’CLEC12A’ kao što je ovde korišćeno odnosi se na familiju 12 C-tipa lektin domena člana A, takođe poznat kao C-tip lektinu-slični molekul-1 (CLL-1), antigen koji je eksprimiran na leukemijskim blast ćelijama i na leukemijskim stem ćelijama u akutnoj mijeloidnoj leukemiji (AML), uključujući CD34 negativne ili CD34 nisko eksprimirajuće leukemijske stem ćelije (sporedne populacija) (A.B. Bakker et al. Cancer Res 2004, 64, p8443-50; Van Rhenen et al. 2007 Blood 110:2659; Moshaver et al. 2008 Stem Cells 26:3059). Ekspresija CLEC12A je inače ograničena na hematopoetsku liniju, naročito na mijeloidne ćelije u perifernoj krvi i kostnoj srži, tj., prekursore granulocita, monocita i dendritskih ćelija. Još važnije, CLEC12A nije prisutan na hematopoetskim stem ćelijama. Ovaj ekspresioni profil čini CLEC12A naročito poželjnim ciljnim mestom u AML.

Alternativni nazivi za CLEC12A uključuju C-tip lektin-2 povezan sa dendritskom ćelijom (DCAL-2), mijeloid inhibitorni C-tip lektinu-slični receptor (MICL) i lektinu-slični receptor potfamilija L ćelije ubice, član 1 (KLRL1) (Zhang W. et al. GenBankTM access.no: AF247788; A.S. Marshall, et al. J Biol Chem 2004, 279, p14792-802; GenBankTM access.no: AY498550; Y.Han et al. Blood 2004, 104, p2858-66; H.Floyd, et al. GenBankTM access.no: AY426759; C.H.Chen, et al. Blood 2006, 107, p1459-67). Poravnanje ovih sekvenci je predstavljeno na SL.1. Oblik pune dužine CLEC12A sadrži 275 aminokiselinskih ostataka, uključujući dodatni intracelularni niz od 10 aminokiselina koji nije prisutan u većini drugih izoformi, i prikazuje striktno mijeloidni ekspresioni profil (površinska ekspresija i nivo iRNA). Termin ’CLEC12A’ označava sve varijante na koje se pozivalo prethodno.

[0013] Termin ’aberantne ćelije’ kao što je ovde korišćeno uključuju ćelije tumora, specifičnije ćelije tumora hematološkog porekla uključujući takođe pre-leukemijske ćelije kao što su ćelije koje izazivaju mijelodisplastične sindrome (MDS) i leukemijske ćelije kao što su tumorske ćelije akutne mijeloidne leukemije (AML) ili ćelije hronične mijelogene leukemije (CML).

[0014] Termin ’imuna efektorska ćelija’ ili ’efektorna ćelija’ kao što je ovde korišćeno odnosi se na ćeliju unutar prirodnog repertora ćelija u sisarskom imunom sistemu koje se mogu aktivirati da utiču na vijabilnost ciljne ćelije. Imune efektorne ćelije uključuju limfoidne linije kao što su ćelije prirodne ubice (NK), T ćelije uključujući citotoksične T ćelije, ili B ćelije, ali takođe ćelije mijeloidne linije se mogu smatrati kao imune efektorne ćelije, kao što su monociti ili makrofage, dendritske ćelije i neutrofilni granulociti. Stoga, pomenuta efektorna ćelija je poželjno NK ćelija, T ćelija, B ćelija, monocit, makrofag, dendritska ćelija ili neutrofilni granulocit. Prema pronalasku, regrutovanje efektorskih ćelija protiv aberantnih ćelija označava da su imune efektorne ćelije dovedene u blizinu aberantnih ciljnih ćelija tako da efektorna ćelija može direktno ubiti, ili indirektno inicirati ubijanje aberantnih ćelija za koje su regrutovane. Da bi se izbegle nespecifične interakcije poželjno je da bispecifična antitela prema pronalasku specifično prepoznaju antigene na imunim efektornim ćelijama koji su najmanje prekomerno eksprimirani od strane ovih imunih efektornih ćelija u poređenju sa drugim ćelijama u telu. Ciljni antigeni prisutni na imunim efektornim ćelijama uključuju CD3. Poželjno, antigen na imunoj efektornoj ćeliji je CD3 eksprimiran na T ćelijama. Najpoželjniji antigen na imunoj efektornoj ćeliji je CD3ε lanac. Pokazano je da je ovaj antigen efikasan u regrutovanju T ćelija protiv aberantnih ćelija. Stoga, bispecifično IgG antitelo prema predmetnom pronalasku poželjno sadrži jednu ruku koja specifično prepoznaje CD3ε.

[0015] Stoga, pronalazak obezbeđuje bispecifično IgG antitelo pune dužine prema patentnim zahtevima, naznačeno time da bispecifično antitelo sadrži jednu ruku koja specifično prepoznaje CLEC12A i drugu ruku koja specifično prepoznaje CD3 antigen na imunim efektornim ćelijama sposoban da regrutuje takve ćelije protiv aberantne ćelije koja eksprimira CLEC12A, naznačeno time da pomenute imune efektorne ćelije sadrže T ćelije. Pronalazak obezbeđuje bispecifično IgG antitelo prema pronalasku naznačeno time da pomenuti antigen na pomenutim imunim efektornim ćelijama je CD3, poželjno humani CD3ε.

[0016] Pronalazak obezbeđuje bispecifično IgG antitelo prema patentnim zahtevima naznačeno time da obe ruke sadrže zajednički laki lanac. Termin ’zajednički laki lanac’ prema pronalasku odnosi se na lake lance koji mogu biti identični ili imati neke razlike u sekvenci aminokiselina uz zadržavanje specifičnost vezivanja antitela. Na primer, moguće je unutar obima definicije zajedničkih lanaca kao što je ovde korišćeno, pripremiti ili naći lake lance koji nisu identični, ali su još uvek funkcionalno ekvivalentni, npr., introdukcijom i testiranjem konzervativnih aminokiselinskih izmena, izmena aminokiselina u regionu koje ne doprinose ili samo delimično doprinose specifičnosti vezivanja kada su upareni sa teškim lancem, i slično. Termini ’zajednički laki lanac, ’zajednički VL’, ’jedan laki lanac’, ’jedan VL’, sa ili bez dodavanja termina ’rearanžiran’ su svi ovde korišćeni naizmenično. Predmetni pronalazak koristi kao zajednički lanac humani laki lanac koji može biti kombinovan sa različitim teškim lancima da bi formirao antitela sa funkcionalnim antigen vezujućim domenima (WO2004/009618, WO2009/157771, Merchant et al. 1998, Nissim et al. 1994). Poželjno, zajednički laki lanac ima sekvencu klicine linije. Poželjna sekvenca klicine linije je varijabilni region lakog lanca koji je često korišćen u humanom repertoaru i ima superiornu sposobnost da se uparuje sa mnogim različitim VH regionima, i ima dobru termodinamičku stabilnost, prinos i rastvorljivost. Najpoželjniji laki lanac klicine linije je 012, poželjno rearanžirani humani kapa laki lanac IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 klicine linije (nomenklatura prema IMGT database worldwide web na imgt.org) ili fragment ili njegov funkcionalni derivat. Termin rearanžirani humani kapa laki lanac IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 klicine linije, IGKV1-39/IGKJ1, huVκ1-39 laki lanac ili kratko huVκ1-39 su korišćeni u prijavi. Očigledno, stručnjaci će prepoznati da "zajednički" takođe se odnosi na funkcionalne ekvivalente lakog lanca sa kojom aminokiselinska sekvenca nije identična. Mnoge varijante pomenutog lakog lanca postoje naznačeno time da su prisutne mutacije (delecije, supstitucije, adicije) koje ne utiču suštinski na formiranje funkcionalnih vezujućih regiona.

[0017] U naročito poželjnom primeru izvođenja bispecifično IgG antitelo prema pronalasku je obezbeđeno naznačeno time da ruka koja specifično prepoznaje CLEC12A sadrži CDR1 sekvencu teškog lanca koja se sastoji od sekvence koja nije identična SGYTFTSY i CDR2 sekvencu teškog lanca koja se sastoji od sekvence koja je identična IINPSGGS i CDR3

1

sekvencu teškog lanca koja se sastoji od sekvence koja je identična GTTGDWFD. Navedene CDR sekvence su CDR sekvence Fab ruke 4327 koje, kao što je prikazano u Primerima, imaju dobre osobine vezivanja CLEC12A. Sekvenca teškog lanca Fab ruke 4327, stoga VH CLEC12A-specifičnog antitela 4327, prikazana je na Slici 20. U jednom poželjnom primeru izvođenja, bispecifično IgG antitelo prema pronalasku sadrži varijabilnu sekvencu teškog lanca (VH) koja je identična ovom VH antitela 4327. Dodatno je stoga obezbeđeno bispecifično IgG antitelo prema pronalasku, naznačeno time da ruka koja specifično prepoznaje CLEC12A sadrži VH sekvencu koja se sastoji od sekvence koje je identična sekvenci QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSG GS TSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAKGTTGDWFDYWGQGT LV TVS. Kao što je prikazano u Primerima, bispecifična antitela prema pronalasku koja sadrže prethodno pomenutu VH sekvencu, zajedno sa VH sekvencom Fab ruke koja prepoznaje CD3 (i zajedno sa zajedničkim lakim lancem), imaju odličan kapacitet indukcije T ćelijski posredovane lize CLEC12A-pozitivnih AML tumorskih ćelija.

[0018] U sledećem poželjnom primeru izvođenja obezbeđeno je bispecifično IgG antitelo prema pronalasku naznačeno time da ruka koja specifično prepoznaje CLEC12A sadrži CDR1 sekvencu teškog lanca koja se sastoji od sekvence koja je identična SGYTFTSY i CDR2 sekvencu teškog lanca koja se sastoji od sekvence koja je identična IINPSGGS i CDR3 sekvence teškog lanca koja se sastoji od sekvence koja je identična GNYGDEFDY. Navedene CDR sekvence su CDR sekvence VH regiona antitela 4331 koje, kao što je prikazano u Primerima, imaju dobre CLEC12A vezujuće osobine. VH sekvenca Fab ruke 4331 je takođe prikazna na Slici 20. U jednom poželjnom primeru izvođenja, bispecifično IgG antitelo prema pronalasku sadrži VH sekvencu koja je identična ovom VH Fab ruke 4331. Dodatno je stoga obezbeđeno bispecifično IgG antitelo prema pronlasku, naznačeno time da ruka koja specifično prepoznaje CLEC12A sadrži VH sekvencu koja se sastoji od sekvence koja je identična EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSG GS TSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGNYGDEFDYWGQGT LV TVSS. Kao što je prikazano u Primerima, bispecifična antitela prema pronalasku koja sadrže VH sekvencu Fab ruke 4331, zajedno sa VH sekvencom Fab ruke koja prepoznaje CD3, (zajedno sa zajedničkim lakim lancem) imaju odličan kapacitet indukovanja T ćelijski posredovane lize CLEC12A-pozitivnih AML tumorskih ćelija.

[0019] U sledećem poželjnom primeru izvođenja obezbeđeno je bispecifično IgG antitelo prema pronalasku naznačeno time da druga ruka specifično prepoznaje CD3 i sadrži CDR1 sekvencu teškog lanca koja se sastoji od sekvence SYGMH i CDR2 sekvencu teškog lanca koja se sastoji od sekvence IIWYSGSKKNYADSVKG i CDR3 sekvencu teškog lanca koja se sastoji od sekvence GTGYNWFDP. Poželjno, pomenuta CD3-specifična ruka sadrži VH sekvencu koja se sastoji od sekvence QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRSYGMHWVRQAPGKGLEWVAIIWYSGS K KNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGTGYNWFDPWGQGT LV TVSS. Navedene CDR sekvence i VH sekvenca su sekvence antitela 3896. Ove sekvence su takođe predstavljene na Slici 20. Teški lanac koji sadrži ove CD3-specifične CDR sekvence i/ili navedena VH sekvenca Fab ruke 3896 je poželjna za bispecifično IgG antitelo prema pronalasku, jer ove sekvence obezbeđuju bispecifičnom antitelu optimalni afinitet za imune ćelije koje eksprimiraju CD3, uz to da istovremeno dozvoljavaju dovoljno vezivanje CLEC12A-pozitivnih AML tumorskih ćelija. Bez vezivanja za teoriju, smatra se da je ukupni efekat bispecifičnog antitela određen kombinovanim efektom afiniteta jedne ruke za antigen 1 i afiniteta druge ruke za antigen 2. Za antitelo prema predmetnom pronalasku, imajući specifičnost za CLEC12A i antigen na imunim efektornim ćelijama, CD3, optimizovani tajming vezivanja za CD3-pozitivne imune ćelije i tumorske ćelije koje eksprimiraju CLEC12A je poželjan da bi se efikasno indukovala T ćelijski posredovana liza CLEC12A-pozitivnih tumorskih ćelija. Preptostavlja se da ravnoteža između afiniteta CLEC12A/CD3 bispecifičnog antitela je od najveće važnosti. Smatra se da će značajno veći afinitet za CD3 nasuprot mnogo manjem afinitetu za CLEC12A (tj., preveliki afinitet za CD3) rezultovati u situaciji gde bi antitela primarno vezivala CD3 eksprimirajuće T ćelije. Takve T ćeliije ’napunjene bispecifičnim antitelom’ mogu ili internalizovati njihove CD3 ili mogu izvršiti invaziju okolnih tkiva čime napuštaju cirkulaciju pre nego što su uopšte susrele CLEC12A pozitivne tumorske ćelije. Ovo bi poništilo terapeutski efekat bispecifičnog antitela.

[0020] U povoljnijem načinu dejstva, CLEC12A-pozitivne tumorske ćelije su prvo vezane sa jednim ili više bispecifičnih antitela prema pronalasku, nakon čega su T ćelije privučene slobodnom CD3 rukom bispecifičnog antitela i nakon toga se odigrava aktivacija T ćelija. Alternativno, CD3 pozitivne T ćelije i CLEC12A-pozitivne tumorske ćelije su vezane suštinski istovremeno sa bispecifičnim antitelom. Stoga, afiniteti i za CLEC12A i za antigen imunih efektornih ćelija, CD3, su poželjno izabrane ili modulisane tako da se postiže prava ravnoteža, tj. da će rezultujuća bispecifična antitela ili vezati CLEC12A i CD3 suštinski istovremeno ili će bispecifična antitela imati tendenciju da vezuju CLEC12A-pozitivne tumorske ćelije do dovoljnog stepena, nakon čega se odigrava aktivacija T ćelija i tumorske ćelije su lizirane. Prema predmetnom pronalasku, takva odlična ravnoteža između afiniteta vezivanja za CD3 i CLEC12A je poželjno postignuta kombinovanjem VH koji ima CDR sekvence (ili celu VH sekvencu) Fab ruke 3896 (koja je specifična za CD3) pri čemu VH ima CDR sekvence (ili celu VH sekvencu) bilo kojih Fab ruku 4327 ili 4331 (koje su specifične za CLEC12A). Takva rezultujuća bispecifična antitela pokazuju poželjnu ravnotežu između afiniteta vezivanja za CD3 i CLEC12A, tako da su T ćelije i CLEC12A-pozitivne AML tumorske ćelije efikasno dovedene u međusobni kontakt, i optimalno je indukovana T ćelijski posredovana liza CLEC12A-pozitivnih AML tumorskih ćelija.

[0021] Kao što je ovde prethodno opisano, bispecifično IgG antitelo prema patentnim zahtevima je obezbeđeno naznačeno time da obe ruke sadrže varijabilni region zajedničkog lakog lanca. Naročto poželjan zajednički laki lanac je humani rearanživani kapa laki lanac IgVκ1-39*01/IgJκ1*01, takođe nazvan 012. Nukleotidna i aminokiselinska sekvenca 012 VL su takođe predstavljene na Slici 20. CDR sekvence su bold i podvučene. Bispecifično antitelo prema pronalasku koje sadrži zajednički laki lanac koji najmanje sadrži CDR sekvence 012 je stoga obezbeđen. Jedan aspekt pronalaska stoga obezbeđuje bispecifično IgG antitelo prema pronalasku, naznačeno time da prva i druga ruka dodatno sadrže CDR1 sekvencu lakog lanca koja se sastoji od sekvence koja je identična RASQSISSYLN i CDR2 sekvencu lakog lanca koja se sastoji od sekvence koja je identična AASSLQS i CDR3 sekvencu lakog lanca koja se sastoji od sekvence koja je identična QQSYSTPPT. Bispecifično IgG antitelo prema pronalasku sadrži VL sekvencu koja je identična sa 012 VL lancem. Dodatno je stoga obezbeđeno bispecifično IgG antitelo prema pronalasku, naznačeno time da prva i druga ruka sadrže VL sekvencu koja se sastoji od sekvence koja je identična sekvenci

[0022] Bispecifično IgG antitelo pune dužine prema pronalasku po definiciji ima dva različita mesta za vezivanje antigena ali Fc region IgG takođe sadrži treće vezujuće mesto za Fc receptor. Ukoliko ćelija nosi i Fc receptor i jednu od ciljnih struktura bispecifičnog antitela, na površini pomenute ćelije može se odigrati unakrsno vezivanje Fc receptora i pomenute ciljne strukture, što može voditi neželjenim efektima. U poželjnom primeru izvođenja pronalazak obezbeđuje bispecifično IgG antitelo pune dužine prema pronalasku, naznačeno time da bispecifično IgG antitelo ima mutirani donji zglob i/ili CH2 domen tako da je interakcija pomenutog IgG antitela sa Fc gama (Fcγ) receptorima značajno smanjena. Kao što

1

je ovde korišćeno, termin" tako da je interakcija pomenutog IgG antitela sa Fc gama receptorima značajno smanjena" označava da je sposobnost pomenutog bispecifičnog IgG antitela da interaguje sa of Fc gama receptorima, ukoliko su takvi Fc gama receptori prisutni u blizini pomenutog antitela, je smanjena. Stoga, prema pronalasku region antitela, poželjno donjeg zgloba i/ili CH2 domena antitela je mutiran (tipično ekspresijom mutirane sekvence nukleinske kiseline koja ga kodira) čime se sposobnost da interaguje sa Fc receptorom poništava. Poželjno je da je interakcija sa Fc receptor je suštinski ukinuta. Aminokiselinski ostaci u humanom IgG1 koji su uključeni u vezivanje za Fcγ receptore prethodno. Dodatno ostaci koji, kada su promenjeni, su poboljšali vezivanje samo sa specifičnim receptorima ili istovremeno poboljšavali vezivanje sa jednim tipom receptora i smanjeno vezivanje sa drugim tipom, pronađeno je nekoliko ostataka koji su ukinuli vezivanje sa jednim ili više receptora (Shields RL et al. JBC 2001 (276) 6591-6604; Armour et al. Mol. Immunol. 2003 (40) 585-593). U dodatnom poželjnom primeru izvođenja, pomenuti mutirani donji zglob i/ili CH2 domeni sadrže najmanje jednu supstituciju na aminokiselinskim položajima 235 i/ili 236 (numerisanje prema Kabat). Poželjno, oba aminokiselinska položaja 235 i 236 su supstituisana. Pokazano je u primerima da supstitucije na ovim mestima su sposobne da suštinski spreče interakciju između bispecifičnog antitela i Fc receptora prisutnog na tumorskim ćelijama. Naročito je pokazano da supstitucije L235G i/ili G236R su veoma pogodne za tu svrhu. Bispecifično IgG antitelo prema pronalasku, naznačeno time da pomenute mutirane CH2 i/ili domeni donjeg zgloba sadrže supstituciju L235G i/ili G236R, je stoga takođe ovde obezbeđeno. Poželjno, oba L235G i G236R su supstituisani. Alternativno, stručnjak može introdukovati mutacije donjeg zgloba i/ili CH2 domena koje sadrže supstitucije 234F, 235E i/ili 331S (Oganesyan et al. Biol. Crystall.2008(D64)700). Poželjno, sve tri supstitucije su introdukovane u ovoj alternativi.

[0023] U našoj privremenoj SAD prijavi 61/635,935, koja je praćena sa SAD regularnom prijavom br. 13/866,747 i PCT prijavom br. PCT/NL2013/050294, otkrivamo postupke i sredstva za proizvodnju bispecifičnih antitela iz pojedinačne ćelije, pri čemu su obezbeđena sredstva koja favorizuju formiranje bispecifičnih antitela u odnosu na formiranje monospecifičnih antitela. Ovi postupci se takođe mogu povoljno upotrebiti u predmetnom pronalasku. Stoga pronalazak obezbeđuje postupak prema patentnim zahtevima za proizvodnju bispecifičnog IgG antitela pune dužine prema pronalasku iz pojedinačne ćelije. Pomenuti prvi i drugi molekuli nukleinske kiseline mogu biti deo istog vektora ili vehikuluma za isporuku gena i mogu biti integrisani na istom mestu genoma ćelije domaćina. Alternativno, pomenuti prvi i drugi molekuli nukleinske kiseline su zasebno obezbeđeni pomenutoj ćeliji.

[0024] Poželjan primer izvođenja obezbeđuje postupak za proizvodnju bispecifičnog IgG antitela pune dužine prema pronalasku iz pojedinačne ćelije, naznačeno time da bispecifično IgG antitelo sadrži dva CH3 domena koij su sposobni da formiraju interfejs, pomenuti postupak sadrži obezbeđivanje:

- ćelije koja ima a) sekvencu prve nukleinske kiseline koja kodira pomenuti IgG teški lanac koji specifično prepoznaje CLEC12A i koji sadrži prvi CH3 domen, i b) sekvencu druge nukleinske kiseline koja kodira pomenuti IgG teški lanac koji specifično prepoznaje antigen na imunim efektornim ćelijama, CD3, i koji sadrži drugi CH3 domen, naznačeno time da pomenute sekvence nukleinske kiseline su obezbeđene sa sredstvima za preferencijalno uparivanje pomenutih prvih i drugih CH3 domena, pomenuti postupak dodatno sadrži korak kultivisanja pomenute ćelije i omogućavanje ekspresije pomenute dve sekvence nukleinske kiseline i sakupljanje pomenutog bispecifičnog IgG antitela iz kulture. Pomenuta ćelija takođe ima treću sekvencu nukleinske kiseline koja kodira zajednički laki lanac prema patentnim zahtevima. Poželjni zajednički laki lanac je 012, poželjno rearanžirani humani kapa laki lanac klicine linije IgVκ1-39*01/IGJκ1*01, kao što je prethodno opisano. Poželjne mutacije da bi se suštinski proizveli samo bispecifični IgG molekuli pune dužine su supstitucije aminokiselina L351K i T366K (numeracija prema Kabat) u prvom CH3 domenu i aminokiselinske supstitucije L351D i L368E u drugom CH3 domenu, ili obrnuto. Dodatno je stoga obezbeđen postupak prema pronalasku za proizvodnju bispecifičnog IgG1 antitela, naznačeno time da prvi CH3 domen sadrži aminokiselinske supstitucije L351K i T366K (numerisanje prema Kabat) i naznačeno time da pomenuti drugi CH3 domen sadrži aminokiselinske supstitucije L351D i L368E, pomenuti postupak dodatno sadrži korak kultivisanja pomenute ćelije i omogućavanje ekspresije pomenute sekvence nukleinske kiseline i sakupljanje pomenutog bispecifičnog antitela iz kulture. Takođe je obezbeđen postupak prema pronalasku za proizvodnju bispecifičnog IgG1 antitela, naznačeno time da prvi CH3 domen sadrži aminokiselinske supstitucije L351D i L368E (numerisanje prema Kabat) i naznačeno time da pomenuti drugi CH3 domen sadrži aminokiselinske supstitucije L351K i T366K, pomenuti postupak dodatno sadrži korak kultivisanja pomenute ćelije i omogućavanje ekspresije pomenute sekvence nukleinske kiseline i sakupljanje pomenutog bispecifičnog antitela iz kulture. Antitela koja se mogu proizvesti ovim postupcima su takođe deo predmetnog pronalaska.

1

[0025] Pronalazak dalje obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži bispecifično IgG antitelo prema pronalasku i farmaceutski prihvatljiv nosač. Kao što je ovde korišćeno, takav ’farmaceutski prihvatljiv nosač’ uključuje bilo koji i sve rastvarače, soli, medijume za disperziju, obloge, antibakterijske i antigljivične agense, izotonična i sredstva za odlaganje apsorpcije, i slično koji su fiziološki kompatibilni. U zavisnosti od puta primene (npr., intravenski, potkožno, intra-artikularno i slično) aktivno jedinjenje može biti obloženo u materijalu da zaštiti jedinjenje od dejstva kiselina i drugih prirodnih uslova koji mogu deaktivirati jedinjenje.

[0026] Antitela i farmaceutske kompozicije prema pronalasku nalaze svoju upotrebu u tretmanu različitih leukemija i pre-leukemijskih bolesti mijeloidnog porekla ali takođe i B ćelijskih limfoma. Bolesti koje se mogu tretirati prema pronalasku uključuju mijeloidne leukemije ili pre-leukemijske bolesti kao što su AML, MDS i CML i Hodgkin-ovi limfomi i većina ne-Hodgkin-ovih limfoma. Stoga pronalazak obezbeđuje bispecifično IgG antitelo pune dužine prema pronalasku za upotrebu kao farmaceutika u tretmanu mijelodisplastičnog sindroma (MDS), hronične mijelogene leukemije (CML) ili poželjno akutne mijeloidne leukemije (AML). Takođe je predviđena upotreba bispecifičnog IgG antitela prema pronalasku za pripremu medikamenta za tretman ili prevenciju mijelodisplastičnog sindroma (MDS), hronične mijelogene leukemije (CML) ili poželjno akutne mijeloidne leukemije (AML).

[0027] Količina antitela prema pronalasku koje se primenjuje na pacijenta je tipično u terapeutskom opsegu, što znači da dovoljna količina je korišćena za dobijanje terapeutskog efekta, uz to da količina ne pređe vrednost praga što vodi do neprihvatljivog stepena sporednih efekata. Što je potrebna niža količina antitela za dobijanje željenog teraputskog efekta, tipično biće veći terapeutski opseg. Antitelo prema pronalasku koje daje dovoljne terapeutske efekte na niskoj dozi, stogaje poželjno.

[0028] Približno 30.000 pacijenata je dijagnostifikovano svake godine sa akutnom mijeloidnom leukemijom (AML) u Evropi i SAD. Većina ovih pacijenata su 60 godina starosti ili stariji. Starije doba je glavna negativna determinanta ishoda AML i dugoročno preživljavanje (na 5 godina) intenzivno tretiranih starijih AML pacijenata je približno 10%. Kod skoro svih pacijenata koji su postigli remisiju nakon indukovane hemoterapije, uočena je progresija bolesti unutar 3 godine. Trenutni post-remisioni tretman je pokazao ograničenu, ukoliko bilo kakvu, vrednost kod starijih pacijenata sa AML. Stoga, ostaje značajno opterećenje rezidualne rezistentne leukemije, i subpopulacija leukemijskih ćelija rezistentnih na lekove koja preživljava brzo dovodi do ponovne pojave bolesti. Novi tipovi lekova sa potpuno drugačijim načinima dejstva su potrebni da bi se ciljno delovalo na ove AML

1

tumorske ćelije koje ne odgovaraju na hemoterapiju u naporima da se indukuju i održe potpune remisije. Iako se kompletna remisija (CR) može postići sa određenim brojem intenzivnih hemoterapijskih kombinacija u više od 50% starijih AML pacijenata i oko 80% kod mlađih pacijenata, napredovanje odgovora ili preživljavanje ostao je glavni istraživački izazov. U nedavno objavljenoj mrežnoj meta-analizi 65 randomizovanih kliničkih studija (15.110 pacijenata) kod starijih pacijenata sa AML većina popravljenih istraživačkih indukcionih režima imala je slične ili čak gore profile efikasnosti u poređenju sa konvencionalnim 3+7 indukcionim režimom sa daunorubicinom i citarabinom. Ovaj standardni tretman AML je povezan sa visokim morbiditetom i čak mortalitetom. Većina pacijenata je u CR relapsu usled preostalih leukemijskih stem ćelija nakon hemoterapije. Dodatna intenzifikacija doze je ograničena usled neprihvatljive toksičnosti. Hitna potreba za nove načine tretmana poželjno sa manje toksičnosti se stoga pojavljuje naročito kod starijih pacijenata sa AML.

[0029] Tretman hemoterapijski neresponsivnih AML može se postići angažovanjem T ćelija iz pacijentovog sopstvenog imunog sistema i AML tumorskih ćelija korišćenjem bispecifičnog antitela. Na taj način, imuni sistem pacijenta je ojačan i preusmeren da napada i istrebljuje AML tumorske ćelije. Predmetni pronalazak obezbeđuje CD3xCLEC12A bispecifična IgG antitela koja efikasno indukuju lizu AML tumorskih ćelija. CD3xCLEC12A bispecifična antitela su stoga terapija sa ciljanim dejstvom sa manje sporednih efekata koja specifično istrebljuje leukemijske stem ćelije da bi se poboljšala prognoza AML pacijenata. Zbog toga što je CLEC12A eksprimiran na leukemijskim stem ćelijama (LSC) i ne na normalnim hematopoetskim stem ćelijama, terapija usmerena protiv ovog antigena (kao što je pokazano in vitro) istrebiće LSC uz poštedu normalne stem ćelije. Najverovatnije će imati najveći uticaj na situacije kod minimalne rezidualne bolesti (MRD). Očekuje se da će procenat relapsa pasti usled istrebljivanja MRD. Na taj način uticaj ovog novog načina tretmana na pacijenta bi bio manje toksični tretman sa manjim procentom relapsa što rezultuje u poboljšanju ishoda povezanim sa boljim kvalitetom života. Ova IgG bispecifična antitela pune dužine su klinički procenjena kod relapsnih AML pacijenata. Klinička efikasnost je analizirana korišćenjem smanjenja AML blasta u kostnoj srži kao objektivni kriterijum odgovora. Efikasno bispecifično IgG za AML obezbeđuje novu terapeutsku opciju za veliki segment pacijenata za koje trenutno nije dostupan tretman. Dodatno obezbeđivanju sredstava da se postigne dugotrajna remisija, ova opcija tretmana takođe ima lekoviti potencijal za AML kada je primenjena tokom remisije.

PRIMERI

1

Primer 1: Stvaranje i funkcionalna karakterizacija kandidata CD3xCLEC12 bispecifičnog IgG1

[0030] Da bi se validirao koncept ciljanog dejstva imune efektorne ćelije na aberantnu ćeliju sa bispecifičnim IgG pune dužine, kandidat CD3XCLEC12A bispecifični IgG1 je generisan za koji su CD3 i CLEC12A Fab ruke izvedene iz prethodno opisanih antitela. U CD3 Fab ruci, VH region iz anti-CD3 antitela 15C3, korišćeno je jedno od CD3-specifičnih antitela kao što je otkriveno u WO2005/118635, i ovaj VH je označen kao ’3056’. U CLEC12A Fab ruci, VH region iz scFv SC02-357, korišćeno je jedno od CLEC12A-specifičnih antitela kao što je otkriveno u WO2005/000894, (nadalje nazvano ’CLEC12A benčmark [Fab ruka ili antitelo]’; alternativno ovaj VH je označen kao’3116’). Nukleotidne i aminokiselinske sekvence VH od CD3 ruke (3056), kao i nukleotidne i aminokiselinske sekvence VH od CLEC12A ruke (3116) ovog kandidat molekula, koji je označen kao kandidat 3056x3116, obezbeđeni su na Slici 20. Nukleotidne i aminokiselinske sekvence zajedničkog VL (huVκ1-39; 012) su takođe obezbeđene na Slici 20.

[0031] Respektivni VH regioni su klonirani u ekspresione vektore korišćenjem postupaka poznatih u tehnici za proizvodnju bispecifičnog IgG1 (Gunasekaran et al. JBC 2010 (285) 19637-19646; WO2009/089004), zajedno sa rearanžiranim humanim IGKV1-39/IGKJ1 (huVκ1-39) lakim lancem. Prethodno je pokazano da je huVκ1-39 sposobno da se upari sa više od jednog teškog lanca čime se stvaraju antitela sa različitim specifičnostima, što olakšava generisanje bispecifičnih molekula (De Wildt RM et al. J. Mol. Biol. 1999 (285) 895-901; De Kruif et al. J. Mol. Biol.2009 (387) 548-58; WO2009/157771).

[0032] Prvo, vezivanje kandidat 3056x3116 CD3xCLEC12A bispecifičnog IgG1 za CD3ε na HPB-ALL ćelijama je demonstrirano protočnom citometrijom, koja je izvedena prema standardnim procedurama poznatim u tehnici (Tabela 1). Vezivanje za ćelijski eksprimirani CD3ε je potvrđeno korišćenjem CHO ćelija transficiranih sa CD3δ/ε ili CD3γ/ε. Vezivanje kandidat 3056x3116 bispecifičnog IgG1 za CLEC12A je određeno korišćenjem CHO ćelija transficiranih sa CLEC12A ekspresionim konstruktom; CD3 monospecifično antitelo (3056x3056) i CLEC12A monospecifično antitelo (3116x3116), kao i irelevantna IgG1 izotip kontrola mAb uzeti su kao kontrola.

Tabela 1. Vezivanje za ćelijski eksprimirane CD3 i CLEC12A preko protočne citometrije.

1

*Rezultati su dati kao srednja vrednost intenziteta fluorescencije.

[0033] Merenja afiniteta kandidat 3056x3116 bispecifičnog IgG1 za CD3δ/ε i ekstracelularni domen CLEC12A određena su površinskom plazmon rezonancom (BIAcore). Ukratko, prečišćeni rekombinantni antigeni su kovalentno kuplovani sa površinom CM5 senzor čipa korišćenjem hemije slobodnog amina: antigeni su razblaženi u kAc puferu do 10 µg/ml i kuplovani sa površinom koja je aktivirana sa NHS/EDC (prema preporukama proizvođača). Da bi se odredili afiniteti Fab ruku prisutnih u bispecifičnim antitelima, serijski su razblaženi do 100, 50, 20, 10, 1 i 0.1 nM u Hepes puferovanom fiziološkom rastvoru (HBS) i pušteni da protiču preko antigen-kuplovane površine CM5 senzor čipa pri visokoj (30 µg/min) stopi protoka (da bi se sprečilo ponovno vezivanje). Protočna ćelija 1 (FC1) je korišćena kao kontrolna (blanko) površina i odgovori (senzorgrami) koji rezultuju sa ove površine su oduzeti od odgovora merenih na drugim protočnim ćelijama (FC). FC2 i FC3 su korišćene za dva različita antigena prepoznata od strane bispecifičnog antitela, da bi se mogli izmeriti afiniteti obe ruke Fab u jednom kinetičkom propuštanju kroz sve tri površine. Kako se koncentracija antitela ne menja značajno pri protoku preko antigen-kuplovane površine, stope asocijacije (koje su zavisne od koncentracije) bispecifičnih antitela su istovremeno merene na dva različita antigena koja prepoznaju. Senzorgrami faza asocijacije i disocijacije različitih bispecifičnih proteina su tako dobijeni. Korišćenjem BIA evaluacionog softvera i fitovanja krive sa 1:1 modelom interakcije (za monovalentnu interakciju), određeni su afiniteti Fab ruku. U slučaju da je vezivanje bispecifičnog proteina za antigen-obloženu površinu senzor čipa kompromitovano (tj., kada se veoma malo proteina veže, što rezultuje u niskim odgovorima i/ili veoma brzoj stopi disocijacije), obrnuta je postavka eksperimenta: bispecifično antitelo je kovalentno kuplovano za površinu senzor čipa korišćenjem hemije slobodnog amina i rekombinantni prečišćeni antigen pušten je u protok preko površine na visokoj (30 µl/min) stopi protoka da bi se izmerilo afinitet Fab ruke usmerene ka tom antigenu.

[0034] Sledeće, testirana je funkcionalnost kandidat 3056x3116 CD3xCLEC12A bispecifičnog Ig. Prvo, istraživan je stimulatorni kapacitet T-ćelija sa mirujućim T-ćelijama zdravog donora. Ukratko, periferna krv je dobijena od zdravih donora nakon dobijanja. T-ćelije su izolovane standardnom izolacijom na osnovu gradijenta gustine da bi se obogatilo sa mononuklearnim ćelijama periferne krvi (PBMC), nakon čega je izvršena negativna selekcija

1

korišćenjem magnetnih kuglica, (pan T-cell kit, Miltenyi Biotec, cat.no.130-091-155). Korišćenjem strategije prečišćavanja, T-ćelije su bile tzv. ’nedirnute’ (tj., nisu obojene antitelima, tzv. ’mirujuće T-ćelije’) da bi se ograničila mogućnost preaktivacije. Prećišćene mirujuće T-ćelije su nakon toga inkubirane sa ćelijama izvedenim iz HL60 ćelijske linije leukemije u 10% fetalnom goveđem serumu (FBS) ili 10% normalnom humanom serumu (HS) na odnosu efektor: ciljna ćelija od 10:1 u trajanju od dva dana. Rezultati su izraženi kao procenat CD69-pozitivnih ili CD25-pozitivnih ćelija unutar CD4-pozitivne ili CD8-pozitivne T-ćelijske populacije.

[0035] I bivalentni CD3 IgG i CD3XCLEC12A bispecifični IgG efikasno su indukovali ushodnu regulaciju T-ćelijskih aktivacionih markera CD69 i CD25 na CD4-pozitivnim i CD8-pozitivnim T-ćelijama (SL. 2). U prisustvu FBS koji nije blokirao Fc receptore prisutne na HL60 ćelijama (Liesveld et al. 1988, J. Immunol. 140(5), pages 1527-1533), takođe je pokazano da kontrolni bispecifični molekul CD3Xizotip kontrola IgG indukuje aktivaciju T-ćelija. Ovaj efekat je poništen u prisustvu HS, što sugeriše da uočena aktivacija T-ćelija sa monovalentnim CD3 vezivanjem CD3Xizotip kontrola IgG je bila zavisna od Fc unakrsnog vezivanja. Međutim, aktivacija T-ćelija indukovana sa kandidat 3056x3116 CD3xCLEC12A bispecifičnim IgG bila je samo delimično zavisna od Fc-interakcija, jer je potencija ushodne regulacije CD69 i CD25 u velikoj meri zadržana u prisustvu HS (SL.2). Ovo je ukazalo da je unutrašnja potencija monovalentnog CD3 vezivanja bila dovoljna da aktivira T-ćelije kada je vezujući molekul premošćen sa CLEC12A antigenom na HL60 ciljnim ćelijama nakon vezivanja sa drugom Fab rukom.

[0036] Da bi se ispitalo da li je stepen T-ćelijske aktivacije sa kandidat 3056x3116 CD3XCLEC12A bispecifičnim IgG dovoljan da indukuje lizu ciljnih ćelija, HL60 ćelije u ovoj analizi su obeležene sa karboksifluorescein diacetat sukcimidil estrom (CFSE) i kokultivisane sa T-ćelijama na različitim odnosima efektor:ciljna ćelija. Nakon jednog, dva ili tri dana, preživele CFSE-pozitivne HL60 ćelije su kvantifikovane protočnom citometrijom. Rezultati su izraženi kao procenat specifične lize u odnosu na PBS.

[0037] Kao što je očekivano, CD3 monospecifični bivalentni IgG indukovao je ubijanje HL60 ćelija posredovano mirujućim T-ćelijama (SL.3). Iznenađujuće, CD3XCLEC12A bispecifični monovalenti IgG i kontrolni CD3Xizotip kontrola takođe je indukovao ubijanje HL60 ćelija posredovano mirujućim T-ćelijama. Ovi efekti su bili najuočljiviji kada je analiza izvedena u odsustvu viška humanog IgG, tj., kada Fc receptori na HL60 ciljnim ćelijama nisu bili blokirani (FBS uslovi; SL. 3). Iznenađujuće, čak i u prisustvu viška humanog IgG (10% HS uslovi) CD3XCLEC12A bispecifični IgG bio je veoma efikasan u ubijanju HL60 ćelija ukazujući da indukcija HL60 lize nije zavisna od interakcija Fcγ receptora. Na dan 3 takođe je

2

uočena liza HL60 indukovana sa CD3Xizotip kontrola, verovatno usled nekompletne Fcgama receptor blokade nakon produžavanja perioda inkubacije. Ubijanje HL60 ciljne ćelije je variralo sa različitim odnosima efektor:ciljna ćelija (SL.4).

[0038] Kao zaključak, ovaj primer pokazuje da je CD3xCLEC12A bispecifični molekul potentni induktor lize tumorskih ćelija posredovane T ćelijama i potvrđuje našu hipotezu da angažovanje T ćelija za efikasno ubijanje aberantnih ćelija može biti posredovano sa CD3xCLEC12A IgG1 bispecifičnim antitelom pune dužine. Iznenađuje, aktivnost indukovana sa CD3XCLEC12A bispecifičnim IgG nije zavisna od interakcija Fcγ receptora. Da bi se proširio panel CD3XCLEC12A bispecifičnog IgG pune dužine da bi se došlo do finalnog kliničkog kandidata, generisani su paneli CD3 Fab ruku i CLEC12A Fab ruku. Validacija specifičnosti i funkcionalnosti CD3 i CLEC12A Fab ruku urađena je fiksiranjem druge ruke korišćenjem respektivnog Fab od kandidat 3056x3116 CD3XCLEC12A bispecifičnog IgG pokazanog u trenutnom primeru.

Primer 2: Generisanje i karakterizacija CD3 Fab ruku za CD3xCLEC12 bsAb

[0039] Primer 1 pokazao je da CD3xCLEC12A bispecifični molekuli mogu biti potentni induktori lize tumorskih ćelija posredovane T ćelijama. Stoga, da bi se generisali ekstenzivniji paneli takvih bispecifičnih molekula generisani su zasebni paneli CD3 vezujućih molekula kao i CLEC12A vezujućih molekula.

[0040] Za generisanje panela CD3 vezujućih molekula, CD3ε-specific VH regioni su generisani imunizacijom miševa transgenih za huVκ1-39 laki lanac (WO2009/157771) i za humani teški lanac (HC) minilokus sa CD3ε u različitim formatima: (1) izolovani CD3δ/ε ili CD3γ/ε koji može biti fuzionisan ili kuplovan sa molekulom nosača (kao što je humani IgGFc ili His-tag) kao što je poznato u tehnici sa ili bez ađuvansa, (2) ćelije koje eksprimiraju CD3δ/ε ili CD3γ/ε, ili (3) DNA konstrukt koji kodira CD3δ/ε ili CD3γ/ε, ili kombinacija ovih strategija. Od imunizovanih miševa koji pokazuju dovoljan antigen-specifični titar kao što je određeno sa ELISA i/ili protočnom citometrijom, sakupljene su slezine i/ili limfni čvorovi od koji su generisani Fab fagne biblioteke. Alternativno, sekvence VH regiona su izvedene direktno iz materijala iz slezine i limfnog čvora preko dubokog sekvenciranja (SAD privremena prijava 61/539,116 u ko-postupku).

[0041] Antigen-specifične Fab ruke su selektovane iz fagnih biblioteka od imunizovanih miševa ili od sintetičkih biblioteka fagnog prikaza koje sadrže VL region huVκ1-39 lakog lanca i kolekciju humanih VH regiona. Za generisanje sintetičkih biblioteka, korišćeni su randomizovani CDR3 prajmeri kao što je opisano u De Kruif et al. 1995, J Mol Biol 248(1), pages 97-105. Bakteriofagi iz ovih biblioteka su izabrani u više rundi za vezivanje za izolovani CD3δ/ε protein koji se može kuplovati sa molekulom nosača (videti prethodno) ili za ćelije koje eksprimiraju CD3ε kao što su HPB-ALL ili ćelije transfektovane da eksprimiraju CD3δ/ε ili CD3γ/ε, ili kombinacija ovih strategija. Ne-vezujući fagi su uklonjeni i vezujući fagi su eluirani sa kiselim puferom ili, da bi se usmerio selektovani Fab repertoar na željenu specifičnost, sa antitelima na specifični epitop, na primer sa antitelima koja su unakrsno reaktivna sa CD3ε makaki majmuna. Ovi fagi su zatim trasfektovani u kompetentne bakterije koje su uzgajane pod selekcionim pritiskom za bakterije koje sadrže fage. Nakon uzimanja određenog broja preživelih bakterijskih kolonija, fagi su spaseni i podvrgnuti sledećoj rundi selekcije.

[0042] Nakon završetka selekcije, izvršen je skrining preostalih faga za vezivanje za ćelije koje eksprimiraju antigen preko protočne citometrije i za izolovani antigen sa ELISA. Kao pozitivna kontrola za vezivanje, benčmark CD3 antitela su korišćena kao što su poznata u tehnici, npr., OKT-3. Nukleotidni materijal od suštinski svih faga koji su pokazali specifično vezivanje za ćelije koje eksprimiraju antigen podvrgnut je PCR kolonije da bi se umnožili VH regioni i PCR sekvence da bi se odredila sekvenca VH regiona. Rezultujuće sekvence su klasterovane na osnovu jedinstvenosti njihovog HCDR3. Za sekvence izvedene iz imunizovanih miševa, u kojima se može dogodtiti (ograničena) somatska hipermutacija, VH sekvence su dodatno grupisane na osnovu verovatnoće jedinstvenog VDJ (tj., ukoliko HCDR3 u različitim klasterima sadrži <2 aminokiselinske razlike, smatraju se delom istog klastera i grupisani su zajedno). Iz svakog klastera, jedan ili nekoliko VH regiona po klasteru su izabrani za kloniranje u vektore za ekspresiju u IgG monospecifičnom bivalentnom formatu zajedno sa huVκ1-39 lakim lancem. VH regioni za svako specifično vezivanje za izolovani antigen i ćelijski eksprimirani antigen su potvrđeni i nakon toga klonirani u vektore za ekspresiju u CD3XCLEC12A bispecifičnom formatu. Ovi su zatim karkaterisani da bi se izabrao kandidat sa terapeutskim potencijalom (videti sledeće primere).

Primer 3: Generisanje i karakterizacija CLEC12 Fab ruku za CD3xCLEC12 bsAb

[0043] Kao što je demonstrirano u Primeru 1 da CD3xCLEC12A bispecifični molekuli imaju potenciju da indukuju lizu ćelija tumora posredovanu T ćelijama, sledeće što smo želeli je da ustanovimo ekstenzivnije panele takvih bispecifičnih molekula. Dodatno panelu CD3 vezujućih molekula kao što je opisano u Primeru 2 takođe smo generisali panel CLEC12A vezujućih molekula.

[0044] Ukratko, CLEC12A-specifične Fab ruke su selektovane iz Fab sintetičke biblioteke fagnog prikaza koje su sadržale rearanžirani humani IGKV1-39/IGKJ1 VL region i kolekciju humanih VH regiona (De Kruif et al. Biotechnol Bioeng. 2010 (106)741-50). Bakteriofagi iz ovih baza su selektovani u dve runde za vezivanje za CLEC12A. Ovo je urađeno inkubacijom sa ekstracelularnim domenom CLEC12A (aminokiseline 75 do 275) kuplovane sa His-tag (Sino Biological, cat.no. 11896-H07H) koji je obložen na površinu. Ne-vezujući fagi su uklonjeni, vezujući fagi su hemijski eluirani, i korišćeni da inficiraju bakterije koje su uzgajane pod selekcionim pritiskom za bakterije koje sadrže fage. Nakon uzimanja određenog broja preživelih bakterijskih kolonija, fagi su spaseni i podvrgnuti sledećoj rundi selekcije i propagacije.

[0045] Nakon završetka selekcije, izvršen je skrining preostalih faga za vezivanje za CLEC12A eksprimiran na HL60 liniji ćelija tumora preko protočne citometrije. Kao pozitivna kontrola za vezivanje, korišćeno je benčmark CLEC12A antitelo. Nukleotidni materijal od suštinski svih faga koji su pokazali specifično vezivanje za ćelije koje eksprimiraju CLEC12A podvrgnut je PCR kolonije da bi se umnožili VH regioni i PCR sekvence da bi se odredila sekvenca VH regiona. Rezultujuće sekvence su klasterovane na osnovu jedinstvenosti njihovog HCDR3. VH regioni iz svakog jedinstvenog HCDR3 klastera su klonirani u vektore za ekspresiju u IgG monospecifičnim ili bispecifičnim formatima zajedno sa rearanžiranim humanim IGKV1-39/IGKJ1 LC.

[0046] Tri izabrana CLEC12A vezujuća molekula sa jedinstvenom HCDR3 sekvencom pokazala su željeni profil u IgG formatu, koji je sadržao sledeće karakteristike (Tabela 2 i podaci nisu prikazani):

[0047] Specifično vezivanje za izolovani ekstracelularni domen CLEC12A.

[0048] Specifično vezivanje CLEC12A eksprimiranog na tumorskoj ćelijskoj liniji.

[0049] Potvrda ekspresionog obrasca specifičnog za mijeloidnu liniju na humanim PBMC.

Tabela 2: Karakerizacija CLEC12A Fab ruku

2

* Testirano sa ELISA, ekstracelularni domen CLECI2A (Sino Biological) obložen sa 2 µg/ml, rezultati dati kao optička gustina (referentni signal izotip kontrola: 0.127).

** Testirano sa protočnom citometrijom na HL60 ćelija sa optimizovanom IgG koncentracijom, rezultati dati kao srednja vrednost intenziteta fluorescencije (referentni signal izotip kontrola: 116).

*** Testirano sa ELISA sa Fab formatom, nasuprot benčmark IgG na 20 µg/ml.

Primer 4: Selekcija funkcionalne CLEC12 Fab ruke za CD3xCLEC12 bsAb

[0050] Selektovane CLEC12A Fab ruke kao što su opisane u Primeru 3 su naknadno eksprimirane u bispecifičnom IgG formatu sa novom CD3 Fab rukom kao fiksiranom rukom. Ova nova CD3 Fab ruka, označena kao ’3896 CD3 IgG’ ili skraćeno ’3896’, takođe koristi huVκ1-39 laki lanac. Nukleotidne i aminokiselinske sekvence ovog CD3-specifičnog VH kandidata 3896 su prikazane na Slici 20. Stoga, različiti bispecifični CD3XCLEC12A molekuli su eksprimirani koji su svi imali istu 3896 anti-CD3 ruku, ali koji su se razlikovali u CLEC12A ruci (ili CLEC12A benčmark ruka, ili bilo koja od kandidat CLEC12A Fab ruku 4327, 4331 ili 3918). Ovi CD3XCLEC12A bispecifični molekuli su zatim funkcionalno testirani u testu lize ciljnih ćelija kao što je opisano u Primeru 1. Rezultati su eksprimirani kao procenat specifične lize u odnosu na izotip kontrolu. Sve kandidat CLEC12A Fab ruke pokazale su dozno zavisnu specifičnu lizu HL60 ciljnih ćelija u bispecifičnom formatu, sa kinetikama koje su bile slične ili bolje nego kada je korišćena CLEC12A benčmark Fab arm (SL. 5).

[0051] Takođe, CD3xizotip kontrola bsAb pokazala je dozno zavisnu lizu ciljnih ćelija, iako su bile potrebne 1 log više koncentracije za isti stepen specifične lize. Uprkos prisustvu viška humanog IgG preko dodavanja HS, aktivnost ubijanja ovog monovalentnog CD3 IgG bila je i dalje očigledna, verovatno preko Fc-posredovanog unakrsnog vezivanja. Kao što će biti jasno iz Primera 7, ova ciljna ne-specifična liza zaista može biti potpuno ukinuta preko utišavanja interakcije Fc receptora sa CH2 inženjeringom.

Primer 5: Efikasnost CD3xCLEC12 proizvoda kandidata korišćenjem AML T ćelija i/ili AML tumorskih ćelija

[0052] Primeri 1 i 4 demonstrirali su potenciju CD3XCLEC12A bispecifičnog IgG korišćenjem CD3 Fab ruke 3056 ili 3896 i korišćenjem CLEC12A Fab ruke kandidata 4327, 4331 ili 3918 ili CLEC12A benčmark Fab ruke 3116 u indukciji lize ciljnih HL60 ćelija posredovane sa mirujućim T-ćelijama zdravog donora. U predmetnom primeru, proučavano je da li T-ćelije izvedene iz pacijenata sa AML, jedna od primarnih indikacija za terapeutsku primenu CD3XCLEC12A bispecifičnog leka, mogu biti stimulisane da ubiju tumorske ciljeve nakon stimulacije sa CD3XCLEC12A bispecifičnim IgG pune dužine. Sledeće, određeno je da li T-ćelije izvedene iz pacijenta mogu ubiti blastove autologih AML tumorskih ćelija nakon stimulacije sa CD3XCLEC12A bispecifičnim IgG pune dužine.

[0053] T-ćelije su izolovane iz periferne krvi AML pacijenata prema procedurama opisanim u Primeru 1. Prečišćene T-ćelije izvedene iz pacijenta su zatim inkubirane sa CFSE-obeleženim HL60 ćelijama i praćene u odnosu na lizu ćelija kao što je opisano u Primeru 1.

[0054] Dodatno, analiza lize ciljne ćelije posredovana T-ćelijom je izvedena sa AML tumorskim blastovima izolovanim iz istog pacijenta (Norde et al. Blood 2009 (113)2312). Izolovani blasti su zatim obeleženi sa CFSE i ko-kultivisani sa autologim T-ćelijama izvedenim iz pacijenta u prisustvu smeše citokina kao što je opisano u Norde et al. i u prisustvu CD3XCLEC12A bispecifičnog IgG ili kontrola. Liza ciljnih ćelija je praćena kao što je opisano u Primeru 1.

Primer 6: Oslobađanje citokina od strane T ćelija posle kontakta sa CD3XCLEC12A bispecifičnim IgG

[0055] Upotrebom T-ćelijskih stimulatornih bioloških sredstava, prekomerna stimulacija T-ćelija je ozbiljan rizik kako ovo može da dovede do sindroma oslobađanja citokina (Suntharalingam et al.2006, New England J Med 355(10), pages 1018-1028; Chatenoud et al.

1990, Transplantation 49(4), pages 697-702). Da bi se ispitao stepen T-ćelijske stimulacije indukovane pomoću CD3XCLEC12A bispecifičnog IgG, indukcija T-ćelijskih citokina je ispitivana u ko-kulturi T-ćelija i ciljnih ćelija koje eksprimiraju Fc receptor.

[0056] Ukratko, mirujuće T ćelije zdravog donora su ko-kultivisane sa HL60 ciljnim ćelijama u prisustvu kandidata 3056x3116 CD3XCLEC12A bispecifičnog IgG (1 µg/ml) ili kontrolnog IgG kao što je opisano u Primeru 1. Posle dva dana, supernatant je uzorkovan i nivoi proizvodnje citokina su određeni u Luminex analizi kao što je poznata u stanju tehnike upotrebom humanog citokina humanog 10-Plex panela (Invitrogen, kat. br. LHC0001). Ovaj panel pokriva deset glavnih Th1 i Th2 citokina.

[0057] Kao što je očekivano, CD3 monospecifični bivalentni IgG indukovao je snažnu proizvodnju IFNγ, TNFα i IL-2 (Tabela 3), za koje se smatra da uglavnom pokreću sindrom oslobađanja citokina. Pored toga, proizvodnja IL-4, IL-6, IL-8 i IL-10 je povećana inkubacijom sa CD3 IgG. Nasuprot tome, CD3XCLEC12A bispecifičan IgG je samo

2

indukovao proizvodnju IL-8 do sličnog nivoa kao CD3 IgG; ostali citokini nisu bili značajno indukovani pomoću bispecifičnog IgG. GM-CSF je bio ispod granice detekcije kod bilo kog stanja.

Rezultati su dati kao procečna koncentracija citokina u pg/ml dva donora ± standardna devijacija.

[0058] Podaci prikazani ovde sugerišu povoljan terapeutski profil za različite CD3XCLEC12A bispecifične IgG molekule, kako oni potencijalno indukuju lizu ciljnih ćelija (Primeri 1 i 4) bez pokretanja T-ćelija da izlučuju potencijalno štetne količine proinflamatornih citokina kao što je zabeleženo sa CD3 IgG.

Primer 7: Efekat Fc utišavanja na in vitro efikasnost CD3XCLEC12A bsAb

[0059] Pretpostavljeno je da je liza ciljnih ćelija zavisna od doze pomoću CD3X kontrole izotipa bsAb prikazana u Primeru 4 posledica interakcije bsAb Fc dela sa Fc receptorima na HL60 ciljnim ćelijama. Kako takva ciljna ne-specifična ćelijska liza može takođe da se javi in vivo, bilo interakcijom sa Fc receptorima na ciljnim ćelijama ili pomoću neaktivnih ćelija kao što su NK ćelije, konstruisanje CH2/nižeg zglobnog regiona je korišćeno da se indukuje utišavanje Fc-posredovane aktivnosti bsAb.

[0060] Za ovo, ispitivane su dve strategije Fc mutacije, upotrebom 235G 236R dvostruke mutacije (DM; DM-Fc) ili 234F 235E 331S trostruke mutacije (TM; TM-Fc). CD3XCLEC12A bsAbs (3056x3116) sa DM-Fc ili TMFc su generisana i potvrđeno je da

2

vezuju ćelije koje eksprimiraju CLEC12A pomoću protočne citometrije sa istim intenzitetom kao bsAb sa divljim tipom Fc (podaci nisu prikazani). Sledeće, ova bsAb i divlji tip, DM-Fc i TM-Fc verzije CD3X kontrole izotipa bsAb testirana su u analizi lize HL60 ciljne ćelije (videti Primere 1 i 4). Rezultati su eksprimirani kao procenat specifične lize u vezi sa kontrolom izotipa.

[0061] Fc utišavanje pomoću DM ili pomoću TM nije imalo nikakav uticaj ili je imalo samo mali uticaj na stepen HL60 ćelijske specifične lize indukovane pomoću CD3XCLEC12A bsAb (SL. 6). Za CD3X kontrolu izotipa bsAb, međutim, potencija za indukciju lize HL60 ćelija bila je značajno redukovana sa TM i čak dalje sa DM.

[0062] Ovo pokazuje da Fc utišavanje pomoću konstruisanja CH2/nižeg zgloba dalje doprinosi ciljno-specifičnom ubijanju aberantnih ćelija stvaranjem bispecifičnog CD3xCLEC12A IgG1 formata koji efikasno i specifično regrutuje efektorne ćelije i smanjuje potencijal ne-specifične imune aktivacije posredovane preko dodatnih ćelija koje eksprimiraju normalni Fcγ receptor.

Primer 8: Efekat Fc-utišavanja na vezivanje za FcRn, CD16, CD32, CD64 i C1q

[0063] Vezivanje kandidata 3056x3116 CD3XCLEC12A bsAb sa WT Fc ili sa utišanim DM-Fc ili TM-Fc za humani FcRn određeno je pomoću Bio-Layer Interferometry (BLI, Octet QK, FortéBio). Ukratko, prečišćeno CD3XCLEC12A WT Fc IgG1, DM-Fc IgG1 ili TM-Fc IgG1 je uhvaćeno za Protein L biosenzoreb (FortéBio, kat. Br. 18-5085) u koncentraciji od 50 µg/ml u 0.1 M fosfatnom puferu/0.002%Tween20 koji sadrži 1.0µg/ml BSA pH6.0 (FcRnvezujući pufer) na sobnoj temperaturi. Zatim rastvorljivi humani FcRn (Sino Biological Inc, CT009-H08H) je dodat u koncentraciji od 1 µg/ml u FcRn-vezujućem puferu) na sobnoj temperaturi. Analiza podataka upotrebom Octet QK softvera za analizu pokazala je posle normalizacije za IgG vezivanje za ProtL senzor tako da je kasnije vezivanje CD3XCLEC12A bsAb sa DM ili TM utišani Fc za humani FcRn bilo slično sa CD3XCLEC12A bsAb sa divljim tipom Fc-repa (SL.7) i Fc utišavanje na taj način nije uticalo na vezivanje FcRn.

[0064] Vezivanje CD3XCLEC12A bsAb sa utišanim Fc za CD16, CD32 i CD64 je određeno pomoću Bio-Layer Interferometry (BLI, Octet QK, FortéBio). Protokol ukratko: prečišćeni CD3XCLEC12A WT Fc IgG1, DM-Fc IgG1 ili TM-Fc IgG1 je uhvaćen za protein L biosenzore (FortéBio, kat. br. 18-5085) u koncentraciji od 50 µg/ml u 1x kinetičkom puferu (FortéBio 18-5032) na sobnoj temperaturi. Zatim je rekombinantni CD16 (Sino Biological Inc, 10389-H08H1), CD32 (Sino Biological Inc, 10374-H08H) i CD64 (Sino Biological Inc, 10256-H08H) protein dodat u koncentraciji od 1.0 µg/ml u kinetičkom puferu (FortéBio 18-

2

5032) na sobnoj temperaturi. Vezivanje FcR receptora za bsAb je analizirano upotrebom Octet QK softvera za analizu.

[0065] Vezivanje CD3XCLEC12A bsAb sa utišanim Fc za humani C1q je odeđeno pomoću capture ELISA. U tom cilju prečišćeni CD3XCLEC12A WT Fc IgG1, DM-Fc IgG1 ili TM-Fc IgG1 je obložen u opsegu koncentracija od 25-0.012 µg/ml u PBS na Nunc-Immuno maxisorp F96 ploču (Nunc, 439454) O/N na 4C. Zatim humani C1q (Quidel, A400) je dodat u 2.0 µg/ml u ELISA pufer (2%MILK/PBST). Kompleks je zatim vizuelizovan upotrebom ovčjeg-anti-humanog C1q poliklonskog IgG (Meridian, K90020C) i zečjeg-anti-ovčjeg HRP konjugovanog poliklonskog IgG (Southern Biotech, 6150-05). Konačno, upotrebom TMB supstrata (BD 51-2606KC/51-2607KC) razvijeno je vezivanje i OD450 je kvantitativno određeno upotrebom Microplate čitača (Multiskan EX, Thermo Electron Corporation).

Primer 9: Procena in vivo efikasnosti CD3xCLEC12A bispecifičnog IgG.

[0066] Studije životinjskog ksenografta upotrebom HL60 ćelija koje eksprimiraju luciferazu (HL60(-Luc) ćelija) izvedene su radi potvrde i proširenja in vitro nalaza upotrebom CD3xCLEC12A bispecifičnog IgG1. Specifičnije ove studije su izvedene da bi se odredile koncentracije u plazmi u stanju mirovanja na efikasnim dozama, koji će biti uzete u obzir u podešavanju početne doze za kliničku procenu faze 1. U ovu svrhu NOD/SCID miševi (ili slični imuno-ugroženi miševi) su injektirani subkutano sa količinom vijabilnih HL60(-Luc) ćelija što rezultira u uspostavljanju subkutanih HL60 tumora kod većine životinja u roku od dve nedelje posle injekcije. Paralelno sa inokulacijom HL60(Luc), ili posle inicijalnog tumora, primenjeno je 5x10E6 ili 1x10E7 humanih PBMC. CD3xCLEC12A bispecifični IgG ili kontrolni monospecifični ili kontrolni bispecifični IgG su primenjeni intravenski u nekoliko nivoa doze prvog dana primene PBMC, i 3, 6 i 9 dana kasnije. Dimenzije tumora su ocenjivane 1 nedelju posle početne inokulacije HL60(Luc). Aritmetička srednja vrednost dimenzija tumora (označena kao zapremine tumora ili kao ukupna bioluminescencija) iz svake grupe je prikazana na grafikonu naspram vremena.

Primer 10: Upotreba bispecifičnog IgG1 antitela CD3xCLEC12A pune dužine u studiji faze Ia/Ib.

[0067] Finalni glavni CD3xCLEC12A bispecifični IgG1 kandidat pune dužine je korišćen za proizvodnju materijala kvaliteta GMP i klinički je procenjivan kod AML pacijenata. Prvo, formalna neklonička analiza bezbednosti proizvoda kandidata je izvedena da bi se istanovila

2

bezbedna početna doza po prvi put u studijama na čoveku. Ovde u daljem tekstu, otvoreno, multicentrično ispitivanje faze Ia/b sa rastom doze izvedeno je kod relapsiranih i/ili refraktornih AML i kod pacijenata nesposobnih za intenzivan tretman, da bi se istražila bezbednost i tolerabilnost CD3xCLEC12A bispecifičnog IgG posle i.v. primene. Sekundarne krajnje tačke obuhvataju farmakokinetičku i farmakodinamičku karakterizaciju i preliminarnu analizu i efikasnosti. Ukupne stope odgovora su procenjene putem procene redukcije AML blasta u koštanoj srži. U fazi Ia maksimalna tolerisana doza (MTD) je procenjena posle jednog/višestrukih povećanja doze. Posle privremene PK analize, deo studije faze 1b obuhvata kohortu povećanja doze na MTD ili obuhvata dalje istraživanje učestalosti doziranja.

Primer 11: kapacitet CD3xCLEC12A bsAb za indukciju T ćelijske proliferacije.

[0068] Kod pacijenata sa AML brojevi T ćelija su niski u poređenju sa količinom AML blasta pri dijagnozi. Dobro je poznato da T ćelije prolaze kroz proliferaciju posle aktivacije rezultujući u povećanom broju T ćelija. Pored toga, u primeru 1 pokazali smo da CD3xCLEC12A bsAb može da aktivira T ćelije i ima potenciju da indukuje lizu ćelija tumora posredovanu preko T-ćelija. Postavili smo hipotezu da AML pacijenti tretirani sa CD3xCLEC12A bsAb imaju korist od ekspanzije T ćelijskih subsetova posle aktivacije T ćelija posredovane preko CD3xCLEC12A bispecifičnog molekula jer će T ćelijska proliferacija rezultovati u povećanom broju efektornih T ćelija. Da bi pokazali da CD3xCLEC12A bsAb indukuje in vitro T ćelijsku proliferaciju, mirujuće T ćelije su prečišćene, obeležene sa karboksifluorescein diacetat sukcimidil estrom (CFSE) i kokultivisane sa autolognim CLEC12A+ monocitama u prisustvu CD3xCLEC12A bsAb ili kontrolnih Abs. Da bi se specifično ispitala T ćelijska proliferacija indukovana sa CD3xCLEC12A bez nespecifične Fc-gama korišćena je aktivacija CD3xCLEC12A bsAb sa DM-Fc repom, kao što je opisano u Primerima 7 i 8. Kao kontrole, uključeni su CD3x kontrola izotipa WT-Fc bsAb, CD3x kontrola izotipa DM-Fc bsAb, monoklonski CD3 sa WT-Fc i irelevantna kontrola izotipa (IgG sa WT-FC). Monociti i T ćelije iz periferne krvi zdravog donora su izolovani pomoću izolacije standardnim gradijentom gustine da bi se obogatile mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC), nakon čega je usledila CD14 pozitivna selekcija za monocite upotrebom CD14 mikro-kuglica (humane CD14 mikrokuglice, Miltenyi Biotec, kat. br. 130-050-201) i negativna selekcija nedirnutih T ćelija upotrebom magnetnih kuglica protiv ostalih leukocita (pan komplet za izolaciju T-ćelija, Miltenyi Biotec, kat. br.130-096-535). Pan komplet za izolaciju T-ćelija omogućava izolaciju

2

mirujućih (nedirnutih) T ćelija (tj. neobojenih antitelima) izbegavajući mogućnost prethodne aktivacije T ćelija.

[0069] CFSE-obeležene prečišćene mirujuće T ćelije su zatim inkubirane sa prečišćenim monocitima i bsAbs u medijumu sa 10% normalnim humanim serumom (HS) pri odnosu efektornih:ciljnih ćelija od 5:1 tokom sedam dana. Na dan 7 smanjenje CFSE signala kao očitavanje za T ćelijsku proliferaciju je mereno pomoću protočne citometrije. Rezultati su izraženi kao CFSE signal po CD3+, CD3+CD4+ ili CD3+CD8+ T ćelijama u histogramima.

[0070] Pozitivna kontrola CD3 WT-Fc Ab indukovalo je T ćelijsku proliferaciju, dok kontrola izotipa IgG sa WT-Fc nije indukovala T ćelijsku proliferaciju (slika 8). Kao što je očekivano CD3x kontrola izotipa WT-Fc bsAb je indukovala T ćelijsku proliferaciju, ali u nižem stepenu u poređenju sa bivalentnom monospecifičnom anti-CD3 IgG kontrolom. Nasuprot tome, CD3x kontrola izotipa DM-Fc bsAb nije indukovala T ćelijsku proliferaciju zbog njegovog utišanog Fc-repa. CD3xCLEC12A DM-Fc bsAb takođe je indukovalo željenu T ćelijsku proliferaciju posredovanu preko specifičnog premošćavanja CD3 sa CLEC12A antigenom.

[0071] Ovo pokazuje da CD3xCLEC12A bsAb nije samo sposobno da ciljno deluje na specifičnu indukciju T ćelijski posredovane lize tumora kao što je prethodno pokazano, već takođe može potentno da indukuje ciljno delovanje na specifičnu T ćelijsku proliferaciju rezultujući u povećanom broju T ćelija. Pored toga ovo dalje pokazuje da Fc utišavanje pomoću konstrukcije CH2/nižeg zgloba ne samo da doprinosi ciljno-specifičnom ubijanju aberantnih ćelija, već takođe ciljno-specifičnoj indukciji T ćelijske proliferacije pomoću CD3xCLEC12A DM-Fc bsAb IgG.

Primer 12: Procena CD3xCLEC12A indukovane ekspanzije TEMRA subseta iz AML pacijenata.

[0072] Kako je aktivacija T ćelijske proliferacije pokazana za CD3xCLEC12 DM-Fc bsAb, sledeće smo želeli da ispitamo da li je CD3xCLEC12A DM-Fc bsAb sposobno da indukuje proliferaciju CD8+ citotoksičnog T ćelijskog odeljka kod AML pacijenata. CD8+ citotoksične T ćelije su prepoznate kao glavni efektori koji posreduju u regresiji tumora (Sluijter et al., 2010). CD8+ T ćelije mogu biti podeljene u pet subsetova: naivne (CCR7+CD45RA+), ventralne memorijske (TCM, CCR7+CD45RA-), efektorne memorijske (TEM, CCR7-CD45RA-) i CD45RA+ efektorne memorijske (TEMRA, CCR7-CD45RA+) ćelije. Studije su pokazale da subsetovi naivnih i memorijskih CD8+ T-ćelija imaju različite kapacitete da proliferišu i diferenciraju se kao odgovor na TCR stimulaciju (Geginat et al., 2003).

[0073] Prvo CD8+ odeljak u perifernoj krvi AML pacijenata u kliničkoj remisiji je analiziran u poređenju sa zdravim donorima. U tom smislu PBMC su izolovane iz uzoraka zamrznute periferne krvi od AML pacijenata i zdravih donora pomoću standardne izolacije gradijentom gustine. Sledeće, PBMC su obojene sa CCR7, CD3, CD4, CD8, CD45RA i CD45RO antitelima da bi se analizirali CD8+ T ćelijski subsetovi pomoću protočne citometrije. Rezultati su izraženi kao procenat subseta u ukupnom CD8+ T ćelijskom odeljku.

[0074] Analogno onome šta je prethodno opisano, zabeleženo je da je naivni CD8+ T ćelijski subset redukovan u krvi iz AML pacijenata u poređenju sa naivnim CD8+ T ćelijskim subsetom iz zdravih individua, pri čemu je TEMRA odeljak (CCR7-CD45RA+) povećan kod AML pacijenata u poređenju sa zdravim donorima (Slika 9).

[0075] Sledeće, eksperimenti su izvedeni radi studiranja proliferacije tumorskih ciljnih specifičnih T ćelija T ćelijskog odeljka AML pacijenta. Specifičnije, ovi eksperimenti su izvedeni da bi se odredilo da li CD3xCLEC12A DM-Fc bsAb mogu da pojačaju T ćelijsku proliferaciju i izrastanje efektornih T ćelijskih subsetova (TEMi TEMRA) AML pacijenata u odnosu na naivne CD8+ T ćelije AML pacijenata.

[0076] U tom cilju, mirujuće T ćelije iz AML pacijenata u kliničkoj remisiji su prečišćene prema primeru 11. Sastav CD8+ T ćelijskih subsetova na dan = 0 je analiziran bojenjem PBMC sa CCR7, CD3, CD4, CD8, CD45RA i CD45RO antitelima, nakon čega je usledila protočna citometrijska analiza. Pored toga, mirujuće T ćelije su ili obeležene sa CFSE ili nisu obeležene (CFSE obeležavanje kao što je opisano u primeru 11) i ko-kultivisane sa ćelijama leukemije HL60 u odnosu E:T od 5:1 sa kontrolnim ili test antitelima u trajanju od 7 dana. CFSE obeležene T ćelije su korišćene za kvantitativno određivanje T ćelijske proliferacije, dok su neobeležene T ćelije korišćene za određivanje procenta proliferisanih T ćelijskih subsetova. CFSE-obeležene i neobeležene T ćelije su inkubirane sa PBS, kontrolom izotipa WT-Fc Ab, CD3xCLEC12A DM-Fc bsAb, CD3x kontrolom izotipa DM-Fc bsAb i CD3 monoklonskim Ab sa WT-Fc u 1 µg/ml. Posle 7 dana, CFSE obeležene T ćelije su obojene sa CD3, CD4 i CD8 antitelima i podvrgnute FACS analizi da bi se odredili apsolutni brojevi T ćelija i broj ćelijskih deoba, dok su neobeležene CFSE T ćelije obojene sa CCR7, CD3, CD4, CD8, CD45RA i CD45RO antitelima da bi se odredio sastav proliferisanih CD8+ T ćelijskih subsetova pomoću protočne citometrije. T ćelijska proliferacija je eksprimirana kao CFSE signal po T ćelijskom subsetu u histogramima i veličina četiri CD8+ T ćelijska subseta je eksprimirana kao procenat unutar ukupnog CD8+ T ćelijskog odeljka.

Primer 13: Efikasnost CD3xCLEC12A bsAb u indukciji lize ćelija tumora posedovane preko T ćelija kod AML pacijenta.

1

[0077] U primeru 1 pokazano je da CD3xCLEC12A bsAb mogu da indukuju ubijanje CLEC12A-pozitivnih HL60 ćelija pomoću mirujućih T ćelija iz zdravih donora. Sledeće ispitivali smo kapacitet CD3xCLEC12A bsAb da indukuju ciljno-specifičnu aktivaciju T ćelija AML pacijenta i njegov kapacitet da indukuju ubijanje HL60 ćelija posredovane preko T ćelijakod AML pacijenta.

[0078] T ćelije su izolovane iz zamrznute periferne krvi AML pacijenata (AML FAB klasifikacija AML-M1/M2, M4 ili M5) u kliničkoj remisiji upotrebom pan kompleta za izolaciju T-ćelija kao što je opisano u primeru 11. Prečišćene mirujuće T ćelije poreklom od AML pacijenta kasnije su inkubirane sa CSFE-obeleženim HL60 ćelijama u medijumu dopunjenom sa 10% normalnog HS u odnosu efektora: ciljne ćelije od 5:1 tokom dva dana, u prisustvu PBS, kontrole izotipa WT-Fc Ab, CD3xCLEC12A DMFc, CD3x izotipa DM-Fc, i pozitivne kontrole CD3 WT-Fc Ab (sva antitela u koncentraciji od 1 µg/ml). Posle dva dana ko-kulture, T ćelijska aktivacija je određena pomoću protočne citometrijske analize za CD3, CD4 i CD25. Ovi rezultati su eksprimirani kao procenat CD25+ ćelija po CD4+ T ćelijama. Pored toga, preživljavajuće CFSE-pozitivne HL60 ćelije su kvantitativno određene pomoću protočne citometrije. Rezultati su izraženi kao procenat specifične lize u poređenju sa IgG.

[0079] Ovi podaci pokazuju da je antigen-specifična aktivacija zdravog donora i T ćelija AML pacijenta posredovana preko CD3xCLEC12A DM-Fc bsAb bila slična (Slika 10A). Kao što je očekivano CD3x kontrola izotipa DM-Fc bsAb nije indukovala T ćelijsku aktivaciju zdravog donora niti T ćelija poreklom od AML pacijenta. Pokazano je da liza HL60 ćelija posredovana preko CD3xCLEC12A DM-Fc bsAb pomoću T ćelija poreklom od AML pacijenta (68% HL60 ćelijska liza) bila slična onoj kod T ćelija od zdravog donora (69% HL60 ćelijska liza, Slika 10B). Kao što se očekuje, CD3x kontrola izotipa DM-Fc bsAb nije indukovala ubijanje HL60 ćelija, niti od strane T ćelija od AML pacijenta niti od strane T ćelija zdravog donora. Na taj način, CD3xCLEC12A bispecifični molekul je potentni induktor lize ćelija tumora posredovane preko T ćelija, bez obzira na to da li su ove T ćelije poreklom od AML pacijenta ili od zdravih donora.

[0080] Kao što je pokazano da CD3xCLEC12A bsAb ima kapacitet da indukuje potentnu lizu ćelija tumora HL60 pomoću T ćelija AML pacijenta, kasnije je procenjivan kapacitet CD3xCLEC12A bsAb da ciljno deluju na specifičnu aktivaciju T ćelija AML. Pored toga, određen je kapacitet CD3xCLEC12A bsAb da indukuju lizu primarnih CLEC12A-pozitivnih AML blasta pomoću autolognih T ćelija poreklom od AML pacijenta. Prvo, uzorci zamrznute čuvane koštane srži od AML pacijenata pri dijagnozi koji sadrže >70% primarnih AML blasta kao što je određeno pomoću protočne citometrijske analize su odmrznuti, kultivisani preko noći (O/N) u IMDM medijumu dopunjenom sa 10% FCS, 100ng/ml GM-CSF, 100ng/ml G-

2

CSF, 50ng/ml IL-3, 25ng/ml SCF i 20ng/ml Flt3L kao što je prethodno opisano (Norde et al., 2009). Posle O/N kulture, primarni AML blasti su fenotipizirani za površinsku ekspresiju CLEC12A, CD3, CD4, CD8, CD14, CD19, CD33, CD34, CD38, CD45 i CD117 pomoću protočne citometrije i obeleženi sa CFSE. Rezultujuće autologne T ćelije poreklom od pacijenta, sakupljene kada je pacijent primio kliničku remisiju, su izolovane iz periferne krvi upotrebom pan kompleta za izolaciju T-ćelija kao što je opisano u primeru 11. Zatim, AML blasti su ko-kultivisani sa mirujućim autolognim T ćelijama u odnosu E:T od 5:1 u medijumu sa 10% HS tokom dva dana. Testirani uslovi su obuhvatali PBS, kontrolu izotipa Ab WT-Fc, CD3xCLEC12A DM-Fc, CD3x kontrolu izotipa DM-Fc i pozitivnu kontrolu CD3 WT-Fc Ab (sva antitela u 1 µg/ml). Posle dva dana ko-kulture, T ćelijska aktivacija je određena pomoću protočne citometrijske analize za CD3, CD4, CD8 i CD25. Ovi rezultati su eksprimirani kao procenat CD25+ ćelija po CD4+ ili CD8+ AML T ćelijama. Liza AML blasta je određena kvantitativnim određivanjem preživelih CFSE+/CD45<nisko>dvostruko pozitivnih AML blasta pomoću protočne citometrije. Rezultati su eksprimirani kao procenat lize specifičnih blasta u odnosu na IgG.

[0081] Ovi podaci pokazuju da CD3xCLEC12A DM-Fc bsAb ima kapacitet da indukuje AML blast ciljnu specifičnu aktivaciju AML T ćelija slično monoklonskom CD3 WT-Fc pozitivnom kontrolnom Ab (Slika 11A/B). Pored toga ova podaci pokazuju da je CD3xCLEC12A bsAb-indukovano potentno ubijanje autolognih AML blasta pomoću T ćelija poreklom od AML pacijenta potentno kao ubijanje indukovano monoklonskim CD3 WT-Fc pozitivnim kontrolnim Ab (Slika 11C). Kao što je očekivano, ubijanje AML blasta nije indukovano ili je indukovano malo pomoću CD3x kontrole izotipa DM-Fc Ab, što ukazuje na to da je zabeleženo ubijanje AML blasta posredovano preko CD3xCLEC12A bsAb primarno rezultat antigen-specifične aktivacije T ćelija i specifične lize CLEC12A+ AML tumorskih ćelija. Ukupno, ova studija pokazuje da CD3xCLEC12A bsAb može efikasno da indukuje ubijanje CLEC12A-pozitivnih tumorskih ćelija pomoću T ćelija AML pacijenta.

Primer 14: Efekat Fc-utišavanja na nespecifično oslobađanje citokina

[0082] U primerima 7 i 8 pokazano je da je CD3xCLEC12A bsAb IgG1 format sa Fc utišavajućim sa konstrukcijom CH2/nižeg zglobna (DM-Fc) rezultovao u smanjenom afinitetu za Fc gama receptore i ukinutom nespecifičnom citotoksičnošću posredovanom preko Fc receptora HL60 ćelijske linije poreklom od leukemije. Sledeće, ispitivano je da li je bsAb IgG1 format sa DM-Fc utišavanjem ukinuo nespecifičnu citotoksičnost posredovanu preko Fc receptora u prisustvu Fc receptor-pozitivnih neaktivnih ćelija kao što su NK ćelije. U ovoj studiji, autologne mirujuće T ćelije poreklom od zdravog donora su preusmerene protiv CLEC12A-pozitivnih monocita u prisustvu ostalih Fc receptor-pozitivnih neaktivnih urođenih efektornih ćelija kao što su NK ćelije. U tom cilju PBMC su izolovane iz heparinizirane periferne krvi iz zdravih donora pomoću centrifugiranja prema gradijentu gustine i postavljene na ploču u gustini od 1*10^6 ćelija/ml. PBMC su kultivisane dva dana u medijumu sa 10% FBS u prisustvu PBS, kontrole izotipa Ab, CD3xCLEC12A WT-Fc bsAb, CD3xCLEC12A DM-Fc bsAb, CD3x kontrole izotipa WT-Fc bsAb, CD3x kontrole izotipa DM-Fc bsAb ili CD3 monoklonskog Ab sa WT-Fc. Posle dva dana kulture, preživeli monociti su kvantitativno određeni pomoću protočne citometrije na osnovu CD14-ekspresije. Rezultati su eksprimirani kao procenat specifične lize povezane sa IgG.

[0083] Pokazano je da, za CD3xCLEC12A bispecifično antitelo, Fc utišavanje preko prisustva DM-Fc regiona je imalo samo manji efekat na lizu monocita (Slika 12). Nasuprot tome, za CD3x kontrolu izotipa bsAb, Fc utišavanje preko prisustva DM-Fc regiona značajno je redukovalo nespecifičnu lizu monocita. Na taj način, zaključeno je da Fc utišavanje u CD3xCLEC12A bsAb dalje doprinosi ciljno-specifičnom ubijanju: CD3xCLEC12A DM-Fc bsAb specifično regrutuje T ćelije i smanjuje nespecifičnu imunu aktivaciju posredovanu preko normalnih dodatnih ćelija koje eksprimiraju Fcγ receptor.

[0084] Sledeće, postavljeno je pitanje da li Fc utišavanje pomoću DM mutacije u CD3xCLEC12A bsAb ukida Fc receptor-posredovano oslobađanje citokina, za koje je poznato da je povezano sa sindromom oslobađanja citokina (CRS), uobičajeni klinički događaj kod terapija antitelom koji je posledica dodatnih ćelija. U tom smislu profil citokina u supernatantima monocita u analizi ubijanja opisanoj na slici 13 analiziran je upotrebom citokinskog humanog 10-pleksnog panela za Luminex platformu (Invitrogen, LHC0001) prema uputstvima proizvođača. Profil sledećih humanih citokina je meren u supernatantu dana 2: GM-CSF, IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10 i TNF-α. Prikazani rezultati su koncentracija citokina izmerena u pg/ml. Nivoi GM-CSF, IL-4 i IL-5 citokina su bili ispod granice detekcije ove analize (podaci nisu prikazani).

[0085] Podaci pokazuju da su CD3xCLEC12A i CD3x kontrola izotipa bsAb, oba sa WT-Fc repom indukovali oslobađanje IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-10, IL-2 i IFN-γ (Slika 13). Međutim, ništa ili samo veoma niski nivoi ovih citokina su nađeni u CD3xCLEC12A i CD3x kontroli izotipa bsAb kada su nosili DM-Fc rep, sa izuzetkom za IL-8. Kako su monociti glavni izvor IL-8, pretpostavlja se da su visoki nivoi IL-8 oslobođeni iz liziranih monocita i nisu rezultat aspecifičnog FcR posredovanog oslobađanja. Zaključeno je da Fc utišavanje preko DM mutacija u bsAb IgG formatu značajno eliminiše Fc receptorom posredovano oslobađanje IL-1b, IL-6, TNF-α, IL-2 i IFN-γ citokina povezanih sa CRS. Ukupno, ovi podaci pokazuju da Fc

4

utišavanje pomoću DM mutacije u CH2/nižem zglobnom regionu doprinosi pojačanju efikasnosti i specifičnom regrutovanju efektornih ćelija pomoću CD3xCLEC12A DM-bsAb smanjujući potencijal za nespecifičnu imunu aktivaciju posredovanu preko normalnih dodatnih ćelija koje eksprimiraju Fcγ receptor i povezanog oslobađanja proinflamatornih citokina.

Primer 15

[0086] Vezivanje kandidata 3896 kao bivalentnog monoklonskog anti-CD3 IgG pune dužine za CD3 vezan za membranu upoređivano je sa kandidatom 3056 kao bivalentno monoklonsko anti-CD3 IgG pune težine pomoću FACS analize upotrebom HPB-ALL ćelija koje eksprimiraju CD3. Ireleveatan humani IgG1 služio je kao kontrola izotipa IgG. Protočna citometrija je izvedena prema standardnim postupcima poznatim u stanju tehnike. Kao što je prikazano na slici 14A, 3896 CD3 IgG dozno-zavisno vezan za CD3 na HPB-ALL ćelijama, kao 3056 CD3 IgG.

[0087] Sledeće, sposobnost 3896 CD3 IgG da indukuje T-ćelijsku proliferaciju je testirana u direktnom poređenju sa mišjim OKT3 CD3 antitelom, 3056 CD3 IgG i kontrolom izotipa IgG. Ukratko, antitela su serijski razblažena i imobilizovana na 96-komorne ploče. Posle uklanjanja nevezanog IgG, CFSE-obeležene T ćelije su dodate i inkubirane na 37°C. Na dan 5, nivo indukovane T ćelijske proliferacije je analiziran pomoću protočne citometrije. Rezultati su izraženi kao procenat vijabilnih T ćelija koje ispoljavaju najmanje dvostruku redukciju u nivou ekspresije CFSE i prikazani su na slici 14B. Pokazano je da je 3896 CD3 IgG kao bivalentno monospecifično antitelo bilo manje potentno u indukciji T ćelijske proliferacije u poređenju sa kandidatom 3056 CD3 IgG i mišjim OKT3. Ovi podaci sugerišu da redukovani nivo T ćelijske proliferacije kao što je indukovana pomoću 3896 u poređenju sa 3056 CD3 IgG reflektuju redukovani kapacitet vezivanja CD3 kao što je analiziran pomoću protočne citometrije. Ova razlika u vezivanju omogućava izbor grane sa željenim afinitetom, rezultujući u bispecifičnom antitelu koje ispoljava povoljnu ravnotežu između vezujućih afiniteta za CD3 i CLEC12A, tako da su T ćelije i CLEC12A-pozitivne AML tumorske ćelije efikasno skupljene, i optimalno je indukovana T ćelijski posredovana liza CLEC12A-pozitivnih AML tumorskih ćelija.

[0088] Da bi se testirala potencija nove 3896 anti-CD3 grane naspram 3056 anti-CD3 grane u formatu CD3xCLEC12A bispecifičnog antitela, 3896xCLEC12A referentno bispecifično antitelo iz primera 4 (kandidat 3896x3116) i 3056xCLEC12A referentno bs antitelo iz primera 1 (kandidat 3056x3116) direktno su upoređivani u analizi citotoksičnosti HL60 kao što je prethodno opisano. Rezultati su prikazani na slici 15. Zabeleženo je da 3896xCLEC12A referentno bsAb ima sličnu potenciju kao 3056xCLEC12A referentno bsAb. Stoga, kako se oba bispecifična antitela razlikuju samo u njihovoj CD3 Fab grani, dok je CLEC12A Fab grana ista, zaključeno je da je funkcionalnost 3896 CD3 Fab grane slična onoj od 3056 CD3 Fab grane u CD3xCLEC12A bispecifičnom Ab. Zabeleženo je da je u nižim koncentracijama kandidat 3896x3116 čak bolji od kandidata 3056x3116. Ovo je povoljno zbog toga što obezbeđuje veći terapeutski opseg, kao što je objašnjeno ovde u prethodnom tekstu.

Primer 16

[0089] U primeru 3, panel CLEC12A-specifičnih Fab grana je izabran iz biblioteka fagnog prikaza. Svi CLEC12A vezujući molekuli su sadržali huVk1-39 laki lanac. Tri CLEC12A vezujuća molekula su izabrana: Fabs 3918, 4327 i 4331. Ovi Fab su eksprimirani kao humani IgG1 pune dužine: 3918 CLEC12A IgG, 4327 CLEC12A IgG i 4331 CLEC12A IgG. Nukleotidne i aminokiselinske sekvence VH od 3918 CLEC12A IgG, VH od 4327 CLEC12A IgG, VH od 4331 CLEC12A IgG i uobičajeni VL (IGKV1-39; 012) su obezbeđene na Slici 20.

[0090] CLEC12A antitela pune dužine su testirana za vezivanje za CLEC12A eksprimiran od strane HL60 ćelija.

[0091] Vezivanje 3918 CLEC12A IgG, 4327 CLEC12A IgG i 4331 CLEC12A IgG za CLEC12A vezan za membranu je upoređivano sa CLEC12A referentnim antitelo (3116) pomoću FACS analize upotrebom HL60 ćelija koje eksprimiraju CLEC12A. Irelevantan humani IgG1 služio je kao kontrola izotipa IgG. Protočna citometrija je izvedena prema standardnim postupcima poznatim u stanju tehnike. Kao što je prikazano na Slici 16, 4327 CLEC12A IgG vezan za CLEC12A na sličan način kao CLEC12A referentno antitelo. Ostala dva antitela, 3918 CLEC12A IgG i 4331 CLEC12A IgG takođe su pokazala dobro od doze zavisno vezivanje za CLEC12A na HL60 ćelijama. Njihovo vezivanje za CLEC12A je izgledalo donekle niže u poređenju sa CLEC12A referentnim antitelom. U zaključku, Fab 3918, 4327 i 4331 su dobre CLEC12A-vezujuće grane.

Primer 17

[0092] Testirano je da li su bispecifični molekuli koji sadrže 3896 CD3 Fab granu i CLEC12A Fab granu 3981, 4327 ili 4331 bili funkcionalni.

[0093] Za ovo, VH sekvenca od 3896 CD3 Fab grane i VH region bilo kog od CLEC12A referentnog antitela, 3918 CLEC12A Fab, 4327 CLEC12A Fab ili 4331 CLEC12A Fab klonirane su u ekspresione vektore upotrebom postupaka poznatih u stanju tehnike za proizvodnju bispecifičnog IgG1 (Gunasekaran et al., WO2009/089004) zajedno sa rearanžiranim huVκ1-39 lakim lancem da bi se dobila bispecifična antitela; 3896xCLEC12A referentno, 3896x3918, 3896x4327 i 3896x4331.

[0094] Ova bispecifična antitela su testirana u odnosu na funkcionalnost u prethodno opisanoj analizi citotoksičnosti HL60. Mirujuće T ćelije iz dva zdrava donora (HD1 i HD2) su kokultivisane sa CFSE-obeleženim HL60 ćelijama u prisustvu različitih koncentracija bispecifičnog antitela u odosu E:T od 5:1 ili 48 časova u prisustvu 10% HS. Preživljavajuće CFSE-pozitivne HL60 ćelije su kvantitativno određene pomoću protočne citometrije na dan 2. Rezultati na slici 17 su izraženi kao procenat specifične lize. Za dva pojedinačna eksperimenta sa T ćelijama iz donora 1 (HD1; slika 17 gornji panel) i T ćelijama za donora 2 (HD2; slika 17 donji panel), pokazano je da su sva bispecifična antitela bila potentna kao 3896xCLEC12A referentnog bispecifičnog antitela kada su inkubirana u visokoj koncentraciji.

[0095] Napomena je da naročito u nižim koncentracijama bispecifičnih antitela, zabeleženo je da su 3896x4327 i 3896x4331 bispecifična antitela bila potentnija od 3896xCLEC12A referentnih bispecifičnih antitela. Stoga, kako se ova bispecifična antitela razlikuju samo u njihovoj CLEC12A Fab grani, dok je CD3 Fab grana ista, može se zaključiti da je funkcionalnost 4327 i 4331 CLEC12A Fab grana potentnija u poređenju sa CLEC12A referentnom Fab granom. Bez želje da se vežemo za teoriju, zabeležene razlike između 3896x4327 i 3896x4331 naspram 3896xCLEC12A referentnog bispecifičnog IgG mogu da reflektuju razliku u vezujućem afinitetu ovih novih anti-CLEC12A Fab grana ili bi mogli da ciljno deluju na različiti CLEC12A epitop koji omogućava efikasnije unakrsno vezivanje tumorskih ćelija sa T ćelijama koje eksprimiraju CD3.

Primer 18

[0096] U primeru 2 pokazano je da su CLEC12A Fab 3918 i 4331 bili u kompeticiji za vezivanje za epitop na CLEC12A kada su testirani u ELISA kao Fab format protiv Fab fragmenata CLEC12A referentnog antitela. 4327 CLEC12A Fab, međutim, nije bio u kompeticiji sa CLEC12A referentnim IgG za vezivanje u ovoj analizi (Tabela 2).

[0097] U ovom eksperimentu, testirano je da li je IgG pune dužine 4327 CLEC12A IgG bio u kompeticiji za vezivanje za CLEC12A sa CLEC12A referentnim antitelom. Ukratko, HL60 ćelije su prethodno inkubirane sa primarnim antitelom u 50 µg/ml na ledu u trajanju od 20 minuta. Zatim, Oregon Green (OG)-obeleženo (Invitrogen, kat. br. A10476) drugo antitelo je dodato u 1 mg/ml u ćelije plus prvo antitelo (koncentracija prvog antitela posle dodavanja OG-obeleženog IgG -45 µg/ml). Posle 20 minuta ćelije su ispirane i analizirane pomoću FACS.

[0098] Rezultati su prikazani na slici 18: zaključeno je da su 4327 CLEC12A IgG i CLEC12A referentni IgG u kompeticiji za vezivanje za CLEC12A. Ovo sugeriše da se oba IgG vezuju za bilo blisko srodni epitop na CLEC12A antigenu ili da se vezuju za različite epitope koji ne omogućavaju istovremeno vezivanje oba IgG zbog prostornog ograničenja.

Primer 19

[0099] U prethodnim primerima pokazano je da se CLEC12A Fab grane 4327, 4331, 3918 kao i 3116 dobro vezuju za CLEC12A i potentne induktore T ćelijski posredovanog ubijanja u CD3xCLEC12A bispecifičnom formatu. Do sada, bispecifična antitela su dobijena upotrebom poznatih postupaka za izvođenje heterodimerizacije teškog lanca imunoglobulina (Gunasekaran et al.).

[0100] U našim US i PCT prijavama koje su istovremeno u postupku (US regularna prijava br.: 13/866,747 i PCT/NL2013/050294; obuhvaćene ovde referencom) otkrili smo postupke i sredstva za proizvodnju bispecifičnih antitela iz jedne ćelije, pomoću čega su obezbeđna sredstva koja favorizuju formiranje bispecifičnih antitela u odnosu na formiranje monospecifičnih antitela. Ovi postupci takođe mogu biti povoljno korišćeni u predmetnom pronalasku. Specifično, poželjne mutacije za proizvodnju esencijalno samo bispecifičnih IgG molekula pune dužine su aminokiselinske supstitucije L351K i T366K (numeracija prema Kabat-u) u prvom CH3 domenu (’KK-varijanta’ teškog lanca) i aminokiselinske supstitucije L351D i L368E u drugom CH3 domenu (’DE-varijanta’ teškog lanca), ili obrnuto. Prethodno je pokazano u našim prijavama US 13/866,747 i PCT/NL2013/050294 koje su istovremeno u postupku da se DE-varijanta i KK-varijanta preferencijalno sparuju tako da formiraju heterodimere (takozvani ’DEKK’ bispecifični molekuli). Homodimerizacija DE-varijante teških lanaca (DEDE homodimeri) ili KK-varijante teških lanaca (KKKK homodimeri) se teško javlja zbog snažnog odbijanja između nelektrisanih ostataka u CH3-CH3 dodirnoj površini između identičnih teških lanaca.

[0101] Da bi se pokazalo da na efekat CD3xCLEC12A bispecifičnih molekula nije uticala nijedna od poznatih mutacija za heterodimerizaciju (Gunasekaran) ili DEKK mutacije, DE-varijanta i KK-varijanta teških lanaca su korišćene za izvođenje heterodimerizacije različitih teških lanaca za pripremu CD3xCLEC12A bispecifičnih antitela. Pored toga dvostruke mutacije CH2/nižeg zgloba (L235G i G236R; DM) su uvedene u ove DE- i KK-varijante teških lanaca. Fc rep ovih rezultujućih bispecifičnih molekula je označen kao’DM DEKK’.

[0102] Ukratko, VH regioni 3116, 4327 ili 4331 CLEC12A Fab grane su klonirani u ekspresione vektore koji sadrže DE-varijantu DM težak lanac gde je VH region 3056 CD3 antitela kloniran u ekspresioni vektor koji sadrži KK-varijantu DM težak lanac (US regularna prijava br: 13/866,747 i PCT/NL2013/050294) i ovi ekspresioni vektori, zajedno sa molekulom nukleinske kiseline koji kodira rearanžirani humani IGKV1-39/IGKJ1 (huVκ1-39) laki lanac su obezbeđeni ćeliji domaćinu tako da je ćelija domaćin eksprimirala i proizvela bispecifična antitela. Rezultujuća 3056x3116 DM DEKK, 3056x4327 DM DEKK i 3056x4331 DM DEKK bispecifična antitela su zatim testirana za potenciju u analizi citotoksičnosti HL60 kao što je prethodno opisano. Rezultati su prikazani na slici 19: pokazano je da su sve varijante još uvek sposobne za efikasnu lizu tumorskih ćelija i na taj način je zaključeno da DM i DEKK mutacije mogu biti uvedene u Fc region CD3xCLEC12A bispecifičnog antitela, uz održavanje kapaciteta za indukciju lize tumorskih ćelija.

REFERENCE

[0103]

Armour et al. Mol. Immunol.2003 (40) 585-593

Bakker A.B. et al. Cancer Res 2004, 64, p8443-50

Bargou et al.2008 Science 321:974

Bluemel et al.2010 Cancer Immunol. Immunother. 59:1197

Chames and Baty, MABS 2009 (1) 539-547

Chatenoud et al.1990, Transplantation 49(4), pages 697-702

Chen C.H. et al. Blood 2006, 107, p1459-67

Cui et al. JBC 2012 (287) 28206-28214

De Kruif et al.1995, J Mol Biol 248(1), pages 97-105

De Kruif et al. J. Mol. Biol.2009 (387) 548-58

De Kruif et al. Biotechnol Bioeng.2010 (106)741-50

De Wildt RM et al. J. Mol. Biol.1999 (285) 895-901;

Dreier et al.2002 Int.J.Canc.100:690

Geginat, J. et al. Blood, 2003.101(11), p.4260-6

Gunasekaran et al. JBC 2010 (285) 19637-19646

Haagen et al.1995 Blood 85:3208

Han Y. et al. Blood 2004, 104, p2858-66

Kipriyanov et al.1998 Int.J.Can. 77:763

Kontermann, MABS 2012 (4) 182-197

Lanzavecchia et al.1987, Eur.J.Imm.17:105

Liu et al.1985 PNAS 82: 8648

Liesveld et al.1988, J. Immunol. 140(5), pages 1527-1533

Loffler et al.2000 Blood 95:2098

Marshall A.S. et al. J Biol Chem 2004, 279, p14792-802

Merchant et al. Nature Biotechnology 1998 Volume 16, pp 677-681 Moore et al. Blood 2011 (117) 4542-4551

Moshaver et al.2008 Stem Cells 26:3059

Nissim et al. The EMBO Journal vol.13 no.3 pp.692 - 698.1994 Norde W.J. et al. Blood 2009 (113) (10): p.2312-23

Offner et al. Molecular Immunology 2006 (43) 763-771

Oganesyan et al. Biol. Crystall.2008(D64)700

Schaefer et al (Cancer Cell 20, 472-486, October 2011

Sheridan C, Nat Biotechnol. 2012 (30):300-1

Staerz et al.1986 PNAS 83:1453

Shields RL et al. JBC 2001 (276) 6591-6604

Sluijter, B.J., et al. Clin Immunol, 2010.137(2), p.221-33 Suntharalingam et al.2006, New England J Med 355(10), pages 1018-1028 Van Rhenen et al.2007 Blood 110:2659

Zeidler et al.1999 J. Immunol. 163:1246

WO2004/009618

WO2005/118635

WO2005/000894

WO2005/000894

WO 2008/027236

WO2009/089004

WO2009/157771

WO 2010/108127

4

Claims (12)

1. Patentni zahtevi 1. Bispecifično humano IgG antitelo pune dužine, naznačeno time što navedeno bispecifično IgG antitelo sadrži jednu granu koja specifično prepoznaje CLEC12A i drugu granu koja specifično prepoznaje CD3, i pri čemu grana koja specifično prepoznaje CLEC12A sadrži varijabilnu sekvencu teškog lanca koja se sastoji od sekvence koja je identična sa QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSG G STSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAKGTTGDWFDYWGQG T LVTVSS; ili varijabilnu sekvencu teškog lanca koja se sastoji od sekvence koja je identična sa

   i pri čemu obe grane sadrže zajednički laki lanac koji sadrži varijabilnu sekvencu lakog lanca koja se sastoji od sekvence koja je identična sa
2. 2. Bispecifično IgG antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što navedeno antitelo specifično prepoznaje CD3ε.
3. 3. Bispecifično IgG antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-2, naznačeno time što navedeno bispecifično antitelo je humani IgG1.
4. 4. Bispecifično IgG antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, naznačeno time što druga grana koja specifično prepoznaje CD3 sadrži sekvencu CDR1 teškog lanca koja se sastoji od sekvence SYGMH i sekvencu CDR2 teškog lanca koja se sastoji od sekvence IIWYSGSKKNYADSVKG i sekvencu CDR3 teškog lanca koja se sastoji od sekvence GTGYNWFDP.
5. 5. Bispecifično IgG antitelo prema patentnom zahtevu 4, naznačeno time što druga grana koja specifično prepoznaje CD3 sadrži varijabilnu sekvencu teškog lanca koja se sastoji od sekvence
6. 6. Bispecifično IgG antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5, naznačeno time što navedeno bispecifično IgG antitelo ima mutirani CH2 i/ili niže zglobne domene tako da je interakcija navedenog bispecifičnog IgG antitela sa Fcγ receptorima značajno redukovana.
7. 7. Bispecifično IgG antitelo prema patentnom zahtevu 6, naznačeno time što navedeni mutirani CH2 i/ili niži zglobni domeni sadrže najmanje jednu supstituciju na aminokiselinskom položaju 235 i/ili 236 (numercija prema Kabat-u).
8. 8. Bispecifično IgG antitelo prema patentnom zahtevu 6 ili 7, naznačeno time što navedeni mutirani CH2 i/ili niži zglobni domeni sadrže supstituciju L235G i/ili G236R, poželjno L235G i G236R.
9. 9. Postupak za proizvodnju bispecifičnog IgG antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1-8 iz jedne ćelije, pri čemu navedeno bispecifično IgG antitelo sadrži dva CH3 domena koji su sposobni da formiraju dodirnu površinu, pri čemu navedeni postupak sadrži obezbeđivanje: - ćelije koja ima a) prvu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira navedeni IgG težak lanac koji specifično prepoznaje CLEC12A i koji sadrži prvi CH3 domen, i b) drugu sekvencu nukleinske kiselinekoja kodira navedeni IgG težak lanac koji specifično prepoznaje CD3, i koji sadrži drugi CH3 domen, pri čemu navedena ćelija ima treću sekvencu nukleinske kiseline koja kodira navedeni zajednički laki lanac i pri čemu navedene sekvence nukleinskih kiselina su obezbeđene sa mutacijama za preferencijalno sparivanje navedenog prvog i drugog CH3 domena, pri čemu navedeni postupak dalje sadrži korak kultivacije navedene ćelije i omogućava ekspresiju navedenih sekvenci nukleinskih kiselina i sakupljanje navedenog bispecifičnog IgG antitela iz kulture.
10. 10. Postupak prema patentnom zahtevu 9 za proizvodnju bispecifičnog IgG1 antitela, naznačen time što navedeni prvi CH3 domen sadrži aminokiselinske supstitucije L351K i T366K (numeracija prema Kabat-u) i pri čemu navedeni drugi CH3 domen sadrži aminokiselinske supstitucije L351D i L368E, pri čemu navedeni postupak dalje sadrži korak kultivacije navedene ćelije i omogućavanje ekspresije navedenih sekvenci nukleinskih kiselina i sakupljanje navedenog bispecifičnog antitela iz kulture.
11. 11. Farmaceutska kompozicija koja sadrži bispecifično IgG antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-8 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
12. 12. Bispecifično IgG antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-8 za upotrebu kao farmaceutika u lečenju mijelodisplastičnog sindroma (MDS), hronične mijelogene leukemije (CML) ili poželjno akutne mijeloidne leukemije (AML). 4