RS57645B1 - Anti-htra1 antitela i načini primene - Google Patents

Description

OPIS

Oblast pronalaska

Predmetni pronalazak se odnosi na anti-HtrA1 antitela i načine njihove primene.

Osnova

Serinska proteaza HtrA1 (PRSS11; klan PA, porodica S1) pripada evolutivno očuvanoj porodici HtrA proteina (Clausen, T., et al., Nat Rev Mol Cell Biol 12:152-62 (2011); Clausen, T., et al., Mol Cell 10:443-55 (2002)). Kod ljudi, HtrA1, HtrA3 i HtrA4 dele istu arhitekturu domena: N-kraj modula nalik IGFBP i modula nalik Kazalu, domen proteaze sa naborom nalik tripsinu i C-kraj PDZ domena. Fiziološki značaj HtrA1 čvrsto je ustanovljen identifikacijom humanim mutacijama nastalim gubitkom funkcije, što izaziva porodično ishemijsko oboljenje malih cerebralnih krvnih sudova (Hara, K., et al., N Engl J Med 360:1729-39 (2009)). Molekulski mehanizam obuhvata inhibiciju deficitarnog TGF-β pomoću HtrA1, što rezultuje povećanjem signalizacije TGF-β (Hara et al., 2009). Disregulisana signalizacija TGF-β aberantnom ekspresijom HtrA1 može da doprinese i artritičnom oboljenju (Oka, C., et al., Development 131:1041-53 (2004); Tsuchiya, A., et al., Bone 37:323-36 (2005)), možda u konjunkciji sa degradacijom posredovanom HtrA1 različitih komponenti u vanćelijskom matriksu (Chamberland et al., J Biol Chem 284:27352-9 (2009); Grau, S., et al., J Biol Chem 281:6124-9 (2006); Hadfield, K.D., et al., J Biol Chem 283:5928-38 (2008); Tocharus, J., et al., Dev Growth Differ 46:257-74 (2004); Tsuchiya et al., 2005)) ili indirektno putem regulacije metaloproteaza u matriksu (Grau et al., 2006). Pored toga, istraživanjima ljudskih gena identifikovana je snažna korelacija između napredovanja makularne degeneracije uslovljene godinama starosti i SNP u HtrA1 regionu promotera, što je rezultovalo povećanim HtrA1 nivoima transkripcije (Dewan, A., et al., Science 314:989-92 (2006); Yang, Z., et al., Science 314:992-3 (2006)). Poliklonska antitela u poređenju sa HtrA1 obrazložena su u WO 2009/046405. Stoga inhibicija enzimatske funkcije HtrA1 predstavlja atraktivan terapeutski pristup, npr. za makularnu degeneraciju uslovljenu godinama starosti i artritična oboljenja.

Kratak prikaz

Pronalazak obezbeđuje anti-HtrA1 antitela i načine njihove primene za iste terapeutske svrhe kao što je definisano u zahtevima. Pronalazak je usmeren na izolovano monoklonsko antitelo koje se vezuje za HtrA1 i inhibira aktivnost svoje serinske proteaze za jedan HtrA1 supstrat ili više njih, pri čemu antitelo sadrži VH sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 32 i VL sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO:31.

U jednom aspektu, obrazloženjem se daje izolovano antitelo koje se vezuje za HtrA1 i poseduje jedno ili više svojstava navedenih u nastavku: (i) IC50od manje od 50 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 5 nM, 3 nM, 2,5 nM, 2 nM, 1 nM ili manje za jedan HtrA1 supstrat ili više njih; (ii) vezuje se za HtrA1 u razmeri od jednog varijabilnog domena prema jednoj podjedinici HtrA1 trimera (npr. Fab se vezuje za HtrA1 trimer u razmeri tri Faba prema jednom HtrA1 trimeru, a IgG se vezuje za HtrA1 trimer u razmeri tri IgG prema dva HtrA1 trimera), (iii) antitela koja sadrže dva varijabilna domena vezuju se za HtrA1 na način koji rezultuje stvaranjem „kaveza”, slično primeru sa Slike 9; (iv) ne sprečava formiranje trimera od HtrA1, (v) vezuje se za jedan ostatak ili više ostataka u petlji C HtrA1 proteina, (vi) vezuje se za domen proteaze HtrA1, (vii) vezuje se za epitop koji sadrži jednu aminokiselinu ili obe aminokiseline N224 ili K248 od SEQ ID NO: 13 ili ekvivalente aminokiselina u različitim sekvencama HtrA1 (npr. aminokiseline N224 i K248 od SEQ ID NO: 14, videti Slike 10A i 10B); (viii) vezuje se za epitop koji se sastoji od jednog ostatka ili više sledećih ostataka aminokiselina N224, K248, V201, T223, K243, K225, E247 i H220 od SEQ ID NO: 13 ili ekvivalente aminokiselina u različitim sekvencama HtrA1; (ix) unakrsno reaguje s mišijim HtrA1; (x) ne reaguje unakrsno s HtrA2, HtrA3 i/ili HtrA4; (xi) kompetitivno se vezuje za HtrA1 sa antitelom koje sadrži VH sekvencu od SEQ ID NO:8 i VL sekvencu od SEQ ID NO:7, (xii) vezuje se za HtrA1 konstantom disocijacije od ≤500 nM ili (xiii) inhibira formiranje kompleksa između HtrA1 i al-antitripsina (A1AT).

U drugom aspektu, obrazloženjem se daje izolovano antitelo koje se vezuje za HtrA1, pri čemu se antitelo (i) vezuje za epitop koji sadrži N224, K248 ili oba HtrA1 i (ii) inhibira HtrA1sa IC50od ≤ 30 nM. U određenim primerima izvođenja, epitop dalje sadrži jedan ostatak ili više sledećih ostataka HtrA1: V201, T223, K243, K225, E247 i H220. U određenim primerima izvođenja, antitelo može dalje da poseduje jedno ili više svojstava navedenih u nastavku: (i) vezuje se za HtrA1 u razmeri od jednog varijabilnog domena prema jednoj podjedinici HtrA1 trimera ili (ii) ne sprečava formiranje trimera od HtrA1. U određenim primerima izvođenja, IC50se određuje pomoću testa serinskom proteazom sa supstratom koji ima SEQ ID NO: 12, npr. kao što je ovdeopisani FRET test.

U određenim primerima izvođenja, ovdeopisano antitelo ne reaguje unakrsno sa jednim ili više HtrA2, HtrA3 i HtrA4.

U određenim primerima izvođenja, ovdeopisano antitelo ima konstantu disocijacije od ≤500 nM. Konstanta disocijacije se može utvrditi, na primer, instrumentom BIAcore pomoću Faba.

U određenim primerima izvođenja, ovdeopisano antitelo je humano, humanizovano ili himerno antitelo.

U određenim primerima izvođenja, ovdeopisano antitelo je fragment antitela koje vezuje HtrA1.

U određenim primerima izvođenja, ovdeopisano antitelo obuhvata sledeće: (a) HVR-H1 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:4; (b) HVR-H2 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:5; (c) HVR-H3 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:6; (d) HVR-L1 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:1; (e) HVR-L2 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:2 i (f) HVR-L3 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:3.

U određenim primerima izvođenja, ovdeopisano antitelo obuhvata (a) HVR-H1 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:20; (b) HVR-H2 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:5 i (c) HVR-H3 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:6.

U određenim primerima izvođenja, ovdeopisano antitelo dalje obuhvata sledeće: (a) HVR-L1 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:18; (b) HVR-L2 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:2; (c) HVR-L3 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:19 ili ovdeopisano antitelo dalje obuhvata (d) HVR-L1 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:21; (e) HVR-L2 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:2 i (f) HVR-L3 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:22. U određenim primerima izvođenja, ovdeopisano antitelo dalje obuhvata teški lanac okvira varijabilnog domena (FR2) sekvence SEQ ID NO:17.

U određenim primerima izvođenja, ovdeopisano antitelo obuhvata (a) VH sekvencu koja ima najmanje 95% identiteta sekvence aminokiseline SEQ ID NO:8; (b) VL sekvencu koja ima najmanje 95% identiteta sekvence aminokiseline SEQ ID NO:7.

U određenim primerima izvođenja, ovdeopisano antitelo obuhvata VH sekvencu koja sačinjava SEQ ID NO: 32 i VL sekvencu koja sačinjava SEQ ID NO: 31.

U određenim primerima izvođenja, ovdeopisano antitelo obuhvata VH sekvencu koja sačinjava SEQ ID NO: 8 i VL sekvencu koja sačinjava SEQ ID NO: 7.

U određenim primerima izvođenja, ovdeopisano antitelo obuhvata VH sekvencu koja sačinjava SEQ ID NO: 30 i VL sekvencu koja sačinjava SEQ ID NO: 28.

U određenim primerima izvođenja, ovdeopisano antitelo obuhvata VH sekvencu koja sačinjava SEQ ID NO: 30 i VL sekvencu koja sačinjava SEQ ID NO: 29.

U određenim primerima izvođenja, ovdeopisano antitelo je IgG1 ili IgG4 antitelo pune dužine.

U drugom aspektu, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja kodira ovdeopisano anti-HtrA1 antitelo.

U drugom aspektu, obezbeđena je ćelija domaćin koja sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira ovdeopisano anti-HtrA1 antitelo.

U drugom aspektu, obezbeđen je postupak proizvodnje antitela. Postupak može da obuhvata kultivisanje ćelije domaćina koja sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira anti-HtrA1 antitelo u uslovima odgovarajućim za predstavljanje nukleinske kiseline koja kodira anti-HtrA1 antitelo. Postupak može dalje da sadrži izdvajanje anti-HtrA1 antitela iz kulture ćelija domaćina, prečišćavanje anti-HtrA1 antitela ili formulaciju anti-HtrA1 antitela pomoću farmaceutski prihvatljivog ekscipijenta.

U drugom aspektu, obezbeđen je imunokonjugat koji sadrži anti-HtrA1 antitelo i citotoksični agens.

U drugom aspektu, obezbeđena je farmaceutska formulacija koja sadrži anti-HtrA1 antitelo i farmaceutski prihvatljivi nosač.

U drugom aspektu, aplikacija obezbeđuje anti-HtrA1 antitelo za upotrebu u obliku medikamenta, npr. za lečenje makularne degeneracije uslovljene godinama starosti (AMD, mokra ili suva), geografske atrofije (GA), dijabetesne retinopatije (DR), prematurne retinopatije (ROP) ili polipoidne horoidalne vaskulopatije (PCV), u svrhu kočenja degeneracije retinskih ili fotoreceptorskih ćelija ili aktivnosti HtrA1 proteaze u oku.

U drugom aspektu, aplikacija obezbeđuje anti-HtrA1 antitelo za upotrebu u lečenju pojedinaca od makularne degeneracije uslovljene godinama starosti (mokra ili suva), geografske atrofije, dijabetesne retinopatije, prematurne retinopatije ili polipoidne horoidalne vaskulopatije, koje se sastoji od ovdeopisane primene terapeutski efikasne količine anti-HtrA1 antitela na pojedinca.

U drugom aspektu, aplikacija obezbeđuje anti-HtrA1 antitelo za upotrebu u inhibiranju degeneracije retinskih ili fotoreceptorskih ćelija kod pojedinca, što podrazumeva ovdeopisanu primenu terapeutski efikasne količine anti-HtrA1 antitela u cilju kočenja degeneracije retinskih ili fotoreceptorskih ćelija.

U drugom aspektu, aplikacija obezbeđuje anti-HtrA1 antitelo za upotrebu u inhibiranju aktivnosti HtrA1 serinske proteaze u oku pojedinca, što podrazumeva ovdeopisanu primenu terapeutski efikasne količine anti-HtrA1 antitela u cilju kočenja aktivnosti HtrA1 serinske proteaze u oku.

Kratak opis slika

Slike 1A i 1B. Slika 1A prikazuje laki lanac varijabilnog domena sekvence anti-HtrA1 antitela 94 (YW505.94) (SEQ ID NO:7). Slika 1B prikazuje teški lanac varijabilnog domena sekvence anti-HtrA1 antitela 94 (YW505.94) (SEQ ID NO:8). Ostaci su numerisani u skladu sa Kabatovim sistemom numeracije (Kabat, E.A., et al., 1991, u: Sequences of proteins of immunological interest, fifth edition. National Institutes of Health, Bethesda, MD). Laki lanac varijabilnog domena sekvence YW505.94 usklađen je s konsenzus sekvencom humanog Kapalovog lakog lanca (SEQ ID NO: 9), a teški lanac varijabilnog domena sekvence YW505.94 usklađen je sa teškim lancem sekvence (SEQ ID NO: 10) humane podgrupe III. U skladu s Kabatovim definicijama, uokvirene sekvence su regioni CDR. Nisu jasne sekvencijalne razlike između anti-HtrA1 (YW505.94) i konsenzus sekvenci.

Sl. 2. Skrining panela 13 antitela (IgG) dobijenih iz faga. Pojedinačne koncentracije (0,08 mg/ml finalne – 0,28 mg/ml finalne) IgG inkubirane su pomoću HuHtrA1 ili HuHtrA1_PD, a aktivnost enzima se meri FRET testom. Od 13 testiranih antitela, antitela YW503.57, YW504.57, YW504.61 i YW505.94 (pominju se i kao Ab94 ili IgG94) snažno su inhibirale aktivnosti HuHtrA1 i HuHtrA1_PD.

Sl. 3. Inhibicija HuHtrA1 pomoću IgG94 i Fab94. HuHtrA1 je inkubiran sa IgG94 i Fab94 tokom 20 minuta na 37° C. Izmerena je enzimska aktivnost usmerena na peptidske supstrate H2-Opt, a delimične aktivnosti (vi/vo) izračunate su koristeći utvrđenu linearnu brzinu. IgG94 pri 300nM nije inhibirao hidrolizu H2-Opt tripsinom (1 nM) ili elastazu (1 nM).

Sl. 4. IgG94 inhibira hidrolizu kazeina obojenog fluorescentnom bojom (BODIPY FL) pomoću HuHtrA1 i MuHtrA1. HuHtrA1 i MuHtrA1 su inkubirani sa IgG94 tokom 15 minuta na 37° C. Hidroliza reagensa kazeina BODIPY FL izmerena je mikrotitarskim pločicama na 37° C, a linearne stope porasta fluorescencije određene i izražene kao procenti neinhibiranih stopa (% kontrole).

Sl. 5. Specifičnost IgG94. MuHtrA1_PD, MuHtrA3_PD i MuHtrA4_PD inkubirani su sa povećanim koncentracijama IgG94, a enzimska aktivnost usmerena na peptidske supstrate H2-Opt (gornji panel) ili reagens kazeina BODIPY FL (donji panel) utvrđeni su i izraženi kao procenti neinhibirane enzimske aktivnosti (% kontrole).

Sl. 6. Inhibicija HuHtrA1 posredovanog makromolekularnog dela supstrata pomoću IgG94. Povećavanje koncentracija IgG94 (2,3 nM – 150 nM za β-kazein; 2 nM – 125 nM za dekorin; 2,3 nM – 150 nM za biglikan) prilikom inkubacije sa HuHtrA1 (10 nM za β-kazein, 125 nM za dekorin, 75 nM za biglikan) tokom 15 minuta na 37° C. Dodati su supstrati β-kazeina, dekorina i biglikana (50 μg/ml) i inkubirani tokom perioda 2–14 sati. Nakon dodavanja pufera SDS uzorka, digesti su analizirani pomoću SDS-PAGE (neredukcioni uslovi) i kontrastovani pomoću SimplyBlue Safestain.

Slike 7A–7C. Mapiranje funkcionalnih epitopa IgG94 na HuHtrA1_PD. Slika 7A prikazuje rezultate dobijene ELISA testiranjem vezivanja IgG94 za HuHtrA1_PD mutante sa supstitucijama alanina od ostataka oko aktivnog mesta. Zasenčeni redovi ukazuju na supstitucije alanina koje su izazvala smanjenje veće od petostrukog u pogledu vezivanja. Slika 7B prikazuje strukturu HuHtrA1_PD (PDB 3NWU) (Clausen, T., et al., Nat Rev Mol Cell Biol. 12:152-62 (2011)) sa naznačenim mutiranim ostacima. Srednje sivo zasenčenje prikazuje mutacije bez gubitka u pogledu vezivanja IgG94 u inicijalnim eksperimentima; tamno sivo zasenčenje prikazuje podskup ostataka sa gubitkom većim od petostrukog u pogledu vezivanja. Tri monomera koji formiraju trimer domena proteaze, prikazani na površinskoj prezentaciji, osenčeni su svetlosivom bojom. Ostaci katalitičke trijade, D250 i S328, podvučeni su. Slika 7C prikazuje uveličani prikaz petlji koje zadržavaju ostatke epitopa N224 i K248 na monomeru (svetlosivo, kao crtež) HuHtrA1_PD (PDB 3NWU). Obuhvaćen je i katalitički ostatak H220.

Slike 8A i 8B (hromatografija na molekularnim sitima – višeugaono lasersko rasejanje svetlosti) Fab94:HuHtrA1_PD(S328A) kompleksa (Slika 8A) i IgG94:HuHtrA1_PD(S328A) kompleks (Slika 8B). Prikazani su pikovi elucije pomoću SEC (x-osa) i mase individualnih proteina i kompleksa (y-osa; isprekidane linije preko pikova elucije).

Sl. 9. Hipotetički ’model kaveza’ IgG:HuHtrA1-PD kompleksa.

Slike 10A i 10B. Poravnanje humanog HtrA1 (SEQ ID NO: 13), mišijeg HtrA1 (SEQ ID NO: 14), mišijeg HtrA3 (SEQ ID NO: 15) i mišijeg HtrA4 (SEQ ID NO: 16).

Slika 11. Ekspresija HtrA1 mRNK povećava se u retini miša prilikom konstantnog izlaganja svetlosti (gornji levi panel). Nivoi HtrA2 ne menjaju se značajno na istom modelu (gornji desni panel). Ekspresija HtrA1 značajno je viša od ekspresije HtrA2, HtrA3 id HtrA4 u retini miša na osnovici (donji panel).

Sl. 12. Pojačani odgovori bipolarne ćelije / Milerove ćelije u odsustvu ekspresije HtrA1 na modelu miša prilikom konstantnog izlaganja svetlosti.

Sl. 13. Očuvanje retine u odsustvu ekspresije HtrA1 na modelu miša prilikom konstantnog izlaganja svetlosti.

Sl. 14. Očuvanje spoljašnjeg nuklearnog sloja (ONL) fotoreceptorske ćelije u odsustvu ekspresije HtrA1 na modelu miša prilikom konstantnog izlaganja svetlosti.

Sl. 15. Sekvence HVR lakog lanca za unapređene varijante u pogledu afiniteta anti-HtrA1 antitela YW505.94a.

Sl. 16. Sekvence HVR teškog lanca za unapređene varijante u pogledu afiniteta anti-HtrA1 antitela YW505.94a.

Sl. 17. Rezultati kompetitivnog testa faga prikazuje vezivanje YW505.94a unapređene varijante u pogledu afiniteta u poređenju sa HuHtrA1.

Sl. 18. Rezultati kompetitivnog testa faga prikazuje vezivanje YW505.94a unapređene varijante u pogledu afiniteta u poređenju sa MuHtrA1.

Slike 19A–19C. Rezultati ELISA testa prikazuju nivoe HtrA1 proteina u tkivu pacova (Slika 19A), očnoj vodici miša (Slika 19B) i tkivu retine miša (Slika 19C).

Detaljan opis izvođenja pronalaska

I Definicije

„Akceptorski humani okvir” je za ove svrhe okvir koji sadrži aminokiselinske sekvence okvira varijabilnog domena lakog lanca (VL) ili varijabilnog domena teškog lanca (VH) dobijenog od okvira humanog imunoglobulina ili okvira humanog konsenzusa, kao što je definisano u nastavku. Akceptorski humani okvir „dobijen od” okvira humanog imunoglobulina ili okvira humanog konsenzusa može da obuhvati iste aminokiselinske sekvence kao što su njihove ili može da sadrži izmene u sekvenci aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, broj izmena aminokiselina je 10 ili manje, 9 ili manje, 8 ili manje, 7 ili manje, 6 ili manje, 5 ili manje, 4 ili manje, 3 ili manje, ili 2 ili manje. U nekim primerima izvođenja, VL akceptorski humani okvir je po sekvenci identičan sekvenci VL humanog imunoglobulinskog okvira ili sekvenci okvira humanog konsenzusa.

„Afinitet” se odnosi na snagu zbira ukupnih nekovalentnih interakcija između jednog mesta vezivanja molekula (npr. antitela) i njegovog partnera u vezivanju (npr. antigena). Ukoliko nije drugačije naznačeno, kao što je ovde upotrebljeno, „afinitet vezivanja” se odnosi na suštinski afinitet prema vezivanju koji odražava 1:1 interakciju između članova vezujućeg para (npr. antitela i antigena). Afinitet molekula X prema njegovom partneru Y može generalno da se predstavi pomoću konstante disocijacije (Kd). Afinitet može da se izmeri uobičajenim postupcima poznatim u struci, uključujući one koje su ovde opisane. Specifična ilustrativna izvođenja data kao primer za merenje afiniteta vezivanja opisana su u nastavku.

Termin „afinitetno zrelo” antitelo odnosi se na antitelo sa jednom ili više izmena u jednom ili više hipervarijabilnih regiona (HVR) u poređenju sa matičnim antitelom koje nema takve izmene, pri čemu takve izmene dovode do poboljšanja afiniteta antitela prema antigenu.

Termin „anti-HtrA1 antitelo” ili „antitelo koje se vezuje za HtrA1” odnosi se na antitelo koje je sposobno za vezivanje HtrA1 sa dovoljnim afinitetom tako da je antitelo korisno kao dijagnostički i/ili terapeutski agens u cilju HtrA1. U jednom primeru izvođenja, obim vezivanja anti-HtrA1 antitela za nepovezan protein koji nije HtrA1 manji je od oko 10% od vezivanja antitela za HtrA1 kao što je izmereno, npr. radioimunotestom (RIA). U određenim primerima izvođenja, antitelo koje se vezuje za HtrA1 ima konstantu disocijacije (Kd) od ≤ ≤1µM, ≤ ≤100 nM, ≤ ≤10 nM, ≤≤1 nM, ≤ ≤0,1 nM, ≤ ≤0,01 nM, ili ≤ ≤0,001 nM (npr.10<-8>M ili manje, npr. od 10<-8>M do 10<-13>M, npr. od 10<-9>M do 10<-13>M). U određenim primerima izvođenja, anti-HtrA1 antitelo se vezuje za epitop HtrA1 koji je konzerviran među HtrA1 različitih vrsta.

Termin „antitelo” ovde je upotrebljen u najširem smislu i obuhvata različite strukture antitela, uključujući, bez ograničenja, monoklonska antitela, poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela) i fragmente antitela, dokle god oni pokazuju željenu antigen vezujuću aktivnost.

„Fragment antitela” ukazuje na molekul koji nije netaknuto antitelo, a koji sadrži deo netaknutog antitela i vezuje antigen za koji se vezuje netaknuto antitelo. Primeri za fragmente antitela uključuju, bez ograničenja, Fv, Fab, Fab', Fab’-SH, F(ab’)2; dijatela, linearna antitela, molekule antitela sa jednim lancem (npr. scFv) i multispecifična antitela nastala od fragmenata antitela.

„Antitelo koje se vezuje za isti epitop”, kao referentno antitelo, odnosi se na antitelo koje blokira vezivanje referentnog antitela za njegov antigen u kompetitivnom testu za 50% ili više, i obrnuto, referentno antitelo blokira vezivanje antitela za njegov antigen u kompetitivnom testu za 50% ili više. Ovde je dat primer kompetitivnog testa.

Termin „himerno” antitelo ukazuje na antitelo kod koga je deo teškog i/ili lakog lanca dobijen od posebnog izvora ili vrste, dok je ostatak teškog i/ili lakog lanca dobijen od različitog izvora ili vrste.

„Klasa” antitela ukazuje na vrstu konstantnog domena ili konstantnog regiona koju ima njegov teški lanac. Postoji pet glavnih klasa antitela: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a neke od njih mogu dalje da se dele na potklase (izotipove), npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1i IgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina zovu se α, δ, ε, γ, odnosno μ.

Termin „citotoksični agens” kao što se ovde koristi odnosi se na supstancu koja inhibira ili sprečava ćelijsku funkciju i/ili izaziva ćelijsku smrt ili uništenje. Citotoksični agensi uključuju, bez ograničenja, radioaktivne izotope (npr. At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>, Pb<212>i radioaktivne izotope Lu); hemoterapeutske agense ili lekove (npr. metotreksat, adriamicin, vinka alkaloide (vinkristin, vinblastin, etopozid), doksorubicin, melfalan, mitomicin C, hlorambucil, daunorubicin ili druge interkalirajuće agense); agense za inhibiciju rasta; enzime i njihove fragmente, kao što su nukleolitički enzimi; antibiotike; toksine, kao što su toksini malog molekula ili enzimski aktivni toksini bakterijskog, fungalnog, biljnog ili životinjskog porekla, uključujući njihove fragmente i/ili varijante, kao i različite antitumorske ili antikancerogene agense koji su objašnjeni u nastavku.

„Efektorske funkcije” ukazuju na one biološke aktivnosti koje mogu da se pripišu Fc regionu antitela, čiji izotipom antitela varira. Primeri efektorskih funkcija antitela uključuju: vezivanje C1q i komplementno zavisnu citotoksičnost (CDC); vezivanje Fc receptora, ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC); fagocitozu; nishodnu regulaciju površinskih ćelijskih receptora (npr. B-ćelijski receptor) i aktivaciju B ćelija.

„Efikasna količina” agensa, npr. farmaceutske formulacije, odnosi se na količinu koja je u potrebnim dozama i vremenskim periodima efikasna za postizanje željenog terapeutskog ili profilaktičkog rezultata.

Termin „Fc region” ovde se koristi da definiše region C-kraja imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži barem deo konstantnog regiona. Termin uključuje nativne sekvence Fc regiona i varijante Fc regiona. U jednom primeru izvođenja, Fc region teškog lanca humanog IgG pruža se od Cys226, ili od Pro230, do karboksilnog kraja teškog lanca. Međutim, C-terminalni lizin (Fys447) Fc regiona može, ali ne mora biti prisutan. Ukoliko ovde nije drugačije naznačeno, numerisanje ostataka aminokiselina u Fc regionu ili konstantnom regionu u skladu je sa EU sistemom numeracije, koji se takođe naziva EU indeks, kao što je opisano u Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

„Okvir regiona” ili „FR„” se odnosi na ostatke varijabilnog domena koji nisu ostaci hipervarijabilnog regiona (HVR). FR varijabilnog domena uglavnom se sastoji od četiri FR domena: FR1, FR2, FR3 i FR4. Prema tome, HVR i FR sekvence uglavnom se pojavljuju u sledećoj sekvenci u VH (ili VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

Termini „antitelo pune dužine”, „netaknuto antitelo” i „kompletno antitelo” ovde se koriste naizmenično da bi se ukazalo na antitelo koje ima strukturu u suštini sličnu nativnoj strukturi antitela ili koje ima teške lance koji sadrže Fc region kao što je ovde definisano.

Termini „ćelija domaćin”, „linija ćelija domaćina” i „kultura ćelija domaćina” koriste se kao sinonimi i ukazuju na ćelije u koje je uvedena egzogena nukleinska kiselina, uključujući potomstvo takvih ćelija. Ćelije domaćini uključuju „transformante” i „transformisane ćelije” koje uključuju primarne transformisane ćelije i njihovo potomstvo, bez obzira na broj presejavanja. Po sadržaju nukleinskih kiselina potomstvo ne mora da bude sasvim identično matičnoj ćeliji, već može da sadrži mutacije. Ovde je obuhvaćeno mutantno potomstvo koje ima istu funkciju ili biološku aktivnost kao što je ispitano ili odabrano u originalno transformisanoj ćeliji.

„Humano antitelo” je ono koje ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara aminokiselinskoj sekvenci koju proizvodi čovek ili humana ćelija ili je dobijeno iz nehumanog izvora koji koristi humane repertoare antitela ili druge sekvence za kodiranje humanog antitela. Ova definicija humanog antitela specifično isključuje humanizovano antitelo koje sadrži nehumane antigen vezujuće ostatke.

„Okvir humanog konsenzusa” je okvir koji predstavlja najčešće ostatke aminokiselina u izboru okvirnih sekvenci VL il VH humanog imunoglobulina. Uglavnom, izbor VL ili VH sekvenci humanog imunoglobulina je iz podgrupe sekvenci varijabilnog domena. Uglavnom, podgrupa sekvenci je podgrupa kao u radu Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3. U jednom primeru izvođenja, za VL, podgrupa je podgrupa kapa I, kao u Kabat et al., gore. U jednom primeru izvođenja, za VH, podgrupa je podgrupa HI kao u Kabat et al., gore.

„Humanizovano” antitelo ukazuje na himerno antitelo koje obuhvata aminokiselinske ostatke od nehumanih HVR i aminokiselinske ostatke od humanih FR. U određenim primerima izvođenja, humanizovano antitelo će da sadrži u suštini sve ili barem jedan, a tipično dva, varijabilna domena, u kojima svi ili suštinski svi HVR (npr. CDR) odgovaraju onima iz nehumanog antitela, a svi ili suštinski svi FR odgovaraju onima iz humanog antitela. Humanizovano antitelo opciono može da sadrži barem deo konstantnog regiona antitela dobijenog od humanog antitela. „Humanizovani oblik„” antitela, npr. nehumanog antitela, ukazuje na antitelo koje je pretrpelo humanizaciju.

Termin „hipervarijabilni region” ili „HVR”, u smislu ovog dokumenta, ukazuje na svaki od regiona varijabilnog domena antitela koji su hipervarijabilni u sekvenci i/ili formiraju strukturno definisane petlje („hipervarijabilne petlje”). U suštini, nativna četvorolančana antitela sadrže šest HVR: tri u VH (H1, H2, H3) i tri u VL (L1, L2, L3). HVR regioni uglavnom sadrže ostatke aminokiselina iz hipervarijabilnih petlji i/ili iz „regiona koji određuju komplementarnost” (CDR), gde ovi drugi imaju najveću varijabilnost sekvenci i/ili su uključeni u prepoznavanje antigena. Ovdekorišćeni HVR region sadrži bilo koji broj ostataka lociranih u krugu pozicija 24-36 (za L1), 46-56 (za L2), 89-97 (za L3), 26-35B (za H1), 47-65 (za H2) i 93-102 (za H3). Stoga, HVR sadrži ostatke na prethodno opisanim pozicijama:

A) 24-34 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) i 96-101 (H3) (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol.196:901-917 (1987);

B) 24-34 od L1, 50-56 od L2, 89-97 od L3, 31-35B od H1, 50-65 od H2 i 95-102 od H3 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).

C) 30-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35 (H1), 47-58 (H2), 93-100a-j (H3) (MacCallum et al. J. Mol. Biol.262:732-745 (1996).

Sa izuzetkom CDR1 u VH, CDR uglavnom sadrže aminokiselinske ostatke koji formiraju hipervarijabilne petlje. CDR takođe sadrže „ostatke koji određuju specifičnost” ili „SDR”, koji su ostaci koji stupaju u kontakt sa antigenom. SDR se nalaze u okviru regiona CDR koji se nazivaju skraćeni CDR ili a-CDR. Primeri a-CDR (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 i a-CDR-H3) dešavaju se na aminokiselinskim ostacima 31-34 kod L1, 50-55 kod L2, 89-96 kod L3, 31-35B kod H1, 50-58 kod H2 i 95-102 kod H3. (Pogledajte Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008).) Ako nije drugačije naznačeno, HVR ostaci i drugi ostaci u varijabilnom domenu (npr. FR ostaci) ovde su nabrojani prema radu Kabat et al, gore.

„Imunokonjugat” je antitelo konjugovano sa jednim molekulom ili više heterolognih molekula, uključujući, bez ograničenja, citotoksični agens.

„Pojedinac” ili „ispitanik” je sisar. Sisari uključuju, bez ograničenja, domaće životinje (npr. krave, ovce, mačke, pse i konje), primate (npr. ljude i nehumane primate, kao što su majmuni), zečeve i glodare (npr. miševe i pacove). U određenim primerima izvođenja, pojedinac ili ispitanik je čovek.

„Izolovano” antitelo je ono koje je izdvojeno iz svog prirodnog okruženja. U nekim primerima izvođenja, antitelo je prečišćeno do čistoće veće od 95% ili 99% kao što je određeno, na primer, elektroforetski (npr. SDS-PAGE, izoelektrično fokusiranje (IEF), kapilarna elektroforeza) ili hromatografski (npr. jonskom izmenom ili reverzno faznim HPLC postupkom). Za pregled postupaka za određivanje čistoće antitela pogledajte npr. Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).

„Izolovana” nukleinska kiselina ukazuje na molekul nukleinske kiseline koji je odvojen od komponenata svog prirodnog okruženja. Izolovana nukleinska kiselina uključuje molekul nukleinske kiseline koji se nalazi u ćelijama koje uobičajeno sadrže molekul nukleinske kiseline, ali je molekul nukleinske kiseline prisutan ekstrahromozomski ili na hromozomskoj lokaciji koja se razlikuje od njegove prirodne hromozomske lokacije, ili sadrži samo kodirajuće sekvence.

„Izolovana nukleinska kiselina koja kodira anti-HtrA1 antitelo” ukazuje na jedan ili više molekula nukleinske kiseline koji kodiraju teške i lake lance antitela (ili njihove fragmente), uključujući takve molekule nukleinske kiseline u jednom vektoru ili odvojenim vektorima, i takve molekule nukleinske kiseline nalaze se na jednoj ili više lokacija u ćeliji domaćina.

Termin “monoklonsko antitelo”, kako je ovde korišćen, odnosi se na antitelo, dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, t.j., pojedinačna antitela koja su sadržana u populaciji su identična i/ili se vezuju za isti epitop, sa izuzetkom mogućih varijanti antitela, npr. koje sadrže mutacije koje postoje u prirodi ili se mogu razviti tokom proizvodnje preparata monoklonskog antitela, a takve su varijante uopšteno prisutne u neznatnim količinama. Kao suprotnost preparatima poliklonskih antitela, koji tipično uključuju različita antitela, usmerena prema različitim determinantama (epitopima), svako monoklonsko antitelo iz preparata monoklonskog antitela je usmereno prema jednoj determinanti na antigenu. Tako, oznaka “monoklonsko” ukazuje na karakter antitela, da je dobijeno iz suštinski homogene populacije antitela, i ne bi se trebala tumačiti kao zahtev za proizvodnju antitela bilo kojim posebnim postupkom. Na primer, monoklonska antitela koja će se koristiti u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu se dobiti različitim tehnikama, uključujući, bez ograničenja, postupak hibridoma, postupke rekombinantne DNK, postupak displeja faga i postupke koje koriste transgene životinje koje sadrže kompletne lokuse humanog imunoglobulina ili njihove delove, i ovde su opisane takvi postupci i primeri drugih postupak za dobijanje monoklonskih antitela.

„Golo antitelo” ukazuje na antitelo koje nije konjugovano sa heterologim delom (npr. citotoksičnim delom) ili radiološkom oznakom. Golo antitelo može da se nalazi u farmaceutskoj formulaciji.

„Nativna antitela” ukazuju na molekule imunoglobulina koji se sreću u prirodi, sa različitim strukturama. Na primer, nativna IgG antitela su heterotetramerni glikoproteini od oko 150.000 daltona, sastavljeni od dva identična laka lanca i dva identična teška lanca koji su povezani disulfidnim vezama. Od N-kraja do C-kraja, svaki teški lanac ima varijabilni region (VH), koji se takođe zove varijabilni teški domen ili varijabilni domen teškog lanca, za kojim slede tri konstantna domena (CH1, CH2 i CH3). Slično tome, od N-kraja do C-kraja, svaki laki lanac ima varijabilni region (VL), koji se takođe zove varijabilni laki domen ili varijabilni domen lakog lanca, za kojim sledi konstantni laki (CL) domen. Laki lanac antitela može se svrstati u jedan od dva tipa, koji se zovu kapa (κ) i lambda (λ), na osnovu aminokiselinske sekvence njihovog konstantnog domena.

Termin „uputstvo za upotrebu” označava uputstvo koje se obično nalazi u prodajnoj ambalaži terapeutskih proizvoda, a koje sadrži informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, primeni, kombinovanoj terapiji, kontraindikacijama i/ili upozorenjima u vezi sa upotrebom takvog terapeutskog proizvoda.

„Procenat (%) identičnosti sekvence aminokiselina” u odnosu na sekvencu referentnog polipeptida definisan je kao procenat aminokiselinskih ostataka u sekvenci kandidatu koji su identični sa aminokiselinskim ostacima u sekvenci referentnog polipeptida, nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalni procenat identičnosti sekvence, ne uzimajući u obzir nikakve konzervativne supstitucije kao deo identiteta sekvence. Poravnavanje radi određivanja procenta identičnosti sekvence aminokiselina može se postići na različite načine koji su u okviru struke, na primer, pomoću javno dostupnog kompjuterskog softvera, kao što je BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) softver. Stručnjaci za ovu oblast mogu da odrede odgovarajuće parametre za poravnavanje sekvenci, uključujući sve potrebne algoritme za postizanje maksimalnog poravnavanja u kompletnoj dužini sekvenci koje se porede. Međutim, ovde su u tu svrhu vrednosti za % identičnosti sekvence aminokiselina dobijene pomoću kompjuterskog programa za poređenje sekvenci ALIGN-2. Kompjuterski program za poređenje sekvenci ALIGN-2 delo je kompanije Genentech, Inc., a izvorni kod je podnet sa korisničkom dokumentacijom u U.S. Copyright Office (Patentni zavod SAD), Washington D.C., 20559, gde je registrovan pod patentnim brojem U.S. Copyright Registration No. TXU510087. Program ALIGN-2 je javno dostupan kod Genentech, Inc., South San Francisco, California, ili može biti kompiliran iz izvornog koda. Program ALIGN-2 treba da se kompilira za primenu na operativnom sistemu UNIX, uključujući digitalni UNIX V4.0D. Sve parametre poređenja sekvenci je postavio program ALIGN-2 i nisu se menjali.

U slučajevima kada je ALIGN-2 korišćen za poređenja sekvenci aminokiselina, % identičnosti sekvence aminokiseline date sekvence aminokiseline A sa datom sekvencom aminokiseline B, ili u odnosu na nju (što drugačije može da se izrazi kao data aminokiselinska sekvenca A koja ima ili sadrži određeni % identičnosti sekvence aminokiseline prema, sa ili u odnosu na datu aminokiselinsku sekvencu B) izračunava se na sledeći način:

100 puta količnik X/Y

gde je X broj aminokiselinskih ostataka za koje je dobijen rezultat da su identični putem programa za poređenje sekvenci ALIGN-2 pri poravnavanju A i B u tom programu, i gde je Y ukupan broj aminokiselinskih ostataka u B. Treba shvatiti da, u slučaju da dužina aminokiselinske sekvence A nije jednaka dužini aminokiselinske sekvence B, % identičnosti sekvence aminokiseline A u odnosu na B neće biti isti kao % identičnosti sekvence aminokiseline B u odnosu na A. Osim ako nije drugačije navedeno, sve ovde upotrebljene vrednosti % identičnosti sekvence aminokiseline dobijene su kako je opisano u prethodnom paragrafu pomoću ALIGN-2 kompjuterskog programa.

Termin „farmaceutska formulacija” odnosi se na preparat koji je u takvom obliku koji omogućava da biološka aktivnost aktivnog sastojka koji se u njoj sadrži bude efikasna, i koji ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksične za ispitanika na kome će formulacija biti primenjena.

„Farmaceutski prihvatljiv nosač” upućuje na sastojak farmaceutske formulacije koji nije aktivni sastojak, a koji je netoksičan za ispitanika. Farmaceutski prihvatljiv nosač uključuje, bez ograničenja, pufer, ekscipijens, stabilizator ili konzervans.

Termin „Pridruženi protein A koji zahteva visoku temperaturu” ili „HtrA1”, kao što se ovde koristi, ukazuje na svaki nativni HtrA1 koji potiče od bilo kog kičmenjaka, uključujući sisare, kao što su primati (npr. ljudi) i glodare (npr. miševe i pacove) ako nije drugačije naglašeno. Termin obuhvata neobrađen HtrA1 „pune dužine”, kao i sve oblike proteina HtrA1 koji nastaju obradom u ćeliji. Termin takođe obuhvata prirodno postojeće varijante HtrA1, npr. splajsovane ili alelne varijante. Sekvenca aminokiseline primera HtrA1 prikazana je u SEQ ID NO:13. Egzemplarni fragmenti humane HtrA1 obuhvataju fragmente koji sadrže, sastoje se ili koje sačinjavaju aminokiseline Q23-P480 ili P161-K379.

U smislu ovog dokumenta, „lečenje” (i njegovi gramatički oblici, kao što je „lečiti”) odnosi se na kliničku intervenciju u pokušaju da se izmeni prirodni tok bolesti kod pojedinca koji se leči, a može se primenjivati radi profilakse ili tokom kliničke patologije. Poželjni efekti lečenja uključuju, bez ograničenja, sprečavanje pojave ili recidiva bolesti, ublažavanje simptoma, smanjenje svih direktnih ili indirektnih patoloških posledica bolesti, sprečavanje metastaze, usporavanje napredovanja bolesti, poboljšavanje ili ublažavanje stanja bolesti i remisiju ili poboljšanu prognozu. U nekim primerima izvođenja, antitela iz ovog pronalaska se koriste da odlože razvoj bolesti ili da uspore napredovanje bolesti.

Termin „varijabilni region” ili „varijabilni domen” ukazuje na domen teškog ili lakog lanca antitela, a koji je uključen u vezivanje antitela za antigen. Varijabilni domeni teškog lanca i lakog lanca (VH i VL, datim redom) nativnog antitela u suštini imaju slične strukture, pri čemu svaki domen sadrži četiri očuvana okvirna regiona (FR) i tri hipervarijabilna regiona (HVR). (Videti, na primer, Kindt et al., Kuby Immunology, 6<th>ed., W.H. Freeman and Co., str.91 (2007).) Jedan VH ili VL domen može biti dovoljan za dodeljivanje antigen vezujuće specifičnosti. Nadalje, antitela koja vezuju određeni antigen mogu se izolovati pomoću VH ili VL domena iz antitela koje vezuje antigen, za pregledanje biblioteke komplementarnih VH, odnosno VL domena. Videti, e.g., Portolano et al., J. Immunol.150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).

Termin „vektor”, kao što se ovde koristi, ukazuje na molekul nukleinske kiseline koji može da propagira drugu nukleinsku kiselinu za koju je vezan. Termin uključuje vektor kao samoumnožavajuću strukturu nukleinske kiseline, kao i vektor ugrađen u genom ćelije domaćina u koju je uveden. Pojedini vektori mogu da upravljaju ekspresijom nukleinskih kiselina za koje su operativno vezani. Takvi vektori se ovde pominju kao „ekspresioni vektori”.

II. Kompozicije i postupci

U jednom aspektu, pronalazak se delom zasniva na otkriću toga da redukcija aktivnosti HtrA1 ima zaštitne efekte na fotoreceptorske ćelije u oku, spoljašnji nuklearni sloj i funkcionalnost elektroretinograma. U određenim primerima izvođenja, obezbeđena su antitela koja se vezuju za HtrA1. Antitela iz predmetnog pronalaska su korisna za npr. dijagnozu ili lečenje različitih oboljenja u vezi sa aktivnošću HtrA1, uključujući okularne poremećaje, kao što su makularna degeneracijae uslovljena godinama starosti ili geografska atrofija.

A. Primeri za anti-Htra1 antitela

Pronalazak je usmeren na izolovano monoklonsko antitelo koje se vezuje za HtrA1 i inhibira aktivnost svoje serinske proteaze za jedan HtrA1 supstrat ili više njih, pri čemu antitelo sadrži VH sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 32 i VL sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO:31. Anti-HtrA1 antitelo može da ima jedno ili više svojstava navedenih u nastavku: (i) IC50od manje od 50 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 5 nM, 3 nM, 2,5 nM, 2 nM, 1 nM ili manje za jedan HtrA1 supstrat ili više njih; (ii) vezuje se za HtrA1 u razmeri od jednog varijabilnog domena prema jednoj podjedinici HtrA1 trimera (npr. Fab se vezuje za HtrA1 trimer u razmeri tri Faba prema jednom HtrA1 trimeru, a IgG se vezuje za HtrA1 trimer u razmeri tri IgG prema dva HtrA1 trimera), (iii) antitela koja sadrže dva varijabilna domena vezuju se za HtrA1 na način koji rezultuje stvaranjem „kaveza”, slično primeru sa Slike 9; (iv) ne sprečava formiranje trimera od HtrA1, (v) vezuje se za jedna ostatak ili više ostataka u petlji C HtrA1 proteina, (vi) vezuje se za domen proteaze HtrA1, (vii) vezuje se za epitop koji sadrži jednu aminokiselinu ili obe aminokiseline N224 ili K248 od SEQ ID NO: 13 ili ekvivalente aminokiselina u različitim sekvencama HtrA1 (npr. aminokiseline N224 i K248 od SEQ ID NO: 14, videti Sliku 10B); (viii) vezuje se za epitop koji se sastoji od jednog ostatka ili više ostataka aminokiselina N224, K248, V201, T223, K243, K225, E247 i H220 od SEQ ID NO: 13 ili ekvivalente aminokiselina u različitim sekvencama HtrA1; (ix) unakrsno reaguje s mišijim HtrA1; (x) ne reaguje unakrsno s HtrA2, HtrA3 i/ili HtrA4; (xi) kompetitivno se vezuje za HtrA1 sa antitelom koje sadrži VH sekvencu od SEQ ID NO:8 i VL sekvencu od SEQ ID NO:7, (xii) vezuje se za HtrA1 konstantom disocijacije od ≤500 nM ili (xiii) inhibira formiranje kompleksa između HtrA1 i α1-antitripsina (A1AT).

Opisano je anti-HtrA1 antitelo koje sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiti, pet ili šest HVR izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 87; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 88; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 18 ili SEQ ID NO: 20; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 85; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 58 i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 86. U jednom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje anti-HtrA1 antitelo koje sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiti, pet ili šest HVR izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 25; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 27; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 23; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2 i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 24. U jednom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje anti-HtrA1 antitelo koje sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiti, pet ili šest HVR izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od: SEQ ID NO:4, 20, 47-51 i 75-80; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od: SEQ ID NO:5, 52 i 81-82; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od: SEQ ID NO:6, 53 i 83-84; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od: SEQ ID NO:1, 18, 21, 33 i 54-57; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od: SEQ ID NO:2 i 58; (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od: SEQ ID NO:3, 19, 22, 34-46 i 59-74. U jednom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje anti-HtrA1 antitelo koje sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiti, pet ili šest HVR izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2 i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3. U jednom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje anti-HtrA1 antitelo koje sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiti, pet ili šest HVR izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2 i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 19. U jednom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje anti-HtrA1 antitelo koje sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiti, pet ili šest HVR izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 21; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2 i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 22.

U jednom aspektu, ovdeopisano antitelo obuhvata najmanje jednu, dve ili tri VH HVR sekvence izabrane od (a) HVR-H1 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:87; (b) HVR-H2 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:88 i (c) HVR-H3 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:89. U jednom primeru izvođenja, antitelo obuhvata HVR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:89. U drugom primeru izvođenja, antitelo obuhvata HVR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:89 i HVR-L3 koji sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:86. U sledećem primeru izvođenja, antitelo dalje obuhvata HVR-H3 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:89, HVR-L3 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:86 i HVR-H2 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:88. U sledećem primeru izvođenja, antitelo obuhvata (a) HVR-H1 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:87; (b) HVR-H2 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:88 i (c) HVR-H3 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:89.

U jednom aspektu, ovdeopisano antitelo obuhvata najmanje jednu, dve ili tri VH HVR sekvence izabrane od (a) HVR-H1 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:25; (b) HVR-H2 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:26 i (c) HVR-H3 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:27. U jednom primeru izvođenja, antitelo obuhvata HVR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:27. U drugom primeru izvođenja, antitelo obuhvata HVR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:27 i HVR-L3 koji sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:24. U sledećem primeru izvođenja, antitelo dalje obuhvata HVR-H3 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:27, HVR-L3 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:24 i HVR-H2 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:26. U sledećem primeru izvođenja, antitelo obuhvata (a) HVR-H1 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:25; (b) HVR-H2 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:26 i (c) HVR-H3 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:27.

U jednom primeru izvođenja, opisano je antitelo koje sadrži najmanje jedan, dva ili tri VH HVR sekvenci izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od: SEQ ID NO:4, 20, 47-51 id 75-80; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:5, 52 i 81-82 i (c) HVR-H3 ckoji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od: SEQ ID NO:6, 53 i 83-84. U jednom primeru izvođenja, antitelo obuhvata HVR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiseline izabranu od SEQ ID NO:6 i 53. U drugom primeru izvođenja, antitelo obuhvata HVR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiseline izabranu od SEQ ID NO:6, 53 i 83-84 i HVR-L3 koji sadrži sekvencu aminokiseline izabranu od SEQ ID NO:3, 19, 22, 34-46 i 59-74. U sledećem primeru izvođenja, antitelo obuhvata HVR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiseline izabranu od SEQ ID NO:6, 53 i 83-84 i HVR-L3 koji sadrži sekvencu aminokiseline izabranu od SEQ ID NO:3, 19, 22, 34-46 i 59-74 i HVR-H2 koji sadrži sekvencu aminokiseline izabranu od SEQ ID NO:5, 52 i 81-82. U sledećem primeru izvođenja, antitelo obuhvata (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu aminokiseline izabranu od SEQ ID NO:4, 20, 47-51 i 75-80 i (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu aminokiseline izabranu od SEQ ID NO:5, 52, i 81-82 i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiseline izabranu od SEQ ID NO:6, 53 i 83-84.

U jednom primeru izvođenja, ovdeopisano antitelo obuhvata najmanje jednu, dve ili tri VH HVR sekvence izabrane od (a) HVR-H1 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:4; (b) HVR-H2 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:5 i (c) HVR-H3 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:6. U jednom primeru izvođenja, antitelo obuhvata HVR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:6. U drugom primeru izvođenja, antitelo obuhvata HVR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:6 i HVR-L3 koji sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:3. U sledećem primeru izvođenja, antitelo dalje obuhvata HVR-H3 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:6, HVR-L3 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:3 i HVR-H2 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:5. U sledećem primeru izvođenja, antitelo obuhvata (a) HVR-H1 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:4; (b) HVR-H2 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:5 i (c) HVR-H3 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:6.

U jednom primeru izvođenja, ovdeopisano antitelo obuhvata najmanje jednu, dve ili tri VH HVR sekvence izabrane od (a) HVR-H1 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:20; (b) HVR-H2 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:5 i (c) HVR-H3 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:6. U jednom primeru izvođenja, antitelo obuhvata HVR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:20. U drugom primeru izvođenja, antitelo obuhvata HVR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:20 i HVR-L3 koji sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:19. U sledećem primeru izvođenja, antitelo dalje obuhvata HVR-H3 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:20, HVR-L3 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:19 i HVR-H2 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:5. U drugom primeru izvođenja, antitelo obuhvata HVR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:20 i HVR-L3 koji sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:22. U sledećem primeru izvođenja, antitelo dalje obuhvata HVR-H3 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:20, HVR-L3 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:22 i HVR-H2 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:5. U sledećem primeru izvođenja, antitelo obuhvata (a) HVR-H1 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:20; (b) HVR-H2 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:5 i (c) HVR-H3 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:6.

U drugom aspektu, opisano antitelo obuhvata najmanje jednu, dve ili sve tri VL HVR sekvence izabrane od (a) HVR-L1 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:85; (b) HVR-L2 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:58 i (c) HVR-L3 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:86. U jednom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje antitelo koje obuhvata najmanje jednu, dve ili sve tri VL HVR sekvence izabrane od (a) HVR-L1 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:23; (b) HVR-L2 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:2 i (c) HVR-L3 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:24. U sledećem primeru izvođenja, antitelo obuhvata (a) HVR-L1 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:85; (b) HVR-L2 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:58 i (c) HVR-L3 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:86. U sledećem primeru izvođenja, antitelo obuhvata (a) HVR-L1 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:23; (b) HVR-L2 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:2 i (c) HVR-L3 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:24.

U drugom primeru izvođenja, opisano antitelo obuhvata najmanje jednu, dve ili sve tri VL HVR sekvence izabrane od (a) HVR-L1 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:1, 18, 21, 33 i 54-57; (b) HVR-L2 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:2 i 58; i (c) HVR-L3 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:3, 19, 22, 34-46 i 59-74. U sledećem primeru izvođenja, antitelo obuhvata (a) HVR-L1 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:1, 18, 21, 33 i 54-57; (b) HVR-L2 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:2 i 58; i (c) HVR-L3 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:3, 19, 22, 34-46 i 59-74.

U drugom primeru izvođenja, opisano je antitelo koje obuhvata najmanje jednu, dve ili sve tri VL HVR sekvence izabrane od (a) HVR-L1 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:1; (b) HVR-L2 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:2 i (c) HVR-L3 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:3. U sledećem primeru izvođenja, antitelo obuhvata (a) HVR-L1 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:1; (b) HVR-L2 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:2 i (c) HVR-L3 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:3.

U drugom primeru izvođenja, opisano je antitelo koje obuhvata najmanje jednu, dve ili sve tri VL HVR sekvence izabrane od (a) HVR-L1 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:18; (b) HVR-L2 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:2 i (c) HVR-L3 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:19. U sledećem primeru izvođenja, antitelo obuhvata (a) HVR-L1 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:18; (b) HVR-L2 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:2 i (c) HVR-L3 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:19.

U drugom primeru izvođenja, opisano je antitelo koje obuhvata najmanje jednu, dve ili sve tri VL HVR sekvence izabrane od (a) HVR-L1 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:21; (b) HVR-L2 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:2 i (c) HVR-L3 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:22. U sledećem primeru izvođenja, antitelo obuhvata (a) HVR-L1 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:21; (b) HVR-L2 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:2 i (c) HVR-L3 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:22.

U drugom aspektu, antitelo obuhvata (a) VH domen koji obuhvata najmanje jednu, dve ili sve tri VH HVR sekvence izabrane od (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 87; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 88; (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 89; (b) VL domen koji obuhvata najmanje jednu, dve ili sve tri VL HVR sekvence izabrane od (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 85; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 58 i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 86. U sledećem primeru izvođenja, antitelo obuhvata (a) VH domen koji obuhvata najmanje jednu, dve ili sve tri VH HVR sekvence izabrane od (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 25; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26; (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 27; (b) VL domen koji obuhvata najmanje jednu, dve ili sve tri VL HVR sekvence izabrane od (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 23; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2 i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 24.

U drugom primeru izvođenja, antitelo obuhvata (a) VH domen koji obuhvata najmanje jednu, dve ili sve tri VH HVR sekvence izabrane od (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4, 20, 47-51 i 75-80; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5, 52 i 81-82; (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6, 53 i 83-84; (b) VL domen koji obuhvata najmanje jednu, dve ili sve tri VL HVR sekvence izabrane od (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1, 18, 21, 33 i 54-57; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2 i 58; (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3, 19, 22, 34-46 i 59-74.

U drugom primeru izvođenja, antitelo obuhvata (a) VH domen koji obuhvata najmanje jednu, dve ili sve tri VH HVR sekvence izabrane od (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5; (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6; (b) VL domen koji obuhvata najmanje jednu, dve ili sve tri VL HVR sekvence izabrane od (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2 i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3.

U drugom primeru izvođenja, antitelo obuhvata (a) VH domen koji obuhvata najmanje jednu, dve ili sve tri VH HVR sekvence izabrane od (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 20; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5; (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6; (b) VL domen koji obuhvata najmanje jednu, dve ili sve tri VL HVR sekvence izabrane od (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2 i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 19.

U drugom aspektu, antitelo obuhvata (a) VH domen koji obuhvata najmanje jednu, dve ili sve tri VH HVR sekvence izabrane od (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 20; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5; (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6; (b) VL domen koji obuhvata najmanje jednu, dve ili sve tri VL HVR sekvence izabrane od (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 21; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2 i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 22.

U drugom aspektu, opisano je antitelo koje sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 87; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 88; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 89; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 85; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 58 i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 86. U sledećem primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje antitelo koje sadrži šest HVR izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 25; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 27; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 23; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 24.

U drugom primeru izvođenja, opisano antitelo obuhvata (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4, 20, 47-51 i 75-80; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5, 52 i 81-82; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6, 53 i 83-84; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1, 18, 21, 33 i 54-57; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2 i 58; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3, 19, 22, 34-46 i 59-74.

U drugom primeru izvođenja, opisano je antitelo koje sadrži (a) HVR-H1 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:4; (b) HVR-H2 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:5; (c) HVR-H3 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:6; (d) HVR-L1 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:1; (e) HVR-L2 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:2 i (f) HVR-L3 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:3.

U drugom primeru izvođenja, opisano je antitelo koje sadrži (a) HVR-H1 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:20; (b) HVR-H2 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:5; (c) HVR-H3 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:6; (d) HVR-L1 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:18; (e) HVR-L2 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:2 i (f) HVR-L3 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:19.

U drugom primeru izvođenja, opisano je antitelo koje sadrži (a) HVR-H1 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:20; (b) HVR-H2 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:5; (c) HVR-H3 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:6; (d) HVR-L1 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:21; (e) HVR-L2 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:2 i (f) HVR-L3 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:22.

U svim gorenavedenim primerima izvođenja, anti-HtrA1 antitelo je humanizovano. U sledećem primeru izvođenja, anti-HtrA1 antitelo sadrži HVR kao u svakom od prethodnih primera izvođenja, a dalje sadrži akceptorski humani okvir, npr. okvir humanog imunoglobulina ili okvir humanog konsenzusa. U drugom primeru izvođenja, anti-HtrA1 antitelo sadrži HVR kao u svakom od prethodnih primera izvođenja, a dalje sadrži VH sa FR2 sekvencom SEQ ID NO:17.

U drugom aspektu, anti-HtrA1 antitelo sadrži teški lanac varijabilnog regiona (VH) sekvence koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% sličnosti sekvence u odnosu na sekvencu aminokiseline bilo koje od SEQ ID NO:8 ili 29. U određenim primerima izvođenja, sekvenca VH sa sličnošću od najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), ubacivanja ili uklanjanja u odnosu na referentnu sekvencu, ali anti-HtrA1 anititelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost da se vezuje za HtrA1. U određenim primerima izvođenja, ukupno 1 do 10 aminokiseline je supstituisana, ubačena i/ili uklonjenja u SEQ ID NO:8 ili 29. U određenim primerima izvođenja, supstucije, ubacivanja ili izbacivanja se dešavaju u regionima izvan HVR (npr. u FR). Opciono, anti-HtrA1 antitelo sadrži VH sekvencu u SEQ ID NO: 8, 29 ili 32, uključujući post-translacione modifikacije te sekvence. U posebnom primeru izvođenja, VH sadrži jednu, dve ili tri VR izabrane od: (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od: SEQ ID NO:4, 20, 25 i 47-51; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:5, 26 i 52 i (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:6, 27 i 53.

U drugom aspektu, anti-HtrA1 antitelo je obezbeđeno, pri čemu sadrži laki lanac varijabilnog regiona (VL) sekvence koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% sličnosti sekvence u odnosu na sekvencu aminokiseline bilo koje od SEQ ID NO:7, 28 ili 30. U određenim primerima izvođenja, sekvenca VL sa sličnošću od najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), ubacivanja ili uklanjanja u odnosu na referentnu sekvencu, ali anti-HtrA1 anititelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost da se vezuje za HtrA1. U određenim primerima izvođenja, ukupno 1 do 10 aminokiseline je supstituisana, ubačena i/ili uklonjenja u SEQ ID NO:7, 28 ili 30. U određenim primerima izvođenja, supstucije, ubacivanja ili izbacivanja se dešavaju u regionima izvan HVR (npr. u FR). Opciono, anti-HtrA1 antitelo sadrži VL sekvencu u SEQ ID NO:7, 28, 30 ili 31, uključujući post-translacione modifikacije te sekvence. U posebnom primeru izvođenja, VL obuhvata jednu, dve ili sve tri HVR (a) HVR-L1 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:1, 18, 21, 23 i 33; (b) HVR-L2 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:2; i (c) HVR-L3 sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:3, 19, 22, 24 i 34-36.

U drugom aspektu, dato je anti-HtrA1 antitelo, pri čemu antitelo sadrži VH kao u svim gorenavedenim primerima izvođenja, i VL kao u svim gorenavedenim primerima izvođenja. U sledećem primeru izvođenja, antitelo sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO: 32, odnosno SEQ ID NO: 31, uključujući post-translacione modifikacije tih sekvenci. U sledećem primeru izvođenja, antitelo sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO: 8, odnosno SEQ ID NO: 7, uključujući post-translacione modifikacije tih sekvenci. U sledećem primeru izvođenja, antitelo sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO: 29, odnosno SEQ ID NO: 28, uključujući post-translacione modifikacije tih sekvenci. U sledećem primeru izvođenja, antitelo sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO: 29, odnosno SEQ ID NO: 30, uključujući post-translacione modifikacije tih sekvenci.

U daljem aspektu, opisano je antitelo koje se vezuje za isti epitop kao i ovdeopisano anti-HtrA1 antitelo. Na primer, u određenim primerima izvođenja, obezbeđeno je antitelo koje se vezuje za isti epitop kao i ovdeopisano anti-HtrA1 antitelo koje sadrži VH sekvencu SEQ ID NO:8 i VL sekvencu SEQ ID NO:7. U određenim primerima izvođenja, obezbeđeno antitelo koje vezuje epitop HtrA1 koje sadrži ostatke N224, K248 ili oba SEQ ID NO:13, ili njima ekvivalentne ostatke u različitim sekvencama HtrA1. U određenim primerima izvođenja, epitop HtrA1 dalje obuhvata jedan ostatak ili više sledećih ostataka V201, T223, K243, K225, E247 i H220 SEQ ID NO:13, njima ekvivalentne aminokiseline u različitim sekvencama HtrA1. U određenim primerima izvođenja, obezbeđeno antitelo koje vezuje epitop HtrA1 koje sadrži jedan ostatak ili više sledećih ostataka N224, K248 i V201 ili sve njih SEQ ID NO:13, ili njima ekvivalentne ostatke u različitim sekvencama HtrA1. U određenim primerima izvođenja, obezbeđeno antitelo koje vezuje epitop HtrA1 koje sadrži jedan ostatak ili više sledećih ostataka N224, K248 V201, T223 i K243 ili sve njih SEQ ID NO:13, ili njima ekvivalentne ostatke u različitim sekvencama HtrA1. U određenim primerima izvođenja, obezbeđeno antitelo koje vezuje epitop HtrA1 koje sadrži jedan ostatak ili više sledećih ostataka N224, K248, V201, T223, K243, K225, E247 i H22A ili sve njih SEQ ID NO:13, ili njima ekvivalentne ostatke u različitim sekvencama HtrA1. U određenim primerima izvođenja, epitop je linearni epitop. U drugim primerima izvođenja, epitop je konformacioni epitop.

U daljem aspektu, prema svim gorenavedenim primerima izvođenja anti-HtrA1 antitelo je monoklonsko antitelo, uključujući himerno, humanizovano ili humano antitelo. U sledećem primeru izvođenja, anti-HtrA1 antitelo je fragment antitela, npr. Fv, Fab, Fab’, scFv, dijatelo ili F(ab’)2fragment. U drugom primeru izvođenja, antitelo je antitelo kompletne dužine, npr. netaknuto IgG1 antitelo ili druga klasa ili izotip antitela kao što je ovde definisano.

U određenim primerima izvođenja, prema svim gorenavedenim primerima izvođenja anti-HtrA1 antitelo nije antitelo koje sadrži VH sekvencu SEQ ID NO:8 i VL sekvencu SEQ ID NO:7.

U daljem aspektu, anti-HtrA1 antitelo prema svim gorenavedenim primerima izvođenja može da uključi bilo koju karakteristiku, samu ili u kombinaciji, kao što je opisano u Odeljcima 1–7 u nastavku:

1. Afinitet antitela

U određenim primerima izvođenja, ovde dato antitelo ima konstantu disocijacije (Kd) ≤1 µM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM, ili ≤ 0,001 nM (npr.10<-8>M ili manje, npr. od 10<-8>M do 10<-13>M, npr. od 10<-9>M do 10<-13>M).

U sledećem primeru izvođenja, Kd se meri putem testa za vezivanje radioaktivno obeleženog antigena (RIA) koji se izvodi sa Fab verzijom željenog antitela i njegovim antigenom, kao što je opisano u narednom testu. Afinitet vezivanja Fab u rastvoru za antigene određen je uravnotežavanjem Fab sa minimalnom koncentracijom antigena obeleženog sa(<125>I) u prisustvu titracionih serija neobeleženog antigena, a zatim hvatanjem vezanog antigena pomoću ploče prevučene anti-Fab antitelom (videti npr. Chen et al., J. Mol. Biol.293:865-881(1999)). Da bi se utvrdili uslovi za test, MICROTITER<®>ploče sa udubljenjima (Thermo Scientific) preko noći su prevučene sa 5 µg/ml anti-Fab antitela koje služi za hvatanje (Cappel Labs) u 50 mM natrijumkarbonatu (pH 9,6) i nakon toga su blokirane 2% (w/v) albuminom goveđeg seruma u PBS tokom dva do pet sati na sobnoj temperaturi (oko 23° C). U neadsorbantnoj ploči (Nunc #269620), 100 pM ili 26 pM [<125>I] antigen se pomešaju sa serijskim razblaženjima Fab od interesa (npr. u skladu sa procenom anti-VEGF antitela, Fab-12, u Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)). Željeni Fab se onda inkubira tokom noći; međutim, inkubacija može da se nastavi u dužem periodu (npr. oko 65 sati) kako bi se obezbedilo uspostavljanje ravnoteže. Nakon toga, smeše se prenose na ploču za hvatanje i inkubiraju se na sobnoj temperaturi (npr. jedan sat). Rastvor se zatim ukloni i ploča se ispere osam puta 0,1% polisorbatom 20 (TWEEN-20<®>) u PBS. Kada se ploče osuše, doda se 150 µl po bunaru fluorescentnog agensa (MICROSCINT-20™; Packard), i ploče se prebroje na TOPCOUNT™ gama brojaču (Packard) tokom 10 minuta. Koncentracije svakog Fab koje daje maksimalno vezivanje manje ili jednako 20% izabrane su za upotrebu u kompetitivnim testovima vezivanja.

U skladu sa drugim primerima izvođenja, Kd se određuje testom površinske plazmonske rezonance pomoću BIACORE<®>-2000 ili BIACORE<®>-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) na 25 °C sa čipovima imobilisanog antigena CM5 na ~10 jedinica odgovora (RU). Ukratko, biosenzorski čipovi sa karboksimetilovanim dekstranom (CM5, BIACORE, Inc.) aktivirani su pomoću N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidrohlorida (EDC) i N-hidroksisukcinimida (NHS) prema uputstvu dobavljača. Antigen je razblažen 10 mM natrijum acetatom, pH 4,8, do 5 μg/ml (~0,2 μM) pre injektovanja pri protoku od 5 µl/minutu da bi se dobilo oko 10 jedinica odgovora (RU) kuplovanog proteina. Nakon injektovanja antigena, injektovan je 1 M etanolamin da blokira neproreagovale grupe. Za kinetička merenja, dve serije razblaženja Fab (0,78 nM do 500 nM) su injektovane u PBS-u sa 0,05% polisorbata 20 (TWEEN-20™) surfaktanta (PBST) na 25°C pri protoku od oko 25 μl/min. Brzine asocijacije (kon) i brzine disocijacije (koff) izračunate su pomoću jednostavnog jedan-na-jedan Lengmirovog modela vezivanja (BIACORE<®>Evaluation Software verzija 3.2) istovremenim podešavanjem senzorgrama asocijacije i disocijacije. Ravnotežna konstanta disocijacije (Kd) izračunata je kao odnos koff/kon. Videti, npr. Chen et al., J. Mol. Biol.

293:865-881 (1999). Ako brzina asocijacije pređe 10<6>M<-1>s<-1>prema gore opisanom testu plazmonske rezonance, onda brzina asocijacije može da se odredi primenom tehnike fluorescentnog prigušivanja, koja meri porast ili opadanje intenziteta fluorescentne emisije (ekscitacija = 295 nm; emisija = 340 nm, 16 nm širina trake) na 25 °C kod 20 nM anti-antigen antitela (Fab oblik) u PBS, pH 7,2, u prisustvu rastućih koncentracija antigena, određeno spektrometrom, kao što je spektrofotometar sa mogućnošću zaustavljanja toka (Aviv Instruments) ili serija 8000 SLM-AMINCO™ spektrofotometra (ThermoSpectronic) sa kivetom sa mešanjem.

2. Fragmenti antitela

U određenim primerima izvođenja, ovdeopisano antitelo je fragment antitela. Fragmenti antitela uključuju, bez ograničenja, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, Fv i scFv fragmente, i druge fragmente opisane u nastavku. Pregled određenih fragmenata antitela potražite u Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003). Pregled scFv fragmenata potražite npr. u: Pluckthün, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg and Moore izd., (Springer-Verlag, New York), str. 269-315 (1994); pogledajte takođe WO 93/16185; i U.S. Patent br. 5,571,894 i 5,587,458. Raspravu o Fab i F(ab’)2fragmentima koji sadrže regenerisane ostatke receptorski vezujućih epitopa koji imaju produžen poluživot in vivo pogledajte u U.S. Patentu br.5,869,046.

Dijatela su fragmenti antitela sa dva antigen vezujuća mesta koja mogu biti bivalentna ili bispecifična. Pogledajte, na primer, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med.9:129-134 (2003); i Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Trijatela i tetratela su takođe opisana u Hudson et al., Nat. Med.9:129-134 (2003).

Antitela sa jednim domenom su fragmenti antitela koji sadrže kompletan varijabilni domen teškog lanca antitela ili njegov deo, ili kompletan varijabilni domen lakog lanca antitela ili njegov deo. U određenim primerima izvođenjima, antitelo sa jednim domenom je humano antitelo sa jednim domenom (Domantis, Inc., Waltham, MA; videti, npr. U.S. Patent br.6,248,516 B1).

Fragmenti antitela mogu se dobiti različitim tehnikama, uključujući, bez ograničenja, proteolitičku digestiju netaknutog antitela, kao i proizvodnju pomoću rekombinantnih ćelija domaćina (npr. E. coli ili faga), kao što je ovde opisano.

3. Himerna i humanizovana antitela

U određenim primerima izvođenja, ovdeopisano antitelo je himerno antitelo. Pojedina himerna antitela su opisana npr. u U.S. Patent No.4,816,567; i Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. SAD, 81:6851-6855 (1984)). U jednom primeru, himerno antitelo sadrži nehumani varijabilni region (npr. varijabilni region dobijen od miša, pacova, hrčka, zeca ili nehumanog primata, kao što je majmun) i humani konstantni region. U daljem primeru, himerno antitelo je antitelo „sa zamenjenom klasom”, kod koga je klasa ili potklasa zamenjena klasom ili potklasom matičnog antitela. Himerna antitela uključuju njihove antigen-vezujuće fragmente.

U određenim primerima izvođenja, himerno antitelo je humanizovano antitelo. Tipično, nehumano antitelo je humanizovano da bi se smanjila imunogenost za ljude, pri čemu zadržava specifičnost i afinitet matičnog nehumanog antitela. Generalno, humanizovano antitelo sadrži jedan ili više varijabilnih domena kod kojih su HVR, npr. CDR (ili njihovi delovi) dobijeni od nehumanog antitela, a FR (ili njihovi delovi) su dobijeni od sekvenci humanog antitela. Humanizovano antitelo opciono takođe sadrži najmanje deo humanog konstantnog regiona. U nekim primerima izvođenja, neki FR ostaci u humanizovanom antitelu su supstituisani odgovarajućim ostacima nehumanog antitela (npr. antitela sa koga su dobijeni HVR ostaci), npr. da bi se povratila ili poboljšala specifičnost antitela ili njegov afinitet.

Pregled humanizovanih antitela i postupaka za njihovo dobijanje dali su, npr. Almagro and Fransson, Front. Biosci.13:1619-1633 (2008), a dalje su opisani u npr. Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); US Patent Nos. 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321, i 7,087,409; Kashmiri et al, Methods 36:25-34 (2005) (opisuje SDR (a-CDR) grafting); Padlan, Mol. Immunol.28:489-498 (1991) (opisuje „površinske promene”); Dall’Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (opisuje „mešanje FR”); i Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) i Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (opisuje pristup „vođene selekcije” kod mešanja FR).

Humani okvirni regioni koji mogu da se koriste za humanizaciju uključuju, bez ograničenja,: okvirne regione izabrane postupkom „najboljeg slaganja” (pogledajte, npr. Sims et al. 151:2296 (1993)); okviri regioni dobijeni od konsenzus sekvence humanog antitela određene podgrupe lakog ili teškog lanca varijabilnog regiona (videti, npr. Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); i Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)); humani sazreli (somatski mutirani) okviri regiona ili humani germitivni okviri regiona (videti, npr. Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); i okvirne regione dobijene pregledanjem FR kolekcija (pogledajte, npr. Baca et al., J. Biol. Chem.272:10678-10684 (1997) i Rosok et al., J. Biol. Chem.

271:22611-22618 (1996)).

4. Humana antitela

U određenim primerima izvođenja, ovdeopisano antitelo je humano antitelo. Humana antitela mogu se dobiti primenom različitih tehnika poznatih u struci. Humana antitela načelno su opisana u van Dijk and van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001) i Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008).

Humana antitela mogu se dobiti primenom imunogena na transgenu životinju koja je modifikovana da proizvodi netaknuta humana antitela ili netaknuta antitela sa humanim varijabilnim regionima kao odgovor na antigen. Takve životinje tipično sadrže kompletne lokuse humanog imunoglobulina ili njihov deo, koji zamenjuju lokuse endogenog imunoglobulina ili koji su prisutni ekstrahromozomski ili nasumično integrisani u životinjske hromozome. U takvim transgenim miševima, lokusi endogenog imunoglobulina su generalno inaktivirani. Pogledajte pregled postupaka za dobijanje humanih antitela od transgenih životinja u: Lonberg, Nat. Biotech.

23:1117-1125 (2005). Pogledajte takođe, npr. U.S. Patent br. 6,075,181 i 6,150,584 koji opisuju XENOMOUSE™ tehnologiju; U.S. Patent br.5,770,429 koji opisuje HuMab<®>tehnologiju; U.S. Patent br.7,041,870 koji opisuje K-M MOUSE<®>tehnologiju, i U.S. Patent Application Publication br. US 2007/0061900, koja opisuje VelociMouse<®>tehnologiju). Humani varijabilni regioni netaknutih antitela koja stvaraju takve životinje mogu se dalje modifikovati, npr. kombinovanjem sa različitim humanim konstantnim regionom.

Humana antitela mogu se takođe dobiti postupcima na bazi hibridoma. Opisane su ćelijske linije humanog mijeloma i mišje-humanog heteromijeloma za proizvodnju humanih monoklonskih antitela. (Videti, npr. Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); i Boemer et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).) Humana antitela dobijena putem tehnologije humanih B-ćelija hibrdoma takođe su opisana u Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Dodatni postupci uključuju one opisane, na primer, u U.S. Patentu br. 7,189,826 (opisuje proizvodnju monoklonskih humanih IgM antitela iz ćelijskih linija hibridoma) i Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (opisuje humano-humane hibridome). Tehnologiju humanih hibridoma (Trioma tehnologija) takođe su opisali Vollmers i Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) i Vollmers i Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005).

Humana antitela takođe mogu da se proizvedu izolovanjem sekvenci varijabilnog domena Fv klona izabranih iz kolekcija displeja humanizovanih faga. Takve sekvence varijabilnog domena mogu onda da se kombinuju sa željenim humanim konstantnim domenom. Tehnike za izbor humanih antitela iz biblioteka antitela su opisane u nastavku.

5. Antitela dobijena iz kolekcija

Antitela predmetnog pronalaska mogu da se izoluju pregledanjem kombinatornih kolekcija antitela sa željenom aktivnošću ili aktivnostima. Na primer, veliki broj postupaka je poznat u struci za stvaranje kolekcija displeja faga i pretraživanje takvih kolekcija za antitela koja imaju željene karakteristike vezivanja. Pregled takvih postupaka daju, npr. Hoogenboom et al. u Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) i npr. the McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol.222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, u Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol.338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol.340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); i Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004).

Kod pojedinih postupaka displeja faga, repertoari VH i VL gena su odvojeno klonirani putem lančane reakcije polimeraze (PCR) i nasumično rekombinovani u kolekcijama faga, koje zatim mogu da se pretražuju za antigen vezujuće fage, kao što opisuju Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Fagi tipično vrše displej fragmenata antitela kao jednolančanih Fv (scFv) fragmenata ili kao Fab fragmenata. Kolekcije iz imunizovanih izvora daju antitela velikog afiniteta prema imunogenu, ne zahtevajući konstruisanje hibridoma. Alternativno, naivni repertoar može biti kloniran (npr. od ljudi) da bi se dobio jedan izvor antitela za širok spektar nesvojstvenih, kao i svojstvenih antigena bez ikakve imunizacije, kao što opisuju Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Najzad, naivne kolekcije mogu takođe da se naprave sintetički, kloniranjem nepreuređenih segmenata V-gena iz matičnih ćelija, i upotrebom PCR prajmera koji sadrže nasumične sekvence za kodiranje veoma varijabilnih CDR3 regiona, i za postizanje premeštanja in vitro, kao što opisuju Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Patentne publikacije koje opisuju kolekcije faga humanih antitela uključuju, na primer: US Patent br.

5,750,373, i US Patent Publication br. 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 i 2009/0002360.

Antitela ili fragmenti antitela izolovani iz kolekcija humanih antitela se ovde smatraju humanim antitelima ili fragmentima humanih antitela.

6. Multispecifična antitela

U određenim primerima izvođenja, ovdeopisano antitelo je multispecifično antitelo, npr. bispecifično antitelo. Multispecifična antitela su monoklonska antitela koja imaju sposobnost specifičnog vezivanja za najmanje dva različita mesta. U određenim primerima izvođenja, jedna od specifičnosti vezivanja je za HtrA1 a druga je za bilo koji drugi antigen. U određenim primerima izvođenja, bispecifična antitela mogu da se vežu za dva različita epitopa HtrA1. Bispecifična antitela mogu takođe da se upotrebe za lokalizaciju citotoksičnih agenasa na ćelije koje eksprimiraju HtrA1. Bispecifična antitela mogu da se dobiju kao antitela kompletne dužine ili kao fragmenti antitela.

Tehnike proizvodnje multispecifičnih antitela uključuju, bez ograničenja, rekombinantnu koekspresiju parova teški lanac – laki lanac dva imunoglobulina sa različitim specifičnostima (videti Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829, i Traunecker et al., EMBO J.

10: 3655 (1991)) i „čvor u otvor” inženjering (videti, npr. U.S. Patent No. 5,731,168). Multispecifična antitela mogu se takođe napraviti dejstvima elektrostatičkog usmeravanja za izradu Fc-heterodimeričnih molekula (WO 2009/089004A1); unakrsnim vezivanje dva ili više antitela ili fragmenata (videti, npr. US Patent No. 4,676,980, i Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); korišćenjem leucinskih zatvarača za proizvodnju bispecifičnih antitela (videti, npr. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992)); korišćenjem tehnologije dijatela za izradu fragmenata bispecifičnih antitela (videti, npr. Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); i korišćenjem jednolančanih Fv (sFv) dimera (videti, npr. Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); i pripremom trispecifičnih antitela, kao što je opisano u Tutt et al. J. Immunol.

147: 60 (1991).

Dizajnirana antitela sa tri ili više funkcionalnih mesta vezivanja antigena, uključujući „antitela hobotnice”, ovde su takođe obuhvaćena (pogledajte, npr. US 2006/0025576A1).

Ovde antitelo ili fragment takođe uključuje „dvojno delujuće FAb” ili „DAF”, koje sadrži mesto vezivanja antigena koji se vezuje za HtrA1, kao i za drugi, različit antigen (pogledajte, na primer US 2008/0069820).

7. Varijante antitela

U određenim primerima izvođenja, razmatrane su varijante aminokiselinskih sekvenci antitela koja su ovde data. Na primer, može biti poželjno da se poboljša afinitet vezivanja i/ili druge biološke osobine antitela. Varijante aminokiselinskih sekvenci antitela mogu se dobiti uvođenjem odgovarajućih modifikacija u sekvencu nukleotida koja kodira antitelo, ili sintezom peptida. Takve modifikacije uključuju, na primer, izbacivanja, i/ili ubacivanja, i/ili supstitucije ostataka u aminokiselinskim sekvencama antitela. Svaka kombinacija izbacivanja, ubacivanja i supstitucije može se načiniti da se dođe do finalnog konstrukta, pod uslovom da finalni konstrukt ima željene karakteristike, npr. antigen vezujuće.

a) Varijante supstitucije, ubacivanja i izbacivanja

U određenim primerima izvođenja, date su varijante antitela koja imaju jednu ili više supstitucija aminokiselina. Mesta od interesa za supstitucionu mutagenezu uključuju HVR i FR. Konzervativne supstitucije su prikazane u Tabeli 1 pod naslovom „konzervativne supstitucije”. Veće izmene su date u Tabeli 1 pod naslovom „primeri supstitucija” i kako su dalje opisani ispod u odnosu na klase bočnih nizova aminokiselina. Supstitucije aminokiselina mogu biti uvedene u željeno antitelo i proizvod ispitan na željenu aktivnost, npr. zadržano/poboljšano vezivanje antigena, smanjena imunogenost, ili poboljšan ADCC ili CDC.

TABELA 1:

Aminokiseline mogu da se grupišu prema zajedničkim osobinama bočnog niza:

(1) hidrofobne: Norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) neutralne hidrofilne: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) kisele: Asp, Glu;

(4) bazne: His, Lys, Arg;

(5) ostaci koji utiču na orijentaciju niza: Gly, Pro;

(6) aromatične: Trp, Tyr, Phe.

Nekonzervativne supstitucije zahtevaju izmenu člana jedne od ovih klasa drugom klasom.

Jedna vrsta supstitucionih varijanti uključuje supstituciju jednog ili više ostataka hipervarijabilnog regiona matičnog antitela (npr. humanizovanog ili humanog antitela). Generalno, rezultujuće varijante izabrane za dalje ispitivanje će imati modifikacije (npr. poboljšanja) izvesnih bioloških osobina (npr. povećan afinitet, smanjenu imunogenost) u odnosu na matično antitelo i/ili će imati suštinski zadržane izvesne biološke osobine matičnog antitela. Primer supstitucione varijante je afinitetno zrelo antitelo, koje može biti stvoreno na pogodan način, npr. korišćenjem tehnika afinitetnog sazrevanja na osnovu displeja faga, kao što su one ovde opisane. Ukratko, jedan ili više HVR ostataka je mutiran, i varijantna antitela su izložena na fagu i ispitana u pogledu određene biološke aktivnosti (npr. afiniteta vezivanja).

Izmene (npr. supstitucije) mogu se napraviti u HVR, npr. radi poboljšanja afiniteta antitela. Takve izmene mogu se napraviti u HVR „aktivnim oblastima”, tj. kodonima kodiranim ostacima koji veoma često mutiraju tokom somatskog sazrevanja (videti, npr. Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)) i/ili SDR (CDR) sa rezultujućim varijantama VH ili VL koje se testiraju u pogledu afiniteta vezivanja. Afinitetno sazrevanje putem konstruisanja i ponovnog izbora iz sekundarnih kolekcija opisali su, npr. Hoogenboom et al.u Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001).) U nekim primerima izvođenja afinitetnog sazrevanja, raznovrsnost se uvodi u varijabilne gene izabrane za sazrevanje putem bilo kojih od raznovrsnih postupaka (npr. PCR koji favorizuje greške, mešanje lanaca ili mutageneza kontrolisana oligonukleotidima). Zatim se kreira sekundarna kolekcija. Kolekcija se zatim pretražuje radi identifikovanja varijanti antitela sa željenim afinitetom. Drugi postupak za uvođenje raznovrsnosti uključuje pristup usmeren na HVR, gde je nekoliko HVR ostataka randomizovano (npr.4–6 ostataka istovremeno). HVR ostaci uključeni u vezivanje antigena mogu biti specifično identifikovani, npr. primenom skenirajuće mutageneze alaninom ili modelovanja. Posebno su često cilj CDR-H3 i CDR-L3.

U određenim primerima izvođenja, supstitucije, ubacivanja ili izbacivanja mogu se desiti u jednom ili više HVR, dokle god takve izmene znatno ne smanje sposobnost antitela da vezuje antigen. Na primer, konzervativne izmene (npr. konzervativne supstitucije kao što su ovde date) koje ne smanjuju znatno afinitet vezivanja mogu se načiniti u HVR. Takve izmene mogu biti izvan HVR „aktivnim oblastima” ili SDR. U određenim primerima izvođenja varijanti VH i VL sekvenci datih iznad, svaki HVR je ili neizmenjen, ili sadrži najviše jednu, dve ili tri supstitucije aminokiselina.

Korisni postupak za identifikovanje ostataka ili regiona antitela koji mogu biti ciljani za mutagenezu se zove „ciljana mutageneza sa alaninom” i opisali su ga Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085. U tom postupku, ostatak ili grupa ciljanih ostataka (npr. naelektrisani ostaci, kao što su arg, asp, his, lys i glu) se identifikuju i zamene neutralnom ili negativno naelektrisanom aminokiselinom (npr. alaninom ili polialaninom) da bi se odredilo da li to utiče na interakciju antitela sa antigenom. Dalje supstitucije mogu biti uvedene na lokacijama aminokiselina koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na inicijalne supstitucije. Alternativno, ili dodatno, kristalna struktura kompleksa antigen-antitelo služi za identifikovanje tačaka kontakta antitela sa antigenom. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci mogu biti ciljani, ili eliminisani kao kandidati za supstituciju. Mogu se pregledati varijante da bi se odredilo da li imaju željena svojstva.

Ubacivanja aminokiselinskih sekvenci uključuju fuzije amino- i/ili karboksi-kraja, pri čemu se dužina kreće od jednog ostatka do polipeptida koji sadrže stotine ostataka ili više, kao i ubacivanja u sekvencu jednog ostatka aminokiselina, ili većeg broja. Primeri terminalnih ubacivanja uključuju antitelo sa N-terminalnim metionil ostatkom. Druge varijante ubacivanja kod molekula antitela uključuju fuziju sa N- ili C- krajem antitela sa enzimom (npr. za ADEPT) ili polipeptidom, što povećava poluživot antitela u serumu.

b) Varijante glikozilacije

U određenim primerima izvođenja, ovdedato antitelo je izmenjeno da bi se povećao ili smanjio stepen do koga je antitelo glikozilovano. Adicija ili uklanjanje mesta glikozilacije antitela može se pogodno postići izmenom aminokiselinske sekvence, tako da jedno ili više mesta glikozilacije nastane ili se ukloni.

Kada antitelo uključuje Fc region, može biti izmenjen ugljovodonik vezan za njega. Nativna antitela koja proizvode ćelije sisara tipično sadrže razgranati, biantenarni oligosaharid koji je generalno vezan N-vezom za Asn297 CH2 domena Fc regiona. Videti, npr. Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). Oligosaharidi mogu da uključuju različite ugljovodonike, npr. manozu, N-acetil glukozamin (GlcNAc), galaktozu i sijalinsku kiselinu, kao i fukozu vezanu za GlcNAc u osnovi biantenarne oligosaharidne strukture. U nekim primerima izvođenja, modifikacije oligosaharida u antitelu iz pronalaska mogu biti načinjene da bi se dobile varijante antitela sa određenim poboljšanim osobinama.

U sledećem primeru izvođenja, date su varijante antitela koja imaju ugljovodoničnu strukturu kojoj nedostaje fukoza vezana (direktno ili indirektno) za Fc region. Na primer, količina fukoze u tom antitelu može biti od 1% do 80%, od 1% do 65%, od 5% do 65% ili od 20% do 40%. Količina fukoze se određuje izračunavanjem prosečne količine fukoze u šećernom lancu na Asn297, u odnosu na zbir svih glikostruktura vezanih za Asn297 (npr. kompleksne, hibridne ili strukture sa visokim sadržajem manoze), kao što je određeno MALDI-TOF masenom spektrometrijom, npr. kao što je opisano u WO 2008/077546. Asn297 se odnosi na asparaginski ostatak koji se nalazi oko položaja 297 u Fc regionu (prema EU numeraciji ostataka Fc regiona); međutim, Asn297 takođe može da se nalazi oko ± 3 aminokiseline uzvodno ili nizvodno od položaja 297, tj. između položaja 294 i 300, usled manjih varijacija sekvenci kod antitela. Takve varijante fukozilacije mogu da imaju poboljšanu ADCC funkciju. Pogledajte, npr. US Patent Publication br. US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Primeri publikacija vezanih za „defukozilovane” ili „sa manjkom fukoze” varijante antitela uključuju: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol.336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Primeri ćelijskih linija koje mogu da proizvedu defukozilovana antitela uključuju Lee 13 CHO ćelije sa manjkom fukozilacije proteina (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys.249:533-545 (1986); US Pat Appl No US 2003/0157108 A1, Presta, L; i WO 2004/056312 A1, Adams et al., naročito primer 11),i nokaut ćelijske linije, kao što su gen alfa-1,6-fuckoziltransferaze, FUT8, nokaut CHO ćelije (videti, npr. Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); i WO2003/085107).

Varijante antitela su dalje obezbeđene sa prepolovljenim oligosaharidima, npr. kod kojih je biantenarni oligosaharid vezan za Fc region antitela bisektiran pomoću GlcNAc. Takve varijante antitela mogu da imaju smanjenu fukozilaciju i/ili poboljšanu ADCC funkciju. Primeri takvih varijanti antitela su opisani, npr. u WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); US Patent No.6,602,684 (Umana et al.); i US 2005/0123546 (Umana et al.). Varijante antitela sa najmanje jednim ostatkom galaktoze u oligosaharidu vezanom za Fc region su takođe date. Takve varijante antitela mogu da imaju poboljšanu CDC funkciju. Takve varijante antitela su opisane, npr. u WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); i WO 1999/22764 (Raju, S.).

c) Varijante Fc regiona

U određenim primerima izvođenja, jedna ili više modifikacija aminokiselina može biti uvedena u Fc region ovde datog antitela, time stvarajući varijantu Fc regiona. Varijanta Fc regiona može da sadrži sekvencu humanog Fc regiona (npr. Fc region humanog IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4) koji sadrži modifikaciju aminokiseline (npr. supstituciju) na jednom ili više mesta aminokiselina.

U određenim primerima izvođenja, pronalazak razmatra varijantu antitela koja ima neke, ali ne sve efektorske funkcije, što ga čini pogodnim kandidatom za primene kod kojih je poluživot antitela in vivo važan, ali su pojedine efektorske funkcije (kao što je komplementna i ADCC) nepotrebne ili štetne. In vitro i/ili in vivo testovi citotoksičnosti mogu se sprovesti radi potvrde smanjenja/sniženja CDC i/ili ADCC aktivnosti. Na primer, testovi vezivanja Fc receptora (FcR) se mogu sprovesti kako bi se obezbedilo da antitelo nema FcγR vezivanje (stoga verovatno nema ADCC aktivnost), ali zadržava sposobnost vezivanja FcRn. Primarne ćelije za posredovanje kod ADCC, NK ćelije, eksprimiraju samo Fc(RIII, dok monociti eksprimiraju Fc(RI, Fc(RII i Fc(RIII. Ekspresija FcR na hematopoetskim ćelijama je rezimirana u tabeli br. 3 na strani 464 Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991). Neograničavajući primeri in vitro testova za određivanje ADCC aktivnosti željenog molekula opisani su u U.S. Patentu br. 5,500,362 (pogledajte, npr. Hellstrom, I. et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) i Hellstrom, I et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (videti Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). Alternativno, za testove mogu da se koriste neradioaktivni postupci (pogledajte, npr. ACTI™ neradioaktivni test citotoksičnosti za protočnu citometriju (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; i CytoTox 96<®>neradioaktivni test citotoksičnosti (Promega, Madison, WI). Korisne efektorske ćelije za takve testove uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodne ubice (NK). Alternativno, ili dodatno, ADCC aktivnost ispitivanog molekula može se odrediti in vivo, npr. na životinjskom modelu, kao što je onaj objavljen u Clynes et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). C1q vezujući testovi mogu takođe da se izvedu da bi se potvrdilo da antitelo ne može da veže C1q, i stoga nema CDC aktivnost. Videti, npr. C1q i C3c vezujući ELISA test u WO 2006/029879 i WO 2005/100402. Za procenu komplementne aktivnosti, može se obaviti CDC test (videti, npr. Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); i Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). FcRn vezivanje i in vivo određivanje klirensa/poluživota može takođe da se izvrši pomoću postupaka poznatih u struci (pogledajte, npr. Petkova, S.B. et al., Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)).

Antitela sa redukovanom efektorskom funkcijom uključuju ona sa supstitucijom jednog ili više Fc regiona ostataka 238, 265, 269, 270, 297, 327 i 329 (U.S. Patent br.6,737,056). Takvi Fc mutanti uključuju Fc mutante sa zamenama aminokiselina na dva ili više mesta 265, 269, 270, 297 i 327, uključujući takozvani „DANA” Fc mutanta sa zamenom ostataka 265 i 297 u alanin (US Patent br.7,332,581).

Pojedine varijante antitela sa poboljšanim ili smanjenim vezivanjem za FcR su opisane. (Videti, npr. U.S. Patent br.6,737,056; WO 2004/056312 i Shields et al., J. Biol. Chem.9(2): 6591-6604 (2001)).

U određenim primerima izvođenja, varijanta antitela sadrži Fc region sa jednom ili više supstitucija aminokiselina koje poboljšavaju ADCC, npr. supstitucije na mestima 298, 333 i/ili 334 Fc regiona (EU numeracija ostataka).

U nekim primerima izvođenja, napravljene su izmene u Fc regionu koje imaju za rezultat izmenjeno (tj. poboljšano ili smanjeno) C1q vezivanje i/ili komplementno zavisnu citotoksičnost (CDC), npr. kao što opisuje US Patent No.6,194,551, WO 99/51642,i Idusogie et al. J. Immunol.

164: 4178-4184 (2000).

Antitela sa produženim poluživotom i unapređenim vezivanjem za neonatalne Fc receptore (FcRn), koji su odgovorni z a transfer majčine IgG do fetusa (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) i Kim et al., J. Immunol.24:249 (1994)), opisana u US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Ta antitela sadrže Fc region sa jednom ili više supstitucija koje poboljšavaju vezivanje Fc regiona za FcRn. Takve Fc varijante uključuju one sa supstitucijom na jednom ili više ostataka Fc regiona: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ili 434, npr. supstitucija ostatka Fc regiona 434 (US Patent br.7,371,826).

Pogledajte, takođe, Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); U.S. Patent No.

5,648,260; U.S. Patent No. 5,624,821; i WO 94/29351 koji se tiču drugih primera varijanti Fc regiona.

d) Varijante antitela projektovane sa cisteinom

U sledećem primeru izvođenja, može biti poželjno da se naprave antitela projektovana sa cisteinom, npr. „tioMAb”, kod kojih je jedan ili više ostataka antitela zamenjen ostacima cisteina. U posebnom primeru izvođenja, supstituisani ostaci se nalaze na pristupačnim mestima na antitelu. Supstitucijom tih ostataka cisteinom, reaktivne tiolske grupe se time postavljaju na pristupačna mesta na antitelu, i mogu se koristiti za konjugovanje antitela sa drugim funkcionalnim ostacima, kao što su funkcionalni ostaci lekova ili linker-lek, da bi se dobio imunokonjugat, kao što je u nastavku opisano. U određenim primerima izvođenja, bilo koji ostatak ili više ostataka navedenih u nastavku mogu biti supstituisani cisteinom: V205 (Kabatova numeracija) lakog lanca; A118 (EU numeracija) teškog lanca; i S400 (EU numeracija) teškog lanca Fc regiona. Antitela projektovana sa cisteinom mogu se dobiti kao što je opisano, npr. u U.S. Patentu br.7,521,541.

e) Derivati antitela

U određenim primerima izvođenja, ovde dato antitelo može se dalje modifikovati da sadrži dodatne neproteinske funkcionalne ostatke koji su poznati u struci i dostupni su. Funkcionalni ostaci pogodni za derivatizaciju antitela uključuju, ali nisu ograničeni na hidrosolubilne polimere. Neograničavajući primeri hidrosolubilnih polimera uključuju, bez ograničenja, polietilen glikol (PEG), kopolimere etilen glikol/propilen glikol, karboksimetilcelulozu, dekstran, polivinil alkohol, polivinil pirolidon, poli-1,3-dioksolan, poli-1,3,6-trioksan, kopolimer etilen/anhidrid maleinske kiseline, poliaminokiseline (homopolimere ili nasumične kopolimere), i dekstran ili poli(n-vinil pirolidon)polietilen glikol, propropilen glikol homopolimere, kopolimere polipropilen oksid/etilen oksid, polioksietilovane poliole (npr. glicerol), polivinil alkohol, i njihove smeše. Polietilen glikol propionaldehid može imati prednosti u proizvodnji zbog svoje stabilnosti u vodi. Polimer može imati bilo koju molekulsku masu i može biti razgranat ili sa ravnim nizom. Broj polimera vezanih za antitelo može da varira i, ako je više od jednog polimera vezano, to mogu biti isti ili različiti molekuli. Generalno, broj i/ili vrsta polimera korišćenih za derivatizaciju može se odrediti na osnovu razmatranja, uključujući, bez ograničenja, naročite osobine ili funkcije antitela koje treba poboljšati, da li će derivat antitela biti korišćen u terapiji pod definisanim uslovima, itd.

U drugom primeru izvođenja, dati su konjugati antitela i neproteinskog ostatka koji mogu selektivno da se zagrevaju izlaganjem radijaciji. U sledećem primeru izvođenja, neproteinska komponenta je karbonski nanotub (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). Radijacija može biti na bilo kojoj talasnoj dužini i uključuje, bez ograničenja, talasne dužine koje ne oštećuju obične ćelije, ali koje zagrevaju neproteinski ostatak na temperaturu na kojoj ćelije u blizini neproteinskog ostatka antitela bivaju ubijene.

B. Rekombinantni postupci i kompozicije

Antitela se mogu proizvesti korišćenjem rekombinantnih postupaka i kompozicija, npr., kako je opisano u U.S. Patentu br. 4,816,567. U sledećem primeru izvođenja, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja kodira ovde opisano anti-HtrA1 antitelo. Takva nukleinska kiselina može kodirati aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL i/ili aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela (npr. lake i/ili teške lance antitela). U sledećem primeru izvođenja, obezbeđen je jedan ili više vektora (npr., ekspresionih vektora) koji sadrže takvu nukleinsku kiselinu. U sledećem primeru izvođenja, obezbeđena je ćelija domaćina koja sadrži takvu nukleinsku kiselinu. U jednom konkretnom izvođenju takvog primera, ćelija domaćin sadrži (npr., transformisana je sa): (1) vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL antitela, i aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela, ili (2) prvi vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL antitela, i drugi vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira amino kiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela. U sledećem primeru izvođenja, ćelija domaćin je eukariotska, npr. ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO) ili limfoidna ćelija (npr., Y0, NS0, Sp20 ćelija). U sledećem primeru izvođenja, obezbeđen je postupak za proizvodnju anti-HtrA1 antitela, pri čemu postupak obuhvata uzgajanje ćelije domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo, kako je dato gore, u uslovima koji su pogodni za ekspresiju antitela i, eventualno, izolovanje antitela iz ćelije domaćina (ili medijuma za uzgajanje ćelija domaćina).

Za rekombinantnu proizvodnju anti-HtrA1 antitela, nukleinska kiselina koja kodira antitelo, npr. kako je gore opisano, izoluje se i ubacuje u jedan ili više vektora radi daljeg kloniranja i/ili ekspresije u ćeliji domaćina. Takva nukleinska kiselina može biti lako izolovana i sekvencirana korišćenjem klasičnih postupaka (npr. korišćenjem oligonukleotidnih sondi koje mogu selektivno da se vežu za gene koji kodiraju teške i lake lance antitela).

Pogodne ćelije domaćini za kloniranje ili ekspresiju vektora koji kodiraju antitelo uključuju prokariotske ili eukariotske ćelije, ovde opisane. Na primer, antitela se mogu proizvesti u bakteriji, naročito kada nije neophodna glikozilacija niti Fc efektorska funkcija. Za ekspresiju fragmenata antitela i polipeptida u bakteriji, pogledajte, npr. U.S. Patente br. 5,648,237, 5,789,199, i 5,840,523. (Videti, takođe, Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254, opis ekspresije fragmenata antitela u E. coli.) Nakon ekspresije, antitelo može da se izoluje iz paste bakterijskih ćelija u rastvorljivoj frakciji, i može dalje da se prečišćava.

Osim prokariota, eukariotski mikrobi, kao što su filamentozne gljivice ili kvasci, pogodni su domaćini za kloniranje ili ekspresiju za vektore koji kodiraju antitelo, uključujući sojeve gljivica i kvasaca čiji su putevi glikozilacije "humanizovani", što dovodi do proizvodnje antitela sa delimičnim ili potpunim humanim glikozilacionim obrascem. Videti Gerngross, Nat. Biotech.

22:1409-1414 (2004), i Li et al., Nat. Biotech.24:210-215 (2006).

Pogodne ćelije domaćini za ekspresiju glikozilovanog antitela, isto tako, izvedene su od višećelijskih organizama (beskičmenjaka i kičmenjaka). Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata. Identifikovani su brojni sojevi bakulovirusa koji mogu da se koriste zajedno sa ćelijama insekata, naročito za transfekciju ćelija Spodoptera frugiperda.

Kulture biljnih ćelija se, takođe, mogu koristiti kao domaćini. Videti npr. US Patente br.

5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, i 6,417,429 (opisuju PLANTIBODIES™ tehnologiju za proizvodnju antitela u transgenim biljkama).

Ćelije kičmenjaka se, isto tako, mogu upotrebiti kao domaćini. Na primer, mogu se koristiti ćelijske linije sisara koje su adaptirane za rast u suspenziji. Druge primere korisnih ćelijskih linija sisara predstavljaju CV1 linije bubreg majmuna transformisane putem SV40 (COS-7); embrionske linije ljudskih bubrega (293 ili 293 ćelije, kao što je opisano, npr. u Graham et al., J. Gen Virol.

36:59 (1977)); linije bubrega mladunaca hrčka (BHK); mišje sertoli ćelije (TM4 ćelije, kao što je opisano, npr. u Mather, Biol. Reprod.23:243-251 (1980)); ćelije bubrega majmuna (CV1); ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76); ćelije humanog karcinoma cerviksa (HELA); bubrežne ćelije psa (MDCK; ćelije jetre pacova (BRL 3A); ćelije pluća čoveka (W138); ćelije jetre čoveka (Hep G2); mišji tumor dojke (MMT 060562); TRI ćelije, kako su opisane, npr. u: Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982); MRC 5 ćelije; i FS4 ćelije. Druge primere upotrebe ćelijskih linija domaćina sisara predstavljaju jajne ćelije kineskog hrčka (CHO), uključujući DHFR<->CHO ćelije (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)); i ćelijske linije mijeloma, kao što su: Y0, NS0 i Sp2/0. Pregled nekih ćelijskih linija domaćina iz sisara, pogodnih za proizvodnju antitela, pogledajte npr. u Yazaki i Wu, Methods in Molecular Biology, Vol.248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp.255-268 (2003).

C. Testovi

Anti-HtrA1 antitela koja su ovde data mogu se identifikovati, pretražiti ili okarakterisati prema svojim fizičkim/hemijskim osobinama i/ili biološkoj aktivnosti, putem različitih testova poznatih u struci.

1. Testovi vezivanja i drugi testovi

U jednom aspektu, antitelo iz pronalaska ispitano je da se odredi njegova antigen vezujuća aktivnost, npr. poznatim postupcima kao što je ELISA, vestern blot, itd.

U drugom aspektu, mogu se koristiti kompetitivni testovi da se identifikuje antitelo koje se takmiči sa Fab94 ili IgG94 u pogledu vezivanja za HtrA1. U određenim primerima izvođenja, takvo konkurentsko antitelo se vezuje za isti epitop (npr. linearni ili konformacioni epitop) koji je vezan za Fab94 ili IgG94. cDetaljni primeri postupaka za mapiranje epitopa za koji se vezuje antitelo dati su u: Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” u Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ).

U primeru kompetitivnog testa, imobilizovani HtrA1 je inkubiran u rastvoru koji sadrži prvo obeleženo antitelo, koje se vezuje za HtrA1 (npr. Fab94 ili IgG94) i drugo neobeleženo antitelo, čija se sposobnost da se takmiči sa prvim antitelom u pogledu vezivanja za HtrA1 ispituje. Drugo antitelo može da se nalazi u supernatantu hibridoma. Kao kontrola, imobilisana HtrA1 je inkubirana u rastvoru koji sadrži prvo obeleženo antitelo, ali ne i drugo neobeleženo antitelo. Nakon inkubacije pod uslovima koji dopuštaju vezivanje prvog antitela za HtrA1, višak nevezanog antitela se uklanja, i meri se količina obeleživača vezanog za imobilisanu HtrA1. Ako je količina obeleživača vezanog za imobilisanu HtrA1 u test uzorku značajno smanjena u odnosu na kontrolni uzorak, to ukazuje da se drugo antitelo takmiči sa prvim antitelom oko vezivanja za HtrA1. Pogledajte Harlow i Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual gl.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

2. Testovi aktivnosti

U jednom aspektu, dati su testovi za identifikaciju ovih anti-HtrA1 antitela koja imaju biološku aktivnost. Biološka aktivnost može da uključuje, npr. blokiranje, antagonizovanje, potiskivanje, mešanje, modulaciju i/ili smanjivanje jedne biološke aktivnosti ili više bioloških aktivnosti HtrA1. Antitela koja imaju takvu biološku aktivnost in vivo i/ili in vitro takođe su data.

U određenim primerima izvođenja, antitelo kako je ovde opisano je ispitano na takvu biološku aktivnost. U određenim primerima izvođenja, anti-HtrA1 antitelo se vezuje za HtrA1 i smanjuje ili inhibira aktivnost svoje serinske proteaze za jedan HtrA1 supstrat ili više njih, uključujući, na primer, H2-Opt peptid, β-kazein ili supstrat kazeina BODIPY FL, kao što je opisano u Primerima u nastavku, ili bilo kog drugog odgovarajućeg supstrata HtrA1. U određenim primerima izvođenja, anti-HtrA1 antitelo inhibira aktivnost HtrA1 serinske proteaze sa IC50manje od 50 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 5 nM, 3 nM, 2,5 nM, 2 nM, 1 nM ili manje za jedan HtrA1 supstrat ili više njih. U određenim primerima izvođenja, anti-HtrA1 antitelo štiti fotoreceptorske ćelije od propadanja, održava debljinu spoljašnjeg nuklearnog sloja ili štiti funkcionalnu aktivnost elektroretinograma u modelu očnog oboljenja, kao što je model konstantnog izlaganja svetlosti miša opisan u Primerima u nastavku.

D. Imunokonjugati

Pronalazak takođe daje imunokonjugate, uključujući anti-HtrA1 antitelo ovde konjugovano sa jednim ili više citotoksičnih agenasa, kao što su hemoterapeutski agensi ili lekovi, agensi za inhibiciju rasta, toksini (npr. proteinski toksini, enzimski aktivni toksini bakterijskog, fungalnog, biljnog ili životinjskog porekla, ili njihovi fragmenti) ili radioaktivni izotopi.

U sledećem primeru izvođenja, imunokonjugat je konjugat antitelo-lek (ADC) u kome je antitelo vezano za jedan ili više lekova, uključujući, bez ograničenja, maitansinoid (pogledajte SAD patent br.5.208.020, 5.416.064 i evropski patent EP 0425 235 B1); kao što su funkcionalni ostaci leka monometilauristatin DE i DF (MMAE i MMAF) (pogledajte SAD patent br.5.635.483 i 5.780.588 i 7.498.298); dolastatin; kaliheamicin ili njegov derivat (pogledajte SAD patent br.

5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001, i 5.877.296; Hinman et al., Cancer Res.53:3336-3342 (1993); i Lode et al., Cancer Res.58:2925-2928 (1998)); antraciklin, kao što je daunomicin ili doksorubicin (pogledajte Kratz et al., Current Med. Chem.

13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002); i U.S. Patent No.6,630,579); metotreksat; vindezin; taksan, kao što su docetaksel, paklitaksel, larotaksel, tesetaksel i ortataksel; trihotecen; i CC1065.

U drugom primeru izvođenja, imunokonjugat uključuje antitelo, kao što je ovde opisano, vezano za enzimski aktivan toksin ili njegov fragment, uključujući, bez ograničenja, A lanac difterije, nevezujuće aktivne fragmente toksina difterije, A lanac egzotoksina (iz Pseudomonas aeruginosa), A lanac ricina, A lanac abrina, A lanac modecina, alfa-sarcin, Aleurites fordii proteine, diantin proteine, proteine vinobojke Phytolaca americana (PAPI, PAPE i PAP-S), inhibitor iz gorke dinje (momordica charantia), kursin, krotin, inhibitor iz sapunjače (sapaonaria officinalis), gelonin, mitogelin, restriktocin, fenomicin, enomicin i trikotecene.

U drugom primeru izvođenja, imunokonjugat uključuje antitelo, kao što je ovde opisano, vezano za radioaktivni atom, dajući radiokonjugat. Dostupni su raznovrsni radioizotopi za proizvodnju radiokonjugata. Primeri uključuju At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>, Pb<212>i radioaktivne izotope Lu. Kada se radiokonjugat koristi za detekciju, on može da sadrži radioaktivni atom za scintigrafske studije, na primer tc<99m>ili I<123>ili spin oznaku za snimanje nuklearnom magnetnom rezonancom (NMR) (takođe poznato kao snimanje magnetnom rezonancom, MR), kao što je jod-123, jod-131, indijum-111, fluor-19, ugljenik-13, azot-15, kiseonik-17, gadolinijum, mangan ili gvožđe.

Konjugati antitela i citotoksičnog agensa mogu se napraviti pomoću različitih agenasa za vezivanje bifunkcionalnih proteina, kao što je N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio) propionat (SPDP), sukcinimidil-4-(N-maleimidometil) cikloheksan-1-karboksilat (SMCC), iminotiolan (IT), bifunkcionalni derivati imidoestara (kao što je dimetil adipimidat HCl), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao što je glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis (pazidobenzoil) heksandiamin), bis-diazonijum derivati (kao što je bis-(p-diazonijumbenzoil)-etilendiamin), diizocijanati (kao što je toluen 2,6-diizocijanat), i bis-aktivna jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). Na primer, imunotoksin ricina može se dobiti kao što opisuju Vitetta i sar., Science 238:1098 (1987). Ugljenikom-14 obeležena 1-izotiocijanatobenzil-3-metildietilen triaminpentasirćetna kiselina (MX-DTPA) je primer helatnog agensa za vezivanje radionukleotida za antitelo. Pogledajte WO94/11026. Povezivač može biti „raskidivi linker” koji olakšava oslobađanje citotoksičnog leka u ćeliji. Na primer, mogu se koristiti kiselinski labilni linker, linker osetljiv na proteazu, dimetilni linker ili linker koji sadrži disulfide (Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992); U.S. Patent No.5,208,020).

Imunokonjugati ili ADC koji su ovde izričito razmatrani, bez ograničenja, takve konjugate pripremljene sa reagensima za biokonjugaciju koji uključuju, bez ograničenja, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC i sulfo-SMPB i SVSB (sukcinimidil-(4-vinilsulfon)benzoat) koji su komercijalno dostupni (npr. Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL.,SAD).

E. Postupci i kompozicije za dijagnostiku i detektovanje

U određenim primerima izvođenja, svako od anti-HtrA1 antitela koja su ovde data korisno je za detektovanje HtrA1 u biološkim uzorcima. Termin „detekcija”, u smislu ovog dokumenta, obuhvata kvantitativnu ili kvalitativnu detekciju. U određenim primerima izvođenja, biološki uzorak obuhvata ćeliju ili tkivo, kao što je uzorak koji sadrži fototreceptorsku ćeliiju, retinalni pigment ćelija epitela, ćelije spoljašnjeg nuklearnog sloja, unutrašnju nuklearni sloj, Milerove ćelije, cilijarni epitel ili retinsko tkivo.

U sledećem primeru izvođenja, dato je anti-HtrA1 antitelo za upotrebu u postupcima za dijagnozu ili detekciju. U daljem aspektu, dat je postupak za detekciju prisustva HtrA1 u biološkom uzorku. U određenim primerima izvođenja, postupak obuhvata kontakt biološkog uzorka sa anti-HtrA1 antitelom kao što je ovde opisano, pod uslovima koji dopuštaju vezivanje anti-HtrA1 antitela sa HtrA1, i detektovanje da li je nastao kompleks između anti-HtrA1 antitela i HtrA1. Takav postupak može biti in vitro ili in vivo postupak. U sledećem primeru izvođenja, anti-HtrA1 antitelo je upotrebljeno da se izabere ispitanik podoban za terapiju anti-HtrA1 antitelom, npr. kada je HtrA1 biomarker za izbor pacijenata.

U određenim primerima izvođenja, pacijent podoban za lečenje anti-HtrA1 antitelom može se identifikovati uočavanjem jednog polimorfizma ili više njih u HtrA1 genu ili HtrA1 kontrolnoj sekvenci, kao što je polimorfizam HtrA1 promotera rs11200638(G/A) (A. DeWan, et al., Science 314: 989-992 (2006)).

Primeri poremećaja koji se mogu dijagnostikovati pomoću antitela predmetnog pronalaska uključuju okularne poremećaje, kao što su, na primer, mokra makularna degeneracija uslovljene godinama starosti (AMD), suva makularna degeneracija uslovljena godinama starosti, geografska atrofija (GA), dijabetesna retinopatija (DA), prematurna retinopatija (ROP) ili polipoidna horoidalna vaskulopatija (PCV).

U određenim primerima izvođenja, data su obeležena anti-HtrA1 antitela. Oznake uključuju, bez ograničenja, oznake ili grupe koje se detektuju direktno (kao što su fluorescentne, hromoforne, elektronski nepropusne, hemiluminescentne i radioaktivne oznake), kao i grupe, kao što su enzimi ili ligandi, koje se detektuju indirektno, npr. putem enzimske reakcije ili molekulske interakcije. Primeri oznaka uključuju, bez ograničenja, radioizotope 32P, 14C, 125, 3H i 131I, fluorofore kao što su helati retkih zemalja ili fluorescein i njegovi derivati, rodamin i njegovi derivati, dansil, umbeliferon, luceriferaze, npr. luciferaza svica i bakterijska luciferaza (U.S. Patent br. 4,737,456), luciferin, 2,3-dihidroftalazindioni, peroksidaza rena (HRP), alkalna fosfataza, βgalaktozidaza, glukoamilaza, lizozim, saharid oksidaze, npr. glukoza oksidaza, galaktoza oksidaza i glukoza-6-fosfat dehidrogenaza, heterociklične oksidaze, kao što je urikaza i ksantin oksidaza, vezane sa enzimom koji koristi vodonik peroksid za oksidaciju prekursora boje, kao što je HRP, laktoperoksidaza ili mikroperoksidaza, biotin/avidin, spin oznake, oznake bakteriofagi, stabilni slobodni radikali i slično.

F. Farmaceutske formulacije

Farmaceutske formulacije anti-HtrA1 antitela kako su ovde opisane pripremaju se mešanjem takvog antitela koje ima željeni stepen čistoće sa jednim ili više opcionih farmaceutski prihvatljivih nosača (Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora. Farmaceutski prihvatljivi nosači su generalno netoksični za primaoca u primenjenim dozama i koncentracijama, i uključuju, bez ograničenja,: pufere, kao što je fosfatni, citratni, , i puferi drugih organskih kiselina; antioksidanse, uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što je oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabene, kao što je metil ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide male molekulske mase (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što je albumin iz seruma, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere, kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline, kao što je glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate, uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatne agense, kao što je EDTA; šećere, kao što je saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontra-jone koji grade soli, kao što je natrijum; metalne komplekse (npr. kompleksi Znprotein); i/ili nejonske surfaktante, kao što je polietilen glikol (PEG). cPrimeri farmaceutski prihvatljivih nosača ovde dalje uključuju sredstva za intersticijalnu disperziju lekova, kao što su rastvorni neutralno aktivni glikoproteini hijaluronidaze (sHASEGP), na primer, humani rastvorljivi PH-20 glikoproteini hijaluronidaze, kao što je rHuPH20 (HYLENEX<®>, Baxter International, Inc.). Pojedine primere sHASEGP i postupke primene, uključujući rHuPH20, opisuje US Patent Publication br.2005/0260186 i 2006/0104968. U jednom aspektu, sHASEGP se kombinuje sa jednom ili više dodatnih glikozaminoglikanaza, kao što je hondroitinaza.

Primeri liofilizovanih formulacija antitela su opisani u US Patentu br.6,267,958. Vodene formulacije antitela uključuju one opisane u US Patentu br. 6,171,586 i WO 2006/044908, pri čemu ove druge formulacije uključuju histidin-acetatni pufer.

Formulacije ovde mogu takođe da sadrže više od jednog aktivnog sastojka, kao što je neophodno za naročitu indikaciju koja se leči, poželjno one sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču negativno jedna na drugu. Na primer, za lečenje okularnih poremećaja u vezi sa neželjenom neovaskularizacijom, kao što je mokra AMD, bilo bi poželjno dodatno obezbediti antiangiogenu terapiju, poput anti-VEGF terapije LUCENTIS™ (ranibizumab). Takvi aktivni sastojci su pogodno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za nameravane svrhe. U drugim primerima izvođenja, lečenje bolesti ili poremećaja u vezi sa neželjenom okularnom neovaskularizacijom može da obuhvati kombinaciju terapija anti-HtrA1 antitelom i fotodinamičnu terapiju (npr. MACUGEN™ ili VISUDYNE™).

Aktivni sastojci mogu biti zarobljeni u pripremljenim mikrokapsulama, na primer, tehnikom koacervacije ili interfacijalne polimerizacije, na primer, hidroksimetilceluloze, odnosno želatinskih mikrokapsula, i poli-(metilmetakrilat) mikrokapsula, u koloidnim sistemima za isporuku lekova (na primer, lipozomi, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su objavljene u Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).

Mogu se pripremiti preparati sa produženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju semipermeabilne matrice čvrstih hidrofobnih polimera koje sadrže antitelo, pri čemu su matrice uobličeni proizvodi, npr. film ili mikrokapsule.

Formulacije za primenu in vivo generalno su sterilne. Sterilnost se može lako postići, npr. filtracijom kroz sterilne filtracione membrane.

G. Terapeutski postupci i kompozicije

Svako od anti-HtrA1 antitela koja su ovde data može biti upotrebljeno u terapeutskim postupcima.

U određenim primerima izvođenja, anti-HtrA1 antitelo je korisno za inhibiciju degeneracije retinalnih ćelija (npr. retinalni pigment ćelija epitela RPE) ili fotoreceptorskih ćelija u oku pacijenta koji boluje ili je u riziku od dobijanja okularnog oboljenja (npr. pacijent koji ima HtrA1 polimorfizam, povišenu ekspresiju HtrA1 u oku ili druze u bar jednom oku). U određenim primerima izvođenja, anti-HtrA1 antitelo može se koristiti za usporavanje progresije kasnog stadijuma geografske atrofije ili suve makularne degeneracije uslovljene godinama starosti u oku pacijenta koji ima druze u oku koje se leči. U određenim primerima izvođenja, pacijent podoban za lečenje anti-HtrA1 antitelom može se identifikovati otkrivanjem bolesti u bar jednom oku. Na primer, određeni pacijenti mogu se izabrati na osnovu uočavanja druza, geografske atrofije ili horoidalne neovaskularizacije u jednom oku, dok drugo oko nema simptome. Takvi pacijenti mogu da budu dobri kandidati za preventivno lečenje oka bez simptoma, npr. odlaganje početka ili smanjivanje ozbiljnosti takvih simptoma (npr. druze, geografska atrofija i/ili horoidalna neovaskularizacija) u oku bez simptoma. Umesto toga, oko sa simptomima može da se leči ili oko sa simptoma i oko bez simptoma mogu da se leče u skladu sa ovdeopisanim postupcima. Shodno tome, anti-HtrA1 antitelo može se koristiti za sprečavanje ili inhibiciju progresije okularnog poremećaja u oku pacijenta, pri čemu je pacijent dobio druze, mokru AMD ili geografsku atrofiju u drugom oku, ali oko koje se leči još uvek nema simptome. Umesto toga, oko sa simptomima se leči ili se oba oka leče, ono sa simptomima i ono bez njih.

U drugom primeru izvođenja, anti-HtrA1 antitelo delotvorno je za lečenje artritisa.

U jednom aspektu, anti-HtrA1 antitelo se koristi kao lek. U daljem aspektu, obezbeđeno je anti-HtrA1 antitelo za lečenje okularnih oboljenja ili poremećaja, kao što su, na primer, AMD (mokra ili suva), GA, DR, PCV ili ROP. U određenim primerima izvođenja, dato je anti-HtrA1 antitelo za upotrebu u postupku lečenja. U određenim primerima izvođenja, pronalazak daje agonističko anti-HtrA1 antitelo za upotrebu u postupku lečenja pojedinca koji ima metaboličku bolest, koja obuhvata davanje pojedincu efikasne količine anti-HtrA1 antitela. U jednom konkretnom izvođenju takvog primera, postupak dalje uključuje davanje pojedincu efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, npr. kao što je opisano u nastavku. U sledećem primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-HtrA1 antitelo za upotrebu u inhibiranju degeneracije retinalnih ćelija (RPE ćelije) ili fotoreceptorskih ćelija u oku pacijenta. U određenim primerima izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-HtrA1 antitelo za upotrebu u postupku inhibiranja degeneracije retinskih ili fotoreceptorskih ćelija kod pojedinca, što podrazumeva ovdeopisanu primenu efikasne količine anti-HtrA1 antitela u cilju kočenja degeneracije retinskih ili fotoreceptorskih ćelija. U sledećim primerima izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-HtrA1 antitelo za upotrebu u inhibiranju aktivnosti HtrA1 serinske proteaze u oku pacijenta. U određenim primerima izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-HtrA1 antitelo za upotrebu u postupku inhibirana aktivnosti HtrA1 serinske proteaze u oku pojedinca, što podrazumeva ovdeopisanu primenu efikasne količine anti-HtrA1 antitela u cilju kočenja aktivnosti HtrA1 serinske proteaze u oku. „Pojedinac” u skladu sa svim gorenavedenim primerima izvođenja poželjno je čovek. U sledećim primerima izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-HtrA1 antitelo za upotrebu u inhibiranju PCV kod pacijenata kojima je to potrebno, npr. pacijenti koji imaju horoidalne vaskularne mreže sa aneurizmatskim dilatacijama nalik polipima.

„Pojedinac” u skladu sa svim gorenavedenim primerima izvođenja može da bude čovek. Efikasnost lečenja okularnih poremećaja pomoću anti-HtrA1 antitela može se izmeriti različitim pregledima koji se obično koriste za procenu intraokularnih oboljenja, kao što su, npr. očni pregled merenje intraokularnog pritiska, procena vizuelne oštrine, merenje pritiska biomikroskopom, procena intraokularnog zapaljenja, merenje CNV, merenje curenja CNV (npr. angiografija fluorscinom), merenje količine druza, merenje lokacije druza, itd. U određenim primerima izvođenja, gubitak vida može se proceniti merenjem srednje vrednosti promene vizuelne oštrine (BCVA) od osnove do željene tačke (npr. kad se BCVA zasniva na tabeli vizuelne oštrine iz studije ranog lečenja dijabetesne retinopatije (ETDRS) i testu koji se izvodi sa četiri metra udaljenosti), merenje proporcija ispitanika koji su izgubili manje od 15 slova prilikom procene vizuelne oštrine u poređenju sa osnovicom, merenje proporcija ispitanika koji je dobio više od ili 15 slova prilikom procene vizuelne oštrine u poređenju sa osnovicom, merenje proporcija ispitanika sa vizuelnom oštrinom ekvivalentnoj 20/2000 ili lošije u trenutku merenja ili merenje prema NEI upitniku funkcionisanja vida.

U daljem aspektu, pronalazak daje farmaceutske formulacije koje obuhvataju bilo koje od ovde datih anti-HtrA1 antitela, npr. za upotrebu u bilo kojoj od gornjih terapeutskih postupaka. U sledećem primeru izvođenja, farmaceutska formulacija uključuje bilo koje od ovde datih anti-HtrA1 antitela i farmaceutski prihvatljiv nosač. U drugom primeru izvođenja, farmaceutska formulacija uključuje bilo koje od ovde datih anti-HtrA1 antitela, i najmanje jedno dodatno lekovito sredstvo, npr. kao što je dole opisano.

Antitela iz pronalaska mogu se koristiti ili sama ili u kombinaciji sa drugim agensima u terapiji. Na primer, antitelo iz pronalaska može biti primenjeno uz barem jedan dodatni terapeutski agens. U određenim primerima izvođenja, dodatni terapeutski agens je terapeutski agens pogodan za lečenje okularnih poremećaja u vezi sa neželjenom neovaskularizacijom u oku, kao što je, mokra AMD. Odgovarajući terapeutski agensi uključuju, na primer, antiangiogene terapije kao što je anti-VEGF terapija LUCENTIS™ (ranibizumab).

Takve kombinovane terapije koje su gore pomenute obuhvataju kombinovanu primenu (gde su dva ili više terapeutskih agenasa obuhvaćeni istom formulacijom, ili različitim formulacijama), i odvojenu primenu, u kom slučaju primena antitela iz pronalaska može da se odigra pre primene dodatnog terapeutskog agensa i/ili adjuvansa, istovremeno sa njim i/ili nakon njegove primene. Antitela iz predmetnog pronalaska mogu se koristiti u kombinaciji sa fotodinamičnom terapijom (MACUGEN™ ili VISUDYNE™).

Antitelo iz pronalaska (i svaki dodatni terapeutski agens) može biti primenjeno bilo kojim pogodnim postupkom, uključujući parenteralnu, intrapulmonarnu i intranazalnu i, ako se želi za lokalno lečenje, intralezionu primenu. Parenteralne infuzije uključuju intramuskularnu, intravensku, intraarterijsku, intraperitonealnu ili supkutanu primenu. U primernom izvođenju, antitelo iz pronalaska (i svaki dodatni terapeutski agens) može se davati intravitrealnim injekcijama. Doziranje može biti bilo kojim prikladnim načinom, npr. putem injekcija, kao što su intravenske ili supkutane injekcije, što delimično zavisi od toga da li je primena kratkotrajna ili hronična. Ovde su razmatrani različiti rasporedi doziranja uključujući, bez ograničenja, pojedinačnu ili višestruku primenu u različitim terminima, bolusnu primenu i pulsnu infuziju.

Antitela iz predmetnog pronalaska bi bila formulisana, dozirana i primenjena u skladu sa dobrom lekarskom praksom. Faktori za razmatranje u ovom kontekstu uključuju konkretni poremećaj koji se leči, konkretnog sisara koji se leči, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzrok poremećaja, mesto isporuke agensa, postupak primene, raspored primene i ostale faktore poznate lekarima. Antitelo ne mora da bude, ali je opciono formulisano sa jednim ili više agenasa koji se tekuće primenjuju za sprečavanje ili lečenje poremećaja o kome se radi. Efikasna količina takvih drugih agenasa zavisi od količine antitela prisutnog u formulaciji, vrste poremećaja ili lečenja, kao i drugih faktora koji su razmatrani u gornjem tekstu. Oni se generalno koriste u istim dozama i sa istim načinom primene kao što je gore opisano, ili od oko 1 do 99% doza koje su ovde opisane, ili u bilo kojoj dozi i sa bilo kojim načinom primene za koje je empirijski/klinički dokazano da su odgovarajući.

Za prevenciju ili lečenje bolesti, odgovarajuća doza antitela iz pronalaska (kada se koristi samo ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih dodatnih terapeutskih agenasa) zavisiće od vrste bolesti koja se leči, vrste antitela, težine i toka bolesti, bilo da se antitelo koristi u preventivne ili terapeutske svrhe, kao i od prethodne terapije, kliničke istorije pacijenta i njegovog odgovora na antitela i odluke nadležnog lekara. Antitelo se pogodno primenjuje na pacijentu jednokratno, ili kao serija terapija. U zavisnosti od vrste i težine bolesti, oko 1 μg/kg do 15 mg/kg (npr.0,1 mg/kg – 10 mg/kg) antitela je kandidat za početnu dozu za primenu na pacijentu, ili, na primer, putem jedne ili više primena, ili kontinualnom infuzijom. Jedna tipična dnevna doza može biti u rasponu od oko 1 μg/kg do 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od gorenavedenih faktora. Kod ponovljene primene tokom nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje će generalno biti nastavljeno sve do željenog suzbijanja simptoma bolesti. Doza antitela navedena kao primer bila bi u opsegu od oko 0,05 mg/kg do oko 10 mg/kg. Tako, jedna ili više doza od oko 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ili 10 mg/kg (ili bilo koja njihova kombinacija) može se dati pacijentu. Takve doze mogu se primenjivati povremeno, npr, svake nedelje ili svake tri nedelje (npr. tako da pacijent primi od oko dve do oko dvadeset ili npr. oko šest doza antitela). Može se primeniti veća početna doza, a nakon toga jedna ili više manjih doza.

Podrazumeva se da bilo koja od gorenavedenih formulacija ili terapeutskih postupaka može biti izvedena uz upotrebu imunokonjugata iz pronalaska umesto anti-HtrA1 antitela ili kao dodatak anti-HtrA1 antitelu.

H. Proizvodi

U drugom aspektu pronalaska, obezbeđen je proizvod koji sadrži materijale korisne za lečenje, prevenciju i/ili dijagnostikovanje gore opisanih poremećaja. Proizvod sadrži ambalažu i etiketu ili uputstvo u pakovanju, na ambalaži ili povezano sa njom. Pogodna ambalaža uključuje, na primer, boce, bočice, špriceve, kese za IV rastvor, itd. Ambalaža može biti izrađena od različitih materijala, kao što je staklo ili plastika. Ambalaža sadrži smešu koja je sama po sebi ili u kombinaciji sa drugom smešom efikasna za lečenje, prevenciju i/ili dijagnostikovanje stanja, i može da ima priključak za sterilni pristup (na primer, ambalaža može biti kesa za intravenski rastvor, ili bočica sa zapušačem koji može da se probuši iglom za potkožnu injekciju). Najmanje jedan aktivni agens u kompoziciji je antitelo iz pronalaska. Etiketa ili uložak pakovanja ukazuje da se kompozicija koristi za lečenje stanja po izboru. Pored toga, proizvod može da sadrži (a) prvo pakovanje sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, pri čemu kompozicija sadrži antitelo iz pronalaska; i (b) drugo pakovanje sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, pri čemu kompozicija sadrži dodatni citotoksični ili drugi terapeutski agens. Proizvod u ovoj realizaciji pronalaska može dalje da sadrži uputstvo u pakovanju koje ukazuje da kompozicija može da se koristi za lečenje specifičnog stanja. Alternativno, ili dodatno, proizvod može dalje da sadrži drugo (ili treće) pakovanje koje sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekciju (BWFI), fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Može dalje da obuhvati druge materijale poželjne sa komercijalnog i aspekta upotrebe, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.

Podrazumeva se da bilo koja od gorenavedenih proizvoda mogu biti izvedena uz upotrebu imunokonjugata iz pronalaska umesto anti-HtrA1 antitela ili kao dodatak anti-HtrA1 antitelu.

Ključ sekvence

Laki lanac HVR za anti-HtrA1 antitelo YW505.94

Tabela A. HVR i sekvence varijabilnog domena za anti-HtrA1 YW505.94 antitelo i njegove varijante sa unapređenim afinitetom.

III. Primeri

Primer 1: Generacija anti-HtrA1 antitela Displej faga. Kolekcije sintetičkih antitela sadrže bivalentne Fab fragmente na M13 fagu, a diverzitet je generisan upotrebom oligousmerenih mutageneza u tri regiona za utvrđivanje komplementarnosti (CDR) teškog lanca. Pojedinosti Fab kolekcija opisane u prethodnom delu teksta (Lee, C.V., et al., J Mol Biol. 340:1073-93 (2004); Lee, C.V., et al., J Immunol Methods.

284:119-32 (2004)). Nunc Maxisorp mikrotitarske ploče sa 96 udubljenja obložene su preko noći na 4° C sa MuHtrA1_PD (10 μg/ml), a zatim blokirane tokom sat vremena na sobnoj temperaturi sa puferom za blokadu faga (PBS, 1% (w/v) BSA, 0,05% (v/v) Tween 20). Kolekcije antitela dobijenih iz faga dodate su mikrotitarskim pločama obloženim MuHtrA1_PD tokom noći na sobnoj temperaturi. Mikrotitarske ploče su oprane BS, puferom 0,05% (v/v) Tween-20, a vezani fag prečišćen elucijom pomoću 50 mM HCl – 500 mM NaCl tokom 30 minuta i neutralizovan jednakom količinom 1 M Tris-HCl, pH 7,5. Izdvojeni fag je amplificiran pomoću Xl-1 plavih ćelija E. coli. Tokom narednih faza selekcije, inkubacija antitela faga mikrotitarskim pločama obloženih antigenom smanjena je na 2–3 sata, a učestalost pranja ploče postepeno je povećana. Trinaest identifikovanih klonova je reformatirano u IgG (kao što je opisano u nastavku za Fab94), eksprimirano u 293 ćelije i prečišćeno pomoću afinitetne hromatografije proteina A. Trinaest prečišćenih IgG vezanih za MuHtrA1_PD u vezujućem ELISA testu.

Ekspresija i prečišćavanje anti-HtrA1 Fab94 i IgG94. Varijabilni regioni teškog i lakog lanca Fab94 (YW505.94) subklonirani su u E. coli Fab ekspresione vektore (AEP1). Rezultujući plazmid je transformiran u E. coli. u soj 34B8. Preko noći je uzgojena jedna kolonija na 37° C u 30 ml LB medijuma obogaćenog sa 50 μg/ml karbenicilina. Pet ml kulture je kalemljeno u 500 ml kompletnog C.R.A.P. medijuma (Simmons, L.C., et al., J Immunol Methods. 263:133-47 (2002)) obogaćenog sa karbenicilinom (50 μg/ml) i uzgajano na 30° C tokom 24 h. Fab94 protein je prečišćen pomoću protein A agaroza smole.

Varijabilni domeni lakog i teškog lanca Fab94 klonirani su u plazmid zasnovan na pRK5 pomoću humanog lakog lanca ili teškog lanca (humani IgG1) konstatnog domena za tranzijentnu ekspresiju u ćelijama kineskog hrčka (CHO). IgG94 protein je prečišćen pomoću agarozne hromatografije proteina A.

Sekvence aminokiselina za laki lanac varijabilnog regiona i teški lanac varijabilnog regiona za Fab94 (YW505.94) prikazane su na Slikama 1A i 1B, datim redosledom.

Primer 2: Proizvodnja HtrA1 proteina

Konstrukti proteina. Humani HtrA1 (HuHtrA1) (Q23-P480) pune dužine i mišiji trA1 (MuHtrA1) (P24-P480) pune dužine klonirani su amplifikacijom PCR od klonova pune dužine koristeći Taq polimerazu. Prajmerima sa nukleotidima bio je potreban dodatni deo restrikcionih mesta BamHI i EcoRI za rezultujuće PCR proizvode. PCR fragmenti vezani su u modifikovanom transfernom vektoru pAcGP67 bakulovirusa (BD Pharmingen) sa sadržajem His6sekvence (SEQ ID NO: 90) iznad BamHI restrikcionog mesta, rezultujući N-kraj His6tag (SEQ ID NO: 90) na HtrA1 proteinima.

Domen proteaze humanog HtrA1 (HtrA1_PD) kojem nedostaje N-domen i PDZ domen (npr. sadrži ostatke D161-K379) kloniran je PCR amplifikacijom. Amplifikovani DNK umetnut je u modifikovani pET vektor rezultujući N-krajem His6tag (SEQ ID NO: 90) i mesto sečenja trombina sjedinjeno je iznad D161 kodona HtrA1. HtrA1_PD Ala-mutanti generisani su pomoću kompleta za QuikChange XL graničnikom posredovanu mutagenezu u skladu sa protokolom proizvođača (Agilent Technologies, Santa Clara CA). Konstrukti su verifikovani postupkom sekvenciranja DNK. Domeni proteaze mišijeg HtrA1 (MuHtrA1_PD) (G156-S367), mišijeg HtrA3 (MuHtrA3_PD) (P133-F350) i mišijeg HtrA4 (MuHtrA4_PD) (E159-Y371) klonirani su prema klonovima pune dužine pomoću Pfu (Agilent) polimeraze. Prajmerima sa nukleotidima bilo je potrebno dodavanje restrikcionih mesta Not I i Stu I za rezultujuće PCR proizvode. PCR fragmenti su vezani u pST23 ekspresionog vektora pomoću phoA promotera. Ovaj vektor ekspresije sadrži sekvence aminokiseline MK(HQ)6MHQSTAA (SEQ ID NO: 11) iznad Not I restrikcionog mesta rezultujući fuzijom N-kraja enzimskog taga za domene proteaze.

Kao što je ovde opisano, ostaci aminokiseline huHtrA1, muHtrA1, muHtrA3, i muHtrA4 napravljeni su prema SEQ ID NO: 13-16, datim redosledom. Pozicije aminokiselina naznačeni su aminokiselinskom šifrom od jednog slova praćeno pozicijom u okviru jedne od SEQ ID NO:13-16. Na primer, huHtrA1 pune dužine sadrži početak sekvence na glutaminu na položaju 23 SEQ ID NO:13, a kraj na prolinu na položaju 480 SEQ ID NO:13, npr. Q23-P480. Slično tome, mutacije na određenim položajima u okviru HtrA proteina označene su početnom aminokiselinom, praćeno položajem jedne SEQ ID NO:13-16, praćeno supstituisanom aminokiselinom. Na primer, mutacija lizina na položaju 248 HuHtrA1 (SEQ ID NO:13) do alanina označava se kao K248A.

Ekspresija i prečišćavanje proteina. HuHtrA1 i MuHtrA1 su eksprimirani u ćelijama insekta Trichoplusia ni (Expression Systems LLC, Woodland, CA). Obrađenom mediju ćelije insekta (nakon što je pH podešen na 6,8) dodat je NiCl2, CaCl2i NaCl do dobijanja finalne koncentracije od 1,0 mM, 2,5 mM i 150 mM, datim redosledom.

Konstrukti HuHtrA1_PD (nemutirani i S328A mutant) eksprimovani su E. coli BL21 (Stratagene). Kulture E. coli su uzgajane na 37° C u LB medijumu sa 50 μg/ml karbenicillina, dok A600ne dostigne 0,8 do 1,0, a zatim se indukuje sa 0,4 mM IPTG i uzgajani na 16° C tokom 24 h. Kuglice bakterijskih ćelija su resuspendovane u 1/10<th>kulturi zapremine 50 nM Tris pH 8,0, 500 mM NaCl i prekinute pomoću uređaja Microfluidizer. Lizati su centrifugirani pri 30,000 x g tokom 30 min.

HuHtrA1, MuHtrA1, HuHtrA1_PD i HuHtrA1_PD(S328A) su prečišćeni pomoću smole nikl-nitrilo trisirćetne kiseline (Qiagen). Nakon dodavanja medija ćelije insekta ili lizata E. coli, kolone su oprane zapreminom 10 kolona (CV) 50 mM Tris pH 8,0, 500 mM NaCl praćeno 10 CV 50 mM Tris pH 8,0, 1 M NaCl, 20 mM imidazola. Proteini su prečišćeni elucijom pomoću 50 mM Tris pH 8,0, 200 mM NaCl, 10% glicerola, 0,25% CHAPS, 300 mM imidazola. Spojene frakcije su dodatno prečišćene hromatografijom na molekularnim sitima na S-200 koloni (GE Healthcare), a prikupljeni su pikovi frakcija u skladu sa trimeričnim oblicima proteina. Čistoća proteina bila je veća od 90% prema proceni SDS-PAGE, dok su koncentracije proteina utvrđene pomoću proteinskog testa BCA™ (Pierce, Rockford, IL).

HuHtrA1_PD Ala mutanti (panel od 15 mutanata, osim S328A) eksprimovani su kao što je opisano za nemutirani oblik HuHtrA1_PD (videti iznad). Pufer za liziranje (PopCulture, EMD Chemical, San Diego CA) dodat je kuglicama bakterijskih ćelija u odnosu 50 ml pufera za liziranje / 500 ml peleta. Pelet je u potpunosti suspendovan u pufer za liziranje pomoću politrona i mešan na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. Ćelijski lizat je centrifugiram (Beckman, LA-16.250 rotor) pri 33,700 x g tokom 30 min na 4° C, a rezultujući supernatant je filtriran kroz 0,22 μm filtarsku jedinicu (Nalgene). Filtrirani supernatant je nasut u Ni-NTA kolonu (3 ml, Qiagen) prethodno uravnoteženu sa 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazola, 10% glicerol pH 8,0 (pufer A). Nakon punjenja, kolona je oprana sa 12 CV pufera A, praćeno 20 CV pufera A+ 0,1% Triton X-114. Kolona je opet oprana pomoću 15 CV pufera A radi uklanjanja deterdženta. Proteini su prečišćeni elucijom koristeći pufer A 200 mM imidazole, 0,25% CHAPS. Spojene frakcije su dodatno prečišćene na koloni Superdex 200 (Hi load 16/60, 120 ml, GE Healthcare) uravnotežene sa 50 mM Tris pH 8,0, 200 mM NaCl, 10% glicerol, 0,25% CHAPS. Frakcije koje odgovaraju HtrA1_PD trimer pikovima su spojene. Čistoća proteina bila je veća od 90% prema proceni SDS-PAGE, dok su koncentracije proteina utvrđene pomoću proteinskog testa BCA™ (Pierce, Rockford, IL).

MuHtrA1_PD, MuHtrA3_PD i MuHtrA4_PD eksprimovane su E. coli 58F3 (Szeto, W., et al., Cancer Res. 61:4197-205 (2001)). Kulture E. coli ostavljene preko noći, rasle su na 30° C u LB medijumu sa 50 μg/ml karbenicillina, zatim su razređene (1/100 vol) u veću kulturu sa C.R.A.P. medijumom (Simmons, L.C., et al., J Immunol Methods. 263:133-47 (2002)) obogaćen sa 50 μg/ml karbenicillina. Nakon inokulacije, E. coli su uzgajane tokom približno 20 h na 30° C. MuHtrA1_PD je prečišćen kao što je opisano za HuHtrA1_PD (videti iznad). Za prečišćavanje MuHtrA3_PD i MuHtrA4_PD, pufer za liziranje (50 mM Tris pH 8,5, 500 mM NaCl, 10 mM imidazol, 10% glicerol) dodat je u kuglice bakterijskih ćelija. Kuglice su homogenizovane u puferu za liziranje pomoću politrona, a ćelije su prekinuta mikrofluidizerom. Ćelijski lizat je centrifugiran, a rezultujući supernatant filtriran kroz 0,22 μm filtarsku jedinicu (Nalgene). Filtrirani supernatant je nasut u Ni-NTA kolonu zapremine 3 ml (Qiagen) prethodno uravnoteženu sa 25 mM Tris pH 8,5, 500 mM NaCl, 20 mM imidazola, 10% glicerol (pufer B). Nakon punjenja, kolona je oprana sa 12 CV pufera B, praćeno 20 CV pufera B+ 0,1% Triton X-114. Kolona je opet oprana pomoću 15 CV pufera B radi uklanjanja deterdženta. Proteini su prečišćeni elucijom pomoću 25 mM Tris pH 8,5, 500 mM NaCl, 250 mM imidazola, 10% glicerola, 0,25 % CHAPS. Spojene frakcije su dodatno prečišćene na koloni Superdex 75 zapremine 120 ml (GE Healthcare) uravnotežene sa 25 mM Tris pH 8,5, 10% glicerol, 0,5 mM TCEP, 0,25% CHAPS. Frakcije koje odgovaraju trimer pikovima proteaze su spojene. Čistoća proteina bila je veća od 90% prema proceni SDS-PAGE.

Primer 3: Utvrđivanje inhibitorske aktivnosti anti-HtrA1 antitela pomoću FRET testa

Sinteza peptidnih supstrata. Peptid H2-Opt (Mca-IRRVSYSF(Dnp)KK) (SEQ ID NO:12), originalno opisan kao supstrat za HtrA2 (Martins, L.M., et al., J Biol Chem.278:49417-27 (2003)), sintetizovan je na Fmoc-Lys(Boc)-wang smoli pomoću standardnih procedura kuplovanja sa HBTU. Fmoc-Lys(DNP)-OH (Anaspec) je inkorporiran na poziciji P5'. Peptid je sintetizovan sve do P5 (Mca, 7-metoksi-kumarin, Aldrich), a zatim odvojen od čvrste podloge pomoću trifluorosirćetne kiseline, triizopropilsilana i vode tokom 2 sata na sobnoj temperaturi. Peptid je precipiran od etil-etra, ekstrahovan sirćetnom kiselinom, acetonitrilom, vodom, a zatim je liofilizovan. Sirovi peptid je rastvoren i prečišćen na obrnutoj C18 koloni preparativnom hromatografijom koristeći acetonitril/vodu. Prečišćene frakcije su spojene, liofilizirane i analizirane tečnom hromatografijom / masenom spektometrijom (Ph/Sciex) i utvrđeno je sa su u skladu sa svojim izračunatim masama.

Enzimski testovi sa peptidnim supstratom. HtrA1 je inkubiran u ploči za uzorke sa 96 udubljenja sa crnim optičkim dnom (Nalge Nunc Int., Rochester, NY) sa IgG94 ili Fab94 rastvorenim u 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 200 mM NaCl, 0,25% CHAPS (pufer testa) tokom 20 minuta na 37° C. Za inicijalno testiranje, panel od 13 anti-HtrA1 dobijenih iz faga, pojedinačne koncentracije IgG (finalne koncentracije 0,16 mg/ml – 0,28 mg/ml) inkubirano je sa HuHtrA1 ili HuHtrA1_PD. Rastvor 10 mM peptidnog supstrata Mca-IRRVSYSF(Dnp)KK (SEQ ID NO:12) (H2-Opt) u DMSO rastvoren je u vodi do 12,5 μM, prethodno ugrejan na 37° C, a zatim dodat u reakcionu smešu. Finalne koncentracije reaktanata bile su sledeće: 5 nM HuHtrA1 ili MuHtrA1, 0,005 – 300 nM IgG94, 0,02 – 900 nM Fab94, 2,5 μM H2-Opt. Porast fluorescentnog signala (ekscitacija 328 nm, emisija 393 nm) izmeren je na SPECTRAmax M5 čitaču za mikrotitarske ploče (Molecular Devices, Sunnyvale, CA), a utvrđene su i linearne stope H2-Opt (mRFU/min). Eksperimenti sa inhibicijom IgG94 tripsina (Roche) i elastaze (MP Biomedicals) izvedeni su identično, osim što su finalne koncentracije enzima bile 1 nm, IgG94 koncentracije je bila 300 nM, a vreme inkubacije 15 minuta.

Kao što je prikazano na Slici 2, panel od 13 antitela dobijenih iz faga (IgG) inkubiran je sa HuHtrA1 ili HuHtrA1_PD, a enzimska aktivnost je izmerena. Od 13 testiranih antitela, antitela YW503.57, YW504.57, YW504.61 i YW505.94 (pominju se i kao Fab94, antitelo 94, Ab94 ili IgG94) snažno su inhibirale aktivnosti HuHtrA1 i HuHtrA1_PD.

Kao što je prikazano na Slici 3, IgG94 je inhibirao enzimatsku aktivnost HuHtrA1 usmerenu na H2-Opt supstrat na način zavisan od koncentracije sa IC50vrednostima od 1,8 nM. Kompletna inhibicija je dostignuta iznad 30 nM IgG94. Nasuprot tome, dva preostala člana porodice serinske proteaze nalik tripsinu, tripsin i elastaza, nisu bili inhibirani IgG94 pri 300 nM, što ukazuje na to da IgG94 ima specifičnost usmerenu na HuHtrA1. Fab94 takođe je inhibirao HuHtrA1 na način zavisan od koncentracije, ali manje potentno od IgG94, kao što je naznačeno IC50vrednošću od 29,1 nM. Ovi rezultati su u sjajnom odnosu sa KDvrednosti od 31,1 nM utvrđenim eksperimentima površinske plazmonske rezonance (videti Tabelu 1 u nastavku). Rezultati pokazuju da IgG94 i Fab94 imaju sposobnost da u potpunosti neutralizuju enzimsku aktivnost HuHtrA1 usmerenu na male supstrate sintetičkog peptida i da je ova aktivnost specifična. Štaviše, približno 16-struki porast u potentnosti IgG94 u odnosu na Fab94 konzistentan je sa efektima aviditeta predviđenim ’modelom kaveza’ IgG94:HtrA1 kompleksa na osnovu masene analize (videti, npr. Tabelu 2 i Sliku 9).

Inhibitorni potencijal varijansnog antitela sa unapređenim afinitetom YW505.94a.28 takođe je utvrđen pomoću prethodnoopisanog testa sa ugašenom fluorescencijom peptidnog supstrata H2-Opt i 1,0 nM HuHtrA1 ili 1,5 nM HuHtrA1_PD. Rezultati su prikazani u nastavku.

Primer 4: Utvrđivanje inhibitorske aktivnosti anti-HtrA1 antitela pomoću makromolekularnog supstrata

Goveđi β-kazein (Sigma-Aldrich) prečišćen je na MonoQ jonoizmenjivačkoj koloni za dobijanje visokoprečišćenog materijala. HuHtrA1 je inkubiran u ependorf tubama sa povećanim koncentracijama IgG94 u puferu testa tokom 15 minuta na 37° C nakon čega se dodaju makromolekularni supstrati. Za digestiju β-kazeina, finalne koncentracije reaktanata iznosile su: 10 nM HuHtrA1, 50 μg/ml β-kazein, 2,3 nM – 150 nM IgG94. Za dekorin, finalne koncentracije iznosile su: 125 nM HuHtrA1, 50 μg/ml dekorina (R & D Systems), 2 nM – 125 nM IgG94. Za biglikan, finalne koncentracije iznosile su: 75 nM HuHtrA1, 50 μg/ml biglikana (R & D Systems), 2,3 nM – 150 nM IgG94. Nakon inkubacije na 37° C (2 h za β-kazein, 14 h za dekorin, 6 h za biglikan), dodat je SDS uzorak pufera, a uzorci su prokuvani i analizirani pomoću SDS-PAGE (neredukcioni uslovi).

Hidroliza kazeina kontrastovanog fluorescentnom bojom, BODIPY FL kazein (Invitrogen), izvršena je u ploči za uzorke sa 96 udubljenja sa crnim optičkim dnom (Nalge Nunc Int., Rochester, NY). HuHtrA1 ili MuHtrA1 su inkubirani sa IgG94 rastvorenom u puferu testa tokom 15 minuta na 37° C. Nakon dodavanja BODIPY FL u pufer testa, koncentracije reaktanata bile su sledeće: 30 nM HuHtrA1, 30 nM MuHtrA1, 5μg/ml BODIPY FL, 0,24 nM – 250 nM IgG94. Porast fluorescentnog signala (ekscitacija 484 nm, emisija 535 nm) izmeren je na SPECTRAmax M5 čitaču za mikrotitarske ploče (Molecular Devices, Sunnyvale, CA), a utvrđene su i linearne stope BODIPY FL (mRFU/min) određene i izražene kao procenti neinhibiranih stopa (kontrole).

Kao što je prikazano na Slici 6, HuHtrA1 je degradirao supstrate β-kazein, dekorin i biglikan (2. linija). U odsustvu HuHtrA1, supstrati su ostali netaknuti tokom eksperimentalnog perioda (Slika 6, 1. linija). Preinkubacija HuHtrA1 sa povećanim koncentracijama IgG94 (Slika 6, 9. linija – 3. linija) rezultovala je inhibiciju degradacije supstrata zavisnu od koncentracije. Pri najvišim testiranim koncentracijama IgG94, potpuno je sprečena degradacija β-kazeina, dekorina i biglikana (Slika 6, 3. linija). Rezultati pokazuju da IgG94 potentno i efikasni inhibira aktivnost HuHtrA1 usmerenu na tri makromolekularna supstrata.

Kao što je prikazano na Slici 4, hidroliza IgG94 inhibiranim BODIPY FL zavisna od koncentracije pomoću HuHtrA1 i MuHtrA1 sa IC50vrednostima od 8,3 nM i 5,4 nM, datim redosledom. Rezultati pokazuju da IgG94 prepoznaje i potpuno neutralizuje enzimsku aktivnost HuHtrA1 i MuHtrA1 usmereni na makromolekularni supstrat BODIPY FL.

Primer 5: Utvrđivanje specifičnosti vezivanja anti-Htra1 antitela za Htra1

Specifičnost IgG94 procenjena je merenjem aktivnosti za inhibiciju muHtrA1_PD u poređenju sa njegovom sposobnošću da inhibira strukturno povezane proteaze MuHtrA3_PD i MuHtrA4_PD (videti Sliku 5). Specifičnost je utvrđena FRET testom, kao što je opisano u Primeru 3, osim toga što su koncentracije MuHtrA1_PD, MuHtrA3_PD i MuHtrA4_PD 6nM bile 20nM i 20nM, datim redosledom, a opseg koncentracije IgG94 bio je 0,2 nM – 400 nM. Specifičnost je takođe utvrđena supstratom kazeina BODIPY FL, kao što je opisano u Primeru 4, osim toga što su koncentracije MuHtrA1_PD, MuHtrA3_PD i MuHtrA4_PD bile 50nM, a opseg koncentracije IgG94 bio je 1,4 nM – 1000 nM. IgG94 je inhibirao MuHtrA1_PD isečak H2-Opt (Slika 5, gornji panel) i BODIPY FL (Slika 5, donji panel), ali nije inhibirao isecanje istog supstrata MuHtrA3_PD i MuHtrA4_PD do koncentracija od 400 nM i 1000 nM za H2-Opt i BODIPY FL supstrate, datim redosledom. Rezultati ukazuju na to da IgG94 ima izvanrednu specifičnost i da ne ometa aktivnosti povezanih proteaza.

Primer 6: Utvrđivanje afiniteta antitela pomoću uređaja BIAcore

Za utvrđivanje afiniteta vezivanja Fab94 pomoću kinetičke titracije, korišćena je površinska plazmonska rezonanca (SPR) na uređaju BIAcore™ T100. Ukratko, S serije senzorskih čipova CM5 aktivirano je pomoću reagensa EDC i NHS, u skladu sa uputstvima proizvođača, a streptavidin (Pierce) je kupolovan da dostigne približno 2000 jedinica odgovora (RU), praćeno blokiranjem nereagovanih grupa sa 1M etanolamina.

Za kinetička merenja, prvo su injektovani biotinilirani HuHtrA1_PD ili MuHtrA1_PD pri stopi protoka od 10µl/min za obuhvatanje približno 100 RU na 3 različite protočne ćelije (FC), osim za FC1 (referentna ćelija), a zatim je injektovan petostruki serijski rastvor Fab94 (0,48 nM – 300 nM) u 0,01M HEPES pH 7,4, 0,15M NaCl, 0,005% surfaktanta P20 (stopa protoka: 30 µl/min) bez regeneracije između injekcija. Senzorgrami su zabeleženi i procenjeni pomoću evaluacionog softvera BIAcore™ T100 (verzija 2.0) nakon oduzimanja referentnih ćelijskih signala. Brzine asocijacije (kon) i brzine disocijacije (koff) izračunate su pomoću jednostavnog jedan-na-jedan Lengmirovog modela vezivanja. Ravnotežna konstanta disocijacije (KD) izračunata je kao razmera koff/kon(videti Tabelu 1 u nastavku). Kinetika vezivanja Fab94 za HuHtrA1_PD i MuHtrA1_PD bila je veoma slična. Vrednosti KDiznosile su 31,1 nM i 28,9 nM, datim redosledom.

Tabela br.1. Afinitet vezivanja Fab94 za HuHtrA1_PD i MuHtrA1_PD pomoću površinske plazmonske rezonance.

Primer 7: Mapiranje epitopa IgG94 na HuHtra1_pd

Za identifikovanje funkcionalnog epitopa vezivanja IgG94, generisan je panel HuHtrA1_PD mutanata sa individualnim alaninskim mutacijama za eksperimente vezivanja. Većina mutiranih ostataka locirana je površinskim petljama koje okružuju aktivna mesta i takođe uključuju katalitički serin (S328) id aspartat (D250). Mutanti su eksprimovani u E. coli, a trimeri su prečišćeni hromatografijom na molekularnim sitima, kao što je opisano u Primeru 2. Vezivanje je utvrđeno pomoću ELISA testa, koji je sproveden pomoću MAXISORP™ mikrotitarske pločice obložene HuHtrA1_PD mutantima pri 2 µg/ml u PBS tokom 1 h, praćeno blokiranjem PBST pufera (0,5% BSA i 0,05% Tween 20 u PBS) tokom jednog sata na sobnoj temperaturi. Dodat je IgG94 (50 nM na 0,0006 nM) petostruko rastvoren u PBST puferu i inkubiran tokom 30 minuta. Ploče su oprane PBT puferom (0,05% Tween 20 u PBS), dodata su kozja antihumana antitela konjugovana HRP (H+L) (Invitrogen) (1:5000 u PBST puferu) i inkubirana tokom jednog sata.

Ploče su oprane PBT puferom i razvijene dodavanjem supstrata tetrametilbenzidina (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD). Apsorpcija pri 450 nm iskorišćena je kao funkcija koncentracije antitela u rastvoru za utvrđivanje EC50vrednosti. Lokacije mutanata koji utiču na vezivanje zatim su mapirane na strukturu HtrA1.

U vezujućem ELISA testu, IgG94 prikazao je najveću redukciju vezivanja za mutante HuHtrA1_PD(N224A) i HuHtrA1_PD(K248A) (videti Sliku 7A). Nakon ponavljanja eksperimenta sada sa nižim koncentracijama HtrA1 za oblaganje ploča (1 µg/ml) i kraćim vremenom inkubacije (skraćeno sa 1 sata na 20 minuta inkubacije), IgG94 takođe je prikazao najmanje petostruko smanjenje vezivanja za HuHtrA1 mutante V201A, H220A, T223A, K225A, K243A i E247A (videti Sliku 7A). Rezultati ukazuju na to da se IgG94 vezuje za epitop koji uključuje ostatke N224 i K248, koji su locirani na petlji B i petlji C (videti Slike 7B i 7C). U serinskoj proteazi nalik tripsinu ove petlje su poznate kao deo regiona koji određuje specifičnost i reaguje sa supstratima. K248 (petlja C) veoma je bliska katalitičkim D250, N224 i H220. Stoga, vezivanje IgG94 za ove ostatke može da onemogući pristup supstrata katalitičkim pukotinama bilo direktnom prostornom preprekom ili indirektnim alosteričnim mehanizmom kao što je utvrđeno za neutralizaciju anti-HGFA antitela koje takođe prepoznaje ostatke u petlji C (Ganesan, R., et al., Structure 17:1614-1624 (2009); Wu, Y., et al., Proc Natl Acad Sci USA 104:19784-9 (2007)). Umesto toga, vezivanje antitela može da inhibira katalizu direktnim uticanjem na ostatke katalitičke trijade D250 i/ili H220.

Primer 8: Stehiometrija kompleksa HtrA1_PD sa Fab94 i IgG94 pomoću hromatografije na molekularnim sitima – višeugaono lasersko rasejavanje svetlosti (SEC-MALLS)

Katalitički neaktivan oblik HuHtrA1_PD(S328A) korišćen je za formaciju kompleksa. Kompleksi Fab94:HuHtrA1_PD(S328A) i IgG94:HuHtrA1_PD(S328A) formiranu su Tris puferu (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 200 mM NaCl, 10% glicerol, 0,25% CHAPS). Kompleksi i pojedinačne komponente inkubirane su na 4° C preko noći, a zatim injektovana i razrešena na koloni S200 Superdex 10/300 GL (GE Healthcare) u Tris puferu sa stopom protoka od 0,5 mL/min. Podaci su prikupljani pomoću 18-ugaonog detektora za rasejavanje svetlosti (Dawn Helios II sa QELS) i detektora indeksa refrakcije (Optilab reX) kompanije Wyatt Technologies. Analiza je izvršena pomoću Astra 5 softvera za prinos molarne mase nezavisno od vremena elucije. Normalizacija je izvršena sa kontrolnim IgG.

SEC-MALLS eksperimenti pokazuju da Fab94 i IgG94 formiraju komplekse sa HuHtrA1_PD(S328A) koji imaju različite mase. Utvrđene mase i izvedena stehiometrija kompleksa prikazane su u Tabeli 2.

Tabela 2. Stehiometrija HuHtrA1_PD(S328A) u kompleksu sa Fab94 i IgG94 utvrđena pomoću SEC-MALLS.

<*>HuHtrA1_PD je HuHtrA1_PD sa katalitičkim serinom mutiranim u alanin (HuHtrA1_PD(S328A)); masa predstavlja trimer

<**>Prosek dva nezavisna eksperimenta

<&>Razmera antitelo:trimer proteaze

Utvrđene mase Fab94:HtrA1_PD(S328A) kompleksa od 210,100 Da odgovaraju kompleksu tri Faba koja se vezuju za jedan HuHtrA1_PD(S328A) trimer (3:1 kompleks). Razlika između eksperimentalnih i teoretskih masa takvog 3:1 kompleksa iznosi samo 4,2%. Stoga, jedan Fab ima sposobnost da se veže za svaki HuHtrA1_PD(S328A) monomer u okviru jednog HtrA1 homo-trimera.

Utvrđene mase IgG94:HtrA1_PD(S328A) kompleksa od 618,600 Da odgovaraju 3:2 stehiometriji, s tim da se tri IgG molekula vezuju za dva HuHtrA1_PD(S328A) trimera. Razlika između eksperimentalnih i teoretskih masa takvog 3:2 kompleksa iznosi samo 1,9%.

Objašnjene stehiometrije u skladu su sa nalazima da Fab94 i IgG94 imaju sposobnost kompletnog inhibiranja HtrA1 aktivnosti, s tim da se svaki monomer u okviru HtrA1 trimera vezuje za jedan Fab ili za jednu Fab granu na IgG. Stoga, u ovim kompleksima nema ’slobodnog’ HtrA1 monomera, u skladu sa kompletnom inhibicijom HtrA1 aktivnosti enzima pomoću Fab94 i IgG94. Predlažemo ’model kaveza’ za IgG94:HtrA1_PD(S328A) kompleks u kom Fab grane 3 IgG spajaju dva trimera, svaka Fab grana se vezuje za jedan monomer (videti Sliku 9). Model uzima u obzir i približno 16-struko povećanje potencije IgG94 u odnosu na Fab94 u enzimskim testovima (videti Sliku 3), s tim da IgG94 ima velike koristi od efekata aviditeta u svom vezivanju za HtrA1_PD trimere.

Primer 9: Afinitetno sazrevanje YW505.94

Kolekcije konstrukata za anti-HtrA1 afinitetno sazrevanje. Klon YW505.94a dobijen je od YW505.94 [Ab94] menjanjem Kabatovog ostatka N28 za serin u okviru CDR H1 u cilju uklanjanja potencijalnog mesta N-vezane glikozilacije. Fazmid pW0703, dobijen od fazmida pV0350-2b (Lee et al., J Mol. Biol 340, 1073-1093 (2004)), koji sadrži stop kodon (TAA) u svim CDR-L3 pozicijama i prikazuje monovalentni Fab na površini M13 bakteriofaga, koji služi kao obrazac kolekcije za graftovanje teškog lanca varijabilnog domena (VH) klona YW505.94a za afinitetno sazrevanje. Za afinitetno sazrevanje korišćene su obe strategije randomizacije, čvrsta i mekana. Za čvrstu randomizaciju, jedna kolekcija lakog lanca (L1/L2/L3hard) sa izabranim pozicijama na tri laka lanca CDR randomizovana je pomoću aminokiselina koje imitiraju prirodna humana antitela, a projektovana DNK degeneracija bila je u skladu s opisom (Lee et al., 2004). Za mekanu randomizaciju, izabrani ostaci na Kabalovim pozicijama 91, 92, 93, 94 i 96 od CDR-L3, 28-35 od CDR-H1, 50-58 od CDR-H2 i 95-100 od CDR-H3 sa dve različite kombinacije CDR petlji, L3/H1soft, L3/H2soft i L3/H3soft, ciljani su za randomizaciju. Za postizanje uslova mekane randomizacije, kojima se uvodi stopa mutacije od približno 50% na izabranim položajima, mutagena DNK bila je sintetizovana sa 70-10-10-10 smešama baza naklonjenih nemutiranim nukeotidima (Gallop et al., J. of Med. Chem.37, 1233-1251 (1994)).

Strategija sortiranja faga radi izolovanja unapređenih varijnati u pogledu afiniteta. Za selekciju na osnovu unapređenja afiniteta, kolekcije faga su podvrgnute sortiranju na ploči tokom prve faze, praćene sa još četiri faze sortiranja rastvora. Tokom prve faze sortiranja na ploči, četiri kolekcije (L1/L2/L3hard, L3/H1soft, L3/H2soft i L3/H3soft) sortirane su na mikrotitarske ploče (NUNC Maxisorp ploča) obložene humanim HtrA1 (HuHtrA1) odvojeno od inputa faga pri približno 3 O.D./ml u 1% BSA i 0,05% Tween 20 tokom 1 sata na sobnoj temperaturi (RT). Nakon prve faze sortiranja na ploči, obavljene su četiri faze sortiranja rastvora za povećanje učestalosti selekcije. Za sortiranje rastvora, 1 O.D./ml propagiranog faga iz prve faze sortiranja na ploči inkubirano je sa 500 nM biotiniliranog HuHtrA1 u 100 ul pufera sa sadržajem 1% superblok (Pierce biotechnology) i 0,05% Tween20 tokom najmanje 1 sata na sobnoj temperaturi (RT). Smeša je dalje rastvorena 10X pomoću 1% superbloka i primenjena u količini od 100ul/udubljenju u udubljenja obložena neutravidinom (10ug/ml) tokom 15 minuta na RT uz nežno mešanje tako da biotinilirani HuHtrA1 može da veže fag. Udubljenja su oprana deset puta pomoću PBS-0,05% Tween20. Za utvrđivanje pozadinskog vezivanja, kontrolna udubljenja u kojima su fagi bez biotiniliranog izbora HuHtra1 izdvojeni su na pločama obloženim neutravidinom. Vezani fag je prečišćen elucijom pomoću 0,1N HCl tokom 20 minuta, neutralizovan 1/10 zapremine od 1M Tris pH11, titriran i propagiran za sledeću fazu. Dalje, obavljene su još tri runde sortiranja rastvora koristeći dva postupka povećanja simultane učestalosti selekcije. Prvi postupak, koja služi za brzu selekciju, smanjuje koncentraciju biotiniliranog ciljanog proteina sa 10 nM na 0,1 nM. Drugi postupak, koja služi za sporu selekciju, dodaje dodatnu količinu nebiotiniliranog HuHtrA1 proteina (100~1000 puta više) za odbacivanje onih sa slabijim vezivnim svojstvima. Takođe, input faga se smanjio (0,1 O.D/ml ~ 0,5 O.D/ml) kako bi se snizilo pozadinsko vezivanja faga.

ELISA skrining afiniteta visoke propustljivosti (kompetitivni test s pojedinačnim uzorkom). Izabrane su kolonije iz pete faze skrininga i preko noći uzgajane na 37° C u 350ul/udubljenju 2YT medijuma sa 50ug/ml karbenicillina i 1e 10/ml K07 u ploči sa 96 udubljenja (QIAgene). Sa iste ploče je izabrana kolonija XL-1 inficirana matičnim fagom kao kontrolna grupa. Nunc Maxisorp mikrotitarske ploče sa 96 udubljenja obložene su količinom od 100 ul/udubljenju HuHtrA1 proteina (2ug/ml) u PBS na RT tokom 2 sata. Ploče su blokirane pomoću 100ul 0,5% BSA i 0,05% Tween u PBS (PBST pufer) tokom sat vremena.

Supernatant faga je razređen u odnosu 1:5 u PBST puferu sa ili bez 5nM HuHtrA1 u 100ul ukupne zapremine i inkubiran najmanje 1 sat na RT. Zatim, 75 ul smeše je prebačeno u ploče obložene HuHtrA1. Ploča je nežno mešana tokom 15 minuta radi izdvajanja nevezanog faga na ploči obloženoj HuHtra1. Ploča je oprana pet puta pomoću 0,05% Tween20 u PBS (PBT pufer). Vezivanje je kvantifikovano dodavanjem anti-M13 antitela konjugovanog peroksidazom rena u ELISA puferu (1:5000) i inkubacijom od 30 minuta na RT. Udubljenja su oprana pet puta pomoću PBT pufera. Dalje, 100ul/udubljenje u razmeri 1:1 supstrat peroksidaze 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin (TMB) i rastvor B peroksidaze (H2O2) (Kirkegaard-Perry Laboratories (Gaithersburg, MD)) dodati su u udubljenje i inkubirani 5 minuta na RT. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 100 ul 1M fosforne kiseline (H3PO4) u svako udubljenje i ostavljena da se inkubira 5 minuta na RT. OD svakog udubljenja utvrđeno je pomoću čitača standarne ELISA ploče na 450 nm. OD redukcija (%) izračunata je sledećom jednačinom:

OD450nmredukcija (%) = [(OD450nmudubljenja s kompetitorom) / (OD450nmudubljenja bez kompetitora)] *100

U poređenju sa OD450nmredukcijom (%) udubljenja matičnog faga (100%), klonovi koji su imali OD450nmredukcije (%) niži od 50% izabrani su za sekvencijalnu analizu (videti Slike 15 i 16). Jedinstveni klonovi su izabrani za preparaciju faga radi utvrđivanja afiniteta vezivanja (fag IC50) pomoću ELISA kompetitivnog testa faga (videti Slike 17 i 18). Zatim, oni klonovi kojima se najviše unapredio afinitet (YW505.94a.28 & YW505.94a.54) reformatirani su u humani IgG1 za proizvodnju antitela i dalje BIAcore kinetičke analize vezivanja.

ELISA kompetitivni test faga za utvrđivanje IC50. MAXISORP™ mikrotitarske ploče obložene su HuHtrA1 pri 2 µg/ml u PBS tokom 2 sata na RT, a zatim blokirane PBST puferom za još jedan sat na RT. Prečišćeni fag iz kulture supernatanta inkubiran je sa rastvorom HuHtrA1 ili MuHtrA1 u PBST puferu na mikrotitarskoj ploči sa kulturom tkiva tokom jednog sata, nakon čega je 80 µl smeše prebačeno u udubljenja obložena HuHtrA1 na 15 minuta radi izdvajanja nevezanog faga. Ploča je oprana PBT puferom, a zatim je dodato anti-M13 antitelo konjugovano HRP (Amersham Pharmacia Biotech) (1:5000 u PBST puferu) na jedan sat. Ploča je oprana PBT puferom i razvijena dodavanjem supstrata tetrametilbenzidina (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD). Apsorpcija pri 450 nm iskorišćena je kao funkcija koncentracije HuHtrA1 ili MuHtrA1 u rastvoru za utvrđivanje IC50vrednosti faga. Ovo je korišćeno kao procena afiniteta za laboratorijskog klona na površini faga. Slika 17 sadrži rezultate kompetitivnog testa faga koji prikazuju vezivanje YW505.94a unapređene varijante u pogledu afiniteta u poređenju sa HuHtrA1. Slika 18 sadrži rezultate kompetitivnog testa faga koji prikazuju vezivanje YW505.94a unapređene varijante u pogledu afiniteta u poređenju sa MuHtrA1.

Utvrđivanje afiniteta antitela pomoću BIAcore. Za utvrđivanje afiniteta vezivanja HtrA1 antitela pomoću kinetičke titracije, korišćena je površinska plazmonska rezonanca (SPR) na uređaju BIAcore™ T100. Ukratko, S serije senzorskih čipova CM5 aktivirano je pomoću reagensa EDC i NHS, u skladu sa uutstvima proizvođača, a streptavidin (Pierce) je kuplovan da dostigne približno 2000 jedinica odgovora (RU), praćeno blokiranjem nereagovanih grupa sa 1M etanolamina.

Za kinetička merenja, prvo su injektovani biotinilirani humani ili mišiji HtrA1 pri stopi protoka od 10µl/min za obuhvatanje približno 100 RU na 3 različite protočne ćelije (FC), osim za FC1 (referentna ćelija), a zatim je injektovan petostruki serijski rastvor anti-HtrA1 Fab u HBS-P puferu (0,01M HEPES pH 7,4, 0,15M NaCl, 0,005% surfaktanta P20) počevši od niske (0,48 nM) do visoke (300 nM) [5 tačaka] (stopa protoka: 30µl/min) jedan za drugim u istom ciklusu bez regeneracije između injekcija. Senzogram je zabeležen, upoređen, a pufer je oduzet pre procene evaluacionim softverom BIAcore™ T100 (verzija 2.0). Brzine asocijacije (kon) i brzine disocijacije (koff) izračunate su pomoću jednostavnog jedan-na-jedan Lengmirovog modela vezivanja. Ravnotežna konstanta disocijacije (KD) izračunata je kao odnos koff/kon. Rezultati su prikazani ispod u Tabeli 3.

Tabela 3. Afinitet vezivanja sazrelih fabova u poređenju sa matičnim fabom.

Primer 10: Očuvanje fotoreceptora, spoljašnjeg nuklearnog sloja (ONL) i funkcionalnih odgovora u odsustvu HtrA1 nakon konstantnog izlaganja svetlosti Konstrukcija HtrA1 nokaut-miša. Za dobijanje HtrA1(+/-) embrionskih stem ćelija, linearizovani ciljani vektor DNK elektroporiran je u ES ćelije Balb/c pozadine za uvođenje Flox mesta u regionu 5’ eksona 1 i regionu 3’ eksona 1 i uvedenog gena otpornog na neomicin (Neo). Izabrani su ES klonovi otporni na neomicin, a ekson 1 sa transporterom neomicina je izrezan elektroporacijom ES ćelija sa ekspresionim plazmidom koji eksprimira cre-rekombinazu. Homologna rekombinacija je potvrđena sekvenciranjem čitavog HtrA1 lokusa i gornjeg regiona promotera u ciljanoj ES ćeliji. Ciljani klonovi su ubrizgani u C57BL/6 blastociste za dobijanje muških himernih miševa germitivne transmisije. Ukrštanje /- ženki i /-mužjaka miševa izvršeno je radi dobijanja -/- ženki ili -/- mužjaka HtrA1 miševa na Balb/c pozadini. Uspešno brisanje HtrA1 potvrđeno je RT-PCR jajnih ćelija od HtrA1 wt i ko miševa.

Model konstantnog izlaganja svetlosti. Mužjaci Balb/c Htra1 wt/wt ili ko/ko miševa, starosti 8–13 nedelja, nalaze se u normalnom kavezu (<100 lux) do početka konstantnog izlaganja svetlosti (CLE). Radi započinjanja CLE, miševi se drže pojedinačno u normalnim kavezima pokrivenim samo žičanim poklopcem, bez filtera. Kuglice hrane i hidrogela postavljaju se na dno kaveza, a ne na žičani poklopac, tako da ne utiče na ulazak svetlosti u kavez. Deset kaveza je postavljeno na Metro policu opremljenu fluorescentnim svetlima i opkoljenu belim panelima kako bi reflektovali ~1200 luksa miševima tokom 14 dana. Kavezi se rotiraju u smeru suprotnom kazaljki na satu svakog dana tokom CLE kako bi se obezbedila podjednaka raspodela svetlosti. Ako se koristi više polica, kavezi se takođe rotiraju između polica kako bi se obezbedila podjednaka raspodela svetlosti.

Optička koherentna tomografija. Optička koherentna tomografija (OCT) izvodi se 4–7 dana pre izlaganja svetlosti radi dobijanja osnovice za merenje debljine retine. OCT se izvodi pomoću kamere Heidelberg Spectralis HRA+OCT. Životinje dobijaju anesteziju 70 mg/kg – 80 mg/kg ketamine / 15 mg/kg ksilazina u 150 ul – 300 ul sterilnog slanog rastvora, oči se šire pomoću kapi 1% tropikamida, a debljina retine se meri pomoću OCT. Veštačke suze se koriste za održavanje vlažnosti oka i sprečavanja katarakte. Nakon OCT, životinje oporavljaju od anestezije i vraćaju u svoje kaveze na svetlosne police.

Elektroretinogram. Elektroretinogrami (ERG) se sprovode 7 dana pre izlaganja svetlosti i 15 dana posle CLE. ERG se obavlja i beleži pomoću sistema vizuelne elektrofiziologije Diagnosys LLC Espion 2 i Colordome desktop Ganzfeld kao izvora svetlosti. Miševi se prilagođavaju mraku tokom noći u mračnoj sobi za uravnotežavanje fotoreceptora. Kada se priviknu na mrak, sve naknadne procedure se izvode u mraku samo sa crvenim svetlom za iluminaciju. Životinje se anesteziraju ketaminom, 75 mg/kg – 80 mg/kg, i ksilazinom 7,5 mg/kg – 15 mg/kg, IP u 200 ul – 300 ul PBS. Telesna temperatura miševa se održava na 37° C pomoću homeotermičke ploče povezane sa kontrolnom jedinicom. Zenice se šire pomoću 1% tropikamida. ERG oba oka biće snimljeni simultano pomoću Burian-Allen srebrnih ili platinastih provodnih žica elektroda. Miševi se postavljaju na platformu, referentna elektroda se umeće supkutano kroz čelo, a uzemljenje se umeće supkutano iznad repa. Rastvor Gonak hypermellose se postavlja na korneu za uspostavljanje električnog kontakta između kornee i elektrode, i da zaštiti oko od sušenja tokom eksperimenta. Elektrode se postavljaju na levo i desno oko, a miš se stavlja u svetlosni simulator ColorDome. Oči se stimulišu belom svetlošću (7 bleskova jačine 4e-5, 2e-5, 0,5, 2, 5, 10, 20 cd.s/m<2>), signali se filtriraju kroz propusnike pri 0,15 Hz – 1000 Hz i uzorkuju na 2 kHz.

Utvrđivanje HtrA mRNK nivoa u retini i jajnicima miševa. Cele oči su izvađene, retina uklonjena i postavljena u RLT pufer (Qiagen), a zatim zamrznuta na -80° C do homoginizacije. Retine su homogenizovane i isečene pomoću tuba gentleMACS M (Miltinyi Biotec). Slično retini, jajnici su izolovani iz ženki HtrA1 wt, het i ko miševa i homogenizovane na način opisan za retinu. RNK je izolovana pomoću kompleta Qiagen Plus RNeasy; cDNK je generisana pomoću kompleta High Capacity cDNA (Applied Biosystem); Taqman qPCR je izvršena pomoću 20 ug cDNK, Taqman mešavinom za ekspresiju gena (Applied Biosystem) i Taqman prajmera za testove ekspresije gena (Applied Biosystem) za ekson 1–2 (retina i jajnik), ekson 3–4 (jajnik) i ekson 5–6 (jajnik) i izvedena na sistemu ABI 7500 Real-time PCR (Applied Biosystem). HtrA ekspresija je normalizovana na 18 s ekspresije (prajmer kompanije Applied Biosystem).

Kao što je prikazano na Slici 11, ekspresija HtrA1 mRNK povećava se kod modela miša konstantno izloženog svetlosti. Međutim, kod istog modela, HtrA2 nivoi se ne povećavaju u retini. Pored toga, HtrA1 nivoi su značajno viši od nivoa HtrA2, HtrA3 i HtrA4 u retini kod neizloženih miševa.

Pored toga, ustanovili smo da se kod miševa kojima nedostaje HtrA1 ekspresija uočava očuvanje fotoreceptora (Slika 13), spoljašnjeg nuklearnog sloja (ONL) (Slika 14) i funkcionalnih odgovora (ERG) (Slika 12) kod degeneracije modela miševa indukovanih svetlom.

Primer 11: Uticaji na anti-HtrA1 antitela kod modela pacova konstantno izloženih svetlosti

Pacovi se izlažu konstantnoj svetlosti na način goreopisan za miševe. Biće procenjena efikasnost anti-HtrA1 antitela da zaštiti oko pacova od degeneracije izazvane izlaganjem svetlosti. Oči pacova se podvrgavaju intravitrealnim injekcijama anti-HtrA1 antitela u dozama i ponavljanjima potrebnim za održavanja efikasne koncentracije anti-HtrA1 antitela u oku tokom trajanja eksperimenta. Oči pacova se prate nakon izlaganja svetlosti radi utvrđivanja debljine retine pomoću OCT i njene funkcionalnosti pomoću ERG, kao što je goreopisano za model miša.

Primer 12: Ekspresija HtrA1 je obilna u staklastom telu pacova, a kod miševa se akumulira u očnoj vodici i očnom tkivu nakon svetlosnog stresa

ELISA test. Za analizu tkiva pacova, anti-muHtrA1 poliklonsko antitelo zeca (Genentech) razređeno je u 125 ng/mL, dok je za analizi očne vodice miša i tkiva retine rastvoreno anti-huHtrA1 moklonsko antitelo miša (Genentech) u 250 ng/mL, oba u PBS puferu, a zatim obloženi na ELISA ploče sa 384 udubljenja (Nunc; Neptune, NJ) tokom inkubacije preko noči na 4° C. Ploče su oprane PBS plus 0,05% Tween-20 i blokirane tokom dvočasovne inkubacije sa PBS plus 0,5% seruma albumina goveda (BSA). Ove i sve sledeće inkubacije sprovode se na sobnoj temperaturi uz nežnu agitaciju. Standardni rekombinantni mišiji HrA1 (Genentech) i uzorci pacova ili mišijeg tkiva razređeni su u rastvoru standardnog/uzorkovanog pufera (PBS, 0,5% BSA, 15 ppm Proclin, 0,05% Tween 20, 0,25% CHAPS, 0,2% BgG, 5 mM EDTA, 0,35M NaCl, (pH 7,4)), dodati na oprane ploče i inkubirani 1,5–2 sata. Pločom ograničeni HtrA1 otkriven je tokom jednočasovne inkubacije sa biotiniliranim anti-muHtrA1 poliklonskim antitelom zeca (Genentech) razređenim u 100 ng/mL za tkiva pacova i očnu vodicu i tkivo retine miša, biotiniliranim anti-huHtrA1 moklonsko antitelo miša (Genentech) razređenim u 200 ng/mL, oba u puferu testa (PBS, 0,5% BSA, 15 ppm proklin, 0,05% Tween 20), praćeno pranjem i 30-minutnom inkubacijom sa streptavidin-HRP (GE Healthcare; Piscataway, NJ), takođe razređenim u puferu testa (1:20000). Nakon poslednjeg pranja, dodat je tetrametil-benzidin (KPL, Gaithersburg, MD), boja je razvijana 10–15 minuta, a rearakcija zaustavljena pomoću 1 M fosforne kiseline. Ploče su pročitane pri 450 nm sa 620 nm referencom pomoću čitača mikroploče. Koncentracije pacovskog ili mišijeg HtrA1 izračunate su pomoću poklapanja prema četiri parametra standardne krive muHtrA1.

Kao što je prikazano na Slici 19A, ekspresija HtrA1 bila je niža u jajnicima, mozgu, slezini i tkivu oka pacova u poređenju sa nivoima ekspresije HtrA1 u staklastom telu pacova. Kao što je prikazano na Slici 19B, nivo HtrA1 u očnoj vodici miša povećao se kod modela konstantnog izlaganja svetlosti u poređenju s kontrolnim modelom. Kao što je prikazano na Slici 19C, nivo HtrA1 u tkivu retine miša povećao se kod modela konstantnog izlaganja svetlosti u poređenju s kontrolnim modelom.

Claims (23)

PATENTNI ZAHTEVI

1. Izolovano monoklonsko antitelo koje se vezuje za HtrA1 i inhibira aktivnost svoje serinske proteaze za jedan HtrA1 supstrat ili više njih, pri čemu antitelo sadrži VH sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 32 i VL sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 31.

2. Antitelo prema zahtevu 1, pri čemu se antitelo vezuje za epitop koji sadrži jednu ili obe aminokiseline N224 ili K248 SEQ ID NO: 13.

3. Antitelo prema zahtevu 1, pri čemu antitelo dalje sadrži jedno ili više svojstava navedenih u nastavku: (i) vezuje se za HtrA1 u razmeri od jednog varijabilnog domena prema jednoj podjedinici HtrA1 trimera ili (ii) ne sprečava formiranje trimera od HtrA1.

4. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 3, pri čemu antitelo ne reaguje unakrsno sa jednim ili više HtrA2, HtrA3 i HtrA4.

5. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 5, pri čemu antitelo ima konstantu disocijacije od ≤500 nM kao što je utvrđeno pomoću uređaja BIAcore koji koristi Fab na 25° C.

6. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 5, koje je humano, humanizovano ili himerno antitelo ili fragment antitela koji vezuje HtrA1.

7. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 6, pri čemu antitelo sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6, (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3.

8. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 6, pri čemu antitelo sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 19.

9. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 6, pri čemu antitelo sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6, (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 21; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 22.

10. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 9 obuhvata VH sekvencu koja ima najmanje 95% identiteta sekvence aminokiseline SEQ ID NO: 8 i VL sekvencu koja ima najmanje 95% identiteta sekvence aminokiseline SEQ ID NO: 7.

11. Antitelo prema zahtevu 1 obuhvata VH sekvencu SEQ ID NO: 8 i VL sekvencu SEQ ID NO: 7, VH sekvencu SEQ ID NO: 29 i VL sekvencu SEQ ID NO: 28 ili VL sekvencu SEQ ID NO: 30 i VH sekvencu SEQ ID NO: 29.

12. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 11, koje je IgG1 ili IgG4 antitelo pune dužine.

13. Izolovana nukleinska kiselina koja kodira antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 12.

14. Ćelija domaćin koja obuhvata nukleinsku kiselinu prema zahtevu 13.

15. Postupak proizvodnje antitela obuhvata kultivisanje ćelije domaćina prema zahtevu 14, u uslovima odgovarajućim za predstavljanje nukleinske kiseline koja kodira anti-HtrA1 antitelo.

16. Postupak prema zahtevu 15 dalje sadrži izdvajanje anti-HtrA1 antitela iz kulture ćelija domaćina.

17. Imunokonjugat koji sadrži antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 12 i citotoksični agens.

18. Farmaceutska formulacija koja sadrži antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 12 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

19. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 12 koje se koristi kao medikament.

20. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 12 koje se koristi za lečenje makularne degeneracije uslovljene godinama starosti, geografske atrofije, dijabetesne retinopatije, prematurne retinopatije ili polipoidne horoidalne vaskulopatije.

21. Antitelo prema zahtevu 20 koje se koristi za lečenje makularne degeneracije uslovljene godinama starosti.

22. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 12 koje se koristi za inhibiranje degeneracije retinskih ili fotoreceptorskih ćelija.

23. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 17 koje se koristi za inhibiranje aktivnosti HtrA1 proteaze u oku.